【手続補正書】
【提出日】平成27年7月13日(2015.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆植物体のゲノム内に配列番号１８又はその変異体を含み、前記変異体が配列番号１８に対して少なくとも９８％同一である、遺伝子組換え大豆植物体。
【請求項２】
アクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託された、代表的な種子に存在する、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含むゲノムを含む、大豆種子。
【請求項３】
そのゲノム内に配列番号１９および配列番号２０を含む、請求項２に記載の種子を生長させることにより産出された大豆植物体。
【請求項４】
イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む、請求項３に記載の大豆植物体の子孫植物体。
【請求項５】
前記大豆植物体のゲノム内で配列番号１８を産生するように大豆ゲノムＤＮＡのセグメント内に挿入された大豆植物用の発現カセット。
【請求項６】
花粉、胚珠、花、シュート、根および葉からなる群から選択され、前記インサートを含む、請求項３に記載の植物体の部分。
【請求項７】
単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記分子が、少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな洗浄条件下において、配列番号１および配列番号２からなる群から選択される核酸配列とのハイブリダイゼーションを維持する、前記分子。
【請求項８】
単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号３〜２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
大豆植物を産生する方法であって、ゲノム内で配列番号１８を産生するように前記大豆ゲノムのＤＮＡセグメント内に導入遺伝子を挿入する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
大豆植物を育種する方法であって、配列番号１９および配列番号２０を含む、大豆ゲノムＤＮＡの前記セグメント中に遺伝子組換えインサートを含む第１の大豆植物を、第２の大豆植物と交雑させて、ゲノムを含む第３の大豆植物を産生する工程と、前記ゲノムにおける前記セグメント中に前記遺伝子組換えインサートの存在に関して、前記第３の植物をアッセイする工程とを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記大豆植物内に除草剤耐性形質を遺伝子移入するのに使用され、前記第１の大豆植物が、配列番号１９および配列番号２０を含み、前記第３の大豆植物が、前記ゲノムにおける、配列番号１９および配列番号２０の少なくとも１つの存在についてアッセイされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
雑草を抑制する方法であって、少なくとも１つのアリールオキシアルカノアート、グリホサート、ビアラホス、ホスフィノトリシンまたはグルホシネートの除草剤をフィールドに散布する工程を含み、前記フィールドが、請求項１の植物体を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記アリールオキシアルカノアート除草剤が、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；およびＭＣＰＢからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、少なくとも１つの更なる除草剤を前記フィールドに散布する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの更なる除草剤が、前記植物体表面上に散布される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０を含む核酸分子に、少なくとも９５％の同一性を含むポリヌクレオチドを含む、安定的に形質転換された双子葉植物。
【請求項１７】
前記双子葉植物が、ダイズ（Glycine max）由来である、請求項１６に記載の安定的に形質転換された双子葉植物。
【請求項１８】
請求項１の植物体から製造される粉末またはオイル製品。
【請求項１９】
配列番号１９および配列番号２０を産生するように、前記植物細胞の１５番染色体内に遺伝子導入で挿入された発現カセットを含む大豆植物細胞。
【請求項２０】
ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で寄託された種子に存在する、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のジャンクション配列を、前記ジャンクション配列に特異的に結合し、または、前記ジャンクション配列を増幅するプローブまたは少なくとも１つのプライマーにより検出する工程を含み、前記ジャンクション配列が、配列番号１９の残基１２４６〜１２４７または配列番号２０の残基１７６〜１７７を含む、試料中のイベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を特定するための方法。
【請求項２１】
