【事件の表示】
　特許第３３７１３７９号「グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）レセプター」の請求項１ないし１５に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３３７１３７９号の請求項１ないし１３に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３３７１３７９号についての出願は、１９９３年３月２３日に国際出願された（PCT/EP93/00697、パリ条約による優先権主張１９９２年３月２５日）特願平５−５１６２８７号の特許出願であって、平成１４年１１月２２日にその特許の設定登録がなされ、その後、間山世津子より特許異議の申立てがなされたところ、当審において取消理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１６年４月５日に意見書が提出されると共に訂正請求がなされた。さらに、同年６月１７日付けで当審において特許権者に対し審尋をおこなったところ、同年７月１６日付けで特許権者より回答書が提出された。
　
II．訂正の請求について
１．訂正事項
（１）訂正事項（ａ）
　請求項１を、
「１．配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むGLP-1レセプター、又は配列番号１に示される部分アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾され、且つGLP-1に結合する上記天然GLP-1レセプター由来のアナログ。」から、
「１．配列番号１に示されるアミノ酸配列から成る組換えGLP-1レセプター、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾され、且つ10nM未満の親和定数（KD）をもってGLP-1に結合する上記天然GLP-1レセプター由来のアナログ。」と訂正する。
　
（２）訂正事項（ｂ）
　訂正前請求項２を削除し、請求項の番号（請求項自体の番号、及び引用する請求項の番号）を、訂正前請求項３〜５から、訂正後請求項２〜４に訂正する。
　
（３）訂正事項（ｃ）
　訂正前請求項６を削除し、請求項の番号（請求項自体の番号、及び引用する請求項の番号）を、訂正前請求項７〜１５から、訂正後請求項５〜１３に訂正する。
　
（４）訂正事項（ｄ）
　訂正前請求項１１の記載、
「１１．GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニスト又はエンハンサーをスクリーニングする方法であって、請求項１乃至３のいづれか１項に記載のGLP-1レセプターを、GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニストとされる物質と共に、そしてその後GLP-1(7-37)若しくはGLP-1(7-36)アミド又はそのアミドの１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つ上記GLP-1レセプターに結合する活性を有するものと共に、インキュベートする、ここでのアナログはGLP-1レセプターに結合している、上記方法。」を、訂正後請求項９において、
「９．GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニスト又はエンハンサーをスクリーニングする方法であって、請求項１又は２に記載のGLP-1レセプターを、GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニストとされる物質と共に、そしてその後GLP-1(7-37)若しくはGLP-1(7-36)アミド又は当該アミドのアナログであって１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つ上記GLP-1レセプターに結合する活性を有するものと共に、インキュベートする、上記方法。」
に訂正する。
　
（５）訂正事項（ｅ）
　訂正前請求項１２の記載、
「１２．GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニスト又はエンハンサーをスクリーニングする方法であって、GLP-1(7-37)若しくはGLP-1(7-36)アミド又はそのアミドの１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つGLP-1レセプターに結合する活性を有するものを、ここでアナログはGLP-1レセプターに結合し、GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニストとされる物質と共に、そしてその後請求項１乃至３のいづれか１項に記載のGLP-1レセプターと共に、インキュベートする上記方法。」を、訂正後請求項１０において、
「１０．GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニスト又はエンハンサーをスクリーニングする方法であって、GLP-1(7-37)若しくはGLP-1(7-36)アミド又は当該アミドのアナログであって１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つGLP-1レセプターに結合する活性を有するものを、GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニストとされる物質と共に、そしてその後請求項１又は２に記載のGLP-1レセプターと共に、インキュベートする、上記方法。」
　
（６）訂正事項（ｆ）
