(57)【要約】【課題】ナノ構造化微小電極およびそれを組み込んだバイオセンシング装置の提供。【解決手段】ナノ構造化微小電極およびそれを組み込んだバイオセンシング装置が本明細書に開示されている。一態様において、本発明は、ナノ構造化微小電極（ＮＭＥ）を特徴とする。ＮＭＥは、ナノ表面構造を有し、それにしたがって、表面積が増加している電極である。別の態様において、本発明は、プローブと会合したＮＭＥを特徴とする。さらなる態様において、本発明は、基板上に整列した複数のＮＭＥを特徴とする。【選択図】図２
2018049035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ナノ構造化微小電極およびそれを組み込んだバイオセンシング装置という発明の名称である、２００８年９月５日に出願された米国仮出願第６１／０９３，６６７号の優先権を主張し、その米国仮出願は全体として本明細書に参照により組み入れられている。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム分析は、早期疾患診断に革命を起こし、患者ケアを劇的に向上させている（ＭｃＧｕｉｒｅら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１６８７、Ｓｒｉｎｉｖａｓら、ＬａｎｃｅｔＯｎｃｏｌ．２：６９８）。マイクロアレイ（Ｄｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１６４９、Ｈａｃｉａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４４１）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０）に基づいた技術は、ツールとして、この革命の先陣を切ることに貢献し、患者検査のためのアッセイの発見および初期開発（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：５４７）を可能にした。しかしながら、ゲノミクス革命の範囲をベッドサイドの患者へ広げるには、推測される疾患状態に関連して評価される個々のバイオマーカープロファイリングについての費用効率の高いツールを必要とする。具体的には、日常的な患者ケアを可能にするツールは、ＰＣＲに基づいた方法より簡単で、持ち運びでき、かつ費用が安く、しかも高度の選択性および感度を保持するべきである。
【０００３】
電気的読み出しに基づいたバイオマーカー分析は、医療検査のための適切な費用および感度をもつ、新しい一群のチップに基づいた装置を可能にする有望なアプローチとして長い間挙げられている（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１１９２、Ｋａｔｚら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  １５：９１３）。電気的読み出しの感度は、原理上では、簡単な計測での少数の分析分子の直接的検出を可能にするのに十分である。しかしながら、この領域および新しい診断法を目指す関連分野における大幅な進歩にもかかわらず（Ｃｌａｃｋら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：８２５、Ｇｅｉｓｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：３１７、Ｈａｈｍら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．４：５１、Ｍｕｎｇｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７７：４６６２、Νｉｃｅｗａｒｎｅｒ−Ｐｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１３７、Ｐａｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２９５：１５０３、Ｓｉｎｅｎｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｎａｎｏ．２：６５３、Ｓｔｅｅｍｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９１、Ｘｉａｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１１８９６、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ．Ｎａｎｏ．１：２１４、Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：４０９３、Ｙｉら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０：１３２０、Ｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９：１８０、Ａｒｍａｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：７８３）、現在の多重化チップは、細胞試料および臨床試料におけるバイオマーカーの直接的な電気的検出をまだ達成していない。そのような装置の実現を制限している課題は、複雑な生物学的試料がアッセイされる場合に存在する高いバックグラウンドノイズレベルの存在下で非常に低い検出限界を得ることの困難さ、および高度に感度が高く、かつ特異的である多重化システムを作り出すことの難関さに主として起因している。
【０００４】
マイクロスケールからナノスケールの寸法を有するシステムを用いて感度の向上の達成が可能になる可能性があるため（Ｓｚａｍｏｃｋｉら、Ａ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７、７９、５３３−５３９）、電気化学システムの小型化は、分析化学および生物分析化学における主要な焦点であり続けている（Ｍａｔｙｓｉｋ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、２００２））。マイクロメートルまたはマイクロメートル以下のスケールの寸法での電極を用いて大量の作業を実行している。これらのシステムは、二重層充電の高速化、抵抗損の低減、高い質量輸送速度、および高い電流密度などの、従来のマクロ電極と比較して多くの利点を提供する（Ｂｏｎｄら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍｉ．Ａｃｔａ
１９８９ｍ  ２１６、１７７−２３０、Ｈｅｉｎｚｅ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３、３２、１２６８−１２８８）。実際、そのような電極は、幅広い範囲の分析適用において十分確立されたツールになっている（Ｂａｒｄ、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１）、Ｒｅｉｍｅｒｓ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００７、１０７、５９０−６００、Ｚｏｓｉｃ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００７））。しかしながら、ナノスケール電極を用いて機能させることは、製作が典型的には、大きな労働力を要し、再現性が乏しく、かつそのような構造から得られる電流が典型的には、正確に測定することが難しいため、非常により困難である。
【０００５】
超高感度の核酸およびタンパク質検出のためのナノワイヤー電極の使用が研究されている（Ｇａｓｐａｒａｃら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１２２７０）。この電極プラットフォームの使用により、マクロスケール材料を用いては可能ではない感度のレベルである、ピコモルレベルの分析物の電気化学的検出が可能になる。ナノワイヤーが、アトモルレベルの分析物を検出できることが報告されているが、分析に典型的に用いられる容量を扱う場合、これは、実際には、ピコモルレベルに対応する。ナノ粒子修飾化電極が、質量輸送の増強、触媒作用、高い有効表面積、および電極微小環境の制御などの、従来のマクロ電極と比較していくつかの利点を示し得ることも実証されている（Ｋａｔｚら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  ２００４、１６、１９−４４、Ｗｅｌｃｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、３８４、６０１−６１９）。しかしながら、ナノワイヤー電極のアレイを製造することは簡単ではない。
【０００６】
白金ナノ粒子の電着により修飾されたホウ素ドープダイヤモンド微小電極は、１ｐｐｂ未満のレベルでのＡｓ（ＩＩＩ）の酸化的測定に用いられている（Ｈｒａｐｏｖｉｃら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７、７９、５００−５０７）。しかしながら、この型の電極は、多重化実験のためのアレイに基づいた型式へ組み込むことができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＭｃＧｕｉｒｅら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１６８７
【非特許文献２】Ｓｒｉｎｉｖａｓら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．２：６９８
【非特許文献３】Ｄｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１６４９
【非特許文献４】Ｈａｃｉａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４４１
【非特許文献５】Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０
【非特許文献６】Ｍｏｒｒｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：５４７
【非特許文献７】Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１１９２
【非特許文献８】Ｋａｔｚら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  １５：９１３
【非特許文献９】Ｃｌａｃｋら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：８２５
【非特許文献１０】Ｇｅｉｓｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：３１７
【非特許文献１１】Ｈａｈｍら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．４：５１
【非特許文献１２】Ｍｕｎｇｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７７：４６６２
【非特許文献１３】Νｉｃｅｗａｒｎｅｒ−Ｐｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１３７
【非特許文献１４】Ｐａｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１５０３
【非特許文献１５】Ｓｉｎｅｎｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｎａｎｏ．２：６５３
【非特許文献１６】Ｓｔｅｅｍｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９１
【非特許文献１７】Ｘｉａｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１１８９６
【非特許文献１８】Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ．Ｎａｎｏ．１：２１４
【非特許文献１９】Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：４０９３
【非特許文献２０】Ｙｉら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０：１３２０
【非特許文献２１】Ｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９：１８０
【非特許文献２２】Ａｒｍａｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：７８３
【非特許文献２３】Ｓｚａｍｏｃｋｉら、Ａ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７、７９、５３３−５３９
【非特許文献２４】Ｍａｔｙｓｉｋ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、２００２）
【非特許文献２５】Ｂｏｎｄら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍｉ．Ａｃｔａ  １９８９ｍ  ２１６、１７７−２３０
【非特許文献２６】Ｈｅｉｎｚｅ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３、３２、１２６８−１２８８
【非特許文献２７】Ｂａｒｄ、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１）
【非特許文献２８】Ｒｅｉｍｅｒｓ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００７、１０７、５９０−６００、Ｚｏｓｉｃ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００７）
【非特許文献２９】Ｇａｓｐａｒａｃら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１２２７０
【非特許文献３０】Ｋａｔｚら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  ２００４、１６、１９−４４
【非特許文献３１】Ｗｅｌｃｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、３８４、６０１−６１９
【非特許文献３２】Ｈｒａｐｏｖｉｃら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７、７９、５００−５０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
