【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年12月4日(2014.12.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＩＸ因子ポリペプチドと伸長した組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）とを含む単離された第ＩＸ因子融合タンパク質であって、該ＸＴＥＮは、配列番号３５、３６、３７、３８、４３、４４、４５および４６からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一であり、該ＸＴＥＮは、
ａ．グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基が、該ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の８０％超を構成し、
ｂ．（ｉ）該ＸＴＥＮは、アミノ酸がセリンでない限り、３つの連続する同一のアミノ酸を含まないか、もしくは（ｉｉ）該ＸＴＥＮの少なくとも８０％が、非重複配列モチーフを含み、該配列モチーフの各々は９〜１４アミノ酸残基を含み、任意の２つの連続するアミノ酸残基が該配列モチーフの各々において２回を超えては存在しないように、該ＸＴＥＮは非反復性である、
該第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＸＴＥＮが、配列番号３５、３６、３７、３８、４３、４４、４５または４６と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＸＴＥＮが、配列番号３６に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＸＴＥＮが、配列番号３６と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＸＴＥＮが、配列番号３７に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＸＴＥＮが、配列番号３７と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項７】
前記第ＩＸ因子ポリペプチドが、そのＣ末端で前記ＸＴＥＮに連結する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項８】
以下の式に従って構成された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＡＰ１）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ２）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ
この場合、各要素について独立して、
（ａ）Ｇｌａが、該第ＩＸ因子ポリペプチドのＧｌａドメインであり；
（ｂ）ＥＧＦ１が、該第ＩＸ因子ポリペプチドのＥＧＦ１ドメインであり；
（ｃ）ＥＧＦ２が、該第ＩＸ因子ポリペプチドのＥＧＦ２ドメインであり；
（ｄ）ＡＰ１が、該第ＩＸ因子ポリペプチドの活性化因子ペプチドドメインの一部であり；
（ｅ）ＡＰ２が、少なくとも第一の開裂配列を含む該第ＩＸ因子ポリペプチドの活性化ペプチドドメインの一部であり；
（ｆ）Ｐｒｏが、該第ＩＸ因子ポリペプチドのプロテアーゼドメインであり；
（ｇ）Ｓが、開裂配列を任意に含むことのできる１〜５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；
（ｈ）ＸＴＥＮが、前記伸長した組換えポリペプチドであり、
（ｉ）ｕが、０または１のいずれかであり；
（ｊ）ｖが、０または１のいずれかであり；
（ｋ）ｘが、０または１のいずれかであり；
（ｌ）ｙが、０または１のいずれかであり；かつ
（ｍ）ｚが、０または１のいずれかであり、ただし、ｕ＋ｖ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１という条件付きである。
【請求項９】
２つ以上のＸＴＥＮを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＸＴＥＮが、前記第ＩＸ因子融合タンパク質に含まれる任意の２つの隣接したドメイン間に組み込まれ、この場合、該２つの隣接したドメインがＧｌａ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＡＰ、およびペプチダーゼＳ１（Ｐｒｏ）からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＸＴＥＮが、配列番号２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、３４１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、および４８９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＸＴＥＮが、配列番号225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277
、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、341、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、および489からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＸＴＥＮが、配列番号225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、341、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、および489からなる群より選択される配列と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＸＴＥＮが、配列番号225、229、231、239、243、249、255、257、265、または283を含む、請求項１１に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が配列番号２２９を含む、請求項１４に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＸＴＥＮが、配列番号61、62、63、65、66、69、71、73、74、75、76、77、78、79、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、および555からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＸＴＥＮが、配列番号61、62、63、65、66、69、71、73、74、75、76、77、78、79、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、および555からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１８】
前記ＸＴＥＮが、配列番号61、62、63、65、66、69、71、73、74、75、76、77、78、79、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、および555からなる群より選択される配列と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項１９】
前記ＸＴＥＮが、配列番号６３または６５を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項２０】
前記融合タンパク質が、配列番号602、604、606、608、612、614、616、または618と少なくとも90％同一の配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、配列番号602、604、606、608、612、614、616、または618と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項２２】
前記融合タンパク質が、配列番号602、604、606、608、612、614、616、または618を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の第ＩＸ因子融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第ＩＸ因子融合タンパク質をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項２４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第ＩＸ因子融合タンパク質、請求項２３に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクター、または請求項２５に記載の宿主細胞と、医薬として許容し得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第ＩＸ因子融合タンパク質、請求項２３に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、または請求項２６に記載の医薬組成物を含む、対象における凝固障害を治療するための組成物。
【請求項２８】
前記凝固障害が血友病Ｂである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第ＩＸ因子融合タンパク質、請求項２３に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、または請求項２６に記載の医薬組成物を含む、対象における出血症状を治療するための組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第ＩＸ因子融合タンパク質、請求項２３に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、または請求項２６に記載の医薬組成物を含む、凝固タンパク質を欠損する対象を治療するための組成物。
【請求項３１】
前記凝固タンパク質が、内在性の第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子または第ＸＩ因子タンパク質である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項２５に記載の宿主細胞を、前記第ＩＸ因子融合タンパク質が発現される条件下で培養する工程を包含する、第ＩＸ因子融合タンパク質の製造方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】凝固第ＩＸ因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法
【技術分野】
【０００１】
（連邦助成研究に関する供述）
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＳＢＩＲ助成金２Ｒ４４ＧＭ０７９８７３‐０２の下で政府の支援により実施された。政府は、本発明においてある権利を有する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年８月２４日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／２３６，４９３号、２００９年８月２５日に出願された第６１／２３６，８３６号、２００９年１１月１０日に出願された第６１／２８０，９５５号、２００９年１１月１０日に出願された第６１／２８０，９５６号、および２０１０年２月３日に出願された米国出願シリアル番号第１２／６９９，７６１号の優先権の利益を主張するものであり、これらのすべて、および本明細書とともに出願される米国弁護士整理番号（ｄｏｃｋｅｔ  ｎｕｍｂｅｒ）３２８０８‐７１９．２０１の下での同時係属出願は、それらの内容が全体としてすべての目的のために引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
血友病において、血液の凝固は、ある血漿血液凝固因子の欠失によって妨害される。ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、血液凝固カスケードの内在性の経路の重要な構成要素であるセリンプロテアーゼの酵素前駆体である。ＦＩＸ欠乏症を有さない個体において、ＦＩＸの平均半減期は短く、およそ１８〜２４時間である。機能的ＦＩＸの欠乏症は、３０，０
００人の男性において約１人に生じるＸ連結型障害によるものであり、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｃｈｒｉｓｔｍａｓという名の若い少年がこの因子を欠失していることが発見された後で名付けられたクリスマス病としても公知の血友病Ｂを結果的に生じる。１００を超える第ＩＸ因子の突然変異が説明されており、いくつかは症状を生じないが、多くは、有意な出血性障害をもたらす。治療されていない場合、血友病Ｂは、筋肉、関節、および損傷後の体腔への制御されていない出血と関係し、死に至り得る。すでに、該疾患のための治療は、ドナープール由来のヒト血漿から調製されたＦＩＸの投与を包含しており、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含む血液由来のウイルスによる感染に関する付帯リスクを抱えていた。より最近では、組換えＦＩＸ製剤が市販されるようになった。
【０００４】
外来性に供給される第ＩＸ因子のインビボでの活性は、タンパク質の半減期および抗トロンビンを含む凝固阻害薬の両方によって制限される。第ＩＸ因子組成物は典型的には、頻繁な注射を必要とする短い半減期を有する。また、現行のＦＩＸベースの治療薬は、生物学的利用能が乏しいことにより静脈内投与を必要とする。したがって、血友病Ｂを含む血友病のための予防的および／または治療的投与計画の一部として投与される場合、延長した半減期および活性の保持を伴う改良された第ＩＸ因子組成物に対する需要がある。
【０００５】
第ＶＩＩ因子は、肝臓において合成され血中に分子量およそ５０ｋＤａの一本鎖酵素前駆体として分泌される凝固因子タンパク質である。ＦＶＩＩ酵素前駆体は、タンパク質分解性開裂によって活性型（ＦＶＩＩａ）に変換され、活性型は、組織因子（ＴＦ）と複合体形成する場合、第ＩＸ因子および第Ｘ因子の両方をそれらの活性型に変換して、迅速なトロンビン生成およびフィブリン形成をもたらすことができる。ｒＦＶＩＩａの循環半減期は約２．３時間である（「Ｓｕｍｍａｒｙ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  ｆｏｒ  ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ著作権」米国食品医薬品局参照番号９６‐０５９７）ので、複数回のかつ頻繁な投与が、血友病および第ＶＩＩ欠乏症を有する対象における出血性障害の治療に必要とされる。
【０００６】
治療用タンパク質に対する化学的修飾は、そのインビボでのクリアランスを低下させることができ、その後、血清半減期を延長することができる。一般的な修飾の一例は、アミン基と反応するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）上でアルデヒド基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を介してタンパク質と共役したＰＥＧ部分の付加である（例えば、リシン側鎖またはＮ末端）。しかしながら、抱合工程は結果的に、分離される必要のある異種性生成物混合物の形成を生じて、有意な生成物の損失及び製造の複雑さをもたらす可能性があり、完全に化学的に均一な生成物を結果として生じない。また、治療用タンパク質の薬理学的機能は、その結合部位近くのアミノ酸側鎖がペグ化処理によって修飾される場合、阻止され得る。Ｆｃドメインと治療用タンパク質との融合は、治療用タンパク質の大きさを増大させる別の手法であり、それゆえ、腎臓を通じてのクリアランス速度を低下させる。加えて、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎ受容体に結合する能力、およびＦｃＲｎによってリソソームからリサイクルされる能力を与え、結果的に薬物動態半減期を延長させる。残念ながら、Ｆｃドメインは、組換え発現の間に効率的に折りたためず、封入体として公知の不溶性粒子状物質を形成する傾向にある。これらの封入体は、可溶化されなければならず、機能タンパク質は、誤って折りたたまれた凝集体から再生されなければならない。このような処理は、時間がかかり、非効率的で、費用がかかる。したがって、あまり頻繁に投与することができないおよび／またはより安いコストでより単純な処理によって製造することのできる、半減期の延長した改良された凝固因子組成物についての需要が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、容態の治療または改良あるいは凝固第ＩＸ因子および／または凝固第ＶＩＩ因子の投与と関連したパラメータの亢進のための組成物ならびに方法に関する。特に、本発明は、１以上の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む融合タンパク質の組成物を提供する。対象のＸＴＥＮは典型的には、非反復性配列および構造化されていない立体配座である。ＸＴＥＮは、第ＩＸ因子（「ＦＩＸ」）、第ＶＩＩ因子（「ＦＶＩＩ」）、第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子複合体、およびそれらの配列変異形から選択される凝固因子（「ＣＦ」）に連結され、結果的に凝固因子‐ＸＴＥＮ融合タンパク質（「ＣＦＸＴＥＮ」）を生じる。一部、本開示は、該融合タンパク質を含む医薬組成物および凝固因子関連の疾患、障害、または容態を治療するためのその使用に関する。ＣＦＸＴＥＮ組成物は、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して高い薬物動態特性を有し、そのことが、より簡便な投薬および改良された効能を可能にし得る。いくつかの実施態様において、本発明のＣＦＸＴＥＮ組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、抗体、および抗体断片からなる群から選択される構成要素を有しない。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
伸長した組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む単離された第ＩＸ因子ポリペプチドであって、該ＸＴＥＮが少なくとも３６のアミノ酸残基を含み、この場合、該第ＩＸ因子ポリペプチドは、対象に投与される場合に約１２時間よりも長い終末半減期を呈する、該第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目２）
前記第ＩＸ因子ポリペプチドが、最適に整列した場合に、表１から選択される配列と比較して少なくとも９０％の配列同一性を呈する、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目３）
前記第ＶＩＩ因子が、そのＣ末端で前記ＸＴＥＮに連結される、項目１または２に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目４）
第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ‐２、ＭＭＰ‐１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ‐１７、およびＭＭＰ‐２０からなる群から選択される哺乳類プロテアーゼによって開裂可能な開裂配列を介して前記ＸＴＥＮに連結される、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目５）
前記哺乳類プロテアーゼによる前記開裂配列における開裂が、前記第ＩＸ因子ポリペプチドから前記ＸＴＥＮを放出する、項目４に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。（項目６）
前記ＸＴＥＮが以下を特徴とする、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド：
（ａ）ＸＴＥＮアミノ酸残基の累積合計が、２００超〜約３０００アミノ酸残基であり：
（ｂ）アスパラギン残基およびグルタミン残基の合計が、該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であり；
（ｃ）メチオニン残基およびトリプトファン残基の合計が、該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であり；
（ｄ）該ＸＴＥＮ配列が、１０未満のサブシーケンススコアを有し；
（ｅ）該ＸＴＥＮ配列が、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、９０％超のランダムコイル形成を有し；かつ
（ｆ）該ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される時、２％未満のアルファヘリックスおよび２％未満のベータ‐シートを有する。
（項目７）
少なくとも約４の見かけの分子量因子を呈する、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目８）
前記ＸＴＥＮが、表４、表９、表１０、表１１、表１２、または表１３から選択されるアミノ酸配列の同等な長さと少なくとも９０％の配列同一性を呈する、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目９）
式ＶＩＩに従って構成された、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＡＰ１）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ２）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ  ＶＩＩ
この場合、各発生について独立して、
（ａ）Ｇｌａが、第ＩＸ因子のＧｌａドメインであり；
（ｂ）ＥＧＦ１が、第ＩＸ因子のＥＧＦ１ドメインであり；
（ｃ）ＥＧＦ２が、第ＩＸＩ因子のＥＧＦ２ドメインであり；
（ｄ）ＡＰ１が、第ＩＸ因子の活性化因子ペプチドドメインの一部であり；
（ｅ）ＡＰ２が、少なくとも第一の開裂配列を含む第ＩＸ因子の活性化因子ペプチドドメインの一部であり；
（ｆ）ＰＲＯが、第ＩＸ因子のプロテアーゼドメインであり；
（ｇ）Ｓが、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；
（ｈ）ＸＴＥＮが、表４、表９、表１０、表１１、表１２、または表１３から選択されるアミノ酸の同等な長さと少なくとも９０％の配列同一性を呈する伸長した組換えポリペプチドであり、
（ｉ）ｕが、０または１のいずれかであり；
（ｊ）ｖが、０または１のいずれかであり；
（ｋ）ｘが、０または１のいずれかであり；
（ｌ）ｙが、０または１のいずれかであり；かつ
（ｍ）ｚが、０または１のいずれかであり、ただし、ｕ＋ｖ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１という条件付きである。
（項目１０）
ｙ＝１であり、かつ、ＳがＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ‐２、ＭＭＰ‐１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ‐１７、およびＭＭＰ‐２０からなる群から選択される哺乳類プロテアーゼによって開裂可能である開裂配列を含む、項目９に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。（項目１１）
２つ以上のＸＴＥＮを含む、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目１２）
前記ＸＴＥＮが、前記ＩＸ因子に含まれる任意の２つの隣接したドメイン間に組み込まれ、この場合、該２つの隣接したドメインがＧｌａ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＡＰ、およびペプチダーゼＳ１（Ｐｒｏ）からなる群から選択される、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目１３）
（ｉ）同等なモル用量で哺乳類に投与される場合、前記ＸＴＥＮを欠失する相応する第ＩＸ因子と比較して、哺乳類に投与する場合により長い終末半減期を有し；
（ｉｉ）該ＩＸ因子ポリペプチドのより小さなモル量が、他は等価な用量処方計画の下で哺乳類に投与されるＸＴＥＮを欠失する相応する第ＩＸ因子との比較において哺乳類に投与される場合、該第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）を達成し；
（ｉｉｉ）該第ＩＸ因子ポリペプチドのより小さなモル量が、他は等価な用量処方計画
の下で哺乳類に投与されるＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子との比較において哺乳類に投与される場合、該ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な治療効果を達成し；
（ｉｖ）該第ＩＸ因子ポリペプチドが、他は等価なモル量を用いて哺乳類に投与されたＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子と比較してあまり頻繁に哺乳類に投与されない場合、第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）を達成し；
（ｖ）該第ＩＸ因子ポリペプチドが、他は等価なモル量を使用して哺乳類に投与されたＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子と比較してあまり頻繁に哺乳類に投与されない場合、第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な治療効果を達成し；
（ｖｉ）他は等価な投薬期間の下で哺乳類に投与されたＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子と比較して、累積的により小さなモル量の第ＩＸ因子ポリペプチドが、哺乳類に投与される場合、該第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）を達成し；又は
（ｖｉｉ）他は等価な投薬期間の下で哺乳類に投与されるＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子と比較して、累積的により小さなモル量の第ＩＸ因子ポリペプチドが、哺乳類に投与される場合、該第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な治療効果を達成することを特徴とする、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目１４）
項目１の一項に記載の治療有効量の第ＩＸ因子ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、該対象における凝固障害を治療する方法。
（項目１５）
前記凝固障害が血友病Ｂである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
項目１に記載の治療有効量の第ＩＸ因子ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、該対象における出血症状を治療する方法。
（項目１７）
項目１〜１３のいずれか一項に記載の治療有効量の第ＩＸ因子を含む組成物を、凝固タンパク質を欠損する対象に投与することを含む、該対象を治療する方法。
（項目１８）
前記凝固タンパク質が、野生型の第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＸＩ因子と置き換わる、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ＸＴＥＮが、少なくとも１００のアミノ酸残基を含む、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
（項目２０）
伸長した組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）が、以下を特徴とする、該ＸＴＥＮを含む単離された第ＩＸ因子ポリペプチド：
（ａ）該ＸＴＥＮが、少なくとも３６のアミノ酸残基を含み；
（ｂ）前記ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の合計が、該ＸＴＥＮの全アミノ酸の少なくとも８０％を構成し；
前記配列モチーフの各々において２倍超を生じず；
（ｄ）該ＸＴＥＮ配列が、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって分析される場合、推定Ｔ細胞エピトープを欠失し、この中で、該ＸＴＥＮ配列内のエピトープについての該ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムの推定は、−９のスコアに基づいており；
（ｅ）該ＸＴＥＮ配列が、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、９０％超のランダムコイル形成を有し；かつ
（ｆ）該ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される時、２％未満のアルファヘリックスおよび２％未満のベータ‐シートを有する。
【０００８】
いくつかの実施態様において、本発明は、表１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％同一である第ＩＸ因子配列を含む、単離された第ＩＸ因子融合タンパク質を提供する。このような配列同一性を有する第ＩＸ因子はさらに、少なくとも約１００〜約３０００のアミノ酸残基を有する伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に連結される。一実施態様において、ＸＴＥＮは、ＦＩＸ  ＣＦまたはＦＶＩＩ  ＣＦのＣ末端に連結される。いくつかの実施態様において、本発明は、表２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％同一である第ＶＩＩ因子を含む、単離された第ＶＩＩ因子融合タンパク質を提供する。このような配列を有する第ＶＩＩ因子は、伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に連結される。
【０００９】
単一のＸＴＥＮに連結された単一のＦＩＸまたは単一のＦＶＩＩを有するＣＦＸＴＥＮに関する非限定例を表４１に呈する。一実施態様において、本発明は、表４１由来のＣＦＸＴＥＮと比較して少なくとも約８０％の配列同一性を、あるいは表４１由来のＣＦＸＴＥＮと比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有するＣＦＸＴＥＮ組成物を提供する。いくつかの実施態様において、融合タンパク質のＣＦおよびＸＴＥＮ構成要素は、内在性哺乳類プロテアーゼを含むプロテアーゼによって開裂可能な開裂配列を介して連結される。このようなプロテアーゼの例には、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、トロンビン、エラスターゼ‐２、グランザイムＢ、ＭＭＰ‐１２、ＭＭＰ‐１３、ＭＭＰ‐１７、もしくはＭＭＰ‐２０、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、リノウイルス３Ｃプロテアーゼ、およびソルターゼＡ、または表７から選択される配列が挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様において、開裂配列を有するＣＦＸＴＥＮ組成物組成物は、表４２由来のＣＦＸＴＥＮと比較して少なくとも約８０％の配列同一性を、あるいは、表４２由来のＣＦＸＴＥＮと比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％。８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する配列を有する。しかしながら、本発明はまた、表１もしくは表２の任意のＣＦ配列と表４２の配列におけるＣＦとの置換、および表４の任意のＸＴＥＮ配列と表４２の配列におけるＸＴＥＮとの置換、および表７の任意の開裂配列と表４２の配列における開裂配列との置換を提供する。開裂配列を有するＣＦＸＴＥＮ実施態様において、プロテアーゼによる開裂配列の開裂は、ＣＦからＸＴＥＮを放出する。先のいくつかの実施態様において、ＣＦ構成要素は、生物学的に活性となるかまたは、開裂配列の開裂によるＸＴＥＮからのその放出の際に活性の増大を有し、この場合、前駆凝固因子活性は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＦＩＸまたはＦＶＩＩと比較して、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である。
【００１０】
本発明は、第一のＸＴＥＮと同一であり得また異なり得る約３６〜約３０００のアミノ酸残基の第二のＸＴＥＮを含む、単離されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、この場合、第二のＸＴＥＮは、ＣＦの任意の２つの隣接したドメイン間に、すなわち、Ｇｌａ、ＥＦＧ１、ＥＧＦ２、活性化ペプチド、およびプロテアーゼドメイン間に組み込まれることができ、または、実施例においてより完全に説明されるように、ＣＦのドメイン配列の既存のループドメインの配列内に組み込まれる。一実施態様において、第一および第二のＸＴＥＮは、表４もしくは表９〜１３の任意の１つから選択されるアミノ酸配列であり
得、または表４および表９〜１３から選択される配列と比較して少なくとも少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％配列同一性を呈することができる。別の実施態様において、単離された融合タンパク質は、約３６〜約３０００のアミノ酸残基の第二のＸＴＥＮを含む。融合タンパク質は、表６の多重ＸＴＥＮ立体配置またはその変形を採用することができる。
【００１１】
本発明は、同じかまたは異なる前駆凝固因子プロテアーゼによって開裂可能な１以上の異種性開裂配列を含む第ＶＩＩ因子に連結されたＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ組成物を提供する。先のいくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子は、ＦＶＩＩ配列の一部に組み込まれまたは該一部と置換された第ＸＩ因子の異種性配列を含み、結果的に、第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子複合体配列変異形を生じる。いくつかの実施態様において、ＦＩＸの活性化ペプチドドメイン由来の配列の一部または全部は、ＥＦＧ２とＦＶＩＩ構成要素のプロテアーゼドメインとの間の領域を架橋するＦＶＩＩ配列に組み込まれまたは該配列と置換され、結果的に、凝固カスケードの内在性の系の一部として活性化されることのできる組成物を生じる（例えば、活性化型第ＸＩ因子）。このような場合、第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子ＣＦＸＴＥＮ組成物は、組織因子の不在下で前駆凝固因子プロテアーゼによって活性化されることができ、それにより、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子が（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂにおいて）欠失する場合、またはこれらの因子に対する阻害薬が存在する場合、ＣＦＸＴＥＮは、内在性の凝固経路におけるこのような因子の迂回路として機能することができる。一実施態様において、ＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列変異形は、全長のＦＩＸ
ＡＰドメインに加え、ＦＩＸ  ＡＰドメインのＲ１４５‐Ａ１４６開裂部位およびＲ１８０‐Ｖ１８１開裂部位の片側または両側における隣接するアミノ酸残基と隣接する少なくとも約２の、または少なくとも約３の、または少なくとも約４の、または少なくとも約５の、または少なくとも約６の、または少なくとも約７の、または少なくとも約８の、または少なくとも約９の、または少なくとも約１０の、または少なくとも約１１の、または少なくとも約１２の、またはそれより多くのアミノ酸を組み込む（例えば、Ｎ末端側の１２の隣接するアミノ酸およびＣ末端側の５の隣接するアミノ酸の場合の配列ＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥ）。
【００１２】
別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ  ＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列変異形は、最適に整列した場合、配列ＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶと比較して少なくとも少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または１００％の同一性を呈する異種性のＦＩＸ配列を含む。
【００１３】
他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、Ｒ１４５‐Ａ１４６開裂部位の片側または両側と隣接する少なくとも約２の、または少なくとも約３の、または少なくとも約４の、または少なくとも約５の、またはより多くのアミノ酸の配列（例えば、開裂部位のいずれかの側の６の隣接するアミノ酸の場合の配列ＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰ）を、あるいはＲ１８０‐Ｖ１８１開裂部位の片側または両側と隣接する少なくとも約２の、または少なくとも約３の、または少なくとも約４の、または少なくとも約５の、またはそれより多くのアミノ酸の配列（例えば、該配列ならびに、Ｎ末端の隣接部の４のアミノ酸およびＦＩＸ由来の開裂部位のＣ末端としてのバリンの場合のＤＦＴＲＶ）を含むＦＩＸ  ＡＰの一部を組み込むＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列変異形を含む。先の一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ  
ＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列変異形は、最適に整列した場合、ＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰおよびＦＮＤＦＴＲＶから選択される配列と比較して、少なくとも少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または１００％の同一性を呈する異種性のＦＩＸ配列を含む。
【００１４】
別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、融合タンパク質のＦＶＩＩ構成要素のＣ末端とＸＴＥＮ構成要素との間のリンカーと同じＡＰ開裂配列をさらに含む先に開示されたＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列変異形、例えばＦＶＩＩ変異形‐ＡＰ配列‐ＸＴＥＮのＮ末端からＣ末端への立体配置を含み、それによりＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの移行の構成要素につき同じ前駆凝固因子プロテアーゼによって開裂される場合、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質からのＦＶＩＩ変異形構成要素の放出を可能にする。一実施態様において、任意の先の実施態様のＦＶＩＩ‐ＦＩＸ  ＣＦＸＴＥＮには、ＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列とＸＴＥＮとの間のリンカーとしての第ＸＩ因子開裂配列ＫＬＴＲＡＥＴを含み、それにより内在性の凝固カスケードの開始によってＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質からのＦＶＩＩ変異形構成要素の放出を可能にする。一実施態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮに、表４３由来の配列と比較して少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を呈するＦＶＩＩ‐ＦＩＸ複合体配列を提供する。他の実施態様において、本発明は、ＸＴＥＮに連結されていない組み込まれたＦＩＸに由来するＡＰ開裂配列をＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列に提供する。一実施態様において、ＸＴＥＮを有さないＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列は、ＸＴＥＮを有さない表４３由来の配列と比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を呈する。
【００１５】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の一実施態様において、本発明は、式Ｉ：
（ＸＴＥＮ）ｘ−ＣＦ−（ＸＴＥＮ）ｙ                                Ｉ
の融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、ＣＦは凝固因子であり；ｘは０または１のいずれかであり、かつｙは０または１のいずれかであり、式中、ｘ＋ｙ≧１であり；かつＸＴＥＮは伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）である。
【００１６】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式ＩＩ：
（ＸＴＥＮ）ｘ−（ＣＦ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）  ｙ                  ＩＩ
の融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、ＣＦは凝固因子であり；Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｘは０または１のいずれかであり、かつｙは０または１のいずれかであり、式中、ｘ＋ｙ≧１であり；かつＸＴＥＮは伸長組換えポリペプチドである。
【００１７】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、単離された融合タンパク質を提供し、この場合、融合タンパク質は、式ＩＩＩ：
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＣＦ）−（Ｓ）ｙ  −（ＸＴＥＮ）ｙ              ＩＩＩ
に属し、式中、各発生について独立して、ＣＦは凝固因子であり；Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｘは０または１のいずれかであり、かつｙは０または１のいずれかであり、式中、ｘ＋ｙ≧１であり；かつＸＴＥＮは伸長組換えポリペプチドである。
【００１８】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式ＩＶ：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ  ＩＶ
の単離された融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、Ｇｌａは、ＦＩＸのＧｌａドメインであり；ＥＧＦ１は、ＦＩＸのＥＧＦ１ドメインであり；ＥＧＦ２は、ＦＩＸのＥＦＧ２ドメインであり；ＡＰは、ＦＩＸの活性化因子ペプチドであり；ＰＲＯは、ＦＩＸのプロテアーゼドメインであり；Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｕは０または１のいずれかであり；ｖは０または１のいずれかであり；ｘは０または１のいずれかであり；ｙは０または１のいずれかであり；ｚは０または１のいずれかであり、ただし、ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｚ≧１という条件付きであり；かつＸＴＥＮは伸長組換えポリペプチドである。
【００１９】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式Ｖ：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＡＰ１）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ２）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ          Ｖ
の単離された融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、Ｇｌａは、ＦＩＸのＧｌａドメインであり；ＥＧＦ１は、ＦＩＸのＥＧＦ１ドメインであり；ＥＧＦ２は、ＦＩＸのＥＦＧ２ドメインであり；ＡＰは、ＡＰドメインの第一の天然開裂配列を含むＦＩＸの活性化因子ペプチドドメインのＮ末端配列部分であり；ＰＲＯは、ＦＩＸのプロテアーゼドメインであり；Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｕは０または１のいずれかであり；ｖは０または１のいずれかであり；ｘは０または１のいずれかであり；ｙは０または１のいずれかであり；ｚは０または１のいずれかであり、ただし、ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｚ≧１という条件付きであり；かつＸＴＥＮは伸長組換えポリペプチドである。
【００２０】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式ＶＩ：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）ｙ      ＶＩ
の単離された融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、Ｇｌａは、ＦＶＩＩのＧｌａドメインであり；ＥＧＦ１は、ＦＶＩＩのＥＧＦ１ドメインであり；ＥＧＦ２は、ＦＶＩＩのＥＦＧ２ドメインであり；ＰＲＯは、ＦＶＩＩのプロテアーゼドメインであり；Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｕは０または１のいずれかであり；ｖは０または１のいずれかであり；ｘは０または１のいずれかであり；ｙは０または１のいずれかであり、ただし、ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｙ≧１という条件付きであり；かつＸＴＥＮは伸長組換えポリペプチドである。
【００２１】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式ＶＩＩ：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｔ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ２）−（ＡＰ１）ｖ−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ２）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ    ＶＩＩ
の単離された融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、Ｇｌａは、ＦＶＩＩのＧｌａドメインであり；ＥＧＦ１は、ＦＶＩＩのＥＧＦ１ドメインであり；ＥＧＦ２は、ＦＶＩＩのＥＦＧ２ドメインであり；ＰＲＯは、ＦＶＩＩのプロテアーゼドメインであり；ＡＰ１は、天然の開裂配列を含むＦＩＸの活性化因子ペプチドドメインのＮ末端配列部分であり；ＡＰ２は、天然開裂配列を含むＦＩＸの活性化因子ペプチドドメインのＣ末端配列部分であり；Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｔは０または１のいずれかであり；ｕは０または１のいずれかであり；ｖは０または１のいずれかであり；ｘは０または１のいずれかであり；ｙは０または１のいずれかであり；ｚは０または１のいずれかであり、ただし、ｔ＋ｕ
＋ｗ＋ｚ≧１という条件付きであり；かつＸＴＥＮは伸長組換えポリペプチドである。本実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ組成物には、先により完全に説明した通り、ＦＩＸ活性化因子ペプチドドメイン配列の全部または第ＩＸ因子の活性化因子ペプチドドメイン由来の片側のもしくは両方の開裂配列、例えば、Ｒ１４５‐Ａ１４６開裂部位と隣接する少なくとも約３〜約１２のアミノ酸の配列、およびＲ１８０‐Ｖ１８１開裂部位と隣接する少なくとも約１〜約５のアミノ酸の配列を含むことができる。また、本発明は、ＡＰ開裂配列について表７のその他の任意の開裂配列の置換を意図する。
【００２２】
本明細書に説明される実施態様のＣＦＸＴＥＮ組成物は、本明細書に開示された任意の適切なインビトロアッセイを用いて活性の保持について評価され、凝固因子関連の疾患、障害、または容態の治療における治療薬としての使用のための立体配座の好適性を判定することができる。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていない天然ＣＦと比較して、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の活性を呈する。別の実施態様において、ＣＦ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素を連結する組み込まれた開裂配列の酵素開裂によってＣＦＸＴＥＮから放出されたＣＦ構成要素は、ＸＴＥＮに連結されていない天然ＣＦと比較して、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の活性を呈する。
【００２３】
ＣＦＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、少なくとも約２００の、または少なくとも約４００の、または少なくとも約８００の、または少なくとも約９００の、または少なくとも約１０００の、または少なくとも約２０００の、最大約３０００のアミノ酸残基を有する。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物のＸＴＥＮは、以下の特徴の１以上を有することを特徴とする：（ａ）表４に示される配列から選択されるアミノ酸配列の同等な長さと少なくとも約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の同一性を呈する少なくとも約２００の連続的なアミノ酸を含み；（ｂ）ＸＴＥＮ配列は、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって分析される場合、予測されるＴ細胞エピトープを欠失し、この場合、ＸＴＥＮ配列内のエピトープについてのＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム予測は、−５、または−６、または−７、または−８、または−９、またはそれより大きなスコアに基づいており；（ｃ）ＸＴＥＮは、１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６未満、または５未満、またはさらにより少ないサブシーケンススコアを有し；（ｄ）アスパラギン残基およびグルタミン残基の合計は、ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であり；（ｅ）メチオニン残基およびトリプトファン残基の合計は、ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であり；（ｆ）ＸＴＥＮは、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、９０％超のランダムコイル形成、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％のランダムコイル形成を有し；（ｇ）ＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される時、２％未満のアルファヘリックスおよび２％未満のベータ‐シートを有し；ならびに（ｈ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、およびプロリン（Ｐ）残基の合計は、ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約９０％超、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％を構成する。
【００２４】
別の実施態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、この場合、ＸＴＥＮは、アスパラギン残基およびグルタミン残基の合計が、ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であり、メチオニン残基およびトリプトファン残基の合計が、ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であり、ＸＴＥＮ配列が、正の電荷を有する５％未満のアミノ酸残基を有し、ＸＴＥＮ配列が、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、９０％超のランダムコイル形成、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％のランダムコイル形成を有し；ならびにＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ‐
Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される時、２％未満のアルファヘリックスおよび２％未満のベータ‐シートを有することを特徴とする。いくつかの実施態様において、いずれの種類のアミノ酸も、ＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列の３０％超を構成しない。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、この場合、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、非重複配列モチーフからなり、この場合、各配列モチーフが約９〜約１４のアミノ酸残基を有し、かつ、この場合、任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなることを特徴とする。一実施態様において、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、非重複配列モチーフからなり、この場合、モチーフが表３から選択されることを特徴とする。
【００２６】
いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮは、３つの連続したアミノ酸がセリンでない限り（該アミノ酸がセリンである場合、３以下の連続したアミノ酸がセリン残基である。）、該アミノ酸が同一ではない配列を有する。他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素は、１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６未満、または５未満、またはそれより少ないサブシーケンススコアを有する。本段落の実施態様において、ＸＴＥＮは、「実質的に非反復性」として特徴づけられる。
【００２７】
いくつかの実施態様において、本発明は、少なくとも１つの第二のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮを提供し、この場合、ＸＴＥＮ配列は、表４、表９、表１０、表１１、表１２、または表１３由来の配列と比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を呈する。
【００２８】
いくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して高い薬物動態特性を呈し、この場合、高い特性には、より長い終末半減期、より大きな曲線下面積、血中濃度が治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）内に留まる時間の延長、治療域内の血中濃度を結果として生じる連続用量間の時間の延長、およびＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して投与することができ、なおもまだ、該組成物についての治療域内の血中濃度を結果的に生じる経時的なモル用量の減少が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、対象に投与されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の終末半減期は、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約６０倍、または少なくとも約１００倍、またはさらにより長く延長し、対象に同等な用量で投与される。他の実施態様において、対象に投与されるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の終末半減期は、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間、または少なくとも約２１日間、またはそれより長い。他の実施態
様において、高い薬物動態特性は、所与の期間についてＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質についての治療域内に留まる血中濃度が、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約６０倍、または少なくとも約１００倍であるという事実によって反映され、同等な用量で対象に投与される。半減期および治療域内で経過する時間の延長は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較して、対象に投与される融合タンパク質のあまり頻繁ではない投薬および少ない量（モル当量）を可能にする。一実施態様において、治療有効量の投与計画を用いる対象へのＣＦＸＴＥＮの投与は結果的に、ＸＴＥＭに連結されていない相応のＣＦと比較して融合タンパク質の血中レベルについての少なくとも２つの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎ谷部の間で少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも８倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも６０倍、または少なくとも約１００倍、またはそれより長い時間の延長を生じ、対象に同等な用量投与計画を用いて投与される。
【００２９】
いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結される場合にＣＦの熱安定性を高め、この場合、熱安定性は、ＸＴＥＮに連結されていない生物活性のあるタンパク質と比較して生物活性のあるタンパク質の３７℃の温度への少なくとも約７日間の曝露後に生物活性の保持を測定することによって確認される。先の一実施態様において、生物活性の保持は、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、または約５００％長く延長する。
【００３０】
いくつかの実施態様において、単離されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較してクリアランス受容体に対する低い結合親和性を有するよう形成される。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦの結合親和性の約０．０１％〜３０％、または約０．１％〜約２０％、または約１％〜約１５％、または約２％〜約１０％の範囲で、ＣＦのクリアランス受容体に対する結合親和性を呈する。別の実施態様において、低い親和性を有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、活発なクリアランスの低下および、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較して少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１２倍、または少なくとも約１５倍、または少なくとも約１７倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約３０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍長い半減期の相応の延長を有することができる。
【００３１】
いくつかの実施態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、この場合、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して生理学的条件において少なくとも３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１５倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも６０倍の高い溶解度を呈する。
【００３２】
いくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、実際の分子量と比較して、分子ふるいクロマトグラフィーによって決定される時、大きな見かけの分子量を呈する。いくつかの実施態様において、ＦＩＸおよび少なくとも１つの第一のＸＴＥＮを含む
ＣＦは、少なくとも約４００ｋＤ、または少なくとも約５００ｋＤ、または少なくとも約７００ｋＤ、または少なくとも約１０００ｋＤ、または少なくとも約１４００ｋＤ、または少なくとも約１６００ｋＤ、または少なくとも約１８００ｋＤ、または少なくとも約２０００ｋＤの見かけの分子量を呈するのに対し、融合タンパク質の各ＦＩＸ構成要素の実際の分子量は、約５０ｋＤであり、融合タンパク質の分子量は約７０〜約１２５ｋＤａの範囲である。他の実施多様において、ＦＶＩＩと少なくとも１つの第一のＸＴＥＮとを含むＣＦは、少なくとも約４００ｋＤ、または少なくとも約５００ｋＤ、または少なくとも約７００ｋＤ、または少なくとも約１０００ｋＤ、または少なくとも約１４００ｋＤ、または少なくとも約１６００ｋＤ、または少なくとも約１８００ｋＤ、または少なくとも約２０００ｋＤの見かけの分子量を呈するのに対し、融合タンパク質の各ＦＩＸ構成要素の実際の分子量は、約５０ｋＤであり、融合タンパク質の分子量は、約７０〜約１２５ｋＤの範囲である。したがって、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、該融合タンパク質の実際の分子量よりも約６倍大きい、または約８倍大きい、または約１０倍大きい、または約１２倍大きい、または約１５倍大きい見かけの分子量を有することができる。いくつかの場合、本明細書に開示される任意の実施態様の単離されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、約４よりもおおきい、または約５、または約６、または約７、または約８、または約１０、または約１５よりも大きい生理学的条件下で見かけの分子量因子を呈する。
【００３３】
いくつかの実施態様において、式Ｉ〜ＶＩＩのうちの１つの治療有効量の融合タンパク質の投与を必要とする対象への該投与は結果的に、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較されおよび対象に同等な用量で投与される融合タンパク質についての治療域内で経過する少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、またはそれより多くの時間の延長を生じることができる。他の場合、式Ｉ〜ＶＩＩの実施態様の治療有効量の融合タンパク質の投与を必要とする対象への該投与は結果的に、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較されおよび同等な用量で投与される連続した用量間で少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約７日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間の治療有効量投与計画を維持するのに必要な連続した用量間の時間の延長を生じることができる。
【００３４】
開示された組成物の融合タンパク質は、ＣＦおよびＸＴＥＮおよび任意のスペーサー配列のＮ末端からＣ末端への異なる立体配置を有するよう設計されることができ、該立体配置には、ＸＴＥＮ−ＣＦ、ＣＦ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−Ｓ−ＣＦ、ＣＦ−Ｓ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＣＦ−ＸＴＥＮ、ＣＦ−ＣＦ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＣＦ−ＣＦ、ＣＦ−Ｓ−ＣＦ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＣＦ−Ｓ−ＣＦ、およびこれらの多量体が挙げられるが、それらに限定されない。立体配置の選択は、本明細書に開示されるように、組み込まれた開裂配列の場合の活性の同時増大を伴うＣＦの放出を含む特定の薬物動態特性、物理／化学特性、または薬理学的特性を与えることができる。
【００３５】
いくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、以下を特徴とする：（ｉ）他は等価な用量の下で対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子と比較して、対象に投与される場合、より長い半減期を有し；（ｉｉ）より小さな分子量の融合タンパク質が、他は等価な用量投与計画の下で対象に投与されるＸＴＥＮを欠失する相応の凝固因子と比較して対象に投与される場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）に到達し；（ｉｉｉ）より小さなモル量の融合タンパク質が、他は等価な用量投与計画の下で対象に投与されるＸＴＥＮを欠失する相応の凝固因子と比較して対象に投与される場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な治療効果を達成し；（ｉｖ）融合タンパク質が、他は等価なモル量を用いて対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子と比較して、あまり頻繁に対象に投与されない場合、融合タンパク質は
、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）に到達し；（ｖ）融合タンパク質が、他は等価なモル量を用いて対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子と比較してあまり頻繁に対象に投与されない場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な治療効果を達成し；（ｖｉ）他は等価な投薬期間の下で対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子と比較して、累積的により小さなモル量の融合タンパク質が対象に投与される場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）に到達し；または（ｖｉｉ）他は等価な投薬期間の下で対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子と比較して、累積的により小さなモル量の融合タンパク質が対象に投与される場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な治療効果を達成する。
【００３６】
本発明は、以下を含む、１つ以上の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に融合した第ＶＩＩ因子または第ＩＸ因子または第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子複合体凝固因子を含む融合タンパク質を生成する方法を提供する：（ａ）融合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を提供すること（ｂ）該宿主細胞を、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること；および（ｃ）融合タンパク質を培養物から回収すること。本方法の一実施態様において、融合タンパク質の凝固因子は、表１または表２から選択される配列と比較して少なくとも９０％の配列同一性を有する。本方法の別の実施態様において、発現した融合タンパク質の１つ以上のＸＴＥＮは、表４から選択された配列と比較して少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％の配列同一性を有する。本方法の別の実施態様において、宿主細胞は真核細胞である。本方法の別の実施態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本方法の別の実施態様において、単離された融合タンパク質は、宿主細胞の実質的に可溶性形態の細胞質から回収される。
【００３７】
本発明は、（ａ）任意の先の実際態様の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一実施態様において、本発明は、（ａ）表４１および表４２から選択される同等な長さのポリヌクレオチド配列と比較して；または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体と比較して、８０％の配列同一性、または約８５％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。本発明は、本段落に説明される先の任意の実施態様の核酸を含む発現ベクターを提供する。一実施態様において、上述の発現ベクターはさらに、該ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された組換え調節配列を含む。別の実施態様において、上述の発現ベクターのポリヌクレオチド配列は、ＣＦ天然シグナル配列であり得る分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドにフレーム内で融合する。本発明は、本段落において説明される先の任意の実施態様の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施態様において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施態様において、宿主細胞はＨＥＫ細胞である。
【００３８】
一実施態様において、本発明は、上述の任意の実施態様の融合タンパク質と医薬として許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。別の実施態様において、本発明は、包装材料と、上述の実施態様の医薬組成物と医薬組成物ならびに保管条件および取り扱い条件を同定する標識とを含む少なくとも１つの第一の容器と、医薬組成物の再構成および／または医薬組成物の対象への投与についての説明のシートとを含むキットを提供する。
【００３９】
本発明は、対象に、治療有効量の上述の任意の実施態様のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を投与することを含む、対象における凝固障害または凝固因子と関連した疾患、障害、もしくは容態を治療する方法を提供する。本方法の一実施態様において、凝固因子関連容態は、出血性障害（例えば、欠陥性血小板機能、血小板減少、またはフォンウィルブランド病）、凝固障害（凝固因子欠乏を含む血液凝固に関する任意の障害）、血友病Ｂ（別名クリスマス病）、第ＩＸ因子関連出血性障害、第ＶＩＩ因子欠乏、血友病Ａ、脈管損傷、血友病に苦しんでいない対象における制御されていない出血、外傷もしくは手術に由来する出血、抗凝固薬両方による出血、および肝疾患による出血から選択される。治療方法の一実施態様において、凝固障害は血友病Ａである。治療方法の一実施態様において、凝固障害は血友病Ｂである。治療方法の別の実施態様において、凝固障害は第ＶＩＩ因子欠乏である。治療方法の別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、出血症状を制御するために対象に投与される。治療方法の別の実施態様において、第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列複合体を含むＣＦＸＴＥＮは、出血症状を制御するために対象に投与され、この場合、ＣＦＸＴＥＮは、内在性の凝固カスケードの前駆凝固因子プロテアーゼ（例えば、活性化型第ＸＩ因子）によって活性化される。別の実施態様において、本発明は、以下を含む、対象における凝固因子欠乏を治療する方法を提供する：該対象に、本明細書に提供される治療有効量の第ＶＩＩ因子を含む組成物を投与すること。
【００４０】
いくつかの実施態様において、組成物は、皮下的に、筋肉内に、または静脈内に投与されることができる。一実施態様において、組成物は、治療有効量で投与され、この場合、投与は、ＸＴＥＮに連結されていない融合タンパク質の相応のＣＦと比較されおよび対象に同等な用量で投与される融合タンパク質についての治療域内で経過する時間の延長を結果的に生じる。治療域内で経過する時間の延長は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦよりも少なくとも３倍長くあり得、またはそれに代わるものとして、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦよりも少なくとも４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも約３０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍長くあり得る。治療方法のいくつかの実施態様において、（ｉ）別の同一の用量投与計画の下で、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子と比較して、より小さなモル量（例えば、約２倍未満、または約３倍未満、または約４倍未満、または約５倍未満、または約６倍未満、または約８倍未満、または約１００倍未満、またはそれより大きい）の融合タンパク質が投与され、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な曲線下面積および／または同等な治療効果を達成し；（ｉｉ）融合タンパク質は、別の同一の用量の下で、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子と比較してあまり頻繁に投与されず（例えば、２日ごと、約７日ごと、約１４日ごと、約２１日ごと、または約毎月）、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な曲線下面積および／または同等な治療効果を達成し；あるいは（ｉｉｉ）別の同一の用量投与計画の下でＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子と比較して、累積的なより小さなモル量（例えば、約５％、または約１０％、または約２０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％未満）の融合タンパク質が投与され、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の凝固因子として同等な曲線下面積および／または同等な治療効果を達成する。累積的なより小さなモル量は、少なくとも約１週間、または約１４日間、または約２１日間、または約１ヶ月間の期間に測定される。治療方法のいくつかの実施態様において、治療効果は、凝固因子の血中濃度、プロトロンビン（ＰＴ）アッセイ、活性化型部分プロトロンビン（ａＰＴＴ）アッセイ、出血時間アッセイ、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）、および血栓弾性描写法から選択される測定されたパラメータである。
【００４１】
別の実施態様において、本発明は、先に説明した医薬組成物を対象に、治療有効量投与計画を用いて投与される複数回の連続した用量の医薬組成物を用いて投与することを含む
、疾患、障害、または容態を治療する方法を提供する。上述の一実施態様において、治療有効量投与計画は結果的に、融合タンパク質に連結されていない融合タンパク質の相応のＣＦと比較され、対象に同等な用量投与計画で投与される融合タンパク質の血中レベルについて少なくとも２つの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎ谷部の間で少なくとも３倍、またはそれに代わるものとして、少なくとも４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも約３０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍長い時間の延長を生じることができる。上述の別の実施態様において、融合タンパク質の投与は結果的に、融合タンパク質に連結されていない相応の生物活性のあるタンパク質構成要素（複数可）と比較され、対象ｄに治療有効量の投与計画を用いて対象に投与される医薬組成物の融合タンパク質のモルであまり頻繁でない投薬またはより低い合計薬用量を用いて、凝固因子関連疾患の少なくとも１つの測定されるパラメータの改良を生じる。
【００４２】
本発明はさらに、疾患、障害、または容態を治療することを必要とする対象における疾患、障害、または容態を治療するための薬剤の調製における上述の任意の実施態様の融合タンパク質を含む組成物の使用を提供する。上述の一実施態様において、該疾患、障害、または容態は、出血性障害、凝固障害、血友病Ｂ（別名クリスマス病）、第ＩＸ因子関連出血性障害、第ＶＩＩ因子欠乏、脈管損傷、外傷もしくは手術に由来する出血、抗凝固薬療法による出血、および肝疾患からなる群から選択される。開示された任意の実施態様は、単独で、または関心出願に応じた組み合わせで実施されることができる。
【００４３】
（引用による組み込み）
本明細書において記載されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、引用により組み込まれるよう具体的かつ個々に示されたのと同じ程度まで、引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
本発明の特長および利点は、実例となる実施態様を示す以下の詳細な説明および添付の図によってさらに説明され得る。
【図１】図１は、例示的なＣＦＸＴＥＮ（ＦＩＸ−ＸＴＥＮ）融合タンパク質の模式図を示す。図１のＡは、ガンマ−カルボキシグルタミン酸ドメイン、ＥＧＦ１ドメインおよびＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド、およびプロテアーゼドメインを有する天然ＦＩＸのドメイン構造を示し、連結されたＸＴＥＮがＣ末端にある。矢印は、活性化ペプチドドメインのための開裂部位を示す。図１のＢは、開裂配列を介してＣ末端に結合したＸＴＥＮポリペプチドを有するＦＩＸ分子を示し、ＸＴＥＮを放出するためのタンパク質分解性開裂のための部位を示す（矢印は、活性化ペプチドドメインについての開裂部位およびＸＴＥＮのための放出地点を示す）。
