【事件の表示】
　特願２００６−５０５４１４「閉塞ストローガラス化方法を利用するヒト胚盤胞由来幹細胞の低温保存法」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年１１月１８日国際公開、ＷＯ２００４／０９８２８５、平成１８年１１月　９日国内公表、特表２００６−５２５００６〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　
　この出願は，２００４年５月１０日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００３年５月８日デンマーク（ＤＫ），２００３年５月８日米国（ＵＳ），２００３年６月２７日デンマーク（ＤＫ），２００３年６月２７日デンマーク（ＤＫ））を国際出願日とする出願であって，以降の手続の経緯は以下のとおりのものである。
　　
　　　平成２２年　２月１６日付け　拒絶理由通知書
　　　平成２２年　７月１６日　　　意見書・手続補正書
　　　平成２３年　５月１６日付け　拒絶査定
　　　平成２３年　９月２６日　　　審判請求書・手続補正書
　　　平成２５年　２月１４日付け　審尋
　　　平成２５年　５月１３日　　　回答書
　
第２　本願発明の認定
　
　本件は，平成２３年９月２６日付け手続補正書（以下，「本件補正」という）が提出されており，本件補正は，補正前の請求項２４ないし２６を削除し，それにあわせ補正前の請求項２７ないし３４を繰り上げるものである。　そして，本件補正は，平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法（以下，「平成１８年改正前特許法」という。）第１７条の２第４項第１号の請求項の削除に該当し，同法同条同項の規定に適合する。
　
　そうすると，この出願の請求項１に係る発明は，平成２３年９月２６日付けの手続補正により補正された特許請求の範囲，明細書及び図面（以下，「本願明細書」という。）の記載からみて，特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定されるとおりのものであると認められ，該請求項１にかかる発明（以下,「本願発明」という。）は，次のとおりのものであると認める。
　
「ｉ）ｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞由来細胞を第１溶液（溶液Ａ）に移し，
　ｉｉ）任意的に第１溶液の細胞を培養し，
　ｉｉｉ）工程ｉ）あるいはｉｉ）で得られた細胞を第２溶液（溶液Ｂ）に移し，
　ｉｖ）任意的に第２溶液の細胞を培養し，
　ｖ）工程ｉｉｉ）あるいはｉｖ）で得られた少なくとも２０μｌの細胞を一つ以上の閉塞ストローに移し，
　ｖｉ）一つ以上の閉塞ストローをシールし，さらに
　ｖｉｉ）一つ以上の閉塞ストローをガラス化する工程から構成されることを特徴とするｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞由来細胞のガラス化法。」
　
第３　刊行物に記載された事項
　
１　刊行物　
　Ｃｒｙｏｂｉｏｌ．（１９９８）ｖｏｌ．３７，ｐ．７７−８５（原査定における引用例１。以下，「刊行物１」という。）
　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｐｒｏｄ．（２００１）ｖｏｌ．１６，ｐ．２１８７−２１９４（原査定における引用例３。以下，「刊行物２」という。）
　
２　刊行物に記載された事項　
　この優先日前に頒布された刊行物である刊行物１，２には，以下の事項が記載されている。なお，提示した翻訳は，当審での翻訳であり，下線は当審で付与した。以下，同様。
　
（１）刊行物１
１ａ「Cryopreservation of Mature Bovine Oocytes by Vitrification in Straws」（７７頁タイトル）
　（翻訳）
「
ストローでのガラス固化による成熟ウシ卵母細胞の凍結保存
　
１ｂ「Vitrification Solutions
　　The solution used as a carrier for the cryoprotectants was TCM199 medium supplemented with 10% FBS and antibiotics (TF). Ethylene glycol(EG) was diluted to 20, 30, 40, and 50% (v/v) in TF medium supplemented with 0.35 mol/L sucrose. The respective solutions were designated ES20, ES30, ES40, and ES50, after the initials of the cryoprotectants plus concentration of EG, All manipulations were conducted at room temperature (21-25℃).
　
Oocyte Vitrification
　　In the first series of experiments, the effect of stepwise addition before exposure to vitrification solution on the developmental competence of oocytes vitrified in ES30 solution was tested. In the one-step addition procedure, in vitro matured oocytes were directly exposed to ES30 solution. In the two-step addition procedure, the oocytes were placed into culture dishes containing 2 ml of TF medium with 15% EG for 1 min before being exposed to ES30 solution. In the three-step addition procedure, the oocytes were placed into culture dishes containing 2 ml of TF medium with 10% EG for 1 min and were subsequently suspended to 20% EG for 1 min before exposure to ES30 solution, After equilibration at each step, about 30 oocytes were first suspended in a microdrop (30μl) of ES30 solution in a culture dish and then transferred into different fresh microdrops twice for equilibration. The oocytes were loaded into a straw and vitrified in liquid nitrogen within 1 min alter exposure to ES30. 
