【手続補正書】
【提出日】平成27年2月27日(2015.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質を発現するための宿主細胞として有用な、ゼロフコースレベルを有するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を選択する方法であって、
（ａ）メトトレキサート（ＭＴＸ）に細胞を接触させることにより、遺伝的突然変異をＣＨＯ細胞の集団に導入する工程、
（ｂ）突然変異細胞を含むＣＨＯ細胞の集団を、非毒性フコース結合剤と、細胞集団の細胞膜上のフコース部分への該フコース結合剤の結合がなされる時間接触させる工程であって、その時間が細胞の殺傷を可能としない時間である工程；および
（ｃ）突然変異細胞を含む細胞の集団から、フコース結合剤に結合する細胞の亜集団を除去し、それにより組換えタンパク質の発現のために宿主細胞として有用な細胞を選択する工程であって、選択された細胞がゼロフコース含量を有する工程
を含む製造方法。
【請求項２】
ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−１Ｅ５、ＣＨＯ３Ｆ、ＣＨＯ／ＤＧ４４およびＣＨＯ−２．６から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
組換えタンパク質が抗体またはＦｃタンパク質である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記フコース結合剤が、突然変異細胞を含む前記細胞集団に非毒性である請求項１記載の方法。
【請求項５】
フコース結合剤が検出可能部分またはアフィニティー部分に結合される請求項１記載の方法。
【請求項６】
時間が６０分間以下である請求項１記載の方法。
【請求項７】
フコース結合剤がアフィニティー部分に結合される場合、方法は、さらに突然変異した細胞集団を、アフィニティー部分と同族の結合部分を含む追加的な薬剤と接触させることを含む請求項５記載の方法。
【請求項８】
アフィニティー部分がビオチンを含む請求項５記載の方法。
【請求項９】
同族の結合部分が検出可能な部分に結合される請求項７記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な部分が、蛍光部分または磁気部分を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
除去が、ＦＡＣＳソーティングによりまたは磁気分離により、少なくとも３回の連続的な除去によりなされる請求項１記載の方法。
【請求項１２】
フコース結合剤が、ヒイロチャワンダケ（aleuria aurantia）レクチン（ＡＡＬ）またはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）１−フコース−特異的レクチン（ＡＯＬ）である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法により作製された単離ＣＨＯ細胞。
【請求項１４】
配列番号２３および／または２４記載のアミノ酸配列を有する突然変異ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現するように遺伝的に改変されている単離ＣＨＯ細胞。
【請求項１５】
発現されるタンパク質のフコシル化の量が外部フコース濃度に直線的に依存するように遺伝的に改変されている単離ＣＨＯ細胞。
【請求項１６】
突然変異ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現するように遺伝的に改変されている請求項１５記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項１７】
前記ＧＭＤの各アレルの少なくとも１つが少なくとも１つの機能喪失型突然変異を担持する請求項１３、１４または１６記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項１８】
外部フコースの濃度がゼロの場合、タンパク質のフコシル化量がゼロである請求項１５記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項１９】
非変異ＣＨＯ細胞よりも２０％高い積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を有する請求項１３、１４または１８記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項２０】
野生型フコシルトランスフェラーゼ−８（Ｆｕｔ８）を発現する請求項１３または１４記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項２１】
野生型ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース ３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）を発現する請求項１３または１４記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項２２】
突然変異ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現する請求項１３記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項２３】
突然変異ＧＭＤが、配列番号２３および／または２４記載のアミノ酸配列を有する請求項２２記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項２４】
（ａ）その親のＣＨＯ細胞同様の集団倍化時間を有する；
（ｂ）少なくとも３７０集団倍化に対して安定なフコース表現型を有する；および
（ｃ）目的の組換え抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現する
からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１３または１４記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項２５】
請求項１３または１４記載の単離細胞を含むＣＨＯ細胞株。
【請求項２６】
ＣＮＣＭ受託番号Ｉ−４４４９として寄託された請求項２５記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項２７】
請求項１３、１４または２４記載の単離ＣＨＯ細胞と、異種混入物質を含まない細胞培養培地とを含む細胞培養物であって、該細胞培養培地がフコースを含むかまたはフコースを含まない細胞培養物。
【請求項２８】
組換えタンパク質の製造方法であって、請求項１３または１４記載の単離ＣＨＯ細胞を、組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドでトランスフェクトする工程、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を組換えタンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、およびタンパク質を単離する工程を含む方法。
【請求項２９】
組換えタンパク質が抗体またはＦｃ融合タンパク質である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
トランスフェクトする工程が外因性フコースの存在下でなされる請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
さらに、請求項２２記載の単離ＣＨＯ細胞をトランスフェクトする工程の後にフコースを含む培養培地において培養する工程を含む請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法により産生されたＡＤＣＣが増強された抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】低フコース細胞株およびその使用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施態様において、ＣＨＯ細胞株、その作製方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換え治療用抗体は、多種多様な疾患の治療において重要な役割を担っている。新たに登場する薬物の約３０％が、これからの１０年で抗体に基づくものとなると予想されている。３０もの組換え抗体およびＦｃ融合体の市販が承認され、２００８年の売上高は３５０億ドルに達した。
【０００３】
抗体は、重鎖および軽鎖の両方の可変領域から構成される標的抗原−特異的領域を含む。抗体のこの部分が、可溶性抗原または膜結合型標的に結合し、中和することができる。
【０００４】
Ｆｃ部分は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機序、補体依存性複合体（ＣＤＣ）、および新生児受容体ＦｃＲｎを通してエフェクター機能に関与している。これらのエフェクター機能は、エフェクター分子とＦｃのヒンジおよびＣＨ２領域との相互作用を通して仲介される。ＣＨ２ドメインは、エフェクター細胞に結合するという重要な役割を担うことが知られている抗体の２９７位のＮグリコシル化部位に位置するオリゴ糖を含む。オリゴ糖は、通常、追加の可変外側糖残基と一緒になったコア七糖などの、かなり不均一な二分岐型複合体から成る。
【０００５】
ＡＤＣＣは、標的細胞の膜上のリガンドに結合する抗体のための重要な殺傷機序の１つである。白血球上に発現されるＦｃγＲは、抗体のＣＨ２ドメインに結合し、結合の際に、白血球の標的細胞活性化に対する抗原を有する免疫複合体の作製が開始される。その活性化は、細胞の透過化および細胞死を導く、食作用および細胞メディエータの放出などである。ＡＤＣＣ活性は、一方でＩｇＧアイソタイプに依存し、もう一方で特異的ＦｃγＲに依存する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３がこの活性を誘導できるのに対して、ＩｇＧ４は誘導しない。ＩｇＧに結合し、ＡＤＣＣ機序活性化に重要なＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩＩａとして知られ、ＮＫ細胞およびマクロファージ上に発現される。多くの場合、ＮＫ細胞の標的細胞への結合の際に得られるＡＤＣＣ活性は、標的細胞の殺傷を行うのに充分なほど効率的なものではない。その理由は、ＩｇＧＩに対するＦｃγＲＩＩＩａのアフィニティーが低いことにある。
【０００６】
ＡＤＣＣ活性の増加は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｐｈｅを発現する患者と比較して、１０〜１５％の人口に見られる高アフィニティーアロタイプＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖａｌを発現する患者に見られた。ＡＤＣＣの上昇は、ＩｇＧ  Ｆｃ上になされる操作によっても得られた。コンピュータによる設計アルゴリズムは、抗体を設計し、ハイスループットスクリーニングにより高い親和性に対して選択するために使用された。この研究は、インビトロでのエフェクター機能の２桁より大きな増大を示す抗体を生じさせた（Lazar, Dang et al. 2006）が、変異したＩｇＧ１（変異Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０ＬおよびＩ３３２Ｅを有するＩｇＧ１）の熱安定性の減少が検出された。ＡＤＣＣの増強された抗体を得るためのもう１つのアプローチは、２９７位のオリゴ糖における低フコースレベルの抗体を産生することである。先に、オリゴ糖上のフコース残基が、ＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃ結合を妨害することが見いだされた（Shinkawa, Nakamura et al. 2003）。低フコースレベルの抗体を得るための１つの方法は、そのような天然の能力を有する細胞、たとえばラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞（Shinkawa, Nakamura et al. 2003）などを利用することであるが、これらの細胞において産生される組換えタンパク質は、可変のフコース含有量レベルを示す。いくつかの他の可能性のある非哺乳類細胞には、Ｖｉｖａｌｉｓ社のトリ細胞、バイオレックス社（Biolex）の遺伝子改変された水生植物ウキクサ（Lemna）（Cox, Sterling et al. 2006）およびＩｇｅｎｅｏｎ社のヒメツリガネゴケ（Physocmirtella patens）の変異体（Nechansky, Schuster et al. 2007）が挙げられる。さらに、ＧｌｙｃｏＦｉ社は、増強されたＡＤＣＣを含むいくつかのグリコシル化ソリューションにふさわしい能力を有するピキア・パストリス（Pichia Pastoris）細胞の様々な株を作製した（Hamilton, Davidson et al. 2006）。また、いくつかの哺乳類細胞も、通常の様々なグリコシル化ソリューション、そして特に増強されたＡＤＣＣを有する抗体の産生のために使用される。Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ社は、糖最適化バイオ治療グリコシル化に様々な糖鎖工学的に作製されたヒト細胞株を作製した。ロシュ社に買収されたＧｌｙｃａｒｔ社は、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（ＧｎＴIII）、すなわち抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関わっている二等分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ、を導入することにより低減されたフコースレベルを有する組換え抗体を産生する細胞株を作り出した（Umana, Jean-Mairet et al. 1999）。Ｂｉｏｗａ社は、フコースレベルを減少させるためにＣＨＯ  ＤＧ４４のフコシル転移８（Ｆｕｔ８）遺伝子のノックアウトを作製した（Yamane-Ohnuki, Kinoshita et al. 2004）。
【０００７】
近年の研究により、原核生物の酵素、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロース還元酵素の、細胞質内における不均一発現が、中間体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースの、典型的には脊椎動物細胞においては生じない行き止まりの産物への変換を阻害するということが証明された。したがって、この方法で改変されたＣＨＯ細胞は、コアのフコースを欠いた抗体を分泌した（von Horsten, Ogorek et al.）。もう１つのアプローチは、毒性フコース特異的レクチンの存在下で生存するレクチン耐性変異体を作り出すことである。ＬＥＣ１３は、毒性エンドウフコース特異的レクチンの存在下でのＣＨＯ細胞のインキュベーションにより開発されたＣＨＯに基づく細胞株である（Ripka and Stanley 1986）。ＬＥＣ１３は、ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ活性が乏しく、フコースの少ないヒトＩｇＧ１の発現を生じる（Shields, Lai et al. 2002）。
【０００８】
米国特許出願番号２０１０／００８１１５０号明細書は、抗体を発現するのに有用な細胞を作製するために、薬剤での処理によるＣＨＯ細胞の変異と、高いフコースを有する細胞を殺すことによるフコシル化の減少などの変異グリコシル化パターンを示す細胞を選択することを教示している。
【０００９】
米国特許出願番号２０１０／０３０４４３６号明細書は、細胞の能力をポリペプチドのフコシル化に向かわせるために、Ｆｘタンパク質の突然変異によるおよびフコースの外部源の供給力を制御することによるフコシル化の減少したＣＨＯ細胞株を教示している。
【００１０】
Kandaらは（Kanda, Imai-Nishiya et al. 2007）、ＧＭＤおよびＦＵＴ８ノックアウト宿主細胞株を開示している。ＧＭＤノックアウト細胞は、ＧＭＤエクソン５、６および７領域に相当するゲノム欠失を有する。
【００１１】
Ripkaらは（Ripka and Stanley 1986）、４種のレクチン耐性ＣＨＯ変異細胞を開示している。この突然変異は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンとインキュベートすることによりなされた。
【００１２】
Shieldsらは（Shields, Lai et al. 2002）、Ｌｅｃ１３（フコース欠損ＣＨＯ）細胞株により産生されたＩｇＧ１が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を５０倍まで増加させ、またＡＤＣＣも増加させたことが開示されている。
【００１３】
Kandaらは（Kanda, Yamane-Ohnuki et al. 2006）は、Ｌｅｃ１３が５０〜７０％フコシル化抗体を産生することを開示しているが、この既知の細胞株は、抗体を安定的に産生できなかった。したがって、Ｌｅｃ１３細胞株は、産生細胞株としては適切ではない。
【発明の概要】
【００１４】
本発明のある実施態様の１つの側面によれば、組換えタンパク質を発現するための宿主細胞として有用なＣＨＯ細胞を選択する方法であって、
（ａ）ＣＨＯ細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）と接触させることにより、遺伝的突然変異をＣＨＯ細胞集団に導入する工程、
（ｂ）突然変異した細胞を含むＣＨＯ細胞の集団を、非毒性フコース結合剤と、細胞集団の細胞膜上のフコース部分への該フコース結合剤の結合がなされる時間接触させる工程であって、その時間が細胞の殺傷を可能としない時間である工程、
（ｃ）突然変異した細胞を含む細胞集団から、フコース結合剤に結合する細胞亜集団を除去し、それにより組換えタンパク質を発現するための宿主細胞として有用な細胞を選択する工程であって、選択された細胞は、ゼロフコース含有量を有する工程
を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明のある実施態様の１つの側面によれば、本発明の方法にしたがって作製された単離ＣＨＯ細胞が提供される。
【００１６】
本発明のある実施態様の１つの側面によれば、配列番号２３および／または２４に記載のアミノ酸配列を有する突然変異ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現するように遺伝的に改変されている単離ＣＨＯ細胞が提供される。
【００１７】
本発明のある実施態様の１つの側面によれば、本発明の単離細胞を含むＣＨＯ細胞株が提供される。
【００１８】
本発明のある実施態様の１つの側面によれば、本発明の単離ＣＨＯ細胞および異種混入物質（xeno contaminants）のない細胞培養培地を含む細胞培養物が提供される。
【００１９】
本発明のある実施態様の１つの側面によれば、組換えタンパク質の製造方法であって、本発明の単離ＣＨＯ細胞を組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドでトランスフェクトする工程、組換えタンパク質の発現に適した条件下でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培養する工程、およびタンパク質を単離する工程を含む方法が提供される。
【００２０】
本発明のある実施態様の１つの側面によれば、細胞において発現されるタンパク質のフコシル化の量が外部フコースの濃度に直線的に依存するように遺伝的に改変されている単離ＣＨＯ細胞が提供される。
【００２１】
本発明のある実施態様によれば、フコース結合剤は、突然変異されたＣＨＯ細胞集団に対して非毒性である。
【００２２】
本発明のある実施態様によれば、フコース結合剤は、検出可能な部分またはアフィニティー部分に付着する。
【００２３】
本発明のある実施態様によれば、ＣＨＯ細胞集団への遺伝的突然変異の導入は、細胞をＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ、すなわちフコース合成経路の遺伝子における突然変異を引き起こす突然変異原と接触させることによりなされる。
【００２４】
本発明のある実施態様によれば、突然変異された細胞集団がフコース結合剤と接触されている時間は、６０分以内である。
【００２５】
本発明のある実施態様によれば、フコース結合剤がアフィニティー部分に付着される場合、方法は、さらに、突然変異したＣＨＯ細胞集団を追加的な薬剤と接触させることを含み、そのような追加的な薬剤は、アフィニティー部分と同族の（cognate）結合部分を含む。
【００２６】
本発明のある実施態様によれば、アフィニティー部分はビオチンを含む。
【００２７】
本発明のある実施態様によれば、同族の結合部分は検出可能な部分に付着される。
【００２８】
本発明のある実施態様によれば、検出可能な部分は、蛍光部分または磁気部分を含む。
【００２９】
本発明のある実施態様によれば、除去は、ＦＡＣＳソーティングによりなされる。
【００３０】
本発明のある実施態様によれば、除去は、磁気分離によりなされる。
【００３１】
本発明のある実施態様によれば、除去は、少なくとも３回の連続的な除去によりなされる。
【００３２】
本発明のある実施態様によれば、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ／ＤＧ４４およびＰｒｏ−５から選択される。
【００３３】
本発明のある実施態様によれば、フコース結合剤は、ヒイロチャワンダケ（aleuria aurantia）レクチン（ＡＡＬ）またはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）１−フコース−特異的レクチン（ＡＯＬ）である。
【００３４】
本発明のある実施態様によれば、単離ＣＨＯ細胞は、野生型フコシルトランスフェラーゼ−８（Ｆｕｔ８）を発現する。
【００３５】
本発明のある実施態様によれば、単離ＣＨＯ細胞は、野生型ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース ３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）を発現する。
【００３６】
本発明のある実施態様によれば、突然変異されたＧＭＤは、配列番号２３および／または２４に記載のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
本発明のある実施態様によれば、単離ＣＨＯ細胞は、突然変異されたＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現する。
【００３８】
本発明のある実施態様によれば、単離細胞は、少なくとも３７０の細胞集団倍化に対して安定なフコース表現型を有する。
【００３９】
本発明のある実施態様によれば、単離ＣＨＯ細胞は、目的の組換えタンパク質を発現する。
【００４０】
本発明のある実施態様によれば、細胞培養培地はフコースを含む。
【００４１】
本発明のある実施態様によれば、細胞培養培地はフコースを含まない。
【００４２】
本発明のある実施態様によれば、トランスフェクションは、外因性フコースの存在下でなされる。
【００４３】
本発明のある実施態様によれば、方法はさらに、トランスフェクションに続き、本発明の単離ＣＨＯ細胞をフコース含有培養培地において培養することを含む。
【００４４】
ある実施態様によれば、組換えタンパク質は抗体である
【００４５】
ある実施態様によれば、組換えタンパク質はＦｃ融合タンパク質である。
【００４６】
ある実施態様によれば、抗体は増強されたＡＤＣＣを有する。
【００４７】
ある実施態様によれば、単離ＣＨＯ細胞は、突然変異ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現するように遺伝的に改変されている。
【００４８】
ある実施態様によれば、ＧＭＤの少なくとも１つのアレルが、少なくとも１つの機能喪失型突然変異を担持する。
【００４９】
ある実施態様によれば、ＧＭＤの各アレルが、少なくとも１つの機能喪失型突然変異を担持する。
【００５０】
ある実施態様によれば、外部フコースの濃度がゼロである場合、タンパク質のフコシル化の量はゼロである。
【００５１】
ある実施態様によれば、単離ＣＨＯ細胞は、非変異ＣＨＯ細胞より２０％高い積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を有する。
【００５２】
特段の定義がなされていない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および／または科学的用語は、当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料は、本発明の実施態様を実施する、または試験する場合に用いることができ、例示的な方法および／材料が後述される。対立する場合は、定義を含めて特許明細書が統制する。加えて、材料、方法および実施例は一例に過ぎず、限定されることを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本発明のいくつかの実施態様が、一例として、添付の図面やイメージを参照して本明細書に記載される。特にこれから詳細に図面を参照する場合、示される事項が例示であり、本発明の実施態様の例示的な説明を目的とするものであることが強調される。このため、図面になされた記載は、本発明の実施態様をどのように実施し得るかを当業者に明らかにするものである。
【００５４】
【図１】ゼロフコースレベルまたは低フコースレベルを有するポリペプチドを発現する細胞を得るために使用された実験的アプローチのフローチャートである。
【図２】抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂインタクトおよびモノマー精製処理のフローチャートである。
【図３】Ｏｃｔｅｔによる速度論的解析の例示的プロファイルである。
【図４】ＩＴＬ−ＬＦ１低フコース細胞（外部フコース非存在下でフコースゼロ）の単離のための例示的戦略を説明するダイアグラムである。ＣＨＯ−Ｓ細胞は、変異誘発剤メトトレキサート（ＭＴＸ）と共にインキュベートし、その後、ビオチン化フコース特異的レクチン（ビオチン化ＡＡＬ）で細胞を標識することおよびストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合しない細胞を単離することにより、低フコース細胞の選択を２回行った。この工程は、その後、細胞をビオチン化フコース特異的レクチン（ＡＡＬ）および蛍光ストレプトアビジンで標識した選択をもう１度行い、ＦＡＣＳによる低蛍光細胞のソーティングを行なった。
【図５】ＩＴＬ−ＬＦ１低フコース細胞の単離のための例示的戦略を説明するためのダイアグラムである。ＣＨＯ−Ｓ細胞を、変異原試薬ＭＴＸとインキュベートし、ビオチン化フコース特異的レクチン（ビオチン化ＡＡＬ）と蛍光ストレプトアビジンとで細胞標識を４回行い、ＦＡＣＳにより低蛍光細胞のソーティングを行った。
【図６】磁気ビーズ上での分離後のＭＴＸ処理および未処理ＣＨＯ−Ｓ細胞上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。ＭＴＸとインキュベートしたかまたはしていないＣＨＯ−Ｓ細胞をビオチン化ＡＡＬで標識し、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズと混合した。細胞を磁石で分離し、磁石に付着しなかった細胞をさらに増殖させた。細胞をビオチン化ＡＡＬで標識し、蛍光ストレプトアビジンで染色することによりＦＡＣＳ分析を行った。ＭＴＸで処理し、標標識していないＣＨＯ−Ｓ細胞（□）、ＭＴＸとインキュベートし、ＡＡＬで標識化したＣＨＯ−Ｓ細胞（○）、ＭＴＸでインキュベートし、ビーズでソートした低フコースＣＨＯ−Ｓ細胞（△）、ビーズでソートしたＣＨＯ−Ｓ（◇）。
【図７Ａ】磁気ビーズおよびＦＡＣＳにより単離されたＩＴＬ−ＬＦ１細胞上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。ＭＴＸとインキュベートされたＣＨＯ−Ｓ細胞は、ビオチン化ＡＡＬで標識され、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズと混合された。細胞を磁石上で分離し、磁石に付着しなかった細胞をさらに増殖させた。この工程は、２回繰り返された。その後、細胞をビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンで標識し、低蛍光細胞をＦＡＣＳによりソートし、さらに増殖させた。細胞をビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンで標識することによりＦＡＣＳ分析を行った。ＭＴＸで処理し、標識していないＣＨＯ−Ｓ細胞（□）、ＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（○）、ビーズ上での単回分離後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（△）、ビーズ上での２回分離サイクル後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（◇）、ビーズ上での２回分離サイクルおよび単回ＦＡＣＳソーティングサイクル後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（▼）。
【図７Ｂ】アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）１−フコース−特異的レクチン（ＡＯＬ）を用いて選択された細胞上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。標識していないＣＨＯ−Ｓ細胞（□）、ＣＨＯ−Ｓ細胞（○）、ビーズ上での単回分離の後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（△）、ビーズ上での２回分離サイクル後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（◇）、ビーズ上での２回分離サイクルおよび単回ＦＡＣＳソーティングサイクル後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（▼）。
