【事件の表示】
　特許第３１６０８０２号「真核発現系用エンハンサー」の請求項１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１６０８０２号の請求項１に係る特許を取り消す。
【理　由】
〔１〕本件特許3160802号は、特願昭60-185632号の出願（優先権主張1984.8.24DE）をもとの出願として分割した特願平9-132529号の特許出願であって、平成13年2月23日に特許権の設定登録がなされ、その後ロンザ・アーゲー、沢村嘉朗及び間山世津子から特許異議の申立てがなされたところ、当審において平成16年5月24日付で取消理由の通知がなされ（同年6月1日発送）、その指定期間内の平成16年12月1日に意見書が提出されると共に明細書の訂正請求がなされたものである。
　
〔２〕訂正の請求について：
　本件訂正の趣旨は、本件特許の明細書を請求書に添付した訂正明細書のとおりに訂正を求めるにあり、その訂正の要旨は、特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲第１項及び第２項における「DNA断片、またはそのエンハンサーの活性部分であって-524〜-118、-524〜-263、-524〜-458、-458〜-118、-458〜-263または-263〜-118、・・・を含むDNA断片」の記載を、「DNA断片、またはそのエンハンサーの活性部分であって-524〜-118、-524〜-263、-458〜-118または-458〜-263、・・・からなるDNA断片」と訂正することを求めるものである。
　当該訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮するものであって、実質上特許請求の範囲を拡張又は変更するものとは認められないから、上記訂正請求は適法なものである。
　
〔３〕特許法第29条第2項違反についての判断：
１．本件発明：
　上述の如く前記訂正が認められることから、本件特許発明の要旨は、訂正明細書の特許請求の範囲第１項に記載された下記のとおりのものであると認められる。
　
　「構造遺伝子又は調節領域の上流又は下流において、ヒトサイトメガロウィルス（HCMV）のPstI-m断片の転写開始点の上流に位置するPstI切断部位から該断片の-118位に存在するエンハンサー活性を有するDNA断片、またはそのエンハンサー活性部分であって-524〜-118、-524〜-263、-458〜-118または-458〜-263、好ましくは-118〜-458または-263〜-524位からなるDNA断片を組込むことからなり、DNA断片が構造遺伝子または調節領域の5'末端または3'末端の部位から7000bp以下の上流又は下流に組込まれる、真核発現系における外来遺伝子の発現方法。」
　
２．引用文献との対比判断：
（２−１）本件発明のエンハンサー活性を有するDNA断片について：
　下記刊行物２の第3図には、HCMVの転写開始点（capサイト）の上流側の塩基配列（-490〜+1）が記載されており、これは本願明細書のFig.1bに記載されたHCMVの塩基配列（-737〜+193）の一部配列に相当する。
  そして、当該配列のうち、真核細胞プロモーター領域の特徴を有する領域におけるCAAT　boxの上流の、19と18塩基からなる2種の4回ずつの繰り返し配列がある-100〜-468位については、遺伝子発現の相対量をシス作用性で調節する配列である可能性が示唆されており（第662頁右欄〜左欄）、HeLa細胞の細胞抽出物を用いたin　vitro実験でCATTボックスの上流に位置するHincII部位（約-65位）の上流側配列を除くと、転写は可能であるが転写量はほぼ半分になることが記載されている（同第661頁右欄）。
　このことは、まさに、「シスに作用して真核細胞系用プロモータの転写効率を増強する配列」である周知の「エンハンサー領域」（例えば刊行物３〜７、特に刊行物６）が、HCMVの主要IE遺伝子のプロモーターの上流配列中の「約-65〜-490位」の特に「-100〜-468位」のDNA配列中に存在していることを明確に示唆しているといえる。
　一方、本件特許発明における「DNA断片のエンハンサー活性部分」としては、転写開始点に対して「-524〜-118、-524〜-263、-458〜-118または-458〜-263、好ましくは-118〜-458または-263〜-524位」からなるDNA断片であることが規定されているが、このうち特に好ましいとされた「-458〜-118位」断片は、上記刊行物２でエンハンサー活性部位として示された「-468〜-100位」の位置とほぼ一致している。
