【事件の表示】
　特許第２９８７２０７号「血小板因子に富む生物接着剤の調製方法及びその適用」の請求項１、２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９８７２０７号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
 　　　　　理　　　　　　　由
１．手続の経緯
　本件特許第２９８７２０７号の発明については、平成５年９月３０日に特許出願され、平成１１年１０月１日にその特許権の設定登録がなされ、その後、サーモジェネシス　コーポレーションより特許異議の申し立てがなされ、当審により取消しの理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年６月１５日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
　ア．訂正の内容
  特許権者が求めている訂正の内容は、以下のとおりである。
(i)訂正事項１
　特許請求の範囲の請求項１の
「血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いることを特徴とする、生物接着剤の構成要素となる寒冷沈降物を凍結血漿から調製し回収することによる、生物接着剤の調製方法。」を「（ａ）血小板に富む血漿を凍結すること；及び
（ｂ）凍結された血小板に富む血漿から、寒冷沈降物を単離することを含む、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含む、生物接着剤の調製方法。」
と訂正する。
(ii)訂正事項２
　特許掲載公報、第７欄、第６〜１０行の「そして本発明は、血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いることによって特徴づけられる、凍結血漿から寒冷沈殿物を調製し回収するところの生物接着剤の調整方法に関するものである。」を、「そして本発明は、（ａ）血小板に富む血漿を凍結すること；及び（ｂ）凍結された血小板に富む血漿から、寒冷沈降物を単離することを含む、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含む、生物接着剤の調製方法に関するものである。」と訂正する。
　
　イ．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否  
　上記の訂正事項１は、請求項１における生物接着剤を、「少なくとも一つの血小板由来成長因子を含む」ものに限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当し、訂正事項２は、上記訂正事項１に付随して生じる記載の不備を解消するものであって、明りょうでない記載の釈明を目的とした明細書の訂正に該当する。
　そして、上記の訂正事項は、特許明細書に記載された事項の範囲内のものであって、かつ、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではない。
　
  ウ．むすび
　以上、イのとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する第１２６条第２及び３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについて
　ア．本件発明
　特許第２９８７２０７号の請求項１及び２に係る発明は、訂正明細書の請求項１及び２に記載された次のとおりのものである。
「【請求項1】（ａ）血小板に富む血漿を凍結すること；及び
（ｂ）凍結された血小板に富む血漿から、寒冷沈降物を単離することを含む、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含む、生物接着剤の調製方法。
【請求項２】前記濃縮血漿が１ｍｌ当たり少なくとも５０ｘ１０６の血小板を含むことによって特徴づけられる請求の範囲１記載の方法。」
　
イ．申立の理由の概要
　特許異議申立人サーモジェネシス　コーポレーション（以下、「申立人」という。）は、証拠として甲第１号証（エフ　エー　デービス　カンパニー発行の「臨床血液学及び止血の原理（第２版）」）、甲第２号証（血液バンクアメリカ協会の「技術マニアル（第１２版）」）、甲第３号証（米国特許第４７１４４５７号明細書）、甲第４号証（ＨＧ−４Ｌスウィング式バケット装着のソベールＨ４０００遠心分離器の仕様書）、甲第５号証（サクラメントメディカル　ファンデーションのデータ）、及び甲第６号証（ザ　シーヴィ　モスバイ　カンパニー、１９８５年６月発行、「サージェーリー」）を提出し、訂正前の本件請求項１及び２に係る発明は、甲第１〜６号証に記載された発明であり、またはそれらに基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第１項第３号または同条第２項の規定に違反し、特許を取り消すべき旨主張する。
