【手続補正書】
【提出日】平成27年3月16日(2015.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞中のミトコンドリアゲノムＤＮＡにおける複製事象の開始の発生の検出、及び真核細胞中のミトコンドリア転写の検出の両方を行うための方法であって、以下のステップ：
−  第一のヌクレオチドプローブが、ミトコンドリアＤＮＡゲノム中の標的領域とインサイチュハイブリダイゼーションすることができる条件下で、前記ミトコンドリアゲノムＤＮＡを含む前記真核細胞を前記第一のヌクレオチドプローブと接触させ、ここで前記標的領域は、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ＤＮＡの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持し、ここで前記第一のヌクレオチドプローブは、転写されないミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントに特異的であり、そして、
ｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの配列を有する核酸、或いは、
ｉｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である配列を有する核酸、或いは、
ｉｉｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、若しくは、配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、
を含むか、又はからなり、前記核酸分子は、一本鎖分子であるか、又は相補的配列の二本鎖分子であるか、のいずれかであり、そして
−  前記真核細胞を、前記細胞中のミトコンドリアＤＮＡ分子の転写された領域に対応する少なくとも１つのミトコンドリアＲＮＡ分子を標的とする少なくとも第二のヌクレオチドプローブと接触させ、そして
−  前記ミトコンドリアＤＮＡにハイブリダイズされる前記第一のヌクレオチドプローブ、及び前記ミトコンドリアＲＮＡ分子にハイブリダイズされる前記第二のヌクレオチドプローブを検出すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第一のヌクレオチドプローブが、少なくとも２つの、プローブのサブセットからなり、ここで少なくとも１つの前記サブセットは、ミトコンドリアＤＮＡゲノム中の標的領域とハイブリダイズし、ここで前記標的領域は、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ミトコンドリアＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．前記ゲノムＤＮＡを含む真核細胞を、７２〜７８℃で、好ましくは７５℃で、２〜８分間、好ましくは４〜５分間、特に５分間加熱すること；又は
ｂ．化学剤、例えばホルムアミドと、例えば７０％ホルムアミド溶液と接触させること；或いは
ａ及びｂの両方を行うこと
のいずれか１つのステップによって、前記標的領域を含むゲノムＤＮＡ分子を部分的に変性するステップを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のヌクレオチドプローブが、８０ｂｐ〜３０００ｂｐ、８０〜２０００ｂｐ、又は、８０〜４００、８００、１２００若しくは１５００ｂｐ、又は９０〜１５０ｂｐ、特に９５〜１１０ｂｐ、好ましくは９９ｂｐの大きさの一本鎖ＤＮＡ断片であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のヌクレオチドプローブが、真核細胞のミトコンドリアゲノムの２つのプロモーターであるＰＨ１（ＨＳＰ）とＬＳＰとの間に局在化されるゲノムＤＮＡ配列を標的とするか、又は、前記第一のヌクレオチドプローブが、真核細胞のミトコンドリアゲノムの２つのプロモーターであるＰＨ１（ＨＳＰ）とＬＳＰとの間に局在化される標的ＤＮＡ領域と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列と相補的であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第一のヌクレオチドプローブが、ミトコンドリアのｇＤＮＡのセグメントと特異的であり、そして、
ａ．配列番号１７及び配列番号１８を含む核酸分子、特に、ｍｔＤＮＡの配列と、又は、前記ｍｔゲノムのＨ鎖の４２５番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドと、相補的であるか、若しくは少なくとも相補的であるか、又はハイブリダイズする核酸分子；或いは
ｂ．その配列が配列番号１及び配列番号１７によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜２２５番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約４００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子；或いは
ｃ．その配列が配列番号１及び配列番号１８によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約８００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子；或いは
ｄ．その配列が、配列番号１、配列番号１７及び配列番号１８をこの順番で含む核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６０２４番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約１２００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子
