【事件の表示】
　特許第２５７２５５４号「リポソームからの薬剤の放出速度低減方法」の請求項１ないし６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５７２５５４号の請求項１ないし６に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２５７２５５４号発明は、昭和６０年８月７日（パリ条約による優先権主張、１９８４年８月８日及び１９８５年６月２６日、アメリカ合衆国）に出願した特願昭６０−５０３６２７号の一部を平成６年８月２２日に新たな特許出願としたものであって、平成８年１０月２４日にその特許の設定登録がなされ、その後、シキュース　ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッド、ネクスター　ファーマシューティカルズ　インコーポレーテッド及び都野キヨコより特許異議申立がなされ，当審より取消理由通知がなされ．その指定期間内である平成１０年６月９日に訂正請求がなされた後、訂正拒絶理由通知が通知され、訂正拒絶理由通知に対して手続補正書が提出された後、再度訂正拒絶理由通知が通知され、これに対する意見書が提出されたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
（１）訂正請求に対する補正の適否について
　特許権者は平成１１年６月２９日付け手続補正書を提出して、平成１０年６月９日付けの訂正請求書の訂正事項である特許請求の範囲の記載を補正するが、この補正は訂正事項の内容を変更することが明らかであるから、訂正請求書の要旨を変更するものである。
　したがって、当該訂正請求に対する補正は、特許法第１２０条の４第３項において準用する同法１３１条第２項の規定に違反しているので、認められない。
（２）訂正の内容
　上記訂正請求書に基づき、特許請求の範囲の請求項１の、
「・・・外部媒体中に貯蔵されたリポソーム類からイオン化可能で生物学的に活性な薬剤を放出させる速度を低減させる方法。」とあったものを「・・・医薬製剤として有効な濃度のイオン化可能で生物学的に活性な薬剤が貯蔵されたリポソーム類から該薬剤を外部媒体中に放出させる速度を低減させる方法。」と訂正する。
（３）訂正の目的の適否、拡張・変更の存否、新規事項の追加の有無及び独立特許要件
　上記訂正は、リポソーム内に貯蔵されたイオン化可能で生物学的に活性な薬剤の濃度が任意であったものを、医薬製剤として有効な濃度と規定し、また、リポソームから薬剤を放出させる場所が明記されていなかったものを外部媒体中に放出させると明確にするものであるから、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。そして、この訂正は、特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、願書に添付された明細書及び図面（以下、特許明細書という。）に記載された範囲内のものである。
（４）独立特許要件に対する判断
　後述の「３．特許異議申立てについての判断」に記載した理由から明らかなように、訂正後の特許請求の範囲の請求項１に記載された発明（以下、単に特許発明という。）は、独立して特許を受けることができる発明である。
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについての判断
（１）本件発明
　本件特許発明は、特許明細書及び図面の記載からみて、特許請求の範囲の請求項１に記載された次のとおりのものである。
「イオン化可能な生物活性剤が正に帯電している場合にはリポソーム類の内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに比較して負であり、また該生物活性剤が負に帯電している場合にはリポソーム類の内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに比較して正であるような配向を有するリポソーム膜を越えて膜貫通ポテンシャルを発生させることよりなる、医薬製剤として有効な濃度のイオン化可能で生物学的に活性な薬剤が貯蔵されたリポソーム類から該薬剤を外部媒体中に放出させる速度を低減させる方法。」
（２）異議申立ての概要
　異議申立人シキュース　ファーマシューテイカルズ、インコーポレイテッドは、甲第１〜７号証を提出して、本件特許発明は特許法第２９条第１項第３号、又は同法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであり、また同法第３６条第３及び４項に規定する要件を満たしていない出願に対して特許されたものであるから、取り消されるべきであることを、ネクスター　ファーマシューティカルズ　インコーポレーテッドは、甲第１〜６号証を提出して、本件特許発明は特許法第２９条第１項第３号又は同法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるから、取り消されるべきであることを、及び都野キヨコは、甲第１号証を提出して、本件特許発明は第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるから、取り消されるべきであることを、それぞれ主張している。
　各異議申立人が提出した証拠は次のとおりである。
ａ．シキュース　ファーマシューティカルズ、インコーポレイテツド
　甲第１号証（Biochim. Biophys. Acta，８１２，ｐ６６−７６、１９８５．１．３０発行）
　甲第２号証（Biochim. Biophys. Acta，２７４，ｐ３２３−３３５、１９７２年、以下、刊行物１という。）
　甲第３号証（Biochim. Biophys. Acta，４５５，ｐ２６９−２７１、１９７６年、以下、刊行物２という。）
　甲第４号証（G. Gregoriadisら編　”Liposomes in Biological Systems”，John Wiley ＆ Sons，ｐ８７−１００、１９８０年、以下刊行物３という。）
　甲第５号証（J. Neurol. Sci.，６３、ｐ１５３−１６５、１９８４年２月、以下、刊行物４という。）
　甲第６号証（Membrane Biol.，６５、ｐ２３５−２４２、１９８２年、以下、刊行物５という。）
　甲第７号証（Biochim. Biophys. Res. Commun.，Vol. ７５，No. ２，ｐ２９５−３０１、１９７７年、以下、刊行物６という。）
ｂ．ネクスター　ファーマシューティカルズ　インコーポレーテッド
　甲第１号証（J. Neurol. Sci.，６３、ｐ１５３−１６５、１９８４年２月、上記刊行物４）
　甲第２号証（Biochim. Biophys. Acta，４５５，ｐ２６９−２７１、１９７６年、上記刊行物２）
　甲第３号証（Cancer Treat. Rep.．Vol．６２，ｐ４５−５９、１９７８年、以下、刊行物７という。）
　甲第４号証（Proc.Nat. Acad. Sci. USA，Vol. ６９，ｐ１５０８−１５１３、１９７２年、以下、刊行物８という。）
　甲第５号証（Cancer Research、Vol. ４２，ｐ４７３４−４７３９、１９８２年、以下、刊行物９という。）
　甲第６号証（Labo−Pharm−Probl.　Tech.，Vol.３０，ｐ１３３−１５１、１９８２年、以下、刊行物１０という。）
ｃ．都野キヨコ
　甲第１号証（Biochim. Biophys. Acta，４５５，ｐ２６９−２７１、１９７６年、上記刊行物２）
　なお、シキュース　ファーマシューテイカルズ、インコーポレイテッドが提出した甲第１号証は、以下に述べるとおり、本件優先権主張日の１９８４年８月８日の後の日である、１９８５年１月３０日に頒布された刊行物であるから、証拠として採用しない。
（３）優先権主張について
　異議申立人シキュース　ファーマシコーテイカルズ、インコーポレイテッド及びネクスター　ファーマシューティカルズ　インコーポレーテッドは１９８４年８月８日に出願した米国出願を基礎とする優先権主張（以下、第１優先権主張という。）は、その優先権証明書に本件特許発明が記載されていないから、本件特許発明について第１優先権主張は認められないと主張しているので、まず、この点について検討する。    
  第１優先権証明書には、「脱水されたリポソーム」との名称の下に、１又は複数の糖類の存在下で脱水されたリポソーム製剤に関する発明が記載され、さらに、下記（i）〜（iv）の記載がある。
（i）「上述したとおり、薬物の投与のような応用に対して、リポソームに装填する工程をリポソームの製造工程から分離できることは望ましいことである。これは予め形成されたリポソーム膜を超えた膜貫通ポテンシャルを創り出し、その膜貫通ポテンシャルを荷電した物質、例えば、荷電した薬物をリポソーム内に装填するために利用することによりなし得る。膜貫通ポテンシャルは、リポソームの膜を超えるように１又はそれ以上の帯電した種（例えば、Ｋ＋及び／又はＨ＋）の濃度勾配を創出することによって発生する。濃度勾配は、異なる内部及び外部媒体、例えば、１又はそれ以上の帯電した種の異なった濃度をもつ内部及び外部媒体をもつリポソームを製造することにより創出される。」（１３頁１２〜２６行）
（ii）「リポソーム膜の透過性に依存して、濃度勾配に対応する全膜貫通ポテンシャルは自然に形成されるか、又は透過性向上剤、例えば、ワリノマイシンのようなイオノフオアが浴媒体に添加され得る。どちらの場合にも、ネルンスト式によって定義される大きさを有する膜貫通ポテンシャルがリポソームの膜を貫通して生じるであろう。この膜貫通ポテンシャルは、帯電した物質、例えば、帯電した薬物をリポソーム内に装填させるであろう。特に、膜貫通ポテンシャルはリポソームの内部ポテンシャルに対して反対に帯電している物質をリポソーム内に蓄積させるであろう。このように装填したい物質を外部媒体に添加することによって、及び濃度勾配と適当な方向をもつ膜貫通ポテンシャルを選択することによって、リポソームの装填はリポソームの形成とは異なる操作として行い得る。」（１４頁１５行〜１５頁６行）
（iii）実施例６には、「膜貫通ポテンシャルを使用する再水和されたリポソームの装填」とのタイトルの下に、１）膜を越える濃度勾配をもつリポソームは保護糖の存在下で脱水され、また濃度勾配のロスなしに再水和され得ること、及び２）再水和後、濃度勾配はリポソーム中へ帯電物質（薬物アドリアマイシン）を装填するのに使用し得ることが示され（第２８頁第１〜１０行）、これらの結果は、脱水／再水和べシクルは対照べシクルと同じ速度及び同じ量で実質的にアドリアマイシンを蓄積すること（第３０頁第２４〜２７行）が記載されている。
（iv）表１：脱水されたべシクルのアドリアマイシン保持能　（第３２頁）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　アドリアマイシン含有量
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（μモル／μモル脂質）
脱水前　　　　　　　　　　　　　　　　　１９７
脱水及び再水和直後　　　　　　　　　　　１８５
脱水及び再水和後１時間　　　　　　　　　１５８
脱水及び再水和後２時間　　　　　　　　　１４５
