【手続補正書】
【提出日】平成27年2月3日(2015.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８５】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して９７．４％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡ、ＮＰＤＡおよびＨＰＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、当業者に周知の手段を使用して容易に変換して代替的形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができることを認識する（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、およびそれらの組合せに変換することができる）。したがって、例えば、９７．４％のＥＰＡエチルエステルを、グリセロール分解を介してトリグリセリドに再エステル化して油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡ、ＮＰＤＡおよびＨＰＡを含まないトリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物をもたらすことができる。
さらに、ＥＰＡの生成について遺伝子操作された組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の任意の微生物バイオマスから本明細書における本発明の方法により調製されたＥＰＡ濃縮物は、実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まないと予期されることが留意される。最終ＥＰＡ濃縮物が実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まない、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株から得られた微生物油に基づき上記で得られた結果は、実施例２７および実施例３１から得られた微生物油から調製されるＥＰＡ濃縮物から予期される。ＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡ不純物が、油として乾燥細胞重量の２５％を超過して蓄積するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から得られた、ＴＦＡの重量％として計測して３０から７０重量％のＥＰＡを含む初期微生物油中に存在しないため、脂肪酸不純物は、それから生成されたＥＰＡ濃縮物中にも存在しない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８６】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマスをペレット化する工程；
（ｂ）工程（ａ）のペレット化された微生物バイオマスを抽出して抽出油を生成する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の抽出油を、短行程蒸留条件下で少なくとも１回蒸留する工程
を含み、前記蒸留が、蒸留物画分および脂質含有画分を生成する方法。
２．前記含油微生物が、酵母、藻類、菌類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイルおよび卵菌綱からなる群から選択される、上記１に記載の方法。
３．前記含油微生物が、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を油中に含む、上記１に記載の方法。
４．前記微生物バイオマスの前記水分レベルが、約１から１０質量パーセントの範囲である、上記１に記載の方法。
５．前記微生物バイオマスをペレット化する工程（ａ）が、
（１）前記微生物バイオマスおよび少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して、破砕微生物バイオマスを含む破砕バイオマス混合物を提供する工程；
（２）前記破砕バイオマス混合物を少なくとも１つの結合剤とブレンドして、固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供する工程；ならびに
（３）前記固定可能な混合物を固体ペレットに形成して、ペレット化微生物バイオマスを提供する工程
を含む、上記１に記載の方法。
６．前記破砕微生物バイオマスを、
（ａ）約０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）の総比エネルギーインプット（ＳＥＩ）；
（ｂ）次第に短くなるピッチ長さを有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域；および
（ｃ）流動制限を使用する圧縮帯域
を含む２軸スクリュー押出機中で生成し；前記押出機中で前記圧密帯域は前記圧縮帯域よりも先行する、上記５に記載の方法。
７．（ａ）前記少なくとも１つの粉砕剤が、
（ｉ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、２．０から６．０のＭｏｈ硬度およびＡＳＴＭ法Ｄ１４８３−６０に従って測定される０．８以上の吸油係数を有する粒子である；
（ｉｉ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、シリカおよびケイ酸塩からなる群から選択される；ならびに
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、前記固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の質量の総和に対して約１から２０質量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有し、ならびに／または
（ｂ）前記少なくとも１つの結合剤が、
（ｉｖ）前記少なくとも１つの結合剤は、水ならびにスクロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、および可溶性デンプンからなる群から選択される炭水化物から選択される；ならびに
（ｖ）前記少なくとも１つの結合剤は、前記固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の質量の総和に対して約０．５から１０質量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有する、
上記５に記載の方法。