【図８】種々の培地におけるＩＴＬ−ＬＦ１上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ１細胞をＰｒｏＣＨＯ５およびＣ６６１４において増殖させ、ビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンでの細胞の標識化後、ＦＡＣＳにより分析した。標識していないＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ（□）、ＰｒｏＣＨＯ５でのＣＨＯ−Ｓ（○）、ＰｒｏＣＨＯ５でのＩＴＬ−ＬＦ１（△）、Ｃ６６１４でのＩＴＬ−ＬＦ１（◇）。
【図９】種々の培地におけるＩＴＬ−ＬＦ１細胞上のシアル酸レベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ１細胞は、ＰｒｏＣＨＯ５およびＣ６６１４培地においてシアル酸レベルについて分析した。細胞をＦＩＴＣ共役シアル酸結合レクチン特異的レクチン（ＭＡＡ）で標識し、ＦＡＣＳで分析した。標識していないＣＨＯ−Ｓ細胞（□）、ＭＡＡ−ＦＩＴＣで標識したＣＨＯ−Ｓ細胞（○）、ＭＡＡ−ＦＩＴＣで標識したＰｒｏＣＨＯ５でのＩＴＬ−ＬＦ１細胞（△）、ＭＡＡ−ＦＩＴＣで標識したＣ６６１４でのＩＴＬ−ＬＦ１細胞（◇）。
【図１０】ＩＴＬ−ＬＦ１細胞のフコース安定性の評価を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ１細胞を、低フコース発現の安定性を評価するために、分離プロセスの完了後の種々の時点で細胞表面上のフコースレベルについてＦＡＣＳにより分析した。分析のために、細胞をビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンで標識した。
【図１１】ＩＴＬ−ＬＦ１細胞の増殖率の評価を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ１細胞を３６３細胞集団倍化（ＰＤＬｓ）に沿って増殖させ、増殖率を各継代後に決定した。
【図１２】。連続ＦＡＣＳソーティングにより単離されたＩＴＬ−ＬＦ２細胞のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。ＭＴＸでインキュベートしたＣＨＯ−Ｓ細胞を、ビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンで標識した。低蛍光細胞をＦＡＣＳによりソートし、さらに増殖させた。この手順を４回繰り返した。ＦＡＣＳ分析は、ビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンで細胞を標識化することにより行った。標識していないＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（□）、ＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（○）、１回目のソート後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（△）、２回目のソート後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（◇）、３回目のソート後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（▼）、４回目のソート後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（■）。
【図１３】種々の培地におけるＩＴＬ−ＬＦ２細胞上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞をＰｒｏＣＨＯ５およびＣ６６１４において増殖させ、ビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンでの細胞の標識後、ＦＡＣＳにより分析した。標識していないＣＨＯ−Ｓ（□）、ＰｒｏＣＨＯ５でのＣＨＯ−Ｓ（○）、ＰｒｏＣＨＯ５でのＩＴＬ−ＬＦ２（△）、Ｃ６６１４でのＩＴＬ−ＬＦ２（◇）。
【図１４】。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞上のシアル酸レベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ細胞をＰｒｏＣＨＯ５培地においてシアル酸レベルについて分析した。細胞をＦＩＴＣ共役シアル酸結合レクチン（ＭＡＡ）で標識し、ＦＡＣＳにより分析した。標識していないＣＨＯ−Ｓ細胞（□）、ＭＡＡ−ＦＩＴＣで標識したＣＨＯ−Ｓ細胞（○）、ＭＡＡ−ＦＩＴＣで標識したＰｒｏＣＨＯ５でのＩＴＬ−ＬＦ２細胞（△）。
【図１５】低フコース発現の安定性を評価するために、分離プロセスの完了後の種々の時点で細胞表面上のフコースのレベルを分析するためのＩＴＬ−ＬＦ２細胞のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。分析のために、細胞をビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンで標識した。
【図１６】ＩＴＬ−ＬＦ２細胞の増殖率を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞を３７０ＰＤＬｓに沿って増殖させ、増殖率を各継代後に決定した。
【図１７】ＰｒｏＣＨＯ５でのＩＴＬ−ＬＦ２細胞の最大細胞濃度の評価を説明するグラフである。細胞を、バッチプロセスにおいて０．２×１０6で播種し、細胞数を２日おきに測定した。ＣＨＯ−Ｓ細胞（○）およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞（△）。
【図１８】ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のフコシル化レベル対する外因性フコースの効果を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞を、種々の濃度のＬ−フコースを有するＰｒｏＣＨＯ５培地に濃度０．２×１０6細胞／ｍｌで播種し、ＣＯ2を備えた３２０ｒｐｍでの振とう器上の３７℃のインキュベーターでインキュベートした。
【図１９】タンパク質フコシル化経路およびｍＲＮＡ分析に可能性のある酵素を説明するためのダイアグラムである（□で記した）。
【図２０】フコシル化経路遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を説明する写真である。全ＲＮＡをＣＨＯ−Ｓ（Ｃ）およびＩＴＬ−ＬＦ２（ＬＦ）細胞から単離し、ポリｄＴを用い、その後遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲに付した。得られた産物をアガロースゲル上に走らせ、ＳｙｂｅｒＳａｆｅ（登録商標）染色によりＵＶ光下で検出した。予測サイズ：Ｆｕｔ８−１．７Ｋｂ；ＧＭＤ−１．１Ｋｂ；ＦＸ−１．２Ｋｂ；ＧＦＰＰ−１．７Ｋｂ；Ｍ−ＤＮＡサイズマーカー。
【図２１】全長ＧＭＤおよびスプライス変異体の間のタンパク質配列比較である。ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２細胞から抽出されたＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより調製されたｃＤＮＡｓをゲル上に走らせ、単離および配列決定した。その後、ｃＤＮＡ配列をＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアによりタンパク質に翻訳した。スプライス変異体１（ＳＶ１；図２１Ａ；配列番号２３）およびスプライス変異体２（ＳＶ２；図２１Ｂ、配列番号２４）のタンパク質配列を、全長ＧＭＤ遺伝子（配列番号２５）と比較した。破線は、欠失領域を示す。文字は、各スプライス変異体において欠失されたエクソンを示す。
【図２２Ａ】２つのＧＭＤスプライス変異体の制限酵素分析を説明する図である。ＧＭＤスプライス変異体内の独特な制限酵素部位の位置。
【図２２Ｂ】２つのＧＭＤスプライス変異体の制限酵素分析を説明する図である。制限後のバンドを示すアガロースゲル。サイズおよびそれらの説明は、以下の実施例の項の表７に詳述される。
【図２３】Ｑ−ＰＣＲによるＩＴＬ−ＬＦ２細胞対ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるフコシル化経路の遺伝子発現レベルの分析を説明するグラフである。ｃＤＮＡは、ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ（コントロール）ＲＮＡから調製され、エクソン５〜６（全長ＧＭＤｍＲＮＡおよび両スプライス変異体に存在する）上にある遺伝子特異的プライマーおよびプローブを利用するＱ−ＰＣＲ分析に付された。各遺伝子に関する結果は、４つの異なる日に置かれた細胞由来の、４つの別個のＲＮＡ抽出物から得られた。各抽出日からｃＤＮＡｓを調製し、Ｑ−ＰＣＲによりすべての遺伝子の検出に用いた。すべての試料を三重に行い、ベータ−アクチン内因性コントロールに対して正規化した。棒の上の数字は、対応のあるＴ検定統計分析を用いて算出した各遺伝子に対するＰ値である。有意差は、Ｐ値＜０．０５で示される。ＰＱ−コントロールからの発現の比。
【図２４】ベクターＭＢ−１２９（ｐＣＭＶ−Ｐ−ＧＭＤ）の概略図である。ＣＨＯ−Ｓ  ｗｔからの全長ＧＭＤ  ｃＤＮＡを、ベクターｐＣＭＶ−Ｐにクローン化した。ｐＣＭＶｐｒ−ヒトＣＭＶプロモーター。ＩＶＳ−ｈＣＭＶ  ＩＥ遺伝子のイントロンＡ。ＰＡＣ−ピューロマイシン耐性遺伝子。
【図２５】ＩＴＬ−ＬＦ２が、野生型ＧＭＤ  ｃＤＮＡでのトランスフェクションに際し、フコシル化を再獲得することを説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞を、フコースの存在下、Ｃ６６１４培地においてＧＭＤ  ｃＤＮＡ（ｐＣＭＶ−Ｐ−ＧＭＤ）を含むベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、フコースの非存在下でＰｒｏＣＨＯ５培地に移した。細胞を、ビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジンにより標識した後、ＦＡＣＳにより分析した。標識していないＣＨＯ−Ｓ（□）、ＣＨＯ−Ｓ（○）、ＩＴＬ−ＬＦ２（△）、ＧＭＤトランスフェクトＩＴＬ−ＬＦ２細胞（◇）。
【図２６】抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂを含むプラスミド、ＰＧＬ３抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ−ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１−ＤＨＦＲタンデムを説明するダイアグラムである。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂのＬＣおよびＨＣを含む線状プラスミドは、ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２のトランスフェクションのために使用された。ｍＣＭＶ−マウスサイトメガロウイルスプロモータ、ＥＭＣＶ−脳心筋炎ウイルス、ＩＲＥＳ−内部リボソーム侵入部位、ＰＡＣ−ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、ＤＨＦＲ−ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＨＣ−重鎖、ＬＣ−軽鎖、ＳＶ４０−シミアンウイルス４０、ｐＡ−ポリアデニル化。
【図２７】ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓプールにおける抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂの安定発現を説明するダイアグラムである。ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓは、抗ＥＧＦＲ    ｍＡｂ含有ベクター（ＰＧＬ３抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１−ＤＨＦＲタンデム）でトランスフェクトした。回収後。生産性をプールにおいて評価した。
【図２８】ＩＴＬ−ＬＦ２抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。フコースの除去前後でのＣ６６１４培地において増殖させた抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞の膜上のフコースレベルの分析。標識していないＣＨＯ−Ｓ（□）、ＰｒｏＣＨＯ５でのＣＨＯ−Ｓ（○）、Ｃ６６１４でのＩＴＬ−ＬＦ２（◇）、フコース存在下Ｃ６６１４での抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂでトランスフェクトされたＩＴＬ−ＬＦ２（▼）、フコース非存在下Ｃ６６１４での抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂでトランスフェクトされたＩＴＬ−ＬＦ２（△）。
【図２９】ＩＴＬ−ＬＦ２抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞上のシアル酸レベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。ＰｒｏＣＨＯ５培地において増殖させた抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞の膜上のシアル酸レベルの分析。細胞をＦＩＴＣ共役シアル酸結合レクチン（ＭＡＡ）で標識し、ＦＡＣＳにより分析した。標識していないＣＨＯ−Ｓ（□）、ＣＨＯ−Ｓ（○）、ＩＴＬ−ＬＦ２（◇）、抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ（▼）、抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂでトランスフェクトされたＩＴＬ−ＬＦ２（△）。
【図３０】ＩＴＬ−ＬＦ２細胞への一過性トランスフェクションのために構築されたベクターの説明図である。ベクターＭＢ−１２７およびＭＢ−１２８は、ベクターｐＴＴ５の骨格上に構築された。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ−ＬＣ−  ＥＧＦＲ  ｍＡｂの軽鎖；抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ−ＨＣ−  ＥＧＦＲ  ｍＡｂの重鎖。
【図３１】ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞における抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂの一過性発現を説明する棒グラフである。ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞は、ＰｒｏＣＨＯ５培地において抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ含有ＰＴＴ５ベクターで一時的にトランスフェクトされた。トランスフェクションの条件は、細胞の型に特異的であった。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞にＶＰＡを補足し、３１℃に移した。ＣＨＯ−ＳにＶＰＡを補足し、細胞をトランスフェクション後２４時間増加させた（boost）。
【図３２】抗体上の糖残基レベルのＦＡＣＳによる分析を説明する説明図である。粗製収穫物または精製抗体試料をプロテインＧ被覆磁気ビーズと混合し、その後蛍光ラベルレクチンに結合させた。フコースレベルを蛍光によるＦＡＣＳにより測定した。
【図３３】ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓにおいて一時的に発現された抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のフコースレベルのＦＡＣＳによる分析を説明するグラフである。粗製収穫物試料をプロテインＧ被覆磁気ビーズと混合し、その後ビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジン混合物に結合させた。フコースレベルを蛍光によるＦＡＣＳにより測定した。磁気ビーズ（□）、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ（○）、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ（△）。
【図３４】ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ培養物において安定に発現された抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ由来の粗製収穫物上のフコースレベルのＦＡＣＳによる分析を説明するグラフである。粗製収穫物試料をプロテインＧ被覆磁気ビーズと混合し、その後ビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジン混合物に結合させた。フコースレベルを蛍光レベルによりＦＡＣＳにより測定した。磁気ビーズ（□）、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（○）、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（△）。
【図３５】ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ培養物において安定に発現された抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ由来の粗製収穫物上のシアル酸レベルのＦＡＣＳによる分析を説明するグラフである。粗製収穫物試料をプロテインＧ被覆磁気ビーズと混合し、その後ＦＩＴＣ共役ＭＡＡに結合させた。シアル酸レベルを蛍光レベルによりＦＡＣＳにより測定した。磁気ビーズ（□）、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞由来の粗製収穫物（○）、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクト細胞由来の粗製収穫物。
【図３６】ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓにおいて安定に発現された抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。精製した抗体試料をプロテインＧ被覆磁気ビーズと混合し、その後ビオチン化ＡＡＬおよび蛍光ストレプトアビジン混合物に結合させた。フコースレベルを蛍光レベルによりＦＡＣＳにより測定した。磁気ビーズ（□）、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（○）、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（△）。
【図３７】ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓにおいて安定に発現された抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のシアル酸レベルのＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。精製抗体試料をプロテインＧ被覆磁気ビーズと混合し、その後ＦＩＴＣ共役ＭＡＡに結合させた。シアル酸レベルを蛍光レベルによりＦＡＣＳにより測定した。磁気ビーズ（□）、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ（○）、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ（△）。
【図３８】精製したインタクトな抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のフコースレベルのＯｃｔｅｔ分析の読み出しである。ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２由来の抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂの精製産物−Ｏ.Ｄ.２８０で２２５μｇ／ｍｌを、ストレプトアビジンでプレコートしたバイオセンサに事前に付着されたビオチン化ＡＡＬ（２μｇ／ｍｌ）に結合した。グラフは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステムによる速度論的分析の結合工程を表す。各曲線は矢印により示された特定の試料を表す。
【図３９】精製したインタクトな抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のシアル酸レベルのＯｃｔｅｔ分析の読み出しである。ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂの精製産物−Ｏ.Ｄ.２８０で１１５μｇ／ｍｌを、ストレプトアビジンでプレコートしたバイオセンサに事前に付着されたビオチン化−ＭＡＡ（１０μｇ／ｍｌ）に結合した。グラフは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステムによる速度論的分析の結合工程を表す。各曲線は矢印により示された特定の試料を表す。
【図４０】Ｏｃｔｅｔによる精製した抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマー上のフコースレベルの分析のグラフである。ＣＨＯ−Ｓ細胞およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂのＦｃ画分−Ｏ.Ｄ.２８０で４０μｇ／ｍｌを、ストレプトアビジンでプレコートしたバイオセンサに事前に付着されたビオチン化−ＡＡＬ（１μｇ／ｍｌ）に結合した。グラフは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステムによる速度論的分析の結合工程を表す。各曲線は矢印により示された特定の試料を表す。
【図４１】Ｏｃｔｅｔによる精製した抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマー上のシアル酸レベルの分析のグラフである。ＣＨＯ−Ｓ細胞由来およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂのＦｃ画分−Ｏ.Ｄ.２８０で２５０μｇ／ｍｌを、ストレプトアビジンでプレコートしたバイオセンサに事前に付着されたビオチン化ＭＡＡ（１０μｇ／ｍｌ）に結合した。グラフは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステムによる速度論的分析の結合工程を表す。各曲線は矢印により示された特定の試料を表す。
【図４２】ｉＣＥ２８０による抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ精製産物の荷電プロファイル分析の結果を示すグラフである。ＣＨＯ−Ｓ細胞由来（■）およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来（▲）の抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂの精製産物−Ｏ.Ｄ.２８０で０．４ｍｇ／ｍｌを、ｉＣＥ２８０で分析した。点はｉＣＥ２８０プロファイルにおけるアイソフォームのピーク面積の％を示す（図中の線は、連続した関数を表すものではなく、同じ産物のアイソフォームを理解し易いようにのみ記載されたものであるということに留意）。
【図４３】抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃ画分に関するグリカンプロファイルを提供する表である。
【図４４】ＩＴＬ−ＬＦ２  ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞のフコシル化レベルに対する外因性フコースの効果を説明するグラフである。ＩＴＬ−ＬＦ２抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞を、ＰｒｏＣＨＯ５培地に０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度でＬ−フコースの種々の濃度で播種し、ＣＯ2を含む３２０ｒｐｍでの振とう器上の３７℃インキュベーターでインキュベートした。
【図４５】ＥＧＦＲ  ｍＡｂのフコシル化レベルに対する外因性フコースの効果を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、そのいくつかの実施態様において、ゼロフコースＣＨＯ細胞および細胞株、その作製方法およびそれらの使用に関する。
【００５６】
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に詳細に記載されるかまたは実施例により例示されるものにその適用において限定されるものではないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施態様とすることができ、また多種多様な方法により実現することまたは実施することができる。
【００５７】
組換えタンパク質、たとえば増強されたＡＤＣＣを得るための抗体のフコシル化レベルを低減させるために、本発明者らは、それらの細胞表面に変異グルコシル化パターンを発現するように改変されたＣＨＯ−Ｓ細胞から細胞株を開発した。これは、ＭＴＸの存在下で細胞をインキュベートし、細胞膜上の最も低いフコースレベルを有する細胞を効率的に選択することによりなされた。
【００５８】
選択は、抗体のＦｃグリコシル化部位上に存在するαＦｕｃ１−６ＧｌｃＮＡ残基への高い親和性を有するフコース特異的レクチン（たとえばヒイロチャワンダケ（aleuria aurantia）レクチン（ＡＡＬ）またはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）１−フコース−特異的レクチン（ＡＯＬ））を用い、磁気ビーズ上での単離およびＦＡＣＳソーティング（図７Ａ〜Ｂ）、またはＦＡＣＳソーティングのみ（図１２）のいずれかにより行われた。
【００５９】
ゼロフコース発現細胞の選択は、細胞膜上のフコースレベルにより行われるが、種々の方法により分析した場合に、これらの細胞において発現された組換え抗体（抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ）上で同じフコースレベルが見られた（図３３〜４１）。
【００６０】
フコースを含む培地において細胞をインキュベートすることにより、本発明者らは、そこで発現される組換えタンパク質上のフコシル化のレベルが制御可能であるということを示した。この結果は、再現可能であることが示された。
【００６１】
さらに、本発明の細胞の表現型は、試験された３７０ＰＤＬｓに関して安定であることが見いだされた（図１５）。したがって、このような細胞は、それ自身、１００ＰＤＬｓ以上が要求される組換えタンパク質の産生細胞として役に立つものである。
【００６２】
ゼロフコース発現細胞（ＩＴＬ−ＬＦ２細胞と名付られた）の増殖率は、フコース安定性試験の間測定され、ＩＴＬ−ＬＦ２が誘導されたＣＨＯ−Ｓと同様に、集団倍化時間（ＰＤＴ）約１５〜２０時間という結果となった（図１１）。
【００６３】
フコシル化に関与することが知られている鍵タンパク質の分析により、本発明の選択された細胞におけるＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）のｍＲＮＡサイズが、それらの野生型対応物におけるものよりも短いことが明らかとなり（図２０）、配列から、２つのスプライス変異体であることが明らかとなった。細胞から抽出されたそのｍＲＮＡ分子は、３番目および４番目のエクソンを欠いているか、８番目および９番目のエクソンを欠いているかのいずれかであった（図２１Ａ〜Ｂおよび図２２Ａ〜Ｂ）。
【００６４】
本発明者らは、本明細書に開示される特別な特性を有する細胞型を作製および同定するための方法が、さらなる有用な細胞型を選択するために利用できるということを提案する。
【００６５】
したがって、本発明の１つの側面によれば、組換えタンパク質を発現するための宿主細胞として有用なＣＨＯ細胞を選択する方法であって、
（ａ）メトトレキサート（ＭＴＸ）に細胞を接触させることにより遺伝的突然変異をＣＨＯ細胞の集団に導入する工程、
（ｂ）突然変異細胞を含むＣＨＯ細胞の集団を、フコース結合剤と、該フコース結合剤が細胞集団の細胞膜上のフコース部分に結合するのに充分な時間接触させる工程であって、その時間が細胞の殺傷を可能としない時間である工程；および
（ｃ）細胞の集団から、フコース結合剤に結合する細胞の亜集団を除去し、それにより組換えタンパク質の発現のために宿主細胞として有用な細胞を選択する工程であって、選択された細胞はゼロフコース含有量を有する工程
を含む方法が提供される。
【００６６】
チャイニーズハムスター卵巣組織誘導ＣＨＯ細胞または本発明により適切な細胞株は、チャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ種（Cricetulus griseus））の卵巣組織から確立された細胞株である任意の細胞である。具体例としては、Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Nat Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Nat Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Nat Acad, Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900)などの文献に記載されたＣＨＯ細胞があげられる。さらに、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）に登録されたＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９０９６）およびＰｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７８１）や、ＣＨＯ−Ｓ（ライフテクノロジー、カタログ番号１１６１９）または種々の培地を用いてこの細胞株を適合させることにより得られたサブ−細胞株も本発明において用いることができる。