　上記摘示事項によれば、第１優先権証明書には、（ａ）荷電した薬物をリポソーム内に装填するために利用される膜貫通ポテンシャルは１又はそれ以上の帯電した種（例えば、Ｋ＋及び／又はＨ＋）の濃度勾配をリポソーム膜を越えるように創出することによって発生すること、（ｂ）膜貫通ポテンシャルはリポソームの内部ポテンシャルに対して反対に帯電している物質をリポソーム内に蓄積させると想定していること、及び（ｃ）実際に膜ポテンシャルを利用してリポソーム内にアドリアマイシンを蓄積したことが記載されており、本件発明の構成が記載されている。
　したがって、第１優先権主張は認められないとする異議申立人の主張は採用できない。
　なお、上記摘記事項は、第１優先権主張に係る米国出願の特許請求の範囲には記載されていないが、パリ条約第４条Ｈには「優先権は、発明の構成部分で当該優先権の主張に係るものが最初の出願において請求の範囲内のものとして記載されていないことを理由としては、否認することはできない。」と規定されているので、第１優先権主張を否認する理由にはならない。
（４）証拠に記載の発明
ａ．刊行物１には、リン脂質リポソームを用いて、膜を超えたｐＨ勾配を測定するための蛍光プローブとしてアテブリン及び９−アミノアクリジンをテストしたこと、９−アミノアクリジンの蛍光のクエンチングは定量的にリポソーム膜を超えたｐＨ勾配の大きさと関係しており、この関係はこのアミンのリポソーム系の内側と外側の容積間での分布が理想的なモノアミンの分布であることを示したことが記載されている。（第３２３頁、「要約」）
ｂ．刊行物２には、
（i）「リポソームを、その膜を超えたｐＨ勾配（外部緩衝液に対して、内部が酸性）を伴って調製した。これらのリポソームは、外部緩衝液に添加されたカテコールアミン（ドパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリン）を効果的に濃縮した。我々の観察結果は、ｐＨ勾配が、非細胞（Sub−cellular）貯蔵部位によるカテコールアミンの取り込みに貢献し得ることを示唆する機構を支持する。」（第２６９頁、「要約」）
（ii）「リポソームを、５５℃で、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１４ｍｌに、エーテルに溶解した卵ホスファチジルコリン７ｍｌ（２μｍｏｌ／ｍｌ）を注入することにより調製した。この条件で注入したとき、エーテルが揮発して、リン脂質が直径０．０５〜０．２μｍのべシクルを形成し、このべシクルは緩衝液を効果的に捕捉する（参考文献６）。リポソーム−緩衝液混合物を、１．２μｍのミリポア・フィルタを通して濾過し、より大きいマルチラメラリポソームからなる小分画を除去した。このリポソーム−緩衝液混合物をＮａＯＨで滴定してｐＨ８とし、３ｐＨユニットの初期勾配を確立した。次にトリチウム標識したカテコールアミン（エピネフリン、ノルエピネフリン、ドパミン）を、リポソーム−緩衝液混合物に添加し、最終濃度１０μＭ（５０００ｃｐｍ／０．１ｍｌ）とした。２ｍｌのリポソーム−緩衝液のインキュベーション混合物を指定した間隔で取り出し、溶出するためにｐＨ８クエン酸−リン酸塩緩衝液を用いてセファデックスＧ−５０カラムを通して濾過した。」（第２７０頁５〜１７行）及び
（iii）「これらの条件で、我々は試験したカテコールアミンそれぞれの著しい蓄積を観察した。リポソームへの取り込みは比較的ゆっくりと起こり、アミン添加後９０分で最高値となった。この時点で、我々は、ノルエピネフリンについて、コントロールの１２倍の濃縮を見いだした。エピネフリンおよびドパミンは、それぞれ１８倍及び２３倍濃縮された。・・・塩化アンモニウムを加えることによって勾配が破壊されたときに、蓄積されたカテコールアミンは放出され、その捕捉が可逆的で、ｐＨ勾配に依存するものであることが立証された。・・・対照に対して１０〜２０倍という観察された蓄積は３ｐＨ単位勾配に対応する理想的なモノアミンに対して期待されるほんの一部であることに注目すべきである。これは恐らく時間の経過によるｐＨ勾配の崩壊のためである。我々は△ｐＨ指示薬として９−アミノアクリジンを用いてこの系における崩壊率を測定した。そして３０分でｐＨ勾配の半分が失われたことを見出した。」（２７１頁１０〜２６行）との記載があり、さらに、
（iv）第１図には、ｐＨ勾配３単位で、右肩上がりのグラフでカテコールアミン類がほぼ６０００〜８０００ｃｐｍ捕捉されること、及びｐＨ濃度勾配がないもの（コントロール）では３００〜１３００ｃｐｍ捕捉されていることが示されている。
ｃ．刊行物３には、
（i）「リポソーム内の水性空間の容積は薬剤捕捉に影響を与える最も重要な要素の一つである。この容積が大きければ大きいほど捕捉されうる極性薬剤の量は大きくなる。・・
　水中または炭化水素溶媒中での薬剤の溶解度も捕捉の大きさに影響する。水中での薬剤の溶解度が高ければ高いほど、リポソームの水性コンパートメント中に多く捕捉される。同様に、非極性溶媒中の薬剤の溶解度が高ければ高いほど、リポソームの疎水性の領域により隔離される量が多くなる。」（第９１頁１８〜４０行）
（ii）「薬剤の増大された水溶性は、利用可能な官能基をイオン化するために溶液のｐＨを調整することで容易に達成され得る。リポソームを横切る、２ユニットを越えるｐＨ勾配を数時間以上維持することは極めて可能である。その勾配は、アニオン性リポソームの水性内部中における水素イオン濃度を測定するためのプローブとしてピラニンによりモニターされ得る。」（第９６頁６〜１１行）、及び
（iii）「脂質二重層を横切るプロトン透過性は、リポソーム内部のｐＨを調整するために使用される緩衝液に依存する。ホウ酸またはリン酸緩衝液を使用した場合、ｐＨ勾配は２４時間以上維持され得る。しかし、酢酸ナトリウム緩衝液存在下でのプロトン透過性は数分以内に生じる。これらのデータは、薬剤をより効果的に捕捉するための手段を提供する。」（９６頁２０〜２５行）との記載がある。
ｄ．刊行物４には、
（i）「逆相法によって調製されたリポソームからの［１２５Ｉ］ブレオマイシン及び［３Ｈ］ビンクリスチンの放出速度を、透析法によって、リポソームの脂質組成及び濃度、リポソーム内の緩衝液のｐＨ及びイオン強度、ならびに透析緩衝液の温度を変えて研究した。全ての場合に、リポソーム調製物はｖｉｓｋｉｎｇ　ｔｕｂｉｎｇ中に置かれ、０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析した。緩衝液を一定時間の間隔でサンプリングし、放射活性のレベルを測定した。」（第１５６頁１３〜１９行）、及び
（ii）「逆相法によって調製されたリポソームからのビンクリスチンの放出速度は、ｐＨの変化に著しく影響され、より酸性のｐＨではより遅い速度となる（Ｆｉｇ．２ａ、ｂ）。ビンクリスチンの放出速度もまた、緩衝液モル濃度の変化により有意に影響される。最遅速度は０．０２５Ｍのモル濃度で生じる。」（第１６１頁Ｆｉｇ．４の下１〜４行）、との記載がある。
ｅ．刊行物５には、
（i）「カリウムイオンの拡散ポテンシャルを、ホスファチジルコリンのユニラメラベシクルで形成した。このべシクルは、リン酸カリウムで緩衝化された硫酸カリウムを含み、硫酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムからなる類似の塩溶液に、希釈された。拡散ポテンシャルを、カリウムイオン透過担体であるワリノマイシンの添加によって創り出した。膜ポテンシャルの形成に続く、脂質の微少粘度の変化を、１，６−ジフェニル−１，３，５−へキサトリエンをプローブとする蛍光脱分極という慣用的手法によって測定した。」（第２３５頁要約、１〜１０行）との記載、及び（ii)「ワリノマイシンの存在は、ベシクルを両方に横切るカリウムイオンの輸送を容易にする。ナトリウムイオンならびに他のアニオンはこの交換プロセスに加わらずに完全に区別され、ワリノマイシン通過により発生された正味の膜ポテンシャルＥは、ベシクル内外のカリウム濃度の差異のみによるものであることが推測される。」（第２３６頁左欄３０〜３６行）との記載がある。
ｆ．刊行物６には、
（i）「プロトンＮＭＲ分光器を使用して、単一の二重層べシクル膜を横切る膜貫通ｐＨ勾配が、カルボン酸の輸送及び濃縮をもたらすことを示した。得られた結果から、この輸送は、プロトン化（非荷電）形態の酸の選択的膜透過により生じることが示される。」（第２９５頁要約）
（ii）「したがって、密閉べシクル膜の外部のカルボン酸溶液のｐＨを低下させることは、ベシクルの内容量中の酸を濃縮する。クロマフィンベシクル内のカテコールアミンの濃縮について異なるメカニズムが提案されており、ｐＨ勾配と輸送現象との関係について近年の研究を導いている。」（第２９５頁下から３行〜第２９６頁２行）
（iii）「ｐＨ７にて、０．１９Ｍマレイン酸のＤ２０溶液中に１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリン−コレステロール（モル比２：１）を懸濁した液を超音波処理することにより、マレイン酸ジアニオンを含む、直径３２０Åのシングル二重層べシクルを調製した。外部のマレイン酸溶液を、フマル酸ジアニオン（９．３ｍＭ）、ＮａＣ１（０．２６Ｍ）及び２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−スルホン酸ナトリウム（４．６ｍＭ；内部ＮＭＲ標準）を含むｐＨ７の等張Ｄ２０溶液で置換した。この溶液置換は、ベシクル調製物を、予め上記のフマル酸溶液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムに通すことによって行なった。　０．４ＮＤＣＩを添加して外部ｐＨを下げることによって、べシクル膜を超えたｐＨ勾配を確立した。」（第２９６下から４行〜２９７頁本文７行）
（iv）「Figure３及び４は、外部のｐＨをより低い値（５．５に対して４．７）に調整した結果、内部フマル酸が急速かつより高度に蓄積し、その後の両方の酸の同時に起こる漏れがゆるやかであったことを明らかにしている。」（第２９８頁下から４〜２行）、及び
（v）「Figure４は、この場合のｐＨ勾配が、全フマル酸の４０％の輸送をもたらすことを示している。これは、ベシクル調製物の内部容積が全容積の５％であると想定すると、内部及び外部濃度として、それぞれ７４ｍＭ及び５．９ｍＭに該当する。したがって、この例では、ｐＨ勾配はフマル酸を係数１３で濃縮させている。」（第２９９頁３〜８行）との記載がある。
ｇ．刊行物７には、ドーパ、ドパミン（Ｐ４９８）、ノルアドレナリン及びアドレナリン等が、抗腫瘍作用を有することが記載されている。（第５５頁右欄４０〜４６行及び第５１頁の表４）
ｈ．刊行物８には、
「ここで我々は小細胞、細胞膜ベシクル及びリン脂質ベシクルにおける膜貫通ポテンシャルの測定法について報告する。特に、我々はホスファチジルコリン（ＰＣｈｏｌ）ベシクルのＫ＋　拡散ポテンシャルの測定について報告する。」との記載がある。
ｉ．刊行物９には、アドリアマイシンをリポソームに被包させることが示されている。
ｊ．刊行物１０には、ダウノマイシン及びビンブラスチンをリポソームに被包させることが示されている。
（５）特許法第２９条第１項第３号について
　刊行物１には、リポソーム膜を横切るｐＨ勾配を測定する際にアテブリン及び９−アミノアクリジンを蛍光プローブとして用いることが記載されているものの、医薬製剤として薬剤を外部媒体中に放出させる速度を低減させることについては何も記載されていない。
