(57)【要約】【課題】効率のよいアミンの誘導体化を行う前処理を実現する。【解決手段】分析方法は、生物の体液から取得した、少なくとも一種類のアミンを含む液体に、酸、ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに還元剤を加えた後、塩基を加え、アミン誘導体を生成することと、アミン誘導体を質量分析により検出することと、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の体液から取得した、少なくとも一種類のアミンを含む液体に、酸、ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに還元剤を加えた後、塩基を加え、アミン誘導体を生成することと、
前記アミン誘導体を質量分析により検出することと、
を備える分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の分析方法において、
前記酸と、前記塩基との反応により生じた熱により前記アミンを含む液体の温度を上昇させる分析方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の分析方法において、
前記塩基を加える前の前記液体のｐＨと、前記塩基を加えた後の前記液体のｐＨとが、前記少なくとも一種類のアミンについての前記アミン誘導体の生成反応に適したｐＨに基づく分析方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記アミン誘導体の生成は、ワンポット合成により行われる分析方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記還元剤は、２−ピコリンボランを含む分析方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記ケトンおよび／またはアルデヒドはブタナールを含む分析方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記酸は、酢酸を含む分析方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記塩基は、アンモニアを含む分析方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記アミン誘導体の生成において、前記アミンを含む液体にさらにエタノールを加える分析方法。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記アミンの分子量は、５００以下である分析方法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記アミンを備える液体は、血漿であり、
前記アミンは、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン、メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−Ｏ−メチルドーパから選択される少なくとも一つの化合物である分析方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記アミン誘導体を液体クロマトグラフィにより分離することと、
を備え、
前記アミン誘導体を前記質量分析により検出するにあたり、前記アミン誘導体を衝突誘起解離により開裂する分析方法。
【請求項１３】
生物の体液から取得された、アミンを含む液体を収容する収容部を備え、前記収容部に収容された前記アミンを含む液体に、酸、ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに還元剤を加えた後、塩基を加え、アミン誘導体を生成する前処理部と、
前記前処理部で生成した前記アミン誘導体を分離する液体クロマトグラフと、
分離された前記アミン誘導体を検出する質量分析計と、
を備える分析装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の分析装置において、
前記前処理部は、前記アミンを含む液体に、前記酸、前記ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに前記還元剤を加えた後、前記塩基を加える自動分注装置を備える分析装置。
【請求項１５】
請求項１から１２までのいずれか一項に記載の分析方法、または、請求項１３若しくは１４に記載の分析装置に使用されるキットであって、
前記酸、前記ケトンおよび／またはアルデヒド、前記還元剤、ならびに前記塩基の少なくともいずれか一つを含む溶液を少なくとも１種類備えるキット。
【請求項１６】
酸、ならびに、ケトンおよび／またはアルデヒドを備える第１溶液と、
還元剤を備える第２溶液と、
塩基性の第３溶液と、
を備え、液体クロマトグラフィおよび／または質量分析の前処理に使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析方法、分析装置およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物個体の体液中に存在するアミン（以下、生体アミン）を測定することにより、個体の健康状態についての情報を得ることができる。例えば、カテコールアミンに属するノルアドレナリンやアドレナリンは、ホルモンとして副腎から血中に分泌され、交感神経系に作用するため、これらの生体アミンを測定することにより、副腎や自律神経に関わる異常等を検出することができる。
