【事件の表示】
　特許第３２７００４１号「シグナル形質導入に関与する蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定法」の請求項１ないし１９に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　
　訂正を認める。
　特許第３２７００４１号の請求項１ないし１９に係る特許を維持する。
【理　由】
　
Ｉ．手続の経緯
　
　本件特許第３２７００４１号の請求項１乃至１９に係る発明についての出願は、１９９１年７月１７日（パリ条約による優先権主張外国庁受理１９９０年７月１９日、米国）を国際出願日とする出願であって、平成１４年１月１８日にその特許の設定登録がなされ、その後、その特許について異議申立人池野耕司より特許異議の申立がなされ、取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１５年７月１４日に訂正請求がなされ（その後取り下げ）、平成１５年１０月１６日に審尋がなされ、再度、取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１６年１１月１０日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
　
１．訂正の内容
(１)訂正事項１
　特許請求の範囲の請求項１に係る記載、
「【請求項１】(ａ)ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現する、爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される動物の色素被験細胞を、ＰＰＧタンパク質を活性化させるかまたは阻害する化学物質と接触させ、結果として細胞内で色素を分散させるかまたは凝集させること；そして(ｂ)細胞内での色素の局在にいずれかの変化をもたらすことにより、化学物質がアゴニストかまたはアンタゴニストかを決定すること、を含む、ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストである化学物質を同定する方法。」を、
「【請求項１】(ａ)ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現する、アフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素被験細胞を、ＰＰＧタンパク質を活性化させるかまたは阻害する化学物質と接触させ、結果として細胞内で色素を分散させるかまたは凝集させること；そして(ｂ)細胞内での色素の局在にいずれかの変化をもたらすことにより、化学物質がアゴニストかまたはアンタゴニストかを決定すること、を含む、ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストである化学物質を同定する方法。」と訂正する。
(２)訂正事項２
　特許請求の範囲の請求項１１に係る記載、
「【請求項１１】下記の工程からなる、ＧＰＣ受容体のクローニング方法：(ａ)爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される動物由来であって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで継続的に増殖をすることができる色素細胞に、外来性の細胞表面受容体をコードする外来性の核酸クローンを導入し；(ｂ)該細胞に、内在性の受容体を活性化することにより該細胞中の色素配置を初期状態にする刺激を与え；(ｃ）色素配置が初期状態になった上記細胞を、ＧＰＣ受容体を活性化する化学物質と接触させ、そして(ｄ)該化学物質との接触により色素配置がその初期状態から変化した細胞を同定し、細胞の色素配置の変化をＧＰＣ受容体をコードする外来性クローン発現の指標とする。」を、
「【請求項１１】下記の工程からなる、ＧＰＣ受容体のクローニング方法：(ａ)ｉｎ　ｖｉｔｒｏで継続的に増殖をすることができるアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素細胞に、外来性の細胞表面受容体をコードする外来性の核酸クローンを導入し；(ｂ)該細胞に、内在性の受容体を活性化することにより該細胞中の色素配置を初期状態にする刺激を与え；(ｃ）色素配置が初期状態になった上記細胞を、ＧＰＣ受容体を活性化する化学物質と接触させ、そして(ｄ)該化学物質との接触により色素配置がその初期状態から変化した細胞を同定し、細胞の色素配置の変化をＧＰＣ受容体をコードする外来性クローン発現の指標とする。」と訂正する。
(３)訂正事項３
　特許請求の範囲の請求項１２に係る記載、
「【請求項１２】 ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現し、そして刺激物質を与えたときに細胞中で色素を分散しまたは凝集することができる、爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される動物の色素細胞。」を、
「【請求項１２】 ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現し、そして刺激物質を与えたときに細胞中で色素を分散しまたは凝集することができる、請求項１に記載の方法のために使用するアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素細胞。」と訂正する。
(４)訂正事項４
　特許請求の範囲の請求項１５に係る記載、
「【請求項１５】化学物質が外来性ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するかどうかを決定するためのキットであって、(ａ)外来性ＰＰＧタンパク質をコードする外来性クローンを発現する、１またはそれ以上の、爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される動物の色素被験動物；(ｂ)外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の凝集を誘導することができるか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の分散を誘導することができる刺激物質(例えば第一の刺激物質)；そして(ｃ)アンタゴニストのキットについては、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の分散を誘導することができるか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素凝集を誘導することができる、第二の刺激物質、を１またはそれ以上のコンテナ中に含む、前記キツト。」を、
「【請求項１５】化学物質が外来性ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するかどうかを決定するためのキットであって、(ａ)外来性ＰＰＧタンパク質をコードする外来性クローンを発現する、１またはそれ以上の、アフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素細胞；(ｂ)外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の凝集を誘導することができるか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の分散を誘導することができる刺激物質(例えば第一の刺激物質)；そして(ｃ)アンタゴニストのキットについては、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の分散を誘導することができるか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素凝集を誘導することができる、第二の刺激物質、を１またはそれ以上のコンテナ中に含む、前記キツト。」と訂正する。
(５)訂正事項５
　特許請求の範囲の請求項１６に係る記載、
「【請求項１６】(ａ)色素被験細胞がアフリカツメガエルの黒色素胞であり；(ｂ)刺激物質(例えば第一の刺激物質)が、外来性ＰＰＧを活性化することにより色素の分散が誘導される場合にはメラトニン、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合にはメラニン細胞刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項１５に記載のキット。」を、
「【請求項１６】(ａ)色素被験細胞がアフリカツメガエルの黒色素胞であり；(ｂ)刺激物質(例えば第一の刺激物質)が、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することにより色素の分散が誘導される場合にはメラトニン、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合にはメラニン細胞刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項１５に記載のキット。」と訂正する。
　
２．訂正の適否
（１）訂正事項１について
　訂正事項１は、訂正前の請求項１に記載の「爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される動物の色素被験細胞」を、「アフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素被験細胞」に限定するものであって、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　そして、上記訂正事項が、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内のものであり、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
（２）訂正事項２について
　訂正事項２は、訂正前の請求項１１に記載の「爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される動物由来であって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで継続的に増殖をすることができる色素細胞」を、「ｉｎ　ｖｉｔｒｏで継続的に増殖をすることができるアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素細胞」に限定するものであって、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　そして、上記訂正事項が、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内のものであり、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
（３）訂正事項３について
　訂正事項３は、訂正前の請求項１２に記載の「爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される動物の色素細胞」を、「請求項１に記載の方法のために使用するアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素細胞」に限定するものであって、特許請求の範囲の減縮に該当する。  
　そして、上記訂正事項が、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内のものであり、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
（４）訂正事項４
　訂正事項４は、１）訂正前の請求項１５に記載の「爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される動物」を、「アフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)」に限定するものであって、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　また、２）訂正前の請求項１５に記載の「色素被験動物」との誤記を、「色素被験細胞」に訂正するものであって、誤記の訂正を目的とする訂正に該当する。　
　そして、上記訂正事項が、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内のものであり、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
（５）訂正事項５
　訂正事項５は、訂正前の請求項１６に記載の「外来性ＰＰＧ」との誤記を、「外来性ＰＰＧタンパク質」に訂正するものであって、誤記の訂正を目的とする訂正に該当する。
　そして、上記訂正事項が、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内のものであり、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
　
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正は、特許法１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
　
１．特許異議申立書の理由の概要
　特許異議申立人池野耕司は、下記の甲第１乃至６号証を提出し、訂正前の本件請求項１乃至１９に係る発明は、甲第１乃至６号証刊行物に記載された発明に基づき当業者が容易に発明することができたものであるから同法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないものである、また、本願は、明細書の記載が不備であるから特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていないから、取り消すべき旨、主張している。
　
甲第１号証：The Journal of Biochemistry　262巻32号15796〜15802頁、1987年
甲第２号証：Science　238巻　1987年、672〜675頁
甲第３号証：Pigment Cell Research　3巻、1990年、38〜43頁　
甲第４号証：国際公開第89/07654号（wo 89/07654）1989年
甲第５号証：Geneal and Comparative Endocrinology、70巻、1988年、127〜132頁
甲第６号証：Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87巻、133〜136頁、1990年
　
２．判断
　
２−１．本件発明　
　上記II．に示したように上記訂正は認められるから、訂正後の本件請求項１乃至１９に係る発明（以下、「本件発明１乃至１９」という。）は、上記訂正請求により訂正された特許請求の範囲の請求項１乃至１９に記載された事項により特定される、以下のとおりのものである。
