【事件の表示】
　特願２００７−５３０１４８「抗アミロイドベータ抗体の製法」拒絶査定不服審判事件〔平成１８年　３月　９日国際公開、ＷＯ２００６／０２６４０８、平成２０年　４月１７日国内公表、特表２００８−５１１３２８〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯　
　本願は，２００５年８月２６日（パリ条約による優先権主張　２００４年８月２７日（ＵＳ）アメリカ合衆国）を国際出願日とする出願であって，平成２３年３月９日付けの拒絶理由通知に対して，同年９月１５日に意見書，手続補正書が提出され，同年１０月６日付けで拒絶査定がなされ，これに対し，平成２４年２月１７日に拒絶査定不服審判の請求がなされるとともに，同日に手続補正書が提出され，平成２５年５月２９日付けの審尋に対し，同年１２月４日に回答書が提出されたものである。　
　
第２　平成２４年２月１７日付けの手続補正についての補正却下の決定　
　
［補正の却下の決定の結論］　
　平成２４年２月１７日付けの手続補正（以下，「本件補正」という。）を却下する。　
　
［理由］　
１　補正後の請求項１に記載された発明　
　本件補正は，補正前の特許請求の範囲の請求項１の　
「【請求項１】　
　大規模生産細胞培養における抗−Ａベータ抗体の製造方法であって、下記工程：　
　　抗−Ａベータ抗体をコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞、ここで、該遺伝子は細胞培養条件下で発現して抗−Ａベータ抗体を生産する；および　
　　　グルタミンを含有し、（ｉ）７０ｍＭを超える累積アミノ酸濃度、（ｉｉ）２未満の累積アスパラギンに対する累積グルタミンのモル比、（ｉｉｉ）０．２未満の総累積アミノ酸に対する累積グルタミンのモル比、（ｉｖ）０．４〜１の総累積アミノ酸に対する累積無機イオンのモル比、（ｖ）１６ｍＭを超えるグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積濃度、およびそれらの組合せからなる群から選択される培地特性を有する培地；　
を含む細胞培養物を供給する工程；　
　　初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１のセットの培養条件下に維持された場合に、該細胞が可能な最大生存細胞密度の２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度を得るのに十分な第１の期間、第１のセットの培養条件下で該培養物を維持する工程；　
　　少なくとも１つの培養条件を変更して、第２のセットの培養条件を適用する工程、ここで、少なくとも１つの培養条件を変更する工程における該細胞培養条件は、（ｉ）温度、（ｉｉ）ｐＨ、（ｉｉｉ）重量オスモル濃度、（ｉｖ）化学誘導剤レベル、およびそれらの組合せからなる群から選択される；　
　　第２のセットの条件下、第２の期間、該培養物を維持して、抗−Ａベータ抗体を細胞培養物中に堆積させる工程；　
を含む方法。」　
を，　
「【請求項１】　
　大規模生産細胞培養における抗−Ａベータ抗体の製造方法であって、下記工程：　
　　抗−Ａベータ抗体をコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞、ここで、該遺伝子は細胞培養条件下で発現して抗−Ａベータ抗体を生産する；および　
　　　グルタミンを含有し、
かつ、２未満の累積アスパラギンに対する累積グルタミンのモル比を有し、さらに、
ｉｉ
ｉｉｉ
ｉｖ
を含む細胞培養物を供給する工程；　
　　初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１のセットの培養条件下に維持された場合に、該細胞が可能な最大生存細胞密度の２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度を得るのに十分な第１の期間、第１のセットの培養条件下で該培養物を維持する工程；　
　　少なくとも１つの培養条件を変更して、第２のセットの培養条件を適用する工程、ここで、少なくとも１つの培養条件を変更する工程における該細胞培養条件は、（ｉ）温度、（ｉｉ）ｐＨ、（ｉｉｉ）重量オスモル濃度、（ｉｖ）化学誘導剤レベル、およびそれらの組合せからなる群から選択される； 
および
　　第２のセットの条件下、第２の期間、該培養物を維持して、抗−Ａベータ抗体を細胞培養物中に堆積させる工程；　
を含む方法。」　
（下線は補正箇所を示す。）とする補正を含むものである。　
　
　上記補正は，補正前の請求項１に記載された発明を特定するために必要な事項である「培地」を「
２未満の累積アスパラギンに対する累積グルタミンのモル比を有
 　それに伴い、「培地特性」の選択項目番号を繰り上げ、また、複数の培養条件の規定に、「
および
 　そこで，本件補正後の請求項１に記載された発明（以下，「補正発明」という。）が独立して特許を受けることができるものであるか（平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するか）について，以下に検討する。 
 　 
２　引用刊行物とその記載事項 
　
（１）原査定の拒絶の理由に引用された本願の優先日前に頒布された刊行物１（原査定の引用文献２）に係る国際公開第０２／０４６２３７号には、以下の事項が記載されている。　
　なお、以下の日本語訳による摘示は、引用刊行物に対応する日本語出願の公表公報である特表２００５−５００８０８号公報の記載に基づくものであり、その段落番号も便宜上そのまま記載した。また、下線は当審が付したものである。 
 　　 
（刊１−１）　
「131. A humanized antibody, or antigen-binding fragment thereof, which specifically binds to beta amyloid peptide (Aβ), comprising a variable region comprising complementary determining regions (CDRs) corresponding to CDRs from the mouse 10D5 antibody.　
・・・　
  150. An isolated nucleic acid molecule encoding the immunoglobulin of any one of claims 114-132.　
・・・　
  153. A host cell comprising the nucleic acid molecule of any of claims 147-151.　
  154. A method of producing an antibody, or fragment thereof, comprising culturing the host cell of claim 153 under conditions such that the antibody or fragment is produced and isolating said antibody from the host cell or culture.」（１３６頁１行〜１３８頁２０行）　
（訳文）　
「【請求項１３１】マウス１０Ｄ５抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するＣＤＲを含んで成る可変領域を含んで成る、
βアミロイドペプチド（Ａβ）に特異的に結合するヒト化抗体
・・・　
【請求項１５０】請求項１１４−１３２のいずれか１つ記載の
免疫グロブリンをコードする単離された核酸分子
・・・　
【請求項１５３】請求項１４７−１５１のいずれか記載の
核酸分子を含んで成る宿主細胞
【請求項１５４】
抗体もしくはフラグメントが産生されるような条件下で請求項１５３記載の宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞もしくは培養物から前記抗体を単離することを含んで成る、抗体
の製造方法
　
（刊１−２）　
「In addition to microorganisms, mammalian tissue cell culture may also be used to express and produce the polypeptides of the present invention (e.g., polynucleotides encoding immunoglobulins or fragments thereof). See Wimiacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Eukaryotic cells are actually preferred, because a number of suitable host cell lines capable of secreting heterologous proteins (e.g., intact immunoglobulins) have been developed in the art, and include CHO cell lines, various Cos cell lines, HeLa cells, preferably, myeloma cell lines, or transformed B-cells or hybridomas. Preferably, the cells are nonhuman.」（４４頁８〜１５行）　
（訳文）　
「【０１０６】微生物に加え、
哺乳動物組織細胞培養物もまた本発明のポリペプチド（例えば免疫グロブリンもしくはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を発現かつ産生させるのに使用してよい。
異種タンパク質（例えば損なわれていない免疫グロブリン）を分泌することが可能な多数の適する宿主細胞系が当該技術分野で開発されているため、真核生物細胞が実際に好ましく、そして、ＣＨＯ細胞系
を包含する
　
（２）原査定の拒絶の理由に引用された本願の優先日前に頒布された刊行物２（原査定の引用文献３）に係る国際公開第０２／１０１０１９号には、以下の事項が記載されている。　
　なお、以下の日本語訳による摘示は、引用刊行物に対応する日本語出願の公表公報である特表２００４−５３２６４２号公報の記載に基づくものであり、その段落番号も便宜上そのまま記載した。また、下線は当審が付したものである。 
　
（刊２−１）　
「Field of the Invention　
　This invention relates to a method of improving expression of polypeptides in mammalian cell culture systems. In particular, it is directed to methods of culturing mammalian cells under conditions where environmental and nutritional conditions are controlled and adjusted so as to improve process robustness and to promote superior expression of polypeptides having desired qualities, e.g., biological activity. The invention also relates to polypeptides, especially antibodies or fragments thereof, produced by the methods, and to methods of using such antibodies, and to pharmaceutical composition containing the polypeptides. The invention also relates to methods of culturing animal cells in a fed batch cell culture to maximize production capacity, viability of the cell culture, and overall enhancement of yield from use of such cultures.」（１頁４〜１４行）　
（訳文）　
「【０００１】　
発明の分野　
本発明は、哺乳動物細胞の培養系においてポリペプチドの発現を改善する方法に関する。特に、プロセスの堅牢性が改善されるとともに所望の質、例えば
生物学的活性を有するポリペプチドの優れた発現が促進されるように環境的及び栄養的条件を制御及び調整した条件下で、哺乳動物細胞を培養する方法
該方法によって産生されたポリペプチド、特に抗体又はその断片、そのような抗体の使用方法
動物細胞を培養して、産生能、細胞培養の生存率、及びこのような培養を用いての収率の全体的な向上を、最大にする方法
　
（刊２−２）　
「Summary of the Invention　
　In response to this need there is provided in accordance with the embodiments of the invention improvements to methods for culturing cells to produce polypeptides. Such methods can improve the viability of the cell culture, produce higher yields of desired products, reduce by-product accumulation and/or achieve cost savings through more efficient and productive systems, particularly for large scale production. 」（３頁２〜７行）　
（訳文）　
「【０００７】　
発明の概要　
上述した必要性に応じて、本発明の実施態様によりポリペプチドを産生するための細胞の培養方法を改善する。このような方法により、
細胞培養の生存率を改善し
高収率で所望の産生物を産生し
副産物の蓄積を低減し
より効率的で生産的なシステムにより特に大規模生産の場合に費用削減を達成することができる
　
（刊２−３）　
「The terms cell culture medium and culture medium refer to a nutrient solution used for growing mammalian cells that typically provides at least one component from one or more of the following categories:　
1) an energy source, usually in the form of a carbohydrate such as glucose;　
2) all essential amino acids, and preferably, and most commonly, the basic set of twenty amino acids plus cysteine;　
3) vitamins and/or other organic compounds required at low concentrations;　
4) free fatty acids; and　
5) trace elements, where trace elements are defined as inorganic compounds or naturally occurring elements that are typically required at very low concentrations, usually in the micromolar range.」（１９頁１１〜２１行）　
（訳文）　
「【００５２】　
用語「細胞培地」及び
「培地」は
１）通常は炭水化物の形態のエネルギー源、例えばグルコース；　
２）
全ての必須アミノ酸、好適には及び最も一般的には、基本的な組である２０種のアミノ酸とシステイン
３）低濃度で必要とされるビタミン類及び／又は他の有機化合物；　
４）遊離脂肪酸；及び　
５）微量元素（ここで微量元素は、通常非常に低濃度で必要とされる無機化合物又は天然発生要素として定義される）　
からの成分を少なくとも１つ典型的に提供する、哺乳動物細胞を増殖するために使用される栄養溶液を意味する。」
　
（刊２−４）　
「EXAMPLES　
　The following examples of the practice of the invention are presented by way of illustration and not by way of limitation. 　
