【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年1月7日(2015.1.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体に配置され、蛍光顕微鏡に取り付けられた生体試料の光学セグメンテーションのための方法であって、
生体試料がその表面全域で均一に照明されるように光源から所定の波長の光を生体試料に送り、前記光によって生体試料から蛍光を発光せしめるステップと、
画像取込デバイスを使用して生体試料の蛍光画像を取得するステップと、
生体試料中の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成するために、少なくとも部分的に特徴情報又は画素強度情報を利用して蛍光画像を解析するステップと、
画像取込デバイスの画像をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標に位置合わせするために、前記マスキングパターンを再構成マスキングパターンに変換するステップと、
光源と生体試料との間に配置されたデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用して、再構成マスキングパターンを生体試料に投影するステップであって、再構成マスク化パターンが生体試料と位置合わせされるステップと、
生体試料がその表面全域で均一に照明されるように光源から所定の波長の光を再構成マスキングパターンを通して生体試料に送り、前記光によって生体試料から蛍光を発光せしめるステップと、
生体試料のマスク化蛍光画像を画像取込デバイスで取得するステップと、
マスク化蛍光画像をデジタル画像に転換するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記マスキングパターンを再構成マスキングパターンに変換することが、アフィン変換パラメータをマスキングパターンに適用することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アフィン変換パラメータが較正手順を用いて計算され、前記較正手順が、
目標画像をＤＭＤに転送して、画像を較正試料上に投影し、
較正試料上に投影された目標画像の較正画像を取得し、
画像取込デバイスとデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標との間の形状係数を一致させるために、較正画像をダウンサンプリングして、再構成画像を生成し、
再構成画像を目標画像と位置合わせして、アフィン変換パラメータについて解くこと
を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ダウンサンプリングが、画像取込デバイスからの画像に双一次補間及び２Ｄテーパリング関数を適用することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記アフィン変換パラメータについて解くことが、フーリエ変換を画像位置合わせに適用することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記フーリエ変換の大きさが対数極座標空間で表される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記再構成マスクパターンを生体試料に投影することが、生体試料の空間照明の変更をもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記マスク化蛍光画像をデジタル画像に転換することが、再構成マスキングパターンのポジ又はネガ画像を表す、請求項１記載の方法。
【請求項９】
生体試料の蛍光画像を取得することが、蛍光画像の信号対雑音比、忠実度、特異性又はそれらの組合せを向上させるために試料を選択的に照明するために以前の画像からの画像情報を使用することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
固体支持体に配置された生体試料の光学セグメンテーションのための画像解析システムであって、
生体試料を取り付けるためのステージを有する蛍光顕微鏡と、
生体試料を照明するための光源であって、光が蛍光顕微鏡の開口を通って生体試料へと導かれるように配置された光源と、
光源と蛍光顕微鏡の開口との間に配置されるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）と、
蛍光顕微鏡に取り付けられ、生体試料の蛍光画像を取得するように構成された画像取込デバイスと、
デジタル光プロセッサであって、
画像取込デバイスからの蛍光画像を受け取り、
