(57)【要約】【課題】本発明は、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための新規組成物を提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための組成物が提供される。認知機能の維持、向上および改善は、好ましくはアセチルコリンエステラーゼ活性阻害およびムスカリン性アセチルコリン受容体活性化によるものである、【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための組成物。
【請求項２】
ホップ由来のタンニンエキスが、含水エタノール抽出物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
認知機能の維持、向上および／または改善が、アセチルコリンエステラーゼ活性阻害および／またはムスカリン性アセチルコリン受容体活性化によるものである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、アセチルコリンエステラーゼ活性阻害および／またはムスカリン性アセチルコリン受容体活性化に用いるための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知機能の改善等のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症の原因として最も多いとされるアルツハイマー病は、神経伝達物質であるアセチルコリンの脳内における機能障害が発症要因の一つであると考えられている（コリン仮説）。このため、アセチルコリンの分解を抑制しアセチルコリン濃度を上昇させることにより認知機能を改善させる治療薬が開発されてきた。例えば、アセチルコリンはアセチルコリンエステラーゼにより分解されるため、アセチルコリンエステラーゼ活性を阻害する薬剤によってアセチルコリン濃度を上昇させることができる。このような作用機序をもつ認知症治療薬として、例えばドネペジルが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、アセチルコリン受容体は、ニコチン性アセチルコリン受容体とムスカリン性アセチルコリン受容体の２つに大別され、さらにムスカリン性アセチルコリン受容体には５種類のサブタイプ（Ｍ１からＭ５まで）が存在していることが知られている。Ｍ１受容体は大脳皮質や海馬に多く存在し、記憶に関与していると考えられており、認知症薬のターゲットとしてＭ１受容体作動薬の開発が進められている（非特許文献２）。
【０００４】
これまでに認知機能の改善に有効な天然物由来の成分の探索が行われており、例えば、ホップ抽出物に含まれるイソフムロン類に認知機能の改善効果があることが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−２２４１９４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】医学のあゆみ、257巻5号、423-428頁、2016年
【非特許文献２】ファルマシア、33巻11号、1228-1234頁、1997年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための新規組成物および用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは今般、ホップ由来のタンニンエキスがアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有するとともに、ムスカリン性アセチルコリン受容体（Ｍ１受容体）活性化作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００９】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための組成物並びに認知機能の維持剤、向上剤および／または改善剤。
［２］ホップ由来のタンニンエキスが、含水エタノール抽出物である、上記［１］に記載の組成物および用剤。
［３］認知機能の維持、向上および／または改善が、アセチルコリンエステラーゼ活性阻害および／またはムスカリン性アセチルコリン受容体活性化によるものである、上記［１］または［２］に記載の組成物および用剤。
［４−１］ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、アセチルコリンエステラーゼ活性阻害に用いるための組成物およびアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤。
［４−２］ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、ムスカリン性アセチルコリン受容体活性化に用いるための組成物およびムスカリン性アセチルコリン受容体活性化剤。
［５］食品組成物である、上記［１］〜［３］、［４−１］および［４−２］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［６］ホップ由来のタンニンエキスを配合することを含んでなる、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための食品の製造方法。
【００１０】
本発明の組成物および用剤は、人類が長年摂取してきた食品素材であるホップ由来のタンニンエキスを有効成分とする。従って、本発明の組成物および用剤は、認知機能の維持、向上、改善に使用できるとともに、長期にわたり安全に摂取できる点でも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】マウスムスカリンＭ１受容体を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞における、ホップタンニンエキスによる細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示す図である。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明において有効成分として用いられる「タンニンエキス」に含まれるタンニンは、フラバノール骨格を持つ化合物が重合した縮合型タンニンと、没食子酸やエラグ酸などの芳香族化合物とグルコースなどの糖がエステル結合を形成した加水分解型タンニンの二つに分類することができる。本発明において「タンニン」はこれらいずれのタンニンを含む意味で用いられるものとする。