Materials and Methods
　A Chinese hamster ovary (CHO) cell line, derived from dihydrofolate reductase minus (dhfr−) DUKX CHO host, was used in all examples (See Urlaub G., Chasin L. A. Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient in Dihydrofolate Reductase Activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 41216-4220). In the present examples, CHO cells were genetically engineered to secrete recombinant anti-tissue factor antibody using a dhfr/methoxrexate selection method similar to that used by Kaufman and Sharpe (See Kaufman R. J., Sharpe P. A. Amplification and Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene. J. Mol. Biol. 1982, 159, 601-621).　
　As discussed above, the process of culturing cells involved two or three phases. An initial growth phase where a seed train is produced, an optional inoculum train in which cells are expanded for the inoculum, and a culturing phase in which polypeptide (e.g., antibody) production occurred. Serum-free low-protein (recombinant human insulin) cell culture growth media, based on a mixture of HAM'S F12/DMEM was used in all procedures for these examples. The two basic media formulations (Medium A versus Medium B) have similar compositions as indicated in Table 1 below and were used in the experiments disclosed herein. The levels of some of the components, specifically glutamine and glutamate, were varied during the experiments as described in these Examples.　
　Table 1: Compositions of Media A and B　
　During the growth phase, the cells were continuously subcultivated in log phase under selective pressure in a seed train. The cells from the seed train were expanded in bioreactors using nonselective medium to provide inoculum for production cultures. 3L liter glass stirred bioreactors (Applikon, Foster City, CA) were used for both inoculum and production cultures at 1.5 - 2.0L working volume. Temperature, pH, agitation and dissolved oxygen were controlled using digital control units (B. Braun Biotech International, Allentown, PA). Temperature in seed and inoculum cultures was maintained at 37℃ in the principle experiment. The initial temperature of the production culture was also maintained at 37℃.　
　After a specified period following inoculation, the temperature was shifted down to the levels specified in the experimental design and the temperature was maintained at that set point for the duration of the culture.　
　The culture pH was automatically maintained by the addition of CO2 (acid) and/or Na2CO3 or NaOH (base), as known in the art. The dissolved oxygen concentration was automatically maintained at 30% of air saturation by direct sparging with air and/or oxygen as known. To maintain cell viability and productivity, additional quantities of some production medium components, in the form of a concentrated nutrient mixture (batch feed), were fed to the production vessel at specified times. Batch feed had some initial media components in concentrated form (4 fold concentrated). After addition of the batch feed to the production phase culture medium, the initial media components were increased by 30-40%, including a 30% increase in initial peptone concentration, an increase of greater than 100% glucose concentration, and an increase of 100% of trace elements.　
　Daily samples were taken to monitor cell growth, viability and extracellular product titer. Cell growth was determined by cell counts and packed cell volume (PCV). PCV was measured using graduated centrifuge tubes (Kimble Science Products, Fullerton, CA) after spinning cell suspension for 10 minutes at 830 g. PCV was expressed as percentage of the total culture volume. Cell viability was determined by a standard trypan-blue dye- exclusion method. The pH of the culture, Na+, K+, lactate and glucose concentrations in supernatant were measured using Nova-Bioprofile(Registered Trademark)(Nova Biomedical, Waltham, MA) according to the manufacturer's instructions. Product titer was quantified with HPLC by using a Protein A column (POROS(Registered Trademark) 20 A, Perkin Elmer) to quantitate Fc-containing anti- tissue factor antibody in cell culture supernatant. Product quality of selected samples was determined by measuring the number of terminal galactose residues per glycan using MALDI-TOF mass spectrometry (see, for example, Papac, D.I. et al., Analysis of acidic oligosaccharides and glycopeptides by matrix-assisted laser-desorption ionization time-of- flight mass spectrometi . Anal. Chem. 68:3215-3223 (1996)). Alternately, CE-LIF (capillary electrophoresis and laser-induced flouorescence) may be used to analyze glycan terminal galactosylation. 」（３１頁４行〜３４頁８行）　
（訳文）　
「【００８９】　
実施例　
以下の本発明の実施例は、例として示されるものであって、限定するものではない。　
物質及び方法　
ジヒドロ葉酸還元酵素マイナス（ｄｈｆｒ−）ＤＵＫＸ  ＣＨＯ宿主由来のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を全実施例で使用した（Urlaub G., Chasin L. A. Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient in Dihydrofolate Reductase Activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:41216-4220参照）。本実施例でＣＨＯ細胞は、Kaufman及びSharpe（Kaufman R. J., Sharpe P. A. Amplification and Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene. J. Mol. Biol. 1982, 159, 601-651参照）により使用されたものと同様のｄｈｆｒ／ｍｅｔｈｏｘｒｅｘａｔｅ選択方法を用いて、組換え抗組織因子抗体を分泌するように遺伝子操作された。　
【００９０】　
上述したように、細胞培養プロセスは２又は３段階を含んでいた。種系列が導入される最初の増殖段階、細胞が接種原のために拡大される任意の接種原列、及びポリペプチド（例えば抗体）産生が発生する培養段階である。ＨＡＭ’Ｓ  Ｆ１２／ＤＭＥＭの混合に基づく無血清の低タンパク質（組換えヒトインスリン）細胞培養増殖培地を、これら実施例の全手順で用いた。
２つの基本的な培地形成（培地Ａ対培地Ｂ）は下の表１に示したように同様の組成物を有し、それらをここで開示する実験で使用した。いくつかの成分、特にグルタミンとグルタミン酸のレベルは、これら実施例に記載のように実験中変化した。
【００９１】　
【００９２】　
増殖段階中、対数期の細胞を、種系列での選択的な圧力下で連続的に継代培養した。産生培養のための接種原を提供するために、非選択的な培地を用いて種系列からの細胞をバイオリアクター内で拡大した。１．５ないし２．０Ｌの作業量の産生培養と接種原の双方のために、３Lリッターガラス攪拌バイオリアクター（Applikon、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いた。温度、ｐＨ、攪拌及び溶存酸素量は、デジタル制御装置（B. Braun Biotech International、アレンタウン、ペンシルベニア）を用いて制御した。種細胞及び接種原培養物の温度は原理実験において３７℃に維持した。産生培養の最初の温度も３７℃に維持した。　
接種に続く特定の期間の後、温度を実験計画で特定した水準に低下させ、培養の間、その設定値を維持した。　
【００９３】　
培養ｐＨは、当該技術分野で知られるように、ＣＯ２（酸）及び／又はＮａ２ＣＯ３又はＮａＯＨ（塩基）の添加により自動的に維持した。溶存酸素濃度は、該技術分野で知られるように、空気及び／又は酸素の直接散布により３０％の空気飽和度に自動的に維持した。細胞の生存率と産生率を維持するために、追加的な量のいくつかの産生培地成分を、濃縮された栄養混合物（バッチ添加物）の形態で特定の回数、産生容器に投入した。バッチ添加物は濃縮（４倍濃縮）された状態で最初の培地成分をいくつか有するものであった。バッチ添加物を産生段階培地に添加すると、最初の培地成分は、最初のペプトン濃度の３０％の増加、グルコース濃度の１００％を超える増加、及び微量元素の１００％の増加を含み、３０ないし４０％増加した。　
【００９４】　
細胞増殖、生存率及び産生物力価を観察するために試料を毎日採取した
産生物力価は、プロテインＡカラム（POROS（登録商標）20A, Perkin Elmer）を用いてＨＰＬＣで定量化し、細胞培養上清中のＦｃ含有抗組織因子抗体を計量した
　
（刊２−５）　
「
Experimental Design
　Eleven cell culture parameters were examined in this study: final temperature after a temperature shift, temperature shift timing, butyrate concentration, media type (A or B), pH shift, batch feed (one or more batch feedings), glutamine concentration, glutamate concentration, total amount of glucose added to the medium throughout the experiment, glucose regimen (e.g., the number of increments, amount, and timing of glucose addition) and the seeding density. Full factorial designs were generated using JMP(Registered Trademark) software (SAS Institute, 1996, supra). Preferred levels and ranges for these factors are shown in Table 1.　
　In the first set of experiments, four factors (final temperature, temperature shift timing, butyrate and media) were studied at two levels. A repeated full factorial design required 2x2n = 32 runs for n = 4 factors. The experiments were performed in blocks. In the design of eight blocks of size four, blocking effect (performing experiments sequentially rather than all at once) was confounded with the two way interaction of temperature shift timing with butyrate.　
　The second set of experiments was performed after analyzing the results of the first set of experiments. Temperature, temperature shift timing, butyrate and media were set at 34℃, 24 hrs, 0 mM butyrate and media (A) respectively while investigating the effects of pH shift, glutamine levels and batch feed additions. Two levels were identified for pH shift and batch feed. The pH set point was lowered from 7.15 to 7.0 on day 3 of fermentation for the pH shifted cases only. All cell cultures in this set of experiments received additional quantities of the same production medium components (except glutamine) in the form of a concentrated mixture (batch feed) on day 2. Glutamine was omitted from the batch feed to investigate its influence as a separate factor. The cultures with two batch feeds received the second feed with the same composition on day 4 or 5. All cases had an initial glutamine level of 5mM. Additional 5 mM glutamine was added from a concentrated glutamine stock on day 2 for 10 mM glutamine cultures. Cultures containing 15mM glutamine received glutamine additions on both days 2 and 5. The mixed n level full factorial design for this set of experiments required 2n x3k = 12 runs where n is the number of 2 level factors and k is 3 level factors.　
　In the third set of experiments, the impact of additional glucose (compared to the previous set of experiments), multiple additions of batch feed (two batch feed additions in these experiments), and glutamine as well as their affects on osmolality and final product titer was investigated. A total of twelve runs were performed for this set of experiments.　
