【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年2月5日(2015.2.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）の阻害剤を含む、癌の処置のための医薬。
【請求項２】
癌が、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に依存する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ＥＧＦＲが、すべての発癌性変異体および他のＥｒｂＢファミリーのメンバー／ＨＥＲを含む、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
ＰＡＰ阻害剤が、プロプラノロール、デシプラミン、クロルプロマジン、スフィンゴシンおよびブロモエノールラクトンから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
ＰＡＰ阻害剤がプロプラノロールである、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬。
【請求項６】
ＰＡＰ阻害剤がプロプラノロールのラセミ混合物から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
ＰＡＰ阻害剤がＤ−プロプラノロールである、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
ＰＡＰ阻害剤が単独で、または、他のＰＡＰ阻害剤と組み合わせて使用される、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
ＰＡＰ阻害剤がプロプラノロールであり、かつデシプラミンと組み合わせて使用される、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
ＰＡＰ阻害剤が、Ｄ−プロプラノロールである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
癌が、頭頸部、結腸、卵巣、肺、乳房、前立腺、胃、肝臓の癌および神経膠芽腫から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬。
【請求項１２】
ＰＡＰ阻害剤が単独で、または、ＰＡＰの阻害とは異なる経路を介してＥＧＦＲを阻害する他の薬物と組み合わせて使用される、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬。
【請求項１３】
ＰＡＰ阻害剤が単独で、または他の処置と組み合わせて使用される、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬。
【請求項１４】
他の処置が、放射線療法または外科手術である、請求項１３に記載の医薬。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、その発癌性変異体およびＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーの他のメンバーに依存する癌の処置用の、単独またはデシプラミンと組み合わせたＤ−プロプラノロールおよびその類似体を含むホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）の阻害剤
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単独の化合物またはそれらの組合せとしてのホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）酵素の阻害剤の、癌の処置に有用な医薬製剤のための使用に関する。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、その発癌性変異体およびチロシンキナーゼ受容体のＥｒｂＢファミリーの他のメンバーに依存する癌の進行を妨害するために、ＰＡＰ阻害剤を利用し、それらのエンドサイトーシスを誘導し、かくして癌の進行を促進する刺激にそれらが接近できないようにすることを提唱する。
【０００３】
本発明のＰＡＰ阻害剤には、陽イオン性両親媒性分子であることを除き、それらの間には関連のない他の臨床目的で現在使用中の薬物が含まれる。これらには、他の医療目的のために外来診療にて夫々使用されるプロプラノロール、デシプラミンおよびクロロプロマジンを含む。本発明は、スフィンゴシンおよびブロモエノールラクトンを含めた全ての既知のＰＡＰ阻害剤を包含する。
【０００４】
本発明のある具体例は、単独で、または、デシプラミンと組み合わせて使用されるＤ−プロプラノロールに相当する。Ｌ−プロプラノロールを含むそのラセミ混合物と組み合わされたＤ−プロプラノロールは、プロプラノロールとして知られている薬物を構成し、これは他の病状の処置に使用される一般的なベータ−ブロッカーである。しかしながら、Ｌ−プロプラノロールのみが、ベータ−アドレナリン受容体のブロッカー（ベータ−ブロッカー活性）として有用であり、それは、抗高血圧効果を担う活性である。この発明に含まれるＤ-プロプラノロールは、有用なベータブロッカー活性がない。
【０００５】
本発明は、Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンの組合せが、ＥＧＦＲまたはその発癌性変異体（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体）に依存する癌細胞の進行を阻害し、その死滅を引き起こすのに有用であることを立証する。
【０００６】
従って、本発明は、他の臨床目的で使用された既知の薬物の第二の用途に相当するが、ベータ−ブロッカー活性を欠くＤ−プロプラノロールの類似体などの任意の他の種類のＰＡＰ阻害剤も含む。任意の種類のＰＡＰ阻害剤は、単独で、または、それらの間で、もしくは、ホルモン、抗体および化学療法で使用される薬物を含む、別個の作用メカニズムを有する抗腫瘍薬と組み合わせて、使用できる。
【０００７】
本発明のＰＡＰ阻害剤は、また、外科手術および放射線療法を含む他の種類の処置と、同時にまたは後で組み合わせて使用できる。これらの化合物は、化学療法またはＥＧＦＲおよびその発癌性変異体の機能の遮断を対象とする薬物を補足するものとして作用するのみならず、ＥＧＦＲに対して現在使用されている薬物に対する耐性を発達させた場合に、唯一利用できる治療でもあり得る。
【０００８】
本発明は、頻繁なＥＧＦＲ（過剰発現または突然変異）またはそのファミリーのメンバーであるＥｒｂＢ２／Ｎｅｕの発癌性変化を示すことが多い、頭頸部、結腸、肺、乳房、前立腺、胃、肝臓由来のものおよび神経膠芽腫などの癌の処置に、新しい可能性を開く。
【０００９】
本発明の分野
本発明は、以下の分野を包含する：
１）癌の病原性の決定要因である、ＥＧＦＲおよびそのチロシンキナーゼ受容体のファミリーのメンバー（ＥｒｂＢ／ＨＥＲ）の発癌性シグナル伝達機能を伴うことが多い癌細胞の生物学。そのような変化は、腫瘍細胞の攻撃性および悪性度を増強し、また、それらの増殖、生存および転移段階への進行に決定的であり、従って、本発明により提唱されるように、新規の抗癌戦略の設計に有効な標的をもたらす；
２）ＥＧＦＲおよびそのＥｒｂＢ／ＨＥＲ１−４ファミリーの他のメンバーの正常および病的機能において決定的な役割を果たす、細胞内輸送；
３）本発明における立証は、外部刺激に対するＥＧＦＲのアクセシビリティーの調節に関与する。このＰＡ/ＰＡＫシグナル伝達経路の新規機能が、本発明の基礎を構成する。
４）癌の処置のためのＰＡＰ阻害剤の使用。これは、以前に提唱されていない。
５）既知であり、ＰＡＰ阻害とは異なる作用メカニズムに基づいて他の臨床目的で使用中の薬剤のための第二の用途。既知であり、ＰＡＰ阻害以外の薬剤の作用メカニズムについて他の臨床試験で使用された第二の用途。例えば、プロプラノロールは、Ｌ-およびＤ−プロプラノロールのラセミ混合物である。Ｌ-プロプラノロールのみのプロプラノロールは、非選択的ベータアドレナリン阻害剤であって、かつ高血圧、不整脈などの処置におけるその効果に寄与する。別の例は、デシプラミンであって、抗うつ的処置にて処方されるように、ノルエピネフリン再捕捉の阻害剤として、およびムスカリン作用性受容体として一般的に使用される。
【００１０】
本発明の基礎は、ＰＡ／ＰＫＡシグナル伝達経路について発見された新規の機能およびＥＧＦＲの細胞表面レベルを決定する新規の調節メカニズムと絡み合う、すべてのこれらの分野を含む。これらの調節メカニズムは、エンドサイトーシスを誘導して、その外部リガンドによるＥＧＦＲ活性化へのその利用可能性を低下させることを目的する薬理的操作の影響を受けやすい。
