【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年10月28日(2015.10.28)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
本発明の主題の特に好ましい一態様において、ゲノムデータを解析する方法は、腫瘍ゲノム配列および対応する正常ゲノム配列（ｍａｔｃｈｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の相対コピー数を決定するステップを含む。該方法は、該腫瘍ゲノム配列および該対応する正常ゲノム配列における推定の切断点を同定するさらなるステップを含む。別のステップでは、該推定の切断点を精緻化するが、好ましくは該腫瘍ゲノム配列をフラグメント化することおよびこのフラグメントを参照データベースと比較することにより精緻化し、切断点の位置および該腫瘍ゲノムの方向を同定する。また、別の態様において、リード支援閾値（ｒｅａｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（例えば、ユーザが決定したリード支援閾値）を、該切断点が重要な切断点であるかを確認するために使用し、および、該方向を、環状ソリューション（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（該環状ソリューションは、二重微小染色体を示し得る）を有するゲノム構成を決定するために使用する。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
特に好ましい態様において、上記相対コピー数を決定するステップは、動的ウィンドウを用いて実施し、および／または、上記推定の切断点を同定するステップは、不一致の対リード（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｐａｉｒｅｄ  ｒｅａｄ）を用いて実施する。本発明の主題に限定するものではないが、上記ゲノム構成を、切断点グラフを作成し、および該切断点グラフを解析して上記環状ソリューションに到達することによって決定することが一般的に好ましい。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
本発明の主題の別の態様において、固体腫瘍のゲノムデータの解析方法は、該固体腫瘍が、その腫瘍ゲノムの少なくとも一部が生体液中に存在する腫瘍であること、を同定するステップを含むであろう。また、該方法は、患者から生体液を獲得する別のステップおよび該腫瘍ゲノムの少なくとも一部を単離するステップも含むであろう。該腫瘍ゲノムの少なくとも一部は、その後、上記したように、および、詳細な記載内に記載されているように、ゲノムデータを解析するために使用する。もっとも一般的には、該腫瘍ゲノムの一部は、二重微小染色体として、該単離された少なくとも一部の該腫瘍ゲノム内に存在するが、該二重微小染色体は、発癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含み得る。このイベントにおいて、該方法は、該発癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を標的とした医薬品の処方計画を用いて患者を治療するステップまたは治療の助言をするステップもまた含むであろう。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の主題に係る、推定構造の異形（変異）の初期の同定を表す例示的なグラフである。
【図２】図２は、図１の推定構造異形における切断点の精緻化した解析を表す例示的なグラフである。
【図３】図３は、本発明の主題に係る例示的な切断点グラフである。
【図４】図４は、体細胞の切断点に関するリード支援の例示的なヒストグラムである。
【図５】図５は、高いコピー数および高度にサポート（支援）された切断点を表す例示的なゲノムブラウザディスプレイである。
【図６】図６は、図５に示したデータ、および、切断点グラフに関する環状ソリューションの詳細な図である。
【図７】図７は、染色体７および１２上の高いコピー数および高度にサポートされた切断点を表す例示的なゲノムブラウザディスプレイを示す。
【図８】図８は、図７に示した選択データおよび切断点グラフの環状ソリューションの詳細な図である。
