【事件の表示】
　特許第３２０４８７５号「細胞電位測定装置」の請求項１ないし１３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３２０４８７５号の請求項１ないし１３に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第３２０４８７５号の請求項１ないし１３に係る発明についての出願は、平成７年６月１２日（優先権主張６年６月１３日）に特許出願され、平成１３年６月２９日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、申立人アヤンダ　バイオシステムズ　ザールより特許異議の申立てがなされ、取消理由が通知され、その指定期間内である平成１４年８月６日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
（１）訂正の内容
＜訂正事項ａ＞
　特許請求の範囲の請求項１中の「Ｂ．前記一体化複合電極に電気信号を付与するとともに前記一体化複合電極からの電気信号を導出するための電気接続手段と、Ｃ．前記細胞に電気的刺激を与えるために前記電気接続手段Ｂに接続される刺激信号付与手段と、Ｄ．前記細胞の電気生理活動による出力信号を処理するために前記電気接続手段に接続される信号処理手段と、」を、
「Ｂ．前記細胞に電気信号を付与するための刺激信号付与手段と、Ｃ．前記細胞の電気生理活動によって出力される電気信号を処理するための信号処理手段と、Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段と備え、」と訂正する。
＜訂正事項ｂ＞
　特許明細書の段落番号【０００６】の「Ｂ．前記一体化複合電極に電気信号を付与するとともに前記一体化複合電極からの電気信号を導出するための電気接続手段と、Ｃ．前記細胞に電気的刺激を与えるために前記電気接続手段Ｂに接続される刺激信号付与手段と、Ｄ．前記細胞の電気生理活動による出力信号を処理するために前記電気接続手段に接続される信号処理手段と、」を、
「Ｂ．前記細胞に電気信号を付与するための刺激信号付与手段と、Ｃ．前記細胞の電気生理活動によって出力される電気信号を処理するための信号処理手段と、Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段とを備え、」と訂正する。
　
(２)　訂正事項について
　訂正事項ａは、電気接続手段が、刺激信号付与手段から複数の微小電極への電気信号の付与、ならびに複数の微小電極から信号処理手段への電気信号の導出の両方を同時に行うことが可能な構成となっているものに限定する訂正であって、特許請求の範囲の減縦を目的とするものである。
　そして、その訂正は、特許明細書における段落番号【０００９】、【００３４】、【００４４】、図９および図１２に記載された事項に基づくものであって、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもない。
　また、訂正事項ｂは、訂正事項ａの訂正に伴い、明細書の発明の詳細な説明の項における対応個所を訂正するものであって、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　そして、その訂正は、訂正事項ａと同様、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもない。
　
(３)　訂正事項の検討結果
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書き、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについて
（１）申立ての理由の概要
　異議申立人は、下記の刊行物を甲第１〜９号証として提出して、請求項１ないし１３に係る発明は、甲第１〜９号証に記載の発明に基づいて、当業者が容易に想到できたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである旨主張している。
　刊行物１：Journal of Neuroscience Methods， 23（1988）149−159（甲第１号証）
　刊行物２：Journal of Neuroscience Methods， 53（1994）101−110（甲第２号証）
　刊行物３：特開平６−１５１０２５号公報（平成６年５月３１日公開）（甲第３号証）
　刊行物４：特開平６−４３２０８号公報（平成６年２月１８日公開）（甲第４号証）
　刊行物５：特開平５−２５１１４５号公報（甲第５号証）
　刊行物６：特開平５−２１８１５４号公報（甲第６号証）
　刊行物７：特開平４−１８８７５５号公報（甲第７号証）
　刊行物８：特開平２−１１４１８６号公報（甲第８号証）
　刊行物９：特開昭６１−１１７４６８号公報（甲第９号証）
　
（２）本件特許発明
　本件特許第３２０４８７５号の請求項１ないし１３に係る発明（以下、「本件発明１」、・・・「本件発明１３」という。）は、平成１４年８月６日付けの訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし１３に記載された事項により特定される次のとおりのものである。
【請求項１】細胞の電気生理学的特性を測定するための細胞電位測定装置あって、
　　Ａ．基板上に複数の微小電極を備え、その上に細胞を置くための細胞設置部を備え、さらに前記微小電極の引き出し用導電パターンと、前記導電パターンの端部に接続された電気接点とを備えた一体化複合電極と、
　　Ｂ．前記細胞に電気信号を付与するための刺激信号付与手段と、
　　Ｃ．前記細胞の電気生理活動によって出力される電気信号を処理するための信号処理手段と、
　　Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段とを備え、
　　Ｅ．前記電気接続手段は、前記電気接点に接触する接触金具を有し前記ガラスプレートを上下から挟んで固定する２分割ホルダを備えていることを特徴とする細胞電位測定装置。
【請求項２】前記細胞を光学的に観察するための光学観察手段をさらに備えている請求項１に記載の細胞電位測定装置。
【請求項３】前記細胞の培養雰囲気を維持するための細胞培養手段をさらに備えている請求項１または２に記載の細胞電位測定装置。
【請求項４】細胞培養手段が、温度を一定に保つ温度調節手段と、培養液を循環する手段と、空気と二酸化炭素の混合気体を供給する手段とからなる請求項３に記載の細胞電位測定装置。
【請求項５】前記複数の微小電極として６４個の電極が８列８行に配置されている請求項１に記載の細胞電位測定装置。
【請求項６】前記微小電極のそれぞれの電極面積が４×１０2〜４×１０4μｍ2の範囲内にある請求項１に記載の細胞電位測定装置。
【請求項７】 前記電気接続手段は、前記ホルダを固定すると共にコネクタを介して前記ホルダの接触金具に接続している外部接続パターンを有するプリント配線板をさらに備えている請求項１に記載の細胞電位測定装置。
【請求項８】前記電気接点と前記接触金具との接触抵抗、及び前記接触金具と前記コネクタとの接触抵抗がそれぞれ３０ミリオーム以下である請求項７に記載の細胞電位測定装置。
【請求項９】前記光学観察手段が、光学顕微鏡と、これに接続された撮像装置及び画像表示装置を備えている請求項２に記載の細胞電位測定装置。
【請求項１０】前記光学観察手段が、さらに画像記憶装置を備えている請求項９に記載の細胞電位測定装置。
【請求項１１】前記刺激信号付与手段がパルス信号発生器である請求項１に記載の細胞電位測定装置。
【請求項１２】前記信号処理手段が、前記細胞の電気生理活動による出力信号を増幅する多チャンネル増幅器と、増幅された信号波形をリアルタイム表示するチャンネル表示装置とを備えている請求項１に記載の細胞電位測定装置。
【請求項１３】Ｄ／Ａ変換器を介して前記刺激信号を出力するとともに、Ａ／Ｄ変換器を介して前記細胞の電気生理活動による出力信号を入力して処理し、かつ、前記光学観察手段及び前記細胞培養手段の制御を行うコンピュータを備えている請求項３に記載の細胞電位測定装置。
　
（３）引用刊行物について　
（３−１）刊行物１の記載事項
