【事件の表示】
　特許第３２３００９１号「ヒト血清アルブミンの着色抑制方法」の請求項１ないし３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３２３００９１号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３２３００９１号の請求項１乃至３に係る発明についての出願は、平成２年６月２５日に特願平２−１６６０９１号として出願され、平成１３年９月１４日にその特許の設定登録がなされ、その後、デルタ、バイオテクノロジー、リミテッドより特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１４年１０月２２日に訂正請求がなされたものである。
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１に係る記載を、
「遺伝子操作により調製したヒト血清アルブミンを菌体外発現により産生する宿主を培養してヒト血清アルブミンを菌体外発現させる際に、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを添加した培養液中で当該宿主を培養することにより、ヒト血清アルブミンと着色成分とが結合する前に、当該ヒト血清アルブミンと当該着色成分とを分離することを特徴とするヒト血清アルブミンの着色抑制方法。」と訂正する。
(2)特許請求の範囲の請求項３に係る記載を、
「遺伝子操作によりヒト血清アルブミンを菌体外発現により産生する宿主を調製し、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを添加した培養液中で当該宿主を培養し、ヒト血清アルブミンを菌体外発現させる、工程を含む、着色が抑制されたヒト血清アルブミンの製造方法。」と訂正する。
(3)本件明細書（特許公報で表示）２頁3欄35行の「菌体内または」を削除する。
(4)同２頁4欄1〜2行の「菌体内発現または」を削除する。
(5)同２頁4欄3〜7行の「しかしながら、ヒト血清アルブミンと着色成分とを分離する工程は、・・・、菌体外発現の場合、培養工程中に行うことが望ましい。」を「ヒト血清アルブミンと着色成分とを分離する工程は培養工程中に行う。」と訂正する。
(6)同４頁7欄36〜49行の「HSAと着色成分とを分離する工程は、培養工程中、・・・、酵素処理法等の常套の方法が挙げられる。」を「HSAと着色成分とを分離する工程は、培養工程中に組み込まれ、培養液のHSA含有水溶液中にて行われる。本発明においては、培養により発現されるヒト血清アルブミンおよび着色成分を、両者が互いに結合する前に、分離することにより着色を防止する。従って、菌体外発現においては、当該分離工程は、培養工程中に行う。」と訂正する。
(7)同４頁8欄24〜25行の「また、本発明においては、・・・これらの精製工程に組み合わせてもよい。」を削除する。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)及び(2)は、「ヒト血清アルブミン産生宿主」を「ヒト血清アルブミンを菌体外発現により産生する宿主」と、また、「ヒト血清アルブミンを発現」を「ヒト血清アルブミンを菌体外発現」と、いずれも「菌体外発現」という事項を直列的に付加するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当し、また、訂正事項(3)乃至(7)は、訂正事項(1)及び(2)に伴う訂正である。
　そして、この訂正は新規事項に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項及び同条３項で準用する１２６条２項及び３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　特許異議申立人は、甲第１号証乃至甲第12号証を提出し、訂正前の本件請求項１乃至３に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから特許法２９条１項３号の規定に該当する、若しくは、甲第５号証、甲第７号証及び甲第８号証に記載された発明、又は、甲第６号証，甲第７号証及び甲第８号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから同条２項の規定に違反する、或いは、本件明細書は当業者が実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されていないから同法３６条４項の規定を満たしていない、と主張している。
　　　　　　　　　記
甲第２号証：Naval J.et al.,J.Biochem.,111(5),pp649-654(1992)
甲第３号証：Watkns S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(6),pp2409-2413(1993)
甲第４号証：本件特許に対応する欧州特許出願第９１１１０４５５．２号の審査に当たって出願人から欧州特許庁に１９９６年２月２６日付で提出された意見書
甲第５号証：特開平２−３１６８７号公報
甲第６号証：Quirk A.et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.,11.pp273-287(1989)
甲第８号証：ＥＰＯ２４４９９８Ａ１公報
甲第９号証：Nakano N.et al.,Anal.Biochem.,129,pp64-71(1983)
甲第10号証：Smith D.et al.,Plant Cell Reports,9,pp34-37(1990)
甲第11号証：Halper G.et al.,J.Chromatogr.,317,pp103-188(1984)
甲第12号証：本件特許に対応する欧州特許出願第９１１１０４５５．２号の審査に当たって出願人から欧州特許庁に１９９５年３月２２日付で提出された意見書
２．甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、「この分子は、オクチルセファロースやフェニルセファロースのいずれかに対するバッチ吸着により、形質転換されたサル腎臓細胞系の培養培地から抽出された。」（209頁 要約 3〜4行）、「ヒト成長ホルモンのフェニルセファロースやオクチルセファロースへのバッチ吸着が前処理なしで培養培地において研究された。」（210頁33〜34行）、及び「この技術はまた、培養培地の前処理を必要とせず、微細物、すなわち細胞断片の懸濁液の存在下において使用できる穏やかな方法を提供する。」（215頁下から7〜5行）が記載されている。
