【手続補正書】
【提出日】平成26年11月11日(2014.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）シルクポリペプチドのＮ末端断片と、弾性モチーフおよび強度モチーフからなる群から選択される１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフと、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端断片と、を含むキメラスパイダーシルクポリペプチドをコードすることを特徴とする核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸において、前記１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフが、スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントを含み、各反復セグメントが、１〜４コピーの強度モチーフ（Ｓ）と線形順序で共有結合した４〜１６コピーの弾性モチーフ（Ｅ）を含むことを特徴とする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸において、前記弾性モチーフがＧＰＧＧＡ（配列番号２）であり、かつ、前記強度モチーフがＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８（配列番号３）であることを特徴とする核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸において、キメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする前記核酸が、その５’末端に、前記Ｂ．ｍｏｒｉフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）遺伝子の主要プロモーター、上流エンハンサーエレメント（ＵＥＥ）、及び基本プロモーターを含む核酸が配置されており、及び、その３’末端に、前記Ｂ．ｍｏｒｉフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）遺伝子の転写終結部位及びポリアデニル化部位を含む核酸が配置されていることを特徴とする核酸。
【請求項５】
請求項１に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸において、前記弾性モチーフが１つ又は複数のＦｌａｇ様モチーフ、ＭａＳｐ様モチーフ、又はＭｉＳｐ様モチーフを含むことを特徴とする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸において、前記１つ又は複数のＭａＳｐ様モチーフが、１つ又は複数のＭａＳｐ１モチーフ又はＭａＳｐ２モチーフを含むことを特徴とする核酸。
【請求項７】
以下の配列：
（ａ）トランスポゾンの第一末端反復を含む配列；
（ｂ）前記Ｂ．ｍｏｒｉフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）遺伝子の主要プロモーター、上流エンハンサーエレメント（ＵＥＥ）、及び基本プロモーターを含む第一調節配列であって、前記プロモーターが動作可能に連結している第一調節配列；
（ｃ）キメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸配列であって、当該キメラポリペプチドが：
（ｉ）前記Ｂ．ｍｏｒｉシルクポリペプチドのフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）のアミノ末端ドメイン；
（ｉｉ）スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントであって、１〜４コピーの強度モチーフ（Ｓ）と線形順序で共有結合した４〜１６コピーの弾性モチーフ（Ｅ）を含み；
[（Ｅ）ｉ−（ＬＳ）ｊ］ｋの公式に従い、ここでｉは４〜１６、ｊは１〜４、ｋは１４〜４２であり；
前記弾性モチーフ（Ｅ）がＧＰＧＧＡ（配列番号２）であり；
Ｌは任意的なリンカーであり；及び
前記強度モチーフ（Ｓ）がＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８（配列番号３）である；
反復セグメント；    
（ｉｉｉ）前記カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン；
をこの順序で含む核酸配列；
（ｄ）前記Ｂ．ｍｏｒｉフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）遺伝子の、転写終結部位及びポリアデニル化部位、を含む第二調節配列；及び
（ｅ）トランスポゾンの第二末端反復を含む配列であって；
前記プローモーターの少なくとも１つが、形質転換したＢ．ｍｏｒｉの細胞又は組織内で活性であり；
前記末端反復の少なくとも１つが、配列（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の、形質転換したＢ．ｍｏｒｉカイコのゲノムへの転位を促進する配列；
を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターにおいて、当該ベクターがトランスポゾンを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターにおいて、前記トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンであることを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターが、ｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ１６で表され、配列番号３４に記載の配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載のベクターが、ｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ２４で表され、配列番号３５に記載の配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１３】
（ａ）カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルクポリペプチドのＮ末端断片と、弾性モチーフと強度モチーフからなる群から選択される、１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフと、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端断片と、を含むキメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸を含むｐｉｇｇｙＢａｃベクターを、変異体カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の卵へ挿入して、注入されたカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）卵を提供するステップと、
