【手続補正書】
【提出日】平成27年4月27日(2015.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のプロトセルを含むプロトセル組成物であって、前記プロトセルは、脂質二重層によって囲まれた多孔性のシリカコア又は多孔性の金属酸化物コアを含み、前記プロトセル組成物における前記複数のプロトセルは単分散である、プロトセル組成物。
【請求項２】
複数のプロトセルを含むプロトセル組成物であって、前記プロトセルは、
担持された脂質二重層を有するナノ多孔性のシリカコア又はナノ多孔性の金属酸化物コアと、
細胞を標的にする化学種と、
エンドソーム脱出を促進する融合ペプチドと、
二本鎖直鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、薬物、造影剤、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びタンパク質毒素からなる群から選択されるカーゴと、
を含む、プロトセル組成物。
【請求項３】
前記プロトセルが被包されたカーゴを含む、請求項１に記載のプロトセル組成物。
【請求項４】
複数のプロトセルを含むプロトセル組成物であって、前記プロトセルが、
脂質二重層によって囲まれた多孔性のシリカコア又は多孔性の金属酸化物コアと、
融合ペプチドと、
被包されたカーゴと、
を含む、プロトセル組成物。
【請求項５】
複数のプロトセルを含むプロトセル組成物であって、前記プロトセルが、
脂質二重層によって囲まれ、アミン含有シランによって修飾された多孔性のシリカコアと、
被包されたカーゴと、
を含む、プロトセル組成物。
【請求項６】
複数のプロトセルを含むプロトセル組成物であって、前記プロトセルが、
脂質二重層によって囲まれた正電荷の多孔性シリカコア又は正電荷の多孔性金属酸化物コアと、
被包されたカーゴと、
を含む、プロトセル組成物。
【請求項７】
前記プロトセル組成物が細胞を標的にする化学種を含む、請求項１、３から６のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項８】
前記プロトセル組成物が融合ペプチドを含む、請求項１、３、５から７のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項９】
前記被包されたカーゴが、二本鎖直鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、薬物、造影剤、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はタンパク質毒素を含む、請求項３から８のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１０】
前記プロトセルの前記シリカコアが、直径１０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲である、請求項１から９のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１１】
前記プロトセルの前記シリカコアが１５０ｎｍの平均直径を有する、請求項１から１０のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１２】
前記プロトセルが単分散である、請求項２から１１のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１３】
前記プロトセルが多分散である、請求項２から７のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１４】
前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１ＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される脂質で構成される、請求項１から１３のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１５】
前記脂質二重層が、ＤＯＰＣ及びＤＯＰＥを含む、請求項１から１４のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１６】
前記脂質二重層が、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＧ、又はＤＯＰＣを含む、請求項１から１５のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１７】
前記脂質二重層がＤＯＰＧ及びＤＯＰＣを含む、請求項１から１６のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１８】
前記脂質二重層がコレステロールを含む、請求項１から１７のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項１９】
前記脂質二重層が、脂質にコンジュゲートされたＰＥＧを含む、請求項１から１８のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２０】
前記細胞を標的にする化学種がターゲティングペプチドである、請求項２、７から１９のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２１】
前記細胞を標的にする化学種がＳＰ９４ペプチドである、請求項２、７から２０のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２２】
前記細胞を標的にする化学種が配列番号６、配列番号７、又は配列番号８である、請求項２、７から２１のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２３】
前記細胞を標的にする化学種がＭＥＴ結合ペプチドである、請求項２、７から２２のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２４】
前記ＭＥＴ結合ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５である、請求項２３に記載のプロトセル組成物。
【請求項２５】
前記融合ペプチドが、Ｈ５ＷＹＧペプチド（配列番号１３）又はポリアルギニンの８ｍｅｒ（配列番号１４）である、請求項２、４、８から２４のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２６】
前記カーゴはプラスミドＤＮＡを含み、該プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために任意で修飾される、請求項２から２５のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２７】
