(57)【要約】【課題】癌の新規な治療剤の提供。【解決手段】シスタチンAタンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含む癌治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シスタチンAタンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含む癌治療剤。
【請求項２】
シスタチンAをコードするDNAを含むベクターを有効成分として含む、請求項１記載の癌治療剤。
【請求項３】
Ｔ細胞依存性腫瘍免疫を誘導する、請求項１又は２に記載の癌治療剤。
【請求項４】
癌が膵臓癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シスタチンAを有効成分として含む癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスタチンA(CSTA)は、血清タンパク質であり、シスタチンスーパーファミリーの２型に属するシステインプロテアーゼインヒビターである。
【０００３】
シスタチンAが特定の疾患のマーカーになり得ることは報告されていたが（特許文献１及び２を参照）、癌治療との関連についての報告はなかった。
【０００４】
膵臓癌は日本人で部位別がん死亡数（男女計）順位が4番目の消化器系悪性腫瘍であり、厚生労働省調べでは年間3万1千人の患者が死亡する。癌の発見が非常に難しく、早期に発見されることは稀である。膵臓癌と診断された75％の症例は既に手術不能例であり、発見後１〜２年以内に死亡する極めて予後不良の消化器癌である（国立がんセンターがん対策情報センター調べhttp://ganjoho.jp/public/cancer/data/pancreas.html）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2007-291089号公報
【特許文献２】特表2013-527478号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌の新規な治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、膵臓癌細胞であるPAN02細胞をマウスに接種し、膵臓癌モデルマウスを作製し、膵癌の検出や治療に関する検討を行っていた。PAN02細胞にシスタチンA(CSTA)をコードするDNAを挿入した発現プラスミドを導入しマウスに接種し経時的に観察したところ、該プラスミドを導入していないPAN02細胞を接種したマウスに比べ有意に死亡率が低下した。また、PAN02細胞にシスタチンAをコードするDNAを挿入した発現プラスミドを導入し、無胸腺マウスに接種した場合、死亡率の低下はみられなかった。これらの結果より、シスタチンAがＴ細胞依存的に腫瘍免疫を誘導し得ると考え、シスタチンＡを癌治療に用いることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]  シスタチンAタンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含む癌治療剤。
[２]  シスタチンAをコードするDNAを含むベクターを有効成分として含む、[１]の癌治療剤。
[３]  Ｔ細胞依存性腫瘍免疫を誘導する、[１]又は[２]の癌治療剤。
[４]  癌が膵臓癌である、[１]〜[３]のいずれかの癌治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
シスタチンＡは生体内でＴ細胞依存的に腫瘍免疫を活性化することにより癌治療剤としての効果を奏し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウスCSTA(mCSTA)をGFPと共に、CMVプロモーター下に発現するプラスミドMG220055の構造を示す図である。
【図２】PAN02-CSTA腹腔内（i.p.）投与群(wild type)、PAN02 i.p. 投与群（wild type）及びPAN02-CSTA i.p. 投与群（nude type）の生存率を示す図である。
【図３】PAN02-CSTA投与群マウス(wild type）に、抗CD4抗体又は抗CD8抗体を投与する実験の投与スケジュールを示す図である。
【図４】PAN02-CSTA投与群マウス(wild type)に、抗CD4抗体又は抗CD8抗体を投与したときのマウス生存率を示す図である。
【図５】シスタチンAタンパク質の膵癌治療効果を調べる実験プロトコールを示す図である。
【図６】シスタチンAタンパク質の膵癌治療効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の癌治療剤は、シスタチンA（CSTA)タンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含む。
【００１３】
シスタチンAは、生体内において、Ｔ細胞依存性腫瘍免疫を誘導し得る。該Ｔ細胞依存性腫瘍免疫はCD4細胞及びCD8細胞を介した腫瘍免疫である。
【００１４】
本発明においては、ヒトシスタチンAを用いる。
ヒトシスタチンAをコードするDNAの塩基配列は、配列番号１に表される。また、ヒトシスタチンAタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に表される。
【００１５】
本発明の癌治療剤に含まれるシスタチンAタンパク質は、配列番号２に表されるアミノ酸配列又は配列番号２に表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、Ｔ細胞依存性腫瘍免疫活性を有するタンパク質である。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
【００１６】
シスタチンAをコードするDNA及びシスタチンAタンパク質は、配列番号１又は配列番号２の配列情報に基づいて、化学合成や遺伝子工学的作製法により得ることができる。
【００１７】
本発明の癌治療剤に含まれるシスタチンAをコードするDNAは、配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、配列番号１に表される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているDNA、又は前記DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAのうち、Ｔ細胞依存性腫瘍免疫活性を有するタンパク質をコードするものである。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％ SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％ SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％ SDS、65℃」程度の条件である。さらに、本発明の癌治療剤に含まれるシスタチンAをコードするDNAは、配列番号２に表されるタンパク質をコードするDNAである。