　ところで、典型的なSV40エンハンサーが72bpという短い長さであることが刊行物６などにより周知である以上、HCMVのエンハンサー活性部分が「-468〜-100位」という300bp中に存在する旨の教示に接した当業者にとって、当該300bp中の真のエンハンサー位置を確定すべく両端の塩基の一部を除去してエンハンサー活性の有無を検討することは必要に応じて適宜行う事柄に過ぎない。当該300bpの断片の両端からたかだか10〜18bpの塩基を除去した「-458〜-118位」断片にエンハンサー活性があることを確認した程度のことには何らの困難性も見出せない。そして、本件明細書の記載からは、そのDNA断片両端の「-458位」及び「-118位」という数値に格別臨界的意義があるともいえない。
　してみれば、本件発明のエンハンサー活性を有するDNA断片として「-118〜-458位」のDNA断片を用いることは当業者が容易に想到し得ることである。
　
（２−２）本件発明において、上記エンハンサー活性DNA断片を真核発現系発現ベクターへ組み込む位置を、「構造遺伝子または調節領域の5'末端または3'末端の部位から7000bp以下の上流又は下流」と規定したことについて：
　刊行物６では、典型的なSV40エンハンサーの組込み位置に関して、「転写開始点から5'上流及び3'下流にそれぞれ1000及び3000塩基対以上離れた位置に存在しても機能すること」が記載されており、同じSV40エンハンサーについて刊行物４の第308頁左欄には「あまりに距離が離れていると（数キロbp）その転写効率は減少する。」と記載されている。また、刊行物５では、「ポリオーマウイルスのエンハンサー」が、形質転換後のマウス3T6細胞及びヒトHeLa細胞中で1400塩基を越える離れた位置のウサギ由来β-グロビン遺伝子の転写レベルを強く増強したことが記載されており、こられの記載も考え合わせると、当業者がエンハンサーを発現ベクターに組み込む際には当然に「プロモーターから数千bp以内」とするはずであり、本件発明において「DNA断片が、構造遺伝子または調節領域の5'末端または3'末端の部位から7000bp以下の上流又は下流に組込まれる」とした点にも何らの困難性は見出せない。
　
（２−３）なお、刊行物４では、「SV40エンハンサー」のin　vitroでの転写増強効果を観察し、in　vivoでのそれと比較した結果、「エンハンサーのin　vivoでの効果の多くはin　vitroと良く類似していた（同第308頁「要約」の項）。」と記載されており、このことは、エンハンサー領域についてin　vitroで観察された効果がin　vivoにおいても十分期待できることが示唆されていることに他ならない。加えて、特許権者が本件の拒絶査定不服審判において審判請求理由補充書に添付した参考資料3には「エンハンサー効果は生細胞において最も明白であるが、ある効果は無細胞転写抽出物においても見られる」と記載されており（第229頁右欄下から第18行〜第16行）、また上記刊行物4の「エンハンサーのin　vivoでの効果の多くはin　vitroと良く類似していた（ABSTRACT）。」の記載、「このin　vitroでの刺激は、in　vivoのSV40エンハンサーの公知の性質の多くのものと一致している（DISCUSSIONの第5行〜第7行）。」、「イン・ビトロでの刺激の程度はイン・ビボでの刺激の程度よりも少なくとも1桁低い（DISCUSSIONの第12行〜第15行）。」との記載を考え合わせれば、エンハンサーについては、in　vitroとin　vivoでその効果は類似しており、in　vivoで観察されたエンハンサー効果がin　vitroで見られない場合があるとしても、in　vitroですら観察されたエンハンサー効果であればin　vivoではむしろ当然に見られることが予測される。
　そうであるから、上記刊行物２に記載のin　vitroでの転写増強効果は当然にin　vivoでも奏されると期待するはずであって、予測されたエンハンサー活性を単にin　vivoで確認した点をもって格別のこととはいえない。
　
３．以上述べたとおり、本件特許発明は、刊行物１乃至７の記載に基づいて当業者が容易に想到し得る範囲内のものであって、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることはできない。
　
＜引用文献＞　
刊行物２：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81(Feb.1984)p.659-663
（申立人ロンザ・アーゲーが提出した甲第４号証、申立人沢村嘉朗が提出した甲第２号証、申立人間山世津子が提出した甲第１号証）
刊行物３：Cell,27(1981)p.299-308
（申立人沢村嘉朗が提出した甲第３号証）
刊行物４：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81(Jan.1984)p.308-312
