【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年12月1日(2014.12.1)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】複数の性質をエンジニアリングするための部位評価ライブラリーを用いた、配列と活性との関係の系統的な評価
【発明の分野】
【０００１】  本発明はタンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。具体的には、本発明は部位評価ライブラリーを用いる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】  本分野において、各種タンパク質エンジニアリング方法が知られている。通常、タンパク質は所望のタンパク質の性質を得るために修飾される。大部分の方法において、タンパク質をコードしているクローン遺伝子の核酸配列を変異させて、修飾された遺伝子が変異体を発現させ、所望の活性についてスクリーニングされる。時折、変異体の性質は野生型タンパク質の性質と比較される。【０００３】  歴史的には、タンパク質設計プロセスは所望の製品のための最良の配列を、全てのタンパク質の中で見つけるという課題と等しく発達してきた。この課題は非常に困難であり、「ＮＰハード」と言われている。複雑な理論において、クラスＰにおいて定義されているこの課題は、それらの問題のための容易且つ効果的な多項式時間アルゴリズムであると考えられている。ＮＰハード問題は効果的な多項式時間アルゴリズムが近年知られていないという問題であり、もし、任意のＮＰハード問題が解消したならば、全てのＮＰハード問題も解消するだろう（Pierce  and  Winfree，Protein  Engineer.，15:779-782  [2002]）。ライブラリーの構築及びスクリーニングのための最近の戦略は全配列にわたりまたはタンパク質内の決められた位置において無作為に多様化するタンパク質配列を生成することを含む。これらのライブラリーは、通常、所望本来の性質に対しては「負」である多数のメンバーを有し、相対的に僅かな正の変異を見つけるために多くのスクリーニングを必要とする。通常、ネガティブミューテーションは無視され、ポジティブメンバーに対して配列情報が得られる。【０００４】  飽和突然変異誘発（Estell  et  al.，in  World  Biotech  Report  1984，vol.  2:  USA， Online  Publications，London  [1984]，pages  181-187；  and  Wells  et  al，Gene  34:315-323  [1985]）はタンパク質中の幾つかの性質を最適化する変異誘発のために、タンパク質空間を探すにの用いることができる技術のうちのひとつである。幾つかのグループが飽和突然誘発変異により変化させるべき部位を同定するための発展した方法を有している。（Reetz  et  al，Angew.  Chem.  Int.  Edn.，44:4192-4196  [2005]；  Kato  et  al.，J.  MoI.  Biol.，351  :683-692  [2005]；  and  Sandberg  et  al.s  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.，90:8367-8371  [1993]）。しかし、部位を特定するための一般化された方法は提言されていない。【０００５】  更に、大部分のタンパク質エンジニアリング方法は多くのアミノ酸変異誘発オプションを生成するので、所望のタンパク質性質を生成するために数多くの変異体のスクリーニングが必要とされてきた。通常、スクリーニングは有益な変異体を生成するために何度も繰り返されている。したがって、大部分の方法は骨の折れる時間のかかるものであった。効率的で所望の結果を得ることのできるタンパク質エンジニアリング方法が引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】  本発明はタンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。具体的には、本発明は部位評価ライブラリーを用いた方法を提供する。特に、本発明は所望の性質を最適化するライブラリーを合理的かつ効率的に設計するために、多数の所望の性質について得られた情報を用いるための方法を提供する。幾つかの態様において、本発明は少なくとも２つの所望の性質について改善されたライブラリーを設計するための手段を提供する。
【０００７】  本発明は、タンパク質の所望の性質を改善するのに関連したタンパク質のアミノ酸配列内の位置を同定するための手段を提供する。幾つかの好適な態様において、本発明は改善された性質とともに所望の性質を有するタンパク質を製造するために好ましい変異体を同定するための手段を提供する。幾つかの追加的な好ましい態様において、本発明は野生型タンパク質よりも特定のパーセンテージの改良を有するアミノ酸ポジションおよび変異誘発を同定するための手段を提供する（例えば、１つの性質について野生型タンパク質よりも１１０％優れている）。更なる好適な態様において、本発明は少なくとも１つの改良された性質及び少なくとも１つの追加的な野生型タンパク質より有意には劣らない性質を（例えば、１つの性質について野生型タンパク質よりも１１０％優れており、他の性質において野生型タンパク質の９０％より悪くない）を提供する変異体を同定する手段を提供する。更なる好適な態様において、ライブラリーはこの情報にもとづいて構築される。幾つかの態様において、このライブラリーは同定された変異体の全てを用いて構築される。一方他の態様において、このライブラリーは同定された変異体のサブセットを用いて構築される。すなわち、このライブラリーが特定の数及びタイプの変異体で構築されることは意図していない。
【０００８】  本発明はタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、所望の試験方法において、少なくとも１つの所望の性質についてタンパク質へのライブラリーを試験する工程、少なくとも１つの所望の性質について値の範囲を同定する工程、所望の試験における好ましい結果に関係する値の範囲内の最小値を同定する工程、及び少なくとも１つの所望の性質の範囲内における最小値を上回る少なくとも１つの変異を有する複数のタンパク質変異体を提供する工程、それゆえ、少なくとも１つの変異を含むタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程を含むタンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。このライブラリーは所望の試験における好ましい結果を有するメンバーを多く含む。幾つかの態様において、この好ましい結果は、前述の第一の工程で定義される試験で観察される最大値よりも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％大きい値に相当する。幾つかの代替的な態様において、１つ以上の所望の試験が本発明の方法に用いられる。幾つかの好適な態様において、タンパク質は酵素である。幾つかの特定の好適な態様において、この酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選択される。
【０００９】  本発明は、タンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、所望の試験において少なくとも２つの所望の性質について変異体のライブラリーを試験する工程、少なくとも２つのタンパク質の性質についての値の範囲を同定する工程、所望の試験における好適な結果に関係する値の範囲内における最小値を同定する工程、及び少なくとも２つの所望の性質の範囲内の最小値を上回る複数のタンパク質変異体を提供する工程、それゆえ、所望の試験において好適な結果を有するメンバーに富むタンパク質変異体のライブラリーが提供される。請求項５の方法は、好適な結果が前述の第一工程において定義された試験で観察された最大値の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％大きい値に相当する。幾つかの好適な態様において、前記タンパク質は酵素である。幾つかの特定の好適な態様において、この酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選択される。
【００１０】  本発明は野生型タンパク質及びこの野生型タンパク質のタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、前記タンパク質変異体のライブラリー及び野生型タンパク質を所望の試験において少なくとも１つの所望の性質について試験をする工程、この少なくとも１つの所望の性質に関する値の範囲を同定する工程、所望の試験での好適な結果に関係する値の範囲を同定する工程、所望の試験の好適な結果に関係する値の範囲の中の最小値を決める工程、野生型について得られた結果と比較して好ましい結果を有するタンパク質変異体を同定する工程（好ましい結果とは所望の改善された性質である。）、及び所望の少なくとも１つの性質の範囲の最小値を超える複数のタンパク質変異体を提供し、それゆえ、所望の試験において、好ましい結果を有するメンバーの多い改善されたタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程を含む、タンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。幾つかのの好適な態様において、前記メンバーは更にパフォーマンスインデックスを決定する工程を更に含む。このパフォーマンスインデックスは改善されたタンパク質変異体のそれぞれについて得られた値を野生型タンパク質について得られた値で割ることにより決定される。幾つかの特に好適な態様において、前記方法は更に改善されたタンパク質変異体を同定する工程を更に含む。前記改善されたタンパク質変異体は所望の試験において１．１より大きいパフォーマンスインデックス値を有する。幾つかの追加的な態様において、このタンパク質は酵素である。幾つかの特に好適な態様において、前記酵素はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される。幾つかの代替的な態様において、前記タンパク質は抗体及び成長因子から選択される。更なる追加的な態様において、野生型タンパク質はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素の成熟体である。幾つかの好適な態様において、前記所望の性質は、電荷、洗浄性能、硬表面洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性、洗剤安定性、基質結合性、酵素抑制、発現レベル、反応速度、及び基質分解性から選択される。幾つかの態様において、野生型タンパク質及びタンパク質変異体は少なくとも１つの洗浄組成物の成分である。幾つかの好適な態様において、洗浄性能は５乃至１２．０のｐＨを有する粉末又は液体洗剤に製剤化された洗浄組成物中で試験される。
【００１１】  本発明はタンパク質折りたたみの中において親タンパク質の改善された変異体を生成するための方法も提供する。前記方法は、所望のアッセイにおいて所望の性質の範囲にわたりタンパク質折りたたみ内で試験タンパク質の複数の変異体をアッセイする工程、所望のアッセイにおいて好ましい結果に関係する所望の性質の範囲内の最小値を同定する工程、所望のアッセイにおいてタンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイする工程、及び、改善された変異体が所望の性質の範囲の最小値を超えるように、親タンパク質のアミノ酸置換を導入して、親タンパク質の改善された変異体を生成する工程、を含む。幾つかの好適な態様において、前記親タンパク質及び試験されるタンパク質は異なる。幾つかの態様において、前記方法は、パフォーマンスインデックスを決定する工程を含む。このパフォーマンスインデックスは、改善されたタンパク質について得られた値を親タンパク質について得られた価で割ることにより決定される。幾つかの態様において、試験タンパク質及び親タンパク質は酵素である。幾つかの好適な態様において、この酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される。いくつかの代替的な態様において、試験されたタンパク質及び親タンパク質は抗体及び成長因子から選択される。更なる追加的な好適な態様において、親タンパク質はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素の成熟体である。幾つかの好適な態様において、所望の性質は、電荷、洗浄性能、硬表面洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性、洗剤安定性、基質結合性、酵素抑制、発現レベル、反応速度、及び基質分解性から選択される。幾つかの態様において試験された及び親タンパク質は少なくとも１つの洗剤組成物の成分である。幾つかの代替的な態様において、改善された変異体は洗浄組成物の成分となる。幾つかの好適な態様において、洗浄性能は、５乃至１２．０のｐＨを有する粉末及び液体に製剤化される洗剤組成物中で試験される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】  図１は各性質について得られた２８５１の△△Ｇａｐｐの分布を示す。【００１３】  図２Ａは４つの部位において、１０００のランダムに選択された変異体の組合せについての、ＬＡＳ安定性及びケラチン活性についての△△Ｇａｐｐの値の予測される分布を、このライブラリーのランダムに選択された６４のメンバーについての△△Ｇａｐｐの実際の分布との比較を計算した結果を示す。【００１４】  図２Ｂはこのライブラリーからランダムに選択された６４のメンバーについて観察された実際の分布を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１５】  本発明はタンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。具体的には、本発明は部位評価ライブラリーを用いた方法を提供する。
【００１６】  具体的な目的のために、特定の製品について最適であるタンパク質を生成するために、タンパク質配列中の最良配列を見つけることは常に必要ではない。大部分の製品について、解決すべき課題は、いくつかの性質に必要とされる最小値に見合う又はこれを超える少なくとも１つのタンパク質配列を同定することである。このためには、任意の所望の性質について都合の悪い変異の知識だけでなく、特定の性質に好適な変異の知識が必要である。本発明は初期の性質を改善し、所望の限度内に他の性質の値を維持するために修飾することができるタンパク質において、これらの位置を同定することにより目標を達成するための手段を提供する。
【００１７】  本発明は、各部位において、「部位評価ライブラリー」を構築して、タンパク質の所望の性質の全てについて、全ての位置を評価するための手段を提供する。好適な態様において、これらのライブラリーは、各部位において、９乃至１９の変異を含み、タンパク質を改変し、ライブラリーの構築に用いるために、各位置を評価する。各性質は、親酵素について測定され、野生型に対する各変異体についての見せかけの自由エネルギーの差が評価される。これらのデルタデルタＧ（即ち、△△Ｇ）の見かけの値は、加算性を評価するために用いる。
【００１８】  変異体を解析するための理想的な方法は、所望の方法において、親タンパク質に対する変異体につての自由エネルギーの差を考慮することである。プロセスのためのギブス自由エネルギーは、システムにより実行可能な仕事の最大量を表している。親酵素に対する自由エネルギーの変化（△△Ｇ）は以下の様である。
【式１】
2009540862.tif 000001
【００１９】  式中、ｋｖａｒｉａｎｔは、変異体酵素の速度定数であり、ｋｐａｒｅｎｔは親酵素の速度定数であり、Ｒは気体法則定数であり、Ｔは絶対温度である。大部分のアッセイは真の自由エネルギーを決定するようには構築されていないので、我々は以下の数量を用いた。
【式２】
2009540862.tif 000002
【００２０】  式中、Ｐｖａｒｉａｎｔは変異体のパフォーマンスバリューであり、Ｐｐａｒｅｎｔは同じ条件下での親酵素のパフォーマンスバリューである。△△Ｇａｐｐバリューはデータの分布及び加算性について、△△Ｇと同様な挙動を示すと考えられる。しかしながら、△△Ｇは親酵素と比較したときの変異体により実行される仕事の最大量であるので、△△Ｇａｐｐの量は通常△△Ｇを小さく見積もり、２つの追加的な位置の性質は、それらの△△Ｇバリューを一緒に加算することにより予測される値よりも大きくなるであろうという、相乗効果にみえる結果を導く。
【００２１】  本発明の方法は、並行して複数の性質を改善するのに用いる、効果的なライブラリーを設計するのに用いる。１８９アミノ酸よりなるセリンプロテアーゼである「ＡＳＰ」が、本明細書で説明されるけれども、本方法は任意所望のタンパク質エンジニアリングに適用することができる。ＳＡＰプロテアーゼはセリンプロテアーゼのＳ１Ｅファミリー（Rawlings  et  al.，Nucleic  Acids  Res.，34:D270-D272  [2006]）内に属し、ストレプトグリシン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒｉｓｉｎｓ）の相同体である。セルロモナス株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｉｎ）６９Ｂ４（ＤＳＭ９８３３１６０３５）由来の成熟セリンプロテアーゼ酵素は、以下に示すように、１８９アミノ酸長（配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であり、Ｈｉｓ３２、Ａｓｐ５６、及びＳｅｒ１３７からなる触媒トリアドを有する（触媒トリアドを太字下線で示す。）
【式３】
【００２２】
2009540862.tif 000003
【００２３】  部位評価ライブラリー（ＥＳＬｓ）は１２乃至１９の置換を１８９個の部位のそれぞれに導入して、本明細書で説明するように構築される。１８９個の部位について２８５１の変異体を３つの異なる活性アッセイ及び２つの異なる安定性アッセイを用いて解析された。これらは１つの部位当たり、平均１５の変異体である。ＳＥＬ変異体の評価データ
【００２４】表１はタンパク質中の１つの位置、すなわち、１４位についてのデータを示す。【表１】
2009540862.tif 000004
【００２５】  全ての位置について野生型アミノ酸は参照位置として列挙した。部位１４において、Ｒ０１４Ｒが野生型である。Ｒ０１４Ｘは測定されたそれぞれの変異を示す。各性質について、親酵素に対して、１６回測定を行い、△△Ｇａｐｐの平均値及び標準偏差を決定した。親酵素の平均値（μｐａｒｅｎｔ）を０とし、△△Ｇａｐｐに対する標準偏差（σｐａｒｅｎｔ）が決定された。これらの値はこの分子の各位置におけるそれぞれの性質についての参照として用いられた。表１はＲ０１４Ｒラインを列挙している。
【００２６】 全２８５１の変異体に対する結果の概要を表２に示す。変異体は２つのクラス、「アップ」及び「ダウン」に分けられた。△△Ｇａｐｐが負又は０であれば、変異体は「アップ」であり、△△Ｇａｐｐが正であれば、変異体は「ダウン」である。変異体が「アップ」又は「ダウン」である可能性は、ｕｐ又はｄｏｗｎのいずれかであった変異体の数をカウントし、この数を変異体の総数で割ることにより（すなわち、ＡＳＰの場合は２８５１）決定した。特定の性質について、変異体がダウンである確立（即ち、ｐダウン）は８４乃至９４％の範囲であったと分かった。特定の性質について、変異体がｕｐ（すなわちｕｐ）である可能性は、６乃至１６％の範囲であったと分かった。これらのデータは、１つの特性に良い突然変異を蓄積は、他のすべての特性がより悪くなるであろうということを必要としていることを示す。【表２】
2009540862.tif 000005
【００２７】  各性質について得られた２８５１の△△Ｇａｐｐの値の分布を図１に示す。幾つかの態様において、全ての性質についての分布は２つ以上のガウス分布の合計としてモデル化された。このことは文献中に報告されているライブラリーの自由エネルギーの分布に一致している（Lancet  et  al.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90:8367-8371  [1993]； and  Lu  et  al.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  98:1410-1415  [2001]）。従って、各性質についての平均△△Ｇａｐｐ値はすべて親酵素よりも相当悪くなる。親の活性の１％以下の活性（△△Ｇａｐｐ＞２．７）を有するそれぞれの変異体について、この値は、アッセイシステム固有の誤差により、任意で１％とされた。各性質について、親酵素の１％以下を有する変異体の数が非常に多かった。これらのデータについて、および親酵素の５％より高い活性を示す変異体のサブセットについて、平均値及び標準偏差を計算した。（表３を参照のこと。）