【０００３】
クロマトグラフおよび／または質量分析計を用いて生体アミンを検出する方法が知られている。特許文献１に記載されたカテコールアミンの定量方法では、カテコール基を有する化合物に対して特異的に反応する誘導体化試薬によりポストカラム誘導体化を行った蛍光検出高速液体クロマトグラフィが行われている。
【０００４】
非特許文献１には、代謝物のアミノ基に対して幅広く反応する試薬を用いた分析方法が提案されている。一方で、非特許文献２には、還元的アミノ化反応を機序とした誘導体化法により、一級アミンと二級アミンとを同時に誘導体化する分析方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０５−２２３８１３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ワン，ジン（Jin Wang）、外６名、サイエンティフィック・レポーツ（Scientific Reports）、２０１７年５月３日、第７巻、文献番号（Article Number）１４２３
【非特許文献２】ジ，チェンジエ（Chengjie Ji）、外６名、アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）、２００８年１２月１日、第８０巻、第２３号、ｐ．９１９５−９２０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載されたカテコールアミンの定量方法では、カテコール基に対してのみ反応が進むように設計されており、測定対象となる化合物が大きく制限される。非特許文献１に記載された分析方法は、一級アミンを二級アミンにする誘導体化を利用するため、二級アミンを有する代謝物の分析には恩恵が得られず、異なる等級のアミンを含む生物の体液への適用は好適ではない。非特許文献２に記載された分析方法では、夾雑成分やｐＨの変化に敏感なため、髄液試料からあらかじめ透析により生体アミンを回収しており、測定対象が血漿や尿等の複雑性の高い試料の場合、前処理に時間およびコストがかかるという問題点があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、生物の体液から取得した、少なくとも一種類のアミンを含む液体に、酸、ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに還元剤を加えた後、塩基を加え、アミン誘導体を生成することと、前記アミン誘導体を質量分析により検出することと、を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記酸と、前記塩基との反応により生じた熱により前記アミンを含む液体の温度を上昇させる。
さらに好ましい実施形態では、前記塩基を加える前の前記液体のｐＨと、前記塩基を加えた後の前記液体のｐＨとが、前記少なくとも一種類のアミンについての前記アミン誘導体の生成反応に適したｐＨに基づく。
さらに好ましい実施形態では、前記アミン誘導体の生成は、ワンポット合成により行われる。
さらに好ましい実施形態では、前記還元剤は、２−ピコリンボランを含む。
さらに好ましい実施形態では、前記ケトンおよび／またはアルデヒドはブタナールを含む。
さらに好ましい実施形態では、前記酸は、酢酸を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記塩基は、アンモニアを含む。
さらに好ましい実施形態では、前記アミン誘導体の生成において、前記アミンを含む液体にさらにエタノールを加える。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンの分子量は、５００以下である。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンを備える液体は、血漿であり、前記アミンは、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン、メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−Ｏ−メチルドーパから選択される少なくとも一つの化合物である。
さらに好ましい実施形態では、前記アミン誘導体を液体クロマトグラフィにより分離することと、を備え、前記アミン誘導体を前記質量分析により検出するにあたり、前記アミン誘導体を衝突誘起解離により開裂する。
本発明の好ましい実施形態による分析装置は、生物の体液から取得された、アミンを含む液体を収容する収容部を備え、前記収容部に収容された前記アミンを含む液体に、酸、ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに還元剤を加えた後、塩基を加え、アミン誘導体を生成する前処理部と、前記前処理部で生成した前記アミン誘導体を分離する液体クロマトグラフと、分離された前記アミン誘導体を検出する質量分析計と、を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記前処理部は、前記アミンを含む液体に、前記酸、前記ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに前記還元剤を加えた後、前記塩基を加える自動分注装置を備える。
本発明の好ましい実施形態によるキットは、上述の分析方法、または、上述の分析装置に使用されるキットであって、前記酸、前記ケトンおよび／またはアルデヒド、前記還元剤、ならびに前記塩基の少なくともいずれか一つを含む溶液を少なくとも１種類備える。