【００６７】
ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ−１Ｅ５、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−３ＦまたはＣＨＯ−２．６クローンである。
【００６８】
突然変異原ＭＴＸは、フコース合成経路に関与する遺伝子またはポリペプチドに突然変異をもたらす。
【００６９】
述べたように、本発明の１つの側面の方法は、ＣＨＯ細胞の突然変異された集団を、突然変異した細胞の細胞膜にフコース結合剤が結合するようにそのフコース結合剤と接触させることによってなされる。
【００７０】
本明細書において使用される場合、語句「フコース結合剤」は、少なくとも１×１０-5のＫｄで細胞表面のフコース部分に結合することができる任意の薬剤（たとえばレクチン）を意味する。１つの実施態様によれば、フコース結合剤は、αＦｕｃｌ−６ＧｌｃＮＡ残基に少なくとも１×１０-3のＫｄで（Matsumura, Higashida et al. 2009）、たとえば少なくとも１×１０-4のＫｄで、少なくとも１×１０-5のＫｄで、少なくとも１×１０-6のＫｄで、または少なくとも１×１０-7のＫｄで結合する。
【００７１】
１つの実施態様によれば、フコース結合剤は、ポリペプチド、たとえばレクチンである。
【００７２】
本発明により考慮される例示的なレクチンとしては、ヒイロチャワンダケ（aleuria aurantia）レクチン（ＡＡＬ）またはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）１−フコース−特異的レクチン（ＡＯＬ）およびハリエニシダ（Ulex europaeus）凝集素（ＵＥＡ）および（Oda, Senaha et al. 2003; Tateno, Nakamura-Tsuruta et al. 2009）に開示されたものが挙げられるが、それらに限定されるものではなく、またその文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
述べたように、接触は、細胞膜上のフコースへのフコース結合剤の結合を可能とする条件下でなされる。１つの実施態様によれば、結合は、レクチンがその結合する細胞に死（すなわち細胞枯渇）をもたらさない条件下でなされる。
【００７４】
特定の実施態様によれば、結合は、レクチンがその結合する細胞の５０％よりも多い細胞に死をもたらさない条件下でなされる。
【００７５】
特定の実施態様によれば、結合は、レクチンがその結合する細胞の４０％よりも多い細胞に死をもたらさない条件下でなされる。
【００７６】
特定の実施態様によれば、結合は、レクチンがその結合する細胞の３０％よりも多い細胞に死をもたらさない条件下でなされる。
【００７７】
特定の実施態様によれば、結合は、レクチンがその結合する細胞の２０％よりも多い細胞に死をもたらさない条件下でなされる。
【００７８】
１つの実施態様によれば、結合は、３時間以下、好ましくは２時間以下、なおより好ましくは１時間以下でなされる。
【００７９】
１つの実施態様によれば、本発明のこの側面のフコース−結合剤は、その結合剤に結合される細胞集団の枯渇（直接的または間接的のいずれか）を許す機能的部位に結合される。
【００８０】
したがって、フコース結合剤は、蛍光部分または磁気部分などの検出可能な部分に結合することができるが、それらに限定されるものではない。
【００８１】
例示的な蛍光部分としては、フルオレセインまたはその誘導体、たとえばフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン、東京グリーン、ＳＮＡＦＬ、カルボキシナフトフルオレセイン（ＣＦＳＥ）、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＰＥ−Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ）、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＰＥ−Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＰＣ−Ｃｙ７およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００８２】
あるいは、フコース結合剤は、アフィニティー部分に結合されていてもよい。
【００８３】
本明細書において使用される場合、用語「アフィニティー部分」は、同族の（cognate）結合部分と選択的に相互作用ができる分子、たとえばビオチン／アビジン、リガンド／レセプターなどを意味する。
【００８４】
フコース結合剤をアフィニティー部分または検出可能な部分に結合するための詳細なプロトコールは、本明細書の以下の実施例の項において見ることができる。
【００８５】
フコース結合剤を蛍光部分に（直接または同族の結合分子により間接的に）結合する場合、突然変異した細胞集団は、たとえば蛍光−活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）の使用によるなど公知の細胞ソーティング手順を用いて不要な細胞を除去できる（may be depleted）ことが理解されよう。
【００８６】
複数のフローサイトメーターが市販されており、たとえばベクトン・デッキンソン  ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（ＢＤ  バイオサイエンス、マウンテンビュー、ＣＡ）などがある。ＦＡＣＳ分析に使用され得る抗体は、Schlossman S, Boumell L, et al.,［Leucocyte Typing V. New York: Oxford University Press; 1995］に教示されており、広く市販されている。
【００８７】
フコース結合剤を磁気部分に（直接または同族の結合分子により間接的に）結合する場合、突然変異した細胞集団は、磁気活性化細胞分離により不要な細胞を除去することができる。
【００８８】
フコース結合剤をアフィニティー部分に結合する場合、突然変異された細胞集団は、同族の結合分子とのアフィニティー精製により不要な細胞を除去することができる。したがって、たとえば、フコース結合剤をビオチンに結合させた場合、突然変異した細胞集団は、ストレプトアビジンビーズまたはカラムで精製することにより不要な細胞を除去することができる。たとえば、フコース結合剤が抗体または抗体のＦｃに結合された場合、突然変異された細胞集団は、プロテインＡビーズまたはカラムでの精製により不要な細胞を除去することができる。
【００８９】
上述したように、同族の結合分子は、それ自身が検出可能な部分に結合され、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳにより同族の結合分子の添加後、除去がなされる。
【００９０】
不要な細胞集団の除去が、連続的な除去の複数の回数（たとえば、２、３またはそれ以上の回数）においてなされ得ることが理解されよう。さらに、除去工程は、同じ方法（たとえばもっぱらＦＡＣＳベースの分離）を用いた連続的除去を複数回含むか、または複数の異なる方法が組み合わされる（たとえば、磁気ビーズ分離とその後の蛍光ビーズ分離など）。
【００９１】
１つの実施態様によれば、除去の回数と特定の方法は、フコース結合剤が結合する細胞が、実質的に除去されるように選択される。
【００９２】
用語「実質的に除去される」は、特定の細胞型の少なくとも５０％以上の除去、たとえば特定の細胞型の少なくとも約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９７％など、少なくとも９９％、９９．５％、９９．９％それ以上などの除去を意味することを意図とする。
【００９３】
特定の実施態様によれば、フコース結合剤が結合する細胞は、実質的に除去され、細胞膜上にゼロフコースを有する細胞のみが維持される。
【００９４】
上記除去後に外部フコースが細胞に添加されると、特定のフコース含有量を有する種々の細胞が、添加されたフコースの量に応じて得られる。
【００９５】
したがって、もう１つの実施態様によれば、５０％より少ないフコースをその細胞膜に有するＣＨＯ細胞が、野生型（すなわち、メトトレキサート処理前の）細胞と比較して得られる。
【００９６】
もう１つの実施態様によれば、４０％より少ないフコースをその細胞膜に有するＣＨＯ細胞が、野生型（すなわち、メトトレキサート処理前の）細胞と比較して得られる。
【００９７】
もう１つの実施態様によれば、３０％より少ないフコースをその細胞膜に有するＣＨＯ細胞が、野生型（すなわち、メトトレキサート処理前の）細胞と比較して得られる。
【００９８】
もう１つの実施態様によれば、２０％より少ないフコースをその細胞膜に有するＣＨＯ細胞が、野生型（すなわち、メトトレキサート処理前の）細胞と比較して得られる。
【００９９】
もう１つの実施態様によれば、１０％より少ないフコースをその細胞膜に有するＣＨＯ細胞が、野生型（すなわち、メトトレキサート処理前の）細胞と比較して得られる。
【０１００】
本発明の細胞集団を単離した後、それらを培地中で、また発酵装置またはバイオリアクターなどの培養物を増殖させるために使用することのできる任意の装置において、増殖させてもよい。それらは、単層として増殖されてもよく、または表面に付着されてもよい。あるいは、単離された細胞集団は、懸濁液において増殖させることもできる。
【０１０１】
細胞は、血清不含の培養培地において増殖させることができる。培地は、市販されている培地でよく、たとえばＰｒｏＣＨＯ５（ロンザ、カタログ番号ＢＥ１２−７６６Ｑ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ-パウダー培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス、カタログ番号Ｃ６６１４）または８ｍＭ  Ｌ−グルタミンなどのグルタミンを補足したＯｐｔｉ−ＣＨＯ（インビトロジェン、カタログ番号１２６８１）などがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
１つの実施態様によれば、培地は、キセノ不純物を含まない、たとえば動物由来成分を含まない。
【０１０３】
もう１つの実施態様によれば、細胞は、無限増殖を可能とする条件（たとえば培地およびスペース）下で、細胞培地中で増殖される、すなわち細胞株。
【０１０４】
単離されたＣＨＯ細胞は、継代の数の多い培養物に対してそれらの変異グリコシル化パターン（すなわち低フコース発現）を維持できる、すなわち高い安定性を有する。１つの実施態様によれば、改変ＣＨＯ宿主細胞は、３７０継代後でさえその変異グリコシル化パターンを維持できることが見いだされた。
【０１０５】
本発明者らは、本明細書に記載された方法により選択されたＣＨＯ細胞は、特別な表現型、すなわち突然変異ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）の発現を有し、それは、それらの細胞膜の低フコシル化の原因となる。
【０１０６】
突然変異誘発後の細胞は、機能喪失型突然変異を有するＧＭＤの少なくとも１つのアレルを含み得る。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、用語「アレル」は、遺伝子座の１つ以上の代替的な形態のいずれかを意味し、それらのアレルすべては、形質または特徴に関連する。二倍体細胞または二倍体生物において、所定の遺伝子の２つのアレルは、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。
【０１０８】
「機能喪失型突然変異」は、遺伝子配列の突然変異であって、遺伝子産物、通常タンパク質の機能を減少させるかまたは完全に喪失させる。機能喪失型突然変異は、たとえば、フレームシフトやナンセンス突然変異による遺伝子産物の切断により生じる。機能喪失型突然変異を有するアレルと関連した表現型は、通常劣性であるが、優性にもなり得る。
【０１０９】
本発明は、ＧＭＤの両アレルが機能喪失型突然変異を持つ細胞をも予期するものであることが理解されよう。そのような場合、ＧＭＤは、ホモ接合型またはヘテロ接合型であり得る。この実施態様によれば、ホモ接合性とは、ＧＭＤ遺伝子座で両アレルが同じヌクレオチド配列により特徴付けられる状態である。ヘテロ接合性とは、ＧＭＤ遺伝子座での遺伝子の異なる状態を意味する。
【０１１０】
具体的には、本発明者らは、突然変異生成と本発明の選択手順後のＣＨＯ細胞が、配列番号２３および２４に記載されたＧＭＤの２つの変異体型を発現し、それらはそれぞれＧＭＤ遺伝子のエクソン３および４の欠失とエクソン８および９の欠失に対応するということを見出した。
【０１１１】
したがって、本発明の別の側面によれば、配列番号２３および／または２４に記載されたアミノ酸配列を有する突然変異ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現するために遺伝的に改変されている単離ＣＨＯ細胞が提供される。
【０１１２】
本発明のこの側面における細胞は、機能的なフコシルトランスフェラーゼ−８（Ｆｕｔ８）を発現することが見出された。機能的なＦｕｔ８は、配列番号２９に記載のポリペプチド配列を有する野生型Ｆｕｔ８であり得る。
【０１１３】
さらに、本発明の細胞は、機能的なＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース ３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）を発現する。機能的ＦＸは、配列番号３０に記載のポリペプチド配列を有する野生型ＦＸであり得る。
【０１１４】
本発明者らは、本明細書に記載された方法により作製されたＣＨＯ細胞を、収穫または回収できる糖タンパク質、たとえば抗体またはＦｃ融合タンパク質を産生するために使用できることを見出した。その糖タンパク質は、本明細書にさらに説明されるように、分泌され、変異フコシル化パターンを示し、および／または治療用途を有する。そのような糖タンパク質は、たとえば本明細書にさらに説明されるように、未改変の親の宿主細胞において産生された対応する抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を有する抗体などの抗体であり得る。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、「抗体依存性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、ＦｃＲｓを発現するエフェクター細胞（たとえばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が標的細胞の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の細胞溶解を引き起こす細胞介在反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞は、ＮＫ細胞、単球およびマクロファージを含む。ＮＫ細胞は、通常Ｆｃ．ガンマ．ＲＩＩＩを主に発現し、単球はＦｃ．ガンマ．ＲＩ、Ｆｃ．ガンマ．ＲＩＩおよびＦｃ．ガンマ．ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) に要約されている。
【０１１６】
「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲｓを発現しエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃ．ガンマ．ＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを介在するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣｓおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然の起源から、たとえば本明細書において説明しているように血液または末梢血単核細胞から単離してもよく、または当該技術分野において公知の方法を用いてインビトロで増殖させてもよい。
【０１１７】
１つの実施態様において、本発明のＣＨＯ細胞株から産生される抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をヒトエフェクター細胞の存在下で、対象抗体が同等の量で適用される場合、親の宿主細胞により産生された対応する抗体よりも効果的に媒介する。通常、ＡＤＣＣ活性は、本明細書に開示されたアッセイを用いて確かめることができるが、ＡＤＣＣ活性を測定するための他のアッセイまたは方法、たとえば動物モデルにおける方法なども予期される。本発明のＣＨＯ細胞株から得られた抗体は、たとえばさらに米国特許出願公開第２０１０／００８１１５０号明細書に記載されているようなインビボまたはインビトロアッセイシステムにおいても、親の抗体よりも効果的にＡＤＣＣを媒介する。米国特許公開第２０１０／００８１１５０号は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【０１１８】
このように、単離された細胞集団または、変異フコシル化パターンを得られるようにすでに改変された本開示の細胞株は、さらに、異種ポリヌクレオチド配列を含むように改変されてもよい。そのような配列は、遺伝子のコーディング領域または非コーディング領域、または遺伝子フラグメント、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイムなどを含む。異種配列は、タンパク質様部分をコードしてもよく、タンパク質様部分とは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸配列を意味し、任意の長さのアミノ酸のポリマーを包含する。異種ポリヌクレオチド配列は、通常、組換えポリペプチドの発現を可能とするプロモーター（つまり発現ベクター中に）に作動可能に連結される。
【０１１９】
１つの実施態様によれば、本発明のＣＨＯ細胞のトランスフェクションは、外因性フコースの存在下でなされる。フコースの予定濃度としては、１〜２０μｇ／ｍｌ、たとえば１０μｇ／ｍｌである。
【０１２０】
図４４に説明されているように、組換えポリペプチドのフコシル化の量は、フコース中でトランスフェクトされた細胞をインキュベートすることにより制御できる。フコースの予定濃度としては、１〜１０μｇ／ｍｌ、たとえば２．５〜５μｇ／ｍｌ、たとえば３．５μｇ／ｍｌである。
【０１２１】
したがって、細胞膜上でフコシル化されず、可変のフコシル化の程度のタンパク質を発現できるＣＨＯ細胞の集団が提供される。フコシル化の量は、トランスフェクション時およびトランスフェクション後の培養培地中のフコースの量に依存する。組換えポリペプチドのフコシル化の量は、ゼロ〜１００％の範囲であり得る。
【０１２２】
挿入したコーディング配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含める以外に、用いられる発現構築物は、発現されるペプチドの安定性、生産、精製、収率または毒性を高めるために操作された配列も含めることができる。たとえば、本発明のある実施態様のタンパク質と異種タンパク質とを含む融合タンパク質または切断可能な融合タンパク質の発現が設計可能である。そのような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより、たとえば異種タンパク質に特異的なカラム上への固定化により、その融合タンパク質が容易に単離できるように設計することができる。切断部位がタンパク質と切断可能な融合タンパク質との間に設計された場合、切断可能な融合タンパク質は、切断部位を分断する適切な酵素または試薬による処理によりクロマトグラフのカラムから放出させることができる［たとえば、Booth et al. (1988) Immunol. Lett. 19:65-70;および Gardella et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:15854-15859参照］。
【０１２３】
１つの実施態様によれば、精製は、外因性フコースの非存在下で行われる。
【０１２４】
核酸の調製は、種々のルーチンな組換え技術および合成手法により行うことができる。標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術が本技術分野において公知であり、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989)(Maniatis) および T.J. Silhavy, M.L. Bennan, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1984) および Ausubel, F.M.et al, Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) に説明されている。簡単に言えば、対象核酸が調製され、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡｓおよびＲＮＡｓのすべては細胞から直接抽出するか、またはＰＣＲやｒｔ−ＰＣＲなどであるがこれらに限定されるものではない種々の増幅プロセスにより組換え的に生産することができる。
【０１２５】
記述したように、本発明のＣＨＯ細胞は、抗体産生のための宿主細胞として使用することができる。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【０１２６】
ある実施態様において、抗体は阻害抗体である。阻害抗体は、その抗体の結合する抗原の１つ以上の生物学的活性を阻害し得る。たとえば、阻害抗体は、抗原の活性を阻害するかまたは抗原の発現を阻害することにより、対応する抗原のシグナル伝達をダウンレギュレートすることができる。ある実施態様において、抗体は中和抗体である。中和抗体は、可溶性抗原のまたは生きている微生物、たとえば感染性因子などのいくつかの生物学的活性を低減するか無効化する。中和抗体は、その抗原の天然のリガンドまたはレセプターと競争し得る。ある実施態様において、抗体は、刺激または活性抗体である。刺激または活性抗体は、抗原に結合し、抗原の活性を活性化またはアップレギュレートするか、または抗体が結合する抗原の発現をアップレギュレートし得る、対応する抗原のシグナル伝達を活性化するアゴニスト抗体であり得る。
【０１２７】
本発明において使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな分子のみならず、次のように、他のポリペプチドまたはタンパク質に直接、または適切なポリペプチドを介して結合される重鎖の定常領域を含む遺伝的に操作された分子、と定義されるＦｃ融合タンパク質などのその機能的フラグメントを含む。
【０１２８】
非−ヒト（たとえばマウス）抗体のヒト化型は、非ヒトイムノグロブリン由来の最少配列を含むキメラのイムノグロブリン分子、イムノグロブリン鎖またはフラグメントである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非−ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられているヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの場合において、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非−ヒト残基により置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、輸入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見られない残基も含む。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは非−ヒトイムノグロブリンのものに対応するＣＤＲ領域の実質上すべておよびＦＲ領域のすべてまたは実質上すべてが、ヒトイムノグロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの種々のドメインのすべてを実質的に含む。ヒト化抗体はまた、最適には、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトイムノグロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１２９】
１つの実施態様において、軽鎖および重鎖は、別個の改変された宿主細胞培養物であって同じ種または異なる種のいずれかに形質転換され得る。代替的な実施態様では、軽鎖および重鎖に対する別個のプラスミドが、単一の改変宿主細胞培養物を同時形質転換するために使用することができる。別の実施態様では、両遺伝子を含み、軽鎖および重鎖両方に対して遺伝子を発現させることができる単一の発現プラスミドが、単一の改変された宿主細胞培養物に形質転換されてもよい。
【０１３０】
重鎖および軽鎖が同じ宿主から同時に発現される場合、単離手順は、再構成された抗体を回収するために設計された。これは、たとえば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手法により達成することができる。
【０１３１】
本発明の細胞において生産される組換え抗体は、抗体のエフェクター機能を増加させるために変異フコシル化パターンを有する。好ましくは、本発明の組換え抗体は、ＡＤＣＣ関連フコース残基であるＦｃモノマー上の低いフコースレベルを有し、それにより抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増加させる。
【０１３２】
１つの実施態様によれば、産生される抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３型抗体である。
【０１３３】
変異フコシル化パターンを有し、および／または本開示の改変されたＣＨＯ宿主細胞により産生される抗体は、ガン抗原などの抗原に結合し得る。ガン抗原は、ＨＥＲ２、イムノグロブリンエプシロンＦｃレセプターＩＩ、Ａｌｋ−１、ＣＤ２０、ＥＧＦレセプター、ＶＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＮＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、ＥｐＣａｍ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５１、ＣＤ５５、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＴＬＡ−４、ムチン１、ムチン１６、エンドグリン、メソテリンレセプター、Ｎｏｇｏレセプター、葉酸レセプター、ＣＸＣＲ４、インスリン−様成長因子レセプター、ガングリオシドＧＤ３、ならびにアルファおよびベータインテグリンからなる群より選択される。
【０１３４】
本発明の細胞において産生される抗体の例としては、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、ダゼツズマブ、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））、エプラツズマブ、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、チウキセタン、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、トラツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、オクレリズマブ、ペルツズマブ、ｈｕ  Ｍ１９５Ｍａｂ、抗−Ａｂｅｔａ、抗−ＣＤ４、抗−ｏｘＬＤＬ、トランスツズマブ−ＤＭ１、アポマブ、ｒｈｕＭＡｂ  ＧＡ１０１、抗−ＯＸ４０Ｌ、イピリムマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、ザルツムマブ、モタビズマブ、エクロメキシマブ、ＭＤＸ０１０、４Ｂ５、ＴＮＸ−９０１、ＩＤＥＣ−１１４、および抗原に特異的であり、かつＡＤＣＣを誘導できる任意のＦｃ抗体フラグメントなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１３５】
本明細書において使用される場合、用語「約」は、±１０％を意味する。
【０１３６】
用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（having）」およびそれらの同義語は、「含むが限定されるものではない」ことを意味する。
【０１３７】
本件出願を通して、本発明の種々の実施態様は、幅をもった形式で表され得る。幅をもった形式での記載は、単に便宜および簡略のためのものであり、本発明の範囲への柔軟性のない制限と解釈するべきものではないことは理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能なサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数値すべてを具体的に開示しているものとみなされるべきである。たとえば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数字も開示されているとみなすべきである。
【０１３８】
数値範囲は本明細書に示されている場合はいつでも、示された範囲内の任意の引用数（分数または整数）を含むことが意図される。句、最初の表示数と２番目の表示数との「間を変動する（ranging）／変動する（ranges）」、および最初の表示数「から」２番目の表示数「まで変動する（ranging）／変動する（ranges）」は、本明細書において、区別なく用いられ、最初の表示数と２番目の表示数を含み、それらの間の分数および整数すべてを含むことが意図される。
【０１３９】
本明細書において使用される場合、用語「方法」は、所定の目的を達成するためのやり方、手段、技術および手順を意味し、公知のそれらのやり方、手段、技術および手順または公知のやり方、手段、技術および手順から化学、薬理学、生物学、生化学および医学の分野の専門家により容易に発展されるそれらのやり方、手段、技術および手順が挙げられるがそれらに限定されるものではない。
【０１４０】
