【手続補正書】
【提出日】平成27年6月19日(2015.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１３）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１０）も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１１）及びショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１２）は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４、１９９１）。細胞標的化の目的のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、又はＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
ｖ．ペプチドベースの切断可能な結合基
更なる別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基の例は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩ）〜（ＸＸＸＩＶ）のいずれかに示す構造の群から選択される二価又は三価の分枝状リンカーにコンジュゲートされる：
【化１３】
2014524738.tif 000001
式中：ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは、各存在に関して独立して０〜２０を表し、反復単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各々、各存在に関して独立して不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各存在に関して独立して不在、アルキレン、置換されたアルキレンであり、ここで１つ又は複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終結されてもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各々、各存在に関して独立して不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化１４】
2014524738.tif 000002
又はヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、リガンドを表し；即ち、各々、各存在に関して独立して単糖（ＧａｌＮＡｃなどの）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。式（ＸＸＸＶ）のものなどの、三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、ＲＮＡｉ剤と共に使用されて、標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用である：
【化１５】
2014524738.tif 000003
式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５５】
相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、又は疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを用いて４パラメータ適合モデルを使用してＩＣ５０を計算し、ＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、又は未処理の細胞に対して、同じ用量範囲に亘って正規化し、又はそれ自体の最低用量に対して正規化した。陰性対照として使用されるＡＤ−１９５５配列は、ルシフェラーゼを標的とし、以下の配列を有していた：センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号１４）；アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号１５）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
【表５】
2014524738.tif 000004
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６３】
【表９】
2014524738.tif 000005
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８０】
【表２３】
2014524738.tif 000006
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８９】
【表３２】
2014524738.tif 000007
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４００】
【表４２】
2014524738.tif 000008
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１１】
【表５２】
2014524738.tif 000009
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５０】
インビボ試験
実施例３
被験物質
本発明のｄｓＲＮＡ配列を用いて、インビボ実験を行った。実験に使用されるｄｓＲＮＡ配列は、ＧａｌＮａｃコンジュゲートＡＤ−５２９８１（「ＡＮＧ」、センス配列：ＡｆｃＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆＬ９６（配列番号６５７）；アンチセンス配列：ａＡｆａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓＵｆｓｇ（配列番号８４２）であった。陰性対照として使用されるｄｓＲＮＡ配列は、ルシフェラーゼコンジュゲートＡＤ−４８３９９Ｂ１（「Ｌｕｃ」、センス配列：ＣｆａＣｆｕＵｆａＣｆｇＣｆｕＧｆａＧｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆｇＡｆＬ９６（配列番号１７２８）、アンチセンス配列：ｕＣｆｇＡｆａＧｆｕＡｆｃＵｆｃＡｆｇＣｆｇＵｆａＡｆｇＵｆｇｓＡｆｓｕ（配列番号１７２９））であった。交互の２’−メチル及び２’フルオロ修飾を含有するＧａｌＮａｌコンジュゲートＡＤ−１９５５も陰性対照として使用された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５６】
実施例４
被験物質
ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質にレベルに対する本発明のｄｓＲＮＡ配列の単回投与の効果を試験した。実験に使用されるｄｓＲＮＡ配列は、ＧａｌＮａｃコンジュゲートＡＤ−５２９８１（「ＡＮＧ」、センス配列：ＡｆｃＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆＬ９６（配列番号６５７）；アンチセンス配列：ａＡｆａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓＵｆｓｇ（配列番号８４２））であった。ＰＢＳを陰性対照として使用した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号ｌのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号５のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項２】
ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表２、３、７、８、９及び１０に列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項３】
前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、表７及び８のＡＤ−５２９８１．１、ＡＤ−５３０６３．１、ＡＤ−５３００１．１、ＡＤ−５３０１５．１、ＡＤ−５２９８６．１、ＡＤ−５２９５３．１、ＡＤ−５３０２４．１、ＡＤ−５３０３３．１、ＡＤ−５３０３０．１、ＡＤ−５３０８０．１、ＡＤ−５３０７３．１、ＡＤ−５３１３２．１、ＡＤ−５２９８３．１、ＡＤ−５２９５４．１、ＡＤ−５２９６１．１、ＡＤ−５２９９４．１、ＡＤ−５２９７０．１、ＡＤ−５３０７５．１、ＡＤ−５３１４７．１、ＡＤ−５３０７７．１からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
前記相補性の領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記相補性の領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
前記相補性の領域が、１９ヌクレオチド長である、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
それぞれの鎖が、３０ヌクレオチド長以下である、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドに３’オーバーハングを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドに３’オーバーハングを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
リガンドを更に含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
前記リガンドが、ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされている、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
前記リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１６】
前記リガンドが、
【化１】
2014524738.tif 000010
である、請求項１５に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１７】
前記相補性の領域が、表２、３、７、８、９及び１０のアンチセンス配列のうちの１つからなる、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
表２、３、９及び１０の配列から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表２、３、７、８、９及び１０の配列から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞。
【請求項２０】
ｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするベクターであって、前記ｄｓＲＮＡが、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補性の領域を含み、前記ｄｓＲＮＡが、３０塩基対以下の長さであり、前記ｄｓＲＮＡが、切断のために前記ｍＲＮＡを標的とするベクター。
【請求項２１】
前記相補性の領域が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
前記相補性の領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項２０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２４】
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ又は請求項２０に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項２５】
脂質製剤を更に含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害方法であって、
ａ）前記細胞を、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ又は請求項２０に記載のベクターと接触させる工程と；
ｂ）工程（ａ）で生成された前記細胞を、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、前記細胞内での前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する工程と
を含む方法。
【請求項２７】
前記細胞が、ヒト以外の対象中にある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＮＧＰＴＬ３の発現が、少なくとも約３０％阻害される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の処置するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ又は請求項２０に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項３０】
前記障害が、脂質代謝障害である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記脂質代謝障害が、高脂血症又は高トリグリセリド血症である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記ｄｓＲＮＡが、前記対象における１つ又は複数の血清脂質の減少及び／又はＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の蓄積の低下を引き起こす、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ｄｓＲＮＡが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ又は請求項２０に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項３５】
前記ｄｓＲＮＡが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項３４に記載の医薬組成物。