【手続補正書】
【提出日】平成27年10月13日(2015.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
経皮プロトセルであって、（ａ）１つ以上の薬学的に活性な薬剤が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持する多孔性ナノ粒子コアを含み、前記脂質二重層は、一価飽和ω−９脂肪酸、アルコール、ジオール、溶媒、共溶媒、Ｒ８ペプチド、及びエッジアクチベータからなる群から選択される１つ以上の角質層透過性増強剤を含む、経皮プロトセル。
【請求項２】
前記薬学的に活性な薬剤が、二本鎖直鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、薬物、造影剤、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はそれらの混合物を含む、請求項１に記載の経皮プロトセル。
【請求項３】
前記薬学的に活性な薬剤が核局在配列にコンジュゲートされる、請求項２に記載の経皮プロトセル。
【請求項４】
前記プロトセルが細胞を標的にする化学種を含む、請求項１から３のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項５】
前記プロトセルが融合ペプチドを含む、請求項１から４のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項６】
前記１つ以上の角質層透過性増強剤は、オレイン酸、エライジン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、ネルボン酸、及びそれらの混合物からなる群から選択される一価飽和ω−９脂肪酸である、請求項１から５のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項７】
前記１つ以上の角質層透過性増強剤は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びそれらの混合物からなる群から選択されるアルコールである、請求項１から６のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項８】
前記１つ以上の角質層透過性増強剤は、ＰＥＧ４００及びＤＭＳＯからなる群から選択される溶媒又は共溶媒である、請求項１から７のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項９】
前記１つ以上の角質層透過性増強剤は、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物からなる群から選択されるジオールである、請求項１から８のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項１０】
前記１つ以上の角質層透過性増強剤は、胆汁酸塩、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンエーテル、一本鎖界面活性剤、及びそれらの混合物からなる群から選択されるエッジアクチベータである、請求項１から９のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項１１】
前記エッジアクチベータは胆汁酸塩であり、該胆汁酸塩はデオキシコール酸ナトリウムである、請求項１０に記載の経皮プロトセル。
【請求項１２】
前記プロトセルは１０ｎｍ〜５００ｎｍの直径を有する、請求項１から１１のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項１３】
前記プロトセルは５０ｎｍ〜３００ｎｍの直径を有する、請求項１から１２のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項１４】
前記プロトセルは６５ｎｍ〜２１０ｎｍの直径を有する、請求項１から１３のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項１５】
前記多孔性ナノ粒子コアは、シリカ、生分解性ポリマー、ゾルゲル、金属、及び金属酸化物からなる群から選択される１つ以上の組成物を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項１６】
前記薬学的に活性な薬剤は少なくとも１つの抗癌剤を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項１７】
前記抗癌剤は、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、��酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の経皮プロトセル。
【請求項１８】
（ａ）前記１つ以上の薬学的に活性な薬剤は、薬学的に活性な量の抗癌剤を含み、（ｂ）前記１つ以上の角質層透過性増強剤は、ＰＥＧ４００、ＤＭＳＯ、及びエタノール、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１９】
前記プロトセルは、０．２０〜０．３０μｇ／ｃｍ2ｈｒの前記抗癌剤の流量を有する、請求項１６又は１７に記載の経皮プロトセル。
【請求項２０】
前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１ＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される脂質で構成される、請求項１から１９のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２１】
前記多孔性ナノ粒子コアはアミン含有シランで修飾される、請求項１から２０のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２２】
前記薬学的に活性な薬剤は、ｓｉＲＮＡ又はポリペプチド毒素を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２３】
前記脂質二重層は、カチオン性脂質及び１つ以上の双性リン脂質を含む、請求項１から２２のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２４】
前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ（１８：１））又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びそれらの混合物からなる群から選択される脂質を含む、請求項１から２３のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２５】
前記多孔性ナノ粒子コアは、６００ｍ2／ｇよりも大きいＢＥＴ表面積を有する、請求項１から２４のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２６】
前記多孔性ナノ粒子コアは、６０％〜７０％の細孔容積の割合を有する、請求項１から２５のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２７】
前記多孔性ナノ粒子コアは多峰分布の細孔形態を有する、請求項１から２６のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２８】
前記多孔性ナノ粒子コアは、２０ｎｍ〜３０ｎｍの平均直径を有する細孔を含む、請求項１から２７のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項２９】
前記多孔性ナノ粒子コアは、５ｎｍ〜１５ｎｍの平均直径を有する細孔によって相互に連結された表面から利用可能な細孔を含む、請求項１から２８のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項３０】
前記１つ以上の薬学的に活性な薬剤は、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、及びサイクリンＥからなる群から選択されるサイクリンスーパーファミリーのメンバーを標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡを含み、（ａ）前記脂質二重層はＳＰ９４及び／又はＭＥＴペプチドとエンドソーム分解性ペプチドとを装填され、（ｂ）該装填後に肝細胞癌に選択的に結合する、請求項１から２９のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項３１】
前記脂質二重層は、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ−２０００を、５５：５：３０：１０質量比で含む、請求項１から３０のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項３２】
前記多孔性ナノ粒子コアは、（１）それぞれがケイ素原子を用いて機能化された第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、（２）モノアミン又はポリアミン、（３）Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）、（４）３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、（５）３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（６）アミノ官能性トリアルコキシシラン、（７）プロトン化された第２級アミン、プロトン化された第３級アルキルアミン、プロトン化されたアミジン、プロトン化されたグアニジン、プロトン化されたピリジン、プロトン化されたピリミジン、プロトン化されたピラジン、プロトン化されたプリン、プロトン化されたイミダゾール、プロトン化されたピロール、及び第４級アルキルアミン、及び（１）〜（７）の組み合わせからなる群から選択されるアミン含有シランで修飾される、請求項１から３１のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項３３】
前記多孔性ナノ粒子コアはシリカを含む、請求項１から３２のいずれかに記載の経皮プロトセル。
【請求項３４】
多孔性シリカナノ粒子コアを含むプロトセルであって、前記多孔性シリカナノ粒子コアは、
（ａ）（１）それぞれがケイ素原子を用いて機能化された第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、（２）モノアミン又はポリアミン、（３）Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）、（４）３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、（５）３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（６）アミノ官能性トリアルコキシシラン、（７）プロトン化された第２級アミン、プロトン化された第３級アルキルアミン、プロトン化されたアミジン、プロトン化されたグアニジン、プロトン化されたピリジン、プロトン化されたピリミジン、プロトン化されたピラジン、プロトン化されたプリン、プロトン化されたイミダゾール、プロトン化されたピロール、及び第４級アルキルアミン、及び（１）〜（７）の組み合わせからなる群から選択されるアミン含有シランで修飾され、
（ｂ）１つ以上のｓｉＲＮＡ又はポリペプチド毒素が装填され、
（ｃ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持し、前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含む、プロトセル。
【請求項３５】
前記プロトセルは、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、及びサイクリンＥからなる群から選択されるサイクリンスーパーファミリーのメンバーを標的とするｓｉＲＮＡが装填される、請求項３４に記載のプロトセル。
【請求項３６】
前記プロトセルは、ＮｉＶヌクレオカプシドタンパク質（ＮｉＶ−Ｎ）ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発するｓｉＲＮＡが装填される、請求項３４に記載のプロトセル。
【請求項３７】
前記脂質二重層は、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ−２０００を、５５：５：３０：１０質量比で含む、請求項３４から３６のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３８】
請求項１から３３のいずれかに記載の経皮プロトセルを複数含むプロトセル組成物。
【請求項３９】
前記経皮プロトセルは５０ｎｍ〜３００ｎｍの平均直径を有する、請求項３８に記載のプロトセル組成物。
【請求項４０】
前記経皮プロトセルは６５ｎｍ〜２１０ｎｍの平均直径を有する、請求項３８又は３９に記載のプロトセル組成物。
【請求項４１】
請求項３４から３７のいずれかに記載のプロトセルを複数含むプロトセル組成物。
【請求項４２】
前記プロトセルは６００ｎｍ未満の有効平均粒子サイズを有する、請求項４１に記載のプロトセル組成物。
【請求項４３】
請求項３８から４２のいずれかに記載のプロトセル組成物と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４４】
経皮投与に適用される請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
癌に罹患した対象を治療するための医薬の製造における請求項１から３７のいずれかに記載のプロトセルの使用。
【請求項４６】
疾患の治療において使用するための請求項４３又は４４に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記疾患が癌である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記癌が転移性である、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記癌が、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、及び急性リンパ性白血病症候群（ＨＥＳ）からなる群から選択される、請求項４３に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の経皮的な実施形態は、（ａ）１つ以上の薬学的に活性な薬剤が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する多孔性ナノ粒子からなるプロトセルを包含する。ここで脂質二重層は、一価飽和ω−９脂肪酸（オレイン酸、エライジン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、及びネルボン酸、最も好ましくはオレイン酸）、アルコール、ジオール（最も好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、Ｒ８ペプチド、並びにエッジアクチベータ（edge activator）（胆汁酸塩、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンエーテル、一本鎖界面活性剤（例えばデオキシコール酸ナトリウム）など）からなる群から選択される１つ以上の角質層透過性増強剤を含む。ここでプロトセルは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、より好ましくは約５５ｎｍ〜約２７０ｎｍ、より好ましくは約６０ｎｍ〜約２４０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約２１０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約１９０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約１６０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約９０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約８０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約７５ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ〜約６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、又は７５ｎｍ、最も好ましくは約７０ｎｍの平均直径を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
従って本発明は、一態様においては、（ａ）１つ以上の薬学的に活性な薬剤が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する複数の多孔性ナノ粒子を含む経皮プロトセルを提供する。ここで脂質二重層は、一価飽和ω−９脂肪酸、アルコール、ジオール、溶媒、共溶媒、透過促進ペプチド及びヌクレオチド、並びにエッジアクチベータからなる群から選択される１つ以上の角質層透過性増強剤を含む。ここでプロトセルは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍの平均直径を有する。一価飽和ω−９脂肪酸は、オレイン酸、エライジン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、及びネルボン酸、最も好ましくはオレイン酸、並びにそれらの混合物からなる群から選択されることができる。アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びそれらの混合物からなる群から選択されることができ、溶媒及び共溶媒は、ＰＥＧ４００及びＤＭＳＯからなる群から選択される。ジオールは、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物からなる群から選択されることができる。エッジアクチベータは、胆汁酸塩、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンエーテル、一本鎖界面活性剤、及びそれらの混合物からなる群から選択されることができる。好ましい一実施形態においては、エッジアクチベータはデオキシコール酸ナトリウムである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
