【手続補正書】
【提出日】平成27年10月19日(2015.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在を検出する方法であって、前記試料は核酸を含み、
（ａ）少なくとも１つのプライマーおよびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記プライマーは少なくとも１１ヌクレオチド長であり、前記プローブは少なくとも１４ヌクレオチド長であり、
（ｉ）前記プライマーは、配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブは、配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む；または
（ｉｉ）前記プライマーは、配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブは、配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む、
前記ステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅を検出するステップと
を含む前記方法。
【請求項２】
配列番号６〜１１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３】
プライマー−プローブ複合体を含むポリヌクレオチドであって、前記プライマー−プローブ複合体が核酸プライマー部分および核酸プローブ部分を含み、前記プライマー部分は少なくとも１１ヌクレオチド長であり、前記プローブ部分は少なくとも１４ヌクレオチド長であり、前記プローブ部分の３’末端は前記プライマー部分の５’末端に直接または間接的に結合しており、
（ｉ）前記プライマー部分は配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブ部分は配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含むか；または
（ｉｉ）前記プライマー部分は配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブ部分は配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む、
前記ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出のためのキット。
【請求項５】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む試薬錠剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
好ましい対照配列には、例えば、ＳＶ４０ＤＮＡに対する対照プライマーおよびプローブが含まれる。
対照反応は増幅反応の確認に有用である。対照ＤＮＡの増幅は試験される試料と同一の反応管内で起こり、したがって試料が標的陰性である場合、すなわち、標的増幅産物が産生されない場合に良好な増幅反応の指標となる。増幅反応の有意な確認を達成するため、対照ＤＮＡ鋳型の好適な数のコピーをそれぞれの増幅反応に含めなければならない。
一部の例において、追加の陰性対照複製組成物を含めることが有用であり得る。陰性対照複製組成物は複製組成物と同一の試薬を含有するが、ポリメラーゼを含まない。このような対照の主な機能は、本方法が蛍光検出手段を用いる場合に均質形式での擬似バックグラウンド蛍光をモニタリングすることである。
複製組成物は、それらが標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡを増幅するために使用されるように設計されるかどうかに応じて改変することができる。標的ＤＮＡを増幅する複製組成物（試験複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に耐熱性）、（ｉｉ）標的ＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーペアおよび（ｉｉｉ）増幅反応の進行に必要な緩衝液を含み得る。対照ＤＮＡを増幅する複製組成物（陽性対照または陽性複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に耐熱性）；（ｉｉ）対照ＤＮＡ；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡにハイブリダイズし得る少なくとも１つのプライマー；および（ｉｖ）増幅反応の進行に必要な緩衝液を含み得る。さらに、標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡ増幅のいずれかのための複製組成物は、好ましくは検出可能な標識を有する核酸プローブを含有し得る。
以下に本発明の具体的実施態様をいくつか例示的に列挙する。
（１）試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在を検出する方法であって、前記試料は核酸を含み、
（ａ）少なくとも１つのプライマーおよびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記プライマーは少なくとも１１ヌクレオチド長であり、前記プローブは少なくとも１４ヌクレオチド長であり、
（ｉ）前記プライマーは、配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブは、配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む；または
（ｉｉ）前記プライマーは、配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブは、配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む、
前記ステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅を検出するステップと
を含む前記方法。
（２）反応混合物が、（ｉ）のプライマーおよびプローブならびに（ｉｉ）のプライマーおよびプローブの両方を含む、（１）に記載の方法。
（３）プライマーおよびプローブがそれぞれ、３’末端および５’末端を有し、前記プローブの３’末端が前記プライマーの５’末端に直接または間接的に結合しており、それによりプライマー−プローブ複合体を形成している、（１）に記載の方法。
（４）プライマー−プローブ複合体が検出可能な標識を含む、（３）に記載の方法。
（５）配列番号１に選択的にハイブリダイズし得るプライマーが配列番号４０〜５４からなる群から選択される核酸配列を含み、配列番号２に選択的にハイブリダイズし得るプローブが配列番号６〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む、（１）または（３）に記載の方法。
（６）配列番号３に選択的にハイブリダイズし得るプライマーが配列番号９５〜１１１からなる群から選択される核酸配列を含み、配列番号４に選択的にハイブリダイズし得るプローブが配列番号５５〜９４からなる群から選択される核酸配列を含む、（１）または（３）に記載の方法。
（７）プライマー−プローブ複合体が５’ステム配列および３’ステム配列をさらに含み、前記５’ステム配列の３’末端が前記プローブの５’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の５’末端が前記プローブの３’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の３’末端が前記プライマーの５’末端に直接または間接的に結合している、（３）に記載の方法。
（８）５’ステム配列が配列番号１１２〜１１９からなる群から選択される核酸配列を含み、３’ステム配列が配列番号１２０〜１３０からなる群から選択される核酸配列を含む、（７）に記載の方法。
（９）反応混合物がプローブにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む、（１）または（３）に記載の方法。
（１０）配列番号６〜１１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
（１１）プライマー−プローブ複合体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記プライマー−プローブ複合体が核酸プライマー部分および核酸プローブ部分を含み、前記プライマー部分は少なくとも１１ヌクレオチド長であり、前記プローブ部分は少なくとも１４ヌクレオチド長であり、前記プローブ部分の３’末端は前記プライマー部分の５’末端に直接または間接的に結合しており、
（ｉ）前記プライマー部分は配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブ部分は配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含むか；または
（ｉｉ）前記プライマー部分は配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブ部分は配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む、
前記ポリヌクレオチド。
（１２）プライマー部分が配列番号４０〜５４からなる群から選択される核酸配列を含み、プローブ部分が配列番号６〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む、（１１）に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１３）プライマー部分が配列番号９５〜１１１からなる群から選択される核酸配列を含み、プローブ部分が配列番号５５〜９４からなる群から選択される核酸配列を含む、（１１）に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１４）プライマー−プローブ複合体が５’ステム配列および３’ステム配列をさらに含み、前記５’ステム配列の３’末端が前記プローブ部分の５’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の５’末端が前記プローブ部分の３’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の３’末端が前記プライマー部分の５’末端に直接または間接的に結合している、（１１）に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１５）５’ステム配列が配列番号１１２〜１１９からなる群から選択される核酸配列を含み、３’ステム配列が配列番号１２０〜１３０からなる群から選択される核酸配列を含む、（１４）に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１６）（１１）に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出のためのキット。
（１７）（１１）に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む試薬錠剤。