(57)【要約】【課題】アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）を用いて癌を処置する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、一般に、アルギニンデイミナーゼ、特にペグ化アルギニンデイミナーゼを用いて癌を処置する方法に関する。一局面において、白血病を処置するのに使用するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む、化合物が提供される。別の局面において、上記白血病は急性骨髄性白血病である。別の局面において、上記白血病は再発性急性骨髄性白血病である。さらに別の局面において、上記白血病はリンパ性白血病または慢性骨髄性白血病ではない。なおさらなる局面において、患者における癌を処置するのに使用するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼをオートファジー阻害剤と組み合わせて含む化合物が提供され、この癌は、膵臓癌、肉腫または小細胞肺癌である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニンデイミナーゼを用いる処置方法など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１２年４月４日に出願された米国仮出願第６１／６２０，３６８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
配列表に関する記載
本出願に関する配列表はハードコピーに代えてテキストフォーマットで提供され、参照により本明細書に組み込まれる。本配列表を含むテキストファイルの名称は、ＰＯＬＡ＿００１＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは８ＫＢであり、２０１２年５月３０日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂで電子的に提出されている。
【０００３】
本発明は、一般に、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）、特にペグ化ＡＤＩ（ＡＤＩ−ＰＥＧ）を用いて癌を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
アミノ酸枯渇療法は、一部の癌型の有効な処置であり得る。これまでに、このアプローチに関する公知の一臨床例があるが、それは、アスパラギナーゼを用いてアスパラギンの循環レベルを低下させ、タンパク質合成を阻害するものである。この処置は、急性リンパ芽球性白血病に特に有効である（非特許文献１、非特許文献２）。急性リンパ芽球性白血病細胞は、成長および増殖にアミノ酸のアスパラギンを必要とする。対照的に、ほとんどの正常なヒト細胞はアスパラギンを合成でき、アスパラギン枯渇によって影響を受けない。したがって、アスパラギナーゼで血清アスパラギンを減少させることにより、正常な細胞、組織および宿主を害さずに癌細胞を選択的に殺すことができる。アスパラギナーゼの大腸菌に由来する形態は、ヒトにおける使用が承認されている。しかしながら、アスパラギナーゼは微生物でしか発見されていないので、ヒトでは免疫原性が高く、注射後の血清半減期も短い（非特許文献１）。アスパラギナーゼをより有効な薬物にするために、大腸菌に由来するアスパラギナーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて処方して、この酵素の抗原性および関連するアレルギー反応を減少させることによって、これらの欠点は最小限にされた。加えて、ＰＥＧはアスパラギナーゼの循環半減期を大幅に延長するので、処置頻度および総治療費の両方を減少させる。ＰＥＧ処方のアスパラギナーゼは使用承認されており、商品名Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）２０１１，非特許文献１、非特許文献２、Ｆｕ  ２００７，Ｚｅｉｄａｎ  ２００８）で販売されている。
【０００５】
アルギニンは、ヒトおよびマウスにとって非必須の別のアミノ酸である（概説には、Ｒｏｇｅｒｓ  １９９４を参照のこと）。ヒトでは、アルギニンは、シトルリンから、クレブス（尿素）サイクルの酵素であるアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ、Ｌ−シトルリン：Ｌ−アスパラギン酸リガーゼ［ＡＭＰ形成］、ＥＣ６．３．４．５）およびアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ、Ｌ−アルギニノコハク酸アルギニンリアーゼ、ＥＣ４．３．２．）を介して２段階で合成され得る（Ｈａｉｎｅｓ  ２０１１，Ｗｕ  ２００９，Ｍｏｒｒｉｓ  ２００６，Ｈｕｓｓｏｎ  ２００３，Ｔａｐｉｅｒｏ  ２００２，Ｒｏｇｅｒｓ  １９９４）。ＡＳＳはシトルリンおよびアスパラギン酸のアルギニノコハク酸塩への変換を触媒し、次いで、これがＡＳＬによってアルギニンおよびフマル酸に変換される（図１）。ヒトにおけるアルギニン欠乏食は高アンモニア血症、オロチン酸尿症を引き起こさず、成人のヒトで全身の一酸化窒素（ＮＯ）合成の速度も変化させない（Ｔａｐｉｅｒｏ  ２００２，Ｃａｓｔｉｌｌｏ  １９９５，Ｒｏｇｅｒｓ  １９９４，Ｃａｒｅｙ  １９８７，Ｂａｒｂｕｌ  １９８６，Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ  １９５９，Ｒｏｓｅ  １９４９）。早産児はアルギニンを必要とするようだが（Ｗｕ  ２００４）、幼児、子供および若年成人の間では、アルギニンレベルは年齢と相関しない（Ｌｕｅｃｋｅ  ２００７）。１９９２年に、ＴａｋａｋｕおよびＳｕｇｉｍｕｒａは、ヒト黒色腫および肝細胞癌腫（ＨＣＣ）細胞株が成長にアルギニンを必要とするようであることを別々に報告した。その他の研究では、ペグ化ＡＤＩは、悪影響をほとんど伴わずに黒色腫および肝細胞癌の処置に有効であったことが示された。
【０００６】
癌は、３種類の治療法：外科手術、放射線および化学療法の１つまたは組み合わせで主に処置される。外科手術、放射線および塞栓形成などの局所療法で処置できない癌については、全身化学療法が唯一の処置選択肢である。しかしながら、従来の化学療法は正常細胞と癌細胞とを区別できず、これが、有意な毒性および有効性の限界につながる。新世代の全身療法は、正常細胞と癌細胞との間の違いを利用することによって、癌細胞を選択的に殺すように設計された標的化療法である。本発明は、癌の処置についてのこの利点およびその他の利点を提供する。
【０００７】
参考文献：非特許文献１；Ｂａｒｂｕｌ  Ａ．  １９８６．  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ  １０：２２７−２３８；Ｃａｒｅｙ  ＧＰら、１９８７．  Ｊ  Ｎｕｔｒ  １１７：１７３４−１７３９；Ｃａｓｔｉｌｌｏ  Ｌら、１９９５．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６８（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ３１）：Ｅ３６０−３６７；Ｆｕ  ＣＨ，  Ｓａｋａｍｏｔｏ  ＫＭ．  ２００７．  Ｅｘｐｅｒｔ
Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ８：１９７７−１９８４；  Ｈａｉｎｅｓ  ＲＪら    ２０１１．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２：８−２３；  Ｈｕｓｓｏｎ  Ａら  ２００３．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０：１８８７−１８９９；  Ｌｕｅｃｋｅ  Ｔら    ２００７．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ４５：１５２５−１５３０；  Ｍｏｒｒｉｓ  ＳＭ  Ｊｒ．  ２００６．  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８３（Ｓｕｐｐｌ）：５９８Ｓ−５１２Ｓ；  Ｒｏｇｅｒｓ  ＱＲ．  １９９４．  Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｈｏｎｏｒｉｎｇ  Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｊ．  Ｖｉｓｅｋ  −  ｆｒｏｍ  Ａｍｍｏｎｉａ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ８６  −  Ａｐｒｉｌ，  １９９４，  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  ２１１  Ｍｕｍｆｏｒｄ  Ｈａｌｌ，  Ｕｒｂａｎａ，  ＩＬ  ６１８０１，  ｐｐ．  ９−２１；    Ｔａｐｉｅｒｏ  Ｈら    ２００２．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ５６：４３９−  ４４５，  ２００２；非特許文献２；  Ｗｕ  Ｇら  ２００９．  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３７：１５３−１６８；  Ｗｕ  Ｇら    ２００４．  Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：４４２−４５１；  Ｚｅｉｄａｎ  Ａら    ２００８．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：１１１−１１９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｖｒａｍｉｓ  ＶＩ，  Ｐａｎｏｓｙａｎ  ＥＨ．、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ（２００５）４４：３６７〜３９３
【非特許文献２】Ｖｉｅｒａ  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ＪＰ，  Ｂｏｏｓ  Ｊ．、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ（２００４）１２５：１１７〜１２７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、患者における白血病を処置する方法であって、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含む化合物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、前記白血病は、急性骨髄性白血病または再発性急性骨髄性白血病である。さらなる実施形態において、前記白血病は、リンパ性白血病または慢性骨髄性白血病ではない。しかしながら、さらなる実施形態において、前記白血病は、リンパ性白血病または慢性骨髄性白血病を含み得る。別の実施形態において、前記アルギニンデイミナーゼは、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、前記化合物は、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される；ここで、前記アルギニンデイミナーゼは、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与され；および、前記白血病は、ＡＳＳの発現減少を示す。
【００１０】
本発明の別の態様は、患者における癌を処置する方法であって、オートファジー阻害剤と、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含む化合物とを前記患者に投与することを含み、前記癌が、膵臓癌または小細胞肺癌である方法を提供する。この点に関して、オートファジー阻害剤は、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ウォルトマンニンおよびビンブラスチンからなる群より選択される。当技術分野において公知のその他のオートファジー阻害剤が、本明細書の方法における使用について企図される。ある種の実施形態において、前記ＡＤＩおよび前記オートファジー阻害剤は、相加的または相乗的に作用する。別の実施形態において、前記アルギニンデイミナーゼは、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、前記化合物は、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される；ここで、前記アルギニンデイミナーゼは、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与され；および、前記癌は、ＡＳＳの発現減少を示す。
【００１１】
本発明の一態様は、患者における癌を処置する方法であって、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含む化合物を前記患者に投与することを含み、前記癌が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸部癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌および胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群より選択される方法を提供する。一実施形態において、前記アルギニンデイミナーゼは、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、前記化合物は、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される；ここで、前記アルギニンデイミナーゼは、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与され；および、前記癌は、ＡＳＳの発現減少を示す。
【００１２】
本発明の一態様は、患者における黒色腫を処置する方法であって、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含む化合物をシスプラチンと組み合わせて前記患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、前記アルギニンデイミナーゼは、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、前記化合物は、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される；ここで、前記アルギニンデイミナーゼは、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与され；および、前記黒色腫は、ＡＳＳの発現減少を示す。
【００１３】
本発明の別の態様は、患者における癌を処置する方法であって、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含む化合物を前記患者に投与することを含み、前記癌が、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞癌および肉腫ではない方法を提供する。一実施形態において、前記アルギニンデイミナーゼは、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、前記化合物は、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される；ここで、前記アルギニンデイミナーゼは、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与され；および、前記癌は、ＡＳＳの発現減少を示す。
【００１４】
本開示の別の態様は、患者における非小細胞肺癌、頭頸部癌または前立腺癌を処置する方法であって、治療有効量の、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む化合物をドセタキセルと組み合わせて投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、前記アルギニンデイミナーゼは、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、前記化合物は、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される；ここで、前記アルギニンデイミナーゼは、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与され；および、前記非小細胞肺癌、頭頸部癌または前立腺癌は、ＡＳＳの発現減少を示す。
【００１５】
本開示の別の態様は、患者における腎細胞癌腫を処置する方法であって、治療有効量の、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む化合物をラパマイシンと組み合わせて投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、前記アルギニンデイミナーゼは、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、前記化合物は、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される；ここで、前記アルギニンデイミナーゼは、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与され；および、前記癌は、ＡＳＳの発現減少を示す。
【００１６】
本発明のある種の実施形態において、前記ＡＤＩは、１個よりも多くのポリエチレングリコール分子、または約９個〜約１２個のポリエチレングリコール分子に共有結合している。本発明の別の実施形態において、前記ポリエチレングリコールは、約１，０００〜約４０，０００の総重量平均分子量を有し、約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、ある種の実施形態において、前記ポリエチレングリコールは、２０，０００の分子量を有する。
【００１７】
本開示のある種の実施形態において、前記連結基は、スクシンイミド基である。ある種の実施形態において、前記スクシンイミド基は、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせであり得る。一実施形態において、前記スクシンイミド基は、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネートまたはそれらの組み合わせである。
【００１８】
本開示のある種の実施形態において、前記ＡＤＩは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉから単離されるものではない。その他の実施形態において、前記ＡＤＩは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓから単離されるものである。特定の一実施形態において、前記ＡＤＩは、配列番号１の１１２位、３７４位、４０５位または４０８位の少なくとも１個のリシンを含まないように修飾されており、別の実施形態において、前記ＡＤＩは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、前記アルギニンデイミナーゼは、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、ある種の実施形態において、前記ＰＥＧは、直鎖状ＰＥＧである。
【００１９】
本方法のいくつかの実施形態において、前記ＡＤＩは、１週間に約２回〜２週間毎に約１回投与され、特定の実施形態において、前記ＡＤＩは、毎週投与される。
【００２０】
一実施形態において、前記ＡＤＩは、約８０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の間の用量で投与され、特定の一実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２の用量で投与される。別の実施形態において、前記ＡＤＩは、約１６０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与される。
【００２１】
一実施形態において、本明細書において記載される方法に使用される化合物であって、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む化合物は、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される。
【００２２】
本発明の別の態様は、患者におけるＧＶＨＤを処置する方法であって、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含む化合物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、患者における癌を処置する方法であって、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含む化合物を前記患者に投与することを含み、前記癌がＡＳＳを示す方法を提供する。一実施形態において、前記癌は、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、精巣癌および胃癌からなる群より選択される。さらなる実施形態において、ＡＳＳの発現減少は、アルギニノコハク酸合成酵素プロモーターのメチル化に起因する。別の実施形態において、ＡＳＳの発現減少は、ＤＮＡの変異または欠失に起因する。特定の一実施形態において、ＡＳＳの発現減少は、「フィラデルフィア染色体」の一部としての９ｑ３４遺伝子座の欠失または転移に起因する。ある種の実施形態において、前記癌は、ＡＳＳの発現減少を示す。
【００２４】
さらに、本発明のさらなる態様は、患者における癌を処置する方法であって、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含む化合物を前記患者に投与することを含み、前記癌が、アルギニノコハク酸リアーゼの発現減少を示す方法を提供する。一実施形態において、前記癌は、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、精巣癌および胃癌からなる群より選択される。一実施形態において、ＡＳＬの発現減少は、アルギニノコハク酸リアーゼプロモーターのメチル化に起因する。ある種の実施形態において、ＡＳＬの発現減少は、ＤＮＡの変異または欠失に起因する。特定の一実施形態において、前記癌は、ＡＳＬ陰性である。
【００２５】
本発明のある種の実施形態において、ＡＤＩ−ＰＥＧによる処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＮＯ合成を阻害するか、血管新生を阻害するか、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導するか、またはそれらの組み合わせである。ある種の実施形態において、前記処置は、安定病態をもたらす。その他の実施形態において、前記処置は、前記患者における無増悪生存期間（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｔｉｍｅ）を増大させる。さらに別の実施形態において、血漿アルギニンは、少なくとも１カ月間、または２カ月間よりも長く枯渇される。
【００２６】
ある種の実施形態において、本明細書において記載される方法は、化学療法剤、例えば限定されないが、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブおよびエベロリムスなどの治療剤の投与をさらに含む。ある種の実施形態において、前記ＡＤＩおよび前記化学療法剤は、相加的または相乗的に作用する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
白血病を処置するのに使用するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む、化合物。
（項目２）
上記白血病が急性骨髄性白血病である、項目１に記載の化合物。
（項目３）
上記白血病が再発性急性骨髄性白血病である、項目１に記載の化合物。
（項目４）
上記白血病がリンパ性白血病または慢性骨髄性白血病ではない、項目１に記載の化合物。
（項目５）
患者における癌を処置するのに使用するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼをオートファジー阻害剤と組み合わせて含む化合物であって、該癌が、膵臓癌、肉腫または小細胞肺癌である、化合物。
（項目６）
上記オートファジー阻害剤が、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ウォルトマンニンおよびビンブラスチンからなる群より選択される、項目５に記載の化合物。
（項目７）
患者における癌を処置するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む化合物であって、該癌が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、精巣癌および胃癌からなる群より選択される、化合物。
（項目８）
患者における癌を処置するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む化合物であって、該癌が、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞癌または肉腫ではない、化合物。
（項目９）
患者における黒色腫を処置するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼをシスプラチンと組み合わせて含む、化合物。
（項目１０）
患者における非小細胞肺癌、頭頸部癌または前立腺癌を処置するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼをドセタキセルと組み合わせて含む、化合物。
