(57)【要約】      （修正有）【課題】感覚過敏抑制手段の提供。【解決手段】下記化合物を含有するＴＲＰＡ１，ＴＲＰＶ４又はＡＮＯ１の活性抑制剤。2018127440.tif 000007（Ｒ１〜Ｒ１０は各々独立して，Ｈ，ＯＨ又はＣ１〜４のアルキル基）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１それぞれの活性を抑制するための活性抑制剤であって、有効成分として式（Ｉ）：
【化１】
2018127440.tif 000006
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基を示す）
で表わされる化合物を含有してなる活性抑制剤。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10が水素原子である請求項１に記載の活性抑制剤。
【請求項３】
皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する感覚過敏を抑制するための皮膚感覚過敏抑制剤であって、有効成分として請求項１または２に記載の活性抑制剤を含有してなる皮膚感覚過敏抑制剤。
【請求項４】
前記感覚過敏が、皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒みである請求項３に記載の皮膚感覚過敏抑制剤。
【請求項５】
前記感覚過敏が、皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みをさらに含む請求項３または４に記載の皮膚感覚過敏抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性抑制剤および皮膚感覚過敏抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚における感覚過敏としては、例えば、皮膚における痒み、痛みなどが挙げられる。前記感覚過敏のうち、皮膚における痒みは、例えば、物理的刺激、痒みを引き起こす物質による化学的刺激などの刺激によって引き起こされる。皮膚における痒みを引き起こす物質として、例えば、ヒスタミンなどが知られている。そこで、皮膚における痒みを抑制する物質として、強い抗ヒスタミン作用を有するジフェンヒドラミンまたはその塩を含む外用組成物などが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１８０２０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、前記ジフェンヒドラミンまたはその塩を含む外用組成物は、痒みを引き起こす刺激の種類によっては、皮膚における痒みを抑制し難いことがある。また、前記痒み以外の皮膚における感覚過敏にも、発生原因が異なる種々の感覚過敏がある。したがって、痒み、痛みなどの感覚過敏を抑制することができる新たな手段が待ち望まれている。
【０００５】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１それぞれの活性を抑制することができる活性抑制剤ならびに皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する感覚過敏を抑制することができる皮膚感覚過敏抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の要旨は、
（１）ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１それぞれの活性を抑制するための活性抑制剤であって、有効成分として式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2018127440.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基を示す）
で表わされる化合物を含有してなる活性抑制剤、
（２）式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10が水素原子である前記（１）に記載の活性抑制剤、
（３）皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する感覚過敏を抑制するための皮膚感覚過敏抑制剤であって、有効成分として前記（１）または（２）に記載の活性抑制剤を含有してなる皮膚感覚過敏抑制剤、
（４）前記感覚過敏が、皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒みである前記（３）に記載の皮膚感覚過敏抑制剤、および
（５）前記感覚過敏が、皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みをさらに含む前記（３）または（４）に記載の皮膚感覚過敏抑制剤
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の活性抑制剤によれば、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１それぞれの活性を効果的に抑制することができる。また、本発明の皮膚感覚過敏抑制剤によれば、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する皮膚感覚過敏を効果的に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）は試験例１において、（ａ）４−イソプロピルシクロヘキサノール、（ｂ）イソプロピルシクロヘキサンまたは（ｃ）１−イソプロピル−４−メチルシクロヘキサンを投与したときのマウスＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化を示すグラフ、（Ｂ）は４−イソプロピルシクロヘキサノール濃度とマウスＡＮＯ１の相対電流値との関係を示す用量反応曲線である。
【図２】試験例２において、ヒトＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化を示すグラフである。
【図３】（Ａ）は試験例３において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のアリルイソチオシアネート誘導マウスＴＲＰＡ１電流の経時的変化を示すグラフ、（Ｂ）は４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与の有無とマウスＴＲＰＡ１電流密度との関係を示すグラフである。
【図４】（Ａ）は試験例３において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの有無とマウスＴＲＰＡ１電流の振幅の大きさとの関係を示すグラフ、（Ｂ）は４−イソプロピルシクロヘキサノールの有無とマウスＴＲＰＡ１の開口時間との関係を示すグラフ、（Ｃ）は４−イソプロピルシクロヘキサノールの有無とマウスＴＲＰＡ１の閉口時間との関係を示すグラフである。
【図５】（Ａ）は試験例４において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のアリルイソチオシアネート誘導ヒトＴＲＰＡ１電流の経時的変化を示すグラフ、（Ｂ）は４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与の有無とヒトＴＲＰＡ１電流密度との関係を示すグラフである。
【図６】（Ａ）は試験例５において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のＧＳＫ１０１６７９０Ａ誘導マウスＴＲＰＶ４電流の経時的変化を示すグラフ、（Ｂ）は４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のＧＳＫ１０１６７９０Ａ誘導ヒトＴＲＰＶ４電流の経時的変化を示すグラフである。
【図７】（Ａ）は試験例８において、４−イソプロピルシクロヘキサノール濃度とマウスＴＲＰＡ１の相対電流値との関係を示す用量反応曲線、（Ｂ）は４−イソプロピルシクロヘキサノール濃度とヒトＴＲＰＡ１の相対電流値との関係を示す用量反応曲線である。
【図８】（Ａ）は試験例９において、マウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化を示すグラフ、（Ｂ）はヒトＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．活性抑制剤
本発明の活性抑制剤は、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１それぞれの活性を抑制するための活性抑制剤である。本発明の活性抑制剤は、有効成分として式（Ｉ）：
【００１２】
【化２】
2018127440.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基を示す）
で表わされる化合物を含有していることを１つの大きな特徴とする。式（Ｉ）で表わされる化合物は、アゴニストによってもたらされるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１それぞれの活性化を抑制する。また、本発明の活性抑制剤は、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１それぞれの活性を抑制することから、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１間の相互作用を効果的に抑制することができる。
【００１４】
式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基である。炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１５】
式（Ｉ）において、Ｒ1は、水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基であるが、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１の活性を効果的に抑制する観点から、好ましくは水素原子および水酸基、より好ましくは水酸基である。
【００１６】
式（Ｉ）において、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基であるが、本発明の活性抑制剤の用途などによって異なるので一概には決定することができないことから、本発明の活性抑制剤の用途などに応じて決定することが望ましい。本発明の活性抑制剤の用途が、例えば、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する皮膚感覚過敏を迅速に抑制することが求められる用途である場合、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、抑制効果を迅速に発現させる観点から、それぞれ独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であることが好ましく、水素原子であることをより好ましい。また、本発明の活性抑制剤の用途が、例えば、皮膚に対して高い親和性が求められる用途である場合、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は、皮膚に対する親和性を高める観点から、それぞれ独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であることが好ましく、炭素数１〜４のアルキル基であることがより好ましい。
