【手続補正書】
【提出日】平成26年11月20日(2014.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞のフォワードプログラミングまたは体細胞の分化転換により造血前駆細胞を提供するインビトロの方法であって、
造血前駆細胞への該多能性幹細胞のフォワードプログラミングまたは該体細胞の分化転換を引き起こす能力がある１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子の発現レベルを増加させる条件下で、該多能性幹細胞または該体細胞を培養して、造血前駆細胞に該多能性幹細胞をフォワードプログラミングするかまたは該体細胞を分化転換させることによって、造血前駆細胞を提供する工程
を含む、方法。
【請求項２】
ｉ）前記造血前駆細胞が、多能性幹細胞のフォワードプログラミングによって提供され、特に、該多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞であるか；または
ｉｉ）該造血前駆細胞が、体細胞の分化転換によって提供され、特に、該体細胞が、不死化体細胞であるか；または
ｉｉｉ）該多能性幹細胞または前記体細胞が、少なくとも１つの外因性発現カセットを含み、該発現カセットが、１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞または前記体細胞と、造血前駆細胞への該多能性細胞のフォワードプログラミングまたは該体細胞の分化転換を引き起こすのに十分な量の前記１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子の遺伝子産物を含む１つ以上の造血前駆体プログラミング因子とを接触させる工程をさらに含み、特に、
１つ以上の該遺伝子産物が、１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子のポリペプチド産物、または１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子のＲＮＡ転写産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、内皮分化因子遺伝子を含み、特に、少なくとも１つの前記内皮分化因子が、ＥＲＧ（ｖ−ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６がん遺伝子ホモログ（鳥類））、ＦＬＩ−１（フレンド白血病ウイルス組込み１）またはＥＴＶ２（ｅｔｓ改変体２）を含み、特に、少なくとも１つの内皮分化因子がＥＲＧであり、特に、該ＥＲＧが、ＥＲＧ−２またはＥＲＧ−３である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＧＦＩ１（成長因子非依存性１転写リプレッサ）、ＧＦＩ１Ｂ（成長因子非依存性１Ｂ転写リプレッサ）、ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ球性白血病）、ＬＹＬ１（リンパ芽球性白血病由来配列１）、ＬＭＯ２（ＬＩＭドメインオンリー２（ロンボチン様１））、ＧＡＴＡ２（ＧＡＴＡ結合タンパク質２）、ＧＡＴＡ３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）、またはＳＰＩ１（脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＰ）プロウイルス組込みがん遺伝子ｓｐｉ１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞または前記体細胞が、造血前駆細胞への該多能性幹細胞のフォワードプログラミングまたは該体細胞の分化転換を引き起こす能力がある２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子の発現レベルを増加させる条件下で培養されて、該多能性幹細胞が造血前駆細胞にフォワードプログラミングされるか、または該体細胞が造血前駆細胞に分化転換され、特に
ａ）該少なくとも２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＥＲＧ、ＧＦＩ１、ＧＡＴＡ２、ＳＰＩ１、ＴＡＬ１またはＬＭＯ２を含むか、または
ｂ）少なくとも１つの造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、内皮分化因子遺伝子を含み、特に
ｂ１）該少なくとも２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＥＲＧおよびＧＦＩ１を含むか、または
ｂ２）該少なくとも２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＥＲＧおよびＧＡＴＡ２を含むか、または
ｂ３）該少なくとも２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２およびＳＰＩ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記造血前駆細胞が、
（ｉ）１つ以上の造血前駆体マーカーの発現；
（ｉｉ）１つ以上の多能性幹細胞マーカーまたは体細胞マーカーの発現の欠如；
（ｉｉｉ）１つ以上の造血前駆体機能的特徴；
（ｉｖ）１つ以上の造血前駆体形態学的特徴
からなる群より選択される造血前駆細胞の１つ以上の特性を含み、特に、
ａ）該１つ以上の造血前駆体マーカーが、ＣＤ４３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ２３５ａおよびＣＤ４１ａからなる群より選択され、特に該１つ以上の造血前駆体マーカーが、ＣＤ４３、ＣＤ４５およびＣＤ３４からなる群より選択されるか、または
ｂ）該１つ以上の多能性幹細胞マーカーまたは体細胞マーカーが、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＣＤ１６６およびＣＤ１４０ｂからなる群より選択されるか、または
ｃ）該１つ以上の造血前駆体機能的特徴が、形質細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、肥満細胞、巨核球、赤血球、顆粒球、リンパ球、単球、白血球および血小板からなる群より選択される２つ以上の細胞タイプに分化する能力を包含し、特に、該１つ以上の造血前駆体機能的特徴が、骨髄系列、リンパ球系列、または赤血球−巨核球系列の細胞に分化する能力を包含し、特に、該１つ以上の造血前駆体機能的特徴が、リンパ球系列、骨髄系列および赤血球−巨核球系列の細胞に分化する能力を包含するか、または
