【事件の表示】
　特許第２７９８６７４号「ヒトインターフェロンベータを生産する動物細胞の作成方法」の請求項１ないし１０に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７９８６７４号の請求項１乃至２に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第2798674号の請求項1-10に係る発明についての出願は、昭和63年4月13日に出願（パリ条約による優先権主張、1987年4月14日、独国）され、平成10年7月3日にその発明について特許の設定登録がされ、その後、その特許について、異議申立人バイオジェン インコーポレイテッドにより特許異議の申立てがなされ、取り消し理由通知がなされ、その指定期間内に訂正請求がなされた後、再度取り消し理由通知がなされ、その指定期間内である平成13年10月5日に訂正請求がなされたものである。
２．訂正請求について
（１）訂正の内容
　本件訂正請求は、本件特許請求の範囲を訂正請求書に添付された訂正明細書のとおり訂正することを求めるものであり、具体的には、
ア．特許請求の範囲の請求項１−５、８−１０を削除し、請求項６，７をそれぞれ繰り上げ、請求項１，２とする。
　すなわち、特許請求の範囲を下記の通り訂正するものである。
「【請求項１】図２に示す制限酵素地図を備える組換えＤＮＡ分子ｐＳＶtss-ＡsuＩＮＦ（ＤＳＭ4078P）をトランスフェクションすることにより得られる、ヒトインターフェロン−β１を産生する組換え細胞ラインＢＩＣ８６２２（ＥＣＡＣＣ８７０４０３０１）。
【請求項２】特許請求の範囲第１項記載の組換え細胞ラインを培養し、細胞分泌物からインターフェロン−β１を単離する、ヒトインターフェロン−β１の構成的生産方法。」
（２）訂正の適否についての判断
ア．特許請求の範囲の訂正
　上記訂正は、請求項１−５，８−１０を削除することであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであり、請求項６，７を請求項１、２に繰り上げる訂正は明りょうでない記載の釈明に該当する。
イ．特許請求の範囲の拡張または変更
　さらに、上記の訂正は、実質上特許請求の範囲を拡張または変更するものでもない。
（３）独立特許要件
（引用刊行物）
　当審が平成12年10月27日付けで通知した取消理由で引用した刊行物は、以下のものである。
刊行物１：ＤＮＡ, Vol.3, No.4, (1984), p.287-308
刊行物２：Nucleic Acids Research, Vol.9, No.11, (1981), p.2495-2507
刊行物３：R.W.オールド, S.B.プリムローズ共著, 関口睦夫監訳,「遺伝子操作の原理」(1983-9-10)　P.150-153, P.274
刊行物４：Nucleic Acids Research, Vol.13, No.12, (1985), p.4417-4429
刊行物５：Arzneim.-Forsch./Drug Res., Vol.37, No.1, (1987), p.482-485
刊行物６：J. Biol. Chem., Vol.262, (1987), p.14600-14604
（証拠の内容）
　刊行物１には、特許異議申立人の提出した特許異議申立書「4.申立の理由　証拠甲第１号証」の欄に記載したとおりの発明が、刊行物２には同「甲第２号証」の欄に記載したとおりの発明が、刊行物４には同「甲第４号証」の欄に記載したとおりの発明が、刊行物５には同「甲第５号証」の欄に記載したとおりの発明が、刊行物６には同「甲第８号証」の欄に記載したとおりの発明が、また刊行物３には、（ａ）「Changら(1980) Shepardら(1982)およびGheysenら(1982）によってプロモーターとATGコドンとの間の配列が遺伝子発現の強さに影響を与えることが確認された。」（P.150 下から７行目?５行目）,（ｂ）「遺伝子発現を最大限にする方法が提案されている。それは遺伝子とプロモーターの間が少しずつ違った距離をとるようなクローンのバンクを作成し、その中から最も高い収量を示す組換え体クローンを選択するというものである。」（P.152  1-3行目）、（ｃ）刊行物４には「クローン化遺伝子の末端に転写終結信号が存在することが重要であること、その理由として転写物の中に好ましくない二次構造が形成され翻訳の効率を減少させることになる。」（P.157　14-17行目）、また（ｄ）「SV40の初期遺伝子を　他の配列に置き換えるとウイルスの複製に必須なＴ抗原が失われるため、　これを外から補う必要がある。SV40ベクターの開発上でのこの大きな問題は、COS細胞株を用いるとこのＴ抗原が補われることが分かり解決した。」（P.274 ３-６行目）が記載されている。
（対比・判断）
ア．訂正明細書の請求項１に係る発明（以下「本件請求項１に係る発明」と　　いう）について。
　本件請求項１に係る発明」と刊行物１−６に記載された発明とを対比すると、刊行物１−６のいずれにも、本件請求項１に係る発明を特定するための事項である、図２に示した制限酵素地図を備える組換えＤＮＡ分子ｐＳＶtss-ＡsuＩＮＦ（DSM4078P）をトランスフェクションすることにより得られる、ヒトインターフェロン−β１を産生する組換え細胞ラインＢＩＣ８６２２（ＥＣＡＣＣ８７０４０３０１）が記載されていない。