【図２】図２は、ＦＩＸ−ＸＴＥＮのＣＸＴＥＮ立体配置および関連するプロテアーゼ開裂部位のいくつかの例を示す。図２のＡは、ＦＩＸの活性化ペプチド内の２つのタンパク質分解性分解部位（矢印）と開裂部位連結を有さないＣ末端ＸＴＥＮとを有するＦＩＸ−ＸＴＥＮを示す。図２のＢは、図２のＡの立体配置と類似しているが、Ｃ末端ＸＴＥＮは、開裂配列を介して連結されており、矢印は、放出地点を示す。図２のＣは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮの３つの立体配置を示し、ＸＴＥＮは、ＦＩＸの種々のドメイン間に組み込まれる。図２のＤは、ＸＴＥＮ部分が、ＦＩＸのタンパク質分解性活性化の際にＸＴＥＮを放出するであろう天然分解部位間の活性化ペプチドに挿入された、ＦＩＸ−ＸＴＥＮを示す。図２のＥは、Ｃ末端に放出可能なＸＴＥＮの付加を有する異なるドメイン間に挿入された複数のＸＴＥＮ配列を含むＦＩＸ−ＸＴＥＮを示す。図２のＦは、ＸＴＥＮが、ＦＩＸのループドメイン内に挿入されたＦＩＸ−ＸＴＥＮを示す。
【図３】図３は、外来性経路及び内在性経路の両方を示す、凝固カスケードの模式図である。
【図４】図４は、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮのＣＸＴＥＮ立体配置のいくつかの例を示す。図４のＡは、活性化されなかったＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを示す。図４のＢは、ペプチドが開裂され、結果的に活性化型ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮを生じるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを示し；図４のＣは、ＦＶＩＩ構成要素が活性化されなかった放出可能なＸＴＥＮについての開裂配列を有するＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ組成を示し、活性化プロテアーゼ（ＡＰ）についての開裂部位および放出プロテアーゼ（ＲＰ）についての第二の開裂部位を含む。図４のＤは、放出プロテアーゼについての開裂部位を含む活性化型ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの組成示す。
【図５】図５は、内部ＸＴＥＮを用いるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ設計アプローチについての戦略を示す。図５のＡ〜Ｄは、左側に不活性化型ＦＶＩＩを右側にＦＶＩＩの活性化型形態を有するＦＶＩＩドメインの境界間のＸＴＥＮの挿入についての例示的な部位を示す（Ａ：ＧｌａとＥＧＦ１ドメインの間のＸＴＥＮの挿入、Ｂ：ＥＧＦ１とＥＧＦ２の間のＸＴＥＮの挿入。Ｃ：活性化ペプチドのＣ末端におけるＸＴＥＮの挿入、Ｄ：活性化ペプチドのＮ末端におけるＸＴＥＮの挿入）。図５のＥは、ＸＴＥＮが個々のドメイン融合タンパク質内の外部ループ内に配置されるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮの例を示し、左側に不活性化型ＦＶＩＩを、右側にＦＶＩＩａを有する。ＦＶＩＩにおける活性化ペプチドは細い線として示されており、それに対して、ＸＴＥＮは太字として示されている。
【図６】図６は、図５と本質的に同じコンストラクトを示すが、ＸＴＥＮは、各コンストラクトのＣ末端に連結されている。
【図７】図７は、ＸＴＥＮが、凝固因子ＦＶＩＩまたはＦＩＸの配列に対して内部に挿入できる種々の位置のいくつかを示す模式図である。
【図８】図８は、凝固系の鍵となる構成要素の模式図である。図７のＡ：兄財政及び外来性のカスケード構成要素を有する通常の凝固系。図７のＢは、不活性化型／低活性化型形態のＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ（ＦＶＩＩ＊）が、投与後に内在性に活性化される場合に内在性の系のＦＩＸおよびＦＶＩＩＩの構成要素を迂回するよう意図される変法を示す。
【図９】図９は、ｐＢＣ００１４  ＣＨＯ‐Ｋ１形質転換体の初代スクリーニング由来の細胞クラスターの大きさの分布（灰色棒）およびＥＬＩＳＡによるＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡ力価（ｎｇ／ｍＬ）（黒色棒）のグラフである（不十分な空間により棒の真下に全てのクローンが標識されているわけではなかった）（実験の詳細については実施例２５参照）。クローンをＥＬＩＳＡの力価に従って、低いから高い（左から右）に分類した。
【図１０】図１０は、上位のｐＢＣ００１４クローンの細胞計数（白色棒）およびＦＶＩＩ力価（ｎｇ／ｍＬ）（黒色棒）のグラフである（実験の詳細については実施例２５参照）。クローンをＥＬＩＳＡの力価に従って、低いから高い（左から右）に分類した。
【図１１】図１１は、上位のｐＢＣ００１４クローンのＦＶＩＩ力価と細胞計数の比のグラフである（実験の詳細については実施例２５参照）。クローンを比に従って、低いから高い（左から右）に分類した。
【図１２】図１２は、ＥＬＩＳＡに従った上位のｐＢＣ００１４クローンのウェスタンブロット、凝固、ＥＬＩＳＡ／細胞計数比、および凝固／細胞計数比である（実験の詳細については実施例２５参照）。クローン６Ｇ１は、切りつめられた生成物を発現し、さらには評価されなかった。
【図１３】図１３は、ＥＬＩＳＡに従った上位のｐＢＣ００１６クローンのウェスタンブロット、凝固、ＥＬＩＳＡ／細胞計数比、および凝固／細胞計数比である（実験の詳細については実施例２５参照）。
【図１４】図１４は、ＥＬＩＳＡに従った上位ｐＢＣ００１８クローンのウェスタンブロット、凝固、ＥＬＩＳＡ／細胞計数比、および凝固／細胞計数比である（実験の詳細については実施例２５参照）。クローン３Ｂ２は、切りつめられた生成物を発現し、さらには評価されなかった。
【図１５】図１５は、抗ＧＬＡアフィニティクロマトグラフィーによるＦＶＩＩ−ＡＥ８６４の精製を示す（実験の詳細については実施例２６参照）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析は、濃縮された上清からのＦＶＩＩ−ＡＥ８６４の精製およびＥＤＴＡにより溶出された９０％超の純度の画分を示す。
【図１６】図１６は、ＦＸａ処理によるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合物からＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ融合物への活性化を示す（実験の詳細については実施例２６参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＦＸａ処理後の還元条件下での軽鎖バンドの出現を示すが、未処理の試料においては示されない。加えて、軽鎖の損失を示す上部のバンドの下方向の移行がある。
【図１７】図１７は、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合物からＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ融合部への自己活性化を示すＳＤＳ‐ＰＡＧＥを示す（実験の詳細については実施例２６参照）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析は、ＦＸａ処理後の、およびＣａＣｌ２による高濃縮での４℃でのインキュベーション後の還元条件下での軽鎖バンドの出現を示す。加えて、軽鎖の損失を示す上部のバンドの下方向の移行がある。
【図１８】図１８は、ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８のＳＥＣ分析を示す（実験の詳細については実施例２６参照）。ＳＥＣは、最少の混入での単分散の集団、およびカラムの空隙容積（〜２２ｍＬ）に凝集物がないことを示す。
【図１９】図１９は、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＦＶＩＩ−ＡＥ８６４の精製を示す（実験の詳細については実施例２６参照）。クロマトグラムは、混入タンパク質よりも遅くに活性のバルクが溶出し、正味５倍の精製をなすＭａｃｒｏｃａｐ  Ｑカラム由来の全タンパク質含有量およびＦＶＩＩ活性の溶出特性を示す。
【図２０】図２０は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＦＶＩＩ‐ＡＥ８６４の精製を示す（実験の詳細については実施例２６参照）。クロマトグラムは、混入タンパク質よりも早くに活性のバルクが溶出し、正味２倍の精製をなすトヨパールフェニルカラム由来の全タンパク質含有量及びＦＶＩＩ活性の溶出特性を示す。
【図２１】図２１は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた単量体ＦＶＩＩ‐ＡＥ８６４からの凝集タンパク質の除去を表す２つのクロマトグラフィー出力を示す（実験の詳細については実施例２６参照）。図２１のＡは、初期のピークと関連した緩衝剤の後に２つのピークが溶出するマクロキャップＱカラム由来のＦＶＩＩ‐ＸＴＥＮ溶出特性を図示するクロマトグラムである。図２１のＢは、初期のピークにおける凝集体の不在を表す初期および後期のマクロキャップＱのＳＥＣクロマトグラムを示す。
【図２２】図２２は、ＦＩＸ／ｃＦＸＩ／ＸＴＥＮがＦＩＸ‐ＸＴＥＮと比較して活性の増大したＥＬＩＳＡアッセイまたはａＰＴＴアッセイの結果を示す（実験の詳細については実施例２９参照）。一過性に発現したＦＩＸコンストラクトを、ＥＬＩＳＡによる抗原含有量について、およびａＰＴＴベースのアッセイによる活性についてアッセイした。ＦＩＸ‐ＸＴＥＮの抗原含有量は、ＦＩＸ／ｃＦＸＩ／ＸＴＥＮコンストラクトと類似していたが、活性は有意に増大した。この増大は、ＦＩＸ／ｃＴＥＶ／ＸＴＥＮがＦＩＸ‐ＸＴＥＮに対して有意に異なる活性を示さないので、本アッセイにおけるＦＸＩプロテアーゼの特異的作用に起因する。ＦＩＸ試料のＥＬＩＳＡ力価が１９７ｎｇ／ｍＬであり、グラフの尺度を外れることに留意されたい。
【図２３】図２３は、実施例３０に説明されるとおり、示されている得られた等価のＦＶＩＩ濃度でラットに皮下投与した単回用量後の薬物動態特性を示す。
【図２４】図２４は、実施例３１に説明されるとおり、示されている得られた等価のＦＩＸ濃度でラットに皮下投与した単回用量後の薬物動態特性を示す。
【図２５】図２５は、実施例３９に説明されるとおり、皮下的または静脈内のいずれかで投与された変動する長さの構造化されていないポリペプチドに連結されたＧＦＰの異なる組成物の単回用量後のカニクイザルにおける薬物動態特性（血漿濃度）を示す。組成物は、ＧＦＰ‐Ｌ２８８、ＧＦＰ‐Ｌ５７６、ＧＦＰ‐ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ‐Ｙ５７６、およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６‐ＧＦＰであった。血液試料を注射後の種々の時点で分析し、血漿中のＧＦＰの濃度を、捕捉のためにＧＦＰに対するポリクローナル抗体と、検出のために同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物とを用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、投与後の血漿濃度対時間（時）として呈され、特に、ＸＴＥＮの最長の配列長を有する組成物であるＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６‐ＧＦＰについての半減期のかなりの延長を示す。最短の配列長を有するコンストラクトＧＦＰ‐Ｌ２８８は、最短の半減期を有していた。
【図２６】図２６は、ＧＦＰのＮ末端に融合したＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の融合タンパク質の安定性研究からの試料のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを示す（実施例４０参照）。ＧＦＰ‐ＸＴＥＮをカニクイザル血漿およびラット腎臓可溶化液において３７℃で最大７日間インキュベートした。加えて、カニクイザルに投与したＧＦＰ‐ＸＴＥＮも評価した。試料を０、１、および７日目に引き抜き、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに次いで、ＧＦＰに対する抗体を用いるウェスタン分析を用いた検出によって分析した。
【図２７】図２７は、ＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７、およびＬＣＷ５５２由来のクローンのＮ末端配列における第三および第四のコドンについて用いられる３つの無作為化したライブラリーを示す（実験の詳細については実施例１４参照）。示されるように、第三および第四の残基の位置において許容可能なＸＴＥＮコドンのすべての組み合わせが存在するよう修飾した第三および第四の残基を用いてライブラリーを設計した。各ライブラリーについて許容可能なＸＴＥＮコドンを含むために、第三および第四の残基のコドン多様性を有する１２のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドの９の対を設計し、アニーリングし、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素で消化した詰め物ベクター（ｓｆｕｆｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）ｐＣＷ０５５１へと連結し（Ｓｔｕｆｆｅｒ‐ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５‐ＧＦＰ）、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞へと形質転換し、３つのライブラリーのコロニーＬＣＷ０５６９、ＬＣＷ０５７０、およびＬＣＷ０５７１を得た。
【図２８】図２８は、基準ＣＢＤ＿ＡＭ８７５コンストラクトに対するＧＦＰ蛍光シグナルについての実施例１５において説明されるような最適化工程後の上位７５のクローンの再試験のヒストグラムを示す。本結果は、いくつかのクローンが、基準クローンよりも今や優れていることを示した。
【図２９】図２９は、Ｎ末端の４８のアミノ酸の２つの領域についてのコドン最適な選択の組み合わせを保証した組み合わせアプローチの模式図である（実験の詳細については実施例１６参照）。本アプローチは、ＸＴＥＮがＣＦに対してＮ末端であるＸＴＥＮタンパク質の発現についての解決策であり得るリーダー配列を結果として生じる発現の最適化の評価のためのＸＴＥＮタンパク質のＮ末端における新規の４８マーを作製した。
【図３０】図３０は、実施例１７において説明されるように、コンストラクト配列のＮ末端にＣＢＤリーダー配列を含む基準ＸＴＥＮクローンと比較した、ＸＴＥＮ  Ｎ末端コドン最適化実験から得られた好ましいクローンの発現を確認するＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３１】図３１は、ＸＴＥＮの構築、生成、および評価における代表的な工程の模式的流れ図である。
【図３２】図３２は、融合タンパク質をコードするＣＦＸＴＥＮポリヌクレオチドコンストラクトの構築における代表的な工程の模式的流れ図である。個々のオリゴヌクレオチド５０１を１２のアミノ酸モチーフ（「１２マー」）などの配列モチーフ５０２へとアニーリングした後、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含むオリゴと連結させる。ライブラリー由来の追加的な配列モチーフを、ＸＴＥＮ遺伝子５０４の所望の長さに到達するまで、１２マーとアニーリングする。ＸＴＥＮ遺伝子を詰め物ベクターへとクローン化する。この場合、ベクターは、任意のＦｌａｇ配列５０６に続いて、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位５０７によって隣接されるストッパー配列をコードし、結果的にＸＴＥＮ‐ＦＶＩＩ融合タンパク質をコードする遺伝子５００を生じる。
【図３３】図３３は、ＣＦおよびＸＴＥＮを含む融合タンパク質をコードする遺伝子の構築、ならびに融合タンパク質としてのその発現および回収、ならびに候補ＣＦＸＴＥＮ産物としてのその評価における代表的な工程の模式的流れ図である。
【図３４】図３４は、異なるプロセシング戦略を用いたＣＦＸＴＥＮ発現ベクターの設計の模式図である。図３４のＡは、ＦＶＩＩをコードする配列の３’末端に融合したＸＴＥＮをコードする発現ベクターを示す。追加的なリーダー配列がこのベクターに必要とされないことに留意されたい。図７のＢは、ＣＢＤリーダー配列およびＴＥＶプロテアーゼ部位を有するＦＶＩＩをコードする配列の５’末端に融合したＸＴＥＮをコードする発現ベクターを示す。図７のＣは、ＣＢＤおよびＴＥＶプロセシング部位が最適化したＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）と置き換えられた図７Ｂにあるような発現ベクターを図示する。図７のＤは、ＮＴＳ配列をコードする発現ベクター、ＶＦＩＩをコードする配列、およびＸＴＥＮをコードする第二の配列を図示する。
【図３５】図３５は、公知の分子量のタンパク質標準物質に対して測定されたグルカゴン‐ＸＴＥＮコンストラクト試料の分子ふるいクロマトグラフィー分析の結果を示し、グラフは、実施例３７に説明されるように、吸光度対保持容積として出力される。グルカゴン‐ＸＴＥＮコンストラクトは、１）グルカゴン‐Ｙ２８８；２）グルカゴンＹ‐１４４；３）グルカゴン‐Ｙ７２；および４）グルカゴン‐Ｙ３６である。本結果は、ＸＴＥＮ部分の長さの増大に伴う見かけの分子量の増大を示す。
【図３６】図３６は、天然ＦＩＸの部分と、天然ＦＶＩＩの部分と、ＥＧＦ２ドメインおよびＰｒｏドメインにわたる分子の部分に組み込まれたＡＰドメインの異なる部分を有するＦＶＩＩ‐ＦＩＸ配列複合体の部分との間の配列アラインメントを示す。凡例は、コンストラクト名を提供する。個々の配列における間隙（ダッシュ）は、ＦＩＸと相同的ではないがさもなくば連続した連結された配列のストレッチを表す。下線を付したアミノ酸は、ＦＩＸ由来の配列である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明の実施態様を説明する前に、このような実施態様が例としてのみ提供され、および本明細書に説明される本発明の実施態様に対する種々の代替物が、本発明を実施する上で採用され得ることは理解されるべきである。数多くの変法、変更、および置き換えを今や、本発明から逸脱せずに当業者は想起するであろう。
【００４６】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって普遍的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に説明されているものと類似のまたは等価の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料を下記に説明する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が統制する。加えて、材料、方法、および実施例は、説明に過ぎず、制限しているよう意図するものではない。数多くの変法、変更、および置き換えを今や、本発明から逸脱せずに当業者は想起するであろう。
【００４７】
（定義）
本明細書で使用する場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、該用語に帰する意味を有する。
【００４８】
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が別段に明確に記さない限り、複数の指示を含む。例えば、用語「１つの細胞」には、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００４９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換可能に用いられる。ポリマーは、直鎖または分岐鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得る。該用語はまた、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分との抱合などの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、Ｄ型またはＬ型の光学異性体、およびアミノ酸類似体、およびペプチド模倣体のいずれをも含むがこれらに限定されない天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸のいずれかを指す。標準的な１文字表記または３文字表記を用いて、アミノ酸を明示する。
【００５１】
用語「天然Ｌ−アミノ酸」は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）のＬ型の光学異性体形態を意味する。
【００５２】
用語配列に適用される場合および本命最初で使用される場合の用語「非天然の」は、哺乳類において見出される野生型配列または天然配列と対応する部分を有しない、該配列と相補的ではない、あるいは高い程度の相同性を有しない、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列を意味する。例えば、非天然のポリペプチドまたは断片は、好適に整列される場合、天然配列と比較して９９％以下、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、またはそれよりさらに低いアミノ酸配列同一性を共有し得る。
【００５３】
用語「親水性」おおよび「疎水性」は、物質が有する水との親和性の程度を指す。親水性物質は、水に対して強い親和性を有し、水に溶解し、水と混合し、または水によって湿潤する傾向にあるのに対し、疎水性物質は、水に溶解し、水と混合し、または水によって湿潤しない傾向にある。アミノ酸は、その疎水性に基づいて特徴付けることができる。いくつかの尺度が開発されている。一例は、Ｌｅｖｉｔｔ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （１９７６）  １０４：５９によって開発された尺度であり、Ｈｏｐｐ，  ＴＰ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  （１９８１）  ７８：３８２４に列挙されている。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミンである。特に関心対象なのは、親水性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、およびセリン、およびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。
【００５４】
「断片」は、治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保有する天然の生物活性のあるタンパク質の切り詰められた形態である。「変異体」は、生物活性のあるタンパク質の治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保有する天然の生物活性のあるタンパク質との配列相同性を有するタンパク質である。例えば、変異体タンパク質は、生物活性のある基準タンパク質と比較して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を共有し得る。本明細書で使用する場合、用語「生物活性のあるタンパク質部分」には、例えば、位置指定突然変異誘発、挿入によって故意に、または突然変異によって偶発的に修飾されたタンパク質を含む。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「内部ＸＴＥＮ」は、凝固因子の配列に挿入されたＸＴＥＮ配列を指す。内部ＸＴＥＮは、凝固因子の２つの隣接するアミノ酸もしくはドメインによって、またはこの場合ＸＴＥＮが凝固因子の部分的な内部配列を置き換えることによってのいずれかによるＦＩＸもしくはＦＶＩＩなどの凝固因子の配列へのＸＴＥＮ配列の挿入によって構築されることができる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「末端ＸＴＥＮ」は、凝固因子のＮ末端もしくはＣ末端に融合したもしくは該末端において融合した、または凝固因子のＮ末端もしくはＣ末端におけるタンパク質分解性開裂配列と融合したＸＴＥＮ配列を指す。末端ＸＴＥＮは、凝固因子の天然末端に融合することができる。あるいは、末端ＸＴＥＮは、凝固因子の末端配列を置き換えることができる。
【００５７】
用語「ＸＴＥＮ放出部位」は、哺乳類プロテアーゼによって認識および開裂することができるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質における配列を指し、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質からのＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの一部の放出を有効にする。本明細書で使用する場合、「哺乳類プロテアーゼ」は、哺乳類の体液、細胞、または組織に通常存在するプロテアーゼを意味する。ＸＴＥＮ放出部位は、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ‐２、ＭＭＰ‐１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ‐１７、ＭＭＰ‐２０、または凝固事象の間に存在する任意のプロテアーゼなどの種々の哺乳類プロテアーゼ（別名「ＸＴＥＮ放出プロテアーゼ」）によって開裂されるよう操作されることができる。
【００５８】
本明細書で提供されるＣＦＸＴＥＮポリペプチドの形態（複数可）に適用される場合の「活性」は、天然凝固因子の生物活性の保有を指し、この場合、「生物活性」は、インビトロもしくはインビボでの生物学的な機能もしくは効果を指し、これには、受容体もしくはリガンドのいずれかの結合、酵素活性、または凝固因子について当該技術分野で一般的に公知の凝固に及ぼす効果を含む、
本明細書で提供されるＣＦＸＴＥＮポリペプチドの形態（複数可）に適用される場合の「治療効果」は、ヒトもしくは他の動物における疾患もしくは容態の治癒、緩和、逆転、寛解、もしくは予防を含むがこれらに限定されない生理学的効果、またはさもなければヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を指す。「治療有効量」は、疾患もしくは容態（例えば、出血症状）の症状を予防、軽減、逆転、もしくは寛解させるのに、または治療途中の対象の生存を長期化させるのに有効な化合物の量を指す。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力内に十分にある。
【００５９】
「宿主細胞」には、対象ベクターについての受け手であり得るまたは受け手であった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫を含む。子孫は、天然の、偶発的な、または故意の突然変異により、元の親細胞と（全ＤＮＡ相補体の形態においてまたはゲノムにおいて）必ずしも完全に同一でなくてよい。宿主細胞には、本発明のベクターをインビボで形質移入された細胞を含む。
【００６０】
「単離された」は、本明細書で開示された種々のポリペプチドを説明するのに使用する場合、その天然環境の成分から同定ならびに分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の混入物質成分は、ポリペプチドについての診断用途または治療用途に典型的に干渉するであろう材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質を含み得る。当業者に明らかなように、非天然のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、その天然の対応物と区別するために「単離」を必要としない。加えて、「濃縮され」、「分離され」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片は、容積あたりの分子の濃度または数がその天然の対応物のものよりも一般的に大きいという点で、その天然の対応物と区別することができる。一般に、組換え手段によって作製され、宿主細胞において発現したポリペプチドは、「単離され」ていると考えられる。
【００６１】
「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする核酸または他のポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸の天然源において、同定され、通常会合している少なくとも１つの混入物質核酸分子から分離された核酸分子である。ポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、天然に見出される形態または設定以外である。ポリペプチドをコードする単離された核酸分子はそれゆえ、天然の細胞に存在する場合、ポリペプチドをコードする具体的な核酸分子とは区別される。しかしながら、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子には、例えば核酸分子が天然の細胞のものとは異なる染色体位置もしくは染色体外位置にあるポリペプチドを普通発現する細胞に含
まれる、ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００６２】
「キメラ」タンパク質は、配列において天然に生じるものとは異なる位置における領域を含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。領域は通常、別個のタンパク質に存在し得、融合ポリペプチドにおいて互いにもたらされ；または同じタンパク質に通常存在し得るが、融合ポリペプチドにおいて新たな配置に配置される。キメラタンパク質は例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関連性においてコードされるポリヌクレオチドを作製および翻訳することによって作製され得る。
【００６３】
「抱合した」、「連結された」、「融合した」、および「融合」は、本明細書で互換可能に用いられる。これらの用語は、化学的抱合または組換え手段を含むどんな手段によっても、２つ以上の化学元素または化学的成分の互いに接合を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に作用可能に連結される。一般的に、「作用可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、読み取り相またはフレーム内にあることを意味する。「フレーム内融合」は、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を接合して、元のＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する様式で連続したより長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、結果として生じる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに相応する２つ以上のセグメント（該セグメントは天然では通常そのように接合していない）を含む単一のタンパク質である。
【００６４】
ポリペプチドの文脈において、「直鎖配列」または「配列」は、配列において互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続しているアミノ末端からカルボキシル末端への方向におけるポリペプチドのアミノ酸の順序である。「部分配列」は、一方向または両方向において追加的な残基を含むことが公知であるポリペプチドの一部の直鎖配列である。
【００６５】
「異種性の」とは、比較されている実体の残りとは遺伝子型として異なる実体に由来することを意味する。例えば、グリシンの豊富な配列の天然のコード配列から取り出され、天然の配列以外のコード配列に作用可能に連結されたたグリシンの豊富な配列は、異種性のグリシンの豊富な配列である。用語「異種性の」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較されている実体の残りのものとは遺伝子型として異なる実体に由来することを意味する。
【００６６】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は互換可能に用いられる。該用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、公知のまたは公知ではない任意の機能を実施し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連結分析から定義された座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの重合の前または後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分との抱合などによって、重合後にさらに修飾され得る。
【００６７】
用語「ポリヌクレオチドの相補体」は、完全な忠実度を有する基準配列とハイブリッド
形成し得るよう、基準配列と比較して相補的な塩基配列および逆方向を有するポリヌクレオチド分子を示す。
【００６８】
「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、該ポリぬｋる絵落ち度が、インビトロでのクローン化工程、制限工程および／または連結工程、ならびに宿主細胞において潜在的に発現できるコンストラクトを結果的に生じる他の手順の種々の組み合わせの産物である。
【００６９】
用語「遺伝子」および「遺伝子断片」は、本明細書で互換可能に用いられる。該用語は、転写および翻訳後に特定のタンパク質をコードすることのできる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、該ポリヌクレオチドが、全コード領域またはその断片に及び得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む限り、ゲノムまたはｃＤＮＡであり得る。「融合遺伝子」は、互いに連結される少なくとも２つの異種性ポリヌクレオチドから構成される遺伝子である。
【００７０】
「相同性」または「相同の」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の間の配列類似性または互換性を指す。ＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラムを用いて、２つの異なるアミノ酸配列間の配列の同一性、類似性、または相同性を決定する場合、デフォルト設定が用いられ得、またはｂｌｏｓｕｍ４５もしくはｂｌｏｓｕｍ８０などの適切なスコア化マトリックスを選択して、同一性、類似性、または相同性のスコアを最適化し得る。好ましくは、相同であるポリヌクレオチドは、本明細書に定義されるようなストリンジェントな条件下でハイブリッド形成し、かつ該ポリヌクレオチドの配列と比較して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、およびさらにより好ましくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。
【００７１】
「連結」は、互いに連結している２つの核酸断片または遺伝子の間のホスホジエステル結合を形成する過程を指す。ＤＮＡ断片または遺伝子を互いに連結するために、ＤＮＡの末端は、互いに適合していなければならない。いくつかの場合、末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直接適合するであろう。しかしながら、末端を連結に適合させるために、エンドヌクレアーゼ消化の後に通常生成されるねじれ型末端を平滑断端にまず変換することは必要であり得る。
【００７２】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」には、ポリヌクレオチドがその標的配列と、他の配列よりも検出可能により大きな程度まで（例えば、背景を上回る少なくとも２倍）ハイブリッド形成するであろう条件に対する引用を含む。一般的に、ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、一部、洗浄工程が実施される温度および塩濃度に関して表わされる。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０において約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であるものであり、温度は、短いポリヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いポリヌクレオチド（例えば、５０超のヌクレオチド）については少なくとも約６０℃であり、例えば、「ストリンジェントな条件」には、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリッド形成、および６０℃〜６５℃で０．１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳにおける各１５分間の３回の洗浄を含むことができる。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度を用いてもよい。ＳＳＣ濃度は、約０．１〜２×ＳＳＣで変動し得、それとともにＳＤＳは、約０．１％で存在する。このような洗浄温度は典型的には、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特異的な配列についての融点温度よりも低い約５℃〜２０℃であるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に合致した
プローブとハイブリッド形成する（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。核酸ハイブリッド形成についてのＴｍおよび条件を算出するための等式は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  Ｎ．Ｙ．において見出されることができ、具体的には、第２巻の第９章を参照されたい。典型的には、遮断試薬を用いて、非特異的ハイブリッド形成を遮断する。このような遮断試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍＬで剪断および変性したサケ精子ＤＮＡを含む。約３５〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度のホルムアミドなどの有機溶媒も、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド形成などのための特定の状況下で用いてよい。これらの洗浄条件に関する有用な変法は、当業者に容易に明らかである。
【００７３】
用語「パーセント同一性」および「％同一性」は、ポリヌクレオチド配列に適用する場合、標準化されたアルゴリズムを用いて整列した少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間の残基合致の百分率を指す。このようなアルゴリズムは、標準化され再生可能な方法で、２つの配列間の整列を最適化し、それゆえ２つの配列のより有意義な比較を達成するために比較される配列において間隙を挿入し得る。パーセント同一性は、規定された全ポリヌクレオチド配列の長さにわたって測定され得、またはより短い長さにわたって、例えば、より長い規定されたポリヌクレオチド配列から採取された断片、例えば、少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０、または少なくとも４５０の連続した残基の断片の長さにわたって測定され得る。このような長さは例示的にすぎず、本明細書、表、図、または配列リストに示される配列によって支持される任意の断片長を用いて、パーセンテージ同一性が測定され得る長さを説明し得る。
【００７４】
「パーセント（％）配列同一性」は、本明細書で同定されるポリペプチド配列に関して、必要な場合、配列および導入間隙を整列して、最大パーセント配列同一性に達した後に、第二の基準ポリペプチド配列またはその部分のアミノ酸残基と同一である問題の配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして規定されており、配列同一性の一部としての何らかの保存的置換を考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的についての整列は、当該技術分野内の種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ‐２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公共的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大の整列を達成するのに必要な何らかのアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。パーセント同一性は、規定された全長のポリペプチド配列の長さにわたって測定され得、またはより短い長さにわたって、例えばより長い規定されたポリペプチド配列から採取された断片、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なくとも１５０の連続した残基の断片の長さにわたって測定され得る。このような長さは例示的にすぎず、本明細書に、表、図、または配列リストに示される配列によって支持される任意の断片長を用いて、パーセンテージ同一性が測定され得る長さを説明し得ることは理解される。
【００７５】
用語「非反復性」は、ポリペプチドの文脈において本明細書で用いられる場合、ペプチドまたはポリペプチドの配列における内部相同性の欠失または限定された程度を指す。用語「実質的に非反復性の」は例えば、同一のアミノ酸種類であるか、または（後掲に定義される）１０以下のサブシーケンススコアを有するか、またはポリペプチド配列を構成する配列モチーフのＮ末端からＣ末端への順序にパターンが存在しない、配列における４つの連続したアミノ酸のうちの数個あるかまたはまったくないことを意味することができる。用語「反復性」は、ポリペプチドの文脈で本明細書において用いられる場合、ペプチド
またはポリペプチドの配列における内部相同性の程度を指す。対照的に、「反復性の」配列は、短いアミノ酸配列の複数の同一コピーを含み得る。例えば、関心対象のポリペプチド配列は、ｎマーの配列に分割され得、同一の配列の数が計数できる。高度に反復性の配列は、同一の配列の大きな画分を含むのに対し、非反復性配列は、数個の同一の配列を含む。ポリペプチドの文脈において、配列は、規定されたまたは可変の長さのより短い配列の複数のコピー、あるいはモチーフ自体が非反復性配列を有し、全長のポリペプチドを実質的に非反復性にするモチーフを含むことができる。非反復性が測定されるポリペプチドの長さは、３アミノ酸〜約２００アミノ酸、約６〜約５０アミノ酸、または約９〜約１４アミノ酸で変動することができる。ポリヌクレオチド配列の文脈で用いられる「反復性」は、例えば、所与の長さの同一のヌクレオチド配列の頻度など、配列における内部相同性の程度を指す。反復性は例えば、同一の配列の頻度を分析することによって測定することができる。
【００７６】
「ベクター」は好ましくは、挿入された核酸分子を宿主細胞へとおよび／または宿主細胞間で転移させる適切な宿主において自己複製する核酸分子である。この用語には、ＤＮＡもしくはＲＮＡの細胞への挿入のために主として機能するベクター、ＤＮＡもしくはＲＮＡの複製のために種として機能するベクターの複製、ＤＮＡもしくはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、上記の機能のうちの２つ以上を提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入される場合、ポリペプチド（複数可）へと転写および翻訳することのできるポリヌクレオチドである。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるよう機能することのできる発現ベクターから構成される好適な宿主細胞を意味する。
【００７７】
「血清分解耐性」は、ポリペプチドに適用される場合、血液またはその構成要素における、血清または血漿中のプロテアーゼを典型的に包含する分解に耐えるポリペプチドの能力を指す。血清分解耐性は、タンパク質をヒト（または適宜、マウス、ラット、サル）血清または血漿と、ある範囲の日数の間（例えば、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日間）、典型的には約３７℃で組み合わせることによって測定することができる。これらの時点についての試料をウェスタンブロットアッセイに供することができ、タンパク質を抗体で検出する。抗体は、タンパク質におけるタグとなり得る。タンパク質がウェスタンにおいて単一のバンドを示し、タンパク質のサイズが、注射されたタンパク質のものと同一である場合、分解は生じていない。この例示的な方法において、タンパク質の５０％が分解される時点は、ウェスタンブロットまたは等価の技術によって判断される場合、該タンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
【００７８】
用語「ｔ１／２」は、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして算出される終末半減期を意味する。Ｋｅｌは、対数濃度の末端直線部分と時間曲線との線形回帰によって算出される末端除去速度定数である。半減期は典型的には、生体に沈積した投与された物質の量の半分が、正常な生物学的プロセスによって代謝または除去されるのに必要な時間を指す。用語「ｔ１／２」、「終末半減期」、「除去半減期」、および「循環半減期」は、本明細書で互換可能に用いられる。
【００７９】
「能動的クリアランス」は、ＣＦが濾過または凝固以外によって循環から除去され、かつ細胞、受容体、代謝、またはＣＦの分解によって仲介される循環からの除去を含む機序を意味する。
【００８０】
「見かけの分子量因子」および「見かけの分子量」は、特定のアミノ酸配列によって呈される見かけの分子量の相対的な増加または減少の測定単位を指す関連用語である。見かけの分子量は、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）および類似の方法を用いて、球状タンパク質標準物質と比較して決定され、「見かけのｋＤ」単位で測定される。見かけ
の分子量因子は、見かけの分子量と実際の分子量の間の比であり；後者は、アミノ酸組成に基づいて、組成物中のアミノ酸の各種類に関して算出された分子量を加算することによって、またはＳＤＳ電気泳動ゲルにおける分子量標準物質との比較からの概算によって推定される。
【００８１】
用語「水力学的半径」または「Ｓｔｏｋｅｓ半径」は、溶液を通じて移動する本体であるという仮説を立てることによって測定され、かつ溶液の粘度によって抵抗される溶液中の分子の有効半径（ｎｍにおけるＲｈ）である。本発明の実施態様において、ＸＴＥＮ融合タンパク質の水力学的半径の測定基準は、より直観的な測定基準である「見かけの分子量因子」と相関する。タンパク質の「水力学的半径」は、その水溶液中での拡散速度およびマクロ分子のゲルでの移動能力に影響を及ぼす。タンパク質の水力学的半径は、その分子量によって、ならびに形状およびコンパクトさを含めたその構造によって決定される。水力学的半径を決定するための方法は、米国特許第６，４０６，６３２号および第７，２９４，５１３号において説明されるような分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用によるなど、当該技術分野において周知である。たいていのタンパク質は、タンパク質が最小の水力学的半径を有することのできる最もコンパクトな三次元構造である球状構造を有する。いくつかのタンパク質は、不揃いで開いた、構造化されていない、または「直鎖状の」立体配座を採用し、結果として、類似の分子量の典型的な球状タンパク質と比較して非常により大きな水力学的半径を有する。
【００８２】
「生理学的条件」は、生体の条件を模倣する、温度、塩濃度、ｐＨを含めた生体宿主における１セットの条件およびインビトロでの条件を指す。インビトロでのアッセイにおける使用についての生理学的に関連性のある条件の宿主が確立されている。一般的に、生理学的緩衝液は、生理学的な塩濃度を含んでおり、約６．５〜約７．８、好ましくは約７．０〜約７．５に及ぶ中性ｐＨに調整される。種々の生理学的緩衝液は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）に列挙されている。生理学的に関連性のある温度は、約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３５℃〜約３７℃に及ぶ。
【００８３】
「反応基」は、第二の反応基に共役することのできる化学構造である。反応基の例は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基である。いくつかの反応基を活性化して、第二の反応基との共役を促進することができる。活性化についての非限定例は、カルボキシル基のカルボジイミドとの反応、カルボキシル基から活性化型エステルへの変換、またはカルボキシル基からアジド機能への変換である。
【００８４】
「徐放薬」、「遅延放出薬」、「デポー製剤」、および「持続放出薬」は、本発明のポリペプチドが薬剤の不在下で投与される場合、放出の持続時間に対して該ポリペプチドの放出の持続時間を延長させることのできる薬剤を指すために互換可能に用いられる。本発明の異なる実施態様は、異なる治療量を結果として生じる異なる放出速度を有してよい。
【００８５】
用語「抗原」、「標的抗原」、および「免疫原」は、抗体断片または抗体断片ベースの治療薬が結合しまたは特異性を有する構造または結合決定因子を指すために本明細書で互換可能に用いられる。
【００８６】
用語「負荷量」は、本明細書で使用する場合、生物活性または治療活性を有するタンパク質またはペプチドの配列；小分子のファルマコフォアに対する対応物を指す。負荷量の例には、サイトカイン、酵素、ホルモンおよび血液、ならびに増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。負荷量はさらに、化学治療薬、抗ウイルス化合物、毒素、または造影剤などの遺伝子融合したまたは化学的に抱合した部分を含むことができる。これらの抱合した部分は、開裂可能または開裂不可能であり得るリンカーを介して、ポリペプチド
の残りに接合することができる。
【００８７】
用語「アンタゴニスト」は、本明細書で使用する場合、本明細書に開示される天然ポリペプチドの生物活性を部分的にもしくは完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、天然ポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させることと、該天然ポリペプチドと通常関連した１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。本発明の文脈において、アンタゴニストには、生物活性のあるタンパク質の効果を低下させるタンパク質、核酸、炭水化物、抗体、または任意の他の分子を含み得る。
【００８８】
用語「アゴニスト」は、最も広範な意味で用いられ、本明細書に開示される天然ポリペプチドの生物活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子は、天然のポリペプチド、ペプチド、小有機分子当のアゴニスト抗体または抗体断片、断片、もしくはアミノ酸配列バリアントを特異的に含む。天然ポリペプチドのアゴニストを同定するための方法は、天然ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させることと、天然ポリペプチドと通常関連した１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。
【００８９】
本明細書における目的のための「活性」は、相応する天然の生物活性のあるタンパク質のものと一致する融合タンパク質の構成要素の作用または効果を指し、この場合、「生物活性」は、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、または細胞レベルの応答もしくは生理学的応答を含むがこれらに限定されないインビトロまたはインビボでの生物学的機能または効果を指す。
【００９０】
本明細書で使用する場合、「治療」もしくは「治療すること」、または「緩和すること」または「寛解させること」は、本明細書で互換可能に用いられる。これらの用語は治療上の有益性および／または予防上の有益性を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の有益性によって意味されるのは、治療途中の潜在的な障害の根絶または寛解である。また、治療上の有益性は、対象がなおも潜在的な障害に苦しめられ得るにもかかわらず、改善が対象において観察されるよう、潜在的な障害と関連した１つ以上の生理学的症状の根絶または寛解にともない達成される。予防的な有益性のために、組成物は、特定の疾患を発症させる危険にある対象に、または疾患（この疾患の診断はなされていなくてもよい）の１つ以上の生理学的症状を報告している対象に投与され得る。
【００９１】
「治療効果」は、本明細書で使用する場合、生物活性のあるタンパク質によって所有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、本発明の融合ポリペプチドによって生じる、ヒトまたは他の動物における疾患の治癒、緩和、寛解、または予防、あるいはさもなくば、ヒトまたは動物の身体的または精神的健康を高めることを含むがこれらに限定されない生理学的効果を指す。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示の観点で、当業者の能力内に十分にある。
【００９２】
用語「治療有効量」および「治療有効用量」は、本明細書で使用する場合、対象に単回用量または反復用量で投与されると、任意の症状、局面、測定されるパラメータ、または疾患状態もしくは容態の特徴に及ぼす何らかの検出可能な有益な効果を有することのできる、単独でのまたは融合タンパク質組成物の一部としてのいずれかの生物活性のあるタンパク質の量を指す。このような効果は、有益であることが絶対的である必要はない。
【００９３】
用語「治療有効用量投与計画」は、本明細書で使用する場合、単独でまたは融合タンパク質組成物の一部としてのいずれかで、生物活性のあるタンパク質の連続的に投与される複数回用量（すなわち、少なくとも２回以上）についてのスケジュールを指し、この場合
、用量は、任意の症状、局面、測定されるパラメータ、または疾患状態もしくは容態の特徴に及ぼす持続された有益な効果を結果的に生じるために治療有効量で与えられる。
【００９４】
（Ｉ）．一般的な技術）
本発明の実施は、別段の記載がない限り、当該技術分野の技術内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、および組換えＤＮＡに関する従来技術を採用する。それらの内容がすべて引用により本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１；  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，１９８７；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．；  “ＰＣＲ  ２：    ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｐｐｒｏａｃｈ”，  Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９５；    “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；  “Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”  １１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ２００５；  ａｎｄ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，  “Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，  ＮＪ，  ２０００を参照されたい。
【００９５】
（ＩＩ）．凝固因子）
本発明は、凝固因子（ＣＦ）を含む融合タンパク質組成物に一部関する。本明細書で使用する場合、「凝固因子」または「ＣＦ」は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、ＦＶＩＩおよびＦＩＸの配列組み合わせ、またはそれらの模倣体、配列バリアント、および切り詰められたバージョンを指す。
【００９６】
（（ａ）第ＩＸ因子）
「第ＩＸ因子」または「ＦＩＸ」は、凝固因子タンパク質ならびにそれらの種および配列バリアントを意味し、ヒトＦＩＸ前駆体ポリペプチド（「プレプロ」）の４６１の一本鎖アミノ酸配列および成熟ヒトＦＩＸの４１５の一本鎖アミノ酸配列を含むがこれらに限定されない。ＦＩＸには、血液凝固因子ＩＸの典型的な特徴を有する第ＩＸ分子の任意の形態を含む。本明細書で使用する場合、「第ＩＸ因子」および「ＦＩＸ」は、Ｇｌａドメイン（γ−カルボキシグルタミン酸残基を含む領域）、ＥＧＦ１ドメインおよびＥＧＦ２ドメイン（ヒト表皮増殖因子に相同の配列を含む領域）、活性化ペプチドドメイン（成熟ＦＩＸの残基Ｒ１３６〜Ｒ１８０によって形成）、ならびにＣ末端プロテアーゼドメイン（「Ｐｒｏ」）、または当該技術分野で公知のこれらのドメインの同義語を含む、あるいはこの天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保有する切り詰められた断片または配列バリアントであり得る、ポリペプチドを包含するよう意図される。ＦＩＸまたは配列バリアントは、米国特許第４，７７０，９９９号、第７，７００，７３４号に説明されるようにクローン化されており、ヒト第ＩＸ因子をコードするｃＤＮＡは単離され、特徴づけられ、発現ベクターへとクローン化されている（例えば、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９９：１７８−１８０  （１９８２）；  Ｆａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ６４：１９４−２０４  （１９８４）；  ａｎｄ  Ｋｕｒａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７９：６
４６１−６４６４  （１９８２）参照）。
【００９７】
ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、ｑ２７．１においてＸ染色体に存在する単一コピー遺伝子によってコードされる。ヒトＦＩＸのｍＲＮＡは、５’非翻訳領域のための２０５塩基、プレプロ第ＩＸ因子のための１３８３塩基、終止コドン、および３’非翻訳領域のための１３９２塩基から構成される。ＦＩＸポリペプチドは、５５ｋＤａであり、３つの領域：２８アミノ酸からなるシグナルペプチド、１８アミノ酸からなり、グルタミン酸残基のガンマ‐カルボキシル化に必要とされるプロペプチド、および４１５アミノ酸からなる成熟第ＩＸ因子から構成されるプレプロポリペプチドとして合成される。プロペプチドは、ガンマ‐カルボキシグルタミン酸ドメインに対してＮ末端の１８アミノ酸残基配列である。プロペプチドは、ビタミンＫ依存性ガンマカルボキシラーゼを結合し、次に内在性プロテアーゼ、最も有望な、フリンもしくはＰＣＳＫ３としても公知のＰＡＣＥ（対形成した塩基性アミノ酸の開裂酵素）によってＦＩＸの前駆体ポリペプチドから開裂する。ガンマカルボキシル化がないと、Ｇｌａドメインは、負に帯電したリン脂質表面にタンパク質をつなぎとめるのに必要な正確な立体配座を想定するためにカルシウムを結合することができず、それにより第ＩＸ因子は無機能性となる。カルボキシル化された場合でさえ、Ｇｌａドメインはまた、適切な機能のためのプロペプチドの開裂に依存しており、その理由として、保有されたプロペプチドが、カルシウムおよびリン脂質に対する最適な結合に必要なＧｌａドメインの立体配座変化に干渉するからである。ヒトにおいて、結果として生じる成熟第ＩＸ因子は、肝細胞によって血流へと、およそ１７重量％の炭水化物を含む４１５アミノ酸残基の一本鎖タンパク質である不活性化型酵素前駆体として分泌される（Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ａ．  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ，  １３：  ３９）。成熟第ＩＸ因子は、Ｎ末端からＣ末端への構造において、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメイン、およびプロテアーゼ（または触媒）ドメインであるいくつかのドメインから構成される。ＦＩＸは、Ｒ１４５‐Ａ１４６およびＲ１８０‐Ｖ１８１によってそれぞれ形成される２つの活性化ペプチドを含む。活性化後、一本鎖ＦＩＸは二本鎖分子となり、その中で、２つの鎖が該酵素をＧｌａドメインに付着させるジスルフィド結合によって連関される。ＣＦは、変化した活性化特異性を結果的に生じることによって、これらの活性化ペプチドを置き換えることによって操作することができる。哺乳類において、成熟ＦＩＸは、活性化された第ＸＩ因子によって活性化されて、第ＩＸａ因子を生じなければならない。プロテアーゼドメインは、ＦＩＸからＦＩＸａへの活性化の際に、ＦＩＸの触媒活性を提供する。活性化された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）は、ＦＩＸａ活性の完全な発現に特異的な補助因子である。
【００９８】
凝固に関与するタンパク質には、第Ｉ因子、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第ＩＶ因子、第Ｖ因子、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロテインＣ、および組織因子（「凝固タンパク質」）が挙げられる。凝固タンパク質の大部分は、活性化されると凝固前駆体プロテアーゼ活性を呈して、他の凝固タンパク質を活性化する酵素前駆体形態に存在し、内在性または外来性の凝固経路および凝固形成に貢献する。凝固カスケードの内在性経路において、ＦＩＸは、活性化された第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、カルシウム、およびリン脂質の複合体と会合する。該複合体において、ＦＩＸは、第Ｘｉａ因子によって活性化される。第ＩＸ因子の活性化は、該分子からの活性化ペプチド（Ａｌａ１４６〜Ａｒｇ１８０）の２工程除去によって達成される（Ｂａｊａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ，  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ．  １９９３）。第一の開裂は、第Ｘｉａ因子又は第ＶＩＩａ因子／組織因子のいずれかによって、Ａｒｇ１４５‐Ａｌａ１４６においてなされる。第二のおよび律側開裂は、Ａｒｇ１８０‐Ｖａｌ１８１においてなされる。活性化は３５残基を除去する。活性化されたヒト第ＩＸ因子は、Ｃ末端重鎖（２８ｋＤａ）およびＮ末端軽鎖（１８ｋＤａ）
のヘテロ二量体として存在し、該鎖は、酵素をＧｌａドメインに付着させる１つのジスルフィド架橋によって互いに保持される。第ＩＸａ因子は順に、活性化された第ＶＩＩＩ因子と協調して第Ｘ因子を活性化させる。あるいは、第ＩＸ因子および第Ｘ因子は両方とも、外来性経路を介して生じた脂質付加された組織因子と複合体形成した第ＶＩＩａ因子によって活性化されることができる。次に、第Ｘａ因子は、最終的な共通経路に参加し、それによりプロトロンビンはトロンビンに変換され、トロンビンは順にフィブリノーゲンをフィブリンに変換して、凝固を形成する。
【００９９】
凝固プロセスにおける欠陥は、凝固形成にかかる時間が延長する出血障害をもたらすことができる。このような欠陥は、先天性または後天性であり得る。例えば、血友病Ａおよび血友病Ｂはそれぞれ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）およびＦＩＸの欠乏を特徴とする遺伝性疾患である。組換えタンパク質として一般的に調製されたこれらのタンパク質との置き換え療法は、血友病Ｂ（クリスマス病）および第ＩＸ因子関連出血障害の治療介入において用いてよい。第ＩＸ因子は、両容態の治療において用いることができる。しかしながら、いくつかの場合、患者は、治療の有効性を低下または無効にする、投与されたタンパク質に対する抗体を発生させる。
【０１００】
本発明は、ＦＩＸ配列と相同性を有するＣＦＸＴＥＮ組成物におけるＦＩＸ配列、ヒト、非ヒト霊長類、哺乳類（家畜動物を含む）などに由来する天然の配列断片、ならびにＦＩＸの生物活性または生物学的機能の一部を保有しおよび／または凝固因子と関連した疾患、欠乏症、障害、または容態（例えば、外傷、手術と関連した、凝固因子の欠乏症に関する出血症状）を予防、治療、仲介、または寛解させるのに有用な非天然配列バリアントの包含を熟慮する。ヒトＦＩＸと相同性を有する配列は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴなど、標準的な相同性検索技術によって見出すことができる。
【０１０１】
一実施態様において、対象の組成物に組み込まれたＦＩＸは、天然に見出されるタンパク質に相応する配列を有する組換えポリペプチドである。別の実施態様において、ＦＩＸは、相応の天然ＦＩＸの生物活性の少なくとも一部を保有する天然配列の配列バリアント、断片、ホモログ、または模倣体である。表１は、本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質によって包含されるＦＩＸのアミノ酸配列に関する非限定的なリストを提供する。融合タンパク質組成物に組み込まれるべき任意のＦＩＸ配列または相同的な誘導体は、表１のアミノ酸配列間の個々の突然変異をシャッフリングすることによって構築され、かつ活性について評価されることができる。天然ＦＩＸの生物活性の少なくとも一部を保有するモノは、本発明の融合タンパク質組成物に有用である。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込めるＦＩＸには、表１から選択されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性またはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質が挙げられる。
【０１０２】
【表１−１】
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【０１０３】
【表１−２】
2013502459.tif 000002
【０１０４】
【表１−３】
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（（ｂ）第ＶＩＩ因子）
「第ＶＩＩ因子」または「ＦＶＩＩ」は、凝固因子のタンパク質および種ならびにその配列バリアントを意味し、ヒトＦＶＩＩの４０６の一本鎖アミノ酸配列ならびに前駆体タンパク質の４４４のアミノ酸配列の不活性型および活性化型（相反する性質に対して別段の記載がない限り）の両方を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用する場合、第ＶＩＩ因子およびＦＶＩＩは、Ｇｌａドメイン（γ‐カルボキシグルタミン酸残基を含む領域）、ＥＧＦ１ドメインおよびＥＧＦ２ドメイン（ヒト表皮増殖因子と相同の配列を含む領域）、ＥＧＦ２ドメインとＰｒｏドメインの間の配列にわたる活性化ペプチドドメイン、ならびに触媒ドメインまたはペプチドダーゼＳ１ドメイン（セリンプロテアーゼ触媒三連構造）、あるいは当該技術分野で公知のこれらのドメインの同義語を含むポリペプチドを包含するか、あるいは天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保有する切りつめられた断片または配列バリアントであり得る。肝臓によって産生されるビタミンＫ依存性血漿タンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）はまず、酵素前駆体として血中で循環する。第ＶＩＩ因子の主要な役割は、組織因子（ＴＦ）とともに凝固の過程を開始することである。血管の損傷の際に、組織因子は血液に曝露され、第ＶＩＩ因子を循環させる。一旦、ＴＦに結合すると、ＦＶＩＩは、異なるプロテアーゼによって第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）の活性化型となるよう活性化され、これには、トロンビン（第ＩＩａ因子）、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩＩａ因子、およびＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体自体がある。ＦＶＩＩ酵素前駆体は、単一の部位であるＡｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３におけるタンパク質分解性開裂によって活性化され、単一のジスルフィド結合によって連結される二本鎖プロテアーゼを結果的に生じる。ＦＶＩＩａは、その補助因子である組織因子（ＴＦ）を結合して、第Ｘ因子（ＦＸ）をＦＸａに活性化することのできる複合体を形成し、それにより、フィブリン形成および止血を結果として生じる凝固カスケードを惹起する。ヒト第ＶＩＩ因子についての完全なヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は公知であり、ヒトＦＶＩＩまたは配列バリアントは米国特許第４，７８４，９５０号、第５，８３３，９８２号、第６９１１３２３号、および第７，０２６，５２４号に説明される通りクローン化されている。
【０１０５】
第ＶＩＩ因子の現行の治療的使用は存在するが、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、または第ＩＸ因子の欠乏を呈する個体およびフォンヴィレブランド病を有する個体のＦＶＩＩａ製剤による治療において問題となり得る。より具体的には、補充療法における第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を受容する個体は、これらのタンパク質に対する抗体を発生させる。持続的な治療は、これらの抗体の存在のために、非常に困難である。この問題を経験している患者は通常、第ＶＩＩａ因子を含む活発なおよび活発でない凝固酵素の混合物からなることが公知の活性化型プロトロンビン複合体により治療される。また、ＦＶＩＩは、外傷など、制御されていない出血の治療と関連して利用され、この活性化反応は、活性化型血小板に関して主として生じると考えられている（Ｈｅｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ＆  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，  ２０００；１１；１０７−１１１）。
【０１０６】
第ＶＩＩ因子の配列バリアントは、野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じ生物活性を呈しようとより良好な生物活性を呈しようと、またはそれに代わるものとして、野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に修飾された生物活性を呈しようと低下した生物活性を呈しようと、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このようなＦＶＩＩバリアントは、当該技術分野で公知であり、引用により本明細書に組み込まれている米国特許および出願第６，９６０，６５７号、第７，１７６，２８８号、第７４１４０２２号、第７，７００，７３３号、第２００６０２０５０３６Ａ１号、第２００８０３１８２７６Ａ１号、および第２００９００１１９９２Ａ１号に説明されるものを含む。
【０１０７】
組換えＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害剤を有する血友病Ａまたは血友病Ｂの患者の治療のために認可されており、また、外傷および／または手術と関連した、出血症状を停止するために、または出血を予防するために用いられる。また、組換えＦＶＩＩａは、後天的ＦＶＩＩ欠乏を有する患者の治療のために認可されており、血友病患者および非血友病患者における他の後天的または後天的な出血性の障害、外傷、および手術と関連した出血の治療など、適用外使用においてますます利用されている。
【０１０８】
本発明は、ＣＦ関連の疾患、欠乏症、障害、または容態を予防、治療、仲介、または寛解させるのに有用なＦＶＩＩａの生物活性または生物学的機能の少なくとも一部を保有するＦＶＩＩ配列、配列断片、模倣体、および非天然配列バリアントに対する相同性を有する配列をＣＦＸＴＥＮ組成物に包含することを熟慮する。加えて、ＦＶＩＩを含むＣＦＸＴＥＮの比較的長い半減期のため、哺乳類内在性プロテアーゼ（下記でより完全に説明）によって活性化することのできる、または自己活性化を経験することのできるＦＶＩＩの不活性型を含む組成物は、本質的にＦＶＩＩの「プロドラッグ」形態であるものを用いた、ある形態の慢性凝固障害を有する対象を治療する手段を表す。表２は、本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質によって包含されるＦＶＩＩの配列のリストを提供する。天然のＣＦの生物活性の少なくとも一部を保有する種間またはファミリー間の個々の突然変異をシャッフリングすることによって構築されるＦＶＩＩ配列または相同の誘導体は、本発明の融合タンパク質に有用である。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込めるＦＶＩＩには、表２から選択される配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を呈するタンパク質を含む。
【０１０９】
【表２−１】
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【０１１０】
【表２−２】
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【０１１１】
【表２−３】
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（ＩＩＩ）凝固因子融合タンパク質組成物）
本発明は、凝固因子（ＣＦ）を含む融合タンパク質組成物を提供する。治療用タンパク質の循環半減期を延長させる１つの方法は、タンパク質の腎クリアランスを低下させることである。このことは、増大した分子サイズ（または水力学的半径）をタンパク質に与えることのできる、それゆえ腎クリアランスを低下させるポリマーに対してタンパク質を抱合することによって達成され得る。したがって、本発明の１つの目的は、より長い循環または終末半減期を有し、天然凝固因子の活性の少なくとも一部を保有する改良したＦＩＸまたはＦＶＩＩ（またはＦＶＩＩａ）分子を提供することであり（それにより、必要な投与回数を低下させる）、そのことが、それにより凝固欠乏および制御されていない出血をより効率的に治療することである。一態様において、本発明は、伸長した組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」または「ＸＴＥＮ類」）に共有結合したＦＩＸまたはＦＶＩＩなどのＣＦの全長の配列または配列バリアントを含むＣＦの単離された単量体融合タンパク質を提供する。下記でより完全に説明されるように、融合タンパク質には任意に、プロテアーゼによって作用される場合、融合タンパク質からＣＦを放出する開裂配列をさらに含むスペーサー配列を含む。
【０１１２】
一態様において、本発明は、１つ以上の伸長した組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）に共有結合した少なくとも１つの第一の生物活性のある凝固因子タンパク質を含む単離された融合タンパク質を提供し、それにより、融合タンパク質組成物（以後、「ＣＦＸＴＥＮ」）を結果的に生じる。用語「ＣＦＸＴＥＮ」は、本明細書で使用する場合、凝固因子と関連する１つ以上の生物活性または治療活性を仲介する生物活性のあるＣＦを各々含む１つ以上の負荷量領域と、担体として機能する少なくとも１つの第一のＸＴＥＮポリペプチドを含む少なくとも１つの他の領域とを含む、融合ポリペプチドを包含するよう意味される。一実施態様において、凝固因子は、先に開示されるように、ＦＩＸまたはＦＩＸの配列バリアントである（表１の配列と相同性のある配列を含む）。別の実施態様において、凝固因子はＦＶＩＩであり、これには、先に開示されるように、ＦＶＩＩの活性化型、またはＦＶＩＩの配列バリアントを含むことができる（表２の配列と相同性のある配列を含む）。ＦＶＩＩを含む本発明のＣＦＸＴＥＮ組成物の場合、ＦＶＩＩ成分の活性化は、自己活性化によって、またはＯｓｔｅｒｕｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：２８５３−２８５７  （１９７２）；  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，４５６，５９１；  Ｈｅｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｓｉｅｌ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７１：１８３６−１８４１  （１９８３）；  もしくはＫｉｓｉｅｌ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｋａｗａ，  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．  Ｍｉｔｔ．  ７３：２９−４２  （１９８３）によって開示されるものなど、当該技術分野で公知の手順
に従って、活性化型第Ｘ因子への曝露によって実施され得る。あるいは、第ＶＩＩ因子は、Ｍｏｎｏ  Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）または類似のクロマトグラフィー樹脂など、イオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｂｊｏｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ  （１９８６）  ２６９：５６４−５６５参照）に通過させることによって活性化することができる。
【０１１３】
対象の組成物のＣＦ、特に表１および表２に開示されているものは、それらの相応する核酸およびアミノ酸配列とともに当該技術分野で周知であり、説明および配列は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）、およびＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）等の署名の提供されるデータベースなどの公共のデータベースにおいて入手可能である。ポリヌクレオチド配列は、所与のＣＦ（例えば、全長または成熟のいずれか）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であり得、またはいくつかの場合、配列は、野生型ポリヌクレオチド配列のバリアント（例えば、野生型の生物活性のあるタンパク質をコードするポリヌクレオチド）（この場合、ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は、例えば特定の週における発現のために最適化されている）；または位置指定突然変異体もしくは対立遺伝子バリアントなど、野生型タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドであり得る。ＣＦの野生型配列もしくは共通ｃＤＮＡ配列またはコドンの最適化されたバリアントを用いて、本発明によって熟慮されるＣＦＸＴＥＮコンストラクトを、当該技術分野で公知の方法を用いておよび／または本明細書に提供されるガイダンスおよび方法と関連して作製することは、当業者の能力内に十分あり、実施例においてより完全に説明される。
【０１１４】
