【事件の表示】
　特許第３０１８２６１号「共役酵素反応によるＬ−ホスフィノトリシンの製造方法」の請求項１ないし３、５、９に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０１８２６１号の請求項１、２、６に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３０１８２６１号に係る発明についての出願は、平成３年９月２６日（パリ条約による優先権主張１９９０年９月２７日、ドイツ国）の出願であって、平成１２年１月７日にその特許の設定登録がなされ、その後、明治製菓株式会社より特許異議申立がなされ、平成１３年６月１２日付で訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
  上記訂正請求に係る訂正事項は、特許請求の範囲の請求項１に係る記載を「【請求項１】式（Ｉ）　［式（Ｉ）省略］　で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（II）　［式（II）省略］　で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）から以下の反応工程、すなわち　ａ）トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテートの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ１）の存在下に、アスパルテートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザルアセテートおよびグルタメートを生成させる、およびｂ）トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのグルタメートの存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ２）存在下に、グルタメートと式（II）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグルタレート及びＬ−ホスフィノトリシンを生成させる工程より成る共役酵素反応により製造する方法であって、アスパルテート対ＨＭＰＢモル比を０．５〜１．５対１，好ましくは０．８〜１．２対１，特に等モル比とし、またグルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加し、そして前記トランスアミナーゼがピルベートをアラニンに転化しないトランスアミナーゼ又はピルベートからアラニンへの転化特異性が低減された精製トランスアミナーゼであることを特徴とする製造方法。」と訂正、同請求項３，５及び８を削除、同請求項４に係る記載を「【請求項３】トランスアミナーゼ１がブタ、大腸菌またはバチルスを起源とする請求項１または２記載の方法。」と訂正、及び同請求項６に係る記載を「【請求項４】トランスアミナーゼ２が大腸菌を起源とする請求項１または２記載の方法。」と訂正するものであるから、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明に該当し、いずれも、新規事項の追加に該当せず、実質的に特許請求の範囲を拡張又は変更するものではない。
　ところで、上記請求項４及び請求項６に係る訂正は、特許異議の申立がなされていない請求項についての訂正であるから、訂正明細書の請求項３及び請求項４に係る発明（以下、「本件発明３及び４」という。）の独立特許要件について検討するに、本件発明３及び４は、訂正明細書の請求項１及び２に係る発明（以下、「本件発明１及び２」という。）の構成要件を全て含むものであるところ、本件発明１及び２は、下記「III２．判断」に記載のように、特許法２９条１項３号、同条２項、並びに同法３６条４項及び６項の規定に違反するものではないので、本件発明３及び４も特許法２９条１項３号、同条２項、並びに同法３６条４項及び６項の規定に違反するものではない。
　そうすると、本件発明３及び４は、出願の際、独立して特許を受けることができるものである。
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法１２０条の４，２項及び３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、当該訂正は認められるものである。
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１乃至請求項３，請求項５及び請求項９に係る発明は、甲第１号証（特開昭６４−２７４８５号公報）に記載された発明である、若しくは、甲第１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条１項３号或いは同条２項の規定により特許を受けることができない、或いは、本件明細書には記載の不備があるから、特許法３６条４項、６項の規定により特許を受けることができない。
２．判断
Ａ．特許法２９条１項３号或いは同条２項違反について
　甲第１号証には、特許請求の範囲の項に、
「１．次式　（II式略）　で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ−酪酸を、１つ又はそれ以上のアミノ基供与体の存在下に１つ又はそれ以上のトランスアミナーゼで、あるいは１つ又はそれ以上のトランスアミナーゼを産生する能力をもつ微生物で処理することを特徴とする次式　（Ｉ式略）　で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸の製造法。