　刊行物２には、カテコールアミン類を３ユニットのｐＨ勾配にしてリポソーム内に取り込むことが記載されているが、これはカテコールアミン類が神経細胞膜を通過することのモデルとしてリポソーム中に装填するものであって、医薬製剤用途としてリポソーム製剤を製造することは何も記載されていない。
　刊行物３には、リポソームを横切る、２ユニットを越えるｐＨ勾配を数時間以上維持することが可能であること（上記摘記事項ｃ．（ii））、脂質二重層を横切るプロトン透過性はリポソーム内のｐＨを調節するために使用する緩衝液に依存すること（上記摘記事項ｃ．（iii））が記載されているものの、リポソーム内に捕捉された薬剤を外部媒体中へ放出させる速度を低減させることについては何も記載されていない。
　刊行物４には、逆相法によって調製されたリポソームからのブレオマイシン及びビンクリスチン放出速度を、透析法により、脂質の組成、リポソームの濃度、リポソーム内の緩衝液のｐＨとイオン強度を変えて研究したこと、リポソームからのビンクリスチンの放出速度はｐＨの変化によって影響され、より酸性のｐＨでは放出速度はより遅くなったこと（上記摘記事項ｄ．（ii））が記載されている。
　しかしながら、図２aではビンクリスチンの放出について、ｐＨ６．０でリポソーム中に装填されたビンクリスチンは、透析バッファー（外部媒体）のｐＨ（ｐＨ７．４）により近いｐＨを有するリポソーム中に装填されたものより低い速度で放出されることが示されている。これに対し、図１ｂに示されているとおり、ブレオマイシンについては、ｐＨ約６．０のｐＨを有するリポソームからの方が、透析バッファー（外部媒体）のｐＨ（ｐＨ７．４）により近いｐＨを有するリポソームからよりも、より速く放出されることが示されている。
　このように、同刊行物では、ブレオマイシンとビンクリスチンのリポソームの内部及び外部媒体の間のポテンシャルにおいて、その放出速度に関して逆の方向性を有するという著しい相違があるから、同刊行物に記載の事項が、本件発明の特定の配向を有するようにリポソーム膜を越えて膜貫通ポテンシャルを発生させることにより、リポソーム内に装填された生物学的に活性な薬剤がリポソームから低減された速度で放出させ得ることを開示しているということはできない。
　刊行物５には、ホスファチジルコリンのユニラメラベシクルにおいて、カリウムイオンの拡散ポテンシャルをワリノマイシンの添加によって形成したことが記載されているが、膜ポテンシャルを生物学的に活性な薬剤のリポソームからの放出の抑制に使用することについては何も記載されていない。
　刊行物６には、単一の二重層べシクル膜を横切る膜貫通ｐＨ勾配が、フマル酸やマレイン酸の輸送及び濃縮をもたらすことについて記載されているが、これはリポソームをモデル膜システムとして使用して輸送機構を研究するものであって、薬剤をリポソーム中に装填し、それからの薬剤の放出速度を減ずることについては何も記載されていない。
　したがって、本件特許発明は、刊行物１〜６に記載されたものではない。
（６）特許法第２９条第２項について
　本件発明と刊行物１に記載のものを対比すると、刊行物１には、上記（５）で述べたとおり蛍光プローブを用いてリポソームのｐＨ勾配を測定することについて記載されているだけで、生物学的に活性な薬剤がリポソームから低減された速度で放出されることについては何も記載されていないし、又、示唆もない。
　次に、本件発明と刊行物２に記載のものとを対比する。
　刊行物２には、カテコールアミンが神経細胞膜を通過することのモデルとしてリポソームを使用しており、リポソーム膜を横切るｐＨ勾配を有するリポソーム（外部緩衝液に対して内部が酸性に維持されているもの）を調整したこと、このリポソームは外部緩衝液に添加されたカテコールアミンを１２〜２３倍に濃縮したこと、及び時間の経過によるｐＨ勾配の崩壊のため、３０分でｐＨ勾配の半分が失われたこと等が記載されている。
　しかしながら、同刊行物は、もともと、カテコールアミンの蓄積に関する研究を記載するものであって、３０分でｐＨ勾配の半分が失われたという記載はあるものの、リポソーム内部に取り込まれた生物活性剤の放出速度について、薬剤として有用な程度に徐放性を有するものとし得ることは何も記載されていないから、同刊行物の記載からは、本件発明の薬剤の外部媒体中への放出速度を減少させる方法を想到し得るものではない。即ち、同刊行物は、イオン化し得る生物活性剤の放出速度を低減させる医薬製剤における必須の要因が、リポソームの内部及び外部媒体との間のポテンシャルであるということを教示している、ということはできない。
　刊行物３には、上記（５）で述べたとおり、リポソーム内に捕捉された薬剤を外部媒体中に放出させる速度を低減させることについては何も記載されていないし、又、それを示唆する記載もない。
　刊行物４には、上記（５）で述べたとおり、ブレオマイシンとビンクリスチンのリポソームの内部及び外部媒体の間のポテンシャルにおいて、その放出速度に関して逆の方向性を有するという著しい相違があるから、同刊行物に記載の事項が、本件発明の特定の配向を有するようにリポソーム膜を越えて膜貫通ポテンシャルを発生させることにより、リポソーム内に装填された生物学的に活性な薬剤がリポソームから低減された速度で放出されることを一般的事実として記載しているということはできず、同刊行物の記載に基づいて、本件発明を容易に想到し得るということはできない。
　刊行物５には、リポソームの膜貫通ポテンシャルを発生させるために、Ｋイオン及びＮａイオンの勾配を用いることが記載されているが、リポソーム膜を貫通している勾配の形成により、イオン化し得る生物活性剤が該膜を通過するのを抑制し得ることについては何も記載されておらず、又、これを示唆する記載もない。
　刊行物６には、薬剤をリポソーム中に装填することについての記載はないし、そもそも、同刊行物はスモールユニラメラリポソームに関するものであって、その水性容積は小さなものであるから、リポソーム中に薬剤を多量に捕捉し得ないものである。
　そして、刊行物７〜１０には、ドパミン、アドリアマイシン、ダウノマイシン及びビンクリスチン等が抗腫瘍活性を有する化合物であること、これらを被包するリポソーム、及び、膜貫通ポテンシャルの測定法等が記載されているが、本件発明の如くの特定の配向を有するようにして膜貫通ポテンシャルを創出するリポソームについては何等記載されていなし、ましてや、薬剤の放出速度を減少する方法が示唆されるものではない。
　そうすると、刊行物１〜１０には、特定の膜貫通ポテンシャルの創出によりリポソーム製剤からの薬剤の放出速度を抑制することが記載されていない以上、これらの刊行物のいずれを組み合わせても、医薬製剤として有効な濃度のイオン化可能で生物学的に活性な薬剤が貯蔵されたリポソームから該薬剤を外部媒体中に放出させる速度を低減させる方法を、当業者が容易に想到し得るとすることはできない。
　一方、本件発明は、実施例及び表２等の記載によれば、例えば、アドリアマイシンの５０％放出時間が３時間から１６時間に増大しており（特許公報第９頁第１８欄第７〜９行）、医薬製剤として有効な濃度のイオン化可能で生物学的に活性な薬剤が貯蔵されたリポソームから、外部媒体中への薬剤の放出時間を増大させ得たことは明らかであるから、本件発明は薬剤を長時間有効に維持させる方法として顕著な効果を奏した得たものである。
　したがって、本件発明は、刊行物１〜１０に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　また、本件発明が容易になし得ないものである以上、かかる発明に従属する発明が容易になし得ないことも明らかである。
（７）特許法第３６条第３項及び第４項について
　異議申立人　シキュース　ファーマシコーテイカルズ、インコーポレイテッドは、ａ．本件特許発明の薬剤の放出速度低減方法は、「膜貫通ポテンシャルを発生させる」工程のみからなる方法であるが、放出速度を低減させるためには、発生させた膜貫通ポテンシャルを維持しなければならないにも拘らず、この点が請求の範囲に記載されていない、ｂ．膜貫通ポテンシャルを発生させる工程の作用が、薬剤の装填との関係において不明瞭である、ｃ．請求項２に係る「１種又はそれ以上の帯電した種」という記載について、これ以外に膜貫通ポテンシャルを発生し得るものが明細書に記載されていないから、結果として請求項１に記載の範囲が不当に広いという点で明細書の記載が不備である旨主張している。
　そこで、これらの点について検討する。
ａ．について：特許明細書には、例えば、「事実、このような濃度勾配により生成する膜貫通ポテンシャルによりリポソーム類が負荷されるならば、元の濃度勾配を保つ外部媒体内にリポソーム類を保つことだけで放出速度の所望の低減を生ずるであろう。」（特許公報第４頁第７欄第２２〜２６行）と記載されており、また、Ｎａ＋／Ｋ＋勾配がｐＨ勾配に加わった場合にアドリアマイシンの５０％放出速度が３時間から１６時間に増大することが示されている（明細書第９頁第１８欄第７〜９行）。かかる記載事項を考慮すれば、膜貫通ポテンシャルを発生させてから放出速度が低減している間は膜貫通ポテンシャルが維持されていることになり、膜貫通ポテンシャルを維持するとの明示の記載がなくても本件発明を理解できるから、特許請求の範囲の記載が不備であるとまではいえない。
ｂ．について：本件発明は、リポソーム膜を越えて特定の配向を生ずる膜貫通ポテンシャルを発生させることにより、リポソーム内に貯蔵された薬物が外部媒体中に放出される速度を低減させる方法に関するものであるから、少なくとも放出速度を低減させる目的でリポソームを使用するときまでに薬剤がリポソーム内に装頃されていればよいといえる。このため、請求項１の記載について、膜貫通ポテンシャルを発生させる工程と薬剤の装填との関係が不明瞭であるということはできない。
ｃ．について：異議申立人は、「１種又はそれ以上の帯電した種」以外に膜貫通ポテンシャルを発生しうるものが明細書に記載されていないと主張するとともに、請求項２の記載によれば、請求項１の記載は不当に広いと主張している。
　ところで、明細書の記載からは、膜貫通ポテンシャルを発生し得る、実用的に使用し得る手段として、「１種又はそれ以上の帯電した種」による濃度勾配に加えて、どのような手段があるのかは必ずしも明らかではないが、放出速度を低減させる薬剤がイオン化可能な薬剤である場合には、その作用機序からみて、膜貫通ポテンシャルは、主として、「１種又はそれ以上の帯電した種」による濃度勾配により発生させるものと考えられるから、請求項１の記載が不当に広いとまではいえない。
　したがって、本件特許明細書に不備はない。
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件特許は特許法第２９条第１項第３号及び同法第２９条第２項に違反してされたものではないし、さらに、同第３６条第３項又は第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものでもない。
　そして、本件特許については、他に取消理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年５月２日（２００３．５．２）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
　審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
