(57)【要約】      （修正有）【課題】担体タンパク質と複合化された糖を含有する複合糖質及びその複合糖質を含む免疫原性組成物の提供。【解決手段】肺炎連鎖球菌血清型１２Ｆ莢膜多糖を、安定なニトロキシルラジカル関連剤／酸化体を酸化剤として使用し、シュードモナス属、大腸菌、ブドウ球菌属、または連鎖球菌属等の毒素を担体タンパク質として糖を複合化する調製方法によって作製される、複合糖質、及びその複合糖質を含む免疫原性組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の作製方法であって、
ａ）糖を安定なニトロキシルラジカル化合物および酸化体と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、
ｂ）前記活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有するピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有するピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する分子である、請求項１または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ニトロキシルラジカル化合物が、ＴＥＭＰＯ、２，２，６，６−テトラメチル−４−（メチルスルホニルオキシ）−１−ピペリジノオキシ、４−ホスホノオキシ−ＴＥＭＰＯ、４−オキソ−ＴＥＭＰＯ、４−メトキシ−ＴＥＭＰＯ、４−イソチオシアナト−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ヨードアセトアミド）−ＴＥＭＰＯフリーラジカル、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ、４−シアノ−ＴＥＭＰＯ、４−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ、４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ニトロキシルラジカル化合物が、３β−ＤＯＸＹＬ−５α−コレスタン、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、１６−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸メチル、３−（アミノメチル）−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ、３−シアノ−ＰＲＯＸＹＬからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ニトロキシルラジカル化合物が、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化体が、ニトロキシルラジカル化合物の存在下で第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、Ｎ−ハロ部分を有する分子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化体が、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸、および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化体がＮ−クロロスクシンイミドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応ステップａ）を水性溶媒中で実施する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応ステップａ）を非プロトン性溶媒中で実施する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応ステップａ）を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶媒中で実施する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖を０．１〜１０モル当量の酸化体と反応させる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖を０．５〜１．５モル当量の酸化体と反応させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、触媒量で存在する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖を、約０．３モル当量未満の安定なニトロキシルラジカル化合物と反応させる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の作製方法であって、
ａ）水性溶媒中で、糖を２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、
ｂ）前記活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記活性化した糖の酸化度が３〜４０の範囲である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記活性化した糖の酸化度が６〜１４の範囲である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記糖が細菌莢膜多糖である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記莢膜多糖が肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型３、Ｐｎ−血清型１０Ａ、Ｐｎ−血清型１２Ｆ、およびＰｎ−血清型３３Ｆ莢膜多糖から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記莢膜多糖がＰｎ−血清型１２Ｆ莢膜多糖である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記莢膜多糖が髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記莢膜多糖が、髄膜炎菌（Ｍｎ）−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記莢膜多糖が髄膜炎菌（Ｍｎ）−血清型Ｘ莢膜多糖である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記莢膜多糖がＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）由来である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記莢膜多糖が、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記担体タンパク質が、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒素である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記糖が、合成によって得られたものである、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ステップａ）の前に、前記糖をサイズ調整する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記糖を加水分解または機械的にサイズ調整する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記糖を、加水分解し、または加圧均質化によって機械的にサイズ調整して、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を実現する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ステップａ）の前に、前記糖を、１００〜４００ｋＤａの範囲の分子量に加水分解する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記糖を、１５０〜３５０ｋＤａの範囲の分子量に加水分解する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステップｂ）の前に、前記活性化した多糖を精製するステップをさらに含む、請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
ステップｂ）の後に、還元剤を加えるステップをさらに含む、請求項１から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記還元剤がＮａＣＮＢＨ３である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＮａＣＮＢＨ３を加えた後にＮａＢＨ４を加えるステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＮａＢＨ４を加えた後に、精製ステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法によって製造された複合糖質。
【請求項４５】
請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な複合糖質。
【請求項４６】
分子量が約５０ｋＤａ〜約２０，０００ｋＤａの間である、請求項４４または４５に記載の複合糖質。
【請求項４７】
分子量が約５００ｋＤａ〜約５，０００ｋＤａの間である、請求項４４または４５に記載の複合糖質。
【請求項４８】
分子量が約１，０００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａの間である、請求項４４または４５に記載の複合糖質。
【請求項４９】
分子量が、約６００ｋＤａ〜約２８００ｋＤａの間、約７００ｋＤａ〜約２７００ｋＤａの間、約１０００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの間、約１８００ｋＤａ〜約２５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａ〜約２２００ｋＤａの間、約１９００ｋＤａ〜約２７００ｋＤａの間、約１２００ｋＤａ〜約２４００ｋＤａの間、約１７００ｋＤａ〜約２６００ｋＤａの間、約１３００ｋＤａ〜約２６００ｋＤａの間、または約１６００ｋＤａ〜約３０００ｋＤａの間である、請求項４４または４５に記載の複合糖質
【請求項５０】
分子量が１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間である細菌莢膜多糖を含む、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項５１】
分子量が５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間である細菌莢膜多糖を含む、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項５２】
全多糖に対して約３０％未満の遊離糖を含む、請求項４４から５１のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項５３】
全多糖に対して約２０％、１５％、１０％、または５％未満の遊離多糖を含む、請求項４４から５１のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項５４】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項５５】
糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２〜４の間である、請求項４４から５４のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項５６】
糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が１．１〜１．７の間である、請求項４４から５４のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項５７】
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の１００個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ存在する、請求項４４から５６のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項５８】
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の４個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる、請求項５７に記載の複合糖質。
【請求項５９】
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の１０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる、請求項５７に記載の複合糖質。
【請求項６０】
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の１５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる、請求項５７に記載の複合糖質。
【請求項６１】
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の２０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる、請求項５７に記載の複合糖質。
【請求項６２】
前記担体タンパク質と糖の間の共有結合連結を、５〜１０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ含む、請求項５７に記載の複合糖質。
【請求項６３】
前記担体タンパク質と糖の間の共有結合連結を、２〜７個の糖繰返し単位毎、３〜８個の糖繰返し単位毎、４〜９個の糖繰返し単位毎、６〜１１個の糖繰返し単位毎、７〜１２個の糖繰返し単位毎、８〜１３個の糖繰返し単位毎、９〜１４個の糖繰返し単位毎、１０〜１５個の糖繰返し単位毎、２〜６個の糖繰返し単位毎、３〜７個の糖繰返し単位毎、４〜８個の糖繰返し単位毎、６〜１０個の糖繰返し単位毎、７〜１１個の糖繰返し単位毎、８〜１２個の糖繰返し単位毎、９〜１３個の糖繰返し単位毎、１０〜１４個の糖繰返し単位毎、１０〜２０個の糖繰返し単位毎、または４〜２５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ含む、請求項５７に記載の複合糖質。
【請求項６４】
請求項４４から６３のいずれか一項に記載の複合糖質と、薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物。
【請求項６５】
追加抗原をさらに含む、請求項６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６６】
前記追加抗原が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項６７】
前記追加抗原が、Ｐｎ−血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、および２３Ｆ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項６６に記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
前記追加抗原が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
前記追加抗原が、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項６８に記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
前記追加抗原が、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）由来の莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
前記追加抗原が、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項７０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
アジュバントをさらに含む、請求項６４から７１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
前記アジュバントがアルミニウム系アジュバントである、請求項７２に記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
前記アルミニウム系アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項７３に記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
担体タンパク質と複合化されたＰｎ−血清型１２Ｆを含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量が、調製されてから１２０日後に３５％未満である、免疫原性組成物。
【請求項７６】
遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量が、調製されてから１２０日後に３０％未満である、請求項７５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
前記担体タンパク質が、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒素である、請求項７５または７６に記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項７５または７６に記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、請求項７５から７８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８０】
追加抗原をさらに含む、請求項７５から７９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
前記追加抗原が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項８０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
前記追加抗原が、Ｐｎ−血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、および２３Ｆ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項８１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
前記追加抗原が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項８２に記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
前記追加抗原が、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項８３に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
前記追加抗原が、血清型Ｘ莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項８３に記載の免疫原性組成物。
【請求項８６】
前記追加抗原が、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）由来の莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項８０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８７】
前記追加抗原が、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項８６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８８】
アジュバントをさらに含む、請求項７５から８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８９】
前記アジュバントがアルミニウム系アジュバントである、請求項８８に記載の免疫原性組成物。
【請求項９０】
前記アルミニウム系アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項８９に記載の免疫原性組成物。
【請求項９１】
対象において、細菌性の感染、疾患、または状態を予防、治療、または改善する方法であって、請求項６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の免疫学的有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項９２】
前記感染、疾患、または状態が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌と関連する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記感染、疾患、または状態が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌と関連する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記感染、疾患、または状態が、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌と関連する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
対象において防御免疫応答を誘発する方法であって、請求項６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の免疫学的有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項９６】
医薬として使用するための、請求項６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９７】
医薬として使用するための、請求項４４から６３のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項９８】
ワクチンとして使用するための、請求項６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９９】
対象において、細菌性の感染、疾患、または状態を予防、治療、または改善する方法において使用するための、請求項６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１００】
対象において防御免疫応答を誘発する方法において使用するための、請求項６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、酸化剤としてＴＥＭＰＯ／ＮＣＳを使用することによる、担体タンパク質と複合化された糖を含有する複合糖質の調製方法、そのような複合糖質を含む免疫原性組成物、ならびにそのような複合糖質および免疫原性組成物の使用方法に関する。本開示はまた、担体タンパク質と複合化された糖を含有する複合糖質を、ピペリジン−Ｎ−オキシやピロリジン−Ｎ−オキシ化合物などの安定なニトロキシルラジカルまたはニトロキシドラジカルを酸化体の存在下で使用して、前記糖の第１ヒドロキシルを選択的に酸化することにより調製する方法、そのような複合糖質を含む免疫原性組成物、ならびにそのような複合糖質および免疫原性組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖タンパク質結合型ワクチンは、一般には細菌の表面外皮の多糖を、タンパク質担体に連結させたものを使用して作られる。多糖とタンパク質担体の化学結合によって、ワクチン内に含まれている多糖をその表面に提示している細菌に対する免疫応答が誘発され、したがって疾患が予防される。それゆえに、病原性細菌の多糖を使用してのワクチン接種は、宿主免疫を増強するための見込みのある戦略である。細菌を覆う多糖は、細菌の単一種内でさえ、変化に富んでいる。たとえば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（世界全域で乳幼児における髄膜炎、肺炎、および重度侵襲性疾患の主要な原因）では、細菌多糖外皮の相違により、９０を超える異なる血清型が存在する。その結果、多糖ワクチンは、多くの場合、防御を高めるために、一団の多糖からなる。
