【事件の表示】
　特願２００４−５２３２９３「精子細胞操作系」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年　１月２９日国際公開、ＷＯ２００４／００９２３７、平成１７年１１月１０日国内公表、特表２００５−５３３５０１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯　 
　本願は，平成１５年７月２２日（パリ条約による優先権主張外国庁受理　２００２年７月２２日　米国）を国際出願日とする特許出願であって，平成２１年６月１２日付けの拒絶理由通知に対して，同年１２月１５日に意見書及び手続補正書が提出され，平成２２年２月５日付けの拒絶理由通知（最後）に対し，同年６月３日に意見書及び手続補正書が提出された。これに対し，平成２３年４月１５日付けで補正却下の決定がなされ，同日付けで拒絶査定がなされたところ，同年７月２７日に拒絶査定不服審判が請求されるとともに，同日に手続補正書が提出され，平成２５年２月１４日付けの審尋に対し，同年５月３１日に回答書が提出されたものである。  
　その後，当審において平成２５年８月３０日付けで平成２３年７月２７日付け手続補正書による補正が却下されるとともに拒絶理由が通知され，その指定期間内である平成２６年１月６日に意見書及び手続補正書が提出され，同月７日に手続補足書が提出されたものである。　
 　 
第２　本願発明　
　本願請求項１に係る発明（以下，「本願発明」という。）は，平成２６年１月６日付け手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項１の記載からみて，次のとおりのものと認める。　
　
「【請求項１】  
　精子細胞を分離する方法であって，該方法は，以下：　 
　ａ．哺乳動物のウマ種のオスから精液（複数の精子細胞を含む）を獲得する工程，　 
　ｂ．有意に高い妊娠の成功を達成する１０℃と１５℃との間の低い温度（その温度を超えると精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する）で該精液をインキュベートする工程，　 
　ｃ．複数の該精子細胞の性形質を決定する工程，　 
　ｄ．該性形質に基づいて該精子細胞をＸ染色体保有集団とＹ染色体保有集団とに分離する工程，および　 
　ｅ．分離した精子細胞を収集する工程， 
を包含する，方法。」　 
　 
第３　刊行物に記載された事項　 
１　刊行物１に記載された事項　 
　本願優先権主張日前に頒布された刊行物である国際公開第０１／３７６５５号（平成２１年６月１２日付け拒絶理由通知の引用文献１。以下，「刊行物１」という。）には，次の事項が記載されている。（なお，翻訳は，対応する日本出願の公表特許公報である特表２００３−５３０３１２号公報によるものであり，引用箇所は，刊行物１の頁と行を示す。）　 
　なお，下線は当審にて付記したものである。以下も同様である。　
 
（刊１−１）　 
「Example 8　 
　Evaluation of the Fertility of Flow-sorted, Frozen Bull Sperm in Field Studies  
　MATERIALS AND METHODS  
Semen Collection and Processing  
　Semen from young bulls of unknown fertility was collected via artificial vagina (see Example 1A). After determining sperm concentration with a spectrophotometer and subjective evaluation of progressive sperm motility, semen was processed and sorted as described in Example 2 except that the sperm were sorted by sex-type at 90% purity using a laser incident power of about 135 to about 150 mW. Processing and freezing was achieved as in Example 2 except that the equilibration time was about 3 h. Cornell Universal Extender (Seidel GE Jr., Theriogenology 1997; 48:1255-1264) was used for liquid semen in field trials 1, 2, and 3. For frozen semen in field trials 2 and 3, the extender used was 2.9% Na citrate + 20% egg yolk with a final glycerol concentration of 7% (see Example 1). 　 
・・・（略）・・・　 
　Field trial 2 (Table 11) provided the first evidence that results with sexed, frozen sperm are similar to sexed, unfrozen sperm if adjustment is made for numbers of sperm killed during cryopreservation. There also was no difference in pregnancy rates between sexed sperm stored at 5 versus 18℃. Pregnancy rates at 2+ months after insemination for sexed semen from individual bulls ranged from 22 to 42% pregnant (P0.05). Embryonic loss between 1 and 2 months of gestation was very similar for sexed and control pregnancies. Calvmg data were available from 39 heifers from this trial; each of these heifers (30 sexed pregnancies, 9 controls) pregnant at 2 months calved after a normal-length gestation.  
　Field trial 3 (Table 12) confirmed that sexed, frozen sperm results in reasonable pregnancy rates. The accuracy of sexing sperm was confirmed again; however, there were 4 errors in sexing fetuses relative to the calves born; the actual sexes of calves born are presented. Again, there were no abortions between 2 months of gestation and term. Pregnancy rates averaged over sexed, unfrozen and sexed, frozen sperm for bulls N8, N9, AN5, and AN4 were 24, 31 , 50, and 60%, respectively (P0.1).  
