【事件の表示】
　特許第２５９８５９６号「Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびＣ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン」の請求項１ないし９に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５９８５９６号の請求項１ないし７に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第２５９８５９６号の請求項１−９に係る発明は、平成３年１２月２０日（１９９０年１２月２１日優先権主張、ドイツ）に国際出願され、平成９年１月９日にその特許権の設定登録がされ、その後浅沼幸江より特許異議の申立てがなされ、これを受けて取消理由通知がなされたところ、特許異議意見書が提出され、特許権者に審尋がなされ、回答書が提出され、再度取消理由通知がなされ、その指定期間内に訂正請求がされたものである。
　
２．訂正の適否
　特許権者は、請求項１及び８を削除して、同２−７及び９を同１−７と訂正し、さらに、前記訂正にあわせて、請求項３、４、６、７、９項において引用する請求項の番号を訂正することを求めている。
　請求項を削除する訂正は、特許請求の範囲の減縮を目的とする明細書の訂正に該当し、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内のものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　又、請求項の削除に伴う請求項の番号の訂正は、明瞭でない記載の釈明を目的とする明細書の訂正に該当し、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内のものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　そして、後述のように（下記３、４参照）、本件訂正後の発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　以上のとおりであるから、上記訂正は、平成１１年改正前の特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書き、第２項、及び、第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについて
（１）本件発明
　特許第２５９８５９６号の請求項１ないし７に係る発明は、平成１２年７月２７日付け訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし７に記載された以下のとおりのものである。
　
　「【請求項１】下記のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
　
Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｅｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　
　
　【請求項２】請求項１記載のポリペプチドを含有することを特徴とする試料中のＣ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体を検出するためのテストキツト。
　
　【請求項３】ポリペプチドが、固相に結合されていることを特徴とする請求項２記載のテストキット。
　
　【請求項４】更に、ポリペプチドと検出すべき抗体とから形成された複合物に関する指示成分を有することを特徴とする請求項２又は３記載のテストキット。
　
　【請求項５】請求項１記載の少なくとも１種のポリペプチドが塗布され、更に抗原−抗体反応の強度判定用に少なくとも１種の対照蛋白質を含有するテストストリップであることを特徴とする請求項３〜４のいずれか１項に記載のテストキツト。
　
　【請求項６】ＥＬＩＳＡテストキツトであることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のテストキット。
　
　【請求項７】請求項１記載のポリペプチドを使用することを特徴とする試料中のＣ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体の検出法。
　
（２）特許異議申立ての概要
　特許異議申立人は、下記甲第１−３号証及び参考資料１−３を提出して、（イ）訂正前の本件請求項１ないし９に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、
（ロ）同請求項１及び２に係る発明は、甲第３号証で示す出願に係る発明（請求項１）と同一であり、さらに、同請求項８に係る発明は、甲第２号証で示す出願に係る発明（請求項１）と同一であるから、特許法第３９条第１項の規定により特許を受けることができないものであり、
当該発明の特許は取り消されるべきものである旨主張している。
　なお、特許異議申立書第１頁の表の上には異議申立てに係る条文として「特許法第２９条第１項第３」との記載があり、又同第２頁の表の上には「特許法第２９条第２項第３号」との記載があるが、当該表の「理由」の項の記載内容、及び、同５頁の「（３）申立ての根拠の項の条文の記載（２９条２項）からすると、特許異議申立人の主張は、上記のとおりのものと認める。
　
　　　　　　　　　　　　　　　　記
　甲第１号証：欧州特許出願公開第３８８２３２号明細書（１９９０年９月　　　　　　　１９日公開）
　甲第２号証：特願平２−５０５０９４号（平成９年３月２７日付け意見書　　　　　　　に係る手続補正書及び特表平５０４７１５号公報第１頁）
　甲第３号証：特願平６−１２９８８号（平成８年９月４日付けの手続補正　　　　　　　書及び特開平７−１０１９８６号公報第１頁）
　参考資料１：甲第１号証図１７−１のアミノ酸配列と本件請求項１のアミ　　　　　　　ノ酸配列を対比する図である。
　参考資料２：甲第１号証図１７−１のアミノ酸配列と本件請求項２のアミ　　　　　　　ノ酸配列を対比する図である。
　参考資料３：甲第１号証図１７−１のヌクレオチド配列と本件請求項８の　　　　　　　ヌクレオチド配列を対比する図である。
