【手続補正書】
【提出日】平成26年11月13日(2014.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するリコンビナントタンパク質であって、アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒し、かつ末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒し、そして少なくとも２種の異なる酵素由来の触媒ドメインを含む、リコンビナントタンパク質。
【請求項２】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項３】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインがヒト酵素に由来する、請求項２記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項４】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインが、配列番号１のアミノ酸残基１０５〜４４５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項３記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項５】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインが、配列番号２１のアミノ酸残基３０〜４４７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項３または請求項４記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項６】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインが、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインに対してＮ末端側にある、請求項２〜５のいずれか一項記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項７】
さらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインとＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインの間にスペーサーを含む、請求項２〜６のいずれか一項記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項８】
スペーサーがステムドメイン由来の配列を含む、請求項７記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項９】
スペーサーが、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、および配列番号１２４から成る群より選択される配列を含む、請求項７または請求項８記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１０】
さらに、触媒ドメインのＮ末端に結合したターゲティングペプチドを含む、請求項２〜９のいずれか一項記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１１】
ターゲティングペプチドが、ステムドメイン、ステムドメインのＮ末端に結合した膜貫通ドメイン、及び、場合により、ステムドメインのＮ末端に結合した細胞質ドメインを含む、請求項１０記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１２】
ターゲティングペプチド、ステムドメイン、膜貫通ドメイン及び/又は細胞質ドメインが、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、２型ゴルジ体タンパク質、ＭＮＮ２、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ９、ＭＮＮ１０、ＭＮＳ１、ＫＲＥ２、ＶＡＮ１、およびＯＣＨ１から成る群より選択されるタンパク質に由来するか又は表１のタンパク質に由来する、請求項８または請求項１１記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１３】
タンパク質が、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ヒュミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、およびトリコデルマ属（Trichoderma）から成る群より選択される生物に由来する、請求項１２記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１４】
ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインおよびヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン、ここで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端側に位置する、触媒ドメインの間に位置するヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩステムドメイン由来の配列を含むスペーサー配列、ならびにＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側に位置するターゲティングペプチド、ここで、ターゲティングペプチドは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ由来の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含む、を含む請求項１または２記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１５】
配列番号９５に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１または２記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１６】
ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン、ここで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端側に位置する；触媒ドメインの間に位置するスペーサー、ここで、スペーサーは、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、および配列番号１２４から成る群より選択される配列を含む；ならびにＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインに対してＮ末端側に位置するターゲティングペプチド、ここで、ターゲティングペプチドは、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ由来の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含む、を含む請求項１または２記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１７】
スペーサーが、配列番号１１８、配列番号１２０、および配列番号１２４から成る群より選択される配列を含む、請求項１６記載のリコンビナントタンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項記載のリコンビナントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１８記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載の発現ベクターを含むホスト細胞。
【請求項２１】
複合Ｎ−グリカンを製造する方法であって、
（１）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むホスト細胞を提供すること；そして
（２）アクセプター性グリカンの末端Ｍａｎα３残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移および末端Ｍａｎα６残基へのＮ−アセチルグルコサミンの転移を触媒して複合Ｎ−グリカンを製造する融合タンパク質が発現されるようにホスト細胞を培養すること
を含む、方法。
【請求項２２】
アクセプター性グリカンが、異種ポリペプチドに結合している、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
複合Ｎ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎβ３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎβ６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃである、請求項２１または請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ホスト細胞が、トリコデルマ属種（Trichoderma sp.）、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、およびトリポクラジウム属（Tolypocladium）から成る群より選択される糸状菌細胞である、請求項２１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
ホスト細胞が、さらに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
ホスト細胞が、野生型ホスト細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリキルマンノシルトランスフェラーゼを有するか又はａｌｇ３遺伝子が、ホスト細胞から欠失されている、請求項２１〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
ホスト細胞が、野生型ホスト細胞における活性又は発現レベルに比べて低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ又は低下した発現レベルのｏｃｈ１遺伝子を有する、請求項２１〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ホスト細胞が、さらに、
ｉ）α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド；および／または、
ｉｉｉ）シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド
を含む、請求項２１〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
複合Ｎ−グリカンを製造する方法であって、
（１）野生型ホスト細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有するトリコデルマ属（Trichoderma）ホスト細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする第１のポリヌクレオチドおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むトリコデルマ属（Trichoderma）ホスト細胞を提供すること；ならびに
（２）ホスト細胞を培養して複合Ｎ−グリカンを製造すること
を含む、方法。
【請求項３０】
野生型糸状菌細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのａｌｇ３遺伝子を有するか又はａｌｇ３遺伝子が欠失している、請求項２〜１７のいずれか一項記載のリコンビナントタンパク質を含む糸状菌細胞。
【請求項３１】
さらに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３０記載の糸状菌細胞。
【請求項３２】
野生型糸状菌細胞における活性レベルに比べて低下した活性レベルのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有する、請求項３０〜３１のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項３３】
野生型糸状菌細胞における発現レベルに比べて低下した発現レベルのｏｃｈ１遺伝子を有する、請求項３０〜３２記載の糸状菌細胞。
【請求項３４】
さらに、
ｉ）α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド；および／または、
ｉｉｉ）シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド
を含む、請求項３０〜３３のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項３５】
トリコデルマ属種（Trichoderma sp.）、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリソスポリウムス属（Chrysosporium）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフソラ属（Myceliophthora）、ミロセシウム属（Myrothecium）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ピロミセス属（Piromyces）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロミセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、およびトリポクラジウム属（Tolypocladium）から成る群より選択される、請求項３０〜３４のいずれか一項記載の糸状菌細胞。