【００１７】
本発明の活性抑制剤の用途が、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する皮膚感覚過敏を迅速に抑制することが求められる用途である場合、抑制効果を迅速に発現させる観点から、式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子、水酸基または炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10が水素原子である化合物が好ましく、Ｒ１が水素原子または水酸基であり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10が水素原子である化合物がより好ましく、Ｒ１が水酸基であり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10が水素原子である化合物がさらに好ましい。式（Ｉ）で表わされる化合物としては、例えば、４−イソプロピルシクロヘキサノール、イソプロピルシクロヘキサン、１−イソプロピル−４−メチル−シクロヘキサンなどが挙げられるが本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの式（Ｉ）で表わされる化合物のなかでは、本発明の活性抑制剤の用途が、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する皮膚感覚過敏を迅速に抑制することが求められる用途である場合、抑制効果を迅速に発現させる観点から、４−イソプロピルシクロヘキサノール、イソプロピルシクロヘキサンおよび１−イソプロピル−４−メチル−シクロヘキサンが好ましく、４−イソプロピルシクロヘキサノールがより好ましい。
【００１８】
式（Ｉ）で表わされる化合物としてシス−トランス異性体が存在する場合、式（Ｉ）で表わされる化合物は、トランス体およびトランス体とシス体の混合物のいずれであってもよい。
【００１９】
本発明の活性抑制剤における式（Ｉ）で表わされる化合物の含有量は、本発明の活性抑制剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００２０】
なお、本発明の活性抑制剤は、本発明の目的が妨げられない範囲内で、例えば、適切な溶媒、ｐＨ調整剤、カルシウムキレート剤などの他の成分を含有していてもよい。
【００２１】
本発明の活性抑制剤は、生体外での用途に用いてもよく、生体内での用途に用いてもよい。
【００２２】
ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ４は、一過性受容体型電位依存性チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」ともいう）である。また、ＡＮＯ１は、細胞内カルシウムイオンによって活性化される塩素イオンチャネルである。
【００２３】
ＴＲＰＡ１としては、例えば、ヒトＴＲＰＡ１、マウスＴＲＰＡ１などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ヒトＴＲＰＡ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２に示されるアミノ酸配列を有する。また、マウスＴＲＰＡ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７７７８１に示されるアミノ酸配列を有する。また、本発明において、ＴＲＰＡ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２またはＮＭ＿１７７７８１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性と同等の活性（以下、「ＴＲＰＡ１活性」という）を示すものであれば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２またはＮＭ＿１７７７８１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であってもよい。ＴＲＰＡ１の変異体としては、例えば、（Ａ１）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２またはＮＭ＿１７７７８１に示されるアミノ酸配列において、１または数個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有し、ＴＲＰＡ１活性を示すポリペプチド、
（Ｂ１）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２またはＮＭ＿１７７７８１に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９５％以上、好ましくは９８％以上である配列からなり、ＴＲＰＡ１活性を示すポリペプチド
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、本明細書において、「配列同一性」とは、デフォルトパラメータでＰＲＯＴＥＩＮ  ＢＬＡＳＴを用い、所定のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の配列（参照配列）に対して、評価対象の配列（クエリー配列）をアライメントして算出された値をいう。
【００２４】
ＴＲＰＡ１活性としては、例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの輸送能、細胞におけるＴＲＰＡ１に起因する電流（以下、「ＴＲＰＡ１電流」ともいう）の発生能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＡ１活性は、ＴＲＰＡ１アゴニストによってＴＲＰＡ１が活性化することによって発現される。ＴＲＰＡ１アゴニストとしては、例えば、アリルイソチオシアネート、アリシン、イシリンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。本発明の活性抑制剤によるＴＲＰＡ１に対する抑制作用は、例えば、ＴＲＰＡ１を発現する細胞（以下、「ＴＲＰＡ１発現細胞」という）におけるＴＲＰＡ１アゴニストによって誘導されたＴＲＰＡ１電流（以下、「アゴニスト誘導ＴＲＰＡ１電流」ともいう）などに基づいて評価することができる。なお、ＴＲＰＡ１電流は、例えば、パッチクランプ法などによって測定することができる。この場合、活性抑制剤を投与したときのアゴニスト誘導ＴＲＰＡ１電流は、活性抑制剤を投与していないときのアゴニスト誘導ＴＲＰＡ１電流よりも小さくなる。
【００２５】
ＴＲＰＶ４としては、例えば、ヒトＴＲＰＶ４、マウスＴＲＰＶ４などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ヒトＴＲＰＶ４は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５に示されるアミノ酸配列を有する。また、マウスＴＲＰＶ４は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２２０１７に示されるアミノ酸配列を有する。また、本発明において、ＴＲＰＶ４は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５またはＮＭ＿０２２０１７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性と同等の活性（以下、「ＴＲＰＶ４活性」という）を示すものであれば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５またはＮＭ＿０２２０１７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であってもよい。ＴＲＰＶ４の変異体としては、例えば、（Ａ２）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５またはＮＭ＿０２２０１７に示されるアミノ酸配列において、１または数個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有し、ＴＲＰＶ４活性を示すポリペプチド、
（Ｂ２）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５またはＮＭ＿０２２０１７に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９５％以上、好ましくは９８％以上である配列からなり、ＴＲＰＶ４活性を示すポリペプチド
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２６】
ＴＲＰＶ４活性としては、例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの輸送能、細胞におけるＴＲＰＶ４に起因する電流（以下、「ＴＲＰＶ４電流」ともいう）の発生能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ４活性は、ＴＲＰＶ４アゴニストによってＴＲＰＶ４が活性化することによって発現される。ＴＲＰＶ４アゴニストとしては、例えば、ＧＳＫ１０１６７９０Ａなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。本発明の活性抑制剤によるＴＲＰＶ４に対する抑制作用は、例えば、ＴＲＰＶ４を発現する細胞（以下、「ＴＲＰＶ４発現細胞」という）内におけるＴＲＰＶ４アゴニストによって誘導されたＴＲＰＶ４電流（以下、「アゴニスト誘導ＴＲＰＶ４電流」ともいう）などに基づいて評価することができる。なお、ＴＲＰＶ４電流は、例えば、パッチクランプ法などによって測定することができる。この場合、活性抑制剤を投与したときのアゴニスト誘導ＴＲＰＶ４電流は、活性抑制剤を投与していないときのアゴニスト誘導ＴＲＰＶ４電流よりも小さくなる。
【００２７】
ＡＮＯ１としては、例えば、ヒトＡＮＯ１、マウスＡＮＯ１などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ヒトＡＮＯ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８０４３に示されるアミノ酸配列を有する。また、マウスＡＮＯ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７８６４２に示されるアミノ酸配列を有する。また、本発明において、ＡＮＯ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８０４３またはＮＭ＿１７８６４２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性と同等の活性（以下、「ＡＮＯ１活性」という）を示すものであれば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８０４３またはＮＭ＿１７８６４２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であってもよい。ＡＮＯ１の変異体としては、例えば、（Ａ３）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８０４３またはＮＭ＿１７８６４２に示されるアミノ酸配列において、１または数個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有し、ＡＮＯ１活性を示すポリペプチド、
