【手続補正書】
【提出日】平成27年5月27日(2015.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
（ａ）クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、該ｃｒＲＮＡと二本鎖ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対合によって該二本鎖ＤＮＡ上のプロトスペーサーに結合するように特異的に適合されたデザインされた配列を含み、ここで、該ＤＮＡは好ましくは真核細胞中のゲノムＤＮＡであり、好ましくは哺乳動物細胞であり、ここで、該プロトスペーサーは、該二本鎖ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフに隣接している、ｃｒＲＮＡ；および
（ｂ）ヌクレアーゼを含む、クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチド
を含む、組成物。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記真核細胞が真菌細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記真核細胞が酵母細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼがＦｏｋＩである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞がヒト胚性幹細胞以外の哺乳動物幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記デザインされた配列がスペーサー配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記スペーサー配列が３２ヌクレオチドであり、かつ前記二本鎖ＤＮＡに対して少なくとも５０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記デザインされた配列が、前記二本鎖ＤＮＡの前記相補鎖上の前記プロトスペーサー隣接モチーフに隣接してハイブリッド形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｃｒＲＮＡが３５〜７５残基の範囲の長さを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ｃｒＲＮＡがシード領域、３’ヘアピン領域、またはシード領域と３’ヘアピン領域との両方を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記プロトスペーサー隣接モチーフが、５’−ＣＣＴ−３’、５’−ＣＴＴ−３’、５’−ＣＡＴ−３’および５’−ＣＴＣ−３’からなる群より選択されるトリプレットを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プロトスペーサー隣接モチーフがＣＣジヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プロトスペーサー隣接モチーフが、前記二本鎖ＤＮＡ中の、前記ｃｒＲＮＡとの塩基対合が起こるポイントを標識する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチドが、ヘリカーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写アクチベーター、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合ポリペプチド、ＤＮＡ構造化ポリペプチド、マーカーポリペプチド、レポーターポリペプチド、蛍光ポリペプチド、リガンド結合ポリペプチド、シグナルポリペプチド、細胞内局在ポリペプチド、および抗体エピトープ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチドが、前記二本鎖ＤＮＡ内の所望の位置に少なくとも１つの一本鎖の切断を導入することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチドが、前記二本鎖ＤＮＡ内の所望の位置に少なくとも１つの二本鎖の切断を導入することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチドが、前記二本鎖ＤＮＡを切断することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチドが、前記二本鎖ＤＮＡ中の所望の位置でｄｓＤＮＡ分子の非相同末端結合をすることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチドが、前記二本鎖ＤＮＡ中に所望の位置で核酸の相同組換えをすることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチドが、前記二本鎖ＤＮＡ中に所望のヌクレオチド配列を挿入することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記二本鎖ＤＮＡが遺伝的改変の標的である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復ＲＮＡおよび前記クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドリーム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ポリペプチドが、リボ核タンパク質複合体を形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
送達ビヒクルをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
疾患を処置するための医薬の調製における請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物を含むキット。
【請求項２８】
宿主哺乳動物細胞における標的核酸を改変、視覚化、転写活性化、または転写抑制することができるリボ核タンパク質の成分を生成するための発現ベクターであって、ここで、該発現ベクターは、請求項１〜２３のいずれかに記載のクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復ＲＮＡをコードする配列、および請求項１〜２３のいずれかに記載のクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復関連ポリペプチドをコードする配列を含む、発現ベクター。
【請求項２９】
組成物であって、
（ａ）プロトスペーサー隣接モチーフを含む二本鎖標的核酸；および
（ｂ）クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復ＲＮＡを含むデザインされた核酸であって、ここで、該クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復ＲＮＡのスペーサー部分は、塩基対合によって該二本鎖標的核酸の一方の鎖に結合する、核酸、
を含む、組成物。
【請求項３０】
哺乳動物細胞中の標的核酸の発現を変更することができるクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復システムであって、ここで、該システムは、
ａ）該標的核酸とハイブリッド形成する、クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復ＲＮＡをコードする第１ヌクレオチド配列、および
ｂ）クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復関連ポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列、
を含む１つ以上のベクターを含み、
ここで、構成部分（ａ）および（ｂ）は、該システムの同じかまたは異なるベクターに存在し、それにより、該クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復ＲＮＡは、該標的核酸をターゲティングし、そして該クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復関連ポリペプチドタンパク質は、該ＤＮＡ分子を切断する、システム。