さらに、少なくとも２つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、前記試料中に存在する核酸から、ＤＮＡフラグメントを増幅する工程を含み、前記第１のプライマーが、配列番号１８内の挿入配列もしくはその相補体に特異的に結合し、および、第２のプライマーが、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるフランキング配列内の配列に特異的に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で寄託された種子に存在する、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む大豆植物のイベント接合性を判定するための方法であって、前記イベントが、導入遺伝子構築物を含み、前記導入遺伝子構築物が、５’フランキング大豆ゲノムＤＮＡおよび３’フランキング大豆ゲノムＤＮＡに隣接され、前記方法が、
前記大豆植物からのゲノムＤＮＡのＤＮＡ試料を取得する工程；
ａ．ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供された場合、イベント増幅産物を産生する、前記導入遺伝子構築物に特異的に結合する第１のイベントプライマー、および、前記５’大豆ゲノムフランキングＤＮＡまたは前記３’大豆ゲノムフランキングＤＮＡに特異的に結合する第２のイベントプライマー
ｂ．ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供された場合、内因性大豆参照遺伝子由来の参照増幅産物を産生する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマー
ｃ．前記イベント増幅産物とハイブリダイズする蛍光イベントプローブ
ｄ．前記参照増幅産物とハイブリダイズする蛍光参照プローブ
と、前記ＤＮＡ試料とを接触させることにより、接触試料を産生する工程；
蛍光ベースのエンドポイントＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に、前記接触試料を供する工程；
前記イベント増幅産物にハイブリダイズする前記蛍光イベントプローブを定量化する工程；
前記参照増幅産物にハイブリダイズする前記蛍光参照プローブを定量化する工程；
ハイブリダイズした蛍光参照プローブに対する、ハイブリダイズした蛍光イベントプローブの量を比較する工程：ならびに、
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの蛍光比を比較することにより、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の接合性を判定する工程を含む、
前記方法。
【請求項２３】
前記５’フランキングＤＮＡが、配列番号１を含み、前記３’フランキングＤＮＡが、配列番号２を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のイベントプライマーが、配列番号２１に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記参照遺伝子が、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される配列を含むか、または、前記配列にハイブリダイズする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記イベントプローブが、配列番号１４を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記イベントプライマーが、配列番号１２および配列番号１３である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記イベントプライマーが、配列番号１２および配列番号１３からなり、前記参照プライマーが、配列番号１５および配列番号１６からなり、前記イベントプローブが、配列番号１４からなり、ならびに、前記参照プローブが、配列番号１７からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のイベントプライマー、前記第２のイベントプライマー、前記参照フォワードプライマー、前記参照リバースプライマー、前記イベントプローブおよび前記参照プローブを含む、請求項２２に記載の方法を行うためのキット。
【請求項３０】
配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０およびそれらの相補体からなる群から選択される配列に、少なくとも９５％の同一性を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明は以下を提供する。
［１］大豆のゲノムＤＮＡのセグメント中に遺伝子組換えインサートを含み、上記セグメントが、配列番号１および配列番号２を含む、遺伝子組換え大豆植物体。
［２］アクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託された、代表的な種子に存在する、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含むゲノムを含む、大豆種子。
［３］上記セグメント中に上記遺伝子組換えインサートを含む、上記［１］に記載の植物体の大豆種子。