本発明のＣＦＸＴＥＮに含まれるためのＣＦには、対象に投与する場合、出血障害、凝固因子における凝固因子欠乏、または凝固因子における欠損と関連した疾患、障害、もしくは容態を仲介または予防または寛解させるのに有用な凝固因子または配列バリアントを含む。特に関心対象なのは、天然ＣＦと比較しての薬物動態パラメータの増大、増大した溶解度、増大した安定性、または増大したいくつかの他の医薬特性が選択され、あるいは終末半減期を延長することが有効性、安全性を改良し、または低下した投薬頻度を結果として生じ、および／もしくは患者の服薬順守を改良する、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物である。したがって、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、対象に投与した場合、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較すると、例えば、インビボでの曝露、または治療ウィンドウ内にＣＦＸＴＥＮがとどまる長さを増大させることによって、生理活性のあるＣＦの治療有効性を改良することを含む、種々の目的を考慮して調製される。
【０１１５】
一実施態様において、対象の組成物に組み込まれたＣＦは、天然に見出されるタンパク質に相応する配列を有する組換えポリペプチドであり得る。別の実施態様において、ＣＦは、天然のＣＦの生物活性の少なくとも一部を保有する天然の配列の配列バリアント、断片、ホモログ、または模倣体である。非限定例において、ＣＦは、表１からまたは表２から選択されたタンパク質配列と少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは少なくとも約９９％、もしくは１００％の配列同一性を呈する配列である。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、単一のＸＴＥＮ（例えば、下記により完全に説明されるようなＸＴＥＮ）に連結された単一のＣＦ分子を含む。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、第一のＣＦと同じＣＦの第二の分子とを含み、結果的に、表６から選択されたＮ末端からＣ末端への立体配置における１つ以上のＸＴＥＮに連結された２つのＣＦを含む融合タンパク質を生じる。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、第一のおよび第二のＸＴＥＮに連結された単一のＣＦ分子を含み、該ＸＴＥＮに
おいて、ＣＦは、表１からまたは表２から選択されたタンパク質配列と少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは少なくとも約９９％、もしくは１００％の配列同一性を呈する配列であり、第一のおよび／または第二のＸＴＥＮは、表４から選択された配列と比較して少なくとも約８０５の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは少なくとも約９９％、もしくは１００％の配列同一性を呈する配列である。
【０１１６】
本発明の対象のＣＦＸＴＥＮは、天然のＣＦと比較して、１つ以上の薬物動態パラメータの亢進を呈する。薬物動態パラメータの亢進したＣＦＸＴＥＮは、ほとんど頻繁ではない投薬、あるいはＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較してより長い時間、最少有効用量または血中濃度（Ｃｍｉｎ）と最大許容用量または血中濃度（Ｃｍａｘ）の間の治療ウィンドウ内に生物活性のあるＣＦＸＴＥＮを維持することを含むがこれに限定されない亢進した薬理学的効果を可能にする。このような場合、選択したＸＴＥＮ配列（複数可）を含む融合タンパク質へのＣＦの連結は結果的に、該配列の特性における改良を生じることができ、該配列を、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して治療薬または予防薬としてより有用にする。いくつかの実施態様において、本発明の対象のＣＦＸＴＥＮは、ＣＦとＸＴＥＮの間に組み込まれた開裂配列を有し、ＣＦ成分の生物活性は、下記に説明されるように、内在性プロテアーゼによる開裂配列の開裂による融合タンパク質からのＣＦの放出によって亢進される。
【０１１７】
（ＩＶ）．ＸＴＥＭ付加した組換えポリペプチド）
一態様において、本発明は、ＣＦの連結された融合タンパク質パートナーとして有用なＸＴＥＮポリペプチド組成物を提供し、結果的にＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。ＸＴＥＮは一般的に、小さな親水性アミノ酸から主として構成される非天然の実質的に非反復性の配列を有する一般的に伸長した長さのポリペプチドであり、該配列は、生理学的条件下で低い程度の構造も、二次構造も三次構造も有さない。
【０１１８】
ＸＴＥＮは、「担体」として機能する融合タンパク質パートナーとしての有用性を有し、ＣＦタンパク質に連結された場合に融合タンパク質を作製するよう、ある所望の薬物動態特性、物理化学的特性、および医薬特性を与える。このような所望の特性には、本門明細書に説明される数ある特性のうち、組成物の増大した薬物動態パラメータ特徴および溶解度特徴が挙げられるが、これらに限定されない。このような融合タンパク質組成物は、本明細書に説明されるように、ある凝固因子関連性の疾患、障害、または容態を治療するための有用性を有する。本明細書で使用する場合、「ＸＴＥＮ」は具体的には、全抗体または抗体断片（例えば、一本鎖抗体およびＦＣ断片）を除外する。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮは、担体として使用する場合に約１００〜約３０００超のアミノ酸残基を、または２つ以上のＸＴＥＮ単位を単一融合タンパク質において使用する場合に、４００〜約３０００超の残基を累積的に有する長いポリペプチドである。他の実施態様において、ＸＴＥＮを融合タンパク質成分間のリンカーとして使用する場合、あるいは融合タンパク質の半減期の延長が必要ではないが、溶解度またはＣＦ融合パートナー成分についてのいくつかの他の物理／化学特性の増大が所望である場合、約９６、または約８４、または約７２、または約６０、または約４８、または約３６のアミノ酸残基など、１００アミノ酸残基よりも短いＸＴＥＮ配列が、該特性を有効にするためにＣＦを有する融合タンパク質組成物へと組み込まれる。
【０１２０】
本発明の融合タンパク質組成物を作製するために用いられる生物活性のあるタンパク質
に連結されるべきＸＴＥＮについての選択基準は一般的に、順に融合タンパク質組成物に亢進した医薬特性及び薬物動態特性を与えるために用いられるＸＴＥＮの物理／化学特性および立体配座構造の特質に関する。本発明のＸＴＥＮは、以下の有利な特性の１つ以上を呈する：立体配座の柔軟性、増大した水性溶解度、高い程度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳類受容体に対する低い結合、および増大した水力学的半径（またはＳｔｏｋｅｓ半径）；融合タンパク質パートナーとして特に有用にする特性。ＸＴＥＮによって亢進される、ＣＦを含む融合タンパク質の特性に関する非限定例には、全体的な溶解度および／または代謝安定性の増大、タンパク質分解に対する低下した感受性、低下した免疫原性、皮下または筋肉内に投与した場合の低下した吸収速度、ならびに、亢進した薬物動態特性、例えばより高い終末半減期および増大した曲線下面積、Ｃｍａｘがより低く、そのことが結果的に、対象に投与されるＣＦＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質が治療活性を保有する延長した時間を結果的に集約的に生じるＣＦの有害な効果の低下を生じるような、（ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して、かつ類似の経路によって投与される）皮下または筋肉内注射後のより遅い吸収。
【０１２１】
本発明のＸＴＥＮＭを含む組成物などのタンパク質の物理／化学特性を決定するための種々の方法およびアッセイは、当該技術分野で公知である。このような特性には、二次構造もしくは三次構造、溶解度、タンパク質凝集、有開特性、混入、および水分含有量が挙げられるが、これらに限定されない。このような方法には、分析的遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ‐イオン交換、ＨＰＬＣ‐分子ふるい、ＨＰＬＣ‐逆相、光散乱、毛細管電気泳動、円二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ‐イオン交換、ＨＰＬＣ‐分子ふるい、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折分析、およびＵＶ／可視光分光法が挙げられる。追加的な方法は、Ａｒｎａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ
（２００６）  ４８，  １−１３に開示されている。
【０１２２】
一実施態様において、ＸＴＥＮは、ポリマーの伸長した長さにもかかわらず、生理学的条件下で変性したペプチド配列のように挙動するよう設計される。「変性した」は、ペプチド主鎖の大きな立体配座自由度を特徴とする溶液中でのペプチドの状態を説明する。ほとんどのペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下でまたは上昇した温度で、変性した立体配座を採用する。変性した立体配座におけるペプチドは、例えば、特徴的な円二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲによって決定される時、長い範囲の相互作用の欠失を特徴とする。「変性した立体配座」および「構造化されていない立体配座」は本明細書で同義的に用いられる。いくつかの実施態様において、本発明は、生理学的条件下で二次構造において大きく欠失する変性した配列に似たＸＴＥＮ配列を提供する。他の場合、ＸＴＥＮ配列は、生理学的条件下で二次構造を実質的に欠失する。この文脈において用いられる「大きく欠失する」は、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の５０％未満が、本明細書で説明される手段によって測定または決定される時、二次構造に寄与することを意味する。「実質的に欠失する」は、この文脈において使用する場合、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または少なくとも約９９％が、本明細書で説明される方法によって測定または決定される時、二次構造に寄与しないことを意味する。
【０１２３】
種々の方法が、所与のポリペプチドにおける二次構造および三次構造の存在または不在を認めるために、当該技術分野で確立されている。特に、二次構造は、例えば、「遠‐ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）における円二色性分光法によって、分光光度的に測定することができる。アルファ‐ヘリックスおよびベータ‐シートなどの二次構造要素は各々、特徴的な形状および程度のＣＤスペクトルを生じる。二次構造はまた、米国特許出願公報第２００３０２２８３０９Ａ１号に説明されるような、周知のＣｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，  Ｐ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３：  ２２２−４５）およびＧａｒｎｉｅｒ‐Ｏｓｇｕｔ
ｈｏｒｐｅ‐Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｂｒａｔ  ＪＦ，  Ｒｏｂｓｏｎ  Ｂ．  （１９９６），  ＧＯＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ
ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５４０−５５３）など、あるコンピュータプログラムまたはアルゴリズムを介してポリペプチド配列について推定することができる。所与の配列について、該アルゴリズムは、二次構造がいくつか存在するかまたはまったく存在しないかを推定することができ、例えば、アルファ‐ヘリックスもしくはベータ‐シートを形成する配列の残基の合計および／もしくは百分率、または（二次構造を欠失する）ランダムコイル形成を結果として生じるよう推定された配列残基の百分率として表される。
【０１２４】
いくつかの実施態様において、対象の融合タンパク質組成物において用いられるＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される時、０％〜約５％未満の範囲のアルファ‐ヘリックス百分率を有することができる。他の場合、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される時、０％〜約５％未満の範囲のベータ‐シート百分率を有する。いくつかの実施態様において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される時、０％〜約５％未満の範囲のアルファ‐ヘリックス百分率および０％〜約５％未満の範囲のベータ‐シート百分率を有する。いくつかの実施態様において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のアルファ‐ヘリックス百分率および約２％未満のベータ‐シート百分率を有する。他の場合、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、高い程度のランダムコイル百分率を有する。いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、および最も好ましくは少なくとも約９９％のランダムコイルを有する。
【０１２５】
（１．非反復性配列）
いくつかの実施態様において、組成物のＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性である。一般に、反復性アミノ酸配列は、コラーゲンおよびロイシンジッパーなどの天然の反復性配列によって具現化されるように、より高次の構造を凝集または形成する傾向を有する。これらの反復性アミノ酸はまた、結晶性のまたは偽結晶性の構造を結果的に生じる接触を形成する傾向にあり得る。対照的に、非反復性配列が凝集する低い傾向は、配列が反復性である場合にさもなくば凝集しがちであろう比較的低頻度の帯電したアミノ酸を有する長い配列のＸＴＥＮの設計を可能にする。典型的には、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、配列が実質的に非反復性である約１００超〜約３０００のアミノ酸残基のＸＴＥＮ配列を含む。一実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、配列中の３つの連続したアミノ酸がセリンでない限り（この場合、３つ以下の連続したアミノ酸はセリン残基である）、同一のアミノ酸種類である約１００超〜約３０００のアミノ酸残基を有する。前述の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、「実質的に非反復性で」ある。
【０１２６】
ポリペプチドまたは遺伝子の反復性の程度は、コンピュータプログラムもしくはアルゴリズムによって、または当該技術分野で公知の他の手段によって測定することができる。ポリペプチド配列における反復性は例えば、所与の長さのより短い配列がポリペプチド内で生じる回数を決定することによって評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、１９２回重複する９アミノ酸配列（または９マー「フレーム」）および１９８の３マーフレームを有するが、独特な９マーまたは３マーの配列の数は、該配
列内の反復性の量に依存する。全体的なポリペプチド配列におけるサブシーケンスの反復性の程度を反映するスコア（以後、「サブシーケンススコア」）が生じる。本発明の文脈において、「サブシーケンススコア」は、２００アミノ酸配列内の独特な３マーサブシーケンスの絶対数によって除されるポリペプチドの２００の連続したアミノ酸の配列にわたる各独特な３マーフレームの発生の合計を意味する。反復性および非反復性のポリペプチドの最初の２００のアミノ酸に由来するこのようなサブシーケンススコアの例を実施例４４に呈する。いくつかの実施態様において、本発明は、１つ以上のＸＴＥＮを各々含むＣＦＸＴＥＮを提供し、この場合、該ＸＴＥＮは、１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、および最も好ましくは５未満のサブシーケンススコアを有する。この節において説明される上記の実施態様において、約１０未満のサブシーケンススコアを有するＸＴＥＮ（すなわち、９、８、７等）は、「実質的に非反復性で」ある。
【０１２７】
ＸＴＥＮの非反復性特徴は、反復性配列を有するポリペプチドと比較して、より大きな程度の溶解度およびより小さな凝集傾向をＣＦ融合タンパク質に分け与える。これらの特性は、いくつかの場合１００ｍｇ／ｍＬを超過する極度に高い薬物濃度を含むＸＴＥＮ含有医薬調製物の製剤化を容易にする。
【０１２８】
さらに、該実施態様のＸＴＥＮポリペプチドは、哺乳類に投与される場合に免疫原性を低下または実質的に除去するために、低い程度の内部反復性を有するよう設計される。グリシン、セリン、およびグルタミン酸などの３つのアミノ酸に大きく限定される短い反復したモチーフから構成されるポリペプチド配列は結果的に、哺乳類に投与される場合、これらの配列における推定Ｔ細胞エピトープの不在にもかかわらず、比較的高い抗体力価を生じ得る。このことは、タンパク質凝集体、交差架橋した免疫原、および反復性炭水化物を含む、反復したエピトープを有する免疫原が、光度に免疫原性であり、例えば、Ｂ細胞活性化を生じるＢ細胞受容体の交差架橋を結果的に生じることができることが示されるように、ポリペプチドの反復性の性質によって生じ得る（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２５  ：１６７６−８２  ；  Ｙａｎｋａｉ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ３４５  ：１３６５−７１  ；  Ｈｓｕ，  Ｃ．  Ｔ．，  ｅｔ
ａｌ．  （２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ６０：３７０１−５）；  Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＭＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９５）  ２５（１２）：３４４５−３４５１）。
【０１２９】
（２．例示的な配列モチーフ）
本発明は、モチーフのアミノ酸配列が非反復性である、複数単位のより短い配列またはモチーフを含む融合パートナーとして用いられるＸＴＥＮを包含する。非反復性基準は、ＸＴＥＮ配列を作製するために多量体化される配列モチーフのライブラリーを用いた「構築ブロック」アプローチにもかかわらず適合することができる。したがって、モチーフ自体が一般ｔ値基に非反復性のアミノ酸配列からなるので、ＸＴＥＮ配列は、４つの異なる種類の配列モチーフと同じくらい少数の複数単位からなり得るのに対し、全体的なＸＴＥＮ配列は実質的に非反復性にされる。
【０１３０】
一実施態様において、ＸＴＥＮは、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基の非反復性配列を有し、この場合、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約１００％が非重複性の配列モチーフからなり、この場合、各モチーフは約９〜３６のアミノ酸残基を有する。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約１００％が非重複性の配列モ
チーフからなり、この場合、各モチーフは９〜１４のアミノ酸残基を有する。なおも他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約１００％が非重複性配列モチーフからなり、この場合、各モチーフは１２のアミノ酸残基を有する。これらの実施態様において、配列モチーフは、全体的な配列が構造化されていない柔軟な特徴を有するよう、小さな親水性アミノ酸から主として構成されることが好ましい。ＸＴＥＮに含まれるアミノ酸の例は、例えば、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、およびグリシンである。コドンの最適化、配列モチーフをコードする組み立てポリヌクレオチド、タンパク質の発現、発現したタンパク質の電荷分布および溶解度、ならびに二次構造および三次構造などの変数を試験する結果として、亢進した特徴を有するＸＴＥＮ組成物が主として、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基を含むことが発見され、この場合、該配列は、実質的に非反復性であるよう設計される。一実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、長さ約１００超〜約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超〜約３０００のアミノ酸残基である実質的に非反復性の配列において配置されるグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、またはプロリン（Ｐ）から選択される主として４〜６種類のアミノ酸を有する。いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮは、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基の配列を有し、この場合、該配列の少なくとも約８０％は、非重複性配列モチーフからなり、この場合、各モチーフは、９〜３６のアミノ酸残基を有し、この場合、各モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなり、かつ、この場合、全長のＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸の種類の含有量は３０％を超過しない。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％は非重複性の配列モチーフからなり、この場合、各モチーフは、９〜３６のアミノ酸残基を有し、この場合、該モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなり、かつ、この場合、全長のＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸の種類の含有量は３０％を超過しない。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％は、非重複性配列モチーフからなり、この場合、各モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなる１２のアミノ酸残基を有し、かつ、この場合、全長のＸＴＥＮにおおける任意の１つのアミノ酸の種類の含有量は３０％を超過しない。なおも他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％は、非重複性配列モチーフからなり、この場合、該モチーフの各々は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる１２のアミノ酸残基を有し、かつ、この場合、全長のＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸の種類の含有量は３０％を超過しない。
【０１３１】
なおも他の実施態様において、ＸＴＥＮは、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基の非反復性配列を含み、この場合、該配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は、９〜１４のアミノ酸残基の非重複性配列モチーフからなり、この場合、該モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなり、かつ、この場合、任意の１つのモチーフにおける任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、配列モチーフにお
いて３回以上反復しない。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は、１２のアミノ酸残基からなる非重複性配列モチーフからなり、この場合該モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸からなり、かつ、この場合、任意の１つの配列モチーフにおける任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、該配列モチーフにおいて３回以上反復しない。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は、１２のアミノ酸残基からなる非重複性配列モチーフからなり、この場合該モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなり、かつ、この場合、任意の１つの配列モチーフにおける任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、該配列モチーフにおいて３回以上反復しない。なおも他の実施態様において、ＸＴＥＮは、１２のアミノ酸配列モチーフからなり、この場合、該アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択され、かつ、この場合、任意の１つの配列モチーフにおける任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、該配列モチーフにおいて３回以上反復せず、かつ、この場合、全長のＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸の種類の含有量は３０％を超過しない。本節において説明される先の前述の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は実質的に非反復性である。
【０１３２】
いくつかの実施態様において、本発明は、約１００超〜約３０００アミノ酸残基の非反復性ＸＴＥＮ配列（複数可）を含む組成物を提供し、この場合、該配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％が、表３のアミノ酸配列から選択される２つ以上の非重複性配列モチーフの複数単位からなる。いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮは、非重複性配列の約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％が、表３の単一モチーフファミリーから選択される２つ以上の非重複性配列からなり、結果的に、全体的な配列が実質的に非反復性に留まる「ファミリー」配列を生じる該非重複性配列のモチーフを含む。したがって、これらの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、表３の配列のＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの非重複配列モチーフの複数単位を含む。他の実施態様において、ＸＴＥＮは、表３のモチーフファミリーの２つ以上に由来するモチーフ配列を含む。
【０１３３】
【表３】
2013502459.tif 000007
＊は、種々の順列において互いに用いる場合に「ファミリー配列」を結果として生じる個々のモチーフ配列を示す。
【０１３４】
他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ組成物は、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基からなる非反復性ＸＴＥＮ配列を含み、この場合、該配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％は、表９〜１２のポリペプチド配列の１つ以上から選択される非重複性の３６のアミノ酸配列モチーフからなる。
【０１３５】
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ成分が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６のアミノ酸からなる該融合タンパク質のアミノ酸の１００％未満を有するかまたは表３由来のＸＴＥＮと比較して１００％未満の配列同一性を有する実施態様において、その他のアミノ酸残基は、１４の天然Ｌ−アミノ酸のその他から選択されるが、ＸＴＥＮ配列が、少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、
または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の親水性アミノ酸を含むよう、親水性アミノ酸から優先的に選択される。グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）ではないＸＴＥＮアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列配列じゅうに散在し、配列モチーフ内もしくは配列モチーフ間に配置され、またはＸＴＥＮ配列の１つ以上の短いストレッチにおいて濃縮される。ＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮ成分がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）以外のアミノ酸を含むような場合において、該アミノ酸が疎水性残基ではなく、かつＸＴＥＮ成分の二次構造を実質的に与えるべきではないことが好ましい。ＸＴＥＮの構築にあまり好ましくない疎水性残基には、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが挙げられる。加えて、以下のアミノ酸、すなわち（ジスルフィド形成および酸化を回避するための）システイン、（酸化を回避するための）メチオニン、（デスアミデーション（ｄｅｓａｍｉｄａｔｉｏｎ）を回避するための）アスパラギンおよびグルタミンのうちの少数（例えば、５％未満）を含むかまたはまったく含まないよう、ＸＴＥＮ配列を設計することができる。したがって、いくつかの実施態様において、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）に加えて他のアミノ酸を含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ成分は、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって測定されるようなアルファ‐ヘリックスおよびベータ‐シートに寄与する残基の５％未満を有する配列を有し、かつＧＯＲアルゴリズムによって測定されるような少なくとも９０％、または少なくとも約９５％以上のランダムコイル形成を有するであろう。
【０１３６】
（３．配列の長さ）
本発明の別の態様において、本発明は、伸長した長さの配列を有するＸＴＥＮポリペプチドの担体を含むＣＦＸＴＥＮ組成物を包含する。本発明は、非反復性の構造化されていないポリペプチドの長さを増大させると、ＸＴＥＮの構造化されていない性質を亢進し、相応して、ＸＴＥＮ担体を含む融合タンパク質の生物学的特性及び薬物動態特性を高めるという発見を用いる。実施例においてより完全に説明されるように、ＸＴＥＭの長さにおける比例的延長は、単一のファミリー配列モチーフ（例えば、表３の４つのＡＥモチーフ）の固定された反復順序によって作製される場合でさえ、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、より短いＸＴＥＮ長と比較して、より高い百分率のランダムコイル形成を有する配列を結果的に生じる。一般に、実施例において説明されるように、構造化されていないポリペプチド融合パートナーの長さを増大させると、結果的に、配列長のより短い構造化されていないポリペプチドパートナーとの融合タンパク質と比較して、終末半減期の不相応な延長を有する融合タンパク質を結果的に生じる。
【０１３７】
本発明のＣＦＸＴＥＮに含まれるよう熟慮されるＸＴＥＮの非限定例を以下の表４に呈する。一実施態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ組成物を提供し、この場合、融合タンパク質（複数可）のＸＴＥＮ配列長は、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基であり、いくつかの場合、４００超〜３０００のアミノ酸残基であり、この場合、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して、ＣＦＸＴＥＮに亢進した薬物動態特性を与える。いくつかの実施態様において、本発明のＣＦＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮ配列は、長さ約１００、または約１４４、または約２８８、または約４０１、または約５００、または約６００、または約７００、または約８００、または約９００、または約１０００、または約１５００、または約２０００、または約２５００、または最大約３０００のアミノ酸残基であり得る。他の場合、ＸＴＥＮ配列は、長さ約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、４０１〜約５００、約５００〜９００、約９００〜１５００、約１５００〜２０００、または約２０００〜約３０００のアミノ酸残基であり得る。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列を含むことができ、この場合、該配列は、
表４から選択されるＸＴＥＮと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を呈する。いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質をコードする遺伝子のＸＴＥＮ部分における最適化されたＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）のためのコードヌクレオチドを含むことによるＣＦＸＴＥＮのＮ末端成分としての最適化した発現のために設計される。一実施態様において、発現したＣＦＸＴＥＮのＮ末端ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４８またはＡＭ４８、ＡＥ６２４、またはＡＥ９１２またはＡＭ９２３の配列と比較して少なくとも９０％の配列同一性を有する。別の実施態様において、ＸＴＥＮは、実施例１４〜１７に説明されるＮ末端残基を有する。
【０１３８】
他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、第一および第二のＸＴＥＮ配列を含み、この場合、ＸＴＥＮ配列における残基の累積的合計は、約４００超〜約３０００のアミノ酸残基であり、かつＸＴＥＮは、配列において同一であり得るかまたは異なり得る。先の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、第一および第二のＸＴＥＮ配列を含み、この場合、該配列は各々、表４から選択される少なくとも第一のもしくは加えて第二のＸＴＥＮと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を呈する。２つ以上のＸＴＥＮがＣＦＸＴＥＮ組成物において用いられる例には、少なくとも１つのＣＦのＮ末端およびＣ末端の両方に連結されたＸＴＥＮを有するコンストラクトを含むが、これに限定されない。
【０１３９】
下記により完全に説明されるように、本発明は、ＣＦＸＴＥＮが、ＸＴＥＮの長さを選択して、対象に投与される融合タンパク質に標的半減期を与えることによって設計される方法を提供する。一般に、ＣＦＸＴＥＮ組成物に組み込まれた累積的な約４００の残基よりも長いＸＴＥＮ長は結果的に、より短い累積的長さ；例えば、約２８０よりも短い残基と比較してより長い半減期を生じる。しかしながら、別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、対象への皮下投与または筋肉内投与の後、より小さな全身吸収速度を追加的に与えるよう選択される、より長い配列長を有するＸＴＥＮを含むよう設計される。このような実施態様において、Ｃｍａｘは、ＸＴＥＮに連結されていない、匹敵する用量のＣＦとの比較において低下し、それにより、該組成物についての治療ウィンドウ内にＣＦＸＴＥＮを維持する能力に寄与する。したがって、ＸＴＥＮは、本明細書に説明される他の物理的／化学的特性に加えて、投与されたＣＦＸＴＥＮにデポー特性を与える。
【０１４０】
【表４−１】
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【０１４１】
【表４−２】
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【０１４２】
【表４−３】
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【０１４３】
【表４−４】
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【０１４４】
【表４−５】
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【０１４５】
【表４−６】
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【０１４６】
（４．ＸＴＥＮセグメント）
一実施態様において、本発明は、単離されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、この場合、ＸＴＥＮ成分の累積的な長さは、表４、９、１０、１１、１２、および１３から選択される少なくとも１つのポリペプチド配列セグメントを含む約１００超〜約３０００のアミノ酸残基であり、かつＸＴＥＮ配列の残りの少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、またはそれより多くが、親水性アミノ酸を含み、かつＸＴＥＮの残りの約２％未満が、疎水性アミノ酸もしくは芳香族アミノ酸もしくはシステインからなる。いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮは、セグメントが同一かまたは異なる複数のセグメントを含む。別の実施態様において、本発明は、単離されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、この場合、ＸＴＥＮ成分の累積的な長さは、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基であり、かつ少なくとも約１００〜約９２３、または少なくとも約１００〜約８７５、または少なくとも約１００〜約５７６、または少なくとも約１００〜約１４４のアミノ酸残基の少なくとも１つの配列セグメントを含み、この場合配列セグメント（複数可）は、少なくとも３つの異なる種類のアミノ酸から成り、配列セグメント（複数可）におけるグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の合計が、配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を構成し、ＸＴＥＮ配列（複数可）の残りの少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％が親水性アミノ酸から成り、かつ、ＸＴＥＮ配列（複数可）の残りの２％未満が疎水性アミノ酸もしくは芳香族アミノ酸もしくはシステインからなる。別の実施形態において、本発明は、単離されたＣＦＸＴＥＮ
融合タンパク質を提供し、この場合、ＸＴＥＮ成分の累積的な長さは、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基であり、かつ少なくとも約２００〜約９２３、または少なくとも約２００〜約８７５、または少なくとも約２００〜約５７６、または少なくとも約２００〜約２８８のアミノ酸残基の少なくとも１つの配列セグメントを含み、この場合、配列セグメント（複数可）におけるグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の合計が、配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を構成し、かつ該セグメントのサブシーケンススコアは、１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、最も好ましくは５未満であり、かつＸＴＥＮ配列（複数可）の残りの少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％が親水性アミノ酸からなり、かつＸＴＥＮ配列（複数可）の残りの約２％未満が疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、またはシステインアミノ酸からなる。
【０１４７】
（５．Ｎ末端ＸＴＥＮ発現増強配列）
いくつかの実施態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＮ末端部分として組み込まれた短い長さのＸＴＥＮ配列を提供する。融合タンパク質の発現は、結合している融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに組み込まれた（Ｎ末端ＸＴＥＮをコードする）最適化されたＮ末端リーダーポリヌクレオチド配列を含む好適な発現ベクターで形質転換された宿主細胞において亢進することが発見された。実施例１４〜１７において説明されるように、結合している融合タンパク質遺伝子における最適化されたＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）を含むこのような発現ベクターで形質転換された宿主細胞は結果的に、ＮＴＳを含まないポリヌクレオチドからの相応する融合タンパク質の発現と比較して、融合タンパク質の非常に亢進した発現を生じ、発現を亢進するために用いられる非ＸＴＥＮリーダー配列の組み込みの必要性を除去する。一実施態様において、本発明は、ＮＴＳを含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、この場合、宿主細胞におけるコード遺伝子からの結合している融合タンパク質の発現は、（コード遺伝子がＮＴＳを欠失する）Ｎ末端ＸＴＥＮ配列を含まないＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の発現と比較して約５０％、約５０％、または約７５％、または約１００％、または約１５０％、または約２００％、または約４００％亢進する。
【０１４８】
一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮのＮ末端ＸＴＥＮポリペプチドは、個々のアミノ酸配列が以下のとおりであるＡＥ４８またはＡＭ４８のアミノ酸配列と比較して、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を呈するかまたは１００％の配列同一性を呈する配列を含む：
ＡＥ４８：ＭＡＥＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳ
ＡＭ４８：ＭＡＥＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳ
。
【０１４９】
別の実施態様において、短い鎖のＮ末端ＸＴＥＮは、より長い長さのＸＴＥＮに連結さ
れ、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＮ末端領域を形成し、この場合、短い長さのＮ末端ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞における亢進した発現の特性を与え、かつ、この場合、発現したＸＴＥＮの長い長さは、先に説明した通り、融合タンパク質におけるＸＴＥＮ担体の亢進した特性に起用する。前述において、短い長さのＸＴＥＮは、本明細書に開示される任意のＸＴＥＮ（例えば、表３のＸＴＥＮ）に連結され、結果として生じるＸＴＥＮは順に、融合タンパク質の成分としての本明細書に開示される任意のＣＦ（例えば、表１または表２のＣＦ）のＮ末端に連結される。あるいは、短い長さのＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド（またはその相補体）は、本明細書に開示される任意のＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド（またはその相補体）に連結され、結果として生じるＮ末端ＸＴＥＮコード遺伝子は順に、本明細書に開示される任意のＣＦをコードするポリヌクレオチドの５’に（またはその相補体の３’末端に）連結される。いくつかの実施態様において、長い長さのＮ末端ＸＴＥＮポリペプチドは、配列ＡＥ６２４、ＡＥ９１２、およびＡＭ９２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも９９％を呈するか、または１００％の配列同一性を呈する。
【０１５０】
先に説明された前述の任意のＮ末端ＸＴＥＮの実施態様において、Ｎ末端ＸＴＥＮは、融合タンパク質の標的部分をコードする遺伝子にＮ末端ＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを接合するために採用される制限エンドヌクレアーゼ制限部位を収容するために、好ましくはＧＥＳＴＰＡから選択される約１〜約６の追加的なアミノ酸残基を有することができる。Ｎ末端配列の生成および本発明の融合タンパク質への組み込みのための方法は、実施れにおいてより完全に説明される。
【０１５１】
（６．正味の電荷）
他の実施態様において、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮ配列における正味の電荷を有するおよび／または疎水性アミノ酸の比を低下させるアミノ酸残基の組み込みによって与えられる構造化されていない特徴を有する。全体的な正味の電荷および正味の電荷密度は、ＸＴＥＮ配列における帯電したアミノ酸の含有量を修飾することによって制御される。いくつかの実施態様において、組成物のＸＴＥＮの正味の電荷密度は、＋０．１電荷／残基を上回り得るかまたは−０．１電荷／残基を下回り得る。本明細書のタンパク質またはペプチドの「正味の電荷密度」によって意味されるのは、該タンパク質またはペプチドにおけるアミノ酸の総数によって除される正味の電荷である。他の実施態様において、ＸＴＥＮの正味の電荷密度は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％、またはそれより多くあり得る。
【０１５２】
ヒトまたは動物におけるほとんどの組織および表面は、正味の負の電荷を有するので、いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮ含有組成物と血管、健常組織、または種々の受容体などの種々の表面との間の非特異的相互作用を最小化するために正味の負の電荷を有するよう設計される。特定の理論によって結びつけられることなく、ＸＴＥＮは、正味の負の電荷を個々の保有しかつＸＴＥＮポリペプチドの配列にわたって分布されるＸＴＥＮポリペプチドの個々のアミノ酸間の静電反発力により開いた立体配座を採用することができる。伸長した配列長のＸＴＥＮにおける正味の負の電荷のこのような分布は、構造化されていない立体配座をもたらすことができ、該立体配座は順に、水力学的半径における有効な増大を結果的に生じるｋとができる。好ましい実施態様において、負の電荷は、グルタミン酸残基の組み込みによって与えられる。したがって、一実施態様に
おいて、本発明は、ＸＴＥＮ配列が約８、１０、１５、２０、２５、またはさらに約３０％のグルタミン酸を含むＸＴＥＮを提供する。一般的に、グルタミン酸残基は、ＸＴＥＮ配列にわたって均一に一定間隔で配置される。いくつかの場合において、ＸＴＥＮは、産物の電荷均一性を増大させることができかつその等電点を鋭くすることができ、それゆえ生成手順を簡素化するために、結果として生じるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の物理化学的特性を亢進することのできる、非常に類似したｐＫａを有するであろう帯電した残基を有するＸＴＥＮを結果的に生じることのできる２０ｋＤａのＸＴＥＮあたり約１０〜８０、または約１５〜６０、または約２０〜５０のグルタミン酸残基を含むことができる。
【０１５３】
本発明の組成物のＸＴＥＮは一般的に、正に帯電したアミノ酸を全く有さないかまたは該アミノ酸の低含有量を有する。いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮは、正の電荷を有する約１０％未満のアミノ酸残基、または正の電荷を有する約７％未満、もしくは約５％未満、もしくは約２％未満、もしくは約１％未満のアミノ酸残基を有し得る。しかしながら、本発明は、リシンなど、正の電荷を有するアミノ酸の制限された数が、該リシンのイプシロンアミンとペプチドにおける反応基、リンカー架橋、またはＸＴＥＮ主鎖に抱合されるべき薬物もしくは小分子における反応基との間の抱合を可能にするためにＸＴＥＮに組み込まれる。前述の一実施態様において、ＸＴＥＮは、約１〜約１００のリシン残基、または約１〜約７０のリシン残基、または約１〜約５０のリシン残基、または約１〜約３０のリシン残基、または約１〜約２０のリシン残基、または約１〜約１０のリシン残基、または約１〜約５のリシン残基、またはそれに代わるものとしてたった１つの単一のリシン残基を有する。先のリシン含有ＸＴＥＮを用いて、ＸＴＥＮ、凝固因子、加えて、増殖関連疾患もしくは障害の治療に有用な化学治療薬を含む融合タンパク質が構築され、この場合、ＸＴＥＮ成分に組み込まれた薬剤の分子の最大数は、ＸＴＥＮに組み込まれたリシン、または反応性側鎖を有する他のアミノ酸（例えば、システイン）の数によって決定される。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、より良好な発現挙動または精製挙動をもたらす、セリンまたはグリシンなどの他の残基によって分離される帯電した残基を含む。正味の電荷に基づいて、いくつかのＸＴＥＮは、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、またはさらには６．５の等電点（ｐＩ）を有する。好ましい実施態様において、ＸＴＥＮは、１．５〜４．５の等電点を有する。これらの実施態様において、本発明のＣＦＸＴＥＮ［融合タンパク質組成物に組み込まれたＸＴＥＮは、構造化されていない立体配座ならびに哺乳類のタンパク質および組織へのＸＴＥＮ成分の低下した結合に寄与する生理学的条件下で正味の負の電荷を保有する。
【０１５５】
疎水性アミノ酸は、ポリペプチドに対して構造を与えるので、本発明は、ＸＴＥＮにおおける疎水性アミノ酸の含有量が、典型的には、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含有量であることを提供する。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ成分におけるメチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸含有量は、典型的には５％未満、または２％未満、および最も好ましくは１％未満である。別の実施態様において、ＸＴＥＮは、正の電荷を有する１０％未満のアミノ酸、または正の電荷を有する約７％未満、もしくは約５％未満、もしくは約２％未満のアミノ酸残基を有する配列を有し、メチオニン残基およびトリプトファン残基の合計は２％未満であり、かつアスパラギン残基およびグルタミン残基の合計は、全ＸＴＥＮ配列の１０％未満である。
【０１５６】
（７．低免疫原性）
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ配列が、低い程度の免疫原性を有するかまたは実質的に非免疫原性である組成物を提供する。いくつかの因子は、ＸＴＥＮの低免疫原性
に寄与することができ、例えば、ＸＴＥＮ配列における、非反復性配列、構造化されていない立体配座、高い程度の溶解度、低い程度の自己凝集もしくは自己凝集の欠失、配列内のタンパク質分解性部位の低い程度もしくは欠失、およびエピトープの低い程度もしくは欠失である。
【０１５７】
立体配座のエピトープは、タンパク質抗原の複数の不連続なアミノ酸配列から構成されるタンパク質表面の領域によって決定される。タンパク質の精確な折りたたみは、これらの配列を、宿主体液性免疫系によって「外来」として認識できる、該タンパク質に対する抗体の産生もしくは細胞仲介性免疫応答の活性化を結果的に生じる、十分に規定された安定な空間的立体配置、またはエピトープにする。後者の場合、個体におけるタンパク質に対する免疫応答は、個体のＨＬＡ‐ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の関数であるＴ細胞エピトープ認識によって著しく影響される。Ｔ細胞の表面における同族のＴ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の会合は、ＣＤ４分子などの他のある共受容体の交差結合とともに、活性化された状態をＴ細胞内で誘導することができる。活性化は、Ｂ細胞などの他のリンパ球をさらに活性化させて抗体を産生させる、または完全な細胞免疫応答としてＴキラー細胞を活性化させるサイトカインの放出をもたらす。
【０１５８】
ＡＰＣ（抗原提示細胞）の陽めんにおける提示のための所与のＭＨＣクラスＩＩ分子を得ｋ都合するペプチドの能力は、いくつかの因子に依存しており、最も顕著なのはその一次配列である。一実施態様において、より低い程度の免疫原性は、抗原提示細胞における抗原加工に対する抵抗するＸＴＥＮ配列を設計すること、および／またはＭＨＣ受容体を十分に結合しない配列を選択することによって達成される。本発明は、ＭＨＣＩＩ受容体との結合を低下させ、およびＴ細胞受容体のためのエピトープの形成もしくは抗体結合を回避するよう設計され、結果的に低い程度の免疫原性を生じる、実質的に非反復性のＸＴＥＮポリペプチドを有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は、ＸＴＥＮ配列の立体配座の柔軟性の結果、すなわち、アミノ酸残基の選択及び順序による二次構造の欠失に少なくとも一部起因する。例えば、特に関心対象であるのは、水溶液中でまたは立体配座エピトープを結果的に生じ得る生理学的条件下でコンパクトに折りたたまれた立体配座に適応する傾向の低い配列である。従来の治療的実施および投薬を用いた、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与は、ＸＴＥＮ配列に対する中和抗体の形成を一般的に生じるだけでなく、ＣＦＸＴＥＮ組成物におけるＣＦ融合パートナーの免疫原性も低下させるであろう。
【０１５９】
一実施態様において、対象の融合タンパク質において利用されるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープが実質的に存在し得ない。より低い免疫原性のタンパク質を生成する目的のためのこのようなエピトープの除去はすでに開示されており、例えば、本命い最初に引用により組み込まれているＷＯ  ９８／５２９７６、ＷＯ  ０２／０７９２３２、および  ＷＯ  ００／３３１７を参照されたい。ヒトＴ細胞エピトープについてのアッセイは、すでに説明されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２８１：  ９５−１０８）。特に関心対象であるのは、Ｔ細胞エピトープも非ヒト配列も生じないオリゴマー化されることのできるペプチド配列である。このことは、Ｔ細胞エピトープの存在について、およびヒトではない６〜１５マー、特に９マーの配列の発生についてこれらの配列の直接的な反復を試験した後、ＸＴＥＮ配列の設計を変更して、エピトープ配列を除去または破棄することによって達成される。いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合することが推定されるＸＴＥＮのエピトープの数の制限によって、実質的に非免疫原性である。ＭＨＣ受容体に対して結合することのできるエピトープ数の減少とともに、Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞ヘルパー機能についての能力の同時低下、Ｂ細胞の低下した活性化または上方制御、ならびに低下した抗体産生がある。低い程度の推定Ｔ細胞エピトープは、実施例４５に示されるように、例えばＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌ
ｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １７：
５５５−６１）などのエピトープ推定アルゴリズムによって決定することができる。タンパク質内の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：５５５に開示されるように、複数の最も普遍的なヒトＭＨＣ対立遺伝子に対する該ペプチドフレームの結合のＫｄ（解離定数、親和性、オフレート））の対数である。該スコアは、少なくとも２０ｌｏｇを上回り、約１０〜約−１０にわたり（１０ｅ１０Ｋｄ〜１０ｅ−１０Ｋｄの結合拘束に相当）、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＦなどのＭＨＣにおけるペプチドディスプレイの間にアンカー残基として機能する疎水性アミノ酸を回避することによって低下することができる。いくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮに組み込まれたＸＴＥＮ成分は、約−５以上、または−６以上、または−７以上、または−８以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアにおいて、あるいは−９以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアにおいて推定Ｔ細胞エピトープを有しない。本明細書で使用する場合、「−９以上」のスコアは、１０〜−９のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを包括的に包含するであろうが、−１０が−９よりも小さいので−１０のスコアを包含しないであろう。
【０１６０】
別の実施態様において、対象のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれたものを含む本発明のＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ  ＩＩ受容体に結合することのできる小ペプチドへのＸＴＥＮのプロセシングを低下させるＸＴＥＮの配列由来の公知のタンパク質分解性部位の制限によって、実質的に非免疫原性にする。別の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、二次構造を実質的に欠く配列の使用によって実質的に非免疫原性にされ、該構造の高いエントロピーにより多くのプロテアーゼに対する耐性を与える、したがって、低下したＴＥＰＩＴＯＰＥスコアおよび、ＸＴＥＮからの公知のタンパク質分解性部位の除去によって、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物のＸＴＥＮを含めたＸＴＥＮ組成物を、免疫系の受容体を含む哺乳類受容体によって結合することが実質的にできないようにする。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、哺乳類受容体に対する＞１００ｎＭ  Ｋｄの結合を有し得、または哺乳類細胞表面もしくは循環しているポリペプチド受容体に対しては、５００ｎＭ  Ｋｄ超もしくは１μＭ  Ｋｄ超を有し得る。
【０１６１】
加えて、非反復性配列およびＸＴＥＮのエピトープの相応する欠失は、Ｂ細胞がＸＴＥＮに結合しまたはＸＴＥＮによって活性化される能力を制限する。反復性配列は認識され、数個のＢ細胞とさえ多価接触を形成することができ、複数のＴ細胞と無関係の受容体の交差連結の結果として、Ｂ細胞増殖および抗体産生を刺激することができる。対照的に、ＸＴＥＮは、その伸長した配列にわたって多くの異なるＢ細胞と接触することができるが、各個々のＢ細胞は、該配列の反復性のないことにより、個々のＸＴＥＮと１つまたは少数の接触しかなし得ない。いずれの理論によっても結びつけられることなく、ＸＴＥＮは典型的には、Ｂ細胞の増殖を刺激する傾向、およびしたがって免疫応答が非常により低い。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮＴに融合しない相応のＣＦと比較して、低下した免疫原性を有する。一実施態様において、哺乳類への最大３非経口用量のＣＦＸＴＥＮの投与は結果的に、１：１００の血清希釈において検出可能な抗ＣＦＸＴＥＮ  ＩｇＧを生じるが、１：１０００の希釈においては生じない。別の実施態様において、哺乳類へのＣＦＸＴＥＮの最大３経口用量の投与は結果的に、１：１００の血清希釈において検出可能な抗ＣＦ  ＩｇＧを生じるが、１：１０００の希釈においては生じない。別の実施態様において、哺乳類への最大３経口用量のＣＦＸＴＥＮの投与は結果的に、１：１００の血清希釈において検出可能な抗ＸＴＥＮ  ＩｇＧを生じるが、１：１０００の希釈においては生じない。先の実施態様において、哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、またはカニクイザルであり得る。
【０１６２】
高い程度の反復性を有する配列に対する非反復性配列を有するＸＴＥＮの追加的な特長は、抗体とより弱い接触を形成する非反復性ＸＴＥＮである。抗体は、多価分子である。
例えば、ＩｇＧは、２つの同一の結合部位を有し、ＩｇＭは、１０の同一の結合部位を含む。したがって、反復性配列に対する抗体は、このような反復性配列の潜在能力および／または除去に影響することのできる高い結合活性を有するこのような反復性配列と多価の接触を形成することができる。対照的に、非反復性ＸＴＥＮに対する抗体は、一価の相互作用を生じ得、結果的に、ＣＦＸＴＥＮ組成物が、延長した時間循環に留まることができるよう、免疫クリアランスの見込みをほとんど生じない。
【０１６３】
（８．増大した水力学的半径）
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮポリペプチドが、ＸＴＥＮを組み込んでいるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に相応の増大した見かけの分子量を与える高い水力学的半径を有する、ＸＴＥＮを提供する。実施例３８に詳述されるように、ＦＩＸ配列またはＦＶＩＩ配列など、ＣＦ配列に対するＸＴＥＮの連結は結果的に、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して、増大した水力学的半径、増大した見かけの分子量、および増大した見かけの分子量因子を結果的に生じる。例えば、長期化した半減期が所望である治療適用において、高い水力学的半径を有するＸＴＥＮが、ＣＦを含む融合タンパク質に組み込まれている組成物は、（天然のＦＩＸおよびＦＶＩＩの両方よりも大きな、約７０ｋＤＡの見かけの分子量に相当する）およそ３〜５ｎｍの糸球体の孔サイズを超えて、該組成物の水力学的半径を効果的に拡大することができ（Ｃａｌｉｃｅｔｉ．  ２００３．    Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．    Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５５：１２６１−１２７７）、結果的に循環しているタンパク質の低下した腎クリアランスを生じる。タンパク質の水力学的半径は、その分子量によっておよび、形状またはコンパクトさを含めたその構造によって決定される。特定の理論に結び付けられることなく、ＸＴＥＮは、ペプチドの個々の電荷間の静電反発力、または二次構造を与える能力を欠失する配列中の特定のアミノ酸によって与えられる固有の柔軟性により、開いた立体配座を採用することができる。ＸＴＥＮポリペプチドの開いた、伸長した、および構造化されていない立体配座は、典型的な球状タンパク質などの二次および／または三次構造を有するかなりの配列長および／または分子量のポリペプチドと比較してより大きな比例した水力学的半径を有することができる。米国特許第６，４０６，６３２号および第７，２９４，５１３号において説明されるような分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用などによる、水力学的半径を決定するための方法は、当該技術分野で周知である。実施例３８の結果が示すように、ＸＴＥＮの増大する長さの付加は結果的に、水力学的半径、見かけの分子量、および見かけの分子量因子のパラメータにおける比例的な増大を生じ、ＣＦＸＴＥＮを所望の特徴的なカットオフの見かけの分子量または水力学的半径に仕立てることができる。したがって、ある実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、該融合タンパク質が少なくとも約５ｎｍ、または少なくとも約８ｎｍ、または少なくとも約１０ｎｍ、または１２ｎｍ、または少なくとも約１５ｎｍの水力学的半径を有することができるよう、ＸＴＥＮを用いて構成されることができる。先の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質におけるＸＴＥＮによって与えられる大きな水力学的半径は、結果として生じる融合タンパク質の低下した腎クリアランスをもたらし、終末半減期の相応する延長、平均滞留時間の延長、および／または腎クリアランス速度の低下をもたらす。
【０１６４】
別の実施態様において、選択された長さおよび配列（例えば、表４由来の配列またはその配列バリアント）のＸＴＥＮは、ＣＦＸＴＥＮに選択的に組み込まれ、生理学的条件下で少なくとも約５００ｋＤａ、または少なくとも約８００ｋＤａ、または少なくとも約１０００ｋＤａ、または少なくとも約１５００ｋＤＡ、または少なくとも約１８００ｋＤａ、または少なくとも約２０００ｋＤａ、または少なくとも約２３００ｋＤａ、またはそれより大きな見かけの分子量を有する融合タンパク質を作製することができる。別の実施態様において、選択された長さおよび配列のＸＴＥＮは、ＣＦに選択的に連結され、生理学
的条件下で、少なくとも４の、あるいは少なくとも５の、あるいは少なくとも６の、あるいは少なくとも８の、あるいは少なくとも１０の、あるいは少なくとも１５の見かけの分子量因子を、あるいは、少なくとも２０以上の見かけの分子量因子を有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を結果的に生じる。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、生理学的条件下で、該融合タンパク質の実際の分子量に対して約４〜約２０である、または約６〜約１５である、または約８〜約１２である、または約９〜約１０である見かけの分子量因子を有する。
【０１６５】
（Ｖ）．ＣＦＸＴＥＮバリアント、構造的立体配置、および特性）
対象の組成物のＣＦは、天然の全長のＦＩＸポリペプチドまたはＦＶＩＩポリペプチドに限定されないだけでなく、組換えバージョン、ならびに配列バリアント、ＦＶＩＩ配列およびＦＩＸ配列の組み合わせ、またはそれらの断片を有する生物学的におよび／または薬理学的に活性のある形態も含む。例えば、種々のアミノ酸の欠失、挿入、および置換がＣＦにおいて実施され、ＣＦの生物学的活性または薬理学的特性に関して本発明の精神から逸脱せずにバリアントを作製することは認識される。ポリペプチド配列におけるアミノ酸についての保存的置換の例を表５に示す。しかしながら、ＣＦの配列同一性が、本明細書に開示される具体的な配列と比較して１００％未満であるＣＦＸＴＥＮの実施態様において、本発明は、その他の任意の１９の天然Ｌ−アミノ酸と、隣接するアミノ酸残基を含めたＣＦの配列内の任意の位置にあり得る所与のＣＦ（例えば、ＦＩＸまたはＦＶＩＩ）の所与のアミノ酸残基との置換を熟慮する。任意の１つの置換が、生物活性における望ましくない変化を結果的に生じる場合、代替的なアミノ酸のうちの１つを採用することができ、本明細書に説明される方法によって、または例えばそのすべての内容が全体として引用により組み込まれている米国特許第５，３６４，９３４号において示される保存的突然変異および非保存的突然変異についての任意の技術およびガイドラインを用いて、または当該技術分野で一般的に公知の方法を用いて、コンストラクトを評価する。加えて、バリアントには、例えばポリペプチドを含むことができ、この場合、１つ以上のアミノ酸残基が、天然ペプチドの生物活性のすべてではないにしてもいくらかを保有するＣＦの全長の天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端において付加または欠失され；例えば、凝固カスケードにおいて別の凝固因子を活性化させるおよび／または該カスケードに関与する能力は、フィブリン形成および止血をもたらす。
【０１６６】
一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれる第ＩＸ因子は、表１に由来する配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性を、あるいは、表１に由来する配列と比較して少なくとも約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列同一性を呈する配列を有する。
【０１６７】
一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれる第ＶＩＩ因子は、表２由来の配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性を、あるいは表２由来の配列と比較してａｔｌｅａｓｔ約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列同一性を呈する配列を有する。
【０１６８】
【表５】
2013502459.tif 000014
（１．内部ＸＴＥＮ配列）
本発明は、ＣＦ配列に対して内部に配置された１つ以上のＸＴＥＮ配列を含むＣＦＸＴＥＮを包含する。１つ以上の内部に配置されたＸＴＥＮは、３６〜≧１０００のアミノ酸残基の配列長であり得る。いくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、表４、９、１０、１１、１２、および１３から選択される１つ以上のＸＴＥＮと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する１または２または３または４またはそれより多くのＸＴＥＮ配列を有することができ、この場合、ＸＴＥＮ配列は、ＣＦ配列に対して内部に配置される。前述の一実施態様において、１つ以上の内部ＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮは、表４から選択される１つ以上のＸＴＥＮと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に配置される追加的なＸＴＥＮを有する。別の実施態様において、本発明は、プロテアーゼによって作用される場合にＸＴＥＮが放出されることができるよう、開裂配列（例えば、表７の開裂配列）によってＣＦに連結されたＣ末端ＸＴＥＮをさらに含む（下記に詳述されるような）内部ＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮを提供した。開裂配列によるＸＴＥＮの連結は、下記におよび実施例においてより完全に説明される。
【０１６９】
いくつかの実施態様において、図２に示されかつ実施例においてより完全に説明されるように、ＸＴＥＮは、ＦＩＸ配列のドメイン間に、例えば、ＧｌａとＥＧＦ１との間に、またはＥＧＦ１とＥＧＦ２との間に、またはＥＧＦ２と活性化ペプチドとの間に、またはＡＰのＲ１４５‐Ａ１４６およびＲ１８０‐Ｖ１８１の活性化ペプチド残基間（すなわち、配列ＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦの任意の２つのアミノ酸の間）の活性化ペプチドの配列内に、またはＥＧＦ２と活性化ペプチドとの間
に、または活性化ペプチドとプロテアーゼドメインとの間に配置されることができるか、または前述の任意の組み合わせであり得る。他の実施態様において、図２に示されかつ実施例においてより完全に詳述されるように、ＸＴＥＮは、ＦＩＸ配列の個々のドメイン内の既存のループ配列内に挿入されることができ、それにより１）ＸＴＥＮは、該ドメインの外側にループ化構造を形成し、かつ該ドメインの正常なアーキテクチャーを破壊せず；かつ２）ＸＴＥＮは、組み込まれた開裂部位の開裂によって放出されることができる。
【０１７０】
別の実施態様において、本発明は、ＦＶＩＩ配列のドメイン間、例えば、ＧｌａとＥＧＦ１との間、またはＥＧＦ１とＥＧＦ２との間、またはＥＧＦ２と活性化ペプチドとの間、または活性化ペプチドとプロテアーゼドメインとの間に配置される１つ以上のＸＴＥＮ、あるいは前述の任意の組み合わせを組み込むＦＶＩＩを含むＣＦＸＴＥＮを提供する。ＸＴＥＮは、表４、８、９、１０、１１、１２、および１３由来の配列と比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％またはそれより大きな配列同一性を有する配列を含むがこれらに限定されない３６〜＞１０００のアミノ酸残基の配列であり得る。一実施態様において、図５および図６に示されるように、ＸＴＥＮは、残基Ａｒｇ１５２‐Ｉｌｅ１５３間においてＥＧＦ２ドメインと単一の溶解性開裂部位トの間に組み込まれる。他の実施態様において、図５および図６において示されかつ実施例においてより完全に説明されるように、ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩ配列の個々のドメイン内の既存のループ配列内に挿入されることができ、それにより１）ＸＴＥＮは、該ドメインの外側にループ化構造を形成しかつ該ドメインの正常なアーキテクチャーを破壊せず；かつ２）ＸＴＥＮは、組み込まれた開裂部位の開裂によって放出されることができる。
【０１７１】
（２．第ＶＩＩ因子‐ＦＩＸ複合配列バリアント）
本発明は、野生型第ＶＩＩ因子を活性化しない凝血原プロテアーゼによって開裂可能な少なくとも１つの異種性配列を含む単離された第ＶＩＩ因子ポリペプチドを提供し、この場合、開裂の際に異種性配列である第ＶＩＩ因子ポリペプチドが活性化される。例えば、配列の一部に組み込まれまたは配列の一部を第ＩＸ因子由来の活性化ペプチドドメイン（ＡＰ）配列の第ＶＩＩ因子コンストラクト部分と置き換える第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子複合配列バリアントを有するＣＦＸＴＥＮは結果的に、凝固カスケードの内在性システムの一部として活性化されることのできる複合組成物を生じる。融合タンパク質のＣＦ成分と同じ第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントを組み込むＣＦＸＴＥＮは、ＣＦ成分が活性化されない組成物の対象への投与を可能にし、内在性凝固カスケードの惹起によってまたは自己活性化によって（後者は遅い過程である）活性化されるまで、プロテアーゼ阻害剤による不活性化に大きく抵抗性のある不活性の循環するデポーとしてとどまるので多量で投薬することができる。ＦＶＩＩ／ＦＩＸ複合配列に関する非限定例を、天然ＦＩＸおよびＦＶＩＩのものとの相同性を有する複合アミノ酸配列の当該部分を示す図３６に示す。いくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、ＦＩＸ活性化ペプチド配列の部分または全体を、ＦＶＩＩのプロテアーゼドメインのＮ末端側への、すなわち、全長の前駆体ポリペプチドの位置２１２におけるアルギニンまたは位置２１３におけるイソロイシンで始まるＮ末端に向けてのＦＶＩＩ配列についての１つまたは両方のＦＩＸ  ＡＰ開裂部位と置き換える第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントを含む。一実施態様において、第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列ＣＦは、完全長のＦＩＸ  ＡＰドメインに加え、ＦＩＸのＲ１４５‐Ａ１４６開裂部位およびＲ１８０‐Ｖ１８１開裂部位の片側または両側において隣接するアミノ酸残基に接する少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくとも約６、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１０、または少なくとも約１１、または少なくとも約１２のアミノ酸を組み込む（例えば、Ｎ末端側における１２の隣接するアミノ酸およびＣ末端側の５の隣接するアミノ酸の場合における配列ＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴ
ＲＶＶＧＧＥ）。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、Ｒ１４５‐Ａ１４６開裂部位に隣接する少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５の配列を含むＡＰの一部を組み込む第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントを含む（例えば、開裂部位のいずれかの側にある６の隣接するアミノ酸の場合におけるＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰ）。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、Ｒ１８０‐Ｖ１８１  ＡＰ開裂部位の片側または両側に隣接する少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５のアミノ酸の配列を含むＡＰの一部を組み込む第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントを含む（例えば、ＦＩＸ由来の開裂部位のＮ末端隣接における４のアミノ酸およびＣ末端としてのバリンの場合における該配列およびＤＦＴＲＶ）。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、融合タンパク質のＦＶＩＩ成分のＣ末端とＸＴＥＮ成分との間のリンカーと同じＡＰ配列をさらに含む本節の前述の任意の実施態様の第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアント；例えば、ＦＶＩＩバリアント‐ＡＰ配列‐ＸＴＥＮのＮ末端からＣ末端への立体配置を含み、それによりＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの移行のものによる同じ内在性凝固因子によるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質からの第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアント成分の放出を可能にする。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、ＦＶＩＩバリアント配列とＸＴＥＮとの間のリンカーとしての第ＸＩ因子開裂配列ＫＬＴＲＡＥＴをさらに含む本節の前述の任意の実施態様の第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントを含み、それにより内在性の凝固カスケードの開始によるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質からの第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアント成分の放出を可能にする。第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントからのＸＴＥＮの放出とともに、活性化された第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントが、無処置のＣＦＸＴＥＮと比較してより短い半減期を有し、それにより対象における組成物の安全性および許容性の余地を増大させるであろうことが期待される。本節の実施態様において、活性化された第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアント分子は、適切な任意のアッセイまたは本明細書で開示されるパラメータ（例えば、プロトロンビン時間または出血時間アッセイ）によって測定されるように、天然ＦＶＩＩａとして生物活性の少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を有することができる。
【０１７２】
