(57)【要約】【課題】デリケートエリアのかぶれの発症リスクを判定する方法の提供。【解決手段】  月経直後又は非月経期の被験者の陰股部におけるバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又は陰股部皮膚細菌叢におけるバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を測定する工程を含む、デリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスクの判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
月経直後又は非月経期の被験者の陰股部におけるバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又は皮膚細菌叢におけるバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を測定する工程を含む、デリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスクの判定方法。
【請求項２】
月経直後の被験者の陰股部においてバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量の比が８８．３％以上ある場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が１１．７％以下、又は陰股部皮膚細菌叢において、バシラス目細菌の存在比率が３６．３％以上である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が１．６％以下である場合にかぶれが無い又はかぶれ発症リスクが低いと判定し、前記総和に対するバシラス目細菌量の比が１６．６％以下である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が８３．４％以上、又はバシラス目細菌の存在比率が３．３％以下である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が２０．８％以上である場合にかぶれが有る又はかぶれ発症リスクが高いと判定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
月経直後の被験者の陰股部においてスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌の総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が９９．２％以上ある場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が０．８％以下、又は陰股部皮膚細菌叢において、スタフィロコッカス科細菌の存在比率が３６．３％以上である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が０．０４％以下である場合にかぶれが無い又はかぶれ発症リスクが低いと判定し、前記総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が１９．８％以下である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が５４．１％以上である場合、又はスタフィロコッカス科細菌の存在比率が３．３％以下である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が１６．９％以上である場合にかぶれが有る又はかぶれ発症リスクが高いと判定する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
非月経期の被験者の陰股部においてバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量の比が９２．２％以上ある場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が７．８％以下、又は陰股部皮膚細菌叢において、バシラス目細菌の存在比率が３１．７％以上である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が２．０％以下である場合にかぶれ発症リスクが低いと判定し、前記総和に対するバシラス目細菌量の比が１４．９％以下である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が８５．１％以上、又は陰股部皮膚細菌叢において、バシラス目細菌の存在比率が５．７％以下である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が３５.０％以上である場合にかぶれ発症リスクが高いと判定する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
非月経期の被験者の陰股部において、スタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が９６．７％以上である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が３．３％以下、又は陰股部皮膚細菌叢において、スタフィロコッカス科細菌の存在比率が３１．７％以上である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が０．５％以下である場合にかぶれ発症リスクが低いと判定し、前記総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が１４．６％以下である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が８５．４％以上、又は全細菌量に対するスタフィロコッカス科細菌の存在比率が５．６％以下である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が３４．９％以上である場合にかぶれ発症リスクが高いと判定する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
陰股部皮膚上の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のデータ群に基づいて、バシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌に属する塩基配列のデータ数、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌に属する塩基配列のデータ数を求め、バシラス目細菌とラクトバチルス目細菌のデータ数の総和に対するそれぞれのデータ数の比、又はスタフィロコッカス科細菌とラクトバチルス科細菌のデータ数の総和に対するそれぞれのデータ数の比を算出する、又は陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数に対するそれぞれのデータ数の比率を算出する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
被験者デリケートエリアへの外用剤、内服剤、身体洗浄剤、入浴剤、吸収性物品、又は衣服の適用前後における、月経直後又は非月経期の該被験者の陰股部におけるバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量に総和に対するそれぞれの菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又は陰股部皮膚細菌叢におけるバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を算出する工程を含む、該適用のデリケートエリアのかぶれに及ぼす作用の評価方法。
【請求項８】
バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量に対するスタフィロコッカス科細菌量の比、又はバシラス目細菌又はスタフィロコッカス科細菌の存在比率が増加、又は／及びバシラス目細菌量とのラクトバチルス目細菌量の総和に対するラクトバチルス目細菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とのラクトバチルス科細菌量に対するラクトバチルス科細菌量の比、又はラクトバチルス目細菌又はラクトバチルス科細菌の存在比率が低下した場合、前記適用はデリケートエリアのかぶれを改善又は抑制する作用がある、又はデリケートエリアのかぶれリスクを低減する作用があると評価する、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスクを評価・判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性の陰部（デリケートエリア）は、生理やおりもの、汗によるムレや、下着のこすれ等によってかぶれが起こるというケースが多く見られる。斯かるデリケートエリアのかぶれは、尿や血液等の排泄物や生理用品等の刺激により生じる接触性皮膚炎であると考えられ、特に月経期において強いかゆみと発疹を伴い、ひどくなると腫れたり水疱ができる場合もある。
したがって、かぶれを生じやすいヒトは、前もって原因物質との接触を避けるべく、デリケートエリアを常に清潔に保つこと、保湿を心がけること、刺激の少ない下着や生理用品を選択することなどの対策が必要とされる。
【０００３】
従来、デリケートエリアのかぶれや痒みは、敏感肌やアレルギー体質の人が起こりやすい傾向があること、また、ストレスや疲れで身体の抵抗力が低下している場合に起こりやすいと言われているが、詳しい因果関係はこれまでに解明されていない。
【０００４】
一方、近年、ヒトの皮膚常在菌の細菌叢を解析することにより、肌質を評価したり、疾患の原因を解明する試みがなされている。例えば、膣内の菌叢解析においては、健常人においては多く存在するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｅｒｓやＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓといった乳酸菌が、細菌性膣炎を起こした場合には減少することが報告されている（非特許文献１）。また、膣内と大陰唇では、菌叢が異なることが報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
しかしながら、デリケートエリア上の皮膚細菌とかぶれとの関係は全く報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sujatha Srinivasan et al., PLoS ONE 7(6): e37818, 2012
【非特許文献２】Brown CJ，J Med Microbiol. 2007 56(Pt 2):271-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、デリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスクを判定する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、女性のデリケートエリアの一部である陰股部の皮膚上の細菌叢を網羅的に解析し、かぶれとの関連性を調べたところ、非かぶれ者の細菌叢はバシラス目のスタフィロコッカス科細菌が主要菌であるのに対し、かぶれ者の細菌叢は、ラクトバチルス目のラクトバチルス科細菌が主要菌であり、バシラス目細菌（スタフィロコッカス科細菌）に対してラクトバチルス目細菌（ラクトバチルス科細菌）が有意に増加し、デリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢における当該細菌の存在比率を指標としてデリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスクを評価・判定できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、月経直後又は非月経期の被験者の陰股部皮膚細菌叢における、バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量およびラクトバチルス科細菌量の両者の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を測定する工程を含む、デリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスクの判定方法、に係るものである。
また本発明は、被験者デリケートエリアへの外用剤、内服剤、身体洗浄剤、入浴剤、吸収性物品、又は衣服等の適用前後における、月経直後又は非月経期の該被験者の陰股部皮膚細菌叢における、バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、スタフィロコッカス科細菌量およびラクトバチルス科細菌量の両者の総和に対するそれぞれの菌量の比、又は全細菌量に対するバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を測定する工程を含む、該適用のデリケートエリアのかぶれに及ぼす作用の評価方法、に係るものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、デリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスク、すなわちかぶれが生じているか否か、或いはかぶれ易いか否かを客観的に測定又は判定することが可能となる。これにより、例えば、被験者は、かぶれの有無を客観的に認識できるとともに、必要に応じてデリケートエリアを清潔に保つこと、保湿を心がけること、刺激の少ない下着や生理用品を選択すること等のかぶれ対策を講じることができ、デリケートエリアのかぶれの発症を未然に防止できる。
また、本発明の方法によれば、デリケートエリアに適用する外用剤、内服剤、身体洗浄剤、入浴剤、吸収性物品、および衣服等のかぶれリスクへの影響を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】医師による診断及び皮膚上の細菌を採取した部位を示す。
【図２】全５６サンプルのデリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢の平均を示す。
【図３】月経直後における非かぶれ群（Ｎ＝１４）及びかぶれ群（Ｎ＝１４）のデリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢に占める（a）スタフィロコッカス科及び（b）ラクトバシラス科の分布を示す。
【図４】月経直後における非かぶれ群（Ｎ＝１４）及びかぶれ群（Ｎ＝１４）のデリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢に占める（ａ）バシラス目及び（ｂ）ラクトバシラス目の分布を示す。
【図５】月経直後における非かぶれ群（Ｎ＝１４）及びかぶれ群（Ｎ＝１４）のデリケートエリア陰股部の皮膚角層中の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比を示す。
【図６】非月経期における非かぶれ群（Ｎ＝１４）及びかぶれ群（Ｎ＝１４）のデリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢に占める（a）スタフィロコッカス科及び（ｂ）ラクトバシラス科の分布を示す。
【図７】非月経期における非かぶれ群（Ｎ＝１４）及びかぶれ群（Ｎ＝１４）のデリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢に占める（ａ）バシラス目及び（ｂ）ラクトバシラス目の分布を示す。
