(57)【要約】      （修正有）【課題】上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）突然変異非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療用組成物。【解決手段】下式で表されるチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体を含む組成物。前記誘導体はHSP90阻害剤に類似する作用を有し、EGFRとcMETタンパク質を同時に分解させることを経由し、EGFR−TKI抵抗性を克服し、EGFR突然変異NSCLC細胞を毒殺する。HSP90阻害剤と違って、前記誘導体には網膜細胞に対して細胞毒性がない。2018104300.tif 000010【選択図】図１３
2018104300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式で表されるチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体を含む非小細胞肺がんの治療用組成物。
2018104300.tif 000007
式中、Ｒは−NH（CH2）n1NH（CH2）n2OHであり、n1は1〜5、n2は1〜5を表す。
【請求項２】
R基のn1が3、n2が2である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
非小細胞肺がんはEGFR−TKI抵抗性の肺がんである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
TKI抵抗性は先天性のTKI抵抗性及び後天性のTKI抵抗性を含む請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
先天性のTKI抵抗性はpaxillinが過度に表現されて生成するTKI抵抗性である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
後天性のTKI抵抗性はEGFRがexon20のT790Mにおける突然変異が生成するTKI抵抗性である請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
非小細胞肺がんの治療は細胞アポトーシスを引き起こすことで、非小細胞肺がん細胞殺滅する請求項１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
組成物は、チオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含む請求項１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９】
以下の式で表されるチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体を含むHSP90阻害用組成物。
2018104300.tif 000008
式中、Rは−NH（CH2）n1NH（CH2）n2OHであり、n1は1〜5、n2は1〜5を表す。
【請求項１０】
R基のn1が3、n2が2である請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
HSP90阻害剤はp−EGFR、p−Src、pY118−PXN、p−AKT、p−ERK、p−cMETの表現を低下させると同時に、BIMの表現を増加させる請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物は、チオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含む請求項９〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１３】
以下の式で表されるチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体を含むEGFR及びcMET二重阻害用組成物。
2018104300.tif 000009
式中、Rは−NH（CH2）n1NH（CH2）n2OHであり、n1は1〜5、n2は1〜5を表す。
【請求項１４】
R基のn1が3、n2が2である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物は、同時にEGFRとcMETとの表現量を低下させる請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物は、EGFRとcMETとをポリユビキチン化して分解させることができる請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１７】