　「【請求項１】(ａ)ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現する、アフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素被験細胞を、ＰＰＧタンパク質を活性化させるかまたは阻害する化学物質と接触させ、結果として細胞内で色素を分散させるかまたは凝集させること；そして(ｂ)細胞内での色素の局在にいずれかの変化をもたらすことにより、化学物質がアゴニストかまたはアンタゴニストかを決定すること、を含む、ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストである化学物質を同定する方法。
【請求項２】工程(ａ)の前に、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、被験細胞中で色素の凝集を引き起こすために、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、細胞中で色素の分散を引き起こすために、第一の刺激物質を適用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】工程(ｂ)において、アゴニストの存在を示すような色素性状の変化を引き起こすかどうかを決定することにより、化学物質がアゴニストかどうかを決定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】外来性のクローンを発現せず、そして特定の刺激物質に反応してその色素を分散しまたは凝集することができるが、第一の刺激物質に対しては色素を分散しまたは凝集することができない、対照細胞を用いることによる対照をさらに含み、そして色素性状における変化が第一の刺激物質と接触するときに対照細胞中で引き起こされることがない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】化学物質との接触の後に細胞を観察して、細胞の色素性状の状態が変化しないことを決定すること、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、化学物質と接触させた被験細胞に対して、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化による色素分散を誘導することができる第二の刺激物質を添加するか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の凝集を誘導することができる第二の刺激物質を添加すること、そして第二の刺激物質が色素性状の変化を引き起こすかどうかを決定し、変化がないことにより上記化学物質がアンタゴニストであることの示唆を得ること、により、工程(ｂ)において化学物質がアンタゴニストかどうかを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】被験細胞に対して記載されているのと同一の対照細胞を使用し、そして対照細胞は前記化学物質で処理しない点以外は被験細胞に対して適用された条件と同一の条件下で、対照細胞を使用することによる対照をさらに含む、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】ＰＰＧタンパク質がＧＰＣ受容体である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】ＰＰＧタンパク質がセロトニン受容体である、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】ＰＰＧタンパク質がＭＳＨ受容体である、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】ＰＰＧタンパク質が、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２またはＧタンパク質である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】下記の工程からなる、ＧＰＣ受容体のクローニング方法：(ａ)ｉｎ　ｖｉｔｒｏで継続的に増殖をすることができるアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素細胞に、外来性の細胞表面受容体をコードする外来性の核酸クローンを導入し；(ｂ)該細胞に、内在性の受容体を活性化することにより該細胞中の色素配置を初期状態にする刺激を与え；(ｃ）色素配置が初期状態になった上記細胞を、ＧＰＣ受容体を活性化する化学物質と接触させ、そして(ｄ)該化学物質との接触により色素配置がその初期状態から変化した細胞を同定し、細胞の色素配置の変化をＧＰＣ受容体をコードする外来性クローン発現の指標とする。
【請求項１２】ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現し、そして刺激物質を与えたときに細胞中で色素を分散しまたは凝集することができる、請求項１に記載の方法のために使用するアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ　)の色素細胞。
【請求項１３】細胞がアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ)の黒色素胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】ＰＰＧタンパク質がセロトニン受容体またはＭＳＨ受容体であるか、またはタンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２またはＧタンパク質である、請求項１２または１３に記載の細胞。
【請求項１５】化学物質が外来性ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するかどうかを決定するためのキットであって、(ａ)外来性ＰＰＧタンパク質をコードする外来性クローンを発現する、１またはそれ以上のアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ)の色素細胞;(ｂ)外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の凝集を誘導することができるか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の分散を誘導することができる刺激物質(例えば第一の刺激物質);そして(ｃ)アンタゴニストのキットについては、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の分散を誘導することができるか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素凝集を誘導することができる、第二の刺激物質、を１またはそれ以上のコンテナ中に含む、前記キツト。
【請求項１６】(ａ)色素被験細胞がアフリカツメガエルの黒色素胞であり；(ｂ)刺激物質(例えば第一の刺激物質)が、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することにより色素の分散が誘導される場合にはメラトニン、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合にはメラニン細胞刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】ＰＰＧタンパク質がＧＰＣ受容体である、請求項１２〜請求項１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】ＰＰＧタンパク質がＧＰＣ受容体である、請求項１５または請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】外来性の核酸クローンが、プラスミドベクター中で作成したｃＤＮＡライブラリーより得たものであり、それがエレクトロポレーションにより色素細胞に導入される、請求項１１の方法。」
　
２−２．甲号証記載事項
　
甲第１号証：The Journal of Biochemistry262巻32号15796〜15802頁、1987年
（１−１）アフリカツメガエル卵母細胞にヒトβ2アドレナリン受容体のｃＤＮＡ由来のＲＮＡを注入し、受容体を発現させた。発現した受容体はβ2アドレナリン受容体リガンドと結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化し、それは通常の組織におるβアドレナリン受容体と同様の様式でアゴニストによって調節(脱感作)された。(第１５７９６頁右欄第２６〜３２行)
（１−２）βアドレナリン受容体のＲＮＡを注入した後では、イソプロテレノールは酵素活性の刺激を１０倍程度引き起こした。これは、２種類のβアドレナリン性アンタゴニストによって完全にブロックされ(図６)、β２選択的のＩＣＩ１１８５５１はβ１選択的のべタキソロールよりも約１００倍有効であった。(第１５７９７頁右欄下から１２行〜７行)
（１−３）我々の結果は、アフリカツメガエル卵母細胞へのヒトβ2アドレナリン受容体ｃＤＮＡから転写したＲＮＡの注入により、これら細胞に完全に機能的かつ調節可能なβ２アドレナリン受容体の発現が導かれたことを示す。受容体は、典型的なβ２アドレナリン受容体の特異的特性を伴い、リガンドに結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化する。(第１５８００頁右欄第１〜６行)
 
甲第２号証：Science　238巻　1987年、672〜675頁
（２−１）特定の受容体サプタイプが様々なエフェクター系に共役し得るかどうかを調べるために、組換え型のＭ２ムスカリン受容体を内在性受容体のない細胞に発現させた。(第６７２頁要約第１〜３行）
（２−２）チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)をブタ心房由来のＭ２ムスカリン性アセチルコリン受容体(Ｍ２ ｍＡＣｈＲ)相補性ＤＮＡの発現を誘導するべクターで安定的に形質移入した。(第６７２頁左欄下から１行〜中欄第３行)
（２−３）アンタゴニストである［3Ｈ]キニヌクレジニルベンジレート(［3Ｈ]ＱＮＢ)は、解離定数(ＫＤ)７５ｐＭで、形質転換した無傷のＣＨＯ細胞に結合し、これは細胞ホモジネートでの値(６３ｐＭ)の我々の知見と同様であり、天然型ブタ心房のムスカリン性アセチルコリン受容体との比較は４７に対して６１ｐＭであった。(第６７２頁中欄第８〜１４行)
（２−４）心臓及び脳においては、ｍＡＣＴＲには少なくとも２つのアゴニスト親和状態があり、おそらく、Ｇタンパク質との相互作用に由来する。実際に、受容体からＧタンパク質を脱離させるグアノシン三リン酸(ＧＴＰ)及びその非加水分解性アナログは、高親和性ｍＣｈＲｓを低親和性に変換する。形質転換した細胞のホモジネートにおいては、３０%のムスカリン性アセチルコリン受容体はアゴニストであるカルバコールと高親和性を示した(図１Ａ)。グアノシン５'−(３−０−チオ)３リン酸(ＧＴＰγＳ)は高親和性部位の７０%を低親和性に変換した。アゴニストであるオキソトレモリンは高親和性で２４%のムスカリン性アセチルコリン受容体を認識し、ＧＴＰγＳはそのうち４５%を低親和性に変換した(図１Ｂ)。これらの結果(表１)は天然型ブタ心房Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体で得られていた結果と同様である。百日咳毒素(ＰＴＸ)のアゴニスト結合に対する効果についても検討した(図１)。ＰＴＸはＧタンパク質のアデノシン２リン酸(ＡＤＰ)−リボシル化を触媒し、それらの受容体との相互作用をアゴニストへの受容体の親和性を減少させることにより阻害する(１)。形質転換細胞のＰＴＸ処置によって高親和性カルバコール、オキソトレモリン結合部位の数はＧＴＰγＳによる減少と同程度にまで減少し(図１、表１)、導入したムスカリン性アセチルコリン受容体がＣＨＯ細胞の内在性Ｇタンパク質と相互作用したことが確認された。さらに、様々なアゴニスト結合状態は一種類のムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイブの特性、即ち高親和性状態はＧタンパク質との相互作用に由来する。組換え型ムスカリン性アセチルコリン受容体とＧタンパク質の相互作用の結果生化学的応答共役するかどうかを調べるため、我々はカルバコールの２次伝達系であるアセチルコリン(ＡＣ)とフォスフォリパーゼＣ(ＰＬＣ)の二種類に対する影響を調べた。実験条件(１０,１９−２１）はこの応答を最適化するものを選んだ。カルバコール誘導のＡＣ阻害は細胞内アデノシン３',５'−モノリン酸(ｃＡＭＰ)レベルをフォルスコリン刺激の後測定した(２１,２２)。ｃＡＭＰレベルがｃＡＭＰフォスフォジェステラーゼ活性の変化に影響されていないことを確認するために、フォスフォジエステラーゼ阻害剤であるイソブチルメチルキサンチン(ＩＢＭＸ)を使用した。フォルスコリン誘導のｃＡＭＰ蓄積の５０%有効量(ＥＤ５０)はカルバコール濃度７.１×１０−8Ｍであり、カルバコール濃度１０−4Ｍにより１６.５倍誘導の７６%までが阻害された(図2Ａ)。(第６７２頁中欄第１７行〜右欄第２９行)
　
甲第３号証：Pigment Cell Research　3巻、1990年、38〜43頁　
（３−１）日光の照射は皮膚において多様な生物学的応答を引き起こす。しかしこれらの応答に付随しているメカニズムはほとんど理解されていない。これらの現象の原因を学ぶために、我々は培養したアフリカツメガエルの黒色素胞(メラニン保有細胞)への光の効果を研究した。可視光線照射後最初の１分の内に細胞内ｃＡＭＰレベルの著しい上昇が刺激された。この光誘導によるｃＡＭＰ上昇はメラトニンによって阻害され、同様に照射した線維芽細胞においては認められなかった。これらのデータにより、両生類の皮膚の色素細胞での光応答はｃＡＭＰにより仲介されるメカニズムでありうることが示され、またこの過程に関与するロドプシンファミリーのユニークなメンバーを提案する。(第３８頁要約)
（３−２）多くの種に由来する黒色素胞において、色素顎粒の分散は、細胞内３',５'−環状アデノシンモノリン酸(ｃＡＭＰ)レベルを上昇させるテオフィリンといった刺激に応答して起こり、一方ｃＡＭＰの減少(例えばエピネフリンによって起こされる)は色素顎粒の凝集をもたらす。(第３８頁左欄下から４行〜右欄第３行)
（３−３）本報においては、我々はアフリカツメガエル由来の培養黒色素胞への光照射が細胞内ｃＡＭＰの上昇、並びにメラノソームの分散を誘導することを確立した。(第３８頁右欄第１８〜２１行)
