(57)【要約】【課題】新規な血栓予防用組成物を提供する。【解決手段】米糠酵素処理物を含む、血栓予防用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
米糠酵素処理物を含む、血栓予防用組成物。
【請求項２】
前記米糠酵素処理物が、米糠のプロテアーゼ処理物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記米糠酵素処理物が、米糠のサーモリシン処理物である、請求項１又は２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４】
経口組成物である、請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５】
食品組成物又は医薬組成物である、請求項１〜４の何れか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓予防用組成物に関する。より詳細には、本発明は米糠酵素処理物を含む血栓予防用組成物、さらには虚血性疾患予防用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞は、血管ずり応力、アセチルコリン、インスリンなどに応じて一酸化窒素を産生し、血管内皮機能を調節している。血管内皮細胞が一酸化窒素を産生する際には、血管内皮型一酸化窒素産生酵素（ｅＮＯＳ）が重要な役割を果たしている。血管内皮細胞から放出される一酸化窒素の生理機能の一つに血栓形成予防作用が知られている。一方、ｅＮＯＳの活性が抑制されると血栓発生の一要因になることも知られている。この知見をもとに、ｅＮＯＳを活性化させ、ｅＮＯＳの発現を促進させることなどにより、血栓の発生を予防する技術の開発が進められている。
【０００３】
血栓を生じさせる要因は、動脈硬化症状の進行などの慢性的な要因だけでなく、何らかの刺激によって生じる急性的な要因も知られており、効果的に血栓形成を予防するためには、日常的に継続して実施できるものが好ましい。したがって、安全性が高く、かつ容易に実施できる手段として、日常摂取できる食経験を有する食材料から効果を有するものを選択し、技術開発することがなされている。この観点から、ブドウ果実、果皮、種子、新芽又は茎の１つあるいは複数からなる素材から水とエタノールとの混合溶媒を用いて抽出する方法などにより得られるスチルベン誘導体であるレスベラトロールに優れた抗血栓作用が存在することが見出されている。しかし、食経験がある植物素材を由来としていても、レスベラトロールは天然界においてブドウ等に微量含有されるポリフェノールであることから、濃度を高める精製工程が必要であるだけでなく、高度に精製した場合は、食経験を超えた摂取量により、長期間摂取で毒性を生じたりするなどのリスクがあり、より簡便に入手でき、かつ安全性が高く、手軽に長期間使用できる効果的な技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−４１２９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、血管内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）をリン酸化し、酵素活性を発現させることで一酸化酸素の産生を増加させ、血栓形成を予防する技術である。本発明は、新規な血栓予防用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記した目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、米糠酵素処理物が優れたｅＮＯＳの活性化作用を有し、その結果血栓形成を予防できることを見出した。本発明者らはかかる知見に基づきさらなる研究を重ねることにより、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の項に記載の主題を包含する。
項１．米糠酵素処理物を含む、血栓予防用組成物。
項２．前記米糠酵素処理物が、米糠のプロテアーゼ処理物である、請求項１に記載の組成物。
項３．前記米糠酵素処理物が、米糠のサーモリシン処理物である、請求項１又は２に記載の組成物。
項４．経口組成物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