組成物は、チオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含む請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、EGFR）の突然変異は、チロシンキナーゼ阻害剤（tyrosine kinase inhibitors、TKI）を非小細胞肺がん（non−small−cell lung cancer、NSCLC）の治療に用いる関連の生物マークと認識される（参考文献1、2、3参照）。
【０００３】
先天性TKI抵抗性の生成メカニズムは今まで明確ではない。NSCLCはpaxillin（PXN）が過度に表現し活性化されたERKにより、Mcl−1及びBIMタンパク質の安定性を調整することでTKI抵抗性を生成する（参考文献6参照）。細胞と動物モードにおいて、TKIとERK阻害剤であるselumetinibとの結合はTKIの感度を増加することができ（参考文献7、8参照）、しかし、今までERK阻害剤又はTKIでNSCLC疾患を治療する方法は確立されない。
【０００４】
NSCLC疾患をTKIで治療する際に発生するTKI抵抗性は、後天性のTKI抵抗性と呼ばれる（参考文献4、5参照）。最もよく見られる後天性のTKI抵抗性は、EGFRのexon20におけるT790M突然変異である（参考文献9、10参照）。EGFR−TKI抵抗性を有するNSCLC疾患を観察する際、EGFR−T790M突然変異及びcMET遺伝子の増幅はそれぞれ50−60％及び5−20％を占め、TKI標的として治療する疾患に、EGFR−T790MとcMETのタンパク質表現とリン酸化が先天性又は後天性のTKI抵抗性に関連していることが示されている（参考文献9、10参照）。
【０００５】
EGFR−TKI及びcMET阻害剤の発展がEGFR−TKI突然変異NSCLC疾患を克服する重要な策略であることは何回も発表されたが（参考文献11−19参照）、その実用面においては、未だ成功していない。Planchardらは、第3世代のTKI薬物AZD9291で治療するEGFR−E790M−positiveのNSCLC疾患にEGFR依存メカニズムの後天抵抗性が既に生成したということを発表した（参考文献20参照）。
【０００６】
Xuらは、同時に発現されたEGFR突然変異のDel19−T790M又はL858R−T790M及びcMET過度に発現されたマウス肺がんモードにおいて、EGFR又はcMETを独立に治療する場合、腫瘍は顕著に消えず、EGFRとcMETとを同時に治療する場合、EGFR−TKI抵抗性を有する腫瘍を顕著に抑制することができることを示した（参考文献21参照）。臨床で人体に対する実験の結果、EGFR−TKI阻害剤とcMET阻害剤とを併用して使用しても、EGFR突然変異NSCLC疾患を治療する顕著な効果はない（参考文献22参照）。
【０００７】
参考文献：
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
EGFR突然変異NSCLCを突破できる治療方法を設計するために、発明者はEGFRとcMETとに対する二重阻害剤を提案することを試み、EGFR阻害剤とcMET阻害剤とを併用して使用することにより、より効果的な治療効果を得ることができる。
【０００９】
発明者が先に提案した台湾特許 I488843、US8927717及び好評した記事（参考文献23参照）では、チオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体（thiochromeno［2，3−c］quinolin−12−one derivatives）が非小細胞肺がん細胞DU−145とPC−3の増殖とを抑制する効果を有することを示した。本発明において、発明者はEGFR−TKI抵抗性があるNSCLC細胞を治療するために、EGFRとcMETとを抑制する効果を有するチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体についてさらに詳細に開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的はチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体を含む非小細胞肺がんを治療するための薬物または医薬組成物及びその製造のために用いられる用途を提供することである。チオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体は下記の式に示される化合物である。
2018104300.tif 000003
式中R基は−NH（CH2）n1NH（CH2）n2OHであり、n1＝1〜5、n2＝1〜5を表す。
【００１１】
前記目的に達成するために、
R基のn1を3、n2を2とすることが好ましい。
非小細胞肺がんはEGFR−TKI抵抗性肺がんであることが好ましい。  
TKI抵抗性は先天性のTKI抵抗性及び後天性のTKI抵抗性を含むことが好ましい。
先天性のTKI抵抗性はpaxillinが過度に発現されて生成するTKI抵抗性であることが好ましい。
後天性のTKI抵抗性はEGFRのexon20のT790Mにおける突然変異が生成するTKI抵抗性であることが好ましい。