（項目１１）
患者における腎細胞癌腫を処置するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼをラパマイシンと組み合わせて含む、化合物。
（項目１２）
上記アルギニンデイミナーゼが、１個よりも多くのポリエチレングリコール分子に共有結合している、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１３）
上記アルギニンデイミナーゼが、約９個〜約１２個のポリエチレングリコール分子に共有結合している、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１４）
上記アルギニンデイミナーゼが、５±１．５個のＰＥＧ分子に共有結合している、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１５）
上記ＰＥＧ分子が直鎖状ＰＥＧ分子である、項目１４に記載の化合物。
（項目１６）
上記ポリエチレングリコールが、約１，０００〜約４０，０００の総重量平均分子量を有する、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１７）
上記ポリエチレングリコールが、約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１８）
上記ポリエチレングリコールが、２０，０００の分子量を有する、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１９）
上記ポリエチレングリコールが直鎖状ポリエチレングリコールである、項目１７に記載の化合物。
（項目２０）
上記連結基がスクシンイミド基である、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２１）
上記スクシンイミド基が、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、項目２０に記載の化合物。
（項目２２）
上記スクシンイミド基が、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネートまたはそれらの組み合わせである、項目２０に記載の化合物。
（項目２３）
上記アルギニンデイミナーゼがＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉから単離されるものではない、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２４）
上記アルギニンデイミナーゼがＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓから単離されるものである、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２５）
上記アルギニンデイミナーゼが、配列番号１の１１２位、３７４位、４０５位または４０８位の少なくとも１個のリシンを含まないように修飾されている、項目２４に記載の化合物。
（項目２６）
約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方される、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２７）
上記アルギニンデイミナーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の化合物。
（項目２８）
上記アルギニンデイミナーゼが、１週間に約２回〜２週間毎に約１回投与される、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２９）
上記アルギニンデイミナーゼが毎週投与される、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目３０）
上記アルギニンデイミナーゼが、約８０ＩＵ／ｍ２〜約６５０ＩＵ／ｍ２の間の用量で投与される、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目３１）
上記アルギニンデイミナーゼが約１６０ＩＵ／ｍ２の用量で投与される、項目３０に記載の化合物。
（項目３２）
上記アルギニンデイミナーゼが約１６０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与される、項目１、５および７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目３３）
患者におけるＧＶＨＤを処置するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む、化合物。
（項目３４）
患者における癌を処置するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む化合物であって、該癌が、アルギニノコハク酸合成酵素の発現減少を示す、化合物。
（項目３５）
上記癌が、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、精巣癌および胃癌からなる群より選択される、項目３４に記載の化合物。
（項目３６）
上記アルギニノコハク酸合成酵素の発現減少が、アルギニノコハク酸合成酵素プロモーターのメチル化に起因する、項目３４に記載の化合物。
（項目３７）
上記アルギニノコハク酸合成酵素の発現減少が、ＤＮＡの変異または欠失に起因する、項目３４に記載の化合物。
（項目３８）
上記癌がアルギニノコハク酸合成酵素陰性である、項目３７に記載の化合物。
（項目３９）
患者における癌を処置するための、連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したアルギニンデイミナーゼを含む化合物であって、該癌が、アルギニノコハク酸リアーゼの発現減少を示す、化合物。
（項目４０）
上記癌が、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、精巣癌および胃癌からなる群より選択される、項目３９に記載の化合物。
（項目４１）
上記アルギニノコハク酸リアーゼの発現減少が、アルギニノコハク酸リアーゼプロモーターのメチル化に起因する、項目３９に記載の化合物。
（項目４２）
上記アルギニノコハク酸リアーゼの発現減少が、ＤＮＡの変異または欠失に起因する、項目３９に記載の化合物。
（項目４３）
上記癌がアルギニノコハク酸リアーゼ陰性である、項目４２に記載の化合物。
（項目４４）
上記処置が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＮＯ合成を阻害するか、血管新生を阻害するか、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導するか、またはそれらの組み合わせをもたらす、項目１、５、７〜１１、３４および３９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目４５）
上記処置が安定病態をもたらす、項目１、５、７〜１１、３４および３９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目４６）
上記処置が、上記患者における無増悪生存期間を増大させる、項目１、５、７〜１１、３４および３９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目４７）
血漿アルギニンが少なくとも１カ月間枯渇される、項目１、５、７〜１１、３４および３９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目４８）
血漿アルギニンが２カ月間よりも長く枯渇される、項目１、５、７〜１１、３４および３９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目４９）
上記アルギニンデイミナーゼおよび上記オートファジー阻害剤が相乗的に作用する、項目５に記載の化合物。
（項目５０）
化学療法剤の投与をさらに含む、項目１、５、７〜８、１０〜１１、３４および３９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目５１）
上記化学療法剤が、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブおよびエベロリムスからなる群より選択される、項目５０に記載の化合物。
（項目５２）
（ａ）上記アルギニンデイミナーゼが、５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合しており、上記化合物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ、約５％未満の遊離ＰＥＧまたはその両方を含む組成物中に処方され；
（ｂ）該アルギニンデイミナーゼが、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約６４０ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与され；かつ
（ｃ）上記癌が、ＡＳＳの発現減少を示す、
項目１、５、７〜１１および３９のいずれか一項に記載の化合物。
【００２７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ  ＡＤＩタンパク質のアミノ酸配列である
配列番号２は、修飾Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ  ＡＤＩタンパク質のアミノ酸配列である
配列番号３および４は、アルギニノコハク酸合成酵素のｃＤＮＡを増幅するのに使用されるＰＣＲプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、クレブス（尿素）サイクルを介したアルギニン代謝の図である。
【図２】図２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＡＤＩによって膵臓癌細胞のカスパーゼ依存性アポトーシスおよびオートファジーが誘導されたことを示す。図２Ａは、汎カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤ−ｆｍｋ（「Ｚｖａｄ」）および／またはＡＤＩ−ＰＥＧと一緒にインキュベートした後の細胞死を受けている細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。図２Ｂは、ＡＤＩ−ＰＥＧと一緒に７２時間インキュベートした後のアネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージをＰＢＳ対照と比較して示す棒グラフである。
【図３】図３は、ヒト膵臓癌細胞をヒドロキシクロロキン（「ＣｈＱ」）および／またはＡＤＩ−ＰＥＧと一緒にインキュベートした後の切断型カスパーゼ３、ｐ６２およびＬＣ３Ｂの発現レベルを示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ヒト膵臓癌細胞をＣｈＱおよび／またはＡＤＩ−ＰＥＧと一緒にインキュベートした後のアネキシンＶ陽性細胞およびサブＧ０／Ｇ１期細胞のパーセンテージを示す。
【図５】図５は、クロロキン（ＣＱ）および／またはＡＤＩ−ＰＥＧで処置した後のマウスにおける腫瘍容積を示す。ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡ  ＰａＣａ−２の皮下異種移植片を無胸腺マウスに定着（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ）させた。
【図６】図６は、クロロキンおよび／またはＡＤＩ−ＰＥＧで処置した後のＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍の組織病理学を示す。１列目はＨ＆Ｅ染色を示し、２列目は活性型カスパーゼの染色を示し、３列目はＴＵＮＥＬアッセイによるＤＮＡ断片化の染色を示し、４列目はｐ６２の染色を示す。
【図７】図７は、小細胞肺癌ヒト腫瘍および細胞株におけるＡＳＳ発現を示す。抗ＡＳＳ抗体１９５−２１−１を使用して、正常皮膚（図７Ａ）、結腸癌腫（図７Ｂ）および小細胞肺癌（図７Ｃ）におけるＡＳＳタンパク質発現を検出した。図７Ｄは、ウエスタンブロットによって、小細胞肺癌細胞株パネルにおけるＡＳＳタンパク質発現を陽性対照ＳＷ１２２２結腸癌細胞と比較して示す。図７Ｅは、ウエスタンブロットによって測定したＡＳＳタンパク質発現と、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定したｍＲＮＡ発現との相関関係を示す。
【図８】図８は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０によるＡＳＳ陰性小細胞肺癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖の阻害を示す。接着（図８Ａ）および非接着（図８Ｂ）細胞をＡＤＩ−ＰＥＧ２０で１２０時間処理してから、接着細胞にはＭＴＳアッセイを、または非接着細胞にはＢＣＡ全タンパク質アッセイを使用して、増殖をアッセイした。
【図９−１】図９は、ＡＤＩが、ＡＳＳ陰性ＳＫ−ＬＣ−１３小細胞肺癌細胞においてアポトーシスおよびオートファジーを誘導することを示す。アポトーシスを実証しているサブＧ１期ＤＮＡ含量の蛍光活性化細胞分取分析では、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるＤＮＡ染色前に、対照培地（図９Ａ）、２５ｎＭトポテカン（図９Ｂ）、１．０ｍＩＵｍｌ−１のＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図９Ｃ）および１０ｍＩＵｍｌ−１のＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図９Ｄ）中で、細胞を７２時間インキュベートした。図９Ｅは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０またはクロロキン（「ＣＱ」）−陽性対照と一緒に２４時間インキュベートした後のＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩのタンパク質レベルを示す。図９Ｆは、ＳＫ−ＬＣ−１３細胞において、ウエスタンブロットによって検出された活性型カスパーゼ３を示す（図９Ｆ）。
【図９−２】図９は、ＡＤＩが、ＡＳＳ陰性ＳＫ−ＬＣ−１３小細胞肺癌細胞においてアポトーシスおよびオートファジーを誘導することを示す。アポトーシスを実証しているサブＧ１期ＤＮＡ含量の蛍光活性化細胞分取分析では、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるＤＮＡ染色前に、対照培地（図９Ａ）、２５ｎＭトポテカン（図９Ｂ）、１．０ｍＩＵｍｌ−１のＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図９Ｃ）および１０ｍＩＵｍｌ−１のＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図９Ｄ）中で、細胞を７２時間インキュベートした。図９Ｅは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０またはクロロキン（「ＣＱ」）−陽性対照と一緒に２４時間インキュベートした後のＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩのタンパク質レベルを示す。図９Ｆは、ＳＫ−ＬＣ−１３細胞において、ウエスタンブロットによって検出された活性型カスパーゼ３を示す（図９Ｆ）。
【図９−３】図９は、ＡＤＩが、ＡＳＳ陰性ＳＫ−ＬＣ−１３小細胞肺癌細胞においてアポトーシスおよびオートファジーを誘導することを示す。アポトーシスを実証しているサブＧ１期ＤＮＡ含量の蛍光活性化細胞分取分析では、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるＤＮＡ染色前に、対照培地（図９Ａ）、２５ｎＭトポテカン（図９Ｂ）、１．０ｍＩＵｍｌ−１のＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図９Ｃ）および１０ｍＩＵｍｌ−１のＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図９Ｄ）中で、細胞を７２時間インキュベートした。図９Ｅは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０またはクロロキン（「ＣＱ」）−陽性対照と一緒に２４時間インキュベートした後のＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩのタンパク質レベルを示す。図９Ｆは、ＳＫ−ＬＣ−１３細胞において、ウエスタンブロットによって検出された活性型カスパーゼ３を示す（図９Ｆ）。
【図１０】図１０は、ｓｉＲＮＡによるＡＳＳ発現のサイレンシングを示す。図１０Ａは、ＡＳＳ  ｓｉＲＮＡで処理したＳＷ１２２２細胞において、ＲＴ−ＰＣＲによって決定したＡＳＳ  ｍＲＮＡ発現の相対発現を示す。図１０Ｂは、ＡＳＳ  ｓｉＲＮＡで処理したＳＷ１２２２細胞において、ウエスタンブロットによって評価したＡＳＳタンパク質の相対発現を示す。図１０Ｃは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０で処理した細胞の増殖をＭＴＳ増殖アッセイによって測定したものを示す。
【図１１−１】図１１は、分子量（ｍ．ｗ．）２０，０００のＰＥＧとともに処方したＡＤＩ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）によって、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける中程度のサイズのＳＫ−ＬＣ−１３小細胞肺癌異種移植片の成長が阻害されたことを示す。ＰＢＳビヒクル（黒丸）、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の短い２０日間の過程（５日毎に投薬）（黒四角）、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０の継続投薬（群を終了するまで５日毎）（白四角）を、マウス１匹あたり１ＩＵ（図１１Ａ）、マウス１匹あたり２ＩＵ（図１１Ｂ）およびマウス１匹あたり５ＩＵ（図１１Ｃ）の用量で受けたマウスの腫瘍容積の成長曲線を示す。３３日目に対照群を終了した際の腫瘍容積を図１１Ｄに示す。研究０日目、１２日目および４０日目について、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図１１Ｅ）、アルギニン（図１１Ｆ）およびシトルリン（図１１Ｇ）の血清レベルを示す。延長投薬は２０日目になって初めて開始したので、０日目および１２日目の短期投薬コホートおよび延長投薬コホートでは、数値は同じものである。
【図１１−２】図１１は、分子量（ｍ．ｗ．）２０，０００のＰＥＧとともに処方したＡＤＩ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）によって、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける中程度のサイズのＳＫ−ＬＣ−１３小細胞肺癌異種移植片の成長が阻害されたことを示す。ＰＢＳビヒクル（黒丸）、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の短い２０日間の過程（５日毎に投薬）（黒四角）、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０の継続投薬（群を終了するまで５日毎）（白四角）を、マウス１匹あたり１ＩＵ（図１１Ａ）、マウス１匹あたり２ＩＵ（図１１Ｂ）およびマウス１匹あたり５ＩＵ（図１１Ｃ）の用量で受けたマウスの腫瘍容積の成長曲線を示す。３３日目に対照群を終了した際の腫瘍容積を図１１Ｄに示す。研究０日目、１２日目および４０日目について、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図１１Ｅ）、アルギニン（図１１Ｆ）およびシトルリン（図１１Ｇ）の血清レベルを示す。延長投薬は２０日目になって初めて開始したので、０日目および１２日目の短期投薬コホートおよび延長投薬コホートでは、数値は同じものである。
【図１１−３】図１１は、分子量（ｍ．ｗ．）２０，０００のＰＥＧとともに処方したＡＤＩ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）によって、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける中程度のサイズのＳＫ−ＬＣ−１３小細胞肺癌異種移植片の成長が阻害されたことを示す。ＰＢＳビヒクル（黒丸）、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の短い２０日間の過程（５日毎に投薬）（黒四角）、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０の継続投薬（群を終了するまで５日毎）（白四角）を、マウス１匹あたり１ＩＵ（図１１Ａ）、マウス１匹あたり２ＩＵ（図１１Ｂ）およびマウス１匹あたり５ＩＵ（図１１Ｃ）の用量で受けたマウスの腫瘍容積の成長曲線を示す。３３日目に対照群を終了した際の腫瘍容積を図１１Ｄに示す。研究０日目、１２日目および４０日目について、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０（図１１Ｅ）、アルギニン（図１１Ｆ）およびシトルリン（図１１Ｇ）の血清レベルを示す。延長投薬は２０日目になって初めて開始したので、０日目および１２日目の短期投薬コホートおよび延長投薬コホートでは、数値は同じものである。
【図１２】図１２は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＡＳＳ陽性ＮＣＩ−Ｈ６９小細胞肺癌異種移植片の腫瘍容積の成長曲線を示す。マウスは、ＰＢＳビヒクルまたはマウス１匹あたり２ＩＵのＡＤＩ−ＰＥＧ２０を受けた（黒色矢印）。
【図１３−１】図１３は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける大きなＳＫ−ＬＣ−１３小細胞肺癌異種移植片の阻害を示す。ＰＢＳビヒクル（円）、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の短い２０日間の過程（黒色矢印）（四角）、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０の継続投薬（灰色矢印）（三角）を、マウス１匹あたり１ＩＵ（図１３Ａ）、マウス１匹あたり２ＩＵ（図１３Ｂ）およびマウス１匹あたり５ＩＵ（図１３Ｃ）の用量で受けたマウスの腫瘍容積の成長曲線を示す。３２日目に対照群を終了した際の腫瘍容積を図１３Ｄに示す。
【図１３−２】図１３は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける大きなＳＫ−ＬＣ−１３小細胞肺癌異種移植片の阻害を示す。ＰＢＳビヒクル（円）、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の短い２０日間の過程（黒色矢印）（四角）、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０の継続投薬（灰色矢印）（三角）を、マウス１匹あたり１ＩＵ（図１３Ａ）、マウス１匹あたり２ＩＵ（図１３Ｂ）およびマウス１匹あたり５ＩＵ（図１３Ｃ）の用量で受けたマウスの腫瘍容積の成長曲線を示す。３２日目に対照群を終了した際の腫瘍容積を図１３Ｄに示す。
【図１４】図１４は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０およびオートファジー阻害剤クロロキンによる各ｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置について比較した相対細胞生存率（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）を示す。
【図１５】図１５は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０およびシスプラチンの組み合わせが、ＡＳＳ欠損黒色腫細胞における抗腫瘍活性の増強をもたらすことを実証する異種移植データのグラフを示す。
【図１６】図１６は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０およびラパマイシンの組み合わせが、異種移植されたＣａｋｉ−１腎細胞癌腫細胞株に対する抗腫瘍活性の増強をもたらすことを実証する異種移植データのグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本発明は、一般に、ＡＤＩ、特にＡＤＩ−ＰＥＧを用いて癌を処置する方法に関する。
【００３０】
正常細胞は、ＡＳＳおよびＡＳＬによって触媒される２段階の工程でシトルリンからアルギニンを合成できるので、成長にアルギニンを必要としない（図１を参照のこと）。対照的に、ある種の癌は、ＡＳＳを発現していない。ある種の癌はＡＳＬを発現しておらず、その他の癌は、ＡＳＳおよび／またはＡＳＬの発現が減少しているかもしれないし、ＡＳＳおよび／またはＡＳＬを発現していないかもしれない。したがって、これらの癌は、アルギニン栄養要求性である。この代謝の違いは、安全かつ有効な治療法を開発してこれらの癌型を処置するのに利用し得る。ＡＤＩは、アルギニンジヒドロラーゼ経路を介したアルギニンのシトルリンへの変換を触媒するので、アルギニンを排除するのに使用し得る。
【００３１】
