【事件の表示】
　特願２００６−５０３７１４「電気穿孔法による細胞への抗原の負荷方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年　９月　２日国際公開、ＷＯ２００４／０７４４５１、平成１８年　８月１０日国内公表、特表２００６−５１８２１９〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　
　この出願は，２００４年２月１８日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００３年２月１８日米国（ＵＳ））を国際出願日とする出願であって，以降の手続の経緯は以下のとおりのものである。
　
　平成２２年　３月　３日付け　拒絶理由通知書
　平成２２年　９月　７日　　　意見書，手続補正書
　平成２３年　５月１０日付け　拒絶理由通知書
　平成２３年　９月　１日　　　意見書，手続補正書
　平成２４年　４月　５日付け　拒絶査定
　平成２４年　８月１０日　　　審判請求書
　
第２　本願発明の認定
　
　この出願の請求項１に係る発明は，願書に最初に添付した明細書，特許請求の範囲又は図面（以下，「本願明細書」という。）の記載からみて，平成２３年９月１日提出の手続補正書の特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定されるとおりのものであると認められるところ，請求項１にかかる発明（以下,「本願発明」という。）は,次のとおりのものであると認める。
　
「樹状細胞に１つまたは複数の抗原を負荷するための方法であって，以下を含む方法：
（ａ）樹状細胞と，１つまたは複数の癌細胞抗原を有する溶解物とを含む混合物を調製する段階であって，樹状細胞の数が溶解物に相当する細胞の数よりも多い，段階；および
（ｂ）１つまたは複数の癌細胞抗原が樹状細胞内に負荷されるのに十分な様式で，混合物の電気穿孔処理を行う段階。」
　
第３　原査定の拒絶の理由の概要
　
　原査定の拒絶の理由の概要は，本願発明は，その出願前日本国内又は外国において頒布された下記の刊行物に記載された発明又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった発明に基いて，その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない，というものである。
　　　　　　　　　　　　　　　記　
　Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，ｐ．３２８−３３２（１９９８）（原査定における引用文献２。以下，「刊行物１」という。）
　
第４　刊行物に記載された事項
　
　この優先日前に頒布された刊行物である刊行物１には，以下の事項が記載されている。なお，提示した翻訳は当審での翻訳であり，下線は当審で付与した。以下，同様。
　
１　刊行物１に記載された事項
　
１ａ「Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells」（３２８頁標題）
　（翻訳）
「ペプチド又は腫瘍溶解物でパルスされた樹状細胞を用いた黒色腫患者のワクチン接種」
　
１ｂ「In the present clinical pilot study, DCs were generated in the presence of granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4) and were pulsed with tumor lysate or a cocktail of peptides known to be recognized by CTLs, depending on the patient's HLA haplotype. ・・・Sixteen patients with advanced melanoma were immunized on an outpatient basis. Vaccination was well tolerated. No physical sign of autoimmunity was detected in any of the patients. 」（３２８頁要約９〜１８行）