薬物はチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含むことが好ましい。
本発明のもう一つの目的はチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体を含むHSP90阻害用の薬物又は組成物及びその製造のために使用する用途である。チオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体は下記の式に示される化合物である。
2018104300.tif 000004
式中、R基は−NH（CH2）n1NH（CH2）n2OHであり、n1は1〜5、n2は1〜5を表す。
前記目的に達成するために、R基のn1は3、n2は2であることが好ましい。
HSP90阻害剤はp−EGFR、p−Src、pY118−PXN、p−AKT、p−ERK、p−cMETの発現を低下させることができると同時に、BIMの表現を増加することができることが好ましい。
薬物はチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含むことが好ましい。
本発明のもう一つの目的はチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体を含むEGFRとcMETとの二重阻害用薬物又は医薬組成物及びその製造のために用いられる用途を提供することである。チオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体は下記の式に示される化合物である。
2018104300.tif 000005
式中、R基は−NH（CH2）n1NH（CH2）n2OHであり、n1は1〜5、n2は1〜5である。
前記目的に達成するために、R基のn1は3、n2は2であることが好ましい。
二重阻害剤は同時にEGFRとcMETとの発現量を低下させることが好ましい。
二重阻害剤はEGFRとcMETとをポリユビキチン化して分解させることが好ましい。
薬物はチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含むことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】gefitinibのEGFR突然変異NSCLC細胞の成長に対する影響を示す。上部図面はEGFR突然変異肺がん細胞（H1975、H1650、CL97、PC9−PXN、PC9GR、PC9）のPXN表現であり、下部図面はEGFR突然変異肺がん細胞（H1975、H1650、CL97、PC9−PXN、PC9GR、PC9）をgefitinibで48時間処理し、MTTで細胞の生存率及びIC50を分析した結果を表す。
【図２】N19のEGFR突然変異NSCLC細胞の成長に対する影響を示す。左側図面は正常の肺細胞（WI38、Beas−2B）であり、右側図面はEGFR突然変異肺がん細胞（H1975、H1650、CL97、PC9−PXN、PC9GR、PC9）である。細胞をN19で48時間処理し、MTTで細胞の生存率及びIC50を分析した結果を示す。
【図３】gefitinib及びN19のNSCLC細胞集落の形成に対する影響を示す。
【図４】gefitinib及びN19のNSCLCの細胞アポトーシスに対する影響を示す。annexinV−PIで染色して分析した結果を示す。
【図５】gefitinib及びN19がEGFR、cMET及びその下流分子のタンパク質表現に対する影響を示す。細胞をgefitinib（10μM）及びN19（10μM）で48時間処理し、細胞の溶解産物を収集し、ウエスタンブロット法でタンパク質表現を検出した結果を示す。
【図６】N19のプロテアソームを経由してEGFR、cMETのタンパク質表現に対する影響を示す。細胞をMG132又はN19で処理し、ウエスタンブロット法で観察した結果である。
【図７】N19の内生性EGFR、cMETのタンパク質表現に対する影響を示す。PC9−PXN、H1650、PC9GR細胞をcycloheximide（100μg／ml）で、N19（10μM）と併用し／併用しないで異なる時間に処理し、ウエスタンブロット法でEGFR及びcMETのタンパク質表現に対する影響を観察した結果を示す。
【図８】N19のEGFR、cMETのポリユビキチン化に対する影響を示す。PC9−PXN、H1650、PC9GR細胞をN19（10μM）で5時間処理し、EGFR、cMETを免疫沈降法で処理した後ウエスタンブロット法でEGFR、cMETのポリユビキチン化を観察した結果を示す。
【図９】N19のEGFR、cMETの削減により引き起こした細胞アポトーシスに対する影響を示す。PC9−PXN、H1650、PC9GR細胞をEGFR shRNA、cMET shRNAに移植し、N19（10μM）で24時間処理し、ウエスタンブロット法でEGFR、cMETのタンパク質表現を観察し、annexinV−PIで細胞アポトーシスを検出した結果を示す。