」　 
（３８頁４行〜４４頁１０行表１２）　 
「例８：　 
　現場研究における流動分類された凍結雄牛精子の受精能の評価：　 
　材料及び方法：　 
精液採取及び加工：　 
　
未知の受精能の若い雄牛からの精液を，人工膣を通して採取した（例１Ａを参照のこと）。分光計により精子濃度，及び前進精子運動の主観的評価の決定の後，精液を，例２に記載のようにして，加工し，そして分類し，但し，精子は約１３５〜約１５０ｍＷのレーザー入射力を用いて，９０％の純度で性タイプにより分類された
　加工及び凍結は，例２に記載のようにして達成されたが，但し平衡化時間は約３時間であった。Cornell Universal Extender (Seidel GE Jr., Theriogenology 1997; 48: 1255-1264) が，現場試験１，２及び３において液体精液のために使用された。現場試験２及び３における凍結された精液に関して，使用されるエキステンダーは，７％の最終グリセロール濃度を有する，２．９％のクエン酸ナトリウム及び２０％の卵黄であった（例１を参照のこと）。 
・・・（略）・・・　 
　現場試験２（表１１）は，性別され，凍結された精子に関する結果は，調節が低温保存の間，殺害された精子の数に関して行われる場合，性別され，凍結されていない精子に類似する最初の証拠を提供した。５℃対１８℃で貯蔵された，性別された精子間での妊娠割合の差異もまた存在しなかった。個々の雄牛からの性別された精液に関する受精の後，２ヶ月での妊娠割合は，２２〜４２％の範囲であった（ｐ＞０．０５）。妊娠の１〜２ヶ月での胚の損失は，性別された妊娠及び対照の妊娠に関して非常に類似した。分娩データは，この試験からの３９匹の雌牛から入手でき；２ヶ月での妊娠のそれらの雌牛（３０匹の性別された妊娠，９匹の対照）の個々は，正常な長さの妊娠の後，分娩した。　 
　表１１．現場試験２の結果−１９９８年コロラドにおける交雑された雌牛：　 
　ａ：有意な差異は存在しない，χ２。　 
 　 
　現場試験３（表１２）は，性別され，凍結された精子が適切な妊娠割合をもたらしたことを確かめた。精子の性別の精度を再び確かめ；しかしながら，生まれる子牛に関して胎児の性別において４匹の誤りが存在し；生まれる子牛の実際の性が表される。再び，２ヶ月の妊娠期間で流産は存在しなかった。雄牛Ｎ８，Ｎ９，ＡＮ５及びＡＮ４に関する，性別され，凍結されていない精子及び性別され，凍結された精子に対する平均の妊娠割合は，それぞれ２４，３１，５０及び６０％（ｐ＜０．１）であった。　 
　表１２．現場試験３の結果−１９９８年ワイオミングにおけるAngns雌牛：　 
　ａ，ｂ：共通する上付きを有さない意味は異なる（ｐ＜０．０５）。　 
　ｃ，ｄ：性別処理からの雌の子牛の百分率（８３％）は，対照グループとは異なった；ｐ＜０．０５，片側，χ２。」　 
 　 
（刊１−２）　 
「EXAMPLES  
　Example 1  
　Effects Of Dilution On Sperm  
Objective: to determine the effect of sperm concentration on sperm motility for non-frozen, non-sorted, but highly diluted sperm.  
A. Effects of Dilution on Non-washed Sperm  
　1. Collection of Source Sample. Sperm were collected from bulls on a routine collection schedule using an artificial vagina as described in Schenk J., Proc 17th NAAB, p.48-58 (1998), and Saacke RG, Proc NAAB Tech Conf Al Reprod. 41:22-27 (1972). All ejaculates used contained greater than 50% progressively motile and greater than 75% morphologically normal sperm. Antibiotics were added to the raw ejaculate as described by Shin S., Proc NAAB Tech Conf Al Reprod. 11:33-38 (1986) within 15 minutes of collection, and the concentration of sperm was determined using a spectrophotometer.  
　2. Methods. Sperm from 4 bulls were diluted to 1.25, 2.5, 5, 10, 15, and 20 x 10６/ml using an egg yolk-citrate extender (EYC) prepared with 20% egg yolk (vol/vol) in 72 mM sodium citrate, 50 Tg/ml tylosin, 250 Tg/ l gentamicin, and 250/300 Tg/ l linco- spectin. Each sample was prepared in duplicate (2 tubes/dilution/bull) and comprised 8 ml total volume per tube. All samples were incubated for 60 minutes at 22℃, after which they were centrifuged using a swinging bucket centrifuge (Eppendorf, Model # 5810R) at 600 x g for 10 minutes to concentrate the sperm.・・・（略）・・・　 
　3. Evaluation of Motility. After incubation, the samples were warmed to 37℃ using a dry block incubator for 10 minutes prior to determination of motility. For this experiment, a single, blind estimate ofthe percentage of progressively motile sperm was determined for each sample. Progressive sperm motility was determined subjectively for each subclass by a single observer (x200, phase-contrast microscopy); another person prepared the microscope slides in a randomized manner so the observer was unaware of treatments.」　 
（１７頁１行〜１８頁３行）　 
「実施例　 
　
例１
　精子に対する希釈の効果：　 
目的：凍結されても，分類されてもいないが，しかし高く希釈された精子に関しての精子運動に対する精子濃度の効果を決定すること。　 
Ａ
　１．サンプル源の採取：
精子を，Schenk J., Proc. 17th NAAB, p.48-58 (1998), 及びSaacke RG, Proc. NAAB Tech. Conf. AI Reprod. 41: 22-27 (1972) に記載のようにして人工腟を用いて，通常の採取スケジュールに基づいて雄牛から採取した
そして精子の濃度を分光計を用いて決定した
　２．方法：４匹の雄牛からの精子を，７２ｍＭのクエン酸ナトリウム中，２０％（体積/体積）の卵黄，５０Ｔｇ／ｍｌのチロシン，２５０Ｔｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び２５０／３００Ｔｇ／ｍｌのリンコ−スペクチンにより調製された卵黄−クエン酸塩エキステンダー（ＥＹＣ）を用いて，１．２５，２．５，５，１０，１５及び２０×１０６／ｍｌに希釈した。個々のサンプルは，２重反復して調製され（２本の管／希釈／雄牛），そして８ｍｌの合計体積/管を含んだ。 
　
すべてのサンプルを２２℃で６０分間インキュベートし
　３．運動性の評価：インキュベーションの後，サンプルを，運動性の決定の前，ドライブロックインキュベーターを用いて，３７℃に１０分間，暖めた。
この実験に関しては，前進的に運動する精子の百分率の単一の盲検評価を，個々のサンプルについて決定した。前進性精子運動性は，１人の観察者により個々のサブクラスについて主観的に決定され
　 
（刊１−３）　 
「Example 2　 
　Effects of Equilibration Time Before Freezing Sorted Sperm　 
Objective: to evaluate the effect of equilibration times (3, 6 and 18 h, 5℃) before freezing on flow-sorted sperm.　 