　（翻訳）　
「この臨床パイロット試験では，樹状細胞は顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とインターロイキン４（IL-4）の存在下で調製され，その樹状細胞を患者のＨＬＡハプロタイプにより腫瘍溶解物又はＣＴＬにより認識されることが知られているペプチドのカクテルでパルスした。・・・
１６名の進行性黒色腫患者を外来患者ベースで免疫した。ワクチン接種は良く許容された。自己免疫の物理的兆候は，いずれの患者にも検出されなかった
　
１ｃ「Pulsing of in vitro generated DCs. Routinely, 1x106 DCs were generated after 7 days of culture in GM-CSF/lL-4. DCs were pulsed either with HLA-A2-binding melanoma-associated peptides for tyrosinase (MLLAVLYCL), Melan-A/MART-1(AAGICILTV) and gpl00(KTWGQYWQV) or HLA-Al-bindlng peptides derived from MAGE-1(EADPTGHSY) and MAGE-3 (EVDPIGHLY), depending on the HLA type of the patient at a concentration of 50μg/ml 2h at room temperature(RT). In case of the lack of expression of HLA-A1 or HLA-A2 and/or the availability of autologous tumor tissue, DCs were pulsed with autologous tumor lysates (100 μg/ml) for 4 h at RT. ・・・Antigen-loaded DCs were administered immediately in an uninvolved lnguinal lymph node.」（３３２頁左欄２３〜３６行）　
　（翻訳）
「
インビトロで生成した樹状細胞のパルス工程
通常のように，GM-CSF/lL-4存在下で７日間培養して１×１０
６
樹状細胞を生成した
HLA-A1又はHLA-A2の発現が欠如し，及び／又は，自己腫瘍組織が利用可能な場合，室温で４時間自己腫瘍溶解物（１００μg/ml）と共に樹状細胞をパルスした
抗原を負荷した樹状細胞
　
第５　当審の判断
　
１　刊行物１に記載された発明
　
　刊行物１は，「ペプチド又は腫瘍溶解物でパルスされた樹状細胞を用いた黒色腫患者のワクチン接種」（１ａ）に関し記載するものであって，この腫瘍溶解物でパルスされた樹状細胞を調製する方法として，刊行物１の１ｃには，「GM-CSF/lL-4存在下で７日間培養して１×１０６樹状細胞を生成し」，「自己腫瘍組織が利用可能な場合」は，「室温で４時間自己腫瘍溶解物（１００μg/ml）と共に樹状細胞をパルスした。」と記載されている。
　この結果，「抗原を負荷した樹状細胞」（１ｃ）が調製されていることから，この腫瘍溶解物でパルスされた樹状細胞を調製する方法は，樹状細胞に抗原を負荷する方法といえる。
　そうすると，刊行物１には，
　
「樹状細胞に抗原を負荷する方法であって，GM-CSF/lL-4存在下で７日間培養して１×１０６樹状細胞を生成し，室温で４時間自己腫瘍溶解物１００μg/mlと共に樹状細胞をパルスする，方法。」
　
の発明（以下，「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
２　本願発明と引用発明との対比
　
（１）引用発明の「樹状細胞に抗原を負荷する方法」は，本願発明の「樹状細胞に１つまたは複数の抗原を負荷するための方法」に相当する。