（Ｂ３）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８０４３またはＮＭ＿１７８６４２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９５％以上、好ましくは９８％以上である配列からなり、ＡＮＯ１活性を示すポリペプチド
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２８】
ＡＮＯ１活性としては、例えば、細胞における塩素イオンの輸送能、細胞におけるＡＮＯ１に起因する電流（以下、「ＡＮＯ１電流」ともいう）の発生能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＡＮＯ１活性は、ＡＮＯ１アゴニストによってＴＲＰＡ１が活性化することによって発現される。ＡＮＯ１アゴニストとしては、例えば、カルシウムイオンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。本発明の活性抑制剤によるＡＮＯ１に対する抑制作用は、例えば、ＡＮＯ１を発現する細胞（以下、「ＡＮＯ１発現細胞」という）内におけるＡＮＯ１アゴニスト（カルシウムイオン）によって誘導されたＡＮＯ１電流（以下、「アゴニスト誘導ＡＮＯ１電流」ともいう）などに基づいて評価することができる。なお、ＡＮＯ１電流は、例えば、パッチクランプ法などによって測定することができる。この場合、活性抑制剤を投与したときのアゴニスト誘導ＡＮＯ１電流は、活性抑制剤を投与していないときのアゴニストＡＮＯ１電流よりも小さくなる。
【００２９】
２．皮膚感覚過敏抑制剤
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤は、皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する感覚過敏を抑制するための皮膚感覚過敏抑制剤であって、有効成分として前記活性抑制剤を含有していることを１つの大きな特徴とする。本発明の皮膚感覚過敏抑制剤は、前記活性抑制剤を含有しているため、当該皮膚感覚過敏抑制剤を皮膚と接触させることにより、皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する感覚過敏を効果的に抑制することができる。前記感覚過敏には、例えば、皮膚におけるＴＲＰＡ１とＡＮＯ１とが関与する感覚過敏、皮膚におけるＴＲＰＶ４とＡＮＯ１とが関与する感覚過敏などが含まれる。
【００３０】
前記感覚過敏としては、例えば、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒み、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒みとしては、例えば、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与するヒスタミン非依存性の痒み、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与するヒスタミン依存性の痒みなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与するヒスタミン非依存性の痒みとしては、例えば、クロロキン、胸腺間質性リンパ球新生因子〔ＴＳＬＰ〕、ウシ副腎髄質ペプチド（８−２２）〔ＢＡＭ  ８−２２〕、ＰＡＲ２アゴニストペプチド〔ＳＬＩＧＲＬ〕などによる痒みなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与するヒスタミン依存性の痒みとしては、例えば、ヒスタミン；肥満細胞などからのヒスタミンの放出を引き起こす物質などによる痒みなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みとしては、例えば、アリルイソチオシアネート、プロテアーゼなどのＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種の活性に関連する物質によってＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種を介して引き起こされる痛みなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤は、前記活性抑制剤を含有していることから、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒みを抑制する用途に用いられる皮膚感覚過敏抑制剤として好適である。また、本発明の皮膚感覚過敏抑制剤は、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与するヒスタミン非依存性の痒みの抑制作用と、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与するヒスタミン依存性の痒みの抑制作用との両方を発現する。したがって、本発明の皮膚感覚過敏抑制剤は、ヒスタミン非依存性の痒みとヒスタミン依存性の痒みの双方を抑制することが求められる用途に用いられることが期待されるものである。
【００３２】
前記痒みを抑制する用途に用いられる皮膚感覚過敏抑制剤が適用される感覚過敏には、皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みがさらに含まれていてもよい。すなわち、本発明の皮膚感覚過敏抑制剤が適用される痒みは、皮膚におけるＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みを伴うものであってもよい。
【００３３】
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤は、前記活性抑制剤を含有していることから、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みを抑制する用途に用いられる痛み抑制剤であってもよい。
【００３４】
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤における前記活性抑制剤の含有量は、皮膚感覚過敏を抑制するのに有効な量であればよい。したがって、本発明の皮膚感覚過敏抑制剤における前記活性抑制剤の含有量は、皮膚感覚過敏抑制剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００３５】
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤には、本発明の目的が妨げられない範囲で、例えば、適切な溶媒、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート化剤、ｐＨ調整剤、などの他の成分が配合されていてもよい。
【００３６】
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤の剤型としては、例えば、外用散剤などの外用固形剤；リニメント剤、ローション剤などの外用液剤；外用エアゾール剤などのスプレー剤；軟膏剤；クリーム剤；ゲル剤；テープ剤、パップ剤などの貼付剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３７】
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤の適用対象としては、ヒト、非ヒト哺乳動物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤の用量および適用回数は、前記感覚過敏の種類、適用対象の種類、適用対象の年齢、適用対象の体重などに応じて適宜選択することが好ましい。
【００３９】
本発明の皮膚感覚過敏抑制剤の適用回数は、前記感覚過敏の種類、適用対象の種類、適用対象の年齢、適用対象の体重などに応じて適宜選択することが好ましい。また、本発明の皮膚感覚過敏抑制剤の用法は、本発明の皮膚感覚過敏抑制剤の剤型などに応じて適宜選択することが好ましい。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００４１】
＜略語の説明＞
ＮＭＤＧ：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン
ＮＭＤＧ−Ｃｌ：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩酸塩
ＥＧＴＡ：エチレングリコール四酢酸
ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］エタンスルホン酸
ＢＡＰＴＡ：１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシド）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
ＡＴＰ−Ｍｇ：アデノシン−５’−三リン酸マグネシウム
ＧＴＰ−Ｎａ2：グアノシン−５’−三リン酸二ナトリウム
【００４２】
製造例１
５体積％二酸化炭素を含む雰囲気に保たれ、３７℃に維持された加湿チャンバー内において、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ、０４４−２９７６５；５８４ｍｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１５ｍｇ／Ｌフェノールレッド、１０質量％ウシ胎仔血清（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、１０４３７−０２８）、５００００ユニット／Ｌペニシリン／ストレプトマイシン混合物（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、商品名：Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ、１５１４０−１２２）および細胞培養用サプリメント（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、商品名：ＧｌｕｔａＭａｘ）を含むＤＭＥＭ（高グルコース）〕中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を７０〜８０％コンフルエンシーになるまで培養した。
【００４３】
つぎに、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）〕を用い、マウスＡＮＯ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７８６４２）を保持するｃＤＮＡ０．５μｇを前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることにより、マウスＡＮＯ１発現細胞を得た。
【００４４】
製造例２〜６
