(57)【要約】【課題】本発明は、霊芝（Ganoderma lingzhi）中に含まれるトリテルペノイド類を有効成分として含有し、ヒストン脱アセチル化酵素の活性を阻害または抑制することができる新規のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、これを含有した抗腫瘍剤、食品および薬剤、並びにそれらの製造方法の提供をすることを目的とする。【解決手段】霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機系溶媒で抽出することにより得られる所定の抽出成分を含む剤等とする。【選択図】図１
2018104396.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊芝（Ganoderma lingzhi）から有機系溶媒で抽出することにより得られる抽出成分を含むことを特徴とするヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
【請求項２】
（１）ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、
（２）ガノデリックアシッドＮ（Ganoderic acid N）、
（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、
（４）ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、
（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、
（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、
（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、
（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、
（１１）ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）、
（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、
（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、
（１５）ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、
（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、
（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、
（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）、
（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）、
（２０）ガノデリオールF（Ganoderiol F）、
（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、
（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、
（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、
（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、
（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、
（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、
（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、
（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、
（２９）ガノデレニックアシッドＡ（Ganoderenic acid A）、
（３０）ガノデレニックアシッドＣ（Ganoderenic acid C）、
（３１）ガノデレニックアシッドＤ（Ganoderenic acid D）、
（３２）ガノデレニックアシッドＦ（Ganoderenic acid F）、および
（３３）ガノデレニックアシッドＨ（Ganoderenic acid H）からなる群から選択された１種または２種以上のトリテルペノイド類であることを特徴とするヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
【請求項３】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の有効成分としての前記１種または２種以上のトリペノイド類が、霊芝（Ganoderma lingzhi）から有機系溶媒で抽出することにより得られるトリペノイド類である、請求項２に記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
【請求項４】
霊芝（Ganoderma lingzhi）から有機系溶媒で抽出された抽出物（エキス）を、有機系溶媒抽出物（エキス）換算量で、５μｇ／ｍＬ以上の量で含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含む抗腫瘍剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含む細胞分裂阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、ハンチントン病、うつ病、またはアルツハイマー病の進行の抑制または軽減のための医薬品または食品。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する苦味料。
【請求項９】
霊芝（Ganoderma lingzhi）から、有機系溶媒を用いてヒストン脱アセチル化酵素阻害を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を製造する方法。
【請求項１０】
霊芝（Ganoderma lingzhi）から、有機系溶媒を用いてヒストン脱アセチル化酵素阻害を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、請求項５〜７のいずれかの抗腫瘍剤、医薬品、食品または苦味料を製造する方法。
【請求項１１】
（６）ガノデリックアシッドＬＭ２および／または（１４）ガノデリックアシッドT-Qを含むＨＤＡＣ活性促進剤。
【請求項１２】
（６）ガノデリックアシッドＬＭ２および／または（１４）ガノデリックアシッドT-Qを含む細胞分裂促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、該阻害剤を用いた食品(健康補助食品)または医薬品、苦味料および薬剤、並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
霊芝（Ganoderma lingzhi）は、キノコを形成する真菌であり、その子実体(キノコ)は昔から東アジアの国々、特に中国及び日本において健康増進および様々な病気の治療に用いられてきた。霊芝は抗腫瘍活性を有することが知られているが、霊芝や霊芝に含まれるガノデレニックアシッド等の成分について抗腫瘍剤の標的分子の１つとして知られるヒストン脱アセチル化酵素に対する阻害能の有無について検討された例はこれまで存在しない。
【０００３】
ヒストンは、クロマチンの主要なタンパク成分であり、ＤＮＡを巻き取るスプールとして働く細胞内分子である。細胞内では、ヒストンアセチル化酵素群（ＨＡＴｓ：Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ａｃｅｔｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）およびヒストン脱アセチル化酵素群（ＨＤＡＣｓ：Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ）により、ヒストン中のリジン残基のアセチル化および脱アセチル化が行われている。
【０００４】
ＨＡＴｓの作用によりヒストンのリジン残基のアセチル化が起こると、リジン残基の側鎖にある「ＮＨ3+」が「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3」に変換されるため、ヒストンの正電荷が部分的に中和されることとなる。
【０００５】
逆に、ＨＤＡＣｓの作用によりヒストンのリジン残基の脱アセチルが起こると、リジン残基の側鎖にある「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3」が「ＮＨ3+」に変換されるため、ヒストンが部分的により正に帯電することとなる。
【０００６】
このようにヒストンの正電荷量が調節されることにより、マイナスに帯電したＤＮＡとヒストンとの（電気的な）結合の程度が調節されている。
ある遺伝子のＤＮＡ塩基配列部分がヒストンに結合した状態では、遺伝子発現の前提となる転写因子が上記ＤＮＡ塩基配列部分に結合することができない為に、該遺伝子の発現が抑制されることとなる。その一方で、上記遺伝子のＤＮＡ塩基配列部分がヒストンに結合していない状態では、遺伝子発現の前提となる転写因子が上記塩基配列部分に結合することができるようになる為に、該遺伝子の発現が促進されることとなる。したがって、ヒストンの脱アセチル化とアセチル化により遺伝子の発現が制御されている。
【０００７】
正常細胞内では、ヒストンの所定のリジン残基のアセチル化および脱アセチル化が適正に制御される結果、各遺伝子の発現が適正に制御されるが、異常な細胞（腫瘍細胞等）では上記アセチル化および脱アセチル化の適正な制御がなされないため、遺伝子が異常な発現をするようになる。
【０００８】