　
　なお、参考資料１及び３は、上記訂正によって削除された請求項に関するものである。
　
（３）対比、判断　
（ｉ）上記（イ）の主張について
　まず、甲第１号証を見てみると、甲第１号証には、「ＮＡＮＢＶ診断薬およびワクチン」という表題の下に、下記（ａ）〜（ｆ）の事項が記載されている。
（ａ）「本発明は、部分的に、欧州特許出願公開第３１８２１６号公報またはPCT公開公報第 WO０８９／０４６６９号に開示されていない新しいＨＣＶ配列およびポリペプチドに基づき、これらの新しい配列およびポリペプチドの応用、特に免疫学的診断法、プローブ診断法、抗ＨＣＶ抗体の生産、ＰＣＲ法、および組換えＤＮＡ法を含む。さらに、本発明には、ＨＣＶｃＤＮＡを含むクローン中にコードされる新規な免疫原性ポリペプチド、免疫原性ＨＣＶポリペプチドを精製する新規な方法およびＨＣＶｃＤＮＡに由来するアンチセンスポリヌクレオチドもまた、含まれる。」（第１頁要約の欄）
（ｂ）「一般に、ＨＣＶ株または単離体はポリペプチドレベルで約４０％を越える相同性を、おそらくは約７０％を越える相同性を、さらに場合によっては約９０％を越える相同性を有すると考えられる。」（第９頁第１３〜１６行）
（ｃ）「イムノアッセイと診断用キット：ＨＣＶ抗体を含有する血清と免疫学的に反応するポリペプチド、・・・略・・・は、イムノアッセイにおいて、生物学的試料におけるＨＣＶ抗体の存在、・・・略・・・を検出するために有用である。」（第２１頁第７〜１３行）
（ｄ）「免疫診断に適し、適切に標識された試薬を有するキットは、適切な材料を適当な容器中に包装することによって得られる。この適切な材料には、ＨＣＶエピトープを有する本発明のポリペプチド、あるいはＨＣＶエピトープに対する抗体が含まれる。このキットは、アッセイを実施するのに必要な残りの試薬および材料と、さらにアッセイの指示書の適当なセットとを含む。」（第２１頁第４３〜４６行）
（ｅ）「多くのクローン（後述する）が、ＮＡＮＢＨ個体の血清と免疫学的に反応するＨＣＶエピトープを含むポリペプチドを発現した。これらのペプチドのうち、５つは、これらのポリペプチド中のＨＣＶエピトープに対する抗体が多くの異なる患者の血清において検出されたという点で、非常に免疫原性であった。これらのポリペプチドをコードするクローン、および推定ＨＣＶポリタンパク中のポリペプチドの位置（アミノ酸番号は、推定開始コドンから数える）は次の通りである：・・・クローンＣＡ２７９ａ，アミノ酸１−８４；およびクローンＣＡ２９０ａ，アミノ酸９−１７７。」（第３１頁第４６〜５２行）
（ｆ）「図１７に示されるＨＣＶｃＤＮＡのセンス鎖の配列は、欧州特許出願公開第３１８２１６号に記載された種々のクローンおよび前述のクローンにおける重複ＨＣＶｃＤＮＡから推定された。ＨＣＶゲノムが、ポリタンパクをコードする１つの長い連続したＯＲＦを主に含んでいることは、この配列から推測することができる。・・・略・・・ＨＣＶｃＤＮＡセンス鎖配列から推定された推定ＨＣＶポリタンパクのアミノ酸配列もまた、図１７に示されており、１番は推定開始メチオニンから始まる。・・・略・・・コードされたＨＣＶポリタンパクの可能なタンパク領域およびそのおよその境界は次のとおりである（括弧内に示されたポリペプチドは、フラビウイルスの領域内にコードされているポリペプチドである）：推定ドメインとおよその境界（アミノ酸番号）　”Ｃ“　（ヌクレオカプシドタンパク）　　１−１２０　”Ｅ”　（ビリオンエンベロープタンパク（Ｓ）および推定のマトリックス（Ｍ）タンパク）　１２０ー４００・・・略・・・示された境界は、推定ポリペプチド間の正確な境界を示すものではない。」（第３３頁第３１〜第３４頁第１８行）
　さらに、甲第１号証の図２０ー１には、推定ＨＣＶポリタンパク（１−５００）の親水性／疎水性プロファイルおよび抗原指数の記録の一部が示されている。
　
　 そこで、本件訂正後の請求項１に係る発明（以下、「本件発明」という。）と甲第１号証に記載されている発明を対比、検討する。
　先ず、本件発明の「下記のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド」における「有する」の意味するところについてみると、訂正明細書には、「しかしながら、インサートを３′端から短縮した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で極めて良好な発現が行われる。即ち、約１５ｋＤａｌの発現生成物は、アミノ酸１〜１２４のコア配列に相当する。この抗原は、同じく、通常の方法によって極めて効率的に精製できる。」（実施例１）及び「コア生成物はすべて非常に強く反応し、Ｃ末端の読取り枠をアミノ酸１２４までに短縮することにより発現収率を顕著に改善できる。」（実施例２）と記載されており、かかる記載を根拠として、特許権者は、当審における平成１０年１０月２７日付け異議意見書において「本件発明のアミノ酸１−１２５からなるポリペプチドが特に優れたエピトープであり、引例１に開示のエピトープ１−８４及び９−１７７をもってしては、エピトープ１−１２５が特に優れたエピトープであるということは予測可能なことではありません。」と主張していることを考えると、上記「有する」は、「からなる」の意味に解するのが妥当である。
　これに対して、甲第１号証には、ＨＣＶ　ｃＤＮＡ内にコードされる約３０００の推定アミノ酸配列が記載され、そこにはさらに、１−１２０のアミノ酸配列がヌクレオカプシドタンパクに対応すると推定できること、１−８４または９−１７７を有するポリペプチドは、これらのポリペプチド中のＨＣＶエピトープに対する抗体が多くの異なる患者の血清において検出されたという点で、非常に免疫原性であったと記載されているが、本件発明で特定するアミノ酸配列１−１２５からなるコアペプチドそのものは開示されておらず、またアミノ酸配列１−１２５からなるコアペプチドが、生理条件下で溶解性であり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶化された形で発現でき、かつその発現収率が極めて高く、Ｃ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体を検出するためのテストキットとして特に優れていることを示唆する記載は何もない。
