(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現増強法、該方法において用いるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増強するためのＲＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、さらにＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現が増強された細胞および該細胞を含む細胞製剤の提供。【解決手段】ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを用いて、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増強する方法、該方法において用いるＲＮＡ発現ベクター、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現が増強された細胞および該細胞を含む細胞製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せである、ＲＮＡの組合せ。
【請求項２】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも４つを標的とする、ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せである、請求項１に記載のＲＮＡの組合せ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＲＮＡの組合せであって、
［１］以下（１）〜（４）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ、
［２］以下（５）〜（８）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ、または
［３］以下（１）〜（８）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ：
（１）配列番号１で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（２）配列番号２で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（３）配列番号３で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（４）配列番号４で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（５）配列番号５で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（６）配列番号６で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（７）配列番号７で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、および
（８）配列番号８で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
【請求項４】
［１］に記載のＲＮＡの組合せである、請求項３に記載のＲＮＡの組合せ。
【請求項５】
（１）〜（４）に記載のすべてのｇＲＮＡを含むか、または（１）〜（４）に記載のすべてのｃｒＲＮＡを含む、請求項４に記載のＲＮＡの組合せ。
【請求項６】
［２］に記載のＲＮＡの組合せである、請求項３に記載のＲＮＡの組合せ。
【請求項７】
（５）〜（８）に記載のすべてのｇＲＮＡを含むか、または（５）〜（８）に記載のすべてのｃｒＲＮＡを含む、請求項５に記載のＲＮＡの組合せ。
【請求項８】
［３］に記載のＲＮＡの組合せであって、（１）〜（８）からなる群から選択される４つ以上のｇＲＮＡの組合せまたはｃｒＲＮＡの組合せである、請求項１に記載の組合せ。
【請求項９】
それぞれのＲＮＡが、ｇＲＮＡである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＲＮＡの組合せ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡの組合せ、に含まれる各ＲＮＡをコードする核酸の組合せ。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸の組合せに含まれる核酸をそれぞれ発現可能に含む、ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを含む、医薬または組合せ医薬。
【請求項１３】
請求項１１に記載のＲＮＡ発現ベクターを含む、医薬または組合せ医薬。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを安定発現する、真核細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の真核細胞を含む、細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現増強法に関する。本発明は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増強するためのＲＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターにも関する。本発明はさらに、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現が増強された細胞および該細胞を含む細胞製剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現量の低下は、てんかんや社会性行動異常の原因となることが知られている（非特許文献１〜３）。ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現量を向上させるためには、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を細胞に導入することが考えられるが、２００ｋＤａを超えるタンパク質であり、遺伝子サイズが大きいために細胞に導入することが困難である。また、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域が解析されつつあるが数十キロｂｐに及ぶ巨大な領域であり、その制御機構はいまだ不明の部分が多い（非特許文献４）。
【０００３】
細胞内のゲノムＤＮＡから遺伝子発現を増強する方法としてＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムが開発されている（非特許文献５〜７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ogiwara et al., J. Neuroscie., 27: 5903-5914, 2007
【非特許文献２】Ogiwara et al., Hum. Mol. Genet., 22: 4784-4804, 2013
【非特許文献３】Ito et al., Neurobiol. Dis., 49: 29-40, 2013
【非特許文献４】Nakayama T., et al., Hum. Mutat., 31(7): 820-829, 2010
【非特許文献５】Cheng et al., Cell Research, 23: 1163-1171, 2013
【非特許文献６】Mali et al., Science, 339 (6121): 823-826, 2013
【非特許文献７】Konermann et al., Nature, 517 (7536): 583-588, 2015
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を特異的に増強する方法を提供する。本発明はまた、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を特異的に増強するためのＲＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターを提供する。本発明はさらに、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現が増強された細胞および該細胞を含む細胞製剤を提供する。
【０００６】
本発明者らは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域の複数の箇所を標的配列としてＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムを用いた場合、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を顕著に増強させることができることを見出した。本発明者らはまた、配列番号１〜８のいずれか１以上、特に４つ以上を標的配列とする場合に、効果的にＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増強させることができることを見出した。
【０００７】
本発明によれば、例えば、以下の発明が提供される。
〔１〕ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せである、ＲＮＡの組合せ。
〔２〕ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも４つを標的とする、ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せである、上記〔１〕に記載のＲＮＡの組合せ。
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載のＲＮＡの組合せであって、
［１］以下（１）〜（４）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ、
［２］以下（５）〜（８）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ、または
［３］以下（１）〜（８）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ：
（１）配列番号１で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（２）配列番号２で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（３）配列番号３で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（４）配列番号４で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（５）配列番号５で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（６）配列番号６で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、
（７）配列番号７で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、および
（８）配列番号８で示される配列を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