  　
　ウ．申立人が提出した甲号証記載の発明
　申立人の提出した甲第１号証には、全血中の血小板の数について、１mlあたり１億３０００万個から４億個の血小板を含有することが記載されている。
　甲第２号証は、その発行日が不明であり、平成１５年１月３１日付けで提出された上申書でその発行日を立証する趣旨で提出された甲第２号証の１は、甲第２号証と版を異にするものであり、その内容も同一のものとはいえないものであるので、証拠として採用できない。
　甲第３号証は、遠心分離器で全血から遠心分離された血漿を基にした血小板に富む血漿由来の寒冷沈殿物からフィブリン糊を調製する方法について開示したもので、その第３欄第２６行〜第６１行には、以下の記載がある（原文は英語）。
「パケット１は実体上の円筒形をした挿入式の固定用アッセンブリー６の中に配置される。該固定用アッセンブリー６はパケット１を保持した状態で、従来型の遠心分離器７のカップ８の内の１個の中に収納される。例として、該遠心分離器はソベール(Sorvall)H-4000型で、ＨＧ−４Ｌ形スウィング式バケット回転器を付帯とするものを指す。
　血液３は、例として該血液を上澄み血漿９および沈殿赤血球１０とに分離する目的で、約５分間、2000rpmで遠心分離する。該上澄み血漿９は、血漿抽出部１５を通じて最初にパケット１と類似する開孔部４’および５’を有する第２パケット１’に移入する。この時点で、第２番目のパケット１’中の該血漿９は、例えば−８０℃で約１時間凍結される。その後、該凍結血漿９は、循環式用浴槽１１中に、パケット１’に入れられたままで解凍される。解凍は浴槽温度−４℃から−２℃の間で、１５分から３０分後に開始するが、該パケット１’の凍結内容物の表面積を増やして、手で砕くことにより解凍を速めることができる。
　次に、第２番目のパケット１’は浴槽１１から取り出され、素早く固定用アッセンブリー６の内部に収納され、そこで、パケット１’を保持したまま該固定用アッセンブリーは遠心分離器７のカップ８の中に挿入される。続いて、該血漿の遠心分離は、例として約０℃から４℃の温度の一定の抑制温度環境下で約１０分間荷役4000rpmで実施される。
　この第２番目の遠心分離の処理段階が、血漿を上澄み血漿９および濃縮フィブリノーゲンの寒冷沈殿物１２の分離を結果的に達成して、後者はパケット１’の内部表面に沈殿した状態となる。
　該上澄み血漿９’は、パケット１及び１’に類する第３番目のパケット１''に移入される。該寒冷沈殿物１２は２番目のパケット１’の内部表面に付着したままの状態で残留する。」
　甲第４号証は、申立人が、甲第３号証に例示したソーベルHG-4L,H-4000型の遠心分離器の仕様書と主張するものであるところ、この発行日もまた不明のものであるので、証拠として採用できない。
　甲第５号証は、ＡＡＢＢ基準の重回転(5000ｘｇ、７分間)に従って全血から血漿を調製して、その血漿単位の血小板の数を測定した結果を示すものである。
　甲第６号証には、単一のドナーの新鮮に凍結された血漿からのフィブリン接着剤の調製についての記載がある。
　
エ．判断
（特許法２９条第１項第３号について）
　申立人の提出した甲第１〜６号証のうち、具体的に全血から血漿を分離し、凍結させ、さらに寒冷沈殿物を調製することを開示しているのは、甲第３号証であり、その他の甲号証は、甲第３号証を補充するものであるので、本件請求項１に係る発明と甲第３号証に記載の発明とを対比すると、両者は、血漿を原料として、生物接着剤を調製する点で一致し、一方、前者がその原料としての血漿が血小板に富む血漿であるのに対して、後者においてはこの点を明記していない点で相違する。
　この点について、申立人は、甲３号証には、遠心分離器としてソーベルHG-4L,H-4000型の遠心分離器を用い、約５分間、2000rpmで遠心分離することが記載（上記３ウ．）されており、この操作は、甲第４号証によれば、１０３３ｇｘ５（＝５１６５ｇ・分）の遠心分離にあたり、甲第２号証を参酌すれば、この遠心分離操作で得られる血漿は血小板に富むものである、と主張するが、上記したように甲第４及び２号証はいずれもその発行日が不明のものであるから、参酌することができず、したがって、甲第３号証で原料として用いられる血漿が、血小板に富む血漿であるとまではいうことはできない。
　したがって、請求項１に係る発明、及びそれを引用する請求項２に係る発明はいずれも甲第１〜６号証に記載された発明ではない。
（特許法第２９条第２項について）
　本件請求項１に係る発明は、原料血漿として、血小板に富む血漿を用いることにより、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含む生物接着剤を調製する方法であるのに対して、甲第１〜６号証には、血小板由来成長因子についての記載は全くなく、当業者が、甲第１〜６号証に記載された発明に基づいて、本件請求項１に係る発明を想到し得ないものである。