生体試料中の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成するために、少なくとも部分的に特徴情報又は画素強度情報を利用して蛍光画像を解析し、
画像取込デバイスの画像をＤＭＤの空間座標に位置合わせするために、前記マスキングパターンを再構成マスキングパターンに変換し、
光源から所定の波長の光が再構成マスキングパターンを通して生体試料に送られるようにＤＭＤを制御して、生体試料中の特異的構造がその表面全域で均一に照明され、前記光によって生体試料から蛍光を発光せしめる
ように構成された、デジタル光プロセッサと
を備えるシステム。
【請求項１１】
前記デジタル光プロセッサがアフィン変換パラメータをマスキングパターンに適用するように構成される、請求項１０記載のシステム。
【請求項１２】
前記デジタル光プロセッサが、以前に解析された１以上の試料からのアフィン変換パラメータを記憶するようにさらに構成される、請求項１１記載のシステム。
【請求項１３】
前記以前に解析された試料が較正試料からのものである、請求項１２記載のシステム。
【請求項１４】
前記ＤＭＤが、個々のマイクロミラー表面に入射する光が蛍光顕微鏡の開口の中又は外に偏向され、パターン画像を生体試料上に投影できるように構成された２次元ＭＥＭＳミラーアレイである、請求項１０記載のシステム。
【請求項１５】
前記デジタル光プロセッサが、以前の画像からの画像情報を用いて生体試料の照明を制御するようにさらに構成されており、前記照明によって、取得された蛍光画像の信号対雑音比、忠実度、特異性又はそれらの組合せが向上する、請求項１０記載のシステム。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】生体試料の光学セグメンテーション方法及び装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体試料の光学セグメンテーション方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子病理学のための一般的な蛍光撮像法では、特異的タンパク又は細胞内コンパートメントを標識するために染料が使用される。多くの場合、最も関心のあるタンパクは、低レベルで発現し、しかも撮像用の蛍光リポーターの励起中に発現され、組織切片などの生体試料全体が照明され、目標の関心領域外での内在源又は非特異的結合に起因する蛍光発光を生じる。余計な発光源は雑音信号であり、低発現タンパクを正確に定量化するには、一般に、後処理法によって除去又は排除しなければならない。
【０００３】
構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）は、そのような後処理法を伴う撮像技術であり、関心のある特異的細胞領域の照明及び解像度の空間的制御ができるように照明パターン又はマスクを使用する。この方法は、自己蛍光の低減、拡張ダイナミックレンジ撮像及び光学的深さセクショニングのような用途に使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／１４５７２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、画像取得自体の間に、関心のある特異的領域を目標とするために或いはコントラスト及び信号対雑音比を局所的に向上させるために使用することができる方法が必要とされている。リアルタイムＳＩＭプロセスは、後続の照明パターンを調整するために組織画像の以前の情報又は特異的特徴を使用して試料の蛍光励起及び解析の効率又は特異性を向上させることができる。しかし、これを達成するには、プロセスにおいて、取得された画像と照明マスクとを位置合わせして、後続の画像取得の際に照明マスクを試料に正確に重ねることができるようにする必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、光学セグメンテーションを用いた生体試料中のタンパクの発現及び場所の撮像に関する。
【０００７】