　「３２要素微小電極アレイを用いた海馬細胞スライスの多点における記録及び刺激」と題する論文である刊行物１には、次の事項が記載されている。
（１ａ）要約部分（１４９頁１２〜１７行）には、「２００μｍ離間して４×８に配置された３２微小電極プレーナアレイが、海馬細胞スライスの多点において、記録、および刺激するために用いられる技術が、開発されている。・・・多点刺激は、また、多くの空間パターンで脳スライスから迅速な刺激および記録を実験者ができるように、アレイを用いて行うことも可能である。」と記載され、
（１ｂ）使用された電極アレイについては、「電極アレイの製造は、詳細に記述されている（・・・）。簡単に言うと、清浄な３インチ四方のガラスプレートの上に、チタン（１０−３０ｎｍ）と金（１５０−３００ｎｍ）が蒸着され、標準技術を使ってフォトパターン化される。この結果、ガラスプレートの端部のコネクターパッドから、中央の電極マトリックスへと延びる金属導電体パターンが生じる。これらの導電体の先端は、電極（直径２０μｍ）として作用し、中心距離２００μｍの４×８マトリックスに配置されている。」（１５０頁左欄下から４行〜右欄７行）と記載されている。
（１ｃ）電極アレイによる記録については、「アレイ電極による記録のためには、双極性のステンレス刺激電極（先端径１００ミクロン、先端間隔４００ミクロン）を用いて刺激を行った。」（１５０頁右欄２６〜２９行）と記載される一方、
（１ｄ）アレイを用いた刺激については、「アレイ電極による刺激で得られた応答は、３〜５ＭΩ、３ＭのＮａＣｌ充填ガラスピペット電極を用いて記録された。電圧パルス（１００μｓ）がアレイ電極間あるいはアレイ電極と外部Ａｇ／ＡｇＣｌ電極とのいずれかに与えられた。」（１５１頁右欄６〜１２行）と記載されている。
（１ｅ)図１（１５１頁）には、３″×３″ガラス基板上に作成された電極アレイと、信号処理回路が図示され、アレイ中央には、直径２０μｍの電極が中心距離２００μｍで４×８の格子に配置され、各電極は被覆絶縁物中の孔からなり、フォトエッチングされた金の導電体が、端部上のコネクターパッドに導出されていることが、説明されている。
（１ｆ）アレイ記録チャンバーと媒体については、電極アレイが、記録チャンバーの底部として働き、木綿ガーゼで覆われ、ガーゼは切り取りとられ、電極マトリックス上に７ｍｍ四方の孔が設けられていること、ＮａＣｌ等を含む溶液である媒体は、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2混合物が吹き込まれ、ガーゼに注がれ、アレイ表面を流れ、廃液容器へしたたり落ちるようになっていること、また、表面張力によって疎水性アレイ表面上に媒体が留まり、アレイとガーゼがプレキシグラスカバーで覆われて、暖められ湿ったガス混合物が囲まれたチャンバーを通り抜けるようにされた（図２）こと、そして該カバーの近接用孔が外部刺激電極及び記録電極の使用を可能とし、それを顕微鏡スライドで覆うこともできたことが記載されている（１５１頁右欄１７行〜１５２頁左欄１０行）。
（１ｇ）図２（１５２頁）として、アレイ記録チャンバーの写真が示され、「木綿ガーゼ（示されていない）がチャンバー内のアレイの上に配置され、キャリア媒体が上方入口から廃液容器へと流される。アレイに対する電気接続は、端部コネクター経由で行われる。」と、その説明にある。図２において、電極アレイの右側には、多数の電線が右側方に延びて見えている細長い棒状の部材がその両端にウイングナットが位置する状態で存在し、一方、左側の多数の電線が左側方に延びて見えている細長い棒状の部材は、手前のウイングナットから離れて位置して、左側の電極アレイのコネクターパッドが見える状態になっている。
　
（３−２）刊行物２は、「プレイナー細胞外電極アレイを用いる単離されたヒル神経細胞の同時多点記録および刺激」と題する論文であって、神経を刺激するための電気信号の付与に使用可能なガラスプレート上に配置されたプレーナ電極アレイを備える実験装置が記載されているが、特許異議意見書に“甲第１号証”として添付されたその掲載雑誌の表紙にもあるように、本件特許出願の優先権主張日以降に頒布された刊行物である。
　
（３−３）刊行物３〜刊行物９には、いずれも、ＩＣ装置（デバイス）等の試験・検査に用いられる「ＩＣソケット」が記載されている。
　
（３−４）取消理由に上記刊行物１〜刊行物９に加えて引用した「一体化複合電極」の発明についての刊行物１０（特開平６−７８８８９号公報：平成６年３月２２日公開）には、次の事項が記載されている。
（１０ａ）従来技術
「【０００３】従来、神経細胞の電気的活動を計測するには、ガラス電極等からなる記録電極と、金属電極等からなる刺激電極とを各々細胞内または細胞間に挿入し、刺激電極より刺激電流（または電圧）を印加した際の、神経細胞の電気的活動を記録電極により計測するのが普通であった。
　・・・・
【０００５】さらには、絶縁性の基盤上にＩＴＯ（酸化インジウム錫）等の導電性物質で直径（または１辺）１５〜２０μｍの電極を形成し、この上で神経細胞を培養することにより、細胞に電極を刺入する事なく、細胞に電気的刺激を印加し、また神経細胞の電気的活動を記録する方法についても本発明者等が別途提案している。」
（１０ｂ）【発明が解決しようとする課題】（【０００６】〜【００１０】）
「上述した従来の技術およびその変法においては、ガラス電極など、細胞に比べてかなりの大きさにならざるを得ない電極を用いるので、主に空間的な制約と操作精度上の制約で、１つのサンプル中に一度に２本以上の記録電極を挿入し、神経細胞の電気的活動を記録する多点同時計測は非常に困難であるという課題があった。
　・・・・
【０００８】さらには、ガラス・金属等の電極を細胞内に刺入する必要があるために、細胞に与える損傷が大きく、数時間以上の長時間にわたる測定ができ難いという問題点があった。
　・・・・
【００１０】本発明は、かかる従来の問題点を解決し、神経細胞などの多点同時刺激・計測を簡便に行い、多細胞間に渡る信号伝達観察を数時間以上の長期に渡り可能ならしめる一体化複合電極を提供することを目的とする。」
（１０ｃ）【課題を解決するための手段】（【００１１】）
「上記課題を解決するため、本発明の一体化複合電極は、絶縁基盤上に、最近接の電極間距離が相等しい複数個の電極を備え、前記電極からリード線を略放射状に配設した配線部と、前記リード線をカバーする絶縁層とを設け、かつ電極が、正方形もしくは円形であって、１辺の長さ若しくは直径が２０μｍよりも大きく、且つ２００μｍ以下である構成を有する。」
（１０ｄ）好ましい態様
「【００２９】さらに、本発明の前述した好ましい態様によれば、一体化複合電極の絶縁層中の孔は、一体化複合電極上で培養した細胞体に電気刺激を与えると同時に、隣合う細胞体から電気的活動を検知するため、電極を露出する目的で形成し、電極中心部に位置する。この孔の大きさは、・・・程度が好ましい。」
（１０ｅ）一体化複合電極上での神経細胞を培養
「【００４５】（ル）一体化複合電極上に直径２５ｍｍ、高さ６ｍｍのプラスティック製円筒を、複合電極の中心とプラスティック円筒の中心を合わせて接着することにより構成した細胞培養用ウエル中に、・・・混合培地５００μｌを加え、・・これら一連の操作により、一体化複合電極上でラット大脳皮質の神経細胞を培養することができた。」
（１０ｆ）刺激電極、記録電極
「【００４８】細胞は絶縁層（ＮＰＩ）上・・・電極上でも良好に生育した。したがって、適切な位置にある電極を刺激電極または記録電極として用いれば、神経細胞電気活動の同時多点計測が可能であった。」
（１０ｇ）アレイ電極による刺激
「【００４９】また、ウエルにDMEM／Ｆ−１２培養液を満たした状態で、２個の電極を通じ、・・・定電流刺激を０．２Ｈｚで４８時間以上与えても、電極の破壊はみられなかった。
【００５０】したがって、神経細胞電気活動の同時多点計測を４８時間以上の長期に渡り連続的におこなうことが可能であった。」
　
（４）本件発明１について
（イ）本件発明１と刊行物１に記載された発明との対比
　刊行物１には、微小電極アレイを試料細胞の刺激および記録に用いることが可能であるとの記載が要約部分に存在する（前記記載（１ａ）参照）が、微小電極アレイによる刺激と記録は、前記記載（１ｃ）および（１ｄ）にあるように、刺激と記録のどちらかを微小電極アレイで行っているにすぎず、両者を、共に微小電極アレイを用いて同時に行うことは記載も示唆もされていない。したがって、本件発明の「Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段」も、当然備えていない。