本発明の好ましい実施形態によるキットは、酸、ならびに、ケトンおよび／またはアルデヒドを備える第１溶液と、還元剤を備える第２溶液と、塩基性の第３溶液と、を備え、液体クロマトグラフィおよび／または質量分析の前処理に使用される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、様々な種類のアミンが含まれる、生物の体液等を分析するため、より効率のよい誘導体化を行う前処理を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本実施の形態の分析方法に係る分析装置の概略構成を示す図である。
【図２】図２は、本実施の形態の分析方法における前処理を説明するための模式図であり、（Ａ）は、試料のｐＨの変化について説明する図であり、（Ｂ）は試料の温度変化について説明する図である。
【図３】図３は、２−ピコリンボランを還元剤としたドーパミンの誘導体化反応を示す概念図である。
【図４】図４は、本実施の形態の分析方法に使用されるキットを示す概念図である。
【図５】図５は、本実施の形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図６】図６は、実施例で行った質量分析に係る前駆イオンおよび生成イオンを示す図である。
【図７】図７は、実施例で得られたクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。以下の実施形態では、生物個体から採取した血液に含まれる生体アミンを解析する例を用いて説明するが、血液以外の唾液、尿、脳脊髄液等の任意の体液に含まれる生体アミンを対象としてもよい。また、クロマトグラフィおよび／または質量分析により検出可能なアミンを含む試料であれば、生物個体以外から取得したものでもよい。
【００１２】
図１は、本実施の形態の分析方法に係る分析装置１の概略構成を示す図である。分析装置１は、測定部１００と、制御部４０とを備える。測定部１００は、前処理部１０と、液体クロマトグラフ２０と、質量分析計３０とを備える。前処理部１０は、収容部１１と、分注部１２と、遠心分離部１３とを備える。制御部４０は、入力部４１と、通信部４２と、記憶部４３と、出力部４４と、処理部５０とを備える。処理部５０は、解析部５１と、装置制御部５２と、画像作成部５３とを備える。
なお、制御部４０の機能の一部または全部は、測定部１００を備える測定装置とは物理的に離れた電子計算機等に配置してもよい。
【００１３】
測定部１００の前処理部１０では、遠心分離された採血管から血漿を取り出し、酸、誘導体化試薬、ならびに還元剤を加えた後、塩基を加え、アミン誘導体を生成する。誘導体化反応は、生成過程における各反応後に、反応溶液中の成分の分離、抽出等を行う必要のないワンポット合成により行うことが好ましい。
【００１４】
測定対象となる生体アミンは、神経伝達物質、神経修飾物質および／またはホルモンとしての役割を持っているものが好ましく、芳香族アミンが好ましい。測定対象となる生体アミンの分子量は、クロマトグラフィおよび／または質量分析により検出可能であれば特に限定されないが、ホルモン等として働く生体アミンの一般的な分子量や、液体クロマトグラフ三連四重極質量分析計等を用いた精度の高い検出を効率的に行うことを考慮して５００以下が好ましく、３００以下がさらに好ましい。測定対象となる生体アミンの例としては、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン、メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−Ｏ−メチルドーパが挙げられる。本実施の形態の分析方法では、生体アミンを含む体液は、人間の被験者から採取することが、当該人間の健康状態等を検査するために好適である。
【００１５】
血漿試料に加えられる誘導体化試薬は、還元的アミノ化によりその一部がアミンに結合するように選択された試薬であり、ケトンおよび／またはアルデヒド等が好ましく、アルキルアルデヒドがより好ましく、ブチルアルデヒド、すなわちブタナールがさらに好ましい。誘導体化試薬の疎水性が高いと、還元的アミノ化され生体アミンと結合しアミン誘導体を形成した際に、逆相カラムで分離されやすくなるため好ましい。
【００１６】
血漿試料に加えられる還元剤は、還元的アミノ化に用いられる還元剤が特に好ましく、２−ピコリンボランがさらに好ましい。２−ピコリンボランは取り扱いやすく、ケトンまたはアルデヒドと、一級アミンまたは二級アミンとを用いた還元的アミノ化に用いられる。還元剤は、適宜溶媒に溶解され、血漿試料に加えられる。例えば、２−ピコランボランはエタノール等の溶媒に溶解され、血漿試料に加えられる。
【００１７】
前処理部１０の収容部１１は、採血管やマイクロチューブ等の、生体アミンを含む液体試料、試薬を保持したり、または反応容器として用いられるチューブを複数個収容する支持体（以下、チューブ支持体と呼ぶ）を備える。チューブ支持体は、後述する装置制御部５２の制御の下で、適宜回転可能または移動可能に構成されていてもよく、また、遠心分離の際の支持体として機能し、後述する遠心分離部１３と一体として構成されてもよい。
【００１８】
前処理部１０の分注部１２は、先端に着脱可能なピペットを備えた分注用プローブ等を含んで構成される。分注部１２は、装置制御部５２の制御の下、収容部１１に収容された採血管の上清を空のチューブに分注したり、血漿試料が分注されたチューブに試薬、測定対象の各生体アミンに対応する内部標準物質、反応液等を追加したりする。
