【手続補正書】
【提出日】平成27年8月17日(2015.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的DNA分子を部位特異的に修飾するための方法であって、
標的DNA分子をCas9タンパク質、crRNAおよびtracrRNAを含む、設計されたCas9-crRNA複合体と接触させることを含み、
crRNAが、Cas9-crRNA複合体を標的DNA分子中の前記部位を含む領域に誘導するように設計される、方法。
【請求項２】
修飾がin vivoまたはin vitroで起こる、 請求項１に記載の方法。
【請求項３】
in vivoでの修飾が哺乳動物細胞で起こる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
crRNAの断片が実質的に標的ＤＮＡ分子に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
実質的に標的ＤＮＡ分子に相補的であるcrRNAの前記断片が約20ヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Cas9タンパク質がRuvC活性部位モチーフおよびHNH活性部位モチーフの少なくとも一つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Cas9タンパク質が配列番号１と少なくとも80％の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
crRNAが3’および5’領域を含み、3’領域がCRISPRリピートの少なくとも22ヌクレオチドを含み、5’領域が標的ＤＮＡの一部に実質的に相補的であるように設計されたスペーサー配列の少なくとも20ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
tracrRNAが5'および3'領域を含み、5'領域の少なくとも一部がcrRNAの3'領域に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的ＤＮＡ分子が、プロトスペーサー配列の下流のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＡＭ配列が核酸配列5’-NGGNGを有する核酸分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標的ＤＮＡ分子の部位特異的修飾が標的ＤＮＡ分子の切断である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
Cas9タンパク質がRuvCモチーフまたはHNHモチーフにおける点突然変異を含み、標的ＤＮＡ分子の修飾が標的ＤＮＡ分子の部位特異的ニッキングである、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
RuvCモチーフにおける点突然変異がＤ３１Ａであり、HNHモチーフにおける点突然変異がN891Aである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的ＤＮＡが二本鎖であるか、一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Cas9および／またはcrRNAが組換えＤＮＡ技術、in vitro翻訳によって生成されるか、または化学的に合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
crRNAが、任意の所望のスペーサー配列とともに5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'(配列番号15)を含む配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞中の標的ＤＮＡ分子のCas9-RNA媒介性二本鎖切断を指示する方法であって、前記方法が、以下：
細胞中の標的ＤＮＡ分子を、細胞中で、Cas9タンパク質、設計されたcrRNAおよびtracrRNAを含む組換えCas9-crRNA複合体と接触させる工程、
を含み、
ここで、前記設計されたcrRNAは、前記Cas9-crRNA複合体を標的ＤＮＡ分子に誘導するように設計されている、方法。
【請求項１９】
前記設計されたcrRNAが標的ＤＮＡに対して実質的に相補性を有する約２０ヌクレオチドの断片を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
細胞中の標的ＤＮＡ分子におけるCas9-RNA媒介性相同組換え（ＨＲ）を指示する方法であって、前記方法が、以下：
細胞中の標的ＤＮＡ分子を、Cas9タンパク質、crRNAおよびtracrRNAを含む設計されたCas9-crRNA複合体と接触させる工程〔ここで、前記crRNAは、前記設計されたCas9-crRNA複合体を標的ＤＮＡ分子に誘導するように設計されている〕、および
標的部位に隣接する第１および第２の相同部位を含む組換え核酸構築物、
を含む方法。
【請求項２２】
前記crRNAが標的ＤＮＡに対して実質的に相補性を有する約２０ヌクレオチド断片を含むように設計される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的ＤＮＡが、前記複合体中のcrRNA中のスペーサー配列に少なくとも80％相補的であるプロトスペーサー配列、およびプロトスペーサー配列の下流のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列NGGNGを含み、ここで、Cas9タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流３ヌクレオチドに位置する切断部位で標的ＤＮＡ鎖の両方の鎖を切断し、平滑末端を作出する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
プログラム可能なCas9-crRNA複合体であって、以下：
Cas9タンパク質、
3’および5’領域を含むcrRNAポリヌクレオチドであって、3’領域がCRISPR遺伝子座中に存在するリピート配列を含み、5’領域がCRISPR遺伝子座中のリピートのすぐ下流の設計されたスペーサー配列の少なくとも20ヌクレオチドを含むcrRNAポリヌクレオチド、および
5’および3’領域を含むtracrRNAポリヌクレオチドであって、5’領域の少なくとも一部がcrRNAの3’領域に相補的であるtracrRNAポリヌクレオチド
を含み、ここで、前記スペーサー配列は、Cas9-crRNA複合体がプロトスペーサー隣接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されている、Cas9-crRNA複合体。
【請求項２６】
Cas9タンパク質がRuvC活性部位モチーフおよびHNH活性部位モチーフの少なくとも一つを含む、請求項２５に記載のプログラム可能なCas9-crRNA複合体。
【請求項２７】
Cas9タンパク質が、RuvCモチーフ中の点突然変異および／またはHNHモチーフ中の点突然変異を含む、請求項２６に記載のプログラム可能なCas9-crRNA複合体。
【請求項２８】
RuvCモチーフにおける点突然変異がＤ３１Ａであり、HNHモチーフにおける点突然変異がN891Aである、請求項２７に記載のプログラム可能なCas9-crRNA複合体。
【請求項２９】
crRNAの3’領域がCRISPR遺伝子座中に存在するリピート配列の少なくとも22ヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のプログラム可能なCas9-crRNA複合体。
【請求項３０】
Cas9タンパク質、crRNAポリヌクレオチドおよびtracrRNAポリヌクレオチドをコードする少なくとも一つのプラスミドを微生物に導入して遺伝的に改変された微生物を生じ、前記遺伝的に改変された微生物から前記複合体を単離することによってin vivoで前記複合体が形成される、請求項２５に記載のプログラム可能なCas9-crRNA複合体。
【請求項３１】
さらに単離されたCas9タンパク質、crRNAポリヌクレオチド、およびtracrRNAポリヌクレオチドを複合体の組み立てに好適な条件下でインキュベートすることを含む、請求項３０に記載のプログラム可能なCas9-crRNA複合体。
【請求項３２】
Cas9タンパク質、crRNAポリヌクレオチド、およびtracrRNAポリヌクレオチドが２つまたは３つの別々のプラスミド中にコードされている、請求項３０に記載のCas9-crRNA複合体。
【請求項３３】
前記複合体が、複合体の要素を複合体の組み立てに好適な条件下でインキュベートすることによってin vitroで形成される、請求項２５に記載のCas9-crRNA複合体。
【請求項３４】
crRNAポリヌクレオチドが、単一のリピート-スペーサー-リピート単位を含むＤＮＡ断片からのin vitro転写によって得られ、スペーサーが任意の所望の配列を有するか、化学的に合成されたものである、請求項３３に記載のCas9-crRNA複合体。
【請求項３５】
前記要素がCas9ポリペプチド（配列番号１）、tracrRNAポリヌクレオチド(配列番号5)、およびcrRNAポリヌクレオチド(5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3')(配列番号15)を任意の所望のスペーサー配列と一緒に含む、請求項２５に記載のCas9-crRNA複合体。