【０００３】
多糖は、それだけで免疫原性ではあるが、免疫原性を向上させるために、多糖のタンパク質担体との複合化が使用されてきた。担体タンパク質は、その病原体に対する特異的な免疫応答を増強する、標的病原体の近縁タンパク質抗原でも、またはむしろアジュバントもしくは全般的な免疫応答刺激剤として働く、一般免疫原性タンパク質でもよい。
【０００４】
肺炎球菌多糖−タンパク質結合型多価ワクチンは、長年にわたり認可されており、乳児における肺炎球菌疾患の予防において有益であることがわかっており、また最近では成人に推奨されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本開示は、担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の作製方法であって、ａ）水性溶媒中で、糖を２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、ｂ）活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法を提供する。別の態様では、活性化した糖の酸化度は、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜５、３〜４０、３〜３０、３〜２０、３〜１０、４〜４０、４〜３０、４〜２０、４〜１０、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１０、６〜５０、６〜４０、６〜３０、６〜２０、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、７〜４０、７〜３０、７〜２０、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、８〜４０、８〜３０、８〜２０、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、９〜４０、９〜３０、９〜２０、９〜１５、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、または１０〜１５の範囲である。別の態様では、活性化した糖の酸化度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。
【０００７】
別の態様では、本開示は、担体タンパク質と複合化させた糖を含む複合糖質の作製方法であって、ａ）酸化体の存在下で、糖を、ピペリジン−Ｎ−オキシやピロリジン−Ｎ−オキシ化合物などの安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物と反応させ、前記糖の第１ヒドロキシルを選択的に酸化して、アルデヒド基を含有する活性化した糖を生成するステップと、ｂ）活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法を提供する。
【０００８】
前記反応では、触媒回路において、実際の酸化体は、Ｎ−オキソアンモニウム塩である。安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、酸化体の存在下で、カルボン酸へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的にアルデヒドに酸化する能力を有することが好ましい。
【０００９】
一態様では、反応のステップａ）は、水性溶媒中で実施する。別の態様では、ステップａ）は、非プロトン性溶媒中で実施する。一態様では、ステップａ）は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、スルホラン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実施する。
【００１０】
一態様では、担体タンパク質との複合化後に、未反応のアルデヒド基が、キャッピングステップの際に、水素化ホウ素を使用して、第一級アルコールに元通り変換され、その結果、酸化に続く複合化を含む修飾ステップの間の糖エピトープ修飾が最小限に抑えられる。
【００１１】
一態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である。前記化合物は、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することが好ましい。前記化合物は、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することがより好ましい。
【００１２】
一態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する。前記化合物は、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することが好ましい。前記化合物は、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することがより好ましい。
【００１３】
一態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。一態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ、２，２，６，６−テトラメチル−４−（メチルスルホニルオキシ）−１−ピペリジノオキシ、４−ホスホノオキシ−ＴＥＭＰＯ、４−オキソ−ＴＥＭＰＯ、４−メトキシ−ＴＥＭＰＯ、４−イソチオシアナト−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ヨードアセトアミド）−ＴＥＭＰＯフリーラジカル、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ、４−シアノ−ＴＥＭＰＯ、４−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ、４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルからなる群から選択される。前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯであることが好ましい。
【００１４】
別の態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、３β−ＤＯＸＹＬ−５α−コレスタン、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、１６−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸メチル、３−（アミノメチル）−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ、３−シアノ−ＰＲＯＸＹＬからなる群から選択される。
【００１５】
一態様では、前記酸化体は、Ｎ−ハロ部分を有する分子である。前記分子は、ニトロキシルラジカル化合物の存在下で第一級アルコールを選択的に酸化する能力を有することが好ましい。
【００１６】
一態様では、前記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸、および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される。前記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミドであることが好ましい。
【００１７】
一態様では、活性化した糖の酸化度は、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜５、３〜４０、３〜３０、３〜２０、３〜１０、４〜４０、４〜３０、４〜２０、４〜１０、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１０、６〜５０、６〜４０、６〜３０、６〜２０、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、７〜４０、７〜３０、７〜２０、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、８〜４０、８〜３０、８〜２０、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、９〜４０、９〜３０、９〜２０、９〜１５、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、または１０〜１５の範囲である。別の態様では、活性化した糖の酸化度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。
【００１８】
一態様では、糖を０．１〜１０モル当量の酸化体と反応させる。糖は、０．２〜５、０．５〜２．５、または０．５〜１．５モル当量の酸化体と反応させることが好ましい。一態様では、多糖を約０．２、０．４、０．６、０．８、１、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８、または５モル当量の酸化体と反応させる。
【００１９】
一態様では、安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、触媒量で存在する。一態様では、糖を約０．３モル当量未満の安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物と反応させる。一態様では、糖を約０．００５モル当量未満の安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物と反応させる。一態様では、糖を約０．００５、０．０１、０．０５、または０．１モル当量の安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物と反応させる。
【００２０】
別の態様では、糖は、細菌の莢膜多糖である。別の態様では、糖は、合成によって得られたオリゴ糖または多糖である。一態様では、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（Ｐｎ）由来である。別の態様では、莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１０Ａ、Ｐｎ−血清型１２Ｆ、およびＰｎ−血清型３３Ｆ莢膜多糖から選択される。たとえば、一態様では、莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１２Ｆ莢膜多糖である。
【００２１】
別の態様では、莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である。一態様では、莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｍｎ）−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される。
【００２２】
別の態様では、莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｍｎ）−血清型Ｘ莢膜多糖である。
【００２３】
別の態様では、莢膜多糖は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）由来である。一態様では、莢膜多糖は、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される。
【００２４】
一態様では、本開示は、担体タンパク質が、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒素である、本明細書で開示する方法のいずれかを提供する。一態様では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【００２５】
別の態様では、本開示は、ステップａ）の前に、糖を加水分解して、分子量を１００〜４００ｋＤａの範囲にする、本明細書に記載のとおりの方法を提供する。たとえば、一態様では、分子量は、１００〜３５０ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、１００〜２５０ｋＤａ、１００〜２００ｋＤａ、１００〜１５０ｋＤａ、２００〜４００ｋＤａ、２００〜３５０ｋＤａ、２００〜３００ｋＤａ、２００〜２５０ｋＤａ、３００〜４００ｋＤａ、または３００〜３５０ｋＤａの範囲である。
【００２６】
別の態様では、本開示は、活性化した多糖を、ステップｂ）の前に精製するステップをさらに含む、本明細書で提供した方法のいずれかを提供する。別の態様では、方法は、ステップｂ）に続いて還元剤を加えるステップをさらに含む。一態様では、還元剤は、ＮａＣＮＢＨ３である。別の態様では、方法は、ＮａＣＮＢＨ３を加えた後にＮａＢＨ４を加えるステップをさらに含む。別の態様では、方法は、ＮａＢＨ４を加えた後に精製ステップを含む。
【００２７】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示する方法のいずれかによって製造される、または取得可能な複合糖質を提供する。たとえば、一態様において、本開示は、ａ）水性溶媒中で糖を、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、ｂ）活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法によって製造される、または取得可能である、担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質を提供する。別の態様では、本開示は、ａ）糖を、安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物および酸化体と反応させて、アルデヒド基を含んでいる活性化した糖を生成するステップと、ｂ）活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法によって製造される、または取得可能である、担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質を提供する。安定なニトロキシルラジカル化合物および酸化体については、上の２〜４頁で定義したとおりでよい。
【００２８】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示する複合糖質のいずれかと、薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物を提供する。別の態様では、免疫原性組成物は、追加抗原を含む。別の態様では、追加抗原は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む。たとえば、一態様では、追加抗原は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、および２３Ｆ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む。別の態様では、追加抗原は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む。別の態様では、追加抗原は、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む。別の態様では、追加抗原は、血清型Ｘ莢膜多糖からの莢膜多糖の複合糖質を含む。別の態様では、追加抗原は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）由来の莢膜多糖の複合糖質を含む。一態様では、追加抗原は、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される莢膜多糖の複合糖質を含む。
【００２９】
別の態様では、本開示は、アジュバントをさらに含む、本明細書で開示する免疫原性組成物のいずれかを提供する。一態様では、アジュバントは、アルミニウム系のアジュバントである。別の態様では、アルミニウム系のアジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される。
【００３０】
別の態様では、本開示は、対象において、細菌性の感染、疾患、または状態を予防、治療、または改善する方法であって、本明細書で開示する免疫原性組成物のいずれかの免疫学的有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。一態様では、感染、疾患、または状態は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌と関連する。別の態様では、感染、疾患、または状態は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌と関連する。
【００３１】
別の態様では、本開示は、対象において防御免疫応答を誘発する方法であって、本明細書で開示する免疫原性組成物のいずれかの免疫学的有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３２】
別の態様では、本開示は、担体タンパク質と複合化されたＰｎ−血清型１２Ｆを含む免疫原性組成物であって、複合物が安定である、免疫原性組成物を提供する。たとえば、一態様では、本開示は、担体タンパク質と複合化されたＰｎ−血清型１２Ｆを含む免疫原性組成物であって、組成物中の遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量が、調製されてから１２０日後に３５％未満である、免疫原性組成物を提供する。別の態様では、遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量は、調製されてから１２０日後に、３０％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、または２５％未満である。別の態様では、遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量は、調製されてから９０日後に、３５％未満、３０％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、または２５％未満である。別の態様では、遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量は、調製されてから６０日後に、３５％未満、３０％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、または２５％未満である。別の態様では、遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量は、調製されてから３０日後に、３５％未満、３０％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、または２５％未満である。別の態様では、本開示は、担体タンパク質と複合化されたＰｎ−血清型３、１０Ａ、または３３Ｆを含む組成物であって、組成物中の遊離Ｐｎ−血清型３、１０Ａ、または３３Ｆ多糖それぞれの量が、調製されてから１２０日後に３５％未満である、組成物を提供する。別の態様では、遊離Ｐｎ−血清型３、１０Ａ、または３３Ｆ多糖の量は、調製されてから１２０日後に、３０％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、または２５％未満である。別の態様では、遊離Ｐｎ−血清型３、１０Ａ、または３３Ｆ多糖の量は、調製されてから９０日後に、３５％未満、３０％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、または２５％未満である。別の態様では、遊離Ｐｎ−血清型３、１０Ａ、または３３Ｆ多糖の量は、調製されてから６０日後に、３５％未満、３０％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、または２５％未満である。別の態様では、遊離Ｐｎ−血清型３、１０Ａ、または３３Ｆ多糖の量は、調製されてから３０日後に、３５％未満、３０％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、または２５％未満である。一態様では、上で論述したとおりの遊離多糖の量は、２５℃で測定される。一態様では、本明細書で開示する組成物中の担体タンパク質は、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒素である。別の態様では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【００３３】
本開示はさらに、上で開示したこのような複合糖質のいずれかと、薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物を提供する。別の態様では、このような免疫原性組成物は、追加抗原を含む。たとえば、一態様では、追加抗原は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む。別の態様では、追加抗原は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、および２３Ｆ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む。さらに別の態様では、追加抗原は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む。さらに別の態様では、追加抗原は、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む。別の態様では、追加抗原は、血清型Ｘ莢膜多糖からの莢膜多糖の複合糖質を含む。別の態様では、追加抗原は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）からの莢膜多糖の複合糖質を含む。一態様では、莢膜多糖は、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される。
【００３４】
さらに別の態様では、このような免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。たとえば、一態様では、アジュバントは、アルミニウム系アジュバントである。別の態様では、アルミニウム系アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｐｎ−血清型１２Ｆの莢膜多糖の構造を示す図である。
【図２】Ｔｅｍｐｏ／ＮＣＳ酸化反応におけるＮ−クロロスクシンイミドの、酸化度（ＤＯ）への依存を示すグラフである。
【図３】Ｐｎ−血清型１０Ａの莢膜多糖の構造を示す図である。
【図４】Ｐｎ−血清型３３Ｆの莢膜多糖の構造を示す図である。
【図５】Ｐｎ−血清型３の莢膜多糖の構造を示す図である。
【図６】ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳを使用してＰｎ−血清型１２Ｆが酸化／複合化される推定上の機序を示す図である。
【図７】過ヨウ素酸塩酸化とＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化を使用して調製したＰｎ−血清型１２Ｆ複合物の安定性の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示は、本開示の種々の実施形態についての以下の詳細な説明、および本明細書に含まれる実施例を参照することで、より容易に理解することができる。別段定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載のものと同様または同等のどんな方法および材料を使用してもよいが、ある特定の好ましい方法および材料を本明細書に記載する。実施形態について述べる際、また請求項において、ある特定の術語は、以下で述べる定義に従って使用する。
【００３７】