【図１０】N19のHSP90阻害剤を経由するEGFR、cMETタンパク質の分解結果を示す。細胞を17−AAG（10μM）又はN19（10μM）で48時間処理し、細胞の溶解産物を収集し、ウエスタンブロット法でタンパク質表現を観察し、annexinV−PIで細胞アポトーシスを検出した結果を示す。
【図１１】N19のHSP90阻害剤を経由するEGFR、cMETタンパク質の分解結果を示す。PC9−PXN、H1650細胞を薬物で48時間処理し、細胞の溶解産物を収集し、ウエスタンブロット法でタンパク質表現を観察し、annexinV−PIで細胞アポトーシスを検出した結果を示す。
【図１２】免疫沈降法でHSP90とEGFR又はcMETとの相互作用を分析し、H1650細胞をN19（10μM）で43時間処理した後、MG132を加えて5時間処理し、細胞の溶解産物を収集してから抗−HSP90−粒子で、免疫沈降法にて処理した後ウエスタンブロット法で分析した結果を示す。
【図１３】N19の腫瘍の成長に対する影響を示す。腫瘍が移植されたマウスの腹腔に27日薬物を注射することによる、マウスの体重及び腫瘍の体積に対する影響を示す。
【図１４】N19の網膜ARPE−19細胞に対して毒性がない結果を示す。MTTで分析すると同時に、annexinV−PIでN19、17−AAG、17−DMAGが引き起こす細胞毒性を染色分析して観察した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載の前記技術性及び科学用語は、別に定義されたものを除き、全部所属する分野において、通常の技術者に理解できる意味を有する。
用語「治療」、「治療中」及びこの種類の用語は、現在患者を苦しめる疾患又はこの疾患に関連するいずれかの症状を遅延させ、改善し、緩和し又は逆転させる方法及びこの疾患又は他に発言する症状を予防する方法を指す。
用語「薬学的に許容される」は物質又は組成物が製剤中の他の成分と相容れ、且つ患者に無害であることを意味する。
【００１４】
本発明を下記の実施例によって説明するが、本発明は下記実施例に制限されない。本発明が用いる薬物、生物材料は全部市販で取得しやすい。下記は例を示す取得できる経路だけである。
【００１５】
実施例における化学薬品及び抗体のソースは下記のとおりである：Gefitinib、SU11274、17−DMAG、17−AAGはSelleckchem（アメリカのテキサス州のヒューストン）、他の化学薬品はSigma Chemical（アメリカのミズーリ州のセントルイス）から購入される。抗体Anti−EGFR、anti−total ERK、anti−phosphorylated（p）−ERK、anti−total AKT、anti−p−AKTはCell Signaling（アメリカのマサチューセッツ州のダンフォス）、抗体Anti−HSP70、anti−HSP90はGenetex（アメリカのカリフォルニア州のアーバイン）、他の抗体はSanta Cruz Biotechnology（アメリカのテキサス州のダラス）から購入される。
【００１６】
実施例に用いるチオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン誘導体は、その構造は下記の式に示される。
2018104300.tif 000006
式中、R基は−NH（CH2）3NH（CH2）2OHであり、IUPACにより10−クロール−6−（（3−（（2−ヒドロキシエチル）アミノ）プロピル）アミノ）−12H−チオクロム［2，3−c］キノリン−12−オン（10−Chloro−6−（（3−（（2−hydroxyethyl）amino）propyl）amino）−12−thiochromeno［2，3−c］quinolin−12−one）と称され、その後TC19（N19、NSC777201）で表わされる。
【００１７】
動物実験：皮下注射で腫瘍細胞を4−5週のBalb／c雌のヌードマウスの背部に注射し、3日づつ異種に移植された腫瘍のサイズと体積とを測量した。体積の計算公式は（長さ＊幅2）／2であり、腫瘍の体積が50mm3に達する時、マウスをランダムにプラシーボ（DMSO）、gefitinib（5mg／kg）、N19（5mg／kg）の三組に分類した。投薬方法は3日づつ腹腔からマウスの体内に注射した。
【００１８】
プラスチドの構築と移入：PXNが過度に表現されたプラスチドはDr Salgia（アメリカのイリノイ州のシカゴにあるシカゴ大学）、EGFR（TRCN0000121068）、cMET（TRCN0000009850）プラスチドは中央研究院RNAi Core（台湾の台北市）から購入した。プラスチドをTurbofect reagent（アメリカのメリーランド州のグレンバーニーにあるFormentasから購入される）で肺がん細胞（1＊106）に48時間移入した後、細胞を収集して後続の実験に用いた。
【００１９】
MTT細胞の毒性実験：細胞を指数増殖期まで培養し、プラスチドを事前に24時間処理することで過度表現又は累減表現を引き起こし、薬物で処理した後、細胞をMTT（3−（4，5−Dimethylthiazol−2−yl）−2，5−diphenyltetrazolium bromide）試薬（550nm）で検出して薬物の毒性影響を算出した。細胞の生存率は投薬されない細胞を100％として計算した。
