【手続補正書】
【提出日】平成27年8月20日(2015.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高い収量および／または純度で所望のマルチサブユニット複合体を産生する宿主細胞を同定する方法であって：
（ａ）宿主細胞のパネルを提供する工程であって、前記パネルは、それぞれが、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる遺伝子を含む少なくとも２種類の宿主細胞を含み；
ここで前記少なくとも２種類の宿主細胞はそれぞれ、２つの親細胞を交配することまたは融合させることによって生成され、各親細胞は、前記マルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている少なくとも１つの遺伝子を１コピー以上含む、工程；
（ｂ）該マルチサブユニット複合体を発現させるために各前記宿主細胞を培養する工程であって、ここで前記少なくとも２種類の宿主細胞に含まれる該遺伝子は、前記マルチサブユニット複合体の少なくとも１つのサブユニットを様々なレベルで発現する、工程；
（ｃ）各前記宿主細胞が産生した該マルチサブユニット複合体の収量および／または純度を測定する工程；および
（ｄ）前記宿主細胞のパネル中で、別の宿主細胞よりも高い収量および／または純度を産生する該宿主細胞を、所望のマルチサブユニット複合体を高い収量で産生する宿主細胞であると同定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、および前記該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる遺伝子が、前記所望の抗体の軽鎖および重鎖をコードしている遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
（ｉ）スクリーニングした細胞の該パネルが、該マルチサブユニット複合体を含んでいる該サブユニットをコードする該遺伝子を、異なるコピー数の組み合わせで発現する宿主細胞を含む；
（ｉｉ）スクリーニングした細胞の該パネルが、それぞれが、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる１つ以上の遺伝子を様々なコピー数で含む少なくとも２種類の宿主細胞を含む；
（ｉｉｉ）宿主細胞の該パネルが、該マルチサブユニット複合体をコードする各遺伝子を１５コピーまで発現させ、および、実質的に、各サブユニットのその他のサブユニットに対する全ての可能なコピー数の組み合わせを構成している細胞を含む；
（ｉｖ）宿主細胞の該パネルが、該マルチサブユニット複合体をコードする各遺伝子を１２コピーまで発現し、および、実質的に、各サブユニットのその他のサブユニットに対する全ての可能なコピー数の組み合わせを構成している細胞を含む；
（ｖ）宿主細胞の該パネルが、該マルチサブユニット複合体をコードする各遺伝子を１０コピーまで発現し、および、実質的に、各サブユニットのその他のサブユニットに対する全ての可能なコピー数の組み合わせを構成している細胞を含む；
（ｖｉ）宿主細胞の該パネルが、該マルチサブユニット複合体をコードする各遺伝子を８コピーまで発現し、および、実質的に、各サブユニットのその他のサブユニットに対する全ての可能なコピー数の組み合わせを構成している細胞を含む；
（ｖｉｉ）宿主細胞の該パネルが、該マルチサブユニット複合体をコードする各遺伝子を６コピーまで発現し、および、実質的に、各サブユニットのその他のサブユニットに対する全ての可能なコピー数の組み合わせを構成している細胞を含む；
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の該パネルが、抗体である該マルチサブユニット複合体をコードする各遺伝子を１０コピーまで発現し、および、実質的に、各サブユニットのその他のサブユニットに対する全ての可能なコピー数の組み合わせを構成している細胞を含む；
（ｉｘ）該宿主細胞が二倍体酵母細胞である；
（ｘ）該宿主細胞がピキア細胞である；
（ｘｉ）該宿主細胞がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である；または
（ｘｉｉ）該宿主細胞が、ピキア属の二倍体メチロトローフ酵母細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・グイレルモルジィ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｒｄｉｉ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、またはピキア・イノシトベラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｉｎｏｓｉｔｏｖｅｒａ）である；
前記方法。
【請求項４】
前記純度が、１種類以上のグリコシル化された抗体鎖の相対的な割合を測定することで決定され、場合により、前記１種類以上のグリコシル化された抗体鎖が、グリコシル化された抗体重鎖変異体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
（ｉ）該宿主細胞が二倍体酵母細胞である；
（ｉｉ）該宿主細胞が、ピキア属の二倍体メチロトローフ酵母である；
（ｉｉｉ）該宿主細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・グイレルモルジィ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｒｄｉｉ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、またはピキア・イノシトベラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｉｎｏｓｉｔｏｖｅｒａ）から選択されるピキア属の二倍体メチロトローフ酵母である；