　本件請求項２に係る発明は、本件請求項１に係る発明を技術的にさらに限定するものであるから、本件請求項１に係る発明に対するのと同様の理由により、当業者が、甲第１〜６号証に記載された発明に基づいて、本件請求項２に係る発明を容易に想到し得ないものである。
　
　したがって、申立人の主張はいずれも採用できない。
　以上のとおりであるから、本件特許は、申立人の特許異議申立ての理由及び証拠によっては取り消すことができない。
  また、他に本件発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年５月２日（２００３．５．２）
【訂正の要旨】
▲１▼　特許公報、特許請求の範囲、請求項１の「血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いることを特徴とする、生物接着剤の構成要素となる寒冷沈殿物を凍結血漿から調製し回収することによる、生物接着剤の調製方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として
「
（ａ）血小板に富む血漿を凍結すること；及び
（ｂ）凍結された血小板に富む血漿から、寒冷沈殿物を単離すること
を含む、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含む、
▲２▼　特許請求の範囲との整合を図り、明瞭でない記載を目的として、特許公報、第７欄、第５〜９行の「そして本発明は、血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いることによって特徴づけられる、凍結血漿から寒冷沈殿物を調製し回収するところの生物接着剤の調製方法に関するものである。」を、「そして本発明は、
（ａ）血小板に富む血漿を凍結すること；及び（ｂ）凍結された血小板に富む血漿から、寒冷沈殿物を単離することを含む、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含む、生物接着剤の調製方法に関するものである。
（５４）【発明の名称】
血小板因子に富む生物接着剤の調製方法及びその適用
【発明の詳細な説明】
　本発明の目的は、凝固性ヒト血漿蛋白質を含有する生物接着剤を製造することである。本発明に従って得られる生物接着剤は、特に、血小板由来の成長因子を含有する。
　トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物又はフィブリノーゲン溶液が、特に止血作用を発揮しながら生組織の結合を可能とする接着物質の製造中に用いられるということは知られている。例えば、仏国特許第２４４８９００号明細書に見ることができる。この接着物質は、一般に”生物接着剤”と呼ばれており、手術で用いられている。
　生物接着剤は、生理的条件下で凝固工程の最終段階を再現することを可能とする。そのために、フィブリノーゲン及び第ＸＩＩＩ因子を含んだ溶液を、使用の直前に、処置する生組織上で、トロンビン及びカルシウムイオンを含んだ溶液と混合する。トロンビン及びカルシウムイオンの存在下で、フィブリノーゲンはフィブリンに転化する。フィブリンモノマーは相互に結合し、フィブリンポリマーを形成し、これらのポリマーは活性化された第ＸＩＩＩ因子の作用によって架橋結合される。カルシウムイオンの存在下でトロンビンの作用により活性化された第ＸＩＩＩ因子は、トランスアミダーゼであり、ネットワークの形成を伴ったフィブリン鎖間のペプチド結合を形成する。
　本明細書において、”生物接着剤”なる語は、トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物（高濃度物：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を意味する。だが、実際、正確にはそのような濃縮物が接着剤を構成するのは、トロンビンとカルシウム塩の存在下（又は、それが含有するプロトロンビンの活性化の後）のみである。
　フィブリンネットワークの形成が、生物接着剤の止血活性を引き起こす。更に、フィブリンは、特にフィブロネクチン及びコラーゲンを通して周辺組織に接着する。加えて、活性化第ＸＩＩＩ因子は、フィブリン及びフィブロネクチン間にペプチド結合を形成し、これによって接着性を補強する。
　インビボでは、プラスミンと呼ばれる蛋白分解酵素の作用でフィブリンクロットが徐々に消失し、このことによって接着結合の持続が制限されることが知られている。しかしながら、例えばα−２−アンチプラスミン又はアプロチニン等のプロテアーゼインヒビター、さもなければε−アミノカプロン酸をそれらに加えることによって生物接着剤の作用の持続を増強することは可能である。