【図８】非月経期における非かぶれ群（Ｎ＝１４）及びかぶれ群（Ｎ＝１４）のデリケートエリア陰股部の皮膚角層中の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、「デリケートエリア」とは、女性の陰部(股間)のことを意味し、本発明において、「陰股部」又は「デリケートエリア陰股部」とは、デリケートエリアのうち、鼠蹊部から陰唇部の間の部分を意味する。
また、本発明において、「月経直後」とは、好ましくは月経終了３日以内であり、「非月経期」とは、好ましくは月経終了１０〜１４日後である。
【００１３】
本発明における「デリケートエリアのかぶれ」とは、尿や血液などの排泄物や生理用品等の接触源がデリケートエリアの皮膚に接触して発症する接触皮膚炎であり、原因物質の接触部位に一致して、紅班、丘疹、浮腫、小水疱、水泡等が生じ、強い掻痒を伴う。斯かるデリケートエリアのかぶれは、大半は月経期において発症し、非月経期においてはその症状が治まる場合が多いとされている。
【００１４】
本発明において、「デリケートエリアのかぶれ発症リスク」とは、デリケートエリアのかぶれの易罹患性（かぶれ易さ）をいう。すなわち、本発明において、あるヒト個体が高リスク群であるとは、該ヒト個体がデリケートエリアのかぶれを発症する危険率が高いと予想されることを意味し、低リスク群であるとは、該ヒト個体がデリケートエリアのかぶれを発症する危険率が低いと予想されることを意味する。
【００１５】
本発明のデリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスクの判定方法においては、被験者の陰股部の皮膚常在細菌における、バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量のの総和に対するそれぞれの菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又は全細菌量に対するバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率（割合）、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を測定することを含む。
ここで、陰股部の皮膚細菌叢とは、陰股部の皮膚上に存在する細菌の菌叢を指し、スタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、クロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、エンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）等の細菌が含まれる。主要細菌種はスタフィロコッカス科（バシラス目）、ラクトバシラス科（ラクトバシラス目）の２菌種であり、これら２菌種が全細菌の５０．１％程度を占める。
【００１６】
陰股部の皮膚細菌叢において、バシラス目細菌としては、スタフィロコッカス科、バシラス科、パエニバシラス科等が挙げられるが、このうちかぶれに関与するのはスタフィロコッカス科（ブドウ球菌科）細菌である。
また、ラクトバチルス目細菌としては、ラクトバチルス科、ストレプトコッカス科、エンテロコッカス科が挙げられるが、このうちかぶれに関与するのはラクトバチルス科細菌である。
【００１７】
本発明において、陰股部の皮膚細菌叢におけるバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を測定する手段は特に限定されないが、好適には、菌叢ゲノムＤＮＡに含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、陰股部の皮膚細菌叢おける細菌種を解析する方法が挙げられる。
以下、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて陰股部皮膚細菌叢における菌種を分類、同定する方法を説明する。
１）皮膚上の細菌の採取
陰股部皮膚上の細菌の採取は、滅菌ウレタン綿棒（カルチャースワブEZ, Becton Dicktson）を用いて行うことができる。具体的には、滅菌ウレタン綿棒を生理食塩水に浸し、陰股部に対して数往復擦ることにより行うことできる（図１）。検体は、採取後すぐに１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列決定に使用することもできるが、スワブの状態で、−８０℃で凍結保存することも可能である。
【００１８】
２）細菌検体からゲノムＤＮＡの抽出
１）で採取された皮膚上の細菌検体について、公知の溶菌酵素法（BMC Microbiol.,2004,4:16）やビーズ法（Science, 2008,320,1647-1651）等により、核酸を遊離させた後、ＤＮＡの分離抽出法として知られている公知の方法、例えば、フェノール−クロロホルム法（Mol.Biol.,1986,191,615-624）やグアニジン法（Science,2005,308:1635-1638）等の汎用法を採用することによりゲノムＤＮＡの抽出が行われる。
【００１９】
３）ゲノムＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定
次に、抽出した細菌ゲノムＤＮＡに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列が決定される。すなわち、各菌種に特徴的な１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列が決定され、その配列データに基づいて皮膚細菌叢の構造が解析される。このため、該菌叢構造を反映するように、配列決定を行うべき１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の領域を選択する必要があるが、迅速に解析を行い、配列の読み取りエラーを排除すべく、各菌種の配列の特徴が反映される限り、短い領域の配列を決定して比較することが望ましい。
配列決定を行うべき１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の領域は、ＰＣＲによって増幅されるが、この場合のプライマーは、菌種間で普遍的に保存されている領域に設定することが好ましい。斯かるプライマーとしては、例えば表１に示すもののForwardとReverse組み合わせたプライマー挙げられる（BMC Microbiology,2012,12:66）。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
増幅されたＰＣＲ産物を精製後、配列決定が行われる。配列決定は既知の如何なる方法を用いることができるが、例えば、次世代型超高速シークエンス装置、例えば４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）等を使用すると、迅速に配列決定することができる。
細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子上には、塩基配列が菌種間で保存されずに、変化に富む領域（Ｖ１〜Ｖ１０）が存在することが知られている。従って、斯かる領域のいずれか、例えば、スタフィロコッカス科を種レベルで分類することが可能であることが報告されているＶ１〜Ｖ３を含む領域（Conlan, S., H.H. Kong, and J.A. Segre, Species-level analysis of DNA sequence data from the NIH Human Microbiome Project. PLoS One, 2012. 7(10): p. e47075.）の塩基配列を決定することが望ましい。
【００２２】