【００２８】  ２８５１個の変異体の各性質についての平均△△Ｇａｐｐ値は０．９から１．５Ｋｃａｌ／ｍｏｌまで変動した。この範囲は親酵素の活性の２０％乃至７％に相当する。
【００２９】  これらの分布はメンバー当たり平均１つの変異を有する、ランダムライブラリー中に期待される△△Ｇａｐｐ値の分布も表していることに気づくことが重要である。【表３】
2009540862.tif 000006
【００３０】  部位評価データは性質の間の関係の証明として試験された。各性質の△△Ｇａｐｐの値を他のそれぞれの他の性質についてプロットし、相関係数を計算し、表４に示した。タンパク質基質上の２つの活性測定は相関性があり（ｒ２＝０．７７）、合成ペプチド基質ＡＡＰＦ上の活性を有するいずれかのタンパク質の相関が低かった（ｒ２＝０．５３）。２つの安定性の測定値は活性の測定値にも相関しておらず、お互いに相関してもいなかった。【表４】
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ＳＥＬポジションデータの評価
【００３１】  アミノ酸配列内の位置を解析するために、２つのタイプの部位を定義した。「アンプロダクティブ」部位は親酵素よりも優れている変異を有していない。一方、「プロダクティブ」部位は、親酵素よりも優れている少なくとも１つの置換を有している。表５はＡＳＰの１８９個の位置の中の各性質についてのプロダクティブ及びアンプロダクティブ部位の数を示す。部位がプロダクティブであろうという可能性はプロダクティブ部位の数を部位の総数（１８９個）で割って計算される。任意の変異が親酵素よりも優れているという可能性は低いけれども（即ち、６％乃至２８％）、所与の部位が少なくとも１つのアップ変異である可能性は非常に高い。【表５】
2009540862.tif 000008
【００３２】  ＡＳＰにおいて、進化において保存又は変更された配列部位だけでなく、どのようにしてプロダクティブ及びアンプロダクティブ部位が構造特性（例えば、埋没アミノ酸、相互作用しているアミノ酸、活性部位の近くなど、）を参照しながら分布したのかを決定することは興味深い。このことを決定するために、ＡＳＰの構造を試験し、２０の非重複相同体に対して、配列をアラインした（Edgar，  Nucl.  Acids  Res.，32:1792-1797  [2004]）。結果を表６に示す。【表６】
2009540862.tif 000009
【００３３】  調査した性質に対して、プロダクティブ部位がＡＳＰの疎水性コアには見られなかったことは特筆すべきことである。カゼイン活性について大部分のプロダクティブ部位は、触媒トリアドに近い部位にはないことも興味深い。１つのカゼインプロダクティブ（Ｐ１１８）部位のみが基質に接触していた。カゼインプロダクティブ部位の残りの部分はタンパク質全体の全体のフレキシブル表面ループ上に分布している。ケラチン活性についてのプロダクティブ部位は活性部位の近くには見られなかった。これらの部位は分子全体の表面に広がっていることが発見された。ケラチンプロダクティブの最も近いのはＲ０１４であり、触媒セリンからほぼ１３Ａ離れている（Ｓ１３７、Ｃａ−Ｃａディスタンス）。
【００３４】  ＬＡＳ安定性プロダクティブ部位の位置は例えば、全体のフレキシブル表面ループ中に広がった全体枠に続いている。このことは、１つの例外を除いて、熱安定性プロダクティブ部位についても当てはまる。その例外は、Ｃ０３３はアミノ酸配列中のＨ０３２にワンデルワールス接触しており、Ｈ０３２に連続的に隣接している。
【００３５】  配列アラインメントに基づいて、部位をＡＳＰに対して、「保存」（２０配列中違いなし）、「可変」（２０アミノ酸配列中６又はそれ以上のアミノ酸配列が異なる）、「挿入又は欠失部位」に定義した。期待される数を、部位が所与の条件に適合し、所与の性質についてプロダクティブ又はアンプロダクティブのいずれかである可能性から計算した。期待された数に対する観察された割合を計算した。１．４を超える数及び０．６を下回る数は部位の特定のクラスのオーバーリプレゼンテイション又はアンダーリプレゼンテーションのいずれかの指標と考えられる。各部位の数にマッチして１０のランダムに生成されたデータの結果に基づいて、カットオフバリューが選択される。埋没残査、及び幾つかの接触を有する残査は、ＬＡＳ安定性だけでなく２つのタンパク質基質におけるプロテアーゼ活性について、アンプロダクティブ部位と強く関係付けられる。驚くことに、活性部位の近くの位置はプロダクティブよりもアンプロダクティブであるということが発見された。配列アラインメントにおいて、タンパク質基質上の活性及びＬＡＳ安定性について、特にアンプロダクティブであるようなことが発見され、一方、高い可変部位及び挿入又は欠失部位は活性についてプロダクティブであり、安定性については僅かに効果があった。
【００３６】  実施例５で説明するように、性質間の相関に関わらず、任意の性質について有害な変異体は他の性質について有害な変異体であった。僅かな数の部位（５−１０％）のみが、全ての性質について悪い変異を有していた。これらの部位を「ホールド」と定義され、進化において保存されている。このことは、任意の性質について有益な突然変異の同定はその性質について本当の予測可能なスクリーンを必要とするが、任意の性質に対して有害であろう突然変異の同定は任意（ＡＮＹ）のスクリーンを用いて行うことを、示唆している。単純化されたタンパク質エンジニアリングストラテジーはＳＥＬを構築し、単純な活性及び／又は安定性スクリーンを用いたスクリーンである。有害な突然変異体を同定し、幾つかの有害な突然変異を有するそれらの部位をライブラリー及び突然変異の組合せを構築して、複数の性質を改善する。タンパク質表面のピッキング部位を僅かな相互作用を有し、プロダクティブ部位の大部分を提供する配列アラインメントにおいて変動的である。多くの接触を有し、進化において強く保存された分子の内部の部位は有害な変異を有している可能性が高く、避けるべきである。コンピューター及び／又は電気的方法、及び／又はプログラム等を含むがこれらに限定されない、配列解析及び／又は構造情報を得るための任意の好適な方法を本発明に用いることができる。
【００３７】  表５に示す表は、２つの性質についての相関係数に従って、２つの性質のそれぞれについて、５％より活性の高い及び５％より活性の低い変異体の数の対での比較である。３つの酵素、即ち、ＡＳＰ、ＡＣＴ、及びＮＰＲｅからの結果を示した。しかしながら、本発明を特定の酵素に限定することを意図しない。ここで説明する方法は任意のタンパク質に用いることができる。
【００３８】  酵素（ＡＳＰ、ＡＣＴ、及びＮＰＲｅ）及びアッセイシステムについての詳細は米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏｓ．１０／５７６，３３１、１０／５８１，０１４、１１／５８１，１０２、及び１１／５８３，３３４に記載されている。これらの文献全体を参照により本明細書に援用する。更に、２００７年６月６日に出願された米国仮特許出願Ｓｅｒ  Ｎｏ．６０／９３３，３１２に、本発明に関係して用いることができる。本明細書で用いる性質はカゼイン活性（ＣＡＳ）、ケラチン活性（ＫＥＲ）、ＡＡＰＦ活性（ＡＡＰＦ）、ＬＡＳ安定性、ＡＳＰに対する熱安定性、並びにＡＣＴについての過酸形成（ＰＡＦ）、及び過酸分解（ＰＡＤ）である。これらの実験において、相関が見られたのは（相関係数＞０．５）ＡＳＰに対するＣＡＳ，ＫＥＲ、及びＡＡＰＦのみである。他の全ては相関が無かった（相関係数＜０．３）。性質については相関がかなったものの、２つの性質に対して有害であろう変異の可能性は、たまたま期待されたよりも高い。表において、チャンスに基づいて基体される変異体の観察された数の計算された割合を示す。１を超えるマスは正の相関を示し、１より少ない数は負の相関を示す。ライブラリーデザイン
【００３９】  幾つかの特に好適な態様において、部位評価ライブラリーは組合せライブラリーデザインに用いる。従来のライブラリー構築においては、ランダムライブラリーが構築され、１つの性質に対して多くのライブラリーのメンバーをスクリーニングして、それらを組合せ、この工程を繰り返していた。幾つかの研究において発見されているように（Bloom  et  ah，  Curr.  Opin.  Struct.  Biol.，15:447-452  [2005]；  Bloom  et  ah，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  103:5869-5874  [2006]；and  Guo  et  ah，  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  101  :9205-9210  [2004]参照のこと）、1つの性質においてポジティブな変異体の蓄積は、他の性質について好ましくない結果となる。任意の変異体が任意の性質についてアップである可能性は少なく、任意の変異体がダウンである確立が高く、（＞８５％）及び活性を高める３以上の蓄積が幾つかの他の性質を減らすことが非常に高いことから、変異体このことは、表２からも容易に理解できる。
【００４０】  しかしながら、この問題は複数の性質について好ましいライブラリーを構築するための部位評価データを用いることによって避けることができる。アンプロダクティブ部位は組合せライブラリーに含まれていない。プロダクティブ部位は更にアップである変異体のパーセンテージで分類される。ＬＡＳ安定性及びケラチン活性についてアップである変異体の高いパーセンテージを有する４つの非相互作用部位のグループが一度に両者の性質を改善するためのライブラリーを設計するために用いられた（表７参照）。【表７】
2009540862.tif 000010
【００４１】  これらの部位の加算性を仮定すると、予想される△△Ｇａｐｐの値はライブラリーから計算され、実際のライブラリーについて決定された値と比較される。幾つかの態様において、この性質について付加的であるこれらの部位について、この結果は典型的に合致している。しかし、他の態様において、予想と合致しない結果において、矛盾する方法がこれらの部位の相互作用、性質の非加算性、及び／又は用いたアッセイの適合性についての情報を提供する。
【００４２】  ４つの部位において１０００のランダムに選択された変異体の組合せについての、ＬＡＳ安定性及びケラチン活性についての、△△Ｇａｐｐの値の予想される分布を計算し、ライブラリーのランダムに選択された６６４のメンバーの△△Ｇａｐｐの実際の分布と比較した。この結果を図２Ａに示す。図２Ｂはこのライブラリーのランダムに選択された６４について観察された実際の分布を示す。このライブラリーは明らかに、ＬＡＳ安定性及びケラチン安定性の両者について親酵素よりも優れているメンバーを数多く有する。これらの部位の加算性と一致して、ケラチン活性について観察された平均値は０．０２Ｋｃａｌで、この値は予測された値の−０．０１Ｋｃａｌに非常に合致していた。ＬＡＳ安定性の結果から、標準偏差は同様であったが、−１．１３の観察された平均値は有意に予測値の−０．２８を上回った。【表８】
2009540862.tif 000011
【００４３】  ＬＡＳ安定性の場合、ＳＥＬ変異体についてのオリジナルアッセイは真の△△Ｇの値を低く評価した。インキュベーション温度を２５℃から３５℃に変更してアッセイを行った。このようにしたのは、大部分のライブラリーのメンバーがアッセイ条件下において安定であり、条件をより過酷にするためである。△△Ｇａｐｐの値はこれにより補正された、しかし、補正された可能性は、依然として△△Ｇの値を低く見積もり、部位はおそらく依然としてＬＡＳ安定性に対して加算的であり、標準偏差の一致を与えていた。定義
【００４４】  特に言及しない限り、本発明の実施は、分子生物学、タンパク質エンジニアリング、微生物学、及び組み換えＤＮＡにおける当業者が通常用いる従来技術を含む。そのような技術は当業者に良く知られているものであり、多くの文献及び参考となる研究に記載されている（Sambrook  et  al.，  "Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual"，  Second  Edition  （Cold  Spring  Harbor），[1989]）；  and  Ausubel  et  al.，"Current  Protocols  in  Molecular  Biology"  [1987]参照のこと）。本明細書で言及されている、全ての特許、特許出願、文献及び／又は刊行物は参照により本明細書に援用される。
【００４５】  別に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的文言は、本発明の属する分野における当業者により理解されているのと同様の意味で用いられる。例えば、Singleton  and  Sainsbury，Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology，  2d  Ed.，  John  Wiley  and  Sons，  NY  （1994）；  and  Hale  and  Marham，The  Harper  Collins  Dictionary  of  Biology，Harper  Perennial，NY  （1991）は本発明に用いる文言の多くについての一般的な辞書である。本明細書で言及しているものと同じか同等である任意の方法及び物質を本発明の実施に用いることができるが、本明細書では、好適な方法及び物質について記載している。従って、以下で定義される文言は明細書全体を参照することでより深く定義されるものである。本明細書において、単数は、明らかに言及していない限り、複数も含む。別に定義しない限り、核酸配列は左から右に向かって、５’末端から３’末端になるように記載する。アミノ酸配列は左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端となるように記載する。本発明をここに言及する特定の方法、手順、及び試薬に限定することは意図していない。それらは当業者により用いられる文脈上の意味に依存して変化することを理解されたい。
【００４６】  本発明の実施には、特に定義しない限り、当業者の知識の範囲内である、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術、及びタンパク質配列決定の従来技術が用いられる。
【００４７】  更に、本明細書における標題は本発明の各種側面又は態様を限定するものではない。本発明は明細書全体を参照することで理解されるべきである。すなわち、以下で定義する門限は明細書全体を参照することでよりよく定義される。しかしながら、本発明の迅速な理解のために、以下に多くの文言の定義を記載する。
【００４８】  本明細書において、「プロテアーゼ」及び「タンパク質分解活性」の語は、ペプチド又はペプチド結合を有する基質を加水分解する能力を有するタンパク質又はペプチド又はを意味する。タンパク質分解活性を測定するための良く知られた方法は数多くある（Kalisz，  "Microbial  Proteinases，"In:  Fiechter（ed.），Advances  in  Biochemical  Engineering/Biotechnology，[1988]）。例えば、タンパク質分解活性は市販の基質を加水分解する個々のプロテアーゼの能力を解析して比較することにより、確認される。プロテアーゼ又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質は、ジメチルカゼイン（シグマ  Ｃ−９８０１）、ウシコラーゲン（シグマ  Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（シグマ  Ｅ−１６２５）、及びウシケラチン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ９０２１１１）を含むがこれらに限定されない。これらの基質を用いた比色分析は当業者に良く知られている（WO  99/34011  及び  U.S.  Pat.  No.  6，376，450，参照のこと。これらの文献を参照により本明細書に援用する。）ｐＮＡアッセイ（例えば、Del  Mar  et  ah，Anal  Biochem.，99:316-320  [1979]参照）もグラジエント溶離をする間に収集される分画の活性酵素濃度を決定するのに有用である。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質である、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアラニン（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解したときに放出されるｐ−ニトロアラニンの割合を測定する。加水分解反応からの黄色の生成速度が４１０ｎｍの比色計で測定され、活性酵素の濃度が計算される。更に、２８０ｎｍの吸光度はタンパク質の総濃度を測定するのに用いることができる。活性酵素／総タンパク質の比が酵素の精製度を示す。
【００４９】  本明細書において、「ＡＳＰタンパク質」、「Ａｓｐプロテアーゼ」、及び「Ａｓｐ」はセリンプロテアーゼを意味する。幾つかの好適な態様においてＡｓｐプロテアーゼはセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株９６Ｂ４から得られた９６Ｂ４プロテアーゼとして設計されたプロテアーゼである。従って、好適な態様において、「９６Ｂ４プロテアーゼ」の語は配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で提供されるアミノ酸配列と実質的に同一な配列を有するセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｒｏｍｏｎａｓ）株９６Ｂ４（ＤＳＭ１６０３５）由来の自然発生成熟プロテアーゼを意味する。代替的な態様において、本発明はＡＳＰプロテアーゼの一部分を提供する。
【００５０】  セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）タンパク質ホモログの語は、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株９６Ｂ４由来の成熟タンパク質に対するアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有する自然発生プロテアーゼ、又はそのような自然発生プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列、及びそのような核酸は配列によりコードされるセリンプロテアーゼの機能特性を保持していプロテアーゼを意味する。幾つかの態様において、これらのプロテアーゼホモログはセルロモナジン（cellulomonadin）と言う。
【００５１】  「プロテアーゼ変異体」、「ＡＳＰ変異体」、「ＡＳＰプロテアーゼ変異体」、及び「９６Ｂプロテアーゼ変異体」の語は、野生型ＡＳＰと、特にその機能において同様であるが、野生型プロテアーゼの配列とは異なる配列となるようにそれらのアミノ酸はいえるにおいて変異を有するプロテアーゼを表す言葉として本明細書において用いる。
【００５２】  本明細書において「セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）種」の語はCellulomonadaceae，  Suborder  Micrococcineae，  Order  Actinomycetales，Class  Actinobacteriaのファミリーのメンバーとして分類されるグラム陰性バクテリアである「セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）」属に属する全ての種を意味する。従って、再分類された種をこの属に含まれる。