明確にするために、個々の実施態様の内容において説明されている本発明のある特徴は、単一の実施態様において組み合わせても提供され得ることが理解されるであろう。反対に、簡略のために単一の実施態様の内容において説明されている本発明の種々の特徴は、別々にも、または任意の適切なサブコンビネーションで、または本発明のその他に説明された実施態様に適切なものとしても提供される。種々の実施態様の内容において記載されたある特徴は、その実施態様がそれらの要素なしでは作動できない場合を除いて、その実施態様の必須の特徴とみなされるべきではない。
【０１４１】
これまで本明細書に説明し、そして特許請求の範囲において請求されている本発明の種々の実施態様と側面は、つぎの実施例において実験的なサポートが満たされる。
【実施例】
【０１４２】
以下の実施例が参照され、上記の説明と共に、非限定様式にて本発明のいくつかの実施態様を説明する。
【０１４３】
通常、本明細書において使用される命名および本発明において利用される実験室での手順は、分子、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献において完全に説明されている。たとえば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual”, Sambrook et al., (1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”, Volumes I-III Ausubel, R. M., ed.(1994) ; Ausubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al.,“Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)を参照されたい。また、米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号明細書；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994);“Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition;“Current Protocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds),“Basic and Clinical Immunology”(8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds),“Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980) などに記載されている手法も参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許文献や科学文献、たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号明細書、“Oligonucleotide Synthesis”Gait, M. J., ed. (1984);“Nucleic Acid Hybridization”Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985);“Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984);“Animal Cell Culture”Freshney, R. I., ed. (1986);“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press, (1986);“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B., (1984) and“Methods in Enzymology”Vol. 1-317, Academic Press;“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al.,“Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual”CSHL Press (1996) に幅広く記載されている。これらのすべては、本明細書に完全に記載されるものとして参照により組み込まれる。ほかの一般的な参照は、この文書全体を通じて提供される。そこに記載された手順は、当該技術分野において周知であると考えられ、読み手の利便のために提供される。そこに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
一般的な材料
細胞：
培養培地シグマＣ６６１４に適応されたＣＨＯ−Ｓ（ギブコＢＲＬ、カタログ番号１１６１９）細胞が確立された。
２００ｎＭのＭＴＸで培養されたＣ６６１４中のＣＨＯ−Ｓ
Ｃ６６１４中のＣＨＯ−Ｄｕｋｘ
ＰｒｏＣＨＯ−５中のＣＨＯ−Ｓ１
【０１４５】
プラスミド：ＰＧＬ３抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１−ＤＨＦＲタンデム−８７２；ｐＴＴ５ベクター；ｐＣＭＶ−Ｐ
【０１４６】
試薬
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  インビトロジェンＤＮＡポリメラーゼ、カタログ番号１２３４４−０２４；
分子生物学用アガロース、ＩＢＩアガロース、カタログ番号ＩＢ７００４２；
アルブミンウシ画分溶液（ＢＳＡ）、７．５％、シグマ、カタログ番号Ａ８４１２；
ヒイロチャワンダケ（Aleuria aurantia）レクチンＡＡＬ：１ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号Ｌ−１３９０、ベクター；
アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）レクチンＡＯＬ、５ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号Ｌ０１６９、ＥＹ
アンピシリン−シグマ、カタログ番号Ａ９５１８；
ＥＬＩＳＡ用抗体：捕捉：ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ジャクソンイムノリサーチ、カタログ番号１０９−００５−０８８（ＵＳＡ）。検出：ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｆａｂ2）、ジャクソンイムノリサーチ、カタログ番号１０９−０３６−０９８（ＵＳＡ）；
ベータアクチンアッセイ注文対応（Ｑ−ＰＣＲに対するプローブおよびプライマー）−ＡＢＩ、カタログ番号ＲＮ００６６７８６９＿ｍｌ；
ビオチン（ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン、Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ（商標）フォーマット、カタログ番号２１３２９、サーモ、カタログ番号２１３２９；
ビオチン化ＡＡＬ  １ｍｇ活性コンジュゲート、ベクター、カタログ番号Ｂ−１３９５；
ビオチン化ＭＡＬ  １ｍｇ、ＥＹ、カタログ番号ＢＡ−７８０１−２；
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ボボスター（Bovostar）．ボボジェン（Bovogen）、カタログ番号ＢＳＡＳ．０１；
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ、ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０８６６．０１；
ＣＨＯ  ＣＤ  ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ａ、インビトロジェン、カタログ番号Ａ１０２３４−０１
ＣＨＯ  ＣＤ  ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｂ、インビトロジェン、カタログ番号Ａ１０２４０−０１
クエン酸、シグマ、カタログ番号Ｃ−１９０９；
デキストラン硫酸ナトリウム塩、シグマ、カタログ番号Ｄ４９１１；
ＤＨ５αコンピテントバクテリア、ライフ−テクノロジーズ、カタログ番号１８２６３−０１２；
ＤＭＳＯ、メルク、カタログ番号１．０２９３１．１０００
ＤＮＡラダー：ＤＮＡ用１ｋｂラダー、バイオラボ、カタログ番号３２３２Ｌ
ＤＮＡラダー：ＤＮＡ用１００ｂｐラダー、バイオラボ、カタログ番号３２３１Ｌ
ＤＴＴ、カタログ番号：Ｄ９７７９、シグマ；
ＥＤＴＡ、シグマ、カタログ番号Ｅ７８８９；
エタノール、メルク、カタログ番号００９８３．１０００；
ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン、Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ（商標）フォーマット、カタログ番号２１３２９、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific Inc）、ＵＳＡ；
ＦＡＣＳ  Ａｃｃｕｄｒｏｐ  Ｂｅａｄｓ、ベクトンデッキンソン、カタログ番号ＭＡＢ３４５２４９；
フコース、シグマ、カタログ番号Ｆ２２５２；
グルコース、シグマ、カタログ番号Ｇ７０２１；
グルタミン、バイオロジカルインダストリーズ、カタログ番号０３−０２０−１Ａ；
グルタミン、シグマ、カタログ番号Ｇ５９７２；
グリシン、メルク、カタログ番号４２０１；
グアニジン−ＨＣｌ、カタログ番号Ｇ３２７２、シグマ；
Ｈｅｐｅｓ  １Ｍ、インビトロジェン、カタログ番号１５６３０−０５６；
大容量ｃＤＮＡ逆転写キット、アプライドバイオシステムズ、カタログ番号４３６８８１４；
ＨＴＸ５０、バイオロジカルインダストリーズ、カタログ番号０３−０８５−１Ｃ；
塩酸、メルク、カタログ番号ＵＮ−１７８９ １．００３１７．２５００；
ｉＣＥ２８０メチルセルロース１％、カタログ番号１０２２２０および１０１８７６、コンバージェントバイオサイエンス（Convergent Biosciences）、（カナダ）；
ｉＣＥ２８０  ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ３−１０、カタログ番号１０−０４５６−０１、ＧＥヘルスケア（独国）；
ｉＣＥ２８０  ｐＩマーカー  ６．１４および９．５、それぞれカタログ番号１０２２２０および１０１９９６、コンバージェントバイオサイエンス、（カナダ）；
ｉＣＥ２８０  システム好適キット、カタログ番号１０２０９３−ｊ、コンバージェントバイオサイエンス、（カナダ）；
ｉＣＥ２８０  ＩＥＦキット、コンバージェントバイオサイエンス；
ＩＭａｇバッファー、ベクトンデッキンソン、カタログ番号５５２３６２；
ＩＭａｇ  ＳＡ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ、ベクトンデッキンソン、カタログ番号５５７８１２；
ヨードアセトアミド、カタログ番号Ｉ１１４９、シグマ；
ＩＴＳＸ１００、インビトロジェン、カタログ番号５１５００−０５６；
ＬＢ＋アンピシリンプレート−Ｈｙ−Ｌａｂｓ、カタログ番号ＰＤ１７８；
Ｌ−システイン、カタログ番号Ｃ７３５２、シグマ；
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ、インビトロジェン、カタログ番号５０４７０；
イヌエンジュ凝集素（Maackia amurensis agglutinin）１ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号Ｌ８０２５、ロット：０３６ｋ４０７５  シグマ；
ＭＡＡ−ＦＩＴＣ、２ｍｌバッファー中２ｍｇ、ＥＹ、カタログ番号Ｆ−７８０１−２；
マレイミド、カタログ番号１２９５８５、ロット：Ｓ５６７８３−２７８  シグマ；
Ｎａ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、メルク、カタログ番号６５８０；
ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、メルク、カタログ番号６３４６；
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ×１０、カタログ番号１８−５０３２  Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、ＵＳＡ；
パパイン、カタログ番号Ｐ３１２５、シグマ、０．０５％チモールを含むｐＨ４．５の０．０５Ｍ  酢酸ナトリウムで；
フェノールレッド、シグマ、カタログ番号Ｐ０２９０；
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８、シグマ、カタログ番号Ｐ５５５６
ポリエチレンイミンパウダー、直線ＭＷ２５０００、ポリサイエンス（Polysciences）、カタログ番号２３９６６；
プロテアーゼ阻害剤カクテル、シグマ、カタログ番号Ｐ８３４０；
プロテアーゼ阻害剤、シグマ、カタログ番号Ｐ８３４０；
プロテインＡセファロース−Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ、カタログ番号１７−５２６９−０７、ロット番号１００１１５４５；
プロテインＧ磁気ビーズ、バイオラッド、カタログ番号Ｓ１４３０；
ピューロマイシン、インビボジェン、カタログ番号Ａｎｔ−ｐｒ５；
ピューロマイシン、シグマ、カタログ番号Ｐ８８３３；
参照試料：ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）  ５ｍｇ／ｍｌ注入用溶液、メルクセロノ、ロット番号７８２０９０７；
制限酵素は、ニューイングランドバイオラボから購入した。
Ｒ−フィコエリトリン−共役ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）、０．２ｍｇ／ｍｌ、バイオレジェンド（BioLegend）、カタログ番号４０５２０３；
Ｒ−フィコエリトリン−共役ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）、ジャクソン、カタログ番号０１６−１１０−０８４；
スキムミルクパウダー、フルカ、カタログ番号７０１６６；
重炭酸ナトリウム、メルク、カタログ番号６３２９；
炭酸ナトリウム、メルク、カタログ番号６３９２；
塩化ナトリウム、メルク、カタログ番号６４０４；
水酸化ナトリウムペレット、メルク、カタログ番号１．０６４９８．５０００；
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III  ＣｅｌｌｓＤｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡ合成キット、インビトロジェン、カタログ番号１８０８０−０５１；
ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ゲル染色、ＤＭＳＯ中１００００×、インビトロジェン、カタログ番号Ｓ３３１０２；
ＴＭＢ溶液、カタログ番号１９２８、Ｓａｖｙｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；
ＴｒａｎｓＩＴ−ＰＲＯ試薬キット、Ｍｉｒｕｓ、カタログ番号Ｍｉｒ５７００；
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、カタログ番号Ｔ３０３８、ロット：０３７Ｋ８４０２、シグマ；
Ｔｗｅｅｎ２０、カタログ番号８．１７０７２、メルク；
バルプロ酸ナトリウム塩、シグマ、カタログ番号Ｐ４５４３。
【０１４７】
溶液
ビオチン化ＡＡＬ−ＳＡ−ＰＥ混合物：ＰＢＳ＋０．１プルロニック酸中にビオチン化ＡＡＬ  ２０μｇ／ｍｌおよびＳＡ−ＰＥ  ２μｇ／ｍｌ；
１％漂白剤  −ＦＡＣＳ  Ｃｌｅａｎ、ベクトン  デッキンソン、カタログ番号３４０３４５；
ＥＬＩＳＡアッセイ溶液  −ＰＢＳ中に１％スキムミルクパウダー；
ＥＬＩＳＡブロッキングバッファー  −ＰＢＳ中１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０；
ＥＬＩＳＡ捕捉（コーティング）溶液  −ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、０．１Ｍ  炭酸塩バッファーｐＨ９．６に、最終濃度２ｍｃｇ／ｍｌに１：９００で希釈した；
ＥＬＩＳＡ標準曲線試料：参照試料Ｅｒｂｉｔｕｘ（ＥＭＤ  ロット７８２０９０７、５．０ｍｇ／ｍｌ）を、アッセイバッファーで１００ｎｇ／ｍｌまで希釈し、その後、１．５６ｎｇ／ｍｌまで２倍段階希釈した。各標準点濃度は、少なくとも１ｍｌの最終容量で調製した；
ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー  −ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０；
フォーミュレーションバッファー：塩化ナトリウム１１．７ｇ（１００ｍＭ）；クエン酸４．２ｇ（１０ｍＭ）；グリシン１５ｇ（１００ｍＭ）；水酸化ナトリウムｐＨ５．８までを、ＷＦＩで２リットルの容量にした；
ｉＣＥ２８０ランニング原液：１％メチルセルロース７０ｍｃｌ、６．１４および９．５ｐＩマーカー１ｍｃｌ、ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（ｐＨ３〜１０）８ｍｃｌをＷＦＩ１００ｍｌに加えた；
パパイン切断バッファー：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  システイン  ｐＨ７．６。システインは、新しいものをその都度調製すべきである。製造業者の取扱説明書にしたがって、バッファーでパパインを１ｍｇ／ｍｌに希釈；
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）  −１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２、１０×ＰＢＳの１：１０希釈で調製；
０．１％プルロニック含有ＰＢＳ；
ＰＢＳ（ＩＴＬ製品、ＢＲ  Ｒ０４５０Ｖ０１）；
ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０：０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を１ＬのＰＢＳ×１と混合した；
リン酸バッファー２０ｍＭ：ｐＨ７．５：１Ｌの水中に、Ｎａ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ  １．８ｇおよびＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  １．３８ｇ；
プロテインＡ  −溶出バッファー：２０ｍＭ  酢酸  ｐＨ＝３．２；
プロテインＡ  −平衡／洗浄２バッファー：５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８；
プロテインＡ  −洗浄１バッファー：５０ｍＭ  酢酸ナトリウム＋１．５Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ＝６．８；
還元バッファー×２：８Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．８（その都度新しく調製）。
【０１４８】
培養培地
３．５％Ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ６ストック；
ＣＨＯクローニング培地、カタログ番号Ｃ６３６６、シグマ；
ＣＨＯ  ＤＨＦＲ-培地パウダー、ＳＡＦＣバイオサイエンス、カタログ番号Ｃ６６１４（ＩＴＬ製品、Ｒ０４６１Ｖ０１）；
ＤＭＥＭ−Ｆ／１２  １：１  ×１、インビトロジェン、カタログ番号２１３３１−０２０；
ＦＥＭＥ培地（８ｍｌ／Ｌ  ＩＴＳ−Ｘ（インビトロジェン、カタログ番号５１５００−０５６）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）（インビトロジェン、カタログ番号３２  ５００＿０４３））；
イーグル最小必須培地、シグマ、カタログ番号Ｍ２２７９；
ＰｒｏＣＨＯ５、ロンザ（Lonza）、カタログ番号ＢＥ１２−７６６Ｑ；
Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＤ１０００、ベクトンデッキンソン、カタログ番号２１５２０４；
ＶＰＡナトリウム塩ストック、１００ｍＭ。
【０１４９】
消耗品
１４ｍｌ遠心分離チューブ、Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号１８７２６１；
１５ｍｌ遠心分離チューブ、コーニング、カタログ番号４３００５２；
２４ウェルプレート、Ｎｕｎｃ、カタログ番号１４２４７５；
５ｍｌポリスチレン丸底チューブ、ベクトンデッキンソン、ファルコン、カタログ番号３５２０５４；
５ｍｌ丸底チューブポリスチレン、ベクトンデッキンソン、ファルコン、カタログ番号３５２０５４；
９６ウェルプレート、コスター（Costar）、カタログ番号３５９５；
９６ウェルプレート、ファルコン、カタログ番号３５３０７２；
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）光学接着カバー  １００／Ｐｋｇ、アプライドバイオシステムズ、カタログ番号４３１１９７１；
冷凍チューブバイアル２ｍｌ、Ｇｒｅｎｉｅｒ、カタログ番号１２６−２６３；
Ａｃｒｏｄｉｓｃフィルター０．２μｍ、ゲルマン（Gelman）、カタログ番号４１９２；
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５ｍｌ  １０ｋＤａ、カタログ番号ＵＦＣ９０１０２４、ミリポア；
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３ｋＤａ、カタログ番号ＵＦＣ９００３２４、ミリポア；
Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ、遠心分離フィルターユニット、ミリポア、カタログ番号ＵＦＣ８０１０２４；
Ｃｒｙｏ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  １℃容器、Ｎａｌｇｅｎｅ、カタログ番号５１００−０００１；
ＰＢＳまたは水の滅菌用使い捨て０．２２μフィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、カタログ番号１２７００２０；
ＡＣＦＭ滅菌用使い捨て０．２μフィルター（ＧＰ発現プラスメンブレン）、ミリポア、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０５ＲＥまたはＳＣＧＰＵ１１ＲＥ；
ＦＡＣＳ洗浄滅菌用使い捨て０．４５μフィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、カタログ番号４５０００４５；
使い捨て４０μセルストレーナー無菌、ベクトンデッキンソン、ファルコン、カタログ番号３５２３４０；
セルストレーナーカップ３５μを備えた使い捨て５ｍｌポリスチレンチューブ、ベクトンデッキンソン、ファルコン、カタログ番号３５２２３５；
使い捨て７０μ（または３５μ）滅菌フィルターカップ  Ｆｉｌｃｏｎ、ベクトンデッキンソン、ファルコン、カタログ番号３４０６３４；
使い捨てフィルター１０μ  Ｃｕｐ  ｆｉｌｃｏｎ、ベクトンデッキンソン、カタログ番号３４０７３２；
使い捨てフィルター３０μ  Ｃｕｐ  ｆｉｌｃｏｎ、ベクトンデッキンソン、カタログ番号３４０６２５；
ＤｙｎａＭａｇ、Ｄｙｎａｌ、インビトロジェン、カタログ番号１２３．０１Ｄ；
ＤｙｎａＭａｇ、Ｄｙｎａｌ、インビトロジェン、カタログ番号１２３．２１Ｄ；
ＥＬＩＳＡ、マイクロタイタープレート  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｆ９６、カタログ番号ＮＵＮＣ；
エーレンマイヤー１０００ｍｌ、Ｔｒｉｆｏｒｅｓｔ、カタログ番号ＴＦ  ＦＰＣ１０００Ｓ；
三角フラスコ：１２５ｍｌ、コーニング、カタログ番号ＷＩ−４３１１４３、２５０ｍｌ、コーニング、カタログ番号ＷＩ−４３１１４４、５００ｍｌ、コーニング、カタログ番号ＷＩ−４３１１４５、２Ｌ、コーニング、カタログ番号ＷＩ−４３１２５５；
ＦＡＣＳチューブ、ファルコンカタログ番号３５２２３５  ブルーフィルターキャップ付；
ＦＡＣＳチューブ、ＢＤファルコン、カタログ番号３５２２３５；
フィルター１０”０．１μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ、ミリポア、カタログ番号ＭＩＬＬＩＰＡＫ２００；
フィルターチューブ５０、ＴＰＰ、カタログ番号８７０５０；
ｉＣＥ２８０キャピラリーカートリッジ、カタログ番号ＦＣコーティング（ＰＮ：１０１７００）、コンバージェントバイオサイエンス；
ｉＣＥ２８０マイクロインジェクタートランスファーキャピラリー、カタログ番号ＰＮ：１０２０１９、コンバージェントバイオサイエンス；
ＩＭａｇｎｅｔ、ベクトンデッキンソン、カタログ番号５５２３１１；
グリッドを備えたＫｏｖａ  Ｇｌａｓｓｔｉｃ  Ｓｌｉｄｅ  １０、Ｈｙｃｏｒ、カタログ番号８７１４４；
マイクロ遠心分離チューブ（１．７ｍｌ）、コスター、カタログ番号３２０７；
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ  Ｓｙｓｔｅｍ、マイクロプレート、黒９６ウェル、カタログ番号６５５２０９、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、独国；
バーコード付のＯｐｔｉｃａｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｆａｓｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  ２０／Ｐｋｇ、アプライドシステムズ、カタログ番号４３４６９０６；ピペットチップ、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ、カタログ番号１４２００および１４２２０；
ピペットチップ、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ、カタログ番号１４２００および１４２２０；
ピペットチップ  ０〜２００μｌ、コスター、カタログ番号４８６４；
スライド−Ａ  Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｇ２  ２ｋＤａ：カタログ番号８７７１８、サーモ；
ＳｎａｋｅＳｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｔｕｂｉｎｇ  １０ｋＤａ、カタログ番号６８１００、ロット：ＪＪ１２７５４９、Ｔｈｅｒｍｏ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ  １ｍｌ、カタログ番号２８−４０８２−５８、ＧＥ；
ステリカップ（Stericup）１Ｌ  フィルターユニット０．１μｍ、ミリポア、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０５ＲＥ；
ステリカップ１Ｌ  フィルターユニット０．２μｍ、ミリポア、カタログ番号ＳＣＧＰＵ１１ＲＥ；
ステリフリップ（Steriflip）フィルターユニット  ５０ｍｌ、０．２２μｍ、ミリポア、カタログ番号ＳＣＧＰ００５２５；
滅菌２４−ウェルプレート、Ｎｕｎｃ、カタログ番号１４３９８２；
滅菌６−ウェルプレート、コスター、カタログ番号３５０６；
滅菌遠心チューブ：１５ｍｌ、ベクトンデッキンソン、ファルコン、カタログ番号２０９７およびコーニング、カタログ番号４３００５５、５０ｍｌ  コーニング、カタログ番号４３０２９０、２５０ｍｌ  コーニング、カタログ番号４３０７７６、５００ｍｌ、コーニング、カタログ番号４３１１２３；
滅菌ＦＡＣＳチューブ、ベクトンデッキンソン、ファルコン、カタログ番号３５２０５４；
滅菌ピペット：１０ｍｌステリリン（Sterillin）、カタログ番号４７１１０、１ｍｌステリリン、カタログ番号４０１０５、２ｍｌステリリン、カタログ番号４０１０２、５ｍｌコーニング、カタログ番号４０１１、５０ｍｌコーニング、カタログ番号４５０１、２５ｍｌファルコン、カタログ番号３５−７５２５；
滅菌組織培養フラスコ：２５ｃｍ2、（Ｔ−２５）、Ｎｕｎｃ、カタログ番号１６３３７１；
ストレプトアビジン  バイオセンサ  チップ、カタログ番号１８−５０１９、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、ＵＳＡ；
シリンジ  ２．５ｍｌ、滅菌、メディ−プラス（Medi-Plus）、カタログ番号；
ＴＣＦ  １７５ｃｍ2、Ｎｕｎｃ、カタログ番号１５６５０２；
ＴＣＦ  ２５ｃｍ2、Ｎｕｎｃ、カタログ番号１３６１９６；
ＴＣＦ  ８０ｃｍ2、Ｎｕｎｃ、カタログ番号１５３７３２。
【０１５０】
機器
ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００、カタログ番号１８−１１１２−４１、ＧＥ（独国）；
Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ  −Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、ロシュ；
遠心分離機  −カタログ番号５４１７Ｒ−エッペンドルフ；
遠心分離機  −カタログ番号５４１７Ｒ−エッペンドルフ；
遠心分離機  −ＲＣ  ３Ｃ  Ｐｌｕｓ型−Ｓｏｒｖａｌｌ（ＵＳＡ）；
循環水浴、モデルＦ３／Ｋ、Ｈａａｋｅ（フィンランド）；
電気伝導度計ＯＲＩＯＮ、モデル１５０、オリオンリサーチ社；
コールター・カウンター  −モデルＺｌ、コールターエレクトロニクス（イングランド）；
Ｃｒｙｏ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  １℃容器、Ｎａｌｇｅｎｅ、カタログ番号５１００−０００１；
ＥＬＩＳＡプレートリーダー  Ｓｕｎｒｉｓｅ  ｂａｓｉｃ、カタログ番号１６０３９４００、ＴＥＣＡＮ；
ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ  Ｗａｓｈｅｒ  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，カタログ番号６０４０８３４、ＴＥＣＡＮ；