〔４〕［１］に記載のＲＮＡの組合せである、上記〔３〕に記載のＲＮＡの組合せ。
〔５〕（１）〜（４）に記載のすべてのｇＲＮＡを含むか、または（１）〜（４）に記載のすべてのｃｒＲＮＡを含む、上記〔４〕に記載のＲＮＡの組合せ。
〔６〕［２］に記載のＲＮＡの組合せである、上記〔３〕に記載のＲＮＡの組合せ。
〔７〕（５）〜（８）に記載のすべてのｇＲＮＡを含むか、または（５）〜（８）に記載のすべてのｃｒＲＮＡを含む、上記〔５〕に記載のＲＮＡの組合せ。
〔８〕［３］に記載のＲＮＡの組合せであって、（１）〜（８）からなる群から選択される４つ以上のｇＲＮＡの組合せまたはｃｒＲＮＡの組合せである、上記〔１〕に記載の組合せ。
〔９〕それぞれのＲＮＡが、ｇＲＮＡである、上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のＲＮＡの組合せ。
〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のＲＮＡの組合せ、に含まれる各ＲＮＡをコードする核酸の組合せ。
〔１１〕上記〔１０〕に記載の核酸の組合せに含まれる核酸をそれぞれ発現可能に含む、ＲＮＡ発現ベクター。
〔１２〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを含む、医薬または組合せ医薬。
〔１３〕上記〔１１〕に記載のＲＮＡ発現ベクターを含む、医薬または組合せ医薬。
〔１４〕上記〔１〕〜〔９〕に記載のＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを安定発現する、真核細胞。
〔１５〕上記〔１４〕に記載の真核細胞を含む、細胞製剤。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の翻訳開始点およびその上流の領域を示す模式図である。ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の複数の転写産物と、設計したｇＲＮＡの標的配列の位置的関係が示されている。
【図２】図２は、マウスＳｃｎ１ａ遺伝子の翻訳開始点およびその上流の領域を示す模式図である。マウスＳｃｎ１ａ遺伝子の複数の転写産物と、設計したｇＲＮＡの標的配列の位置的関係が示されている。
【図３】図３は、ＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムを用いたヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写産物の増加効果をヒト培養細胞（HEK293FT）における半定量RT-PCRにより示した図である。
【図４】図４は、ＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムを用いたマウスＳｃｎ１ａ遺伝子の転写産物の増加効果をマウス培養細胞（Neuro2A）における半定量RT-PCRにより示した図である。
【図５】図５は、ＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムを用いたマウスＳｃｎ１ａ遺伝子の転写産物の増加効果をノーザンブロット解析により示した図である。マウス培養細胞（Neuro2A）においてマウスＳｃｎ１ａ遺伝子に対して４つのｇＲＮＡを組み合わせて用いて転写を活性化させると、当該遺伝子の転写産物(mRNA)全長の発現量を大幅に増加させることができた。
【発明の具体的な説明】
【０００９】
本明細書では、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」とは、真性細菌や古細菌が有する獲得免疫として発見されたClustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein （ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムをゲノム編集に転用したシステムである（Jinek, M., et al. (2012) Science 337, 816-821）。
具体的には、上記細菌のＣＲＩＳＰＲ領域と呼ばれるゲノム領域には、断片化された外来ＤＮＡ（２０ｂｐ）が取り込まれたカセットが複数リピートしており、各カセットには、異なる外来ＤＮＡが取り込まれている。
各カセットは、外来生物（例えば、ファージなど）のＤＮＡが細胞内に取り込まれた場合にこれを断片化してＣＲＩＳＰＲ領域に組み込むことで生じると考えられる。
各カセットは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードしている。ｃｒＲＮＡは、プロトスペーサー配列と後述するｔｒａｎｓ−ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と相補的な配列とを有する。プロトスペーサー配列は、２０ヌクレオチド長であり、標的となるＤＮＡ配列と相補的な配列を有する。プロトスペーサー配列は、標的配列と１００％の相補性を有している必要はなく、５’末端から６ヌクレオチドの領域ではミスマッチが許容される。ｃｒＲＮＡは、相補的部分を介して別に転写されるｔｒａｎｓ−ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとさらなる複合体を形成する。ｃｒＲＮＡ中のプロトスペーサー部分は、外来ＤＮＡと相補的にハイブリッド形成を行い、これによりＣａｓ９エンドヌクレアーゼを外来ＤＮＡの標的配列に先導する。外来ＤＮＡは標的配列の部位においてＣａｓ９エンドヌクレアーゼにより切断され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、外来ＤＮＡから宿主を防御する。
このようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、真性細菌や古細菌が新しい外来ＤＮＡに対する獲得免疫として機能することで発見されたものであるが、外来ＤＮＡからなるプロトスペーサーを設計することで、哺乳動物のゲノムを配列依存的に切断できること、およびそれにより、哺乳動物のゲノムを編集できることから、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ゲノム編集システムとして急速に世界に広がったものである。
現在主に使用されているシステムは、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）に由来する第２種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。
【００１０】
本明細書では、「Ｃａｓ９」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡを切断する活性を有するエンドヌクレアーゼを意味する。本明細書では、「Ｃａｓ９」は、「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」と同義であり、相互に互換的に用いられる。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、上述の通りｃｒＲＮＡの５’側から２０ｂｐのプロトスペーサーにより、標的配列と相補的にはハイブリッド形成し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的配列に導かれる。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのエンドヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ１様ヌクレアーゼドメインとＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン）を有し、これらがそれぞれ２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖を切断し、結果として標的配列において２本鎖切断をＤＮＡに導入する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、エンドヌクレアーゼであるＣａｓ９を配列特異的に外来ＤＮＡに先導し、これにより外来ＤＮＡを分解することができる。
標的配列は、一般的に、その直後にprotospacer adjacent motif（ＰＡＭ）を有することが知られている。ＰＡＭ配列は、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）の場合には、５’−ＮＧＧ（ここでＮは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣである）である。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの種に依存して異なる。
【００１１】
本明細書では、「ｄＣａｓ９」とは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが有する２つのエンドヌクレアーゼドメインのエンドヌクレアーゼ活性が不活化されたＣａｓ９である。エンドヌクレアーゼを不活化させるために１０ＤＡおよびＨ８４０Ａに対応するアミノ酸変異がＣａｓ９に導入され得る。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡによりｄＣａｓ９は、ゲノムＤＮＡ上の標的配列に先導されるが、エンドヌクレアーゼ活性を有しないためにゲノムＤＮＡを切断しない。
ｄＣａｓ９は、転写活性化タンパク質と連結させることで、転写活性化タンパク質を配列特異的にゲノムＤＮＡ上にリクルートさせることに用いることができる。
【００１２】
本明細書では、「ｃｒＲＮＡ」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおけるｃｒＲＮＡを意味し、プロトスペーサー部分と、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリッド形成する部分とを有するＲＮＡである。細菌ゲノム上のＣＲＩＳＰＲ領域からｐｒｅ−ｃｒＲＮＡとして産生され、ＲＮａｓｅＩＩＩなどの働きにより成熟型ｃｒＲＮＡにプロセッシングされる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはｄＣａｓ９を標的配列に先導するために、ｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体形成を必要とする。ｃｒＲＮＡのプロトスペーサー配列は、標的配列またはその相補鎖と相補的な配列を有する（ただし、１〜数塩基のミスマッチが許容される）。
【００１３】
本明細書では、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおけるｔｒａｃｒＲＮＡを意味し、ｃｒＲＮＡとハイブリッド形成する。細菌ゲノム上のＣＲＩＳＰＲ領域からｐｒｅ−ｔｒａｓｒＲＮＡとして転写され、ＲＮａｓｅＩＩＩなどの働きにより成熟型ｔｒａｃｒＲＮＡにプロセッシングされる。
【００１４】
