【手続補正書】
【提出日】平成27年4月27日(2015.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンの生産量を増大させることのできる組み換え細胞であって、
ａ．Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
ｂ．Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺
伝子、
ｃ．Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、並びに
ｄ．Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、前記ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、
ｉ．ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、及び
ｉｉ．イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸、を更に含み、
前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞と比較して、イソプレンの生産量が増大している、細胞。
【請求項２】
イソプレノイド前駆体の生産量を増大させる事のできる組み換え細胞であって、
（ａ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
（ｂ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
（ｃ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、及び
（ｄ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、前記ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド前駆体生産細胞と比較して、多量にイソプレン前駆体を生産する、細胞。
【請求項３】
イソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え細胞であって、
（ａ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
（ｂ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
（ｃ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、及び
（ｄ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、前記ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、
ｉ．ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、及び
ｉｉ．ポリプレニルピロリン酸合成酵素をコードしている１つ以上の核酸、
を更に含み、前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド生産細胞と比較して、イソプレノイドの生産量が増大している、細胞。
【請求項４】
イソプレンの生産量を増大させることのできる組み換え細胞であって、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、およびＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）から選択される株に由来するｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含む１つ以上の異種核酸を含み、
前記ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、
ｉ．ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、及び
ｉｉ．イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸、を更に含み、
前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞と比較して、イソプレンの生産量が増大している、細胞。
【請求項５】
イソプレノイド前駆体の生産量を増大させることのできる組み換え細胞であって、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、およびＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）から選択される株に由来するｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含む１つ以上の異種核酸を含み、
前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、
前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド前駆体生産細胞と比較して、イソプレノイド前駆体の生産量が増大している、細胞。
【請求項６】
イソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え細胞であって、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、およびＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）から選択される株に由来するｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含む１つ以上の異種核酸を含み、
前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、
ｉ．ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、及び
ｉｉ．ポリプレニルピロリン酸合成酵素をコードしている１つ以上の核酸、
を更に含み、
前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド生産細胞と比較して、イソプレノイドの生産量が増大している、細胞。
【請求項７】
前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子が異なる株由来である、請求項４、５、および６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
ａ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＬ．グレイ（L. grayi）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．ファシウム（E. faecium）由来である、
ｂ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＬ．グレイ（L. grayi）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．ガリナラム（E. gallinarum）由来である、
ｃ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＬ．グレイ（L. grayi）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来である、
ｄ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．ファシウム（E. faecium）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＬ．グレイ（L. grayi）由来である、
ｅ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．ファシウム（E. faecium）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．ガリナラム（E. gallinarum）由来である、
ｆ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．ファシウム（E. faecium）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来である、
ｇ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．ガリナラム（E. gallinarum）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＬ．グレイ（L. grayi）由来である、
ｈ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．ガリナラム（E. gallinarum）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．ファシウム（E. faecium）由来である、
ｉ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．ガリナラム（E. gallinarum）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来である、
ｊ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＬ．グレイ（L. grayi）由来である、
ｋ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．ファシウム（E. faecium）由来由来である、または
ｌ）前記ｍｖａＥ遺伝子がＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来であり、前記ｍｖａＳ遺伝子がＥ．ガリナラム（E. gallinarum）由来である、
請求項４、５、および６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞が、（Ａ）エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子を含み、（Ｂ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、およびＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子およびｍｖａＳ遺伝子を含まない、イソプレン生産細胞と比較して、イソプレンの生産量が増大している、請求項１または４に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、（Ａ）エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子を含み、（Ｂ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、およびＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子およびｍｖａＳ遺伝子を含まない、イソプレノイド前駆体生産細胞と比較して、イソプレンの生産量が増大している、請求項２または５に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、（Ａ）エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子を含み、（Ｂ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、およびＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子およびｍｖａＳ遺伝子を含まない、イソプレノイド生産細胞と比較して、イソプレノイドの生産量が増大している、請求項３または６に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸が、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、及び（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、から選択される酵素を含む、請求項１、３、４、６〜９、および１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である、請求項１、４、７、８、９、１２、１３および１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Popu
lus）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体由来のポリペプチドである、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）及びポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）からなる群から選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドが、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）のイソプレン合成酵素ポリペプチドである、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている核酸を更に１種以上含む、請求項１、３、４、６〜９、および１１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸が、ＩＤＩポリペプチドをコードしている異種核酸である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記ＩＤＩポリペプチドが、酵母ＩＤＩポリペプチドである、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸が、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２３】
前記１つ以上の核酸が、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータ下に配置される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記１つ以上の核酸が、マルチコピープラスミドにクローン化される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記１つ以上の核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、バクテリア細胞または真菌細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、大腸菌（Escherichia）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、又はアスペルギルス（Aspergillus）細胞である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記細胞が、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２９】
前記細胞が、大腸菌（E. coli）である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記真菌細胞が酵母細胞である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項３１】
前記酵母細胞が、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）の細胞から選択される、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
前記酵母細胞が、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
イソプレンの生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項１または４に記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）イソプレンを生産させる工程と、を含む、方法。
【請求項３４】
（ｃ）前記イソプレンを回収する工程、を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記イソプレノイド前駆体が、メバロン酸（ＭＶＡ）である、請求項２、５、７、８、１０、および２３〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３６】
イソプレノイド前駆体の生産方法であって、（ａ）イソプレノイド前駆体の生産に好適な条件下で請求項２または５に記載の宿主細胞を培養する工程、並びに（ｂ）前記イソプレノイド前駆体を生産させる工程、を含む、方法。
【請求項３７】
（ｃ）前記イソプレノイド前駆体を回収する工程、を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpenes）及びポリテルペンからなる群から選択される、請求項３、６、７、８、１１−１４、および１９〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３９】
前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
イソプレノイドの生産方法であって、（ａ）イソプレノイドの生産に好適な培養条件下で請求項３または６に記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）前記イソプレノイドを生産させる工程と、を含む、方法。
【請求項４２】
（ｃ）前記イソプレノイドを回収する工程、を更に含む、請求項４１に記載の方法。