ＥＬＩＳＡ  Ｒｏｂｏｔ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＳＰ  １５０／８、カタログ番号６１１４０８、ＴＥＣＡＮ；
ＥＬＩＳＡ、ｉＥＭＳインキュベーター、カタログ番号５１１２２００、サーモ；
エッペンドルフ遠心分離機、シリーズ５４１７Ｒ、エッペンドルフ（ドイツ）；
ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター、ベクトンデッキンソン；
Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ、カタログ番号４５４００００  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ（フィンランド）；
ＧＥ  Ｆａｎｕｃシリーズ９０−７０  プログラム可能なコントローラ  −ジェネラルエレクトリック社（ＵＳＡ）；
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００、ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＵＳＡ）；
水平ゲル電気泳動システム、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  Ｈｏｒｉｚｏｎ５８、カタログ番号４１０６０；
ｉＣＥ２８０  イメージキャピラリー電気泳動アナライザー、カタログ番号１２４１、コンバージェントバイオサイエンス；
ｉＣＥ２８０  ＰｒｉｎＣＥ  ＭｉｃｒｏＩｎｊｅｃｔｏｒ、カタログ番号５４１８０７４０６７、コンバージェントバイオサイエンス；
ｉＣＥ２８０  ソフトウェアｉＣＥ２８０  ＣＦＲソフトウェアｖ．２．３．６  コンバージェントバイオサイエンス；
Ｉｍａｇｅ  ｍａｓｔｅｒ  ＶＤＳ、カタログ番号８０−６２５４−８０  ファルマシア（スウェーデン）；
インキュベーションシェーカーボックス、ＣＥＲＴＯＭＡＴ（登録商標）  ＢＳ−Ｔ、Ｂ．ブラウンバイオテックインターナショナル（B. Braun Biotech International）（ドイツ）；
インキュベーター３７℃５％ＣＯ2、温度およびＣＯ2は制御されている、Tuttnauer（イスラエル）；
Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ−Ｓｈａｋｅ  “ｎ”  ｓｔａｃｋ、Ｈｙｂａｉｄ、カタログ番号ＨＢＭＯＶＣ５Ｔ２２０（ハイブリダイゼーションオーブン）；
Ｌａｍｉｎａｒ  Ｆｌｏｗ  Ｈｏｏｄ（ＬＦＨ）クラス１００−Ｉｓｒａｆｌｏｗ（イスラエル）；
光学顕微鏡−モデルＴＭＳ  Ｎｏ．３０１０７０−ニコン（日本）；
マイクロプレートインキュベーター／振とう器、ｉＥＭＳ、ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍ（フィンランド）；
マイクロプレート洗浄機、カタログ番号ＷＷ０１５、アプライドクオリティーサービス社（ＵＫ）；
電子レンジ  −Ｃｒｙｓｔａｌ  １７Ｌ；
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ  Ｓｙｓｔｅｍ、データ収集ソフトウェア６．３バージョン、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、ＵＳＡ；
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ  Ｓｙｓｔｅｍ、データ分析ソフトウェア６．３バージョン、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、ＵＳＡ；
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、ＣＡ、ＵＳＡ；
２５ｍｍの振とう振幅（軌道）を有する軌道プラットフォーム振とう器、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）；
蠕動ポンプ  −Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  ５０３Ｓまたは５０５Ｕ（英国）；
ｐＨメーター、シリーズＰＨＭ２１０、Ｒａｎｄｉｏｍｅｔｅｒ（デンマーク）；
プレート洗浄機（ＳＬＴ  ９６ＰＷ）ＴＥＣＡＮ；
プラットフォームロッキング振とう器−Ｈｏｅｆｅｒ“Ｒｅｄ−Ｒｏｃｋｅｒ”  ＰＲ５０−２５０Ｖ（ファルマシアバイオテック）；
電力供給装置、カタログ番号ＰＳ５００ＸＴ、Ｈｏｅｆｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＳＡ）；
冷却遠心分離機、Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３  Ｓ−Ｒ、Ｈｅｒａｅｕｓ；
冷却インキュベーター振とう器、Ｉｎｎｏｖａ  ４２３０、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）；
ロボット試料プロセッサー、モデルＲＳＰ  １５０／８  Ｇｅｎｅｓｉｓ、ＴＥＣＡＮ、（スイス）；
振とう器、Ｒｏｔａｍａｘ、シリーズ番号１２０、ハイドルフ（ドイツ）；
ソフトウェア−ＷＩＺＣＯＮ−ＰＣ  Ｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（イスラエル）；
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム、アプライドバイオシステムズ、カタログ番号４３７６６００；
ＵＶ  ｔａｂｌｅ、ＢＴＳ２０．ＭＳ、Ｕｖｉｔｅｃ、カタログ番号Ｍ０２３６４１；
水浴−温度コントローラ、ポリサイエンス、モデル９１０６
【０１５１】
一般的な方法
略語
ＡＡＬ−          ヒイロチャワンダケ（Aleuria aurantia）レクチン
ＡＣＦ−          動物成分不含
ＡＣＦＭ          動物成分不含培地
ＡＤＣＣ−        抗体依存性細胞傷害
抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ
ＣＨＯ−          チャイニーズハムスター卵巣
ＤＨＦＲ−        ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ＤＭＥＭ−        ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＳＯ          ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ−          ジチオトレイトール
ＥＤＴＡ          エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＦＲ          上皮成長因子受容体
ＥＬＩＳＡ        酵素関連免疫吸着アッセイ
ＥＭＣＶ−        脳心筋炎ウイルス
Ｆａｂ−          ＩｇＧ１の重鎖のＣＨ１およびＶＨ部分と軽鎖
ＦＡＣＳ−        蛍光活性化細胞ソーター
Ｆｃ−            ＩｇＧ１重鎖のＣＨ３およびＣＨ２部分
Ｆ−ＳＡ−        蛍光ストレプトアビジン
Ｆｕｔ８−        フコシルトランスフェラーゼ８
ＦＸ              ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース ３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ
ＧＦＴ−          ＧＤＰ−フコーストランスポーター
ＧＭＤ−          ＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ
ＧＯＩ−          目的の遺伝子
ＨＣ−            重鎖
ｈＣＭＶ−ＩＥ−  ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーター
ＨＲＰ            西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＣＥ            イメージキャピラリー（imaged capillary）電気泳動
ＩｇＧ１          Ｇ１型イムノグロブリン
ＩＲＥＳ−        内部リボソーム侵入部位
ＬＣ−            軽鎖
ＭＡＡ−          イヌエンジュ（Maackia amurensis）レクチン
ＭＣＢ−          マスター細胞バンク
ｍＣＭＶ−        マウスサイトメガロウイルスプロモーター
ＭＦＩ−          平均蛍光強度
ＭＳ−            質量分析
ＭＴＸ−          メトトレキサート
ＮＫ−            ナチュラルキラー細胞
ｐＡ−            ポリアデニル化
ＰＡＣ−          ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ
ＰＢＳ            リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＤ−          ピコグラム／細胞／日
ＰＣＲ−          ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤＬ−          細胞集団倍化レベル
ＰＤＴ−          細胞集団倍化時間
ＰＯＩ−          目的のタンパク質
ＰｒｅＭＣＢ−    プレマスター細胞バンク
ＲＥ−            制限酵素
ＲＴ−            室温
ＳＡ−            ストレプトアビジン
ＳＡ−ＰＥ        Ｒ−フィコエリトリン共役ストレプトアビジン
ＳＰ−            シグナルペプチド
ＳＶ４０−        シミアンウイルス４０
ＴＭ−            膜貫通ペプチド
ＴＭＢ            ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
ＶＰＡ−          バルプロ酸
【０１５２】
ＭＴＸの存在下でのＣＨＯ−Ｓ細胞のインキュベーション：
Ｃ６６１４中のＣＨＯ−Ｓ細胞を０．２×１０6細胞／ｍｌで１００ｎＭ  ＭＴＸに播種し、生存率が９０％を超えるまで１０日間増殖させた。その後、細胞を２７日間２００ｎＭ  ＭＴＸに移し、続いて細胞を２００ｎＭ  ＭＴＸの存在下で凍結させた。ゼロフコース発現細胞の単離のために、細胞を、ＭＴＸを含まない培地に溶かした。
【０１５３】
ストレプトアビジン磁気ビーズによる低フコース細胞の選択：
ＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞を、ビオチン化したＡＡＬまたはＡＯＬで標識し、磁気ビーズに結合されたストレプトアビジンと混合した。細胞を磁石で分離し、磁石に付着しなかった懸濁液中の細胞（すなわち、その表面上のフコースレベルが低い）をさらに増殖させた。この手順を２回行い、その後細胞をＦＡＣＳによりソーティングした。
【０１５４】
５０×１０6ＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞を回収し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸（プルロニックＦ−６８、シグマ、カタログ番号Ｐ５５５６）中で洗浄した。その後、細胞を、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中、２０μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ＡＡＬ（ベクター、カタログ番号Ｂ−１３９５、ロット番号Ｕ０９２２）または５μｇ／ｍｌの濃度のＡＯＬ（カタログ番号Ｌ０１６９、ＥＹ）５ｍｌにＲＴで３０分再懸濁した。染色された細胞を、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸で洗浄し、２５０μｌのＢＤ  ＩＭａｇ  ＳＡ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ、カタログ番号５５７８１２）を添加し、もう３０分ＲＴでインキュベートした。その後、２．２５ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸＋０．５％ＢＳＡを加えた。ビーズを３つの５ｍｌチューブに分けた。そのチューブをＢＤ  ＩＭａｇｎｅｔ（ＢＤ、カタログ番号５５２３１１）上におき、８分間静置した。上清を吸引し、新しい１５ｍｌチューブに移した。このステップを２回行い、吸引した上清を合わせた。上清を再び５ｍｌチューブに分け、ＢＤ  ＩＭａｇｎｅｔ（ＢＤ、カタログ番号５５２３１１）上で８分間静置した。上清を回収し、遠心分離にかけ、Ｃ６６１４培地（ＣＨＯ  ＤＨＦＲ-培地パウダー、ＳＡＦＣバイオサイエンス、カタログ番号Ｃ６６１４）（ＩＴＬ製品、Ｒ０４６１Ｖ０１）に播種した。細胞を増殖させ、その後ビーズにより分離する別の回（round）を行った。
【０１５５】
レクチンとのインキュベーションの後、細胞生存率は、ＡＡＬとインキュベートした場合８３％であり、ＡＯＬとインキュベートした場合８９％であった。ＰＢＳでインキュベートした後の典型的な細胞の生存率は８５〜９５％である。
【０１５６】
ＦＡＣＳによる低フコース細胞のソーティング
Ａ．磁気ビーズでの分離後のソーティング：
磁気ビーズで２回分離後の細胞を、細胞表面上の低フコースレベルを有する細胞のためのＦＡＣＳソーティングに付した。４０×１０6細胞を冷ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中で洗浄し、遠心分離し、１０ｍｌのビオチン化ＡＡＬまたはＡＯＬ＋ＳＡ−ＰＥ混合物２０μｇ／ｍｌに再懸濁させ、Ｔ８０フラスコに移して、４５ｒｐｍで振とう下、３７℃で３０分間インキュベーションした。細胞を遠心分離し、冷ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中で洗浄し、２回遠心分離に付し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中に再懸濁させ、最終濃度１０×１０6細胞／ｍｌとした。集団の最も弱い蛍光画分（１．５％）を、２ｍｌのシグマ  Ｃ６６１４  ＳＦＭ＋ＨＴ（バイオロジカルインダストリーズ、カタログ番号０３−０８５−ＩＣ）／チューブ中にＦＡＣＳによりソートし、遠心分離して、１．５ｍｌシグマＣ６６１４ＳＦＭ＋ＨＴ／チューブに再懸濁し、６ウェルプレートのウェルに播種し、増殖させた。
【０１５７】
Ｂ．低フコース細胞のソーティング−４回：
１００×１０6細胞を冷ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中で洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中のビオチン化ＡＡＬ（２０μｇ／ｍｌ）＋ＳＡ−ＰＥ（１：１００）混合物１０ｍｌに再懸濁し、Ｔ８０フラスコに移し、４５ｒｐｍで振とう下、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、冷ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中で洗浄し、２回遠心分離し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸で再懸濁して１０×１０6／ｍｌの細胞濃度とし、ＦＡＣＳチューブに濾過した。ＡＡＬとのインキュベーションの後、細胞生存率は８１％であった。ＰＢＳでインキュベートした後の典型的な細胞の生存率は８５〜９５％である。集団の最も弱い蛍光画分（１回目のソートで０．２％、２回目で０．０７％、３回目で１％、４回目で２％）を、２ｍｌのシグマＰｒｏＣＨＯ５  ＳＦＭ＋ＨＴ／チューブにＦＡＣＳによりソートし、遠心分離して、１ｍｌ（１回目および２回目のソートで）または３ｍｌ（３回目および４回目のソートで）のＰｒｏＣＨＯ５＋ＨＴ／チューブに再懸濁し、２４ウェルプレートのウェル（１回目および２回目のソート）またはＴ２５フラスコ（３回目および４回目のソート）に播種し、増殖させた。
【０１５８】
ＦＡＣＳによる細胞膜上のフコースレベルの分析：
２×１０6細胞をＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸で洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中のビオチン化ＡＡＬ（カタログ番号Ｂ１３９５、ベクター）（２０μｇ／ｍｌに希釈）またはＡＯＬ（カタログ番号Ｌ０１６９、ＥＹ）（５μｇ／ｍｌに希釈）＋ＳＡ−ＰＥ（カタログ番号４０２５０、バイオレジェンド）（２μｇ／ｍｌに希釈）混合物５００μｌに再懸濁し、２４ウェルプレートに移し、振とう下３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を完全に再懸濁して１５ｍｌチューブに移した。１０ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸を添加し、細胞を混合し、遠心分離し、そして再び洗浄した。ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸／チューブ中に再懸濁し、細胞の蛍光により分析するためにＦＡＣＳチューブに濾過した。
【０１５９】
ＦＡＣＳによる細胞膜上のシアル酸含有量の分析：
２×１０6細胞をＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸で２回洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中のＭＡＡ−ＦＩＴＣ（５０μｇ／ｍｌに希釈）５００μｌに再懸濁し、２４ウェルプレートに移し、振とう下２５℃で３０分間インキュベートした。細胞を完全に再懸濁して１５ｍｌチューブに移した。１０ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸を添加し、細胞を混合し、遠心分離し、そして再び洗浄した。ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸／チューブ中に再懸濁し、細胞の蛍光により分析するためにＦＡＣＳチューブに濾過した。
【０１６０】
ＩＴＬ−ｌｆ２細胞培養物への外因性フコースの添加：
抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂでのトランスフェクションの前または後のいずれかのＩＴＬ−ＬＦ２細胞を、ＰｒｏＣＨＯ５培地に０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で種々の濃度のＬ−フコース（シグマ、カタログ番号Ｆ２２５２）と共に播種し、ＣＯ2と共に３２０ｒｐｍで振とう下３７℃でインキュベートした。４日後、細胞のサンプルを細胞の蛍光によるＦＡＣＳ分析のために採取した（本明細書において後述する）。さらに、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞からの粗収穫サンプルをＦＡＣＳにより分析した。
【０１６１】
プレ−マスター細胞バンクの調製：
細胞凍結用細胞培養物をエーレンマイヤーに広げた。必要量の細胞を遠心分離し、新鮮なＰｒｏＣＨＯ５培地＋ＨＴおよび馴化培地（指数関数的に増殖しているＩＴＬ−ＬＦ２宿主細胞由来）の１：１混合物９２．５％およびＤＭＳＯ７．５％からなる凍結保存培地に再懸濁した。６０本のバイアルを、各クローンからそれぞれプレ−マスター細胞バンク（ｐｒｅ−ＭＣＢ）において凍結した、１バイアルにつき１．５ｍｌ中に１０×１０6細胞／バイアル。細胞を、−８０℃でＣｒｙｏＦｒｅｅｚｉｎｇ  １℃容器（ＮＡＬＧＥＮＥ、カタログ番号５１００−０００１）において凍結し、２４時間後液体窒素ガスにおける保管に移した。
【０１６２】
細胞バンク検査：
ｐｒｅ−ＭＣＢ製造の１１日後に、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のｐｒｅ−ＭＣＢでの凍結アンプル中の細胞の生存率を調べた。１つのアンプルを解凍し、生存率を解凍後直ちに測定した。細胞を３回の増殖サイクルに沿って増殖させ、生存率を３回目のサイクルの後に測定した。
【０１６３】
直接移転または浸漬技術により無菌テストを行った。マイコプラズマに関しても細胞をテストした。
【０１６４】
ＦＡＣＳ  ＡＣＤＵによるクローニング：
ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞ソーターの自動細胞捕集装置（ＡＣＤＵ）による、ＰｒｏＣＨＯ５＋ＨＴにおいて増殖している細胞のクローニングを、ＡＣＤＵの「単細胞」精度モードで、８０％Ｃ６３６６＋２０％ＰｒｏＣＨＯ５  ＡＣＦＭ混合物を２００μｌ／ウェル含有する９６ウェルプレート中に行った。細胞の濃度は０．４×１０6細胞／ｍｌであった。プレートを、クローニングした日（０日目）およびその８日後にＣｅｌｌａｖｉｓｔａで撮影した。いくつかのクローンを選び出し、増殖させ、その後、シグマ  Ｃ６３６６を５０％およびＰｒｏＣＨＯ５を５０％含む混合物４ｍｌを含むＴ２５フラスコに移した。細胞増殖中ＰｒｏＣＨＯ５を徐々に添加した。これらの細胞をｍＲＮＡの特徴付けのために解析した。
【０１６５】
細胞からのＲＮＡ抽出：
全ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書にしたがってＲｎｅａｓｙキット（キアゲン、カタログ番号７４１０４）を用いて細胞から全ＲＮＡを単離した。
【０１６６】
フコース経路遺伝子の検出のためのＲＴ−ＰＣＲ：
ＣＨＯ−ＳまたはＩＴＬ−ＬＦ２細胞から抽出した全ＲＮＡから、インビトロジェンＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  IIIキット（カタログ番号１８０８０−０５１）およびこのキットに備えられたオリゴｄＴプライマーを利用してｃＤＮＡを調製した。その後、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーはシグマ・アルドリッチにて合成された。プライマーの配列をつぎの表１に示す。得られたバンドはアガロースゲル上で分析され、ＤＮＡサイズマーカーと比較された。
【０１６７】
【表１】
2014509850.tif 000001
【０１６８】
フコース経路ｍＲＮＡ発現レベルの評価のためのＱ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）：
アプライドシステムズの高性能ｃＤＮＡ逆転写酵素キットおよびそのキットに補足のランダムプライマー（アプライドシステムズ、カタログ番号４３６８８１４）を利用してｃＤＮＡを調製した。
【０１６９】
遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブをアプライドシステムズで合成した。プライマーとプローブの配列をつぎの表２に示す。
【０１７０】
【表２】
2014509850.tif 000002
【０１７１】
Ｑ−ＰＣＲは、以下の方法で行った。
各反応に対して、５μｌの調製したｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現マスターミックス、フォアワードおよびリバースプライマーおよびＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢプローブを含む混合物に添加し、最終容量１３μｌとした。
【０１７２】
ＱＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲ機の「高速」モードで行い、結果をＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）およびＤａｔａＡｓｓｉｓｔ  ｖ２．０ソフトウェアを利用して解析した。
【０１７３】
ｃＤＮＡフラグメントおよびプラスミドのＤＮＡ配列決定：
ＤＮＡ配列決定は、完全自動化１６キャピラリーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  ジェネティックアナライザーにより行った。配列は、Ｓｃｉ−Ｅｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ソフトウェア（Ｃｌｏｎｅ  ｍａｎａｇｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン７．０１およびＡｌｉｇｎ  ｐｌｕｓ  ５、バージョン５．０１）を利用して組織内で分析した。
【０１７４】
ＤＮＡ発現ベクターの構築：
すべてのベクターは、標準的な分子生物学の技術を利用して構築した。
【０１７５】
プラスミドＤＮＡの調製：
プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ  Ｈｉｓｐｅｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて、製造業者により記載された手法にしたがって単離した。安定トランスフェクションについては、ＤＮＡを特定の制限酵素により線状化し、エタノールにおけるＤＮＡ沈殿により滅菌した。一過性のトランスフェクションは環状ＤＮＡで行った。
【０１７６】
ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞の安定トランスフェクション：
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞をＣ６６１４血清不含培地（ＣＨＯ  ＤＨＦＲ-培地パウダー、ＳＡＦＣ  バイオサイエンス、カタログ番号Ｃ６６１４）に適応させた。細胞を５０ｍｌチューブ（フィルターチューブ５０、ＴＰＰ、カタログ番号８７０５０）内の懸濁液中で、３７℃、加湿下、３２０ＲＰＭで振とうして増殖させた。トランスフェクションの２日前に、１００ｍｌの細胞を５００ｍｌのエーレンマイヤー（コーニング、カタログ番号ＷＩ−４３１１４５）に０．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で播種した。細胞を、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂコード配列を含むＰＧＬ３抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１  ＤＨＦＲタンデム−８７２ベクターで、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（ギブコＢＲＬ、カタログ番号１８３２４−０２０）によりトランスフェクトした。トランスフェクションの日、複製の細胞を洗浄し、再懸濁し、１０×１０6細胞を、Ｔ−２５フラスコ（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１６３３７１）につき、４ｍｌＭＥＭ（シグマ、カタログ番号Ｍ２２７９）中に播種した。単一プラスミドによる各トランスフェクションに対して、２０μｇの線状化ＰＧＬ３抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１  ＤＨＦＲタンデム−８７２ベクターを用いた。最終のＤＮＡ容量は、ＭＥＭ中１００μｌに調整した。その後、１００μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを添加し、室温で４５分間インキュベートした。その後、ＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ混合物を細胞に添加し、５０ＲＰＭの振とうインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。このインキュベーション期間の終了時に、細胞を沈降させ、培地を、ヒポキサンチン１３．６ｍｇ／Ｌ／チミジン３．９ｍｇ／Ｌ（ＨＴ、バイオロジカルインダストリーズ、カタログ番号０３−０８５−１Ｃ）および１０μｇ／ｍｌフコース（シグマ、カタログ番号Ｆ２２５２）を補足した８ｍｌの新しいＣ６６１４（シグマ）５０％とＣ６３６６（シグマ）５０％に置き換えた。
【０１７７】
フラスコを５０ＲＰＭで振とうインキュベーターにおいて３７℃で７２時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、遠心分離し、そして１０ｍｇ／ｍｌフコースおよび５〜１０μｇ／ｍｌピューロマイシン（それぞれ異なる実験（replicates）に対して）を補足した５０％Ｃ６６１４＋５０％Ｃ６３６６培地１０ｍｌに再懸濁し、元のＴ−２５フラスコに戻した。これらの選択的条件下では、ＰＡＣ遺伝子を発現する細胞のみが生存できた。複製プール回復の後、Ｃ６６１４培地＋１０μｇ／ｍｌフコースを徐々に添加した。プールを完全に回復させると、細胞をフコースなしの新しいＣ６６１４培地に播種した。その後、細胞をＰｒｏＣＨＯ５培地に移し、細胞膜上のフコシル化レベルを本明細書の以下に説明するように検出した。
【０１７８】
ＣＨＯ−Ｓ細胞を、ヒポキサンチン１３．６１ｍｇ／Ｌおよびチミジン３．８８ｍｇ／Ｌ（ＨＴ×１、バイオロジカルインダストリーズ、カタログ番号０３−０８５−１Ｂ）を補足したＰｒｏＣＨＯ５血清不含培地（ロンザ、カタログ番号ＢＥ１２−７６６Ｑ）で培養した。細胞をフィルターチューブ５０ｍｌ、バイオリアクター（ＴＰＰ、カタログ番号８７０５０）中の懸濁液において、３７℃加湿下３２０ＲＰＭで振とうして増殖させた。トランスフェクションの２日前に、細胞を、フィルターカップ付５００ｍｌのエーレンマイヤー振とうフラスコ（コーニング、カタログ番号４３１１４５）中０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播種した。トランスフェクションの日、細胞を遠心分離し１０×１０6細胞をＴ２５フラスコ（Ｎｏｎｃ、カタログ番号１６３３７１）のＭＥＭ（シグマ、カタログ番号Ｍ２２７９）４ｍｌ中に播種した。単一プラスミドによる各トランスフェクションについて、２０μｇ線状ベクター（ＰＧＬ３抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１  ＤＨＦＲタンデム−８７２）を用いた。最終のＤＮＡ容量をＭＥＭ中１００μｌに調整した。その後、１００μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（ギブコＢＲＬ、カタログ番号１８３２４−０２０）を添加し、室温で４５分間インキュベートした。その後、ＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ混合物を細胞に添加し、５０ＲＰＭの振とうインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。このインキュベーション期間の終了時に、細胞を沈降させ、培地を、フィルターカップ付エーレンマイヤー１２５ｍｌ（コーニング、カタログ番号４３１１４３）中のデキストラン硫酸０．１ｍｇ／ｍｌ、ヒポキサンチン２７．２２ｍｇ／Ｌおよびチミジン７．７６ｍｇ／Ｌ（ＨＴ×２、バイオロジカルインダストリーズ、カタログ番号０３−０８５−１Ｂ）を補足した８ｍｌの新しいＰｒｏＣＨＯ５（ロンザ、カタログ番号ＢＥ１２−７６６Ｑ）に置き換えた。フラスコを１２５ＲＰＭで振とうインキュベーターにおいて３７℃で７２時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、遠心分離し、２５μｇ／ｍｌピューロマイシン（インビトロジェン、カタログ番号ａｎｔ−ｐｒ−１）を補足した２０ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５培地に再懸濁した。これらの選択条件下ではＰＡＣ遺伝子を発現する細胞のみが生存できた。