一実施形態においては、ＴＤＤＳとして機能するナノ多孔性粒子に担持された脂質二重層（「プロトセル」）の開発について記載する。プロトセルは、静電的にリポソームをナノ多孔性シリカ粒子コアに融合させることによって形成される。それらは、無機ナノ粒子及びリポソームの両方の利点、例えば調整可能な多孔性、異種のカーゴの大容量の装填が可能な大きい表面積、及び様々な分子を用いて改変されることができる調整可能な流動性を有する担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を相助作用的に組み合わせている。これらの生物物理学的特性及び生化学的特性は、プロトセルが種々の用途に向けて改変されることを可能にする。予備研究において、誘導結合プラズマ質量分析を用いて、本発明者は、８．１２５ｍｇで投薬された本発明者の標準的なプロトセル組成（５５％ＤＯＰＥ、３０％コレステロール、１５％ＰＥＧ−２０００）の０．１〜０．５ｗｔ％が、患者から得られた腹部皮膚の全層を通過することができることを示した。さらに、本発明者は、プロトセルの０．３〜２．４ｗｔ％が、角質層が除去された部分的な層の皮膚を通過することができることを明らかにした。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
前段落の実施形態においては、脂質は、好ましくは１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ（１８：１））又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びそれらの混合物からなる群から選択され、プロトセルは、約６００ｍ2／ｇよりも大きいＢＥＴ表面積、約６０％〜約７０％の細孔容積の割合、約２０ｎｍ〜約３０ｎｍの平均直径を有する細孔からなる多峰分布の細孔形態、約５ｎｍ〜約１５ｎｍの平均直径を有する細孔によって相互に連結された表面から利用可能な細孔、の特徴のうちの少なくとも１つを有する。好ましくは、プロトセルは、１０10個のナノ粒子シリカコア当たり約１０ｎＭのｓｉＲＮＡを被包する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
前段落のプロトセルの一部の実施形態においては、脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ターゲティングペプチド、及びＲ８を含み、メソ多孔性のナノ粒子シリカコアはそれぞれ、約１００ｎｍの平均直径、１，０００ｍ2／ｇよりも大きい平均表面積、及び約２０ｎｍ〜約２５ｎｍの平均直径を有する表面から利用可能な細孔を有し、１０10個の粒子当たり約１μΜ又はそれ以上のｓｉＲＮＡ装填量を有する。ターゲティングペプチドは、好ましくはエフリンＢ２（ＥＢ２）に結合するペプチドであり、最も好ましくはＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）である。最も好ましくは、プロトセルは、約０．０１〜約０．０２ｗｔ％のＴＧＡＩＬＨＰと、約１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００と、約０．５００ｗｔ％のＲ８とを含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【図１】エアロゾルによって支援されるＥＩＳＡプロセスによって調製される本発明で用いられる一実施形態のナノ粒子が、粒子のサイズ及び分布を制御するために変えられ得ることを示す図である。
【図２】一実施形態において、多くの種類のカーゴに合わせて設計されることができる細孔のサイズ及び骨格と、エアロゾル化した補助成分が容易に取り込まれることとを示す。
【図２Ａ】図２のａ、ｂ、ｃ、及びｅが、ＣＴＡＢ、Ｂ５８、Ｐ１２３、及びＰＳ＋Ｂ５６による鋳型であることを示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、ＣＴＡＰ＋ＮａＣｌ、３ｗｔ％のＰ１２３、３ｗｔ％のＰ１２３＋ポリ（プロピレングリコールアクリレート）、ミクロエマルション、及びＣＴＡＢ（ＮＨ4）2ＳＯ4による鋳型である。
【図３】一実施形態における、同時自己集合又は自己集合後の誘導体化によって細孔表面の化学的性質（即ち電荷及び疎水性）並びに細孔サイズが、有機シランと珪酸との共縮合によって主に制御されることを示す。Linら、Chem. Mater. 15, 4247-56 2003；Liu, J.ら、J. Phys. Chem.,104, 8323-2339, 2000；Fan, H.ら、Nature, 405, 56-60, 2000；Lu, Y.ら、J. Am. Chem. Soc., 122, 5258-5261, 2000参照。
【図４】ヒストンタンパク質によるＣＢ１プラスミドのパッケージングを示す。（Ａ）は、ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）を超らせん化し、超らせんｐＣＢ１をヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４でパッケージングし、得られたｐＣＢ１−ヒストン複合体を、核膜孔を通る移行を促進する核局在配列（ＮＬＳ）で修飾するために用いられるプロセスを示す概念図である。（Ｂ）及び（Ｄ）は、ＣＢ１プラスミド（Ｂ）及びヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（Ｄ）の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像である。スケールバー＝１００ｎｍ。（Ｃ）及び（Ｅ）は、それぞれ（Ｂ）及び（Ｄ）での赤線に対応する高さプロファイルを示す。
【図５】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１が装填され、ＭＣ４０によって標的を定められたメソ多孔性のシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の合成を示す。（Ａ）は、ＤＮＡを装填し、ペプチドで標的を定められたプロトセルを生成するために用いられるプロセスを示す概念図である。プロトセルのコアを形成するメソ多孔性のシリカナノ粒子をｐＣＢ１−ヒストン複合体の溶液中に単純に浸漬することによって、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をシリカナノ粒子に装填する。次にＰＥＧ化リポソームをＤＮＡが装填されたコアと融合し、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＭＣ４０）と、内在化したプロトセルのエンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）とで更に修飾された、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を形成する。スルフヒドリル−アミン架橋剤（スペーサーアーム＝９．５ｎｍ）を用いて、Ｃ末端システイン残基で修飾したペプチドをＳＬＢ中のＤＯＰＥ成分にコンジュゲートした。（Ｂ）は、プロトセルのコアとして用いられるメソ多孔性のシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝２００ｎｍ。挿入画像＝走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であって、１５〜２５ｎｍの細孔が表面から利用可能であることを示す。挿入画像のスケールバー＝５０ｎｍ。（Ｃ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定されたメソ多孔性のシリカナノ粒子のサイズ分布を示す。（Ｄ、左軸）バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）モデルを用いて図１４Ａに示す窒素収着等温線の吸着枝から計算された、メソ多孔性のシリカナノ粒子の累積細孔容積である。（Ｄ、右軸）ＤＬＳにより測定された、ｐＣＢ１−ヒストン複合体のサイズ分布である。
【図６】一実施形態における、メソ多孔性のシリカナノ粒子がヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１について高い収容能力を有し、得られたプロトセルが、エンドソーム環境を模倣する状況下でのみ被包されたＤＮＡを放出することを示す。（Ａ）は、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝−３８．５ｍＶ）又はアミン含有シランのＡＰＴＥＳで修飾されたメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝＋１１．５ｍＶ）中に被包可能な、ｐＣＢ１又はヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「複合体」）の濃度を示す。（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（１×１０9個）と共に１×１０6細胞／ｍＬを３７℃で２４時間培養した場合に、ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＣＢ１によりコードされる緑色蛍光タンパク質）に対して陽性となるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。ｘ軸は、プロトセルのコアがＡＰＴＥＳで修飾されたか否か及びｐＣＢ１がヒストンで予めパッケージングされたか否かを示す。（Ａ）及び（Ｂ）では、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）でパッケージングされたｐＣＢ１を対照として含む。（Ｃ）及び（Ｄ）は、疑似体液（Ｃ）又はｐＨ５緩衝液（Ｄ）に暴露した際の、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子及び対応するプロトセルからの、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の時間に依存した放出を示す。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、（Ｂ）については、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図７】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をＨＣＣまで送達するプロセスを示す概念図である。［１］種々のＨＣＣ株により過剰発現されるＭｅｔへのターゲティングペプチドの動員によって、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に高親和性で結合する。流動性のＤＯＰＣのＳＬＢはペプチドの流動性を促進し、それにより低いＭＣ４０密度で修飾されたプロトセルがＨｅｐ３Ｂに対して高い特異親和性を保持することを可能にする（図８Ａ参照）。［２］ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、受容体依存性エンドサイトーシスを介してＨｅｐ３Ｂによって内在化される（図８Ｂ及び図１５Ａ参照）。［３］エンドソーム条件はＳＬＢを不安定化し（Nature Materialsの参考文献を挿入）、エンドソーム分解性ペプチドＨ５ＷＹＧのプロトン化を引き起こす。これらは何れも、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞質ゾル中に拡散することを可能にする（図１６Ｂ参照）。［４］ｐＣＢ１−ヒストン複合体は、核局在配列（ＮＬＳ）で修飾された場合に、約２４時間以内にＨｅｐ３Ｂ細胞の核内に濃縮される（図１６Ｃ参照）。これによって、分裂中及び非分裂中の癌細胞の両方での効率的なトランスフェクションが可能になる（図１７参照）。
【図８】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルがＨＣＣに高親和性で結合し、Ｈｅｐ３Ｂによって内在化されるが正常肝細胞によっては内在化されないことを示す。（Ａ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルをＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に暴露した場合の見かけの解離定数（Ｋd）を示す。Ｋd値は、特異親和性に対して逆の関係にあり、飽和結合曲線から求められた（図２１参照）。エラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル（１０００倍の過剰量）に３７℃で１時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。ＭｅｔはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体で染色され（緑色）、プロトセルコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（Ａ〜Ｃ）又は０．５００ｗｔ％（Ａ）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。
【図９】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルは、ピコモル濃度でＨＣＣのアポトーシスを誘導するが、正常肝細胞の生存性に関してはごく小さい影響しか有さないことを示す。ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃でＨｅｐ３Ｂを連続して暴露した際の、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びサイクリンＢ１タンパク質の発現における用量（Ａ）及び時間（Ｂ）に依存した減少を示す。（Ａ）では、細胞を種々のｐＣＢ１濃度に４８時間暴露し、（Ｂ）では、５ｐＭのｐＣＢ１に種々の時間に渡って暴露した。肝細胞でのサイクリンＢ１タンパク質の発現及びＨｅｐ３ＢでのＺｓＧｒｅｅｎの発現が、対照として含まれる。リアルタイムＰＣＲ及び免疫蛍光法を用いて、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びタンパク質それぞれの濃度を測定した。（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した後の、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂの割合を示す。Ｇ2／Ｍ期の肝細胞の割合及びＳ期のＨｅｐ３Ｂの割合を比較のために含む。細胞は、細胞周期分析の前にヘキスト３３３４２で染色された。（Ｄ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。アポトーシスのマーカーに陽性である肝細胞の割合を対照として含む。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶに陽性である細胞は、アポトーシスの初期にあると見なし、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムの両方に陽性である細胞は、アポトーシスの後期にあると見なした。アポトーシス性細胞の総数は、一方及び両方に陽性である細胞の数を加算して求められた。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１０】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルが、対応するリポプレックスよりも２５００倍有効にＨＣＣの選択的なアポトーシスを誘導することを示す。（Ａ）は、ＤＯＰＣプロトセル、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）で修飾されたＤＯＰＣプロトセル、ｐＣＢ１とＤＯＴＡＰ及びＤＯＰＥの混合物（１：１ｗ／ｗ）とからなるリポプレックス、並びに１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００で修飾されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスのζ電位の値を示す。全てのζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。（Ｂ、左軸）ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル又はリポプレックスによって送達された５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合である。（Ｂ、右軸）１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞の９０％において３７℃で４８時間以内にアポトーシスを誘導するのに必要な、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル又はリポプレックスの数である。（Ｂ）については、細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色された。一方及び両方に陽性である細胞をアポトーシス性と見なした。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１１】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、肝細胞の生存性には影響を与えることなく、高濃度のタキソール、Ｂｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１をＨＣＣに選択的に送達することを示す。（Ａ）は、１０12個のプロトセル、リポソーム、又はリポプレックスの中に被包可能な、タキソール、Ｂｃｌ−２の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、及びＣＢ１プラスミドの濃度を示す。赤色のバーは、タキソール及びｐＣＢ１の両方がプロトセルに装填された場合に、タキソール及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。青色のバーは、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１のすべてがプロトセルに装填された場合又はｓｉＲＮＡ及びｐＣＢ１がリポプレックスに装填された場合に、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによってＨｅｐ３Ｂまで送達された場合の、オレゴングリーン（登録商標）４８８標識タキソール（緑色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ｓｉＲＮＡ（赤色）、及びＣｙ５標識ｐＤＮＡ（白色）の細胞内分布を示す共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞をＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの１０００倍の過剰量と共に３７℃で２４時間培養した後に固定して、ヘキスト３３３４２で染色した（青色）。スケールバー＝１０μｍ。（Ｃ）は、１０ｎＭのタキソール及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞細胞の割合を示す。割合は、Ｇ2／Ｍでの対数増殖細胞の割合に対して正規化された。