【００２０】
AnnexinV−PI染色分析：細胞をトリプシンで分離し、（1000＊g、5分）遠心分離して細胞を収集し、結合バッファー（binding buffer：10mMのHEPES−NaOH、140mMのNacl、2．5mMのCaCl2）で細胞密度が1−2＊106cell／mlになるまで再懸濁し、100μlの細胞液（1−2＊105cells）を採取し、5μlのAnnexin V−FITC、5μlのPIを加えて室温で15分遮光した。その後、400μlの結合バッファーを加えて1時間以内にフローサイトメーター（アメリカのカリフォルニア州のサンノゼにあるBD Biosciencesから購入）で読み取って分析し、それぞれのサンプルに10000個の細胞試料をカウントした。
【００２１】
細胞集落の形成分析：細胞を六穴培養プレートに植えて一夜を培養し、培地をgefitinib、N19又はDMSO（プラシーボ制御組）を含む培地に置換して48時間培養し、その後の10日に細胞を10％のFBSを含む培地に培養した。観察する際、細胞を0．01％のクリスタルバイオレットで室温において1時間染色し、撮影し、細胞集落の形成を観察した。
【００２２】
ウエスタンブロット法及び免疫沈降法：細胞タンパク質を抽出して、完全のプロテアーゼ阻害剤カクテル混合物（スイスのヴァルセにあるRoche Diagnosticsから購入）を含む免疫沈降溶解バッファー（immunoprecipitated lysis buffer、20mMのTris、PHが7．5であり、100mMのsodium chloride、1％のIGEPAL CA−630、100μMのNa3VO4、50mMのNaF、30mMのsodium pyrophosphate調製）は、全ての細胞の溶解産物を取得し、タンパク質の濃度をBio−Radタンパク質試薬（アメリカのカリフォルニア州のリッチモンドにあるBio−Radから購入される）で測定した。免疫沈降法（immunoprecipitation、IP）は1μgの一次抗体及びprotein A粒子（アメリカのマサチューセッツ州のダンフォスにあるSigmaから購入）で4時間反応させてタンパク質を免疫沈降法で処理し、その後それぞれのサンプルを溶解バッファーで3回洗浄した。
ウエスタンブロット法：タンパク質サンプルを10％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels）で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（polyvinylidene difluoride membranes、アメリカのマサチューセッツ州のビレリカにあるMilliporeから購入）を染色し、免疫ブロットに用いる初級抗体を1：500から1：1000までの倍率で希釈した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合−抗マウス、抗ヤギ又は抗ウサギ二次抗体（アメリカのテキサス州のダラスにあるSanta Cruz Biotechnologyから購入）を1：5000の倍率で希釈し、タンパク質シグナルを化学発光指示薬（アメリカのニュージャージー州のピスカタウェイにあるAmersham Pharmaciaから購入）で検出した。
【００２３】
本発明は下記実施例で説明されるが、下記実施例に制限されない。
実施例1
N19はgefitinibと比べると、細胞のアポトーシスを経由して、EGFR突然変異非小細胞肺がん細胞における細胞の生存及び細胞集落の形成をもっと効果的に抑制することができる。
PXNはEGFR突然変異のNSCLCの先天性TKI抵抗性を引き起こし、6細胞株（CL97、H1975、H1650、PC9、PC9GR、PC9−PXN）のPXN表現は図1に示すように、細胞を異なる濃度のgefitinibで48時間処理し、MTTで細胞の生存率を分析した。gefitinibは肺がん標的薬物であり、EGFR−TKIを抑制する効果があり、gefitinibのH1975、H1650、CL97、PC9GR（gefitinib−resistant PC9 cells）におけるIC50濃度は13．2〜13．8μM間にあり、gefitinibのPC9細胞におけるIC50は最低（0．06μM）であるが、PC9−PXN（PXNが異性に表現されたPC9）細胞のIC50はPC9細胞より14．6μM（図1）まで大幅に向上した。
【００２４】
N19の肺細胞に対する毒性は、図2に示すように、N19のEGFR突然変異NSCLC細胞株におけるIC50は5．5〜7．0μM間にあり、N19のPC9細胞におけるIC50は他の細胞より低く（4．9μM）、N19は正常の肺細胞株WI38とBeas−2Bに対して細胞毒性がない。
【００２５】
