【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年1月7日(2015.1.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌患者の腫瘍転移のリスクの測定を補助する方法であって、
（ａ）前記乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞の試料における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、前記発現レベルを転移スコア（ＭＳ）を決定するためのアルゴリズムに挿入し、それによって、前記遺伝子の発現レベルに基づく前記転移スコア（ＭＳ）を得る工程を包含し、
（ｂ）ここで、前記転移スコアと所定の転移スコアのカットオフ閾値（ＭＳ閾値）との比較が、前記乳癌患者の腫瘍転移のリスクを示し、
ここで、ＣＥＮＰＡは配列番号３５のヌクレオチド配列を含み、ＰＫＭＹＴ１は配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、ＭＥＬＫは配列番号３７のヌクレオチド配列を含み、ＭＹＢＬ２は配列番号３８のヌクレオチド配列を含み、ＢＵＢ１は配列番号３９のヌクレオチド配列を含み、ＲＡＣＧＡＰ１は配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、ＴＫ１は配列番号４１のヌクレオチド配列を含み、ＵＢＥ２Ｓは配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＤＣ１３は配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、ＲＦＣ４は配列番号４４のヌクレオチド配列を含み、ＰＲＲ１１は配列番号４５のヌクレオチド配列を含み、ＤＩＡＰＨ３は配列番号４６のヌクレオチド配列を含み、ＯＲＣ６Ｌは配列番号４７のヌクレオチド配列を含み、そして、ＣＣＮＢ１は配列番号４８のヌクレオチド配列を含む、
方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、前記所定のＭＳ閾値より高いＭＳは、腫瘍転移のリスクの増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、前記所定のＭＳ閾値より低いＭＳは、腫瘍転移のリスクの減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、２以上のＭＳ閾値に対する前記転移スコアの比較が、前記乳癌患者について腫瘍転移のリスクを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記乳癌患者が、リンパ節において検出可能な腫瘍細胞を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記乳癌患者が、腫瘍転移を発症するリスクが増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された切片に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、腫瘍生検由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、凍結腫瘍組織由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子のｍＲＮＡが、エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞から得られ、ｃＤＮＡに逆転写され、前記ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡが、逆転写およびＰＣＲ増幅前に濃縮される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子の各々のｍＲＮＡが、逆転写され、表３の配列番号１〜２８に示される対応する遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の発現レベルが、ある内在性対照遺伝子または２以上の内在性対照遺伝子の平均の発現レベルに対して標準化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記内在性対照遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択され、ここで、ＮＵＰ２１４は配列番号４９のヌクレオチド配列を含み、ＰＰＩＧは配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、そして、ＳＬＵ７は配列番号５１のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記内在性対照遺伝子のｍＲＮＡが、逆転写され、表３に列挙される、配列番号２９〜３４の前記内在性対照遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現レベルが、マイクロアレイによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
乳癌患者の腫瘍転移のリスクの測定を補助する方法であって、
（ａ）前記乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞の試料における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、前記発現レベルを転移スコア（ＭＳ）を決定するためのアルゴリズムに挿入し、それによって、前記遺伝子の発現レベルに基づく前記転移スコア（ＭＳ）を得る工程を包含し、
（ｂ）ここで、前記転移スコアと所定の転移スコアのカットオフ閾値（ＭＳ閾値）との比較が、腫瘍転移のリスクを示し、
ここで、ＣＥＮＰＡは配列番号３５のヌクレオチド配列を含み、ＰＫＭＹＴ１は配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、ＭＥＬＫは配列番号３７のヌクレオチド配列を含み、ＭＹＢＬ２は配列番号３８のヌクレオチド配列を含み、ＢＵＢ１は配列番号３９のヌクレオチド配列を含み、ＲＡＣＧＡＰ１は配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、ＴＫ１は配列番号４１のヌクレオチド配列を含み、ＵＢＥ２Ｓは配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＤＣ１３は配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、ＲＦＣ４は配列番号４４のヌクレオチド配列を含み、ＰＲＲ１１は配列番号４５のヌクレオチド配列を含み、ＤＩＡＰＨ３は配列番号４６のヌクレオチド配列を含み、ＯＲＣ６Ｌは配列番号４７のヌクレオチド配列を含み、そして、ＣＣＮＢ１は配列番号４８のヌクレオチド配列を含み、
