(57)【要約】【課題】ゲノムサイズが巨大な全ＤＮＡをテンプレートとし、コピー数が少ない遺伝子をＰＣＲで検出しようとすると、用いるプライマーと類似する配列が多く存在するため、単純にＰＣＲをしたのでは、ノイズとなる配列が多く増幅されてしまう。【解決手段】核酸試料に対して第１プライマーでプラトーになる前までＰＣＲを行う第１増幅工程と、  前記第１増幅工程の指数関数的増幅期の産生物に対して第２プライマーでリアルタイムＰＣＲを行う第２増幅工程と、  前記第２増幅工程において増幅産物が所定の閾値を超えたコピー数（Ｃｔ値：指数関数的増幅期に達した値）を得る工程と、  前記コピー数（Ｃｔ値）と予め求めておいた目的遺伝子に関して前記コピー数とサンプル量に関する検量線より目的遺伝子量を求める工程を有することを特徴とする遺伝子量の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料に対して第１プライマーでプラトーになる前までＰＣＲを行う第１増幅工程と、
前記第１増幅工程の指数関数的増幅期の産生物に対して第２プライマーでリアルタイムＰＣＲを行う第２増幅工程と、
前記第２増幅工程において増幅産物が所定の閾値を超えたコピー数（Ｃｔ値：指数関数的増幅期に達した値）を得る工程と、
前記コピー数（Ｃｔ値）と予め求めておいた目的遺伝子に関して前記コピー数とサンプル量に関する検量線より目的遺伝子量を求める工程を有することを特徴とする遺伝子量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムＤＮＡの任意の部位の遺伝子量を測定する方法に関するものであり、特に汎用されているネステッド（Ｎｅｓｔｅｄ）−ＰＣＲ法とリアルタイムＰＣＲ法を一定の条件で組み合わせて行うことで極微量な試料（ゲノムＤＮＡ０．６２５ｎｇ）からでも正確かつ簡便に遺伝子量を測定し、解析費用も安価な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムＤＮＡに存在する任意の遺伝子の量的解析は遺伝性疾患の診断や癌組織の体細胞遺伝子異常としてのアレル欠失診断に重要である。例えば、遺伝子量が原因となる疾患としては、すくなくとも表１に示したものがよく知られている。
【０００３】
【表１】
2018088919.tif 000002
【０００４】
３×１０９存在するゲノムＤＮＡにおいて局在する個々の遺伝子の量的解析は精度の担保が困難である。既存解析法として、アレイＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法やＭＬＰＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などハイブリダイゼーション法を応用した解析法が考案され利用されてきたが、いずれも特殊で高額な解析措置を要し、解析費用も高額であるため利用が限られてきた。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法は経時的にかつ正確にＤＮＡの増幅過程を追跡可能で、その結果、当初試料に用いたＤＮＡ量の正確な評価が可能である。しかし、ゲノムＤＮＡは３×１０９と巨大なため、用いるプライマーが非特異的に働き、正確な量的解析を阻害してきた。Ｔｈｅｒｍｏ社（旧  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は特殊な蛍光色素を用いるＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ法により特性を確保してきた。そのため試薬の高額化が余儀なくされ利用頻度に限度があった。
【０００６】
特許文献１には、ネステッドＰＣＲを用いる遺伝子解析方法が開示されている。ネステッドＰＣＲは、塩基配列の一部を増幅するに際して、目標となる部分のフォワードプライマーとリバースプライマー（インナープライマー）だけでなく、その外側にもフォワードプライマーとリバースプライマー（アウタープライマー）を設け、アウタープライマーで増幅した産生物に対してさらにインナープライマーで増幅を行う方法である。
【０００７】
ネステッドＰＣＲでは、１つの試験管内で、アウタープライマーによる増幅と、インナープライマーによる増幅を行う。したがって、インナープライマーで増幅する際にアウタープライマーによる増幅が不要な配列の増幅（汚染）となる。ゲノムＤＮＡのように巨大な配列の場合は、プライマーが非特異的に働くこともあり、不要な部分の増幅の機会は多くなる。
