【手続補正書】
【提出日】平成27年3月31日(2015.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の記載から、および請求の範囲から明らかであろう。特に明確に定義されていない限り、本明細書に使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたのと類似または等価な方法および材料を本発明の実践または試験に使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載されている。本明細書に引用された全ての公開されている外国特許および特許出願は、本明細書に参照により組み入れられる。本明細書に引用されたアクセッションナンバーによって示されるGenbankおよびNCBIへの提出物は、本明細書に参照により組み入れられる。本明細書に引用された全ての他の刊行された参考文献、文書、原稿、および科学文献は本明細書に参照により組み入れられる。矛盾のある場合には、本明細書（定義を含む）が規制する。さらに、材料、方法、および例は単に説明するためのものであり、限定するものではない。
[本発明1001]
多孔性ポリマー構造の組成物、疾患に関連した抗原、およびtoll様受容体（TLR）アゴニストを含む装置であって、該TLRアゴニストがTLR3に優先的に結合する、装置。
[本発明1002]
疾患に関連した抗原が腫瘍抗原を含む、本発明1001の装置。
[本発明1003]
ポリマー構造の組成物がポリ−ラクチド−コ−グリコリド（PLG）を含む、本発明1001の装置。
[本発明1004]
TLRアゴニストがTLR3アゴニストを含む、本発明1001の装置。
[本発明1005]
TLR3アゴニストが、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリI：C）またはPEI-ポリ（I:C）を含む、本発明1001の装置。
[本発明1006]
TLRアゴニストが、病原体関連分子パターン（PAMP）をさらに含む、本発明1001の装置。
[本発明1007]
TLRアゴニストが核酸を含む、本発明1001の装置。
[本発明1008]
TLRアゴニストがTLR9アゴニストをさらに含む、本発明1001の装置。
[本発明1009]
TLR9アゴニストがシトシン−グアノシンオリゴヌクレオチド（CpG-ODN）またはPEI-CpG-ODNを含む、本発明1008の装置。
[本発明1010]
動員（recruitment）組成物をさらに含む、本発明1001の装置。
[本発明1011]
動員組成物が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、Flt3LまたはCCL20を含む、本発明1011の装置。
[本発明1012]
動員組成物が、封入されたGM-CSFを含む、本発明1010の装置。
[本発明1013]
腫瘍抗原が、腫瘍溶解物、精製されたタンパク質腫瘍抗原、または合成された腫瘍抗原を含む、本発明1002の装置。
[本発明1014]
PAMPが、モノホスホリルリピドA（MPLA）を含む、本発明1006の装置。
[本発明1015]
TLRアゴニストの組合せを含み、該組合せがTLR3アゴニストおよびTLR9アゴニストを含む、本発明1001の装置。
[本発明1016]
TLR3アゴニストがポリ（I：C）を含み、かつTLR9アゴニストがCpG-ODNを含む、本発明1015の装置。
[本発明1017]
TLRアゴニストの組合せを含み、該組合せがTLR3アゴニストおよびTLR4アゴニストを含む、本発明1001の装置。
[本発明1018]
TLR3アゴニストがポリ（I：C）を含み、かつTLR4アゴニストがMPLAを含む、本発明1017の装置。
[本発明1019]
TLR3アゴニストが、CD8+樹状細胞またはCD141+樹状細胞を優先的に刺激するような量で存在する、本発明1001の装置。
[本発明1020]
ポリマー構造の組成物、腫瘍抗原、およびTLRアゴニストの組合せを含む装置であって、該TLRアゴニストが、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12およびTLR13からなる群より選択される、装置。
[本発明1021]
ポリマー構造の組成物、腫瘍抗原およびTLRアゴニストを含む装置を対象に接触させるかまたは埋め込む段階を含む、抗腫瘍免疫応答を惹起する方法であって、該TLRアゴニストがTLR3に優先的に結合する、方法。
[本発明1022]
TLRアゴニストがTLR3アゴニストを含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
TLRアゴニストがTLR3アゴニストおよびTLR9アゴニストを含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
抗腫瘍免疫応答が、CD8+樹状細胞またはCD141+樹状細胞の活性化を含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
抗腫瘍免疫応答が、形質細胞様樹状細胞またはCD141+樹状細胞の活性化を含む、本発明1023の方法。
[本発明1026]
抗腫瘍免疫応答が、腫瘍量の低減を含む、本発明1023の方法。
[本発明1027]
TLRアゴニストが、樹状細胞によるインターロイキン-12（IL-12）の産生を誘発するのに有効な濃度で存在する、本発明1021の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
ヒトTLR3は、以下のmRNA配列によってコードされている（GenBankアクセッションナンバーNM_003265.2(GI:19718735)、参照により本明細書に組み入れられる；SEQ ID NO: 5）:
2015503626.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
ヒトTLR3は、以下のアミノ酸配列によってコードされている（GenBankアクセッションナンバーABC86910.1（GI:86161330）、参照により本明細書に組み入れられる；SEQ ID NO: 4）:
2015503626.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
【表２】
2015503626.tif 000003
*TLR1およびTLR2によって認識されるリガンド
**TLR2およびTLR6によって認識されるリガンド
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
TLR9を阻害する抑制性CpG ODNは、本発明に包含される。例示的な強力な阻害性配列は、哺乳動物のテロメアにおいて見い出される (TTAGGG)4（ODN TTAGGG、InvivoGen）、および3塩基の置換によってマウス刺激性CpG ODNに由来するODN 2088（InvivoGen）である。抑制性ODNは、細胞との結合および細胞による取り込みに影響を及ぼすことなくエンドソーム小胞におけるTLR9とCpG ODNの同時局在を破壊する。本発明に包含される抑制性のCpG ODNは、刺激性CpG ODNの作用を微調節するか、減弱させるか、逆転させるか、または妨害するために使用される。代替的にまたは加えて、抑制性のCpG ODNを含む本発明の組成物、方法、または装置は、自己免疫状態を処置するために、または移植術後の免疫応答を防止するために使用される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
インビトロにおけるDC遊走アッセイおよびDC活性化
DC株、JAWSII（ATCC, Manassas, VA）をインビトロ実験のために使用し、そして20％FBS（Invitrogen, Carlsbad, CA）および5ng/mlのGM-CSFが補充されたα-MEM（Invitrogen, Carlsbad, CA）において維持した。DC活性化に及ぼすCpGに富むオリゴヌクレオチド（CpG-ODN）のインビトロ効果を決定するために、JAWSII細胞を5μg/mlのCpG-ODN 1826、5'-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3'（SEQ ID NO: 10; Invivogen, San Diego, CA）と共に24時間培養し、そして0、50、または500ng/mlのGM-CSFの存在下で12時間培養した。DC活性化に及ぼす縮合CpG-ODNの効果を評価するために、ODN-1826溶液をPEI溶液中に滴下することによって（該混合物をボルテックスにかけながら）CpG-ODNをPEI分子と縮合した（Huang YC, Riddle F, Rice KG, and Mooney DJ. Hum Gene Ther. 5, 609-17. (2005）；参照により本明細書に組み入れられる）。PEIとCpG-ODNとの電荷比（NH3+：PO4-）を縮合の間では7で一定に維持した。DC活性化に関する陽性対照として、DCをまた、刺激因子、TNF-α（10ng/ml）（Peprotech, Rocky Hill, NJ）およびLPS（10ng/ml）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と共に培養した。次にDCを収集し、そして一次抗体（BD Pharmingen, San Diego, CA）：PE結合CD86（B7、共刺激分子）、FITC結合CCR7、およびFITC結合MHCIIで染色した。細胞をFACSによって分析し、そしてアイソタイプ対照を使用して陽性FITCおよびPEに従ってゲートを設定し、そして各表面抗原に関して染色陽性の細胞の比率を記録した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
インビボDC遊走および活性化アッセイ
ブランク足場、および10μgのPEI-ODN対照（5'- tcc atg agc ttc ctg agc tt -3'）（SEQ ID NO: 6）を含むまたは含まないGM-CSFを含有する足場、または10μgのPEI-CpG-ODN縮合物の負荷された足場を、7〜9週齢の雄C57BL/6Jマウスの背部の皮下嚢に埋め込んだ。組織学的検査のために、足場を切り出し、そしてZ-固定液で固定し、パラフィンに包埋し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。DC動員を分析するために、足場を切り出し、そしてコラゲナーゼ溶液（Worthingtion, 250U/ml）を使用して37℃で45分間撹拌した中で増殖した組織を単細胞懸濁液へと消化した。その後、細胞懸濁液を40μmセルストレーナーに通して注いで、足場の粒子から細胞を単離し、そして細胞をペレット化し、そして冷PBSで洗浄し、そしてZ2コールターカウンター（Beckman Coulter）を使用して計数した。その後、得られた細胞集団を、フローサイトメトリーによる分析を可能とするために蛍光マーカーに結合させた一次抗体（BD Pharmingen, San Diego, CA）で染色した。APC結合CD11c（樹状細胞マーカー）およびPE結合CD86（B7、共刺激分子）染色をDC動員分析のために行い、そしてAPC結合CD11c、FITC結合CCR7、およびPE結合MHCII染色をDCプログラミング分析のために行なった。