　明細書（平成９年１１月１４日付け手続補正書による全文補正明細書、以下同じ）第２頁下から第４行目の記載、「10nM未満を有する」を、「10nM未満をもって」に訂正する。
　
（７）訂正事項（ｇ）
　明細書第３頁下から第１２〜１１行目の記載、「親和力を有する」を、「親和力をもって」に訂正する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
（１）訂正事項（ｆ）について
　訂正前の明細書第２頁下から第５行〜下から第３行には、「GLP-1レセプターに関し…親和定数KD100nM未満、好ましくは10nM未満を有するGLP-1に結合するアナログを含む。」と記載されているが、親和定数とは特定の物質が「有する」というものではなく、リガンドとレセプターの結合親和性の程度を意味するものである。ここでは、GLP-1とGLP-1レセプターとの結合親和性を意味することは明らかであるから、「…10nM未満をもってGLP-1に結合する…」という表現の方が適切な表現であるといえる。
　したがって、この訂正は、誤記の訂正もしくは明りょうでない記載の釈明を目的とするものであり、特許請求の範囲を実質的に拡張又は変更するものでもなく、また、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内においてするものである。
　
（２）訂正事項（ｇ）について
　訂正事項（ｇ）は、「10nM未満の親和力を有するGLP-1と結合するその機能的アナログ」を「10nM未満の親和力をもってGLP-1と結合するその機能的アナログ」と訂正するものであり、その訂正の趣旨は訂正事項（ｆ）と同じである。
　したがって、（１）と同じ理由で、この訂正は、誤記の訂正もしくは明りょうでない記載の釈明を目的とするものであり、特許請求の範囲を実質的に拡張又は変更するものでもなく、また、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内においてするものである。
　
（３）訂正事項（ａ）について
（イ）「配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むGLP-1レセプター」を「配列番号１に示されるアミノ酸配列から成る組換えGLP-1レセプター」とする訂正は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末やＮ末に、さらにアミノ酸やアミノ酸配列が添加するもの、及び、非組換え型のGLP-1レセプターを排除するものなので、特許請求の範囲の減縮に該当し、特許請求の範囲を拡張するものでも変更するものでもない。
　また、明細書第２頁下から第６行目には「本発明は組換えグルカゴン様ペプチド−１（GLP-1）レセプターに関する。」と記載されており、また、明細書に示されている実施例はすべて組換えGLP-1レセプターに関するものであり、とりわけ実施例１は配列番号１から成る組換えGLP-1レセプターに関するものである。したがって、この訂正は、願書に最初に添付した明細書に記載した事項の範囲内の訂正である。
　
（ロ）「配列番号１に示される…１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾され、且つGLP-1に結合する上記天然GLP-1レセプター由来のアナログ」を「配列番号１に示される…１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾され、且つ10nM未満の親和定数（KD）をもってGLP-1に結合する上記天然GLP-1レセプター由来のアナログ」とする訂正は、「GLP-1レセプター由来のアナログ」を、GLP-1と結合する際の結合定数（KD）の値で限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、特許請求の範囲を拡張するものでも変更するものでもない。
　また、訂正後の明細書第２頁下から第５行目〜第３頁第６行目には、「本発明はGLP-1レセプターに関し、これは配列番号１に示すアミノ酸配列、又は、親和定数KD100nM未満、好ましくは10nM未満をもってGLP-1に結合するアナログを含む。明細書中、用語「アナログ」は…生来の天然アミノ酸配列のＣ末端およびＮ末端のいずれか又は両方での１以上のアミノ酸の付加、生来のアミノ酸配列中の１以上の部位での１以上のアミノ酸の置換、生来の配列の一端又は両端での又は生来の配列の１以上の部位での１以上のアミノ酸の欠失、又は生来の配列内への１以上のアミノ酸の挿入をもたらすことにより生来のGLP-1レセプターから得られる。」と記載されており、この訂正は（１）で述べたとおり適法なものであるから、当該訂正に基づくこの訂正は、願書に最初に添付した明細書に記載した事項の範囲内の訂正であるといえる。
　
（４）訂正事項（ｂ）について
　訂正事項（ｂ）のうち、訂正前の請求項２を削除するものは、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　また、訂正前の請求項３〜５を２〜４とする訂正は、訂正前の請求項２の削除に伴い、請求項を繰り上げて整理するものであるから、明りょうでない記載の釈明に該当する。
　したがって、これらの訂正は、願書に最初に添付した明細書に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許請求の範囲を拡張するものでも変更するものでもない。
　
（５）訂正事項（ｃ）について
　訂正事項（ｃ）のうち、訂正前の請求項６を削除するものは、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　また、訂正前の請求項７〜１５を５〜１３とする訂正は、訂正前の請求項６の削除に伴い、請求項を繰り上げて整理するものであるから、明りょうでない記載の釈明に該当する。