　
（ロ）本件発明１と刊行物１０に記載された発明との対比
　刊行物１０にも、「・・電極を刺激電極または記録電極として用いれば、神経細胞電気活動の同時多点計測が可能であった。」といずれかの電極としてしか使用しないような記載がある（前記記載（１０ｆ））が、刊行物１０記載の発明は、電極を細胞内に刺入することによる細胞への損傷という「従来の問題点を解決し、神経細胞などの多点同時刺激・計測を簡便に行い、多細胞間に渡る信号伝達観察を数時間以上の長期に渡り可能ならしめる一体化複合電極を提供することを目的とする」ものである（前記記載（１０ａ）、（１０ｂ）参照）から、刊行物１０の一体化複合電極を用いた細胞電位測定装置において、一体化複合電極を記録電極に使用しても、刺激電極は従来どおり細胞に損傷を与える外部電極を使用するというように、一体化複合電極を刺激電極または記録電極のいずれかにしか使用しないものであると刊行物１０の記載を解することはできないので、上記記載（１０ｆ）は、一体化複合電極のある電極を「刺激電極または記録電極として用いれば」の意味であって、刊行物１０には、記載された一体化複合電極の一部の電極を刺激電極として、他の電極を記録電極として用いて、一体化複合電極上で培養した細胞体に電気刺激を与えると同時に、隣合う細胞体から電気的活動を計測する細胞電位測定装置が記載されていると認められる。そして、一体化複合電極に電気信号を付与するにしても、それから電気信号を導出するにしても、基板上の微小電極の引き出し用導電パターン（リード線）の端部には、技術常識からして、ホトエッチングにより作成された極細いリード線だけではなく、刊行物１にも見られるように電気接点を備えているのが普通であり、その電気接点は、細胞電位測定装置に用いられる場合、各微小電極が刺激電極または記録電極として用いることができるように刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれに接続されているはずであるから、刊行物１０には、本件発明１と共通する、
「細胞の電気生理学的特性を測定するための細胞電位測定装置あって、
Ａ．基板上に複数の微小電極を備え、その上に細胞を置くための細胞設置部を備え、さらに前記微小電極の引き出し用導電パターンと、前記導電パターンの端部に接続された電気接点とを備えた一体化複合電極と、
Ｂ．前記細胞に電気信号を付与するための刺激信号付与手段と、
Ｃ．前記細胞の電気生理活動によって出力される電気信号を処理するための信号処理手段と、
Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段とを備えている細胞電位測定装置。」
が記載されているものと認められる。
　そうすると、本件発明１と刊行物１０記載の細胞電位測定装置を対比すると、両者は、
（相違点）
　電気接続手段について、本件発明１が、「Ｅ．前記電気接続手段は、前記電気接点に接触する接触金具を有し前記ガラスプレートを上下から挟んで固定する２分割ホルダを備えている」のに対し、刊行物１０には、電気接続手段について何ら具体的な記載がない点、で相違する。
　
（ハ）上記相違点についての検討
　刊行物１には、前記のように細胞の刺激電極及び記録電極を電極アレイの電極のみで構成しようとすることが記載も示唆もされていないから、相違点の如き電気接続手段を設けようとする動機付けがそもそも存在しない。
　そして、刊行物１の図２において、その説明にある「端部コネクター」に当たると認められる左右２本の細長い棒状部材をその両端に位置するウイングナットで上から締め付けるようにし、基板ガラスプレートが置かれている刊行物１の記載からは詳細の不明な部材と該棒状部材との間でガラスプレートを上下に挟んで固定し、ガラスプレート端部の電気接点（コネクターパッド）と該棒状部材との電気接続を行っているものと認められるが、それらの２本の棒状部材と詳細の不明なガラスプレートの載置部材を、「前記電気接点に接触する接触金具を有し前記ガラスプレートを上下から挟んで固定する２分割ホルダ」であるということもできない。
　そして、刊行物３〜６，８，９に記載の各種ＩＣソケットは、「リード」、「端子」などとよばれてている電気接点の電気接続手段につき、電気接点に接触する接触金具を有し、電気接点を上下に挟んで固定する２分割ホルダーを含むものであるが、それらの電気接点は、いずれもＩＣパッケージ等からＩＣ基板とは別平面に多数突出するものであって、基板上にある電気接点ではなく、ＩＣソケットの２分割ホルダーは基板ガラスプレートを挟むものではない。また、刊行物７記載のＩＣ用ソケットは、ＩＣパッケージの底面にマトリックス状に配置した多数の接点に対する電気接続手段であるが、ベースクランプ１０、ベースハウジング２０，サポートハウジング４０，ホルダー５０，スペーサ７０，ロッキングプレート８０の多数の部材からなるものであって、「２分割ホルダー」には該当するものではない。
　そうすると、電気接点に接触する接触金具を有し電気接点を上下から挟んで固定する２分割ホルダが、ＩＣ等を電気接続して試験する際に使用されるＩＣソケットにおいて知られているとしても、電気接続中にも培養液を要する細胞設置部をその上に備えた一体化複合電極における電極への刺激電気信号付与および電気信号の導出のために基板ガラスプレート端部の電気接点を、電気接点に接触する接触金具を有し前記ガラスプレートを上下から挟んで固定する２分割ホルダを備えている電気接続手段によって、刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれに接続するようなことが、当業者に容易に想到することができたものとはいえない。
　
（ニ）したがって、本件発明１は、その優先権主張日前に頒布された刊行物１及び刊行物３〜刊行物１０に記載された発明に基づいて、当業者が容易に想到することができたものとはいえない。
　
（５）本件発明２〜本件発明１３について
　本件発明２〜本件発明１３は、請求項１を引用するものであり、請求項１が備えている発明を特定事項を全て備えているから、本件発明１と同様に、その優先権主張日前に頒布された刊行物１及び刊行物３〜刊行物１０に記載された発明に基づいて、当業者が容易に想到することができたものとはいえない。
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、異議申立人の理由及び証拠によっては、本件発明１〜本件発明１３についての特許を取り消すことができない。
　また、他に本件発明１〜本件発明１３についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年９月１１日（２００２．９．１１）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
＜訂正事項ａ＞
　特許請求の範囲の請求項１中の「Ｂ．前記一体化複合電極に電気信号を付与するとともに前記一体化複合電極からの電気信号を導出するための電気接続手段と、Ｃ．前記細胞に電気的刺激を与えるために前記電気接続手段Ｂに接続される刺激信号付与手段と、Ｄ．前記細胞の電気生理活動による出力信号を処理するために前記電気接続手段に接続される信号処理手段と、」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「Ｂ．前記細胞に電気信号を付与するための刺激信号付与手段と、Ｃ．前記細胞の電気生理活動によって出力される電気信号を処理するための信号処理手段と、Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段と備え、」と訂正する。
＜訂正事項ｂ＞
　特許明細書の段落番号【０００６】の「Ｂ．前記一体化複合電極に電気信号を付与するとともに前記一体化複合電極からの電気信号を導出するための電気接続手段と、Ｃ．前記細胞に電気的刺激を与えるために前記電気接続手段Ｂに接続される刺激信号付与手段と、Ｄ．前記細胞の電気生理活動による出力信号を処理するために前記電気接続手段に接続される信号処理手段と、」を、不明りょうな記載の釈明を目的として、
