【事件の表示】
　特許第３１５６２３６号「記憶障害改善治療剤」の請求項１〜３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１５６２３６号の請求項１〜３に係る特許を取り消す。
【理　由】
１．手続の経緯
　
　特許第3156236号の請求項1〜3に係る発明は、平成3年9月30日に特許出願され、平成13年2月9日にその特許権の設定登録がなされ、その後、土井清暢により特許異議の申立がされ、取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成14年2月19日に訂正請求がされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
(1)訂正の内容
　特許権者が求めている訂正の内容は以下のとおりである。
ア．訂正事項a
　特許請求の範囲の請求項１の
「エリスロポエチン蛋白質を有効成分として含有するアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤。」を
「エリスロポエチン蛋白質を有効成分として含有するアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤であって、脳神経細胞に存在するエリスロポエチンレセプターに結合することによって脳神経内Ca2+濃度を上昇させることによる長期増強を誘導する剤。」と訂正する。
イ．訂正事項ｂ
発明の詳細な説明の段落【0006】の「ヒト神経芽細胞株」及び段落【0013】の「神経細胞由来」を「神経芽細胞様株」と訂正する。
　
(2)訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張、変更の存否
　上記訂正事項ａは、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤について、その機作が「脳神経細胞に存在するエリスロポエチンレセプターに結合することによって脳神経内Ca2+濃度を上昇させることによる長期増強を誘導する」ものである点をさらに限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　そしてかかる点は段落【0008】に記載されているから、上記訂正は願書に添付した明細書及び図面の範囲内のものであって特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
　また、上記訂正事項ｂについては、本件特許明細書に記載された実施例で使用しているPC-12細胞（ATCC CRL-1721）はヒト神経芽細胞由来ではなく、ラット副腎の褐色細胞腫由来の神経芽細胞様の細胞であることは明らかであるから、誤記の訂正を目的とする訂正に該当する。
　そして、上記と同様に願書に添付した明細書の範囲内であり、特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
(3)結び
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第120条の4第2項ただし書き、及び、特許法第120条の4第3項において準用する平成6年法律第116号による改正前の特許法第126条第1項ただし書き、第2項及び第3項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．異議申立についての判断
(1)本件発明
　上記のとおり、訂正が認められるから、本件請求項1〜3に係る発明は、訂正請求書に添付された訂正明細書の特許請求の範囲に記載された下記のとおりのものである。
「【請求項１】エリスロポエチン蛋白質を有効成分として含有するアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤であって、脳神経細胞に存在するエリスロポエチンレセプターに結合することによって脳神経内Ca2+濃度を上昇させることによる長期増強を誘導する剤。
　【請求項２】エリスロポエチン蛋白質が遺伝子工学的手法によって作成されたエリスロポエチンまたはエリスロポエチンミュテインタンパク質である請求項1記載の予防・改善・治療剤。
　【請求項3】剤型が脳内中隔野直接注入剤である請求項1または2に記載の予防・改善・治療剤。」
　
(2)取消理由について
　当審が、平成13年12月12日で通知した取消しの理由の概要は、以下のとおりである。
「本件明細書の記載からは、エリスロポエチン蛋白質がアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤として使用した場合に所期の効果を奏することを確認することができない。
（本件特許出願時において、実施例３の方法が、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤の効果を確認する手法として確立されていたものとは認められない。）
　したがって、本件特許は、特許法第29条第1項柱書きに規定する要件を満たさない発明、あるいは特許法第36条第4項（平成2年改正法）の規定を満たさない特許出願に対してされたものであるから、取り消されるべきである。」
　
(3)当審の判断
1)本件明細書の記載事項