【請求項３１】
クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復ＲＮＡおよびクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復関連タンパク質複合体を含む、リボ核タンパク質複合体であって、ここで、該リボ核タンパク質複合体は、哺乳動物細胞における標的核酸を改変、視覚化、転写活性化、または転写抑制することができる、リボ核タンパク質複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
本発明を、ここに、詳細且つ特定の例および図面を参照して記載するであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
少なくとも以下のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質サブユニット：
−配列番号３のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１８％同一の配列を有するＣａｓ７、
−配列番号４のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１７％同一の配列を有するＣａｓ５、および
−配列番号５のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１６％同一の配列を有するＣａｓ６を含み、
該サブユニットの少なくとも１つが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列を含む、
抗ウイルス防御のための、クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質複合体、またはその一部。
（項目２）
前記Ｃａｓ６サブユニットが、配列番号１７のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１６％同一の配列を有するＣａｓ６ｅサブユニットである、項目１に記載のタンパク質複合体。
（項目３）
配列番号２のアミノ酸配列またはこれと少なくとも２０％同一の配列を有するＣｓｅ２サブユニットをさらに含み、必要に応じて、さらなるアミノ酸配列を含むのはＣｓｅ２サブユニットである、項目１または項目２に記載のタンパク質複合体。
（項目４）
配列番号１のアミノ酸配列またはこれと少なくとも９％同一の配列を有するＣｓｅ１サブユニットをさらに含み、必要に応じて、さらなるアミノ酸配列を含むのはＣｓｅ１サブユニットである、項目１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
（項目５）
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムタンパク質複合体、好ましくはＩ−Ｅ亜型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質複合体である、項目４に記載のタンパク質複合体。
（項目６）
前記さらなるアミノ酸配列が、前記少なくとも１つのサブユニットに翻訳的に融合するかまたは共有結合しており、好ましくは、前記さらなるアミノ酸配列が、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、またはＣａｓ６ｅサブユニットのうちの少なくとも１つの少なくともＮ末端および／またはＣ末端に融合または連結している、項目１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
（項目７）
前記さらなるアミノ酸配列がＣｓｅ１、Ｃｓｅ２、またはＣａｓ５サブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくは、Ｃｓｅ１サブユニットのＮ末端、Ｃｓｅ２サブユニットのＮ末端、またはＣａｓ７サブユニットのＮ末端に融合または連結している、項目６に記載のタンパク質複合体。
（項目８）
前記さらなるアミノ酸配列がタンパク質であり、該タンパク質が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ（例えば、Ｃａｓ３）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｄａｍ）、またはＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（コ）アクチベーター、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構造化タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙまたは重金属結合タンパク質）、シグナルペプチド（例えば、Ｔａｔ−シグナル配列）、細胞内局在配
列（例えば、核局在配列）、または抗体エピトープから必要に応じて選択される、項目７に記載のタンパク質複合体。
（項目９）
前記ヌクレアーゼが、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはＦｏｋＩ、より好ましくは改変ＦｏｋＩ（例えば、ＫＫＲ  ＳｈａｒｋｅｙまたはＥＬＤ  Ｓｈａｒｋｅｙ）から選択される、項目８に記載のタンパク質複合体。
（項目１０）
標的核酸配列と少なくとも５０％同一のリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をさらに含む前記いずれかの項目に記載のタンパク質複合体であって、該タンパク質複合体および該ＲＮＡ分子がリボ核タンパク質複合体を形成する、タンパク質複合体。
（項目１１）
前記ＲＮＡ分子の一部が前記標的配列と少なくとも５０％同一である、項目１０に記載のリボ核タンパク質複合体。
（項目１２）
前記ＲＮＡ分子の前記一部がその長さに沿って前記標的配列と少なくとも実質的に相補的である、項目１１に記載のリボ核タンパク質複合体。
（項目１３）
前記ＲＮＡ分子の長さが３５〜７５残基の範囲である、項目１０〜１２のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
（項目１４）
所望の核酸配列をターゲティングするために使用した前記ＲＮＡ分子の前記一部が３２または３３残基長である、項目１０〜１３のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
（項目１５）
前記ＲＮＡ分子が前記標的配列と少なくとも実質的な相補性を有するＲＮＡ配列の５’側にある８残基を含む、項目１０〜１４のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
（項目１６）
前記ＲＮＡ分子が、前記標的配列に少なくとも実質的な相補性を有する前記ＲＮＡ配列の３’側にヘアピンおよびテトラヌクレオチドループ形成配列を有する、項目１０〜１５のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
（項目１７）
ａ．配列番号１のアミノ酸配列またはこれと少なくとも９％同一の配列を有するＣｓｅ１サブユニット；
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列またはこれと少なくとも２０％同一の配列を有するＣｓｅ２サブユニット；
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１８％同一の配列を有するＣａｓ７サブユニット；
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１７％同一の配列を有するＣａｓ５サブユニット；
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１６％同一の配列を有するＣａｓ６サブユニットから選択され、
ここで、少なくともａ、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質サブユニットをコードする単離核酸分子。
（項目１８）
前記核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列が前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク
質サブユニットに融合している、項目１７に記載の単離核酸分子。
（項目１９）