細胞集落はテングサ平面培地に形成する代表的な結果は図3に示すように、PC9を除いた5細胞株（CL97、H1975、H1650、PC9GR、PC9−PXN）に、N19はgefitinibより細胞集落の形成をもっと効果的に抑制することができる。細胞アポトーシスの代表図は図4に示すように、PC9を除いた5細胞株（CL97、H1975、H1650、PC9GR、PC9−PXN）に、N19はgefitinibより細胞アポトーシスの比率がもっと多く増加する。
【００２６】
実験のデータはEGFR突然変異NSCLCにおいて、N19が細胞の生存及び細胞集落の形成に対して、gefitinibよりさらに良好な抑制効果を有し、この抑制効果は細胞アポトーシスを経由する。
【００２７】
実施例2
N19はEGFR、cMETタンパク質の分解が引き起こす細胞アポトーシスを経由してEGFR突然変異の非小細胞肺がん細胞を殺滅する。
図5のウエスタンブロット法の結果によれば、PC9、PC9−PXN（PXNが過度に表現されたPC9）、H1650細胞をgefitinib（10μM）で処理した後p−EGFR及びp−AKT表現は顕著に低下した。ただしgefitinib処理は、PC9GRとH1975細胞のp−EGFR及びp−AKT表現に対して低下させる作用は著しくない。全ての5株の実験細胞（PC9、PC9GR、PC9−PXN、H1650、H1975）に対して、gefitinib処理はEGFR、AKT、ERKとcMET表現に影響せず、N19は、全ての細胞におけるp−EGFR、EGFR、p−cMET、cMET、p−AKT、AKT、p−ERK表現を顕著に抑制した。gefitinib、N19（10μM）処理はPXNが高度に表現されたCL97細胞にも類似する抑制効果を有する。
【００２８】
MG132はプロテアソーム（proteosome）阻害剤であり、図6の結果により、N19（10μM）処理はEGFRとcMET表現量を抑制する効果があり、MG132は抑制をN19で処理される前のEGFRとcMET表現量まで回復させることができる。結果から見ると、N19がEGFRとcMETとに対する抑制はプロテアソームを経由する可能性があることが分かる。
【００２９】
図7はウエスタンブロット法の結果であって、PC9−PXN、H1650、PC9GR細胞を薬物で指定の時間に処理してから、100μg／mlのcycloheximideで処理して瞬間標識追跡実験（pulse−chase experiment）を行った。N19（10μM）処理時間の延長と共に、EGFRとcMETタンパク質との表現は漸次低減した。独立にプラシーボを使用しても、EGFRとcMETタンパク質との表現に影響しなかった。
【００３０】
図8は、PC9−PXN、H1650、PC9GR細胞をN19（10μM）で処理し、EGFRとcMETタンパク質を免疫沈降法で処理し、さらにウエスタンブロット法でユビキチン断片を観察した結果を示す。この結果によれば、N19は、引き起こしたEGFRとcMETの分解は、翻訳メカニズムの代わりに、翻訳された後のプロテアソームユビキチンを経由することが分かった。
【００３１】
図9の実験結果は、N19がEGFRとcMETタンパク質の分解を経由して細胞アポトーシスを引き起こし、三種類の細胞株（PC9−PXN、PC9GR、H1650）がEGFRのsmall hairpin RNA（shEGFR）、及びcMETのsmall hairpin RNA（shcMET）を移入し、次にN19（10μM）で処理することを証明した。ウエスタンブロット法の結果は、N19処理がnonspecific shRNA control（NC）のEGFRとcMET表現量を顕著に低下させ、細胞がEGFRのsmall hairpin RNA（shEGFR）及びcMETのsmall hairpin RNA（shcMET）を移入すると同時に、EGFRとcMETのsmall hairpin RNA（shEGFR＋shcMET）を移入してからN19で処理し、そうするとEGFRとcMET表現量が更に顕著に低下し、細胞のアポトーシスはEGFRとcMET表現量の低下割合に関連することを示した。結果から、N19がポリユビキチンされたプロテアソームによりEGFRとcMETを分解させて、細胞のアポトーシスを引き起こす手段で、EGFR突然変異NSCLCを殺すことが証明された。
【００３２】
実施例3
N19はHSP90阻害剤として、ポリユビキチンされたプロテアソームにより、同時にEGFRとcMETを分解させることでEGFR突然変異の非小細胞肺癌細胞を殺滅させる可能性がある。
EGFR、cMETはHSP90の下流分子であり、N19がポリユビキチンされたプロテアソームにより、EGFRとcMETを分解させることでEGFR突然変異NSCLCを殺すことができるため、ここで更にN19をHSP90阻害剤とすることができるかどうかを実験で確認した。
図10のウエスタンブロット法の結果に基づき、4種類の実験細胞株（PC9、PC9−PXN、H1650、H1975）において、N19（10μM）と17−AAG（10μM、HSP90阻害剤）はほとんどEGFRとcMET表現を完全に抑制し、p−AKT、p−ERK表現を大幅に低下させ、且つHSP70表現を増加し、N19と17−AAGもMcl−1の増加及びBIMの低下を回復させることもできる。N19と17−AAGはMcl−1とBIM表現量の変化が細胞アポトーシス比例と関連するようにさせる。その結果は、PXNが過度に表現されるたEGFR−TKI抵抗性がMcl−1表現を増加し、BIM表現を低下させることを証明した。