（ｂ）前記卵を適切なインキュベーション条件下で孵化させて幼虫を提供するステップと；
（ｃ）適切なインキュベーション条件下で前記幼虫を成熟させるステップ；及び
（ｄ）遺伝子組み換えＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉカイコを選択するステップと；
を具えることを特徴とする、キメラスパイダーシルク繊維への組み込みに適したキメラスパイダーシルクポリペプチドを、安定的に発現することができる遺伝子組み換えＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉカイコの作成方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記核酸が、更に、遺伝子組み換えカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の選択を促進するレポーターポリペプチドをコードする核酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法において、前記ｐｉｇｇｙＢａｃベクターが、
（ａ）ｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐｌＸ１６で表され配列番号３４に記載の配列を含むベクター、及び、
（ｂ）ｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ２４で表され配列番号３５に記載の配列を含むベクター、
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
キメラスパイダーシルク繊維の製造方法において：
（ａ）キメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸を含むｐｉｇｇｙＢａｃベクターを使用して、遺伝子組み換えカイコを作製するステップであって、当該ポリペプチドが、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）シルクポリペプチドのＮ末端断片と、弾性モチーフと強度モチーフからなる群から選択される、１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフと、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルポリクペプチドのＣ末端断片と、を含むステップと、
（ｂ）前記遺伝子組み換えカイコに、前記カイコにとって天然の適切な生理学条件下で、１つ又は複数のキメラスパイダーシルク繊維を含む繭を産生させるステップと、
（ｃ）当該繭から、１つ又は複数のキメラスパイダーシルク繊維を収集し抽出するステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記遺伝子組み換えカイコが、遺伝子組み換えＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉカイコであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルクポリペプチドのＮ末端断片と、弾性モチーフと強度モチーフからなる群から選択される１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフ、およびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端断片と、を含むことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドにおいて、前記弾性モチーフが、１つ又は複数の、Ｆｌａｇ様モチーフ、ＭａＳｐ様モチーフ、又はＭｉＳｐ様モチーフ、を含むことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドにおいて、前記１つ又は複数のＭａＳｐ様モチーフが、１つ又は複数の、ＭａＳｐ１モチーフ又はＭａＳｐ２モチーフを含むことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１８に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドにおいて、
前記キメラポリペプチドが：
（ｉ）  前記Ｂ．ｍｏｒｉシルクポリペプチドのフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）のアミノ末端ドメイン；
（ｉｉ）スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントであって、各々が：
１〜４コピーのリンカー／強度モチーフ（Ｓ）と線形順序で共有結合した４〜１６コピーの弾性モチーフ（Ｅ）を含み；
[（Ｅ）ｉ−（ＬＳ）ｊ］ｋの公式に従い、ここでｉは４〜１６、ｊは１〜４、ｋは１４〜４２であり；
前記弾性モチーフ（Ｅ）がＧＰＧＧＡ（配列番号２）であり；
Ｌは任意選択的なリンカーであり；及び
前記強度モチーフ（Ｓ）がＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８（配列番号３）である、反復セグメント；
（ｉｉｉ）前記カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン；
をこの順序で含むことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のキメラポリペプチドにおいて、
前記４〜１６コピーの弾性モチーフが：
Ａ１で表され、配列番号３６の（ＧＰＧＧＡ）４；
Ａ２で表され、配列番号３７の（ＧＰＧＧＡ）８；
Ａ３で表され、配列番号３８の（ＧＰＧＧＡ）１２；及び
Ａ４で表され、配列番号３９の（ＧＰＧＧＡ）１６；
からなる群から選択されることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２１に記載のキメラポリペプチドにおいて、
前記強度モチーフが、Ｓ８で表され、配列番号４０のＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８であることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２１に記載のキメラポリペプチドにおいて、
前記スパイダーシルクモチーフの反復セグメントが：
配列番号４１の［（ＧＰＧＧＡ）１６ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］２４；