具体的に反対の指示がない限り、本発明の実施には、当業者の範囲内にあるウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の通常の方法を利用し、説明のためにこれらの多くを以下に記載する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）およびその他の類似参考文献を参照のこと。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、内容上明らかなその他の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００３３】
本明細書全体を通して、文脈上その他の意味を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語またはその変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載されている要素もしくは整数、または要素もしくは整数のグループを包含するが、あらゆるその他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数のグループを除外しないことを意味すると理解される。
【００３４】
本明細書における各実施形態は、その他の意味を明記しない限り、必要な変更を加えてあらゆるその他の実施形態に適用される。
【００３５】
標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書にしたがって、または当技術分野において一般的に行われるようにもしくは本明細書において記載されるように実施され得る。これらのおよび関連の技術および手順は、一般に、当技術分野において周知の通常の方法にしたがって、ならびに本明細書全体を通して引用および議論される種々の一般的な文献およびより専門的な文献に記載されているように実施され得る。特定の定義が提供されない限り、本明細書において記載される分子生物学、分析化学、有機合成化学ならびに医薬品化学および医薬化学に関連して用いられる命名法、ならびにそれらの検査法および検査技術は当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技術が、組換え技術、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、医薬品調製、処方および送達、ならびに患者の処置に使用され得る。
【００３６】
「患者」は、動物、ある種の実施形態では哺乳動物、具体的な実施形態ではヒトを指す。
【００３７】
「生体適合性」は、生物学的機能に一般に有害ではない材料または化合物であって、アレルギー状態および疾患状態を含むいかなる程度の許容できない毒性ももたらさない材料または化合物を指す。
【００３８】
本開示全体を通して、以下の略語が使用され得る：ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＡＤＩ、アルギニンデイミナーゼ；ＳＳ、スクシンイミジルスクシネート；ＳＳＡ、スクシンイミジルスクシンアミド；ＳＰＡ、スクシンイミジルプロピオネート；ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；ＡＳＳ１またはＡＳＳ、アルギニノコハク酸合成酵素；ＡＳＬ、アルギニノコハク酸リアーゼ。
【００３９】
本発明において、ＡＤＩ遺伝子は、任意の起源、例えば微生物、組換えバイオテクノロジーまたはそれらの任意の組み合わせなどに由来し得るか、これらからクローニングされ得るか、またはこれらから製造され得る。例えば、アルギニンデイミナーゼは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｉａｒｄｉａ属の微生物からクローニングされ得る。ある種の実施形態において、アルギニンデイミナーゼは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅまたはそれらの任意の組み合わせからクローニングされる。特に、本発明に使用されるＡＤＩは、配列番号１または２のアミノ酸配列、またはＡＤＩ活性を有する（例えば、アルギニンをシトルリンおよびアンモニアに代謝できる）それらの変異体、もしくはＡＤＩ活性を有するそれらの断片を含み得る。
【００４０】
本発明のある種の実施形態において、前記ＡＤＩは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属の微生物からクローニングされる。さらなる実施形態において、前記ＡＤＩは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓまたはそれらの任意の組み合わせからクローニングされるが、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉに由来しない。特に、本発明に使用されるＡＤＩは、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列、またはＡＤＩ活性を有する（例えば、アルギニンをシトルリンおよびアンモニアに代謝できる）それらの変異体、もしくはＡＤＩ活性を有するそれらの断片を有し得る。
【００４１】
天然ＡＤＩは微生物で見られ得、抗原性であり、患者の循環系から迅速に除去される。これらの問題は、ＡＤＩを修飾することによって克服され得る。したがって、本開示は、変性剤、例えば限定されないが、高分子ポリマー、タンパク質、ペプチド、多糖またはその他の化合物によって修飾されたＡＤＩを提供する。アルギニンデイミナーゼおよび前記変性剤は、共有結合または非共有相互作用のいずれかによって連結されて、安定なコンジュゲートまたは安定な組成物を形成して、所望の効果を達成し得る。ある種の実施形態において、前記修飾ＡＤＩはＡＤＩの生物学的活性を保持し、非修飾ＡＤＩよりも長いｉｎ
ｖｉｖｏ半減期および低い抗原性を有する。ある種の実施形態において、前記修飾ＡＤＩは、非修飾ＡＤＩの生物学的活性の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を保持する。
【００４２】
一実施形態において、変性剤は、生体適合性のポリマーもしくはタンパク質またはそれらの断片であり得、ＡＤＩの血中半減期を増大させ得る。前記変性剤は、ＡＤＩに化学的にカップリングされ得るか、または適用可能な場合は、融合タンパク質発現により前記ＡＤＩに連結され得る。
【００４３】
高分子ポリマーとしては、非ペプチド高分子ポリマーが挙げられ得るが、ある種の実施形態ではそれ自体が生物活性を有してもよい。適切なポリマーとしては、限定されないが、ポリエノール化合物、ポリエーテル化合物、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルと無水マレイン酸とのコポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、多糖、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリンまたはその断片、ポリ−アルキル−エチレングリコールおよびその誘導体、ポリ−アルキル−エチレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリ（ビニルエチルエーテル）、ａ，Ｐ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］、ポリカルボキシラート、ポリオキシエチレン−オキシメチレン、ポリアクリロイルモルホリン、アミノ化合物とオキシオレフィンとのコポリマー、ポリヒアルロン酸、ポリオキシラン、エタン二酸とマロン酸とのコポリマー、ポリ（１，３−ジオキソラン）、エチレンとマレイン酸ヒドラジドとのコポリマー、ポリシアル酸、シクロデキストリンなどが挙げられる。ある種の実施形態において、前記ポリマーは、ポリエチレングリコールである。
【００４４】
本明細書において使用されるポリエノール化合物としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（モノメトキシポリエチレングリコール、モノヒドロキシルポリエチレングリコールを含む）、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリブテノールなど、およびそれらの誘導体、例えば脂質が挙げられる。
【００４５】
ポリエーテル化合物としては、限定されないが、ポリアルキレングリコール（ＨＯ（（ＣＨ２）ｘＯ）ｎＨ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｒｅｈｙｌｅｎｅ）（ＨＯ（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎＨ）、ポリビニルアルコール（（ＣＨ２ＣＨＯＨ）ｎ）が挙げられる。
【００４６】
ポリアミノ酸としては、限定されないが、１種類のアミノ酸のポリマー、または２種類以上のアミノ酸のコポリマー、例えばポリアラニンもしくはポリリシンまたはそれらのブロックコポリマーが挙げられる。
【００４７】
多糖としては、限定されないが、グルコサンおよびその誘導体、例えば硫酸デキストラン、セルロースおよびその誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む）、デンプンおよびその誘導体、ポリスクロースなどが挙げられる。
【００４８】
本発明の具体的な一実施形態において、ＡＤＩは、タンパク質またはペプチドとカップリングすることによって修飾され、ここで、１個以上のタンパク質またはペプチドが、ＡＤＩに直接的または間接的に連結される。前記タンパク質は、天然に存在するタンパク質またはそれらの断片、例えば限定されないが、天然に存在するヒト血清タンパク質またはそれらの断片、例えばチロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、ａ１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ＩｇＦｃ領域（ｒｅｇｕｉｓ）、アルブミンおよびそれらの断片であり得る。「断片」は、タンパク質全体よりも小さいが、タンパク質の所望の機能を保持する任意のタンパク質部分を意味する。ＡＤＩは、共有結合を介してタンパク質に直接的または間接的に連結され得る。直接的な連結は、ＡＤＩの１個のアミノ酸が、ペプチド結合またはジスルフィド架橋を介して前記修飾タンパク質の１個のアミノ酸に直接的に連結されることを意味する。間接的な連結は、ＡＤＩと修飾タンパク質との間の連結であって、それらの間に元々存在する化学基、または生物学的もしくは化学的な手段により付加された特定の化学基を介した連結、または上記連結の組み合わせを指す。
【００４９】
特定の一実施形態において、ＡＤＩは、ＰＥＧとの共有結合によって修飾される。ＰＥＧで共有結合的に修飾されたＡＤＩは（連結基を含むか含まない）、以下、「ＡＤＩ−ＰＥＧ」と称され得る。天然ＡＤＩと比較した場合、ＡＤＩ−ＰＥＧは、その酵素活性の大部分を保持し、抗原性が極めて低く、非常に長い循環半減期を有し、腫瘍の処置により有効である。
【００５０】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、エチレンオキシドと水との縮合ポリマーの混合物で分岐状または直鎖状のものを指し、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、ｎは、少なくとも４である）によって表される。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、それらのおおよその重量平均分子量を示すための接尾数字と組み合わせて使用される。例えば、ＰＥＧ５，０００は、約５，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指す；ＰＥＧ１２，０００は、約１２，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指す；および、ＰＥＧ２０，０００は、約２０，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指す。
【００５１】
本発明の一実施形態において、前記ＰＥＧは、約１，０００〜約５０，０００；一実施形態では約３，０００〜約４０，０００、および別の実施形態では約５，０００〜約３０，０００；ある種の実施形態では約８，０００〜約３０，０００；その他の実施形態では約１１，０００〜約３０，０００；さらなる実施形態では約１２，０００〜約２８，０００；さらにその他の実施形態では約１６，０００〜約２４，０００；およびその他の実施形態では約１８，０００〜約２２，０００；別の実施形態では１９，０００〜約２１，０００の総重量平均分子量を有し、一実施形態において、前記ＰＥＧは、約２０，０００の総重量平均分子量を有する。一般に、３０，０００以上の分子量を有するＰＥＧは溶解するのが困難であり、処方産物の収量が非常に減る。前記ＰＥＧは分岐状でもよいし、直鎖状でもよいが、ある種の実施形態では直鎖状であり得る。一般に、前記ＰＥＧの分子量の増大は、前記ＡＤＩの免疫原性を減少させる。本実施形態において記載される分子量を有するＰＥＧをＡＤＩおよび場合により生体適合性連結基とあわせて使用して、例えば、急性骨髄性白血病、例えば再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、精巣癌、胃癌および食道癌を含む癌を処置し得る。
【００５２】
本発明の別の実施形態において、前記ＰＥＧは、約１，０００〜約５０，０００；ある種の実施形態では約３，０００〜約３０，０００；その他の実施形態では約３，０００〜約２０，０００；一実施形態では約４，０００〜約１２，０００；さらにその他の実施形態では約４，０００〜約１０，０００；さらなる実施形態では約４，０００〜約８，０００；さらにさらなる実施形態では約４，０００〜約６，０００；および別の実施形態では約５，０００の総重量平均分子量を有する。前記ＰＥＧは分岐状でもよいし、直鎖状でもよいが、ある種の実施形態では直鎖状であり得る。本実施形態において記載される分子量を有するＰＥＧをＡＤＩおよび場合により生体適合性連結基とあわせて使用して、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または癌を処置し得る。
【００５３】
ＡＤＩ−ＰＥＧは本明細書において記載される例示的な修飾ＡＤＩであるが、当業者によって認識されているように、所望の効果、特に免疫原性を減少させ、血清半減期を増大させるために、ＡＤＩは、その他のポリマーまたは適切な分子で修飾され得る。
【００５４】
ＡＤＩは、連結基を含むかまたは含まないＰＥＧなどの変性剤に共有結合され得るが、好ましい実施形態では連結基を用いる。
【００５５】
ＡＤＩを変性剤、例えばＰＥＧに共有結合させるのに使用される連結基は、任意の生体適合性連結基であり得る。上で論じたように、「生体適合性」は、前記化合物または基が非毒性であり、傷害、病気、疾患または死を引き起こさずにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで用いられ得ることを示す。ＰＥＧなどの変性剤は、例えば、エーテル結合、エステル結合、チオール結合またはアミド結合を介して前記連結基に結合され得る。適切な生体適合性連結基としては、例えば、エステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、スクシンイミド基（例えば、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む）、エポキシド基、オキシカルボニルイミダゾール基（例えば、カルボニルジイミダゾール（ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｍｉｄａｚｏｌｅ）（ＣＤＩ）を含む）、ニトロフェニル基（例えば、ニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）またはトリクロロフェニルカルボネート（ＴＰＣ）を含む）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または第一級アミンが挙げられる。一実施形態において、前記生体適合性連結基は、エステル基および／またはスクシンイミド基である。別の実施形態において、前記連結基は、ＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡまたはＮＨＳである；ある種の実施形態ではＳＳ、ＳＰＡまたはＮＨＳがより好ましく、その他の実施形態ではＳＳまたはＳＰＡが最も好ましい。
【００５６】
あるいは、ＡＤＩは、アミノ基、スルフヒドラル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介して変性剤、例えばＰＥＧに直接的に（すなわち、連結基無しで）カップリングされ得る。
【００５７】
ＡＤＩは、例えば、Ｐａｒｋら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１：３７３−３７６（１９８１）；およびＺａｐｌｉｐｓｋｙ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２１（１９９２）（これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、当技術分野において公知の方法を使用して、生体適合性連結基を介してＰＥＧに共有結合され得る。
【００５８】
ＰＥＧのＡＤＩへの付着は、ＡＤＩの循環半減期を増大させる。一般に、ＰＥＧは、ＡＤＩの第一級アミンに付着される。ＰＥＧまたはその他の変性剤のＡＤＩ上への付着部位の選択は、当業者に公知のように、タンパク質の活性ドメイン内の各部位の役割によって決定される。ＰＥＧは、酵素活性の実質的な喪失を伴わずにＡＤＩの第一級アミンに付着され得る。例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓからクローニングされたＡＤＩは、この手法によって修飾され得る約１７個のリシンを有する。換言すれば、１７個のリシンはすべて、ＡＤＩが生体適合性連結基、例えばＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡおよび／またはＮＨＳを介してＰＥＧに付着され得る可能性のある点である。当業者であれば本開示を考慮して明らかなように、ＰＥＧは、ＡＤＩ上のその他の部位にも付着され得る。
【００５９】
１個〜約３０個のＰＥＧ分子が、ＡＤＩに共有結合され得る。ある種の実施形態において、ＡＤＩは、１個のＰＥＧ分子で修飾される。その他の実施形態において、ＡＤＩは、１個よりも多くのＰＥＧ分子で修飾される。一実施形態において、ＡＤＩは、約７個〜約１５個のＰＥＧ分子、一実施形態では約９個〜約１２個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、前記ＡＤＩは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個のＰＥＧ分子で修飾される。具体的な一実施形態において、ＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、ＡＤＩは、５±１．５個のＰＥＧ分子で修飾される。
【００６０】
別の実施形態において、ＡＤＩの第一級アミノ基の約３０％〜約７０％がＰＥＧで修飾され、一実施形態において、アルギニンデイミナーゼの第一級アミノ基の約４０％〜約６０％、またはある種の実施形態では約４５％〜約５５％、およびその他の実施形態では約５０％がＰＥＧで修飾される。ＰＥＧがＡＤＩの末端部に共有結合される場合、１個のＰＥＧ分子のみを用いることが望ましいかもしれない。ＡＤＩ上のＰＥＧ単位数の増大は、酵素の循環半減期を増大させる。しかしながら、ＡＤＩ上のＰＥＧ単位数の増大は、酵素の比活性を減少させる。したがって、当業者であれば本開示を考慮して明らかなように、２つの間でバランスを取ることが必要である。
【００６１】
本発明において、生体適合性連結基の共通の特徴は、それらがマレイミド基を介してアルギニンデイミナーゼの第一級アミンに付着することである。ＡＤＩとカップリングすると、ＳＳ−ＰＥＧは前記ＰＥＧの隣にエステル結合を有し、これにより、この部位は、体内でＡＤＩからＰＥＧを放出させ得る血清エステラーゼに対して感受性になり得る。ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＰＥＧ２−ＮＨＳはエステル結合を有しないので、それらは血清エステラーゼに対して感受性ではない。
【００６２】
本発明において、特定の連結基は、ＡＤＩ−ＰＥＧの循環半減期またはその酵素比活性に影響を与えるとは思われない。しかしながら、ある種の実施形態において、生体適合性連結基が本発明に使用される。前記タンパク質に付着されているＰＥＧは、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＳＣ−ＰＥＧのように直鎖状のものでもよいし、ＰＥＧ２−ＮＨＳのように分岐状のＰＥＧ鎖を使用してもよい。
【００６３】
ある種の実施形態において、本開示のＡＤＩは、米国特許第６，６３５，４６２号明細書に記載されているように修飾され得る。特に、特にＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するＡＤＩの天然に存在するアミノ酸残基の１個以上を修飾することにより、より容易に復元および処方される酵素を提供し、それにより、ＡＤＩおよびそれを含む治療組成物を製造するための既存の技術を改善できる。一実施形態において、本開示のＡＤＩは、１個以上のリシン残基を除去するように修飾される（例えば、前記リシンは、別のアミノ酸で置換され得る）。特に、一実施形態において、前記ＡＤＩは、配列番号１の１１２位、３７４位、４０５位または４０８位のリシンを含まないように修飾される。
【００６４】
ある種の実施形態において、ＡＤＩに関連するペグ化部位であって、前記酵素の触媒領域に位置するか、または前記酵素の触媒領域に隣接するペグ化部位が修飾される。本発明の目的のために、「ペグ化部位」という語句は、ポリエチレングリコールで共有結合的に修飾され得るＡＤＩの任意の部位または位置と定義され得る。「ペグ化部位」は、前記酵素の触媒領域に位置するか、または前記酵素の触媒領域に隣接し、前記部位のペグ化は、前記酵素の触媒活性の有意な減少をもたらすと考えられ得る。このような部位のペグ化は、前記酵素の不活性化を従来もたらしている。例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するＡＤＩは１１２位にリシンを有するが、これは、前記酵素の触媒領域にあるか、または前記酵素の触媒領域に隣接すると考えられ得る。１１２位のこのリシンにＰＥＧを付着させることにより、前記酵素を不活性化できる。加えて、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するＡＤＩは、３９７位にシステインを有するが、これは、前記酵素の触媒領域にあるか、または前記酵素の触媒領域に隣接すると考えられ得る。３９７位のシステインをアミノ酸置換することにより、前記酵素を不活性化できる。特に、３９７位のシステインをアラニン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、リシンまたはチロシンに置換することにより、すべての検出可能な酵素活性の喪失をもたらすことができる。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するＡＤＩはまた、この保存されたシステインの近くに位置する３個のリシン、特にＬｙｓ３７４、Ｌｙｓ４０５およびＬｙｓ４０８を有する。Ｌｙｓ３７４、Ｌｙｓ４０５、Ｌｙｓ４０８またはそれらの組み合わせにＰＥＧを付着させることにより、前記酵素を不活性化できる。
【００６５】
その他の生物に由来するＡＤＩもまた、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するＡＤＩの１１２位に対応するペグ化部位を有し得ると理解されるべきである。例えば、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓに由来するＡＤＩは１０４位にリシンを有し、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するＡＤＩは１０６位にリシンを有し、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓに由来するＡＤＩは１１４位にリシンを有する。加えて、いくつかの生物に由来するＡＤＩは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するＡＤＩの１１２位と同じ一般位置に対応するリシンを有し得る。このような生物に由来するＡＤＩにおけるリシンの位置は当業者に公知であり、米国特許第６，６３５，４６２号明細書に記載されている。
【００６６】
したがって、一実施形態において、本発明は、ＡＤＩのポリペプチド鎖におけるある種のアミノ酸置換を提供する。これらのアミノ酸置換は、変性剤による修飾によって（例えば、ペグ化によって）活性の低下を免れる修飾ＡＤＩを提供する。酵素の触媒領域にあるか、または酵素の触媒領域に隣接するペグ化部位またはその他の公知の修飾部位を排除することによって、活性の喪失を伴わずに最適な修飾、例えばペグ化が達成され得る。
【００６７】
本発明のその他の実施形態は、組換え技術により製造した場合に、アルギニンデイミナーゼのある種の構造特徴がアルギニンデイミナーゼの適切かつ迅速な復元を防止または阻止し得るという理解に基づくものであると理解されるべきである。特に、これらの構造特徴は、組換え製造時に前記酵素が活性コンフォメーションをとるのを妨害または防止する。本発明の目的のために、「活性コンフォメーション」という語句は、非修飾または修飾アルギニンデイミナーゼによる酵素活性を可能にする三次元構造と定義され得る。活性コンフォメーションは、特に、アルギニンのシトルリンへの変換を触媒するのに必要であり得る。「構造特徴」という語句は、特定のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせから生じるポリペプチド鎖の任意の形質、性質または特性と定義され得る。例えば、アルギニンデイミナーゼは、曲がりまたはねじれを正常なペプチド鎖にもたらすことにより、前記酵素の復元時に前記酵素が活性コンフォメーションをとるのを妨害するアミノ酸を含有し得る。特に、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するアルギニンデイミナーゼは２１０位にプロリンを有するが、これが、曲がりまたはねじれをペプチド鎖にもたらし、組換え製造時に前記酵素を復元するのをより困難にし得る。その他の生物に由来するアルギニンデイミナーゼもまた、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するアルギニンデイミナーゼの２１０位に対応する部位を有し得ると理解されるべきである。