したがって、本発明の一実施形態は、固体支持体に配置され、蛍光顕微鏡に取り付けられた生体試料の光学セグメンテーションのための方法を包含する。本方法は、光源から所定の波長の光を生体試料に送るステップであって、その光によって生体試料から蛍光を発光せしめるステップと、画像取込デバイスを使用して生体試料の蛍光画像を取得するステップと、生体試料中の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成するために、少なくとも部分的に特徴情報又は画素強度情報を利用して蛍光画像を解析するステップと、画像取込デバイスの画像をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標に位置合わせするために、マスキングパターンを再構成マスキングパターンに変換するステップと、光源と生体試料との間に配置されたデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用して、再構成マスキングパターンを生体試料に投影するステップであって、再構成マスク化パターンが生体試料と位置合わせされるステップと、生体試料のマスク化蛍光画像を画像取込デバイスで取得するステップと、マスク化蛍光画像をデジタル画像に転換するステップとを含む。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、固体支持体に配置された生体試料の光学セグメンテーションのための画像解析システムを含む。本画像解析システムは、生体試料を取り付けるためのステージを有する蛍光顕微鏡と、生体試料を照明するための光源であって、光が蛍光顕微鏡の開口を通って生体試料へと導かれるように配置された光源と、光源と蛍光顕微鏡の開口との間に配置されるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）と、蛍光顕微鏡に取り付けられ、生体試料の蛍光画像を取得するように構成された画像取込デバイスと、デジタル光プロセッサとを備える。デジタル光プロセッサは、画像取込デバイスからの蛍光画像を受け取り、生体試料中の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成するために、少なくとも部分的に特徴情報又は画素強度情報を利用して蛍光画像を解析し、画像取込デバイスの画像をＤＭＤの空間座標に位置合わせするために、マスキングパターンを再構成マスキングパターンに変換するように構成される。
【０００９】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点については、図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって理解を深めることができるであろう。図面を通して、同様の部分には同様の符号を付した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】「オン」及び「オフ」状態でマイクロミラー表面に入射する光を示すＤＭＤ動作の概略図である。
【図２】光の誘導にＤＭＤデバイスを用いる照明システムを通しての照明経路を示す概略図である。
【図３】カメラ座標をＤＭＤの座標にマッピングするためのパラメータを解くのに用いることができる１つの較正ルーチンを示す流れ図である。
【図４】ＤＬＰ座標に一致させるためうにカメラ画像を較正するのに使用される目標ＤＭＤ画像の顕微鏡写真である。
【図５】ハニング窓を乗算した後のカメラ画像及びＤＭＤ画像の顕微鏡写真である。
【図６】ＤＭＤ画像（Ａ）及びカメラ画像（Ｂ）のフーリエ変換の大きさの対数極座標変換の顕微鏡写真である。
【図７】赤血球が飽和を引き起こす３００ｍｓ露光時間で撮像した均一照明の前立腺試料の顕微鏡写真である。
【図８】以前に飽和した領域での励起を低減する照明マスクを使用して、９００ｍｓ露光時間で撮像した前立腺試料の顕微鏡写真である。
【図９】ＤＡＰＩチャネルで撮像した結腸試料の染色核を示す顕微鏡写真、（Ａ）、Ｃｙ３バンドでのケラチン染色（Ｂ）、及びケラチン画像を照明マスクとして用いたＤＡＰＩチャネルで撮像した上皮核（Ｃ）の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
従来の蛍光撮像システムでは、関心のある蛍光標識バイオマーカーを励起するために空間的に均一な光源が用いられており、生体試料中の外来性蛍光体及び内在性蛍光化合物が共に励起されていた。しかし、所与のタンパクが、細胞核又は上皮のような特異的細胞領域で主に発現することが知られている場合、この情報を利用すれば蛍光励起の効率又は特異性を改善することができる。まず関心のある構造の均一照明画像を所与のチャネルで取り込んでから、その画像を、関心のあるマーカーに対応するチャネルの照明マスクとして使用することよって、タンパク質発現領域の外部での励起を避けることができる。
【００１２】
本発明は、概して、均一照明の生体試料から得られた情報を使用して、生体試料中の関心のある構造特徴を選択的に照明する画像取得法に関する。この方法は、生体試料中の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成することを含む。特異的構造は、限定されるものではないが、膜マーカー、血管マーカー、核染色、腫瘍マーカー、上皮マーカー又は間質マーカーを始めとする高発現形態学的信号である。
【００１３】
