【事件の表示】
　特願２００９−　１１１９４「循環腫瘍細胞、断片およびデブリスの分析」拒絶査定不服審判事件〔平成２１年　５月２１日出願公開、特開２００９−１０９５１４〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯 
 　本願は、平成１４年８月２３日（優先権主張：平成１３年８月２３日，平成１４年４月３日　米国）を国際出願日とする出願（特願２００３−５２３９６１号）の一部を、平成２１年１月２１日に新たな特許出願（特願２００９−１１１９４号）として出願されたものであって、平成２２年６月２９日付けで拒絶理由が通知され、同年１２月２日に意見書及び手続補正書が提出され、平成２３年５月６日付けで最後の拒絶理由が通知され、同年９月２０日に意見書及び手続補正書が提出されたが、平成２４年３月３０日付けで、同手続補正について補正却下の決定がなされるとともに、同日付で拒絶査定がなされ、これに対し、同年８月１日に拒絶査定不服審判が請求されるとともに，同日付けで手続補正がなされたものである。
 　 
第２　平成２４年８月１日付けの手続補正についての補正の却下の決定
 ［補正の却下の決定の結論］ 
 　平成２４年８月１日付けの手続補正（以下、「本件補正」という。）を却下する。 
 　 
 ［理由］  
 １．本件補正について
　（１）本件補正後の請求項１に記載された発明
　本件補正により、補正前の特許請求の範囲（平成２３年９月２０日付けの手続補正は補正却下されているので、平成２２年１２月２日付けの手続補正により補正されたもの。）の請求項１が、次のとおりに補正された。（下線は補正箇所を示す。）
「　　【請求項１】
　テスト対象において病気を検出する方法であって、
　ａ．テスト対象から生物学的検体を得、該検体は無傷の稀な細胞を含有することが疑われる混合された細胞集団を含み、およびさらに
　　i．稀な細胞に由来する細胞断片、または
　　ii．稀な細胞に由来する細胞デブリス；
を含み；
　ｂ．磁気−標識試料を調製し、ここに、該生物学的試料は、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスと特異的に反応する第１の生物特異的リガンドにカップリングしたコロイド状磁性粒子と、他の検体成分の実質的排除まで、混合され、ここに、前記コロイド状磁性粒子は、蛋白質ベースのコーティング材料でコートされた磁性コア材料であり、９０ないし１５０ｎｍの範囲内の、かつ７０ないし９０％の磁性質量を有し
、９０ｎｍより小さなまたは１５０ｎｍより大きな痕跡量の材料を含み
　ｃ．該磁気−標識試料を、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドと、他の検体成分の実質的排除まで、接触させ；
　ｄ．該標識された稀な細胞、および該標識された細胞断片または該標識された細胞デブリスを分析することを含み、該標識された稀な細胞、該標識された細胞断片、および該標識された細胞デブリスの存在は病気の存在を示す；
ことを特徴とする方法。」
　
　なお、上記記載中の「ｃ．」の工程は、本件補正の前後とも「ｃ．該磁気−標識試料
、
を
、
を
 　 
 （２）本件補正の目的について
　特許請求の範囲の請求項１についての上記の補正は、補正前の「前記コロイド状磁性粒子は、蛋白質ベースのコーティング材料でコートされた磁性コア材料であり、９０ないし１５０ｎｍの範囲内の、かつ７０ないし９０％の磁性質量を有し；」という、前記コロイド状磁性粒子についての記載を、さらに「９０ｎｍより小さなまたは１５０ｎｍより大きな痕跡量の材料を含み」と限定するものであるから、上記補正は、平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるものとされた同法による改正前の特許法（以下、「平成１８年改正前特許法」という。）第１７条の２第４項第２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当すると認められる。
　そこで、補正後の請求項１に記載された発明（以下、「補正発明」という。）が特許出願の際に独立して特許を受けることができるものであるか（同法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するか否か）について以下に検討する。
  　 
２．独立特許要件についての検討
　（１）引用刊行物及びその記載事項 
　ア　刊行物１（WANG, Z.-P. et al.，Identification and characterization of circulating prostate carcinoma cells，Cancer，２０００年６月１５日，Vol.88, No.12，p.2787-2795）
　原査定の拒絶の理由に引用され、本願優先権主張日前に頒布された刊行物１は、“循環前立腺癌細胞の同定と特徴付け”と題する論文であって、次の事項が図等とともに記載されている。 
　（ア）第２７８８頁左欄３１行〜４０行
「MATERIALS AND METHODS
Blood Collection
With informed consent, 10-20 mL of blood were drawn from the 
antecubital veins of control subjects and patients with prostate 
carcinoma into Vacutainer tubes (Becton Dickinson, Frankin Lakes, 
NJ) containing acid citrate dextrose solution A as an anticoagulant.
The samples were processed at room temperature by using an isolation
 procedure within 24 hours of the draw. 」
（当審和訳：
材料と方法 
血液採取 
 インフォームドコンセントを行い、１０−２０ｍＬの血液が、対照被験者と前立腺癌患者の肘正中静脈から、抗凝固剤としてクエン酸デキストロース溶液Ａを収容した真空採血管（Becton　Dickinson，Frankin　Lakes，NJ）に採取された。採血から２４時間以内に単離工程を用いて室温で処理された。）
　
　（イ）第２７８８頁左欄４３行〜右欄１８行
「Isolation of Circulating Cancer Cells in the Prostate Carcinoma 
Patient Group
Ten to twenty milliliters of the patients’ blood were diluted to 30
 mL (at 15-30 ℃) with room temperature 1 × phosphate-buffered 
saline (PBS) in a Corning 50-mL polypropylene tube (Corning Glass 
Works,Corning, NY). Tubes were capped and mixed gently by inversion
 three to six times. With a 30-mL syringe and pipetting standard hub
 blunt end stainless steel needle (Popper and Sons, Inc., New Hyde 
Park, NJ), 10 mL of a 1.068 g/mL density gradient were added to the
bottom of the sample tube followed by another 10 mL of a 1.083 g/mL
 gradient beneath the 1.068 g/mL density gradient. The tube was 
centrifuged at ×400 g for 30 minutes at 20 ℃ to allow separation.
The upper gradient interface (1.068 g/mL) and the lower gradient 
interface (1.083 g/mL) were collected along with the gradient (about
 10 mL for each of the two layers) using a disposable transfer 
pipette. The two collections were placed in two new 50-mL 
polypropylene tubes from Corning and were labeled according to 
density. Forty milliliters of PBS were added to these new tubes 
containing the interfaces, and the tubes were mixed gently but 
thoroughly by inversion. Both tubes were centrifuged at ×258 g for 
10 minutes to wash the collected cells. The supernatant in each tube
 was then gently aspirated and discarded using a 25-mL pipette or 
vacuum pump, and the cell pellet was retained at the bottom of each 
tube.」
（当審和訳：
前立腺癌患者グループの循環腫瘍細胞の単離 
 患者の血液１０−２０ｍＬが、コーニング５０ｍＬポリプロピレン管（Corning　Grass　Works，Corning、ＮＹ）中で、室温の１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３０ｍＬに希釈された（１５−３０℃）。管は蓋をして反転により穏やかに３−６回混合された。３０ｍＬのシリンジとピペッティングスタンダードハブ鈍端ステンレス鋼針（Popper　and　Sons，Inc.，New　Hyde　Park，ＮＪ）を用いて、１．０６８ｇ／ｍＬ密度勾配液１０ｍＬが試料管の底部に添加され、次いで１．０８３ｇ／ｍＬ勾配液の別の１０ｍＬが、１．０６８ｇ／ｍＬ密度勾配液の下に添加された。試料管は、×４００ｇで３０分、２０℃で分離できるまで遠心分離された。上部の勾配界面（１．０６８ｇ／ｍＬ）と下部の勾配界面（１．０８３ｇ／ｍＬ）は、使い捨て移送ピペットを用いて、勾配液（それぞれの層約１０ｍＬ）と共に収集された。２つの収集物は、２つの新しい５０ｍＬのコーニング社製ポリプロピレン管に入れられて、密度に応じて標識された。ＰＢＳ４０ｍＬが、界面を入れたこれら２つの新しい管に加えられ、管は穏やかにしかし完全に反転により混合された。２つの管は、収集された細胞を洗浄するために、×２５８ｇで１０分遠心分離された。２つの管の上清は、２５ｍＬのピペットまたは真空ポンプによりそれから穏やかに吸引され廃棄され、そして細胞ペレットは、各管の底に保持された。）
　
　（ウ）第２７８８頁右欄１９行〜最終行
「Magnetic Cell Sorting and Slide Preparation
To remove excess leukocytes and thus enrich the target cancer cells 
in the blood, a CD-45 mouse-antihuman immunoglobulin G magnetic bead
 isolation system was employed. The cell pellet from the 1.083g/mL 
gradient collection was resuspended with 1.0mL of 0.1% bovine serum 
albumin (BSA) and placed on ice for the magnetic cell sorting. Two 
hundred microliters of magnetic Dynal beads (M450;Dynal,Oslo,Norway)
 were pipetted and added to a 5-mL polypropylene tube. The beads 
were washed in 3.0 mL of 0.1% BSA to remove sodium azide. The cell 
suspension from the 1.083 g/mL gradient (about 1.0 mL) was transferr-ed to the tube containing the washed beads. Remaining cells were 
washed from the wall of the original centrifuge tube with another 
1.0 mL of 0.1% BSA and transferred to the tube containing the magne-tic beads for a total volume of 2.0 mL. The cells were incubated 
with the beads at 4-8℃ for 30 minutes at 10 rpm on an Orbitron 
Rotator (Dynal). The tube was then placed in a magnetic particle 