【０１７９】
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞の一過性トランスフェクション：
トランスフェクションの２日前に、細胞をＰｒｏＣＨＯ５中で増殖させ、２日後に約２．５〜３．０×１０6細胞／ｍｌの密度に達するように、１０００ｍｌエーレンマイヤー（ＴＲＩＦＯＲＥＳＴ、カタログ番号ＴＦ  ＦＰＣ１０００Ｓ）中の２５０ｍｌに０．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で播種した。
【０１８０】
２つのトランスフェクションプロトコールを用いた。
１．ＰｒｏＣＨＯ５（ロンザ）を含む培地でのトランスフェクション
トランスフェクションの日、３７．５μｇＤＮＡ（１８．７５μｇ、各ＨＣ＋ＬＣプラスミド）を、１５ｍｌチューブ（コーニング、カタログ番号４３００５２）中の２．５ｍｌのＦＥＭＥ培地（（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）（インビトロジェン３２  ５００＿０４３）、２９ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｇ／ｌ  Ｄ−グルコースおよび７．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン）に希釈した。Ｅｒ１２５フラスコを、初期容量１０ｍｌのＦＥＭＥ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）（インビトロジェン、カタログ番号３２  ５００＿０４３）、８ｍｌ／Ｌ  ＩＴＳ−Ｘ（インビトロジェン、カタログ番号５１５００−０５６）補足）で満たし、１８７．５μｇ  ＰＥＩストック（ポリサイエンス社、カタログ番号２３９６６）をＤＮＡ＋ＦＥＭＥ培地（ＤＮＡ：ＰＥＩ  １：５）に添加し、その試薬をボルテックスで１０秒間混合し、室温で１０秒間インキュベートした。６０×１０6生細胞を５０ｍｌチューブで遠心分離した。ペレットをトランスフェクション混合物で静かに再懸濁し、１２５ｍｌエーレンマイヤーに移し、１６０ｐｍ、３７℃でＣＯ2振とうインキュベーターにおいて１８０分間インキュベートした。１２．５ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５培地を添加し、２５ｍｌ培養物において最終濃度２．４×１０6細胞／ｍｌとした。
【０１８１】
トランスフェクションの２４時間後、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞に、１００μｌのバルプロ酸（ＶＰＡ）ナトリウム塩ストック１００ｎＭ（シグマ、カタログ番号Ｐ４５４３）（最終濃度０．５ｍＭ）および２ｍｌの３．５％Ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０８６６．０１）を補足した。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞に１００μｌのバルプロ酸（ＶＰＡ）ナトリウム塩ストック１００ｍＭ（シグマ、カタログ番号Ｐ４５４３）（最終濃度０．５ｍＭ）を補足し、インキュベーション温度を３１℃に下げた。
【０１８２】
インキュベーションの６日後、細胞懸濁液試料を細胞計数と生存率測定のために採取した。遠心分離後、上清をＥＬＩＳＡ試験における一過性発現の評価のために採取した。
【０１８３】
２．第２培地でのトランスフェクション
ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞による抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂの製造：
濃度０．５〜２×１０6の細胞を、１または２Ｌのエーレンマイヤーフラスコ中のデキストラン硫酸を含む２００〜６００ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５に播種し、３２０ｒｐｍで振とうインキュベーター上、３７℃で４日間培養した。収穫物を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通してろ過した。その後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ、カタログ番号Ｐ８３４０）を添加した（培養物１Ｌに対して１ｍｌ）。収穫物を、精製プロセスの開始まで−８０℃で凍結保存した。
【０１８４】
粗収穫物試料または精製組換えタンパク質のＦＡＣＳによるフコースレベルの分析：
プロテインＧ磁気ビーズ（カタログ番号Ｓ１４３０Ｓ、Ｂｉｏｌａｂｓ）を完全に再懸濁し、２５μｌを室温で２ｍｌチューブに移した。チューブを磁石のうえに１分間置き、上清を吸引した。２０ｍＭリン酸バッファーを０．５ｍｌ添加し、プロテインＧビーズを再懸濁した。この洗浄ステップをもう１回繰り返した。
【０１８５】
１００μｌの試料抗体（２５〜３７μｇ／ｍｌの粗収穫物または精製タンパク質のいずれか）を磁気ビーズ含有チューブに加えた。その混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、上清を捨てるために磁石上に置いた。ビーズを０．５ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファーで２回洗浄し、バッファーを磁石上で吸引した。試料抗体に結合したビーズを、０．５ｍｌのビオチン化ＡＡＬ−ＳＡ−ＰＥ混合物（ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中、２μｇ／ｍｌに希釈した、ビオチン化ＡＡＬベクター、カタログ番号Ｂ１３９５、２０μｇ／ｍｌおよびＳＡ−ＰＥ、バイオレジェンド、カタログ番号４０５２０、０．２ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１４２４７５）に移してアルミホイルを被せ、８０ｒｐｍで振とうして３７℃で３０分インキュベートした。混合物を完全に再懸濁し、１０ｍｌのＰＢＳ＋０．１プルロニック酸を含む１５ｍｌチューブ（コーニング、カタログ番号４３００５２）に移した。その後、１０ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸の添加、遠心分離および上清の除去により洗浄を２回行った。ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸に再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（ファルコン、カタログ番号３５２２３５）を通してろ過し、ＦＡＣＳにより分析した。
【０１８６】
粗収穫物試料または精製組換えタンパク質のＦＡＣＳによるシアル酸レベルの分析：
プロテインＧ磁気ビーズ（カタログ番号Ｓ１４３０Ｓ、Ｂｉｏｌａｂｓ）を完全に再懸濁し、２５μｌを室温で２ｍｌチューブに移した。チューブを磁石のうえに１分間置き、上清を吸引した。２０ｍＭリン酸バッファーを０．５ｍｌ添加し、プロテインＧビーズを再懸濁した。この洗浄ステップをもう１回繰り返した。
【０１８７】
１００μｌの試料抗体（２５μｇ／ｍｌの粗収穫物または精製タンパク質のいずれか）を磁気ビーズ含有チューブに加えた。その混合物を室温で３０分間インキュベートし、上清を捨てるために磁石上に置いた。ビーズを０．５ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファーで２回洗浄し、バッファーを磁石上で吸引した。試料抗体に結合したビーズを、０．５ｍｌのＭＡＡ−ＦＩＴＣ（２ｍｌに２ｍｇ、ＥＹ、カタログ番号Ｆ−７８０１−１、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸中、２５μｇ／ｍｌに希釈）に再懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１４２４７５）に移してアルミホイルを被せ、８０ｒｐｍで振とうしながら室温で３０分インキュベートした。混合物を完全に再懸濁し、１０ｍｌのＰＢＳ＋０．１プルロニック酸を含む１５ｍｌチューブ（コーニング、カタログ番号４３００５２）に移した。その後、１０ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸の添加、遠心分離および上清の除去により洗浄を２回行った。ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸に再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（ファルコン、カタログ番号３５２２３５）を通してろ過し、ＦＡＣＳにより分析した。
【０１８８】
抗−ＥＧＦＲ抗体についてのＥＬＩＳＡ：
テスト試料におけるヒト抗体の濃度を測定するためにＥＬＩＳＡアッセイを用いた。アッセイは、以下に記載するように行った。
【０１８９】
マイクロタイタープレートを、０．１Ｍ  炭酸バッファーｐＨ９．６中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。その後、プレートをブロッキングバッファー（ＰＢＳ−Ｔ０．０５％中１％ＢＳＡ）２００μｌ／ウェルでＲＴで１時間ブロックした。ブロッキング後、プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。コートしたプレートを調製後直ちに使用するか、または使用まで−２０℃で保管した（６週間以内）。試料、標準曲線および評価試料（check sample）をプレートに添加し（１００μｌ／ウェル）、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄バッファーで４回洗浄し、アッセイバッファー（ＰＢＳ中１％スキムミルクパウダー）中８ｎｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ−共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂの１００μｌアリコートと３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで再度４回洗浄し、１００μｌの基質溶液（ＴＭＢ）を添加し、ＲＴで約１０分間インキュベートした。１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌを各ウェルに添加して反応を止めた。吸光度をＡ450でＥＬＩＳＡリーダーにおいて測定した。標準溶液を参照試料抗−ＥＧＦＲ（メルクセロノ製ＥＲＢＩＴＵＸ）の段階希釈により調製し、アッセイバッファーにおける１００〜１．５６ｎｇ／ｍｌの範囲の標準曲線を得た。プール２３９０由来の粗生成物の試料（ＩＴＬで生産）を、評価試料として使用した。Ｍａｇｅｌａｎ５ソフトウェアは、光学的データ結果を計算した。４つのパラメータのロジスティック方程式を用い、未知試料の結果を自動的にｎｇ／ｍｌで表される標準曲線から挿入した。試料の希釈、標準曲線の調製、プレート上の試料の配置は、ロボットサンプルプロセッサーにより行った。
【０１９０】
抗−ＥＧＦＲインタクトおよびＦＣモノマーの精製：
プール（２３９０および２６２２ＵＮ）から生成された抗−ＥＧＦＲ産物は、プロテインＡカラム上で精製された。精製した産物を、（後述するように生成された）インタクトＩｇＧまたはＦｃモノマーのいずれかとして分析した。精製プロセスは、図２に概説されているようになし、ＡＫＴＡエクスプローラシステムを用いて行った。
【０１９１】
プロテインＡ上での抗−ＥＧＦＲ精製：
プロテインＡセファロース−ＭＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａプレ充填カラム（５ｍｌ容量）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．８の５〜６ＣＶで、流速２．０ｍｌ／分で平衡化した。プールからの生成物を含む浄化（clarified）粗収穫物（〜５００ｍｌ）を、流速２．０ｍｌ／分でカラム上にロードした。カラムを２段階（７〜９ＣＶ）：５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ６．８中の１．５Ｍ  ＮａＣｌによる第１洗浄と、それに続く、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．８での第２洗浄で、流速２．０ｍｌ／分で、ベースラインが得られるまで洗浄した。生成物を２０ｍＭ酢酸ｐＨ３．２、流速２．０ｍｌ／分で１つの画分に溶出した。カラムの稼働は、ＲＴで行い、２８０および２１５ｎｍのＵＶによりモニターした。Ｔｒｉｓ  １ＭでｐＨを６．０に調整した。カラムを０．１Ｍ酢酸、ｐＨ２．９で洗浄し、その後、８ＣＶ  ４Ｍ  グアニジンＨＣｌで、インプレースで掃除した。カラムを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．８で再平衡化し、２０％エタノールで保管した。
【０１９２】
インタクトな抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂの透析および濃縮：
プロテインＡセファロース−ＭＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａカラムから溶出した画分を、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ孔サイズ）において、「フォーミュレーションバッファー」（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．８）に対して一晩、約１：１００の容量比で２回透析した。透析後、試料をＡｍｉｃｏｎ濃縮器において限外ろ過（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ膜）により濃縮した。それらのステップは、２〜８℃で行った。濃縮した生成物の生成物濃度は、ＥＬＩＳＡにより、またはＯ.Ｄ.２８０ｎｍにより測定された。
【０１９３】
抗体のパパイン切断：
プロテインＡカラムから溶出した画分を、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ孔サイズ）において、バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）に対して一晩、４℃で、約１：１００（タンパク質：バッファー）の容量比で２回透析した。透析後、試料をＡｍｉｃｏｎ濃縮器において限外ろ過（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ膜）により１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。抗−ＥＧＦＲをパパインによりＦａｂおよびＦｃ画分に切断した。切断は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭシステイン中、最終濃度１ｍｇ／ｍｌで抗体をインキュベートすることにより行った。消化は、最終のタンパク質：酵素比１００：１（ｗ／ｗ）となるようパパイン（水で１ｍｇ／ｍｌに希釈された）の添加により開始された。消化は、３７℃で２時間行い、切断は、マレイミド（３３ｍＭ）の添加により停止され、氷で冷却された。Ｆｃ二量体画分を、本明細書で上述したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより切断混合物から精製した。精製したＦｃ二量体は、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ孔サイズ）において、ＰＢＳ×１、ｐＨ７．２に対して２回透析し、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器において限外ろ過（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ膜）により２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１９４】
還元およびアルキル化：
還元およびアルキル化を、変性条件下、Ｆｃ二量体画分を用いて行い、重鎖のＣＨ２ドメインに位置する２９７位のＮグルコシル化部位上のフコースレベルの特徴付けのためにＦｃモノマーを生成した（背景技術を参照）。Ｆｃ二量体画分を１ｍｇ／ｍｌにバッファー（４Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８）で希釈し、その後ジチオトレイトール（ＤＴＴ、５ｍＭ）を添加し、反応混合物を７５℃で５分間置いた。次にタンパク質溶液を室温まで冷却し、０．５Ｍヨードアセトアミドストック溶液を添加し、最終濃度を１５ｍＭとした。アルキル化は、室温で４０分間、暗所で行った。その後、０．５Ｍ  ＤＴＴストック溶液を１５ｍＭの濃度まで添加し、アルキル化をクエンチした。
【０１９５】
抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマーの透析および濃縮：
プロテインＡセファロース−ＭＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａカラムから溶出した画分を、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ孔サイズ）において、「フォーミュレーションバッファー」（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．８）に対して一晩、約１：１００（タンパク質：バッファー）の容量比で２回透析した。透析後、試料をＡｍｉｃｏｎ濃縮器において限外ろ過（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ膜）により濃縮した。それらのステップは、２〜８℃で行った。濃縮した生成物の生成物濃度は、ＥＬＩＳＡにより、またはＯ.Ｄ.２８０ｎｍにより測定された。
【０１９６】
Ｏｃｔｅｔによる精製したタンパク質上のフコースおよびシアル酸レベルの分析：
このアッセイは、Ｏｃｔｅｔ速度論的分析により精製した生成物（インタクトＩｇＧ１またはＦｃモノマー）上のフコースまたはシアル酸のいずれかのレベルを測定するために用いられた。このアッセイは以下に記載するように行った。
【０１９７】
ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン試薬をＡＡＬまたはＭＡＡいずれかのビオチン化のために、製造業者の取扱説明書にしたがって用いた。ビオチン試薬溶液（ＰＢＳ×１中１ｍＭ、ｐＨ７．２）を１ｍｌのレクチン（１ｍｇ／ｍｌ）に添加した（１：５比、レクチン：ビオチン）。反応混合物を氷上で２時間インキュベートした。試料の透析は、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフ孔サイズ）においてＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して行った。
【０１９８】
ストレプトアビジンバイオセンサ（ＳＡ）を、速度バッファーにおいて２０分間３０℃で振とうせずに実験を開始する前にプレ−インキュベートした。バッファー、ビオチン化レクチンおよび精製生成物を、要求される濃度に調製し、９６ウェルプレート（２５０μｌ／ウェル）に移し、すべてのステップを３０℃で振とう速度（１０００ｒｐｍ）で行った。稼働は、すべてコンピュータ制御下で、適切なウェルにバイオセンサを配置することにより開始し、層の厚さ（ｎｍでの）の時間による変化を測定した。最初に、１μｇ／ｍｌのビオチン化ＡＡＬ（ＡＡＬ−Ｂ）または１０μｇ／ｍｌビオチン化ＭＡＡ（ＭＡＡ−Ｂ）をストレプトアビジンバイオセンサチップ表面上に４０分間固定化した（ローディングステップ）。次に、このチップを希釈した速度論的バッファー（ＫＢ×１）中で１０分間洗浄した（ベースラインステップ）。結合ステップでは、精製したタンパク質をビオチン化レクチンに４０分結合させ、その後、ＫＢ×１バッファーにおいて解離ステップのために洗浄した。図３は、Ｏｃｔｅｔによる速度論的に分析の典型的なプロファイルを示す。データは、Ｏｃｔｅｔ  Ｕｓｅｒソフトウェアバージョン６．３を用いて自動的に処理した。
【０１９９】
ＩＣＥ２８０による精製抗体の電荷プロファイル分析：
イメージキャピラリー等電点フォーカシングは、ｉＣＥ２８０分析機（コンバージェントバイオサイエンス）を用いて行った。アイソフォーム分離は、キャピラリーカートリッジ（５０ｍｍ長、１００μｍＩ．Ｄ．カラム）、フッ化炭素化合物で事前コートされた内部表面を有する分離キャピラリーでなされた。
【０２００】
精製および透析した抗−ＥＧＦＲ試料を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルターにおいて、限外ろ過（１０ｋＤａ  ＭＷ  カットオフセルロース膜）により４ｍｇ／ｍｌに濃縮した。２０μｌの４ｍｇ／ｍｌ  抗−ＥＧＦＲ、８０μｌのランニングストック溶液を混合することにより分析用試料を調製した。分離は、１００ｍＭ  ＮａＯＨを陰極液として、８０ｍＭ  Ｈ3ＰＯ4を陽極液として用いて行った。電気泳動図は、２８０ｎｍのＵＶ吸収により得た。最終の条件および濃度の概要を本明細書の以下の表３に示す。
【０２０１】
【表３】
2014509850.tif 000003
【０２０２】
ＭＳによるＦｃモノマー上のグリコシル化プロファイルの分析：
ＥＧＦＲに対する抗体のＦｃモノマーを上述したように単離し、ＭＳによるグリカン分析に関してさらに評価した。
【０２０３】
ＡＣＦＭにおける細胞の増殖および生産性：
細胞培養物の維持およびＰＤＴ計算
細胞培養物をつぎのとおりＡＣＦＭにおいて維持した。細胞を５０ｍｌチューブに０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播種し、３２０ｒｐｍでオービタル振とう器上において３７℃でインキュベートした。週に２回、細胞数と生存率を測定した。培養物を１００ｇ、４℃で５分間の遠心分離により継代し、その後、細胞ペレットを事前に温めた新鮮なＡＣＦＭに再懸濁した。
【０２０４】
細胞集団倍化レベル（ＰＤＬ）および細胞集団倍化時間（ＰＤＴ）の計算は、以下の等式により決定した。
【数１】
2014509850.tif 000004
【０２０５】
最大細胞濃度の決定：
５０ｍｌチューブ（ＴＰＰ、カタログ番号８７０５０）に細胞を０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播種し、３２０ｒｐｍでオービタル振とう器上において３７℃でインキュベートした。種々の時点で、細胞数と生存率を測定した。
【０２０６】
ＡＣＦＭにおける特異的生産性：
ＡＣＦＭにおける特異的生産性（ＰＣＤ）について、細胞を特定のＡＣＦＭに０．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で５０ｍｌチューブに播種し、振とう器インキュベーター（３２０ｒｐｍ）において３７℃で２４時間インキュベートした。その後、培地を取り出し、生成物の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。計算は、２４時間力価を、播種時および実験の２４時間後の細胞の平均濃度で割ることによりなされた。
【数２】
2014509850.tif 000005
【０２０７】
バッチプロセスにおける増殖と生産性：
細胞懸濁液バッチプロセスにおける増殖と生産性は、生存率レベルが７０％を下回るまで、３７℃、５％ＣＯ2で、１２５ＲＰＭで振とうしながら１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ（コーニング、カタログ番号ＷＩ−４３１１４３）において、ＰｒｏＣＨＯ５培地４０ｍｌおよびＣＨＯ  ＣＤ  ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ａ（インビトロジェン、カタログ番号Ａ１０２３４−０１）＋ＣＨＯ  ＣＤ  ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｂ（インビトロジェン、カタログ番号Ａ１０２４０−０１）（１：１）１２ｍｌ中で播種時の濃度０．２×１０6細胞／ウェルで行った。試料を生成物力価分析（ＥＬＩＳＡによる）、代謝物濃度、細胞濃度および生存率のために、３日目以降、１〜２日ごとに回収した。
【０２０８】
実施例１
低フコース含有細胞の単離のための戦略
低フコース発現細胞の単離のために用いた戦略は、無作為の突然変異の創出および所要の低フコース表現型を有する細胞の選択に基づくものであった。
【０２０９】
プロセスは、いくつかのステップ（図４および５に説明されるような）を含み、突然変異体を生み出すためのＣＨＯ−Ｓ細胞の変異誘発剤ＭＴＸとのインキュベーションにより開始された。その後、ＭＴＸを除去し、細胞を以下のステップの１つにより単離した。
【０２１０】
１．ビオチン化フコース特異的レクチン（ビオチン化ＡＡＬまたはＡＯＬ）による細胞標識およびストレプトアビジンコート磁気ビーズへ結合しない細胞の単離を２回。このステップの後、ビオチン化フコース特異的レクチン（ビオチン化ＡＡＬまたはＡＯＬ）および蛍光ストレプトアビジンによる細胞標識化、そしてＦＡＣＳによる低蛍光細胞の単回ソーティング（図４）。
【０２１１】
２．ビオチン化フコース特異的レクチン（ビオチン化ＡＡＬ）と蛍光ストレプトアビジンによる細胞標識化およびＦＡＣＳによる低蛍光細胞のソーティングを４回（図５）。
【０２１２】
ＭＴＸにおけるＣＨＯ−Ｓ細胞のインキュベーション：
Ｃ６６１４におけるＣＨＯ−Ｓ細胞を、１００ｎＭ  ＭＴＸに０．２×１０6細胞／ｍｌで播種し、生存率が９０％を超えるまで１０日間増殖させた。その後、細胞を最初と同じ濃度で２００ｎＭ  ＭＴＸを含むＣ６６１４に移し、生存率が９０％を超えるまで。細胞を凍結し、低フコース含有細胞の単離のために供した。
【０２１３】
実施例２
ストレプトアビジン磁気ビーズでの単離２回と１回のＦＡＣＳソーティングサイクルによる低フコース細胞の選択
２００ｎＭ  ＭＴＸでインキュベートした５０００万のＣＨＯ−Ｓ細胞、野生型ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ  ＤＵＫＸ細胞を、磁気ビーズで一旦分け、９６ウェルプレートに播種し、増殖させ、Ｔ８０フラスコに移した。分離した非結合の細胞の数と生存率は、ＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞の場合により高く、非ＭＴＸ処理細胞においてより低かった。さらに、ＭＴＸにおいてインキュベートしたＣＨＯ−Ｓ細胞は、１４日間でＴ８０フラスコの範囲に達し、一方、ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ−ＤＵＫＸは２２日後にのみＴ８０フラスコの範囲に達した。さらなる低フコース細胞の単離は、ＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞でのみ行った。２回目のストレプトアビジンコート磁気ビーズ単離は、５×１０7細胞で開始し、選択された非結合細胞を９６ウェルプレートに播種した。１．５％の最も低いフコース集団のＦＡＣＳソーティングは、回収および細胞増殖の後で４×１０7細胞で行った。
【０２１４】
細胞の膜上のフコースレベルの分析：
細胞表面のフコースレベルの分析により、ビオチン化ＡＡＬおよびＳＡ−ＰＥによる細胞の標識化ののち、ＣＨＯ−Ｓ  ＭＴＸソート細胞のみが細胞の膜上の低フコースレベルを有する亜集団を示したということがわかった。ＣＨＯ−Ｓ（図６）およびＣＨＯ  ＤＵＫＸ（データは示さず）分離細胞は、細胞の膜上の通常のフコースレベルを表した。２回のストレプトアビジンコート磁気ビーズ選択と、１回のＦＡＣＳソーティング選択の後、ＣＨＯ−Ｓ  ＭＴＸ処理細胞のさらなる分析は、図７Ａに表現され、ソートされた細胞の低フコースプロファイルを示す。低フコースプロファイルは、ＰｒｏＣＨＯ５およびＣ６６１４培地の両方において同様であることがわかった（図８）。
【０２１５】
同様のアプローチをビオチン化ＡＯＬで行った。磁気ビーズおよびＦＡＣＳにより単離されたＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析を説明する。ＭＴＸでインキュベートされたＣＨＯ−Ｓ細胞は、ビオチン化ＡＯＬで標識し、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズと混合した。細胞を磁石上で分離し、磁石に付着しなかった細胞をさらに増殖させた。この工程を２回繰り返した。その後、細胞をビオチン化ＡＯＬおよび蛍光ストレプトアビジンで標識し、低蛍光細胞をＦＡＣＳによりソートし、さらに増殖させた。ＦＡＣＳ分析は、ビオチン化ＡＯＬおよび蛍光ストレプトアビジンにより細胞を標識することにより行った。２回のストレプトアビジンコート磁気ビーズ選択および１回のＦＡＣＳソーティング選択の後の、ビオチン化ＡＯＬにより標識されたＣＨＯ−Ｓ  ＭＴＸ処理細胞の分析は、ソートされた細胞の低フコースプロファイルを示す。標識していないＣＨＯ−Ｓ細胞（□）、ＣＨＯ−Ｓ細胞（○）、ビーズ上での単回分離後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（△）、ビーズ上での２回分離サイクル後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（◇）、ビーズ上での２回分離サイクルおよび単回ＦＡＣＳソーティングサイクル後のＭＴＸ処理ＣＨＯ−Ｓ細胞（▼）。