製造例１において、マウスＡＮＯ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７８６４２）を保持するｃＤＮＡを用いる代わりに、ヒトＡＮＯ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８０４３）を保持するｃＤＮＡ（製造例２）、マウスＴＲＰＡ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７７７８１）を保持するｃＤＮＡ（製造例３）、ヒトＴＲＰＡ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）を保持するｃＤＮＡ（製造例４）、マウスＴＲＰＶ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２２０１７）を保持するｃＤＮＡ（製造例５）またはヒトＴＲＰＶ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５）を保持するｃＤＮＡ（製造例６）を用いたことを除き、製造例１と同様の操作を行ない、ヒトＡＮＯ１発現細胞（製造例２）、マウスＴＲＰＡ１発現細胞（製造例３）、ヒトＴＲＰＡ１発現細胞（製造例４）、マウスＴＲＰＶ４発現細胞（製造例５）またはヒトＴＲＰＶ４発現細胞（製造例６）を得た。
【００４５】
製造例７
ＮＭＤＧ−Ｃｌ、塩化マグネシウム、ＥＧＴＡ、グルコースおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を、下記組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合し、標準バス溶液を得た。
【００４６】
製造例８
ＮＭＤＧ−Ｃｌ、塩化マグネシウム、ＢＡＰＴＡおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）を、下記組成：１４０ｍＭ  ＮＭＤＧ−Ｃｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＢＡＰＴＡおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合し、ピペットソリューションを得た。また、ピペットソリューソンに含まれるフリーカルシウムを５００ｎＭに保持した。
【００４７】
実施例１
製造例７の標準バス溶液に、式（Ｉ）で表される化合物である４−イソプロピルシクロヘキサノールをその濃度が３ｍＭとなるように添加し、実施例１のバス溶液を得た。
【００４８】
実施例２および３
実施例１において、式（Ｉ）で表される化合物として、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いる代わりにイソプロピルシクロヘキサン（実施例２）または１−イソプロピル−４−メチル−シクロヘキサン（実施例３）を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、実施例２および３のバス溶液を得た。
【００４９】
比較例１
実施例１において、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いる代わりに式（Ｉ）で表わされる化合物ではないシクロヘキサノールを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、比較例１のバス溶液を得た。
【００５０】
実施例４〜８
実施例１において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度を３ｍＭとする代わりに０．０１ｍＭ（実施例４）、０．０３ｍＭ（実施例５）、０．１ｍＭ（実施例６）、０．３ｍＭ（実施例７）または１ｍＭ（実施例８）としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、実施例４〜８のバス溶液を得た。
【００５１】
試験例１
（１）全細胞電位固定記録法によるマウスＡＮＯ１電流の測定
製造例１のマウスＡＮＯ１発現細胞を潅流チャンバーに入れ、製造例７の標準バス溶液にて洗浄した。製造例８のピペットソリューションを含むパッチ電極の先端開口部にマウスＡＮＯ１発現細胞を吸引して密着させた。その後、マウスＡＮＯ１発現細胞をさらに強く吸引することによってパッチ膜に穴を開けた。つぎに、潅流チャンバー内の標準バス溶液を実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液に置換し、ＡＮＯ１発現細胞を実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液に曝露するとともに、全細胞電位固定記録法にしたがってマウスＡＮＯ１電流の測定を開始した。曝露開始時から５分間〜１０分間経過後に、潅流チャンバー内の実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液を製造例７の標準バス溶液に置換し、ＡＮＯ１発現細胞を製造例７の標準バス溶液で洗浄した。
【００５２】
全細胞電位固定記録法によるマウスＴＲＰＡ１電流の測定は、パッチクランプ増幅器〔モレキュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕と、データ取得器（アクソン・インスツルメンツ製、商品名：Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ）と、データ取得・解析ソフトウェア〔アクソン・インスツルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ  １０〕とを用い、保持電位：−６０ｍＶでのマウスＡＮＯ１発現細胞におけるマウスＡＮＯ１電流の経時的変化を記録することにより、全細胞電位固定記録法によるマウスＡＮＯ１電流の測定を行なった。得られたマウスＡＮＯ１電流の測定値を用い、マウスＡＮＯ１の相対電流値を算出した。具体的には、実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液におけるマウスＡＮＯ１電流値を製造例７の標準バス溶液中におけるマウスＡＮＯ１電流値で除することにより、マウスＡＮＯ１の相対電流値を算出した。算出されたマウスＡＮＯ１の相対電流値を用い、マウスＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化を調べた。
【００５３】
試験例１において、マウスＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化を調べた結果を図１（Ａ）に示す。図１（Ａ）中、（ａ）は前記マウスＡＮＯ１発現細胞を実施例１のバス溶液に曝露させたとき（４−イソプロピルシクロヘキサノール投与）のマウスＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化、（ｂ）は前記マウスＡＮＯ１発現細胞を実施例２のバス溶液に曝露させたとき（イソプロピルシクロヘキサン投与）のマウスＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化、（ｃ）は前記マウスＡＮＯ１発現細胞を実施例３のバス溶液に曝露させたとき（１−イソプロピル−４−メチルシクロヘキサン投与）のマウスＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化を示す。また、図１（Ａ）中、「投与」はＡＮＯ１発現細胞を実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液に曝露している期間、「ウォッシュアウト」は灌流チャンバー内の実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液を製造例７の標準バス溶液に置換した後の期間を示す。
【００５４】
図１（Ａ）に示された結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノール（実施例１）、イソプロピルシクロヘキサン（実施例２）または１−イソプロピル−４−メチル−シクロヘキサン（実施例３）を含むバス溶液を用いたときのマウスＡＮＯ１の相対電流値は、各バス溶液の曝露前の相対電流値と比べて、著しく減少していることがわかる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノール、イソプロピルシクロヘキサン、１−イソプロピル−４−メチル−シクロヘキサンなどの式（Ｉ）で表わされる化合物は、ＡＮＯ１の活性を阻害することがわかる。なお、実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液の代わりに比較例１のバス溶液を用いたところ、バス溶液の曝露前後の相対電流値の変化が見られなかった。
【００５５】
また、実施例１の４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液を用いたときのマウスＡＮＯ１の相対電流値は、実施例２のイソプロピルシクロヘキサンを含むバス溶液または実施例３の１−イソプロピル−４−メチル−シクロヘキサンを含むバス溶液を用いたときのマウスＡＮＯ１の相対電流値と比べ、迅速に減少することがわかる〔図１（Ａ）の「投与」参照〕。これらの結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールの作用は、イソプロピルシクロヘキサンおよび１−イソプロピル−４−メチル−シクロヘキサンそれぞれの作用と比べて迅速に発現することがわかる。
【００５６】
さらに、図１（Ａ）に示された結果から、実施例１の４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液を用いたときのマウスＡＮＯ１の相対電流値は、灌流チャンバー内の実施例１のバス溶液を製造例７の標準バス溶液に置換した後に増加することがわかる。これに対し、イソプロピルシクロヘキサンを含むバス溶液（実施例２）または１−イソプロピル−４−メチル−シクロヘキサンを含むバス溶液（実施例３）を用いたときのマウスＡＮＯ１の相対電流値は、灌流チャンバー内の実施例１のバス溶液を製造例７の標準バス溶液に置換した後に増加しないことがわかる。
【００５７】
（２）４−イソプロピルシクロヘキサノールのＩＣ50値の算出
試験例１（１）において、実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液を用いる代わりに実施例１、４〜８の各バス溶液を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、マウスＡＮＯ１の相対電流値を求めた。
【００５８】
試験例１において、４−イソプロピルシクロヘキサノール濃度とマウスＡＮＯ１の相対電流値との関係を調べた結果を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）中、「４−ｉＰｒ−ＣｙＨ−ＯＨ」は４−イソプロピルシクロヘキサノールを示す。
【００５９】
図１（Ｂ）に示された用量反応曲線から、４−イソプロピルシクロヘキサノールのＩＣ50値を算出した。その結果、４−イソプロピルシクロヘキサノールのＩＣ50値は、１．０９ｍＭであった。
【００６０】
試験例２
試験例１において、マウスＡＮＯ１発現細胞を用いる代わりにヒトＡＮＯ１発現細胞を用いたことおよび実施例１、実施例２または実施例３のバス溶液を用いる代わりに実施例１のバス溶液を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行ない、ヒトＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化を調べた。
【００６１】