取得された配列データの解析は、得られた塩基配列のデータ群について、Ｑｉｉｍｅ（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）等の解析ソフトを用いて行うことができ、各配列の同定は、Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（Lan, Y et al, Using the RDP classifier to predict taxonomic novelty and reduce the search space for finding novel organisms. PLoS One 2012. 7:e32491.）の体系に従って行うことができる。また、ＮＣＢＩ  ｎｕｃｌｅａｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ、ＮＣＢＩ  １６Ｓ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒＲＮＡ  ｄａｔａｂａｓｅ、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ、ＳＩＬＶＡといった遺伝子配列データベースに対するＢＬＡＳＴ  アルゴリズムを用いた相同性検索によっても可能である(J.Mol.Biol.,1990,215(3):403-410)。
各塩基配列間の類似度に基づいたクラスター解析は、例えば１００％塩基配列類似度で形成されるクラスターＯＴＵ（operational taxonomic unit）に分類することにより行うことができる。
【００２３】
後記実施例に示すように、非かぶれ群及びかぶれ群（それぞれ非月経期、月経直後）の細菌の菌叢解析から、デリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢における主要細菌種はスタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，２８．４％）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ，２１．７％）の２菌種であった（図２）。
月経直後における非かぶれ群及びかぶれ群のデリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢を比較すると、非かぶれ群と比較してかぶれ群では、ラクトバシラス科が有意に多く、スタフィロコッカス科が少ない傾向が認められた（図３ａ及び図３ｂ）。また、上位の生物分類である目（ｏｒｄｅｒ）で分類した際にも、非かぶれ群と比較してかぶれ群では、ラクトバシラス科の上位であるラクトバシラス目が有意に多いことが確認され、スタフィロコッカス科の上位であるバシラス目が少ない傾向が認められた（図４ａ及び４ｂ）。
【００２４】
また、非月経期における非かぶれ群及びかぶれ群のデリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢を比較すると、非かぶれ群と比較してかぶれ群では、スタフィロコッカス科が有意に少なく、ラクトバシラス科は有意に多いことが確認された（図６ａ及び図６ｂ）。また、上位の生物分類である目で分類した際にも、非かぶれ群と比較してかぶれ群では、スタフィロコッカス科の上位であるバシラス目が有意に少なく、ラクトバシラス科の上位であるラクトバシラス目が有意に多いことが確認された（図７ａ及び７ｂ）。
【００２５】
尚、通常、皮膚のかぶれ症状の診断マーカーとして、角層中の炎症性サイトカインの比（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）が使用されるが、月経直後又は非月経期の非かぶれ群及びかぶれ群で、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比を測定したところ、かぶれ群では非かぶれ群と比較して、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比が高いが有意な傾向は認められず（図５、図８）、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１αは、デリケートエリアかぶれリスクの指標としては不十分である。特に、非月経期の非かぶれ群及びかぶれ群でＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１αの差は僅かであり、デリケートエリアのかぶれ発症リスクの指標とはなり得ないことがわかる。
【００２６】
したがって、被験者の陰股部皮膚上の細菌に由来する塩基配列のデータ群に基づいて、バシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の塩基配列のデータ数、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の塩基配列のデータ数を算出し、バシラス目細菌とラクトバチルス目細菌の塩基配列のデータ数の総和に対するそれぞれのデータ数の比率を算出する、又はスタフィロコッカス科細菌とラクトバチルス科細菌の塩基配列のデータ数の総和に対するそれぞれのデータ数の比率を算出する、又は皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数に対する割合を、被験者の陰股部皮膚細菌叢におけるバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率とし、それぞれを単独又は組み合わせること（バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はバシラス目細菌及び／若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌及び／若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率）により、デリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ症発症リスクの判定に使用することができる。
【００２７】
具体的には、月経直後の被験者において、陰股部におけるバシラス目細菌の塩基配列のデータ数（バシラス目細菌の量）とラクトバチルス目細菌の塩基配列のデータ数（ラクトバチルス目細菌の量）の総和に対するバシラス目細菌の塩基配列のデータ数の比（ｒ１ａ）が８８．３％以上ある場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌の塩基配列のデータ数（ｒ２ａ）が１１．７％以下、又は陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するバシラス目細菌の塩基配列のデータ数（バシラス目細菌の量）の比率（Ｒ１ａ）が３６．３％以上である場合及び／又は、陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するラクトバチルス目細菌の塩基配列のデータ数（ラクトバチルス目細菌の量）の比率（Ｒ２ａ）が１．６％以下である場合には「かぶれが無い」又は「かぶれ発症リスクは低い」（非かぶれ群）と判定でき、一方、ｒ１ａが１６．６％以下であるか又はｒ２ａが８３．４％以上である場合、又はＲ１ａが３．３％以下であるか又はＲ２ａが２０．８％以上である場合は「かぶれが有る」又は「かぶれ発症リスクが高い」（かぶれ群）と判定できる（図４）。
【００２８】
また、月経直後の被験者において、陰股部におけるスタフィロコッカス科細菌の塩基配列のデータ数（スタフィロコッカス科細菌の量）とラクトバチルス科細菌の塩基配列のデータ数（ラクトバチルス科細菌の量）の総和に対するスタフィロコッカス科細菌の塩基配列のデータ数の比（ｒ１ｂ）が９９．２％以上である場合及び／又は前記総和に対するラクトバチルス科細菌の塩基配列のデータ数の比（ｒ２ｂ）が０．８％以下、又は陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するスタフィロコッカス科細菌の塩基配列のデータ数（スタフィロコッカス科細菌の量）の比率（Ｒ１ｂ）が３６．３％以上である場合及び／又は、陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するラクトバチルス科細菌の塩基配列のデータ数（ラクトバチルス科細菌の量）の比率（Ｒ２ｂ）が０．０４％以下である場合には「かぶれが無い」又は「かぶれ発症リスクは低い」（非かぶれ群）と判定でき、一方、ｒ１ｂが１９．８％以下であるか又はｒ２ｂが５４．１％以上である場合、又はＲ１ｂが３．３％以下であるか又はＲ２ｂが１６．９％以上である場合は「かぶれである」又は「かぶれ発症のリスクが高い」（かぶれ群）と判定できる（図３）。