（Ｄ）は、１０ｎＭのタキソール、２５０ｐＭのＢｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について陽性になるＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞の細胞の割合を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）において、「ｐＣＢ１」は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）を用いてパッケージングされて細胞まで非特異的に送達されたｐＣＢ１を指す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポソームは、５ｗｔ％のＤＭＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１６：０）を含むＤＳＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポプレックスは、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）混合物からなり、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１２】ＣＢ１プラスミドのベクターマップを示す。ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）は、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（クロンテック・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）及びｐＮＥＢ１９３ベクター（ニュー・イングランド・バイオラボ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）から構築された。ｐＣＢ１は、サイクリンＢ１特異的短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びスナギンチャク種の緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）をコードする。構成的ｓｈＲＮＡ発現は、ＲＮＡＰｏｌＩＩＩ依存性ヒトＵ６プロモーター（ＰU6）によって駆動され、構成的ＺｓＧｒｅｅｎ発現は、サイトメガロウイルスの最初期プロモーター（ＰCMV IE）によって駆動される。ｏｒｉエレメント及びＡｍｐRエレメントは、大腸菌内におけるプラスミドの増殖を可能にする。サイクリンＢ１特異的ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列に下線を付す。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＩＲＥＮベクターに導入するために用いた制限酵素部位（ＢａｍＨＩは赤色、ＥｃｏＲＩは青色）が横にある。
【図１３】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の特徴を示す。（Ａ）は、漸増濃度のヒストン（モル比１：２：２：２：２のＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）に暴露されたｐＣＢ１に関する電気泳動移動度シフトアッセイを示す。ｐＣＢ１：ヒストンのモル比をレーン３〜６に示す。レーン１はＤＮＡラダーを含み、レーン２はｐＣＢ１を含み添加ヒストンを含まない。（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（ｐＣＢ１：ヒストンのモル比１：５０）のＴＥＭ画像である。スケールバー＝５０ｎｍ。
【図１４】未装填のメソ多孔性のシリカナノ粒子及びｐＣＢ１が装填されたメソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着分析を示す。（Ａ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着等温線である。（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子のブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積である。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１５】ＤＯＰＣプロトセルの小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）データを示す。フィッティングデータは、一定厚さの共形シェルを有する多分散な多孔性シリカ球のモデルを用いて得られたものであり、シリカ粒子の表面に細孔開口部を覆う３６Åの二重層が存在することを示す。厚さ０、２０、６０Åの二重層についてシミュレーションされたＳＡＮＳデータを比較のために含む。測定された二重層の厚さ３６Åは、平坦な担持された脂質二重層について行われた他の中性子研究（３３〜３８Å）と一致しており、これらの対照条件下では、脂質二重層の水素に富む炭化水素コアからの散乱を主に示す。
【図１６】プロトセルが、被包されたＤＮＡをヌクレアーゼ分解から守ることを示す。ＤＮａｓｅＩ処理したｐＣＢ１（レーン３）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン５）、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（レーン７）、カチオン性コアを有するプロトセルに装填されたｐＣＢ１（レーン９）、及びアニオン性コアを有するプロトセルに装填されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１１）のアガロースゲル電気泳動を示す。裸のｐＣＢ１（レーン２）、ヒストンから放出されたｐＣＢ１（レーン４）、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスから放出されたｐＣＢ１（レーン６）、カチオン性コアを有するプロトセルから放出されたｐＣＢ１（レーン８）、及びアニオン性コアを有するプロトセルから放出されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１０）を比較のために含む。レーン１はＤＮＡラダーを含む。サンプルをＤＮａｓｅ１（５０ｎｇのＤＮＡ当たり１ユニット）と共に室温で３０分培養し、ｐＣＢ１放出は１％ＳＤＳを用いて促進された。
【図１７】メソ多孔性のシリカナノ粒子（「未修飾のコア」）、２０％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳ中に室温で１２時間浸漬したメソ多孔性のシリカナノ粒子（「ＡＰＴＥＳ修飾コア」）、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「ｐＣＢ１−ヒストン複合体」）、及びＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（「ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックス」）のζ電位（ζ）の値を示す。ζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１８】図６及び２４においてＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性の細胞の割合を求めるのに用いられた、代表的な前方散乱−側方散乱（ＦＳＣ−ＳＳＣ）プロット図及びＦＬ−１ヒストグラムである。（Ａ）〜（Ｄ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ａ及びＣ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＢ及びＤ）であり、（Ａ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｃ）はしていない。ＦＬ−１チャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を、（Ｂ）及び（Ｄ）に示す。（Ｅ）〜（Ｈ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ｅ及びＧ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＦ及びＨ）であり、（Ｅ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｇ）はしていない。（Ｆ）及び（Ｈ）のゲートは、ＭＦＩ≦２８２、即ちＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞のＭＦＩの１００倍（Ｄ図参照）の細胞の割合に対応する。
【図１９】ＭＣ４０ターゲティングペプチドの識別を示す。図中に示す概念図は、ＭＣ４０ターゲティングペプチドを選択するのに用いられたプロセスを表す。１×１０11ｐｆｕ／ｍＬのペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された１００ｎＭの組み換えヒトＭｅｔ（ｒｈＭｅｔ）と共に室温で１時間培養した。プロテインＡ又はプロテインＧでコーティングした磁性粒子を用いてＭｅｔ−ファージ複合体を親和性捕捉し、続いてＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１０回洗浄して未結合のファージを除去した。結合したファージクローンは低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ２．２）で溶出し、溶出物を宿主細菌（大腸菌ＥＲ２７３８）の感染によって増幅した。
【図２０】ＭＣ４０ターゲティングペプチドの特徴を示す。（Ａ）は、５回目の選択ラウンド後のペプチド配列アラインメントである。主配列ＡＳＶＨＦＰＰ（配列番号１）は、以前に確認されていたＭｅｔ特異的な１２ｍｅｒのＹＬＦＳＶＨＷＰＰＬＫＡ（配列番号１５、Zhaoら、ClinCancerRes 2007;13(20 6049-6055)）の下線部分に相似である。標的に無関係のＨＡＩＹＰＲＨペプチド（約１０％）（配列番号１６、Brammerら、Anal.Biochem. 377 (2008) 88-89）を提示するファージクローンは、配列アラインメントから除かれた。（Ｂ）及び（Ｃ）は、親和性選択したファージクローンがｒｈＭｅｔに結合した度合を、酵素結合免疫吸着剤法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。（Ｂ）に示すＥＬＩＳＡのスキームは、材料及び方法の項で説明する。ＥＬＩＳＡの結果を（Ｃ）に示す。（Ｄ）は、Ｍｅｔに結合しないペプチドを除去した後の配列アラインメントである。図１９に示す共通配列は、このアラインメントから決定された。（Ｅ）及び（Ｆ）は、（１）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、無関係なファージクローン（ＴＰＤＷＬＦＰ）（配列番号１７）と、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（青色のドット）、又は（２）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、ＭＣ４０クローンと、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（橙色のドット）、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｅ）及び肝細胞（Ｆ）についてのフローサイトメトリーの散布図である。未処理細胞（赤色のドット）を用いて、ＦＬ−１（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光）及びＦＬ−２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６蛍光）のチャンネルについての電圧パラメータを設定した。
【図２１】Ｈｅｐ３Ｂに暴露されたＭＣ４０で標的を定められたプロトセルについての例示の結合曲線である。図８Ａの解離定数を求めるために、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞をサイトカラシンＤで前処理してエンドサイトーシスを抑制し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められた種々の濃度のプロトセルと共に３７℃で１時間培養した。フローサイトメトリーを用いて得られた細胞群の平均蛍光強度を測定し、プロトセル濃度に対してプロットして全体の結合曲線を得た。非特異的結合は、飽和濃度の非分類の肝細胞増殖因子の存在下において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められたプロトセルと共に細胞を培養することによって求められた。特異的結合曲線は、非特異的結合曲線を全体の結合曲線から引くことによって得られた。Ｋd値は、特異的結合曲線から計算された。この図に示す実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（約６ペプチド／粒子）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。対応するＫd値は１０５０±１４２ｐＭである。全てのエラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図２２】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化され、Ｈ５ＷＹＧペプチドの非存在下でリソソームへ誘導されることを示す。（Ａ）は、Ｈｅｐ３Ｂ又は肝細胞の細胞のそれぞれによって１時間以内に３７℃で内在化された、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの平均数である。１×１０6個の細胞を飽和濃度（１００μｇ／ｍＬ）のヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の非存在下（−）又は存在下（＋）において種々の濃度のプロトセルと共に培養し、フローサイトメトリーを用いて各細胞に結合した粒子の平均数を求めた。プロトセルをＮＢＤ及びｐＨｒｏｄｏ（商標）で標識して、表面に結合した粒子を酸性細胞内区画に内在化されたものから区別した（それぞれについて）。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）は、プロトセルと、（１）Ｒａｂ５、（２）Ｒａｂ７、（３）リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）又は（４）Ｒａｂ１１ａとの間のピアソンの相関係数（ｒ値）を示す。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を１０００倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識されたプロトセルと共に３７℃で１時間培養した後、固定して透過処理し、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、ＬＡＭＰ−１、又はＲａｂ１１ａに対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体と共に培養した。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２３】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、ＨＣＣ細胞の核内で時間に依存して濃縮されることを示す。（Ａ）〜（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で１５分（Ａ）、１２時間（Ｂ）、又は２４時間（Ｃ）暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。（Ｂ）については、プロトセルのエンドソーム脱出及びｐＣＢ１の細胞質ゾル内分散は、約２時間後までには明白であった。しかし、ＺｓＧｒｅｅｎ発現は１２〜１６時間まで検出可能でなかった。２４時間の時点で、Ｃｙ５標識ｐＣＢ１は細胞内全体に分布したままであった。一方、（Ｃ）において細胞質ゾルの染色が見えないのは、核内に局在したピクセルの飽和を回避するためにＣｙ５チャンネルのゲインを下げたせいである。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）は、Ｃｙ５で標識したｐＣＢ１及びヘキスト３３３４２で標識したＨｅｐ３Ｂの核についての、時間に対するピアソンの相関係数（ｒ値）である。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０個の細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２４】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、分裂中及び非分裂中のＨＣＣ細胞の両方をほぼ１００％の効率で選択的にトランスフェクションすることを示す。（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で２４時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、（Ａ）では分裂中であり、（Ｃ）及び（Ｅ）では約９５％コンフルエントであった。全ての画像においてｐＣＢ１はヒストンで予めパッケージングされており、（Ｅ）において、ｐＣＢ１−ヒストン複合体はＮＬＳで更に修飾された。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（「ＰＣ」）１×１０9個に３７℃で２４時間連続して暴露された際に、ＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合を示す。細胞は（Ｂ）では分裂中であり、（Ｄ）及び（Ｆ）では約９５％コンフルエントであった。ｘ軸は、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）及びｐＣＢ１−ヒストン複合体（「複合体」）がＮＬＳで修飾されていたか否かを示す。ｐＣＢ１単独に加えて、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１も対照として用いられた。細胞を２０ｍｇ／ｍＬの小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）に暴露し、核膜孔複合体を経るＮＬＳ修飾したｐＣＢ１の移行を遮断した。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｇ）〜（Ｉ）は、それぞれ（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）で用いた細胞の細胞周期のヒストグラムである。Ｇ0／Ｇ1期の細胞の割合を各ヒストグラムについて示す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２５】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。（Ｂ）の矢印は、有糸分裂細胞を示す。サイクリンＢ１はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識モノクローナル抗体で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【図２６】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ（白色）及びヨウ化プロピジウム（赤色）で染色し、それぞれ初期及び後期のアポトーシスを試験した。細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【図２７】双性イオン性脂質からなるＳＬＢを有するプロトセルが、ごく低い非特異的細胞毒性しか誘導しないことを示す。１×１０9個のＡＰＴＥＳ修飾メソ多孔性のシリカナノ粒子、ＡＰＴＥＳ修飾コアを有するＤＯＰＣプロトセル、スクランブルｓｈＲＮＡ配列をコードするプラスミド（「スクランブルｐＣＢ１」）が装填されたＤＯＰＣプロトセル、又はスクランブルｐＣＢ１が装填されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）リポプレックスに３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂの割合を示す。プロトセル及びリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。正荷電及び負荷電のポリスチレンナノ粒子（それぞれ「アミン−ＰＳ」及び「カルボキシル−ＰＳ」）を正の対照として用い、一方で１０ｍＭの抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）又は１ｐｍｏｌの遊離したｐＣＢ１に暴露されたＨｅｐ３Ｂを負の対照として用いた。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図２８】ｐＨの関数としてのイマチニブの水溶性を示す。薬物の溶解度は、化学構造での弱塩基性官能基のイオン化により、ｐＨが減少するに連れて増大した。