　
（２）引用発明の「GM-CSF/lL-4存在下で７日間培養して１×１０６樹状細胞を生成し，室温で４時間自己腫瘍溶解物１００μg/mlと共に樹状細胞」を存在させることについて，この「自己腫瘍溶解物」は，癌細胞抗原を当然有しているものであり癌細胞抗原を有する溶解物といえるから，１×１０６樹状細胞はこの溶解物と共存するよう調製されているといえる。
　そうすると，引用発明の「GM-CSF/lL-4存在下で７日間培養して１×１０６樹状細胞を生成し，室温で４時間自己腫瘍溶解物１００μg/mlと共に樹状細胞」があることと，本願発明の「（ａ）樹状細胞と，１つまたは複数の癌細胞抗原を有する溶解物とを含む混合物を調製する段階であって，樹状細胞の数が溶解物に相当する細胞の数よりも多い，段階」とは，樹状細胞と，１つまたは複数の癌細胞抗原を有する溶解物とを含む混合物を調製する段階である点で，共通する。
　
（３）引用発明の「室温で４時間自己腫瘍溶解物１００μg/mlと共に樹状細胞をパルスする」ことについて，この「パルスする」とは，電気穿孔処理することか明らかではないが，腫瘍溶解物と樹状細胞との混合物を「パルス」処理することにより「抗原を負荷した樹状細胞」（１ｃ）が調製されていることから，腫瘍溶解物中の癌細胞抗原が樹状細胞内に負荷されるのに十分な様式で，混合物の処理が行われているといえる。
　そうすると，引用発明の「室温で４時間自己腫瘍溶解物１００μg/mlと共に樹状細胞をパルスする」ことと，本願発明の「（ｂ）１つまたは複数の癌細胞抗原が樹状細胞内に負荷されるのに十分な様式で，混合物の電気穿孔処理を行う段階」とは，１つまたは複数の癌細胞抗原が樹状細胞内に負荷されるのに十分な様式で，混合物の処理を行う段階である点で，共通する。
　
　したがって，両者は，
　
「樹状細胞に１つまたは複数の抗原を負荷するための方法であって，以下を含む方法：
（ａ）樹状細胞と，１つまたは複数の癌細胞抗原を有する溶解物とを含む混合物を調製する段階；および
（ｂ）１つまたは複数の癌細胞抗原が樹状細胞内に負荷されるのに十分な様式で，混合物の処理を行う段階。」
　
である点で一致し，以下の点で相違する。
　
ア　（ｂ）段階における混合物の処理が，本願発明では電気穿孔であるのに対し，引用発明では電気穿孔か明らかでない点。（以下，「相違点ア」という。）
　
イ　（ａ）段階における混合物の調製に関し，本願発明では，樹状細胞の数が溶解物に相当する細胞の数よりも多いのに対し，引用発明では，樹状細胞の数が溶解物に相当する細胞の数よりも多いか明らかでない点。（以下，「相違点イ」という。）
　
３　判断
　
（１）相違点について
　
ア　相違点アについて
　一般に，動物細胞内へ蛋白質を効率的に挿入する方法として，動物細胞に電界パルスを印加する方法があり，これは，動物細胞に電界パルスが印加されると電荷分離が細胞膜内に生じて電位差が生じ，膜上の反対電荷が互いに吸引し膜に圧力が加わり膜が薄くなり，臨界電位差（電界強度）になると膜の局部的な絶縁破壊が起きて孔が明き媒質や細胞質の流れが可能になることによる方法で，電気穿孔であることは，以下の刊行物Ａの記載より明らかなように，本願優先日前，周知技術であった。
　そうすると，樹状細胞に抗原を負荷する方法である引用発明において，樹状細胞に腫瘍溶解物中の癌細胞抗原を効率的に挿入する目的で，樹状細胞にパルスする方法として，上記周知技術を適用し，電気穿孔を適用することは，当業者が容易になし得たことである。
　
　刊行物Ａ：特開平３−１１７４８６号公報
Ａ１「２．特許請求の範囲
１）
疎水性の膜貫通配列を有する挿入すべき蛋白質の緩衝溶液の存在下に細胞を電気挿入媒質中に懸濁した状態で前記細胞に電界を印加し
細胞膜への蛋白質挿入方法
２）
細胞が血液中の動物細胞
４）
電界が電界パルス
　
Ａ２「（発明の目的）　
　本
発明は細胞膜に蛋白質を挿入する効率的な方法を提供することを目的とする
（発明の具体的な説明）