　したがって、これらの訂正は、願書に最初に添付した明細書に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許請求の範囲を拡張するものでも変更するものでもない。
　
（６）訂正事項（ｄ）について
　訂正前の請求項１１においては、「そのアミドの１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つ上記GLP-1レセプターに結合する活性を有するものと共に、インキュベートする、ここでのアナログはGLP-1レセプターに結合している」と記載されているが、この請求項中、これより前に「アナログ」についての記載はない。また、これよりも前の他の請求項における「アナログ」はGLP-1レセプター自体に係るものであり、この請求項におけるようなGLP-1アミドに係るものではない。したがって、ここでの「アナログ」の意味するところは不明りょうである。
　ところで「アナログ」は、本件出願時の技術常識に鑑みると、明細書の第２頁下から第３行〜第３頁第６行にも記載のとおり、「生来の天然アミノ酸配列のＣ末端およびＮ末端のいずれか又は両方での１以上のアミノ酸の付加、生来のアミノ酸配列中の１以上の部位での１以上のアミノ酸の置換、生来の配列の一端又は両端での又は生来の配列の１以上の部位での１以上のアミノ酸の欠失、又は生来の配列内への１以上のアミノ酸の挿入をもたらすことにより生来の」タンパクから得られるものであることは明らかである。そして、この請求項中で、そのような物として表現されているのは「GLP-1アミドの１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つ上記GLP-1レセプターに結合する活性を有するもの」（「記載Ａ」という）であることも明らかである。
　してみると、「記載Ａ」の後ろに唐突に記載されていた「アナログ」に関する説明を、当該記載Ａの前に「当該アミドのアナログであって、」という表現で加える訂正は、不明りょうな記載の釈明に該当するものであり、また、特許請求の範囲を拡張するものものでも変更するものでもなく、かつ、願書に最初に添付した明細書に記載した範囲内にあるものである。
　
（７）訂正事項（ｅ）について
　訂正事項（ｅ）は、「そのアミドの１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つGLP-1レセプターに結合する活性を有するものを、こでのアナログはGLP-1レセプターに結合し、」を、「当該アミドのアナログであって１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つGLP-1レセプターに結合する活性を有するものを、」と訂正するものであり、その訂正の趣旨は、訂正事項（ｄ）と同じである。
　したがって、（６）と同じ理由で、この訂正は、不明りょうな記載の釈明に該当するものであり、また、特許請求の範囲を拡張するものものでも変更するものでもなく、かつ、願書に最初に添付した明細書に記載した範囲内にあるものである。
　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び第３項で準用する特許法第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立について
１．本件発明
　本件発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１〜１３に記載された事項により特定されたとおりのものであり、それらの発明は下記のとおりである（以下、それぞれ「本件発明１〜本件発明１３」ともいう。）。
「１．配列番号１に示されるアミノ酸配列から成る組換えGLP-1レセプター、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾され、且つ10nM未満の親和定数（KD）をもってGLP-1に結合する上記天然GLP-1レセプター由来のアナログ。
２．界面活性剤可溶化膜調製中に存在するか又は補因子の存在下で可溶化されている請求項１記載のGLP-1レセプター。
３．請求項１記載のGLP-1レセプターをコードするDNA配列を含むDNA構築物。
４．配列番号１に示されたDNA配列、又は配列番号１に示されるDNA配列において、１又は数個の塩基の置換、付加又は欠失により修飾されたDNA配列を有し、且つGLP-1に結合するGLP-1レセプターをコードするDNA配列、を含む請求項３記載のDNA構築物。
５．請求項３又は４に記載されたDNA構築物を坦持する組換え発現ベクター。
６．請求項５記載の組換え発現ベクターを含む細胞。
７．請求項３又は４に記載のDNA構築物をそのゲノム内に組み込まれて含む細胞。
８．昆虫又は哺乳動物細胞の如き真核細胞である、請求項６又は７記載の細胞。
９．GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニスト又はエンハンサーをスクリーニングする方法であって、請求項１又は２に記載のGLP-1レセプターを、GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニストとされる物質と共に、そしてその後GLP-1(7-37)若しくはGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニストとされる物質と共に、そしてその後GLP-1(7-37)若しくはGLP-1(7-36)アミド又は当該アミドのアナログであって１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つ上記GLP-1レセプターに結合する活性を有するものと共に、インキュベートする、上記方法。