　本件特許明細書の段落【0008】には、「EPOはPC-12細胞に作用し細胞中のアセチルコリン含量を高める作用があるので脳の神経細胞に作用して、アセチルコリン量を上昇させる作用があり、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療に用いることができる。あるいは、脳神経細胞に作用して神経細胞内Ca2+濃度を調節し長期増強を誘導する。」と記載されている。
　しかし、実験例１及び２の結果からPC-12細胞にはEPO受容体が存在すること、実験例３の結果からEPOの添加によりPC-12細胞における細胞内カルシウム濃度の上昇が確認されたことが記載されているにとどまり、EPOが「脳の神経細胞に作用してアセチルコリン含量を高める効果があり、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療に用いることができること」及び「脳神経細胞に作用して神経細胞内Ca2+濃度を調節し長期増強を誘導する」ことを確認できる事項は何ら示されていない。
　
2)特許権者の主張
　特許権者は、上記のとおり訂正を請求するとともに、参考資料１〜７を提出し、本件出願時における技術水準及び参考資料の記載事項を参酌すれば、実験例３はエリスロポエチン（以下、EPOという）がPC-12細胞を活性化し、長期増強の誘導につながる細胞内カルシウム濃度の上昇をもたらすことを示しており、本件明細書はEPOがアルツハイマー病において低下した長期増強誘導を促進する可能性を示している旨主張している。
　
3)特許権者の主張についての判断
　そこで、実験例１〜3の結果から、EPOが脳神経細胞に存在するエリスロポエチンレセプターに結合することによって脳神経内Ca2+濃度を上昇させることによる長期増強を誘導する剤であり、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤として使用できることが当業者に理解できるといえるか否かについて検討する。
　
　本件発明の実験例で使用されているPC-12細胞は、脳神経細胞ではなく、ラット副腎髄質褐色細胞腫より得られた細胞であり（参考資料7及び異議申立人が提出した甲第18号証）、神経芽細胞様の性質を有し、神経細胞研究のモデルとして用いられるものである（参考資料2〜5）が、いずれの参考資料にも、PC-12細胞においてCa2+濃度を上昇させることと、アルツハイマー型記憶障害の治療剤としての効果、あるいは長期増強を誘導する剤としての効果との関連については何ら記載されていない。
　参考資料1は「栄養による脳機能の活性化」と題する論文であって、「LTP（長期増強）の発生機構には興奮精神系伝達物質であるグルタミン酸がpostsynaputic neuron のN-methyl-D- aspartate（NMDA)レセプタと結合することが初発反応となるらしい。これに加えてグルタミン酸が．．．Mg2+で抑制されていたNMDAチャンネルの抑制がとれて開口し、細胞外からCa2+を流入させる。このCa2+がカルモジュリン依存性キナーゼIIか、C-キナーゼを介してLTPを増強するらしい。．．．カルシウムの摂取は脳の活性化に欠かせない。．．．絶対含量は「ざこの煮干し」などに比較すると少ないかもしれないが、牛乳の摂取がすすめられる。」と記載されているにすぎず、PC-12細胞における細胞内カルシウム濃度の上昇とアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療との関係についても、また、それによる長期増強の誘発効果との関連についても、何ら記載されていない。
　そして、参考資料6-1は本件出願の約6年後（June 20, 1997）に投稿され
た論文であり、参考資料6-2は、参考資料6-1の論文に関する研究内容を紹介するホームページであるところ、参考資料6-1には、脳側室へのEPOの注入は虚血によってひきおこされる記憶障害を予防し、致命的な虚血性損傷から海馬のCA1神経細胞を助けたことが記載されているが、虚血性の記憶障害とアルツハイマー型の記憶障害とは異なる病変であると認識されており、参考資料6-1には、EPOがアルツハイマー型の記憶障害の治療に有効であることは何ら記載されていなから、本件出願の6年以上後においてさえ、EPOがアルツハイマー型の記憶障害の治療に有効であることは確認されていないというべきである。
　
　以上のとおり、特許権者が参考資料として提出した各刊行物等の記載事項を参酌しても、本件出願時において、実験例1〜3の記載からはEPOが脳神経細胞に存在するエリスロポエチンレセプターに結合することによって脳神経内Ca2+濃度を上昇させることによる長期増強を誘導する剤であり、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤として使用できることを当業者が理解できたと認めることはできない。
　また、本件明細書には、上記実験例1〜3以外にEPOが脳神経細胞に存在するエリスロポエチンレセプターに結合することによって脳神経内Ca2+濃度を上昇させることによる長期増強を誘導する剤であり、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤として使用できることを示す記載はない。
　