１０．使用される酵素が、グルタミン酸−オキサロ酢酸−トランスアミナーゼ、グルタミン酸−ピルビン酸−トランスアミナーゼ、あるいはアミノ基供与体としてのグルタミン酸の存在下に４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ−酪酸をＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸に変換するトランスアミナーゼのいずれか一つ、あるいはそれらの組み合わせである特許請求の範囲第１項記載の方法。
１１．使用されるアミノ基供与体がグルタミン酸及び／又はアスパラギン酸である特許請求の範囲第１項乃至第10項記載の方法。」が、発明の詳細な説明の項には、
「本発明の方法で用いられるトランスアミナーゼの適当な例は、市販のグルタミン酸−オキザロ酢酸−トランスアミナーゼ（GOTと略称される）（酵素国際分類番号EC2.6.1.1）、あるいはグルタミン酸−ピルビン酸−トランスアミナーゼ（GPTと略称される）（酵素国際分類番号EC2.6.1.2）、あるいはアミノ基供与体としてのＬ−グルタミン酸の存在下にOMPBをL-AMPBに変換するトランスアミナーゼ活性をもつ酵素がある、これらのトランスアミナーゼ活性を単独にあるいは二種又はそれ以上を組み合わせて使用できる。その中でも、好ましい組合せのトランスアミナーゼは、アスパラギン酸をアミノ基供与体として用いて２−ケトグルタール酸をグルタミン酸に変換する酵素活性、すなわちいわゆるGOT活性を合わせもつトランスアミナーゼと、アミノ基供与体としてグルタミン酸の存在下にOMPBをL-AMPBに変換するトランスアミナーゼ活性を持つ第２のトランスアミナーゼとの組み合わせである。」（４頁右下欄10行〜５頁左上欄8行）、
「通常は、グルタミン酸（またはその塩）の濃度（添加量）とOMPB濃度（添加量）とのモル比は０．２：１〜３．０：１の範囲にあるのがよい。またアスパラギン酸（またはその塩）の濃度（添加量）とOMPBの濃度（添加量）とのモル比は１．０：１〜３．０：１の範囲であるのがよい。」（５頁右下欄7行〜12行）、及び、「実施例１」には、「アミノ基供与体としてＬ−アラニン（Ala）を添加した。」（７頁左下欄13行〜15行）が、それぞれ記載されている。
　本件発明１と甲第１号証に記載された発明とを対比すると、両者は、「Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）から以下の反応工程、すなわち、ａ）トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテートの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ１）の存在下に、アスパルテートとα−ケトクルタレートを反応させてオキザルアセテートおよびグルタメートを生成させる、およびｂ）トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのグルタメートの存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ２）存在下に、グルタメートとＨＭＰＢを反応させてα−ケトグルタレート及びＬ−ホスフィノトリシンを生成させる工程より成る共役酵素反応により製造する方法」において軌を一にするが、前者では、使用するトランスアミナーゼが「ピルベートをアラニンに転化しないトランスアミナーゼ又はピルベートからアラニンへの転化特異性が低減された精製トランスアミナーゼである」のに対し、後者では、そのような特定はない。
　すなわち、本件発明においては、本件明細書の「しかしながら、これまでに報告されているすべてのGOTはグルタメートの存在下においてピルベートをアミノ基転移してアラニンにする副次的活性を有しているため、NH4＋が反応系から連続的に除かれてしまい、また等モル量のHMPBとアミノ供与体（グルタメートおよび／またはアスパルテート）を用いたのではＬ−ホスフィノトリシン生成反応は完全なところまで進行しない。加えて、生成Ｌ−ホスフィノトリシンはアラニンによって汚染されている。」（特許公報２頁4欄22行〜30行）との記載に徴し、反応系においてアラニンの存在は極力排されるものであるが、甲第１号証には、トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテートの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートにアミノ基転移できる酵素、及びトランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのグルタメートの存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミノ基転移できる酵素について記載されているものの、「実施例１」には、「アミノ基供与体としてＬ−アラニン（Ala）を添加した。」との記載があり、この記載に照らし、甲第１号証に係る発明では、反応系にアラニンの存在を許容していると解される。
　そうすると、甲第１号証において使用するトランスアミナーゼは、ピルベートをアラニンに転化しないトランスアミナーゼ又はピルベートからアラニンへの転化特異性が低減された精製トランスアミナーゼを包含しているとはいえないから、本件発明１は、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。