concentrator (Dynal) for 2 minutes to allow for maximum leukocyte 
depletion. The 1.068 g/mL cell suspension was transferred to a 5-mL 
Falcon 2005 tube and kept on ice during the CD45+ incubation of the 
1.083 g/mL suspension. After leukocyte depletion, the supernatant
from the CD45 negative collection of the 1.083 g/mL suspension was 
transferred to the same tube as the 1.068 g/mL suspension. After 
mixing the two collections, the suspension was loaded into a 
cytofunnel and cytospun at 1000 rpm for 10 minutes at room temperat-ure. Slides were air dried for at least 2 hours before staining.」
(当審和訳：
磁気細胞分離とスライド調製 
　過剰な白血球を除去し、血中の標的癌細胞を豊富化するために、ＣＤ−４５マウス抗ヒトイムノグロブリンＧ磁気ビーズ単離システムが採用された。１．０８３ｇ／ｍＬ勾配収集物は、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１．０ｍＬに再懸濁され、磁気細胞分離のために氷の上に置かれた。２００μｌの磁気Dynalビーズ（Ｍ４５０；Dynal,　Oslo,　Norway）がピペットで５ｍＬポリプロピレン管に入れられた。ビーズは、アジ化ナトリウムを除去するために３．０ｍＬの０．１％ＢＳＡで洗浄された。１．０８３ｇ／ｍＬ勾配液からの細胞懸濁液（約１．０ｍＬ）は、洗ったビーズが入った管に移された。残った細胞は当初の遠心管の壁から、別の１．０ｍLの０．１％ＢＳＡで洗い落とされ、磁気ビーズが入った管に移され、合計量２．０ｍＬとした。細胞はビーズと共に、４−８℃で３０分間、オービトロンロータ（Dynal）で１０ｒｐｍインキュベートされた。それから、該管は、最大の白血球枯渇が得られるように、磁気粒子豊富化器（Dynal）中に２分間置かれた。１．０６８ｇ／ｍＬ細胞懸濁液は、５ｍＬファルコン２００５管に移され、１．０８３ｇ／ｍＬ細胞懸濁液のＣＤ４５＋インキュベーションの間、氷の上に置かれた。白血球枯渇後、１．０８３ｇ／ｍＬ細胞懸濁液のＣＤ４５陰性収集物の上清は、１．０６８ｇ／ｍＬ細胞懸濁液と同じ管に移された。２つの収集物を混合した後、１０００ｒｐｍで１０分間室温でサイトファネルとサイトスピンにかけられた。スライドは、染色前に少なくとも２時間空気で乾燥させた。）
　
　（エ）第２７８９頁左欄１行〜右欄２２行
「Immunocytochemical Staining
 Slides were fixed in 2% paraformaldehyde for 15 minutes then rinsed
 two times with 1 × PBS. Slides were then incubated in 1 × PBS for
 10 minutes at room temperature. Next,30μL of anticytokeratin 
antibody fluorescein isothiocyanate (CAM 5.2; Becton-Dickinson), an 
antibody against prostate specific antigen (PSA; DAKO, Carpinteria,
 CA), and an antibody against PSMA were added to each slide. The 
7E11-C5 and 9H10-A4 antibodies7 against PSMA that were used in this 
procedure were produced from a hybridoma culture (American Type 
Culture Collection, Rockville, MD). The J591 antibody8 against PSMA
that was used in this procedure was generously donated by Dr. Neil
 Bander at the New York Hospital-Connell Medical Center. A coverslip
 was placed on the sample area, and slides were incubated at room 
temperature for 60 minutes in a moisture box. Coverslips were then 
removed from the slides, and slides were washed in a Coplin jar 
containing 1 × PBS at room temperature for 10 minutes. Finally，
slides were air dried for 10 minutes at room temperature.」
(当審和訳：
免疫細胞化学染色 
　スライドは、２％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定され、１×ＰＢＳで２回すすがれた。それから、スライドは、１×ＰＢＳで１０分間、室温でインキュベートされた。次に、３０μＬの抗サイトケラチン抗体フルオレセインイソチオシアネート（ＣＡＭ５．２、；Becton-Dickinson）、前立腺特異的抗原に対する抗体（PSA；DAKO，Carpinteria，CA）、および抗ＰＳＭＡ抗体が、それぞれのスライドに加えられた。この工程で用いられた、ＰＳＭＡに対する７Ｅ１１−Ｃ５と９Ｈ１０−Ａ４抗体は、ハイブリドーマから作られた（Americai Type Culture Collection,Rockvill,MD）。この工程で用いられた、ＰＳＭＡに対するＪ５９１抗体は、ニューヨークのCornell medical病院のNeil Bander博士から気前よく提供された。試料領域にカバーガラスが置かれ、スライドは加湿された箱の中で、室温で６０分間インキュベートされた。それから、スライドからカバーガラスが取り除かれ、スライドは、１×ＰＢＳの入ったコプリン広口瓶中で、室温１０分間洗浄された。最後に、スライドは、１０分間室温で空気乾燥された。
　
　（オ）第２７８９頁左欄２３行〜最終行
「Fluorescent in Situ Hybridization
 The slides were dehydrated by using 75%, 85%, and 95% alcohol in a 
Coplin jar for 1 minute at each concentration. Next, slides were 
dried for 10 minutes at room temperature. Fluorescent in situ 
hybridization (FISH) cocktail (volume/slide) was prepared by using
 either 19μL of FISH buffer with １μL of chromosomal centromere 
probes (Cell Works, Baltimore, MD), PSMA mRNA probes (Cell Works), 
or an androgen receptor gene probe (Vysis, Downers Grove, LL). FISH
 cocktail was added to the sample area on the slide, covered with a 
coverslip, and sealed with rubber cement. Samples were denatured at 
85 ℃ for 5 minutes on a hot plate. Samples were then placed in a 
moisture box and hybridized in a 42 ℃ oven for 4 hours. After
 hybridization, rubber cement and coverslips were removed carefully from the slides. Slides were washed in a Coplin jar containing 2 × 
standard saline citrate/ 0.1% NP-40 (USB, Cleveland, OH) at 42 ℃ 
(preheated) for 2 minutes then air dried at room temperature.Samples
 were counterstained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 
mounting medium (1.0μg/ mL; Vector Laboratories, Burlingame, CA),
covered with a coverslip, and sealed with FLO-TEXX mounting medium
 (Lerner Laboratories, New Haven,CT). The slides were placed in a 
dark area at room temperature for at least 10 minutes. Analysis of 
stained slides was conducted by using computerized fluorescent 
microscopy. Positive cancer cells were imaged and stored electronic-
ally.」
(当審和訳：
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション 
　スライドは、コプリン広口瓶中で、７５％、８５％、９５％のアルコールでそれぞれ１分間水分を除いた。次にスライドは、１０分間室温で乾燥された。蛍光インサイシューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）混合物（容量／スライド）が、ＦＩＳＨ緩衝液１９μLと、１μLの染色体セントロメアプローブ（Cell Works,Baltimore,MD）、PSM ｍRNAプローブ（Cell Works）、又はアンドロゲンレセプタープローブ（Vysis,Downers Grove,IL）とを用いて調製された。ＦＩＳＨ混合物はスライドの試料領域に添加され、カバーガラスがかけられ、そしてゴム接着剤で封入された。・・・・試料は、封入剤中（1.0μg/mL；Vector　Laboratories,CA）で、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により対比染色され、カバーガラスをかけ、FLO-TEXX封入剤（Lerner laboratories，New Haven,CT）で封入された。スライドは、暗くして室温で１０分間置かれた。染色したスライドの分析は、コンピュータ化された蛍光顕微鏡で行われた。陽性癌細胞は画像化され電子的に保存された。）
　
　（カ）第２７８９頁右欄２１行〜２７行
「Negative Controls
With informed consent, 10-20 mL of blood from 20 females and 43
males without cancer were collected for negative control samples. 
The blood samples were subjected to the complete isolation and 
staining procedure described above. Stained slides were examined by
microscopy.」
(当審和訳：
陰性コントロール 
　インフォームドコンセントのもと、１０−２０ｍＬの血液が、癌でない２０人の女性および４３人の男性から、陰性コントロールとして採取された。血液サンプルは、上述のような完全な単離と染色工程を受けた。染色スライドは、顕微鏡で観察された。）
 　 
　（キ）第２７８９頁右欄２８行〜第２７９０頁左欄５行 
「RESULTS
・・・・・・
In the female control samples (no cultured cells added), no 
circulating epithelial cells were found. Three of 43 male controls
(7%; no cultured cells added)were found to have cytokeratin 7/18
positive epithelial cells in circulation; however, these cells
lacked prostate specific signals and chromosome aneuploidy. 