なおも別の実施態様において、本発明は、連結されたＸＴＥＮを有さない、本節の前述の実施態様の第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントを提供し、内在性または外因性のいずれかの凝固カスケードによって活性化されることのできる第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子複合の循環するデポーとしての対象への投与を可能にする。一実施態様において、本発明は、表４３由来の配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９６％の配列同一性、または少なくとも約９７％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性を呈する全体的な配列を有する組み込まれたＦＩＸ由来の配列を有する第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントをＣＦＸＴＥＮに提供する。別の実施態様において、本発明は、ＸＴＥＮを有さない表４３由来の配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を呈する配列を有する組み込まれたＦＩＸ由来の開裂配列（ＸＴＥＮ非含有）を第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列バリアントに提供する。
【０１７３】
第ＶＩＩ因子‐第ＩＸ因子配列を含むＣＦＸＴＥＮは、本明細書に説明されるようなアッセイ又はインビボでのパラメータ（例えば、インビトロでの凝固アッセイまたは血友病モデルにおける薬力学的効果）を用いて生物活性について評価することができ、相応の天然ＦＶＩＩ配列と比較して少なくとも約４０％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％または
それより大きな活性を保持する該配列は、対象のＣＦＸＴＥＮにおける包含に好適と考えられる。好適なレベルの活性を保持することが見出されたＣＦは、上記に説明される１つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結することができる。一実施態様において、好適なレベルの活性を保有することが見出されたＣＦは、表４由来の配列と少なくとも約８０％の配列同一性を、あるいは表４の配列と比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する１つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結して、結果的にキメラ融合タンパク質を生じることができる。
【０１７４】
（３．ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質立体配置）
本発明は、特異的なＮ末端からＣ末端への立体配置において連結されたＣＦ成分およびＸＴＥＮ成分を有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供する。いくつかの実施態様において、１つ以上のＣＦは、１つ以上のＸＴＥＮに、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにおいて、スペーサーを用いてまたは用いずに連結され、ブロックコポリマーを形成し、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質におけるＣＦおよびＸＴＥＮの配列配置は、ブロックコポリマー化学物質において公知の立体配置と同じである。２つ以上のＣＦ、ＸＴＥＮ、またはスペーサーがある場合、ＣＦ、ＸＴＥＮまたはスペーサーの各々は、同じかまたは異なる配列を有し、ＣＦおよび／またはＸＴＥＮは、連続的にまたは交互に（規則的にまたは不規則に）のいずれかで連結される。したがって、本明細書に提供される処方すべてにおいて、２つ以上のＣＦ、ＸＴＥＮ、またはスペーサーがある場合、ＣＦ、ＸＴＥＮ、およびスペーサーの各々は同じかまたは異なる。いくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、１つのＸＴＥＮポリペプチドに連結されたＣＦとの単量体融合タンパク質である。他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、２つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結されたＣＦとの単量体融合タンパク質である。さらに他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、１つのＸＴＥＮポリペプチドに連結された２つ以上のＣＦとの単量体融合タンパク質である。さらに他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、２つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結された２つ以上のＣＦとの単量体融合タンパク質である。さらに他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮがＣＦ配列内に（例えば、図２および図５に示されるような１つ以上のドメイン間などのＦＩＸ配列内に）配置された単一のＣＦとの単量体融合タンパク質である。表６は、本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質によって包含される立体配置の非限定例を提供し、本明細書に開示されるまたは当該技術分野で公知のスペーサーおよび開裂配列の組み込みを含む数多くの他の変形は、当業者に明らかである。
【０１７５】
【表６】
2013502459.tif 000015
＊１つの成分について単一であるかまたは２つ以上の該成分について複数であることを特徴とする。
＊＊増殖因子成分およびＸＴＥＮ成分のＮ末端からＣ末端への立体配置を反映
【０１７６】
本発明は、表１または表２から選択される単一のまたは複数のＣＦ（またはその断片もしくは配列バリアント）、表６に示される立体配置にある表４から選択される単一のまたは複数のＸＴＥＮ（またはその配列バリアント）を含むがこれらに限定されないＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を熟慮する。単一のＸＴＥＮに連結される単一のＣＦを含む融合タンパク質の配列に関する非限定例を表４１に呈する。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ組成物は、表４１由来のＣＦＸＴＥＮと比較して少なくとも約８０％の配列同一性を
、あるいは、表４１由来のＣＦＸＴＥＮと比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むであろう。一般的に、結果として生じるＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦの生物活性の少なくとも一部を保有する。本節において説明された先の前述の融合タンパク質において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、表７由来の開裂配列をさらに含むことができ、開裂配列は、ＣＦとＸＴＥＮとの間に、または（２つ以上のＣＦがＣＦＸＴＥＮに含まれる場合、）隣接するＣＦ間に配置される。いくつかの場合において、開裂配列を含むＣＦＸＴＥＮはまた、ＣＦと開裂配列の間にまたはＸＴＥＮと開裂配列の間に１つ以上のスペーサー配列アミノ酸を有し、プロテアーゼのアクセスを容易にし、該スペーサーアミノ酸は、グリシンおよびアラニンを好ましいアミノ酸として含めた任意の天然アミノ酸を含む。ＣＦ、ＸＴＥＮ、開裂配列（複数可）、およびスペーサーアミノ酸を含むＣＦＸＴＥＮの非限定例を表４２に呈する。しかしながら、本発明は、表１および表２の任意のＣＦ配列と表４２のＣＦ配列との置換、表４の任意のＸＴＥＮ｝配列と表４２のＸＴＥＮ配列との置換、および表７の任意の開裂配列と表４２の開裂配列との置換も熟慮する。１つ以上の開裂配列を有するＣＦＸＴＥＮ実施態様において、ＣＦ成分は、下記により完全に説明される開裂配列（複数可）の開裂によるＸＴＥＮからのＣＦの放出の際に、生物学的に活性となるかまたは活性の亢進を有するかのいずれかである。
【０１７７】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の一実施態様において、本発明は、式Ｉの融合タンパク質を提供する：
（ＸＴＥＮ）ｘ−ＣＦ−（ＸＴＥＮ）ｙ        Ｉ
式中、各発生について独立して、ＣＦは凝固因子であり、ｘは０または１のいずれかであり、かつｙは０または１のいずれかであり、この場合ｘ＋ｙ≧１であり、かつＸＴＥＮは伸長した組換えポリペプチドである。
【０１７８】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式ＩＩの融合タンパク質を提供する：
（ＸＴＥＮ）ｘ−（ＣＦ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）  ｙ      ＩＩ
式中、各発生について独立して、ＣＦは凝固因子ａであり、Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｘは０または１のいずれかであり、かつｙは０または１のいずれかであり、この場合ｘ＋ｙ≧１であり、かつＸＴＥＮは伸長した組換えポリペプチドである。
【０１７９】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、単離された融合タンパク質を提供し、この場合、融合タンパク質は、式ＩＩＩからなる：
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＣＦ）−（Ｓ）ｙ  −（ＸＴＥＮ）ｙ    ＩＩＩ式中、各発生について独立して、ＣＦは凝固因子であり、Ｓは開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｘは０または１のいずれかであり、かつｙは０または１であり、この場合ｘ＋ｙ≧１であり、かつＸＴＥＮは、伸長した組換えポリペプチドである。
【０１８０】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式ＩＶの単離された融合タンパク質を提供する：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ  ＩＶ式中、各発生について独立して、ＧｌａはＦＩＸのＧｌａドメインであり、ＥＧＦ１は、ＦＩＸのＥＧＦ１ドメインであり、ＥＧＦ２は、ＦＩＸのＥＦＧ２ドメインであり、ＡＰは、ＦＩＸの活性化因子ペプチドであり；  ＰＲＯは、ＦＩＸのプロテアーゼドメインで
あり、Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｕは、０または１のいずれかであり、ｖは０または１のいずれかであり、ｘは０または１のいずれかであり、ｙは０または１のいずれかであり、ｚは０または１のいずれかであり、ただし、ｕ＋ｖ＋ｘ＋ｚ≧１でありかつＸＴＥＮが伸長した組換えポリペプチドであることという条件付きである。
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式Ｖの単離された融合タンパク質を提供する：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＡＰ１）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ２）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ  
Ｖ
式中、各発生について独立して、ＧｌａはＦＩＸのＧｌａドメインであり、ＥＧＦ１は、ＦＩＸのＥＧＦ１ドメインであり、ＥＧＦ２は、ＦＩＸのＥＦＧ２ドメインであり、ＡＰ１は、ＡＰドメインの第一の天然開裂配列を含むＦＩＸの活性化因子ペプチドドメインのＮ末端配列部分であり、ＡＰ２は、ＡＰドメインの第二の天然開裂配列を含むＦＩＸの活性化因子ペプチドドメインのＣ末端配列部分であり、ＰＲＯは、ＦＩＸのプロテアーゼドメインであり、Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｕは、０または１のいずれかであり、ｖは０または１のいずれかであり、ｗは０または１のいずれかであり、ｘは０または１のいずれかであり、ｙは０または１のいずれかであり、ｚは０または１のいずれかであり、ただし、ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｚ≧１でありかつＸＴＥＮが伸長した組換えポリペプチドであることという条件付きである。
【０１８１】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式ＶＩの単離された融合タンパク質を提供する：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）ｙ        ＶＩ
式中、各発生について独立して、ＧｌａはＦＶＩＩのＧｌａドメインであり、ＥＧＦ１は、ＦＶＩＩのＥＧＦ１ドメインでありＥＧＦ２はＦＶＩＩのＥＦＧ２ドメインであり、ＰＲＯはＦＶＩＩのプロテアーゼドメインであり、Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｕは０または１のいずれかであり、ｖは０または１のいずれかであり、ｘは０または１のいずれかであり、ｙは０または１のいずれかであり、かつＸＴＥＮは伸長した組換えポリペプチドである。
【０１８２】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の別の実施態様において、本発明は、式ＶＩＩの単離された融合タンパク質を提供する：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｔ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ２）−（ＡＰ１）ｖ−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ２）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ  ＶＩＩ式中、各発生について独立して、ＧｌａはＦＶＩＩのＧｌａドメインであり、ＥＧＦ１はＦＶＩＩのＥＧＦ１ドメインであり、ＥＧＦ２はＦＶＩＩのＥＦＧ２ドメインであり、ＰＲＯは、ＦＶＩＩのプロテアーゼドメインであり、ＡＰ１は、天然開裂配列を含むＦＩＸの活性化因子ペプチドドメインのＮ末端配列部分であり、ＡＰ２は、天然開裂配列を含むＦＩＸの活性化因子ペプチドドメインのＣ末端配列部分であり、Ｓは、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、ｔは０または１のいずれかであり、ｕは０または１のいずれかであり、ｖは０または１のいずれかであり、ｘは０または１のいずれかであり、ｙは０または１のいずれかであり、ｚは０または１のいずれかであり、ＸＴＥＮは伸長した組換えポリペプチドである。該実施態様において、第ＶＩＩ因子バリアントには、第ＩＸ因子の活性化因子ペプチドドメイン由来の１つまたは両方の開裂配列、例えば、下記により完全に説明されるように、Ｒ１４５‐Ａ１４６開裂部位に隣接する少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４
、または少なくとも約５のアミノ酸からなる配列（例えば、５の隣接するアミノ酸の場合、配列ＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰ）、およびＲ１８０‐Ｖ１８１開裂部位に隣接する少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５のアミノ酸からなる配列（例えば、５の隣接するアミノ酸の場合、配列ＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤ）を含むことができる。、あた、本発明は、第ＶＩＩ因子バリアントのＡＰ配列についての表７の任意の他の開裂配列の置換を熟慮する。
【０１８３】
式Ｖおよび式ＶＩの実施態様は、第ＩＸ因子および第ＶＩＩ因子のＣＦＸＴＥＮ立体配置をそれぞれ包含し、この場合、約３６アミノ酸〜≧１０００アミノ酸にわたる長さの１つ以上のＸＴＥＮ（例えば、表４および９〜１３から選択される配列）は、第ＩＸ因子配列または第ＶＩＩ因子配列の隣接するドメイン間にそれぞれ挿入および連結される。本発明は、表７から選択される追加的な開裂配列を任意に介して、追加的なＸＴＥＮをＦＩＸまたはＦＶＩＩのＣ末端に任意に連結して結果的にＣＦＸＴＥＮ組成物を生じることで、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩのいずれかのドメイン間のＸＴＥＮの挿入に関して起こり得るすべての順列を熟慮し、これに関する非限定例を図２、図５、および図６に描く。本節に説明される先の前述の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、凝固因子関連の疾患、障害、または容態の治療における治療薬としての使用についての立体配置の好適性を決定するために、本明細書に開示される任意の適切なインビトロアッセイ（例えば、表４０のアッセイまたは実施例において説明されるアッセイ）を用いて、生物活性の保持（任意の組み込まれたＸＴＥＮ放出開裂部位の開裂後を含む）について評価されることができる。
【０１８４】
いくつかの実施態様において、治療有効量の式Ｉ〜ＶＩＩのうちの１つの融合タンパク質の投与を必要とする対象への該融合タンパク質の投与は結果的に、ＸＴＥＮに連結されておらずかつ対象に投与されるかなりの量で投与される相応のＣＦと比較して、該融合タンパク質について終末半減期における少なくとも２倍、または終末半減期の少なくとも３倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも４０倍、もしくは少なくとも１００倍の延長を生じる。いくつかの実施態様において、治療有効量の式Ｉ〜ＶＩＩのうちの１つの融合タンパク質の投与を必要とする対象への該融合タンパク質の投与は結果的に、ＸＴＥＮ［に連結されておらずかつ対象に投与されるかなりの量で投与される相応のＣＦと比較して、融合タンパク質についての治療ウィンドウ内で経過する少なくとも２倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも４０倍、もしくは少なくとも１００倍もしくはそれより長い時間の延長を生じる。他の実施態様において、治療有効量の式Ｉ〜ＶＩＩのうちの１つの融合タンパク質の投与を必要とする対象への該融合タンパク質の投与は結果的に、ＸＴＥＮに連結されておらずかつかなりの用量で投与されるＣＦと比較して、連続的な用量間で少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約７日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間の治療有効量の血中レベルの融合タンパク質を維持するのに必要な連続した用量間の時間の延長を生じることができる。
【０１８５】
任意のスペーサー配列基は、本発明によって包含される対象の融合タンパク質に任意に導入される。スペーサーは、ＣＦ成分がその所望の三次構造を仮定し得および／またはその標的基質と適切に相互作用し得るよう、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を亢進しまたは立体障害を低下させるために提供される。スペーサーおよび望ましいスペーサーを同定する方法については、例えば、本明細書に引用により具体的に組み込まれているＧｅｏｒｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １５：８７１−８７９を参照されたい。一実施態様において、スペーサーは、長さ１〜５０のアミノ酸残基、または長さ約１〜２５残基もしくは約１〜１０残基である１つ以上の
ペプチド配列を含む。スペーサー配列は、開裂部位を除き、２０の任意の天然Ｌ型アミノ酸を含むことができ、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）を含むことができるがこれらに限定されない立体的に妨げられていない親水性アミノ酸を好ましくは含む。いくつかの場合、スペーサーは、ポリグリシンもしくはポリアラニンであり得、または主としてグリシン残基およびアラニン残基の組み合わせの混合物である。開裂配列を除くスペーサーポリペプチドは、主として二次構造を、例えば、Ｃｈｏｕ‐ＦａｓｍａｎアルゴリズムおよびＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、約１０％未満、または約５％未満、実質的に欠くこととなる。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物におけるスペーサー配列は、同一であるかまたは異なる１つ以上の開裂配列をさらに含み、この場合、開裂配列は、融合タンパク質からＣＦを放出するためのプロテアーゼによって作用され得る。
【０１８６】
いくつかの実施態様において、開裂配列のＣＦＸＴＥＮへの組み込みは、ＸＴＥＮからのＣＦの報酬つの際に活性となるかまたはより活性のあるＣＦの放出を可能にするよう設計され、例えば、ＣＦ成分の酵素活性は増大する。先の１つの実施態様において、放出後に活性となるＣＦは、ＦＩＸまたはその配列バリアントである。先の別の実施態様において、放出後に活性となるＣＦは、ＦＶＩＩまたはその配列バリアントである。開裂配列は、ＣＦ配列に十分近くに、一般的にＣＦ配列末端の１８アミノ酸内に、または１２アミノ酸内に、または６アミノ酸内に、または２アミノ酸内に配置され、それにより開裂後にＣＦに付着した任意の残余残基は、（例えば、リガンドもしくは基質への結合などの）活性にそれほど干渉せず、開裂配列の開裂を有効にすることができるようプロテアーゼに対する十分なアクセスをなおも提供する。いくつかの実施態様において、開裂部位は、ＣＦＸＴＥＮが、対象への投与後に開裂されることができるよう、哺乳類対象に対して内在性のプロテアーゼによって開裂されることのできる配列である。このような場合、ＣＦＸＴＥＮは、ＣＦのためのプロドラッグまたは循環デポーとして機能することができる。一実施態様において、開裂配列の開裂によって融合タンパク質から放出されるＣＦは、無処置のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質と比較して、ＣＦの天然基質についての酵素活性の少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍の亢進を呈する。
【０１８７】
本発明によって熟慮される開裂部位の例には、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ‐２、グランザイムＢ、ＭＭＰ‐１２、ＭＭＰ‐１３、ＭＭＰ‐１７、もしくはＭＭＰ‐２０から選択される哺乳類内在性プロテアーゼによって、またはＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（リノウイルス３Ｃプロテアーゼ）、およびソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）Ａなどの非哺乳類プロテアーゼによって開裂可能なポリペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。先のプロテアーゼおよびその他によって開裂されることが公知の配列は、当該技術分野で公知である。例示的な開裂配列および該配列内の切断部位を表７に、その配列バリアントと同様に呈する。例えば、トロンビン（活性化型凝固因子ＩＩ）は、配列ＬＴＰＲＳＬＬＶに作用し［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，
ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］、該配列は、該配列における位置４のアルギニンの後ろで切断される。活性化型ＦＩＩａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でＦＸａによるＦＩＩの開裂によって生じ、凝固経路における第ＩＸ因子から下流である。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、フィブリノーゲンを開裂することであり、次にフィブリノーゲンは順に、凝固形成を始める。ＦＩＩａ活性は、きっちりと制御され、凝固が適切な止血に必要な場合に生じるにすぎない。しかしながら、凝固が哺乳類において進行中の過程である場合、ＣＦＸＴＥＮへのＬＴＰＲＳＬＬＶ配列の組み込みおよびＣＦ成分とＸＴＥＮ成分との間の連結によって、凝固が生理学的に必要とされる場合に、ＸＴＥＮは、外因性のまたは
内在性のいずれかの凝固経路の活性化と同時に、隣接するＣＦから除去され、それにより経時的にＣＦを放出する。同様に、内在性プロテアーゼによって作用されるＣＦＸＴＥＮへの他の開裂配列、特に表７に列挙される活性化された凝固タンパク質に対して感受性のある該開裂配列の組み込みは、ＣＦＸＴＥＮに関するある実施態様において、無処置の形態のＣＦＸＴＥＮから放出されるＣＦ成分についてのより高い程度の活性を提供するＣＦの持続的な放出を提供するであろう。一実施態様において、本発明は、開裂の際に融合タンパク質からＣＦを放出するよう作用可能に配置された１つ以上の開裂配列を含むＣＦＸＴＥＮを提供し、この場合、１つ以上の開裂配列は、表７から選択される配列と少なくとも約８６％、または少なくとも約９２％、またはそれより大きな配列同一性を有する。別の実施態様において、開裂配列を含むＣＦＸＴＥＮは、表４２から選択される配列と比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するであろう。
【０１８８】
いくつかの実施態様において、切断部位の両側に隣接する２つまたは３つのアミノ酸のみ（合計４〜６のアミノ酸）が、開裂配列に組み込まれ、該開裂配列は順に、該実施態様のＣＦＸＴＥＮに組み込まれる。他の実施態様において、公知の開裂配列は、公知の配列における１つ以上の欠失もしくは挿入、または１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸の任意の１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸との置換を有し、この場合、欠失、挿入、または置換は、低下または亢進した許容性を結果的に生じるが、プロテアーゼに対する許容性の不在を生じず、ＸＴＥＮからのＣＦの放出の速度を仕立てる能力を結果として生じる。例示的な置換を表７に示す。
【０１８９】
【表７】
2013502459.tif 000016
↓は、開裂部位を示す。  ＮＡ：適用不可能
＊スラッシュの前、間、または後の複数のアミノ酸の列挙は、該位置において置換されることのできる代替アミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸が、中央の列に示される相応のアミノ酸と置換され得ることを示す。
【０１９０】
（ａ）ＣＦＸＴＥＮの薬物動態特性
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して増大した薬物動態を有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。所与のＸＴＥＮをＣＦに連結することによって増大することのできるＣＦの薬物動態特性には、終末半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ、分布の大きさ、および生物学的利用能；凝固因子と関連した障害、疾患、および関連した容態の治療において増大した有用性を提供する特性が挙げられるが、これらに限定されない。増大した特性の結果として、ＣＦＸＴＥＮは、本明細書に説明される方法によって組成物に適切であると決定された用量および用量投与計画で用いられる場合、所望の薬理学的効果を結果的に生じる循環濃度を達成することができ、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦの同等な用量と比較して、組成物の生物活性成分についての安全な範囲内に延長した時間、なおもとどまる。このような場合、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して融合タンパク質組成物のための治療ウィンドウ内に延長した時間とどまり、対象に同等な用量で投与される。本明細書で使用する場合、「同等な用量」は、同等な様式で対象に投与される活性のあるＣＦファルマコフォア（例えば、ＦＩＸまたはＦＶＩＩ）について等価のモル／ｋｇの用量を意味する。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の「同等な薬用量」が、薬剤のより大きな重量を表すであろうが、投与される融合タンパク質の用量におけるＣＦの本質的に同じモル当量を有するであろうことは、当該技術分野において理解される。
【０１９１】
いくつかの実施態様において、薬物動態特性の増大したＣＦＸＴＥＮは、表４１、表４２、または表４３の任意の１つから選択されるタンパク質配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列であり得る。他の実施態様において、薬物動態特性の増大したＣＦＸＴＥＮは、表４由来の配列と比較して少なくとも約８０％の配列同一性をまたはそれに代わるものとして、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有する１つ以上のＸＴＥＮに連結された、表１由来のまたは表２由来の配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、表４由来の配列と比較して、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有するＣＦ配列を含むことができる。本発明の組成物について、半減期のより長いＣＦＴＥＮが一般的に好ましく、それにより患者の簡便さを改良し、用量間の間隔を延長し、および持続した効果を達成するの必要な薬物の量を減少させる。本節において説明される前述の実施態様において、融合タンパク質の投与は、融合タンパク質に連結されておらずかつ対象に同等な単位用量または用量投与計画で投与される相応のＣＦ成分と比較して、融合タンパク質のモルにおけるより低い単位用量を用いて、（対象の疾患、容態、または障害を評価するのに有用であるような本明細書に開示される）パラメータの少なくとも１つにおける改良を結果的に生じる。前述の実施態様において、改良を達成するために投与されるモルにおける総用量は、融合タンパク質に連結されていない相応のＣＦ成分と比較して、少なくとも約３倍低いか、または少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約６倍、もしくは少なくとも約８倍、もしくは少なくとも約１０倍低い。
【０１９２】
ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の薬物動態特徴に関係する実施例においてより完全に説
明されるように、ＸＴＥＮ配列の長さを増大させることは、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の終末半減期の不相応な延長を与えることが観察された。したがって、本発明は、ＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、この場合、融合タンパク質に連結されておらずかつ同等な用量で投与される相応のＣＦと比較して、対象に投与されるＣＦＸＴＥＮについての終末半減期の延長を与えるよう選択され、この場合、延長は、融合タンパク質に連結されていないＣＦと比較して、少なくとも約２倍長いか、または少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約６倍、もしくは少なくとも約７倍、もしくは少なくとも約８倍、もしくは少なくとも約９倍、もしくは少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１５倍、もしくは少なくとも約２０倍、もしくは少なくとも約４０倍、もしくは少なくとも約８０倍、もしくは少なくとも約１００倍、もしくはそれより長い終末半減期の延長である。外来的に投与される第ＩＸ因子は、およそ１８〜２４時間のヒトにおける終末半減期を有することが報告されており（Ｍｏｒｆｉｎｉ，  Ｍ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．  （２００８）  ６（ｓ２）：  ｓ２１−ｓ２５）、外来的に投与される第ＶＩＩ因子は、およそ４〜６時間の終末半減期を有することが報告されている（Ｋｌｉｔｇａａｒｄ  Ｔ，  Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  （２００８）  ６５（１）：３−１１）のに対し、実施例において説明されるように、動物に実験的に投与された本明細書に開示される種々のＣＦＸＴＥＮ組成物は、かなりより長い終末半減期値を結果的に生じた。一実施態様において、本発明は、ＸＴＥＮに連結されておらずかつ同等な用量で対象に投与される相応のＣＦと比較して少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％、または少なくとも約５００％、または少なくとも約１０００％、または少なくとも約２０００％のＡＣＵの増大を呈するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。ＣＦＸＴＥＮの薬物動態パラメータは、投薬、回数間の血液試料の採取、およびタンパク質のアッセイを、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ラジオアッセイ、または当該技術分野で公知のもしくは本明細書に説明される他の方法を用いた後、半減期および他のＰＫパラメータを派生させるためのデータの標準的な算出によって決定することができる。
【０１９３】
増大したＰＫパラメータによって、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して、ＣＦＸＴＥＮ組成物の減少した投薬が可能となる。いくつかの実施態様において、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較して、より少量のモル量の約２倍低い、または約３倍低い、または約４倍低い、または約５倍低い、または約６倍低い、または約８倍低い、または約１０倍低いもしくは高い融合タンパク質が、止血を維持するために必要とされる用量投与計画の下で投与され、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のモル量のＣＦとしての同等な曲線下面積を達成する。他の実施態様において、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていないさもなくば同じ投薬量の相応のＣＦの毎日の投与と比較して、対象に投与される約２日間ごとの、約７日間ごとの、約１４日間後との、約２１日間ごとの、または約毎月のあまり頻繁ではない投与計画の融合タンパク質を有し、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦとして同等な曲線下面積を達成する。なおも他の実施態様において、ＸＴＥＮに連結されていない相応のモル量のＣＦと比較して、累積的なより少量のモル量の約５％、または約１０％、または約２０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％未満の融合タンパク質が、止血を維持するのに必要とされる用量投与計画の下で、対象に投与され、なおも融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦとしての少なくとも同等な曲線下面積を達成する。累積的なより少量のモル量は、少なくとも約１週間、または約１４日間、または約２１日間、または約１ヶ月間の期間についての測定基準である。
【０１９４】
本発明は、１つ以上の開裂配列、例えば表７由来の配列によってＸＴＥＮ配列から分離
されたＣＦ分子を含むＣＦＸＴＥＮを提供する。いくつかの実施態様において、無処置のＣＦＸＴＥＮ組成物は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較して、その無処置の形態においてより低い活性を有するが、より長い半減期を有すするが、対象への投与の際に、ＣＦ成分が内在性プロテアーゼによる開裂配列（複数可）における開裂によって融合タンパク質から徐々に放出され、そうすると、ＣＦ成分が活性、すなわち、その標的凝固タンパク質基質に効果的に結合し活性化する能力を呈するよう設計される。非限定例において、開裂配列を有するＣＦＸＴＥＮは、表４２由来の配列と比較して約８０％の配列同一性を、または表４２由来の配列と比較して約８５％、もしくは約９０％、もしくは約９５％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有する。したがって、本節における前述の実施態様のＣＦＸＴＥＮは、プロドラッグまたは循環するデポーとして機能し、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較してより長い終末半減期を結果的に生じる。このような場合、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較してより高濃度のＣＦＸＴＥＮを対象に投与することができ、その理由は、より小さな割合の循環している組成物が活性となっているからである。
【０１９５】
（ｂ）ＣＦＸＴＥＮの薬理学および医薬特性
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して亢進した特性を有することのできるＸＴＥＮに共有結合したＣＦを含むＣＦＸＴＥＮ組成物、ならびに該組成物の個々の２つのＣＦ成分の治療的および／もしくは生物学的活性もしくは効果を亢進する方法を提供する。加えて、本発明は、アルブミン、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、より短い長さのポリペプチド、および／または反復性配列を有するポリペプチドパートナーを含む当該技術分野で公知の融合タンパク質と比較して、亢進した特性を有するＣＦＸＴＥＮ組成物を提供する。加えて、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ペグ化したコンストラクトなど、化学的抱合体を上回る有意な利点を提供し、組換えＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質が、生成物の研究および開発および製造のいずれの段階の時間および経費も削減することができる細菌細胞発現系において作製されることができ、結果的に、ペグ化した抱合体と比較してＣＦＸＴＥＮの生成物および代謝産物の両方についての毒性のあまりない、より均質な規定された生成物を生じるという事実で明らかである。
【０１９６】
治療薬として、ＣＦＸＴＥＮは、以下の非限定的である例示的な亢進した特性の１つ以上を含む、ＸＴＥＮを含まない治療薬を上回るいくつかの利点を有する：増大した溶解度、増大した熱安定性、低下した免疫原性、増大した見かけの分子量、低下した腎クリアランス、低下したタンパク質分解、低下した代謝、亢進した治療効率、より低い有効治療用量、増大した生物学的利用能、ＣＦについての治療ウィンドウ内に血中レベルを維持することのできる薬用量間の延長した時間、皮下もしくは筋肉内に投与した場合の「仕立てられた」吸収速度、亢進した凍結乾燥安定性、亢進した血清／血漿安定性、延長した終末半減期、血流における増大した溶解度、中和抗体による低下した結合、低下した活発なクリアランス、低下した副作用、基質結合親和性の保持、分解に対する安定性、凍結融解に対する安定性、プロテアーゼに対する安定性、ユビキチン化に対する安定性、投与の容易さ、他の医薬賦形剤もしくは担体との適合性、対象における残留性、保管における増大した安定性（例えば、延長した有効期間）、生物もしくは環境における低下した毒性、およびこれらに類すること。亢進した特性の正味の効果は、ＣＦＸＴＥＮ組成物の使用が、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して亢進した治療的および／もしくは生物学的効果を結果として生じることができ、または凝固因子と関連した疾患もしくは障害を有する対象に投与される場合、改良した患者の服薬順守を結果的に生じることができることである。
【０１９７】
発現したタンパク質の物理的特性および構造特性を測定するための具体的なアッセイおよび方法は、当該技術分野において公知であり、タンパク質の凝集、溶解度、二次構造および三次構造、融解特性、混入、および水分含有量などの特性を決定するための方法を含む。このような方法には、分析的遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ‐イオン交換、ＨＰＬＣ‐
分子ふるい、ＨＰＬＣ‐逆相、光散乱、毛細管電気泳動、円二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ‐イオン交換、ＨＰＬＣ‐分子ふるい、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折分析、およびＵＶ／可視光分光法を含み、これらのうちのいくつかは、実施例において説明されるように、本発明のＣＦＸＴＥＮに適用される。追加的な方法は、Ａｒｎａｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ  （２００６）  ４８，  １−１３に開示されている。本発明の組成物の亢進した特性を解明するためのこれらの方法の適用は、当業者の理解内である。
【０１９８】
一実施態様において、融合パートナーとしてのＸＴＥＮは、ＣＦ負荷量の溶解度を増大させる。したがって、水中での溶解度または安定性の程度など、ＣＦの医薬特性または物理化学的特性の亢進が所望である場合、融合タンパク質に組み込まれたＸＴＥＮ配列の長さおよび／またはモチーフファミリー組成物は、個々の融合タンパク質に異なる程度の溶解度および／または安定性を与えるよう各々選択され得、それにより、ＣＦＸＴＥＮ組成物の全体的な医薬特性が亢進される。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書に説明される方法を用いて構築およびアッセイされ、必要とされる場合に所望の特性を結果的に生じるよう調整された物理化学的特性およびＸＴＥＮを確認することができる。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質が、融合タンパク質に連結されていないＣＦと比較して少なくとも約２５％大きいかまたは、融合タンパク質に連結されていない相応のＣＦよりも少なくとも約３０％、もしくは少なくとも４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約１００％、もしくは少なくとも約２００％、もしくは少なくとも約３００％、もしくは少なくとも約４００％、もしくは少なくとも約５００％、もしくは少なくとも約１０００％大きな内にある水性溶解度を有するよう選択される。
【０１９９】
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較して亢進した溶解度および回復の容易さを有する、宿主細胞から発現したＣＦＸＴＥＮを生成および回収する方法を提供する。いくつかの実施態様において、該方法には、真核宿主細胞を、約２００よりも大きな、または約４００よりも大きな、または約６００よりも大きな、または約８００よりも大きなアミノ酸残基の累積的配列長の１つ以上のＸＴＥＮ成分を有するＣＦＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドで形質転換する工程、宿主細胞においてＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を発現させる工程、および発現した融合タンパク質を可溶性形態で回収する工程を含む。本節において説明される先の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、表４から選択される１つ以上のＸＴＥＮと比較して、少なくとも  約  ８０％の配列同一性を、または約９０％、もしくは約９１％、もしくは約９２％、もしくは約９３％、もしくは約９４％、もしくは約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％、最大約１００％の配列同一性を有することができ、ＣＦは、表１または表２から選択されるＣＦと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性を、または約９０％、もしくは約９１％、もしくは約９２％、もしくは約９３％、もしくは約９４％、もしくは約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％、もしくは１００％の配列同一性を有することができ、ＣＦＸＴＥＮ成分は、式Ｉ〜ＶＩＩから選択されるＮ末端からＣ末端への立体配置にあることができる。
【０２００】
一実施態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ組成物および、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦの同等な薬用量と比較してより長い時間、治療ウィンドウ内にＣＦ成分を維持することのできる該組成物を作製するための方法を提供する。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の「同等な薬用量」は、より大きな薬剤重量を表すであろうが、融合タンパク質の用量における同じ概算モル等価量のＣＦを有するであろうし、および／またはＣＦに対する同じ概算モル濃度を有するであろうことは、当該技術分野において理解される。治療ウィンドウ内にＣＦ成分を維持することのできる組成物を作製する方法には、ＣＦとの抱合
に適したＸＴＥＮを選択して、所与の用量および用量投与計画を提供する工程、ＣＦＸＴＥＮの投与を必要とする対象へのＣＦＸＴＥＮの投与の工程、それに続く投与された組成物の薬物動態特性、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の活性、および安全性を確認するアッセイの工程を含む。該方法によって、本明細書に提供されるＣＦＸＴＥＮは、治療ウィンドウ内にＣＦの循環する濃度を延長した時間維持することによって、投与された組成物の増大した効能を可能にする。本明細書で使用する場合、「治療ウィンドウ」は、許容し得ない毒性を伴わずに、疾患または容態に効能または所望の薬理学的効果を経時的に提供する血中濃度範囲または血漿濃度範囲、すなわち、任意の生の治療効果を達成するための最少量と（より高い用量または濃度で）対象に対する毒性の直前の応答である応答を結果的に生じる最大量との間の循環血中濃度の範囲としての薬物または生物の量を意味する。加えて、治療ウィンドウは一般的に、時間の態様；許容し得ない毒性もしくは有害事象を結果的に生じない所望の薬理学的効果を経時的に結果的に生じる最大濃度および最小濃度を包含する。また、対象のために治療ウィンドウ内に留まる投薬された組成物は、「安全範囲」内であるといわれ得る。
【０２０１】
結果として生じる機能的特徴または生物学的および薬理学的な活性およびパラメータを含む本発明のＣＦＸＴＥＮ組成物の特徴は、所望の特徴を測定するために、当該技術分野で公知の任意の好適なスクリーニングアッセイによって決定することができる。本発明は、ＣＦＸＴＥＮに所望の程度の生物活性および／または治療活性ならびに安全特性を提供するために、異なる組成または立体配置のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をアッセイする方法を提供する。具体的なインビボおよびエクスビボでの生物学的アッセイを用いて、ＣＦＸＴＥＮに組み込まれるべき構築されたＣＦＸＴＥＮおよび／またはＣＦ成分の各々活性を評価し、該アッセイには、実施例のアッセイ、表４０のアッセイ、ならびに以下のアッセイまたはＣＦの特性および効果をアッセイするための当該技術分野で公知の他のこのようなアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。プロトロンビン（ＰＴ）および活性化型部分的プロトロンビン（ａＰＴＴ）アッセイ（Ｂｅｌａａｏｕａｊ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （２０００）  ２７５：２７１２３−８；  Ｄｉａｚ−Ｃｏｌｌｉｅｒ  ＪＡ．  Ｈａｅｍｏｓｔ  （１９９４）  ７１：３３９−４６）、血液凝固時間（ＷＢＣＴ）、血栓弾性描写法、または出血時間アッセイなど、凝固活性の決定を可能にする機能的アッセイを実施することができる。他の考えられ得るアッセイは、米国特許第５，５３４，６１７号に説明されるような、チップ結合型受容体もしくは結合タンパク質を有するビアコアアッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ、本明細書の実施例に説明されるアッセイ、放射性受容体アッセイ、または当該技術分野で公知の他のアッセイなどの結合アッセイまたは競合的結合アッセイを用いてアッセイされることのできる相応のＣＦの標的基質に対するＣＦＸＴＥＮの結合親和性を決定し得る。前述のアッセイを用いて、（単一の成分としてまたはＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイされる）ＣＦ配列バリアントを評価することもでき、該バリアントがＣＦＸＴＥＮに含まれるのに好適であるよう、該バリアントが、天然のＣＦまたはそのいくらかの断片と同じ程度の生物活性を有するかどうかを決定することができ、天然ＣＦと比較して、例えば少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の活性である。
【０２０２】
用量の最適化は、すべての薬物にとって、特に狭い治療ウィンドウを有する薬物にとって重要である。例えば、多様な症状または異常な臨床的パラメータを呈するすべての患者のための標準化された単一用量のＣＦは、必ずしも常に有効ではないかもしれない。これらの因子の考慮は、許容し得ない毒性を結果的に生じかつ安全性範囲の外側となるであろう量または臨床的改良が達成されないような不十分な効力と対比して、治療有効量または薬理学的有効量のＣＦＸＴＥＮを決定する目的のための、人並みに熟達した臨床医の範囲内に十分ある。
【０２０３】
多くの場合、異なる齢または疾患の程度の対象におけるＣＦのための治療ウィンドウが確立されており、および公表された文献において入手可能でありまたはＣＦを含む認可された製剤のための薬物ラベルに記載されている。他の場合、治療ウィンドウは、本開示のＣＦＸＴＥＮを含む新たな組成物のために確立されることができる。所与の組成物について治療ウィンドウを確立するための方法は、当業者に公知である（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  （２００５）を参照されたい）。例えば、標的の疾患または障害を有する対象における用量の段階的増大の研究を用いて、効能または所望の薬理学的効果、有害事象の様相、および循環している血中レベルの決定を決定することによって、所与の対象または対象の集団についての治療ウィンドウは、所与の薬物もしくは生物製剤、または生物製剤もしくは薬物の組み合わせについて決定することができる。用量の段階的増大の研究は、当該技術分野で公知の様にまたは本明細書に説明されるように、生理学的または生化学的パラメータを、代謝性の疾患もしくは障害と関連した１つ以上のパラメータ、または特定の適応の有益な結果と関連した臨床的パラメータについて、無効用量、有害事象、最大許容用量、およびそれに類することを決定するための所見および／または測定されたパラメータとともに、決定したまたは導き出された循環している血中レベルを確立する薬物動態パラメータの測定結果とともにモニターする対象または対象の群における代謝研究を通じてＣＦＸＴＥＮの活性を評価することができる。次に、本結果は、前述の決定されたパラメータまたは有効レベルと一致した治療薬の投与された用量および血中濃度と相関づけることができる。これらの方法によって、ある範囲の用量および血中濃度は、最少有効用量ならびに、所望の効果が生じかつそれを上回ると毒性が生じる最大用量および最大血中濃度と相関づけることができ、それにより投薬された治療薬についての治療ウィンドウを確立する。最大値を上回る融合タンパク質の血中濃度（またはＣＦ成分によって測定されるような）は、治療ウィンドウまたは安全性範囲の外側と考えられる。したがって、前述の方法によってＣｍｉｎ血中レベルが確立され、それを下回ると、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は所望の薬理学的効果を有さないであろうし、許容し得ない副作用、毒性、または有害事象を惹起して、ＣＦＸＴＥＮについての安全性範囲の外側となるであろう濃度に到達する前の最大循環濃度を表すであろうＣｍａｘ血中レベルが確立される。このような濃度が確立されると、投薬の頻度および投薬量は、適切な用量および投薬頻度を提供して、治療ウィンドウ内に融合タンパク質（複数可）を維持するために、ＣｍａｘおよびＣｍｉｎの測定結果によってさらに精密にすることができる。
【０２０４】
当業者は、本明細書に開示された手段によってまたは当該技術分野で公知の他の方法によって、投与されたＣＦＸＴＥＮが、所望の間隔の間治療ウィンドウに留まり、またはＸＴＥＮの用量もしくは長さもしくは配列における調整を必要とすることを確認することができる。さらに、治療ウィンドウ内にＣＦＸＴＥＮを維持するための適切な用量および投薬頻度の決定は、治療有効量の投与計画を確立し、治療有効量の融合タンパク質を用いた複数の連続した用量の、該融合タンパク質を必要とする対象への投与についてのスケジュールは、治療ウィンドウ内にとどまる連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎ谷部を結果的に生じ、標的の疾患、障害、または容態と関連した少なくとも１つの測定されたパラメータにおける改良を結果的に生じる。いくつかの場合、適切な用量で対象に投与されたＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されておらずかつ同等な用量で投与される相応のＣＦと比較して、治療ウィンドウ内に少なくとも約２倍長い、あるいは、ＸＴＥＮに連結されておらずかつ同等な用量で投与される相応のＣＦと比較して、少なくとも約３倍長い、あるいは少なくとも約４倍長い、あるいは少なくとも約５倍長い、あるいは少なくとも約６倍長い、あるいは少なくとも約７倍長い、あるいは少なくとも約８倍長い、あるいは少なくとも約９倍長い、または少なくとも約１０倍長い、またはそれより長い期間とどまるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度を結果的に生じる。本明細書で用いる場合、「適切な用量」は、対象に投与されると、所望の治療効果もしくは薬理学的効果または治療
ウィンドウ内の血中濃度を結果的に生じるであろう薬物または生物製剤の用量を意味する。
【０２０５】
一実施態様において、治療有効量の投与計画で投与されるＣＦＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されておらずかつ対象に同等な用量投与計画で投与される融合タンパク質の相応の生物活性タンパク質と比較して、融合タンパク質の血中レベルについての少なくとも２つの連続したＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎ谷部の間の少なくとも約３倍長い、あるいは少なくとも約４倍長い、あるいは少なくとも約５倍長い、あるいは少なくとも約６倍長い、あるいは少なくとも約７倍長い、あるいは少なくとも約８倍長い、あるいは少なくとも約９倍長い、または少なくとも約１０倍長い時間の延長を結果的に生じる。別の実施態様において、治療有効量の投与計画で投与されるＣＦＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されておらずかつＣＦについて治療有効量の投与計画を用いて対象に投与される相応の生物活性タンパク質成分（複数可）と比較して、医薬組成物の融合タンパク質のモルにおけるあまり頻繁ではない投薬またはより低い総薬用量を用いて、１、または２、または３、またはそれより多くの測定されたパラメータにおける同等な改良を結果的に生じる。測定されたパラメータには、凝固因子関連障害を有する対象を評価するための、本明細書に開示された臨床的、生化学的、または生理学的パラメータのいずれか、あるいは当該技術分野で公知のその他が挙げられる。
【０２０６】
いくつかの実施態様において、本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、凝固因子と関連した疾患、障害、および容態の治療および予防において公知の、または該治療および予防における天然ＣＦの使用と関連した、インビトロでの生物活性または薬理学的効果に関して、融合タンパク質に連結されていない相応のＣＦの生物活性の少なくとも約０．０５％、または約０．１％、または約１％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９８％、または約９９％を保有する。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の保有された活性を評価するためにアッセイすることのできるパラメータまたは生理学的効果に関する非限定例には、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化型部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、出血時間、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）、および血栓弾性描写法が挙げられる。いくつかの実施態様において、ＣＦ成分の活性は、無処置のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質によって明らかとなるのに対し、他の場合において、ＣＦ成分の活性は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれた開裂配列に作用するプロテアーゼの作用による融合タンパク質からのＣＦの開裂および放出の際に主として明らかとなり、その実施態様は先に開示されている。前述において、ＣＦＸＴＥＮは、先により完全に説明されるように、ＸＴＥＮに連結されると凝固基質に対するＣＦ成分の結合親和性を低下させるが、ＣＦＸＴＥＮ配列に組み込まれた開裂配列（複数可）の開裂を通じてＸＴＥＮから放出されると、回復したまたは増大した親和性を有するよう設計される。前述の一実施態様において、本発明は、開裂配列によってＸＴＥＮに連結されたＦＩＸを含む単離された融合タンパク質を提供し、この場合、融合タンパク質は、開裂の前に実質的に不活性であり、かつ、この場合、開裂配列においてタンパク質分解性開裂によって融合タンパク質から放出されたＦＩＸは、ＸＴＥＮに連結されていない天然ＦＩＸと比較して、活発であるとして少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である生物活性を有する。
【０２０７】
他の場合、ＣＦＸＴＥＮは、対象に投与されるＣＦＸＴＥＮの終末半減期を延長させるが、なおも生物活性を保有するために、ＣＦＸＴＥＮの活発なクリアランスを低下させるよう設計することができる。循環からＣＦを除去するためのクリアランス機構は、なおも完全に解明されなければならない。ＣＦの取り込み、除去、および不活性化は、循環系においておよび脈管外空間において生じることができる。凝固因子は、多数の他のタンパク
質、脂質、および受容体と相互作用する複合体タンパク質であり、これらの相互作用の多くは、ＣＦの循環からの除去に寄与することができる。例えば、異種性にグリコシル化されるタンパク質であるＦＶＩＩについてのクリアランス機構には、肝臓によるクリアランスを含み得る。ＦＶＩＩａクリアランスに及ぼす該タンパク質のガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインおよびシアル酸含有量の効果は、灌流した肝臓モデルを用いて研究されており、それに伴う結果は、炭水化物受容体（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体ＡＳＧＰＲ）が、ＦＶＩＩａクリアランスにおいてある役割を担い得ることを示唆している（Ａｐｐａ，  Ｒ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．
（２０１０，  ｅｐｕｂ  Ｍａｙ  ２７）  １０４（２））。加えて、ＣＦは、第ＶＩＩａ因子などの静脈内投与された凝固因子の一般的に乏しい生物学的利用能に反映される滲出および迅速な活発なクリアランスを通じて失われる可能性がある（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎパッケージ挿入物を参照されたい）。本発明のＣＦＸＴＥＮは、低下した活発なクリアランスによって、および／または構造化されていないＸＴＥＮの凝固因子への付加によって分子の水力学的半径または見かけの大きさを増大させることによる低下した滲出によって、達成される比較的より高い生物学的利用能を有する。一実施態様において、本発明は、１つ以上のＸＴＥＮを融合タンパク質のＣＦ成分に連結することによって融合タンパク質のクリアランスを低下させるＣＦＸＴＥＮを提供し、この場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較して、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１２倍、または少なくとも約１５倍の見かけの分子量因子の増大を有し、かつ、この場合、対象に投与されるとＣＦＸＴＥＮの終末半減期は、少なくとも  約２倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約３０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約６０倍、または少なくとも約７０倍、または少なくとも約８０倍、またはそれより長く延長する。前述の実施態様において、この場合、少なくとも２つのＸＴＥＮ分子がＣＦＸＴＥＮに組み込まれ、ＸＴＥＮは、同一であり得るかまたは、異なる配列組成（および正味の電荷）もしくは長さからなり得る。２つのＸＴＥＮが単一のＦＶＩＩに連結された前述の実施態様に関する非限定例は、図６に示され、（ＦＶＩＩのドメインを用いて表される）コンストラクトＧｌａ−ＥＧＦ１−ＥＧＦ２−ＡＥ１４４−プロテアーゼ−ＡＥ８６４またはＧｌａ−ＥＧＦ１−ＡＥ２８８−ＥＧＦ２−プロテアーゼ−ＡＥ８６４（この場合、ＡＥ  ＸＴＥＮ成分は、組み込まれたグルタミン酸により、およそ１７％の正味の電荷を有する）、Ｇｌａ−ＥＧＦ１−ＥＧＦ２−ＡＧ１４４−プロテアーゼ−ＡＧ８６４またはＧｌａ−ＥＧＦ１−ＡＧ１４４−ＥＧＦ２−プロテアーゼ−ＡＥ８６４（この場合、ＡＧ  ＸＴＥＮ成分は、正味の電荷をほぼ有さない）を含む。特定の理論によって結びつけられることなく、より高い正味の電荷を有するＣＦＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、先に説明されるように、低下した活発なクリアランスにさらに機用ｓるうであろう、血管、組織、または種々の受容体などの種々の負に帯電した表面との非特異的相互作用をほとんど有さないと期待される。逆に、正味の電荷の低い（またはまったくない）凝固過程および凝固因子の活性化の強度に対する細胞（例えば、血小板）および脈管表面の公知の寄与を考慮すると、ＣＦＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、活発なクリアランスに寄与しながら、会合した凝固因子の活性を増強することのできる表面とのより高い程度の相互作用を有すると期待される（Ｚｈｏｕ，  Ｒ．��  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  （２００５）  ２６（１６）：２９６５−２９７３；  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２０００）  ３９（３２）：９８５０−９８５８）。したがって、本発明は、効力、生物学的利用能、および半減期の程度が、ＣＦＸＴＥＮ組成物におけるＸＴＥＮの種類および長さの選択および配置によって仕立てられることができるＣＦＸＴＥＮを提供する。したがって、本発明は、表１由来のまたは表２由来のＣＦおよび表４由来のＸＴＥＮが、前述の例の個々の成分と置換され、例えば、表６由来のまたは式Ｉ〜ＶＩＩ由来の立体配置において、個々の成分の代替的な立体配置と比較して、コンストラクト
が低下したクリアランスを有するよう作製される組成物を熟慮する。いくつかの実施態様において、終末半減期を延長させるための前述の方法は、活発なクリアランスが低下していない第二の立体配置におけるＣＦＸＴＥＮの半減期と比較して、少なくとも約３０％、または約５０％、または約７５％、または約１００％、または約１５０％、または約２００％、または約３００％、または約４００％、またはそれより長い終末半減期の延長を結果的に生じることのできる形成されたＣＦＸＴＥＮを提供する。本発明はさらに、低下したオン速度または増大したオフ速度のいずれかの結果として、クリアランス受容体に対する低下した結合は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかの阻害によって、および組成物の別のポリペプチドへの連結として該末端を用いることによって、ＣＦ、ＸＴＥＮ、またはスペーサーの配列の別の分子が、低下した結合を結果的に生じようとなかろうと、果たされ得る。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の特定の立体配置の選択は、活発なクリアランスの低下した速度が達成されるよう、クリアランス受容体に対する結合の程度を低下させる。
【０２０８】
活発なクリアランスの低下が所望されるが生物活性の少なくとも一部の保有も所望される場合、ＣＦＸＴＥＮは、無処置の分子に十分な生物活性を保有するよう設計される。したがって、一実施態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮの生物活性が、相応の天然凝固因子と比較して、生物活性の約０．０１％〜４０％、または約０．０１％〜３０％、または約０．０１％〜２０％、または約０．０１％〜１０の範囲にあるよう設計されたＣＦＸＴＥＮを提供する。標的受容体についての形成されたＣＦＸＴＥＮの生物活性は、ＸＴＥＮに連結されていない相応の天然ＣＦと比較して、「実質的に低下する」。したがって、本発明は、組成物、およびＣＦＸＴＥＮを形成することによって生物活性は低下したが半減期の延長した組成物を作製する方法を提供し（この例は先に提供されている）、それにより活発なクリアランス機構をなおも回避しながら所望のインビボでの生物学的応答を提供することができる。延長した半減期によって、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較してまたはＣＦＸＴＥＮ立体配置（この場合、融合タンパク質は、凝固因子クリアランス機構を受けやすい）と比較して、より多量の薬用量および低下した投薬頻度が可能となる。
【０２０９】
（ＶＩ）．本発明の組成物の使用）
別の態様において、本発明は、出血障害においておよび／またはＦＩＸもしくはＦＶＩＩによって仲介される凝固因子と関連した疾患、障害、もしくは容態において有益な効果を達成するための方法を提供する。本明細書で使用する場合、「凝固因子と関連した疾患、障害、または容態」は、出血障害（例えば、欠陥性血小板機能、血小板減少症、またはフォン‐ウィルブランド病）、凝固障害（凝固因子欠乏症を含む血液凝固に関する任意の障害）、血友病Ｂ（別名クリスマス病）、第ＩＸ因子関連出血障害、第ＶＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、脈管性損傷、血友病に苦しんでいない対象における制御されていない出血、外傷または手術由来の出血、抗凝固薬治療法による出血、およびＦＩＸまたはＦＶＩＩの対象への投与によって寛解または矯正することのできる肝臓の疾患または容態による出血を含むよう意図されるが、これらに限定されない。本発明は、比較的短い終末半減期および／または狭い治療ウィンドウを有する第ＩＸ因子または第ＶＩＩ因子を用いた治療の他の方法の不利および／または限界に対処する。
【０２１０】
いくつかの実施態様において、本発明は、治療有効量または予防有効量のＣＦＸＴＥＮをヒトなどの対象に投与する工程を含む、凝固因子と関連した疾患、障害、または容態を有する該対象を治療するための方法を提供し、この場合、該投与は、凝固因子と関連した疾患、障害、または容態と関係する１つ以上の生化学的もしくは物理的パラメータまたは臨床エンドポイントの改良を結果として生じる。前述の一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮはＦＶＩＩを含む。前述の別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮはＦＩＸを含む。有効量は、凝固因子と関連した疾患、障害、または容態を治療する（例えば、治癒するまたは重症度を低下させる）または予防する（例えば、発症または重症度の見込みを低下させる
）のを助ける上で有益な効果を生じる。本明細書で使用する場合、「治療すること」は、薬物または生物製剤（例えば、ＣＦＸＴＥＮ）を投与して、既存の疾患、障害、もしくは容態における改良を達成すること、または疾患、障害、もしくは容態の発症を予防すること（予防法を含む）を意味する。治療有効量のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、単回用量または反復した用量として対象に投与すると、潜在的な疾患、障害、もしくは容態の改良もしくは寛解、まてゃあ潜在的な疾患、障害、もしくは容態と関係する徴候もしくは症状もしくは生理学的パラメータにおける改良をもたらす組成物の量であり得る。
【０２１１】
止血は、複数のタンパク質因子によって調節され、このようなタンパク質およびその類似体は、凝固因子と関連した疾患、障害、および容態の治療において有用性を認める。しかしながら、市販の凝固因子の使用は、このような疾患、障害、および容態に苦しんでいる対象の管理において最適を下回る成功に遭遇した。特に、用量の最適化および投薬頻度は、凝固因子と関連した疾患、障害、もしくは容態における出血症状または血友病に苦しんでいない対象における制御されていない出血の治療または予防において用いられる凝固因子にとって重要である。凝固因子が短い半減期を有するという事実によって、臨床的有益性を達成するために頻繁な投薬が必要となり、このことは、このような患者の管理の困難さを結果として生じる。
【０２１２】
本発明は、凝固因子と関連した疾患、障害、もしくは容態に苦しんてでいるまたはこれらを発症する危険にある対象に、ＣＦＸＴＥＮを投与することを含む治療方法を提供し、この場合、投与は、該容態と関係する１つ以上の生化学的もしくは生理学的パラメータまたは臨床的エンドポイントの改良を結果的に生じる。一実施態様において、血友病Ａに苦しんでいる対象に治療有効量のＣＦＸＴＥＮ組成物を投与することを含み、この場合、投与は、該容態と関係する１つ以上の生化学的もしくは生理学的パラメータまたは臨床的エンドポイントの改良を結果的に生じる。別の実施態様において、治療方法は、血友病Ｂに苦しんでいる対象に治療有効量のＣＦＸＴＥＮ組成物を投与することを含み、この場合、投与は、該容態と関係する１つ以上の生化学的もしくは生理学的パラメータまたは臨床的エンドポイントの改良を結果的に生じる。別の実施態様において、治療方法は、第ＶＩＩ因子欠乏症に苦しんでいる対象に治療有効量のＣＦＸＴＥＮ組成物を投与することを含み、この場合、投与は、該容態と関係する１つ以上の生化学的もしくは生理学的パラメータまたは臨床的エンドポイントの改良を結果的に生じる。別の実施態様において、治療方法は、制御されていない出血に苦しんでいるかまたはそれを発症する対象に治療有効量のＣＦＸＴＥＮ組成物を投与することを含み、この場合、投与は、該容態と関係する１つ以上の生化学的もしくは生理学的パラメータまたは臨床的エンドポイントの改良を結果的に生じる。ほとんどの場合、ＦＶＩＩを含むＣＦＸＴＥＮを利用する開示された治療方法の実施態様は、ＦＶＩＩが活性化された、すなわちＦＶＩＩａである組成物である。しかしながら、本発明は、ＦＶＩＩが活性化されていないＣＦＸＴＥＮ組成物も熟慮する。ＦＶＩＩを含むＣＦＸＴＥＮの比較的長い半減期のため、哺乳類内在性プロテアーゼによって活性化されることのできる不活性化型のＦＶＩＩを含む組成物（なぜなら、該プロテアーゼには１つ以上の開裂配列、例えば表７の配列を含むからである）または融合タンパク質は、自己活性化を受け、それにより１）活性化型ＦＶＩＩの急速投与量が、惹起された内在性凝固カスケードの凝固タンパク質を介して入手可能であり、または２）活性化型ＦＶＩＩの持続的な量は、循環に持続的にまたは一過性に存在するプロテアーゼ、例えば、ＭＭＰ‐１２、ＭＭＰ‐１７等を介する活性化によって入手可能である。
【０２１３】
したがって、本発明は、（先に説明されたような）ＦＶＩＩバリアントを含むＣＦＸＴＥＮの投与を含む、凝固因子と関連した疾患、障害、または容態を有する対象のための治療方法を提供し、この場合、ＦＶＩＩは活性化されないが、内在性プロテアーゼによって開裂されると、ＦＶＩＩ成分を活性化型に変換する１つ以上の開裂配列を有する。前述の一実施態様において、該方法は、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間、
または少なくとも約４８時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１４４時間、または少なくとも約１６０時間の終末半減期を有するＣＦＸＴＥＮ組成物を利用する。したがって、該方法は、ある形態の慢性凝固障害を有する対象を、本質的に「プロドラッグ」形態のＦＶＩＩであるもので治療する手段を表す。
【０２１４】
いくつかの実施態様において、対象へのＣＦＸＴＥＮの投与は、同じアッセイを用いてまたは測定された臨床的パラメータに基づいて決定される、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦ成分のものよりも程度の大きな生化学的、生理学的、または臨床的パラメータの１つ以上の改良を結果的に生じる。他の実施態様において、治療有効用量の投与計画を用いた対象へのＣＦＸＴＥＮの投与は、同じアッセイを用いてまたは測定された臨床的パラメータに基づいて決定される、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦ成分の活性よりも持続時間の長い生化学的、生理学的、または臨床的パラメータの１つ以上の活性を結果的に生じる。一実施態様において、対象へのＦＶＩＩを含む治療有効量のＣＦＸＴＥＮの投与は、ＸＴＥＮに連結されていない同等な量のＦＶＩＩの投与後の同等な時間での対象におけるプロトロンビン時間と比較して、投与約２〜７日後の少なくとも約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、またはそれより長いプロトロンビン時間の短縮を結果として生じる。別の実施態様において、治療有効量を用いたＦＶＩＩを含むＣＦＸＴＥＮの対象への投与は、対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩの同等な用量投与計画と比較して少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍長い時間、対象において正常の３０％以内のプロトロンビン時間の維持を結果的に生じる。別の実施態様において、ＦＩＸを含む治療有効量のＣＦＸＴＥＮの対象への投与は、ＸＴＥＮに連結されていない同等な量のＦＩＸの投与後の同等な時間での対象における活性化型部分的プロトロンビン時間と比較して、投与約２〜７日後の対象における少なくとも約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、またはそれより長い活性化型部分的プロトロンビン時間の短縮を結果的に生じる。別の実施態様において、ＦＩＸを含むＣＦＸＴＥＮの対象への、治療有効量を用いた投与は、対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていないＦＩＸの同等な用量投与計画と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍長い時間の、対象における正常の３０％以内の活性化型部分的プロトロンビン時間の維持を結果的に生じる。別の実施態様において、ＦＶＩＩを含むＣＦＸＴＥＮの対象への治療有効量を用いた投与は、対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていない同等な量のＦＶＩＩと比較して、少なくとも２倍、または約３倍、または少なくとも約４倍長い時間、対象における正常の３０％内の（出血時間アッセイにおける）出血時間の維持を結果的に生じる。別の実施態様において、ＦＩＸを含むＣＦＸＴＥＮの対象への治療有効量を用いた投与は、対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていない同等な量のＦＩＸと比較して、少なくとも２倍、または約３倍、または少なくとも約４倍長い時間、対象における正常の３０％以内の（出血時間アッセイにおける）出血時間の維持を結果的に生じる。
【０２１５】
本明細書に説明されるように、ＣＦＸＴＥＮに関する亢進したＰＫパラメータの結果として、ＣＦは、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと比較して、用量間のより長い間隔を用いて投与され、凝固因子と関連した疾患、障害、もしくは容態の症状もしくは臨床的以上を予防、治療、緩和、逆転、もしくは寛解させ、または治療途中の対象の生存を長期化する。特定の適用において、ＦＶＩＩを含むＣＦＸＴＥＮは、血友病Ａおよび血友病Ｂの治療における有用性を有する。
【０２１６】
高濃度で投与されるＦＶＩＩａは、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩの不在下でさえＦＸの活性化を結果として生じるバイパス薬として機能することができるが観察されている。バイパス薬として作用するために、ＦＶＩＩａは、健常者においてＦＶＩＩａのレベルをおよそ
１００倍ほど超過した濃度で投与されなければならない。これらのレベルは、ＦＶＩＩの結合する組織因子（ＴＦ）の不在下でＦＶＩＩａが低い活性を有するので、一般的に安全である。組織因子は、外来性の系を介して凝固を惹起する損傷した組織に放出または呈される。ＦＶＩＩａの循環半減期は、抗トロンビン（ＡＴ）によるその不活性化によって一部制限される。抗トロンビンは、ＦＶＩＩに結合することはできないが、ＦＶＩＩａにのみ結合することができる。したがって、一実施態様において、本発明は、活性化型のＦＶＩＩを含むある量のＣＦＸＴＥＮを投与することによって血友病Ａまたは血友病Ｂを治療する方法を提供し、この場合、対象の循環においてＦＸを活性化させる能力は、ＸＴＥＮに連結されておらずかつ同等な用量で同等な対象に投与されるＦＶＩＩと比較して、少なくとも約２倍長い、または少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約２０倍長い時間維持される。本発明はさらに、ＦＶＩＩａ‐ＸＴＥＮへの活性化の前に約５％以下ほどＡＴによって不活性化されることのできないＸＴＥＮに連結されたＦＶＩＩを含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。一実施態様において、本発明は、活性化されていないＦＶＩＩ成分を有するＣＦＸＴＥＮを投与することを含む治療方法を提供し、この場合、ＣＦＸＴＥＮは循環デポーとして機能し、この場合、ＦＶＩＩａへと活性化されかつＡＴと複合体形成しないＦＶＩＩについての曲線下面積は、ＸＴＥＮに連結されておらずかつ同等な用量で投与されるＦＶＩＩよりも少なくとも  約２倍大きい、または少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約２０倍大きい。
【０２１７】
治療方法のいくつかの実施態様において、（ｉ）より小さなモル量の（例えば、約２倍未満、または約３倍未満、または約４倍未満、または約５倍未満、または約６倍未満、または約８倍未満、または約１０倍未満またはそれより大きな）融合タンパク質は、さもなくば同じ用量投与計画の下でＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦとの比較において投与され、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと同等な治療効果を達成し；（ｉｉ）融合タンパク質は、さもなくば同じ投薬量の下で、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦとの比較においてあまり頻繁には投与されず（例えば、２日間ごと、約７日間ごと、約１４日間ごと、約２１日間ごと、または約毎月）、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと同等な治療効果を達成し；または累積的なより小さなモル量（例えば、約５％、または約１０％、または約２０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％未満）の融合タンパク質が、さもなくば同じ用量投与計画の下でＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦとの比較において投与され、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦと同等な治療効果を達成する。累積的なより小さなモル量は、少なくとも約１週間、または約１４日間、または約２１日間、または約１ヶ月間の期間についての基準である。治療効果は、本明細書に説明される測定された任意のパラメータまたは臨床的エンドポイントによって決定することができる。