　甲第２号証には、「大量のアルブミンおよびAFPmRNA分子が致死的である肝臓に見出され、かなりの量がまた胃腸管や腎臓に存在していた。」（649頁 要約 6〜8行）が、
　甲第３号証には、「サルとヒトの血清アルブミンの比較は、アミノ酸レベルで９３．５％の同一性を示す。」（2409頁 要約 21〜22行）が、
　甲第４号証には、「“着色成分がヒト血清アルブミンに結合する前に”という特徴を挿入することに関し、出願人の意見としては、分離工程が宿主細胞について実施されるか、溶解物について実施されるかは本質的ではない。」（２頁下から5〜3行）がそれぞれ記載されている。
　甲第５号証には、純化された組換え体由来の血清アルブミンの製造方法において、血清アルブミンをコードする構造遺伝子を有する発現性構成体の使用による形質転換の結果その中に血清アルブミンを発現している微生物細胞群を培地中で生育させ・・・」（特許請求の範囲第１項）、「微生物が酵母である・・・」（同第９項）、及び「けれども形質転換細胞群を用いる発酵によって産生された血清アルブミンの純化における主問題の一つは生育培地（発酵ブロス）又は細胞分解物からの夾雑成分の存在であってこれらは純化された均質な血清アルブミンの収得のために除去されなければならない。」（３頁左上欄5〜10行）が記載されている。
　甲第６号証には、「サッカロマイセス・セレビシアエからの組換えヒトアルブミンの製造」との表題の下、「ヒト血清アルブミンはサッカロマイセス・セレビシアエ醸造用酵母において構成的に発現させた。」（要約1〜2頁）、及び「しかしながら、ピークの高さは標準品とはいくらか異なっており、これは未同定のＵＶ吸収不純物の存在を示している、・・・（中略）・・・他の技術（例えば、SDS-PAGE）によると、これらの不純物はタンパク質ではなく、組換えヒト血清アルブミンの結合部位に決着するリガンドかも知れない。」（286頁6〜11行）が記載されている。
　甲第７号証には、「生物学的発酵培地はしばしば望まざる着色現象を有し、もしそれが除去されなければ生産物の品質は減少する。適当な表面活性化固相吸着体を使用することにより、溶液中に存在する着色物質をこの固相担体の表面に吸着させることができ、それにより培養物を脱色することができる。」（406頁左下部分）が記載されている。
　甲第８号証には、「商業的な必要性としては通常、上澄み液や濾液が清澄であることが挙げられる。しかし細胞培養液にはしばしば、濾過中、その後の静置、あるいはその後の工程中のいずれかにおいて、混入タンパク質あるいは混濁および／また着色を生じさせる他の物質が含まれている（あるいはこれらを微生物が生産している）。生産物が商業的に受け入れられるためには、通常、混濁物質や着色物質、あるいはそれらを生成する物質を取り除き、培地を更なる混濁や着色の生成から安定させなければならない。」（２頁11〜17行）、「本発明の方法で使用される微粒子の重合体からなる吸着物質は、濁りおよび／または着色を生成する物質を吸着し、その後の液体−固体の分離工程中にこれらを保持することができる微粒子の重合体からなる物質であることができる。例えば、陰イオン交換樹脂のような正に電荷した重合体が挙げられる。これらの物質は、濁りおよび／または着色を生成する物質と化学結合、あるいは静電的な引力で結ばれている。その他の有効な微粒子の重合体からなる吸着物質としては、イオン交換樹脂前駆物質（好ましくは架橋されているが不水溶性で架橋されていない物質を含む）、および電荷を有さず、かつ疎水性または親水性の引力あるいはファンデルワールス力、生体特異的または他の親和力によって、濁りおよび／また着色を生成する物質を保持する吸着物質が挙げられる。」（同39〜47行）が記載されている。
　甲第９号証には、「５％活性炭粉末が４％アガロースに担持された活性炭ビーズがエマルジョン技術により調製された。ビーズカラムは、0.1MNaCl、pH3.0（HCl）の条件下、ゾーンあるいはフロント分析により、アルブミンを含有する溶液から、サリチル酸、ワルファリン、長鎖脂肪酸を効果的に除去することが示された。」（要約 １〜４頁）が、
　甲第10号証には、「栄養培地における活性炭の存在は、種々の阻害代謝物や培養成育中に放出される物質の吸着によって胚形成を促進することが知られている。」（３４頁右欄10〜13行）が、
　甲第11号証には、「ビーズ状のアガロース上に炭化水素鎖を担持させることにより、種々の起源のものから赤血球やリンパ球を吸着できるカラム物質とすることができる。」（103頁1〜2行）がそれぞれ記載されている。
　甲第12号証には、「出願人の意見としては、本発明の本質的な特徴の一つは、着色不純物を除去するために新たに発現されたヒト血清アルブミンを陰イオン交換樹脂や疎水性担体や活性炭と接触させ、そしてヒト血清アルブミンへの結合が生じる前に着色成分とこれらの結合物質との結合を達成するために、菌体外発現の場合にはヒト血清アルブミンを得る細胞を処理した直後にバッチを接触させることが必要である、ということである。」（１頁下から5行〜２頁7行）が記載されている。
３．判断
Ａ．特許法２９条１項３号について
　訂正された請求項１乃至３に係る発明（以下、「本件発明１乃至３」という。）のうち、前２者は、「ヒト血清アルブミンの着色抑制方法」、後者は、「着色が抑制されたヒト血清アルブミンの製造方法」に係るところ、甲第１号証には、「形質転換サル腎臓細胞系」を培養することにより「ヒト成長ホルモン」を調製する記載はあるものの、「ヒト血清アルブミン」について開示されているところは全くない。
　そして、「ヒト血清アルブミン」は、「ヒト成長ホルモン」とは別異の物質であるから、結局、本件発明１乃至３は、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。
　これに関し、特許異議申立人は、甲第２号証には、培養されたサル腎臓細胞からはアルブミンが発現されていること、また、甲第３号証には、サルアルブミンとヒトアルブミンとはアミノ酸レベルで９３．５％の同一性を有していること、及び甲第４号証に記載の事項を踏まえると、甲第１号証には遺伝子操作により調製したヒト血清アルブミン産生宿主を培養してヒト血清アルブミンを発現させる方法が記載されてるといえると主張している。
