【手続補正書】
【提出日】平成27年3月3日(2015.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本願はまた、米国仮特許出願第61/628,259号の利益を主張する（出願日2011年10月27日）;
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
細胞を識別し分類する光学的手法を使用することは多くの潜在的な長所（速度、選択性/特異性およびそれらの非侵入性の性質）を持つ。その結果、光を使用して細胞を調べて決定的な情報を決定する多くの方法が実証された。そのような1つの方法は蛍光マーカーを使用する。それは、標的細胞内の特定構造または合成物に結合し、細胞の混合物に導入される化学薬品である。混合物は引き続き洗浄して超過の蛍光マーカーを取り除く。また、細胞は重要な測定値および細胞を分類するために強いUVあるいは他の短い波長の放射線に露出される。化学的マーカーはよい特異性を提供する。しかしながら、これらの化学的マーカーは標的細胞の機能を傷つけるか変化させ、その損傷又は変化は実際の細胞選別には特に不利になる。試験では、マーカーとしてDNAに使用された染料は、例えば、染色体に損傷をもたらした。さらに、細胞内のマーカーのレベルを読む強いUVか可視光線は細胞に破損を与えることがあり、特にDNA損傷は高エネルギーのUVあるいは可視光への露出に起因する。波長のために、さらにいわゆる蛍光活性化細胞選別（FACS）システムに使用される波長のために、定量的測定（特定の抗体用の二者選択的測定値というよりも）は非常に困難になる。なぜなら照明の波長および放射された蛍光の両方が散乱し、細胞の構成要素に吸収されるからである。これは、細胞定位が正確に測定する際に重要な要因になり、劇的にシステムの有効性を低減しうることを意味する。例えば、XおよびY-保有精子の精細胞選別（細胞間のDNA差異を測定する）は、まさに特定の定位（細胞の10%だけが典型的に定位基準を満たす）を必要とし、ヒトについては70-90%の範囲内だけの正確さを提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【図１】図1は、本発明がフロー血球計数器に似ている形式で構築されていることを説明する。
【図２】図2は、図１中で示されたフロー血球計数器の配置のように、サンプル流を調べるレーザーソースの潜在的な配置を示す。
【図３】図3は、図１および図２内に記述されたフローの中赤外スペクトルの単純化された例を説明する。
【図４】図4は、フロー内の細胞を調べるシステムの配置例を、横断面で示す。
【図５】図5は、フロー120および細胞122が多数の角度から測定される本発明の実施形態を示す。
【図６】図6は、図３中で示されるサンプル・スペクトルに対応する単純化された検知器信号を説明する。
【図７】図7は、細胞が乾燥状態に測定される場合の、本発明の別の実施形態を示す。
【図８】図8は、ミクロフロータイプの細胞選別システムを使用して具体化された本発明の適用を示す。
【図９】図9は、生細胞測定値用のミクロフローシステムである本発明の非常に基礎的な実施形態の一部を示す。
【図１０Ａ】図10aは、ミクロフロー経路の測定領域の実施形態の詳細を示す。
【図１０Ｂ】図10bは、横断面内の10aと同じ例を示す。
【図１０Ｃ】図10cは、中赤外光用の反射測定を使用する他の実施形態の横断面を示す。
【図１１】図11は、ミクロフローおよびQCLに基づいたスペクトルの測定システムがより従来の蛍光に基づいた測定システムと併用されている場合の、発明の実施形態を示す。
【図１２】図12は、ミクロフローサブシステムが細胞選別の流体スイッチを含んでいる、本発明の典型的な実施形態を示す。
【図１３Ａ】図13aは、一連の微小ウェルがミクロフロー・フロー経路/容器へ統合できる場合の、本発明の代替ミクロフローに基づいた実施形態を示す。
【図１３Ｂ】図13bは、ウェルが1つ以上のQCLからの中赤外光を使用してどのように走査されてもよいか示す、走査はミクロフローチップまたはレーザー先導機序を移動させて遂行する。
【図１４】図14は、ミクロフロー容器が2次元である場合の別の実施形態を示す。
【図１５】図15は、ミクロフロー経路と併用した中赤外光の別の実施形態を示す。