リポソームからの薬剤の放出速度低減方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】イオン化可能な生物活性剤が正に帯電している場合にはリポソーム類の内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに比較して負であり、また該生物活性剤が負に帯電している場合にはリポソーム類の内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに比較して正であるような配向を有するリポソーム膜を越えて膜貫通ポテンシャルを発生させることよりなる、
医薬製剤として有効な濃度のイオン化可能で生物学的に活性な薬剤が
該
　【請求項２】膜貫通ポテンシャルが、リポソーム膜を越えて１種またはそれ以上の帯電した種の濃度勾配をつくることにより発生されるものである請求項１記載の方法。
　【請求項３】濃度勾配がＮａ＋／Ｋ＋濃度勾配である請求項１又は２に記載の方法。
　【請求項４】濃度勾配がｐＨ勾配である請求項１
又は
　【請求項５】生物活性剤が抗腫瘍剤である請求項１、２、３又は４記載の方法。
　【請求項６】抗腫瘍剤がダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求項１、２、３、４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、抗腫瘍剤類（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｇｅｎｔｓ）、特に、リポソーム類における抗腫瘍剤類の放出させる速度を低減させる方法に関するものである。
　【０００２】
　【従来の技術】
　種々の研究者により確立されているように、抗腫瘍剤類の使用による癌の治療は、多くの場合、抗腫瘍剤類を人体に直接投与するよりもリポソーム類に該抗腫瘍剤類を被包することにより大いに改善され得る［例えばフォルセン等（Ｆｏｒｓ腫瘍剤類を被包することにより大いに改善され得る［例えばフォルセン等（Ｆｏｒｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）（１９８３），キャンサー　レス（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．），
４３
４２
１８
１１
４２
２６
　【０００３】
　【発明が解決しようとする課題】
　リポソーム類を使用して抗腫瘍剤類を投与する際には、医薬被包および治療中の医薬放出の両方に関して問題が生ずる。被包に関しては、治療中に患者に与える脂質負荷を最小にするように、トラップ効果を増加する必要性が引続いてあった。さらに、高いトラップ効果によって、癌の治療において現在使用されている高価な医薬を処理する際の重要な点である少量の医薬しか損失しないという利点が得られるのである。
　医薬の放出に関しては、アドリアマイシンのような多くの抗腫瘍剤類が被包後にリポソーム類から急速に放出されることが見出されていた。このような急速な放出は、リポソーム被包の有用な効果を減少させるため一般に望ましくないことである。したがって、リポソーム類からの抗腫瘍剤類およびその他の医薬の放出速度を減少させる方法を見出す努力が当業者により引続いて行なわれてきた。
　これらの被包および放出の問題の他に、臨床医に抗腫瘍剤類含有リポソーム類を提供するための商業的に許容し得る方法を見出すという無視すべからざる問題がある。「必要な」ベ−スにリポソーム類の生産および負荷が実験室的には許容し得る方法であるとはいえ、一般に、臨床的には不満足である。したがって、被包された医薬を有するあるいは有さないリポソーム類が出荷され、貯蔵されかつ従来の商業的な販売ルートを通じて一般に移動される方法に対して重要でかつ継続的な需要がある。
　【０００４】
　【課題を解決するための手段】
　上記のごとき技術の状態から、本発明の目的は、リポソーム類に抗腫瘍剤類（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｇｅｎｔｓ）を被包し、リポソーム類からの抗腫瘍剤類またはその他の生物学的に活性な薬剤の放出速度を減少させる方法を提供することにある。
　本発明によれば、リポソーム類に薬剤を保持するために配向した膜貫通ポテンシャルがリポソーム膜を横切って発生しているリポソーム類からのイオン化可能な抗腫瘍剤類または他の生物学的に活性な薬剤の放出速度を減少させる方法が提供される。下記に詳述するように、リポソーム類からのアドリアマイシンのようなイオン化可能な薬剤の放出速度を、このような膜貫通ポテンシャルが１０倍も減少させ得ることは驚くべきことである。この膜貫通ポテンシャルは、被包後に発生させ得るか、あるいは上記被包技術によりリポソーム類に負荷されていた膜貫通ポテンシャルと同一であり得る。
　本発明の前記および他の目的および利点の達成は、本発明の好ましい実施態様の記載を参照されたい。
　【０００５】
　本明細書で使用されているように、「医薬製剤」、「イオン化可能な抗腫瘍剤（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ　ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｇｅｎｔ）」および「イオン化可能な生物学的に活性な薬剤（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ａｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ）」の用語は、次ぎの意味を有している。すなわち、ヒトまたは動物への投与に好適でかつ生物学的に活性な物質および適当な緩衝剤、希釈剤、担体等よりなる組成物を意味し、イオン化可能な抗腫瘍剤は水性媒体に溶解したときに帯電した状態で存在し得る抗腫瘍剤を意味し、また、イオン化可能な生物学的に活性な薬剤は水性媒体に溶解したときに帯電した状態で存在し得る生物学的に活性な薬剤を意味する。
　抗腫瘍剤類が被包されるリポソーム類は、種種の組成および内部含有物を有しており、かつ現在知られているあるいは将来開発されるマルチラメラ、ユニラメラまたは他のタイプのリポソーム類あるいは一般に脂質含有粒子は、米国特許出願第４７６，４９６号（米国特許第４，５２２，８０３号）、同第５２１，１７６号（米国特許第４，５８８，５７８号）、同第５９１，５７６号（米国特許４，６１０，８６８号）および同第５９９，６９１号（米国特許第４，７２１，６１２号）に開示されているタイプのステロイドリポソーム類、安定なプルリラメラリポソーム類（ＳＰＬＶ類、）単相ベシクル類（ＭＰＶ類）または脂質マトリックス担体（ＬＭＣ類）の形であり得、その関連個所を参考にされたい。
　リポソーム類は、リポソーム類の製造法として現在知られているかあるいは将来開発されるいかなる方法によっても製造できる。例えば、マルチラメラリポソーム類（ＭＬＶ類）製造用の従来の技術により該リポソーム類は形成できる。すなわち、クロロホルム中に脂質類を溶解することにより適当な容器の内壁に１種またはそれ以上の選ばれた脂質類を堆積させ、ついでクロロホルムを蒸発させ、被包させるべき水溶液を容器に加え、該水溶液で脂質類を水和し、かつ得られる懸濁液を旋回させることにより目的とするリポソーム類が製造される。
　別法としては、逆相蒸発法、注入法および洗浄剤希釈法のごとき大型ユニラメラリポソーム類（ＬＵＶ類）の製造に用いられる技術がリポソーム類の製造に使用できる。リポソーム類製造のためのこれらおよびその他の方法の総説は、マーク　ジェイ　オストロ（Ｍａｒｃ　ｊ．Ｏｓｔｒｏ）編「リポソーム類（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）」マーテル　テッカー　インコーポレーテッド（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ．）ニューヨーク１９８３年発行の第１章に見出すことができ、その該当個所を参考にされたい。スゾカ　ジュニアら（Ｓｚｏｋａ，ｊｒ．，ｅｔ　ａｌ）（１９８０）アン　レブ　バイオフィズ　バイオエジニヤ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇｒ．），９：４６７も参照されたい。ＬＵＶ類製造の特に好ましい方法は、１９８４年６月２０日に出願された米国特許出願第６２２，６９０号「ユニラメラベシクル類製造用押出技術」（関連米国特許第５，００８，０５０号）に記載されている。その関連個所を参考にされたい。
　他の別法としては、上記米国特許第４，５２２，８０３号、同第４，５８８，５７８号および同第４，７２１，６１２号に記載の方法により製造できる。また、リポソーム類自体を使用するよりも、上記米国特許第４，６１０，８６８号に記載されているような他の脂質含有粒子が、本発明の実施に当って使用できる。さらに、また、必要により、抗腫瘍剤類の担持により使用されるリポソーム類または脂質含有粒子が「決められた粒径分布を有するリポソーム類」という名称の１９８４年６月２０日に出願された米国特許第６２２，５０２号に記載されている方法によりさらに均一な粒径分布を与える抗体とができ、その関連個所を参考にされたい。
　【０００６】
　膜貫通ポテンシャルは、リポソーム膜をはさんで１種またはそれ以上の帯電した種（ｃｈａｒｇｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばＮａ＋，Ｋ＋および／またはＨ＋）に対応する濃度勾配をつくることにより発生する。この濃度勾配は、異なる内部および外部媒体、すなわち１種またはそれ以上の帯電された種を有する内部および外部媒体を有するリポソーム類を製造することによりつくり出される。
　特に、１種またはそれ以上の帯電された種の最初の濃度を有する最初の媒体を被包するリポソーム類が製造される。代表的なリポソーム製造技術には（上記参照）、この最初の媒体はリポソーム類が生成するにつれてリポソーム類をつつみ、しかしてリポソーム類の元の外部媒体は最初の媒体と同一組成を有することになる。濃度勾配をつくりだすには、元の外部媒体は異なる濃度の１種またはそれ以上の帯電された種を有する新たな外部媒体で置換される。この外部媒体の置換は、新たな媒体で平衡化されたゲルフィルトレーションカラム、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラムにリポソーム製剤を通すことにより、または遠心分離、透析または関連する技術等、種々の技術により達成できる。
　リポソーム膜の透過性に応じて濃度勾配に相当する全膜貫通ポテンシャルを同時に形成するかあるいは透過性増強剤、例えばワリノマイシンのようなイオン透過担体が浴媒体に添加されなければならない（必要により、透過性増強剤は、クロマトグラフィまたは他の技術を用いて負荷を完了したのち、該製剤から除去できることに注目されたし。）。いずれの場合も、ネルンスト式により決定されるマグニチュードを有する膜貫通ポテンシャルはリポソーム類の膜を横切って発現する。
