(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０における突然変異の有無を簡便・正確かつ迅速・安価に判別可能なキットおよび方法に関する。【解決手段】特定のフォワードプライマー、リバースプライマー、および、プローブを用いる、ＥＧＦＲ遺伝子における変異の有無を検出するための方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列の１６８番目の塩基を認識するように設計された核酸プローブであって、１５〜２５個のヌクレオチドからなり、かつ、配列番号１０、１１、１２または１３で示される塩基配列の中から選択する連続した１５個以上の塩基配列を含むヌクレオチドである核酸プローブ。
【請求項２】
配列番号１０、１１、１２または１３で示される塩基配列からなる、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項３】
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、請求項１または請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項４】
以下の（ｐ）〜（ｓ）の工程を含む、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異を検出する方法。
（ｐ）請求項１〜請求項３のいずれかに記載のプローブと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成する工程。
（ｑ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
（ｒ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定する工程。
（ｓ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸におけるＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異を検出する工程。
【請求項５】
さらに、以下の（ｏ）の工程を含む、請求項４に記載の方法。
（ｏ）前記（ｐ）の工程においてハイブリッドを形成する前、または、前記（ｐ）の工程においてハイブリッドを形成すると同時に、核酸を増幅する工程。
【請求項６】
請求項５の（ｏ）に記載の核酸増幅工程で、以下の（ａ）および（ｂ）の組合せからなるプライマーセットを用いて核酸を増幅する、請求項５に記載の方法。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列の中から連続する１６塩基以上３２塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号３、４、５または６で示される塩基配列の中から選択する連続した１６個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるフォワードプライマー。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の連続する１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号７、８または９で示される塩基配列の中から選択する連続した１６個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるリバースプライマー、
【請求項７】
（ａ）のフォワードプライマーが、配列番号３、４、５または６で示される塩基配列からなり、および／または、（ｂ）のリバースプライマーが、配列番号７、８または９で示される塩基配列からなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載のプローブを含む、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異を検出するためのキット。
【請求項９】
さらに、請求項６に記載の（ａ）および（ｂ）の組合せからなるプライマーセットを含む、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮成長因子受容体遺伝子の変異の有無を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）は、シグナル伝達を行う上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）のチロシンキナーゼ型受容体である。
【０００３】
ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異は、抗癌薬、たとえばＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブなどの分子標的薬に対する薬剤耐性と関連している。前記変異は、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）に置換された変異である。ＥＧＦＲ遺伝子のコーディング領域（ｃｏｒｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＣＤＳ）においては、ｅｘｏｎ２０の塩基番号２３６９の塩基シトシンがチミンに変異している。
したがって、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０における変異の有無を明らかにすることは、がん疾患において、より効果的な治療法の選択などに極めて重用である。
【０００４】
遺伝子変異を検出する方法は、いくつか報告されており、例えば特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ダイレクトシーケンス法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（特許文献１）などの解析方法がある。
【０００５】
特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法では、ハイブリダイゼーション条件の調整が非常に繊細で、反応条件を厳しくコントロールする必要がある。
ダイレクトシーケンス法は、ＰＣＲで増幅された領域全体の配列を観察できるが、癌組織のような正常細胞由来のＤＮＡが混入する場合には、変異を検出するために最低、１５〜２０％以上の腫瘍由来のＤＮＡが必要となり、解析に時間を要する。
また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを、制限酵素で切断し、電気泳動にかけるという手法のため、多くの処理ステップを要し手間がかかる。また、得られたＰＣＲ増幅産物を扱うため、増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。
【０００６】