【００１３】
本発明の「タンニンエキス」は、例えば、Proceedings of the 31st EBC Congress 2007, 6.-10.5.07, Veniceに記載の方法に従い、植物体の含水エタノール抽出物から製造することができる。具体的には、植物体の５０％含水エタノール抽出物からエタノールを除去し、遠心分離により固液分離した上清をタンニンエキスとすることができる。なお、遠心分離で除去された沈殿物は水に不溶の樹脂画分である。
【００１４】
本発明の「タンニンエキス」はホップ由来のものである。ここで、タンニンエキスの原料として使用されるホップは、ルプリン部を含有するものであれば任意の形態のものでよく、収穫して乾燥したもの、圧縮したもの、粉砕したもの、またはペレット状に加工したもの等用いてもよいが、好ましくはホップペレットの形態である。ホップペレットは、市販品を使用してもよく、例えば、ホップ毬花を圧縮しペレット状にしたもの（Type90ペレット）、ルプリン部分が選択的に濃縮されたペレット（Type45ペレット）、または異性化処理をしたホップペレット（例えば、Isomerized Pellets (HopSteiner社)）等が挙げられる。
【００１５】
本発明においてホップ由来のタンニンエキスは、タンニンなどのポリフェノールを含有する混合物であり、ポリフェノール以外には、ミネラル、糖、タンパク質を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明においてホップ由来のタンニンエキスに含まれるタンニンは、ポリフェノール量として定量することができ、例えば、フォーリン・デニス（Ｆｏｌｉｎ Ｄｅｎｉｓ）法に従って測定することができる。フォーリン・デニス法はフォーリン試薬（フェノール試薬）を用いる吸光光度法で、ワインや蒸留酒のタンニン分析法としてAOAC Internationalの公定法(AOAC Method 952.03, 955.25)に採用されている（栗林剛、工業技術総合センター 食品技術部門加工食品部http://www.gitc.pref.nagano.lg.jp/pdf/gijutujoho275.pdf）。
【００１７】
後記実施例に示されるように、ホップ由来のタンニンエキスは、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有するとともに、ムスカリンＭ１受容体のアゴニスト活性を有する。ここで、アセチルコリンエステラーゼを阻害することによって認知機能を改善等できることが知られている（非特許文献１）。また、ムスカリンＭ１受容体を活性化させることにより認知機能を改善等できることが知られている（非特許文献２）。従って、本発明によれば、ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための組成物、並びに認知機能の維持剤、認知機能の向上剤および認知機能の改善剤が提供される。
【００１８】
本発明によればまた、有効量のホップ由来のタンニンエキスを、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、認知機能の維持方法、認知機能の向上方法および認知機能の改善方法が提供される。本発明の方法を実施する場合にはそれを必要としている哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に有効量の本発明の有効成分を投与することにより実施することができる。
【００１９】
本発明によればまた、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための組成物および用剤並びに食品の製造のための、ホップ由来のタンニンエキスの使用が提供される。本発明によればさらにまた、認知機能の維持、向上および／または改善に用いるためのホップ由来のタンニンエキスが提供される。
【００２０】
本発明において「認知機能の維持」とは、認知機能の低下を抑制することなどを含む意味で用いられる。また、「認知機能の向上」とは、認知機能を現状より高めることなどを含む意味で用いられる。さらに、「認知機能の改善」とは、例えば、いったん低下した機能や低下の兆しがある機能を回復させることなどを含む意味で用いられる。
【００２１】
アルツハイマー型認知症やパーキンソン型認知症では、脳内コリン作動性神経系の障害が生じ、それにより認知症を発症すると考えられている。本発明の有効成分であるホップ由来のタンニンエキスは、アセチルコリンを分解する酵素であるアセチルコリンエステラーゼを阻害することができる。従って、脳内アセチルコリン量を増加させ、それにより脳内コリン作動性神経系を賦活することにより認知症を予防および治療することができる。すなわち、本発明によれば、ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、認知症の治療および／または予防用医薬組成物並びに認知症の治療剤および予防剤が提供される。本発明によればまた、有効量のホップ由来のタンニンエキスを、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、認知症の治療方法および予防方法が提供される。本発明によればさらに、認知症の治療および／または予防用医薬組成物並びに認知症の治療剤および予防剤の製造のための、ホップ由来のタンニンエキスの使用が提供される。本発明によればさらにまた、認知症の治療および／または予防に用いるためのホップ由来のタンニンエキスが提供される。