【図９】図９は、本発明の主題に係るゲノム解析のための設定およびシステムを例示的に示す概略図である。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、第一の腫瘍試料における再構成パターンおよび対応する環状ソリューションの例示的な図である。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、第二の腫瘍試料における再構成パターンおよび対応する環状ソリューションの例示的な図である。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、さらに別の腫瘍試料における再構成パターンおよび対応する環状ソリューションの例示的な図である。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本発明者らは、信頼度の高い切断点および関連する高いコピー数を同定することによって、ならびに、再構成プロットにおける環状ソリューションに到達するためのデータの解析によって、全ゲノム配列データから１以上のＤＭを同定するためにゲノム解析を実施できることを発見した。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
腫瘍および対応する正常（ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｎｏｒｍａｌ）の間の計算相対コピー数：腫瘍相対コピー数対正常相対コピー数を、動的ウィンドウアプローチを用いて計算する。該動的ウィンドウアプローチは、該腫瘍または正常配列データセットのいずれかにおけるリードの包括度（ｃｏｖａｒａｇｅ）に応じてウィンドウのゲノム幅を拡張および収縮する。この工程は、ゼロ幅のウィンドウによって初期化される。該腫瘍および対応する正常配列データの両方から得られる、ある品質の閾値（例えば、リードマッピング品質）を超える各リードは、それぞれ、腫瘍カウントであるＮｔｕｍｏｒおよび正常カウントであるＮｎｏｒｍａｌに計算される。第一のリードの開始位置および終了位置が初期ウィンドウ幅を定義し、ならびに、さらに多くのリードが収集されるにつれて、該ウィンドウ幅は、処理された全てのリードの最小の開始位置および最大の終了位置を含むように拡張する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
相対コピー数計算は、次の条件に適合するときに実施される：腫瘍または対応する正常データセットのいずれかから得たリードカウントが、ユーザが定義した上限の閾値および１００リードに固定された下限の閾値の両方を超える。この状況が生じた場合、該ウィンドウのサイズおよび位置、生のリードカウントであるＮｔｕｍｏｒ、Ｎｎｏｒｍａｌ、および相対コピー数計算値Ｎｔｕｍｏｒ／Ｎｎｏｒｍａｌが記録される。その後、全ての値は、次の収集および計算のためにリセットされる。局所リードの包括度に従うＮｎｏｒｍａｌウィンドウのサイズに適合させることにより、この方法は、信号−ノイズ比を向上させるために狭い包括度の領域内に大きなウィンドウを作成する。一方で、高度に増幅された領域は、より小さなウィンドウを作成するだろう。これにより、アンプリコン境界の解像度が高められる。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
ペアエンドクラスタリンを用いた構造異形領域の推定：推定の染色体内および染色体間の再構成を同定するために、ｂａｍｂａｍは、座標で分類されたＢＡＭファイルの一対のペア内に保存された不一致の対リードを検索する。該ＢＡＭファイルのペアの一方は、上記腫瘍試料からのものであり、他方は、上記対応する正常試料からのものである。ここで、該不一致対の各リードは、参照配列の異なる領域に位置する。染色体内の不一致対は、異常に大きい挿入サイズを有するものである（すなわち、該対リードを分離する上記参照配列上の該ゲノム距離は、ユーザが定義した閾値を超える。）。あるいは、染色体内の不一致対は、誤った方向に位置するものである（すなわち、逆位である）。染色体間の不一致対は、異なる染色体に位置する対リードによって定義される。この工程の概要を、図１に示す。図１は、構造異形呼び出しの概要を概略的に表す。推定構造異形の初期の同定は、不調和に位置する対リードを用いるｂａｍｂａｍによって同定される。ここで、両方のリードは、該参照ゲノムに完全に位置するが、異常な、標準的でない方法で位置する。ｂａｍｂａｍによって見つけ出された該推定切断点は、その後、ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）と呼ばれるプログラムによって、該切断点の近辺内の任意の分離リードを用いて、精緻化される。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