　In the fourth set of experiments, effects of seeding density, replacement of glutamine with glutamate, glucose addition regimen, and additional ranges of temperature were examined. As described, supra, the results of the third set of experiments indicated that glucose in the initial media, in first batch feed, and further provided by addition on day 4, had a favorable affect. Thus, in the fourth set of experiments, the effect of glucose regimen was examined: in the no additional glucose regimen, experimental cell cultures received no additional glucose other than that provided in the initial media ('no additional'); in the high glucose regimen, cultures received 10g/L additional glucose on day 4 ('high'); and in the multiple glucose regimen, cultures received 6 g/L on day 4 plus 4 g/L on day 7 ('multiple'). A total of 24 runs were performed for this set of experiments.」（３４頁９行〜３５頁１７行）　
（訳文）　
「【００９５】　
実験計画　
当該研究では１１の細胞培養パラメーター：温度シフト後の最終温度、温度シフトのタイミンング、酪酸塩濃度、培地タイプ（Ａ又はＢ）、ｐＨシフト、バッチ添加物（１又は複数のバッチ添加物）、グルタミン濃度、グルタミン酸濃度、実験中に培地に添加されるグルコースの総量、グルコース投与法（例えば回分投入の回数、量、及びグルコース添加のタイミング）、及び播種密度を考察した。全要因の計画は、ＪＭＰ（登録商標）ソフトウェア（SAS Institute, 1996, 上掲）を用いて作成した。これら要因の好適な水準と範囲を表１に示す。　
【００９６】　
第一設定の実験では、
温度シフトのタイミング
を２水準で研究した
第二設定の実験は、
培地Ａに設定して、
グルタミン水準
の効果を調べた
この設定の実験では細胞培養の全てに、２日目に、追加的な量の同一の産生培地成分（グルタミンを除く）を、濃縮された混合物（バッチ添加物）の形態で付与した。グルタミンは、別の要因としてその影響を調べるためにバッチ添加物から省いた
全ケースにおいて最初のグルタミン水準は５mMとした
【００９７】　
第三設定の実験では、
グルタミンによる影響
最終産生物力価への影響を調査した
第四設定の実験では、播種密度、グルタミンのグルタミン酸での置換、グルコース投与法、及び温度範囲の拡大による影響を考察した。上掲したように、第三設定の実験の結果は、最初の培地内の、第一のバッチ添加物内の、及び４日目の添加により提供されるグルコースは好適な影響を持つことを示した。よって第四設定の実験では、グルコース投与法の影響を考察した：「グルコース添加なし」の投与法では最初の培地に提供されたグルコース以外は実験細胞培養に添加されず（「添加なし」；「高グルコース」の投与法では4日目に１０g/Lのグルコースが培養に添加され（「高」）；「複数グルコース」投与法では4日目に６g/L、そして７日目に４g/Lが培養に添加された（「複数」）。この設定の実験では合計２４回行われた。」　
　
（刊２−６）　
「
Example 1: Results from the first set of experiments
　The analysis of the first set of experiments identified temperature and media as having significant effects. Interactions were found between final temperature and temperature shift timing and also final temperature and media. Tables 2 and 3 show the scaled parameter estimates (estimated value for each factor in the model), standard error (SE), T ratio (ratio of parameter estimate to standard error) and the P- values for titer and % final culture viability responses respectively. Small P values indicate that the mean response varies when the associated variable is altered. A P value below 0.05, by convention, is considered statistically significant. An F value is calculated by dividing the mean square model error by the mean square error variance. F value provides information on how well the factors describe the statistical variation in the data from its mean. The higher the F value from unity, the greater is the certainty of the factors explaining the variation in the data about its mean.　
　In the present invention, the F values for both responses between final temperature and temperature shift timing and also final temperature and media (Tables 3 and 4) indicate that the temperature variation at specified times as described herein is significant. Table 3 shows a very small P-value for temperature shift, indicating that it has a very significant main effect on product antibody titer. In particular, a temperature shift from the initial temperature of 37℃ down to a range between 31 to 34℃ was significant when said shift occurred between 12 and 36, and preferably at about 24 hours after culturing. The positive parameter estimate shows that the titer increases in proportion to the higher end of the temperature range for the post-shift temperature. The interaction between time and temperature (denoted as time*temperature) was highly significant. Large negative temperature*time interaction suggests that using the low temperature shifting time (24 hours) with the high end of the post-shift temperature range (i.e., 33 to 34℃) provides the best titer. The specific time*temperature relationship was also dependent on the seeding density. In particular, the highest titers were observed in a 0.2% seeding density where the shift occurred at 24 hours and moved from 37℃ to 34℃, while in a 0.4% seeding density a shift at 24 hours from 37℃ to 33℃ produced the highest titers. The block effect (performing experiments in blocks) was insignificant.　
　The media used in such settings did not appear to affect titer but did affect viability of the cell culture medium (Table 4). In particular, media that had higher glutamine concentrations, including as a consequence of batch feed additions containing glutamine) had lower viability. Higher ammonia levels accumulated in cultures with higher glutamine concentrations. This is consistent with the negative impact of ammonium on growth, viability, and product quality reported by others (see, e.g., McQueen, A., Bailey, J.E., Mathematical Modeling of the Effects of Ammonia ion on the Intracellular pH of hybridoma Cells., 1990, Biotechnology and Bioengineering, 35:897-906;. Wu, P., Ray, N.G., and Shuler, M. L., A Computer model for intracellular pH Regulation in Chinese Hamster Ovary Cells, 1993, Biotechnol. Prog., 9:374 -384; and Wu, P., Ray, N.G., and Shuler, M. L., A Single-Cell Model for CHO Cells. 1992, Ann. N. Y. Acad. Sci. (Biochem. Eng. VII), 152 - 187). Thus, the lower viability of media was due to the additional glutamine in such media.」（３６頁１０行〜３７頁１８行）　
（訳文）　
「【０１００】　
実施例１：第一設定の実験の結果　
第一設定の実験の分析は、温度及び培地を有意な影響を持つものとして同定した。最終温度と温度シフトのタイミング間、及び最終温度と培地間には相互作用が見られた。表２及び３は、力価と最終培養生存率％応答についての、推定パラメーター（モデルの各要因に関する推定値）、標準誤差（ＳＥ）、Ｔ比率（推定パラメーター対標準誤差の比率）及びＰ値をそれぞれ示す。低いＰ値は、関連する変数が変化されると平均応答が変化することを示す。慣例により０．０５未満のＰ値は統計的に有意であると考えられる。Ｆ値は、平均二乗モデル誤差を平均二乗誤差分散で割って計算する。Ｆ値が１より高ければ高いほど、データ中の変数をその平均値について説明する要因の確実性が増す。　
【０１０１】　
本発明で、最終温度と温度シフトのタイミング間、及び最終温度と培地間の応答の双方についてのＦ値（表３及び４）は、ここで説明するような特定の時間における温度変化が有意であることを示す。表３は、温度シフトについて非常に低いＰ値を示し、これは、それが産生物抗体力価に非常に有意な主効果を持つことを示唆する。特に、最初の温度３７℃から３１ないし３４℃の範囲への温度シフトは、該シフトが培養から１２ないし３６時間後、及び好適には約２４時間後に起こった場合、有意であった。プラスの推定パラメーターは、シフト前温度の温度範囲の上限に比例して力価が増加することを示す。タイミングと温度の相互作用（「タイミング*温度」と示す」）が非常に有意であった。温度*タイミング間の相互作用が大きなマイナス値であることは、低温度のシフトタイミング（２４時間）と、上限の高いシフト前温度の範囲（つまり３３ないし３４℃）を用いると、最高の力価が得られることを示唆する。また特定のタイミング*温度の関係は、播種密度に依存した。特に、２４時間で３７℃から３４℃へのシフトが起こった場合は０．２％の播種密度で最高の力価が観察され、一方、２４時間で３７℃から３３℃へのシフトが起こった場合は０．４％の播種密度で最高の力価が発生した。（ブロックで実験を行う）ブロック効果は僅かであった。　
【０１０２】　
このような設定で使用した培地は、力価には影響しなかったようであるが、細胞培地の生存率には影響した（表４）。
特に、グルタミンを含有するバッチ添加物で添加した分を含み、より高いグルタミン濃度を持つ培地は、より低い生存率を有した。グルタミン濃度が高いほど、より高いアンモニアレベルが培養内に蓄積した。これは、他者
から報告された、アンモニウムが増殖、生存率及び産生物の質に及ぼす悪影響と一致する。よって、培地の生存率の低さは、その培地へのグルタミンの添加に起因するものである
　
（刊２−７）　
「
Example 2: Results from the second set of experiments
　A second set of experiments investigated the impact of varying glutamine levels in addition to pH and batch feed. Glutamine was removed from the batch feed composition to separate the effects of batch feed and glutamine. The best temperature (34℃), temperature shift timing (24hrs), butyrate concentration (0 mM) and Media (A) combination deduced from the first set of experiments was used as a baseline for the second set of screening experiments. The results in 　Table 5 …　
　The factor of pH shift had a negative impact while batch feed had a positive impact on titer. Therefore, it is preferred to not reduce pH during the culturing or production phases. Evidence for the main effect of glutamine on titer was not strong; however glutamine appeared to interact with pH. Figure 2 shows that highest maximum ammonium level correlates with highest glutamine cases (15mM). Ammonium levels decrease in all cases as the culture progresses. There are reports in the literature that high ammonium levels lower intracellular pH. For example, one model for CHO cells predicted a severe decrease in pH in the presence of ammonium, both endogenous and exogenous, even at the moderate level of a few millimolar ammonium (see Wu et al., 1993 and 1992, supra). 　
　Figure 3 shows a negative impact on viability with increasing glutamine levels. A significant decrease in CHO culture viability in relation to the higher ammonium levels was reported in literature by other researchers (see Yang, M., and Butler, M. Effect of Ammonia on the Glycosylation of Human recombinant Erythropoietin in Culture, Biotechnol. Prog., 2000, 16(5):751-759). The present results are consistent with this. 　
　Higher osmolality was measured in the cultures with high glutamine and second batch feed addition. The glucose component of the batch feed was one of the contributors to higher osmolality. Glutamine also impacted osmolality due to higher lactate production with higher glutamine levels and higher base addition to these cases to control the pH. Cultures with higher osmolality had higher volumetric titers. See Figure 1. This finding is consistent with reports in literature showing an increase in specific productivity with increasing osmolality (See, for example, Chen, M. and Forman, L. W., Polypeptide Production in Animal Cell Culture. 1999, and U.S. Patent No. 5,856,179).」（３８頁７行〜３９頁２２行）　
（訳文）　
「【０１０５】　
実施例２：第二設定の実験の結果　
第二設定の実験では、ｐＨ及びバッチ添加物に加えて、様々なグルタミンレベルの影響を調査した。
培地（Ａ）の組合せを、第二設定のスクリーニング実験の基準として用いた
【０１０６】　
表５（省略）　
【０１０７】　
要因ｐＨシフトは力価に悪影響を及ぼし、一方、バッチ添加物はプラス効果を及ぼした。従って、培養又は産生段階の間、ｐＨは低減させないほうが好ましい。グルタミンが力価に主効果を持つという証拠は強いものではなかった；しかし、グルタミンはｐＨと相互作用するようであった。
図２は、最も高いアンモニウムレベルが、グルタミンの最も高いケース（１５mM）と相関することを示す
【０１０８】　
図３は、グルタミンレベルの増加が及ぼす生存率への悪影響を示す。高アンモニウムレベルに関連するＣＨＯ培養生存率の大幅な低下は、他の研究者によって文献報告されている
今回の結果はこれと一致する。
　
（刊２−８）　
「
Example 3: Results of the third set of experiments
　As shown herein, osmolality is one of the significant variables in cell culture processes. It can be impacted by various parameters. For example, media components, especially glutamine and glucose, impact osmolality by their concentration levels or by affecting the accumulation of by-products lactate and ammonia.　 