　また、甲第１号証には、「ピルベートをアラニンに転化しないトランスアミナーゼ又はピルベートからアラニンへの転化特異性が低減された精製トランスアミナーゼ」を使用することについて示唆すらされていないのであるから、本件発明１は、甲第１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　さらに、本件発明２及び訂正明細書の請求項６に係る発明（以下、「本件発明６」という。）は、本件発明１の構成要件を全て含むものであるから、上記本件発明１についての判断と同様の理由により、甲第１号証に記載された発明ではなく、また、甲第１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　以上のように、本件発明１，２及び６の特許は、特許法２９条１項３号或いは同法２項の規定に違反してされたものであるとはいえない。
Ｂ．特許法３６条４項，６項違反について
　特許異議申立人は、(1)訂正前の請求項１における「適当なトランスアミナーゼ１の存在下」及び「適当なトランスアミナーゼ２の存在下」の「適当な」という記載は不明確である、(2)同請求項１における「グルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加する」の「触媒量」という記載は不明確である、(3)同請求項２におけるグルタメートをHMPBに対し添加する添加量の最も好ましいとする数値（「実験１」では、HMPB：Glu＝１：１）が、明細書の記載内容と一致しない、並びに(4)「実施例１」の記載が不明であり、また「実施例３」を追試することができない、と主張している。
　(1)について
　上記訂正請求により、「適当なトランスアミナーゼ１の存在下」及び「適当なトランスアミナーゼ２の存在下」は、それぞれ、「トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテートの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ１）の存在下」及び「トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのグルタメートの存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ２）の存在下」と訂正されたのであるから、もはや訂正明細書の請求項１に係る記載は不明確であるとはいえない。
  (2)について
　「グルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加する」とは、本件明細書の記載に徴し、本件発明の反応系においてグルタメート又はα−ケトグルタレートが触媒として作用し、そのために必要な量が添加されればよいと解されるから、特許異議申立人の、「触媒量」とは微量でなければならないことを前提した主張は失当である。
　(3)について
　本件発明は、「実質的に定量的収率で、そしてまた天然アミノ酸によって実質的に全く汚染されることなくホスフィノトリシンが生成する」（本件明細書段落【0007】）ことを目的とするものであるところ、上記「実験１」では反応時間が１時間であり、しかも反応系には相当のグルタミン酸が残存することを考慮すると、「実験１」が本件発明における最適条件であるとは必ずしもいえない。
　そうすると、特許異議申立人の、実施例３の「実験１」での転化率を根拠した上記主張は採用できない。
　(4)について
　本件明細書の「実施例１」の記載は、特許異議申立人が指摘するように若干不明なところがあるが、この記載があることをもって本件明細書の記載は不適法であるとまではいえない。
　また、「実施例３」では、「実施例２」において調製したブタの心臓からのGOTを使用しているところ、「実施例２」は、「ブタからのグルタメート／オキザルアセテートトランスアミナーゼの精製」という表題が記載されているだけで、その精製に関する詳細な記載はないのであるから、この点で本件明細書の記載は適切でないとの誹りは免れないが、該酵素は本件出願前に入手可能であったことは明らかであるから（必要ならば、「biochemica informationII」Boehringer Mannheim GmbH,1975年3月発行84〜85頁参照のこと）、本件発明が追試できないとはいえない。　
　以上のように、本件発明１及び２に係る特許は、特許法３６条４項及び６項の規定に違反するものではない。
３．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１，２及び６についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１，２及び６についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年９月１８日（２００２．９．１８）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