本明細書では、「ｇＲＮＡ」（ガイドＲＮＡ）とは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを連結させて得た単鎖ＲＮＡであり、単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれることもある。ｇＲＮＡは、生理的条件下でｃｒＲＮＡ部分とｔｒａｃｒＲＮＡ部分がハイブリッド形成してその連結部においてヘアピン構造を形成する。Ｃａｓ９は、ヘアピン構造を形成したｇＲＮＡと複合体を形成できる。ｇＲＮＡにおいては、連結させるｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとは、それぞれ全長であってもよいし、成熟型であってもよいし、成熟型の配列からさらに不要な配列（主に３’側）を除いた成熟型配列の部分配列であってもよいことが知られている（Jinek, M., et al. (2012) Science 337, 816-821）。ｇＲＮＡは、分子中にｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを有し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはｄＣａｓ９と結合することができるので、ｇＲＮＡ単独でＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはｄＣａｓ９を標的配列に先導することができる。
【００１５】
本明細書では、「ＣＲＩＳＰＲ−ｏｎ」とは、エンドヌクレアーゼ活性を失活させたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）と転写活性化タンパク質との融合タンパク質を用いて、配列特異的に転写活性化タンパク質をプロモーター領域に結合させ、これにより当該プロモーターにより駆動される遺伝子の発現を活性化させるシステムをいう。ＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムで用い得るｄＣａｓ９融合タンパク質としては、特に限定されないが例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ４８融合タンパク質、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質、ｄＣａｓ９−ＶＰ９６、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０融合タンパク質、ｄＣａｓ−ＶＰＲ融合タンパク質が挙げられる。
【００１６】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物を意味し、特にヒトであり得る。
【００１７】
本明細書では、「処置」とは、「治療」と「予防」とを含む意味で用いられる。従って、本明細書において「ドラベ症候群を処置することに用いる医薬組成物」とは、ドラベ症候群を治療または予防することに用いる医薬組成物（例えば、ドラベ症候群の治療剤または予防剤）を意味する。
本明細書では、「治療」とは、疾患若しくは障害の治療、治癒、防止若しくは、寛解の改善、または、疾患若しくは障害の進行速度の低減を意味する。本明細書では、「予防」とは、疾患もしくは病態の発症の可能性を低下させる、または疾患もしくは病態の発症を遅らせることを意味する。
【００１８】
本明細書では、「ＳＣＮ１Ａ遺伝子」とは、電位依存性ナトリウムチャネルのαサブユニットの一つであるＮａｖ１．１をコードする遺伝子である。Ｎａｖ１．１は、ヒトでは中枢神経系に発現することで知られる。ＳＣＮＡ１遺伝子の変異は、熱性痙攣＋（Generalized Epilepsy with Febrile Seizures Plus: GEFS+）やドラベ症候群（以前は、「乳児重症ミオクロニーてんかん」とも呼ばれたがミオクロニーを示さない場合があることからこの呼び方はされなくなってきている）を含む幅広いてんかん患者において認められている。
Ｓｃｎ１ａのナンセンス変異Ｒ１４０７Ｘを導入したノックインマウスを用いた研究からＳｃｎ１ａ遺伝子がてんかんの原因となっていることを明らかにしている（Ogiwara et al., J. Neuroscie., 27: 5903-5914, 2007）。また、抑制性神経細胞のみでＳｃｎ１ａをヘテロノックアウトしたコンディショナルノックアウトマウスにおいて、非常に重篤なてんかん症状が生じることが明らかとなっている（Ogiwara et al., Hum. Mol. Genet., 22: 4784-4804, 2013）。また、Ｓｃｎ１ａ遺伝子変異が、社会性行動の低下を生じることが明らかとなっている（Ito et al., Neurobiol. Dis., 49: 29-40, 2013）。
本明細書では、用語「ＳＣＮ１Ａ遺伝子」には、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子に加えてマウスおよびその他の種のＳＣＮ１Ａ遺伝子のオーソログが含まれる意味で用いられる。
【００１９】
本明細書では、「ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域」とは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写活性化または抑制に関する領域を意味する。ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子では、翻訳開始点の上流にエクソンＡ、エクソンＢ、エクソンＣおよびエクソンＤの４つの非コーディングエクソン（non-coding exons）の存在が知られている（Nakayama T., et al., Hum. Mutat., 31(7): 820-829, 2010）。
【００２０】
本明細書では、「組合せ」とは、２つ以上の異なる成分の組合せを意味する。組合せにおいて、成分は、別々の形態で含まれていてもよいし、混合されていてもよい。
【００２１】
本発明者らは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域の複数の箇所を標的とするＣＲＩＳＰＲ−ｏｎのシステムによりＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を活性化できることを明らかにした。特に、本発明者らは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域の４つ以上の箇所を標的とするＣＲＩＳＰＲ−ｏｎのシステムによりＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を活性化できることを明らかにした。このＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムでは、ｄＣａｓ−転写活性化タンパク質融合タンパク質を共通のコンポーネントとして用いることができる。ｄＣａｓ−転写活性化タンパク質融合タンパク質は核移行シグナルを有し得る。そして、このＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムでは、標的配列に対応したｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを標的配列の数だけ提供することにより、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を活性化できる。
【００２２】
したがって、本発明によれば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せである、ＲＮＡの組合せが提供される。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位は、上述の通り、ＰＡＭ配列の直前にのみ存在し得るので、当業者であればＣａｓ９エンドヌクレアーゼが要求するＰＡＭ配列を考慮して、プロモーター領域の配列の中から決定することができる。
【００２３】
ヒトにおいて、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域のうち、特にエクソンＡの上流−１〜−６００の領域（以下、「プロモーター領域１」と呼ぶことがある）およびエクソンＢの上流−１〜−６００の領域（以下、「プロモーター領域２」と呼ぶことがある）上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位が標的となり得る。したがって、本発明によれば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域のエクソンＡの上流−１〜−６００の領域および／またはエクソンＢの上流−１〜−６００の領域上に存在する少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せである、ＲＮＡの組合せが提供される。ここで、エクソンＡは、ＳＣＮ１Ａ転写産物の例えばバリアント１（Genbank登録番号：NM_001165963.1）の１番目の塩基から開始する領域である。また、エクソンＢは、ＳＣＮ１Ａ転写産物の例えばバリアント３（Genbank登録番号：NM_001165964.1
）の１番目の塩基から開始する領域である。
本発明によればまた、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域１上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せである、ＲＮＡの組合せが提供される。
本発明によればさらに、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域２上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せである、ＲＮＡの組合せが提供される。
【００２４】
本発明では、プロモーター領域１のうち、配列番号１〜４で示される配列のいずれか１、２、３または４つを標的配列とするｇＲＮＡの組合せおよびｃｒＲＮＡの組合せが提供される。本発明ではまた、プロモーター領域２のうち、配列番号５〜８で示される配列のいずれか１、２、３または４つを標的配列とするｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡが提供される。本発明ではさらにまた、プロモーター領域のうち、配列番号１〜８で示される配列のいずれか１、２、３、４、５、６、７、または８つを標的配列とするｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡが提供される。
【００２５】
本発明によれば、
以下、［１Ａ］〜［３Ａ］のいずれかのＲＮＡまたはＲＮＡの組合せが提供される：
［１Ａ］以下（１Ａ）〜（４Ａ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、
［２Ａ］以下（５Ａ）〜（８Ａ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、または
［３Ａ］以下（１Ａ）〜（８Ａ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）：
（１Ａ）配列番号１で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（２Ａ）配列番号２で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（３Ａ）配列番号３で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（４Ａ）配列番号４で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（５Ａ）配列番号５で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（６Ａ）配列番号６で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（７Ａ）配列番号７で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、および