　そして、当該組換え細胞ラインを用いることにより本件請求項１に係る発明は、従来（特に刊行物１に記載）のヒトインターフェロン−β１産生組換え細胞ラインと比較して、時として数倍にも及ぶ顕著に優れたヒトインターフェロンβ１産生能を有するという顕著な効果を奏するものであり、本件請求項１に係る発明は、上記刊行物１−６記載のものから当業者が容易に想到し得たものではない。また、当審が通知した平成12年10月27日付け取消理由通知に記載した理由によっても、本件請求項１に係る発明が、特許出願の際独立して特許を受けることができないものとはいえない。
イ．本件請求項２に係る発明について。
　本件請求項２に係る発明は、本件請求項１に係る発明である組換え細胞ラインＢＩＣ８６２２（ＥＣＡＣＣ８７０４０３０１）を用いることを特徴する発明であり、該細胞を培養して細胞分泌物からヒトインターフェロンβ１を単離することを特徴とするヒトインターフェロンβ１の生産方法である。それゆえ、本件請求項２に係る発明を特定する事項は、本件請求項１と同様、図２に示した制限酵素地図を備える組換えＤＮＡ分子ｐＳＶtss-ＡsuＩＮＦ（DSM4078P）をトランスフェクションすることにより得られる、ヒトインターフェロン−β１を産生する組換え細胞ラインＢＩＣ８６２２（ＥＣＡＣＣ８７０４０３０１）であり、これは刊行物１−６のいずれにも記載されていない。
　そして、本件請求項２係る方法は、従来の方法とを比較して、ヒトインターフェロンβ１を効率的に生産するいう顕著な効果を奏するものである。
　したがって、本件請求項２に係る発明は、上記刊行物１−６記載のものから当業者が容易に想到し得たものではなく、また、当審が通知した平成12年10月27日付け取消理由通知に記載した理由によっても、本件請求項２に係る発明が、特許出願の際独立して特許を受けることができないものとはいえない。
（４）むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２−４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
３．特許異議の申立について
ア．本件発明
　本件請求項１，２に係る発明は、その特許請求の範囲の請求項１、２に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。
【請求項１】図２に示す制限酵素地図を備える組換えＤＮＡ分子ｐＳＶtss-ＡsuＩＮＦ（ＤＳＭ4078P）をトランスフェクションすることにより得られる、ヒトインターフェロン−β１を産生する組換え細胞ラインＢＩＣ８６２２（ＥＣＡＣＣ８７０４０３０１）。
【請求項２】特許請求の範囲第１項記載の組換え細胞ラインを培養し、細胞分泌物からインターフェロン−β１を単離する、ヒトインターフェロン−β１の構成的生産方法。
イ．申立ての理由の概要
　特許異議申立人バイオジェン，インコーポレイテッドは、下記の証拠を提出し、訂正前の本件請求項１−７に係る発明は、甲第１−１０号証の発明に基いて当業者が容易に発明することができた発明である。したがって、訂正前の本件請求項１−７に係る発明は、特許法第２９条第２項規定する発明に該当し、上記各発明に係る本件特許は同法第１１３条第１項第２号の規定により取り消されるべきものである（以下、申立理由１という）。
　さらに、訂正前の本件請求項８−１０に係る発明は、甲第１−１０号証に記載された発明であるか、少なくとも甲第１ー１０号証に記載の発明に基いて当業者が容易に想到し得た発明である。したがって、請求項８−１０に係る発明は、特許法第２９条第１項第３号もしくは第２項の規定に該当し、上記各発明に係る本件特許は、同法第１１３条第１項第２号の規定により取り消されるべきものである（以下、申立理由２という）。
　また、同じく訂正前の本件請求項８−１０に係る発明は、本件明細書に当業者がその実施をすることができる程度に明確且つ十分に記載されていないから、請求項８−１０に係る発明は、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない。したがって、上記各発明に係る本件特許は、同法第１１３条第１項第４号の規定により取り消されるべきものである（以下、申立理由３という）旨主張する。
　　　　　　　　　　　　　　　　　記
甲第１号証：ＤＮＡ, Vol.3, No.4, (1984), p.287-308
甲第２号証：Nucleic Acids Research, Vol.9, No.11, (1981), p.2495-2507
甲第３号証：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.79, (1982)　P.4897-4901
甲第４号証：Nucleic Acids Research, Vol.13, No.12, (1985), p.4417-4429
甲第５号証：Arzneim.-Forsch./Drug Res., Vol.37, No.1,(1987), p.482-485
甲第６号証：Molecular and Cellular Biology, Vol.14, No.1, (1984), p.166-172
甲第７号証：J. Biol. Chem., Vol.263, No.33, (1988), p.17508-17515
甲第８号証：J. Biol. Chem., Vol.262, (1987), p.14600-14604
