【手続補正書】
【提出日】平成26年12月18日(2014.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化ヒト血液細胞、好ましくは骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞の懸濁物を培養するための方法であって、以下の特徴を有する方法：
ａ）該懸濁物は、結果として生じる特定の電力入力が、少なくとも０．００５Ｗ／ｋｇとなるように、撹拌される。
【請求項２】
前記方法は、１つまたは複数の以下のさらなる特徴を有する、請求項１に記載の方法：
ｂ）前記該懸濁物は、該懸濁物の限定流の気体供給を可能にするのに適した強度で撹拌される、
ｃ）該懸濁物は、結果として生じる剪断力が、少なくとも０．１Ｎ／ｍ２となるように、撹拌される、
ｄ）撹拌機が撹拌のために使用される場合、該懸濁物は、該撹拌機の先端における結果として生じる剪断速度が、少なくとも３００ｓ−１となるように、撹拌される、
ｅ）該細胞に、限定流によって少なくとも１つの気体が供給される、
ｆ）該細胞に、リアクター容積の１リットル当たり多くとも０．０５ｌ／時間の流速で少なくとも１つの気体が供給される、
ｇ）該気体供給が、０．０５ｖｖｍ以下の最大流速を有する。
【請求項３】
前記懸濁物の撹拌のための前記特定の電力入力が、少なくとも０．０１Ｗ／ｋｇであり、前記気体供給が、限定気流によって達成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
最大気体流量が、０．０５ｖｖｍ以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒト不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病を起源とする細胞、またはそれに由来する細胞における、対象とする産物、好ましくは糖タンパク質の組換え産生のための方法であって、該細胞が、対象とする該産物をコードする遺伝子を含み、該細胞が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって培養される方法。
【請求項６】
発現された対象とする前記産物が、好ましくは細胞培養培地から対象とする該産物を精製することによって、細胞培養物から得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト骨髄性白血病細胞が、Ｋ５６２細胞またはそれに由来する細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、細胞保持を伴う連続発酵（灌流）によって培養される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
連続遠心分離機が、灌流に使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、培養の間に、好ましくはブリーディングによって除去される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養物中の細胞密度が、少なくとも１×１０６／ｍｌに達する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞培養物中の細胞生存率が、少なくとも７０％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵が、少なくとも８０μｇ／（ｍｌｄ）、好ましくは少なくとも９０μｇ／（ｍｌｄ）の最大生産性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
撹拌機が、撹拌に使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜から成る群から選択されるデバイスが、エアレーションに使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
エアレーションのために、少なくとも１種の気体のパルスが、培養プロセス中に与えられる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
エアレーションによって引き起こされる気泡発生が、選ばれるエアレーション方法によって制限され、生成される該気泡が、好ましくは、＞５ｍｍ、好ましくは１０ｍｍのサイズを有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
エアレーションのために、純酸素が供給される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞培養物中の酸素値が決定され、酸素のレベルが、所定のレベルより下に下がった場合、酸素および／または酸素を含有する気体もしくは気体混合物が、前記細胞培養培地の中にパルスとして導入される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
所定のレベルのｐＨまたはｐＨ範囲を維持するために、前記培養中に塩基が添加される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
特徴ａ）〜ｆ）のどれも含まない対応する方法に対して、細胞凝集の形成が低減する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞培養培地が、剪断保護剤を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、無血清培地中で培養される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞培養が、６．５〜８、好ましくは７〜７．５の間のｐＨ範囲、３０％〜５０％、好ましくは３５％〜４５％のｐＯ２、および／または３０〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で実行される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および／または前記細胞の産生速度が、培養容積によって実質的に影響を受けない、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１ｌ〜１０００ｌ、好ましくは１０ｌ〜２５０ｌの容積を有する発酵槽が、細胞培養に使用される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記電力入力がスケールアップ基準として使用される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法において使用される前記培養プロセスをアップスケールするための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