　特許異議申立人は、「甲第１号証の図２０ー１の親水性／疎水性プロファイルからすると、本件発明に係るポリペプチドは、親水性が高く、生理条件下で溶解性であろうことを十分示唆しているし、アミノ酸配列１−８４及び９−１７７のポリペプチド中のＨＣＶエピトープに対する抗体が多くの異なる患者の血清において検出されたとの記載からすると、本件発明に係るポリペプチドが強い免疫原性を有することは予想できるし、更に、Ｃ末端をアミノ酸１２４まで短縮することにより発現効率を顕著に改善できる効果も十分予想できることである」旨主張している。
　しかしながら、アミノ酸配列１−８４あるいは９−１７７からなるポリペプチドが非常に免疫原性であるとの甲第１号証の記載から、特に優れたエピトープとしてアミノ酸配列１−１２５からなるポリペプチドを直ちに導き出すことはできないし、また、甲第１号証の図２０ー１の親水性／疎水性プロファイルに関し「しかしながら、これらのプロファイルは、必ずしもポリペプチドの免疫原性の強さの指標ではないことに注意すべきである。」（第３４頁第３３〜３４行）と記載されていることを参酌すると、甲第１号証の記載に基づいて、アミノ酸配列１−１２５からなるポリペプチドが、生理条件下で溶解性であり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶化された形で発現でき、かつその発現収率が極めて高く、Ｃ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体を検出するためのテストキットとして特に優れていることを当業者が予測することは困難である。したがって、異議申立人の上記主張は採用しない。
　そして、本件発明は、訂正明細書に記載されたとおりの効果を奏するものである。
　してみると、本件発明は、甲第２号証及び参考資料１ないし３を参酌するも、甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明できたものとはいえない。
　また、本件訂正後の請求項２−７に係る発明は、同請求項１のポリペプチドをその構成として含むものであるから、さらに詳細に検討するまでもなく、甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明できたものということはできない。
　
（ｉｉ）上記（ロ）の主張について
　甲第３号証で示される特願平６−１２９８８号は、特許第２６９３９０８号として登録されているところ、その請求項１に係る発明は、以下のとおりのものである。
「【請求項１】　以下の特性を有する、少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列を含むポリペプチド：（１）該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列は、少なくとも一つの部位を有し、該部位は、該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列からなる配列中においても該ポリペプチド中においてもＣ型肝炎ウイルスに対する抗体によって結合され得；そして（２）該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列から得られる：【化１】　　配列省略　」
　
　上記請求項１の記載から明らかなように、上記特許の請求項１に係る発明においては、アミノ酸配列１−１２５のペプチドが特定されているわけではなく、願書に添付した明細書の発明の詳細な説明の項にも具体的にアミノ酸配列１−１２５からなるポリペプチドが開示されているわけでもない。
　してみると、本件発明は、当該先願に係る発明と同一であるとすることはできない。
　
　なお、訂正前の請求項１及び８は、上記訂正請求により削除されたので、それぞれ、甲第３号証、甲第２号証で示された出願に係る発明との比較、検討を要しないこととなった。　
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては、本件訂正後の請求項１−７に係る特許を取り消すことはできない。
　又、他に本件訂正後の請求項１−７に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年２月１９日（２００３．２．１９）
【訂正の要旨】
　▲１▼　訂正事項ａ
　特許明細書の特許請求の範囲の請求項１を削除する。
　▲２▼　訂正事項ｂ
　特許明細書の特許請求の範囲の請求項８を削除する。
　▲３▼　訂正事項ｃ
　特許明細書の特許請求の範囲に区分した請求項が、「「請求項２」、「請求項３」、「請求項４」、「請求項５」、「請求項６」、「請求項７」および「請求項９」、とあるを、それぞれ「請求項１」、「請求項２」、「請求項３」、「請求項４」、「請求項５」、「請求項６」および「請求項７」と訂正する。
　▲４▼　訂正事項ｄ
　特許明細書の特許請求の範囲の請求項３、請求項６および請求項９に「請求項１または２」とあるを［請求項１」と訂正する。
　▲５▼　訂正事項ｅ
　特許明細書の特許請求の範囲の請求項４に［請求項３」とあるを［請求項２」と訂正する。
　▲６▼　訂正事項ｆ
　特許明細書の特許請求の範囲の請求項７に［請求項３〜６」とあるを［請求項２〜５」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびＣ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン
（５７）【特許請求の範囲】
　
【請求項１】
　
【請求項２】
請求項１
　
【請求項３】
請求項２
　
【請求項４】
請求項２又は３
　
【請求項５】
請求項１
請求項３〜４
　
【請求項６】
請求項２〜５
　
【請求項７】
請求項１
【発明の詳細な説明】
技術分野
　Ａ型肝炎およびＢ型肝炎以外に、ウイルスによって伝播される肝炎が存在することは、約１５年前から知られている。このものは、病原体が未知であるので、通常、非Ａ−非Ｂ型肝炎と呼ばれた。そのうちに、上記非Ａ−非Ｂ型肝炎の群が、Ｃ型肝炎またはＥ型肝炎と呼ばれる少なくとも２種の異なるウイルスによって惹起されることが示された。