【００６８】
したがって、本発明は再度、アルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖におけるある種のアミノ酸置換を提供する。このようなアミノ酸置換は、アルギニンデイミナーゼのペプチド鎖における問題の構造特徴を排除できる。このようなアミノ酸置換は、修飾アルギニンデイミナーゼの復元の改善を提供する。これらのアミノ酸置換は、減少した量の緩衝液を使用して修飾アルギニンデイミナーゼを迅速に復元するのを可能にする。これらのアミノ酸置換はまた、復元された修飾アルギニンデイミナーゼの収量の増大を提供し得る。本発明の一実施形態において、修飾アルギニンデイミナーゼは、Ｐ２１０に１個のアミノ酸置換を有する。前述のように、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓに由来するアルギニンデイミナーゼは、２１０位に位置するアミノ酸プロリンを有する。本発明を限定するものではないが、２１０位のアミノ酸プロリンの存在は、アルギニンデイミナーゼの復元（すなわち、再折り畳み）の困難性を高める曲がりまたはねじれを正常なポリペプチド鎖にもたらすと現在は考えられている。２１０位のプロリンの置換は、減少した量の緩衝液を使用して修飾アルギニンデイミナーゼを迅速に復元するのを可能にする。また、２１０位のプロリンの置換は、復元された修飾アルギニンデイミナーゼの収量の増大を提供し得る。好ましい実施形態において、２１０位のプロリンは、セリンで置換される。本発明の本態様にしたがって、２１０位におけるその他の置換が行われ得ると理解されるべきである。その他の置換の例としては、Ｐｒｏ２１０からＴｈｒ２１０、Ｐｒｏ２１０からＡｒｇ２１０、Ｐｒｏ２１０からＡｓｎ２１０、Ｐｒｏ２１０からＧｌｎ２１０またはＰｒｏ２１０からＭｅｔ２１０が挙げられる。野生型アルギニンデイミナーゼの２１０位のアミノ酸に関連するこれら構造特徴を排除することによって、前記酵素の適切な再折り畳みが達成され得る。
【００６９】
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途またはｉｎ  ｖｉｖｏ用途のいずれかを含み得る。細胞培養用途を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途の場合、本明細書において記載される化合物を培養物中の細胞に加えて、次いでインキュベートできる。本発明の化合物はまた、当技術分野において周知の抗体製造技術を使用してモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を製造するのを容易にするのに使用され得る。次いで、当業者であれば明らかなように、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を多種多様な診断用途に使用できる。
【００７０】
本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ投与手段は、目的の用途に応じて変化する。本明細書において記載されるＡＤＩ組成物を純粋な形態で、または適切な医薬組成物で投与することは、類似の効用を果たすために任意の許容されている薬剤投与様式により行われ得る。前記医薬組成物は、ＡＤＩ、例えばＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を適切な生理学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせることによって調製され得、固体、半固体、液体または気体の形態の調製物、例えば錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、溶液、座薬、注射液、吸入剤、ゲル、ミクロスフィアおよび、エアロゾルに処方され得る。加えて、その他の医薬有効成分（本明細書のその他の場所において記載されるその他の抗癌剤を含む）および／または適切な賦形剤、例えば塩、緩衝液および安定剤が組成物内に存在してもよいが、存在する必要はない。投与は、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、皮内、皮下または局所を含む様々な異なる経路によって達成され得る。投与様式は、処置または予防すべき状態の性質に依存する。したがって、ＡＤＩ−ＰＥＧ、例えばＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、経口投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、非経口投与、静脈内投与、リンパ管内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、間質内投与、動脈内投与、皮下投与、眼内投与、滑液包内投与、経上皮投与および経皮投与され得る。投与後に癌の進行および／または転移を低減、阻害、予防または遅延させる量が有効であると考えられる。ある種の実施形態において、本明細書のＡＤＩ組成物は、患者の平均生存期間を統計的に有意な量だけ増大させる。一実施形態において、本明細書において記載されるＡＤＩ処置は、患者の平均生存期間を４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、４０週間またはそれ以上増大させる。ある種の実施形態において、ＡＤＩ処置は、患者の平均生存期間を１年間、２年間、３年間またはそれ以上増大させる。一実施形態において、本明細書において記載されるＡＤＩ処置は、無増悪生存期間を２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間またはそれ以上増大させる。ある種の実施形態において、本明細書において記載されるＡＤＩ処置は、無増悪生存期間を１年間、２年間、３年間またはそれ以上増大させる。
【００７１】
ある種の実施形態において、前記投与量は、生存腫瘍量の統計的に有意な減少（例えば、腫瘍質量の少なくとも５０％の減少）によって示した場合に、またはスキャン寸法を変更（例えば、統計的有意性のある減少）した場合に腫瘍退縮をもたらすのに十分である。ある種の実施形態において、前記投与量は、安定病態をもたらすのに十分である。その他の実施形態において、前記投与量は、熟練の臨床医に公知の特定の疾患徴候の症状の臨床的に関連する低減をもたらすのに十分である。
【００７２】
ある種の実施形態において、前記投与量は、ＮＯ合成を阻害し、血管新生を阻害するのに十分であり、およびもしくは腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導するのに十分であり、またはそれらの任意の組み合わせである。ＮＯ合成、血管新生およびアポトーシスは当技術分野において公知の方法を使用して測定され得るが、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｔｈｅｒｅｔｏ）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；およびその他の類似参考文献を参照のこと。特定の一実施形態において、前記投与量は、ＮＯ合成を阻害し、黒色腫の成長を阻害し、本明細書において記載されるその他の化学療法薬、例えばシスプラチンと相乗作用する。したがって、本開示の一実施形態は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０をシスプラチンと一緒に投与することによって黒色腫を処置する方法であって、前記処置が内因性一酸化窒素（ＮＯ）を枯渇させる方法を提供する。
【００７３】
正確な投薬量および処置期間は処置されている疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して、または当技術分野において公知のモデル系で組成物を試験し、それから外挿することによって経験的に決定され得る。対照臨床試験も実施され得る。投薬量はまた、緩和するべき状態の重症度により変化し得る。医薬組成物は、一般に、望ましくない副作用を最小限に抑えながら治療上有用な効果を発揮するように処方および投与される。前記組成物は１回で投与してもよいし、時間間隔で投与するべき多数のより少ない用量に分けてもよい。任意の特定の被験体については、特異的な投薬レジメンを個体のニーズに応じて時間をかけて調整してもよい。
【００７４】
前記ＡＤＩ組成物は、単独で、またはその他の公知の癌処置、例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法などと組み合わせて投与され得る。前記組成物はまた、抗生物質と組み合わせて投与され得る。
【００７５】
したがって、これらのおよび関連する医薬組成物の典型的な投与経路としては、限定されないが、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、口腔、直腸、経膣および鼻腔内が挙げられる。本明細書において使用される非経口は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、胸骨内注射または注入技術を含む。本発明のある種の実施形態の医薬組成物は、そこに含まれる有効成分が、前記組成物を患者に投与する際に生物学的に利用可能になるように処方される。被験体または患者に投与される組成物は１つ以上の投薬単位形態をとり得、例えば、錠剤は単回の投薬単位であり得、エアロゾル形態の本明細書において記載されるＡＤＩ組成物の容器は複数回の投薬単位を保持し得る。このような投薬形態を調製する実際の方法は公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００）を参照のこと。本明細書の教示にしたがって目的の疾患または状態を処置するために、投与するべき組成物は、いずれの場合も、治療有効量の本開示のＡＤＩ−ＰＥＧ、例えばＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含有する。
【００７６】
医薬組成物は固体の形態でもよいし、液体の形態でもよい。一実施形態において、前記担体は、前記組成物が例えば錠剤または粉剤の形態となるような粒子状のものである。例えば、前記組成物が経口用オイル、注射液、または例えば吸入投与に有用なエアロゾルである場合、前記担体は液体であり得る。経口投与を意図する場合、前記医薬組成物は、一般に、固体または液体のいずれかの形態であり、半固体、半液体、懸濁液およびゲルの形態は、本明細書において固体または液体として考えられる形態の中に含まれる。
【００７７】
経口投与用の固体組成物として、前記医薬組成物は、粉剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム、オブラートなどに処方され得る。このような固形組成物は、典型的には、１つ以上の不活性希釈剤または食用担体を含有する。加えて、以下のものの１つ以上が存在し得る：結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、ラクトースまたはデキストリン、崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、コーンスターチなど；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテックス（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料；および着色剤。前記医薬組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、それは、上記種類の材料に加えてポリエチレングリコールまたはオイルなどの液体担体を含有し得る。
【００７８】
前記医薬組成物は、液体の形態、例えばエリキシル剤、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁液であり得る。２つの例として、前記液体は経口投与用でもよいし、注射送達用でもよい。経口投与を意図する場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて甘味剤、防腐剤、色素／着色剤および風味相乗剤の１つ以上を含有する。注射によって投与することを意図する組成物では、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、縣濁剤、緩衝液、安定剤および等張剤の１つ以上を含めてもよい。
【００７９】
前記液体医薬組成物は、それらが溶液、懸濁液またはその他の類似形態であろうと、以下のアジュバントの１つ以上を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、ある種の実施形態では生理食塩水、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム、不揮発性油、例えば溶媒または懸濁媒体として働き得る合成のモノグリセリドまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；および、張度調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。前記非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数回用量バイアルに封入され得る。生理食塩水は、好ましいアジュバントである。注射可能な医薬組成物は、好ましくは、滅菌したものである。
【００８０】
非経口投与用または経口投与用のいずれかの液体医薬組成物は、適切な投薬量が得られるように、一定量の本明細書において開示されるＡＤＩ、例えばＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含有するべきである。典型的には、この量は、前記組成物中のＡＤＩの少なくとも０．０１％である。経口投与を意図する場合、この量は、前記組成物の重量の０．１％〜約７０％の間で変化し得る。ある種の経口医薬組成物は、約４％〜約７５％の間のＡＤＩ−ＰＥＧを含有する。ある種の実施形態において、本発明の医薬組成物および調製物は、非経口投薬単位が希釈前に０．０１重量％〜１０重量％の間のＡＤＩ−ＰＥＧを含有するように調製される。
【００８１】
前記医薬組成物は局所投与を意図するものでもよく、この場合、前記担体は、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲル基剤を適切に含み得る。前記基剤は、例えば、以下のものの１つ以上を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤、例えば水およびアルコール、ならびに乳化剤および安定剤。増粘剤は、局所投与用医薬組成物中に存在し得る。経皮投与を意図する場合、前記組成物は、経皮パッチまたはイオン導入デバイスを含み得る。前記医薬組成物は、例えば、直腸内で融解して薬物を放出する座薬の形態での直腸投与が意図され得る。前記直腸投与用組成物は、適切な非刺激性の賦形剤として油性基剤を含み得る。このような基剤としては、限定されないが、ラノリン、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８２】
前記医薬組成物は、固体投薬単位または液体投薬単位の物理的形態を改変する種々の材料を含み得る。例えば、前記組成物は、有効成分の周辺にコーティングシェルを形成する材料を含み得る。コーティングシェルを形成する材料は典型的には不活性であり、例えば、糖、セラックおよびその他の腸溶性コーティング剤から選択され得る。あるいは、前記有効成分は、ゼラチンカプセルに入れてもよい。固体形態または液体形態の前記医薬組成物は、ＡＤＩ−ＰＥＧに結合し、それにより前記化合物の送達を助ける薬剤を含み得る。このような能力で作用し得る適切な薬剤としては、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、１つ以上のタンパク質またはリポソームが挙げられる。前記医薬組成物は、本質的には、エアロゾルとして投与され得る投薬単位からなり得る。エアロゾルという用語は、コロイド的性質の系から加圧パッケージからなる系に及ぶ様々な系を示すのに使用される。送達は液化ガスまたは加圧ガスによるものでもよいし、前記有効成分を分配する適切なポンプシステムによるものでもよい。前記有効成分を送達するために、エアロゾルは、単相系、二相系または三相系で送達され得る。エアロゾルの送達は、必要な容器、アクチベーター、バルブ、補助容器などを含み、これらは一緒にキットを形成し得る。当業者であれば、過度な実験を伴わずに好ましいエアロゾルを決定し得る。
【００８３】
前記医薬組成物は、医薬分野で周知の方法によって調製され得る。例えば、注射によって投与することを意図する医薬組成物は、本明細書において記載されるＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物および場合により塩、緩衝液および／または安定剤の１つ以上を滅菌蒸留水と組み合わせて溶液を形成させることによって調製され得る。界面活性剤を添加して、均一な溶液または懸濁液の形成を容易にし得る。界面活性剤は、前記ＡＤＩ−ＰＥＧ組成物と非共有結合的に相互作用して、水性送達系における前記ＡＤＩ−ＰＥＧの溶解または均一な懸濁を容易にする化合物である。
【００８４】
前記組成物は治療有効量で投与され得るが、これは、用いる特定の化合物（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ）の活性；化合物の代謝安定性および作用期間；患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事；投与様式および投与時間；排出速度；薬物の組み合わせ；特定の障害または状態の重症度；ならびに治療を受けている被験体を含む様々な要因に応じて変化し得る。
【００８５】
本発明の化合物のうちの１つの治療有効量は、腫瘍成長を阻害するのに有効な量である。一般に、処置は少ない投薬量で開始し、その状況下で最適な効果が達成されるまで、これを少しの増分ずつ増大させることができる。一般に、本発明の化合物の治療投薬量は、約１〜約２００ｍｇ／ｋｇで１週間に２回〜２週間毎に約１回であり得る。例えば、前記投薬量は、２ｍｌの静脈内注射として約１ｍｇ／ｋｇで１週間に１回〜約２０ｍｇ／ｋｇで３日毎に１回であり得る。さらなる実施形態において、前記用量は、約５０ＩＵ／ｍ２〜約７００ＩＵ／ｍ２で、３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与され得る。ある種の実施形態において、前記用量は、約５０ＩＵ／ｍ２、６０ＩＵ／ｍ２、７０ＩＵ／ｍ２、８０ＩＵ／ｍ２、９０ＩＵ／ｍ２、１００ＩＵ／ｍ２、１１０ＩＵ／ｍ２、１２０ＩＵ／ｍ２、１３０ＩＵ／ｍ２、１４０ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、１６０ＩＵ／ｍ２、１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、３６０ＩＵ／ｍ２、３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６２０ＩＵ／ｍ２、６３０ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、６６０ＩＵ／ｍ２、６７０ＩＵ／ｍ２、６８０ＩＵ／ｍ２、６９０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２で、３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与され得る。被験体が抗ＡＤＩ免疫反応を確立（ｍｏｕｎｔ）し得るある種の実施形態において、前記用量は、所望により熟練の臨床医によって修正され得る。
【００８６】
ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００の最適な投薬量は１週間に約２回であり得るが、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の最適な投薬量は１週間に約１回〜２週間毎に約１回であり得る。ある種の実施形態において、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の最適な投薬量は、１週間に約２回であり得る。
【００８７】
ＡＤＩ−ＰＥＧは、注射前に、リン酸緩衝食塩水、または当業者に公知の任意のその他の適切な溶液と混合され得る。一実施形態において、ＡＤＩ−ＰＥＧを含む液体組成物は、約１０〜約１２ｍｇのＡＤＩ、約２０〜約４０ｍｇのポリエチレングリコール、１．２７ｍｇ＋５％のリン酸一ナトリウム、ＵＳＰ；約３ｍｇ＋５％のリン酸二ナトリウム、ＵＳＰ；７．６ｍｇ＋５％の塩化ナトリウム、ＵＳＰを、ｐＨ約６．６〜約７で適切な量の注射用水（例えば、約１ｍｌまたは約２ｍｌ）中に含む。一実施形態において、ＡＤＩ−ＰＥＧを含む液体組成物はヒスチジン−ＨＣｌを含み、ある種の実施形態において、前記組成物緩衝液は、約０．００３５Ｍヒスチジン−ＨＣｌ〜約０．３５Ｍヒスチジン−ＨＣｌである。特定の一実施形態において、前記組成物は、０．０３５Ｍヒスチジン−ＨＣｌをｐＨ６．８で０．１３Ｍ塩化ナトリウムと一緒に含む緩衝液中で処方される。別の実施形態において、前記組成物は、０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液をｐＨ６．８で０．１３Ｍ塩化ナトリウムと一緒に含む緩衝液中で処方される。
【００８８】
一実施形態において、ＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物は、約５〜約９、約６〜約８、または約６．５〜約７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＡＤＩを含む組成物は、約６．８±１．０のｐＨを有する。
【００８９】
一実施形態において、ＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離ＰＥＧは１〜１０％の間であり、さらなる実施形態では全ＰＥＧの７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満である。ある種の実施形態において、ＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物中の天然ＡＤＩは、約１％未満、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％未満である。一般に、ＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物は、約４％以下、３％、２％、１．５％、１％または０．５％の全不純物を有する。
【００９０】
一実施形態において、ＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離スルフヒドリルは、約９０％よりも多い。いくつかの実施形態において、ＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離スルフヒドリルは、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％または約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上である。
【００９１】
一実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約０．５μＭ〜約１５μＭ、さらなる実施形態では約１μＭ〜約１２μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約１．５μＭ〜約９μＭ、約１．５μＭ〜約８μＭまたは約１．５μＭ〜約７μＭのＫｍを有する。ある種の実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約１．５μＭ〜約６．５μＭのＫｍを有する。いくつかの実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、または約７μＭのＫｍを有する。
【００９２】
一実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約０．５ｓｅｃ−１〜約１５ｓｅｃ−１、さらなる実施形態では約１ｓｅｃ−１〜約１２ｓｅｃ−１、約１ｓｅｃ−１〜約１０ｓｅｃ−１、約１．５ｓｅｃ−１〜約９ｓｅｃ−１、約２ｓｅｃ−１〜約８ｓｅｃ−１または約２．５ｓｅｃ−１〜約７ｓｅｃ−１のＫｃａｔを有する。ある種の実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約２．５ｓｅｃ−１〜約７．５ｓｅｃ−１のＫｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約２．５ｓｅｃ−１、約３ｓｅｃ−１、約３．５ｓｅｃ−１、約４ｓｅｃ−１、約４．５ｓｅｃ−１、約５ｓｅｃ−１、約５．５ｓｅｃ−１、約６ｓｅｃ−１、約６．５ｓｅｃ−１、約７ｓｅｃ−１、約７．５ｓｅｃ−１または約８ｓｅｃ−１のＫｃａｔを有する。
【００９３】
一実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、さらなる実施形態では約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍまたは約１０ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍの伝導率（当技術分野において比コンダクタンスとも称される）を有する。いくつかの実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約９ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍ、約１２ｍＳ／ｃｍまたは約１３ｍＳ／ｃｍ、約１４ｍＳ／ｃｍまたは約１５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。ある種の実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約１３ｍＳ／ｃｍ±１．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。