ここで、前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数８】
2010516292.tif 000001
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０は０でありかつａｉは１であるか、または、ａ０は０．０２２であり、ａｉは前記遺伝子の各々について表２にある値に対応する）
によって計算される、方法。
【請求項１８】
前記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ  ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によってΔ（ΔＣｔ）値として算定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
乳癌患者の腫瘍転移のリスクの測定を補助する方法であって、
（ａ）前記乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞の試料における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、前記発現レベルを転移スコア（ＭＳ）を決定するためのアルゴリズムに挿入し、それによって、前記遺伝子の発現レベルに基づく前記転移スコア（ＭＳ）を得る工程を包含し、
（ｂ）ここで、前記転移スコアと所定の転移スコアのカットオフ閾値（ＭＳ閾値）との比較が、腫瘍転移のリスクを示し、
ここで、ＣＥＮＰＡは配列番号３５のヌクレオチド配列を含み、ＰＫＭＹＴ１は配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、ＭＥＬＫは配列番号３７のヌクレオチド配列を含み、ＭＹＢＬ２は配列番号３８のヌクレオチド配列を含み、ＢＵＢ１は配列番号３９のヌクレオチド配列を含み、ＲＡＣＧＡＰ１は配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、ＴＫ１は配列番号４１のヌクレオチド配列を含み、ＵＢＥ２Ｓは配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＤＣ１３は配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、ＲＦＣ４は配列番号４４のヌクレオチド配列を含み、ＰＲＲ１１は配列番号４５のヌクレオチド配列を含み、ＤＩＡＰＨ３は配列番号４６のヌクレオチド配列を含み、ＯＲＣ６Ｌは配列番号４７のヌクレオチド配列を含み、そして、ＣＣＮＢ１は配列番号４８のヌクレオチド配列を含み、
ここで、前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数８Ａ】
2010516292.tif 000002
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０が０であり、ａｉが１である）
によって計算される、方法。
【請求項２０】
前記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ  ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によってΔ（ΔＣｔ）値として算定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数９】
2010516292.tif 000003
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の基準化された発現レベルであり、ａ０が０．０２２であり、ｂが−０．２５１であり、ａｉが前記遺伝子の各々について表２に示される値に対応するか、または、ａ０が０であり、ｂが−１であり、ａｉが１である）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ  ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によってΔ（ΔＣｔ）値として算定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１０】
2010516292.tif 000004
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０が０．８６５７であり、ｂが−０．０４７７８であり、ａｉが１であるかまたは、ａ０が０であり、ｂが−１であり、ａｉが１である）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ  ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によってΔ（ΔＣｔ）値として算定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１１】
2010516292.tif 000005
（式中、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルである）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ  ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によってΔ（ΔＣｔ）値として算定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記転移スコア（ＭＳ）が、１４個の前記遺伝子の各遺伝子の発現レベルを一緒に加えることによって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記各遺伝子の発現レベルがΔ（ΔＣｔ）値によって表される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Δ（ΔＣｔ）値の総計が負の係数によって乗じられるか、または、前記Δ（ΔＣｔ）値の各々が負の係数によって乗じられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記負の係数が−１である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを検出するための試薬、および酵素；並びにバッファーを含む、請求項１〜３０に記載の方法において使用するためのキット。
【請求項３２】
１以上の内在性対照遺伝子の発現レベルを検出するための試薬またはその組み合せをさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記内在性対照遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