試験例２において、ヒトＡＮＯ１の相対電流値の経時的変化を調べた結果を図２に示す。図２中、「投与」はヒトＡＮＯ１発現細胞に対して実施例１のバス溶液を曝露している期間、「ウォッシュアウト」は灌流チャンバー内の実施例１のバス溶液を製造例７の標準バス溶液に置換した後の期間を示す。図２中、「４−ｉＰｒ−ＣｙＨ−ＯＨ」は４−イソプロピルシクロヘキサノールを示す。
【００６２】
図２に示された結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液（実施例１）を用いたときのヒトＡＮＯ１の相対電流値は、４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液（実施例１）を用いたときのマウスＡＮＯ１の相対電流値（図１参照）と同様の経時的変化を示すことがわかる。また、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いる代わりに式（Ｉ）で表わされる他の化合物を用いたときも、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いたときと同様の傾向が見られる。したがって、式（Ｉ）で表わされる化合物は、ヒトＡＮＯ１の活性を抑制することがわかる。なお、実施例１のバス溶液の代わりに比較例１のバス溶液を用いたところ、バス溶液の曝露前後の相対電流値の変化が見られなかった。
【００６３】
製造例９
塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ＥＧＴＡ、グルコースおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を、下記組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭグルコースおよびＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合した。得られた混合液を、標準バス溶液とした。
【００６４】
製造例１０
ＮＭＤＧ−Ｃｌ、塩化マグネシウム、ＢＡＰＴＡおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）を、下記組成：１４０ｍＭ  ＮＭＤＧ−Ｃｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＢＡＰＴＡおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合し、ピペットソリューションを得た。
【００６５】
実施例９
製造例９の標準バス溶液に、アリルイソチオシアネートおよび４−イソプロピルシクロヘキサノールを、前記アリルイソチオシアネートの濃度が３００μＭおよび前記４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が３ｍＭとなるように添加し、実施例９のバス溶液を得た。
【００６６】
製造例１１
製造例９の標準バス溶液に、アリルイソチオシアネートをその濃度が３００μＭとなるように添加し、製造例１１のバス溶液を得た。
【００６７】
製造例１２
塩化ナトリウム、ＥＧＴＡ、グルコースおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を、下記組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭグルコースおよびＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合した。得られた混合液を、標準バス溶液およびピペットソリューションとした。
【００６８】
実施例１０
製造例１１の標準バス溶液に、アリルイソチオシアネートおよび４−イソプロピルシクロヘキサノールを、前記アリルイソチオシアネートの濃度が１０μＭおよび前記４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が１００μＭとなるように添加し、実施例１０のバス溶液を得た。
【００６９】
製造例１３
製造例１２の標準バス溶液に、アリルイソチオシアネートをその濃度が１０μＭとなるように添加し、製造例１３のバス溶液を得た。
【００７０】
試験例３
（１）全細胞電位固定記録法によるマウスＴＲＰＡ１電流の測定
製造例３のマウスＴＲＰＡ１発現細胞を潅流チャンバーに入れ、製造例９の標準バス溶液にて洗浄した。製造例９の標準バス溶液で洗浄した後、製造例１０のピペットソリューションを含むパッチ電極の先端開口部に前記マウスＴＲＰＡ１発現細胞を吸引し密着させた。その後、さらに強く吸引し、パッチ膜に穴を開けた。つぎに、潅流チャンバー内の標準バス溶液を製造例１１のバス溶液に置換するとともに、全細胞電位固定記録法にしたがってマウスＴＲＰＡ１電流の測定を開始した。バス溶液の置換開始時から１５秒間〜３０秒間経過後、潅流チャンバー内のバス溶液を実施例９のバス溶液に置換し、マウスＴＲＰＡ１発現細胞を実施例９のバス溶液に曝露した。マウスＴＲＰＡ１電流が最小値となった後に、灌流チャンバー内の実施例９のバス溶液を製造例１１のバス溶液に置換した。つぎに、再び、マウスＴＲＰＡ１電流が最大値となるまでマウスＴＲＰＡ１電流を測定した後、製造例９の標準バス溶液に置換した。
【００７１】
全細胞電位固定記録法によるマウスＴＲＰＡ１電流の測定は、パッチクランプ増幅器〔モレキュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕と、データ取得器（アクソン・インスツルメンツ製、商品名：Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ）と、データ取得・解析ソフトウェア〔アクソン・インスツルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ  １０〕とを用い、保持電位を−６０ｍＶとし、−１００〜＋１００ｍＶで３００ミリ秒間のランプパルスをパッチ電極に与え、電流の経時的変化を記録することによって行なった。
【００７２】
また、アリルイソチオシアネートの投与後のアリルイソチオシアネート誘導マウスＴＲＰＡ１電流の最大値を細胞膜の静電容量で除することにより、４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与していないときのマウスＴＲＰＡ１電流密度を求めた。また、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与後、アリルイソチオシアネート誘導マウスＴＲＰＡ１電流の最小値を細胞膜の静電容量で除することにより、４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与したときのマウスＴＲＰＡ１電流密度を求めた。
【００７３】
試験例３（１）において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のアリルイソチオシアネート誘導マウスＴＲＰＡ１電流の経時的変化を調べた結果を図３（Ａ）、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与の有無とマウスＴＲＰＡ１電流密度との関係を調べた結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ａ）および（Ｂ）中、「４−ｉＰｒ−ＣｙＨ−ＯＨ」は４−イソプロピルシクロヘキサノール、「ＡＩＴＣ」はアリルイソチオシアネートを示す。また、図３（Ｂ）中、レーン１は４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与していないときのアリルイソチオシアネート誘導マウスＴＲＰＡ１電流密度、レーン２は４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与したときのアリルイソチオシアネート誘導マウスＴＲＰＡ１電流密度を示す。
【００７４】
図３（Ａ）に示された結果から、アリルイソチオシアネートの投与によって誘導されたマウスＴＲＰＡ１電流は、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与後に減少していることがわかる。また、図３（Ｂ）に示された結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与したときのアリルイソチオシアネート誘導マウスＴＲＰＡ１電流密度（レーン２）は、４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与していない場合アリルイソチオシアネート誘導マウスＴＲＰＡ１電流密度（レーン１）よりも低いことがわかる。これらの結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、アリルイソチオシアネートによるマウスＴＲＰＡ１電流の誘導を阻害することがわかる。なお、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いる代わりに式（Ｉ）で表わされる他の化合物を用いたときも、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いたときと同様の傾向が見られる。したがって、式（Ｉ）で表わされる化合物は、マウスＴＲＰＡ１の活性を抑制することがわかる。
【００７５】
（２）単一チャネル電位固定記録法によるマウスＴＲＰＡ１電流の測定
製造例３のマウスＴＲＰＡ１発現細胞を灌流チャンバーに入れ、製造例１２の標準バス溶液にて洗浄した。洗浄後、製造例１２のピペットソリューションを含むパッチ電極の先端開口部に前記マウスＴＲＰＡ１発現細胞を吸引密着させ、パッチ膜を引きはがして前記先端開口部にインサイド−アウトのパッチ膜を形成した。つぎに、灌流チャンバー内の標準バス溶液を製造例１３のバス溶液に置換した。バス溶液の置換開始時から１〜３分間経過後、潅流チャンバー内のバス溶液を実施例１０のバス溶液に置換し、マウスＴＲＰＡ１発現細胞を実施例１０のバス溶液に曝露した。曝露開始時から１分間経過後に、潅流チャンバー内の実施例１０のバス溶液を製造例１２の標準バス溶液に置換した。
【００７６】
パッチクランプ増幅器〔モレキュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕と、データ取得器（アクソン・インスツルメンツ製、商品名：Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ）と、データ取得・解析ソフトウェア〔アクソン・インスツルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ  １０〕とを用い、保持電位を−６０ｍＶとしたときの電流の経時的変化を記録することにより、単一チャネル電位固定記録法よるマウスＴＲＰＡ１電流を測定した。得られたマウスＴＲＰＡ電流の測定値に基づき、マウスＴＲＰＡ１電流の振幅ヒストグラムを作成した。前記振幅ヒストグラムを用い、マウスＴＲＰＡ１電流の振幅の大きさ（ｐＡ）の平均値、マウスＴＲＰＡ１の開口時間の平均値およびマウスＴＲＰＡ１の閉口時間の平均値を算出した。
【００７７】
また、前記において、実施例１０のバス溶液を用いる代わりに製造例１３のバス溶液を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、マウスＴＲＰＡ１電流の振幅の大きさ（ｐＡ）の平均値、マウスＴＲＰＡ１の開口時間の平均値およびマウスＴＲＰＡ１の閉口時間の平均値を算出した。
【００７８】