【０２１８】
本発明の方法には、所望のパラメータまたは臨床う効果を達成および／または維持するのに十分な時間、治療有効量のＣＦＸＴＥＮの連続的な用量の投与を含み、このような連続的な用量の治療有効量は、ＣＦＸＴＥＮについての治療有効用量投与計画、すなわち、融合タンパク質の連続的に投与される用量についてのスケジュールを確立し、この場合、用量は、本明細書に説明されるものを含むがこれらに限定されない、凝固因子と関連した疾患、障害、または容態の任意の臨床的徴候もしくは症状、様相、測定されたパラメータ、または特徴に及ぼす持続した有益な効果を結果として生じるための治療有効量で与えられる。一実施態様において、該方法は、ＸＴＥＮに連結されかつ同等な用量で投与されるＣＦを含む医薬組成物の投与によって仲介される効果と比較して、ＣＦ成分（複数可）によって仲介される少なくとも１つのパラメータ、生理学的条件、または臨床結果（その非限定例は先に説明されている）におけるより大きな改良を結果として生じる、ＸＴＥＮ配
列（複数可）に連結したＣＦと少なくとも１つの医薬として許容し得る担体とを含む、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを必要とする対象に、外医薬組成物を投与することを含む。一実施態様において、医薬組成物は、治療有効用量で投与される。別の実施態様において、医薬組成物は、（本明細書に定義されるような）治療有効用量投与計画を投薬期間の長さの間、用いて投与される。
【０２１９】
治療有効量のＣＦＸＴＥＮは、個体の疾患状態、齢、性別、および体重などの因子、ならびに個々における所望の応答を誘発する投与された融合タンパク質の能力に従って変動する。治療有効量は、ＣＦＸＴＥＮの任意の毒性効果または有害効果が、治療的に有益な効果によって凌がれるものでもある。予防有効量は、所望の予防的結果、例えば、出血症状の遅延した開始を達成するのに必要な時間に必要とされるＣＦＸＴＥＮの量を指す。治療の方法において、対象に投与されるＣＦＸＴＥＮの用量は、負荷用量および維持用量として７０ｋｇの対象については、約０．５ｍｇ〜１０００ｍｇ／用量、または約１ｍｇ〜４００ｍｇ／用量、または約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ／用量にわたっており、対象の体重および容態の重症度に依存する。
【０２２０】
治療方法は、治療有効用量の投与計画を用いて、凝固因子の疾患、障害、または容態と関係した１つ以上のパラメータにおける改良をもたらすＣＦＸＴＥＮの投与を含む。いくつかの実施態様において、対象へのＣＦＸＴＥＮの投与は、同じアッセイを用いてまたは測定された臨床的パラメータに基づいて決定される、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦ成分のものよりも大きな程度の生化学的、生理学的、または臨床的パラメータの１つ以上における活性を結果的に生じる。前述の一実施態様において、治療有効用量の投与計画を用いた対象へのＣＦＸＴＥＮの投与は、対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていない同等な用量のＣＦと比較して、対象における少なくとも約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約１００％またはそれより長いプロトロンビン時間または活性化型部分的トロンボプラスチン時間の改良を結果的に生じる。前述の別の実施態様において、治療有効用量の投与計画を用いた対象へのＣＦＸＴＥＮの投与は、対象に投与されるＸＴＥＮに連結されていないＣＦの同等な用量投与計画と比較して、少なくとも約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％またはそれより大きな対象における低下した出血事例を結果的に生じる。
【０２２１】
本発明は、凝固因子と関連した疾患、障害、および容態、または凝固因子が補助的療法である容態、例えば、損傷または手術による出血症状を治療するのに有用な他の治療方法および組成物（例えば、他の凝固タンパク質）とともに投与される。
【０２２２】
別の態様において、本発明は、所望の薬理学的特性または医薬特性を有するＣＦＸＴＥＮ組成物を設計する方法を提供する。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、凝固因子と関連した疾患、障害、および容態の治療のための治療効能を改良すること、ＣＦと比較して融合タンパク質の薬物動態特徴を高めること、薬理学的効果を達成するために必要うとされる用量または投薬の頻度を低下させること、医薬特性を高めること、および治療ウィンドウ内に延長した時間とどまるようＣＦ成分の能力を高めることを含む、（融合タンパク質に連結されていないＣＦ成分と比較して）種々の目的を考慮して設計および調製される。
【０２２３】
一般に、図３１〜図３３に示されるように、融合タンパク質および本発明の組成物の設計および生成における工程には、（１）特定の疾患、障害、または容態を治療するためのＣＦの選択（例えば、表１および表２の天然のタンパク質、配列、活性を有するアナログまたは誘導体）；（２）結果として生じるＣＦＸＴＥＮに所望のＰＫおよび物理化学的特徴を与えるＸＴＥＮを選択すること（例えば、対象へのＣＦＸＴＥＮ組成物の投与は、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦと比較してより長い時間治療ウィンドウ内に維持される融
合タンパク質を結果的に生じる）；（３）ＣＦＸＴＥＮの所望のＮ末端からＣ末端への立体配置を確立して、所望の効能またはＰＫパラメータを達成すること；（４）形成されたＣＦＸＴＥＮをコードする発現ベクターの設計を確立すること；（５）好適な宿主を発現ベクターで形質転換すること；ならびに（６）結果として生じる融合タンパク質の発現および回収が含まれる。半減期の延長（２４時間超）または治療ウィンドウ内で経過する延長した時間が所望であるＣＦＸＴＥＮについては、組み込むために選択されたＸＴＥＮは一般的に、単一のＸＴＥＮがＣＦＸＴＥＮに組み込まれることになっている少なくとも約１００、または約１４４、または約２８８、または約４３２、または約５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１２、または約９２３のアミノ酸残基を有する。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、前述の長さの第一のＸＴＥＮと、約３６、または約７２、または約１４４、または約２８８、または約５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１２、または約９２３のアミノ酸残基の少なくとも１つの第二のＸＴＥＮとを含む。
【０２２４】
半減期の延長が必要ではないが、医薬特性（例えば溶解度）の増大が所望である他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、より短い長さのＸＴＥＮを含むよう設計される。前述のいくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、少なくとも約２４、または約３６、または約４８、または約６０、または約７２、または約８４、または約９６のアミノ酸残基を有するＸＴＥＮに連結されたＣＦを含み、その中で、生理学的条件下の融合タンパク質の溶解度は、ＸＴＥＮに連結されていない相応のＣＦよりも少なくとも３倍大きく、またはそれに代わるものとして、ＸＴＥＮに連結されていないＣＦよりも少なくとも４倍、もしくは５倍、もしくは６倍、もしくは７倍、もしくは８倍、もしくは９倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも３０倍、もしくは少なくとも５０倍、もしくは少なくとも６０倍もしくはそれより大きい。前述の一実施態様において、ＣＦは第ＩＸ因子である。別の実施態様において、ＣＦは第ＶＩＩ因子である。別の実施態様において、ＸＴＥＮは、表４および表９〜表１３由来の配列と比較して少なくとも約８０％、または約９０％、または約９５％の配列同一性を有する配列である。
【０２２５】
別の態様において、本発明は、天然ＣＦと比較して、製造の容易さを改良し、増大した安定性、増大した水溶解度、および／または製剤の容易さを結果的に生じるＣＦＸＴＥＮ組成物を作製する方法を提供する。一実施態様において、本発明には、結果的に生じる可溶性形態のより高濃度のＣＦＸＴＥＮが、融合していない状態のＣＦと比較して、生理学的条件下で達成されることができるよう、１つ以上のＸＴＥＮにＣＦを連結する工程を含むＣＦの水溶解度を増大させる方法を含む。融合タンパク質に組み込まれる場合にＣＦの増大した水溶解度を与えるようＸＴＥＮの特性に寄与する因子には、高い溶解度のＸＴＥＮ融合パートナーおよび溶液中での低い程度のＸＴＥＮ分子間自己凝集を含む。いくつかの実施態様において、該方法は、水溶解度が、融合していないＣＦと比較して生理学的条件下で少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％大きな、または少なくとも約５０％大きな、または少なくとも約７５％大きな、または少なくとも約９０％大きな、または少なくとも約１００％大きな、または少なくとも約１５０％大きな、または少なくとも約２００％大きな、または少なくとも約４００％大きな、または少なくとも約６００％大きな、または少なくとも約８００％大きな、または少なくとも約１０００％大きな、または少なくとも約２０００％大きな、または少なくとも約４０００％大きな、または少なくとも約６０００％大きなＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を結果的に生じる。一実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、表４および表９〜１３由来の配列と比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも９０％、または約９５％の配列同一性を有する配列である。
【０２２６】
別の実施態様において、本発明には、結果的に生じるＣＦＸＴＥＮの有効期間が、ＣＦを、融合していない状態のＣＦと比較して延長するよう選択された１つ以上のＸＴＥＮと
連結する工程を含む、ＣＦの有効期間を延長する方法を含む。本明細書で使用する場合、有効期間は、溶液中にあるかまたはいくつかの他の貯蔵製剤中にあるＣＦまたはＣＦＸＴＥＮの機能的活性が活性の過度の損失なく安定したままである経時的な時間を指す。本明細書で使用する場合、「機能的活性」は、当該技術分野で公知のように、受容体もしくはリガンド、または基質を結合する能力、あるいは酵素活性、あるいはＣＦと関係した１つ以上の公知の機能的活性を示す能力など、薬理学的効果または生物活性を指す。分解または凝集するＣＦは一般的に、溶液中に留まるものと比較して、低下した機能的活性または低下した生物学的利用能を有する。融合タンパク質に組み込まれるとＣＦの有効期間を延長させる該方法の能力に起用する因子には、ＸＴＥＮ融合パートナーの、増大した水溶解度、低下した溶液中での自己凝集、および増大した熱安定性が含まれる。特に、ＸＴＥＮが凝集する低い傾向は、より高い薬物濃度のＣＦを含む医薬調製物を製剤する方法を容易にし、ＸＴＥＮの熱安定性は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質が、延長した時間、可溶性でありかつ機能的に活発であるままである特性に寄与する。一実施態様において、該方法は、同じ貯蔵条件および取り扱い条件に供した標準物質に対してより大きな活性を呈する「長期化した」または「延長した」有効期間を有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を結果的に生じる。一実施態様において、該方法には、単離されたＣＦＸＴＥＮを、ＸＴＥＮがその構造化されていない立体配座を保有する能力、およびＣＦＸＴＥＮが相応の融合していないＣＦのものよりも長い時間製剤中で可溶性のままである能力を高める１つ以上の医薬として許容し得る賦形剤とともに製剤化する工程を含む。一実施態様において、該方法は、ＣＦを、表４および表９〜１３から選択される１つ以上のＸＴＥＮに連結して、所与の時点で比較した場合、および標準物質と同じ貯蔵条件および取り扱い条件に供した場合、標準物質の機能的活性の約１００％超を、または機能的活性の約１０５％超、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、または２００％を保有する溶液を結果として生じるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を作製することを含む。
【０２２７】
また、有効期間は、貯蔵を開始した時の機能的活性に対して標準化された貯蔵後に留まる機能的活性の点においても評価され得る。長期化または延長した機能的活性によって呈されるような、有効期間の長期化または延長した本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、同じ条件に同じ時間供した場合に、ＸＴＥＮに連結されていない等価のＣＦの５０％超の機能的活性を、または機能的活性の約６０％、７０％、８０％、もしくは９０％超を保有する。例えば、表４および表９〜１３から選択される１つ以上のＸＴＥＮ配列に融合した凝固因子を含む本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、溶液中のＣＦＸＴＥＮの元の活性の約８０％以上を種々の温度条件下で最長２週間、または４週間、または６週間以上の期間保有する。いくつかの実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、８０℃で１０分間加熱した場合、溶液中のＣＦＸＴＥＮの元の活性の少なくとも５０％、または約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも約９０％以上を保有する。他の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮは、３７℃で約７日間加熱または維持される場合、溶液中のＣＦＸＴＥＮの元の活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、またはそれに代わるものとして少なくとも約９０％以上を保有する。別の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、約３０℃〜約７０℃の温度への約１時間〜約１８時間の時間にわたる曝露の後で、ＣＦＸＴＥＮの機能的活性のの少なくとも約８０％以上を保有する。本節に説明される先の前述の実施態様において、ＣＦＸＴＥＮ［の保有された活性は、融合タンパク質に連結されていない相応のＣＦのものよりも、所与の時点において、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍大きい。
【０２２８】
（ＶＩＩ）．本発明の核酸配列）
本発明は、ＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸、およびその相同的バリアントを含むＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸
分子を提供する。別の態様において、本発明は、ＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸、およびその相同的バリアントを含むＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸分子と相補的な配列を作製する方法を包含する。一般に、および図４〜図６において示されるように、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を作製し、およびその結果として生じる遺伝子産物を発現する方法には、ＣＦおよびＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを構築すること、フレームにおいて成分を連結すること、コード遺伝子を宿主細胞に適切な発現ベクターに組み込むこと、適切な宿主細胞を発現ベクターで形質転換すること、および形質転換した宿主細胞において融合タンパク質を発現させるまたは発現させることのできる条件下で、宿主細胞を培養し、それにより生物活性のあるＣＦＸＴＥＮポリペプチドを産生し、該ポリペプチドが、単離された融合タンパク質として、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法によって回収されることを含む。分子生物学における標準的な組み換え技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製する。
【０２２９】
本発明によると、ＣＦＸＴＥＮをコードする核酸配列（またはその相補体）を用いて、適切な宿主細胞においてＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の発現に向かう組換えＤＮＡ分子を生成する。いくつかのクローニング戦略は、本発明を実施するのに好適であり、その多くを用いて、本発明のＣＦＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質をコードする遺伝子またはその相補体を含むコンストラクトを生成する。いくつかの実施態様において、クローニング戦略を用いて、少なくとも１つの第一のＣＦと少なくとも１つの第一のＸＴＥＮポリペプチドとを含む単量体ＣＦＸＴＥＮをコードする遺伝子またはその相補体を作製する。前述の一実施態様において、該遺伝子は、ＣＦまたはその配列バリアントをコードする配列を含む。他の実施態様において、クローニング戦略を用いて、少なくとも１つの第一の分子のＣＦをコードするヌクレオチドまたはその相補体と、１つの第一のおよび少なくとも１つの第二のＸＴＥＮをコードするヌクレオチドまたはその相補体を含む単量体ＣＦＸＴＥＮをコードする遺伝子を作製し、それを用いて、ＣＦＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質の発現のために宿主細胞を形質転換する。本節に説明される先の前述の実施態様において、該遺伝子は、開裂配列（複数可）もコードするスペーサー配列をコードするヌクレオチドをさらに含むことができる。
【０２３０】
所望のＸＴＥＮ配列を設計する上で、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反復性の性質が、ＸＴＥＮコード配列の作製における「構築ブロック」分子アプローチの使用にもかかわらず、達成されることが発見された。このことは、後で連結および／または多量体化されてＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を作製する、先に説明されるペプチド配列モチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリーの使用によって達成された（図４および図５ならびに実施例を参照されたい）。したがって、発現した融合タンパク質のＸＴＥＮ（複数可）は、４つの異なる配列モチーフと同じくらい少ない複数の単位からなり得、なぜなら、モチーフ自体は非反復性アミノ酸からなり、全体的なＸＴＥＮ配列は非反復性となるからである。したがって、一実施態様において、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドは、フレームにおいて作用可能に連結された非反復性の配列またはモチーフをコードする複数のポリヌクレオチドを含み、この場合結果として生じる発現したＸＴＥＮアミノ酸配列は非反復性である。
【０２３１】
一アプローチにおいて、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に相応するＤＮＡ配列を含むコンストラクトをまず調製する。組成物のＣＦをコードするＤＮＡを、標準的な方法を用いて、ＣＦ  ｍＲＮＡを所有しかつそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織または単離された細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得る。ライブラリーを、従来の分子生物学技術を用いたハイブリッド形成によって、関心対象のＣＦ遺伝子を同定するよう設計された、例えば約２０〜１００塩基を含むプローブを用いてスクリーニングする。プローブについての最良の候補は、凝固因子について高度に相同性の配列を表すが、１
つ以上の位置において変性していてもよいものであり、偽陽性が最小化される十分な長さでありかつ十分に明白であるべきである。必要な場合、コード配列は、ｃＤＮＡへと逆転写されなかったかもしれないｍＲＮＡの前駆体および加工中間体を検出するために、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．において説明される従来のプライマー伸長手順を用いて得ることができる。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法論を用いて、標的のＤＮＡまたはＲＮＡのコード配列を増幅して、ＣＦ遺伝子（複数可）を含むＣＦＸＴＥＮコンストラクトの調製に十分な材料を得る。次に、アッセイを実施して、ハイブリッド形成している全長の遺伝子が所望のＣＦ遺伝子（複数可）であることを確認することができる。これらの従来法によって、ＤＮＡは、このような源から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。ＣＦコード遺伝子（複数可）はまた、ゲノムライブラリーから得られ、または当該技術分野で公知の標準的な合成手順（例えば、Ｅｎｇｅｌｓ
ｅｔ  ａｌ．（Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  ２８：７１６−７３４  １９８９）において説明される方法のうちの１つを用いた、公共のデータベース、特許、または文献引用から得られるＤＮＡ配列を用いた自動核酸合成）によって得られる。このような手順は、当該技術分野で周知であり、かつ科学文献および特許文献において十分説明されている。例えば、配列は、（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙにより公表されている）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  （ＣＡＳ）  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｕｍｂｅｒｓおよび／または関心対象のタンパク質または該タンパク質の断片もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むＣＡＳ  ＲｅｇｉｓｔｒｙまたはＧｅｎＢａｎｋにおけるエントリーに相応する、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるワールドワイドウェブにおいて入手可能なａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブページを通じて入手可能なＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒｓ（例えば、遺伝子座ＩＤ、ＮＰ＿ＸＸＸＸＸ、およびＸＰ＿ＸＸＸＸＸ）モデルタンパク質識別子から得ることができる。本明細書で提供されるこのような配列識別子については、これらのＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑ受入番号の各々と関係した要約ページならびに引用される雑誌公表物（例えば、ＰｕｂＭｅｄ  ＩＤ番号（ＰＭＩＤ））は、特に本明細書に説明されるアミノ酸配列に関して、その全体が引用により各々組み込まれる。一実施態様において、ＣＦコード遺伝子は、表１もしくは表２の任意の１つからのタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする。
【０２３２】
対象のＣＦＸＴＥＮタンパク質のＣＦ部分をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドは、単一のＣＦを含む発現した融合タンパク質の場合、次に、生物系における高レベルのタンパク質発現に適切な転写配列および翻訳配列の制御下のプラスミドまたは他のベクターであるコンストラクトへとクローン化される。後者の工程において、ＸＴＥＮをコードする第二の遺伝子またはポリヌクレオチドは、ＣＦをコードする遺伝子（複数可）に隣接しそれとともにフレーム内にあるコンストラクトへとクローン化することによって、ＣＦ遺伝子のＮ末端および／またはＣ末端をコードするヌクレオチドへと遺伝子的に融合される。この第二の工程は、連結工程または多量体化工程を通じて生じる。本節に説明される先の前述の実施態様において、作製される遺伝子コンストラクトが、あるいは個々の融合タンパク質をコードする個々の遺伝子の相補体であり得ることは理解されるべきである。
【０２３３】
ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、実施例により完全に説明される方法を含む、制限酵素仲介性クローニング、ＰＣＲ、および重複伸長など、完全に合成的にまたは酵素的加工と組み合わされた合成によってのいずれかで１つ以上の工程において作製されることができる。本明細書に開示された方法を用いて、例えば、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドの短い配列を、所望の長さおよび配列のより長いＸＴＥＮへと連結することができる。一実施態様において、該方法は、約９〜１４アミノ酸、または約１２〜２０アミノ酸、または約１８〜３６アミノ酸、または約４８〜約１４４アミノ酸、または約１４４〜約２８８またはそれより長いＸＴＥＮモチーフ配列またはセグメント配列、あるいはモチーフ又
はセグメントの長さの前述の範囲の任意の組み合わせをコードする２つ以上のコドン最適化オリゴヌクレオチドを連結する。
【０２３４】
あるいは、開示された方法を用いて、ＸＴＥＮコード配列を、所望の長さのより長い配列へと多量体化し、例えば、ＸＴＥＮの３６アミノ酸をコードする遺伝子は、７２の、次いで１４４、次いで２８８などのアミノ酸をコードする遺伝子へと二量体化することができる。多量体化を用いてでさえ、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮコード遺伝子が、使用されている最小単位のモチーフについて選択されたコドンの設計を通じて低い反復性を有するかまたは事実上まったく反復性を有さないように構築されることができ、形質転換された宿主におけるコード遺伝子の組換えを低下させ安定性を増大させることができる。非反復性配列を有するＸＴＥＮをコードする遺伝子は、遺伝子合成の標準的な技術を用いてオリゴヌクレオチドから構築される。遺伝子設計は、コドンの使用およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを用いて実施することができる。本発明の一方法において、比較的短いＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドコンストラクトのライブラリーを、図４および図５に示すように作製した後、構築する。このことは、各ライブラリーメンバーが、同じアミノ酸配列を有するが多くの異なるコード配列が可能であるよう純粋なコドンライブラリーであり得る。このようなライブラリーを、部分的に無作為化されたオリゴヌクレオチドから構築することができ、該ライブラリーを用いて、配列モチーフを含むＸＴＥＮセグメントの大きなライブラリーを作製することができる。無作為化スキームを最適化して、各位置についてのアミノ酸選択およびコドンの使用を制御することができる。前述を達成するための例示的な方法を実施例に開示する。
【０２３５】
（ポリヌクレオチドライブラリー）
別の態様において、本発明は、所望の長さおよび配列のＸＴＥＮを個０−度する遺伝子を構築するために用いられるＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
【０２３６】
ある実施態様において、ＸＴＥＮコードライブラリーコンストラクトは、固定された長さのポリペプチドセグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。初期工程として、９〜１４のアミノ酸残基のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーを構築することができる。好ましい実施態様において、１２のアミノ酸のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーが構築される。
【０２３７】
ＸＴＥＮコード配列セグメントは、より長いコード配列へと二量体化または多量体化されることができる。二量体化または多量体化は、連結、重複伸長、ＰＣＲ構築、または当該技術分野で公知の類似のクローン化技術によって実施することができる。この加工は、結果として生じるＸＴＥＮコード配列が配列の組織化および所望の長さに到達して、ＸＴＥＮコード遺伝子を提供するまで、複数回反復することができる。明らかなように、例えば１２のアミノ酸モチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、３６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーへと二量体化および／または連結されることができる。異なる長さのモチーフ、例えば、２７〜４２のアミノ酸をコードするライブラリーをもたらす９〜１４のアミノ酸モチーフをコードするライブラリーは、本発明によって熟慮される。順に、２７〜４２のアミノ酸、好ましくは（実施例において説明されるように）３６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、本明細書に開示されるように、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子への組み込みのために所望の長さのＸＴＥＮ配列をコードする連続的により長い長さのポリヌクレオチドを含むライブラリーへと連続的に二量体化されることができる。いくつかの実施態様において、具体的な配列ＸＴＥＮファミリー、例えば、表３のＡＤ配列、ＡＥ配列、ＡＦ配列、ＡＧ配列、ＡＭ配列、またはＡＱ配列に限定されるアミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーが構築される。他の実施態様において、ライブラリーは、表３由来のモ
チーフファミリーの２つ以上をコードする配列を含む。３６マーをコードするライブラリーの代表的な非限定的なポリヌクレオチド配列名称および配列を表９〜表１２に呈し、それらを作製するために用いた方法を、個々の実施例においてより完全に説明する。他の実施態様において、ＸＴＥＮをコードするライブラリーは、コドンの少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）のアミノ酸についてのコドンからなる群から選択されるアミノ酸をコードする無作為化した配列に連結されたポリヌクレオチドコドンのセグメントから構築される。該ライブラリーを順に、連続的な二量体化または連結に用いて、例えば、コードされたＸＴＥＮが、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の相補体として発現する場合に、本明細書に開示された特性の１つ以上を有することのできる４８、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、８７５、９１２、９２３、１３１８のアミノ酸、または最大全長約３０００のアミノ酸、および中間長のＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチド配列ライブラリーを達成することができる。いくつかの場合、ポリヌクレオチドライブラリー配列には、下記により完全に説明される「配列決定アイランド」として用いられる追加的な塩基も含んでよい。
【０２３８】
図５は、本発明の実施態様におけるＸＴＥＮポリヌクレオチドコンストラクトおよびＣＦＸＴＥＮポリヌクレオチドコンストラクトの構築における代表的な非限定的工程の模式的流れ図ある。個々のオリゴヌクレオチド５０１を、１２のアミノ酸モチーフ（「１２マー」）などの配列モチーフ５０２へとアニーリングし、それをその後、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩの制限部位を含むオリゴ５０３と連結する。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４を達成するまで、ライブラリー由来の追加的な配列モチーフを１２マーへとアニーリングする。ＸＴＥＮ遺伝子をスタッファーベクターへとクローン化する。ベクターは任意にＦｌａｇ配列５０６をコードした後、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位によって隣接されるスタッファー配列５０７をコードし、この場合、（この例においてＦＩＸをコードする）単一のＣＦ遺伝子５０８であり、結果的に単一のＣＦを含むＣＦＸＴＥＮをコードする遺伝子を生じる５００。ＸＴＥＮ配列および前駆体配列をコードするポリヌクレオチドについてのＸＴＥＮ名称に関する非網羅的なリストを表８に提供する。
【０２３９】
【表８−１】
2013502459.tif 000017
【０２４０】
【表８−２】
2013502459.tif 000018
【０２４１】
【表８−３】
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【０２４２】
【表８−４】
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【０２４３】
【表８−５】
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【０２４４】
【表８−６】
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【０２４５】
【表８−７】
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【０２４６】
【表８−８】
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【０２４７】
【表８−９】
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【０２４８】
【表８−１０】
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【０２４９】
【表８−１１】
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【０２５０】
当該技術分野で公知の１つ以上の発現ベクターへとＸＴＥＮコード遺伝子のライブラリーをクローン化してもよい。十分に発現するライブラリーメンバーの同定を容易にするために、リポータータンパク質への融合としてライブラリーを構築することができる。好適なリポーター遺伝子に関する非限定例は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびベータ−ガラクトシダーゼである。スクリーニングすることによって、選択の宿主生物において高濃度で発現することのできる短いＸＴＥＮ配列を同定することができる。その後、ランダムＸＴＥＮ二量体のライブラリーを作製して、高レベルの発現についてのスクリーンを反復することができる。その後、発現レベル、プロテアーゼ安定性、または抗血清に対する結合などのいくつかの特性について、結果として生じるコンストラクトをスクリーニングすることができる。
【０２５１】
本発明の一態様は、ポリヌクレオチド配列の作製がコドンの最適化を受けた融合タンパク質の成分をコードするポリヌクレオチド配列を提供することである。特に関心対象なのは、ポリペプチド組成物の発現を改良する目的のコドンの最適化、および産生宿主におけるコード遺伝子の遺伝的安定性を改良することである。例えば、コドンの最適化は、グリシンの多いＸＴＥＮ配列または非常に反復性のアミノ酸配列を有するＸＴＥＮ配列にとって特に重要である。コドンの最適化は、コンピュータプログラムを用いて実施され（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２２：  ３４６−５３）、そのうちのいくつかはリボソーム転写中断（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐａｕｓｉｎｇ）を最小化する（Ｃｏｄａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）。一実施態様において、ライブラリーのすべてのメンバーが同じアミノ酸配列をコードするがコドンの使用が変動する、コドンライブラリーを構築することによって、コドンの最適化を実施することができる。このようなライブラリーは、ＸＴＥＮ含有産物の大規模作製に特に好適な、高度に発現しかつ遺伝的に安定なメンバーをスクリーニングされることができる。ＸＴＥＮ配列を設計する場合、いくつかの特性を考慮することができる。コードＤＮＡ配列における反復性を最小化することができる。加えて、産生宿主によってまれに用いられるコドン（例えば、大腸菌におけるＡＧＧおよびＡＧＡのアルギニンコドンならびに１つのロイシンコドン）の使用を回避または最小化することができる。大腸菌の場合の場合、２つのグリシンコドンＧＧＡおよびＧＧＧは、高度に発現したタンパク質においてまれに用いられる。したがって、ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子のコドン最適化は、非常に望ましくあり得る。高レベルのグリシンを有するＤＮＡ配列は、不安定性もしくは低い発現レベルをもたらすことのできる高いＧＣ含有量を有する傾向がある。し
たがって、可能な場合、ＸＴＥＮコード配列のＧＣ含有量が、ＸＴＥＮを製造するために用いられる産生生物に好適であるようコドンを選択することが好ましい。
【０２５２】
任意に、全長のＸＴＥＮをコードする遺伝子は、１つ以上の配列決定アイランドを含む。この文脈において、配列決定アイランドとは、ＸＴＥＮライブラリーコンストラクト配列とは別個でありかつ全長のＸＴＥＮをコードする遺伝子に存在しないもしくは存在すると期待されない制限部位を含む、短いストレッチの配列である。一実施態様において、配列決定アイランドは、配列５’−ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴ−３’である。別の実施態様において、配列決定アイランドは、配列５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’である。
【０２５３】
一実施態様において、ポリヌクレオチドライブラリーは、開示された方法を用いて構築され、この場合、ライブラリーのすべてのメンバーが同じアミノ酸配列をコードするが配列における個々のアミノ酸についてのコドン使用が変動する。このようなライブラリーは、ＸＴＥＮ含有産物の大規模作製に特に好適な、高度に発現しかつ遺伝的に安定なメンバーをスクリーニングされることができる。
【０２５４】
任意に、ある望ましくない配列を含む単離物を除去するために、ライブラリーにおけるクローンを配列決定することができる。短いＸＴＥＮ配列の初期のライブラリーは、アミノ酸配列におけるいくつかの変動を可能にする。例えば、いくつかの親水性アミノ酸が特定の位置で生じることができるよう、いくつかのコドンを無作為化することができる。反復性多量体化の加工の間、結果として生じるライブラリーメンバーを、高レベルの発現のためのスクリーンに加えて、溶解度またはプロテアーゼ耐性のような他の特徴についてスクリーニングすることができる。
【０２５５】
一旦、所望の長さおよび特性のＸＴＥＮをコードする遺伝子が選択されると、ＣＦをコードする遺伝子に隣接してそれとともにフレーム内にある、またはそれに代わるものとして、ＣＦの隣接するドメインをコードするヌクレオチド間にある、またはそれに代わるものとして、所与のＣＦドメインをコードする配列内にある、またはそれに代わるものとして、末端ＸＴＥＮに連結されたスペーサー／開裂配列をコードするヌクレオチドともにフレーム内にある、コンストラクトへとクローニングすることによって、ＣＦ遺伝子（複数可）をコードするヌクレオチドに、所望の位置で遺伝子的に融合される。本発明は、コードされるべきＣＦＸＴＥＮに応じて、前述の種々の順列を提供する。例えば、先に示されるように、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子は、式ＶＩによって具現化されるなど、ＣＦと２つのＸＴＥＮとを含み、該遺伝子は、ＣＦをコードし、組成および配列長において同一であるかまたは異なることができる２つのＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを有するであろう。前述の非限定的な一実施態様において、ＣＦポリヌクレオチドは凝固因子をコードするであろうし、Ｃ末端ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドは、ＡＥ８６４をコードするであろうし、およびＥＧＦ２のＣ末端に隣接する内部ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドはＡＥ１４４をコードするであろう。ＣＦ遺伝子をＸＴＥＮコンストラクトにクローン化する工程は、図３２に示されるように、連結工程または多量体化工程を通じて生じることができる。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするコンストラクトは、式Ｉ〜式ＶＩの立体配置など、成分ＸＴＥＮ、ＣＦ、およびスペーサー配列の異なる立体配置において設計することができる。一実施態様において、コンストラクトは、以下の順序（５’から３’）のＣＦおよびＸＴＥＮにおける成分の単量体ポリペプチドをコードするものに相補的なポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、コンストラクトは、以下の順序（５’から３’）のＣＦ、スペーサー配列、およびＸＴＥＮにおける成分の単量体ポリペプチドをコードするものに相補的なポリヌクレオチド配列、または該単量体ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。スペーサーポリヌクレオチドは任意に、開裂配列をコードする配列を含むことができる。当業者にとって明らかなように、前述の他の順列または多量体は可能である。
【０２５６】
本発明は、（ａ）表８由来のポリヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドと相補的な配列と比較して高い百分率の配列同一性を有するＸＴＥＮコードポリヌクレオチドバリアントを含むポリヌクレオチドも包含する。高い百分率の配列同一性を有するポリヌクレオチドは、前述の（ａ）もしくは（ｂ）と比較して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、それに代わるものとして少なくとも約８１％、それに代わるものとして少なくとも約８２％、それに代わるものとして少なくとも約８３％、それに代わるものとして少なくとも約８４％、それに代わるものとして少なくとも約８５％、それに代わるものとして少なくとも約８６％、それに代わるものとして少なくとも約８７％、それに代わるものとして少なくとも約８８％、それに代わるものとして少なくとも約８９％、それに代わるものとして少なくとも約９０％、それに代わるものとして少なくとも約９１％、それに代わるものとして少なくとも約９２％、それに代わるものとして少なくとも約９３％、それに代わるものとして少なくとも約９４％、それに代わるものとして少なくとも約９５％、それに代わるものとして少なくとも約９６％、それに代わるものとして少なくとも約９７％、それに代わるものとして少なくとも約９８％、およびそれに代わるものとして少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するもの、またはストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリッド形成することのできるものである。
【０２５７】
また、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の相同性、配列類似性、もしくは配列同一性は、ＢｅｓｔＦｉｔまたはＧａｐ対比較プログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．  ５３７１１）などの公知のソフトウェアまたはコンピュータプログラムを用いることによって従来通り決定してもよい。ＢｅｓｔＦｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ．  １９８１．  ２：  ４８２−４８９）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の同一性または類似性の最良のセグメントを見出す。Ｇａｐは、１つの配列のすべてと、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  １９７０．  ４８：４４３−４５３）の方法を用いて別の類似の配列のすべてとの包括的なアラインメントを実施する。ＢｅｓｔＦｉｔなどの配列アラインメントプログラムを用いる場合、配列相同性、類似性、または同一性の程度を決定するために、デフォルト背艇を用いてもよく、または適切なスコア化マトリックスを選択して、同一性、類似性、または相同性のスコアを最適化してもよい。
【０２５８】
「相補的で」ある核酸配列は、標準的なワトソン‐クリック相補性則に従って塩基対形成することができるものである。本明細書で使用する場合、用語「相補的な配列」は、先に示される同じヌクレオチド比較によって評価され得るように、または本明細書に説明されるものなど、ストリンジェントな条件下でＣＦＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成することができるものとして定義されるように、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【０２５９】
ＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードする結果として生じるポリヌクレオチドは次に、発現ベクターへと個々にクローン化されることができる。核酸配列は、種々の手順によってベクターへと挿入される。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野で公知の技術を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）へと挿入される。ベクター成分には一般的に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロ
モーター、および転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。これらの成分の１つ以上を含む好適なベクターの構築は、当業者に公知である標準的な連結技術を採用する。このような技術は、当該技術分野において周知であり、化学文献および特許文献において十分に説明されている。
【０２６０】
種々のベクターは公共的に入手可能である。ベクターは例えば、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得るプラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態にあり得、ベクターの選択は、導入されるべき宿主細胞にしばしば依存する。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製に依存する、ベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれ先の染色体（複数可）とともに複製されるものであり得る。
【０２６１】
本発明は、宿主細胞と適合性がありかつ宿主細胞によって認識され、およびＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の制御された発現のためのＣＦＸＴＥＮ遺伝子に作用可能に連結された複製配列および制御配列を含むプラスミドベクターの使用を提供する。ベクターは通常、複製部位、および形質転換された細胞における表現型選択を提供することのできるタンパク質をコードする配列を保持する。このようなベクター配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。使用することのできる有用な発現ベクターには、例えば、染色体配列、非染色体配列、および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含む。「発現ベクター」は、好適な宿主において融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現をもたらすことのできる好適な制御配列に作用可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトを指す。必要条件は、ベクターが選択の宿主細胞において複製可能かつ生存可能であることである。低コピー数または高コピー数のベクターを、所望の通り用いてもよい。
【０２６２】
他の好適なベクターには、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの誘導体ならびに、Ｓｍｉｔｈ，
ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ５７：３１−４０  （１９８８）によって説明されるような、ｃｏｌ  ＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ‐Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸなどの公知の細菌プラスミド、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド、ＮＭ９８
９などのファージＩの数多くの誘導体などのファージＤＮＡ、およびＭ１３などの他のファージＤＮＡ、ならびに糸状一本鎖ファージＤＮＡ；２ミクロンプラスミドもしくは２ｍプラスミドなどの酵母プラスミド、ならびにセントロメアおよび組込みの酵母シャトルベクター；昆虫細胞もしくは哺乳類細胞において有用なベクターなど、真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡもしくは発現制御配列を採用するよう修飾されたプラスミドなど、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター；ならびにこれらの類似物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。また、本発明において用いることのできる酵母発現系には、非融合型ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ）、ｐＲＳベクター、およびこれらの類似物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０２６３】
ベクターの制御配列には、転写をもたらすプロモーター、このような転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列が含まれる。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示し、かつ宿主細胞に対して同属性または異種性のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る、任意のＤＮＡ配列であり得る。
【０２６４】
哺乳類細胞におけるＣＦポリペプチドバリアントをコードするＤＮＡの転写を方向づけるするのに好適なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １  （１９８１），  ８５４−８６４）、ＭＴ‐１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａ
ｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２  （１９８３），  ８０９−８１４）、ＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０，  １９８５）、またはアデノウイルス２型主要後期（ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ）プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２：１３０４−１３１９，  １９８２）である。ベクターは、ＵＣＯＥ（遍在性クロマチン開放要素）などの配列も保持し得る。
【０２６５】
糸状真菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーターまたはｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルス・オリゼアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼトリオースリン酸イソメラーゼ、またはアスペルギルス・ニデュランスアセトアミダーゼに由来するものである。好ましいのは、ＴＡＫＡ‐アミラーゼおよびｇｌｕＡプロモーターである。原核宿主との発現ベクターの使用に好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼ系およびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７５：６１５  （１９７８）；
Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８１：５４４  （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７  （１９８０）；  ＥＰ  ３６，７７６］、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０：２１−２５  （１９８３）］が含まれ、すべて、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作用可能に連結される。細菌系における使用のためのプロモーターは、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作用可能に連結されたシャイン・ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含むことができる。
【０２６６】
本発明は、例えば、ｐＶＬ９４１（Ｓｕｍｍｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：３９０−４０２  （１９７８））、ｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（Ｓｕｍｍｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：３９０−  ４０２  （１９７８）  およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などだがこれらに限定されない非融合転移ベクターと、ｐＡｃ７  ００（Ｓｕｍｍｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：３９０−４０２  （１９７８））、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０−２（ｐＡｃ７００と同じであり、異なるリーディングフレームを有する）、ｐＡｃ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などだがこれらに限定されない融合転移ベクターの両方を用いてバキュロウイルス発現系を含む他の発現系の使用を熟慮し、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も用いることができる。
【０２６７】
哺乳類細胞におけるＣＦポリヌクレオチドバリアントをコードするＤＮＡの転写を方向づけるのに好適なプロモーターの例は、ＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０，  １９８５）、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １  （１９８１），  ８５４−８６４）、ＭＴ‐１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２  （１９８３），  ８０９−８１４）、アデノウイルス２型主要後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，
Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２：１３０４−１３１９，  １９８２）である。ベクターは、ＵＣＯＥ（遍在性クロマチン開放要素）などの配列も保持し得る。
【０２６８】
糸状真菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーターまたはｔｐｉＡプロモーターである。
【０２６９】
ＣＦＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列も、必要な場合、ｈＧＨ終結因子（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２，  １９８３，  ｐｐ．  ８０９−８１４）またはＴＰＩ１終結因子（Ａｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．  １，  １９８２，  ｐｐ．  ４１９−４３４）またはＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４，  １９８５，  ｐｐ．  ２０９３−２０９９）などの好適な終結因子に作用可能に接続され得る。発現ベクターは、アデノウイルスから得られたスプライス部位を含む、プロモーターから下流かつＣＦＸＴＥＮ配列のための挿入部位から上流に配置された１セットのＲＮＡスプライス部位も含み得る。また、発現ベクターに含まれているのは、挿入部位の下流に配置されたポリアデニル化シグナルである。特に好ましいポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  同誌）、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ｈＧＨ終結因子（ＤｅＮｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９：３７１９−３７３０，  １９８１）を含む。発現ベクターには、プロモーターとＲＮＡスプライス部位の間に配置されるアデノウイルス２型三連リーダー；およびＳＶ４０エンハンサーなどのエンハンサー配列も含み得る。
【０２７０】
本発明のＣＦＸＴＥＮを宿主細胞の分泌経路へと向かわせるために、分泌シグナル配列（別名、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列）は、組換えベクターに含まれ得る。分泌シグナル配列は、ＣＦＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結されており、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列に対して５’に通常配置される。分泌シグナル配列は、タンパク質と通常会合しているものであり得るかまたは、分泌された別のタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。非限定例には、大腸菌発現のためのＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、およびＤｓｂＡ、酵母発現のためのｐｐＬ−アルファ、ＤＥＸ４、インベルターゼシグナルペプチド、酸ホスファターゼシグナルペプチド、ＣＰＹ、またはＩＮＵ１、ならびに哺乳類発現のためのＩＬ２Ｌ、ＳＶ４０、ＩｇＧカッパ、およびＩｇＧラムダが挙げられる。シグナル配列は典型的には、転置（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）および分泌過程の間にタンパク質からタンパク質分解性に取り出され、規定されたＮ末端を生じる。方法は、Ａｒｎａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４８：  １−１３  （２００６）に開示されている。
【０２７１】
ＣＦＸＴＥＮ、プロモーター、ならびに任意に終結因子および／または分泌シグナル配列をそれぞれコードするＤＮＡ配列を連結して、それらを複製に必要な情報を含む好適なベクターへと挿入するのに用いられる手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９参照）。
【０２７２】
他の場合、本発明は、コンストラクト、および、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端におけるＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮ担体コード配列のＮ末端において含まれることのできるＸＴＥＮ特徴を有する少なくとも約２０〜約６０のアミノ酸をコードする発現に最適化されたポリヌクレオチド（言い換えれば、２０〜６０のコードされた最適化されたアミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、ＣＦに対してＮ末端であるＸＴＥＮ成分をコードするポリヌクレオチドに対してフレームにおいて連結される）を含むコンストラクトを作製する方法を提供する。前述の利点において、該配列は、その後の開裂を必要とせず、それによりＸＴＥＮ含有
組成物を製造する工程数を減少させる。実施例においてより詳細に説明されるように、最適化されたＮ末端配列は、構造化されていないタンパク質の属性を有するが、翻訳の開始および亢進した発現を促進する能力について選択されたアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基を含み得る。前述の一実施態様において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ９１２と比較して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の一実施態様において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ９２３と比較して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施態様において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ４８と比較して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施態様において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ４８と比較して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。一実施態様において、最適化されたポリヌクレオチドＮＴＳは、
ＡＥ  ４８：  ５’−  ＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＡ−３’
および
ＡＭ  ４８：  ５’−  ＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡ−３’
から選択される配列またはその相補体と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を呈する配列を含む。
【０２７３】
この様式において、単量体ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子は、コンストラクト内に生じる。任意に、このキメラＤＮＡ分子は、より適切な発現ベクターである別のコンストラクトへと転移またはクローン化され得る。この点において、キメラＤＮＡ分子を発現することのできる宿主細胞は、キメラＤＮＡ分子を用いて形質転換されることができる。
【０２７４】
本発明における使用のための哺乳類細胞株の例は、ＣＯＳ‐１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ‐７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＢＨＫ‐２１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、およびＢＨＫ‐２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３；  Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９−７２，  １９７７）、ＢＨＫ‐５７０細胞（ＡＴＣＣ    ＣＲＬ  １０３１４）、ＣＨＯ‐Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ
６１）、ＣＨＯ‐Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１６１９−０１２）、および２９３‐Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｒ７９０−７）である。ｔｋ−ｔｓ１３  ＢＨＫ細胞株も受入番号ＣＲＬ  １６３２の下でＡＴＣＣから入手可能である。加えて、Ｒａｔ  Ｈｅｐ  Ｉ細胞（ラット肝細胞癌；  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６００）、Ｒａｔ  Ｈｅｐ  ＩＩ細胞（ラット肝細胞癌；  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＴＣＭＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ
１３９）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ８０６５）、ＮＣＴＣ  １４６９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９．１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、およびＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０，  １９８０）を含むいくつかの他の細胞株が本発明内で用いられ得る。
【０２７５】
好適な酵母細胞の例には、サッカロミケス属またはシゾサッカロミケス属の細胞、特に出芽酵母またはサッカロミケス・クルイベリの株が挙げられる。酵母細胞を異種性ＤＮＡで形質転換し、そこから異種性ポリペプチドを産生するための方法は、例えば米国特許第４，５９９，３１１号、米国特許第４，９３１，３７３号、米国特許第４，８７０，００８号、第５，０３７，７４３号、および米国特許第４，８４５，０７５号において説明されており、それらのすべては引用により本明細書により組み込まれている。形質転換された細胞は、選択可能なマーカー、普遍的に薬剤耐性、または特定の栄養物質、例えばロイシンの不在下で増殖する能力によって決定された表現型によって選択される。酵母における使用に好ましいベクターは、米国特許第４，９３１，３７３号において開示されたＰＯＴ１ベクターである。ＣＦＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列は、例えば先に説明されたように、シグナル配列および任意にリーダー配列によって先行され得る。好適な酵母細胞のさらなる例は、キラー酵母などのクルイベロミケス属、ハンゼヌラ属、例えばＨ．  ポリモルファ、またはピキア属、例えば、Ｐ．  パストリスの株である（Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３２，  １９８６，  ｐｐ．
３４５９−３４６５；  米国特許第４，８８２，２７９号参照）。他の真菌細胞の例は、糸状真菌、例えば、コウジカビ属、アカパンカビ属、フザリウム属、またはトリコデルマ属、特に、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニデュランス、またはアスペルギルス・ニガーの株である。タンパク質の発現のためのコウジカビ属の使用は、例えば、欧州特許第２７２  ２７７号、欧州特許第２３８  ０２３号、欧州特許第１８４  ４３８号において説明されている。フザリウム・オキシスポルムの形質転換は、例えばＭａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  ，  Ｇｅｎｅ  ７８：  １４７−１５６によって説明されるように実施され得る。トリコデルマ属の形質転換は、例えば欧州特許第２４４  ２３４号に説明されるように実施され得る。
【０２７６】
本発明において使用することのできる他の好適な細胞には、大腸菌（例えば、ＤＨ５‐α株）、枯草菌、サルモネラ・ティフィムリウム、またはシュードモナス属、ストレプトミケス属、およびスタフィロコッカス属の株などの原核宿主細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好適な原核細胞の非限定例には、アクチノプラネス、  アーキオグロブス、ブデオビブリオ、ボレリア、クロロフレクス、エンテロコッカス、エシェリキア、ラクトバチルス、リステリア、オセアノバチルス、パラコッカス、シュードモナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、ストレプトマイセス、サーモプラズマ、およびビブリオ由来のものが挙げられる。
【０２７７】
哺乳類細胞を形質移入し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９  （１９８２），  ６０１−６２１；  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １  （１９８２），  ３２７−３４１；  Ｌｏｙｔｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９  （１９８２），  ４２２−４２６；  Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １４  （１９７８），  ７２５；  Ｃｏｒｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７  （１９８１），  ６０３，  Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２  （１９７３），  ４５６；  およびＮｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １  （１９８２），  ８４１−８４５において説明されている。
【０２７８】
クローン化したＤＮＡ配列は、培養された哺乳類細胞に、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １４：７２５−７３２，  １９７８；  Ｃｏｒｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３−６１６，  １９８１；  Ｇｒａｈａｍ  ａｎ
ｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２ｄ：４５６−４６７，  １９７３）、ＦｕＧＥＮＥＧ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）もしくはリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの多くの市販の試薬によるトランスフェクションによって、または電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １：８４１−８４５，  １９８２）によって導入される。外来性ＤＮＡを発現する細胞を同定および選択するために、選択可能な表現型を与える遺伝子（選択可能なマーカー）は一般的に、関心対象の遺伝子またはｃＤＮＡとともに細胞へと導入される。好ましい選択可能なマーカーには、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える遺伝子が含まれる。選択可能なマーカーは、増幅可能な選択可能なマーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）である。選択可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知であり、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのリポーターを含む。選択可能なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｓｔｏｎｅｈａｍ，  Ｍａｓｓ．、引用により本明細書に組み込まれる）によって概説されている。当業者は、好適な選択可能なマーカーを容易に選択することができる。任意の公知の選択可能なマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することができる限り採用され得る。
【０２７９】
選択可能なマーカーは、関心対象の遺伝子と同時に別個のプラスミドにおいて細胞へと導入され得るかまたは、同じプラスミドにおいて導入され得る。同じプラスミドにおける場合、選択可能なマーカーおよび関心対象の遺伝子は、異なるプロモーターまたは同じプロモーターの制御下にあり、後者の配置は、２シストロン性メッセージを生じる。この種類のコンストラクトは、当該技術分野で公知である（例えば、ＬｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎの米国特許第４，７１３，３３９号）。「担体ＤＮＡ」として公知の追加的なＤＮＡを、細胞に導入される混合物に添加することも有利であり得る。
【０２８０】
細胞がＤＮＡを取り込んだ後、該細胞は、適切な増殖培地において典型的には１〜２日間増殖して、関心対象の遺伝子を発現し始める。本明細書で使用する場合、用語「適切な増殖培地」は、細胞の増殖および関心対象のＣＦＸＴＥＮの発現に必要な栄養物質および他の成分を含む培地を意味する。培地には一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖類、ビタミン類、塩類、リン脂質類、タンパク質、及び増殖因子が含まれる。ガンマ−カルボキシル化したタンパク質の産生のために、培地は、ビタミンＫを、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬのの濃度で含む。次に、薬物選択を適用して、選択可能なマーカーを安定した様式で発現している細胞の増殖を選択する。増殖可能な選択可能なマーカーで形質移入した細胞について、薬物濃度は、増加したコピー数のクローン化した配列を選択するよう増大し得、それにより発現レベルを増大させる。安定して形質移入された細胞のクローンを次に、関心対象のＣＦポリペプチドバリアントの発現についてスクリーニングする。
【０２８１】
次に、形質転換または形質移入した宿主細胞を、ＣＦポリペプチドバリアントの発現を可能にする条件下で好適な栄養物質培地において培養し、その後、結果として生じるペプチドが後に培養物から回収され得る。細胞を培養するのに用いられる培地は、適切なサプリメントを含む最小培地または複合培地など、宿主細胞を増殖するのに好適な任意の従来培地であり得る。好適な培地は、市販の供給元から入手可能であるかまたは、（例えば、米国培養細胞系統保存機関のカタログにおいて）公表されたレシピに従って調製され得る。温度、ｐＨ、およびそれらに類することなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞ですでに用いられたものであり、当業者に明らかである。
【０２８２】
遺伝子発現は、試料において直接的に、例えば従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するノザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：５２０１−５２０５  （１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、またはインサイツハイブリダイゼーションによって、適切に標識されたプローブを用いて、本明細書に提供される配列に基づいて測定され得る。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ‐ＲＮＡ複合二本鎖またはＤＮＡ‐タンパク質二本鎖抗体はを採用してもよい。該抗体は順に標識され得、該二本鎖が表面に結合するアッセイが実施され得、それにより、表面における二本鎖の形成の際に、二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０２８３】
あるいは、遺伝子発現を、細胞もしくは組織切片の免疫組織化学的染色、および細胞培養物もしくは体液のアッセイなどの免疫学的蛍光法、または選択可能なマーカーの検出によって測定して、遺伝子産物の発現を直接的に定量してもよい。試料液の免疫組織化学的染色および／またはアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、および任意の哺乳類において調製され得る。簡便に、抗体は、天然配列ＣＦポリペプチドに対して、または本明細書に提供されるＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対して、またはＣＦに融合しかつ特異的抗体エピトープをコードする外来性配列に対して調製され得る。選択可能なマーカーの例は、当業者に周知であり、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのリポーターを含む。
【０２８４】
発現したＣＦＸＴＥＮポリペプチド産物（複数可）当該技術分野で公知の方法を介して、または本明細書に開示された方法によって精製され得る。ゲル濾過、（例えば、抗ＣＦ抗体カラムを用いた）アフィニティ精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などの手順を用いてよく、各々は、個々の宿主細胞によって産生される融合タンパク質を回収および生成するためにあつらえられる。追加的な精製は、高性能液体クロマトグラフィーなど、従来の化学的精製手段によって達成され得る。いくつかの発現したＣＦＸＴＥＮは、単離および精製の間に再折りたたみを必要とし得る。精製方法は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ．  Ｃａｓｔｏｒ  （ｅｄ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４，  およびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，上述に説明されている。多工程精製分離は、Ｂａｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：１７９−９０  （１９９０）  およびＢｅｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ．  ６７９：６７−８３  （１９９４）においても説明されている。治療目的のために、本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質が実質的に純粋であることが好ましい。したがって、本発明の好ましい実施態様において、本発明のＣＦＸＴＥＮは、少なくとも約９０〜９５％の均質性まで、好ましくは少なくとも約９８％の均質性まで精製される。純度は、例えばゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、およびアミノ末端アミノ酸配列決定によって評価され得る。