「Ｂ．前記細胞に電気信号を付与するための刺激信号付与手段と、Ｃ．前記細胞の電気生理活動によって出力される電気信号を処理するための信号処理手段と、Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段とを備え、」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
細胞電位測定装置
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】細胞の電気生理学的特性を測定するための細胞電位測定装置であって、
　Ａ．基板上に複数の微小電極を備え、その上に細胞を置くための細胞設置部を備え、さらに前記微小電極の引き出し用導電パターンと、前記導電パターンの端部に接続された電気接点とを備えた一体化複合電極と、
　
Ｂ．前記細胞に電気信号を付与するための刺激信号付与手段と、
　
Ｃ．前記細胞の電気生理活動によって出力される電気信号を処理するための信号処理手段と、
　
Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段とを備え、
　Ｅ．前記電気接続手段は、前記電気接点に接触する接触金具を有し前記ガラスプレートを上下から挟んで固定する２分割ホルダを備えていることを特徴とする細胞電位測定装置。
　【請求項２】前記細胞を光学的に観察するための光学観察手段をさらに備えている請求項１に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項３】前記細胞の培養雰囲気を維持するための細胞培養手段をさらに備えている請求項１または２に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項４】細胞培養手段が、温度を一定に保つ温度調節手段と、培養液を循環する手段と、空気と二酸化炭素の混合気体を供給する手段とからなる請求項３に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項５】前記複数の微小電極として６４個の電極が８列８行に配置されている請求項１に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項６】前記微小電極のそれぞれの電極面積が４×１０２〜４×１０４μｍ２の範囲内にある請求項１に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項７】前記電気接続手段は、前記ホルダを固定すると共にコネクタを介して前記ホルダの接触金具に接続している外部接続パターンを有するプリント配線板をさらに備えている請求項１に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項８】前記電気接点と前記接触金具との接触抵抗、及び前記接触金具と前記コネクタとの接触抵抗がそれぞれ３０ミリオーム以下である請求項７に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項９】前記光学観察手段が、光学顕微鏡と、これに接続された撮像装置及び画像表示装置を備えている請求項２に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項１０】前記光学観察手段が、さらに画像記憶装置を備えている請求項９に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項１１】前記刺激信号付与手段がパルス信号発生器である請求項１に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項１２】前記信号処理手段が、前記細胞の電気生理活動による出力信号を増幅する多チャンネル増幅器と、増幅された信号波形をリアルタイム表示する多チャンネル表示装置とを備えている請求項１に記載の細胞電位測定装置。
　【請求項１３】Ｄ／Ａ変換器を介して前記刺激信号を出力するとともに、Ａ／Ｄ変換器を介して前記細胞の電気生理活動による出力信号を入力して処理し、かつ、前記光学観察手段及び前記細胞培養手段の制御を行うコンピュータを備えている請求項３に記載の細胞電位測定装置。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、神経細胞の活動に伴う電位変化などを測定するいわゆる電気神経生理の分野で用いられる細胞電位測定装置に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　近年、神経細胞の医学的検討や電気素子としての適用の可能性の検討などが活発に行われてきている。神経細胞が活動する際には活動電位が発生する。この活動電位は、神経細胞のイオン透過性の変化に伴って細胞膜内外のイオン濃度が変化し、これに伴って細胞膜電位が変化することによって生じるものである。そこで、電極により神経細胞近傍のイオン濃度変化（すなわちイオン電流）に伴う電位変化を測定することによって、神経細胞の活動を検出することができる。
　【０００３】
　上記のような細胞活動による電位の測定は、例えば、ガラス製の細胞外電位測定用電極を細胞に挿入して行うことができる。刺激による誘発電位を測定する場合は、記録用のガラス電極と共に刺激用の金属電極も挿入される。しかし、これらの電極挿入による測定では細胞に損傷を与えるおそれがあり、長時間にわたって測定することが難しい。また、複数箇所を同時に測定することについても空間的な制限及び位置精度上の問題がある。
　【０００４】
　そこで、絶縁性基板上に導電性物質を用いて複数の微小電極とその引出しパターンを形成し、この上での細胞培養を可能にした一体化複合電極が本発明者らによって発明された（特開平６−７８８８９号公報、特開平６−２９６５９５号公報参照）。この一体化複合電極を用いれば、空間的な制約を受けることなく狭い間隔の複数箇所において同時に電位変化を測定することができ、しかも長時間にわたって測定することができる。
　【０００５】
　【発明が解決しようとする課題】
　しかし、このような一体化複合電極を最大限に活用して、測定を正確かつ効率的に行うことができるとともに測定結果の整理の便宜を図ることができる測定装置つまり測定システムが強く望まれていた。本発明は、かかる要望にかなう細胞電位測定装置を提供することを目的とするものである。
　【０００６】
　【課題を解決するための手段】
　本発明による細胞電位測定装置は、細胞の電気生理学的特性を測定するための細胞電位測定装置であって、Ａ．基板上に複数の微小電極を備え、その上に細胞を置くための細胞設置部を備え、さらに前記微小電極の引き出し用導電パターンと、前記導電パターンの端部に接続された電気接点とを備えた一体化複合電極と、
Ｂ．前記細胞に電気信号を付与するための刺激信号付与手段と、Ｃ．前記細胞の電気生理活動によって出力される電気信号を処理するための信号処理手段と、Ｄ．前記刺激信号付与手段および前記信号処理手段のそれぞれと、前記一体化複合電極の前記電気接点とを互いに接続し、前記刺激信号付与手段から前記複数の微小電極の一部への電気信号の付与、ならびに前記複数の微小電極の他の一部から前記信号処理手段への電気信号の導出を同時に行うことが可能に構成された電気接続手段とを備え、
　【０００７】
　好ましくは、前記細胞を光学的に観察するための光学観察手段を備え、さらに前記細胞の培養雰囲気を維持するための細胞培養手段を備えていることにより、長時間にわたる測定が可能となる。
　【０００８】
　他の好ましい構成については作用とともに後述する。
　【０００９】
　【作用】
　上記のような構成を備えた本発明の装置による測定の概略は例えば以下のように行われる。一体化複合電極を備えた一体化細胞設置器の細胞設置部に試料である細胞がセットされ、複数の微小電極がその細胞に接触する。光学観察手段によって得られる細胞の像を参照しながら、刺激信号付与手段によって電気接続手段を介して複数の微小電極うちの任意の一対の電極間に刺激信号を印加する。他の各電極に得られる誘発電位の時間変化が電気接続手段を介して信号処理手段に与えられ、必要な信号処理を経て例えば表示装置等に出力される。なお、刺激信号を与えない自発電位の測定も同様にして行われる。