　生物接着剤の適用は非常に多く、特に手術においては、出血を避けるため、縫合糸の代わりに、又は、縫合を補強するために適用できる。
　しかしながら、従来の生物接着剤は瘢痕形成を促進することができる特異活性を有していない。
　瘢痕形成が、創傷に存在するターゲット細胞に直接作用するある種の成長因子によって、特に促進されるということが知られている。これらの成長因子は、増殖や分化、更には細胞遊走（走化性）さえを引き起こす。血小板は、血液中の成長因子の主要な供給源の一つである。
　インビボでは、細胞の損傷中、血小板アクチベーターの作用でトロンビンを含む血小板は顆粒中に包含された成長因子を放出する。活性化血小板の上清は、非常に多様な分子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板因子−４、血小板由来血管内皮細胞増殖因子、ヘパリン結合性上皮細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、結合組織活性化ペプチドＩＩＩ、β−トロンボグロブリン、上皮細胞成長因子、プラスミノーゲン、フォンウィルブランド因子、フィブリノーゲン、セロトニン、ヒスタミン、アデノシン　ジ−又はトリ−ホスフェート、フィブロネクチン、ビトロネクチン、血小板第ＸＩＩＩ因子、蛋白分解性又は解糖系酵素、アラキドン酸の代謝産物等を含む。特に、Ｈ．Ｌ．Ｗｏｎｇ　＆　Ｓ．Ｍ．Ｗａｈｌ”ペプチド成長因子及びそれらのレセプター”Ｓｐｏｒｎ　＆　Ｒｏｂｅｒｔｓ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｂｅｒｌｉｎ，ｐ．５１０；Ｒ．Ａ．Ｔｅｒｋｅｌｔａｕｂ　＆　Ｍ．Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ”創傷修復の分子及び細胞生物Ｃｌａｒｋ＆Ｈｅｎｓｏｎ編，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐ．３８に見ることができる。
　血小板抽出液は、高い分裂誘発活性を含んでおり、又その瘢痕形成能が知られている。特に、Ｄ．Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．，１９６，３７９−３８８（１９８２）；Ｄ．Ｍ　Ｃａｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，”創傷治癒における成長因子及びその他の特徴”，Ｂａｒｂｕｌ．Ｐｉｎｅｓ，Ｃａｄｗｅｌｌ　Ｈｕｎｔ編，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８８，ｐ．３０３−３１７；米国特許第４７６０１３１号明細書、及びＰＣＴ特許出願　ＷＯ８６／０３１２２、ＷＯ８８／０３４０９、ＷＯ８９／０５６５６に見ることができる。
　今、トロンビン−凝固性蛋白質及び血小板因子を互いに合わせることを可能とする方法により、特に瘢痕形成を促進する改善された生物接着剤を得ることができることを見いだした。
　トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物の調製方法は知られている。原料は血漿、即ち血液から血液細胞を除いたものからなる。言い換えれば、それは血小板が激減された製造物である。その方法は、エタノールで（Ｃｏｈｎ法）又は寒冷沈降物の製造によってフィブリノーゲンを沈降させることを必須の工程として含む。寒冷沈降物の調製は、血漿を凍結し、次いで０℃を越えた６℃未満の温度、一般には１℃〜４℃で融解することからなる。特にフィブリノーゲン及びフィブロネクチンを含有する残存の固形画分は寒冷沈降物と呼ばれ、遠心分離により液画分から分離できる。寒冷沈降物の容量は、一般に開始原料の血漿の容量の１／２５〜１／１００である。それ故、寒冷沈降物製造の条件下で不溶性の血漿蛋白質は、寒冷沈降操作により２５〜１００倍に濃縮される。しかし、このようにして得られた調製物は、成長因子は少ない。特に、公知の工業的方法によって調製された生物接着剤は、注目すべき分裂促進活性は含有していない。
　今、得られる液画分と寒冷沈降物の間に血小板因子の一様な分布が通常期待されるようなときに、開始原料製造物として血小板に富む血漿を用いることにより、寒冷沈降物製造の条件下で通常可溶性である多くの血小板因子が、該寒冷沈降物中に非常に高い比率で保持されるようになることが見いだされた。
　本発明の方法は、二つの分離した調製を行う必要なく、トロンビン−凝固性蛋白質濃縮物の止血及び接着特性、及び血小板抽出液の瘢痕形成活性を合わせ持った製造物を得ることを可能とした。
　このように、本発明の方法によって、寒冷沈降物中のＰＤＧＦの濃度比は一般に１０より大きい。ＰＤＧＦの収率は、一般に、開始原料血漿中に存在する１０６血小板当たり２０ｎｇより大きい。