【００５３】  本明細書において、「バシルス属」は「バシルス」属に属すると当業者により認識されている全ての種を含む。この例としては、バチルススブチリス（B.  subtilis）、バチルスリケニホルミス（B.  licheniformis）、バチルスレンタス（B.  lentus）、バチスルブレビス（B.  brevis）、バチルスステアロセレモフィリス（B.  stearothermophilus）、バチルスアルカノフィリス（B.  alkalophilus）、バチルスアミロロケファシエンス（B.  amyloliquefaciens）、バチルスクラウシ（B.  clausii）、バチルスハロデュランス（B.  halodurans）、バチルスメガテリウム（B.  megaterium）、バチルスコアギュランス（B.  coagulans）、バチルスサーキュランス（B.  circulans）、バチルレンタス（B，  lautus）及びバチルススリンギエンシス（B.  thuringiensis）を含むがこれらに限定されない。バシルス属は分類上再編成され続けている。従って、バチルスステアロセレモフィリス（B.  stearothermophilus）のように、依然はバチルス属に分類されていたけれども、現在はゲオバシルスステアロセレモフィリス（Geobacillus  stearothermophilus）と呼ばれているものも含むがこれらに限定されない。酸素の存在下で耐性のある内性胞子を生成することはバシルス属の特徴であると定義されている。しかしながらこの特徴は、近年分類されたアリシクロバチルス（Alicyclobacitlus）、アンピバチリルス（Amphibacillus）、アネウニバチスル（Aneurinibacillus）、アノキシバチスル（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバシルル（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、セルモバチルス（Thermobacillits）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びバージバチルス（Virgibacillus）についても当てはまる。
【００５４】  「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は、本明細書において、リブヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかである、任意の長さの核酸のポリマーを意味し、互換的に用いられる。この語は、一重鎖、二重鎖、又は三重鎖DNA、ゲノムDNA、ｃDNA、RNA、DNA−RNAハイブリッド、又はプリン又はピリジン塩基を含むポリマー、又は他の天然の、化学的に、生物学的に修飾された、非天然の又は誘導されたヌクレオチド塩基を含むがこれらに限定されない。以下にポリヌクレオチドの非限定的な例を示す。遺伝子、遺伝子フラグメント、染色体フラグメント、EST、エキソン、イントロン、ｍRNA、ｔRNA、リボゾーム、ｃDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列より単離されたDNA、任意の配列より単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマー。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド、及びヌクレオチドアナログ、ウラシル、他の糖、及びフルオロリボゾーム及びチオール、及びヌクレオチド分岐等の修飾されたヌクレオチドを含む。代替的な態様において、ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により阻害されたヌクレオチド配列を含む。
【００５５】  本明細書において、「DNA構築物」及び「DNAの軽質転換」の語は宿主細胞又は有機体に配列を導入するために用いるDNAを意味するために互換的に使用される。このDNAはPCRによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されるか又は当業者に知られている他の好適な方法で生成される。特に好適な態様において、ＤＮＡ構築物は所望の配列を含む（例えば、挿入配列として）。幾つかの態様において、この配列は制御エレメント等（例えば、プロモーター）の付加的なエレメントに作動可能に結合している。更なる好適な態様において、この軽質転換しているＤＮＡは末端に付加している非相同配列を含む（例えば、スタッファー配列又はフランク）。幾つかの態様において、挿入配列の末端を閉じて、軽質転換ＤＮＡが閉鎖環を形成する。この軽質転換は配位野生型であってもよく、変異体又は修飾されていてもよい。幾つかの態様においてＤＮＡ構築物は宿主細胞染色体に相同な配列を含み。他の態様において、このＤＮＡ構築物は非相同配列を含む。一旦ＤＮＡ構築物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されると、それは、１）異種の配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入するため、及び／又は２）宿主細胞の染色体の領域を変異させるため（即ち、内性の配列を異種の配列で置換る）、及び／又は３）標的遺伝子を欠失させるため、及び／又は４）宿主細胞に組換えプラスミドを導入するために用いられる。
【００５６】  本明細書において、「発現カセット」及び「発現ベクター」の語は、標的細胞内で特定の核酸の転写をさせることができる一連の特定の核酸エレメントで、組み得て的又は合成的に生成された核酸構築物を意味する。この組み換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸フラグメントに取り込まれる。通常、発現ベクターの組換え発現か設置部分は、他の配列の中で、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。好適な態様において、発現ベクターは宿主細胞内でヘテロＤＮＡを取り込み発現する能力を有している。多くの真核及び原核発現ベクターが市販されている。好適な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。「発現カセット」の語は、「ＤＮＡ構築物」と同じ意味に用いられ、これらの語は同義である。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
【００５７】  本明細書において、「ベクター」の語は核酸を１つ以上のタイプの細胞に導入するために設計されたポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、及びカセット等を含む。幾つかの態様において、このポリヌクレオチド構築物は、適した宿主の中でＤＮＡの発現に影響を与えることができる好適なプロ配列（例えば、分泌等）に作動可能に結合しているプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼ前駆体及び成熟プロテアーゼ）をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００５８】  本明細書において、「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖（ds）DNA構築体であり、種々の原核及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子要素を形成し、又は他の宿主細胞に組み込むことができるものを意味する。
【００５９】  本明細書において、核酸配列を宿主細胞に導入する意味で用いられる、「導入する」の語は宿主細胞に核酸配列を輸送するのに適した任意の方法を意味する。そのような導入するための方法は、プロトプラスト融合、形質感染、形質変換、結合、及び形質導入を含むがこれらに限定されない（例えば、Ferrari  et  al.，  "Genetics，  "  in  Hardwood  et  al，  （eds.），  Bacillus，  Plenum  Publishing  Corp.，  pages  57-72，  [1989]参照）。
【００６０】  細胞に対して用いる「形質転換された」、「安定に形質転換された」又は「遺伝子導入された」の語は、そのゲノム内に、又は数世代にわたり維持されているエピソームプラスミドとして、組み込まれている本発明の異種核酸配列を有する細胞を意味する。
【００６１】  核酸は、他の核酸配列と機能的な位置にある場合に「作動可能に結合する」という。例えば、シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に結合し、プロモーターは、配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に結合するという。一般に、「作動可能に結合」とは、結合するＤＮＡ配列が隣接することを意味し、セクレタリーリーダーの場合には、隣接し、且つリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接を有しない。結合は都合のよい制限部位で結合されることにより行われる。そのような部位がない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来の方法により用いられる。
【００６２】  本明細書において、「遺伝子」の語は、ポリヌクレオチドをコードし、個々のコード配列（エキソン）の間の介在配列（イントロン）だけでなく、コード領域の前及び後ろに続く領域を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡフラグメント）を意味する。
【００６３】  本明細書において、「相同遺伝子」の語は異なるが通常関連性を有している一組の遺伝子を意味する。これらはお互いに対応し、お互いに同一であるか非常に似ている。この語は遺伝子複製により分離された遺伝子（パラロガス）の他に、スペーシエーションにより分離された遺伝子（即ち、新たな種の発達）（例えば、オーソログ遺伝子）種により分離された遺伝子も含む。
【００６４】  本明細書において「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」の語はスペーシエーションにより共通の遺伝子の祖先から進化した遺伝子を意味する（即ち、ホモロガス遺伝子）。通常、オーソロガスは進化の過程において同じ機能を保持している。オーソロガスの同定は新たに配列決定されたゲノムにおいて遺伝子の機能を予測するのに有用である。
【００６５】  本明細書において、「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」の語はゲノム内の複製により関係している遺伝子を意味する。オーソロガスは進化の過程で同じ機能を保持しているのに対し、パラロガスは、幾つかの機能はオリジナルのものに関連しているが、更に新たな機能を獲得している。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びトロンビンをコードしている遺伝子を含むがこれらに限定されない。これらは全て、セリンプロテアーゼであり同じ種を起源とする。
【００６６】  本明細書において、タンパク質は同じ配列において、同じトポロジー結合を有する同じ主要２次構造を有しているならば、共通の「折りたたみ」を有する。同じ折りたたみを有する異なるタンパク質は２次構造の末端エレメント及びサイズ及び立体構造において異なるターン領域を有する。幾つかのケースにおいて、これらの異なる末端領域は構造の半分を占めるであろう。同じホールドカテゴリに置かれたタンパク質は共通の進化の祖先を有しているわけではない（例えば、特定のパックは位置及びチェーントポロジーを好む例えば、の物理的及び化学的由来の構造的類似性）。
【００６７】  本明細書において、「ホモロジー」の語は類似又は同一な配列を意味し、同一であることが好ましい。このホモロジーは当業者において標準的な方法で測定することができる（例えば、Smith  and  Waterman，Adv.  Appl.  Math.，2:482  [1981]；  Needleman  and  Wunsch，  J.  MoI.  Biol.，  48:443  [1970]；  Pearson  and  Lipman，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:2444  [1988]；programs  such  as  GAP，BESTFIT，FASTA，and  TFASTA  in  the  Wisconsin  Genetics  Software  Package（Genetics  Computer  Group，  Madison，  WI）；  and  Devereux  et  ah，Nucl.  Acid  Res.，12:387-395  [1984]参照のこと）。
【００６８】  本明細書において、「アナロガス配列」の語は遺伝子の機能がセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４プロテアーゼに基づく遺伝子と本質的に同じであることを意味する。追加的に、アナロガス遺伝子は、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４プロテアーゼの配列に対して、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０５、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同等性を有している。あるいは、アナロガス配列はセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４プロテアーゼに見られる遺伝子の７０乃至１００％の間のアラインメントを有し、及び／又はセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４染色体における遺伝子に配列される領域において５乃至１０の間の遺伝子を有している。追加的な態様において、１つ以上の前述の性質がこの配列に適用される。アナロガス配列は配列アラインメントの既知の方法により決定される。通常行われているアラインメントはＢＬＡＳＴである。上と下に示したように、配列をアラインするのに他の方法も用いられる。
【００６９】  有用なアルゴリズムの１例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰはプログレッシブ、ペアワイズアラインメントを用いて関係する配列のグループから複数の配列アラインメントを作り出す。このアラインメントを作り出すためにクラスタリング関係を示す系統樹もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント方法の簡略化したものを用いる（Feng  and  Doolittle，J.  MoI.  Evol.，35:351-360  [1987]）。この方はＨｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより説明されるものと類似している（Higgins  and  Sharp，CABIOS  5:151-153  [1989]）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは３．００のデフォルトギャップ、０．１０のデフォルトギャップレングスウエイト、及び重量測定されたエンドギャップを用いる。
【００７０】  他の有用なアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｔｃｈｕｌ等により説明されている（Altschul  et  ah，  J.  MoI.  Biol.，215:403-410，  [1990]；  and  Karlin  et  al，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90:5873-5787  [1993]）。特に有用なＢＡＬＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり（Altschul  et  al.，  Meth.  Enzymol.，  266:460-480  [1996]参照）、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は大部分がデフォルトの値である幾つかのサーチパラメーターを用いる。調節可能なパラメーターは以下の値に設定されている：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワードスレッシュホールド（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰＳパラメーターは動的値であり、特定の配列のコンポシシヨン及び所望の配列をサーチされる所望の配列に対する特定のデータベースのコンポジションに依存してプログラム自身により確立される。しかしながら、この値は感受性を高めるために調節することができる。「より長い」配列は配列された領域において最も実際的な残基を有するものである（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップは無視される）。
【００７１】  従って、「核酸配列の相同性のパーセンテージ（％）」の語は初期の配列（即ち、所望の配列）の核酸残基に同一である候補配列中の核酸残基のパーセンテージであると定義される。好適な方法はデフォルトパラメータが設定され、オーバーラップスパン、及びオーバーラップフラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定されているＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＩＮモジュールを用いる。
【００７２】  本明細書において、「組み換え」の語は、異種核酸配列の導入により修飾されている又はそのように修飾されて細胞由来の、細胞又はベクターを意味する。したがって、例えば、組み換え細胞は、自然発生細胞（非組み換え）の中に見られるのと同一遺伝子を発現している、又は計画された人為的介入の結果、天然遺伝子を過剰に発現した、未発現のままにする、又はまったく発現しない。「組み換え」、「組み換されている」及び「組み換え」核酸配列を生成することは、通常２つ以上の核酸フラグメントをキメラ遺伝子が生じるように組み立てることを意味する。
【００７３】  好適な態様において、変異体ＤＮＡ配列は少なくとも１つのコドンにおいて飽和突然変異誘発を用いて生成される。他の好適な態様において、変異体ＤＮＡ配列は野生型配列に対して、５０％より多い、５５％より多い、６０％より多い、６５％より多い、７０％より多い、７５％より多い、８０％より多い、８５％より多い、９０％より多い、９５％より多い、又は９８％より多い配列相同性を有する。代替的な態様において、変異体ＤＮＡは、例えば、放射線、ニトロソグアニジン（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）等の既知の変異法を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで生成される、所望のＤＮＡ配列がその後単離され、本明細書に定義される方法に用いられる。
【００７４】  本明細書において、「増幅」及び「遺伝子増幅」の語は特定のＤＮＡ配列が増幅された遺伝子がゲノム中の初期に存在する遺伝子のコピー数よりも多くなるように、不均衡に複製されるプロセスを意味する。幾つかの態様において、試薬（例えば、抑制可能な酵素の抑制剤）の存在下の育成により細胞の選択がその薬物の育成のために必要な遺伝子生成物をコードする内因性の遺伝子の増幅、この遺伝子産物をコードする外因性（即ち、挿入）配列の増幅により、又は両者により、細胞の選択が行われる。
【００７５】  「増幅」はテンプレート特異性と含む核酸複製の特別なケースである。非特異的テンプレート複製で構築される（即ち、テンプレート依存性ではあるが特定のテンプレートには依存していない）。テンプレート特異性は、本明細書において、複製の忠実性（即ち、プロパーポリヌクレオチド配列の合成）及び（リボ又はデオキシ）ヌクレオチドとは区別して用いられる。テンプレート特性はしばしば、「標的」特性とも言われる。標的配列が他の核酸以外から分かれたものであるような意味において「標的」である。増幅技術は主にこの分類のために設計されている。
【００７６】  本明細書において、「プライマー」の語は、核酸即ち、とランドに相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下（即ち、ヌクレオチドの存在、及びＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の下、好適な温度、及びｐＨ）におかれた場合に、合成の開始点として作用することができる、制限消化精製により自然発生する、又は合成的に生成されたオリゴヌクレオチドを意味する。このプライマーは増幅の最大効率のためには好ましくは１本鎖ＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、代替的には２本鎖ＤＮＡでもよい。もし、２本鎖ＤＮＡを用いる場合には、このプライマーを初めに伸長生成物に用いる前に各鎖を分離する処理を行う。好ましくは、このプライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。このプライマーは誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を準備するために十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの源、及び用いる方法に依存する。
