【手続補正書】
【提出日】平成27年4月23日(2015.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．複数のアダプターを複数の第１の区画に細分するステップであって、該第１の区画のそれぞれが平均して第１の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含み、該第１の区画は第１の液滴である、ステップと、
ｂ．複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第２の区画に細分するステップであって、該第２の区画のそれぞれが平均して第２の体積を有し、該第２の体積が、該第１の体積よりも大きく、該第２の区画は第２のウェルまたは第２の液滴である、ステップと、
ｃ．少なくとも１つの該第２の区画を、少なくとも１つの第１の液滴と融合させる処理を適用し融合された区画を形成するステップと、
ｄ．該融合された区画において、該複数のポリヌクレオチドのうちの１つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも１つを用いてタグを付けるステップと
を含む方法。
【請求項２】
ｄ．複数のアダプターを複数の第１の区画に細分するステップであって、該第１の区画のそれぞれが平均して第１の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含み、該第１の区画は第１の液滴である、ステップと、
ｅ．複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第２の区画に細分するステップであって、該第２の区画のそれぞれが平均して第２の体積を有し、該第２の体積が、該第１の体積よりも小さく、該第２の区画は第２の液滴である、ステップと、
ｆ．少なくとも１つの該第１の区画を、少なくとも１つの第２の液滴と融合させる処理を適用し融合された区画を形成するステップと、
ｇ．該融合された区画において、該複数のポリヌクレオチドのうちの１つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも１つを用いてタグを付けるステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記液滴が、不混和性の流体内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの第２の液滴が、少なくとも１つの前記第１の液滴を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの第１の液滴が、少なくとも１つの前記第２の液滴を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の体積が、前記第１の体積の前記体積の少なくとも２倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の体積が、前記第２の体積の前記体積の少なくとも２倍である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記処理は、前記液滴の温度を改変するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記融合させるステップが、前記第１の液滴のそれぞれが前記第２の液滴のそれぞれと融合するような制御器の使用を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合させるステップが、ポリヌクレオチドを含む液滴を、アダプターを含む液滴とランダムに融合させるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片をプールするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片を分析するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析するステップが、前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片の配列を決定するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片が、同じ区画に位置したかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記配列を決定するステップにより得られた任意の２つの配列の読取りが、同じまたは異なる区画から生じた可能性を推定するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
所与の区画が、異なる染色体由来であるが、同じ遺伝子座由来の２つ以上のポリヌクレオチドまたはそれらの断片を含む可能性がないように、前記試料を区画化する、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ゲノムＤＮＡが、１０，０００個超の塩基または塩基対である、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の区画内の前記ポリヌクレオチドを断片化して、ポリヌクレオチドの断片を形成するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドの断片が、前記ポリヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼを用いて断片化することによって生成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アダプターを複数の前記融合された区画内の前記ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって、該ポリヌクレオチドにタグを付ける、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記タグを付けるステップが、トランスポゾンを使用して達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記タグを付けたポリヌクレオチドが増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが、タグを付ける前に増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の区画のそれぞれが平均して５つ未満のアダプターを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の区画のそれぞれが平均して５つ未満の、前記複数のポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料を前記細分するステップが、該試料を前記第２の区画と乳化させるかまたは混合するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のアダプターを前記細分するステップが、該複数のアダプターを前記第２の区画と乳化させるかまたは混合するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅が、多置換増幅である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の区画が第２の液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の区画が第２のウェルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
第２の体積は、平均して前記第１の体積より４倍大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの第２のウェルまたは第２の液滴が、少なくとも１つの第１の液滴を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
第１の体積は、平均して前記第２の体積より４倍大きい、請求項２に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つの第２の液滴は、少なくとも１つの第１の液滴を含む、請求項２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
また、本開示は、ａ．微生物を複数の区画に区画化するステップと、ｂ．該複数の区画中の該微生物からポリヌクレオチドを得るステップと、ｃ．該複数の区画中の該ポリヌクレオチドに、バーコードを含むアダプターを用いてタグを付けるステップであって、該複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップとを含む方法も提供する。場合によっては、上記区画のそれぞれが平均して５つ未満の微生物を含む。この方法は、タグを付けた上記ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ、および／またはタグを付けた上記ポリヌクレオチドの断片が、同じ区画由来であるかを決定するステップをさらに含むことができる。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ａ．複数のアダプターを複数の第１の区画に細分するステップであって、該第１の区画のそれぞれが平均して第１の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含むステップと、
ｂ．複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第２の区画に細分するステップであって、該第２の区画のそれぞれが平均して第２の体積を有し、該第２の体積が、該第１の体積よりも大きいステップと、
ｃ．該第１の区画のうちの少なくとも１つを、該第２の区画のうちの少なくとも１つと合体させて、合体区画を形成するステップと、
ｄ．該複数のポリヌクレオチドのうちの１つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも１つを用いてタグを付けるステップと