（申立人ロンザ・アーゲーが提出した甲第１７号証、申立人沢村嘉朗が提出した甲第４号証、申立人間山世津子が提出した甲第４号証）
刊行物５：Nucleic Acids Res.,9(1981)p.6251-6264
（申立人沢村嘉朗が提出した甲第５号証）
刊行物６：生化学辞典、東京化学同人発行(1984年4月10日）
（申立人沢村嘉朗が提出した甲第６号証、申立人間山世津子が提出した甲第３号証）
刊行物７：Cell,36,(April.1984)p.983-992
（申立人ロンザ・アーゲーが提出した甲第５号証、申立人間山世津子が提出した甲第２号証）
　
〔４〕結語：
 　以上のとおりであるから、本件発明についての特許は、特許法第113条第2項の規定により取り消されるべきものである。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年１２月２０日（２００４．１２．２０）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
真核発現系用エンハンサー
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
　構造遺伝子又は調節領域の上流又は下流において、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）のＰｓｔＩ−ｍ断片の転写開始点の上流に位置するＰｓｔＩ切断部位から該断片の−１１８位に存在するエンハンサー活性を有するＤＮＡ断片のエンハンサー活性部分であって−５２４〜−１１８、−５２４〜−２６３、−４５８〜−１１８または−４５８〜−２６３、好ましくは−１１８〜−４５８または−２６３〜−５２４位からなるＤＮＡ断片を組込むことからなり、ＤＮＡ断片が構造遺伝子または調節領域の５′末端または３′末端の部位から７０００ｂｐ以下の上流又は下流に組込まれる、真核発現系における外来遺伝子の発現方法。
　【請求項２】
　ＤＮＡ断片が、構造遺伝子または調節領域の５′末端または３′末端の部位から３０００ｂｐ未満の上流又は下流に組込まれる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、真核発現系用エンハンサーおよびその使用にかかる真核発現系の改良方法に関するものである。
　【０００２】
　【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
　本発明による真核発現系用エンハンサーは、ヒトサイトメガロウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉｅ−Ｖｉｒｕｓ）（ＨＣＭＶ）の「主要イメディエート・アーリー」（ｍａｊｏｒ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ））遺伝子の「上流」領域からのＤＮＡを有するものである。このエンハンサーの具体例は、ＨＣＭＶのＩＥ領域からのＤＮＡ音波処理による約３００ｂｐ断片の形成、ＣＶ１サル細胞及びエンハンサー不存在ＳＶ４０ゲノムのコトランスフェクション、溶菌増殖性を示す組換え体の単離、および挿入ＨＣＭＶ　ＤＮＡ及びこのＤＮＡのエンハンサー活性変異体の単離によって得ることができる。
　【０００３】
　本発明による真核発現系の改良方法は、構造遺伝子又は調節遺伝子の上流又は下流において上記の本発明エンハンサーを組込むこと、からなるものである。本発明による真核発現系の改良方法の具体例は、エンハンサーを所定部位から約７０００ｂｐ以下、特に３０００ｂｐ未満、の上流又は下流に組込むことからなるものである。
　【０００４】
　従って、本発明は下記に関するものである。
　【０００５】
　構造遺伝子又は調節領域の上流又は下流においてヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）における主要イメディエート・アーリー遺伝子の上流領域からのＤＮＡを有する真核発現系用エンハンサーを組込むことからなる真核発現系の改良方法。
　【０００６】
　エンハンサーが、所定部位から約７０００ｂｐ以下の上流又は下流に組込まれる、上記の方法。
　【０００７】
　エンハンサーが、所定部位から３０００ｂｐ未満の上流又は下流に組込まれる、上記の方法。
　【０００８】
　本発明は下記のものが関連する。
　【０００９】
　ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）の主要イメディエート・アーリー（ＩＥ）遺伝子の上流領域からのＤＮＡを有する真核発現系用エンハンサー。
　【００１０】
