【手続補正書】
【提出日】平成27年6月18日(2015.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアウィルスを生成するための方法であって、
（ａ）表面に接着したＨｅＬａ細胞を０．００５〜０．５プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でワクシニアウィルスと接触させることにより、該ＨｅＬａ細胞をワクシニアウィルスに感染させるステップと、
（ｂ）７．１超および７．６未満のｐＨで４０〜８０時間の期間３６℃〜３７．５℃の温度で維持されている感染培地中で、感染させた該細胞を培養するステップと、
（ｃ）培養物からワクシニアウィルスを採取するステップと
を含み、
それによって、全ウィルス収量（ｐｆｕ）／ステップ（ａ）における生存ＨｅＬａ細胞の総数として算出された、ＨｅＬａ細胞１個当たり少なくとも５０ｐｆｕのワクシニアウィルスが生成される、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の間、接着したＨｅＬａ細胞の密度が、１０４〜１０６個、好ましくは約１０５個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨｅＬａ細胞が、セルキューブ、セルファクトリー、Ｔ型フラスコ、ローラーボトル、またはマイクロキャリアに接着しており、好ましくは、該ＨｅＬａ細胞が、１６８，０００ｃｍ２の累積培養面積を備えた複数のプラスチックのローラーボトル容器に接着している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）の間、ワクシニアウィルスの濃度が１０３〜１０５ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは約１０４ｐｆｕ／ｍｌである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記感染培地のｐＨが、７．２超であり、かつ好ましくは約７．３である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、３６℃〜３７．５℃の温度で、好ましくは３７℃で実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、約４４時間の期間実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＨｅＬａ細胞１個当たり少なくとも７５ｐｆｕのワクシニアウィルスが生成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が、硫酸デキストラン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８、ポリソルベート８０、および大豆加水分解物のうちの一つ以上を含まず；ウシ胎児血清を含み、好ましくは１０％未満のウシ胎児血清を含み；かつ／または該培地が血清を含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）のｍ．ｏ．ｉ．が、約０．０１〜０．０５ｐｆｕ／細胞であり、かつ好ましくは約０．０２ｐｆｕ／細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
採取された前記ウィルスが、（ａ）ＨｅＬａ細胞核酸を除去するためのヌクレアーゼによる該採取されたウィルスの処理、および／またはＨｅＬａ細胞タンパク質を除去するためのプロテアーゼによる該採取されたウィルスの処理、（ｂ）タンジェンシャルフロー濾過、（ｃ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、ならびに（ｄ）膜吸収クロマトグラフィーのうちの一つ以上を任意で含む一つ以上の精製ステップに供される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクシニアウィルスが、
− ワクシニアウィルスのＩＨＤ−Ｊ株、ワイス株、ウェスタンリザーブ株、またはコペンハーゲン株であり、
− 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの免疫促進性ポリペプチドをコードする異種のコード領域を含み、かつ／または
− 機能性チミジンキナーゼ遺伝子を欠如している、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
感染の前にＨｅＬａ培養物を増大させることをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨｅＬａ細胞が、少なくとも一つのローラーボトル培養容器を通過し、該ローラーボトル培養容器が、直前の培養容器と比べて増加した培養面積を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ローラーボトル培養容器の播種と、感染との間の間隔が、４８〜９６時間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）のｍ．ｏ．ｉ．が、約０．０１〜０．０５ｐｆｕ／細胞であり、かつ前記感染培地のｐＨが、７．２〜７．４の間に維持される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
[本発明1001]
ワクシニアウィルスを生成するための方法であって、
（ａ）表面に接着したＨｅＬａ細胞を0．005〜1．0プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でワクシニアウィルスと接触させることにより、該ＨｅＬａ細胞をワクシニアウィルスに感染させるステップと、
（ｂ）ｐＨ7．1超を有する感染培地中で、感染させた該細胞を培養するステップと、
（ｃ）培養物からワクシニアウィルスを採取するステップと
を含む、方法。
[本発明1002]
ステップ（ａ）の間、接着したＨｅＬａ細胞の密度が、104〜106個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ2である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
ステップ（ａ）の間、接着したＨｅＬａ細胞の密度が、約105個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ2である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記ＨｅＬａ細胞が、セルキューブ、セルファクトリー、Ｔ型フラスコ、ローラーボトル、またはマイクロキャリアに接着している、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記ＨｅＬａ細胞が、一つ以上のプラスチックのローラーボトル容器に接着している、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記一つ以上のローラーボトルが少なくとも168，000ｃｍ2の培養面積を備えている、本発明1005の方法。
[本発明1007]
ステップ（ａ）の間、ワクシニアウィルスの濃度が103〜105ｐｆｕ／ｍｌである、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