　したがって、本件明細書の発明の詳細な説明には、当業者が本件請求項１〜3に係る発明を理解でき、容易にその発明を実施できる程度に、その発明の目的、構成及び効果が記載されているとすることはできない。
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件明細書は、平成5年法律第26号による改正前の特許法第36条第4項の規定を満たしていない。
　したがって、本件請求項1〜3に係る発明の特許は、拒絶の査定をしなければならない特許出願に対してされたものである。
　よって、特許法等の一部を改正する法律（平成6年法律第116号）附則第14条の規定に基づく、特許法等の一部を改正する法律の施行に伴う経過措置を定める政令（平成7年政令第205号）第4条第2項の規定により、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年１２月２６日（２００２．１２．２６）
【訂正の要旨】
訂正事項
ａ．　　請求項１の「アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤」を特許請求の範囲の減縮及び不明瞭な記載の釈明を目的として、「アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤であって、脳神経細胞に存在するエリスロポエチンレセプターに結合することによって脳神経系細胞内Ｃａ２＋濃度を上昇させることによる長期増強を誘導する剤」に訂正する（訂正事項ａ）。
ｂ．　　明細書第３頁第８行（平成１２年９月６日付手続補正書第３頁第４行）の「ヒト細胞芽細胞株」及び第５頁第１５行「神経細胞由来」を「神経芽細胞様株」に訂正する（訂正事項ｂ）。
（５４）【発明の名称】
記憶障害改善治療剤
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　エリスロポエチン蛋白質を有効成分として含有するアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤
であって、脳神経細胞に存在するエリスロポエチンレセプターに結合することによって脳神経系細胞内Ｃａ２＋濃度を上昇させることによる長期増強を誘導する剤
　【請求項２】　エリスロポエチン蛋白質が遺伝子工学的手法によって作製されたエリスロポエチンまたはエリスロポエチンミュテイン蛋白質である請求項１記載の予防・改善・治療剤。
　【請求項３】　剤型が脳内中隔野直接注入剤である請求項１または２に記載の予防・改善・治療剤。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、サイトカインの一種、造血因子であるエリスロポエチン（以下ＥＰＯと略する）蛋白質を有効成分として含有するアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　ＥＰＯは、分子量３０〜４０ｋＤａの高度に糖付加された蛋白質で赤血球産生を促進する造血因子として発見され、すでにその全アミノ酸配列が明かにされている〔Ｊａｃｏｂｓ　ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１３，８０６−８１０（１９８５）〕。また、ヒト・ＥＰＯは、遺伝子工学的手段により高純度のものが大量に生産され貧血治療薬としてすでに応用されている〔Ｕｒａｂｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｃｌｏｌｉｎｇ，６，１７９−１９１（１９８８）〕。ＥＰＯの作用は、ＥＰＯの標的細胞表面に存在するＥＰＯレセプターを介して行われており、ＥＰＯレセプターは、サイトカインスパーファミリーに属することが明かにされている〔Ｄ’Ａｎｄｒｅａ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６，６８１−６８７（１９９０）〕。中枢神経障害修復の観点に立ち、サイトカインの神経栄養因子としての作用に関する研究も近年活発に行われ、ＩＬ−３が培養ラット中隔野神経細胞やコリン作動性ニューロン由来ＰＣ−１２細胞のコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ活性）を高めること〔田平　武　他，平成２年度ヒューマンサイエンス研究報告、第３分野３−４−１−Ａ，２８８−３０２（１９９１）〕や、ＩＬ−６がＰＣ−１２細胞の樹状突起の進展を促進すること〔鳥居邦夫，代謝，２６，臨時増刊号，脳代謝とその異常，１９５−２０１（１９８９）〕が報告されている。
　【０００３】
　一方、アルツハイマー病患者においては、脳や髄液中のＣｈＡＴ活性の著しい低下が認められる〔中村重信，蛋白質核酸酵素，３６，３０−４０（１９９１）〕。即ち、アルツハイマー型痴呆病のような中枢退行性疾患においては、前脳基底部（中隔野、ブロッカー対角帯およびマイネルト基底核）のコリン作動性神経細胞の変性脱落により、神経伝達物質であるアセチルコリンが生産されず顕著な低下が惹起される。アセチルコリンの低下が、アルツハイマー型痴呆病の記憶学習障害の原因と考えられている〔Ｗｈｉｔｅａｈｏｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１２３７−１２３９（１９８２）；Ｃｏｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，１１８４−１１９０（１９８３）〕。実験的には、ラットの前脳基底部のコリン作動性神経細胞を破壊するとアセチルコリン量の低下と記憶障害が惹起されることが報告されている〔Ｈｅｌｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，５，８６６−８７３（１９８５）〕。１９８０年代に入って、海馬の長期増強と学習・記憶の相関が注目され、細胞内カルシウムの上昇がカルモジュリン依存性キナーゼないしＣキナーゼを介して長期増強を誘導することによって脳を活性化すると考えられている〔中川八郎，代謝，２６，臨時増刊号，脳代謝とその異常，３７−４４（１９８９）〕。