細胞を、アイソタイプ対照を使用して陽性FITC、APC、およびPEに従ってゲートを設定し、そして各表面抗原に関して染色陽性の細胞の比率を記録した。足場から鼠径リンパ節に向かうインビボにおけるDCの遊走を追跡するために、250μgの凍結乾燥させたフルオレセインイソチオシアネート（FITC）（Molecular Probes, Carlsbad, CA）を、PLGミクロスフェアと混合することによって足場に組み入れ、その後、足場の加工を行ない、330μlの3％FITC溶液と共に足場を30分間インキュベーションすることによってFITCを適用した。その後、FITCでペイントされた足場をC57BL/6Jマウスの左腹側部皮下に埋め込み、そして鼠径リンパ節（LN）を、足場埋め込み後の様々な時点で収集した。LNからの細胞懸濁液をコラゲナーゼ中での30分間の消化、および圧力をかけて70μmセルストレーナーに組織を通すことによって調製し、そしてフローサイトメトリーによってCD11c(+)FITC(+)細胞数に関して調べた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
マトリクス製作
D,L-ラクチドおよびグリコリドの85：15、120kDコポリマー（PLG）（Alkermes）をガス発泡プロセスにおいて利用して、多孔性PLGマトリクスを形成した（L. D. Harris, B. S. Kim, D. J. Mooney, Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J. Biomed. Mater. Res. 42, 396-402 (1998)）。簡潔に言えば、まずGM-CSFを封入したPLGミクロスフェアを標準的なダブルエマルションを使用して作出した（S. Cohen, T. Yoshioka, M. Lucarelli, L. H. Hwang, R. Langer, Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid)microspheres. Pharm. Res. 8, 713-720 (1991)）。その後、PLGミクロスフェアを孔形成物質である150mgのショ糖（粒子径が250mm〜425mmとなるようにふるいにかける）と混合し、そして圧縮成形した。得られたディスクを高圧CO2環境において平衡にし、そして圧を急速に低減させて、ポリマー粒子を膨張させ、そして相互接続構造へと融合させた。水の中に浸すことによってショ糖を足場から浸出させると、90％多孔性である足場が得られた。腫瘍溶解物をPLG足場に組み入れるために、C57BL/6Jマウス（Jackson Laboratory）の背部の皮下で成長させたB16-F10腫瘍の生検材料をコラゲナーゼ（250U/ml）（Worthington）で消化し、そして40μmセルストレーナーを通してろ過した後、107個/mlの細胞と同等の濃度で懸濁した。腫瘍細胞懸濁液を液体窒素中での急速凍結と解凍（37℃）の4サイクルに供し、そしてその後、400rpmで10分間遠心分離にかけた。腫瘍溶解物を含有する上清（1ml）を収集し、PLGミクロスフェアと共にインキュベーションし、そして凍結乾燥し、そして得られた混合物を、高圧CO2プロセスに使用して、腫瘍溶解物が組み込まれたマクロ孔性のPLGマトリクスを発泡させた。CpG-ODNをPLG足場に組み込むために、CpG-ODN 1826、5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'（SEQ ID NO: 10）（Invivogen）を、ODN-1826溶液をPEI溶液に滴下し、混合物をボルテックスにかけることによって、PEI（Mn約60,000）分子と縮合させた（L.D.Harris, B.S.Kim, D.J.Mooney, Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J. Biomed. Mater. Res. 42, 396-402 (1998); S, Cohen, T. Yoshioka, M. Lucarelli, L. H. Hwang, R. Langer, Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid)microspheres. Pharm. Res. 8, 713-720 (1991); Y. C. Huang, M. Connell, Y. Park, D. J. Mooney, K. G. Rice, Fabrication and in vitro testing of polymeric delivery system for condensed DNA. J. Biomed. Master. Res. A 67, 1384-1392 (2003)）。PEIとCpG-ODNの電荷比（NH3+：PO4-）を、縮合の間は7で一定に維持した。その後、PEI-CpG-ODN縮合物溶液を60μlの50％（重量／体積）ショ糖溶液と共にボルテックスにかけ、凍結乾燥し、そして乾燥ショ糖と混合して最終重量を150mgとした。ショ糖含有PEI-CpG-ODN縮合物をブランク、GM-CSFおよび／または腫瘍溶解物の負荷されたPLGミクロスフェアと混合してPLG癌ワクチンを作出した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