を含む方法。
（項目２）
ａ．複数のアダプターを複数の第１の区画に細分するステップであって、該第１の区画のそれぞれが平均して第１の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含むステップと、
ｂ．複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第２の区画に細分するステップであって、該第２の区画のそれぞれが平均して第２の体積を有し、該第２の体積が、該第１の体積よりも小さいステップと、
ｃ．該第１の区画のうちの少なくとも１つを、該第２の区画のうちの少なくとも１つと合体させて、合体区画を形成するステップと、
ｄ．該複数のポリヌクレオチドのうちの１つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも１つを用いてタグを付けるステップと
を含む方法。
（項目３）
前記第１の区画が液滴である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記第２の区画が液滴である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記液滴が、不混和性の流体内にある、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡである、項目１または２に記載の方法。
（項目７）
前記タグを付けるステップが、前記アダプターのうちの１つを含む少なくとも１つの第１の液滴を、前記ポリヌクレオチドのうちの１つを含む少なくとも１つの第２の液滴と合体させるステップを含む、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記第１の区画が第１の液滴であり、前記第２の区画が第２の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第２の液滴が、少なくとも１つの該第１の液滴を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記第１の区画が第１の液滴であり、前記第２の区画が第２の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第２の液滴が、少なくとも１つの該第１の液滴を含まない、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の区画が第１の液滴であり、前記第２の区画が第２の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第１の液滴が、少なくとも１つの該第２の液滴を含む、項目２に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の区画が第１の液滴であり、前記第２の区画が第２の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第１の液滴が、少なくとも１つの該第２の液滴を含まない、項目２に記載の方法。
（項目１２）
前記第２の体積が、前記第１の体積の前記体積の少なくとも２倍である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記第１の体積が、前記第２の体積の前記体積の少なくとも２倍である、項目２に記載の方法。
（項目１４）
前記液滴の温度を改変するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１５）
前記合体させるステップが、前記第１の液滴のそれぞれが前記第２の液滴のそれぞれと合体するような制御器の使用を含む、項目７に記載の方法。
（項目１６）
前記合体させるステップが、ポリヌクレオチドを含む液滴を、アダプターを含む液滴とランダムに合体させるステップを含む、項目７に記載の方法。
（項目１７）
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片をプールするステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片を分析するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記分析するステップが、前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片の配列を決定するステップを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片が、同じ区画に位置したかどうかを決定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記配列を決定するステップにより得られた任意の２つの配列の読取りが、同じまたは異なる区画から生じた可能性を推定するステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
所与の区画が、異なる染色体由来であるが、同じ遺伝子座由来の２つ以上のポリヌクレオチドまたはそれらの断片を含む可能性がないように、前記試料を区画化する、項目６に記載の方法。
（項目２３）
前記ゲノムＤＮＡが、高分子量ＤＮＡである、項目６に記載の方法。
（項目２４）
前記第２の区画内の前記ポリヌクレオチドを断片化して、ポリヌクレオチドの断片を形成するステップをさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目２５）
前記ポリヌクレオチドの断片が、前記ポリヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼを用いて断片化することによって生成される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記アダプターを、複数の前記合体区画内の前記ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって、該ポリヌクレオチドにタグを付ける、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記タグを付けるステップが、トランスポゾンを使用して達成される、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記タグを付けたポリヌクレオチドが増幅される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ポリヌクレオチドが、タグを付ける前に増幅される、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記第１の区画のそれぞれが平均して５つ未満のアダプターを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目３２）
前記第２の区画のそれぞれが平均して５つ未満の、前記複数のポリヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目３３）
前記試料を前記細分するステップが、該試料を前記第２の区画と乳化させるステップまたは混合するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記複数のアダプターを前記細分するステップが、該複数のアダプターを前記第２の区画と乳化させるステップまたは混合するステップを含む、項目２に記載の方法。
（項目３５）
前記増幅が、多置換増幅である、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
ａ．オルガネラを複数の区画に区画化するステップであって、各区画が平均して１つの区画当たり５つ未満のオルガネラを含む、ステップと、
ｂ．該複数の区画中の細胞外の該オルガネラを溶解するステップであって、該溶解するステップにより、該オルガネラからＲＮＡが放出される、ステップと、
ｃ．該複数の区画中の該放出されたＲＮＡから、バーコードを含むアダプターを用いて、タグを付けたｃＤＮＡを生成するステップであって、該複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップと
を含む方法。
（項目３７）
前記オルガネラが、細胞外のオルガネラである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記オルガネラが、エキソソームである、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記タグを付けたｃＤＮＡを生成するステップが、前記放出されたＲＮＡの、区画特異的バーコードを付けたプライマーを用いての逆転写を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記タグを付けたｃＤＮＡの配列を決定するステップをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記タグを付けたｃＤＮＡが、同じオルガネラ由来であるかを決定するステップをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
ａ．微生物を複数の区画に区画化するステップと、
ｂ．該複数の区画中の該微生物からポリヌクレオチドを得るステップと、
ｃ．該複数の区画中の該ポリヌクレオチドに、バーコードを含むアダプターを用いてタグを付けるステップであって、該複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップと
を含む方法。
（項目４３）
前記区画のそれぞれが平均して５つ未満の微生物を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記タグを付けたポリヌクレオチドの配列を決定するステップをさらに含む、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記タグを付けたポリヌクレオチドの断片が、同じ区画由来であるかを決定するステップをさらに含む、項目４２に記載の方法。