【図２９】種々の組成におけるｐＨ７におけるイマチニブの溶解度を示す。１０％エタノールを有する組成は、他の組成と比較して最も高い溶解度を示した。イマチニブは、ＤＭＳＯに非常に可溶であることも見いだされた。
【図３０】溶媒系が２４時間に渡ってイマチニブの透過に及ぼす影響を示す。共溶媒を含有する全ての組成は、対照（水、ｐＨ７）と比較してより高い皮膚透過性を示した。ＤＭＳＯは最大の透過を示した。（N12-186PCT 2012-032-01 Provisional.PDF）。
【図３１】イマチニブの流量（経皮透過の速度）に溶媒系が及ぼす影響を示す。ＤＭＳＯを含有する組成は、調査された組成のうちで最高の流量を示した。
【図３２】ｓｉＲＮＡ又はタンパク質毒素が装填されたナノ多孔性粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）を合成するのに用いられるプロセスを示す図である。高分子治療薬が装填された、肝細胞癌（ＨＣＣ）を標的としたプロトセルを形成するために、アミン含有シラン（ＡＥＰＴＭＳ）で修飾されたナノ多孔性シリカコアを、最初に短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はタンパク質系毒素（例えばリシン毒素Ａ鎖）の溶液中に浸漬した。次に、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及び１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ（５５：５：３０：１０質量比）からなるリポソームを、カーゴが装填されたコアに融合した。得られた担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＳＰ９４）及び内在化されたプロトセルのエンドソーム／リソソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）を用いて修飾した。グリシン−グリシン（ＧＧ）スペーサー及びＣ末端システイン残基で修飾されたペプチドを、９．５ｎｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを有するヘテロ二官能性の架橋剤（ＳＭ（ＰＥＧ）24）を介して、ＤＯＰＥ成分に存在する１級アミンにコンジュゲートした。実施例３に引用するLoら65及びMooreら66によって報告されたＳＰ９４配列及びＨ５ＷＹＧ配列は赤色で示されている。
【図３３】プロトセルコアを形成するナノ多孔性シリカ粒子の特徴を示す。（Ａ）は、サイズに基づく分離の前後における多峰分布シリカ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）を示す。粒子は、分離後に約１６５ｎｍの平均粒子直径を有する。（Ｂ）は、多峰分布粒子の窒素収着等温線を示す。ヒステリシスの存在は、小さい細孔によって相互に連結された大きい細孔の網状組織と矛盾しない。（Ｃ）は、（Ｂ）の吸着等温線から算出された細孔直径対細孔容積のプロットが、大きい（２０〜３０ｎｍ）細孔及び小さい（６〜１２ｎｍ）細孔の存在を明らかにする。
【図３４】プロトセルはｓｉＲＮＡの高い収容能力を有し、その放出は酸性ｐＨによって引き起こされる。（Ａ）は、１０10個のプロトセル及び１０10個のリポプレックスに装填され得るｓｉＲＮＡ濃度を示す。０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中における未修飾シリカコア及びＡＥＰＴＭＳで修飾されたシリカコアのζ電位値は、それぞれ−３２ｍＶ及び＋１２ｍＶである。（Ｂ）及び（Ｃ）は、３７℃でｐＨ７．４の疑似体液（Ｂ）又はｐＨ５．０の緩衝液（Ｃ）に暴露された際の、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを有するＤＯＰＣプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、及びＤＯＴＡＰリポプレックスからｓｉＲＮＡが放出される速度を示す。ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、及びＤＯＴＡＰリポプレックスの平均直径は、それぞれ１７８ｎｍ、１３５ｎｍ、及び１４４ｎｍであった。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図３５】ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、様々なサイクリンファミリーのメンバーをＨＣＣにおいて発現抑制するが、肝細胞においては発現抑制しない。（Ａ）及び（Ｂ）は、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルにＨｅｐ３Ｂを暴露した際の、サイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥタンパク質の発現の用量（Ａ）及び時間（Ｂ）に依存した減少を示す。（Ａ）では１×１０6個の細胞が、様々な濃度のｓｉＲＮＡに４８時間連続して暴露され、（Ｂ）では、１２５ｐＭのｓｉＲＮＡに様々な時間連続して暴露された。（Ｃ、左軸）１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞を１２５ｐＭのｓｉＲＮＡに４８時間暴露した際に残る、初期サイクリンＡ２タンパク質濃度に対する割合（％）を示す。（Ｃ、右軸）サイクリンＡ２タンパク質発現を初期濃度の１０％まで抑えるために１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞と一緒に培養する必要がある、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、及びＤＯＴＡＰリポプレックスの数である。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ＤＯＰＣ（及びＤＯＴＡＰ）リポプレックスは、５５：５：３０：１０の比のＤＯＰＣ（又はＤＯＴＡＰ）：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−２０００ＰＥを用いて調製され、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全ての実験は、完全増殖培地において３７℃で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図３６】ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露した後の、Ｈｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞を１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたプロトセル（白色）と一緒に培養した後に固定して透過処理し、ヘキスト３３３４２（青色）及びサイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、又はサイクリンＥに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗体（緑色）で染色した。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％ＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。スケールバー＝２０μｍ。
【図３７】サイクリン特異的ｓｉＲＮＡ混合物が装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、肝細胞の生存性に影響すること無くＨＣＣのアポトーシスを誘発する。（Ａ）は、サイクリン特異的ｓｉＲＮＡ混合物が装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに様々な時間連続して３７℃で暴露された際に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識アネキシンＶ及び／又はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合（％）を示す。アネキシンＶに陽性である細胞はアポトーシスの初期にあると見なし、アネキシンＶ及びＰＩの両方に陽性の細胞はアポトーシスの後期にあると見なした。アポトーシス性細胞の総数は、アポトーシスの初期及び後期にある細胞数を加算して求められた。ｓｉＲＮＡの総濃度は、約１２５ｐＭに維持された。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露された後の、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞を１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたプロトセル（白色）と一緒に培養した後に、ヘキスト３３３４２（青色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識アネキシンＶ（緑色）、及びヨウ化プロピジウム（赤色）で染色した。細胞の形状を示すために、微分干渉（ＤＩＣ）画像を含む。スケールバー＝２０μｍ。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図３８】プロトセルは、高濃度のリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）を被包し、酸性ｐＨにおいてのみそれを放出する。（Ａ）は、１０10個のプロトセル中及び１０10個のリポソーム中に被包され得るＲＴＡの濃度を示す。未修飾シリカコア及びＡＥＰＴＭＳで修飾されたシリカコアの０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）におけるζ電位値は、それぞれ−３２ｍＶ及び＋１２ｍＶである。脱グリコシル化されたＲＴＡの等電点（ｐＩ）は約７である。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを有するＤＯＰＣプロトセル、及びＤＯＰＣリポソームをｐＨ７．４の疑似体液（Ｂ）又はｐＨ５．０の緩衝液（Ｃ）に３７℃で暴露した際の、時間に依存したＲＴＡ放出を示す。ＲＴＡが装填されたプロトセル及びリポソームの平均直径は、それぞれ１８４ｎｍ及び１４０ｎｍであった。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図３９】ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、タンパク質生合成をＨＣＣにおいて阻害するが、肝細胞においては阻害しない。（Ａ）及び（Ｂ）は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルにＨｅｐ３Ｂを暴露した際の、新生タンパク質合成の用量に依存した減少（Ａ）及び時間に依存した減少（Ｂ）を示す。（Ａ）では、１×１０6個の細胞を様々な濃度のＲＴＡに４８時間連続して暴露し、（Ｂ）では、２５ｐＭのＲＴＡに様々な時間連続して暴露した。新生タンパク質合成は、メチオニンのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識誘導体を用いて定量化された。（Ｃ、左軸）１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞が２５ｐＭのＲＴＡに４８時間連続して暴露された際に残留した、初期の新生タンパク質濃度の割合（％）を示す。（Ｃ、右軸）タンパク質生合成を９０％抑えるために１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞と一緒に培養される必要がある、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセル及びリポソームの数である。プロトセル及びリポソームの二重層は、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全ての実験は、完全増殖培地において３７℃で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図４０】ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露された後の、Ｈｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞を１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたプロトセル（白色）と一緒に培養した後、ヘキスト３３３４２（青色）及びＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＡＨＡ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８タンパク質合成キット（緑色）で染色した。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。スケールバー＝２０μｍ。
【図４１】ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、ＨＣＣの選択的アポトーシスを誘発する。（Ａ）は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で様々な時間暴露された際に、カスパーゼ−９活性化又はカスパーゼ−３活性化に陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合（％）を示す。ＲＴＡの総濃度は、約２５ｐＭに維持された。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露された後の、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞は、１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたプロトセル（白色）と一緒に培養された後に、ヘキスト３３３４２（青色）、ＣａｓｐＧＬＯＷフルオレセイン活性カスパーゼ−９染色キット（緑色）、及びＣａｓｐＧＬＯＷレッド活性カスパーゼ−３染色キット（赤色）で染色された。細胞の形状を示すために、微分干渉（ＤＩＣ）画像を含む。スケールバー＝２０μｍ。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図４２】角質層の「レンガ及びモルタル」構造を、受動的な経皮拡散の３つの経路と共に示す図である。経細胞間拡散は主要な経路として広く認められているが、通常は経細胞拡散と並行して起こり、両方とも用いられる透過増強方法によって影響される。汗腺及び毛穴は体表面積の約１％に相当するのみであるので、経付属器官での拡散は多くの場合に無視される。
【図４３】プロトセル、並びに特定の用途に関して最適化するためになされ得るそのコア及びＳＬＢの様々な改変の代表例を説明する図である。先ず左下では、プロトセルは、担持された脂質二重層によって被包されたナノ多孔性シリカコアからなる。コアは、大きい表面積、制御可能な粒子直径、調整可能な細孔サイズ、改変可能な表面の化学的性質を有し、多種類のカーゴ（即ち、ナノ粒子、タンパク質毒素、治療用核酸、薬物）の大容量の装填を促進するように設計されることができる。担持された脂質二重層は、特異的結合、内在化及び透過に作用するように、へテロ二官能性の架橋剤を用いて様々な分子（即ち、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））がコンジュゲートされることができる流動性表面を提供する。
【図４４】予備試験の結果は、プロトセルが角質層と相互作用し、角質層に浸透し、及び皮膚を通って拡散できること、並びにそれらの相互作用の経皮動力学がＳＬＢの成分及び組成によって影響されることを明らかにする。ａ．）は、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで処理された皮膚サンプル（ｎ＝３）の容器中のＳｉＯ2総量（μｇ）を示す、ＩＣＰ−ＭＳの結果である。ここで角質層は、そのままであるか又は除去された。ｂ．）は、フルオロフォアを用いたコアの機能化を、各ステップ後になされるべき必要な特性評価と共に説明する図である。ｃ．）では、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌから組成されたプロトセルは、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌの組成に対して約２倍量のＳｉＯ2を２４時間後の容器中において示した。ただし、ＰＥＧを用いて組成された同プロトセルは、それらの未ＰＥＧ化組成に対して著しく減少した動力学を示す。