【０００８】
特許文献１では、アウタープライマーが不要となるインナープライマーを使った増幅時に、アウタープライマーの機能を選択的に不活性化する機構を用意することで、特異性及び効率を向上させた遺伝子の関心領域を増幅する。
【０００９】
より具体的には、フォワード及びリバースのインナープライマーペアのＴｍ（融解温度）をアウタープライマーペアのＴｍより高く設定する。
【００１０】
このようにすることで、インナープライマーのアニール温度ではアウタープライマーは働かず、インナープライマーを使ってＰＣＲを行うとアウタープライマーが例え混入していてもその働きを実質的に阻害する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２０１２−５２８５７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献１の方法は、アレイＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法やＭＬＰＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などよりは、低価格で行うことができる。
【００１３】
ところで、特許文献１の方法は、関心領域をプラトーまで増幅することを目的としている。確かに、培養困難な病原微生物の同定検査、抗生物質加療中や感染初期の病原微生物の検出、移行抗体が疑われた際の抗原検出、病原微生物の感染源調査、親子鑑定などの個人識別には、極微量な遺伝子の増幅が必要である。
【００１４】
しかし、ある種の疾病の判断や、治療方法の選択のためには、特定遺伝子の保有量（アレルコピー数）自体が必要となる場合が多い。つまり、増幅された遺伝子が必要なのではなく、その遺伝子の量の判断が必要となる。特許文献１の方法では、目的遺伝子の増幅は可能であるが、その量的な判断は別途行う必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、目標となる遺伝子量をより簡便で低価格に測定する方法を提供する。
【００１６】
より具体的に本発明に係る遺伝子量の測定方法は、
核酸試料に対して第１プライマーでプラトーになる前までＰＣＲを行う第１増幅工程と、
前記第１増幅工程の指数関数的増幅期の産生物に対して第２プライマーでリアルタイムＰＣＲを行う第２増幅工程と、
前記第２増幅工程において増幅産物が所定の閾値を超えたコピー数（Ｃｔ値：指数関数的増幅期に達した値）を得る工程と、
前記コピー数（Ｃｔ値）と予め求めておいた目的遺伝子に関して前記コピー数とサンプル量に関する検量線より目的遺伝子量を求める工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る遺伝子量の測定方法は、通常汎用される蛍光色素を用いるリアルタイムＰＣＲを使用することで遺伝子量を測定することができるため、測定費用は非常に安価にできる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｘ染色体を用いて第１回目のＰＣＲの増幅回数を検討した結果を示すグラフである。
【図２】Ｘ染色体を用いて第１回目のＰＣＲに用いるアウタープライマーの濃度を検討した結果を示すグラフである。
【図３】リアルタイムＰＣＲの伸長毎の蛍光強度の結果を示すグラフである。
【図４】Ｘ染色体に関して作成した検量線である。
【図５】Ｘ染色体に関する男性サンプル（１アレル）と女性サンプル（２アレル）のサンプル量を変化させたときの測定結果を示すグラフである。
【図６】ポイツ・ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）患者の１９番染色体と健康人の１９番染色体を本発明に係る測定方法で測定した結果を示すグラフである。
【図７】図６とは別のポイツ・ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）患者の１９番染色体と健康人の１９番染色体（エクソン１同士）を本発明に係る測定方法で測定した結果を示すグラフである。