これらの問題を解決する方法として、標的核酸と結合すると消光する特徴を有する蛍光色素標識プローブであるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）を用いて簡便で正確性に優れたＥＧＦＲ遺伝子変異を検出する方法が提案されている。この検出方法では核酸増幅と核酸検出を連続して行えるため、核酸増幅後に反応系を開放する必要がなく、キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１３５０７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＥＧＦＲ遺伝子変異の検出は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤に対する薬剤耐性を解明する上で非常に重要な意義を持っている。そこで、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異の有無をより簡便・正確かつ迅速・安価に判別可能な方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＥＧＦＲ遺伝子の一部領域を特異的に増幅するための特定の核酸プライマー、該核酸プライマーを用いた核酸増幅反応によって得られた増幅核酸を検出するための特定の核酸プローブ、または、前記プライマーと前記プローブとの組合せを用いることにより、簡便・正確かつ迅速・安価にＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異の有無を判別できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のような構成からなる。
【００１０】
［項１］
配列番号１に示される塩基配列の１６８番目の塩基を認識するように設計された核酸プローブであって、１５〜２５個のヌクレオチドからなり、かつ、配列番号１０、１１、１２または１３で示される塩基配列の中から選択する連続した１５個以上の塩基配列を含むヌクレオチドである核酸プローブ。
［項２］
配列番号１０、１１、１２または１３で示される塩基配列からなる、項１に記載の核酸プローブ。
［項３］
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、項１または項２に記載の核酸プローブ。
［項４］
以下の（ｐ）〜（ｓ）の工程を含む、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異を検出する方法。
（ｐ）項１〜項３のいずれかに記載のプローブと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とをハイブリダイズさせて複合体（ハイブリッド）を形成する工程。
（ｑ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
（ｒ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定する工程。
（ｓ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸におけるＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異を検出する工程。
［項５］
さらに、以下の（ｏ）の工程を含む、項４に記載の方法。
（ｏ）前記（ｐ）の工程においてハイブリッドを形成する前、または、前記（ｐ）の工程においてハイブリッドを形成すると同時に、核酸を増幅する工程。
［項６］
項５の（ｏ）に記載の核酸増幅工程で、以下の（ａ）および（ｂ）の組合せからなるプライマーセットを用いて核酸を増幅する、項５に記載の方法。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列の中から連続する１６塩基以上３２塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号３、４、５または６で示される塩基配列の中から選択する連続した１６個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるフォワードプライマー。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の連続する１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号７、８または９で示される塩基配列の中から選択する連続した１６個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるリバースプライマー、
［項７］
（ａ）のフォワードプライマーが、配列番号３、４、５または６で示される塩基配列からなり、および／または、（ｂ）のリバースプライマーが、配列番号７、８または９で示される塩基配列からなる、項６に記載の方法。
［項８］
項１〜項３のいずれかに記載のプローブを含む、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異を検出するためのキット。
［項９］
さらに、項６に記載の（ａ）および（ｂ）の組合せからなるプライマーセットを含む、項８に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＥＧＦＲ遺伝子変異の有無を簡便、正確かつ迅速・安価に判別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例1の結果を示す図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。
【図３】比較例１の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を判別するための核酸プローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いてＥＧＦＲ遺伝子変異（ｅｘｏｎ２０）の有無を検出するための方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。
本明細書において、「ＥＧＦＲ遺伝子の変異」とは、特に断りのない場合は前記ｅｘｏｎ２０における変異を意味する。
【００１４】
ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列を示したものが配列番号１であり、本発明の検出目的の多型は塩基番号１６８の塩基である。野生型は塩基番号１６８がシトシンであり、変異型は塩基番号１６８がチミンである。
また、配列番号２は配列番号１の相補的配列である。
【００１５】
核酸プローブ
本発明で用いられる核酸プローブは、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０における変異の有無を検出するためのものであり、ＥＧＦＲ遺伝子、好ましくは後述の核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
【００１６】
そのような核酸プローブとして好ましくは配列番号１で示される塩基配列の１６８番目の塩基を認識するように設計され、１５〜２５個のヌクレオチドからなる核酸プローブが挙げられる。
