【手続補正書】
【提出日】平成27年4月20日(2015.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水不混和性化合物を組換え産生し分泌する細胞；
（ｂ）前記細胞から分泌された水不混和性化合物；
（ｃ）前記分泌された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素；および
（ｄ）細胞培養培地
を含む、液体組成物。
【請求項２】
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組換え産生された水不混和性化合物がイソプレノイドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記蛍光色素がＮｉｌｅ  Ｒｅｄである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記蛍光色素がＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３またはＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組換え産生された水不混和性化合物が、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組換え産生された水不混和性化合物がファルネセンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１または複数の酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む組換え酵母細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードする核酸を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組換え酵母細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組換え酵母細胞が、メバロネートをメバロン酸５−ホスフェートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記１または複数の異種ヌクレオチド配列が、前記メバロン酸経路の１つより多い酵素をコードする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞が、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞が、ＩＰＰまたはポリプレニルを改変してイソプレノイド化合物を形成できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＩＰＰまたはポリプレニルを改変してイソプレノイド化合物を形成できる前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼ、ヌートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
溶液中で、細胞から産生され分泌されたファルネセンを検出する方法であって、
（ａ）溶液をＮｉｌｅ  Ｒｅｄと接触させるステップであって、前記溶液は、ファルネセンを組換え産生し分泌する細胞を含む、ステップ；および
（ｂ）約２６０〜２９０ｎｍの励起波長および約５３０〜５７０ｎｍの発光波長においてＮｉｌｅ  Ｒｅｄを検出するステップ、
を含む、方法。
【請求項２０】
前記複数の細胞を含む前記溶液が、マルチウェル細胞培養プレートのウェル中に含まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記マルチウェル細胞培養プレートがＴｅｆｌｏｎで被覆される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、前記検出するステップの前に少なくとも１２時間の期間にわたり培養される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出するステップの前に、前記マルチウェル細胞培養プレートを振盪するステップをさらに含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選択される、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が酵母細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
別の態様では、
（ａ）水不混和性化合物を組換え産生し分泌する細胞；
（ｂ）細胞から分泌された水不混和性化合物；
（ｃ）分泌された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素；および
（ｄ）細胞培養培地
を含む、液体組成物が本明細書中で提供される。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
溶液中で、複数の細胞から組換え産生された水不混和性化合物（ＷＩＣ）を検出する方法であって、
（ａ）溶液を、前記ＷＩＣに直接結合する蛍光色素と接触させるステップであって、前記溶液は、前記ＷＩＣを組換え産生する複数の細胞を含む、ステップ；および
（ｂ）前記組換え産生されたＷＩＣに結合した前記蛍光色素の選択的検出に適したスペクトル条件下で前記蛍光色素を検出するステップ、
を含む、方法。
（項目２）
前記ＷＩＣが、前記ＷＩＣを組換え産生する前記細胞から分泌される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記蛍光色素がＮｉｌｅ  Ｒｅｄである、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記蛍光色素がＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３またはＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５である、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記複数の細胞を含む前記溶液が、マルチウェル細胞培養プレートのウェル中に含まれる、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記細胞が、前記検出するステップの前に少なくとも１２時間の期間にわたり培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
ＷＩＣ：細胞バイオマス比を決定するステップをさらに含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記細胞バイオマスが、前記複数の細胞の自己蛍光を検出するステップを含む方法によって決定される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記複数の細胞の前記自己蛍光を検出するステップが、前記ＷＩＣに結合した前記蛍光色素からの蛍光を検出しないスペクトル条件下で前記自己蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）を検出するステップを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記自己蛍光が、３３０〜３５０ｎｍの励起波長および４７０〜５１０ｎｍの発光波長で検出される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記蛍光色素がＮｉｌｅ  Ｒｅｄであり、ＷＩＣ：細胞バイオマス比を決定するステップが、緑色対赤色蛍光の比を決定するステップを含む、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記スペクトル条件が、
（ａ）前記蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、前記第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、項目１に記載の細胞と同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第１の複数の前記細胞集団の各々がＷＩＣを含み、前記第２の複数の前記細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）前記第１の複数および前記第２の複数についての励起スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）励起波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第１の複数由来の細胞集団と、前記第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）前記第２の複数由来の細胞密度ｘの細胞集団と細胞密度５ｘの細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
によって選択される励起波長において前記蛍光色素を検出するステップを含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｂ）の前記励起スペクトルについての前記発光波長が、５５０ｎｍに固定される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記スペクトル条件が、
（ａ）前記蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、前記第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、項目１に記載の細胞と同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第１の複数の前記細胞集団の各々がＷＩＣを含み、前記第２の複数の前記細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）前記第１の複数および前記第２の複数についての発光スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）発光波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第１の複数由来の細胞集団と、前記第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）前記第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
によって選択される発光波長において前記蛍光色素を検出するステップを含む、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