腫瘍細胞では、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣｓ）の発現量が正常細胞より高くなるため、本来アセチル化されるべきヒストンの所定のリジン残基にあるアセチル基が脱離して「ＮＨ3+」が生成されてしまい、ヒストンに必要以上に正電荷が付与されてしまう。その結果、図８（Ａ）に示すように、本来発現すべき遺伝子のＤＮＡ塩基配列部分（市松模様部分）がヒストン（白抜の楕円）に巻き取られて、該遺伝子の発現が抑制されてしまう。本来発現すべき遺伝子が、細胞分裂の周期を調節する遺伝子ｐ２１，Ｐ２７である場合には、それら遺伝子が不活性された状態となるため、細胞周期の適正な調節が行われず、異常な細胞分裂が生じることとなる。したがって、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することができる化合物が見出されれば、細胞分裂促進剤、ひいては抗腫瘍剤の有効成分として意義がある。
【０００９】
また、上述したヒストン脱アセチル化酵素として、現在１８種類知られ、そのうち１１種類の主要なＨＤＡＣアイソフォーム（ＨＤＡＣ１〜ＨＤＡＣ１１）が存在する。このため、もし、ある化合物がヒストン脱アセチル化酵素の特定のアイソフォームに選択的に阻害能を示すことが見出されれば、その種類に応じて、より少ない毒性の抗腫瘍剤、アルツハイマー病治療薬などとして有益であるとともに、ＨＤＡＣアイソフォームを調べるためのツールとしても有益である。
【００１０】
また、ＨＤＡＣ活性を促進する化合物が見出されれば、上記ＨＤＡＣ活性促進剤、細胞分裂阻害剤として有用である。
現在、細菌（Streptomyces hygroscopicus）から単離されたトリコスタチンAを初めとしてヒストン脱アセチル化酵素阻害能を有する各種化合物が知られているが、該阻害能を有する化合物が新たに見出されれば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤や抗腫瘍剤の多様化に寄与する観点からも有益である。
【００１１】
特許文献１には、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）が開示されているが、特許文献１の化合物はガノデレニックアシッド等のステロイド骨格とは異なる骨格構造を有している。なお、この特許文献１には、霊芝由来の成分について何ら言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１５−５７４１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、（霊芝由来の）所定のトリテルペノイド類について、ヒストン脱アセチル化酵素阻害能の有無について鋭意研究した結果、上記トリテルペイド類の一部が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有し、細胞分裂調節剤や抗腫瘍剤の有効成分として有用であることを見出して本発明に至った。
【００１４】
したがって、本発明は、霊芝(Ganoderma lingzhi) 中に含まれるトリテルペノイド類を有効成分として含有し、ヒストン脱アセチル化酵素の活性を阻害または抑制することができる新規のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、これを含有した抗腫瘍剤、食品および薬剤、並びにそれらの製造方法の提供をすることを目的とする。
【００１５】
また、本発明は、霊芝(Ganoderma lingzhi) 中に含まれるトリテルペノイド類を有効成分として含有し、ヒストン脱アセチル化酵素の活性を促進することができる新規のヒストン脱アセチル化酵素促進剤（ＨＤＡＣ活性促進剤）の提供をすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、下記［１］〜［１２］に示されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、該阻害剤を用いた食品(健康補助食品)または医薬品、苦味料および薬剤、並びにそれらの製造方法を提供する。
［１］  霊芝（Ganoderma lingzhi）から有機系溶媒で抽出することにより得られる抽出成分を含むことを特徴とするヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
［２］  （１）ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、（２）ガノデリックアシッドＮ（Ganoderic acid N）、（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、（４）ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、（１１）ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）、（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、（１５）ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）、（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）、（２０）ガノデリオールF（Ganoderiol F）、（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、（２９）ガノデレニックアシッドＡ（Ganoderenic acid A）、（３０）ガノデレニックアシッドＣ（Ganoderenic acid C）、（３１）ガノデレニックアシッドＤ（Ganoderenic acid D）、（３２）ガノデレニックアシッドＦ（Ganoderenic acid F）、および（３３）ガノデレニックアシッドＨ（Ganoderenic acid H）からなる群から選択された１種または２種以上のトリテルペノイド類であることを特徴とするヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
［３］  前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の有効成分としての前記１種または２種以上のトリペノイド類が、霊芝（Ganoderma lingzhi）から有機系溶媒で抽出することにより得られるトリペノイド類である、［２］に記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
［４］  霊芝（Ganoderma lingzhi）から有機系溶媒で抽出された抽出物（エキス）を、有機系溶媒抽出物（エキス）換算量で、５μｇ／ｍＬ以上の量で含む［１］〜［３］のいずれかに記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
［５］  ［１］〜［３］のいずれかに記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含む抗腫瘍剤。
［６］  ［１］〜［３］のいずれかに記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含む細胞分裂阻害剤。
［７］  ［１］〜［３］のいずれかに記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、ハンチントン病、うつ病、またはアルツハイマー病の進行の抑制または軽減のための医薬品または食品。
［８］  ［１］〜［３］のいずれかに記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する苦味料。
［９］  霊芝（Ganoderma lingzhi）から、有機系溶媒を用いてヒストン脱アセチル化酵素阻害を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、［１］〜［４］のいずれかのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を製造する方法。
［１０］  霊芝（Ganoderma lingzhi）から、有機系溶媒を用いてヒストン脱アセチル化酵素阻害を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、［５］〜［７］のいずれかの抗腫瘍剤、医薬品、食品または苦味料を製造する方法。
［１１］  （６）ガノデリックアシッドＬＭ２および／または（１４）ガノデリックアシッドT-Qを含むＨＤＡＣ活性促進剤。
［１２］  （６）ガノデリックアシッドＬＭ２および／または（１４）ガノデリックアシッドT-Qを含む細胞分裂促進剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、霊芝（Ganoderma lingzhi）中に含まれるトリテルペノイド類を有効成分として含有し、ヒストン脱アセチル化酵素の活性を阻害または抑制することができる新規のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、該阻害剤を用いた食品(健康補助食品)または医薬品、苦味料および薬剤、並びにそれらの製造方法の提供をすることができる。また、ヒストン脱アセチル化酵素の活性を促進することができる新規のヒストン脱アセチル化酵素促進剤（ＨＤＡＣ活性促進剤）の提供をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド類（２０．０μＭ）を「HDAC Activity Assay Kit」(CycLex社製)を用いて評価した場合の相対蛍光強度（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。図1中、（Ａ）はガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、（Ｂ）はガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、（Ｃ）はガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、（Ｄ）はガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、（Ｅ）はガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、（Ｆ）はガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）のグラフを示す。なお、比較のため、クラスＩおよびＩＩのほ乳類由来のＨＤＡＣに対する、従来公知の強力なヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)を終濃度５μＭ(1.512μg/mL)で用いた例、および、阻害剤を添加しなかったコントロールの例（No inhibitor control)も併せて示す。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）は強力なＨＤＡＣ阻害剤であり、ＨＤＡＣが強く阻害されるので、ＨＤＡＣ活性を示す相対蛍光強度（ＲＦＵ）が殆ど増加していない。一方、阻害剤を含まないもの（no inhibitor）では、相対蛍光強度（ＲＦＵ）が経時的に増加し、ＨＤＡＣの本来の酵素活性が示されている。したがって、グラフ線の傾斜角度が小さいほど、より強いＨＤＡＣ活性を有することを示す。