を含むか、又はからなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１若しくは２以上のＲＮＡ分子を検出する少なくとも第二のヌクレオチドプローブが、１若しくは２以上のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を標的とするか、又は、ミトコンドリアのｇＤＮＡのＤループ領域中でミトコンドリアのｇＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡを標的とする、ミトコンドリアのｇＤＮＡ及びＲＮＡ分子の両方を検出するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第二のヌクレオチドプローブが、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド構造の形成に関連するＲＮＡ分子若しくはその断片と特異的であるか、又は、Ｄループ領域中でｇＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ若しくはその断片と特異的であり、そして、配列番号１７若しくは１８を含むか若しくは配列番号１７若しくは１８からなるか、又は配列番号１７若しくは１８の断片であるか、又は配列番号１７若しくは１８と少なくとも８０％の同一性を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のヌクレオチドプローブ及び前記第二のヌクレオチドプローブが、蛍光性基で直接標識化され、そして／又は修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ミトコンドリアＤＮＡゲノム上の標的領域の核酸配列、及びミトコンドリアＲＮＡ分子の検出は、１ステップで、特に、同時になされることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固定された１若しくは２以上の細胞上か、又は固定された１若しくは２以上の組織上で行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの真核細胞中においてミトコンドリアヌクレオチド性物質をインサイチュハイブリダイゼーションし、且つ検出するために、以下のステップ：
ａ．１〜４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で、好ましくは２％ＰＦＡ中で、約２０〜３０分間、特に３０分間かけて前記細胞を固定化し、
ｂ．０．５％〜１％のトリトン（Triton） Ｘ１００のＰＢＳ １Ｘ液で、約５〜１０分間、４℃にて、特に５分間、前記固定化された細胞を透過処理し、
ｃ．７２〜７８℃にて、好ましくは７５℃にて、２〜８分間、好ましくは４〜５分間、特に５分間かけて、浸透処理された前記固定化細胞の核酸含有物を変性し、
ｄ．前記ステップ（ｃ）にしたがって処理された細胞中の１又は２以上のミトコンドリア核酸が、１又は２以上のミトコンドリアヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができるように、前記１又は２以上のミトコンドリア核酸を前記１又は２以上のミトコンドリアヌクレオチドプローブと接触させ、ここで前記プローブは、８０〜３０００ヌクレオチドの大きさを有し、特に９５〜１１０ヌクレオチドの大きさを有し、そして１００ｎｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中に含有され、
ｅ．前記ステップ（ｄ）において添加された１又は２以上のプローブとハイブリダイズされる１又は２以上のミトコンドリア核酸を検出すること
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出ステップの前に、好適なバッファーを用いて、前記１又は２以上のミトコンドリアヌクレオチドプローブと接触される細胞を洗浄するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイゼーションステップが、約１５時間、３７℃にて行われる、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
真核細胞中の少なくとも１つの目的のタンパク質の標識化を可能とするステップ、及び、前記タンパク質を免疫蛍光法によって検出するステップをさらに含み、ここで、ミトコンドリアヌクレオチド性物質及び目的のタンパク質の検出が、場合により１ステップで、特に同時になされる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
実施された１又は２以上の検出の結果を分析するステップをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
真核細胞のミトコンドリアゲノムＤＮＡ中の標的領域とハイブリダイズする核酸分子であって、請求項１及び４〜６のいずれか１項で規定されたものであり、場合により標識化され、ここで前記標的領域は、前記真核細胞のミトコンドリアゲノムＤＮＡを含む代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ミトコンドリアＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持する、前記核酸分子。
【請求項１８】
ＲＮＡフリーの核酸配列とハイブリダイズし、そして前記ＲＮＡフリーの核酸配列と同じ長さか、又はそれよりも長い、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
ｍｔゲノムのＨ鎖上の４４６番目のヌクレオチドと１６２０２４番目のヌクレオチドとの間に、特にヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの４４６番目のヌクレオチドと１６３６６番目のヌクレオチドとの間に局在化されるミトコンドリアのｇＤＮＡのセグメントと特異的であり、或いは、ｍｔゲノムのＨ鎖上の４４６番目のヌクレオチドと１６２０２４番目のヌクレオチドとの間に、特にヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの４４６番目のヌクレオチドと１６３６６番目のヌクレオチドとの間に局在化される標的ＤＮＡ領域と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列と相補的であり、そして、