【００３３】
PC9−PXN、H1650細胞をgefitinib、SU11274（cMET阻害剤）、gefitinib＋SU11274、17−AAG又はN19で処理する。ウエスタンブロット法の結果（図11）は、gefitinib＋SU11274、17−AAG又はN19による処理が二種類の細胞（PC9−PXN、H1650）のp−EGFR、p−Src、pY118−PXN、p−AKT、p−ERK、p−cMET表現を大幅に低下させ、gefitinib、SU11274処理がp−EGFR、p−Src、pY118−PXN、p−AKT、p−ERK、p−cMET表現を小幅に低下させ、17−AAGとN19処理だけがHSP70表現を観察できたことを表明した。gefitinib＋SU11274処理は細胞におけるMcl−1とBIM表現を回復させ、17−AAGとN19処理もMcl−1とBIM表現の回復を観察できた。gefitinib＋SU11274、17−AAG又はN19処理は高い比率の細胞アポトーシスを有した。独立にgefitinibとSU11274を用いても、細胞のアポトーシス率は高くない。図12の免疫沈降法（Immunoprecipitation、IP）に基づいて分析すると、MG132（プロテアソーム阻害剤）を使用するにもかかわらず、HSP90とEGFR、又はHSP90とcMETとの相互作用はN19処理により低下することが分かる。この結果から、N19がHSP90阻害剤として且つEGFR、cMETの分解を経由して細胞アポトーシスを引き起こすことができることが証明された。
【００３４】
PC9−PXN−stableでヌードマウスの皮下に腫瘍を植え、N19、gefitinib処理が腫瘍の成長に対する影響を観察した。その結果は図13に示すように。PC9−VC又はPC9−PXN−stable cloneによって植えられた腫瘍は、N19で処理された後、ほとんど完全に抑制された。媒介物制御組（vector control、VC）と比較すると、gefitinibは腫瘍の成長を抑制する効果を有するが、gefitinib又はプラシーボ処理はPC9−PXN−stable clone、PC9−VC cellsがヌードマウスに植えた腫瘍のサイズに対して、27日に異なる変化が発生し、N19、gefitinib又はプラシーボを使用するにもかかわらず、マウスの体重を影響しない。N19処理はPC9GR細胞が植えた腫瘍の成長を完全に抑制することができる。N19がPC9−PXN−stable clone又はPC9GR細胞が植えた腫瘍の成長を完全に抑制することができるため、それはN19が先天性又は後天性のTKI抵抗性の細胞異性腫瘍の成長を効果的に抑制することができることを示した。
【００３５】
実施例4：網膜細胞の毒性分析
既存のHSP90阻害剤は全部網膜細胞毒性を有し、それで臨床実験を実行できない。そのため、MTTでN19が網膜細胞ARPE−19に毒性を引き起こすかどうかを分析して確認した。
図14に示すように、N19は10μMの濃度（この濃度はHSP90を効果的に抑制することができる）において、ARPE−19細胞にいずれかの細胞毒性もない。ただし他のHSP90阻害剤17−AAG又は17−DMAGはARPE−19細胞に顕著な細胞毒性を有する。
【００３６】
本発明は、従来のNSCLC治療に、EGFR阻害剤とcMET阻害剤とを同時に用いることによっても、EGFR−TKI突然変異NCSLC疾患を治療する効果は良くなく、且つHSP90（EGFR、cMETの上流分子）阻害剤が全部網膜細胞毒性を有する欠陥を解決し、且つ下記効果に達成した：
1）N19はPXNが過度に表現された先天性のTKI抵抗性NSCLCを治療する効果を有する。
2）N19はT790M突然変異の後天性TKI抵抗性NSCLCを治療する効果を有する。
3）N19はポリユビキチンされたタンパク質により、EGFRとcMETを分解させることでEGFR突然変異NSCLCを殺滅する。
4）N19はEGFRとcMETとの二重阻害剤である。
5）N19はHSP90阻害剤であり、且つ網膜細胞毒性がない。N19はHSP90阻害剤としてEGFR−TKI抵抗性を克服し、EGFR突然変異NSCLCを毒殺し、ポリユビキチンされたプロテアソームを経由して、EGFRとcMETを同時に分解させた。他のHSP90阻害剤と比較すると、N19は網膜細胞に対して細胞毒性がない。
【００３７】
上記詳細な説明は本発明に対して、実行可能な実施例に関する具体的な説明であるが、該実施例は本発明の特許請求範囲を制限しない。本発明の技術精神から離れない同効果の実施又は変更は全部、本案の特許請求範囲に含まれるべきである。
上記複数の効果は、新規性と進歩性に十分合う法定の特許請求項に属する。このため法律に基づいて申請を提出し、発明を励ますために、本発明の特許請求を許可するよう懇請しております。