ｄ）前記方法が、造血前駆細胞について選択または富化する工程をさらに含み、選択または富化された造血前駆細胞が、造血前駆細胞の前記特性の１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞または前記体細胞が、１つ以上の成長因子を含む培地で培養され、特に、前記１つ以上の成長因子が、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＬＴ−３−リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−９（ＩＬ−９）からなる群より選択され、特に該多能性幹細胞、該体細胞、または該多能性幹細胞もしくは該体細胞の子孫が、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−３およびＩＬ−６を含む培地で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）前記提供される造血前駆細胞が、１０日以下の発現増加後に得られるか、または
（ｉｉ）該提供される造血前駆細胞が、４日以下または６日以下の発現増加後に得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のプロセスによって提供される造血前駆細胞。
【請求項１１】
疾患、障害もしくは傷害を有する被験体または疾患、障害もしくは傷害を発症するリスクがある被験体の処置に使用するための組成物であって、請求項１〜９のいずれかに記載のプロセスによって提供される造血前駆細胞を含む、組成物。
【請求項１２】
ａ）前記被験体が、血液障害を有するかまたは血液障害を発症するリスクがあるとさらに定義されているか、または
ｂ）該被験体が、新生物疾患を有するとさらに定義されており、特に、
ｂ１）該被験体が、造血を抑制する療法を受けたかまたは造血を抑制する療法を受ける可能性が高いとさらに定義されているか、または
ｂ２）該被験体が、化学療法を受けたかまたは化学療法を受ける可能性が高いとさらに定義されており、または
ｃ）該被験体が、造血細胞または血液細胞を必要とする被験体であるとさらに定義されており、特に、
ｃ１）該被験体が、輸血を必要とする被験体であるとさらに定義されているか、または
ｃ２）該被験体が、貧血もしくは溶血性貧血を有するかまたは貧血もしくは溶血性貧血を発症するリスクがあるとさらに定義されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
疾患、障害もしくは傷害を有する被験体または疾患、障害もしくは傷害を発症するリスクがある被験体を処置するための医薬品の調製における、請求項１〜９のいずれかに記載のプロセスによって提供される造血前駆細胞の使用であって、特に（ｉ）該障害が血液障害であるか、または（ｉｉ）該疾患が、新生物疾患である、使用。
【請求項１４】
造血前駆細胞を含む細胞集団であって、該造血前駆細胞の少なくとも８０％が、１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子を含む外因性発現カセットを含む、細胞集団。
【請求項１５】
ａ）血液障害を有する被験体または血液障害を発症するリスクがある被験体を処置するための方法；または
ｂ）新生物疾患を有する被験体を処置するための方法であって、特に
ｂ１）該被験体が、造血を抑制する療法を受けたかまたは造血を抑制する療法を受ける可能性が高いとさらに定義されているか、または
ｂ２）該被験体が、化学療法を受けたかまたは化学療法を受ける可能性が高いとさらに定義されている、方法；または
ｃ）造血細胞または血液細胞を必要とする被験体を処置するための方法であって、特に
ｃ１）該被験体が、輸血を必要とする被験体であるとさらに定義されているか、または
ｃ２）該被験体が、貧血もしくは溶血性貧血を有するかまたは貧血もしくは溶血性貧血を発症するリスクがあるとさらに定義されている、方法、
において使用するための組成物であって、該組成物は、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって得られた前駆細胞を含み、該方法は、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって得られた治療有効量の造血前駆細胞を該被験体に投与する工程を含む、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
一定の実施形態では、細胞集団を提供する。かかる細胞集団は、造血前駆細胞、造血細胞、またはＥＭｋ前駆細胞を含み得る。前記集団は、幹細胞もしくは幹細胞の子孫、造血前駆細胞、造血細胞、またはＥＭｋ前駆細胞も包含し得る。例えば、前記細胞集団は、造血前駆細胞であって、該造血前駆細胞の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、９９％（またはそこから導出可能な任意の範囲）が、１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子を備えている外因性発現カセットを保有するものである、造血前駆細胞からなり得る。一部の態様において、提供する細胞集団は、造血前駆細胞を包含し、該造血前駆細胞の少なくとも８０％は、１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子を含む外因性発現カセットを備えている。他の態様において、前記細胞集団は、ＥＭｋ前駆細胞であって、該ＥＭｋ前駆細胞の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、９９％（またはそこから導出可能な任意の範囲）が、１つ以上のＥＭｋ前駆体プログラミング因子遺伝子を備えている外因性発現カセットを保有するものである、ＥＭｋ前駆細胞からなり得る。例えば、提供する細胞集団は、ＥＭｋ前駆細胞を包含し得、該ＥＭｋ前駆細胞の少なくとも８０％は、１つ以上のＥＭｋ前駆体プログラミング因子遺伝子を含む外因性発現カセットを備えている。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
多能性幹細胞のフォワードプログラミングまたは体細胞の分化転換により造血前駆細胞を提供するインビトロの方法であって、
造血前駆細胞への該多能性幹細胞のフォワードプログラミングまたは該体細胞の分化転換を引き起こす能力がある１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子の発現レベルを増加させる条件下で、該多能性幹細胞または該体細胞を培養して、造血前駆細胞に該多能性幹細胞をフォワードプログラミングするかまたは該体細胞を分化転換させることによって、造血前駆細胞を提供する工程