　　The oocytes were loaded into straws using a modification of the procedures of Leibo (17) and Renard et al. (31). The 0.25-ml plastic straws (I.M.V., l'Aigle, France, No. AAA201) were loaded as followed: a 7-cm. length was filled with TF medium containing 0.5 M sucrose followed by a 0.5-cm air bubble, 0.5 cm of vitrification solution, an air bubble (about 0.5 cm), 1.2 cm of vitrification solution (about 30μl) containing the oocytes, an air bubble (about 0.5 cm), vitrification solution (about 0.5 cm), and an air bubble (the remainder of the straw). The straw was sealed with powder. Approximately half of the straw, including the vitrification solution, was rapidly immersed in liquid nitrogen, and the rest of the straw was then immersed slowly to prevent bursting.」（７８頁右欄１行〜７９頁左欄５行）　
　（翻訳）
「ガラス固化液
　
凍結保護物質のキャリアーとして用いられた液は，１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＴＣＭ１９９培地である。０.３５ｍｏｌ／Ｌシュークロースを補充したＴＦ培地でエチレングリコール（ＥＧ）を
３０
％（Ｖ／Ｖ）に希釈した
ＥＳ３０
　
　卵母細胞のガラス固化
　実験の第一シリーズでは，ＥＳ３０溶液でガラス化される卵母細胞の発生能力についてガラス固化液に浸す前に段階的に付加した場合の効果をテストした。一ステップ付加手順では，インビトロで成熟卵母細胞をＥＳ３０溶液に直接さらした。
二ステップ付加手順では，卵母細胞をＥＳ３０溶液にさらす前に，卵母細胞を１５％ＥＧ入りＴＦ培地２ｍｌを有する培養皿に１分間載置した
各ステップで平衡化後，最初に約３０卵母細胞を培養皿にて微滴（３０μｌ）のＥＳ３０溶液に懸濁し，次に平衡化のために２回別の新鮮な微滴に移した。ＥＳ３０にさらした後１分以内に卵母細胞をストローに装填し液体窒素でガラス化した
　
Leibo(17)とRenard等(31)の手順の修正版を使って卵母細胞をストローに装填した
０.２５ｍｌのプラスチックストロー(LM.V., l'Aigle, France, No. AAA201)に以下のように装填した
卵母細胞を含有する１.２ｃｍのガラス固化液（約３０μｌ）
ストローを粉で密封した
ストローのおよそ半分，ガラス固化液を含んでいる部分，を液体窒素に急速に浸漬し，その後破裂を防ぐためにストローの残りの部分をゆっくりと浸漬した
　
１ｃ「　　　　RESULTS
　　Effect of Stepwise Addition before Vitrification
As shown in Table 1, when judged after 48 h in culture, the morphological survival of oocytes vitrified by the one-step addition procedure was significantly lower (P0.05) than in the other groups. Moreover, none of the ooeytes vitrified by the one-step addition procedure cleaved and developed to blastocysts. There were no significant differences between the two-step and three-step addition procedures with respect to the rates of morphological survival, cleavage, and development to blastocysts of vitrified oocytes.」(８０頁右欄４〜１７行)