項５．食品組成物又は医薬組成物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の血栓予防用組成物は、古くから食経験がある植物から食品分野で使用される処理を施して得られるものであるから、長期に渡って摂取しても副作用を生じるなどの安全性上の懸念が全くない。この血栓予防用組成物を継続して摂取することにより、ｅＮＯＳの活性化が促進され、その結果、血液中に放出される一酸化窒素量が増加することにより血栓の形成を抑制若しくは予防し、その結果、虚血性心疾患や脳卒中などの虚血性疾患を予防できる効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＨＵＶＥＣｓを用いたｅＮＯＳのリン酸化効果の評価結果を示す。米糠酵素処理物とγ―オリザノールの各濃度におけるｅＮＯＳリン酸化効果をリン酸化修飾ｅＮＯＳ量／ｅＮＯＳ量の比で比較した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、血栓予防用組成物を包含する。本発明の血栓予防用組成物は、米糠酵素処理物を含む。なお、本明細書において、本発明の血栓予防用組成物を単に「本発明の組成物」と記載する場合がある。
【００１２】
本発明の組成物に含まれる米糠酵素処理物は、米糠をプロテアーゼ（ペプチダーゼを含む）により処理して得られるものである。
【００１３】
米糠は、玄米の果皮、種皮、外胚乳、糊粉層等であり、通常玄米の８〜１０重量％程度を占めており、玄米を搗精（精白）して白米を製造する際に副生するため、本発明ではこれを利用することができる。米糠は、赤糠、中糠、白糠に分けられることがあるが、何れの糠も使用することが出来る。この中でも、赤糠と中糠およびそれらの混合物が好ましく、赤糠と中糠の混合物が最も好ましい。
【００１４】
製造された米糠中には、例えば石などの異物や砕米を除去した後に、通常、熱風による気流乾燥などの公知の方法を用いて水分含有量を減少させる。特に限定するものではないが、通常、５〜１０％の水分量とすることが多い。これらの処理で得られる米糠は、空気中の酸素や日光などによる米糠含有成分の劣化や、米糠に内含されるリパーゼによって米糠中の油成分が分解されたりするため、時間単位で変質が生じるくらいに経時安定性が悪い。このため、前記で得られる米糠に対して、直ちに圧搾処理やサーモリシンなどの酵素処理を行なわない場合は、米糠の品質安定性向上のため、米糠に含まれる酵素の失活処理を施す必要がある。なお以下、玄米等から製造した未処理の米糠を生米糠という場合がある。酵素失活処理としては、通常、生米糠を７０〜１３０℃程度で加熱・焙煎することにより行われる。具体的には、常圧加熱処理、加圧加熱処理、水蒸気処理、沸騰水処理などの方法がある。この中でも、加圧加熱処理や水蒸気処理が好ましく、水蒸気処理が最も好ましい。
【００１５】
酵素処理に供する米糠としては、酵素反応の効率を考慮すると脱脂された米糠であることが好ましい。米糠の脱脂方法としては、通常、ヘキサンなどの溶媒を使用して脱脂する方法と圧搾により脱脂する方法が産業上行われている。このうち、有害成分になり得る溶媒の除去処理の必要がなく、また常温で液状でない油溶性の有用成分が除去されることのない圧搾法により得られる圧搾脱脂米糠が好ましい。圧搾法としては、脱脂した米糠の品質劣化を回避するため、低温圧搾法を使用することが好ましい。具体的には、加熱焙煎処理され１００〜１１５℃程度になった米糠を低温連続圧搾機（例えば、テクノシグマ社より販売されているミラクルチャンバー）により圧搾することで行う。圧搾処理による米糠からの搾油は、ヘキサンなどの溶媒抽出とは異なり、搾油処理後の米糠に油成分が残留する特徴がある。本発明で酵素処理に供する圧搾で得られる脱脂米糠（以下、圧搾脱脂米糠という場合がある）は、圧搾後の脱脂米糠中の脂質が５〜２０質量％程度となるまで圧搾し得られるものが好ましい。なお、酵素失活処理前に、生米糠や圧搾脱脂米糠に含まれる水分含有量を低減させる等の目的で乾燥処理を行っても良い。また、圧搾脱脂米糠は公知の方法により粉砕、分級し、粉末状とすることが好ましい。この際、粉末の平均粒子径は、５〜２００μｍが好ましく、１０〜１５０μｍがより好ましく、４０〜１００μｍが最も好ましい。なお、脱脂米糠中の脂質含量は、上述の通り５〜２０質量％が好ましく、７〜１５質量％がより好ましい。なお、市販されている、上記のような脱脂米糠を購入して用いることもできる。このような市販脱脂米糠としては、例えばヌカップ（株式会社東京ブレフ製）やハイブレフ（サンブラン株式会社製）を挙げることができる。
【００１６】
また、本願における米糠としては、米糠の水若しくは水−エタノール混合液で抽出される抽出物も含まれる。（以下、「米糠溶媒抽出物」という。）米糠の抽出に用いる溶媒としては、水のほか、水とエタノールの混合液を使用できる。抽出溶媒として水とエタノールの混合液を用いる場合、当該混合液におけるエタノールの含有量は特に限定されず、任意の割合とすることができる。例えば、当該エタノール−水混液におけるエチルアルコールの含有量は２５〜７５％（ｗｔ／ｗｔ）程度であり、４５〜５５％（ｗｔ／ｗｔ）程度であることが好ましく、５０％（ｗｔ／ｗｔ）程度であることがより好ましい。好ましい溶媒は水である。抽出方法や条件については公知の方法を用いることが出来る。抽出処理して得られた処理物は、そのまま酵素処理に用いることが出来るが、濾過、濃縮、乾燥などの処理を施した後に酵素処理しても良い。酵素処理は、当該米糠溶媒抽出物に対して、後述する酵素を加えて処理することで、米糠酵素処理物を得ることができる。