　しかし、ヒト血清アルブミンに関し遺伝子操作をしてないサル腎臓細胞を培養しても、ヒト血清アルブミンは絶対産生されないのであるから、技術常識を無視した上記特許異議申立人の主張は失当である。
Ｂ．特許法２９条２項について
　甲第５号証及び甲第６号証には、遺伝子操作により調製したヒト血清アルブミン産生宿主を培養してヒト血清アルブミンを発現させることが記載されている。
　そして、甲第７号証には、活性炭を用いて培養物から着色物質を分離し、培養物を脱色することが、甲第８号証には、陰イオン交換体及び疎水性担体を用いて細胞培養物から濁りや着色を生じさせる物質を分離し、培養物を脱色する方法が、甲第９号証には、活性炭を用いてアルブミンから不純物を取り除くことが、甲第10号証には、活性炭を用いて培養培地中に存在する望ましくない分子を取り除くことが、及び甲第11号証には、疎水性担体を用いてアルブミンと細胞とを分離することがそれぞれ記載されている。
　しかるに、本件発明１乃至３は、「陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを添加した培養液中で当該宿主を培養」することに特徴があるところ、上記甲７号証乃至甲第11号証は、いずれも、陰イオン交換体、疎水性担体、或いは活性炭を培養後の培養物中に存在する不純物を除去しようとするもので、陰イオン交換体、疎水性担体、或いは活性炭と共に、宿主を培養することについて言及しているところはない。
　本件発明１乃至３は、上記の構成を採用することにより、ヒト血清アルブミンと着色成分とが結合する前に当該ヒト血清アルブミンと当該着色成分とを分離することができるものであるから、甲第５号証乃至甲第11号証に記載の事項に基づき当業者が容易に想到し得る域を超えているというべきである。
　したがって、本件発明１乃至３は、甲第１号証乃至甲第11号証に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたものではない。
Ｃ．特許法３６条４項について
　特許異議申立人は、本件明細書には、細胞内発現の場合に活性炭等を培養液中に単に存在させてヒト血清アルブミンと着色成分とを分離することは記載されてないと主張している。
　しかし、上記訂正請求により、請求項１及び請求項３に係る「ヒト血清アルブミン産生宿主」を「ヒト血清アルブミンを菌体外発現により産生する宿主」と、「ヒト血清アルブミンを発現」を「ヒト血清アルブミンを菌体外発現」と訂正されたのであるから、最早、上記主張に理由はない。
　したがって、本件明細書に記載の不備はない。
４．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至３についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至３についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年１１月７日（２００２．１１．７）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
（１）特許請求の範囲の請求項１に係る記載を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「遺伝子操作により調製したヒト血清アルブミンを菌体外発現により産生する宿主を培養してヒト血清アルブミンを菌体外発現させる際に、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを添加した培養液中で当該宿主を培養することにより、ヒト血清アルブミンと着色成分とが結合する前に、当該ヒト血清アルブミンと当該着色成分とを分離することを特徴とするヒト血清アルブミンの着色抑制方法。」と訂正する。
（２）特許請求の範囲の請求項３に係る記載を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「遺伝子操作によりヒト血清アルブミンを菌体外発現により産生する宿主を調製し、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを添加した培養液中で当該宿主を培養し、ヒト血清アルブミンを菌体外発現させる、工程を含む、着色が抑制されたヒト血清アルブミンの製造方法。」と訂正する。
　以下、（３）乃至（７）は、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
（３）本件明細書（特許公報で表示）２頁３欄３５行の「菌体内または」を削除する。
（４）同２頁４欄１〜２行の「菌体内発現または」を削除する。
（５）同２頁４欄３〜７行の「しかしながら、ヒト血清アルブミンと着色成分とを分離する工程は、・・・、菌体外発現の場合、培養工程中に行うことが望ましい。」を「ヒト血清アルブミンと着色成分とを分離する工程は培養工程中に行う。」と訂正する。
（６）同４頁７欄３６〜４９行の「ＨＳＡと着色成分とを分離する工程は、培養工程中、・・・、酵素処理法等の常套の方法が挙げられる。」を「ＨＳＡと着色成分とを分離する工程は、培養工程中に組み込まれ、培養液のＨＳＡ含有水溶液中にて行われる。本発明においては、培養により発現されるヒト血清アルブミンおよび着色成分を、両者が互いに結合する前に、分離することにより着色を防止する。従って、菌体外発現においては、当該分離工程は、培養工程中に行う。」と訂正する。
（７）同４頁８欄２４〜２５行の「また、本発明においては、・・・これらの精製工程に組み合わせてもよい。」を削除する。
（５４）【発明の名称】
ヒト血清アルブミンの着色抑制方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】遺伝子操作により調製したヒト血清アルブミン
を菌体外発現により産生する
菌体外
　【請求項２】前記宿主が酵母である、請求項１記載のヒト血清アルブミンの着色抑制方法。
　【請求項３】遺伝子操作によりヒト血清アルブミン
を菌体外発現により産生する
菌体外
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
　本発明は遺伝子操作による発現されるヒト血清アルブミンの着色抑制方法に関する。
〔従来技術およびその課題〕
　アルブミン、特にヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する責を負う。