　特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的として、特許請求の範囲の請求項１に係る記載を「【請求項１】式（Ｉ）　［式（Ｉ）省略］　で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（ＩＩ）　［式（ＩＩ）省略］　で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）から以下の反応工程、すなわち　ａ）トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテートの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ１）の存在下に、アスパルテートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザルアセテートおよびグルタメートを生成させる、およびｂ）トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのグルタメートの存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ２）存在下に、グルタメートと式（ＩＩ）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグルタレート及びＬ−ホスフィノトリシンを生成させる工程より成る共役酵素反応により製造する方法であって、アスパルテート対ＨＭＰＢモル比を０．５〜１．５対１，好ましくは０．８〜１．２対１，特に等モル比とし、またグルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加し、そして前記トランスアミナーゼがピルベートをアラニンに転化しないトランスアミナーゼ又はピルベートからアラニンへの転化特異性が低減された精製トランスアミナーゼであることを特徴とする製造方法。」と訂正、同請求項３，５及び８を削除、同請求項４に係る記載を「【請求項３】トランスアミナーゼ１がブタ、大腸菌またはバチルスを起源とする請求項１または２記載の方法。」と訂正、及び同請求項６に係る記載を「【請求項４】トランスアミナーゼ２が大腸菌を起源とする請求項１または２記載の方法。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
共役酵素反応によるＬ−ホスフィノトリシンの製造方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　式（Ｉ）
　【化１】
で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（ＩＩ）
　【化２】
で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）から以下の反応工程、すなわち
　ａ）　トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテートの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ１）の存在下に、アスパルテートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザルアセテートおよびグルタメートを生成させる、および
　ｂ）　トランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのグルタメートの存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミノ基転移できる酵素（トランスアミナーゼ２）の存在下に、グルタメートと式（ＩＩ）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグルタレートおよびＬ−ホスフィノトリシンを生成させる
工程より成る共役酵素反応により製造する方法であって、アスパルテート対ＨＭＰＢモル比を０．５〜１．５対１、好ましくは０．８〜１．２対１、特に等モル比とし、またグルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加し、そして前記トランスアミナーゼがピルベートをアラニンに転化しないトランスアミナーゼ又はピルベートからアラニンへの転化特異性が低減された精製トランスアミナーゼであることを特徴とする製造方法。
　【請求項２】　グルタメートまたはα−ケトグルタレートをＨＭＰＢに対し０．０１〜１対１、好ましくは０．０１〜０．２対１、特に０．０５〜０．２対１のモル比で添加する請求項１記載の方法。
　【請求項３】　トランスアミナーゼ１がブタ、大腸菌またはバチルスを起源とする請求項１または２記載の方法。
　【請求項４】　トランスアミナーゼ２が大腸菌を起源とする請求項１または２記載の方法。
　【請求項５】　オキザルアセテートが多価陽イオン、好ましくはＡｌ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋またはＦｅ３＋の存在下にピルベートに脱カルボキシル化される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
　【請求項６】　少くとも一方のトランスァミナーゼが固定化された形で存在する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