【図８】図７と同一のポイツ・ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）患者の１９番染色体と健康人の１９番染色体（エクソン２同士）を本発明に係る測定方法で測定した結果を示すグラフである。
【図９】図７と同一のポイツ・ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）患者の１９番染色体と健康人の１９番染色体（エクソン４同士）を本発明に係る測定方法で測定した結果を示すグラフである。
【図１０】図７と同一のポイツ・ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）患者の１９番染色体と健康人の１９番染色体（エクソン８同士）を本発明に係る測定方法で測定した結果を示すグラフである。
【図１１】図７と同一のポイツ・ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）患者の５ｑ２２．２染色体と健康人の５ｑ２２．２染色体を本発明に係る測定方法で測定した結果を示すグラフである。
【図１２】図７〜図１１をまとめたグラフである。
【図１３】カウデン病を発症している患者の第１０番遺伝子上にあるＰＴＥＮ遺伝子と健常人の第１０番遺伝子上にあるＰＴＥＮ遺伝子を本発明に係る測定方法で測定した結果を示すグラフである。
【図１４】カウデン病を発症している図１３とは別人の患者の第１０番遺伝子上にあるＰＴＥＮ遺伝子と健常人の第１０番遺伝子上にあるＰＴＥＮ遺伝子を本発明に係る測定方法で測定した結果を示すグラフである。
【図１５】本発明に係る測定方法と他の測定方法を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明に係る遺伝子量の測定方法について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。
【００２０】
本発明に係る遺伝子量の測定方法では、ネステッドＰＣＲとリアルタイムＰＣＲを組み合わせる。具体的には、インナープライマーでのＰＣＲの際にリアルタイムＰＣＲを行う。
【００２１】
測定の対象は遺伝子である。本明細書ではヒトの遺伝子を用いた場合について説明を行うが、遺伝子が明確になっていれば、対象生物は限定されない。対象生物の核酸は公知の方法で用意されてよい。
【００２２】
アウタープライマーとインナープライマーの配列は、目標とする遺伝子によって適切に設計される。本発明の測定方法では、特許文献１のように、アウタープライマーとインナープライマーの融解温度Ｔｍを違える必要は特にない。もちろん、異なっていてもよい。
【００２３】
本発明の遺伝子量の測定方法では、結局アウタープライマーとインナープライマーで４種のプライマーを用いる。それぞれのプライマーは２０〜３０塩基のものを用いるのが望ましい。プライマーの塩基数が多ければ、場合の数が多くなり特異性を高めることができるからである。たとえば、平均２０ヌクレオチド程度の４種類のプライマーを用いれば、理論上（１／（４）２０×４の特異性があり、非特異的なＰＣＲ増幅による定量の不安定化を防ぐことができる。
【００２４】
本発明の遺伝子量の測定方法では、アウタープライマーは１回目のＰＣＲでほぼ使い切ってしまうようにする。２回目のＰＣＲの際に不要な増幅産生物が増えないようにするためである。したがって、アウタープライマーの濃度は最初の投入時から制御される。具体的には０．０１〜０．１ｐＭ程度の濃度が望ましい。
【００２５】
またアウタープライマーを用いる１回目のＰＣＲの回数は１０〜１８回程度が望ましい。本発明に係る遺伝子量の測定方法では、１回目のＰＣＲでプラトーになるまでの増幅は行わない。本発明に係る遺伝子量の測定方法では、原サンプル中の遺伝子量を測定するのが目的であるので、原サンプル中の遺伝子量を反映する状態以上に増幅させてしまったのでは、遺伝子量の測定ができなくなるからである。言い換えると、本発明の遺伝子量の測定方法では、第１回目のＰＣＲは指数関数的増幅期で止める。
【００２６】
２回目のＰＣＲはリアルタイムＰＣＲを行う。したがって、インナープライマーと共に、ハイブリダイゼーションによって発光する染色用試薬を同時に入れる。リアルタイムＰＣＲの際に典型的に使われる。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉは、染色用試薬として好適に用いられる。リアルタイムＰＣＲを行うために伸長反応毎に染色用試薬による蛍光強度を測定する分光蛍光光度計も用いられる。言い換えると、２回目のＰＣＲは、第１回目のＰＣＲの指数関数的増幅期の産生物に対してリアルタイムＰＣＲを行うと言ってよい。