　Ｃ型肝炎ウイルスは、直径約５０−６０ｎｍの一本鎖の、被包ＲＮＡウイルスである。ゲノムは、約１０，０００個のヌクレオチドからなり、その場合、構造蛋白質（例えば、包皮および核）をコードする遺伝子領域を区別できる。この種の構造蛋白質は、Ｃまたはコア、ＥまたはエンベロープおよびＮＳで示すことができる。更に、このゲノムは、ウイルスの非構造構成成分例えば酵素等の遺伝子をも包含する。これまで、ゲノムが各種の蛋白質を包含することは知られているが、各個のウイルス蛋白質は、殆ど知られていない（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ　Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ　Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ（１９９０）、Ｖｏｌ．１２０、ｐ．１１７−１２４）。
背景技術
　Ｃｈｉｒｏｎ社の欧州特許出願８８．３１０９２２には、Ｃ型肝炎ウイルスの部分ヌクレオチド配列が開示されている。しかしながら、上記ヌクレオチド配列は、いわゆる非構造蛋白質をコードしているにすぎないと言うことが判った。構造蛋白質をコードするヌクレオチド配列部分は、上記出願には開示されていない。
　欧州特許出願Ｎｏ．８９．３０９２６１．９には、非Ａ−非Ｂ型肝炎ウイルス抗原の別のＤＮＡ配列が開示されている。
　Ｃｈｉｒｏｎ社の欧州特許出願９０．３０５４２１．１にはＨＣＶウイルスのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が開示されている。
　各種のＨＣＶウイルスペプチドの発現は、先行技術から公知で、これらはもちろん、常に、いわゆる融合ペプチドとして発現される。融合タンパク質としての発現の背景は、Ｃ型肝炎ウイルスは、真核蛋白質生合成に適合し、従って、一般に、この種のポリペプチドは、バイクテリア系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ系）において、いわゆる融合蛋白質としてのみ発現されうるといえる。従って、融合した部分は、別の蛋白質（例えば、β−ガラクトシダーゼまたは過酸化物ディスムターゼ）に由来する。しかしながら、この種の融合蛋白質には、上記ポリペプチドを検出反応に使用した場合、融合した蛋白質部分との交差反応が現れる可能性があり、従って、誤って陽性結果を生ずるという欠点がある。
発明の開示
　従って、本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスに由来し、融合成分を含まず、しかも、良い収率で発現されうるポリペプチドを提供することにある。
　本出願において、融合蛋白質とは、異種蛋白質（例えば、β−ガラクトシダーゼまたは過酸化物ディスムターゼ）の実質的部分を有するポリペプチドを意味する。
　ここに開示の方法にもとづき、構造蛋白質Ｃ（コア）およびＥＮＶ（エンベロープ）からポリペプチドをクローニングして配列決定することができた。上記ポリペプチドは、表面または表面の近傍の範囲のウイルス粒子に現れる構造蛋白質の部分であることが、重要である。それによって、上記ポリペプチドは、免疫系と接触して免疫応答を惹起する。この免疫応答は、一方では、感染の検出に重要であり、その場合、このウイルスに対する抗体が存在するか否かを検知し、他方では、ウイルス感染に対し防御するための免疫付与に重要である。
　第１、４および６図に、本発明の好ましいポリペプチドを示す。
　ここに開示のアミノ酸配列によれば、ここに記載のポリペプチドと同一または同等の免疫性を有する短いポリペプチドを大きな困難を伴うことなく調製できる。同様に、ここに開示のアミノ酸配列は、少数のアミノ酸を置換することにより、ポリペプチドの免疫性を保持したままわずかに変えることもできる。それゆえ本発明の範囲内においては、開示のアミノ酸配列の部分配列をなすか、または少数のアミノ酸置換ゆえに開示の配列と異なるポリペプチドが好ましい。しかしながら、置換されたアミノ酸配列は、全アミノ酸の２％を越えてはならない。
　更に、本発明の範囲内において、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムから異なる所定のポリペプチドを生成する３種のクローンが提供される。
　Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドを生成する各種クローンを調製するための出発材料は、ウイルスに感染した患者の血清であった。
　血清を公知の方法により前処理し、“ポリメラーゼ連鎖反応”（ＰＣＲ）によって個々のクローンを得た。
　この間にドイツ微生物収集機関（ＤＳＭ）に受託番号６８４７の下に寄託されたクローンＮＳ−３は、５２７アミノ酸のポリペプチドの遺伝情報を含有する。クローンＮＳ−３から生成されたポリペプチドのＮ末端には、クローニングによって生成しベクター（ｐＵＣ）に由来する若干のアミノ酸が存在する。しかしながら、これらの少数のナンセンス・アミノ酸は決して融合部分ではない。クローニングされたポリペプチドは、部分的に配列決定されており、Ｃ末端に下記の部分配列を有する。
　クローンＮＳ−４は、２４７個のアミノ酸のポリペプチドの遺伝情報を含み、ＤＳＭに受託番号６８４８の下に寄託されている。クローンＮＳ−４から調製できるＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドは、同じく、Ｎ末端に、ベクターｐＵＣに由来し、融合された異種蛋白質の意味での融合部分ではない若干のアミノ酸を含有する。
　クローンｐｌＣ１９Ｈ−Ｎ５１２は、ＤＳＭに受託番号６８４９の下に寄託されている。クローンｐｌＣ１９Ｈ−Ｎ５１２は、３９２アミノ酸を有するＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドの情報を含有する。この場合も、Ｎ末端には、ベクターｐＵＣに由来する少数のアミノ酸が存在する。このＨＣＶに特異的なペプチドは、Ｎ末端に、同じく提示のＤＮＡ配列によってコードされる下記のアミノ酸配列を有する。
　本出願の範囲内で開示されたポリペプチドは、良い収率（全蛋白質の約５％）で発現できること、およびポリペプチドが異種蛋白質と融合することなくこの発現ができるという利点を有する。