　また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持っている。
　ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とすることがある。
　従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を治療する点に存する。
　現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の分画からの産物として製造されている。この製造法の欠点は不経済であることと、血液の供給が困難であるということである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡの代替の原料を開発することが有益となろう。
　ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によって、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産が可能となった。多くの哺乳動物ポリペプチド類、例えばヒト成長ホルモン、インターフェロンが既に種々の微生物により生産されている。この技術によって、種々の有用なポリペプチドの微生物による生産が可能となり、種々のワクチン、ホルモン、酵素、抗体を微生物に生産させることができるようになった。
　前述したＨＳＡの生産上の難点を克服するために、遺伝子操作の技術によりＨＳＡに大量に得、それを高度精製する方法が確立されつつある。
　ところが、血漿由来のＨＳＡ、本来黄色または黄褐色であるが、遺伝子操作により発現されたＨＳＡは、濃黄色または濃黄褐色となり、ＨＳＡを製造、精製する際に、原料中にある種の着色成分が夾雑してくるため、これがＨＳＡと結合してＨＳＡそのものが着色してしまう。これらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡの製造方法では充分に除去することができない。
〔課題を解決するための手段〕
　そこで本発明者らは、かかる技術的背景の下に鋭意研究を重ねた結果、遺伝子操作を経
て菌
　即ち、本発明は遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブミンとの着色成分とが結合する前に、当該ヒト血清アルブミンと当該着色成分とを分離することを特徴とするヒト血清アルブミンの着色抑制方法であり、さらに、ヒト血清アルブミンと着色成分とを分離する手段として、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用いることを特徴とするヒト血清アルブミンの着色抑制方法である。
　本発明において用いられるＨＳＡは、遺伝子操作に由来して調製されるものであれば、特に限定されない。従って、遺伝子操作を経てＨＳＡを発現する菌体（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、動物細胞等）を培養し
、菌
　
ヒト血清アルブミンと着色成分とを分離する工程は培養工程中に行う。
　また、本発明において着色成分とは、ＨＳＡを着色しうるものをいい、培養培地由来の着色成分のみをいうのではない。
（ｉ）遺伝子操作によりＨＳＡ発現菌体の調製
　ＨＳＡを発現する菌体の例として、以下にＨＳＡ産生酵母の調製方法を説明する。
　本発明においてＨＳＡ産生酵母とは、ＨＳＡ遺伝子を担持したプラスミドを用いて形質転換した酵母である。
　ＨＳＡ遺伝子を担持したプラスミドは公知の手法により得られる。
　具体的には、ＨＳＡ遺伝子、プロモーター、シグナル配列、ターミネーター等を含む。
　プラスミドが含有するアルブミンコード領域は、特にＨＳＡと同一または相同なＤＮＡ配列であり、例えばＨＳＡを産生することができる任意のヒト細胞から得られる。該ＤＮＡは染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡである。染色体ＤＮＡはＨＳＡ遺伝子を含有する遺伝子ライブラリーから分離することができ、そしてＨＳＡ　ｃＤＮＡは公知の方法を用いてｍＲＮＡ経路を介して調製することができる。
　プロモーターは、通常酵母、好適にはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは、高発現酵母遺伝子のプロモーターをＨＳＡの発現のために使用する。即ち、ＴＲＰ　Ｉ遺伝子、ＡＤＨ　ＩもしくはＡＤＨ　ＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３もしくはＰＨＯ５）遺伝子、またはイソチトクロームＣ遺伝子のプロモーター、ガラクトース代謝系のプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０もしくはＧＡＬ７）、インベルターゼのプロモーター（ＳＵＣ２）あるいは解糖系酵素をコードする遺伝子のプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼの遺伝子のプロモーター、またはａ−ファクターあるいはα−ファクターをコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーターを使用することができる。
　他の好ましい態様においては、構成物中にシグナル配列を導入する。シグナル配列は、酵母インベルターゼ、α−ファクター遺伝子のような酵母由来のシグナル配列を使用することができる。また、ＨＳＡのシグナル配列は好適であり、好ましくは酵母での分泌発現のために特に合成されたシグナル配列（ＥＰ公開３１９６４１号公報または特開平１−２４０１９１号公報）を用いることもできる。
　このシグナル配列の導入により、ＨＳＡ遺伝子の発現の後、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム空間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への当該産物の分泌を達成することができ、これにより収量の相当な増加が可能となる。さらに、細胞を破壊する必要がないので回収工程を単純化することが可能である。
　また、プラスミドは転写停止のための適当なターミネーター、例えばＰＨＯ５もしくはＧＡＰＤＨターミネータを含有する。