【図４５】見込まれる宿主細胞及び感染細胞への抗ウイルス薬の標的送達用に、本発明者が開発を提案するプロトセルを示す図である。多孔性シリカナノ粒子のコアは青色で示され、ＳＬＢは黄色で示されている。
【図４６】標的を定められていないＰＥＧ化プロトセルの予備試験のインビボでの特性評価を示す。（Ａ）は、プロトセル又は食塩水が注射されたＢａｌｂ／ｃマウスの時間に依存した体重を示す。（Ｂ）は、ＤｙＬｉｇｈｔ６３３標識プロトセル又は１００μＬの食塩水（対照）が注射され、ＩＶＩＳ−ＬｕｍｉｎａＩＩを用いてイメージングされたＢａｌｂ／ｃマウスである。全ての実験において、プロトセルは１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００で修飾され、尾静脈に注射された。
【図４７】インビボにおけるプロトセルのおおまかな生体内分布及び毒性を示す。（Ａ）は、静注直後の粒子の体循環を示し、（Ｂ）は、注射後４８時間での肝臓及び骨への局在を示す。（Ｃ）では、週３回のプロトセル投与は、動物の全体重などの全体的な毒性徴候をもたらさなかった。（Ｄ）では、粒子の蛍光は、肝臓の解剖学的構造に影響を及ぼすこと無く、プロトセルが注射されたマウスの肝臓に蓄積することが観察される（Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４。４週間で計３０ｍｇ）。
【図４８】肝臓の厚い切片中の粒子分布の３Ｄレンダリングを示す。粒子は、決まってはいるが現時点では特定されていない肝臓の部分に経時的に蓄積することが分かった。全体的な毒性及び組織学的毒性は、最大３０ｍｇ／マウスの用量で４週間に渡って観察されなかった。スケール＝２０μｍ。
【図４９】実施例８の実験で測定された、皮膚の全層及び部分的な層を通過してのプロトセルの拡散を示す。
【図５０】実施例８の実験で測定された、皮膚の全層及び部分的な層を通過してのプロトセルの拡散を示す。
【図５１】実施例８の実験で測定された、皮膚の全層及び部分的な層を通過してのプロトセルの拡散を示す。
【図５２】実施例８の実験で測定された、ドナーキャップサンプルのＩＣＰ質量分析を示す。
【図５３】実施例８の実験で測定されたコアの機能化を示す。
【図５４】実施例８の実験で測定された、容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために用いられた蛍光分光分析を示す。
【図５５】実施例８の実験で測定された、容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために用いられた蛍光分光分析を示す。
【図５６】実施例８の実験で測定された、容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために用いられた蛍光分光分析を示す。
【図５７】実施例８の実験で測定された、容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために用いられた蛍光分光分析を示す。
【図５８】実施例８の実験で測定されたように、正の対照は、皮膚の自己蛍光を利用しながら、皮膚中の蛍光標識された粒子がイメージングされることができることを示した。
【図５９】様々なプロトセルの組成が、それぞれの組成についてｎ＝４で投与された（０．５×ＰＢＳ中１６ｍｇ／ｍｌを５００μＬ）。各実験につき１つの皮膚（Ｓ１）が、０．５×ＰＢＳで処理された。標準曲線は、実施例９の実験で測定されたように、Ｓ１の２４時間の容器液の１：２希釈を用いて濃度範囲０．１６ｍｇ／ｍｌ〜１．９５３１２５Ｅ-5ｍｇ／ｍｌについて作成された。
【図６０】実施例９の実験で測定された蛍光分光分析と関連した線形回帰分析を示す。
【図６１】ＳＬＢの組成は、実施例９の実験で測定されたように経皮拡散に大きく影響し得る。
【図６２】ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌの組成へのＰＥＧの添加及びＤＳＰＣ／ｃｈｏｌの組成へのＰＥＧの添加は、実施例９の実験で測定されたように経皮拡散を著しく減少させた。
【図６３】実施例９の実験で測定された、時間の関数としての補正後の平均蛍光強度における個々の増大を示す。
【図６４】実施例９の実験で測定された、時間の関数としての補正後の平均蛍光強度における個々の増大を示す。
【図６５】実施例９の実験で測定された動力学に関する組成の影響を示す。
【図６６】実施例９の実験で測定された動力学に関する組成の影響を示す。
【図６７】実施例９の実験で測定された動力学に関する組成の影響を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１が装填された、ＭＣ４０によって標的を定められたメソ多孔性のシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の合成＞
図５に示すように、図５（Ａ）はＤＮＡを装填し、ペプチドで標的を定められたプロトセルを生成するために用いられるプロセスを示す概念図である。この方法に従って、プロトセルのコアを形成するメソ多孔性のシリカナノ粒子をｐＣＢ１−ヒストン複合体の溶液中に単純に浸漬することによって、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をシリカナノ粒子に装填する。次にＰＥＧ化リポソームをＤＮＡが装填されたコアと融合し、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＭＣ４０）と、内在化したプロトセルのエンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）とで更に修飾された、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を形成する。スルフヒドリル−アミン架橋剤（スペーサーアーム＝９．５ｎｍ）を用いて、Ｃ末端システイン残基で修飾したペプチドをＳＬＢ中のＤＯＰＥ成分にコンジュゲートした。図５（Ｂ）は、プロトセルのコアとして用いられるメソ多孔性のシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝２００ｎｍ。挿入画像＝走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であって、１５〜２５ｎｍの細孔が表面から利用可能であることを示す。挿入画像のスケールバー＝５０ｎｍ。５（Ｃ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定されたメソ多孔性のシリカナノ粒子についてのサイズ分布を示す。（５Ｄ、左軸）バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）モデルを用いて図１４Ａに示す窒素収着等温線の吸着枝から計算された、メソ多孔性のシリカナノ粒子の累積細孔容積の線図である。（５Ｄ、右軸）ＤＬＳにより測定された、ｐＣＢ１−ヒストン複合体のサイズ分布である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルはＨＣＣに高親和性で結合し、Ｈｅｐ３Ｂによって内在化されるが正常肝細胞によっては内在化されない＞
図８（Ａ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルをＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に暴露した場合の見かけの解離定数（Ｋd）を示す。Ｋd値は、特異親和性に対して逆の関係にあり、飽和結合曲線から求められた（図２１参照）。エラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。図８（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル（１０００倍の過剰量）に３７℃で１時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。ＭｅｔはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体で染色され（緑色）、プロトセルコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（Ａ〜Ｃ）又は０．５００ｗｔ％（Ａ）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
＜イマチニブの経皮送達＞
上皮は皮膚の最上層であり、さらに４つの層に分解されることができる。上皮の最外層は角質層であって、厚さ約１０〜２０ｐｍであり、経皮送達に伴う問題の原因である。上皮の他の３つの層は、まとめて生存上皮として分類されることができる。生存上皮は、厚さ５０〜１００ｐｍである。生存上皮は、免疫細胞（ランゲルハンス細胞）、表皮ケラチノサイト、感覚神経（メルケル細胞）、並びに毛細血管床、細静脈及び細動脈の網状組織を含んでいる。真皮は厚さ１〜２ｍｍであり、他の種類の免疫細胞（マスト細胞、リンパ球、マクロファージ、好中球、プラズマ細胞）、線維芽細胞、及び様々な線維（神経線維、コラーゲン、弾性線維）を含む疎性組織からなる。さらに図４２は、角質層を通過するカーゴの送達に用いられることができる４種類の主要な手法である、（ａ）経細胞間経路、（ｂ）毛穴経路、（ｃ）経細胞経路、及び（ｄ）角質層除去を説明する。重要なことに、角質層から真皮を通る漸増的な水和の勾配が存在し、この勾配は、生存上皮及び真皮の中への様々な分子の拡散の駆動力を提供することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
経皮プロトセルは、従って、（ａ）イマチニブなどの１つ以上の薬学的に活性な薬剤が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する多孔性ナノ粒子からなることができる。ここで脂質二重層は、１つ以上の角質層透過性増強剤、例えば一価飽和ω−９脂肪酸（オレイン酸、エライジン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、及びネルボン酸、最も好ましくはオレイン酸）、アルコール、ジオール（最も好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、Ｒ８ペプチド、並びにエッジアクチベータ（胆汁酸塩、ポリオキシエチレンエステル及びポリオキシエチレンエーテル、一本鎖界面活性剤（例えばデオキシコール酸ナトリウム）など）を含む。プロトセルは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、好ましくは約６５ｎｍ〜約７５ｎｍの平均を有することができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
［ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルによって誘発されるアポトーシス］
［結果］
＜ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセルの特徴＞
シリカナノ粒子は、Carrollら35によって記載されるように調製され、６００ｍ2／ｇより大きなＢＥＴ表面積、約６５％の細孔容積率、及び６〜１２ｎｍの細孔によって相互に連結された、表面から利用可能な大きな（２０〜３０ｎｍ）細孔からなる多峰分布の細孔形態を有した（図３３Ｂ、Ｃ参照）。シリカナノ粒子は、方法の項に記載のように、ｓｉＲＮＡ（又はリシン毒素Ａ鎖）を装填される前にサイズによって分けられた（図３３Ａ参照）。一連の方法を用いて構成されたプロトセル又はリポプレックスのｓｉＲＮＡ装填容量が、図３４Ａに示される。双性リン脂質ＤＯＰＣからなるリポプレックスは、１０10個の粒子当たり約１０ｎＭのｓｉＲＮＡを被包した。カチオン性脂質ＤＯＴＡＰからなるリポプレックスの構築物は、恐らくは負荷電のヌクレオチドと正荷電の脂質成分との間の引力的な静電相互作用により、ｓｉＲＮＡカーゴでの５倍の増加をもたらした。双性脂質二重層を備えた負荷電のシリカコアを含有するプロトセルは、カチオン性のリポプレックスとほぼ同等の収容能力を有した。アミン含有シランであるＡＥＰＴＭＳを用いたシリカコアの修飾は、ζ電位を−３２ｍＶから＋１２ｍＶへと増大させ、１０10個の粒子当たり約１μΜのｓｉＲＮＡの収容能力をもたらした。ｓｉＲＮＡを負荷電のコア中に相助作用的に装填するためのＤＯＴＡＰリポソームの使用は36、粒子ベースの治療用途にしばしば用いられる双性リポプレックスよりも１００倍よりも大きな、類似の収容能力を有するプロトセルをもたらした。代用生体液中に分散された際のＤＯＰＣリポプレックス、ＤＯＴＡＰリポプレックス、及びＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを有するＤＯＰＣプロトセルの安定性が、図３４Ｂ、３４Ｃに示される。ＤＯＰＣリポプレックスは、中性ｐＨ条件下及び弱酸性ｐＨ条件下の両方においてそれらの被包されたｓｉＲＮＡを迅速に放出し、４〜１２時間以内に含有したヌクレオチドの完全な喪失をもたらす。ＤＯＴＡＰリポプレックスは中性ｐＨ条件下においてＤＯＰＣリポプレックスよりも安定であったが、それらのｓｉＲＮＡ含有量の約５０％は、７２時間の間に失われた。両方のリポプレックスとは極めて対照的に、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを有するＤＯＰＣプロトセルは、疑似体液に７２時間暴露された場合に、それらの被包されたＲＮＡの９５％を保持した。エンドソーム／リソソーム経路を反映する弱酸性条件下においては、ｓｉＲＮＡが装填されてＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアと、担持された脂質二重層のＰＥ頭部基及びＰＣ頭部基との間での減少した静電相互作用及び双極性相互作用は、膜の不安定化及び酸性媒体へのコアの暴露を引き起こした。膜の不安定化後に、カーゴの拡散とコアの分解とが組み合わされた速度は、図３４Ｃに見られる放出プロファイルをもたらした。従って、ｓｉＲＮＡ装填容量、粒子安定性、及び放出特性の点で、プロトセルは相当するリポプレックスを上回る劇的な改善を示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
＜毒素が装填されたプロトセルの特徴＞
大きくて（２０〜３０ｎｍ）表面から利用可能な細孔の存在により、多峰分布のシリカナノ粒子には、ジフテリア毒素、コレラ毒素、及びリシン毒素などの様々なタンパク質毒素が容易に装填可能である。さらに、低密度（０．０１５ｗｔ％、又は約６ペプチド／プロトセル）のＳＰ９４で修飾されたＤＯＰＣプロトセルによって示された高度の差別的な特異性は、特に癌細胞への細胞毒性な薬剤の選択的送達を可能にする。リシン毒素はヒマ（トウゴマ）の種子中で見つけられ、ジスルフィド結合によって一緒になったＡサブユニット及びＢサブユニットからなるヘテロ二量体で構成される。Ｂサブユニットは、受容体依存性エンドサイトーシスによる細胞内への毒素侵入を媒介し、Ａサブユニットは、２８ＳｒＲＮＡ中の特定のグリコシド結合を切断することによってタンパク質合成を阻害する38。触媒活性のリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）は、多数のモデル系において癌細胞の増殖を阻害するために、腫瘍特異的免疫毒素のサブユニットとして用いられて来た39、40。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
ＲＴＡが装填されたプロトセルがＨＣＣにおいて細胞毒性を選択的に誘発するが対照の肝細胞では誘発しないという能力は、図４１に示される。ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、カスパーゼ−９及び／又はカスパーゼ−３の活性化によって測定された場合、早くも８時間でＨｅｐ３細胞のアポトーシスを誘発し、２０〜２８時間までには５０％の細胞が陽性になった（Ａ図）。完全な細胞死が４８時間までに見られた。同等のプロトセル濃度は、７日間の培養後でさえも、肝細胞の生存性を対照レベルより減少させなかった。プロトセル分布及びアポトーシスを示す顕微鏡法画像が、Ｂ図及びＣ図に示される。ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルのＨｅｐ３Ｂへの添加後４８時間では、プロトセルは細胞質に分布し、細胞はカスパーゼ−９活性化及びカスパーゼ−３活性化の両方に陽性であった（Ｂ図）。Ｃ図に示されるように、対照の肝細胞は、同一の実験条件下においてカスパーゼ染色及び粒子蓄積に陰性のままであった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
１５０ｎｍのコアを有するプロトセルは、粒子当たり（Ｌ当たり）平均で約６×１０7個のｓｉＲＮＡ分子又は約１×１０7個のリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）分子を被包し、疑似体液に７２時間暴露した際にそれらのカーゴの約１００％を保持する。それに比べ、脂質及びポリマーのナノ粒子は、高分子カーゴについて１０〜１０００倍低い収容能力を有し、中性ｐＨにおいて実質的により安定でない51、52。さらに、プロトセルは、他のメソ多孔性シリカ粒子よりも核酸カーゴの高い収容能力を有する。ｓｉＲＮＡが装填されたナノリポソームの卵巣癌への持続的送達用にTanakaらによって開発されたＳＩＭＰは、プロトセルとほぼ同量のＲＮＡを被包するものの（２．０ｐｇ／粒子対１．３ｐｇ／粒子）、それらの平均直径は１０倍大きい（１．６μｍ対１５０ｎｍ）53。Xiaらによって開発された、ポリエチレンイミンでコーティングされたメソ多孔性シリカナノ粒子は、１０μｇの粒子当たり約１μｇのｓｉＲＮＡ（１０ｗｔ％）を複合体化する33。それに比べ、１０μｇのプロトセルは、約６．５μｇのｓｉＲＮＡ（６５ｗｔ％）を装填されることができる。収容能力及び安定性の増強は、ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセルが標的遺伝子を発現抑制し、文献51、52、54〜58の報告値よりも１０〜１０，０００倍低い濃度でＨＣＣのアポトーシスを誘発することを可能にする。ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、サイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥの発現の９０％を９０ｐＭ〜３７０ｐＭのｓｉＲＮＡ濃度で抑制し（ＩＣ90）、９０％を超えるＨＣＣを４８時間以内に１２５ｐＭのｓｉＲＮＡ濃度で殺す（ＬＣ90）。それに比べて、標的を定められたリポソームは、粒子の種類及び実験が行われた条件に応じて５〜５００ｎＭのＩＣ90及びＬＣ90値を有する54〜56、58〜60。ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルの治療有効性は、ポリマーで被包されたメソ多孔性ナノ粒子も上回る。複数のグループが、ｓｉＲＮＡを複合体化するために、ポリカチオン性ポリマーに被包されたメソ多孔性シリカナノ粒子を用いている。そのような粒子は、レポーター及び内在性遺伝子の発現の３０〜６０％のノックダウンを、１０〜２０のナノ粒子：ｓｉＲＮＡ（ｗ／ｗ）比で２４〜４８時間以内にもたらす33、61。本発明者は、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたシリカナノ粒子のナノ細孔中にｓｉＲＮＡを装填するので、プロトセルの収容能力はかなり高く、約８のプロトセル：細胞比でサイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥの発現の完全な抑制をもたらす。結論すると本発明者の発見は、プロトセルが、核酸及び毒素などの多種多様な高分子用の普遍的な標的を定められたナノ担体として機能することを示唆している。ナノ多孔性コアは、テラノスティクス及び個別化医療という急成長分野に必要な造影剤及び診断薬などの他の異なるタイプのカーゴも装填されることができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