The average numbers of prostatic circulating cells from the patients
with prostate carcinoma were 17.28±37.45 (mean ±standard deviation
;n =106 cells), and the median number was 5(1-259 cells)in 10-20 mL
of blood. The data from 25 patients with advanced prostate carcinoma
are shown in Table 2.」
(当審和訳：
結果 
・・・・・
女性コントロール試料（培養細胞非添加）中には、循環上皮細胞は発見されなかった。４３中３人の男性コントロール（７％、培養細胞非添加）は、サイトケラチン７／１８陽性上皮細胞が循環していた。しかしながら、これらの細胞は、前立腺特異的シグナルと、染色体の異数性は欠如していた。循環前立腺細胞数の平均は、前立腺患者では１７．２８±３７．４５（平均±標準偏差；ｎ＝１０６細胞）、そして中位数は、血液１０−２０ｍL中５（１−２５９細胞）であった。進行前立腺癌の２５人の患者からのデータが、表２に示されている。）
　
　（ク）第２７９０頁右欄１９行〜第２７９３頁左欄１５行
「 The morphologic characteristics exhibited by circulating cancer 
cells stained with fluorescent dyes are different from those 
exhibited by using the traditional method of Papanicolaou. Based on
morphologic analysis under a computerized fluorescent microscope, 
the major class, or class １ (Fig. 1A), representing approximately 
70% of circulating cancer cells, is comprised of the following 
structural features: First, the cells have large cell bodies 
(diameter 20-30μm), and the shapes of the cancer cells can be 
irregular, elliptical, or round. After staining, two signals can be
detected in the cancer cell cytoplasm. The cytokeratin staining
produces a network that covers areas of cytoplasm and nucleus
comprised of thick, intensely fluorescent filaments. The PSMA
antibody staining results in homogenous signal intensity in the
central cytoplasm, with more intense staining at the edge of the
cytoplasm. This forms a fluorescent rim at the outermost edges of
the cancer cell. The cancer cell nucleus also varies in shape with 
DAPI staining. Nuclear morphology can be irregular, elliptical, or
round. The majority of circulating cancer cells in this group 
exhibited aneuploidy regardless of cell size or shape.  In addition
to the major class of circulating cancer cell described above, 
there are six additional classes that have been identified using 
fluorescent microscopy. Class 2 is comprised of cells that are very
large compared with the surrounding blood cells. The nuclei are very
large and loose in structure when they are viewed under DAPI 
staining.　These cells are light, fragile, and capable of being 
detained in a 1.068 g/mL gradient. Their fragility prohibits this 
class of circulating cancer cells from to lerating isolation
procedures that involve magnetic beads. The third class (Fig.1B,C)
can be stained with cytokeratin and PSMA antibodies but lacks 
a nucleus when it is subjected to DAPI staining. This class
of cells appears to become enucleated as they circulate in the 
patients' blood. The fourth class consists of cellular debris (Fig.
1D) with cytokeratin and PSMA specific positive staining. 
At times, nuclear debris can be observed among the cytoplasmic 
debris with DAPI staining. The fifth class (Fig. 1E)　
possesses stem cell-like morphologic characteristics, such as small
size (comparable to a large monocyte), high density, a cytokeratin 
system, PSMA expression, and aneuploidy. The sixth class
contains cytokeratin and PSMA positive cells in M-phase 
(Fig.1F), a rarity among the large population of circulating cancer 
cells in interphase. The seventh and final class of circulating
cancer cells conglomerates in clusters in the patients' blood
(Fig. 1G,H). These circulating cancer cell clusters contain 3-100
cells, possess variable cell sizes, and exhibit positive expression
of cytokeratin (Fig. 1G) and PSMA (not shown). The morphologic
profile of the cluster is like that of a massive ball with a rough 
surface.」
(当審和訳：
　蛍光染料で染色された循環腫瘍細胞が示す形態的特徴は、パパニコローの従来法により示されるものと異なる。コンピューター化された蛍光顕微鏡による形態分析に基づき、主要クラス、つまりクラス１（図１Ａ）であり、循環癌細胞が７０％をしめる細胞は、次のような構造的特徴を示す：第１に、大きな細胞体（直径２０−３０μｍ）を持つ、そして、癌細胞の形は、不定形、楕円形、又は円形。染色の後、癌細胞の細胞質中に２つのシグナルを検出できる。サイトケラチン染色は、細胞質の領域を覆う網目を形成し、核は、濃く強い蛍光フィラメントで構成される。ＰＳＭＡ抗体染色は、細胞質の中央に均一な濃度のシグナルを形成し、細胞質の縁には、さらに濃い染色を伴っている。癌細胞の最外部縁では、蛍光の縁を形成する。癌細胞核は、ＤＡＰＩ染色で、同様に形が様々である。核の形態は、不定形、楕円形、円形である。このグループの循環癌細胞の大多数は、細胞の大きさ又は形にかかわらず、異数性を示す。 
 　上述の循環腫瘍細胞の主要クラスに加えて、蛍光顕微鏡を使って特定される６つの付加的なクラスがある。クラス２は、周りの赤血球に比べてとても大きい細胞で構成される。ＤＡＰＩ染色の観察で、核は非常に大きく、構造が緩んでいる。これらの細胞は、軽く、壊れやすく、１．０６８ｇ／ｍＬ勾配液中に拘留されうる。その細胞の壊れやすさは、循環腫瘍細胞のこのクラスが、磁気ビースを含んだ分離工程に耐えられないことを示す。第３のクラス（図１Ｂ，Ｃ）は、サイトケラチン及びＰＳＭＡ抗体で染色することができるが、ＤＡＰＩ染色を受けても核がない。このクラスは、患者血中を循環することにより、除核されて出現する。第４のクラスは細胞デブリスから構成され（図１Ｄ）、サイトケラチン及びＰＳＭＡ抗体で特異的に染色される。同時に、ＤＡＰＩ染色された核デブリスが、細胞質デブリスの間に観察される。第５のクラス（図１Ｅ）は、幹細胞様の形態的特徴を有し、その特徴は、小さなサイズ（大きな単球と比べて）、高密度、サイトケラチンシステム及びＰＳＭＡ発現、異数性である。第６のクラスは、サイトケラチン及びＰＳＭＡ陽性のＭ期細胞（図１Ｆ）を含み、間期における循環細胞の大集団の中で希である。循環癌細胞の第７および最後のクラスは、患者血液中で、クラスターに集塊している（図１Ｇ，Ｈ）。これらの循環癌細胞クラスターは、３−１００細胞を含み、様々な細胞の大きさを有し、サイトケラチン(図１Ｇ）とＰＳＭＡ（図示しない）の陽性表現を示す。クラスターの形態的特徴は、粗い表面の巨大なボールの様である。）
 
　（ケ）第２７９３頁左欄から始まる「DISCUSSION」の項の第２７９３頁右欄２７行〜第２７９４頁左欄最終行
「Cytologic Dynamics of Circulating Cancer Cells
The occurrence of circulating cancer cells is a strong indication of
the presence of cancer but cannot be considered a significant
indication of the presence of metastasis unless these circulating
cells can be proven to be viable and capable of forming metastases.
It is difficult to demonstrate viability, because the number of 
circulating cancer cells present in blood generally is small, and 
single-cell culture of these isolated cells proves difficult.
Several authors have postulated (on clinical grounds) that 
blood-borne malignant cells must be viable and possess the potential
to proliferate and establish metastatic growth,  although no direct
evidence for this hypothesis has been provided.14 The description
of the characteristics of the seven morphologic classes of 
circulating prostate cancer cells described above may provide 
insight regarding the fate of the circulating cancer cells. These
seven cell classes can be subclassified into two limiting 
categories: 1) terminal and 2) living/growing.
  The terminal circulating cancer cells include three different 
cytomorphologic classes (Fig. 2). The first class of circulating 
cancer cells is very large compared with the major population of
circulating cancer cells. These cells are light, fragile, capable
of being captured in a low-density gradient, and easily broken by
any complex isolation procedure (Fig. 2, cell D). The second class
of circulating cancer cells is enucleated and stains positively with
cytokeratin and PSMA antibodies (Fig. 2, cell E). The third class 
consists of cellular debris with cytokeratin and PSMA positive 
signals, with occasional nuclear debris that can be observed among 
the cytoplasmic debris (Fig. 2, cell F). A process leading to the
death and destruction of circulating cancer cells can be formulated
tentatively through the observation of the aforementioned classes 
(Fig. 2, cells C-F).　
  The growing cancer cells also include three classes: stem-like 
cells, dividing cells, and cell clusters. There are indications that
these three classes of circulating cancer cells are living and 
multiplying in the patients' blood. In the first class of cells, the
stem-like cells, circulating cancer cells appear to be 
“undifferentiated,”have relatively small cell bodies, exhibit
aneuploidy, have a developed cytokeratin system, show strong PSMA
expression when they are stained, and are dense enough to be 
collected in a 1.077 g/mL or higher gradient (Fig. 2, cell 
cluster C). Most of these growing, circulating cancer cells are in 
interphase; the exception is a few cells in M-phase that comprise 
the second class (Fig. 2, cell cluster G). The existence of these 
dividing cells may serve as evidence that circulating cancer cells 
are capable of survival and mitosis while they are in circulation.