　それ故、本発明の主体は、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含むことによって特徴づけられる、トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物を含有する生物接着剤である。
　前記成長因子は、特にＰＤＧＦである。
　本発明に従って得られる生物接着剤は、一般に少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ、多くの場合は少なくとも５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含有する。一般に、前記生物接着剤は２０〜６００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含有する。
　本発明による生物接着剤は、血小板抽出液中に通常存在する他の製造物、特にβ−トロンボグロブリン、タイプ１プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）、血小板第ＸＩＩＩ因子（第ＸＩＩＩ因子−Ａ）を含んでもよい。例えば、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、特に１０〜３００μｇ／ｍｌのβ−トロンボグロブリン、少なくとも１μｇ／ｍｌ、特に５〜４０μｇ／ｍｌのＰＡＩ−１を含む。第ＸＩＩＩ因子−Ｓに対する第ＸＩＩＩ因子−Ａの比は、通常血漿中のこれらの因子の比の少なくとも１．２倍、特に１．２〜４倍である。
　本発明の生物接着剤は、例えば、
　　蛋白質　　　　　　　　　：６０〜２００ｇ／ｌ
　　フィブリノーゲン　　　　：３０〜１５０ｇ／ｌ、特に５０〜１００ｇ／ｌ
　　フィブロネクチン　　　　：６〜１４ｇ／ｌ、特に８〜１２ｇ／ｌ
　　第ＸＩＩＩ因子　　　　　：１０〜６０　血漿等価単位
　　アルブミン　　　　　　　：１０〜３８ｇ／ｌ、特に１８〜３０ｇ／ｌ
を含む。
　血漿等価単位とは、プールした血漿中に存在する第ＸＩＩＩ因子の通常の血漿濃度に相当する。
　蛋白質濃度は、ビウレット法によって決定される。フィブリノーゲンの濃度は重量法によって、フィブロネクチン及びＰＡＩ−１の濃度は仕様書に従いＥＬＩＳＡ試験（Ｓｔａｇｏ）によって、第ＸＩＩＩ因子活性は仕様書に従いペプチド基質（ベリクロム　Ｆ　ＸＩＩＩ　試薬、べーリング社）中のグリシンエチルエステルの取り込みによって起こるアンモニア放出試験によって、第ＸＩＩＩ因子−Ａ及び第ＸＩＩＩ因子−Ｓは特異的な抗血清（Ｓｔａｇｏ）を用いたラウレル法によって決定される。アルブミンの濃度は、仕様書に従ってセルロースアセテート（Ｓｅｂｉａ）上で電気泳動することにより決定される。アルブミンを示す泳動バンドの蛋白質量は、デンシトメーター分析により決定される。
　本発明の生物接着剤は、血液凝固の内因経路又は外因経路を活性化することによって凝固特性を与えるのに十分な量の凝固性因子を含む。生物接着剤は、例えば、プロトロンビンの通常の血漿濃度の０．５〜１．５倍のプロトロンビンを含む。これは仕様書に従って、特異的抗血清　　　（Ｓｔａｇｏ）を用いたラウレル法又は時間測定法（Ｓｔａｇｏ欠損ＩＩ、Ｓｔａｇｏ）によって決定した。
　生理緩衝液で１／２に希釈した上記生物接着剤溶液は、１／２〜１／６に希釈した通常血漿のそれと同等のクイックタイムを有している。ここでいうクイックタイムとは、血液凝固の外因経路を活性化する能力を調べるものである。それは、仕様書に従いトロンボプラスチンを含む、”ネオプラスチン”（商標、Ｓｔａｇｏ）試薬を用いて決定される。生理緩衝液で１／２に希釈した上記生物接着剤溶液は、１：１〜１：４に希釈した通常血漿のそれと同等のカオリンタイムを有している。カオリンタイムとは、血液凝固の内因経路を活性化する能力を調べるものである。それは、試験中にセファリンを省略した以外は仕様書に従いＣ．Ｋ．ＰＲＥＳＴ試薬（Ｓｔａｇｏ）を用いて決定される。
　本発明の生物接着剤は、常法によって示すことができる分裂誘発特性を与えるのに十分な量の血小板因子を含有する。
　本発明の生物接着剤の分裂誘発活性は、例えば、１／４０００に希釈したものが（一般には、１／５０００に希釈した場合でも）、定常期へと刺激された３Ｔ３細胞によるトリチウムラベルチミジンの取り込み測定試験において、０．１ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含んだ溶液のそれと少なくとも同等の分裂誘発活性を有するようなものである。