【図１６】図16は、本発明に基づいた細胞の成長および浄化用のシステムを示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】図17aと17bは、本発明のQCLおよび中赤外光の検知器用の2つの潜在的な配置を示す。
【図１８】図18は、それが受胎前性別選択の目的で生精細胞を選別するために使用する場合の、本発明の実施形態を示す。
【図１９Ａ】図19aは、この場合フローが紙の平面を流入流出して、測定ボリュームを通過する細胞が運搬されるように志向させられた流体流の横断面を示す。
【図１９Ｂ】図19bは、フロー内に2個の細胞例がある同じ配置を示す。
【図２０】図20aは、水の吸収に起因するフロー内のセル位置の影響を最小限にする本発明の1つの配置を説明する。図20bは、長方形水路を、測定ボリューム内の2つの仮説のセル位置、中心にある細胞およびオフ軸芯細胞、で例証する。
【図２１】図21は、QCLに基づいた中赤外光の細胞測定値に適合する、標準流動細胞計測法システムに実装された本発明の実施形態を示す。
【図２２】図22は、中赤外光吸収信号の位置依存変化を補うようにフロー内のセル位置が正確に測定できる構造で具体化された本発明を示す。
【図２３】図23aは、QCL（s）からの中赤外光を使用して照明された炉心流量を囲む被覆フローを示す。図23bは、測定ボリューム内に細胞を有する同じフローを示す。
【図２４】図24は、多数の中赤外光ビームが使用して測定ボリュームを調べる本発明の別の実施形態を示す。
【図２５】図25aは、測定されかつ/または選別される細胞サンプルが、ユーザーによってあらかじめ組み込まれたミクロフローチップを受け入れるツールを示す。図25bは、本明細書に記述されたツールの別の配置を示す。
【図２６Ａ】図26aは、DNA対細胞数がヒストグラム・フォーマットで表示される配置を示す。
【図２６Ｂ】図26bは DNAに加えて補足パラメーターを使用して細胞を選別する配置を示す。
【図２７】図27は、システムで使用するプラスチックキャリアを備えたミクロフローチップから構成される、単一ユニットの使い捨て測定ユニットの例を示す。
【図２８】図28は、チップがキャリアとは異なる部品であり、潜在的にプラスチックのキャリアが1つ以上のミクロフローチップと一緒に使用してもよい場合の別の配置を示す。
【図２９Ａ】図29aは、測定のみの応用で利用できるミクロフローチップ用のフォーマット例を示す。
【図２９Ｂ】図29bは、細胞の選別に使用されるミクロフローチップ用のフォーマット例を示す。
【図３０Ａ】図30aは、希釈/シース流体を、測定経路中心のフローを提供するためにサンプルと一緒に使用してもよい場合の配置を有するミクロフローチップ用のフォーマット例を示す。
【図３０Ｂ】図30bは、スウィッチ点の電場を利用する振動分光法測定に基づいて細胞が切り替えできる配置におけるミクロフローチップ用のフォーマット例を示す。
【図３１】図31は、本発明の中で使用されるミクロフローチップの構成例を示す。
【図３２】図32は、測定ボリュームおよび圧力作動細胞スイッチを含むミクロフロー経路の実施形態例の詳細を示す。
【図３３】図33は、本発明で使用される光学的検出システムの実施形態を説明する。
【図３４】図34は、高速に細胞内の干渉性結合指紋を測定する非ストークラマン分光学（CARS）を使用する本発明の例を示す。
【図３５】図35は、細胞のスペクトルの測定値読み出し中の空間依存度を最小限にするようにコヒーレンス長を短縮させるコンポーネントを備えたQCLの配置を示す。
【図３６】図36は、ツールを細胞選別に使用してよい場合の、ディスプレイ/ユーザー・インタフェースの例を示す。
【図３７】図37は、サンプル上のスポットサイズを最小限にし、かつサンプルからの散乱光を拒絶する要素を含んでいる本発明の実施形態サンプルを示す。
【図３８Ａ】図38aは、中赤外でフーリエ変換赤外分光（FTIR）分光法を使う液体または固体を測定するのにしばしば使用される減衰全反射法ATR配置を示す。
【図３８Ｂ】図38bは、吸収を向上させるプラズモン層（パターン化された金属導電層）を使用するのにしばしば使用される配置を示す。
【図３８Ｃ】図38cは、中赤外測定に使用されてきた本当の伝送構成を示す。