　宿主としては酵母、特にサッカロマイセスもしくはピキアが使用される。好ましくは、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。例えば、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株で、かつＧ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２株（ａ，ｈｉｓ　４，ｌｅｕ　２，ｃａｎ　１）等が好適に用いられる。
　形質転換法としては、プラスミドを直接宿主細胞内に導入する方法と、プラスミドを酵母染色体に組み込む方法等が挙げられる。
　前者は公知の手法により行われる。具体的には、リン酸カルシウム微少沈澱法、プロトプラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法等が例示される（特開平３−７２８８９号公報、特公平６−６９３６５号公報）。
　後者は、例えば下記の方法によって行われ、本発明においては、このようにプラスミドが酵母染色体に組み込まれたＨＳＡ酸生酵母がより好適に使用される。
　後者の方法においてプラスミドは、宿主酵母染色体中に存在する遺伝子の一部のＤＮＡ配列（例えば、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ＤＮＡ遺伝子等）を含有する。相同な配列により、全プラスミドまたはその線状断片は組換により宿主染色体に安定に導入することができる。即ち、増殖中、子孫細胞は選択圧が存在しない場合でも導入された遺伝物質を安定に保持する。
　例えば、酵母染色体遺伝子中の天然に存在する配列およびＨＳＡ遺伝子を含むプラスミドは、前記染色体遺伝子の座に安定に組み込まれ得る。
　具体的には、挿入するプラスミドの有する、宿主酵母細胞の染色体に相同な配列中の任意の部位を制限酵素処理により切断し、直線化したプラスミドを宿主に導入することが望ましい。直線化されたプラスミドは、宿主酵母細胞染色体上のプラスミドに組み込まれた領域と相同な領域に組み込まれる。直線化されたプラスミドは環状プラスミドより、宿主染色体上に組み込まれる頻度が上昇する。
　宿主酵母染色体配列に相同な配列として、特にアミノ酸または核酸合成系遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ＤＮＡ、Ｔｙ因子（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ　ｅｌｅｍｅｎｔ）等が使用できる。特に、アミノ酸または核酸合成系遺伝子は、宿主酵母がアミノ酸または核酸栄養要求性株である時、すなわち、該アミノ酸または核酸合成系遺伝子が欠損している株においては、宿主の変異を補完する遺伝子であるので、形質転換体の選択マーカーとして使用することができる。この際、宿主酵母の栄養要求性に原栄養性をもたらす。アミノ酸または核酸合成系遺伝子としては、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＴＲＰ１またはＵＲＡ３がある。
　酵母用の選択遺伝子マーカーとしては、上記のように、宿主酵母が栄養要求性株である時、アミノ酸または核酸合成系遺伝子のようなものが使用できるほか、宿主が抗生物質感受性株である時は、該抗生物質耐性を発現する遺伝子が使用できる。例えば、シクロヘキシド、Ｇ４１８、クロラムフェニコール、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン等の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
　また、プラスミドは宿主酵母内で自律的に複製できない。すなわち、宿主酵母内での自律複製開始領域、例えば２μｍ　ＤＮＡの複製開始領域やＡＲＳ領域（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を実質的に含まない。
　このプラスミドはプロモーター、ＨＳＡコード領域および宿主染色体相同領域とは別に、細菌宿主、特に大腸菌のための複製開始点および遺伝的選択マーカーを含有することもできる。大腸菌複製開始点および大腸菌のための選択マーカーを酵母ハイブリドベクター中に使用することに関して有用な特徴が存在する。まず、大腸菌における増殖および複製により大量のハイブリドベクターＤＮＡを得ることができ、そして第２に、大腸菌に基礎を置くクローニング技法のすべてを用いてハイブリドベクターの構築を容易に行うことができる。大腸菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２等は大腸菌複製開始点、および抗生物質、例えばテトラサイクリンおよびアンピシリンに対する耐性をもたらす大腸菌遺伝子マーカーを含有し、そして酵母ハイブリドベクターの部分として有利に使用される。
　従って、本プラスミドは、プロモーター、該プロモーターに制御されるアルブミンコード領域、それに続く転写停止のためのターミネーターを含み、かつ宿主酵母染色体配列に相同な配列を含むものである。また、本プラスミドは、所望により、分泌生産のためのシグナル配列、酵母用の選択遺伝子マーカー、大腸菌の複製開始領域、大腸菌用選択遺伝子マーカーを含有することができる。そして、酵母の複製開始領域は実質的に含まないものである。
　次に期待した部位へプラスミドが導入されているか否か、および導入した遺伝子が安定であるか否かを調べる。具体的には、サザンブロッティング法により、形質転換に利用した宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列をプローブとして、期待通りの部位へプラスミドが導入されていることを確認する。またアルブミンをコードする遺伝子の安定性を、アルブミン産生量および栄養要求性の回復維持を指標に調べ、形質転換体を非選択培地で数十代培養した後でも、変化しないことを確認する。
　この形質転換体を宿主として使用し、再度、アルブミンコード領域を含むプラスミドで形質転換させることができる。この場合、酵母細胞染色体相同領域としては、初めの形質転換で使用した領域以外の相同領域も使用できる。
　この他、宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列として、ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ＤＮＡやＴｙ因子も挙げられる。これらの遺伝子は細胞当り、複数個存在するので、１回の形質転換で、複数個の目的遺伝子を宿主染色体に組み込むことができる。