The following experiment was replicated in its entirety using the same bulls:  
　1. Collection of Source Sample. Sperm of 4 bulls were collected and prepared as described in Example 1A.  
　2. Methods.  
　a) Stainins and Preparation for Sort.  
　i) Preparation of Stain Stock Solution: a stock solution of 8.89 mM Hoechst 33342 (bis-Benzimide H-33342; #190305, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) was prepared in deionized water.  
　ii) Sperm Stain Procedure: sperm were diluted in a modified TALP buffer (Table 3) to 400 x 10６ sperm/ml. Following dilution, Hoechst 33342 dye was added to the sperm suspensions at a concentration of 224 μM. After the stain was added to the sperm suspensions, the samples were incubated for 60 minutes at 5 34℃. Following incubation, sperm were diluted to 100 x 10６/ml with TALP containing 2.67% clarified egg yolk and 0.002% food coloring dye (FDC #40) which quenches the fluorescence of Hoechst 33342 in sperm with compromised cell membranes, allowing them to be gated out during the sorting process. Just prior to flow sorting, samples were filtered at unit gravity through a 40-μm nylon mesh filter 0 to remove any debris and/or clumped sperm.  
　b) Sorting. A two-line argon laser operating at 351 and 364 ran and 150 mW was used to excite the Hoechst 33342 dye. The flow cytometer/cell sorter used was an SX MoFloR (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) operating at 50 psi. A Tris-based sheath fluid was used, consisting of Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris; 197.0 mM; #T-1503, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), citric acid monohydrate (55.4 mM; #C-7129, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) and fructose (47.5 mM; #F-0127, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Baseline antibiotics were also added to the Tris-based sheath fluid consisting of 0.58 g/L of penicillin and 0.05 g/L of streptomycin sulfate.  
The sperm were sorted by a process referred to as bulk sorting which permits rapid accumulation of large numbers of sperm so that large-scale examples can be done within a reasonable time. The sperm pass through the flow cytometer under the standard operating conditions with the exception that all droplets containing viable sperm were collected into a single tube rather than being sorted into 2 tubes based upon specific characteristics (e.g., sorting by sex-type). Sperm were sorted on the basis of viability; hence, sperm that have compromised plasma membranes were excluded during bulk sorting.  
Stained sperm were maintained at 22 ± 1℃ during sorting. Bulk sorted sperm were collected in 50-ml plastic tubes containing 2 ml of 20% egg yolk-Tris extender prepared with 20% egg yolk (vol/vol) in 200 mM Tris, 65 mM citric acid, 56 mM fructose, 50 Tg/ml tylosin, 250 Tg/ml gentamicin, and 150/300 Tg/ml linco-spectin in deionized water. The egg yolk-Tris extender was termed Tris-A fraction to denote the lack of glycerol at this point in the procedure. Sperm were collected in tubes to contain 12 ml and approximately 6 x 10６ sperm. The sperm were subsequently incubated at 22℃ for 1 to 3 h to simulate conditions of a sort based on sex-type. 」　 
（２０頁３０行〜２２頁１３行） 
「
例２
　分類された精子の凍結の前の平衡化時間の効果：　 
目的：流動−分類された精子に対する，凍結の前の平衡化時間（３．６及び１８時間，５℃）の効果を評価すること。　 
　次の実験を，同じ雄牛を用いて完全に反復した：　 
　１．サンプル源の採取：４匹の雄牛を採取し，そして例１Ａに記載のようにして調製した。　 
　２．方法：　 
　ａ）分類のための染色及び調製：　 
　ｉ）染色原液の調製：８．８９ｍＭのHoechst 33342 (ビス−ベンズイミドH-33342；#190305, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) の原液を，脱イオン水において調製した。　 
　ｉｉ）精子染色方法：精子を，変性されたＴＡＬＰ緩衝液（表３）において４００×１０６個の精子/mlに希釈した。
希釈に続いて，Hoechst 33342色素を，２２４μMの濃度で精子懸濁液に添加した
　ｂ）
分類：３５１及び３６４ｎｍ及び１５０ｍＷで作動する２−ラインアルゴンレーザーを用いて，Hoechst 33342色素を励起した。使用される流動細胞計測法/細胞ソーターは，５０ｐｓｉで作動するSX MoFlo（商標）（Cytomation, Inc., Fort Collins, Co, USA）であった
　精子を，多数の精子の急速な蓄積を可能にする“大量分類”として言及される方法により分類し，その結果，大規模サンプルが道理に合った時間内で行われ得る。
精子は，標準の操作条件下で流動細胞計測法に通した
生存精子を含むすべての液滴を，特定の特徴に基づいて（性タイプにする分類），２本の管中に分類されるよりもむしろ一本の管中に採取した
　染色された精子を，分類の間，２２±１℃で維持した。大量分類された精子を，２００ｍＭのトリス中，２０％（体積／体積）の卵黄，６５ｍＭのクエン酸，５６ｍＭのフルクトース，５０Ｔｇ／ｍｌのチロシン，２５０Ｔｇ／ｍｌのゲンタマイシン，及び脱イオン水中，１５０／３００Ｔｇ／ｍｌのリンコ−スペクチンにより調製された２０％の卵黄−トリスエキステンダ−２ｍｌを含む，５０ｍｌのプラスチック管に採取した。前記卵黄−トリスエキステンダーは，工程のこの点でグリセロールの欠失を示すために“トリス−Ａ画分”と称する。精子は，１２ｍｌ及び約６×１０６の精子を含むように管に採取された。続いて，精子を２２℃で１〜３時間インキュベートし，性タイプに基づいての分類の条件をシュミレートした。」　 
 　 
（刊１−４）　 
「Flow cytometry is a particularly efficient selection method that has been employed for sorting sperm by sex-type. However, sorted sperm are subject to stresses beyond those normally encountered in standard artificial insemination or in vitro fertilization protocols. In particular, flow cytometry is time consuming, and, because ofthe physical constraints of flow cytometers, sperm must be diluted for sorting to levels that are not optimal for storage . (usually to on the order of 10５ - 10６/ml). Furthermore, sorted sperm intended for artificial insemination must be concentrated so that conventional packaging and delivery equipment can be used. The need for a concentration step thus exposes already somewhat compromised sperm to additional physical stresses.」　 