【図１】
2018104300.tif 000011
【図２】
2018104300.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018104300.tif 000020
【図１１】
2018104300.tif 000021
【図１２】
2018104300.tif 000022
【図１３】
2018104300.tif 000023
【図１４】
2018104300.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月7日(2018.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式で表されるチオクロム［２，３−ｃ］キノリン−１２−オン誘導体を含むＥＧＦＲ−ＴＫＩ抵抗性の肺がんの治療用組成物。
【化１】
2018104300.tif 000025
式中、Ｒは−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ１ＮＨ（ＣＨ２）ｎ２ＯＨであり、ｎ１は１〜５、ｎ２は１〜５を表す。
【請求項２】
Ｒ基のｎ１が３、ｎ２が２である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＴＫＩ抵抗性は先天性のＴＫＩ抵抗性及び後天性のＴＫＩ抵抗性を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
先天性のＴＫＩ抵抗性はｐａｘｉｌｌｉｎが過度に表現されて生成するＴＫＩ抵抗性である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
後天性のＴＫＩ抵抗性はＥＧＦＲがｅｘｏｎ２０のＴ７９０Ｍにおける突然変異が生成するＴＫＩ抵抗性である請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
非小細胞肺がんの治療は細胞アポトーシスを引き起こすことで、非小細胞肺がん細胞殺滅する請求項１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
組成物は、チオクロム［２，３−ｃ］キノリン−１２−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含む請求項１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
以下の式で表されるチオクロム［２，３−ｃ］キノリン−１２−オン誘導体を含むＨＳＰ９０阻害によるＥＧＦＲ−ＴＫＩ抵抗性の肺がん治療用組成物。
【化２】
2018104300.tif 000026
式中、Ｒは−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ１ＮＨ（ＣＨ２）ｎ２ＯＨであり、ｎ１は１〜５、ｎ２は１〜５を表す。
【請求項９】
Ｒ基のｎ１が３、ｎ２が２である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ＨＳＰ９０阻害により、ｐ−ＥＧＦＲ、ｐ−Ｓｒｃ、ｐＹ１１８−ＰＸＮ、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＥＲＫ、ｐ−ｃＭＥＴの表現を低下させると同時に、ＢＩＭの表現を増加させる請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物は、チオクロム［２，３−ｃ］キノリン−１２−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含む請求項８〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
以下の式で表されるチオクロム［２，３−ｃ］キノリン−１２−オン誘導体を含むＥＧＦＲ及びｃＭＥＴ二重阻害によるＥＧＦＲ−ＴＫＩ抵抗性の肺がん治療用組成物。
【化３】
2018104300.tif 000027
式中、Ｒは−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ１ＮＨ（ＣＨ２）ｎ２ＯＨであり、ｎ１は１〜５、ｎ２は１〜５を表す。
【請求項１３】
Ｒ基のｎ１が３、ｎ２が２である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物は、同時にＥＧＦＲとｃＭＥＴとの表現量を低下させる請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物は、ＥＧＦＲとｃＭＥＴとをポリユビキチン化して分解させることができる請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物は、チオクロム［２，３−ｃ］キノリン−１２−オン誘導体又はその塩立体異性体、鏡像異性体及び薬学的に許容される支持剤、賦形薬及び／又は希釈剤を含む請求項１２〜１５のいずれか１つに記載の組成物。