核酸またはタンパク質のバイオマーカーのパネルの分析は、下される臨床決定のための有用な診断情報および予後情報を提供する。臨床試料をプロファイリングするための特異性および感度を提供する既存の方法は、典型的には、費用がかかり、遅く、直列的である。このように、多重化形式でバイオマーカーを検出するための超高感度装置の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、ナノ構造化微小電極（ＮＭＥ）を特徴とする。ＮＭＥは、ナノ表面構造を有し、それにしたがって、表面積が増加している電極である。好ましいＮＭＥは、貴金属（例えば、金、白金、パラジウム、銀、オスミウム、インジウム、ロジウム、ルテニウム）；貴金属の合金（例えば、金−パラジウム、銀−白金など）；導電性ポリマー（例えば、ポリピロール（ＰＰＹ））；非貴金属（例えば、銅、ニッケル、アルミニウム、スズ、チタン、インジウム、タングステン、白金）；金属酸化物（例えば、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニッケル、酸化インジウムスズ、酸化チタン、窒素ドープ酸化チタン（ＴｉＯｘＮｙ））；金属ケイ化物（ケイ化ニッケル、ケイ化白金）；金属窒化物（窒化チタン（ＴｉＮ）、窒化タングステン（ＷＮ）、または窒化タンタル（ＴａＮ））；炭素（ナノチューブ、ファイバー、グラフェン、および非晶質）、または上記のいずれかの組み合わせで構成される。上記の材料のＮＭＥは、非常に導電性であり、プローブ（例えば、核酸およびペプチド）と強い結合を形成する。好ましいＮＭＥは、約０．５ミクロン（μｍ）〜約１００ミクロン（μｍ）の範囲、例えば、約５ミクロン〜約２０ミクロンの範囲（例えば、１０ミクロン）の範囲の高さ；約１ミクロン〜約１０ミクロンの範囲の直径をもち、ナノスケールの形態を有する（例えば、約１ナノメートル〜約３００ナノメートル、より好ましくは約１０ナノメートル〜約２０ナノメートルの範囲の長さスケールでナノ構造化されている）。ＮＭＥは、半球形、不規則な（例えば、スパイク状の）形、円形（ワイヤー状）、またはフラクタル形（例えば、樹枝状）を含む様々な形のいずれかであり得る。ＮＭＥの表面は、電極の高導電性を維持するが、プローブとの結合を促進する材料でさらにコーティングされてもよい。例えば、窒素含有ＮＭＥ（例えば、ＴｉＮ、ＷＮ、またはＴａＮ）は、プローブのアミン官能基と結合することができる。同様に、ＮＭＥの一部としてのシリコン／シリカ化学的性質は、プローブ上のシラン基またはシロキサン基と結合することができる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、プローブと会合したＮＭＥを特徴とする。一実施形態において、プローブは、核酸（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ））または、例えば、デオキシリボースもしくはリボースよりむしろペプチドによって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されるバックボーンを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド核酸、ロックド核酸、もしくはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを含むその類似体である。適切な条件下で、プローブは、相補的な核酸にハイブリダイズし、試料中のその核酸の存在を表示することができる。別の実施形態において、プローブは、バイオマーカー標的（例えば、受容体またはリガンド）と結合し、または別なふうに相互作用し、試料中のリガンドまたは受容体の存在を表示することができるペプチドまたはタンパク質（例えば、抗体）である。プローブは、ＮＭＥとの結合を促進する官能基（例えば、チオール、ジチオール、アミン、カルボン酸）を含んでもよい。プローブはまた、縦方向スペーサー、二本鎖および／または一本鎖領域、ポリＴリンカー、強固なリンカーとしての二本鎖デュプレックス、ならびにＰＥＧスペーサーなどの他の特徴も含んでもよい。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、基板上に整列した複数のＮＭＥを特徴とする。好ましい基板は、シリコン、シリカ、水晶、ゲルマニウム、ガリウムヒ素、炭化ケイ素およびインジウム化合物（例えば、ヒ化インジウム、アンチモン化インジウム、およびリン化インジウム）、硫化セレン、セラミック、ガラス、プラスチック、ポリカーボネートもしくは他のポリマー、または上記のいずれかの組み合わせなどの半導体材料で構成される。基板は、高抵抗性を提供し、かつ小さな活性表面積を維持する材料で構成される保護層を任意で含んでもよい。適切な材料の例として、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、窒素ドープ酸化ケイ素（ＳｉＯｘＮｙ）、またはパラリエンが挙げられる。特定の実施形態において、基板上に整列した複数のＮＭＥは、単層スペーサーと連結したプローブを含み、その単層スペーサーが、プローブ密度を最小限にし、それによって錯体形成効率を最大限にする。好ましい単層スペーサーは、金属への親和性を有し、例えば、メルカプトヘキサノール、アルカンチオール、システイン、シスタミン、チオール−アミン、芳香族チオール（例えば、ベンゼンチオール、ジチオール）、ホスホン酸、またはホスフィン酸などのチオールアルコールで構成することができる。
【００１２】
別の態様は、例えば、基板；基板上の導電性リード線；絶縁層がリード線の一部を露出するアパーチャを有する、リード線を覆う絶縁層または保護層；および微小電極が生体分子刺激（例えば、核酸ハイブリダイゼーション、またはタンパク質とタンパク質の結合）に応答して電荷を発生するように適応している、リード線の露出部分と電気通信するナノ構造化微小電極を含む、集積回路などのバイオセンシング装置を特徴とする。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明はＮＭＥを製造するための方法を特徴とする。ＮＭＥシードからナノ構造化微小電極を成長させるために電着を用いることによって、これらの構造のサイズおよび形態を精細に制御すること、ならびに１つまたは様々な基板で構成される電極の万能な製作が可能になる。ＮＭＥは、多重化実験を可能にするように単一のチップ上に一連のＮＭＥを作製するように、チップに基づいた型式などのバイオセンシング装置上に調製してもよい。このＮＭＥシステムは特に有用かつ万能であり得、ＮＭＥサイズおよび形のマイクロスケール制御、ＮＭＥナノ表面構造のナノスケール制御、ならびにＮＭＥ材料の選択を含むいくつかのパラメーターの調整を可能にする。
【００１４】
さらに別の態様は、ナノ構造化微小電極を有するバイオセンシング装置を製造するための方法を特徴とする。例えば、この方法は、リード線が絶縁層によって覆われている、基板および基板上の導電性リード線を提供するステップと；絶縁層にアパーチャをエッチングしてリード線の一部を露出させるステップと；リード線の露出部分に導電性材料を電着して上記のようなナノ構造化微小電極を形成するステップとを含み得る。
【００１５】
別の態様において、生物学的試料を含むための試料チャンバ、上記のようなバイオセンシング装置を含み、かつバイオセンシング工程を実行するためのバイオセンシングチャンバを含むバイオセンシングカートリッジが提供される。
【００１６】
さらに別の態様において、上記のようなバイオセンシングカートリッジを保持するためのカートリッジホルダーと；バイオセンシングカートリッジにアクセスするための計器チップ；実行されるべきバイオセンシング工程を選択するための選択機構と；バイオセンシングカートリッジを用いてバイオセンシング工程を実行するように、かつバイオセンシングカートリッジから発生した電気的信号からのバイオセンシング工程の結果を決定するように適応したプロセッサと；バイオセンシング工程の結果を表示するためのディスプレイとを含むバイオセンシングワークステーションが提供される。
【００１７】
さらなる態様は、上記のような装置へ組み込まれた、プローブ含有ナノ構造化微小電極を用いるバイオセンシング工程を実行する方法と；微小電極を参照電極に対してバイアスをかける方法と；微小電極と参照電極との間の参照電荷または参照電流フローを測定する方法と；微小電極を生体分子刺激（例えば、核酸プローブと相補的核酸とのハイブリダイゼーション、またはペプチドプローブと生物学的試料に存在する結合パートナーとの結合）に曝す方法と；生体分子刺激に応答して微小電極に発生した電荷または電流フローを測定する方法と；測定された電荷または測定された電流フローを参照電荷または参照電流フローに対して比較することによって存在する生体分子刺激の量を決定する方法を特徴とする。
【００１８】
ＮＭＥは万能で、ロバストで、かつ扱いが簡単である。加えて、それらは、ＣＭＯＳファウンドリーからの金属最上層への無電解析出または電着などの、最上層金属の製作のための既存のシリコンＣＭＯＳファウンドリー製作手順またはその単純な外挿法を用いて製造することができ、それによって、ＮＭＥの製造を既存の製造設備へと容易に統合することが可能になる。加えて、ＮＭＥは、プローブ分子に一貫して付着することができる。さらに、ＮＭＥは、標的分子のアクセスしやすさを促進し、それによって、ＮＭＥ付着プローブに相補的である標的分子がそのプローブの近くに入った場合、ハイブリダイゼーションまたはタンパク質とタンパク質の結合が高い確率で起こる。ＮＭＥはさらに、ハイブリダイゼーション事象の読み出しに用いられる電極触媒の電気化学作用の性能と適合する。
【００１９】
本明細書に開示された本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ナノ構造化微小電極。
（項目２）
貴金属、貴金属の合金、導電性ポリマー、金属酸化物、金属シリサイド、金属窒化物、炭素、からなる群から選択されるいずれか１つ以上の材料から構成されることを特徴とする項目１に記載のナノ構造化微小電極。
（項目３）
前記ナノ構造化微小電極の高さが０．５ミクロン〜１００ミクロンの範囲であることを特徴とする項目１に記載のナノ構造化微小電極。
（項目４）
前記ナノ構造化微小電極の長さが１ナノメートル〜３００ナノメートルの範囲であることを特徴とする項目１に記載のナノ構造化微小電極。
（項目５）
前記ナノ構造化微小電極の長さが１０ナノメートル〜２０ナノメートルの範囲であることを特徴とする項目１に記載のナノ構造化微小電極。
（項目６）
前記ナノ構造化微小電極が１ミクロン〜１０ミクロンの範囲の直径を有することを特徴とする項目１に記載のナノ構造化微小電極。
（項目７）
前記ナノ構造がスパイク状、フラクタルのいずれかであることを特徴とする項目１に
記載のナノ構造化微小電極。
（項目８）
チオール化プローブ分子、核酸、ペプチド核酸、ロックド核酸、またはチオール、核酸、ペプチド核酸、ロックド核酸で終結するホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー、またはアミン、核酸、ペプチド核酸、ロックド核酸で終結するホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー、またはカルボキシレートで終結するホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー、適切なテザー分子で官能化されたタンパク質またはペプチド、および適切なテザー分子で官能化された抗体からなる群から選択されるいずれか１つ以上のプローブをさらに含むことを特徴とする項目１に記載のナノ構造化微小電極。
（項目９）
基板と、
前記基板上の導電性リード線と、
前記リード線の一部を露出するアパーチャを有する前記リード線を覆う絶縁層と
前記リード線の露出部分と電気通信し生体分子刺激に応答して電荷を発生するように適応しているナノ構造化微小電極とを含むことを特徴とするバイオセンシング装置。
（項目１０）
前記リード線が、Ａｕ、Ａｌ、Ｗ、ＴｉＮ、およびポリシリコンからなる群から選択される材料を含む、項目９に記載のバイオセンシング装置。
（項目１１）
前記基板が、シリコン、シリカ、水晶、ガラス、サファイア、ガリウムヒ素、ゲルマニウム、炭化ケイ素、インジウム化合物、硫化セレン、セラミック、プラスチック、ポリカーボネートおよび他のポリマー、または上記のいずれかの組み合わせからなる群から選択される材料を含む、項目９に記載のバイオセンシング装置。
（項目１２）
前記絶縁層が、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、窒素ドープ酸化ケイ素、およびパリレン、または上記のいずれかの組み合わせからなる群から選択される材料で構成される、項目
９に記載のバイオセンシング装置。
（項目１３）
前記アパーチャが１００ｎｍ〜１０μｍの範囲の直径を有する、項目９に記載のバイ
オセンシング装置。
（項目１４）
前記微小電極からの電荷を蓄積するための、前記リード線と電気通信する電荷蓄積部をさらに含み、積分時間の終わりにおける前記電荷蓄積部の電荷が生体分子刺激を示している、項目９に記載のバイオセンシング装置。
（項目１５）
前記電荷蓄積部に蓄積された電荷を表示するためのディスプレイコンポーネントをさらに含む、項目９に記載のバイオセンシング装置。
（項目１６）
トランジスタをさらに含む、項目９に記載のバイオセンシング装置。
（項目１７）
前記トランジスタが電場効果トランジスタ（ＦＥＴ）である、項目１６に記載のバイ
オセンシング装置。
（項目１８）
前記ＦＥＴが、ｎ型シリコンチャネルおよびｐ型シリコンチャネルからなる群から選択される、項目１７に記載のバイオセンシング装置。
（項目１９）
前記トランジスタがバイポーラトランジスタである、項目１６に記載のバイオセンシ
ング装置。
（項目２０）
前記バイポーラトランジスタが、ｎ−ｐ−ｎバイポーラ接合トランジスタおよびｐ−ｎ−ｐバイポーラ接合トランジスタからなる群から選択される、項目１９に記載のバイオ
センシング装置。
（項目２１）
複数のリード線を含み、それぞれが個別の微小電極を有する、項目９に記載のバイオ
センシング装置。
（項目２２）
前記微小電極上に提供された少なくとも２つの異なるプローブ分子を含む、項目２１
に記載のバイオセンシング装置。
（項目２３）
前記微小電極がアレイで提供され、各微小電極が個々に電気的にアクセス可能である、項目９に記載のバイオセンシング装置。
（項目２４）
基板および前記基板上の導電性リード線を提供することであって、前記リード線が絶縁層によって覆われていることと；前記絶縁層にアパーチャをエッチングして、前記リード線の一部を露出させることと；前記リード線の露出部分に導電性材料を電着してナノ構造化微小電極を形成することとを含む、バイオセンシング装置を製造するための方法。
（項目２５）
所望の樹枝状構造を達成するために、電着することが、加電圧を制御することを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記加電圧が約０ｍＶ〜約−２５０ｍＶの範囲である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記電着することが、約２５秒間〜約５００秒間の範囲の時間で行われる、項目２４