【００９４】
一実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する。ある種の実施形態において、組成物中のＡＤＩまたはＡＤＩ−ＰＥＧは、約３００±３０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する。
【００９５】
本開示のＡＤＩ−ＰＥＧを含む組成物はまた、１つ以上のその他の治療剤の投与の前またはその後に同時投与され得る。このような併用療法は、本発明の化合物と１つ以上のさらなる活性剤とを含有する単一医薬投薬処方物を投与すること、および本発明のＡＤＩ−ＰＥＧ（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）と各活性剤とを独自の別個の医薬投薬処方物中に含む組成物を投与することを含み得る。例えば、本明細書において記載されるＡＤＩ−ＰＥＧおよび前記その他の活性剤は、錠剤またはカプセル剤などの単一経口投薬組成物で一緒に患者に投与され得るか、または各薬剤は別個の経口投薬処方物で投与され得る。同様に、本明細書において記載されるＡＤＩ−ＰＥＧおよび前記その他の活性剤は、食塩水またはその他の生理学的に許容され得る溶液などの単一非経口投薬組成物で一緒に患者に投与され得るか、または各薬剤は別個の非経口投薬処方物で投与され得る。別個の投薬処方物が使用される場合、ＡＤＩ−ＰＥＧおよび１つ以上のさらなる活性剤を含む組成物は、本質的には同時に（すなわち、共時的に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ））、または時間をずらして別個に（すなわち、逐次的に）任意の順序で投与され得る；併用療法は、すべてのこれらのレジメンを含むと理解される。
【００９６】
したがって、ある種の実施形態において、本開示のＡＤＩ組成物を１つ以上のその他の治療剤と組み合わせて投与することも企図される。このような治療剤は、当技術分野において、本明細書において記載される特定の疾患状態、例えば特定の癌またはＧＶＨＤについての標準的処置として認められているものであり得る。企図される例示的な治療剤としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法薬、放射線療法薬、オートファジー阻害剤、またはその他の活性補助剤が挙げられる。
【００９７】
ある種の実施形態において、本明細書において開示されるＡＤＩ組成物は、任意の数の化学療法剤とあわせて投与され得る。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホナート、例えばブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチルアメルアミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロロメラミン；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えばメトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充物、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトザントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）．，Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトザントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸誘導体、例えばＴａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（フェアストン）；ならびに抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどもこの定義に含まれる；さらなる化学療法剤としては、ソラフェニブおよびその他のタンパク質キナーゼ阻害剤、例えばアファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルクソリチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブおよびスニチニブ；シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムスおよびその他のｍＴＯＲ阻害剤が挙げられる。上記のいずれかの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体もまた、本明細書における使用について企図される。
【００９８】
ある種の実施形態において、本明細書において開示されるＡＤＩ組成物は、任意の数のオートファジー阻害剤とあわせて投与され得る。いくつかの好ましい実施形態において、前記オートファジー阻害剤は、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（商標））、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、２Ａ型または１型のタンパク質ホスファターゼを阻害するオートファジー抑制藻類毒素、ｃＡＭＰ類似体およびｃＡＭＰレベルを高める薬物、アデノシン、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ウォルトマンニンならびにビンブラスチンからなる群より選択される。加えて、オートファジーに不可欠なタンパク質、例えばＡＴＧ５などの発現を阻害するアンチセンスまたはｓｉＲＮＡもまた使用され得る。
【００９９】
一実施形態において、ＡＤＩ−ＰＥＧと１つ以上の治療剤との組み合わせは、相加的または相乗的に作用する。この点に関して、本明細書において記載される相乗的に作用する薬剤としては、本明細書において提供されるＡＤＩ−ＰＥＧと相乗的に作用できる治療剤（例えば、本明細書において記載される癌、ＧＶＨＤまたは炎症性腸疾患の処置に使用される化学療法剤、オートファジー阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、または任意のその他の治療剤）が挙げられ、このような相乗効果は、前記化学療法剤が存在するが前記ＡＤＩ−ＰＥＧ組成物は非存在である場合、および／または前記ＡＤＩ−ＰＥＧが存在するが前記化学療法剤は非存在である場合に検出され得る効果よりも大きい（すなわち、適切な対照条件と比較して統計的に有意な）規模の検出可能な効果として現れる。相乗効果を測定するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｊａｎｕａｒｙ  １５，２０１０  ７０；４４０を参照のこと）。
【０１００】
本明細書において記載されるＡＤＩを含む組成物および場合によりその他の治療剤は、癌を処置するための治療方法、および癌の転移を予防するための方法に使用され得る。したがって、本発明は、様々な異なる癌を処置するか、その症状を改善するか、または様々な異なる癌の進行を阻害するか、または様々な異なる癌を予防するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、ＧＶＨＤを処置するか、その症状を改善するか、またはＧＶＨＤの進行を阻害するための方法を提供する。特に、本開示は、患者における癌もしくはＧＶＨＤを処置するか、その症状を改善するか、または患者における癌もしくはＧＶＨＤの進行を阻害するための方法であって、治療有効量の本明細書において記載されるＡＤＩ組成物を前記患者に投与することを含み、それにより、前記癌もしくはＧＶＨＤを処置するか、その症状を改善するか、または前記癌もしくはＧＶＨＤの進行を阻害する方法を提供する。したがって、本明細書において記載されるＡＤＩ組成物は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病；潰瘍性大腸炎）、ＧＶＨＤまたは癌、例えば限定されないが、白血病（例えば、急性骨髄性白血病および再発性急性骨髄性白血病）、黒色腫、肉腫（限定されないが、転移性肉腫、子宮平滑筋肉腫を含む）、膵臓癌、前立腺癌（例えば限定されないが、ホルモン抵抗性前立腺癌）、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（限定されないが、胃腺癌を含む）、神経膠腫、多形性膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌（限定されないが、腎細胞癌腫を含む）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌（限定されないが、頭頸部の扁平上皮細胞癌腫；舌の癌を含む）、子宮頸部癌、精巣癌、胆嚢、胆管癌腫および胃癌に罹患した個体に投与され得る。
【０１０１】
一実施形態において、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０を投与することによって、骨髄性白血病（例えば限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））を処置するか、その症状を改善するか、または骨髄性白血病の進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、ＡＭＬなどの前記骨髄性白血病は、ＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している。別の実施形態において、前記骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬ）は、転座ｔ（１５；１７）を含まない。さらなる実施形態において、本開示は、ＡＭＬを処置する方法であって、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与することを含む方法を提供する。ある種の実施形態において、ＡＭＬを処置するために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約３６０ＩＵ／ｍ２の間であり、その他の実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２、約１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、約３６０ＩＵ／ｍ２、約３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２である。ＡＤＩ−ＰＥＧによるＡＭＬの処置がＡＤＩに対する免疫反応を誘導するある種の実施形態において、本開示は、ＡＭＬを処置する方法であって、ＡＤＩの用量が２倍であり、１週間あたり６４０ＩＵ／ｍ２以上に増大され得る方法を提供する。特定の一実施形態において、ＡＭＬを処置するためのＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり３．５個〜６．５個、または一実施形態では４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、本開示は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を投与することによってＡＭＬを処置する方法であって、前記組成物が、５±１．５個のＰＥＧ分子、一実施形態では５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、前記組成物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧで修飾されていない）および／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、前記組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
【０１０２】
一実施形態において、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０を投与することによって、肉腫（限定されないが、転移性肉腫を含む）を処置するか、その症状を改善するか、または肉腫の進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、前記肉腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している。さらなる実施形態において、本開示は、肉腫を処置する方法であって、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与することを含む方法を提供する。ある種の実施形態において、ＡＭＬを処置するために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約３６０ＩＵ／ｍ２の間であり、その他の実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２、約１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、約３６０ＩＵ／ｍ２、約３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２である。ＡＤＩ−ＰＥＧによる肉腫の処置がＡＤＩに対する免疫反応を誘導するある種の実施形態において、本開示は、肉腫を処置する方法であって、ＡＤＩの用量が２倍であり、１週間あたり６４０ＩＵ／ｍ２以上に増大され得る方法を提供する。特定の一実施形態において、ＡＭＬを処置するためのＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり３．５個〜６．５個、または一実施形態では４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、本開示は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を投与することによって肉腫（転移性肉腫を含む）を処置する方法であって、前記組成物が、５±１．５個のＰＥＧ分子、一実施形態では５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、前記組成物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧで修飾されていない）および／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、前記組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
【０１０３】
一実施形態において、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０をオートファジー阻害剤、例えば限定されないが、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ウォルトマンニンおよびビンブラスチンと組み合わせて投与することによって、膵臓癌を処置するか、その症状を改善するか、または膵臓癌の進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、前記膵臓癌は、ＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している。さらなる実施形態において、本開示は、膵臓癌を処置する方法であって、治療有効量のオートファジー阻害剤、例えばクロロキンと組み合わせて、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与することを含む方法を提供する。この点に関して、クロロキンの治療有効量は、初回用量約６００ｍｇ基準、続いて追加の３００ｍｇ基準、そして連続する２日間の各日に単回用量３００ｍｇ基準であり得る。これは、３日間で総用量２．５ｇのリン酸クロロキンまたは１．５ｇ基準を表す。さらなる実施形態において、前記用量は、約３００ｍｇ基準であり得る。クロロキンまたはその他のオートファジー阻害剤の用量は、必要に応じて熟練の臨床医によって当技術分野において公知の投薬量を使用して修正され得る。当業者であれば理解しているように、前記オートファジー阻害剤は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、同時に、または後に投与され得る。ある種の実施形態において、膵臓癌を処置するために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約３６０ＩＵ／ｍ２の間であり、その他の実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２、約１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、約３６０ＩＵ／ｍ２、約３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２である。クロロキンと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧによる膵臓癌の処置がＡＤＩに対する免疫反応を誘導するある種の実施形態において、本開示は、膵臓癌を処置する方法であって、ＡＤＩの用量が２倍であり、１週間あたり６４０ＩＵ／ｍ２以上に増大され得る方法を提供する。特定の一実施形態において、膵臓癌を処置するためのＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり３．５個〜６．５個、または一実施形態では４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、本開示は、クロロキンまたはその他の適切なオートファジー阻害剤を、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物と組み合わせて投与することによって膵臓癌を処置する方法であって、前記組成物が、５±１．５個のＰＥＧ分子、一実施形態では５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、前記組成物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧで修飾されていない）および／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、前記組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
【０１０４】
一実施形態において、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０をオートファジー阻害剤と組み合わせて投与することによって、小細胞肺癌を処置するか、その症状を改善するか、または小細胞肺癌の進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、前記小細胞肺癌は、ＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している。さらなる実施形態において、本開示は、小細胞肺癌を処置する方法であって、治療有効量のオートファジー阻害剤、例えばクロロキンと組み合わせて、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与することを含む方法を提供する。この点に関して、クロロキンの治療有効量は、初回用量約６００ｍｇ基準、続いて追加の３００ｍｇ基準、そして連続する２日間の各日に単回用量３００ｍｇ基準であり得る。これは、３日間で総用量２．５ｇのリン酸クロロキンまたは１．５ｇ基準を表す。さらなる実施形態において、前記用量は、約３００ｍｇ基準であり得る。クロロキンの用量は、必要に応じて熟練の臨床医によって当技術分野において公知の投薬量を使用して修正され得る。当業者であれば理解しているように、前記オートファジー阻害剤は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、同時に、または後に投与され得る。ある種の実施形態において、小細胞肺癌を処置するために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約３６０ＩＵ／ｍ２の間であり、その他の実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２、約１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、約３６０ＩＵ／ｍ２、約３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２である。クロロキンと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧによる小細胞肺癌の処置がＡＤＩに対する免疫反応を誘導するある種の実施形態において、本開示は、小細胞肺癌を処置する方法であって、ＡＤＩの用量が２倍であり、１週間あたり６４０ＩＵ／ｍ２以上に増大され得る方法を提供する。特定の一実施形態において、小細胞肺癌を処置するためのＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり３．５個〜６．５個、または一実施形態では４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、本開示は、クロロキンを、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物と組み合わせて投与することによって小細胞肺癌を処置する方法であって、前記組成物が、５±１．５個のＰＥＧ分子、一実施形態では５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、前記組成物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧで修飾されていない）および／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む方法を提��する。さらなる実施形態において、前記組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
【０１０５】
一実施形態において、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０をオートファジー阻害剤と組み合わせて投与することによって、肉腫（限定されないが、転移性肉腫を含む）を処置するか、その症状を改善するか、または肉腫の進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、前記肉腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している。さらなる実施形態において、本開示は、肉腫を処置する方法であって、治療有効量のオートファジー阻害剤、例えばクロロキンと組み合わせて、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与することを含む方法を提供する。この点に関して、クロロキンの治療有効量は、初回用量約６００ｍｇ基準、続いて追加の３００ｍｇ基準、そして連続する２日間の各日に単回用量３００ｍｇ基準であり得る。これは、３日間で総用量２．５ｇのリン酸クロロキンまたは１．５ｇ基準を表す。さらなる実施形態において、前記用量は、約３００ｍｇ基準であり得る。クロロキンの用量は、必要に応じて熟練の臨床医によって当技術分野において公知の投薬量を使用して修正され得る。当業者であれば理解しているように、前記オートファジー阻害剤は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、同時に、または後に投与され得る。ある種の実施形態において、肉腫を処置するために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約３６０ＩＵ／ｍ２の間であり、その他の実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２、約１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、約３６０ＩＵ／ｍ２、約３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２である。クロロキンと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧによる肉腫の処置がＡＤＩに対する免疫反応を誘導するある種の実施形態において、本開示は、肉腫を処置する方法であって、ＡＤＩの用量が２倍であり、１週間あたり６４０ＩＵ／ｍ２以上に増大され得る方法を提供する。特定の一実施形態において、肉腫を処置するためのＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり３．５個〜６．５個、または一実施形態では４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、本開示は、クロロキンを、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物と組み合わせて投与することによって肉腫を処置する方法であって、前記組成物が、５±１．５個のＰＥＧ分子、一実施形態では５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、前記組成物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧで修飾されていない）および／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む方法を提供する。さらなる実��形態において、前記組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
【０１０６】