【図３９】図39は、本発明に述べられていたミクロフロー経路の実施形態例を示す。
【図４０Ａ】図40aは、検知波長の4分の1波の倍数でさえありうるミクロフロー・ギャップについての電場を示す。
【図４０Ｂ】図40bは、図40aのミクロフロー・ギャップについての光強度を示す。
【図４０Ｃ】図40cは、流体経路の内容のより一様なサンプリングを保証する検知波長で共振しないギャップ を示す。できるだけ位置依存がQCLに基づいた流体の測定システムから取り出されるようにどのようにミクロフロー空洞が最適化されて共振光学効果を縮小させているかを示す。
【図４１】図41は、バーニヤ同調外部共振器量子カスケードレーザに基づいた本発明の実施形態を示す。
【図４２】図42は、本発明の一部として高速中赤外光液体分光法用に提案されたバーニヤ同調機序をさらに説明する。
【図４３Ａ】図43aは、吸収スペクトルが、ピーク上で測定される3点を有する対象とする吸収ピークで測定される場合の配置を示す。
【図４３Ｂ】図43bは、ピーク吸収波長および参照波長だけがサンプリングされる図43aの場合より最小の配置を示す。
【図４４】図44は、本発明の別の実施形態例を示す。
【図４５Ａ】図45aは、粒子の吸収、およびそれが測定される媒体の吸収を、両方とも光周波数の関数として示す。
【図４５Ｂ】図45bは、粒子と媒体の導かれた実際の屈折率を示す。
【図４６】図46は、非制限的に生細胞を含む細胞の粒子の中赤外光吸収測定用の一般化系統図を示す。
【図４７】図47は、散乱問題の改善への1つのアプローチを示す。
【図４８】図48は、散乱光が直接測定される場合の別の構造を示す。
【図４９】図49は、散乱光のみによって粒度および化学的濃度を測定するQCLを使用できることを示唆する実施形態を示す。
【図５０Ａ】図50aは、測定される流体が経路を通過する単純なフロー構造示す。
【図５０Ｂ】図50bは、流体フロー内の流体を描写する。
【図５０Ｃ】図50cは、核心が液滴に壊されたフローの例を描写する。
【図５１】図51aは、波長（ラムダ）の関数であらわした液滴などのボリュームの散乱効率（Q）の例を示す。図51bは、波長の関数であらわした散乱効率を示す。
【図５２】図52aは、液滴またはフローが2D経路または多岐管内に制限される場合の、流体の配置を示す。図52bは、液滴またはコアフローが1つのより大きな3Dコアフロー内に集中させられる場合の、流体システムを示す。
【図５３】図53a-cは、QCL発振中赤外光ビームを使用する液滴またはフローを測定するシステムの代表的な例を示す。
【図５４】図54aは、生物学的細胞（内側の円）が液滴（それは乳剤内に含まれている）内に含まれている場合を示す。図54bは、乳剤内の液滴の使用をして本明細書に説明する異なる技術を示す。
【図５５】図55は、生物学的細胞を含んでいる液滴に基づいたシステムの例を示す。
【図５６】図56は、対象とする非常に希薄な粒子群を持つ固体試料の配置を示す。
【図５７】図57a-c、中赤外光の共振光学干渉測定値を増強させるのに使用できうるフローおよび粒子の配置を示す。
【図５８】図58は、細胞または粒子を測定し、選別することができる1つの方法を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
図23a及びbは、フロー内のコアまたはシース流体に添加物を使用して、中赤外サブシステムによって直接測定できる「トレーサー」を作成する本発明の実施形態を示す。したがって、コア流量の位置およびフローの形および位置の変化の正確なリアルタイムのキャリブレーション/補償ができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
図25a及びbは、ミクロフローチップ・システムの２つの配置例である。図25aは、ユーザーによって、測定されかつ/または選択される細胞サンプルがあらかじめ組み込まれたミクロフローチップを受け入れるツールを示す。これは、比較的小さなボリュームのサンプル用の一般的な配置で、この配置は 単一のミクロフローチップ上に含まれていてよく、それで選別してもよい。スロット2502は測定/選別方式へチップを読み込んでよい。ディスプレイ2504は、細胞内DNA内容に関するヒストグラムおよび他の指標を示す。ディスプレイは、 ユーザーが選択設定ポイントを作り、データのグラフィック表示を設定し、およびスタートと停止ができるタッチスクリーン・ディスプレイであってよい。ツールは、 コンピューターへの（またはコンピューターでコントロールされる）データ転送、またはUSBメモリスティックへデータの転送もしくはバックアップができるUSBインターフェース、などのインターフェースを含んでいてよい。 無線通信ネットワーキング・インターフェースも同様に含まれていてよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