に記載の方法。
（項目２８）
前記電着することが、Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ、およびＨＣｌＯ４からなる群から選択される電解質を用いて行われる、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記エッチングされた領域がフォトリソグラフィー的に規定される、項目２４に記載
の方法。
（項目３０）
標的生体分子についてのプローブ分子を前記微小電極の表面に結合することによって微小電極を機能化することをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目３１）
前記プローブ分子がチオール基、アミン基、またはカルボキシレート基で官能化されている、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
ナノ構造化微小電極を用いるバイオセンシング工程を行う方法であって：
項目９に記載の装置を提供することと；
参照電極に対して前記微小電極をバイアスすることと；
前記微小電極と前記参照電極の間の参照電荷または参照電流フローを測定することと；
前記微小電極を生体分子刺激に曝すことと；
前記生体分子刺激に応答して前記微小電極に発生した電荷または電流フローを測定することと；
前記測定された電荷または測定された電流フローを前記参照電荷または前記参照電流フローに対して比較することによって、存在する生体分子刺激の量を決定することと；
を含む、ナノ構造化微小電極を用いるバイオセンシング工程を行う方法。
（項目３３）
生物学的試料を含むための試料チャンバと；項目９に記載のバイオセンシング装置を
含むためのバイオセンシングチャンバとを含む、バイオセンシングカートリッジ。
（項目３４）
前記バイオセンシングチャンバが、化学的、機械的、または振動的手段によって前記生物学的試料を細分するように適応している、項目３３に記載のカートリッジ。
（項目３５）
前記試料を精製または単離するための精製チャンバをさらに含む、項目３３に記載の
カートリッジ。
（項目３６）
バイオセンシング工程を行うための試薬を含むカプセル付き蓋をさらに含む、項目３
３に記載のカートリッジ。
（項目３７）
使い捨てである、項目３３に記載のカートリッジ。
（項目３８）
項目３３に記載のバイオセンシングカートリッジを保持するためのカートリッジホル
ダー、前記バイオセンシングカートリッジにアクセスするための計器チップと；行われるべきバイオセンシング工程を選択するための選択機構と；前記バイオセンシングカートリッジを用いるバイオセンシング工程を行うように、かつ前記バイオセンシングカートリッジから発生した電気的信号から前記バイオセンシング工程の結果を決定するように適応したプロセッサと；前記バイオセンシング工程の結果を表示するためのディスプレイとを含む、バイオセンシングワークステーション。
（項目３９）
複数のバイオセンシングカートリッジを保持するための複数のカートリッジホルダーがある、項目３７に記載のワークステーション。
（項目４０）
前記計器チップが使い捨てである、項目３７に記載のワークステーション。
（項目４１）
前記バイオセンシングカートリッジを一意的に同定するためのバーコードリーダーをさらに含む、項目３７に記載のワークステーション。
（項目４２）
前記バイオセンシング工程からの廃棄物を含むための廃棄物チャンバをさらに含む、請求項３７に記載のワークステーション。
（項目４３）
無線ネットワークを通しての無線通信の能力がある、項目３７に記載のワークステー
ション。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】（Ａ）はＮＭＥバイオセンシング装置の概略図である。
【図１Ｂ】（Ｂ）はＮＭＥを形成するためのアパーチャの断面概略図である。
【図１Ｃ】（Ｃ）はアパーチャにおけるＮＭＥの形成の概略図である。
【図２】ＮＭＥバイオセンシング装置の概略図である。
【図２Ｂ】ＮＭＥバイオセンシング装置の概略図である。
【図３】プローブを有するＮＭＥの概略図であり、さらに、プローブ単層中、および電極とプローブの間のスペーサーの存在を示している。
【図４】ナノ構造化の程度が増加しているＮＭＥのＳＥＭ画像の図である。
【図５】ＮＭＥを用いる特定の配列の検知に関与するステップを示す図である。
【図６】ＮＭＥを有する集積回路の断面図である。
【図６Ｂ】ＮＭＥを有する集積回路の断面図である。
【図７】ＮＭＥと共に用いることができる回路の回路図である。
【図８】ＮＭＥのアレイを有するバイオセンシング装置の図である。
【図９】異なるＮＭＥを有するバイオセンシング装置の図である。
【図１０】バイオセンシングカートリッジの概略図である。
【図１１】バイオセンシングワークステーションの概略図である。
【図１２】（記載なし）
【図１３】（記載なし）
【図１４】（記載なし）
【図１５】（記載なし）
【図１６】（記載なし）
【図１７】（記載なし）
【図１８】（記載なし）
【図１９】（記載なし）
【図２０】（記載なし）
【図２１】（記載なし）
【図２２Ａ】（記載なし）
【図２２Ｂ】（記載なし）
【図２３】（記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示は、バイオセンシングチップなどのバイオセンシング装置に用いることができるナノ構造化微小電極（ＮＭＥ）を記載する。
【００２２】
ＮＭＥ
図１Ａは、ＮＭＥを組み込んだ例示的な装置の概略図を示す。示された例において、装置は、８本のリード線のアレイを有するチップである。この例において、ＮＭＥは、５ミクロンの幅まで次第に細くなる金リード線上に形成される。リード線は、ＳｉおよびＳｉＯ２の基板上に提供されるが、他の適切な基板材料を用いてもよい。リード線の最上層に、ＳｉＯ２などの絶縁層が析出して、リード線を電気的に絶縁し、保護している。この場合５００ｎｍの穴である、アパーチャが、絶縁層に作り出され、リード線の一部を露出させている。
【００２３】
図１Ｂは、アパーチャが位置しているチップの部分の側面図であり、装置の層を示している。最も一般的に知られたフォトリソグラフィー技術は、１００ｎｍ〜１μｍの直径アパーチャなどのアパーチャを作り出すのに適し得る。これは、典型的には、高いロバスト性と再現性を以て既存の製作設備で達成可能である。この露出した表面のみが電気化学的に活性があることを考えれば、電着（Ｍｅｎｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒ．２００６、５、９１４−９１９）を用いてこのスペース内にＮＭＥを成長させることができる。
【００２４】
図１Ｃは、ＮＭＥについてＰｄを用いる、ＮＭＥ析出の例の断面図である。この工程は下記に、より詳細に記載されている。
【００２５】
以下、同様に、チップ上のＮＭＥの形成を示す図２について言及する。図１Ａの場合のように、小さな電極がチップ上にその場で提供され、ＮＭＥの位置および電気的接触はフォトリソグラフィー的に規定されている。図１の場合のように、このチップは８重の多重化受動チップである。シリコン基板上に、約３５０ｎｍ厚さの金層が、外部計器への接続のために８本の５μｍ幅のＡｕリード線を大きな金属パッドへ接続するように、通常のフォトリソグラフィー技術を用いてパターン化されている。ピンホールのない絶縁ＳｉＯ２層が析出され、リード線の一区画を露出するためにＡｕリード線のそれぞれの末端に約５００ｎｍの開口部を生じるように（例えば、エッチングによって）パターン化されている。その後、金属ＮＭＥが、電着を用いてこの開口部にめっきされる。
【００２６】
ＮＭＥは異なる導電性材料を含んでもよい。ＮＭＥのいくつかの例が以下のように形成されているが、変形例が可能であり、下記に、より詳細に記載されている：−２５０ｍＶで１５秒間のＤＣ電位アンペラメトリーを用いて、５ｍＭのＨ２ＰｄＣｌ４および０．５ＭのＨＣｌＯ４を含む水溶液中で、分岐フラクタルＰｄ  ＮＭＥが析出された。−１００ｍＶで３００秒間のＤＣ電位アンペラメトリーを用いて、５ｍＭのＨ２ＰｄＣｌ４および０．５ＭのＨＣｌを含む水溶液中で、ナノスケールの粗度をもつ半球形Ｐｄ  ＮＭＥが析出された。０ｍＶで３００秒間、同じ溶液中で、滑らかな半球形Ｐｄ  ＮＭＥが作り上げられた。−１００ｍＶで４０秒間、０．０１ＭのＨＡｕＣｌ４の溶液および０．５ＭのＨ２ＳＯ４を含む金浴中でＡｕ  ＮＭＥが作り上げられた。−１００ｍＶで５００秒間、５ｍＭのＨ２ＰｔＣｌ６の溶液および０．５ＭのＨ２ＳＯ４を含む白金浴中でＰｔ  ＮＭＥが作り上げられた。ＮＭＥサイズおよび形態は、金属塩濃度、支持電解質の型および濃度、ならびに電着電位および持続時間を変えることによって制御することができる。
【００２７】
図３は、プローブ単層中および電極とプローブの間にスペーサーがある、プローブを有するＮＭＥの概略図である。金属陽イオンを含む化学溶液は、ＮＭＥおよび参照電極の表面との通信をもたらすことができる。参照電極はＮＭＥでも同じリード線上の従来の電極であってもよい。電気的バイアスは、ＮＭＥと参照電極の間に供給することができる。その後、化学溶液を除去し、電極を洗浄することができる。その後、プローブ分子を含む溶液は、ＮＭＥの表面との通信をもたらすことができる。プローブ分子は、ＮＭＥの表面に結合するように修飾または官能化されてもよい。例えば、プローブ分子は、チオール基、アミン基、またはカルボキシレート基で官能化されてもよい。
【００２８】
ナノ構造化が増加したＮＭＥが図４に示されている。予想外にも、電着条件を変化させることによって、極めて滑らかな半球形微小電極（左）；高度に分岐したナノスケールフラクタル構造（右）；またはナノスケールの粗度を有する半球体（中央）の成長が可能になった。左側の構造は、支持電解質としてＨＣｌを用いて０ｍＶの加電圧で形成された。中央の構造もまた、支持電解質としてＨＣｌを用いたが、−１００ｍＶの加電圧で形成された。右側の構造は、支持電解質としてＨＣｌＯ４、および−２５０ｍＶの加電圧で形成された。図上のスケールバーは、他に規定がない限り、５μｍに対応する。
【００２９】
図５は、特定の配列の検知に関与するステップを示す（Ｌａｐｉｅｒｒｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：６３２７、Ｒａｔｉｌａｉｎｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：７７８１、Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６４４）。この例において、Ｐｄ  ＮＭＥがまず、チオール誘導体化プローブ配列で修飾され、その後、標的配列がハイブリダイズされる。その後、標的の存在が電気触媒的レポーターシステムを用いて変換される。電気触媒は、電気的増幅または電気的増加を与えて、高感度読み出しを促進する：数百個の電子が各生体分子錯体形成事象から生じ得る。本明細書で用いられるアプローチは、一次電子受容体Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋に依存しており、その受容体は、結合した核酸の量と相関するレベルで電極表面に静電的に引きつけられる。電気化学的読み出しの間のＦｅ（ＣＮ）６３−の含有は、Ｆｅ（ＩＩＩ）種がよりさらに還元されやすいので、Ｒｕ（ＩＩＩ）基質を再生する働きをするが、Ｆｅ（ＩＩＩ）種は、電極から静電的に跳ね返され、それにしたがって、Ｒｕ（ＩＩ）による化学的還元を受けるだけである。この方法はまた標識なしであり、試料を何の処理をする必要もない。
【００３０】
バイオセンシング装置は、集積回路（ＩＣ）チップなどのチップの形をとって提供されてもよい。一般的に、ＮＭＥを組み込んだＩＣは、絶縁層で覆われている導電性リード線をもつ基板を有し得る。絶縁層は、リード線の一部を露出するアパーチャを有し、ＮＭＥは、リード線の露出部分で提供される。ＮＭＥは生体分子刺激に応答する。特に、ＮＭＥはプローブ分子で機能化されていてもよく、そのプローブ分子は標的生体分子（例えば、核酸配列）とのハイブリダイゼーション反応を起こし、その結果、ＮＭＥで発生する電荷を生じる。ＩＣはまた、この発生した電荷を蓄積するための、リード線と電気通信する電荷蓄積部（例えば、コンデンサーまたはバッテリー）を有する。典型的な使用法として、ＮＭＥを、試料に既知の時間または積分時間、曝し、その後、その時間にわたって蓄積された電荷が、標的生体分子の存在および／または量を示すことになる。蓄積された電荷は、分析のためにコンピュータ装置へ通信されてもよいし、積分時間後、蓄積された電荷の直接的読みとして（例えば、デジタル・ディスプレイ・コンポーネントを通して）表示されてもよい。
【００３１】
そのようなＩＣは、一般的なＩＣ製造機器を用いて製造することができ、この装置を容易に製造し、かつ他の型のバイオセンシング微小電極より安価であり得る。用いられる材料は、ＩＣ製造ですでに一般的に用いられているものであってもよい。例えば、基板は、シリコン、水晶、ガラス、セラミックス、シリカ、サファイア、ガリウムヒ素、またはＩＣに現在用いられている他の材料から作製することができる。基板または支持体は、導電体を組み込んで電極としての役割を果たすことができる。金表面を有する導電性支持体もまた用いてもよい。支持体は、通常、平らな（平面の）表面、または問い合わせられるプローブがほとんど同じ平面にある構造を少なくとも含む。支持体は電極であり得、または電極に付着し得る。
【００３２】
リード線は、Ａｕ、Ａｌ、Ｗ、ＴｉＮ、ポリシリコン、または他の一般的に用いられるリード線材料でできていてもよい。ＩＣは、ｎ型シリコンチャネルＦＥＴおよびｐ型シリコンチャネルＦＥＴを含む電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）、またはｎ−ｐ−ｎバイポーラ接合トランジスタおよびｐ−ｎ−ｐバイポーラ接合トランジスタを含むバイポーラトランジスタなどのトランジスタを含んでもよい。
【００３３】
ＩＣは、ＮＭＥと化学的および電気的通信する電気触媒溶液と共に提供され、その中に浸漬され、またはそれに別なふうに曝されていてもよい。これは、ＮＭＥにおける電荷発生を助けることができる。
【００３４】
以下、図６について言及する。この図は、生物学的試料中の生体分子の存在を検知するのに適した集積回路の断面図を示す。基板（１）は、シリコンなどの従来の半導体装置基板である。トランジスタ（２）のチャネル、ゲート酸化物（３）、およびポリシリコンゲート電極（４）が示され、集積回路のトランジスタを形成するための従来のＣＭＯＳエレクトロニクスの使用を図解している。金属（５）はゲート電極と接触するように用いられる。保護酸化物（６）は、上方のチップの最上層表面から下方のシリコントランジスタレベルを分離する。一連の金属バイアル（７）およびインターコネクトは、トランジスタ層と最上層電極との電気通信のための選択的経路を提供する。実質的に平面の最上層表面は、最上層電極（９）と最上層絶縁体（８）の異種組み合わせである。図は、例えば、上記の方法を用いて、電極上に提供されるＮＭＥ（１０）を示している。図は、相補的標的分子との効率的ハイブリダイゼーションについて表示される、チオール末端核酸などのプローブ生体分子（１１）を示す。電気触媒溶液（１２）を用いて、生体分子（１１）とのハイブリダイゼーションの触媒的読み出しを提供してもよい。ＮＭＥ（１０）から電気的接点（９）（７）（５）（４）を通して、下にある電子回路への連続形式で、電位は下へ伝えられ、電流は下へ流れる。