　【請求項７】　固定化されたトランスアミナーゼがカラム反応装置に存在する請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は二つの酵素反応の共役による４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）からのＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）の合成に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　共役酵素合成によるホスフィノトリシン製造は既にＥＰ　２４９　１８８に開示されている。これにはアミノ供与体であるアスパルテートおよび、グルタメート／オキザルアセテート・トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）の存在下にα−ケトグルタレートをグルタメートに転化することが記載されている。この転化反応は、この第一反応において形成されたアミノ供与体であるグルタメートの存在下に４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）をＬ−ホスフィノトリシンに転化するもう一つのトランスアミナーゼ反応と共役されている。
　【０００３】
　さて、共役酵素反応における基質転化を完全なものとするには、個々の酵素反応の平衡定数が相互に異なっていることが重要である。しかしながら、アミノ基転移反応の平衡定数は約１．０であるため、一般に目的物は５０％収率でしか得られない（米国特許第４，８２６，７６６号参照）。
　【０００４】
　平衡系から反応生成物を除去するかまたは過剰の出発物質を用いることにより、酵素反応の平衡を生成物側にずらすことは可能である。
　【０００５】
　一般に、Ｌ−ホスフィノトリシン合成のための前記アミノ基転移反応には過剰のアミノ供与体であるグルタメートが用いられる〔Ａ．Ｓｃｈｕｌｚ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．
５６
５６
　【０００６】
　ホスフィノトリシン特異的トランスアミナーゼおよびＧＯＴの関与する共役法のもう一つの可能性は、そのホスフィノトリシントランスアミナーゼにより消費されるグルタメートを再循環させることにより反応をＧＯＴによってホスフィノトリシン合成の方向に動かすことである。これはＧＯＴ反応生成物であるオキザルアセテートが二価金属イオンの存在下においてピルベートに自然に脱カルボキシされ、従って反応平衡系から除かれるためである。しかしながら、これまでに報告されているすべてのＧＯＴはグルタメートの存在下においてピルベートをアミノ基転移してアラニンにする副次的活性を有しているため、ＮＨ４＋が反応系から連続的に除かれてしまい、また等モル量のＨＭＰＢとアミノ供与体（グルタメートおよび／またはアスパルテート）を用いたのではＬ−ホスフィノトリシン生成反応は完全なところまで進行しない。加えて、生成Ｌ−ホスフィノトリシンはアラニンによって汚染されている。
　【０００７】
　【課題を解決するための手段】
　今般、ＧＯＴ活性を有するトランスアミナーゼおよびＬ−ホスフィノトリシントランスアミナーゼ活性を有するトランスアミナーゼを用いた共役酵素反応においてアミノ供与体であるグルタメートを触媒量で用いそしてアミノ供与体であるアスパルテートがＨＭＰＢに対して略等モル量で用いると、実質的に定量的収率で、そしてまた天然アミノ酸によって実質的に全く汚染されることなくホスフィノトリシンが生成することを見出した。
　【０００８】
　従って本発明は式（Ｉ）
　【化３】
で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（ＩＩ）
　【化４】
で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）から以下の反応工程、すなわち
　ａ）　適当なトランスアミナーゼ１の存在下にアスパルテートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザルアセテートおよびグルタメートを生成させる、および
　ｂ）　適当なトランスアミナーゼ２の存在下にグルタメートと式（ＩＩ）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグルタメートおよびＬ−ホスフィノトリシンを生成させる
工程より成る共役酵素反応により製造する方法であって、アスパルテート対ＨＭＰＢモル比を０．５〜１．５対１、好ましくは０．８〜１．２対１、特に等モル比とし、またグルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加することを特徴とする前記方法に関する。
　【０００９】
　グルタメート、アスパルテートおよびα−ケトグルタレートまたはそれらの相当する酸は購入可能な物質である。ＨＭＰＢはＥＰ　３０４２４に記載されている如くに製造することができる。
　【００１０】
　トランスアミナーゼ１はトランスアミナーゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテートの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートにアミノ基転移できるいずれかの酵素（いわゆるＧＯＴ活性酵素）である。ピルベートからアラニンにアミノ基転移できず、またそれ故に共役反応の目的生成物であるＬ−ホスフィノトリシンを他の天然アミノ酸で汚染することのないＧＯＴ（グルタメート／オキザルアセテートトランスアミナーゼ）を用いるのが好ましい。ピルベートは例えばアスパルテートのアミノ基転移反応生成物であるオキザルアセテートの脱カルボキシ化によって製造される。
　【００１１】
　特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（