【００１８】
シスタチンAをコードするDNAは、配列番号１の配列情報に基づいて、ヒト細胞、ヒト組織等から得ることができる。
【００１９】
さらに、本発明はシスタチンAをコードするDNAを含むベクターをも包含する。該ベクターを被験体に導入することにより、被験体体内でシスタチンAタンパク質が発現し癌に対する治療効果を発揮し得る。
【００２０】
遺伝子治療においては、目的の遺伝子（DNA)を被験体の癌病変部へ導入する必要があるが、DNAの導入は公知の方法により行うことができる。遺伝子を被験体へ導入する方法として、ウイルスベクターを用いる方法やプラスミド等の非ウイルスベクターを用いる方法がある。これらの方法については、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；別冊実験医学、遺伝子導入&発現解析実験法、羊土社、1997；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、1999、Walter J. Burdette、知っておきたい遺伝子治療の基礎知識、タカラバイオ、2004；等に記載されている。
【００２１】
遺伝子導入のためのウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。無毒化したレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免疫不全症ウイルス(HIV)等のDNAウイルス又はRNAウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
【００２２】
また、これらのウイルスを癌細胞のみで増殖するように遺伝子改変した腫瘍溶解性ウイルス（制限増殖型ウイルス）も利用でき、遺伝子組換えアデノウイルスや遺伝子組換え単純ヘルペスウイルスが実用化されている。
【００２３】
遺伝子を導入したウイルスベクターは特異的受容体を介して細胞に感染させることができる。
【００２４】
また、上記ウイルスを用いなくても、プラスミド等の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、遺伝子を標的細胞や組織に導入することができる。例えば、リン酸-カルシウム共沈法、リポフェクション法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いたDNAの直接注入法等の手法を用いて細胞内へ遺伝子を導入することができる。また、内包型リポソーム(internal liposome)による遺伝子導入法、静電気型リポソーム(electorostatic type liposome)による遺伝子導入法、HVJ-リポソーム法、改良型HVJ-リポソーム法(HVJ-AVEリポソーム法)などのリポソームを用いる方法、HVJ-E(エンベロープ)ベクターを用いる方法、レセプター介在性遺伝子導入法、naked-DNAの直接導入法、パーティクル銃を用いてDNAを金属粒子と共に細胞に導入する方法、種々のポリマーによる導入法等を利用することによって、組換え発現ベクターを標的細胞や組織に導入することができる。この目的のためには、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであるかぎりいかなる発現ベクターをも用いることができる。例えば、pCMV6、pBK-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV(インビトロゲン社、ストラタジーン社)、pCAGGS（Gene 108, 193-200(1991)）、pVAX1等の発現ベクターを用いることができる。
【００２５】
シスタチンAをコードするDNAを含むベクターは、プロモーター、エンハンサー、ポリAシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識や選別に用いるためのマーカー遺伝子等を含んでいてもよい。この際のプロモーターとしては、公知のプロモーターを用いることができる。
【００２６】
本発明のシスタチンAをコードするDNAを含むベクターの被験体への導入には、ベクター直接体内に導入することもできるし（in vivo法）、ヒトから細胞を取り出して体外でベクターを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す方法（ex vivo法）によっても可能である。
【００２７】
本発明のシスタチンAタンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含む癌治療剤により治療可能な癌は、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、黒色腫、腎細胞癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、前立腺癌等であり、この中でも膵臓癌の治療に有用に用いることができる。また、本発明のシスタチンAタンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含む癌治療剤は、癌の進行抑制にも用いることができる。本発明においては、癌の改善や進行抑制も癌治療という。
【００２８】
本発明のシスタチンAタンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含む癌治療剤は、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれる。シスタチンAは凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。本発明の癌治療剤は、血管内注射（静脈注射、動脈注射）、腹腔内、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内又は皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮又は皮内の各経路によって投与できる。好ましくは静脈投与又は腹腔内投与である。また、本発明の癌治療剤は、局所投与することも可能である。例えば癌部に対して、カテーテルや注射器等により投与することによりその効果を発揮し得る。
【００２９】