　【００１０】
　上記のような細胞の電気化学的測定は、細胞が生きている状態で行う必要があるので、通常、培養細胞が用いられ、一体化細胞設置器の細胞設置部は培地を備えている。一体化細胞設置器は測定装置に対して着脱自在であり、一体化細胞設置器ごと通常のインキュベータに入れて細胞培養を行い、測定する際に一体化細胞設置器をインキュベータから取り出して測定装置にセットするようにしてもよいが、一体化細胞設置器上の細胞の培養雰囲気を維持するための細胞培養手段をさらに備えている場合は、長時間にわたる測定が可能となる。この細胞培養手段は、温度を一定に保つ温度調節手段と、培養液を循環する手段と、空気と二酸化炭素の混合気体（例えばＣＯ２５％）を供給する手段とから構成される。
　【００１１】
　好ましくは、前記一体化細胞設置器は、ガラスプレート上にマトリックス状（格子状）に配置された複数の微小電極と、これらの微小電極の引き出し用導電パターンと、これらの導電パターンの端部に接続された電気接点と、前記導電パターンの表面を覆う絶縁被膜とを備え、前記複数の微小電極を含む領域に前記細胞設置部が設けられている。透明ガラスプレートを基板とすることにより細胞の光学的観察が容易になる。したがって、導電パターンや絶縁被膜も実質的に透明または半透明であることが好ましい。また、複数の微小電極がマトリックス状に配置されておれば、刺激信号を印加する電極や細胞活動による電圧信号を検出する電極の位置指定をしやすい。例えば、６４個の微小電極を８列８行に配置することが好ましい。また、各電極の表面積は、表面抵抗をできるだけ小さくして検出感度を高める観点からはできるだけ広いほうが良いが、電極間隔からの制約および測定の分解能等を考慮して、４×１０２〜４×１０４μｍ２の範囲内にあることが好ましい。
　【００１２】
　前記電気接続手段は、前記電気接点に接触する接触金具を有し前記ガラスプレートを上下から挟んで固定する２分割ホルダを含んでいることが好ましく、このような構造により前記ガラスプレートの固定及び微小電極の外部への引出しが容易かつ確実に行われる。さらに、前記ホルダを固定するとともに、前記ホルダの接触金具にコネクタを介して接続する外部接続パターンを有するプリント配線板をさらに備えていることが好ましく、これにより外部機器、つまり刺激信号付与手段及び信号処理手段との接続が容易になる。刺激信号や検出信号をできるだけ減衰及び歪みなく伝達するためには、前記電気接点と前記接触金具との接触抵抗、及び前記接触金具と前記コネクタとの接触抵抗がそれぞれ３０ミリオーム以下であることが好ましい。
　【００１３】
　前記光学観察手段は、光学顕微鏡と、これに接続された撮像装置及び画像表示装置を備えていることが好ましい。つまり、顕微鏡で拡大された細胞の像が撮像装置（ビデオカメラ）で撮像されて画像表示装置（高精細度ディスプレー）に表示されることにより、細胞と電極位置を視覚的に把握しながら測定を行うことが容易になる。さらに好ましくは、光学観察手段が画像記憶装置を備えておれば、測定結果の記録等に便利である。
　【００１４】
　また、前記刺激信号付与手段にパルス信号発生器を用いることにより、多くの種類の信号波形を刺激信号として細胞に印加できることができる。前記信号処理手段は、細胞活動による検出信号を増幅する多チャンネル増幅器と、増幅された信号波形をリアルタイム表示する多チャンネル表示装置とを備え、複数の電極から得られた信号波形（細胞電位の時間変化）を同時に表示できることが好ましい。
　【００１５】
　一方、Ｄ／Ａ変換器を介して前記刺激信号を出力するとともに、Ａ／Ｄ変換器を介して前記細胞の電気生理活動による出力信号を入力して処理するコンピュータをさらに備えていることが好ましく、これによって、刺激信号を画面上で任意の波形に設定したり、検出信号の波形を画面に表示させるのみならず種々の加工を施して表示し、プロッタに出力し、または記憶するといったことが容易になる。さらに、このコンピュータを用いて前記光学観察手段や前記細胞培養手段の制御を行うこともできる。
　【００１６】
　【実施例】
　以下本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
　【００１７】
　まず、本測定装置に使用する一体化細胞設置器について説明する。この一体化細胞設置器１は、図１に斜視図を、図２に組立図をそれぞれ示すように、ガラスプレートに複数の微小電極及びその引出しパターンが設けられた一体化複合電極２、それを上下から挟んで固定する２分割ホルダ３，４、及び、このホルダを固定するプリント配線板５からなる。
　【００１８】
　一体化複合電極については、特開平６−７８８８９号公報等に開示されているものとほぼ同様である。厚さ１．１ｍｍ、大きさ５０ｍｍ角の透明パイレックスガラスからなる基板の中央部に６４個の微小電極１１が８×８のマトリックス状に形成され、各微小電極には引出し用導電パターン１２が接続されている（図３参照）。各電極１１は５０μｍ角（面積２５×１０２μｍ２）であり、隣接する電極の中心間距離は４５０μｍである。また基板の４辺には、各々１６個、計６４個の電気接点７が形成され（図２参照）、これらの電気接点と基板中央部の６４個の微小電極とが１対１で対応するように引出し用導電パターン１２で接続されている。各辺の１６個の電気接点はピッチ１．２７ｍｍで並んでいる。この一体化複合電極２の製造方法を図４の断面図に基づいて以下に説明する。なお、図４は見易さのために各部の縮尺を変えて描いている。
　【００１９】
　ガラスプレート１３の表面に１５０ｎｍ厚のＩＴＯ（酸化インジウム錫）膜を塗布し、フォトレジスト及びエッチングにより導電パターン１２を形成する。この上に１．４μｍ厚のネガティブフォトセンシティブポリイミド膜を塗布し、同様に絶縁被膜１４を形成する。微小電極及び電気接点の部分はＩＴＯ膜が露出しており、この部分に５００ｎｍ厚のニッケルメッキ１５及び５０ｎｍ厚の金メッキ１６を施す。内径２２ｍｍ、外径２６ｍｍ、高さ８ｍｍの円筒状ポリスチレン枠６（図２参照）をガラスプレートに（導電パターン８及び絶縁被膜９を介して）シリコーン系接着剤を用いて接着する。この円筒状ポリスチレン枠はガラスプレートの中心、すなわち６４個の微小電極の中心部と中心合わせした状態で固定され、このポリスチレン枠の内側が細胞設置部に相当する。このポリスチレン枠内に１重量％クロロ白金酸、０．０１重量％酢酸鉛、０．００２５重量％塩酸の水溶液を満たし、２０ｍＡ／ｃｍ２の電流を１分間通電することによって微小電極部の金メッキの表面に白金黒１１ａを析出させる。
　【００２０】
　次に、一体化複合電極２を上下から挟んで固定する２分割ホルダ３，４について説明する。ホルダ３，４は樹脂で形成され、図２に示すように、一体化複合電極２の縁部を保持するための段部と矩形開口とが中央部に備えられている。上部ホルダ３には一対の固定具８と１６個×４対の接触金具９が備えられている。一体化複合電極２を挟んで固定したホルダ３，４の上面図を図５（Ａ）に、その側面図（Ｂ−Ｂ断面図）を図５（Ｂ）に、そして裏側からみた斜視図を図６にそれぞれ示す。これらの図からもわかるように、固定具８は上部ホルダ３の対向する２辺に軸ピン８ａによって枢支されている。また、下部ホルダ４の裏面の対向する２辺には溝４ａが形成されており、ここに固定具８の凸条８ｂが嵌まることによって上下のホルダ３，４は一体化複合電極２を挟んだ状態でしっかり固定される。
　【００２１】
　一体化複合電極２の電気接点７に対応するように上部ホルダ３設けられた６４個の接触金具９は、ＢｅＣｕにＮｉ及びＡｕメッキを施したもののような弾力性に富む良導体金属板を加工して形成され、図７に示すような形状をしている。つまり、ピン部９ａとその基部９ｂ、そして、この基部９ｂから湾曲部９ｃを介して延びる可動接触部９ｄからなる。このような構造により、可動接触部９ｄは基部９ｂに対して弾性変位可能である。上部ホルダ３には接触金具９のピン部９ａが挿通される孔と基部９ｂが嵌まる溝とが６４（１６×４）箇所に形成されている。
　【００２２】