【０２１６】
アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）１−フコース特異的レクチン（ＡＯＬ）の低フコース細胞の選択のための使用：
ＭＴＸとインキュベートされたＣＨＯ−Ｓ細胞は、ビオチン化ＡＯＬで標識化し、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ選択と混合した。細胞を磁石上で分離し、磁石に付着しない細胞をさらに増殖させた。このステップを２回繰り返した。その後、細胞をビオチン化ＡＯＬおよび蛍光ストレプトアビジンで標識化し、低蛍光細胞をＦＡＣＳによりソートし、さらに増殖させた。ＦＡＣＳ分析は、細胞をビオチン化ＡＯＬおよび蛍光ストレプトアビジンで標識化することにより行った。図７Ｂに示された結果は、ＡＯＬが低フコース発現細胞を選択するためにも使用できることを示す。
【０２１７】
細胞の膜上のシアル酸レベルの分析：
シアル酸レベルの分析は、オリゴ糖上のシアル酸の存在を示すのみならず、低フコース細胞選択の間、全オリゴ糖が喪失されていないことを確保することもできる。細胞の膜上のシアル酸レベルの分析は、シアル酸特異的レクチン（ＭＡＡ）共役ＦＩＴＣと細胞をインキュベーションすることによりなされ、その後ＦＡＣＳ分析を行う。分析は、ビオチン化ＡＡＬおよびＳＡ−ＰＥによる細胞の標識化の後、ＰｒｏＣＨＯ５およびＣ６６１４培地においてＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ１細胞の両方が同様のレベルの細胞の膜上のシアル酸を示すことが示された（図９）。
【０２１８】
低フコース表現型の安定性：
細胞表面上のフコースレベルの分析は、３５８集団倍化（ＰＤＬｓ）に対してＩＴＬ−ＬＦ１細胞の選択後、種々の時点で測定し、ビオチン化ＡＡＬおよびＳＡ−ＰＥによる細胞の標識化の後、低フコース表現型が低くかつ安定にとどまったことが示された（図１０）。
【０２１９】
増殖率：
ＩＴＬ−ＬＦ１細胞の増殖率は、フコース安定性試験の間測定され、ＣＨＯ−Ｓと同様１５〜２０時間のＰＤＴとなることがわかった（図１１）。
【０２２０】
実施例３
ＦＡＣＳでのソーティングによるゼロフコース細胞の選択（ＩＴＬ−ＬＦ２細胞）
２００ｎＭ  ＭＴＸでインキュベートしたＣＨＯ−Ｓ細胞を、低フコース集団について選択するためにＦＡＣＳによりソートした。ソーティングのための採取した初期細胞数、低フコースゲート細胞の画分、ならびに各ソーティングサイクルにおいてソートされた細胞数を以下の表４に示す。
【０２２１】
【表４】
2014509850.tif 000006
【０２２２】
細胞の膜上のフコースレベルの分析：
細胞の表面上のフコースレベルの分析は、ビオチン化ＡＡＬおよびＳＡ−ＰＥでの細胞の標識化後、ゼロフコースソートＣＨＯ−Ｓ  ＭＴＸ画分が行われたソート数と共に増加したということを示した。３回のソートで、低フコシル化レベルを有する均一な集団が得られた。４回目のソートは、低フコースレベルを有する均一な集団の選択をさらに実証するために適用した（図１２）。別の分析では、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のフコシル化レベルが、ＰｒｏＣＨＯ５およびＣ６６１４培地の両方でゼロであったことが示された（図１３）。
【０２２３】
細胞の膜上のシアル酸レベルの分析：
シアル酸レベルの分析は、オリゴ糖上のシアル酸の存在を示すのみならず、低フコース細胞選択の間、全オリゴ糖が喪失されていないことを確保することもできる。分析は、シアル酸特異的レクチンＦＩＴＣ共役ＭＡＡでの細胞の標識化の後、ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２細胞の両方が同様のレベルの細胞の膜上のシアル酸を示すことが示された（図１４）。
【０２２４】
低フコース表現型の安定性：
細胞表面上のフコースレベルの分析は、３７０ＰＤＬｓに対してＩＴＬ−ＬＦ２低フコース細胞の選択後、種々の時点で測定し、ビオチン化ＡＡＬおよびＳＡ−ＰＥによる細胞の標識化の後、低フコース表現型が低くかつ安定にとどまったことが示された（図１５）。
【０２２５】
増殖率：
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞の増殖率は、フコース安定性試験の間測定され、ＣＨＯ−Ｓと同様１５〜２０時間のＰＤＴとなることがわかった（図１６）。
【０２２６】
最大細胞濃度：
純粋なバッチ培養条件下（フィードなし）での最大細胞濃度を測定するために、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞を、０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で、５０ｍｌチューブに播種し、７日間培養した。達した最大生細胞濃度は、７．５×１０6生細胞／ｍｌに達した親のＣＨＯ−Ｓよりもわずかに高い８．４×１０6細胞／ｍｌであった（図１７）。
【０２２７】
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のフコシル化レベルに対する外因性フコースの影響：
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞を、培養培地中のＬ−フコースの濃度を増加させているＰｒｏＣＨＯ５培地に播種した。ＦＡＣＳ分析の結果は、外因性添加フコース濃度と細胞の膜上のフコシル化レベルとの間の相関を示す（図１８）。
【０２２８】
バッチプロセスにおけるＩＴＬ−ＬＦ２細胞の増加：
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞の能力を上昇させ、それらをバッチプロセスにおけるＣＨＯ−Ｓ細胞と比較するため、細胞を、ＰｒｏＣＨＯ５＋ＣＨＯ  ＣＤ  ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）に播種し、生存率が６０％よりも高くとどまるだけ長く増殖させた。細胞濃度、細胞生存率、代謝物濃度および生成物力価を測定するために、試料を培養物から採取した。結果は、ＩＴＬ−ＬＦ２は、ＣＨＯ−Ｓ細胞と比較してより高い生存率と、〜２０％より高い積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）でより長い時間増加した。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞は、プロセスの間有意に低い乳酸塩濃度も示し、これらの細胞が、親のＣＨＯ−Ｓ細胞よりもより効率的に炭素源として乳酸塩を利用することを示す。バッチプロセスにおけるＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓの生存率は、細胞を、バッチプロセスで補足（supplements）を有するＰｒｏＣＨＯ５に０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播種し、細胞の生存率をプロセスに沿って分析した。バッチプロセスにおけるＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓの生細胞濃度は、細胞を、バッチプロセスで補足を有するＰｒｏＣＨＯ５に０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播種し、細胞数をプロセスに沿って分析した。バッチプロセスにおけるＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓの積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）は、細胞を、バッチプロセスで補足を有するＰｒｏＣＨＯ５に０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播種し、生細胞濃度をプロセスに沿って測定した。ＩＶＣＣは、細胞濃度測定値に基づいて算出した。ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２株は共に適合するが、しかしＣＨＯ−Ｓ細胞は、たった９日目で、一方ＩＴＬ−ＬＦ２細胞は１２日目で達したことに注意。ＣＨＯ−Ｓ細胞（○）およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞（△）。
【０２２９】
ＦＡＣＳ  ＡＣＤＵによるクローニング：
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のクローニングは、ＦＡＣＳＡｒｉａ  セルソーターの自動細胞捕集装置（ＡＣＤＵ）により行った。１９２ウェルから生じた１０３および１２４クローンを、クローニング後８日に、２つの実験（５４および６５％回収を示す）において、８０％  Ｃ６３６６＋２０％  ＰｒｏＣＨＯ５に播種した。通常、同様の回収範囲がＣＨＯ−Ｓ細胞のクローニング後に得られる（データは示さず）。いくつかのクローンをＰｒｏＣＨＯ５培地で増殖させ、ｍＲＮＡ特徴付のために供した。
【０２３０】
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞の遺伝的分析：
フコシル化経路は、別々に開始しそして収束する２つのルートからなる。その２つのルートは、Ｄ−グルコースからのデノボ経路とＬ−フコースからのサルベージ経路から構成される。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞における低フコース表現型の原因を調べるために、経路に関与する遺伝子の発現について分析を行った。これは、これらの遺伝子のいずれかが配列または発現レベルのいずれかで破壊され得るかどうかを確かめるためのものである。発現パターン（ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定により）および発現レベル（Ｑ−ＰＣＲ）を分析された遺伝子は、図１９において強調されている。
【０２３１】
プライマーの配列を以下の表５に詳述する。
【０２３２】
【表５】
2014509850.tif 000007
【０２３３】
ＣＨＯ−Ｓ親細胞と比較して、ＩＴＬ−ＬＦ２において発現されるフコシル化経路遺伝子を分析するために、全ＲＮＡを両細胞株から抽出し、逆転写（ＲＴ）に付し、その後全コード領域を捕捉する遺伝子特異的プライマーによるＰＣＲを行った。得られたｃＤＮＡｓは、その後アガロースゲル上を走らせ、親のＣＨＯ−Ｓ細胞およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞から得られたサイズに相違があるかどうか分析した。得られたバンドをさらに配列決定により分析した。図２０は、すべての４つの試験遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲ後に得られた結果を示す。
【０２３４】
同様のサイズのｃＤＮＡｓを、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース  エピメラーゼ−レダクターゼ（Ｆｘ）およびアルファ１，６−フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）遺伝子について得た。配列決定分析により、両遺伝子のｃＤＮＡｓは、２つの細胞株において同一であることを確認した。ＧＤＰベータＬフコースピロホスホリラーゼ（ＧＦＰＰ）は、ＣＨＯ−Ｓ細胞において検出できなかった（複数のＲＴ−ＰＣＲ分析でチェックした）が、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞においては予測されたサイズに非常に弱いバンドが検出された（図２０の矢印）。配列決定は、このケースにおいては行わなかった。
【０２３５】
ＧＭＤ遺伝子については、ＣＨＯ−Ｓ細胞では予想されたサイズでバンドが検出され、そして配列決定により、予測された全長ＧＭＤ  ｍＲＮＡであることが明らかとなった。しかしながら、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞では、２つのバンドが検出され（これらの２つのバンドは、時には、二重バンドを示すゲル１つの「太い」バンドのように見える）、両方全長ＯＲＦよりより小さかった。配列決定により、２つのスプライス変異体：１つ目（スプライス変異体１−ＳＶ１で示される）は、エクソン８および９の欠失を有し（図２１Ａ）そして２つ目（スプライス変異体２−ＳＶ２）は、エクソン３および４の欠失を有する（図２１Ｂ）、の存在が明らかとなった。全長ＧＭＤおよび両スプライス変異体のタンパク質の配列は、配列番号２３〜２５に記載されている。全長ＧＭＤおよび両スプライス変異体のＤＮＡ配列は、配列番号２６〜２８に記載されている。加えて〜２５０ｂｐの小さなバンドが、ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２の両細胞において見られた。この小さなバンドが両細胞型に検出されたというその事実により、このバンドはこれらの両細胞型におけるグリコシル化の相違の原因ではないようである。したがって、このバンドを「小」バンドと呼び、さらなる分析は行わなかった。
【０２３６】
ＧＭＤスプライス変異体（ＳＶ）配列の分析により、各スプライス変異体について独自の制限酵素部位の存在が明らかとなった（エクソン４上のＢｇｌＩＩおよびエクソン８上のＸｍｎＩ）（図２２Ａ参照）。ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２細胞におけるｍＲＮＡパターンのさらなる検証のため、追加のＲＴ−ＰＣＲが各細胞型について行われた。その後、ｃＤＮＡを３つに等分し、１つ目は処理せず、もう１つはＢｇｌＩＩで消化し、３つ目はＸｍｎＩで消化した。その後、すべての反応物をアガロースゲル上に走らせ、バンドを検出し、ＤＮＡサイズマーカーと比較した（図２２Ｂ）。この実験の根拠は、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞が２つのＳＶｓの混合物を含む場合、１つの制限酵素による消化で、特異的制限部位を含まないＳＶのより長いバンドはそのままで、追加の新しいバンドが、特異的制限部位を含む他のＳＶに対して予測されたサイズで現れるであろうということである。バンドの予測されたサイズは、すべての消化において得られ、実際ＩＴＬ−ＬＦ２において、２つのスプライス変異体が混合物として存在することを示している。加えて、制限処理後の最も大きい（高い）バンド（消化されていないＳＶ）をゲルから切り出し、配列決定した。結果は、各ケースにおいて予測されたＳＶの存在：ＢｇｌＩＩ消化画分における最も高いバンドとして残ったＳＶ２およびＸｍｎＩ消化フラグメントに残ったＳＶ１を示した（得られたフラグメントサイズの説明は、下記表６参照）。
【０２３７】
【表６】
2014509850.tif 000008
【０２３８】
フコース合成に関与する遺伝子の発現レベル：
フコシル化経路に関与する遺伝子の発現レベルは、遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いたＱ−ＰＣＲにより測定された。試験遺伝子のいずれの発現レベルにおいても有意な変化は検出されなかった（図２３）。結果は、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のフコシル化における変化は、ＧＭＤ  ｍＲＮＡｓ発現レベルによるものではなかったことを示す。
【０２３９】
Ｐｒｅ−ＭＣＢの製造（製造、解凍、滅菌およびマイコプラズマ試験）：
ＦＡＣＳによる４サイクルの低フコース選択の後に生じたＩＴＬ−ＬＦ２細胞を増殖し、凍結させた。これらの細胞を増殖させるために解凍し、ＰｒｅＭＣＢを作製した。１バイアルにつき１０×１０6細胞を有する６０アンプルを含むプレ−マスター細胞バンク（ｐｒｅ−ＭＣＢｓ）を作製した。
【０２４０】
プレ−マスター細胞バンクの生存率試験、無菌テストおよびマイコプラズマ試験：
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のｐｒｅ−ＭＣＢ由来の１つのアンプルを、凍結後１１日で解凍した。解凍直後に測定した生存率は９８．３％であった。細胞を３回の増殖サイクルの間増殖させ、それぞれ９９．０％生存率であることがわかった。
【０２４１】
ｐｒｅ−ＭＢＣｓを、無菌性およびマイコプラズマ混入について調べた。バンクは無菌でマイコプラズマを含まないことがわかった。
【０２４２】
実施例４
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞は、野生型ＧＭＤ遺伝子によるトランスフェクションによりフコシル化を再獲得する
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞において、ＧＭＤ遺伝子（フコースのデノボ合成経路に関与する）が２つのスプライス変異体を示し、全長ｍＲＮＡを示さないことがわかった。これは、ＣＨＯ−Ｓ野生型細胞において見られるパターンとは異なる。全長ＧＭＤタンパク質の欠如が、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞において見られる低フコース表現型の原因であるかどうかを評価するために、細胞を全長ＧＭＤ  ｃＤＮＡでトランスフェクトし、その後フコシル化レベルのＦＡＣＳ分析をした。
【０２４３】
プラスミドＭＢ−１２９の構築（ＰＣＭＶ−Ｐ−ＧＭＤ）：
全長ＧＭＤ  ｃＤＮＡは、上述の表５に示されたプライマー５８６−２６および５８７−２２を利用するＣＨＯ−Ｓｗｔ細胞から抽出された全ＲＮＡ上のＲＴ−ＰＣＲにより作製した。この遺伝子を必要とされるベクターにクローン化するために、ＰＣＲの追加ステップを、クローニングステップに必要とされる制限酵素（ＲＥ）部位（５’ＳｗａＩおよび３’ＸｈｏＩ）の追加を可能とするプライマー７００−４５および７０１−３０（詳細は下記表７参照）により実施した。
【０２４４】
【表７】
2014509850.tif 000009
【０２４５】
ＰＣＲフラグメントをＳｗａＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ制限酵素で消化したベクターｐＣＭＶ−Ｐにライゲートした。
【０２４６】
得られたベクター（ＭＢ−１２９）は、図２４に説明するように別のカセット上に選択マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子と、ｈＣＭＶプロモーターのもとにＧＭＤ遺伝子を含有する。
【０２４７】
トランスフェクトされた細胞のフコース発現：
ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞は、リポフェクトアミン試薬を用いて３重でＧＭＤコード配列（ｐＣＭＶ−Ｐ−ＧＭＤ）を含む線状プラスミドでトランスフェクトした。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞は、３日間、１３．６ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン／３．９ｍｇ／Ｌのチミジン（ＨＴ）および１０μｇ／ｍｌフコースを補足した５０％Ｃ６６１４（シグマ）および５０％Ｃ６３６６（シグマ）において回収された。その後、トランスフェクトされた細胞を、１０μｇ／ｍｌフコースおよび１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを補足した５０％Ｃ６６１４（シグマ）および５０％Ｃ６３６６（シグマ）において選択した。完全な回収後、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクトプールを、フコースを含まず、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＰｒｏＣＨＯ５培地に移した。
【０２４８】
ＩＴＬ−ＬＦ２  ＧＭＤトランスフェクト細胞上でＦＡＣＳによりフコシル化レベルを分析し、ＣＨＯ−Ｓ細胞（陽性対照）およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞（陰性対照）のフコシル化レベルと比較した（図２５）。結果から、おおよそ４５％の集団がＣＨＯ−Ｓ細胞と同様のフコシル化レベルを有するタンパク質を発現することがわかる。集団の残り（〜５５％）は、より低いフコシル化レベルを示した。それにもかかわらず、この低フコシル化レベルを有する集団は、ＩＴＬ−ＬＦ２非トランスフェクト細胞のものよりも高いフコシル化レベルを有する。上記の結果は、プラスミドを含むＧＭＤでのトランスフェクションの後、フコシル化がＩＴＬ−ＬＦ２細胞に再構築されたことを示し、ＧＭＤ  ｍＲＮＡにおける欠失がＩＴＬ−ＬＦ２細胞の低フコシル化レベルの原因であったことが確認される。異なるフコシル化レベルを有するＩＴＬ−ＬＦ２  ＧＭＤトランスフェクト細胞の２つの亜集団が存在する理由は、ピューロマイシン選択のストリンジェンシーに由来し得る。低フコシル化亜集団と高フコシル化亜集団の両方が、ピューロマイシン選択を生き抜くのに十分な量のピューロマイシンＮアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）を発現するが、ＰＡＣ発現およびＧＭＤ発現との間に直接的な相関は見られなかった。したがって、２つの亜集団は、フコシル化の異なるレベルを結果として生じる異なるレベルのＧＭＤタンパク質を発現する
【０２４９】
実施例５
安定および一過性トランスフェクション後のＩＴＬ−ＬＦ２細胞の分析
ＩＴＬ−ＬＦおよびＣＨＯ−Ｓ細胞の安定トランスフェクション：
ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞を、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂコード配列を含む線状プラスミド（ＰＧＬ３抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１−ＤＨＦＲタンデム）で三重に（図２６）リポフェクトアミン試薬を用いてトランスフェクトした。
【０２５０】
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞は、３日間、１３．６ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン／３．９ｍｇ／Ｌのチミジン（ＨＴ）および１０μｇ／ｍｌのフコースを補足した５０％Ｃ６６１４（シグマ）および５０％Ｃ６３６６（シグマ）において回収された。その後、トランスフェクト細胞を、１０μｇ／ｍｌのフコースおよび５〜１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補足した５０％Ｃ６６１４（シグマ）および５０％Ｃ６３６６（シグマ）において選択した。８日後、細胞を１０μｇ／ｍｌのフコースおよび２５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含むＣ６６１４培地に移した。完全な回収後、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクトプールを、低フコーストランスフェクト細胞の複合プールを作製するために併せた。フコースを培地から回収し、その後、細胞を１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＰｒｏＣＨＯ５培地に移した。
【０２５１】
ＣＨＯ−Ｓ細胞は、３日間、２７．２ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン／７．８ｍｇ／Ｌのチミジン（ＨＴ）および１０μｇ／ｍｌのフコースを補足したＰｒｏＣＨＯ５（シグマ）において回収された。その後、トランスフェクト細胞を、１０μｇ／ｍｌのフコースおよび２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補足したＰｒｏＣＨＯ５培地において選択した。１２日後、ＣＨＯ−Ｓ細胞を完全に回収した。
【０２５２】
組換え抗体発現は、ＥＬＩＳＡにより分析され、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞と比較してＩＴＬ−ＬＦ２細胞においてわずかに低いのみであることがわかった（図２７）。
【０２５３】
抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞の膜上のフコースレベルのＦＡＣＳ分析：
フコースの除去前後、Ｃ６６１４培地において増殖された抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞の細胞膜上のフコースレベルの分析は、フコース除去により、フコシル化が、フコースの非存在下で得られる初期の低いレベルに減少することを示す（図２８）。
【０２５４】
抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞の膜上のシアル酸のＦＡＣＳ分析：
分析により、トランスフェクション後でありシアル酸特異的レクチン：ＦＩＴＣ共役ＭＡＡによる細胞の標識化後、ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２の両方の抗ＥＧＦＲトランスフェクト細胞は、同様のレベルの細胞膜上のシアル酸を提示するということが示された。これらのレベルは、ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２非トランスフェクト細胞のレベルとも同様である（図２９）。
【０２５５】
一過性トランスフェクションのためのｐＴＴ５−抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂベクターの構築：
抗ＥＦＧＲ  ｍＡｂのＩＴＬ−ＬＦ２細胞への一過性のトランスフェクションのために、２つのベクターをｐＴＴ５ベクターの骨格上に構築した。１つのベクターは、ＥＧＦＲ  ｍＡｂ抗体の軽鎖（ＬＣ）を含み、他方は重鎖（ＨＣ）を含んだ。
【０２５６】
ベクターＭＢ−１２７を作り出すために、ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＨＣを含む１４７６ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ベクターＰＧＬ３  抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１−ＤＨＦＲタンデム−８７２上のプライマー６９０−３６＆６９１−３８を用いて作製した。フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ制限酵素で消化したベクターｐＴＴ５にライゲートした。得られたベクターを図３０Ａに示す。
【０２５７】
ベクターＭＢ−１２８を作り出すために、ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＬＣを含む７６２ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ベクターＰＧＬ３  抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  ＥＭＣＶ−ＰＡＣ１−ＤＨＦＲタンデム−８７２上のプライマー６９２−３６＆６９３−３２を用いて作製した。フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ制限酵素で消化したベクターｐＴＴ５にライゲートした。得られたベクターを図３０Ｂに示す。
【０２５８】
ＩＴＬ−ＬＦおよびＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性のトランスフェクション：
ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞を、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ含有ＰＴＴ５ベクター（図３０Ｂ）で、ＰＥＩ試薬を用いて三重にトランスフェクトした。その後、２つのトランスフェクションプロトコールを実施した。
【０２５９】
ＰｒｏＣＨＯ５でのトランスフェクション：
ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２細胞を、ＰｒｏＣＨＯ５を含む培地において３７℃でトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間にＣＨＯ−Ｓ細胞にバルプロ酸を補充し、３１℃でインキュベートした。前記条件下でのＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞におけるタンパク質濃度は、それぞれ１２．５μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌであった（図３１）。
【０２６０】
実施例６
組換え抗体の分析
ＦＡＣＳによる粗製物（crude material）または精製した抗体におけるフコースおよびシアル酸レベルの分析：
抗体を含む粗製物または精製物を、プロテインＧ磁気ビーズに結合させ、蛍光ラベルした特異的レクチンで染色した（図３２に説明するように）。糖残基のレベルを検出するために抗体試料をＦＡＣＳにより分析した。
【０２６１】
一過性トランスフェクト細胞由来の粗収穫物上のフコースレベルのＦＡＣＳによる分析：
一過性トランスフェクションからの粗収穫試料をスピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  カタログ番号ＵＦＣ８０１０２４）により濃縮し、２５μｇ／ｍｌより上の濃度とした。分析は、タンパク質産物濃度３２〜３７μｇ／ｍｌで方法の項に示すように行った。結果は、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクト細胞が、安定なトランスフェクト細胞由来物のフコースレベル（図３６）と同様であり、かつ細胞膜上に検出されたレベルと相関する（図２８）低いフコースレベルを有する抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂタンパク質を発現する（図３２）ということを明らかに示す。
【０２６２】
安定なプール由来の粗収穫物上のフコースレベルのＦＡＣＳによる分析：
細胞培養物バッチから調製した粗収穫物試料を集めた。分析は、タンパク質濃度２５μｇ／ｍｌで方法の項に説明するようにＦＡＣＳにより行った。結果は、ＩＴＬ−ＬＦ２トランスフェクト細胞が、一過性トランスフェクト細胞由来物のフコースレベル（図３３）と同様であり、かつ細胞膜上に検出されたレベルと相関する（図２８）低いフコースレベルを有する抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂタンパク質を発現する（図３４）ということを明らかに示す。