前記カーゴはプラスミドＤＮＡを含み、該プラスミドＤＮＡが、超らせんプラスミドＤＮＡ又はパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項２から２６のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２８】
前記カーゴはプラスミドＤＮＡを含み、該プラスミドＤＮＡが、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡであり、該ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡは、ヒトのヒストンタンパク質の混合物を含む、請求項２から２７のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項２９】
前記カーゴはプラスミドＤＮＡであり、該プラスミドＤＮＡが、タンパク質毒素、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現可能である、請求項２から２８のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項３０】
前記タンパク質毒素が、リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖からなる群から選択される、請求項２９に記載のプロトセル組成物。
【請求項３１】
前記カーゴが細胞のアポトーシスを誘導する、請求項２から３０のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項３２】
前記カーゴは、レポータータンパク質を発現可能なＤＮＡを含む、請求項２から３１のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項３３】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質である、請求項３２に記載のプロトセル組成物。
【請求項３４】
前記カーゴは核局在配列にコンジュゲートされる、請求項２から３３のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項３５】
前記核局在配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２のペプチドである、請求項２５又は３４に記載のプロトセル組成物。
【請求項３６】
前記カーゴが抗癌剤を含む、請求項２から３５のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項３７】
前記カーゴが抗ウィルス剤を含む、請求項２から３６のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項３８】
前記抗ウィルス剤が、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、又は抗ＨＣＶ剤である、請求項３７に記載のプロトセル組成物。
【請求項３９】
複数のプロトセルを含むプロトセル組成物であって、前記プロトセルが、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性シリカコアと、ＭＥＴ結合ペプチドとを含む、プロトセル組成物。
【請求項４０】
前記プロトセルは、６００ｍ2／ｇ以上の表面積を有する、請求項１から３９のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項４１】
前記プロトセルは、単峰分布の細孔形態を有する、請求項１から４０のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項４２】
前記プロトセルは、多峰分布の細孔形態を有する、請求項１から４０のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項４３】
請求項１から４２のいずれかに記載のプロトセル組成物の有効量と、医薬的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項４４】
前記プロトセル内にカーゴとして配置されない薬物を更に含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記薬物が、抗癌剤又は抗ウィルス剤である、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記抗ウィルス剤が、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、抗ＨＣＶ剤、又はそれらの混合物である、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
非経口剤形である請求項４３から４６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記剤形が、皮内、筋肉内、骨内、腹腔内、静脈内、皮下、又は髄腔内投与の剤形である、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
局所剤形又は経皮剤形である、請求項４３から４６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＭＥＴ結合ペプチド。
【請求項５１】
複数のプロトセルを含むプロトセル組成物であって、前記プロトセルは、抗癌剤、及び抗ＨＢＶ剤、抗ＨＣＶ剤又はそれらの混合物と組み合わせて、肝細胞癌の細胞に対して前記プロトセルが選択的に結合するようにターゲティングペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項５２】
疾患の治療において使用するための、請求項４３から４９、５１のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項５３】
癌の治療において使用するための、請求項４３から４９、５１のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項５４】
癌の診断において使用するための、請求項１から４２のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【請求項５５】
癌治療観察において使用するための、請求項１から４２のいずれかに記載のプロトセル組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図１】エアロゾルによって支援されるＥＩＳＡプロセスによって調製される本発明で用いられる一実施形態のナノ粒子が、粒子のサイズ及び分布を制御するために変えられ得ることを示す図である。
【図２】一実施形態において、多くの種類のカーゴに合わせて設計されることができる細孔のサイズ及び骨格と、エアロゾル化した補助成分が容易に取り込まれることとを示す。
