(57)【要約】      （修正有）【課題】汎用性が高く、組織の健全性自体を確認することができる培養組織の直接的検査方法を提供する。【解決手段】培養組織Ｔｓの直接的検査方法は、ポジトロン核種を含むトレーサが添加された培養液でシート状の培養組織Ｔｓを培養し、前記培養組織Ｔｓをイメージングチャンバ内１０に配置し、バイオラジオグラフィ法またはリアルタイムバイオラジオグラフィ法により前記培養組織Ｔｓにおける放射能分布を示す画像をラジオルミノグラフィプレート２０で取得する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポジトロン核種を含むトレーサが添加された培養液でシート状の培養組織を培養し、
前記培養組織をイメージングチャンバ内に配置し、
バイオラジオグラフィ法またはリアルタイムバイオラジオグラフィ法により前記培養組織における放射能分布を示す画像を取得する、
培養組織の直接的検査方法。
【請求項２】
前記トレーサは、フルオロデオキシグルコースおよび酸素ガスのいずれかである、請求項１に記載の培養組織の直接的検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養組織の直接的検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞やｉＰＳ細胞から組織や臓器を作製し、宿主に移植する再生医療が具現化されつつある。これに伴い、厚生労働省は平成２６年「再生医療等製品の製造管理及び品質管理の基準」を定め、当該組織・臓器の品質、有効性、安全性や人の健康に与える影響を適正に評価することが求められている。しかし、現在行われている品質管理では、並行培養した組織・臓器に実施されており、移植する組織・臓器そのものの安全性・健全性（癌化、細胞生存率など）が事前評価されてはいない。
【０００３】
この点について、特許文献１には、培養組織の硬さ情報を測定し、測定結果に基づいて細胞の増殖および産生基質の量の状態を把握し、当該状態に基づいて、培養組織の移植適性を判定する培養組織の品質管理方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−７６４０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の方法は、培養組織に与えるダメージが小さいため、移植に供する培養組織を直接検査できる利点があるが、培養期間の経過に伴って組織の硬さまたは弾性が変化する組織にしか適用できないため、すべての組織に適用できるわけではない。また、組織の硬さや弾性のみを見ているため、実際の組織の健全性自体を見ていないという点でも改善の余地がある。
【０００６】
上記事情を踏まえ、本発明は、汎用性が高く、組織の健全性自体を確認することができる培養組織の直接的検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポジトロン核種を含むトレーサが添加された培養液でシート状の培養組織を培養し、前記培養組織をイメージングチャンバ内に配置し、バイオラジオグラフィ法またはリアルタイムバイオラジオグラフィ法により前記培養組織における放射能分布を示す画像を取得する培養組織の直接的検査方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の培養組織の直接的検査方法は、汎用性が高く、かつ組織の活性自体を確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施形態に係る培養組織の直接的検査方法の流れを示すフローチャートである。
【図２】バイオラジオグラフィ法の原理を模式的に示す図である。
【図３】リアルタイムバイオラジオグラフィ法の原理を模式的に示す図である。
【図４】対照組織およびＳＤＳ処理組織における細胞生存率を示すグラフである。
【図５】対照組織およびＳＤＳ処理組織におけるＦＤＧ取り込み量を示すグラフである。
【図６】バイオラジオグラフィ法により取得された、対照組織およびＳＤＳ処理組織のＦＤＧ集積画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一実施形態について、図１から図６を参照して説明する。図１は、本実施形態の培養組織の直接的検査方法（以下、単に「検査方法」と称する。）の流れを示すフローチャートである。