【図２】図２は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（２０．０μＭ）を「HDAC Activity Assay Kit」(CycLex社製)を用いて評価した場合の上記相対蛍光強度（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。図２中、（Ａ）はガノデレニックアシッドＨ（Ganoderenic acid H）、（Ｂ）はガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、（Ｃ）はガノデレニックアシッドＤ（Ganoderenic acid D）、（Ｄ）はガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、（Ｅ）はガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、（Ｆ）はガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）のグラフを示す。なお、比較のため、トリコスタチンＡ(ＴＳＡ)５μＭ(1.512μg/mL)、コントロール(阻害剤無添加:No inhibitor control)を用いた場合も併せて示す。
【図３】図３は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（２０．０μＭ）を「HDAC Activity Assay Kit」(CycLex社製)を用いて評価した場合の上記相対蛍光強度（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。図３中、（Ａ）はガノデレニックアシッドＡ（Ganoderenic acid A）、（Ｂ）はガノデリックアシッドＳ（Ganoderenic acid S）、（Ｃ）はガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、（Ｄ）はガノデリックアシッドＣ６（Ganoderenic acid C6）、（Ｅ）はガノデロールＡ（Ganoderol A）、（Ｆ）はガノデレニックアシッドＦ（Ganoderenic acid F）のグラフを示す。なお、比較のため、トリコスタチンＡ(ＴＳＡ)５μＭ(1.512μg/mL)、コントロール(阻害剤無添加:No inhibitor control)を用いた場合も併せて示す。
【図４】図４は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（２０．０μＭ）を「HDAC Activity Assay Kit」(CycLex社製)を用いて評価した場合の上記相対蛍光強度（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。図４中、（Ａ）はガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、（Ｂ）はルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、（Ｃ）はガノデロールＢ（Ganoderol B）、（Ｄ）はガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、（Ｅ）はガノデリオールF（Ganoderiol F）、（Ｆ）はガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）のグラフを示す。なお、比較のため、トリコスタチンＡ(ＴＳＡ)５μＭ(1.512μg/mL)、コントロール(阻害剤無添加:No inhibitor control)を用いた場合も併せて示す。
【図５】図５は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（２０．０μＭ）を「HDAC Activity Assay Kit」(CycLex社製)を用いて評価した場合の上記相対蛍光強度（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。図５中、（Ａ）はルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、（Ｂ）はガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、（Ｃ）はガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）、（Ｄ）はガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、（Ｅ）はガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、（Ｆ）はガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）のグラフを示す。なお、比較のため、トリコスタチンＡ(ＴＳＡ)５μＭ(1.512μg/mL)、コントロール(阻害剤無添加:No inhibitor control)を用いた場合も併せて示す。
【図６】図６は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（２０．０μＭ）を「HDAC Activity Assay Kit」(CycLex社製)を用いて評価した場合の上記相対蛍光強度（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。図６中、（Ａ）はガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）、（Ｂ）はガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）のグラフを示す。なお、比較のため、トリコスタチンＡ(ＴＳＡ)５μＭ(1.512μg/mL)、コントロール(阻害剤無添加:No inhibitor control)を用いた場合も併せて示す。  図１〜図６によれば、コントロール(無添加)およびＴＳＡと、（霊芝由来の）各トリペノイド化合物との相対蛍光強度（ＲＦＵ）の経時変化の対比から、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られる各種のトリテルペノイド（図１〜図５のもの）は、ＴＳＡのヒストン脱アセチル化酵素の阻害能よりは低いが、上記コントロールに比べて十分なヒストン脱アセチル化酵素の阻害能を有することが分かる。一方で、図６のものは、ＴＳＡおよび上記コントロールの何れのヒストン脱アセチル化酵素の阻害能と比べても、経時的にＲＦＵ値が上昇しており、ヒストン脱アセチル化酵素の促進能を有することが分かる。
【図７】図７は、ＨＤＡＣ活性を測定するキット「HDAC Activity Assay Kit」(CycLex社製)によるＨＤＡＣ活性の測定原理を示した図である。図７中、（Ａ）ではヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）が反応基質のリジン残基（Ｌｙｓ）のアセチル基（Ａｃ）に結合し、次いで、（Ｂ）では該アセチル基（Ａｃ）を除去（脱アセチル化）する様子を示す。（Ｃ）では、次に、アセチル基（Ａｃ）が除かれた前記リジン残基（Ｌｙｓ）にリジルエンドペプチダーゼ（ＬＥＰＤａｓｅ）が作用して、（Ｄ）ではリジン残基後方のリジン残基と、(蛍光を発しない)７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）部分との間の結合を切断し、遊離して蛍光物質となる７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）が生成する様子を示す。図７中、「Ｘ」は任意のアミノ酸を示し、Ｌｙｓはリジン残基を示し、ＡＣはアセチル基を示し、ＨＤＡＣは脱ヒストンアセチル化酵素８を示し、「ＡＭＣ」は７−アミノ−４−メチルクマリンを示す。上記キット「HDAC Activity Assay Kit」は、上記（Ａ）〜（Ｄ）に示す反応をこの順で行うものである。ＨＤＡＣ活性の強さ（量）に応じて最終的に遊離するＡＭＣ量が変化する。なお、ＡＭＣは遊離状態でなければ蛍光を発しない。遊離したＡＭＣに３５０ｎｍの励起光（Ｆ３５０）を照射し、励起したＡＭＣから発する４４０ｎｍの蛍光（Ｆ４４０）の量を計測し、Ｆ４４０の量／Ｆ３５０の量（＝Ｆ４４０／Ｆ３５０）を相対蛍光強度（ＲＦＵ）として算出し、ＲＦＵとＨＤＡＣ活性とを対応づけした検量線に照らして、ＨＤＡＣ活性が決定される。ＨＤＡＣを１００％阻害しない限り、反応開始から経時的にＡＭＣ量が増加し、相対蛍光強度（ＲＦＵ）が経時的に増加する（図１〜図６参照）。