【００３５】
これから、開示されたＮＭＥと共に用いることができる回路例の回路図を示す図７について言及する。この例において、回路は以下の機能を提供することができる：プローブ機能化ＮＭＥのバイアス；既知の電荷蓄積能力を有する電荷蓄積部へＮＭＥを通って流れる電流の積分；電荷蓄積部における電圧の読み出し；および蓄積部と電極の２次元アレイが高度多重化アレイチップとの関連において提供される場合の対象となる電荷蓄積部またはＮＭＥの選択。
【００３６】
回路例のコンポーネントについてこれから記載する。バイアス電圧はＶｂｉａｓで提供される；バイアスは、典型的には約０．１〜２．８Ｖの範囲で選択され得る。バイアス電圧ＶｂｉａｓＤは、ソースフォロアドレーンで提供され；典型的には約０．１〜２．８Ｖの範囲で選択される。バイアス電圧ＶｂｉａｓＲはリセットノードで提供され；典型的には約−２Ｖ〜２．８Ｖの調整可能値で選択され得る。信号電圧は、典型的には約１．５〜２．５Ｖの範囲であり得るＶｓｒｃである。列電圧Ｖｃｏｌは約１．５Ｖ〜０．５Ｖの範囲であり得る。タイミング制御信号は、行選択のためのもの（例えば、範囲は約０〜２．８Ｖであり得る）およびリセットのためのもの（例えば、範囲は約０〜４Ｖであり得る）を含む。トランジスタはリセットトランジスタＴｒ（リセット）、読み出しバッファトランジスタＴＲ（ソースフォロア）、および行選択トランジスタＴＲ（行選択）であり得る。
【００３７】
上記のバイアス、信号電圧、およびタイミング制御信号は例にすぎず、他の値を用いてもよい。これらのバイアス、電圧、および信号は、当分野において一般的に知られているように、特定の適用または製造条件に適するように選択または調整することができる。この例において、プローブ機能化ＮＭＥは、チオール化核酸プローブ、例えば、上記のようなプローブを用いて機能化されたＮＭＥを含み得る。電気触媒溶液と電気通信して、Ｖｓｒｃは、プローブ機能化電極に適用され、ＶｂｉａｓＲは第２の電極に適用され、その第２電極は、ＮＭＥまたは任意の他の一般的な電極であってもよい。これは結果として、プローブ機能化電極と電気触媒溶液との電圧差を生じる。したがって、この電位差の結果として電流が流れ得る。流れる電流の量は、典型的には、プローブ機能化ＮＭＥ上のハイブリダイゼーションの量に依存し得、すなわち、電流が、ＮＭＥによってこのように検出された標的量を示し得る。
【００３８】
回路例の動作をこれから記載する。流れる電流、Ｉｓｅｎｓｅを捕獲するために、ノード１１がＶｂｉａｓ（ノード６）と等しい電圧（典型的には、供給レール；例えば、２．８Ｖまで設定することができる）まで充電されるよう十分高く（例えば、４Ｖまで。それは、当分野において一般的に知られているように、オンチップ電荷ポンプまたは調整回路を通してできる）ノードを「リセット」に設定することによって、リセットトランジスタをオンにする。これはリセットフェーズである。この「リセット」動作が完了したら、ノード５を０Ｖに設定して、リセットトランジスタＴｒ（Ｒｅｓｅｔ）（１）をオフにする。そうすることで、電荷注入および寄生容量性帰還効果が、ノード１１（今、浮動ノードになっている）を約３００ｍＶだけ降下させるであろう。それゆえに、「リセット」動作後、ノード１１における実際の「リセット」電圧値は約２．５Ｖである。この時、流れる電流Ｉｓｅｎｓｅは、適用される電圧（すなわち、Ｖｓｒｃ−ＶｂｉａｓＲ）に依存する。ＶｂｉａｓＲは−２Ｖ〜２．８Ｖの任意の電圧レベルに任意に設定することができるので、適用される電位差を調整することができる。電流Ｉｓｅｎｓｅは、Ｖｓｒｃノード（１１）での寄生容量を放電し、その電圧レベルは、Ｖｓｒｃ（ノード１１）における寄生容量および積分時間中の流れるＩｓｅｎｓｅの値に依存する速度で降下する。特定の積分時間後、ノード１１において生じた積分電圧は、ノードＳＥＬ（８）を高レベル（２．８Ｖ）に設定することによって、ソース・フォロア・バッファトランジスタおよび行選択トランジスタであるトランジスタＴＲ（ソースフォロア）およびＴＲ（行選択）を通して読み出される。
【００３９】
ノード１１で放電される電荷蓄積は、Ｖｓｒｃ（ノード１１）でピクセル領域の電極と電気通信する１つまたは複数のトランジスタの寄生容量を含み得る。Ｖｓｒｃ（ノード１１）における電極は、寄生容量を供給するＴｒ（ソースフォロア）２などのトランジスタのゲートと電気通信し得る。一実施形態例において、電荷蓄積は、ソース・フォロア・トランジスタ、Ｔｒ（ソースフォロア）２のゲートとドレーンの間の寄生容量、およびリセットトランジスタ、Ｔｒ（リセット）１のソースと基板の間の寄生容量によって少なくとも一部、供給され得る。これらは、ピクセル回路がその上または内に形成されている半導体基板（例えば、ポリ、ｎ−ウェル、および基板）上の構造間の寄生容量である。一実施形態例において、これらの寄生容量は、約１〜２フェムトファラッドの範囲、より一般的には約０．５〜３フェムトファラッドの範囲、またはそれらに含まれる任意の範囲であり得る。プローブ機能化ＮＭＥへの接触は、トランジスタを形成するために用いられる半導体基板の領域より上の異なる層に形成してもよい。代替の実施形態において、バイアスの極性は逆転し、Ｖｓｒｃにおける寄生容量が、積分時間中に放電される代わりに、充電され得る。
【００４０】
個々にアドレス可能なプローブ機能化ＮＭＥの多重化アレイを有するＩＣ例の上面図を示す図８についてこれから言及する。「個々にアドレス可能な」とは、各ＮＭＥが個々に電気的にアクセスすることができ、その結果、各ＮＭＥによって発生した電流または電荷を個々に測定できることを意味する。この例において、ＮＭＥは、行−列形式で整列している。合計ｍ×ｎ個の独立したＮＭＥについてｎ個の行とｍ個の列がある。たった１個の行または列のＮＭＥがある場合には、行／列アドレス回路構成を有する必要がないことがある。しかしながら、多数の合計数のＮＭＥが単一の装置上に望まれる場合、２次元のグリッドまたは類似物にそれらを整列させることはより効率的であり得、したがって、各ＮＭＥへの独立した電気的アクセスが有用であり得る。これは、図７に示された回路構成を用いて効率的に達成することができる。このアプローチにおいて、各ＮＭＥを通して流れる電流に関連した電荷は、コンデンサーなどの電荷蓄積部へ統合され；蓄積された電荷に比例する電圧が、ノードＳＥＬ（８）を高レベルに設定し、その列における電圧Ｖｃｏｌをモニターすることによって、特定の行におけるＮＭＥについて読み出すことができる。
【００４１】
各列について、時間依存性信号（その時間依存性は行アドレス回路形成のクロッキングによって決定することができる）が存在し得ることを図は示しており、その信号は、いくつかの実施形態において、電気的バッファリングまたは増幅の助けを受ける場合には、アナログ・デジタル・コンバータへ送ることができる。アナログ・デジタル・コンバータは、あらかじめ決定された電圧振幅（典型的には、０〜１Ｖなど）を有する信号を受諾し、各入力チャネルごとに、その信号におけるアナログレベルのデジタル表示が推定される量子化動作を実行することができる。Ａ／Ｄコンバータの出力は、並列性（例えば、それぞれが値の２進法表示における有効数字に対応している、複数の平行電線）および直列タイミング（例えば、異なるプローブ機能化ＮＭＥに対応する順データ要素の時限表示）を組み合わせるデジタルストリームである。
【００４２】
上記のようなバイオセンシング装置またはＩＣ上に提供され得る構成での、単一の行に沿った３つの隣接したＮＭＥを示す図９についてこれから言及する。これらの３つのＮＭＥは、３つの異なる列、ｊ、ｊ＋１、およびｊ＋２を用いて読まれる。この図は、ＮＭＥ間の違いに関していくつかの特徴を示している。
【００４３】
ＮＭＥ  Ｅｉ，ｊおよびＮＭＥ  Ｅｉ，ｊ＋１を、両方とも同じクラスのプローブ（例えば、チオール官能化ＰＮＡ）で機能化してもよいが、その配列は異なってもよい。すなわち、各ＮＭＥを、異なる標的生体分子を有する類似したプローブで機能化してもよい。この例において、電極Ｅｉ，ｊおよびＥｉ，ｊ＋１は、研究中の試料に存在する異なる配列への応答である。要するに、異なる機能化の使用によって、単一クラス内であるが、異なる配列、立体構造、または機能性を有する生体分子の検知が可能になる。
【００４４】
異なる形態および／またはサイズ、ならびに異なる程度のナノ構造化を有するＮＭＥ  Ｅｉ，ｊ、ＮＭＥ  Ｅｉ，ｊ＋１、およびＮＭＥ  Ｅｉ，ｊ＋２が示されている。上記で論じられているように、異なる形態および／またはサイズが、標的分子の検出において異なる検出限界および異なるダイナミックレンジの両方を提供することができる。異なる形態および／または異なる程度のナノ構造化を有するＮＭＥを１つの装置へ組み込むことによって、単一装置を用いて検知することができる標的濃度のダイナミックレンジを拡大することが可能になり得る。要するに、異なるＮＭＥ形態、サイズ、および／またはナノ構造化の使用が、そうではなくて、たった１つの形態／ナノ構造化がバイオセンシング装置に提供されている場合に達成されるであろうものより広い濃度範囲の所与の標的種の検知を可能にすることができる。
【００４５】
異なるクラスのプローブ分子を用いて機能化されている場合のＮＭＥ  Ｅｉ，ｊ＋１、およびＮＭＥ  Ｅｉ，ｊ＋２もまた示されている。例えば、Ｅｉ，ｊ＋１を、ＰＮＡなどの核酸を用いて機能化してもよく、Ｅｉ，ｊ＋２を、電極に付着する抗体を用いて機能化してもよい。要するに、異なるクラスのプローブ分子の使用によって、例えば、ＤＮＡからＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、タンパク質へと異なるクラスの標的生体分子の検知が、単一のバイオセンシング装置を用いて、可能になり得る。
【００４６】
バイオセンシングカートリッジおよびワークステーション
上記のようなバイオセンシング装置は、バイオセンシングカートリッジへ組み込んでもよい。そのようなカートリッジは、破壊、および樹脂またはビーズに基づいた核酸精製などの試料処理のためのチャンバ、ならびにバイオセンシング装置のためのチャンバを含んでもよい。カートリッジは、自給式であってもよく、例えば、全ての必要な試薬がカートリッジの蓋に含まれてもよい。カートリッジは再利用可能であっても、使い捨てであってもよい。使い捨てカートリッジは、試料間の相互汚染のリスクを最小限にすることができる。
【００４７】
カートリッジは、バイオセンシング工程をコーディネートし、かつ実行するためのバイオセンシングワークステーション内で用いてもよい。ワークステーションのコンポーネントとして、試料ホルダー、試料の操作のためのピペッターなどの計器チップ、試料同定モジュール、実行されるべき試験を選択するための選択機構、バイオセンシング試験の結果を示すための電子ディスプレイ、ならびにこれらのコンポーネントを管理し、選択された試験を実行するためのプロセッサが挙げられ得る。ワークステーションは、一度に、いくつかの異なるカートリッジを保持することができる（例えば、１０個またはそれ以上）。ワークステーションは、カートリッジへのランダムなアクセスを可能にすることができる−すなわち、独立した試験を、ワークステーションにおいて任意のカートリッジで任意の時間に実行することができる。ワークステーションは使い捨ての計器チップを有してもよく、それは、試料および試薬との直接的接触を生じるワークステーションの唯一の部分である。使い捨てカートリッジと共の使い捨てチップは、ワークステーションで試験される試料間の相互汚染のリスクを最小限にすることができる。
【００４８】
一般的に、バイオセンシングカートリッジは、試験される試料を含むための第１チャンバ、および上記のようなバイオセンシング装置を含む第２チャンバを有し得る。精製および／または細分などの試料へ他の作用を（例えば、化学的、機械的、または振動的な手段を通して）実施するための追加のチャンバがあってもよい。試料のいくつかの処理および破壊は、第１チャンバ自体で実行されてもよい。第２チャンバにおけるバイオセンシング装置による検出のために第１チャンバから第２チャンバへ試料を導入してもよい。装置の活動化または試験の開始から第２チャンバへの試料の導入までのプリセット時間間隔があってもよい。この時間間隔によって、バイオセンシング装置が適切にバイアスされ、または別なふうに試験のために準備されるのが可能になり得る。バイオセンシング装置で発生した電荷または電流フローは、上記のように、積分時間後、測定することができる。
【００４９】
バイオセンシングカートリッジおよびそのようなカートリッジを用いるステップの例を示す図１０についてこれから言及する。この例において、カートリッジは、試料を含む試料チャンバ、試料を精製するための精製チャンバ、およびバイオセンシングを行うためのバイオセンシングである、３つのチャンバを有する。この例において示されているように、カートリッジの蓋は、各チャンバのための試薬を含むカプセルと共に提供され、その中に計器チップを挿入してもよい。これにより、カートリッジを、バイオセンシング動作を実行するのに適した試薬をすでに含む自給式にし、かつ用いられることになっているバイオセンシング装置の特定のプローブおよび／または標的生体分子に合わせることができる。この例において、試料チャンバは、試料にアクセスするための１つのカプセルを有する。精製チャンバは、洗浄試薬を含む２つのカプセルおよび溶出緩衝液を含む１つのカプセルである３つのカプセルを有する。バイオセンシングチャンバは、それぞれがバイオセンシング装置についての分析物を含む電気化学的混合物を含む、３つのカプセルを有する。計器チップは、バイオセンシング動作を実行するために各カプセル中に逐次、挿入してもよい。例として、試料チャンバ上のカプセルは、化学的変性剤（例えば、尿素またはホルムアミド）を含む溶解緩衝液を含んでもよく；精製チャンバ上のカプセルは、洗浄緩衝液を含む２つのカプセルを有してもよく、溶出緩衝液は、低レベルのナトリウム、塩化物、およびトリス塩を含むものなどの標準緩衝液であってもよく；バイオセンシングチャンバ上のカプセルは、ルテニウムヘキサミン、フェリシアン化物などのレドックスレポーター群、ならびにナトリウム、リン酸塩、塩化物、およびマグネシウムを含む緩衝液を含んでもよい。
【００５０】
使用において、まず、試料チャンバからその単一のカプセルを通して試料を抽出する。その後、試料を精製チャンバへ導入し、そこで、計器チップが２つの洗浄カプセルを通して導入されるので、試料が２回、洗浄され、溶出緩衝液が導入される。この工程を通して、バイオセンシング装置によるバイオセンシングのために試料を調製することができる。例えば、核酸試料の場合、精製チャンバにおける工程は、試料中のＲＮＡまたはＤＮＡを単離することができる。その後、精製試料をバイオセンシングチャンバへ各電気化学的カプセルを通して導入する。その後、バイオセンシングチャンバ内のバイオセンシング装置は、試料に存在する任意の標的生体分子を検出することができ、発生した電流または電荷を測定することができる。カートリッジをワークステーションで用いる場合、ワークステーション内のプロセッサは、この発生した電流または電荷を読み、この読みに基づいて標的生体分子の存在を決定することができる。
