【手続補正書】
【提出日】平成27年6月17日(2015.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、
（ｉ）位置６１におけるロイシンからプロリンへ；
（ｉｉ）位置１５９におけるフェニルアラニンからロイシンへ；
（ｉｉｉ）位置１６２におけるグリシンからシステインへ；
（ｉｖ）位置１６９におけるプロリンからヒスチジンへ；
（ｖ）位置６１におけるロイシンからトリプトファンへ；
（ｖｉ）位置６１におけるロイシンからヒスチジンへ；
（ｖｉｉ）位置６１におけるロイシンからフェニルアラニンへ；および
（ｖｉｉｉ）位置６１におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列；または
（ｂ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｎ末端から４０２〜４０７アミノ酸長を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｎ末端から４０２〜４０７アミノ酸長を有し、（ａ）の少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する、変種スクロース輸送ポリペプチド。
【請求項２】
ゲノム中、または、少なくとも１つの組換え構築物上に、
（ａ）（ｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、
（Ａ）位置６１におけるロイシンからプロリンへ；
（Ｂ）位置１５９におけるフェニルアラニンからロイシンへ；
（Ｃ）位置１６２におけるグリシンからシステインへ；
（Ｄ）位置１６９におけるプロリンからヒスチジンへ；
（Ｅ）位置６１におけるロイシンからトリプトファンへ；
（Ｆ）位置６１におけるロイシンからヒスチジンへ；
（Ｇ）位置６１におけるロイシンからフェニルアラニンへ；および
（Ｈ）位置６１におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列；または、
（ｉｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｎ末端から４０２〜４０７アミノ酸長を有するアミノ酸配列；または、
（ｉｉｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｎ末端から４０２〜４０７アミノ酸長を有し、（ｉ）の少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
（ｂ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含んでなる細菌であって、
（ａ）および（ｂ）が、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結し、さらに配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する野生型スクロース輸送ポリペプチドを含有する細菌よりもさらに大きな速度でスクロースを代謝する前記細菌。
【請求項３】
ａ）スクロース存在下で、請求項２に記載の組換え細菌を培養するステップと；
ｂ）前記産生されたグリセロール、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップ、
とを含んでなる、スクロースからグリセロール、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
本発明は、バッチ、流加または連続法を使用して実施されてもよく、任意の公知の発酵様式が適切であることが考察される。さらにホールセル触媒として、細胞を基質上に固定化し、１，３−プロパンジオールなどのグリセロールおよびグリセロール誘導体生成のための発酵条件に曝露してもよいことが、検討される。
一実施形態では、スクロースからグリセロール、１，３−プロパンジオール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法が提供される。方法は、上述したように、スクロース存在下で組換え細菌を培養するステップを含んでなり、生成されたグリセロール、１，３−プロパンジオール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップを含んでなってもよい。生成物は、当該技術分野で公知の方法を使用して回収されてもよい。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、固形物を発酵培地から除去してもよい。次に、上述したように固形物を除去するように処理された発酵培地から、蒸留、液-液抽出、または膜ベース分離などの方法を使用して、生成物を単離してもよい。例えば生物学的に生成された１，３−プロパンジオールを精製する方法が、米国特許第７，９１９，６５８号明細書に記載される。
本発明のいくつかの具体的実施態様を以下に例示する。
（１）（ａ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、
（ｉ）位置６１におけるロイシンからプロリンへ；
（ｉｉ）位置１５９におけるフェニルアラニンからロイシンへ；
（ｉｉｉ）位置１６２におけるグリシンからシステインへ；
（ｉｖ）位置１６９におけるプロリンからヒスチジンへ；
（ｖ）位置６１におけるロイシンからトリプトファンへ；
（ｖｉ）位置６１におけるロイシンからヒスチジンへ；
（ｖｉｉ）位置６１におけるロイシンからフェニルアラニンへ；および
（ｖｉｉｉ）位置６１におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列；または
（ｂ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｎ末端から４０２〜４０７アミノ酸長を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｎ末端から４０２〜４０７アミノ酸長を有し、（ａ）の少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する、変種スクロース輸送ポリペプチド。
（２）ゲノム中、または、少なくとも１つの組換え構築物上に、
（ａ）（ｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、
（Ａ）位置６１におけるロイシンからプロリンへ；
（Ｂ）位置１５９におけるフェニルアラニンからロイシンへ；
（Ｃ）位置１６２におけるグリシンからシステインへ；
（Ｄ）位置１６９におけるプロリンからヒスチジンへ；
（Ｅ）位置６１におけるロイシンからトリプトファンへ；
（Ｆ）位置６１におけるロイシンからヒスチジンへ；
（Ｇ）位置６１におけるロイシンからフェニルアラニンへ；および
（Ｈ）位置６１におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列；または、
（ｉｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｎ末端から４０２〜４０７アミノ酸長を有するアミノ酸配列；または、
（ｉｉｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｎ末端から４０２〜４０７アミノ酸長を有し、（ｉ）の少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
（ｂ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含んでなる細菌であって、
（ａ）および（ｂ）が、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結し、さらに配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する野生型スクロース輸送ポリペプチドを含有する細菌よりもさらに大きな速度でスクロースを代謝する前記細菌。
（３）ポリペプチドが、ＥＣ  ３．２．１．２６またはＥＣ  ２．４．１．７に分類されるスクロースヒドロラーゼ活性を有する、（２）に記載の細菌。
（４）ゲノム中または少なくとも１つの組換え構築物上に、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる、（２）に記載の細菌。
（５）フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ  ２．７．１．４、ＥＣ  ２．７．１．３、またはＥＣ  ２．７．１．１に分類される、（４）に記載の細菌。
（６）エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、およびアエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される、（２）に記載の細菌。
（７）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、（６）に記載の細菌。
（８）１，３−プロパンジオール、グリセロール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する組換え細菌である、（２）に記載の細菌。
（９）ａ）スクロース存在下で、（８）に記載の組換え細菌を培養するステップと；
ｂ）前記産生されたグリセロール、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップ、
とを含んでなる、スクロースからグリセロール、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法。