　本発明によれば、この膜貫通ポテンシャルは、イオン化可能な抗腫瘍剤類をリポソーム類に負荷するために使用できる。特に、濃度勾配を有しかつこのために適当な配向の膜貫通ポテンシャルを持つリポソーム類がいったん作られると、該リポソーム類への抗腫瘍剤類の負荷方法は、該薬剤を外部媒体へ添加する極めて簡単な工程に縮小される。いったん添加すると、膜貫通ポテシャルは自動的にリポソーム類へ該薬剤を負荷する。さらに、下記例１に記載したように、この負荷は簡単であるだけでなく極めて効果的である。この例に記載したように、９５％以上の抗腫瘍剤類捕捉効果が、この膜貫通ポテンシャル負荷技術により達成できることが見出された。
　【０００７】
　膜貫通ポテンシャル負荷方法は、適当な水性媒体（例えばプロトン化し得るアミノ基を有する有機化合物）に溶解したときに帯電状態で存在するものであればいかなる抗腫瘍剤でも実質的に使用できる。好ましくは、薬剤がリポソーム複数の膜に分画されるように、比較的に親油性でなければならない。この方法でリポソーム類内へ負荷できる抗腫瘍剤類の例としては、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ビンブラスチン（ｂｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、メクロレタミンハイドロクロライド（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、シクロホスファミド、トリエチレンチオホスフォルアミド、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロスムチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、セムスチン（ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）、フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、チオグアニン、チタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、フロクスリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｓｔｉｎ）およびプロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）等が挙げられる。
　リポソーム類からのイオン化可能な抗腫瘍剤または他のイオン化可能な抗腫瘍剤または他のイオン化可能な生物学的に活性な薬剤の放出速度の低減に関する本発明の方法については、驚くべきことには、リポソーム類に該薬剤を保持するために配向しているリポソーム膜を横切って膜貫通ポテンシャルを形成することによって、放出速度が著しく低減されることが見出された。すなわち、イオン化したときに正に帯電する薬剤用には、外部ポテンシャルに比較して負である内部ポテンシャルを有するリポソーム膜を横切った膜貫通ポテンシャルがつくり出されるが、負に帯電している薬剤用には、反対の配向が使用される。
　【０００８】
　本発明の膜貫通負荷の面に関しては、薬剤放出の速度を低減するために使用される膜貫通ポテンシャルは、Ｎａ＋，Ｋ＋および／またはＨ＋のような帯電した種のリポソーム類の内部および外部の濃度を調整することによりつくり出される。事実、このような濃度勾配により生成する膜貫通ポテンシャルによりリポソーム類が負荷されるならば、元の濃度勾配を保つ外部媒体内にリポソーム類を保つことだけで放出速度の所望の低減を生ずるであろう。別法としては、膜貫通ポテンシャルがリポソーム膜を横切ってつくり出されていない場合、例えばリポソーム類が従来の技術を用いて負荷されている場合には、所望の膜貫通ポテンシャルは、上記交換技術を用いて外部媒体の組成を変えることにより直ちにつくり出すことができる。
　本発明の低減された放出速度は、リポソーム類内に被包され得る実質的にイオン化可能な生物学的に活性な薬剤のいずれも使用できる。特に、この技術は、上記のイオン化可能な抗腫瘍剤類および局部麻酔剤、例えばジブカインおよびクロルプロナジン、β−アドレナリンしゃ断薬、例えばプロパノール、チモロールおよびラベトロール、抗高血圧薬、例えばクロニジンおよびヒドララジン、抗うつ剤、例えばイミプラミン、アミプリプチリンおよびドキセピム、鎮痙薬、例えばフェニトイン、制吐薬、例えばプロカインアミドおよびプロクロルペラジン、抗ヒスタミン剤、例えばジフェニルヒドラミン、クロルフェニラミンおよびプロメタジン、抗不整脈剤、例えばキシジンおよびジソピラミド、抗マラリア剤、例えばクロロキニーネ、および鎮痛剤、例えばコカインを含む他の種々のイオン化可能な医薬とともに使用できる。一般に、放出速度の最大の低減は、その通常放出速度が非親油性物質に比べて高い親油性物質に見られる。
　【０００９】
　【実施例】
　本発明を以下の例によりさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定するためものではない。種々の例において共通な材料および方法は、つぎの通りである。
　　　
実施例及び参考例の材料および方法
材料
　卵ホスファチジルコリン（卵−ＰＣまたはＥＰＣ）を、標準方法［例えば、シングルトンら（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ）（１９６５）ジャーナル　オブ　ジ　アメリカン　オイル　ケミカル　ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ），４２：５３］により分離し、このものはＴＬＣで測定して９９％以上の純度であった。卵−ＰＳを、ホープら（Ｈｏｐｅ　ｅｔ　ａｌ）（１９８５），ビオヒム　ビオフィズ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）８１２：５５］に記載の方法により卵−ＰＣから調製した。
　コレステロール、ワリノマイシン、ビンブラスチン、ヘペス、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、トレハロース、ＣＣＣＰおよび塩類は、シグマ　ケミカル　カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズリー州セントルイス）から入手した。
　アドリアマイシンはアドリア　ラボラトリー（Ａｄｒｉａ　Ｌａｏｒａｔｏｒｙ）（オンタリオ州ミッシソらが）またはキャンサー　リサーチ　センター（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）（ブリテッシュコロンバア州バンクーバー）のいずれかから入手した。メトトレキセイト（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）およびチトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）もキャンサー　リサーチ　センターから入手した。
　トリテイエイテッドメトトレキセート（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ＤＰＰＣおよびメチルトリフェニルホスフォニウム、また同様に２２Ｎａ＋、３Ｈ−イヌリン、１４Ｃ−イヌリン、３Ｈ−テトラフェニルホスフォニウジュブロマイドおよび３Ｈ−Ｈ２Ｏはニューイングラド　ニュークレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）（ケベック州ラシーヌ）から入手した。トリテイエイテッドチトシンアラビノシド（ｔｒｉｔｉａｔｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏｓａｉｄｅ）はアメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（オンタリオ州オークビル）から入手した。
　【００１０】
試薬
　グルタミン酸カリウム、ＫＣｌおよびＮａＣｌ緩衝液はＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した２０ｍＭのへペス緩衝液中で調製した。この溶液は、それぞれ１５０、１５０および１６９ｍＭのＫＣｌ、ＮａＣｌおよびグルタミン酸カリウムの濃度に相当する通常の３１０ｍｏｓｍ／ｋｇの浸透性（ｏｓｍｏｔａｒｉｔｙ）に調整された。
ベシクル製剤
　ベシクル類は、上記米国特許出願第６２２，６９０号（関連米国特許第５，００８，０５０号）および同第６２２，５０２号に記載の押出技術を用いて調製した。使用されるこの技術の完全な記載は、これらの出願および特許にみられ、かつ参考のために本明細書に記載されその一部を構成する。この技術はまた、ホープら（Ｈｏｐｅ　ｅｔ　ａｌ）（１９８５），ビオヒム　ビオフィズ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）
８１２
Ｅ
Ｔ
Ｖ
Ｌ
Ｕ
Ｌ
　簡単にいえば、乾燥脂質フィルムは２５〜１００μｍｏｌのリン脂質／ｍｌの濃度範囲で大きなマルチラメラベシクル類を製造するために適当な緩衝液で水和される。使用時には水和前に２２Ｎａ＋（５μＣｉ）または３Ｈ−イヌリン（５μＣｉ）が乾燥脂質に添加される。
　混合物を渦回により分散させ、ついで例えば２５０ｐｓｉの圧力を用いて１００ｎｍの孔径の２枚の積重ねたポリカーボネートフィルタ［ヌクレポア，インコーポレーテッド（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．），カルフォルニア州プレザントン］を１０回通過させた。例１Ｂおよび２Ｂの実験には、分散液は液体窒素中で凍結され、かつポリカーボネートフィルタへの押出前に５回融凍を行なった。得られるベシクル類は１０３ｎｍの平均粒径を有し、かつ約１．５μｌ／μｍｏｌリン脂質の捕捉容積を有していた。例１および２の残りの実験用には、液体窒素中で２回の凍結−融凍のサイクルにより最初の押出を行ない、その後、５回以上フィルタを通過させた。この場合、ベシクル類は９０ｎｍの平均粒径を有し、かつ再び約１．５μｌ／μｍｏｌリン脂質の捕捉容積を有していた。
　被包されなかった２２Ｎａ＋、３Ｈ−イヌリンの除去に当っては、２２Ｎａ＋の除去用にはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０の、また３Ｈ−イヌリン除去用にはウルトラゲル（Ｕｌｔｒａｇｅｌ）ＡｃＡ３４のカラム（１．４×１０ｃｍ）にべシクル類を通過させて除去を行なった。この方法では、一般に試料のリン脂質顔料を約５０％まで希釈した。
　【００１１】
脱水
　試料（１ｍｌ）をバーチスフリーズドライヤー（Ｖｉｒｔｉｓ　Ｆｒｅｅｚｅ　Ｄｒｉｅｒ）（ニューヨーク州ガーディナー）を用い高真空下に室温で１０ｍｌのキメックス管（Ｋｉｍｅｘ　ｔｕｂｅ）内で乾燥した。いくつかの場合、試料を脱水前に液体窒素中で凍結させた。それぞれの場合、減圧脱水法を約２４時間行なった。
再水和
　１〜７日間脱水および貯蔵を行なった後、試料を蒸留水（９００μｌ）で再水和化し、ベシクル類をゆるく渦回させて分散させた。
測定
　リン脂質はチェンら（ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ），（１９５６）アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌ．ｃｈｅｍ．）
２８
２４