切断点は、該切断点が上記腫瘍データセットからのリードに顕著にサポートされるとき「体細胞」に分類される。対応する正常データセットからの、「体細胞」切断点のためのリードサポートの最少量が、あるレベルの腫瘍ＤＮＡが上記対応する正常試料内に存在するケースに対応することができる。このケースにおいては、固体腫瘍のＤＮＡ内に存在する高度に増幅された領域が、血中に、低いが検出可能なレベルで放出される。あるいは、血液癌の場合、上記対応する正常試料（典型的には、皮膚）内への高レベルの腫瘍遺伝子移入が予想されるであろう。該対応する正常データセットにおいて許容される体細胞切断点のサポート量は、該対応する正常試料内に想定される腫瘍「汚染」の量によって調節することができる。「生殖細胞系」切断点は、腫瘍および対応する正常データセットの両方に顕著なサポートを有するもの、または、該対応する正常データセット内にのみサポートを有するものである。これらはこの解析において、上記の再構成が当面の問題には関係しないため、考慮されない。さらに、これらの切断点の多くが、擬似のものであると考えられるが、それは、シークエンシング機器、試料の調製（例えば、全ゲノム増幅など）、または採用した短リードマッピングアルゴリズムにおける系統的バイアスによって誘発された人工物のためである。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
分離リードを用いた構造異形の精緻化：ｂａｍｂａｍによって初期に発見された切断点は、近似である。この近似において、完全に位置するリード（ｆｕｌｌｙ−ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）が用いられる。該リードは、その性質から、該切断点の実際の接合点と実質的には重複しないが、これは、それが上記参照（または、体細胞の再構成の場合は、上記対応する正常データセット）中に存在しない配列を示しているからである。該切断点の位置を精緻化するために、ブリッジと呼ばれるプログラムが開発された。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
実施例
本発明者らは、上記の方法を２つの多形性膠芽腫（ＧＢＭ）試料に適用した。該２つのＧＢＭ試料は、ＴＣＧＡ−０６−０６４８およびＴＣＧＡ−０６−０１５２に指定されており、両者は、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）プロジェクトにより配列が決定された。これらの試料から得た腫瘍および対応する正常（血液）配列データセットを、上記の方法に記載したように処理することによって、腫瘍対正常の相対コピー数の概算値を算出し、切断点を同定し、および、分離リード解析を実施した。該両試料の腫瘍および正常ゲノムは、約３０ｘの平均包括度に配列した。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
合計３，６９６の切断点を、ｂａｍｂａｍによって同定し、そのうちの１３２の切断点について、ブリッジによって、上記推定切断点を直接スパニングする分離リードを有することが発見された。図４は、試料ＴＣＧＡ−０６−０６４８内で観察される全ての体細胞切断点をサポートするリードのヒストグラムを示す。最小リードサポート閾値を１００に設定することによって、１６を除く全てのブリッジによってサポートされる該体細胞の切断点が、除去された。興味深いことに、図５に示すように、これら高度にサポートされた１６の全ての切断点は、染色体１２のクラスター化された領域内の高度に増幅されたセグメントの境界近くに存在する。図５において、該ゲノムブラウザは、ＴＣＧＡ−０６−０６４８に関する、相対コピー数（灰色で示した「全体のコピー数」）および高度にサポートされた切断点（切断点サポートが＞１００リードである、「染色体間再構成」および「染色体内再構成」）を示す。合計で１６の増幅されたセグメントが、ＧＢＭの腫瘍形成に関与する既知の発癌遺伝子ＭＤＭ２を含有する一つのセグメントと共に発見される。事実、それぞれの増幅されたセグメントの境界は、単一の切断点と関連し得る。該単一の切断点は、それが増幅へと入るまたは増幅から出るように、正しく方向付けられている。これは、高度にサポートされた切断点および該増幅が関連していること、および、実際には腫瘍のゲノムにおいて増幅されたセグメントの再構成された構造を示しているかもしれないこと、を示唆する。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