　ＨＣＭＶのＩＥ領域からのＤＮＡ音波処理による約３００ｂｐ断片の形成、ＣＶ１サル細胞及びエンハンサー不存在ＳＶ４０ゲノムのコトランスフェクション、溶菌増殖性を示する組換え体の単離、および挿入ＨＣＭＶ　ＤＮＡおよび該ＤＮＡのエンハンサー活性変異体の単離により得ることができる、上記のエンハンサー。
　【００１１】
　「エンハンサー・トラップ（ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｔｒａｐ）」はエフ・ウェーバーら、「セル」、第３６巻、１９８４年、第９８３−９９２頁〔Ｆ．Ｗｅｂｅｒ　ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ３６（１９８４）９８３−９９２〕に記載されており、ＨＣＭＶ　ＤＮＡに関しては、ジー・ジャーンら、「ジャーナル・オブ・バイロロジー」、１９８４年２月、第４９巻、第３６３−３７０頁（Ｇ．Ｊａｈｎｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．１９８４，Ｖｏｌ．４９，３６３−３７０）及びそこで引用された文献、並びにディー・アール・トムセンら、「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」第８１巻、１９８４年、第６５９−６６３頁〔Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１（１９８４），６５９−６６３〕及びピー・ジェイ・グリーナウェーら、「ジーン」、第１８巻、１９８２年、第３５５−３６０頁〔Ｐ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎａｗａｙ　ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅ１８（１９８２）３５５−３６０〕を参照されたい。
　【００１２】
　ＨＣＭＶ　ＤＮＡにおいて、エンハンサーはＰｓｔＩｍ断片（約２．１Ｋｂ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ　Ｅ断片〔グリーナウェーら、上記文献（Ｇｒｅｅｎａｗ−ａｙ　ｅｔ　ａ１．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）〕に位置している。
　【００１３】
　二つの組換え体は前述のように単離されたが、公表されたＤＮＡ鎖〔グリーナウェーら、上記文献（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ　ｅｔ　ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）〕上のそれぞれ部位−１１８〜−４５８及び−２６３〜−５２４に位置する３４１及び２６２ｂｐのＨＣＭＶ　ＤＮＡを含有していた。１９６ｂｐの重複箇所は、エンハンサーの必須部分を含んでいる。欠失変異体、たとえばＡｈａＩＩによりかつ断片の各種組合せの再連結により得られたもの、は同様にエンハンサー活性を持つ。
　【００１４】
　本発明は、また、再単離されたＨＣＭＶ特異的エンハンサーＤＮＡと少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％が相同するＤＮＡ鎖あるいはそれとハイブリッド形成されたＤＮＡに関する。
　【００１５】
　このエンハンサーは、適切な遺伝子の下流に組込まれると、方向性とは無関係に、少なくとも２ケタのオーダーでＨｅＬａ細胞におけるウサギβ−グロビンの発現を増大させる。このように、このエンハンサーは、ＳＶ４０のそれよりも３〜５倍優れている（宿主系に依存する）。
　【００１６】
　ＨＣＭＶエンハンサーは、広範囲の宿主細胞（霊長類、マウス、ラット及びカエルの細胞）において活性をもつ。これは真核系でのタンパク質発現を促進し、このため変性タンパク質、例えば糖タンパク質、の産生を促進する。
　【００１７】
　例えば、Ｂａｌ３１を用いて、ＳａｃＩ制限部位以外の約１００ｂｐを除去することにより、ＨＣＭＶに固有のプロモーターを除去することも可能である。必要に応じて、エンハンサー配列はアダプター又はリンカーを連結させることにより改変してもよい。
　【００１８】
　固有のプロモーターと一緒に用いられる場合には、例えば発現すべき遺伝子の「スプライス・アクセプター配列」前に存在するＩＥ遺伝子の第一「スプライス・ドナー・コンセンサス配列」とともに組込むことにより、真核プロモーターが置き換えられてもよい。
　【００１９】
　本発明は、下記の例において詳細に説明されている。
　【００２０】
　【実施例】