　（翻訳）
「　　結果
　ガラス固化前の段階的付加の効果
表１に示されるように，４８時間培養後に判断すると，一ステップ付加手順でガラス化された卵母細胞の形態的生存は，他のグループより際立って低かった（P０．０５）。さらに，一ステップ付加手順でガラス化された卵母細胞はいずれも細胞分裂や胚盤胞への分化がなされなかった。
形態的生存，細胞分裂及びガラス化卵母細胞の胚盤胞への分化のそれぞれの割合に関し，二ステップ付加手順及び三ステップ付加手順の間に重要な相違はなかった。
　
１ｄ「In conclusion, the findings in this study suggest that the vitrification method may be superior to the conventional slow cooling procedure for cryopreservation of in vitro matured bovine oocytes. Moreover,the improvements of the concentration of cryoprotectant and the addition procedures have critical effects on the developmental competence of oocytes vitrified in straws.」（８３頁右欄２８〜３６行）
　（翻訳）
「結論として，この研究結果は，ガラス固化法がインビトロでの成熟ウシ卵母細胞の凍結保存にとり，従来のゆっくりした冷却手順より優れているかもしれないことを示唆する。さらに，凍結保存剤の濃度と付加手順の改良は，ストローでガラス固化された卵母細胞の分化能力につき重要な効果を持っている。」
　
（２）刊行物２
２ａ「Effective cryopreservation of human embryonic stem cells by the open pulled straw vitrification method」（２１８７頁タイトル）
　（翻訳）
「開口引出型ストローのガラス固化法によるヒト胚性幹細胞の効果的凍結保存」
　
２ｂ「BACKGROUND: Human embryonic stem (ES) cells originate from the inner cell mass of the blastocyst, and retain in culture the properties of pluripotent cells of the early embryo. The study aim was to determine whether the open pulled straw (OPS) vitrification method, which is highly effective for the cryopreservation of embryos, might be also efficient for human ES cells.・・・CONCLUSIONS: Vitrification by the OPS method is reliable and effective for the cryopreservation of human pluripotent embryonic stem cells.」（２１８７頁要約）
　（翻訳）
「背景：ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞は胚盤胞の内部細胞塊由来で，培養で初期胚の多能性細胞特性を維持する。研究の目的は，胚の凍結保存にかなり効果的である開口引出型ストローのガラス固化法が，ヒト胚性幹細胞にとっても効率的であるかどうかを決定することであった。・・・
結論：開口引出型ストロー法によるガラス固化は，ヒト多能性胚性幹細胞の凍結保存に信頼でき有用である。
　
第４　当審の判断
　
１　刊行物１に記載された発明
　
　刊行物１は，「ストローでのガラス固化による成熟ウシ卵母細胞の凍結保存」（１ａ）に関し記載するものである。この凍結保存の具体的な方法として，「卵母細胞のガラス固化」（１ｂ）の欄には，成熟ウシ卵母細胞をガラス固化液であるＥＳ３０溶液にさらした後，卵母細胞をストローに装填し，ストローを粉で密封し，液体窒素でガラス化した方法（１ｂ）が具体的に記載されている。
　そして，同欄には，卵母細胞をガラス固化液にさらす前に段階的に付加した方法として，一ステップ付加手順，二ステップ付加手順及び三ステップ付加手順も具体的に記載されている。これらの内，ガラス化された卵母細胞の発生能力に問題のない二又は三ステップ付加手順（１ｃ）の内の二ステップ付加手順に着目し，二ステップ付加手順を踏まえこの卵母細胞をガラス化する方法を書き表すと，刊行物１には，
