【手続補正書】
【提出日】平成27年1月20日(2015.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）それぞれが検体結合ドメインと核酸ドメインとを含み、前記検体に同時に結合することが可能な少なくとも第１および第２の近接プローブの少なくとも１セットに前記試料を接触させる工程と、
（ｂ）前記近接プローブが前記検体に結合する際に、前記近接プローブの核酸ドメインを相互作用させる工程であって、前記相互作用はデュプレックスの形成を含む工程と、
（ｃ）前記試料を、３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分に接触させる工程と、
（ｄ）前記デュプレックスの少なくとも１つの核酸ドメインの３’末端を伸長して伸長生成物を生成する工程であって、前記工程（ｃ）と同時にまたはその後に起こり得る工程と、
（ｅ）前記伸長生成物を増幅および検出する工程、とを含む方法。
【請求項２】
前記検体は、完全にまたは部分的にタンパク様分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも第１および第２の近接プローブの少なくとも一方の検体結合ドメインは、抗体、その結合断片、またはその誘導体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｄ）は、３’エキソヌクレアーゼ活性をさらに含む核酸ポリメラーゼによって行われ、前記核酸ポリメラーゼは工程（Ｃ）の３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分を提供する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ファイ２９（Φ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ピュロコックス・フリオスス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、および／またはピュロコックス・ヴェッセイ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼからなる群の１つ以上から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｄ）は、３’エキソヌクレアーゼ活性を最小限含むかまたは全く含まない核酸ポリメラーゼによって行われ、前記ポリメラーゼは、前記３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分の後に加えられ、前記伸長生成物が生成されるように前記試料がさらにインキュベートされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニット、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウｅｘｏ（-）断片、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＰｗｏ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分は、エキソヌクレアーゼＩである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分が、前記伸長生成物を増幅する工程の前に不活化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記３’エキソヌクレアーゼ活性が、熱変性によって不活化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱不活化は、前記工程（ｅ）の増幅反応の第１の工程である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料を前記３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分に接触させる前に、前記工程（ｅ）の増幅反応のための試薬の一部または全てを前記試料に加えるか、または前記試薬の一部または全てを、前記３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分と同時に前記試料に接触させる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬を前記工程（ｂ）および（ｃ）の間に加える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｅ）は、前記伸長生成物の伸長部位の一部分を増幅することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記伸長生成物の伸長部位の一部分の増幅は、前記伸長生成物の伸長部位の一部分のいずれかの側に配置されるプライマーを用い、前記一部分を増幅することにより実現される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記伸長生成物の伸長部位の前記一部分は、オリゴヌクレオチドのライゲーションを鋳型して環状オリゴヌクレオチドを生成し、前記環状オリゴヌクレオチドは、ローリングサークル増幅の鋳型として作用する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記伸長生成物の伸長部位の前記一部分は、環状オリゴヌクレオチドのローリングサークル増幅のためのプライマーとして作用する、請求項１４または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｅ）は、ポリメラーゼ連鎖反応または定量ポリメラーゼ連鎖反応を含み、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ｅ）は、定量ポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記定量ポリメラーゼ連鎖反応は、核酸分子とインターカレートして検出可能な信号、好ましくは蛍光信号を提供する色素を用いる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる前記プライマーは、３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を持つように修飾された形で提供され、前記プライマーは、その３’末端に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記修飾ヌクレオチドは、チオホスフェイト修飾ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ−ＣＥホスホロアミダイト修飾ヌクレオチド、および／またはペプチド核酸ヌクレオチドからなる一覧の１つ以上から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プライマーは、ホットスタートプライマー、および/または、前記ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および第２の近接プローブの核酸ドメインの一方または双方が、前記工程（ｄ）で伸長される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸ドメインの少なくとも１つは、部分的に二本鎖である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記部分的に二本鎖の核酸ドメインは、スプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた一本鎖核酸ドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記スプリントオリゴヌクレオチドが、
（ｉ）前記工程（ａ）の前に、前記近接プローブの一方の核酸ドメインにプレハイブリダイズされる、または
（ｉｉ）フリーな核酸分子として別で提供される、または
（ｉｉｉ）前記近接プローブよりも先に、同時に、または後で前記試料に加えられる、または
（ｉｖ）第３の近接プローブの核酸ドメインとして提供される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記スプリントオリゴヌクレオチドを前記工程（ｄ）で伸長して伸長生成物を形成する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記伸長生成物を環状化してローリングサークル増幅のための鋳型を提供し、前記伸長生成物の３’末端は、鋳型ライゲーションによって伸長生成物オリゴヌクレオチドの５’末端にライゲーションされている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記伸長核酸ドメインは互いにライゲーションされており、前記ライゲーション反応は、請求項２５〜２８のいずれか１項に規定のスプリントオリゴヌクレオチドを介したものである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも第１および第２の近接プローブを複数セット用いる複合解析を含み、それぞれのセットが独自の伸長生成物を生成する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記工程（ａ）および／または（ｂ）にクラウディング剤が含まれる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
試料中の検体を検出するための方法に用いるキットであって、
（ａ）それぞれが検体結合ドメインと核酸ドメインとを含み、前記検体に同時に結合することが可能な少なくとも第１および第２の近接プローブを少なくとも１セットと、
（ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分と、
（ｃ）任意で、前記第１および第２の近接プローブの少なくとも一方の核酸ドメインを伸長して伸長生成物を生成するための手段と、
（ｄ）任意で、前記伸長生成物を増幅および検出するための手段と、
（ｅ）任意で、前記第１および第２のプローブのためのスプリントオリゴヌクレオチドおよび／またはブロッキングオリゴヌクレオチドと、および
（ｆ）任意で、前記検体のための固定化捕捉プローブまたは固定化手段を備えた捕捉プローブ、を含むキット。
【請求項３３】
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を含む成分は請求項５または８に規定のものである、請求項３２に記載のキット。