 The third class of dividing circulating cancer cells can be 
categorized based on their tendency to form clusters in the 
patients' blood (Fig. 2, cell cluster H). A process leading to the
formation of cancer cell colonies in the circulation may be 
described hypothetically on the basis of these different 
cytomorphologic classes of circulating cancer cells 
(Fig. 2, cells C-H).」
(当審和訳：
循環癌細胞の細胞学的動態 
 循環腫瘍細胞の発生は、癌の存在の強い証拠であるが、成長でき、転移を形成できることは証明されていない以上、転移の存在の明確な証拠とみなすことはできていない。成長を証明することは難しい。なぜなら、血中の循環腫瘍細胞の数は一般に少なく、これら分離細胞の単一細胞の培養が難しいことが判明している。何人かの著者は、血液感染性の腫瘍細胞は成長し、急速に増殖し転移成長を形成すると仮定したが（医学分野で）、この仮説の直接的な証拠は提供されていない。上述の循環前立腺癌細胞の７つの形態学的クラスの記述は、循環癌細胞の運命の洞察を提示する。これらの７つの細胞クラスは、２つの限定的カテゴリーに分類できる：１）終末期と２）生存／成長 。
　終末期の循環癌細胞は、３つの異なった細胞形態学的クラスを含む（図２）。循環癌細胞の第１のクラスは、循環癌細胞の主要集団に比べてとても大きい。これらの細胞は、軽く、壊れやすく、低密度の勾配中に捕捉され、単離工程で簡単に壊れる（図２、細胞Ｄ）。第２のクラスは、除核され、サイトケラチン及びＰＳＭＡ抗体で染色される（図２細胞Ｅ）。第３のクラスは、サイトケラチン及びＰＳＭＡ抗体で陽性シグナルの細胞デブリスで構成され、たまに、細胞質デブリスの間に観察される核デブリスを伴う（図２細胞Ｆ）。循環癌細胞の死滅と破壊につながるプロセスは、前述したクラス（図２細胞Ｃ−Ｄ）の観察をとおして、とりあえず系統立てて説明されることができる。 
 　成長癌細胞も３つのクラスを含む：幹細胞様細胞、分裂細胞、細胞クラスター。これらの３つのクラスは、患者血中で生きており、増殖していることを示す第１のクラス、幹細胞様細胞では、循環癌細胞は、「未分化」であることを示し、比較的小さく、異数性で、発達したサイトケラチンシステムを有し、染色されたときに強いＰＳＭＡ発現を示し、１．０７７ｇ／ｍＬまたはそれ以上の高勾配液に収集されるほどの高密度である（図２、細胞クラスターＣ）。成長する循環癌細胞の多くは、細胞分裂の間期である；例外的に、少数の細胞は、第２のクラス（図２細胞クラスターＧ）を構成するＭ期である。この生きた細胞の存在は、循環癌細胞が生き残り、循環中に有糸分裂する証拠を提示している。第３のクラスは、循環癌細胞の分裂であり、患者血中でクラスターを形成する傾向に基づいて分類できる（図２細胞クラスターＨ）。循環中の細胞コロニーの形成につながるプロセスは、これらの異なった細胞形態学的クラスに基づいて、仮説を立てることができる（図２細胞Ｃ−Ｈ）。）
　
　（コ）第２７９４頁右欄最終行〜第２７９５頁左欄１２行
　「In this study, large numbers of circulating prostate carcinoma 
cells were observed in the blood of a few patients: as many as 
50-100 cells per 20 mL of blood. We currently are analyzing the 
profiles of these cell populations in view of the terminal pathway 
versus the living /multiplying pathway. Correlation of disease 
progression in these patients with the dynamic change of the 
circulating cancer cell populations at different stages (in terms 
of total cell numbers and distribution among classes/categories) 
may provide some insight into the application of the circulating 
microtumor hypothesis described above to a clinical and/or 
diagnostic setting.」
（当審和訳：
　この研究の中で、少数の患者の血中に多数の循環前立腺癌細胞が観察された：血液２０ｍＬ中に５０−２００細胞も。我々は、終末期経路対生存／増殖経路という観点で、これらの細胞集団の特徴を分析してきている。これらの患者の病気の進行と、循環腫瘍細胞集団の異なるステージ（総細胞数とクラス／カテゴリー間の分散の観点から）へのダイナミックな変化の相関は、循環マイクロ癌の前述の仮説が、臨床／診断背景への応用への洞察を提供するかもしれない。） 
　
　イ　刊行物２（米国特許第６１９０８７０号明細書）
　同じく、原査定の拒絶の理由に引用された刊行物２には、撒き散らされた腫瘍細胞の効率的豊富化と検出に関して、次の事項が記載されている。
　（ア）第１欄８行〜１０行
「　 TECHNICAL FIELD
　The field of this invention is the detection of tumor cells.」
（当審和訳：　技術分野
　この発明の分野は、腫瘍細胞の検出である。）
　
　（イ）第２欄１３行〜２４行
「An alternative approach to cell sorting has been described, 
whereby magnetic microparticles coupled to antibodies are used to 
select for specific cell types. Shpall et al., (1991) have described
 a method and a device for immunomagnetic purging of breast cancer 
cells from bone marrow cell samples for autologous transplantation 
of carcinoma patients receiving high-dose chemotherapy.
An improved magnetic sorting process whereby tumor cells could be 
separated from peripheral blood or other tissue sources, and which 
allows multiple, samples to be run on the bench would provide 
numerous benefits to the field of oncologic diagnosis.」
（当審和訳：
　細胞を仕分ける代替えの提案がなされ、そこでは、抗体が結合した磁気マイクロ粒子が、特異的な細胞のタイプを選別するのに用いられる。Shpall等（1991)は、高投与量の化学療法を受けた癌患者の自己移植のための骨髄細胞試料から、肺癌細胞を免疫磁気パージする装置と方法を記載している。 
　それによって腫瘍細胞が末梢血またはその他の組織源から分離することができ、作業台上で取り扱われるべきサンプルの多様化を許容する、進歩した磁気選別方法は、腫瘍診断の分野に多くの恩恵を提供するだろう。）
　
　（ウ）第２欄下から１０行〜下から１行
　「High gradient magnetic cell sorting is described in Miltenyi 
et al.(1990) Cytometry 11:231-238. Molday, U.S. Pat. No. 4,452,773 
describes the preparation of magnetic iron-dextran microspheres and 
provides a summary describing the various means of preparation of 
particles suitable for attachment to biological materials. A 
description of polymeric coatings for magnetic particles used in 
HGMS are found in DE 3720844 (Miltenyi) and Miltenyi et al., U.S.
Pat. No. 5,385,707.」
（当審和訳：
　Miltenyi等(1990)Cytometry 11:231-238に、高勾配磁気細胞分別が記述されている。Molday，U.S.Pat.No.4452773は、磁性鉄−デキストランミクロ球の調製と生物材料に結合させるのに適切な粒子の多数の調整方法を記述した要約が記述されている。ＨＧＭＳで用いられる高分子被覆磁気粒子が、ＤＥ3720844(Miltenyi)とMiltenyi等、U.S.Pat.No.5385707に見出される。）
　
　（エ）第９欄下から４行〜第１０欄３５行
「　　　EXPERIMENTAL
　　　　　EXAMPLE 1
　Immunomagnetic separation of breast cancer cells from artificial 
mixtures of blood cells and breast cancer cells by high-gradient 
magnetic cell sorting using an anti cytokeratin 8/18 antibody 
chemically linked to colloidal superparamagnetic microparticles.
Material and Methods
Cell sample preparation. Leukocyte-rich buffy coats were prepared 
from anticoagulant treated peripheral blood of a healthy donor by 
centrifugation at 400×g. Four samples of 5 ml of buffy coat 
were mixed with 30.000, 3000, 300 and 0 cells of the mammary 
carcinoma cell line SK-BR-3.
　Erythrocyte lysis and permeabilization of nucleated cells. Cells 
were incubated in phosphate-buffered saline (PBS) and 0.1% saponin 
(erythrocyte lysis/cytokeratin unmasking solution) for 5 min at room
 temperature.
　Fixation. Cells were fixed in PBS, 0.05% saponin and 2% 
formaldehyde for 30 minutes at room temperature and washed once in 
PBS with 0.5% BSA and 0.5% saponin (PBS/BSA/saponin buffer)
　Magnetic labeling of cytokeratin 8/18-expressing cells. Cells were
 incubated with anti-cytokeratin 8/18 mAb-conjugated colloidal 
superparamagnetic microbeads in PBS/BSA/saponin buffer for 35 
minutes at room temperature (Moll et al. (1982) Cell 31:11). 
Afterwards, anti-cytokeratin 8/18 mAb-conjugated to PE and 
biotinylated HEA-125 mAb were added and the cells were incubated for
 further 10 minutes at room temperature. Cells were washed in 
PBS/BSA/saponin buffer and stained with CD45-FITC and streptavidin-
CyChrome for 10 minutes at room temperature in PBS/BSA/saponin 
buffer.
　Positive selection of cytokeratin 8/18-expressing cells by high-
gradient magnetic cell sorting (HGMS). Magnetically labeled 
cytokeratin 8/18-expressing cells were enriched by two sequential 
positive selections on MiniMACS columns (magnetizable steelball 
matrix, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach) inserted in a 
MiniMACS permanent magnet.