【００１９】
分注部１２による分注方法の一例を説明する。ユーザは、遠心分離を行った採血管、試薬および反応容器となるチューブを収容部１１のチューブ支持体に配置する。ユーザは、配置された採血管、試薬および反応容器となるチューブの位置を、後述する入力部４１に入力する。ユーザは、いずれの採血管の上清をいずれの反応容器に分注させるかについての指示を、個々のチューブが収容されたチューブ支持体内の位置に対応付けて入力部４１に入力する。さらに、ユーザは、いずれの反応容器にいずれの試薬をいつ追加するかについての指示を、個々のチューブが収容されたチューブ支持体内の位置に対応付けて入力部４１に入力する。
【００２０】
装置制御部５２は、入力部４１から入力された情報を基に分注部１２の分注用プローブおよび／またはチューブ支持体の動作を制御し実行させる。このように、収容部１１、分注部１２、入力部４１および装置制御部５２の一部または全部は自動分注装置を構成する。装置制御部５２は、反応容器に対する各試薬の分注後、反応容器をミキサー等の振動体と接触させる等して撹拌するように分注部１２を制御してもよい。
なお、自動分注装置を用いずに、人間の手で前処理における分注等の操作を行ってもよい。
【００２１】
本実施形態の分析方法では、分注された血漿試料に、酸性溶媒下で誘導体化試薬および還元剤を加えた第１条件下で反応を引き起こすとともに、第１条件下での反応を開始させてから所定の時間が経過した後、塩基を加えた第２条件下での反応を引き起こす。生物個体から得られた試料には、誘導体化のための反応（以下、適宜、誘導体化反応と呼ぶ）に最適なｐＨが異なる様々な生体アミンが含まれると考えられるが、異なる複数のｐＨの下で反応を進めることにより、より多くの生体アミンについて、より速く反応を進めることができる。
【００２２】
図２（Ａ）は、本実施の形態の分析方法における前処理でのｐＨの変化を模式的に示す図である。図中、血漿試料に酸、誘導体化試薬および還元剤を加える前と後のｐＨをそれぞれＰ０およびＰ１とし、血漿試料に塩基を加えた後のｐＨをＰ２とした。図中、Ｐ０はＰ１とＰ２との間の値をとっているが、Ｐ０の値はＰ１とＰ２との間の値でなくともよい。
【００２３】
血漿試料に酸を加えることにより、ｐＨは酸性側のより小さい値Ｐ１へと減少する。まず、このｐＨ＝Ｐ１の第１条件下で、誘導体化反応の少なくとも一部が進められる。一定時間後、血漿試料に塩基を加えることにより、ｐＨはＰ１より塩基性側のより大きい値Ｐ２へと増加する。このｐＨ＝Ｐ２の第２条件下でも、誘導体化反応が進められる。
【００２４】
血漿試料に加える酸・塩基の種類、濃度等の条件は、塩基を加える前でかつ酸を加えた後の血漿試料のｐＨと、塩基を加えた後の血漿試料のｐＨとが、少なくとも一種類の生体アミンについての誘導体化反応に適したｐＨに基づくように設定される。
【００２５】
例えば、上記酸・塩基の種類、濃度等の条件は、塩基を加える前でかつ酸を加えた後の血漿試料のｐＨおよび／または塩基を加えた後の血漿試料のｐＨとが、特定の生体アミンについての誘導体化反応に最適なｐＨから０．５以内、好ましくは０．３以内等に設定されることが好ましい。あるいは、上記酸・塩基の種類、濃度等の条件は、複数の生体アミンについてのそれぞれの誘導体化反応に最適なｐＨに基づいて、算術平均等の統計値により設定してもよい。
【００２６】
誘導体化反応が複数の反応を含んで構成される場合、各段階の反応に最適なｐＨに基づいて血漿試料のｐＨを調節してもよい。例えば、上記酸・塩基の種類、濃度等の条件は、酸を加えた後でかつ塩基を加える前の血漿試料のｐＨが、第１段階の反応に適したｐＨに基づいて設定され、塩基を加えた後のｐＨが、第２段階の反応に適したｐＨに基づいて設定されることが好ましい。
【００２７】
図３は、ブタナールを誘導体化試薬とし、２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）を還元剤としたドーパミンの誘導体化反応を示す図である。酸性下において、一級アミンのドーパミンは、ドーパミンの窒素原子に結合した水素原子の１つがブタナールに由来する側鎖に置換されたイミニウム（中間体１）との間で平衡状態にある。中間体１が、２−ＰＢを還元剤として還元的アミノ化され、二級アミンの中間体２となる。中間体２を生成する反応を反応Ｒ１とする。
【００２８】
中間体２は、中間体２の窒素原子に結合した水素原子がブタナールに由来する側鎖に置換されたイミニウム（中間体３）との間で平衡状態にある。中間体２が、２−ＰＢを還元剤として還元的アミノ化され、三級アミンのジブチル化ドーパミンとなる。目的とするアミン誘導体の一つであるジブチル化ドーパミンを生成する反応を反応Ｒ２とする。
【００２９】
反応Ｒ１の最適ｐＨは、酢酸等の弱酸によりもたらされるｐＨの範囲にあるが、反応Ｒ２の最適ｐＨは、反応Ｒ１の最適ｐＨよりも塩基性側となる。従って、例えば、二級アミンを生成する第１段階での反応の最適ｐＨに基づいて、血漿試料に加えられる酸の種類および／または濃度等を選択し、三級アミンを生成する第２段階の反応の最適ｐＨに基づいて、血漿試料に加えられる塩基の種類および／または濃度等を選択することができる。
【００３０】
本実施の形態の分析方法で血漿試料に加えられる酸は、水に対する酸解離定数が０〜１０程度の酸が好ましく、酢酸またはクエン酸がより好ましい。本実施の形態の分析方法で血漿試料に加えられる塩基は、特に限定されないが、取扱い等の観点からアンモニア水が好ましい。
【００３１】