一実施形態において、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０をドセタキセルと組み合わせて投与することによって、黒色腫を処置するか、その症状を改善するか、または黒色腫の進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、前記黒色腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している。さらなる実施形態において、本開示は、黒色腫を処置する方法であって、治療有効量のドセタキセルと組み合わせて、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与することを含む方法を提供する。この点に関して、ドセタキセルの治療有効量は、約３週間毎に３０分間〜１時間の間にわたって静脈内投与される７５ｍｇ／ｍ２または１００ｍｇ／ｍ２を含み得る。熟練の臨床医であれば理解しているように、ドセタキセルの用量は、疾患徴候および／または以前の処置に応じて修正され得、ドセタキセルは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、同時に、または後に投与され得る。ある種の実施形態において、黒色腫を処置するために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約３６０ＩＵ／ｍ２の間であり、その他の実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２、約１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、約３６０ＩＵ／ｍ２、約３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２である。ドセタキセルと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧによる黒色腫の処置がＡＤＩに対する免疫反応を誘導するある種の実施形態において、本開示は、黒色腫を処置する方法であって、ＡＤＩの用量が２倍であり、１週間あたり６４０ＩＵ／ｍ２以上に増大され得る方法を提供する。特定の一実施形態において、黒色腫を処置するためのＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり３．５個〜６．５個、または一実施形態では４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、本開示は、ドセタキセルを、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物と組み合わせて投与することによって黒色腫を処置する方法であって、前記組成物が、５±１．５個のＰＥＧ分子、一実施形態では５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、前記組成物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧで修飾されていない）および／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、前記組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
【０１０７】
一実施形態において、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０をシスプラチンと組み合わせて投与することによって、黒色腫を処置するか、その症状を改善するか、または黒色腫の進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、前記黒色腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している。さらなる実施形態において、本開示は、黒色腫を処置する方法であって、治療有効量のシスプラチンと組み合わせて、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与することを含む方法を提供する。この点に関して、シスプラチンの治療有効量は、５０〜１００ｍｇ／ｍ２で１サイクルあたり（３〜４週間毎に）１回投与すること、または１サイクルあたり合計１００ｍｇ／ｍ２で５日間毎日投与することのいずれかを含み得る。熟練の臨床医であれば理解しているように、シスプラチンの用量は、疾患徴候、個々の患者および／または以前の処置に応じて修正され得、シスプラチンは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、同時に、または後に投与され得る。ある種の実施形態において、黒色腫を処置するために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約３６０ＩＵ／ｍ２の間であり、その他の実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２、約１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、約３６０ＩＵ／ｍ２、約３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２である。シスプラチンと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧによる黒色腫の処置がＡＤＩに対する免疫反応を誘導するある種の実施形態において、本開示は、黒色腫を処置する方法であって、ＡＤＩの用量が２倍であり、１週間あたり６４０ＩＵ／ｍ２以上に増大され得る方法を提供する。特定の一実施形態において、黒色腫を処置するためのＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり３．５個〜６．５個、または一実施形態では４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、本開示は、シスプラチンを、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物と組み合わせて投与することによって黒色腫を処置する方法であって、前記組成物が、５±１．５個のＰＥＧ分子、一実施形態では５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、前記組成物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧで修飾されていない）および／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、前記組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
【０１０８】
一実施形態において、本開示は、治療有効量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０をｍＴＯＲ阻害剤、例えば限定されないが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムスおよびリダフォロリムスと組み合わせて投与することによって、腎細胞癌腫を処置するか、その症状を改善するか、または腎細胞癌腫の進行を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、前記腎細胞癌腫は、ＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している。さらなる実施形態において、本開示は、腎細胞癌腫を処置する方法であって、治療有効量のｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンと組み合わせて、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与することを含む方法を提供する。ラパマイシンまたはその他のｍＴＯＲ阻害剤の用量は、必要に応じて熟練の臨床医によって当技術分野において公知の投薬量を使用して決定され得る。当業者であれば理解しているように、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物の前に、同時に、または後に投与され得る。ある種の実施形態において、腎細胞癌腫を処置するために投与されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、約１６０ＩＵ／ｍ２〜約３６０ＩＵ／ｍ２の間であり、その他の実施形態では約１６０ＩＵ／ｍ２、約１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、約３６０ＩＵ／ｍ２、約３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２または約７００ＩＵ／ｍ２である。クロロキンと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧによる腎細胞癌腫の処置がＡＤＩに対する免疫反応を誘導するある種の実施形態において、本開示は、腎細胞癌腫を処置する方法であって、ＡＤＩの用量が２倍であり、１週間あたり６４０ＩＵ／ｍ２以上に増大され得る方法を提供する。特定の一実施形態において、腎細胞癌腫を処置するためのＡＤＩは、ＡＤＩ１個あたり３．５個〜６．５個、または一実施形態では４．５個〜５．５個のＰＥＧ分子で修飾される。別の実施形態において、本開示は、ラパマイシンまたはその他の適切なｍＴＯＲ阻害剤を、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物と組み合わせて投与することによって腎細胞癌腫を処置する方法であって、前記組成物が、５±１．５個のＰＥＧ分子、一実施形態では５±１．５個の直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＡＤＩを含み、ある種の実施形態では、前記組成物が、約０．５％未満の天然ＡＤＩ（すなわち、ＰＥＧで修飾されていない）および／または約５％未満の遊離ＰＥＧを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、前記組成物は、ヒスチジン−ＨＣＬ緩衝液を含む。
【０１０９】
ある種の実施形態において、本開示は、患者における癌を処置するか、その症状を改善するか、または患者における癌の進行を阻害する方法であって、本明細書において記載されるＡＤＩを含む組成物を前記患者に投与することを含み、前記癌が、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞癌または肉腫ではない方法を提供する。
【０１１０】
本開示はまた、患者における炎症性障害を処置するか、その症状を改善するか、または患者における炎症性障害の進行を阻害する方法であって、本明細書において記載されるＡＤＩ（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、特にＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物を単独で、または１つ以上のその他の治療剤と組み合わせて前記患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、本開示はまた、患者における炎症性腸疾患を処置するか、その症状を改善するか、または患者における炎症性腸疾患の進行を阻害する方法であって、本明細書において記載されるＡＤＩ（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、特にＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物を単独で、または１つ以上のその他の治療剤と組み合わせて前記患者に投与することを含む方法を提供する。この点に関して、本開示は、患者におけるクローン病もしくは潰瘍性大腸炎を処置するか、その症状を改善するか、または患者におけるクローン病もしくは潰瘍性大腸炎の進行を阻害する方法であって、本明細書において記載されるＡＤＩ（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、特にＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物を単独で、または１つ以上のその他の治療剤と組み合わせて前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１１１】
別の実施形態において、本開示は、患者における癌を処置するか、その症状を改善するか、または患者における癌の進行を阻害する方法であって、本明細書において記載されるＡＤＩを含む組成物および場合により１つ以上のその他の治療剤を前記患者に投与することを含み、前記癌はＡＳＳ、ＡＳＬまたはその両方が欠損している方法を提供する。この点に関して、ＡＳＳまたはＡＳＬの欠損は、ｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現によって測定した場合の発現減少でもよいし、タンパク質活性の減少でもよく、一般には、当業者が決定した場合に発現または活性が統計的に有意に減少することを含む。ＡＳＳもしくはＡＳＬの発現または活性の減少は、発現または活性が、癌を含まないことが公知の適切な対照試料における発現または活性と比較して約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％またはそれ以上減少することであり得る。ある種の実施形態において、ＡＳＳもしくはＡＳＬの発現または活性は、非癌対照試料における発現または活性と比較して多くとも１／２だけ減少する。
【０１１２】
ある種の実施形態において、ＡＳＳもしくはＡＳＬの発現または活性の減少は、ＡＳＳまたはＡＳＬプロモーターのメチル化に起因する。別の実施形態において、ＡＳＳもしくはＡＳＬの発現または活性の減少は、ＤＮＡの変異（例えば、１つ以上の点変異、小さな欠失、挿入など）または遺伝子の欠失から生じる染色体異常に起因する。一実施形態において、前記癌はＡＳＳまたはＡＳＬ陰性であり、これは、発現または活性が観察されないことを意味する。
【０１１３】
ＡＳＳもしくはＡＳＬの発現または活性の減少は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば限定されないが、定量ＰＣＲ、免疫組織化学、酵素活性アッセイ（例えば、シトルリンのアルギニノコハク酸塩への変換、またはアルギニノコハク酸塩のアルギニンおよびフマル酸塩への変換を測定するためのアッセイ；例えば、図１を参照のこと）などを使用して測定され得る。
【０１１４】
したがって、本発明は、患者における癌を処置するか、その症状を改善するか、または患者における癌の進行を阻害するための方法であって、本明細書において記載されるＡＤＩを含む組成物を前記患者に投与することを含み、前記癌が、ＡＳＳもしくはＡＳＬまたはその両方の発現または活性の減少を示す方法を提供し、ここで、前記癌としては、限定されないが、白血病（例えば、急性骨髄性白血病および再発性急性骨髄性白血病）、黒色腫、肉腫（限定されないが、転移性肉腫、子宮平滑筋肉腫を含む）、膵臓癌、前立腺癌（例えば限定されないが、ホルモン抵抗性前立腺癌）、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（限定されないが、胃腺癌を含む）、神経膠腫、多形性膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌（限定されないが、腎細胞癌腫を含む）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌（限定されないが、頭頸部の扁平上皮細胞癌腫；舌の癌を含む）、子宮頸部癌、精巣癌、胆嚢、胆管癌腫および胃癌が挙げられる。
【０１１５】
前記文献における種々の研究には、以下の腫瘍でＡＳＳが欠損していることが示されている：
【０１１６】
【表１】
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したがって、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を単独で、またはその他の処置と組み合わせて用いてこれらのＡＳＳ欠損癌を処置することが、本明細書において具体的に企図される。
【０１１７】
本発明はさらに、患者における癌を処置するか、その症状を改善するか、または患者における癌の進行を阻害するための方法であって、本明細書において記載されるＡＤＩ（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、特にＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を含む組成物をオートファジー阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、本発明は、患者における癌を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書において記載されるＡＤＩを含む組成物をオートファジー阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記癌が、膵臓癌または小細胞肺癌である方法を提供する。
【０１１８】
ある種の実施形態において、本発明は、処置方法であって、本明細書において記載されるＡＤＩを含む組成物の投与が、血漿中のアルギニンを少なくとも１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間またはそれよりも長く枯渇させる方法を提供する。
【実施例】
【０１１９】
実施例１
アルギニンデイミナーゼは、アルギニノコハク酸合成酵素欠損急性骨髄性白血病細胞の生存率を減少させる
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は成人では最も一般的な白血病であり、子供では２番目に一般的な白血病であり、医療費の大きな割合を占めており、１万件の症例が米国だけで毎年診断されている。アスパラギナーゼ型における酵素系療法は急性リンパ芽球性白血病の処置に革命をもたらし、ＡＭＬにおける類似の扱い易い代謝欠陥を利用することに関心が高まっている。アルギニン産生の律速酵素であるアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）の欠損が原因でアルギニン栄養要求性の腫瘍は、アルギニン分解酵素に対して感受性がある。
【０１２０】
本実施例では、ＡＭＬ細胞株および原発性ＡＭＬ試料を使用して、ＡＳＳ陰性は、ペグ化アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）の有効性を予測するか否かを決定した。７個の白血病細胞株のうちの３個（Ｋ５６２、ＫａｓｕｍｉおよびＫＧ−１）において、ならびに細胞遺伝学的に正常または異常な核型（ｋａｒｏｔｙｐｅ）のＡＭＬを有する患者に由来する９個の試料すべてにおいて、ＡＳＳタンパク質の欠如が同定された。ＡＳＳプロモーターのメチル化は、ＡＳＳ  ｍＲＮＡレベルの減少およびＡＳＳ発現の欠如と相関していた。ＡＭＬを有する患者からの骨髄トレフィンにより、免疫組織化学試料の８７％（４６／５３）においてＡＳＳタンパク質の欠如が明らかになったが、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＡＤＩ−ＰＥＧ２０に対する反応のバイオマーカーとして、ＡＳＳ発現を使用し得ることを示している。転座ｔ（１５；１７）を有する急性前骨髄球性白血病において、ＡＳＳ  ｍＲＮＡレベルの増大および検出可能なＡＳＳタンパク質発現が見られた。
【０１２１】
重要なことに、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０はＡＳＳ陰性ＡＭＬ株の生存率を減少させたのに対して、ＡＳＳ陽性対照株であるＦｕｊｉｏｋａおよびＵ９３７は薬物誘導性のアルギニン枯渇に対して耐性であった。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで良好に生着した原発性ＡＳＳ陰性ＡＭＬ試料を特定し、この原発性ＡＭＬ異種移植モデルを使用して、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の有効性研究を開始した。本明細書において記載した結果、およびヒトではアルギニン枯渇の毒性が低いという潜在的有効性に基づいて、再発性ＡＭＬを有する患者において、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の第ＩＩ相試験を計画した。
【０１２２】
実施例２
オートファジーの阻害は、アルギニノコハク酸合成酵素欠損膵臓腺癌細胞のアルギニンデイミナーゼ誘導細胞死を増大させる
オートファジーの役割、および細胞死に対するその寄与については議論がある。オートファジーはアルギニン枯渇の場面で保護的であり、ヒドロキシクロロキン（ＣｈＱ）によるオートファジーの阻害は細胞死を増大させると仮定した。
【０１２３】
ペグ化アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＰＥＧ）を単独で、またはＣｈＱの存在下で用いて、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡ−ＰａＣａ２をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで処理した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）−ＦＡＣＳによって細胞死を測定してサブＧ１期ＤＮＡ含量を決定し、アネキシンＶ−ＰＩフローサイトメトリーによってアポトーシスを評価した。カスパーゼ３の切断は、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによって評価した。オートファジーは、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによってＬＣ３およびヌクレオポリンｐ６２（ｐ６２）の発現レベルを評価することによって測定した。
【０１２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、皮下異種移植片を無胸腺マウス中に作成し、続いて、ＰＢＳ、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＣｈＱ、またはＡＤＩ−ＰＥＧおよびＣｈＱの組み合わせを腹腔内注射することによって行った。屠殺時に、腫瘍を分析用に取り出した。カスパーゼ３およびｐ６２のウエスタンブロットによって、腫瘍溶解物を分析した。活性型カスパーゼ３の免疫組織化学染色アッセイおよびＤＮＡ断片化（ＴＵＮＥＬ）も実施した。
【０１２５】
ＡＤＩがアポトーシスおよびオートファジーをカスパーゼ依存的に誘導するか否かを決定するために、ＡＤＩ−ＰＥＧ、またはＡＤＩ−ＰＥＧおよびＺＶＡＤ−ｆｍｋ（汎カスパーゼ阻害剤）のいずれかの組み合わせと一緒に、細胞をインキュベートした。図２Ａに示されるように、ＡＤＩ−ＰＥＧと一緒にインキュベートすることにより、サブＧ０／Ｇ１期細胞の数が増大したが、この効果は、汎カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤ−ｆｍｋを共インキュベートすると可逆的であった。膵臓癌細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＤＩ−ＰＥＧ（０．３μｇ／ｍＬ）と一緒に７２時間インキュベートすることにより、アネキシンＶの脱分極（別のアポトーシス指標）が誘導された（図２Ｂ）。７２時間の時点で、ＡＤＩは、カスパーゼの切断およびＬＣ３ＢのＰＥとのコンジュゲーションを用量依存的に誘導することがさらに実証された。これらの結果により、ＡＤＩは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてカスパーゼ依存性アポトーシスおよびオートファジーを誘導することが示された。
【０１２６】
オートファジーの阻害がＡＤＩ誘導アポトーシスを促進するか否かを決定するために、ＣｈＱ（５μＭ）の有無の下でＡＤＩ−ＰＥＧ（０．３μｇ／ｍＬ）と一緒に、細胞を７２時間培養した。ウエスタンブロット分析により、カスパーゼ３切断で測定されるＡＤＩによるアポトーシスの誘導が明らかになった（図３）。オートファジーフラックスを調べるために、ウエスタンブロット分析によってｐ６２、ＬＣ３Ｂ−ＩおよびＬＣ３Ｂ−ＩＩのレベルを測定した。ｐ６２レベルの増大、ならびにＬＣ３Ｂ−ＩおよびＬＣ３Ｂ−ＩＩの両方の蓄積の増大によって示されるように、ＣｈＱの追加により、オートファジーフラックスが減少した（図３）。これらの結果は、ＣｈＱが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＡＤＩ誘導アポトーシスを促進し、オートファジーフラックスを阻害したことを実証している。
【０１２７】
ＣｈＱが、ＡＤＩと組み合わせて使用した場合にアポトーシス細胞死または非アポトーシス細胞死の量を変化させるか否かを調べるために、ＡＤＩ−ＰＥＧのみ、またはＡＤＩ−ＰＥＧおよびＣｈＱの組み合わせと一緒に、細胞をインキュベートした。ＣｈＱを細胞培養物に追加することにより、サブＧ０／Ｇ１期細胞のパーセンテージの増大がもたらされた（図４Ｂ）。対照的に、ＡＤＩ−ＰＥＧおよびＡＤＩ−ＰＥＧ＋ＣｈＱとともにインキュベートした培養物は、アネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージが類似していた（図４Ａ）。したがって、これらの結果は、ＣｈＱが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて非アポトーシス細胞死を促進することを示している。
【０１２８】
ＡＤＩ依存性腫瘍成長抑制に対するＣｈＱの効果を評価するために、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２の皮下異種移植片を無胸腺マウスに定着させた。次いで、マウスをＰＢＳ、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＣｈＱ、またはＡＤＩ−ＰＥＧ＋ＣｈＱで最大７週間処置した。腫瘍容積は、毎週２回測定した。図５に示されるように、ＡＤＩ−ＰＥＧ＋ＣｈＱで処置したマウスは、ＡＤＩ−ＰＥＧ単独で処置したマウスと比較して有意に小さい腫瘍容積を有していた。安楽死させて腫瘍を１０％ホルマリン中で保存し、活性型カスパーゼ３、ｐ６２の増大およびＤＮＡ切断などのアポトーシスのマーカーについて染色した（図６）。これらの結果は、ＡＤＩ−ＰＥＧおよびＣｈＱの組み合わせが腫瘍成長に対して相乗的な抑制を示したことを実証している。