　
「成熟ウシ卵母細胞をＥＳ３０溶液にさらす前に，卵母細胞を１５％ＥＧ入りＴＦ培地２ｍｌを有する培養皿に１分間載置し，平衡化後，最初に約３０卵母細胞を培養皿にて微滴（３０μｌ）のＥＳ３０溶液に懸濁し，次に平衡化のために２回別の新鮮な微滴に移し，ＥＳ３０にさらした後１分以内に卵母細胞をストローに装填し，ストローを粉で密封し，液体窒素でガラス化する方法。」
　
の発明（以下，「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
２　本願発明と引用発明との対比
　
（１）本願発明の「ｈＢＳ細胞」とは，本願明細書の「【発明の名称】閉塞ストローガラス化方法を利用する
ヒト胚盤胞由来幹細胞
胚盤胞由来幹細胞（ＢＳ細胞）
胚性幹細胞は
胚盤胞由来であり
胚盤胞由来幹細胞あるいはｈＢＳ細胞として記載する
　そうすると，引用発明の「成熟ウシ卵母細胞」と本願発明の「ｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞由来細胞」とは，哺乳動物細胞である点で共通する。
　
（２）本願発明の「第１溶液（溶液Ａ）」及び「第２溶液（溶液Ｂ）」とは，本願明細書の「【００２１】ガラス化溶液（第１溶液，第２溶液）のうちの少なくとも一つは１つ以上の抗凍結剤，あるいは抗凍結剤混合物を含有する。・・適切な抗凍結剤はエチレングリコール・・スクロース・・からなるグループから選択される。」という記載から，ｈＢＳ細胞をガラス化する溶液で，少なくとも一つの溶液は１つ以上の抗凍結剤（エチレングリコール，スクロース等）を含有するものといえる。
　
　引用発明の「１５％ＥＧ入りＴＦ培地２ｍｌ」は，刊行物１の「凍結保護物質のキャリアーとして用いられた液は，１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＴＣＭ１９９培地である。０.３５ｍｏｌ／Ｌシュークロースを補充したＴＦ培地でエチレングリコール（ＥＧ）を２０，３０，・・％（Ｖ／Ｖ）に希釈した。」（１ｂ）という記載より，１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＴＣＭ１９９培地にシュークロースを補充した液に，１５％エチレングリコール（ＥＧ）を入れた溶液で，このエチレングリコール（ＥＧ）及びシュークロースは抗凍結剤といえる。　
　そうすると，引用発明の「１５％ＥＧ入りＴＦ培地２ｍｌ」は，卵母細胞をガラス化するために用いられる溶液の一つで２つの抗凍結剤を含有するものといえ，ガラス化する溶液としてはじめに用いられる溶液であることから，本願発明の「第１溶液（溶液Ａ）」に相当する。
　
（３）引用発明の「卵母細胞を１５％ＥＧ入りＴＦ培地２ｍｌを有する培養皿に１分間載置し」は，上記（２）で述べたことを踏まえると，上記（１）の点を除き，本願発明の「ｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞由来細胞を第１溶液（溶液Ａ）に移し」に相当する。
　そして，この工程に引き続き，本願発明には「任意的に第１溶液の細胞を培養し」という工程があるが，これは任意的な工程であるから，引用発明にこの工程がなくても，本願発明との差異はない。
　
（４）引用発明の「ＥＳ３０溶液」は，刊行物１の「１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＴＣＭ１９９培地である。０.３５ｍｏｌ／Ｌシュークロースを補充したＴＦ培地でエチレングリコール（ＥＧ）を２０，３０，４０，５０％（Ｖ／Ｖ）に希釈した」（１ｂ）という記載より，１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＴＣＭ１９９培地に０.３５ｍｏｌ／Ｌシュークロースを補充したＴＦ培地で，エチレングリコール（ＥＧ）を３０％（Ｖ／Ｖ）に希釈した溶液であることが分かる。
　この「ＥＳ３０溶液」は，「卵母細胞を１５％ＥＧ入りＴＦ培地２ｍｌを有する培養皿に１分間載置し」平衡化した後の卵母細胞が移されるところの溶液で，卵母細胞をガラス化するための溶液といえ，この溶液に含まれるエチレングリコール（ＥＧ）及びシュークロースは，上記（２）で述べたように，抗凍結剤といえる。　
　そうすると，引用発明の「ＥＳ３０溶液」は，卵母細胞をガラス化する溶液の一つで２つの抗凍結剤を含有するものといえ，ガラス化する溶液として２番目に用いられる溶液であることから，本願発明の「第２溶液（溶液Ｂ）」に相当する。
　