８．（ａ）前記微生物バイオマスを混合する工程（１）および少なくとも１つの結合剤をブレンドする工程（２）は、押出機中で実施し、同時に実施し、または押出機中で同時に実施し；
（ｂ）前記固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程（３）は、
（ｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成する工程；
（ｉｉ）前記ストランドを乾燥および破壊する工程；ならびに
（ｉｉｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成する工程（ｉ）ならびに前記ストランドを乾燥および破壊する工程（ｉｉ）の組合せ
からなる群から選択される工程を含む、
上記５に記載の方法。
９．前記固体ペレットが、
（ａ）前記固体ペレットは、約０．５から約１．５ｍｍの平均直径および約２．０から約８．０ｍｍの平均長さを有する；
（ｂ）前記固体ペレットは、約０．１から５．０質量パーセントの水分レベルを有する、ならびに
（ｃ）前記固体ペレットは、前記固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の質量の総和に対して約７０から約９８．５質量パーセントの含油微生物を含む微生物バイオマス、約１から約２０質量パーセントの少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤および約０．５から１０質量パーセントの少なくとも１つの結合剤を含む
からなる群から選択される特性を有する、上記５に記載の方法。
１０．工程（ｂ）において、前記抽出は、有機溶媒により実施して抽出油を生成し、前記抽出油を、前記抽出油を蒸留する前記工程（ｃ）の前に脱ガム処理し、場合により漂白する、上記１に記載の方法。
１１．工程（ｂ）において、前記抽出が：
（１）前記ペレット化微生物バイオマスを、液体または超臨界流体二酸化炭素を含む溶媒により処理することであって、含油微生物を含む前記ペレット化微生物バイオマスは、
（ｉ）実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含む抽出物；および
（ｉｉ）リン脂質を含む残留バイオマス；
を得るために少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を油中にさらに含むこと；ならびに
（２）工程（１）区分（ｉ）において得られた抽出物を少なくとも１回分別して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含むリファインド脂質組成物を有する抽出油を得ることであって、前記リファインド脂質組成物は、溶媒により処理されていないペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してトリアシルグリセロールが濃縮されていること
を含む、上記１に記載の方法。
１２．（ｉ）工程（ｂ）の前記抽出油が、ステロール画分を含み、
（ｉｉ）工程（ｃ）の前記蒸留物画分が、前記ステロールを含み、
（ｉｉｉ）工程（ｃ）の前記脂質含有画分が、短行程蒸留に供されなかった前記抽出油中のステロールの量と比較して低減した量の前記ステロールを含む、
上記１に記載の方法。
１３．前記ステロール画分が、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β−シトステロールおよびデスモステロールからなる群から選択される１つ以上のステロールを含む、上記１２に記載の方法。
１４．少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含み、溶媒により処理されていないペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してトリアシルグリセロールが富化されたリファインド脂質組成物を有する前記抽出油が、少なくとも３００ｍｇ／１００ｇのステロール画分をさらに含む、上記１１に記載の方法。
１５．リファインド脂質組成物を有する前記抽出油を、短行程蒸留条件下で少なくとも１回蒸留し、前記蒸留が、ステロールを含む蒸留物画分ならびにトリアシルグリセロールおよび短行程蒸留に供されなかったリファインド脂質組成物を有する前記抽出油中のステロールの量と比較して低減した量のステロールを含む脂質含有画分を生成する、上記１４に記載の方法。
１６．前記酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）である、上記２に記載の方法。
１７．前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される多価不飽和脂肪酸の生成について組換え遺伝子操作されている、上記１６に記載の方法。
１８．（ｄ）工程（ｃ）の脂質含有画分をエステル交換する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）のエステル交換された脂質含有画分を富化して油濃縮物を得る工程
をさらに含む、上記１に記載の方法。
１９．（ｉ）前記含油微生物が、微生物油としてそれらの乾燥細胞質量の２５％を超過して蓄積し；
（ｉｉ）前記微生物油が、総脂肪酸の質量パーセントとして計測して３０から７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、実質的にドコサヘキサエン酸を含まず、
（ｉｉｉ）工程（ｅ）の富化が、少なくとも２つのプロセスの組合せによるものであり、前記第１のプロセスは、分留を含み、前記第２のプロセスは、尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、実移動床クロマトグラフィーおよびそれらの組合せからなる群から選択され；
（ｉｖ）前記油濃縮物が、油の質量パーセントとして計測して少なくとも７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、実質的にドコサヘキサエン酸を含まないエイコサペンタエン酸濃縮物である、
上記１８に記載の方法。
２０．リン脂質を含む前記残留バイオマスをさらに抽出して前記リン脂質を単離する、上記１１に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマスをペレット化する工程；
（ｂ）工程（ａ）のペレット化された微生物バイオマスを抽出して抽出油を生成する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の抽出油を、短行程蒸留条件下で少なくとも１回蒸留する工程
を含み、前記蒸留が、蒸留物画分および脂質含有画分を生成する方法。