【００１１】
本発明は、新規の抗癌治療を設計するための、Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンなどのＰＡＰ阻害剤ならびに元々は他の目的で使用された他の薬物の使用にある。この戦略は、以前に使用されていない。
【００１２】
本発明の利点
本発明は、ＥＧＦＲに依存する癌の進行を低減するために現在使用されているものとは別個の戦略を提唱する。現在使用されている薬物および設計段階で見出された薬物は、発癌性シグナルの生成剤であるそのチロシンキナーゼドメインの該リガンドまたは該活性との相互作用のいずれかを遮断することを試みて、ＥＧＦＲ分子に対して直接向けられている。対照的に、本発明で提唱される化合物は、直接的な標的として、ＥＧＦＲの分子ではなく、代わりに、エンドサイトーシスの機構を介して、その細胞表面到達性の内因性制御に関与する分子を有する。
【００１３】
この戦略は、癌細胞で変化したシグナル伝達経路を主に妨害することに処置を標的化するという現在の傾向に適合する。本発明は、エンドサイトーシスを介するＥＧＦＲの細胞表面からの除去を誘導するための戦略として、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）活性の妨害を提唱する。
【００１４】
他の利点は、ＰＡＰ阻害の能力を共有する既知の構造を有するいくつかの分子を利用できることであり、かくして、かかる目的のために従前に使用されていない作用メカニズムを誘導することにより、ＰＡＰ阻害剤の新規ファミリーを設計するための構造情報を提供する。
【００１５】
付加的かつ重要な利点は、特定の癌種のための処置の選択性である；本発明は、ＥＧＦＲ発癌性機能に関与する特異的プロセスを標的化する。これにより、既知の分子マーカーによる処置を個人化する機会を与え、これは、各場合で分析でき、応答する可能性が高い癌に対して薬物の使用を最適化できる。ＥＧＦＲのメンバーの発癌性の変化（過剰発現または突然変異）を示す癌に限定されたＰＡＰ阻害剤の適用は、明確な経済的利点を有する。
【００１６】
最後に、発癌に直接関与しない分子に対して作用する化合物の使用は、発癌性キナーゼを直接的に標的とする薬物の主な問題である処置に対する耐性の発生を遅延させるか、または回避させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図面の簡単な説明
【図１】図１：プロプラノロールおよびデシプラミンは、培養された腫瘍細胞においてＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導する。画像は、７５μＭプロプラノロール、７５μＭデシプラミン、５０μＭメトプロロールまたは５０μＭチモロールの存在下または非存在下でインキュベートされたＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＲの免疫蛍光パターンを例示する。
【図２】図２：エナンチオマーのＬ−およびＤ−プロプラノロール並びにデシプラミンは、放射性リガンド結合により評価されるＥＧＦＲの細胞表面の利用可能性を低下させる。Ａ. Ｌ−およびＤ−プロプラノロール；Ｂ. デシプラミン；Ｃ. 様々な濃度のＤ−プロプラノロール（上の目盛り）とデシプラミン（下の目盛り）の組合せ；Ｄ. Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンのＥＣ５０の組合せ。
【図３】図３：異なる増殖速度の腫瘍モデルとして、神経膠芽腫細胞Ｕ８７および発癌性突然変異ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するように形質転換されたＵ８７（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）。
【図４】図４：神経膠芽腫細胞Ｕ８７およびＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ並びに非腫瘍性上皮細胞ＭＤＣＫの生存能に対する、非継続的処置として添加されたＤ−プロプラノロールおよびデシプラミンの効果。
【図５】図５：低濃度のＤ−プロプラノロール（Ｐｒｏｐ）およびデシプラミン（Ｄｅｓ）による継続的処置は、単独でも組み合わせても、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲを過剰発現する神経膠芽腫の患者由来の初代培養の腫瘍細胞（ＧＢＭ１）において、増殖の増強を選択的に阻害する。
【図６】図６：不整脈のために処置される患者の血液に見いだされるものに近い２種の濃度（１０および３０μＭ）のＤ−プロプラノロールによる継続的処置は、単独で、または、１ｍＭデシプラミンとの併用で、いくつかの腫瘍細胞株およびＥＧＦＲを過剰発現する神経膠芽腫の患者由来の初代培養の腫瘍細胞（ＧＢＭ１）の増殖を選択的に阻害する。
【図７】図７：Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンの効果を基礎とする、ＥＧＦＲに依存する癌の新規処置戦略。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の背景
癌の問題
癌は、異常細胞の制御されない浸潤性の増殖により生じる疾患の群を包含し、それは、有効な処置がなければ、短期間（＜１２ヶ月、または、最も悪性の場合では５−９ヶ月でも）で患者の死亡をもたらし得る。従って、頻度と死亡率により、癌は世界中で公衆衛生の深刻な問題を構成している。
【００１９】
女性に最も多い癌は、乳房、子宮頸、結腸直腸および肺の癌であり、男性では、肺、前立腺、胃および結腸直腸の癌である（１,２）。死因として、癌は心血管疾患および感染症に次いで第三位を占めるが、先進国のみでは、一般的に心血管疾患に次ぐ第二の死因である（１,２）。２００２年の統計は、この年に何らかの癌に苦しむ２４６０万人の罹患者のうち、１０９０万人の新症例および６７０万人（男性３.７９６.０００人および女性２.９２８.０００人）の死亡例を示している（１）。癌のうち、最多の死亡を引き起こしたのは肺（１.１７９.０００人の死亡者）、胃（７００.０００人）、肝臓（５９８.０００人）および結腸直腸（５２８.０００人）のものであり、５年後の生存率が２０％未満である最も悪性のものは、肺、食道、胃、肝臓のものおよび神経膠芽腫であった（１-３）。
【００２０】
チリにおいて、患者の発症事例および生存能について正確には知られていない。毎年、癌により約３５０００名の入院患者および１４０００名の死亡者がでる。過去４０年において、１０００００人あたりの死亡者は８６〜１２３名に増加し（２０００）、１年あたりの新規症例は３６５００と推定された[ＭＩＮＳＡＬ，２００５，（４）]。
【００２１】
現在の治療は、通常、悪性の率が高い進行性癌に対しては有効ではない
癌の治療には、切除手術、放射線療法、化学療法、ホルモン治療、生物学的治療、および標的化治療が挙げられ、これらは伝統的処置に対して応答性が比較的低い、悪性が高い癌に対する新規の可能性をもたらしてきた。癌が依然として重要な死因であるという事実は、有効でない処置、特に進行性かつ悪性が高い症例に対する処置を反映している。新規の抗癌剤は、ある特定癌において応答率および全体の生存能を上げることができるが、多くの癌種は、依然として高レベルの悪性度および死亡率を維持している。年間に１０万以上の新規症例が診断され、この病因により約６万人もの人が死亡する。この数字は、人口増加、寿命予測値の長期化およびリスクファクターに対する暴露増加という理由から、今後徐々に増加するであろう。新規症例数は、次の２０年間で５０％に上昇し、２０２０年までには１５万人となるであろう。先進国では、４人に１人が癌で死亡するであろう（５）（２）。
【００２２】
幾つかの症例において実現する化学療法的処置に導入されている新規薬物は、患者の全体的な生存率および応答率を上げるが、依然として高レベルの制御不能な悪性腫瘍が、多くの癌種において残っている。
【００２３】
肺、胃および神経膠芽腫のその悪性腫瘍に注目すると、これらは、５年間で生存率が２０％より下がり、診断９ヶ月以内で高い死亡率を示す。このような癌の新規治療方法を、新規戦略を探索し、改良してみることは重要である。
【００２４】
肺癌：
癌による全死亡の約３０％が肺癌によるものであり、世界中で癌による死亡の主原因である（６）。肺癌の約９０％は、世界中で約１３億人を冒している喫煙によるものであり、一年に約５百万人の３０歳以上の人々を殺している（７）。チリでは、肺癌は、男性（２５．３対１７／１００．０００入院患者）における胃癌、および女性（１３．８対７．４／１００，０００）における胆管癌（１７．１対７．４／１００，０００）を上回る。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の癌は、大きい死亡のリスクを伴う進行した悪性腫瘍の１つである。処置しなければ、ＮＳＣＬＣおよび転移の患者では、生存期間中央値は４−５ヶ月である。患者の１０％しか、その年に生き残らない。進行性または転移性ＮＳＣＬＣの標準的な第一選択の治療は、プラチナダブレットと組み合わせた化学療法を基礎とし、それは、生存期間中央値を８−１１ヶ月に延ばし、生存率を１年で約３０％、２年で１４−２０％に高める（８）。
