【手続補正書】
【提出日】平成27年4月27日(2015.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンの生産性を上昇させることのできる組み換え細胞であって、次のものからなる群：
（ａ）クエン酸シンターゼ、
（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、
（ｃ）酢酸キナーゼ、
（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、
（ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
（ｇ）ホスホグルコノラクトナーゼ及び
（ｈ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のうちの１つ以上の酵素活性を調節することで、イソプレン生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、（ｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含み、かつイソプレンに取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されていないイソプレン生産細胞と比較してイソプレンの生産量が増加している、細胞。
【請求項２】
メバロン酸の生産性を上昇させることのできる組み換え細胞であって、次のものからなる群：
（ａ）クエン酸シンターゼ、
（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、
（ｃ）酢酸キナーゼ、
（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、
（ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
（ｇ）ホスホグルコノラクトナーゼ及び
（ｈ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のうちの１つ以上の酵素活性を調節することで、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含み、かつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されていないメバロン酸生産細胞と比較してメバロン酸の生産量が増加している、細胞。
【請求項３】
イソプレノイドの生産性を上昇させることのできる組み換え細胞であって、次のものからなる群：
（ａ）クエン酸シンターゼ、
（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、
（ｃ）酢酸キナーゼ、
（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、
（ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
（ｇ）ホスホグルコノラクトナーゼ及び
（ｈ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のうちの１つ以上の酵素活性を調節することで、メバロン酸に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、（ｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１つ以上の核酸を更に含み、かつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作をされていないイソプレノイド生産細胞と比較してイソプレノイドの生産量が増加している、細胞。
【請求項４】
前記ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、前記ＭＶＡ経路上流に由来するものであり、前記ＭＶＡ経路上流の核酸は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の核酸からなる群から選択される、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子が：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択される、請求項３に記載の細胞。
【請求項７】
前記ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、前記ＭＶＡ経路下流に由来するものであり、前記ＭＶＡ経路下流の核酸が、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤ核酸からなる群から選択される、請求項１または３に記載の細胞。
【請求項８】
前記ＭＶＫが、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞が、ＤＸＰ経路の１種以上のポリペプチド（one or DXP pathway polypeptides）をコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む、請求項１または３に記載の細胞。
【請求項１０】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）な
どの交雑種、又はこれらの変異体（variant）由来のポリペプチドである、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、グラム陽性細菌細胞、ストレプトマイセス（Streptomyces）細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌（Escherichia cells）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞、又は酵母細胞である、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、前記クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
染色体上の、前記内在性のクエン酸シンターゼ遺伝子を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、前記クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記ＮＡＤＨ感受性のクエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子が、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記クエン酸シンターゼの活性が、前記内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１６】
前記クエン酸シンターゼの活性の減少が、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素が前記メバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞の酢酸の生成量が、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項１７又は１８に記載の細胞。
【請求項２１】
前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する、請求項１〜１１又は１７〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記炭素の取り込みが、前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失させることによって減弱させられる、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞の乳酸の生成量が、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることにより調節される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が内在性遺伝子である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータを、前記常時発現型合成プロモータと置き換えることにより増加する、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
前記細胞が、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む、請求項２７又は２８に記載の細胞。
【請求項３２】
前記細胞のピルビン酸の生成量が、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して増加している、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３】
前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子発現を増加させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３４】
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成される前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項３４又は３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つ以上の遺伝子が、内在性遺伝子である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記１種以上の内在性遺伝子プロモータを、１種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する１種以上の内在性遺伝子の発現を増加させる、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記細胞が、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む、請求項３４又は３５に記載の細胞。
【請求項４０】
前記内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させられる、請求項３６に記載の細胞。
【請求項４１】
前記細胞のアセチルＣｏ−Ａ生産量が、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して増加している、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較してより多くの炭素が前記メバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
前記炭素の取り込みが、前記ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４４】
前記ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
前記ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって減弱させられる、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
前記内在性ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子の欠失により減弱させられる、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
前記炭素の取り込みが、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４８】
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることによって減弱させられる、請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠失させることで減弱させられる、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
イソプレンの生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、（ｂ）前記イソプレンを生産する工程と、を含む、方法。
【請求項５２】
メバロン酸の生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項２、４、５、６、および１１〜５０のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、（ｂ）前記メバロン酸を生産する工程と、を含む、方法。
【請求項５３】
トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物と比較して、メバロン酸生産量が増加しており、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、並びに（ｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体、からなる群の１種以上の酵素の活性を調節することにより、細胞における代謝性炭素の取り込みがメバロン酸の生産に指向している、請求項２、４、５、６、１１〜５０、および５２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５４】
前記クエン酸シンターゼの活性が、前記内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより調節され、前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記内在性の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節され、及び前記酢酸キナーゼの活性が、前記内在性の酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される、請求項２、４、５、６、１１〜５０、および５２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５５】
前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpenes）及びポリテルペンからなる群から選択される、請求項３〜９および１１〜５０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５６】
前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５８】
イソプレノイドの生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項３〜９、１１〜５０、５５、５６、および５７のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、（ｂ）前記イソプレノイドを生産する工程と、を含む、方法。
【請求項５９】
（ｃ）前記イソプレンを回収する工程、を更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
（ｃ）前記メバロン酸を回収する工程、を更に含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
（ｃ）前記イソプレノイドを回収する工程、を更に含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプ
チドをコードしている核酸を更に１種以上含む、請求項１または３に記載の細胞。