　The effects of glucose batch feeding and glutamine concentration on osmolality and product titer was investigated in more detail in a third set of experiments. All cell cultures were maintained at a glucose concentration of at least about 3 g/L to promote cell viability. In the test cultures, glucose additions on day 4 or 5 were primarily used to increase osmolality. In these experiments, glucose was omitted from the second batch feed only and glutamine was omitted from both batch feeds. All cultures had an initial 5mM glutamine, level and later additions of glutamine and glucose were made using concentrated glutamine and glucose solutions.　
　Table 6 shows the results of data analysis for titer response for this third set of experiments. A very small P-value calculated for glucose indicates that it is a significant factor for the titer response. A positive parameter estimate shows that addition of glucose impacts the response in a positive way. Increasing the number of batch feeds also had a positive impact on titer. In these experiments, batch feed was added once (day 2) or twice (day 2 and day 4 or 5), and it was observed that two batch feed additions had statistically significant beneficial effects. In these expermiments, glutamine did not have a significant impact on titer.　
　Table 6. …　
　The results of this third set of experiments also showed a very significant negative linear correlation between cell culture viability and glutamine levels. 」（３９頁２４行〜４０頁１６行）　
（訳文）　
「【０１０９】　
実施例３：第三設定の実験の結果　
ここで示すように、重量モル浸透圧濃度は細胞培養プロセスにおける有意な変数の１つである。それは種々のパラメーターにより影響され得る。例えば培地成分、特にグルタミン及びグルコースは、その濃度レベルにより、又は
副産物である乳酸塩及びアンモニアの蓄積
第三設定の実験では、グルコースバッチ添加物とグルタミン濃度が重量モル浸透圧濃度と産生物力価に及ぼす影響について、より詳細に調査した。全ての細胞培養を、細胞生存率を向上するために少なくとも約３g/Lのグルコース濃度で維持した。検査培養で、まず４又は５日目に、重量モル浸透圧濃度を増加するためにグルコース添加を行った。これらの実験では、グルコースを第二のバッチ添加物からのみ省き、グルタミンを両方のバッチ添加物から省いた。
全ての培養が、最初５mMのグルタミンレベルを有し
【０１１０】　
表６は、第三設定の実験の、力価応答に関するデータ分析の結果を示す。グルコースについて算出された非常に低いＰ値は、それが力価応答の有意な要因であることを表す。プラスの推定パラメーターは、グルコース添加が応答にプラス影響を持つことを示す。バッチ添加物数の増加もまた力価にプラス影響を及ぼした。これらの実験で、バッチ添加物は１回（２日目）又は２回（２日目と４又は５日目）添加され、２回のバッチ添加物の添加は統計的に有意な有益な効果を持つことが観察された。これらの実験で、グルタミンは力価に有意な影響を及ぼさなかった。　
【０１１１】　
表６（省略）　
【０１１２】　
第三設定の実験の結果はまた、細胞培養生存率とグルタミンレベル間の、非常に有意な負の線形相関を示した。」　
　
（刊２−９）　
「
Example 4: Results of the fourth set of experiments
　A fourth set of experiments investigated by-product accumulation by examining the use glutamate as an alternative to glutamine in the cell culture medium. Seed density, final temperature (using a different range of temperatures compared to the first experiment), and the glucose regimens were other factors investigated. Significant individual effects for seed density, glutamine versus glutamate, temperature and glucose regimens were determined for titer response. Seed density was also noted to interact with temperature. Lower temperature with higher seeding density is preferred for higher product titers. If the seeding density is low, however, temperature has little effect. Figure 4 summarizes the accumlation of by-products ammonium ion and lactate for all the experiments in this fourth set of experiments. Maximum ammonium levels are shown on the y axis. On the z-axis (vertical bars), Na+ concentration represents the concentration of added Na2CO3  required to neutralize lactate as a means for controlling pH in the medium, thus allowing the Na+ concentration to reflect the amount of lactate produced during the production phase. Glutamine concentrations are indicated on the x-axis. The final glutamine concentration in the production phase varies, right to left on the x-axis, from 0mM glutamine, to 5mM glutamine, to l0mM glutamine (5mM initial concentration, with glutamine added as batch feed to l0mM), to 15mM glutamine (l0mM initial concentration, with glutamine added as batch feed to 15 mM). Glutamate was present in the culture medium at a concentration of 5mM in the experiment with OmM glutamine. Temperature is indicated in the shaded circles atop the vertical bars as shades of grey, where dark grey representing 35 ℃ as high temperature, while the lightest grey represents low temperature of 31 ℃. Intermediate shades of darker and lighter grey represent 34 ℃ and 33 ℃, respectively. Each vertical bar represents the results of an individual experiment in this fourth set of experiments. Thus, Fig. 4 shows that 5 mM glutamate (at 0mM glutamine) leads to the lowest level of by-product accumulation (shortest vertical bars at low NH4 +  concentration) regardless of the culture temperature. Other researchers have reported generation of minimal quantities of lactate and ammonium upon substitution of glutamine with glutamate (See, Altamirano, C, Paredes, C, Cairo, J.J., and Godia, F., Improvement of CHO Cell Culture Medium Formulation: Simultaneous Substitution of Glucose and Glutamine. Biotechnol. Prog. 2000, 16:69-75). 」（４１頁１〜３１行）　
（訳文）　
「【０１１４】　
実施例４：第四設定の実験の結果　
第四設定の実験では、細胞培地でのグルタミンの代替物としてのグルタミン酸の使用を考察して、副産物の蓄積を調査した。播種密度、最終温度（第一の実験とは異なる温度範囲を使用）及びグルコース投与法を他の要因として調査した。播種密度、グルタミン対グルタミン酸、温度及びグルコース投与法に関する有意な個々の影響を力価応答について決定した。播種密度はまた温度と相互作用することがわかった。より高い播種密度でより低い温度であるのが、より高い産生物力価に好ましい。しかし播種密度が低いと、温度は殆ど影響を持たない。図４は、この第四設定の全実験における、副産物である乳酸塩及びアンモニアの蓄積をまとめたものである。最大アンモニウムレベルをｙ軸上に示した。ｚ軸（縦棒）上では、Ｎａ+濃度が、乳酸塩の中和に必要な、培地のｐＨを制御するための手段として添加されたＮａ２ＣＯ３の濃度を表し、よってＮａ+濃度は産生段階中に産生された乳酸塩の量を反映することができる。グルタミン濃度はｘ軸上に示す。産生段階における最終グルタミン濃度は、ｘ軸の右から左へ、０mMグルタミンから５mMグルタミンへ、１０mMグルタミンへ（最初５mM濃度で、バッチ添加物としてのグルタミン添加により１０mMへ）、１５mMグルタミンへ（最初１０mM濃度で、バッチ添加物としてのグルタミン添加により１５mMへ）変化する。グルタミン０mMの実験では、グルタミン酸は５mMの濃度で培地中に存在する。温度は縦棒先端の影付き円のグレーの濃さで示し、濃いグレーは「高温」として３５℃を表し、最も明るいグレーは３１℃の「低温」を表す。中間の濃さは、より濃いグレーが３４℃、より明るいグレーが３３℃をそれぞれ表す。各縦棒は、この第四設定の実験の各実験の結果を表す。従って図４は、培養温度に関わらず、５mMのグルタミン酸（０mMのグルタミンで）が最も低いレベルの副産物の蓄積（ＮＨ4 + 濃度が低く、縦棒が最も低い）をもたらすことを示す。他の研究者は、グルタミン酸をグルタミンの替わりとした時の、最小量の乳酸塩及びアンモニアの生成を報告している（Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J. J., 及びGodia, F., Improvement of CHO Cell Culture Medium Formulation: Simultaneous Substitution of Glucose and Glutamine. Biotechnol. Prog. 2000, 16:69-75参照）。」　
　
（刊２−１０）　
「
Example 5: Product Quality
　Product quality was evaluated for selected antibodies produced by the method of the invention by analyzing the percentage of antibody glycans having zero, one, or two terminal galactose residues. Antibody glycan distribution, and particularly terminal galactosylation, has profound affects on complement recognition, immune modulation by ADCC (antigen-dependent cytotoxic cellular) response, aggregation of the antibody. Preferably, the percentage of glycans having zero galactose residues (GO) is less than about 80%, more preferably less than about 70%, even more preferably less than about 60%, and most preferably about 55% or less.　
　By-product accumulation adversely affects product antibody quality. One byproduct, ammonium ion, had an adverse affect on terminal galactosylation and, as a result, had an adverse affect on antibody quality. Several cell cultures were shown to have varying levels of ammonium accumulation at the end of the production phase. Table 8 shows quality data, as glycan distribution, as a function of ammonium ion accumulation in the production phase culture medium for antibodies isolated from these cultures. The ammonia levels correlated with increasing glutamine concentration and the total amount of glucose added to the production phase culture medium. Each of the ammonium ion levels shown in Table 8 was the maximum level measured throughout the cell culture process. The data indicate a negative impact of increasing ammonia levels on glycan distribution. As the maximum ammonium concentration increased from 4 to 13 mM, a concurrent increase (36%) in the percentage of G0 glycans was observed, thereby indicating a decrease in terminal galactosylation. Other researchers also showed that ammonium in the culture medium affects glycolysation (see Chen, 1999, supra). They reported a significant increase in the heterogeneity of the glycoforms and a reduction of the sialylation at 20 mM NH4 C1. A 40% decrease in terminal galactosylation was observed as ammonium increased from 1 mM to 15mM post growth phase with CHO cells, as reported by another group (See Gawlitzek, M., Ryll, T., Lofgren, J., Sliwkowski, M. B., Ammonium Alters N-Glycan Structures of Recombinant TNFR-IgG: Degradative Versus Biosynthetic Mechanisms, Biotechnology and Bioengineering, 2000, 68:637-646).　