　図２及び図５（Ｂ）に示すように、接触金具９が上記孔及び溝に挿入され固定された状態で、ピン部９ａが上部ホルダ３から突出している。基部９ｂの長さが異なる２種類の接触金具９が交互に配置されることにより、上部ホルダ３から突出した１６個のピン部９ａは千鳥状の２列に並んでいる。後述するように、これらのピン部９ａは外部との接続用のプリント配線板５に実装されたコネクタに接続される。
　【００２３】
　一方、接触金具９の可動接触部９ｄは、接触金具９が上部ホルダ３の孔及び溝に挿入され固定された状態で、上部ホルダ３の下面から突出している。この状態は、図２の組立図に対して反対側から見た組立図である図８に良く示されている。一体化複合電極２を挟んでホルダ３，４が固定された状態で、各接触金具９の可動接触部９ｄが一体化複合電極２の電気接点７に接触し、湾曲部９ｃの弾性変形によって所定の接触圧が接触部に与えられている。このようにして一体化複合電極２の微小電極１１に導電パターン１２を介して接続する電気接点７は、接触金具９に対して小さい接触抵抗（３０ミリオーム以下）で電気的に接続される。
　【００２４】
　次に、プリント配線板５について説明する。このプリント配線板５は、一体化複合電極２とホルダ３，４との組立品を固定するとともに、一体化複合電極２の微小電極１１から導電パターン１２、電気接点７、そして接触金具９に至る電気接続をさらにコネクタを介して外部に引き出す役目を担っている。また、測定装置へのセット等の取り扱いを容易にする働きをもしている。
　【００２５】
　このプリント配線板５は両面パターンのガラスエポキシ基板を用いて構成されており、図８に示された裏面において、中央部に形成された円形開口の周囲４箇所にコネクタ５ａが設けられている。上部ホルダ３の表面４箇所から２列千鳥状に突出した１６個のピン部９ａがそれぞれ対応するコネクタ５ａに挿入されることにより、一体化複合電極２とホルダ３，４との組立品がプリント配線板５に固定されるとともに電気的に接続される。
　【００２６】
　プリント配線板５の両側エッジ部５ｂには両面エッジコネクタ用の２．５４ｍｍピッチの電気接点が形成され、これらの電気接点と中央部のコネクタ５ａとが引出しパターン５ｃで接続されている。両側コネクタ５ａの内側列は表面パターンで、外側列は裏面パターンでそれぞれ引き出され、それぞれのエッジ部５ｂに表裏両面で３２個、したがって合計６４個の電気接点が形成されている。機械的な固定を確実なものとするために、ビス止めによって上部ホルダ３をプリント配線板５に固定することもできる。
　【００２７】
　以上のように構成された一体化細胞設置器１を用いて構成した細胞電位測定装置の好適な実施例を図９に示す。本実施例の測定装置は、上述した一体化細胞設置器１と、この一体化細胞設置器１にセットされた細胞を光学的に観察するための倒立顕微鏡２１を含む光学観察手段２０と、細胞への刺激信号を付与する手段及び細胞からの出力信号を処理する手段を含むコンピュータ３０と、細胞の培養雰囲気を維持するための細胞培養手段４０とを備えている。
　【００２８】
　光学観察手段２０には、一体化細胞設置器１がセットされる倒立顕微鏡２１（オリンパス製ＩＭＴ−２−Ｆ又はＩＸ７０相当品）の他に、顕微鏡用のＳＩＴカメラ（浜松ホトニクス製Ｃ２４００−０８相当品）２２、高精細度ディスプレー２３、及び画像ファイル装置（松下電器製ＴＱ−２６００又はＦＴＱ−３１００Ｆ相当品）２４が含まれている。但し、高精細度ディスプレーはコンピュータ３０のディスプレーを兼用してもよい。尚、上記の括弧内に示した具体的な装置は一例であり、これらに限られるものではない。以下同様である。
　【００２９】
　コンピュータ３０には、ＷＩＮＤＯＷＳ対応のパーソナルコンピュータにＡ／Ｄ変換ボード及び測定用ソフトウエアを搭載したものが使用される。Ａ／Ｄ変換ボードは図９のＡ／Ｄ変換器３１とＤ／Ａ変換器３２を含んでいる。Ａ／Ｄ変換器３１は１６ビット６４チャンネルであり、Ｄ／Ａ変換器３２は１６ビット８チャンネルである。
　【００３０】
　測定用ソフトウエアは刺激信号付与の条件や得られた検出信号の記録条件を設定するためのソフトウエアを含んでいる。この測定用ソフトウエアによって、コンピュータ３０は細胞に刺激信号を付与する手段と、細胞から検出された信号を処理する手段とを構成するだけでなく、光学観察手段（ＳＩＴカメラ及び画像ファイル装置）や細胞培養手段の制御をも司る。以下に、測定用ソフトウエアの主な仕様を画面ごとに説明する。
　【００３１】
　パラメータ設定画面では、キーボード又はマウスを用いて画面上で刺激波形を描くことにより、複雑な刺激条件の設定が可能である。また、記録条件の設定は、入力チャンネル数６４、サンプリングレート１０ｋＨｚで数時間の連続記録に対応できるようにしている。さらに、刺激信号を付与する電極や細胞からの検出信号を取り出す電極の指定に関しては、画面上に表示された顕微鏡像をマウスやペンで指示することにより指定できるようにしている。その他、細胞培養手段４０の温度やｐＨ等の諸条件の設定をキーボードを用いて行うことができる。
　【００３２】
　記録画面では、細胞から検出された自発活動電位又は誘導電位をリアルタイムで最大６４チャンネル表示する。また、記録された自発活動電位又は誘導電位を細胞の顕微鏡像に重ねて表示することもできる。誘発電位測定の場合は記録波形全体を表示する。自発活動電位測定の場合は、ウインドーディスクリミネータ又は波形ディスクリミネータを用いたスパイク検出機能によって自発活動の発生が検出されたときのみ記録波形が表示される。記録波形の表示と共に、記録時の測定パラメータ（刺激条件、記録条件、温度、ｐＨ等）もリアルタイムで表示される。温度又はｐＨが許容範囲を外れたときの警報機能も備えられている。
　【００３３】
　データ解析画面では、ＦＦＴ解析、コヒーレンス解析、コリレーション解析が可能である。波形ディスクリミネータを用いたシングルスパイク分離機能、テンポラルプロファイル表示機能、トポグラフィー表示機能、電流源密度解析機能等も備えている。これらの解析結果は、画像ファイル装置に保存されている顕微鏡像に重ねて表示することができる。
　【００３４】
　以上のようなコンピュータ３０から刺激信号が出力される場合、この刺激信号はＤ／Ａ変換器３２及びアイソレータ（ＢＡＫ　ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ社製ＢＳＩ−２相当品）３３を経て細胞に与えられる。つまり、一体化細胞設置器１の６４個の微小電極１１のうちの選択された２点間に刺激信号が印加される。そして、各微小電極１１とＧＮＤレベル（培養液の電位）との間に生ずる誘発電位は、６４チャンネル分の高感度増幅器（日本光電ＡＢ−６１０Ｊ相当品）３４及びＡ／Ｄ変換器３１を経てコンピュータ３０に入力される。なお、増幅器３４の増幅率は１００ｄＢ、周波数帯域は０〜１０ｋＨｚである。但し、刺激信号による誘導電位の測定の場合はローカットフィルタにより１００Ｈｚ〜１０ｋＨｚの周波数帯域としている。
　【００３５】
　次に、細胞培養手段４０には、温度調節器４１と、培養液の循環手段４２と、空気及び二酸化炭素の混合ガスを供給する手段４３とが備えられている。実際には、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のマイクロインキュベータＰＤＭＩ−２相当品と温度コントローラＴＣ−２０２相当品、そして、ＣＯ２ボンベ等を用いて細胞培養手段４０が構成される。このマイクロインキュベータはペルチェ素子によって０〜５０℃の温度範囲に制御することができ、液送速度３．０ｍｌ／ｍｉｎ以下、給気速度１．０ｌ／ｍｉｎ以下に対応しうる。あるいは、温度コントローラを内蔵しているマイクロインキュベータ（オリンパス社製ＩＭＴ２−ＩＢＳＶ）を用いてもよい。
　【００３６】
　以上、本発明による細胞電位測定装置の好適な実施例を説明したが、本発明による細胞電位測定装置は上記実施例に限定されるものではなく、例えば以下に述べるような種々の変更実施が可能である。
　【００３７】
　上記実施例では細胞に刺激信号を与える手段をコンピュータ及びＤ／Ａ変換器で構成したが、汎用または専用のパルス信号発生器で構成してもよい。尚、刺激信号は、アーチファクトの影響を除くため、即ち、直流成分が流れないようにするために、正負一対のパルスで構成された双極性定電圧パルスとすることが好ましい。また、過電流を流さないように定電流パルスに変換することが好ましい。例えば、パルス幅１００μｓｅｃの正パルス、１００μｓｅｃの間隔、１００μｓｅｃの負パルスで刺激信号が構成され、正負パルスのピーク電流は３０〜２００μＡの範囲内にあることが好ましい。