（２頁６〜１４行） 
「
流動細胞計測法（Flow cytometry）は，性タイプにより精子を分類するために使用されて来た，特に効果的な選択方法である
分類された精子は，標準の人口受精又は胎外受精プロトコールにおいて通常，遭遇するそれらのストレス以上にストレスを受けやすい
 　 
（刊１−５）　 
「The term sex-type refers to the type of sex chromosome present in the sperm (i.e., the X or Y chromosome). 」 
（３頁２６〜２７行）　 
「用語“性タイプ”とは，精子に存在する性染色体のタイプ（すなわち，Ｘ又はＹ染色体）を言及する。」　 
 　 
（刊１−６）　 
「Obtaining a Selected Sperm Sample　 
　The first step in the cryopreservation method ofthe invention encompasses obtaining a previously selected sperm sample, as well as subjecting a source sample to any suitable selection method. Sperm from any species can be selected and frozen according to the method ofthe invention. The method can be carried out with sperm from domesticated animals, especially livestock, as well as with sperm from wild animals (e.g., endangered species). Preferably, the selected sperm sample contains mammalian sperm. Human sperm, bovine, equine, porcine, ovine, elk, and bison sperm are particularly preferred.」　 
（５頁４〜１１行）　 
「選択された精子サンプルの獲得：　 
　本発明の低温保存方法における第１段階は，前もって選択された精子サンプルを獲得し，そしていずれかの適切な選択方法にサンプル源をゆだねることを包含する。いずれかの種からの精子が，本発明の方法に従って，選択され，そして凍結され得る。前記方法は，家畜動物，特に家畜からの精子，及び野生動物（例えば，絶滅の危機にある種）からの精子により行われ得る。
好ましくは，選択された精子サンプルは，哺乳類精子を含む。ヒト精子，ウシ，ウマ，ブタ，羊，ヘラジカ及びバイソン精子が特に好ましい
 　 
（刊１−７）　 
「Flow cytometry is a preferred method for separating cells from mixed populations based on differential staining with fluorescent dyes or binding to fluorescently labeled molecules, such as antibodies or nucleic acids. In fluorescence activated cell sorting (FACS), cells are sorted into different populations based on the fluorescence intensity upon irradiation. FACS can be used for sex-selection of sperm because the X chromosome contains slightly more DNA than the Y chromosome. When sperm are stained with a fluorescent DNA-binding dye, X-chromosome bearing sperm absorb more dye than Y- chromosome bearing sperm and the two populations can therefore can be separated by FACS. ・・・（略）・・・　 
　The selection method used to obtain the selected sperm sample is preferably one that preserves sperm viability. Because of the relative fragility of sperm, normal flow cytometry techniques should generally be modified for sorting sperm. More specifically, the flow cytometry entails staining, dilution, and interrogation of cells with light. All of these steps represent stresses that can reduce sperm viability. The sensitivity of sperm to these stresses can vary between species and even between individuals within species. Such sensitivities have either been documented or can readily be determined by empirical studies, such as those described in Examples 1-5.  
　Modifications that enhance viability are described the patent publications discussed above. For instance, procedures that provide improved sheath and collector systems for sorting sperm are disclosed in PCT Publication No. WO 99/33956 (Application No. PCT/US98/27909). Further, Examples 1-7 below describe exemplary procedures for staining and sorting sperm. Example 3 describes a study ofthe effects of laser intensity and dye concentration of post-thaw motility of sorted frozen sperm. This study indicates that the use of lower laser intensities during sorting can increase post-thaw motility.」　 
（６頁１〜２８行） 
「
流動細胞計測法は，蛍光色素による示差染色，又は蛍光ラベルされた分子，例えば抗体又は核酸への結合に基づいて，混合された集団から細胞を分離するための好ましい方法である
　
精子が蛍光ＤＮＡ−結合色素により染色される場合，Ｘ染色体担持の精子は，Ｙ染色体担持の精子よりも，より色素を吸収し，そして従って，２種の集団がＦＡＣＳにより分離され得る
　選択された精子サンプルを得るために使用される選択方法は好ましくは，精子生存性を保存する方法である。
精子の比較的ぜい弱性のために，通常の流動細胞計測技法は，一般的に，精子を分類するために改良されるべきである。より特定には，流動細胞計測法は，光による細胞の染色，希釈及び質問を必要とする。それらの段階のすべては，精子生存性を低めるストレスを提供する。それらのストレスに対する精子の感受性は，種間で及びさらに，種内の個々間で変化することができる
 　生存を増強する変法が，上記で論じられた特許公開に記載されている。例えば精子を分類するための改良された被覆及び採取器システムを提供する方法が，PCT公開番号WO99/33956号（出願番号PCT/US98/27909号）に開示される。さらに，下記例１〜７は，精子を染色し，そして分類するための典型的な方法を記載する。例３は，分類された凍結精子の後−解凍運動性に対するレーザー強度及び色素濃度の効果の研究を記載する。この研究は，分類の間，弱いレーザー強度の使用が後−解凍運動性を高めることができることを示す。」　 
 　 
２　刊行物２に記載された事項　 
　本願優先権主張日前に頒布された刊行物であるAnimal Reproduction Science，２００１年，Vol. 68，pp. 181-190（平成２１年６月１２日付け拒絶理由通知の引用文献２。以下，「刊行物２」という。）には，次の事項が記載されている。（なお，翻訳は当審によるものである。）　 
　 
（刊２−１）　 
「Abstract　 
　In the horse industry, milk or milk-based extenders are used routinely for dilution and storage of semen cooled to 4-8℃. Although artificial insemination (AI) with chilled and transported semen has been in use for several years, pregnancy rates are still low and variable related to variable semen quality of stallions. Over the years, a variety of extenders have been proposed for cooling, storage and transport of stallion semen. Fractionation of milk by microfiltration, ultrafiltration, diafiltration and freeze-drying techniques has allowed preparation of purified milk fractions in order to test them on stallion sperm survival. Finally, a high protective fraction, native phosphocaseinate (NPPC), was identified. A new extender, INRA96, based on modified Hanks’ salts, supplemented with NPPC was then developed for use with cooled/stored semen.  