ａ．配列番号１７及び配列番号１８を含む核酸分子、特に、ｍｔＤＮＡの配列と、又は、前記ｍｔゲノムのＨ鎖の４２５番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドと、相補的であるか、若しくは少なくとも相補的であるか、又はハイブリダイズする核酸分子；或いは
ｂ．その配列が配列番号１及び配列番号１７によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜２２５番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約４００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子；或いは
ｃ．その配列が配列番号１及び配列番号１８によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約８００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子；或いは
ｄ．その配列が、配列番号１、配列番号１７及び配列番号１８をこの順番で含む核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６０２４番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約１２００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子
からなる群から選択される、請求項１７又は１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
転写されないミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントと特異的であり、そして、
ｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの配列を有する核酸、或いは、
ｉｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である配列を有する核酸、或いは、
ｉｉｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、若しくは、配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
を含むか、又はからなり、前記核酸分子は、一本鎖分子であるか、又は相補的配列の二本鎖分子であるかのいずれかである、請求項１７又は１８に記載の核酸分子。
【請求項２１】
ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ／ＤＮＡ分子と結合する、請求項７又は８に記載の核酸分子であって、ここで前記ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ／ＤＮＡ分子は、ミトコンドリアｇＤＮＡのＤループ領域中に局在化されるミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントとハイブリダイズする分子であり、ここで前記核酸分子は、配列番号１７若しくは配列番号１８の配列を含むか、又は配列番号１７若しくは配列番号１８の配列を有するか、又は配列番号１７若しくは配列番号１８の配列の断片であるか、又は配列番号１７若しくは配列番号１８と相補的である配列と少なくとも８０％の同一性を有する、前記核酸分子。
【請求項２２】
固定された細胞上でインサイチュハイブリダイゼーションを実施するためのキットであって、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の検出可能な核酸分子からなる第一のヌクレオチドプローブ、及びＲＮＡ分子とハイブリダイズする第二のヌクレオチドプローブを含む、前記キット。
【請求項２３】
請求項２１に記載の検出可能な核酸分子からなるヌクレオチドプローブを含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
１若しくは２以上のミトコンドリア疾患のインビトロでの検出のための、或いは、１若しくは２以上の腫瘍性疾患、又は１若しくは２以上の癌のインビトロでの検出のための、或いは、１若しくは２以上の慢性感染性疾患に関連する筋障害のインビトロでの検出のための、或いは、筋障害のインビトロでの検出若しくはモニタリングのための、或いは、有機化合物若しくは化学化合物、特に薬剤の真核細胞に対する毒性の試験のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
１若しくは２以上のミトコンドリア疾患のインビトロでの検出のための、或いは、１若しくは２以上の腫瘍性疾患、又は１若しくは２以上の癌のインビトロでの検出のための、或いは、１若しくは２以上の慢性感染性疾患に関連する筋障害のインビトロでの検出のための、或いは、筋障害のインビトロでの検出若しくはモニタリングのための、或いは、有機化合物若しくは化学化合物、特に薬剤の真核細胞に対する毒性の試験のための、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
１若しくは２以上のミトコンドリア疾患のインビトロでの検出のための、或いは、１若しくは２以上の腫瘍性疾患、又は１若しくは２以上の癌のインビトロでの検出のための、或いは、１若しくは２以上の慢性感染性疾患に関連する筋障害のインビトロでの検出のための、或いは、筋障害のインビトロでの検出若しくはモニタリングのための、或いは、有機化合物若しくは化学化合物、特に薬剤の真核細胞に対する毒性の試験のための、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２７】
細胞中における、変更されたミトコンドリアの活性を検出するための方法であって、
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の第一のプローブを用いて、ＤＮＡ複製のミトコンドリアにおける開始のレベルを検出し、そして
請求項２１に記載の第二のプローブを用いて、ミトコンドリアにおける転写物のレベルを検出すること
を含む、前記方法。