投与形態は限定されないが、錠剤、顆粒剤、噴霧剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。
【００３０】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤；デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
【００３１】
乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
【００３２】
注射剤は、水、ショ糖、ソルビトール、キシロース、トレハロース、果糖などの糖類；マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを添加剤として用いることができる。
【００３３】
本発明のシスタチンAタンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを含む癌治療剤の投与量は、投与する患者の年齢、性別、重篤度等により変えることができるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約0.01mg〜1000mgであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約0.01mg〜1000mgを皮下注射、筋肉注射、動脈注射又は静脈注射によって投与することができる。単回投与でもよいし、１日から２週間にわたって数回にわたって投与してもよい。また、DNAとして１回あたり0.001mg〜100mgを投与してもよい。
【００３４】
また、シスタチンAをコードするDNAを含むベクターを用いる場合、例えば107〜109pfu(plaque forming unit)のベクターを投与すればよい。
【実施例】
【００３５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３６】
実施例１  マウスへのPAN02-CSTA腹腔内投与とマウス生存率
PAN02膵がん細胞（米国NCIより入手、MTA締結）をC57BL/6マウスの腹腔内に接種し、膵がん腹膜播種モデルを作製した。
【００３７】
マウスシスタチンA(mCSTA)をGFPと共に、CMVプロモーター下に発現するプラスミド（MG220055、OriGene社）をPAN02細胞へ遺伝子導入し、Geneticin耐性で安定的にシスタチンAを発現する細胞株PAN02-CSTA細胞を作製した。MG220055の構造を図１に示す。
【００３８】
雌C57BL/6マウス又は雌無胸腺マウスの腹腔に、PAN02-CSTA細胞を注射(1x106個）して経時的なマウス生存率を観察した。PAN02-CSTAを投与したC57BL/6マウス群を、PAN02-CSTA i.p. 投与群（wild type）とし（５匹）、PAN02-CSTAを投与した無胸腺マウス群を、PAN02-CSTA i.p. 投与群（nude type）とした（５匹）。コントロールとして、C57BL/6マウスの腹腔に、MG220055を導入していないPAN02細胞を注射した。コントロールをPAN02 i.p.投与群とした（１０匹）。
【００３９】
結果を図２に示す。図２に示すように、PAN02 i.p. 投与群（wild type）及びPAN02-CSTA i.p. 投与群（nude type）では、PAN02膵癌細胞接種後３０日前後でほとんどのマウスが死亡したが、PAN02-CSTA i.p. 投与群（wild type）では、５９日後でも全マウスが生存していた。すなわち、PAN02-CSTA i.p. 投与群（wild type）の生存率は、PAN02 i.p. 投与群（wild type）及びPAN02-CSTA i.p. 投与群（nude type）に比べ、有意に上昇した。
【００４０】
本実施例の結果は、マウスCSTA発現プラスミドを導入したPAN02-CSTAがマウス生体内でシスタチンAを発現した結果シスタチンAによりマウスの死亡率が有意に上昇したことを示している。すなわち、シスタチンAの癌治療効果を示している。また、無胸腺マウス（nude type)で生存率延長の効果がなかったことは、シスタチンAがT細胞依存性腫瘍免疫を誘導したことを示している。
【００４１】
実施例２  免疫細胞枯渇（depletion)下マウスへのPAN02-CSTA腹腔内投与とマウス生存率
雌C57BL/6マウスに実施例１で用いた１×106個のPAN02-CSTAを投与する、２日前、並びに２、６、10、14、18、22及び26日後に0.2 mgの抗CD4抗体又は抗CD8抗体を腹腔に投与した。抗体は、BD Biosciences社より入手した。PAN02-CSTAを投与した日を０日として、経時的なマウス生存率を観察した。それぞれの群について５匹のマウスを用いた。
【００４２】
投与スケジュールを図３に示す。
結果を図４に示す。図４に示すように、PAN02-CSTAを腹腔内に投与したC57BL/6マウスであっても、抗CD4抗体又は抗CD8抗体を投与したマウス群は生存率がコントロール群に対して有意に低下した。
【００４３】
本実施例の結果は、シスタチンAの癌治療効果がCD4細胞及びCD8細胞を介した腫瘍免疫によるものであることを示している。
【００４４】
実施例３  シスタチンAタンパク質の膵癌治療効果
図５に実験プロトコールを示す。図５に示すように、C57BL/6Jマウス（雌、12週齢）に１×107細胞の膵臓癌細胞株PAN02を皮下投与した。投与後２９日目から３〜４日毎にシスタチンAを200μg／回の投与量で静脈内投与した。コントロールとしてPBSを投与した。Tumor volume (mm3) = (the shortest diameter (mm))2 x (the longest diameter(mm))/2の式で体積を算出した。
【００４５】
結果を図６に示す。図６に示すように、Day 57で、シスタチンAを投与したマウスで腫瘍体積が小さく、p値0.01で腫瘍体積に有意差が認められた。
この結果は、シスタチンAタンパク質の抗腫瘍効果を示す。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のシスタチンAタンパク質、シスタチンAをコードするDNA又は該DNAを含むベクターを含む癌治療剤は、癌の治療薬として用いることができる。
【図１】
2018104303.tif 000002
【図２】
2018104303.tif 000003
【図３】
2018104303.tif 000004
【図４】
2018104303.tif 000005
【図５】
2018104303.tif 000006
【図６】
2018104303.tif 000007
【配列表】
2018104303000001.app