　宿主として、難種類もの栄養要求変異株が取得できれば、または何種類もの抗生物質に対して感受性を示す株が取得できれば、それに応じた領域に有用遺伝子を複製導入することができる。
　このように、宿主染色体の複数領域に目的遺伝子を挿入することができる。これら染色体に組み込まれた遺伝子は、脱落することなく安定に維持され、かつ複数の遺伝子を組み込むことにより、目的生産物を多量に取得することが可能となる。
　また、複数の形質転換株を細胞融合させて、ＨＳＡ産生酵母を調製してもよい（特開平３−５３８７７号公報、特許第２８５５１３０号公報）。
　形質転換株は、公知の培地で培養する。培地としては、例えばＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）、２％バクトポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、２％グルコース〕等が例示される。培養は通常１５〜４３℃（好適には３０℃程度）で２０〜１００時間程度行い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。また、フェッド−バッチ培養を利用することもできる（特開平３−８３５９５号公報、特公平８−７７号公報）。
（ｉｉ）ＨＳＡと着色成分とを分離する工程
　
ＨＳＡと着色成分とを分離する工程は、培養工程中に組み込まれ、培養液のＨＳＡ含有水溶液中にて行われる。
　本発明においては、培養により発現されるヒト血清アルブミンおよび着色成分を、両者が互いに結合する前に、分離することにより着色を防止する。従って、菌体外発現においては、当該分離工程は、培養工程中に行う。
　分離する手段としては、例えば着色成分を吸着体により除去する方法が例示され、吸着体としては、陰イオン交換体、疎水性担体あるいは活性炭が望ましく、さらに陽イオン交換体を併用してもよい。
　陰イオン交換体としては、ＤＥＡＥ系（例えば、ＤＥＡＥ−アガロース、ＤＥＡＥ−架橋デキストラン、ＤＥＡＥ−セルロース等）、ＱＡＥ系（例えば、ＱＡＥ−アガロース、ＱＡＥ−架橋デキストラン等）等が挙げられる。
　本発明において疎水性担体とは、疎水性リガンドを不溶性担体に結合させたものである。疎水性リガンドとしては、アルキル（エチル、ブチル、オクチル等の炭素数１〜４のもの）、フェニル、フェニルアラニル等が例示される。また、不溶性担体としてはアガロース、架橋デキストラン、親水性ビニルポリマー等が例示される。
　当該分離工程における処理条件は、好適には次の通りである。
　ｐＨ条件：ｐＨ４〜８（好適にはｐＨ５〜６．５）
　添加量：０．０１〜１０ｗ／ｖ％（培地中）
　本発明においては、培養工程中に分離工程を並行して行なったのち、自体公知の方法により、ヒト血清アルブミンを精製することが望ましい。
　精製方法としては、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離法、透析等の公知の方法が採用される
。
〔発明の効果〕
　本発明方法により、遺伝子操作により発現されるＨＳＡの着色の程度が、未処理の場合の１／７０〜１／１０程度に抑えられる。
　また、ＨＳＡの回収率もよく、ＨＳＡ本来の性質も全く変化しない。
　特に色疎吸着剤に着色成分を吸着させる方法は、簡便で工業的に効率よく行える。
　従って、本発明方法により処理されたＨＳＡは、血漿由来のＨＳＡと同様に、臨床上有用な医薬品として利用することができる。
〔実施例〕
　本発明をより詳細に説明するため、参考例、実施例、比較例および試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
参考例
ＨＳＡ分泌発現酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＭＳ３３−１ｈ４の調製
〔ｉ〕ＧＡＰＤＨプロモーター領域，ＳＵＣ　２シグナル領域，ＬＥＵ　２領域，ＴＲＰ　１領域，ＰＨＯ　５ターミネーター領域のクローニングおよびＨＳＡ遺伝子，Ｇ−４１８耐性遺伝子の調製
　それぞれ次の文献に記載の方法、それに準じる方法によるか、または市販のものを使用した。
ＧＡＰＤＨプローモーター：Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｈ．Ｊ．ａｎｄ　Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２５４
２５４
ＳＵＣ　２シグナル配列：特開昭６０−４１４８８号公報　特開昭６３−８４４９８号公報
ＨＳＡ遺伝子：特開昭６２−２９９８５号公報
ＰＨＯ　５ターミネーター：特開昭６２−１５１１８３号公報
Ｇ−４１８耐性遺伝子：Ｏｋａ，Ａ．，Ｓｕｇｉｓａｋｉ，Ｈ．ａｎｄ　Ｔａｋａｎａｍｉ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
１４７
２８７
ＴＲＰ　１：プラスミドｐＢＴＩ−１０由来（ベーリンガーマンハイム社より市販）
ＬＥＵ　２：プラスミドｐＢＴＩ−１由来（ベーリンガーマンハイム社より市販）
大腸菌複製開始領域及びアンピシリン耐性遺伝子：ｐＵＣ　１９（宝酒造より入手）
〔ｉｉ〕各プラスミドの構築
　各プラスミドｐＭＭ−００６およびｐＨＯ−０１１の構築は、ｐＵＣ１９から「モレキュラークローニング」コールドスプリングハーバーラボラトリー（１９８２）に記載の方法に準じて常法通り行った（第１図（ａ）および（ｂ）参照）。
　プラスミドｐＭＭ−００６は、宿主酵母細胞の染色体配列と相同な配列として、ロイシン合成系遺伝子のＬＥＵ２を含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下にＳＵＣ２シグナル配列、ＨＳＡ構造遺伝子およびＰＨＯ５ターミネーターを連結したものである。
　プラスミドｐＨＯ−０１１は宿主酵母細胞の染色体配列と相同な配列として、トリプトファン合成系遺伝子のＴＲＰ１を含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下にＳＵＣ２シグナル配列、ＨＳＡ構造遺伝子およびＰＨＯ５アーミネーターを連結したもので、酵母選択マーカー遺伝子として、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むものである。
　プラスミドｐＭＭ−００６およびｐＨＯ−０１１は、平成元年（１９８９）４月２８日に通産省工業技術院微生物工業技術研究所へ各々次のとおり国際寄託されている。