試験例３において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの有無とマウスＴＲＰＡ１電流の振幅の大きさとの関係を調べた結果を図４（Ａ）、４−イソプロピルシクロヘキサノールの有無とマウスＴＲＰＡ１の開口時間との関係を調べた結果を図４（Ｂ）、４−イソプロピルシクロヘキサノールの有無とマウスＴＲＰＡ１の閉口時間との関係を調べた結果を図４（Ｃ）に示す。図４（Ａ）において、レーン１は４−イソプロピルシクロヘキサノールの非存在下でのマウスＴＲＰＡ１電流の振幅の大きさ、レーン２は４−イソプロピルシクロヘキサノールの存在下でのマウスＴＲＰＡ１電流の振幅の大きさを示す。図４（Ｂ）において、レーン１は４−イソプロピルシクロヘキサノールの非存在下でのマウスＴＲＰＡ１の開口時間、レーン２は４−イソプロピルシクロヘキサノールの存在下でのマウスＴＲＰＡ１の開口時間を示す。図４（Ｃ）において、レーン１は４−イソプロピルシクロヘキサノールの非存在下でのマウスＴＲＰＡ１の閉口時間、レーン２は４−イソプロピルシクロヘキサノールの存在下でのマウスＴＲＰＡ１の閉口時間を示す。
【００７９】
図４（Ａ）に示された結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールの非存在下でのマウスＴＲＰＡ１電流の振幅の大きさ（レーン１参照）と、４−イソプロピルシクロヘキサノールの存在下でのマウスＴＲＰＡ１電流の振幅の大きさ（レーン２）とは、ほとんど同程度であることがわかる。これらの結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、マウスＴＲＰＡ１のコンダクタンスに影響を与えないことがわかる。
【００８０】
図４（Ｂ）および図４（Ｃ）に示された結果について、スチューデントｔ検定を行なった。図４（Ｂ）に示された結果において、スチューデントのｔ検定のｐ値は、０．０１未満であった。したがって、この結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールの非存在下でのマウスＴＲＰＡ１の開口時間と、４−イソプロピルシクロヘキサノールの存在下でのマウスＴＲＰＡ１の開口時間との間には、有意な差があることが示唆される。一方、図４（Ｃ）に示された結果において、スチューデントのｔ検定のｐ値は、０．０６８であった。したがって、この結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールの非存在下でのマウスＴＲＰＡ１の閉口時間と、４−イソプロピルシクロヘキサノールの存在下でのマウスＴＲＰＡ１の閉口時間との間には、有意な差がないことが示唆される。これらの結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、マウスＴＲＰＡ１のゲーティングに影響を与えることがわかる。
【００８１】
これらの結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、マウスＴＲＰＡ１におけるコンダクタンスに影響を与えないが、マウスＴＲＰＡ１のゲーティングに影響を与えることがわかる。
【００８２】
試験例４
試験例３（１）において、製造例３のマウスＴＲＰＡ１発現細胞を用いる代わりに製造例４のヒトＴＲＰＡ１発現細胞を用いたことを除き、試験例３（１）と同様の操作を行ない、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のアリルイソチオシアネート誘導ヒトＴＲＰＡ１電流の経時的変化および４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与の有無とヒトＴＲＰＡ１電流密度との関係を調べた。
【００８３】
試験例４において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のアリルイソチオシアネート誘導ヒトＴＲＰＡ１電流の経時的変化を調べた結果を図５（Ａ）、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与の有無とヒトＴＲＰＡ１電流密度との関係を調べた結果を図５（Ｂ）に示す。図５（Ａ）中、「４−ｉＰｒ−ＣｙＨ−ＯＨ」は４−イソプロピルシクロヘキサノール、「ＡＩＴＣ」はアリルイソチオシアネートを示す。また、図５（Ｂ）中、レーン１は４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与していないときのヒトＴＲＰＡ１電流密度、レーン２は４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与したときのヒトＴＲＰＡ１電流密度を示す。
【００８４】
図５（Ａ）に示された結果から、アリルイソチオシアネートの投与によって誘導されたヒトＴＲＰＡ１電流は、マウスＴＲＰＡ１電流と同様に、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与後に減少していることがわかる。また、図５（Ｂ）に示された結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与したときのアリルイソチオシアネート誘導ヒトＴＲＰＡ１電流密度（レーン２）は、４−イソプロピルシクロヘキサノールを投与していないときのアリルイソチオシアネート誘導ヒトＴＲＰＡ１電流密度（レーン１）よりも低いことがわかる。これらの結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、アリルイソチオシアネートによるヒトＴＲＰＡ１電流の誘導を阻害することがわかる。なお、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いる代わりに式（Ｉ）で表わされる他の化合物を用いたときも、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いたときと同様の傾向が見られる。したがって、式（Ｉ）で表わされる化合物は、ヒトＴＲＰＡ１の活性を抑制することがわかる。
【００８５】
実施例１１
製造例９の標準バス溶液に、ＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）および４−イソプロピルシクロヘキサノールを、前記ＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）の濃度が３００ｎＭおよび前記４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が３ｍＭとなるように添加し、実施例１１のバス溶液を得た。
【００８６】
製造例１４
製造例９の標準バス溶液に、ＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）をその濃度が３００ｎＭとなるように添加し、製造例１４のバス溶液を得た。
【００８７】
試験例５
製造例５のマウスＴＲＰＶ４発現細胞を灌流チャンバーに入れ、製造例９の標準バス溶液にて洗浄した。製造例９の標準バス溶液で洗浄した後、製造例１０のピペットソリューションを含むパッチ電極の先端開口部に前記マウスＴＲＰＶ４発現細胞を吸引し密着させた。その後、マウスＴＲＰＶ４発現細胞をさらに強く吸引し、パッチ膜に穴を開けた。つぎに、灌流チャンバー内の標準バス溶液を製造例１４のバス溶液に置換するとともに、全細胞電位固定記録法にしたがってマウスＴＲＰＶ４電流の測定を開始した。バス溶液の置換開始時から３０秒間経過後、灌流チャンバー内のバス溶液を実施例１１のバス溶液に置換し、マウスＴＲＰＶ４発現細胞を実施例１１のバス溶液に曝露した。マウスＴＲＰＶ４電流が最小値となった後に、灌流チャンバー内の実施例１１のバス溶液を製造例１４のバス溶液に置換した。バス溶液の置換開始時から１分間経過後、製造例９の標準バス溶液に置換した。
【００８８】
全細胞電位固定記録法によるマウスＴＲＰＶ４電流の測定は、パッチクランプ増幅器〔モレキュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕と、データ取得器（アクソン・インスツルメンツ製、商品名：Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ）と、データ取得・解析ソフトウェア〔アクソン・インスツルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ  １０〕とを用い、保持電位：−６０ｍＶで、−１００〜＋１００ｍＶで３００ミリ秒間のランプパルスをパッチ電極に与えたときのマウスＴＲＰＶ４発現細胞におけるマウスＴＲＰＶ４電流の経時的変化を記録することによって行なった。
【００８９】
また、前記において、製造例５のマウスＴＲＰＶ４発現細胞を用いる代わりに製造例６のヒトＴＲＰＶ４発現細胞を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ヒトＴＲＰＶ４電流の経時的変化を測定した。
【００９０】
試験例５において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のＧＳＫ１０１６７９０Ａ誘導マウスＴＲＰＶ４電流の経時的変化を調べた結果を図６（Ａ）、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与前後のＧＳＫ１０１６７９０Ａ誘導ヒトＴＲＰＶ４電流の経時的変化を調べた結果を図６（Ｂ）に示す。図６（Ａ）および（Ｂ）中、「４−ｉＰｒ−ＣｙＨ−ＯＨ」は４−イソプロピルシクロヘキサノール、「ＧＳＫ１０１」はＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）を示す。
【００９１】
図６（Ａ）および（Ｂ）に示された結果から、ＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）の投与によって誘導されたマウスＴＲＰＶ４電流およびヒトＴＲＰＶ４電流は、それぞれ、４−イソプロピルシクロヘキサノールの投与後に減少していることがわかる。したがって、これらの結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、ＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）によるマウスＴＲＰＶ４電流およびヒトＴＲＰＶ４電流の誘導を阻害することがわかる。なお、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いる代わりに式（Ｉ）で表わされる他の化合物を用いたときも、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いたときと同様の傾向が見られる。したがって、式（Ｉ）で表わされる化合物は、マウスＴＲＰＶ４の活性およびヒトＴＲＰＶ４の活性を抑制することがわかる。
【００９２】