［４］大豆のゲノムＤＮＡのセグメント中に遺伝子組換えインサートを含み、上記セグメントが、配列番号１および配列番号２を含む、上記［２］に記載の種子を生長させることにより産出された大豆植物体。
［５］イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む、上記［４］に記載の大豆植物体の子孫植物体。
［６］上記セグメント中に除草剤耐性遺伝子を含む、上記［１］に記載の大豆植物体の除草剤耐性子孫植物体。
［７］大豆植物用の発現カセットを製造する方法であって、作動可能にプロモータに結合され、配列番号１および配列番号２を含む大豆ゲノムＤＮＡのセグメント内に挿入された、異種性ポリヌクレオチドを産生する工程を含む、上記方法。
［８］花粉、胚珠、花、シュート、根および葉からなる群から選択され、上記インサートを含む、上記［４］に記載の植物体の部分。
［９］単離されたポリヌクレオチド分子であって、上記分子が、少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな洗浄条件下において、配列番号１および配列番号２からなる群から選択される核酸配列とのハイブリダイゼーションを維持する、上記分子。
［１０］単離されたポリヌクレオチドであって、上記ポリヌクレオチドが、配列番号３〜２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
［１１］大豆ゲノムを修飾する方法であって、上記大豆ゲノムのＤＮＡセグメント内に導入遺伝子を挿入する工程を含み、上記ＤＮＡセグメントが、配列番号１を含む５’末端、および、配列番号２のヌクレオチド残基を含む３’末端を含む、上記方法。
［１２］大豆植物を育種する方法であって、配列番号１および配列番号２を含む、大豆ゲノムＤＮＡの上記セグメント中に遺伝子組換えインサートを含む第１の大豆植物を、第２の大豆植物と交雑させて、ゲノムを含む第３の大豆植物を産生する工程と、上記ゲノムにおける上記セグメント中に上記遺伝子組換えインサートの存在に関して、上記第３の植物をアッセイする工程とを含む、上記方法。
［１３］上記方法が、上記大豆植物内に除草剤耐性形質を遺伝子移入するのに使用され、上記第１の大豆植物が、配列番号１９および配列番号２０を含み、上記第３の大豆植物が、上記ゲノムにおける、配列番号１９および配列番号２０の少なくとも１つの存在についてアッセイされる、上記［１２］に記載の方法。
［１４］雑草を抑制する方法であって、少なくとも１つのアリールオキシアルカノアート、グリホサート、ビアラホス、ホスフィノトリシンまたはグルホシネートの除草剤をフィールドに散布する工程を含み、上記フィールドが、上記［１の植物体を含み、上記遺伝子組換えインサートが、配列番号１８の残基１２４７〜１１５０７を含む、上記方法。
［１５］上記除草剤が、同時に、または／および、連続して選択および散布される、上記［１４］に記載の方法。
［１６］上記アリールオキシアルカノアート除草剤が、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；およびＭＣＰＢからなる群から選択される、上記［１４］に記載の方法。
［１７］上記方法が、少なくとも１つの更なる除草剤を上記フィールドに散布する工程を含む、上記［１４］に記載の方法。
［１８］上記少なくとも１つの更なる除草剤が、ジカンバである、上記［１７］に記載の方法。
［１９］上記方法が、上記除草剤の散布の１４日以内に上記フィールドに種子を播く工程を含み、上記植物体が上記種子から生長する、上記［１４］に記載の方法。
［２０］上記少なくとも１つの更なる除草剤が、同じ生長時期内に散布される、上記［１４］に記載の方法。
［２１］上記少なくとも１つの更なる除草剤が、上記植物体表面上に散布される、上記［１４］に記載の方法。
［２２］配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０を含む核酸分子に、少なくとも９５％の同一性を含むポリヌクレオチドを含む、安定的に形質転換された双子葉植物。
［２３］上記双子葉植物が、ダイズ（Glycine max）由来である、上記［２２］に記載の安定的に形質転換された双子葉植物。
［２４］上記［１の植物体から製造される粉末またはオイル製品。
［２５］アリールオキシアルカノアート除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも１つの除草剤に抵抗性であり、上記遺伝子組換えインサートが、配列番号１８の残基１２４７〜１１５０７を含む、上記［１］に記載の大豆植物体。
［２６］発現カセットを含む植物細胞であって、配列番号１および配列番号２に隣接される、または、配列番号１および配列番号２を含む遺伝子座において、１５番染色体内に遺伝子導入で挿入され、上記発現カセットが、
ａ．グリホサート除草剤耐性遺伝子を発現する第１の植物転写ユニット；
ｂ．アリールオキシアルカノアート除草剤耐性遺伝子を発現する第２の植物転写ユニット；および、
ｃ．グルホシネート除草剤耐性遺伝子を発現する第３の植物転写ユニットを含む、
上記植物細胞。
［２７］ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で寄託された種子に存在する、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のジャンクション配列を、上記ジャンクション配列に特異的に結合し、または、上記ジャンクション配列を増幅するプローブまたは少なくとも１つのプライマーにより検出する工程を含み、上記ジャンクション配列が、配列番号１９の残基１２４６〜１２４７または配列番号２０の残基１７６〜１７７を含む、試料中のイベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を特定するための方法。