本明細書で使用するとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段指摘しない限り、複数の言及を包含する。したがって、たとえば、「方法」への言及は、本明細書に記載されている、かつ／または本開示を読めば当業者に明白となる種類の、１つまたは複数の方法および／またはステップを包含する。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「約」とは、記載された濃度範囲、時間枠、分子量、温度、ｐＨなどの値の統計的に意味のある範囲内の意味である。このような範囲は、所与の値または範囲の、一桁分内、典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、さらに典型的には５％以内または１％以内でよい。時として、このような範囲は、所与の値または範囲の測定および／または定量に使用される標準の方法に特有である実験誤差内でよい。用語「約」によって包含される許容可能なばらつきは、研究中の特定の系次第となり、当業者なら容易に認識しうる。本出願内で範囲を列挙するときは常に、その範囲内の一つ残らずの整数を、本開示の実施形態であると考える。
【００３９】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてこれらにあるとされる意味を有してよく、たとえば、こうした用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれた（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味しうることを、特に言及する。このような用語は、他の成分を除外することなく、特定の成分または成分一式を含むことを指す。「本質的に、〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」や「本質的に、〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてこれらにあるとされる意味を有し、たとえば、こうした用語は、本開示の新規または基本的な特徴から逸脱しない追加成分またはステップが含まれることを見込んでいる、すなわち、これらの用語によって、本開示の新規または基本的な特徴から逸脱する列挙されない追加成分またはステップは除外される。用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、米国特許法においてこれらにあるとされる意味を有する、すなわち、こうした用語は、排他的（ｃｌｏｓｅｄ  ｅｎｄｅｄ）である。したがって、こうした用語は、特定の一成分または成分一式を含み、他のすべての成分を除外することを指す。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「糖」は、多糖、オリゴ糖、または単糖を指すのに使用することがある。
【００４１】
本明細書で使用するとき、用語「酸化度」は、糖に関して、アルデヒド１モルあたりの糖繰返し単位のモルの比を指す。糖の酸化度は、当業者に知られている型通りの方法を使用して求めることができる。
【００４２】
本明細書で使用する用語「複合物」または「複合糖質」とは、担体タンパク質と共有結合を介して複合化された糖を指す。本開示の複合糖質およびそれを含む免疫原性組成物は、多少の量の遊離糖を含有してよい。
【００４３】
本明細書で使用する用語「遊離糖」とは、担体タンパク質と共有結合を介して複合化されていないが、それにもかかわらず、複合糖質組成物中に存在する糖を意味する。遊離糖は、複合化された糖−担体タンパク質複合糖質と非共有結合を介して関連していてよい（すなわち、非共有結合を介して結合し、吸着され、またはそこに閉じ込められていてよい）。用語「遊離多糖」および「遊離莢膜多糖」は、本明細書では、糖がそれぞれ多糖または莢膜多糖である複合糖質に関して、同じ意味を伝えるのに使用することができる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「複合化する（ｔｏ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」、「複合化された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」、および「複合化する（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）」とは、糖、たとえば、細菌莢膜多糖を、担体分子または担体タンパク質に共有結合を介して付着させ取り付ける方法を指す。複合化は、以下で述べる方法に従って、または当技術分野で知られている他の方法によって実施することができる。複合化によって、細菌莢膜多糖の免疫原性は増強される。
【００４５】
用語「対象」とは、ヒトを含めた哺乳動物、または鳥、魚、爬虫類、両生類、もしくは他のいずれかの動物を指す。用語「対象」は、家庭用愛玩動物または研究動物も包含する。家庭用愛玩動物および研究動物の非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、モルモット、フェレット、サル、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、カメ、およびカエルが挙げられる。用語「対象」は、家畜動物も包含する。家畜動物の非限定的な例としては、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウ、およびシチメンチョウが挙げられる。
【００４６】
複合糖質
本開示は、特に、安定なニトロキシルまたはニトロキシド遊離基化合物を使用し、さらに酸化体を使用して、糖の第一級アルコールを選択的にアルデヒドに酸化することによる、担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の調製方法に関する。一態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である。前記化合物は、酸化体の存在下で、カルボン酸へ過酸化することなく、また第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに、第一級アルコールを選択的にアルデヒドに酸化する能力を有することが好ましい。一態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する分子である。前記分子は、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することが好ましい。前記分子は、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することがより好ましい。一態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ、２，２，６，６−テトラメチル−４−（メチルスルホニルオキシ）−１−ピペリジノオキシ、４−ホスホノオキシ−ＴＥＭＰＯ、４−オキソ−ＴＥＭＰＯ、４−メトキシ−ＴＥＭＰＯ、４−イソチオシアナト−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ヨードアセトアミド）−ＴＥＭＰＯフリーラジカル、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ、４−シアノ−ＴＥＭＰＯ、４−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ、４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルからなる群から選択される。前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯであることが好ましい。別の態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、３β−ＤＯＸＹＬ−５α−コレスタン、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、１６−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸メチル、３−（アミノメチル）−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ、３−シアノ−ＰＲＯＸＹＬからなる群から選択される。一態様では、酸化体は、Ｎ−ハロ部分を有する分子である。前記分子は、ニトロキシルラジカル化合物の存在下で第一級アルコールを選択的に酸化する能力を有することが好ましい。一態様では、前記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸、および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される。前記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミドであることが好ましい。
【００４７】
一態様では、本開示は、特に、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ）を使用し、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を共酸化体として使用して、糖の第一級アルコールをアルデヒドに酸化することによる、担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の調製方法に関する。
【００４８】
本開示の複合糖質において、糖は、多糖、オリゴ糖、および単糖からなる群から選択され、担体タンパク質は、本明細書でさらに説明するまたは当業者に知られているような適切ないずれかの担体から選択される。一部の実施形態では、糖は、多糖、特に、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ（Ｐｎ−血清型１０Ａ）、Ｐｎ−血清型１２Ｆ、またはＰｎ−血清型３３Ｆなどの、細菌莢膜多糖である。一部のこのような実施形態において、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【００４９】
莢膜多糖は、当業者に知られている標準技術によって調製することができる。たとえば、莢膜多糖は、様々な血清型、たとえば、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から調製することができる。こうした肺炎球菌複合物を、別の方法で調製し、単一投与製剤に製剤する。たとえば、一実施形態では、各肺炎球菌多糖血清型をダイズ系培地で成長させる。次いで、個々の多糖を、遠心分離、沈殿、限外濾過、およびカラムクロマトグラフィーによって精製する。精製された多糖を化学的に活性化させて、担体タンパク質と反応しうる糖（すなわち、活性化した糖）を作製する。活性化させたなら、各莢膜多糖を、別々に担体タンパク質と複合化して、複合糖質を生成する。一実施形態では、各莢膜多糖を、同じ担体タンパク質と複合化する。多糖の化学的活性化、および後続の担体タンパク質との複合化は、従来の手段によって実現することができる。たとえば、米国特許第４，６７３，５７４号、第４，９０２，５０６号、第７，７０９，００１号、および第７，９５５，６０５号を参照されたい。
【００５０】
一実施形態では、本開示の複合糖質は、分子量が約５０ｋＤａ〜約２０，０００ｋＤａの間である。別の実施形態では、複合糖質は、分子量が約２００ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａの間である。別の実施形態では、複合糖質は、分子量が約５００ｋＤａ〜約５，０００ｋＤａの間である。一実施形態では、複合糖質は、分子量が約１，０００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａの間である。他の実施形態では、複合糖質は、分子量が約６００ｋＤａ〜約２８００ｋＤａの間、約７００ｋＤａ〜約２７００ｋＤａの間、約１０００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの間、約１８００ｋＤａ〜約２５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａ〜約２２００ｋＤａの間、約１９００ｋＤａ〜約２７００ｋＤａの間、約１２００ｋＤａ〜約２４００ｋＤａの間、約１７００ｋＤａ〜約２６００ｋＤａの間、約１３００ｋＤａ〜約２６００ｋＤａの間、約１６００ｋＤａ〜約３０００ｋＤａの間である。上記範囲のいずれかの内にあるいかなる整数も、本開示の実施形態であると考える。
【００５１】
本開示の複合糖質の新規な特色として、糖および得られる複合物の分子量プロファイル、担体タンパク質あたりの結合型リシンの比率および多糖に共有結合連結したリシンの数、糖の繰返し単位に応じた、担体タンパク質と糖の間の共有結合連結の数、ならびに遊離糖の全糖に対する相対量が挙げられる。
【００５２】
別の実施形態では、多糖は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の莢膜多糖である。一部のこのような実施形態において、莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｘ、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。あるこのような実施形態において、莢膜多糖は、血清型Ｃ莢膜多糖である。別のこのような実施形態において、莢膜多糖は、血清型Ｗ１３５莢膜多糖である。別のこのような実施形態において、莢膜多糖は、血清型Ｙ莢膜多糖である。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示の複合糖質は、分子量が１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間または５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間である細菌莢膜多糖を含む。一部のこのような実施形態において、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である。一部のこのような実施形態において、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であり、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。他のこのような実施形態において、莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来であり、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｘ、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００５４】
一実施形態では、本開示は、担体タンパク質と共有結合を介して複合化された莢膜多糖を含み、次の特色、すなわち、多糖の分子量が５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間である、複合糖質の分子量が１，０００ｋＤａ〜３，０００ＫＤａの間である、および複合物が含む遊離多糖が全多糖の約４５％未満である、のうちの１つまたは複数を有する複合糖質を提供する。一部の実施形態では、多糖は、分子量が１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間である。一部の実施形態では、複合糖質は、分子量が５０ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａの間である。他の実施形態では、複合糖質は、分子量が２００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間である。他の実施形態では、複合物は、全多糖の約３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の遊離多糖を含む。遊離多糖の量は、時間に応じて、たとえば、複合物を調製してから１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１２０日後、または一層長時間後に測定することができる。
【００５５】
糖と複合化された担体タンパク質中のリシン残基の数は、結合型リシンの範囲として特徴付けることができ、モル比として示すことができる。たとえば、ＣＲＭ１９７の４〜１５個のリシン残基が糖に共有結合連結している免疫原性組成物では、複合糖質における結合型リシンのＣＲＭ１９７に対するモル比は、約１０：１〜約４０：１の間である。ＣＲＭ１９７の２〜２０個のリシン残基が糖に共有結合連結している免疫原性組成物では、複合糖質における結合型リシンのＣＲＭ１９７に対するモル比は、約５：１〜約５０：１の間である。
【００５６】
一実施形態では、結合型リシンの担体タンパク質に対するモル比は、約１０：１〜約２５：１である。一部のこのような実施形態において、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【００５７】
一実施形態では、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．２〜４の間である。別の実施形態では、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、１．１〜１．７の間である。一部の実施形態では、糖は、細菌莢膜多糖であり、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．２〜４の間である。他の実施形態では、糖は、細菌莢膜多糖であり、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、１．１〜１．７の間である。一部のこのような実施形態において、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【００５８】
糖鎖が担体タンパク質上のリシンに付く頻度は、本開示の複合糖質を特徴付ける別のパラメーターである。たとえば、一実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結が、多糖の１００個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ存在する。一実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結が、多糖の５０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ存在する。一実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結が、多糖の２５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結は、多糖の４個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結は、多糖の１０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる。さらなる実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結は、多糖の１５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる。
【００５９】
高頻度の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖の間の共有結合連結は、多糖の４、１０、１５、または２５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる。一部のこのような実施形態において、多糖は、細菌莢膜多糖、たとえば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌由来の莢膜多糖である。
【００６０】
他の実施形態では、複合物は、担体タンパク質と糖の間の共有結合連結を、５〜１０個の糖繰返し単位毎、２〜７個の糖繰返し単位毎、３〜８個の糖繰返し単位毎、４〜９個の糖繰返し単位毎、６〜１１個の糖繰返し単位毎、７〜１２個の糖繰返し単位毎、８〜１３個の糖繰返し単位毎、９〜１４個の糖繰返し単位毎、１０〜１５個の糖繰返し単位毎、２〜６個の糖繰返し単位毎、３〜７個の糖繰返し単位毎、４〜８個の糖繰返し単位毎、６〜１０個の糖繰返し単位毎、７〜１１個の糖繰返し単位毎、８〜１２個の糖繰返し単位毎、９〜１３個の糖繰返し単位毎、１０〜１４個の糖繰返し単位毎、１０〜２０個の糖繰返し単位毎、または４〜２５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ含む。
【００６１】
別の実施形態では、担体タンパク質と糖の連結は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の糖繰返し単位毎に、少なくとも１回生じる。
【００６２】
一実施形態では、本開示の複合糖質は、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結を、多糖の２５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ含む。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結は、多糖の４個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結は、多糖の１０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖の間の共有結合連結は、多糖の１５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる。
【００６３】
一実施形態では、複合糖質は、糖の総量に対して約４５％未満の遊離糖を含む。別の実施形態では、複合糖質は、糖の総量に対して約３０％未満の遊離糖を含む。別の実施形態では、複合糖質は、糖の総量に対して約２０％未満の遊離糖を含む。さらなる実施形態では、複合糖質は、糖の総量に対して約１０％未満の遊離糖を含む。別の実施形態では、複合糖質は、糖の総量に対して約５％未満の遊離糖を含む。
【００６４】
別の実施形態では、複合糖質は、複合糖質の総量に対して約２０モル％未満の担体タンパク質残基を含む。
【００６５】
別の態様において、本開示は、本開示の複合糖質と、アジュバント、希釈剤、または担体の少なくとも１つとを含む免疫原性組成物を提供する。
【００６６】
一実施形態では、本開示は、本開示の複合糖質と、アジュバント、希釈剤、または担体の少なくとも１つとを含む免疫原性組成物であって、複合糖質が、担体タンパク質と共有結合を介して複合化された細菌莢膜多糖を含む、免疫原性組成物を提供する。一部のこのような実施形態において、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である。
【００６７】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。一部のこのような実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウム系アジュバントである。一実施形態では、免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントを含む。
【００６８】
一部の実施形態では、本開示の複合糖質または免疫原性組成物は、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食作用死滅検定での細菌の死滅によって測定したときに機能しうる抗体の生成に使用することができる。
【００６９】
一実施形態では、本開示は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、本明細書に記載のとおりの本開示の免疫原性組成物の免疫学的有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。別の態様において、本開示は、対象において病原性細菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、本明細書に記載のとおりの免疫原性組成物の免疫学的有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。別の態様では、本開示は、対象において、病原性細菌が引き起こす疾患または状態を予防、または改善する方法であって、本明細書に記載のとおりの免疫原性組成物の免疫学的有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。別の態様では、本開示は、対象において、病原性細菌による感染によって引き起こされた疾患または状態の少なくとも１つの症状の重症度を軽減する方法であって、本明細書に記載のとおりの免疫原性組成物の免疫学的有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、病原性細菌は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。