【図８】図８（Ａ）は、ＨＤＡＣ阻害剤が存在しない腫瘍細胞内の状態を説明した模式図である。必要以上にＨＤＡＣ活性が発現している為に、ヒストン（白抜の楕円）から突出したリジン残基（絨毛のような白抜の線）にあるアセチル基（Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ3）の多くが除去（脱アセチル化）されており、リジン残基の側鎖の末端にＮＨ3+基（不図示）が必要以上に増加してしまい、マイナス（−）に帯電したＤＮＡ（ｐ２１等の腫瘍抑制遺伝子（市松模様で網掛けした部分）を含むＤＮＡ（らせん状の白抜線））がヒストン（白抜の楕円）に必要以上に強固に巻き取られる。そのため、腫瘍抑制遺伝子に転写因子（不図示）が結合することができず、腫瘍抑制遺伝子が発現できない様子を示している。図８（Ｂ）は、ＨＤＡＣ阻害剤が存在する腫瘍細胞内の状態を説明した模式図である。腫瘍細胞内で必要以上に発現しているＨＤＡＣに対して、所定量のＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）が作用することにより、過剰なＨＤＡＣ活性が適正に調節されて、ヒストンのリジン残基の脱アセチル化の程度（リジン残基に存在するＮＨ3+基の量）が適正となる。その結果、ｐ２１等の腫瘍抑制遺伝子（市松模様で網掛けした矩形部分）がヒストンから遊離した正常な状態となり、この遊離した腫瘍抑制遺伝子に転写因子が結合することができ、腫瘍抑制遺伝子が適正に発現して腫瘍細胞の増加が抑制される様子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明に係るヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、該阻害剤を用いた食品（健康補助食品を含む。）または医薬品、苦味料および薬剤、並びにそれらの製造方法等について、図１〜図８を参照しながら説明する。
【００２０】
本発明に係るヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（以下、ＨＤＡＣ阻害剤という。）は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機系溶媒で抽出することにより得られる抽出成分を含むことを特徴とする。なお、該成分は、前記霊芝から有機系溶媒による抽出を経て調製された成分に限らず、人工的に合成した同一の成分であってもよい。
以下、ＨＤＡＣ阻害剤とその製法、このＨＤＡＣ阻害剤に含まれる霊芝トリペノイド化合物とその物性、効果、用途等について説明する。
【００２１】
《ＨＤＡＣ阻害剤》
（抽出）
抽出素材としての霊芝(Ganoderma lingzhi)は、採取した霊芝をそのまま原料として用いてもよいが、抽出効率等の点からは、好ましくは採取した天然物(霊芝)を乾燥、破砕等の加工処理に供して調製したものを挙げることができる。抽出素材を粉砕する場合、ロール式粉砕機、フードプロセッサー、ボールミル粉砕機、ハンマー式粉砕機等による粉砕が例示できる。
【００２２】
抽出用の有機系溶媒は、ヒストン脱アセチル化酵素（以下「ＨＤＡＣ」という。）の活性を阻害する作用を有する霊芝中のトリペノイド類等の成分を効率よく抽出する観点から、該溶媒として有機溶媒を１０％以上含有する溶媒が好ましく、有機溶媒を５０％以上含有する溶媒（有機系溶媒）がさらに好ましい。なお、有機系溶媒中に含まれる有機溶媒の量は、溶媒全量に対して、通常１０％以上、さらには３０〜７０％程度であることが望ましい。
【００２３】
該有機系溶媒の例としては、ハロゲン化アルキル（例：クロロホルム等）、アルコール類（例：メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等、Ｃ１〜Ｃ１０程度の1価の脂肪族アルコール、あるいはエチレングリコールやグリセリンなどの多価アルコール）、炭化水素（例：ｎ−ヘキサンなど、Ｃ１〜Ｃ１０程度の脂肪族炭化水素）、エーテル（例：ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル等の式「Ｒ1−Ｏ−Ｒ2(Ｒ1,Ｒ2はＣ１〜５程度のアルキル基）」で示される鎖状エーテル；フラン、ジベンゾフラン、テトラヒドロフラン等の脂肪族又は芳香族系の環状エーテル；エステル（例：酢酸エチル等、1価〜多価カルボン酸のＣ１〜Ｃ５程度のアルキルエステル）の有機溶媒；又は水とこれらの有機溶媒との混合物を挙げることができる。
【００２４】
特に、アルコール類としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールが好ましいが、抽出成分中に残存しても人体に悪影響が少ない観点からエタノールまたは含水エタノール（含水アルコール）が特に好ましい。含水エタノールとしては、例えば、エタノール濃度が５〜９９.５％の含水エタノールを用いることができる。
【００２５】
抽出処理は、特に制限されないが、例えば、山野より採取した天然物や人工栽培の霊芝を、必要に応じて乾燥または粉砕した後、上記抽出溶媒に浸漬し放置することにより所望の成分を抽出する浸漬法（冷浸法、温浸法）、及びソックスレー抽出器を用いた加熱還流によるソックスレー抽出法等の公知の抽出法を適用することができる。このように抽出された抽出液は、必要に応じて、溶媒を蒸発させて濃縮または乾固してもよく、固体又はその粉末の形態として調製することができる。
【００２６】
抽出温度は、用いられる抽出用溶媒が凍結・固化しない限り、特に制限はなく、有機系溶媒抽出などでは、例えば０℃〜１００℃である。また、抽出時間は、所望の成分（前記トリペノイド類）を抽出できれば特に制限はなく例えば１時間〜３日間である。抽出処理の圧力は特に制限はなく、例えば常圧〜４気圧である。
【００２７】
また、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相分取液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などの各種クロマトグラフィーに供して分画操作を繰り返し、所定の抽出成分（ＨＤＡＣ活性を負に制御するトリテルペノイド類）の含有量及び純度を高めてもよい。
【００２８】
（抽出成分）
霊芝(Ganoderma lingzhi)から、上記有機系溶媒で抽出することにより得られる成分(霊芝有機系溶媒抽出物)として下記トリペノイド類（１）〜（３３）が含まれる。なお、以下の説明では、化合物（１）〜（３３）をまとめて「化合物（１）等」という。
【００２９】
これらの化合物（１）等が抽出物に含まれていることは、例えばＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津製作所「ＬＣＭＳ−２０２０」）等を用いたＬＣＭＳ分析(液体クロマトグラフ質量分析)により確認することができる。
【００３０】
本発明者らは、これらのトリペノイド類の化合物（１）〜（５）、（８）〜（１３）、（１５）〜（３３）について、活性の高低はあるものの、ＨＤＡＣ阻害能を有することを見出している。したがって、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤には、トリペノイド類の化合物（１）〜（５）、（８）〜（１３）、（１５）〜（３３）からなる群から選択された１種または２種以上を含むものが挙げられる。これらの化合物（１）〜（５）、（８）〜（１３）、（１５）〜（３３）それ自体は、霊芝由来の化合物として市販(販売会社：Chemfaces社（武漢市、湖北省、中国）およびPhytochemicals社（LLC,ニュージャージー州、アメリカ合衆国）など)されているため、これを購入して用いてもよい。なお、ガノデリックアシッドＤＭ(Ganoderic acid DM；化合物（７））については、ＨＤＡＣ阻害能を有する可能性がある。
【００３１】
【化１】
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【００３２】
【化２】
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【００３３】
【化３】
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【００３４】
【化４】
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【００３５】
【化５】
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【００３６】
【化６】
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【００３７】
【化７】
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【００３８】
【化８】
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【００３９】
【化９】
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【００４０】
【化１０】
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【００４１】
【化１１】
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【００４２】
【化１２】
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【００４３】
【化１３】
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【００４４】
【化１４】
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【００４５】
【化１５】
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【００４６】
【化１６】
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【００４７】
【化１７】
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【００４８】
【化１８】
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【００４９】
【化１９】
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【００５０】
【化２０】
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【００５１】
【化２１】
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【００５２】
【化２２】
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【００５３】
【化２３】
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【００５４】
【化２４】
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【００５５】
【化２５】