【図２Ａ】図２のａ、ｂ、ｃ、及びｅが、ＣＴＡＢ、Ｂ５８、Ｐ１２３、及びＰＳ＋Ｂ５６による鋳型であることを示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、ＣＴＡＰ＋ＮａＣｌ、３ｗｔ％のＰ１２３、３ｗｔ％のＰ１２３＋ポリ（プロピレングリコールアクリレート）、ミクロエマルション、及びＣＴＡＢ（ＮＨ4）2ＳＯ4による鋳型である。
【図３】一実施形態における、同時自己集合又は自己集合後の誘導体化によって細孔表面の化学的性質（即ち電荷及び疎水性）並びに細孔サイズが、有機シランと珪酸との共縮合によって主に制御されることを示す。Linら、Chem. Mater. 15, 4247-56 2003；Liu, J.ら、J. Phys. Chem.,104, 8323-2339, 2000；Fan, H.ら、Nature, 405, 56-60, 2000；Lu, Y.ら、J. Am. Chem. Soc., 122, 5258-5261, 2000参照。
【図４】ヒストンタンパク質によるＣＢ１プラスミドのパッケージングを示す。（Ａ）は、ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）を超らせん化し、超らせんｐＣＢ１をヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４でパッケージングし、得られたｐＣＢ１−ヒストン複合体を、核膜孔を通る移行を促進する核局在配列（ＮＬＳ）で修飾するために用いられるプロセスを示す概念図である。（Ｂ）及び（Ｄ）は、ＣＢ１プラスミド（Ｂ）及びヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（Ｄ）の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像である。スケールバー＝１００ｎｍ。（Ｃ）及び（Ｅ）は、それぞれ（Ｂ）及び（Ｄ）での赤線に対応する高さプロファイルを示す。
【図５】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１が装填された、ＭＣ４０によって標的を定められたメソ多孔性のシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の合成を示す。（Ａ）は、ＤＮＡを装填し、ペプチドで標的を定められたプロトセルを生成するために用いられるプロセスを示す概念図である。プロトセルのコアを形成するメソ多孔性のシリカナノ粒子をｐＣＢ１−ヒストン複合体の溶液中に単純に浸漬することによって、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をシリカナノ粒子に装填する。次にＰＥＧ化リポソームをＤＮＡが装填されたコアと融合し、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＭＣ４０）と、内在化したプロトセルのエンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）とで更に修飾された、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を形成する。スルフヒドリル−アミン架橋剤（スペーサーアーム＝９．５ｎｍ）を用いて、Ｃ末端システイン残基で修飾したペプチドをＳＬＢ中のＤＯＰＥ成分にコンジュゲートした。（Ｂ）は、プロトセルのコアとして用いられるメソ多孔性のシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝２００ｎｍ。挿入画像＝走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であって、１５〜２５ｎｍの細孔が表面から利用可能であることを示す。挿入画像のスケールバー＝５０ｎｍ。（Ｃ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定されたメソ多孔性のシリカナノ粒子のサイズ分布を示す。（Ｄ、左軸）バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）モデルを用いて図１４に示す窒素収着等温線の吸着枝から計算された、メソ多孔性のシリカナノ粒子の累積細孔容積である。（Ｄ、右軸）ＤＬＳにより測定された、ｐＣＢ１−ヒストン複合体のサイズ分布である。
【図６】一実施形態における、メソ多孔性のシリカナノ粒子がヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１について高い収容能力を有し、得られたプロトセルが、エンドソーム環境を模倣する状況下でのみ被包されたＤＮＡを放出することを示す。（Ａ）は、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝−３８．５ｍＶ）又はアミン含有シランのＡＰＴＥＳで修飾されたメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝＋１１．５ｍＶ）中に被包可能な、ｐＣＢ１又はヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「複合体」）の濃度を示す。（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（１×１０9個）と共に１×１０6細胞／ｍＬを３７℃で２４時間培養した場合に、ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＣＢ１によりコードされる緑色蛍光タンパク質）に対して陽性となるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。ｘ軸は、プロトセルのコアがＡＰＴＥＳで修飾されたか否か及びｐＣＢ１がヒストンで予めパッケージングされたか否かを示す。（Ａ）及び（Ｂ）では、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）でパッケージングされたｐＣＢ１を対照として含む。（Ｃ）及び（Ｄ）は、疑似体液（Ｃ）又はｐＨ５緩衝液（Ｄ）に暴露した際の、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子及び対応するプロトセルからの、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の時間に依存した放出を示す。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、（Ｂ）については、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図７】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をＨＣＣまで送達するプロセスを示す概念図である。