【手続補正書】
【提出日】平成27年11月2日(2015.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＴＡＬＥ反復単位を含む単離された天然に存在しないＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドであって、前記ＴＡＬＥ反復単位がそれぞれ反復可変ジ残基領域（ＲＶＤ）を含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドが少なくとも３つの非正準ＲＶＤを含む、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記非正準ＲＶＤが、標的ＤＮＡでアデニン（Ａ）を認識するために、１２位および１３位にＨＩ、ＣＩ、ＲＩ、ＫＩ、ＳＩ、ＡＩ、ＱＩ、ＹＩ、ＧＩ、ＶＩ、ＴＩ、ＤＩ、ＥＩ、またはＦＩを含むか、
前記非正準ＲＶＤが、標的ＤＮＡでシトシン（Ｃ）を認識するために、１２位および１３位にＮＤ、ＡＤ、ＫＤ、ＲＤ、ＳＤ、ＣＤ、ＩＤ、またはＥＤを含むか、
前記非正準ＲＶＤが、標的ＤＮＡで標的ＤＮＡでグアニン（Ｇ）を認識するために、１２位および１３位にＫＮ、ＥＮ、ＨＮ、ＳＮ、ＡＮ、ＣＮ、ＧＮ、ＦＮ、ＡＫ、ＣＫ、ＲＨ、ＫＫ、ＤＨ、ＷＮ、ＬＮ、ＶＮ、ＩＮ、ＮＫ、ＴＮ、ＤＮ、ＱＮ、ＲＮ、ＹＮ、ＱＫ、またはＨＨを含むか、または
前記非正準ＲＶＤが、標的ＤＮＡでチミン（Ｔ）を認識するために、１２位および１３位にＨＧ、ＫＧ、ＭＧ、ＱＧ、ＲＧ、ＡＡ、ＱＡ、ＶＡ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧ、ＳＧ、ＶＧ、ＴＧ、ＳＡ、ＣＰ、ＹＧ、ＹＡ、ＹＰ、ＷＧ、ＩＧ、またはＩＳを含む、請求項１に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記反復単位のうちの少なくとも１つの１１位のアミノ酸が、天然に存在するＴＡＬＥ反復単位と比較して変化している、請求項１または２に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項４】
１１位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択されるアミノ酸に変化する、請求項３に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドおよび機能ドメインを含む融合タンパク質であって、ここで、前記機能ドメインが、必要に応じて、転写活性化因子、転写抑制因子、メチルトランスフェラーゼ、およびヌクレアーゼ切断ドメインからなる群から選択される、融合タンパク質。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼ切断ドメインが活性または不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質または請求項５もしくは６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質、請求項５もしくは６のいずれかに記載の融合タンパク質、または請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞。
【請求項９】
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質を作製する方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質を作製することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥ反復単位から組み立てられ、前記ＴＡＬＥ反復単位のうちの少なくとも３つが非正準ＲＶＤを含み、さらに前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が、正準ＲＶＤのみを含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質と比較して、増強された特異性または活性を呈する、方法。
【請求項１０】
細胞における内在性遺伝子の発現を調節するインビトロでの方法であって、
請求項５または６に記載の融合タンパク質を前記細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が前記内在性遺伝子中の標的部位に結合し、さらに前記内在性遺伝子の発現が前記融合タンパク質によって調節される、方法。
【請求項１１】
前記調節が、遺伝子活性化、遺伝子抑制、および遺伝子不活性化からなる群から選択される、請求項１０に記載のインビトロでの方法。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が切断ドメインまたは切断半ドメインを含み、前記内在性遺伝子が切断によって不活性化される、請求項１１に記載のインビトロでの方法。
【請求項１３】
細胞のゲノム中の目的とする領域を修飾するインビトロでの方法であって、
請求項５または６に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を前記細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が前記細胞の前記ゲノム中の標的部位に結合し、前記融合タンパク質が前記目的とする領域中の前記ゲノムを切断する、方法。
【請求項１４】
前記修飾が外因性核酸を前記目的とする領域に導入することを含み、前記方法が前記外因性核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記外因性核酸が相同組換えによって前記目的とする領域に組み込まれる、請求項１３に記載のインビトロでの方法。
【請求項１５】
（ａ）請求項６に記載の第１および第２の融合タンパク質を含む二量体を形成することであって、前記第１の融合タンパク質が活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第２の融合タンパク質が不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記修飾が、二本鎖ＤＮＡ標的配列内に一本鎖切断を作製すること、または