　このような試験は、例えば、ＨＡＲＴ　Ｃ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｖｏｌ．２９，１６６−１７２（１９９０）に記載されている。　３Ｔ３細胞は、Ｓｗｉｓｓ　マウス胚芽細胞である（細胞株　ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　９２）。サブクローニングによって得られた細胞株もまた入手できる（ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）。
　本発明の生物接着剤は、血小板に富む血漿由来の寒冷沈殿物を含むことが必須でありうる。そして本発明は、血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いることによって特徴づけられる、凍結血漿から寒冷沈殿物を調製し回収するところの生物接着剤の調製方法に関するものである。
　言い換えれば、本発明の方法は、寒冷沈殿物を調製する前に血小板に富む血漿を調製することによって特徴づけられる。血漿における血小板の濃縮操作は、常法に従って、特に、集めた血液の遠心によって行える。
　血小板に富む血漿はまた、１ｍｌ当たり少なくとも５×１０７の血小板、特に１ｍｌ当たり１×１０８〜１×１０９の血小板、例えば１ｍｌ当たり約１×１０８〜５×１０８の血小板を含む。
　寒冷沈殿物の製造条件は通常の条件である。例えば、凍結は−１５℃以下の温度、例えば−１５〜−６０℃で行う。製造物は、少なくとも製造物全てが熱平衡になるのに十分な時間この温度に維持される。この時間は、例えばおよそ１２〜７２時間になる。
　次いで、血漿を、０℃を超えるが全凍結製造物が液化する温度未満の温度で融解する。この工程は、一般に１〜６℃、特に４℃近辺で行われる。融解温度で温置する期間は、熱平衡に到達するのに十分な時間であり、例えば、１２〜２４時間である。
　その後、寒冷沈殿物を液画分から分離する。そのために、融解血漿を、再凍結しないのに十分高い温度で、かつ寒冷沈殿物の液化を防ぐのに十分低い温度で遠心し、次いで、上清を公知の方法で除く。そして遠心沈殿物を構成する寒冷沈殿物を回収する。寒冷沈殿物の容量は、一般に、開始原料血漿容量の１／２５〜１／１００となる。
　一般に、遠心は１〜６℃の間の温度で行う。
　得られた寒冷沈殿物から成る上記生物接着剤をすぐに使用することを望まない場合は、例えば−２０℃で、それを再凍結することができる。
　上記生物接着剤をすぐに使用する予定の場合は、それを十分な温度、通常は３２〜３８℃で加熱し液化するのが好ましい。
　本発明による血小板因子に富む生物接着剤の製造方法の簡便さは、この方法を、自己生物接着剤、すなわちあるドナー由来の血漿から得てこのドナーに用いる生物接着剤の製造に適用することを可能とする。この方法の利点の一つは、血漿における血小板の濃縮を含む全ての操作を、ドナーから血液を集めるために用いるバッグシステム中で行えるということである。
　もちろん、上記の生物接着剤は、種々の同定されたドナー由来の血漿から調製することができる。
　本発明の方法の開始原料製造物は、血小板に富む血漿である。このような血小板に富む血漿の調製は、それ自体公知である。例えば、それは以下の方法によって製造することができる。献血中に集めたトリプルバッグシステム（例えば、マコ−ファーマ）中の全血を、ジョウアン（Ｊｏｕａｎ）Ｋ１１０遠心機で４分間、３０００×ｇで遠心する。血小板に富んだ上清血漿をトリプルバッグシステムのトランスファーバッグ３に、血漿抽出機を用いて注入する。前記バッグ３は、チューブをシールすることにより残りのシステムから分離される。このバッグをトロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物の本発明の製造のために用いることができる。
　本発明の主体はまた、上記方法によって得ることができる生物接着剤を用いることである。
　この使用は、それ自体公知の方法に従って行える。この使用の原則は、フィブリノーゲンの転化によりフィブリンの形成を起こすことからなる。この転化は、トロンビンの作用によって達成される。トロンビンは、それ自体公知の方法に従って、外部より加えたトロンビンであってもよい。そのために、上記のようにして得た生物接着剤をトロンビン及びカルシウムイオンを含有する水性溶液と混合して、フィブリノーゲンをフィブリンに転化させることによって凝固反応を開始する。
　特に、０．５〜５００ＮＩＨ　Ｕ／ｍｌのトロンビン及び例えば５〜１００ｍＭ、特に２０〜６０ｍＭの濃度の（特に、塩化カルシウムの形で）カルシウムイオンを含有する水性溶液を用いることができる。
　トロンビン溶液との混合は、その部位、即ち処置される組織上で行うのが好ましい。
　一般に、液化した寒冷沈殿物及びトロンビン水性溶液は５：１〜１：２の容量比で混合する。
　所望により、プラスミン阻害剤又は類似物（例えば、α−２−アンチプラスミン、アプロチニン、ε−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸）を最終的な接着剤、又はそれらを混合する前の成分の一つに加えてもよい。