以上説明したように、４−イソプロピルシクロヘキサノールなどの式（Ｉ）で表わされる化合物は、ＴＲＰＡ１アゴニストによって誘導されたＴＲＰＡ１電流、ＴＲＰＶ４アゴニストによって誘導されたＴＲＰＶ４電流およびＡＮＯ１アゴニストによって誘導されたＡＮＯ１電流を阻害することから、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１の活性を抑制することがわかる。なお、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１の活性と痒みとの関係を調べたところ、両者には相関関係が見られることから、痒みの発生に関与していると考えられる。また、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１の活性と痛みとの関係を調べたところ、両者には相関関係が見られることから、痛みの発生に関与していると考えられる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノールなどの式（Ｉ）で表わされる化合物は、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒み、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みなどの感覚過敏を抑制することが示唆される。
【００９３】
実施例１２
０．９質量％  塩化ナトリウムを含む生理食塩水溶液に４−イソプロピルシクロヘキサノールと、ヒスタミン非依存性の痒みを引き起こす発痒物質とを添加し、実施例１２の被験試料を得る。
【００９４】
比較例２
０．９質量％  塩化ナトリウムを含む生理食塩水溶液にヒスタミン非依存性の痒みを引き起こす発痒物質を添加し、比較例２の被験試料を得る。
【００９５】
試験例６
３０ゲージ針を付けた５０μＬ容量ハミルトンシリンジを用い、Ｃ５７／ＢＬ６ＮＣｒマウスの背部に実施例１２の被験試料または比較例２の被験試料５０μＬを皮下注射する。デジタルカメラを用い、被験試料の注射終了時から３０分間における前記マウスによる引っ掻き行動時間を測定する。測定結果をマン・ホイットニーのＵ検定によって統計解析する。ｐ値が０．０５未満である場合を統計学的に有意な差があるとして判断する。
【００９６】
その結果、実施例１０の４−イソプロピルシクロヘキサノールを含む被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き行動時間は、４−イソプロピルシクロヘキサノールを含まない比較例２の被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き行動時間と比べ、著しく短いことを確認することができる。これらの結果から、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与するヒスタミン非依存性の痒みに対する鎮痒作用を有することを確認することができる。
【００９７】
実施例１３
０．９質量％  塩化ナトリウムを含む生理食塩水溶液に４−イソプロピルシクロヘキサノールと、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１を活性化して痛みを引き起こす発痛物質とを添加し、実施例１３の被験試料を得る。
【００９８】
比較例３
０．９質量％  塩化ナトリウムを含む生理食塩水溶液にＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１を活性化して痛みを引き起こす発痛物質を添加し、比較例３の被験試料を得る。
【００９９】
試験例７
３０ゲージ針を付けた２５μＬ容量ハミルトンシリンジを用い、Ｃ５７／ＢＬ６ＮＣｒマウスの後脚の先端に実施例１３の被験試料または比較例３の被験試料１０μＬを皮下注射する。デジタルカメラを用い、発痛物質を含む被験試料の注射終了時から５分間（発痛物質投与後５分間）における前記マウスによる足舐め時間を測定する。測定結果をマン・ホイットニーのＵ検定によって統計解析する。ｐ値が０．０５未満である場合を統計学的に有意な差があるとして判断する。
【０１００】
その結果、実施例１３の４−イソプロピルシクロヘキサノールを含む被験試料を投与したときのマウスの足舐め時間は、比較例３の４−イソプロピルシクロヘキサノールを含まない被験試料を投与したときの足舐め時間と比べて著しく短いことを確認することができる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痛みに対する鎮痛作用を有することを確認することができる。
【０１０１】
実施例１４〜１８
実施例９において、４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度を３ｍＭとする代わりに０．０１ｍＭ（実施例１４）、０．０３ｍＭ（実施例１５）、０．１ｍＭ（実施例１６）、０．３ｍＭ（実施例１７）または１ｍＭ（実施例１８）としたことを除き、実施例９と同様の操作を行ない、実施例１４〜１８のバス溶液を得た。
【０１０２】
試験例８
製造例３のマウスＴＲＰＡ１発現細胞を潅流チャンバーに入れ、製造例９の標準バス溶液で洗浄した。製造例１０のピペットソリューションを含むパッチ電極の先端開口部に前記マウスＴＲＰＡ１発現細胞を吸引し密着させた。その後、マウスＴＲＰＡ１発現細胞をさらに強く吸引することによってパッチ膜に穴を開けた。つぎに、潅流チャンバー内の標準バス溶液を製造例１１のバス溶液に置換するとともに、全細胞電位固定記録法にしたがってマウスＴＲＰＡ１電流の測定を開始した。バス溶液の置換開始時から１５〜３０秒間経過後、潅流チャンバー内のバス溶液を実施例９、実施例１４〜１８の各バス溶液に置換し、マウスＴＲＰＡ１発現細胞を実施例９、実施例１４〜１８の各バス溶液に曝露した。マウスＴＲＰＡ１電流が最小値となった後に、灌流チャンバー内の実施例９、実施例１４〜１８の各バス溶液を製造例１１のバス溶液に置換した。つぎに、再び、マウスＴＲＰＡ１電流が最大値となるまでマウスＴＲＰＡ１電流を測定した後、製造例９の標準バス溶液に置換した。
【０１０３】
全細胞電位固定記録法によるマウスＴＲＰＡ１電流の測定は、パッチクランプ増幅器〔モレキュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕と、データ取得器（アクソン・インスツルメンツ製、商品名：Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ）と、データ取得・解析ソフトウェア〔アクソン・インスツルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ  １０〕とを用い、保持電位：−６０ｍＶで、−１００〜＋１００ｍＶで３００ミリ秒間のランプパルスをパッチ電極に与え、電流の経時的変化を記録することによって行なった。
【０１０４】
得られたマウスＴＲＰＡ１電流の測定値を用い、マウスＴＲＰＡ１の相対電流値を算出した。具体的には、実施例９、実施例１４〜１８の各バス溶液を用いたときのマウスＴＲＰＡ１電流値を製造例１１の標準バス溶液中におけるマウスＴＲＰＡ１電流値で除することにより、マウスＴＲＰＡ１の相対電流値を算出した。
【０１０５】
また、前記において、製造例３のマウスＴＲＰＡ１発現細胞を用いる代わりに製造例４のヒトＴＲＰＡ１発現細胞を用いたことを除き、試験例７と同様の操作を行ない、ヒトＴＲＰＡ１の相対電流値を算出した。
【０１０６】
試験例８において、４−イソプロピルシクロヘキサノール濃度とマウスＴＲＰＡ１の相対電流値との関係を調べた結果を図７（Ａ）、４−イソプロピルシクロヘキサノール濃度とヒトＴＲＰＡ１の相対電流値との関係を調べた結果を図７（Ｂ）に示す。図中、「４−ｉＰｒ−ＣｙＨ−ＯＨ」は４−イソプロピルシクロヘキサノールを示す。
【０１０７】
図７（Ａ）に示された結果から、バス溶液における４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が高いほど、マウスＴＲＰＡ１の相対電流値が高い傾向が見られることがわかる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、マウスＴＲＰＡ１を用量依存的に阻害することがわかる。また、図７（Ａ）に示された用量反応曲線に基づき、マウスＴＲＰＡ１に対する４−イソプロピルシクロヘキサノールのＩＣ50値を算出した。その結果、マウスＴＲＰＡ１に対する４−イソプロピルシクロヘキサノールのＩＣ50値は、０．２３ｍＭであった。
【０１０８】
図７（Ｂ）に示された結果から、バス溶液における４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が高いほど、ヒトＴＲＰＡ１の相対電流値が高い傾向が見られることがわかる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、ヒトＴＲＰＡ１を用量依存的に阻害することがわかる。また、図７（Ｂ）に示された用量反応曲線に基づき、ヒトＴＲＰＡ１に対する４−イソプロピルシクロヘキサノールのＩＣ50値を算出した。その結果、ヒトＴＲＰＡ１に対する４−イソプロピルシクロヘキサノールのＩＣ50値は、１．２５ｍＭであった。
【０１０９】
実施例１９〜２２
製造例９の標準バス溶液に、ＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）および４−イソプロピルシクロヘキサノールを、前記ＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）の濃度が３００μＭおよび前記４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が０．３ｍＭ（実施例１９）、１ｍＭ（実施例２０）、２ｍＭ（実施例２１）または３ｍＭ（実施例２２）となるように添加し、実施例１９〜２２のバス溶液を得た。
【０１１０】
製造例１５
製造例９の標準バス溶液に、ＴＲＰＶ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１６７９０Ａ）をその濃度が３００μＭとなるように添加し、製造例１５のバス溶液を得た。
【０１１１】
試験例９
製造例５のマウスＴＲＰＶ４発現細胞を灌流チャンバーに入れ、製造例９の標準バス溶液で洗浄した。つぎに、製造例１０のピペットソリューションを含むパッチ電極の先端開口部に前記マウスＴＲＰＶ４発現細胞を吸引し密着させた。その後、マウスＴＲＰＶ４発現細胞をさらに強く吸引することによってパッチ膜に穴を開けた。つぎに、灌流チャンバー内の標準バス溶液を製造例１５のバス溶液に置換するとともに、全細胞電位固定記録法にしたがってマウスＴＲＰＶ４電流の測定を開始した。バス溶液の置換開始時から３０秒間経過後、灌流チャンバー内のバス溶液を実施例１９〜２２の各バス溶液に置換し、マウスＴＲＰＶ４発現細胞を実施例１９〜２２の各バス溶液に曝露した。マウスＴＲＰＶ４電流が最小値となった後に、灌流チャンバー内の実施例１９〜２２のバス溶液を製造例１５のバス溶液に置換した。置換開始時から１分間経過後、製造例９の標準バス溶液に置換した。
【０１１２】
全細胞電位固定記録法によるマウスＴＲＰＶ４電流の測定は、パッチクランプ増幅器〔モレキュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕と、データ取得器（アクソン・インスツルメンツ製、商品名：Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ）と、データ取得・解析ソフトウェア〔アクソン・インスツルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ  １０〕とを用い、保持電位：−６０ｍＶで、−１００〜＋１００ｍＶで３００ミリ秒間のランプパルスをパッチ電極に与えたときのマウスＴＲＰＶ４発現細胞におけるマウスＴＲＰＶ４電流の経時的変化を記録することによって行なった。
【０１１３】
得られたマウスＴＲＰＶ４電流の測定値を用い、マウスＴＲＰＶ４の相対電流値を算出した。具体的には、実施例１９〜２２の各バス溶液を用いたときのマウスＴＲＰＶ４電流値を製造例９の標準バス溶液中におけるマウスＴＲＰＶ４電流値で除することにより、マウスＴＲＰＶ４の相対電流値を算出した。