ステップ（ａ）の間、ワクシニアウィルスの濃度が約104ｐｆｕ／ｍｌである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記感染培地のｐＨが、7．2超であり、かつ好ましくは約7．3である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、36℃〜37．5℃の温度で、好ましくは37℃で実施される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
ステップ（ｂ）が、40〜80時間、好ましくは約44時間の期間実施される、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
ＨｅＬａ細胞1個当たり少なくとも50ｐｆｕのワクシニアウィルスが生成され、好ましくは、ＨｅＬａ細胞1個当たり少なくとも75ｐｆｕのワクシニアウィルスが生成される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記培地が、硫酸デキストラン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−68、ポリソルベート80、および大豆加水分解物のうちの一つ以上を含まない、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記培地が硫酸デキストランを含まない、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記培地が、硫酸デキストラン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−68、ポリソルベート80、および大豆加水分解物を欠如している、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記培地がウシ胎児血清を含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記培地が10％未満のウシ胎児血清を含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記培地が血清を含まない、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1019]
ステップ（ａ）のｍ．ｏ．ｉ．が、約0．01〜0．5ｐｆｕ／細胞であり、かつ好ましくは約0．02ｐｆｕ／細胞である、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1019]
採取された前記ウィルスが一つ以上の精製ステップに供される、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記精製が、ＨｅＬａ細胞核酸を除去するためのヌクレアーゼによる前記採取されたウィルスの処理、および／またはＨｅＬａ細胞タンパク質を除去するためのプロテアーゼによる該採取されたウィルスの処理を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記精製がタンジェンシャルフロー濾過ステップを含む、本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
前記精製が、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーステップを含む、本発明1019〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記精製が、膜吸収クロマトグラフィーステップを含む、本発明1019〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記ワクシニアウィルスが、ワクシニアウィルスのＩＨＤ−Ｊ株、ワイス株、ウェスタンリザーブ株、またはコペンハーゲン株である、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記ワクシニアウィルスが組み換え型ワクシニアウィルスである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記組み換え型ワクシニアウィルスが、免疫促進性ポリペプチドをコードする異種のコード領域を含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記免疫促進性ポリペプチドがサイトカインである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記組み換え型ワクシニアウィルスが腫瘍細胞において選択的に複製する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記組み換え型ワクシニアウィルスが内因性遺伝子中に突然変異を含んでいる、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記組み換え型ワクシニアウィルスが機能性チミジンキナーゼ遺伝子を欠如している、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記組み換え型ワクシニアウィルスが、ワクシニアウィルスのＩＨＤ−Ｊ株、ワイス(Ｗｙｅｔｈ)株、ウェスタンリザーブ株、またはコペンハーゲン株である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記組み換え型ワクシニアウィルスが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ポリペプチドをコードする、本発明1032の方法。
[本発明1034]
感染の前にＨｅＬａ培養物を増大させることをさらに含む、本発明1001〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記ＨｅＬａ細胞が、少なくとも一つのローラーボトル培養容器を通過し、該ローラーボトル培養容器が、直前の培養容器と比べて増加した培養面積を有する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記ローラーボトル培養容器が少なくとも850ｃｍ2の培養面積を有する、本発明1035の方法。
[本発明1037]
最終通路が、少なくとも168，000ｃｍ2の培養面積を有するローラーボトル培養容器である、本発明1035の方法。
[本発明1038]
前記ローラーボトル培養容器の播種と、感染との間の間隔が、48〜96時間である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記接着ＨｅＬａ細胞を2×103〜1×105個の組み換え型複製コンピテントワクシニアウィルス／ｍｌと接触させる、本発明1038の方法。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本発明では特定の実施形態を示しているが、詳細な説明および特定の各実施例は、例示目的にのみ示すものであると理解されるべきであり、この理由は、本発明の主旨およびその範囲内での各種の変形および変更は、この詳細な説明から当業者に明らかになるからである。