図２（Ｂ）は、本実施の形態の分析方法における前処理での血漿試料の温度の変化を模式的に示す図である。図中、血漿試料に塩基を加える直前と直後の温度をそれぞれＴ１およびＴ２とした。酸を加えた血漿試料に塩基を加えると、酸と塩基との反応により生じた中和熱により血漿試料の温度がＴ１からＴ２へと増加する。Ｔ１からＴ２への温度の増加により、生体アミンの誘導体化に関わる反応の反応速度が増加し、効率よく誘導体化反応を進めることができる。
【００３２】
本実施の形態の分析方法では、実施例に示されるように、血漿試料の希釈倍率が、血漿に対して１０倍以下にすることも可能である。また、誘導体化反応の反応時間も１０分以下に抑えることが可能である。さらに、本実施の形態の分析方法では、塩基を加えることで血漿タンパク質を沈殿させることもできるため、効率よく分析用試料を調整することができる。
【００３３】
前処理部１０の遠心分離部１３は、遠心分離器を備え、分注部１２により、アミン誘導体を生成する一連の操作が終了した後、最終生成物を含む反応容器を遠心分離する。遠心分離された最終生成物の上清は、分注部１２により取り出され、分析用試料として液体クロマトグラフ２０に導入される。
なお、遠心分離ではなく、フィルターろか等により、血漿試料から分析用試料を分離してもよい。
【００３４】
液体クロマトグラフ２０は、分析用試料に含まれていた複数種類のアミン誘導体を分離する。液体クロマトグラフ２０の分離モードは、アミン誘導体が分離されれば特に限定されないが、移動相が後段の質量分析計３０でのイオン化に適していることから逆相分配クロマトグラフィを行うことが好ましい。液体クロマトグラフ２０は、逆相カラムを備えることが好ましく、逆相カラムは、シリカゲル等の担体に、オクタデシル基（Ｃ１８）等の直鎖の炭化水素を結合させたシランを結合させたものが好ましく、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）カラム（Ｃ１８カラム）がより好ましい。
【００３５】
液体クロマトグラフ２０で分離された分析用試料は、質量分析計３０に導入される。液体クロマトグラフ２０から質量分析計３０までの処理は、オンライン処理により自動化されることが好ましく、前処理部２０から質量分析計３０までの処理が、オンライン処理により自動化されていることがさらに好ましい。
【００３６】
質量分析計３０は、それぞれの種類のアミン誘導体を分離し検出することができればその種類等は限定されないが、２段階の質量分離により精度を高められることから三連四重極質量分析計が好ましい。
【００３７】
質量分析計３０を三連四重極質量分析計とした場合、第１質量分離部（Ｑ１）でイオン化されたアミン誘導体を、ｍ／ｚの値に基づき前駆イオンとして分離する。分離した前駆イオンは衝突室（Ｑ２）で衝突誘起解離（ＣＩＤ）により開裂され生成イオンが生成される。開裂された生成イオンは、第２質量分離部（Ｑ３）でｍ／ｚの値に基づき分離される。分離された生成イオンは、二次電子増倍管または光電子増倍管等を備える検出器により検出され、得られた信号はＡ／Ｄ変換され制御部４０の処理部５０に出力される（図１実線矢印参照）。
【００３８】
質量分析計３０において、ノルアドレナリンは、ノルアドレナリンの誘導体を２８１．７０〜２８２．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、ノルアドレナリンの誘導体を前駆イオンとして２８１．７０〜２８２．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを２６３．７０〜２６４．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００３９】
質量分析計３０において、アドレナリンは、アドレナリンの誘導体を２３９．６５〜２４０．６５の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、アドレナリンの誘導体を前駆イオンとして２３９．６５〜２４０．６５の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを２２１．６５〜２２２．６５の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００４０】
質量分析計３０において、ドーパミンは、ドーパミンの誘導体を２６５．７０〜２６６．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、ドーパミンの誘導体を前駆イオンとして２６５．７０〜２６６．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを１３６．６０〜１３７．６０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００４１】
質量分析計３０において、メタネフリンは、メタネフリンの誘導体を２５３．６５〜２５４．６５の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、メタネフリンの誘導体を前駆イオンとして２５３．６５〜２５４．６５の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを２３５．６５〜２３６．６５の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００４２】