【００２９】
非月経期の被験者において、陰股部におけるバシラス目細菌の塩基配列のデータ数（バシラス目細菌の量）とラクトバチルス目細菌の塩基配列のデータ数（ラクトバチルス目細菌の量）の総和に対するバシラス目細菌の塩基配列のデータ数の比（ｒ１ｃ）が９２．２％以上ある場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌の塩基配列のデータ数の比（ｒ２ｃ）が７．８％以下、又は陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するバシラス目細菌の塩基配列のデータ数（バシラス目細菌の量）の比率（Ｒ１ｃ）が３１．７％以上である場合及び／又は、陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するラクトバチルス目細菌の塩基配列のデータ数（ラクトバチルス目細菌の量）の比率（Ｒ２ｃ）が２．０％以下である場合には「かぶれ発症リスクは低い」（非かぶれ群）と判定でき、一方、ｒ１ｃが１４．９％以下であるか又はｒ２ｃが８５．１％以上、又はＲ１ｃが５．７％以下であるか又はＲ２ｃが３５．0％以上である場合は「かぶれ発症リスクが高い」（かぶれ群）と判定できる（図７）。
【００３０】
また、非月経期の被験者において、陰股部におけるスタフィロコッカス科細菌の塩基配列のデータ数（スタフィロコッカス科細菌の量）とラクトバチルス科細菌の塩基配列のデータ数（ラクトバチルス科細菌の量）の総和に対するスタフィロコッカス科細菌の塩基配列のデータ数の比（ｒ１ｄ）が９６．７％以上である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌の塩基配列のデータ数の比（ｒ２ｄ）が３．３％以下、又は陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するスタフィロコッカス科細菌の塩基配列のデータ数（スタフィロコッカス科細菌の量）の比率（Ｒ１ｄ）が３１．７％以上である場合及び／又は、陰股部皮膚細菌叢全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するラクトバチルス科細菌の塩基配列のデータ数（ラクトバチルス科細菌の量）の比率（Ｒ２ｄ）が０．５％以下である場合には「かぶれ発症リスクは低い」（非かぶれ群）と判定でき、一方、ｒ１ｄが１４．６％以下であるか又はｒ２ｄが８５．４％以上、又はＲ１ｄが５．６％以下であるか又はＲ２ｄ３４．９％以上である場合は「かぶれ発症リスクが高い」（かぶれ群）と判定できる（図６）。
さらに上記より、月経直後、非月経期のいずれにおいても、外用剤、内服剤、身体洗浄剤、入浴剤、吸収性物品、又は衣服等の適用前後のデリケートエリア陰股部の皮膚細菌叢において、バシラス目細菌の量、特にスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス目細菌の量、特にラクトバチルス科細菌量の両者の総和に対する比を解析する、または陰股部の皮膚細菌叢における全細菌量に対するバシラス目細菌、特にスタフィロコッカス科細菌の存在比率、又は／及び、ラクトバチルス目細菌、特にラクトバチルス科細菌の存在比率を解析することにより、該適用のかぶれに及ぼす作用を評価することが可能であると考えられる。
具体的には、該適用により、バシラス目細菌量、特にスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス目細菌量、特にラクトバチルス科細菌量の両者の総和に対するバシラス目細菌量、特にスタフィロコッカス科細菌量の比の増加及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量、特にラクトバチルス科細菌量の比の減少、又は全細菌量に対するバシラス目細菌、特にスタフィロコッカス科細菌の存在比率の増加、又は／及び、ラクトバチルス目細菌、特にラクトバチルス科細菌の存在比率の低下が認められた場合は、該適用が、かぶれを改善又は抑制する作用がある、又はかぶれリスクを低減する作用があると評価することができ、一方、前記総和に対するバシラス目細菌量、特にスタフィロコッカス科細菌量比の増の比の低下及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量、特にラクトバチルス科細菌量の比の増加、又はバシラス目細菌、特にスタフィロコッカス科細菌の存在比率の低下、又はラクトバチルス目細菌、特にラクトバチルス科細菌の存在比率の上昇が認められた場合は、該適用が、かぶれを増悪、誘導する作用がある、又はかぶれリスクを高める作用があると評価することができ
なお、外用剤、内服剤、身体洗浄剤、入浴剤の組成、剤形、形態等は限定されない。また、吸収性物品としては、例えば生理用品、オムツ、軽失禁用パット等をいう。衣服としては、例えば下衣、下衣肌着、生理用肌着等をいう。
【００３１】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞月経直後又は非月経期の被験者の陰股部におけるバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量又はラクトバチルス目細菌量の比、又は陰股部皮膚細菌叢における全細菌量に対するバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を測定する工程を含む、デリケートエリアのかぶれの有無又はかぶれ発症リスクの判定方法。
＜２＞月経直後の被験者の陰股部皮膚細菌叢において、バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量が８８．３％以上、及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量が１１．７％以下、又はバシラス目細菌の存在比率が３６．３％以上である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が１．６％以下である場合にかぶれが無い又はかぶれ発症リスクが低いと判定し、前記総和に対するバシラス目細菌量が１６．６％以下、及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量が８３．４％以上、又はバシラス目細菌の存在比率が３．３％以下である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が２０．８％以上である場合にかぶれが有る又はかぶれ発症リスクが高いと判定する、＜１＞の方法。
＜３＞月経直後の被験者の陰股部皮膚細菌叢において、スタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が９９．２％以上、及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量が０．８％以下、又はスタフィロコッカス科細菌の存在比率が３６．３％以上である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が０．０４％以下である場合にかぶれが無い又はかぶれ発症リスクが低いと判定し、前記総和に対するスタフィロコッカス科細菌量が１９．８％以下、及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量が５４．１％以上、又はスタフィロコッカス科細菌の存在比率が３．３％以下である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が１６．９％以上である場合にかぶれが有る又はかぶれ発症リスクが高いと判定する、＜１＞の方法。