【００７７】  本明細書において、「プローブ」の語は、他の所望のオリグヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、精製制限消化のように自然発生的に、合成的に、組み換え的に、又はＰＣＲ増幅により得られたオリグヌクレオチドを意味する。プローブは１本鎖又は２本鎖でもよい。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定、オリグヌクレオチド単離に有用である。本発明に用いる任意のプローブは、酵素（例えば、酵素ベースの組織学的アッセイの他、ＥＬＩＺＡ）、蛍光法、放射線法、及び発光法を含むがこれらに限定されない任意の検出システムにおいて、検出すことができるように、「レポーター分子」で標識される。本発明を特定の検出法又は標識に限定することは意図しない。
【００７８】  本明細書において「標的」の語は、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるためのプライマーにより結合される核酸領域を意味する。従って、「標的」は他の核酸配列から区別される。「セグメント」は標的配列の中の核酸の領域であると定義される。
【００７９】  本明細書において、「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」の語は、クローニング又は精製をせずに、ゲノムＤＮＡの混合物中で、標的配列のセグメントの濃度を高めるための方法を含み、参照により本明細書に援用される米国特許Ｎｏｓ．４，６８３，２０２、４，６８３，１９５、及び４、９６５，１８８の方法を意味する。この標的配列を増幅するための方法は、ＤＮＡ混合物に過剰量の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、所望の標的配列に接触させ、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で適切な加熱サイクルを行うことを含む。２つのプライマーは２本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。好適な増幅のために、混合物を変性させて、標的配列内のそれらに相補的な配列にアニールする。アニールに続いて、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させて、新たな相補的な鎖を形成する。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長の工程は、高濃度の所望の標的配列の増幅されたセグメントを得るために何回も繰り返すことができる（即ち、変性、アニーリング、及び伸長の工程は１つのサイクルを形成し、多くのサイクルを行うことができる）。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、お互いにに関してプライマーの相対的な位置より決定することができ、それゆえ、この長さは制御可能なパラメーターである。このプロセスは繰り返すことができることから、この方は「ポリメラーゼ連鎖反応」（本明細書において、ＰＣＲという。）と呼ばれている。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物中では（濃度について言うと）主な配列となることから、これらのことをＰＣＲ増幅物と言う。
【００８０】  本明細書において、「増幅試薬」の語は、プライマー、核酸、及び増幅用酵素以外に必要な増幅のための試薬を意味する。通常、増幅試薬の他の成分と一緒に反応管（テストチューブ、マイクロウェル等）内に含まれている。
【００８１】  本明細書において、「ＲＴ−ＰＣＲ」の語はＲＮＡ配列の複製及び増幅することを意味する。この方において、逆方向転写をＰＣＲに組合せ、熱安定性ポリメラーゼを用いる１つの酵素的な方法を用いる。この方法は米国特許Ｎｏ．５、３２２、７７０に記載されており、該特許を参照により本明細書に援用する。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡテンプレートはポリメラーゼの逆転写活性によりｃＤＮＡに転換され、その後、（ＰＣＲ方法に見られるように）ポリメラーゼの重合活性によりそれらを増幅する。
【００８２】  本明細書において、「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の語は特定のヌクレオチド配列で、またはその付近でそれぞれの２本鎖ＤＮＡを切断するバクテリア酵素を意味する。
【００８３】  「制限部位」とは、所与のエンドヌクレアーゼにより認識され切断される核酸配列を意味し、しばしば、この部位はＤＮＡフラグメントに挿入される部位でもある。本発明の特定の態様において、制限部位は選択マーカーにエンジニアされ、ＤＮＡ構築物の５’末端及び３’末端に導入される。
【００８４】  「相同組み換え」の語は２つのＤＮＡ分子又は一対の染色体の間のＤＮＡフラグメントを同一の部位又は近くの部位の核酸配列を交換することを意味する。特定の態様において、染色体取込は相同組み換えである。
【００８５】  本明細書において、「アミノ酸」は、ペプチド又はタンパク質配列、あるいはそれらの一部分を意味する。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」の語は互換的に使用される。
【００８６】  本明細書において、「所望のタンパク質」及び「所望のポリペプチド」の語は所望の及び／又はアッセイされるタンパク質又はポリペプチドを意味する。幾つかの態様において、所望のタンパク質は細胞内で発現され、他の態様においてはそれは分泌タンパク質である。特に好適な態様において、これらの酵素は本発明のセリンプロテアーゼを含む。幾つかの態様において、所望のタンパク質はシグナルペプチドに融合する分泌されたプロテアーゼである（即ち、分泌されるタンパク質上のアミノ末端伸長）。ほとんど全ての分泌されたタンパク質は、膜を横断するタンパク質前駆体を標的とする、又はこの輸送に重要な役割をしているアミノ末端タンパク質伸長を用いる。この伸長は膜輸送の間又は膜輸送に引き続き、シグナルペプチダーゼにより、タンパク質を分解するように除去される。
【００８７】  ポリヌクレオチドは、天然の状態において又は当業者により既知の方法で操作される場合、それが転写及び／又は翻訳されてＲＮＡ、ポリペプチド、又はそれらのフラグメントを生成する場合、ＲＮＡ又はポリペプチドを「コードする」と言う。そのような核酸のアンチセンスストランドもこの配列をコードする。当業者に知られているように、ＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼにより転写され、ＲＮＡを生成する。しかし、ＲＮＡは逆転写酵素により逆転写されて、ＤＮＡを生成することもできる。従って、ＤＮＡはＲＮＡをコードし、その逆も成立する。
【００８８】  「宿主株」又は「宿主細胞」の語は本発明においては、ＤＮＡを含む発現ベクターに好適な宿主を意味する。
【００８９】  酵素は、野生型細胞において発現されるレベルよりも高いレベルで細胞内で発現された場合、「過剰発現」しているという。
【００９０】  「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は本明細書において互換的に使用される。本明細書において、アミノ酸を示す３つのコードはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＪｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｒｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）により規定された３文字コードを使用する。遺伝子コードの退縮により、１つのポリペプチドが１つ以上の核酸配列によりコードされることは理解されている。
【００９１】  「プロシークエンス」はプロテアーゼの分泌に必要な、シグナル配列と成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列である。プロ配列の切断が成熟活性プロテアーゼとなる。
【００９２】  「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」の語はタンパク質の成熟又は前駆型の分泌において、参加する核酸配列及び／又はアミノ酸配列の任意の配列である。シグナル配列の定義は、機能的なものであり、タンパク質の分泌に影響を与えるタンパク質遺伝子のＮ末端部分によりコードされるアミノ酸配列の全てを含むことを意味する。これらは、しばしば、しかし一般的ではないが、タンパク質のＮ末タンパク質又は前駆体タンパク質のＮ末部分に結合する。このシグナル配列は内因性でも、外因性のものでもよい。このシグナル配列はタンパク質（例えば、プロテアーゼ）に関係するものでもよいし、又の分泌例えば、をコードしている遺伝子由来のものでもよい。例示的なシグナル配列の例としては、バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）（ＡＴＣＣ２１５３６）由来スブチリシンのシグナル配列の残りに融合するバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のシグナル配列の最初の７つのアミノ酸残基を含む。
【００９３】  「ハイブリッドシグナル配列」の語は、発現される遺伝子のシグナル配列に融合する発現宿主から得られる配列の一部分であるシグナル配列を意味する。幾つかの態様において、合成配列が用いられる。
【００９４】  「成熟」の語は、タンパク質又はペプチドの最終的な機能形態を意味する。例えば、本発明のプロテアーゼの成熟形態は配列番号（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：２）の１乃至１８９の位置に同一なアミノ酸配列を少なくとも含む。
【００９５】  タンパク質又はペプチドの「前駆体」はタンパク質のアミノ又はカルボニル末端に作動可能に結合しているプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を意味する。この前駆体は、プロ配列のアミノ末端に作動可能に結合している「シグナル」配列も有する。この前駆体は翻訳後活性において含まれる付加的なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質又はポリペプチドの成熟形態から切り離されたポリペプチド）も有する。
【００９６】  「自然発生酵素」は自然に見られるのと同一な修飾されていないアミノ酸配列を有する酵素を意味する。自然発生酵素は天然酵素、特定の微生物中で自然発生的に発現さる  又は見られる酵素を含む。
【００９７】  「〜由来の」又は「〜より得られた」の語は、問題の有機体の株より生成された又は生成可能なプロテアーゼだけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列、及びそのようなＤＮＡ配列を含む宿主有機体により生成されたプロテアーゼも含む。更に、この語は合成ＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡのよりコードされるプロテアーゼを含み、このプロテアーゼは問題のプロテアーゼの同定された性質を有する。例えば、「セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）由来のプロテアーゼはセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）により自然発生的に生成されたタンパク質分解活性を有する酵素のほかに、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）源により同様に生成されたセリンプロテアーゼ、前記セリンプロテアーゼをコードする核酸配列を有する形質転換された非セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）有機体により生成された遺伝子的エンジニア技術の使用は含まない。
【００９８】  この定義の範囲内において、「誘導体」の語は、誘導体が野生型、天然、又親同様の目的のために有用な誘導体であるという意味において、野生型、天然、又は親において見られるタンパク質分解活性の性質を有している。セリンプロテアーゼの機能的な誘導体は自然発生、合成、又は組み換え的に生成されたポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含み、それらは、本発明のセリンプロテアーゼの一般的な性質を有する。
【００９９】  「機能的な誘導体」の語はセリンプロテアーゼをコードする核酸の機能的な性質を有する核酸の誘導体を意味する。本発明のセリンプロテアーゼをコードする核酸配列の機能的な誘導体は天然発生、合成、又は組み換え的に生成された核酸又はフラグメントを含み、本発明のセリンプロテアーゼ性質をコードする。本発明のセリンプロテアーゼをコードする野生型核酸は自然発生対立遺伝子及び当分野で知られている遺伝子コードの退縮に基づく相同体を含む。
【０１００】  ２つの核酸配列又はポリヌクレオチド配列に対して用いる「同一」の語は、以下の１つの配列比較又は配列解析アルゴリズムを用いて測定したときに、最大対応配列したときに２つの配列における残基が同じであることを意味する。
【０１０１】  「最適アラインメント」の語は、最も高い同一性のパーセンテージスコアを有するアラインメントを意味する。
【０１０２】  ２つのアミノ酸、ポリヌクレオチド、及び／又は遺伝子配列に対して用いる「配列相同性」、「アミノ酸配列相同性パーセント」、「遺伝子配列相同性のパーセント」及び／又は「核酸／ポリヌクレオチド配列の相同性のパーセント」の語は配列を最適にアラインメントしたときに２つの配列において同一な残基のパーセンテージを意味する。従って、８０％のアミノ酸配列相同性は最適にアラインメントされたポリヌクレオチド配列において８０％のアミノ酸が同一であることを意味する。
【０１０３】  ２つの核酸又はポリヌクレオチドに対して用いる「実質的に同一」であるとは、標準的なパラメーターを用いてプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）対象の配列と比較したときに、少なくとも７０％の配列相同性、好ましくは少なくとも７５％の配列相同性、好ましくは少なくとも８０５の配列相同性、好ましくは少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９７％の配列相同性、好ましくは少なくとも９８％の配列相同性、及び好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるという同定は第一ポリヌクレオチドが免疫学的に第二ポリペプチドに交差反応性があることでわかる。通常、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドが免疫学的に交差反応性がある。従って、２つのポリペプチドが保存置換によってのみ違う場合は、ポリペプチドは第二ポリペプチドに対して実質的に同一であると言う。２つの核酸配列が実質的に同一である他の同定は、２つの分子が過酷な条件においてハイブリダイズすることで同定できる（例えば、中程度から高度に過酷な条件）。
【０１０４】  「等しい」の語は、中程度から高度に過酷な条件下で、配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に示すような配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチドによりコードされるセリンプロテアーゼ酵素を意味する。例えば、等しい成熟セリンプロテアーゼは配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で定義されるアミノ酸配列を有するセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）セリンプロテアーゼに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも０１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７５、少なくとも９８％、及び／又は少なくとも９９％の配列相同性を有する。
【０１０５】  「単離された」又は「精製された」の語は本来の環境（例えば、それが自然派生的なものであるならば自然環境）から切り離されている物質に対して用いる。例えば、この物質は、自然発生又は野生型有機体と比較したときに低い又は高い濃度で存在するか、又は自然発生又は野生型有機体から発現する上では通常存在しない成分と組み合わされ存在する場合、「精製」されていると言う。例えば、生きている動物中にある自然派生ポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていない。しかし自然システムにおいて共存している物質の幾つか又は全てを分離した、同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていると言う。幾つかの態様において、そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、及び／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物一部であり、更にそのようなベクター又は組成物において、単離されたものは自然環境の一部ではない。好適な態様において、核酸又はタンパク質は、電気泳動又はブロットにおいて１つのバンドか検出された場合には、精製されていると言う。
【０１０６】  「単離された」の語は、ＤＮＡ配列に対して用いる場合、本来の遺伝的環境から単離されているＤＮＡ配列を意味し、従って、これは他の外来又は不要なコード配列を有しておらず、遺伝的なエンジニアリングによりタンパク質を生成することに用いるのに有用である。そのような単離された分子はそれらの本来の環境から分離されており、ｃＤＮＡ及び／又はゲノムクローンを含む。本発明の単離されたＤＮＡ分子は通常関連している他の遺伝子を含まないが、プロモーター及びターミネーターとしての自然発生５’末端及び３’を含む。関係のある領域の同定は、当業者に良く知られており（例えば、Dynan  and  Tijan，  Nature  316:774-78  [1985]）参照のこと）。「単離されたＤＮＡ配列」の語は、代替的に「クローンされたＤＮＡ配列」と言うこともある。
【０１０７】  「単離された」の語は、タンパク質について用いる場合、その本来の環境以外の環境で見られるタンパク質を意味する。好適な態様において、単離されたタンパク質は実質的に他のタンパク質、特に他の相同タンパク質を含まない。単離されたタンパク質は、ＤＳＤ−ＰＡＧＥにより、１０％より、好ましくは２０％より、更に好ましくは３０％より高く精製されている。本発明の更なる側面は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、より高度に（即ち、４０％より高く、６０％より高く、８０％より高く、９０％より高く、９５％より高く、９７％より高く、及び９９％より高く）精製されたタンパク質を含む。
【０１０８】  本明細書において、「組合せ変異誘発」の語は初期配列の変異体のライブラリーを生成する方法を意味する。これらのライブラリーにおいて、変異体は変異体のあらかじめ決められたセットから選択される１つ又は幾つかの変異を含む。更に、この方法は変異体のあらかじめ決められたメンバーではないランダム変異体を導入する手段を提供する。幾つかの態様において、この方法は２０００年１０月２６日にファイルされた米国特許出願番号０９／６９９．２５０に記載の方法を含む。この文献を参照により本明細書に援用する。代替的な態様において、組合せ変異誘発法は市販のキットを含む（例えば、QuikChange（商標）Multisite，Stratagene，San  Diego，CA）。