」（４２頁１行〜４３頁６行）　
（訳文）　
「【０１１５】　
実施例５：産生物の質　
ゼロ、１又は２末端ガラクトース残基を有する抗体グリカンのパーセンテージを分析することにより、本発明の方法で産生した、選択した抗体について産生物の質を評価した。抗体グリカン分布、及び特に末端ガラクトシル化は、補体認識、ＡＤＣＣ（antigen-dependent cytotoxic cellular：抗原依存性細胞障害）応答による免疫変調、抗体の集合に対し重大な影響を持つ。好適には、ゼロガラクトース残基（Ｇ０）を持つグリカンのパーセンテージは約８０％未満、より好ましくは約７０％未満、さらに好ましくは約６０％未満、最も好ましくは約５５％未満である。　
【０１１６】　
副産物の蓄積は、産生物である抗体の質に悪影響を及ぼす。１つの副産物、アンモニウムイオンは末端ガラクトシル化に悪影響を持ち、その結果抗体の質に悪影響を及ぼした。複数の細胞培養は、産生段階の最後に様々なレベルのアンモニウム蓄積を有することが示された。表８は、産生段階の培地中のアンモニウムイオン蓄積の、これら培養から分離された抗体に対する関数として、グリカン分布としての質データを示す。アンモニアレベルは、増加するグルタミン濃度、及び産生段階の培地に添加されたグルコースの総量と相関した。表８に示した各アンモニウムイオンレベルは、細胞培養プロセス中に測定された最大レベルである。データは、増加するアンモニアレベルがグリカン分布に悪影響を及ぼすことを示す。最大アンモニウム濃度が４から１３mMに増加すると、同時にＧ０グリカンのパーセンテージの増加が観察され、これは末端ガラクトシル化の減少を示唆する。他の研究者も、培地中のアンモニウムが解糖に影響することを示した（Chen, 1999, 上掲参照）。彼等は、２０mMのＮＨ４Ｃｌでのグリコフォームの不均一性の著しい増加と、シアリル化の減少を報告した。他のグループの報告によると、ＣＨＯ細胞での増殖段階前にアンモニウムが１mMから１５mMに増加すると、末端ガラクトシル化の４０％の減少が観察された（Gawlitzek, M., Ryll, T., Lofgren, J., Sliwkowski, M. B., Ammonium Alters N-Glycan Structures of Recombinant TNFR-IgG: Degradative Versus Biosynthetic Mechanisms, Biotechnology and Bioengineering, 2000, 68:637-646参照）。　
【０１１７】　
」
　
（刊２−１１）　
「The present invention allows for reduced levels of glutamine, e.g, less than 5 mM, to be used in a cell culturing medium, thereby reducing lactate and ammonium ion accumulation. Surprisingly, the present invention allows an increased level of glucose without causing an increase in by-product accumulation. The higher glucose levels result in increased osmolality and enhanced polypeptide (e.g. antibody) productivity and antibody quality.」（４３頁８〜１３行）　
（訳文）　
「【０１１８】　
本発明は、低レベル、例えば５mMのグルタミンの、細胞培地での使用を可能にし、それにより酪酸塩（当審注；正しくは乳酸塩（lactate））及びアンモニウムイオンの蓄積を低減する
　
（刊２−１２）　
「　
」　
　
（刊２−１３）　
「　
」　
　
（３）原査定の拒絶の理由に引用された本願の優先日前に頒布された刊行物３（原査定の引用文献５）に係るCytotechnology, 1994, Vol.16, p.37-42には、以下の事項が記載されている。　
　なお、訳文は当審によるものであり、下線は当審が付したものである。 
　
（刊３−１）　
「Glutamine is the major source of ammonium, which has been shown to inhibit mammalian cell growth including CHO cells (Kurano et al. 1990; Newland et al. 1990; Schlaeger  Schumpp 1989).  The free form of glutamine decomposes spontaneously with a half life of only 7 days (Negrotti et al. 1988) or is metabolized by the cells. The concentration of glutamine is usually high in most growth media. In the lag phase and the early exponential phase, the cell concentration is still low and the ammonium formed primarily derives from spontaneous decomposition of glutamine. 　
　To avoid the problems with ammonium, glutamine has been replaced by another nitrogen source in medium for CHO cells (Kurano et al. 1990). Asparagine is transported into the cell by the same transport system as glutamine (the ASC system) (Shotwell et al. 1981). When metabolized by the cells or decomposed spontaneously, it leads to precisely as much ammonium as  glutamine does, but the free form of asparagine has a half life of 87 days (MEM-α medium + 10% FCS, 37℃) (Kurano et al. 1990). This means, that the contribution of ammonium from decomposition is very small. One of the advantages of using asparagine instead of glutamine is that large amounts of asparagine can be added from the beginning of the cultivation without the contribution from decomposition getting particularly high. When using glutamine, it is necessary to add small amounts at short intervals (fed-batch) in order to obtain an equivalent low ammonium concentration (Glacken et al. 1989).」（３７頁左欄１０行〜右欄下から４行）　
（訳文）　
「
グルタミンが、CHO細胞を含む哺乳動物の細胞増殖を抑制することを示されたアンモニウムの主要源である
　
アンモニウムによる問題点を避けるために、グルタミンはCHO細胞のための培地において他の窒素源と置換されてきた
　
（刊３−２）　
「　
」（３９頁）　
（訳文）　
「表１．生存力、最大生存細胞濃度、アンモニウムとｔ−ＰＡの最終（すなわち最大）濃度　
血清を含む培地について、最大ｔ−ＰＡ濃度は最終濃度ではない。血清含有培地においては、細胞濃度は測定不可能である。＠は、血清含有培地においては、細胞は足場依存性であり、細胞増殖は注意深く顕微鏡で毎日、グルコース消費とｔ−ＰＡ生産により追跡された。アンモニウムとｔ−ＰＡ生産から得られる結果は信頼できると考える。　
」　
　
（刊３−３）　
「Our motivation for manipulating with asparagine and glutamine was the problems with the toxicity of ammonia, but it did not give rise to a large variation in the results, so ammonia inhibition does not appear to be a key factor for this cell line as observed with other cell lines (Kurano et al. 1990; Newland et al. 1990; Schlaeger  Schumpp 1989). We will not go so far as to state, that ammonia may be beneficial for production, we think it is rather the availability of glutamine/asparagine or other amino acids that benefits productivity. The results show, that it may be beneficial to substitute at least part of the glutamine with asparagine, if not for any other reason, it gives a more stable cultivation medium.」（４１頁右欄１２〜２５行）　
（訳文）　
「アスパラギンとグルタミンを操作することについての我々の動機づけは、アンモニアの有毒性の問題であったが、それは結果において大きな変動値をもたらさなかったことから、アンモニアの阻害が、他の細胞株で観察されたのと同様にこの細胞株にとっても鍵となる因子であるとは思われない（Kuranoら1990年；Newlandら1990年；Schlaeger ＆ Schumpp 1989年）。我々は、アンモニアが物質生産に有益であるとまでは言わないが、我々は生産力に役立つのはどちらかと言えばグルタミン／アスパラギンあるいは他のアミノ酸の利用可能性であると考える。
これらの結果からは、少なくともグルタミンの一部をアスパラギンで代用することが有益であると考えられ
　
３　刊行物１記載の発明 　
　刊行物１の請求項１５４について，請求項１３１のヒト化抗体に注目し（刊１−１），整理すると，刊行物１には以下の発明が記載されていると認められる。 
　
「抗体が産生されるような条件下で、βアミロイドペプチド（Ａβ）に特異的に結合するヒト化抗体をコードする単離された核酸分子を含んで成る宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞もしくは培養物から前記抗体を単離することを含んで成る、抗体の製造方法。」（以下，「刊行物１発明」という。） 
　
４　刊行物２記載の発明 
　刊行物２の実施例２（摘示（刊２−７）、（刊２−１２）、（刊２−１３））の
グルタミン５ｍＭの培地Ａ
「以下のアミノ酸組成（ｍＭ）を有するＣＨＯ細胞培養培地Ａ　
　アラニン　　　　　　　　　　　　　　０．６９９３　
　アルギニン、一塩酸塩　　　　　　　　７．４１０　　
　アスパラギン、一水和物　　　　　　　４．２７７　
　アスパラギン酸　　　　　　　　　　　３．８４４　
　システイン、一塩酸塩、一水和物　　　１．４００　
　シスチン、二塩酸塩　　　　　　　　　０．１９９８　
　グルタミン酸　　　　　　　　　　　　０．６９９４　
　
グルタミン　　　　　　　　　　　　　５．０００
　グリシン　　　　　　　　　　　　　　４．９４１　
　ヒスチジン、一塩酸塩、一水和物　　　０．８９８２　
　イソロイシン　　　　　　　　　　　　３．０３３　
　ロイシン　　　　　　　　　　　　　　４．４９７　
　リジン、一塩酸塩　　　　　　　　　１２．１２　
　メチオニン　　　　　　　　　　　　　１．２３４　
　フェニルアラニン　　　　　　　　　　０．６０９７　
　プロリン　　　　　　　　　　　　　　２．０９８　
　セリン　　　　　　　　　　　　　　　６．０４１　
　トレオニン　　　　　　　　　　　　　７．０４４　
　トリプトファン　　　　　　　　　　　０．４４４０　
　チロシン、二ナトリウム塩、二水和物　１．０４７　
　バリン　　　　　　　　　　　　　　　４．５０３　」　
（当審注：アミノ酸以外の組成は省略する。総アミノ酸濃度は７２．０４ｍＭとなる。）　
　
５　対比 
　補正発明と刊行物１発明とを対比する。 
　
（１）抗−Ａベータ抗体とその遺伝子、培養される細胞について　