質量分析計３０において、ノルメタネフリンは、ノルメタネフリンの誘導体を２９５．７０〜２９６．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、ノルメタネフリンの誘導体を前駆イオンとして２９５．７０〜２９６．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを２７７．７０〜２７８．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００４３】
質量分析計３０において、３−Ｏ−メチルドーパは、３−Ｏ−メチルドーパの誘導体を３２３．７０〜３２４．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、３−Ｏ−メチルドーパの誘導体を前駆イオンとして３２３．７０〜３２４．７０の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを１５２．５５〜１５３．５５の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００４４】
制御部４０の入力部４１は、各種ボタンおよび／またはタッチパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部４１は、前処理部１０における分注および誘導体化反応に必要な情報、液体クロマトグラフ２０および質量分析計３０の制御に必要な情報、ならびに処理部５０の行う処理に必要な情報等を、ユーザから受け付ける。
【００４５】
制御部４０の通信部４２は、インターネット等の無線や有線接続により通信可能な通信装置を含んで構成され、解析部５１の解析結果を送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
【００４６】
制御部４０の記憶部４３は、不揮発性の記憶媒体で構成され、測定部１００から出力された測定結果に関するデータ、処理部５０に処理を実行させるプログラム、および解析部５１の解析結果等を記憶する。
【００４７】
制御部４０の出力部４４は、液晶モニタ等の表示モニタやプリンター等を含んで構成され、測定部１００の測定に関する情報や、解析部５１の解析結果等を、表示モニタに表示したり、紙媒体に印刷したりする。
【００４８】
制御部４０の処理部５０は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成され、分析装置１を制御する動作の主体として機能する。処理部５０は、記憶部４３等に記憶されたプログラムを実行することにより、制御部４０における各種処理を行う。
【００４９】
処理部５０の解析部５１は、質量分析計３０から出力されたデータ（以下、ＭＳデータと呼ぶ）を解析し、測定対象となる生体アミンを定量する。解析部５１は、ＭＳデータから測定対象の各生体アミンの生成イオンスペクトルを構築する。解析部５１は、入力部４１から入力された各生体アミンの生成イオンのｍ／ｚ値に関する情報に基づいて、生成イオンスペクトル上の各生成イオンと関連したピークを同定する。解析部５１は、ピークに対応する面積を、ノイズを抑えるように公知の方法を用いて算出する。解析部５１は、生成イオンスペクトル上の各ピークに対応する面積と、各ピークに対応する生成イオンの情報を基に、各生体アミンの分析用試料における検出量を算出し、各生体アミンに対応する内部標準物質の検出量との比に基づいて、各生体アミンの血漿における濃度を算出する。
【００５０】
処理部５０の装置制御部５２は、入力部４１から入力された測定条件に関する情報や、記憶部４３に記憶されている情報に基づいて、前処理における分注や液体クロマトグラフ２０および質量分析計３０等における移動相の制御等、測定部１００の動作を制御する。
【００５１】
処理部５０の画像作成部５３は、ＭＳデータから作成したクロマトグラムやマススペクトル、測定部１００の測定条件および／または解析部５１の解析結果等から出力画像を作成し、出力部４４に出力する。
【００５２】
図４は、本実施の形態の分析方法および／または分析装置１で好適に用いられるキットを示す模式図である。キット９０は、本実施の形態の分析方法で使用する溶液が充填された瓶等の容器のセット、である、第１溶液９１と、第２溶液９２と、第３溶液９３とを備える。
なお、キット９０は、溶液９１，９２，９３の他に液体クロマトグラフ２０で使用されるカラム等、液体クロマトグラフ２０や質量分析計３０で使用される交換部品および／または消耗品を備えてもよい。
【００５３】
第１溶液９１は、酸と、誘導体化試薬とを含むことが好ましく、酢酸またはクエン酸と、ケトンまたはアルデヒドとを含むことがより好ましく、酢酸およびブタナールを含むことがさらに好ましい。第１溶液９１の酢酸の濃度は適宜調整されるが、例えば重量比で酢酸を１０〜７５％含む溶液とすることができる。
【００５４】
第２溶液９２は、還元剤と溶媒とを含むことが好ましく、還元剤は、還元的アミノ化に用いられる還元剤であることがより好ましく、２−ピコリンボランがさらに好ましい。第２溶液９２は、２−ピコリンボランと、エタノール等を含むことが最も好ましい。
【００５５】
第３溶液９３は、塩基性溶液を含むことが好ましく、アンモニア水を含むことがさらに好ましい。
なお、キット９０に含まれる溶液の種類は上記のような３種類に限定されず、少なくとも一種類備えていればよい。
【００５６】
図５は、本実施の形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、医療従事者等により、生物個体、特に人間から血液が採取される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
【００５７】