［１］種々のＨＣＣ株により過剰発現されるＭｅｔへのターゲティングペプチドの動員によって、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に高親和性で結合する。流動性のＤＯＰＣのＳＬＢはペプチドの流動性を促進し、それにより低いＭＣ４０密度で修飾されたプロトセルがＨｅｐ３Ｂに対して高い特異親和性を保持することを可能にする（図８Ａ参照）。［２］ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、受容体依存性エンドサイトーシスを介してＨｅｐ３Ｂによって内在化される（図８Ｂ及び図１５Ａ参照）。［３］エンドソーム条件はＳＬＢを不安定化し（Nature Materialsの参考文献を挿入）、エンドソーム分解性ペプチドＨ５ＷＹＧのプロトン化を引き起こす。これらは何れも、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞質ゾル中に拡散することを可能にする（図１６Ｂ参照）。［４］ｐＣＢ１−ヒストン複合体は、核局在配列（ＮＬＳ）で修飾された場合に、約２４時間以内にＨｅｐ３Ｂ細胞の核内に濃縮される（図１６Ｃ参照）。これによって、分裂中及び非分裂中の癌細胞の両方での効率的なトランスフェクションが可能になる（図１７参照）。
【図８】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルがＨＣＣに高親和性で結合し、Ｈｅｐ３Ｂによって内在化されるが正常肝細胞によっては内在化されないことを示す。（Ａ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルをＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に暴露した場合の見かけの解離定数（Ｋd）を示す。Ｋd値は、特異親和性に対して逆の関係にあり、飽和結合曲線から求められた（図２１参照）。エラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル（１０００倍の過剰量）に３７℃で１時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。ＭｅｔはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体で染色され（緑色）、プロトセルコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（Ａ〜Ｃ）又は０．５００ｗｔ％（Ａ）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。
【図９】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルは、ピコモル濃度でＨＣＣのアポトーシスを誘導するが、正常肝細胞の生存性に関してはごく小さい影響しか有さないことを示す。ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃でＨｅｐ３Ｂを連続して暴露した際の、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びサイクリンＢ１タンパク質の発現における用量（Ａ）及び時間（Ｂ）に依存した減少を示す。（Ａ）では、細胞を種々のｐＣＢ１濃度に４８時間暴露し、（Ｂ）では、５ｐＭのｐＣＢ１に種々の時間に渡って暴露した。肝細胞でのサイクリンＢ１タンパク質の発現及びＨｅｐ３ＢでのＺｓＧｒｅｅｎの発現が、対照として含まれる。リアルタイムＰＣＲ及び免疫蛍光法を用いて、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びタンパク質それぞれの濃度を測定した。（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した後の、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂの割合を示す。Ｇ2／Ｍ期の肝細胞の割合及びＳ期のＨｅｐ３Ｂの割合を比較のために含む。細胞は、細胞周期分析の前にヘキスト３３３４２で染色された。（Ｄ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。アポトーシスのマーカーに陽性である肝細胞の割合を対照として含む。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶに陽性である細胞は、アポトーシスの初期にあると見なし、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムの両方に陽性である細胞は、アポトーシスの後期にあると見なした。アポトーシス性細胞の総数は、一方及び両方に陽性である細胞の数を加算して求められた。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１０】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルが、対応するリポプレックスよりも２５００倍有効にＨＣＣの選択的なアポトーシスを誘導することを示す。（Ａ）は、ＤＯＰＣプロトセル、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）で修飾されたＤＯＰＣプロトセル、ｐＣＢ１とＤＯＴＡＰ及びＤＯＰＥの混合物（１：１ｗ／ｗ）とからなるリポプレックス、並びに１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００で修飾されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスのζ電位の値を示す。全てのζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。（Ｂ、左軸）ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル又はリポプレックスによって送達された５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合である。（Ｂ、右軸）１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞の９０％において３７℃で４８時間以内にアポトーシスを誘導するのに必要な、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル又はリポプレックスの数である。（Ｂ）については、細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色された。一方及び両方に陽性である細胞をアポトーシス性と見なした。