（５）引用発明の「最初に約３０卵母細胞を培養皿にて微滴（３０μｌ）のＥＳ３０溶液に懸濁し，次に平衡化のために２回別の新鮮な微滴に移し，ＥＳ３０にさらした」は，上記（４）で述べたことを踏まえると，上記（１）の点を除き，本願発明の「工程ｉ）あるいはｉｉ）で得られた細胞を第２溶液（溶液Ｂ）に移し」に相当する。
　そして，この工程に引き続き，本願発明には「任意的に第２溶液の細胞を培養し」という工程があるが，これは任意的な工程であるから，引用発明にこの工程がなくても，本願発明との差異はない。
　
（６）引用発明の「卵母細胞をストローに装填し」について，刊行物１には「Leibo(17)とRenard等(31)の手順の修正版を使って卵母細胞をストローに装填した。
０.２５ｍｌのプラスチックストロー(LM.V., l'Aigle, France, No. AAA201)に以下のように装填した
卵母細胞を含有する１.２ｃｍのガラス固化液（約３０μｌ）
　ここで，「ストロー」として「０.２５ｍｌのプラスチックストロー(I.M.V., l'Aigle, France, No. AAA201)」（１ｂ）を用いており，この市販品のストローを確認し，且つ，後にこのストローを密封していることを勘案すると，このストローは閉塞ストローといえる。
　そして，このストローに「ＥＳ３０にさらした後」（１ｂ）の「卵母細胞を含有する１.２ｃｍのガラス固化液（約３０μｌ）」を装填しており，少なくとも２０μｌの細胞を閉塞ストローに移しているといえる。
　そうすると，引用発明の「卵母細胞をストローに装填し」は，上記（１）の点を除き，本願発明の「工程ｉｉｉ）あるいはｉｖ）で得られた少なくとも２０μｌの細胞を一つ以上の閉塞ストローに移し」に相当する。
　
（７）引用発明の「ストローを粉で密封し」は，本願発明の「一つ以上の閉塞ストローをシールし」に相当する。
　
（８）引用発明の「液体窒素でガラス化する」は，刊行物１の「ストローのおよそ半分，ガラス固化液を含んでいる部分，を液体窒素に急速に浸漬し，その後破裂を防ぐためにストローの残りの部分をゆっくりと浸漬した。」（１ｂ）との記載から，密封したストローを液体窒素中に浸漬してガラス化することといえる。
　本願発明の「一つ以上の閉塞ストローをガラス化する」は，本願明細書の「【００５４】実施例１　ｈＢＳ細胞のガラス化・・ストローはボンドで閉塞される。このストローは液体窒素中に投入される。」という記載から，閉鎖ストローを液体窒素中に投入してガラス化することといえる。
　そうすると，引用発明の「液体窒素でガラス化する」は，本願発明の「一つ以上の閉塞ストローをガラス化する」に相当する。
　
（９）引用発明の「方法」は，成熟ウシ卵母細胞のガラス化方法といえる。
　そうすると，上記（１）で述べたことを踏まえると，本願発明の「ｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞由来細胞のガラス化法」と引用発明の「方法」とは，哺乳動物細胞のガラス化法である点で共通する。
　
　したがって，両者は，
　
「ｉ）哺乳動物細胞を第１溶液（溶液Ａ）に移し，
　ｉｉ）任意的に第１溶液の細胞を培養し，
　ｉｉｉ）工程ｉ）あるいはｉｉ）で得られた細胞を第２溶液（溶液Ｂ）に移し，
　ｉｖ）任意的に第２溶液の細胞を培養し，
　ｖ）工程ｉｉｉ）あるいはｉｖ）で得られた少なくとも２０μｌの細胞を一つ以上の閉塞ストローに移し，
　ｖｉ）一つ以上の閉塞ストローをシールし，さらに
　ｖｉｉ）一つ以上の閉塞ストローをガラス化する工程から構成されることを特徴とする哺乳動物細胞のガラス化法。」
　
である点で一致し，以下の点でのみ相違する。
　
　哺乳動物細胞が，本願発明はｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞由来細胞であるのに対し，引用発明は成熟ウシ卵母細胞である点（以下，「相違点」という。）。
　
３　判断
　
（１）相違点について
　
  本願発明の「ｈＢＳ細胞」は，上記２（１）で述べたように，ヒト胚盤胞由来幹細胞のことであり，ヒト胚性幹細胞といえる。
　
　一般に，胚盤胞由来幹細胞である胚性幹細胞は，胚盤胞から誘導される多能性幹細胞で，培養時に胚の特性を保持すること，それ故，胚性幹細胞の効果的な保存方法は，胚の保存に効率的である凍結保存が最も適当であり，中でもガラス化法が好ましいことは，刊行物２に「ガラス固化は，ヒト多能性胚性幹細胞の凍結保存に信頼でき有用である」（２ｂ）と記載されているのみならず，以下に示す刊行物Ａにも，ヒト胚性幹細胞にガラス化法を適用していることが記載されていることからも明らかなように，本願優先日前，良く知られていたことである。　
　