（ｉｖ）宿主細胞の前記パネルが、前記マルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む半数体細胞を交配または融合させ、前記交配によって前記マルチサブユニット複合体の該サブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む二倍体細胞を作出することで生成される；
（ｖ）宿主細胞の前記パネルが、前記マルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む半数体細胞を交配または融合させ、前記交配によって前記マルチサブユニット複合体の該サブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む二倍体細胞を作出することで生成され、そして、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる前記遺伝子が、半数体細胞のゲノム中に組み込まれている；
（ｖｉ）前記宿主細胞が倍数体の酵母細胞である；および／または
（ｖｉｉ）前記宿主細胞が四倍体酵母細胞である；
前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
（ｉ）前記同定した宿主細胞を生産培養を展開するために使用する；
（ｉｉ）前記宿主細胞が真核細胞である；
（ｉｉｉ）前記真核細胞が酵母細胞である；
（ｉｖ）宿主細胞の前記パネルが、前記マルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む半数体細胞を交配または融合させ、前記交配によって前記マルチサブユニット複合体の該サブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む二倍体細胞を作出することで生成され、そして、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる前記遺伝子が、半数体細胞のゲノム中に組み込まれており、交配または融合される親細胞が、それぞれ半数体、倍数体、または四倍体の酵母細胞、場合によりメチロトローフ酵母細胞である；
（ｖ）宿主細胞の前記パネルが、前記マルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む半数体細胞を交配または融合させ、前記交配によって前記マルチサブユニット複合体の該サブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む二倍体細胞を作出することで生成され、そして、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる前記遺伝子が、半数体細胞のゲノム中に組み込まれており、交配または融合される親細胞が、それぞれピキア属の半数体、倍数体、または四倍体のメチロトローフ酵母細胞である；
（ｖｉ）宿主細胞の前記パネルが、前記マルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む半数体細胞を交配または融合させ、前記交配によって前記マルチサブユニット複合体の該サブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む二倍体細胞を作出することで生成され、そして、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる前記遺伝子が、半数体細胞のゲノム中に組み込まれており、交配または融合される親細胞が、それぞれ半数体、倍数体、または四倍体のメチロトローフ酵母細胞であり、前記酵母細胞がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である；
（ｖｉｉ）宿主細胞の前記パネルが、前記マルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む半数体細胞を交配または融合させ、前記交配によって前記マルチサブユニット複合体の該サブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む二倍体細胞を作出することで生成され、そして、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる前記遺伝子が、半数体細胞のゲノム中に組み込まれており、交配または融合される親細胞が、それぞれ半数体、倍数体、または四倍体の酵母細胞であり、前記酵母細胞が、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・グイレルモルジィ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｒｄｉｉ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、およびピキア・イノシトベラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｉｎｏｓｉｔｏｖｅｒａ）からなる群より選択されるメチロトローフ酵母である；および／または