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１１】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、肝細胞の生存性には影響を与えることなく、高濃度のタキソール、Ｂｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１をＨＣＣに選択的に送達することを示す。（Ａ）は、１０12個のプロトセル、リポソーム、又はリポプレックスの中に被包可能な、タキソール、Ｂｃｌ−２の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、及びＣＢ１プラスミドの濃度を示す。赤色のバーは、タキソール及びｐＣＢ１の両方がプロトセルに装填された場合に、タキソール及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。青色のバーは、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１のすべてがプロトセルに装填された場合又はｓｉＲＮＡ及びｐＣＢ１がリポプレックスに装填された場合に、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによってＨｅｐ３Ｂまで送達された場合の、オレゴングリーン（登録商標）４８８標識タキソール（緑色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ｓｉＲＮＡ（赤色）、及びＣｙ５標識ｐＤＮＡ（白色）の細胞内分布を示す共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞をＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの１０００倍の過剰量と共に３７℃で２４時間培養した後に固定して、ヘキスト３３３４２で染色した（青色）。スケールバー＝１０μｍ。（Ｃ）は、１０ｎＭのタキソール及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞細胞の割合を示す。割合は、Ｇ2／Ｍでの対数増殖細胞の割合に対して正規化された。（Ｄ）は、１０ｎＭのタキソール、２５０ｐＭのＢｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について陽性になるＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞の細胞の割合を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）において、「ｐＣＢ１」は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）を用いてパッケージングされて細胞まで非特異的に送達されたｐＣＢ１を指す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポソームは、５ｗｔ％のＤＭＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１６：０）を含むＤＳＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポプレックスは、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）混合物からなり、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１２】ＣＢ１プラスミドのベクターマップを示す。ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）は、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（クロンテック・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）及びｐＮＥＢ１９３ベクター（ニュー・イングランド・バイオラボ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）から構築された。ｐＣＢ１は、サイクリンＢ１特異的短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びスナギンチャク種の緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）をコードする。構成的ｓｈＲＮＡ発現は、ＲＮＡＰｏｌＩＩＩ依存性ヒトＵ６プロモーター（ＰU6）によって駆動され、構成的ＺｓＧｒｅｅｎ発現は、サイトメガロウィルスの最初期プロモーター（ＰCMV IE）によって駆動される。ｏｒｉエレメント及びＡｍｐRエレメントは、大腸菌内におけるプラスミドの増殖を可能にする。サイクリンＢ１特異的ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列に下線を付す。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＩＲＥＮベクターに導入するために用いた制限酵素部位（ＢａｍＨＩは赤色、ＥｃｏＲＩは青色）が横にある。
【図１３】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の特徴を示す。（Ａ）は、漸増濃度のヒストン（モル比１：２：２：２：２のＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）に暴露されたｐＣＢ１に関する電気泳動移動度シフトアッセイを示す。ｐＣＢ１：ヒストンのモル比をレーン３〜６に示す。レーン１はＤＮＡラダーを含み、レーン２はｐＣＢ１を含み添加ヒストンを含まない。（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（ｐＣＢ１：ヒストンのモル比１：５０）のＴＥＭ画像である。スケールバー＝５０ｎｍ。
【図１４】未装填のメソ多孔性のシリカナノ粒子及びｐＣＢ１が装填されたメソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着分析を示す。（Ａ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着等温線である。（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子のブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積である。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１５】ＤＯＰＣプロトセルの小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）データを示す。フィッティングデータは、一定厚さの共形シェルを有する多分散な多孔性シリカ球のモデルを用いて得られたものであり、シリカ粒子の表面に細孔開口部を覆う３６Åの二重層が存在することを示す。厚さ０、２０、６０Åの二重層についてシミュレーションされたＳＡＮＳデータを比較のために含む。測定された二重層の厚さ３６Åは、平坦な担持された脂質二重層について行われた他の中性子研究（３３〜３８Å）と一致しており、これらの対照条件下では、脂質二重層の水素に富む炭化水素コアからの散乱を主に示す。