【０１０９】  本明細書において、「変異体のライブラリー」の語は、それらのゲノムの大部分が同一であるが、１つ異常の遺伝子の別の相同体を含む細胞の集団を意味する。そのようなライブラリーは、例えば、改善された性質を有する遺伝子又はオペロンを同定するのに用いることができる。
【０１１０】  本明細書において、「開始遺伝子」は本発明に用いる改善された又は変更された所望のタンパク質をコードする所望の遺伝子を意味する。
【０１１１】  本明細書において、「複数配列アラインメント（ＭＳＡ）」はアルゴリズム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いて配列させる開始遺伝子の複数の相同体の配列を意味する。
【０１１２】  本明細書において「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」の語は比較される特定のタンパク質又は所望の配列の全ての変異体に対しての原型であるアミノ酸配列を意味する。この語は所望のＤＮＡ配列中に最も多く存在する核酸配列も意味する。遺伝子の各位置に対して、コンセンサス配列はＭＳＡにおける位置において最も豊富なアミノ酸を与える。
【０１１３】  本明細書において、「コンセンサス変異」の語は開始遺伝子の配列とコンセンサス配列における違いを意味する。コンセンサス変異は開始遺伝子の配列とＭＳＡにより得られたコンセンサス配列を比較することにより同定される。幾つかの態様において、コンセンサス変異はコンセンサス配列により類似するように開始遺伝子に導入される。コンセンサス変異は、開始遺伝子におけるアミノ酸を、開始剤遺伝子におけるアミノ酸の頻度に関係する位置において、ＭＳＡに見られるよりもより高い品詞であるアミノ酸に変更するアミノ酸変異を含む。従って、コンセンサス変異は、ＭＳＡにおいけるアミノ酸よりも豊富に存在するアミノ酸で開始遺伝子のアミノ酸を置き換える、単一のアミノ酸変異を含む。
【０１１４】  本明細書において、「イニシャルヒット（ｉｎｉｔｉａｌ  ｈｉｔ）の語は組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーをスクリーニングすることにより同定された変異体を意味する。好適な態様において、イニシャルヒットは開始遺伝子と比較して、改善された性能を有する。
【０１１５】  本明細書において「改善されたヒット（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｉｔ）」は、高められた組合せコンセンサス変異体ライブラリーをスクリーニングすることで同定された変異体を意味する。
【０１１６】  本明細書において「改善された変異体」及び「性能が高められた変異体」の語は開始遺伝子に導入したときに、改善された性能を示す変異体を意味する。幾つかの好適な態様において、これらの変異体は本発明のスクリーニング工程の間に同定されたシークエンシングヒット（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｈｉｔ）により同定された。大部分の態様において、ヒット中により頻繁に見られる変異体はスクリーニングされていない組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーと比較したときに、改善された変異体である。
【０１１７】  本明細書において、「高められた組合せコンセンサス変異誘発ライブラリー」の語は、ＣＣＭ変異誘発及びスクリーニングの初期のラウンドから得られたスクリーニング及び／又は配列決定に基づいて設計され、構築されたＣＣＭライブラリーを意味する。幾つかの態様において、高められたＣＣＭライブラリーはＣＣＭの初期のラウンドから得られたイニシャルヒットの配列に基づいている。更なる態様において、高められたＣＣＭは変異誘発及び配列の初期ラウンドから得られたイニシャルヒットにおいて頻繁に見られる変異を好ましくするように設計される。いくつかの好適な態様において、初期のＣＣＭライブラリーにおいて用いた他のプライマーに対して性能が劣る変異体をコードするプライマーを省略する又は性能が高い変異体をコードするプライマーの濃度を高めることにより、達成することができる。
【０１１８】  本明細書において「性能が劣る変異体」の語は、スクリーンされていない組合せコンセンサス変異体ライブラリーと比較してスクリーニングから得られたヒットにおいてより頻繁に見られない組み換えコンセンサス変異体ライブラリーにおける変異体を意味する。好適な態様において、スクリーニングプロセスは「性能が劣る変異」を含む変異体の多く除去及び／又は減らす。
【０１１９】  本明細書において、「機能アッセイ」の語は、タンパク質活性の同定を提供するアッセイを意味する。特定の好適な態様において、この語は、タンパク質が、有用な性能において機能する能力について解析するためのアッセイシステムを意味する。例えば、酵素の場合、機能アッセイは反応を触媒する酵素の有効性を決定することを含む。
【０１２０】  本明細書において、「標的性質」の語は、開始遺伝子の変更する性質を意味する。本発明を特定の標的性質に限定することは意図しない。しかしながら、幾つかの好適な態様において、この標的性質は遺伝子生成物の安定性である（例えば、変性、タンパク質分解性、又の分解因子に対する安定性）。他の態様において、生産宿主における生産レベルが変更される。即ち、開始遺伝子の任意の性質を本発明に用いることができる。
【０１２１】  本明細書において用いる「性質」又は核酸に対して用いる同義語は分泌又は検出することができる拡散の任意の性質又は属性を意味する。これらの性質は、ポリペプチドへの結合に影響する性質、特定の核酸を含む細胞に与えられた性質、遺伝子転写に影響する性質（例えば、プロモーター強度、プロモーター認識、プロモーター調節、エンハンサー機能）、ＲＮＡプロセシングに影響する性質（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡコンフォメーション、及び／又は転写後調節）、翻訳に影響する性質（例えば、レベル、調節、ｍＲＮＡのリボゾームタンパク質への結合、翻訳後調節）を含むがこれらに限定されない。例えば、核酸の転写因子についての結合部位、ポリメラーゼ、調節因子等は所望の性質を生成するために又は好ましくない性質を同定するために、変更される。
【０１２２】  本明細書において用いる「性質」又は（タンパク質を含む）ポリペプチドに対して用いるこれと同義語は分泌又は検出されるポリペプチドの任意の性質又は属性を意味する。この性質は、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解に対する安定性、ＫＭ、Ｋｃａｔ、Ｋｃａｔ／ＫＭ比、タンパク質折りたたみ、免疫誘発性、リガンドへの結合する性質、レセプターへの結合性能、分泌性能、細胞表面への提示能力、オリゴマー化性能、シグナル性能、細胞増幅の刺激性能、細胞増殖の抑制性能、アポトーシス誘発性能、リン酸化又はグリコシル化により修飾される能力、及び／又は病気を治癒する能力等を含むがこれらに限定されない。
【０１２３】  本明細書において、「スクリーニング」の語は、通常用いられる意味において、複数の工程プロセスを意味する。第一ステップにおいて、変異体核酸又は変異体ポリペプチドが提供される。第二の工程において、変異体核酸又は変異体ポリペプチドの性質が決定される。第三の工程において、決定された性質が対応する核酸の性質、対応する自然発生ポリペプチドの性質、又は変異体核酸の生成のための開始剤物質（例えば、開始配列）と比較される。
【０１２４】  変更された性質を有する核酸又はタンパク質を得るためにのスクリーニング手順は開始物質及び促進を意図する変異体拡散の生成の修飾に依存する。従って、当業者は本発明はスクリーンされる特定の態様に限定することは意図されず、以下の例は例示のみであることを理解するだろう。任意の特定の性質のためのスクリーニングの方法は当分野で知られている。例えば、結合、ｐＨ、特異性等を変異の前と後で測定することができる。これらの変化が変異を示している。好ましくは、スクリーニングは、チップ、ファージディスプレイ、及び複数基質及び／又はインジケーターを含むがこれらに限定されない、複数のサンプルを同時にスクリーニングすることを含む、高い処理能力の方法で行われる。
【０１２５】  本明細書において、幾つかの態様において、スクリーニングは変異体の集団から所望の変異体を豊富に含むようにするための選択工程を含む。これらの態様の例は、宿主微生物の生育に有利な変異低の選択の他、ファージディスプレイ、又は変異体をそれらの結合能又は触媒性質に基づき変異体の集団から捕捉することができる他のディスプレイ法を含む。好適な態様において、変異体のライブラリーはストレスに曝され（熱、プロテアーゼ、変性）引き続き、已然としてインタクトである変異体をスクリーニングにおいて同定し、又は選択により高濃度化する。この語は選択のための任意の好適な手段を含むことを意図する。即ち、本発明を特定のスクリーニング方法に限定することは意図しない。
【０１２６】  本明細書において、「標的ランダム化」の語は１つ又は幾つかの位置がランダム化されている複数の配列を生成する工程を意味する。幾つかの態様において、ランダム化は完全に位置をランダム化する（即ち、４つのヌクレオチドのＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣがランダムな位置にある）。代替的な態様において、ヌクレオチドのランダム化は４つのヌクレオチドのサブセットに限定される。標的ランダム化は所望の１つ又は幾つかの位置をコードする１つ又は幾つかの配列のコドンに適用することができる。発現したときに、得られたライブラリーが１つ以上のアミノ酸部位が、ランダム化コドンのランダム化スキームによち決定されるように、２０全てのアミノ酸又はアミノ酸のサブセットの混合物を含むことができるように、タンパク質集団を生成する。幾つかの態様において、標的ランダム化から得られた集団の個々のメンバーは、標的にされた又はランダム化挿入又は欠失されたコドンに依存してアミノ酸のメンバーが異なる。更なる態様において、合成アミノ酸は生成されたタンパク質の集団の中に含まれる。幾つかの好適な態様において、標的ランダム化の結果得られた集団の主なメンバーは初期の遺伝子よりもコンセンサス配列に対して配列相同性が高い。幾つかの態様において、この配列は１つ以上の所望のタンパク質をコードする。代替的な態様において、タンパク質は異なる生物学的機能を有する。幾つかの好適な態様において、インカミング配列は少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。この配列は所望の１つ以上のタンパク質をコードすることができる。それはほかの生物学的機能を有する。多くの場合。インカミング配列は、抗生物質耐性を付与する遺伝子等の選択マーカーを含む。
【０１２７】  「修飾配列」及び「修飾遺伝子」の語は本明細書において互換的に使用され、欠失、挿入、又は自然発生核酸配列を阻害を含む配列を意味する。幾つかの好適な態様において、修飾配列の発現生成物は切断されたタンパク質である（例えば、修飾が配列の切断又は阻害である場合）。幾つかの特に好適な態様において、切断されたタンパク質は生物活性を有する。代替的な態様において、修飾配列の発現生成物は伸長されたタンパク質である（例えば、修飾が核酸配列内へ挿入を含む場合）。幾つかの態様において、挿入は切断タンパク質を生成する（例えば、挿入が停止コドンの情報となる場合）。従って、挿入は発現性生物としては、切断タンパク質又は伸長タンパク質のいずれかになる。
【０１２８】  本明細書において、「変異体配列」及び「変異体遺伝子」の語は互換的に使用され、宿主細胞の野生型配列において生じる少なくとも１つのコドンの変更を有する配列を意味する。変異配列の発現性生物は野生型に対して変更されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。発現性生物は変更された機能的な能力を有する（例えば、高められた酵素活性）。
【０１２９】  「変異プライマー」又は「変異オリゴヌクレオチド」の語は（本明細書において互換的に使用され）、テンプレート配列の一部分に対応し、それらにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド組成物を意味する。変異体プライマーに関して、このプライマーは正確にテンプレート核酸に一致しない。プライマー中に１つ以上のミスマッチを核酸ライブラリーに所望の変異を導入するために用いる。本明細書において「非変異プライマー」又は「非変異オリゴヌクレオチド」の語は、核酸テンプレートに正確に一致するオリゴヌクレオチド組成物を意味する。本発明の幾つかの態様において、変異プライマーのみを用いる。本発明の他の好適な態様において、プライマーは変異プライマーにおける少なくとも１つの領域について、オリグヌクレオチド混合物中に非変異プライマーが含まれるように設計される。少なくとも１つの変異プライマーに対応する変異プライマー及び非変異プライマーの混合物を添加することにより、各種組合せ変異パターンが存在する核酸ライブラリーを生成することができる。例えば、変異体核酸ライブラリーのいくつかのメンバーが特定の部位においてそれらの前駆体配列を有し、他のメンバーそのような部位で変異していることが望まれる場合、非変異プライマーは所与の残査に対しての核酸ライブラリー内の非変異メンバーの特定のレベルを得ることができる能力を提供する。本発明の方法は、通常１０乃至５０ベースの間の長さ、好ましくは約１５乃至４５ベースの間の長さの変異体及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかしながら、所望の変異誘発を行うためには１０ベースより短い又は５０ベースより長いプライマーを用いることが必要である。変異及び非変異プライマーに関して、対応するオリゴヌクレオチドの長さに同一である必要はないが、加えられる変異に対応する領域において、重複のみが見られる。プライマーは本発明により予め決められた比で添加される。例えば、得られたライブラリーが有意なレベルの特定の変異を有し、同じ又は別の部位において、より少ない量の別の変異を有することが望ましい場合、添加するプライマーの量を調節することで、所望の偏ったライブラリーを生成することができる。あるいは、より少ない又はより多い量の非変異プライマーの添加により。変異核酸ライブラリーにおいて生成される対応する変異体を調節することができる。
【０１３０】  本明細書において、「隣接している変異」の語は、同じオリゴヌクレオチドプライマー内に存在する変異を意味する。例えば、隣接している変異は隣にあるか又はお互いに近い場所にある。しかしながら、これらは同じプライマーにより得られた変異体テンプレート核酸に導入される。
【０１３１】  本明細書において、「隣接していない変異」の語は別のオリゴヌクレオチドプライマーに存在する変異を意味する。例えば、隣接してない変異は別々に調節されたオリゴヌクレオチドプライマーにより得られたテンプレート核酸に導入される。
【０１３２】  本明細書において、「野生型配列」又は「野生型遺伝子」の語は、互換的に用いられ、宿主細胞内に自然発生的に本来存在する配列を意味する。幾つかの態様において、この野生型配列はタンパク質エンジニアリングプロジェクトの開始点である所望の配列である。この野生型配列は相同の又は異種のタンパク質のいずれかをコードする。相同タンパク質は本発明を用いずに宿主細胞が生成するものである。異種タンパク質は本発明に寄らなければ宿主細胞が生成することができないものである。
【０１３３】  本明細書において、「抗体」の語はイムノグロブリンを意味する。抗体は、抗体を生成するために好ましい特定の種から直接得られたイムノグロブリンを含むがこれらに限定されない。更に、本明細書は修飾された抗体も含む。この語は、インタクト抗体が結合するエピトープに結合する能力を有する抗体フラグメントを意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗ＩＤ）抗体を含む。抗体フラグメントは相補決定領域（ＣＤＲ）、１本鎖フラグメント可変領域（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ポリクローナル及びモノクローナル抗体も本発明に含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１３４】  「酸化安定性」の語は、例えば、漂白剤又は酸化剤に曝され又は接触させる間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間に、所与の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼを意味する。幾つかの態様において、このプロテアーゼは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のタンパク質活性分解活性を、例えば、少なくとも１分、３分、５分、８分、１２分、１６分、２０分等の特定の間漂白剤又は酸化剤に接触させた後に有している。幾つかの態様において、この安定性は実施例において測定される。
【０１３５】  「キレート安定性」の語は例えば、キレート剤に曝され又は接触させる間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間に、所与の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼを意味する。幾つかの態様において、このプロテアーゼは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のタンパク質活性分解活性を、例えば、少なくとも１０分、２０分、４０分、６０分、１００分等の特定のキレート剤に接触させた後に有している。幾つかの態様において、キレート剤安定性は実施例において測定される。
【０１３６】  「熱安定性」の語は、例えば、温度を変更させた場合に、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間に、所与の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼを意味する。変更させた温度は温度の上昇及び下降を含む。いくつかの態様において、このプロテアーゼは、変更させた温度に特定の時間、例えば、少なくとも６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分等曝されたあとに、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のタンパク質活性分解活性を有している。幾つかの態様において、この熱安定性は実施例において測定される。
【０１３７】  酸化安定性、キレート安定性、熱安定性、及び／又はｐＨ安定性について用いる「高められた安定性」の語は他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した時に、所定の時間、より高い活性を維持するタンパク質を意味する。
【０１３８】  酸化安定性、キレート安定性、熱安定性、及び／又はｐＨ安定性について用いる「減少した安定性」の語は、他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した時に、所定の時間、より低い活性を維持するタンパク質を意味する。
【０１３９】  「洗浄活性」の語は、本発明のタンパク質分解、洗浄、又は他のプロセスの間の条件下でプロテアーゼにより達成される洗浄性能を意味する。幾つかの態様において、洗浄性能は、例えば、ガラス、血液、ミルク、又はタマゴのタンパク質等の酵素感受性のある汚れを評価する各種洗浄アッセイを用い、これらの汚れを標準的な洗浄条件に曝した後に、各種クロマトグラフ、分光高度計、又は他の等しい方法を用いて評価される。例示的なアッセイは実施例で行う方法のほかに、ＷＯ９９／３４０１１、及び米国特許Ｎｏ．６，６０５，４５８（これらの文献を参照により本明細書に援用する）に記載されているがこれらに限定されない。
【０１４０】  プロテアーゼの「洗浄に有効な量」の語は特定の洗浄組成物において望ましい酵素活性のレベルを達成するプロテアーゼの量を意味する。そのような有効量は当業者に容易に理解され、用いるプロテアーゼ、洗浄製品、洗浄組成物の特定の組成、及び液体又は乾燥組成物（例えば、粉末、バー）が必要とされているかどうかなどの多くの要因に基づく。
【０１４１】  本明細書で用いる「洗浄添加物」の語は、組成物に用いられるプロテアーゼ酵素に特に相性のよい物質である、所望の洗浄組成物の特定のタイプ及び製品の形状（例えば、液体、下流、粉末、バー、スプレー、タブレット、ゲル、又は発泡組成物）のために選択された、任意の液体、固形又は気体物質を意味する。幾つかの態様において、顆粒組成物は、「コンパクト」形態であり、他の態様において、液体組成物は「濃縮」形態である。
【０１４２】  洗浄活性に関して用いる「高められた性能」の語は、標準的な洗浄サイクル及び／又は複数の洗浄サイクルの後に評価された場合、タマゴ、ミルク、草、又は血液等の特定の酵素に感受性のある汚れの線上活性がより高い又は大きいことを意味する。