【００２７】
本発明に係る遺伝子量の測定方法では、予め遺伝子量と蛍光強度の閾値（Ｃｔ値）の関係を示す検量線を作成しておく。これは目的遺伝子に対する検量線である。検量線は、遺伝子毎に作成される。なお、リアルタイムＰＣＲにおいて、指数関数的増幅期に到達したと判断する蛍光強度の閾値も遺伝子毎に決めてよい。より具体的には、０．０６６〜０．２０の値で、遺伝子毎に適時決めることができる。
【００２８】
次に具体的な方法について説明する。常法に従い処理された核酸に、所定濃度のアウタープライマーとｄＮＴＰ、酵素（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）等を投入し、所定回数のＰＣＲを行う。ＰＣＲの回数は上記の説明のように、アウタープライマーによるＰＣＲがプラトーに達する前の指数関数的増幅期の回数である。また、２回目のＰＣＲでアウタープライマーの影響を除くため、この回数で使用され尽くす程度の濃度のアウタープライマーを投入する。
【００２９】
アウタープライマーを用いたＰＣＲで指数関数的増幅期の産生物に、インナープライマーおよび染色用試薬を投入する。そして、２回目のＰＣＲを行う。２回目のＰＣＲはリアルタイムＰＣＲを行う。この際は、伸長反応毎にＰＣＲ産生物の蛍光強度を測定する。蛍光強度は測定される毎に所定の閾値と比較される。この閾値を「蛍光強度閾値」と呼ぶ。
【００３０】
蛍光強度閾値はＰＣＲにおいて、指数関数的増幅期に到達したか否かを判断する値である。蛍光強度が蛍光強度閾値を超えたらその時のコピー回数を以てＣｔ値とする。最後に検量線からＣｔ値に対する原試料中の遺伝子量を求める。したがって、遺伝子量は重量若しくは濃度で求められる。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
本発明に係る遺伝子量の測定方法の妥当性を確認するためにヒトの性染色体を用いて以下の実験を行った。ヒト細胞核内にＸ染色体は、男性では１つであり、女性では２つ存在する。したがって、１アレルの例として男性の核酸（以下「男性サンプル」と呼ぶ。）を用い、２アレルの例として女性の核酸（以下「女性サンプル」と呼ぶ。）を用いた。
【００３２】
それぞれのサンプルは血液から作成した。具体的には、男性の血液と女性の血液から、ＱＩＡＧＥＮ社製のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて抽出し、濃度・純度を測定した後、ＰＣＲ用のサンプル（男性用サンプルおよび女性用サンプル）とした。
【００３３】
また、Ｘ染色体に対するプライマーは、ＩＫＢＫＧ遺伝子のイントロン４領域の配列で、Ｗｅｂサイト上の設計ソフト（Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓ、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ）を用いて作成した。具体的なプライマーの配列を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2018088919.tif 000003
【００３５】
２回のＰＣＲは、以下のレシピに則って行った。
＜第１回目ＰＣＲ＞
最初のＰＣＲは関心領域以外のゲノムを排除し、２回目に行うリアルタイムＰＣＲの特異的増幅を確保するために行う。
【００３６】
１回目のＰＣＲは、主剤（ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含む）としてＨｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を７．５μＬ（ＤＮＡ量  ０．６２５ｎｇ〜１０ｎｇ）と、表１の第１回目ＰＣＲでのフォワードプライマーを０．６μＬ（終濃度：０．０２ｐＭ〜０．１ｐＭ）と、リバースプライマーを０．６μＬ（終濃度：０．０２ｐＭ〜０．１ｐＭ）と、ＲＮａｓｅフリー水５．７μＬを混合し、反応液の合計は１５μＬで行った。
【００３７】
ＰＣＲ装置は、ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００３８】
