【手続補正書】
【提出日】平成27年4月13日(2015.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物のゲノムＤＮＡを解析する方法であって、
（ａ）生物のゲノムＤＮＡの異なるポリヌクレオチドを含むサンプルを分注して、各アリコートが前記異なるポリヌクレオチドのいくつかを含み、ゲノムＤＮＡのハプロイドゲノム相当物よりも少なく含む、複数のアリコートを生成することと、
各アリコート中の前記ポリヌクレオチドを断片化して、各アリコート中のポリヌクレオチドの断片を生成することと、
前記断片をアリコート特異的タグ配列でタグ付けすることと、
（ｂ）各アリコート中の断片を配列決定して、各アリコートからゲノム配列およびタグ配列を含む複数のリードを生成することと
（ｃ）前記リードのアリコート特異的タグ配列を使用して各アリコートからの前記リードをアセンブルして、生物のゲノムの少なくとも一部に対応し、７０パーセント以上のコールレートで、メガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、アセンブルされた配列を生成することと
を含む、方法。
【請求項２】
ゲノムが哺乳類ゲノムであり、アセンブルされた配列が７０パーセント以上のゲノムコールレートおよび７０パーセント以上のエキソームコールレートを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ゲノムが少なくとも１ギガベースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アリコート特異的タグ配列がポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アリコート特異的タグ配列がエラー修正コードまたはエラー検出コードを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列決定する前に、アリコート中の断片をプールすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アセンブルされた配列がアセンブルされた配列の位置にベースコールを含み、ベースコールが２種以上のアリコートから出自する場合に、前記ベースコールを真実と同定することをさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
サンプルが１ｐｇから１０ｎｇの間のゲノムＤＮＡを含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
各アリコート中の前記断片を増幅することをさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ゲノムＤＮＡが、ゲノム、エキソーム、メチローム、異なる生物のゲノムの混合物、ある生物の異なる細胞種のゲノムの混合物およびそれらのサブセットからなる群から選択されるものに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アセンブルされた配列がゲノムの８０×以下のカバレッジを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アセンブルされた配列の位置の塩基が、予備的ベースコールに基づいて、２種以上のアリコートからの位置にコールされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
リードをアセンブルすることが、ゲノムの特定の位置の偽のベースコールを同定することを含み、前記偽のベースコールは、前記特定の位置にアリコートの第２の数に現れる異なるベースコールも含むアリコートの第１の数に現れるとき、アリコートの第２の数がアリコートの第１の数より大きい場合に同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
リードをアセンブルすることが、
ゲノムの特定の位置にある第１のベースコールの第１のスコアを決定することと、ここで、アリコートの第１の数に基づく第１のスコアが第１のベースコールを含む、
第１のスコアを第１の閾値と比較することと、
スコアが第１の閾値を上回るか、または下回るかどうかに基づいて、第１のベースコールが認められる、またはエラーであるかどうかを同定すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
スコアのすべてが第１の閾値を下回る場合、特定の位置がコールなしであると決定される、特定の位置でのその他のベースコールの１種または複数のその他のスコアを決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２つのスコアが第２の閾値を超える場合、特定の位置がゲノムにおいてヘテロ接合性であると決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
７０パーセント以上のコールレートで、メガベースあたり１より少ない偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、哺乳類のゲノムのアセンブルされた配列。
【請求項１８】
生物のゲノムＤＮＡを解析する方法であって、
（ａ）１ｐｇ〜１０ｎｇのゲノムＤＮＡを含むサンプルを用意することと、
（ｂ）ゲノムＤＮＡを増幅して、増幅された核酸を生成することと、
（ｃ）増幅された核酸を配列決定して、リードを生成することと、
（ｄ）前記リードをアセンブルして、生物のゲノムの少なくとも７０パーセントのコールレートを有するアセンブルされた配列を生成することと
を含む、方法。
【請求項１９】
サンプルが未精製である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ゲノムＤＮＡの増幅が多重置換増幅によって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ゲノムＤＮＡを少なくとも１０００倍増幅することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
サンプルが、生物の１〜２０個の細胞または前記細胞から単離されたゲノムＤＮＡを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ゲノムＤＮＡおよび細胞夾雑物を含む細胞を溶解することをさらに含み、ここで、ゲノムＤＮＡの増幅が細胞夾雑物の存在下で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞が、生物の血液からの循環非血液細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
アセンブルされた配列がメガベースあたり２以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
サンプルのゲノムＤＮＡを分注して、各アリコートがゲノムＤＮＡのハプロイドゲノム相当物よりも少なく含む複数のアリコートを生成することを含み、ここで前記ゲノムＤＮＡの増幅が各アリコートにおいて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
各アリコート中の増幅された核酸を断片化して、各アリコート中の増幅された核酸の断片を生成することと、
各アリコート中の増幅された核酸の断片をアリコート特異的タグでタグ付けして、各アリコート中のタグ付けした断片を生成することと
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アセンブルされた配列の位置の塩基が、予備的ベースコールに基づいて、２種以上のアリコートからの位置にコールされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