【００５１】
バイオセンシングワークステーションの例を示す図１１についてこれから言及する。このワークステーションは、各カートリッジ上に提供された固有のバーコードを用いて試料の同定を可能にする、バーコードリーダーを含む。ワークステーションは、選択機構、この例においては、実行されるべき特定の試験の選択を可能にするタッチスクリーンを有する。バイオセンシング工程によって生じた、いかなる廃棄物をも処理するための廃棄物容器もまたある。ワークステーションのプロセッサは、さらなる分析のために、別のワークステーションなどの外部コンピュータ装置に接続してもよい。この接続は、無線ネットワークを通してもよい。ワークステーションは比較的小さくてもよく（例えば、１．５×１フィートの設置面積）、使用の利便性および容易さを可能にする。
【００５２】
使用の方法
ＮＭＥおよびそれを含む装置を用いるための方法をこれから記載する。ＮＭＥがすでにプローブ分子で機能化されている装置を提供してもよいし、または使用するために装置を調製するときに、プローブ分子をＮＭＥに結合してもよい。その後、装置を、使用するために、例えば、電気触媒的レポーターを添加し、特定の時間間隔を待つことによって、バイアスする。ＮＭＥに加えて、電気触媒的レポーターと接触するが、試料と接触しない参照電極があってもよく、それはＮＭＥであってもそれでなくてもよい。ＮＭＥと参照電極の間でこの時間間隔にわたって発生した電流フローまたは電圧を測定し、参照点として記録することができる。その後、ＮＭＥを対象となる試料に曝し、特定の時間間隔（積分時間とも呼ばれる）にわたって発生した電流フローまたは電荷を測定することができる。曝露時間間隔とバイアス時間間隔の間の電流フローまたは電荷の差を比較することによって、試料中の標的生体分子の濃度、結合、および／または量を決定することができる。
【００５３】
本明細書に記載されているように、ＮＭＥを含む装置は、試料中の特定のバイオマーカーの存在または非存在を検出するための適切なプローブと共に用いることができる。本明細書においては、「試料」または「生物学的試料」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質を含む任意の天然材料（例えば、植物、動物、藻類、細菌、またはウイルス）または合成材料を指し、例えば、個体から単離された組織、細胞培養物、または液体などの臨床試料（非限定的に、血液、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ、涙、尿、唾液、粘液、滑液、脳脊髄液、および組織切片を含む）、環境（例えば、水、食物、または空気試料）が挙げられる。生物学的試料は、溶解（電気的、機械的、および化学的）、電気泳動、酵素消化を含む様々な手段によってさらに処理してもよい。ほとんどの場合、試料は生物体から取り出されているが、用語「生物学的試料」はまた、インビボで、すなわち、取り出されることなしに、分析される細胞または組織を指し得る。典型的には、「生物学的試料」は、細胞を含むが、その用語はまた、血液、唾液、または尿の非細胞性画分などの非細胞性生物学的材料を指し得る。「生物学的試料」はさらに、タンパク質または核酸分子などの細胞性成分を含む、生物体が増殖している栄養ブロスまたはゲルなどの媒体を指す。
【００５４】
今記載された本ＮＭＥと共に用いるプローブは、核酸で構成してもよい。「核酸プローブ」は、通常、水素結合形成による、通常、相補的塩基対形成を通して、１つまたは複数の型の化学結合によって相補配列の標的核酸へ結合する能力がある核酸（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または、例えば、ホスホジエステラーゼ連結によって連結したデオキシリボースまたはリボースよりむしろペプチドによって連結したＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されるバックボーンを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むその類似体）を指す。本明細書で用いられる場合、核酸プローブは、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）、もしくは修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）、または糖成分が修飾されたものを含み得る。加えて、プローブ内の塩基は、ハイブリダイゼーションに干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の連結によって結合することができる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列を結合することができることは当業者によって理解されているであろう。プローブの存在または非存在についてアッセイすることによって、選択配列または部分配列の存在または非存在を検出することができる。核酸プローブを用いて標的核酸を検出するための方法は、例えば、「電気触媒的核酸ハイブリダイゼーション検出（Ｅｌｅｃｔｒｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」という発明の名称の米国特許第７，３６１，４７０号、および同じ名称の米国特許出願第２００５／００８４８８１号に記載されている。
【００５５】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合する任意の過程を指す。「ハイブリダイゼーション条件」は、核酸分子が類似した核酸分子を同定するために用いられる標準条件を指す。そのような標準条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９に開示されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書は、全体として本明細書に参照により組み入れられている（具体的には、ページ９．３１−９．６２参照）。加えて、適切なハイブリダイゼーションを計算するための式、およびヌクレオチドの様々な程度のミスマッチを可能にするハイブリダイゼーションを達成するための洗浄条件は、例えば、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８、２６７−２８４に開示されている；Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、同文献は、全体として本明細書に参照により組み入れられている。ハイブリダイゼーション条件の非限定的例には、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション、および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が挙げられる。
【００５６】
別の実施形態において、プローブは、バイオマーカー標的（例えば、受容体またはリガンド）と結合し、または別なふうに相互作用して、試料中のリガンドまたは受容体の存在を表示することができるペプチド（例えば、４〜４０アミノ酸で構成される）またはタンパク質（例えば、抗体）である。ペプチドまたはタンパク質のプローブを用いて分析物を検出するための方法は、例えば、「電気触媒的タンパク質検出のための方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」という発明の名称の国際公開第２００７／０９４８０５号（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３７７１）に記載されている。
【００５７】
プローブは、ＮＭＥとの結合を促進する官能基（例えば、チオール、ジチオール、アミン、カルボン酸）を含んでもよい。プローブはまた、縦方向のスペーサー、二本鎖および／または一本鎖領域、ポリＴリンカー、剛性リンカーとしての二本鎖デュプレックス、ならびにＰＥＧスペーサーなどの他の特徴を含んでもよい。
【００５８】
上記のように、ＮＭＥの表面ナノ構造は制御することができ、ＮＭＥを有する装置の感度および／または効率に影響を及ぼし得る。実施例１において、核酸についての検出効率への表面ナノ構造の影響を調べた。２つの異なる型のＮＭＥを比較した−低い析出電位で得られた、より微細なナノ構造化ＮＭＥを、より高い析出電位で得られた、より粗い表面構造のものと比較した。
【００５９】
低い析出電位で得られた、より微細なナノ構造化ＮＭＥで、低くも１ｐＭの濃度を検出することができたが、より高い析出電位で得られた、より粗い表面構造のものについては、検出限界が１０ｐＭまで増加した。これらの結果より、ナノ構造化の増加は、電極プラットフォームにおけるより高い感度のバイオセンシング能力に寄与することが実証されている。この分析により、より微細な構造化ＮＭＥがｎＭ未満の濃度の標的配列に対してより大きな応答性を示すことが明らかにされた。
【００６０】
開示されたＮＭＥおよび電気触媒的レポーターシステムを用いてここで観察された１０ａＭ感度は、標識なしかつＰＣＲなしのセンサーについて低い検出限界を提供し；検出限界は、＜１００コピーの標的配列の検出に対応する。６０〜１０００コピーの標的配列の測定は、多段階触媒的読み出しを利用する電気化学的検出器で以前、達成されているが（Ｍｕｎｇｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７７：４６６２、Ｎｉｃｅｗａｒｎｅｒ−Ｐｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１３７、Ｐａｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１５０３、Ｓｉｎｅｎｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｎａｎｏ．２：６５３、Ｓｔｅｅｍｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９１、Ｘｉａｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１１８９６、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ．Ｎａｎｏ．１：２１４、Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：４０９３）、開示された装置は、単一段階読み出しでのチップに基づいたプラットフォームでこの測定を行う。
【００６１】
実施例２は、電気的信号を用いて臨床関連試料における癌バイオマーカーのパネルを直接、読むための、本明細書に記載されているような多重化電極プラットフォームの使用を記載する。システムは、ナノ表面構造化電極を迅速な触媒的読み出しと組み合わせて、長年の目標：安価で実用的なプラットフォームを用いる癌バイオマーカーの多重化分析を達成する。
【００６２】
実施例３は、最も困難な検出標的の１つであるマイクロＲＮＡを検出するためのＮＭＥに基づいたチップの使用を記載する。マイクロＲＮＡプロファイルの電気的読み出しによって、標的増幅の必要性なしに、特定の配列についてＲＮＡ試料を直接アッセイする、迅速で、しかも非常に正確な方法が提供される。
【００６３】
提供された例は、癌バイオマーカーの検出に関するが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質の検出を含み得る、他の適用にもＮＭＥ装置は利用可能であり得る。例として、（例えば、ＲＮＡマーカーを検出することによる）乳癌遺伝子のプロファイリング；（例えば、ＲＮＡマーカーを検出することによる）白血病関連遺伝子のプロファイリング；（例えば、ＤＮＡマーカーおよびＲＮＡマーカーを検出することによる）薬物代謝（例えば、ワーファリン）に影響するチトクロームＰ４５０突然変異のプロファイリング；（例えば、ＤＮＡマーカーを検出することによる）遺伝病（例えば、嚢胞性線維症）に関連した突然変異のプロファイリング；（例えば、ＤＮＡマーカーおよびＲＮＡマーカーを検出することによる）ウイルス（例えば、ＨＰＶおよびＨＩＶ）の検出およびタイピング；（例えば、タンパク質マーカーを検出することによる）電気化学的イムノアッセイ形式を用いる癌関連タンパク質（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ））の検出；ならびに癌を同定するためのマイクロＲＮＡの検出が挙げられる。これらのＮＭＥを組み込むバイオセンシング装置は、当分野において一般的に知られているように、適切なプローブをＮＭＥに結合することによって、および／または検知されるべき適切な電気触媒反応を選択することによって、これらの他の生体分子について検出するように適応することができる。
【００６４】
変形例が本開示から逸脱することなく可能であることは当業者によって理解されているであろう。記載された全ての例および実施形態は、例示を目的としてのみ提供されるのであって、限定することを意図するものではない。本明細書に言及された全ての参考文献は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【実施例１】
【００６５】
ＮＭＥを製造するためのパラメーター
この実施例において、電極材料としてＰｄを用いた。電着の時間依存性を調べるために、電着されることになっているＰｄ  ＮＭＥの構造を時間の関数としてモニターした。時間依存性電着実験を、支持電解質として０．５ＭのＨＣｌを用いて−１００ｍＶで行った。Ｐｄ構造を（ａ）２５秒間、（ｂ）５０秒間、（ｃ）１２５秒間、（ｄ）２５０秒間、および（ｅ）５００秒間、形成した。５０秒後、１．３μｍの平均直径、０．５μｍの高さを有する構造が観察され、５００秒後、Ｐｄ電極は、典型的には、直径が８μｍ、高さが５μｍであった。より短い析出時間で生じたより小さい構造は、典型的には、微小電極の中央に析出を示し、核生成がアパーチャの境界に優先的に起こることを示している可能性がある。
【００６６】