甲第９号証：Research Reference Reagent Note No.36, National Institutes of Health, (1992), p.1-4
甲第１０号証：Werner Meierの第１の宣誓書
ウ．申立理由１について
（甲号各証の概要）
　甲第１，２，４，５，８号証は、先の刊行物１，２，４，５，６と同じであり、甲第３，６，７，９，１０号証には特許異議申立人の提出した特許異議申立書「４．申立の理由　証拠甲第３，６，７，９，１０号証」の欄に記載したとおりの発明が記載されている。
(対比・判断)
　まず、訂正により、訂正前の請求項１−１０は前記のとおり本件発明１、２に訂正された。
　そこで、本件請求項１、２に係る発明と甲第１ー１０号証に記載された発明とを対比すると、甲第１−１０号証のいずれにも、本件請求項１、２に係る発明を特定するための事項である、図２に示した制限酵素地図を備える組換えＤＮＡ分子ｐＳＶtss-ＡsuＩＮＦ（DSM4078P）をトランスフェクションすることにより得られる、ヒトインターフェロン−β１を産生する組換え細胞ラインＢＩＣ８６２２（ＥＣＡＣＣ８７０４０３０１）が記載されていない。
　そして、当該組換え細胞ラインを用いることにより本件請求項１、２に係る発明は、従来（特に甲第１号証に記載）のヒトインターフェロン−β１産生組換え細胞ラインと比較して、時として数倍にも及ぶ顕著に優れたヒトインターフェロンβ１産生能を有するという顕著な効果を奏するものであり、本件請求項１、２に係る発明は、上記甲第１−１０号証記載の発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
エ．申立理由２について
　本件請求項１、２に係る発明と甲第１ー１０号証に記載された発明とを対比すると、甲第１−１０号証のいずれにも、本件請求項１、２に係る発明を特定するための事項である、図２に示した制限酵素地図を備える組換えＤＮＡ分子ｐＳＶtss-ＡsuＩＮＦ（DSM4078P）をトランスフェクションすることにより得られる、ヒトインターフェロン−β１を産生する組換え細胞ラインＢＩＣ８６２２（ＥＣＡＣＣ８７０４０３０１）が記載されていない。
　そして、当該組換え細胞ラインを用いることにより本件請求項１、２に係る発明は、従来（特に甲第１号証に記載）のヒトインターフェロン−β１産生組換え細胞ラインと比較して、時として数倍にも及ぶ顕著に優れたヒトインターフェロンβ１産生能を有するという顕著な効果を奏するものであり、本件請求項１、２に係る発明は、上記甲第１−１０号証記載の発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
オ．申立理由３について
　訂正により、訂正前請求項８ー１０を削除する訂正がなされたのであるから、申立理由３に関する点は解消された。
　したがって、申立人の主張はいずれも採用できない。
４．まとめ
　以上のことから、前記取消理由並びに特許異議申立の理由及び提出された証拠方法によっては、本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年１月２１日（２００３．１．２１）
【訂正の要旨】
訂正の事項
　特許第２７９８６７４号発明の明細書を、請求書に添付された訂正明細書のとおりに、すなわち、特許第２７９８６７４号発明に係る明細書中の特許請求の範囲の請求項１〜１０において、特許請求の範囲の減縮を目的として、もとの請求項１〜５及び８〜１０を削除し、請求項６を独立項形式に書き換えて新たに請求項１とし、残る請求項７の項番号を繰り上げて、請求項２と訂正します（クレーム対応表参照）。
　これに伴い、従属関係の整合を図るため、特許時の請求項７（訂正後の請求項２）の「第２〜６項のいずれかに記載の」という記載を「第１項記載の」と訂正します。
（５４）【発明の名称】
ヒトインターフェロンベータを生産する動物細胞の作成方法
（５７）【特許請求の範囲】
（
１
図２に示す制限酵素地図を備える組換えＤＮＡ分子ｐＳＶｔｓｓ￣ＡｓｕＩＦＮ（ＤＳＭ４０７８Ｐ）をトランスフェクションすることにより得られる、ヒトインターフェロン−β１を産生する
（
２
１項
【発明の詳細な説明】
　〔発明の概要〕
　動物宿主細胞にてＩＦＮベータを生産する方法を開示する。比較的高収量で細胞分泌物から単離されたＩＦＮベータは約３．８×１０８ＩＥ／ｍｇ蛋白質の比活性を有する。生物学的および免疫学的試験により、この単離されたＩＦＮベータは天然ＩＦＮベータとほぼ完全に同一であることが示された。開示する方法で生産されたＩＦＮベータは９５％まで配糖化されており、この配糖化は構造および配列の点で天然ＩＦＮベータと実質的に一致し、なおその同一性が失われることはない。
　〔従来の技術〕
　インターフェロンは有効な抗ウイルスポリペプチドの一群を構成し、これは、外来誘導物質（例えばウイルス、核酸、特定の抗原）と接触した後の誘発細胞を培養することにより生成する。小群の１つがベータインターフェロン（ＩＦＮベータ）を構成するが、これは主として繊維芽細胞を培養することにより生成する（ハーベル（Ｈａｖｅｌｌ）ら（１９７２）およびステワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ＩＩ（１９７９））。従来、２種のベータインターフェロンが知られていたが、それぞれの免疫学的特徴は互いに類似し、生成し得る単離されたモノクロナール、中和抗体は両方のインターフェロンを共に不活性化する（チルベルスタイン（Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ）ら（１９８５））。しかしながら、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション実験においてＩＦＮベータ１　ｃＤＮＡプローブに対しＩＦＮベータ２ｍＲＮＡがクロスハイブリダイズしたことは皆無であり、その逆も皆無である（セーガル（Ｓｅｈｇａｌ）ら（１９８０））。