【０１４３】  洗浄活性に関して用いる「減少した性能」の語は、標準的な洗浄サイクルの後に評価した場合、タマゴ、ミルク、草、又は血液等の特定の酵素に感受性のある汚れの洗浄活性が減少又はより少なくなっていることを意味する。
【０１４４】  洗浄活性に関して用いる「比較可能な性能」の語は、OPTIMASE（商標）protease  （Genencor），PURAFECT（商標）protease  products（Genencor），SAVINASE（商標）  protease（Novozymes）， BPN'-variants（U.S.Pat.  No.  Re  34，606），RELASE（商標），DURAZYME（商標）， EVERLASE（商標）， KANNASE（商標）  protease（Novozymes）， MAXACAL（商標），MAXAPEM（商標）， PROPERASE（商標）  proteases（Genencor；  U.S.  Pat.  No.  Re  34，606，and  U.S. Pat.  Nos.5，700，676；5，955，340；6，312，936；and6，482，628），and  B.  lentus  variant  protease  products  を含むがこれらに限定されない比較可能なスブチリシンプロテアーゼ（例えば、市販のプロテアーゼ）の洗浄活性の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の洗浄活性を意味する。例示的なスブチリシンプロテアーゼ変異体は、ＢＰＮの７６、１０１、１０３、１０４、１２０、１５９、１６７、１７０、１９４、１９５、２１７、２３５、２３６、２４５、２４８、及び／又は２５２の位置に等しい残基の置換又は欠失を含むがこれらに限定されない。洗浄性能は、標準的な洗浄サイクル条件の後に分光光度計、又は他の解析技術により決定され、草、血液、又はミルク等の酵素に感受性のある汚れを考慮した各種洗浄アッセイにおいてこれらのスブチリシンと本発明のプロテアーゼを比較することにより決定される。
【０１４５】  本明細書において「布製品洗浄用組成物」の語は洗濯用添加剤組成物及び汚れた布製品（例えば、衣類、繊維、及び他の布製品）を浸す及び／又は前処理するのに用いるのに好適な組成物を含む、手洗い又は機械洗いのための洗濯用組成物を意味する。
【０１４６】  本明細書において、「非布製品洗浄用組成物」の語は、布製品以外の表面を洗浄する組成物を意味し、食器洗浄用組成物、口腔洗浄用組成物、歯磨き用組成物、及びパーソナルケア組成物を含むがこれらに限定されない。
【０１４７】  本明細書における洗浄組成物の「コンパクト」形態は、密度についていうとコンパクトであり、組成物の観点からは、無機充填塩の量に最も良く反映されている。無機充填塩は粉末形態の洗浄用組成物の従来の成分である。従来の洗浄組成物において、充填塩は組成物全体に対して、通常１７乃至３５％の量で存在する。対照的に、コンパクト組成物において、充填塩は１５％を超えない量で存在する。幾つかの態様において、この充填塩は１０％を超えない量で存在し、又はより好ましくは組成物の重量により５％である。幾つかの態様において、無機充填塩は硫酸又は塩素のアルカリ及びアルカリ土類金属塩である。好適な充填剤点在は硫酸ナトリウムである。
【実施例】
【０１４８】  本発明は以下の実施例においてより詳細に説明される。これらの実施例は特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。添付の図は明細書及び発明の説明の一部分をなす。本明細書において参照された全ての文献は、参照により本明細書に援用される。以下の実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。【０１４９】  以下の実施例において、以下に示す略語を用いる。ＰＩ  （プロテイナーゼインヒビター）、ｐｐｍ（１００万分の１）；Ｍ（モルの）；ｍＭ（ミリモルの）；μＭ（マイクロモルの）；ｎＭ（ナノモルの）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）；μｌ及びμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（セントメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）； ｈ（ｓ）及びｈｒ（ｓ）（時間）；℃（摂氏温度）；ＱＳ（十分量）；ＮＤ（行わず）；ＮＡ（適用せず）；ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（ベースペア）；ｋｂ（キロベースペア）；ｋＤ（キロダルトン）；ｃＤＮＡ（コピー又は相補ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）；ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＮｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（容量対重量）；ｖ／ｖ（重量対重量）；ｇ（重力）；ＯＤ（光学密度）；ダルベッコのリン酸緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＤＰＢＳ）；ＳＯＣ（２％  バクトトリプトン（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ），０．５％バクトイースト抽出物（Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ）；テリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ；１２ｇ／ｌ  バクトトリプトン（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、２４ｇ／ｌグリセロール、２．３１ｇ／１ＫＨ２ＰＯ４、及び１２．５４ｇ／ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４）； ＯＤ２８０（２８０ｎｍにおける光学密度）； ＯＤ６０Ｏ（６００ｎｍにおける光学密度）； Ａ４０５（４０５ｎｍにおける吸光度）； Ｖｍａｘ（酵素触媒反応の最大初期速度）； ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）； ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２］）； ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．２５％  ＴＷＥＥＮ（商標）２０）； ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）； ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）； ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）； ＳＤＳ（ドデシルナトリウム硫酸塩）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）； ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホニック酸］； ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス［ヒドロ���シメチル］アミノメタン-ヒドロクロライド）；トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）-メチル］-グリシン）；ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロ−ヘキシルアミノ）エタン−スルホン酸）；ＴＡＰＳ（３−｛［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸）；ＣＡＰＳ（３−（シクロ−ヘキシルアミノ）−プロパン-スルホン酸；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）； ＤＴＴ（１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール）；ＳＡ（シナピニック酸）（ｓ，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシけい皮酸）；ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）；Ｇｌｕｔ及びＧＳＨ（還元グルタチオン）；ＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）； ＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシメチル］フォスフィン）；Ｃｉ（キュリー）；ｍＣｉ（ミリキュリー）；μＣｉ（マイクロキュリー）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）； ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィー）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間分析）；Ｔｓ（トシル）；Ｂｎ（ベンジル）；Ｐｈ（フェニル）；Ｍｓ（メシル）；Ｅｔ（エチル）、Ｍｅ（メチル）；Ｔａｑ（サーマスアクチス（Ｔｈｅｒｍｉｔｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ）；クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）フラグメント）；ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ‘−四酢酸）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ブラ（ｂｌａ）  （βガラクトシダーゼ又はアンピシリン耐性遺伝子）；ＨＤＬ（高密度流体）；ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＭＪリサーチ、レノ、ネバダ）；ベースクリア（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ）（ベースクリア・ビーブイ・インク、レイデン、オランダ）；パーセプティブ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）（パーセプティブバイオシステムズ、フレーミングハム、マサチューセッツ）；サーモフィニガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）（サーモフィニガン，サンジョーズ，カリフォルニア）；アルゴ（Ａｒｇｏ）（アルゴバイオアナリティカ，モリスプレインズ，ニュジャージ）；セイツＥＫＳ（Ｓｅｉｔｚ  ＥＫＳ）（セイツシケン（ＳｅｉｔｚＳｃｈｅｎｋ）フィルターシステムズ  ＧｍｂＨ，  バートクロイツナハ，  ドイツ）；パル（Ｐａｌｌ）（パルグループ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ），  イーストヒルズ，  ニュヨーク）；スペクトラム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）（スペクトラムラボラトリーズ、ドミングランコ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  Ｒａｎｃｈｏ）、カリフォルニニア）；モレキュラートラクチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（モレキュラーストラクチャーグループ、ウッドランド、テキサス）；アセライズ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）（アセライズインク、サンディエゴ、カリフォルニア）；ケミカルコンピューティング（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）（ケミカルコンピューティンググループ、モントリオール、カナダ）；ニューブランクウィシュ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）  （ニューブランクウィシュ社、エジソン、ニュージャージ）；ＣＦＴ（建材試験センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）��フラールディンゲン，オランダ）；プロクターアンドギャンブル（Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ）（プロクターアンドギャンブル社、シンシナティー、オハイオ）；ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（ＧＥヘルスケア，チャルフォントストリート、チャイルズ，イギリス）；ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０，メロンパーク，カリフォルニア）；ＯＸＯＩＤ（オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）、ベージングストーク，ハンプシャー，イギリス）；メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）（メガザイム・インターナショナル・アイルランド社、ベイビジネスパーク、ウィックロー、アイルランド）；フィンザイムズ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）（フィンザイムズ・オイ、エスポー、フィンランド）；ケルコ（Ｋｅｌｃｏ）（ＣＰケルコ、ウイルミントン、デラウェア）；コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（コーニングライフサイエンス、コーニング、ニューヨーク）；（ＮＥＮ（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ、ボストン、マサチューセッツ）；ファルマＡＳ（Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ）（ファルマＡＳ，オスロ、ノルウェイ）；ダイナル（Ｄｙｎａｌ）（ダイナル，オスロ，ノルウェイ）；バイオシンセシス（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（バイオシンセシス、ルイスビル、テキサス）；ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・ｋレクション、ロックビル、メリーランド）；ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（ギブコ／ＢＲＬ、グランドアイランド、ニュヨーク）；シグマ（Ｓｉｇｍａ）（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ）；ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュジャージ）；ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）；アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（アプライドバイオシステムズ，フォスターシティー，カリフルニア）；ＢＤバイオサイエンス及びクロンテック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  及び／又はＣｌｏｎｔｅｃｈ）（ＢＤバイオラボサイエンス  クロンテックラボラトリーズ、パルアルト、カリフォルニア）；オペロンテクノロギーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（オペロンテクノロジーズ社、アラメダ、カリフォルニア；ＭＷＧバイオテック（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ＭＷＧバイオテック、ハイポイント、ノースカロライナ）；オリゴズＥｔｃ（Ｏｌｉｇｏｓ  Ｅｔｃ）（オリゴズＥｔｃ社、ウィルソンビル，オレゴン）；バケム（Ｂａｃｈｅｍ）（バケムバイオサイエンス社、キングオブプルシア、ペンシルバニア）；ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン州）；メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）  （メディアテック、ハーンドン、バージニア）；サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）（サンタクルーズバイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア）；オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）（オキソイド社、オグデンスバーグ、ニューヨーク）；ワージントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）（ワージントンバイオケミカルグループ、フリーホルド、ニュジャージ）；ギブコＢＲＬ（ライフテクノロジー社、ゲイサーズバーグ、メリーランド）；ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ミリポア、ビルリカ、マサチューセッツ）；バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（バイオラド、ハーロキューズ、カリフォルニア）；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（インビトロジェングループ、サンディエゴ、カリフォルニア）；ＮＥＢ（ニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベバリー、マサチューセッツ）；シグマ（Ｓｉｇｍａ）（シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー）；ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ピアスバイオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ）；タカラ（Ｔａｋａｒａ）（タカラ・バイオ・インク、大津、日本）；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）（ホフマン・ロシュ，バーゼル，スイス）；ＥＭサイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ＥＭサイエンス、ギボスタウン、ニュジャージー）；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（キアゲン社、ベレニカ，カリフォルニア）；バイオデザイン（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）（バイオデザイン社、ソーコ、メイン）；アプタゲン（Ａｐｔａｇｅｎ）（アプタゲン社、ヘンドン、バージニア）；ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）（ケンドロラブラトリーによるソーバルブランド製品、アッシュビル、ノーソカロライナ）；モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）（モレキュラーデバイスグループ、サニーベル、カリフォルニア）；Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミメアポリス，  ミネソタ）；ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ストラタジェンクロニングシステム，ラホーヤ，カリフォルニア）；マーシュ（Ｍａｒｓｈ）（マーシュバイオサイエンス、ロチェスター、ニューヨーク）；ジーンアート（Ｇｅｎｅａｒｔ）（ジーンアートＧｍｂＨ、レーゲンスブルク，ドイツ）；ババイオテック（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）（バイオテックインスツルメンツ、ウィヌースキー、バーモント）；ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（ビアコア社，ピスカタウェイ、ニュージャージ）；ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）（ペプロテック，ロッキーヒル，ニュージャージ）；シンペップ（ＳｙｎＰｅｐ）（シンペップ，ダブリン，アイルランド）；ニューオブジェクティブ（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）（ニューオブジェクティブブランド；サイエンティフィックインスツルメンツサービス社、リンゴーズ，ニュージャージ）；ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（ウォーターズ社、ミルフォールド、マサチューセッツ）；マトリックスサイエンス（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（マトリックスサイエンス、ボストン、マサチューセッツ）；ディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）（ディオネックスグループ、サニーベル、カリフォルニア）；モンサント（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）（モンサント社、セントルイス、ミズリー）；ウインターシェル（Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ）（ウインターシェルＡＧ、カッセル，ドイツ）；ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ社、フローハムパーク，ニュージャージー）；ハンツマン（Ｈｕｎｔｓｍａｎ）（ハンツマンファーマスーティカル社、ソルトレイクシティー、ユタ）；エニケム（Ｅｎｉｃｈｅｍ）（エニケムイベリカ，バルセロナ、スペイン）；フルカケムＡＧ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ）（フルカケムＡＧ、ブッシュ，スイス）；ギストブロカデス（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）（ギストブロカデス，ＮＶ���デルト，オランダ）；ダウコーニング（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）  （ダウコーニンググループ、ミッドランド、ミネソタ）、及びマイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）（マイクオソフト社、レドモンド、ワシントン）。