＜４＞非月経期の被験者の陰股部皮膚細菌叢において、バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量の比が９２．９％以上及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量が７．８％以下、バシラス目細菌の存在比率が３１．７％以上である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が２．0％以下である場合にかぶれ発症リスクが低いと判定し、前記総和に対するバシラス目細菌量が１４．９％以下、及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量が８５．１％以上、又はバシラス目細菌の存在比率が５．７％以下である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が３５．０％以上である場合にかぶれ発症リスクが高いと判定する、＜１＞の方法。
＜５＞非月経期の被験者の陰股部皮膚細菌叢において、スタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が９６．７％以上、及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量が３．３％以下、又はスタフィロコッカス科細菌の存在比率が３１．７％以上である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が０．５％以下である場合にかぶれ発症リスクが低いと判定し、前記総和に対するスタフィロコッカス科細菌量が１４．６％以下、及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量が８５．４％以上、又はスタフィロコッカス科細菌の存在比率が５．６％以下である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が３９．４％以上である場合にかぶれ発症リスクが高いと判定する、＜１＞の方法。
＜６＞陰股部皮膚上の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のデータ群に基づいて、バシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌に属する塩基配列のデータ数、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌に属する塩基配列のデータ数を求め、両者の該データ数の総和に対する比を算出する、又は陰股部皮膚細菌叢の塩基配列のデータ数に対するそれぞれのデータ数の比率を算出する、＜１＞〜＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞被験者デリケートエリアへの外用剤、内服剤、身体洗浄剤、入浴剤、吸収性物品、又は衣服の適用前後における、月経直後又は非月経期の該被験者の陰股部におけるバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するそれぞれの菌量の比を算出する、又は陰股部皮膚細菌叢の全細菌量に対するバシラス目細菌若しくはラクトバチルス目細菌の存在比率、又はスタフィロコッカス科細菌若しくはラクトバチルス科細菌の存在比率を算出するする工程を含む、該適用のデリケートエリアのかぶれに及ぼす作用の評価方法。
＜８＞バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量の比が増加、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が増加、又は／及びバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が低下、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が低下、又は／及びラクトバチルス目細菌又はラクトバチルス科細菌の存在比率が低下した場合、前記適用は、デリケートエリアのかぶれを改善又は抑制する作用があると評価する、またはデリケートエリアのかぶれリスクを低減する作用があると評価する＜７＞記載の方法。
＜９＞バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量の比が低下、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が低下、又は／及びバシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が増加、又はスタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が増加、又は／及びラクトバチルス目細菌又はラクトバチルス科細菌の存在比率が増加した場合、前記適用は、デリケートエリアのかぶれを悪化させる作用があると評価する、又はデリケートエリアのかぶれリスクを高める作用があると評価する＜７＞記載の方法。
＜１０＞月経直後が月経終了３日以内であるか、又は非月経期が月経終了１０〜１４日後である＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００３３】
実施例１  陰股部皮膚上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡによる菌叢解析
（１）被験者及びかぶれの判定
ヘルシンキ宣言の下、２０歳〜４０歳までの女性を対象に、かぶれ症状の診断および試料の採取を行った。採取は月経直後（月経終了３日以内）と非月経期（月経終了１０〜１４日後）の２回実施した。デリケートエリアのかぶれ症状に関しては、医師が紅班、丘疹、浸軟、落屑について５段階（０：なし、１：軽微、２：軽度、３：中等度、４：重度）のスコア評価による判定を行った。そのうち、月経直後の診断において、陰股部または陰唇部における紅班スコアが０であった被験者を非かぶれ群とし、１以上であった被験者をかぶれ群とした（各群１６名）。
【００３４】
（２）試料の調製
デリケートエリア陰股部からの皮膚の細菌のサンプリングは、滅菌ウレタン綿棒（カルチャースワブＥＺ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｔｓｏｎ）を用いて行った。具体的には、滅菌ウレタン綿棒を生理食塩水に浸し、左陰股部に対して、数往復擦ることにより菌の採取を行った（図１）。かぶれを有している被験者に対しては、かぶれ部位は避けて採取を行った。採取後のサンプルに関してはＤＮＡの抽出を行うまで−８０℃で保存した。
【００３５】
（３）細菌からのゲノムＤＮＡの抽出
スワブサンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は以下の方法で行った。まず、１５ｍＬ遠心チューブにジルコニアビーズ１，２００ｍｇを入れ、さらに１ｍＬのＴＥ飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、氷上で冷却した。スワブを５００μＬのＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（終濃度１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（終濃度１ｍＭ）、ＮａＣｌ（終濃度１００ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（終濃度２％（ｖ／ｖ））、ＳＤＳ（終濃度１％（ｗ／ｖ））］に懸濁し、準備したフェノール入り１５ｍＬ遠心チューブに３００μＬ添加した。上記作業を３回繰り返し、計９００μＬの抽出液を回収した。Ｃｕｔｅ  Ｍｉｘｅｒを用いて５分間攪拌後、４℃、９，０００  ｒｐｍで１０分間遠心した。水相７００  μＬをＴＥ飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬを入れたＭａＸｔｒａｃｔ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）に混合した。試験管ミキサーにより５分攪拌後、２０℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、水相６００μＬを１．５ｍＬ  マイクロチューブに回収し、４  μＬの共沈剤（エタ沈メイト、和光純薬工業）及び６０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）を混合した。さらに、イソプロパノールを６００μＬ混合し、転倒混和後、４℃で１０分間インキュベーションした。１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した後、上清を除去し、６００μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールを混合し、タッピングにより洗浄した。再度、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した後、上清を除去し、減圧乾燥にてペレットを乾燥させた。最後に２００μＬのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いて溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００３６】