図26a及びbは、ツールのユーザーに見せるDNA含量のディスプレイ例を示す。図26aは DNA対細胞数がヒストグラム・フォーマットで表示される配置を示す。この例におけるX軸2602は、細胞のDNA含量を表わしている。Y軸2604はサンプルの累積細胞数を表わす。測定された細胞の分布は2608に示されている （ここでは活発に分裂している細胞の分布標本を示す、 またその内いくつかの細胞は、一番左端の小さなピークによって指し示される異数性を示し、これは異常に低DNA数を示す ）。このヒストグラムはそれ自体で、ユーザーが細胞サンプルを迅速に評価するのに貴重である。さらに、各状態の細胞のパーセンテージを評価するために、測定後にリアルタイムもしくはオフラインで、曲線あてはめアルゴリズムを手動もしくは自動的に適用できる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
図29a及びbは、本発明で使用されるミクロフローチップ用のいくつかのフォーマット例を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
図30a及びbは、本発明で使用されるミクロフローチップの追加の配置例を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
図38a-cは、本発明が特に回避しようと設計した表面効果に悩まされている他者が使用しているいくつかの配置サンプルを示す。図38aは、中赤外でフーリエ変換赤外分光（FTIR）分光法を使う液体または固体を測定するのにしばしば使用される減衰全反射法ATR配置を示す。ここで、それは、流速を示す液体のマイクロ経路に接して断面図で示される。システムでは通常であるように、インターフェースの近くの速度は非常に低いだろう。さらに、ATRプリズムから液体フローへの一過性の場の限定的な浸透が示される。従来のFTIRシステムでATRを使用するという利点は、液体の吸収が非常に高い場合でさえ、光がこの配置でほとんど吸収されることはないことである。この図から明白な大きな不都合は、フローのコアへの浸透厚が制限されていることであろう。図 38bは、多くのグループによって使用されるより最近の配置を示す。それは類似しているが、吸収を向上させるプラズモン層（パターン化された金属導電層）を使用する。これによって、プラズモン・フィルターと直接接触するサンプルの吸収識別特性は非常に向上させられる。再び、しかしながら、中赤外の場は液体への浸透を非常に制限されている。この例の生物学的細胞のうちの1つによって示されるような基板に付着させられ静止している細胞の測定について、これによって時系列測定ができるようになる。しかしながら、液体のマイクロ経路を通り抜ける細胞の高速検知について、これは、吸収は強い深さ依存がありおよびその深さに制限があるために、適切な構成ではないかもしれない。図38cは、いくつかのグループによる中赤外測定に使用されてきた本当の伝送構成を示す。この「半透過」構成で、中赤外光は中赤外サンプルを通過し、反射する基板（それは可視で伝送可能）によって反射され、次に検知器に移る前にサンプルを通る第二のパスがなされる。この構成に基づいてHolmanらは「開経路」測定について記述した、トップのウィンドウがない場合、それは反射基板上を限度内の距離だけ開いたおよび液体フローである。この利点は改善された伝送およびより単純な構築であろう。大きな短所は、液体層厚さの中のどんなばらつきもサンプルの吸収における大規模な明白な変化を生じる点である。しかしながら、半透過構成に関するより本質的な問題は反射基板に起因する干渉効果に由来する。例えば、電場は低レベルに落ちているに違いない反射面に非常に近い細胞は、比較的小さな中赤外光を吸収できる。反対に、基板からの一定距離の細胞は、光を最大限吸収するだろう。深さへの依存性は、補正が難しい信号のばらつきを引き起こすだろう。さらに、この構成では、どの光がサンプルによって反射されるのか、サンプルによって散乱するのか、またはサンプルを通って伝達されるか識別するのは難しい。本発明は、これらの構成が抱えるほとんどの問題を取り除く努力をしている。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