前記さらなるアミノ酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ（例えば、Ｃａｓ３）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｄａｍ）、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（コ）アクチベーター、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構造化タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙまたは重金属結合タンパク質）、シグナルペプチド（例えば、Ｔａｔ−シグナル配列）、細胞内局在配列（例えば、核局在配列）、または抗体エピトープから選択される、項目１８に記載の単離核酸分子。
（項目２０）
項目１７〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目２１）
項目１０〜１６のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目２０に記載の発現ベクター。
（項目２２）
標的核酸の改変、視覚化、転写活性化、または転写抑制の方法であって、該核酸を、
ａ．項目１０〜１６のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体、または
ｂ．項目１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質複合体および項目１０〜１６のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子
と接触させる工程を含む、方法。
（項目２３）
細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を項目２２に記載の発現ベクターおよび項目１０〜１８のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入する工程を含む、方法。
（項目２４）
細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を項目２２に記載の発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入し、次いで、項目１０〜１８のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子を該細胞へまたは該細胞内に投与する工程を含む、方法。
（項目２５）
細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を項目２１に記載の発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入する工程を含む、方法。
（項目２６）
前記核酸またはクロマチンを改変または視覚化する活性を有するさらなるアミノ酸配列がマーカーであり、前記マーカーが前記標的核酸またはクロマチンと会合し、好ましくは、前記マーカーがタンパク質であり、該タンパク質は必要に応じて蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））である、項目２２〜２５のいずれか１項に記載の標的核酸を改変するかまたは視覚化する方法。
（項目２７）
前記標的核酸がＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡである、項目２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記標的核酸がＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである、項目２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性を有するさらなるアミノ酸配列がヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ−ヘリカーゼであり、前記改変が所望の遺伝子座での一本鎖切断または二本鎖切断である、項目２２〜２６のいずれか１項に記載の標的核酸を改変する方法。
（項目３０）
ｄｓＤＮＡ分子からヌクレオチド配列の少なくとも一部を除去するため（必要に応じて、遺伝子の機能をノックアウトするため）の所望の遺伝子座での細胞内のｄｓＤＮＡ分子の非相同末端結合方法であって、項目２９に記載の標的核酸を改変する方法を使用して二本鎖切断をつくる工程を含む、方法。
（項目３１）
既存のヌクレオチド配列を改変するかまたは所望のヌクレオチド配列を挿入するための所望の遺伝子座での細胞内のｄｓＤＮＡ分子中への核酸の相同組換え方法であって、項目２９に記載の標的核酸を改変する方法を使用して所望の遺伝子座で一本鎖または二本鎖切断をつくる工程を含む、方法。
（項目３２）
項目２２〜２５のいずれか１項に記載の方法で標的核酸配列を改変する工程を含む生物における遺伝子発現を改変するか、活性化するか、または抑制する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、デメチラーゼまたはデアセチラーゼ）、転写アクチベーター、または転写リプレッサーから選択される、方法。
（項目３３）
項目２２〜２５のいずれか１項に記載の方法に記載のとおりに標的核酸配列を改変する工程を含む生物における遺伝子発現を改変するか、活性化するか、または抑制する方法であって、前記核酸がｍＲＮＡであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性、または転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列が、リボヌクレアーゼであり、該リボヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、３’エキソヌクレアーゼ、または５’エキソヌクレアーゼから必要に応じて選択される、方法。
（項目３４）
前記細胞が原核生物である、項目２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞が、真核細胞であり、例えば、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞である、項目２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記哺乳動物またはヒトの細胞がヒト胚性幹細胞以外の幹細胞、好ましくは単離幹細胞である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションする、項目３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記標的核酸が三次構造を有し、該三次構造が必要に応じてスーパーコイルであり、好ましくは、前記標的核酸が負のスーパーコイルである、項目２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
項目１〜９のいずれか１項に記載のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体を含む薬学的組成物。
（項目４０）
項目１０〜１６のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体を含む薬学的組成物。
（項目４１）
項目１７〜１９のいずれか１項に記載の単離核酸または項目２０もしくは項目２１に記載の発現ベクターを含む薬学的組成物。
（項目４２）
項目１〜９のいずれか１項に記載のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体および項目１０〜１６のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子を含むキット。
（項目４３）
医薬として使用するための項目１〜９のいずれか１項に記載のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体。
（項目４４）
医薬として使用するための項目１０〜１６のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
（項目４５）
医薬として使用するための項目１７〜１９のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目４６）
医薬として使用するための項目２０または項目２１に記載の発現ベクター。