【手続補正書】
【提出日】平成27年6月22日(2015.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）体細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子および、該体細胞中で発現した場合に、該体細胞を多能性幹細胞へと変換するのに十分な１つまたは複数のリプログラミング因子を発現する染色体外の遺伝要素を含む少なくとも１つの第二の核酸分子を前記細胞に導入する工程；
ｂ）前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程；および
ｃ）それらのゲノム中に組み込まれた前記第一の核酸を含むｉＰＳ細胞の集団を得る工程を含み、ここで前記第一の核酸が発現可能であり、かつ、該第二の核酸分子が該ｉＰＳ細胞中には存在しない、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産方法。
【請求項２】
ｃ）（ｉ）それらのゲノムに組み込まれた前記第一の核酸を含む細胞および（ｉｉ）それらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含まない細胞を含むｉＰＳ細胞の集団を得る工程；
ｃ）それらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含むｉＰＳ細胞の第一集団およびそれらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含まないｉＰＳ細胞の第二集団を得る工程；あるいは
ｃ）それらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含むｉＰＳ細胞をスクリーニングまたは選択し、それによって、該第一の核酸が発現可能である、ｉＰＳ細胞の該集団を得る工程；
をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
該ｉＰＳ細胞の分化に際して該第一の核酸が発現される、請求項１の方法。
【請求項４】
該第一の核酸分子が、該細胞の該ゲノム中に無作為に組み込まれているか、または該細胞のゲノムの選択された部位に組み込まれている、請求項１の方法。
【請求項５】
該細胞のゲノムの選択された部位がＡＡＶＳ１組み込み部位である、請求項４の方法。
【請求項６】
該第一の核酸分子が、メガヌクレアーゼ、または該選択された部位でゲノムＤＮＡを切断する転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して、選択されたゲノム部位に組み込まれるか、または相同的組換えを使用して該選択されたゲノム部位に組み込まれる、請求項４または５の方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、該第一のもしくは第二の核酸分子を含有しているウイルスベクターを該細胞に形質導入すること、または該第一のもしくは第二の核酸分子を含有しているｐｉｇｇｙＢａｃベクターをトランスフェクトすることを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
該ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、シンプルレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである、請求項７の方法。
【請求項９】
該第一の核酸分子が、スクリーニング可能なマーカーまたは選択マーカーのコード配列を含むか、または
細胞内の遺伝的欠損を修正する配列；病原体感染に対する耐性を付与する配列；薬剤物への耐性を付与する配列；薬剤物への感受性を付与する配列；細胞の免疫原性を変える配列；および細胞内に遺伝的タグを付与する配列からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
該体細胞が、ヒト線維芽細胞、角化細胞、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、乳房細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、または膵島細胞である、請求項１の方法。
【請求項１１】
該第二の核酸分子がＲＮＡまたはエピソームベクターである、請求項１の方法。
【請求項１２】
該エピソームベクターが、複製起点および、リプログラミング因子を発現させるための１つもしくは複数の発現カセットを含み、ここで１つもしくは複数の前記発現カセットが、染色体外の鋳型を複製するための該複製起点に結合するトランス活性化因子をコードしているヌクレオチド配列をさらに含み、ならびに／または該体細胞がそのようなトランス活性化因子を発現している、請求項１１の方法。
【請求項１３】
該リプログラミング因子が、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、形質転換欠損性のｍｙｃ突然変異体またはホモログ、およびＳＶ４ＯＬＴからなる群より選択される１つまたは複数を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｂ）が、
（ｉ）フィーダー細胞を本質的に使用せずに該細胞を培養すること、
（ｉｉ）マトリックス成分の存在下で該細胞を培養すること、
（ｉｉｉ）該第一の核酸分子の存在に関して、該細胞を選択することまたはスクリーニングすること、
（ｉｖ）該細胞を、少なくともおよそ１日〜１５日間、リプログラミング条件下で培養すること、および／または
（ｖ）該細胞をリプログラミング培地中で培養すること
を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
該選択またはスクリーニングが、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリーによるか、または該細胞培養への薬剤の添加を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
（ｉ）該細胞が、該第一の核酸分子および染色体外の遺伝要素の該細胞への導入後、およそ１日目〜３日目に開始される該薬剤の存在下で培養される、ならびに／または