　更に、驚くべきことには、構造蛋白質（コア）に由来する本発明に係るポリペプチドは生理的条件下に溶解性であるということが判った。これに関連して、生理的条件下とは、たとえば、約０．５ＭのＮａＣｌを含有するリン酸塩緩衝液またはトリス・バッファーに可溶であることを意味する。
　抗抗体を固相に結合させ、被験血清を固相と反応させ、次いで、抗原を溶解形で添加するいわゆる“捕捉テスト”にこれらポリペプチドを使用する場合に、ポリペプチドの溶解度は、重要な役割を演じる。この場合、抗原は、通常、抗原に対する抗体の検出を可能にするマーカーを有する。
　本発明により調製せるポリペプチドは、特に、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出に適するテストキットに使用される。テストキットとは、必須成分として少なくとも１つの本発明に係るポリペプチドを有する器具を意味する。通常、ポリペプチドは、被験試料と接触される固相に結合される。被験試料では、通常、血清試料が主であるが、他の抗体含有生理的液体中で検出を行うこともできる。
　本発明に係るポリペプチドとこれに対する抗体とから形成された複合物が、指示成分によって検出される。その場合、好ましくは、被検抗体に対する抗体が重要である。この抗抗体は通常、検出を可能にするマーカーを有する。マーカーは、例えば、放射性マーカーまたは発色反応を触媒する酵素を有するマーカーがあげられうる。
　図面について説明すると、
　第１図は、ＨＣＶ−コアコーディング領域（Ｃ−１）のアミノ酸配列を示す。第２図は、ＨＣＶ−コアコーディング領域（Ｃ−１）の核酸配列を示す。第３図は、ＨＣＶ−コアコーディング領域の核酸配列とアミノ酸配列との関係を示す。第４図は、アミノ酸配列１−１２３を有し、約１５ｋＤの発現生成物に相当する短縮されたＨＣＶ−コアコーディング領域の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。第５図は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＥＮＶ（エンベロープ）コーディング領域の核酸配列を示し、図中小文字で示したヌクレオチドはベクターの配列に由来し、同時に翻訳される。第６図は、Ｃ型肝炎ウイルスのＥＮＶ（エンベロープ）ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。第７図は、Ｃ型肝炎ウイルスのＥＮＶ（エンベロープ）ポリペプチド領域の核酸配列とアミノ酸配列との関係を示し、図中小文字で示したヌクレオチド配列はベクターの配列に由来し、発現に際して同時に翻訳される。第８図は、実施例２に記載のゲルを示す。
　本発明を実施するための最良の態様
　本発明の範囲内においては、テストキットの２つの実施態様が特に好ましい。１つの実施態様は、ストリップ−ＥＬＩＳＡとも呼ばれ、テストストリップの形のテストキットである。このテストストリップは、抗原として作用する各種の蛋白質を有する。この場合、その配置は、ウェスタンプロットの配置と同様である。ストリップは、少なくとも１種の本発明に係るポリペプチドおよびそれに加え、抗原−抗体反応の強度判定に役立つ１種またはそれ以上の対照蛋白質を含有する。
　好ましい方法においては、ポリペプチドまたは蛋白質を電気泳動法で分離してテストストリップに移す。特に好ましい実施態様では、ポリペプチドまたは蛋白質をニトロセルロースフィルターに移し、次いで、これをストリップに截断する。
　テストの実施および評価は、公知のＥＬＩＳＡテストおよび公知のウェスタンプロットと同様に行う。
　まず、テストストリップ上に、相当する蛋白質またはポリペプチドを塗布し、固体表面に結合させる。次いで、希釈緩衝液中で上記テストストリップを試料と一緒にインキュベートする。十分なインキュベーション後、テストストリップを洗浄し、指示成分を添加する。この場合、通常、発色酵素を結合させた抗抗体が使用される。発色反応を触媒するこの種の酵素の例は、ペルオキシダーゼである。再び洗浄した後、基質、即ち、酵素によって反応し得る化合物を加え、インキュベートする。この場合、発色反応の有無にもとづき、抗体が存在するか否かを読みとり得る。
　本発明に係るテストキットの別の好ましい態様は、ＥＬＩＳＡテストキットである。このテストキットの場合、本発明に係る少なくとも一種のポリペプチドを微小滴定板の固相に結合させる。微小滴定板の各テスト区画を検出すべき抗体を含有する液体とインキュベートする。次いで、各洗浄工程後、指示成分を加え、再び洗浄する。基質添加後、発色反応にもとづき、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体が存在するか否かを判定できる。
　本発明に係るポリペプチドの別の使用分野は、ワクチンの調製である。この場合、まず本発明に係るポリペプチドまたはこのポリペプチドから誘導されるより短いポリペプチドを遺伝子工学的に高純度で調製できる。次に、ポリペプチドを、注射可能な液（溶液または懸濁液でありうる）の形とする。この場合、ポリペプチドは乳化させることもできるし、あるいは、ポリペプチドをリポソーム中に封入することもできる。ワクチンの別の構成成分は、例えば、水、塩溶液、グルコースまたはグリセリンである。更に、ワクチンは、少量の補助物質（例えば、乳化剤、ｐＨ値緩衝剤、免疫応答を高めるアジュパント）をも含有する。アジュパントとしては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミンおよび公知の同様の化合物を挙げることができる。ワクチンは、通常、注射、好ましくは、皮下注射または筋肉注射によって非経口投与する。本発明の範囲内において、有利なことには、請求のポリペプチドが高収率で発現されうるということが判った。この場合、ポリペプチドが融合蛋白質でないことが重要である。遺伝子工学的には容易に調製できない蛋白質は、通常融合蛋白質の形で発現される。この場合、所望の蛋白質またはポリペプチドは、良好に発現される、概ね細菌性の他の蛋白質に融合される。その結果、融合された蛋白質成分と所望のポリペプチドまたは蛋白質とを含有する、いわゆる、融合蛋白質が得られ、その際、双方の部分は、相互に融合されていわゆる融合蛋白質を生成する。