　本発明の生物接着剤にプロトロンビン及び他の凝固性因子を存在させることも好ましく、そして凝固の内因経路又は外因経路を活性化することができる。
　それ故、本発明の主体は、特に上記のようにして得られる生物接着剤の使用であり、この使用は、内在のプロトロンビンの活性化を助ける少なくとも一つの薬剤を該生物接着剤に添加することによって特徴づけられる。凝固の現象はまた、好ましくは３７℃に近い温度で上記工程を行うことによって開始する。
　そのためには（例えば５〜１００ｍＭ、特に２０〜６０ｍＭの）カルシウムイオンを含んだ水性溶液を単に上記生物接着剤に添加すればよい。
　この凝固を加速することを望む場合は、上記工程を以下に示す様にして、活性化剤を用いて行うこともできる。
　内因経路の活性化のためには、生物接着剤を（例えば５〜１００ｍＭ、特に２０〜６０ｍＭの）カルシウムイオンを含む水性溶液と混合し、それを凝固第ＸＩＩ因子の少なくとも一つの公知の活性化剤、更に一般的には生物接着剤に不溶性で負の荷電を持った固体表面又は化合物（例えばパウダー形状）、例えば、シリケート、（特にカオリン）、シリカ、シリカガラス、例えばサンゴ骨格から得られるアラゴナイト等のカルシウムカーボネートの結晶、トリカルシウムジシトレートの結晶等と接触させることができる。単純な繰り返し実験により決定されうる十分な時間後に、上記生物接着剤を上記不溶性化合物から濾過により分離する。例えば、上記工程はフィルターを備えたカラムで行うことができる。
　凝固の外因経路の活性化のためには、生物接着剤を（５〜１００ｍＭ、特に２０〜６０ｍＭの）カルシウムイオンを含む水性溶液、及び組織トロンボプラスチン（例えば動物由来のもの）又は遺伝子工学によって製造したトロンボプラスチンと混合する。
　それ故、本発明によって得られる生物接着剤の重要な利点の一つは、それが外部よりのトロンビンの添加なしに接着剤の凝固を開始するのに十分な量のプロトロンビンを含有し、それによって不慮の汚染のリスクが減少すると言うことである。それ故、本発明の方法は特に自己製造物の使用という現在の要求に適応できるものである。
　本発明の生物接着剤は、特に外傷性又は外科手術の創傷の処置、移植片（特に皮膚又は骨の移植片等）の適合及び保持に用いることができる。本発明の生物接着剤はまた、人工移植部材、例えば、人工骨、骨接合部材及び義歯の固定、骨充填物質、特にカルシウムカーボネートをベースとした吸収性充填物質（例えば、サンゴ骨格又はピンクタダ−マルガリチヘラ貝（Ｐｉｎｃｔａｄａ　ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａ　ｓｈｅｌｌ）をベースとしたもの）、ヒドロキシアパタイト又はポリ乳酸等の生分解性ポリマーの固定及び保持に用いることもできる。
実施例１
　血小板濃縮ヒト血漿を上記のようにして調製した。
　このようにして得た濃縮血漿は１ｍｌ当たり１５４×１０６の血小板を含んでいる。
　前記血小板濃縮血漿２３０ｍｌの入ったトランスファーバッグを冷却チャンバー中にて、−４０℃で７２時間置いた。次いで、その血漿の入ったバッグを冷蔵庫中にて、４℃で２０時間置いた。その後、そのバッグをやはり４℃の温度で、１分当たり３，０００回転で２０分間遠心した。遠心後、バッグを水平にし、採取管をはめ、上清をアスピレーションで吸引した。
　バッグに入っている固形残留物は、寒冷沈殿物であり、使用するまで−２０℃の温度にて再凍結して保存できる。寒冷沈殿物をすぐに使用する場合は、バッグを水浴中、例えば３７℃に置く。１５分間温置後、残った溶液を回収する。容量は約３ｍｌであった。
　得られた製造物を分析した。結果を下記表１に示す。
実施例２
　実施例１と同様の方法により操作を行った。処理した血漿の容量は２５０ｍｌであった。血漿は、最初は１ｍｌ当たり２５６×１０６の血小板を含んでいた。寒冷沈殿物の液化により回収された最終溶液の容量は５ｍｌであった。　分析結果を表１に示す。
　融解した血漿の遠心後に得られた遠心上清のＰＤＧＦの濃度は、たった５．９ｎｇ／ｍｌであった。
　表１の結果と比較することにより、実質的に全てのＰＤＧＦが寒冷沈殿物中にあるということが分かる。
（１）ブラッドフォード法（バイオラッド社製の試薬　照会番号５００−０００６）によって決定した。
（２）ＰＤＧＦ：血小板由来成長因子はＥＬＩＳＡ試験によって測定した。
（３）ＥＬＩＳＡ試験によって測定した（Ｓｔａｇｏ，Ｆｒａｎｃｅ、照会番号０４１９）。
（４）液化した寒冷沈殿物の一容量を５００ＮＩＨ　Ｕのトロンビン及び５０ｍＭの塩化カルシウムを含む溶液の一容量と混合することによって決定した。
（５）比活性は以下の方法により決定した。対照において得られた放射能は２０００ｃｐｍであった。実施例１では、４０００ｃｐｍで、蛋白濃度が０．００９６ｍｇ／ｍｌであった。比較として、同じ方法により測定したチスコル（Ｔｉｓｓｕｃｏｌ；ＩＭＭＵＮＯ社によって販売されている生物接着剤の商標名）の比活性は０．２２であった。