【００７０】
加えて、本開示は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫応答を誘発する方法、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌が引き起こす疾患を予防する方法、および肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌による感染によって引き起こされた疾患の少なくとも１つの症状の重症度を軽減する方法を提供する。
【００７１】
糖
糖には、多糖、オリゴ糖、および単糖が含まれる。一部の実施形態では、糖は、多糖、特に細菌莢膜多糖である。
【００７２】
莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物中への使用に関して考慮すべき事項である。高分子量の莢膜多糖は、抗原表面に存在するエピトープの結合価がより高いために、ある特定の抗体免疫応答を誘発しうる。高分子量莢膜多糖の単離および精製は、本開示の複合物、組成物、および方法における使用のために考慮される。
【００７３】
一実施形態では、莢膜多糖は、分子量が１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間である。一実施形態では、莢膜多糖は、分子量が５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間である。別の実施形態では、莢膜多糖は、分子量が５０ｋＤａ〜３００ｋＤａの間である。別の実施形態では、莢膜多糖は、分子量が７０ｋＤａ〜３００ｋＤａの間である。さらなる実施形態では、莢膜多糖は、分子量が、９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、９０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、９０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、７０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、７０ｋＤａ〜１１０ｋＤａ、７０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、７０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、７０ｋＤａ〜１４０ｋＤａ、７０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、７０ｋＤａ〜１６０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜１１０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜１４０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜１６０ｋＤａ、９０ｋＤａ〜１１０ｋＤａ、９０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、９０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａ、９０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、９０ｋＤａ〜１６０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１４０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１６０ｋＤａの間、および同様の所望の分子量範囲である。上記範囲のいずれかの内にあるいかなる整数も、本開示の実施形態であると考える。
【００７４】
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆ（Ｐｎ−血清型１２Ｆ）の莢膜多糖は、図１に示す構造を有する。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ（Ｐｎ−血清型１０Ａ）の莢膜多糖は、図３に示す構造を有する。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ（Ｐｎ−血清型３３Ｆ）の莢膜多糖は、図４に示す構造を有する。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３（Ｐｎ−血清型３）の莢膜多糖は、図５に示す構造を有する。
【００７５】
一部の実施形態では、抗体による細菌の死滅を実証する動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食作用死滅検定での細菌死滅によって測定したときに機能しうる抗体の生成に、本開示の莢膜多糖、複合糖質、または免疫原性組成物を使用する。莢膜多糖は、当業者に知られている単離手順を使用して、細菌から直接取得することができる。たとえば、それぞれ、その全体が明示されたかのごとく参照により本明細書に援用される、Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８４）、前掲；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８７）、Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：５６１〜５６７；米国特許出願公開第２００７／０１４１０７７；および国際特許出願公開第ＷＯ００／５６３５７号を参照されたい。加えて、莢膜多糖は、合成プロトコールを使用して製造することもできる。さらに、莢膜多糖は、これも当業者に知られている遺伝子工学手順を使用して、組換え産生することもできる（それぞれ、その全体が明示されたかのごとく参照により本明細書に援用される、Ｓａｕら（１９９７）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３：２３９５〜２４０５および米国特許第６，０２７，９２５号を参照されたい）。確立された培養物コレクションまたは臨床検査材料から取得した、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）株を、それぞれの多糖の作製に使用することができる。
【００７６】
担体タンパク質
本開示の複合糖質の別の構成要素は、糖が複合化される担体タンパク質である。用語「タンパク質担体」、「担体タンパク質」、または「担体」とは、免疫応答が所望される（莢膜多糖などの）抗原と複合化することのできる、いずれかのタンパク質分子を指す。
【００７７】
担体との複合化により、抗原の免疫原性を増強することができる。抗原用のタンパク質担体は、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、および連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）からの毒素、トキソイド、またはその毒素のいずれかの突然変異体交差反応性材料（ＣＲＭ）でよい。一実施形態では、担体は、ＣＲＭ１９７タンパク質を産生するジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株Ｃ７（β１９７）由来のジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７のものである。この菌株は、ＡＴＣＣ受入番号５３２８１を有する。ＣＲＭ１９７の産生方法は、その全体が明示されたかのごとく参照により本明細書に援用される、米国特許第５，６１４，３８２号に記載されている。別法として、タンパク質担体または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用することができる。たとえば、ヘパテン抗原は、細菌毒素、トキソイド、またはＣＲＭのＴ細胞エピトープに結合させることができる。適切な他の担体タンパク質として、不活化細菌毒素、たとえば、コレラトキソイド（たとえば、国際特許出願第ＷＯ２００４／０８３２５１号に記載のとおり）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの外毒素Ａが挙げられる。細菌外膜タンパク質、たとえば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄを使用することもできる。卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク質として使用できる。
【００７８】
本明細書で予め論述したとおり、糖と複合化される担体タンパク質中のリシン残基の数は、結合型リシンの範囲として特徴付けることができる。たとえば、所与の免疫原性組成物において、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち、糖に共有結合連結した１〜１５個のリシン残基を含むことがある。このパラメーターを示す別の手段は、約２．５％〜約４０％のＣＲＭ１９７リシンが、糖に共有結合連結しているということである。たとえば、所与の免疫原性組成物において、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち、糖に共有結合連結した１〜２０個のリシン残基を含むことがある。このパラメーターを示す別の手段は、約２．５％〜約５０％のＣＲＭ１９７リシンが、糖に共有結合連結しているということである。
【００７９】
複合糖質の作製方法
複合糖質を作製するために、多糖は、まず活性化（すなわち、化学修飾）しなければならず、その後、タンパク質などの担体に化学的に連結することができる。活性化ステップの前に、糖を、加水分解して、または加圧均質化によって機械的にサイズ調整して、活性化および後続の複合化に適正な分子量（たとえば、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ）にすることができる。多糖における炭水化物の部分的な酸化は、アルデヒド基の生成に有効に利用されてきており、アルデヒド基を、次いで、担体タンパク質のリシン残基などのアミン基に結合させて、免疫原性複合物が生成される。重要なのは、多糖を担体タンパク質と複合化するのに使用した方法の結果として、安定な共有結合連結が生じ、また反応条件が、個々の構成要素の構造上の完全性が保たれるほど十分に穏やかであることである。多糖を活性化させ、担体タンパク質に結合させるのに一般に使用される方法としては、還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）、シアニル化、およびカルボジイミドの使用が挙げられる。還元的アミノ化には、通常、ビシナルな−ＯＨ基を選択的に酸化して活性アルデヒド基にするために、過ヨウ素酸ナトリウムもしくはカリウムまたは過ヨウ素酸の使用が伴う。シアニル化は、−ＯＨ基を活性−ＣＮ基にランダムに変換するのに使用される。カルボジイミドは、−ＯＨ基をカルボジイミドで置き換えることによる、カルボキシル基の活性化に使用される。
【００８０】
還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）は、結果として生じる多糖のカルボニル基と担体タンパク質のアミノ基の反応によって、対応するシッフ塩基を生成することができ、次いでこれが、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）の存在下で選択的に還元されて、非常に安定な飽和炭素−窒素結合となりうるので、多糖をタンパク質に結合させるのに使用される最も一般的な方法の１つである。さらに、還元的アミノ化は、糖およびタンパク質構成要素の構造上の完全性が保たれるほど十分に穏やかな条件下で、水溶液中で実施することができる。複合化の後、未反応のアルデヒドは、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）還元によって、次いでキャッピングすることができる。次いで、複合物を（たとえば、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって）精製して、コハク酸緩衝溶液中に最終バルク複合糖質を得ることができる。
【００８１】
しかし、特定の多糖次第では、上記の一般的な方法を使用することで、必ずしも妥当な結果は得られない。たとえば、多糖を過ヨウ素酸ナトリウムで直接酸化すると、多糖主鎖が切断される場合がある。
【００８２】
たとえば、標準の過ヨウ素酸塩酸化条件（に続く還元的アミノ化）を使用して調製された複合物について、２５℃以上では、代表的なバッチで、遊離多糖の増加および分子量の低下が示されたことが観察された。本開示は、Ｎ−オキソアンモニウム塩を主体とした酸化方法の使用によって、いくつかの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖複合物、特に血清型１２Ｆの安定性が向上したという知見を提供する。特に、実施例１〜７でさらに詳しく示すとおり、フリーラジカル２，２，６，６，−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）をＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と組み合わせて使用すると、血清型１２Ｆ、１０Ａ、３、および３３Ｆの第１ヒドロキシル基が有効に酸化されて、得られる複合物の安定性が向上した。ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳを使用して第一級アルコールを選択的にアルデヒドに酸化することは、有機溶媒中で低分子を使用する有機化学反応に関連して示されてはいるが（たとえば、Ｅｉｎｈｏｒｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．
６１、７４５２〜７４５４頁（１９９６）を参照されたい）、本開示は、安定な多糖タンパク質複合物を生成するために、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳを酸化剤として使用して、複雑な多糖を水溶液中で選択的に酸化できるという新規な知見を提供する。
【００８３】
したがって、一実施形態では、本開示は、担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の作製方法であって、ａ）糖を安定なニトロキシルラジカル化合物および酸化体と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、ｂ）活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法を提供する。
【００８４】
一態様では、担体タンパク質との複合化後に、未反応のアルデヒド基が、キャッピングステップの際に、水素化ホウ素を使用して、第一級アルコールに元通り変換され、その結果、酸化に続く複合化を含む修飾ステップの間の糖エピトープ修飾が最小限に抑えられる。
【００８５】
一態様では、ステップａ）の反応は、水性溶媒中で実施する。別の態様では、ステップａ）は、非プロトン性溶媒中で実施する。一態様では、ステップａ）は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、スルホラン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実施する。
【００８６】
一態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である。前記化合物は、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することが好ましい。前記化合物は、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することがより好ましい。一実施形態では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する分子である。前記分子は、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することが好ましい。前記分子は、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化して、アルデヒド基を生じる能力を有することがより好ましい。一態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。一実施形態では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ、２，２，６，６−テトラメチル−４−（メチルスルホニルオキシ）−１−ピペリジノオキシ、４−ホスホノオキシ−ＴＥＭＰＯ、４−オキソ−ＴＥＭＰＯ、４−メトキシ−ＴＥＭＰＯ、４−イソチオシアナト−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ヨードアセトアミド）−ＴＥＭＰＯフリーラジカル、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ、４−シアノ−ＴＥＭＰＯ、４−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ、４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルからなる群から選択される。前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯであることが好ましい。さらなる実施形態では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、３β−ＤＯＸＹＬ−５α−コレスタン、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、１６−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸メチル、３−（アミノメチル）−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ、３−シアノ−ＰＲＯＸＹＬからなる群から選択される。一実施形態では、前記酸化体は、Ｎ−ハロ部分を有する分子である。前記分子は、ニトロキシルラジカル化合物の存在下で第一級アルコールを選択的に酸化する能力を有することが好ましい。一実施形態では、前記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸、および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される。前記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミドであることが好ましい。
【００８７】
一態様では、糖を０．１〜１０モル当量の酸化体と反応させる。糖は、０．２〜５、０．５〜２．５、または０．５〜１．５モル当量の酸化体と反応させることが好ましい。一態様では、多糖を、約０．２、０．４、０．６、０．８、１、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８、または５モル当量の酸化体と反応させる。
【００８８】
一態様では、安定なニトロキシルラジカル化合物は、触媒量で存在する。一態様では、糖を、約０．３モル当量未満の安定なニトロキシルラジカル化合物と反応させる。一態様では、糖を、約０．００５モル当量未満の安定なニトロキシルラジカル化合物と反応させる。一態様では、糖を、約０．００５、０．０１、０．０５、または０．１モル当量の安定なニトロキシルラジカル化合物と反応させる。
【００８９】
一実施形態では、本開示は、担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の作製方法であって、ａ）水性溶媒中で、糖を２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、ｂ）活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法を提供する。
【００９０】
他の実施形態では、方法は、複合糖質を、たとえばダイアフィルトレーションによって精製するステップをさらに含む。
【００９１】
各場合において、糖は、多糖、オリゴ糖、および単糖からなる群から選択される。
【００９２】
各場合において、前記糖は、発酵培地から精製しても、または合成して得てもよい。
【００９３】
高頻度の実施形態において、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。一実施形態では、細菌莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の莢膜多糖である。別の好ましい実施形態では、細菌莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）由来の莢膜多糖である。
【００９４】
一実施形態では、本開示の複合糖質の製造方法は、糖−担体タンパク質複合物を生成した後にそれを単離するステップを含む。高頻度の実施形態において、複合糖質は、限外濾過によって単離する。
【００９５】
一実施形態では、単離された肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖−担体タンパク質複合物の製造方法において使用される担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７を含む。一実施形態では、単離された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜多糖−担体タンパク質複合物の製造方法において使用される担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７を含む。
【００９６】
一実施形態では、約１：１の重量比で、ＣＲＭ１９７を、活性化した多糖と反応させる。
【００９７】
一実施形態では、単離された肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖：担体タンパク質複合物の製造方法は、多糖−担体タンパク質複合物反応混合物をキャッピングして、未反応の活性化基を除去するステップを含む。
【００９８】
一実施形態では、莢膜多糖−ＣＲＭ１９７複合物の製造方法におけるＣＲＭ１９７は、約０．４：１のＣＲＭ１９７：莢膜多糖分子の重量比で加える。他の実施形態では、ＣＲＭ１９７：莢膜多糖の重量比は、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、約１：１、約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、または約１．５：１である。
【００９９】
一実施形態では、本開示の複合糖質の製造方法において使用する糖は、分子量が約１０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａの間である。他の実施形態では、分子量は、約５０ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａの間、約５０ｋＤａ〜約２０，０００ｋＤａの間、約２００ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａの間である。
【０１００】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによって製造された複合糖質を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１０１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによって取得可能な複合糖質を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１０２】
免疫原性組成物
用語「免疫原性組成物」は、抗原、たとえば、微生物またはその成分を含有し、対象において免疫応答を惹起するのに使用できる、いずれかの医薬組成物に関する。
【０１０３】
本明細書で使用するとき、「免疫原性」とは、細菌莢膜多糖などの抗原（もしくは抗原のエピトープ）または抗原を含む複合糖質もしくは免疫原性組成物が、哺乳動物などの宿主において、免疫応答を、体液性もしくは細胞媒介性のいずれかまたは両方で惹起する能力を意味する。
【０１０４】
したがって、本明細書で使用する「複合糖質」または「複合物」とは、免疫応答を惹起するのに使用できる、細菌莢膜多糖の抗原または抗原決定基（すなわち、エピトープ）が担体分子と複合化されたものを含有する、いずれかの複合糖質を意味する。
【０１０５】