　アドリマイシンは、ベシクル懸濁液の一定量を０．５％のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（これはベシクル類を分断しかつ捕捉されている薬剤を放出する）と混合し、パイ　ユニカム（Ｐｙｅ　Ｕｍｉｃａｍ）ＳＰ８−２００分光光度計を用いて４８０ｎｍにおける吸収を測定した。ビンブラスチンは、９４％エタノール中に溶解した懸濁液の２６５ｎｍにおける吸収を測定することにより測定した。
　種々のトリムウム標識化合物（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）および１４Ｃ−イヌリンはフィリップス（ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ＰＷ４７００液体シンチレーションカウンターにより定量し、２２Ｎａ＋はベックマンガンマ８００（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｇａｍｍａ８００）でガンマカウンティングで定量した。
　【００１２】
　　　
例１
膜貫通ポテンシャルを利用したリポソーム類内へのイオン化し得る抗腫瘍剤の負荷
　本例は、膜貫通ポテンシャルを利用したリポソーム内へのイオン化可能な抗腫瘍剤の活性負荷を説明するものである。
　例のＡ部は、膜貫通ポテンシャルを発生するためにＮａ＋／Ｋ＋勾配を利用したリポソーム類中に抗癌剤であるアドリアマイシンおよびビンビラスチンの負荷を説明し、Ｂ部はｐＨ勾配を利用したアドリアマイシンの負荷を説明し、またＣ部はメトトレキセイトまたはチトシンアラビノシドのいずれかにより予め受動的に負荷されたリポソーム類へアドリアマイシンを負荷させるための膜貫通ポテンシャルの利用を説明する。
　　　
Ａ部
　　　
Ｎａ＋／Ｋ＋勾配を利用した活性負荷
　膜ポテンシャルは、グルタミン酸カリウム緩衝液（上記）中で卵−ＰＣ　ＬＵＶ類を形成し、ついでセファデックスＧ−５０脱塩カラムを用いてＮａＣｌ緩衝液（上記）用の未捕捉緩衝液と交換することにより発生させた。この時、カリウムイオン透過担体、ワリノマイシン（１ｍｇ／ｍｌエタノール）を０．５μｇ／μｍｏｌリン脂質の濃度になるように添加した。膜ポテンシャルは、膜ポテンシャルのプローブであるメチルトリフェニルホスフォニウムを用いて測定された［バリーら（Ｂａｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ），（１９８５），ビオフィム　ビオフィズ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ），
８１２
　アドリアマイシン（０．２ｍＭの最終濃度）およびビンブラスチン（０．２ｍＭの最終濃度）をＮａ＋／Ｋ＋イオン勾配のあるまたはないＬＵＶ分散液にワリノマイシンとともにおよびなしに添加した。種々の時間において、隔離されていない医薬を、該溶液の一定量ずつを１ｍｌのセファデックスＧ−５０カラムに通すことにより除去した。次いで脂質および医薬濃度を上記の方法を用いて測定した。その結果は、図１および図２に示されている。
　図１に示すように、Ｎａ＋／Ｋ＋勾配およびワリノマイシンの両方がない場合、低いＬＵＶ会合アドリアマイシンのレベル（６ｎｍｏｌアドリアマイシン／μｍｏｌリン脂質以下）が２時間の培養で観察された。しかしながら、ワリノマイシンおよびＮａ＋／Ｋ＋勾配が存在すると、ベシクル会合アドリアマイシンの量の著しい増加が観察される。この吸収は２０分以内で７５％以上完成し、１９０ｎｍｏｌアドリアマイシン／μｍｏｌリン脂質の平衡レベルに達する。これは、溶液中に最初含有されていた９５％の薬剤がベシクル類によって吸収され、９５％の捕捉率に相当する。濃度の点から、この吸収は約１２７ｍＭの内部アドリアマイシン濃度に相当する。
　図２に示すように、ビンブラスチンも膜ポテンシャルに応じてＬＵＶ系内に蓄積できる。ワリノマイシンおよびＮａ＋／Ｋ＋勾配が存在する場合には、４０ｎｍｏｌビンヒブラスチン／μｍｏｌリン脂質が、Ｎａ＋／Ｋ＋勾配がない場合のほとんどゼロに近い捕捉と比較して２時間以内に蓄積される。また、ワリノマイシンがなくてもＮａ＋／Ｋ＋勾配の存在によりかなり捕捉することができる。
　要約すれば、図１および図２の結果は、膜貫通ポテンシャルに応じてアドリアマイシンおよびビンブラスチンを隔離するＬＵＶ系の著しい能力を明らかにしている。使用する条件下では、捕捉レベルは、それぞれビンブラスチンおよびアドリアマイシンの２×１０２および２×１０４の最終貫通膜医薬濃度勾配に応じて達成される。更に、これらの勾配は２０℃で４０時間以上安定であることが見出された。
　操作について特別な理論に結び付けることを望むものではないが、Ｎａ＋／Ｋ＋勾配に応じてアドリアマイシン、ビンブラスチンおよび他のイオン化可能な抗腫瘍剤に見られる捕捉に関係する機構は、Ｈ＋イオンに対するリポソーム膜の透過性に基づくＮａ＋／Ｋ＋勾配に応じて自動的に発生するｐＨ勾配を含むものと思われる。この機構によれば、イオン化可能な抗腫瘍剤は、内部および外部Ｈ＋イオン濃度の関数であるその内部および外部濃度によって非荷電状態で膜を通過し、その薬剤の内部濃度はその内部Ｈ＋濃度が高い場合に高く、その逆もまた同様である。
　膜貫通ポテンシャルの負荷方法は、さらに使用される医薬の量を変えることによってさらに特徴づけられるものである。図３に示すように、所定のベシクル濃度（１ｍＭリン脂質）を保ちながら、０から１０ｍＭへと初期アドリアマイシン濃度を増加することによって、膜貫通ポテンシャルによって作動するアドリアマイシン捕捉工程が約４００ｎｍｏｌ／μｍｏｌリン脂質で飽和になることを示した。０から０．２ｍＭのアドリアマイシンで、その捕捉は最初の遊離濃度に比例しかつほぼ定量的（９５％以上の捕捉効率）である。０．２ｍＭ以上のアドリアマイシンでは、捕捉効率は捕捉工程の飽和により減少した。しかしながら、これらの高い医薬濃度での高い補足効果は、ベシクル濃度増加という簡単な方策により直ちに達成できる。例えば、５０ｍＭのリン脂質濃度に相当するＬＵＶ類の存在下に１０ｍＭのアドリアマイシンを培養すると、９８％の捕捉率に相当する１９６ｎｍｏｌアドリアマイシン／μｍｏｌリン脂質のレベルの捕捉が生じたのである。
　ビンブラスチンを使用した同様な研究により、４０ｎｍｏｌ瞳ビンブラスチン／μｍｏｌリン脂質で捕捉レベルが飽和に達することが明らかとなった。１００％に近い捕捉率は、５ｍＭのリン脂質に相当するＬＵＶ類の濃度で０．２ｍＭのビンブラスチンの培養を行なうことにより達成される。
　リポソーム系医薬搬送システムは、血清成分により誘発される捕捉される物質の漏出を減少させるために当モルレベルのコレステロールおよびさらに飽和されたリン脂質を通常含むので［例えば、ギャビゾンら（Ｇａｂｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）（１９８２）キャンサー　レス（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，），
４２
　アドリアマイシンの膜貫通ポテンシャル負荷に関するリン脂質アシル鎖の増大した飽和度の効果は、ＤＤＰＣ−コレステロール（１：１）ＬＵＶ類への捕捉をチェックすることにより試験された。図５に示すように、２０℃で４時間以上経ってもアドリアマイシンの捕捉は見られなかった。しかしながら、６０℃での培養は、２時間で１５０ｎｍｏｌ医薬／μｍｏｌ脂質の隔離されたアドリアマイシンレベルを生じる。また、かなりの捕捉（約６０ｎｍｏｌ／μｍｏｌ脂質まで）がワリノマイシンの不存在下に培養したこれらの系で観察された。同様に、卵−ＰＣ　ＬＵＶ類には、それぞれ３７℃および６０℃で６０および１００ｎｍｏｌ／μｍｏｌ脂質のアドリアマイシン捕捉レベルが達成された（図５）。
　アシル鎖組成およびコレステロール含量の変動の他に、生体内分布および捕捉工程に影響する帯電した脂質種もリポソーム系分配系に配合された［フレーリーら（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ）（１９８１）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），
２０
　【００１３】
　　　
Ｂ部
　　　
ｐＨ勾配を利用した活性負荷
　１５０ｍＭのＫＯＨおよび１７５ｍＭのグルタミン酸（ｐＨ４．６）でＬＵＶ類を形成させついでセファデックスＧ−５０脱塩カラムを用いて１５０ｍＭのＫＯＨ、１２５ｍＭのグルタミン酸および３０ｍＭのＮａＣｌの未捕捉緩衝液で交換することにより、膜貫通ｐＨ勾配を発生させた。［ホープら（Ｈｏｐｅ　ｅｔ　ａｌ），（１９８５），ビオヒム　ビオフィズ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ），
８１２
　アドリアマイシン（０．２ｍＭの最終濃度）を該ＬＵＶ分散液に添加した。種々の時間において、隔離されていない医薬を１ｍｌのセファデックスＧ−５０カラムに該溶液を一定量づつ通過させることにより除去した。ついで、脂質および医薬濃度を測定した。
　図７は、膜貫通ｐＨ勾配を示すＥＰＣおよびＥＰＣ／コレステロールより構成されるＬＵＶが、プロトンイオン透過担体ＣＣＣＰの不存在下にアドリアマイシンを蓄積することを示す。２０℃で、５０％の最大捕捉がＥＰＣ／コレステロールおよびＥＰＣ　ＬＵＶで各々１５分間および５分以下で観察された（図７Ａ）。これらの結果は、二つの膜系の相対的プロトン透過性と一致する。ＥＰＣおよびＥＰＣ／コレステロールベシクル類に観察される捕捉率パーセントはそれぞれ９８および７２％であり、Ｎａ＋／Ｋ＋勾配に関して報告された値に匹敵するものである。コレステロール含有ＬＵＶ類の場合に得られる僅かに低い量の捕捉は、これらのベシクル類がＥＰＣベシクルよりも僅かに低い捕捉容積を有するという事実に基づく。
　培養混合物にＣＣＣＰを含有させると一時的にアドリアマイシンの高いレベルでの蓄積があり、つづいてベシクル内部から徐々に放出された。ＬＵＶ系が明らかにプロトンを充分透過してＣＣＣＰの不存在下にアドリアマイシンを蓄積するので、イオン透過担体の添加は、ｐＨ勾配を損ない、この結果、非常に大きな膜貫通医薬濃度勾配を保つエネルギー力が減少せしめるようである。
　培養温度を３７℃に増加させると、ＥＰＣ／コレステロールＬＵＶ類の捕捉速度（図７Ｂ）が２０℃で平衡にした系（図７Ａ）と比較して増大した。ＣＣＣＰの不存在下で昇温したＥＰ過担体が存在する場合には急速な放出が起こった。これらの結果は、種々のＬＵＶ系に対する相対プロトン透過性に相当する。
　【００１４】
　　　
Ｃ部
　　　
能動的／受動的負荷−「医薬カクテル」
　親油性またはカチオン性を示さない水溶性抗癌剤であるメトトレキセートおよびチトシンアラビノシドを、最初のベシクル形成工程中にＬＵＶ類に受動的に被包させた。
　簡単に述べると、卵−ＰＣ　ＬＵＶ類（１８７μｍｏｌリン脂質／ｍｌ）を、２０ｍｇ／ｍｌのチトシンアラビノシド（２μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］チトシンアラビノシド）または１０ｍｇ／ｍｌメトトレキセート（２μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］メトトレキセート）が添加された上記グルタミン酸カリウム緩衝液中で製造した。このベシクル類を、ついで、上記ＮａＣｌ緩衝液で予め平衡にしたゲルフィルトレリーションカラムに通し、未捕捉の医薬を除去し、Ｎａ＋／Ｋ＋化学勾配を確立した。この方法で調製されたＬＵＶ類の分析の結果、３３％の有効なチトシンアラビノシドまたはメトトレキセートが被包されていることが判明した（表１参照）。