　【００３８】
　また、細胞培養手段４０が測定装置に備えられていることにより、長期にわたる連続測定が可能であるが、測定装置とは別に設置されたインキュベータ内で、試料細胞を一体化細胞設置器にセットしたままで培養し、比較的短時間の測定の際だけ一体化細胞設置器をインキュベータから取り出して測定装置にセットするようにしてもよい。この場合は細胞培養手段４０が測定装置に備えられている必要はない。
　【００３９】
　以上のような細胞電位測定装置を用いて、実際に一体化細胞設置器上で培養された神経細胞又は組織の活動に伴う電位変化を測定した例について以下に説明する。神経組織としてラット大脳皮質の切片を用い、後述する培養法実施例に示す方法で培養した。
　【００４０】
　先ず、本装置の一体化細胞設置器を用いて測定された電圧波形と従来の汎用ガラス電極（細胞外電位測定用電極）を用いて測定された電圧波形とを比較した結果について説明しておく。測定は、培養開始後１４日を経過した神経組織を試料として行った。一体化細胞設置器を構成する一体化複合電極の隣接する２つの電極間に刺激信号を印加し、その近くの８個の電極に誘起される誘発電位の時間変化の波形を測定した。そして比較するために、ガラス電極を３次元マイクロマニュピュレータを用いて上記８個の電極の近傍に順次移動させて同様の電圧波形を測定した。
　【００４１】
　上記のように、８箇所について一体化複合電極（一体化細胞設置器）を用いて測定した電圧波形とガラス電極を用いて測定した波形とを比較した結果、両者の波形はいずれの箇所においてもよく近似していた。その代表例を図１０（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図１０（Ａ）は一体化複合電極による測定波形を示し、図１０（Ｂ）はガラス電極による測定波形を示す。両波形を比べると、周波数特性にやや差があることがわかる。ガラス電極を用いた測定は、一体化複合電極（プラナー電極）を用いた測定に比べ、速い電位変化に対する追従性が若干損なわれている。この差は、ガラス電極とプラナー電極の持つ電気容量の差に起因すると考えられる。
　【００４２】
　次に、一体化細胞設置器上で培養された神経細胞の培養日数と細胞の活動による電位の分布との関係を調べた実験結果を説明する。なお、細胞の培養に先立って、一体化複合電極の各電極と細胞との接着性を高める目的で、一体化複合電極の表面をコラーゲンゲルで覆った。つまり、前述のように白金黒で被覆された各電極表面と、その周辺の絶縁被膜表面に厚さ５０μｍ以下のコラーゲンゲルを形成した。そして、コラーゲンゲル上に、かつ、微小電極上に位置するようにラット大脳皮質の切片（厚さ５００μｍ以下）を置いて培養した。図１１に自発電位の測定結果を、図１２に刺激信号を与えたときの誘発電位の測定結果を示す。
　【００４３】
　図１１（Ａ）に試料細胞及び微小電極の顕微鏡像が示されており、この像に１〜７で指示されている７箇所の電極で測定された自発電位の波形がそれぞれ図１１（Ｂ）及び（Ｃ）に示されている。図１１（Ｂ）は培養後６日目の波形であり、図１１（Ｃ）は培養後１０日目の波形である。顕微鏡像のスケール、測定波形の時間及び電圧のスケールは図中に示している通りである。この測定結果から例えば、培養後６日目では各電極で測定される細胞の自発活動が弱く電極相互の同期性がほとんど見られないのに対し、培養後１０日目になると多数の神経細胞が同時に活動するようになり電極相互の同期性が高まっていることがわかる。
　【００４４】
　図１２（Ａ）にも試料細胞及び微小電極の顕微鏡像が示されている。そして、前述のコンピュータの測定用ソフトウエアに含まれる画像処理によって、この顕微鏡像から細胞の輪郭及び各電極の位置を画面上に描き、さらに、各電極で測定された電圧波形を重ねて表示したものが図１２（Ｂ）及び（Ｃ）に表示されている。図１２（Ｂ）は培養後５日目、図１２（Ｃ）は培養後１０日目の誘発電位の分布をそれぞれ示している。右上にある＋，−で指示された一対の電極が刺激信号を印加された電極である。各電極の位置を示す小四角記号のすぐ上にその電極で測定された波形が表示されている。これらの波形において、左端の大きく縦に振れている部分は刺激信号に直接対応するアーチファクトであって、その後にある電位変化が実際の細胞活動を示している。この測定結果から例えば、培養後５日目では細胞の活動が刺激信号を印加した電極位置の比較的近傍に限られているが、培養後１０日目になると細胞の活動は広い範囲にわたって観測され、その大きさ（振幅）が大きくなることがわかる。
［大脳皮質培養法実施例］
（１）培地
ダルベッコ改変イーグル培地とハムＦ１２培地の１：１混合培地（ＧＩＢＣＯ　Ｃｏ．，ＬＴＤ．４３０−２５００ＥＢ）に、以下の添加物を加えて用いた。
＊グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧＩＢＣＯ　８２０−５０２３ＩＮ）２．８５ｍｇ／Ｌ
　（上記培地にもともと含まれているものと合わせて、トータル６ｍｇ／Ｌになる）
＊プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ，ＳＩＧＭＡ　Ｃｏ．，ＬＴＤ．Ｐ５７８０）１００μＭ
＊プロジェステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，ＳＩＧＭＡ　Ｐ８７８３）２０ｎＭ
＊ハイドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，ＳＩＧＭＡ　Ｈ０８８８）２０ｎＭ
＊亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ，ＷＡＫＯ　Ｃｏ．，ＬＴＤ．１９８−０３１９）２０ｎＭ
＊インシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ，ＳＩＧＭＡ　１６６３４）５ｍｇ／Ｌ
＊トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ＳＩＧＭＡ　Ｔ１１４７）１００ｍｇ／Ｌ
＊重炭酸ナトリウム　２．４３８ｍｇ／Ｌ
＊１Ｎ　ＨＣｌ又は１Ｎ　ＮａＯＨを適量加え、ｐＨ７．４に調整する。
　【００４５】
　以上の添加物を加え濾過殺菌した後、４℃で保存し使用に備えた。以下、本培地を、単に「培地」と呼ぶ。
（２）一体化複合電極上のウエルの構成
　一体化複合電極上での神経細胞または神経組織の培養の便を図るため、内径２２ｍｍ、外径２６ｍｍ、高さ８ｍｍのポリスチレン製円筒を、以下に記載する方法で接着した。
（イ）ポリスチレン製円筒（内径２２ｍｍ、外径２６ｍｍ、高さ８ｍｍ）の下面に、１液性シリコン系接着剤（ダウコーニング８９１または信越化学ＫＥ−４２ＲＴＶ）を必要十分量塗布する。
（ロ）一体化複合電極のガラス基板中心とポリスチレン製円筒の中心が一致するよう注意しながら、両者を接着する。
（ハ）埃の入りにくい環境で２４時間放置することにより、接着剤を固化させる。
（ニ）７０％エタノールに５分漬けた後クリーンベンチ内で風乾することによって滅菌を行い、電極表面の処理に備える。
（３）電極表面の処理
　一体化複合電極表面の細胞接着性を高めるため、以下の方法で電極表面にコラーゲンゲルを構成した。以下の操作は、全て無菌的雰囲気下で行った。
（イ）以下のＡ，Ｂ，Ｃの溶液を用意し、氷冷しておく。
Ａ．０．３ｖｏｌ．％希塩酸コラーゲン溶液（ｐＨ３．０，新田ゼラチンＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ＴｙｐｅＩ−Ａ）
Ｂ．ダブルベッコ改変イーグル溶液とハムＦ１２培地の１：１混合培地（ＧＩＢＣＯ　４３０−２５００ＥＢ）に重炭酸ナトリウムを加えないで、通常用いる際の１０倍濃度の液を作り、濾過滅菌したもの
Ｃ．０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬに対し、重炭酸ナトリウム２．２ｇ，ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ　８４５−１３４４ＩＭ）４．７７ｇを溶かし、濾過滅菌したもの