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【００５６】
【化２６】
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【００５７】
【化２７】
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【００５８】
【化２８】
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【００５９】
【化２９】
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【００６０】
【化３０】
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【００６１】
【化３１】
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【００６２】
【化３２】
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【００６３】
【化３３】
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【００６４】
（塩、エステル）
本発明においては、抽出した上記化合物（１）〜（３３）をアルコールと反応させてエステル化したり、または塩基と反応させて塩を形成しても良い。これら化合物（１）等のエステルとして、メチルエステル等、炭素数１〜１１を有する直鎖または分岐状のアルキルエステルを挙げることができる。これら化合物（１）等の塩としては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩；アンモニウム塩等を挙げることができる。
【００６５】
（成分濃度）
当該ＨＤＡＣ阻害剤に含まれる有効成分（化合物（１）等（化合物（６），（１４）を除く。）のいずれか１種または２種以上の合計）の濃度は、ＨＤＡＣ活性を阻害する作用を発揮することを限度として特に制限されず、例えば、１０〜５００μｇ／ｍＬとなるように、ＨＤＡＣ阻害剤１００重量％中、剤型、用法、用量に合わせて０．１〜１００重量％の範囲から適宜設定することができる。
【００６６】
（ＨＤＡＣ阻害剤の評価）
従来、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）等の他に、ボリノスタット（ゾリンザ（登録商標））、ロミデプシン、Trapoxin A、HC Toxin、Tubacin等がＨＤＡＣ阻害剤として知られている。これらＨＤＡＣ阻害剤は、「−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−」の構造を共通して有しているため、当該構造がＨＤＡＣ阻害能に寄与していると考えられる。
【００６７】
上記従来のＨＤＡＣ阻害剤のうち、例えば、ボリノスタットは、クラスI（HDAC1、2及び3）及びクラスII（HDAC6）のHDACの触媒ポケットに直接結合し、その酵素活性を低濃度（IC50≦86nM）で阻害し、また、培養細胞においてヒストンアセチル化を誘導し、種々の培養がん細胞において細胞周期の停止、アポトーシス又は分化を誘導することが知られている。そのため、ＨＤＡＣ阻害剤には、同様の性能があると考えられる。
【００６８】
【化３４】
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【００６９】
【化３５】
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【００７０】
【化３６】
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【００７１】
【化３７】
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【００７２】
【化３８】
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【００７３】
【化３９】
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【００７４】
ここで、本発明に係る化合物（１）等は、従来のＨＤＡＣ阻害剤間に共通する構造（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−の構造）が存在しないため、上述した従来のＨＤＡＣ阻害剤と異なる阻害態様でＨＤＡＣを阻害している可能性がある。
【００７５】
また、上記とは別の従来公知のＨＤＡＣ阻害剤として、分岐鎖とカルボン酸の構造のみを有するバルプロ酸が知られている（下記化学式参照）。しかし、化合物（１）〜（３３）のうち、化合物（８）（ガノデリックアシッドＡ）と化合物（１４）（ガノデリックアシッドＴ−Ｑ）とはいずれも分岐鎖のカルボン酸の構造をその一部に有しているが、（８）ガノデリックアシッドＡはＨＤＡＣを顕著に阻害する一方で、（１４）ガノデリックアシッドＴ−ＱはＨＤＡＣ活性を逆に顕著に促進する（図１（Ａ）および図６（Ｂ）を対比して参照）。したがって、トリテルペノイド類について、分岐鎖とカルボン酸の構造を有するからといって、必ずしもＨＤＡＣ阻害能を有するとは限らない。
【００７６】
【化４０】
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【００７７】
また、化合物（１）〜（５）、（８）〜（１３）、（１５）〜（３３）はＨＤＡＣ阻害能を有するが、化合物（７）や（１４）は逆にＨＤＡＣ促進活性を有することから、化合物（１）〜（３３）は、細胞分裂調節剤（細胞分裂阻害剤，細胞分裂促進剤）や、ＨＤＡＣ阻害機構を解明するための研究試薬としても非常に有用である。
【００７８】
また、従来公知のＨＤＡＣ阻害剤については、一般的に、免疫抑制作用ならびに主たる副作用として認められる血小板減少作用が知られている。詳細には、血小板産生に関わる転写因子ＧＡＴＡ−１の転写が阻害されることで血小板減少の副作用が生じることが分かっているが、霊芝について、これまでの服用経験から副作用が知られてもいないし報告もないことから、霊芝由来のトリテルペノイド類（化合物）についても副作用は生じにくいと考えられる。
【００７９】
さらに、霊芝（Ganoderma lingzhi）由来のトリテルペノイド類の化合物（１）等は、上記公知のＨＤＡＣ阻害剤(例：ＴＳＡ)のもつＨＤＡＣ阻害能よりは弱いものの(図１〜５参照)、上述したＴＳＡ等の薬剤に比べて入手しやすく安価なＨＤＡＣ阻害剤である。また、安全性については、古来よりこれら成分を含む霊芝の熱湯抽出物は漢方薬として用いられ、ＦＤＡ等でも認可されており、安全性の点でも有利であるなどという利点もある。
【００８０】
（阻害率）
以下、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤の阻害率について説明する。
（阻害率の測定方法）
本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤のＨＤＡＣ阻害率は、従来公知の方法、例えば、Deacetylase Assay Kitsのサイト（http://ruo.mbl.co.jp/product/discovery/deacetylase.html）等に記載の方法により測定することができる。
【００８１】
一般にＨＤＡＣの阻害率はＨＤＡＣ活性を測定する方法を利用して調べることができる。具体的には、ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）が全く存在しない条件下と所定量存在する条件下でそれぞれＨＤＡＣ活性を測定した後、ＨＤＡＣ阻害剤の添加により低下したＨＤＡＣ活性の量を本来のＨＤＡＣ活性の量に対する割合として表すことで、該割合を阻害率（％）として得ることができる。
【００８２】
ＨＤＡＣ活性の測定方法自体は、例えば、「CycLex HDAC8 Deacetylase Fluoremetric Assay Kit」(Cat# CY-1158, CycLex社製）を使用することができる。このキットを使用する場合の測定原理を図７に示す。
【００８３】
図７（Ａ）〜（Ｂ）に示すように、（Ａ）ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）が反応基質のリジン残基（Ｌｙｓ）のアセチル基（Ａｃ）に結合し、（Ｂ）該アセチル基（Ａｃ）を除去（脱アセチル化）する。（Ｃ）次に、アセチル基（Ａｃ）が除かれた前記リジン残基（Ｌｙｓ）にリジルエンドペプチダーゼ（ＬＥＰＤａｓｅ）が作用して、（Ｄ）リジン残基後方のリジン残基とＡＭＣとの間の結合を切断し、蛍光物質である７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）が遊離する。
【００８４】
遊離のＡＭＣは３４０ｎｍの励起光（Ｆ３４０）を受けて励起され、極大蛍光として波長４４０ｎｍの蛍光（Ｆ４４０）を発する。反応開始時点（０分）から反応液に対してＦ３４０を照射しつつ、分光蛍光光度計を用いて反応液から得られるＦ４４０の蛍光量を経時的に測定（例えば０分〜６０分まで１分ごとにＦ４４０の量を測定）し、Ｆ４４０の量をＦ３４０の量に対する相対値（ＲＦＵ）として表し、さらに、予め別途ＲＦＵとＨＤＡＣ活性量とを対応づけした検量線のグラフから、測定したＨＤＡＣの活性を決定することができる。
【００８５】
［測定手順の具体例］
より詳細には、所定の緩衝液（２０ｍＭTris-HCl,pH8.0,125mM NaCl, 1%グリセロール）５μＬに対して、５０倍基質（１Ｍの基質（ｘ−ｘ−Ｌｙｓ−ＡＭＣ）溶液）１μＬ、リジルエンドペプチダーゼ（５ｍＡＵ／ｍＬ）２．５μＬ、純水２６．５μＬを混合して、ＨＤＡＣ反応液３５μＬを調製後、最終濃度の１０倍の阻害剤溶液（化合物（１）等の溶液またはコントロールの阻害剤の溶液）５μＬ添加し、５倍のＨＤＡＣ（例；ＨＤＡＣ８等）の酵素溶液１０μＬ添加し、最終反応系を５０μＬとして、室温（例；２５℃）で６０分間、静置（インキュベート）しつつ、上記相対蛍光強度（ＲＦＵ）（Ｆ４４０/Ｆ３４０×１０-3）を計測する。
【００８６】
阻害剤の有／無の各反応系で測定したＨＤＡＣ活性の値から、測定に使用した阻害剤についてＨＤＡＣ阻害率を算出することができる。