ステップＳ１００３において、医療従事者等により、ステップＳ１００１で採取された血液を含む採血管が遠心分離され血漿が分離される。分離された血漿は前処理部１０の分注部１２により血漿試料として反応容器となるチューブに分注される。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。ステップＳ１００５において、分注部１２は、血漿試料に測定する生体アミンに対応する内部標準物質を加える。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。
【００５８】
ステップＳ１００７において、分注部１２は、血漿試料に、酸と、ケトンおよび／またはアルデヒドとを含む溶液（反応液１）と、還元剤を含む溶液（反応液２）とを加え、所定の時間放置する。ここで、血漿試料に、反応液１および反応液２を加えた後に放置する時間は、適宜設定されるが、実施例に示されるように、例えば１時間以下、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下とすることができる。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９に進む。
【００５９】
ステップＳ１００９において、分注部１２は、血漿試料に、塩基性溶液（反応液３）を加え、所定の時間放置する。ここで、血漿試料に、反応液３を加えた後に放置する時間は、適宜設定されるが、実施例に示されるように、例えば１時間以下、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下とすることができる。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１に進む。
【００６０】
ステップＳ１０１１において、遠心分離部１３は、血漿試料を遠心分離し、分注部１２は、上清を分注して分析用試料とする。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３に進む。ステップＳ１０１３において、液体クロマトグラフ２０は、分析用試料に含まれるアミン誘導体を液体クロマトグラフィにより分離する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５に進む。
【００６１】
ステップＳ１０１５において、質量分析計３０は、液体クロマトグラフィにより分離されたアミン誘導体を質量分析により検出する。ステップＳ１０１５が終了したら、ステップＳ１０１７に進む。ステップＳ１０１７において、解析部５１は、検出されたアミン誘導体の血漿における濃度を算出し、出力部４４が当該濃度を出力する。ステップＳ１０１７が終了したら、処理を終了する。
【００６２】
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の分析方法または分析装置１は、生物の体液から取得した、少なくとも一種類の生体アミンを含む液体試料に、酸、ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに還元剤を加えた後、塩基を加え、アミン誘導体を生成する。これにより、ｐＨ等が異なる複数の条件下で誘導体化反応を行うことができ、より効率的に前処理を行うことができる。
【００６３】
（２）本実施形態の分析方法または分析装置１において、酸と、塩基との反応により生じた熱により生体アミンを含む液体試料の温度を上昇させる。これにより、反応速度を高め、より効率的に誘導体化反応を行うことができる。また、分析装置１の前処理部に恒温槽等の溶液外部の熱源を設置する必要が無く、装置の構成を簡略化することができる。
【００６４】
（３）本実施形態の分析方法または分析装置１において、塩基を加える前の液体試料のｐＨと、塩基を加えた後の液体試料のｐＨとが、少なくとも一種類の生体アミンについてのアミン誘導体の生成反応に適したｐＨに基づく。これにより、少なくとも、上記一種類の生体アミンの誘導体化反応を効率的に行うことができる。
【００６５】
（４）本実施形態の分析方法または分析装置１において、アミン誘導体の生成は、ワンポット合成により行われる。これにより、誘導体化反応のための操作を少なくし、短い時間で前処理を行うことができる。
【００６６】
（５）本実施形態の分析方法または分析装置１において、アミン誘導体を液体クロマトグラフィにより分離し、さらに、アミン誘導体を質量分析により検出するにあたり、アミン誘導体を衝突誘起解離により開裂する。これにより、液体クロマトグラフィにおける分離と、質量分析における前駆イオンおよび生成イオンの分離との多段階の分離により、より精密に生体アミンを定量することができる。
【００６７】
（６）本実施形態の分析装置１において、前処理部１０は、アミンを含む液体試料に、酸、ケトンおよび／またはアルデヒド、ならびに還元剤を加えた後、塩基を加える自動分注装置を備える。これにより、ユーザによる手間の少ない生体アミンの分析を行うことができ、例えば、遠心分離した採血管を収容部１１に配置し、入力部４１を操作するだけで生体アミンの測定結果を取得することが可能となる。
【００６８】
（７）本実施形態のキット９０は、本実施形態の分析方法または分析装置１に使用されるキット９０であって、酸、ケトンおよび／またはアルデヒド、還元剤、ならびに塩基の少なくともいずれか一つを含む溶液を少なくとも１種類備える。これにより、上述の分析方法または分析装置１に必要な溶液等を簡便に準備することができ、より手間がかからず、ミスの少ない生体アミンの分析が実現できる。
【００６９】
