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　特願２０００−６１１６５２「膵臓プロカルボキシペプチダーゼＢ、そのアイソフォームおよび突然変異タンパク質の製造ならびにそれらの使用」拒絶査定不服審判事件〔平成１２年１０月１９日国際公開、ＷＯ００／６１７２７、平成１４年１２月１０日国内公表、特表２００２−５４１７９３〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯・本願発明
　本願は、平成１２年（２０００年）３月２３日を国際出願日（パリ条約による優先権主張１９９９年４月９日　ドイツ）とする出願であって、その請求項１に係る発明は、平成２２年５月１４日付け手続補正書によって補正された特許請求の範囲の請求項１に記載される、以下のとおりのものである。
　
「【請求項１】　成熟インスリンまたは成熟インスリン誘導体の製造方法において、
　(ａ)  天然もしくは非天然前駆体型カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質を微生物中分泌様式により発現させ、
　(ｂ)  分泌様式により発現された前駆体型を精製し、および
　(ｃ)  精製された前駆体型を酵素処理によって活性型カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質に変換することからなり、
　工程（ｃ）はインスリンのＢ、ＣおよびＡ鎖からなるインスリン前駆体型またはインスリン誘導体の存在下に適当な反応条件で進行させ、この過程において成熟インスリンまたは成熟インスリン誘導体が形成され、これを反応混合物から単離する、方法。」（以下、「本願発明」という。）
　
第２　引用例の記載事項
１．原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願優先日前に頒布された刊行物である特表平９−５０５９９８号公報（以下、「引用例１」という。）には、以下の事項が記載されている（下線は、当審で付与した。）。
（ア）「１．ブタカルボキシペプチダーゼＢをコードするＤＮＡ化合物であって、明細書中、配列番号３として示している以下の配列：（配列省略）を有するＤＮＡ化合物。
２．ブタプロカルボキシペプチダーゼＢのプロペプチド部分を更に含み、明細書中、配列番号１として示している以下のヌクレオチド配列：（配列省略）を有することを特徴とするＤＮＡ化合物である請求項１記載のＤＮＡ化合物。
３．請求項１記載のＤＮＡ化合物を含んでいる組換えＤＮＡベクター。
４．Ｐｉｃｈｉａ発現ベクターである請求項３記載のベクター。・・・
６．ヒト血清アルブミンのシグナルペプチドを含む請求項４記載のＰｉｃｈｉａ発現ベクター。・・・
１４．（ａ）請求項４記載のＰｉｃｈｉａ発現ベクターを培養し、
（ｂ）
培地からカルボキシペプチダーゼＢを回収し
　
（イ）「本発明は、カルボキシペプチダーゼＢ発現系を作製するために、
ブタプロカルボキシペプチダーゼＢ
ｃＤＮＡからなるベクターならびにこれらのベクターで形質転換されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞
　
（ウ）「式ＩのＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列は、Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔのアミノ−末端（Ｎ−末端）伸長部を有するブタプロカルボキシペプチダーゼＢをコードするｃＤＮＡ配列を表す。
プロカルボキシペプチダーゼＢ
はトリプシン処理によって容易にカルボキシペプチダーゼＢに変換され
　
（エ）「本発明の好ましい発現系には、所望の産物（ブタカルボキシペプチダーゼまたはそのＮ−末端伸長同等物）
を分泌させる
　
（オ）「一般に、用語「カルボキシペプチダーゼＢ」は、蛋白のカルボキシ末端から塩基性残基を優先的に開裂させるメタロエクソペプチダーゼを表す。」（4頁8行〜9行）
　
　上記記載事項において、引用例１の「プロカルボキシペプチダーゼＢ」は「天然」の「前駆体型カルボキシペプチダーゼＢ」であり、引用例１において、トリプシン処理によりプロカルボキシダーゼＢから変換されたカルボキシペプチダーゼＢは、活性を有するものであるから、「活性型カルボキシペプチダーゼＢ」である。
　そして、引用例１の上記記載事項（ア）において、カルボキシペプチダーゼＢを「回収」すると記載されていることから、発現されたプロカルボキシペプチダーゼＢを「精製」することは記載されているに等しい事項であるといえる。
　
　そうすると、引用例１には、以下の発明が記載されていると認められる。
「(ａ)  天然の前駆体型カルボキシペプチダーゼＢをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞中分泌様式により発現させ、