　本発明は，細胞を電気挿入媒質中に懸濁した状態で前記細胞に電界，好ましくは１つ以上の電界パルスを印加し，次いでこの処理された細胞を再封孔媒質に接触させる，細胞膜を貫通する長さの疎水性の膜貫通配列を有する蛋白質を細胞膜へ挿入する方法を提供する。・・・
　電
界にされされると細胞膜には電気コンデンサの誘電体層における電荷分離（分極）と同様の電荷分離が膜内に生じる。これにより膜を通じての電位差が生じる。膜上の反対電荷が互いに吸引し，膜に圧力を加えて膜を薄くする。臨界電位差（電界強度）になると膜の局部的な絶縁破壊が起きて孔が明き媒質や細胞質の流れが可能になる。もし電界強度と電界パルス幅が過度でなければ電界の除去により穴は治癒（閉鎖）される
　本
発明は，一般に細胞に適用出来る
本発明に使用出来る非制限的な例を挙げると
単細胞
あらゆる種類のほ乳類の培養細胞
大食細胞（マクロファージ）等
　
Ａ３「
細胞の電気穿孔に使用する電界パルス
　
イ　相違点イについて
　引用発明は，樹状細胞と腫瘍溶解物との混合物の調製に関し，１×１０６樹状細胞と腫瘍溶解物１００μg/mlとを含む混合物としている。
　ここで，腫瘍溶解物１００μg/mlに相当する細胞数を検討すると，以下に示す刊行物Ｂ（原査定における参考文献１）の記載より，哺乳動物細胞１個の重量は，総細胞数６×１０９個あたり総細胞重量７０〜８０ｇより７０〜８０ｇ／６×１０９個＝１．２〜１．３×１０−２μｇ／個となり，以下に示す刊行物Ｃ（原査定における参考文献２）の記載より，細胞内のおよそのタンパク質量は細胞の約２０％より，１．２〜１．３×１０−２μｇ／個×０．２＝２．４〜２．６×１０−３μｇ／個となることから，引用発明の腫瘍溶解物１００μg/mlに相当するおよその細胞数は，１００μg/ml／（２．４〜２．６×１０−３μｇ／個）＝３．８〜４．２×１０４個／ｍｌとなる。　
　この数値は濃度であることより，１×１０６樹状細胞に加えられた腫瘍溶解物１００μg/mlの量を推測するに，本願明細書の段落【００７８】に腫瘍溶解物と共に樹状細胞をパルスする方法の従来技術文献として示されている下記刊行物Ｄの記載（Ｄ２）を参酌すると，１０７樹状細胞１０ｍｌを用い，この樹状細胞へ腫瘍溶解物を１：１の細胞当量比で添加していること，具体的には１０７腫瘍細胞と等量の腫瘍溶解物を添加していることが記載されており，これを参酌すると，引用発明において，１０６樹状細胞を実施する場合１ｍｌを用いると推測され，そしてこの１０６樹状細胞１ｍｌに混合される腫瘍溶解物の量は，それと等量である１ｍｌ程度と推測される。
　そうすると，引用発明の，腫瘍溶解物１００μg/mlが１０６樹状細胞に１ｍｌ程度混合された場合の細胞数は，３．８〜４．２×１０４個／ｍｌ×１ｍｌ＝３．８〜４．２×１０４個程度と推測される。
　これは腫瘍細胞の処理からの蛋白質回収率が１００％の場合であって，通常ロスがあることを勘案すると，例えば極端な場合，ロスが９０％程度もあり回収率１０％程度しかない場合でも，腫瘍溶解物に相当する腫瘍細胞必要数は３．８〜４．２×１０４個程度×１０＝３．８〜４．２×１０５個程度，すなわち１０５個のオーダーと推測される。
　そうすると，引用発明において，腫瘍溶解物に相当する細胞数は，樹状細胞１×１０６個より少ない数であろうと，当業者は推測し得たと解される。
　
　そして，上述のように，本願明細書の段落【００７８】にも記載され，刊行物Ｄの記載（Ｄ２）からも明らかなように，癌治療用のワクチンを調製すべく腫瘍溶解物と共に樹状細胞をパルスする方法において，腫瘍溶解物と樹状細胞とを１：１程度の細胞当量比で混合することは，本願優先日当時，通常行われていたと考えられ，これを目安とし，癌細胞抗原が樹状細胞へ適切に負荷されるよう，腫瘍細胞の種類や腫瘍進行程度等を加味しつつ，腫瘍溶解物と樹状細胞との細胞当量比を適切に決定することは，当業者が適宜なし得たことである。
　
　そうすると，引用発明において，本願優先日当時通常行われていた，腫瘍溶解物と樹状細胞とを１：１程度の細胞当量比で混合することを念頭に，癌細胞抗原が樹状細胞へ適切に負荷されるよう，腫瘍細胞の種類や腫瘍進行程度等を加味しつつ該比を適宜決定し，この際，刊行物１の記載からの上記推測を踏まえ，腫瘍溶解物に相当する細胞数は樹状細胞数より少なくできる，すなわち，樹状細胞数は腫瘍溶解物に相当する細胞数より多くできると判断し，樹状細胞数を腫瘍溶解物に相当する細胞数よりも多くすることは，当業者が容易に想到し得たことである。　