＜ナノ多孔性シリカ粒子へのリポソームの融合＞
プロトセルを合成するのに用いられる手順は以前に記載されており34、36、62、63（ENREF 33）、簡単にのみ言及される。脂質をアバンティ・ポーラー・リピッズ社に注文し、クロロホルム中に予め溶解して−２０℃に保存した。プロトセル合成の直前に、２．５ｍｇの脂質を窒素流のもとで乾燥し、真空オーブン（１４５０Ｍ型、ＶＷＲインターナショナル社、ペンシルバニア州ウエストチェスター）中に一晩置いて残留溶媒を除去した。脂質を０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に濃度２．５ｍｇ／ｍＬで再水和し、Ｍｉｎｉ−エクストルーダーセット（アバンティ・ポーラー・リピッズ社、アラバマ州アラバスター市）を用いて１００ｎｍフィルターを少なくとも１０回通した。得られたリポソーム（直径約１２０ｎｍ）を４℃で最大１週間保存した。ナノ多孔性シリカコア（２５ｍｇ／ｍＬ）を２〜４倍体積過剰のリポソームと一緒に室温で３０〜９０分間培養した。プロトセルを過剰な脂質の存在下において４℃で最大１ヶ月保存した。過剰な脂質を除去するために、プロトセルを５，０００ｒｐｍで１分間遠心し、２回洗浄し、０．５×Ｄ−ＰＢＳに再懸濁した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
＜ＲＴＡが装填されたリポソームの合成＞
ＲＴＡが装填されたＤＯＰＣリポソームを調製するために、２．５ｍｇの脂質（５５：５：３０：１０の質量比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール：１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）を窒素流のもとで乾燥し、真空オーブン（１４５０Ｍ型、ＶＷＲインターナショナル社、ペンシルバニア州ウエストチェスター）中に一晩置いて残留溶媒を除去した。脂質を０．５×Ｄ−ＰＢＳに濃度２．５ｍｇ／ｍＬで再水和し、短時間音波処理し、等体積のＲＴＡ（１００μΜ、０．５×Ｄ−ＰＢＳ中）と混合した。この混合物を渦動させ、アセトン及びドライアイスの浴槽中で急速冷凍して凍結乾燥させた。使用の直前に、リポソーム調製物を上記の等張ショ糖溶液で再水和し、激しく渦動させ、そして室温で２〜４時間静置した。次にリポソームを、ミニエクストルーダーセット（アバンティ・ポーラー・リピッズ社、アラバマ州アラバスター）を用いて１００ｎｍフィルターを少なくとも１０回通し、セファデックス（登録商標）Ｇ−２００カラムを通して被包されていないＲＴＡを除去した。ＲＴＡが装填されたリポソームを、上記のようにＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧで修飾した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
＜フローサイトメトリーの装置及び設定＞
図３５Ａ〜Ｃ、３６Ａ、３９Ａ〜Ｃ、及び４１Ａでは、細胞サンプルは、ＢＤ−ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェアｖｅｒ．５．２．１を備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を用いて分析された。サンプルは、ＦＳＣチャンネルは線形モード、その他の全チャンネルはＬｏｇモードで取り込まれた。事象は前方散乱光に基づいて起こされ、細胞の破片を除外するゲートを前方散乱−側方散乱プロット上に設定した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８及びフルオレセインを４８８ｎｍレーザー光源を用いて励起し、発光強度をＦＬ１チャンネル（５３０／３０フィルター／バンドパス）で集めた。ヨウ化プロピジウム及びスルホローダミン（ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）レッド活性カスパーゼ−３染色キット）を４８８ｎｍレーザー光源を用いて励起し、発光強度をＦＬ２チャンネル（５８５／４２）で集めた。平均蛍光強度をＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖｅｒ．６．４（ＴｒｅｅＳｔａｒ社、オレゴン州アッシュランド）を用いて算出した。全てのプロットは、シグマプロットｖｅｒ．１１．０（シスタットソフトウェア社、カリフォルニア州サンホセ）を用いて作成された。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
＜共焦点蛍光顕微鏡法の装置及び設定＞
３色画像及び４色画像は、ＬＳＭ５１０ソフトウェアのチャンネルモードで操作されたツァイスＬＳＭ５１０−ＭＥＴＡ（カールツァイスマイクロイメージング社、ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて得られた。全てのイメージングで、６３倍の１．４−ＮＡ油浸対物レンズを用いた。通常のレーザー出力設定は、４０５ｎｍダイオードレーザーについては３０％透過、４８８ｎｍアルゴンレーザーについては５％透過（６０％出力）、５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーについては１００％透過、６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーについては８５％透過であった。ゲイン及びオフセットは、飽和を回避するために各チャンネルについて調整され、通常はそれぞれが５００〜７００及び−０．１に維持された。１０２４×１０２４分解能の８ビットのｚスタックを、０．７〜０．９μｍの光学スライスを用いて得た。複数のチャンネルを重ね合わせるため及びｚスタック画像を重ね合わせた投影像を作成するために、ＬＳＭ５１０ソフトウェアを用いた。全ての蛍光画像は、重ね合わされた投射画像である。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６０】
全ての顕微鏡実験に関して、細胞は、培養フラスコ中で７０〜８０％コンフルエントになるまで培養され、回収され（０．０５％トリプシン、１０分間）、４０００ｒｐｍで２分間遠心され、そして完全増殖培地に再懸濁された。１×１０4〜１×１０6細胞／ｍＬを０．０１％ポリＬ−リジン（１５０〜３００ｋＤａ）でコーティングされた無菌カバーガラス（２５ｍｍ、Ｎｏ．１．５）上に播種し、３７℃で４〜２４時間接着した後にプロトセルに暴露した。４８時間のサンプルは、Ｃｙｔｏｐｒｏ（登録商標）遠心機７６２０型（Ｗｅｓｃｏｒ社、ユタ州ローガン）を用いてカバーガラス上に再度遠心沈降された。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６２】
［メソ多孔性シリカナノ粒子に担持された脂質二重層（ＭＳＮ−ＳＬＢ）による、ニパウイルスに「感染した」宿主細胞への治療用のＲＮＡ及びＤＮＡの標的送達］
ニパウイルス（ＮｉＶ）は、パラミクソウイルス科の極めて病原性の高いメンバーであり、その多数の伝播経路及び感染に伴う高い致死率によりＢＳＬ−４規制病原体に分類される。しかしながらＮｉＶの細胞指向性の理解での最近の進展にもかかわらず、治療法は主として支持療法に留まっている。この目的のために、本発明者は、ＮｉＶ遺伝子でトランスフェクションされたモデル宿主細胞に高濃度の治療用ＲＮＡ及びＤＮＡを特異的に送達する、メソ多孔性シリカナノ粒子に担持された脂質二重層（ＭＳＮ−ＳＬＢ。ネイチャー・マテリアルズ誌（２０１１年）第１０巻ｐ．３８９−３９７参照）を開発した。ＭＳＮ−ＳＬＢは、１００ｎｍのメソ多孔性シリカナノ粒子へのリポソーム（ペプチド用及びＰＥＧコンジュゲート用の５ｗｔ％のＤＯＰＥを含むＤＯＰＣ）の融合によって形成される。その大きい表面積（＞１０００ｍ2／ｇ）及び表面から利用可能な大きな（２０〜２５ｎｍ）細孔により、メソ多孔性シリカコアは、ＮｉＶヌクレオカプシドタンパク質（ＮｉＶ−Ｎ）ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する高濃度（約１μΜ／１０10個の粒子）のｓｉＲＮＡを迅速に装填されることができる。ｓｉＲＮＡが装填されたコアへのリポソーム融合は、長期的な（＞３ヶ月）カーゴ保持を促進し、かつリガンド提示用の流動性界面を提供する担持された脂質二重層（ＳＬＢ）をもたらす。ＭＳＮ−ＳＬＢの二重層は、モデル宿主細胞へのｓｉＲＮＡの細胞質送達を可能にするために、ターゲティングペプチド、マクロピノサイトーシスを誘発するペプチド（Ｒ８）、及びＰＥＧの複数のコピーで修飾される。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
本発明者は、ファージディスプレイを用いて、エフリンＢ２（ＥＢ２）に結合するペプチドを特定した。エフリンＢ２（ＥＢ２）は、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、及びＥｐｈＢ４チロシンキナーゼの膜貫通アンカー型リガンドであり、ヒト内皮細胞及びニューロンによって発現されてマクロピノサイトーシスによるＮｉＶ感染の主要な受容体として機能する。ＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）は、ヒトＥＢ２を発現するようにトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する５ラウンドの親和性選択、並びに親ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びヒトエフリンＢ１を発現するようにトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方に対するカウンター選択後での主配列であった。本発明者は、フローサイトメトリーを用いて、ＴＧＡＩＬＨＰによって標的を定められたＭＳＮ−ＳＬＢが、高（１．５ｗｔ％又は約５００個のペプチド／粒子）ペプチド価及び低（０．０１５ｗｔ％又は約５個のペプチド／粒子）ペプチド価の両方において、ＥＢ２陽性細胞（ＨＥＫ２９３）に対してナノモルの親和性を有することを見いだした。重要なことに、０．０１５ｗｔ％のＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（コロイド安定性を促進し非特異的相互作用を抑える）で修飾されたＭＳＮ−ＳＬＢは、ＥＢ２陰性細胞（親ＣＨＯ−Ｋ１）よりもＨＥＫ２９３細胞に対して１０3倍高い親和性を有する。本発明者は、共焦点蛍光顕微鏡法を用いて、０．０１５ｗｔ％のＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）及び０．５００ｗｔ％のＲ８で修飾されたＭＳＮ−ＳＬＢがＨＥＫ２９３によって迅速に（ｔ1/2＝５分）内在化されること、並びに様々なマクロピノサイトーシス阻害剤を用いた細胞の前処理が取り込みを６０〜８０％低減することを明らかにした。マクロピノソームの酸性化は、（１）ＳＬＢを不安定化して、被包されたｓｉＲＮＡの放出を引き起こし、（２）Ｒ８ペプチドをプロトン化して、プロトンスポンジ効果によってマクロピノソーム膜を崩壊させる。これらは両方とも、ｓｉＲＮＡの細胞質分布を可能にする。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６６】
表１は、全ての脂質についての名称、略称、及び関係する物理的特性を示す。拡散実験用には改変されたフランツ型拡散セルが、容器を満たし、皮膚サンプルを配置し、ドナーキャップを留めることによって用いられた。各群（角質層そのまま、角質層除去後）の対照は０．５×ＰＢＳを用いて処理され、残りのサンプルは８．１２５ｍｇのプロトセルを用いて２４時間処理された。次に、ドナーキャップ中に残っているサンプル、皮膚サンプル、及び容器液が回収された。サンプルについての高コストにより、容器液のみをＩＣＰ−ＭＳで分析した。図４４ａは容器液中のＳｉＯ2総量を群（ｎ＝３）ごとに示しており、ＩＣＰ−ＭＳによって報告されたように、プロトセルが角質層に浸透して皮膚を通って拡散することが可能であることを明示している。角質層をそのまま有するものと比較して、約４倍量のプロトセルが、角質層が除去された皮膚サンプルを通って拡散できた。しかしながら、各群内の大きな誤差により、これらの値は統計的に有意でなく、従ってこれらのデータは提案された働きの実行可能性を確認するだけである。次の実験は２つの目的を果たす。第１に、サンプルについてのＩＣＰ−ＭＳの高コストにより、経皮流量を定量化する費用効果が高い方法を開発することである。第２に、プロトセルのＳＬＢ成分及び組成が経皮動力学に及ぼす影響を明らかにすることである。蛍光分光分析は、その高感度、蛍光光度計の容易な入手、及びコアが容易に蛍光標識できることにより、流量を定量化するために選択された。図４４ｂは、１級アミン含有有機シランである３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を用いてのコアの機能化と、それに続くアミン反応性フルオロフォアとの培養によって、プロトセルコアがどのように蛍光標識されることができるかを説明する図である。皮膚そのものは全ての可視波長で非常に自己蛍光性だが、長波長の赤色波長は、蛍光分光分析及び共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）によって明示されるように最小量の自己蛍光を示す。従って、この実験にはＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６３３（励起６３２、発光６４７）が選択され、以降の全実験で用いる。容器緩衝液中の６３３で標識されたコアに対する蛍光光度計の感度は、皮膚の自己蛍光の程度に応じて約１９５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲であった。この実験では、蛍光標識されたコアを有するプロトセルが３つの基本的なＳＬＢ成分を用いて構成され、脂質の転移温度、飽和度／不飽和度、及び頭部基の違いに基づいて以下の合計６つの組成を有した。
１）７０ｗｔ％のＤＯＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ。
２）５５ｗｔ％のＤＯＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ／１５ｗｔ％のＤＯＰＥ−ＰＥＧ−２０００。
３）７０ｗｔ％のＤＳＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ。
４）５５ｗｔ％のＤＳＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ／１５ｗｔ％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００。
５）４５ｗｔ％のＤＯＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ／２５ｗｔ％のＤＯＰＥ。
６）３０ｗｔ％のＤＯＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ／２５ｗｔ％のＤＯＰＥ／１５ｗｔ％のＤＯＰＥ。
角質層は全サンプル上にそのまま残され、対照は０．５×ＰＢＳを用いて処理され、各サンプルは８ｍｇのプロトセルを用いて２４時間処理された。図４４ｃは結果をまとめており、ＳＬＢ成分及び組成がプロトセルの経皮動力学に大きく影響を与えることを明らかにする。これは文献と一致しており、より低い転移温度を有する脂質が全層の皮膚中により深く拡散すること、及びより高い転移温度を有する脂質が角質層において局所に留まることを示唆している51。まとめると、予備的なデータは、提案された働きの実行可能性及びその高い成功可能性を明示している。加えて、費用効果が高い蛍光分光プロトコールが、プロトセルの経皮動力学を定量化するために開発された。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
［方法］
＜プロトセルの合成及び特徴＞
ナノ多孔性粒子コアは、コロイド溶液中における又はエアロゾル化による種々の蒸発誘起自己組織化（ＥＩＳＡ）法を用いて合成される。ＥＩＳＡは、単純な溶媒蒸発での高度に規則的な／均一な細孔サイズを備えた球形のナノサイズシリカ（ＳｉＯ2）粒子の自己組織化を促進するために、可溶なゾル−ゲル前駆体（即ち、酸又は塩基、Ｈ2Ｏ又はＥｔＯＨ、及びある種の有機シラン）と併せて構造指向剤としての両親媒性の界面活性剤及びブロックコポリマーを用いる56、57。粒子の合成が完了したら、構造指向剤は溶媒抽出又は５００℃の焼成を用いて除去される。粒子サイズ（３０〜１０００ｎｍ）、多孔性、細孔サイズ（２．５〜２０ｎｍ）、分解動力学、及び表面の化学的性質は、濃度の調整及び構造指向剤の選択によって制御されることができる。さらに、上記の手順を用いて合成後の機能化が行われることができる（図４４ｂ）。単分散のリポソーム溶液を得るために、均一な細孔を有する多孔性ポリカーボネート膜を水溶性脂質溶液が複数回通過するプロセスである押し出しによって、ＳＬＢが形成される。脂質は、クロロホルム中に保存された２５ｍｇ／ｍｌストック溶液として購入され、従って押し出し前には抽出されて乾燥されなければならない。脂質は、１個のシンチレーション瓶に調合され、最終質量が２．５ｍｇとなるように種々の比で組成される。脂質成分及び組成の選択は、ＳＬＢの物理的特性及び化学的特性に関して、精密な制御の１つの段階を可能にする。制御の別の段階は、コアに融合された後のＳＬＢの修飾に由来する（表１）。クロロホルムは減圧下で除去され、脂質は０．５×ＰＢＳを用いて終濃度２．５ｍｇ／ｍｌに再水和されて押し出しされるか、又は直ちに−２０℃で６ヶ月未満保存される。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】