  補正発明の「抗−Ａベータ抗体」について、本願明細書段落【００４１】にも、「 一の具体例において、抗体は、アミロイド前駆タンパク質のＡβフラグメントまたはアミロイド斑の他の成分に特異的に結合する抗体であり、アルツハイマー病を特徴つける脳におけるアミロイド斑の蓄積に対して有用である（例えば、米国仮出願番号第６０／６３６，６８４号）。」と記載されており、刊行物１発明の「βアミロイドペプチド（Ａβ）に特異的に結合するヒト化抗体」は補正発明の「抗−Ａベータ抗体」に相当する。　
　また、当該抗体をコードする、刊行物１発明の「単離された核酸分子を含んで成る宿主細胞」は、補正発明の「遺伝子を含有する哺乳動物細胞」とは、当該抗体をコードする「遺伝子を含有する細胞」である点で共通する。　
　そして、刊行物１発明は、「抗体が産生されるような条件下で」、上記抗体をコードする「単離された核酸分子を含んで成る宿主細胞を培養すること」、「を含んで成る、抗体の製造方法。」であるから、上記抗体をコードする「単離された核酸分子」は、「細胞培養条件下で発現して抗−Ａベータ抗体を生産する」遺伝子である。　
　よって，刊行物１発明の「抗体の製造方法」と，補正発明の「抗−Ａベータ抗体の製造方法」とは，「細胞培養における抗−Ａベータ抗体の製造方法であって、抗−Ａベータ抗体をコードし、細胞培養条件下で発現して抗−Ａベータ抗体を生産する遺伝子を含有する細胞を含む細胞培養物を供給することを含む方法」という点で共通する。　
　
（２）抗体を細胞培養物中に堆積させる工程について　
　刊行物１発明の「抗体の製造方法」は、宿主細胞を培養することに加え、該宿主細胞もしくは培養物から前記抗体を単離することを含むものであり、「単離する」ためには当然に、少なくとも単離できる程度の抗体が培養物中に堆積するまでの期間、培養物が維持されることが前提であるから、刊行物１発明は、補正発明とは、「所定の期間、該培養物を維持して、抗−Ａベータ抗体を細胞培養物中に堆積させる工程を含む方法」である点でも、共通する。　
　
（３）培地と培養条件について　
　刊行物１発明は，上記したように，補正発明と同じ「抗−Ａベータ抗体」が細胞培養により生成物として得られる方法であるが，細胞培養に用いられる培地、その他の培養条件については規定がなく，培養の詳細な工程が不明である。 
　
（４）小括　
　したがって，補正発明と刊行物１発明との間には，次の（一致点），及び（相違点１）〜（相違点４）がある。　
　
 （一致点）　
「細胞培養における抗−Ａベータ抗体の製造方法であって、下記工程：　
　　抗−Ａベータ抗体をコードする遺伝子を含有する細胞、　
ここで、該遺伝子は細胞培養条件下で発現して抗−Ａベータ抗体を生産する；　
を含む細胞培養物を供給すること；　
　　所定の期間、該培養物を維持すること；　
を含む方法。」　
 　 
 （相違点１）　
　細胞培養が，補正発明では「大規模生産」であるのに対し，刊行物１発明ではそのように特定されていない点。　
 　　 
 （相違点２）　
　培養される細胞が、補正発明では「哺乳動物細胞」であるのに対し，刊行物１発明ではそのように特定されていない点。　
　
 （相違点３） 
　補正発明では，細胞培養物は「グルタミンを含有し、かつ、２未満の累積アスパラギンに対する累積グルタミンのモル比を有し、さらに、（ｉ）７０ｍＭを超える累積アミノ酸濃度、（ｉｉ）０．２未満の総累積アミノ酸に対する累積グルタミンのモル比、（ｉｉｉ）０．４〜１の総累積アミノ酸に対する累積無機イオンのモル比、（ｉｖ）１６ｍＭを超えるグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積濃度、およびそれらの組合せからなる群から選択される培地特性を有する培地」を含むものであるのに対し，刊行物１発明では培地について記載がない点。　
　
 （相違点４）　
　補正発明では，培養条件が「初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１のセットの培養条件下に維持された場合に、該細胞が可能な最大生存細胞密度の２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度を得るのに十分な第１の期間、第１のセットの培養条件下で該培養物を維持する工程；　
　　少なくとも１つの培養条件を変更して、第２のセットの培養条件を適用する工程、ここで、少なくとも１つの培養条件を変更する工程における該細胞培養条件は、
（ｉ）温度、（ｉｉ）ｐＨ、（ｉｉｉ）重量オスモル濃度、（ｉｖ）化学誘導剤レベル、およびそれらの組合せからなる群から選択される； および　
　　第２のセットの条件下、第２の期間、該培養物を維持して、抗−Ａベータ抗体を細胞培養物中に堆積させる工程」を含むものであるのに対し，刊行物１発明では培養条件について何ら特定がない点。　
　
６　検討・判断　 
　
（１）相違点１について　 
　本願明細書には，大規模細胞培養生産について，段落【００１６】及び【００８８】に、バイオリアクターの体積は、少なくとも５００リットルであることが記載されている。　
　これに対し，刊行物１にはバイオリアクターの体積についての言及がないが、物質生産において収量の向上は自明な課題であって、細胞培養による抗体製造を「大規模」とすることは、当業者が容易に想到し得たことである（摘示（刊２−２）等）。　
　
（２）相違点２について　 
　刊行物１には、抗体を発現かつ産生させるのに「哺乳動物組織細胞培養物」を使用してよいことが記載され、好ましい宿主細胞として、ＣＨＯ細胞（当審注：チャイニーズハムスター卵巣細胞）が例示されており（摘示（刊１−２））、培養する細胞として、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を採用することに格別の創意を見出せない。　
　
（３）相違点３について　 
　哺乳動物細胞の培養でポリペプチドを産生する方法において、哺乳動物細胞を増殖するために使用される栄養溶液である培地が必要であることは当業者に自明である（摘示（刊２−３）等参照）。　
　ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞の培養による抗体等のポリペプチドの製造方法について記載された刊行物２には、培地中のグルタミン量を低減することにより、細胞増殖に不利益をもたらすアンモニウムイオンを低減させ、細胞生存率の低下を抑制することができること（摘示（刊２−６）、（刊２−７））、培地中のグルタミン量を５ｍＭ程度とし得ることが記載されている（摘示（刊２−１１）、（刊２−１２）、（刊２−１３））。また、刊行物３には、グルタミンが ＣＨＯ細胞を含む哺乳動物の細胞増殖を抑制するアンモニウムの主要源であることから、培地中のグルタミンの代替物としてアスパラギンが検討されていたことが記載されている（摘示（刊３−１）、（刊３−３））。　
　ここで、刊行物２に記載された実施例２のグルタミンレベルの影響の検討において、グルタミン量を低減し５ｍＭとした培地Ａの組成（刊行物２発明）では、累積アスパラギンに対する累積グルタミンのモル比は、４．２８ｍＭに対し５．００ｍＭであり１．１７となり、これは２未満である。また、総累積アミノ酸に対する累積グルタミンのモル比は、７２．０ｍＭに対し５．００ｍＭであり０．０６９４となり、これは０．２未満である。また、当該７２．０ｍＭは、「７０ｍＭを超える総累積アミノ酸濃度」でもある。　
　そうすると、刊行物１発明の細胞培養において、細胞生存率の低下を抑制することを目的として、他のアミノ酸に対するグルタミンのモル比に着目した刊行物２発明の培地を採用することは、当業者が容易に想到し得る事項であるし、累積グルタミンの、累積アスパラギンと総累積アミノ酸に対する、それぞれ２未満、０．２未満のモル比は、刊行物２発明の培地がその範囲にあることからも理解されるように、上記の目的を達成するために自ずと定まるものであって、格別のものとはいえない。　
　
（４）相違点４について　 
　哺乳動物細胞の培養でポリペプチドを産生する方法において、哺乳動物細胞を増殖するための培養条件の最適化は、当業者に自明の課題であり、ＣＨＯ細胞系を用いて種々の組換えタンパク質を発現させる際に、対数増殖期に温度シフトを行うことにより、組換えタンパク質の発現量が増加することが、本願の優先日前に周知の事項であった（刊行物Ａ，刊行物Ｂ，刊行物Ｃ参照）。　
　ここで、刊行物Ａにおいて実証された「培養温度を３７℃から３２℃へシフトさせる最適な時点」は３日間の細胞成長の後の温度シフトであり（摘示（刊Ａ−１））、該時点の生存細胞密度は図１のグラフ（摘示（刊Ａ−２））から最大生存細胞密度の約６０％であって、対数増殖期である。したがって、刊行物Ａの記載からは、最大生存細胞密度の約６０％の生存細胞密度を得るのに十分な第１の期間である３日間（７２時間）、第１の培養条件である３７℃で培養物を維持し（摘示（刊Ａ−２））、温度条件を３２℃に変更した第２の培養条件下、該培養物を維持することにより、温度シフトを定常期、すなわち、最大生存細胞密度に達する４日（９６時間）後以降に行う場合に比較して、組換えタンパク質生産量が増大すること（摘示（刊Ａ−３）、（刊Ａ−４））が理解される。　
　刊行物Ｂには、対数増殖期にあり、最大生存細胞密度の５９％の生存細胞密度を得るのに十分な第１の期間である６２時間、第１の培養条件である３６℃で培養物を維持し、温度条件を３２℃に変更した第２の培養条件下、該培養物を維持することにより、温度シフトを定常期、すなわち、最大生存細胞密度に達する９８時間後に行う場合に比較して、組換えタンパク質生産量が増大すること（摘示（刊Ｂ−３））が記載されている。　
　刊行物Ｃには、図５として、細胞密度と組換えタンパク質生産率について、３７℃で７２時間培養後に３０℃へ温度シフトさせる場合（細胞密度×、生産率●）と温度シフトさせない場合（細胞密度□、生産率▼）のグラフが記載されており、７２時間時点の生存細胞密度（□）は、１２０時間で達する最大生存細胞密度の約３０％であって、対数増殖期である。したがって、刊行物Ｃの記載からは、最大生存細胞密度の約３０％の生存細胞密度を得るのに十分な第１の期間である７２時間、第１の培養条件下で３７℃で培養物を維持し、温度条件を３０℃に変更した第２の培養条件下、該培養物を維持することにより、温度シフトを行わない場合に比較して、組換えタンパク質生産量が増大することが理解される（摘示（刊Ｃ−２））。　
　そうすると、刊行物１発明の細胞培養において、組換えタンパク質発現量を増加させることを目的として、対数増殖期に培養条件を変更することは、当業者が容易に想到し得る事項であるし、補正発明における培養条件変更の時期である「最大生存細胞密度の２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度を得るのに十分な第１の期間」も、上記刊行物Ａないし刊行物Ｃに記載された温度シフト時期の細胞密度が、それぞれ約６０％、５９％及び約３０％であってその範囲内にあることから理解されるように、上記の目的を達成するために当業者が適宜設定するものである。　
　
刊行物Ａ：BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，2004年，vol.85 no.2，pp.177-184（審尋の周知文献６）　 
　なお、訳文は当審によるものであり、下線は当審が付したものである。 
 
（刊Ａ−１）　 
「Abstract: The Chinese hamster ovary (CHO) cell line producing interferon-γ(IFN-γ) exhibits a 2-fold increase in specific productivity when grown at 32℃ compared to 37℃. Low temperature also causes growth arrest, meaning that the cell density is significantly lower at 32℃, nutrients are consumed at a slower rate and the batch culture can be run for a longer period of time prior to the onset of cell death. At the end of the batch, product concentration is doubled at the low temperature. However, the batch time is nearly doubled as well, and this causes volumetric productivity to only marginally improve by using low temperature. One approach to alleviate the problem of slow growth at low temperature is to utilize a biphasic process, wherein cells are cultured at 37℃ for a period of time in order to obtain reasonably high cell density and then the temperature is shifted to 32℃ to achieve high specific productivity. Using this approach, it is hypothesized that IFN-γ volumetric productivity would be maximized. We developed and validated a model for predicting the optimal point in time at which to shift the culture temperature from 37℃ to 32℃. It was found that by shifting the temperature after 3 days of growth, the IFN-γ volumetric productivity is increased by 40% compared to growth and production at 32℃ and by 90% compared to 37℃, without any decrease in total production relative to culturing at 32℃ alone. The modeling framework presented here is applicable for optimizing controlled proliferation processes in general.」（１７７頁左欄１〜２８行）　