Ｅ．
ｃｏｌｉ
　【００１２】
　トランスアミナーゼ２はトランスアミナーゼ活性を有し、またアミノ供与体としてのグルタメートの存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミノ基転移することができるいずれかの酵素である。このタイプの酵素はＥＰ　２４９１８８に示されている。トランスアミナーゼ１と同様、ピルベートからアラニンにアミノ基転移できないトランスアミナーゼをトランスアミナーゼ２として用いるのが好ましい。
　【００１３】
　特に、大腸菌からのＬ−ホスフィノトリシン特異的トランスアミナーゼはピルベート特異的活性を有さず、従って好ましいものとして用いることができる。大腸菌からのＬ−ホスフィノトリシン特異的トランスアミナーゼは例えばＡ．Ｓｃｈｕｌｚ（１９９０）の方法によって濃縮することができる。
　【００１４】
　原則として、特定のトランスアミナーゼ活性を有する全細胞、細胞抽出物、部分的精製細胞抽出物または精製酵素をアミノ基転移反応に用いることもできる。しかしながら、副次的反応、特にピルベートからアラニンへのアミノ基転移反応、がもはや生じなくなるまで精製された酵素を用いるのが有利である。
　【００１５】
　少くとも一つの、特に両方の、酵素を固定された形で用いるのが特に有利である。トランスアミナーゼ固定のための一つの可能な方法は例えばＡ．Ｓｃｈｕｌｚ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）に記載されている。
　【００１６】
　アミノ基転移反応は一般に、バイオコンパチブル（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）緩衝液、すなわちｐＨを６．５〜１０、好ましくは７．５〜９．０、特に７．５〜８．５の範囲に維持しかつ個々の成分とは反応しない緩衝液、中で行われる。ホスフェートまたはｔｒｉｓ緩衝液、特にｔｒｉｓ緩衝液を選択するのが好ましい。アスパルテート対ＨＭＰＢモル比は０．５〜１．５対１、好ましくは０．８〜１．２対１、特に等モル比である。グルタメートまたはα−ケトグルタレートは触媒量で反応混合物に添加される。ＨＭＰＢ対グルタメートまたはα−ケトグルタレートは一般に０．０１〜１対１、好ましくは０．０１〜０．２対１、特に０．０５〜０．２対１である。反応混合物は一般に少量の補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）であるピリドキサールホスフェートをも例えば１〜５００μｍ、好ましくは５〜１００μｍの濃度で含有する。反応温度は一般に約２０〜７０℃、好ましくは３０〜４０℃である。
　【００１７】
　Ｌ−ホスフィノトリシン収率を高めるために、グルタメート／オキザルアセテートトランスアミナーゼ反応で生成したオキザルアセテートを多価金属イオンの存在下に脱カルボキシル化するのが好ましい（英国特許出願第２　１６１　１５９号）。適当な多価金属イオンの例は前記英国特許出願に列挙されたすべての金属イオン、好ましくは、Ａｌ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋またはＦｅ３＋である。この好ましい態様において、付加的なピルベート特異的活性を有するトランスアミナーゼまたはトランスアミナーゼ画分を全く用いないのがさらに有利である。前述の反応条件下にオキザルアセテートの脱カルボキシル化反応を行うことによってＬ−ホスフィノトリシンの収率が増大したことは全く予想外であった。何故ならば英国特許出願第２　１６１　１５９号によれば最高の生成物収率は反応系においてアスパルテートを唯一のアミノ供与体として用いた場合に認められたに過ぎなかったからである。
　【００１８】
　アミノ供与体であるアスパルテートとグルタメートが実質的に完全に消費されると、実質的に天然アミノ酸不含の生成物Ｌ−ホスフィノトリシンが得られ、またそれの形成されたα−ケト酸、α−ケトグルタレートおよびオキザルアセテートまたはピルベートからの分離は一段階で可能である。α−ケトグルタレートまたはグルタメートは過剰にではなく極く少量で添加されたに過ぎず、また同様に、アスパルテートは過剰にではなく好ましくはＨＭＰＢに対して等モルで添加されたにもかかわらず、ＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンへの実質的に完全な転化が認められた。このことは全く予測し得なかったことである。
　【００１９】
　Ｌ−ホスフィノトリシンは既知の方法、例えばメチルイソブチルケトン抽出により、または例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲ　１２０を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより簡易に精製することができる。
　【００２０】
　得られるＬ−ホスフィノトリシンは一般に農業において除草剤として用いられる。以下の実施例は本発明をさらに詳述するものであるが、本発明を限定するものでは全くない。
　【００２１】
　【実施例】
　実施例１
大腸菌Ｋ−１２による生物学的転換によるＬ−ホスフィノトリシン合成
　大腸菌Ｋ−１２をＬＢ培地（１０ｇ／リットル　トリプトン、５ｇ／リットル酵母エキス、１０ｇ／リットルＮａＣｌ）中、３７°で１５時間培養した。５０００ｇで１０分間遠心分離することにより菌体を集め、ホスフェート緩衝液（１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０、１０ｍＭ　ＮａＣｌ）で２回洗浄し、次いで以下の溶液に１００ｍｇ／ｍｌ濃度となるように再懸濁した。