【００２２】
本発明の別の面によれば、ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、アセチルコリンエステラーゼ活性阻害に用いるための組成物および用剤並びに食品が提供される。本発明によればまた、有効量のホップ由来のタンニンエキスを、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、アセチルコリンエステラーゼ活性の阻害方法が提供される。本発明によればさらに、アセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に用いるための組成物および用剤並びに食品の製造のための、ホップ由来のタンニンエキスの使用が提供される。本発明によればさらにまた、アセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に用いるためのホップ由来のタンニンエキスが提供される。
【００２３】
本発明のさらに別の面によれば、ホップ由来のタンニンエキスを有効成分として含んでなる、ムスカリン性アセチルコリン受容体（Ｍ１受容体）の活性化に用いるための組成物および用剤並びに食品が提供される。本発明によればまた、有効量のホップ由来のタンニンエキスを、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、ムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化方法が提供される。本発明によればさらに、ムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化に用いるための組成物および用剤並びに食品の製造のための、ホップ由来のタンニンエキスの使用が提供される。本発明によればさらにまた、ムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化に用いるためのホップ由来のタンニンエキスが提供される。
【００２４】
本発明の有効成分であるホップ由来のタンニンエキスの本発明における使用は、ヒトおよび非ヒト動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
【００２５】
本発明の認知機能の維持、向上および／または改善に用いるための組成物および用剤、本発明のアセチルコリンエステラーゼ活性阻害に用いるための組成物および用剤並びに本発明のムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化に用いるための組成物および用剤（以下、「本発明の組成物および用剤」ということがある）は、医薬品、医薬部外品、食品、飼料などの形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。また本発明の認知機能の維持方法、認知機能の向上方法および認知機能の改善方法、本発明のアセチルコリンエステラーゼ活性の阻害方法並びに本発明のムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化方法は、下記の記載に従って実施することができる。
【００２６】
本発明の有効成分であるホップ由来のタンニンエキスは、ヒトおよび非ヒト動物に経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
【００２７】
本発明の有効成分であるホップ由来のタンニンエキスを食品として提供する場合には、それをそのまま食品として提供することができ、あるいはそれを食品に含有させて提供することができる。このようにして提供された食品は本発明の有効成分を有効量含有した食品である。本明細書において、本発明の有効成分を「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲で本発明の有効成分が摂取されるような含有量をいう。また「食品」とは、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品）を含む意味で用いられる。
【００２８】
本発明の組成物および用剤は、認知機能の維持、向上および／または改善作用を有するため、日常摂取する食品、さらにはサプリメントとして摂取する食品に含有させて提供することができる。この場合、本発明の組成物および用剤は１食当たりに摂取する量が予め定められた単位包装形態で提供することができる。１食当たりの単位包装形態としては、例えば、パック、包装、缶、ボトル等で一定量を規定する形態が挙げられる。本発明の組成物および用剤の各種作用をよりよく発揮させるためには、後述する、ホップ由来のタンニンエキスの１回当たりの摂取量に従って１食当たりの摂取量を決定できる。本発明の食品は、摂取量に関する説明事項が包装に表示されるか、あるいは説明事項が記載された文書等と一緒に提供されてもよい。
【００２９】
本発明の組成物および用剤並びに食品には認知機能の維持、向上および／または改善作用を有する旨の表示が付されてもよい。この場合、消費者に理解しやすい表示とするため本発明の組成物および用剤並びに食品には以下の一部または全部の表示が付されてもよい。なお、本発明において「認知機能の維持、向上および／または改善」が以下の表示を含む意味で用いられることはいうまでもない。
・記憶力を持続する、高める、向上させる、改善する、増強する、サポートする、維持する
・認知機能を持続する、高める、向上させる、改善する、増強する、サポートする、維持する
・注意力を持続する、高める、向上させる、改善する、増強する、サポートする、維持する
・集中力を持続する、高める、向上させる、改善する、増強する、サポートする、維持する
・記憶力の維持に役立つ、低下を防止する
・うっかりを防止する、物忘れを防止する
・記憶の定着を向上させる、記憶の精度を高める
・加齢に伴う記憶の低下を抑制する
【００３０】