　しかしながら、特に、免疫学的検出法またはワクチンの調製には、融合蛋白質としての所望のポリペプチドの調製は望ましくない。なぜならば、免疫学的検出操作において、実際には、融合された蛋白質部分に対する抗体が存在するに過ぎない場合も、ウイルス抗原に対する抗体が存在すると誤認されるからである。
　ワクチンの枠内の免疫付与の場合も、抗体に対する、別の蛋白質を不純物として含む蛋白質またはポリペプチドを生成させることは、望ましくない。なぜならば、この場合、上記成分に対しても抗体が生成されるからである。さて、本発明範囲内において、本発明に係るポリペプチドを純粋な形で調製できた。本発明に係るポリペプチドは、クローニングまたは発現の枠内において本発明に係るポリペプチドの遺伝子が結合された別の遺伝子に起因する最大１５のアミノ酸を有する。しかしながら、本発明に係るポリペプチドは、クローニングに起因の人工物質から生ずる５つよりも少ないアミノ酸しか含まないことが特に好ましい。
実施例１
　ＨＣＶ−コアおよびＥＮＶ−１をコーディングする配列の調製
　公知の配列（欧州特許出願８８３１０９２２）から出発して、ｃ−ＤＮＡ合成時にウイルス・ゲノムの５′末端の方向のスタートとして用いられるＤＮＡプライマーと、ｃ−ＤＮＡプライマーの５′末端にありハイブリッド形成用プローブとして使用するプライマーを合成した。
　ｃ−ＤＮＡ合成用プライマーは、下記の配列を有した。
　　５′−ＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＡＴＡＣＣＧＧＡＣＣ
　ハイブリッド形成用の配列を以下に示す。
　　５′−ＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＴＡＴ
　慢性ＨＣＶ感染患者の血清５ｍｌを２０％スクロース・クッションに加え、１０，０００ｇで２時間遠心分離した。ペレットをｐＨ８．０の２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含有する緩衝液３００μｌ中に再懸濁させ、５５℃で１．５時間インキュベートした。次いで、フェノール／クロロホルムで処理した後、エタノールで核酸を沈殿させ、次いで、再び、水５０μｌにとった。
　上記溶液のＲＮＡを通常の方法により上述のプライマーを用いて逆転写し、ラムダｇｔｌｌファージ中に挿入した。ＨＣＶ−ＤＮＡ陽性クローンはハイブリッド形成性プライマーとのハイブリッド形成により見出された。これには、ジゴキシゲニン標識ＵＴＰおよび末端トランスフェラーゼを用いて上記プライマーを末端で標識した。次いで、結合されたプライマーの検出を市販のキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって実施した。
　ハイブリッド形成陽性のファージのＨＣＶインサートの大きさについて制限消化によって調べた。約１．７ｋＢのインサートを有するクローンをｐＵＣ８ベクター中にサブクローニングし、そして配列を決定した。その際、市販のｐＵＣ配列決定プライマーから出発して、まず、インサート末端の配列を決定し、次いで、あらたに決定された３′端の配列を有するプライマーを合成し、このプライマーを次の配列決定反応に利用した。このようにして決定された配列から、インサート始端から１６９個目のヌクレオチドで始まる連続する読取り枠が得られる。
　ＨＣＶの場合、ポリ蛋白質の始端には、コアのコード範囲またはカプシド蛋白質およびこれに続く２の膜蛋白質範囲のコード領域が存在する。
　コア蛋白質および直接続く膜蛋白質の領域を発現させるためＥ．ｃｏｌｉ中にサブクローニングした。これは、特異的なＤＮＡプライマーおよびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって行った。それにより、蛋白質をコーディングするＤＮＡ範囲が増幅される。
　次にクローニングされてコア蛋白質の発現をもたらすＤＮＡ領域の増幅に使用されたプライマー配列を以下に示す。
　　５′端には、５′−ｇａｇｇｇａｔｃｃａｔｃ　ＡＴＧ　ＡＧＣ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＣＣ
　　３′端には、５′−ｇａｇａａｇｃｔｔａ　ＧＧＡ　ＡＧＣ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＴＣＡ　ＡＧｃ
　次にクローニングされてＥＮＶ−１−蛋白質の発現をもたらすＤＮＡ領域の増幅に使用されたプライマー配列を以下に示す。
　　５′端についてｇａｇｇｇａｌｃｃ　ＧＣＴ　ＴＡＣ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＣＧＣ　ＡＡＣ
　　３′端についてｇａｇＧＧＡＴＣＣ　ＧＧＡ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＴＧＡ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣ
　小文字のヌクレオチドは、ＨＣＶに特異的ではなく、続くクローニングのための制限切断部位（ＧＧＡＴＣＣ−ＢａｍＨ　Ｉ、ＡＡＧＣＴＴ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、ＴＣＡＴＧＡ−ＢａｐＨ　ＩＩ）を得るためにプライマー中に使用した。
　ＰＣＲから得られ、増幅されたＤＮＡフラグメント（ＥＮＶ−１の４６３ヌクレオチド、コアの５７９ヌクレオチド）は、ＢａｍＨ　Ｉ（ＥＮＶ−１）またはＢａｍＨ　ＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩＩ（コア）で切断してＰＵＣ８に挿入された。
　ＥＮＶ−１のコーディング領域を含むプラスミドｐＵＣ８−ＥＮＶ−１を有するＥ．ｃｏｌｉは、ＩＰＴＧ誘導により、通常の方法（モレキュラー・シーブ、イオン交換クロマトグラフィ）により効率的に精製できる量の、約２５ｋＤａｌの大きさの蛋白質を発現する。コアコーディング領域を有するｐＵＣ８−Ｃｌの生成量はより少ない。即ち、インサートを別の発現ベクター（ｐＤＳ、ｐＫＫ２３３−２）に変換しても本質的改善は得られない。しかしながら、インサートを３′端から短縮した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で極めて良好な発現が行われる。即ち、約１５ｋＤａｌの発現生成物は、アミノ酸１〜１２４のコア配列に相当する。この抗原は、同じく、通常の方法によって極めて効率的に精製できる。