　そして，哺乳動物の種を超え一般に哺乳動物胚や卵子を含む哺乳動物細胞のガラス化法では，開口引出型ストロー又は閉塞ストローを用いるが，開口引出型ストローは，液体窒素でガラス化する際ウイルスや細菌による感染の危険性があることから，該危険性を避けるべく，開口引出型ストローではなく閉塞ストローを適用することは，以下に示す刊行物Ｂの記載からも明らかなように，本願優先日当時，周知事項であった。
　それ故，ヒト胚性幹細胞のガラス化法が記載されている刊行物２及び刊行物Ａでは共に開口引出型ストローを用いているものの，これはウイルス等の感染の危険性があることから，その危険性を回避すべく閉塞ストロ−を適用することは，当業者は当然考え得ることであり，ヒト胚性幹細胞のガラス化法で閉塞ストローを適用することに特段の阻害要因もない。
　
　そうすると，引用発明は，成熟ウシ卵母細胞のガラス化法であり，ガラス化法が，種々の哺乳動物胚や卵子（刊行物Ｂ）のみならず，ヒト胚性幹細胞（刊行物２及び刊行物Ａ）についても効果的で効率的な凍結保存方法として適用されていることは，本願優先日前，良く知られていたことであり，また，引用発明は閉塞ストローを用いていることからウイルス感染等の危険性もなく，ヒト胚性幹細胞のガラス化法に適用することに特段の阻害要因もないことから，引用発明において，カラス化法を適用する対象の哺乳動物細胞として，成熟ウシ卵母細胞に代えて，刊行物２記載のヒト胚性幹細胞を適用することは，当業者が容易に想到し得たことである。
　
　刊行物Ａ：特表２００２−５２９０７０号公報
「【００２８】
　好ましくは，
未分化の細胞系統は，凍結保存などの保存方法によって保存される
好ましくは，凍結保存の方法は，ガラス化などの胚に使用するのに非常に効率的な方法である
　
「【０１１５】
　
ES細胞の効果的な保存は
従って，胚に効率的である方法を使用した凍結保存が最も適当である。胚の凍結保存に効率的である任意の方法を使用することができる。好ましくは，ガラス化法を使用する
　
「【０１４８】
　例6；
ヒトES細胞の凍結保存
　従来のゆっくりした凍結プロトコールを使用することによってヒトES細胞を凍結保存する試みは融解後に良好ではない結果が得られるだけであった。ES細胞は胚盤胞から誘導され，培養中に胚の特性を保持するので，本発明者らは，胚に効率的な方法を使用することによる凍結乾燥が有用であると推測した。
ヒトES細胞の早期継代細胞集団を，ウシ胚盤胞の凍結保存にかなり効率的であることが最近示されているオープンプルドストロー（Open Pulled Straw）（OPS）ガラス化方法を使用することによって凍結した（Vajtaら，1998）
ガラス化手法の成果をさらに細胞系統HES-1について検討し，この手法による生きている細胞の回収はかなり効率的であることが見出された。全ての細胞集団（n=25）は手法から生存し，接着し，融解後も増殖した
　
　刊行物Ｂ：特開２０００−１８９１５５号公報
「【請求項１】
哺乳動物胚または卵子を滅菌処理した凍結ストロー
の凍結保存用容器の内面に，これらの胚または卵子を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付け，該凍結保存用容器を密封し，該容器を液体窒素に接触させて急速に冷却してなることを特徴とする哺乳動物胚または卵子の保存方法
【請求項２】前記ガラス化液の量が前記胚または卵子１個につき０．５μｌ以下であることを特徴とする請求項１記載の哺乳動物胚または卵子の保存方法。　　　　　　　　　　・・（略）・・
【請求項６】
前記胚を前記ガラス化液に暴露する前に，該胚を約１５％エチレングリコール溶液または約１０％グリセロール溶液に５〜１０分間平衡処理することを特徴とする請求項４記載の哺乳動物胚または卵子の保存方法
　
「【０００６】これに対し，Luyet (1937)により提唱された
ガラス化保存法は，細胞内外の溶液を急速な冷却によりガラス化させて液体窒素温度で保存する方法で，高価な冷却装置を用いず，急速に胚を冷却する
マウス胚のガラス化保存の成功例がSheffen et al. (1986)によって報告されたのをはじめとして
マウス
ラット
ウサギ
ヒツジ
ブタ
において，ガラス化保存の成功例が報告された
【０００７】ウシにおいてはMassip et al.(1986) が，Sheffen et al. (1986) のマウスでの方法を応用して，生体から回収した後期桑実胚においてガラス化保存後の生存例を得た。しかし，一般に胚移植に用いられる胚盤胞では生存例は得られず，胚盤胞のガラス化保存の困難さが指摘された(Massip et al., 1986; 堂地ら, 1990; Van Der Zwalmen et al., 1989) 。また近年，体外受精技術の開発にともなって，その利用価値が実験上のみならず産業面においても急増してきた