前記塩基配列の核酸プローブは、配列番号１の共通配列の一部と同じ配列を有しており、配列番号２で示される塩基配列を含む核酸増幅産物とも複合体を形成することができる。
【００１７】
前記の核酸プローブは、該核酸増幅産物と複合体を形成するのであれば、該核酸プローブ塩基配列の一部は配列番号１または２で示される塩基配列と異なっていてもよい。ただし、該核酸プローブの塩基配列が配列番号１または２と大きく異なる場合は該核酸プローブの特異性が低下し、該核酸増幅産物以外との複合体を形成しうる可能性が大きくなる。従って、該核酸プローブは配列番号１または配列番号２の一部塩基配列と８５％以上の同一性があることが好ましい。より好ましくは８６％、より好ましくは８７％、より好ましくは８８％、より好ましくは８９％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、より好ましくは１００％である。
【００１８】
［塩基配列の同一性］
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブからアクセスできる相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴにおいて、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の同一性の値（％）を算出する。
【００１９】
このような核酸プローブとして、配列番号１に示される塩基配列の１６８番目の塩基を認識するように設計された核酸プローブであって、１５〜２５個のヌクレオチドからなり、かつ、配列番号１０、１１、１２または１３で示される塩基配列の中から選択する連続した１５個以上の塩基配列を含むヌクレオチドが挙げられる。中でも好ましくは、配列番号１０、１１、１２または１３で示される塩基配列からなるヌクレオチドが例示できる。
【００２０】
上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。
【００２１】
標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（モレキュラープローブ社製）、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。
【００２２】
本発明のＥＧＦＲ遺伝子変異の検出方法
本発明のＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異の有無を判別する方法は、試料中のＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０における変異を検出する方法であって、ある特定の工程により試料中の核酸を検出する方法、を含むことを特徴とする。
【００２３】
該方法の一つの様態として、以下の（ｐ）〜（ｓ）の工程を含む、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異を検出する方法が挙げられる。
（ｐ）前記のプローブと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とをハイブリダイズさせて複合体（ハイブリッド）を形成する工程。
（ｑ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
（ｒ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定する工程。
（ｓ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸におけるＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異を検出する工程。
該方法で用いられる核酸プローブとしては前記のものが使用できる。
【００２４】
本発明のＥＧＦＲ遺伝子の変異有無を判別する方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。変異の有無が判別可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。
例えば、上記の方法において、さらに工程（ｓ）のあとに以下の工程（ｔ）を行うことができる。
（ｔ）工程（ｓ）で測定または検出されるデータを解析することでＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を判別する工程
【００２５】
また、本発明のＥＧＦＲ遺伝子の変異有無を判別する方法は、さらに、以下の（ｏ）の工程を含んでもよい。
（ｏ）前記（ｐ）の工程においてハイブリッドを形成する前、または、前記（ｐ）の工程においてハイブリッドを形成すると同時に、核酸を増幅する工程。
【００２６】
該方法で用いられるＥＧＦＲ遺伝子を増幅するための核酸プライマーセットについては後述する。
【００２７】
核酸プライマーセット
本発明のＥＧＦＲ遺伝子変異の検出方法において、ＥＧＦＲ遺伝子の領域を特異的に増幅する核酸プライマーセットは、特に限定されないが、配列番号１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において、塩基番号１６８の変異を含む部分領域を核酸増幅するために用いられるものが好ましい。
そのようなものとして、例えばフォワードプライマーが以下の（Ａ）からなり、リバースプライマーが以下の（Ｂ）からなるプライマーセットが挙げられる。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の連続する１６塩基以上３２塩基以下の塩基配列からなるプライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の連続する１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるプライマー
【００２８】
さらに好ましくは、以下の（ａ）および（ｂ）の組合せからなるプライマーセットである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列の中から連続する１６塩基以上３２塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号３、４、５または６で示される塩基配列の中から選択する連続した１６個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるフォワードプライマー。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の連続する１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号７、８または９で示される塩基配列の中から選択する連続した１６個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるリバースプライマー、
【００２９】
このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号３〜６のいずれかで示される塩基配列、および、リバースプライマーとして配列番号７〜９のいずれかで示される塩基配列、の組合せが例示できる。
【００３０】
本発明における「１対の核酸プライマーセット」は、１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとで構成されることが好ましい。また、「２対の核酸プライマーセット」は、２種類のフォワードプライマーと２種類のリバースプライマーとで構成されることが好ましい。だたし、２種類は同一配列であってもよい。
【００３１】
本発明の方法において、さらに、例えばＥＧＦＲ遺伝子とは異なる遺伝子を同時に増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーや核酸プローブを追加することも特に制限されない。
【００３２】
被検核酸の増幅（工程（ｏ））
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００３３】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる。
また、これらの生体試料から抽出された核酸を用いてもよい。
【００３４】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、大腸、直腸等の組織、口腔粘膜擦過物、羊水、胸水、尿、パラフィン含埋組織、喀痰、組織切片、便、血液（全血）、血液培養液、胃液などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３５】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００３６】
［ＤＮＡポリメラーゼ］
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００３７】
本発明プローブが含まれる反応系でＥＧＦＲ遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＥＧＦＲ遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＥＧＦＲ遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００３８】
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−  ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＥＧＦＲ遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００３９】
他方、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００４０】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
【００４１】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
【００４２】
核酸増幅産物とプローブとの複合体形成（工程（ｐ））
本発明のＥＧＦＲ遺伝子変異検出方法においては、前記工程（ｏ）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
【００４３】
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００４４】
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００４５】
核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出（工程（ｑ）（ｒ）（ｓ）（ｔ））
工程（ｑ）（ｒ）（ｓ）において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
【００４６】
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００４７】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のＥＧＦＲ遺伝子の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
【００４８】
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
【００４９】
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００５０】
本発明のＥＧＦＲ遺伝子変異の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００５１】
得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００５２】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００５３】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００５４】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００５５】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５６】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００５７】
被検核酸の有無の決定（工程（ｔ））は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００５８】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５９】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【００６０】
ＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出するためのキット
本発明のＥＧＦＲ遺伝子変異を検出するためのキット（または組成物）は、前記核酸プローブを含み、前記ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２０の変異検出方法に用いることが出来る。前記キットは、さらに前記核酸プライマーセットを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。
【００６１】
本発明の方法を実施するためのキットに含まれる組成としては、請求項に記載の事項以外は特に限定されず、核酸増幅・核酸検出に必要な試薬を適宜用いることができる。核酸の増幅・検出法としては、前記の種々の方法を用いることができ、これらの方法は既に当該技術分野において確立されている。
【実施例】
【００６２】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６３】