　(ｂ)  分泌様式により発現された前駆体型を精製し、および
　(ｃ)  精製された前駆体型をトリプシン処理によって活性型カルボキシペプチダーゼＢに変換することからなる方法」（以下、「引用発明」という。）
　
２．原査定の拒絶の理由で引用文献４として引用された本願優先日前に頒布された刊行物である特開平２−８５２９８号公報（以下、「引用例４」という。）には、以下の事項が記載されている（下線は、当審で付与した。）。
　
（ア）「例５：
　インシュリンの調製
２００ｍｇの
モノ−Ａｒｇインシュリン
カルボキシペプチダーゼＢ
ヒトインシュリン
　
（イ）「例６：
　
トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢとの組合せ使用によるモノ−Ａｒｇインシュリンからのインシュリンの調製
モノ−Ａｒｇインシュリン
トリプシン
カルボキシペプチダーゼＢ
ヒトインシュリン
　
（ウ）「
ミニ−プロインシュリン
　可能な切断部位の数を通常のプロインシュリンに較べて減らすことはこの目的のために特に有利であることが証明されることから、
モノ−Ａｒｇインシュリンまたはインシュリンの遊離はトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼＢの作用によって
　
（エ）「驚いたことに、天然のプロインシュリンと対照的に、ミニプロインシュリンの切断ではいかなるインシュリンＤｅｓ−Ｂ３０もほとんど形成されない。
　後者はきわめて困難な方法にてインシュリンから分離できるのみであることから、天然のプロインシュリンからのインシュリンの生産においては「ｔｗｏ−ｐｏｔ反応」が好ましい。すなわち、トリプシン切断主要産生物、インシュリン−ＡｒｇＢ３１−ＡｒｇＢ３２およびモノ−Ａｒｇ−インシュリンを既知の方法でイオン交換によってインシュリンＤｅｓ−Ｂ３０から先ず分離して、次いでカルボキシペプチダーゼＢを用いて切断して、ヒトインシュリンを得る。これに比較して、
ミニ−プロインシュリンは、「ｏｎｅ−ｐｏｔ反応」による理想的な方法で、トリプシンもしくはカルボキシペプチダーゼＢまたは同じ作用を有する酵素を同時に用いることによって、ヒトインシュリンに変換することができる
　
第３　対比・判断
１．対比
　本願発明と引用発明を対比する。
　引用発明の「Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞」は本願発明の「微生物」に包含され、引用発明の「トリプシン処理」は本願発明の「酵素処理」に包含される。
　そうすると、両者は、
「(ａ)  天然の前駆体型カルボキシペプチダーゼＢを微生物中分泌様式により発現させ、
　(ｂ)  分泌様式により発現された前駆体型を精製し、および
　(ｃ)  精製された前駆体型を酵素処理によって活性型カルボキシペプチダーゼＢに変換することからなる」方法である点で一致し、以下の点で相違する。
　
相違点：本願発明は、上記一致点に係る「(ｃ)  精製された前駆体型を酵素処理によって活性型カルボキシペプチダーゼＢに変換する」工程は、「インスリンのＢ、ＣおよびＡ鎖からなるインスリン前駆体型またはインスリン誘導体の存在下に適当な反応条件で進行させ、この過程において成熟インスリンまたは成熟インスリン誘導体が形成され、これを反応混合物から単離する」ことにより、成熟インスリンまたは成熟インスリン誘導体を製造する方法であるのに対し、引用発明では、そのような特定はなされていない点。
　
２．判断
　引用例１には、カルボキシペプチダーゼＢは、蛋白のカルボキシ末端から塩基性残基を優先的に開裂させるメタロエクソペプチダーゼであることが記載されていること（記載事項（オ））及び、引用例４には、カルボキシペプチダーゼＢを、インスリン誘導体であるモノ−Ａｒｇインスリンから成熟インスリンの変換に使用することが記載されていること（記載事項（ア））を考慮すれば、引用発明において変換された活性型カルボキシペプチダーゼＢを、インスリン誘導体から成熟インスリンの製造のために使用することは、当業者が容易に想起することである。
　ところで、２以上の反応により目的物を製造する方法において、２以上の反応を１つの反応容器中（ワンポット）で行うことにより、プロセスを簡略化することは本願優先日前における周知の課題であり、引用例４にも、ミニプロインスリンからトリプシン切断主要産生物を経てインスリンを製造する工程をワンポット反応で行うことが記載されている（記載事項（エ））。
　また、引用例４には、モノ−Ａｒｇインスリンを成熟インスリンに変換する反応に、トリプシン及びカルボキシペプチダーゼＢを加える実施例も記載されているところ（記載事項（イ））、引用発明の、前駆体型カルボキシペプチダーゼＢを活性型カルボキシペプチダーゼＢに変換する反応及び、引用例４の、インスリン誘導体から成熟インスリンを変換する反応は、反応系に成分として共にトリプシン及びカルボキシダーゼＢを含むものであることからも、両反応を１つの反応容器中で実施することを動機付けられるともいえる。