　【０００４】
　以上のことからコリン作動性神経細胞に作用してＣｈＡＴ活性を上昇させる薬物（例えばＮＧＦ）や神経細胞内カルシルム濃度を上昇させる物質は、アルツハイマー型痴呆症のような中枢退行性疾病に対して予防・治療の作用を有すると考えられている。尚、近年、高齢化に伴い急増する老人性疾患の中でも、とりわけ老人性アルツハイマー型痴呆症は、有効な治療法がなく、社会問題となり、その有効な治療薬の開発が切望されている。
　【０００５】
　【発明が解決しようとする課題】
　本発明は、神経細胞に作用する薬剤をアルツハイマー型記憶障害の予防、改善、治療に応用するものである。
　すなわち、本発明の課題は、アルツハイマー型記憶障害を予防、改善あるいは治療する薬剤を提供することにある。
　【０００６】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者等は、上記の技術背景に立ち、サイトカインの中から赤血球造血因子であるＥＰＯに着目し
、神
様
　【０００７】
　すなわち、本発明は、ＥＰＯ蛋白質を有効成分として含有するアルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤に関する。
　上記ＥＰＯ蛋白質は、ＥＰＯ活性、即ち赤血球前駆細胞の分化・増殖作用を有する物質であればいずれでもよい。このようなＥＰＯ蛋白質としては、天然のヒト尿由来のＥＰＯ蛋白質でもよく、また、遺伝子工学的手法によって製造したＥＰＯ蛋白質、あるいは、ミュテインでもよい。ＥＰＯミュテインとしては、例えば、特開平３−１５１３９９号公報に記載したミュテインが挙げられる。上記ＥＰＯミュテインとしては、もとの糖蛋白質のペプチド鎖のＡｓｎがＧｌｎに変異し、結合するＮ結合型糖鎖の結合数が変異したものがある。また他に、アミノ酸変異としては、特開平２−５９５９９号公報、特開平３−７２８５５号公報記載のものが挙げられる。即ち、ＥＰＯの有するＥＰＯレセプターへの作用特性を失わない限り、アミノ酸の変異、欠失、付加は何個でもよい。
　【０００８】
　本発明のＥＰＯは貧血治療薬としてすでに臨床に応用されており、特筆すべき副作用も報告されていない。このように、治療剤は低毒性であるので、安全に使用することができる。ＥＰＯはＰＣ−１２細胞に作用し細胞中のアセチルコリン含量を高める作用があるので脳の神経細胞に作用して、アセチルコリン量を上昇させる作用があり、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療に用いることができる。あるいは、脳神経細胞に作用して神経細胞内Ｃａ２＋濃度を調節し長期増強を誘導する。本治療剤は、公知の製剤学的製造法に準じ薬学的に許容しうる液体に１万〜１０万単位で加え分散させて調製することができる。また、得られる溶液を凍結乾燥し、用時生理食塩水に溶解して用いる用時溶解型としてもよい。さらに、安定化剤として公知の生物学的製剤に使用される一般的薬剤、例えば、ヒト血清アルブミンや糖を添加することにより安定に使用することができる。さらに、他の配合剤として、アミノ酸や、脂肪酸を加えることもできる。
　【０００９】
　本記憶障害の改善・治療剤は、投与の方法として直接脳組織内に投与することにより、アルツハイマー型記憶障害の改善・治療を促進させることができる。投与部位としては脳内中隔野に直接注入することが望ましい。また、投与量は障害の程度によって適宜変更しうるが、成人の場合、一回あたり１０００〜１０００００ＩＵ程度を投与する。
　【００１０】
　次に実施例及び実験例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
　【実施例１】
　
アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤の製造
　　人尿由来ＥＰＯ　　　　６，０００，０００ＩＵ
　　ヒト血清アルブミン　　　　　　２，５００ｍｇ
　注射用蒸留水にて全量を１ｌとする。この組成を１ｍｌずつアンプルに充填し、滅菌を行い、ＥＰＯ　６０００ＩＵ注射液を作成した。
　【００１１】
　【実施例２】
　
アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤の製造
　　遺伝子組換ＥＰＯ　１２０，０００，０００ＩＵ
　　ヒト血清アルブミン　　　　　　２，５００ｍｇ
　注射用蒸留水にて全量を１ｌとする。この組成液をミリポアフィルターによりろ過し、滅菌バイアル瓶に１ｍｌづつ分注し、凍結乾燥後密封した。このバイアル瓶の内容を１ｍｌの生理食塩水に溶解することにより、１２０，０００ＩＵの注射液を作成した。