　メトトレキセートおよびチトシンアラビノシドの受動的捕捉につづいて、Ｎａ＋／Ｋ＋勾配およびワリノマイシンを用いてアドリアマイシンをベシクル類に能動的に負荷させた。特に表１に示すように、０．２ｍＭのアドリアマイシンの存在下にベシクル類（１．０ｍＭのリン脂質）の一定量を培養すると、９８％の有効なアドリアマイシンの吸収が生じた。アドリアマイシンに見られる捕捉効率と吸収レベルは、受動的に捕捉された医薬の不存在下にみられたそれらとほとんど同一であった（表１と図１および図２を比較されたい。）
　【００１５】
　【００１６】
　メトトレキセートを、ベシクル類の製造中（１８７μｍｏｌの脂質／ｍｌ）に、２０ｍＭの濃度で受動的に捕捉した。アドリアマイシンは、ワリノマイシンの存在下に、１ｍＭのリン脂質に相当しかつ１００μＭで始まるアドリアマイシン濃度のベシクル濃度で、透過膜Ｎａ＋／Ｋ＋勾配を用いて捕捉された。チトシンアラビノシドは、ベシクル類（１８７μｍｏｌの脂質／ｍｌ）の製造中に２５ｍＭの濃度で受動的に捕捉された。またビンブラスチンはは、ワリノマイシンの存在下に５ｍＭのリン脂質に相当しかつ２００μＭで始まるビンブラスチン濃度のベシクル濃度で膜貫通Ｎａ＋／Ｋ＋勾配を用いて捕捉した。
　【００１７】
　　　
例２
膜貫通ポテンシャルを利用したリポソーム類からの荷電された医薬の放出速度の低減
　この例は、イオン化可能な医薬がリポソーム類から放出される速度を低減する膜貫通ポテンシャルの能力を説明するものである。本例のＡ類およびＢ類は、それぞれ必要な膜貫通ポテンシャルを発生させるためのＮａ＋／Ｋ＋勾配およびｐＨ勾配の利用を説明するものである。
　　　
Ａ部
　　　
医薬放出速度低減のためのＮａ＋／Ｋ＋勾配の使用
　例１Ａに続いて行なわれた活性捕捉に引き続いてＬＵＶ類からのアドリアマイシンの放出は、つぎのようにして測定された。アドリアマイシンを含有するベシクル類（１０ｍＭリン脂質）は、最初遊離の医薬を除去するために上記のＮａＣｌまたはＫＣｌ緩衝液で平衡にした１５ｍｌのゲルフィルトレーションカラムを通した。ついで、３７℃で平衡にした流動透析装置中に溶質をおいた。流通速度は、試料区分容量（５０ｍｌ）の全交換が２０分間以下で起こるように調製した。一定量（１００μｌ）の検体が種々の時間において取り出され、未捕捉の物質は１ｍｌのゲルフィルトレーションカラムを用いて分離した。ついで、試料についてアドリアマイシンおよびリン脂質を測定した。
　これらの実験の結果は、表２に示されている。この表から明らかなように、Ｎａ＋／Ｋ＋膜貫通勾配が存在すると、卵−ＰＣ、卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（８：２）および卵ＰＣ／コレステロール（１：１）ベシクル類の医薬保持時間が非常に長くなる。同様な試験をＤＰＰＣ／コレステロール（１：１）ベシクル類についても行なった。この場合、複雑な医薬放出の動力学が観察され、Ｔ５０を決定することは困難である。しかしながら、一般にＮａ＋／Ｋ＋勾配は、この組成のベシクル類で保持時間を著しく増加させないことが判った。測定されたデータは、２４時間で約４４％の医薬が放出され、膜貫通Ｎａ＋／Ｋ＋勾配が使用されるか否かには関係ないことを示している。
　【００１８】
　　　
Ｂ部
　　　
医薬放出速度を低減させるためのｐＨ勾配の使用
　例１Ｂの方法を用いて活性負荷を行なったのち、ＬＵＶ類からのアドリアマイシンの放出を、つぎのようにして測定した。すなわちアドリアマイシンを含有するベシクル類（５ｍＭのリン脂質）を最初適当な緩衝液で平衡にした１５ｍｌのゲルフィルトレーションカラムを通して遊離の医薬を除去した。ベシクルを含有する画分を３７℃で平衡にした流動透析装置においた。流通速度を試料の画分容量（５０ｍｌ）の全交換が１０分でできるように調整した。一定量（０．１５ｍｌ）の試料を数回にわたって除去し、かつ未捕捉の物質を１ｍｌのゲルフィルトレーションカラムを用いて分離した。ついで、試料についてアドリアマイシンおよびリン脂質を測定した。ｐＨ勾配の存在下（パネルＢ）および不存在下（パネルＡ）でのＥＰＣ　ＬＵＶ類（丸印）およびＥＰＣ／コレステロールＬＵＶ類（四角印）についての放出性を図８に示す。黒印はＮａ＋／Ｋ＋勾配の不存在下での放出性を示し、白抜き印はこのような勾配の存在下での放出性を示す。特に、図８Ａでは、アドリアマイシ含有ベシクル類を内部ｐＨと同じにｐＨ４．６に調製された緩衝液で脱塩カラムを通し、図８Ｂでは、ベシクル会合医薬の分離中に外部ｐＨを７．５に保持した。
　図８に示すように、すべての場合、膜貫通ｐＨ勾配を除去すると、アドリアマイシンの流出速度が著しく増大する。Ｎａ＋／Ｋ＋勾配の不存在下（黒印）にｐＨを７．５から４．６に減少させると、ＥＰＣ／コレステロールＬＵＶ類（四角印）では捕捉薬剤の５０％放出時間が２４時間から４時間に、またＥＰＣ／コレステロールＬＵＶ類（四角印）では３時間から１時間未満に減少した。放出の動力学に対する影響は、ｐＨ勾配およびＮａ＋／Ｋ＋勾配勾配の両者がｐＨ勾配のみの代わりに使用される場合にはＥＰＣ／コレステロールベシクル類にはみられなかった（黒印と白抜印とを比較されたし）。しかしながら、卵−ＰＣ系では、ｐＨ勾配とＮａ＋／Ｋ＋勾配との組合せは、ｐＨ勾配のみで達成する場合より保持時間が長くなる［黒丸印（ｐＨのみ）と白抜丸印（ｐＨ＋Ｎａ＋／Ｋ＋）とを比較されたし］。この効果は、膜貫通ｐＨ勾配（パネルＢ）の存在下では、ＥＰＣ　ＬＵＶ類には最も著しく、Ｎａ＋／Ｋ＋勾配がｐＨ勾配に加わった場合にアドリアマイシンの５０％放出時間が３時間から１６時間に増大する。１６時間Ｔ５０値がＮａ＋／Ｋ＋勾配のみを使用したＥＰＣベシクル類でも得られることに注目されたい（表２参照）。
　【００１９】
　医薬を被包したのち、外部緩衝液及び未捕捉の薬剤を、記載したようにＫＣｌまたはＮａＣｌ緩衝液で置換した。Ｔ５０は、捕捉された薬剤の５０％をベシクル類から放出するために必要な時間を示す。
　【００２０】
　　　
例３
　　　
抗腫瘍剤を含有するリポソーム類の脱水
　この例は、抗腫瘍剤であるアドリアマイシンを含有するリポソーム類の脱水およびその後の再水和を説明するものである。
　卵ホスファチジルコリンＥＴＶ類を２５０ｍＭのトレハロースを含有する溶質溶液［１６９ｍＭのグルタミン酸カリウム、２０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．４）、４０μｍｏｌ脂質／ｍｌ］を使用して上記のようにして調製した。ついで、外部カリウム緩衝液をナトリウム緩衝液［１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのへペス（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭトレハロース］と交換した。アドリアマイシン（２００ｎｍｏｌ／μｍｏｌ脂質）を、ワリノマイシン（０．５μｇ／μｍｏｌ脂質）とともに加えて膜ポテンシャルを発生させた。２時間培養したのち、上記のトレハロース含有ナトリウム緩衝液で平衡にしたセファデックスＧ−５０のカラムにベシクル類を通して未被包アドリアマイシンを除去した。ＥＴＶ類は、予め凍結することなく２４時間で脱水し、ついで上記のようにして再水和化した。脱水／再水和前および後の両方においてベシクル類内の捕捉されたアドリアマイシンの量ならびにベシクル類からの医薬漏出の速度は、セファデックスＧ−５０のカラム（１ｍｌ）にべシクル懸濁液の１００μｌの部分を通しての未捕捉物質を除去したのち、上記測定方法（「測定」の項参照）を用いて測定した（さらに詳細には米国特許第６２２，６９０号参照のこと）。このカラムは使用されるリポソーム類の少量パーセントが捕捉されるので、脱水／再水和工程後に保持される被包物質の量について測定された値は、本発明の方法で実際に達成されるレベルよりも幾分低い。
　これらの実験の結果は、表３に示されている。ここに示すように、９０％を越える医薬が脱水および再水和後に保持される。さらに、アドリアマイシンの再水和ベシクル類からの漏出速度は、脱水されなかったベシクル類でみられる速度に匹敵する（データは示さず）。
　【００２１】
　【００２２】
　　　
例４
　　　
膜貫通ポテンシャルを利用した再水和リポソーム類へのイオン化可能な抗腫瘍剤の負荷
　この例は、（１）膜を越えての濃度勾配を有するリポソーム類が、保護糖の存在下に脱水され、かつ濃度勾配の損失なしに再水和されること、および（２）再水和後に、濃度勾配がイオン化可能な抗腫瘍剤（アドリアマイシン）をリポソーム類へ負荷するのに使用し得ることを説明するものである。
　グルタミン酸カリウム緩衝液（１６９ｍＭのグルタミン酸カリウム、２５０ｍＭのトレハロース、２０ｍＭのへペスｐＨ７．４）中でＥＴＶ類（４０μｍｏｌ脂質／ｍｌ）を形成し、ついでＮａＣｌ溶液で予め平衡にしたセファデックスＧ−５０カラム（１．４×１０ｃｍ）に該ベシクル類を通してＮａＣｌ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのトレハロース、２０ｍＭのへペス、ｐＨ７．４）で外部緩衝液を置換することにより膜を横切ってのＮａ＋／Ｋ＋化学勾配を有するベシクル類を調製した。このときワリノマイシン（ミズリー州セントルイスのシグマ社製）を０．５μｇ／μｍｏｌリン脂質の濃度になるように添加した。
　同様に、膜貫通ｐＨ勾配（内部酸）を、低いｐＨ（１３５ｍＭのグルタミン酸、２５０ｍＭのトレハロース、水酸カリウムを添加してｐＨを５．５にした）を有する緩衝液中でリポソーム類を調製し、ついで高いｐＨ（１２５ｍＭのグルタミン酸、３０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのトレハロース、水酸化カリウムを添加してｐＨを７．５にした）を有する緩衝液を用いてセファデックスＧ−２０上で交換した。このとき、プロトンイオン透過担体ＣＣＣＰを最終濃度２０μＭになるよう添加した。
　膜貫通ポテンシャルは、親油性カオチン３Ｈ−テトラフェニルホスフォニウムブロマイド（３Ｈ−ＴＰＰＢ、カナダ国ＮＥＮ）の分布を決定することにより測定した。具体的には１μｌのエタノール中の１μＣｉの３Ｈ−ＴＰＰＢをＥＴＶ分散液の１〜２ｍｌの試料に添加し、かつその混合物を２０℃で２０分間培養した。一定量（１００μｌ）の試料を取り出し未捕捉の３Ｈ−ＴＰＰ＋を１ｍｌの使い捨て可能なシリシンジに充填したセファデックスにその一定量試料を負荷することにより除去し、ついでこのカラムを５００ｇで３分間遠心してベシクル類を溶出させた。捕捉された３Ｈ−ＴＰＰ＋は液体シンチレーションカウンティングにより測定し、かつリン脂質はホスフェートアッセイにより測定した。
　ＥＴＶ法によりＥＴＶ類内に捕捉された２２Ｎａ、３Ｈ−イヌリンまたは１４Ｃ−イヌリンの量を測定することにより決定されたＥＴＶ類用の捕捉容量値（μｌ／μｍｏｌのリン脂質）を使用して、ベシクル類の３Ｈ−ＴＰＰ＋（内側［３Ｈ−ＴＰＰ＋］ｉおよび外側［３Ｈ−ＴＰＰ＋］ｏの濃度を計算し、これから、膜貫通ポテンシャル（Ｖｍ）をネルンスト式を用いて計算した。
　　Ｖｍ＝−５９ｌｏｇ［３Ｈ−ＴＰＰ＋］ｉ／［３Ｈ−ＴＰＰ＋］ｏ）