【００２５】
胃癌：
胃癌は、最も一般的な上皮由来の癌の１つである（９）。その発生率は過去５０年間で減少してきたが、依然として、頻度で第４位であり、死因としては肺癌に次いで第２位であり、性別および人種の群間で有意差がある。毎年、約１００万件の新しい症例が診断され、この原因で約８００,０００件の死亡がある。チリでは、胃癌は、男性における死因の第一位を占め、１００，０００名の入院患者あたり２５．３の割合を示しており、女性においては胆嚢癌に次いで第二位にあたり、１００，０００名の入院患者あたり１３．８の割合を示す。チリにおける胃癌の年間死亡率は、近年では一定しており、２００３年では死亡者が３１１５名に達した。局在した癌の患者の５年目の生存率は６０％に昇り、一方、転移がある患者では、わずか２％である（１２）。進行した疾患の場合、処置しなければ、生存期間中央値は１２ヶ月未満である（しばしば、わずか５.４ヶ月）。新しい化学療法の様式は、生存期間中央値を下げるのに失敗し、過去１０−２０年にわたり概して変わらないままである。この癌について、確立された化学療法は存在しない（１３-１５）。
【００２６】
神経膠芽腫
「神経膠腫」は、膠細胞に起源があると考えられるすべての腫瘍を含み、中枢神経系の最も一般的な腫瘍である。グレードＩＩＩ（未分化星状細胞腫）およびグレードＩＶ（神経膠芽腫）は、悪性神経膠腫とみなされる（３）。神経膠芽腫は、毎年３／１００,０００人の発生頻度であり、すべてのヒトの癌の中で最も致死的な腫瘍の１つである。神経膠芽腫の生存期間中央値は、数十年間にわたり、約９−１２ヶ月で維持されてきた。６５歳以上の患者の２％のみ、４５歳未満の患者の３０％が、２年間生存し、一方、約７５％が診断の１８ヶ月後には死亡する（１６,１７）。浸潤性の特徴と、放射線療法および化学療法を含む標準的処置への応答の乏しさが、予後不良に寄与している（１８）。放射線療法および同時のテモゾロミドと、後続の補助的なテモゾロミドの投与という現在の処置は、１２.１ヶ月の生存期間中央値を１４.６ヶ月に延ばす（１９）。チリでは、ロレンゾニら（２０）は、患者の生存率が、より高度な診断および手術システムならびに再先端技術を有する他国で報告された生存率と相違しないことを実証した。従って、良好な治療結果を得る可能性は、診断や手術の能力には依拠しない。
【００２７】
特異的分子標的を使用する癌の処置
細胞および分子レベルでの癌の知識の増加は、発癌部位に応じて、特異的分子標的を対象とし、アプローチを個人化する、新しい処置への期待を開いた。
癌細胞は、新しい特性の獲得を決定する遺伝子の損傷に由来し、正常な挙動から逸脱する。一般に、３種類の遺伝子が腫瘍形成を導き得る：（ｉ）癌遺伝子、（ｉｉ）腫瘍抑制遺伝子（癌抑制遺伝子）；および（ｉｉｉ）遺伝子の安定性に関与する遺伝子（２１，２２）。これらの遺伝子の変化は、以下の異常な特性を特徴とする悪性形質の獲得をもたらす：１）増殖シグナルの自己充足性；２）抗増殖シグナルに対する非感受性；３）アポトーシスの回避；４）無限の複製可能性；５）持続する血管形成；６）組織侵襲および転移（２２）。
【００２８】
あらゆるこれらの異常な特性にも拘わらず、癌細胞は、特定の内部シグナルのネットワークの活動亢進に対して、文字通り「中毒」になる。幸運にも、この特性は、対応する活動亢進ネットワークを阻害するように特別に設計された薬物を用いて、それらの悪性度に対抗するために使用されている（２３-２６）。従って、活動亢進したシグナル伝達ネットワークを持続させる遺伝子の変化が各腫瘍で同定され得るなら、最小の二次的作用で、最大の恩恵を得ることが可能である（２７）。遺伝子の病変の同定は、いくつかの決定的なシグナル伝達経路について比較的進んでおり、従って、薬物の使用を、第一選択として、または、化学療法と組み合わせて、特定の標的に対して個人化することが可能である（２８）。
【００２９】
今や、決定的な遺伝子の病変、並びに、癌細胞を正常な細胞と区別する、頻繁に変更される分子的および生化学的過程の知識に基づいて、癌の処置を個人化することに対する傾向と広範な合意がある（２１）（２２）。
【００３０】
直接療法のための、一般的な標的としてのタンパク質キナーゼ
直接療法の主な標的は、シグナル伝達経路に極めて関係が深いタンパク質キナーゼである。腫瘍細胞の増殖、生存、遊走および転移の過程においてその重要性が認められた最も試験された分子はまさに、セリン、スレオニンまたはチロシン残基をリン酸化するタンパク質−キナーゼ活性を有する酵素である。これらの酵素およびその直接的なレギュレーターの遺伝子には、腫瘍遺伝子および抗腫瘍遺伝子が挙げられる（２９）。
【００３１】
例示は、ＰＩ３ＫＣＡ腫瘍形成分子、ＥＧＦＲおよびＢ−ＲＡＦ、Ｒａｆキナーゼとして両方のＰＩ３Ｋを活性化するＲＡＳ腫瘍遺伝子ファミリー、ならびにＰＩ３Ｋシグナル伝達を阻害するＰＴＥＮ腫瘍抑制因子である（２９）。キナーゼ阻害剤は、癌の選抜群の処置を改善するが、高い悪性腫瘍の特定癌に対するその効力は、理論的予想を下まわる（２９）。さらに、これらの薬剤を用いる処置により恩恵を受ける群であっても、短期間で耐性が頻繁に発生する。腫瘍細胞は、分子標的においてそれらを耐性とする突然変異を理由にキナーゼ阻害剤の効果から逃れる。それ故に、腫瘍形成キナーゼの直接阻害を超えるその他の戦略を探索する必要がある。
【００３２】
ＥＧＦＲキナーゼ
ＥＧＦＲは、悪性腫瘍の表現型の発生および維持に決定的な細胞の過程を制御するチロシン−キナーゼのパラダイムである。ＥＧＦＲは、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒＢＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒＢＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢＢ４を含む受容体チロシン−キナーゼファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲは、一旦膜を横切る、即ちＥＧＦＲは、リガンドと相互作用する細胞外ドメインおよびチロシン−キナーゼドメインを有する細胞内ドメインを示す（３０）。それは、主に細胞膜に局在し、そこで細胞外リガンドの刺激による相互作用で活性化される。リガンド結合が、互いにホモまたはヘテロダイマーを誘導し、そして細胞内チロシン−キナーゼドメインが活性化されて、細胞の増殖および生存を調節するシグナル伝達経路を開始させる。
ＥＧＦＲは、細胞増殖および生存および遊走に関する最も広範に分布する受容体の１つであり、全て腫瘍形成に関与する。ＥＧＦＲは、腫瘍細胞により頻繁に分泌されるＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよび腫瘍増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）を含む少なくとも７つの異なるリガンドにより活性化される（３１）。ＥＧＦＲは、また、様々な他の受容体、特にＧＴＰａｓｅ（ＧＰＣＲ）と共役する受容体の刺激によりトランス活性化される（３２）。我々の研究室では、ＡＴＰおよびＰ２Ｙ１受容体を含む、細胞外ヌクレオチドからなる広範に分布する調節系が、ＥＧＦＲをトランス活性化できるということを示した（３３）。
従って、ＥＧＦＲの役割は、厳格な制御下で存在すべきであって、これらのシステム不全または受容体それ自体の変化は、誇張されたシグナルを決定かつ伝達するか、細胞癌を生じさせ、かつ継続させる腫瘍形成細胞の形質転換を伴う可能性がある（２３,３０）。
【００３３】
これらの受容体は、癌の発症機序において全面的に重要な増殖、遊走および細胞生存を制御する処理過程の刺激を受信かつ翻訳する細胞表面上で主に見出される。従って、細胞表面から細胞内コンパートメントへの内在化をもたらし得る薬物は、外部刺激とのその相互作用を防ぎ、腫瘍形成シグナル伝達に対するその位置特定を変化させる。これらの条件において、活性なＥＧＦＲからのシグナル伝達が変更されて、腫瘍細胞に対して毒性となる可能性がある。
【００３４】
癌に関連するＥＧＦＲの変化