　Four experiments were conducted to compare INRA96 and milk-based extenders under various conditions of storage. The diluted semen was maintained under aerobic conditions when stored at 15℃, and anaerobic conditions when stored at 4℃. In experiment 1, split ejaculates from 13 stallions were diluted either in INRA96 extender then stored at 15℃ or diluted in Kenney or INRA82 extenders and then stored at 4℃ for 24 h, until insemination. In experiment 2, semen from two stallions was extended in INRA96 then inseminated immediately or stored at 15℃ for 3 days until insemination. In experiment 3, semen from three stallions was diluted in INRA96 then stored at 15 or 4℃ for 24 h until insemination, finally, in experiment 4, split ejaculates from four stallions were diluted in INRA96 or E-Z Mixin extenders then stored at 4℃ for 24 h until insemination. Experiment 1 demonstrated that at 15 ℃, INRA96 extender significantly improved pregnancy rate per cycle compared to Kenney or INRA82 extenders at 4℃ after 24 h of storage (57%, n = 178 versus 40%, n = 171, respectively;P 0.01). Experiment 2 showed that semen stored at 15℃ for 3 days can achieve pregnancy at a fertility rate per cycle of 48% (n = 52) compared to 68% (n = 50,immediate insemination, P = 0.06). Experiment 3 demonstrated that INRA96 extender can be as efficient at 15℃ (54%, n = 37) as at 4℃ (54%, n = 35) after 24 h of storage. Finally, experiment 4 showed that INRA96 extender used at 4℃ (59%, n = 39) seems to improve fertility per cycle compared to E-Z Mixin at 4℃ (49%, n = 39, P = 0.25), but this result has to be confirmed.  
　These results demonstrate that semen diluted in INRA96 extender and stored at 15℃ can be an alternative to semen diluted in milk-based extenders and stored at 4℃ for “poor cooler” stallions. Furthermore, INRA96 extender can be as efficient at 15℃ as at 4℃, for preserving sperm motility and fertility. 」（１８１〜１８２頁　Abstractの項） 　 
「馬産業では，ミルクあるいはミルクに基づいた希釈剤が，稀釈と，
４〜８℃に冷却された精液の貯蔵に慣例的に使用される
　４つの実験が様々な貯蔵条件の下でのＩＮＲＡ９６およびミルクに基づく希釈剤を比較するために行なわれた。１５℃で貯蔵された時には好気性条件下で，４℃で貯蔵された時には嫌気性条件下で，希釈された精液は維持された。実験１では，１３頭の種馬からの
分離した射精液
分離した射精液
実験１は１５℃におけるＩＮＲＡ９６希釈剤が，ケニーまたはＩＮＲＡ８２希釈剤での４℃における２４時間の貯蔵に比較して，周期当たりの妊娠率を顕著に改善したことを示した
実験２は，１５℃で３日間貯蔵された精液が，６８％（ｎ＝５０，直後の受精，Ｐ＝０．０６）に比較して，周期当たり４８％（ｎ＝５２）の出生率での妊娠を達成できることを示した
実験３は，２４時間の貯蔵後において，ＩＮＲＡ９６希釈剤が１５℃（５４％，ｎ＝３７）で，４℃（５４％，ｎ＝３５）と同様に効果的であったことを実証した
　これらの結果は，
ＩＮＲＡ９６希釈剤で薄められ，１５℃で貯蔵された精液が，”冷却に弱い”種馬のために，ミルクに基づく希釈剤で希釈され４℃で貯蔵された精液の代替手段となり得ることを実証する。更に，ＩＮＲＡ９６希釈剤は精子運動性および出生率の保持のために，１５℃でも４℃と同様に効率的であり得る
 　 
（刊２−２）　 
「4. Discussion　 
　In previous experiments, it has been demonstrated that INRA96 extender significantly improved in vitro survival of spermatozoa at 15℃ when compared to milk extenders at 4℃ (Batellier et al., 1997). The aim of the in vivo experiments reported here was to evaluate efficiency of INRA96 extender on pregnancy rate per cycle and to compare it to the traditional methods of semen storage. We have demonstrated that, when semen was stored for 24 h, semen extended in INRA96 and incubated at 15℃ significantly improved the pregnancy rate per cycle compared with traditional milk-based extenders at 4℃. Furthermore, INRA96 at 15℃ seemed to improve the pregnancy rates of stallions whose fertility was altered after semen storage at 4℃ (cf. Fig. 2). It has been evidenced that cold shock occurs between 19 and 8℃ in the equine species (Moran et al., 1992). Cold shock mechanism is not well understood but membrane status is impaired when temperature is decreased because of the loss of phospholipids. Therefore, we could hypothesize that storage at 15℃ may spare sperm plasma membranes from cold shock injuries, especially for “poor cooler” stallions, resulting in the improvement of fertility when semen is stored at 15℃ compared with 4℃. Thus, sperm storage at 15℃ could be an alternative to traditional cooling or to freezing for “poor cooler” stallions.  