【図１６】プロトセルが、被包されたＤＮＡをヌクレアーゼ分解から守ることを示す。ＤＮａｓｅＩ処理したｐＣＢ１（レーン３）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン５）、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（レーン７）、カチオン性コアを有するプロトセルに装填されたｐＣＢ１（レーン９）、及びアニオン性コアを有するプロトセルに装填されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１１）のアガロースゲル電気泳動を示す。裸のｐＣＢ１（レーン２）、ヒストンから放出されたｐＣＢ１（レーン４）、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスから放出されたｐＣＢ１（レーン６）、カチオン性コアを有するプロトセルから放出されたｐＣＢ１（レーン８）、及びアニオン性コアを有するプロトセルから放出されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１０）を比較のために含む。レーン１はＤＮＡラダーを含む。試料をＤＮａｓｅ１（５０ｎｇのＤＮＡ当たり１ユニット）と共に室温で３０分培養し、ｐＣＢ１放出は１％ＳＤＳを用いて促進された。
【図１７】メソ多孔性のシリカナノ粒子（「未修飾のコア」）、２０％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳ中に室温で１２時間浸漬したメソ多孔性のシリカナノ粒子（「ＡＰＴＥＳ修飾コア」）、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「ｐＣＢ１−ヒストン複合体」）、及びＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（「ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックス」）のζ電位（ζ）の値を示す。ζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１８】図６及び２４においてＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性の細胞の割合を求めるのに用いられた、代表的な前方散乱−側方散乱（ＦＳＣ−ＳＳＣ）プロット図及びＦＬ−１ヒストグラムである。（Ａ）〜（Ｄ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ａ及びＣ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＢ及びＤ）であり、（Ａ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｃ）はしていない。ＦＬ−１チャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を、（Ｂ）及び（Ｄ）に示す。（Ｅ）〜（Ｈ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ｅ及びＧ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＦ及びＨ）であり、（Ｅ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｇ）はしていない。（Ｆ）及び（Ｈ）のゲートは、ＭＦＩ≦２８２、即ちＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞のＭＦＩの１００倍（Ｄ図参照）の細胞の割合に対応する。
【図１９】ＭＣ４０ターゲティングペプチドの識別を示す。図中に示す概念図は、ＭＣ４０ターゲティングペプチドを選択するのに用いられたプロセスを表す。１×１０11ｐｆｕ／ｍＬのペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された１００ｎＭの組み換えヒトＭｅｔ（ｒｈＭｅｔ）と共に室温で１時間培養した。プロテインＡ又はプロテインＧでコーティングした磁性粒子を用いてＭｅｔ−ファージ複合体を親和性捕捉し、続いてＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１０回洗浄して未結合のファージを除去した。結合したファージクローンは低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ２．２）で溶出し、溶出物を宿主細菌（大腸菌ＥＲ２７３８）の感染によって増幅した。
【図２０】ＭＣ４０ターゲティングペプチドの特徴を示す。（Ａ）は、５回目の選択ラウンド後のペプチド配列アラインメントである。主配列ＡＳＶＨＦＰＰは、以前に確認されていたＭｅｔ特異的な１２ｍｅｒのＹＬＦＳＶＨＷＰＰＬＫＡ（配列番号１８、Zhaoら、ClinCancerRes 2007; 13(20 6049-6055)）の下線部分に相似である。標的に無関係のＨＡＩＹＰＲＨペプチド（約１０％）（配列番号１９、Brammerら、Anal.Biochem. 377 (2008) 88-89）を提示するファージクローンは、配列アラインメントから除かれた。（Ｂ）及び（Ｃ）は、親和性選択したファージクローンがｒｈＭｅｔに結合した度合を、酵素結合免疫吸着剤法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。（Ｂ）に示すＥＬＩＳＡのスキームは、材料及び方法の項で説明する。ＥＬＩＳＡの結果を（Ｃ）に示す。（Ｄ）は、Ｍｅｔに結合しないペプチドを除去した後の配列アラインメントである。図１９に示す共通配列は、このアラインメントから決定された。（Ｅ）及び（Ｆ）は、（１）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、無関係なファージクローン（ＴＰＤＷＬＦＰ）（配列番号２０）と、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（青色のドット）、又は（２）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、ＭＣ４０クローンと、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（橙色のドット）、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｅ）及び肝細胞（Ｆ）についてのフローサイトメトリーの散布図である。未処理細胞（赤色のドット）を用いて、ＦＬ−１（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光）及びＦＬ−２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６蛍光）のチャンネルについての電圧パラメータを設定した。
