【手続補正書】
【提出日】平成27年3月23日(2015.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
ＩＧＦＢＰ−５断片の定量のためのサンドイッチ免疫アッセイの設計 
アフィニティー精製したモノクローナル抗体ＩＢＰＦ７２の特異性を、サンドイッチ免疫アッセイでも確認した（図１１）。完全な（全長）ＩＧＦＢＰ−５の存在とは関係のない、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５の特異的な検出が可能なサンドイッチ免疫アッセイを開発するために、ＩＢＰＦ７２を完全な（全長）ＩＧＦＢＰ−５に特異的なモノクローナル抗体とともに試験した。ＩＧＦＢＰ−５のＮ末端タンパク質分解断片に特異的なＩＢＰＦ７２モノクローナル抗体（間接ＥＬＩＳＡにおける全長分子との交差反応性は５％未満）、及び完全なＩＧＦＢＰ−５を認識する別のＭＡｂを用いる、２種類のサンドイッチアッセイを開発した。サンドイッチ蛍光免疫アッセイを実施するために、Hyytia et al., 2010に記載の安定化Ｅｕ３＋キレートで標識した検出用ＭＡｂを用いた。このアッセイに用いる捕捉抗体は完全なＩＧＦＢＰ−５に特異的であるが、一方、検出用抗体は、ＩＧＦＢＰ−５のタンパク質分解性新規エピトープに特異的である。ウェル当たり１．５μｇの捕捉抗体（ＩＢＰＦ１５又はIＢＰＦ１６）を含む１００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水を、９６穴の免疫アッセイプレート中で、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５ｇ／ＬのＮａＮ３を添加した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）緩衝液（即ち、緩衝液Ａ）で洗浄した。洗浄後、種々の濃度のヒト組み換え全長ＩＧＦＢＰ−５又は組み換えＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５断片を含有する０．０５ｍｌのアッセイ用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）、９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ４０、０．５％のＢＳＡ及び０．５ｇ／ＬのＮａＮ３）と、０．０５ｍｌの検出用抗体（ＩＢＰＦ７２）溶液（アッセイ用緩衝液からなる４ｍｇ／Ｌ溶液）とをプレートに加えた。プレートを、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、各ウェルに０．２ｍｌの増強溶液（１．７５ＭのＮａＳＣＮ、１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、２０％の１−プロパノール、５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ１０．０）を添加し、穏やかな振盪下、室温で３分間インキュベートした。Ｅｕ３＋の蛍光をVictor 1420 マルチラベルカウンター（Wallac-Perkin Elmer製）で測定した。蛍光は、１秒当たりのカウント（ＣＰＳ）で表した。開発したサンドイッチ免疫アッセイは、ＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５（即ち、ＩＧＦＢＰ−５の組み換えＮ末端断片）のみを検出し、全長ＩＧＦＢＰ−５との交差反応は生じなかった（あるいは、５％未満であった）。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５に特異的な２つのペアは、ＩＢＰＦ１５−ＩＢＰＦ７２とＩＢＰＦ１６−ＩＢＰＦ７２とであった（それぞれ、図１１Ａ、図１１Ｂ）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
配列番号１（ＩＧＦＢＰ−４のＮ末端）：
ＤＥＡＩＨＣＰＰＣＳＥＥＫＬＡＲＣＲＰＰＶＧＣＥＥＬＶＲＥＰＧＣＧＣＣＡＴＣＡＬＧＬＧＭＰＣＧＶＹＴＰＲＣＧＳＧＬＲＣＹＰＰＲＧＶＥＫＰＬＨＴＬＭＨＧＱＧＶＣＭＥＬＡＥＩＥＡＩＱＥＳＬＱＰＳＤＫＤＥＧＤＨＰＮＮＳＦＳＰＣＳＡＨＤＲＲＣＬＱＫＨＦＡＫＩＲＤＲＳＴＳＧＧＫＭ 
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該個体から採取した試料において、
配列番号１に相当するＩＧＦＢＰ−４のＮ末端断片、配列番号１の少なくとも１３個の連続するアミノ酸を有する配列に相当する断片、若しくは配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列に相当する断片の定量、又は
配列番号２に相当するＩＧＦＢＰ−４のＣ末端断片、配列番号２の少なくとも１３個の連続するアミノ酸を有する配列に相当する断片、若しくは配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列に相当する断片の定量、又は
配列番号４に相当するＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片、配列番号４の少なくとも９個の連続するアミノ酸を有する配列に相当する断片、若しくは配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する配列に相当する断片の定量、又は
配列番号５に相当するＩＧＦＢＰ−５のＣ末端断片、配列番号５の少なくとも９個の連続するアミノ酸を有する配列に相当する断片、若しくは配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有する配列に相当する断片の定量
を実施する工程、
（ｂ）工程（ａ）において得た定量値を、対応するペプチドに関する適当な参照値と比較する工程、及び
（ｃ）将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定する工程
を包含する方法。
【請求項２】
個体における循環器系疾患の治療の効果をモニタリングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）該治療の開始前、該治療の開始時、又は該治療の期間中に採取した該個体の第１試料について、請求項１に記載の断片のいずれかを定量する工程、