　以後ＩＦＮベータというヒト２倍体繊維芽細胞（ＦＳ−４）に由来するＩＦＮベータ１は、かなり長い間臨床的応用に用いられた。これは１９８３年に連邦厚生局により重篤で生命を脅かすウイルス感染の処置に対し調製が許可された。その有効性の理由および欠点に起因し、広範な他の有効なウイルス抑制剤が多くの場合選択手段として示された。
　しかしながら、通常の形質転換されていない２倍体繊維芽細胞を基礎として生産を行うと、貴重で高価な原料を使用するばかりでなくコストのかかる細胞基材の使用が必要となると共に手順遂行の合理化が狭い範囲に止まり、臨床的に使用する薬剤の高価格を著しく限定する。
　このような状況によりずっと早くから代替調製手段の探索が行われ、一般に最新の遺伝子工学的手法の開発の重要な刺激となった。異種宿主細胞系内にヒトＩＦＮベータの遺伝子を導入することは、古典的な好適手段に対する１つの真の代替手段を示唆し、生理学的バリヤを越えた狭い境界領域へ至る成功への道程を照らすものである。
　宿主細胞系、原核生物、下等および高等真核生物につき処理に対し原則的に存在する３群では、技術水準に基けば、細菌の宿主系である大腸菌（イー・コリ）は一般に低い生産コストの点で、一義的に利点を与え得る。
　期待は高いにも拘らず、技術的観点から見ればこれらの生産系においてはこの方法論による多量の原体ＩＦＮベータ生産には成功していないに止まる（タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら（１９８０）およびゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）（１９８０））。この困難性の主要な原因は、宿主細胞内で変性型の原体材料が合胞体として存在する点にある。実際、増殖する宿主細胞の一部から有効に分離することは可能であるが、種々の点（低い溶解性、処置による誤ったイオウ部分結合形成）に問題があり、臨床的に利用可能な材料の収率は極めて低い。
　有効性に部分的欠点があるのは、変性または正しく構成されない内部イオウ結合部分によると推定され（ローン（Ｌａｗｎ）ら（１９８１））、天然に認められる形態と対比すると生産物が配糖化されていないことに起因する。
　〔発明が解決しようとする課題〕
　このような背景の結果、真核生物の発現系の開発を現実のものとし、これにより異種遺伝子産物の複合構造が正確な「プロセシング」を経て標準的に広く認められた形態として生産されることを可能にする必要性が増大する。現在、この技術の系は一連の著者により白熱して著述されているところである（レエス（Ｒｅｙｅｓ）ら（１９８２）、ミトラニ−ロゼンバウム（Ｍｉｔｒａｎｉ−Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ）ら（１９８３）、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１９８３）、マコーミック（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）ら（１９８４）、チェルナヨフスキイ（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ）ら（１９８４）、フクナガ（Ｆｕｋｕｎａｇａ）ら（１９８４）、パージ（Ｐａｇｅ）ら（１９８５））。
　〔課題を解決するための手段〕
構成原理
　以下に遺伝子工学的技術を応用した新規な細胞ラインＢＩＣの構成を記載する。従来技術と比較すると、実質的に天然物質と同定された未変性産物を大量にかつ実質的に低コストで生産することができる。
宿主細胞ライン
　宿主細胞として、ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）ら（１９８０）に記載された完全ＣＨＯライン（チャイニーズハムスタ卵）のＤＨＦＲ￣変異株を選ぶ。
ベクタ
インターフェロン遺伝子
　出発材料としてプラスミドベクタｐＢＲ１３を用い、これにゲノミックＩＦＮベータ遺伝子を含有せしめる。このゲノミックＤＮＡの特定の断片をマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）に記載された方法により切断調製し、既に公知のベクタ（ｐＳＶｄ２−３）と組換える。
プロモータ
　一般に重要な点は、発現を制御する適切なプロモータを選択することである。誘導的プロモータを配置する際の可能性（ハウザ（Ｈａｕｓｅｒ）ら（１９８２）およびブリンスタ（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら（１９８２）に対し、モスタフ（Ｍｏｓｔｈａｆ）ら（１９８５）に記載されたＳＶ４０の強力な構成的プロモータには利点があり、これはさらにエンハンサ領域を含む。可能性と並んで誘導依存性の生産方法を用いる特に不利な経験（ネガティブフィードバック、細胞毒性）が一方であり、他方では完全な発酵方法でも細胞培養の付着は避けられず、このような結論となる。詳細に記載した構成の下で、これを一般にｐＳＶＩＦＮＡｓｎと命名する。