ＥＧＦＲの機能の変化は、頻繁におこり、様々な固形癌の発症機序に重要である。ＥＧＦＲは、抗癌剤の新規生成のための標的として、最も試験され、かつ最も有望な分子類のうちの一つである。これは、固形癌および発癌性を示す多くの種類が、この受容体の機能を変化させたことが理由である（３４）（２７）（３５）。最も頻度の高い変化は、過剰発現（３６, ３７）または特異的なアミノ酸の再修復(re-repair)または置換により生じる遺伝的変異（３８−４０）を包含する。ＥＧＦＲ機能が過剰発現または変異活性化により変化した場合、細胞内で生じる誇張されたシグナルが、腫瘍細胞の発生、維持および浸潤を導く（３４）。
【００３５】
固形腫瘍のほぼ４０−５０％が、遺伝子の変化により決定されるＥＧＦＲチロシン−キナーゼの活性の増悪に依存する。ＥＧＦＲの遺伝子変化の詳細な列挙には、以下が含まれる：（ｉ）該受容体の過剰発現を導く、ＥＧＦＲ遺伝子対の数の増加。神経膠腫および肺腫瘍は、頻繁にそのような遺伝子の増幅を示す（２０,２１）。しかしながら、胃癌に見られるように、遺伝子の増幅を伴わない、他の未だ不明のＥＧＦＲ過剰発現のメカニズムが存在する（３６,３７）。しかし、ＥＧＦＲ遺伝子増幅が稀であり、また稀であっても高い悪性度と関連するこの受容体の過剰発現を示すという胃癌で発生するような過剰発現が解明されないその他のメカニズムが存在する（１３,１４）；（ｉｉ）活動亢進したＥＧＦＲをもたらす突然変異；ａ）神経膠芽腫において最も重要である、リガンド結合のドメインに一致する細胞外領域を欠失により欠くＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異（４０）；ｂ）ロイシン８５８がアルギニンで置換されているＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異および保存配列ＬＲＥＡ（ＤｅｌＥ７４６−Ａ７５０；ＥＧＦＲＤｅｌ）を除去するエクソン１９の欠失を伴うＥＧＦＲＤｅｌＥ７４６−Ａ７５０、両突然変異は、受容体のチロシン−キナーゼドメインに影響し（ＥＧＦＲＴＫＤｍｕｔ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の１０−１５％に見られる（３８,３９）。
【００３６】
ＥＧＦＲの遺伝子の変化を有する細胞は、受容体から生じる悪化した（発癌性）シグナルに「中毒」になる。ＥＧＦＲの悪化した活性の阻害は、正常な細胞よりも癌細胞に損傷を与える。従って、ＥＧＦＲ機能の阻害剤は、現在、各腫瘍におけるＦＧＥＲの変化の同定後に個人化でき、かくして処置への応答を最適化する、標的化された癌治療を開発するためのパラダイムを構成している（２５）（４１）。
【００３７】
ある種の癌を処置するためにＥＧＦＲに対して現在使用されている薬物：
８０年代に開発されて、ＦＤＡに認可された最初の抗-ＥＧＦＲ薬には、２種のアンタゴニストが挙げられる（３５）。
（ｉ）リガンド結合を阻害するモノクローナル抗体（セツキシマブおよびパニツムマブ）。セツキシマブ（アービタックス；Merk KGaA, Darmstad, Germany；ＷＯ２００９０９９６４９）は、ＥＧＦＲに高い親和性で結合し、リガンド結合を競合的に妨害するモノクローナルヒト化抗体である。それは、また、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスおよび負の調節も誘導する。それは、主に、ＥＧＦＲを発現する進行した結腸直腸癌の処置に使用される（４２,４３）；（ｉｉ）エルロチニブおよびゲフィチニブなどの、ＥＧＦＲのチロシン−キナーゼを阻害する低分子（３５）（ＷＯ０３１０３６７６およびＷＯ２００５１１７８８７）。これらの薬物は、チロシンキナーゼドメインへの結合についてＡＴＰと競合する。これにより、増殖、生存および細胞遊走、癌の変容に関与するシグナル変換過程の阻害に至る。チロシンキナーゼ阻害剤は、転移ＮＳＣＬＣおよび結腸、頭頸部および膵臓の癌の処置に使用できる（２８,３５）。他のＥＧＦＲ機能を阻害する抗腫瘍剤の特許には、ＷＯ０３０９７８５５、ＵＳ５７９５８９８が含まれる。
【００３８】
個人化された治療の標的としてのＥＧＦＲ
ＥＧＦＲは、悪性細胞増殖を制御する細胞内シグナル伝達経路の不可欠な部分であるので（２３,３０）、標的化される個人化された治療のために最も研究された標的の一つとなっている（３５）。２つの注目に値する例は、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)および結腸癌であり、これらでは、ＥＧＦＲ発癌性突然変異の分析が、チロシンキナーゼ阻害剤を好都合に使用できるか否かを決定するのを助ける（４４-４６）。
【００３９】
ＮＳＣＬＣでは、患者の１０−２０％のみが、エルロチニブまたはゲフィチニブに応答し、全体的な生存率、進行のない生存率、症候およびクオリティーライフを有意に改善する（４７,４８）。セツキシマブはあまり有効ではない（４９）。応答性の患者は、チロシンキナーゼドメインに上述の突然変異のいずれかを有するＥＧＦＲＴＫＤｍｕｔ受容体を発現し、それは、発癌性をもたらすのみならず、受容体を薬物に対して感受性にする（３９,５０,５１）。エルロチニブまたはゲフィチニブによる処置に感受性のチロシンキナーゼドメイン（ＥＧＦＲＴｋＤｍｕｔ）の約９０％の変異とは、既に言及された位置８５８にてロイシンをアルギニンに置換すること（Ｌ８５８Ｒ；ＥＧＦＲ）、またはＬＲＥＡ保存配列を除くエクソン１９において削除することである（ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０；ＥＧＦＲＤｅｌ）（３９）。これらの変異は、構成的にＥＧＦＲチロシンキナーゼを活性化するのみならず、ルロチニブまたはゲフィチニブに関する親和性を増強し、処置に対する感受性を高めるようである（３９）。これらの患者は、１年あたり約８０％のうち８０−９０％生存率に近く、また２８ヶ月まで延び得る平均生存期間を示す（４４,４５,５２−５４）。これらの突然変異の同定は、８０−９０％に迫る応答と生存の改善を達成できる、処置の個人化を可能にする。
【００４０】
利用可能な抗ＥＧＦＲ薬の制限
ＥＧＦＲの発癌機能に対抗する現在の薬物の主な制限は、大部分が応答せず、最初は感受性の腫瘍に耐性が発生するために、比較的低い効力である。
証拠は、現在使用中の薬剤に対して深刻な制限も存在しているが、ＥＧＦＲが良好な抗腫瘍剤標的であることを示しており、その機能との干渉を補完する新規戦略へと研究を後押しすることを示す。
例えば、症例のほぼ８５−９０％を占める、エルロチニブまたはゲフィチニブに感受性のＥＧＦＲ突然変異に依存しないＮＳＣＬＣに罹患している患者には、与えるものは多くない。これは、これらの種類の阻害剤に応答しない他の癌にも該当する。さらに、最初はエルロチニブまたはゲフィチニブに応答する感受性の患者でさえ、腫瘍の増殖が６ヶ月ないし２年の間に回復することが頻繁に観察される。これらの耐性腫瘍のほぼ５０％が、チロシンキナーゼドメインのメチオニン７９０をスレオニンに置換する第二の突然変異を示し、これが、薬物とＡＴＰ結合部位の相互作用を妨害する。最近の研究は、今度はＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を阻害する新しい薬物を報告している（５５）。しかしながら、このことがキナーゼ阻害剤に共通の問題であるように、新しい薬物に対する耐性発生の可能性は依然として存続している（２９）。一方、耐性を発生するがＴ７９０Ｍ突然変異を持たない、さらに別の５０％の症例があり、そのメカニズムは不明のままである（５６−５８）。
【００４１】
これらの証拠全てが、ＥＧＦＲは抗腫瘍剤を設計するのに良好な標的であるが、既に使用されているものに対する代替的かつ補完的戦略を研究する必要があるということを示す。現在、同じ戦略に従いＥＧＦＲ機能、即ちリガンド結合またはチロシン−キナーゼ活性受容体の遮断を標的とする多くのその他の薬剤が試験されている（３５）。
【００４２】
抗腫瘍薬の標的としてのＥＧＦＲエンドサイトーシス
エンドサイトーシスは、ＥＧＦＲの機能を制御する様々な過程の中で重要である。
リガンド結合は、再処理を活性化させるＥＧＦＲの二量体化を誘導するか、またはリソソーム分解経路に参画する、このように分解の前にシグナル伝達に関する可変かつ制御された期間をすごす（５９,６０）。従って、エンドサイトーシスは、ＥＧＦＲシグナル伝達の減弱化および分別化の双方に対するメカニズムの制御を提供する。この重要な役割を理由に、エンドサイトーシスは、新規抗腫瘍治療を設計するという目的において、ＥＧＦＲ機能に対する薬理学的介入の良好な機会を提供するが、今までのところ、直接ＥＧＦＲに対する抗体により誘導されたエンドサイトーシスを単に対象とするのみである（６１）。
【００４３】