体外受精由来胚においては，Kuwayama et al.(1992) が胚盤胞において初めての成功例の報告後，同様に高いガラス化保存の成功例が報告されている（Tachikawa et al, 1994)
　
「【００１０】Martino(1996) は電子顕微鏡用グリッドを用い，
最少化したガラス化液とともに卵子を直接液体窒素に浸漬することにより従来より高いガラス化保存後の生存率を得た
先端を熱熔解して引き，細長く伸ばした0.25mlプラスチックストロー(Open Pulled Straw:OPS) を用いて，胚を含んだ少量のガラス化液を直接液体窒素に触れさせて冷却することによりガラス化保存後の生存を得た
しかしながら，両方ともに冷却時液体窒素に直接卵子を触れさせるため，ウィルス感染の危険性があり実用化には適さない
　
「【００１４】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するため，本発明に係る
哺乳動物胚または卵子の保存方法では
凍結ストロー
の内面に，これらの胚または卵子を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付け，この凍結保存用容器を密封し，そしてこの容器を液体窒素に接触させて急速に冷却してなる
【００１５】これにより，
胚または卵子は密封された凍結保存用容器内にあって，その外部の液体窒素と直接接触することなく凍結されるので，胚または卵子がウイルスや細菌に感染されるおそれが無い
　
「【００２６】
ガラス化液はこれまでに報告されているあらゆる組成のガラス化液，すなわち，細胞膜透過性凍結保護物質としてグリセロール
ジメチルスルホサイド（DMSO），エチレングリコール
細胞膜非透過性凍結保護物質としてシュークロース，トレハロース
などを添加したガラス化液が利用可能であるが
【００２７】
卵子および胚をガラス化液に暴露する前，あらかじめ細胞内に低濃度の細胞膜透過性凍結保護物質を浸透させる平衡処理を行うことにより，ガラス化液へ投入時の胚の浸透圧差による物理的損傷を軽減し，さらに冷却ー加温時の細胞内氷晶形成を防止することにより，保存後のより高い生存性を得ることが可能である
　
（２）本願発明の効果について
　
　本願発明の課題は，本願明細書の「【０００８】・・できるだけ操作性が良く且つできるだけ少ない工程で実施される・・同時に処理中に細胞に対する不要な汚染の危険性を防ぐあるいは少なくとも減少させる効果的なガラス化方法・・特に・・より多量な容量の細胞あるいは細胞系の効果的なガラス化方法を研究する必要性がある。」という記載，及び，平成２５年５月１３日付け回答書の「１．拒絶理由について（２）特許法第２９条第２項に基づく理由について」における「本願発明は，この低速度凍結及び急速解凍方法と上記引用例３のOPS方法との両欠点を克服すること，すなわちｈＢＳ細胞の高い生存率および生存維持率を維持する一方で大量にｈＢＳ細胞を低温保存することができる方法を提供することを目的としております。」との記載より，
　ア　できるだけ操作性が良く且つできるだけ少ない工程で実施する。
　イ　細胞に対する不要な汚染の危険性を防ぐ又は少なくとも減少させる。
　ウ　より多量な容量の細胞又は細胞系をガラス化する。
　エ　ｈＢＳ細胞の高い生存率および生存維持率を維持する。
ことであるといえ，本願発明の効果は，これら課題を解決することにより奏される効果といえる。
　　
　そこで，これらの課題を解決することにより奏される効果を検討する。
　アについて，ガラス化工程は，上記２で検討したように，引用発明と本願発明とは同じであることから，できるだけ操作性が良く且つできるだけ少ない工程で実施されるという効果は，引用発明でも同じく奏するものである。　イについて，引用発明は閉塞ストローを用いた方法であり，上記３（１）で述べたように，閉塞ストローを適用すれば，細胞に対する不要な汚染の危険性を防ぐ又は少なくとも減少されることは，刊行物Ｂの記載からも明らかなように，当業者であれば予測し得たことである。
　ウについて，「より多量な容量の細胞又は細胞系」とは，本願発明においては「少なくとも２０μｌの細胞」であり，本願明細書中具体的には「【００５４】実施例１　ｈＢＳ細胞のガラス化・・溶液Ａにおいて１分間培養され，次に２５μｌの溶液Ｂに移され３０秒間培養され，次に新鮮な一滴の溶液Ｂに再び移され，３０秒間培養される。この容量はおよそ４０〜５０μｌである。およそ１０この細胞切片はガラス化用に調製されたストロー内に吸引され・・閉塞される」との記載から，およそ４０〜５０μｌ（２５μｌを２回）の溶液Ｂにおよそ１０個の細胞程度と理解される。