　【００２２】
溶液１：
　　ＨＭＰＢ：グルタミン酸：アスパラギン酸＝１：１：１
　　１００ｍＭ　ＨＭＰＢ
　　１００ｍＭグルタミン酸
　　１００ｍＭアスパラギン酸
　　５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０
　【００２３】
溶液２：
　　ＨＭＰＢ：グルタミン酸＝１：４
　　１００ｍＭ　ＨＭＰＢ
　　４００ｍＭ　グルタミン酸
　　５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０
　【００２４】
　菌体懸濁液を反応混合物と共に３７℃でインキュベートした。反応混合物中のＬ−ホスフィノトリシン含量を合成過程の様々な時点でアミノ酸分析機を用いて測定した。表１は反応過程におけるＬ−ホスフィノトリシンへの転化率（％）を両方の生物学的転換混合物について示したものである。（溶液２の場合）Ｌ−ＰＰＴ収率は４倍過剰のアミノ供与体グルタミン酸を用いても８５％を超えなかったのに、（溶液１の場合）アミノ供与体グルタミン酸およびアスパラギン酸の等モル使用によりほぼ１００％の転化率を達成できた。
　【００２５】
　【表１】
　【００２６】
　実施例２
ブタからのグルタメート／オキザルアセテートトランスアミナーゼの精製
　【００２７】
　実施例３
大腸菌からの精製Ｌ−ホスフィノトリシン特異的トランスアミナーゼおよびブタからのＧＯＴを様々なグルタミン酸濃度で用いたＬ−ホスフィノトリシン合成
　大腸菌Ｋ−１２からのＬ−ホスフィノトリシン特異的トランスアミナーゼ（ＰＳＴ）（ＥＰ−Ａ　０　３３４　６８３参照）およびブタ心臓からのＧＯＴ（実施例２参照）をホスフェート緩衝液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０、０．１ｍＭピリドキサールホスフェート、１ｍＭ　２−ケトグルタレート、５ｍＭ　β−メルカプトエタノール）に１ｍｇ／ｍｌ濃度となるよう溶解した。次に各場合について、それら二酵素の１単位（＝ＰＳＴの場合は１μｍｏｌ　Ｌ−ホスフィノトリシン／分、およびＧＯＴの場合は１μｍｏｌグルタメート／分）の活性に相当する容量を混合しそして以下の反応溶液と共に３７℃で１時間インキュベートした。
　【００２８】
　すべての反応混合物は
　　１００ｍＭ　ＨＭＰＢ
　　１００ｍＭアスパラギン酸
　　５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ／８．０
および付加的にグルタミン酸を以下の濃度で含有した。
　　実験１：１００ｍＭ
　　実験２：５０ｍＭ
　　実験３：２０ｍＭ
　　実験４：１０ｍＭ
　　実験５：５ｍＭ
　　実験６：−
　【００２９】
　反応時間後の各種混合物中のＬ−ホスフィノトリシン含有量をアミノ酸分析機（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ　ＬＣ　５００１）で測定した。それより転化率（％）として算出されたＬ−ホスフィノトリシン合成速度を表２にまとめる。これらの実験は、グルタミン酸濃度をＨＭＰＢまたはアスパルテート使用濃度の０．２倍まで低下させることができしかもＬ−ホスフィノトリシン合成速度に対する悪影響は無視できることを示している。
　【００３０】
　【表２】
　【００３１】
　実施例４
精製ＰＳＴ（大腸菌）およびＧＯＴ（ブタ）を各種酵素比で用いたＬ−ホスフィノトリシン合成
　それら二つの精製トランスアミナーゼを実施例３に記載の如く、１００ｍＭ　ＨＭＰＢ、２０ｍＭグルタミン酸、１００ｍＭアスパラギン酸および５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、より成る反応溶液と共に３７℃でインキュベートした。それら二酵素の様々な活性比をこのために用いた：
　　１．ＰＳＴ　１単位／ＧＯＴ　１０単位
　　２．ＰＳＴ　１単位／ＧＯＴ　１単位
　　３．ＰＳＴ　１単位／ＧＯＴ　０単位
　【００３２】
　合成反応過程の様々な時点で検体をアミノ酸分析機で測定しながら混合物中のＬ−ホスフィノトリシン含量を測定した。それより算出されたＬ−ホスフィノトリシン合成を表３に示す。酵素比ＰＳＴ：ＧＯＴ＝１：１（混合物２）の場合に最高転化率が得られた。ＧＯＴを添加しない場合（混合物３）に達成し得る最大ＰＰＴ転化率はわずか約２０％に過ぎなかったが、これは、この場合、Ｌ−ホスフィノトリシン合成にグルタミン酸しか用い得ず、アスパラギン酸は使用できないからである。
　【００３３】
　【表３】
　【００３４】
　実施例５
Ｌ−ホスフィノトリシン合成に対する塩化マンガンの効果
　精製トランスアミナーゼを実施例３に記載の如く１：１比（各１単位）で混合し、そして１ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下と、あるいはＭｎＣｌ２を用いずに、反応溶液（１００ｍＭ　ＨＭＰＢ、２０ｍＭグルタミン酸、１００ｍＭアスパラギン酸、５０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）と共に３７℃でインキュベートした。Ｌ−ホスフィノトリシン合成の進行を実施例４に記載の如く測定し、それを表４にまとめる。塩化マンガンの添加により反応速度を顕著に増大させることができた。２４時間の反応時間後のＬ−ホスフィノトリシン転化率は塩化マンガンを用いない比較混合物よりも約１０％高かった。