我々は、最近、タンパク質キナーゼＡの下方調節に向かうホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）の酵素活性のシグナル伝達経路（ＰＡ／ＰＫＡ経路）を含むＥＧＦＲエンドサイトーシスの制御の新しいメカニズムを記載した。ＰＡＰ酵素がＰＡをジアシルグリセロールに加水分解するので、このメカニズムは、ＰＡＰの薬理的阻害により開始させることができる。ＰＫＡ活性の低下は、ＰＡＰの低分子薬によるＥＧＦＲエンドサイトーシスの誘導において重要な過程である。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＥＧＦＲまたはその発癌性変異に依存する癌細胞の増殖を妨害するための、エンドサイトーシスの誘導に基づく新戦略としての、単独またはデシプラミンと組み合わせたＤ−プロプラノロールによるＰＡＰの阻害を記述する。
【００４５】
プロプラノロール（これは、ＤおよびＬプロプラノロールのラセミ混合物を表す）は、ベータ−アドレナリン受容体を発現する癌細胞の腫瘍増殖および転移の実験的弱化のために、ベータ−ブロッカーとして使用されたことがあり、従って、この活性の本質はＤ−プロプラノロールではなく、Ｌ−プロプラノロールに向けられている。これらの実験では、プロプラノロールは、ストレス条件による腫瘍形成を促進すると考えられるベータ−アドレナリンの刺激を単に防止するのみであり、むしろ物議をかもし出している（６２, ６３）。国際公開ＷＯ２００６／０１７１８５は、インビトロで抗増殖作用を示すいくつかの化合物を記述しており、この中ではデシプラミンが挙げられる。しかし、この刊行物は、デシプラミンが細胞増殖の減少を引き起こし得るメカニズムにはなんら言及していない。国際公開ＷＯ２００８／１１２２９７は、酵素酸スフィンゴミエリナーゼの阻害剤を記載しており、その中でデシプラミンを類似の化合物として挙げ、それが抗癌作用を有し得ると予測しているが、具体的な結果は報告されていない。
【００４６】
本発明の発明者らは、ラセミ混合物としてのプロプラノロールまたはＬ−およびＤ−プロプラノロールがＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導することを発表し、そのメカニズムがＰＡＰ阻害、ＰＡの増加および結果的に４型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４）の活性の増加を含み、ｃＡＭＰレベルの低下およびＰＫＡ活性の低下（６４）をもたらすことを示した。この新規制御システムは、ＥＧＦＲエンドサイトーシスを誘導し、その悪性度が発癌性のＥＧＦＲの機能に依存する腫瘍の増殖を低下させる新しい標的として、ＰＡＰを含むＰＡ／ＰＫＡ経路の様々な酵素を使用する可能性をもたらす。
【００４７】
本発明は、また、以下のさらなる観察に基づく：１）Ｌ−プロプラノロールのベータ−ブロッカー活性を欠くエナンチオマーのＤ−プロプラノロールおよびデシプラミンは、両方ともＰＡＰの阻害剤として使用され、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導する；２）Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンは、ＥＧＦＲ過剰発現およびＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異を含む、ＥＧＦＲの発癌性の変化を発現する癌細胞の増殖を阻害する。これらの薬物の効果は悪性細胞に選択的であり、非腫瘍細胞は比較的影響されないか、または弱く影響される。
【００４８】
Ｄ−プロプラノロールおよびベータ−ブロッカー活性を欠く類似体は、単独で、または、デシプラミンと組み合わせて、化学療法またはＥＧＦＲ阻害剤をベースとする処置を補完するために、また、現在の治療への耐性が既に発生している場合に単独の治療として、使用され得る。
【００４９】
本発明は、結腸、肺、乳房、前立腺、胃、頭頸部、肝臓の癌および神経膠芽腫を含む、悪性度がＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ２の発癌性変化に依存することが多い癌の処置に、新しい可能性を開く。
【００５０】
本願発明者は、ＰＫＡの阻害はＥＧＦＲの内在化を誘導するということを以前に立証してきた。より近年になって、ＰＡＰ酵素活性（ＰＡをジアシルグリセロールに加水分解する）を阻害することにより達成されたホスファチジル酸の増加は、ＰＫＡ阻害の効果を再生させて、リガンドの非存在下においてもＥＧＦＲ内在化をもたらすことを立証した。このメカニズムは、ｃＡＭＰレベルの低下およびＰＫＡ活性の低下（６４）をもたらすＰＡ介在性の４型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４）の活性化を含む。このＰＡ／ＰＤＥ４／ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達経路は以前に記載されたが、その機能は未知のままであった（６６）。研究者の結果は、このＰＡ／ＰＤＥ４／ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達経路が、エンドサイトーシスとリサイクリングの機構に作用して、ＥＧＦＲの細胞表面レベルを調節することを示す（６４）。
【００５１】
ＰＡＰ阻害剤（６６）として使用されるプロプラノロールおよびデシプラミンは、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導するＰＡ／ＰＤＥ４／ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達経路を活性化する（６４）。プロプラノロールおよびデシプラミンの使用は、臨床的処置におけるそれらの現行の使用とは完全に異なる。例えば、プロプラノロールは、Ｌ-プロプラノロールのベータ−ブロッカー活性を理由として高血圧を処置するために臨床的に使用される。デシプラミンは、鬱病の処置においてノルアドレナリンの再取り込みを阻害するために使用される。ＰＡＰ酵素活性に対する阻害効果は、クロロプロマジンおよびエスフィンゴシンを含むプロプラノロールおよびデシプラミンについて記述されている（６６, ６８）。しかし、血液濃度を遥かに超える（１−２μＭ）高濃度での（１０−７０μＭ）プロプラノロールおよびデシプラミンは、高血圧または鬱病治療中の患者において見られる。プロプラノロールは、現在、シグナル伝達、タンパク質輸送および細胞骨格機能などの様々な細胞の過程におけるＰＡおよびジアシルグリセロールの機能を研究するために、ＰＡＰ阻害剤として使用されている（６９）。
【００５２】
ＰＡが関与する様々なシグナル伝達経路の中で、ＰＡによるＰＤＥ４の活性化は、ｃＡＭＰレベルを低下させて、結果的にＰＫＡ活性の低下を導き、これが、そのベータ−ブロッカーの作用とは独立してプロプラノロールにより、そして、そのノルアドレナリン再取り込みへの作用とは独立してデシプラミンにより誘起される効果である（６６,６７）。
【実施例】
【００５３】
実施例
実施例１：ＥＧＦＲ内在化を誘導するＰＡＰ阻害剤として使用されるプロプラノロールおよびデシプラミン
図１の間接的免疫蛍光により、プロプラノロール（Ｌ−、Ｄ−ラセミ混合物）が、細胞表面から細胞内の主に核周囲の場所（それは、この種のエンドソームのマーカーであるトランスフェリンとの共局在により、リサイクリングエンドソームと定義された）へのＥＧＦＲの再分布を誘導することを示す（６４）。この効果は、メトプロロールおよびチモロールなどの他のベータ−ブロッカーにより、再現されないので、ベータ−遮断活性によるものではない。同様にＰＡＰ活性に対する阻害作用を有するデシプラミン（６６,６７）は、プロプラノロールのエンドサイトーシス効果を模倣する。
【００５４】
今までのところ、全ての既知のＰＡＰ阻害剤は、プロプラノロールおよびデシプラミンと同じ効果を誘起するため、本発明の範囲をあらゆるＰＡＰ阻害剤にまで拡張する。本明細書に示した結果は、例示に過ぎず、本発明の範囲を限定または制限しない。
【００５５】
近年、プロプラノロール（Ｌ/Ｄ）のラセミ混合物が、最高用量にて８０％となる３０分間、放射線リガンド１２５Ｉ-ＥＧＦの結合を低下させることが報告されている（６４）。
プロプラノロールにより誘導された放射線リガンド結合活性の低下は、本発明の基本の一つを示し、すなわちＥＧＦＲが細胞外リガンドに接近できないようにし、結果としてその発癌活性機能を低減させる。
【００５６】
実施例２：放射性リガンド結合によるＥＧＦＲエンドサイトーシスに対する、Ｌ-、Ｄ-プロプラノロールおよびデシプラミンの比較評価
本発明によりＥＧＦＲの発癌作用の妨害のために提唱される、ＰＡＰの阻害剤としてのプロプラノロールの効果は、インビトロで、ベータ−アドレナリンブロッカーとして報告されたものより、高い濃度を必要とする（６２,６３）。しかしながら、本願発明者らの結果は、Ｌ-プロプラノロールとＤ-プロプラノロールは細胞表面のＥＧＦＲを減らす能力において同等であり（図２,Ａ）、両方とも約７５−１００μＭのＥＣ５０であったことを示す。
【００５７】