　Flow cytometric analysis. To evaluate the efficiency of the 
magnetic enrichment of cytokeratin 8/18-expressing SK-BR-3 cells, 
aliquots of unseparated cells, magnetic and nonmagnetic cell 
fractions were analyzed by flow cytometry using a FACScan (Becton 
Dickinson). Data of 5000-17000 cells were collected and analyzed 
using FACScan Research Software (Becton Dickinson) or CellQuest 
(Becton Dickinson), shown in Table 1.」
（当審和訳：　実験 
　　　例１ 
　血液細胞と肺癌細胞の人工的な混合物からの、抗サイトケラチン８／１８抗体を化学的に結合した超磁性ミクロ粒子コロイドを用いた高勾配磁気細胞分別方法による免疫磁気分離。 
材料と方法 
　細胞試料調製。健康な提供者からの末梢血液から、４００×ｇの遠心分離で白血球に富んだバッフィーコートが調製された。５ｍｌのバッフィーコート試料４つが、30,000、3000、300、0個のほ乳類癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３と混合された。
　赤血球溶解と有核細胞の透過性上昇。細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と０．１％サポニン（赤血球溶解／サイトケラチン非マスク溶液）中で、５分間室温でインキュベートされた。 
 　固定化。細胞は、ＰＢＳ、０．０５％サポニン、２％ホルムアルデヒド中で、３０分間室温で固定化され、０．５％ＢＳＡと０．５％サポニン含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／サポニン緩衝液）で１回洗浄された。 
　サイトケラチン８／１８発現細胞の磁気標識。細胞は、コロイド状超常磁性マイクロビーズと結合した抗サイトケラチン８／１８モノクローナル抗体と、ＰＢＳ／ＢＳＡ／サポニン緩衝液中で３５分間室温でインキュベートされた（Moll et al.(1982)Cell 31:11）。その後、抗サイトケラチン８／１８モノクローナル抗体−ＰＥ結合体とビオチン化ＨＥＡ-１２５モノクローナル抗体が加えられ、細胞は、さらに１０分間室温でインキュベートされた。細胞は、ＰＢＳ／ＢＳＡ／サポニン緩衝液で洗浄され、ＣＤ４５−ＦＩＴＣとストレプトアビジン−Ｃｙクロムで、１０分間室温でＰＢＳ／ＢＳＡ／サポニン緩衝液中で染色された。 
　サイトケラチン８／１８発現細胞の高勾配磁気細胞分別（ＨＧＭＳ）による陽性選択。磁気的に標識されたサイトケラチン発現細胞は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ永久磁石に挿入されたＭｉｎｉＭＡＣＳカラム（磁化可能な鋼ボールマトリックス，Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach）上での２つの連続した陽性分別により豊富化された。
　フローサイトメトリー分析。サイトケラチン８／１８発現ＳＫ−ＢＲ−３細胞の豊富化を評価するために、未分離の細胞のアリコート、磁性及び非磁性細胞分画が、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton　Dickinson）を使用するフローサイトメトリーによって分析された。５０００−１７０００細胞のデータが集められて、FACScan　Research　Software（Becton　Dickinson）またはCellQuest（Becton　Dickinson）を使って、表１の示すように分析された。）
　
　（オ）第１９欄６０行〜第２０欄１１行
　「What is claimed is:
1. A method for separation of disseminated tumor cells from a whole 
blood cell sample present as a fluid suspension, the method 
comprising the steps, in order, of:
　adding to said whole blood cell sample antibodies specific 
    for one or more antigens expressed by said tumor cells 
    and absent on blood cells, wherein said antibodies are 
    coupled to a magnetically responsive reagent, under 
    conditions sufficient to specifically bind said coupled 
    antibodies to said antigens;
  passing said sample through a ferromagnetic matrix in the 
    presence of a magnetic field to magnetically immobilize 
    cells in the sample having coupled antibodies bound thereto;
  washing said matrix of unbound cells; and
  removing the magnetic field and eluting bound cells from 
    said matrix directly onto a solid support to provide an 
    enriched cell sample comprising tumor cells, wherein 
    said eluting is by centrifugation or vacuum filtration.
2. The method of claim 1, wherein said solid support is 
a polycarbonate filter or a slide.」
（当審和訳：請求の範囲 
１．全血細胞懸濁液試料からの、撒き散らされた腫瘍細胞の分離方法であって、以下の順の工程からなる：
　全血細胞試料に１つ以上の前記腫瘍細胞により発現される１またはそれ以上の抗原であって血液細胞にはない抗原に特異的な抗体を加え、ここで、結合した抗体が前記抗原と特異的に結合するのに充分な条件下で、前記抗体は磁気応答性試薬と結合しており； 
　前記試料を、磁界の存在下で強磁性マトリックスをとおして、それに磁気応答性試薬に結合した抗体と結合した細胞を磁気的に固定化し； 
　前記マトリックスの未結合細胞を洗い流し；そして、 
　磁界を解除し、結合細胞を前記マトリックスから、直接固体支持体上に流出させて、腫瘍細胞を含む豊富化細胞試料を提供し、前記流出は遠心分離または真空濾過により行う。
２．前記固体支持体はポリカーボネートフィルターまたはスライドである請求項１記載の方法。」 
　
　ウ　刊行物３（特表平１１−５０６５６８号公報）
　同じく、原査定の拒絶の理由に周知例として引用された刊行物３には、磁気反応粒子の改良した製法に関して、次の事項が記載されている。
　（ア）特許請求の範囲
　「１．ａ．磁性出発物質の少なくとも１粒子を複数の、凝集できる、より小さなサイズの粒子に分割して、非被覆微粒子磁性基質を得、
  ｂ．該非被覆微粒子磁性基質を液体媒体中に懸濁し、
  ｃ．該被覆、懸濁微粒子磁性基質を、微粒子磁性基質の実質的な凝集が起こる前に、被覆剤が基質に付着するのに十分な時間被覆剤で被覆し、再懸濁できる被覆磁性粒子を形成させることからなる被覆剤を微粒子磁性基質に直接適用することによる再懸濁できる被覆磁性微粒子の製造法。
・・・・
５．被覆剤が天然または合成ポリマーである請求項１または２記載の方法。」
　
　（イ）第２６頁下から４行〜第３０頁１４行
　「表Ｉは、被覆実験で使用した異なる化合物、それらの濃度、および他の溶媒条件のリストである。コロイドの存在および半定量ならびに凝塊した物質を前記の方法によって、コロイドおよび凝塊保存物の既知混合物から調製した標準物と比較することによって視覚的に決定した。表Ｉから明らかなように、化合物を試験する度に、いくつかの量の安定なコロイド物質が生じた。注目すべきことに、ＨＧＭＳおよびリン酸緩衝液中に再懸濁に従う安定性もまた、示唆される。全ての場合、被覆実験の成功は、光分散からの音波処理法に従って、または溶液の明らかな「光沢」によって、すぐに決定できる。対照的に、被覆条件が不適当である（例えば、安定な被覆した細分粒子を生じない）物質は、外見が曇っていて、不均一であった。
　　　　　　　　　　　表Ｉ
上清被覆剤および濃度　　パーセント　　　　　　　　　　コロイド状後の
　　重量（％）　　
コロイド状
ＨＧＭＳ回収
再懸濁処理
デキストラン，１２．５％　　５０％　　　　　　良好　　　　　　良好
・・・・・・・
　BSA，１％；50mM　P　　　９５％　　　　　　良好　　　　　　良好
 BSA，7.5％；50mM　P　　　８０％　　　　　　ＮＤ　　　　　　ＮＤ
 BSA，7.5％；40mM　P　　　７５％　　　　　　ＮＤ　　　　　　ＮＤ
     ・・・・・・・
　BSA，.２５％；　　　　
  .016％Tween-20 　　　　　　９５％　　　　　　良好　　　　　　良好
     ・・・・・・・
　
ＮＤ＝測定せず
Ｐ＝リン酸緩衝液
・・・・
Tween-20＝ポリオキシエチレン界面活性剤（ICI　Americans）」
　
　エ　刊行物４（特開昭６１−８７３０３号公報）
　同じく、原査定の拒絶の理由に周知例として引用された刊行物４には、生物学的磁性液体に関して、次の事項が記載されている。
　（ア）特許請求の範囲
「１．液体分散媒中に分散された磁性コロイド分散相を有し、該分散相が架橋した生物学的に相溶性のあるポリマーで被覆された磁性微粒子を含有する生物学的磁性液体。
　２．前記磁性粒子が実質的成分としてマグネタイトを含有する特許請求の範囲第１項に記載の液体。
　３．前記粒子が実質的成分としてコバルトを含有する特許請求の範囲第１項に記載の液体。
　４．前記粒子がボロンを含有する特許請求の範囲第１項に記載の液体。
　５．前記磁性粒子がコバルトおよびボロンを含有する特許請求の範囲第１項に記載の液体。
　６．前記生物学的に相溶性のあるポリマーが生物学的ポリマーである特許請求の範囲第１項に記載の液体。
　７．前記ポリマーがヒトアルブミンである特許請求の範囲第６項に記載の液体。」
　
　オ　刊行物５（米国特許第５３８５７０７号明細書）
　同じく、原査定の拒絶の理由に、上記刊行物２中に参照されているとして引用された刊行物５には、生物学的物質の高勾配磁気分離において使用するための金属マトリックス（発明の名称参照）に関して、次の事項が記載されている。
　（ア）第７欄２０行〜４９行
「　　　Preparation of the Particles
　The superparamagnetic particles of the invention are initially 
prepared in a range of sizes which result in variations in their 
abilities to acquire magnetic properties upon exposure to a magnetic
 field. The magnetic particles themselves are collections of 
magnetic iron oxide microcrystal of 50-600 angstroms which are 
aggregated into particles of colloidal size--i.e., approximately 100
-2000 angstroms in diameter, preferably around 400-1000 angstroms in
 diameter. By sorting the mixture of particles into subfractions 
which have uniform magnetization, compositions having homogeneous 
properties with respect to ability to be retained in the magnetic 
field can be obtained. Use of particles of such homogeneity has the 
advantage of effecting a sharp separation peak in chromatographic 
procedure, as well as the potential for labeling various components 
in a mixture with sets of particles of differing magnetic 
susceptibilities to permit chromatographic separation of these 
components. The particles can also be separated according to size. 