遺伝子ＣＥＮＰＡの配列番号３５のヌクレオチド配列からなる領域、ＰＫＭＹＴ１の配列番号３６のヌクレオチド配列からなる領域、ＭＥＬＫの配列番号３７のヌクレオチド配列からなる領域、ＭＹＢＬ２の配列番号３８のヌクレオチド配列からなる領域、ＢＵＢ１の配列番号３９のヌクレオチド配列からなる領域、ＲＡＣＧＡＰ１の配列番号４０のヌクレオチド配列からなる領域、ＴＫ１の配列番号４１のヌクレオチド配列からなる領域、ＵＢＥ２Ｓの配列番号４２のヌクレオチド配列からなる領域、ＤＣ１３の配列番号４３のヌクレオチド配列からなる領域、ＲＦＣ４の配列番号４４のヌクレオチド配列からなる領域、ＰＲＲ１１の配列番号４５のヌクレオチド配列からなる領域、ＤＩＡＰＨ３の配列番号４６のヌクレオチド配列からなる領域、ＯＲＣ６Ｌの配列番号４７のヌクレオチド配列からなる領域およびＣＣＮＢ１の配列番号４８のヌクレオチド配列からなる領域に配列特異的な様式でハイブリダイズする、複数のポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３０に記載の方法において使用するためのマイクロアレイ。
【請求項３５】
内在性対照遺伝子の領域に配列特異的な様式でハイブリダイズする複数のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３４に記載のマイクロアレイ。
【請求項３６】
前記内在性対照遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７からなる群から選択される、請求項３５に記載のマイクロアレイ。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１２】
このようにして、本発明の核酸分子は、本明細書に開示されている遺伝子の発現レベルを検出およびプロファイリングするために、ハイブリダイゼーションプローブ、逆転写および／または増幅プライマーとしても用いることができ、それにより、乳癌およびその発現プロファイリングを有する個体は遠隔転移に対するリスクにあることを決定する。開示されている発現プロファイリングは、遠隔転移に対する予後ツールを提供する。
転移スコアの作成
表２に開示されている１４個の遺伝子の発現レベルは、転移リスクを予測する転移スコア（ＭＳ）を誘導するために用いることができる。発現レベルは、Δ（ΔＣｔ）法によって計算されてもよく、ここで、Ｃｔは、標的増幅のための閾値サイクル；即ち、標的の時間の指数関数的な増幅が始まるＰＣＲにおけるサイクル数である。（ＫＪ  Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  ＴＤ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８）。１４個のプロファイルされた遺伝子の各々のｍＲＮＡのレベルは、
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
として定義されてもよく、ここで、ＧＯＩは対象とする遺伝子（１４個のサイン遺伝子の各々）であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者試料から得られたＲＮＡであり、ｒｅｆＲＮＡは校正参照ＲＮＡであり、ＥＣは内在性対照である。各サイン遺伝子の発現レベルは、初めに、表２（ＥＣ）に列挙されている３個の内在性対照遺伝子に標準化されてもよい。３個の内在性対照（ＣｔＥＣ）の増幅から得られた、Ｃｔ（複数）の平均のＣｔを用いて、ただ１つの対照遺伝子が用いられる場合に発生する標準化バイアスのリスクを最小化することができる。（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，ＰＪ  Ｈｉｇｇｉｎｓら，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：３３２−３３７）。内在性対照遺伝子を増幅するために選択的に用いられてもよいプライマーを表３に列挙している；しかし、これらの内在性対照を増幅することができるプライマーは、これらの開示されたオリゴヌクレオチドに限定されない。対象とする遺伝子の調整された発現レベルは、校正参照ＲＮＡプール、ｒｅｆＲＮＡ（ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）にさらに標準化されてもよい。これは、種々の機械から得られた発現結果を標準化するために用いられてもよい。
Δ（ΔＣｔ）値は、１４個のサイン遺伝子の各々についての遺伝子発現プロファイリングにおいて得られ、転移スコア（ＭＳ）を作成するための下記の式：
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６６】
サインの１４個の遺伝子は、実施例１に記載される研究において選択され、新しいＭＳスコアおよびカットポイントは、実施例２に記載されるガイ病院からの未処置試料を用いて、この研究に基づいて測定された。新しいＭＳアルゴリズムは、実施例４および５で適用され、検証された。そこで、新しい転移スコア（ＭＳ（新規））が、１４個の遺伝子の遺伝子発現レベルの平均の負数として計算される。この新しいスコアを用いて、１４個の遺伝子は、同計量を与えた。高いＭＳが遠隔転移の高リスクに対応するように、−１の乗数を用いた。新しいＭＳは、下記の式：
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７３】
実施例２において測定されたＭＳと、１４個全ての遺伝子の遺伝子発現の平均の負数としてのＭＳは、互いに単に一次変換であることに留意しなければならない。それ自体は、それらは完全相関（ピアソン相関係数＝１）を有し、高、中、及び低ＭＳへの患者の分類は、記載されている対応するカットポイントを用いることは同じである。
統計学的分析
遠隔転移なしの生存に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、高、中および低ＭＳ群について作成された。３つの群のＤＭＦＳ比を調べると、中および低ＭＳ群は、高ＭＳを有する高リスク群と比較される低リスク群として組み合わせられた。ログランク試験を行った。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８３】
転移スコア（ＭＳ）は、各個体について計算された。ＭＳは、サインの１４個の遺伝子の遺伝子発現レベル（ΔΔＣｔによる）の平均の負数に基づいていた。さらに、２つのカットポイントは、以前に、ガイ病院からの未処置の患者からの腫瘍組織を用いた研究から測定され（実施例２）、患者を高、中間および低ＭＳ群にグループ分けした。
統計学的分析
遠隔転移なしの全生存に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、高、中間および低ＭＳ群について作製された。３つの群のＤＭＦＳ比を調べると、中間および低ＭＳ群は、高リスク群と比較される低リスク群として、高ＭＳと比較された。ログランク試験を行った。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９７】
【表４】
2010516292.tif 000006