　他方，引用発明も，本願発明の溶液Ａに相当する１５％ＥＧ入りＴＦ培地２ｍｌを有する培養皿に１分間載置・平衡化後，約３０卵母細胞を微滴（３０μｌ）のＥＳ３０溶液（本願発明の溶液Ｂに相当）に懸濁し，次に２回別の新鮮な微滴に移しＥＳ３０にさらしており，３０μｌ２回の量の溶液Ｂ相当溶液に約３０卵母細胞を適用しており，本願発明と同じ程度の多量な容量の溶液の細胞であるといえる。したがって，この効果についても当業者の予測し得たことである。　
　エについて，引用発明のガラス化工程で行っているように，卵子や胚をガラス化液に暴露する前，予め細胞内に低濃度の細胞膜透過性凍結保護物質を浸透させる平衡処理を行うことにより，ガラス化液へ投入時の胚の浸透圧差による物理的損傷を軽減し，更に冷却ー加温時の細胞内氷晶形成を防止することにより，保存後のより高い生存性を得ることが可能であることは，刊行物Ｂの記載（【００２７】）からも明らかなように，本願優先日前良く知られていたことである。それ故，引用発明に対しヒト胚性幹細胞を適用した場合も，該細胞の高い生存率及び生存維持率を維持できるという効果を奏することは，当業者の予測し得たことである。
　加えて，本願明細書における具体的な効果を確認すると「【００５８】実施例４　閉塞ストローと開口引出しストローとの直接比較・・結果として，各閉塞ストロー由来の生菌数（絶対数）がより多くえられる一方で許容回復率を維持できることが示された」と記載されている。この結果を示す表２を検討すると，ｈＢＳ細胞の解凍回復率自体は，閉塞ストロー及び開口引出しストローは同程度で変化ないが，閉塞ストローは大量の細胞のガラス化をできることから，生菌の絶対数が多く得られている。そうすると，本願発明におけるｈＢＳ細胞の高い生存率および生存維持率とは，生菌の絶対数が多く得られる一方で，回復率を維持できる程度ということともいえ，これは閉塞ストローを適用することに伴って奏される効果といえるから，上記ウで述べたことより，引用発明においても，予測し得る効果といえる。
　
　以上より，本願発明の効果は，刊行物１，２及び本願優先日前の周知技術から予測される範囲内のものであり，格別顕著なものではない。
　
（３）請求人の主張について
　
　請求人は，平成２５年５月１３日付け回答書の「１．拒絶理由について（２）特許法第２９条第２項に基づく理由について」において，「上記引用例１は・・成熟したウシの卵母細胞のガラス化に関しております・・サイズやハプロタイプだけでなく，細胞型まで完全に異なっており，卵母細胞と胚性幹細胞とは比較することはできません。これらの異なる構造から，卵母細胞は，胚性幹細胞と比較して，環境条件の変化に対し，非常に異なる反応を示します。上記引用例１に記載されるように，ウシの卵母細胞は低温に特に高い感受性を示すことが明らかとなっております（引用例１，第７７頁，右欄第５〜９行）。したがって，これらの細胞が冷凍された場合に全く異なった作用を示すことを理解する当業者は，卵母細胞をガラス化するために開発されたガラス化手順を，ヒト胚性幹細胞をガラス化する手順に単純に適用しようとはしません。」，及び，「引用例３・・ｈＢＳ細胞に対してOPS技術が利用できることを示したとしても，胚に対して記載されたあらゆる技術を適用できることを一般的に示したとみなすことはできず，ましてヒトの胚をヒトの幹細胞に対して適用することは不可能です。」と主張している。
　
　しかしながら，上記（１）で述べたように，刊行物Ａの「【０１１５】ES細胞の効果的な保存は・・胚に効率的である方法を使用した凍結保存が最も適当である。胚の凍結保存に効率的である任意の方法を使用することができる。好ましくは，ガラス化法を使用する」との記載，及び，刊行物Ｂには，哺乳動物の種を超えて一般に哺乳動物胚のみならず卵子の凍結保存法として，閉塞ストローによるガラス化法，特に胚をガラス化液に暴露する前に胚等を抗凍結剤に平衡処理する工程を含むガラス化法が適用されることが記載され，これは本願優先日前，良く知られた技術であったことを勘案すれば，引用発明の，卵子の基である卵母細胞のガラス化法を，ヒト由来を含め胚の効率的な凍結保存法を適用することが最も適当である胚性幹細胞に適用することは，当業者が容易に想到し得たことといえ，適用しようとはしない又は不可能であるとはいえない。
　以上のとおりであるから，請求人の上記主張を採用することはできない。
　
第５　むすび
　
　以上のとおり，本願発明は，この出願の出願前に頒布された刊行物１，２に記載された発明及び周知技術に基いて，当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により，特許を受けることができないものであるので，その余について言及するまでもなく，この出願は，拒絶すべきものである。
　
　よって，結論のとおり審決する。