　「エンハンサー・トラップ」を、ウェーバーらの上記文献（Ｗｅｂｅｒ．ｅｔ　ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）の方法に従い、ＳＶ４０ゲノムから７２ｂｐ反復領域（ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで制限）を除去して得た。ＨＣＭＶ、即ちＡＤ１６９株、由来のＰｓｔＩｍ断片（２．１Ｋｂ）を音波処理で破壊して約３００ｂｐの大きさの断片とし、「エンハンサー・トラップ」とのコトランスフェクションを行なった。組換えＤＮＡを、最大の溶菌増殖性を示すコロニーから単離した。配列を調べることにより、ＨＣＭＶ　ＤＮＡの２６２ｂｐ断片は、その一端で末端相互の連結が起こり、一方他端で、ＨＣＭＶ（ヌクレオチド−５３１〜−５２６、図１）及びＳＶ４０（ヌクレオチド６７〜７２）間の６ｂｐ相同部分を介して組換えが生じていることが見出された。これは、ＳＶ４０の「アーリー・プロモーター」の２１ｂｐ反復配列双方に影響を及ぼすＳＶ４０ＤＮＡの２７ｂｐ（ヌクレオチド７３〜９９）を欠損していた。２６２ｂｐ断片は、制限地図（図１）及びＤＮＡ配列（図２）において四角括弧で符号が付されたＣ４により示されている。
　【００２１】
　ＨＣＭＶ　ＤＮＡの３４１ｂｐとの別のエンハンサー活性組換え体は、直鎖「エンハンサー・トラップ」分子（おそらく、トランスエクションを受けた細胞内で連結される前に、数個の塩基がＳＶ４０ＤＮＡのＫｐｎＩ及びＸｂａＩ未満から除去されていた）の両端を有する連結生成物であることが判明した。この組換え体のＨＣＭＶ　ＤＮＡは図１及び図２において「Ｃ２」で示され、−１８８〜−４５８に存在する。このように断片Ｃ２及びＣ４は１９６ｂｐの領域で重複している。
　【００２２】
　Ｃ４が挿入された組換えウィルスのＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ断片及びＨＣＭＶのＰｓｔＩｍ断片を、まず、ｐＵＣ８〔ジェイ・ビエーラら：「ジーン」、第１９巻、１９８２年、第２５９−２６８頁（Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ１９（１９８２）２５９−２６８）〕において両方向にクローン化し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片として切り出し、ｐβＸ１４のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩの制限部位間、即ちウサギβ−グロビン遺伝子の下流で再クローン化した〔ジェイ・バネルジら：「セル」、第２７巻、１９８１年、第２９９−３０８頁（Ｊ．Ｂａｎｅｒｊｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ２７（１９８１）２９９−３０８）、ジェイ・デ・ヴィリエールら：「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」、第９巻、１９８１年、第６２５１−６２５４頁（Ｊ．ｄｅ　Ｖｉ−ｌｌｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．９（１９８１）６２５１−６２５４）、エス・ルスコニら：「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」第７８巻、１９８１年、第５０５１−５０５５頁（Ｓ．Ｒｕｓｃｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８（１９８１）５０５１−５０５５）、エッチ・ウェーバーら：「ＩＣＮ−ＵＣＬＡシンポジウム・オブ・モレキュラー・アンド・カルラー・バイオロジー」、第３３巻、１９８１年、第３６７頁（Ｍ．Ｗｅｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＩＣＮ−ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３３（１９８１）３６７）、ビー・ワシリクら：「セル」、第３２巻、１９８３年、第５０３−５１４頁（Ｂ．Ｗａｓｙｌｙｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ３２（１９８３）５０３−５１４）〕。β−グロビン転写におけるエンハンサーの作用を、ＨｅＬａ細胞での一時的発現後に、細胞質ＲＮＡのＳ１ヌクレアーゼ分析によって測定した。
　【００２３】
　すべての組換え体を、標準条件下で、ＳＶ４０のエンハンサーを有する相同組換え体と比較した。ＨＣＭＶエンハンサーは、方向性とは無関係に、少なくとも２ケタのオーダーでβ−グロビン合成を増大させることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　ＨＣＭＶの制限地図を示す説明図である。
　【図２】
　ＤＮＡ配列を示す説明図である。