【０１２９】
要約すると、アルギニン枯渇は、ＡＳＳ欠損細胞株においてオートファジーおよび細胞死を誘導した。オートファジーは、膵臓腺癌細胞のアルギニン枯渇において保護的な役割を果たしており、ヒドロキシクロロキンによるオートファジーの不活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍抑制の増強をもたらしたことが示された。
【０１３０】
実施例３
アルギニンデイミナーゼは、アルギニノコハク酸合成酵素欠損小細胞肺癌の腫瘍成長を阻害する
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は化学療法に対する強い初期反応を特徴とするが、患者の大多数は再発することになる（Ｄｏｗｅｌｌ，Ａｍ  Ｊ  ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ３３９（１）：６８−７６，２０１０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｌｉｌｅｎｂａｕｍ，Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  １２（５）：３２７−３３４，２０１０）。第一選択の化学療法が失敗する患者では、二次処置に対する反応の機会は依然として約１０％であり、これらの患者における全生存期間はわずか３〜４カ月間である。さらに、現在の処置には腫瘍特異性がないので多くの毒性が生じ、その結果として、治療薬の投与が最大有効用量未満に限定され得る（Ｄｅｍｅｄｔｓら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  ３５（１）：２０２−２１５，２０１０；Ｄｏｗｅｌｌ，Ａｍ  Ｊ  ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ３３９（１）：６８−７６，２０１０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｌｉｌｅｎｂａｕｍ，Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  １２（５）：３２７−３３４，２０１０）。この状況は、高い治療指数を有する有効な抗癌剤を継続開発することの必要性を強調している。
【０１３１】
本実施例では、ＳＣＬＣにおけるアルギニン栄養要求性の程度、およびこの疾患におけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０アルギニン治療の効力を説明する。
【０１３２】
細胞株、抗体および化学物質
１０個のＳＣＬＣのパネルは、Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｒａｎｃｈ  ａｔ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）の細胞バンクから入手した。細胞はＭＳＫＣＣで樹立したか、またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。細胞は、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清、５％ｗ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン（ペニシリンＧ５０００単位ｍｌ−１／硫酸ストレプトマイシン５０００ｍｇｍｌ−１）および１％Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で成長させた。ウエスタンブロットによるアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）の細胞発現は、抗ＡＳＳ抗体（Ｃｌｏｎｅ２５，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して評価した。ＬＣ３Ｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）、活性型カスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、総カスパーゼ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびアクチン（ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、製造業者の説明書にしたがって使用した。塩酸トポテカンはＡｘｘｏｒａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手し、クロロキンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。
【０１３３】
免疫組織化学
腫瘍および正常組織は、Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈら（Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２３（Ｓｕｐｐｌ  １）：３８７Ａ，２０１０）に詳述されているように、抗ＡＳＳ抗体１９５−２１−１（ＬＩＣＲ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して染色した。
【０１３４】
ウエスタンブロット分析
ＳＣＬＣ細胞株の全細胞溶解物は、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、０．０５％ＳＤＳ、０．５％Ｎａ−デオキシコール酸塩、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ＋プロテアーゼ阻害剤の混合緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）中で調製した。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用してタンパク質量を決定し、４〜１２％ゲル（ＮｕＰＡＧＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって等量のタンパク質を分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に転写し、５％ＢＳＡでブロッキングし、適切な抗体を用いて４℃で一晩プローブした。洗浄した後、次いで前記膜を適切な二次抗体でプローブしてから、最後に、ＥＣＬ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してタンパク質を可視化した。
【０１３５】
定量リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡ抽出について、細胞ペレットを６００μｌのＴＲＩ試薬溶液（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）中に溶解させ、次いで６０μｌのブロモクロロパンを添加した。次いで、約２滴の最適切削温度化合物（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ，ＵＳＡ）をチューブに添加し、この混合物をボルテックスし、室温（ＲＴ）で２分間静置した。１４，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した後、上清を新たなチューブに回収し、そこに等容積の１００％イソプロパノールを添加して、ＲＮＡを沈殿させた。１４，０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離した後、ＲＮＡペレットを７５％エタノール中で洗浄し、再度遠心分離してから、５０μｌの温水中に再懸濁した。ＲＮＡ濃度は、ナノフォトメーター（Ｉｍｐｌｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して決定した。
【０１３６】
ｃＤＮＡの増幅について、１．５μｇのＲＮＡを、１０×反応緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、５ｍＭ  ｄＮＴＰａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）、オリゴＤＴ（Ｑｉａｇｅｎ）、逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＲＮＡｓｅ  Ｏｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むｃＤＮＡ反応混合液（全容量２０μｌ）に添加した。定量リアルタイム（ｑＲＴ）−ＰＣＲ反応について、１．５μｌのｃＤＮＡを、５μｌのＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．０２μｌのＲｏｘ、０．２μｌのプライマーおよび水を含有する反応混合液（全反応容量１０μｌ）と混合した。ＡＳＳについて、プライマーは、Ｆ：５’−ＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＧ−３’（配列番号３）およびＲ：５’−ＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号４）であった。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施し、発現の正規化にはＧＡＰＤＨを使用した。遺伝子発現の相対定量（標的ＲＮＡの相対量）は、方程式２（−ΔΔＣＴ）を使用して決定した。
【０１３７】
増殖アッセイ
接着細胞に対するＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗増殖効果を評価するために、細胞を２×１０３個／ウェルの密度で組織培養９６マイクロウェルプレートに播き（ｐｌａｔｅ）、一晩接着させた。翌日、細胞を０〜１０ｍＩＵｍｌ−１の範囲のＡＤＩ−ＰＥＧ２０（ＤｅｓｉｇｎｅＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｖａｃａｖｉｌｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ，Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｇｒｏｕｐの子会社，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理した。１２０時間インキュベートした後、製造業者のプロトコールにしたがって（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（ＭＴＳ，ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して、細胞生存率を決定した。２０マイクロリットルのＭＴＳ試薬を適切な対照およびアッセイウェルに添加してから、プレートを３７℃で２時間インキュベートし、吸光度を４９０ｎｍで読んだ。バックグラウンドのＭＴＳ吸光度を引くことによって各処理の絶対吸光度を決定し、平均および標準偏差を計算した。細胞増殖に対するオートファジー阻害剤クロロキン（Ｓｉｇｍａ）の効果は、ＭＴＳアッセイを使用して評価した。
【０１３８】
非接着細胞におけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の活性を評価するために、細胞を１×１０５個／ウェルの密度で組織培養２４ウェルプレートに播いた。次いで、０〜１０ｍＩＵｍｌ−１の範囲の最終濃度でＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含有する追加の培地を添加した。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０と一緒に１２０時間インキュベートした後の増殖の変化を測定するために、細胞を回収し、洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。次いで、全細胞数の尺度としてＢＳＡタンパク質アッセイを使用して、各処理の全タンパク質を決定した。すべての処理は、少なくとも三連で実施した。
【０１３９】
サブＧ１期染色用のヨウ化プロピジウム染色
アポトーシスは、Ｒｉｃｃａｒｄｉら（Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １（３）：１４５８−１４６１，２００６）によって詳述されているように、ヨウ化プロピジウム染色細胞のＦＡＣＳによって測定した。細胞を２４ウェルプレートに播きＡＤＩ−ＰＥＧ２０で１２０時間処理した。次いで、細胞を回収し、洗浄し、７０％エタノール中で固定した。次いで、１０μｇｍｌ−１のＤＮＡｓｅ無しのＲＮＡｓｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する２０μｇｍｌ−１のヨウ化プロピジウムを使用して、ＤＮＡを染色した。次いで、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を読んで、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
【０１４０】
ＡＳＳの低分子干渉ＲＮＡによる下方制御
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０による処理に対する反応における細胞のＡＳＳ発現の重要性をさらに評価するために、ＡＳＳ特異的ｓｉＲＮＡを使用して、ＡＳＳ発現をサイレンシングした。ＡＳＳコード領域に対する低分子干渉ＲＮＡ構築物は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）から入手した。その他の転写産物にマッチしないｓｉＲＮＡ構築物のみをさらなる実験用に選択した。
【０１４１】
アルギニノコハク酸合成酵素陽性ＳＷ１２２２を、細胞６×１０５個／ディッシュの密度で、８ｍｌの培地が入った１００ｍｍ組織培養ディッシュに播き、一晩接着させた。トランスフェクションについて、１０μｌの１０μＭ  ＡＳＳ  ｓｉＲＮＡを９９０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に添加し、２０μｌのリポフェクタミン２０００試薬を９８０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で希釈した。これらの混合物を室温（ＲＴ）で５分間インキュベートしてから混合し、室温（ＲＴ）でさらに２０分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を前記細胞に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。この時、前記トランスフェクトした細胞の調製物を培養ディッシュから取り出し、前記トランスフェクトした細胞の成長に対するＡＤＩ−ＰＥＧ２０の効果を評価するために、９６ウェルプレートに播いた。ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析用に加工する前に、追加の細胞をさらに７２時間インキュベートした。
【０１４２】
アルギニンデイミナーゼ−ＰＥＧ２０のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究
ＡＳＳ陰性ＳＣＬＣ  ＳＫ−ＬＣ−１３は腫瘍原性であることが分かったので、続いてこれを使用して、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を決定した。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の活性は、ＡＳＳ陽性ＮＣＩ−Ｈ６９  ＳＣＬＣ異種移植片を持つマウスにおいても評価した。小細胞肺癌異種移植片は、雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（３〜４週齢、体重約２０ｇ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に定着させた。腫瘍を定着させるために、培地中の細胞１０×１０６個をＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：１で混合し、マウスの腹部に皮下注射した。腫瘍成長を定期的に測定し、式（ＴＶ＝（長さ×幅２）／２）を使用して腫瘍容積を計算した。すべての動物研究は、ＭＳＫＣＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。マウスは、腫瘍が約１，０００ｍｍ３の容積に達した際に安楽死させた。
【０１４３】
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗腫瘍効果は、中程度のまたは大きなＳＫ−ＬＣ−１３  ＳＣＬＣ異種移植片のいずれかを持つマウスにおいて同時に評価した。最初の研究では、腫瘍が１２５ｍｍ３の平均サイズに達したら、処置を開始した。大きな異種移植片の研究では、腫瘍が５００ｍｍ３の平均サイズに達したら、処置を開始した。アルギニンデイミナーゼ−ＰＥＧ２０は、動物１匹あたり１、２および５ＩＵの用量で２０日間にわたって５日毎に１回投与した（５回の投薬）。持続投薬の効果を評価するために、すべての用量レベルのさらなる群（ｎ＝５）に、腫瘍が１，０００ｍｍ３のサイズ制限に進行するまでＡＤＩ−ＰＥＧ２０を５日毎に継続投与した。加えて、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の有効性を、ＡＳＳ陽性ＮＣＩ−Ｈ６９異種移植片を持つマウスにおいて評価した。ここでは、腫瘍が１５０ｍｍ３の平均サイズに達したら、マウスに、２ＩＵのＡＤＩ−ＰＥＧ２０を２０日間にわたって５回投薬した。アルギニンデイミナーゼ−ＰＥＧ２０は、すべての研究において腹腔内注射によって投与した。これらの研究に使用したＡＤＩ−ＰＥＧ２０の比活性は、９ＩＵｍｇ−１のタンパク質である。したがって、マウス２０ｇあたり１ＩＵのＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、１６０ＩＵｍ−２と同等である。
【０１４４】
血清アルギニンおよびシトルリンの測定
全身アルギニンレベルに対するＡＤＩ−ＰＥＧ２０処置の効果を決定するために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、マウスの血清を分析した。Ｌ−アルギニンおよびＬ−シトルリンは、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＰＣＸ  ５２００ポストカラム誘導体化機器（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）（反応温度３９℃）および蛍光検出器を用いて分離した。緩衝液およびカラムなどの試薬はすべて、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの推奨通りに使用した。全ＡＤＩ−ＰＥＧ２０レベルは、先に記載されているように（Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８０（１−３）：２５９−２７１，２００２）、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１４５】
統計的分析
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０処置の有効性は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、対照群の終了時に対応のない両側ｔ検定を使用して、対照群および処置群の平均を比較することによって評価した。９５％の信頼レベルを使用し、Ｐ＜０．０５の場合に腫瘍容積に有意差があると判定した。
【０１４６】
結果
ＳＣＬＣではＡＳＳ発現が欠如していることが多い
一般に、ＡＳＳ発現の欠如はＡＤＩに対する感受性に関連するので、ヒトＳＣＬＣ腫瘍においてその発現を評価した。図７Ｃに示されるように、ヒトＳＣＬＣ腫瘍の初期免疫組織化学（ＩＨＣ）分析により、一部のＳＣＬＣではＡＳＳ発現がほぼ完全に欠如していたことが明らかになった。この初期分析における約４５％（１６個のうちの７個）の腫瘍では、ＡＳＳ発現がほとんどないかまたは全くないことが実証された。反対に、皮膚などの正常組織（図７Ａ）および結腸癌腫などのその他の癌（図７Ｂ；Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈら、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２３（Ｓｕｐｐｌ  １）：３８７Ａ，２０１０）では、確固としたＡＳＳ発現が見られた。
【０１４７】
初期免疫組織化学分析により、ＳＣＬＣヒト腫瘍における高頻度のＡＳＳ発現消失が示されたので、ＳＣＬＣ細胞株パネルにおけるＡＳＳの発現状態を評価した。ウエスタンブロット分析により、試験したＳＣＬＣ細胞株１０個のうちの５個（５０％）では、タンパク質レベルで有意なＡＳＳ発現が欠如していたことが明らかになった（図７Ｄ）。ウエスタン免疫ブロッティングによって検出した細胞のＡＳＳ発現は、Ｃｌｏｎｅ２５および１９５−２１−１の両抗ＡＳＳ抗体を使用しても同程度であった（データは示さない）。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用してｍＲＮＡレベルを分析することにより、ＡＳＳのｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルの間の一般的な相関関係が実証された（図７Ｅ）。
【０１４８】
アルギニンデイミナーゼ−ＰＥＧ２０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＡＳＳ陰性ＳＣＬＣ細胞株の増殖を阻害する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖に対するＡＤＩ−ＰＥＧ２０の効果は、ＡＳＳ陽性ＳＣＬＣ細胞、および酵素の発現が欠如している細胞の両方で評価した。接着および非接着成長組織の両方の培養特徴を有する細胞をこれらの実験に含めた。増殖の明らかな用量依存的減少が、接着ＡＳＳ陰性ＳＣＬＣ細胞株ＳＫ−ＬＣ−１３およびＳＷ１２７１で見られた。接着ＡＳＳ陽性結腸癌腫細胞株ＳＷ１２２２の成長に対しては、効果が見られなかった（図８Ａ）。非接着細胞については、ＡＳＳ陽性細胞はＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗増殖効果に対するほぼ完全な耐性を示したのに対して、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０処理後のＡＳＳ欠損細胞では、増殖の相対的な減少が再度観察された（図８Ｂ）。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０感受性細胞株ＳＫ−ＬＣ−１３は腫瘍原性であると決定したので、それを、この後のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験用のモデル細胞株に選択した。
【０１４９】
アルギニンデイミナーゼ−ＰＥＧ２０は、オートファジーおよびカスパーゼ非依存性アポトーシスを誘導する
より一般的な栄養飢餓のように、ＡＤＩによる細胞内アルギニンの枯渇は、代謝ストレスおよびそれに続いて細胞のオートファジーを誘導することが観察されている（Ｋｉｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９（２）：７００−７０８，２００９；Ｓａｖａｒａｊら、Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０（４）：４０５−４１２，２０１０）。オートファジー関連タンパク質ＬＣ３−ＩＩの形成についてのアッセイにより、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０による処理がＳＣＬＣにおいて細胞のオートファジーを誘導できるか否かを評価した。ＳＫ−ＬＣ−１３においてＬＣ３−ＩＩ発現の基底発現がいくらか観察されたが、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０による処理は、タンパク質の検出可能な細胞レベルの明らかな増大をもたらした（図９Ｅ）。クロロキンは公知のオートファジー阻害剤であり、正常なリソソーム機能を破壊することによりＬＣ３−ＩＩの細胞レベルの増大をもたらす。続いて、陽性対照としてクロロキンで処理した細胞は、非常に確固としたＬＣ３−ＩＩ発現を示した。細胞をＡＤＩ−ＰＥＧ２０およびクロロキンで併用処理することにより、個別の処理と比較してわずかであるが有意な（Ｐ＝０．００８）生存率の減少がもたらされたが、これは、オートファジーの阻害がＡＤＩ−ＰＥＧ２０の有効性を高め得ることを示唆している（図１４）。
【０１５０】
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗増殖効果の可能性のある機序を決定するために、サブＧ１期ＤＮＡ含量によるアポトーシスのＦＡＣＳ分析を実施した。前記分析を実施する前に、細胞を７２時間処理した。未処理の細胞では検出可能なアポトーシスはほとんどなかったが、陽性対照として使用した２５ｎＭトポテカンは、ＳＫ−ＬＣ−１３細胞の約４５％でアポトーシスを引き起こすことが観察された（図９Ａおよび図９Ｂ）。トポテカンほど有効ではないが、１．０および１０ｍＩＵｍｌ−１のＡＤＩ−ＰＥＧ２０と一緒にインキュベートすることにより、それぞれ細胞の約６％および１６％でアポトーシスの誘導がもたらされた（図９Ｃおよび図９Ｄ）。サブＧ１期ＤＮＡ含量によればアポトーシスが見られたが、トポテカンで処理した細胞とは対照的に、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０で細胞を処理した後にカスパーゼの活性化は観察されなかった（図９Ｆ）。