　Experiment 2 (Table 4) has shown that the pregnancy rate per cycle can be maintained successfully for 3 days when semen is extended in INRA96 and stored at 15℃. However, such results have to be confirmed on a larger number of stallions and compared with traditional storage conditions (milk-based extender at 4℃). As reported by Pickett (1995) and Katila (1997), numerous studies have been carried out to compare extenders, temperature of storage, etc. Unfortunately, the majority of studies are based on motility evaluation which do not always reflect true fertilizing capacity. So, it is quite difficult to compare our results to the literature. Moreover, few studies report fertility trials after long-term storage (≧24 h). In a review, Pickett (1995) summarized results obtained after 24 or 48 h of storage. After 24 h of storage, the embryo recovery rate was 51% (n = 123) when sperm was stored at 20℃ and 59% (n = 34) when sperm was stored at 5℃, while after 48 h of storage, it was 0% (n = 16) when sperm was stored at 20℃ and 32% (n = 34) when stored at 5℃. Only one study has reported good fertility rates per cycle after storage of sperm for 70-80 h. However, the results were obtained on a low number of mare cycles (70 h storage: 77%, n = 17; 80 h storage: 53%, n = 23).  
　INRA96 extender was as efficient when semen was stored at 15℃ as when it was stored at 4℃. In previous in vitro experiments, no significant difference was evidenced on sperm motility after incubation at 4 or 15℃ for 48 h (Batellier, 1997). Moreover, when comparing INRA96 extender to a traditional milk-based extender, it was found that INRA96 could improve pregnancy rate per cycle after 24 h of storage at 4℃, suggesting that INRA96 extender could be more efficient against cold shock than traditional milk extenders. However, this improvement in pregnancy rate (59% versus 49%) has to be confirmed. Nevertheless, it is important to notice that the slight improvement in fertility is related to a significant increase in motility parameters (Table 5) when sperm was extended in INRA96 compared to E-Z Mixin after 24 h of storage at 4℃.  
　・・・（略）・・・ 
　In conclusion, the fertility trials reported here have demonstrated that INRA96 is an efficient extender to preserve fertility potential of spermatozoa for at least 24 h. It also seems to protect sperm cells during long-term storage with more efficiency than traditional milk extenders. Storage at 15℃ may prevent cold shock injury to sperm cells of “poor cooler” stallions and could be an alternative to freezing semen. However, the absence of commercial containers that maintain semen at 15℃ and are transportable by mail lead us to propose the following recommendations: storage of AI doses at 15℃ when AI can be performed at the stud, and storage at 4℃ when transport is necessary. However, one has to keep in mind that the decision will depend mainly on the quality of the stallion semen.」（１８８〜１９０頁　4. Discussionの項）　 
「以前の実験では，４℃でミルク希釈剤と比較された時，ＩＮＲＡ９６希釈剤が１５℃での生体外での精子存続性を著しく改善したことが実証された（Ｂａｔｅｌｌｉｅｒら，１９９７年）。ここで報告された生体内での実験の目的は，周期当たりの妊娠率におけるのＩＮＲＡ９６希釈剤の有効性を評価し，それを精液貯蔵の従来の方法と比較することであった。我々は，精液が２４時間貯蔵された時，４℃における従来のミルクに基づく希釈剤と比較して，ＩＮＲＡ９６で希釈され，１５℃でインキュベートされた精液が，周期当たりの妊娠率を顕著に改善したことを実証した。更に，１５℃でのＩＮＲＡ９６は，その出生率が４℃での精液貯蔵後には変化してしまう種馬の妊娠率を改善するようであった（図２参照）。