上記算出は、反応後（例；６０分後）のサンプル(ＨＤＡＣ阻害剤)で処理したウェル（As）の吸光度と、反応後（例；６０分後）のＨＤＡＣ阻害剤を全く含まない反応液（ネガティブコントロール）の吸光度（Ac）と、反応後（例；６０分後）のＨＤＡＣを含まないブランクのウェル（Ab）の吸光度とを比較することにより、阻害率を下記に示した式（I）で算出することができる。
阻害率（％）＝［（Ac−As）／（Ac−Ab）］×１００・・・（I）
【００８７】
（ＩＣ50）
ＨＤＡＣ阻害能は、ＨＤＡＣの阻害剤が全く存在しない場合に最終産物として生成される発色体（上記例ではＡＭＣ）の量を１００％とした場合に、該発色体の量を５０％とするのに必要なＨＤＡＣ阻害剤の量(すなわち、ＩＣ50)として評価することができる。
【００８８】
例えば、上述したＨＤＡＣ阻害能の測定において、同一のＨＤＡＣ阻害剤について終濃度の異なるサンプル（ＨＤＡＣ阻害剤）を複数用意（例；１０００μｇ／ｍＬ、７５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬのＨＤＡＣ阻害剤（トリテルペノイド等）を用意）してそれぞれＨＤＡＣ阻害率を測定し、これらのサンプル（ＨＤＡＣ阻害剤）の濃度とＨＤＡＣ阻害率との関係から近似曲線を得ることでＨＤＡＣの活性を５０％阻害する濃度(ＩＣ50)を算出することができる。
【００８９】
ＨＤＡＣの阻害率の観点から、ＨＤＡＣ阻害剤として特に好ましいものは、順に、（８）ガノデリックアシッドＡ、（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、（２６）ガノデリックアシッドＨ、（２）ガノデリックアシッドＮ、（２４）ガノデリックアシッドＣ２、（３３）ガノデレニックアシッドＨ、（２７）ガノデリックアシッドＫ、（４）ガノデリックアシッドＦである。これら化合物のうち、化合物（２），（８）、（４）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）が少なくとも環構造（シクロペンタヒドロフェナントレン骨格）の点で共通し、しかもＣ８−９間に炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）を有し、下記式（ａ）に当てはまることから、下記化学式（ａ）の環構造部位の基本骨格を有する（霊芝由来の）トリテルペノイド類を有効成分として含むＨＤＡＣ阻害剤が好ましい。
【００９０】
【化４１】
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【００９１】
一方、（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）については、上記化学式（ａ）とは異なり炭素８−９位置に二重結合を有さず、また、ステロイド骨格（シクロペンタヒドロフェナントレン骨格）を除いた部分の構造(例：Ｃ−１７位の分岐構造)が異なり化学式（ｂ）に属するグループである。
【００９２】
化合物（１７）は、上記式（ａ）の群の化合物とは異なると考えられる。したがって、化合物（１７）がＨＤＡＣに作用（ドッキング）する際に、化合物（１７）の各部と、ＨＤＡＣとの各部との結合（水素結合等）の態様が上記化学式（ａ）の群とは異なると考えられる。
【００９３】
【化４２】
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【００９４】
（ＨＤＡＣ阻害剤の細胞送達）
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）は、細胞核の内側に多く存在しており、がん抑制遺伝子（ｐ２１，２７等）のアセチル化に関与している酵素である。したがって、所望の細胞（例；腫瘍細胞）の核内のＨＤＡＣの存在する箇所まで特異的にＨＤＡＣ阻害剤を送達することができれば、より効率的にＨＤＡＣ阻害を引き起こすことができる。例えば、後述するように、腫瘍細胞の表面に特異的に発現する糖鎖抗原、核内移行シグナル（nuclear localization signal: NLS）を有するペプチド等を利用して本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤を腫瘍細胞等の所望の細胞の細胞核内に送達してもよい。なお、核内移行シグナル（nuclear localization signal: NLS）とは、細胞内で合成され核に移送されるべきタンパク質の１次構造中に存在する、塩基性アミノ酸のリジンとアルギニン残基が数個集まった領域を意味し、該タンパク質が核内へ輸送されるために必要なものである。
【００９５】
具体的には、腫瘍細胞の上記細胞表面に特異的に発現している糖鎖抗原（下記表１参照）を特異的に認識して該糖鎖抗原に結合する抗体（Ａ）と、該抗体（Ａ）に連結されたペプチドリンカーと、該ペプチドリンカーに接続されたＮＬＳ配列を含むペプチドと、該ＮＬＳ配列を含むペプチドに連結され上記化合物（１）等に特異的に結合する抗体（Ｂ）と、該抗体（Ｂ）に特異的に結合した上記化合物（１）〜（５）、（８）〜（１３）、（１５）〜（３３）の少なくともいずれか１種（好ましくは化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）の少なくともいずれか１種）と、を有する複合体（以下「薬物複合体」という）を形成し、これを本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤を含むＤＤＳ製剤（ドラッグデリバリーシステムを利用して特定の細胞にのみ所定の薬剤を送達するように構成した薬剤）として用いる例が考えられる。
【００９６】
【表１】
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ここで、上記核内にＮＬＳ（核内移行シグナル）を多コピー化して核内への移行をしやすくしてもよい。また、上記例において抗体（Ｂ）を介在させなくともよい。また、ＮＬＳの代わりに細胞核に取り込まれやすいＮＬＳを含むペプチド以外の物質を用いてもよい。
【００９７】
また、前述したペプチドリンカーは、細胞内のプロテアーゼによる切断可能な特定のアミノ酸配列部位（例；バリン−シトルリン）を含むリンカーであり、例えば特開2012-144576号に例示されているものを参考にすることができる。
【００９８】
上述した薬物複合体は、血中では安定であるので細胞内に取り込まれた後、該細胞由来のタンパク質分解酵素によりペプチドリンカーの上記特定のアミノ酸配列部位が切断されてＮＬＳ配列−各化合物（上記化合部（１）等）あるいはＮＬＳ配列−抗体−各化合物（上記化合部（１）等）の複合体が細胞内に放出される。その後、ＮＬＳ配列により上記複合体が細胞核の内側に送達され、化合物（１）等が目的の腫瘍細胞の核内においてＨＤＡＣの活性を阻害することとなる。
【００９９】
なお、糖鎖抗原を組織特異抗原に変更して標的細胞を腫瘍細胞ではない正常細胞としてもよい。また、化合物（６）ノデリックアシッドＬＭ２及び／又は化合物（１４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑを上記と同様に用いた場合には、ＨＤＡＣを促進し、細胞分裂を阻害するＤＤＳ製剤となる。
【０１００】
《ＨＤＡＣ阻害剤の用途》
本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤は、食品（サプリメント、食品添加物等）、化粧料（ミスト等）、医薬品、研究試薬等として用いることができる。これらは、上記の有機溶媒系抽出物、好ましくはトリペノイド化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）のいずれか１種または２種以上を含有しているものである。
【０１０１】
〔食品〕
本発明に係る食品は、霊芝の溶媒（例:クロロホルム,エタノール）抽出物に高濃度で含まれるＨＤＡＣ阻害剤としての上記有機溶媒系抽出物、好ましくは有効成分の化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）のいずれか１種または２種以上を含有するものである。
【０１０２】
本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤の有効成分である化合物（１）等（化合物（６）および（１４）を除く）を所定量含む食品によれば、ヒストン脱アセチル化阻害を引き起こして、上述したように、腫瘍抑制遺伝子（ｐ２１等）の発現が強まる。また、細胞周期停止および細胞増殖抑制の傾向が強まるので、がんを患っている人に特に有用であり、また、健常人でもがん予防や細胞の老化防止効果を期待することができる。
【０１０３】
（食品中のトリテルペノイド濃度）
公知のＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（分子量：302.37ｇ／ｍol）のＩＣ50値は約２０ｎＭ（約６．０４μｇ／Ｌ）である。後記の表３に示すように、ＴＳＡ（５μＭ）の４倍量の２０μＭであれば、化合物（１）等（化合物（６），（１４）を除く）は、ＴＳＡと同等またはそれよりやや劣る程度のＨＤＡＣ阻害能を発揮する。
【０１０４】
したがって、化合物（１）等（化合物（６）および（１４）を除く）のＨＤＡＣ阻害におけるＩＣ50は１００ｎＭ〜２００ｎＭ程度と考えられる。
財団法人食品薬品安全センターの報告「p-トルエンスルホンアミド（ＴＳＡ）のラットを用いる反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/home/pdf/PDF88-19-7d.pdf）によれば、ＴＳＡについてラット成体に対し５００ｍｇ／ｋｇ体重／日、ラット出生児に対し１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の経口投与した場合に毒性に関する問題は生じないとされている。
【０１０５】
また、この報告とは別に、マウスに対するＴＳＡの投与量として0.5〜2.0mg/kgとしてＨＤＡＣ阻害効果が得られることが知られている（「ヒストン脱アセチル化阻害による関節リウマチの炎症および骨・軟骨破壊の抑制法の開発」，https://kaken.nii.ac.jp/d/p/17659470.en.html）。
【０１０６】
そのため、本発明に係る食品（１日分）に含まれる上記化合物（１）等（化合物（６），（１４）を除く）の量としては、上記ＴＳＡ投与量の４倍程度（２ｍｇ／ｋｇ体重）以上〜上記毒性基準の濃度（１００ｍｇ／ｋｇ体重）以下の範囲で適宜濃度を設定することが好ましい。
【０１０７】