【０１５０】  以下の実施例に用いる野生型セリンプロテアーゼについての詳細は、ＵＳ０４／３９００６及びＵＳ０４／３９０６６に記載されている。これらの文献を参照により本明細書に援用する。実施例１アッセイ【０１５１】  以下の実施例において、タンパク質同定、適合性ベース試験、安定性ベース試験等の各種試験を行った。明確にするために、アッセイ方法を以下で定義し、個々の実施例で引用する。本発明を開発する間に行われた任意の試験におけるプロトコルの各種変更は実施例で説明する。  Ａ．９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるタンパク質含量決定のためのＴＣＡアッセイ【０１５２】  このアッセイは２３０ＲＰＭの振とう速度及び湿気の高い空気を通気して、３３℃で４日間育成したマイクロタイタープレートからのフルターろ過した培養液の上清を用いて開始した。新しい９６ウェルフラットボトムのプレートをアッセイに用いた。第一に、１００μＬ／ウェルの０．２５Ｎ  ＨＣｌをウェルに添加する。その後、５０μＬのフィルターろ過した培養ブロスをウェルに添加する。「ブランク」の値を決定するために、光散乱／４０５ｎｍにおける吸光度をその後決定する（プレート反応器において５秒混合する）。【０１５３】  試験のために、１００μＬ／ウェルの１５％（Ｗ／ｖ）ＴＣＡをプレートに添加し、室温で５乃至３０分間インキュベーションする。光散乱／４０５ｎｍにおける吸光度をその後決定する（プレート反応器において５秒混合する）。【０１５４】  ＴＣＡを含む試験の値からブランク（ＴＣＡを含まない）の値を引いて、計算を行った。必要であるならば、既知の変換因子を用いてクローンのＡＡＦＰアッセイを用いてＴＣＡの値をキャリブレーションすることにより標準曲線を作成した。しかしながら、ＴＣＡの値は５０乃至５００ｐｐｎではタンパク質の濃度に比例する。従って、優れた性能の変異体の選択の目的のための酵素性能に対して直接的にプロットすることができる。  Ｂ．９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるプロテアーゼのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイ【０１５５】  このアッセイシステムにおいて用いる試薬溶液は、  １．０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）―８０（トリス緩衝液）を含む１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．６、  ２．１０ｍＭＣａＣｌ２及び０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）−８０（トリス緩衝液）を含む１００ｍＭトリス、ｐＨ８．６、  ３．ＤＭＳＯ中１６０ｍＭｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液）（シグマ：Ｓ−７３８８）【０１５６】  ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡワーキング溶液を調製するために、１ｍｌ  ＡＡＰＦストックを１００ｍｌトリス緩衝液に添加し少なくとも１０秒間よく混合する。【０１５７】  このアッセイは１０μｌの希釈プロテアーゼ溶液を各ウェルに添加し、その後１９０μｌの１ｍｇ／ｍｌＡＡＰＦワーキング溶液を添加して行う。この溶液を５秒間混合し、２５℃で、ＭＴＰリーダーに４１０ｎｍにおける吸光度の変化��測定する。このプロテアーゼ活性はＡＵで示す（活性＝△ＯＤ・ｍｉｎ−１．ｍｌ−１）。  Ｃ．ケラチン加水分解活性【０１５８】  このアッセイシステムにおいて用いた試薬を以下に示す。  ケラチン：ＩＮＣ９０２１１１  洗剤：１．６ｇの洗剤を１０００ｍｌの水に溶解する（ｐＨ＝８．２）、１１９０ｍｇのＨＥＰＥＳの他に０．６ｍｌのＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２の１０，０００ｇｐｇを添加して、硬度及びバッファー強度をそれぞれ、６ｇｐｇ及び５ｍＭになるようにする。ｐＨはＮａＯＨで８．２になるように調整する。ピルリルスルホン酸（ＴＮＢＳ）、シグマＰ−２２９７（水中５％溶液）  試薬Ａ：４５．４ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ（メルク６３０８）及び１５ｍｌの４Ｎ  ＮａＯＨを最終容量が１０００ｍｌになるように溶解する（必要に応じて加熱する）  試薬Ｂ：３５．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４１Ｈ２Ｏ（メルク６３４６）及び０．６ｇＭａ２ＳＯ３（メルク６６５７）を最終容量が１０００ｍｌになるように溶解する。方法【０１５９】  インキュベーションの前に一度に少しの部分をとりながらケラチンを１００μｍの篩にかける。その後、１０ｇの１００μｍ未満のケラチンをｐＨを８．２に維持しながら、室温で、２０分間洗剤溶液中で添加した。最後に、この懸濁液を室温で２０分間遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ、ＧＳＡローター、１３，０００ｒｐｍ）。この工程を繰り返した。最後に、ぬれた沈殿物を相容量が２００ｍｌになるように洗剤中に懸濁した。インキュベーションの前に、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）を１ウェル当たり２００μｌのバイオヒットマルチチャンネルピペットと１２００μｌのチップを用いて基質で満たした（２００μｌを６回分注する。ケラチンの沈殿を防ぐためにこの操作はできるだけ早く行う。）。その後、１０μｌのフィルターろ過した培養物をＭＴＰを含む基質に添加した。このプレートをタップで多い、インキュベーター中で２０℃、３時間、３５０ｒｐｍ（Ｉｎｎｏｖａ４３３０［ニューブランスウィック］）で培養した。インキュベーションの後、このプレートを３分間、３０００ｒｐｍ（シグマ  ６Ｋ遠心分離器）で遠心分離した。インキュバータから第一のプレートを除去する前約１５分に、ＴＮＢＳ試薬を試薬Ａ５０ｍｌ当たり１ｍｌＴＮＢＳ溶液を混合して調製した。【０１６０】  ＭＴｐを１ウェル当たり６０μｌのＴＮＢＳ試薬で満たした。インキュベートしたプレートから、１０μｌをＴＮＢＳ試薬Ａを含むＭＴＰに移した。このプレートをタップで覆い、室温及び５００ｒｐｍでベンチシェーカー（ＢＭＧサーモスター）中で２０分間振とうした。最後に、２００μｌの試薬Ｂをウェルに添加して、シェーカーで１分混合し、ＭＴＰリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。  ケラチン加水分解活性の計算【０１６１】  得られた吸光度の値を（実質的に酵素のない）ブランクの値で補正した。得られた吸光度は加水分解活性の測定を提供する。各サンプル（変異体）のパフォーマンスインデックスを計算した。このパフォーマンスインデックスを同じタンパク質濃度の変異体のパフォーマンス（実際の値）と標準酵素のパフォーマンス（理論的な値）を比較した。更に、標準的な酵素のラングミュアの式のパラメー��ーを用いて理論的な値が計算できる。１より大きいパフォーマンスインデックス（ＰＩ）は好ましい変異体（標準（例えば、野生型）と比較して）であり、１のＰＩは標準と同じ性能の変異体を示し、１未満のＰＩは標準より悪い変異体を示す。従って、このＰＩは、特定の環境に用いるのに好ましくない変異体の他に好ましいものも示す。【０１６２】  Ｄ．ジメチルカゼイン加水分解アッセイ（９６ウェル）  このアッセイシステムに用いた試薬を以下に示す；  ジメチルカゼイン（ＤＭＣ）：シグマＣ−９８０１  ＴＷＥＥＮ（商標）−８０：シグマＰ−８０７４  ＰＩＰＥＳ緩衝液（遊離酸）：１５．１ｇのシグマＰ−１８５１を９６０ｍｌの水に溶かす、４Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調節する、１ｍｌの５％ＴＷＥＥＮ（商標）−８０を添加して容量を１０００ｍｌにする。ＰＩＰＥＳ及びＴＷＥＥＮ（商標）−８０の最終濃度はそれぞれ５０ｍＭ及び０．００５％である  ピクリルスルホン酸（ＴＮＢＳ）：シグマＰ−２２９７（水中５％溶液）  試薬Ａ：４５．４ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７１０Ｈ２Ｏ（メルク６３０８）及び１５ｍｌの４Ｎ  ＮａＯＨを最終容量が１０００ｍｌになるように溶解する（必要に応じて加熱する）  試薬Ｂ：３５．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４１Ｈ２Ｏ（メルク６３４６）及び０．６ｇＭａ２ＳＯ３（メルク６６５７）を最終容量が１０００ｍｌになるように溶解する方法【０１６３】  基質を調節するために。４ｇのＤＭＣを４００ｍｌのＰＩＰＥＳ緩衝液に溶解した。フィルターろ過した培養上清をＰＩＰＥＳ緩衝液で希釈して、対照の最終濃度が育成プレート中２０ｐｐｍにした。その後、１０μｌの希釈した各上清をＭＴＰのウェル中にある２００μｌの基質に添加した。このＭＴＰプレートをタップで覆い、数秒攪拌して、攪拌をせずに３７℃のオーブン内で２時間置いた。【０１６４】  このオーブンから第一のプレートを取り出す１５分前に、試薬Ａ５０ｍｌ当たり１ｍｌのＴＮＢＳ溶液を混合してＴＮＢＳ試薬を調製した。ＭＴＰを１ウェル当たり６０μｌのフィルターろ過した上清で満たした。インキュベートしたプレートを数秒振とうして、１０μｌをＴＮＢＳ試薬Ａを含むＭＴＰに移した。このプレートをタップで覆い、室温及び５００ｒｐｍでベンチシェーカー（ＢＭＧサーモスター）中で２０分間振とうした。最後に、２００μｌの試薬Ｂをウェルに添加して、シェーカーで１分混合し、ＭＴＰリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ジメチルカゼイン加水分解活性の計算【０１６５】  得られた吸光度の値を（実質的に酵素のない）ブランクの値で補正した。得られた吸光度を加水分解活性の測定に提供する。サンプルの任意の活性は確定しているタンパク質の濃度で吸光度を割ることにより計算した。  Ｅ．熱安定性アッセイ【０１６６】  このアッセイは緩衝された培養上清の過熱後及び前のジメチルカゼイン加水分解に基づいている。ジメチルカゼイン加水分解アッセイで説明したのと同じ化学物質及び試薬溶液を用いた。方法【０１６７】  フィルターろ過された上清を２０ｐｐｍのＰＩＰＥＳ緩衝液（育成プレートにおける対照の濃度に基づいて）で希釈した。その後、５０μｌの各希釈上清を空のＭＴＰに入れた。このＭＴＰプレートをｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ中で６０℃、４００ｒｐｍで９０分間、インキュベーションした。このプレートを氷上で５分間冷却した。その後、１０μｌの溶液を１ウェル当たり２００μｌのジメチルカゼインを含む基質新しいＭＴＰに添加した。このＭＴＰをタップで覆い、数秒攪拌した後、攪拌を行わずに２時間３７℃のオーブン内に置いた。ＤＭＣ加水分解アッセイで用いたものと同じ検出方法を用いた。熱安定性の計算【０１６８】  サンプルの残余活性を最終の吸光度と開始の吸光度の比で示す。これらの吸光度はブランクで補正されている。  Ｆ．ＬＡＳ安定性【０１６９】  ＬＡＳ安定性は、０．０６％ＬＡＳ（ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム）の存在下で試験プロテアーゼをインキュベーションした後に測定し、残余活性をＡＡＰＦアッセイに用いて決定した。  試薬  ドデシルベンゼンスルホネート、硫酸ナトリウム（＝ＬＡＳ）：シグマＤ−２５２５  ＴＷＥＥＮ（商標）−８０：シグマＰ−８０７４  ＴＲＩＳ緩衝液（遊離酸）：６．３５ｇのシグマＴ−１３７８を９６０ｍｌの水に溶解した、ｐＨを４Ｎ  ＨＣｌで８．２に調節した。ＴＲＩＳの最終濃度は５２．５ｍＭである  ＬＡＳストック溶液：ＭＱ水中１０．５％ＬＡＳ溶液（＝１０．５ｇ／１００ｍｌＭＱ）  ＴＲＩＳ緩衝液：１００ｍＭ／ｐＨ８．６（１０００ｍＭＴｒｉｓ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）  ＴＲＩＳ−Ｃａ緩衝液：ｐＨ８．６（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭＣａＣｌ２／０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）  設備機器  フラットボトムＭＴＰ：Ｃｏｎｓｔａｒ（＃９０１７）  バイオメリックＦＸ  ＡＳＹＳマルチピペッター  スペクトラマックスＭＴＰリーダー  ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー イノバ４３３０インキュベーター／シェーカー  バイオヒットマルチチャンネルピペッター  ＢＭＧサーモスターシェーカー方法【０１７０】  ０．０６３％ＬＡＳ溶液を５２．５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．２中で調製した。このＡＡＰＳワーキング溶液は、１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌ  ＡＡＰＦストック溶液（ＤＭＳＯ中）を１００ｍｌ（１００ｍＭ）ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．６に添加して調製した。上清を希釈するために、フラットボトムプレートを希釈緩衝液で満たし、上清の一部分を添加して、よく混合した。希釈の比は育成プレート中のＡＳＰ対照の濃度に依存する（ＡＡＰＦ活性）。所望のタンパク質濃度は８０ｐｐｍであった。【０１７１】  １０μｌの希釈した上清を１ウェル当たり１９０μｌの０．０６３％ＬＡＳに添加した。このＭＴＰをタップで覆い、数秒振とうし、２５℃又は３５℃の温度で、２００ｒｐｍの攪拌速度のインキュベーター（イノーバ４２３０）に６０分置いた。初期活性（ｔ＝１０分）を、インキュベーションの１０分後に各ウェルの混合物を１９０μｌのＡＡＰＦワーキング溶液を含む新しいＭＴＰに移すことにより決定した。これらの溶液を混合してＡＡＰＦ活性をＭＴＰリーダー（２５℃において５分間で２５回測定する）を用い測定した。【０１７２】  最終活性（ｔ＝６０）をインキュベーションの６０分後にインキュベーションプレートから別の１０μｌの溶液を除去して決定した。このＡＡＰＦ活性を上で述べたのと同様の方法で決定した。計算は以下のように行った；  残余活性（％）＝［ｔ＝６０の値］＊１００／［ｔ＝１０の値］実施例２グラム陰性アルカリ性バクテリア６９Ｂ４から６９Ｂ４プロテアーゼの生成【０１７３】  この実施例は、本発明により提供される、新規なプロテアーゼ６９Ｂ４の単離に用いたセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株９６Ｂ４について説明する。このアルカリ性微生物であるセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４（ＤＭＳ１６０３５）は（ｇＬ−１）を含むアルカリカゼイン培地状で３７℃で単離された。（例えば、Duckworth  et  al，FEMS  Microbiol.  Ecol.，19:181-191[1996]参照のこと）  グルコース（メルク１．０８３４２）：１０  ペプトン（ディフコ０１１８）：５  イースト抽出物（ディフコ０１２７）：５  Ｋ２ＨＰＯ４：１  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．２  ＮａＣｌ：４０  Ｎａ２ＣＯ３：１０  カゼイン：２０  アガー：２０。【０１７４】  セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４を育成するために、以下の追加的なアルカリインキュベーション培地も用いた グラントアルカリ性培地（ＧＭＡ）溶液Ａ（ｇＬ−１）  グルコース（メルク１．０８３４２）：１０  ペプトン（ディフコ０１１８）：５  イースト抽出物（ディフコ０１２７）：５  Ｋ２ＨＰＯ４：１  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．２  ８００ｍｌの脱イオン水に溶解し、オートクレーブで滅菌した ＧＭＡ溶液Ｂ（ｇＬ１）  ＮａＣｌ：４０  Ｎａ２ＣＯ３：１０【０１７５】  ２００ｍｌの脱イオン水に溶解し、オートクレーブで滅菌した。【０１７６】  混合溶液Ａ（８００ｍｌ）と混合溶液Ｂ（２００ｍｌ）を混合して完全なＧＡＭ培地を調製した。固形培地はアガロース（２％ｗ／ｖ）を添加することにより調製できる。育成条件【０１７７】  培養物の新しく凍結されたグリセロールバイアル（−８０℃で２０％ｖ／ｖの凍結グリセロールとして貯蔵）から、アガロースプレート中に、上で説明したグラントアルカリ性培地（ＧＡＭ）の上にオキュレーションループを用いて、微生物を接種し、少なくとも２日間３７℃で育成した。１つのコロニーをｐＨ１０で１００ｍｌＧＭＡを含む５００ｍｌ振とうフラスコに接種するのに用いた。（目視により）良好な育成がえら得れるまで、１乃至２日間、ロータリーシェーカーを用いてこのフラスコを３７℃でインキュベートした。その後、１００ｍｌの培養物のブロスを５リットルのＧＭＡを含む７リットルの発酵槽に接種するのに用いた。この発酵槽はプロテアーゼの最大生産量を得るために、３７℃で２乃至３日間稼動させた。十分に通気した条件を、約５００ｒｐｍで回転するインペラー領域に５Ｌ／分の速度で空気をインジェクションし続けることにより維持した。塩を用いてｐＨを１０に設定したが、発酵の間には調整はしていない。【０１７８】  ６９Ｂ４粗酵素サンプルの調製  培養ブロスを発酵槽より回収し、１０℃、５００×ｇで３０分間遠心分離して、細胞を除去した。得られた上清を、ＳｅｉｔｚＥＫＳ（ＳｅｉｔｚＥＫＳフィルターシステム）上でデプス（ｄｅｐｔｈ）ろ過により精製した。得られた滅菌図にの培養物の上清を１０ｋＤａをカットオフする（パルオメガ１０ｋＤａミニカセット（Ｐａｌｌ）を用いたウルトラフィルトレーションにより、約１０倍に濃縮した。