生成されたマスキングパターンは、少量マーカーが存在すると推定される領域の照明に使用できる。したがって、この方法は、リポフスチンや赤血球のような試料中の高発光源に関連する問題の幾つかを軽減することによって試料のダイナミックレンジ撮像を拡大するのに使用される。例えば、選択された細胞内組織領域のダイナミックレンジ撮像は、赤血球などの試料中の他の物体の励起を避けながら、必要とされる場所の照明を増すことによって、最適化することができる。換言すると、目標とされていない、生体試料中の外来性蛍光体及び内在性蛍光化合物の励起を共に減少させることができる。さらに、形態学的マーカーを使用して設計された照明マスクによって、特異的細胞及び組織構造における他のバイオマーカーの検出が可能となる。
幾つかの実施形態では、生体試料は固体支持体に取り付け、生体試料上に投影されるマスキングパターンを使用して解析するための蛍光顕微鏡に配置することができる。生体試料という用語は、生体内又は生体外で得られる生体組織又は流体起源の試料を始めとする生物学的対象から得られる試料をいう。そのような試料は、限定されるものではないが、人間を始めとする哺乳動物から分離された体液（例えば、血液、血漿、血清又は尿）、臓器、組織、画分及び細胞とすることができる。生体試料は、組織を始めとする生体試料の切片（例えば、臓器又は組織の薄片部分）を含んでいてもよい。生体試料は、生体試料からの抽出物、例えば、生体液（例えば、血液又は尿）からの抗原を含んでいてもよい。
【００１４】
生体試料は原核生物起源のものでも、真核生物起源（例えば、昆虫、原生動物、鳥、魚、爬虫類）のものでもよい。実施形態によっては、生体試料は哺乳類（例えば、ネズミ、マウス、牛、犬、ロバ、モルモット又はウサギ）である。幾つかの実施形態では、生体試料は霊長類起源（例えば、チンパンジー又は人間）である。さらに、固体支持体とは、生体試料を固定化し、次いで本明細書で開示する方法によって検出することのできる物品をいう。生体試料は、物理吸着、共有結合形成又はそれらの組合せによって固体支持体に固定化できる。固体支持体は、ポリマー材料、ガラス又は金属材料を含むことができる。固体支持体の例としては、膜、マイクロタイタープレート、ビーズ、フィルター、テストストリップ、スライド、カバーガラス及び試験管が挙げられる。
【００１５】
撮像に先立って、生体試料を、まず、蛍光色素又は蛍光体を有する分子マーカー（色素及び抗体）を用いて標識してもよい。例えば、細胞核はＤＡＰＩ（ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素）で染色することができ、組織の他の領域は、直接結合した抗体によって又は主要な二次増幅検出によって関心分子をターゲティングする免疫蛍光法で標識することができる。赤血球（ＲＢＣ）のようなある種の構造では、自己蛍光が起こることがある。
【００１６】
マスキングパターンを生成する方法は、光源から所定の波長の光を生体試料に導くことを含んでおり、その光によって生体試料は蛍光を発する。幾つかの実施形態では、生体試料は表面全域で均一に照明される。他の実施形態では、試料を選択的に照明するのに、以前の走査又は同様の試料で得られた画像情報を用いることができる。選択的な照明は、後で取り込まれる広視野蛍光画像の信号対雑音比、忠実度、特異性又はそれらの組合せを向上させることができる。
【００１７】
生体試料の広視野蛍光画像は画像取込デバイスを用いて取り込んで、解析のためにデジタル光プロセッサ（ＤＬＰ）に移送することができる。画像は、生体試料中の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成するため、少なくとも部分的に特徴情報又は画素強度情報を用いて解析される。
【００１８】
マスキングパターンは、広視野蛍光画像をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標に位置合わせするためにＤＬＰを用いて再構成することができ、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）は、光源と撮像システムの照明光学系との間に配置され、取り付けられた生体試料上に再構成マスク化画像を投影するのに使用される。画像をＤＭＤ座標に再構成すると、広視野画像とＤＭＤデバイスとの間のアレイ密度の差に関連する画像解像度の変動が除去され、重ねられた画像の配置が改良される。
【００１９】