複合糖質は、細胞表面でのＭＨＣ分子と共同した抗原の提示によって、宿主を感作するように働きうる。加えて、抗原に特異的なＴ細胞または抗体が生成されて、免疫化された宿主の以後の防御を可能にすることができる。したがって、複合糖質は、細菌による感染と関連する１つまたは複数の症状から宿主を防御することができ、または莢膜多糖と関連付けられる細菌の感染による死亡から宿主を防御する場合もある。複合糖質を使用して、対象への受動免疫の付与に使用することのできる、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成してもよい。複合糖質はまた、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食作用死滅検定での細菌の死滅によって測定したときに機能しうる抗体の生成に使用してもよい。
【０１０６】
「抗体」とは、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に、自身の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して特異的に結合することのできる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用するとき、文脈によりそうでなく示唆されない限り、この用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、改変抗体（たとえば、エフェクター機能、安定性、および他の生物学的活性を変化させるためにキメラ化、ヒト化、および／または誘導体化されたもの）およびその断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）および単ドメイン抗体（サメおよびラクダ科動物抗体を含める）、抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多特異性抗体（たとえば、所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体）、本明細書に記載のとおりの抗体断片、ならびに、抗原認識部位を含む他のいずれかの変更された立体配置の免疫グロブリン分子も包含するものである。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどのいずれかのクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り振ることができる。５つの主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元配置は、よく知られている。
【０１０７】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部分だけを含み、その部分は、無傷の抗体中に存在するときその部分と通常関連付けられる機能の少なくとも１つ、好ましくは大部分またはすべてを保持することが好ましい。
【０１０８】
用語「抗原」とは、一般に、動物に注射または吸収される組成物を含めて、動物内で抗体産生もしくはＴ細胞応答または両方を刺激しうる、生物学的分子、通常は、免疫原性組成物中のタンパク質、ペプチド、多糖、もしくは複合物、または免疫原性物質を指す。免疫応答は、完全な分子に対して生じても、または分子の様々な部分（たとえば、エピトープまたはハプテン）に対して生じてもよい。この用語は、個々の分子、または抗原分子の均質もしくは不均質な集団を指すのに使用することができる。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体、または特異的な体液性および／もしくは細胞性免疫の他の要素によって認識される。「抗原」は、関係のあるすべての抗原エピトープも包含する。所与の抗原のエピトープは、当技術分野でよく知られている、いくつものエピトープマッピング技術を使用して特定することができる。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ）を参照されたい。たとえば、線状エピトープは、たとえば、固体支持体上に、タンパク質分子の諸部分に対応する多数のペプチドを同時に合成し、ペプチドがなお支持体に付着している間、ペプチドを抗体と反応させることにより、突き止めることができる。このような技術は、当技術分野で知られており、たとえば、それぞれその全体が明示されたかのごとく参照により本明細書に援用される、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５に記載されている。同様に、立体構造的なエピトープは、たとえばｘ線結晶学や二次元核磁気共鳴によって、アミノ酸の空間的な立体配座を求めることにより特定することができる。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、前掲を参照されたい。
【０１０９】
さらに、本開示の目的では、「抗原」は、タンパク質が免疫応答を惹起する能力を維持する限り、自然配列に対する欠失、付加、置換などの修飾を含むタンパク質（一般に、保存的な性質ではあるが、保存的でないといえる）を指すのにも使用することがある。こうした修飾は、部位特異的突然変異誘発、特定の合成手順、または遺伝子工学手法を手段とするような、意図的なものでもよいし、または抗原を産生する宿主の突然変異によるなどの偶発的なものでもよい。さらに、抗原は、微生物、たとえば、細菌から引き出し、取得し、もしくは単離することもでき、または完全な生物とすることもできる。同様に、核酸免疫化適用分野におけるような、抗原を発現させるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、この定義に含まれる。合成抗原、たとえば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ、および他の組換え抗原または合成によって得られた抗原も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７  ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２〜３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ（１９９７）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：４０２  ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）、第１２回世界エイズ会議、スイス国ジュネーブ、１９９８年６月２８日〜７月３日）。
【０１１０】
「防御」免疫応答とは、免疫原性組成物が、対象を感染から防御する働きをする免疫応答を、体液性もしくは細胞媒介性のいずれかまたは両方で惹起する能力を指す。もたらされる防御は、絶対である必要はない、すなわち、対照対象集団、たとえば、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与されない感染動物と比べて、統計的に有意な向上が存在するなら、感染は、完全に予防または根絶される必要はない。防御は、感染の症状の重症度または発症の速さを緩和することに限定されてもよい。一般に、「防御免疫応答」は、各抗原に対する、多少のレベルの測定可能な機能的抗体応答を含みながら、少なくとも５０％の対象における、特定の抗原に特異的な抗体レベルの増大の誘発を包含することになる。特定の状況では、「防御免疫応答」は、各抗原に対する、多少のレベルの測定可能な機能的抗体応答を含みながら、少なくとも５０％の対象における、特定の抗原に特異的な、抗体レベルの２倍の増大または抗体レベルの４倍の増大の誘発を包含しうることになる。ある特定の実施形態では、オプソニン化する抗体は、防御免疫応答と相互に関係がある。すなわち、防御免疫応答は、オプソニン化貪食作用検定、たとえば、以下で述べるものにおいて、細菌カウントの減少パーセントを測定して検定することができる。細菌カウントの減少が、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上あることが好ましい。組成物中の特定の複合物の「免疫原性量」は、一般に、その複合物について複合化されたおよび複合化されていない全多糖を基準にして投薬される。たとえば、２０％の遊離多糖を伴う莢膜多糖複合物は、用量１００ｍｃｇ中に、複合化された多糖約８０ｍｃｇと、複合化されていない多糖約２０ｍｃｇを有する。タンパク質の複合物への寄与は、複合物の用量を算出するとき、普通は考慮に入れない。一般に、各用量は、０．１〜１００ｍｃｇ、特に０．１〜１０ｍｃｇ、より特段には１〜１０ｍｃｇの多糖を含む。
【０１１１】
本開示の一実施形態は、上述の担体タンパク質と複合化された肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含む複合糖質のいずれかを含む免疫原性組成物を提供する。
【０１１２】
本開示の免疫原性組成物は、免疫原性組成物を全身、経皮、もしくは粘膜経路で投与することによって、たとえば肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌による細菌感染に罹りやすいヒトの防御もしくは治療に使用することもでき、または別の対象への受動免疫の付与に使用できることになるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の調製に使用することもできる。こうした投与には、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路による注射、または口腔／消化、呼吸、もしくは尿生殖器路への粘膜投与を含めることができる。免疫原性組成物は、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食作用死滅検定での細菌の死滅によって測定したときに機能しうる抗体の生成に使用してもよい。
【０１１３】
特定の免疫原性組成物についての成分の最適量は、対象における妥当な免疫応答の観察を含む標準の研究によって突き止めることができる。対象は、最初のワクチン接種に続いて、十分に間隔をおいた１回または数回の追加免疫を受けることができる。
【０１１４】
一実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、アジュバント、緩衝剤、凍結保護物質、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性剤、フリーラジカル酸化防止剤、希釈剤、または担体の少なくとも１つをさらに含む。一実施形態では、本開示の免疫原性組成物内のアジュバントは、アルミニウム系アジュバントである。一実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウム系アジュバントである。一実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【０１１５】
アジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与されたとき免疫応答を増強する物質である。限定はしないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（たとえば、米国特許第５，７２３，１２７号を参照のこと）、１３、１４、１５、１６、１７、および１８（およびその突然変異体型）；インターフェロン−α、β、およびγ；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（たとえば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受入番号３９９００を参照のこと）；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；ならびに腫瘍壊死因子αおよびβを含めて、いくつかのサイトカインまたはリンホカインは、免疫変調活性を有することが示されており、したがって、アジュバントと同じくまたは同様にして使用可能である。本明細書に記載の免疫原性組成物と共に有用である、さらに他のアジュバントとしては、限定はせず、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳ；セレクチン、たとえば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、およびＥ−セレクチンなどの接着分子；ムチン様分子、たとえば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１；ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５などの、インテグリンファミリーの構成員；ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、たとえばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３などの、免疫グロブリンスーパーファミリーの構成員；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌなどの同時刺激分子；血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮成長因子を含む成長因子；Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を含む受容体分子；ならびにＩＣＥを含むカスパーゼを含めたケモカインが挙げられる。
【０１１６】
免疫応答を増強するのに使用される適切なアジュバントとして、限定はせず、米国特許第４，９１２，０９４号に記載のＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ、Ｃｏｒｉｘａ；モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）をさらに挙げることができる。アジュバントとしての使用には、Ｃｏｒｉｘａから入手可能である、合成リピドＡ類似体またはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）またはその誘導体もしくは類似体、および米国特許第６，１１３，９１８号に記載のものも適する。あるそのようなＡＧＰは、５２９としても知られる（以前はＲＣ５２９として知られていた）、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである。この５２９アジュバントは、水性形態（ＡＦ）または安定なエマルション（ＳＥ）として製剤される。
【０１１７】
さらに他のアジュバントとして、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などのムラミルペプチド；水中油型エマルション、たとえば、ＭＦ５９（米国特許第６，２９９，８８４号）（５％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．５％のＳｐａｎ８５を含有（種々の量のＭＴＰ−ＰＥを場合により含有）し、マイクロフルイダイザー、たとえば、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）を使用してミクロン以下の粒子に製剤されたもの）、およびＳＡＦ（１０％のスクアレン、０．４％のポリソルベート８０、５％のプルロニックブロックポリマー（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、顕微溶液化されてミクロン以下のエマルションになっているか、またはボルテックスされてより大きい粒度のエマルションが生成されている）；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）；Ａｍｐｈｉｇｅｎ；アブリジン；Ｌ１２１／スクアレン；Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド；プルロニックポリオール；死滅したボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）；サポニン、たとえば、米国特許第５，０５７，５４０号に記載のＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、マサチューセッツ州フレーミングハム）、米国特許第５，２５４，３３９号に記載のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、オーストラリア国Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ）、および免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭＳ）；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；細菌リポ多糖；ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（たとえば、米国特許第６，２０７，６４６号）などの合成ポリヌクレオチド；欧州特許第１，２９６，７１３号および第１，３２６，６３４号に記載のＩＣ−３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  ＡＧ、オーストリア国ウィーン）；百日咳毒素（ＰＴ）もしくはその突然変異体、コレラ毒素もしくはその突然変異体（たとえば、米国特許第７，２８５，２８１号、第７，３３２，１７４号、第７，３６１，３５５号、および第７，３８４，６４０号）；または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）もしくはその突然変異体、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２（たとえば、米国特許第６，１４９，９１９号、第７，１１５，７３０号、および第７，２９１，５８８号）が挙げられる。
【０１１８】
免疫原性組成物は、薬学的に許容できる担体を場合により含んでもよい。薬学的に許容できる担体には、ヒトに加えて非ヒト動物を含めた動物における使用について、連邦の規制機関、州政府、もしくは他の規制機関によって認可され、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に記載されている担体が含まれる。担体という用語は、医薬組成物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指すのに使用することがある。水、食塩水、デキストロースおよびグリセロール水溶液を、特に注射溶液用の液体担体として用いることができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与方式にかなっているべきである。
【０１１９】
本開示の免疫原性組成物は、１種または複数の追加の免疫調節薬をさらに含んでよく、その免疫調節薬とは、体液性および／または細胞媒介性免疫の上方調節または下方調節のいずれかが認められるように、免疫系を混乱または変化させる薬剤である。一実施形態では、免疫系の体液性および／または細胞媒介性の力の上方調節がなされる。
【０１２０】
ある特定の免疫調節薬の例として、たとえば、アジュバントもしくはサイトカイン、または特に、米国特許第５，２５４，３３９号に記載のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、オーストラリア国Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ）が挙げられる。本開示の免疫原性組成物中に使用することのできるアジュバントの非限定的な例としては、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．、モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどのミネラルゲル、水中油型エマルション、油中水型エマルション、たとえば、フロイント完全および不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州アトランタ）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａまたは他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、およびアブリジン（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，３−ジアミノプロパン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）脂質−アミンアジュバントが挙げられる。本開示の免疫原性組成物中に有用な水中油型エマルションの非限定的な例としては、改変ＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２製剤が挙げられる。改変ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（商標）８５界面活性剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）のポリソルベート８０界面活性剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００ｍｃｇ／ｍＬのＱｕｉｌ  Ａ、１００ｍｃｇ／ｍｌのコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含有する水中油型エマルションである。改変ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（商標）８５界面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）のポリソルベート８０界面活性剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００ｍｃｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、および５０ｍｃｇ／ｍｌのコレステロールを含む水中油型エマルションである。免疫原性組成物中に含めることのできる他の免疫調節薬としては、たとえば、１種または複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインもしくはケモカインが挙げられる。一実施形態では、アジュバントは、それぞれ、米国特許第６，１６５，９９５号および第６，６１０，３１０号に記載のものなどの、シクロデキストリン誘導体またはポリアニオンポリマーでよい。使用する免疫調節薬および／またはアジュバントは、免疫原性組成物が投与される対象、注射の経路、およびなされる注射の回数に応じて決まることを理解されたい。
【０１２１】
本開示の免疫原性組成物は、複数の莢膜多糖−タンパク質複合物に加えて、１種または複数の保存剤をさらに含んでよい。ＦＤＡは、複数回用量（多用量）バイアル中の生物学的製剤は、少数だけを例外として、保存剤を含有することを義務付けている。保存剤を含有するワクチン製品としては、塩化ベンゼトニウム（炭疽）、２−フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、ライム、ポリオ（非経口））、フェノール（肺炎、腸チフス（非経口）、ワクシニア）、およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、ＨｅｐＢ、Ｈｉｂ、インフルエンザ、ＪＥ、髄膜炎、肺炎、狂犬病）を含有するワクチンが挙げられる。注射用薬物における使用が認可されている保存剤としては、たとえば、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサール、および硝酸フェニル水銀が挙げられる。
【０１２２】
包装および投薬形態