（ロ）冷却しながら、Ａ，Ｂ，Ｃ液を８：１：１の割合で混合する。この際、ＡとＢをよく混合した後にＣを加え、さらに混合する。
（ハ）あらかじめ４℃程度に冷却しておいた一体化複合電極のウエル内に、ロ）の混合溶液１ｍＬを分注し、電極表面をまんべんなく覆わせた後、ガラスパスツールピペットで混合溶液をできる限り取り除く。この操作により、電極表面上に厚さ５０μｍ以下の混合用液の被膜が構成される。
（ニ）混合用液被膜を構成した一体化複合電極を３７℃で３０分間暖めることにより、混合用液をゲル化させ、コラーゲンマトリクスを構成する。
（ホ）一体化複合電極のウエル内に滅菌水１ｍＬを加え、約５分間放置した後取り除くことにより洗浄を行う。
（ヘ）（ホ）の操作を、あと２回（計３回）繰り返す。
（ト）一体化複合電極のウエル内に、ダルベッコ改変イーグル培地とハムＦＨ１２培地の１：１混合培地（ＧＩＢＣＯ　４３０−２５００ＥＢ）に上記の添加物を加えたもの（ただしインシュリンとトランスフェリンを除く）１ｍＬを分注し、温度３７℃、相対湿度９７％以上、ＣＯ２濃度５％、空気濃度９５％に保ったＣＯ２インキュベーター内に保存し、使用に備える。
（４）神経細胞または神経組織の培養
　培養形態は大まかに２種類に分けられる。すなわち、神経細胞の分散培養と神経組織の器官培養である。以下、各々について述べる。
（４−１）ラット大脳皮質視覚野神経細胞の分散培養法
以下の操作は、全て菌的雰囲気下で行った。
（イ）妊娠後１６〜１８日を経過したＳＤラットの胎児の脳を摘出し、氷冷したハンクス平衡塩液（ＧＩＢＣＯ　４５０−１２５０ＥＢ）に浸す。
（ロ）氷冷ハンクス平衡塩液中の脳から視覚皮質を切り出し、トル最小必須培地（ＧＩＢＣＯ　４１０−１１００ＥＢ）液中に移す。
（ハ）イーグル最小必須培地液中で、視覚皮質をできるだけ細かく、最大でも０．２ｍｍ角となるように切断する。
（ニ）細かく切断した視覚皮質を遠心分離用試験管に入れ、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩液で３回洗浄した後、適量の同液中に分散する。
（ホ）上記（ニ）の遠心分離用試験管中に、０．２５％のトリプシンを溶解したカルシウム及びマグネシウムを含まないハンクス平衡塩液を加え、全量を倍にする。緩やかに攪拌しながら、３７℃で１５分間恒温状態に保ち、酵素反応を行わせる。
（ヘ）前記（１−１）で示した培地（添加物含む。以下、「培地」と略す）に、さらに１０ｖｏｌ．％の牛胎児血清を加えたものを、上記ホ）を経た遠心分離用試験管に中に加え、全量をさらに倍にする。先端をバーナーであぶり口径を小さくしたガラスパスツールピペットで、緩やかにピペッティングを繰り返し（最大２０回程度）、個々の細胞を単離する。
（ト）９８０６．６５ｍ／ｓｅｃ２（すなわち１０００ｇ）で５分間遠心分離を行った。遠心分離終了後、上清を捨て、沈殿を５％の牛胎児血清を含む培地に懸濁する。
（チ）前記（ト）をあと２回（計３回）繰り返す。
（リ）最終的の得られた沈殿を、５ｖｏｌ．％の牛胎児血清を含む培地に懸濁し、懸濁液中の細胞濃度を赤血球計数板を用いて計測する。計測後、同様の培地を用いて細胞濃度が２〜４×１０６個／ｍｌになるように調整する。
（ヌ）前記（１−３）の処理を経た後ＣＯ２インキュベータ内に保存しておいた一体化複合電極を取り出し、ウエル内の培地（ただしインシュリンおよびトランスフェリンを含まない）を取り去り、新たに５ｖｏｌ．％の牛胎児血清を含む培地５００μＬを分注する。さらに、リ）の細胞濃度調整後の細胞懸濁液１００μＬを静かに加え、再びＣＯ２インキュベータ内に静置する。
（ル）前記（ヌ）の操作より３日後に、培地の半量を新しいものと交換する。交換する培地は牛胎児血清を含まない培地を用いた。牛胎児血清の濃度を低くすることによって、神経細胞以外の細胞（例えばクリア細胞）の増殖を抑える。
（ヲ）以後１〜２日毎に上記と同様の培地交換を行う。
（４−２）ラット大脳皮質切片培養法
（イ）生後２日目のＳＤラットから、脳を取り出し、氷冷した０．２５ｖｏｌ．％Ｄ−グルコース入りハンクス平衡塩液に浸す。
（ロ）氷冷した０．２５ｖｏｌ％Ｄ−グルコース入りＨＢＳＳ中で、脳に付着している脳膜を、大脳皮質を傷つけないように注意しながら、先の鋭利なピンセットを用いて除く。
（ハ）脳膜を除いた大脳皮質の片側の脳梁から５００μｍ程度のところを、眼科手術用の微小ハサミを用いて、脳梁にそって後頭葉側から前頭葉側に向かって切断する。
（ニ）続いて、眼科手術用の微小ハサミを用いて、（ハ）の切断面に垂直に２００〜３００μｍの厚さで大脳皮質を切断し、切片を作る。
（ホ）さらに、眼科手術用の微小ハサミを用いて、切片の大きさを１×１程度に調整する。
（ヘ）前述の「（３）電極表面の処理」で用意しておいた一体化複合電極をＣＯ２インキュベータから取り出し、大きさを調整した大脳皮質切片を口径２ｍｍ以上のピペットで傷つけないように静かに吸い取り、一体化複合電極の培養用ウエル中に移す。
（ト）バーナーであぶり先端を滑らかにしたパスツールピペットを用い、大脳皮質切片を傷つけないように注意しながら、皮質の層構造が上面を向きかつ電極上に位置するように調整する。
（チ）大脳皮質切片を一体化複合電極上にのせた後、培地の量を調整し、切片の底面が培地に触れ、上面が外気に触れる状態にする。
（リ）培地量の調整後、一体化複合電極を滅菌ペトリ皿に入れ、培地の乾燥を防ぐために３７℃の滅菌水約５ｍｌをペトリ皿に分注し、再びＣＯ２インキュベータ内に静置する。
（ヌ）以降、培地の量に注意し、毎日１回の培地交換を行った。培地の量については、上記（チ）と同様とする。
　【００４６】
　【発明の効果】
　以上、説明したように、本発明の細胞電位測定装置によれば、一体化細胞設置器にセットされた生きている細胞に損傷を与えることなく、同時に複数の箇所でその活動電位を測定することができる。そして、任意の複数の電極から自発電位を測定できるだけでなく、任意の電極間に刺激を与えて得られる誘発電位の測定についても、複数の電極で同時に行うことができる。また、コンピュータ等を用いた処理により、例えば光学観察手段によって得られた顕微鏡像から試料細胞と電極位置との関係を確認しながら刺激信号を与える電極を決めたり、各電極から得られた電圧波形を細胞や電極位置を示す像に重ねて表示するといったことも可能であり、電気神経生理学の分野等における実験を効率的かつ正確なものとするのに大きく寄与することができる。
　【００４７】
　さらに、一体化細胞設置器にセットされた細胞の培養雰囲気を維持する細胞培養手段を備えることにより、試料細胞を測定装置にセットしたままで長期間にわたる連続測定を安定した状態で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】　本発明の一実施例に係る細胞電位測定装置に使用される一体化細胞設置器の斜視図
　【図２】　一体化細胞設置器の組立図
　【図３】　一体化細胞設置器を構成する一体化複合電極の中央部に設けられた６４個の微小電極及び引出しパターンを示す平面図
　【図４】　一体化複合電極の断面を模式的に示す図
　【図５】　一体化複合電極を上部及び下部ホルダが挟んで固定した状態を示す平面図及び側面断面図
　【図６】　図５の一体化複合電極及び上下ホルダの斜視図
　【図７】　上部ホルダに備えられた接触金具の側面図
　【図８】　図２と逆の方向から見た一体化細胞設置器の組立図
　【図９】　本発明の一実施例に係る細胞電位測定装置のブロック構成図
　【図１０】　本発明の装置に使用される一体化細胞設置器を用いて測定された培養細胞の活動による電圧波形と従来の汎用ガラス電極（細胞外電位測定用電極）を用いて測定された電圧波形との比較の一例を示す図
　【図１１】　本発明の装置を用いて測定された培養細胞の自発電位の測定結果を示す図
　【図１２】　本発明の装置を用いて測定された培養細胞の誘発電位の測定結果を示す図
　【符号の説明】
　１　一体化細胞設置器
　２　一体化複合電極
　３　上部ホルダ
　４　下部ホルダ
　５　プリント配線板
　１１　微小電極
　１２　導電パターン
　２０　光学観察手段
　２１　倒立顕微鏡
　２２　ＳＩＴカメラ
　２４　画像記憶装置
　３０　コンピュータ
　３１　Ａ／Ｄ変換器
　３２　Ｄ／Ａ変換器
　３３　アイソレータ
　３４　多チャンネル増幅器
　４０　細胞培養手段