リードをアセンブルすることが、ゲノムの特定の位置の偽のベースコールを同定することを含み、前記偽のベースコールは、前記特定の位置にアリコートの第２の数に現れる異なるベースコールも含むアリコートの第１の数に現れるとき、アリコートの第２の数がアリコートの第１の数より大きい場合に同定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
リードをアセンブルすることが、
ゲノムの特定の位置にある第１のベースコールの第１のスコアを決定することと、ここで、第１のアリコートに基づく第１のスコアが第１のベースコールを含む、
第１のスコアを第１の閾値と比較することと、
スコアが第１の閾値を上回るか、または下回るかどうかに基づいて、第１のベースコールが認められる、またはエラーであるかどうかを同定すること
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
スコアのすべてが第１の閾値を下回る場合、特定の位置がコールなしであると決定される、特定の位置でのその他のベースコールの１種または複数のその他のスコアを決定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
２つのスコアが第２の閾値を超える場合、特定の位置がゲノムにおいてヘテロ接合性であることが決定されることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ベースコールが２種以上のアリコートからのリード中に存在する場合に、アセンブルされた配列の位置でのベースコールが真実として認められる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
生物がヒトである、請求項１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
メガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体および少なくとも７０パーセントのコールレートを有するアセンブルされた全ヒトゲノム配列であって、１ｐｇ〜１０ｎｇの間のヒトゲノムＤＮＡを配列決定することによって生成される、アセンブルされた全ヒトゲノム配列。
【請求項３６】
複数の染色体を含む生物のゲノムの配列変異体をフェージングする方法であって、
前記複数の染色体各々のベクターフリー断片の混合物を含むサンプルを用意することと、
ベクターフリー断片を配列決定して、複数のリードを生成することと、
複数のリードをアセンブルして、複数の配列変異体を含むゲノム配列を得ることと、
配列変異体をフェージングすることと、ここで、ゲノム配列は、メガベースあたり１より少ない偽の単一ヌクレオチド変異体を有する
を含む、方法。
【請求項３７】
配列変異体の少なくとも７０パーセントをフェージングすることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ゲノム配列がゲノムの少なくとも７０パーセントのコールレートを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
サンプルが１ｐｇ〜１０ｎｇのゲノムを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ヒトゲノムを配列決定する方法であって、
ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートがヒトゲノムＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、
各アリコートからの前記ヒトゲノムＤＮＡを配列決定して、各アリコートから複数のリードを生成することと、
各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、第１のアセンブルされた配列を生成することと、
第１のアセンブルされた配列における複数の配列変異体を同定することと、
配列変異体のうち少なくとも３種をフェージングすることと、
エラーとして、前記少なくとも２種のその他の配列変異体のフェージングと一致しない配列変異体を同定し、それによって第２のアセンブルされた配列を生成することと
を含み、第２のアセンブルされた配列が、７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、方法。
【請求項４１】
ヒトゲノムを配列決定する方法であって、
ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートがヒトゲノムＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、
各アリコート中の前記ヒトゲノムＤＮＡを断片化して、各アリコート中のＤＮＡ断片を生成することと、
各アリコート中のＤＮＡ断片をアリコート特異的タグでタグ付けし、それによって、タグ付けされたＤＮＡ断片が出自するアリコートが決定可能となることと、
各アリコートからのタグ付けされたＤＮＡ断片を配列決定して、各アリコートから複数のリードを生成することと、
各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含むアセンブルされた配列を生成することと
を含み、前記アセンブルされた配列の位置の塩基が、予備的ベースコールに基づいて、２種以上のアリコートからの位置にコールされる、方法。
【請求項４２】
ヒトゲノムを配列決定する方法であって、
ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートがヒトゲノムＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、
各アリコート中の前記ヒトゲノムＤＮＡを断片化して、各アリコート中のＤＮＡ断片を生成することと、
各アリコート中のＤＮＡ断片をアリコート特異的タグでタグ付けし、アリコート特異的タグによって、タグ付けされたＤＮＡ断片が出自するアリコートが決定可能となることと、
各アリコートからの前記タグ付けされたＤＮＡ断片を配列決定して、各アリコートから複数のリードを生成することと、
各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、第１のアセンブルされた配列を生成することと、
前記第１のアセンブルされた配列の位置に、２種以上のアリコートからの前記位置についての予備的ベースコールに基づいて、塩基をコールすること、ならびに
前記第１のアセンブルされた配列中の複数の配列変異体を同定すること、配列変異体のうち少なくとも３つをフェージングすること、および少なくとも２種のその他の配列変異体のフェージングと一致しない配列変異体をエラーと同定することによって、
第１のアセンブルされた配列中のエラーを低減して、第２のアセンブルされた配列を生成することと
を含み、第２のアセンブルされた配列が７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、方法。
【請求項４３】
操作を行うためにプロセッサを制御するための複数の命令を保存するコンピュータによって読み取り可能なメディアであって、前記命令は、
複数のアリコートからゲノムＤＮＡの断片に対応する複数のリードを受け取ること、ここで、ゲノムＤＮＡの各断片はアリコート特異的タグ配列でタグ付けされており、各リードはゲノムＤＮＡの断片およびアリコート特異的タグ配列からの配列を含み、各アリコートはゲノムＤＮＡのハプロイドゲノム相当物よりも少なく含む;
リードがアリコート特異的タグ配列を同定することにより出自するアリコートを決定することと、
前記リードのアリコート特異的タグ配列を使用して各アリコートからの前記リードをアセンブルして、生物のゲノムの少なくとも一部に対応し、７０パーセント以上のコールレートで、メガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、アセンブルされた配列を生成することと
を含む、コンピュータによって読み取り可能なメディア。