【０１１４】
また、前記において、製造例５のマウスＴＲＰＶ４発現細胞を用いる代わりに製造例６のヒトＴＲＰＶ４発現細胞を用いたことおよび実施例１９〜２２の各バス溶液を用いる代わりに実施例２０〜２２の各バス溶液を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ヒトＴＲＰＶ４の相対電流値を算出した。
【０１１５】
試験例９において、マウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化を調べた結果を図８（Ａ）、ヒトＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化を調べた結果を図８（Ｂ）に示す。図８（Ａ）中、（ａ）は実施例１９の０．３ｍＭ  ４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液にマウスＴＲＰＶ４発現細胞を曝露させたときのマウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化、（ｂ）は実施例２０の１ｍＭ  ４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液にマウスＴＲＰＶ４発現細胞を曝露させたときのマウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化、（ｃ）は実施例２１の２ｍＭ  ４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液にマウスＴＲＰＶ４発現細胞を曝露させたときのマウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化、（ｄ）は実施例２２の３ｍＭ  ４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液にマウスＴＲＰＶ４発現細胞を曝露させたときのマウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化を示す。図８（Ａ）中、「投与」は実施例１９〜２２の各バス溶液にマウスＴＲＰＶ４発現細胞を曝露している期間を示す。また、図８（Ｂ）中、（ａ）は実施例２０の１ｍＭ  ４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液にマウスＴＲＰＶ４発現細胞を曝露させたときのマウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化、（ｂ）は実施例２１の２ｍＭ  ４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液にマウスＴＲＰＶ４発現細胞を曝露させたときのマウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化、（ｃ）は実施例２２の３ｍＭ  ４−イソプロピルシクロヘキサノールを含むバス溶液にマウスＴＲＰＶ４発現細胞を曝露させたときのマウスＴＲＰＶ４の相対電流値の経時的変化を示す。図８（Ｂ）中、「投与」は実施例２０〜２２の各バス溶液にヒトＴＲＰＶ４発現細胞を曝露している期間を示す。
【０１１６】
図８（Ａ）に示された結果から、バス溶液における４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が高いほど、マウスＴＲＰＶ４の相対電流値が高い傾向が見られることがわかる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、マウスＴＲＰＶ４の活性を用量依存的に抑制することがわかる。また、図８（Ｂ）に示された結果から、バス溶液における４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が高いほど、ヒトＴＲＰＶ４の相対電流値が高い傾向が見られることがわかる。
【０１１７】
実施例２３
０．９質量％  塩化ナトリウムを含む生理食塩水溶液に４−イソプロピルシクロヘキサノールおよびクロロキンを４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が３ｍＭおよびクロロキンの濃度が２００μｇ／５０μＬとなるように添加し、実施例２３の被験試料を得た。
【０１１８】
比較例４
０．９質量％  塩化ナトリウムを含む生理食塩水溶液にクロロキンをその濃度が２００μｇ／５０μＬとなるように添加し、比較例４の被験試料を得た。
【０１１９】
試験例１０
４匹の１０週齢の雄のＣ５７／ＢＬ６ＮＣｒマウスをゲージに入れて１〜２時間飼育することにより、各Ｃ５７／ＢＬ６ＮＣｒマウスをゲージ内の環境に順化させた。２９ゲージ針を付けた５００μＬ容量のシリンジ〔テルモ（株）製、商品名：マイジェクター〕を用い、各Ｃ５７／ＢＬ６ＮＣｒマウスの頸背部に実施例２３の被験試料５０μＬを皮内注射によって投与した。被験試料の投与終了時から１分間経過時までの間における各Ｃ５７／ＢＬ６ＮＣｒマウスの引っ掻き動作の回数を測定した。つぎに、４匹のＣ５７／ＢＬ６ＮＣｒマウスの引っ掻き動作の回数の平均値を求めた。
【０１２０】
また、前記において、実施例２３の被験試料の代わりに比較例４の被験試料を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、引っ掻き動作の回数の平均値を求めた。
【０１２１】
実施例２３および比較例４の各被験試料の投与したときのＣ５７／ＢＬ６ＮＣｒマウスの引っ掻き動作の回数を調べた結果を表１に示す。
【０１２２】
【表１】
2018127440.tif 000004
【０１２３】
表１に示された結果から、実施例２３の４−イソプロピルシクロヘキサノールを含む被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き動作の回数は、比較例４の４−イソプロピルシクロヘキサノールを含まない被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き動作の回数と比べ、著しく少ないことがわかる。測定結果をマン・ホイットニーのＵ検定によって統計解析した。その結果、ｐ値が０．０５未満であったことから、実施例２３の被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き動作の回数と比較例４の被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き動作の回数との間には、統計学的に有意な差があると判断された。クロロキンに起因する痒みは、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与するヒスタミン非依存性の痒みの１つであると考えられる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、ヒスタミン非依存性の痒みの１つであるクロロキンに起因する痒みに対する鎮痒作用を有することがわかる。なお、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いる代わりに式（Ｉ）で表わされる他の化合物を用いたときも、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いたときと同様の傾向が見られる。
【０１２４】
これらの結果から、式（Ｉ）で表わされる化合物は、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒みを抑制することが示唆される。
【０１２５】
実施例２４
０．９質量％  塩化ナトリウムを含む生理食塩水溶液に４−イソプロピルシクロヘキサノールおよびヒスタミンを４−イソプロピルシクロヘキサノールの濃度が３ｍＭおよびヒスタミンの濃度が１１１．１５ｎｇ／５０μＬとなるように添加し、実施例２４の被験試料を得た。
【０１２６】
比較例５
０．９質量％  塩化ナトリウムを含む生理食塩水溶液にクロロキンをその濃度がヒスタミンの濃度が１１１．１５ｎｇ／５０μＬとなるように添加し、比較例５の被験試料を得た。
【０１２７】
試験例１１
８匹の６週齢の雄のＩＣＲマウスをゲージに入れて１〜２時間飼育することにより、各ＩＣＲマウスを環境に純化させた。２９ゲージ針を付けた５００μＬ容量のシリンジ〔テルモ（株）製、商品名：マイジェクター〕を用い、各ＩＣＲマウスの頸背部に実施例２４の被験試料５０μＬを皮内注射によって投与した。デジタルカメラを用い、被験試料の投与終了時から５分間経過時までの間における各ＩＣＲマウスの引っ掻き動作の回数を測定した。つぎに、８匹のＩＣＲマウスの引っ掻き動作の回数の平均値を求めた。
【０１２８】
また、前記において、８匹のＩＣＲマウスを用いる代わりに１１匹のＩＣＲマウスを用いたことおよび実施例２４の被験試料の代わりに比較例５の被験試料を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、引っ掻き動作の回数の平均値を求めた。
【０１２９】
実施例２４および比較例５の各被験試料を投与したときのＩＣＲマウスの引っ掻き動作の回数を調べた結果を表２に示す。
【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
表１に示された結果から、実施例２４の４−イソプロピルシクロヘキサノールを含む被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き動作の回数は、４−イソプロピルシクロヘキサノールを含まない比較例５の被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き動作の回数と比べ、著しく少ないことがわかる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、ヒスタミン依存性の痒みに対する鎮痒作用を有することがわかる。なお、測定結果をマン・ホイットニーのＵ検定によって統計解析した。その結果、ｐ値が０．０５未満であったことから、実施例２４の被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き動作の回数と比較例５の被験試料を投与したときのマウスの引っ掻き動作の回数との間には、統計学的に有意な差があると判断された。ヒスタミンに起因する痒みは、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒みの１つであると考えられる。したがって、４−イソプロピルシクロヘキサノールは、ヒスタミン依存性の痒みに対する鎮痒作用を有することがわかる。なお、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いる代わりに式（Ｉ）で表わされる他の化合物を用いたときも、４−イソプロピルシクロヘキサノールを用いたときと同様の傾向が見られる。
【０１３２】
以上説明したように、式（Ｉ）で表わされる化合物は、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ４およびＡＮＯ１からなる群より選ばれた少なくとも１種が関与する痒みを抑制することが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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