（ｂ）第１および第２の二量体を形成することであって、前記二量体がそれぞれ請求項６に記載の第１および第２の融合タンパク質を含み、前記第１および第２の二量体が二本鎖ＤＮＡ標的の相補鎖上に第１および第２の一本鎖切断を作製するように、それぞれの前記二量体の前記第１の融合タンパク質が活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第２の融合タンパク質が不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第１および第２の一本鎖切断が前記二本鎖ＤＮＡを２つの断片に分離し、それによって前記二本鎖ＤＮＡ標的を切断すること、
を含む、請求項１３に記載のインビトロでの方法。
【請求項１６】
ヒトまたは哺乳類対象の治療の方法において使用するための、請求項５または６に記載の融合タンパク質を含む組成物であって、
（ａ）前記融合タンパク質が、前記対象の細胞に導入され、前記融合タンパク質が、前記内在性遺伝子の標的部位に結合し、そしてさらに、前記内在性遺伝子の発現が、前記融合タンパク質によって調節されることを特徴とするか、または
（ｂ）前記融合タンパク質が、前記対象の細胞に導入され、前記融合タンパク質が、前記細胞のゲノム内の標的部位に結合し、そして前記融合タンパク質が目的とする領域における前記ゲノムを切断することを特徴とする、組成物。
【請求項１７】
外因性核酸が前記細胞にさらに導入され、前記外因性核酸が、目的とする領域を修飾するために、相同組換えによって目的とする領域に組み込まれることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記方法が、
（ａ）請求項６に記載の第１および第２の融合タンパク質を含む二量体を形成することであって、前記第１の融合タンパク質が活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第２の融合タンパク質が不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、そして前記修飾が、二本鎖ＤＮＡ標的配列内に一本鎖切断を作製すること、または
（ｂ）第１および第２の二量体を形成することであって、前記二量体がそれぞれ請求項６に記載の第１および第２の融合タンパク質を含み、前記第１および第２の二量体が二本鎖ＤＮＡ標的の相補鎖上に第１および第２の一本鎖切断を作製するように、それぞれの前記二量体の前記第１の融合タンパク質が活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第２の融合タンパク質が不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第１および第２の一本鎖切断が前記二本鎖ＤＮＡを２つの断片に分離し、それによって前記二本鎖ＤＮＡ標的を切断すること、
を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
植物細胞における内在性遺伝子の発現を調節する方法であって、
請求項５または６に記載の融合タンパク質を前記植物細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が前記内在性遺伝子中の標的部位に結合し、さらに前記内在性遺伝子の発現が前記融合タンパク質によって調節される、方法。
【請求項２０】
植物細胞のゲノム中の目的とする領域を修飾する方法であって、
請求項５または６に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を前記植物細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が前記細胞の前記ゲノム中の標的部位に結合し、前記融合タンパク質が前記目的とする領域中の前記ゲノムを切断する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
なおさらなる態様において、本発明の増強されたＴＡＬＥドメインタンパク質（およびこれらのＴＡＬＥ反復タンパク質を含む融合タンパク質）を含むキットが本明細書に提供される。これらのキットを用いて使用者はゲノム操作を促進することができ、したがって、例えば、ゲノム内の所望の標的またはセーフハーバー遺伝子座を切断するＴＡＬＥＮを提供することができる。ＴＡＬＥＮは、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）として提供され得るか、またはタンパク質として提供され得るかのいずれかである。いくつかの事例において、タンパク質は、安定性を増加させるために製剤化され得るか、または乾燥形態で提供され得る。いくつかの事例において、キットは、診断目的に使用される。いくつかの事例において、キット内に含まれるＴＡＬＥ融合物は、転写制御因子である。いくつかの事例において、ＴＡＬＥ融合物は、レポーターを含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
複数のＴＡＬＥ反復単位を含む単離された天然に存在しないＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドであって、前記ＴＡＬＥ反復単位がそれぞれ反復可変ジ残基領域（ＲＶＤ）を含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドが少なくとも３つの非正準ＲＶＤを含む、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
（項目２）
前記反復単位のうちの少なくとも１つの１１位のアミノ酸が、天然に存在するＴＡＬＥ反復単位と比較して変化している、項目１に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
（項目３）
１１位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択されるアミノ酸に変化する、項目２に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