　【００１２】
　【実施例３】
　
アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤の製造
　　遺伝子組換ＥＰＯ原液　　　　２．４４ｍｌ（２，１００，０００ＩＵ）
　　２０％ヒト血清アルブミン　　７．７５ｍｌ
　　注射用蒸留水　　　　　　１４４．８１ｍｌ
　全量を混合溶解後、ミリポアフィルターでろ過し、滅菌バイアル瓶に０．５ｍｌづつ充填し、凍結乾燥後密封した。本バイアルは６，０００ＩＵに相当する。
　【００１３】
　以下に本発明の治療剤を用いた実験例を示す。
　【実験例１】
　
神経芽様細胞ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプター測定
　レセプターアッセイ並びにレセプターの分子サイズの測定はＳａｓａｋｉらの方法〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６８，４３４８（１９８７）〕に従い実施した。ＰＣ−１２細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７２１）１〜８×１０６　細胞／１５０μｌ、ＥＰＯ濃度０．５〜１０ｎＭとし、１５℃、２〜３時間反応を行った。ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプターのＥＰＯに対する結合親和常数はＫｄ＝８ｎＭ、レセプター数は細胞あたり約１０００個と算出された。また、ＳＤＳ電気泳動法によるＥＰＯレセプターの分子サイズは、約６６ｋＤａと算出された。
　【００１４】
　【実験例２】
　
ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプタ」の特性
　実験例１と同様に、ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプターに対するＥＰＯの親和性と、糖、キレート剤、サイトカイン類、ホルモンの結合阻害性を測定した。測定は　１２５Ｉ−ｒＨｕＥＰＯを用い、この特異的結合に対する阻害能を測定した。特異的結合は、無添加時の１２５Ｉ−ＥＰＯの結合阻害率を１００とした相対率で表した。数値が小さいほど１２５Ｉ−ＥＰＯとＰＣ−１２細胞の結合阻害が大きい。すなわち添加した物質のＥＰＯレセプターへの結合親和力が強い。このように測定したＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプターの特性を表１〜表３に記載した。ＥＰＯレセプターは、ヒトＥＰＯ、Ｎ結合型糖鎖結合部位を欠く変異ＥＰＯ並びにマウスＥＰＯを認識した（表１）。表１に示したｒＨｕＥＰＯとは遺伝子組換ＥＰＯであり、ｒＨｕＥＰＯ（Ｎ−グリカナーゼ処理）は、遺伝子組換ＥＰＯを津田らの方法（Ｔｓｕｄａ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｖｏｌ．１８８，４０５−４１１，１９９０）に従って調製したものであり、ＮＱ１２３は特開平３−１５１３９９号公報に開示された方法に従い調製したＮ結合型糖鎖を一分子当たり３本を欠くｒＨｕＥＰＯミュテインである。また、他の各種サイトカイン（表３）および糖（表２）は、ＥＰＯとレセプターの結合に影響しなかった。即ち、ＰＣ−１２細胞のＥＰＯレセプターは、ＥＰＯと特異的に結合した。
　【００１５】
　【表１】
　　＊ｒＨｕＥＰＯ：遺伝子組換ヒトエリスロポエチン
　　＊　１２５Ｉ−ｒＨｕＥＰＯの特異的結合は、無添加時の１２５Ｉ−ＥＰＯとＰＣ−１２細胞の結合量の相対値であらわした。数値が小さいほど添加物質のＥＰＯレセプターへの結合親和力が強い。
　【００１６】
　【表２】
　　＊　１２５Ｉ−ｒＨｕＥＰＯとＰＣ−１２細胞の特異的結合量を１００とした相対値で表した。
　数値が小さいほど結合阻害がおおきい。すなわち添加物のＥＰＯレセプターへの結合親和力が強い。
　【００１７】
　【表３】
　　＊　１２５Ｉ−ｒＨｕＥＰＯの特異的結合は、無添加時の　１２５Ｉ−ｒＨｕＥＰＯとＰＣ−１２細胞の結合量の相対値で表した。数値が小さいほど添加物質のＥＰＯレセプターへの結合親和力が強い。
　【００１８】
　【実験例３】
　
ｒＨｕＥＰＯのＰＣ−１２細胞内カルシウム濃度上昇活性の測定
　細胞内カルシウム濃度の測定は、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｅｚら〕Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３４４０−３４５０（１９８５））方法に準じ、ＰＣ−１２細胞５×１０６　ｃｅｌｌ／ｍｌで行った。ＥＰＯ　２０単位／ｍｌのＰＣ−１２細胞内カルシウム濃度の上昇は、ブラジキニン　１０μＭ添加時の効果に匹敵した。ＥＰＯ添加量と細胞内カルシウム濃度を表４に示した。
　【００１９】
　【表４】
　以上の実験の結果、ＥＰＯは神経細胞の細胞内カルシウム濃度を上げることが確認された。
　【００２０】
　【発明の効果】
　本発明のＥＰＯ蛋白質を有効成分とする製剤は、神経細胞に対し神経栄養因子として働き、アルツハイマー型記憶障害の予防、改善、治療作用を有するもので、アルツハイマー型記憶障害の予防・改善・治療剤として有利に用いることができる。