臨床において使用されるプロプラノロール（ＬおよびＤラセミ混合物）のベータ遮断効果は、Ｌ−プロプラノロールの効力にのみ頼るものである（７０）。Ｄ−プロプラノロールもまた、報告されるＰＡＰ阻害剤であるが、高用量にて使用され得る（６７）。
【００５８】
デシプラミンも、約２０μＭのＥＣ５０で、放射性リガンド結合の減少を誘導するのに有効である（図２Ｂ）。デシプラミン（２０μＭ）とプロプラノロール（７５μＭ）のＥＣ５０の組合せは、１２５Ｉ−ＥＧＦ結合アッセイで評価される通り（図２ＣおよびＤ）、７５−８０％のＥＧＦＲを細胞表面から減らす。
【００５９】
従って、Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンの組合せは、ＥＧＦＲまたはエンドサイトーシスを介するその発癌性突然変異に依存する癌の処置に、各々の薬剤単独よりもより有効であり得る。
【００６０】
実施例３：ＥＧＦＲおよびその発癌性変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩに依存する様々な増殖速度を有する腫瘍細胞モデル
ヒト神経膠芽腫由来の細胞株Ｕ８７は、低レベルのＥＧＦＲ（データは示さない）を発現し、突然変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するように形質移入されると、増殖速度が非常に高まる（図３）。
これらの細胞は、薬物を試験するのに適当な実験モデルを提供する。使用した他のモデル系は、高レベルのＥＧＦＲを発現するがＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しない（データを示す）患者から直接得られた神経膠芽腫多形細胞（ＧＢＭ１）であった。
【００６１】
実施例４：培養中の神経膠芽腫細胞におけるＤ−プロプラノロールとデシプラミンの抗腫瘍効果
ＥＧＦＲ依存性の腫瘍細胞の増殖および生存能に関する阻害剤としてＤ−プロプラノロールとデシプラミンの効果を、培養中の神経膠芽腫細胞において実証した。
１日に２回、６０分間、細胞培養物に投与したＤ−プロプラノロール（６０μｌ）単独およびデシプラミン（２μＭ）との組み合わせは、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞と同じように、Ｕ８７細胞の増殖および生存能の双方を阻害する（図４）。
【００６２】
Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンの組合せに対する感受性は、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞においてより高い。選択性の対照として、この実験は、低レベルのＥＧＦＲを発現し、悪性ではないイヌの腎臓上皮性細胞株のＭＤＣＫ細胞（３３）が、薬物単独によっては影響を受けず、この組合せた処置によりそれらの生存能が２０％低下したことを示す。これらの結果は、腫瘍形成変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現により増える神経膠芽腫細胞における治療の選択性を提示する。
【００６３】
実施例５
増殖および細胞生存能を阻害するために、有意な低濃度を、長期的処置に使用した。２μＭという低濃度のプロプラノロール（プロプラノロールによる高血圧の処置中の患者の血漿に記載されたものの２倍にすぎない）と０.６μＭデシプラミン（血漿において記載されたものの半分）は、この発癌性突然変異を発現しない細胞に大きく影響を与えずに、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞で顕著な効果を達成する（図５）。
【００６４】
両薬物の組合せに関する驚異的な結果は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌について、臨床学的に許容された用量を使用することを可能にする。
【００６５】
まとめると、Ｄ−プロプラノロール（および、ベータ−ブロッカー活性を欠く類似体）およびデシプラミンは、単独で、または組み合わせて、過剰発現（ＢＭＢ１など）または突然変異（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）により与えられるＥＧＦＲの発癌性の変化に悪性度が依存する癌の処置に有用である。
【００６６】
本発明の範囲は、肺癌で記載されたものなどの他の発癌性ＥＧＦＲ変異体、または他のファミリーのメンバー（例えば、ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）を発現する癌に、そして既知の他のＰＡＰ阻害剤（スフィンゴシンおよびクロルプロマジン）に及ぶ。
【００６７】
図面の詳細な説明
図１：プロプラノロールおよびデシプラミンは、培養中の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導する：
免疫蛍光画像は、Ｈｅｒａ対照細胞および目的の薬剤により３０分間処理された細胞におけるＥＧＦＲの分布を示す。プロプラノロール（７５μＭ）およびデシプラミン（７５μＭ）は、細胞の境界線を染色により示される細胞表面（対照）から、小胞および核周辺の染色により示される細胞内区分へと、受容体の分布における変化を誘導する。メトプロロール（５０μＭ）およびチモロール（５０μＭ）、すなわち他のβアドレナリンブロッカーは効果を示さない。
【００６８】
図２：エナンチオマーＬおよびＤ-プロプラノロール並びにデシプラミンは、放射性リガンド結合により測定される細胞表面でのＥＧＦＲの利用可能性を低下させる：
事前に４時間にわたり血清を除いたＨｅＬａ細胞を、示した用量の様々な薬物で３０分間処理し、次いで、細胞を２０ｎｇ／ｍｌ１２５Ｉ−ＥＧＦと共に４℃で１時間インキュベートして放射性リガンド結合アッセイを実施し、細胞表面のＥＧＦＲを検出した。Ａ. Ｌ−およびＤ−プロプラノロールは、７５μＭ（ＥＣ５０）の濃度で約５０％、２５０μＭで８０％の細胞表面のＥＧＦＲの減少を反映して、１２５Ｉ−ＥＧＦ結合の低下を引き起こした。Ｌ−およびＤ−プロプラノロールの作用は、区別がつかない；Ｂ. デシプラミンも、ＥＣ５０約２０−２５μＭで、放射性リガンド結合レベルの低下を誘導した；Ｃ. 様々な濃度のＤ−プロプラノロール（上の目盛り）とデシプラミン（下の目盛り）の組合せ；Ｄ. 各々のＥＣ５０で使用されたＤ−プロプラノロール（７５μＭ）およびデシプラミン（２５μＭ）の組合せは、１２５Ｉ−ＥＧＦ結合の約７５％の減少を引き起こした。
【００６９】
図３：異なる増殖速度を有する腫瘍細胞モデルとしての、神経膠芽腫細胞Ｕ８７および発癌性突然変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を過剰発現するように形質転換されたＵ８７
１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したＭＥＭ培地を有する２４ウェルプレートに、１０,０００個の細胞を播いた。プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｙｃで永続的に形質移入されたＵ８７細胞（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、Ｕ８７細胞よりも高い増殖を示す。
【００７０】
図４：腫瘍神経膠芽腫細胞Ｕ８７、Ｕ８７-ＥＧＦＲｖＩＩＩ並びに正常上皮ＭＤＣＫ細胞の生存能に対する、非連続処置におけるＤ-プロプラノロールおよびデシプラミンの効果
５０００個の細胞（Ｕ８７、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＭＤＣＫ）を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したＭＥＭ培地を有する９６ウェルプレートに播いた。６０μＭ Ｄ−プロプラノロール（Ｐｒｏｐ）、２μＭ デシプラミン（Ｄｅｓ）または両者の組合せを用いて、３日間にわたり、１日２回、１時間処理を行なった。クリスタルバイオレット比色分析により評価された細胞生存能を、非処理細胞（対照）の％として表現した。各薬物は、ＭＤＣＫではなくＵ８７およびＵ８７-ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の生存能を約６０％低下させる。両者の薬物の組み合わせは、特にＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対してより有効性が高く、それらの９５％以上が死滅するが、一方ＭＤＣＫ細胞はたった２０％しか低下しない。
【００７１】
図５：低濃度のＤ-プロプラノロールおよびデシプラミンによる継続的処置は、過剰増殖したＵ８７-ＥＧＦＲｖＩＩＩならびにＥＧＦＲを過剰発現する神経膠芽腫細胞ＧＢＭ１細胞を選択的に阻害する。