ステップ（ｂ）の前記発光スペクトルについての前記励起波長が、２９０ｎｍに固定される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の複数の前記細胞集団が、少なくとも２ｇ／ＬのＷＩＣを含む、項目１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記組換え産生された水不混和性化合物がイソプレノイドである、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記組換え産生された水不混和性化合物が、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記組換え産生された水不混和性化合物がファルネセンである、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１または複数の酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む組換え酵母細胞である、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記組換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードする核酸を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記組換え酵母細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記組換え酵母細胞が、メバロネートをメバロン酸５−ホスフェートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記１または複数の異種ヌクレオチド配列が、前記メバロン酸経路の１つより多い酵素をコードする、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞が、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞が、ＩＰＰまたはポリプレニルを改変してイソプレノイド化合物を形成できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼ、ヌートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
溶液中で、細胞から産生され分泌されたファルネセンを検出する方法であって、
（ａ）溶液をＮｉｌｅ  Ｒｅｄと接触させるステップであって、前記溶液は、ファルネセンを組換え産生し分泌する細胞を含む、ステップ；および
（ｂ）約２６０〜２９０ｎｍの励起波長および約５３０〜５７０ｎｍの発光波長においてＮｉｌｅ  Ｒｅｄを検出するステップ、
を含む、方法。
（項目３１）
前記複数の細胞を含む前記溶液が、マルチウェル細胞培養プレートのウェル中に含まれる、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記マルチウェル細胞培養プレートがＴｅｆｌｏｎで被覆される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が、前記検出するステップの前に少なくとも１２時間の期間にわたり培養される、項目３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記検出するステップの前に、前記マルチウェル細胞培養プレートを振盪するステップをさらに含む、項目３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選択される、項目３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞が酵母細胞である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
（ａ）水不混和性化合物を組換え産生し分泌する細胞；
（ｂ）前記細胞から分泌された水不混和性化合物；
（ｃ）前記分泌された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素；および
（ｄ）細胞培養培地
を含む、液体組成物。
（項目３９）
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選択される、項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記細胞が酵母細胞である、項目３８に記載の組成物。
（項目４１）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目３９に記載の組成物。
（項目４２）
前記組換え産生された水不混和性化合物がイソプレノイドである、項目３８〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４３）
前記蛍光色素がＮｉｌｅ  Ｒｅｄである、項目３８〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４４）
前記蛍光色素がＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３またはＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５である、項目３８〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４５）
前記組換え産生された水不混和性化合物が、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである、項目３８〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４６）
前記組換え産生された水不混和性化合物がファルネセンである、項目３８〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４７）
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１または複数の酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む組換え酵母細胞である、項目３８〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４８）
前記組換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードする核酸を含む、項目４７に記載の組成物。
（項目４９）
前記組換え酵母細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、項目４７に記載の組成物。
（項目５０）
前記組換え酵母細胞が、メバロネートをメバロン酸５−ホスフェートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、項目４７に記載の組成物。
（項目５１）
前記１または複数の異種ヌクレオチド配列が、前記メバロン酸経路の１つより多い酵素をコードする、項目４７に記載の組成物。
（項目５２）
前記細胞が、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、項目４７に記載の組成物。
（項目５３）
前記細胞が、ＩＰＰまたはポリプレニルを改変してイソプレノイド化合物を形成できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）
前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼ、ヌートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、項目５３に記載の組成物。
（項目５５）
前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、項目５３に記載の組成物。
（項目５６）
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群から選択される、項目５５に記載の組成物。
（項目５７）
細胞から組換え産生された水不混和性化合物（ＷＩＣ）に直接結合した蛍光色素の選択的検出のためのスペクトル条件を決定する方法であって、
（ａ）前記蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、前記第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第１の複数の前記細胞集団の各々がＷＩＣを含み、前記第２の複数の前記細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）前記第１の複数および前記第２の複数についての励起スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）励起波長を選択するステップであって、
（ｉ）前記第１の複数由来の細胞集団と、同じ細胞密度を有する前記第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）前記第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
を含む、方法。
（項目５８）
ステップ（ｂ）の前記励起スペクトルについての前記発光波長が、５５０ｎｍに固定される、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
細胞から組換え産生された水不混和性化合物に直接結合した蛍光色素の選択的検出のためのスペクトル条件を決定する方法であって、
（ａ）前記蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、前記第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第１の複数の前記細胞集団の各々がＷＩＣを含み、前記第２の複数の前記細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）前記第１の複数および前記第２の複数についての発光スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）発光波長を選択するステップであって、
（ｉ）前記第１の複数由来の細胞集団と、同じ細胞密度を有する前記第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）前記第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
を含む、方法。
（項目６０）
ステップ（ｂ）の前記発光スペクトルについての前記励起波長が、２９０ｎｍに固定される、項目５９に記載の方法。