　
　刊行物Ｂ（原査定における参考文献１）：日外学誌，第９０回，第４号（１９８９）ｐ．５４６−５５５
「
イヌ初代培養肝細胞
総細胞数６×１０
９
個，総細胞重量７０〜８０ｇ
　
　刊行物Ｃ（原査定における参考文献２）：社団法人日本生化学会編集，生化学データブックＩ（１９７９）ｐ．１５３６，株式会社東京化学同人発行
「１２．３　細胞の化学組成　
　表１２−４　
代表的な細胞のおよその化学組成（％
　成分　　　　ラット肝Ｃ）　
　水　　　　　　６９　　
　タ
ンパク質
２１
　・・・　　　　・・　　　」（表１２−４）
　
　刊行物Ｄ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８（２００２）ｐ．１０２１−１０３２　
　提示した翻訳は当審での翻訳である。
Ｄ１「A Phase I Trial of Tumor Lysate-pulsed Dendritic Cells in the Treatment of Advanced Cancer1」（１０２１頁標題）
　（翻訳）　
「進行癌治療における腫瘍溶解物でパルスされた樹状細胞のフェーズＩ試験」　
　
Ｄ２「Vaccination Preparation　
　　DC cultures and antigen pulsing were performed in the Human Applications Laboratory of the General Clinical Research Center, which is a facility that operates under good manufacturing procedures.・・・Ten ml of the cell suspension were placed in 75-cm2 flasks (107 DCs/flask) for pulsating with tumor lysate or KLH. ・・・Tumor lysate suspension was added to DCs at 1:1 cell equivalent ratio. Specifically, a volume of tumor lysate equal to 107 tumor cells was added to each flask and incubated for 18 h at 37°C, 5% CO2. ・・・
　　After incubation, the tumor lysate-pulsed and KLH-pulsed DCs were harvested and counted. 」（１０２２頁右欄１７行〜下から３行）
　（翻訳）
「
ワクチン接種
　樹
状細胞培養物と抗原とのパルスを
行った
腫瘍溶解物
と共にパルスするために細胞懸濁液１０ｍｌを７５ｃｍ
２
フラスコに入れた（１０
７
樹状細胞／フラスコ
腫瘍溶解懸濁物を樹状細胞へ１：１の細胞当量比で加えた。具体的には，１０
７
腫瘍細胞と等量の腫瘍溶解物を各フラスコに添加し
　
インキュベーション後，腫瘍溶解物でパルスした及びＫＬＨでパルスした樹状細胞
　
（２）本願発明の効果について
　
　本願発明の効果は，本願明細書の記載を参酌しても，刊行物１および周知技術から予測される範囲内のものであり，格別顕著なものではない。
　
　本願発明の効果について，請求人は平成２４年８月１０日付け審判請求書の「（４）本願発明が特許されるべき理由」において，（ア）本願明細書の図３を示し，腫瘍細胞溶解液を電気穿孔（ＥＰ）することにより誘発されるＤＣ媒介性Ｔ細胞応答が共培養（ｃｏｃｘ）の場合に比べて高いこと，（イ）少ない量の腫瘍細胞を用いて機能的なＤＣワクチンを生成できることは，従来技術からは予測されない効果であり，少ない量の腫瘍細胞の使用を可能とするためには，電気穿孔法と組み合わせることが必要不可欠であること，を述べている。　