【０２８５】
（ＶＩＩＩ）．医薬組成物）
本発明は、ＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供する。一実施態様において、医薬組成物は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質と少なくとも１つの医薬として許容し得る担体とを含む。本発明のＣＦＸＴＥＮポリペプチドは、医薬として有用な組成物を調製するために、公知の方法に従って製剤化されることができ、それにより該ポリペプチドが、水性の溶液もしくは緩衝液、医薬として許容し得る懸濁液、およびエマルションなど、医薬として許容し得る担体ビヒクルとの混合において組み合わされる。非水性溶媒の例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油が挙げられる。治療用製剤
は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）において説明されるように、凍結乾燥した製剤もしくは水溶液の形態において、所望の程度の純度を有する活性成分を、任意の生理学的に許容し得る担体、賦形剤、もしくは安定剤と混合することによって、貯蔵のために調製される。
【０２８６】
医薬組成物は、経口的に、鼻内に、非経口的に、または吸入療法によって投与することができ、錠剤、ロゼンジ錠、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、アンプル剤、坐剤の形態、またはエアゾールの形態を取り得る。該医薬組成物はまた、水性または非水性の希釈剤、シロップ剤、顆粒剤、または散剤における活性成分の懸濁液、溶液、およびエマルションの形態も取り得る。加えて、医薬組成物は、他の医薬として活性のある化合物または本発明の複数の化合物も含むことができる。
【０２８７】
より特定には、本医薬組成物は、経口、直腸、鼻内、（経皮的、エアゾール、頬側、および舌下を含む）局的、膣内、（皮下、注入ポンプによる皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）非経口、硝子体内、および肺内を含む任意の好適な経路によって、療法のために投与され得る。好ましい経路が、受け手の条件および齢、ならびに治療途中の疾患とともに変動することも認識される。
【０２８８】
一実施態様において、医薬組成物は、皮下的に投与される。この実施態様において、組成物は、投与前に再構成されるべき凍結乾燥した粉末として供給され得る。組成物は、患者に直接的に投与することのできる液体形態でも供給され得る。一実施態様において、組成物は、患者が組成物を容易に自己投与することができるよう、あらかじめ充填した注射器における液体として供給される。
【０２８９】
本発明において有用な延長放出製剤は、マトリックスと被覆組成物とを含む経口製剤であり得る。好適なマトリックス材料には、蝋（例えば、カマウバ（ｃａｍａｕｂａ）、蜜蝋、パラフィン蝋、セレシン、セラック蝋、脂肪酸、および脂肪アルコール）、油、硬化油脂（硬化菜種油、ひまし油、牛脂、ヤシ油、および大豆油）、およびポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリエチレングリコール）が含まれ得る。他の好適なマトリックス錠剤形成材料は、微結晶セルロース、粉状セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、であり、他の担体および充填剤を伴う。錠剤は、顆粒、被覆した粉末、またはペレットも含んでもよい。また、錠剤は、多層であってもよい。多層錠剤は、活性成分が、顕著に異なる薬物動態特性を有する場合に特に好ましい。任意に、仕上げられた錠剤は、被覆されまたは非被覆であってもよい。
【０２９０】
被膜組成物は、不溶性マトリックスポリマーおよび／または水溶性材料を含んでもよい。水溶性材料は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、または糖類などの単量体材料（例えば、ラクトース、スクロース、フルクトース、マンニトール、およびこれらに類するもの）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびこれらに類するもの）、有機酸（例えば、フマル酸、コハク酸、硫酸、および酒石酸）、およびこれらの混合物などのポリマーであり得る。任意に、腸溶性ポリマーは、被膜組成物へと組み込まれてもよい。好適な腸溶性ポリマーには、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アセタートスクシナート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタラート、ポリビニルアセタートフタラート、セルロースアセタートフタラート、セルロースアセタートトリメリタート、セラック、ゼイン、およびカルボキシル基を含むポリメタクリラートが挙げられる。被膜組成物は、例えばジエチルフタラート、クエン酸エステル、ポリエチレングリコール、グリセロール、アセチル化グリセリド、アセチル化クエン酸エステル、ジブ
チルセバサート、およびひまし油などの好適な可塑剤を添加することによって可塑化され得る。被膜組成物には、二酸化シリコン、二酸化チタン、滑石、カオリン、アルミナ、デンプン、粉状セルロース、ＭＣＣ、またはポラクリリン（ｐｏｌａｃｒｉｌｉｎ）カリウムなどの不溶性材料であり得る充填剤も含み得る。被膜組成物は、有機溶媒または水性溶媒またはこれらの混合物における溶液またはラテックスとして適用され得る。水、低級アルコール、低級塩素化炭化水素、ケトン、またはこれらの混合物などの溶媒を用いてもよい。
【０２９１】
本発明の組成物は、種々の賦形剤を用いて製剤化され得る。好適な賦形剤には、微結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１）、ポリメタクリラート、ポリ（エチルアクリラート、メチルメタクリラート、トリメチルアンモニオエチルメタクリラートクロリド）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ−３０Ｄなど）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ  ＣＲ  Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ５，  Ｏｐａｄｒｙ（登録商標））、ステアリン酸マグネシウム、滑石、クエン酸トリエチル、水性エチルセルロース分散液（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ（登録商標））、および硫酸プロタミンが挙げられる。遅延放出剤は、例えば、溶剤、分散媒体被膜、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤、および吸収遅延剤も含み得る。医薬として許容し得る塩は、これらの遅延放出剤において使用することもでき、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの鉱物塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩などの有機酸の塩である。組成物は、水、塩類溶液、グリセロール、およびエタノールなどの液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤などの物質も含み得る。リポソームも担体として用いてもよい。
【０２９２】
別の実施態様において、本発明の組成物は、長時間にわたって制御された様式で有益な活性薬を送達する上での有用性を示したリポソームに封入されている。リポソームは、捕捉された水性容量を含む閉じた二重層膜である。リポソームは、単一膜の二重層を有する単ラメラ小胞であるかまたは、各々、水性層によって隣部から分離されている複数膜の二重層を有する多ラメラ小胞でもあり得る。結果として生じる膜の二重層構造は、脂質の疎水性（非極性）尾部が、二重層の中心へと向けられているのに対し、親水性（極性）頭部は、水性相へと向いているようになっている。一実施態様において、リポソームは、単核の食細胞系の臓器、主として肝臓および脾臓による取り込みを回避する柔軟な水溶性ポリマーで被覆されてもよい。リポソームを取り囲むのに好適な親水性ポリマーには、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリラート、  ポリヒドロキシエチルアクリラート、ヒドロキシメチルセルロースヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミド（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）、およびそれらのすべての内容が全体として引用により組み込まれている米国特許第６，３１６，０２４号、第６，１２６，９６６号、第６，０５６，９７３号、第６，０４３，０９４号において説明されるような親水性ペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９３】
リポソームは、当該技術分野で公知の任意の脂質または脂質の組み合わせから構成されてもよい。例えば、小胞形成脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ならびに第６，０５６，９７３号および第５，８７４，１０４号において説明されるようなスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含む天然脂質または合成脂質であり得る。小胞形成脂質は、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ
−［１  ［（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；３  ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ‐Ｃｈｏｌ）；または米国特許第６，０５６，９７３号においても開示されているようなジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）などの糖脂質、セレブロシド、または陽イオン性脂質でもあり得る。コレステロールはまた、米国特許第５，９１６，５８８号および第５，８７４，１０４号において開示されるような小胞に安定性を与えるよう適切な範囲に存在し得る。
【０２９４】
追加的なリポソーム技術は、その内容が引用により本明細書に組み込まれている米国特許第６，７５９，０５７号、第６，４０６，７１３号、第６，３５２，７１６号、第６，３１６，０２４号、第６，２９４，１９１号、第６，１２６，９６６号、第６，０５６，９７３号、第６，０４３，０９４号、第５，９６５，１５６号、第５，９１６，５８８号、第５，８７４，１０４号、第５，２１５，６８０号、および第４，６８４，４７９号において説明される。これらは、リポソームおよび脂質被覆微細気泡、ならびにそれらの製造方法を説明する。したがって、本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮する当業者は、本発明のポリペプチドの延長した放出のためのリポソームを製造し得る。
【０２９５】
脂質製剤について、所望の特性は、該製剤が静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、または皮下投与のために、２５、２８、３０、３１、３２ゲージ針を通過できる形態で供給されるべきであることである。
【０２９６】
経皮製剤を介した投与は、例えば、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている米国特許第５，１８６，９３８号および第６，１８３，７７０号、第４，８６１，８００号、第６，７４３，２１１号、第６，９４５，９５２号、第４，２８４，４４４号、ならびにＷＯ  ８９／０９０５１において説明されるものを含む、当該技術分野で公知でもある方法を用いて実施することができる。経皮パッチは、吸収の問題を有するポリペプチドを用いた特に有用な実施態様である。パッチは、１２時間、２４時間、３日間、および７日間の期間にわたって、皮膚浸透性活性成分の放出を制御するよう作られることができる。一例において、２倍の日用過剰量の本発明のポリペプチドは、不揮発性流体中に配置される。本発明の組成物は、粘着性の不揮発性液体の形態で提供される。具体的な製剤の皮膚を通じての浸透は、当該技術分野における標準的な方法による測定基準であり得る（例えば、Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍ．  ６４：１９４−１９５  （１９７５））。好適なパッチの例は、受動的転移皮膚パッチ、イオン泳動皮膚パッチ、またはＮｉｃｏｄｅｒｍなどのマイクロニードルを有するパッチである。
【０２９７】
他の実施態様において、組成物は、鼻内、頬側、または舌下の経路を介して脳へと送達され、嗅覚通路を通じた中枢神経系への活性成分の転移を可能にし、全身性投与を低下させ得る。この投与経路のために通常用いられるデバイスは、米国特許第６，７１５，４８５号に含まれる。この経路を介して送達される組成物は、一定の薬物と関連した全身性毒性の危険を低下させる増大した中枢神経系投薬または減少した総身体負担を可能にし得る。皮下的に植え込み式のデバイスにおける送達のための医薬組成物の調製は、例えば、米国特許第３，９９２，５１８号、第５，６６０，８４８号、および第５，７５６，１１５号において説明されるものなど、当該技術分野において公知の方法を用いて実施することができる。
【０２９８】
浸透ポンプは、錠剤、丸剤、カプセル剤、または植え込み式のデバイスの形態における
遅延放出薬として用いられ得る。浸透ポンプは、当該技術分野において周知であり、延長した放出薬物送達のための浸透ポンプを提供する上で経験のある企業から、当業者にとって容易に入手可能である。例は、ＡＬＺＡのＤＵＲＯＳ（商標）、ＡＬＺＡのＯＲＯＳ（商標）、Ｏｓｍｏｔｉｃａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌのＯｓｍｏｄｅｘ（商標）システム、Ｓｈｉｒｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）システム、およびＡｌｚｅｔ（商標）である。浸透ポンプ技術を説明する特許は、米国特許第６，８９０，９１８号、第６，８３８，０９３号、第６，８１４，９７９号、第６，７１３，０８６号、第６，５３４，０９０号、第６，５１４，５３２号、第６，３６１，７９６号、第６，３５２，７２１号、第６，２９４，２０１号、第６，２８４，２７６号、第６，１１０，４９８号、第５，５７３，７７６号、第４，２００，０９８４号、および第４，０８８，８６４号であり、それらの内容は引用により本明細書に組み込まれる。本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮する当業者は、本発明のポリペプチドの延長した放出のための浸透ポンプを製造し得る。
【０２９９】
注射器ポンプも遅延放出薬として用いられ得る。このようなデバイスは、米国特許第４，９７６，６９６号、第４，９３３，１８５号、第５，０１７，３７８号、第６，３０９，３７０号、第６，２５４，５７３号、第４，４３５，１７３号、第４，３９８，９０８号、第６，５７２，５８５号、第５，２９８，０２２号、第５，１７６，５０２号、第５，４９２，５３４号、第５，３１８，５４０号、および第４，９８８，３３７号において説明されており、それらの内容は引用により本明細書に組み込まれる。本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮する当業者は、本発明の組成物の延長した放出のための注射器ポンプを製造し得る。
【０３００】
（ＩＸ）．医薬キット）
別の態様におおいて、本発明は、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドの使用を容易にするためのキットを提供する。該キットは、本明細書に提供される医薬組成物、該医薬組成物を同定するラベル、ならびに貯蔵、再構成、および／または該医薬組成物の対象への投与についての説明書を含む。いくつかの実施態様において、該キットは好ましくは、注射のためにまたは滅菌水、緩衝液、もしくはデキストロースによる再構成のために用意ができている製剤において互いに、（ａ）疾患、容態、または障害を治療するのに十分な量のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を必要とする対象への投与の際の該ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物、および（ｂ）ある量の医薬として許容し得る担体を、ＣＦＸＴＥＮ薬物ならびに貯蔵条件および取り扱い条件を同定するラベル、ならびに薬物について認可された適応症に関するシート、認可された適応症の予防および／または治療のための使用のためのＣＦＸＴＥＮ薬物の再構成および／または投与、適切な薬用量および安全情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を同定する情報についての説明書とともに含む。前述の別の実施態様において、該キットは、ＣＦＸＴＥＮ組成物に好適な希釈剤を保持することのできる第二の容器を含み、該容器の使用は、ユーザーに、対象に送達されるべき適切な濃度のＣＦＸＴＥＮを提供する。
【実施例】
【０３０１】
（実施例）
（実施例１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築）
以下の実施例は、３６のアミノ酸のモチーフ配列をコードするコドンの最適化された遺伝子の収集物の集まりを説明する。第一の工程として、スタッファーベクターｐＣＷ０３５９をｐＥＴベクターに基づいて構築し、それは、Ｔ７プロモーターを含む。ｐＣＷ０３５９は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）およびＴＥＶプロテアーゼ認識部位の後の、ＢｓａＩ部位、ＢｂｓＩ部位、およびＫｐｎＩ部位によって隣接されるスタッファー配列をコードする。ＢｓａＩ部位およびＢｂｓＩ部位が消化後に適合性のあるオーバーハングを生じるよう、該部位を挿入した。スタッファー配列に、ＧＦＰ遺伝子の切りつめられた
バージョンおよびＨｉｓタグが続く。スタッファー配列は終止コドンを含み、したがってスタッファープラスミドｐＣＷ０３５９を保持する大腸菌細胞は、非蛍光性コロニーを形成する。スタッファーベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化して、スタッファーセグメントを取り出し、結果として生じるベクター断片をアガロースゲル精製によって単離した。配列は、ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６と命名され、モチーフのＡＤファミリーを反映した。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３を有し、式中Ｘは、配列ＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ、ＧＳＥＧＳＳＧＰＧＥＳＳ、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ、またはＧＳＧＧＥＰＳＥＳＧＳＳを有する１２マーペプチドである。インサートを、以下の対のリン酸化型合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって得た：
ＡＤ１ｆｏｒ：ＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＤＧＧＴＧＧＹＴＣＹＡＧＣＧＧＴＴＣＹＧＡＲＴＣ  
ＡＤ１ｒｅｖ：ＡＣＣＴＧＡＹＴＣＲＧＡＡＣＣＧＣＴＲＧＡＲＣＣＡＣＣＨＧＧＡＧＡＴＴＣ
ＡＤ２ｆｏｒ：ＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＹＧＧＴＣＣＤＧＧＹＧＡＲＴＣＹＴＣ  
ＡＤ２ｒｅｖ：ＡＣＣＴＧＡＲＧＡＹＴＣＲＣＣＨＧＧＡＣＣＲＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＣＴ  
ＡＤ３ｆｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＹＴＣＹＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＹＧＡＲＧＧＹＧＧＴＣＣ
ＡＤ３ｒｅｖ：ＡＣＣＴＧＧＡＣＣＲＣＣＹＴＣＲＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＲＧＡＲＧＡ
ＡＤ４ｆｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＹＧＧＴＧＧＹＧＡＡＣＣＤＴＣＹＧＡＲＴＣＴＧＧＴＡＧＣＴＣ
本発明者らは、リン酸化型オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩストッパーｆｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ、および非リン酸化型オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩストッパーｒｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を連結し、結果的に、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに連結した変動する数の１２マー反復を表す変動する長さの産物の混合物を生じた。３６アミノ酸の長さに相応する産物を混合物から、調製用アガロースゲル電気泳動法によって単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９へと連結した。結果として生じるＬＣＷ０４０１と命名されたライブラリーにおけるクローンのほとんどは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６の配列が、ＧＦＰ遺伝子とフレーム内でｔ連結し、かつＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のほとんどの配列が良好な発現レベルを有していたことを示す。
【０３０２】
本発明者らは、ＩＰＴＧを含むアガープレートにライブラリーＬＣＷ０４０１由来の９６の単離物を刻印することによって、高レベルの蛍光について該単離物をスクリーニングした。同じ単離物をＰＣＲによって評価し、３６のアミノ酸と強い蛍光とを有するセグメントを含む４８の単離物を同定した。これらのセグメントについてのヌクレオチドおよびアミノ酸のコンストラクトのファイル名を表９に列挙する。
【０３０３】
【表９−１】
2013502459.tif 000028
【０３０４】
【表９−２】
2013502459.tif 000029
【０３０５】
【表９−３】
2013502459.tif 000030
（実施例２：ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築）
３６のアミノ酸長のＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮヒア列をＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と命名した。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３を有し、式中、Ｘは、配列ＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥ、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥ  ＴＰ、ＧＴＳＥＳＡ  ＴＰＥＳＧＰ、またはＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰを有する１２マーのペプチドである。インサートを、以下に対のリン酸化型合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって得た：
ＡＥ１ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＡＧＣＣＣＤＧＣＷＧＧＹＴＣＴＣＣＤＡＣＹＴＣＹＡＣＹＧＡＲＧＡ
ＡＥ１ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＴＣＹＴＣＲＧＴＲＧＡＲＧＴＨＧＧＡＧＡＲＣＣＷＧＣＨＧＧＧＣＴ
ＡＥ２ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＣＫＧＣＷＡＣＹＴＣＹＧＧＹＴＣＴＧＡＲＡＣＹＣＣ
ＡＥ２ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＲＧＴＹＴＣＡＧＡＲＣＣＲＧＡＲＧＴＷＧＣＭＧＧＴＴＣＧＣＴ
ＡＥ３ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＧＡＡＡＧＣＧＣＷＡＣＹＣＣＫＧＡＲＴＣＹＧＧＹＣＣ
ＡＥ３ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＲＧＡＹＴＣＭＧＧＲＧＴＷＧＣＧＣＴＴＴＣＡＧＡＲＧＴ
ＡＥ４ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＡＣＹＧＡＡＣＣＫＴＣＹＧＡＲＧＧＹＡＧＣＧＣＷＣＣ
ＡＥ４ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＧＣＴＲＣＣＹＴＣＲＧＡＭＧＧＴＴＣＲＧＴＡＧ
ＡＲＧＴ
本発明者らは、リン酸化型オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩストッパーｆｏｒ：  ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣおよびひリン酸化型オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩストッパーｒｅｖ：  ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を連結し、結果的に、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに連結された１２マーの変動する数の反復を表す変動する長さの産物の混合物を生じた。３６アミノ酸の長さに相応する産物を調製用アガロースゲル電気泳動法によって混合物から単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９へと連結した。ＬＣＷ０４０２と命名された、結果として生じるライブラリーにおけるクローンのほとんどは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６がＧＦＰ遺伝子とフレームにおいて連結され、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６のほとんどの配列が良好な発現を示すことを示す。
【０３０６】
本発明者らは、ライブラリーＬＣＷ０４０２由来の９６の単離物を、ＩＰＴＧを含むアガープレートに刻印することによって、高レベルの蛍光について該単離物をスクリーニングした。同じ単離物をＰＣＲによって評価し、３６のアミノ酸と強い蛍光とを有するセグメントを含む４８の単離物を同定した。これらの単離物を配列決定し、正確なＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントを含む３７のクローンを同定した。これらのセグメントについてのヌクレオチドおよびアミノ酸コンストラクトのファイル名を表１０に列挙する。
【０３０７】
【表１０−１】
2013502459.tif 000031
【０３０８】
【表１０−２】
2013502459.tif 000032
【０３０９】
【表１０−３】
2013502459.tif 000033
（実施例３：ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築）
３６のアミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリーを構築した。該配列をＸＴＥＭ＿ＡＦ３６と命名した。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３を有し、式中Ｘは配列ＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴＡＰ、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ、ＧＴＳＰＳＧＥＳＳＴＡＰ、またはＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧＰを有する１２マーのペプチドである。インサートを、以下の対のリン酸化型合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって得た：
ＡＦ１ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＴＣＴＡＣＹＡＧＣＧＡＡＴＣＹＣＣＫＴＣＴＧＧＹＡＣＹＧＣＷＣＣ
ＡＦ１ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＲＧＴＲＣＣＡＧＡＭＧＧＲＧＡＴＴＣＧＣＴＲＧＴＡＧＡ
ＡＦ２ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＡＣＹＣＣＫＧＡＡＡＧＣＧＧＹＴＣＹＧＣＷＴＣＴＣＣ  
ＡＦ２ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＷＧＣＲＧＡＲＣＣＧＣＴＴＴＣＭＧＧＲＧＴＡＧＡＲＧＴ
ＡＦ３ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＹＣＣＫＡＧＣＧＧＹＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＣＹＧＣＷＣＣ
ＡＦ３ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＲＧＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣＲＣＣＧＣＴＭＧＧＲＧＡＲＧＴ
ＡＦ４ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＴＣＹＡＣＹＡＧＣＴＣＴＡＣＹＧＣＷＧＡＡＴＣＴＣＣＫＧＧＹＣＣ
ＡＦ４ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＭＧＧＡＧＡＴＴＣＷＧＣＲＧＴＡＧＡＧＣＴＲＧＴＲＧＡ
本発明者らは、リン酸化型オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩストッパーｆｏｒ：  ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣおよび非リン酸化型オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩストッパーｒｅｖ：  ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニーリングした。アリーニングしたオリゴヌクレオチド対を連結し、結果的に、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに連結した１２マーの変動する数の反復を表す変動する長さの産物の混合物を生じた。３６のアミノ酸の長さに相応する産物を、調製用アガロースゲル電気泳動法によって混合物から単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９へと連結した。ＬＣＷ０４０３と命名された結果として生じるライブラリーにおけるクローンのほとんどは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の配列がＧＦＰ遺伝子とフレーム内で連結され、かつＸＴＥＮ＿ＡＦ３６のほとんどの配列が良好な発現を示すことを示す。
【０３１０】
本発明者らは、ライブラリーＬＣＷ０４０３由来の９６の単離物を、ＩＰＴＧを含むアガープレートに刻印することによって、高レベルの蛍光について該単離物をスクリーニングした。同じ単離物をＰＣＲによって評価し、３６のアミノ酸と強い蛍光とを有するセグメントを含む４８の単離物を同定した。これらの単離物を配列決定し、正確なＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントを含む４４のクローンを同定した。これらのセグメントについてのヌクレオチドおよびアミノ酸コンストラクトのファイル名を表１１に列挙する。
【０３１１】
【表１１−１】
2013502459.tif 000034
【０３１２】
【表１１−２】
2013502459.tif 000035
【０３１３】
【表１１−３】
2013502459.tif 000036
【０３１４】
【表１１−４】
2013502459.tif 000037
（実施例４：ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築）
３６のアミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリーを構築した。該配列をＸＴＥＭ＿ＡＧ３６と命名した。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３を有し、式中Ｘは配列ＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ、またはＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰを有する１２マーのペプチドである。インサートを、以下の対のリン酸化型合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって得た：
ＡＧ１ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＡＣＹＣＣＫＧＧＹＡＧＣＧＧＴＡＣＹＧＣＷＴＣＴＴＣＹＴＣＴＣＣ  
ＡＧ１ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＲＧＡＡＧＡＷＧＣＲＧＴＡＣＣＧＣＴＲＣＣＭＧＧＲＧＴ
ＡＧ２ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＹＣＣＫＴＣＴＧＧＴＧＣＷＡＣＹＧＧＹＴＣＹＣＣ
ＡＧ２ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＲＧＡＲＣＣＲＧＴＷＧＣＡＣＣＡＧＡＭＧＧＲＧＴＡＧＡＧＣＴ
ＡＧ３ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＴＣＴＡＧＣＣＣＫＴＣＴＧＣＷＴＣＹＡＣＹＧＧＴＡＣＹＧＧＹＣＣ
ＡＧ３ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＲＧＴＡＣＣＲＧＴＲＧＡＷＧＣＡＧＡＭＧＧＧＣＴＡＧＡ
ＡＧ４ｆｏｒ：  ＡＧＧＴＧＣＷＴＣＹＣＣＫＧＧＹＡＣＹＡＧＣＴＣＴＡＣＹＧＧＴＴＣＴＣＣ
ＡＧ４ｒｅｖ：  ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＲＧＴＡＧＡＧＣＴＲＧＴＲＣＣＭＧＧＲＧＡＷＧＣ
本発明者らは、リン酸化型オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩストッパーｆｏｒ：  ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣおよび非リン酸化型オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩストッパーｒｅｖ：  ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニーリングした。アリーニングしたオリゴヌクレオチド対を連結し、結果的に、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに連結した１２マーの変動する数の反復を表す変動する長さの産物の混合物を生じた。３６のアミノ酸の長さに相応する産物を、調製用アガロースゲル電気泳動法によって混合物から単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９へと連結した。ＬＣＷ０４０４と命名された結果として生じるライブラリーにおけるクローンのほとんどは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の配列がＧＦＰ遺伝子とフレーム内で連結され、かつＸＴＥＮ＿ＡＧ３６のほとんどの配列が良好な発現を示すことを示す。
【０３１５】
本発明者らは、ライブラリーＬＣＷ０４０４由来の９６の単離物を、ＩＰＴＧを含むアガープレートに刻印することによって、高レベルの蛍光について該単離物をスクリーニングした。同じ単離物をＰＣＲによって評価し、３６のアミノ酸と強い蛍光とを有するセグメントを含む４８の単離物を同定した。これらの単離物を配列決定し、正確なＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを含む４４のクローンを同定した。これらのセグメントについてのヌクレオチドおよびアミノ酸コンストラクトのファイル名を表１２に列挙する。
【０３１６】
【表１２−１】
2013502459.tif 000038
【０３１７】
【表１２−２】
2013502459.tif 000039
【０３１８】
【表１２−３】
2013502459.tif 000040
【０３１９】
【表１２−４】
2013502459.tif 000041
（実施例５：ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の構築）
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６からＡＥ７２、１４４、２８８、５７６、および８６４への連続的な二量体化から構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントの収集物をＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７の異なるセグメントから集めた。３７の異なる３６アミノ酸セグメントすべてを保有する大腸菌の培養物を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、小さな断片をインサートとして生じた。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、大きな断片をベクターとして生じた。インサート断片およびベクター断片を連結し、結果的に長さを二倍にし、連結混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞へと形質転換して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２のコロニーを得た。
【０３２０】
このＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４０６と命名した。ＬＣＷ０４０６由来のすべてのクローンを組み合わせ、先に説明したのと同じ過程を用いて再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリーＬＣＷ０４１０を生じた。ＬＣＷ０４１０由来のすべてのクローンを組み合わせ、先に説明したのと同じ過程を用いて再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリーＬＣＷ０４１４を生じた。２つの単離物ＬＣＷ０４１４．００１およびＬＣＷ０４１４．００２をライブラリーから無作為に拾い、配列決定して同一性を実証した。ＬＣＷ０４１４由来のすべてのクローンを組み合わせて、先に説明したのと同じ過程を用いて再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライブラリーＬＣＷ０４１８を生じた。本発明者らは、高レベルのＧＦＦＰ蛍光についてライブ
ラリーＬＣＷ０４１８由来の９６の単離物をスクリーニングした。ＰＣＲによる正しい大きさのインサートかつ強い蛍光を有する８の単離物を配列決定し、２の単離物（ＬＣＷ０４１８．０１８およびＬＣＷ０４１８．０５２）を、配列決定および発現データに基づいてさらに使用するために選択した。
【０３２１】
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の具体的なクローンｐＣＷ０４３２を、先に説明したのと同じ二量体化過程を用いて、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８およびＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のＬＣＷ０４１４．００２を組み合わせることによって構築した。
【０３２２】
（実施例６：ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４の構築）
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７の異なるセグメント、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の４４のセグメント、およびＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の４４のセグメントから出発して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントの収集物を集めた。
【０３２３】
１２５の異なる３６アミノ酸セグメントすべてを保有する大腸菌の培養物を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、小さな断片をインサートとして生じた。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、大きな断片をベクターとして生じた。インサート断片およびベクター断片を連結し、結果的に長さを二倍にし、連結混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞へと形質転換して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ７２のコロニーを得た。
【０３２４】
このＸＴＥＮ＿ＡＭ７２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４６１と命名した。ＬＣＷ０４６１すべてのクローンを組み合わせ、先に説明したのと同じ過程を用いて再度二量体化し、ライブラリーＬＣＷ０４６２を生じた。ライブラリーＬＣＷ０４６２由来の１５１２の単離物を、タンパク質発現についてスクリーニングした。個々のコロニーを９６ウェルプレートへと転移させ、出発物質培養物として一晩培養した。これらの出発物質培養物を新鮮自己誘導培地へと希釈し、２０〜３０時間培養した。発現を、３９５ｎｍでの励起および５１０ｎｍでの発光を有する蛍光プレートリーダーを用いて測定した。１９２の単離物は、高レベルの発現を示し、ＤＮＡ配列決定に供された。ライブラリーＬＣＷ０４６２におけるほとんどのクローンは、良好な発現および類似の物理化学的特性を示し、ＸＴＥＮ＿ＡＭ３６セグメントのほとんどの組み合わせが有用なＸＴＥＮ配列を生じることを示唆した。ＬＣＷ０４６２由来の３０の単離物を、複数のＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントを含む多機能性タンパク質の構築のために、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントの好ましい収集物として選択した。これらのセグメントについてのヌクレオチドおよびアミノ酸コンストラクトのファイル名を表１３に列挙する。
【０３２５】
【表１３−１】
2013502459.tif 000042
【０３２６】
【表１３−２】
2013502459.tif 000043
【０３２７】
【表１３−３】
2013502459.tif 000044
【０３２８】
【表１３−４】
2013502459.tif 000045
【０３２９】
【表１３−５】
2013502459.tif 000046
【０３３０】
【表１３−６】
2013502459.tif 000047
【０３３１】
【表１３−７】
2013502459.tif 000048
【０３３２】
【表１３−８】
2013502459.tif 000049
（実施例７：ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の構築）
ライブラリーＬＣＷ０４６２全体を実施例６において説明される通り二量体化し、結果的に、ＬＣＷ０４６３と命名されたＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８クローンのライブラリーを生じた。ライブラリーＬＣＷ０４６３由来の１５１２の単離物を、実施例６において説明されるプロトコールを用いてスクリーニングした。１７６の高度に発現するクローンを配列決定し、４０の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントを、２９９のアミノ酸残基を有する複数のＸＴＥＮセグメントを含む多機能性タンパク質の構築のために選択した。
【０３３３】
（実施例８：ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２の構築）
本発明者らは、ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのライブラリーＬＣＷ０４６２由来のセグメントおよびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントのライブラリーＬＣＷ０４６３由来のセグメントを組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーを生じた。このＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントの新たなライブラリーをＬＣＷ０４６４と命名した。プラスミドを、ＬＣＷ０４６２およびＬＣＷ０４６３をそれぞれ有する大腸菌の培養物から単離した。ライブラリーＬＣＷ０４６４からの１５１２の単離物を、実施例６において説明されるプロトコールを用いてスクリーニングした。１７６の高度に発現するクローンを配列決定し、３９の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを、より長いＸＴＥＮの構築のために、および４３２のアミノ酸残基を有する複数のＸＴＥＮセグメントを含む多機能性タンパク質の
構築のために選択した。
【０３３４】
並行して、本発明者らは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４およびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の好ましいセグメントを用いて、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーＬＭＳ０１００を構築した。このライブラリーのスクリーニングは、さらなる構築のために選択される４の単離物を生じた。
【０３３５】
（実施例９：ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の構築）
スタッファーベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化してスタッファーセグメントを取り出し、結果として生じるベクター断片を、アガロースゲル精製によって単離した。
【０３３６】
本発明者らは、アミノ酸ＧＡＳＡＳＧＡＰＳＴＧをコードしかつ制限酵素ＡｓｃＩ制限ヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣを内側に有する配列決定アイランドＡ（ＳＩ‐Ａ）を導入するために、リン酸化型オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：  ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣおよび非リン酸化型オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：  ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＴＧＣをアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を、先に調製された、ＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９と連結して、ＳＩ‐Ａを含むｐＣＷ０４６６を生じた。次に、本発明者らは、実施例８由来の４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントおよびｐＣＷ０４６６由来のＳＩ‐Ａセグメントを、実施例５において説明された同じ二量体化過程を用いて、Ｃ末端において組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを生じた。この新たなＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４７９と命名した。
【０３３７】
本発明者らは、実施例５において説明される同じ二量体化過程を用いて、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーＬＣＷ０４７９由来のセグメントおよび実施例８由来の４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーを生じた。この新たなＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８１と命名した。
【０３３８】
（実施例１０：ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８の構築）
本発明者らは、アミノ酸ＧＰＥＰＴＧＰＡＰＳＧをコードしかつ制限酵素ＦｓｅＩ認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＣＧＧＣＣを内側に有する配列決定アイランドＢ（ＳＩ‐Ｂ）を導入するために、リン酸化型オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：  ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣおよび非リン酸化型オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：  ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧをアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を、実施例９において用いたようなＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化したスタッファーベクターｐＣＷ０３５９と連結し、ＳＩ‐Ｂを含むｐＣＷ０４６７を生じた。次に、本発明者らは、実施例８由来の４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントおよびｐＣＷ０４６７由来のＳＩ‐Ｂセグメントを、実施例５に説明された同じ二量体化過程を用いてＣ末端において組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを生じた。この新たなＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８０と命名した。
【０３３９】
本発明者らは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーＬＣＷ０４８０由来の
セグメントおよびＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーＬＣＷ０４８１由来のセグメントを、実施例５におけるのと同じ二量体化過程を用いて組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリーを生じた。この新たなＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８７と命名した。
【０３４０】
（実施例１１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４の構築）
いくつかの連続した回数の二量体化を用いて、本発明者らは、実施例１に列挙されたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントから出発するＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４の収集物を集めた。これらの配列を実施例５に説明されるように構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４由来のいくつかの単離物を評価し、生理学的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが分かった。ＸＴＥＮ＿ＡＤ５７６の１つの中間体コンストラクトを配列決定した。このクローンを、カニクイザルにおけるＰＫ実験において評価し、約２０時間の半減期を測定した。
【０３４１】
（実施例１２：ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の構築）
いくつかの連続した回数の二量体化を用いて、本発明者らは、実施例３に列挙されたＸＴＥＮ＿ＡＦ３６のセグメントから出発するＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の収集物を集めた。これらの配列を実施例５に説明される通り集めた。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４由来のいくつかの単離物を評価し、生理学的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが分かった。ＸＴＥＮ＿ＡＦ５４０の１つの中間体コンストラクトを配列決定した。このクローンをカニクイザルにおけるＰＫ実験において評価し、約２０時間の半減期を測定した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の全長のクローンは、優れた溶解度を有し、カニクイザルにおいて６０時間超の半減期を示した。実施例９に説明されるような配列決定アイランドを含む第二のセットのＸＴＥＮ＿ＡＦ配列を構築した。
【０３４２】
（実施例１３：ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の構築）
いくつかの連続した回数の二量体化を用いて、本発明者らは、実施例１に列挙されたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントから出発するＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列の収集物を集めた。これらの配列を実施例５において説明される通り集めた。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４由来のいくつかの単離物を評価し、生理学的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが分かった。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の全長のクローンは、優れた溶解度を有し、カニクイザルにおいて６０時間超の半減期を示した。
【０３４３】
（実施例１４：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸長の構築および１２マーの追加ライブラリーのスクリーニング）
本実施例は、ヘルパードメインの存在なしで融合タンパク質のＮ末端にけるＸＴＥＮ融合体の発現を可能にするよう翻訳の開始を促進するためのＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適なの工程を詳述する。歴史的に、Ｎ末端にＸＴＥＮを有するタンパク質の発現は乏しく、ＧＦＰ蛍光アッセイにおいて本質的に検出できないであろう値を生じる（Ｎ末端ＣＢＤヘルパードメインによる発現の２５％未満）。コドンレベルで多様性を作製するために、７のアミノ酸配列を選択し、コドンの多様性を用いて調製した。コドン多様性を有する１２のアミノ酸をコードする７対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングし、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素で消化したスタッファーベクターｐＣＷ０５５１（スタッファー−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）へと連結し、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞へと形質転換して、７ライブラリーのコロニーを得た。結果として生じるクローンは、発現をスクリーニングするためにＧＦＰ蛍光の使用を可能にするよう、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰにフレーム内で融合したＮ末端ＸＴＥＮ１２マーを有する。７の作製されたライブラリー由来の個々のコロニーを拾い、９６穴深皿プレートにおける５００μＬのスーパーブロス培地において飽和するまで一晩増殖させた。拾ったコロニー数は、ライブラリーの理論的多様性のおよそ半分〜１／３に及んだ（表１４を参照されたい）。
【０３４４】
【表１４】
2013502459.tif 000050
飽和した一晩培養物を用いて、５００μＬの新鮮な培養物を自己誘導培地に接種し、この場合、該培養物を２６℃で一晩増殖させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレートリーダー（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイし、ＧＦＰリポータータンパク質の量を決定した（発現アッセイの結果については図２８を参照されたい）。本結果は、発現レベルの中央値が、「水準点」のＣＢＤ  Ｎ末端ヘルパードメインと比較して発現レベルのおよそ半分であるのに対し、ライブラリー由来の最良のクローンは、水準点に対して非常により近いことを示し、該配列の周囲のさらなる最適化が保証されることを示した。このことは、ＣＢＤ  Ｎ末端水準点の２５％未満の発現レベルである先行ＸＴＥＮバージョンとは対照的である。本結果は、アミノ酸ＭＡで始まるライブラリーが、ＭＥで始まるものよりも良好な発現レベルを有したことも示す。このことは、最良のクローンでみると最も明らかであり、ＭＡで主に始まるので、水準点に対してより近かった。ＣＢＤ‐ＡＭ８７５水準点の３３％内の１７６のクローンのうち８７％はＭＡで始まり、ＭＡで始まるライブラリーにおける配列の７５％に過ぎないので、最高レベルの発現でＭＡで始まるクローンの明らかに過剰な提示があった。最良のクローンのうち９６を配列決定して、同一性および１２の配列を確認し（表１５を参照されたい）、ＬＣＷ５４６由来の４、ＬＣＷ５４７由来の４、およびＬＣＷ５５２由来の４をさらなる最適化のために選択した。
【０３４５】
【表１５】
2013502459.tif 000051
（実施例１５：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸長の構築ならびにコドン３およびコドン４を最適化するライブラリーのスクリーニング）
本実施例は、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端においてＸＴＥＮ融合体の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するためのＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化における工程を詳述する。確立された第一の２つのコドンについての優先性とともに（上述の実施例を参照されたい）、第三および第四のコドンを無作為化して優先性を決定した。ＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７、およびＬＣＷ５５２由来の最良のクローンに基づいた３つのライブラリーを、許容可能なＸＴＥＮコドンのすべての組み合わせが第三および第四の残基の位置に存在するよう修飾されたこれらの残基を用いて設計した。各ライブラリーについて許容可能なＸＴＥＮコドンすべてを含むために、第三および第四の残基のコドン多様性を有する１２のアミノ酸をコードする９対のオリゴヌクレオチド設計し、アニールし、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素で消化したスタッファーベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）へと連結し、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞へと形質転換し、３つのライブラリーＬＣＷ０５６９〜０５７１のコロニーを得た。作製した３つのライブラリー由来の合計５０４の個々のコロニーを拾い、９６穴深皿プレートにおける５００μＬのスーパーブロス培地において飽和するまで一晩増殖させた。このことは、相対的なライブラリー性能および配列優先性を理解するのに十分な適用範囲を提供した。飽和した一晩培養物を用いて、新たな５００μＬの培養物を自己誘導培地において接種し、該培地において２６℃で一晩増殖させた。これらの発現培養物を次に、蛍光プレートリーダー（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰリポーターの量を決定した。スクリーン由来の上位７５クローンを配列決定し、ＧＦＰリポーター発現対基準点試料について再度試験した（図２８を参照されたい。）。５２のクローンは、使用可能な配列決定データを生じ、その後の分析に用いた。結果は、ライブラリーによって分類され、ＬＣＷ５４６が優れたライブラリーであったことを示す。結果を表１６に呈する。驚くべきことに、最良のクローンについての基本的な蛍光読み取りは〜９００ＡＵであるのに対し、ＣＢＤ  Ｎ末端基準点は〜６００ＡＵに過ぎないことが発見された。このことは、このライブラリーが、ＣＢＤ  Ｎ末端基準点に対して発現においてほぼ等しい先行ライブラリー由来の最良クローンを上回るおよそ３３％の改良を生じた（実施例１４）。
【０３４６】
【表１６】
2013502459.tif 000052
さらなる傾向が、第三および第四の位置における特定のコドンについての優先性を示すデータにおいて見られた。ＬＣＷ５６９ライブラリー内で、第三の位置におけるグルタミン酸コドンＧＡＡ、およびトレオニンコドンＡＣＴは、表１７において見られるようにより高い発現と関係した。
【０３４７】
【表１７】
2013502459.tif 000053
加えて、上位７５クローンの再試験は、いくつかが基準点クローンよりも今や優れていることを示した。
【０３４８】
実施例１６：ＸＴＥＮ構築のＮ末端伸長の構築ならびに組み合わせの１２マーおよび３６マーのライブラリーのスクリーニング
本実施例は、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端においてＸＴＥＮ融合体の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するためのＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化における工程を詳述する。確立された第一の２つのコドンについての優先性とともに（上述の実施例を参照されたい）、まさにＮ末端における１２の選択された１２マー配列（上述の実施例を参照されたい）に続いて、１２５の既に構築された３６マーセグメント（上述の実施例を参照されたい）を組み合わせ様式によって組み合わせることによって、Ｎ末端をより広範な文脈において検討した。このことは、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端における新規の４８マーを作製し、より長い配列の発現に及ぼすＮ末端におけるより長い範囲の相互作用の影響の評価を可能にした（図２９）。３６マーを組み立てるのに用いられた二量体化手順と同様に（上述の実施例を参照されたい）、１２５の選択された３６マーセグメントを含むプラスミドを制限酵素ＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、適切な断片をゲル精製した。クローンＡＣ９４由来のプラスミド（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）もＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、適切な断片をゲル精製した。これらの断片を互いに連結し、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞へと形質転換し、まさにＮ｝末端における１２の選択された１２マーをさらにクローニングするためのベクターとしても機能するライブラリーＬＣＷ０５７９のコロニーを得た。ＬＣＷ０５７９のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲル精製した。１２の選択された１２マー配列をコードする１２対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングし、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化したＬＣＷ０５７９ベクターと連結し、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞へと形質転換し、ライブラリーＬＣＷ０５８０のコロニーを得た。１５００の独特なクローンの理論的多様性とともに、作製された
ライブラリー由来の合計１５１２の個々のコロニーを拾い、９６穴深皿プレートにおける５００μＬのスーパーブロス培地において飽和するまで一晩増殖させた。このことは、相対的なライブラリーの性能および配列の優先性を理解するのに十分な適用範囲を提供した。一晩飽和させた培養物を用いて、自己誘導培地に新たな５００μＬ培養物を摂取し、２６℃で一晩増殖させた。次に、これらの発現培養物を、蛍光プレートリーダー（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイし、存在するＧＦＰリポーターの量を決定した。上位９０のクローンを配列決定し、ＧＦＰリポーター発現について再試験した。８３のクローンは、使用可能な配列決定データを生じ、その後の分析に用いた。配列決定データを用いて、各クローンに存在する導出１２マーを決定し、発現に及ぼす各１２マーの影響を評価した。クローンＬＣＷ５４６＿０６およびＬＣＷ５４６＿０９は、優れたＮ末端であるとして際立っていた（表１８を参照されたい）。
【０３４９】
【表１８】
2013502459.tif 000054
配列決定および再試験は、類似の結果を生じるデータにおける同じ張りえつの独立した複製物のいくつかの場合も明らかにし、本アッセイにおける信頼性を増大させた。加えて、６の独特な配列を有する１０のクローンは、基準点クローンよりも優れていた。該１０のクローンを表１９に呈する。これらは、これらの配列の唯一の発生であり、いずれの場合においても、これらの配列のうちの１つが生じかつ基準点クローンに勝り損ねることはないことが特筆された。これら６つの配列をさらなる最適化のために進行させた。
【０３５０】
【表１９−１】
2013502459.tif 000055
【０３５１】
【表１９−２】
2013502459.tif 000056
実施例１７：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸長の構築ならびにＸＴＥＮ−ＡＭ８７５およびＸＴＥＮ−ＡＥ８６４のための組み合わせ１２マーおよび３６マーのライブラリーのスクリーニング
本実施例は、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端におけるＸＴＥＮ融合体の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するためのＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化における工程を詳述する。Ｎ末端の最初の４つのコドンについての（上述の実施例を参照されたい）、ならびに確立されたＮ末端の１２マーおよび３６マーの最良の対形成のための優先性とともに、組み合わせアプローチに取り掛かり、これらの優先性の合体を検討した。このことは、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端において新規の４８マーを作製し、先行する結論の合流性の試験を可能にした。加えて、これらのリーダー配列がすべてのＸＴＥＮタンパク質の一般的な解決策である能力を、ＸＴＥＮ−ＡＥ８６４およびＸＴＥＮ−ＡＭ８７５の両方の前に新たな４８マーを配置することによって評価した。３６マーセグメントの１２５のクローンすべてを用いる代わりに、最良のＧＦＰ発現を有する３６マーセグメントの６の選択されたクローン由来のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲル精製した。クローンＡＣ９４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）およびＡＣ１０４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ）由来のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲル精製した。これらの断片を出該に連結し、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞へと形質転換し、ライブラリーＬＣＷ０５８５（−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）およびＬＬＣＷ０５８６（−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ）のコロニーを得、これも、まさにＮ末端における８の選択された１２マーをさらにクローニングするためのベクターとして機能することができた。ＬＣＷ０５８５およびＬＣＷ０５８６のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲル精製した。先の（発生２）のスクリーニングにおいて最良のＧＦＰ発現を有する８の選択された１２マー配列をコードする８対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングし、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化したＬＣＷ０５８５およびＬＣＷ０５８６ベクターと連結し、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞へと形質転換し、最終的なライブラリーＬＣＷ０５８７（ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３−ＧＦＰ）およびＬＣＷ０５８８（ＸＴＥＮ＿ＡＥ９１２−ＧＦＰ）のコロニーを得た。４８の独特なクローンの理論的多様性とともに、作製されたライブラリー由
来の合計２５２の個々のコロニーを拾い、９６穴深皿プレートにおいて５００μＬのスーパーブロス培地において飽和するまで一晩増殖させた。このことは、相対的なライブラリー性能および配列優先性を理解するのに十分な適用範囲を提供した。一晩飽和させた培養物を用いて、新たな５００μＬの培養物を自己誘導培地に接種し、これを２６℃で一晩増殖させた。これらの発現培養物を次に、蛍光プレートリーダー（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイし、存在するＧＦＰリポーターの量を決定した。上位３６のクローンを配列決定し、ＧＦＰリポーター発現について再試験した。３６のクローンは、使用可能な配列決定データを生じ、これらの３６をその後の分析に用いた。配列決定データは、クローンに存在する１２マー、第三のコドン、第四のコドン、および３６マーを決定し、クローンの多くが、同じ配列の独立した複製物であることを明らかにした。加えて、これらのクローンについての再試験結果は値が近く、スクリーニング手順が頑強であったことを示す。Ｎ末端におけるある組み合わせについての優先性を観察し、該優先性は、基準点対照よりもおよそ５０％大きなより高い蛍光値を一致して生じた（表２０および表２１を参照されたい）。これらのデータは、最適化されたＮ末端ＸＴＥＮをコードする配列の融合タンパク質遺伝子への包含が、融合タンパク質の発現に顕著な亢進を与えるという結論を支持する。
【０３５２】
【表２０】
2013502459.tif 000057
【０３５３】
【表２１】
2013502459.tif 000058
顕著なことに、ＸＴＥＮ−ＡＭ８７５についてのＮ末端の好ましい組み合わせおよびＸＴＥＮ−ＡＥ８６４についての好ましい組み合わせは同じではなく、開始部位由来の１５０塩基よりもさらにより複雑な相互作用が発現レベルに影響することを示す。好ましいヌクレオチド配列についての配列を表２２に列挙し、好ましいクローンをＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析して、発現を独立して確認した（図３０を参照されたい）。ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３およびＸＴＥＮ−ＡＥ９１２の完全な配列をさらなる分析のために選択した。
【０３５４】
【表２２−１】
2013502459.tif 000059
【０３５５】
【表２２−２】
2013502459.tif 000060
ＣＦＸＴＥＮ組成物を作製および評価するための一般的なスキームは図３３に呈され、本実施例の一般的な説明についての基礎を形成する。実例となる実施例に提供されるガイダンスとともに、開示された方法および当業者に公知の方法を用いて、当業者は、ＸＴＥＮとＣＦと当該技術分野で公知のＣＦのバリアントとを含むある範囲のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を作製および評価することができる。本実施例はそれゆえ、単に説明目的として解釈されるべきであり、任意のやり方の方法は何でも制限されず、幾多の変法は、当業者に明らかである。本実施例において、モチーフのＡＥファミリーのＸＴＥＮに連結された凝固因子のＣＦＸＴＥＮを作製する。
【０３５６】
ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを作製するための一般的なスキームを図３１および図３２に呈する。図３２は、本発明の実施態様のうちの１つにおけるＸＴＥＮポリヌクレオチドコンストラクトの構築体における代表的な工程の模式的流れ図である。個々のオリゴヌクレオチド５０１を１２のアミノ酸モチーフ（「１２マー」）などの配列モチーフ５０２へとアニーリングし、それをその後、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含むオリゴ５０３と連結する。モチーフライブラリーは、具体的な配列のＸＴＥＮファミリー、例えば、表３のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、またはＡＱ配列に限定することができる。この場合、ＡＥファミリーのモチーフをモチーフライブラリーとして用い、それを１２マーにアニーリングし、「構築ブロック」長、例えば、３６アミノ酸をコードするセグメントを作製する。ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子は、所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が達成されるまで、「構築ブロック」の連結および他量体化によって構築されることが
できる。図３２に示すように、この場合のＸＴＥＮ長は、４８アミノ酸残基であるが、より長い長さをこの過程によって達成することができる。例えば、多量体化は、連結、重複伸長、ＰＣＲ構築、または当該技術分野で公知の類似のクローニング技術によって実施されることができる。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファーベクターへとクローニングすることができる。図３２に示される例において、ベクターは、Ｆｌａｇ配列５０６に次いで、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ部位によって隣接されるスタッファー配列５０７、およびＣＦ遺伝子（例えば、ＦＶＩＩ）５０８をコードすることができ、結果的にＣＦＸＴＥＮ５００をコードする遺伝子を生じ、この場合、該遺伝子は、ＸＴＥＮ−ＦＶＩＩのＮ末端からＣ末端への構成における融合タンパク質をコードする。当業者に明らかなように、該方法は、代替的な構築におけるおよびＸＴＥＮ長さの変動する、コンストラクトを作製するために適用することができる。
【０３５７】
ＣＦをコードするＤＮＡ配列は、適切な細胞源から、ゲノムライブラリーから調製されたｃＤＮＡライブラリーから当該技術分野で公知の標準的な手順によって簡便に得ることができ、または公共的に入手可能なデータベース、特許、もしくは文献の参考文献から得られたＤＮＡ配列を用いて合成的に作製され得る（例えば、自動核酸合成）。該タンパク質のＣＦ部分をコードする遺伝子もしくはポリヌクレオチドまたはその相補体を次に、生物系における高レベルのタンパク質発現に適切な転写配列および翻訳配列の制御下で、プラスミドまたは他のベクターであり得る本明細書に説明されるものなどのコンストラクトにクローン化することができる。（４８のアミノ酸残基を有するＸＴＥＮとして示される図３２の場合の）ＸＴＥＮ部分をコードする第二の遺伝子もしくはポリヌクレオチドまたはその相補体は、連結または多量体化の工程を通じて、ＣＦをコードする遺伝子とフレーム内で隣接したコンストラクトへとクローン化することによって、ＣＦ遺伝子の末端をコードするヌクレオチドに遺伝子的に融合することができる。この様式において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質Ｒｅをコードする（またはそれに相補的な）キメラＤＮＡ分子は、コンストラクト内に生じた。任意に、第二のＸＴＥＮをコードする遺伝子を、ＣＦＸＴＥＮ遺伝子の反対側末端をコードするヌクレオチドへと挿入しおよびフレーム内で連結し、またはＣＦコード領域内に挿入することができる。コンストラクトは、異なる構成で設計されて、融合パートナーの種々の順列を単量体ポリペプチドとしてコードすることができる。例えば、遺伝子は、以下の順序の融合タンパク質：ＣＦ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＣＦ、ＣＦ−ＸＴＥＮ−ＣＦ、ＸＴＥＮ−ＣＦ−ＸＴＥＮ、および前述の多量体をコードするために作製されることができる。任意に、このキメラＤＮＡ分子をより適切な発現ベクターである別のコンストラクトへと転移またはクローン化する。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現することのできる宿主細胞をキメラＤＮＡ分子で形質転換する。上述に説明されるように、関心対象のＤＮＡセグメントを含むベクターを周知の方法によって適切な宿主細胞へと、細胞宿主の種類に応じて転移させることができる。
【０３５８】
ＸＴＥＮ−ＣＦ発現ベクターを含む宿主細胞を、プロモーターを活性化させるのに適したように修飾された従来の栄養物質培地において培養する。温度、ｐＨ、およびこれらの類似項目などの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにすでに用いられたものであり、当業者に明らかである。融合タンパク質の発現後、培養ブロスを回収し、細胞塊から分離し、結果として生じる粗抽出物は、融合タンパク質の精製のために保持した。
【０３５９】
遺伝子発現を、試料中で直接、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：５２０１−５２０５  （１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、またはインサイツハイブリッド形成によって、適切に標識されたプローブを用いて、本明細書に提供される配列に基づいて測定する。あるいは、遺伝子発現を、遺伝子産物の発現を直接定量するための細胞の免疫組織化学的染色などの免疫学的な蛍光