【図２１】Ｈｅｐ３Ｂに暴露されたＭＣ４０で標的を定められたプロトセルについての例示の結合曲線である。図８Ａの解離定数を求めるために、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞をサイトカラシンＤで前処理してエンドサイトーシスを抑制し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められた種々の濃度のプロトセルと共に３７℃で１時間培養した。フローサイトメトリーを用いて得られた細胞群の平均蛍光強度を測定し、プロトセル濃度に対してプロットして全体の結合曲線を得た。非特異的結合は、飽和濃度の非分類の肝細胞増殖因子の存在下において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められたプロトセルと共に細胞を培養することによって求められた。特異的結合曲線は、非特異的結合曲線を全体の結合曲線から引くことによって得られた。Ｋd値は、特異的結合曲線から計算された。この図に示す実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（約６ペプチド／粒子）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。対応するＫd値は１０５０±１４２ｐＭである。全てのエラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図２２】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化され、Ｈ５ＷＹＧペプチドの非存在下でリソソームへ誘導されることを示す。（Ａ）は、Ｈｅｐ３Ｂ又は肝細胞の細胞のそれぞれによって１時間以内に３７℃で内在化された、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの平均数である。１×１０6個の細胞を飽和濃度（１００μｇ／ｍＬ）のヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の非存在下（−）又は存在下（＋）において種々の濃度のプロトセルと共に培養し、フローサイトメトリーを用いて各細胞に結合した粒子の平均数を求めた。プロトセルをＮＢＤ及びｐＨｒｏｄｏ（商標）で標識して、表面に結合した粒子を酸性細胞内区画に内在化されたものから区別した（それぞれについて）。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）は、プロトセルと、（１）Ｒａｂ５、（２）Ｒａｂ７、（３）リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）又は（４）Ｒａｂ１１ａとの間のピアソンの相関係数（ｒ値）を示す。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を１０００倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識プロトセルと共に３７℃で１時間培養した後、固定して透過処理し、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、ＬＡＭＰ−１、又はＲａｂ１１ａに対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体と共に培養した。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２３】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、ＨＣＣ細胞の核内で時間に依存して濃縮されることを示す。（Ａ）〜（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で１５分（Ａ）、１２時間（Ｂ）、又は２４時間（Ｃ）暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。（Ｂ）については、プロトセルのエンドソーム脱出及びｐＣＢ１の細胞質ゾル内分散は、約２時間後までには明白であった。しかし、ＺｓＧｒｅｅｎ発現は１２〜１６時間まで検出可能でなかった。２４時間の時点で、Ｃｙ５標識ｐＣＢ１は細胞内全体に分布したままであった。一方、（Ｃ）において細胞質ゾルの染色が見えないのは、核内に局在したピクセルの飽和を回避するためにＣｙ５チャンネルのゲインを下げたせいである。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）は、Ｃｙ５で標識したｐＣＢ１及びヘキスト３３３４２で標識したＨｅｐ３Ｂの核についての、時間に対するピアソンの相関係数（ｒ値）である。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０個の細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２４】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、分裂中及び非分裂中のＨＣＣ細胞の両方をほぼ１００％の効率で選択的にトランスフェクションすることを示す。（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で２４時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、（Ａ）では分裂中であり、（Ｃ）及び（Ｅ）では約９５％コンフルエントであった。全ての画像においてｐＣＢ１はヒストンで予めパッケージングされており、（Ｅ）において、ｐＣＢ１−ヒストン複合体はＮＬＳで更に修飾された。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（「ＰＣ」）１×１０9個に３７℃で２４時間連続して暴露された際に、ＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合である。細胞は（Ｂ）では分裂中であり、（Ｄ）及び（Ｆ）では約９５％コンフルエントであった。