［２８］さらに、少なくとも２つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、上記試料中に存在する核酸から、ＤＮＡフラグメントを増幅する工程を含み、上記第１のプライマーが、配列番号１８内の挿入配列もしくはその相補体に特異的に結合し、および、第２のプライマーが、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるフランキング配列内の配列に特異的に結合する、上記［２７］に記載の方法。
［２９］ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で寄託された種子に存在する、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む大豆植物のイベント接合性を判定するための方法であって、上記イベントが、導入遺伝子構築物を含み、上記導入遺伝子構築物が、５’フランキング大豆ゲノムＤＮＡおよび３’フランキング大豆ゲノムＤＮＡに隣接され、上記方法が、
上記大豆植物からのゲノムＤＮＡのＤＮＡ試料を取得する工程；
ａ．ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供された場合、イベント増幅産物を産生する、上記導入遺伝子構築物に特異的に結合する第１のイベントプライマー、および、上記５’大豆ゲノムフランキングＤＮＡまたは上記３’大豆ゲノムフランキングＤＮＡに特異的に結合する第２のイベントプライマー
ｂ．ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供された場合、内因性大豆参照遺伝子由来の参照増幅産物を産生する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマー
ｃ．上記イベント増幅産物とハイブリダイズする蛍光イベントプローブ
ｄ．上記参照増幅産物とハイブリダイズする蛍光参照プローブ
と、上記ＤＮＡ試料とを接触させることにより、接触試料を産生する工程；
蛍光ベースのエンドポイントＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に、上記接触試料を供する工程；
上記イベント増幅産物にハイブリダイズする上記蛍光イベントプローブを定量化する工程；
上記参照増幅産物にハイブリダイズする上記蛍光参照プローブを定量化する工程；
ハイブリダイズした蛍光参照プローブに対する、ハイブリダイズした蛍光イベントプローブの量を比較する工程：ならびに、
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの蛍光比を比較することにより、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の接合性を判定する工程を含む、
上記方法。
［３０］上記５’フランキングＤＮＡが、配列番号１を含み、上記３’フランキングＤＮＡが、配列番号２を含む、上記［２９］に記載の方法。
［３１］上記第２のイベントプライマーが、配列番号２１に結合する、上記［２９］に記載の方法。
［３２］上記参照遺伝子が、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される配列を含むか、または、上記配列にハイブリダイズする、上記［２９］に記載の方法。
［３３］上記イベントプローブが、配列番号１４を含む、上記［２９］に記載の方法。
［３４］上記イベントプライマーが、配列番号１２および配列番号１３である、上記［２９］に記載の方法。
［３５］上記イベントプライマーが、配列番号１２および配列番号１３からなり、上記参照プライマーが、配列番号１５および配列番号１６からなり、上記イベントプローブが、配列番号１４からなり、ならびに、上記参照プローブが、配列番号１７からなる、上記［２９］に記載の方法。
［３６］上記第１のイベントプライマー、上記第２のイベントプライマー、上記参照フォワードプライマー、上記参照リバースプライマー、上記イベントプローブおよび上記参照プローブを含む、上記［２９］に記載の方法を行うためのキット。
［３７］配列番号１、配列番号２、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０およびそれらの相補体からなる群から選択される配列に、少なくとも９５％の同一性を有する、単離されたポリヌクレオチド。
より具体的には、本発明は、部分的に、アクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託された代表的な種子を有する、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１と命名された大豆（ダイズ（Glycine max））イベント（「イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１」）およびそれ由来の子孫に関連する。本主題の発明は、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む大豆植物体を含む（ならびに、配列番号１と配列番号２との間に遺伝子組換えインサートを含む大豆植物体を含む）。