本開示の製剤は、緩衝剤、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性剤、糖などの凍結保護物質、およびフリーラジカル捕捉剤やキレート剤などの酸化防止剤の１つまたは複数、またはその多様ないずれかの組合せをさらに含んでよい。いずれか１つの成分、たとえば、キレート剤の選択によって、別の成分（たとえば、捕捉剤）が望ましいかどうかが決まる場合もある。投与に向けて製剤された最終組成物は、無菌および／または発熱性物質不使用にすべきである。当業者なら、要求された特定の貯蔵および投与条件などの様々な要素に応じて、これらおよび他の成分のどの組合せが、本開示の保存剤含有免疫原性組成物中に含めるのに最適となるか、経験的に判断することができる。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、非経口投与と適合する本開示の製剤は、限定はしないが、トリス（トリメタミン）、リン酸、酢酸、ホウ酸、クエン酸、グリシン、ヒスチジン、およびコハク酸から選択される、生理学的に許容できる１種または複数の緩衝剤を含む。ある特定の実施形態では、製剤は、約６．０〜約９．０、好ましくは約６．４〜約７．４のｐＨ範囲内に緩衝剤処理される。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本開示の免疫原性組成物または製剤のｐＨを調整することが望ましい場合がある。本開示の製剤のｐＨは、当技術分野の標準技術を使用して調整することができる。製剤のｐＨは、３．０〜８．０の間に調整することができる。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、３．０〜６．０、４．０〜６．０、もしくは５．０〜８．０の間でよい、またはこの数値の間に調整することができる。他の実施形態では、製剤のｐＨは、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約５．８、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０でよい、またはこの数値に調整することができる。ある特定の実施形態では、ｐＨは、４．５〜７．５、４．５〜６．５、５．０〜５．４、５．４〜５．５、５．５〜５．６、５．６〜５．７、５．７〜５．８、５．８〜５．９、５．９〜６．０、６．０〜６．１、６．１〜６．２、６．２〜６．３、６．３〜６．５、６．５〜７．０、７．０〜７．５、または７．５〜８．０の範囲にあってよい、またはこの範囲に調整することができる。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約５．８である。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、非経口投与と適合する本開示の製剤は、限定はしないが、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＭｎＣｌ２を含む１種または複数の二価カチオンを、約５ｍＭまでが好ましい、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、非経口投与と適合する本開示の製剤は、非経口投与後に対象に生理学的に許容されるイオン強度で存在し、選択されたイオン強度または容量オスモル濃度を生じる最終濃度で最終製剤中に含まれる、限定はしないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸カリウムを含む、１種または複数の塩を含む。製剤の最終イオン強度または重量オスモル濃度は、いくつもの成分（たとえば、緩衝化合物および他の非緩衝塩からのイオン）によって決まる。好ましい塩であるＮａＣｌは、約２５０ｍＭまでの範囲から存在し、塩濃度は、他の成分（たとえば、糖）を補完するように選択され、その結果、製剤の最終総容量オスモル濃度は、非経口投与（たとえば、筋肉内または皮下注射）と適合し、免疫原性組成物製剤の免疫原性成分の長期安定性を様々な温度範囲において促進する。無塩製剤では、所望の最終容量オスモル濃度レベルを維持するのに、１種または複数の選択された凍結保護物質の範囲の増大が許容される。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、非経口投与と適合する本開示の製剤は、限定はしないが、二糖（たとえば、ラクトース、マルトース、スクロース、またはトレハロース）およびポリヒドロキシ炭化水素（たとえば、ズルシトール、グリセロール、マンニトール、およびソルビトール）から選択される１種または複数の凍結保護物質を含む。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、製剤の容量オスモル濃度は、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌの範囲であり、約２５０ｍＯｓ／Ｌ〜約５００ｍＯｓ／Ｌ、または約３００ｍＯｓ／Ｌ〜約４００ｍＯｓ／Ｌが好ましい範囲である。無塩製剤は、たとえば、約５％〜約２５％のスクロース、好ましくは約７％〜約１５％、または約１０％〜約１２％のスクロースを含有してよい。別法として、無塩製剤は、たとえば、約３％〜約１２％のソルビトール、好ましくは約４％〜７％、または約５％〜約６％のソルビトールを含有してもよい。塩化ナトリウムなどの塩を加える場合、スクロースまたはソルビトールの有効範囲は、相対的に低減する。これらおよび他のこのような重量オスモル濃度および容量オスモル濃度検討事項は、申し分なく当技術分野の技量の範囲内である。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、非経口投与と適合する本開示の製剤は、１種または複数のフリーラジカル酸化防止剤および／またはキレート剤を含む。様々なフリーラジカル捕捉剤およびキレート剤が当技術分野で知られており、本明細書に記載の製剤および使用方法に適用される。例としては、限定はしないが、エタノール、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、トリエタノールアミン、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトール六リン酸、トリポリリン酸、アスコルビン酸／アスコルベート、コハク酸／スクシネート、リンゴ酸／マレエート、ｄｅｓｆｅｒａｌ、ＥＤＤＨＡ、およびＤＴＰＡ、ならびに上記の２種以上の種々の組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の非還元性フリーラジカル捕捉剤を、製剤の長期安定性を有効に強化する濃度で加えてよい。１種または複数のフリーラジカル酸化防止剤／キレート剤は、捕捉剤と二価カチオンなどの様々な組合せにして加えてもよい。キレート剤の選択により、捕捉剤を加える必要があるかどうかが決まる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、非経口投与と適合する本開示の製剤は、限定はしないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（商標）８０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（商標）６０）、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ（商標）４０）、およびポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標）２０）、限定はしないがＢｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ３５を含めたポリオキシエチレンアルキルエーテル、ならびに他のもの、たとえば、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１１４、ＮＰ４０（ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール）、ＳＰＡＮ（商標）８５、およびＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）シリーズの非イオン性界面活性剤（たとえば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）１２１）を始めとして、１種または複数の非イオン性界面活性剤を含み、好ましい成分は、約０．００１％〜約２％の濃度（約０．２５％までが好ましい）のポリソルベート８０、または約０．００１％〜１％の濃度（約０．５％までが好ましい）のポリソルベート４０である。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本開示の製剤は、非経口投与用に適切な１種または複数の追加安定剤、たとえば、少なくとも１つのチオール（−ＳＨ）基を含む還元剤（たとえば、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元型グルタチオン、チオグリコール酸ナトリウム、チオスルフェート、モノチオグリセロール、またはこれらの混合物）を含む。別法としてまたは場合により、本開示の保存剤含有免疫原性組成物製剤は、貯蔵容器から酸素を除去し、（たとえば、琥珀色のガラス容器を使用することにより）製剤を光から保護することによってさらに安定化することができる。
【０１３２】
本開示の保存剤含有免疫原性組成物製剤は、それ自体で免疫応答を誘発しない、いかなる賦形剤も包含する、薬学的に許容できる１種または複数の担体または賦形剤を含んでよい。適切な賦形剤としては、限定はしないが、タンパク質、糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２１１８）、トレハロース、ラクトース、脂質凝集体（油滴やリポソームなど）などの巨大分子が挙げられる。このような担体は、当業者によく知られている。薬学的に許容できる賦形剤については、たとえば、Ｇｅｎｎａｒｏ、２０００、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において論述されている。
【０１３３】
本開示の組成物は、凍結乾燥されていても、または水性形態、すなわち、溶液もしくは懸濁液でもよい。液体製剤は、有利なことに、その包装された形態から直接投与することができ、したがって、さもなければ本開示の凍結乾燥組成物に必要となるような、水性媒質中での復元の必要がなく、注射に理想的である。
【０１３４】
本開示の免疫原性組成物の対象への直接の送達は、（筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、もしくは組織の間質腔への）非経口投与によって、または直腸、経口、膣内、局所、経皮、鼻腔内、眼内、耳内、肺内、または他の粘膜投与によって実現することができる。好ましい実施形態では、非経口投与は、たとえば、対象の大腿または上腕への筋肉内注射によるものである。注射は、針（たとえば、皮下注射針）を介してもよいが、別法として、無針注射を使用してもよい。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍＬである。本開示の組成物は、様々な形態で、たとえば、注射用には、液体の液剤または懸濁剤として調製することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、肺内投与用の散剤またはスプレー剤として、たとえば、吸入器中に調製することができる。他の実施形態では、組成物は、坐剤もしくは膣坐剤として、または鼻内、耳内、もしくは眼内投与用に、たとえば、スプレー剤、滴剤、ゲル剤、もしくは散剤として調製することができる。特定の免疫原性組成物についての成分の最適量は、対象における妥当な免疫応答の観察を含む標準の研究によって突き止めることができる。対象は、最初のワクチン接種に続いて、十分に間隔をおいた１回または数回の追加免疫を受けることができる。
【０１３５】
本開示の免疫原性組成物は、単位用量または多用量形態（たとえば、２用量、４用量、またはそれ以上）で包装することができる。多用量形態については、充填済み注射器よりバイアルが通常は好まれるが、必ずしもそうでない。適切な多用量フォーマットとして、限定はしないが、１用量あたり０．１〜２ｍＬで、１容器あたり２〜１０用量が挙げられる。ある特定の実施形態では、用量は、０．５ｍＬ用量である。たとえば、参照により本明細書に援用される国際特許出願ＷＯ２００７／１２７６６８を参照されたい。
【０１３６】
組成物は、バイアルもしくは適切な他の貯蔵容器の体裁にしてもよいし、または充填済みの送達デバイス、たとえば、有針もしくは無針で供給してよい単成分もしくは多成分注射器の体裁にしてもよい。注射器は、必ずしもそうである必要はないが、通常、単一用量の本開示の保存剤含有免疫原性組成物を収容し、とはいえ、多用量充填済み注射器も構想される。同様に、バイアルも、単一用量を含むこともあるが、別法として、複数の用量を含むこともある。
【０１３７】
有効投与体積は、型通りに定めることができるが、注射用の組成物の典型的な用量は、０．５ｍＬの体積を有する。ある特定の実施形態では、用量は、ヒト対象への投与用に処方される。ある特定の実施形態では、用量は、成人、１３〜１９才、青年、幼児、または乳児（すなわち、１才以下）のヒト対象への投与用に処方され、好ましい実施形態では、注射によって投与してよい。
【０１３８】
本開示の液体免疫原性組成物は、凍結乾燥形態の体裁である他の免疫原性組成物を復元するのにも適する。免疫原性組成物をそのような即座の復元に使用する場合では、本開示は、２本以上のバイアル、２本以上の充填準備済み注射器、またはそれぞれの１つまたは複数を備え、注射器の中身は、注射前にバイアルの中身を復元するのに使用され、または逆も同様である、キットを提供する。
【０１３９】
別法として、本開示の免疫原性組成物は、たとえば、平均直径サイズなどの粒子特性が、その調製に使用される正確な方法を多様にすることで選択および制御できる、マイクロペレットやマイクロスフェアなどの、規則的形状（たとえば、球形）の乾燥粒子の生成に、当技術分野でよく知られている多数の凍結乾燥方法の１つを使用して、凍結乾燥し、復元してもよい。免疫原性組成物は、マイクロペレットやマイクロスフェアなどの、別個の規則的形状（たとえば、球形）の乾燥粒子と場合により一緒に調製され、またはその中に含まれていてもよい、アジュバントをさらに含んでよい。このような実施形態において、本開示はさらに、安定化された乾燥免疫原性組成物を含み、本開示の１種または複数の保存剤を場合によりさらに含む、第１の構成要素と、第１の構成要素を復元するための滅菌水溶液を含む第２の構成要素とを含む免疫原性組成物キットを提供する。ある特定の実施形態では、水溶液は、１種または複数の保存剤を含み、少なくとも１種のアジュバントを場合により含んでもよい（たとえば、ＷＯ２００９／１０９５５０（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０１４０】
さらに別の実施形態では、多用量フォーマットの容器は、限定はしないが、一般実験用ガラス器具、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクター、管材料、パイプ、袋、広口瓶、バイアル、バイアルクロージャー（たとえば、ゴム栓、ねじ式キャップ）、アンプル、注射器、二重または多重チャンバー注射器、注射器ストッパー、注射器プランジャー、ゴムクロージャー、プラスチッククロージャー、ガラスクロージャー、カートリッジ、および使い捨てペンなどからなる群の１つまたは複数から選択される。本開示の容器には、製造の材料による制限はなく、ガラス、金属（たとえば、鋼、ステンレス鋼、アルミニウムなど）、ポリマー（たとえば、熱可塑性樹脂、エラストマー、熱可塑性エラストマー）などの材料が含まれる。特定の実施形態では、フォーマットの容器は、ブチル栓付きの５ｍＬのＳｃｈｏｔｔ  １型ガラスバイアルである。当業者なら、上述のフォーマットは、決して網羅的なリストでなく、本開示に利用可能なフォーマットの多様性について、当業者への手引きとして役立つものに過ぎないことは理解される。本開示における使用が企図される追加のフォーマットは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．（オハイオ州ライマ）、ＶＷＲなどの、実験器具の供給業者および製造業者の公開カタログにおいて見ることができる。
【０１４１】
免疫応答を誘発し、感染を防御する方法
本開示は、本明細書に記載の免疫原性組成物の使用方法も包含する。たとえば、本開示の一実施形態は、病原性細菌、たとえば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に対する免疫応答を誘発する方法であって、病原性細菌由来の細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかの免疫原性量を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示の一実施形態は、対象の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防御する方法、または肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防する方法、または肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減もしくは発症を遅らせる方法であって、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかの免疫原性量を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示の一実施形態は、対象において、連鎖球菌属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）と関連する連鎖球菌感染、疾患、または状態を治療または予防する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療または予防有効量を対象に投与するステップを含む用法を提供する。一部の実施形態では、連鎖球菌感染、疾患、または状態の治療または予防方法は、ヒト、獣医学、動物、または農学の処置を含む。別の実施形態は、対象において、連鎖球菌属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）と関連する連鎖球菌感染、疾患、または状態を治療または予防する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成するステップと、前記抗体調製物を使用して、対象に受動免疫を付与するステップとを含む方法を提供する。本開示の一実施形態は、外科的手順を受けている対象において連鎖球菌感染を予防する方法であって、外科的手順の前に、本明細書に記載の免疫原性組成物の予防有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１４２】
抗原または免疫原性組成物に対する「免疫応答」は、問題の抗原またはワクチン組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞媒介性免疫応答の、対象における展開である。本開示の目的では、「体液性免疫応答」とは、抗体を媒介とする免疫応答であり、本開示の免疫原性組成物中の抗原を認識し、それにいくらかの親和性で結合する抗体の誘導および生成が伴うのに対し、「細胞性免疫応答」とは、Ｔ細胞および／または他の白血球を媒介とするものである。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩもしくはクラスＩＩ分子、ＣＤ１、または他の非古典的ＭＨＣ様分子と共同しての抗原エピトープの提示によって惹起される。これによって、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）が活性化される。ＣＴＬは、古典的または非古典的ＭＨＣによってコードされ、細胞の表面に発現されたタンパク質と共同して提示されているペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内での破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による、抗原特異的な応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、古典的または非古典的ＭＨＣ分子と共同してその表面にペプチドまたは他の抗原を提示している細胞に対して、非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性を集中させるのを助ける働きをする。「細胞媒介性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカイン、ならびに、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から派生するものを含めて、活性化型Ｔ細胞および／または他の白血球によって産生される他のそうした分子の産生にも関連している。特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫応答を刺激する能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）検定やＣＴＬ細胞傷害性細胞検定などによるいくつかの検定によって、感作された対象において抗原に特異的なＴリンパ球について検定することによって、または抗原による再刺激に応じたＴ細胞によるサイトカイン産生の測定によって求めることができる。このような検定は、当技術分野でよく知られている。たとえば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９〜４１９９；およびＤｏｅら（１９９４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９〜２３７６を参照されたい。
【０１４３】
本明細書で使用するとき、「治療」（その変形語、たとえば、「治療する」または「治療される」を含める）とは、次のいずれか１つまたは複数を意味する。（ｉ）伝統的なワクチンでのような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の重症度の軽減または除去、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的または完全な除去。したがって、治療は、（感染前に）予防的に行ってもよいし、または（感染後に）治療的に行ってもよい。本開示において、予防的治療は、好ましい方式である。本開示の特定の実施形態によれば、宿主動物を微生物感染（たとえば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）などの細菌）に対して予防的および／または治療的に免疫化することを含めて治療する組成物および方法が提供される。本開示の方法は、対象に予防的および／または治療的な免疫を付与するのに有用である。本開示の方法は、生物医学的研究用途のための対象において実施することもできる。
【０１４４】
本明細書で使用するとき、「哺乳動物」とは、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。より詳細には、哺乳動物は、ヒト、家畜、ならびに研究、動物園、競技、および愛玩用の伴侶動物、たとえば、限定はしないが、ウシ、ヒツジ、フェレット、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコなどを含む、家庭用愛玩動物および他の家畜化された動物を含めて、哺乳動物として分類されるいかなる動物も指す。好ましい伴侶動物は、イヌおよびネコである。哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。
【０１４５】
本明細書ではどちらも区別なく使用される「免疫原性量」および「免疫学的有効量」は、当業者に知られている標準の検定によって測定したとき、細胞性（Ｔ細胞）もしくは体液性（Ｂ細胞もしくは抗体）応答のいずれかまたは両方の免疫応答を惹起するのに十分な、抗原または免疫原性組成物の量を指す。
【０１４６】
組成物中の特定の複合物の量は、一般に、その複合物について複合化されたおよび複合化されていない全多糖を基準にして算出される。たとえば、２０％の遊離多糖を伴う複合物は、多糖用量１００ｍｃｇ中に、複合化された多糖約８０ｍｃｇと、複合化されていない多糖約２０ｍｃｇを有する。タンパク質の複合物への寄与は、複合物の用量を算出するとき、普通は考慮に入れない。複合物の量は、連鎖球菌の血清型に応じて様々となりうる。一般に、各用量は、０．１〜１００ｍｃｇ、特に０．１〜１０ｍｃｇ、より特段には１〜１０ｍｃｇの多糖を含む。免疫原性組成物中の種々の多糖成分の「免疫原性量」は、相違することもあり、それぞれが、特定のいずれかの多糖抗原１ｍｃｇ、２ｍｃｇ、３ｍｃｇ、４ｍｃｇ、５ｍｃｇ、６ｍｃｇ、７ｍｃｇ、８ｍｃｇ、９ｍｃｇ、１０ｍｃｇ、１５ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇ、４０ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ、７０ｍｃｇ、８０ｍｃｇ、９０ｍｃｇ、または約１００ｍｃｇを含んでよい。
【０１４７】
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）「侵襲性疾患」は、疾患の関連する臨床徴候／症状が存在する場合において、通常は無菌の部位から細菌が分離されることである。通常は無菌の身体部位には、血液、ＣＳＦ、胸水、心膜液、腹水、関節／滑液、骨、内部身体部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎臓、膵臓、卵巣）、または通常は無菌の他の部位が含まれる。侵襲性疾患を特徴付ける臨床状態には、菌血症、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、敗血症性ショックなどが含まれる。