【００１１】
本実施形態の検査方法は、トレーサを培養組織に取り込ませる第一工程Ｓ１０と、第一工程が終了した培養組織をイメージングチャンバに配置する第二工程Ｓ２０と、イメージングチャンバ内の培養組織の画像を取得する第三工程Ｓ３０とを備える。
【００１２】
本実施形態の検査方法は、患者から採取した細胞で作製したｉＰＳ細胞や、幹細胞等を培養することにより、患者に移植するために作成された組織や臓器等を主な対象として想定している。検査対象となる組織や細胞の種類、および培養方法等については特に制限はなく、適宜選択することができる。
培養組織の形状は、第三工程において適切に評価できる画像を取得する観点から、概ね均一な厚さを有するシート状とされる。シート状の培養組織は、厚さ方向にも数個の細胞が積み重なるよう形成されるのが好ましい。積み重なる細胞の数（層数）は、放射能分布画像取得に最低限必要な強度の信号を得る観点からは、５以上が好ましく、部位ごとの分布が精度よく示された画像を取得する観点からは、１０以下が好ましい。
【００１３】
第一工程Ｓ１０では、シート状の培養組織が、ポジトロン核種を含むトレーサを含む培養液内で培養される。これにより、トレーサの細胞内への取り込み等が進む。
トレーサとしては、現在企業による供給体制が確立されている、ポジトロン核種１８Ｆを含むフルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）が入手しやすく、好適である。トレーサとして１８Ｆ−ＦＤＧを用いた場合は、第三工程で取得される画像により、培養組織の細胞による糖の取り込み（糖代謝）を評価することができる。
【００１４】
上述した１８Ｆ−ＦＤＧの他、サイクロトロン等で生成されるポジトロン核種を用いて製造される様々なトレーサを用いることで、培養組織における種々の代謝や機能等に関する検査を行うことができる。他のトレーサの例としては、例えば、ポジトロン核種として１８Ｆを用いた１８Ｆ−フッ化ナトリウム、ポジトロン核種として１５Ｏを用いた１５Ｏ−酸素ガス、１５Ｏ−一酸化炭素ガス、１５Ｏ−二酸化炭素ガス、１５Ｏ−水、ポジトロン核種として１１Ｃを用いた１１Ｃ−メチオニン、１１Ｃ−酢酸、１１Ｃ−コリン、１１Ｃ−ラクロプライド、１１Ｃ−フルマゼニル、およびポジトロン核種として１３Ｎを用いた１３Ｎ−アンモニア等を挙げることができる。
【００１５】
続く第二工程Ｓ２０において、第一工程を終えた培養組織が培養液を収容したイメージングチャンバ内に配置される。イメージングチャンバ内には酸素等が供給されており、培養組織の生存能を保持しつつイメージングを行うことができる。
【００１６】
続く第三工程Ｓ３０において、イメージングチャンバ内に配置された培養組織から放出される放射線を示す画像が取得される。画像の取得方法としては、バイオラジオグラフィ法、およびリアルタイムバイオラジオグラフィ法のいずれかを用いることができる。
【００１７】
図２に、バイオラジオグラフィ法の原理を模式的に示す。
バイオラジオグラフィ法では、生きている（生存能を有する）組織Ｔｓにおけるポジトロン核種から放出される放射線（β線）を、イメージングチャンバ１０の下部に設置したラジオルミノグラフィ（ＲＬＧ）プレート２０に記録することにより、組織Ｔｓ中のポジトロン核種の２次元分布を記録する。ＲＬＧプレート２０を所定時間ごとに交換することで、所定時間ごとのポジトロン核種２次元分布画像を取得することができ、組織Ｔｓにおけるポジトロン核種２次元分布の動的な評価が可能になる。
【００１８】
図３に、リアルタイムバイオラジオグラフィ法の原理を模式的に示す。リアルタイムバイオラジオグラフィ法では、イメージングチャンバ１０の下方に、組織Ｔｓ中のポジトロン核種から放出される放射線を光に変換するシンチレータ３０が、ＲＬＧプレート２０に代えて配置されている。シンチレータ３０から発せられる光を、フォトンカウンティングカメラ４０で取得することにより、組織Ｔｓ中のポジトロン核種の２次元分布をリアルタイムに画像化することができる。シンチレータ３０においてイメージングチャンバ１０側を鏡面にすると、（１）放射線計測効率の向上、（２）試料の明暗の計数効率に対する影響の排除、（３）チェレンコフ光、生物発光などに起因するバックグラウンドの影響の排除、等の効果が得られるため、好ましい。
リアルタイムバイオラジオグラフィ法に好適に使用可能な装置としては、例えば発明者が出願した特開２００４−２１２２２４号公報に記載の放射線検出装置を挙げることができる。