（ｂ）該第１試料の採取後に該個体から採取した第２試料について、上記断片に対応する断片を定量する工程、
（ｃ）工程（ａ）において得た定量値を、工程（ｂ）において得た対応断片の定量値と比較する工程であって、工程（ｂ）における断片の定量値が、工程（ａ）における断片の定量値に対して増加しているか又は同レベルであることが、該治療は該個体に対しては有効ではないことを示す工程、及び
（ｄ）工程（ａ）において得た定量値を、工程（ｂ）において得た対応断片の定量値と比較する工程であって、工程（ｂ）における断片の定量値が、工程（ａ）における断片の定量値に対して減少していることが、該治療は該個体に対しては有効であることを示す工程
を包含する方法。
【請求項３】
該治療が、該個体のための抗血小板療法、抗炎症療法、スタチン療法、脂質低下療法、プラークの安定化若しくは退縮化のための療法、又は血栓溶解療法であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該断片の定量値が参照値よりも高いことが、該個体の将来の循環器系主要有害事象の危険度が高いことを示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該断片の定量値が参照値よりも低いことが、該個体の将来の循環器系主要有害事象の危険度が低いことを示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該断片の定量値に従って、該個体を異なる危険度群に分類する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
循環器系主要有害事象が、冠動脈心疾患に関連する以下の事象：
発作、急性冠症候群（ＡＣＳ）、不安定狭心症、心筋梗塞（ＭＩ）、ＳＴ上昇型ＭＩ、非ＳＴ上昇型ＭＩ、血管再生、緊急冠動脈バイパス移植、経皮的冠動脈形成、及び死
から選ばれる１種以上の事象であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
コレステロール分画、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニンＴ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ＢＮＰ前駆体ペプチド（ｐｒｏＢＮＰ）、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、ホモシステイン（ＨＣＹ）、コリン、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）からなる群より選ばれる循環器系主要有害事象予測用の１種以上のマーカーを検出するためのアッセイを行う工程をさらに包含し、請求項１に記載のいずれかの断片のレベルと該１種以上のマーカーのレベルとの組合せによって、将来の循環器系主要有害事象の危険度を予測することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程：
（ｄ）該試料について、配列番号３に相当するＩＧＦＢＰ−４を定量する工程、
（ｅ）請求項１に記載のいずれかのＩＧＦＢＰ−４断片の定量値の、ＩＧＦＢＰ−４の定量値に対する比率を計算する工程、
（ｆ）工程（ｅ）において求めた比率を、対応断片のための適当な参照用比率と比較する工程、及び
（ｇ）将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程：
（ｄ）該試料について、配列番号６に相当するＩＧＦＢＰ−５を定量する工程、
（ｅ）請求項１に記載のいずれかのＩＧＦＢＰ−５断片の定量値の、ＩＧＦＢＰ−５の定量値に対する比率を計算する工程、
（ｆ）工程（ｅ）において求めた比率を、対応断片のための適当な参照用比率と比較する工程、及び
（ｇ）将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該個体が、ＡＣＳ、胸痛又は息切れを発症している個体であって、該ＡＣＳが、冠動脈心疾患、安定狭心症、不安定狭心症、ＭＩ、ＳＴ上昇型ＭＩ、非ＳＴ上昇型ＭＩ、左心室機能不全、及び鬱血性心不全から選ばれる１種以上の事象であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該個体が、冠動脈心疾患に関連するいかなる兆候をも示していない個体であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
循環器系疾患に対する治療の効果を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）臨床試験に参加する少なくとも１つの個体から採取した試料について、請求項１に記載の断片のいずれかを定量する工程であって、該定量を該臨床試験の開始時、該臨床試験の期間中、又は該臨床試験の終了後に行う工程、
（ｂ）請求項１に記載の断片のいずれかについて先に得た定量値と、後に得た定量値とを比較する工程であって、後に得た定量値が先に得た定量値に対して増加しているか又は同レベルであることが、該治療は有効ではないことを示す工程、
（ｃ）請求項１に記載のいずれかの断片について先に得た定量値と後に得た定量値とを比較する工程であって、後に得た定量値が先に得た定量値に対して減少していることが、該治療は有効であることを示す工程
を包含する方法。
【請求項１４】
該個体がヒト又は他の哺乳動物であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法を実施するための検査キットであって、該方法を実施するための説明書、並びに
（ａ）個体から採取した試料に含まれる請求項１に記載の断片のいずれかを定量するための手段、及び
（ｂ）工程（ａ）において得た定量値を適当な参照値と比較し、それによって将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定するための手段
を包含するキット。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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