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の前記パネルが、前記マルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む半数体のピキア細胞、好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を交配または融合させ、前記交配によって前記マルチサブユニット複合体の該サブユニットをコードしている遺伝子を様々なコピー数で含む二倍体細胞を作出することで生成され、そして、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる前記遺伝子が、半数体細胞のゲノム中に組み込まれており、そして、該マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる前記遺伝子が、ｐＧＡＰ、３’ＡＯＸ  ＴＴ、ＰｐＵＲＡ５、ＯＣＨ１、ＡＯＸ１、ＨＩＳ４、ＧＡＰ、ＡＲＧ、およびＨＩＳ４  ＴＴ遺伝子座からなる群より選択される１つ以上のゲノムの遺伝子座に組み込まれている；
前記方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
（ｉ）該マルチサブユニット複合体の前記サブユニットをコードしている少なくとも１つの前記遺伝子が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下で発現している；
（ｉｉ）該マルチサブユニット複合体の前記サブユニットをコードしている少なくとも１つの前記遺伝子が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下で発現しており、前記誘導性プロモーターが、ＧＡＰ、ＣＵＰ１、ＡＯＸ１、およびＦＬＤ１プロモーターからなる群より選択される；
（ｉｉｉ）該マルチサブユニット複合体の前記サブユニットをコードしている少なくとも１つの前記遺伝子が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下で発現しており、少なくとも１つの該マルチサブユニット複合体の前記サブユニットをコードしている前記遺伝子が、ＡＯＸ１、ＩＣＬ１、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩脱水素酵素（ＧＡＰ）、ＦＬＤ１、ＡＤＨ１、アルコール脱水素酵素ＩＩ、ＧＡＬ４、ＰＨＯ３、ＰＨＯ５、およびＰｙｋプロモーター、それらに由来するキメラプロモーター、酵母プロモーター、哺乳類のプロモーター、昆虫プロモーター、植物プロモーター、は虫類プロモーター、両生類プロモーター、ウイルスプロモーター、ならびに鳥類プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下で発現している；
（ｉｖ）前記宿主細胞が二倍体細胞または四倍体細胞である；
（ｖ）前記所望のマルチサブユニット複合体を前記細胞からまたは培地から精製する；
（ｖｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体を前記細胞の細胞内成分、細胞質、核質、または膜から精製する；
（ｖｉｉ）前記宿主細胞が前記所望のマルチサブユニット複合体を該培地に分泌する；
（ｖｉｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体を前記培地から精製し、前記所望のマルチサブユニット複合体が単一特異性抗体または二重特異性抗体である；
（ｉｘ）少なくとも２種類の宿主細胞が、前記マルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている遺伝子を異なるコピー数含む；
（ｘ）少なくとも２種類の宿主細胞が、前記マルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている遺伝子を異なるコピー数含み、前記パネル中の少なくとも１種類の宿主細胞が、該マルチサブユニット複合体の少なくとも１つのサブユニットをコードしている前記遺伝子を少なくとも２コピー含む；
（ｘｉ）前記パネル中の少なくとも１種類の宿主細胞が、前記パネル中の別の宿主細胞に含まれている対応する遺伝子の発現を誘導するプロモーターとは別のプロモーターによって発現が誘導されるマルチサブユニット複合体の少なくとも１つのサブユニットをコードしている遺伝子を含む；
（ｘｉｉ）前記パネル中の少なくとも１種類の宿主細胞が、該マルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている２つ以上の配列を含んでいるポリシストロン性の遺伝子を含む；
（ｘｉｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体が、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＧＲＰ、ＰＣＳＫ９、またはＮＧＦに特異的に結合する抗体を含む；
（ｘｉｖ）前記所望のマルチサブユニット複合体が、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそれらの断片を含む；
（ｘｖ）前記所望のマルチサブユニット複合体が、ヒト化抗体またはそれらの断片を含み、前記ヒト化抗体が、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシに由来する、好ましくはウサギに由来する抗体である；
（ｘｖｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体が、一価抗体、二価抗体、または多価抗体を含む；
（ｘｖｉｉ）前記パネル中の少なくとも１つの前記宿主細胞に含まれている前記マルチサブユニット複合体のサブユニットを発現させる少なくとも１つの前記遺伝子が、前記宿主細胞中での発現用に最適化されている；
（ｘｖｉｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記所望の抗体の純度が、前記宿主細胞によって産生され、グリコシル化されておらず、予測した見かけの流体力学半径を有する抗体複合体中に含まれており、および／または前記所望の抗体の標的に特異的に結合する所望の抗体の画分を測定することで評価される；および／または
（ｘｉｘ）前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記所望の抗体の収量が、グリコシル化されており、予測した見かけ流体力学半径を有する複合体とは別の抗体複合体に含まれていて、および／または前記所望の抗体の標的と特異的に結合しない生産に伴う変異体をいずれも計算にいれずに、前記宿主細胞によって産生された所望の抗体の量を決定することで評価される；
前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
（ｉ）該所望のマルチサブユニット複合体をコードしている該遺伝子のコピー数および／または前記所望のマルチサブユニット複合体の収量が２０世代にわたって安定である；
（ｉｉ）該所望のマルチサブユニット複合体をコードしている該遺伝子のコピー数および／または前記所望のマルチサブユニット複合体の収量が５０世代にわたって安定である；
（ｉｉｉ）該所望のマルチサブユニット複合体をコードしている該遺伝子のコピー数および／または前記所望のマルチサブユニット複合体の収量が１００世代にわたって安定である；
（ｉｖ）該所望のマルチサブユニット複合体をコードしている該遺伝子のコピー数および／または前記所望のマルチサブユニット複合体の収量が５００世代にわたって安定である；
（ｖ）該所望のマルチサブユニット複合体をコードしている該遺伝子のコピー数および／または前記所望のマルチサブユニット複合体の収量が１０００世代にわたって安定である；
（ｖｉ）前記マルチサブユニット複合体の少なくとも１つの該サブユニットをコードしている遺伝子のコピーが、２つ以上の遺伝子座に組み込まれている；
（ｖｉｉ）前記マルチサブユニット複合体の少なくとも１つの該サブユニットをコードしている遺伝子のコピーが、３つ以上の遺伝子座に組み込まれている；
（ｖｉｉｉ）前記マルチサブユニット複合体の少なくとも１つの該サブユニットをコードしている遺伝子のコピーが、２つ以上又は３つ以上であり、各遺伝子座が５コピー以下の所定のサブユニットを含む；
（ｉｘ）前記マルチサブユニット複合体の少なくとも１つの該サブユニットをコードしている遺伝子のコピーが、２つ以上又は３つ以上であり、各遺伝子座が４コピー以下の所定のサブユニットを含む；および／または
（ｘ）前記マルチサブユニット複合体の少なくとも１つの該サブユニットをコードしている遺伝子のコピーが、２つ以上又は３つ以上であり、各遺伝子座が３コピー以下の所定のサブユニットを含む；
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
高い純度で所望のマルチサブユニット複合体を産生する宿主細胞として同定される前記宿主細胞から前記所望のマルチサブユニット複合体を組換えによって生産することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、
該宿主細胞が、（ｉ）該マルチサブユニット複合体の各サブユニットをコードしている１つ以上の遺伝子を含む；または（ｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体の各サブユニットをコードしている遺伝子を２〜１０コピー含み、
該方法が、
（ａ）該宿主細胞を提供する工程；および
（ｂ）前記遺伝子を発現させるために前記宿主細胞を培養する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
（ｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含む；
（ｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、該方法が、前記所望の抗体を精製する工程をさらに含む；および／または
（ｉｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記宿主細胞が、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ、１００〜３００ｍｇ／Ｌ、１００〜５００ｍｇ／Ｌ、１００〜１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２５０ｍｇ／リットル、少なくとも１５００ｍｇ／リットル、１７５０ｍｇ／リットル、２０００ｍｇ／リットル、またはそれ以上の力価の抗体を産生する；
前記方法。
【請求項１１】
高い収量および／または純度で所望のマルチサブユニット複合体を産生する前記宿主細胞を培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、前記宿主細胞は、２つの親細胞を交配することまたは融合させることによって生産された宿主細胞であり、各親細胞が前記マルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている少なくとも１つの遺伝子を１コピー以上含み；場合により、それぞれが前記マルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている２種類の異なる遺伝子各々の少なくとも１コピーが、前記宿主細胞、さらに場合により、ピキア属の二倍体細胞または四倍体細胞、例えば、ピキア・パストリス、またはそれに由来する二倍体または四倍体酵母培養、の相同染色体の２つの同じ遺伝子座に組み込まれている、前記方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
（ｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体を発現させる少なくとも１つの遺伝子が前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている；
（ｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体を発現させる少なくとも１つの遺伝子が、１つ以上の染色体外成分、プラスミド、または人工染色体に含まれている；
（ｉｉｉ）該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含む；
（ｉｖ）該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記宿主細胞が、前記所望の抗体の重鎖を発現させる遺伝子のコピー数よりも多いコピー数の前記所望の抗体の軽鎖を発現させる遺伝子を含む；
（ｖ）該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記宿主細胞が、前記所望の抗体の軽鎖を発現させる遺伝子のコピー数よりも多いコピー数の前記所望の抗体の重鎖を発現させる遺伝子を含む；
（ｖｉ）該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記宿主細胞が、前記所望の抗体の軽鎖を発現させる遺伝子のコピーと前記所望の抗体の重鎖を発現させる遺伝子のコピーを同数含む；
（ｖｉｉ）該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記宿主細胞が、前記所望の抗体の軽鎖をコードしている遺伝子を１〜１０コピーと、前記所望の抗体の重鎖をコードしている遺伝子を１〜１０コピー含む；
（ｖｉｉｉ）該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記宿主細胞に含まれる、前記所望の抗体の重鎖をコードしている遺伝子のコピー数と、前記所望の抗体の軽鎖をコードしている遺伝子のコピー数がそれぞれ、２および２、２および３、３および３、３および４、３および５、４および３、４および４、４および５、４および６、５および４、５および５、５および６、または５および７である；および／または
（ｉｘ）該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、前記宿主細胞に含まれる、前記所望の抗体の重鎖をコードしている遺伝子のコピー数と、前記所望の抗体の軽鎖をコードしている遺伝子のコピー数がそれぞれ、２および１、３および１、４および１、５および１、６および１、７および１、８および１、９および１、１０および１、１および２、２および２、３および２、４および２、５および２、６および２、７および２、８および２、９および２、１０および２、１および３、２および３、３および３、４および３、５および３、６および３、７および３、８および３、９および３、１０および３、１および４、２および４、３および４、４および４、５および４、６および４、７および４、８および４、９および４、１０および４、１および５、２および５、３および５、４および５、５および５、６および５、７および５、８および５、９および５、１０および５、１および６、２および６、３および６、４および６、５および６、６および６、７および６、８および６、９および６、１０および６、１および７、２および７、３および７、４および７、５および７、６および７、７および７、８および７、９および７、１０および７、１および８、２および８、３および８、４および８、５および８、６および８、７および８、８および８、９および８、１０および８、１および９、２および９、３および９、４および９、５および９、６および９、７および９、８および９、９および９、１０および９、１および１０、２および１０、３および１０、４および１０、５および１０、６および１０、７および１０、８および１０、９および１０、１０および１０である；
前記方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、
（ｉ）生産培地中で該培養を生育させることをさらに含む；
（ｉｉ）最少培地、場合により、選択剤を含んでいない最少培地である生産培地中で該培養を生育させることをさらに含む；
（ｉｉｉ）予め形成されているアミノ酸または他の複雑な生体分子を含んでいない最少培地である生産培地中で該培養を生育させることをさらに含む；
（ｉｖ）高細胞密度まで該培養を生育させることをさらに含む；
（ｖ）少なくとも５０ｇ／Ｌである高細胞密度まで該培養を生育させることをさらに含む；
（ｖｉ）少なくとも１００ｇ／Ｌである高細胞密度まで該培養を生育させることをさらに含む；
（ｖｉｉ）少なくとも３００ｇ／Ｌである高細胞密度まで該培養を生育させることをさらに含む；
（ｖｉｉｉ）少なくとも４００ｇ／Ｌである高細胞密度まで該培養を生育させることをさらに含む；
（ｉｘ）少なくとも５００ｇ／Ｌである高細胞密度まで該培養を生育させることをさらに含む；
（ｘ）少なくとも７５０ｇ／Ｌである高細胞密度まで該培養を生育させることをさらに含む；
（ｘｉ）少なくとも２０回分裂するまで該酵母細胞を培養することをさらに含み、前記培養が、前記少なくとも２０回分裂した後も、前記所望のマルチサブユニット複合体の発現を高レベルに維持している；
（ｘｉｉ）少なくとも５０回分裂するまで該酵母細胞を培養することをさらに含み、前記培養が、前記少なくとも５０回分裂した後も、前記所望のマルチサブユニット複合体の発現を高レベルに維持している；
