【手続補正書】
【提出日】平成27年4月8日(2015.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
頭−尾配置で結合一体化された２つのユビキチン単量体
を含む、ヒトユビキチンの非天然標的タンパク質への結合能を有するヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、
前記ヘテロ二量体型タンパク質の両方の単量体が、少なくとも配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する少なくとも５、６、７、または８個のアミノ酸の置換により異なって修飾され、かつ
２〜１５個のアミノ酸が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する前記アミノ酸置換から０、１、２、または３アミノ酸離れて少なくとも一方のユビキチン単量体に挿入され、かつ
前記修飾ユビキチン単量体が、配列番号１に対して少なくとも７５％または少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有し、かつ前記修飾ヘテロ二量体型ユビキチンが、Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍの前記非天然標的タンパク質への特異的検出可能結合親和性を有する
ことを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、６〜１０個のアミノ酸または７〜９個のアミノ酸または８個のアミノ酸が、一方または両方のユビキチン単量体に挿入されることを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、アミノ酸の前記挿入が、Ｃ末端（第４）またはＮ末端（第１）のβストランドから０、１、２、３、４、または５アミノ酸離れており、任意選択で、前記挿入が、Ｎ末端（第１）のユビキチン単量体に位置することを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項４】
請求項２または３に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、前記挿入が、配列番号１のアミノ酸の位置６１および６２または位置６２および６３または位置６３および６４または位置６４および６５に対応するアミノ酸間にあり、最も好ましいのが、配列番号１の位置６１および６２に対応するアミノ酸間であることを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、前記非天然標的タンパク質が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、好ましくはＶＥＧＦ−Ａまたはそのアイソフォームであることを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、前記Ｎ末端（第１）の単量体中の置換が、Ｋ６Ｙ、Ｌ８Ｄ、Ｑ６２Ｓ、Ｋ６３Ｗ、Ｅ６４Ｍ、Ｓ６５Ｐ、Ｔ６６Ａであり、かつ／または前記Ｎ末端の単量体中の挿入が、アミノ酸配列ＤＶＡＥＹＬＧＩ（配列番号１２）を含むか、もしくはそれで構成されることを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項７】
医薬活性成分または診断活性成分と融合されたまたはそれにコンジュゲートされた請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲートにおいて、前記医薬活性成分が、任意選択で、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、ユビキチン系結合タンパク質、もしくは酵素であり、または前記診断活性成分が、蛍光性化合物、光増感剤、もしくは放射性核種から選択されることを特徴とする融合タンパク質またはコンジュゲート。
【請求項８】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または請求項７に記載のその融合タンパク質もしくはコンジュゲートからなることを特徴とする多量体。
【請求項９】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または請求項７に記載の修飾ユビキチン融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項８に記載の多量体あるいはそれらの組合せと、薬学的に許容可能な担体と、を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または請求項７に記載の融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項８に記載の多量体と、診断的に許容可能な担体と、を含むことを特徴とする診断剤。
【請求項１１】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または請求項７に記載の修飾ユビキチン融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項８に記載の多量体をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１３】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質、請求項７に記載の融合タンパク質もしくはコンジュゲート、請求項８に記載の多量体、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項１２に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法において、以下のステップ、すなわち、
ａ）ユビキチンタンパク質を提供するステップと、
ｂ）潜在的標的としてユビキチンの非天然標的タンパク質を提供するステップと、
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有する単量体型ユビキチンタンパク質が得られるように前記ユビキチンタンパク質を修飾するステップであって、５、６、７、または８個のアミノ酸が、少なくとも配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８に対応するアミノ酸の置換により修飾され、かつさらなる２〜１５個のアミノ酸が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する前記置換アミノ酸から０、１、２、または３アミノ酸離れて挿入されるものとするステップと、
ｄ）前記単量体型の異なって修飾されたユビキチン単量体の２つを結合するステップと、
ｅ）前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を前記標的タンパク質に接触させるステップと、
ｆ）１０−７〜１０−１２Ｍの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合する修飾されたヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を同定するステップと、任意選択で
ｇ）前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を単離するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の同定方法において、以下のステップ、すなわち、
ａ）単量体型ユビキチンタンパク質に由来する異なって修飾されたヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質の集団を提供するステップであって、前記集団が、頭−尾配置で結合一体化された２つの異なって修飾されたユビキチン単量体を含むヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を含み、前記多量体型タンパク質の各単量体が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する５、６、７、または８個のアミノ酸の置換により修飾され、かつさらなる２〜１５個のアミノ酸が、少なくとも一方の単量体ユビキチンユニット中の前記アミノ酸置換内またはそれにごく近接して、任意選択で、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する前記置換アミノ酸から０、１、２、または３アミノ酸離れて挿入されるものとするステップと、
ｂ）潜在的標的としてユビキチンの非天然リガンドタンパク質を提供するステップと、
ｃ）前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを前記標的タンパク質に接触させるステップと、
ｄ）１０−７〜１０−１２Ｍの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合するヘテロ二量体型修飾ユビキチンを同定するステップと、任意選択で
ｅ）前記結合親和性を有する前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを単離するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項７に記載のヘテロ二量体型融合タンパク質またはコンジュゲートの生成方法において、以下のステップ、すなわち、
ａ）請求項１乃至６の何れか１項に記載の二量体型修飾ユビキチンを提供するステップと、
ｂ）前記修飾された二量体型修飾ユビキチンタンパク質を医薬活性成分および／または診断活性成分に融合またはコンジュゲートするステップと、
を含むことを特徴とする方法。