　しかしながら，（ア）については，上記（１）アで述べたように，一般に，動物細胞内へ蛋白質を挿入する周知技術として，動物細胞に電界パルスを印加する方法（電気穿孔法）があり，これは動物細胞に電界パルスが印加されると電荷分離が細胞膜内に生じて電位差が生じ，臨界電位差（電界強度）になると膜の局部的な絶縁破壊が起きて孔が明き媒質等の流れが可能になる原理に基づくものである。他方，共培養は細胞膜に強制的に孔を明けるものではないことから，癌細胞抗原等の流入は電気穿孔法よりも少なく，結果として癌細胞抗原が樹状細胞に負荷される割合は電気穿孔法の方が高いことは，当業者が予測し得たことである。
　（イ）については，上記（１）アで述べたように，引用発明において，腫瘍溶解物中の癌細胞抗原を効率的に挿入する目的で，樹状細胞にパルスする方法として，周知技術の電気穿孔を適用することは当業者が容易になし得たことであり，電気穿孔を適用すれば，細胞膜に孔が明き癌細胞抗原等の流入が容易となることから，少ない量の腫瘍細胞を用いて機能的なＤＣワクチンを生成できることは，該周知技術から当業者が予測し得たことである。
　
（３）請求人の主張について
　
　請求人は，平成２４年８月１０日付け審判請求書の「（４）本願発明が特許されるべき理由」において，平成２４年４月５日付け拒絶査定にて，イヌ肝細胞の重量（原査定における参考文献１：刊行物Ｂ）及びラット肝臓細胞のおよその化学組成（原査定における参考文献２：刊行物Ｃ）の値を用いて，引用発明の腫瘍溶解物に相当する細胞数を推測することには，以下の３つの理由から，欠陥があると思量すること，理由１として，イヌ肝細胞の重量がヒトメラノーマ腫瘍細胞の重量と等しい又は同等であるとする根拠はないこと，同様に，ラット肝臓細胞の蛋白質含量がヒトメラノーマ腫瘍細胞の蛋白質含量と等しい又は同等であるとする根拠もないこと，理由２として，腫瘍細胞の処理から蛋白質が１００％回収されると仮定しているが，実際には収率はかなり低いものとなり得ること，それ故回収率１００％と仮定していることから，腫瘍溶解物に相当する細胞数を大幅に過小評価してしていること，理由３として，引用発明は，腫瘍溶解物については濃度のみが記載されその量は記載されていないことから，実験に用いた腫瘍蛋白質の重量は判断することができないこと，以上より，本願発明は刊行物１の記載から当業者が容易に想到し得るものではない旨，主張する。
　
　しかしながら，上記理由１については，イヌ肝細胞の重量とヒトメラノーマ腫瘍細胞の重量とは，若干の相違はあろうが，重量単位における桁数を超える程の重量差があるとは通常考えられず，引用発明の腫瘍溶解物に相当する細胞数の推測において，桁数レベルでの相違が存在する状況下では，両者をほぼ同等の重量と考えて推定の計算して差し支えないといえる。また，ラット肝臓細胞のおよその化学組成（原査定における参考文献２：刊行物Ｃ）は，割合（％）で示されており，この化学組成の割合（％）については，哺乳動物の種や細胞の種類等の差により数％程度の相違はあろうが，％の桁数を超える程の差があるとは通常考えられず，通常の哺乳動物細胞におけるおよその化学組成（％）と考えて推定の計算をして差し支えないといえる。
　理由２，３については，上記（１）イで述べたように，腫瘍細胞の処理からの蛋白質の回収率がかなり低い場合も想定し，且つ，引用発明の樹状細胞に加えられた腫瘍溶解物の量も周知技術より推測して，用いられた腫瘍蛋白質の重量を割り出し腫瘍溶解物に相当する腫瘍細胞数を推測している。
　したがって，請求人の上記主張を採用することはできない。
　
４　まとめ
　
　したがって，本願発明は，その優先日前に頒布された刊行物１に記載された発明及び本願優先日前の周知事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
第６　むすび
　
　以上のとおり，本願発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから，その余について言及するまでもなく，この出願は，拒絶すべきものである。
　
　よって，結論のとおり審決する。