【手続補正書】
【提出日】平成27年2月2日(2015.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質含有溶液のタンパク質構成成分を分離するためのクロマトグラフィーによる方法であって、前記溶液が、インスリンペプチド、および1つまたは複数の二価または多価の金属イオンを含み、前記インスリンペプチドが、二価または多価の金属イオンの存在下で、自己会合することおよび/または構造的に変化することが可能であり、前記方法が、
a.タンパク質含有溶液をクロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、インスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料からインスリンペプチドを、最大でも8.5のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用したインスリンペプチドの少なくとも75質量％に相当するインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法。
【請求項２】
インスリン含有溶液のタンパク質構成成分を分離するためのクロマトグラフィーによる方法であって、前記溶液が、亜鉛および二価の亜鉛イオンの存在下で、自己会合することおよび/または構造的に変化することが可能であるインスリンペプチドを含み、前記方法が、
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、最大でも6.8のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用した目的のインスリンペプチドの少なくとも90質量％に相当する目的のインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法。
【請求項３】
二価の金属イオンが、Zn2+であり、溶液中の亜鉛イオンの濃度が、0.01〜200mMの範囲である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
亜鉛イオンとインスリンペプチドとの電荷当量の比が、典型的には、0.1:1〜50:1である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
溶離剤のpHが、最大でも6.8の範囲である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(b)において収集したインスリンペプチドのプールが、ステップ(a)においてカラムに適用したインスリンペプチドの少なくとも91質量％、または少なくとも92質量％、または少なくとも93質量％、または少なくとも94質量％、または少なくとも95質量％、または少なくとも96質量％に相当する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
インスリンペプチドが、天然に存在するインスリンまたはその類似体であるインスリン誘導体およびそのZn2+複合体から選択され、
前記類似体が、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基または親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に結合された側鎖を有し、
前記側鎖が、一般式:
-W-X-Y-Z
[式中、Wは、
- 側鎖中にカルボン酸基を有し、そのカルボン酸基のうちの1つを用いて、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってもしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成するα-アミノ酸残基、
- アミド結合を介して一緒になって連結された2、3もしくは4つのα-アミノ酸残基から構成され、アミド結合を介して、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖{Wのアミノ酸残基は、中性の側鎖を有するアミノ酸残基、および側鎖中にカルボン酸基を有する(したがって、Wが、側鎖中にカルボン酸基を有する少なくとも1つのアミノ酸残基を有する)アミノ酸残基の群から選択される}、または
- Xから、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基への共有結合
であり、
Xは、
a)Wが、アミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合を形成する、または
b)Wが、共有結合である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中のN末端のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合を形成する、
- -CO-;
- -CH(COOH)CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-;
- -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CO-;または
- -N(CH2COOH)CH2CH2CO-
であり、
Yは、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2または3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を10〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- 式-(CH2)vC6H4(CH2)w-{式中、vおよびwが整数であるかまたはそれらのうちの1つがゼロであり、vとwとの和が、6〜30の範囲にある}の二価の炭化水素鎖
であり、  
Zは、
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
- -CH(COOH)2;
- -N(CH2COOH)2;
- -SO3H;または
- -PO3H;
である]
を有する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
インスリンペプチドが、LysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンである、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
インスリン含有溶液のタンパク質構成成分を分離するための請求項1から8のいずれかに記載のクロマトグラフィーによる方法であって、前記溶液が、LysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンおよび二価の亜鉛イオンを含み、前記方法が、
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、6.4〜6.8の範囲のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用したLysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンの少なくとも90質量％に相当するLysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンのプールを収集するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
エタノールおよびトリエタノールアミン(treethanolamine)を含む洗浄用緩衝液を使用する洗浄ステップが、ステップ(a)の後かつ溶出ステップ(b)の前に含まれる、請求項1、2または9に記載の方法。
【請求項１１】
インスリンペプチドが、
式:
【化１】
2014504621.tif 000001
[式中、
Insは、親インスリン部分であり、Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Zは、置換基であり、この場合、Insが、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と、置換基のQ1またはQ2中のCO基との間のアミド結合を介して、置換基に結合しており、
それぞれのnは独立に、0、1、2、3、4、5または6であり、
Q1は、
- アミノ酸と側鎖中のカルボン酸とのアミノ酸アミド、または無電荷の側鎖を有するアミノ酸{このアミノ酸アミドまたはアミノ酸は、そのカルボン酸基を用いて、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってまたはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成する}、あるいは
- アミド結合を介して一緒になって連結された、前記の2、3または4つのα-アミノ酸アミドまたはアミノ酸の残基から構成され、アミド結合を介して、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖、あるいは
- 結合
であり、
Q2は、
- -COCH(CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2OCH2CONH-