を含む、方法。
（項目２）
前記造血前駆細胞が、多能性幹細胞のフォワードプログラミングによって提供される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記造血前駆細胞が、体細胞の分化転換によって提供される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記体細胞が、不死化体細胞である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記多能性幹細胞または前記体細胞が、少なくとも１つの外因性発現カセットを含み、該発現カセットが、１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記多能性幹細胞または前記体細胞と、造血前駆細胞への該多能性細胞のフォワードプログラミングまたは該体細胞の分化転換を引き起こすのに十分な量の前記１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子の遺伝子産物を含む１つ以上の造血前駆体プログラミング因子とを接触させる工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
１つ以上の前記遺伝子産物が、１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子のポリペプチド産物、または１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子のＲＮＡ転写産物である、項目７に記載の方法。
（項目９）
少なくとも１つの造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、内皮分化因子遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
少なくとも１つの前記内皮分化因子が、ＥＲＧ（ｖ−ｅｔｓ赤芽球症ウイルスＥ２６がん遺伝子ホモログ（鳥類））、ＦＬＩ−１（フレンド白血病ウイルス組込み１）またはＥＴＶ２（ｅｔｓ改変体２）を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
少なくとも１つの内皮分化因子がＥＲＧである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＥＲＧが、ＥＲＧ−２またはＥＲＧ−３である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
少なくとも１つの造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＧＦＩ１（成長因子非依存性１転写リプレッサ）、ＧＦＩ１Ｂ（成長因子非依存性１Ｂ転写リプレッサ）、ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ球性白血病）、ＬＹＬ１（リンパ芽球性白血病由来配列１）、ＬＭＯ２（ＬＩＭドメインオンリー２（ロンボチン様１））、ＧＡＴＡ２（ＧＡＴＡ結合タンパク質２）、ＧＡＴＡ３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）、またはＳＰＩ１（脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＰ）プロウイルス組込みがん遺伝子ｓｐｉ１）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記多能性幹細胞または前記体細胞が、造血前駆細胞への該多能性幹細胞のフォワードプログラミングまたは該体細胞の分化転換を引き起こす能力がある２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子の発現レベルを増加させる条件下で培養されて、該多能性幹細胞が造血前駆細胞にフォワードプログラミングされるか、または該体細胞が造血前駆細胞に分化転換される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＥＲＧ、ＧＦＩ１、ＧＡＴＡ２、ＳＰＩ１、ＴＡＬ１またはＬＭＯ２を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
少なくとも１つの造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、内皮分化因子遺伝子を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記少なくとも２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＥＲＧおよびＧＦＩ１を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記少なくとも２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＥＲＧおよびＧＡＴＡ２を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記少なくとも２つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子が、ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２およびＳＰＩ１を含む、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記造血前駆細胞が、
（ｉ）１つ以上の造血前駆体マーカーの発現；
（ｉｉ）１つ以上の多能性幹細胞マーカーまたは体細胞マーカーの発現の欠如；
（ｉｉｉ）１つ以上の造血前駆体機能的特徴；
（ｉｖ）１つ以上の造血前駆体形態学的特徴