図40a-cは、できるだけ位置依存がQCLに基づいた流体の測定システムから取り出されるように、どのようにミクロフロー空洞が最適化されて共振光学効果を縮小させているかを示す。図40aは、検知波長（それはピーク反響かもしれない）の4分の1波の倍数でさえありうるミクロフロー・ギャップを示す。図40aの左側の図形は電場を示し、図40bに示されるように、光強度は右に示す。図にみられるように、流体のギャップの中心の近くに強いピークがあってもよい。一般に、それは、そのような強い空間の依存性を回避し、液体の吸収のより一様なサンプリングを行うことが望ましい（粒子が経路内の様々な高さに配置される場合、浮流が測定されている時、これは特に重要かもしれない）。図40cは、検知波長で共振しないギャップを使用し、 流体経路の内容のより一様なサンプリングを保証する場合の好ましい配置を示す。この配置は、記述されたようなAR被膜および角度と共にもちろん使用してもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８４】
図43a-bは、本発明で使用される複数波長の例を示す。個別の波長は、同調可能なQCL（例えば特に本明細書に記述されたバーニヤ配置）、個々にパッケージ化された一定波長QCL、またはチップ上のモノリシックのQCLアレイによって生じて、個別ビームとして伝達されるか、一つのスポットに合成して伝達される。この図のために、横軸は中赤外周波数を表わす。また、垂直軸は吸光度を表わす。図43aは、吸収スペクトルが対象とする4302の吸収ピークで測定される場合（3点はピーク上で測定される）の配置を示す。これによって形状導関数または二次導関数、同様に絶対吸収が測定できる二次導関数は広域バックグラウンド信号が存在する状態で吸収ピークを測定するのにしばしば使用される。さらに、ローカルの吸収最小限4304はシステム波長のうちの1つで検知される。これによって、例えば、測定ボリュームへ細胞または微粒子を運ぶ液媒の背景吸収レベルが測定できる。図 43bは、ピーク吸収波長4308および参照波長4310だけがサンプリングされるより最小の配置を示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
図45a-bは、中赤外光での分子吸収ピークの概略例を示す。図45aは、粒子（標的分子の一部分から成り立つ）の吸収、およびそれが測定される媒体の吸収を、両方とも光周波数の関数として示す。図45bは、粒子と媒体の導かれた実際の屈折率を示す。図45bで示されるように、吸収ピークの中心のまわりの粒子屈折率に変動がある。粒子には媒体のそれと異なる基線屈折率（「無限大でのインデックス」）がある。ある応用については、媒体を変更して粒子からの屈折率をより近く（より少ない散乱）またはより遠く（より多くの散乱）することが望ましい。直線の吸収測定が望まれる場合、 散乱の影響を最小限にするようにインデックスの不整合を少なくすることが望ましい。他方では、例えば粒度の散乱に基づいた測定が望まれる場合、次に粒子インデックスに対する媒体インデックスを低下させることは有用である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2014503195.tif 000001
【図２】
2014503195.tif 000002
【図３】
2014503195.tif 000003
【図４】
2014503195.tif 000004
【図５】
2014503195.tif 000005
【図６】
2014503195.tif 000006
【図７】
2014503195.tif 000007
【図８】
2014503195.tif 000008