【０１４８】
免疫原としての抗原の有効性は、増殖検定、またはＴ細胞がその特異的な標的細胞を溶解する能力を測定する、クロム放出検定などの細胞溶解性検定、または血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによる、Ｂ細胞活性のレベルの測定のいずれかによって測定することができる。免疫応答は、抗原が投与された後に誘導された、抗原に特異的な抗体の血清レベルの測定によって、より詳細には、そのように誘導された抗体が本明細書に記載のとおりの特定の白血球のオプソニン化貪食作用能を増強する能力を測定することによって検出してもよい。免疫応答の防御のレベルは、免疫化された宿主に、投与したことのある抗原を負荷することによって測定することができる。たとえば、免疫応答が所望される抗原が細菌である場合、免疫原性量の抗原によって誘発された防御のレベルは、動物に細菌細胞を負荷した後の生存パーセントまたは死亡パーセントを検出することによって測定される。一実施形態では、防御の量は、細菌感染と関連する少なくとも１つの症状、たとえば、感染と関連する発熱の計測によって測定することができる。多抗原または多成分ワクチンまたは免疫原性組成物中の抗原それぞれの量は、他の成分それぞれに対して様々となり、当業者に知られている方法によって決定することができる。そのような方法には、免疫原性および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ効力を測定する手順が含まれるであろう。ある特定の実施形態では、用語「約」とは、示した値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【０１４９】
本開示はさらに、本開示の莢膜多糖または複合糖質に特異的かつ選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。一部の実施形態では、抗体は、本開示の莢膜多糖または複合糖質が対象に投与されると生成される。一部の実施形態では、本開示は、本開示の莢膜多糖または複合糖質の１つまたは複数に向けられた、精製または単離された抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示の抗体は、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食作用死滅検定での細菌の死滅によって測定したときに機能しうる。一部の実施形態では、本開示の抗体によって、対象に受動免疫が付与される。本開示はさらに、当業者によく知られている技術を使用して、本開示の抗体もしくは抗体断片をコードするポリヌクレオチド分子、細胞、細胞系（ハイブリドーマ細胞または抗体を組換え産生するための他の操作された細胞系など）、または本開示の抗体または抗体組成物を産生するトランスジェニック動物を提供する。
【０１５０】
本開示の抗体または抗体組成物は、対象において、連鎖球菌感染、連鎖球菌属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）と関連する疾患または状態を治療または予防する方法であって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成するステップと、前記抗体または抗体組成物を使用して、対象に受動免疫を付与するステップとを含む方法において使用することができる。本開示の抗体は、たとえば、莢膜多糖もしくはその複合糖質の存在を検出し、またはそのレベルを定量化する、診断方法にも有用となりうる。
【０１５１】
以下の実施例は、実例として、限定する目的でなく提供する。略語：ＭＷ＝分子量、ＷＦＩ＝注射用水、ＴＥＭＰＯ＝２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシフリーラジカル、ＮＣＳ＝Ｎ−クロロスクシンイミド。
【実施例】
【０１５２】
（実施例１）
ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳを使用してのＰｎ血清型−１２Ｆの複合化
血清型１２Ｆ−ＣＲＭ１９７複合糖質の安定性を向上させるために、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ）および共酸化体としてのＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を使用して第一級アルコールをアルデヒド基に酸化する、代替化学事象を探索した。ＧＣ／ＭＳ分析では、酸化の部位が、過ヨウ素酸塩を媒介とする酸化の部位と異なっていたことが示された。ＴＥＭＰＯ−ＮＣＳ酸化の場合では、α−Ｄ−Ｇｌｃｐおよび２−Ｇｌｃｐが酸化されたが、過ヨウ素酸塩を使用したとき、α−Ｄ−Ｇａｌｐが酸化の主要部位であった（図１を参照のこと）。本明細書でさらに詳述するとおり、ＴＥＭＰＯを触媒量（≦０．１モル当量）で使用し、ＮＣＳの使用量を様々にすることにより、所望の酸化度（ＤＯ）が実現された。引き続いて、いくつかの複合物を合成し、特徴付けた。一般に、血清型１２Ｆ複合糖質の製造は、次のとおりのいくつかの段階で実施した。
１）血清型１２多糖を分子量５０〜５００ｋＤａにする加水分解
２）ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳによる血清型１２Ｆ多糖の活性化
３）活性化した多糖の精製
４）活性化した血清型１２ＦのＣＲＭ１９７タンパク質との複合化
５）血清型１２Ｆ−ＣＲＭ複合物の精製
【０１５３】
（実施例２）
血清型１２Ｆの加水分解および酸化
多糖の加水分解は、通常、酸性条件下で加熱しながら行って、１００〜３５０ｋＤａの所望の範囲の平均分子量を実現した。典型的な実験を以下に記載する。
【０１５４】
加水分解
血清型１２Ｆ多糖溶液をジャケット付き反応容器に加えた。これに、必要な体積の０．３０Ｍ酢酸および注射用水（ＷＦＩ）を加えて、約０．１Ｍの酢酸濃度を維持した。１Ｎ  ＮａＯＨまたは氷酢酸を使用して、溶液のｐＨを３．２±０．３に調整した。反応混合物の温度を７０±５℃に上昇させた。反応混合物を７０±５℃で９０〜１２０分間撹拌した。反応混合物を２３±２℃に冷却し、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を加えて中和した（ｐＨ７．０）。加水分解された多糖は、３０Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用する、ＷＦＩに対する限外濾過／ダイアフィルトレーションによって精製した。溶液を０．２２μｍフィルターで濾過し、酸化まで２〜８℃で貯蔵した。加水分解多糖の分子量をＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって分析して、分子量が１００〜３５０ｋＤａの目標範囲に確実に適合するようにした。
【０１５５】
部分的酸化
ある実験では、マイクロフルイダイザーを使用する加圧均質化を使用して、血清型１２Ｆ多糖を機械的にサイズ調整して、分子量をおよそ１００〜５００ｋＤａに低下させた。サイズ調整された多糖を４．０ｍｇ／ｍＬの濃度で反応容器に加え、炭酸水素塩／炭酸塩緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３／０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．６）と１：１ｖ／ｖの比で混合した。撹拌した混合物に、０．１ｍｏｌ当量以下のＴＥＭＰＯを加えた。０．６〜１．０ｍｏｌ当量のＮＣＳを加えて、反応を開始した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、その後、活性化した多糖を、３０Ｋ限外濾過膜を使用するＷＦＩでのダイアフィルトレーションによって精製した。精製された多糖を集め、アルデヒド（３−メチル−２−ベノチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）検定を使用する）および多糖（アントロン検定を使用する）の定量的測定によって、酸化度（ＤＯ）を求めた。
【０１５６】
別の実験では、血清型１２Ｆ多糖を加水分解して、分子量をおよそ１００〜５００ｋＤａの分子量に低下させた。血清型１２Ｆ多糖を反応容器に加え、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３／０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．６）と１：１ｖ／ｖの比で混合した。撹拌した混合物に、ＷＦＩに溶解した０．６〜１．０モル当量のＮＣＳを加えた。ＷＦＩに溶解したおよそ０．１モル当量のＴＥＭＰＯを加えて、活性化を開始した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、その後、活性化した多糖を、３０Ｋ限外濾過膜を使用するＷＦＩでのダイアフィルトレーションによって精製した。精製した活性化多糖を０．２μｍフィルターで濾過し、使用前に４℃で貯蔵した。
【０１５７】
ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳを媒介とする酸化は、ｐＨ６．５、７．０、７．５、および８．０のリン酸ナトリウム緩衝液中でも好結果に行われた。一部の活性化実験では、糖の過酸化を回避するために、ｎ−プロパノールなどの第一級アルコールを使用して、試薬を失活させた。別の組の実験では、化学的に加水分解した多糖をそのまま酸化にかけ、限外濾過／ダイアフィルトレーション精製ステップを無しとした。
【０１５８】
（実施例３）
酸化した血清型１２Ｆ多糖の複合化
ある実験では、精製された酸化した血清型１２Ｆ多糖を反応容器に加えた後、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて、最終緩衝液濃度を０．１Ｍとした。この溶液に、予め凍結乾燥したＣＲＭ１９７を加え、十分に混合して、均質な溶液を得た。希ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを６．８に調整した。これに続いて、１．５モル当量のＮａＣＮＢＨ３を加えた。反応混合物を室温（２３℃）で２４時間、３７℃で２．５日間撹拌した。次いで、反応混合物を１×０．９％食塩水で希釈し、未反応のアルデヒド基を、２モル当量の水素化ホウ素ナトリウムで「キャッピング」した。キャッピング反応時間は、３時間とした。
【０１５９】
別の実験では、精製された活性化血清型１２Ｆを反応容器に加えた後、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて、最終緩衝液濃度を０．１Ｍとした。この溶液に、予め凍結乾燥したＣＲＭ１９７を加え、十分に混合して、均質な溶液を得た。希ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを６．８に調整した。これに続いて、３モル当量のＮａＣＮＢＨ３を加えた。反応混合物を２３℃で２４時間、３７℃で４８時間撹拌した。次いで、反応混合物を、撹拌しながら１×０．９％食塩水で希釈し、未反応のアルデヒド基を、１モル当量の水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ４で「キャッピング」した。キャッピング反応時間は、３時間とした。
【０１６０】
別の実験では、精製された活性化血清型１２Ｆを反応容器に加え、ＣＲＭ１９７溶液と混合した。混合物を凍結乾燥し、粉末を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解させて、最終糖濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。必要なら、希ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを６．８に調整した。これに続いて、３モル当量のＮａＣＮＢＨ３を加えた。反応混合物を２３℃で２４時間、３７℃で４８時間撹拌した。次いで、反応混合物を１×０．９％食塩水で希釈し、未反応のアルデヒド基を、１モル当量の水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ４で「キャッピング」した。キャッピング反応時間は、３時間とした。
【０１６１】
（実施例４）
複合物の精製
キャッピングされた反応混合物は、５μｍフィルターを使用して濾過し、次いで、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜を使用して精製した。複合物は、最初に、１０ｍＭコハク酸塩／０．９％食塩水（ｐＨ６．０）緩衝液を使用してダイアフィルトレーションにかけた。次いで、精製された複合物を０．４５／０．２２μｍフィルターで濾過して、バルク複合物を得た。
【０１６２】
（実施例５）
酸化度
血清型１２Ｆ多糖における第一級アルコールの好結果の酸化を、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ系を使用して実現した。ＮＣＳ共酸化体の量を調整することにより、加水分解された血清型１２Ｆ多糖を、様々な酸化度（ＤＯ）レベルに酸化した。異なる多糖バッチおよび分子量を使用しての、様々な量のＮＣＳによるＤＯへの影響を図２に示す。通常、０．５〜２．５モル当量のＮＣＳを使用して、目標酸化度を実現した。通常、２時間後にＤＯの有意な変化が認められなかったとき、酸化反応を２時間で終えた。
【０１６３】
ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳで酸化した多糖を使用して、いくつかの血清型１２Ｆ複合物を作製し、特徴付けた。結果を表１に要約する。ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ系で活性化させた他の肺炎球菌血清型を使用しても、いくつかの代表的な複合物が好結果に作製された。他の肺炎球菌血清型についての複合物の作製手順は、血清型１２Ｆに使用した方法と同じであった。結果を表２〜４に記載する。
【０１６４】
【表１】
2018127632.tif 000002
【０１６５】
【表２】
2018127632.tif 000003
【０１６６】
【表３】
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【０１６７】
【表４】
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【０１６８】
（実施例６）
ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化方法を使用してのＰｎ−血清型１２Ｆ−ＣＲＭ１９７複合物の免疫原性
血清型１２Ｆ−ＣＲＭ１９７複合物についてのマウスにおけるオプソニン化貪食作用活性（ＯＰＡ）力価を、標準条件下のマウスにおいて求めた。４週間および７週間の時点のＯＰＡ力価（信頼区間（ＣＩ）９５％の幾何平均力価（ＧＭＴ））を表５に示しており、血清型１２Ｆ−ＣＲＭ１９７複合物（バッチ１２Ｆ−９７Ｂ、この複合物の特徴付けデータについては表１も参照のこと）が、ネズミ免疫原性モデルにおいてＯＰＡ力価を引き出したことが実証されている。ＴＥＭＰＯ−ＮＣＳによって生成した複合物は、過ヨウ素酸塩酸化から生成された対照複合物（１７１Ｂ）よりも免疫原性を有していた。
【０１６９】
【表５】
2018127632.tif 000006
【０１７０】
（実施例７）
Ｐｎ−血清型１２Ｆ複合物について、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳなどの酸化体の存在下でニトロキシルラジカルを使用する推定上の機序
Ｐｎ−血清型１２Ｆの酸化／複合化の推定上の機序を図６に示す。多糖の第１ヒドロキシル基は、化学量論的酸化体としてのＮＣＳなどの酸化体を伴う、触媒量のＴＥＭＰＯなどのニトロキシルラジカルによって酸化される。触媒回路において、実際の酸化体は、Ｎ−オキソアンモニウム塩である。Ｃ−６第１ヒドロキシル基の酸化によってアルデヒド基が生じ、これが、担体タンパク質（ＣＲＭ１９７）のリシンの第一級アミノ基と引き続いて反応して、複合糖質が生成する。
【０１７１】
（実施例８）
安定性比較
過ヨウ素酸塩酸化とＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化によって生成した複合物の（２５℃での）安定性の比較（図７を参照のこと）によって、Ｐｎ−１２Ｆ多糖の酸化によって生成した複合物が相対的により安定であることが実証された。図７に示されるとおり、Ｐｎ−１２Ｆ多糖の過ヨウ素酸塩酸化によって生成した複合糖質では、２５℃で、遊離糖の経時的な増加が認められた。対照的に、Ｐｎ−１２Ｆ多糖のＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化を使用して調製した複合糖質では、同様の条件下で、有意な遊離糖傾向は示されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月11日(2018.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体タンパク質と複合化された糖を含み、約５００ｋＤａ〜約５，０００ｋＤａの間の分子量を有する複合糖質であって、
ａ）糖を安定なニトロキシルラジカル化合物および酸化体と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、ここにおいて、当該糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆ莢膜多糖である、そして、
ｂ）前記活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップと
を含む方法によって作製される、
前記複合糖質。
【請求項２】
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する分子である、請求項１に記載の複合糖質。
【請求項３】
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する分子である、請求項１または２に記載の複合糖質。
【請求項４】
前記ニトロキシルラジカル化合物が、ＴＥＭＰＯ、２，２，６，６−テトラメチル−４−（メチルスルホニルオキシ）−１−ピペリジノオキシ、４−ホスホノオキシ−ＴＥＭＰＯ、４−オキソ−ＴＥＭＰＯ、４−メトキシ−ＴＥＭＰＯ、４−イソチオシアナト−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ヨードアセトアミド）−ＴＥＭＰＯフリーラジカル、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ、４−シアノ−ＴＥＭＰＯ、４−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ、４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルからなる群から選択される、請求項１に記載の複合糖質。
【請求項５】
前記ニトロキシルラジカル化合物が、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である、請求項１に記載の複合糖質。
【請求項６】
前記酸化体が、ニトロキシルラジカル化合物の存在下で第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、Ｎ−ハロ部分を有する分子である、請求項１−５のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項７】
前記酸化体が、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸、および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される、請求項１−６のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項８】
前記酸化体がＮ−クロロスクシンイミドである、請求項１−６のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項９】
前記反応ステップａ）を、
−水性溶媒中で実施する、あるいは；
−非プロトン性溶媒中で実施する、あるいは；
−ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶媒中で実施する、
請求項１−８のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１０】
−０．１〜１０モル当量の酸化体、または；
−０．５〜１．５モル当量の酸化体
と前記糖を反応させる、請求項１−９のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１１】
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、触媒量で存在する、請求項１−１０のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１２】
前記糖を、約０．３モル当量未満の安定なニトロキシルラジカル化合物と反応させる、請求項１−１０のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１３】
前記活性化した糖の酸化度が３〜４０の範囲である、請求項１−１２のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１４】
前記担体タンパク質が、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒素である、請求項１−１３のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１５】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１−１３のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１６】
ステップａ）の前に、前記糖を、加水分解し、または加圧均質化によって機械的にサイズ調整して、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を実現する、請求項１−１５のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１７】
ステップａ）の前に、前記糖を、１５０〜３５０ｋＤａの範囲の分子量に加水分解する、請求項１−１５のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１８】
分子量が約１，０００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａの間である、請求項１−１７のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項１９】
細菌莢膜多糖を含み、ここにおいて、細菌莢膜多糖の分子量が１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間である、あるいは、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間である、請求項１−１７のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項２０】
全多糖に対して約３０％未満の遊離糖を含む、請求項１−１９のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項２１】
糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２〜４の間である、あるいは、１．１〜１．７の間である、請求項１−２０のいずれか一項に記載の複合糖質。
【請求項２２】
請求項１−２１のいずれか一項に記載の複合糖質と、薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む、免疫原性組成物。
【請求項２３】
追加抗原をさらに含む、ここにおいて、前記追加抗原が、Ｐｎ−血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、および２３Ｆ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