（８Ａ）配列番号８で示される配列を標的とするｇＲＮＡ。
【００２６】
本発明によれば、
以下、［１Ｂ］〜［３Ｂ］のいずれかのＲＮＡまたはＲＮＡの組合せが提供される：
［１Ｂ］以下（１Ｂ）〜（４Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、
［２Ｂ］以下（５Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、または
［３Ｂ］以下（１Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）：
（１Ｂ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（２Ｂ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（３Ｂ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（４Ｂ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（５Ｂ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（６Ｂ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（７Ｂ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、および
（８Ｂ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ。
【００２７】
以下、［１Ｂ’］〜［３Ｂ’］のいずれかのＲＮＡまたはＲＮＡの組合せが提供される：
［１Ｂ’］以下（１Ｂ）〜（４Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ、
［２Ｂ’］以下（５Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ、または
［３Ｂ’］以下（１Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ：
（１Ｂ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（２Ｂ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（３Ｂ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（４Ｂ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（５Ｂ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（６Ｂ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（７Ｂ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、および
（８Ｂ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ。
【００２８】
本発明では、ｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、その５’末端に標的配列またはその相補鎖に相補的なＲＮＡ配列を有し得る。ｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡが有する標的配列またはその相補鎖に相補的なＲＮＡ配列は、標的配列またはその相補鎖の配列に基づいて設計することができる。
【００２９】
本発明では、本発明のｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをコードする核酸が提供される。本発明ではまた、本発明の複数のｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せおよび複数のｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せが提供される。ここで、核酸の組合せは、複数のｇＲＮＡのそれぞれをコードする核酸の組合せを意味する。
【００３０】
すなわち、本発明によれば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せまたはｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せである、核酸の組合せが提供される。
【００３１】
本発明によれば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域１および／またはプロモーター領域２上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せまたはｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せである、核酸の組合せが提供される。
本発明によればまた、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域１上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せまたはｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せである、核酸の組合せが提供される。
本発明によればさらに、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域２上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せまたはｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せである、核酸の組合せが提供される。
【００３２】
本発明によれば、
以下、［１Ａ］〜［３Ａ］のいずれかのＲＮＡそれぞれをコードする核酸または核酸の組合せが提供される：
［１Ａ］以下（１Ａ）〜（４Ａ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、
［２Ａ］以下（５Ａ）〜（８Ａ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、または
［３Ａ］以下（１Ａ）〜（８Ａ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）：
（１Ａ）配列番号１で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（２Ａ）配列番号２で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（３Ａ）配列番号３で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（４Ａ）配列番号４で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（５Ａ）配列番号５で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（６Ａ）配列番号６で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（７Ａ）配列番号７で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、および
（８Ａ）配列番号８で示される配列を標的とするｇＲＮＡ。
【００３３】
本発明によれば、
以下、［１Ｂ］〜［３Ｂ］のいずれかのＲＮＡそれぞれをコードする核酸または核酸の組合せが提供される：
［１Ｂ］以下（１Ｂ）〜（４Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、
［２Ｂ］以下（５Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、または
［３Ｂ］以下（１Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）：
（１Ｂ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（２Ｂ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（３Ｂ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（４Ｂ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（５Ｂ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（６Ｂ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（７Ｂ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、および
（８Ｂ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ。
【００３４】
以下、［１Ｂ’］〜［３Ｂ’］のいずれかのＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せが提供される：
［１Ｂ’］以下（１Ｂ）〜（４Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ、
［２Ｂ’］以下（５Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ、または
［３Ｂ’］以下（１Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ：
（１Ｂ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（２Ｂ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（３Ｂ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（４Ｂ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（５Ｂ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（６Ｂ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（７Ｂ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、および
（８Ｂ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ。
【００３５】
本発明によれば、本発明のＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを細胞に発現させる、ＲＮＡ発現ベクターが提供される。ＲＮＡ発現ベクター上では、ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする核酸が、ＲＮＡ発現プロモーターに作動可能に連結されている。ＲＮＡ発現プロモーターとしては、特に限定されないが例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを用いることができ、例えば、Ｕ６プロモーターを用いることができる。