（ｘｉｉｉ）少なくとも１００回分裂するまで該酵母細胞を培養することをさらに含み、前記培養が、前記少なくとも１００回分裂した後も、前記所望のマルチサブユニット複合体の発現を高レベルに維持している；
（ｘｉｖ）前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含む；
（ｘｖ）該培養が、前記細胞を含有する培地を含み、該培地が、少なくとも約５０ｍｇ／リットル、１００ｍｇ／リットル、５００ｍｇ／リットルまたは１０００ｍｇ／リットル、１５００ｍｇ／リットルまたはそれ以上である前記所望のマルチサブユニット複合体の発現レベルを含む；
（ｘｖｉ）該培養が、前記細胞を含有する培地を含み、前記培養中での前記二倍体細胞の細胞密度が少なくとも約５０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ、５００ｇ／Ｌ、７００ｇ／Ｌ、またはそれ以上である；
（ｘｖｉｉ）該培養が、前記細胞を含有する培地を含み、該培地が、少なくとも約５０ｍｇ／リットル、１００ｍｇ／リットル、５００ｍｇ／リットルまたは１０００ｍｇ／リットル、１５００ｍｇ／リットルまたはそれ以上である前記所望のマルチサブユニット複合体の発現レベルを生じ、および／または前記培養中での前記二倍体細胞の細胞密度が少なくとも約５０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ、５００ｇ／Ｌ、７００ｇ／Ｌ、またはそれ以上であり、そして前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含む；
（ｘｖｉｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体の少なくとも１つのサブユニットが分泌シグナルを含み、ここで、場合により該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、さらに場合により該分泌シグナルが、トリリゾチーム（ＣＬＹ）シグナルペプチド；ＣＬＹ−Ｌ８；出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ（ＳＵＣ２）シグナルペプチド；ＭＦ−α（プレプロ）；ＭＦ−α（プレ）−ａｐｖ；ＭＦ−α（プレ）−ａｐｖ−ＳＬＥＫＲ；ＭＦ−α（プレプロ）−（ＥＡ）３；αＦシグナルペプチド；ＫＩＬＭ１シグナルペプチド；抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナルペプチド；Ａ．ｎｉｇｅｒＧＯＸシグナルペプチド；シュワンニオミセス・オシデンタリ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）グルコアミラーゼ遺伝子（ＧＡＭ１）シグナルペプチド；プロ配列を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）シグナルペプチド；プロ配列を含まないヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）シグナルペプチド；ＩＳＮシグナルペプチド；ＩＦＮシグナルペプチド；ＨＧＨシグナルペプチド；フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）；カイコリゾチーム；ヒトリゾチーム（ＬＹＺ１）；アクチビンＩ型受容体；アクチビンＩＩ型受容体；ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）免疫グロブリン結合タンパク質（ＰｐＢｉＰ）；ヒト抗体３Ｄ６軽鎖リーダー配列；およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含む；および／または
（ｘｉｘ）該親細胞がそれぞれ、半数体、二倍体または倍数体酵母細胞である；
前記方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法であって、該宿主細胞が、前記所望のマルチサブユニット複合体の各サブユニットをコードしている遺伝子を１〜１０コピー含み、
前記宿主細胞が、２つの親細胞を交配することまたは融合させることによって生成され、各親細胞は、前記マルチサブユニット複合体の１以上のサブユニットをコードしている遺伝子を１コピー以上含み、所望のマルチサブユニット複合体を組換えによって生産する方法が、さらに場合により以下の１以上を含む、前記方法：
（ｉ）それぞれが前記マルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている、２種類の異なる遺伝子各々の少なくとも１コピーが、前記宿主細胞の相同染色体の２つの同じ遺伝子座に組み込まれている；
（ｉｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含む；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞が真核細胞である；
（ｉｖ）前記宿主細胞が酵母細胞である；
（ｖ）前記宿主細胞がメチロトローフ酵母である；
（ｖｉ）前記宿主細胞がピキア属のメチロトローフ酵母である；
（ｖｉｉ）前記宿主細胞が、ピキア・パストリスであるピキア属のメチロトローフ酵母である；
（ｖｉｉｉ）前記宿主細胞が、ピキア・アングスタ、ピキア・グイレルモルジィ、ピキア・メタノリカ、およびピキア・イノシトベラからなる群より選択されるピキア属のメチロトローフ酵母である；
（ｉｘ）前記マルチサブユニット複合体の該サブユニットを発現させる少なくとも１つの前記遺伝子が、該ｐＧＡＰ遺伝子座および該ＨＩＳ４  ＴＴ遺伝子座からなる群より選択される１つ以上のゲノム遺伝子座に組み込まれている；