ウェル当たり２,０００個の細胞（Ｕ８７、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＤＣＫおよびＧＢＭ１）を播いた後に、同じ条件下で２４時間、図３のとおりに培養し、この培地を、指定の薬剤、２μＭ Ｄ−プロプラノロール（Ｐｒｏｐ）または０．６μＭデシプラミン（Ｄｅｓ）または両者の組合せで含むか、または含まない（対照）培地で置き換え、培地を６日間にわたり２４時間ごとに交換した。細胞生存能をクリスタルバイオレット比色分析により評価し、また非処理対照と比較した％として表した。Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンの組み合わせにより、生存能がＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対してほぼ５倍、そしてＧＢＭ１細胞については半分低下し、一方Ｕ８７細胞は１０％まで低下し、ＭＤＣＫは影響を受けなかった。
【００７２】
図６：ＥＧＦＲに依存する癌を処置するための、Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンの作用に基づく新しい戦略：
リガンド結合またはチロシンキナーゼ活性を阻害することを試みてＥＧＦＲ分子を直接的に標的とする現在の戦略とは対照的に、本発明は、ＰＡＰを阻害し、ＰＡ／ＰＫＡシグナル伝達経路を活性化する薬物により媒介される受容体のエンドサイトーシスを誘導し、それにより、細胞表面からエンドソームへのＥＧＦＲの再局在化を誘導することを提唱する。
【００７３】
技法の説明
試薬および抗体
組み換えヒトＥＧＦは、Invitrogen (Carlsbad, CA) から、タンパク質Ａ−セファロース、プロプラノロールおよび高グルコースＤＭＥＭは、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) から、ウシ胎児血清は、Hyclone Laboratories (Logan, UT) から、細胞培養試薬は、Invitrogen および Sigma Aldrich から、組織培養用のプラスチックプレートは、Nalge Nunc (Naperville, IL) から購入した。アメリカ培養細胞系統保存機関（the American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA）から購入したハイブリドーマＨＢ８５０６の培養培地を、ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の供給源として使用した。ＥＧＦＲのカルボキシル末端ドメインに対するウサギモノクローナル抗体は、Millipore から購入した。
【００７４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ癌遺伝子の発現用プラスミドの構築
（６５）に記載のｐＢＫ−ＣＭＶベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩ部位の間にクローニングしたＥＧＦＲのｃＤＮＡを、発癌性変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現ベクターの構築に使用した。最初に、エクソン１−２および７−２８に相当するＰＣＲ断片を、第１の断片用にＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶの、第２の断片用にＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩの制限部位を含むプライマーを使用して得た。これらの断片を連結した後、エクソン２−７を欠くＥＧＦＲｖＩＩＩに相当する新しい断片を得て、次いで、ｐｃＤＮＡ３.１およびｐｃＤＮＡ３.１ｍｙｃベクターのＫｐｎＩおよびＸｂａＩ部位の間にクローニングし、ベクターｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｙｃを各々得た。両コンストラクトを、配列解読により分析した。
【００７５】
細胞培養および形質移入
放射性リガンド結合アッセイおよびＥＧＦＲのエンドサイトーシスの研究に使用したＨｅＬａ細胞は、我々の研究室で以前に特徴解析した（３３,６４,６５）。この細胞を、約８０％のコンフルエンスまで増殖させ、試験前に血清なしで２時間維持した。ＡＴＣＣから購入したＵ８７ヒトハイブリドーマ細胞を増殖させ、ｐｃＤＮＡ３.１−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｙｃで形質移入した。形質移入は、製造業者（Invitrogen）の指示に従いリポフェクタミン法により行なった。１００,０００個のＵ８７細胞を１５ｍｍプレートに播き、播いてから４８時間後に、細胞を１μｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｙｃで形質移入した。形質移入の４８時間後に、選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、抗生物質（１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）および０.８ｍｇ／ｍｌジェネテシンを添加）を加えた（G418, Sigma）。選択培地中で２週間後、永続的に形質転換された細胞を得て（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＧＦＲの細胞質ドメインに対するウサギモノクローナル抗体（Millipore）を用いて、間接的な免疫蛍光により分析した。
【００７６】
多形神経膠芽腫と診断された患者の生検組織からＧＭＢ１細胞を得た。腫瘍の生検組織は、約１ｃｍであった。それをＰＢＳで４回洗浄し、細かく切断し、継続的に撹拌しながら、０.１２５％トリプシン、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中、１５分間、３７℃でインキュベートした。パスツールピペットによる機械的破砕後に、卓上遠心機で、１２００ｒｐｍで１０分間、細胞を遠心分離した。ペレットを、オボムコイド阻害剤（１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅＩ（１ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ２ｍｌで再懸濁し、１０分間１２００ｒｐｍで再度遠心分離した。細胞をＮＨ４Ｃｌ／Ｔｒｉｓ ｐＨ７.２に再懸濁し、５分間３７℃でインキュベートし（５０００万個の細胞に５ｍｌ）、１０分間、１２００ｒｐｍでの遠心分離によりペレットにし、最終的に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに再懸濁し、培養した。これらの細胞を少なくとも１０回の継代にわたり維持した。
【００７７】
培養した腫瘍細胞のインビトロの増殖および生存能、並びに、Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンによる処理の評価
Ｕ８７、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＤＣＫおよびＧＭＢ１細胞を、２０００−５０００個／ウェルの密度で（対応する図に示したとおり）、２４ウェルプレートに播き、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。培地を、２４時間で交換して、連続的および間欠的様式で処理した。間欠的処置は、該細胞を、６０μＭ Ｄ-プロプラノロール（Ｐｒｏｐ）または２μＭ デシプラミン（Ｄｅｓ）を別々にて、または６０μＭ Ｄ-プロパノロール（Ｐｒｏｐ）と２μＭ デシプラミン（Ｄｅｓ）の組み合わせにて、３日間、１日に２回、１時間インキュベートして行なわれる。該細胞を、２−３０μＭ Ｄ-Ｐｒｏｐ、０．６−１μＭ Ｄｅｓまたは両者薬物の組み合わせと共にインキュベートすること、該培地を２４時間毎に替えることからなる。各対照は、培養培地のみを受容した。細胞の生存能を、５５０ｎｍの光学密度でクリスタルバイオレット比色分析アッセイによるか（この強度は、プレートに付着した細胞数に比例する）、または直接的に細胞を自動細胞計測器（Countess, Invitrogen）で計数することにより評価した。
【００７８】
間接免疫蛍光