ＮＭＥの最終構造に影響を及ぼし得るもう一つの制御可能なパラメーターは析出電位である。具体的には、ＮＭＥのサイズおよび表面形態は、このようにして制御され得る。樹枝状フラクタルは、雪片の成長、煤粒子の凝集、および金属の凝固などの非平衡成長に一般的に観察される現象である。そのようなフラクタル構造はまた、金属の非平衡電着によっても得られ、分岐過程およびフラクタル成長過程の研究についてのモデル系として用いられる（Ｆｌｅｕｒｙ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７、３９０、１４５−１４８）。結晶の形態は熱力学的平衡からのそれらの形成条件の「距離」に大きく依存すると一般的に考えられている：平衡近傍の条件は、熱力学的に安定した結晶面で囲まれた多面体結晶を生じるが、この「距離」が増加することによって、平面を有する結晶の成長する前面が不安定になり、樹枝状結晶が形成される（Ｆｕｋａｍｉら  Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ２００７、１１１、１１５０−１１６０）。金属の電着の場合、そのような「距離」は、単純に析出電位を変化させることによって連続的かつ可逆的に変え得、より負の電位は、より大きい駆動力を発揮し、それにしたがって、電析の平衡からの「距離」を増加させることができる。したがって、電着を、空間的かつ動力学的に制御して、様々の明確な形態を有する整列したＮＭＥを作製することができる。
【００６７】
Ｐｄ構造を、支持電解質として０．５ＭのＨＣｌを用いて、（ａ）０ｍＶ、（ｂ）−１００ｍＶ、（ｃ）−２５０ｍＶ、および（ｄ）−４００ｍＶで２５０秒間、形成した。より負の析出電位が、典型的には、より大きいが、より密ではない微細構造を生じることが見出された。０ｍＶの析出電位において、３．５μｍの直径および０．７μｍの高さのケーキ形の構造が得られた。加電圧を−１００ｍＶに変化させた場合、より粗い微細構造が得られ、サイズもまたより大きかった（平均直径＝５μｍおよび高さ＝２．５μｍ）。得られたナノ表面構造は、非常に小さいナノ粒子の不規則な凝集体である。−２５０ｍＶのより負の電位を加えた場合、樹枝状フラクタル微細構造が得られ、その直径および高さが、さらに、それぞれ１１μｍおよび６μｍに増加することが見出された。電位をさらに（例えば、−４００ｍＶへ）増加させた場合には、微小電極構造は、より広がり、構造はもはや連続していない。
【００６８】
電位の関数として形成されたＰｄ  ＮＭＥの電気化学的挙動をサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）によって研究した。ＮＭＥの電気化学的応答を、３ｍＭのＲｕ（ＮＨ３）６３＋および０．０９Ｍのリン酸ナトリウムを含む溶液中、１００ｍＶ／ｓのスキャン速度でモニターした。予想通り、各電極について定常状態ボルタモグラムが観察され、電極のマイクロスケール寸法と一致した。０ｍＶ、−１００ｍＶ、または−２５０ｍＶの析出電位を用いて作製された電極について、観察された電流は、電極のサイズとよく相関している。すなわち、ＮＭＥの直径が大きければ大きいほど（すなわち、ＮＭＥがより大きな加電圧で形成されるほど）、観察される応答電流は大きい。しかしながら、−４００ｍＶで作製される構造について、観察される電流は、微小電極のサイズに基づいて予想されるより低く、電極構造の不連続性が、弱い電気接続性および作用領域の喪失を生じ得ることを示した。
【００６９】
したがって、中程度の析出電位が、微小電極の表面上に小さなナノ粒子が形成されるので、結果として生じるＮＭＥの完全性を維持しながら、最も顕著なナノ表面構造を提供するように思われる。析出反応についての大きすぎる駆動電位を与えることは、金属ナノ粒子がＮＭＥのコアへの強い接続性なしに形成される点まで速度を加速すると思われる。
【００７０】
ＮＭＥ形態はまた、電解質効果によって制御することができる。Ｐｄ  ＮＭＥを、支持電解質として（ａ）０．５ＭのＨ２ＳＯ４および（ｂ）０．５ＭのＨＣｌＯ４を用いて−１００ｍＶで２５０秒間、形成した。これらの構造は、ＨＣｌを支持電解質として用いた上記と同じ条件下で形成された。Ｈ２ＳＯ４中およびＨＣｌＯ４中で形成された構造は、ＨＣｌ中で形成されたものより有意に大きく、興味深いことに、全ての３つが異なる型のナノ構造化を示した。ＨＣｌＯ４中で作製されたＮＭＥは、小さくも１０〜２０ｎｍほどのフィーチャーを有する、最も微細なナノ構造化を示した。ＨＣｌ中では、電極は、より密で、ナノ構造化は約１００ｎｍであった。最も粗いナノ構造化はＨ２ＳＯ４中で得られ、電極を含む粒子が２００ｎｍより大きかった。これらの観察により、ＮＭＥ形態はまた、電着に用いられる支持電解質を変えることによって制御され得ることが示されている。
【００７１】
典型的には、ＮＭＥについての樹枝状構造は、電着溶液の濃度、電着される金属の選択、および電着中の加電圧を含む、製造中の条件に依存する。これらのパラメーターは容易に制御可能である。例えば、電着に用いられる試薬の濃度および純度を５％以内に制御することが望ましい場合がある。金属の選択は、試薬の純度が高い限り制御することは簡単であり、単に正しい材料を得ることによるだけである。電着中の電位は、数ｍＶ以内に容易に制御することができ、それが、結果として生じるＮＭＥのサイズおよび形態を制御するのに十分である。
【実施例２】
【００７２】
多重化ナノ構造化微小電極集積回路を用いた腫瘍組織中の前立腺癌バイオマーカーの直接的プロファイリング
材料および方法
チップ製作。チップをＣａｎａｄｉａｎ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒで作製した。３’’シリコンウエハーを、熱成長二酸化ケイ素の厚い層を用いて保護した。３５０ｎｍの金層を、電子ビーム援助金蒸着を用いてチップ上に析出させた。金フィルムを、標準フォトリソグラフィーおよび剥離工程を用いてパターン化した。５００ｎｍ層の絶縁二酸化ケイ素を、化学蒸着法を用いて析出させた。５００ｎｍのアパーチャを標準フォトリソグラフィーを用いて電極上にインプリントし、２ｍｍ×２ｍｍ接着パッドを標準フォトリソグラフィーを用いて露出させた。
【００７３】
ナノ構造化微小電極の製作。チップをアセトン、ＩＰＡ、およびＤＩ水中で３０秒間、すすぐことにより清浄にし、窒素流で乾燥させた。全ての電着を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極および白金線補助電極を特徴とする３電極システムを有する生物分析システムイプシロンポテンシオスタット（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｐｓｉｌｏｎ
ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ）を用いて室温で行った。製作された電極上の５００ｎｍのアパーチャを作用電極として用い、それを、露出した接着パッドを用いて接触させた。白金ＮＭＥを、Ｈ２ＰｔＣｌ６の５ｍＭ溶液および０．５ＭのＨＣｌＯ４を含む白金浴中で、−２５０ｍＶ、１０秒間、ＤＣ電位アンペロメトリーを用いて製作した。
【００７４】
オリゴヌクレオチドの調製および精製。全ての合成オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣによってストリンジェントに精製した。以下のプローブ配列および標的配列を実験に用いた。配列Ｐ１。ＩＩＩ型融合プローブ（ＰＮＡ）：ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴ−ＣＯＮＨ２（配列番号１）、配列Ｐ２。Ｉ型融合プローブ（ＰＮＡ）：ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴ−ＣＯＮＨ２（配列番号２）、配列Ｐ３。ＶＩ型融合プローブ（ＰＮＡ）：ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＡＡ−ＣＯＮＨ２（配列番号３）、配列Ｔｌ（ＩＩＩ型ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合ＤＮＡ標的）：５’ＡＧＣ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＡＴ３’（配列番号４）、配列Ｔ２（ＷＴ  ＴＭＰＲＳＳ２  ＤＮＡ標的）：５’ＡＧＣ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  １０  ＡＴＴ  ＧＡ３’（配列番号５）、配列Ｔ３（ＷＴ  ＥＲＧ  ＤＮＡ標的）：５’ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＡＴ３’（配列番号６）、配列Ｔ４（非相補的ＤＮＡ標的）：５’ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ
ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ３’（配列番号７）。２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ／を用いて計算される吸光係数によってオリゴヌクレオチドを定量化した。
【００７５】
ＮＭＥのＰＮＡプローブでの修飾。５００ｎＭのチオール化一本鎖ＰＮＡ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、および２５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液を５０℃で１０分間、加熱した。その後、適切な量の１０ｍＭのＭＣＨを加えて、１００ｎＭの最終ＭＣＨ濃度にした。０．５〜１０μＬ（多重化の程度に依存する）のこの混合物を、暗い湿度チャンバ内で、４℃で一晩、ＮＭＥ上に析出させた。ＮＭＥを、測定前に、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）および２５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中ですすいだ。
【００７６】
電気化学的測定。電気化学的信号を、１０μＭのＲｕ（ＮＨ３）６３＋、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、２５ｍＭの塩化ナトリウム、および４ｍＭのＦｅ（ＣＮ）６３−を含む溶液中で測定した。ハイブリダイゼーション前および後の示差パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）信号を、５ｍＶの電位ステップ、５０ｍＶのパルス振幅、５０ｍｓのパルス幅、および１００ｍｓのパルス間隔を用いて測定した。ハイブリダイゼーション前および後のサイクリックボルタンメトリー信号を、１００ｍＶ／ｓのスキャン速度で収集した。サイクリックボルタンメトリー信号において−３００ｍＶでのカソード電流から０ｍＶでのバックグラウンドを引き算することによって限界還元電流（Ｉ）を定量化した。ハイブリダイゼーションに対応する信号変化は以下の通り、計算した：ΔＩ＝（Ｉｄｓ−Ｉｓｓ）／Ｉｓｓ×１００％（ｓｓ＝ハイブリダイゼーション前、ｄｓ＝ハイブリダイゼーション後）。
【００７７】
ハイブリダイゼーションプロトコール。ハイブリダイゼーション溶液は、典型的には、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）および２５ｍＭのＮａＣｌ中に標的配列を含んだ。電極を、湿度チャンバ内、暗闇中、３７℃で６０分間、インキュベートし、電気化学分析前に、緩衝液で広範囲に洗浄した。
【００７８】
ｍＲＮＡの単離。ｍＲＮＡを、細胞株および患者組織試料からダイナビーズｍＲＮＡ直接キット（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出した。２つの典型的な前立腺癌組織試料を、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ
Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋによって収集された前立腺全摘出術から入手した。ｍＲＮＡ抽出のために腫瘍豊富な組織を選択するまで、組織を−８５℃で保存した。ｍＲＮＡ標的の濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）のナノドロップＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００）によって測定した。融合配列の全てを、ＲＴ-ＰＣＲおよび直接的シークエンシングによって確認した
。
【００７９】
ＮＭＥにおけるＤＮＡハイブリダイゼーションの反応速度測定。ＰＮＡ（配列２）修飾化ＮＭＥを上記のように調製した。すすいだＮＭＥを、１０μＭのＲｕ（ＮＨ３）６３＋、４ｍＭのＦｅ（ＣＮ）６３−、１００ｆＭのＤＮＡ標的（配列４〜７）、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、および２５ｍＭのＮａＣｌを含む溶液中に浸漬した。電気触媒的ＣＶ信号を上記のように得た。全ての測定を３７℃で行った。
【００８０】
結果および考察
本発明者らは、ｉ）非常にロバストであり、製作するのが簡単である；ｉｉ）多重化されており、拡大縮小が可能である；およびｉｉｉ）不均一な生物学的試料を提供された場合、感度が高く、特異的である、超高感度の生物分析のためのナノ材料に基づいたプラットフォームを作製しようとした。要求ｉ）およびｉｉ）を満たすために、本発明者らは、拡大縮小可能なプロトコールを用いる各個別の検知素子の再現可能な配置を達成する手段を必要とした。要求ｉｉｉ）に取り組むために、本発明者らは、ナノスケールフィーチャーを本発明者らの検知アレイに組み込もうとした。しかしながら、整列したナノ構造化検知素子の製造は、多大な労働力を要し、低再現性になりやすい可能性がある。電子ビームリソグラフィーは、ナノスケールフィーチャーおよびそれらの配置に関して必要とされる制御を提供する；しかしながら、それは直列的な技術であり、低コストの大量チップ製造には現在、適していない。代わりに、本発明者らのアプローチは、費用効率が高い従来のフォトリソグラフィーを用いて、本発明者らの電極を位置づけ、アドレス指定することであり；その後、これらの微小電極のナノ構造化を高度の再現性でもたらす手段を見出すことであった。
【００８１】
本発明者らは、外部接触としての役割を果たす大きな金属パッドに付着した８本の５μｍ幅のＡｕ線を生じるようにシリコンチップ上の３５０ｎｍ厚さの金層をパターン化することによって８重の多重化チップを構築した。その後、ＳｉＯ２を保護層として析出させ、Ａｕ線のそれぞれの末端に５００ｎｍ直径のアパーチャを生じるようにパターン化した。これらの開口部は、ナノ構造の制御された局所的成長のための個々の鋳型として機能するように作り出された。その後、本発明者らは、パラジウム電着を用いて、パターン化されたアパーチャに金属を析出させた。本発明者らは、析出時間を変化させることによってナノ構造のサイズを制御し得ることを見出した。本発明者らは、構造の直径を超微小電極領域（＜１０ｕ）に限定することが容易にできた。迅速な金属析出を可能にする条件下で、微小電極の表面は、約２０ｎｍのフィーチャーサイズを有する高レベルのナノ構造を示した。これらの構造は、低い容量性電流および高い定常状態プラトー電流を示す理想的な微小電極挙動を示した。
【００８２】