選択
　選択および増幅を遂行するに際し、高発現細胞を用いＤＨＦＲ遺伝子を別に第２のプラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）−３に導入する。独特なアデノプロモータとＳＶ４０プロモータのエンハンサ領域（Ｓ．Ｏ．）との相互作用を介してＩＦＮベータ発現の選択が最終的に可能となる。予期した通り前記した構成で、共感染ＤＮＡが近接して組込まれる。
感染
　前記発現ベクタ、制御配列並びに構造遺伝子を含み細胞ラインの欠損を回復する選択プラスミドをリン酸カルシウム沈殿法により実験的に決定した所定の至適混合比で相互感染させる。
増幅、クローン化並びにセルバンク
　感染付着したものからインターフェロンを発現するクローンを、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら（１９８５）により最初に記載された方法をメソトレザット（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔ）濃度を越える程度で高生産コロニの二段選別を行わずに用いて増幅させ、連結クローン化すると共に一連の過程において十分な細胞数を確保し、上記の方法により液体窒素中のスタムセルバンクとして保存する。
結果
原体生産
　記載する方法により得られる実験記号ＢＩＣ８６２２（ＢＩＣ，ＰＨＬＳ　受領Ｎｏ．８７０４０３０１）の細胞ラインを操作の後に分離し、この際、マルチトレイ（ＮＵＮＣ）中の定常培養で１〜５％ＮＣＳ　ｂｚｗ．ＦＣＳを補填した通常の細胞培養培地（イーレの塩を用いて改変したイーグルのＭＥＭ）を用いる。マイクロ支持台上のフェルメンタ（シドデックスＩＩＩ，ファルマシア）で、１リットルの培養物当り１日につき０．４〜１．６×１０９の国際単位のＩＦＮベータが構成的に生産される。
濃縮
　スルホプロピル陽イオン交換体への吸着およびそれに続く抗ＩＦＮべータセファロース（セルテック，スロー）への免疫吸着の結果濃縮が起こる。これらの免疫吸着マトリックスは未変性繊維芽細胞インターフェロンに対するモノクロナール抗体を含有し、製造元による免疫結合反応の至適条件下における吸着および脱着は合成分子の同一性により一方向であり、同等の抗体を擁して行うＥＬＩＳＡを併用して定量化し得る。さらに洗浄工程を行いＦＰＬＣ−ゲルろ過をもって終了すれば低分子量および高分子量の不純物が除去される。
特徴
生物学的効果：
　ＦＳ−４細胞由来の天然型ＩＦＮベータの検出を行うバイオアッセイは、抗ウイルス活性を利用し、指示細胞（ＦＳ−４）を用いムリネム・エンセファロミオカルディティス・ウイルス（ＥＭｃＶ）に対する細胞病原性効果の阻害を定量化するもので、ハーベル（Ｈａｖｅｌｌ）ら（１９７２）の改変であり、ＢＩＣ細胞由来のＩＦＮベータを検定するに際し何ら制限なく使用し得る。この試験とローリ（Ｌｏｗｒｙ）ら（１９５１）の蛋白質定量法とを用いて測定した比活性は、ＦＳ−４インターフェロンについての測定データと正確性の制限において２〜３×１０８ＩＥをもって対応する。
免疫学的特徴：
　ＢＩＣ由来のＩＦＮベータを濃縮する免疫アフィニティクロマトグラフと並んで、新しく開発されたＥＬＩＳＡおよび免疫ブロット技術を補助的に用いて天然型および組換えＩＦＮベータの分子的特性の広範な相関の検定を行う。抗体を用いるに際し、マウスハイブリドーマ（ＭＡＫ　ＢＯ−２，セルテック）由来のモノクローナルおよびヤギのポリクローナルＩｇＧ（レガ・インスティテュート，ロイベン）が肝要である。
蛋白質化学的特徴：
アミノ酸分析およびＮ末端の１５のアミノ酸配列決定により免疫学的手法で測定したデータを補完する。これによりクナイト（Ｋｎｉｇｈｔ）ら（１９８０）の天然型と組換えＩＦＮベータとの間には全く相違はないことが示される。組換えＩＦＮベータについて炭水化物部分を調べることにより、天然型ＩＦＮベータが炭水化物の不均質性を示すのに対し、極めて均質に配糖化されていることが示される。
　〔実施例〕
材料：
　イー・コリＫ１２　ＤＨ１（ＤＳＭ４０７９）
ＣＨＯ　ＤＵＫ　ＤＨＦＲ￣　ＢＦ（ＰＨＬＳ　Ｎｏ．８７０４１４０１）
これらのセルラインは、ラインＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣｌ６１）よりジヒドロ葉酸レダクターゼ非存在下で変異および選抜を経て誘導されたものである（ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）ら（１９８０））。
ｐＢＲ１３（ＤＳＭ４０７４）：
このプラスミドはボリバ（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら（１９７７）のクローン化プラスミドｐＢＲ３２５の誘導体である点で肝要であり、この唯一のＥｃｏＲＩ切断部位に１．８３ｋｂの長さのＤＮＡ断片が挿入される。この断片はコスミドｐＣｏｓＩＦＮベータ中に含まれ（グロス（Ｇｒｏｓｓ）ら、１９８１）、少なくともヒト胎盤ＤＮＡのコスミドバンクの一部である。
ｐＳＶｄ２−３（ＤＳＭ４０７５Ｐ）：