　Ｎａ＋／Ｋ＋およびｐＨ勾配ベシクル類の両者は、高真空下に２４時間脱水し、ついで再水和した。比較のためのべシクル類は４℃で２４時間保持した。乾燥しかつ再水和したのち、イオン透過担体の存在下または不存在下にこれらのベシクル類により示される膜貫通ポテンシャルは、同様にイオン透過担体の存在下または不存在下に比較例のものにより発生した膜貫通ポテンシャルに匹敵した。その結果は、図９（ｐＨ）および図１０（Ｎａ＋／Ｋ＋）に示すとおりである。
　これらの図面に示されるように、脱水されかつ再水和されたベシクル類により示される膜貫通ポテンシャルは、比較例のものにより示されるものと実質的に同一である。唯一の明白な差異は、ｐＨ勾配ベシクルの場合、脱水／再水和ベシクル類の膜貫通ポテンシャルが、比較例のベシクル類の膜貫通ポテンシャルより幾分低いということである。
　脱水および再水和後にアドリアマイシンを蓄積するＮａ＋／Ｋ＋ベシクル類の能力を、イオン透過担体の存在下または不存在下に試験し、比較例のベシクル類、すなわち２４時間脱水することなく４℃で２４時間保持されたベシクル類により示される蓄積と比較した。充分なアドリアマイシンをベシクル類の外部媒体に添加して０．２モル−アドリアマイシン／１モル−リン脂質の最終濃度にした。
　これらの試験結果を図１１に示す。ここにみられるように、脱水／再水和ベシクル類は、比較例のベシクル類と実質的に同一の速度および同一程度でアドリアマイシを蓄積する。したがって、この例は、ベシクル類の後からの負荷が濃度勾配と脱水／再水和工程との組合せにより達成され得ることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
　【図１】Ｎａ＋／Ｋ＋拡散ポテンシャルの存在下又は不存在下に大きなユニラメラベシクル類（ＬＵＶ類）へのアドリアマイシン（ＡＤＭ）の吸収を示す。卵−ＰＣ　ＬＵＶ類（１μｍｏｌ　リン脂質／ｍｌ）が０．２ｍＭのアドリアマイシンの存在下に２０℃で培養された。薬剤の吸収は、前記の「材料及び方法」で評価された。実験条件は、つぎのとおりであった。すなわち白抜三角印は、内部及び外部両媒体中に２０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７．５）、１６９ｍＭのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類。白抜丸印は、内部媒体中に１６９ｍＭのグルタミン酸カリウムおよび２０ｍＭのへペス（ｐＨ７．５）を有し、外部媒体には更にワリノマイシン（ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）を有するベシクル類。白抜四角印は内部媒体中に２０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．５）、１６９ｍＭのグルタミン酸カリウムを有し、外部媒体中に２０ｍＭのへペス（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを有するベシクル類。黒丸印は、内部媒体中に２０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．５）および１６９ｍＭのグルタミン酸カリウムを有し、外部媒体中に１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのへペス（ｐＨ７．５）およびワリノマイシンを有するベシクル類を表す。
　【図２】Ｎａ＋／Ｋ＋拡散ポテンシャルの存在下または不存在下での、大きなユニラメラベシクル類へのビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）（ＶＩＮＢ）の吸収を示す。卵−ＰＣ　ＬＵＶ類（１μｍｏｌリン脂質／ｍｌ）が０．２ｍＭのビンブラスチンの存在下に２０℃でつぎの条件下で培養された。白抜三角印は、内部及び外部緩衝液としての２０ｍＭのへペス（ｐＨ７．５）、１６９ｍＭのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類、白抜丸印は内部緩衝液として１６９ｍＭのグルタミン酸カリウムおよび２０ｍＭのヘペスを有し、外部緩衝液としてこのものに更にワリノマイシンが加えられたものを有するベシクル類、白抜四角印は、外部媒体中に１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ヘペス（ｐＨ７．５）を、ベシクル内部には１６９ｍＭのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類を示す。黒丸印は外部媒体中に１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ヘペス（ｐＨ７．５）を内部媒体にはこのものに更にワリノマイシンを加えたベシクル類を示す。
　【図３】最初の遊離のアドリアマイシン濃度（黒丸）の関数としての膜を横切ってのＮａ＋／Ｋ＋勾配を有する卵−ＰＣ　ＬＵＶ類へのアドリアマイシン（ＡＣＭ）の捕捉を示す。白抜丸印は蓄積した使用可能な全薬剤のパーセントを示す。このベシクル類（１ｍＭリン脂質）は、ワリノマイシンの存在下に２時間にわたって示された濃度のアドリアマイシンと共に２０℃で培養した。
　【図４】（Ａ）２０℃および（Ｂ）３７℃での、Ｎａ＋／Ｋ＋膜貫通化学勾配およびワリノマイシンの存在下に卵−ＰＣコレステロール　ＬＵＶ系へのワドリアマイシン（ＡＤＭ）の捕捉を示す。このベシクル類（１μｍｏｌの全脂質／ｍｌ）は、０．２ｍＭのアドリアマイシンの存在下に２０℃または３７℃で２時間培養された。使用したコレステロールに対する卵−ＰＣのモル比は、つぎのとおりである。すなわち、黒丸は１：０、白丸は９：１、黒角は３：１であり、また白角は１：１である。
　【図５】種々の温度において０．２ｍＭのアドリアマイシンの存在下に培養したのちのＮａ＋／Ｋ＋膜貫通化学勾配の存在下でのＤＰＰＣ−コレステロール（１：１）ＬＵＶ類（１ｍＭ脂質）へのアドリアマイシン（ＡＤＭ）の捕捉を示す。白抜丸印はワリノマイシンの存在下で２０℃、黒四角印はワリノマイシンの存在下で３７℃、黒丸印はワリノマイシンの不存在下で３７℃、白抜四角印はワリノマイシンの存在下で６０℃、下向黒三角印（ｓｏｌｉｄ　ｄｏｗｎｗａｒｄ　ｆａｃｉｎｇ　ｔｒｉａｎｇｌｅ）はワリノマイシンの不存在下で６０℃、上向黒三角印（ｓｏｌｉｄ　ｕｐｗａｒｄ　ｆａｃｉｎｇ　ｔｒｉａｎｇｌｅ）はワリノイシンの不存在下での３７℃における卵−ＰＣ　ＬＵＶ類（１ｍＭ）、下向白抜三角印（ｏｐｅｎ　ｄｏｗｎｗａｒｄ　ｆａｃｉｎｇ　ｔｒｉａｎｇｌｅ）はワノマイシンの不存在下での６０℃における卵−ＰＣ　ＬＵＶ類を示す。
　【図６】０．２ｍＭのアドリアマイシンの存在下での２０℃における培養後のＮａ＋／Ｋ＋化学勾配の存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ　ＬＵＶ類へのアドリアマイシン（ＡＤＭ）の捕捉を示す。白抜三角印はワリノマイシンの存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（４：１）、黒三角印はワリノマイシンの不存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（４：１）、白抜四角印はワリノマイシンの不存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（９：１）、黒四角印はワリノマイシン不存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（２０：１）、白抜丸印はワリノマイシンの不存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（５０：１）、黒丸印はＮａ＋／Ｋ＋勾配（内側および外側のＫ＋緩衝液）の不存在下での卵−ＰＣ／卵−ＰＳ（４：１）への捕捉を示す。
　【図７】（Ａ）２０℃および（Ｂ）３７℃における、膜貫通のｐＨ勾配を示すＬＵＶ類へのアドリアマイシンの捕捉を示す。実験条件は、つぎのとおりであった。すなわち、プロトンイオン通過担体ＣＣＣＰ（１０μＭ）の不存在下（黒印）および存在下（白抜印）での０．２ｍＭアドリアマイシン、２ｍＭの脂質。内部緩衝液の組成は１５０ｍＭのＫＯＨ、１７５ｍＭのグルタミン酸（ｐＨ４．６）であり、一方外部緩衝液の組成は１５０ｍＭのＫＯＨ、１２５ｍＭのグルタミン酸および３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）よりなっていた。脂質の組成はＥＰＣ（丸印）および１：１のモル比のＥＰＣ／コレステロール（１：１）であった。
　【図８】３７℃におけるＥＰＣ（黒丸印、白抜丸印）およびＥＰＣ／コレステロール（１：１モル比）（黒四角印、白抜四角印）ＬＵＶ類からのアドリアマイシンの放出を示す。アドリアマイシンは、それぞれ５．０および０．５ｍＭの脂質ならびに薬剤濃度でｐＨ勾配に応じてベシクル類へ捕捉される。遊離のアドリアマイシンは、１５０ｍＭのＫ＋（黒色）または１８０ｍＭのＮａ＋（白抜印）を含有しｐＨを４．６（図８Ａ）またはｐＨを７．５（図８Ｂ）に調整された緩衝液で並衡にしたゲルフィルトレーションクロマトグラフィカラムによりベシクルに会合した薬剤から分離される。
　【図９】比較のためのべシクル類（四角形）および脱水／再水和ベシクル類（円形）に対してｐＨ勾配によって生ずる膜貫通ポテンシャルを示す。予め存在するプロトン勾配を有するベシクル類は、４℃で２４時間保持される（比較例）か、あるいは同一時間高真空下に２５０ｍＭのトレハロースの存在下に脱水された。再水和によるべシクル類に見られるポテンシャルは、ＣＣＣＰの不存在下（白抜丸および白抜四角印）または２０μＭのＣＣＣＰの存在下（黒丸および黒四角印）に３Ｈ−テトラフェニルホスホニウムブロマイドをプローブとして使用して測定された。ＣＣＣＰの存在下または不存在下にｐＨ勾配なしにべシクル類にみられる膜貫通ポテンシャルは、それぞれ黒三角印および白抜三角印で示されている。
　【図１０】比較のためのべシクル類（四角印）および脱水／再水和ベシクル類（丸印）に対してＮａ＋／Ｋ＋化学勾配により発生する膜貫通ポテンシャルを示す。予め存在するＮａ＋／Ｋ＋勾配を有するベシクル類は、４℃で２４時間保持される（比較例）か、あるいは同一時間高真空下に２５０ｍＭのトレハロースの存在下に脱水された。再水和によるべシクル類にみられるポテンシャルは、ＣＣＣＰの不存在下（白抜丸および白抜四角印）または２０μＭのＣＣＣＰの存在下（黒丸および黒四角印）に３Ｈ−テトラフェニルホスホニウムブロマイドをプローブとして使用して測定された。ワリノマイシリンの存在下または不存在下に膜の両側にグルタミン酸カリウムを有するベシクル類にみられる膜貫通ポテンシャルは、それぞれ白抜三角印および黒三角印で示されている。
　【図１１】予め乾燥したベシクル類にアドリアマイシンを負荷するための膜貫通ポテンシャルの使用を示す。予め存在するＮａ＋／Ｋ＋勾配を有するベシクル類は、２５０ｍＭのトレハロースの存在下に２４時間脱水される。再水和化に続いてワリノマイシン（０．５μｇ／リン脂質μｍｏｌ）の存在下（白抜丸印）または不存在下（黒丸印）にアドリアマイシンを蓄積させるベシクル類の能力が測定された。同一時間４℃に保持された比較のためのべシクル類も、ワリノマイシンの存在下（白抜四角印）または不存在下（黒四角印）に試験された。