【図９】
2014503195.tif 000009
【図１０Ａ】
2014503195.tif 000010
【図１０Ｂ】
2014503195.tif 000011
【図１０Ｃ】
2014503195.tif 000012
【図１１】
2014503195.tif 000013
【図１２】
2014503195.tif 000014
【図１３Ａ】
2014503195.tif 000015
【図１３Ｂ】
2014503195.tif 000016
【図１４】
2014503195.tif 000017
【図１５】
2014503195.tif 000018
【図１６】
2014503195.tif 000019
【図１７Ａ】
2014503195.tif 000020
【図１７Ｂ】
2014503195.tif 000021
【図１８】
2014503195.tif 000022
【図１９Ａ】
2014503195.tif 000023
【図１９Ｂ】
2014503195.tif 000024
【図２０】
2014503195.tif 000025
【図２１】
2014503195.tif 000026
【図２２】
2014503195.tif 000027
【図２３】
2014503195.tif 000028
【図２４】
2014503195.tif 000029
【図２５】
2014503195.tif 000030
【図２６Ａ】
2014503195.tif 000031
【図２６Ｂ】
2014503195.tif 000032
【図２７】
2014503195.tif 000033
【図２８】
2014503195.tif 000034
【図２９Ａ】
2014503195.tif 000035
【図２９Ｂ】
2014503195.tif 000036
【図３０Ａ】
2014503195.tif 000037
【図３０Ｂ】
2014503195.tif 000038
【図３１】
2014503195.tif 000039
【図３２】
2014503195.tif 000040
【図３３】
2014503195.tif 000041
【図３４】
2014503195.tif 000042
【図３５】
2014503195.tif 000043
【図３６】
2014503195.tif 000044
【図３７】
2014503195.tif 000045
【図３８Ａ】
2014503195.tif 000046
【図３８Ｂ】
2014503195.tif 000047
【図３８Ｃ】
2014503195.tif 000048
【図３９】
2014503195.tif 000049
【図４０Ａ】
2014503195.tif 000050
【図４０Ｂ】
2014503195.tif 000051
【図４０Ｃ】
2014503195.tif 000052
【図４１】
2014503195.tif 000053
【図４２】
2014503195.tif 000054
【図４３Ａ】
2014503195.tif 000055
【図４３Ｂ】
2014503195.tif 000056
【図４４】
2014503195.tif 000057
【図４５Ａ】
2014503195.tif 000058
【図４５Ｂ】
2014503195.tif 000059
【図４６】
2014503195.tif 000060
【図４７】
2014503195.tif 000061
【図４８】
2014503195.tif 000062
【図４９】
2014503195.tif 000063
【図５０Ａ】
2014503195.tif 000064
【図５０Ｂ】
2014503195.tif 000065
【図５０Ｃ】
2014503195.tif 000066
【図５１】
2014503195.tif 000067
【図５２】
2014503195.tif 000068
【図５３Ａ】
2014503195.tif 000069
【図５３Ｂ】
2014503195.tif 000070
【図５３Ｃ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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