図６は、図５と同じデータの図であり、サイズおよびいくつかのセグメントの位置を強調しているが、これは、図５のブラウザプロットでは、データ同士があまりにも近くに位置していて視覚化できないからである。図６は、ＭＤＭ２を含有する増幅された二重微小染色体の存在を示唆する、ＴＣＧＡ−０６−０６４８の切断点グラフの環状ソリューションを示す。切断点リードサポートは、腫瘍リードカウント／血液リードカウントとしてリストする。たとえば、１３６５／９は、切断点をサポートする１，３６５のリードが該腫瘍中で発見され、９のサポートリードが血中で発見されることを意味する。このソリューションは、セグメントの新しい構造における該セグメントの順序および方向をリストする。なお、マイナスの記号は、逆向きのセグメントを示すために用いた。該増幅されたセグメントの該コピー数は、平均的な腫瘍細胞内に存在する各セグメントのコピーが少なくとも４０存在することを示唆する。この図は、切断点グラフを視覚的に描写したものであり、該切断点グラフを移動させることにより、単一の最適ソリューションが見つかる。このソリューションの興味深い点は、それが環状であり、該ソリューションにおいては、最後のセグメントの最終の横断が、開始位置に戻る。すなわち、最初の頂点が最後の頂点でもあるということである。該環状ソリューションは、全てのセグメントを正確に一度通り、さらに、該コピー数は、該腫瘍ゲノム内に、各セグメントのコピーが約４０コピー存在することを示唆する。これらの特別なコピー（ｅｘｔｒａ  ｃｏｐｉｅｓ）を説明するために、その他の３９パスに関するセグメントをループスルー（ｌｏｏｐ  ｔｈｒｏｕｇｈ）しなければならない。これらの追加のコピーは、多くの異なる構成内に存在し得るだろう。これは、以下の２つの対極によって例示される：（１）４０コピーが、これらのセグメントの完全なタンデム配列を形成するように、正しい順序および方向で複製された、または（２）単一の、自己複製二重微小染色体が形成され、その平均的な腫瘍細胞は集積した４０コピーを有する。明らかに、後者の選択肢がより倹約的である。なぜならば、いかなる増幅されたセグメントも喪失しないようにまたは異なる濃度で存在しないように、後者は、再構成された配列内のおおよそ同じ位置（すなわち、初期アンプリコンの境界頂点）に発生するための４０の連続したタンデム複製を必要としないからである。したがって、該データは、ＧＢＭ腫瘍試料内に存在するＭＤＭ２を含む発癌性のＤＭを示唆する。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
さらに、図６には、腫瘍および血液の配列データセットの両者における、全ての高度にサポートされた切断点に関するリードサポートを示した。第一に、該切断点が、非常に高いサポートを腫瘍内に有しており、そのうちのいくつかの切断点は２，０００以上の分離リードによってサポートされていることに留意されたい。これは、再構成がアンプリコンを定義し、また該アンプリコンがとても高いコピー数で存在することが期待される。さらに興味深いことに、全ての切断点はまた、驚くほど高い量のサポートを患者の血液内で示す。連続した有糸分裂のステージの後に徐々に喪失するというＤＭの傾向を考慮に入れると、該ＤＭが最初から生殖細胞系に存在し十数年も維持されていたわけではなさそうである。腫瘍形成中にのみ増幅されたのだろう。これは特に、発癌性ＤＭが非腫瘍細胞に対して選択的優位性を提供するわけではなさそうであるということを考えると正しい。さらに倹約的なソリューションは、この発癌性ＤＭが、体細胞に起源があるというよりも、ある時点での期間でまたは腫瘍形成の間に、構成されおよび増幅されたということである。このＤＭが提供する新生の腫瘍細胞に対する該選択的優位性によって、より少ないＤＭを有した細胞に対して、増殖優位性を有するより多くのＤＭのコピーを集積させる細胞がもたらされ、結果として、均一に高いコピー数を有し、このＤＭの一部と考えられる領域において観察される腫瘍細胞の集団をもたらした。ＭＤＭ２がしばしば発癌性ＤＭにおいて観察されるという事実は、この仮説にさらなるサポートを与える（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９３  Ｆｅｂ；１５（２）：２８３−９０）。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