（８）本実施形態のキット９０は、酸、ならびに、ケトンおよび／またはアルデヒドを備える第１溶液９１と、還元剤を備える第２溶液９２と、塩基性の第３溶液９３と、を備える。これにより、誘導体化反応の主要な試薬を簡便に準備することができ、より手間がかからず、ミスの少ない生体アミンの分析が実現できる。
【００７０】
（実施例）
以下の実施例では、ノルアドレナリン（ＮＥ）、アドレナリン（Ｅ）、ドーパミン（ＤＡ）、メタネフリン（ＭＮ）、ノルメタネフリン（ＮＭＮ）および３−Ｏ−メチルドーパ（３ＯＭＤ）の６種類の生体アミンを１ｐｐｍ添加した血漿を上述の分析方法を用いて分析した実験結果が説明される。
なお、本発明は、以下の実施例に示された条件に限定されない。
【００７１】
サンプルの調整
５０μＬの血漿をチューブにとって血漿試料とし、上記６種類の生体アミンに対応する内部標準物質を水に溶解させた５０μＬの溶液を加え、混合した。次に、血漿試料に、重量比で酢酸を７５％、ブタナールを２５％含む反応液１を１００μＬを加え、混合した。次に、血漿試料に、２−ピコリンボランをエタノールに溶解して７質量／体積パーセントとした反応液２を５０μＬ加え、混合し、５分間放置した。次に、血漿試料に、１０％アンモニア水を５０μＬ加え、混合し、５分間放置した。ここで、アンモニア水を加えた後、発熱と血漿タンパク質の沈澱が確認された。放置の後、得られた血漿試料を遠心分離し、上清を取り出して純水により１００倍に希釈した溶液を分析用試料とした。
【００７２】
液体クロマトグラフィの条件
上記サンプルの調整で得られた分析用試料（注入量：５μＬ）を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム：ＮＥＸＥＲＡ  Ｘ２（島津製作所）
カラム：  Ｓｈｉｍｐａｃｋ  ＧＩＳＳ  Ｃ１８（島津ジーエルシー）（内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒径３μｍ）
カラム温度：  ４０℃
移動相：
（Ａ）０．１％ギ酸（水に溶解）
（Ｂ）メタノール
流速：  ０．４ｍＬ／ｍｉｎ
グラディエントプログラム：
時間（分）        移動相Ｂの濃度（％）
０                ２
１．７            ３５
３．７            ４５
３．８            １００
５．０            １００
５．１            ２
６．０            停止
【００７３】
質量分析の条件
上記液体クロマトグラフィで分離された分析用試料を、溶出口に直接接続したタンデム質量分析により検出した。
システム：ＬＣＭＳ−８０６０（島津製作所）
イオン化の方法：  エレクトロスプレー法
測定モード：  多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）
温度：
脱溶媒管（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｎｅ；ＤＬ）温度：  ３００℃
ヒートブロック温度：  ４００℃
インターフェイス温度：  ３００℃
ガス流量：
ネブライザーガス流量：  ２．２Ｌ／ｍｉｎ
ドライングガス流量：  ３Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量：  １７Ｌ／ｍｉｎ
【００７４】
ＭＲＭの測定条件（ＣＥはコリジョンエネルギー電圧）
化合物（誘導体化前）    分子量  前駆イオンm/z  生成イオンm/z  CE(V)
ノルアドレナリン        169.18   282.20        264.20          -16
アドレナリン            183.20   240.15        222.15          -14
ドーパミン              153.18   266.20        137.10          -21
メタネフリン            197.23   254.15        236.15          -14
ノルメタネフリン        183.20   296.20        278.20          -17
３−Ｏ−メチルドーパ    211.22   324.20        153.05          -25
上記６種類の生体アミンのアミン誘導体すなわち質量分析における前駆イオンと、想定される質量分析における生成イオンとの分子構造を図６に示した。想定される、衝突誘起解離による開裂部位は点線矢印で示した。横軸に保持時間をとり、縦軸に質量分析で検出された強度を示したクロマトグラムを図７に示した。
【００７５】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【符号の説明】
【００７６】
１…分析装置、１０…前処理部、１１…収容部、１２…分注部、１３…遠心分離部、２０…液体クロマトグラフ、３０…質量分析計、４０…制御部、５０…処理部、５１…解析部、５２…装置制御部、９０…キット、９１…第１溶液、９２…第２溶液、９３…第３溶液。
【図１】
2018205131.tif 000003
【図２】
2018205131.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2018205131.tif 000007
【図６】
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【図７】
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