- -CO-((CR5R6)1-6 -NH-CO)1-4-;
- -CO-((CR5R6)1-6 -CO-NH)1-4-、{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、または
- 結合
であり、
ただし、
- Q1またはQ2のうちの少なくとも1つは、結合ではなく、
- Q2は、nが0または1である場合には、-CO-(CH2)2-CO-NH-ではなく、X1は、結合であり、Q3は、(CH2CH2O)2-、(CH2CH2O)3-または(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)-であり、
- Q1またはQ2中のアミンが、置換基の残りと結合を形成する場合には、アミンは、カルボニル基を介して、置換基の残りに結合しなければならず、
Q3、Q4およびQ5は相互に独立に、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2もしくは3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を4〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-、
- -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、
- -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-{式中、Arは、アリーレンもしくはヘテロアリーレンであり得、アリーレンもしくはヘテロアリーレンは、-CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2(式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る)からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得る}、
- (CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-もしくは(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-、-(CH2OCH2)y-{式中、yは、1〜20である}、
- -CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2{式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る}からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得るアリーレンもしくはヘテロアリーレン、
-式
-(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)W-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)Z-
{式中、Arは、上記の通り定義され、Y1〜Y6は相互に独立に、O、S、S=O、SO2もしくは結合であり得、s、w、tおよびzは相互に独立に、ゼロもしくは1〜10の整数であり、s、w、tおよびzの和は、4〜30の範囲に及び、v1、v2およびv3は相互に独立に、ゼロもしくは1であり得、ただし、Y1〜Y6は、相互に連結せず、構造-O-(CH2)1-O-は生じない}
の鎖、または
- 結合
であり得、
ただし、Q3〜Q5のうちの少なくとも1つは、結合でなく、
X1、X2およびX3は相互に独立に、
- O、
- -C=O、
- 結合、
- NCOR1{式中、R1は、H、-CH3または-(CH)1-6-CH3であり得る}、または、
- 
【化２】
2014504621.tif 000002
{式中、Rは、水素、C1-3-アルキル、C2-3-アルケニルまたはC2-3-アルキニルである}
であり、
ただし、
X1、X2およびX3は、Zに結合し得ず、
X1、X2およびX3がOである場合には、X1、X2およびX3は、Q3、Q4およびQ5中のOには直接結合せず、
Zは、-COOH、-CO-Asp、-CO-Glu、-CO-Gly、-CO-Sar、-CH(COOH)2、-N(CH2COOH)2、SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-PO3H2、-テトラゾル-5-イルまたは-O-W1、
{式中、W1は、アリーレンまたはヘテロアリーレンであり、アリーレンまたはヘテロアリーレンは、テトラゾル-5-イル、-COOH、-SO3H、-(CH2)1-6-SO3H、-(CH2)1-6-O-PO3H2、-CONR3R4または-SO2NR3R4(式中、R3およびR4は相互に独立に、H、-(CH2)1-6-SO3Hまたは-(CH2)1-6-O-PO3H2であり得る)からなる群から選択される1つまたは2つの基で置換され得、ただし、Zが、-O-W1である場合には、Q1は、存在しなければならない}
である]
を有するインスリン誘導体
およびそのZn2+複合体である、請求項1から6に記載の方法。
【請求項１２】
二価または多価の金属イオンの存在下で、自己会合することおよび/または構造的に変化することが可能であるインスリンペプチドのイオン交換クロマトグラフィーにおいて、
a.インスリンペプチドと関連のある不純物との最適な分離を得るための二価または多価の金属イオンを使用することによって、ピークの形状を制御する方法であって、
二価の金属イオンが、インスリンペプチドのフロンティングピークの形状を確保するために添加されており、この場合、関連のある不純物は、インスリンペプチドの前に溶出する、方法。
【請求項１３】
インスリンペプチドが、天然に存在するインスリンまたはその類似体であるインスリン誘導体およびそのZn2+複合体から選択され、
前記類似体が、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基または親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に結合した側鎖を有し、
前記側鎖が、一般式:
-W-X-Y-Z
[式中、Wは、
- 側鎖中にカルボン酸基を有し、そのカルボン酸基のうちの1つを用いて、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってもしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成するα-アミノ酸残基、
- アミド結合を介して一緒になって連結された2、3もしくは4つのα-アミノ酸残基から構成され、アミド結合を介して、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖{Wのアミノ酸残基は、中性の側鎖を有するアミノ酸残基、および側鎖中にカルボン酸基を有する(したがって、Wが、側鎖中にカルボン酸基を有する少なくとも1つのアミノ酸残基を有する)アミノ酸残基の群から選択される}、または
- Xから、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基への共有結合
であり、
Xは、
a)Wが、アミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合を形成する、または
b)Wが、共有結合である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中のN末端のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合を形成する、
- -CO-;
- -CH(COOH)CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-;
- -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CO-;または
- -N(CH2COOH)CH2CH2CO-
であり、
Yは、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2または3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を10〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- 式-(CH2)vC6H4(CH2)w-{式中、vおよびwが整数であるかまたはそれらのうちの1つがゼロであり、vとwとの和が、6〜30の範囲にある}の二価の炭化水素鎖
であり、
Zは、
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
- -CH(COOH)2;
- -N(CH2COOH)2;
- -SO3H;または
- -PO3H;
である]
を有する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
インスリンペプチドが、LysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンである、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
請求項1から14のいずれか一項に記載の方法により生成された精製インスリンペプチド。