ＰＣＲの条件は以下の通りであった。
開始時  ｄｅｎａｔｕｒｅ：１５分、ｄｅｎａｔｕｒｅ：３０秒、アニール：３０秒、伸長反応：１分、最終伸長：１０分
ＰＣＲサイクル数は別途検討を行った。
【００３９】
＜第２回目ＰＣＲ＞
２回目のＰＣＲは、以下のレシピで行った。プレＰＣＲ産物（第１回目のＰＣＲの増幅産生物）を２．０μＬ、染色用試薬として、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを１０μＬ、表１の第２回目ＰＣＲのフォワード・プライマーＦ（３．０ｐｍｏｌ／μＬ）を１．５μＬ（最終濃度：０．２２５μＭ）、リバース・プライマーＲ（３．０ｐｍｏｌ／μＬ）を１．５μＬ（最終濃度：０．２２５μＭ）、ＲＮａｓｅフリー水を５．０μＬを混合し、合計２０μＬで行った。
【００４０】
ＰＣＲ装置としてＣｈｒｏｍｏ  ４  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｃｙｃｌｅｒ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用した。条件は開始時ｄｅｎａｔｕｒｅは１０分、その後ｄｅｎａｔｕｒｅ１５秒、アニール３０秒、伸長反応３０秒で行った。各伸長反応毎に吸光度が測定される。
【００４１】
＜サイクル数の検討＞
すでに説明したように、本発明に係る遺伝子量の測定方法においては、アウタープライマーを用いた第１回目のＰＣＲでは、増幅産生物がプラトーに達する前で指数関数的増幅期に停止する。その回数の妥当性について調べた。
【００４２】
女性サンプルと男性サンプルの量を６（ｎｇ）とし、アウタープライマーの濃度を変化させながら、本発明の測定方法を行った。なお、Ｃｔ値を決める蛍光強度閾値は、０．０６６とした。
【００４３】
結果を図１に示す。横軸は第１回目のＰＣＲのサイクル回数（回）であり、縦軸は女性サンプル（２アレル）の平均値を基準としたときの男性サンプル（１アレル）の比率を示すものである。いずれのグラフも左側に２アレル、右側に１アレルを示し、２アレルと１アレルは少し重ねて表示している。１０サイクルから１８サイクルまでは好適に利用することができる。１０サイクルより少ない若しくは１８サイクルより多くなると、誤差が多くなってくる。通常、ＰＣＲ反応は３０サイクル程度でプラトーに達すると考えられている。
【００４４】
＜アウタープライマー濃度の検討＞
第１回目のＰＣＲの増幅回数を１４回とし、アウタープライマーの量を変化させた時の本発明に係る遺伝子量の測定方法の結果を図２に示す。図２を参照して、横軸はアウタープライマーの濃度（ｐＭ）であり、縦軸は女性サンプル（２アレル）の平均値を基準とした男性サンプル（１アレル）の比率を表すものである。いずれのグラフも左側に２アレル、右側に１アレルを示し、２アレルと１アレルは少し重ねて表示している。
【００４５】
図２を参照すると、アウタープライマーの量を０．０２ｐＭから０．１ｐＭまで変化させても、１アレルと２アレルの比率はほぼ２であるといえる。したがって、アウタープライマーの量は０．０２ｐＭ〜０．１ｐＭまで好適に利用することができる事がわかった。
【００４６】
＜検量線の作成＞
これらの結果より、男性サンプルの濃度を変化させＣｔ値と第２回目のＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）の増幅回数毎の蛍光強度値について検量線を作成した。なお、蛍光強度閾値は０．０７とした。リアルタイムＰＣＲの伸長毎の蛍光強度の結果を図３に示す。また図３に基づいて作成した検量線を図４に示す。図３を参照して、横軸はＰＣＲのサイクル回数（回）であり、縦軸は蛍光強度（無単位）である。蛍光強度閾値（０．０７）は点線で示した。この蛍光強度閾値に到達したサイクル数が、そのサンプル濃度におけるＣｔ値となる。例えば、図３中の曲線Ａの場合は、蛍光強度閾値との交点である。２８回がＣｔ値となる。
【００４７】
なお、蛍光強度閾値を決める指数関数的増幅期とは、１回目のＰＣＲ増幅からプラトーになるまでの間をいう。本発明に係る測定方法では、ＰＣＲの増幅を開始する前の状態からプラトーに達するまでの間の早い時期に決めるのがよい。
【００４８】