The desirable size will depend on the nature of the separation 
desired. It may be desirable to prepare relatively small particles 
for multiple labeling of a cell, e.g., in order to resolve the 
number of antigens on a cell, or relatively large particles for 
separation of a multiplicity of molecules of a single substance. It 
is, in any event, of interest to obtain sets of particles with 
uniform magnetizations, i.e., which become equally magnetized in the
 presence of the same externally applied magnetic field.」
（当審和訳：
　　　粒子の調製
　この発明の超常磁性粒子は、当初、磁界に曝されたときの磁気的性質を獲得する能力において様々になるような寸法範囲に調製される。磁性粒子自体は、コロイド粒子、すなわち直径１００−２０００オングストローム、好ましくは直径約４００−１０００オングストローム、に凝集される５０-６００オングストロームの磁性酸化鉄マイクロ結晶の収集物である。粒子混合物を均一な磁化を有するサブフラクションに分別することによって、磁界中で保持される能力に関して、均質な性質を有する組成物が得られる。そのような均質性の粒子の使用が、クロマトグラフ手順におけるシャープな分離ピークをもたらし、同様に、様々な磁性感受性の粒子セットで混合物における様々な成分を標識するための能力が、これらの成分のクロマトグラフ的分離を可能にする。粒子はまた、大きさによっても分離できる。望ましい大きさは、望まれる分離に依存するだろう。細胞の多重標識用、例えば、細胞上の抗原の数を解析するためには相対的に小さな粒子を調製することが望ましいし、単一物質の分子の多様性の分離用には、相対的に大きな粒子を調製することが望ましい。どの場合でも、均一磁化、すなわち同じ外部適用磁界の存在下で、等しく磁化される、粒子のセットを得ることに重要である。）
　
　（２）補正発明と刊行物１発明との対比・判断
　ア　刊行物１発明
　刊行物１の上記記載事項（特に（１）ア（イ）〜（オ）、（ク））から、刊行物１には、次の発明が記載されていると認められる。
「採取した前立腺癌患者の血液を、 
 　１．０６８ｇ／ｍＬ密度勾配液と１．０８３ｇ／ｍＬ密度勾配液を用いて遠心分離し、上部の勾配界面（１．０６８ｇ／ｍＬ）と下部の勾配界面（１．０８３ｇ／ｍＬ）をそれぞれ収集する工程、 
 　１．０８３ｇ／ｍＬ勾配収集物から、過剰な白血球を除去し、血中の標的癌細胞を濃縮するために、ＣＤ-４５マウス抗ヒトイムノグロブリンＧ磁気ビーズ単離システムを採用し、１．０８３ｇ／ｍＬ勾配収集物の細胞懸濁液を磁気Ｄｙｎａｌビーズと共にインキュベートし、磁気粒子濃縮器中に置き白血球を除去する工程、 
 　白血球除去後の１．０８３ｇ／ｍＬ細胞懸濁液のＣＤ４５陰性収集物の上清を、１．０６８ｇ／ｍＬ細胞懸濁液と同じ管に移し、２つの収集物を混合する工程、 
 　２つの収集物の混合物をサイトファネルとサイトスピンにかけ、スライドを染色前に空気乾燥させる工程、 
 　抗サイトケラチン抗体フルオレセインイソチオシアネート、前立腺特異的抗原に対する抗体（ＰＳＡ）、抗ＰＳＭＡ抗体をスライドに加えインキュベートした後洗浄し免疫組織染色する工程、 
 　蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、ＤＡＰＩによる対比染色で核を染色する工程、 
 　蛍光染料で染色された循環腫瘍細胞が示す形態的特徴が、コンピューター化された蛍光顕微鏡により、以下のクラス１〜７に形態分析される工程、を有する、循環前立腺癌細胞を同定し特徴付ける方法。 
　クラス１（図１Ａ）は、大きな細胞体を持ち、癌細胞の形は、不定形、楕円形、又は円形。染色の後、癌細胞の細胞質中に２つのシグナルを検出できる。サイトケラチン染色は、細胞質の領域を覆う網目と、濃く高密度の蛍光フィラメントを形成する核を形成する。ＰＳＭＡ抗体染色は、細胞質の中央に均一な濃度のシグナルを形成し、細胞質の縁には、さらに濃い染色を伴っている。癌細胞の最外部縁では、蛍光の縁を形成する。癌細胞核は、ＤＡＰＩ染色で、同様に形が様々である。核の形態は、不定形、楕円形、円形である。このグループの丸い癌細胞の大多数は、細胞の大きさと形にかかわらず、異数性を示す。 
　クラス２は、周りの赤血球に比べてとても大きい細胞で構成され、ＤＡＰＩ染色の観察で、核は非常に大きく、構造が緩んでおり、軽く、壊れやすく、１．０６８ｇ／ｍＬ勾配液中に拘留され、細胞の壊れやすさは、循環腫瘍細胞のこのクラスが磁気ビースを含んだ分離工程に耐えられないことを示す。　クラス３（図１Ｂ，Ｃ）は、サイトケラチン及びＰＳＭＡ抗体で染色することができるが、ＤＡＰＩ染色を受けても核がなく、患者血中を循環することにより、除核されて出現する。 
　クラス４は、細胞デブリスから構成され（図１Ｄ）、サイトケラチン及びＰＳＭＡ抗体で特異的に染色され、同時に、ＤＡＰＩ染色された核デブリスが、細胞質デブリスの間に観察される。 
　クラス５（図１Ｅ）は、幹細胞様の形態的特徴を有し、小さなサイズ（大きな単球と比べて）、高密度、サイトケラチンシステム及びＰＳＭＡ発現、異数性である。 
　クラス６は、サイトケラチン及びＰＳＭＡ陽性のＭ期細胞（図１Ｆ）を含み、間期における循環細胞の大集団の中で希である。 
　クラス７は、患者血液中で、クラスターに集塊し（図１Ｇ，Ｈ）、様々な大きさの３−１００細胞でクラスターを形成し、サイトケラチン(図１Ｇ）とＰＳＭＡ（図示しない）を発現し、クラスターの形態的特徴は、粗い表面の巨大なボールの様である。」（以下、「刊行物１発明」という。） 
 　 
　イ　対比
　そこで、補正発明と刊行物１発明とを比較する。 
　（ア）刊行物１発明の「前立腺癌患者」、「血液」は、補正発明の「テスト対象」、「生物学的検体」にそれぞれ相当する。 
　（イ）刊行物１発明は、「蛍光染料で染色された循環腫瘍細胞が示す形態的特徴が、コンピューター化された蛍光顕微鏡により、以下のように形態分析される工程」により、クラス１ないし７の特徴を有する細胞に形態分析されるものである。 
　そして、「クラス１」は、サイトケラチン染色及びＰＳＭＡ抗体染色され、癌細胞核は、ＤＡＰＩ染色で染色され、異数性を示すものであり「癌細胞」とされており、癌細胞は、本来血液中に含まれている細胞ではないので、稀な細胞といえるから、刊行物１発明の「クラス１」は、補正発明の「無傷な稀な細胞」に相当する。 
　また、刊行物１発明の「クラス４」は、「細胞デブリス」から構成されるものであり、細胞デブリスはサイトケラチン及びＰＳＭＡ抗体で特異的に染色されることから、癌細胞由来のものといえるので、補正発明の「稀な細胞に由来する細胞デブリス」に相当する。 
　また、刊行物１発明の「クラス３」は、サイトケラチン及びＰＳＭＡ抗体で染色することができるが、ＤＡＰＩ染色を受けても核がないものであるし、上記記載（１）ア（カ）にも「このクラスは、患者血中を循環することにより、除核されて出現する。」と記載されている。一方、補正発明の「稀な細胞に由来する細胞断片」は、本願明細書段落【００５７】に「細胞断片は、デブリスが細胞に必ずしも似ていない点で「デブリス」とは異なる。」と、段落【００７６】に「図４Ｃに示された腫瘍細胞断片は、細胞に対して形態学的類似性を有しない核物質の解離の有りまたは無しにて４μｍよりも大きな丸いサイトケラチン染色物体と定義された。」と記載されていることから、刊行物１発明の「クラス３」は、補正発明の「稀な細胞に由来する細胞断片」に相当するものといえる。 
　そうすると、刊行物１発明の「採取した前立腺癌患者の血液」は、無傷な稀な細胞、これに由来する細胞断片及び細胞デブリスを含んでいるから、補正発明の「テスト対象から得た生物学的検体」であって、「該検体は無傷の稀な細胞を含有することが疑われる混合された細胞集団を含み、およびさらにi．稀な細胞に由来する細胞断片、またはii．稀な細胞に由来する細胞デブリス」を含むものに相当する。 
　（ウ）刊行物１発明の「１．０６８ｇ／ｍＬ密度勾配液と１．０８３ｇ／ｍＬ密度勾配液を用いて遠心分離し、上部の勾配界面（１．０６８ｇ／ｍＬ）と下部の勾配界面（１．０８３ｇ／ｍＬ）をそれぞれ収集する工程、１．０８３ｇ／ｍＬ勾配収集物から、過剰な白血球を除去し、血中の標的癌細胞を濃縮するために、ＣＤ-４５マウス抗ヒトイムノグロブリンＧ磁気ビーズ単離システムを採用し、１．０８３ｇ／ｍＬ勾配収集物の細胞懸濁液を磁気Ｄｙｎａｌビーズと共にインキュベートし、磁気粒子濃縮器中に置き白血球を除去する工程、白血球除去後の１．０８３ｇ／ｍＬ細胞懸濁液のＣＤ４５陰性収集物の上清を、１．０６８ｇ／ｍＬ細胞懸濁液と同じ管に移し、２つの収集物を混合する工程」は、採取した前立腺癌患者の血液から、密度勾配遠心分離法及び磁気粒子を用いた白血球除去により、分析目的物である循環前立腺癌細胞を分離して結果的に豊富化する工程であるから、補正発明の「ｂ．磁気−標識試料を調製し、ここに、該生物学的試料は、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスと特異的に反応する第１の生物特異的リガンドにカップリングした磁性粒子と、他の検体成分の実質的排除まで、混合され」る工程とは、無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを他の検体成分から分離して豊富化する点で共通している。 