（訳文）　
「要約：インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を生産するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系は３７℃と比較して３２℃で培養されるとき、特定の生産性において2倍の増加を示す。低温はまた成長阻害をも引き起こし、これは、３２℃では細胞密度が顕著に低下し、栄養がより遅い速度で消費され、回分培養が細胞死が始まる前により長い期間行なわれ得ることを意味する。回分培養の終了時に、生産物濃度は低温において２倍となる。しかしながら、培養時間も同様にほぼ２倍となり、そしてこれは、低温を使うことによって、容積生産性をただかろうじて改善させるだけである。低温での遅い成長の問題を軽減する１つのアプローチが、二相性プロセスを利用することである。このプロセスにおいて、
細胞は適度に高い細胞数密度を得るために一定期間３７℃で培養され、そして次に高い特定の生産性を達成するために３２℃に温度シフトされる
我々は培養温度を３７℃から３２℃へシフトさせる最適な時点を予測するためのモデルを発展させ実証した。３日間の細胞成長の後の温度シフトにより、ＩＦＮ−γの容積生産性を、３２℃のみで培養される場合の総生産量の減少を伴わずに、３２℃で成長と生産を行った場合と比較して４０％増加させること、３７℃で成長と生産を行った場合と比較して９０％増加させることが見いだされた。ここで示されたモデリングフレームワークは、制御された細胞増殖プロセスの最適化に関して、一般的に適用可能である
　
（刊Ａ−２）　
「　
」（１７８頁左下）
（訳文）　
「図１．低温による細胞成長の抑制　３２℃(○) と３７℃(□)における細胞濃度データ」　
　
（刊Ａ−３）　
「　
」（１８１頁右下）
（訳文）　
「図９．温度シフト日の関数としての回分培養終了時の全ＩＦＮ−γ生産量　
サンプルはデキストロースが枯渇した日に採取した。そしてそれは高い細胞生存力の最終日と一致する。
モデル予測（−）と実際のデータ（□）を比較した。シフト日 「０」は、培養が３２℃のみで行なわれたことを意味し、「∞」は、培養が３７℃のみで行なわれたことを意味する。」　
　
（刊Ａ−４）　
「　
」（１８２頁左上）
（訳文）　
「図１０．温度シフト日の関数としての容積測定でのＩＦＮ−γ生産力　 
所定の処理単位での全ＩＦＮ−γ生産量は処理単位完了に必要とされる日数によって正規化された。　
モデル予測（−）と実際のデータ（□）を比較した。シフト日 「０」は、培養が３２℃のみで行なわれたことを意味し、「∞」は、培養が３７℃のみで行なわれたことを意味する。」　
　
 （刊Ａ−５）　 
「For industrial application, the model could be further refined by including downtime for reactor shutdown, cleaning, sterilization, and inoculation. 」（１８３頁左欄２２〜２４行）　
（訳文）　
「工業化への応用のために、このモデルは反応器の運転停止、洗浄、消毒と細胞接種のための稼働停止時間を含むことによって、さらに詳細なものとされ得る。」　
　
刊行物Ｂ：特開平９−７５０７７号公報（審尋の周知文献７）　 
 （刊Ｂ−１）　 
「【請求項１】動物細胞を培養する際に、増殖可能な温度で細胞を増殖させた後、培養温度を低下させることを特徴とする有用物質生産のための培養方法。　
【請求項２】動物細胞が、遺伝子組み換え細胞である請求項１に記載の培養方法。　
【請求項３】低下させた培養温度が３０〜３５℃である請求項２に記載の培養方法。　
【請求項４】動物細胞が、３０〜３５℃の培養温度において十分な物質生産性を示す遺伝子組み換え細胞である請求項３に記載の培養方法。　
【請求項５】動物細胞が、恒温動物に由来する遺伝子組み換え細胞である請求項４に記載の培養方法。　
【請求項６】動物細胞が、哺乳動物に由来する遺伝子組み換え細胞である請求項５に記載の培養方法。　
【請求項７】動物細胞が、齧歯類に由来する遺伝子組み換え細胞である請求項６に記載の培養方法。　
【請求項８】動物細胞が、ＣＨＯ細胞（チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞) に由来する遺伝子組み換え細胞である請求項７に記載の培養方法。」　
　
 （刊Ｂ−２）　 
「【００１３】本発明者らは、
ＣＨＯ細胞を宿主とするアミド化酵素(AE)産生浮遊細胞である3μ-1S 細胞(Animal Cell Technology: Basic  Applied Aspects, Vol. 5, 493-499 (1993)及び参考例２参照）に及ぼす培養温度の影響について、細胞増殖、細胞生存率、物質(AE)生産性、培地消費量、培養上清中の目的物質(AE)の純度の側面から検討した
【００１４】その結果、３７℃未満で培養を行った場合に、細胞増殖は抑制されるものの高細胞生存率が維持され、細胞あたりの物質生産性が上昇し、培地栄養成分（アミノ酸、グルコース) の消費、代謝副産物や細胞内容物等の夾雑物質の培地への混入が抑制され、生産されたAEは質的に変化しないことを見いだした。これらの現象は、十分な細胞数が得られれば培養温度を低下させることにより、動物細胞培養による有用物質生産の大幅な効率化が可能であることを示している。　
【００１５】低温における培養を応用して物質生産を行う場合、回分培養においては、増殖に適した温度 (３６〜３８℃) で培養し細胞増殖させた後に、培養温度を低下させる方法、連続培養においては、増殖に適した温度で培養し高細胞密度となった時点で培養温度を低下させる方法が考えられる。本発明者らは、回分培養及び高密度連続培養において培養温度を３７℃未満とすることで物質生産量が飛躍的に向上することを確認し、本発明を完成した。」　
　
（刊Ｂ−３）　 
「【００３２】
参考例 3.
3 μ-1S 細胞の回分培養における最適な温度シフト時期の決定
3 μ-1S 細胞の回分培養における最適な温度シフト時期は、本実験により求めることができる。また、他の細胞株についても、本実験と同様の実験を行うことにより、回分培養における最適な温度シフト時期を知ることができる
【００３３】図15.-(A) 〜(F) は、培養における各時点で温度シフトしたときの細胞密度の推移を示している。図中の矢印は温度シフトした時点を、●は全細胞密度を、○は生細胞密度を示している。
対数増殖期（培養24〜72時間）に温度シフトした場合、細胞増殖はシフト後24時間で停止し、その後細胞密度は緩やかに減少した
定常期（培養98時間）に温度シフトした場合、培養後期の生存率低下が著しく、培養液中に極めて多くのデブリ(debris ; 死細胞の破片）が認められた
【００３４】温度シフト時期のAE生産量に及ぼす影響を図17.-(A), (B)に示す。(A) は培養時間を横軸に、(B) は温度シフト時期を横軸にとりプロットしたものである。
AE生産量は、対数増殖期に温度シフトした場合に増大し、培養62〜72時間における温度シフトによって最も増大し、9 日間(215hr) の培養で4300 units/mL に達した。一方、定常期（培養98時間）における温度シフトでは、AE生産量は低い水準(2200 units/mL 程度）に留まった
【００３５】回分培養における温度シフトによるAE生産量の増大は、前期培養温度（36℃）における細胞増殖（細胞数の確保）と、それに伴う培地成分の消耗あるいは有害代謝物の蓄積に深く関係していると考えられる。
従って本実験により得られた結果から、温度シフトの時期としては、十分にAE生産量を増大させ、かつ培地成分の消耗あるいは有害代謝物の蓄積を可能な限り低い水準に留める時点、即ち培養62時間が最も適切であると考えられる
【００３６】
しかし大量生産のためにスケールアップを行う場合、細胞増殖速度が1 L スケールで培養した場合と異なることが考えられるため
回分培養による温度シフト時期は細胞増殖を指標にすることが望ましいと考えられる
3 μ-1S 細胞の回分培養における最適な温度シフト時期は、前期培養温度（36℃）において到達し得る細胞密度の59% に達した時点と推定される
　
刊行物Ｃ：BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，1999年，vol.63 no.5，pp.573-582（審尋の周知文献８）　 
　なお、訳文は当審によるものであり、下線は当審が付したものである。 
 
（刊Ｃ−１）　 
「Abstract: Proliferation of mammalian cells can be controlled by low cultivation temperature. However, depending on cell type and expression system, varying effects of a temperature shift on heterologous protein production have been reported. Here, we characterize growth behavior and productivity of the Chinese hamster ovary (CHO) cell line XM111-10 engineered to synthesize the model-product-secreted alkaline phosphatase (SEAP). Shift of cultivation temperature from 37°C to 30°C caused a growth arrest mainly in the G1 phase of the cell cycle concomitant with an up to 1.7-fold increase of specific productivity. A low temperature cultivation provided 3.4 times higher overall product yield compared to a standard cultivation at 37°C. The cellular and molecular mechanisms underlying the effects of low temperature on growth and productivity of mammalian cells are poorly understood. Separation of total protein extracts by two-dimensional gel electrophoresis showed altered expression levels of CHO-K1 proteins after decrease in cultivation temperature to 30°C. These changes in the proteome suggest that mammalian cells respond actively to low temperature by synthesizing specific coldinducible proteins. In addition, we provide the first evidence that the cold response of mammalian cells includes changes in postranslational protein modifications. Two CHO proteins were found to be phosphorylated at tyrosine residues following downshift of cultivation temperature to 30°C. Elucidating cellular events during cold exposure is necessary for further optimization of host-cell lines and expression systems and can provide new strategies for metabolic engineering.」（５７３頁左欄１〜３１行）　