馬の種において，１９℃から８℃の間にコールドショックが起こることは証拠づけられている（モーランら，１９９２年）。コールドショックのメカニズムはよくは理解されていないが，温度低下の際，リン脂質の損失のために膜の状況が損傷される。したがって，１５℃での貯蔵は，特に”冷却に弱い”種馬について，精子の原形質膜をコールドショックによる損傷から救い，結果として精液が４℃と比較して１５℃で貯蔵された時に出生率の改善をもたらしたと我々は仮定することができた。したがって，１５℃での精液貯蔵は，”冷却に弱い”種馬のために，従来の冷却，あるいは凍結の代替手段となり得る
　
実験２（テーブル４）は，精液がＩＮＲＡ９６中に希釈され，１５℃で貯蔵された場合，周期当たりの妊娠率は３日間にわたり成功裡に維持されることができることを示した
　
ＩＮＲＡ９６希釈剤は，精液が１５℃で貯蔵された時に，それが４℃で貯蔵された時と同様に，効率的であった
　・・・略・・・　 
　結論として，ここで報告された出生試験は，少なくとも２４時間，精子の受精能を保存するために，ＩＮＲＡ９６が効率的な希釈剤であることを実証した。さらに，それは，長期間貯蔵においても保存従来のミルク希釈剤よりさらに効率的に精子細胞を保護するようである。
１５℃での貯蔵は，”冷却に弱い”種馬の精子細胞に対するコールドショックによる損傷を防ぎ，精液凍結の代替手段となり得る。しかしながら，１５℃で精液を維持し，かつ，郵送可能な商用コンテナーは存在しないので，我々は次の提言を行う：人工授精が種馬の飼育場で行われることが可能な場合，人工授精用量の貯蔵は１５℃で行い，輸送が必要な場合，４℃で貯蔵する
 　 
第４　刊行物１記載の発明　
　刊行物１の摘示（刊１−１）について，例１Ａ（摘示（刊１−２）），及び例２（摘示（刊１−３））の引用関係を解消して整理すると，次の発明（以下，「刊行物１発明」という）が記載されていると認められる。　 
「雄牛からの精液を，人工膣を通して採取し，　 
　分光計により精子濃度を決定し，　 
　すべてのサンプルを２２℃で６０分間インキュベートし，　 
　前進精子運動の主観的評価を決定し，　 
　Hoechst 33342色素を精子懸濁液に添加し，　 
　精子は，標準の操作条件下で流動細胞計測法（Flow cytometry）に通し， 
　生存精子を含むすべての液滴を，性タイプの特徴に基づいて採取する，方法。」　 
　 
第５　対比　 
　本願発明と刊行物１発明を対比する。　 
 　 
１　精子細胞を分離する方法について　 
　本願発明における「精子細胞を分離する方法」とは，工程ｃや本願明細書の段落【０００２】等の記載から，精子細胞を性形質に基づいて分離する方法であることが分かる。　
　一方，刊行物１発明は，「生存精子を含むすべての液滴を，性タイプの特徴に基づいて採取する，方法」であり，ここで，「精子」と「精子細胞」，「性タイプ」と「性形質」はそれぞれ同義であるから，刊行物１発明の，「生存精子を含むすべての液滴を，性タイプの特徴に基づいて採取する，方法」は，本願発明の「精子細胞を分離する方法」に相当するといえる。　 
 　 
２　精液を獲得する工程について　 
ア　ヒトではない哺乳動物の一種のオスについて　 
　刊行物１発明の「雄牛」と，本願発明の「哺乳動物のウマ種のオス」とは，哺乳動物の一種のオスである点で共通する。　 
 　 
イ　精液（複数の精子細胞を含む）の獲得について　 
　刊行物１発明の「精液」が「複数の精子細胞を含む」ことは自明であるから，刊行物１発明の「精液を，人工膣を通して採取」する工程は，本願発明の「精液（複数の精子細胞を含む）を獲得する工程」に相当する。　 
 　 
３　精液をインキュベートする工程の温度について　 
　刊行物１発明における，精液サンプルをインキュベートする工程は，「２２℃」で行われている。　 
　本願発明では，「有意に高い妊娠の成功を達成する１０℃と１５℃との間の低い温度（その温度を超えると精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する）で該精液をインキュベートする」と規定されている。　 
　本願発明における「有意に高い妊娠の成功を達成する」との規定については，本願明細書の段落【００２４】に，　
「従って，本発明の精子細胞操作システムは，哺乳動物の一種のオスから精子細胞を得ること，哺乳動物のこのような種のこのようなメスの
より高い妊娠率を生じる５℃と２５℃との間の範囲内で選択される温度
ウマのオスから得た精子細胞が，妊娠率を高めるために本発明に従って維持される温度は，約１０℃〜約２０℃との間であり得，具体的には約１５℃であり得る
と記載されていることから，少なくとも「１０℃と１５℃との間」で選択される温度であれば，「有意に高い妊娠の成功を達成する」という意味であることが分かる。　 
　一方，本願発明における「（その温度を超えると…転移する）」との規定については，本願明細書の段落【０００３】に，　 
「特定の精子細胞特徴に基づいて部分集団へと分離された精子細胞の重大な問題は，運動性低下，生存率低下または受精能低下であり得る。この問題の一つ局面は，部分集団へと精子細胞を分離する前に精液を操作および移送する
従来の方法は，一般的に約５℃，または精子細胞膜脂質が液相からゲル相へと転移した温度で実施されることであり得る。精子細胞膜脂質の液相からゲル相への転移は，精子細胞の化学的，物理的，生理学的，または機能的性質を変化させ得，そのような精子細胞の受精率低下をもたらし得るか，または精子細胞死をもたらし得る
収集した精液を既存の慣行的実務よりも実質的に高い温度でインキュベートするか，または収集した精液の温度を維持する本発明
と記載されていることから，その温度より低い温度となると，精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移し好ましくなく，「その温度」より低い温度を排除する意味で記載されているものと解され，「その温度」とは，「精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移しない程度の温度」であることが分かる。　 
　したがって，２２℃は，「より高い妊娠率を生じる５℃と２５℃との間の範囲内で選択される温度」であるし，「その温度を超えると精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する」，排除されるべき，より低い温度範囲ではない。　 
　そうすると，刊行物１発明の「すべてのサンプルを２２℃で６０分間インキュベート」する工程は，本願発明の「有意に高い妊娠の成功を達成する１０℃と１５℃との間の低い温度（その温度を超えると精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する）で該精液をインキュベートする」工程とは，所定の温度で精液をインキュベートする工程である点で，共通する。そして，「所定の温度」は，有意に高い妊娠の成功を達成する温度であって，精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移しない程度の温度でもある。　 
 　 
　なお，本願明細書の段落【００１３】には，「本発明の別の重要な目的は，それより上では精子細胞の膜脂質が液相からゲル相へと転移する温度で精子細胞をインキュベートする方法を提供することであり得る。」とする記載があるが，該当箇所の原文記載は「Another significant object of the invention can be to provide methods in which sperm cells are incubated at temperatures above which sperm cell membrane lipids transition from a liquid phase to a gel phase.」であり，段落【００１３】は正しくは「本発明の別の重要な目的は，精子細胞の膜脂質が液相からゲル相へと転移するより上の温度で，精子細胞をインキュベートする方法を提供することであり得る。」である。　 