（４）網羅的細菌菌叢解析
菌の採取は、非かぶれ群１６名及びかぶれ群１６名の計３２名を対象に行われた。これら３２名のうち両群それぞれ２名（計４名）は採取菌量が検出限界以下であったため解析対象から除外した。
次世代シーケンサーを用いた１６Ｓ  ｒＲＮＡによる菌叢解析は、これら２８名の被験者の月経直後及び非月経期の全５６サンプルを解析した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅は、抽出したＤＮＡを鋳型にして、表２に示すプライマーのForwardとReverseを組み合わせたものを用いて増幅した。表２に示すプライマーは次世代シーケンサーによる解析に必要なアダプター配列と、表１に示すプライマー27Fまたは338Rを連結したプライマーである。さらに、Forward用のプライマーには、データ解析の際に各サンプルを区別するためにインデックス配列（MID）が付加されており、各サンプルには異なるForwardプライマーを使用している。ＤＮＡポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ  ＨＳポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、表３に示した組成でＰＣＲ反応溶液を調製し、表４に示した条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の精製はＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマンコールター）及びＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製した。
増幅した細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列は４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて取得した。エマルジョンＰＣＲは、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｅｍＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｌｉｂ−Ｌ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行い、シーケンス反応は、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＰｉｃｏＴｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）及びＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
４５４  ＧＳ  ＪＵＮＩＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭを用いて取得した配列情報の解析は、ＬＩＮＵＸ  （ＵＢＵＮＴＵ  １２．０４）環境下でフリーソフトＱＩＩＭＥ（ＱＵＡＮＴＩＴＡＴＩＶＥ  ＩＮＳＩＧＨＴＳ  ＩＮＴＯ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＥＣＯＬＯＧＹ）（HTTP://QIIME.ORG/）＜CAPORASO ET AL,. QIIME ALLOWS ANALYSIS OF HIGH-THROUGHPUT COMMUNITY SEQUENCING DATA. NAT METHODS, 2010. 7:335-336.＞を用いて行った。得られた全ての塩基配列情報はＱＩＩＭＥ上でデフォルトのパラメータを用いてクオリティ等を確認し、設定以下のものは、以降のデータ解析から除外した（具体的には平均クオリティスコアが２５以下、ホモポリマーを６以上有する、プライマー配列にミスマッチが存在する、バーコード配列を有さない、配列が２００  ＢＰ以下または１０００  ＢＰ以上のものを解析対象外とした）。解析対象とした配列はＱＩＩＭＥ内のソフトを用いて１００％の類似度で形成されるクラスターＯＴＵ（ＯＰＥＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＴＡＸＯＮＯＭＩＣ  ＵＮＩＴ）に分類した。各配列の同定はＴＨＥ  ＲＩＢＯＳＯＭＡＬ  ＤＡＴＡＢＡＳＥ  ＰＲＯＪＥＣＴ（HTTP://RDP.CME.MSU.EDU/）＜LAN, Y ET AL, USING THE RDP CLASSIFIER TO PREDICT TAXONOMIC NOVELTY AND REDUCE THE SEARCH SPACE FOR FINDING NOVEL ORGANISMS. PLOS ONE 2012. 7:E32491.＞の体系に従って行った。
【００３７】
【表２−１】
2018088843.tif 000003
【００３８】
【表２−２】
2018088843.tif 000004
【００３９】
【表３】
2018088843.tif 000005
【００４０】
【表４】
2018088843.tif 000006
【００４１】
（５）菌叢解析結果
１）採取したデリケートエリア陰股部の全サンプルの細菌叢
図２に百分率で計算した各被験者の細菌叢を用いて算出した全５６サンプルの細菌平均組成を示す。図２から、デリケートエリア陰股部の皮膚主要細菌種はスタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，  ２８．４％）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ，  ２１．７％）の２菌種であることが明らかとなった。
【００４２】
２）月経直後のデリケートエリア陰股部の主要細菌種の比較
図３ａ及び図３ｂには非かぶれ群及びかぶれ群のスタフィロコッカス科及びラクトバシラス科の分布を箱ひげ図で表記した結果を示す。有意差検定の結果、非かぶれ群と比較してかぶれ群では、ラクトバシラス科が有意に多いことが確認された（ｔ−ｔｅｓｔ，  ｐ＜０．０５）。また、スタフィロコッカス科が少ない傾向が認められた（ｔ−ｔｅｓｔ，  ｐ＜０．１）。また、上位の生物分類である目（ｏｒｄｅｒ）で分類した際にも、非かぶれ群と比較してかぶれ群では、ラクトバシラス科の上位であるラクトバシラス目が有意に多いことが確認され（ｔ−ｔｅｓｔ，  ｐ＜０．０５）、スタフィロコッカス科の上位であるバシラス目が少ない傾向が認められた（ｔ−ｔｅｓｔ，  ｐ＜０．１）（図４ａ及び４ｂ）。