ＤＭＤは様々な画素アレイで構成することができる。幾つかの実施形態では、ＤＭＤは、光を照明経路又は液晶デバイスの内外に誘導することができるＭＥＭＳミラーとすることができる。ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）ミラーはリソグラフィで製造されるミラーであり、同様のリソグラフィ技術で製造される集積回路を通して印加される電圧信号で作動される。これらのミラーは、一般に、ミリメートル又は１ミリメートルの数分の１の寸法を有する。幾つかの実施形態では、ＤＭＤを構成するマイクロミラーは、「オン」状態及び「オフ」状態に対応する２つの角度の一方で配置される。状態を切り替えるために、各ミラーはその対角軸のまわりで個々に回転する。各マイクロミラーから反射される光は、図１に示すように、「オン」状態では顕微鏡の照明光学系に誘導され、「オフ」状態では顕微鏡の入口の外に偏向される。
【００２０】
図２は、システムを通る照明経路を示す本発明の一実施形態の図であり、顕微鏡に取り付けられる。コリメータレンズ４０は、光源（図示せず）からの光を撮像素子５０（限定されるものではないが、非球面レンズなど）を通して集束し、光は広帯域ミラー６０からＤＭＤ７０に反射される。ＤＭＤマイクロミラー表面に入射し、顕微鏡対物レンズ８０に誘導される光は、非球面結像レンズ９０を通り視野絞り開口１００に進む。
【００２１】
画像を図２に示す照明経路の視野絞り上に合焦することによって、試料それ自体に焦点が合っている限り、ＤＭＤパターンを試料上に鮮明に結像させることができる。視野絞りは対物レンズの焦点面と共役であり、そのため、視野絞りと同一平面上にある画像は対物レンズの焦点面にリレーされる。
【００２２】
カメラで取得された画像をＤＭＤパターンとして使用するために、画像を顕微鏡光学系を通して投影する際に生じるスケール、平行移動及びシフトを一致させるためアフィン変換を適用することができる。アフィン変換は、当初の線上にあるすべての点が変換後の線上にも残り、距離の比並びに線分の中点が変換後も中点として残るように共線形性が保たれる変換をいう。
【００２３】
アフィン変換の必要性に加えて、形状因子に不一致が存在することがある。例えば、ＤＭＤが７６８×１０２４ミラーのミラーアレイを有していて、カメラセンサが１７２８×２３５２画素の画素アレイを有していることがある。その場合、ＤＭＤで使用するためにカメラ画像を再構成するプロセスには、最終フォーマットが元のカメラ画像よりも画素数が少ないので、ダウンサンプリングが必要となる。
【００２４】
変換パラメータが分かれば、それらをカメラで取得された画像に適用して再構成画像を得ることができ、それをＤＭＤに転送することができる。再構成画像は、顕微鏡を通して投影すれば、試料と正確に位置合わせされる。図３は、カメラ座標をＤＭＤの座標にマッピングするアフィンパラメータを解くのに使用できる１つの較正ルーチンを示す流れ図である。目標の画像は、パラメータＳ、θ、ｘ及びｙ（それぞれ、スケール、回転、ｘシフト及びｙシフト）を解くために元の画像に位置合わせされる。
【００２５】
一実施形態では、図３に示すように、目標画像をＤＭＤに転送し（１）、較正試料上に投影させる（２）。試料上のこの目標の画像は顕微鏡カメラで取得される（３）。次に、試料は、２つの画像の間の形状係数を一致させて再サンプリングしたカメラ画像を生成するために間引き選択することができる（４）。再サンプリングされたカメラ画像と目標ＤＭＤ画像は位置合わせされ、アフィン変換パラメータ、すなわち、２つの画像間の回転、スケーリング（拡大縮小）及びｘ−ｙ平行移動を解くのに使用される（５及び６）。変換パラメータの計算後、パラメータは記憶され（７）、同じ顕微鏡カメラ及びＤＭＤを用いた生体試料画像の位置合わせに適用される（８）。
【００２６】
一実施形態では、較正ルーチンは、変換パラメータのために目標ＤＭＤ画像を使用するが、ＤＭＤ画像は角と直線のような明確な特徴を使用して、目標と試料平面上のその投影との間の堅固な位置合わせを図る。このタイプの較正に使用される較正目標画像を図４に示すが、スライドガラスとカバーガラスとの間の高濃度Ｃｙ３色素の薄層からなる。この目標は、Ｃｙ３フィルターセットで観察すると明るい蛍光の均一な層を生じた。色素層の薄さによって、高いコントラストの最良合焦の狭い範囲が担保された。図４は、ＤＭＤ目標画像（Ａ）と共に、位置合わせの前（Ｂ）及び後（Ｃ）の試料への投影像を示す。
【００２７】
物体への目標ＤＭＤ投影が７６８×１０２４画素を有し、カメラの画像が１７２８×２３５２画素を有すると仮定すると、カメラ画像の再サンプリングを利用して、位置合わせ前の２つの画像間の形状係数を一致させることができる。幾つかの実施形態では、カメラ画像の非整数座標での画素値を求めるために、双一次補間を使用する。
【００２８】
幾つかの実施形態では、ハニング窓などの２Ｄテーパリング又はエッジフィルタリング関数を使用することができる。例えば、図４に示すような画像に２Ｄハニング窓関数を乗算して、画像の外側の５０画素をゼロまで滑らかにテーパリングすることができる。そのようなテーパリング窓は、位置合わせの際に画像特徴として間違えることがあるエッジアーチファクトの存在を避けるために使用できる。窓処理後、アフィン変換パラメータを解くために、目標ＤＭＤ画像と再サンプリングされたカメラ画像とを位置合わせすればよい。