【００１７】
米糠酵素処理物の調製に用いる酵素としては、米糠に含まれるタンパク質やポリペプチドを分解することができるタンパク質分解酵素（プロテアーゼ：ペプチダーゼも含む）であれば特に限定的ではなく、公知の酵素を用いることができる。このような酵素としては、例えば、トリプシン（ＥＣ３．４．２１．４）、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、サーモリシン（ＥＣ３．４．２４．２７）、キモトリプシン（ＥＣ３．４．２１．１、ＥＣ３．４.２１．２）などが挙げられる。なお、カッコ内の記載は、酵素番号（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）である。中でも、サーモリシンが好ましい。なお、本明細書において、米糠酵素処理物を、酵素処理に用いる酵素に応じて、例えば、米糠プロテアーゼ処理物、米糠サーモリシン処理物、米糠キモトリプシン処理物などと表記する場合がある。
【００１８】
米糠の酵素処理に用いる酵素は、例えば、市販品を購入して用いることができる。例えば、サーモリシンは、株式会社ペプチド研究所、大和化成株式会社、ナカライテスク株式会社、天野エンザイム、和光純薬工業株式会社等から購入することができる。
【００１９】
米糠酵素処理物を得るための酵素処理条件は、用いる酵素の活性が得られる条件であれば特に限定的ではなく、適宜決定することができる。例えば、酵素としてサーモリシンを用いる場合、米糠及びサーモリシンを水に混合したうえ、３０℃〜７０℃で穏やかに撹拌しながら１０〜３０時間程度反応させることで処理を行うことができる。反応条件における温度や反応時間については、使用する製造機器の構造・機能や用いるサーモリシンの純度などにより至適条件は相違する。したがって、工業的には３５〜６０℃（さらに好ましくは５０〜６０℃）付近で反応温度を決定することが好ましい。なお、当該処理後、品質を安定化させるなどの目的でサーモリシンを失活させてもよい。サーモリシンの失活処理は、例えば加熱（例えば、１００℃、１０〜２０分程度の処理）等により行うことが出来る。さらに、処理後にろ過や遠心分離などを行って濾液等の回収や、得られた濾液等に対して濃縮、乾燥、カラム処理などの精製を行ってもよい。
【００２０】
上記の通り、米糠酵素処理物は米糠を酵素処理することにより得られるものであり、米糠酵素処理物には、米糠に含まれるタンパク質やポリペプチドの酵素分解物が含まれる。
【００２１】
本発明の血栓予防用組成物は、上記した米糠処理物そのものであってもよいし、当該米糠酵素処理物に加え、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的又は食品衛生学的に許容され得る担体などが挙げられる。
【００２２】
本発明の組成物は、経口組成物として利用することができる。経口組成物としては、例えば、食品組成物、医薬組成物などとして利用することができる。また、本発明の組成物に含まれる米糠酵素処理物は、ｅＮＯＳの活性化を促進し、その結果、血液中に放出される一酸化窒素量が増加することにより血栓の形成を抑制若しくは予防し、その結果、虚血性心疾患や脳卒中などの虚血性疾患を予防できる効果が期待できる組成物として好ましく利用することができる。
【００２３】
本発明の組成物は、１回又は複数回（好ましくは２〜３回）に分けて摂取することができる。また、摂取対象としてはヒトが好ましいが、ヒト以外の非ヒト哺乳動物であってもよい。
【００２４】
本発明の組成物の形態としては特に限定されないが、経口組成物として利用する場合には、例えば、ハードカプセル、ソフトカプセル、サプリメント、チュアブル錠、飲料、粉末飲料、顆粒、フィルムなどの形態とすることができる。また、飲食品として使用する場合には、例えば、茶系飲料、スポーツ飲料、美容飲料、果汁飲料、炭酸飲料、アルコール飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、水や湯、炭酸水等で希釈する濃縮タイプの飲料等の飲料、水や湯等に溶解又は懸濁させて飲用する粉末や顆粒、タブレット等の乾燥固形物、タブレット菓子、ゼリー類、スナック類、焼き菓子、揚げ菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、グミなどの菓子類、スープ類、めん類、米飯類、シリアル等などの食品形態にすることもできる。このうち通常の生活において利用する場合には、サプリメントタイプ、チュアブル錠、ワンショットドリンクタイプなどの形態が好ましく、運動効果を高める目的で摂取する場合には、スポーツ飲料などの飲料の形態が最も好ましい。さらに、これらの経口組成物は容器に充填された容器詰食品として消費者に提供することができる。容器は密封できるものであれば特に限定されない。