また、バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量の比が８８．３％以上ある場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が１１．７％以下、又は全細菌量に対するバシラス目細菌の存在比率が３６．３％以上である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が１．６％以下である場合にかぶれが無い又はかぶれ発症リスクが低いと判定可能であり、前記総和に対するバシラス目細菌量の比が１６．６％以下である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が８３．４％以上、又は全細菌量に対するバシラス目細菌の存在比率が３．３％以下である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が２０．８％以上である場合にかぶれが有る又はかぶれ発症リスクが高いと判定可能であることが認められた。
さらに、スタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が９９．２％以上ある場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が０．８％以下、又は全細菌量に対するスタフィロコッカス科細菌の存在比率が３６．３％以上である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が０．０４％以下である場合にかぶれが無い又はかぶれ発症リスクが低いと判定可能であり、前記総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が１９．８％以下である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が５４．１％以上である場合、又は全細菌量に対するスタフィロコッカス科細菌の存在比率が３．３％以下である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が１６．９％以上である場合にかぶれが有る又はかぶれ発症リスクが高いと判定可能であることが認められた。
【００４３】
３）月経直後の炎症性マーカーとの比較について
通常、皮膚のかぶれ症状の診断マーカーとして、角層中の炎症性サイトカインの比（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）が使用される。そこで、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比と菌叢結果による菌種の存在比率の比較を行った。炎症性サイトカインの測定ために、ＰＰＳテープ（ＮＩＣＨＩＢＡＮ）を用いて、菌採取部位と同部位から角層を採取した。その後、ＰＰＳテープを１ｍｌの０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ―1００/ＰＢＳ溶液に加え、ローターミキサーにて３時間撹拌し、タンパク質を抽出した。タンパク質抽出後、ＥＬＩＳＡ法によって測定を行った。ＥＬＩＳＡ法はＥＬＩＳＡキット：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１ｒａ/ＩＬ―１Ｆ３ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１ａｌｐｈａ/ＩＬ―１Ｆ１ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、本製品の使用説明書に従って行った。月経直後の非かぶれ群及びかぶれ群の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比を図５に示す。図５より、非かぶれ群と比較して、かぶれ群では炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比が高いが有意な傾向は認められなかった（ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＝０．２５）。
一方で、図３及び図４から、皮膚細菌叢は、かぶれ群と非かぶれ群を有意に分類できることが判明している。したがって、皮膚細菌叢は炎症性サイトカインよりも月経直後における皮膚のかぶれ症状の診断マーカーとして優れている。
【００４４】
４）非月経期のデリケートエリア陰股部の細菌叢に関して
図６ａ及び図６ｂには非かぶれ群及びかぶれ群のスタフィロコッカス科及びラクトバシラス科の平均値及び標準偏差をグラフ化した結果を示す。有意差検定の結果、非かぶれ群と比較してかぶれ群では、スタフィロコッカス科が有意に少なく、ラクトバシラス科は有意に多いことが確認された（ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．０５）。また、上位の生物分類である目（ｏｒｄｅｒ）で分類した際にも、非かぶれ群と比較してかぶれ群では、スタフィロコッカス科の上位であるバシラス目が有意に少なく、ラクトバシラス科の上位であるラクトバシラス目が有意に多いことが確認された（ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．０５）（図７ａ及び７ｂ）。
また、バシラス目細菌量とラクトバチルス目細菌量の総和に対するバシラス目細菌量の比が９２．２％以上ある場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が７．８％以下、又は全細菌量に対するバシラス目細菌の存在比率が３１．７％以上である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が２．０％以下である場合にかぶれ発症リスクが低いと判定可能であり、前記総和に対するバシラス目細菌量の比が１４．９％以下である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス目細菌量の比が８５．１％以上、又は全細菌量に対するバシラス目細菌の存在比率が５．７％以下である場合及び／又はラクトバチルス目細菌の存在比率が３５．０％以上である場合にかぶれ発症リスクが高いと判定可能であることが認められた。
さらに、スタフィロコッカス科細菌量とラクトバチルス科細菌量の総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が９６．７％以上である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が３．３％以下、又は全細菌量に対するスタフィロコッカス科細菌の存在比率が３１．７％以上である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が０．５％以下である場合にかぶれ発症リスクが低いと判定可能であり、前記総和に対するスタフィロコッカス科細菌量の比が１４．６％以下である場合及び／又は、前記総和に対するラクトバチルス科細菌量の比が８５．４％以上、、又は全細菌量に対するスタフィロコッカス科細菌の存在比率が５．６％以下である場合及び／又はラクトバチルス科細菌の存在比率が３９．４％以上である場合にかぶれ発症リスクが高いと判定可能であることが認められた。
【００４５】
５）非月経期の炎症性マーカーとの比較について
非月経期においても、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比と菌叢結果による菌種の存在比率の比較を行った。非月経期の非かぶれ群及びかぶれ群の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比を図８に示す。図８より、かぶれ症状が比較的改善している非月経期においては、かぶれ群で炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１α）の比が高いが、有意な傾向は認められず、月経直後（図５）と比較しても、その差は小さくなっている（ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＝０．４９）。一方、図６及び図７の結果より、皮膚細菌叢は非月経期においても、非かぶれ群とかぶれ群を有意に分類することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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