【００２９】
２つの画像間の回転、スケーリング及びｘ−ｙ平行移動が判明すれば、適切な変換を適用してパラメータの各々を系統的に分離し、解くことができる。
【００３０】
幾つかの実施形態では、フーリエ変換を使用することができる。画像のシフトは、フーリエ変換の大きさを変更しないからである。したがって、各画像のフーリエ変換の大きさのみを考慮することによって、画像位置合わせを回転及びスケーリングの係数に限定することができる。画像の回転は、そのフーリエ変換の大きさの等しい回転をもたらす。画像のα倍のスケーリングは、１／α倍スケーリングされたフーリエ変換の大きさをもたらす。しかし、これらのパラメータは、多くの場合、フーリエ変換から直接評価するのが難しい。別の手法は、フーリエ変換の大きさを対数極座標空間で表すことである。
【００３１】
対数極座標変換は画像を動径座標及び角度座標に割り当てるので、対数極座標変換を適用すると、スケーリング及び回転は基本的にρ軸及びθ軸上の平行移動に変換される。画像のフーリエ変換の大きさは以下の通りである。
Ｃ＝ｌｏｇ（ａｂｓ（Ｆ（ｃ）））
及び
Ｄ＝ｌｏｇ（ａｂｓ（Ｆ（ｄ）））
ここで、ｃ及びｄは、それぞれ、ハニング窓を乗算した後のカメラ画像及びＤＭＤ画像を表す。画像Ｃ及びＤが図５に示され、上段はフル画像であり、下段は拡大区域を示す。
【００３２】
図５にみられる通り、画像ＣはＤをスケーリング及び回転したものであり、そのため、極座標変換Ｃｐ及びＤｐは以下の関係式を有する。
Ｃｐ（ρ；θ）＝Ｄｐ（ρ／α，θ−θ’）
ここで、αはスケーリング係数であり、θ’は度単位の回転である。したがって、回転はθ軸に沿った平行移動に換算される。スケーリング係数を半径軸に沿った平行移動に換算するために、ρ軸は対数目盛りで表すことができる。その結果は対数極座標画像Ｃｌｐ及びＤｌｐであり、それらは、以下の関係を有する。
Ｃｌｐ（ρ；θ）＝Ｄｌｐ（ｌｏｇ（ρ）−ｌｏｇ（α），θ−θ’）
【００３３】
すると、スケール係数は、以下のように対数極座標空間で平行移動ｌｏｇ（ａ）を求めて指数化することによって解くことができる。
ａ＝ｅlog(a)
【００３４】
同様に、回転は、ρ軸に沿ったシフトについて解くことによって決定される。対数極座標表現Ｃｌｐ及びＤｌｐを図６に示す。図６は、ＤＭＤ画像（Ａ）及びカメラ画像（Ｂ）のフーリエ変換の大きさの対数極座標変換の顕微鏡写真である。これらの変換は中心としてフーリエ変換の中心又はＤＣ項を使用しており、したがって、以前のフーリエ変換で観察されたスケール及び回転をρ軸及びθ軸に沿った平行移動に転換する。
【００３５】
平行移動は、位相相関、すなわち、２つの画像の相対シフトをそれらの位相オフセットに基づいて決定する周波数ドメイン技術を使用して決定することができる。２つの画像ａ及びｂからの位相相関は、まず２つの信号の規格化クロスパワースペクトルを計算することによって決定することができ、以下の通り定義される。
Ｒ＝ＡＢ*／［ＡＢ*］
ここで、Ａ及びＢは画像ａ及びｂのフーリエ変換である。この場合、ａ及びｂは対数極座標変換Ｃｌｐ及びＤｌｐである。すると、関数ｒがＲの逆フーリエ変換から得られる。横方向シフトは、ｒのピークの水平及び垂直の位置に対応する。
（Δｘ；Δｙ）＝ａｒｇｍａｘ（ｒ）
【００３６】
この技術を使用して、対数極座標プロットにおけるｌｏｇ（ｒ）及びθシフトを解くことができる。同様に、スケーリング及び回転の適用後に得られる２つの画像はｘ及びｙのシフトの点のみで異なる。位相相関を適用して、２つの画像のｘ及びｙ平行移動を見いだすことができる。
【００３７】
実験
構造化照明は、市販のＤＭＤ開発基盤のＤＬＰ（登録商標）ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（商標）４０００（テキサス州、ダラスのＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて実施した。このモジュールは、８ビットグレースケール画像を転送し、ＸＧＡ解像度（７６８×１０２４画素）で表示することができる。広帯域水銀ランプであるＥＸＦＯ  Ｘ−ＣＩＴＥ（登録商標）１２０Ｑ（カナダ、ケベックのＥＸＦＯ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．）をシステムの照明光源として使用した。ランプからの出力光をコリメートレンズまで導くのに液体ライトガイドを使用した。次に、２００ｍｍ焦点距離の非球面レンズでコリメートビームをほぼＤＭＤのサイズ（対角線長さ０．７インチ）のスポットに集束する。集束ビームの経路は、まず方向転換ミラーで適切な角度で方向づけてから、ＤＭＤの面上に集束させる。最後に、直径２インチの１００ｍｍ非球面ダブルレンズを使用して、ＤＬＰの画像をＯｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＢＸ−５１顕微鏡（ペンシルバニア州、Ｃｅｎｔｅｒ  ＶａｌｌｅｙのＯｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．）の視野絞り上にリレーする。