（訳文）　
「哺乳動物細胞の増殖が低い培養温度によってコントロールされ得る。しかしながら、細胞タイプと発現系に応じて、異種タンパク質生産に対する温度シフトのさまざまな効果が報告されている。
ここで、我々はモデル生産物分泌型アルカリ性ホスファターゼ（SEAP）を合成するように遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系 XM111-10の増殖挙動と生産力の特性を明らかにする。３７℃から３０℃への培養温度シフトが、主に、特定の生産力の１.７倍までの増加に付随する、細胞周期のＧ１期に成長阻害を引き起こした。
 
（刊Ｃ−２）　
「　
」（５７８頁左上）　
（訳文）　
「図５　温度シフト回分培養における細胞増殖とSEAP生産量。　
XM111-10細胞は、T25フラスコ中に初期細胞密度１×１０5で接種され、そして細胞数は毎日計数された。
低温培養は、接種７２時間後に３７℃から３０℃に温度シフトされた（×）。
　
（５）補正発明の効果について　
　本願明細書の段落【０００６】には，本発明の方法により，「高レベルのタンパク質生産およびアンモニウムおよび／または乳酸塩のようなある種の望ましくない因子の蓄積を減少させること」ができるとされており，実施例として、ＧＤＦ−８に対する抗体（実施例１、３、４、７−１４および１７）、抗ルイスＹ抗体（実施例５および６）、抗Ａベータ抗体（実施例１５）およびＴＮＦＲ−Ｉｇ（実施例１６）の生産への適用に成功したこと（段落【００５８】、【０１２６】〜【０２４６】）、「６０００リットルの大規模および１リットルの小規模培養間にこれらの特定に関して違いはなかった（段落【０２４６】）」ことが記載されている。　
　そして、本願明細書で唯一具体的に抗Ａベータ抗体の生産について記載された実施例１５には、グルタミン量を４ｍＭとした低グルタミン培地１２を用いてフィード培地にグルタミンを添加しない場合に、グルタミン含有量が高いもの（培地１：１２．９６ｍＭ、フィード培地５：３７．５ｍＭ）に比較して細胞成長、生存率、低乳酸レベル、低アンモニウムレベル及び力価の点で優れていることが記載されている。　
　しかしながら、上記（刊２−１１）、及び（刊３−１）から、低レベルのグルタミンの細胞培地での使用により、乳酸塩、及びアンモニウムイオンの蓄積が低減され、その結果、細胞の増殖や生存率を高め、生産物量が向上することは予想外のこととはいえず、また、対数増殖期に温度シフトを適用することにより高レベルのタンパク質生産を得られることは、周知の事項であった（刊行物ＡないしＣ）。　
　また、物質生産において大規模化は当業者が当然検討する事項であり（（刊２−２）、（刊Ａ−５）、（刊Ｂ−３）段落【００３６】等）、大規模でも使用可能な培養条件であることを確認したことをもって、格別顕著な効果であるとはいえない。　
　したがって、補正発明の上記効果は，刊行物１ないし３，及び上記周知の技術的事項から当業者が予測し得るものであって，格別顕著なものとはいえない。 
　
（６）審判請求人の主張について　
　なお、審判請求人は，平成２５年１２月４日付け回答書において、補正発明の培地特性と培養条件変更の時期に関して、特に文献３（刊行物２）について主張を行っているので、以下に検討する。　
　
ア　培地特性　
（ア）補正発明は、培地が「グルタミンを含有」することを要件としているのに対し、刊行物２には、実施例４に、「図４は、５ｍＭのグルタミン酸（０ｍＭのグルタミン）が最も低い副産物蓄積レベルをもたらすことを示す」と記載され、実施例２及び３により、「グルタミンは力価に対して有意な影響を与えなかった」ことが記載されていることから、グルタミンをグルタミン酸で完全に置換することが意図され、グルタミンの含有を要件とする本願発明の培地を用いる動機付けがない旨、主張している。　
　しかしながら、必須アミノ酸は通常培地に必要とされる成分であり（摘示（刊２−３））、そして、（刊２−１１）には「本発明は、低レベル、例えば５mMのグルタミンの、細胞培地での使用を可能にし」と結論付けられており、グルタミンの低レベルでの含有を意図したものである点で補正発明と異なるものとはいえない。　
　そして、刊行物３において、アンモニウムによる悪影響が致命的なものではないことが言及されていることからも（摘示（刊３−３））、刊行物２の上記「（０ｍＭのグルタミン）が最も低い副産物蓄積レベルをもたらす」との記載が、必ずしもグルタミンをゼロとしなければならないことを意味しているものでは無いことが、当業者には理解されるといえる。　
　
（イ）補正発明は、培地が「２未満の累積アスパラギンに対する累積グルタミンのモル比」を有することを要件としているのに対し、刊行物２には、グルタミンとアスパラギンレベルとの関連性は言及すらされておらす、刊行物３には、「アスパラギンおよびグルタミンのレベルの操作は、結果に大きな変化をもたらさなかった。したがって、アンモニア阻害が他の細胞株で観察されたのと同様にこの細胞株にとって重要な因子であるとは思われない」と報告しており、相対量についての結論を得ることができない旨、主張している。　
　しかしながら、刊行物２において用いられる低レベルのグルタミン５mMを含有する培地Ａにおいて、グルタミンとアスパラギンのモル比が補正発明の範囲にあることは、上記「（３）相違点３について」で検討したとおりである。　
　また、刊行物３の上記報告には、続けて、「少なくともグルタミンの一部をアスパラギンで代用することが有益である」（刊３−３）と記載されており、さらに、刊行物３はグルタミンとアスパラギンの比に着目しているものでもある（摘示（刊３−２））。　
　したがって、グルタミンの、特にアスパラギンに対する相対量に着目することが当業者に想到し得ないものであるとはいえない。　
　
（ウ）補正発明の（ｉ）〜（ｉｖ）の培地特性のいずれについても、引用刊行物のいずれにも開示も認識もされていないとの主張についても、上記「（３）相違点３について」で検討したとおり、刊行物２において用いられる低レベルのグルタミン５mMを含有する培地Ａは、少なくとも、（ｉ）７０ｍＭを超える累積アミノ酸濃度、（ｉｉ）０．２未満の総累積アミノ酸に対する累積グルタミンのモル比をも満たすものである。　
　
（エ）補正発明は大規模生産であるのに対し、刊行物２は、全ての実施例は「１．５〜２．０Ｌの作業容量での生産培養」によって行われており、大規模工業プロセス（本願実施例１７参照）において用いることを想定していない旨、主張しているが、この点については、上記「（１）相違点１について」及び「（５）補正発明の効果について」で検討したとおりである（摘示（刊２−２）、（刊Ａ−５）、（刊Ｂ−３）段落【００３６】）。　
　
（オ）補正発明は抗−Ａベータ抗体の製造方法であるのに対し、刊行物２は、例示された以外のタンパク質に適用可能であることを示唆しているものの、実際には、抗Ａベータ抗体に関連するタンパク質の生産における培地の使用を開示していない旨、主張している。　
　刊行物１ないし３、刊行物ＡないしＣのいずれの引用刊行物においても、ＣＨＯ細胞を用いて種々の組み替えタンパク質を製造する方法が検討されており、刊行物２においても、培地が例示された以外のタンパク質に適用可能であることが示唆されている以上、刊行物１発明の方法において刊行物２の培地を適用することの阻害要因はないものといえる。　
　
（カ）よって、培地特性に関する上記主張のいずれも採用することができない。　
　
イ　培養条件の変更　
（ア）刊行物２には「細胞密度が最大（飽和）であるか又はそれに近いときに温度や重量モル浸透圧濃度の変更を行うこと」が記載されていると理解するのが当然であり、細胞密度が最大密度の２０％〜８０％という特定の範囲内にあるときに培養条件を変更する補正発明に想到することは困難であった旨、主張している。　
　しかしながら、上記「（４）相違点４について」及び「（５）補正発明の効果について」で検討したとおり、ＣＨＯ細胞を用いた組み替えタンパク質の製造方法において、細胞密度が６０％程度に至る以前の温度シフトによる高レベルのタンパク質生産は周知の技術であった。 
　
（イ）刊行物２には、培養条件の変更に関して、培地のｐＨシフトは細胞増殖および細胞培養産生率に悪影響を及ぼすため、培養又は産生段階の間、ｐＨを低減させないことが好ましいことが記載されていると主張しているが、補正発明の培養条件の変更はｐＨに限られるものでなく、周知技術である特定時期の温度シフトを適用することの阻害要因とならない。　
　
（ウ）よって、培養条件の変更とその時期に関する上記主張のいずれも採用することができない。　
　
（７）まとめ 　
　以上のことより，補正発明は，刊行物１ないし刊行物３に記載された発明、及び上記周知の技術的事項に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条２項の規定により特許出願の際独立して特許を受けることができないものである。　
　
７　むすび　 
　したがって，本件補正は，平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するので，同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。　
 　 
第３　本願発明について 
 １　本願発明 　
 　平成２４年２月１７日付けの手続補正は，上記のとおり却下されることになったので，本願の請求項１ないし４７に係る発明は，平成２３年９月１５日付け手続補正書の特許請求の範囲の請求項１ないし４７に記載された事項により特定されるとおりのものと認められ，そのうち請求項１は，次のとおりである。（以下，請求項１に係る発明を「本願発明」という。）　 
 　 
「【請求項１】　
　大規模生産細胞培養における抗−Ａベータ抗体の製造方法であって、下記工程：　
　　抗−Ａベータ抗体をコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞、ここで、該遺伝子は細胞培養条件下で発現して抗−Ａベータ抗体を生産する；および　
　　　グルタミンを含有し、（ｉ）７０ｍＭを超える累積アミノ酸濃度、（ｉｉ）２未満の累積アスパラギンに対する累積グルタミンのモル比、（ｉｉｉ）０．２未満の総累積アミノ酸に対する累積グルタミンのモル比、（ｉｖ）０．４〜１の総累積アミノ酸に対する累積無機イオンのモル比、（ｖ）１６ｍＭを超えるグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積濃度、およびそれらの組合せからなる群から選択される培地特性を有する培地；　
を含む細胞培養物を供給する工程；　
　　初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１のセットの培養条件下に維持された場合に、該細胞が可能な最大生存細胞密度の２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度を得るのに十分な第１の期間、第１のセットの培養条件下で該培養物を維持する工程；　
　　少なくとも１つの培養条件を変更して、第２のセットの培養条件を適用する工程、ここで、少なくとも１つの培養条件を変更する工程における該細胞培養条件は、（ｉ）温度、（ｉｉ）ｐＨ、（ｉｉｉ）重量オスモル濃度、（ｉｖ）化学誘導剤レベル、およびそれらの組合せからなる群から選択される；　
　　第２のセットの条件下、第２の期間、該培養物を維持して、抗−Ａベータ抗体を細胞培養物中に堆積させる工程；　
を含む方法。」　
 　 
 ２　引用刊行物とその記載事項 
 　原査定の拒絶の理由に引用された刊行物１ないし刊行物３と、その記載事項は，前記「第２　２」に記載したとおりである。 
 　 
 ３　対比・判断 
 　本願発明は，前記「第２」で検討した補正発明の「
２未満の累積アスパラギンに対する累積グルタミンのモル比
および
 
 　そうすると，本願発明の構成要件を全て含んだ補正発明が，前記「第２　５」，及び「第２　６」に記載したとおり，刊行物１ないし刊行物３に記載された発明，及び周知の技術的事項に基いて，当業者が容易に発明をすることができたものであるから，本願発明も同様の理由により，刊行物１ないし刊行物３に記載された発明，及び周知の技術的事項に基いて，当業者が容易に発明をすることができたものである。 
 　 
 ４　むすび 
 　以上のとおりであるから，本願発明は，刊行物１ないし刊行物３に記載された発明，及び周知の技術的事項に基いて，当業者が容易に発明をすることができたものであり，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 
 　したがって，その他の請求項に係る発明についての判断を示すまでもなく本願は拒絶すべきものである。 
 　よって，結論のとおり審決する。