ｘ軸は、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）及びｐＣＢ１−ヒストン複合体（「複合体」）がＮＬＳで修飾されていたか否かを示す。ｐＣＢ１単独に加えて、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１も対照として用いられた。細胞を２０ｍｇ／ｍＬの小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）に暴露し、核膜孔複合体を経るＮＬＳ修飾したｐＣＢ１の移行を遮断した。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｇ）〜（Ｉ）は、それぞれ（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）で用いた細胞の細胞周期のヒストグラムである。Ｇ0／Ｇ1期の細胞の割合を各ヒストグラムについて示す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２５】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。（Ｂ）の矢印は、有糸分裂細胞を示す。サイクリンＢ１はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識モノクローナル抗体で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【図２６】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ（白色）及びヨウ化プロピジウム（赤色）で染色し、それぞれ初期及び後期のアポトーシスを試験した。細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【図２７】双性イオン性脂質からなるＳＬＢを有するプロトセルが、ごく低い非特異的細胞毒性しか誘導しないことを示す。１×１０9個のＡＰＴＥＳ修飾メソ多孔性のシリカナノ粒子、ＡＰＴＥＳ修飾コアを有するＤＯＰＣプロトセル、スクランブルｓｈＲＮＡ配列をコードするプラスミド（「スクランブルｐＣＢ１」）が装填されたＤＯＰＣプロトセル、又はスクランブルｐＣＢ１が装填されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）リポプレックスに３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂの割合を示す。プロトセル及びリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。正荷電及び負荷電のポリスチレンナノ粒子（それぞれ「アミン−ＰＳ」及び「カルボキシル−ＰＳ」）を正の対照として用い、一方で１０ｍＭの抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）又は１ｐｍｏｌの遊離したｐＣＢ１に暴露されたＨｅｐ３Ｂを負の対照として用いた。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１が装填された、ＭＣ４０によって標的を定められたメソ多孔性のシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の合成＞
図５に示すように、５（Ａ）はＤＮＡを装填し、ペプチドで標的を定められたプロトセルを生成するために用いられるプロセスを示す概念図である。この方法に従って、プロトセルのコアを形成するメソ多孔性のシリカナノ粒子をｐＣＢ１−ヒストン複合体の溶液中に単純に浸漬することによって、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をシリカナノ粒子に装填する。次にＰＥＧ化リポソームをＤＮＡが装填されたコアと融合し、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＭＣ４０）と、内在化したプロトセルのエンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）とで更に修飾された、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を形成する。スルフヒドリル−アミン架橋剤（スペーサーアーム＝９．５ｎｍ）を用いて、Ｃ末端システイン残基で修飾したペプチドをＳＬＢ中のＤＯＰＥ成分にコンジュゲートした。図５（Ｂ）は、プロトセルのコアとして用いられるメソ多孔性のシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝２００ｎｍ。挿入画像＝走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であって、１５〜２５ｎｍの細孔が表面から利用可能であることを示す。挿入画像のスケールバー＝５０ｎｍ。５（Ｃ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定されたメソ多孔性のシリカナノ粒子についてのサイズ分布を示す。（５Ｄ、左軸）バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）モデルを用いて図１４に示す窒素収着等温線の吸着枝から計算された、メソ多孔性のシリカナノ粒子の累積細孔容積の線図である。（５Ｄ、右軸）ＤＬＳにより測定された、ｐＣＢ１−ヒストン複合体のサイズ分布である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルはＨＣＣに高親和性で結合し、Ｈｅｐ３Ｂによって内在化されるが正常肝細胞によっては内在化されない＞
図８（Ａ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルをＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に暴露した場合の見かけの解離定数（Ｋd）を示す。Ｋd値は、特異親和性に対して逆の関係にあり、飽和結合曲線から求められた（図２１参照）。エラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。図８（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル（１０００倍の過剰量）に３７℃で１時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。ＭｅｔはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体で染色され（緑色）、プロトセルコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（Ａ〜Ｃ）又は０．５００ｗｔ％（Ａ）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。