ここでリポソームは、全脂質が流動性であるように、組成での最高のＴｍよりも少しだけ高温で押し出される。従って、多くの場合には押し出し機をホットプレート上に設置することが必要である。プロトセルは、３：１（ｖ／ｖ）比を用いた体積過剰でリポソームをコアに添加し、撹拌しながら室温で３０〜６０分培養することによって作製される。次に、へテロ二官能性の架橋剤を用いてさらなる二重層修飾が行われ（即ち、ペプチドのコンジュゲート）、そしてプロトセル溶液は所望の使用濃度（＜２０ｍｇ／ｍｌ）まで濃縮される。プロトセル及びそれらの成分の特性評価は、細孔及び粒子の構造を定性的に評価しかつ粒子の直径及び分布を視覚的及び統計的に定量化するための透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、流体力学的半径を得るための動的光散乱（ＤＬＳ）、ブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積及びバレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）細孔サイズ分布を定量化するための窒素収着（ＮＳ）、コロイド安定性及び表面電荷を評価するためのζ電位（ζ）、並びにカーゴ装填容量を評価するための吸光又は蛍光からなる9〜11。プロトセルのコアは、何らかの改変がされる前後に上記の全てが課される。リポソーム及びプロトセルは、何らかの改変の前後にζ電位及びＤＬＳのみが課される。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
＜皮膚調製及びフランツ型拡散装置＞
皮膚の調製及び正しい取り扱いは、皮膚の構造に直接的に影響し得るので重要である。腹部整形術から得られた全層のヒト皮膚は、現地法規に従って提供される。皮膚の受け取り時にそれらは二重袋に入れられ、−２０℃で６ヶ月未満保存される。皮膚のバリア機能は、複数回の凍結融解サイクルによっても元のままであることが示されている58、59。必要に応じて、凍結された皮膚は３０℃のオーブンで解凍され、メスを用いて皮下脂肪が除去され、次に皮膚サンプルは１ｃｍ2の細片に切片化される。次にサンプルを脱イオン水でリンスし、角質層側の水分を取って乾かす。場合によっては、角質層は除去又は分離される必要がある。これは、それぞれテープストリッピング又は酵素的な組織消化を用いてすることができる。実験完了時には、皮膚サンプルを１０ｍｌの０．５×ＰＢＳで洗浄し、水分を取って乾かし、個別に二重袋に入れ、ホイル中に包んで解析時まで凍結する。総合実験棟（ＭＲＦ）に位置するLinda Felton教授の研究室は、９個の水套が装着された拡散セル、加熱／冷却循環装置、内蔵型の撹拌プレート、サンプリングポート、ドナー表面積０．６４ｃｍ2、及び容器容積５．１ｍＬを備えた直立型の改変されたフランツ型拡散装置を有している。実験を準備するために、容器を０．５×ＰＢＳ（又は他の等張性の緩衝液）で満たし、温度を３７℃に設定する。次に皮膚を気泡の形成を避けるよう気をつけて容器上に広げ、ドナーキャップを留め、脱水を防ぐためにカバーをする。そして皮膚を１時間平衡化し、容器液を交換し、皮膚をさらに３０分間再平衡化する。実験開始前に、４００μｌの容器液をサンプリングポートから分離し、それが取られた容器の０時間のブランクとして保管する。サンプリングポートから所望の時点において４００μｌの各サンプルが採取され、そして一定体積を維持し皮膚−液間の界面における気泡の形成を避けるために４００μｌの拡散緩衝液が補充される。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７１】
＜蛍光分光分析＞
全ての経皮プロトセルの拡散実験の定量化は、ＦｅｌｉｘＧＸソフトウェア、２つのＰＭＴ検出器、光学フィルター、及び４個のキュベットを収納可能なサンプルカルーセルを備えたＰＴＩ−ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ−４０蛍光分光光度計を用いて行われる。皮膚は非常に不均質であるとともに非常に自己蛍光性であり、これらは通常は容器液に移される特徴である。このプロトコールは、それらの問題が分析中に説明されることができるように開発された。標準曲線は、１／２希釈を用い、濃度範囲０．１６〜１．９５×１０-5ｍｇ／ｍｌに渡って、対照サンプルの容器液（２４時間の時点）から作成される。さらに、３８０μｌが対照から抽出され、ブランクとしてキュベットに入れられる。このブランクは、実験継続中はカルーセル中にあるため、３つのサンプルのみが一度に解析されることを可能にする。標準は３回測定操作を行い、平均され、９５％信頼区間で報告され、線型方程式を得るためにＬｏｇ−Ｌｏｇ目盛にプロットされる。全てのサンプルは、統計的妥当性のために最低３回、最大９回解析される。全てのサンプルが解析された後、ファイルは保存され、テキストファイルとして書き出され、手作業でＥｘｃｅｌのスプレッドシートに入力される。全ブランクの平均値を平均し、９５％信頼区間を計算する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、全時点の全サンプルについて個別に算出される。線形回帰分析が、未知の濃度を算出するために用いられる。８サンプルのそれぞれの補正値は、全てを標準曲線に対して正規化するために、ブランクのＭＦＩに対する各０時間のＭＦＩの加算／減算によって算出される。補正値は、補正後のＭＦＩを得るために、次に各時点のＭＦＩに対して加算／減算される。各ＭＦＩのＬｏｇが取られ、標準曲線から得られた方程式を用いて濃度が算出される。最後に、各０時間時点について算出された濃度値が他の各時点から差し引かれて、絶対濃度が得られる。ただし、全ての標準曲線は全濃度範囲に渡って多項傾向に従う。線形曲線を得るために、該当する濃度／強度範囲のみがプロットされて、線形の傾向線に対してフィッティングされる（Ｒ2＞０．９３００）。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
＜具体的目標１−プロトセルの担持された脂質二重層（ＳＬＢ）及びナノ多孔性シリカ粒子コアの、経皮透過の動力学に影響するパラメータをインビトロで研究し、ＳＬＢがコアから解離するかどうかを明らかにする＞
この具体的目標を達成するために、プロトセルの生物物理学的特性及び生化学的特性のそれぞれの系統的操作が行われる。先ず、ＳＬＢのそれぞれの個別の特性が調査された後、コアの特性のそれぞれが個別に評価される。流量を定量化するために蛍光分光分析が用いられ、皮膚をパラフィンワックス中に埋め込み、組織学的に切片化し32、皮膚中に分配されるプロトセルを定性的に評価するためにデュアルチャンネルのＣＬＳＭ23を用いてイメージングする。ＣＬＳＭがこれについて不十分である場合には、ＴＥＭ51又はマルチフォトン顕微鏡法42（ＳＮＬ−ＣＩＮＴ）を用いる。ＳＬＢに関する実験では、全てのコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３を用いて蛍光標識され、エアロゾル化によって合成され、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を鋳型にし、標的を定められたプロトセル用に最適化された標準的なコアとなる。これらの粒子は、ζ＝−２０ｍＶ、均一なＢＪＨ細孔サイズ＝２．５ｎｍ、粒子サイズ分布＝９０±６０、及びＢＥＴ表面積＝１０００ｇ／ｍ2を有する。コアに関する実験に関しては、最大の総流量をもたらすことが明らかにされたＳＬＢ組成が用いられ、不変に保たれる。最後に、ＳＬＢ及びコアの特性が最適化されたら、ＳＬＢの結末が明らかにされる。第１の実験は、転移温度／流動性に基づいて、２４時間にどの中性荷電リン脂質（ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、及びＤＳＰＣ）が単独で最大の総流量をもたらすかを特定する。Van den Berghらは、流動性脂質（Ｔｍ＜３７℃）が皮膚中により深く拡散すること、非流動性脂質（Ｔｍ＞３７℃）が角質層において局所に留まることを示している51。予備試験の結果はこれらの知見を支持しているが、コアによって与えられるナノ多孔性の支持、及び温度に依存したＦＲＡＰによって確認されるＳＬＢ脂質の見かけの転移温度の対応した低下により、プロトセルの革新的な特性は同時にＳＬＢの流動性及び安定性を増強する。この特性は、見かけのＴｍが４１℃から３７℃に低下するＤＰＰＣの場合に特に興味深い9。ＤＰＰＣプロトセルの流量がＤＯＰＣプロトセルとＤＳＰＣプロトセルとの間に来るならば、それらの結果はリポソーム文献と一致しているので、以降のプロトセルの基本成分はＤＯＰＣ及びＤＳＰＣのみを用いて、流動性ＳＬＢを有するプロトセルと非流動性ＳＬＢを有するプロトセルとの比較を行う。しかし、ＳＬＢ−コア間の相互作用によりＤＰＰＣプロトセルの総流量がこの範囲に納まらないならば、これらの相互作用の影響をさらに検討するために、全３種類のＳＬＢ基本成分が以降の実験に用いられる。第２の実験は、コレステロール、コレステロール硫酸、及びセラミドが２４時間の総流量に及ぼす影響を検討する。角質層は、コレステロール、コレステロール硫酸、脂肪酸、及びセラミドからなる1、33、60、61。従って、皮膚中におけるプロトセルの溶解度を増大させる試みでは、透過に及ぼす影響を明らかにするために、これらの角質層脂質をＳＬＢに組み込むことが行われる。それらの脂質のそれぞれの影響は、個別的及び総合的に研究される。予備試験の結果は、ＰＥＧ−２０００が流量に大きい影響を及ぼすことを明示する。さらに、ＰＥＧ−４００は、多くの市販の局所用製剤中及び経皮製剤中の一般的な透過増強剤である62〜64。最適なＰＥＧ組成を特定するために、先ずＰＥＧ−２０００の濃度を変える。その後、一定のＰＥＧ濃度でＰＥＧの長さを変える。第４の実験は、最適化されたＳＬＢ組成をアルギニンに富むペプチド（即ち、Ｒ８）で修飾する。アルギニンに富むペプチドは細胞内在化を増大させることが示されている65。一方、シクロスポリンＡへのヘプタアルギニンペプチドのコンジュゲートは、増強された経皮動力学を示す28。次の作業は、コアの特性がどのように経皮動力学に影響するかを明らかにすることである。ＳＬＢ組成を不変に保って、コアサイズ及び表面の機能化の影響が明らかにされる。Alvarez-Romanらは、ポリスチレンビーズがサイズに依存して皮膚の別々の部位に特異的に蓄積することを明らかにした23。さらにRancanらは、メソ多孔性のストーバーシリカ粒子が、改変された角質層を用いて、皮膚細胞によって取り込まれて皮膚を通って拡散することができるが、共にサイズに依存することを示した66。Vermaらは、変形可能で直径１２０ｎｍを有するリポソームの著しく増強された透過を報告し、直径７０ｎｍを有するリポソームでの角質層の最大の増強を報告した20。これらの研究は、経皮動力学について、化学的及び物理的な表面特性に加えて粒子サイズの重要性を示している。エアロゾルによって支援されるＥＩＳＡによって作られる幅広い分布に加えて、３種類の単分散分布の粒子サイズ（３０ｎｍ、１００ｎｍ、及び２００ｎｍ）が、コロイド合成を用いて合成されて特性評価される。第６の実験は、コアの機能化／コアの電荷の影響を調査する。未修飾シリカは、強い負のζ電位（−４０〜−１５ｍＶ）を有し、ζ電位を変えるために機能化されることができる56。最適なコアサイズを用いて、粒子は強い正電荷（＞１０ｍＶ）を有するように機能化されるか、又は疎水性を与えるためにメチル化される。第７の実験は、ＳＬＢの結末を明らかにするために、ＳＬＢを蛍光標識して蛍光共局在実験を行う。最後に、最適化された経皮プロトセルを用いて、経時的な流量が測定される。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
＜具体的目標２−ＳＬＢ組成、成分、及び機能化が経皮動力学を変化させる仕組みを解明する＞
フィックの拡散の第１法則の単純な反復は、容器（ＣR）とドナー（ＣD）との間の濃度差及び角質層の厚さに基づいて、経皮流量（Ｊ）を角質層透過性（Ｐ）に関連づけ1、17、全体的な流量及び透過性の変化を通してプロトセルのＳＬＢ組成の直接的な相関を可能にする。透過係数は実験データから算出されるが、流量及び透過性の実験測定は経皮拡散の動力学に関する情報を明らかにするだけであり、経皮プロトセルのカーゴ送達を理解するための重要なパラメータである透過増強の仕組みについては何も明らかにしない17、30。薬剤学において角質層透過を分析する標準的な手段は、ＤＳＣによる角質層脂質のＴｍ低下の解析を用いる17、26、29〜32、35。ヒト角質層脂質に一般的に関連付けられる３つのＴｍのピークが存在する32、59。第１は７５℃にあり、ラメラ状から不規則状への脂質構造の変化に起因する。９０℃はタンパク質結合脂質のゲル状態から液体状態への転移に関連しており、１２０℃はタンパク質結合脂質が変性したことを示す。様々な透過増強剤で処理された角質層サンプルにおいては、Ｔｍの顕著な減少及び減少したピーク強度が多く報告されている32。しかし、ＤＳＣは角質層の巨視的構造の情報を与えるだけであるので、ＳＬＢがどのように透過を増強するのかを十分に理解するにはさらなる分析が必要である。ＸＲＤは、固定角からのＸ線散乱パターンに基づいて結晶構造の情報を与える材料科学の特性解析技術である。Kimら及びその他多数は、角質層の構造を特性解析するために、以前に小角ＸＲＤ及び広角ＸＲＤを用いている26、32、33。小角ＸＲＤに関しては、２つのピークが、セラミド（ｄ＝６．１３ｎｍ）及び結晶コレステロール（ｄ＝３．３８ｎｍ）による散乱に関連付けられる。広角ＸＲＤに関しては、１６．７Åの１つのピークは、結晶コレステロールに関連付けられる32。ＦＴＩＲ分光を用いて、角質層脂質の伸縮（２８５０ｃｍ-1及び２９２０ｃｍ-1）並びに角質層のケラチン分子の構造変化（１６５０ｃｍ-1）に関連する炭素−水素及び炭素−酸素の伸縮振動数での変化を測定することによって、角質層の構造変化を特性解析することもできる32、35、67。実施される特性解析の最後の方法は、組織学／顕微鏡法である。角質層の構造のいずれかの巨視的変化を調査するために標準的なＨ＆Ｅ染色が用いられ、皮膚中における粒子分布を定性的に評価するために蛍光顕微鏡法が用いられる。この具体的目標の最大の課題は、ＤＳＣ、ＸＲＤ、及びＦＴＩＲ用の角質層サンプルを、その構造を損傷すること無く単離することである。これがなされたら、各ＳＬＢ組成がどのように角質層の構造を変えるかについて相互関係を明らかにするために、具体的目標１で作製された皮膚サンプルが特性解析される。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７４】
＜具体的目標３−経皮拡散に有利又は不利な物理的特性及び化学的特性を有する薬物であるニコチン及びイブプロフェンを用いて、インビトロにおける経皮プロトセルの送達有効性を評価する＞
ニコチンパッチは、我が国において最も広く使用される経皮的パッチの１つである。ニコチンの物理的特性及び化学的特性（Ｋo/w＝１５．８５、Ｈ2Ｏに混和性、１６２．２３４Ｄａ、Ｔｍ＝−７．９℃）は、経皮送達にとって理想的なものである。一方、イブプロフェンの物理的特性及び化学的特性は、Ｋo/w＝９３３２．５４、Ｈ2Ｏに不溶、２０６．２８Ｄａ、Ｔｍ＝７４〜７７℃である。その低い水溶性及び極度の親油性Ｋo/wから明らかなように、その経皮動力学は、角質層中に優先的に分配されて、より深部の組織中には拡散しないので、あまり有利でない17。第１の実験は、最適化されたコア粒子を用いて両方の薬物の装填容量を測定し、次に経皮送達のために最適化されたＳＬＢを装填して融合する。装填容量及び薬物放出動力学は、ＵＶ分光を用いて測定される。さらに、プロトセルがどのようにして薬物の明らかな化学的挙動を隠すのかを評価するために、イブプロフェンが装填されたコアの水溶性及びＫo/wが測定される必要がある。第２の実験は、ニコチン及びイブプロフェンを遊離薬物として及びプロトセルを用いて経皮送達する。プロトセルを用いる経皮送達の有効性を明らかにし、皮膚中におけるプロトセルの薬物放出プロファイルを理解するために、次にＨＰＬＣを用いて薬物の流量が算出される58、59。最後の実験は、異なる化学的特性及び物理的特性を有する薬物の組み合わせを送達することが可能であるかどうかを明らかにする。これは、それらの２種類の薬物の種々の比をプロトセルコアに装填することによってなされる。異なる経皮的な挙動をする個別の薬物の組み合わせをナノ粒子を用いて経皮送達する能力は、過去に実証されていない革新的なものである。潜在的に問題となる点は、ほとんどのＨＰＬＣカラムがシリカビーズを使用しており、従ってＨＰＬＣ分析前に、粒子を溶解するためにサンプルのｐＨを漸増しなければならないという事実である。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７７】
［エマージングウイルス病原体の治療用のモジュール式ナノ粒子プラットフォーム］
＜１．概要／要約＞
１．１  問題提起
抗ウイルス薬は、エマージングウイルス及び人工ウイルスなどによるウイルス感染を有効に治療するためには、通常は大量に頻繁に投与されなければならない。しかし、高用量は宿主に有害な副作用をもたらす傾向があり、不適切に摂取された場合には薬剤耐性病原体の発生を加速させ得る。従って、治療の回数、頻度、期間、及び用量を減らし、現在の限度よりも治療を延期し、そして再発病を予防するためには、生体適合性のナノ粒子送達媒体を開発する必要性がある。しかし、リポソーム及びポリマー性ナノ粒子などのほとんどの現行のナノ担体は、低い収容能力、低い安定性、及び標的細胞によるごく僅かな取り込みに悩まされている。本提案は、リポソーム及びメソ多孔性シリカナノ粒子の利点を相助作用的に組み合わせた、「プロトセル」と呼ばれるモジュール式の非常に順応性があるナノ担体を設計することによってこれらの限界に対処しようとする7〜9。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
＜プロトセルはリポソーム及びメソ多孔性シリカナノ粒子の両方の利点を併せ持つ＞