　（エ）刊行物１発明の「２つの収集物の混合物をサイトファネルとサイトスピンにかけ、スライドを染色前に空気乾燥させる工程、抗サイトケラチン抗体フルオレセインイソチオシアネート、前立腺特異的抗原に対する抗体（ＰＳＡ）、抗ＰＳＭＡ抗体をスライドに加えインキュベートした後洗浄し免疫組織染色する工程、蛍光インサイチューハイブリダイゼイゼーションで、核をＤＡＰＩ染色する工程」は、循環腫瘍細胞を、フルオレセインイソチオシアネートで標識された抗体、つまり標識された生物特異的リガンドを用いて特異的に標識する工程であるから、補正発明の「ｃ．該磁気−標識試料を、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドと、他の検体成分の実質的排除まで、接触させ」ることとは、試料を、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドと接触させる点で共通している。 
　（オ）刊行物１発明の「蛍光染料で染色された循環腫瘍細胞が示す形態的特徴が、コンピューター化された蛍光顕微鏡により、以下のクラス１〜７に形態分析される工程、を有する循環前立腺癌細胞を特定し特徴付ける方法」と補正発明の「ｄ．該標識された稀な細胞、および該標識された細胞断片または該標識された細胞デブリスを分析することを含み、該標識された稀な細胞、該標識された細胞断片、および該標識された細胞デブリスの存在は病気の存在を示す；ことを特徴とするテスト対象において病気を診断する方法」とは、標識された稀な細胞、および標識された細胞断片または標識された細胞デブリスの存在を分析する方法である点で共通している。 
 　（カ）したがって、補正発明と刊行物１発明との間には、次の一致点で一致し、各相違点において相違する。 ： 
（一致点） 
　「テスト対象から得た生物学的検体を用い、該検体は無傷の稀な細胞を含有することが疑われる混合された細胞集団を含み、およびさらに 
 　i．稀な細胞に由来する細胞断片、または 
 　ii．稀な細胞に由来する細胞デブリス； 
 を含み； 
 　無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを他の検体成分から分離して豊富化し、 
　試料を、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドと接触させ；　標識された稀な細胞、および標識された細胞断片または標識された細胞デブリスの存在を分析する方法。」
（相違点１） 
　無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを他の検体成分から分離して豊富化することが、補正発明では、「ｂ．磁気−標識試料を調製し、ここに、該生物学的試料は、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスと特異的に反応する第１の生物特異的リガンドにカップリングした磁性粒子と、他の検体成分の実質的排除まで、混合され」ることにより他の検体成分から該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを分離して豊富化するのに対して、刊行物１発明は、密度勾配遠心分離法及び磁気粒子を用いて他の検体成分である白血球を除去して該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスから分離して該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを豊富化している点。 
　（相違点２） 
　分析する試料を、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドと接触させることが、補正発明では、「ｃ．磁気−標識試料を、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドと、他の検体成分の実質的排除まで、接触させ」るのに対して、刊行物１発明では、試料は、密度勾配遠心分離法及び磁気粒子を用いた白血球除去により分離して豊富化された試料であるから磁気標識を有していないし、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドとの接触が、他の検体成分を実質的排除まで、接触させるとは特定されていない点。
　（相違点３）
　磁性粒子に関し、補正発明では「前記コロイド状磁性粒子は、蛋白質ベースのコーティング材料でコートされた磁性コア材料であり、９０ないし１５０ｎｍの範囲内の、かつ７０ないし９０％の磁性質量を有し、９０ｎｍより小さなまたは１５０ｎｍより大きな痕跡量の材料を含み」と特定されているのに対し、刊行物１発明には、白血球の除去に磁性粒子を用いているものの、磁性粒子についてそのような特定はない点。
　（相違点４） 
　標識された稀な細胞、および標識された細胞断片または標識された細胞デブリスを分析する方法が、補正発明では、「該標識された稀な細胞、該標識された細胞断片、および該標識された細胞デブリスの存在は病気の存在を示す」、「テスト対象において病気を検出する方法」であるのに対して、刊行物１発明は、クラス１〜７に形態分析して循環前立腺癌細胞を同定し特徴付ける方法である点。 
　
　ウ　各相違点についての検討
　（ア）相違点１及び相違点２について 
　ａ．血液に存在する撒き散らされた腫瘍細胞、すなわち微量の循環腫瘍細胞を検出するために、腫瘍細胞と特異的に反応する抗体を結合させた磁気粒子と血液試料を混合して、磁気−標識試料を調製し、循環腫瘍細胞を磁気的に他の血液成分から分離して豊富化した循環腫瘍細胞を含む豊富化細胞試料が得られることは、刊行物２にも記載されている（上記記載（１）イ（ア）、（イ）、（オ））ように、本願優先権主張日前に広く知られた事項である。
　ｂ．複数の成分を含む検体から、特定成分の豊富化試料を得ようとする際に、該特定成分を他の成分から分離して豊富化試料を得るようにする方法も、他の成分を検体中から分離除去して、結果的に該特定成分が豊富化された豊富化試料を得るようにする方法と同様に、豊富化の慣用の手法にすぎないから、後者の手法に該当する刊行物１発明の「密度勾配遠心分離法及び磁気粒子を用いて他の検体成分である白血球を除去して該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスから分離して該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを豊富化する」ことに代えて、前者の手法に該当する刊行物２にも記載された方法に従い、「該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスと特異的に反応する第１の生物特異的リガンドにカップリングした磁性粒子を用いて、該生物学的試料が、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスと特異的に反応する第１の生物特異的リガンドにカップリングした磁性粒子と混合されるようにし、他の検体成分から該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを分離して豊富化し、該磁気粒子に標識された磁気−標識試料を調製する」ように変更することは、当業者が適宜なし得る範囲内の事項にすぎない。
　なお、補正発明において、該生物学的試料と「該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスと特異的に反応する第１の生物特異的リガンドにカップリングした磁性粒子」との混合に際し、「他の検体成分の実質的排除まで、混合され」との特定がなされてはいるが、ここでの「他の検体成分の実質的排除まで」という語句は、本願明細書の段落【００４８】において、「フレーズ「の実質的排除まで」とは、生物特異的リガンドまたは生物特異的試薬またはその対応する標的決定基の間の結合反応の特異性をいう。生物特異的リガンドおよび試薬はその標的決定基についての特異的結合活性を有するが、また、他の試料成分への低レベルの非特異的結合も呈し得る。」と定義されていることに照らせば、周知例として例示した刊行物２に記載の磁気分離方法で使用される磁気粒子にカップリングされた抗体と標的決定基との間の「結合反応特異性」が、補正発明のそれと特に異なるものとはいえず、当該特定により、上記刊行物１発明の他の検体成分から該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを分離して豊富化する工程を、刊行物２に記載されたような周知の磁気分離方法に変更することの困難性の判断に影響を与えるものではない。
　ｃ．そして、刊行物２に「実験　例１」として、「健康な提供者からの抹消血液から遠心分離で白血球に富んだバフィーコート試料とほ乳類癌細胞との混合物である人工的試料を用い、癌細胞の豊富化を評価するための具体例においてではあるが、腫瘍細胞と特異的に反応する抗サイトケラチン抗体を結合したコロイド状超常磁性マイクロビーズ（磁気応答性試薬）を全血試料に加えインキュベートし、すなわち磁気−標識試料を調製し、その後、該磁気−標識試料を、のちにフローサイトメトリーで分析、評価するために、ＰＥで標識した抗サイトケラチン抗体とビオチン化ＨＥＡ−１２５抗体と接触させ、蛍光染色する」ことが記載されている（上記記載（１）イ（エ））ように、「磁気−標識試料」を蛍光標識された抗体により蛍光染色することは通常行われていることであるから、上記ｂ．において説示したように、刊行物１発明の「該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを豊富化する方法」を、周知の「それらと特異的に反応する第１の生物特異的リガンドにカップリングした磁性粒子を用いた磁気分離方法」に変更した場合において、その結果分離された「磁気−標識試料」を蛍光染色して、コンピュータ化された蛍光顕微鏡により形態分析を行うようにすることに格別の困難性は認められない。