　【００３５】
　【表４】
　【００３６】
　実施例６
シリカゲルへの“ＰＳＴ”トランスアミナーゼの固定
　５０ｍｌの活性化シリカゲル（文献、すなわちＫ．Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＸＬＩＶ；Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７６，１３９および１４０ページに記載の如くシラン化およびグルタールアルデヒド活性化したもの）を５０ｍｌのＰＳＴ溶液（大腸菌からの精製ＰＳＴ、０．２５Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）中のタンパク質１０ｍｇ／ｍｌ溶液）に添加し、そしてゆるやかに撹拌しながら３時間反応させる。次にまだ湿っている触媒を濾去しそして１００ｍｌの０．２５Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ８）で洗浄した。このようにして調製された生物学的触媒（ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ）は後述の反応に用いることができる。
　【００３７】
　実施例７
シリカゲルへの“ＧＯＴ”トランスアミナーゼの固定
　１０ｍｌのＧＯＴ溶液（ブタからの精製ＧＯＴ、タンパク質８．４ｍｇ／溶液１０ｍｌ）を実施例６に記載の如き１０ｍｌのシリカゲルに固定する。この生物学的触媒はこの形で共役アミノ基転移反応に用いることができる。
　【００３８】
　実施例８
固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基転移反応
　１８０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＨＭＰＢ、１３３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＬ−アスパラギン酸、２９．４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）のＬ−グルタミン酸、１０ｍｇのピリドキサールホスフェートおよび０．６ｇのＴＲＩＳを蒸留水で５ｇの溶液としそしてｐＨ８に調整する。これに０．５ｍｌの固定化ＰＳＴ（実施例６）および０．５ｍｌの固定化ＧＯＴ（実施例７）を添加し、そして注意深く撹拌しながら２６℃、ｐＨ８で４８時間反応させる。反応混合物のアミノ酸含量をＨＰＬＣ（アミノ酸分析機）により調べる。
　【００３９】
　　収量（ＨＰＬＣ）：０．１２２ｇのＬ−ＰＰＴ（ＨＭＰＢに対し６８％）
　　　　　　　　　　　０．０１２ｇのＬ−アスパラギン酸
　　　　　　　　　　　０．０２８ｇのＬ−グルタミン酸
　　　　　　　　　　　０．０２５ｇのＬ−アラニン
　【００４０】
　実施例９
固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基転移反応
　１ｇ（５．６ｍｍｏｌ）のＨＭＰＢ、７１５ｍｇ（５．６ｍｍｏｌ）のＬ−アスパラギン酸、１６３ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）のＬ−グルタミン酸および１０ｍｇのピリドキサールホスフェートを蒸留水で２０ｇの溶液としそしてＫＨＣＯ３でｐＨ８に調整する。１ｍｌの固定化ＰＳＴ（実施例６）および１ｍｌのＧＯＴ（実施例７）を添加後、ゆるやかに撹拌しながら３６℃で７２時間反応させる。生成物溶液のアミノ酸含量をＨＰＬＣ（ＡＡＡ）により調べる。
　【００４１】
　　収量（ＨＰＬＣ）：０．５８ｇのＬ−ＰＰＴ（ＨＭＰＢに対し５８％）
　　　　　　　　　　　０．３０ｇのＬ−アスパラギン酸
　　　　　　　　　　　０．１６ｇのＬ−グルタミン酸
　　　　　　　　　　　０．０２ｇのＬ−アラニン
　【００４２】
　実施例１０
固定化ＰＳＴおよび遊離ＧＯＴを用いた共役アミノ基転移反応
　１８０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＨＭＰＢ、１４７ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＬ−グルタミン酸、１３３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＬ−アスパラギン酸、１０ｍｇのピリドキサールホスフェートおよび０．７ｇのＴＲＩＳを蒸留水で５０ｇの溶液（ｐＨ８）とし、そして実施例６からの溶液からの０．５ｍｌの固定化ＰＳＴおよび実施例７で調製されたＧＯＴ溶液からの４２μｌの遊離ＧＯＴを添加する。注意深く撹拌しながら３６℃で反応を行う。４８時間後の溶液中のアミノ酸含量をＨＰＬＣ（ＡＡＡ）により調べる。
　【００４３】
　　収量（ＨＰＬＣ）：０．１４５ｇのＬ−ＰＰＴ（ＨＭＰＢに対し８０％）
　　　　　　　　　　　０．０２４ｇのＬ−アスパラギン酸
　　　　　　　　　　　０．１４７ｇのＬ−グルタミン酸
　　　　　　　　　　　０．００３ｇのＬ−アラニン
　【００４４】
　実施例１１
固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基転移反応
　実施例１０と同様にして反応を行う。遊離ＧＯＴに代えて０．５ｍｌの固定化ＧＯＴ（実施例６）を用いる。生成物溶液中のアミノ酸組成は実施例１０のそれに相当する。
　【００４５】
　Ｌ−ＰＰＴ含量は薄層クロマトグラフィーにより測定した。それは約８０％である。