（項目４）
項目１〜３のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドおよび機能ドメインを含む融合タンパク質。
（項目５）
前記機能ドメインが、転写活性化因子、転写抑制因子、メチルトランスフェラーゼ、およびヌクレアーゼ切断ドメインからなる群から選択される、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目６）
項目１〜３のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質または項目４および５のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目７）
項目１〜３のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質、項目４および５のいずれかに記載の融合タンパク質、または項目６に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞。
（項目８）
前記細胞が真核細胞である、項目７に記載の単離された宿主細胞。
（項目９）
前記細胞が哺乳類細胞または植物細胞である、項目８に記載の単離された宿主細胞。
（項目１０）
前記哺乳類細胞が幹細胞である、項目９に記載の単離された宿主細胞。
（項目１１）
前記ヌクレアーゼ切断ドメインが活性または不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含む、項目４または項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質を作製する方法であって、
項目１または項目２に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質を作製することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥ反復単位から組み立てられ、前記ＴＡＬＥ反復単位のうちの少なくとも３つが非正準ＲＶＤを含み、さらに前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が、正準ＲＶＤのみを含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質と比較して、増強された特異性または活性を呈する、方法。
（項目１３）
細胞における内在性遺伝子の発現を調節する方法であって、
項目１１に記載の融合タンパク質を前記細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合が前記内在性遺伝子中の標的部位に結合し、さらに前記内在性遺伝子の発現が前記融合タンパク質によって調節される、方法。
（項目１４）
前記調節が、遺伝子活性化、遺伝子抑制、および遺伝子不活性化からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記融合タンパク質が切断ドメインまたは切断半ドメインを含み、前記内在性遺伝子が切断によって不活性化される、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
細胞のゲノム中の目的とする領域を修飾する方法であって、
項目１１に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を前記細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が前記細胞の前記ゲノム中の標的部位に結合し、前記融合タンパク質が前記目的とする領域中の前記ゲノムを切断する、方法。
（項目１７）
前記修飾は、欠失を前記目的とする領域に導入することを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記修飾が外因性核酸を前記目的とする領域に導入することを含み、前記方法が前記外因性核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記外因性核酸が相同組換えによって前記目的とする領域に組み込まれる、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞が、植物細胞、動物細胞、魚細胞、および酵母細胞からなる群から選択される真核細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記融合タンパク質が前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして導入される、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
二本鎖ＤＮＡ標的配列内に一本鎖切断を作製する方法であって、
項目１１に記載の第１および第２の融合タンパク質を含む二量体を形成することを含み、前記第１の融合タンパク質が活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第２の融合タンパク質が不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含む、方法。
（項目２２）
二本鎖ＤＮＡ標的を切断する方法であって、
第１および第２の二量体を形成することを含み、前記二量体がそれぞれ項目１１に記載の第１および第２の融合タンパク質を含み、前記第１および第２の二量体が前記二本鎖ＤＮＡ標的の相補鎖上に第１および第２の一本鎖切断を作製するように、それぞれの前記二量体の前記第１の融合タンパク質が活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第２の融合タンパク質が不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第１および第２の一本鎖切断が前記二本鎖ＤＮＡを２つの断片に分離し、それによって前記二本鎖ＤＮＡ標的を切断する、方法。
（項目２３）
項目１または項目２に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むキット。