（３−４）５０ｃｍ長ファイバー可視ケーブル経由の１５０Ｗハロゲンバルブからの白光を０.６０ｍＷ/ｃｍ2で、凝集した色素類粒を含んだ培養黒色素胞を照射した。メラノソームの分散は照射後１５−２０分で最高値となった(図２)。ｃＡＭＰレベルは照射の最初の１分間急速に上昇し、約５分後に最大レベルで定常状態となった(図３)。この最大レベル(８,４５０±５２４ ｐｍｏｌ/ｍｇ 蛋白)は基礎レベルに比して４００%上昇に相当し、全照射時間の３０分間実質的に維持された。引き続いて、細胞を暗環境に戻したところ、ｃＡＭＰレベルは減少し、基礎レベルまで下がった(図４)。光刺激時におけるｃＡＭＰの変化は３つの理由により光刺激に応答する非特異的細胞応答の結果ではない。第一に、松果体由来ホルモンであるメラトニンは、ＭＳＨにより誘導されるｃＡＭＰの上昇とメラノソームの分散両方をブロックすることが知られているが、光の細胞への影響を阻害する。第二に、線維芽細胞は細胞内ｃＡＭＰ濃度上昇をともなう光照射に応答しない。最後には、Ｗｒａｔｔｅｎ赤フィル夕を通した光の照射では細胞でメラノソームの分散は起こらず、暗中においたコントロールと較べて光照射した細胞には一過性の上昇さえもない(サーミスター温度計で正確に０.１℃にて測定)(第４０頁右欄第７行〜下から７行)
（３−５）ここで議論している知見や見解に基づき、我々は色素細胞がユニークなロドプシンファミリーのメンバーを有するのではないかと推定する。ロドプシンに対する吸光度スペクトル(図６)は黒色素胞の反応スペクトルと似ている。４９８ｎｍのピークは網膜の蛋白結合に由来する(Ｈａｒｇｒａｖｅ,１９８２)。細胞中のロドプシンは、ＧＴＰ結合タンパク質でありｃＧＭＰを二次メッセンジャーとして利用するトランスデューシンと共役しているが(Ｓｔｒｙｅｒ,１９８６)、これに対しこの推定上のロドプシンファミリーの新メンバーは、βアドレナリン受容体同様に(Ｓｔｒｙｅｒ　ａｎｄ　Ｂｏｕｒｎｅ,１９８６)、おそらくＧＳに共役し、ｃＡＭＰ産生を制御しているであろう。(第４２頁左欄第１行〜右欄第４行)
　
甲第４号証：国際公開第89/07654号（WO 89/07654）1989年
（４−１）本発明は、酵素、受容体、および他のタンパク質の阻害因子及び活性化因子の両者を発見および同定する一般的スクリーニング方法に関する。(第１頁第６〜１４行)
（４−２）この方法は、目的タンパク質(ＰＯＩ)をコードするＤＮＡ(又はｃＤＮＡ)配列を適当なべクター中に挿入すること、および(１)発現べクター単独(「対照」細胞系)または(２)目的タンパク質をコードするＤＮＡ(又はｃＤＮＡ)配列を挿入した発現べクター(「試験」細胞系)を包含する細胞系の産生に関する。(第４頁第２９〜３５行)
（４−３）目的タンパク質を阻害又は活性化する物質は、増殖速度、腫瘍発生の可能性、抗腫瘍発生の可能性、抗転移の可能性、細胞の形態学、抗原の発現、および/または接着非依存性の増殖能力のごとき特性に影響を及ぼすことができる。目的タンパク質を特異的に阻害又は不活性化する物質は、対照細胞系より試験細胞系により大きい作用を有することにおいて他の機構により細胞の形態または増殖に影響を与える物質と区別することができる。この系はいくつかのｃＤＮＡ及びいくつかの受容細胞系を使用して試験された。そして容易に自動化することができる。(第５頁第１４〜２７行)
（４−４）酵素類の阻害因子又は活性化因子の同定にこのスクリーニング方法を使用することは特別に興味のあることである。とくにそれを利用して、腫瘍発生及びそれに関係する現象に関与する酵素、例えばタンパク質キナーゼＣ、オルニチン脱炭酸酵素、環状ＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、インスリンのタンパク質キナーゼドメイン及びＥＧＦ受容体、および種々の細胞の腫瘍遺伝子、例えばｓ−ｓｒｃ(ＰＰ６０src)またはｃ−ｒａｓ(Ｐ２０ｒａｓ)遺伝子の酵素産生物の阻害因子又は活性化因子を同定することに興味がもたれる。(第１４頁第５〜１４行)
　
甲第５号証：Geneal and Comparative Endocrinology、70巻、1988年、127〜132頁
（５−１）シロザケ由来黒色素胞（メラニン保有細胞）刺激ホルモン（ＭＳＨ）は、硬骨魚類であるメダカの単離した黒色素胞の色素拡散を引き起こす。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、光によって色素拡散が起こり、暗くすると色素凝集が起こるという応答であるメダカ黒色素胞のバイオアッセイは、メラニン細胞刺激ホルモンの活性を測定するのに利用されてきた。・・・本件バイオアッセイは、メラニン細胞刺激ペプチドの生物活性のユニークな決定方法を提供する。（第１２７頁要約）
（５−２）従前からの硬骨魚類の黒色素胞バイオアッセイを開発する試みは成功交じりであった。メダカ(Ｏｒｙｚｉａｓ　ｌａｔｉｐｅｓ)の黒色素胞はｉｎ　ｖｉｔｒｏのスキンバイオアッセイにおいてＭＳＨ非感受性のようであった(Ｎｅｇｉｓｈｉ　ａｎｄ　Ｏｂｉｋａ,１９８０)。分離したメダカ鱗が通常生理食塩水中で色素分散を呈するので、ＭＳＨの分散活性を測定するには、まず第一に黒色素胞をアドレナリンあるいはＭＣＨで凝集させておかなければならない。(第１２７頁左欄第１２〜２２行)
（５−３）結果　黒色素胞は６００ルクスの光線下の培地中で完全に分散し(図１ａ)、暗中に４０分おくと完全に凝集した(図１ｂ)。β−ＭＳＨ　Ι(１０−９　Ｍ)処理では、光がまったくないにも拘わらず５分以内にメラノソームの分散が起こった(図１ｃ)。引き続いて生理食塩水でホルモンを取り除くと、メラノソームは２０分以内に求心性に移動した。図２は未処理の黒色素胞が暗中に置いている限り凝集していることを示す。次に光で照射すると、培養した黒色素胞は徐々に分散し、１０分後には完全分散を達成した。図３はβアドレナリン阻害薬であるプロプラノロールの、β−ＭＳＨ　Ιによる色素分散に対する効果を示す。β−ＭＳＨが誘導する黒色素胞分散はプロプラノロールによっては影響されなかった。図４は、シロザケ由来のα−ＭＳＨが様々な用量でのメラノソーム分散活性を示す。この結果はα−ＭＳＨ　Ｉ濃度が１０−11〜１０−15の間で用量依存性であることを示す。図５は、１０−13Ｍ濃度でのサケα−ＭＳＨ及び合成α−ＭＳＨのメラニン分散活性を示す。これらホルモンの最小有効用量はα−ＭＳＨ　Ｉは１０−15Ｍ、Ｎ−ｄｅｓ−Ａｃ−ａ−ＭＳＨ　Ｉは１０−13Ｍ、β−ＭＳＨ　Ιは１０−１１Ｍ、合成α−ＭＳＨ　Ｉは１０−13Ｍと概算された。(第１２８頁左欄第２４行〜右欄第６行)
（５−４）従前の成果により、暗中でのメラノソーム凝集は細胞内ｃＡＭＰあるいはフォスフォジェステラーゼ阻害剤であるテオフィリンによって反転されることが示されている(Ｎｅｇｉｓｈｉ,１９８５)。つまりメダカでのメラノソーム凝集は細胞内ｃＡＭＰレベルの減少によって起こされているようである。一般的に、ＭＳＨは細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇によって黒色素胞での色素拡散をもたらすことが認知されている(Ａｂｅ　ｅｔ　ａｌ.,１９６９:Ｇｏｌｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｈａｄｌｅｙ,１９６９;Ｂａｇｎａｒａ　ａｎｄ,１９７３;Ｆｕｊｉｉ　ａｎｄ　Ｏｓｈｉｍａ,１９８６)。それゆえ、ＭＳＨ類によるメダカメラノソームの拡散が細胞内ｃＡＭＰレベルの増強によってもたらされると提案することは妥当であると思われる。ＭＳＨ類は低濃度において暗中でのメラノソームの拡散をもたらしうるが、それは細胞内ｃＡＭＰで調節されている。また、色素凝集は細胞内ｃＡＭＰの比較的少量の変化によって調節され得る。(第１２８頁右欄下から５行〜第１３０頁右欄第６行)
　
甲第６号証：Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87巻、133〜136頁、1990年
（６−１）下垂体前葉腫蕩細胞系ＡｔＴ２０から単離したＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、機能性ソマトスタチン(ＳＲＩＦ、ソマトトロピン放出阻害因子)受容体を発現させた。ＳＲＩＦ受容体は個々の卵母細胞にβ2アドレナリン性アゴニスト刺激によるｃＡＭＰ形成のＳＲＩＦによる阻害活性の測定により検出した。(第１３３頁左欄要約第１〜６行)
（６−２）個々の卵母細胞でのｃＡＭＰレベルの変化を検出する能力は、ＳＲＩＦ受容体ｃＤＮＡならびにアデニル酸シクラーゼの刺激あるいは阻害に機能的に共役する他の受容体の発現クローニングに簡便な手法を提供するであろう。(第１３３頁左欄要約第１７〜２１行)　
　
２−３．対比・判断　
　
（本件発明１）
　本件発明１は、色素の拡散凝集を媒介しうるＰＰＧ外因性レセプタータンパク質を、アフリカツメガエルの色素細胞に発現させて、細胞内の色素を拡散凝集させることにより、薬剤候補を簡単にスクリーニングできるものである。
　これに対して、甲第１号証には、外因性のヒトβ2アドレナリン受容体がアフリカツメガエルの卵母細胞によって発現され、ｃＡＭＰ調節レベルで機能し得ることが、甲第２号証には、外因性のＭ２ムスカリン性アセチルコリン受容体がチャイニーズハムスターの卵巣細胞によって発現され、ｃＡＭＰ調節レベルで機能し得ることが、夫々記載されているが、甲第１乃至２号証は、ｃＡＭＰ調節レベルで機能し得る外因性レセプターが未分化の細胞によって発現され得ることが記載されているだけであって、色素の拡散凝集を媒介しうるＰＰＧ外因性レセプタータンパク質を、分化したアフリカツメガエルの色素細胞に発現させて、細胞内の色素を拡散凝集させ得ることは記載されていないし、また、それを示唆する記載もない。
　甲第３号証には、アフリカツメガエル由来の培養黒色素胞への光照射が細胞内ｃＡＭＰの上昇、並びにメラノソームの分散を誘導するメカニズムが記載され、甲第５号証にはＭＳＨ類によるメダカメラノソームの拡散が細胞内ｃＡＭＰレベルの増強によってもたらされることが記載されているが、甲第３及び５号証には、黒色細胞における色素の移動がｃＡＭＰレベルの変化で達成されることが記載されているに留まり、色素の拡散凝集を媒介しうるＰＰＧ外因性レセプタータンパク質を、分化したアフリカツメガエルの色素細胞に発現させて、細胞内の色素を拡散凝集させ得ることは記載されていないし、また、それを示唆する記載もない。。
　甲第４号証は、外因性蛋白質を発現する非色素細胞が細胞形態の変化を観察することによって、化学物質に対する応答をモニターする一般的技術が記載されているだけで、色素の拡散凝集の利用は全く示唆されておらず、甲第６号証は、ｃＡＭＰ濃度の変化を観察することでクローニングの成否をモニターすることが記載されているだけで、色素の拡散凝集の利用は全く示唆されていない。
　そして、本件発明１は、外因性レセプターであるＰＰＧタンパク質が色素の移動を制御するｃＡＭＰレベルで機能し得るようにアフリカツメガエルの色素細胞において発現され、潜在的薬剤がＧＰＣリセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を評価する速度を、現在の方法に比べて非常に高めることができるという明細書記載の格別の効果を奏するものと認められる。
　特許異議申立人は、甲第１、２号証記載の発明において、アフリカツメガエルの卵母細胞又は、チャイニーズハムスターの卵巣細胞に代えて、爬虫類、両生類、魚類、甲殻類及び棘皮動物からなる群から選択される動物の色素細胞を用い、その色素細胞で発現させた外来性受容体とリガンドとの結合を、細胞内で色素を分散させるかまたは凝集させること、そして細胞内での色素の局在にいずれかの変化をもたらすことにより評価することは、甲第３号証に記載された技術事項を勘案すれば、当業者が必要に応じて容易になし得る旨主張している。
　しかしながら、未分化の卵母細胞等で外因性レセプターが発現したからといって、分化細胞である特定のアフリカツメガエルの色素細胞で、外因性レセプターがｃＡＭＰレベルで色素の拡散凝集を生じ得る程度に大量に発現するかどうかは不明であり、また、アフリカツメガエルの色素細胞が、外因性ＰＰＧタンパク質と相互作用して色素の拡散凝集を生じ得るために必要な内在タンパク質を含むかどうかも不明であったのであるから、外因性レセプターであるＰＰＧタンパク質が、色素の移動を制御するｃＡＭＰレベルで機能し得るようにアフリカツメガエルの色素細胞において発現されるということは当業者といえども、予測し得るものとはいえない。 
　特許異議申立人は、平成１５年１２月２６日回答書において、甲第１０乃至１１号証を提出し、甲第１０号証により、分化細胞であるマウスの色素細胞にチロシナーゼｃＤＮＡを導入し、その発現産物のチロシナーゼ活性を確認したこと、甲第１１号証により、分化細胞であるアフリカツメガエルの肝臓細胞にヒトエストロゲン受容体ｃＤＮＡ発現ベクターを高効率で導入し、その発現産物がエストロゲン受容体として機能することを確認したことが知られているから、分化したアフリカツメガエル等の色素細胞においても、ＰＰＧ蛋白質をコードする外来遺伝子が機能的に発現することは当業者が充分に予期しうる旨主張しているが、偶々、マウスの色素細胞にチロシナーゼｃＤＮＡを導入し、その発現を確認し、アフリカツメガエルの肝臓細胞にヒトエストロゲン受容体ｃＤＮＡ発現ベクターを導入し、その発現を確認したからといって、前記したとおり、アフリカツメガエルの色素細胞で、外因性レセプターがｃＡＭＰレベルで色素の拡散凝集を生じ得る程度に大量に発現するかどうかは不明であり、また、アフリカツメガエルの色素細胞が、外因性ＰＰＧタンパク質と相互作用して色素の拡散凝集を生じ得るために必要な内在タンパク質を含むかどうかも不明であったのであるから、外因性レセプターであるＰＰＧタンパク質が、色素の移動を制御するｃＡＭＰレベルで機能し得るようにアフリカツメガエルの色素細胞において発現されるということは当業者といえども予測し得ることとはいえず、特許異議申立人の主張は採用できない。
　したがって、本件発明１は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。
  
（本件発明２乃至１０）
　本件発明２乃至１０は、本件発明１の構成要件を全て含み、さらに他の構成要件を付加したものに相当するから、本件発明１と同様の理由で、本件発明２乃至１０は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。　　
　
（本件発明１１）
　本件発明１１は、「ｉｎ　ｖｉｔｒｏで継続的に増殖をすることができるアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ)の色素細胞に、外来性の細胞表面受容体をコードする外来性の核酸クローンを導入し、細胞に、内在性の受容体を活性化することにより該細胞中の色素配置を初期状態にする刺激を与え、色素配置が初期状態になった上記細胞を、ＧＰＣ受容体を活性化する化学物質と接触させ、そして、該化学物質との接触により色素配置がその初期状態から変化した細胞を同定し、細胞の色素配置の変化をＧＰＣ受容体をコードする外来性クローン発現の指標とするＧＰＣ受容体を発現する両生類の色素細胞のクローニング方法」であるから、本件発明１と同様の理由で、本件発明１１は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。　
　
（本件発明１２）