【００１９】
冒頭に説明したように、平成２６年「再生医療等製品の製造管理及び品質管理の基準」では、移植に用いる組織・臓器等の品質、有効性、安全性や人の健康に与える影響を適正に評価することが求められている一方、品質管理は、並行培養した組織・臓器に行われることとなっている。実際に患者に移植される組織と並行培養した組織とは、培養環境は同一であるものの、組織としては同一ではない。したがって、並行培養を用いた品質管理は、移植される組織を直接検査していないという点でその信頼性に限界がある。
【００２０】
移植する組織については、その組織を構成する細胞の活性の良し悪しや、細胞生存率の高低が、移植後の生着率等を大きく左右するため、組織の代謝や機能等を正確に評価することは重要である。また、癌化等の異常が起こっている組織を移植することも避けなければならない。癌化した組織は正常組織に比べて代謝や細胞増殖等が異常に高まっていることが多いため、これらの項目を正確に評価することで、このような移植組織における癌化の可能性も見極めることが可能である。
【００２１】
細胞ひいてはその集合体としての組織の活性を直接評価する方法としては、各種の蛍光試薬や化学発光試薬を用いた方法が知られている。これらの方法に関する大きな問題の一つは、これらの試薬が細胞にとって基本的に毒であることである。したがって、蛍光試薬や化学発光試薬を用いて活性等を正確に評価することはできても、評価自体が組織にダメージを与えるため、評価後の組織を移植に用いることはできない。
【００２２】
このように、移植に供する組織等の活性等を直接評価でき、かつ評価後の組織にダメージを与えない方法はこれまで存在しなかった。発明者は、ポジトロン核種を含むトレーサと、バイオラジオグラフィとを組み合わせることにより、これを実現できることを見出した。
バイオラジオグラフィ法、リアルタイムバイオラジオグラフィ法のいずれも、これまでは例えば脳組織のスライス等が主な測定対象であり、その目的も脳疾患や、脳組織の活性等を見ることであったため、上記知見は非常に新しいものである。
【００２３】
１８Ｆ−ＦＤＧを始めとするポジトロン核種含有トレーサは、現在ヒトを対象とするＰＥＴ（ポジトロン断層撮影法）検査に静脈注射により用いられており、その安全性が確立している。また、１８Ｆ−ＦＤＧは、ＰＥＴによる癌診断に用いられており、癌化した組織の検出についても実績が積み重ねられている。さらに、ポジトロン核種含有トレーサの使用量は、蛍光試薬や化学発光試薬に比べて非常に微量である上、最も半減期が長い１８Ｆであってもその長さは１１０分であり、使用後２日間で放射線量はほぼゼロとなる。
【００２４】
以上より、ポジトロン核種含有トレーサは、検査対象の組織にほとんどダメージを与えないため、本実施形態の検査方法においては、検査後の組織を問題なく再生治療に使用することが可能になる。その結果、移植に用いる組織の検査を、直接かつ超低侵襲の態様で実行することができる。
【００２５】
本発明は、再生医療の安全性向上に絶大な寄与をもたらすものであり、再生医療普及の大きな原動力となりうる。例えば、並行培養が不要となるため、移植組織の作製コストを著しく低減することができる。あるいは、並行培養に代えて、治療に用いるための候補組織を複数培養し、本発明に係る検査の結果に基づいて、最も好適と思われる組織を選択して治療に用いることもできる。さらには、本発明に係る検査の結果、癌化が疑われる部位が見つかった場合は、当該部位を除去した上で治療に用いたり、他の候補組織を選択したりして患者に対するリスクを低減することもできる。
【００２６】
加えて、ポジトロン核種およびトレーサの基本物質を適切に選択することで、組織を構成する細胞の、代謝、呼吸、増殖、レセプター活性など、多種多様な情報を検査により取得することができる上、検査項目を適切に設定することにより、多くの種類の組織等の検査や品質管理に適用することができ、極めて汎用性が高い。
【００２７】
本実施形態の培養組織の直接的検査方法について、実験データを示して説明する。以下の実験では、培養組織としてヒト３次元培養表皮組織を、ポジトロン核種含有トレーサとして１８Ｆ−ＦＤＧを用いている。
【００２８】
ヒト３次元培養表皮組織として、（ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ  ２４  ６Ｄ）をジャパン・ティッシュ・エンジニアリング（Ｊ−ＴＥＣ）より入手し、３日間２５℃インキュベータ上で保管した。実験前に０．５ｍＬアッセイ培地に移し、ＣＯ２インキュベータにて３７℃、６０分間培養した。