【００３８】
Ａ．ダイナミックレンジ拡大
照明強度の空間的な変更を用いると、そうしなければ検出器を飽和させてしまう領域から発せられる信号の量を減少させることができる。これを、赤血球を含む前立腺試料を用いて実証し、試料を図７に示すようにＣｙ３チャネルで撮像した。赤血球は、カメラのダイナミックレンジを十分に上回る強度の蛍光を発し、そのため関心のある信号は比較的低い信号対雑音比（ＳＮＲ）であった。赤血球の励起を低減するマスクを用いて照明した後、集積時間を３倍にしたが検出器は飽和しなかった。これを図８に示す。信号領域の０．３５メガ画素区域での平均化によって、飽和均一照明画像では４３．１の平均画素値となったのに対して、構造化照明での同領域の平均値は９１．９であった。
【００３９】
構造化照明の使用によって、飽和を避けながら平均信号が２倍超増加した。この結果は、強い自己蛍光源を取り扱うシステムのダイナミックレンジの有効な増加を実証している。飽和の場合、均一照明画像を使用して飽和画素をゼロに設定することによって照明マスクが形成される。
【００４０】
Ｂ．光学セグメンテーション
生体構造の光学セグメンテーションは、関心のある形態学的特徴について染色した試料の画像を取得することによって行われる。この画像の処理によって、関心のある構造に対応する領域にしか励起光が到達できないようにする照明マスクを生成する。このマスクを異なるチャネルに使用することにより、マスクに対応する生体試料の形態的構造の空間境界内での任意のバイオマーカーのセグメンテーションが可能になる。これを、上皮核と間質核のセグメンテーションに関して様々な組織試料で実証した。
【００４１】
図９は、ケラチン及び核を染色した結腸組織の例であり、ＤＡＰＩチャネルで撮像した染色核（Ａ）、Ｃｙ３バンドのケラチン染色（Ｂ）及びケラチン画像を照明マスクとして用いたＤＡＰＩチャネルで撮像した上皮核（Ｃ）である。ケラチン（上皮に大量に存在するタンパク質）をＣｙ３バンドで染色し、核をＤＡＰＩで染色した。上皮のＣｙ３チャネル画像が得られると、ヒストグラム正規化とその後の閾値処理によって、上皮組織の２値マップが得られる。このマップを次いで位置合わせしてＤＭＤに送る。ＤＡＰＩチャネルへの切替え及び上皮照明マスクの適用によって、上皮核だけを励起することができる。
【００４２】
本発明は、被検体の検出、組織化学、免疫組織化学又は免疫蛍光法などの分析、診断又は予後用途に生体試料を使用すること全般に関係する実施形態を含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、特に、組織化学、免疫染色、免疫組織化学、免疫測定又は免疫蛍光法に応用することができる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、免疫ブロット技術、例えば、ウェスタンブロット又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫測定に応用することができる。
【００４３】
本発明の要旨又は本質的特徴から逸脱せずに、その他の特異的形態で本発明を具体化することができる。したがって、上述の実施形態は例示にすぎず、本明細書に記載された発明を限定するものではない。したがって、本発明の技術的範囲は上述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって規定され、したがって、特許請求の範囲の均等に属するあらゆる変更も本発明の技術的範囲に包含される。
【符号の説明】
【００４４】
４０  コリメータレンズ
５０  結像要素
６０  広帯域ミラー
７０  デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）
８０  顕微鏡対物レンズ
９０  非球面結像レンズ
１００  視野絞り開口
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2013524261.tif 000001
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図３】
2013524261.tif 000002