カバーガラス上で増殖させたＨｅＬａ細胞を、冷リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＥＧＦＲを細胞表面に蓄積させるために、無血清ＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ培地中、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、０.１ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ−ＣＭ）中の４％パラホルムアルデヒドで、３０分間室温で固定した。ＰＢＳプラス０.２％ゼラチン（300 Bloom, Sigma Aldrich, PBS-CM-G）で各回５分間、３回洗浄した後、細胞を０.２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、１０分間、室温で透過処理し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＨＢ８５０６（ＰＢＳ-ＣＭ-Ｇ中で１／１００）と１時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳ−ＣＭ−Ｇで少なくとも６回洗浄した後、細胞を、Alexa488 に結合させた二次抗体抗マウスＩｇＧ（１／１０００希釈）と、１時間室温でインキュベートした。記載された通りに（６４）、油浸対物レンズ Plan-Apochromat 63X/1.4 および Zeiss Axiocam カメラを備えた Zeiss Axiophot 顕微鏡で蛍光のデジタル画像を得、画像化ソフトウエア AxioVision (Zeiss, Thorn-wood, NY) を動かしているコンピューターワークステーションで１４ビットに変換した（６４）。
【００７９】
リガンド結合アッセイおよびエンドサイトーシス速度定数
放射性リガンド１２５Ｉ−ヒトＥＧＦを、クロラミンＴ法により、記載された（７１）通りに調製し、比活性５００００−７００００ｃｐｍ／ｎｇを得た。記載された（６５）通りに、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むハンクス液中、２時間、４℃で、結合アッセイを実施した（６５）。４ｈ  血清を除いたＨｅＬａ細胞を、３０分間、指定用量の様々な薬物で処理し、次いで、２０ｎｇ／ｍｌ １２５Ｉ−ＥＧＦと、４℃で、結合培地（ＭＥＭ−ハンクス、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０.２％ＢＳＡ ＲＩＡ等級）中、１時間しっかりと撹拌した。細胞を１Ｎ ＮａＯＨで２時間、室温で溶解させ、トリプリケートの各サンプルのカウント毎分をガンマカウンターで測定した。過剰（５００倍）のコールドリガンドとのインキュベーションにより得られる非特異的結合のポイントを含めて測定し、その値を各サンプルから差し引いた。飽和条件での放射性リガンド結合は、細胞表面のＥＧＦＲの量の推定値を提供する。
【００８０】
本発明の癌処置のための新規戦略の概要
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、４つのメンバーを含むチロシンキナーゼ受容体ファミリーＥｒｂＢ／ＨＥＲ（ＥｒｂＢ１−４またはＨＥＲ１−４）に属する。ＥＧＦＲは、少なくとも６つの異なる特異的リガンドにより活性化され、細胞の状況に応じて、各過程または細胞増殖、分化、生存、遊走およびアポトーシスを促進できる細胞内シグナルを広める。全てのこれらの過程は、発癌の間に変化し、頻繁に、ＥＧＦＲ過剰発現または活動亢進性の突然変異により決定される、発癌性機能不全に関連する。この理由から、ＥＧＦＲは、直接的および個人化された抗腫瘍療法の新しい薬物および戦略を開発するために、重要な標的となる（２５）（４１）。腫瘍細胞は、正常細胞よりも高いＥＧＦＲ阻害剤への感受性に反映される通り、そのような変化したＥＧＦＲから発せられる発癌性シグナルに文字通り「中毒」になる。処置は、ＥＧＦＲの発癌性の変異を検出するために、腫瘍の分析により、個人化および最適化できる。今まで、戦略は、抗体によるリガンド結合または低分子による受容体チロシン−キナーゼ活性いずれかの阻害を試みて、薬物をＥＧＦＲ分子自体に向けることに集中してきた。臨床使用されている薬物には、リガンド結合を妨害するヒト化モノクローナル抗体（例えばセツキシマブ）、および、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性部位へのＡＴＰ結合に競合し、その活性を阻害する薬物（ゲフィチニブおよびエルロチニブ）が含まれる。臨床データは、ＥＧＦＲが抗腫瘍処置の直接的なおよび個人化の良好な標的であるという概念を支持するが、この種の薬物の効力は限定されており、通常、感受性の患者の小さい下位群に限られる（３５）。加えて、キナーゼ阻害剤に一般的な問題は、処置への耐性を与える突然変異の比較的頻繁な出現である。従って、現在使用されているものと異なり、それを補足する作用メカニズムの、新しい医薬を持つ必要がある。
【００８１】
我々の発明は、エンドサイトーシスによる内在化を介する細胞表面からのＥＧＦＲ除去の薬理学的誘導のために低分子薬を使用する、すなわち、細胞外の活性化刺激へのその到達性を低下させ、既に活性な受容体のシグナル拡散の細胞内局在を変化させる革新的な戦略を提唱する。両者の選択肢が、細胞表面での過剰なＥＧＦＲシグナル伝達活性を悪性度の基礎とする腫瘍細胞にとって有害であり得る。ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導する薬は、ＥＧＦＲに依存する腫瘍悪性細胞の増殖および生存能を阻害できる。この戦略（図５に記載）は、新規である。これは、我々の研究室で得られた実験データに基づくので、以前に使用されたことがない。
【００８２】
エンドサイトーシスは、ＥＧＦＲの機能において重要な役割を担う。ＥＧＦＲが細胞表面上でそのリガンドに結合すると、まず活性化されて、その後エンドサイトーシスがおこり、細胞表面上で循環中に様々な時点で活性化を維持し、そのシグナル伝達を終結させる分解経路へと最終的に振り分けられる（５９）。我々は、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）活性の阻害剤として使用されるプロプラノロール（ＬおよびＤプロプラノロールのラセミ混合物）が、リガンドから独立して、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスおよび細胞内蓄積を誘導することを立証した（６４）。我々は、また、この作用が、４型ホスホジエステラーゼ（PDE4）を活性化するホスファチジン酸（ＰＡ）の増進を含むシグナル伝達経路に依存し、ｃＡＭＰの減少および結果的なＰＫＡ活性の低下を導くことも示した。ＰＡＰ阻害によるＰＡ／ＰＫＡシグナル伝達経路の活性化後、ＥＧＦＲは内在化し、かくして、外部の分裂促進的刺激に接近不可能になる。これらの観察は、過剰発現を含むＥＧＦＲの発癌性変化に依存する癌の大部分の悪性度に対抗する新しい医薬製剤を設計するために、このＰＡ／ＰＫＡシグナル伝達経路を使用する可能性を開く。
【００８３】
この戦略の実行可能性は、我々のさらなる結果により立証される。我々は、両者ともＰＡＰ阻害剤として使用されるＤ−プロプラノロール（ベータ−ブロッカー活性を欠く）およびデシプラミンが、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導するのみならず、ＥＧＦＲ（患者由来の神経膠芽腫細胞ＧＢＭ１）または発癌性変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩを形質移入されたＵ８７細胞）を過剰発現する腫瘍の癌細胞の増殖を阻害し、生存能を低下させることを観察した。Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンの組合せは、より有効な結果をもたらす。
【００８４】
本発明は、ＥＧＦＲの他の発癌性変異体またはＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーの他のメンバー（例えば、ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）を発現する癌に及ぶ。それは、また、既知の化合物（例えばスフィンゴシンおよびクロルプロマジン）でも、将来現れるかもしれない他の新化合物でも、ＰＡＰの阻害作用を有する他の化合物に拡張できる。本発明で提唱されるＰＡＰ阻害剤は、様々な癌の処置に使用できる。これは、頭頸部、肺、胃、乳房、肝臓、前立腺、卵巣の癌および神経膠芽腫を含む。本発明により提唱される処置は、他の処置を補足できるか、または、化学療法またはＥＧＦＲ阻害薬への耐性がすでに生じている場合、唯一無二のものであり得る。
【００８５】
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