　分裂促進活性の測定方法は以下の通りである。
　線維芽細胞を６月齢の幼児の包皮から分離した。
　細胞を１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁した。９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに、１ｍｌ当たり４０，０００細胞を含んだ懸濁液２００μｌを播種した。５％のＣＯ２を含む雰囲気下、３７℃で３日間培養後、培地を８％新生児牛血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）と交換した。
　更に３日間培養後、５０μｌのトロンビン−凝固性蛋白質溶液（試料）を加えた。各試料を、種々の希釈率でＤＭＥＭ中に希釈し、３回試験した。対照ウェルにはＤＭＥＭ５０μｌを播種した。そのマイクロプレートを前記と同じ条件で２４時間培養した。培養終了の６時間前に、１０μＣｉ／ｍｌのトリチウムチミジン溶液を５０μｌを各ウェルに加えた。培養後、ウェルを生理溶液で洗浄した。その後、エチレンジアミンテトラアセテート存在下で０．２５％のトリプシン溶液（Ｇｉｂｃｏ社の溶液）を用いて、細胞をウェルから剥がした。”スカトロン（Ｓｋａｔｒｏｎ）”タイプ細胞回収装置を用いて、細胞をフィルター上に集めた。次いで、そのフィルターを乾燥し、シンチレーション液の存在下で放射能を測定した。
　比活性の決定：
　前記ウェル中の試料の蛋白質濃度（ｍｇ／ｍｌで表す）をＸ軸、対応する放射能をＹ軸としてグラフにプロットした。対照ウェルの２倍の放射能レベルを与える試料の蛋白質濃度を、捕間法によりグラフから決定した。この濃度の逆数を試料の比活性と呼ぶ。
実施例３
　実施例１と同様の方法により操作を行った。分析結果（数回の実験の平均値）を表２に示す。
実施例４
　生物接着剤を実施例１と同様の方法により調製した。チューブ中で、順次、生物接着剤１５０μｌ、生理食塩水１５０μｌ、２５ｍＭ塩化カルシウム水溶液３００μｌ、及びカオリン懸濁液３００μｌ又はサンゴ粉末懸濁液３００μｌ又は生理食塩水３００μｌのいずれかを混合した。前記チューブを水浴中、３７℃で温置した。チューブ中に凝塊の出現が認められた。
　カオリンの存在下では、凝塊は温置の４分後に形成した。カオリンの代わりにサンゴ粉末の存在下では、凝塊は７分で形成した。（生理食塩水を単に加えることによって得られる）カオリン又はサンゴを加えない調製物は９分後に凝固した。
（５７）【特許請求の範囲】
１．　（ａ）血小板に富む血漿を凍結すること；及び
（ｂ）凍結された血小板に富む血漿から、寒冷沈殿物を単離すること
を含む、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含む、生物接着剤の調製方法。
２．　前記濃縮血漿が１ｍｌ当たり少なくとも５０×１０６の血小板を含むことによって特徴づけられる請求の範囲１記載の方法。
３．　前記開始原料血漿が１ｍｌ当たり１×１０８〜１×１０９の血小板を含むことによって特徴づけられる前記請求の範囲２に記載の方法。
４．　前記接着剤を液形態で得るために、前記寒冷沈殿物を加熱することによって特徴づけられる前記請求の範囲１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．　回収血液から始めて、血小板に富む血漿をまず調製することを特徴とする前記請求の範囲１〜３のいずれか一つに記載の方法。
６．　前記血漿をあるドナーから得、そして前記方法の全ての操作を血液を集めるために用いたバッグの系の中で行うことを特徴とする請求の範囲１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．　内在のプロトロンビンの活性化に適した薬剤を前記接着剤に添加すること、及びトロンビンを加えないことを特徴とする、請求の範囲１〜６のいずれか一つに記載の方法。
８．　前記薬剤がカルシウムイオンを含む水性溶液であることを特徴とする請求の範囲７記載の方法。
９．　前記薬剤がカルシウムイオンの存在下でのトロンボプラスチンであることを特徴とする請求の範囲７記載の方法。
１０．前記薬剤がカルシウムイオンの存在下での凝固第ＸＩＩ因子の活性化剤であることを特徴とする前記請求の範囲７に記載の方法。
１１．前記活性化剤が生物接着剤に不溶性で負の荷電を持っている固形化合物から選ばれることを特徴とする前記請求の範囲１０に記載の方法。
１２．前記固形化合物がシリケート、シリカガラス、カルシウムカーボネート又はトリカルシウムジサイトレートから選ばれることを特徴とする前記請求の範囲１１に記載の方法。
１３．十分な時間後に、生物接着剤が上記不溶性の固形化合物から分離されることを特徴とする請求の範囲１１又は１２に記載の方法。