また、図４を参照して、横軸はＣｔ値（回）であり、縦軸は、Ｌｏｇサンプル量である。なお、Ｌｏｇサンプル量は対数値の値である。このＬｏｇサンプル量は男性サンプルの量（重さ）としてもよい。Ｃｔ値に対してサンプル量は右下がりの直線で近似できるのが分かる。この時のＣｔ値（ｘ）とＬｏｇサンプル量（ｙ）との関係は、ｙ＝−０．２６９２ｘ＋６．４３で近似することができた。図４の検量線を予め求めておくことで、Ｃｔ値からサンプル量を測定することができる。
【００４９】
＜検量線の妥当性の検証＞
男性サンプルと女性サンプルの量を変えながら、上記の検量線を用いた本発明に係る遺伝子量の測定を行った。結果を図５に示す。横軸はｇＤＮＡサンプル濃度（ｎｇ）であり、縦軸は増幅された目的配列濃度（ｆｇ／μｌ）である。なお、縦軸は２回目のＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）における蛍光強度から換算したものである（ｙ＝−０．２６９２ｘ＋６．４３；ｒ２＝１）。なお、Ｃｔ値は決定係数（ｒ２）が１に最も近くなるように設定する。また「ｇＤＮＡ」はゲノムＤＮＡの略である。
【００５０】
サンプル量に関わらず、女性サンプルと男性サンプルの比率はほぼ２であった。これより、本発明に係る遺伝子量の測定方法の妥当性が証明された。
【００５１】
（実施例２）
次に、常染色体の１９番染色体上（１９ｐ１３．３）にあるＳＴＫ１１遺伝子について本発明の遺伝子量の測定方法を適用した例について説明する。
【００５２】
ＳＴＫ１１遺伝子は、ポイツ・ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の原因遺伝子である。がん抑制遺伝子としても知られている。また、多くの癌患者でこれらの遺伝子が欠損していることが分かっている。
【００５３】
まず、健康なヒトの核酸を用いてＳＴＫ１１遺伝子の検量線を作成した。ネステッドＰＣＲで用いる４つのプライマーはエクソン２の配列に基づき作成した。実際のプライマーを表３に示す。蛍光強度閾値は０．２であり、アウタープライマーの濃度は０．０８ｐＭ、第１回目のＰＣＲの増幅回数は１６回とした。
【００５４】
【表３】
2018088919.tif 000004
【００５５】
図６に本発明に係る遺伝子量の測定を行った結果を示す。横軸はサンプル量（ｎｇ）であり、縦軸は増幅された目的配列濃度（ｆｇ／μｌ）である。コントロールは健康なヒトの核酸をサンプルとした場合で、比較対象は、ＰＪＳ患者の核酸サンプルである。サンプル量の変化に関わらず、比較対象サンプルはコントロールサンプルに対してほぼ１／２に減少していることが示された。
【００５６】
（実施例３）
実施例２で調べたＳＴＫ１１のエクソン２を含め、他のエクソンについても本発明に係る遺伝子量の測定を行った。測定したのは、ポイツ・ジェガーズ症候群発症者のＳＴＫ１１のエクソン１、２、４、８である。なお、実施例２とは別の患者である。また同一患者の５番染色体上（５ｑ２２．２）にあるＡＰＣ遺伝子についても測定を行った。コントロールは健常人の同一遺伝子である。ＡＰＣ遺伝子は、家族性腺腫性ポリポーシスの原因遺伝子として知られている。
【００５７】
それぞれに用いたプライマーを表４から表７に示す。また、各プライマーにおいて第１回目と第２回目のアニール温度も示す。なお、エクソン２用のプライマーは表３に示したものと同じ配列番号５から配列番号８を用い、第１回目ＰＣＲのアニール温度は５５℃、第２回目のアニール温度は６０℃であった。
【００５８】
【表４】
2018088919.tif 000005
【００５９】
【表５】
2018088919.tif 000006
【００６０】
【表６】
2018088919.tif 000007
【００６１】
【表７】
2018088919.tif 000008
【００６２】
ＳＫＴ１１の場合の測定条件は以下のように決めた。Ｃｔ値を決める蛍光強度閾値は、対数増殖が確認される領域で通常０．２を採用した。また、アウタープライマーの濃度は０．０８ｐＭ、第１回目のＰＣＲの増幅回数は１６回とした。また、なお、検量線は各エクソン毎に作製した。
【００６３】
また、５ｑ２２．２については、別途検量線を作製した。測定条件は以下のようにした。Ｃｔ値を決める蛍光強度閾値は０．２とした。また、アウタープライマーの濃度は０．０８ｐＭ、第１回目のＰＣＲの増幅回数は１６回とした。
【００６４】
