【手続補正書】
【提出日】平成27年2月10日(2015.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型対照と比較して、増加したイソ酪酸の生合成を示すために改変された組み換え微生物細胞であって、前記細胞がイソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ分子を含む、細胞。
【請求項２】
前記細胞が、サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））などの真菌細胞；又は前記細胞が、プロトバクテリア門（ｐｈｙｌｕｍ Ｐｒｏｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバー、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、ファーミキューテス門（ｐｈｙｌｕｍ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のメンバー、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、若しくはストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ））などの細菌細胞である、請求項１に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項３】
前記イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドが、アルデヒドデヒドロゲナーゼを含み；任意によりここで、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＰａｄＡ）を含み；又は任意によりここで、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＢ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３‐ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＨ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コハク酸セミアルデヒドデヒロドゲナーゼ（ＧａｂＤ）、若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）γ‐アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＹｄｃＷ）を含み；又は任意によりここで、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、Ｂ．アンビファリア（Ｂ．ａｍｂｉｆａｒｉａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨba）を含み；又は任意によりここで、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨpp）を含む、請求項２に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項４】
前記細胞が、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンをさらに含み、ここで前記遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドが、野生型ポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示し；任意によりここで、前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、アルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたａｄｈＥ若しくは遺伝子的に改変されたａｄｈＰによってコードされるポリペプチドを含むものなどを含み；又は任意によりここで、前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、エタノールアミン利用タンパク質、例えば、遺伝子的に改変されたｅｕｔＧによってコードされるポリペプチドを含むものなどを含み；又は任意によりここで、前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、遺伝子的に改変されたｙｉａＹ、遺伝子的に改変されたｙｑｈＤ、若しくは遺伝子的に改変されたｙｉｇＢによってコードされるポリペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項５】
前記触媒活性の低下が、野生型と比較して、少なくとも５０％低下を含む、請求項４に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項６】
前記細胞が、ピルビン酸の、乳酸塩、ギ酸塩、及び酢酸塩の任意の１つ以上への変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンをさらに含み、ここで前記遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドが、野生型のポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示し、任意によりここで、遺伝子的に改変されたポリペプチドが、乳酸デヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたｌｄｈＡによってコードされるポリペプチドを含むものなどを含み；又は任意によりここで、前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、ピルビン酸ギ酸リアーゼＩ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｆｌＢによってコードされるポリペプチドを含むものなどを含み；又は任意によりここで、前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、ピルビン酸オキシダーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｏｘＢによってコードされるポリペプチドを含むものなどを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項７】
前記細胞が、アセチル‐ＣｏＡのエタノール又はアセチル‐Ｐへの変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンをさらに含み、ここで前記遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドが、野生型のポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示し、；任意によりここで、遺伝子的に改変されたポリペプチドが、アルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたａｄｈＥによってコードされるポリペプチドを含むものなどを含み；又は任意によりここで、遺伝子的に改変されたポリペプチドが、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｔａによってコードされるポリペプチドを含むものなどを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項８】
２‐ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドをさらに含み、任意によりここで、前記ポリペプチドが、２‐ケト酸デカルボキシラーゼを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み換え微生物細胞；又はピルビン酸の２‐ケトイソ吉草酸への変換を連続して触媒する複数のポリペプチドをさらに含み、任意によりここで、前記複数のポリペプチドが、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、及びアセト乳酸シンターゼの１つ以上を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項９】
イソブチレートを生成するために組み換え細胞に有効な条件下、炭素源を含む培地において、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み換え微生物細胞をインキュベートすることを含む方法であって、ここで前記炭素源が、グルコース、図１の化合物６、図１の化合物７、図１の化合物８、図１の化合物９、及び図１の化合物１０の１つ以上を含む、方法。
【請求項１０】
改変された宿主細胞が、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するように、プロモーターと作動可能に連結した、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入することを含む方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））などの真菌細胞；又は前記細胞が、プロトバクテリア門（ｐｈｙｌｕｍ Ｐｒｏｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバー、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、ファーミキューテス門（ｐｈｙｌｕｍ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のメンバー、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、若しくはストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ））などの細菌細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、請求項１〜８に記載の組み換え微生物細胞の１つ以上を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
イソブチレートを他の化合物に変換する１つ以上のステップをさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
イソブチルアルデヒドをイソブチレートに変換する能力を増加するために改変されたイソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒する少なくとも１つの内因性酵素を含み、さらに、イソブチルアルデヒドのイソブチレート以外の産物への変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンを含む、遺伝子的に改変された微生物細胞であって、ここで前記遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドが、野生型のポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示す、細胞。
【請求項１５】
前記遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドが、遺伝子的に改変されたバージョンのアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項１４に記載の遺伝的に改変された微生物細胞。