これらのナノ構造化微小電極（ＮＭＥ）を核酸バイオセンサーとして機能させるために、本発明者らは、チオール化ペプチド−核酸（ＰＮＡ）プローブでそれらを修飾した。プローブ分子としてのＰＮＡの使用は、バイオセンシングアッセイの感度を増加させることが以前に示されており、それはバックグラウンド電流の低下を生じるため、電気化学的アッセイにおいて特に有利である。核酸ハイブリダイゼーションを電気的信号へ変換するために、本発明者らは、本発明者らの研究室によって以前に開発された電気触媒的レポーターシステムを用いた（Ｌａｐｉｅｒｒｅ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３、７５．６３２７−６３３３）。このレポーターシステムは、核酸のようなポリアニオン種が結合した場合の電極表面でのＲｕ（ＮＨ３）６３＋の蓄積、およびＦｅ（ＣＮ）６３−の含有によるＲｕ（ＩＩＩ）の還元の触媒反応に依存し、Ｆｅ（ＣＮ）６３−はＲｕ（ＩＩＩ）を再生し、金属中心あたりの複数の還元を可能にする。ＰＮＡ修飾化ＮＭＥが相補配列を負荷された場合、検出可能な信号変化が、フェルトモル濃度範囲まで明確に検出することができた。完全に非相補的な配列について、無視できる信号変化が観察された。
【００８３】
このプラットフォームでの分析について選択された癌バイオマーカーは、前立腺癌に特異的な１群の遺伝子融合体である。ＥＲＧ遺伝子とＴＭＰＲＳＳ２遺伝子を連結する染色体転座から生じるこれらの融合体は、最近、発見され、少なくとも５０％の前立腺腫瘍に現れる。さらに、異なる融合部位を特徴とする約２０個の配列型があり、腫瘍に存在する融合体の正確な型がそれの攻撃性および転移能と相関するように思われる。それゆえに、これらの配列は、有望な診断マーカーであるだけでなく、予後値を有する因子でもある。
【００８４】
ＮＭＥセンサーが遺伝子融合配列を、半相補的である野生型配列から識別できるかどうかを決定するために、ＩＩＩ型融合体のスプライス部位に相補的なプローブで修飾されたセンサーに、（１）融合体標的（配列Ｔ１）、（２）野生型ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子に対応する配列（配列Ｔ２）、および野生型ＥＲＧ遺伝子に対応する配列（配列Ｔ３）を負荷した。完全に非相補的な対照もまたアッセイした（配列Ｔ４）。６０分間のハイブリダイゼーション時間で、完全に相補的な標的について大きな信号の増加が観察されたが、ＴＭＰＲＳＳ２標的については、はるかに小さい信号変化が観察された。ＥＲＧ標的は、さらにより小さい信号変化を生じ、非相補的配列について観察されたものは無視できるくらいであった。ＴＭＰＲＳＳ２標的は、電極に付着していない配列の末端に位置する、プローブの部分に結合するが、ＥＲＧ標的は、電極表面に繋ぎ止められた末端に位置する、プローブの部分に結合する。観察された異なる信号レベルは、プローブの最もアクセス可能な側が、入ってくる標的分子をより良く結合することができるが、配列のより埋もれた部分とのハイブリダイゼーションは非効率的であることを示している。
【００８５】
異なる標的のハイブリダイゼーションが、正確な読み出しのために最初に試験された完全な６０分間の時間を必要とするかどうかを決定するために、最初に試験された時間枠内で様々な間隔で電気触媒的信号をモニターした。興味深いことに、信号の上昇は非常に速く、有意な電流変化が２分以内に観察された。しかしながら、総６０分間にわたって、半相補的配列および非相補的配列についての信号は著しく減少する；２分目の信号の２０〜５０％が６０分間までに消失する。完全には相補的ではない配列について、ＮＭＥセンサーの標的溶液への曝露の最初の２、３分間においていくらかの非特異的結合が起こるが、これらの複合体は、安定のままではなく、電極上に固定化されたままではないと思われる。したがって、非相補的配列は、短いハイブリダイゼーション時間で相補的配列から識別することができ、より長い時間は、示差的な信号変化、およびそれにしたがって、特異性の程度を増加させる。
【００８６】
これらのナノ構造化微小電極の核酸検出器としての性能は、パターン化された構造が実際に、適切なハイブリダイゼーション条件下で用いた場合、感度が高く、かつ特異的であることを示している。したがって、本発明者らは、多重化チップに基づいたＮＭＥが不均一な生物学的試料に存在する癌バイオマーカーをアッセイするために用いることができることを証明しようとした。この能力を探求するために、前立腺癌患者由来の細胞抽出物および腫瘍試料を、システムの感度および特異性が臨床検査として十分ロバストであるかどうかを決定するために評価した。
【００８７】
本発明者らがＮＭＥチップを用いて前立腺癌関連遺伝子融合体を検出できるかどうかを決定するために、本発明者らは、まず、２つの前立腺癌細胞株：ＶＣａＰおよびＤＵ１４５から単離されたｍＲＮＡを分析した。前者の細胞株は、ＩＩＩ型融合体陽性であり、後者は融合体陰性である。この配列を欠く細胞株由来の１０ｎｇのｍＲＮＡを、ＩＩＩ型融合体（配列Ｐ１）に相補的なプローブを表示するＮＭＥとインキュベートした場合、はっきりと認識できる信号変化は生じなかったが、ＩＩＩ型融合体を必ず含む細胞株由来の１０ｎｇのｍＲＮＡの存在下で大きな信号増加が観察された。加えて、異なる融合体（配列Ｐ２）に相補的なプローブでのＮＭＥの修飾は、陽性ｍＲＮＡ試料について有意な信号を生じなかった。したがって、融合遺伝子の検出は高度に特異的である。試料（１０ｎｇ）の使用における効率、および分析に必要とされる総時間（１．５時間未満）は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびシークエンシングのような他の検出方法を有意に改善しているので、これらの結果は意義深い。
【００８８】
ＮＭＥチップの究極的な適用は、関連する患者試料における癌バイオマーカーのパネルの直接的多重化分析である。この型に適用するための本発明者らの装置の性能を試験するために、本発明者らは、一連の遺伝子融合体についての細胞株および臨床腫瘍試料から収集されたｍＲＮＡ試料のパネルを分析した。本発明者らは、３つの最も一般的な型の前立腺癌遺伝子融合体：Ｉ型、ＩＩＩ型、およびＶＩ型の検出を可能にする１群の試料を入手した。異なる臨床転帰がこれらの配列と関連しており、ＩＩＩ型融合体が最も一般的であるが、低い癌再発率と相関しており、Ｉ型およびＶＩ型融合体は、高レベルの再発を有する侵襲性癌と相関している。それゆえに、腫瘍においてこれらの融合体を区別できることは大変重要であり、それらの存在または非存在を迅速かつ直接的に評価することを可能にする方法は、それらのさらなる研究および診断バイオマーカーとしての検証において価値があるだろう。
【００８９】
３つの融合体のそれぞれに相補的なプローブを、ＮＭＥチップ上のそれらのそれぞれの電極に析出させ、５つの異なるｍＲＮＡ試料を、多重化形式で異なる遺伝子融合体の存在についてプロファイリングした。以下の３つの細胞株を試験した：ＶＣａｐ（ＩＩＩ型陽性）、２８  ＮＣＩ−Ｈ６６０（ＩＩＩ型およびＶＩ型陽性）３０、およびＤＵ１４５（融合体陰性）。２８加えて、従来のシークエンシングによって確認した場合、１つがＩ型融合体陽性であり、１つがＩＩＩ型融合体陽性である、２つの腫瘍試料（前立腺全摘出術によって収集された組織）を試験した。それぞれの場合において、全ての実験は２時間もかからず、たった１０ｎｇのｍＲＮＡだけを必要とした。異なるプローブを表示するＮＭＥで収集された電気化学的信号を分析することによって、本発明者らは、各試料に存在する融合遺伝子のアイデンティティを確認した。例えば、（シークエンシングによって検証した場合の）Ｉ型融合体を含む患者試料において、各プローブ修飾化ＮＭＥで観察される電流値は以下の順番で減少した：Ｉ＞＞＞＞ＩＩＩ＞ＶＩ。ＩＩＩ型融合体を含む患者試料において、電気的信号は、プローブＩＩＩ＞＞＞＞Ｉ＞ＶＩという、融合体の正しいアイデンティティを再び、指摘した。電気的プロファイリングが遺伝子融合体の非存在または存在を正しくコールしたこれらの結果、ならびにＤＵ１４５、ＶＣａＰ、およびＨ６６０細胞性ＲＮＡで得られた結果は、ＮＭＥチップが、複雑な試料においてこれらの重要なバイオマーカーをプロファイリングすることができ、かつ異なる臨床転帰に関連したバイオマーカープロファイルを区別し得ることを示している。
【００９０】
本明細書に記載された検出プラットフォームは、特異的で、感度が高く、ロバストであるのではなく、実用的で、拡大縮小が可能である。本発明者らが選択した再現性のある製作方法は、家庭用電化製品マイクロチップ製作に広く用いられている同じフォトリソグラフィーテクノロジーを用いてのプローブ修飾化チップの製造に受け入れられ；単純で安価な計測手段だけが読み出しのために必要とされる。ハイブリダイゼーションが単一の反応容器で実施および読み出しすることができるので、自動分析のためにマイクロフルイディクスは必要とされない。感度が高いが、臨床設定において自動化するのが困難であるＰＣＲに基づいた方法の魅力的な代替法を、このシステムは表している。
【００９１】
要約すれば、本明細書に記載した新しい多重化電極プラットフォームは、電気的信号を用いて臨床関連試料において癌バイオマーカーのパネルを直接、読み得る最初のものである。これらの測定を可能にするアレイは、感度に必須の制御可能かつ万能のナノ表面構造化を有する微小電極を特徴とする。システムは、これらのナノ表面構造化電極を迅速な触媒的読み出しと組み合わせて、長年の目標：安価で実用的なプラットフォームを用いる癌バイオマーカーの多重化分析を達成する。
【実施例３】
【００９２】
直接的な電気的マイクロＲＮＡ検出により３０分間で示差的発現プロファイルが明らかにされる。
【００９３】
材料および方法
材料。６−メルカプト−１−ヘキサノール（９７％ＭＣＨ）、ヘキサミン・ルテニウム・クロライド（９９．９＋％）、フェリシアン化カリウム（９９％）、および塩化パラジウム（ＩＩ）（９９．９＋％）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）から購入した。過塩素酸（７０％）、アセトン（ＡＣＳグレード）、およびイソプロピルアルコール（ＩＰＡ、ＡＣＳグレード）をＥＭＤ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）から入手した。ＨＰＬＣ精製グレードのチオール化ＰＮＡオリゴマーをＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）から入手した。ＰＮＡは、Ｃｙｓ−ＧｌｙジペプチドをそれらのＮ末端で探索する。Ｇｌｙはスペーサーとして働き、Ｃｙｓは電極表面上での固定化のための遊離チオールを提供する。合成マイクロＲＮＡ（５’末端リン酸化およびＨＰＬＣ精製）をＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から入手した。全てのＰＮＡ配列およびＲＮＡ配列は、支援情報において提供された表Ｓ１に示されている。
【００９４】
チップ製作。チップをＣａｎａｄｉａｎ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒで作製した。熱成長二酸化ケイ素の厚い層を用いて３’’シリコンウエハーを保護した。電子ビーム援助金蒸着を用いて３５０ｎｍの金層をチップ上に析出させた。標準フォトリソグラフィーおよび剥離工程を用いて金フィルムをパターン化した。絶縁二酸化ケイ素の５００ｎｍ層を、化学蒸着を用いて析出させた。標準フォトリソグラフィーを用いて５００ｎｍのアパーチャを電極上にインプリントし、標準フォトリソグラフィーを用いて２ｍｍ×２ｍｍの接着パッドを露出させた。
【００９５】
ナノ構造化微小電極の製作。チップをアセトン、ＩＰＡ、およびＤＩ水中で３０秒間、すすぐことにより清浄にし、窒素流で乾燥させた。全ての電着を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極および白金線補助電極を特徴とする３電極システムを有する生物分析システム・イプシロン・ポテンシオスタットを用いて室温で行った。製作された電極上の５００ｎｍのアパーチャを作用電極として用い、露出した接着パッドを用いて接触させた。５ｍＭの塩化パラジウム（ＩＩ）および０．５Ｍの過塩素酸を含むめっき浴へチップの２ｍｍ部分を浸漬し、電気めっき前の約５分間、インキュベートした。接着パッドを溶液に接触しないようにした。ＤＣ電位アンペロメトリーを用いて−１００ｍＶの加電圧で６秒間、Ｐｄ  ＮＭＥを製作した。
【００９６】
ＰＮＡプローブでのＮＭＥの修飾。一本鎖チオール化ＰＮＡプローブを、２５ｍＭのリン酸ナトリウムおよび２５ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝溶液（ｐＨ７）中に５００ｎＭの濃度で溶解した。その後、溶液を５０℃で１０分間、加熱して、ＰＮＡ分子を完全に溶解した。その後、適切な量の１０ｍＭのＭＣＨを加え、１００ｎＭの最終ＭＣＨ濃度にした。１０μＬのこの混合物を、手動マイクロピペッターを用いてＰｄ  ＮＭＥを表示するチップ上に素早く置いた。その後、チップを覆うこのＰＮＡプローブ溶液を、暗い湿度チャンバ内、４℃で一晩、インキュベートした。プローブ修飾化Ｐｄ  ＮＭＥを、測定前に上記緩衝溶液で勢いよくすすいだ。多重化実験について、８本の個々にアドレス可能なリード線を有するチップを用いた。
【００９７】
標的ハイブリダイゼーション。ハイブリダイゼーション溶液は、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および２５ｍＭのＮａＣｌ中に様々な濃度の標的を含んだ。Ｐｄ  ＮＭＥを１０μＬの標的溶液と湿度チャンバ内、３７℃で３０分間、インキュベートして、固定化プローブ分子を標的分子とハイブリダイズさせた。その後、チップを冷却し、電気化学分析の前に緩衝液で勢いよく洗浄した。
【００９８】
電気化学測定。電気化学測定を、１０ｍＭのＲｕ（ＮＨ３）６３＋、４ｍＭのＦｅ（ＣＮ）６３−、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、および２５ｍＭのＮａＣｌを含む溶液中で電気化学分析計（ＢＡＳｉ、Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＵＳＡ）を用いて行った。標的溶液の添加前および後にサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を１００ｍＶ／ｓのスキャン速度で行った。示差パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）を、５ｍＶの電位ステップ、５０ｍＶのパルス振幅、５０ｍｓのパルス幅、および１００ｍｓのパルス間隔で行った。ハイブリダイゼーション前および後のサイクリックボルタンメトリー信号を、１００ｍＶ／ｓのスキャン速度で収集した。サイクリックボルタンメトリー信号において−３００ｍＶでのカソード電流から０ｍＶでのバックグラウンドを引き算することによって限界還元電流（Ｉ）を定量化した。ハイブリダイゼーションに対応する信号変化は以下の通り、計算した：ΔＩ＝（Ｉｄｓ−Ｉｓｓ）／Ｉｓｓ×１００（ｓｓ＝ハイブリダイゼーション前、ｄｓ＝ハイブリダイゼーション後）。検出限界は、バックグラウンド（非相補的ΔＩ）を引き算した信号が、１０ｆＭの非相補的対照試料の標準偏差より２倍高い最初の濃度として決定された。