実施例２
　ＨＣＶ蛋白質“コア”および“ｅｎｖｌ”の発現および免疫反応に相当する発現プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、液体培地で増殖させ、光学濃度（６００ｎｍ）が０．７に達したら、２ｍＭ　ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）を用いて３時間誘導した。培養物１．５ｍｌからの細胞ペレットを次に２％ＳＤＳ、５％メルカプトエタノール、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２％ブロムフェノールブルーおよび３０％スクロースを含む液３００μｌ中に再懸濁させ、１００℃で５分間インキュベートした。蛋白質の分離は、１７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＤＡＤＴ−交差架橋）中で行った。ゲルを第８図に示す。
　同図の左半部に、クーマシー・ブルーで蛋白質を染色した後のゲルを示し、右半部に、免疫染色後のゲルを示した。これには、分離せる蛋白質を“ウェスタン・プロテッティング”によってニトロセルロース膜に移した。次に膜をＴＴＢＳ（１４６ＮａＣｌ、１００ｍｌ　１Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍｌ　Ｔｗｅｅｎ−２０）で１：１００に希釈したＨＣＶ陽性の血清と４時間インキュベートし、未結合の抗体をＴＴＢＳで５分間ずつ３回洗浄して除去した。結合された抗体はペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧウサギ抗体と１時間インキュベートし、ＴＴＢＳで洗浄し、そしてジアミノベンジジンおよびペルオキシドで染色することにより検出した。各トラックに現れる弱いスジは、使用したＨＶＣ血清の抗Ｅ．ｃｏｌｉ−抗体に起因する。
　両図面間に、分子量標準として、蛋白質の４５ｋＤａｌおよび３０ｋＤａｌの走行巾を示した。
　ゲルの各トラックには、下記のものが負荷された。
トラック１：ｐＵＣ８、対照。
トラック２：ｐＤＳ−ＥＮＶ−１、約２５ｋＤａｌの大きさのＨＣＶ−ＥＮＶ−１の発現。
トラック３：ｐＵＣ８−Ｃｌ。コアの発現、アミノ酸１〜１９０、大きさ約２６ｋＤａｌ、クローニング工程に起因して、更に２０のアミノ酸が融合された。
トラック４：ｐＤＳ−Ｃｌ。トラック３と同様であるが、少数の異種アミノ酸が融合されるので、生成物はより小さい。
トラック５：ｐＫＫ−Ｃｌ。トラック３、４と同様。ここでは生成物は、ＨＣＶ特異的アミノ酸のみからなる。配列を図面に示した。
トラック６：ｐＤＳ−ＣｌＣｌａ、アミノ酸１〜１２４の短縮されたコア生成物、Ｎ末端には、更に２つの異種アミノ酸が融合され、Ｃ末端には、更に１つの異種アミノ酸が融合された。
トラック７：ｐＫＫ−Ｃｌ−Ｃｌａ、トレース６と同様であるが、真正のＨＣＶ−Ｎ末端と、Ｃ末端の異種アミノ酸とを含む。配列は図面に示す。
　ＥＮＶ−１生成物は、比較的多量に発現されるが、慢性感染者の被験血清とは免疫プロットでは極めて弱くしか反応しない。コア生成物はすべて非常に強く反応し、Ｃ末端の読取り枠をアミノ酸１２４までに短縮することにより発現収率を顕著に改善できる。
実施例３
コアおよびＥＮＶ−１の反応性のテスト
　上記蛋白質と患者血清中の抗体との反応性を測定するため、双方の精製せる抗原を１７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で平行して分離してニトロセルロース上に移した。ここで、ＥＮＶ−１およびコアを含む双方のトラックが１つのストリップ上にあるよう、ニトロセルロース膜を細いストリップに切断した。次いで、ストリップの各種の患者血清とインキュベートし、特異的抗体を免疫染色によって検出した。
１．テスト
　トランスアミナーゼ値の高い２２人の患者血清、非構造蛋白質を用いるすべてのＨＣＶ−ＥＬＩＳＡは陰性：１つの血清がコアと反応。
２．テスト
　トランスアミナーゼ値の高い患者の９個の血清、非構造蛋白質を用いるＨＣＶ−ＥＬＩＳＡは限界値にある：２つの血清がコアと反応。
３．テスト
　自己免疫反応性を有する肝炎患者血清４種、非構造蛋白質を用いるすべてのＨＣＶ−ＥＬＩＳＡ陽性：３つの血清がコアと反応。
　実施例から明らかな如く、本発明に係るポリペプチドを用いるテストキットは、非構造蛋白質を使用したテストキットよりも感度が高く（テスト１、２）、かつまた特異的である（テスト３）。
実施例４
　第４図に示したポリペプチド（コア抗原）を、更に、Ｃ末端で短縮した。これは、コアをコーディングするプラスミド（実施例１）、実施例１からの５′−ＰＣＲ−コア−プライマーおよび下記配列を有する３′−プライマーからなるＰＣＲを用いて実施した。
　　ｃ　ｇｇａ　ａｇｃ　ｔｔａ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＧＴＣ　ＴＧＴ　ＧＧＧ
　このプライマーはコアをコードするプラスミド上で、コア−ペプチドのアミノ酸１１５に相当する核酸配列がえられるまでハイブリッド形成する。続く翻訳停止のコドンおよびｐＵＣ８／ｐＫＫ２３３−２中にクローニングするためのＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位は、実施例１と同様である。
　このポリペプチドは、第４図に示すアミノ酸配列を有するが、この配列は、もちろん、第４図とは異なり、第４図の最後から２番目の行の３つのアルギニン残基の後ろで終わる。
　このポリペプチドは、特に良好に発現および精製できる。
　上記ポリペプチドの精製は、まず、いわゆる封入体の生成を待ち、ついで、細胞を溶解させることによって実施できる。ペレットをＢＭ尿素にとり、ＤＥＡＥカラムに加える（ＢＭ尿素；ｐＨ８．８）。ＤＥＡＥカラムからの溶離は、塩の勾配によって行い、その際陽性フラクションは、Ｑ−スファロース・カラム（ｐＨ８．０）を通して導く。この場合、活性フラクションは、溶出液中にあり、さらにＳ−セファロース・カラム（ｐＨ７．７）に通す。ポリペプチドの溶離は、約０．４Ｍ　ＮａＣｌの塩濃度で行う。得られたポリペプチドは、０．５Ｍ　ＮａＣｌ含有トリス緩衝液で透析できる。