【００２９】
４つの培養組織の容器内に、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で溶解したＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウムを５０μＬ添加し、培養組織の細胞にダメージを与えた。ＳＤＳの濃度（質量％）は、それぞれ、０．１％、０．５％、１．０％、５．０％とした。対照の培養組織を準備し、こちらにはＰＢＳのみを５０μＬ添加した。
いずれの培養組織も添加１０分後にＰＢＳで３回洗浄した。
【００３０】
グルコース濃度（１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）の異なるＤＭＥＭ培地を調整し、０．１８５ＭＢｑ／８μＬの１８Ｆ−ＦＤＧを０．５ｍＬ加え、ＣＯ２インキュベータ内のイメージングチャンバに入れた。各ＳＤＳ処理組織と対照組織とを、それぞれ１８Ｆ−ＦＤＧの入った培養液に移し、ＣＯ２インキュベータで培養し、培養組織の細胞にグルコース及びＦＤＧを取り込ませた。２時間後、１８Ｆ−ＦＤＧを含まないＤＭＥＭ培養液で洗浄した後、イメージングチャンバを用いてＲＬＧプレートに１５分コンタクトし、ＲＬＧ読取装置でバイオラジオグラフィ法により画像を取得して解析を行った。４時間後にも同様の処理を行った。
【００３１】
その後、培養組織における細胞の生存率を計測した。ＭＴＴ／培養液（０．２５ｍｇ/０．５ｍＬ）を加えて３７℃で１８０分間処理した組織をマイクロチューブに入れ、生成したホルマリン色素の抽出を行った。抽出終了後、分光光度計を用いて５７０ｎｍの吸光度を測定し、そこから６６０ｎｍの吸光度を差し引くことでデータを得た。対照組織の吸光度からブランクの吸光度を引いた値を１００％として、各ＳＤＳ処理組織における細胞の生存率を算出した（生存率＝（各ＳＤＳ処理組織の吸光度−ブランクの吸光度）／（対照組織の吸光度−ブランクの吸光度）。
【００３２】
結果を図４から図６に示す。
図４に、対象組織およびＳＤＳ処理組織（ＳＤＳ濃度５％）の細胞生存率を、培地のグルコース濃度ごとに示す。ＳＤＳ処理組織では、９０％以上の細胞が死滅していた。
【００３３】
図５に、対照組織およびＳＤＳ処理組織（ＳＤＳ濃度５％）におけるＦＤＧ取り込み量を、培地のグルコース濃度ごとに示す。ＳＤＳ処理組織では、生存細胞が減少したことにより、対象組織よりもＦＤＧの取り込み率が低下していた。このことは、ＦＤＧ取り込み率をもって、細胞の生存率を評価することができることを示している。
対照組織において、２時間後よりも４時間後のほうが組織のＦＤＧ取り込み率は高く、ＦＤＧ取り込み率が時間経過とともに増加していることが示された。また、培地のグルコース濃度が上昇するにつれて、対照組織のＦＤＧ取り込み率は低下した。これは、対照組織におけるＦＤＧの取り込みが、皮膚細胞上皮におけるグルコースの特異的取り込み機構（グルコーストランスポータ）を介して行われることを示唆していると考えられる。１８Ｆ−ＦＤＧを用いて本発明の直接的検査方法を行う場合、培養液のグルコース濃度は、生理的濃度に比較的近い１ｍＭ〜５ｍＭ程度が好ましいと考えられた。
【００３４】
図６に、図５に対応する、バイオラジオグラフィ法で取得されたＦＤＧ集積画像を示す。
この検討では、１８Ｆ−ＦＤＧをポジトロン核種含有トレーサとして用いた本実施形態の検査方法により取得したＦＤＧ集積画像にもとづいて、培養組織の細胞生存率を評価できることが示された。
【００３５】
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明の技術的範囲は上記各実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において構成要素の組み合わせを変えたり、各構成要素に種々の変更を加えたり、削除したりすることが可能である。
【符号の説明】
【００３６】
１０  イメージングチャンバ
Ｔｓ  培養組織
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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