得られた濃縮粗６９Ｂ４サンプルを更なる使用に供するまで−２０℃で貯蔵した。精製【０１７９】  細胞が分離された培養ブロスは８ｋＤの分子量をカットオフする（ＭＷＣＯ）スペクトラ−プロ７（スペクトラム）透析チューブを用いて、２０ｍＭ（２−（４−モルフォリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ４．５、１ｍＭＣａＣｌ２について透析された。この透析は、一晩又は好ましくはのサンプルの伝導性がＭＥＳ緩衝液の伝導率以下になるまで行った。透析された酵素サンプルは１０×１００ｍｍ（７．８４５ｍｌ）のＰＯＲＯＳ高密度スルホプロピル（ＨＳ）２０（２０ミクロン）カチオン交換カラム（パーセプティブバイオシンセシス）を有するＢｉｏ  Ｃａｄ  ＶＩＳＩＯＮ（アプライドバイオシステム）を用いて精製した。あらかじめ５ｍｌ／分で平衡化したカラムに酵素を負荷した後に、このカラムを２５カラム容量の２５ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．２、１ｍＭＣａＣｌ２乃至２５ｍＭ  ＣＮ−［２−ヒドロキシメチル］ピペリジン−Ｎ’−［２−エタン］スルホン酸［Ｃ８Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ、ＣＡＳ＃７３６５−４５−９］（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ８．０、１ｍＭＣａＣｌ２のｐＨ勾配で、４０ｍｌ／分で洗浄した。分画（８ｍｌ）を収集した。ｐＨ８の洗浄ステップは、５カラム容量に固定されており、勾配（３５カラム容量の同じ緩衝液で、０乃至１００ｍＭ  ＮａＣｌ）用いて溶出した。分画中のプロテアーゼ活性はｐＮＡアッセイ（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイ；ＤｅｌＭａｒら、上記）を用いてモニターした。４０ｍＭＮａＣｌで溶出されたプロテアーゼ活性を濃縮し、２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．８、１ｍＭＣａＣｌ２へと、（５Ｋ  ＷＭＣＯ  ＶＩＶＡサイエンス  ２０ｍｌ  濃縮器を用いて）バッファー交換を行った。この物質を酵素の特徴づけを行うために用いた。実施例３バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡＳＰプロテアーゼ生産【０１８０】  バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における６９Ｂ４プロテアーゼ（本明細書において「ＡＳＰ」、「Ａｓｐ」、「ＡＳＰプロテアーゼ」、及び「Ａｓｐプロテアーゼ」とも言う）を生産するために行う実験は米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／５７６，３３１に記載されている。この文献を参照により本明細書に援用する。【０１８１】  このＤＮＡ配列（合成ＡＳＰ  ＤＮＡ配列）を以下に示す。コドンの使用についてはバチルス種に適合させ、この配列は野生型ＡＳＰ前駆体タンパク質をコードしている。
【式４】
【０１８２】
2009540862.tif 000012
【０１８３】  上記の配列において、太字は成熟タンパク質をコードするＤＮＡを示し、標準的なフォントはリーダー配列を示し、下線により示されるものはＮ末端及びＣ末端プロ配列を示す。合成ＡＳＰ遺伝子の発現
【０１８４】  合成ＡＳＰ遺伝子の発現は米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／５７６，３３１に記載されている。この文献を参照により本明細書に援用する。実施例４組合せ変異及び複数変異ライブラリーの生成
【０１８５】  本実施例において、組合せ変異及び複数変異ライブラリーを構築するのに用いる方法を記載する。組合せ変異の構築
【０１８６】  ＡＳＰの組合せ変異の構築は米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／５７６，３３１に記載されている。本文献を参照により本明細書に援用する。複数変異ライブラリー構築物
【０１８７】  反応におけるプライマー濃度以外はストラタジェンＱＣＭＳキットに従って複数変異ライブラリーを構築した。具体的には、１μＬのメチル化された精製ｐＵＣ１８−ＡＳＰプラスミド（約７０ｎｇ）を滅菌脱イオン水、１，５μＬのｄＮＴＰ、２．５μＬの１０×緩衝液、１μＬの酵素ブレンド、及び１．０μＬの変異体プライマー混合物と混合した（合計で、１００ｐｍｏｌのプライマー濃度になる）。このプライマー混合物を１８の変異プライマーのそれぞれについて１０μＬ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）、を用いて調製し、ストラタジェンにより推奨されているように、このライブラリーに５０ｎｇの各プライマーを転化して、変異誘発の前の段階でいくらかの変異誘発を得た。従って、この方法は変異誘発の段階において各反応中に１００ｐｍｏｌのプライマーを含むように変更されている。サイクル条件は、薄壁の０．２ｍｌＰＣＲチューブを用いてＭＪリサーチＰＴＣ−２００熱サイクル器を用いて、９５℃を１分、これに続き、９５℃を１分、５５℃を１分、及び６５℃を１２分のサイクルを３０サイクル行った。反応生成物を１μＬのＤｐｎＩ（ＱＣＭＳ付属）で、３７℃で一晩インキュベートして制限消化した。更に０．５μＬのＤｐｎＩを添加し、１時間反応物をインキュベートした。
【０１８８】  続いて、ライブラリーＤＮＡ（変異された１本鎖ｐＵＣ１８−ＡＳＰ生成物）を電気穿孔法により適合したＥ．ｃｏｌｉ細胞（インビトロジェン、カタログＮｏ．Ｃ４０４０−５２、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）ＴＯＰ１０Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）Ｅ．Ｃｏｌｉ，ｄａｍ＋）に導入し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むアラープレート上で選択育成を行い、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内にＡＳＰ複数変異ライブラリーを形成する。（数千のうちの数十の）コロニーを収穫し、キアゲン  スピン  ミニピレップＤＮＡキット（カタログＮｏ．２７１０６）を用いて、キアゲン  ミニピレップキットマニュアルに従い、プラスミドＤＮＡを調製した。このミニピレップＤＮＡを、キットに付属している５０μＬのキアゲンＥＢ緩衝液で溶出した。
【０１８９】  ミニプレップＤＮＡはＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ制限酵素を用いて消化した。ＡＳＰライブラリーフラグメント混合物（ＰｓｔＩ×ＨｉｎｄＩＩＩ）をゲル精製し、インビトロジェンＴ４  ＤＮＡリガーゼ（カタログＮｏ．１５２２４−０２５）を用いて、粘着末端の一般的なクローニングのためのプロトコルに従って、４１５４ベースペアのＨｉｎｄＩＩＩ×ＰａｔＩｐＨＰＬベクターフラグメント内でクローン化した。他のアプローチにおいて、合成ＡＳＰライブラリーフラグメントをＧｅｎｅＡｒｔにより生成した。これらのＡＳＰライブラリーフラグメントもＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化され、リガーゼ反応により、４１５４ベースペアのＨｉｎｄＩＩＩ×ＰａｔＩｐＨＰＬベクターフラグメント内でクローン化した。
【０１９０】  このリガーゼ反応混合物を直接バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入するために、ＤＮＡライブラリー（ＨＰＬＴ内でクローン化されたＡＳＰライブラリーフラグメント混合物）をＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  キット（アマシャム、カタログ＃２５−６４００）を用いて増幅した。この目的のために、１μＬのリゲーション反応混合物をＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  キットに付属の５μＬのサンプル緩衝液と混合して、９５℃で３分間加熱して、ＤＮＡを変性させた。この反応物を氷上に２分間置き、その後、遠沈させた。次に、５μＬの反応緩衝液及びＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  キットに付属の０．２μＬのｐｈｉ２９ポリメラーゼを加えて、反応物をＭＪリサーチＰＣＲマシーン内で３０℃、４時間、インキュベートした。ｐｈｉ２９酵素は前記ＰＣＲマシーンで、６５℃で１０分間、インキュベートすることにより、加熱させて失活させた。
【０１９１】  ライブラリーをバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に形質転換するために、０．１μＬのＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  キット反応生成物を５００μＬの適合するバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（△ａｐｒＥ、△ｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、△ｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、△ａｍｙＥ：：（ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ）と混合し、１時間、３７℃で激しく振とうし、この１００μＬ及び５００μＬを２０ｐｐｍの硫酸ネオマイシン（シグマ、カタログＮｏ．Ｎ−１８７６；１グラム当り７３２μｇのネオマイシンを含む）及び０．５％スキムミルクを含むＨＩ−アガープレートに置いた。ライブラリーからの７５のコロニー配列決定のために取り出された。
【０１９２】  変異誘発は成功し、１４％のクローンだけが、骨格配列と同じであり（Ｒ０１４１−Ａ０６４Ｋ−Ｔ０８６Ｋ−Ｔ１１６Ｅ−Ｒ１２３Ｆ）、約３％のクローンが更なる変異を有していた。配列決定された残りのクローン（７２％）は全てが変異体で、これらのうちの約９４％が独特の変異体であった。このライブラリーの配列決定の結果を以下の表９に示す。【表９】
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実施例５複数の性質についての有害な変異の相関関係
【０１９３】  この実施例において、任意の性質に対して有害な変異体はあらゆる他の性質について有害な変異体と相関関係があるという、主題を例示する。ここで示されるように、わずかな数の部位のみが（５乃至１０％）、全ての性質において悪くなる変異を有していた。これらの部位は折りたたみと定義し、進化において保存されている。このことは、任意の性質について有用な変異を同定することはその性質について真の予測可能なスクリーニングを必要とするが、任意の性質について有害であると思われる変異体の同定は、本発明の方法を含むがこれらに限定されない、任意のスクリーニングを用いることで達成できることを示唆している。
【０１９４】  変異体酵素（ＡＳＰ、ＡＣＴ、及びＮＰＲｅ）は本明細書及び米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏｓ．１０／５７６，３３１、１０／５８１，０１４、１１／５８１，３３４に記載の方法を用いて生成される。これらの文献を参照により本明細書に援用する。以下に示す表は、５％より高い活性を有する変異体の数と、５％より低い活性を有する変異体の数を、２つの性質について相関係数により対比較を行ったものである。この実施例で用いたアッセイシステムはこのアプリケーションに提供される。本明細書において用いる性質は、ＡＳＰに対するカゼイン活性（ＣＡ）、ケラチン活性（ＫＥＲ）、ＡＡＰＦ活性（ＡＡＰＦ９、ＬＡＳ安定性（ＬＡＳ）、及び熱安定性、並びにＡＣＴについての過酸形成（ＰＡＦ）、及び過酸分解性（ＰＡＤ）である。
【０１９５】  以下の表において、相関があるとされた性質は（相関係数＞０．５）、ＡＳＰについてのＣＡＳ、ＫＥＲ、及びＡＡＰＦだけである。他の全ては相関していなかった（相関係数＜０．３）。相関していなかったという事実に関わらず、変異体が２つの性質について有害であろうという可能性は、たまたま予期されたものよりも高かった。表において、可能性に基づいて予測される観察される変異体の数の計算による割合を示す。１よりおおきい数は正の相関を示し、１未満の数は負の相関を示す。【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質エンジニアリングのための方法であって、ａ）タンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、ｂ）所望の試験で、少なくとも１つの所望の性質について、前記変異体のタンパク質変異体のライブラリーを試験する工程、ｃ）前記少なくとも１つの所望の性質のための値の範囲を同定する工程、ｄ）前記所望の好ましい結果に関係する値の範囲内の最小値を決定する工程、及びｅ）前記少なくとも１つの所望の性質の前記範囲において前記最小値を超える少なくとも１つの変異を有するタンパク質変異体の複数を提供し、それゆえ少なくとも１つの変異を含むタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程を含み、前記ライブラリーは前記所望の試験において好ましい結果を有するメンバーを多く含む。
【請求項２】
前記好ましい結果が、前記工程ａ）において観察された最大値よりも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％より大きい、請求項２の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が酵素である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記酵素がプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼである、請求項２の方法。
【請求項５】
タンパク質エンジニアリングのための方法であって、ａ）タンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、ｂ）所望の試験における、少なくとも２つの所望の性質について、前記変異体のタンパク質変異体のライブラリーを試験する工程、ｃ）前記少なくとも２つの所望の性質についての値の範囲を同定する工程、ｄ）前記所望の試験における好ましい結果に関係する値の範囲内の最小値を決定する工程、及びｅ）前記少なくとも２つの所望の性質の範囲において前記最小値を超えるタンパク質変異体の複数を提供する工程を含み、それゆえ前記ライブラリーは前記所望の試験において好ましい結果を有するメンバーを多く含む、方法。
【請求項６】
前記好ましい結果が、前記工程ａ）において観察された最大値よりも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％より大きい、請求項５の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が酵素である、請求項１の方法。
【請求項８】
前記酵素がプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼである、請求項７の方法。
【請求項９】
タンパク質エンジニアリングのための方法であって、ａ）野生型タンパク質と前記野生型タンパク質のタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、ｂ）前記タンパク質変異体のライブラリー及び野生型タンパク質を、所望の試験において、少なくとも１つの所望の性質を試験する工程、ｃ）前記少なくとも１つの所望の性質のための値の範囲を同定する工程、ｄ）前記所望の試験において、好ましい結果に関係する前記範囲の値の中の最小値を決定する工程、ｅ）前記野生型について得られた結果と比較して好ましい結果を有するタンパク質変異体を同定する工程において、前記好ましい結果は所望の性質について改善されていることを特徴とする工程、及びｆ）前記少なくとも１つの所望の性質の前記範囲の最小値を超えるタンパク質変異体複数を同定し、それにより、所望の試験において、好ましい結果を有するメンバーを多く含む改良されたタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、を含む方法。
【請求項１０】
更にパフォーマンスインデックスを決定する工程を含み、前記パフォーマンスインデックスが改良されたタンパク質変異体のそれぞれについて得られた値を、野生型タンパク質について得られた値で割ることにより決定される、請求項９の方法。
【請求項１１】
改良されたタンパク質変異体を同定する工程を更に含み、前記改良されたタンパク質変異体が、所望の試験において、１．１より大きいパフォーマンスインデックスの値を達成する、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が酵素である、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記酵素がプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が抗体及び成長因子から選択される請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記野生型タンパク質がプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素の成熟フォームである、請求項９の方法。
【請求項１６】
請求項所望の性質が、電荷、洗浄性能、硬表面洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性、洗剤安定性、基質結合性、酵素抑制、発現レベル、反応速度、及び基質分解性から選択される、請求項９の方法。
【請求項１７】
前記野生型及びタンパク質変異体が少なくとも１つの洗剤組成物の成分である、請求項９の方法。
【請求項１８】
前記洗浄性能がｐＨ５乃至１２．０のｐＨを有する粉末又は液体洗剤に製剤化された洗浄組成物中で試験される、請求項１６の方法。
【請求項１９】
タンパク質折りたたみについて親タンパク質の改良された変異体を生成する方法であって、ａ）所望のアッセイにおいて所望の性質の範囲全域のタンパク質の折りたたみにおける、試験タンパク質の多重変異体を試験する工程、ｂ）所望の試験において好ましい結果に関係する所望の性質の範囲内で最小値を決定する工程、ｃ）所望のアッセイにおいて前記折りたたみの親タンパク質をアッセイする工程、及びｄ）前記改良された変異体が所望の性質の範囲の最小値よりも大きくなるように、親タンパク質においてアミノ酸置換を導入することにより前記親タンパク質の改良された変異体を生成する工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記親タンパク質及び試験タンパク質が異なることを特徴とする、請求項１９の方法。
【請求項２１】
更に、パフォーマンスインデックスを決定する工程を含み、前記パフォーマンスインデックスが改善されたタンパク質変異体について得られた値を親タンパク質について得られた価で割ることにより決定される、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記試験タンパク質及び親タンパク質が酵素である、請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記酵素がプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、エラスターゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
親タンパク質が、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エラスターゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素の成熟フォームである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記所望の性質が電荷、洗浄性能、硬表面洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性、洗浄安定性、基質結合性、酵素抑制、発現レベル、反応速度、及び基質分解性から選択される、請求項１９の方法。
【請求項２６】
前記試験タンパク質及び親タンパク質が少なくとも１つの洗浄組成物の成分である、請求項１９の方法。