【手続補正書】
【提出日】平成27年8月4日(2015.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主であって、
前記宿主が、さらに以下：
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と約９０％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と約９０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｃ）組換え遺伝子などの、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ＵＧＴ９１Ｄ２機能性ホモログをコードする組換え遺伝子；
（ｅ）ステビオール合成酵素ポリペプチド（ＫＡＨ）をコードする組換え遺伝子；
（ｆ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｇ）ショ糖トランスポーター（ＳＵＣ１）およびショ糖合成酵素（ＳＵＳ１）をコードする１または２以上の組換え遺伝子；
（ｈ）シトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｉ）核酸の配列であって、該核酸が、スクアレン合成酵素（ＳＱＳ）をコードするオープンリーディングフレームに動作可能に連結された異種挿入配列を含み、ここで該異種挿入配列が、式（Ｉ）：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−      （Ｉ）
式中、Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４つの連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、式中、Ｘ３は、ゼロヌクレオチドまたはヘアピンループを形成する１もしくは２以上のヌクレオチドを含み、式中、Ｘ１およびＸ５は、各々独立して、ゼロヌクレオチドまたは１もしくは２以上のヌクレオチドからなる、
を有する、前記核酸配列；
（ｊ）カウレン酸化酵素（ＫＯ）ポリペプチドをコードする１または２以上の組換え遺伝子；
（ｋ）カウレン合成酵素（ＫＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；または
（ｌ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子、
の１または２以上を含み、ここで前記宿主が、１または２以上のステビオール配糖体を生産することが可能である、前記組換え宿主。
【請求項２】
ＵＧＴ９１Ｄ２機能性ホモログが、配列番号５の残基２１１および２８６に置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチド、または、配列番号５の残基２１１にメチオニンおよび残基２８６にアラニンを有するＵＧＴ９１ｄ２ｅ−ｂポリペプチドを含む、請求項１に記載の組換え宿主。
【請求項３】
ＫＡＨポリペプチドが、配列番号１６４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の組換え宿主。
【請求項４】
ＣＤＰＳポリペプチドが、葉緑体輸送ペプチドを欠く、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項５】
ショ糖トランスポーターをコードする１または２以上の組換え遺伝子の発現およびショ糖合成酵素の発現が、宿主におけるウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）レベルの上昇をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項６】
ＣＰＲポリペプチドが、配列番号１７０に記載のS. rebaudianaのＣＰＲアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項７】
（ａ）ＧＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する；
（ｂ）ＫＯポリペプチドは、配列番号１３８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する；
（ｃ）ＣＰＲポリペプチドは、配列番号１６８および配列番号１７０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する；または、
（ｄ）ＫＳポリペプチドは、配列番号１５６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項８】
さらに、以下：
アセトアセチルＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子；切断型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子；メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子；ホスホメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子；および、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子
の１または２以上を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の前記宿主。
【請求項９】
宿主がさらに、以下：
（ｉ）二機能性のＣＤＰＳポリペプチドとＫＳポリペプチドとをコードする遺伝子、または、ＣＤＰＳポリペプチドをコードする遺伝子およびＫＳポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｉｉ）ラムノース合成酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉｉ）ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子；または
（ｉｖ）ＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、
の１または２以上を含み、
ここで、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の遺伝子の少なくとも１つが組換え遺伝子である、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１０】
（ａ）ＣＤＰＳポリペプチドが、配列番号１２９〜１３１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する；
（ｂ）ＫＳポリペプチドが、配列番号１３２〜１３５または配列番号１５６に記載のアミノ酸配列の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する；
（ｃ）ＫＯポリペプチドが、配列番号１３８〜１４１に記載のアミノ酸配列の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する；および
（ｄ）ＫＡＨポリペプチドが、配列番号１４２〜１４６および１６４に記載のアミノ酸配列の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１１】
Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母菌、Escherichia coliを含む微生物、または、Stevia rebaudiana、Physcomitrella patensまたはタバコ植物などの植物または植物細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１２】
ステビオール配糖体を生産する方法であって、
ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え宿主を培養培地中にて、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子が発現される条件下で、増殖させること；および
ｂ）前記組換え宿主により生産されたステビオール配糖体を前記培養培地から回収すること；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
ステビオール配糖体が、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦまたはズルコシドＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステビオール配糖体がレバウジオシドＤであり、レバウジオシドＤが、糖供与体からのグルコース部分の、レバウジオシドＡへの転移の際に生産される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記条件下で培養された場合、培養培地の少なくとも１ｍｇ／リットルまで蓄積する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え宿主において生産されたステビオール配糖体。
【請求項１６】
ステビア抽出物と比較して、ステビア植物由来の不純物のレベルが低下している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の宿主により生産されたステビオール配糖体組成物。
【請求項１７】
野生型ステビア植物のステビオール配糖体組成物と比較して、レバウジオシドＤが富化された、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の宿主により生産されたステビオール配糖体組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014524247000001.app
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2014524247.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２−１】
2014524247.tif 000002
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２−２】
2014524247.tif 000003
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３−１】
2014524247.tif 000004
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３−２】
2014524247.tif 000005
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３−３】
2014524247.tif 000006
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３−４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３−４】
2014524247.tif 000007
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３−５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３−５】
2014524247.tif 000008
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３−６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３−６】
2014524247.tif 000009
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３−７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３−７】
2014524247.tif 000010
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４−１】
2014524247.tif 000011
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４−２】
2014524247.tif 000012
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５−１】
2014524247.tif 000013
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５−２】
2014524247.tif 000014
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７−１】
2014524247.tif 000015
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７−２】
2014524247.tif 000016
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７−３】
2014524247.tif 000017
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2014524247.tif 000018
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２１】
2014524247.tif 000019
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３】
2014524247.tif 000020
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５−１】
2014524247.tif 000021
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５−２】
2014524247.tif 000022
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５−３】
2014524247.tif 000023
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５−４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５−４】
2014524247.tif 000024
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５−５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５−５】
2014524247.tif 000025