▲１▼微生物名：ピーエムエム００６／イー．コーリジェイエム１０９　（ｐＭＭ００６／Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９）
　受託番号：微工研条寄第２４０４号
　　　　　　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２４０４）
▲２▼微生物名：ピーエッチオー０１１／イー．コーリエッチビー１０１　（ｐＨＯ０１１／Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１）
　受託番号：微工研条寄第２４０５号
　　　　　　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２４０５）
〔ｉｉｉ〕プラスミドｐＨＯ−０１１によるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ　２２株の形質転換〕
　宿主として、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株を用いた。
　サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株は、接合型がａ型であり、ヒスチジン合成系遺伝子（ｈｉｓ　４）、およびロイシン合成系遺伝子（ｌｅｕ　２）に変異を持つ。従って、培養液中に、ヒスチジンおよびロイシンを添加しなければ増殖することができない。
　ＨＳＡ分泌発現用プラスミドｐＨＯ−０１１を酵母サッカロマイセス・セレビシエＡＨ　２２株の染色体中に以下の方法により導入した。
　ＹＰＤ液体培地（イーストエキストラクト１０ｇ、バクトペプトン２０ｇを水に溶解し９００ｍｌとした後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した２０％グルコース１００ｍｌと混合した。）５０ｍｌ中３７℃、一夜振盪培養したサッカロマイセスセレビシエＡＨ　２２を遠心し、得られた細胞を水２０ｍｌの懸濁後、再度遠心して細胞を得た。これを１０ｍｌの５０ｍＭジチオスレイトール、１．２Ｍソルビトール２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５に懸濁し、３０℃で１０分間穏やかに振盪した。遠心により細胞を集め、１．２Ｍソルビトール１０ｍｌに懸濁し、再度遠心により細胞を集めた。細胞を１０ｍｌの１．２Ｍソルビトールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞を１０ｍｌの０．２ｍｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ、１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８に懸濁後、３０℃で１時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め、１．２Ｍソルビトール、次いで１０ｍＭ塩化カルシウム、１．２Ｍソルビトール各１０ｍｌで洗浄し、遠心で細胞を集めた。細胞を１ｍｌの１０ｍＭ塩化カルシウム、１．２Ｍソルビトールに懸濁した。懸濁１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶液（ＴＲＰ　１遺伝子上のユニークサイトであるＥｃｏＲ　Ｖで消化し、線状にしたプラスミド（ｐＨＯ−０１１を５μｇを含む。）と混合し、室温に１５分間静置した。更に、１．２ｍｌの２０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５を加え穏やかに混合後、室温で２０分間静置した。遠心で細胞を集め、０．１ｍｌの１．２Ｍソルビトール、３％ノーブルアガー、０．２％リン酸１カリウムを添加したＹＰＤ液体培地に懸濁し、３０℃で３０分間穏やかに振盪した。懸濁液１．５，１０、２０および５０μｌをそれぞれ寒天培地と混合して、４５℃に保温した１０ｍｌの、１．２Ｍソルビトール、３％ノーブルアガー、１００μｇ／ｍｌのＧ−４１８を添加したＹＰＤ液体培地からなるプレートに拡げた。プレートが固化したら、３０℃で３日間静置培養した。形成したコロニーを爪楊枝で採取し、３ｍｌの０．７％イーストナイトロジェンベース、２％グルコースの懸濁後、３０℃で２日間振盪培養した。そのうちの１．５ｍｌを遠心し、細胞を集め、３ｍｌのＹＰＤ液体培地（イーストエキストラクト１０ｇ、バクトペプトン２０ｇを水に溶解し、９００ｍｌとして後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した２０％グルコース１００ｍｌと混合した。）に懸濁し、３０℃で振盪培養した。培養上清のＨＳＡ濃度をＲＰＨＡ法にて測定したところ、３日目で最高６０μｇ／ｍｌのＨＳＡが検出された。かくして得られた形質転換体をＴＭＳ−２６−１０と命名した。
〔ｉｖ〕形質転換体ＴＭＳ−２６−１０のスクリーニング
▲１▼サザンブロッティング法により、ＨＳＡ遺伝子がどこに導入されたかを調べたところ、確かに染色体中のＴＲＰ１領域に導入されていることが確認できた。
▲２▼ＨＳＡ遺伝子の安定性をＨＳＡ産生量とＧ４１８耐性を指標に測定したところ、非選択培地で約６０世代培養した後でも、１００％のＨＳＡ遺伝子が保持されていた。
〔ｖ〕プラスミドｐＭＭ−００６による形質転換体ＴＭＳ−２６−１０の形質転換
　上記〔ｉｉｉ〕に記載の方法と同様の方法によった。但し、次の点で〔ｉｉｉ〕に記載の方法とは異なる。
　宿主：ＴＭＳ−２６−１０
　プラスミド：ｐＭＭ−００６
　プラスミド導入時：ｐＭＭ−００６中のＬＥＵ２遺伝子上のユニークサイトであるＫｐｎ　Ｉで消化し、プラスミドを線状にして導入。
　形質転換培地：ＹＰＤ培地に１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ塩化カルシウムを添加したものに形質転換（プロト）プラストを懸濁。
　プレート：０．７％イーストナイトプロジェンベース、２％グルコース、１．２Ｍソルビトール、３％ノーブルアガーからなるロイシン不含寒天培地。
　ヒト血清アルブミン産生量：８０μｇ／ｍｌ
　かくして得られた形質転換体をＴＭＳ−３３−１株と命名した。
〔ｖｉ〕形質転換体ＴＭＳ−３３−１株のスクリーニング（ＬＥＵ　２遺伝子の安定性・ＨＳＡ産生量）