他のＧＢＭ試料であるＴＣＧＡ−０６−０１５２における同様の結果を、本明細書に記載した方法によって処理した。図７に示したのは、染色体１２上に高度に増幅された領域および染色体７の領域のブラウザショットである。該染色体１２上の高度に増幅された領域は、発癌遺伝子ＣＤＫ４およびＭＤＭ２を含み、該染色体７の領域は、ＥＧＦＲ発癌遺伝子を含む。ここでは、試料ＴＣＧＡ−０６−０１５２上の（ａ）染色体１２および（ｂ）染色体７に関する、増幅されたセグメントおよび高度にサポートされた構造異形（リードサポートは、＞１００）のゲノムブラウザショットを示す。染色体１２上の増殖された小さな領域と染色体７上の増幅された領域とを繋ぎ、これらの領域のＥＧＦＲＡダイアグラムを含む、紫色で示した染色体間の切断点を、図８に示したことに留意されたい。ここでは、ＧＢＭ試料ＴＣＧＡ−０６−０１５２に関する該切断点グラフの環状ソリューションを示しており、これは、腫瘍内で増殖された２つの異なる発癌性ＤＭの存在を示唆している。ＭＤＭ２＋ＣＤＫ４二重微小のソリューションは、いくつかのセグメントを複数回、横断するが、全ての特別な横断は、観察された相対コピー数によって説明される。２０の切断点のうち１１の切断点が、患者の血液試料内における不一致リードの証拠を示す。合計で、該２つの染色体上の２９のセグメントが増幅され、そのうちのいくつかのセグメントは、他のものよりも高い相対コピー数を示した。２０の高度にサポートされた切断が発見され、前記したように、試料ＴＣＧＡ−０６−０６４８で、全ての切断が、相対コピー数における断続と一意的に関連し得る。該切断点グラフを解析することによって、２つの独立した環状ソリューションが見つかった。ソリューション（１）は、染色体１２上の２つの染色体内の切断点を除く全ての切断点を使用し、および発癌遺伝子ＣＤＫ４の１つのコピーと発癌遺伝子ＭＤＭ２の２つのコピーを含む。ソリューション（２）は、染色体７および１２上で増幅された領域をスパニングする２つの染色体間の切断点、および染色体１２上の染色体内の切断点を組込み、ならびに、発癌遺伝子ＥＧＦＲを含む。これら２つのソリューションは、この試料において２つのＤＭが形成されおよび増殖されたことを示唆する。該試料の両方が、異なる発癌遺伝子を含み、および、増殖する腫瘍細胞に対する顕著な選択的優位性を備えているだろう。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
配列決定解析パイプラインを、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）プロジェクトの１７の全ゲノム多形性膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍試料において、信頼度の高い、小規模および大規模の体細胞イベントを発見するために使用した。該パイプラインの使用において、該腫瘍試料に対応する正常配列を、体細胞の再構成を同定するために用いた。これらの試料において同定された多くの興味深い構造的異常のなかで、本発明者らは、極度に増幅された領域内に複雑な再構成パターンを有する２つの腫瘍を発見した。該極度に増幅された領域内の複雑な再構成パターンは、図１０Ａ／Ｂおよび図１１Ａ／Ｂに見られるように、ベースレベルの正確さで、環状の二重微小染色体を構成するように組み立てることができた。二重微小に特有な切断点の証拠が、血液の配列データにおいて見つかり、これによって、体細胞再構成の存在を定量するために、個体別のＰＣＲに基づくアッセイが開発できるであろうことが支持された。該体細胞の再構成の定量結果は、脳腫瘍の進行を監視する際の代替物として使用することができる。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
本明細書で議論した上記ＧＢＭ試料において、増幅されたセグメントの該切断点グラフに対する上記最適ソリューションは、環状である。これらの環状ソリューションは、観察された増殖された領域が、二重微小と呼ばれる環状染色体を形成していたかもしれないこと示唆する。各二重微小上の発癌遺伝子の存在およびそれらの高度に増幅された状態は、該二重微小が強い発癌能を有し、選択的優位性を該腫瘍細胞に与えること、およびそれらの形状が、両ＧＢＭ腫瘍の腫瘍形成において重要なイベントであったであろうことを示唆する。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
血流内のＤＭを検出する能力は、他の癌に拡張するべきである。該他の癌は、一般的に、例えば、非小細胞肺癌内のＥＧＦＲおよび急性骨髄性白血病内のｃ−Ｍｙｃなどの既知の発癌遺伝子を含有する、高度に増幅されたＤＭを特徴とする。実際、この方法に用いられるＤＭを検出する能力は、血流が利用しやすい腫瘍タイプに関して向上し得る。さらに、特にＤＭに基づいたメカニズムによって一般的に増幅される遺伝子を標的とする薬剤を、血流のみから集めた証拠に基づいて処方してよく、痛みを回避すること、およびＧＢＭ腫瘍の場合は危険な腫瘍生体検査を回避することができる。