その上、本発明はまた、産物の収量および品質を維持しながら、発酵の好結果のスケールアップを可能にする方法およびツールをも提供する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
不死化ヒト血液細胞、好ましくは骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞の懸濁物を培養するための方法であって、１つまたは複数の以下の特徴を有する方法：
ａ）該懸濁物は、結果として生じる特定の電力入力が、少なくとも０．００５Ｗ／ｋｇとなるように、撹拌される、
ｂ）該懸濁物は、該懸濁物の限定流の気体供給を可能にするのに適した強度で撹拌される、
ｃ）該懸濁物は、結果として生じる剪断力が、少なくとも０．１Ｎ／ｍ２となるように、撹拌される、
ｄ）撹拌機が撹拌のために使用される場合、該懸濁物は、該撹拌機の先端における結果として生じる剪断速度が、少なくとも３００ｓ−１となるように、撹拌される、
ｅ）該細胞に、限定流によって少なくとも１つの気体が供給される、
ｆ）該細胞に、リアクター容積の１リットル当たり多くとも０．０５ｌ／時間の流速で少なくとも１つの気体が供給される、
ｇ）該気体供給が、０．０５ｖｖｍ以下の最大流速を有する。
（項目２）
前記懸濁物の撹拌のための前記特定の電力入力が、少なくとも０．０１Ｗ／ｋｇであり、前記気体供給が、限定気流によって達成される、項目１に記載の方法。
（項目３）
最大気体流量が、０．０５ｖｖｍ以下である、項目２に記載の方法。
（項目４）
ヒト不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病を起源とする細胞、またはそれに由来する細胞における、対象とする産物、好ましくは糖タンパク質の組換え産生のための方法であって、該細胞が、対象とする該産物をコードする遺伝子を含み、該細胞が、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法によって培養される方法。
（項目５）
発現された対象とする前記産物が、好ましくは細胞培養培地から対象とする該産物を精製することによって、細胞培養物から得られる、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ヒト骨髄性白血病細胞が、Ｋ５６２細胞またはそれに由来する細胞である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記細胞が、細胞保持を伴う連続発酵（灌流）によって培養される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
連続遠心分離機が、灌流に使用される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
細胞が、培養の間に、好ましくはブリーディングによって除去される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞培養物中の細胞密度が、少なくとも１×１０６／ｍｌに達する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞培養物中の細胞生存率が、少なくとも７０％である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記発酵が、少なくとも８０μｇ／（ｍｌｄ）、好ましくは少なくとも９０μｇ／（ｍｌｄ）の最大生産性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
撹拌機が、撹拌に使用される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜から成る群から選択されるデバイスが、エアレーションに使用される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
エアレーションのために、少なくとも１種の気体のパルスが、培養プロセス中に与えられる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
エアレーションによって引き起こされる気泡発生が、選ばれるエアレーション方法によって制限され、生成される該気泡が、好ましくは、＞５ｍｍ、好ましくは１０ｍｍのサイズを有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
エアレーションのために、純酸素が供給される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞培養物中の酸素値が決定され、酸素のレベルが、所定のレベルより下に下がった場合、酸素および／または酸素を含有する気体もしくは気体混合物が、前記細胞培養培地の中にパルスとして導入される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
所定のレベルのｐＨまたはｐＨ範囲を維持するために、前記培養中に塩基が添加される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
特徴ａ）〜ｆ）のどれも含まない対応する方法に対して、細胞凝集の形成が低減する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞培養培地が、剪断保護剤を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が、無血清培地中で培養される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
細胞培養が、６．５〜８、好ましくは７〜７．５の間のｐＨ範囲、３０％〜５０％、好ましくは３５％〜４５％のｐＯ２、および／または３０〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で実行される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および／または前記細胞の産生速度が、培養容積によって実質的に影響を受けない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
発酵槽が、少なくとも１ｌ〜１０００ｌ、好ましくは１０ｌ〜２５０ｌの容積を有する細胞培養に使用される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記電力入力がスケールアップ基準として使用される、前記項目のいずれか一項に記載の方法において使用される前記培養プロセスをアップスケールするための方法。