このプラスミドはクローン化ベクタｐＡＴ１５３の誘導体であり、真核ＤＮＡウイルスＳＶ４０由来の配列（フィールス（Ｆｉｅｒｓ）ら（１９７８））を含む。対応するベクタープラスミドを構成する特定のプラスミドは、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼの発現について構成したものである（スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）ら（１９８１））。発現ベクタｐＳＶにつき用いた改変は、ヘルン・ディ・フイレブロエク博士によってなされ、必須であるとしてフランセン（Ｆｒａｎｓｅｎ）ら（１９８５）の研究において記載されたものである。
ｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）−３（ＤＳＭ４０７６Ｐ）：
クローン化ベクタｐＢＲ３２２由来で１．１ｋｂの長さのＤＮＡ断片を欠損させて作成されたプラスミド誘導体である（ルスキ（Ｌｕｓｋｙ）ら（１９８１））。さらに、このプラスミドにはマウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のｃＤＮＡのみならず真核ＤＮＡウイルスアデノ２由来の翻訳開始シグナル（アデノウイルス主要後期プロモータ）も含まれている。ポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０由来の転写開始部を伴う２００ｂｐの長さの断片である（カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、１９８２ａ）。
発現系
　使用した発現系は矮形チャイニーズハムスタ（ＣＨＯ，ＡＴＣＣ　ＣＣＬ６１　ＣＨＯ−Ｋ１）の保存株細胞由来のセルラインによるものであり、変異により酵素ジヒドロ葉酸脱水素酵素を欠損するものとして作成された（ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）ら（１９８０））。インキュベートの過程でＤＮＡとこの細胞とによりリン酸カルシウム沈澱が生成し得、極めて低頻度であるが細胞内へのＤＮＡの導入が起こる（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（１９７３））。細胞内で開裂したＤＮＡは大部分が連結され、係属する細胞に組込まれる。そこでそれは、細胞のＤＮＡ複製過程で、または細胞染色体における組換え過程で特異的に増加または変化し、細胞遺伝子の組込み天然型構成成分を包含する。特定の場合、ヒトＩＦＮベータ遺伝子を発現させる発現プラスミドは、またＣＨＯ細胞内でマウス由来のジーヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子ｃＤＮＡを発現させるプラスミドを併用して用いるに際し開裂される。発現プラスミドの状態はいわゆるサザンブロット技術を用いて検出する。細胞ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、電界中でアガロースゲル電気泳動を行う。ＤＮＡ切断生成物は、その後ナイロンフィルタ膜に結合させ、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより放射能活性マーカプラスミドＤＮＡを用いて検出する。
インターフェロンベータ遺伝子の単離
　ＤＮＡ制限断片を単離する出発プラスミドとしてＩＦＮベータ遺伝子と共にプラスミドｐＢＲ１３を用いた。このプラスミドを調製するに際し、まずＦＳ４繊維芽細胞由来のＩＦＮベータをコードするｍＲＮＡをｃＤＮＡ中で交叉させ、ハイブリダイゼーションにより相補的染色体ＤＮＡを用いてＩＦＮベータ遺伝子を含むコスミドｐＣＯＳＩＦＮベータを遺伝子バンク（ヒト胎盤）から単離した。次にプラスミドｐＢＲ１３を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断するに際し、ｐＣｏｓＩＦＮベータ由来のＩＦＮベータ遺伝子を用いて断片を処理し、続いて広範な制限酵素ＨｉｎｄＩＩ，ｂｚｗ．Ｎｃｏ　Ｉ並びにＨｉｎｄＩＩＩを用いＩＦＮベータ遺伝子を備える短いＤＮＡ小片を単離して得た。
発現プラスミドの構成
　ヒトＩＦＮベータを発現させるプラスミドを構成するためｐＳＶｄ２−３と呼ばれる発現ベクタを用いた。このベクタの機能的構成部分がイー・コリ内での自動的ＤＮＡ複製を保証するのみならず、イー・コリ細胞のアンピシリン培地での選択を可能にする（転移陰性プラスミドｐＡＴ１５３およびβ−ラクタマーゼ遺伝子の複製の開始）。真核細胞を特定する機能についての構成部分はウイルスＳＶ４０の初期遺伝子のプロモータ−エンハンサ領域から付加遺伝子の転写開始部まで存在し、さらにＳＶ４０ウイルスがポリＡ配列を転写ｍＲＮＡに付加するポリアデニル化シグナル部分は挿入遺伝子を欠落しこの種のシグナル配列は存在すべきでない。翻訳開始のシグナルとポリアデニル化配列との間にさらに合成的に生成せしめた制限エンドヌクレアーゼ認識および切断配列を存在させて発現すべきＤＮＡを挿入した。ヌクレアーゼＸｂａＩの切断部位をこのベクタ内にヒトＩＦＮベータＤＮＡをクローン化すべく設けた。よってベクタをＸｂａＩで切断する。次にプラスミドｐＢＲ１３からＩＦＮベータ遺伝子を有するＥｃｏＲＩ断片を、およびさらにこれからＩＦＮベータ遺伝子を有するＮｃｏ　Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ小断片を単離する。