図７にエクソン１、図８にエクソン２、図９にエクソン４、図１０にエクソン８、図１１に５ｑ２２．２の場合の測定結果をそれぞれ示す。それぞれのグラフは横軸がｇＤＮＡ使用量（ｎｇ）であり、縦軸は目的配列濃度（ｆｇ／μｌ）である。なお、図中には、ｇＤＮＡ使用量の際のコントロールの値（「ｃｏｎｔｒｏｌ平均±ＳＤ」と記載）、患者の値「ＫＫ１００」と記載）そしてコントロールの値に対する患者の値の比（「ＫＫ１００／ｃｏｎｔｒｏｌ」と記載）を記載した。ここでＳＤは標準偏差である。
【００６５】
図７から図１０までいずれのエクソンを測定しても、コントロールに対してポイツ・ジェガーズ症候群発症者は遺伝子の減少が認められた。一方、図１１を参照して、５ｑ２２．２に関しては、健常人と比較して遺伝子の増減はなかった。
【００６６】
図１２は、図７から図１１をコントロールに対する比率で示したものである。横軸は測定した遺伝子の部分であり、縦軸はそれぞれコントロールに対する比率である。横軸の「ＳＴＫ１１ｅｘ１」、「ＳＴＫ１１ｅｘ２」、「ＳＴＫ１１ｅｘ４」、「ＳＴＫ１１ｅｘ８」はそれぞれＳＴＫ１１のエクソン１、エクソン２、エクソン４、エクソン８を示す。
【００６７】
この図１２はポイツ・ジェガーズ症候群を発症している同一人に対する測定結果である。これを見ると、原因遺伝子であるＳＴＫ１１はどのエクソンでも正常値より低く観測され、ポイツ・ジェガーズ症候群と関係のない５ｑ２２．２は健常人と同じであることが分かる。
【００６８】
(実施例４)
第１０番遺伝子上にあるＰＴＥＮ遺伝子について本発明に係る遺伝子量の測定を行った。ＰＴＥＮ遺伝子はカウデン病の原因遺伝子とされている。使用したプライマーはＰＴＥＮ遺伝子のエクソン４に基づいて作製した。表８に示す。また、第１回目ＰＣＲのアニール温度および第２回目ＰＣＴのアニール温度も示す。
【００６９】
【表８】
2018088919.tif 000009
【００７０】
測定条件は以下のようにした。Ｃｔ値を決める蛍光強度閾値は対数増殖が確認される０．２とした。また、アウタープライマーの濃度は０．０８ｐＭ、第１回目のＰＣＲの増幅回数は１６回とした。
【００７１】
図１３および図１４に測定結果を示す。ここでは２名の患者（それぞれ別人）の結果である。図１３および図１４において横軸はｇＤＮＡ使用量（ｎｇ）であり、縦軸は目的配列濃度（ｆｇ／μｌ）である。いずれのグラフも健常人（コントロール）に対して、遺伝子の減少が認められた。この患者は別の解析法（アレイＣＧＨ法）でもＰＴＥＮ遺伝子の量的異常が確認されており、本発明に係る遺伝子量の測定方法の妥当性を示している。
【００７２】
なお、図中には、ｇＤＮＡ使用量の際のコントロールの値（「ｃｏｎｔｒｏｌ平均±ＳＤ」と記載）、患者の値（「ＫＫ０２４（図１３）」若しくは「ＫＫ０５８（図１４）」と記載）、そしてコントロールの値に対する患者の値の比（「ＫＫ０２４／ｃｏｎｔｒｏｌ（図１３）」若しくは「ＫＫ０５８／ｃｏｎｔｒｏｌ（図１４）」と記載）を記載した。ここでＳＤは標準偏差である。
【００７３】
このように本発明に係る遺伝子量の測定方法は、コントロールに対する比率という形で染色体上にある任意の遺伝子量を測定することができる。また、従来からあるネステッドＰＣＲとリアルタイムＰＣＲを組み合わせることで実現することができ、特別に高価な装置を必要としないため、安価に測定することができる。
【００７４】
図１５には、ゲノムサイズを測定することができる方法を比較した図を示す。縦軸はゲノムサイズ（ｂｐ：塩基数）であり、横軸にそれぞれの測定方法が測定することが可能なサイズを示す。
【００７５】
大まかに塩基数が１ｋｂｐ程度までは、エクソン程度であり、数百Ｋｂｐ程度が遺伝子として扱われる大きさである。それ以上は染色体として扱われる大きさとなる。本発明に係る測定方法は、エクソンレベルから染色体レベルまで広範囲にゲノムサイズを測定することができる。また、同程度の範囲を測定することができるＭＬＰＡやＣＧＨアレイと比較すると、少なくとも１／１０程度のコストで測定することができる。したがって、ゲノムサイズを測定するには好適な方法である。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は遺伝子量の測定に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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