プロトセル（図４５参照）は、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）に被包された球形の多孔性シリカナノ粒子のコアからなる。多孔性シリカナノ粒子は極めて大きい表面積（＞１２００ｍ2／ｇ）を有し、従って対象とするカーゴの溶液中にそれらを単純に浸漬することによって、高濃度の様々な治療薬及び診断薬が装填されることができる。さらに、本発明者が多孔性シリカナノ粒子を合成するために用いるエアロゾルによって支援される蒸発誘起自己組織化（ＥＩＳＡ）プロセス10は、幅広い構造指向性の界面活性剤及び得られた粒子の合成後処理と適合性があるので、細孔サイズを２．５ｎｍから２５ｎｍまで変化させることができる。そして、共に様々な化学的に異なるカーゴの簡単な被包を可能にするカチオン性シラン又は疎水性シランを用いて、細孔の壁部を修飾することができる。様々な化学的に異なるカーゴは、所望により、例えば低分子薬（酸性、塩基性、及び疎水性）、薬剤混合物、ｓｉＲＮＡ、タンパク質、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡベクター、並びに必要に応じて、量子ドット及び酸化鉄ナノ粒子などの診断薬である。本発明者は、低分子薬の場合にプロトセルが最大で５０ｗｔ％の装填容量を有することを示しており、これは他の多孔性シリカナノ粒子に基づいた送達媒体よりも５倍大きく、類似のサイズのリポソームよりも１０００倍大きい8。放出速度は、コアのシリカの縮合度、従って生理的条件下におけるその分解速度を制御することによって調整されることができる。熱焼成は縮合を最大化し、持続的な放出プロファイル（最大２週間に渡って７〜１０％放出／日）を有する粒子をもたらす。一方で、界面活性剤を抽出するための酸性エタノールの使用は粒子の溶解度を増強し、被包された薬物のバースト放出をもたらす（１２時間以内に１００％放出）。カーゴが装填された多孔性シリカナノ粒子へのリポソーム融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びターゲティングリガンドなどの機能分子の提示のために、安定で流動性の生体適合性の界面を提供する密なＳＬＢの形成をもたらす。本発明者は、プロトセルが複雑な生体液（例えば完全増殖培地及び血液）中に分散された場合に、ＳＬＢが体温において流動性の脂質からなるか又は非流動性の脂質からなるかにかかわらず、低分子薬を最大４週間安定して被包することを明らかにした。対照的に、リポソームの二重層が完全飽和した脂質からなり、それが高い包装密度を有して、そのために二重層を通過する薬物の拡散を抑えるはずである場合でさえも、リポソームはそれらの被包された薬物を急速に漏出させる8。流動性だが安定したＳＬＢは、低いリガンド密度で非常に高い標的特異性を達成することを可能にし、それはさらに免疫原性及び非特異的相互作用を減少させる。本発明者は、ＳＬＢが流動性の双性脂質である１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）からなる場合に、平均僅か５個のターゲティングペプチド／粒子で修飾されたプロトセルが、非標的細胞よりも標的細胞に対して１０，０００倍高い親和性を有することを示した8。さらに、本発明者は、エンドサイトーシス及びエンドソーム脱出を引き起こすペプチドをプロトセルのＳＬＢ上に組み込むことが、被包されたカーゴの細胞質内分散を可能にすることを示し、核局在配列（ＮＬＳ）などのターゲティング部分を用いてカーゴ分子を修飾することによって、特定のオルガネラ内へのカーゴの細胞内蓄積を達成できることを示した8。異種のカーゴに対するそれらの高い収容能力、低いリガンド密度における高い標的特異性、及び長期的な二重層安定性により、化学療法薬混合物が装填されてヒト肝臓癌に標的を定められたプロトセルは、相当するリポソームよりも１００万倍有効である8。提案された研究開発において、本発明者は、遊離薬物や、薬物が装填されたリポソームよりも優れた同様の治療有効性を実現することを目標として、細胞病原体に感染した細胞への治療薬の標的送達のためのプロトセルを設計する。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
＜プロトセルの適応性に富んだモジュール式の性質は、様々なインビボの課題に対処することを可能にする＞
潜在的な感染宿主細胞又は既に感染した宿主細胞中への抗ウイルス薬の蓄積を促進するために、プロトセルは、（１）宿主に対する毒性を引き起こすこと無く十分な時間連続して循環中に存在し、（２）標的組織中に蓄積し、（３）標的細胞に選択的に結合して内在化され、（４）それらの被包された薬物を必要な動力学を以て適切な細胞内区画内に放出し、（５）容易に排泄されることができる生体適合性のモノマーへと分解しなければならない。上記のように、本発明者は、低密度のターゲティングリガンドで修飾されたＰＥＧ化プロトセルが、容易に標的細胞に結合して内在化されること、さらにエンドソームの酸性化がＳＬＢを不安定化することによってコアを暴露して被包された薬物の持続的放出又はバースト放出をさせるまでは（上記ステップ（３）及び（４））、薬物を安定的に被包することを示した8。提案された研究開発の過程において、本発明者は、ウイルス感染細胞に標的を定められて抗ウイルス剤が装填されたプロトセルのインビトロにおける能力を、下記のように再評価する。ただし、マウスモデル及び鳥類胚モデルにおいても、プロトセルの生体内分布、生体適合性、及び生分解性を特性評価する（上記のステップ（１）、（２）、及び（５））。本発明者の予備的なインビボ研究は、プロトセルが高度に生体適合性であり、標的組織への広い分布及び残留性のために設計され得ることを示している。図４６Ａに示されるように、２００ｍｇ／ｋｇ用量のＰＥＧ化プロトセルを週３回で３週間連続して注射されたＢａｌｂ／ｃマウスは、全体的な毒性又は体重低下の徴候を示さない。それらの大きい装填容量を考えると、この結果は、プロトセルが少なくとも９００ｍｇ／ｋｇの低分子薬をバースト放出又は持続的放出の動力学のいずれかによって送達できることを示している。さらに、図４６Ｂによって明示されるように、直径２０〜２００ｎｍのＰＥＧ化プロトセルは、用量２００ｍｇ／ｋｇでＢａｌｂ／ｃマウスに注射された場合に、４８時間にわたって広く分布したままである。これは、標的を定められたプロトセルが、標的組織に蓄積するのに十分な時間を提供する。本発明者はまた、サイズ及び表面の修飾を制御することによって、急性のリンパ芽球性白血病及び肝細胞癌のそれぞれの治療のために、Ｂａｌｂ／ｃマウス及びＮｕ／Ｎｕマウスの骨及び肝臓へのプロトセルの蓄積を促進できること、及び治療に適切な用量の化学療法薬ドキソルビシンが装填された場合でも、プロトセルが標的組織中に最大４週間残留し、全体的な毒性及び組織学的毒性の徴候が無いことも示しており、これらは器官重量及び病理のそれぞれによって明らかにされている（未発表データ）。さらに、本発明者とのＵＣＬＡのナノテク環境影響センターの共同研究者は、多孔性シリカナノ粒子が生分解性であり、最終的に珪酸として糞尿中に排泄されることを示している12。最後に、本発明者は、高密度（最大１０ｗｔ％）の長さ７〜１２アミノ酸のペプチドで修飾されたプロトセルが、総用量４００ｍｇ／ｋｇでＣ５７Ｂ１／６マウスに注射された場合に、ＩｇＧ応答もＩｇＭ応答も誘発しないことを示している（未発表データ）。具体的な用途に必要な生体内分布に応じて、本発明者は、多孔性シリカナノ粒子のサイズ及び形状（球形、円盤状、及び棒状）並びにＳＬＢの電荷及び表面修飾を制御することができ、このことはプロトセルを、モジュール式の非常に適応性に富んだナノ粒子送達方式にしている。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８２】
＜抗ウイルス剤を装填され、未感染宿主細胞及び感染宿主細胞に標的を定められたプロトセルの合成＞
提案される研究開発において、本発明者は、承認されたワクチンも有効な治療薬も存在しないＢＳＬ−４パラミクソウイルスであるニパウイルス（ＮｉＶ）に感染した細胞への、ｓｉＲＮＡ及び低分子抗ウイルス剤の標的送達のためのプロトセルを設計する。最終目標は、遊離薬物又はリポソーム薬物を用いて達成可能なものと比較した場合に、治療の種類、頻度、期間、及び用量を最小化し、現在の限度よりも治療を延期し、再発病を予防することである。本発明者は、その十分に特徴的な構造及び細胞指向性並びにその生物学的脅威としての重要性により、ＮｉＶをモデルエマージングウイルスとして選択した14。本発明者は、標的細胞の細胞質へのｓｉＲＮＡの送達におけるプロトセルの有用性を以前に報告している7。しかし、本発明者がこれらの研究に用いた多孔性シリカナノ粒子は、粒子のサイズ、サイズ分布及び収率におけるバッチ間変動が高いという問題がある油中水型エマルション技術を用いて合成された15。従って、本発明者は、ｓｉＲＮＡの被包及び送達に好適な多孔性シリカナノ粒子を作製するために、先ずエアロゾルによって支援されるＥＩＳＡプロセスを改変し、再現性ある特性を備えた大量の粒子の製造を可能にすることから始める。これらの多孔性シリカナノ粒子は、負荷電のｓｉＲＮＡ（１３〜１５ｋＤａ）を収容するのに十分な、大きい正荷電の細孔を有する必要があり、肝臓及び脾臓中への蓄積を最小化しかつ細網内皮系（ＲＥＳ）の単球／マクロファージによる取り込みを抑えるために、直径＜２００ｎｍでなければならない6。表面積を最大化すること及び細孔の連結を最大化することも、装填容量を最大化するために重要であると考えられる。これらの特性を有する粒子を作製するために、本発明者は２つの合成方法を検討する。第１の方法においては、本発明者は、単相の粒子を作製するために二成分の界面活性剤方式を用いる。具体的には、大きい細孔を形成するプルロニック（登録商標）Ｆ１２７などの界面活性剤を、高度な連結性を備えた高表面積の中間相を通常形成する臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの界面活性剤と組み合わせて使用する。これらの界面活性剤の安定した３相混合物をシリカ前駆体ゾル中に形成することができれば、５ｎｍより大きい細孔を有する粒子を作製することが可能である。第２の方法においては、本発明者は、大きい細孔を形成する界面活性剤（例えばＦ１２７）を安息香酸でポリマー化することによって、安定したミミズ状の中間相を予形成する。この混合界面活性剤は、表面から利用可能な、サイズが最大２０ｎｍの細孔を得るために、次にポリマー性の膨潤剤（例えばポリプロピレングリコール）と共にシリカ前駆体ゾルに添加される。細孔のサイズ及び構造が最適化された後は、粒子を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのアミン化シランと反応させ、細孔の構造への影響を最小限にしながら粒子のζ電位を劇的に増大させる。最後に、本発明者は、粒子のサイズ及びサイズ分布を抑えるため、通常は粒子の幅広い分布（５０ｎｍ〜＞１μｍ）をもたらすエアロゾルによって支援されるＥＩＳＡプロセスを改変する方法を研究する。加熱又はエタノールを用いた希釈によって前駆体ゾルの粘度を��アロゾル化前に抑えることは、生ずる粒子の分布を＜２００ｎｍまで変えると考えられる。全ての多孔性シリカナノ粒子のサイズ、サイズ分布、ζ電位、表面積、及び細孔サイズ分布は、動的光散乱（ＤＬＳ）、電子顕微鏡法、及び窒素収着を用いて特性評価される。適切な特性を有する多孔性シリカナノ粒子を作製した後に、本発明者は、以前に報告された技術を用いてそれらのｓｉＲＮＡ装填容量及びｐＨに依存した放出速度を試験する7。本発明者は、初期にはバースト放出が可能な粒子を用いるが、下記のエクスオボ研究の結果により放出速度を状況に合わせて変えることができる。本発明者は次に、６５ｗｔ％のＤＯＰＣ、５ｗｔ％の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び３０ｗｔ％コレステロールからなるリポソームをｓｉＲＮＡが装填されたコアに融合させ、生じたＳＬＢを、ＤＯＰＥ中の１級アミン部分及びシステイン中のスルフヒドリル部分と反応する市販の架橋剤を用いて、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）又はペプチド（コンジュゲートを促進するためにＣ末端システイン残基を持つように合成した）で修飾する。本発明者はまた、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を用いてＳＬＢを修飾し、質量分析を用いて平均リガンド密度及びＰＥＧ密度を特性評価する。ＰＥＧ−２０００は、インビボにおけるナノ担体表面への血清タンパク質の吸着を低減し、細網内皮系による取り込みを最小化することが示されている6。図４５は、本発明者が開発を提案するプロトセルの概念図を示す。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８４】
＜プロトセルのインビボ治療能を評価するための鳥類胚の使用＞
本発明者は、ペプチド又はｓｃＦｖによって標的を定められたプロトセルのインビトロにおける結合、内在化、及びカーゴ送達特性を最適化した後に、それらのインビボにおける治療能を評価する。これを行うために、ＮｉＶは一般的な小動物モデル（即ちマウス及びラット）においては発病しないので、本発明者は鳥類胚をインビボのモデル系として用いる14。さらに、鳥類胚はＮｉＶの発病機序を研究するためにすでに用いられており、そして単一細胞分解能を有する生体イメージング技術に適している23。最後に、鳥類胚は、一般的な小動物モデルの１／１０〜１／１００の費用であり、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の規制を受けないので、ナノ粒子の費用効果が高いハイスループットスクリーニングに理想的である。本発明者は、先ず、胚に対する毒性を最小化しながらＮｉＶｐｐがコードするタンパク質の発現を最大化するために、胚齢及びＮｉＶｐｐ濃度を最適化する。本発明者は次に、ｍＫＡＴＥをコードしかつ感染細胞にＮｉＶ−Ｇの表面発現を誘発するＮｉＶｐｐに予め感染した胚を用いて、ｍＫＡＴＥ特異的ｓｉＲＮＡが装填され、ＮｉＶ−Ｇに標的を定められたプロトセルの発現抑制有効性を測定する。最後に、本発明者は、ｓｉＲＮＡ（又は必要に応じて、ミニサークルＤＮＡ）、従来の抗ウイルス剤（リバビリンなど）、及び新規の広域スペクトル抗ウイルス剤（例えばＬＪ００１24）などの抗ウイルス剤の複雑な組み合わせを、ヒトエフリンＢ２を発現するようにトランスフェクションされ、ｍＫＡＴＥ及びＮｉＶ−ＧをコードするＮｉＶｐｐに感染した胚に送達するプロトセルの能力を評価する。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
［標的を定められていないプロトセルの生体内分布及び毒性］
標的を定められていないプロトセルの予備的な生体内分布及び毒性が評価された。Ｂｕｌｂ／ｃ又はＮｕ／Ｎｕマウスでの生きた動物の蛍光イメージングを用いて、蛍光コアで修飾された標的を定められていないプロトセルが、最大用量４ｍｇ／マウス（２００ｍｇ／ｋｇ）の静注後に全身に分布することが分かる（図４７Ａ）。この体循環時間は、標的を定められたプロトセルの特定の細胞中への蓄積の時間を、細胞の所在位置にかかわらず提供すると考えられる。２４〜４８時間にわたって、残りのプロトセルが肝臓及び脾臓に蓄積することを見ることができる。２００ｍｇ／ｋｇでの３回投与後には、かなりの濃度の粒子が、少なくとも２週間肝臓内に留まる（図４７Ｂ、Ｄ）。肝臓内へのこの蓄積及び滞留は、病理及び肝臓重量によって測定されるようないかなる肝臓全体（図４８）の毒性ももたらさない。従って、標的を定められていないプロトセルは、それらが標的送達に用いられる潜在性に加えて、抗ウイルス剤及びｓｉＲＮＡの大きな持続的用量を送達するための理想的な貯蔵容器として機能し得る。さらに、３週間の週３回の２００ｍｇ／ｋｇ投与（総シリカ用量は３６ｍｇ／マウス）後に、毒性及び体重減少は観察されなかった（図４７Ｃ）。この極めて大用量でさえも、プロトセルは最小の毒性か、毒性が無いようである。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８７】
［経皮プロトセルの拡散］
＜方法＞
標準的なプロトセル組成（ＤＯＰＣ（Ｔｍ＝−２０℃）５５ｗｔ％、コレステロール３０ｗｔ％、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ１５ｗｔ％）を用い、それを角質層がそのまま残された箇所及び角質層が除去された箇所で皮膚サンプルに暴露する。ＩＣＰ質量分析を用いて分析する。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９２】
［経皮的なＳｉＯ2ナノ粒子］
＜蛍光光度計の設定＞
強度単位＝カウント／秒
励起：６３２ｎｍ
発光スキャン：６４４ｎｍ〜６５０ｎｍ（全ての値は６４７ｎｍで算出された）
ステップサイズ＝１ｎｍ
スリットサイズ＝２ｎｍ
測定時間＝１秒
ＡＳＯＣサンプリング頻度＝０．２ｋＨｚ
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９３】
＜前提及び公知の変数＞
−全ての粒子は、Ｄｙｌｉｇｈｔ６３３を用いて、ＮＨ2−シリカに対して１０μｇ／ｍｇの染料で蛍光標識された。
−Ｄｙｌｉｇｈｔ６３３の最大発光は６４７ｎｍであり、最大励起は６３２ｎｍである。
−全てのブランクは、容器液からなる同一のストック溶液から取られ、従って値は平均された。
−各サンプルは、最低３回、最大９回の測定操作を行った。
−サンプルは各測定操作前に混合された。
・全てのエラーバーは、９５％信頼区間を表す。平均からの標準偏差が算出された後、標準誤差を算出するのに用いられ、９５％信頼度を得るために１．９６倍された。
・標準曲線は、対照容器（Ｓ１と示す）の２４時間の容器液を用いて作成された。
・標準曲線は、１：２希釈での［開始］の０．１６ｍｇ／ｍｌから始まり、１．９５３１２５Ｅ-5ｍｇ／ｍｌまでであった。
・標準曲線は、２次の多項方程式に従うが（Ｒ2＞０．９９）、該当する濃度範囲に渡って曲線の直線部分を用いて線形回帰分析が適用され得る（Ｒ2＞０．９３）。標準曲線は、Ｌｏｇ平均ＦＩ対Ｌｏｇ［ＳｉＯ2］をプロットした。
・皮膚は自己蛍光での大きな不均質性を示す。従って０時間サンプルは、プロトセルをドナーキャップ中に加える前に抽出され、２４時間のブランク（Ｓ１）との間の自己蛍光の差が確認された。
・次にこの差を、全ての残りの容器液（Ｓ２〜Ｓ９）を対照（Ｓ１）に対して標準化するために、補正値として０時間サンプルに対して加算又は減算した。
・０時間、４時間、及び２４時間の時点における補正後の平均蛍光強度から未知濃度を算出するために、曲線の直線部分の方程式を用いた。
・０時間時点から得られた濃度は、容器中の実際のＳｉＯ2含有量を測定するために４時間及び２４時間の時点から減算された。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９４】
改変されたフランツ型拡散セルが、全ての実験で用いられた。皮下組織の除去後に、ドナー提供された腹部皮膚を約２ｃｍ2の細片に切り分け、気泡の形成を避けながら５．１ｍｌの容器上に配置し、６０分間平衡化した。容器液は３７℃に維持した。６０分後に皮膚を取り除き、容器液を交換し、皮膚を３０分間再平衡化した。３０分後に０時間サンプルを抜き取って（約４００μｌ）新しい拡散緩衝液と替えられた。様々なプロトセル組成が、各組成につきｎ＝４で投与された（５００μｌ、０．５×ＰＢＳ中１６ｍｇ／ｍｌ）。各実験につき１つの皮膚（Ｓ１）を０．５×ＰＢＳで処理した。標準曲線は、Ｓ１の２４時間の容器液の１：２希釈を用いて濃度範囲０．１６ｍｇ／ｍｌ〜１．９５３１２５Ｅ-5ｍｇ／ｍｌについて作成された。全ての標準曲線は、同一の一般的な２次の多項傾向に従い、Ｌｏｇ対Ｌｏｇ目盛にプロットされた。赤線は、９５％信頼度での平均ブランク値（Ｓ１、２４時間）を示す。図５９。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９７】
ＤＯＰＣ（Ｔｍ＝−２０）／コレステロールプロトセルは、ＤＳＰＣ（Ｔｍ＝５５）／コレステロールプロトセルと比較して約２倍の量のＳｉＯ2を２４時間時点で示した。これは、より低い転移温度を有する脂質は全層の皮膚中により深く拡散すること、より高い転移温度を有する脂質は角質層において局所に留まることを提示するリポソーム文献と一致する。ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ組成及びＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ組成へのＰＥＧ添加は、経皮拡散を著しく減少させた。親水性ポリマーであるＰＥＧは、透過増強剤として従来用いられている。本発明者は、減少した拡散は、細胞間ラメラの水性部分での細胞間構造を崩壊させず、従って拡散を妨げる相互作用に起因するという仮説を立てている。ＤＯＰＣプロトセル組成へのＤＯＰＥの導入は、調査された他の組成よりも増大した拡散を示す（貴重なスライド）。ＤＯＰＥ及びＰＥＧの両方の添加は、経皮拡散の著しい増大を示し（高い統計的分散を有する）、エタノールアミンとＰＥＧとの組み合わせが経皮拡散を好適に増大させ得ることを示唆している。この傾向は、ＤＳＣ、小角ＸＲＤ、共焦点顕微鏡法、及び可能であればＦＴＩＲを用いてさらに検討される。図６２。