マトリクスは以下のように作出された。D,L-ラクチドおよびグリコリドの85：15、120 kDのコポリマー（PLG）（Alkermes, Cambridge, MA）をガス発泡プロセスにおいて利用してマクロ孔性のPLGマトリクスを形成した（Harris, L. D., Kim, B. S., and Mooney, D. J. Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J. Biomed.Mater. Res. 42, 396-402 (1998)）。GM-CSFは、高圧CO2発泡プロセスを使用してPLG足場に封入された（54％の効率）。GM-CSFを封入したPLGミクロスフェアを、標準的なダブルエマルションを使用して作出した（Cohen S., Yoshioka T., Lucarelli, M., Hwang L. H., and Langer R. Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid) microspheres. Pharm. Res. 8,713-720 (1991)）。腫瘍溶解物を組み入れるために、C57BL/6Jマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine）の背部皮下で成長させたB16-F10腫瘍の生検材料を、コラゲナーゼ（250 U/ml）（Worthington, Lakewood, NJ）で消化し、そして液体窒素中での急速凍結および解凍（37℃）の4サイクルに供し、そしてその後、400rpmで10分間遠心分離にかけた。腫瘍溶解物を含有する上清を収集し、PLGミクロスフェアと共に凍結乾燥し、そして得られた混合物を使用してPLG足場をベースとした癌ワクチンを作出した。CpG-ODNをPLG足場に組み入れるために、CpG-ODN 1826、5'-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3'（SEQ ID NO: 10; Invivogen, San Diego, CA）をまず、ODN-1826溶液をPEI溶液に滴下し、混合物をボルテックスにかけることによって、ポリ(エチレンイミン)（PEI、分子量約25,000 g mol-1、Sigma Aldrich）分子と縮合させた。PEIとCpG-ODNの電荷比（NH3+：PO4-）を、縮合の間では7で一定に維持した。その後、PEI-CpG-ODN縮合物溶液を60μlの50％（重量／体積）ショ糖溶液と共にボルテックスにかけ、凍結乾燥し、そして乾燥ショ糖と混合して最終重量を150mgとした。その後、ショ糖含有縮合物をブランク、GM-CSFおよび／または腫瘍溶解物の負荷されたPLGミクロスフェアと混合してPLG癌ワクチンを作出した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
CpG-ODNおよびP(I：C)をPLG足場に組み入れるために、CpG-ODN 1826、
2015503626.tif 000004
（SEQ ID NO: 10; Invivogen, Sand Diego, CA）またはP(I：C)（高分子量；Invivogen, San Diego, CA）をまず、ODN-1826溶液をPEI溶液に滴下し、混合物をボルテックスにかけることによって、ポリ（エチレンイミン）(PEI、Mn約60,000、Sigma Aldrich)分子と縮合させた（Huang,et al., 2003 J. Biomed. Mater. Res., A 67:1384-1392）。PEIとCpG-ODNの電荷比（NH3+：PO4-）を、縮合の間では7で一定に維持した。PEIとP(I：C) の電荷比（NH3+：PO4-）を、縮合の間では3で一定に維持した。その後、縮合物溶液を60μlの50％（重量／体積）ショ糖溶液と共にボルテックスにかけ、凍結乾燥し、そして乾燥ショ糖と混合して最終重量を150mgとした。その後、ショ糖含有PEI-CpGODN縮合物をブランク、GM-CSFおよび／または腫瘍溶解物の負荷されたPLGミクロスフェアと混合してPLG癌ワクチンを作出した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
ヒトFlt3の例示的アミノ酸配列を以下に提供する（GenBankアクセッションナンバー：P49771.1(GI:1706818)、本明細書に参照により組み入れられる；SEQ ID NO: 12）：
2015503626.tif 000005
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８７】
ヒトCCL20の例示的アミノ酸配列を以下に提供する（GenBankアクセッションナンバー：AAH20698.1（GI:18088857）、本明細書に参照により組み入れられる；SEQ ID NO: 11）：
2015503626.tif 000006
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９３】
CpG-ODNをPLG足場に組み入れるために、CpG-ODN 1826、
2015503626.tif 000007
（Invivogen, San Diego, CA； SEQ ID NO: 10）をまず、ODN-1826溶液をPEI溶液に滴下し、混合物をボルテックスにかけることによって、ポリ(エチレンイミン)（PEI、Mn約60,000、Sigma Aldrich）分子と縮合させた。PEIとCpG-ODNの電荷比（NH3+：PO4-）を、縮合の間では7で一定に維持した。その後、縮合物溶液を60μlの50％（重量／体積）ショ糖溶液と共にボルテックスにかけ、凍結乾燥し、そして乾燥ショ糖と混合して最終重量を150mgとした。その後、ショ糖含有PEI-CpG-ODN縮合物をブランク、GM-CSFおよび／または腫瘍溶解物の負荷されたPLGミクロスフェアと混合してPLG癌ワクチンを作出した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015503626000001.app