　本件発明１２は、本件発明１に使用する「ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現し、そして刺激物質を与えたときに細胞中で色素を分散しまたは凝集することができるアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ)の色素細胞」であるから、本件発明１と同様の理由で、本件発明１１は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。
　
（本件発明１３乃至１４）
　本件発明１３乃至１４は、本件発明１２の構成要件を全て含み、さらに他の構成要件を付加したものに相当するから、本件発明１２と同様の理由で、本件発明１３乃至１４は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。　
　
（本件発明１５）
　本件発明１５は、本件発明１の構成要件を全て含み、さらに他の構成要件を付加した「化学物質が外来性ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するかどうかを決定するためのキット」であるから、本件発明１と同様の理由で、本件発明１５は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。
　
（本件発明１６）
　本件発明１６は、本件発明１５の構成要件を全て含み、さらに他の構成要件を付加したものに相当するから、本件発明１５と同様の理由で、本件発明１６は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。　
　
（本件発明１７）
　本件発明１７は、本件発明１２乃至１４の構成要件を全て含み、さらに他の構成要件を付加したものに相当するから、本件発明１２乃至１４と同様の理由で、本件発明１７は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。
　
（本件発明１８）
　本件発明１８は、本件発明１５乃至１６の構成要件を全て含み、さらに他の構成要件を付加したものに相当するから、本件発明１５乃至１６と同様の理由で、本件発明１８は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。
　
（本件発明１９）
　本件発明１９は、本件発明１１の構成要件を全て含み、さらに他の構成要件を付加したものに相当するから、本件発明１１と同様の理由で、本件発明１９は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものともすることはできない。
　
　また、特許異議申立人は、アフリカツメガエルの黒色素胞と２，３の受容体において効果が認められるからといって、両生類以外の動物の色素細胞においてレセプターの発現が色素の移動機構にどの程度影響するか予測できることにはならないから、本件明細書の記載が不備である旨主張しているが、この点については、上記訂正により、「爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物」は、「アフリカツメガエル」に限定されたから、記載不備は解消した。
   
３．まとめ
　
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
シグナル形質導入に関与する蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定法
【発明の詳細な説明】
　　　
発明の背景
発明の分野
　本発明は、ヘテロトリマー型グアニンヌクレオチド結合性蛋白質（Ｇ−蛋白質）および／または第２メッセンジャー、たとえばサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を用いる、シグナル形質導入経路に関与する蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化学物質の同定法、ならびにＧ−蛋白質および／または第２メッセンジャー、たとえばｃＡＭＰを用いる、シグナル形質導入径路を介して作用するＧ−蛋白質結合−細胞表面レセプター（ＧＰＣレセプター）をコードする核酸クローンの同定法に関するものである。
背景情報
　ここに述べる刊行物はすべて参考として引用される。
　医学的に重要な生物学的プロセスの多くがＧ−蛋白質および／または第２メッセンジャー、たとえばｃＡＭＰを伴うシグナル形質導入経路に関与する蛋白質により仲介されることは十分に確認されている（レフコヴィッツ（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ）（１９９１）
Ｎａｔｕｒｅ
Ｐｒｏ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｎａｔｕｒｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
　色素細胞に内在する数種類のＧＰＣレセプターを活性化する化学物質のバイオアッセイ法が下記に記載されている：ネギシ（Ｎｅｇｉｓｈｉ）ら（１９８８）
Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ
Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ
Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ
Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　＆　Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ
　以上に挙げた刊行物に記載された方法すべてにおいて、それらと本発明方法との間には下記６つの主要な相異がある：
　（１）本発明方法は連続長期培養において増殖しうる色素細胞に基づくものであるのに対し、上記刊行物に記載されたバイオアッセイ法はいずれも培養において分裂し続ける色素細胞を利用していない。本発明方法の利点は、無制限な数の直系の細胞をアッセイに使用しうることである。これが可能でなければ、大規模の薬物スクリーニングは不可能である。
　（２）本発明方法によってのみ、動物から新鮮な細胞を採取することなく既存のものから形成された色素細胞の継続的供給源を得ることができる。
　（３）本発明方法のみが、組織培養容器内で高い密度にまで増殖しうる色素細胞を使用する。これは多数の薬物をスクリーニングしうるために重要であり、かつこれは標準ミクロタイタープレート読取り装置を用いて信頼性のある結果を得ることができるために重要である。
　（４）本発明方法は、色素細胞上の色素を分散させる内在セロトニンレセプターに作用する薬物をスクリーニングするために利用しうる。これに対し上記に挙げた刊行物の場合、セロトニンは色素を凝集させると述べられている；たとえばメッセンジャーおよびワーナー（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ，Ｗａｒｎｅｒ）（１９７７）
Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
　（５）本発明方法は、色素細胞が天然に発現しないレセプターおよび他の蛋白質に対する薬物のアッセイの基礎として色素細胞が用いられる、組換えＤＮＡ技術を採用する。しかし上記刊行物に記載される方法は色素細胞に内在するレセプターに限定される。
　（６）上記刊行物と異なり、本発明方法のみをＧＰＣレセプターのクローニングに利用しうる。本発明方法は色素細胞の連続培養および組換えＤＮＡ技術を利用するからである。
　現在、ＧＰＣレセプターに対する新規な、より良い薬物を見出すには大きな制限がある。すなわち化学物質がＧＰＣレセプターに作用する能力を試験するための簡単、迅速かつ一般的な初期スクリーニング法が無い。たとえばＧｓまたはＧｉを介して細胞内ｃＡＭＰを増加または減少させる作用をするＧＰＣレセプターを評価するアッセイ法について考えよう。ｃＡＭＰ蓄積についてのラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）は経費がかかり、かつ緩徐であり、１人の技術者が３重試験法で１日２０個以上の化学物質をスクリーニングするのは困難であろう（スタイナー（Ｓｔｅｉｎｅｒ）ら（１９７２）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
定義
　″化学物質″は、薬物、化合物または分子のいずれをも包含するものであると定義される。
　″Ｇ−蛋白質結合−細胞表面レセプター″（ＧＰＣレセプター）は、化学物質により活性化された場合、これがヘテロトリマー型グアニンヌクレオチド結合性蛋白質（Ｇ−蛋白質）を活性化する、いずれかの細胞表面トランスメンブラン蛋白質であると定義される。
　″Ｇ−蛋白質および／または第２メッセンジャーを伴うシグナル形質導入経路に関与する蛋白質（ＰＰＧ蛋白質）″は、この経路に関与するいずれかの蛋白質であると定義され、ＧＰＣレセプター、Ｇ−蛋白質、エフェクター蛋白質およびアクチュエーター蛋白質が含まれる。
　″エフェクター蛋白質″は、Ｇ−蛋白質のαサブユニットにより活性化または不活性化されるいずれかの蛋白質であると定義される。エフェクター蛋白質の若干の例には、アデニルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣおよびホスホリパーゼＡ２が含まれる。ホスホジエステラーゼもエフェクター蛋白質であると考えられる．
　″第２メッセンジャー″は、細胞間または周囲の細胞膜内におけるその濃度がエフェクター蛋白質の活性の結果として上昇または低下する中間化合物であると定義される。第２メッセンジャーの若干の例には、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、たとえばイノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、カルシウム（Ｃａ＋＋）およびアラキドン酸誘導体が含まれる。
　″アクチュエーター蛋白質″は、その活性化状態が第２メッセンジャーの結合の結果として変化する蛋白質であると定義される。エフェクター蛋白質の若干の例には、プテインキナーゼＡおよびプテインキナーゼＣが含まれる。
　Ｇ−蛋白質および第２メッセンジャーｃＡＭＰを用いる１経路の例により、上記の定義の概要を提示する模式図を図１に示す。
　″色素細胞″とは、下記の条件を満たすいずれかの色素含有細胞を意味する：（１）それらは、その色素細胞が特異的刺激、たとえばメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、光などとの接触に応答してそれらの色素を凝集または分散させうるいずれかの動物から誘導される。（２）それらはインビトロで無限に増殖することができ、従って無限な量の細胞が得られる。（３）本発明に用いられる色素細胞（″被験細胞″）にはたとえば下記のクロマトフォア（色素胞）が含まれるが、これらは限定ではない：黒色素胞またはメラニン細胞、黄色素胞、赤色素胞、白色素胞および紅色素胞。色素細胞は進化樹において人類および鳥類より低級の動物から採取される。本発明に用いられる色素細胞を採取しうる″より低級の動物″の例には下記のものが含まれるが、これらは限定ではない：爬虫類（
Ｒｅｐｔｉｌｉａ
Ａｎｏｌｉｓ　ｓｐ
Ａｍｐｈｉｂｉａ
Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ
Ｐｉｓｃｅｓ
Ｚａｃｃｏ　ｔｅｍｍｉｎｃｋｉ
Ｕｃａ　ｐｕｇｉｌａｔｏｒ
Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ
Ｄｉａｄｅｍａ　ａｎｔｉｌｌａｒｕｍ
Ｃｉｎｉｄａｒｉａ
Ｎａｎｏｍｓａ　ｃａｒａ
Ｐｉｇｍｅｎｔ　Ｃｅｌｌ
Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ
　　　
発明の概要
　本発明の目的の１つは、ＰＰＧ蛋白質、特にＧＰＣレセプターに対する新規なアゴニストおよびアンタゴニストを評価するための迅速かつ高感度のバイオアッセイ法を開発することである。
　本発明の他の目的は、ＧＰＣレセプターをコードするＤＮＡのクローニング法を開発することである。
　本発明の他の目的は、ＰＰＧ蛋白質、特にＧＰＣレセプターに対する新規なアゴニストおよびアンタゴニストを評価するためのバイオアッセイ法の実施に用いるキットを提供することである。
　これらの目的および他の目的、意図ならびに利点が本発明により達成される．
　本発明によれば、外来ＧＰＣレセプターに対するアゴニストとして作用する化学物質、たとえば薬物の同定法が提供される。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの色素を分散または凝集しうる、かつＧＰＣレセプターをコードする外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細胞に、外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素分散を誘発する場合は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入するか、または外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素凝集を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色素配置状態を設定する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入し；初期色素配置状態に設定された被験細胞を化学物質と接触させ；そして化学物質で処理された被験細胞において色素配置が初期色素配置状態から変化したか否かを判定することよりなる。対照操作を実施することもできる。対照は上記と同じであるが、ただし外来ＧＰＣレセプターを発現しない色素細胞を用いる。外来ＧＰＣレセプターを発現する被験細胞において色素配置の変化が観察されるが、外来ＧＰＣレセプターを発現しない対照細胞において色素配置の変化が観察されない場合、その化学物質はその外来ＧＰＣレセプターに対するアゴニストである。
　本発明によれば、外来ＰＰＧ蛋白質に対するアゴニストとして作用する化学物質、たとえば薬物の同定法が提供される。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの色素を分散または凝集しうる、かつＰＰＧ蛋白質をコードする外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細胞に、外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素分散を誘発する場合は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入するか、または外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素凝集を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色素配置状態を設定する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入し；初期色素配置状態に設定された被験細胞を化学物質と接触させ；そして化学物質で処理された被験細胞において色素配置が初期色素配置状態から変化したか否かを判定することよりなる。対照操作を実施することもできる。対照は上記と同じであるが、ただし外来ＰＰＧ蛋白質を発現しない色素細胞を用いる。外来ＰＰＧ蛋白質を発現する被験細胞において色素配置の変化が観察されるが、外来ＰＰＧ蛋白質を発現しない対照細胞において色素配置の変化が観察されない場合、その化学物質はその外来ＰＰＧ蛋白質に対するアゴニストである。