▲１▼サザンブロッティング法によりＨＳＡ遺伝子がどこに導入されたかを調べたところ、確かに染色体中のＬＥＵ２領域に導入されていることが確認できた。
▲２▼ＨＳＡ遺伝子の安定性をＨＳＡ産生量とロイシン非要求性を指標に測定したところ、非選択培地で約６０世代培養した後でも、１００％のＨＳＡ遺伝子が保持されていた。
　従って、ＴＭＳ−３３−１株は宿主酵母サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株の染色体の３箇所、すなわちＬＥＵ２領域およびＴＲＰＩ領域にＨＳＡ遺伝子が導入されたものであることが確認できた。
　従って、ＴＭＳ−３３−１株は宿主酵母サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株染色体の３箇所、即ちＬＥＵ２領域およびＴＲＰ１領域にＨＳＡ遺伝子が導入されたものであることが確認できた。
　さらにＴＭＳ−３３−１株のヒスチジン要求復帰変異株ＴＭ３−３３−１ｈ４株の次の要領で取得した。即ち、ＴＭＳ−３３−１株を非選択培地にて一晩成育させた後、集菌し、十分洗浄後、選択プレート（即ち、ヒスチジンを含まない培地からなるプレート）に塗布する。選択プレートを３０℃にて培養し、生育したヒスチジン要求復帰変異候補株よりＴＭＳ−３３−１ｈ４株を取得した。
　ＴＭＳ−３３−１ｈ４を培養する際に、培養液中に各種色素吸着剤を添加し、ＨＳＡの着色に及ぼす影響を調べた。
〔実施例１〜６および比較例１〕
〔ｉ〕培地
▲１▼ＹＮＢ培地：バクト−イーストナイトロジェンベース（ＤＩＦＣＯ製）６．７ｇを１００の蒸留水に溶解し除菌濾過したものと、グルコース（半井化学）２０ｇを蒸留水に溶解して、９００ｍｌとした後に、オートクレーブしたものとを混合した。
▲２▼グルコース−酢酸アンモニウム形合成培地：下記表１に記載の組成。
〔ｉｉ〕
（前培養）
　ＴＭＳ−３３−１ｈ４株の適当量を、ＹＮＢ培地を含むバッフル付き三角フラスコに植菌し、３０℃にて２４時間不盪培養した。
（本培養）
　前培養液を遠心集菌後、１０ｍｌの滅菌水に懸濁し、グルコース−酢酸アンモニウム系合成培地１００ｍｌ当たり菌体懸濁液１ｍｌを植菌した。１００ｍｌの培養液をそれぞれバッフル付き３００ｍｌ容三角フラスコに分注し、３０℃、１２５ｒｐｍで７０時間振盪培養を行なった。
　その際、表２に記載の各種色素吸着剤（添加率各１．０ｗ／ｖ％）を添加し、またはコントロールとして無添加の状態で培養を行なった。
（試験例）
〔ｉ〕培養上清の精製および濃縮
　培養終了後、各々の培養液をサンプリングし、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心して得られた上清の一部を、ＨＳＡ濃度測定に供した。
　残部の培養上清（約１００ｍｌ）にブルーセルロファイン（生理食塩水で十分洗浄したもの：生化学工業製）をフィルターケーキとして１ｇ添加し、室温で２時間アルブミンを吸着させた。アルブミンを吸着させたブルーセルロファインを、ミニカラムに移し、生理食塩水で洗浄後３ｍｌの３Ｍチオシアン酸ナトリウムで溶出を行った。この溶出液を濃縮器〔セントリコン３０（３０Ｋ）アミコン製〕で濃縮したものを測定用のサンプルとした。
〔ｉｉ〕ＨＳＡ濃度の測定
　培養上清を用いて逆受身ヒツジ赤血球凝集反応（ＲＰＨＡ）により測定し、標準ＨＳＡ（Ｍｉｌｅｓ製）との比較により、培養上清中のＨＳＡ濃度を表示した。
〔ｉｉｉ〕着色度の比較
　精製濃縮検体の波長２８０ｎｍ、３５０ｎｍおよび４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、３５０ｎｍと２８０ｎｍとの比および４０５ｎｍと２８０ｎｍとの比を求め、これらの値を着色度の指標とした。
　以上の結果を下記の表２に示す。
〔実施例７〕
〔ｉ〕培地
▲１▼バッチ培養用培地：表３に記載の組成。
▲２▼フィード培養用培地：表４に記載の組成。
〔ｉｉ〕培養
（前培養）
　グリセロール凍結ストック菌株１ｍｌ（ＯＤ５４０＝１０）をＹＮＢ培地を含むバッフル付き三角フラスコに植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養した。遠心集菌後、滅菌水に懸濁して４ｌのバッチ（回分）培養用培地に植菌した。
（本培養）
　１０ｌ容ミニジャーファーメンターを用いて通気攪拌培養した。通気を１ｖｖｍに設定し、攪拌速度は溶存酸素濃度が１０ｐｐｍ以上となるように制御した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加することによりｐＨ５．８に定値制御した。消泡は消泡剤（アデカノール，旭電化工業製）を必要に応じて少量添加することで実施した。
　また、比増殖速度が０．１２となるように制御用プログラムにより流加（フィード）培地４ｌを添加した。
（培養制御用プログラム）
　プログラムを用いて培養中の流加用培地の流加速度を制御した。本プログラムは通常、比増殖速度が０．１２（１／ｈｒ）となるようにフィード培地の流加量を決定するが、培養制御中に溶存酸素濃度が２以下になった時点で、比増殖速度の設定を０にして定速度流加培養を行うようにしたものである。
（色素吸着剤）
　粉末の活性炭（和光純薬製）の最終的な濃度が０．１ｗ／ｖ％（８ｇ／８ｌ）となるように、８ｇをバッチ培養用培地に加えた。
　また、コントロールとして活性炭を添加せずに培養を行なった。
（試験例）
〔ｉ〕菌体濃度の測定
　任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で適当に希釈したのち分光光度計（島津製、ＵＶ２４０型）を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、予め求めておいた検量線より乾燥菌体重量を求めた。
　前述と同様にしてＨＳＡ濃度の測定および着色度の比較を行なった。但し、サンプル中のＨＳＡ濃度をｍｇ／ｌで表示した。
　以上の結果を下記の表５に示す。
　０．１ｗ／ｖ％の活性炭添加条件下でも培養は順調に推移し、培養７０時間目で菌体量は１２０ｇ−ＤＣＷ／ｌ、ＨＳＡ産生量８００ｍｇ／ｌに達した。
　すなわち、活性炭を０．１ｗ／ｖ％（１ｇ／ｌ）を添加しても通常の培養と同様に培養を行うことが可能であり、しかも得られたＨＳＡの着色度は、通常のものの１〜２％程度に抑えられた。
【図面の簡単な説明】
第１図（ａ）および（ｂ）は、それぞれプラスミドｐＭＭ−００６およびｐＨＯ−０１１を示す。