からなる群より選択される造血前駆細胞の１つ以上の特性を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記１つ以上の造血前駆体マーカーが、ＣＤ４３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ２３５ａおよびＣＤ４１ａからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記１つ以上の造血前駆体マーカーが、ＣＤ４３、ＣＤ４５およびＣＤ３４からなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記１つ以上の多能性幹細胞マーカーまたは体細胞マーカーが、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＣＤ１６６およびＣＤ１４０ｂからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記１つ以上の造血前駆体機能的特徴が、形質細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、肥満細胞、巨核球、赤血球、顆粒球、リンパ球、単球、白血球および血小板からなる群より選択される２つ以上の細胞タイプに分化する能力を包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記１つ以上の造血前駆体機能的特徴が、骨髄系列、リンパ球系列、または赤血球−巨核球系列の細胞に分化する能力を包含する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記１つ以上の造血前駆体機能的特徴が、リンパ球系列、骨髄系列および赤血球−巨核球系列の細胞に分化する能力を包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
造血前駆細胞について選択または富化する工程をさらに含み、選択または富化された造血前駆細胞が、造血前駆細胞の前記特性の１つ以上を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
前記多能性幹細胞または前記体細胞が、１つ以上の成長因子を含む培地で培養される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記１つ以上の成長因子が、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＬＴ−３−リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−９（ＩＬ−９）からなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記多能性幹細胞、前記体細胞、または該多能性幹細胞もしくは該体細胞の子孫が、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−３およびＩＬ−６を含む培地で培養される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記提供される造血前駆細胞が、１０日以下の発現増加後に得られる、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記提供される造血前駆細胞が、４日以下または６日以下の発現増加後に得られる、項目１に記載の方法。
（項目３３）
項目１〜３２のいずれかに記載のプロセスによって提供される造血前駆細胞。
（項目３４）
疾患、障害もしくは傷害を有する被験体または疾患、障害もしくは傷害を発症するリスクがある被験体の処置に使用するための、項目１〜３２のいずれかに記載のプロセスによって提供される造血前駆細胞。
（項目３５）
前記被験体が、血液障害を有するかまたは血液障害を発症するリスクがあるとさらに定義されている、項目３４に記載の造血前駆細胞。
（項目３６）
前記被験体が、新生物疾患を有するとさらに定義されている、項目３４に記載の造血前駆細胞。
（項目３７）
前記被験体が、造血を抑制する療法を受けたかまたは造血を抑制する療法を受ける可能性が高いとさらに定義されている、項目３６に記載の造血前駆細胞。
（項目３８）
前記被験体が、化学療法を受けたかまたは化学療法を受ける可能性が高いとさらに定義されている、項目３６に記載の造血前駆細胞。
（項目３９）
前記被験体が、造血細胞または血液細胞を必要とする被験体であるとさらに定義されている、項目３４に記載の造血前駆細胞。
（項目４０）
前記被験体が、輸血を必要とする被験体であるとさらに定義されている、項目３９に記載の造血前駆細胞。
（項目４１）
前記被験体が、貧血もしくは溶血性貧血を有するかまたは貧血もしくは溶血性貧血を発症するリスクがあるとさらに定義されている、項目３９に記載の造血前駆細胞。
（項目４２）
疾患、障害もしくは傷害を有する被験体または疾患、障害もしくは傷害を発症するリスクがある被験体を処置するための医薬品の調製における、項目１〜３２のいずれかに記載のプロセスによって提供される造血前駆細胞の使用。
（項目４３）
前記障害が血液障害である、項目４２に記載の使用。
（項目４４）
前記疾患が、新生物疾患である、項目４２に記載の使用。
（項目４５）
造血前駆細胞を含む細胞集団であって、該造血前駆細胞の少なくとも８０％が、１つ以上の造血前駆体プログラミング因子遺伝子を含む外因性発現カセットを含む、細胞集団。
（項目４６）
血液障害を有する被験体または血液障害を発症するリスクがある被験体を処置するための方法であって、治療有効量の項目１〜３２のいずれかに記載の方法によって得られる造血前駆細胞を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目４７）
新生物疾患を有する被験体を処置するための方法であって、治療有効量の項目１〜３２のいずれかに記載の方法によって得られる造血前駆細胞を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目４８）
前記被験体が、造血を抑制する療法を受けたかまたは造血を抑制する療法を受ける可能性が高いとさらに定義されている、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記被験体が、化学療法を受けたかまたは化学療法を受ける可能性が高いとさらに定義されている、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
造血細胞または血液細胞を必要とする被験体を処置するための方法であって、治療有効量の項目１〜３２のいずれかに記載の方法によって得られる造血前駆細胞を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目５１）
前記被験体が、輸血を必要とする被験体であるとさらに定義されている、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記被験体が、貧血もしくは溶血性貧血を有するかまたは貧血もしくは溶血性貧血を発症するリスクがあるとさらに定義されている、項目５０に記載の方法。