　してみると、引用発明における工程（ｃ）の前駆体型カルボキシダーゼＢをトリプシン処理によって活性型カルボキシペプチダーゼＢに変換する反応と、活性型カルボキシペプチダーゼＢを使用して、インスリン誘導体から成熟インスリンを製造する反応を１つの反応容器中で行うこと、すなわち、引用発明の工程（ｃ）を、カルボキシペプチダーゼＢの基質であるインスリン誘導体の存在下に適当な反応条件で進行させ、形成された成熟インスリンを反応混合物から単離することにより、成熟インスリンを製造することは、当業者が容易に想到し得ることである。
　
　そして、本願明細書の実施例５に、モノ−Ａｒｇインスリンからインスリンの製造のためにトリプシンとプロカルボキシペプチダーゼＢを併用する例が記載されているが、どのような結果が得られたのか具体的に示されておらず、本願発明が各引用例から予想できない顕著な効果を奏するものであるということもできない。
　
　したがって、本願発明は、引用例１及び４に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
３．審判請求人の主張
（１）審判請求人は、請求の理由において以下の主張をする。
主張１：引用例１及び４には、プロ酵素の酵素への活性化と当該酵素による別の基質の転化が１つの反応容器内で生じる、ワンポットリアクションについては、記載も示唆もされていない。
　
主張２：引用例１の知見に基づき、引用例４の例６において、カルボキシペプチダーゼＢに代えて、プロカルボキシペプチダーゼＢを反応系に添加すれば、プロカルボキシペプチダーゼＢがトリプシンの働きによりカルボキペプチダーゼＢに転化される可能性が予測されるとしても、これにより、モノ−Ａｒｇインスリンからインスリンを調製することに関与するトリプシンの働きが弱められる可能性も十分予測される。また、これとは逆に、トリプシンがモノ−Ａｒｇインスリンとの反応をするために、プロカルボキシペプチダーゼＢのトリプシンによるカルボキシペプチダーゼＢへの転化が十分に行われない可能性も十分に予測される。すなわち、モノ−Ａｒｇインスリンに対しトリプシンとプロカルボキシペプチダーゼＢとを組み合わせて使用した際に、最初からトリプシンとカルボキシペプチダーゼＢとを組み合わせて使用したときと同様に、十分にインスリンを得ることができるという保証は何もない。
　
主張３：本発明者は、反応混合物中に存在するトリプシンはプロカルボキシペプチダーゼＢの活性化に働くのみでなくプロインスリンを特異的に切断して成熟インスリンの放出に寄与するということを見出し、本願発明に至ったのであり、このようなことは、当業者といえども容易に予測できることではない。
　
主張４：カルボキシペプチダーゼＢは、限られた安定性しか有していないところ、本願発明において、インスリンＢ鎖のＣ末端アルギニンの加水分解に、あらかじめ調製されたカルボキシペプチダーゼＢではなく、反応系において新たに形成された活性なカルボキシペプチダーゼＢを直ちに用いることを可能としたことにより、カルボキシペプチダーゼＢの活性を最大限に利用することができ、このことは、本願発明の格別の優れた効果ということができる。
　
（２）審判請求人の主張について検討する。
ア．主張１について
　２以上の反応を１つの反応容器中で行うことにより、プロセスを簡略化することは周知の課題であって、引用例４にも記載されているから（記載事項（エ））、審判請求人の主張は採用できない。
　
イ．主張２について
　引用例１及び４の記載からみて、トリプシンは引用発明の反応及び引用例４に記載された反応の両方に関与する酵素であるから、両反応を１つの反応容器中で実施した場合、トリプシンによる加水分解率が低下するのを防ぐために、トリプシンの添加量を増加するなどして、反応条件を最適化することは、当業者が適宜なし得る事項である。加えて、本願明細書にも、本願発明の方法により十分なインスリンが得られたことは具体的に記載されていない。
　
ウ．主張３について
　引用例４には、モノ−Ａｒｇインスリンから成熟インスリンへの反応において、カルボキシペプチダーゼＢだけでなく、トリプシンをも添加する実施例が記載されていることから（記載事項（イ））、引用例４においてもトリプシンはそのような作用を有することを期待して添加されていたといえる。
　
エ．主張４について
　審判請求人の主張する効果は、引用発明の反応と引用例４に記載された反応を１つの反応容器中で実施するワンポット反応を採用すれば、当然予想される効果であって、格別なものとはいえない。
　
第４　むすび
　以上のとおり、本願の請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、その余の請求項について言及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　
　よって、結論のとおり審決する。