配列番号４２の［（ＧＰＧＧＡ）８ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］４２；
配列番号４３の［（ＧＰＧＧＡ）８ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］１４；
配列番号４４の［（ＧＰＧＧＡ）８ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］２８；
からなる群から選択されることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１８に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドが、更に、成長促進ペプチドを含むことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１８乃至２５のいずれか１項に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドを含む複合繊維において、当該繊維が、天然カイコのシルク繊維よりも引張強度が高いことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載の複合繊維において、当該複合繊維が、天然カイコのシルク繊維、及び非キメラスパイダーシルク繊維よりも、引張強度が高いことを特徴とする複合繊維。
【請求項２８】
１つ又は複数の治療剤を更に含むことを特徴とする請求項２７に記載の複合繊維。
【請求項２９】
請求項２８に記載の複合繊維において、前記治療剤の少なくとも１つが、抗感染剤、化学療法剤、抗拒絶剤、鎮痛剤、抗炎症剤、ホルモン剤、及び成長因子からなる群から選択されることを特徴とする複合繊維。
【請求項３０】
請求項２８に記載の複合繊維において、前記治療剤の少なくとも１つが成長因子であることを特徴とする複合繊維。
【請求項３１】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の核酸を含むことを特徴とする遺伝子組み換えカイコ。
【請求項３２】
請求項３１に記載の遺伝子組み換えカイコにおいて、当該カイコが、非キメラカイコ繊維の少なくとも２倍の引張強度を有するキメラ繊維の製造に適したキメラスパイダーシルクポリペプチドを産出することができることを特徴とする遺伝子組み換えカイコ。
【請求項３３】
請求項３１に記載の遺伝子組み換えカイコにおいて、当該カイコがＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉカイコであることを特徴とする遺伝子組み換えカイコ。
【請求項３４】
ポリペプチドをコードする核酸を含み、当該ポリペプチドが、スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントを含み、各反復セグメントが、１〜４コピーのリンカー／強度モチーフ（Ｓ）と線形順序で共有結合した４〜１６コピーの弾性モチーフ（Ｅ）を含むことを特徴とする請求項３１に記載の遺伝子組み換えカイコ。
【請求項３５】
請求項３１に記載の遺伝子組み換えカイコにおいて、前記スパイダーシルク弾性モチーフが、１つ又は複数の、Ｆｌａｇ様モチーフ、ＭａＳｐ様モチーフ、又はＭｉＳｐ様モチーフを含むことを特徴とする遺伝子組み換えカイコ。
【請求項３６】
請求項３１に記載の遺伝子組み換えカイコにおいて、
前記キメラポリペプチドが：
（ｉ）  前記Ｂ．ｍｏｒｉシルクポリペプチドのフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）のアミノ末端ドメイン；
（ｉｉ）スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントであって、
各々が、１〜４コピーのリンカー／強度モチーフ（Ｓ）と線形順序で共有結合した４〜１６コピーの弾性モチーフ（Ｅ）を含み；
[（Ｅ）ｉ−（ＬＳ）ｊ］ｋの公式に従い、ここでｉは４〜１６、ｊは１〜４、
ｋは１４〜４２であり；
前記弾性モチーフ（Ｅ）がＧＰＧＧＡ（配列番号２）であり；
Ｌは任意選択的なリンカーであり；及び
前記強度モチーフ（Ｓ）がＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８（配列番号３）である反復セグメント；
（ｉｉｉ）前記カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン；
をこの順序で含むことを特徴とする遺伝子組み換えカイコ。
【請求項３７】
請求項３６に記載の遺伝子組み換えカイコにおいて、
前記４〜１６コピーの弾性モチーフが：
Ａ１で表され、配列番号３６の（ＧＰＧＧＡ）４；  
Ａ２で表され、配列番号３７の（ＧＰＧＧＡ）８；
Ａ３で表され、配列番号３８の（ＧＰＧＧＡ）１２；及び
Ａ４で表され、配列番号３９の（ＧＰＧＧＡ）１６；
からなる群から選択されることを特徴とする遺伝子組み換えカイコ。
【請求項３８】
請求項３６に記載の遺伝子組み換えカイコにおいて、前記強度モチーフが、Ｓ８で表され、配列番号４０のＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８であることを特徴とする遺伝子組み換えカイコ。
【請求項３９】
請求項３６に記載の遺伝子組み換えカイコにおいて、
前記スパイダーシルクモチーフの反復セグメントが；
配列番号４１の［（ＧＰＧＧＡ）１６ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］２４；
配列番号４２の［（ＧＰＧＧＡ）８ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］４２；
配列番号４３の［（ＧＰＧＧＡ）８ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］１４；
配列番号４４の［（ＧＰＧＧＡ）８ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］２８；
からなる群から選択されることを特徴とする遺伝子組み換えカイコ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
ｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ１６（１０，４５８ｂｐ）（図１２Ａ）およびｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ２４（１１，２５０  ｂｐ）（図１２Ｂ）の遺伝子構築物ｍａｓｐを作製した。
表５は、請求項に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列と、これに対応する配列番号を一覧にしたものである。
2014502140.tif 000001
2014502140.tif 000002
2014502140.tif 000003
2014502140.tif 000004