【手続補正書】
【提出日】平成27年7月27日(2015.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを生産することのできる組み換え微生物であって、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、並びに
ａ．イソプレンシンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるイソプレンシンターゼポリペプチド、及び
ｂ．メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチド
をコードしている１つ以上の核酸を含み、
前記組み換え微生物を適切な培地で培養することで、前記ポリぺプチドの生産及びイソプレンの合成が提供される、組み換え微生物。
【請求項２】
マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子である、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
前記アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子が、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上同一であるアミノ酸配列を有し、かつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている、請求項２に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドであるか、又はその変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）とヤマナラシ（Populus tremula）の交雑種由来のポリペプチド、又はそれらの変異体由来のポリペプチドである、請求項４に記載の組み換え微生物。
【請求項６】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はクズ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）、又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項５に記載の組み換え微生物。
【請求項７】
（ｂ）のＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が異種核酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項８】
（ｂ）のＭＶＡ経路の１つ以上のポリぺプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が、内在性核酸のコピーである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項９】
ＭＶＡ経路の前記１つ以上のポリぺプチドが、（ａ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｃ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素；（ｄ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０】
イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１１】
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１２】
ＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が異種核酸である、請求項１１に記載の組み換え微生物。
【請求項１３】
ＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が内在性核酸のコピーである、請求項１１に記載の組み換え微生物。
【請求項１４】
前記ＤＸＰ経路のポリペプチドがＤＸＳである、請求項１３に記載の組み換え微生物。
【請求項１５】
前記１つ以上の異種核酸が、誘導型プロモーター又は構成型プロモーター下に配置される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１６】
前記１つ以上の異種核酸が、１つ以上のマルチコピープラスミドにクローン化される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１７】
前記１つ以上の異種核酸が、細胞の染色体に組み込まれる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１８】
前記微生物が、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞又は酵母細胞である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１９】
前記微生物がバクテリア細胞である、請求項１８に記載の組み換え微生物。
【請求項２０】
前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項１９に記載のバクテリア細胞。
【請求項２１】
前記バクテリア細胞が、大腸菌（E. coli）、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項２０に記載のバクテリア細胞。
【請求項２２】
前記バクテリア細胞が大腸菌（E. coli）細胞である、請求項２１に記載のバクテリア細胞。
【請求項２３】
前記バクテリア細胞がＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である、請求項２１に記載のバクテリア細胞。
【請求項２４】
前記バクテリア細胞がコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）細胞である、請求項２１に記載のバクテリア細胞。
【請求項２５】
前記微生物が藻類細胞である、請求項１８に記載の組み換え微生物。
【請求項２６】
前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類（chlorarachniophytes）、ミドリムシ類（euglenids）、クロミスタ類（chromista）、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項２５に記載の藻類細胞。
【請求項２７】
前記微生物が真菌細胞である、請求項１８に記載の組み換え微生物。
【請求項２８】
前記真菌細胞が糸状菌である、請求項２７に記載の真菌細胞。
【請求項２９】
前記微生物が酵母細胞である、請求項１８に記載の組み換え微生物。
【請求項３０】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）からなる群から選択される、請求項２９に記載の酵母細胞。
【請求項３１】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である、請求項３０に記載の酵母細胞。
【請求項３２】
イソプレンの生産方法であって、
ａ．請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組み換え微生物を培養する工程と、
ｂ．イソプレンを生産させる工程と
を含む方法。
【請求項３３】
前記組み換え微生物により生産された前記イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項３２に記載の方法。