本発明のＲＮＡ発現ベクターは、１つのＲＮＡ発現ベクター上に複数の核酸が発現可能に組み込まれ、本発明のＲＮＡの組合せを発現できるベクターとすることができる。
ある態様では、複数のＲＮＡ発現ベクターは、複数のＲＮＡ発現ベクターの組合せであり、当該複数のＲＮＡ発現ベクターを組み合わせることにより、本発明のＲＮＡの組合せを発現できるベクターの組合せであってもよい。この態様では、各ＲＮＡ発現ベクターがそれぞれ異なる１つのＲＮＡを発現するものであってもよい。
【００３６】
例えば、上記［１Ａ］に定義されたＲＮＡの組合せは、１つのＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれていてもよいし、複数のＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれていてもよいし、それぞれのＲＮＡが別のＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれていてもよい。
例えば、上記［２Ａ］に定義されたＲＮＡの組合せは、１つのＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれていてもよいし、複数のＲＮＡ発現ベクター上に離れて組み込まれていてもよいし、それぞれのＲＮＡが別のＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれていてもよい。
例えば、上記［３Ａ］に定義されたＲＮＡの組合せは、１つのＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれていてもよいし、複数のＲＮＡ発現ベクター上に離れて組み込まれていてもよいし、それぞれのＲＮＡが別のＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれていてもよい。上記［３Ａ］に定義されたＲＮＡの組合せは、ｃｒＲＮＡは一つのＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれ、ｔｒａｃｒＲＮＡは別のＲＮＡ発現ベクター上に組み込まれていてもよい。
【００３７】
本発明によれば、例えば、ＲＮＡ発現ベクターは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せまたはｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せである、核酸の組合せを含む。
【００３８】
本発明によればまた、ＲＮＡ発現ベクターは、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域１および／またはプロモーター領域２上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せまたはｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せである、核酸の組合せを含む。
本発明によればまた、ＲＮＡ発現ベクターは、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域１上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せまたはｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せである核酸の組合せを含む。核酸は、真核細胞内で発現可能にＲＮＡ発現ベクターに含まれている。
本発明によればさらに、ＲＮＡ発現ベクターは、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域２上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せまたはｃｒＲＮＡそれぞれをコードする核酸の組合せである核酸の組合せを含む。核酸は、真核細胞内で発現可能にＲＮＡ発現ベクターに含まれている。
【００３９】
本発明によれば、下記［４Ａ］〜［６Ａ］のいずれかに記載のＲＮＡ発現ベクターが提供される：
［４Ａ］以下（１Ａ）〜（４Ａ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ発現ベクターもしくは２以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ）、
［５Ａ］以下（５Ａ）〜（８Ａ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ発現ベクターもしくは２以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ）、または
［６Ａ］以下（１Ａ）〜（８Ａ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ）：
（１Ａ）配列番号１で示される配列を標的とするｇＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（２Ａ）配列番号２で示される配列を標的とするｇＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（３Ａ）配列番号３で示される配列を標的とするｇＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（４Ａ）配列番号４で示される配列を標的とするｇＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（５Ａ）配列番号５で示される配列を標的とするｇＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（６Ａ）配列番号６で示される配列を標的とするｇＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（７Ａ）配列番号７で示される配列を標的とするｇＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、および
（８Ａ）配列番号８で示される配列を標的とするｇＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター。
【００４０】
本発明によれば、下記［４Ｂ］〜［６Ｂ］のいずれかに記載のＲＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクターの組合せが提供される：
［４Ｂ］以下（１Ｂ）〜（４Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ発現ベクターもしくは２以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ）、
［５Ｂ］以下（５Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ発現ベクターもしくは２以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ）、または
［６Ｂ］以下（１Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ）：
（１Ｂ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（２Ｂ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（３Ｂ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（４Ｂ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（５Ｂ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（６Ｂ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（７Ｂ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、および
（８Ｂ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター。
【００４１】
本発明によれば、下記［４Ｃ］〜［６Ｃ］のいずれかに記載のＲＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクターの組合せが提供される：
［４Ｃ］以下（１Ｃ）〜（４Ｃ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ発現ベクターもしくは２以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ）、
［５Ｃ］以下（５Ｃ）〜（８Ｃ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ発現ベクターもしくは２以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ）、または
［６Ｃ］以下（１Ｃ）〜（８Ｃ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ）：
（１Ｃ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（２Ｃ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（３Ｃ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（４Ｃ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（５Ｃ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（６Ｃ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（７Ｃ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、および
（８Ｃ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター。
【００４２】
本発明によれば、下記［４Ｄ］〜［６Ｄ］のいずれかに記載のＲＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクターの組合せとｔｒａｃｒＲＮＡを発現する発現ベクターとの組合せが提供される：
［４Ｄ］以下（１Ｄ）〜（４Ｄ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ発現ベクターもしくは２以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ）、
［５Ｄ］以下（５Ｄ）〜（８Ｄ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ発現ベクターもしくは２以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ）、または
