【手続補正書】
【提出日】平成27年5月15日(2015.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高ｐＩのＨＮＳの低下した量を含むヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）の精製のための方法であって、
（ａ）バルクＨＮＳ組成物とアニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程と
（ｂ）ｐＨ約７．０に調節することによってアニオン交換クロマトグラフィー樹脂から該バルクＨＮＳ組成物からのＨＮＳを抽出および／または精製する工程と、
を含み、それによって、該バルクＨＮＳ組成物から抽出および／または精製されたＨＮＳが、高ｐＩのＨＮＳの低下した量を含む、方法。
【請求項２】
ｐＨ約７．０の塩を含む緩衝液で前記樹脂を洗浄して、高ｐＩのＨＮＳを除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、前記バルクＨＮＳ組成物に存在する高ｐＩのＨＮＳのうち約１０〜約２５％を除去する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記高ｐＩのＨＮＳの除去が、抽出および／または精製されたＨＮＳの改善された溶解度をもたらす、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記改善された溶解度が、少なくとも１５ｇ／Ｌである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、ＨＮＳを抽出する前に、ｐＨ約７．０において、約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む約５カラム容積の緩衝液でアニオン交換カラムを洗浄する工程を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、ｐＨ約７．０において、約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約１８０ｍＭ  ＮａＣｌで構成される緩衝液を使用して、前記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂からＨＮＳを溶出する工程を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記バルクＨＮＳ組成物と前記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる前に、前記バルクＨＮＳ組成物の導電率を約３〜約４ｍＳ／ｃｍの導電率を得るように調節する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記バルクＨＮＳ組成物が、前記アニオン交換カラムに添加される前に、ウイルス不活性化される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記抽出および／または精製されたＨＮＳと疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂、および／またはカチオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニオン交換クロマトグラフィー工程から得られる前記抽出および／または精製されたＨＮＳが、疎水性相互作用工程のための出発材料であり、必要に応じて、前記抽出／精製されたＨＮＳのＮａＣｌ濃度を、前記ＨＮＳ組成物と疎水性相互作用カラムとを接触させる前に、約１．１Ｍ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌに調節する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水性相互作用カラムから得られるＨＮＳ組成物が、ヒドロキシアパタイトカラムを使用する精製のための出発材料として使用され、必要に応じて、前記疎水性相互作用カラムからの溶出後のＨＮＳ組成物のＮａＰＯ４濃度を、約２ｍＭ〜約４ｍＭに調節する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒドロキシアパタイトカラムから得られるＨＮＳ組成物が、カチオン交換カラムを使用する精製のための出発材料として使用され、必要に応じて、前記ＨＮＳ組成物の導電率を、前記カチオン交換カラムに添加する前に約３〜約４ｍＳ／ｃｍに調節する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により得られるＨＮＳ組成物。
【請求項１５】
１５ｇ／Ｌを上回るＨＮＳ濃度を有する高ｐＩのＨＮＳの低下した量を含むＨＮＳ組成物。
【請求項１６】
前記ＨＮＳ組成物が、高ｐＩのＨＮＳを実質的に含まない、請求項１５に記載のＨＮＳ組成物。
【請求項１７】
ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＡの処置において使用するための、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のＨＮＳ組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを精製するための方法であって、該方法は、
ａ）ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物とアニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを、該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼが吸着される条件下で接触させる工程；
ｂ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該アニオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られた該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物と、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程；
ｄ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程；
ｅ）工程ｄ）から得られた該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物とヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程；
ｆ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程；
ｇ）工程ｆ）から得られた該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物とカチオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程；および
ｈ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該カチオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物と、４−メルカプト−エチル−ピリジンに連結したセルロースマトリクスとを接触させる工程
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物中のウイルスを不活性化する工程
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目４）
工程ａ）の前記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｑセファロースファストフロー樹脂である、項目１に記載の方法。
（項目５）
工程ｃ）の前記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、フェニルセファロース６ファストフロー樹脂である、項目１に記載の方法。
（項目６）
工程ｅ）の前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩ樹脂である、項目１に記載の方法。
（項目７）
工程ｇ）の前記カチオン交換クロマトグラフィー樹脂は、ＳＰセファロースファストフロー樹脂である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを濾過する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目９）
濾過工程は、ダイアフィルトレーションもしくは限外濾過によって行われる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
工程ａ）を行う前に、前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物をｐＨ  約７．０へと調節する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記溶液は、約５０〜約１００ｍＭの酢酸ナトリウム濃度を有する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
工程ａ）を行う前に、前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を調節して、約３〜約４ｍＳ／ｃｍの導電率を得る工程、
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
工程ｂ）の溶出剤は、約ｐＨ７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約１８０ｍＭ  ＮａＣｌを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
工程ｃ）を行う前に、前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を、ＮａＣｌ濃度  約１．１Ｍ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを達成するように調節する工程、
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記ＮａＣｌ濃度は、約１．２Ｍである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記組成物を、２５℃において導電率  約９０〜１１０ｍＳ／ｃｍを得るように調節する工程、
をさらに包含する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
工程ｃ）を行う前に、前記樹脂を、ｐＨ  約７．０および導電率  約１００〜約１２０ｍＳ／ｃｍにおいて約２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＴｒｉｓおよびＮａＣｌ濃度  約１．２Ｍを含む緩衝液で平衡化する工程、
をさらに包含する、
項目１に記載の方法。
（項目１８）
工程ｃ）の吸着された前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を、ｐＨ  約７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＴｒｉｓおよびＮａＣｌ濃度  約１８０ｍＭ〜約２２０ｍＭを含む溶出剤で平衡化する工程、
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ＮａＣｌ濃度は、約２００ｍＭである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
工程ｄ）において得られた前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を含む溶液を、工程ｅ）を行う前に、濃度  約２ｍＭ〜約４ｍＭのＮａＰＯ４へと調節する工程、
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ＮａＰＯ４の濃度は、約２ｍＭに調節される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
工程ｅ）において前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを前記樹脂から、ｐＨ  約７．５において２５ｍＭ  ＮａＰＯ４を含む溶出剤で溶出する工程、
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２３）
工程ｆ）において得られた前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を、工程ｇ）を行う前に、導電率  約３〜約４ｍＳ／ｃｍを得るように調節する工程、
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記導電率は、約３ｍＳ／ｃｍであり、前記溶液は、約ｐＨ  ５．０において約２０ｍＭ
酢酸ナトリウムを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記導電率は、約４ｍＳ／ｃｍであり、前記溶液は、約ｐＨ  ５．０において約４０ｍＭ  酢酸ナトリウムを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
工程ｈ）は、ｐＨ  約５において約５０ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび約９０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶出剤で行われる、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記溶出剤は、導電率  約１２〜約１４ｍＳ／ｃｍを有する、項目２６に記載の方法。
本発明の上記で考察される、多くの他の特徴および付随する利点は、添付の実施例とともに理解される場合、本発明の以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されることになる。本明細書に記載される種々の実施形態は、無償提供され、本明細書に含まれる教示に鑑みて、当業者によって理解される様式において一緒に組み合わされ得るかもしくは使用され得る。