実施例５
　ＤＳＭ６８４９として寄託されたクローンｐｌＣｌ９Ｈ−Ｎ５１２は、下記の如く調製した。上述の如く、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者の血清を処理し、ＰＣＲ法によってウイルスＲＮＡを増幅させた。次いで、まず、約６１７ヌクレオチドのインサートを有する第１プレクローンを調製した。この場合、合成には下記プライマーが使用された。
　　５′−プライマー：
　　ＣＴＧＣＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ
　および
　　３′−プライマー：
　　ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＧＡＧ
　その際、制限酵素ＢａｍＨ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩを用いてクローニングした。このクローンの３′末端は、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−切断部位の前にＮｈｅｌ−切断部位を含有した（ＧＣＴ−ＡＧＣ）。
　同様な方法で、約６１５のヌクレオチドのインサートを含有するもう一つのプレクローンを合成した。ここでは、下記のプライマーを使用した。
　　５′−プライマー：
　　ＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＡＴＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＣＣ
　　３′−プライマー：
　　ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧ
　このクローン（ＢａｍＨ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩでクローニング）の５′末端は、第１プレクローンとオーバーラップしており、同じく、Ｎｈｅｌ切断部位を含有する。
　双方のプレクローンのインサートを、Ｎｈｅｌ−切断部位の使用により再クローニングすることによって組み立て、この際、上述のクローンｐｌＣｌ９Ｈ−Ｎ５１２が得られた。Ｃ型肝炎特異的ＤＮＡインサートを配列決定し、Ｎ末端に下記の部分配列（ＤＮＡおよびアミノ酸）が確認された。
実施例６
　５２７アミノ酸のウイルスポリペプチドをコーディングするクローンＮＳ−３は受託番号６８４７の下にＤＳＭに寄託された。このポリペプチドは、Ｎ末端に、更に、クローニングベクターｐＵＣから誘導されるが、いわゆるナンセンス・アミノ酸である若干のアミノ酸を有する。
　この場合も、実施例５と同様、２つのオーバーラップするプレクローンを調製し、次にクローニングせるインサートを相互に組合わせた。８１５ヌクレオチドのインサートを有する１つのプレクローンを調製するには下記プライマーが使用された。
　　５′−プライマー：
　　ＡＡＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＣＧＧＧ
　　３′−プライマー：
　　ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＡＧＴＴＡＧＧＡＴＣＧＡＴＣＣＣＡＴＧＡＧ
　ここでは制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩを用いてクローニングされた。第２プレクローンは、７９１ヌクレオチドのインサートを有する。このクローンは、下記プライマーを使用して調製した。
　　５′−プライマー
　　ＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＡＡＣ
　および
　　３′−プライマー：
　　ＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＧＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＧＣＴＣＡＴＡＣＣＡＡＧ
　この場合も、制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩを使用してクローニングを行った。第１プレクローンでは３′末端に、および第２プレクローンでは５′末端に存在する１個のＣｌａ　Ｉ切断部位ＣＡＴＣ　ＧＡＴを介して双方のクローンを統合した。このクローンについて、ウイルス特異的ポリペプチドのＣ末端から出発して部分配列を決定し、下記のＤＮＡおよびアミノ酸配列が確認された。
実施例７
　ＤＳＭ　Ｎｏ．６８４８として寄託されたクローンＮＳ−４は、ウイルス蛋白質に由来する２４７アミノ酸のポリペプチドをコーディングする。このポリペプチドも、Ｎ末端にベクターｐＵＣに由来し、いわゆるナンセンス・アミノ酸をコーディングする若干のアミノ酸を有する。このクローンは、前出の方法により調製した。その際、下記プライマーが使用された。
　　５′−プライマー：
　　ＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＣ
　　３′−プライマー：
　　ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＣＧＣＣＡＣＧＣＣＣＧＣ
　このＰＣＲフラグメントは、ｐＵＣ中でＢａｍＨ　Ｉ（５′末端）およびＨｉｎｄ　ＩＩＩ（３′末端）を用いてクローニングした。
【図面の簡単な説明】
　第１図　ＨＣＶ−コアコーディング領域（Ｃ−１）のアミノ酸配列
　第２図　ＨＣＶ−コアコーディング領域（Ｃ−１）の核酸配列
　第３図　ＨＣＶ−コアコーディング領域（Ｃ−１）の核酸配列およびアミノ酸配列
　第４図　短縮されたＨＣＶ−コアコーディング領域（Ｃ−１）の核酸配列およびアミノ酸配列
　第５図　ＨＣＶ−ＥＮＶ−１コーディング領域の核酸配列。小文字で示したヌクレオチドは、ベクター配列に由来し、同様に翻訳される。
　第６図　ＨＣＶ−ＥＮＶ−１ポリペプチドのアミノ酸配列
　第７図　ＨＣＶ−ＥＮＶ−１ポリペプチド領域の核酸配列およびアミノ酸配列。小文字で示したヌクレオチドは、ベクター配列に由来し、発現時、同時に翻訳される。
【図面】