法によって測定する。免疫組織化学的染色および／または試料流体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナルのいずれかであり得、任意の哺乳類において調製され得る。簡便に、抗体は、本明細書に提供される配列に基づいた合成ペプチドを用いたＣＦ配列ポリペプチドに対して、またはＣＦに融合しかつ特異的な抗体エピトープをコードする外来性配列調製され得る。選択可能なマーカーの例は当業者に周知であり、高感度緑色蛍光タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのリポーターを含む。
【０３６０】
ＣＦＸＴＥＮポリペプチド産物は、当業者に公知の方法を介して精製される。ゲル濾過、アフィニティ精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはゲル電気泳動法などの手順は、精製に用いられ得る技術すべてである。精製に関する具体的な方法は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ．  Ｃａｓｔｏｒ，  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  上述に説明されている。多工程精製分離はまた、Ｂａｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：１７９−９０  （１９９０）  およびＢｅｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ．  ６７９：６７−８３  （１９９４）に説明されている。
【０３６１】
図３３に示されるように、単離されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を次に、それらの化学特性および活性特性について特徴づけるであろう。単離された融合タンパク質を例えば、配列、純度、見かけの分子量、溶解度、および安定性について、当該技術分野で公知の標準的な方法を用いて特徴づける・期待される標準物質に見合う融合タンパク質は次に、活性について評価されるであろうし、該活性は、インビトロまたはインビボにおいて、本明細書に開示される１つ以上のアッセイを用いて、または実施例もしくは表４０のアッセイを用いて、本明細書に説明される凝固因子関連パラメータのうちの１つを測定することによって測定することができる。
【０３６２】
加えて、ＸＴＥＮ−ＣＦ融合タンパク質を、１つ以上の動物種に投与して、実施例３０〜３３において説明されるように、標準的な薬物動態パラメータおよび薬力学的特性を決定する。
【０３６３】
ＣＦＸＴＥＮコンストラクトを生成、発現、および回収する反復過程の後に、本明細書に開示された方法または当該技術分野で公知のその他を用いた該コンストラクトの特徴づけによって、ＣＦとＸＴＥＮとを含むＣＦＸＴＥＮ組成物を当業者によって作製および評価して、相応の融合していないＣＦと比較して全体的な亢進した治療活性をもたらす、亢進した溶解度、亢進した安定性、改良した薬物動態、および低下した免疫原性などの期待される特性を確認することができる。所望の特性を有さない該融合タンパク質について、このような特性を有する組成物を得るために、異なる配列をこれらの方法によって構築、発現、単離、および評価することができる。
【０３６４】
実施例１９：ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮのための発現プラスミドの構築
ＦＶＩＩ−ＴＥＶ−ＸＴＥＮ８６４の発現ベクターの構築
ＦＶＩＩをコードする遺伝子を含むクローニングベクターをＯｒｉＧｅｎｅ（ＳＣ１０９２０５）から購入した。ＰＣＲ反応を実施して、ＦＶＩＩコード領域内のＢｂｓＩおよびＢｓａＩ制限部位を消滅させた。結果として生じるＦＶＩＩコード領域を次に、５’末端および３’末端にそれぞれＮｈｅＩおよびＴＥＶ−ＢｓａＩ配列を導入したプライマーを用いて増幅した。消化したＦＶＩＩ断片を、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４断片に融合して、ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳｅｃＴａｇ
２Ｃ発現ベクターへと挿入した。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞へと電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。最終的なコンストラクトは、ＦＶＩＩ−ＴＥＶ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４タンパク質をコードするｐＣＷ０６４７．００１である（表２３）。
【０３６５】
ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ８６４の発現ベクターの構築
ｐＣＷ０６４７．００１をテンプレートとして用いて、ＦＶＩＩを増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’末端および３’末端にそれぞれＮｈｅＩおよびＢｓａＩ制限酵素認識配列を導入し、ＴＥＶ部位を欠失した。ＮｈｅＩ／ＢｓａＩで消化したＦＶＩＩ断片をＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４断片に融合し、ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳｅｃＴａｇ２Ｃ発現ベクターへと挿入した。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞へと電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。最終的なコンストラクトは、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４タンパク質をコードするｐＣＷ０６４５．００１である（表２３）。
【０３６６】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅプラスミドを用いてＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ８６４の遺伝子をコードする発現ベクターの構築
発現ベクターｐＣＷ０６４５．００１をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化した。結果として生じる４０９１ｂｐ断片は、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４タンパク質をコードするヌクレオチドを含んでいた。この断片をＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化したＣＥＴ１０１９−ＡＳ−ｐｕｒｏ、ＣＥＴ１０１９−ＨＳ−ｐｕｒｏ、ＳＣ  ＡＳ−ｐｕｒｏ、またはＤＣ
ＨＳ−ｐｕｒｏ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから認可）と連結した。これらのベクターは、遺伝子挿入部位の上流に存在するＣＭＶプロモーターを特長とし、ＣＥＴ１０１９ベクターは、該プロモーターの上流にＵＣＯＥ要素も含む。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、ＡＣ３９７（ｐＢＣ００１３、ＳＣ  ＡＳ  ｐｕｒｏ−ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）、ＡＣ４０２（ｐＢＣ００１４、ＳＣ  ＨＳ  ｐｕｒｏ−ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）、ＡＣ４０３（ｐＢＣ００１５、ＣＥＴ１０１９  ＡＳ  ｐｕｒｏ−ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）、およびＡＣ４０４（ｐＢＣ００１６、ＣＥＴ１０１９
ＨＳ  ｐｕｒｏ−ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）であった。
【０３６７】
ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ２８８遺伝子をコードする発現ベクターの構築
発現ベクターｐＣＷ０６４５．００１をＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。結果として生じる６４００ｂｐ断片をＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８断片と連結した。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、ｐＢＣ００１９（ｐＳｅｃＴａｇ２Ｃ−ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８）であった。
【０３６８】
発現ベクターｐＢＣ００１９をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化した。結果として生じる２３６３ｂｐの断片は、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８タンパク質をコードするヌクレオチドを含んでいた。この断片を、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化したＣＥＴ１０１９−ＡＳ−ｐｕｒｏ、またはＣＥＴ１０１９−ＨＳ−ｐｕｒｏ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから認可）と連結した。これらのベクターは、遺伝子挿入部位の上流に存在するＣＭＶプロモーターおよびＵＣＯＥ要素を特長とする。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、ＡＣ４
０５（ｐＢＣ００１７、ＣＥＴ１０１９  ＡＳ  ｐｕｒｏ−  ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８）、およびＡＣ３９８（ｐＢＣ００１８、ＣＥＴ１０１９  ＨＳ  ｐｕｒｏ−ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８）であった（表２３）。
【０３６９】
【表２３−１】
2013502459.tif 000061
【０３７０】
【表２３−２】
2013502459.tif 000062
【０３７１】
【表２３−３】
2013502459.tif 000063
【０３７２】
【表２３−４】
2013502459.tif 000064
【０３７３】
【表２３−５】
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【０３７４】
【表２３−６】
2013502459.tif 000066
実施例２０：ＦＩＸ−ＸＴＥＮのための発現プラスミドの構築
ＦＩＸ−ＸＴＥＮ８６４遺伝子およびベクターの構築
ＦＩＸをコードする遺伝子を含むクローン化ベクターをＯｒｉＧｅｎｅから購入した（ＳＣ１２６５１７）。ＰＣＲ反応を実施して、ＦＩＸコード領域内の２つのＢｂｓＩ制限部位を消滅させた。結果として生じるＦＩＸコード領域を次に、５’末端および３’末端のそれぞれにおけるＮｈｅＩおよびＢｓａＩ制限酵素認識配列を導入するプライマーを用いて増幅した。消化したＦＩＸ断片をＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＸＴＥＮ＿ＡＭ８６４、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、またはＡＧ８６４断片に融合し、ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳｅｃＴａｇ２Ｃ発現ベクターへと挿入した。最終的なコンストラクトは、ＡＣ２８２（ｐＣＷ０５６２、ＦＩＸ−  ＸＴＥＮ＿ＡＭ８６４）、ＡＣ２８３（ｐＣＷ０５６３、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）、ｐＣＷ０５６４（ＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４）、およびｐＣＷ０５６５（ＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４）である（表２４）。
【０３７５】
ＦＩＸヘルパー遺伝子のための発現ベクターの構築
ＰＣ５をコードする遺伝子を含むクローン化ベクターをＯｒｉＧｅｎｅから購入した（ＳＣ３１００５１）。ＰＣ５コード領域を、ＮｏｔＩおよびＢｓｔＢＩ制限酵素認識配列を導入するプライマーを用いて増幅した。ＮｏｔＩ／ＢｓｔＢＩで消化したＰＣ５断片を、ＮｏｔＩ／ＢｓｔＢＩで消化したＣＥＴ１０１９−ＨＤ−ｐｕｒｏベクターまたはＤＣ−ＨＤ−ｐｕｒｏベクターと連結した。ＣＥＴ１０１９−ＨＤ−ｐｕｒｏもＤＣ−ＨＤ−ｐｕｒｏも、ＣＭＶプロモーターが遺伝子挿入部位の上流に存在する二重カセットを特長とし、ＣＥＴ１０１９−ＨＤ−ｐｕｒｏは、該プロモーターの上流にＵＣＯＥ要素も含む。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、ｐＢＣ００３７（ＤＣ−ＨＤ−ｐｕｒｏ−ＰＣ５）およびｐＢＣ００３８（ＣＥＴ１０１９  ＨＤ−ｐｕｒｏ−ＰＣ５）である。
【０３７６】
ＦＩＸ−ＸＴＥＮおよびＰＣ５二重発現ベクターの構築
ｐＢＣ００３７およびｐＢＣ００３８コンストラクトをＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化して、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化したＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４と連結した。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞に電気穿孔した形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、ｐＢＣ００３５（ＤＣ−ＨＤ−ｐｕｒｏ−ＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＰＣ５）およびｐＢＣ００３６（ＣＥＴ１０１９−ＨＤ−ｐｕｒｏ−ＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＰＣ５）であった。
【０３７７】
【表２４−１】
2013502459.tif 000067
【０３７８】
【表２４−２】
2013502459.tif 000068
【０３７９】
【表２４−３】
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【０３８０】
【表２４−４】
2013502459.tif 000070
【０３８１】
【表２４−５】
2013502459.tif 000071
【０３８２】
【表２４−６】
2013502459.tif 000072
【０３８３】
【表２４−７】
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【０３８４】
【表２４−８】
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【０３８５】
【表２４−９】
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【０３８６】
【表２４−１０】
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実施例２４：ＦＩＸ−／ＦＸＩ／‐ＸＴＥＮの構築
ＦＩＸ−ＴＥＶ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４遺伝子およびベクターの構築
ＦＩＸをコードする遺伝子を含むクローン化ベクターをＯｒｉＧｅｎｅから購入した（ＳＣ１２６５１７）。ＰＣＲ反応を実施して、ＦＩＸコード領域内の２つのＢｂｓＩ制限部位を消滅させた。結果として生じるＦＩＸコード領域を次に、５’末端および３’末端のそれぞれにＮｈｅＩおよびＳｆｉＩ−ＴＥＶ−ＢｓａＩ配列を導入するプライマーを用いて増幅した。消化したＦＩＸ断片を、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４断片に融合し、ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳｅｃＴａｇ２Ｃ発現ベクターへと挿入した。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。最終的なコンストラクトは、ＦＩＸ−ＴＥＶ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４タンパク質をコードするｐＣＷ０６４８．００１である（表２５）。
【０３８７】
ＦＩＸ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４遺伝子およびベクターの構築
ＳｆｉＩおよびＢｓａＩを用いてｐＣＷ０６４８発現ベクターを消化することによって、ＴＥＶ部位を除去した。ＳｆｉＩ−ＫＬＴＲＡＥＴ−ＢｓａＩ、ＳｆｉＩ−ＤＦＴＲＶＶＧ−ＢｓａＩ、またはＳｆｉＩ−／ＦＸＩ／−ＢｓａＩをコードするオリゴ含有配列をアニーリングし、消化したｐＣＷ０６４８ベクターと連結した。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、ＦＩＸ−ＫＬＴＲＡＥＴ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４（ｐＣＷ０７３５）、ＦＩＸ−ＤＦＴＲＶＶＧ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４（ｐＣＷ０７３６）、およびＦＩＸ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４（ｐＣＷ０７３７）をコードする。
【０３８８】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅプラスミドを用いたＦＩＸ−／ＦＸＩ／‐ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４遺伝子をコードする発現ベクターの構築
発現ベクターｐＣＷ０７３５をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化した。結果として生じる４１８１ｂｐ断片は、ＦＩＸ−ＫＬＴＲＡＥＴ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４タンパク質をコードするヌクレオチドを含んでいた。この断片を、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化したＣＥＴ１０１９−ＨＤ−ｐｕｒｏ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＤＣ  ＨＤ−ｐｕｒｏ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と連結した。ＣＥＴ１０１９−ＨＤ−ｐｕｒｏもＤＣ−ＨＤ−ｐｕｒｏも、ＣＭＶプロモーターが遺伝子挿入部位の上流に存在する二重カセットを特長とし、ＣＥＴ
１０１９−ＨＤ−ｐｕｒｏは、該プロモーターの上流にＵＣＯＥ要素も含む。連結したＤＮＡ混合物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅ細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、ｐＢＣ００３３（ＤＣ−ＨＤ−ｐｕｒｏ−ＦＩＸ−ＫＬＴＲＡＥＴ−ＸＴＥＮ  ＿ＡＥ８６４）およびｐＢＣ００３４（ＣＥＴ１０１９−ＨＤ−ｐｕｒｏ−ＦＩＸ−  ＫＬＴＲＡＥＴ−ＸＴＥＮ  ＿ＡＥ８６４）であった（表２５）。
【０３８９】
【表２５−１】
2013502459.tif 000077
【０３９０】
【表２５−２】
2013502459.tif 000078
【０３９１】
【表２５−３】
2013502459.tif 000079
【０３９２】
【表２５−４】
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【０３９３】
【表２５−５】
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【０３９４】
【表２５−６】
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【０３９５】
【表２５−７】
2013502459.tif 000083
【０３９６】
【表２５−８】
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実施例２５：ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮの発現
哺乳類細胞の一過性トランスフェクション
ＣＨＯ‐Ｋ１、ＢＨＫ、ＣＯＳ‐７、およびＨＥＫ２９３を含む哺乳類細胞は、形質移入すると異なるＸＴＥＮ長を用いてＦＶＩＩ−ＸＴＥＮまたはＦＩＸ−ＸＴＥＮを発現することが発見された。以下は、一過性トランスフェクションによって種々のＦＶＩＩ−ＸＴＥＮおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質コンストラクトを発現するのに用いられる方法についての詳細である。
【０３９７】
ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの前日に、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および５ｍｇ／ｍＬビタミンＫを含む１ｍＬの培地において、１２ウェルプレートにおいて１ウェルあたり１×１０５個蒔種した。細胞を蒔種した翌日のトランスフェクションのために、ＯｐｔｉＭＥＭに希釈したプラスミドＤＮＡ（０．６μｇ）（合計２５μＬ）を、希釈したＦｕＧＥＮＥ６（２２．９μＬのＯｐｔｉＭＥＭにおける２．１μＬのＦｕＧＥＮＥ６）と混合し、室温で３０分間インキュベートした後、細胞に添加した。トランスフェクションの３日後または４日後に、培地を回収し、５００×ｇで室温で５分間遠心分離した後、上清を０．２μｍフィルターを用いて濾過し他後、ＥＬＩＳＡにおけるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮまたはＦＩＸ−ＸＴＥＮの発現、および凝固アッセイにおける性能（ＦＶＩＩについてはＰＴ、およびＦＩＸ活性についてはａＰＴＴ）を試験した。本結果を表２６に呈する。
【０３９８】
ＰＴアッセイによってＦＶＩＩ−ＸＴＥＮについて測定された力価（活発なＦＶＩＩタンパク質）は、ＥＬＩＳＡによって測定される力価（総ＦＶＩＩタンパク質）よりも高いことは留意されるべきであり、これについての実際の原因が明確でないままであるが、（１）ＸＴＥＮによるエピトープ遮断によるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮの文脈におけるＦＢＩＩの過小評価、（２）ＰＴアッセイによる凝固活性の過大評価、または（１）および（２）の両方の組み合わせにより得る。ａＰＴＴアッセイによるＦＩＸについて測定された力価（活発なＦＩＸタンパク質）が、ＥＬＩＳＡによって測定された力価（総ＦＩＸタンパク質）よりも約２０％のみ有意に低いことも留意されるべきであり、未知の理由によるが、そのうちの１つは、ＣＨＯまたは他の哺乳類細胞において産生される組換えＦＩＸについて報告された現象である不十分なプロペプチドの加工であり得る。ａＰＴＴによるＦＩＸ−ＸＴＥＮの力価は、ＦＩＸ単独と比較してＥＬＩＳＡよりもさらに比例的に低く、ＦＩＸの活性が、ＸＴＥＮとの融合によって低下し得ることを示唆し、１つの仮定が、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮをコードするが間にＴＥＶ開裂部位の挿入されたプラスミドコンストラクトで形質移入した細胞から産生される材料についてのＴＥＶ処理後のタンパク質の活性およびＥＬＩＳＡ力価を分析することによって確認された。
【０３９９】
【表２６】
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ＣＨＯ‐Ｋ１安定プールおよびＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを産生する細胞株の作製
細胞：ＡＴＣＣから購入したＣＨＯ‐Ｋ１細胞（カタログＣＣＬ‐６１、ロット５８０７８５５１）を完全培地（Ｆ‐１２Ｋ、１０％ＦＢＳ、および１×ペニシリン／ストレプトマイシン、付録１）において回復させ、４世代経代した後に、複数のバイアルを５％ＤＭＳＯを有する完全培地において凍結した。１つのバイアルを完全培地と類似だが５％ＦＢＳを有する培地において回復させ、１回以上経代した後トランスフェクションをした。
【０４００】
安定したプールの作製：ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４、ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４、およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８をそれぞれコードするプラスミドｐＢＣ００１４、ｐＢＣ００１６、およびｐＢＣ００１８の構築を先の実施例において説明した。２つのプラスミドｐＢＣ００１６およびｐＢＣ００１８はＵＣＯＥも保持する。該プラスミドをまずＰｖｕＩＩで線形化した後、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を用いて、上記由来のＣＨＯ‐Ｋ１細胞の個別のＴ２５フラスコへとトランスフェクトし、フラスコあたり６．５×１０５個の細胞について３．６μｇのプラスミドＤＮＡであった。２日後、細胞をＴ７５に転移させ、選択培地（１０μｇ／ｍＬピューロマイシンおよび５μｇ／ｍＬビタミンＫを有する完全培地）において培養した・フラスコを新鮮な選択培地に２〜３日ごとに交換した。トランスフェクションの２週間後、Ｔ７５フラスコ由来の細胞を安定したプールとして凍結した。
【０４０１】
クローンの選択：初回スクリーニングのため、凍結した安定したプール細胞を回復させ、０．５個／ウェルの標的密度で６枚の９６ウェルプレートにおいて蒔種した。蒔種の約１週間後、顕微鏡下で観察されたような単一の細胞クラスターを有するウェル由来の消費済み培地をＦＶＩＩの発現についてＥＬＩＳＡによって試験した。ＥＬＩＳＡによって初回スクリーニングにおいて試験されたクローン数は、ｐＢＣ００１４について１５４、ｐＢＣ００１６について２１０、およびｐＢＣ００１８について１３５であった。有意な数のクローンは、検出できないレベルのＦＶＩＩを発現した（図９、黒い棒、ｎｇ／ｍＬとして表現）が、該クローンのうちの１５〜２０％は、３〜８倍高いＦＶＩＩを発現し、これらのクローンは次に、さらなるスクリーニングおよび選択のために選択され、ｐＢＣ００１４については２０、ｐＢＣ００１６については３０、およびｐＢＣ００１８については２０であった。これらのウェルにおける細胞クラスターのサイズは、１〜１０にスコア化され、１は最小のクラスター、１０は最大のクラスターであった。本結果を図９の灰色の棒として示す。これらのクローンの細胞クラスターサイズの分布は、同じバリアントについてのクローンすべてのものと類似しており、該クローンが、最速に増殖するものであるために選択されたわけではないことを示唆した。
【０４０２】
追加的な回数のスクリーニングのために、標準化された数の細胞を複数ウェルプレートに蒔種した。消費済み培地を蒔種の２〜３日後に回収し、ＥＬＩＳＡによってＦＶＩＩ濃度について、およびＰＴによって凝固活性について試験し、また、細胞を該プレートから回収し、Ｖｉ‐Ｃｅｌｌを用いて計数した。クローンを（１）ＥＬＩＳＡおよび凝固に従ったＦＶＩＩ力価；（２）ＥＬＩＳＡ力価／細胞計数の比および凝固力価／細胞計数の比；ならびに（３）ウェスタンブロットによって測定されるような、クローンによって産生される産物の完全性および均質性によって階級分けした。コンストラクトｐＢＣ００１４、ｐＢＣ００１６、およびｐＢＣ００１８の各々についてのクローンの選択を以下において個別に説明した。
【０４０３】
ｐＢＣ００１４：第二ラウンドのスクリーニングのために、初回スクリーニングから選択された上位２０のクローンについての９６ウェルプレートにおける細胞をまず、Ｔ２５フラスコにおいて増量した後、二つ組の２４ウェルプレートに蒔種し、１つを２日間、もう１つを３日間培養した。消費済みの培地をプレートからＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡのために回収し、細胞を収穫し、Ｖｉ‐Ｃｅｌｌによって計数した。１４のクローンをＥＬＩＳＡおよび凝固による力価、ＥＬＩＳＡ力価／個、ならびに凝固力価／細胞計数比に従って選択し、さらにスクリーニングした。凍結バイアルを９のクローン、すなわち１Ｆ１０、２Ｆ７、６Ｈ４、１Ａ３、６Ｆ１０、５Ｃ２、５Ｆ１、３Ｈ２、４Ｃ８について調製した。１４のクローンのうち、１Ｆ１０、１Ｆ４、２Ｆ７、４Ｃ８、６Ｈ４、および６Ｇ１を再度スクリーニングし、ＥＬＩＳＡおよび凝固による力価、ＥＬＩＳＡ力価／細胞計数のおよび凝固力価／細胞計数の比、ならびにウェスタンブロットによる産物の完全性および均質性（図１０〜図１２）に従って階級分けした。クローン６Ｇ１は、全長の産物よりも有意に小さな産物を発現した（図１２）ので、廃棄した。追加的な凍結バイアルをクローン１Ｆ１０、２Ｆ７、６Ｈ４、および４Ｃ８について調製した。クローン４Ｃ８をローラーボトルにおいてＦＶＩＩ−ＡＥ８６４の産生について試験した。
【０４０４】
ｐＢＣ００１６：第二ラウンドのスクリーニングのために、初回スクリーニングから選択された上位３０のクローンについての９６ウェルプレートにおける細胞を１２ウェルプレート、次いでＴ２５に転移させ、ＥＬＩＳＡおよび凝固アッセイに従った力価、ＥＬＩＳＡ力価／細胞計数の比、および凝固力価／細胞計数の比によって階級分けした。第三ラウンドのスクリーニングのために、１Ｄ４、１Ｇ２、１Ｇ６、２Ｃ１１、２Ｈ６、３Ａ２、３Ｂ１、３Ｃ７、３Ｆ２、３Ｈ１、３Ｈ６、３Ｈ１０、４Ｇ８、５Ｅ１２、６Ｆ１１を含む１５のクローンを試験し、先の基準＋ウェスタンブロットに従って階級分けし（図１３）、凍結した細胞を３Ｈ６以外の１５のクローンすべてについて調製した。１Ｇ２、２Ｃ１１、３Ｂ１、３Ｃ７、３Ｆ２、３Ｈ１０、４Ｇ８、５Ｅ１２を含む８のクローンを上位クローンとして選択し、該クローンのために追加的な凍結バイアルを調製した。クローン３Ｈ１０をローラーボトルにおける規模拡大産生のために選択した。
【０４０５】
ｐＢＣ００１８：第二ラウンドのスクリーニングのために、初回スクリーニングから選択された上位２０のクローンについての９６ウェルプレートにおける細胞をまずＴ２５フラスコにおいて増量した後、２４ウェルプレートにおいて蒔種した。消費済み培地をＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡのためのプレートから回収し、細胞を収穫し、Ｖｉ‐Ｃｅｌｌによって計数した。１２のクローンをＥＬＩＳＡおよび凝固による力価、ＥＬＩＳＡ力価／個、および凝固力価細胞計数比に従って選択し、さらにスクリーニングした。凍結したバイアルを９のクローン、すなわち２Ｃ３、２Ｄ５、３Ｂ２、３Ｂ１０、３Ｇ２、３Ｇ１２、５Ａ１２、６Ａ３、ａｎｄ６Ｅ７について調製した。９のクローンのうち、２Ｄ５、３Ｂ２、３Ｇ２、３Ｇ１２、５Ａ１２、６Ａ３、ａｎｄ６Ｅ７を再度スクリーニングし、ＥＬＩＳＡおよび凝固による力価、ＥＬＩＳＡ力価／細胞計数の比、および凝固力価／細胞計数の比、ならびにウェスタンブロットによる産物の完全性および均質性に従って階級分けした（図１４）。クローン３Ｂ２は、ウェスタンブロットにおける複数のバンドを示す産物を発現したので、これを廃棄した。追加的な凍結バイアルをクローン２Ｄ５、３Ｇ２、３Ｇ１２、５Ａ１２、６Ａ３、６Ｅ７について調製した。クローン３Ｇ１２および６Ｅ７をローラーボトルにおけるＦＶＩＩ−ＡＥ２８８の産生のために用いた。
【０４０６】
ローラーボトルにおける細胞培地において分泌されるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮの産生
ＣＨＯ‐Ｋ１細胞の安定したプールまたはクローンをＴ１７５において、フラスコあたり３５ｍＬの選択培地において増量した。細胞をトリプシン処理によって収穫し、該細胞を用いて、ローラーボトルごとにつき１〜２のＴ１７５フラスコ由来の細胞を用いた３００ｍＬの選択培地のローラーボトルに初日に蒔種した（ボトルあたり１７００ｃｍ２表面積）。消費済み培地／馴らし培地を取り出して除去し（またはこの培地におけるＸＴＥＮ
融合タンパク質が精製されることができる場合収穫し）、３００ｍＬの移行培地（１％ＦＢＳ、０．１％Ｅｘ‐Ｃｙｔｅ、５ｍｇ／ｍＬビタミンＫ、および１×ペニシリン／ストレプトマイシン）を各ローラーボトルに添加した。７（または８）日後、消費済み培地を取り出して除去し（またはＸＴＥＮ融合タンパク質がこの培地から精製されることができる場合収穫し）、発現培地（０．１％Ｅｘ‐Ｃｙｔｅ、１％ＩＴＳ‐Ａ、５ｍｇ／ｍＬビタミンＫ、および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＯｐｔｉＭＥＭ）を、ボトルあたり３００ｍＬまたは、最適化からの結果に応じた他の容積ほど添加した。馴らし培地は、所望の産物力価および品質に応じて、１日１回、または２、もしくは３、もしくは４日に１回収穫することができた。収穫するために、馴らし培地を遠心ボトルに注ぎ、新鮮な発現培地をボトルあたり３００ｍＬまたは最適化からの結果に応じた他の容積ほど添加した。消費済み培地を収穫して新鮮な培地で再充填するこの製造は、ローラーボトルを終止した時に力価および／または産物の質があまりにも低いと考えられるまで、２〜４週間持続できた。次に、馴らし培地を卓上遠心機において３５００ｒｐｍ、４〜８℃で１０分間遠心分離した。次に、０．２ｍｍフィルターを用いて上清を濾過した。濾液を即時処理したかまたは、精製のための正接流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，  ＴＦＦ）による処理の前に−８０℃の冷凍庫において保存したかのいずれかであった。
【０４０７】
実施例２６：ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮコンストラクトの精製および特徴づけ
正接流濾過および透析濾過によるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の濃縮および緩衝液交換
ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）を発現する安定したＣＨＯ細胞株由来の総容積１０．７Ｌの上清バッチＳ２７９、Ｓ２８１、Ｓ２８２、およびＳ２８７を、Ｃｕｎｏ  ＺｅｔａＰｌｕｓ  ＢｉｏｃａｐフィルターおよびＣｕｎｏ  ＢｉｏＡｓｓｕｒｅカプセルを用いて濾過した。該バッチをその後、３０，０００Ｄａ  ＭＷＣＯを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｍｉｎｉカートリッジを用いた正接流濾過によっておよそ２０倍濃縮した。同じ正接流濾過カートリッジを用いて、試料を１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡで、５容積分の緩衝液交換を伴って透析濾過した。試料を５０ｍＬの一定分量に分け、−８０℃で凍結させた。ＦＶＩＩ活性は、濾過由来の透過画分において検出できず、活性の〜７５％の回収が、濃縮され緩衝液交換された材料においてみられた。
【０４０８】
ＢａＳＯ４吸着によるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の精製
上清を含むＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）を濃縮し、緩衝液を１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡに交換した。その後、５ｍＬのこの試料をＰＢＳにおいて１０倍希釈し、追加的なＮａＣｌを５０ｍＭまで添加した後、ＢａＳＯ４を２０ｍｇ／ｍＬまで添加した。試料を振蘯機において室温で３０分間弾ませた。次に、試料を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、ＢａＳＯ４をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを５ｍＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウムにおいて再懸濁し、室温で３０分間弾ませた。これを２回以上反復した。第三の洗浄後、ペレットを０．８ｍＬの１００ｍＭクエン酸三ナトリウムｐＨ７．０に再懸濁し、室温で３０分間弾ませた。これを１回反復した。ブラッドフォードアッセイを実施して、試料におけるタンパク質の総量を決定し、Ｉｎｎｏｖｉｎを活性化型トロンボプラスチンとして用いるＰＴベースの因子アッセイにおいてＦＶＩＩ活性をアッセイした（表２７）。層タンパク質に対する活性の比は、この精製工程からの〜１２倍の正味の精製を示した。
【０４０９】
【表２７】
2013502459.tif 000086
ＧｌａアフィニティクロマトグラフィーによるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の精製
カルシウム依存性様式でＦＶＩＩのＧＬＡドメインを結合するモノクローナル抗体（クローンＩＤ  ＣａＦＶＩＩ‐２２）を、Ｐｉｅｒｃｅ製のＵｌｔｒａｌｉｎｋビーズに共役させた。ＰＢＳにおける１０ｍｇの抗体を１．２５の樹脂に添加し、最終容積を共役緩衝液（１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、７００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で１５ｍＬにすることによって、共役を実施した。このことは、１０ｍＬの樹脂スラリーおよび１ｍｇ：１ｍＬの抗体質量：ビーズスラリー容積の比を生じた。該スラリーを室温で２時間インキュベートした後、ビーズを共役緩衝液で洗浄した。ＢＣＡアッセイは、〜７０％の抗体がビーズと共役することを示した。ビーズを次に１ＭトリスｐＨ８．０で室温で２時間クエンチした。ビーズを１０ｍＭトリスｐＨ７．５および１０ｍＭ  ＣａＣｌ２へと平衡化し、５．５ｍＬのビーズを１０ｍＭトリスｐＨ７．５および〜１０ｍＭ  ＣａＣｌ２における濃縮され緩衝液交換したＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）５０ｍＬと混合した。試料を４℃で一晩、振蘯機上でインキュベートして、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを樹脂に結合させた。翌日、ビーズを４５ｍＬの１０ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５で３回洗浄した後、２０ｍＬの１０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で溶出した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析は、純度が９０％を超過することを示す（図１５）。
【０４１０】
ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４およびＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８の活性化
アフィニティ精製したＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８（ＡＣ３９８）をＦＸａの添加によってＦＶＩＩａ−ＡＥ８６４およびＦＶＩＩａ−ＡＥ２８８へと活性化した。ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮタンパク質を１０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５へと、Ａｍｉｃｏｎ限外１０，０００Ｄａ  ＭＷＣＯ濃縮機における反復した回数の濃縮を介して緩衝液交換し、その後希釈した。終容積は、〜０．４ｍｇ／ｍＬにおいて１ｍＬであった。Ｎｏｖａｇｅｎ製のＦＸａを１０単位／ｍＬの終濃度に添加し、試料を４℃で一晩インキュベートした。還元型ＳＤＳ‐ＰＡＧＥは、活性化の際に生じるに過ぎ得ない、分子からの軽鎖の損失を表す非還元型試料と比較して、ＤＴＴを用いた上部バンドにおける下方向の移行によるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮタンパク質からＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮタンパク質への完全な変換を示した（図１６）。加えて、軽鎖は、ゲル上でより低く表れるように見え、対照のＦＶＩＩａの軽鎖と同じ位置に泳動し、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへのＦＶＩＩドメインの移行をさらに確認した。類似の緩衝液条件のもとで、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合体は、トロンビン、ＦＩＸａｍ、ＦＸＩＩａ、またはＲ１５２とＩ１５３の間のペプチド結合を選択的に切断することのできる任意の他のプロテアーゼの添加によって、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮへと活性化される。
【０４１１】
ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４およびＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８の自己活性化
アフィニティ精製したＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）およびＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８（ＡＣ３９８）をＦＶＩＩａ−ＡＥ８６４およびＦＶＩＩａ−ＡＥ２８８へ、試料を４℃で１週間インキュベートすることによって活性化した。ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ
タンパク質を１０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５へと、Ａｍｉｃｏｎ限外１０，０００Ｄａ  ＭＷＣＯ濃縮機における反復した回数の濃縮を介して緩衝液交換し、その後希釈した。インキュベーション後、タンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥによってアッセイし、上部バンドは、分子からの軽鎖の損失を表す非還元型試料と比較して、ＤＴＴを用いて上部バンドにおける特徴的な下方向の移行を示した（図１７）。加えて、軽鎖は、ＦＸａにより活性化された材料の２つのロットと同じ点におけるゲルにおいてより低く表れるのを見ることができ、該タンパク質がＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮに自己活性化したという結論をさらに確証する。
【０４１２】
陰イオン交換クロマトグラフィーによるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の精製
上清を含むＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）の試料を濃縮し、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡへと緩衝液交換した後、１Ｍ  ＣａＣｌ２を添加して〜５ｍＭのＣａＣｌ２の終濃度に調整した。試料を、Ａｋｔａクロマトグラフィーシステムにおいて平衡化した２ｍＬのマクロキャップＱカラムに負荷した。タンパク質を０〜１００％の直線勾配の緩衝液Ｂで２０カラム容積にわたって溶出した。緩衝液Ａはｍ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０を含み、緩衝液Ｂは、２０ｍＭ  ＭＥＳ、５ｍＭ
ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０、および５００ｍＭ  ＮａＣｌを含んだ。画分を、Ｉｎｎｏｖｉｎを活性化型トロンボプラスチンとして用いるＰＴベースの因子アッセイを用いてＦＶＩＩ活性についてアッセイした。活性の単一の締まったピークは、４７．９ｍＬと５２．４ｍＬの間で、または２３．２〜２７．８ｍＳ／ｃｍで溶出しながら観察された（図１９）。ブラッドフォードアッセイを実施して、負荷および溶出画分におけるタンパク質の総量を決定した。活性と総タンパク質との比は、カラムからの〜５倍の正味の精製を示した。
【０４１３】
疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の精製
上清を含むＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）の試料を濃縮し、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡへと緩衝液交換した後、１Ｍ  ＣａＣｌ２の添加によって〜５ｍＭ  ＣａＣｌ２の終濃度に調整した。試料をＡｋｔａクロマトグラフィーシステムにおいて平衡化した２ｍＬトヨパールフェニルカラムへと負荷した。タンパク質を０〜１００％の緩衝液Ｂの直線勾配を用いて２０カラム容積にわたって溶出した。緩衝液Ａは、１０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含み、緩衝液Ｂは、１０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５を含んだ。画分を、Ｉｎｎｏｖｉｎを活性化型トロンボプラスチンとして用いるＰＴベースの因子アッセイを用いてＦＶＩＩ活性についてアッセイした。活性の単一のピークは、１Ｍと２ＭのＮａＣｌの間で溶出されるのが観察された（図２０）。ブラッドフォードアッセイを実施して、負荷および溶出画分におけるタンパク質の総量を決定した。活性と総タンパク質との比は、カラムからの〜２倍の正味の精製を示した。
【０４１４】
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた単量体ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４からの凝集したタンパク質の除去
アフィニティ精製したＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）を負荷し、１ｍＬ緩衝液と１０ｍＬ試料との比で、２００ｍＭ  ＭＥＳ、２１０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０の添加によってｐＨ６．０に調整した。Ａｋｔａ  ＦＰＬＣシステムを用いて、試料を２ｍＬマクロキャップＱカラムを用いて精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０）へと平衡化し、試料を負荷した。試料を、３０％〜８０％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ）の直線勾配を用いて、２０カラム容積にわたって溶出した。２１５ｎｍのクロマトグラムは、溶出特性において２つのピークを示した（図２１のＡ）。初期ピークおよび後期ピークに相応する画分をプールし、６０ｃｍのＢｉｏＳｅｐ  Ｇ４０００カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して分析した。初期ピークは、単量体ＡＥ
８６４タンパク質の特徴的な水力学的半径を有する単分散した集団を含んでいた（１０．１ｎｍまたは１．９ＭＤａの見かけの分子量）（図２１のＢ）。後期ピークは、２つの集団を含んでおり、より小さな単量体ピークは、初期ピークにおける凝集体の不在を示し、カラムの空隙容積（２２ｍＬ）においてより早期に溶出するより大きなピークは、凝集したタンパク質の特徴である。
【０４１５】
ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８のＳＥＣ分析
ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８（ＡＣ３９８）をアフィニティおよび陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、特徴づけた。６０ｃｍのＢｉｏＳｅｐ  Ｇ４０００カラムを用いる分子ふるいクロマトグラフィーは、単量体ＡＥ８６４タンパク質（１５．２の見かけの分子量因子について１０．１ｎｍまたは１．９ＭＤａの見かけの分子量）または単量体ＡＥ２８８タンパク質（９．０の見かけの分子量因子について８．２ｎｍまたは６５０ｋＤａの見かけの分子量）のいずれかについて特徴的な水力学的半径を有する単分散した集団を示した（図１８）。最小の凝集は、いずれかの試料において観察された。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥは、９０％超の純粋なタンパク質を示し、最小の宿主細胞タンパク質の混入を伴った。
【０４１６】
脂質付加組織因子により示されるＦＶＩＩ−ＡＥ８６４およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８の凝固活性分析
活性を、以下の通りＰＴベースの第ＶＩＩ因子アッセイによってアッセイした：標準曲線を、正常血漿をＦＶＩＩ欠乏性血漿で１０倍希釈した後、第ＶＩＩ因子欠乏性血漿を用いてさらに４、５倍の連続希釈を実施することによって調製した。これは、活性の１００、２０、４、０．８、および０．１６ｍ単位／ｍＬにおける点で標準曲線を作成し、ここで、活性の１単位を１ｍＬの正常ヒト血漿におけるＦＶＩＩ活性の量として定義する。また、ＦＶＩＩ欠乏性血漿は、無血漿（ｎｕｌｌ  ｐｌａｓｍａ）における活性の背景レベルを決定するために含まれた。１：１０の容積比で試料を、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮをＦＶＩＩ欠乏性血漿に添加することによって調製した。試料を３７℃で分子デバイスプレートリーダー分光計において３分間インキュベートし、その点において、凝固反応を試料１容積あたり２容積のトロンボプラスチン（Ｄａｄｅ  Ｉｎｎｏｖｉｎ，  Ｂ４２１２‐５０）の添加によって開始した。濁度を４０５ｎｍで５分間モニターして、反応特性を作成した。。ＰＴ時間または凝固活性の開始する時間は、ＯＤ４０５ｎｍがベースラインを０．０６ほど上回って増大する第一の時間として定義した。対数‐直線標準曲線を、ＰＴ時間に対して直線的に関連する活性の対数を用いて作成した。これから、プレートウェルにおける試料の活性を決定した後、試料における活性を、ＦＶＩＩ欠乏性血漿への希釈を説明するために１１ほど乗じることによって決定した。四つ組の測定結果に基づいて、ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４（ＡＣ４０４）の融合体の活性は、３０単位／ｍＬであり、ＦＶＩＩ−ＡＥ２８８（ＡＣ３９８）は１５Ｕ／ｍＬであった。加えて、凝固に関するこの脂質付加した組織因子の活性化を用いて、トロンビン発生アッセイ、ＴＥＧアッセイ、ローテム（ｒｏｔｅｍ）アッセイ、および基質のターンオーバー、機械的凝固形成、または光凝固検出による凝固酵素機能の検出を包含する他のインビトロ／エクスビボのようにより洗練された読み出しを伴う凝固アッセイにおけるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合体の活性をアッセイする。
【０４１７】
ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８の可溶性組織因子により開始される凝固活性分析
ＦＶＩＩａ−ＡＥ２８８に対するＦＶＩＩ−ＡＥ２８８（ＡＣ３９８）の活性化の後、活性を、可溶性組織因子（ｓＴＦ）誘導性凝固によって測定した。このことは、Ｓｔａｇｏ  ＳＴＡ‐Ｃｌｏｔ  ＦＶＩＩａ活性アッセイキットを用いて実施される。簡潔には、ＦＩＩａを結合しＦＶＩＩａ活性を亢進するが、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａに変化しないをｓＴＦとともに試料をインキュベートした。ＦＶＩＩ無血漿における凝固を誘導する時
間を、分子デバイスプレートリーダーにおいてモニターされる場合、ベースラインを上回って０．０６ほどＯＤ４０５ｎｍが増大する第一の時間として定義した。この時間を、ＦＶＩＩ無血漿へ添加した既知のＦＶＩＩａ量を含む標準曲線と比較し、活性数を算出した。ＦＶＩＩａ−ＡＥ２８８試料は、１１２Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩａ活性と等価の活性を含んだ。加えて、凝固に関するこの可溶性組織因子の活性化を用いて、凝固アッセイにおけるＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合体の活性をアッセイし、該アッセイには、トロンビン発生アッセイ、ＴＥＧアッセイ、ローテムアッセイ、および基質のターンオーバー、機械的凝固形成、または光凝固検出による凝固酵素機能の検出を包含する他のインビトロ／エクスビボのようにより洗練された読み出しを伴う。
【０４１８】
ＦＶＩＩ−ＡＥ８６４およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８のＥＬＩＳＡベースの濃度決定
ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合体濃度を、アフィニティ精製したポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＶＩＩ抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定し、ここで、修飾されていない形態の抗体を用いて、該タンパク質を捕捉し、ＨＲＰ抱合した形態を用いて、該タンパク質を検出した。捕捉抗体を４℃で一晩、高結合９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３６９０）へと被覆した。プレートを３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴにおいてプレート洗浄機を用いて６回洗浄した。次に、ＰＢＳＴに希釈した試料または標準物質を適切なウェルへと室温で２時間結合させた。１０ｎｇ／ｍＬ〜１ｐｇ／ｍＬ未満に及ぶ標準曲線を、ＰＢＳＴにおける既知の濃度の市販の血漿由来のＦＶＩＩ（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ６２３８６）を連続希釈することによって調製した。プレートをＰＢＳＴでプレート洗浄機を用いて再度６回洗浄した。ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを次に、検出抗体を用いて検出し、該抗体を３７℃で１時間結合させた。プレートをＰＢＳＴでプレート洗浄機を用いて再度６回洗浄し、水でさらに１回洗浄した。次に、シグナルをＴＭＢ基質で顕色させ、分子デバイスプレートリーダー分光計において４０５ｎｍで読み取ることによって定量した。次に、４パラメータ適合を標準物質、および標準曲線との比較によって決定される試料の濃度に関して実施する。
【０４１９】
蛍光基質の直接的なターンオーバーを介したＦＶＩＩ−ＡＥ８６４活性およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８活性の評価
ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合体活性を、基質Ｄ−ＦＰＲ−６−アミノ−１−ナフタレンスルホンアミド（Ｄ−ＦＰＲ−ＡＮＳＮ）におけるペプチド結合の開裂をモニターすることによって決定し、式中、ＤＦＰＲ部分は、ＡＮＳＨ部分における第二級アミンに連結されたペプチド鎖である。アルギニン残基とＡＮＳＨ部分の間の結合が、ＦＶＩＩ触媒ドメインのセリンプロテアーゼ活性によって開裂される場合、ＡＮＳＨは放出され、強いフルオロフォアとなる。ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ活性は、２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１３５ｍＭ  ＮａＣｌにおける５０μＭ〜１００μＭに及ぶ基質濃度で５０ｐＭ〜１μＭに及ぶ酵素濃度で測定される。ＡＮＳＮ蛍光（励起３５２ｎｍ、発光４７０ｎｍ）の変化を経時的にモニターすることによって、ＦＶＩＩａ触媒ドメインの活性を決定することができる。この活性をＦＶＩＩａ由来の標準曲線と比較して、試料におけるＦＶＩＩａ等価物の量を決定することができ、またはｋｃａｔおよびＫｍなどの動態特性を決定することができる。
【０４２０】
ＦＸａにより共役した色素生成基質アッセイを介したＦＶＩＩ−ＡＥ８６４活性およびＦＶＩＩ−ＡＥ２８８活性の評価
リン脂質およびカルシウムの存在下で組織因子（ＴＦ）と複合体形成する場合、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩ−ＸＴＥＮは、第Ｘ因子を第Ｘａ因子へと活性化する。Ｂｉｏｐｈｅｎ第ＶＩＩ因子は、第ＶＩＩ因子活性を試験するための色素発生アッセイである。第ＶＩＩ因子は、ウサギトロンボプラスチンによって提供される組織因子と酵素複合体を形成する。次に、定常濃度でアッセイに存在する第Ｘ因子を活性化させ、過剰量で第Ｘａ因子となる。ＦＸａの濃度は、具体的な第Ｘａ因子色素発生基質（ＳＸａ‐１１）に及ぼす活性によって実際に測定される。第Ｘａ因子は、基質を開裂し、ｐＮＡを生じる。生じたｐＮＡ
の量は、第Ｘａ因子活性に直接的に比例する。最終的に、アッセイされる試料における第ＶＩＩ因子活性の量と、生じた第Ｘａ因子の活性の間には直接的な関連性があり、放出されるｐＮＡの量によって測定され、４０５ｎｍにおける色素顕色によって決定される。未知の試料由来のシグナルを既知のＦＶＩＩ活性の標準曲線由来のシグナルと比較することによって、未知の試料におけるＦＶＩＩ活性の量を算出することは可能である。
【０４２１】
実施例２７：ＦＩＸ−ＸＴＥＮ濃度決定のためのＥＬＩＳＡアッセイ
ＦＩＸ−ＸＴＥＮ濃度を、具体的な符合した対の抗体によるＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定し、害アッセイにおいて、検出抗体をＨＲＰと抱合させ、検出を簡素化した（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号ＦＩＸ‐ＥＩＡ）。高結合９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６９０）に捕捉抗体を４℃で一晩被覆させた。プレートを３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで室温で１時間ブロッキングした。プレートをプレート洗浄機を用いてＰＢＳＴにおいて６回洗浄した。ＰＢＳＴに希釈した試料または標準物質を次に、適切なウェルへと室温で２時間結合させた。標準曲線は、２５ｎｇ／ｍＬ〜１ｐｇ／ｍＬ未満におよび、ＰＢＳＴにおける既知の濃度の市販の血漿由来のＦＩＸ（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ６２５４４）を連続希釈することによって調製した。プレートをプレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで再度６回洗浄した。次に、ＦＩＸを、３７℃で１時間結合させる検出抗体を用いて検出した。プレートをプレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで再度６回洗浄し、水でさらに１回洗浄した。次に、シグナルをＴＭＢ基質を用いて顕色させ、分子デバイスプレートリーダー分光計において４０５ｎｍで読み取ることによって定量した。次に、４パラメータ適合を、標準物質および標準曲線との比較によって決定した試料の濃度に関して実施する。
【０４２２】
実施例２８：ＦＩＸ−ＸＴＥＮ活性決定のためのａＰＴＴベースのアッセイ
ＦＩＸ−ＸＴＥＮは、内在的なまたは接触で活性化された凝固経路におけるＦＩＸを置き換えるよう作用するであろう。この凝固経路の活性を、活性化型部分的トロンボプラスチン時間アッセイ（ａＰＴＴ）を用いて評価する。ＦＩＸ活性を以下のとおり具体的に測定し、標準曲線を、正常対照血漿（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓカタログ番号１００５９５）をＦＩＸ欠乏性血漿（カタログ番号１００９００）で２倍希釈し、次に、第ＩＸ因子欠乏性血漿で６、４倍連続希釈を再度実施することによって調製した。このことは、活性の５００、１３０、３１、７．８、２．０、０．５、および０．１ｍ単位／ｍＬにおける点での標準曲線を作成し、ここで、活性の１単位を１ｍＬの正常ヒト血漿におけるＦＩＸ活性の量として定義する。また、ＦＩＸ欠乏性血漿は、無血漿における活性の背景レベルを決定するために含まれた。ＦＩＸ−ＸＴＥＮをＦＩＸ欠乏性血漿に、１；１０の容積比で添加することによって試料を調製した。試料を以下の通りａＰＴＴアッセイを用いて試験した。試料を分子デバイスプレートリーダー分光計において３７℃で２分間インキュベートし、その点において等容積のａＰＴＴ試薬（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓカタログ番号１００４０２）を添加し、さらに３分間の３７℃インキュベーションを実施した。インキュベーション後、１容積の塩化カルシウム（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓカタログ番号１００３０４）を添加することによって、該アッセイを活性化させた。濁度を４５０ｎｍにおいて５分間モニターして、反応特性を作成した。ａＰＴＴ時間、または凝固活性の開始する時間を、ＯＤ４０５ｎｍがベースラインを０．０６ほど上回って増大する最初の時点として定義した。対数‐直線標準曲線を、ａＰＴＴ時間と直線的に関連する活性の対数を用いて作成した。これから、プレートウェルにおける試料の活性を決定した後、試料における活性を、ＦＩＸ欠乏性血漿への希釈を説明するために１１ほど乗じることによって決定した。
【０４２３】
実施例２９：ＦＩＸ／ｃＦＸＩ／ＸＴＥＮは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮと比較して亢進した活性を有する
ＦＩＸ（ｐＣＷ０５９６）、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ（ｐＣＷ０５９７）、ＦＩＸ／ｃＦＸＩ
１／ＸＴＥＮ（ｐＣＷ０７３５）、ＦＩＸ／ｃＦＸＩ２／ＸＴＥＮ（ｐＣＷ０７３６）およびＦＩＸ／ｃＦＸＩ３／ＸＴＥＮ（ｐＣＷ０７３７）を、ＣＨＯ‐Ｋ１細胞において一過性に発現させた。一過性トランスフェクションの上清を３０，０００ＭＷＣＯ濃縮装置においておよそ１５倍ほど濃縮した。濃縮した試料および非濃縮試料の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。次に、濃縮した試料の凝固活性を、ａＰＴＴベースの因子アッセイを用いて決定した。含有するＸＴＥＮについて、活性は、任意のＦＸＩｃ開裂部位の存在によって劇的に変化した。３つの場合すべてにおいて、ＦＸＩ開裂部位の存在は、凝固活性を３０倍超ほど亢進した（図２２および表２８を参照されたい）。相対的に一致するＥＬＩＳＡの測定結果は、このことが、力価の変化よりもむしろ比活性の亢進であることを示す。加えて、ＦＸＩ開裂部位コンストラクトについてのＥＬＩＳＡ濃度に対する活性測定結果の比は今や、ＦＩＸに対する比と類似しており、ＦＩＸ−ＦＸＩｃ−ＸＴＥＮが、ＸＴＥＮの不在下で発現したＦＩＸドメインと類似の特性のＦＩＸドメインを含むことを示した。
【０４２４】
【表２８】
2013502459.tif 000087
実施例３０：ラットＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４におけるＣＦＸＴＥＮ融合ポリペプチドの薬物動態分析
ＦＶＩＩ単独と比較して、ＣＦＸＴＥＮ  ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の薬物動態をスプラーグ・ドーリーにおいて試験した。ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４およびＦＶＩＩを雌のスプラーグ・ドーリー系ラット（ｎ＝３）に、頚静脈カテーテルを通じて３μｇ／個体で静脈内投与した。血液試料（０．２ｍＬ）を予冷しておいたヘパリン処理済みチューブへと投与前、０．０８、０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２時間の時点で回収し、血漿へと処理した。試験品の定量を、捕捉および検出の両方について抗ＦＶＩＩ抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって実施した。非コンパートメント分析をＷｉｎＮｏｎＬｉｎにおいて実施し、すべての時点は、ＰＫパラメータを決定するための適合に含まれていた。
【０４２５】
薬物動態結果を表２９および図２３に要約する。データは、ＸＴＥＮが、ＦＶＩＩ単独と比較してＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質としてＦＶＩＩの半減期を大いに延長することができ、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮが、ＦＶＩＩについての１時間と比較しておよそ３８時間の半減期を有することを示す。加えて、ラットにおいて５０．８ｍＬの分布の算出された容積でＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを血流に制限し、細胞外空間への滲出がほとんどないことを示した。
【０４２６】
【表２９】
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実施例３１：ラットＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４におけるＣＦ  ＸＴＥＮ融合ポリペプチドの薬物動態分析
マクロキャップＱ精製したＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の薬物動態を、スプラーグ・ドーリー系ラット（ｎ＝３）において試験し、未精製のＦＩＸ−ＸＴＥＮ、開裂したＦＩＸ−ＸＴＥＮ  ＴＥＶ（ＸＴＥＮをＴＥＶプロテアーゼの使用によって融合タンパク質から除去する調製）、および市販のＦＩＸ  Ｂｅｎｅｆｉｘと比較した。化合物を雌のスプラーグ・ドーリーラットに頚静脈カテーテルを通じて３μｇ／個体で静脈内投与した。血液試料（０．２ｍＬ）を、予冷しておいたヘパリン処理済みチューブへと投与前、０．０８、０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２時間の時点で回収し、血漿へと処理した。試験品の定量を、捕捉および検出の両方について抗ＦＶＩＩ抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって実施した。非コンパートメント分析をＷｉｎＮｏｎＬｉｎにおいて実施し、すべての時点は、ＰＫパラメータを決定するための適合に含まれていた。
【０４２７】
薬物動態結果を表３０および図２４に要約する。データは、ＸＴＥＮが、開裂したＦＩＸ−ＸＴＥＮ  ＴＥＶまたはＦＩＸ  Ｂｅｎｅｆｉｘのいずれかと比較してＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質としてＦＩＸの半減期を大いに延長することができ、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮが、ＦＩＸ  Ｂｅｎｅｆｉｘについての４．６時間と比較しておよそ３４．７時間の半減期を有することを示す。加えて、ラットにおいて３８ｍＬの分布の算出された容積でＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを血流に制限し、細胞外空間への滲出がほとんどないことを示した。
【０４２８】
【表３０】
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実施例３２：動物モデルにおけるＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の薬力学的評価
ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮコンストラクトのインビボでの薬理活性を、血友病、手術、外傷、血小板減少／血小板機能不全、クロピドグレル／ヘパリン誘発性出血、および水力学的注射のものを含むがこれらに限定されない出血の種々の臨床前モデルを用いて評価する。これらのモデルは、他のＦＶＩＩａアプローチのために使用および公表されたものと等価の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギ、およびイヌを含む複数の種において開発されることができる。ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ組成物は、インビボでの投与に適合した水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝塩類溶液、またはトリス緩衝塩類溶液）において提供される。組成物は、特定のモデルのために最適化された適切な用量、投薬頻度、投薬スケジュール、および投与経路で投与される。効能の決定には、とりわけ、ＦＶＩＩａ活性の測定、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化型部分プロトロンビン時間（ａＰＴＴ）、出血回数、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧまたはＲＯＴＥＭ）を含む。
【０４２９】
ＰＤモデルの一例において、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮおよびＦＶＩＩを、遺伝的に欠損したまたは実験的に誘導したＨｅｍＡまたはＨｅｍＢマウスに投与する。投与後の種々の時点で、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの活性を市販のＦＶＩａ活性キットによって測定し、凝固時間をＰＴアッセイによって測定する。全体として、本結果は、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮコンストラクトが、より少ない頻度またはより簡便な投薬間隔でＦＶＩＩａの同等な
薬用量に対する潜在能力におけるＦＶＩＩａおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３０】
マウス出血チャレンジＰＤモデルにおいて、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮおよびＦＶＩＩａを、遺伝的に欠損したまたは実験的に誘導されたＨｅｍＡまたはＨｅｍＢマウスに投与し、止血チャレンジに及ぼす効果を測定する。止血チャレンジには、とりわけ、尾部処置チャレンジ、ヘマートロプチー（ｈｅｍａｒｔｈｒｏｐｔｈｙ）チャレンジ、関節出血、または伏在静脈チャレンジを含むことができる。投与後の種々の時点で、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの活性を市販のＦＶＩＩａ活性キットによって測定し、出血時間を測定し、凝固時間をＰＴアッセイによって測定する。全体として、本結果は、ＶＩＩａ−ＸＴＥＮコンストラクトが、あまり頻繁ではないかまたはより簡便な投薬間隔でＦＶＩＩａの同等な薬用量に対する潜在能力におけるＦＶＩＩａおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３１】
イヌＰＤモデルにおいて、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮおよびＦＶＩＩを、遺伝的に欠損した血友病イヌに投与する。投与後の種々の時点で、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの活性を市販のＦＶＩＩａ活性キットによって測定し、凝固時間をＰＴアッセイによって測定する。全体として、本結果は、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮコンストラクトが、あまり頻繁ではないかまたはより簡便な投薬によるＦＶＩＩａの同等な薬用量に対する潜在能力におけるＦＶＩＩａおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３２】
イヌ出血チャレンジＰＤモデルにおいて、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮおよびＦＶＩＩａを、遺伝的に欠損した血友病イヌに投与し、止血チャレンジに及ぼす効果を測定する。止血チャレンジには、とりわけ角皮の出血時間を含むことができる。投与後の種々の時点において、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの活性を市販のＦＶＩＩａ活性キットによって測定し、出血時間を測定し、凝固時間をＰＴアッセイによって測定する。全体として、本結果は、ＶＩＩａ−ＸＴＥＮコンストラクトが、あまり頻繁ではないかまたはより簡便な投薬間隔によるＦＶＩＩａの同等な薬用量に対する潜在能力におけるＦＶＩＩａおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３３】
出血に関する追加的な臨床前モデルには、血友病、手術、外傷、血小板減少／血小板機能不全、クロピドグレル／ヘパリン誘発性出血、および水力学的注射のものを含むがこれらに限定されない。これらのモデルは、他のＦＶＩＩａアプローチについて使用および公表されたものと等価の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギ、およびイヌを含む複数種において開発されることができる。全体として、本結果は、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮコンストラクトが、あまり頻繁ではないかまたはより簡便な投薬間隔によるＦＶＩＩａの同等な薬用量に対する潜在能力におけるＦＶＩＩａおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３４】
実施例３３：動物モデルにおけるＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の薬力学的評価
ＦＩＸ−ＸＴＥＮコンストラクトのインビボでの薬理活性を、血友病、手術、外傷、血小板減少／血小板機能不全、クロピドグレル／ヘパリン誘発性出血、および水力学的注射のものを含むがこれらに限定されない出血に関する種々の臨床前モデルを用いて評価する。これらのモデルは、他のＦＩＸアプローチについて使用および公表されたものと等価の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギ、およびイヌを含む複数種において開発されることができる。ＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物は、インビボでの投与に適合した水性緩衝液（例え
ば、リン酸緩衝塩類溶液またはトリス緩衝塩類溶液）において提供される。組成物は、特定のモデルのために最適化された適切な用量、投薬頻度、投薬スケジュール、および投与経路で投与される。効能の読み出しには、とりわけ、ＦＩＸ活性の測定、ＰＴ、ａＰＴＴ、出血回数、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧまたはＲＯＴＥＭ）を含む。
【０４３５】
ＰＤモデルの一例において、ＦＩＸ−ＸＴＥＮおよびＦＩＸを、遺伝的に欠損したまたは実験的に誘導したＨｅｍＡまたはＨｅｍＢマウスに投与する。投与後の種々の時点で、ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮの活性を市販のＦＩＸ活性キットによって測定し、凝固時間をａＰＴＴアッセイによって測定する。全体として、本結果は、ＦＩＸ−ＸＴＥＮコンストラクトが、より少ない頻度またはより簡便な投薬間隔でＦＩＸの同等な薬用量に対する潜在能力におけるＦＩＸおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３６】
マウス出血チャレンジＰＤモデルにおいて、ＦＩＸ−ＸＴＥＮおよびＦＩＸを、遺伝的に欠損したまたは実験的に誘導されたＨｅｍＡまたはＨｅｍＢマウスに投与し、止血チャレンジに及ぼす効果を測定する。止血チャレンジには、とりわけ、尾部処置チャレンジ、ヘマートロプチーチャレンジ、関節出血、または伏在静脈チャレンジを含むことができる。投与後の種々の時点で、ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮの活性を市販のＦＩＸ活性キットによって測定し、出血時間を測定し、凝固時間をａＰＴＴアッセイによって測定する。全体として、本結果は、ＦＩＸ−ＸＴＥＮコンストラクトが、あまり頻繁ではないかまたはより簡便な投薬間隔でＦＩＸの同等な薬用量に対する潜在能力におけるＦＩＸおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３７】
イヌＰＤモデルにおいて、ＦＩＸ−ＸＴＥＮおよびＦＩＸを、遺伝的に欠損した血友病イヌに投与する。投与後の種々の時点で、ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮの活性を市販のＦＩＸ活性キットによって測定し、凝固時間をａＰＴＴアッセイによって測定する。全体として、本結果は、ＦＩＸ−ＸＴＥＮコンストラクトが、あまり頻繁ではないかまたはより簡便な投薬によるＦＩＸの同等な薬用量に対する潜在能力におけるＦＩＸおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３８】
イヌ出血チャレンジＰＤモデルにおいて、ＦＩＸａ−ＸＴＥＮおよびＦＩＸを、遺伝的に欠損した血友病イヌに投与し、止血チャレンジに及ぼす効果を測定する。止血チャレンジには、アッセイのうちでとりわけ角皮の出血時間を含むことができる。投与後の種々の時点において、ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮの活性を市販のＦＩＸ活性キットによって測定し、出血時間を測定し、凝固時間をａＰＴＴアッセイによって測定する。全体として、本結果は、ＦＩＸ−ＸＴＥＮコンストラクトが、あまり頻繁ではないかまたはより簡便な投薬間隔によるＦＩＸの同等な薬用量に対する潜在能力におけるＦＩＸおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４３９】
出血に関する追加的な臨床前モデルには、血友病、手術、外傷、血小板減少／血小板機能不全、クロピドグレル／ヘパリン誘発性出血、および水力学的注射のものを含むがこれらに限定されない。これらのモデルは、他のＦＩＸアプローチについて使用および公表されたものと等価の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギ、およびイヌを含む複数種において開発されることができる。全体として、本結果は、ＦＩＸ−ＸＴＥＮコンストラクトが、あまり頻繁ではないかまたはより簡便な投薬間隔によるＦＩＸの同等な薬用量に対す
る潜在能力におけるＦＩＸおよび／または等価物と比較して、出血を阻害する上でより有効であり得ることを示すことができる。
【０４４０】
実施例３４：開裂配列を有するＣＦＸＴＥＮ
ＦＸＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図２のＦにおいて図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製されることができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、放出部位開裂配列は、ＦＸＩａプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．２７，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０３９５１）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含むＦＩＸ−ＸＴＥＮに組み込まれることができる。具体的には、アミノ酸配列ＫＬＴＲＡＥＴは、ＦＸＩａプロテアーゼによって該配列のアルギニンの後ろで切断される。ＦＸＩは、内在性凝固経路または接触で活性化した凝固経路におけるＦＩＸの直前に配置された凝血原プロテアーゼである。活発なＦＸＩａは、ＦＸＩＩａによる酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によって、ＦＸＩから生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割はＦＩＸの位置Ｒ１９１およびＲ２２６におけるタンパク質を切断し、次に、このことが凝固経路を永続化させることによって、酵素前駆体からペプチドを切り出すことによってＦＩＸを活性化することである。ＦＸＩａの生成はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、ＫＬＴＲＡＥＴ開裂配列の組み込みによって、ＸＴＥＮドメインは、内在性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、ＦＩＸから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質が、内在性経路の活性化の間に１つの追加的な様式で加工される状況を作る。ＦＸＩａによってＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６において生じる天然の開裂に加えて、第三の開裂が、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを脱共役するであろうＸＴＥＮ放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離ＦＩＸａを生じるよう加工され、遊離ＦＩＸａが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、ＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
【０４４１】
ＦＸＩＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、ＸＴＥＮ放出部位配列は、ＦＸＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．３８，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００７４８）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含むことができる。具体的には、配列ＴＭＴＲＩＶＧＧは、該配列の位置４におけるアルギニンの後ろで切断される。ＦＸＩＩは、内在性凝固経路または接触で活性化した凝固経路におけるＦＩＸの前に配置された凝血原プロテアーゼである。活発なＦＸＩａは、非自己表面との接触によって、およびカリクレインによる開裂によって、ＦＸＩＩから生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってＦＸＩを活性化することであり（図３）、次に、このことが凝固経路を永続化させる。ＦＸＩＩａの生成はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、ＴＭＴＲＩＶＧＧ開裂配列の組み込みによって、ＸＴＥＮドメインは、内在性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、ＦＩＸから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合体が、内在性経路の活性化の間に１つの追加的な様式で加工される状況を作る。ＦＸＩａによってＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６において生じる天然の開裂に加えて、第三の開裂が、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを脱共役するであろうＸＴＥＮ放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離ＦＩＸａを生じるよう加工され、遊離ＦＩＸａが、それを必要とする対象
における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、ＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
【０４４２】
カリクレインによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、ＸＴＥＮ放出部位配列は、カリクレインプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．３４，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０３９５２）によって認識および開裂されるアミノ酸配列であり得る。具体的には、配列ＳＰＦＲＶＶＧＧ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４におけるアルギニンの後ろで切断される。カリクレインは、内在性凝固経路または接触で活性化した凝固経路におけるＦＩＸの前に配置された凝血原プロテアーゼである。活発なカリクレインは、非自己表面との接触によって、血漿カリリエン（Ｋａｌｌｉｒｉｅｎ）から生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってＦＸＩＩを活性化することであり（図３）、次に、このことが凝固経路を永続化させる。カリクレインの生成はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、ＳＰＦＲＶＶＧＧ開裂配列の組み込みによって、ＸＴＥＮドメインは、内在性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、ＦＩＸから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合体が、内在性経路の活性化の間に１つの追加的な様式で加工される状況を作る。ＦＸＩａによってＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６において生じる天然の開裂に加えて、第三の開裂が、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを脱共役するであろうＸＴＥＮ放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離ＦＩＸａを生じるよう加工され、遊離ＦＩＸａが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、ＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
【０４４３】
ＦＶＩＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位配列は、ＦＶＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．２１，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０８７０９）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＬＱＶＲＩＶＧＧ  ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４におけるアルギニンの後ろで切断される。ＦＶＩＩａは、外来性凝固経路または細胞の損傷で活性化した凝固経路におけるＦＩＸの前に配置された凝血原プロテアーゼである。活発なＦＶＩＩａは、組織因子、リン脂質、およびカルシウムに対する結合によって促進される自己触媒過程においてＦＶＩＩから生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってＦＩＸおよびＦＸを活性化することであり（図３）、次に、このことが凝固経路を永続化させる。ＦＶＩＩａ活性はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、ＬＱＶＲＩＶＧＧ開裂配列の組み込みによって、ＸＴＥＮドメインは、内在性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、ＦＩＸから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合体が、内在性経路の活性化の間に１つの追加的な様式で加工される状況を作る。ＦＶＩＩａによってＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６において生じるであろう天然の開裂に加えて、第三の開裂が、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを脱共役するであろうＸＴＥＮ放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が
遊離ＦＩＸａを生じるよう加工され、遊離ＦＩＸａが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、ＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
【０４４４】
ＦＩＸａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位開裂配列は、ＦＩＸａプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．２２，
Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０００７４０）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＰＬＧＲＩＶＧＧ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４におけるアルギニンの後ろで切断される。活発なＦＩＸａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でＦＸＩａまたはＦＶＩＩａのいずれかによるＦＩＸの開裂によって生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってＦＸを活性化することであり（図３）、次に、このことが凝固経路を永続化させる。ＦＩＸａ活性はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、ＰＬＧＲＩＶＧＧ配列の組み込みによって、ＸＴＥＮドメインは、外来性凝固経路または内在性凝固経路のいずれかの活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、ＦＩＸから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合体が、内在性経路の活性化の間に１つの追加的な様式で加工される状況を作る。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによってＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６において生じるであろう天然の開裂に加えて、第三の開裂が、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを脱共役するであろうＸＴＥＮ放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離ＦＩＸａを生じるよう加工され、遊離ＦＩＸａが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、ＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
【０４４５】
ＦＸａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位は、ＦＸａプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．６，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００７４２）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＩＥＧＲＴＶＧＧ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４におけるアルギニンの後ろで切断される。活発なＦＸａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でＦＩＸａによるＦＸの開裂によって生じ、凝固経路における第ＩＸ因子からすぐ下流の工程である。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってＦＩＩを活性化することであり（図３）、次に、このことが凝固経路を永続化させる。ＦＸａ活性はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、ＩＥＧＲＴＶＧＧ配列の組み込みによって、ＸＴＥＮドメインは、外来性凝固経路または内在性凝固経路のいずれかの活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、ＦＩＸから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合体が、凝固の活性化の間に１つの追加的な様式で加工される状況を作る。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによってＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６において生じるであろう天然の開裂に加えて、第三の開裂が、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを脱共役するであろうＸＴＥＮ放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離ＦＩＸａを生じ
るよう加工され、遊離ＦＩＸａが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、ＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
【０４４６】
ＦＩＩａ（トロンビン）によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位は、ＦＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．５，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００７３４）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＬＴＰＲＳＬＬＶ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４におけるアルギニンの後ろで切断される。活発なＦＩＩａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でＦＸａによるＦＩＩの開裂によって生じ、凝固経路における第ＩＸ因子から下流にある。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素フィブリノーゲンを開裂させることであり（図３）、次に、このことが凝固経路を開始する。ＦＩＩａ活性はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、ＬＴＰＲＳＬＬＶ配列の組み込みによって、ＸＴＥＮドメインは、外来性凝固経路または内在性凝固経路のいずれかの活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、ＦＩＸから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合体が、凝固の活性化の間に１つの追加的な様式で加工される状況を作る。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによってＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６において生じるであろう天然の開裂に加えて、第三の開裂が、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを脱共役するであろうＸＴＥＮ放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離ＦＩＸａを生じるよう加工され、遊離ＦＩＸａが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、ＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
【０４４７】
エラスターゼ‐２によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位は、エラスターゼ‐２プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．３７，
Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０８２４６）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＬＧＰＶＳＧＶＰ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４の後ろで切断される。エラスターゼは、好中球によって構成的に発現され、循環におけるすべての場合に存在する。その活性はセルピンによってきっちりと制御されており、それゆえ、ほとんどの場合最小に活発である。それゆえ長い寿命のＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のＦＩＸのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のＦＩＸを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
【０４４８】
ＭＭＰ‐１２によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位は、ＭＭＰ‐１２プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．６５，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ３９９００）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＧＰＡＧＬＧＧＡ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０
０８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４の後ろで切断される。ＭＭＰ‐１２は、全血において構成的に発現される。それゆえ、長い寿命のＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のＦＩＸのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のＦＩＸを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
【０４４９】
ＭＭＰ‐１３によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位は、ＭＭＰ‐１３プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．−，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４５４５２）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＧＰＡＧＬＲＧＡ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４の後ろで切断される。ＭＭＰ‐１３は、全血において構成的に発現される。それゆえ、長い寿命のＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のＦＩＸのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のＦＩＸを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
【０４５０】
ＭＭＰ‐１７によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位は、ＭＭＰ‐２０プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４．−，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＵＬＺ９）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＡＰＬＧＬＲＬＲ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、該配列の位置４の後ろで切断される。ＭＭＰ‐１７は、全血において構成的に発現される。それゆえ、長い寿命のＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のＦＩＸのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のＦＩＸを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
【０４５１】
ＭＭＰ‐２０によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに図示されるように、ＦＩＸ成分とＸＴＥＮ成分の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表４２に提供する。この場合、該放出部位は、ＭＭＰ‐２０プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４．−，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｏ６０８８２）によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列ＰＡＬＰＬＶＡＱ［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、（矢印によって示される）位置４の後ろで切断される。ＭＭＰ‐２０は、全血において構成的に発現される。それゆえ、長い寿命のＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のＦＩＸのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のＦＩＸを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
【０４５２】
Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度の最適化
Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度を変更した前述の実施例のバリアントを作製することができる。ＸＴＥＮ放出プロテアーゼによるＸＴＥＮ放出の速度が、ＸＴＥＮ放出部位の配列に依存するので、ＸＴＥＮ放出部位におけるアミノ酸配列を変動させることによって、ＸＴ
ＥＮ放出速度を制御することができる。多くのプロテアーゼの配列特異性は当該技術分野で周知であり、いくつかのデータベースにおいて記録されている。この場合、プロテアーゼのアミノ酸特異性は、基質の組み合わせライブラリーを用いて［Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．
Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ９７：  ７７５４］、または［Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３２：  ４３４４］に示されるように基質混合物の開裂に従うことによってマッピングされる。代替案は、ファージディスプレイによる最適なプロテアーゼ開裂配列の同定である［Ｍａｔｔｈｅｗｓ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６０：  １１１３］。コンストラクトを、バリアント配列を用いて作製し、ＸＴＥＮポリペプチドの検出のための標準的なアッセイを用いてＸＴＥＮ放出についてアッセイする。
【０４５３】
実施例３５：ＣＦ配列に対して内部のＸＴＥＮの組み込み
ＫＮＳＡＤＫループへの内部ＸＴＥＮ融合
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに示されるように作製することができる。具体的には、ＸＴＥＮ配列を融合体として、ＥＧＦ２ドメインのＫＮＳＡＤＮＫループ（残基１４６〜１５２）へと挿入し、該ループは、公知の血友病Ｂの突然変異を有さず、ＦＩＸ結晶構造において高度に構造化されていない。この場合、該挿入は、ループ配列のＳＡ結合における天然配列を分割することによって、およびＸＴＥＮ配列を間隙へと融合させることによって作製される。このことは、ループ配列ＫＮ−ＸＴＥＮ−ＡＤＮＫを生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮが凝固の活性化までプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作り、この場合において分子は、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強するＦＩＸａ−ＸＴＥＮを生じるよう加工される。
【０４５４】
ＬＡＥＮループへの内部ＸＴＥＮ融合
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＦに示されるように作製することができる。具体的には、ＸＴＥＮ配列を融合体として、ＥＧＦ２ドメインのＬＡＥＮループ（残基１６３〜１６６）へと挿入し、該ループは、公知の血友病Ｂの突然変異を有さず、ＦＩＸ結晶構造において高度に構造化されていない。この場合、該挿入は、該配列のＡＥ結合における天然配列を分割することによって、およびＸＴＥＮ配列を間隙へと融合させることによって作製される。このことは、ループ配列ＬＡ−ＸＴＥＮ−ＥＮを生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮが凝固の活性化までプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作り、この場合において分子は、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強するＦＩＸａ−ＸＴＥＮを生じるよう加工される。
【０４５５】
活性化ペプチドへの内部ＸＴＥＮ融合
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＤに示されるように作製することができる。具体的には、ＸＴＥＮ配列を活性化ペプチド（残基１９２〜２２６）へと配置し、それにより２つの天然ＦＸＩａ開裂部位のいずれも破壊されないようになっている。挿入は、該配列のＴ２０９‐Ｉ２１０における天然配列を分割し、およびＸＴＥＮ配列を間隙へと融合させることによってなされる。このことは、ＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴ−ＸＴＥＮ−ＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥの残基１８８において開始する配列を生じる。活発なＦＸＩａは、ＦＸＩＩａによる酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってＦＸＩから生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、タンパク質を位置Ｒ１９１およびＲ２２６において切断することによってＦＩＸ酵素前駆体から活性化ペプチドを切り出すことによって、ＦＩＸを活性化することである（図４）。これらの切断部位を
矢印によって示し、配列は、凝固カスケードの間に天然の開裂活性を可能にするよう変更されないＰ４‐Ｐ４’部位を残すよう設計される。それゆえ、ＸＴＥＮドメインは、内在性凝固経路内の正常な活性化過程の一部として、ＦＩＸから除去されるに過ぎないであろう。
【０４５６】
ＦＩＸ  ＥＧＦドメイン間における内部ＸＴＥＮ融合
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質からなるＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、図２のＣに示されるように作製することができる。具体的には、ＸＴＥＮ配列をＦＩＸの２つのＥＧＦ様ドメイン（接合部は残基１２９と残基１３０の間である）の間に配置する。挿入は、Ｅ１２９‐Ｌ１３０における天然の配列を分割し、ＸＴＥＮ配列を間隙に融合させることによってなされる。このこてゃ、の残基１２１において開始する配列を生じるであろう。それにより２つの天然ＦＸＩａ開裂部位のいずれも破壊されないようになっている。挿入は、該配列のＴ２０９‐Ｉ２１０における天然配列を分割し、およびＸＴＥＮ配列を間隙へと融合させることによってなされる。このことは、ＦＧＦＥＧＫＮＣＥ  −  ＸＴＥＮ  −  ＬＤＶＴＣＮＩＫＮＧＲの残基１２１において開始する配列を生じるであろう。実際、このことは、凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮが無処置で循環するであろう状況を作り、この場合、該分子は、個体における凝固機能を再構成または増強するＦＩＸａ−ＸＴＥＮを生じるよう加工される。
【０４５７】
実施例３６：ＦＶＩＩａを含むＣＦＸＴＥＮを評価するためのヒト臨床治験設計
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、凝固カスケードの外来性経路を活性化させることによって止血を促進するよう意図された組換えヒト第ＶＩＩａ凝固因子（ｒＦＶＩＩａ）である。その短い半減期により、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎは、止血が達成されるまで２時間ごと〜６時間ごとに静脈内に投薬される。ＸＴＥＮのＦＶＩＩへの融合は、該タンパク質の半減期を改良し、したがって、このようなＦＶＩＩ含有融合タンパク質組成物を用いて低下した投薬頻度を可能にする。
【０４５８】
臨床治験は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎに対するＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの効能および利点がヒトにおいて立証されることができるよう設計されることができる。例えば、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎについて実施されるような出血の治療のための臨床治験において使用されることができる。このような研究は、３つの相を含むであろう。第一に、成人患者における第Ｉ相安全性および薬物動態研究を実施して、（正常対象または血友病患者のいずれかの）ヒトにおける最大許容用量および薬物動態および薬力学を決定し、ならびにさらなる研究において追跡されるべき潜在的な毒性および有害事象を規定する。ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ組成物の単回上昇用量が投与され、生化学的パラメータ、ＰＫパラメータ、および臨床的パラメータを測定する研究が実施される。このことは、最大許容用量の決定を可能にし、個々の成分についての治療ウィドウを構成する薬用量および循環薬における閾値および最大濃度を確立するであろう。その後、臨床治験は、疾患、障害、または容態を有する患者において実施される。
【０４５９】
臨床治験は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎが臨床上の有益性を提供すると期待され得る任意の疾患に苦しんでいる患者において実施され得る。例えば、このような適応には、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害剤による血友病Ａまたは血友病Ｂの患者における、および後天性血友病を有する患者における出血症状、第ＶＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害剤による血友病Ａまたは血友病Ｂの患者におけるならびに後天性血友病を有する患者における外科的介入または侵襲的手順における出血の予防、先天的ＦＶＩＩ欠乏症を有する患者における外科的介入または侵襲的手順における出血の予防が挙げられる。ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮは、追加的な患者集団における使用のためにも示され得る。パラメータおよび臨床的エンドポイントを、融合タンパク質組成物の投薬の関数として測定し、有害事象と関連した安全性データを集めることに加えて、その後の第ＩＩＩ相治験に適した用量
に関する用量範囲情報を生じる。ＰＫパラメータは、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ組成物についての治療ウィンドウおよび治療用量投与計画を確立するための生理学的、臨床的、および安全性パラメータデータと相関しており、臨床医は該組成物についての適切な用量範囲を確立することができる。最終的に、第ＩＩＩ相効能研究を実施し、この場合患者は、用量投与計画でＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ組成物を投与され、個々の組成物の薬物動態特性および薬力学的特性を考慮して適切と思われる投薬スケジュールを用いて、（市販のＮｏｖｏＳｅｖｅｎなどの）ポジティブコントロールまたは偽薬を投与し、それにともない、すべての薬剤は、研究のエンドポイントに到達するのに適切に延長した期間投与される。モニターされるパラメータには、ＰＴアッセイ、出血時間アッセイ、出血症状の制御、または自発的出血症状の発症；偽薬群もしくはポジティブコントロール群に対して追跡されるパラメータが挙げられる。効能の結果は、標準的な統計方法を用いて決定される。毒性および有害事象のマーカーも本研究において追跡され、化合物が説明されている様式で使用される場合に安全であることを検証する。
【０４６０】
実施例３７：ＦＩＸを含むＣＦＸＴＥＮを評価するためのヒト臨床治験設計
凝固第ＩＸ因子（組換え）であるＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は、手術設定における出血の制御および予防を含む血友病（先天的第ＩＸ因子欠乏症またはクリスマス病）を有する患者における出血症状の制御および予防のために示される。すべての第ＩＸ因子産物についての治療の薬用量および期間は、第ＩＸ因子欠乏症の重症度、出血の位置および程度、ならびに患者の臨床的容態、齢、および第ＩＸ因子の回復による。ＸＴＥＮのＦＩＸへの融合は、該タンパク質の半減期を改良し、したがって低下した投薬頻度を可能にする。
【０４６１】
臨床治験は、他の第ＩＸ因子臨床産物に対するＦＩＸ−ＸＴＥＮの効能利点がヒトにおいて検証されることができるよう設計されることができる。例えば、ＦＩＸ−ＸＴＥＮは、Ｂｅｎｅｆｉｘについて実施されるように、出血症状の治療のための臨床治験において使用されることができる。このような研究は３相を含むであろう。第一に、成人患者における第Ｉ相安全性薬物動態研究を実施して、（正常な対象または血友病患者のいずれかである）ヒトにおける最大許容用量および薬物動態および薬力学を決定し、ならびに将来的な研究において追跡されるべき潜在的な毒性および有害事象を規定する。ＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物の単回上昇用量を投与し、生化学的パラメータ、ＰＫパラメータ、および臨床的パラメータを測定する本研究を実施する。このことは、最大許容用量の決定を可能にし、個々の成分についての治療ウィンドウを構成する薬用量および循環薬における閾値および最大濃度を確立するであろう。その後、臨床治験を、疾患、障害、または容態を有する患者において実施する。
【０４６２】
臨床治験は、第ＩＸ因子が臨床上の利点を提供すると期待され得る任意の疾患に苦しんでいる患者において実施され得る。例えば、このような適応には、手術設定における出血の制御および予防を含む血友病Ｂ（先天的第ＩＸ因子欠乏症またはクリスマス病）を有する患者における出血症状の制御および予防が含まれる。ＦＩＸ−ＸＴＥＮは、追加的な患者集団における使用のためにも示され得る。パラメータおよび臨床的エンドポイントは、融合タンパク質組成物の投薬の関数として測定され、有害事象と関連した安全性データを集めることに加えて、その後の第ＩＩＩ相治験に適した用量に関する用量範囲方法を生じる。ＰＬパラメータは、臨床医が組成物について適切な用量範囲を確立できる、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物についての治療ウィンドウおよび治療用量投与計画を確立するための生理学的、臨床的、および安全性パラメータデータと相関している。最終的に、第ＩＩＩ相効能研究を実施し、この場合患者は、用量投与計画においてＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物を投与され、および個々の組成物の薬物動態特性および薬力学的特性を考慮して適切と思われる投薬スケジュールを用いて、（市販のＢｅｎｅＦＩＸなどの）ポジティブコントロールまたは偽薬が投与され、すべての薬剤は、研究エンドポイントを達成するのに適した延長した時間投与される。モニターされるパラメータには、ａＰＴＴアッセイ、出血時間アッセ
イ、出血症状の制御、または自発的出血症状の発生；偽薬群もしくはポジティブコントロール群に対して追跡されるパラメータが含まれる。効能の結果は、標準的な統計方法を用いて決定される。毒性および有害事象のマーカーも本研究において追跡され、説明された様式で用いる場合に化合物が安全であることを検証する。
【０４６３】
実施例３８：多様な負荷量を有するＸＴＥＮ融合タンパク質の分析用分子ふるいクロマトグラフィー
分子ふるいクロマトグラフィー分析を、増大する長さの種々の治療用タンパク質および構造化されていない組換えタンパク質を含む融合タンパク質に関して実施した。例示的なアッセイは、１ｍｇ／ｍＬの濃度で４０μｇの精製済みグルカゴン融合タンパク質を２０ｍＭリン酸ｐＨ６．８、１１４ｍＭ  ＮａＣｌにおいて０．６ｍＬ／分の流速で分離するＴＳＫＧｅｌ‐Ｇ４０００  ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いた。クロマトグラム特性を、ＯＤ２１４ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍを用いてモニターした。すべてのアッセイのためのカラム較正を、ＢｉｏＲａｄ製の分子ふるい構成標準物質を用いて実施し、マーカーには、チログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリ卵白アルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）、およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含む。グルカゴン‐Ｙ２８８、グルカゴン‐Ｙ１４４、グルカゴン‐Ｙ７２、グルカゴン‐Ｙ３６の代表的なクロマトグラフィー特性を、図３５における重ね合わせとして示す。本データは、各化合物の見かけの分子量が、付着したＸＴＥＮ配列の長さに比例することを示す。しかしながら、本データは、各コンストラクトの見かけの分子量が、（同じアッセイにおいて分析される標準物質との比較によって示されるように）球状タンパク質について期待されるものよりも有意に大きいことも示す。ＣＦＸＴＥＮ組成物を含む評価されるすべてのコンストラクトについてのＳＥＣ分析に基づいて、見かけの分子量、（算出された分子量に対する見かけの分子量の比として表される）見かけの分子量因子、および水力学的半径（ｎｍにおけるＲＨ）を表３１に示す。本結果は、５７６以上のアミノ酸の異なるＸＴＥの組み込みが、およそ３３９ｋＤａ〜７６０の融合タンパク質についての見かけの分子量を与え、かつ８６４以上のアミノ酸のＸＴＥＮがおよそ８００ｋＤＡよりも大きな見かけの分子量を与えることを示す。実際の分子量に対する見かけの分子量における比例的増大に関する結果は、いくつかの異なるモチーフファミリー由来のＸＴＥＮを用いて作製された融合タンパク質と一致し、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、およびＡＭは、少なくとも４倍の増加および約１７倍高い比を有する。加えて、５７６以上のアミノ酸（およびＹ２８８に融合したグルカゴンの場合２８８残基）を有するＸＴＥＮ融合パートナーの、種々の負荷量を有する融合タンパク質への組み込みは結果的に、およそ３〜５ｎｍの糸球体の孔サイズを十分に超えている７ｎｍ以上の水力学的半径とともに生じた。したがって、増殖およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質は、延長した終末半減期の一因となり、相応の融合していない生物学的負荷量のタンパク質に対する治療効果または生物学的効果を改良する、腎クリアランスを低下させたことが期待される。
【０４６４】
【表３１】
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実施例３９：カニクイザルにおけるＧＦＰに融合した伸長したポリペプチドの薬物動態
ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６、およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの薬物動態をカニクイザルにおいて試験し、ＰＫパラメータに及ぼす構造化されていないポリペプチドの組成および長さの効果を決定した。血液試料を注射後の種々の時点で分析し、血漿中のＧＦＰ濃度を、捕捉のためのＧＦＰに対するポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、検出のための同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２５に要約する。本結果は、ＸＴＥＮ配列の長さを増大させると半減期の驚くべき延長を示す。例えば、１０時間の半減期が、（ＸＴＥＮにおいて２８８アミノ酸残基を有する）ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ２８８について決定された。５７６のアミノ酸まで構造化されていないポリペプチド融合パートナーの長さを二倍にすると、複数の融合タンパク質コンストラクト、すなわちＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６について２０〜２２時間まで半減期を延長した。８３６の残基まで構造化されていないポリペプチド融合パートナーの長さをさらに伸長すると、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰについて７２〜７５時間の半減期を結果的に生じた。したがって、２８８残基から５７６残基までポリマー長を伸長すると、インビボでの半減期が約１０時間延長した。しかしながら、ポリペプチドの長さを５７６残基から８３６残基まで２６０残基ほど伸長すると、インビボでの半減期の比例的であることを超える延長を結果的に生じた。したがって、伸長した構造化されていないポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチドと比較して亢進した薬物動態の特性を有すると期待される
。
【０４６５】
実施例４０：ＸＴＥＮの血清安定性
ＧＦＰのＮ末端に融合したＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を含む融合タンパク質を、サル血漿およびラット腎臓可溶化液において３７℃で最大７日間インキュベートした。試料を時点０、１日後、および７日後に抜き取り、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ後にウェスタン分析を用いた検出およびＧＦＰに対する抗体を用いた検出によって、図２６に示す通り分析した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の配列は、血漿において８日間を超える無視できる分解の兆候を示した。しかしながら、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４は、ラット腎臓可溶化液において３日間にわたって迅速に分解した。融合タンパク質のインビボでの安定性を血漿試料において試験し、この場合、ＧＦＰ＿ＡＥ８６４を、先に説明した通り、免疫沈降させ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。注射後最大７日間抜き取られた試料は、分解の非常にわずかな兆候を示した。本結果は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物動態特性の亢進における一因子である、血清プロテアーゼによる分解に対するＣＦＸＴＥＮの耐性を示す。
【０４６６】
実施例４１：ＸＴＥＮに連結することによるペプチド負荷量の増大した溶解度および安定性
溶解度および安定性の物理的／化学的特性を亢進するＸＴＥＮの能力を評価するために、グルカゴンとより短い長さのＸＴＥＮとの融合タンパク質を調製および評価した。試験品を中性ｐＨにおけるトリス緩衝塩類溶液において調製し、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ溶液の特徴づけを逆相ＨＰＬＣおよび分子ふるいクロマトグラフィーによって実施し、該タンパク質が溶液中で均質かつ非凝集性であることを確認した。本データを表３２に呈する。比較目的のために、同じ緩衝液中で修飾されていないグルカゴンの溶解度限界を６０μＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）で測定し、本結果は、添加したＸＴＥＮのすべての長さについて、溶解度における実質的な増大が達成されたことを示す。重要なことに、ほとんどの場合、グルカゴン−ＸＴＥＮ融合タンパク質を調製して、標的濃度を達成し、所与のコンストラクトについての最大溶解度限界を決定するために評価されなかった。しかしながら、ＡＦ−１４４ＸＴＥＮに連結されたグルカゴンの場合、溶解度限界を決定し、結果は、ＸＴＥＮに連結されていないグルカゴンと比較して、溶解度における６０倍の亢進が達成された。加えて、グルカゴン−ＡＦ１４４  ＣＦＸＴＥＮを安定性について評価し、冷蔵条件の下で少なくとも６ヶ月間、および３７℃でおよそ１ヶ月間、液体製剤において安定であることが認められた（データ非表示）。
【０４６７】
本データは、グルカゴンなどの生物活性タンパク質への短い長さのＸＴＥＮポリペプチドの連結が、結果として生じる融合タンパク質によるタンパク質の溶解度特性を顕著に亢進することができ、より高いタンパク質濃度で安定性を与えることができるという結論を支持する。
【０４６８】
【表３２】
2013502459.tif 000091
実施例４２：推定アルゴリズムによる二次構造についての配列分析
アミノ酸配列は、周知のＣｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，  Ｐ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３：  ２２２−４５）およびＧａｒｎｉｅｒ‐Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ‐Ｒｏｂｓｏｎ、または「ＧＯＲ」法（Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｂｒａｔ  ＪＦ，  Ｒｏｂｓｏｎ  Ｂ．  （１９９６）．
ＧＯＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５４０−５５３）など、あるコンピュータプログラムまたはアルゴリズムを介して二次構造について評価されることができる。所与の配列について、アルゴリズムは、いくつかの二次構造が存在するかまたはまったく存在しないかを推定することができ、例えば、アルファ−ヘリックスまたはベータ−シートまたは、ランダムコイル形成を結果として生じるよう推定された配列の残基の百分率を形成する配列の合計および／または百分率として表されることができる。
【０４６９】
ＸＴＥＮ「ファミリー」由来のいくつかの代表的な配列は、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎ法およびＧＯＲ法についての２つのアルゴリズムツールを用いて評価され、これらの配列における二次構造の程度を評価した。Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎツールは、２００９年６月１９日に存在したように、．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ１におけるワールドワイドウェブに配置されたＵＲＬ「Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ」インターネットサイトにおいて、
バージニア大学のＷｉｌｌｉａｍ  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎによって提供された。ＧＯＲツールは、２００８年６月１９日に存在したように、．ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌにおけるワールドワイドウェブに配置されたＵＲＬネットワークタンパク質配列分析インターネットサイトにおいて、Ｐｏｌｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ  Ｌｙｏｎｎａｉｓによって提供された。
【０４７０】
分析における第一の工程として、単一のＸＴＥＮ配列を２つのアルゴリズムによって分析した。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる４つの１２アミノ酸配列モチーフの複数のコピーから作成された８６４のアミノ酸残基を有するＸＴＥＮである。配列モチーフは、モチーフ内に限定された反復性があり、および任意の２つの連続したアミノ酸の配列が任意の１つの１２アミノ酸モチーフにおいて２倍を超えて
反復されずかつ全長のＸＴＥＮの３つの連続したアミノ酸が同一ではない全体的な配列内に限定された反復性がある、という事実を特徴とする。Ｎ末端から連続的により長い部分のＡＦ８６４配列を、Ｃｈｏｕ‐ＦａｓｍａｎアルゴリズムおよびＧＯＲアルゴリズム（後者は、最小１７アミノ酸の長さを必要とする）によって分析した。該配列を、推定ツールへとＦＡＳＴＡフォーマット配列を入力し、および分析を実行することによって分析した。分析由来の結果を表３３に呈する。
【０４７１】
本結果は、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎ計算によって、ＡＥファミリーの４つのモチーフ（表１）が、アルファ−ヘリックスまたはベータシートを全く有さないことを示す。最大２８８残基の配列は、アルファ−ヘリックスもベータシートも有さないことが類似して認められた。４３２残基の配列は、少量の二次構造を有すると推定され、たった２つのアミノ酸が、０．５％の全体的なパーセンテージについてのアルファ−ヘリックスに起因する。全長のＡＦ８６４ポリペプチドは、０．２％の全体的なパーセンテージについてアルファ−ヘリックスに起因する同じ２つのアミノ酸を有する。ランダムコイル形成についての算出は、長さを増大させると、ランダムコイル形成のパーセンテージが増大することを明らかにした。配列の最初の２４のアミノ酸は、９１％のランダムコイル形成を有し、全長の配列について最大９９．７７％の値ほど長さを増大させると増大した。
【０４７２】
他のモチーフファミリー由来の５００アミノ酸以上の数多くのＸＴＥＮ配列も分析し、大部分が９５％超のランダムコイル形成を有することを明らかにした。例外は、３つの連続したセリン残基が１つ以上の場合にある配列であり、結果的に、推定ベータ−シート形成を生じた。しかしながら、これらの配列でさえ、およそ９９％のランダムコイル形成を有していた。
【０４７３】
対照的に、Ａ、Ｓ、およびＰのアミノ酸に限定された８４の残基のポリペプチド配列を、高い程度の推定アルファ−ヘリックスを推定するＣｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって評価した。複数の反復「ＡＡ」および「ＡＡＡ」配列を有する配列は、６９％のアルファ−ヘリックス構造の全体的な推定パーセンテージを有していた。ＧＯＲアルゴリズムは、本実施例において分析されたアミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐからなる１２のアミノ酸配列モチーフからなるどんな配列と比べても、７８．５７％のランダムコイル形成を推定した。
【０４７４】
本分析は、１）連続したアミノ酸に関して限定された反復性を有するＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの複数の配列モチーフから作られるＸＴＥＮは、非常に少量のアルファ−ヘリックスおよびベータ−シートを有すると推定され；２）ＸＴＥＮの長さを増大させると、アルファ−ヘリックスまたはベータシートの形成の確率をさほど増大させず；３）アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる非反復性の１２マーの添加によるＸＴＥＮ配列長の漸増は結果的に、ランダム固オイル形成の増大したパーセンテージを生じるという結論を支持する。対照的に、より高い程度の内部反復性を有するＡ、Ｓ、およびＰに限定されたアミノ酸からつくられるポリペプチドは、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムおよびランダムコイル形成によって決定される時、アルファ−ヘリックスの高いパーセンテージを有すると推定される。これらの方法によって評価される数多くの配列に基づいて、長さ約４００のアミノ酸残基よりも大きな（任意の１つのモチーフにおける２つ以下の同一の連続したアミノ酸して定義される）限定された反復性を有するＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの配列モチーフから作られるＸＴＥＮは、非常に限定された二次構造を有すると期待されると結論付けられる。３つの連続したセリンを含むモチーフの例外はあるが、表３由来の配列モチーフの任意の順序または組み合わせを用いて、二次構造を本質的に欠失するＸＴＥＮ配列を結果的に生じる約４００残基超の長さのＸＴＥＮポリペプチドを作製することができる。このような配列は、本明細書に開示された本発明のＣＦＸＴＥＮ実施態様において説明された特徴を有すると期待される。
【０４７５】
【表３３−１】
2013502459.tif 000092
【０４７６】
【表３３−２】
2013502459.tif 000093
【０４７７】
【表３３−３】
2013502459.tif 000094
【０４７８】
【表３３−４】
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【０４７９】
【表３３−５】
2013502459.tif 000096
【０４８０】
【表３３−６】
2013502459.tif 000097
【０４８１】
【表３３−７】
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【０４８２】
【表３３−８】
2013502459.tif 000099
【０４８３】
【表３３−９】
2013502459.tif 000100
【０４８４】
【表３３−１０】
2013502459.tif 000101
＊  Ｈ：  アルファ−ヘリックス    Ｅ：  ベータ−シート
実施例４３：反復性についてのポリペプチド配列の分析
ポリペプチドアミノ酸配列を、全体的なポリペプチド内により短いサブシーケンスが現れる回数を定量することによって、反復性について評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、１９２の重複する９アミノ酸サブシーケンス（または９マー「フレーム」を有するが、独特な９マーサブシーケンスの数は、配列内の反復性の量に依存する。本分析において、２００アミノ酸配列内の独特な３マーサブシーケンスの絶対数によって除されたポリマー部分の最初の２００アミノ酸にわたる各３アミノ酸フレームについての独特な３マーサブシーケンスすべての発生を合計することによって、異なる配列を反復性について評価した。結果として生じるサブシーケンススコアは、ポリペプチド内の反復性の程度の反映である。
【０４８５】
表３４に示される結果は、２または３のアミノ酸種類からなる構造化されていないポリペプチドが、高いサブシーケンススコアを有するのに対し、内部反復性の程度の低い６のアミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの１２のアミノ酸モチーフからなるものは、１０未満、及びいくつかの場合５未満のサブシーケンススコアを有することを示す。例えば、Ｌ２８８配列は、２つのアミノ酸種類を有し、短く、高度に反復性のある配列を有し、結果的に５０．０のサブシーケンススコアを生じる。ポリペプチドＪ２８８も、３つのアミノ酸種を有するが、短い反復性配列を有し、結果的に、３３．３のサブシーケンススコアを生じる。Ｙ５７６も３つのアミノ酸種を有するが、内部反復でできておらず、最初の２００のアミノ酸にわたって１５．７のサブシーケンススコアに反映されている。Ｗ５７６は、４種類のアミノ酸からなるが、より高い程度の内部反復性、例えば「ＧＧＳＧ」を有し、結果的に２３．４のサブシーケンススコアを生じる。ＡＤ５７６は、４種類の１２アミノ酸モチーフからなり、各々４種類のアミノ酸からなる。個々のモチーフの内部反復性
の低い程度のため、最初の２００アミノ酸にわたる全体的なサブシーケンススコアは、１３．６である。対照的に、４つのモチーフからなるＸＴＥＮは、６種類のアミノ酸を含んでおり、各々低い程度の内部反復性を有し、より低いサブシーケンススコア、すなわちＡＥ８６４（６．１）、ＡＦ８６４（７．５）、およびＡＭ８７５（４．５）を有する。
を有する。
【０４８６】
結論：本結果は、本質的に非反復性である４〜６のアミノ酸種から各々なり、より長いＸＴＥＮポリペプチドへの１２のアミノ酸サブシーケンスモチーフの組み合わせが、非反復性である全体的な配列を結果的に生じることを示す。このことは、各サブシーケンスモチーフが配列にわたって複数回用いられ得るという事実にもかかわらずである。対照的に、より少数のアミノ酸種類から作られるポリマーは、より高いサブシーケンススコアを結果的に生じるが、実際の配列は、より低いサブシーケンススコアを結果的に生じるよう反復性の程度を低下させるよう仕立てられることができる。
【０４８７】
【表３４−１】
2013502459.tif 000102
【０４８８】
【表３４−２】
2013502459.tif 000103
【０４８９】
【表３４−３】
2013502459.tif 000104
【０４９０】
【表３４−４】
2013502459.tif 000105
【０４９１】
実施例４４：ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの算出
Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １７：  ５５５］によって説明されるように、ポケットポテンシャル（ｐｏｃｋｅｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を加算することによって、９マーペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出することができる。本実施例において、個別のＴｅｐｉｔｏｐｅスコアを個々のＨＬＡ対立遺伝子について算出した。表３５は、ＨＬＡ×０１０１Ｂについてのポケットポテンシャルを一例として示し、これは、コーカサス人の集団において高い頻度で生じる。配列Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９を有するペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出するために、表３５における相応の個々のポケットポテンシャルを加算した。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧを有する９マーのペプチドのＨＬＡ＊０１０１Ｂスコアは、０、−１．３、０、０．９、０、−１．
８、０．０９、０、０の合計である。
【０４９２】
長いペプチドについてのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価するために、配列の９マーのサブシーケンスすべてについての過程を反復することができる。この過程を、他のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるタンパク質について反復することができる。表３６〜表３９は、コーカサス人の集団において高い頻度で生じるＨＬＡ対立遺伝子のタンパク質産物についてポケットポテンシャルを与える。
【０４９３】
この方法によって算出されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、およそ−１０から＋１０まで及んだ。しかしながら、Ｐ１位置において疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ）を欠失する９マーペプチドは、−１００９から−９８９の範囲のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出した。この値は、生物学的に意味がなく、疎水性アミノ酸が、ＨＬＡ結合のためのアンカー残基として機能するという事実を反映しており、Ｐ１における疎水性残基を欠失するペプチドは、ＨＬＡに対する結合因子が何らないと考えられる。ほとんどのＸＴＥＮ配列は、疎水性残基を欠失するので、９マーのサブシーケンスの組み合わせすべては、−１００９から−９８９までの範囲でＴＥＰＩＴＯＰＥを有する。本方法は、ＸＴＥＮポリペプチドが、推定Ｔ細胞エピトープをいくつか有し得るかまたはまったく有し得ないことを確認する。
【０４９４】
【表３５】
2013502459.tif 000106
【０４９５】
【表３６】
2013502459.tif 000107
【０４９６】
【表３７】
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【０４９７】
【表３８】
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【０４９８】
【表３９】
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【０４９９】
【表４０−１】
2013502459.tif 000111
【０５００】
【表４０−２】
2013502459.tif 000112
【０５０１】
【表４１−１】
2013502459.tif 000113
【０５０２】
【表４１−２】
2013502459.tif 000114
【０５０３】
【表４１−３】
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【０５０４】
【表４１−４】
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【０５０５】
【表４１−５】
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【０５０６】
【表４１−６】
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【０５０７】
【表４１−７】
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【０５０８】
【表４１−８】
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【０５０９】
【表４１−９】
2013502459.tif 000121
【０５１０】
【表４１−１０】
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【０５１１】
【表４１−１１】
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【０５１２】
【表４１−１２】
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【０５１３】
【表４１−１３】
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【０５１４】
【表４１−１４】
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【０５１５】
【表４１−１５】
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【０５１６】
【表４１−１６】
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【０５１７】
【表４１−１７】
2013502459.tif 000129
【０５１８】
【表４１−１８】
2013502459.tif 000130
【０５１９】
【表４１−１９】
2013502459.tif 000131
【０５２０】
【表４１−２０】
2013502459.tif 000132
【０５２１】
【表４１−２１】
2013502459.tif 000133
【０５２２】
【表４１−２２】
2013502459.tif 000134
【０５２３】
【表４１−２３】
2013502459.tif 000135
【０５２４】
＊  配列名は、凝固因子およびＸＴＥＮ成分のＮ末端からＣ末端への設定を反映する。
【０５２５】
【表４２−１】
2013502459.tif 000136
【０５２６】
【表４２−２】
2013502459.tif 000137
【０５２７】
【表４２−３】
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【０５２８】
【表４２−４】
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【０５２９】
【表４２−５】
2013502459.tif 000140
【０５３０】
【表４２−６】
2013502459.tif 000141
【０５３１】
【表４２−７】
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【０５３２】
【表４２−８】
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【０５３３】
【表４２−９】
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【０５３４】
【表４２−１０】
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【０５３５】
【表４２−１１】
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【０５３６】
【表４２−１２】
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【０５３７】
【表４２−１３】
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【０５３８】
【表４２−１４】
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【０５３９】
【表４２−１５】
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【０５４０】
【表４２−１６】
2013502459.tif 000151
【０５４１】
【表４２−１７】
2013502459.tif 000152
【０５４２】
【表４２−１８】
2013502459.tif 000153
【０５４３】
【表４２−１９】
2013502459.tif 000154
【０５４４】
【表４２−２０】
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【０５４５】
【表４２−２１】
2013502459.tif 000156
【０５４６】
【表４２−２２】
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【０５４７】
【表４２−２３】
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【０５４８】
【表４２−２４】
2013502459.tif 000159
【０５４９】
【表４２−２５】
2013502459.tif 000160
【０５５０】
【表４２−２６】
2013502459.tif 000161
【０５５１】
【表４２−２７】
2013502459.tif 000162
【０５５２】
＊  配列名は、ＣＦ、開裂配列、およびＸＴＥＮ成分のＮＡ末端からＣ末端への設定を反映する。
【０５５３】
【表４３−１】
2013502459.tif 000163
【０５５４】
【表４３−２】
2013502459.tif 000164
【０５５５】
【表４３−３】
2013502459.tif 000165
【０５５６】
【表４３−４】
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【０５５７】
【表４３−５】
2013502459.tif 000167
【０５５８】
【表４３−６】
2013502459.tif 000168
【０５５９】
【表４３−７】
2013502459.tif 000169
【０５６０】
【表４３−８】
2013502459.tif 000170
【０５６１】
＊  配列名は、ＦＶＩＩバリアント（Ｇｌａ−ＥＧＦ２ドメイン）、ＦＩＸ  ＡＰ開裂配列、ＦＶＩＩプロテアーゼドメイン、ＸＴＥＮ開裂配列、およびＸＴＥＮ成分（含まれる場合は後者）のＮ末端からＣ末端への設定を反映する。
＊＊  必ずしもすべての配列がＸＴＥＮを組み込んでいるわけではない。
【０５６２】
（項目１）
伸長した組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む単離された第ＶＩＩ因子ポリペプチドであって、該ＸＴＥＮが少なくとも２００のアミノ酸残基を含み、この場合、該第ＩＸ因子ポリペプチドは、対象に投与される場合に約１２時間よりも長い終末半減期を呈する、該第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
【０５６３】
（項目２）
前記第ＩＸ因子ポリペプチドが、最適に整列した場合に、表２から選択される配列と比較して少なくとも９０％の配列同一性を呈する、項目１に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５６４】
（項目３）
前記第ＶＩＩ因子が、そのＣ末端で前記ＸＴＥＮに連結する、項目１または２に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５６５】
（項目４）
第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ‐２、ＭＭＰ‐１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ‐１７、およびＭＭＰ‐２０からなる群から選択される哺乳類プロテアーゼによって開裂可能な配列を介して前記ＸＴＥＮに連結される、項目１〜３のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５６６】
（項目５）
前記哺乳類プロテアーゼによる前記開裂配列における開裂が、前記第ＩＸ因子ポリペプチドから前記ＸＴＥＮを放出する、項目４に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５６７】
（項目６）
前記ＸＴＥＮが以下を特徴とする、項目１〜５のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド：
（ａ）ＸＴＥＮアミノ酸残基の累積合計が、２００超〜約３０００アミノ酸残基であり：
（ｂ）アスパラギン残基およびグルタミン残基の合計が、該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であり；
（ｃ）メチオニン残基およびトリプトファン残基の合計が、該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であり；
（ｄ）該ＸＴＥＮ配列が、１０未満のサブシーケンススコアを有し；
（ｅ）該ＸＴＥＮ配列が、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される時、９０％超のランダムコイル形成を有し；かつ
（ｆ）該ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される時、２％未満のアルファヘリックスおよび２％未満のベータ‐シートを有する。
【０５６８】
（項目７）
少なくとも約４の見かけの分子量因子を呈する、項目１〜６のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５６９】
（項目８）
前記ＸＴＥＮが、表４、表９、表１０、表１１、表１２、または表１３から選択されるアミノ酸配列の同等な長さと少なくとも９０％の配列同一性を呈する、項目１〜７のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５７０】
（項目９）
式ＶＩＩに従って構成された、項目１〜８のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド：
（Ｇｌａ）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（ＥＧＦ１）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（ＥＧＦ２）−（ＡＰ１）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（ＡＰ２）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｐｒｏ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｚ  ＶＩＩ。
【０５７１】
この場合、各発生について独立して、
（ａ）Ｇｌａが、第ＩＸ因子のＧｌａドメインであり；
（ｂ）ＥＧＦ１が、第ＩＸ因子のＥＧＦ１ドメインであり；
（ｃ）ＥＧＦ２が、第ＩＸＩ因子のＥＧＦ２ドメインであり；
（ｄ）ＡＰ１が、第ＩＸ因子の活性化因子ペプチドドメインの一部であり；
（ｅ）ＡＰ２が、少なくとも第一の開裂配列を含む第ＩＸ因子の活性化ペプチドドメインの一部であり；
（ｆ）ＰＲＯが、第ＩＸ因子のプロテアーゼドメインであり；
（ｇ）Ｓが、開裂配列を任意に含むことのできる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；
（ｈ）ＸＴＥＮが、表４、表９、表１０、表１１、表１２、または表１３から選択されるアミノ酸の同等な長さと少なくとも９０％の配列同一性を呈する伸長した組換えポリペプチドであり、
（ｉ）ｕが、０または１のいずれかであり；
（ｊ）ｖが、０または１のいずれかであり；
（ｋ）ｘが、０または１のいずれかであり；
（ｌ）ｙが、０または１のいずれかであり；かつ
（ｍ）ｚが、０または１のいずれかであり、ただし、ｕ＋ｖ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１という条件付きである。
【０５７２】
（項目１０）
Ｙ＝１であり、かつ、ＳがＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ‐２、ＭＭＰ‐１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ‐１７、およびＭＭＰ‐２０からなる群から選択される哺乳類プロテアーゼによって開裂可能である開裂配列を含む、項目９に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５７３】
（項目１１）
２つ以上のＸＴＥＮを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５７４】
（項目１２）
前記ＸＴＥＮが、前記第ＩＸ因子に含まれる任意の２つの隣接したドメイン間に組み込まれ、この場合、該２つの隣接したドメインがＧｌａ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＡＰ、およびペプチダーゼＳ１（Ｐｒｏ）からなる群から選択される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５７５】
（項目１３）
（ｉ）同等なモル用量で哺乳類に投与される場合、前記ＸＴＥＮを欠失する相応する第ＩＸ因子と比較して、哺乳類に投与する場合により長い終末半減期を有し；
（ｉｉ）該第ＩＸ因子ポリペプチドのより小さなモル量が、他は等価な用量投与計画の下で哺乳類に投与されるＸＴＥＮを欠失する相応する第ＩＸ因子との比較において哺乳類に投与される場合、該第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）を達成し；
（ｉｉｉ）該第ＩＸ因子ポリペプチドのより小さなモル量が、他は等価な用量投与計画の下で哺乳類に投与されるＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子との比較において哺乳類に投与される場合、該ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な治療効果を達成し；
（ｉｖ）該第ＩＸ因子ポリペプチドが、他は等価なモル量を用いて哺乳類に投与されたＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子と比較してあまり頻繁に哺乳類に投与されない場合
、第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）を達成し；
（ｖ）該第ＩＸ因子ポリペプチドが、他は等価なモル量を使用して哺乳類に投与されたＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子と比較してあまり頻繁に哺乳類に投与されない場合、第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な治療効果を達成し；
（ｖｉ）他は等価な投薬期間の下で哺乳類に投与されたＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子と比較して、累積的により小さなモル量の第ＩＸ因子ポリペプチドが、哺乳類に投与される場合、該第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な曲線下面積（ＡＵＣ）を達成し；又は
（ｖｉｉ）他は等価な投薬期間の下で哺乳類に投与されるＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子と比較して、累積的により小さなモル量の第ＩＸ因子ポリペプチドが、哺乳類に投与される場合、該第ＩＸ因子ポリペプチドが、該ＸＴＥＮを欠失する相応の第ＩＸ因子として同等な治療効果を達成することを特徴とする、項目１〜１２のいずれか一項に記載の単離された第ＩＸ因子ポリペプチド。
【０５７６】
（項目１４）
項目１〜１３のいずれか一項に記載の治療有効量の第ＩＸ因子ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、該対象における凝固障害を治療する方法。
【０５７７】
（項目１５）
前記凝固障害が血友病Ｂである、項目１４に記載の方法。
【０５７８】
（項目１６）
項目１〜１３のいずれか一項に記載の治療有効量の第ＩＸ因子ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、該対象における出血症状を治療する方法。
【０５７９】
（項目１７）
項目１〜１３のいずれか一項に記載の治療有効量の第ＩＸ因子を含む組成物を、凝固タンパク質を欠損する対象に投与することを含む、該対象を治療する方法。
【０５８０】
（項目１８）
前記凝固タンパク質が、野生型の第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＸＩ因子と置き換わる、項目１７に記載の方法。