　すなわち、「該磁気−標識試料」を、「該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドと、他の検体成分の実質的排除まで、接触させ」るようにすることに格別の困難性はない。
　なお、「他の検体成分の実質的排除まで、」という特定については、上記ｂ．において検討したことと同様である。
　
　（イ）相違点３について 
　ａ．磁性粒子の表面をＢＳＡ等の蛋白質ベースのコーティング材料でコートすることは、本願優先権主張日前に周知の事項である（必要ならば、例えば刊行物３，４参照。）。
　ｂ．刊行物２に背景技術として記載されている（上記記載（１）イ（ウ））高勾配磁気細胞分別（ＨＧＭＳ）についての「刊行物５」には、「磁気粒子」について、「コロイド粒子、すなわち直径１００−２０００オングストローム（１０−２００ｎｍ）、好ましくは直径約４００−１０００オングストローム（４０−１００ｎｍ）」であると記載されているように、補正発明における「コロイド状磁性粒子」の寸法範囲を包含するコロイド状磁性粒子が示されている（上記記載（１）オ（ア））。
　さらに、刊行物５に「望ましい大きさは、望まれる分離に依存するだろう。」と記載されているように、刊行物１発明のような「血液試料から無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを分離して豊富化する」ために、「磁気分離法」を採用する際に使用されるコロイド状磁性粒子として、どのような粒径が適切な範囲であるかを反復実験等を通じて決定することは、当業者であれば普通に行う技術的創作事項である。
　そして、用いるべき「磁性粒子」の適切な寸法範囲が決定したならば、その範囲外の大きさの粒子が痕跡量のような極力少ないものを使用することも普通の事項にすぎない。
　ｃ．なお、コロイド状磁性粒子の「磁性質量」とは何を意味するのかは明らかでなく、本願明細書においても説明はない。
　そこで「７０ないし９０％の磁性質量」との記載から、磁性粒子中に含まれる磁性体の重量％を意味するものと一応認めて以下検討する。
　「磁気分離法」に使用する磁性粒子に磁性体ではない物質が含まれるとした場合、その量は磁性粒子の磁気的能力に影響することは明らかであるところ、「磁気分離法」において「磁性粒子」が果たす機能から、その磁性粒子に含まれる磁性体の含有量が一定以上の範囲でなければならないことは、技術的に当然要求されるものであるから、「７０ないし９０％の磁性質量を有」するものを使用するようなことにも、格別の技術的困難性は認められない。
　ｄ．そうすると、刊行物１発明の他の検体成分から該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを分離して豊富化する工程を、刊行物２に記載されたような磁気分離方法に変更する際に、「前記コロイド状磁性粒子は、蛋白質ベースのコーティング材料でコートされた磁性コア材料であり、９０ないし１５０ｎｍの範囲内の、かつ７０ないし９０％の磁性質量を有し、９０ｎｍより小さなまたは１５０ｎｍより大きな痕跡量の材料を含」むものを使用することも、当業者であれば、容易に採用し得る範囲内の事項である。
　
　（ウ）相違点４について 
　ａ．刊行物１には、２０人の女性陰性コントロール試料中には、循環上皮細胞、つまり循環腫瘍細胞は発見されず、４３中３人の男性陰性コントロール試料は、循環上皮細胞が存在していたが、前立腺特異的シグナルと、染色体の異数性は欠如していたこと、前立腺癌患者では、癌細胞が検出されることが記載されており（上記記載（１）ア(キ)）、血液中を循環する癌細胞の存在が癌の存在の指標となることが示されているといえる。 
　ｂ．さらに、刊行物１には、図１に示された蛍光顕微鏡の観察に基づいた、循環腫瘍細胞、細胞デブリス及び細胞断片を含む循環腫瘍細胞の７つのクラスの特徴付け（上記記載（１）ア(ク)）に基づいて、図２に、細胞断片や細胞デブリスの細胞からの形成状況を含めた循環腫瘍細胞の終末期と、生存／成長という２つの経路の細胞学的動態が示され（上記記載（１）ア(ケ)）ている。 
　ｃ．そうすると、刊行物１発明において、クラス１〜７に形態分析して循環前立腺癌細胞を同定し特徴付けることを、刊行物１に記載された分析結果や示唆に基づいて、癌（病気）の存在を知るために応用してみようとすることは当業者が当然に考えることであり、そのために採用した方法は、上記（ア）及び（イ）（相違点１〜３について）で検討したように、刊行物２〜５に記載されるような本願優先権主張日前に公知あるいは周知であった磁気分離分析手法であって、このような手法を採用することに上記のとおり困難性がない以上、刊行物１発明を、前立腺癌患者からの血液に対してではなく、前立腺癌である可能性のあるテスト対象からの血液（生物学的検体）に対して適用して、該標識された稀な細胞、該標識された細胞断片、および該標識された細胞デブリスの存在が癌つまり病気の存在を示すとする、病気を検出する方法に応用することは当業者が容易になし得たものといえる。 
 　 
　（エ）なお、請求人は、審判請求の理由で、刊行物１には分析対象として細胞デブリスが挙げられているとしても、無傷の稀な細胞の存在割合から安定化か進行かを判断することは開示も示唆もない等と主張しているが、補正発明は、単に「・・・該標識された稀な細胞、該標識された細胞断片、および該標識された細胞デブリスの存在は病気の存在を示す」とする病気を検出する方法であって、補正発明の記載に基づかない主張であるし、コロイド状磁性粒子についての数値限定についても、格別な臨界的効果を有する特定であるとも認められない。
　
　（３）小活
　以上のとおりであるから、補正発明は、刊行物１に記載された発明及び周知事実に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許出願の際独立して特許を受けることができないものである。
 　 
３．むすび 
　したがって、本件補正は、平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するものであり、同法第１５９条第１項で読み替えて準用する第５３条第１項の規定により却下されるべきものである。 
  
第３．本願発明について 
１．本願発明 
　平成２４年８月１日付けの手続補正は上記のとおり却下されたので、本願の請求項１ないし９に係る発明は、平成２２年１２月２日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１ないし９に記載された事項により特定されるものであって、その請求項１は以下のとおりのものである。（以下、「本願発明」という） 　 
　
「　【請求項１】
　テスト対象において病気を検出する方法であって、
　ａ．テスト対象から生物学的検体を得、該検体は無傷の稀な細胞を含有することが疑われる混合された細胞集団を含み、およびさらに
　　i．稀な細胞に由来する細胞断片、または
　　ii．稀な細胞に由来する細胞デブリス；
を含み；
　ｂ．磁気−標識試料を調製し、ここに、該生物学的試料は、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスと特異的に反応する第１の生物特異的リガンドにカップリングしたコロイド状磁性粒子と、他の検体成分の実質的排除まで、混合され、ここに、前記コロイド状磁性粒子は、蛋白質ベースのコーティング材料でコートされた磁性コア材料であり、９０ないし１５０ｎｍの範囲内の、かつ７０ないし９０％の磁性質量を有し；
　ｃ．該磁気−標識試料を、該無傷の稀な細胞、および該細胞断片または該細胞デブリスを特異的に標識する少なくとも１つのさらなる生物特異的リガンドと、他の検体成分の実質的排除まで、接触させ；
　ｄ．該標識された稀な細胞、および該標識された細胞断片または該標識された細胞デブリスを分析することを含み、該標識された稀な細胞、該標識された細胞断片、および該標識された細胞デブリスの存在は病気の存在を示す；
ことを特徴とする方法。」
　
２．引用刊行物及びその記載事項 
　原査定の拒絶の理由に引用された刊行物１〜５とその記載事項は、前記第２の２．（１）に記載したとおりである。 
　
３．本願発明と刊行物１発明との対比・判断 
　本願発明は、前記第２の２．で検討した補正発明において、前記コロイド状磁性粒子についての「９０ｎｍより小さなまたは１５０ｎｍより大きな痕跡量の材料を含み」という限定記載がないものであるので、本願発明は、前記第２の２．で検討した補正発明を包含する。
　そうすると、補正発明と同様に、本願発明も刊行物１に記載された発明及び周知事実に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。 
 　 
４．むすび 
 　以上のとおり、本願発明は、本願優先権主張日前に頒布された上記刊行物１に記載された発明及び周知事実に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない
　したがって、他の請求項について論及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 
 　よって、結論のとおり審決する。