　また本発明は、外来ＧＰＣレセプターに対するアンタゴニストとして作用する化学物質の同定法に関するものである。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの色素を分散または凝集しうる、かつＧＰＣレセプターをコードする外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細胞に、外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素分散を誘発する場合は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定する第１刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入するか、または外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素凝集を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色素配置状態を設定する第１刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入し；初期色素配置状態に設定された被験細胞を同定すべき化学物質と接触させ；細胞を観察してそれらの色素配置状態が変化していないことを判定し；同定すべき化学物質と接触させた被験細胞に、外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素分散を誘発する場合は外来ＧＰＣレセプターの活性化により色素の分散を誘発する第２刺激物質を添加し；外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素凝集を誘発する場合は外来ＧＰＣレセプターの活性化により色素の凝集を誘発する第２刺激物質を添加し；そして第２刺激物質を添加した被験細胞において色素配置が初期色素配置状態から変化したか否かを判定することよりなる。対照操作を実施することもできる。対照操作の１例は、外来ＧＰＣレセプターを活性化する第２刺激物質の代わりに、その外来ＧＰＣレセプターの活性化が有するものと同じ作用を色素配置に対して有する、内在ＧＰＣレセプターを活性化する第２刺激物質を導入するものである。被験細胞においては色素配置の変化が観察されないが、対照細胞が実際に色素配置の変化を生じる場合、その同定すべき化学物質はその外来ＧＰＣレセプターに対するアンタゴニストである。
　本発明は、更に、外因性ＰＰＧタンパク質に対するアンタゴニストとして作用する化学物質を同定する方法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つＰＰＧタンパク質をコードする外因性クローンを発現することができる試験細胞に対して、外因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し、または外因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素が試験細胞内で分散している色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し；初期状態の色素配置にある試験細胞を、同定される化学物質と接触させ；それらの色素配置の状態が未変化のままであることを確認させる細胞を観察し；同定される化学物質と接触した試験細胞に対して、外因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、外因性ＰＰＧタンパク質を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤を加え、または外因性ＰＰＧタンパク質を活性化することが色素凝集を誘導する場合、外因性ＰＰＧタンパク質を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を加え；そして第二の刺激剤が加えられた試験細胞中の色素配置が初期状態の色素配置から変化しているかどうかを確認することを含む。対照操作も行うことができる。対照操作の一例は、外因性ＰＰＧタンパク質を活性化する第二の刺激剤の代わりに、色素配置に対して外因性ＰＰＧタンパク質の活性化が有すると考えられるのと同一の効果を有する内因性ＰＰＧタンパク質を活性化する第二の刺激剤を試験細胞に対して導入することである。試験細胞において色素配置に変化が見られない場合、対照細胞は色素配置が変化しないので、同定される化学物質は外因性ＰＰＧタンパク質に対するアンタゴニストである。
　更に、本発明は、内因性ＧＰＣ受容体に対するアゴニストとして作用する化学物質、例えば、黒色素胞に対して内因性であるセロトニンに関するものを同定する方法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性セロトニン受容体を発現することができる試験細胞に対して、刺激剤、例えばメラトニンを導入し；色素凝集の初期状態にある試験細胞を化学物質と接触させ；そして化学物質で処理された試験細胞中の色素が分散しているかどうかを確認することを含む。
　更に、本発明は、内因性ＧＰＣ受容体に対するアンタゴニストとして作用する化学物質、例えば、黒色素胞に対して内因性であるセロトニンに関するものを同定する方法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性セロトニン受容体を発現することができる試験細胞に対して、色素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えばメラトニンを導入し；色素凝集の初期状態にある試験細胞を、同定される化学物質と接触させ；細胞を観察して、それらの色素配置の状態が未変化のままであることを確認し；同定される化学物質と接触した試験細胞に対して、内因性セロトニン受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤を加え；そして第二の刺激剤が加えられた試験細胞中の色素が分散しているかどうかを確認することを含む。対照操作も行うことができる。対照操作の一例は、内因性セロトニン受容体を活性化する第二の刺激剤の代わりに、活性化した場合にセロトニン受容体と同様に色素分散を誘導する別の内因性ＧＰＣ受容体、例えば、ＭＳＨ受容体を活性化する第二の刺激剤を試験細胞に対して導入することである。試験細胞において色素分散が見られない場合、対照細胞は色素分散を行わないので、同定される化学物質は内因性セロトニン受容体に対するアンタゴニストであると考えられる。
　本発明により、更に、黒色素胞に対して内因性であるＰＰＧタンパク質、例えば、内因性プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ等に対するアゴニストとして作用する化学物質を同定する方法を提供する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性ＰＰＧタンパク質を発現することができる試験細胞に対して、ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状態を決定する刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し、またはＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素が試験細胞内で分散している色素配置の初期状態を決定する刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し；初期状態の色素配置にある試験細胞を化学物質と接触させ；そして化学物質で処理された試験細胞中の色素が初期状態の色素配置から変化しているかどうかを確認することを含む。
　本発明は、更に、黒色素胞に対して内因性であるＰＰＧタンパク質、例えば、内因性プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ホスホジエステラーゼ等に対するアンタゴニストとして作用する化学物質を同定する方法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性ＰＰＧタンパク質を発現することができる試験細胞に対して、ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し、または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素が試験細胞内で分散している色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し；初期状態の色素配置にある試験細胞を、同定される化学物質と接触させ；その細胞を観察して、それらの色素配置の状態が未変化のままであることを確認し；同定される化学物質と接触した試験細胞に対して、内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、内因性ＰＰＧタンパク質を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤を加え、または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合、内因性ＰＰＧタンパク質を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を加え；そして第二の刺激剤が加えられた試験細胞中の色素配置が初期状態の色素配置から変化しているかどうかを確認することを含む。
　更に、本発明は、ＧＰＣ受容体をクローン化する方法を提供する。その方法は、カエルなどの下等動物由来で且つインビトロで増殖を続けることができる色素細胞に対して、外因性核酸クローン、例えば、プラスミドベクターにおいて生じたｃＤＮＡライブリーを、任意の許容しうる方法、例えば、エレクトロポレーションによって導入することを含む。次に、その方法は、内因性ＧＰＣ受容体を活性化することによって細胞内の色素配置の初期状態を決定する刺激剤、例えば、化学物質または光を細胞に対して導入し；初期状態の色素配置にある細胞を、外因性受容体を活性化する化学物質と接触させ；そして色素配置が初期状態の色素配置から変化していることによって色素配置の変化が、受容体をコードする外因性クローンを発現する細胞を示す、化学物質で処理された細胞を同定することを含む。
　本発明は、更に、薬剤などのある化学物質が外因性ＧＰＣ受容体に対するアゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１個またはそれ以上の容器中に、受容体をコードする外因性クローンを発現する下等動物色素試験細胞；並びに外因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えばメラトニンおよび／または外因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば、光またはＭＳＨを含む。
　本発明により、更に、ある化学物質が外因性ＧＰＣ受容体に対するアンタゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１個またはそれ以上の容器中に、受容体をコードする外因性クローンを発現する下等動物色素試験細胞；外因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメラトニンおよび／または外因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば光；並びに外因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に外因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤および／または外因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に外因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
　更に、本発明は、薬剤などのある化学物質が外因性ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１個またはそれ以上の容器中に、タンパク質をコードする外因性クローンを発現する下等動物色素試験細胞；並びに外因性タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えばメラトニンおよび／または外因性タンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば光を含む。
　本発明により、更に、ある化学物質が外因性ＰＰＧタンパク質に対するアンタゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１個またはそれ以上の容器中に、タンパク質をコードする外因性クローンを発現する下等動物色素試験細胞；外因性タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメラトニンおよび／または外因性タンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば光；並びに外因性タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に外因性タンパク質を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤および／または外因性タンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に外因性タンパク質を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
　本発明は、更に、薬剤などのある化学物質が内因性ＧＰＣ受容体に対するアゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１個またはそれ以上の容器中に、受容体を発現する下等動物色素試験細胞；並びにその化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えばメラトニンおよび／または化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば光を含む。