本発明に係る食品の剤型として、霊芝から上記有機系溶媒で抽出した抽出物、より好ましくは化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のうちのいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）の少なくともいずれか１種または２種以上をそのまま食品として調製したものを挙げることができ、また、前記食品の形態として、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態を挙げることができる。具体的には、上記化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のいずれか１種または２種以上を含む、ゼリー（スティック状）やドリンク剤とする例が挙げられる。
【０１０８】
本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤を食品中に配合してヒトやその他動物が経口摂取（経口投与）する場合には、食品中にＨＤＡＣ阻害剤と共に適宜添加可能な成分として、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などを挙げることができる。その場合、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤を食品およびこれら任意成分と混合し、用途に応じて、その剤型を粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、ＨＤＡＣ阻害剤を食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することができる。
【０１０９】
本発明に係る食品では、上記有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のうちのいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）の少なくともいずれか１種または２種以上の合計が、血中濃度で０．１〜１００μＭとなるように製造し、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤入り食品を摂取することが好ましい。例えば、成人（体重６０ｋｇ）に対して、化合物（１）等のいずれか１種以上または２種以上の上記抽出物を１ｍｇ〜１０００ｍg／日の態様で摂取する例が挙げられる。例えば、上記ドリンク剤の場合、上記有機溶媒系抽出物を１００〜３００ｍｇ／３０ｃｃで含有するドリンク剤が挙げられる。
【０１１０】
（サプリメント）
本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤はサプリメントに用いることができる。サプリメントとする場合は、例えば、化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）の少なくともいずれか１種または２種以上を原料とするか、または霊芝から上記有機系溶媒で抽出した抽出物を原料とし、公知の賦形剤を用いて常法により顆粒状・粉末状・ゲル状・カプセル状・ペースト状または錠剤にしたものをサプリメントとして用いることができる。このうち、ペースト状にする場合、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤をサイクロデキストリンに内包させても良い。また、上記原料には、他のトリテルペノイドを任意に含有してもよい。
【０１１１】
サプリメント中の有機系溶媒抽出物の含有量、霊芝由来のトリペノイドである化合物（１）等（化合物（６）および（１４）を除く）のいずれか１種または２種以上、あるいは、化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）の少なくともいずれか１種または２種以上の合計の含有量は特に制限はないが、霊芝１００ｇ中には２００ｍｇ程度ガノデレニックアシッドが含まれ、通常１回の摂取で霊芝２５〜３０ｇを用いることから、一般的には１回の摂取でガノデレニックアシッドを５０ｍｇ〜６０ｍｇを体内に取り込んでいると考えられる。そのため、この１回の摂取量を基準にしてサプリメント中の化合物（１）等（化合物（６）および（１４）を除く）の何れか１種以上の合計量を調節してもよい。
本発明に係る上記サプリメントによれば、上記効能（がん予防や細胞の老化防止効果）を期待することができる。
【０１１２】
〔医薬品〕
本発明に係る医薬品は、上記化合物（１）等（化合物（６）および（１４）を除く）を有効成分として、つまり上記ＨＤＡＣ阻害剤を有効成分として含むものである。医薬品（１日分）に含まれる上記化合物（１）等（化合物（６）および（１４）を除く）の量としては、上述した食品について説明したように、上記ＴＳＡ投与量の４倍程度（２ｍｇ／ｋｇ体重）以上〜上記毒性基準の濃度（５００ｍｇ／ｋｇ体重）以下の範囲となるように、適宜濃度を設定することが好ましい。
【０１１３】
上述したように、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤を含む医薬品は、腫瘍抑制遺伝子の発現を促す観点で抗腫瘍剤として有用であることが明らかである。
神経変性疾患であるハンチントン病の発症には、ハンチンチン（Huntingtin）と呼ばれるタンパク質の異常が関わることが知られているが、その詳細は不明である。ＨＤＡＣ４について化合物（１）等（化合物（６）および（１４）を除く）がＨＤＡＣの阻害剤として作用すれば、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤を含む医薬品が、ハンチントン病を改善できる可能性があると考えられる（PLoS Biol. 2013 Nov; 11(11): e1001718.参照）。
【０１１４】
森信繁らは、ＨＤＡＣ阻害剤であるブチル酸ナトリウムに抗うつ効果があると報告しており（精神経誌（2010）112巻 10号）、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤を含む医薬品は抗うつ剤として有用であると考えられる。
また、本発明に係るＨＤＡＣ阻害剤を含む医薬品が、アルツハイマー病にも効く可能性がある（Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53:311-30. 2013年）。
【０１１５】
（食品添加物）
有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）は、強い苦味を呈することから、食品添加物（苦味料）として苦味が許容される清涼飲料水、酒精飲料等に用いることができる。有機系溶媒抽出物、化合物（１）等は、基本的にセスキテルペン等の公知の苦味料と同様に取り扱うことが可能である。逆に、これらの苦味を抑えて用いることも可能であり、その場合は、苦味マスキング剤（花王「ベネコート  ＢＭＩ−４０」等）により苦味をマスキングすることができる。
【０１１６】
有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のいずれか１種または２種以上、あるいは、化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）の少なくともいずれか１種または２種以上を上記食品添加物として用いる場合、食品添加物として安全性の点で許可されている、一価アルコール(エタノールなど)、多価アルコール（例：エチレングリコール、グリセリンなど）、動植物油(例：グリセリンのモノ、ジ、トリ-脂肪酸エステルに代表される多価アルコールの脂肪酸エステル等)などの公知の溶媒、公知の界面活性剤または公知の乳化剤｛例：シュガーエステル、ソルビタン脂肪酸エステル（ソルビタンエステル),プロピレングリコール脂肪酸エステル(PGエステル)、レシチン）｝などを用いて水溶性または油溶性にして用いてもよく、水・天然ガム質および多糖類などの高分子物質とともに常用の溶剤または乳化剤を用いて乳化して用いてもよい。この処理により水溶性または油溶性とした有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のいずれか１種または２種以上、あるいは、化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）の少なくともいずれか１種または２種以上等を油性食品（マヨネーズ等）、水性食品（清涼飲料等）に含めても良い。食品添加物中の有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）（化合物（６）および（１４）を除く）のいずれか１種または２種以上、あるいは、化合物（２）、（８）、（４）、（１７）、（２４）、（２６）、（２７）および（３３）の少なくともいずれか１種または２種以上の合計の含有量は特に制限はないが、上述したサプリメントの濃度と同じ範囲に設定することができる。
【０１１７】
〔研究試薬〕
化合物（１）〜（３３）の化学構造は、ＴＳＡをはじめとする従来のＨＤＡＣ阻害剤間で共通する上記構造（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−の構造）を有しておらず、従来のＴＳＡ等のＨＤＡＣ阻害剤とはＨＤＡＣ阻害能や阻害の仕方が相違する可能性がある。
【０１１８】
また、化合物（６）および（１４）については逆にＨＤＡＣ活性を高めるもの（ＨＤＡＣ活性促進剤）である。上述したように化合物（６）および（１４）もＴＳＡ等に共通する上記構造（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−の構造）を有しておらず、ＴＳＡ等とは異なるＨＤＡＣの部分に作用している可能性がある。しかしながら、その詳細は現在不明である。したがって、ＨＤＡＣ活性を調節可能な各化合物（１）〜（３３）、特にＨＤＡＣ阻害能の高い化合物（２）等を、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の活性阻害・促進の機構を解明するための研究試薬として用いることができる。また、これら化合物（１）〜（３３）のＨＤＡＣに対する結合態様の解析に基づいて、さらに高活性のＨＤＡＣ活性阻害剤またはＨＤＡＣ活性促進剤を開発することも可能であり、このための研究試薬としても用いることができる。
【０１１９】