（ｉｉ）該細胞が、およそ１〜１０日間、該薬剤の存在下で培養される、
請求項１５の方法。
【請求項１７】
（ｉ）該リプログラミング培地が、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤またはそれらの組み合わせを含む、
（ｉｉ）該リプログラミング培地が、外部から添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を含む、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）該リプログラミング培地が化学的に規定されている、
請求項１４の方法。
【請求項１８】
該化学的に規定されている培地が、Ｎ２Ｂ２７培地である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
（ｄ）該ｉＰＳ細胞を増殖条件下で培養する工程、および／または
（ｅ）該ｉＰＳ細胞を特徴付ける工程
をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
該ｉＰＳ細胞を増殖条件下で培養する工程（ｄ）が、
（ｉ）外部から添加されたＧＳＫ−３β阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を本質的に含まない培地中で該ｉＰＳ細胞を培養すること、
（ｉｉ）化学的に規定されている増殖培地中で該ｉＰＳ細胞を培養すること、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地または必須８培地中で該ｉＰＳ細胞を培養すること
を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
該ｉＰＳ細胞を特徴付ける工程（ｅ）が、１つ以上の多能性マーカーを検出すること；核型分析を実施すること；該第一の核酸分子の存在を検出すること；該第一の核酸分子の配列を決定すること；該染色体外の遺伝要素の存在を検出すること；テラトーマ形成解析；エピジェネティック解析；ＲＮＡ発現解析；タンパク質発現解析；または縦列型反復配列（ＳＴＲ）の検出を含む、請求項１９の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
ａ）体細胞を得る工程；
ｂ）該細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子および、該体細胞中で発現した場合に、該体細胞を多能性幹細胞へと変換するのに十分な１つまたは複数のリプログラミング因子を発現する遺伝要素を含む少なくとも１つの第二の核酸分子を前記細胞に導入する工程；
ｃ）前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程；および
ｄ）それらのゲノム中に組み込まれた前記第一の核酸を含むｉＰＳ細胞の集団を得る工程を含み、ここで前記第一の核酸が発現可能であり、かつ、該第二の核酸分子が該ｉＰＳ細胞中には存在しない、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団の生産方法。
（項目２）
ｄ）（ｉ）それらのゲノムに組み込まれた前記第一の核酸を含む細胞および（ｉｉ）それらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含まない細胞を含むｉＰＳ細胞の集団を得る工程をさらに含む、項目１の方法。
（項目３）
ｄ）それらのゲノムに組み込まれた前記第一の核酸を含むｉＰＳ細胞の第一集団およびそれらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含まないｉＰＳ細胞の第二集団を得る工程をさらに含む、項目１の方法。
（項目４）
ｄ）それらのゲノムに組み込まれた、発現可能な第一の核酸を含むｉＰＳ細胞をスクリーニングまたは選択し、それによって、前記第一の核酸が発現可能である、ｉＰＳ細胞の該集団を得る工程をさらに含む、項目１の方法。
（項目５）
該ｉＰＳ細胞の分化に際して該第一の核酸が発現可能な、項目１の方法。
（項目６）
該体細胞、該第一の核酸分子および該第二の核酸分子を含有する組成物を形成すること、ならびに前記組成物を培養することによってさらに定義される、項目１の方法。
（項目７）
該第一のまたは第二の核酸分子が、該細胞の該ゲノム中に無作為に組み込まれている、項目１の方法。
（項目８）
工程（ｂ）が、該第一のもしくは第二の核酸分子を含有しているウイルスベクターを該細胞に形質導入すること、または該第一のもしくは第二の核酸分子を含有しているｐｉｇｇｙＢａｃベクターをトランスフェクトすることを含む、項目１の方法。
（項目９）
該ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、シンプルレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである、項目８の方法。
（項目１０）
該第一のまたは第二の核酸分子が、該細胞のゲノムの選択された部位に組み込まれている、項目１の方法。
（項目１１）
該選択された部位がＡＡＶＳ１組み込み部位である、項目１０の方法。
（項目１２）
該第一のまたは第二の核酸分子が、メガヌクレアーゼ、または該選択された部位でゲノムＤＮＡを切断する転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して、選択されたゲノム部位に組み込まれる、項目１０の方法。
（項目１３）
該第一のまたは第二の核酸分子が相同的組換えを使用して選択されたゲノム部位に組み込まれる、項目１０の方法。
（項目１４）
該第一の核酸分子が、スクリーニング可能なマーカーまたは選択マーカーのコード配列を含む、項目１の方法。
（項目１５）
該第一の核酸分子が、細胞内の遺伝的欠損を修正する配列；病原体感染に対する耐性を付与する配列；薬剤物への耐性を付与する配列；薬剤物への感受性を付与する配列；細胞の免疫原性を変える配列；および細胞内に遺伝的タグを付与する配列からなる群より選択される核酸配列を含む、項目１の方法。
（項目１６）