［６Ｄ］以下（１Ｄ）〜（８Ｄ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡ発現ベクターの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡ発現ベクターの組合せ）：
（１Ｄ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（２Ｄ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（３Ｄ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（４Ｄ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（５Ｄ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（６Ｄ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、
（７Ｄ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター、および
（８Ｄ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡを発現可能にコードする遺伝子を含むＲＮＡ発現ベクター。
【００４３】
本発明によれば、ＲＮＡ発現ベクターは、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターとすることができる。ウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどの様々な遺伝子導入可能なベクターを用いることができる。当業者であれば、適宜ベクターを選択して、本発明のｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築することができる。
【００４４】
本発明によれば、本発明のｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡの組合せまたはｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡの組合せを含む、組合せ医薬が提供される。本発明では、組合せ医薬は、複数のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡそれぞれを別々の形態で含む医薬、すなわち、医薬組成物の組合せであってもよいし、複数のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡが混合された形態で含む１つの医薬、すなわち医薬組成物であってもよい。
【００４５】
本発明では、本発明のＲＮＡ発現ベクターを含む医薬または組合せ医薬が提供される。本発明では、組合せ医薬は、ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡそれぞれを発現する複数のＲＮＡ発現ベクターを別々の形態で含む医薬、すなわち、医薬組成物の組合せであってもよいし、複数のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡそれぞれを発現する複数のＲＮＡ発現ベクターが混合された形態で含む１つの医薬、すなわち医薬組成物であってもよい。
【００４６】
本発明では、医薬組成物は、製薬的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤などをさらに含んでなり得る。
「製薬的に許容可能な」とは、医薬業界で通常使用される意味を有し、場合により、ヒトに投与された場合にアレルギー反応または同様の有害反応を生じさせない分子的実体物質または組成物等の使用が可能であることを表す。典型的に、そのような組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液として調製され、  注射前の液体中での溶解または懸濁に好適な固体剤形を調製することもできる。調製物は乳化することもできる。
賦形剤、担体または希釈剤としては、例えば、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイド、などが含まれる。リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０アミノ酸残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；疎水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシアルキレン系）といった例も挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および物質の使用は当技術分野で周知である。任意の慣用の媒体または物質が活性成分と不適合である場合を除き、治療用組成物でのその使用が想定される。補助活性成分を組成物に組み入れることもできる。
本発明の医薬組成物は、製剤に使用される各種の界面活性剤を使用してもよい。界面活性剤の種類は特に限定されず、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、または両性界面活性剤等が挙げられ、中でもノニオン系界面活性剤が好ましい。ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンモノアルキルエーテル、またはポリオキシエチレンモノアリールエーテル等のポリオキシアルキレン系ノニオン界面活性剤；多価アルコール（例えばソルビタン、ソルビトール）の高級脂肪酸エステル；および多価アルコールの高級脂肪酸エステルにエチレンオキシドを重合付加させたもの；等が挙げられる。
【００４７】
本発明の組合せ医薬は、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質またはｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを、別々の形態で、または混合した形態で、さらに含んでいてもよい。本発明の組合せ医薬は、ｃｒＲＮＡが前記融合タンパク質と複合体を形成するために、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの発現ベクターを、別々の形態で、または混合した形態で、さらに含んでいてもよい。
【００４８】
本発明のＲＮＡの組合せは、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質と組み合わされて提供されてもよい。したがって、本発明では、本発明のＲＮＡの組合せとｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質との組合せが提供される。
本発明のＤＮＡの組合せおよびＲＮＡ発現ベクターの組合せは、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸または該核酸を発現する発現ベクターと組み合わされて提供されてもよい。したがって、本発明では、本発明のＤＮＡの組合せまたはＲＮＡ発現ベクターの組合せと、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸または該核酸を発現する発現ベクターとの組合せが提供される。
【００４９】
本発明のＲＮＡの組合せ、ＤＮＡの組合せ、およびＲＮＡ発現ベクターは、これらを含むＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムとして提供されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ−ｏｎシステムは、例えば、本発明のＲＮＡの組合せ、ＤＮＡの組合せ、およびＲＮＡ発現ベクターに加えて、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質を含み得る。
【００５０】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現量は、当業者に周知の発現量測定法により決定することができる。例えば、遺伝子発現は、定量的ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、抗ＳＣＮ１Ａタンパク質抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫組織学染色などの様々な方法により確認することができる。ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現量が増加したか否かは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子導入前後でその発現量を比較することにより決定することができ、所望により、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を発現することが知られる細胞（例えば、健常者の細胞）と比較して決定してもよい。
【００５１】
本発明では、本発明のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡの組合せは、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質と組み合わせて細胞内に導入されると、ｇＲＮＡと前記融合タンパク質との複合体を形成する。形成された複合体は、細胞内のゲノムＤＮＡ上の標的配列に導かれ、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を活性化する。
【００５２】
本発明では、本発明のｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの組合せは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質と組み合わせて細胞内に導入されると、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡと融合タンパク質との複合体を形成する。形成された複合体は、細胞内のゲノムＤＮＡ上の標的配列に導かれ、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を活性化する。
【００５３】
本発明では、本発明のＤＮＡまたはＤＮＡの組合せは、例えば、本発明のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを得るために、または、本発明のＤＮＡまたはＤＮＡの組合せを増幅させるために用いられ得る。例えば、本発明のＤＮＡまたはＤＮＡの組合せは、適切なプロモーターと作動可能に連結し、本発明のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを試験管内で、または細胞内で産生させることに用いることができる。例えば、本発明のＤＮＡまたはＤＮＡの組合せは、大腸菌内で増幅する複製起点を有するプラスミドにクローニングされ、大腸菌内で増幅され得る。また、本発明のＤＮＡまたはＤＮＡの組合せは、ＰＣＲにより増幅され得る。
【００５４】
本発明では、本発明のｇＲＮＡの発現ベクターは、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質を発現する発現ベクターと組み合わせて用いることができる。本発明のｃｒＲＮＡの発現ベクターは、ｔｒａｃｒＲＮＡのＲＮＡ発現ベクターおよびｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質を発現する発現ベクターと組み合わせて用いることができる。