　本発明により、更に、ある化学物質が内因性ＧＰＣ受容体に対するアンタゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１個またはそれ以上の容器中に、受容体を発現する下等動物色素試験細胞；その化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメラトニンおよび／または化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば光；並びに化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に、化学物質が向けられている内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤および／または化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に、化学物質が向けられている内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
　更に、本発明は、薬剤などのある化学物質が内因性ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１個またはそれ以上の容器中に、タンパク質を発現する下等動物色素試験細胞；並びに内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えばメラトニンおよび／または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば光を含む。
　本発明により、更に、ある化学物質が内因性ＰＰＧタンパク質に対するアンタゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１個またはそれ以上の容器中に、タンパク質を発現する下等動物色素試験細胞；内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメラトニンおよび／または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば光；並びに内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性ＰＰＧタンパク質を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤および／または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性ＰＰＧタンパク質を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
　本発明に関する上記論及において、色素配置の初期状態を決定する基準は「化学物質または光」を用いて行われることが多い。キセノプス・レヴィス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）由来の黒色素胞に関して研究した本発明者の経験では、色素凝集の初期状態を決定する最も好都合な方法はメラトニンを用いることであるが、色素分散の初期状態を決定する最も好都合な方法は光を用いることである。これらの選択の理由は、双方の場合において、それらの効果が、色素配置に対して反対の効果を有する刺激によって速やかに且つ容易に克服されることによる。このことは、全ての種類の色素胞の場合ではない。例えば、多数の魚類の黒色素胞は、それらの色素を分散させる代わりに凝集させることによって光に反応するが、メラトニンには全く反応しない。このような黒色素胞を本発明で用いるために開発したならば、別の初期刺激、例えば、色素凝集に対する光および色素分散に対するエピネフリンが用いられるであろう。しかしながら、検定に関係する実際の化学物質または光および色素胞にかかわりなく、その概念は同様である。
　　　
図面の簡単な説明
　図１はＧ−蛋白質及び第二メッセンジャー（本ケースではｃＡＭＰ）を用いたシグナル形質導入経路の一例を示す模式図である。
　図２ａはメラトニンで処理した細胞を示す写真であり、図２ｂはＭＳＨで処理した図２ａと同じ細胞を示す写真である。
　図３は
Ｘｅｎｏｐｕｓ
ｌａｅｖｉｓ
　図４ａ及び４ｂは色素顆粒が凝集または分散されたコンフルエント細胞により示される不透明性の相違を比較する写真である。
　図５は最初にメラトニンで色素凝集状態にセットされ次にＭＳＨで処理されたコンフルエントのメラノフォアを含む９６ウェルプレートのウェルによる、吸光度と時間の変化のプロットである。
　図６ａは各ウェルを異なる組合せのメラトニンとＭＳＨで処理した各ウェルを有する９６ウェルプレートにおけるメラノフォアに関してのドーズリスポンスカーブの写真表示であり、図６ｂはマイクロタイタープレートリーダーにより変換された図６ａと同じ情報のグラフ表示である。
　図７はメラノフォアが（本ケースではβ−ガラクトシダーゼをコードするｃＤＮＡの発現により）組換えＤＮＡを発現できることを示す写真である。
　図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、メラノフォアが外来ヒトβ−２−アドレナリン性リセプターを発現できること、及び該リセプターが刺激されたとき色素細胞がその色素を分散させることを示す一連の写真である。
　図９は色素細胞内で発現することが知られているＧ−蛋白質の異なるサブユニットを示す模式図である。
　図１０はβ−２−アドレナリン性リセプターアゴニストアッセイの模式図である。
　図１１はβ−２−アドレナリン性リセプターアンタゴニストアッセイの模式図である。
　図１２はα−２−アドレナリン性リセプターアゴニストアッセイの模式図である。
　図１３はα−２−アドレナリン性リセプターアンタゴニストアッセイの模式図である。
　図１４ａ及び１４ｂは模式図である。図１４ａは細胞の仮想区域における色素配置の初期状態を示す；図１４ｂはそのリセプターをクローンすべき薬剤で処理した後の同区域での色素分散を示す。
　図１５は、ボンベシンリセプターをコードする種々の組合せのプラスミドでの形質転換に続いてのボンベシンに対する応答性メラノフォアの割合対ベータガラクトシダーゼ応答性メラノフォアの関係を示すグラフである。
　　　
発明の詳細な説明
概要
　本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで連続増殖可能で、そしてＧ−蛋白質および／または第二メッセンジャー（例えばサイクリックアデノシンモノフォスフェート（ｃＡＭＰ））を用いたシグナル形質導入経路に関与する蛋白質の刺激に応答して外観を劇的に変化させることが可能な特殊な色素細胞ライブラリーの開発を利用したものである。
　出願人は、ＧＰＣリセプター及び他のＰＰＧ蛋白質を活性化または阻害する能力について、文字通り１日に何千もの化学物質をスクリーニングするために用いることが可能な、正確で直接的バイオアッセイを設計した。試験可能なＧＰＣリセプターの例には、ベータ　２−アドレナリン性リセプター、ボンベシンリセプター及びセロトニンリセプターが含まれる。試験可能な他のＰＰＧ蛋白質の例には、アデニルサイクラーゼ及びプロテインキナーゼＣが含まれる。
　本発明の主な利点は、潜在的薬剤がＧＰＣリセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を評価する速度を、現在の方法にくらべで非常に高めることができる点である。その本質において、ＧＰＣリセプター、例えばベータ　２−アドレナリン性リセプターをコードするｃＤＮＡクローンを、数あるなかの任意の標準方法例えばエレクトロポレーションにより、色素細胞に導入する。一時的もしくは永久的に該リセプターを発現する細胞を基礎としてバイオアッセイを行い、化学物質の該細胞に対する添加が該細胞内の色素の配置状態にいかに影響するかを観察することにより、該化学物質のベータ　２−アドレナリン性リセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストとしての能力を評価する。同様にして、該細胞は、化学物質が既に色素細胞に存在するＧＰＣリセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を評価するために用いることも可能である。最後に、該細胞は、化学物質が既に色素細胞に存在するＰＰＧ蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を評価するために用いることも可能である。
　出願人はさらに、ＧＰＣリセプターをコードするｃＤＮＡのクローニング方法も設計した。例えば、二つの公知タイプのグルカゴンリセプターが存在し、両者ともＧＰＣリセプターである（Ｗａｋｅｌａｍ，Ｍ．Ｊ．Ｏ．，　Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｊ．，　Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．及びＨｏｕｓｌａｙ，Ｍ．Ｄ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２３：６８−７１）。それらの一方は、細胞内のｃＡＭＰレベルを調節するシグナル形質導入経路を活性化し、他方はＩＰ３のレベルを調節する。いずれのパスウェイも色素の分散を誘発するから、これらリセプターの両者は新たな方法でクローニング可能である。本発明は、色素含有細胞を、目的リセプター（本ケースではグルカゴン）を発現する組織または細胞ライン内に存在するｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリー（プラスミドもしくはウイルス性）で、色素含有細胞をトランスフェクトするために、分子生物学的方法を用いる。イメージ形成システム、例えばコンピューターガイドビデオシステムまたは写真もまた、グルカゴンに応答して色素顆粒（メラノゾーム）を分散する色素細胞を同定するために、用いることができる。一旦反応性細胞が見つかったら、目的リセプターをクローニングするために、いくつもの周知の方法を用いることができる。
細胞
　黒色素胞の培養物を得た。黒色素胞の長期連続培養物を確立した（Ｉｄｅ（１９７４），
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ
刺激剤
　ＧＰＣ受容体またはＰＰＧタンパク質に影響を及ぼす薬剤は黒色素胞に劇的変化をもたらす。生きている動物、皮膚および培養細胞を用いる実験に基づいて、各種動物からのいくつかの型の色素胞、および特に黒色素胞は、そのメラノソームを拡散するか、あるいは凝集することによって多数の薬剤に応答することが長年知られてきた（Ｌｅｒｎｅｒ　ａｎｄ　Ｃａｓｅ（１９５９），Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，３２：２１１−２２１；Ｂｕｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７９），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．，２０８：１７−３４；Ｈｏｇｂｅｎ　ａｎｄ　Ｓｌｏｍｅ（１９３１）Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃ．Ｂ．，１０８：１０−５３）。色素拡散を誘導する化学物質の一例はメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）を含む。一方、メラトニンは色素凝集を引き起こす。ノルエピネフリンのようないくつかの薬剤は
Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ
Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓ
Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ
Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓ
Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓ
Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓ
　本出願人は
Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ
Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ
　表１は、本出願人の黒色素胞において色素移動を誘導する化学物質と光のリストの一部分を示す。
　光導入メラノソーム分散はＧ−蛋白に基づくシグナル形質導入経路によって仲介される。アフリカツメガエル由来のメラニン保有細胞の場合では、経路には第２のメッセンジャーとしてｃＡＭＰが用いられる。この発見は、メラニン保有細胞中への光形質導入は脊椎動物の視覚系において使用されたｃＧＭＰに基づく系と異なる第２のメッセンジャー系によって仲介されるという観点からみて、驚くべきものである（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，９：８７−１１９）。しかしながら、ここでの重要な点は、色素の細胞感光性によって、非常に簡単なやり方で細胞を色素分散状態に固定でき、そして色素の凝集を起こす化学物質をスクリーニングするのに有用なことである。図３はアフリカツメガエル由来の培養されたメラニン保有細胞の分光感光性を示している。メラトニンへの露光の結果である凝集した色素を持つメラニン保有細胞は、ＰＴＩグレーティングモノクロメーターを用いて、様々な波長の光によって１０分間刺激された。異なる波長に対するメラニン保有細胞の比感光性は４６０ｎＭについて１００％の値を与えるように調節された。図３に示されるように、細胞が一定の強さである範囲の波長の光に露光される場合、細胞は４６０ｎｍの光に対して最高の感光性であり、５５０ｎｍ以上の光に対しては感光しなかった。５５０ｎｍは可視領域であるから、光応答性を刺激することなく、メラニン保有細胞を取り扱うことは困難なことではない。
色素配置の定量化
　図４ａ及び図４ｂは、色素粒子が凝集又は分散している融合性細胞によって示される不透明度の違いを比較したものである。図４ａは０．１ｎＭのメラトニンで３０分間処理した融合性メラニン保有細胞をもつ１００ｍｍの組織培養皿を示す。図４ｂは、同数のメラニン保有細胞を含有する別の培養皿を示すが、メラトニンで処理した後１００ｎＭのＭＳＨで３０分間処理したものである。
