【手続補正書】
【提出日】平成27年6月22日(2015.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール化合物を生成するための改変された組換え宿主細胞であって、前記細胞から単離される生成物が、フェノール化合物であるように、
ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸シンターゼ（６−ＭＳＡＳ）又はオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）を含む芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、
ｉｉｉ）前記フェノール化合物を形成するための脱カルボキシル化を触媒する官能性デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系と、
を含み、
ＰＫＳの第１の発現系およびＡＣＰシンターゼの第２の発現系は、単一のベクターまたは別個のベクター上に存在し、官能性デカルボキシラーゼの第３の発現系は、ＰＫＳおよび／またはホロＡＣＰシンターゼと同一のベクター上に存在するか、または別個のベクター上に存在するか、または；
第１、第２、および第３の発現系は、宿主細胞染色体内に組み込まれるか、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から発現される、
改変された組換え宿主細胞。
【請求項２】
前記フェノール化合物が、メタ−クレゾールまたはオルシノールである、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記芳香族ＰＫＳが、真菌または原核生物由来の６−メチルサリチル酸のシンターゼである、請求項１に記載の改変された細胞。
【請求項４】
前記デカルボキシラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、プリムネシウム・パツルム（Ｐ．Ｐａｔｕｌｕｍ）由来の６−ＭＳＡデカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス・クラバタス由来のＰａｔＧ遺伝子、グリオクラジウム・ロゼウム由来のＯＳＡデカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス種由来の２，３−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子、およびスフィンゴモナス・パウシモビリスＳＹＫ−６由来の５−カルボキシバニリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
【請求項５】
前記ＰＫＳおよび前記ホロＡＣＰシンターゼが、２シストロン性メッセンジャーＲＮＡから発現される、請求項１に記載の改変された細胞。
【請求項６】
前記宿主生物が、サッカロマイセス・セレヴィシエ、ピキア・パストリスおよびアスペルギルス種からなる群から選択される、請求項１に記載の改変された細胞。
【請求項７】
フェノール化合物を生成する方法であって、
ａ）改変された組換え宿主細胞であって、
ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸シンターゼ（６−ＭＳＡＳ）又はオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）を含む芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、
ｉｉｉ）官能性デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系と、を含む、改変された組換え宿主細胞を提供することと、
ｂ）前記組換え宿主細胞において第１のフェノール化合物を生成することと、
ｃ）前記第１のフェノール化合物から第２のフェノール化合物を合成することであって、組換えデカルボキシラーゼが、前記第１のフェノール化合物の脱カルボキシル化を触媒して、前記第２のフェノール化合物を形成することと、
を含み、
ＰＫＳの第１の発現系およびＡＣＰシンターゼの第２の発現系は、単一のベクターまたは別個のベクター上に存在し、官能性デカルボキシラーゼの第３の発現系は、ＰＫＳおよび／またはホロＡＣＰシンターゼと同一のベクター上に存在するか、または別個のベクター上に存在するか、または；
第１、第２、および第３の発現系は、宿主細胞染色体内に組み込まれるか、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から発現される、
方法。
【請求項８】
前記第１のフェノール化合物が、６−ＭＳＡまたはオルセリン酸（ＯＳＡ）であり、第２のフェノール化合物が、メタクレゾールまたはオルシノールである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
フェノール化合物を生成する方法であって、
ａ）改変された組換え宿主細胞であって、
ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）シンターゼ（又はオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）を含む芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、を含む、改変された組換え宿主細胞を提供することと、
ｂ）前記組換え宿主細胞において生成された第１のフェノール化合物を単離することと、
ｃ）金属触媒で加熱し、続いて、蒸留することによって、ステップｂ）の前記第１のフェノール化合物を脱カルボキシル化して、前記第２のフェノール化合物を形成することと、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記第１のフェノール化合物が、６−ＭＳＡであり、前記第２のフェノール化合物が、メタクレゾールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記金属触媒が、亜鉛触媒である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
フェノール化合物がアルキル化フェノール化合物である請求項１に記載の改変された細胞であって、前記細胞から単離される生成物が、アルキル化フェノール化合物であるように、改変された細胞が
（ｉｖ）Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＯＭＴ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第４の発現系を更に含む、改変された細胞。
【請求項１３】
前記アルキル化フェノール化合物が、３−メチルアニソールまたは３，５−ジメトキシトルエンである、請求項１２に記載の改変された細胞。
【請求項１４】
ＯＯＭＴが、ＯＯＭＴ１、ＯＯＭＴ２、ＯＯＭＴ３、ＯＯＭＴ４、ＣＯＭＴ１からなる群から選択されるロサ・キネンシス（Ｒ．Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）遺伝子によってコードされる、請求項１２に記載の改変された細胞。
【請求項１５】
アルキル化フェノール化合物を生成するための、請求項７に記載の方法であって、
ｄ）前記組換え宿主細胞において生成された第２のフェノール化合物を単離することと、
ｅ）アルキル化剤での処理によって、ステップｄ）の前記第２のフェノール化合物をアルキル化して、前記アルキル化フェノール化合物を形成することと、を更に含む、方法。
【請求項１６】
前記第２のフェノール化合物中間体が、メタクレゾールまたはオルシノールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列は、プリムネシウム・パツルム（Ｐ．ｐａｔｕｌｕｍ）由来の６−ＭＳＡデカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のＰａｔＧ遺伝子、グリオクラジウム・ロゼウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）由来のＯＳＡ  デカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス種由来の２，３−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子、およびスフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）ＳＹＫ−６由来の５−カルボキシバニリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項７、８、１５または１６の方法。