【００５５】
細胞内のゲノムＤＮＡを切断するためには、発現ベクターを細胞内に導入することができる。発現ベクターの細胞内への導入は、当業者であれば周知の技術により実施することができる。例えば、プラスミドベクターは、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法およびショットガン法などの方法により細胞に導入することができる。また、哺乳動物個体に導入する場合には、該哺乳動物に感染するウイルスベクターを用いて静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与などの様々な投与法で投与することができる。細胞内に導入された発現ベクターは、細胞内で本発明のｇＲＮＡやｃｒＲＮＡおよびｔｒａｒＲＮＡを発現し、また、融合タンパク質を発現する発現ベクターは融合タンパク質を発現し、細胞内でゲノムの標的配列に結合してＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を活性化する。
【００５６】
本発明では、本発明のＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを安定的に発現する真核細胞（特にヒト神経細胞、好ましくはヒト抑制性神経細胞、より好ましくはパルブアルブミン陽性抑制性神経細胞）および該細胞を含む細胞製剤が提供される。本発明の真核細胞および細胞製剤において、真核細胞は、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質をさらに安定発現していてもよい。ＲＮＡを真核細胞に安定的に発現させる方法は当業者に周知である。ここで、細胞製剤とは、細胞を治療上の有効成分とする医薬組成物を意味する。
【００５７】
本発明によれば、
以下、［１Ａ］〜［３Ａ］のいずれかのＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを安定発現する真核細胞（特にヒト神経細胞、好ましくはヒト抑制性神経細胞、より好ましくはパルブアルブミン陽性抑制性神経細胞）および該真核細胞を含む細胞製剤が提供される｛ここで、真核細胞は、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質をさらに安定発現していてもよい｝：
［１Ａ］以下（１Ａ）〜（４Ａ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、
［２Ａ］以下（５Ａ）〜（８Ａ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、または
［３Ａ］以下（１Ａ）〜（８Ａ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）：
（１Ａ）配列番号１で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（２Ａ）配列番号２で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（３Ａ）配列番号３で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（４Ａ）配列番号４で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（５Ａ）配列番号５で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（６Ａ）配列番号６で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、
（７Ａ）配列番号７で示される配列を標的とするｇＲＮＡ、および
（８Ａ）配列番号８で示される配列を標的とするｇＲＮＡ。
【００５８】
本発明によれば、
以下、［１Ｂ］〜［３Ｂ］のいずれかのＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを安定発現する真核細胞（特にヒト神経細胞、好ましくはヒト抑制性神経細胞、より好ましくはパルブアルブミン陽性抑制性神経細胞）および該真核細胞を含む細胞製剤が提供される｛ここで、真核細胞は、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質をさらに安定発現していてもよい｝：
［１Ｂ］以下（１Ｂ）〜（４Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、
［２Ｂ］以下（５Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）、または
［３Ｂ］以下（１Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）：
（１Ｂ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（２Ｂ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（３Ｂ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（４Ｂ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（５Ｂ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（６Ｂ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（７Ｂ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、および
（８Ｂ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ。
【００５９】
以下、［１Ｂ’］〜［３Ｂ’］のいずれかのＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを安定発現する真核細胞（特にヒト神経細胞、好ましくはヒト抑制性神経細胞、より好ましくはパルブアルブミン陽性抑制性神経細胞）および該真核細胞を含む細胞製剤が提供される｛ここで、真核細胞は、ｄＣａｓ９と転写活性化タンパク質との融合タンパク質をさらに安定発現していてもよい｝：
［１Ｂ’］以下（１Ｂ）〜（４Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ、
［２Ｂ’］以下（５Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される１つのＲＮＡ若しくは２〜４つのＲＮＡの組合せ（特に４つのＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ、または
［３Ｂ’］以下（１Ｂ）〜（８Ｂ）からなる群から選択される２〜８つのＲＮＡの組合せ（特に４つ以上のＲＮＡの組合せ）とｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸との組合せ：
（１Ｂ）配列番号１で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（２Ｂ）配列番号２で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（３Ｂ）配列番号３で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（４Ｂ）配列番号４で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（５Ｂ）配列番号５で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（６Ｂ）配列番号６で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、
（７Ｂ）配列番号７で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ、および
（８Ｂ）配列番号８で示される配列を標的とするｃｒＲＮＡ。
【００６０】
本発明では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる方法であって、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを用いて、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を活性化することを含む、方法が提供される。
【００６１】
本発明では、その必要のある対象において疾患を処置する方法であって、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター領域上に存在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ結合部位の少なくとも１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所以上を標的とするｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを用いて、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を活性化することを含む、方法が提供される。
【００６２】
本発明の医薬組成物、組合せ医薬、処置する方法において、ある態様では、対象は、疾患は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の低下を原因とする疾患であり得、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の低下を原因とする疾患を有する対象とし得る。本発明の医薬組成物、組合せ医薬、処置する方法において、ある態様では、処置される疾患は、てんかんであり得る。ある態様では、処置される疾患はドラベ症候群であり得る。ある態様では、処置される疾患は、熱性痙攣＋であり得る。ある態様では、処置される疾患は、自閉症などの社会性行動異常であり得る。
【００６３】
本発明のある態様では、本発明の医薬、組合せ医薬および細胞製剤は、てんかんを処置することに用いるための、ドラベ症候群を処置することに用いるための、熱性痙攣＋を処置することに用いるための、または自閉症などの社会性行動異常を処置することにもちいるための、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の活性および／または発現の低下を原因とする疾患を処置することに用いるための、医薬、組合せ医薬および細胞製剤であり得る。
【００６４】
本発明では、てんかんを処置することに用いるための、ドラベ症候群を処置することに用いるための、熱性痙攣＋を処置することに用いるための、または自閉症などの社会性行動異常を処置することにもちいるための、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の活性および／または発現の低下を原因とする疾患を処置することに用いるための、医薬、組合せ医薬および細胞製剤の製造のための、本発明のＲＮＡもしくはＲＮＡの組合せ、ＤＮＡもしくはＤＮＡの組合せ、または発現ベクターの使用が提供される。
【実施例】
【００６５】
実施例１：ｇＲＮＡの設計と作製