　 
４　性形質の決定，分離，収集について　 
　本願発明における「複数の精子細胞の性形質を決定する工程」（本願発明ｃ工程），「性形質に基づいて精子細胞をＸ染色体保有集団とＹ染色体保有集団とに分離する工程」（本願発明ｄ工程），及び「分離した精子細胞を収集する工程」（本願発明ｅ工程）とは，本願明細書の段落【０００２】，段落【００８３】，及び実施例１−８の記載からみて，三工程をあわせて，一連の周知技術であるところの，流動細胞計測法（Flow cytometry）であり，Hoechst 33342色素により精子細胞を染色し，Ｘ染色体とＹ染色体の染色性の相違に基づいて，染色された精子細胞を分析し，両者を分離して収集する方法，を含む。　 
　したがって，刊行物１発明の， 　 
「Hoechst 33342色素を精子懸濁液に添加し，　 
　精子は，標準の操作条件下で流動細胞計測法（Flow cytometry）に通し，　 
　生存精子を含むすべての液滴を，性タイプの特徴に基づいて採取する，方法」 
は，本願発明の，　 
「複数の精子細胞の性形質を決定する工程」　 
「性形質に基づいて精子細胞をＸ染色体保有集団とＹ染色体保有集団とに分離する工程」　
「分離した精子細胞を収集する工程」　 
に相当することも明白である。　 
 　 
５　小括　 
　以上のことから，本願発明と刊行物１発明は，次の（一致点）及び（相違点１）〜（相違点２）を有する。　 
 　 
（一致点）　 
「精子細胞を分離する方法であって，該方法は，以下：　 
　ａ．哺乳動物の一種のオスから精液（複数の精子細胞を含む）を獲得する工程，　 
　ｂ．所定の温度で該精液をインキュベートする工程，　 
　ｃ．複数の該精子細胞の性形質を決定する工程，　 
　ｄ．該性形質に基づいて該精子細胞をＸ染色体保有集団とＹ染色体保有集団とに分離する工程，および　 
　ｅ．分離した精子細胞を収集する工程， 
を包含する，方法。」　 
　 
（相違点１）　 
　哺乳動物が，本願発明では「ウマ」であるのに対し，刊行物１発明ではそのように特定されていない点。　 
 　 
（相違点２）　 
　精液をインキュベートする工程の，所定の温度が，本願発明では，「有意に高い妊娠の成功を達成する１０℃と１５℃との間の低い温度（その温度を超えると精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する）」であるのに対し，刊行物１発明では２２℃である点。　 
 　 
第６　判断　 
１　相違点１について　 
　刊行物１には，ウシ同様，ウマを精子サンプル源として選択できることが記載されている（摘示（刊１−６））。　 
　刊行物２には，ウマ精子の分離において１５℃の保存温度が採用され得ることも記載されている（摘示（刊２−１），（刊２−２））。　 
　したがって，刊行物１発明において，精子サンプル源の哺乳動物としてウマを選択することは，当業者が適宜なし得たことである。　 
 　 
２　相違点２について　 
　上記「第５　３　精液をインキュベートする工程の温度について」で検討したとおり，本願発明の「有意に高い妊娠の成功を達成する」「低い温度」「（その温度を超えると…転移する）」なる記載は，いずれも，「１０℃と１５℃との間」の温度であれば「低い温度」であって，「有意に高い妊娠の成功を達成」し，かつ，「その温度を超えると…転移する温度」，すなわち，「その温度であれば精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移しない程度の温度」と解されるから，本願発明の精液をインキュベートする工程の温度「有意に高い妊娠の成功を達成する１０℃と１５℃との間の低い温度（その温度を超えると精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する）」は，「１０℃と１５℃との間の温度」であるといえる。　
　一方，刊行物１と同様，哺乳動物の精液保存とその温度条件について記載された刊行物２には，ウマから精液を採取し，ＩＮＲＡ９６を希釈剤として用いて１５℃で保存する方法と，その場合に，精子運動性および出生率は４℃での場合と同様に効率的であり，また，他の希釈剤を用いた４℃での保存と比較して，周期当たりの妊娠率が顕著に改善されたことが記載されている（摘示（刊２−１），（刊２−２））。　 
　そして，刊行物２にはさらに，「１５℃でのＩＮＲＡ９６は，その出生率が４℃（図２参照）での精液貯蔵後には変化してしまう種馬の妊娠率を改善するようであった。馬の種において，１９℃から８℃の間にコールドショックが起こることは証拠づけられている（モーランら，１９９２年）。コールドショックのメカニズムはよくは理解されていないが，温度低下の際，リン脂質の損失のために膜の状況が損傷される。したがって，１５℃での貯蔵は，特に”冷却に弱い”種馬について，精子の原形質膜をコールドショックによる損傷から救い，結果として精液が４℃と比較して１５℃で貯蔵された時に出生率の改善をもたらしたと我々は仮定することができた。したがって，１５℃での精液貯蔵は，”冷却に弱い”種馬のために，従来の冷却，あるいは凍結の代替手段となり得る。」（摘示（刊２−２））と記載されていることから，刊行物１発明において，精子の原形質膜をコールドショックによる損傷から救うことを目的として，低温となりすぎることを回避するために下限温度を定めることも，当業者が適宜なし得る事項である。　 
　 
３　効果について　 
　本願明細書の段落【００２４】には「ウマの種に関して，および特に開示されたウマの種に関して，ウマのオスから得た精子細胞が，妊娠率を高めるために本発明に従って維持される温度は，約１０℃〜約２０℃との間であり得，具体的には約１５℃であり得る。」と記載され，実施例１として，段落【００１６】〜【００２７】に，５℃と１５℃の保存温度での比較の結果，１５℃がより高い妊娠率をもたらしたことが記載されている。　 
　さらに，段落【００５７】（段落【００６２】に同じ表の一部が転記されている）には，輸送温度が１５℃または２０℃である場合に，精子細胞の死数割合が減少することが記載されており，段落【００５７】〜【００６５】，【図９】及び【図１０】には，運動性と輸送温度との関係は，運動性測定のタイミングによって異なり，５℃，１０℃，１５℃で最高値を示す場合があることが示されている。　 
　しかしながら，これらは，温度変化に伴い連続して推移する，精子細胞の生存性と運動性を示したものに過ぎず，本願発明の「１０℃と１５℃との間の低い温度」の臨界的意義を示すものとはいえない。　 
　そして，人工授精用精液の保存において，各処理段階における温度の設定は必須であり，温度条件が重要であることは，刊行物１及び２を含め，他に文献を示すまでもなく周知であるから，一定の温度範囲を設定することは当然である。また，本願発明が，仮に「１０℃と１５℃との間の低い温度」において特に良好な結果を得たものであるとしても，（刊２−２）に記載のように，コールドショックによるリン脂質の損失のために膜が損傷されることがない温度範囲であれば，精子細胞の生存性と運動性が向上することは，当業者が予測し得る範囲の効果であって，格別のものではない。　 
　
第７　むすび　 
　以上のとおり，本願発明は，刊行物１〜２，及び周知の技術的事項に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 
　したがって，その他の請求項に係る発明についての判断を示すまでもなく本願は拒絶すべきものである。 
　よって，結論のとおり審決する。