研究試薬としての使用例としては、例えば、各化合物（１）〜（３３）を個別にヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に結合させ、該結合の状態で結晶化を行い、該結晶を用いてＸ線結晶構造解析を行うことによりＨＤＡＣのコンフォメーションの変化を解析する例が挙げられる。さらに、演算機上（In silico）で、前記基質の疑似物および化合物（１）等をＨＤＡＣに結合させるドッキングシミュレーションを行って各種解析（ドッキングスコアの結果からＨＤＡＣの活性中心に作用してその活性を阻害しているか否かの解析、ひいては阻害態様の解析等）を行う例が挙げられる。また、ＨＤＡＣのコンフォメーションの変化を演算し、実際に行った実験結果と比較する例を挙げることができる。
【実施例】
【０１２０】
［試験例１］（霊芝由来のトリテルペノイドのＨＤＡＣ活性に与える影響の評価）
以下、霊芝由来の各トリテルペノイドについてＨＤＡＣ活性の阻害能を評価した。
３３種類の霊芝(Ganoderma lingzhi)由来のトリテルぺノイド（１）〜（３３）のＨＤＡＣ活性に与える影響について着目し、ＨＤＡＣ阻害活性物質の網羅的探索に関する知見の集積を行った。なお、実験には上述した３３種類の霊芝由来のトリテルペノイド（化合物（１）〜（３３））を使用し、ポジティブコントロールとしてトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を用いた。
【０１２１】
（実験方法）
各霊芝由来のトリテルペノイドについて、「CycLex HDAC8 Deacetylase Fluoremetric Assay Kit」(Cat# CY-1158, CycLex社製）を用いて、各化合物（１）〜（３３）についてＨＤＡＣ８活性に与える影響を以下のように評価した。なお、キットには、所定濃度の緩衝液、蛍光基質ペプチド、リジルエンドペプチダーゼ、およびＨＤＡＣ８酵素溶液等が同梱されている。
【０１２２】
（化合物（１）〜（３３）の用意）
霊芝(Ganoderuma lingzhi)由来の３３種類のトリテルペノイド（純度＞９８％）については、Chemfaces社（武漢市、湖北省、中国）およびQuality Phytochemicals社（LLC、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）から購入した。これらのトリテルペノイド類（１）〜（３３）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２５ｍＭ〜２．５ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解した。
【０１２３】
（阻害剤存在下でのＨＤＡＣ活性測定）
最初に、１０×緩衝液（200ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ８．０，1.25M NaCl, 10%グリセロール）５μＬに対して、５０×蛍光基質ペプチド（１ｍＭの基質（ｘ−ｘ−Ｌｙｓ−ＡＭＣ）溶液）１μＬ、リジルエンドペプチダーゼ（５ｍＡＵ／ｍＬ）２．５μＬ、および純水２６．５μＬを混合して、ＨＤＡＣ反応液３５μＬを調製した。なお、「ｘ」は公知のアミノ酸のいずれかを意味する。
【０１２４】
次に、最終濃度（２０μＭ）の１０倍である２００μＭの阻害剤溶液（化合物（８）：ガノデリックアシッドＡ(Ganoderic acid A)の水分散液）を５μＬ添加し、５倍濃度のＨＤＡＣ８酵素溶液を１０μＬ添加し、最終反応系を全体で５０μＬとして、２５℃で６０分間インキュベートしつつ、分光光度計にて反応系からの４４０ｎｍの蛍光（Ｆ４４０）を測定し、３５０ｎｍの励起光の蛍光（Ｆ３５０）との比率である上記相対蛍光強度（ＲＦＵ）（Ｆ４４０/Ｆ３５０×１０-3）を経時的に算出した。蛍光強度の測定等は測定開始後０分から６０分までの間毎分行われ、計６１回測定等された。
【０１２５】
（阻害率の算出）
阻害率の算出は、反応後（例；６０分後）のサンプル(ＨＤＡＣ阻害剤)で処理した（As）の吸光度と、反応後（例；６０分後）のＨＤＡＣ阻害剤を全く含まない反応液（ネガティブコントロール）の吸光度（Ac）と、反応後（例；６０分後）のＨＤＡＣを含まないブランク（Ab）の吸光度とを比較することにより、阻害率を下記に示した式（I）で算出することができる。
阻害率（％）＝［（Ac−As）／（Ac−Ab）］×１００・・・（I）
２００μＭの上記化合物（１）の分散液５μＬに代えて、５０μＭのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）５μＬを使用して同様に測定等を行った（ポジティブコントロール）。さらに、２００μＭの上記化合物（１）の分散液５μＬに代えて、１０×緩衝液を５μＬ使用して同様に測定等を行った（ネガティブコントロール）。この結果を図１（Ａ）に示す。
【０１２６】
［試験例２〜３２］
試験例１において、上記化合物（１）に代えて、以下の表の化合物を使用した（終濃度２０μＭで使用した）こと以外は試験例１と同様に測定等を行った。この結果を図１（Ｂ）〜図６（Ｂ）に示す。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
（結果と考察）
各化合物について、３３種類の霊芝トリテルペノイド（化合物（１）〜（３３））（（６）ガノデリックアシッドＬＭ２および（１４）ガノデリックアシッドT-Qを除く。）にてネガティブコントロールよりも低い蛍光強度、つまりネガティブコントロールより高いＨＤＡＣ阻害活性が見られた。上記化合物のうち、特に阻害率が高いＨＤＡＣ阻害能が強い化合物（上記表３参照）は（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、
（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、（２）ガノデリックアシッドＮ（Ganoderic acid N）、（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、（３３）ガノデレニックアシッドＨ（Ganoderenic acid H）であった。
【０１３０】
これらの化合物は反応開始初期においてＴＳＡより低いＲＦＵ値（強いＨＤＡＣ阻害能）を示しておりＴＳＡより即効性があると考えられる。また、ＴＳＡと併用してＨＤＡＣを阻害できる可能性があり、ＴＳＡとは異なる機構でＨＤＡＣを阻害している可能性がある。
【０１３１】
以上のように、化合物（１）〜（３３）（（６）ガノデリックアシッドＬＭ２および（１４）ガノデリックアシッドT-Qを除く。）はＨＤＡＣ阻害能を有し、ＨＤＡＣ阻害剤，細胞分裂調節剤の有効成分として有用であることを十分に確認することができた。
【０１３２】
一方、（６）ガノデリックアシッドＬＭ２および（１４）ガノデリックアシッドT-Qについては、ネガティブコントロールより高いＲＦＵ値を示し（図６（Ａ）および（Ｂ）参照）、逆にＨＤＡＣ活性を促進する結果となった。このため、（６）ガノデリックアシッドＬＭ２および／または（１４）ガノデリックアシッドT-QがＨＤＡＣ活性促進剤，細胞分裂調節剤の有効成分として有用であることが分かった。
【０１３３】
［試験例２］（有機溶媒抽出物によるＨＤＡＣ阻害能の確認）
（各抽出物の調製）
・クロロホルム抽出物(Chloroform-Ex.)
クロロホルム抽出物の調製は、霊芝（Ganoderma lingzhi）のパウダー３２０ｇをクロロホルム（純度＞９９．９％、和光純薬）９．６Ｌに浸漬して３日間振盪し、振盪後のクロロホルムの溶液から溶媒のクロロホルム（沸点６１℃）を脱気とボイル（溶液温度＞６１℃）により除去することで、クロロホルム抽出物(Chloroform-Ex.)３．５８５ｇを調製した（収率１．１２％）。これをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に各濃度（１６０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ）で溶解した。
【０１３４】
・99.５％エタノール抽出物（Ethanol-Ex.）
99.５％エタノール抽出物（Ethanol-Ex.）の調製は、霊芝（Ganoderma lingzhi）５．０４７ｇを９９．５％エタノール（純度：９９．５％）１００ｍＬに浸漬して４８時間振盪抽出し、浸漬した液を吸引濾過し濾液を得た。この濾液から、溶媒であるエタノール（沸点７８．３７℃）を脱気とボイル（＞７９℃）により除去することで、エタノール抽出物(Ethanol-Ex.)を調製した。これをＤＭＳＯに各濃度（１６０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ）で溶解した。
【０１３５】
・３０％エタノール抽出物（30%Ethanol-Ex.）
３０％エタノール抽出物（30%Ethanol-Ex.）の調製は、上記９９．５％エタノールから蒸留水を用いて３０％エタノールを調製し、霊芝（Ganoderma lingzhi）５．０３５ｇを前記３０．０％エタノール１００ｍＬに浸漬して４８時間振盪し、振盪後のエタノール溶液から溶媒の水およびエタノール（各沸点：１００℃、７８．３７℃）を脱気とボイル（＞１００℃）により除去することで、エタノール抽出物(Ethanol-Ex.)を調製した。これをＤＭＳＯに各濃度（１６０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ）で溶解した。
【０１３６】
（結果・考察）
上述したクロロホルム抽出物(Chloroform-Ex.)、99.５％エタノール抽出物（Ethanol-Ex.）、および３０％エタノール抽出物（30%Ethanol-Ex.）について試験例１と同様にして測定等を行ったところ、ＨＤＡＣ阻害能があることが確認された（不図示）。
【０１３７】
上述した化合物（１）〜（３３）は、本発明の目的、効果との関係では、ＨＤＡＣ活性を阻害する機構を解明するための研究試薬としても有用といえる。
以上、本発明について、実施形態および実施例を踏まえて説明してきたが、本発明は上記実施例等に限定されず、本願の特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない限り設計変更は許容される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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