本実施例では、Ｓｃｎ１ａ遺伝子のプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡを設計し、作製した。
【００６６】
ヒトゲノム配列はUCSC Genome BrowserよりＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９データセットの配列を使用した。マウスＳｃｎ１ａ遺伝子のプロモーター領域の配列は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のゲノムＤＮＡ配列を使用した。本実施例では、プロモーター領域のうち、主要な翻訳開始点の上流約６００ｂｐから８５０ｂｐの領域内に存在する５’−ＮＧＧ−３’（ＣＡＳ９タンパクのProto-spacer Adjacent Motif（ＰＡＭ）配列）の５’−側２０ｂｐからｇＲＮＡの標的配列を選択した。具体的には、ヒトは４箇所（ｈＳＣ１Ｕ１〜４，ｈＳＣ１Ｄ１〜４）、マウスは５個所（ｍＳＣ１Ｕ１〜５，ｍＳＣ１Ｄ１〜５）の計１８箇所のｇＲＮＡ配列を設計した。選択した配列の標的特異性は、ヒトまたは、マウスのゲノム配列中で他の領域に完全一致しない配列であることをＮＣＢＩの塩基配列データベースとＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索で確認した。さらに、原則的に連続した１７ｂｐ以上の相同な塩基配列がなく、相同性のある部分配列の数が少なく、相同な部分配列が１７ｂｐ以下でも３’−側の末端に位置しない配列を選択した。
【００６７】
ヒトおよびマウスのＳＣＮ１Ａ遺伝子のプロモーター中でｇＲＮＡを設計した部位を大きく分けて上流プロモーターおよび下流プロモーターと命名し、以下説明に用いた（図１および２参照）。設計されたｇＲＮＡの標的配列のプロモーター上での位置、名称および配列番号との対応は図１および２、表１および２、並びに化１〜４の通りであった。
【００６８】
【表１】
2018088888.tif 000002
【００６９】
【化１】
2018088888.tif 000003
上記化学式において、転写開始点を１とした。
【００７０】
【化２】
2018088888.tif 000004
【００７１】
【表２】
2018088888.tif 000005
【００７２】
【化３】
2018088888.tif 000006
【００７３】
【化４】
2018088888.tif 000007
【００７４】
次にプラスミドＤＮＡを調製した。ｇＲＮＡ発現ベクターは、Ｕ６プロモーターでｇＲＮＡを発現するベクター（ＭＬＭ３６３６, addgene: Plasmmid #43860）をＡｄｄｇｅｎｅ社より入手した。Maeder ML et al., Nat Methods., 10(10):977-93, 2013の作製法と同様に、ベクターの制限酵素ＢｓｍＢＩの切断部位に相補的な４塩基の突出末端を付加した２０塩基の標的配列とその相補鎖を合成して２本鎖のＤＮＡ断片を作製し、DNA Ligation kit Ver2.1（タカラバイオ社）を使用して制限酵素ＢｓｍＢＩで切断したＭＬＭ３６３６ベクターに組み込んだ。ｄＣＡＳ９−ＶＰＲ遺伝子は、ＣＭＶプロモーターによる発現ベクター（SP-dCas9-VPR, addgene: Plasmid #63798）をＡｄｄｇｅｎｅ社より入手した。ｇＲＮＡ発現ベクターとｄＣＡＳ９−ＶＰＲ遺伝子発現ベクターのプラスミドＤＮＡは、キアゲン社のHispeed Plasmid Midi Kitを使用して精製した。なお、ｄＣＡＳ９は、野生型ＣＡＳ９が有する２つのＤＮＡエンドヌクレアーゼドメインの酵素機能がいずれも破壊され、ＤＮＡを切断できない変異体である。
【００７５】
実施例２：遺伝子発現の評価
本実施例では、作製したプラスミドを用いて遺伝子発現の制御を行った。
【００７６】
細胞培養と遺伝子導入
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用して、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（ヒト）またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞（マウス）を、３７℃、二酸化炭素濃度５％の条件下で培養した。プラスミドＤＮＡを導入するため、培養した細胞は、６ｗｅｌｌプレートでＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は５×１０4個／ｍＬ、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は１×１０5個／ｍＬの密度で播種して、およそ８０％の密度まで増殖させた。プラスミドＤＮＡの導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ＬＴＸ（ライフテクノロジーズ社）を使用して行った。１ｗｅｌｌ当たり、ｇＲＡＮプラスミドを５００ｎｇ（ｇＲＮＡが１種であれば、５００ｎｇ、５種であれば、各１００ｎｇを使用した。）とｄＣＡＳ９−ＶＰＲプラスミドＤＮＡを２０００ｎｇを使用した。遺伝子導入開始後、１２時間で培地を新しいＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭ培地に交換し、４８時間後まで培養した。
【００７７】
細胞および脳組織からのＲＮＡの精製と定量
培養細胞とマウスの脳組織から全ＲＮＡを回収するためにＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社）を使用した。６ｗｅｌｌプレートで培養した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、１ｗｅｌｌ当たり４００μＬのＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓで細胞からＲＮＡを回収した。マウス脳の場合、４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウスを麻酔して脳を取り出し、２ｍｌのＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社）を加えて、ガラス製ダウンス型ホモジナイザーで組織を破砕してＲＮＡを回収した。
【００７８】
ＲＴ−ＰＣＲによる転写産物の検出
遺伝子の転写産物量を比較するために、タカラバイオ社のPrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)を使用して培養細胞から全ＲＮＡを精製し、常法を用いて全ＲＮＡからｍＲＮＡをＰＣＲで増幅した。用いたプライマーセットは以下の通りであった。
【００７９】
（各遺伝子検出に用いたプライマーセット）
ヒトSCN1A遺伝子の増幅に使用したプライマーは、
hSCN1A_F: 5'-TGGGGAGTGGATAGAGACCA-3'（配列番号２３）
hSCN1A_R: 5'-GAAAGAGATTCAGGACCACTAGG-3'（配列番号２４）
β−アクチン遺伝子の増幅に使用したプライマーは、
hACTB_F: 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'（配列番号２５）
hACTB_R: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'（配列番号２６）
マウスScn1a遺伝子の増幅に使用したプライマーは、
mScn1A_F: 5'-AGCCTATCCCTCGACCTGGA-3'（配列番号２７）
mScn1A_R: 5'-CTGGTCATCCGTTTCCACCA-3'（配列番号２８）
マウスG3pdh遺伝子の増幅に使用したプライマーは、
mG3pdh-F: 5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'（配列番号２９）
mG3pdh-R: 5'-ATTGTGAGGGAGATGCTCAG-3’（配列番号３０）
【００８０】
ヒトのＳＣＮ１Ａ遺伝子とβ−アクチン遺伝子の増幅は、９８℃，５分を１回、９８℃，１５秒、５５℃，５秒、７２℃，３０秒を２５回または、３０回の温度サイクルで行った。
マウスのＳｃｎ１ａ遺伝子とＧ３ｐｄｈ遺伝子のＰＣＲ法では、９８℃，５分を１回、９８℃，１５秒、５６℃，５秒、７２℃，２０秒の温度サイクルを２７回または、３０回行った。
【００８１】
ノーザンハイブリダイゼーションによる転写産物の検出
精製した全ＲＮＡをホルムアルデヒド変性１％アガロースゲルで電気泳動した後、ナイロン膜に転写した。泳動した１レーン当たりの全ＲＮＡ量は、培養細胞では５μｇ、マウスの脳組織から精製した全ＲＮＡは２０μｇを使用した。ＲＮＡプローブの標識とハイブリダイゼーション、および転写産物の検出は、ロシュ・ライフサイエンス社のＤＩＧノーザンスタータキットの方法に従った。プローブには、マウスＳｃｎ１ａ遺伝子の３’側非翻訳領域の６１５塩基の配列（mScn1a 3'UTR615；配列番号３１）を用いた。プローブは、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターでクローン化し、Ｔ７プロモーターを利用してジゴキシゲニンＲＮＡ標識法で調製した。
【００８２】
結果は、図３〜５に示される通りであった。
【００８３】
図３に示されるように、導入したｇＲＮＡの総量は同じであったにも関わらず、１種類のｇＲＮＡによりも４種のｇＲＮＡの組合せにおいてＳＣＮ１Ａの遺伝子発現が向上した。この傾向は、上流プロモーターおよび下流プロモーターのいずれでも共通して観察された。
【００８４】
図４に示されるように、導入したｇＲＮＡの総量は同じであったにも関わらず１種類のｇＲＮＡによりも５種のｇＲＮＡの組合せにおいてＳｃｎ１ａの遺伝子発現が向上した。この傾向は、上流プロモーターおよび下流プロモーターのいずれでも共通して観察された。
【００８５】
このように、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子においてもマウスＳｃｎ１ａ遺伝子においても、このプロモーターを標的とする場合には、それぞれ４種のｇＲＮＡの組合せおよび５種のｇＲＮＡの組合せで顕著な遺伝子の発現増強が見られた。
【００８６】
さらに図５では、このようにして発現増強された遺伝子を、脳組織の内在性遺伝子発現と比較されている。図５の矢印で示された８ｋｂ超のバンドがマウスＳｃｎ１ａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡのバンドである。
【００８７】
図５に示されるように、陰性対照（Ｎ．Ｃ．）ではほとんど発現が観察されないのに対して、上流プロモーターの４つのｇＲＮＡの組合せ（マウス）および５つのｇＲＮＡの組合せ（マウス）により発現を亢進させると、発現量が大幅に亢進した。この結果から、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子においてもマウスＳｃｎ１ａ遺伝子においても、このプロモーターを標的とする場合には、それぞれ４種のｇＲＮＡの組合せおよび５種のｇＲＮＡの組合せで、ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現の大幅な増強・上昇を達成することに成功した。
【図１】
2018088888.tif 000008
【図２】
2018088888.tif 000009
【図３】
2018088888.tif 000010
【図４】
2018088888.tif 000011
【図５】
2018088888.tif 000012
【配列表】
2018088888000001.app