〔実施例１：ＥＧＦＲ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
以下に示す試料１、試料２および試料３を調製した。
試料１：配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドが導入された野生型ｐｌａｓｍｉｄを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５０（コピー／μＬ）となるように調製したｐｌａｓｍｉｄ希釈液
試料２：配列番号１の塩基番号１６８のシトシンがチミンに変異した塩基配列を含むポリヌクレオチドが導入された変異型ｐｌａｓｍｉｄを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５０（コピー／μＬ）となるように調製したｐｌａｓｍｉｄ希釈液
試料３：前記の変異型ｐｌａｓｍｉｄと、前記の野生型ｐｌａｓｍｉｄを１：１０の割合で混合し１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５５０（コピー／μＬ）となるように調製したｐｌａｓｍｉｄ希釈液
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記各試料（３μｌ）にそれぞれ下記試薬（７μｌ）を添加して１０μｌとした。これに対して下記の条件により核酸増幅および融解曲線解析を行ってＥＧＦＲ遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００６４】
（試薬）
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ  オリゴヌクレオチドプライマー（塩基配列・本数等は具体例ごとに後述）０．４μＬ
１００μＭ  オリゴヌクレオチドプライマー（塩基配列・本数等は具体例ごとに後述）０．２μＬ
１０μＭ  オリゴヌクレオチドプローブ（塩基配列・本数・標識等は具体例ごとに後述）０．４μＬ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
（試料）
試料１、試料２、試料３のいずれか一つ（３μｌ）
【００６５】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００６６】
(結果)
（具体例１）図１は、フォワードプライマー（配列番号３）、リバースプライマー（配列番号８）および核酸プローブ（配列番号１１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１において、試料１の測定結果は野生型に由来する１つのシグナルのピークを示している。試料２の測定結果は変異型に由来する１つのシグナルのピークを示している。また、試料３の測定結果は野生型および変異型にそれぞれ由来する２つのシグナルのピークを示している。図1より、試料１〜３のいずれにおいてもＥＧＦＲ遺伝子が検出されており、なおかつ変異の有無が判別できている。試料３は、変異型ｐｌａｓｍｉｄと野生型ｐｌａｓｍｉｄとを１：１０の割合で混合したものであるが、本実施例は、変異型の割合が低くても、変異型のＥＧＦＲ遺伝子を野生型と区別して検出できることを示している。
【００６７】
（具体例２）また、図２は、フォワードプライマー（配列番号４および６）、リバースプライマー（配列番号７および９）および核酸プローブ（配列番号１２、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、上記と同様の実験を行った結果である。図２において、試料１の測定結果は野生型に由来する１つのシグナルのピークを示している。試料２の測定結果は変異型に由来する１つのシグナルのピークを示している。また、試料３の測定結果は野生型および変異型にそれぞれ由来する２つのシグナルのピークを示している。図２より、試料１〜３のいずれにおいてもＥＧＦＲ遺伝子が検出されており、なおかつ変異の有無が判別できている。試料３は、変異型ｐｌａｓｍｉｄと野生型ｐｌａｓｍｉｄとを１：１０の割合で混合したものであるが、本実施例は、変異型の割合が低くても、変異型のＥＧＦＲ遺伝子を野生型と区別して検出できることを示している。
以上から、上記いずれの具体例の核酸プライマー・プローブの組み合わせでもＥＧＦＲ遺伝子変異の有無を検出できており、本発明のＥＧＦＲ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはいずれもＥＧＦＲ遺伝子変異の有無の検出に有効であることが示された。
【００６８】
〔比較例１：異なる核酸プローブを用いたＥＧＦＲ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。ただし、用いた試薬、試料は下記のとおり。
【００６９】
（試薬）
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ  核酸プライマー（塩基配列・本数等は具体例ごとに後述）０．２μｌ
１０μＭ  核酸プライマー（塩基配列・本数等は具体例ごとに後述）０．４μｌ
１０μＭ  核酸プローブ（塩基配列・本数・標識等は具体例ごとに後述）０．４μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
（試料）
試料１、試料２、試料３のいずれか一つ（３μｌ）
【００７０】
(結果)
図３は、フォワードプライマー（配列番号４）、リバースプライマー（配列番号７）および核酸プローブ（配列番号１４）からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図３において、試料１の測定結果は野生型に由来する１つのシグナルのピークを示している。試料２の測定結果は変異型に由来する１つのシグナルのピークを示している。一方、試料３の測定結果は野生型に由来するシグナルのピークを示しているものの、変異型に由来するシグナルのピークは示されていない。試料３は、変異型ｐｌａｓｍｉｄと野生型ｐｌａｓｍｉｄとを１：１０の割合で混合したものであるが、本比較例は、変異型の割合が低い場合、変異型のＥＧＦＲ遺伝子を検出できず野生型のみが検出されることを示している。
【００７１】
以上のことから、本発明の核酸プローブを用いると、ＥＧＦＲ遺伝子の検出において、変異型の割合が低くても野生型と変異型とを区別して検出することができることが示された。以上から、本発明で規定した特徴を有する核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いて、本発明の検出方法を実施することが重要であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、がん細胞のＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無の検出など、診断や医療などの分野に貢献する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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