【０１５１】
ＡＳＳ発現のサイレンシングは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０に対する感受性を誘導する
ＡＳＳ特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後、ＡＳＳ陽性細胞株におけるＡＳＳの相対発現をリアルタイムＰＣＲで評価した。図１０Ａに示されるように、ＡＳＳ  ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションは、７２時間インキュベートした後にＡＳＳ  ｍＲＮＡレベルを約９０％減少させた。同時ウエスタンブロット分析により、ＡＳＳ特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞において、ＡＳＳタンパク質発現レベルの確固とした減少が実証された（図１０Ｂ）。しかしながら、これらの条件下において、いくらかのＡＳＳ発現が依然として残っていた。ＭＴＳアッセイを使用して細胞生存率を調査することにより、ＡＳＳ  ｓｉＲＮＡで処理したＡＳＳ陽性細胞では、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０誘導性のアルギニン枯渇に対して感受性になった結果、細胞生存率が減少したことが実証されたのに対して、対照またはスクランブルｓｉＲＮＡで処理した細胞では、生存率の減少は観察されなかった（図１０Ｃ）。
【０１５２】
アルギニンデイミナーゼ−ＰＥＧ２０は、ＳＣＬＣ異種移植片の成長を阻害する
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０による全身処置の抗腫瘍効果を、ヒトＳＣＬＣ異種移植片を持つＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて評価した。約１２５ｍｍ３の腫瘍を定着させたマウス、および処置開始時により大きな（約５００ｍｍ３）腫瘍を持つマウスにおいて、別の研究を実施した。中程度のサイズのＳＫ−ＬＣ−１３異種移植片（１２４．６±３７．１ｍｍ３）を持つマウスでは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、対照マウスと比較して有意かつ用量依存的な腫瘍成長の減少を引き起こした（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。対照マウスは、腫瘍容積が過大になったので３３日目に安楽死させたが、その時点における対照マウスの平均腫瘍容積は、用量または処置スケジュールにかかわらず、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０で処置したマウス群における平均腫瘍容積よりも有意に大きかった（すべての処置群についてＰ＞０．０００１；図１１Ｄ）。研究終了時において、５日毎に５ＩＵのＡＤＩ−ＰＥＧ２０を継続投薬して処置した腫瘍は、２０日間だけ５日毎に投薬した腫瘍よりも有意に小さかった（Ｐ＝０．００６３）。しかしながら、この効果は１および２ＩＵの用量レベルでは観察されず、短期投薬および継続投薬を受けた群では腫瘍成長が同程度の速度で進行した。続いて、腫瘍容積が過大になったので各短期投薬群を終了した時点では、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の短期投薬または継続投薬を受けたマウスの平均腫瘍容積には有意差がなかった（１ＩＵ：Ｐ＝０．２５１；２ＩＵ：Ｐ＝０．０８４）。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０によるＡＳＳ陽性ＮＣＩ−Ｈ６９  ＳＣＬＣ異種移植片の処置は、腫瘍成長に対するいかなる効果ももたらさなかった（図１２）。
【０１５３】
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の初回投薬前（０日目）、投薬中（１２日目）および投薬後（４０日目）にこれらのマウスに由来する血清を分析することにより、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の血清レベルは用量依存的であったことが明らかになった（図１１Ｅ）。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を２０日目までしか投与しなかったマウスでは、酵素の血清レベルは、４０日目までにベースラインレベルに戻ることが観察されたが、これは、マウスにおけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の半減期が約７日間であることに一致している（Ｅｎｓｏｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２（１９）：５４４３−５４５０，２００２；Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８０（１−３）：２５９−２７１，２００２）。さらに、予想通り、この短期処置は血清アルギニンを一時的に枯渇させたにすぎず、その後、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０をさらに投薬しなければ、最終投薬（４０日目）の２０日後には正常レベルに戻った（図１１Ｆ）。シトルリンレベルはアルギニンと用量依存的な関係で上昇し、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の期間が短くなるほどシトルリンレベルのベースラインへの回帰と相関する（図１１Ｇ）。シトルリンレベルは１ＩＵのレベルの延長投薬で増大したが、これは、アルギニンの血清レベルは検出限界未満であるにもかかわらず、全身性のアルギニンは依然として残っており、シトルリンに代謝されることに一致している。２および５ＩＵの用量レベルの継続投薬では、シトルリンレベルのわずかな増大が観察された。
【０１５４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける第２のＡＤＩ−ＰＥＧ２０研究では、腫瘍が４７３．４±１６１．０ｍｍ３の比較的大きなサイズに成長した際に、処置を開始した。腫瘍成長の用量依存的な阻害が再度観察されたが（図１３Ａ〜１３Ｃ）、これは、より小さな異種移植片を持つ動物で観察されたほど有意ではなかった。本研究の３２日目に対照コホートを終了した際に、腫瘍容積を比較した（図１３Ｄ）。１ＩＵのＡＤＩ−ＰＥＧ２０で継続処置することにより、対照マウスと比較して腫瘍容積を有意に減少させることができたが（Ｐ＝０．００７）、短期処置は、腫瘍サイズの統計的に有意な減少をもたらさなかった（Ｐ＝０．０７）。さらに、３９日目に短期処置群を終了した際に評価したところ、継続投薬は、短期処置と比較してある程度有意な（Ｐ＝０．２６）腫瘍容積の減少を引き起こすことが観察された。短期投与（Ｐ＝０．００４）および継続投与（Ｐ＝０．０００７）の両方を２ＩＵのレベルにして、そしてさらに短期スケジュール（Ｐ＝０．０００３）および継続スケジュール（Ｐ＝０．０００１）の両方を５ＩＵの用量レベルにしてＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量を増大させると、未処置対照と比較して有意な腫瘍容積の減少が観察された。しかしながら、継続投薬は、短期処置と比較して、これらの用量における反応を有意に改善しなかった。
【０１５５】
要約すると、本実施例は、ＳＣＬＣの大部分でＡＳＳ発現が欠如しており、ＡＳＳ陰性ＳＣＬＣはアルギニン枯渇療法に対して感受性であることを実証している。ＡＳＳ欠損の頻度は、黒色腫で報告したほぼ完全な発現消失と同等ではないが、依然として、米国で毎年報告される約３０，０００件の新たなＳＣＬＣ症例の５０％は、アルギニン枯渇療法に対して感受性であり得る。
【０１５６】
接着および非接着ＡＳＳ欠損ＳＣＬＣ細胞株の両方を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は用量依存的な抗増殖効果を引き起こしたことが実証された。本明細書において記載した結果は、ＡＳＳタンパク質の消失が、その他は同じ細胞におけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗増殖効果に関連しており、ＡＳＳ発現が異なるＳＣＬＣ癌で観察された相対的感受性をさらに立証するものであることを示している。細胞保護的なオートファジーの阻害はＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗増殖効果を増強し得るので、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０と２５ｍＭのオートファジー阻害剤クロロキンとの組み合わせがｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価された（Ｋｉｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９（２）：７００−７０８，２００９）。しかしながら、前記組み合わせは、ＳＣＬＣ細胞において、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗増殖効果において、有意ではあるが（Ｐ＝０．００８）中程度の増大を誘導したにすぎなかった（図１４）。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０によるＳＣＬＣの処置は、ヨウ化プロピジウムによる染色後にサブＧ１期ピークの細胞集団を中程度に増大させたが、これは、これらの細胞がアポトーシスを受けたことを示唆している。ウエスタンブロット分析により、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、ＳＫ−ＬＣ−１３  ＳＣＬＣ細胞においてカスパーゼの活性化を引き起こさなかったことが明らかになった。理論に束縛されるものではないが、ＳＣＬＣ細胞においてＡＤＩ−ＰＥＧ２０により誘導されるアルギニン枯渇に対する全体的な細胞反応は、オートファジーとそれに続くカスパーゼ非依存性細胞死の誘導で見られる初期代謝反応に関与する複雑な機序を介して作用するように思われる。
【０１５７】
マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究により、ＳＫ−ＬＣ−１３異種移植片の成長は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０によって用量依存的に抑制されたことが明らかになった。動物１匹あたり１、２および５ＩＵ用量の投薬で、有意な抗腫瘍活性が観察された。重要なことに、腫瘍成長のより確固とした阻害がより小さな（約１２０ｍｍ３）定着腫瘍を持つマウスで観察されたが、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、大きな（約５００ｍｍ３）異種移植片を持つマウスにおいても有意な抗腫瘍有効性を示した。その他の腫瘍型と直接比較することは困難だが、ＳＣＬＣ異種移植片においてＡＤＩ−ＰＥＧ２０を用いて観察された抗腫瘍有効性は、腎臓癌および前立腺癌の異種移植片などの様々な腫瘍型において等用量のＡＤＩ−ＰＥＧ２０を使用して観察された抗腫瘍有効性と同程度かおそらくはそれよりも優れている。
【０１５８】
実施例４
アルギニンデイミナーゼは、ＡＳＳ欠損転移性肉腫の成長を阻害する
肉腫はまれな腫瘍群であるが、現在の臨床レジメンに対する反応不良は、腫瘍学の重要な必要性が満たされていないことを表している。肉腫成長の生物学および代謝を治療上より良く理解することは、この腫瘍群を有する患者を処置するための新規な治療法を開発するのに必要である。アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）は、シトルリンのアルギニンへの変換における律速酵素である。ＡＳＳが発現していない場合、アルギニンは、食事から送達されなければならない、癌細胞にとって必須アミノ酸になる。
【０１５９】
４５個の肉腫亜型を表す患者検体７０１個の免疫組織化学分析により、ＡＳＳは肉腫の８５％超（７０１個の患者試料のうちの６１９個）で発現していないことが実証された。これにより、肉腫は、ペグ化アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）を使用するアルギニン枯渇療法に対して感受性であることが示唆された。
【０１６０】
平滑筋肉腫、骨肉腫、胞状軟部肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒ）およびユーイング肉腫細胞株のパネルをＡＤＩ−ＰＥＧ２０で処置することにより、ＡＳＳ発現が低かった場合はアポトーシスはもたらされなかったが細胞周期の停止がもたらされたのに対して、高ＡＳＳの骨肉腫細胞株ＭＧ６３は分裂し続けた。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０で処置すると、骨肉腫、軟部組織肉腫、複合的な細胞遺伝学的肉腫および転座依存性肉腫（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓａｒｃｏｍａ）のすべてにおいて細胞周期阻害が実証されたように、肉腫細胞株における反応はＡＳＳ発現依存性であった。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０で処置した細胞株のＩＣ５０は、ＡＳＳ発現が低い感受性細胞株において０．０２〜０．１μｇ／ｍＬの範囲であった。
【０１６１】
ＡＳＳが欠如している肉腫をＡＤＩ−ＰＥＧ２０で処置することにより、オートファジーが誘導された。ＡＳＳ欠損肉腫におけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０によるアルギニン枯渇は、オートファジー阻害剤であるクロロキンと組み合わせた場合に、アネキシンＶで測定される細胞死を誘導した。
【０１６２】
ＡＳＳを低発現している骨肉腫細胞株ＭＮＮＧをヌードマウスに異種移植した後にＡＤＩ−ＰＥＧ２０で処置すると、ＰＢＳで処置した対照と比較して、腫瘍成長速度が有意に遅いことが実証された。
【０１６３】
上記実施例に関して、腎細胞癌腫異種移植モデルでは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０＋オートファジー阻害剤ヒドロキシクロロキンは相加効果をもたらさなかったことが観察されたことに注目するべきである。したがって、任意の特定の癌におけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０＋オートファジー阻害剤の効果は予測不可能であり、これは、本開示の驚くべき効果をさらに強調している。
【０１６４】
実施例６
シスプラチンと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍活性を有意に高める
異種移植試験を実施して、シスプラチンと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧ２０のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性も評価した。２匹の異なるヒト黒色腫異種移植ヌードマウスモデルの処置におけるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の単一薬剤としての、またはシスプラチンと組み合わせた場合の治療有効性について、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。シスプラチンの用量は６ｍｇ／ｋｇまたは１８ｍｇ／ｍ２（Ｋｍ＝３）であり、６日毎に３回腹腔内（ＩＰ）投薬した。ヒトについて外挿すると、これと同じ用量は、４０ｍｇ／ｍ２（Ｋｍ＝４０）または３週間にわたって全用量１２０ｍｇ／ｍ２になるであろう。ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を５３．３ＩＵ／ｋｇで６日毎に４回筋肉内（ＩＭ）投薬した。ヒトについて外挿すると、これと同じＡＤＩ−ＰＥＧ２０の用量は、１６０ＩＵ／ｍ２または１８ｍｇ／ｍ２になるであろう。図１５に示されるように、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０およびシスプラチンの組み合わせによる処置は、いずれかの薬剤単独と比較して有意に増強された活性を示した。したがって、異種移植データにより、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０およびシスプラチンの組み合わせは、たとえシスプラチンを限定された期間にわたって投与した場合であっても、ＡＳＳ欠損黒色腫細胞において腫瘍活性の増強をもたらすことが示された。
【０１６５】
実施例７
ドセタキセルと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧ２０の第Ｉ相ヒト試験
進行性固形腫瘍を有する患者に、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０をドセタキセルと組み合わせて３週間毎に静脈内（ＩＶ）投与する場合の最大耐用量および用量制限毒性（ＭＴＤおよびＤＬＴ）を決定するために、単一施設非盲検第Ｉ相用量漸増試験を開始した。患者には、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を漸増用量で毎週筋肉内（ＩＭ）投与し、１時間後（１日目）にドセタキセルを７５ｍｇ／ｍ２で静脈内（ＩＶ）投与した。サイクルの長さは２１日間である。期間中は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を毎週筋肉内（ＩＭ）注射し続けた。用量漸増は、標準的な３＋３デザインを使用して行った。新たな用量レベルの各コホートは、最後の被験者が前のコホートに入った２１日後に開始した。１８ｍｇ／ｍ２は、１６０ＩＵ／ｍ２とほぼ同等である。
【０１６６】
投薬レジメンを以下の表２に要約する。
【０１６７】
【表２】
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処置の概要を以下の表３に要約する。
【０１６８】
【表３】
2018104470.tif 000004
本試験の初期成績を以下の表４に要約する。特に、利用可能な情報を有するこれまでに処置した被験者８人の客観的な臨床上の利益の結果は、以下の通りである：
【０１６９】
【表４】
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したがって、これまでに登録した患者８人のうちの６人（７５％）が、臨床上の利益（安定病態＋部分反応＋完全反応）を有する。
【０１７０】
第３相肝細胞癌腫試験では１８ｍｇ／ｍ２を使用したように、本試験で使用した用量は低用量であり、３６ｍｇ／ｍ２が黒色腫で効力を示した。したがって、この初期データは、このような低用量であっても肯定的な反応が得られるという非常に有望なものであり、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０とドセタキセルとの組み合わせが有効な癌処置であることを示唆している。特に、ドセタキセルは、乳癌、非小細胞肺癌、ホルモン抵抗性前立腺癌、胃腺癌、および頭頸部癌の扁平上皮細胞癌腫における腫瘍の処置について米国で承認されている。さらに、それは、肉腫、特に子宮平滑筋肉腫および変異型の癌の処置に使用されている。このようなものとして、ドセタキセルをＡＤＩ−ＰＥＧ２０と組み合わせてこれらの癌を処置することが、本明細書において具体的に企図される。
【０１７１】
実施例８
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０＋ラパマイシンは、腎細胞癌腫のｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植モデルにおいて相乗効果を示す
マウス異種移植モデルを使用して、腎細胞癌腫の処置についてＡＤＩ−ＰＥＧ２０単独の、およびラパマイシンと組み合わせた場合の効果を研究した。
【０１７２】
Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−４６（商標））異種移植片を持つマウスにおいて、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の活性を評価した。腎細胞癌腫Ｃａｋｉ−１異種移植片を雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（３〜４週齢、体重２０ｇ）（ＳＬＡＣ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）に定着させた。前記腫瘍を定着させるために、培地中の細胞５ｘ１０６個をＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：１で混合し、マウスの腹部に皮下注射した。腫瘍成長を定期的に測定し、式（ＴＶ＝（長さｘ幅２）／２）を使用して腫瘍容積を計算した。腫瘍が約１２５ｍｍ３の容積に達した際に、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を１６０、３２０および６４０ＩＵ／ｍ２の用量レベルで筋肉内注射によって４週間にわたって１週間毎に１回投与した。各研究群は、９匹のマウスを有していた。マウスは、腫瘍が約１，１００ｍｍ３の容積に達した際に安楽死させた。この結果により、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は腫瘍成長を用量依存的に阻害したことが示された。６４０ＩＵ／ｍ２を使用した場合、８０％超の腫瘍阻害が達成された。
【０１７３】
追加の実験では、Ｃａｋｉ−１異種移植片を持つマウスにおいて、単一薬剤としての、またはラパマイシンと組み合わせた場合のＡＤＩ−ＰＥＧ２０の活性を評価した。腎細胞癌腫異種移植片を雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（３〜４週齢、体重約２０ｇ）（ＳＬＡＣ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）に定着させた。前記腫瘍を定着させるために、培地中の細胞５ｘ１０６個をＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：１で混合し、マウスの腹部に皮下注射した。腫瘍成長を定期的に測定し、式（ＴＶ＝（長さｘ幅２）／２）を使用して腫瘍容積を計算した。Ｃａｋｉ−１異種移植片が約１２５ｍｍ３の容積に達した際に、マウスを１群あたり動物８匹の６群に無作為に分け、以下のプロトコールにしたがって処置を開始した：群１には４０μＬのＰＢＳを筋肉内注射によって４週間にわたって１週間毎に１回投与し、群２にはＡＤＩ−ＰＥＧ２０（３２０ＩＵ／ｍ２）を筋肉内注射によって１週間毎に１回で４回投薬し、群３にはラパマイシン（０．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって２１日間にわたって１日に１回投与し、群４にはラパマイシン（０．２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって２１日間にわたって１日に１回投与し、群５にはＡＤＩ−ＰＥＧ２０（３２０ＩＵ／ｍ２）（４週間にわたって１週間毎に１回）およびラパマイシン（０．５ｍｇ／ｋｇ）（２１日間にわたって１日に１回）の組み合わせを投与し、群６にはＡＤＩ−ＰＥＧ２０（３２０ＩＵ／ｍ２）を４週間にわたって１週間毎に１回投与し、ラパマイシン（０．２ｍｇ／ｋｇ）を２１日間にわたって１日に１回投与した。マウスは、腫瘍が約２５００ｍｍ３の容積に達した際に安楽死させた。
【０１７４】
図１６に示されるように、この結果により、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０およびラパマイシンの組み合わせは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０またはラパマイシンのいずれかの単独と比較して、腫瘍阻害を相乗的に増強したことが示された。
【０１７５】
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０とオートファジー阻害剤またはｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンとの組み合わせの効果に関して、前記文献のデータは、異なる癌型では一貫していない。したがって、ラパマイシンと組み合わせたＡＤＩ−ＰＥＧ２０が、腎細胞癌腫腫瘍の阻害で相乗的に作用することは予測できなかった。これらの結果は、当業者が、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０との任意の特定の組み合わせが癌、特に腎細胞癌腫の処置に有効であるか否かを予測できないことを示している。
【０１７６】
種々の上記実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供できる。本明細書において参照し、および／または願書において列挙した米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物はすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。種々の特許、出願および刊行物の概念を用いて、さらにさらなる実施形態を提供することが必要な場合は、前記実施形態の態様を修正できる。
【０１７７】
上記の詳細な説明を考慮して、これらのおよびその他の変更を前記実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲において開示される具体的な実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、このような特許請求の範囲に認められる全範囲の等価物と一緒に、すべての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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