（ｘ）前記所望のマルチサブユニット複合体をコードしている少なくとも１つの前記遺伝子が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下で発現される；
（ｘｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体をコードしている少なくとも１つの前記遺伝子が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下で発現され、前記誘導性プロモーターが、ＧＡＰ、ＡＯＸ１、ＣＵＰ１、およびＦＬＤ１プロモーターからなる群より選択される；
（ｘｉｉ）該所望のタンパク質が抗体であり、該抗体の軽鎖および／または重鎖をコードしている少なくとも１つの前記遺伝子が、ＡＯＸ１、ＩＣＬ１、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩脱水素酵素（ＧＡＰ）、ＦＬＤ１、ＡＤＨ１、アルコール脱水素酵素ＩＩ、ＧＡＬ４、ＰＨＯ３、ＰＨＯ５、およびＰｙｋプロモーター、それらに由来するキメラプロモーター、酵母プロモーター、哺乳類のプロモーター、昆虫プロモーター、植物プロモーター、は虫類プロモーター、両生類プロモーター、ウイルスプロモーター、および鳥類プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下で発現される；
（ｘｉｉｉ）該宿主細胞が二倍体または四倍体細胞である；
（ｘｉｖ）該宿主細胞が前記所望の抗体を該培地中に分泌する；
（ｘｖ）該宿主細胞が単一特異性または二重特異性抗体を発現する；
（ｘｖｉ）該宿主細胞が、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＧＲＰ、ＰＣＳＫ９、またはＮＧＦに特異的に結合する抗体を発現する；
（ｘｖｉｉ）該宿主細胞が、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそれらの断片を発現し、場合によりそれがＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＧＲＰ、ＰＣＳＫ９、またはＮＧＦに特異的に結合する；
（ｘｖｉｉｉ）該宿主細胞が、ウサギに由来するヒト化抗体を発現する；
（ｘｉｘ）該宿主細胞が、一価抗体、二価抗体、または多価抗体を含むマルチサブユニット複合体を発現する；
（ｘｘ）前記所望のマルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている遺伝子の少なくとも１つの前記コピーが、前記宿主細胞中での発現用に最適化されている；
（ｘｘｉ）前記所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、かつ、前記所望の抗体の軽鎖をコードしている遺伝子のコピー数が、前記所望の抗体の重鎖をコードしている遺伝子の前記コピー数よりも多いか、またはそれと同じである；
（ｘｘｉｉ）該方法または培養が、前記所望のマルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている各遺伝子を１コピーしか含まない株よりも、高い収量の前記所望のマルチサブユニット複合体を産生する；
（ｘｘｉｉｉ）該方法または培養が、前記所望のマルチサブユニット複合体のサブユニットをコードしている各遺伝子を１コピーしか含まない株よりも、高い純度で前記所望のマルチサブユニット複合体を産生する；
（ｘｘｉｖ）該所望のマルチサブユニット複合体が所望の抗体を含み、かつ、前記純度が、重鎖および／または軽鎖ポリペプチドの総質量に占める、グリコシル化された重鎖および／または軽鎖ポリペプチドの質量をパーセンテージで測定することによって決定される；および／または
（ｘｘｖ）前記所望のマルチサブユニット複合体の少なくとも１つのサブユニットが分泌シグナルを含み、場合により、該分泌シグナルが、トリリゾチーム（ＣＬＹ）シグナルペプチド；ＣＬＹ−Ｌ８；出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ（ＳＵＣ２）シグナルペプチド；ＭＦ−α（プレプロ）；ＭＦ−α（プレ）−ａｐｖ；ＭＦ−α（プレ）−ａｐｖ−ＳＬＥＫＲ；ＭＦ−α（プレプロ）−（ＥＡ）３；αＦシグナルペプチド；ＫＩＬＭ１シグナルペプチド；抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナルペプチド；Ａ．ｎｉｇｅｒＧＯＸシグナルペプチド；シュワンニオミセス・オシデンタリ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）グルコアミラーゼ遺伝子（ＧＡＭ１）シグナルペプチド；プロ配列を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）シグナルペプチド；プロ配列を含まないヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）シグナルペプチド；ＩＳＮシグナルペプチド；ＩＦＮシグナルペプチド；ＨＧＨシグナルペプチド；フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）；カイコリゾチーム；ヒトリゾチーム（ＬＹＺ１）；アクチビンＩ型受容体；アクチビンＩＩ型受容体；ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）免疫グロブリン結合タンパク質（ＰｐＢｉＰ）；ヒト抗体３Ｄ６軽鎖リーダー配列；およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含む。