制限エンドヌクレアーゼを用いる切断により得られた突出する一本鎖ＤＮＡ末端部をヌクレオチド三リン酸およびイー・コリ由来のＤＮＡポリメラーゼとインキュベートすることにより埋めた。このように作成した断片のＤＮＡ平滑末端を次に制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩの認識配列を有する合成的に調製したオリゴヌクレオチドと連結したヌクレアーゼＸｂａＩとのインキュベートにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、同時にベクタＤＮＡに相補的な突出する一本鎖部分を生成せしめた。ベクタＤＮＡとＩＦＮベータＤＮＡとを酵素的に連結しイー・コリ細胞に導入した。ＩＦＮベータＤＮＡを有する細胞をＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより同定し精製を行うべく多量のプラスミドＤＮＡを調製した。種々の制限エンドヌクレアーゼを用いる切断によりこのプラスミドＤＮＡの特徴を調べ、さらなる実験に備えてプラスミドを選択し、ｐＳＶ　ＩＦＮ　Ｎｃｏ（ＤＳＭ４０７７Ｐ）と命名したものが予定したものと一致した。次いでこのプラスミドｐＳＶ　ＩＦＮ　Ｎｃｏを酵素ＸｂａＩで部分的に切断し、切断断片をゲル電気泳動により分離した。線状プラスミドに対応するバンドを、蛍光色素エチジウムブロミドを用いる染色の後にＵＶライトの下で目視可能にして切り出しＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡをヌクレアーゼＡｓｕＩＩと共にインキュベートした後酵素的に閉環した。このような手順により、もとの発現プラスミドｐＳＶ　ＩＦＮ　ＮｃｏからＸｂａＩ−ＡｓｕＩＩ断片が欠落したものが結果的に得られた。このように調製した発現プラスミドをｐＳＶ　ＩＦＮ　Ａｓｎ（ＤＳＭ４０７８Ｐ）と命名し、ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損するＣＨＯセルラインの細胞に挿入感染させるべく、これにこの発現プラスミドｐＳＶ　ＩＦＮ　Ａｓｕを用いて感染させそのＤＮＡを細胞ゲノムに組込ませ、ｍＲＮＡ形成を図るが、これはＳＶ４０の特定配列由来の６０ヌクレオチド長い断片であり、このように連結してほぼ標準的なＩＦＮベータｍＲ���Ａを実現した。このｍＲＮＡを細胞の蛋白質合成装置でＩＦＮベータ蛋白質に翻訳する。そのアミノ末端領域およびアミノ酸組成はヒト繊維芽細胞由来の天然型ＩＦＮベータ蛋白質と一致しイー・コリが生産した蛋白質とは異なり配糖化されている。
　ＤＮＡ種の挿入により、また発現プラスミドｐＳＶ　ＩＦＮ　Ａｓｕ構成手段によって、ｍＲＮＡの一次構造が転化するが、これは真核生物細胞内でこのプラスミドが染色体に組込まれて形成される。相対的切断部位の詳細な表示と共に発現プラスミドの構造を第２図に示す。遺伝子コードによりヌクレオチド配列を翻訳したアミノ酸配列は、ヒト細胞由来の標準ＩＦＮベータ（タベルニル（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ）ら（１９８４））の一次構造を与える。
感染
　発現ベクタＤＮＡのＣＨＯセルラインヘの導入は、主として、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（１９７３）により記載されビグラ（Ｗｉｇｌｅｒ）（１９７９）により改変された方法で行った。原則的にこの方法で細胞ＤＮＡを処理し、ＣａＰＯ４を用いる手法により共沈澱を生成させた。その後ファゴサイトシスによりこのＤＮＡが導入され大部分が共に未解明の機構で細胞のゲノムに組込まれると推定される。このプロセスはＤＮＡの真核細胞に対する感染と呼ばれるものである。酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼを発現させるベクタを特定の発現ベクタと共に通常に沈澱させ感染過程の後にジヒドロ葉酸欠損ＣＨＯ細胞を利用することによりこの種の細胞を選択することができるが、これはＤＮＡが導入され染色体に組込まれているものである。これは、所定の細胞培養培地で細胞を培養することにより生起し、核酸合成酵素形成を低下させる。
増幅および選択
　このように形質転換し選択した細胞の培養分泌物についてベータインターフェロン活性を調べた。この試験で陽性のクローンに所定の処理を施し、細胞内で導入したＤＮＡが選択的に増加すると共にインターフェロン遺伝子のコピー数増加によりベータインターフェロン生産が増加するとの結果を得た。これは基本的にはジーンドーセジ効果の後に可能である。この目的のために適用する方法は、酵素阻害剤（＋）アメトプテリンを含有する培養培地でベータインターフェロンを生産する細胞の選択を実現する。この阻害剤により、ＣＨＯ細胞内に感染によって遺伝子を導入した酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ濃度に依存して保持される。この阻害によりこの種の細胞は優勢な増殖を示し、これにより対応するＤＮＡの増加によるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のジーンドーセジが起こる。ここでこの種のＤＮＡ複製過程では、最も大きな断片が組込まれ細胞の染色体中で最も近接した感染ＤＮＡ種が組込まれるが、これと同時にベータインターフェロン遺伝子のジーンドーセジが起こる。培養培地中の（＋）アメトプテリン濃度の段階的増加および中間選択並びに拡大過程により一定の細胞混合物が生成し、これにより培養培地中に大量のベータインターフェロンが与えられる。この混合物から培養器内での細胞の希釈接種および単離により金属製シリンダ状の正常な細胞用ラインを用いて細胞コロニを生産し、これによっても同様に培養培地中に大量のベータインターフェロンが与えられる。