　本発明によるメラトニン保有細胞検定は標準９６ウェルプレートリーダーで読み取ることが出来る。化学物質が、メラトニン保有細胞内での色素の分散又は凝集を誘因する能力は、目によって容易に認識できるが、迅速な医薬スクリーニングの為には、例えば標準９６ウェルプレートの使用による色素分散の程度定量化が有用である。図５は９６ウェルマイクロタイタープレートの１つのウェル内で化学的刺激に応答したメラニン保有細胞内の色素分散の結果をグラフ化して示すものである。この曲線を得る為に、メラトニン保有細胞の融合層を有するウェルは最初メラトニンで１時間処理された。６２０ｎｍ（細胞の内因性光レセプターでは検知されない波長）の光の吸光度が決定された。次に、ＭＳＨを１００ｎＭで添加し、そしてウェルによる６２０ｎｍ光の吸光度が５分間隔で１時間測定された。
　本発明によるメラトニン検定はＧＰＣレセプター及び別のＰＰＧ蛋白に作用する化学物質対して応答する投与量を迅速に決定するために使用できる。図６は、色素細胞にたいして内因性であるＭＳＨレセプターにより、この点を示している。図６ａでは、各ウェルが異なるメラトニンとＭＳＨとの組み合わせで処理されたマイクロタイタープレートを示す。最初の８つの異なるメラトニン投与量は、最終濃度が０．１−３２０ｎＭの範囲になるように、列毎に添加された。６０分後、ウェルは、０．５−１０２４ｎＭの範囲のＭＳＨの１２の異なる投与量のうちの１つがカラムにより与えられた。３０分後、プレートはマイクロプレートリーダーで読み取られ、次いで固定された。固定されたプレートは図６ａの写真に示す。一方、マイクロプレートリーダーによって決定された最下部から上部への列を表す投与量応答曲線は図６ｂに示される。プレートリーダーは異なる濃度の化学物質を受け入れているウェルを容易に区別できる。
メラニン保有細胞における外因性ＧＰＣレセプターの発現
　ＧＰＣレセプターにおける化学物質の影響を研究するための、メラニン保有細胞をベースとする方法論を開発する最初の工程は、細胞内で外来ＤＮＡをどのように発現するかを決定することである。幾つかのプロモーター及びＤＮＡのトランスフェクションのための幾つかの方法が、外来ｃＤＮＡ類を発現する為にカエルのメラニン保有細胞において使用されるそれらの能力について、試験された。試験されたプロモーターは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、カエル熱ショック、ＳＶ−４０アーリー及びカエルベータアクチンである。一方、予め評価された細胞にＤＮＡを導入する試験方法はリン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション及びエレクトロポレーション（電気穿孔法）である。
（Ｈａｌｌ，Ｃ．Ｖ．，Ｊａｃｏｂ，Ｐ．Ｅ．，Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｇ．Ｍ．およびＬｅｅ，Ｆ．（１９８３），
Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ
　最良の組み合わせは、初期のｃＤＮＡの発現をもたらすＣＭＶプロモーターをエレクトロポレーションによって使用することであると思われる。図７には、ＣＭＶプロモーターの後ろにベータガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドを色素細胞に導入するためにエレクトロポレーションを用いる例が示されている。サイトプラズム内でＸ−ｇａｌ染色によるベータガラクトシダーゼの可視化を助けるために、細胞は予めメラトニンで処理される。この具体的試験でのトランスフェクションの有効率は６３％であった。試験の平均では、有効率は３７％であった。
　薬剤のスクリーニングに用いる色素細胞ｃＤＮＡ表示システムを明らかにする際の次の工程は、Ｇ−タンパク質に基づく信号形質導入経路を活性化しかつ一般にヒトによって発現される特徴のある７つのトランスメンブランドメインレセプターが、カエルの黒色素胞で適切に発現できることを証明するものであった。本出願人等は、カエルの色素細胞が、ベータ２−レセプター特異的薬剤であるメタプロテレノールに反応しないことを知っていたので（表１参照）、この重要なポイントを評価するために、ヒトベータ２−アドレナリン性レセプターを選んだ。２つの基準を満たさなければならなかった。第１に、レセプターは、有意な数の細胞によって発現されなければならなかった。第２に、トランスフェクトされた細胞によって発現されるレセプターは、内在性のＧに結合することができなければならなかった。
　図８は、前記の基準１及び２を満たしたことを証明している。第１のパネルでは、ＣＭＶプロモーターの後ろに配置されたヒトベータ２−レセプターに４０μｇのプラスミドコードを用いる、エレクトロポーレイション実験において、２日早くトランスフェクトされた色素細胞が示されている。ここで、細胞は１０ｎＭメラトニ　で６０分間処理して色素を凝集させた。第２のパネルは、以下のようにして何回も露光して得た同一範囲の細胞を示す。
　第１に、細胞を赤色光にさらすが、カメラ内のフィルムは前進させなかった。第２に、細胞を１μＭのメタプロテレノールで３０分間処理した。第３に、細胞を白色光にさらした。
　メタプロテノールに反応して色素を分散させたどの細胞も、白色光がフィルムに当たるのを妨げるが、赤色光は通過させた。この結果、メタプロテレノールに反応して色素を分散させた細胞は、中心が黒ずんだ赤色となった。
　一方、ベータ２−レセプタープラスミドを受け入れなかったどの細胞も、メタプロテレノールに反応して色素を分散させることはなく、従って、これらの細胞は、赤色及び白色の光にさらしたフィルムのどの領域も白色となったので、小さな黒っぽいスポットとなっただけである。最後のパネルは、同じ細胞を示すが、メタプロテレノールで処理した後、１回露光したものである。この実験では、メタプロテレノールに反応する能力を得た細胞の割合は、出願人等の平均トランスフェクション効率と同じであった。このことは、人間から本来誘導されたレセプターが、カエルの色素細胞内のＧ−タンパク質仲介信号形質導入経路に機能的に結合することができることを証明している。
　出願人等はまた、他のＧ−タンパク質仲介信号形質導入経路が、いくつかの基準に基づいてカエルの黒色素胞内の色素のトランスロケーションを制御しうることも証明した。第１に、細胞は図９に示すように、多数の異なるＧ−タンパク質を有する。実際、色素細胞は各種類からの多数のＧ−タンパク質を有する。第２に、３つの他の外来性のＧＰＣレセプターが、カエルの黒色素胞内で示された（データは示さない）。これらには、セロトニン、ボンベシン及びサブスタンスＰに対するレセプターが含まれる。いずれの場合も、適当なアゴニストを添加すると色素の分散を引き起こした。これらの研究の重要なことは、ボンベシン及びサブスタンスＰレセプターの効果はＧ−タンパク質仲介信号形質導入経路を経て働くものであるが、これらは、ベータ２−アドレナリン性レセプターが用るものとは異なるものを用いていることである。第３に、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（プレスマン，Ｂ．Ｃ．（１９７６）、
Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．
　トランスフェクションによって色素細胞内で示されるどのＧＰＣレセプターも、色素分散を引き起こすことが可能であるはずである。上述のように、色素細胞は多くの外来性Ｇタンパク質を有する。それらの全てが、ＧＰＣレセプターを細胞内の色素トランスロケーションメカニズムに結び付けるものではないが、それらの多くはそうであるにちがいない。また、黒色素胞内のＧＰＣレセプターを示すのに用いられる組み換えＤＮＡ法の種類で外来性のものを示すことによって、さらに別のものも加えることができる。最後に、色素のトランスロケーションに導くＧ−タンパク質に基づく経路に対して、色素のトランスロケーションに導かないＧ−タンパク質に基づく経路に一般につながるＧＰＣレセプターにすることができる架空のＧ−タンパク質を、試験官内でつくり、そして黒色素胞内で示すことが可能である。これらの点の重要なことは、色素トランスロケーションを調節する信号形質導入システムに細胞をつなぐことができるＧ−タンパク質を発現するように細胞がつくられているとき、どのＧＰＣレセプターも、刺激を加えたときに色素のトランスロケーションを引き起こすことができることである。
外来性ＧＰＣレセプターに対する潜在的なアゴニスト及びアンタゴニストを評価するためのバイオアッセイ
　本発明のバイオアッセイ法の予備工程は、アフリカツメガエル（
Ｘｅｎｏｐｕｓ
ｌａｅｖｉｓ
薬剤計画及び発見プロセスの重要性
　ＧＰＣレセプター及び他のＰＰＧタンパク質に作用する薬剤を見いだすための、及びＧＰＣレセプターをクローン化するための技術は、薬学及び生物学いずれにとっても重要なことである。本発明の方法は以下のものを提供する：（１）ＧＰＣレセプター及び他のＰＰＧタンパク質に作用する新しい薬剤を素早くかつ注意深くスクリーニングする有効な方法、及び（２）新しいＧＰＣレセプターをクローン化するための、及びレセプターがどのように作用するかを厳密に調べるための有効な方法。追加のＧＰＣレセプター遺伝子を特徴づけそして特定部位の突然変異誘発を用いてそれらを分析するので、これらのレセプターに働く基本的なメカニズムについての詳細な知識が得られる。これらのレセプターに働く基本的なメカニズムについての根本的な知識は、有望な新薬をいかに開発するかを理解する際に、大いに用いられる。
　本発明また、食品又は血液もしくは尿のような体液中の麻酔薬、例えばコカイン、ヘロイン、モルフィン又はアヘン誘導体のような薬剤の試験に用いることもできる。
実施例１
第１バイオアッセイ
　
活性化が色素分散を招くヒトベータ２−アドレナリン性レセプター又は別のＧＰＣレセプターに対する潜在的アゴニストを評価するためのバイオアッセイ
　β２−アドレナリン性レセプターを刺激する新薬をスクリーンするために、レセプターを発現する組み換えメラニン含有細胞及びレセプターを発現しない非組み換えメラニン含有細胞を、図１０に示す何組かの組織培養穴にセットする。全ての穴を０．１−１ｎＭメラトニンで処理して、細胞内色素凝集を生じさせる。メラトニンの濃度は、イソプロテレノール（メラニン含有細胞外来性ベータ１−アドレナリン性レセプターを刺激する）又はＭＳＨの少量の投与で、容易に低下させることができる。
　図１０の欄１にあるように、メタプロテレノールのような選択的ベータ２−レセプターアゴニストを、正のコントロール物質として用いる。この場合、ベータ２−レセプターを含む細胞を含有する穴は、色素の拡散により黒っぽく変化する。試験を行う薬剤を同時に、図１０の欄２及び３に示すように、他の組の穴に入れる。これらの穴にはそれぞれ、ベータ２−レセプターを発現するメラニン含有細胞及び非組み換え親細胞が含まれている。
　潜在的に関心のある薬剤は、メタプロテレノールのように、組み換え細胞内に色素の拡散を引き起こすが、標準的なものには作用しない。
　有望な薬剤を識別したら、これをさらに少なくとも２つの方法で特徴づける。第１に、色素の分散を引き起こす様々な濃度での速度を、メタプロテレノールのような確立された薬剤の場合の用量反応と比較することができる。そして第２に、他のＧＰＣレセプターを表すメラニン含有細胞が得られたら、これらのレセプターについての特異性度対交差反応性を確かめることができる。
実施例２
第２バイオアッセイ
　
活性化が色素分散を招くヒトベータ２−アドレナリン性レセプター又は別のＧＰＣレセプターに対する潜在的アゴニストを評価するためのバイオアッセイ
　ベータ２−アドレナリン性レセプターを拮抗する新薬をスクリーンするために、レセプターを発現するメラニン含有細胞及びレセプターを、図１１に示す並列の何組かの組織培養穴にセットする。ベータ２−アドレナリン性レセプターアゴニストを識別する戦略を用いるので、全ての穴に、０．１−１ｎＭメラトニンを加えて、細胞内色素凝集を生じさせる。プロプラノロールのようなベータ−アドレナリン性レセプターを、正のコントロール物質として用いる（欄１）。ベータレセプター遮断薬は、ベータ２−アドレナリン性レセプター選択性刺激物のメタプロテレノールの添加後、細胞が色素を分散するのを妨げる。試験を行う新薬は他の組みの穴に用いる。
　有望な薬剤は、プロプラノロールのように、メタプロテレノールに反応して色素が分散するのを妨げるが、欄２及び３に見られるように細胞上の別のＧＰＣレセプターを刺激するＭＳＨのような薬剤によって引き起こされる色素の黒ずみを妨げないものである。負のコントロール物質は、問題の薬剤が単に細胞の損傷によって色素の分散を妨げているのではないことを確認するために、そしてまたメタプロテレノールによって引き起こされる色素の分散の遮断が、ベータ２−アドレナリン性レセプターを越えたｃＡＭＰカスケードでのいくらかより基本的なレベルで生じているのではないことを確かめるために用いる。後者の例は、アデニレートシクラーゼを直接阻害する薬剤である。興味のある薬剤を見いだしたら、新しいベータ２−アドレナリン性レセプターアゴニストを評価する場合に説明したように、さらに、レセプター特異性及び効能について特徴づける。
実施例３
第３バイオアッセイ
　
活性化が色素凝集を招くヒトα２−アドレナリン性レセプター又は別のＧＰＣレセプターに対する潜在的アゴニストを評価するためのバイオアッセイ
Ｍｏｌｅｃｕｌａ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
　アルファ２−アドレナリン受容体を刺激する新しい薬剤をスクリーニングするために、アッセイは明るいウェルの代わりに暗いウェルで始める点を除いてベーター２−アドレナリン受容体アゴニストの記載とほとんど同一である．受容体を発現する組み換え、および受容体を欠く非組み換えメラニン保有細胞は、図１２に概略されるように平行な組織培養ウェルの組にて準備された．すべてのウェルは光に暴露されるかまたは少量のＭＳＨのような薬剤を与えられて細胞内色素分散を誘導する．ｐ−アミノクロニジンのようなアルファ２−アドレナリン受容体選択的アゴニストは陽性対照として役立つ．
　メラトニンの効果のように、ｐ−アミノクロニジンは組み換え細胞を誘導してそれらのｃＡＭＰの細胞内濃度を低め、それらのメラノソームを凝集させるべきである．試験される薬剤をその他のウェルの組に適用し、その中の幾つかは組み換えメラニン保有細胞を含有し、およびその中の幾つかはカラム２および３に表される標準物質を含むであろう．
　興味深い薬剤はアルファ２−アドレナリン受容体陽性細胞中で色素凝集を誘導するが、親細胞に影響を及ぼさないものである．ベーター２−受容体アゴニストを評価するための章に記載にされるように、潜在的に有用な薬剤はその受容体特異性および効力に関してさらに特性決定され得る．
実施例４：第４バイオアッセイ
ヒトアルファ２−アドレナリン受容体またはその活性化が色素凝集を引き起こすもうひとつのＧＰＣ受容体についての有力アンタゴニストを評価するためのバイオアッセイ
　アルファ２−受容体に拮抗する新しい薬剤に関するアッセイは図１３に概略されたアルファ２−受容体を発現する組み換えメラニン保有細胞を含有するウェルで（光を暗くされた）かまたはＭＳＨのような薬剤を含有するウェルで始まる．ラウウォルシン（ｒａｕｗｏｌｓｃｉｎｅ）のようなアルファ２−受容体アンタゴニストは、色素凝集を誘導することからアゴニストｐ−アミノクロニジンを保護するので陽性対照として役立つであろう．新しい物質を平列ウェルに供し、有力な目的薬剤はラウウォルシンのようにｐ−アミノクロニジンを遮断するが色素凝集を誘導したメラトニンではない。以前のように、有望分子の選択性および効力はベーター２−アドレナリン受容体アゴニストの評価の場合において記載されたようにさらに特徴つけられる。