「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であっても、半液体やゲル状の形態であってもよい。また、サプリメントとしては、本発明の有効成分に賦形剤、結合剤等を加え練り合わせた後に打錠することにより製造された錠剤や、カプセルになどに封入されたカプセル剤が挙げられる。
【００３１】
本発明で提供される食品は、本発明の有効成分を含有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、飯類、麺類、パン類およびパスタ類等炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ヨーグルトやプリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、その他雑酒、酎ハイなどのアルコール飲料；果汁入り飲料、野菜汁入り飲料、果汁および野菜汁入り飲料、清涼飲料水、炭酸飲料、牛乳、豆乳、乳飲料、ドリンクタイプのヨーグルト、ドリンクタイプのゼリー、コーヒー、ココア、茶飲料、栄養ドリンク、スポーツドリンク、ミネラルウォーター、ニア・ウォーターなどの非アルコール飲料；卵を用いた加工品、魚介類や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）などを例示することができる。なお、ミネラルウォーターは、発泡性および非発泡性のミネラルウォーターのいずれもが包含される。
【００３２】
茶飲料としては、発酵茶、半発酵茶および不発酵茶のいずれもが包含され、例えば、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー、ローズ茶、キク茶、ハーブ茶（例えば、ミント茶、ジャスミン茶）が挙げられる。本発明の組成物および用剤の有効成分としてホップ由来のタンニンエキスを利用する場合には、ホップ由来のタンニンエキスを原料に配合して製造した食品や、ホップ由来のタンニンエキスが必然的に含まれる食品は本発明の食品の範囲内である。
【００３３】
果汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる果物としては、例えば、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、モモ、マンゴー、アサイー、ブルーベリーおよびウメが挙げられる。また、野菜汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる野菜としては、例えば、トマト、ニンジン、セロリ、カボチャ、キュウリおよびスイカが挙げられる。
【００３４】
本発明の有効成分であるホップ由来のタンニンエキスの摂取量または投与量は、受容者の性別、年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。ホップ由来のタンニンエキスを認知機能の維持、向上および／または改善を目的として摂取または投与する場合には、成人１日当たりの摂取量および投与量は、例えば、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重）であり、対象者によっては数回に分けて摂取させ、あるいは投与してもよい。
【００３５】
本発明の組成物および用剤はヒトが長年摂取してきた食品素材であるホップ由来の成分を有効成分として利用することから、継続使用しても副作用の懸念がなく、安全性が高い。このため本発明の組成物および用剤を既存の薬剤と組み合わせて用いると、既存薬剤の用量を低減することができ、ひいては既存薬剤の副作用を軽減あるいは解消することができる。他の薬剤との併用に当たっては、他の薬剤と本発明の組成物および用剤を別個に調製しても、他の薬剤と本発明の組成物および用剤を同一の組成物に配合してもよい。
【００３６】
本発明の組成物および用剤は、長期摂取によりその効果をよりよく発揮することができ、例えば３ヶ月以上継続的に投与または摂取させることが好ましく、投与および摂取期間はより好ましくは約半年程度である。ここで、「継続的に」とは毎日投与または摂取を続けることを意味する。本発明の組成物および用剤を包装形態で提供する場合には、継続的摂取のために一定期間（例えば、１ヶ月）の有効摂取量をセットで提供してもよい。
【実施例】
【００３７】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３８】
例１：アセチルコリンエステラーゼ阻害活性の測定
（１）被験試料の調製
ホップ由来のタンニンエキス粉末（HopSteiner社製）を蒸留水に溶解し、ホップタンニンエキス溶液を調製した。
【００３９】
（２）反応溶液の調製
アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）阻害活性をEllman et al., Biochem. Pharmacol., 7, 1961, 88-95およびJpn., Pharmacol., Ther., 26(Suppl. 6), 1998, s1277-1282に記載の方法に従って測定した。具体的には、表１に示す組成の反応溶液を調製した。
【００４０】
【表１】
2018104323.tif 000002
【００４１】
すなわち、上記（１）で調製したホップタンニンエキス溶液を０．５ｍｇ／ｍＬ濃度となるように反応溶液に添加した。反応溶液に含まれるアセチルコリンエステラーゼ（２００ｍｇ／ｍＬ）は、摘出直後のラット脳組織に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）を添加して調製したホモジネートを用いた。
【００４２】
（３）測定