【０２６３】
安定なプールの粗収穫物上のシアル酸レベルのＦＡＣＳによる分析：
細胞培養物バッチから調製した粗収穫物試料を集めた。分析は、タンパク質濃度２５μｇ／ｍｌで方法の項に説明するようにＦＡＣＳにより行った。結果は、ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞が、細胞膜上に検出されたレベルと相関する（図２９）同様のシアル酸レベルを有する抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂタンパク質を発現する（図３５）ということを明らかに示す。
【０２６４】
精製産物上のフコースレベルのＦＡＣＳによる分析：
安定なトランスフェクトＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ精製産物のＦＡＣＳ分析は、低いフコースレベルを示し、一方、親ＣＨＯ−Ｓ細胞由来の精製産物は、通常のフコースレベルを含んだ（図３６）。フコースレベルは、細胞膜上に検出されたレベル（図２８）および粗製物において検出されたレベル（図３３）と相関した。
【０２６５】
精製物上のシアル酸レベルのＦＡＣＳによる分析：
安定なトランスフェクト細胞由来の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ精製物のＦＡＣＳ分析は、ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞の両方由来のものと同様のシアル酸レベルを示した（図３７）。シアル酸レベルは、細胞膜上に検出されたレベル（図２９）および粗製物において検出されたレベル（図３５）と相関した。
【０２６６】
Ｏｃｔｅｔによるインタクトな抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のフコースレベルの測定：
プロテインＡカラムから溶出されたインタクトな抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ精製画分を、フォーミュレーションバッファーに対して透析し、濃縮した。野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞またはＩＴＬ−ＬＦ２いずれかにより産生されたインタクトな精製抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のフコースレベルは、ビオチン化ヒイロチャワンダケ（aleuria aurantia）レクチン（ＡＡＬ）に抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂを結合することにより測定した。アッセイは、キネティック分析モジュールを用いてＯｃｔｅｔ  ＱＫシステム上で行った。まず、ビオチン化−ＡＡＬをストレプトアビジン被覆バイオセンサに結合し、その後、抗ＥＧＦＲ抗体上のフコースをＡＡＬレクチンに結合した。Ｆｃ領域上に位置するフコシル化部位（ＡＳＮ２９７）がＡＡＬにアクセスできないため、インタクトな抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂの分析は、Ｆａｂフコシル化残基のみの検出を可能とする（データは示さず）。Ｆｃ領域上のフコシル化部位を検出するために、Ｆｃモノマーを調製しなければならない。
【０２６７】
結果より、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクト細胞により産生された産物と比較して、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生されたインタクトな抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上の低いフコースレベルが証明された（図３８）。
【０２６８】
Ｏｃｔｅｔによるインタクトな抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のシアル酸レベルの測定：
野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞（ＷＴ）またはＩＴＬ−ＬＦ２細胞のいずれかにより産生された抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂは、シアル化レベルについて評価された。プロテインＡカラムから溶出されたインタクトな抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ精製画分は、フォーミュレーションバッファーに対して透析され、濃縮された。インタクトな精製抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のシアル酸レベルは、ビオチン化イヌエンジュ（Maackia amurensis）レクチンに産物を結合することにより測定した。アッセイは、キネティック分析モジュールを用いてＯｃｔｅｔ  ＱＫシステム上で行った。まず、ビオチン化−ＭＡＡをストレプトアビジン被覆バイオセンサに結合し、その後、抗ＥＧＦＲ抗体上のシアル酸をＭＡＡレクチンに結合した。結果（図３９）は、シアル酸レベルがＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞により産生された両産物において同様であることを示す。結果は、ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞により産生された産物における違いは、フコースレベルのみであったことを暗示しており、一方全グルコシル化プロファイルは、おそらく変化していなかった。
【０２６９】
Ｏｃｔｅｔによる抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマー上のフコースレベルの測定：
抗−ＥＧＦＲのＦｃ画分を、インタクトな抗体のパパイン切断により製造し、その後、還元およびアルキル化を行い、透析し、濃縮ステップを行った。Ｆｃモノマー画分は、野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生された産物から製造した。Ｆｃモノマー上のフコースレベルは、事前にＯｃｔｅｔ  ＱＫのストレプトアビジン被覆バイオセンサに結合させたビオチン化ＡＡＬに画分を結合することにより測定した。結果は、ＣＨＯ−Ｓ細胞により産生された産物と比較して、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の抗ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマー上の低フコースレベルを証明した（図４０）。
【０２７０】
Ｏｃｔｅｔによる抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマー上のシアル酸レベルの測定：
抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂのＦｃ画分は、インタクトな抗体のパパイン切断により調製し、その後、還元およびアルキル化を行い、透析し、濃縮した。Ｆｃ透析および濃縮モノマー画分は、野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生された産物から製造した。Ｆｃモノマー上のフコースレベルは、事前にＯｃｔｅｔ  ＱＫシステムのストレプトアビジン被覆バイオセンサに結合させたビオチン化ＭＡＡに画分を結合することにより測定した。結果は、ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２の両方の細胞から精製したＦｃ画分上のシアル化は同様のレベルであることを示す（図４１）。
【０２７１】
抗−ＥＧＦＲプール由来の精製産物の毛細管等電点電気泳動：
野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞またはＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生された抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ産物を、プロテインＡカラム上で精製し、フォーミュレーションバッファーに対して透析し、濃縮した。インタクトな産物の荷電プロファイルは、ｉＣＥ２８０上での毛細管電気泳動により分析した。図４２は、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の精製産物のｐＩ値の比較を示す。結果は、ＣＨＯ−ＳおよびＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生された産物の荷電プロファイルが同様であり、参照資料がそれらと比べてわずかにより塩基性のようであるが、おそらく、細胞株および培養条件の違いによる。
【０２７２】
抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃ画分の質量分析：
精製抗−ＥＧＦＲインタクトｍＡｂは、パパインにより切断され、ＦｃおよびＦａｂ画分を生じ、その後、Ｆｃ画分を精製し、透析および濃縮した。野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃ試料は、ＥＭＤ  セロノ  リサーチ  センター（ビルリカ、ＵＳＡ）で、変換されたＦｃ領域グルコシル化部位でのフコシル化レベルの評価のために質量分析により分析された。観察されたグリカン構造は、主に、それぞれ図４３に示すように、０、１および２ガラクトースＧ０−Ｆ，Ｇ１−ＦおよびＧ２−Ｆを有する二分岐であった。ガラクトースレベルは、１つおよび主には２つのガラクトース残基を有するより高い画分により示されるように、ＣＨＯ−Ｓ由来物においてより高い。結果は、野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞により産生された産物のＩｇＧ  Ｆｃ領域は、完全にフコシル化されており、一方、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生された産物のＦｃ領域はフコシル化されていなかったということを示す。
【０２７３】
実施例７
ＩＴＬ−ＬＦ２抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞のフコシル化レベルに対する外因性フコースの効果
ＩＴＬ−ＬＦ２抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂトランスフェクト細胞は、培養培地中のＬ−フコースの濃度を増加したＰｒｏＣＨＯ５培地に播種した。細胞ならびに粗製物は、細胞播種の４日後に分析した。ＦＡＣＳ分析結果は、外因的に追加されたフコース濃度と、細胞膜上（図４４）ならびに組換え抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上（図４５）のフコシル化レベルとのあいだの相関を示す。最大フコシル化は、両細胞上および組換え抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上で１０μｇ／ｍｌフコースで得られた。最も低いフコシル化レベルは、１μｇ／ｍｌ外部フコースで細胞において検出されたが、組換え抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上では、最も低いフコシル化レベルは２．５μｇ／ｍｌ外部フコースというより高い濃度で検出された。
【０２７４】
上記の結果にもとづき、最大蛍光強度を１００％フコシル化と解釈し、フコースなしで得られた試料を０％フコシル化として決定した較正曲線を作成した。０％外部フコースでの蛍光レベルを、各外部フコース濃度で得られた蛍光レベルから差し引き、その後、フコシル化の割合は、１００％フコシル化（フコース飽和）での蛍光レベルで割った各フコース濃度での蛍光レベルとして算出した。添加された外部フコースによる抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のフコシル化レベルの較正曲線は、これらの図から引いた。
【０２７５】
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ結果にもとづく、フコシル化および非フコシル化抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  Ｆｃモノマーの較正曲線：
抗−ＥＧＦＲのＦｃ画分は、インタクトな抗体のパパイン切断により調製し、その後、還元およびアルキル化を行い、透析し、濃縮した。Ｆｃモノマー画分は、野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生された産物から製造した。較正曲線のための試料は、ＣＨＯ−Ｓ細胞由来の産物（１００％フコースプール）およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の産物（０％フコース）を種々の比率で混合することにより作製した。各試料上のフコースレベルは、混合試料を、事前にＯｃｔｅｔ  ＱＫシステムのストレプトアビジン被覆バイオセンサに結合させたビオチン化ＡＡＬに結合することにより測定した。キネティック分析の結合ステップは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステムにより行った。各曲線は、試料におけるフコースの特定の％に対応する。較正曲線における結合レベルとフコシル化物の％との間の線状相関は、所要の試料のフコシル化レベルの計算に供することができる。結果は、アッセイの精度が高く、フコースの近接したレベル間を高度に制御して区別することができることを示す。結合レベルとフコシル化物の％との間の線状相関は、要求された割合のフコシル化が、特定の外因性フコース濃度の添加により得られるということを意味している。試料は、ＣＨＯ−Ｓ細胞由来およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂのＦｃモノマー画分由来の産物を混合することにより調製した（Ｏ.Ｄ.２８０で４０μｇ／ｍｌ）。試料をストレプトアビジンでプレコートしたバイオセンサに事前に付着されたビオチン化ＡＡＬ（１μｇ／ｍｌ）に結合した。Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステムによる速度論的分析の結合工程を表す。各曲線は試料におけるフコースの特異的％に対応する。
【０２７６】
Ｏｃｔｅｔによる部分的フコシル化抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマー画分の分析：
外因的に添加したフコース濃度と細胞膜上のフコシル化レベルとのあいだの相関を示すＦＡＣＳ分析の結果を受けて、精製抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ上のフコースレベルをＯｃｔｅｔにより測定した。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂを発現するＩＴＬ−ＬＦ２細胞を、並行して５つのバッチで４日間、３．５μｇ／ｍｌフコースの存在下で培養し、培地を収穫した。抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂを精製し、パパインにより切断し、その後、Ｆｃモノマー画分の単離のために還元およびアルキル化した。フコースレベルは、上述したように分析した。結果は、３．５μｇ／ｍｌフコースの培地への添加により、５つの異なるバッチ由来の精製したタンパク質において＋／−０．５％のばらつきで〜１５％フコシル化レベルを生じることをはっきりと示す。これは、所望のフコースレベルが再現可能であることを示す。Ｏｃｔｅｔによる部分的にフコシル化された抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマー画分の分析では、ＣＨＯ−Ｓ細胞由来およびＩＴＬ−ＬＦ２細胞由来の抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂのＦｃモノマー画分、Ｏ.Ｄ.２８０で４０μｇ／ｍｌを、ストレプトアビジンでプレコートしたバイオセンサに事前に付着されたビオチン化ＡＡＬ（１μｇ／ｍｌ）に結合した。Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステムによる速度論的分析の結合工程を表す。各曲線は特定の試料に対応する。
【０２７７】
質量分析による部分的フコシル化抗−ＥＧＦＲ  Ｆｃモノマー画分の分析：
抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂモノマー画分上のフコシル化レベルを質量分析法により分析した。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂを発現するＩＴＬ−ＬＦ２細胞を、並行して５つのバッチで４日間、３．５μｇ／ｍｌフコースの存在下で培養し、培地を収穫した。前述したように、抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂを精製し、パパインにより切断し、その後、Ｆｃモノマー画分の単離のために還元およびアルキル化した。
【０２７８】
観察されたグリカン構造は、主に、それぞれ以下の表８に示すように、０、１および２ガラクトース残基、Ｇ０−Ｆ，Ｇ１−ＦおよびＧ２−Ｆを有する二分岐であった。ガラクトースレベルは、１つおよび主には２つのガラクトース残基を有するより高い画分により示されるように、ＣＨＯ−Ｓ由来物においてより高い。結果は、３．５μｇ／ｍｌフコースの培地への添加により、５つの異なるバッチ由来のタンパク質において＋／−１．７％のばらつきで１５．６％フコシル化レベルを誘導することを証明する。この結果は、Ｏｃｔｅｔにより得られた結果と相関する。結果は、野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞により産生された産物のＩｇＧ  Ｆｃ領域が完全にフコシル化され、一方、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生された産物のＦｃ領域はフコシル化されなかったことを示す。フコシル化レベルの点において、Ｏｃｔｅｔの結果および質量分析法の結果との間に非常に良好な相関がみられた。
【０２７９】
【表８】
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【０２８０】
結論および考察
近年、増強されたＡＤＣＣを取得するための組換え抗体のフコシル化レベルを減少させるためのいくつかのアプローチが開発されてきた。ＣＨＯ−Ｓ細胞からのＩＴＬ−ＬＦ２細胞株の開発は、メトトレキサートの存在下での細胞のインキュベーションとそれに続く最も低いフコースレベルを有する細胞、たとえば細胞膜上のフコースがゼロである細胞の効率的な選択により、この研究において首尾よくなされた。メトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下での細胞のインキュベーションにより行われた突然変異と遺伝子増幅は、すでに文献において説明した（Schimke 1988; Coquelle, Pipiras et al. 1997; Singer, Mesner et al. 2000）。
【０２８１】
ＭＴＸ処理の後、その突然変異原試薬を次の選択ステップのために除去した。選択は、磁気ビーズ上に単離することによりなす（図７）か、および／または、Ｆｃグルコシル化部位上に存在するａＦｕｃｌ−６ＧｌｃＮＡ残基に高い親和性を有するフコース特異的レクチン、ヒイロチャワンダケ（aleuria aurantia）レクチン（ＡＡＬ）を用いてＦＡＣＳソーティング（図１２）によりなされた。ゼロフコース発現細胞の選択は、細胞膜上のフコースレベルにしたがってなされるが、ゼロフコースレベルは、様々な分析法により（図３３〜４２）、これらの細胞に発現された組換え抗体（抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ）上に見られた。モデル抗体として供される抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂは、１つはＦａｂ断片上にあり、もう１つはＦｃ  ＣＨ２のＡＤＣＣ活性に重要である、２つのＮグルコシル化部位を提示する。ＯｃｔｅｔおよびＭＳ分析は、インタクトなｍＡｂ上のみならず、ＡＤＣＣ関連フコース残基を有するＦｃモノマー上においても行われた。結果は、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞により産生されたもの由来のＡＤＣＣ関連フコース残基上のゼロフコースレベルを示す。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のゼロフコース表現型は、試験された３７０ＰＤＬｓについて安定であることが分かった（図１５）。組換えタンパク質を発現する細胞とバイオ反応基における生産の開発は、通常、細胞の〜２００ＰＤＬｓ内で完成される。ゼロフコース安定性実験（３７０ＰＤＬｓ）の長さは、それより長く、ＩＴＬ−ＬＦ２が完全なクローン開発および生産プロセスのため、安定なままでいることが予測される。ＩＴＬ−ＬＦ２細胞株の特徴のほとんどは、本明細書以下の表８から結論付けられるＣＨＯ−Ｓと同様であると分かった。増殖率、最大細胞濃度、細胞タンパク質のシアル酸レベル、およびこれらの細胞において発現された組換え抗体のシアル酸レベルおよび抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂの発現レベルは非常に似通っていた。また、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞は、生存率の点において、結果としてバッチプロセスにおいて測定される積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）の点において、ＣＨＯ−Ｓ細胞よりも優れていた。この現象は、細胞が、細胞膜上の低フコース含有量についてのソーティングサイクルに沿って通っていくストリンジェントな選択プロセスの結果であろう。
【０２８２】
安定なトランスフェクションは、外因性フコースの存在下においてＩＴＬ−ＬＦ２細胞に高効率でなされた。さらに、トランスフェクションからのＩＴＬ−ＬＦ２細胞の回復（recovery）は、ＣＨＯ−Ｓ細胞よりも速かったが、外因性フコースの非存在下ではトランスフェクトされた細胞はほとんど回復できなかった（データは示さず）。この知見は、フコースが、トランスフェクションおよび選択ステップからの回復に重要な役割を果たしていることを意味する。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂでの一過性のトランスフェクションも、ＣＨＯ−Ｓにおいて得られる生産性の約６５〜７５％で首尾よくなされた。
【０２８３】
本明細書の以下の表９にＩＴＬ−ＬＦ２特性の概要を提供する。
【０２８４】
【表９】
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【０２８５】
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞におけるフコースレベルはゼロで安定していることが分かったという事実は別として、細胞上（図１８および図４４）および組換えタンパク質（図４５）のフコシル化レベルは、用量依存的に外因性フコース添加に依存することが分かった。さらに、ある濃度のフコースの外因的添加により、種々の試料における組換え抗体の得られたフコシル化レベルは、再現可能であった（表８）。フコシル化経路（図１９）は、デノボ経路分岐もサルベージ経路分岐も両方、ＧＤＰ−フコースの産生をもたらすことができるということを示す。ＩＴＬ−ＬＦ２は、ゼロフコース表現型により選択されたので、その特性に関する遺伝的源を発見することは興味深いことであった。外因的フコースの添加は、細胞膜上のタンパク質のフコシル化レベルの再獲得をもたらした（図１８）。この知見は、サルベージ経路が活性（図１９）であるということを意味した。デノボ経路およびサルベージ経路についてのいくつかの鍵となる酵素のＲＴ−ＰＣＲおよび配列分析により、ＩＴＬ−ＬＦ２およびＣＨＯ−Ｓ細胞におけるフコシルトランスフェラーゼ８（Ｆｕｔ８）ｍＲＮＡは、サイズ（図２０）および配列（データは示さず）が共に同一であった。この知見は、逐次相同的組換えによりチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞株においてＦＵＴ８アレルが両方破壊された協和発酵工業株式会社のＩＴＬ−ＬＦ２細胞（Yamane-Ohnuki, Kinoshita et al. 2004; Kanda, Satoh et al. 2005）を差別化する。
【０２８６】
Ｆｕｔ８と同様に、デノボ経路に関与するＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース ３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）のｍＲＮＡサイズと配列は（図２１）、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞において変化しなかった。一方、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞におけるＧＤＰ−マンノース ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）のｍＲＮＡサイズは、ＣＨＯ−Ｓ（図２０）よりも短く、配列は２つのスプライス変異体であることを明らかにした。細胞から抽出したｍＲＮＡ分子は、３番目と４番目のエクソンまたは８番目と９番目のエクソンのいずれかを欠いていた（図２１Ａ〜Ｂおよび図２２Ａ〜Ｂ）。欠失間の区別は、欠失のサイズが同様であるため、ゲルからは検出できなかった（図２０および図２２Ｂ）。しかしながら、短いＧＭＤ型（全長でない）のみ、ゲル上で検出できた（図２０）。突然変異原とインキュベートされた亜集団が種々のスプライス変異体を発現し、全長ｍＲＮＡを発現しない機序は、はっきりとしていないが、おそらくその変異体は、ＭＴＸなしで選択された低フコース細胞はないので、元のＣＨＯ−Ｓ集団においては存在しない。これらの結果は、選択が表現型で行われたということを考慮すると非常に興味深い。
【０２８７】
ＱＰＣＲ分析は、試験された全ての遺伝子がフコシル化経路に関与し、同様のｍＲＮＡレベルで発現することを示した（図２３）。結果は、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞において得られるゼロフコースレベルは、種々のスプライス変異体から発現されたＧＭＤタンパク質の不活性からまたはＧＭＤタンパク質の低いレベルまたは完全な欠如から誘導されるということを示唆する。
【０２８８】
異なる表現型選択アプローチは、他の研究グループにより、ＣＨＯ細胞におけるレクチン耐性変異体（Ｌｅｃ１３）の作製のために使用された（Ripka and Stanley 1986）。このアプローチでは、細胞は、毒性エンドウフコース特異的レクチンとインキュベートされ、耐性細胞が、Ａｓｎ（２９７）結合炭化水素に結合されたフコースが欠けているヒトＩｇＧ１を発現することが見いだされた（Shields, Lai et al. 2002）。さらに、研究活動は、相対的に短い時間の後増加したこれらの細胞におけるフコースレベルは、低フコース表現型は安定ではなく、いくつかの活性ＧＤＰ−フコースタンパク質はデノボ経路において合成されたということ示すことを明らかにした（Kanda, Yamane, Ohnuki et al. 2006
）。もう１つ別の最近の論文では、Kandaおよび共同研究者（Kanda, Imai, Nishiya et al. 2007）が、Ｌｅｃ１３が、ＣＨＯ  ＤＧ４４において発現されるｍＲＮＡと同じサイズでｍＲＮＡを発現するということをＲＴ−ＰＣＲ分析により示した。前述したように、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞は、おそらく活性ＧＭＤ型の完全な欠損のため安定なゼロフコース表現型を示す（図２０）。他のレクチン（レンズマメレクチン（Lens culinaris agglutinin）−ＬＣＡ）耐性細胞株であるＣＨＯ−ＳＭ（Kanda, Imai, Nishiya et al. 2007）の、ＲＴ  ＰＣＲ配列決定およびサザンブロットによる遺伝子型分析は、この細胞株が、重要な活性ドメインをコードするエクソン５、６および７を欠いた突然変異ＧＭＤ  ｍＲＮＡを発現したということを明らかにした（Somoza, Menon et al. 2000; Webb, Mulichak et al. 2004）。エクソン３および４ならびにエクソン８および９は、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞において証明されたように、共にＧＭＤ活性に重要である。したがって、ＩＴＬ−ＬＦ２細胞のＧＭＤプロファイルは、Ｌｅｃ１３およびＣＨＯ  ＳＭの両方と異なるということが結論付けられる。
【０２８９】
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞は、各ソートにおいて最も低いフコース（またはフコースなし）を含む細胞のフラクションを選択するＦＡＣＳによる４回の連続したソーティングサイクルの後に作製された（表４）。第１のソートは、低フコース表現型を有する細胞さえほとんどもたらさなかった。にもかかわらず、２回目のソートの後は、細胞の多くは細胞膜上に低フコースレベルを示した。追加的（３回目）のソートにより、ゼロフコースレベルのみを示す均一な集団となった。４回目のソートは、ゼロフコース発現細胞のみが存在するということを確かにするためになされた（図１２）。
【０２９０】
ＩＴＬ−ＬＦ２細胞株は、パリのパスツール研究所のコレクシオン  ナチオナール  ド  クルチュール  ド  ミクロオルガニスムに受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４４４９として、２０１１年２月２８日に寄託された。
【０２９１】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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