実施例５：第５バイオアッセイ
内因性セロトニン受容体の有力アゴニストを評価するためのバイオアッセイ
　内因性セロトニン受容体を刺激する新しい薬剤に関してスクリーンするためにメラニン保有細胞を組織培養ウェルの組上に準備する．すべてのウェルは０．１−１ｎＭのメラトニンで処理し、細胞内色素凝集を誘導する．メラトニンのこの濃度はイソプロテレノール（メラニン保有細胞内因性ベーター１アドレナリン受容体を刺激する）またはＭＳＨのような少量の薬剤投与で容易に克服される．セロトニンはウェルを色素凝集により暗くすることにより陽性対照として役立つ．試験された薬剤は、同時に他のウェルの組にも適用された．効果の面で興味深い薬剤は、セロトニンのように細胞中で色素分散を誘導するものである．有望な薬剤が同定されると、セロトニンのように確立された薬剤に関する投与反応と比較して、色素分散を誘導する種々の濃度での早さによりさらに特徴つけられ得る。
　有望化合物に関する特異性の対照として、セロトニン受容体アンタゴニストを有望化合物の添加に先立ち加える事ができる。この時有望化合物の添加に引き続き色素凝集が避けられたら、新しい化合物はセロトニン受容体に対する特異的アゴニストであろう．
　これまでに記載されたすべてのアッセイについて、内因性ＧＰＣ受容体を一時的または永久に発現するメラニン保有細胞および他のＰＰＧタンパク質を使用できることが明らかである．
実施例６：ＧＰＣタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの単離
　カエルメラニン保有細胞はｃＤＮＡライブラリーの迅速なスクリーニングによりＧＰＣ受容体に関するクローニング方法の基礎を形成できる。ＧＰＣ受容体をクロニーニングするための鍵は、目的受容体をコードするものを見いだすためにライブラリーから任意のｃＤＮＡクローンを迅速にスクリーニングすることができるようになることである．ここで、マウスボンベジン受容体を使用して、いかに１回の実験で少なくとも１０，０００クローンをスクリーニングできるか、ならび例えばにこの系を使用していかにして新しいＧＰＣ受容体をクローン化するかを提供する．
　ボンベジン受容体を使用するこの実施例において、二つの組のプラスミドを利用する．第一のプラスミドはＣＭＶプロモーターの後ろにボンベジン受容体をコードするｃＤＮＡを含み、一方第二のプラスミドはボンベジン受容体のひとつに位置するマーカー遺伝子ベーターガラクトシダーゼをコードするｃＤＮＡを含有する．プラスミドは種々の相対濃度で一緒に混合されて、各組全４０μｇのプラスミドを産するが、各含量は異なる．ひとつの極端な場合において、ボンベジン受容体をコードするプラスミドのみが存在する．他の混合物はボンベジン対ベーターガラクトシダーゼに関するプラスミドを１：９９および１：９９９９で含む．
　種々のプラスミド混合物を別個のメラニン保有細胞の組に電気的に流入させ、次に別個の組織培養プレートに撒く．各皿は、一度１０ｎＭメラトニンで３０分インキュベーションして処理され、次に写真的または例えばサイエンティフィックイメージングシステム（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ：Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ　Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）のようなコンピュータ制御画像システムを使用して自動的に走査される．
　次にボンベジンを加えてさらに３０分後に、第二写真を第一の物について二倍露光して取るか、または第二の別個ビデオ画像を得る．
　写真的方法を使用する場合は、結果は図８に見られるもののようになり、ここで試験リガンドに反応する細胞は赤く現れる．ビデオシステムを使用する場合には、第一画像は第二から引かれる．この研究の図式的例は図１４により提供される．
　図１４ａは、殆ど全てのベーターガラクトシダーゼに関するプラスミドを含有するプラスミド混合物でトランスフェクトし、次に数日後にメラトニンで処理した細胞の仮説領域を示す．小さな点は凝集した色素をもつメラニン保有細胞であり、一方大きいものはメラトニンには何らかの理由で反応しない分散したメラノソームを持つ擬似細胞によりつくられたバックグラウンドノイズを表す．
　図１４ｂはボンベジン添加後の細胞の同じ領域を表す．画像は元の画像のネガティブである．図式１４ａおよび１４ｂの斜線の箱は、絵を整列させる目的で提供される．同様なマーカーは現実の組織培養プレートの表面に置かれ、コンピューターが領域を一致させることができるようようにする．二つの絵を並べることによって、図１４ｂには裸眼またはコンピューターによってさらに一つの大きな点を観察することが容易にできる．ボンベジン反応細胞が同定された時、加えた薬剤を洗い流し、メラトニンおよびボンベジン処理を繰り返し、そして写真およびビデオ法が再び同じ細胞を見いだすことにより再確認することができる。
　上記のように設計された実験の実際の組からのデータは図１５に表わされる．グラフから３つの点を作ることができる。第一且つ最も重要にはボンベジン受容体をコードするプラスミドを少なくとも１０，０００倍に希釈して、なおボンベジンに反応する色素細胞を見いだすことが可能である．特に、ここで討論された具体的実施例では、ボンベジン受容体をコードするプラスミドが１０，０００個のうち１個存在する時、ボンベジン受容体細胞の頻度は５００個のうちの１個であった．第二に、バックグラウンドノイズ、即ち、任意に与えられた３０分の実験中に自発的に色素を分散する細胞の分画は１０，０００個に１個であり真の信号より２０倍低い．第三に、実験を実施する時間中その自然な色素分散をする１０，０００個のうち１個の細胞のバックグラウンドノイズ上に見ることができる１０，０００倍に希釈したプラスミドからの信号の理由は高希釈プラスミドでの曲線の形から理解できる。これは外来ＤＮＡを発現できる細胞は約１００の異なるプラスミドを発現し、ただ１つでは無いということを示している．これはＧＰＣレセプターをコードするプラスミドである時最高１０，０００個のｃＤＮＡクローンが一回の実験操作でスクリーンできることを意味すると思われる．
　ＧＰＣ受容体をクローニングするためのアッセイ用色素細胞を使用するために、幾つかの基本的考察が関連する．第一にｃＤＮＡライブラリーを、たとえばインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐｃＤＮＡ１のような多くの任意の標準真核発現プラスミド中に構築できる。第二に、ライブラリーを作成するための組織または細胞の選択は目的のＧＰＣ受容体を発現する任意のもので有り得る．第三に、ｃＤＮＡライブラリーからのクローンの種々の組でトランスフェクトした細胞のさらなる組から集めた単純なデータにより１０，０００クローン以上の多くをスクリーンできる．
　ＧＰＣ受容体のクローンを単離するために、いくつかの可能な方法を採用できる。ひとつの例は分画法である．陽性信号が観察されたら、はじめに１０，０００クローンのプールを生じた細菌性コロニーを例えば各１，０００クローンのようなより小さなプールに副分割する．これらを増殖させ、プラスミドが単離されならびに各々の組が再試験される．プールが陽性信号を与えた時、それを再び副分割し、単一クローンが同定されるまでこの工程を繰り返す．Ｇ−タンパク質に結合する受容体をクローンするためにプールスクリーニング法が使用できることはよく実証されている（Ｊｕｌｉｕｓ，Ｄ．，ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ａ．Ｂ．，Ａｘｅｌ，Ｒ．ａｎｄ　Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．（１９８８）；セロトニンｌｃ受容体をコードする機能性ｃＤＮＡの分子特性決定：”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　ｌｃ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；
Ｓｃｉｅｎｃｅ
　本明細書は説明のための実例により説明され限定ではなく、種々の改良および変更は本発明の精神を逸脱することなくなされ得ることが理解されるであろう．
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】（ａ）ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現する、
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の
　【請求項２】工程（ａ）の前に、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、被験細胞中で色素の凝集を引き起こすために、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、細胞中で色素の分散を引き起こすために、第一の刺激物質を適用する、請求項１に記載の方法。
　【請求項３】工程（ｂ）において、アゴニストの存在を示すような色素性状の変化を引き起こすかどうかを決定することにより、化学物質がアゴニストかどうかを決定する、請求項１または２に記載の方法。
　【請求項４】外来性のクローンを発現せず、そして特定の刺激物質に反応してその色素を分散しまたは凝集することができるが、第一の刺激物質に対しては色素を分散しまたは凝集することができない、対照細胞を用いることによる対照をさらに含み、そして色素性状における変化が第一の刺激物質と接触するときに対照細胞中で引き起こされることがない、請求項３に記載の方法。
　【請求項５】化学物質との接触の後に細胞を観察して、細胞の色素性状の状態が変化しないことを決定すること、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、化学物質と接触させた被験細胞に対して、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化による色素分散を誘導することができる第二の刺激物質を添加するか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の凝集を誘導することができる第二の刺激物質を添加すること、そして第二の刺激物質が色素性状の変化を引き起こすかどうかを決定し、変化がないことにより上記化学物質がアンタゴニストであることの示唆を得ること、により、工程（ｂ）において化学物質がアンタゴニストかどうかを決定する、請求項２に記載の方法。
　【請求項６】被験細胞に対して記載されているのと同一の対照細胞を使用し、そして対照細胞は前記化学物質で処理しない点以外は被験細胞に対して適用された条件と同一の条件下で、対照細胞を使用することによる対照をさらに含む、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
　【請求項７】ＰＰＧタンパク質がＧＰＣ受容体である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
　【請求項８】ＰＰＧタンパク質がセロトニン受容体である、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
　【請求項９】ＰＰＧタンパク質がＭＳＨ受容体である、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
　【請求項１０】ＰＰＧタンパク質が、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２またはＧタンパク質である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
　【請求項１１】下記の工程からなる、ＧＰＣ受容体のクローニング方法：（ａ
）ｉ
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の
（ｃ）色素配置が初期状態になった上記細胞を、ＧＰＣ受容体を活性化する化学物質と接触させ、そして（ｄ）該化学物質との接触により色素配置がその初期状態から変化した細胞を同定し、細胞の色素配置の変化をＧＰＣ受容体をコードする外来性クローン発現の指標とする。
　【請求項１２】ＰＰＧタンパク質をコードする外来性の遺伝子を発現し、そして刺激物質を与えたときに細胞中で色素を分散しまたは凝集することができる、
請求項１に記載の方法のために使用する、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の
　【請求項１３】細胞がアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）の黒色素胞である、請求項１２に記載の細胞。
　【請求項１４】ＰＰＧタンパク質がセロトニン受容体またはＭＳＨ受容体であるか、またはタンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２またはＧタンパク質である、請求項１２または１３に記載の細胞。
　【請求項１５】化学物質が外来性ＰＰＧタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するかどうかを決定するためのキットであって、（ａ）外来性ＰＰＧタンパク質をコードする外来性クローンを発現する、１またはそれ以上の、
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）
色素細胞
（ｂ）外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の凝集を誘導することができるか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の分散を誘導することができる刺激物質（例えば第一の刺激物質）；そして（ｃ）アンタゴニストのキットについては、外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素の分散を誘導することができるか、または外来性ＰＰＧタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合には、外来性ＰＰＧタンパク質を活性化することによる色素凝集を誘導することができる、第二の刺激物質、を１またはそれ以上のコンテナ中に含む、前記キット。
　【請求項１６】（ａ）色素被験細胞がアフリカツメガエルの黒色素胞であり；
（ｂ）刺激物質（例えば第一の刺激物質）が、外来性ＰＰＧ
タンパク質
　【請求項１７】ＰＰＧタンパク質がＧＰＣ受容体である、請求項１２〜請求項１４のいずれか一項に記載の細胞。
　【請求項１８】ＰＰＧタンパク質がＧＰＣ受容体である、請求項１５または請求項１６に記載のキット。
　【請求項１９】外来性の核酸クローンが、プラスミドベクター中で作成したｃＤＮＡライブラリーより得たものであり、それがエレクトロポレーションにより色素細胞に導入される、請求項１１の方法。