該体細胞が、ヒト線維芽細胞、角化細胞、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、乳房細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、または膵島細胞である、項目１の方法。
（項目１７）
該第二の核酸分子が染色体外の遺伝要素である、項目１の方法。
（項目１８）
該第二の核酸分子がＲＮＡである、項目１７の方法。
（項目１９）
該第二の核酸分子がエピソームベクターである、項目１７の方法。
（項目２０）
該エピソームベクターが、複製起点および、リプログラミング因子を発現させるための１つもしくは複数の発現カセットを含み、ここで１つもしくは複数の前記発現カセットが、染色体外の鋳型を複製するための該複製起点に結合するトランス活性化因子をコードしているヌクレオチド配列をさらに含み、ならびに／または該体細胞がそのようなトランス活性化因子を発現している、項目１９の方法。
（項目２１）
該リプログラミング因子が、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、形質転換欠損性のｍｙｃ突然変異体またはホモログ、およびＳＶ４ＯＬＴからなる群より選択される１つまたは複数を含む、項目１の方法。
（項目２２）
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｃ）が、フィーダー細胞を本質的に使用せずに該細胞を培養することを含む、項目１の方法。
（項目２３）
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｃ）が、マトリックス成分の存在下で該細胞を培養することを含む、項目１の方法。
（項目２４）
工程（ｃ）が、該第一の核酸分子の存在に関して、前記細胞を選択することまたはスクリーニングすることをさらに含む、項目１の方法。
（項目２５）
該選択またはスクリーニングが、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリーによる、項目２４の方法。
（項目２６）
該選択することが、該細胞培養への薬剤の添加を含む、項目２４の方法。
（項目２７）
該細胞が、該第一の核酸分子および染色体外の遺伝要素の該細胞への導入後、およそ１日目〜３日目に開始される該薬剤の存在下で培養される、項目２６の方法。
（項目２８）
該細胞が、およそ１〜１０日間、該薬剤の存在下で培養される、項目２６の方法。
（項目２９）
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｃ）が、該細胞を、少なくともおよそ１日〜１５日間、リプログラミング条件下で培養することを含む、項目１の方法。
（項目３０）
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｃ）が、該細胞をリプログラミング培地中で培養することを含む、項目２９の方法。
（項目３１）
該リプログラミング培地が、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤またはそれらの組み合わせを含む、項目３０の方法。
（項目３２）
該リプログラミング培地が、外部から添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を含む、項目３０の方法。
（項目３３）
該リプログラミング培地が化学的に規定されている、項目３０の方法。
（項目３４）
該化学的に規定されている培地が、ＴｅＳＲ培地、必須８培地、ヒト胚細胞培養用培地、またはＮ２Ｂ２７培地である、項目３３の方法。
（項目３５）
（ｅ）該ｉＰＳ細胞を増殖条件下で培養する工程をさらに含む、項目１の方法。
（項目３６）
該ｉＰＳ細胞を増殖条件下で培養する工程（ｅ）が、外部から添加されたＧＳＫ−３β阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を本質的に含まない培地中で該ｉＰＳ細胞を培養することを含む、項目３５の方法。
（項目３７）
該増殖培地が化学的に規定されている、項目３６の方法。
（項目３８）
該増殖培地がＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地または必須８培地である、項目３７の方法。
（項目３９）
（ｆ）該ｉＰＳ細胞を特徴付ける工程をさらに含む、項目３５の方法。
（項目４０）
該ｉＰＳ細胞を特徴付ける工程（ｆ）が、１つ以上の多能性マーカーを検出すること；核型分析を実施すること；該第一の核酸分子の存在を検出すること；該第一の核酸分子の配列を決定すること；該染色体外の遺伝要素の存在を検出すること；テラトーマ形成解析；エピジェネティック解析；ＲＮＡ発現解析；タンパク質発現解析；または縦列型反復配列（ＳＴＲ）の検出を含む、項目３９の方法。
（項目４１）
ａ）体細胞を得る工程；
ｂ）該細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子および、該体細胞中で発現した場合に、該体細胞を多能性幹細胞へと変換するのに十分な１つまたは複数のリプログラミング因子を発現している遺伝要素を含む少なくとも１つの第二の核酸分子を前記細胞に導入する工程；
ｃ）前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程；および
ｄ）それらのゲノムに組み込まれた前記第一の核酸を含むｉＰＳ細胞の第一の集団およびそれらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含まないｉＰＳ細胞の第二の集団を得る工程を含む、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団および改変したｉＰＳ細胞の集団を生産するための方法。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下に記す詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい態様を示してはいるが、当然のことながらこれらは例を示すためだけに記載されているものであり、当業者はこの詳細な説明から、本発明の精神および範囲内で、様々な変更や修正を理解するだろう。