アルミニウム系アジュバントをさらに含む、請求項２２または２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記組成物中の遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量が、調製されてから１２０日後に３５％未満である、請求項２２−２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量が、調製されてから１２０日後に３０％未満である、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
医薬として使用するための、請求項１−２１のいずれか一項に記載の複合糖質、または、請求項２２−２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
ワクチンとして使用するための、請求項１−２１のいずれか一項に記載の複合糖質、または、請求項２２−２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
対象において、細菌性の感染、疾患、または状態を予防、治療、または改善する方法において使用するための、ここにおいて、前記感染、疾患、または状態が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌と関連する、請求項２２−２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
対象において防御免疫応答を誘発する方法において使用するための、請求項２２−２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
本開示の抗体または抗体組成物は、対象において、連鎖球菌感染、連鎖球菌属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）と関連する疾患または状態を治療または予防する方法であって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成するステップと、前記抗体または抗体組成物を使用して、対象に受動免疫を付与するステップとを含む方法において使用することができる。本開示の抗体は、たとえば、莢膜多糖もしくはその複合糖質の存在を検出し、またはそのレベルを定量化する、診断方法にも有用となりうる。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の作製方法であって、
ａ）糖を安定なニトロキシルラジカル化合物および酸化体と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、
ｂ）前記活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップと
を含む方法。
［態様２］
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有するピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である、態様１に記載の方法。
［態様３］
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有するピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である、態様１または２に記載の方法。
［態様４］
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、第二級ヒドロキシル基に影響を及ぼさずに第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する分子である、態様１に記載の方法。
［態様５］
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、酸化体の存在下で、カルボキシル基へ過酸化することなく第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、ＴＥＭＰＯまたはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する分子である、態様１または４に記載の方法。
［態様６］
前記ニトロキシルラジカル化合物が、ＴＥＭＰＯ、２，２，６，６−テトラメチル−４−（メチルスルホニルオキシ）−１−ピペリジノオキシ、４−ホスホノオキシ−ＴＥＭＰＯ、４−オキソ−ＴＥＭＰＯ、４−メトキシ−ＴＥＭＰＯ、４−イソチオシアナト−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ヨードアセトアミド）−ＴＥＭＰＯフリーラジカル、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ、４−シアノ−ＴＥＭＰＯ、４−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ、４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルからなる群から選択される、態様１に記載の方法。
［態様７］
前記ニトロキシルラジカル化合物が、３β−ＤＯＸＹＬ−５α−コレスタン、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、１６−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、５−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸メチル、３−（アミノメチル）−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−ＰＲＯＸＹＬ、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ、３−シアノ−ＰＲＯＸＹＬからなる群から選択される、態様１に記載の方法。
［態様８］
前記ニトロキシルラジカル化合物が、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である、態様１に記載の方法。
［態様９］
前記酸化体が、ニトロキシルラジカル化合物の存在下で第一級アルコールを選択的に酸化してアルデヒド基を生じる能力を有する、Ｎ−ハロ部分を有する分子である、態様１から８のいずれか一項に記載の方法。
［態様１０］
前記酸化体が、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸、および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される、態様１から８のいずれか一項に記載の方法。
［態様１１］
前記酸化体がＮ−クロロスクシンイミドである、態様１から８のいずれか一項に記載の方法。
［態様１２］
前記反応ステップａ）を水性溶媒中で実施する、態様１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［態様１３］
前記反応ステップａ）を非プロトン性溶媒中で実施する、態様１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［態様１４］
前記反応ステップａ）を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶媒中で実施する、態様１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［態様１５］
前記糖を０．１〜１０モル当量の酸化体と反応させる、態様１から１４のいずれか一項に記載の方法。
［態様１６］
前記糖を０．５〜１．５モル当量の酸化体と反応させる、態様１５に記載の方法。
［態様１７］
前記安定なニトロキシルラジカル化合物が、触媒量で存在する、態様１から１６のいずれか一項に記載の方法。
［態様１８］
前記糖を、約０．３モル当量未満の安定なニトロキシルラジカル化合物と反応させる、態様１から１６のいずれか一項に記載の方法。
［態様１９］
担体タンパク質と複合化された糖を含む複合糖質の作製方法であって、
ａ）水性溶媒中で、糖を２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化した糖を生成するステップと、
ｂ）前記活性化した糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップと
を含む方法。
［態様２０］
前記活性化した糖の酸化度が３〜４０の範囲である、態様１から１９のいずれか一項に記載の方法。
［態様２１］
前記活性化した糖の酸化度が６〜１４の範囲である、態様２０に記載の方法。
［態様２２］
前記糖が細菌莢膜多糖である、態様１から２１のいずれか一項に記載の方法。
［態様２３］
前記莢膜多糖が肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来である、態様２２に記載の方法。
［態様２４］
前記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型３、Ｐｎ−血清型１０Ａ、Ｐｎ−血清型１２Ｆ、およびＰｎ−血清型３３Ｆ莢膜多糖から選択される、態様２３に記載の方法。
［態様２５］
前記莢膜多糖がＰｎ−血清型１２Ｆ莢膜多糖である、態様２４に記載の方法。
［態様２６］
前記莢膜多糖が髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である、態様２２に記載の方法。
［態様２７］
前記莢膜多糖が、髄膜炎菌（Ｍｎ）−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される、態様２６に記載の方法。
［態様２８］
前記莢膜多糖が髄膜炎菌（Ｍｎ）−血清型Ｘ莢膜多糖である、態様２６に記載の方法。
［態様２９］
前記莢膜多糖がＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）由来である、態様２２に記載の方法。
［態様３０］
前記莢膜多糖が、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される、態様２９に記載の方法。
［態様３１］
前記担体タンパク質が、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒素である、態様１から３０のいずれか一項に記載の方法。
［態様３２］
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様１から３０のいずれか一項に記載の方法。
［態様３３］
前記糖が、合成によって得られたものである、態様１から３２のいずれか一項に記載の方法。
［態様３４］
ステップａ）の前に、前記糖をサイズ調整する、態様１から３３のいずれか一項に記載の方法。
［態様３５］
前記糖を加水分解または機械的にサイズ調整する、態様３４に記載の方法。
［態様３６］
前記糖を、加水分解し、または加圧均質化によって機械的にサイズ調整して、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を実現する、態様３４に記載の方法。
［態様３７］
ステップａ）の前に、前記糖を、１００〜４００ｋＤａの範囲の分子量に加水分解する、態様１から３３のいずれか一項に記載の方法。
［態様３８］
前記糖を、１５０〜３５０ｋＤａの範囲の分子量に加水分解する、態様３７に記載の方法。
［態様３９］
ステップｂ）の前に、前記活性化した多糖を精製するステップをさらに含む、態様１から３８のいずれかに記載の方法。
［態様４０］
ステップｂ）の後に、還元剤を加えるステップをさらに含む、態様１から３９のいずれかに記載の方法。
［態様４１］
前記還元剤がＮａＣＮＢＨ３である、態様４０に記載の方法。
［態様４２］
ＮａＣＮＢＨ３を加えた後にＮａＢＨ４を加えるステップをさらに含む、態様４１に記載の方法。
［態様４３］
ＮａＢＨ４を加えた後に、精製ステップをさらに含む、態様４２に記載の方法。
［態様４４］
態様１から４３のいずれか一項に記載の方法によって製造された複合糖質。
［態様４５］
態様１から４３のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な複合糖質。
［態様４６］
分子量が約５０ｋＤａ〜約２０，０００ｋＤａの間である、態様４４または４５に記載の複合糖質。
［態様４７］
分子量が約５００ｋＤａ〜約５，０００ｋＤａの間である、態様４４または４５に記載の複合糖質。
［態様４８］
分子量が約１，０００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａの間である、態様４４または４５に記載の複合糖質。
［態様４９］
分子量が、約６００ｋＤａ〜約２８００ｋＤａの間、約７００ｋＤａ〜約２７００ｋＤａの間、約１０００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの間、約１８００ｋＤａ〜約２５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａ〜約２２００ｋＤａの間、約１９００ｋＤａ〜約２７００ｋＤａの間、約１２００ｋＤａ〜約２４００ｋＤａの間、約１７００ｋＤａ〜約２６００ｋＤａの間、約１３００ｋＤａ〜約２６００ｋＤａの間、または約１６００ｋＤａ〜約３０００ｋＤａの間である、態様４４または４５に記載の複合糖質
［態様５０］
分子量が１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間である細菌莢膜多糖を含む、態様４４から４９のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様５１］
分子量が５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間である細菌莢膜多糖を含む、態様４４から４９のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様５２］
全多糖に対して約３０％未満の遊離糖を含む、態様４４から５１のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様５３］
全多糖に対して約２０％、１５％、１０％、または５％未満の遊離多糖を含む、態様４４から５１のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様５４］
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様４４から５３のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様５５］
糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２〜４の間である、態様４４から５４のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様５６］
糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が１．１〜１．７の間である、態様４４から５４のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様５７］
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の１００個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ存在する、態様４４から５６のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様５８］
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の４個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる、態様５７に記載の複合糖質。
［態様５９］
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の１０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる、態様５７に記載の複合糖質。
［態様６０］
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の１５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる、態様５７に記載の複合糖質。
［態様６１］
前記担体タンパク質と前記多糖の間の共有結合連結が、前記多糖の２０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１回生じる、態様５７に記載の複合糖質。
［態様６２］
前記担体タンパク質と糖の間の共有結合連結を、５〜１０個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ含む、態様５７に記載の複合糖質。
［態様６３］
前記担体タンパク質と糖の間の共有結合連結を、２〜７個の糖繰返し単位毎、３〜８個の糖繰返し単位毎、４〜９個の糖繰返し単位毎、６〜１１個の糖繰返し単位毎、７〜１２個の糖繰返し単位毎、８〜１３個の糖繰返し単位毎、９〜１４個の糖繰返し単位毎、１０〜１５個の糖繰返し単位毎、２〜６個の糖繰返し単位毎、３〜７個の糖繰返し単位毎、４〜８個の糖繰返し単位毎、６〜１０個の糖繰返し単位毎、７〜１１個の糖繰返し単位毎、８〜１２個の糖繰返し単位毎、９〜１３個の糖繰返し単位毎、１０〜１４個の糖繰返し単位毎、１０〜２０個の糖繰返し単位毎、または４〜２５個の糖繰返し単位毎に少なくとも１つ含む、態様５７に記載の複合糖質。
［態様６４］
態様４４から６３のいずれか一項に記載の複合糖質と、薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物。
［態様６５］
追加抗原をさらに含む、態様６４に記載の免疫原性組成物。
［態様６６］
前記追加抗原が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む、態様６５に記載の免疫原性組成物。
［態様６７］
前記追加抗原が、Ｐｎ−血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、および２３Ｆ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、態様６６に記載の免疫原性組成物。
［態様６８］
前記追加抗原が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む、態様６５に記載の免疫原性組成物。
［態様６９］
前記追加抗原が、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、態様６８に記載の免疫原性組成物。
［態様７０］
前記追加抗原が、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）由来の莢膜多糖の複合糖質を含む、態様６５に記載の免疫原性組成物。
［態様７１］
前記追加抗原が、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、態様７０に記載の免疫原性組成物。
［態様７２］
アジュバントをさらに含む、態様６４から７１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７３］
前記アジュバントがアルミニウム系アジュバントである、態様７２に記載の免疫原性組成物。
［態様７４］
前記アルミニウム系アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される、態様７３に記載の免疫原性組成物。
［態様７５］
担体タンパク質と複合化されたＰｎ−血清型１２Ｆを含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量が、調製されてから１２０日後に３５％未満である、免疫原性組成物。
［態様７６］
遊離Ｐｎ−血清型１２Ｆ多糖の量が、調製されてから１２０日後に３０％未満である、態様７５に記載の免疫原性組成物。
［態様７７］
前記担体タンパク質が、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒素である、態様７５または７６に記載の免疫原性組成物。
［態様７８］
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様７５または７６に記載の免疫原性組成物。
［態様７９］
薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、態様７５から７８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８０］
追加抗原をさらに含む、態様７５から７９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８１］
前記追加抗原が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む、態様８０に記載の免疫原性組成物。
［態様８２］
前記追加抗原が、Ｐｎ−血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、および２３Ｆ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、態様８１に記載の免疫原性組成物。
［態様８３］
前記追加抗原が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の、タンパク質抗原または莢膜多糖の複合糖質を含む、態様８２に記載の免疫原性組成物。
［態様８４］
前記追加抗原が、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、態様８３に記載の免疫原性組成物。
［態様８５］
前記追加抗原が、血清型Ｘ莢膜多糖の複合糖質を含む、態様８３に記載の免疫原性組成物。
［態様８６］
前記追加抗原が、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）由来の莢膜多糖の複合糖質を含む、態様８０に記載の免疫原性組成物。
［態様８７］
前記追加抗原が、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから選択される莢膜多糖の複合糖質を含む、態様８６に記載の免疫原性組成物。
［態様８８］
アジュバントをさらに含む、態様７５から８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８９］
前記アジュバントがアルミニウム系アジュバントである、態様８８に記載の免疫原性組成物。
［態様９０］
前記アルミニウム系アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される、態様８９に記載の免疫原性組成物。
［態様９１］
対象において、細菌性の感染、疾患、または状態を予防、治療、または改善する方法であって、態様６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の免疫学的有効量を前記対象に投与することを含む方法。
［態様９２］
前記感染、疾患、または状態が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌と関連する、態様９１に記載の方法。
［態様９３］
前記感染、疾患、または状態が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌と関連する、態様９１に記載の方法。
［態様９４］
前記感染、疾患、または状態が、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌と関連する、態様９１に記載の方法。
［態様９５］
対象において防御免疫応答を誘発する方法であって、態様６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の免疫学的有効量を前記対象に投与することを含む方法。
［態様９６］
医薬として使用するための、態様６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９７］
医薬として使用するための、態様４４から６３のいずれか一項に記載の複合糖質。
［態様９８］
ワクチンとして使用するための、態様６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９９］
対象において、細菌性の感染、疾患、または状態を予防、治療、または改善する方法において使用するための、態様６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１００］
対象において防御免疫応答を誘発する方法において使用するための、態様６４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【外国語明細書】
2018127632000001.pdf