上記（２）で調製した反応溶液に基質であるヨウ化アセチルコリンを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、あらかじめ２５℃に保温しておいた恒温分光光度計にセットした。基質添加時および基質添加２分後において、産生したチオコリンがＤＴＮＢ試薬と反応して生じる黄色産物を４１２ｎｍにおける吸光度変化量（ΔＡ４１２ｎｍ／分）として測定し、アセチルコリンエステラーゼ活性を求めた。また、ブランクには、被験試料の代わりに緩衝液を添加し同様に測定して吸光度変化量を求め、これを０％として被験試料のアセチルコリンエステラーゼ阻害率（％）を算出した。被験試料のアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を５０％阻害濃度（ＩＣ５０）として求めた。なお、ポジティブコントロールとして塩酸ドネペジル（和光純薬工業社製）を使用し、塩酸ドネペジルの最終濃度０〜１００ｎＭの範囲で検量線を作成した。
【００４３】
（４）結果
ホップタンニンエキスの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は０．８２ｍｇ／ｍＬであった。すなわち、ホップタンニンエキスについてアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有することが確認された。また、塩酸ドネペジル濃度とアセチルコリンエステラーゼ阻害率の関係は良好な直線性（相関係数Ｒ２＝０．９９６７）を示し、本試験が適切に行われたことが確認された（データ示さず）。
【００４４】
例２：ホップタンニンエキスのＭ１受容体アゴニスト活性
（１）Ｍ１受容体発現細胞の調製
マウスムスカリン性アセチルコリン受容体（Ｍ１受容体）を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞Ｍ１ＷＴ３（ＡＴＣＣ）を終濃度１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地、和光社製）で培養した。細胞を回収後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid緩衝液）に懸濁した。
【００４５】
（２）被験試料の調製
例１（１）に記載された手順に従って、ホップタンニンエキス溶液を調製した。
【００４６】
（３）細胞内カルシウムイオン濃度の測定
上記（１）で調製した２０ｍＬの細胞懸濁液に１００μＬの蛍光プローブＦｕｒａ−２ＡＭ（ＤＭＳＯ溶液、同仁化学社製）を添加し、遮光下、室温で３０分間静置した。静置後、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ緩衝液、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有）で２回程度洗浄し、最終濃度１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞培養液を調製した。
【００４７】
調製した細胞培養液に上記（２）で調製したホップタンニンエキス溶液を終濃度１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．００３ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、さらにアンタゴニストであるアトロピン硫酸塩水和物（日本点眼薬研究所製、以下同様）を終濃度１０μＭ添加する群と添加しない群を設けた。ブランクとして、調製した細胞培養液にハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ緩衝液、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有）を添加した。また、ポジティブコントロールとして、調製した細胞培養液にＭ１受容体アゴニストであるアセチルコリンを終濃度１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭとなるように添加し、さらにアンタゴニストであるアトロピン硫酸塩水和物を終濃度１０μＭで添加する群と添加しない群を設けた。
【００４８】
被験試料を添加した細胞培養液をＣＯ２インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０分間培養した。培養後段階希釈したサンプルを９６穴プレート（オプティカルボトムブラックプレート）に滴下アプライし、プレートリーダー（Functional Drug Screening System：FDSS3000、浜松ホトニクス社製）を用いて各ウェルの蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ／３８０ｎｍ、蛍光波長：５１０ｎｍ）を測定した。
【００４９】
被験試料がＭ１受容体アゴニスト活性を有する場合には、細胞内カルシウムイオン濃度が高くなり励起波長３４０ｎｍによる蛍光強度が上昇し、励起波長３８０ｎｍによる蛍光強度が低下する性質がある。このため、被験試料のＭ１受容体アゴニスト活性は蛍光強度比（Ｒａｔｉｏ：Ｒ＝Ｆｅｘ．３４０ｎｍ／Ｆｅｘ．３８０ｎｍ）の変化をモニターすることで求めることができる。
【００５０】
（４）結果
結果を図１に示す。図１の結果から、終濃度が０．０３ｍｇ／ｍＬ以上のホップタンニンエキス溶液において蛍光強度比の変化が認められ、細胞内カルシウム濃度の上昇がみられたことから、ホップタンニンエキスはＭ１受容体アゴニスト活性を有することが確認された。また、アンタゴニストであるアトロピン硫酸塩水和物をホップタンニンエキスと共存させると、蛍光強度比の上昇が抑制され細胞内カルシウム濃度の上昇が抑制されたことからも、ホップタンニンエキスがＭ１受容体活性化作用を有することが確認された。また、ポジティブコントロールとしてＭ１受容体アゴニストであるアセチルコリンを被験試料とした場合、終濃度１０ｎＭ以上のアセチルコリン濃度で蛍光強度比の上昇（細胞内カルシウム濃度の上昇）が認められ、さらにアンタゴニストであるアトロピン硫酸塩水和物を共存させると、蛍光強度比の上昇の抑制（細胞内カルシウム濃度の上昇の抑制）が認められたことから、本試験が適切に行われたことが確認された（データ示さず）。
【図１】
2018104323.tif 000003