【００２５】
錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤などの場合は、乾燥物換算で経口組成物全量に対して、本発明の組成物を０．０１〜９５質量％程度、好ましくは５〜９０質量％程度、最も好ましくは１０〜８０質量％程度配合すればよい。上記以外の経口組成物の場合は、本発明の組成物を０．００１〜５０質量％程度、好ましくは０．００５〜３０質量％程度、最も好ましくは０．０１〜１０質量％程度配合すればよい。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００２７】
製造例：米糠酵素処理物の調製
本製造例では、米糠としてハイブレフ（サンブラン社製）を、酵素としてサーモリシンを３％含有している酵素製剤を用いた。なお、ハイブレフは、米糠を圧搾することにより脱脂を行った圧搾脱脂米糠である。水に米糠を３０ｇ／Ｌとなるように混合し、これにサーモリシンを０．００４５ｇ／Ｌとなるように加えた。そして、当該混合物を５５℃で１５時間撹拌した。その後、８０℃で５分間撹拌し、酵素失活させた。次いで、得た処理液に珪藻土を用いてろ過した後に濃縮し、さらに濃縮液を１２１℃１５分間殺菌した。このようにして得た殺菌済みの濾液を凍結乾燥し、米糠酵素処理物を得た。
【００２８】
試験例：ｅＮＯＳのリン酸化効果の確認  
ｅＮＯＳはセリン残基がリン酸化を受けることにより活性が亢進されることが知られていることから、本願の米糠酵素処理物におけるｅＮＯＳリン酸化修飾効果を確認した。
サンプルとして、上記製造例で調製した米糠酵素処理物（図では「ＨＢ−Ｔ」と表記する）を用い、ポジティブコントロールとしては、γ―オリザノール（図では「ｏｒｙｚａ」と表記する）を用いた。ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ; ＨＵＶＥＣｓ）を解凍し、１０％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１３１培地（ＭＣＤＢ１３１, １０％ＦＢＳ, １０ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎ, １％抗生物質, １０μｇ/ｍＬ ＦＧＦ)で３ 日間培養した。その後、４．４×１０４ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるように調製し、ＴｙｐｅＩコラーゲンコート６ｗｅｌｌプレート（住友ベークライト社製）に播種した。細胞がコンフルエントになった後、２％ＦＢＳを含有するＭＣＤＢ１３１培地に交換し、約１６時間後、被験物質米糠酵素処理物、γ―オリザノール）を２％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１３１培地に目的の濃度になるよう溶解することによって投与した。被験物質投与後、３時間または６時間培養した細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤を添加したＭＰＥＲを用いて細胞を回収した。回収した細胞を超音波破砕し遠心分離後、上清を採取しＬａｎｅｍａｒｋｅｒ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを添加し、加熱することによってタンパク質を変性させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の電気泳動を行い、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜はｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてウエスタンブロットを行った。なお、リン酸化修飾ｅＮＯＳ、全ｅＮＯＳは１:２５０、ＧＡＰＤＨ-ＨＲＰは１:１０００、二次抗体は１:３０００ 希釈で実施した。検出試薬を用いてＰＶＤＦ膜を化学発光させ、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)システムを用いて検出した。得られた結果を図１に示す。
【００２９】
図１に示したとおり、米糠酵素処理物（ＨＢ−Ｔ）はポジティブコントロールのγ―オリザノール（ｏｒｙｚａ）と同等以上のｅＮＯＳリン酸化修飾作用を有し、その効果は試験した濃度範囲において濃度依存的に亢進することがわかった。ｅＮＯＳはリン酸化されることにより活性化され、一酸化窒素の産生促進するので、優れた血栓予防効果を有する。
【図１】
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