　これにより「ＢＩＣ」細胞と命名したクローンとして適切な方針に適合する生産細胞バンク（製造用細胞バンク）を確立し、この細胞の一部を「公共健康研究サービス、動物細胞培養ヨーロッパコレクション（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＰＨＬＣ））」に受領Ｎｏ．８７０４０３０１をもって寄託した。
濃縮
　製造用細胞バンクに由来するＢＩＣの合一定常培養から、２４時間周期で１５ｌの培養分泌物を平均インターフェロン含量で２２５０００ＩＥ／ｍｌ蓄積するものとして繰り返し回収し、陽イオン交換（スルホプロピル）を併用して行った。１７５ｍｌの溶液に３×１０９ＩＥが含有され、８３％の収率が得られた。続くＢＥＴＡ　ＲＥＳＯＬＵＴＥ（Ｒ）（セルテック）に対する免疫吸着により溶出容積１１２ｍｌが得られ、２．２×１０９ＩＥのなお７２％のインターフェロンが比活性３．８×１０８ＩＥ／ｍｇ蛋白質を有するものとして含有されていた。最後のゲルろ過により総収量４８％を得た。
分析
生物学的および免疫学的特徴
　組換えＢＩＣベータＩＦＮおよび天然型ＦＳ４ベータＩＦＮの高度精製調製物を抗ウイルスバイオアッセイにおけるインターフェロン含量につき調べた。これに並行してローリによる蛋白質定量を行った。ミリグラム蛋白質当り天然型材料について比活性約２．７〜３×１０８国際単位（ＩＥ）および組換え材料について活性３〜４×１０８ＩＥ／ｍｇが得られた。この値は、天然型インターフェロンについての文献公知データと一致する。バイオアッセイは比較的不正確であるため比活性の正確な測定は現在の技術の段階では困難である。
　出発材料並びに精製および高度精製画分を用い酵素共役免疫試験（ＥＬＩＳＡ）による抗ウイルスバイオアッセイを行った。
　この試験に際しミクロタイタプレートのプラスチック表面をヤギのポリクローナル抗ＩＦＮベータ抗体で処理した。続いて測定するサンプルの希釈を行った。ベータＩＦＮは次いで固定化抗体に結合する。次の工程でこの複合体をマウスのモノクロナール抗ＩＦＮベータ抗体の手法を用いて反応させる。さらに生成する総合複合体を西洋ワサビペルオキシダーゼとあらかじめ共役させた抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートする。未結合抗体を除去した後、発色反応により結合したペルオキシダーゼの量およびこれにより結合したベータＩＦＮの量を測定する。
　この試験によりＦＳ４繊維芽細胞より得られた天然型ベータＩＦＮを評価した。これにより既知インターフェロン含量の希釈系列サンプルを国際ベータＩＦＮ標準品（ＮＩＨ，Ｇ−０２３−９０２−５２７）の一部と共に調べた。バイオアッセイとＥＬＩＳＡとの間には強い相関が認められた。
　ＢＩＣ細胞の培養分泌物から得られ、濃縮されさらに高度に濃縮されたＩＦＮ調製物についてのＥＬＩＳＡでの値は、並行して行った抗ウイルスバイオアッセイのものと同量とてして対応しつつ測定された。標準化するために全ての場合につき国際標準品または検量した調製物の一部を用いた。これにより天然型および組換えベータＩＦＮの間のＥＬＩＳＡに相関する抗原特性が同一であることも示し得る。
配列／アミノ酸組成
　前期した方法によって生産し精製したＩＦＮベータを用いそのアミノ酸組成およびそのアミノ末端配列について解析した。
　１５番目までのアミノ酸の部分配列をエドマン分解により自動気相配列決定装置（エフエー・アプリード・ビオシステム，タイプ４７０Ａ）を用いて行った。これにより結果的に得られるフェニルヒダントイン誘導体をＰＴＨ−Ｃ１８−マトリックス上で分離した後に検出する。結果は、ローン（Ｌａｗｎ）ら（１９８１）、オーノ（Ｏｈｎｏ）ら（１９８１）並びにデリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ）ら（１９８０）により公表されたデータと一致した。アミノ酸組成の分析に際し、加水分解後のＰＴＨアミノ酸につき同じ分離手法を施すことによりクニヒト（Ｋｎｉｇｈｔ）ら（１９８０）によるＦＳ−４について測定する値およびＣＨＯ由来のＩＦＮベータについて確認し得る。
配糖化
　脱配糖化またはツニカマイシンを用いる配糖化阻害により得られたポリペプチドは、同様にしてＦＳ−４から得られたＩＦＮベータと同じく、変性および未変性条件下で同一の電気泳動的特性を示す。グリコペプチダーゼ下により遊離したオリゴ糖を用いエクソグリコシダーゼによる段階的分解の後メチル化分析およびＦＡＢマススペクトロメトリを行った。これにより炭水化物側鎖の９５±５％が２本のアンテナ状複合体型であり、次に示す構造であることが確認された。
　なお、明細書中に記載した文献を整理すると次の通りである。
【図面の簡単な説明】
　第１図はプラスミドベクタｐＢＲ１３、ＩＦＮβ遺伝子並びにｐＢＲ３２５の説明図、第２図は本発明によるｐＳＶ　ｔｓｓ￣　ＮｃｏＩＦＮおよびｐＳＶ　ｔｓｓ￣　ＡｓｕＩＦＮの構成を示す説明図である。