【００９９】
ＳＥＭイメージング。ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｓ−３４００  ＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を用いて、電気めっきＮＭＥの形態および寸法を研究した。両面接着ブラックカーボンテープを用いてステンレス綱ＳＥＭスタブ上にチップを貼った。２０ｋＶでの二次電子モードを用いてＳＥＭ画像を得た。
【０１００】
ＰＣＲ分析のためのＲＮＡ抽出および増幅プロトコール。全ＲＮＡを細胞株からｍｉｒＶａｎａキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。試料の品質を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙ）を用いて内因性対照ＲＮＵ４４のＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価した。このアッセイは、ステムループＲＴプライマーがｍｉｒ分子に特異的にハイブリダイズし、その後、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素で逆転写されるＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いる逆転写（ＲＴ）ステップを含む。
簡単に言うと、逆転写混合物は、５０ｎＭのステムループＲＴプライマー、１×ＲＴ緩衝液、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．３３Ｕ／μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素、および０．２５Ｕ／μｌのＲＮアーゼインヒビターを含む。その後、７．５μＬの反応物をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）内で１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間、インキュベートし、その後、４℃に保った。続いて、ＲＴ産物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００  ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００  ＨＴ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて配列特異的プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のｈｓａ−ｍｉｒ−２１プライマー４３７３０９０およびｈｓａ−ｍｉｒ−２０５プライマー４３７３０９３）で増幅した。１０μＬのＰＣＲ混合物は、０．６７μＬのＲＴ産物、１ｘ４  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ）、０．２μＭのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、１．５μＭのフォワードプライマー、および０．７μＭのリバースプライマーを含む。反応物を３８４ウェルプレート中、９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間の４０サイクルでインキュベートした。
【０１０１】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２１のクローニングおよび発現。高機能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造会社の使用説明書に従い、ＦａＤｕ細胞から５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写することによってｃＤＮＡを生成した。１μＭのプライマーＭＩＲ−Ｆ（ＣＣＴ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ）およびプライマーＭＩＲ−Ｒ（ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＧＡＴ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＴ）でのｐｒｅｍｉＲＮＡ−２１ステムループのＰＣＲ増幅のための鋳型として５０ｎｇのｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲについての条件は、９５℃で２分間、続いて、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間の４０サイクル、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長ステップであった。ＰＣＲ産物をゲル精製し（Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でクローニングした。コロニーを採取し、ＬＢ培地で増殖させた。
プラスミドＤＮＡをプラスミドミニキット（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、シークエンシング（ＡＣＧＴ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で、正しい産物、配向、および望ましくない突然変異の非存在についてチェックした。インビトロ転写中に高バックグラウンドベクターＲＮＡを生じる３’突出末端を発生させないＮｏｔＩで、プラスミドＤＮＡを消化した。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ３高収率転写キット（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ３  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのインビトロ転写についての鋳型として１μｇの直線化されたプラスミドＤＮＡを用いた。逆転写の完了後、ＤＮアーゼＩを加えて鋳型ＤＮＡを消化し、ＲＮＡをＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  ｔｏ  Ｍｉｄｉ全ＲＮＡ精製キット（ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  ｔｏ  Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製した。ＲＮＡの濃度を、２６０ｎｍでの吸光度を読むことによって決定した。
【０１０２】
結果および考察
本発明者らは、アレイに基づいた分析の簡便さを特徴とするが、わずかな生物学的試料を少量のマイクロＲＮＡについてアッセイするのに必要とされる例外的な感度でそのような多重化のパワーを増強させる、マイクロＲＮＡプロファイリングのための新しい方法を開発しようと努力した。従来の蛍光に基づいた方法が、少数の分子の表面結合プローブ配列へのハイブリダイゼーションを単純な計測手段を用いてモニターするのに感度が十分でないことを考慮して、本発明者らは、代わりに、電気的読み出しを用いるアプローチを追求した。
【０１０３】
電気的マイクロＲＮＡ検出のためのプラットフォームを提供するために、フォトリソグラフィーによって作製された電極パターンを特徴とする多重化チップを調製した。このチップは、ベースとしてシリコンウエハーを用いて作製し、リード線および外部接触の多重化セットを提供するように、金のパターンをその表面上に析出させた。金の最上層にその金属を保護するためにＳｉＯの層を析出させ、その後、最終作製ステップにおいて、各リード線の末端に５００ナノメートルのアパーチャを開いて、金を露出させた。突出微小電極を作製するために、アパーチャにパラジウムを電着させた。高度ナノ構造化微小電極（ＮＭＥ）を生じるように、電着ステップを操作した。以前の研究により、ナノ構造化検知素子が、塊状材料より効率的に生体分子プローブを提示し、表面複合体形成反応を促進し得ることが示されているが、この利点は、直接的生物学的プロファイリングに利用することができていない。
【０１０４】
マイクロＲＮＡ検出における感度および特異性について電子チップを試験するために、Ｐｄ  ＮＭＥをＰＮＡプローブで修飾し、ハイブリダイゼーションのためにＲＮＡに曝した。ナノ構造化電極およびＰＮＡプローブと共に用いる場合、フェムトモルの感度を示すことが以前に示された、レドックス・レポーター・システムを用いて複合体形成をアッセイした（Ｒ．Ｇａｓｐａｒａｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４、１２６、１２２７０；Ｚ．Ｆａｎｇ、Ｓ．Ｏ．Ｋｅｌｌｅｙ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９、８１、６１２；Ｍ．Ａ．Ｌａｐｉｅｒｒｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３、７５、６３２７；Ｍ．Ａ．Ｌａｐｉｅｒｒｅ−Ｄｅｖｌｉｎら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００５、５、１０５１）。このレポーターシステムは、核酸が電極表面でハイブリダイズする場合のＲｕ（ＩＩＩ）の蓄積に依存しており、このレポーターから得られた信号は、Ｒｕ（ＩＩＩ）をそれの電気化学的還元後、化学的に再生することができるフェリシアン化物の含有によって増幅される。ｍｉＲ−２１配列の滴定は、少なくも１０ａＭの標的を含む溶液をチップに基づいたＮＭＥに曝した場合、非相補的対照配列と比較して検出可能な信号変化を示した。これは、１マイクロリットルの試料あたり１０分子に対応する。非常に高レベルの感度は、たった１０２の限られたダイナミックレンジを伴うが、マイクロＲＮＡの検出について、少量のこれらの配列を考慮すれば、このトレードオフはメリットがある。
【０１０５】
マイクロＲＮＡ検出において、２つの重要な追加の検知基準が、特に要求される。第１に、少なくも１つの塩基だけが異なる密接に関連した配列が正確に区別されなければならない。第２に、成熟マイクロＲＮＡ対前駆体マイクロＲＮＡに見出されるもののような配列付加物が識別されなければならない。本発明者らは、これらの必要条件のそれぞれに関して本発明者らのシステムを吟味しようとした。本発明者らは、まず、成熟マイクロＲＮＡ配列についてのアッセイの特異性を調べた。ｍｉＲ−２１の完全長、二本鎖、前駆体型、またはより有意に短い一本鎖成熟ｍｉＲ−２１配列のいずれかを含む溶液にチップを曝した場合に観察される信号変化を分析することによってこれを行った。ヘアピン前駆体構造について得られた信号はバックグラウンドレベルにほぼ等しかったが、成熟ｍｉＲ−２１についてロバストな信号変化が観察された。
【０１０６】
本発明者らは、２つの密接に関連した配列である、ｍｉＲ−２６ａおよびｍｉＲ−２６ｂに対するプローブ修飾化検知素子の応答をモニターすることによって点突然変異に対する検出アプローチの感度を評価した。各配列に相補的なプローブをチップ上に整列させ、相補配列に対するこれらの素子の応答をモニターした。ｍｉＲ−２６ａが導入された場合に得られた信号は、完全にマッチしたｍｉＲ２６ａプローブについて、ミスマッチしたｍｉＲ−２６ｂプローブの約４倍であり、同様に、ｍｉＲ−２６ｂが導入された場合に得られた信号は、完全にマッチしたｍｉＲ２６ｂプローブについて、そのミスマッチした対応プローブの約４．５倍高かった。これらの結果より、この多重化チップが密接に関連したマイクロＲＮＡ配列をうまく識別し得ることが示されている。
【０１０７】
正常細胞と比較して、特に腫瘍型を示す細胞株からマイクロＲＮＡ発現の「フィンガープリント」を引き出すことは、患者においてバイオマーカーとしての役割を果たすことができるマイクロＲＮＡを同定するための強力なアプローチであることが以前に示されている。マイクロＲＮＡ標的に向けてのチップの特異性および感度を確認して、その後、本発明者らは、ヒト正常細胞から抽出されたＲＮＡ試料、および培養で増殖したヒト頭頸部扁平癌細胞株由来のＲＮＡ試料を用いてそれを試験した。例えば、ヒト下咽頭扁平癌ＦａＤｕ細胞株および正常な口腔上皮細胞株から抽出された全ＲＮＡを、ｍｉＲ−２０５に相補的なプローブを表示するナノ構造化微小電極上へ滴定した。ＦａＤｕ細胞由来のわずかにも５ｎｇのＲＮＡについて陽性信号が得られ、一方、正常上皮細胞は最高２０ｎｇのＲＮＡについてでも少しの信号変化も生じなかった。これは、信号応答が、癌細胞株において有意により高いレベルで存在する固有のマーカーに対応していることを示している。
【０１０８】
本発明者らは、２つの異なるマイクロＲＮＡである、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２０５をプロファイリングし、全ＲＮＡ試料のパネルに対照ＲＮＡ、ＲＮＵ−４４も含めた。本発明者らは、３つの異なる頭頸部扁平癌細胞株を用い、正常な口腔上皮細胞から単離されたＲＮＡに対してこれらの全ＲＮＡ試料への微小電極チップの応答を比較した。予想された通り、相補プローブで修飾された検知素子に曝された各全ＲＮＡ試料について測定された電気化学的応答によって判断した場合、ＲＮＵ−４４レベルは、全ての４つの細胞株において一定のままであった。しかしながら、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２０５の信号は、癌細胞株において両方とも有意に上昇した。実際、これらのマイクロＲＮＡのレベルは、正常上皮細胞に対して癌細胞株において１００倍より高いレベルで存在すると判断された。これらの標的の過剰発現は、従来の定量的ＰＣＲを用いて確認された（支援情報を参照）。ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２０５のどちらも、原発性ヒト頭頸部扁平癌腫において上昇することが以前に観察されており、これらのマイクロＲＮＡについての著しい電位がこの悪性腫瘍の診断バイオマーカーとしての役割を果たすことを示している。
【０１０９】
結論として、本明細書に記載されたマイクロＲＮＡ検出チップは、最も困難な検出標的の一つを代表する新規なクラスの核酸バイオマーカーの分析について感度および特異性を提供する。マイクロＲＮＡプロファイルの電気的読み出しは、特定の配列についてＲＮＡ試料を直接的にアッセイするための、迅速で、しかも非常に正確な方法を提供し、標識または増幅がないことが、このアプローチを、他のＰＣＲまたはハイブリダイゼーションに基づいたアプローチでは達成できない特徴である、極めて直接的かつ効率的なものにさせている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【外国語明細書】
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