１０．GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニスト又はエンハンサーをスクリーニングする方法であって、GLP-1(7-37)若しくはGLP-1(7-36)アミド又は当該アミドのアナログであって１又は数個のアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つGLP-1レセプターに結合する活性を有するものを、GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニストとされる物質と共に、そしてその後請求項１又は２に記載のGLP-1レセプターと共に、インキュベートする、上記方法。
１１．GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)アミド活性のアゴニストをスクリーニングするための、請求項１又は２に記載のGLP-1レセプターの使用方法。
１２．請求項１に記載のGLP-1レセプターの組織及び／又は臓器特異的変異体の単離のための、請求項３又は４に記載のDNA構築物の使用方法。
１３．GLP-1アゴニストのスクリーニングのための請求項１２記載の単離されたレセプターの使用方法。」
　
２．特許異議申立理由の概要
　一方、特許異議申立人　間山世津子は、甲第１号証〜甲第１２号証を提出し、
＜特許法第２９条第１項第３号について＞
（１）訂正前の本件請求項１及び３に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから特許法第２９条第１項第３号の規定に違反してなされたものであること、
（２）訂正前の請求項１１〜１３に係る発明は、甲第５号証〜甲第７号証に記載された発明であるから特許法第２９条第１項第３号の規定に違反してなされたものであること、
　
＜特許法第２９条第２項について＞
（３）訂正前の本件請求項１、３〜５、７〜１０及び１４に係る発明は、甲第１号証〜甲第３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであること、
（４）訂正前の本件請求項２に係る発明は、甲第４号証及び甲第８号証〜甲第１０号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであるから特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであること、
（５）訂正前の請求項４、６〜１０及び１４に係る発明のうち請求項２を引用する部分については、甲第４号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであるから特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであること、
（６）訂正前の請求項１１〜１３に係る発明は、甲第５号証〜甲第７号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであること、
（７）訂正前の請求項１５は、(a)甲第１号証〜甲第３号証及び甲第５号証〜甲第７号証、又は、(b)甲第４号証及び甲第５号証〜甲第７号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであること
　
＜特許法第３６条について＞
（８）訂正前の請求項２に関して、本件は、特許法第３６条第５項第２号及び第６項に規定する要件を満たしていないこと、
（９）訂正前の請求項４、６、７〜１０及び１４に係る発明のうち請求項２を引用する部分に関して、本件は、特許法第３６条第４項又は第６項に規定する要件を満たしていないこと、を主張している。
　
甲第１号証：Pancreas, Vol.6, No.6(1991)P.701左下欄, “SOLUBILIZATION OF ACTIVE GLP-1(7-36)AMIDE RECEPTORS FROM RINm5F-CELL PLASMA MEMBRANES”
甲第２号証：Journal of Molecular Endocrinology(1989)Vol.2, P.93-98
甲第３号証：FEBS LETTERS, Vol.280, No.2(1991)P.247-250
甲第４号証：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.89(September 1992)P.8641-8645
甲第５号証：American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology (1989)Vol.20, No.3, G397-G401
甲第６号証：FEBS LETTERS, Vol.267, No.1(1990)P.78-80
甲第７号証：Journal of Endocrinology(1990)Vol.126, P.445-450
甲第８号証：FEBS LETTERS, Vol.236, No.1(1988)P.119-122
甲第９号証：Diabetologia, Vol.35, Supplement 1, A76, 290(August 1992)
甲第１０号証：Diabetologia, Vol.35, Supplement 1, A83, 318(August 1992)
甲第１１号証：DIABETES, Vol.42(1993)P.1678-1682
甲第１２号証：BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARH COMMUNICATIONS, Vol.196, No.1(1993)P.141-146
　
３．甲号証に記載の事項
（１）甲第１号証
　甲第１号証には、ラットのRINm5F細胞（インスリノーマ細胞由来）の形質膜から、活性型のGLP-1レセプターを可溶化した旨、及び、この可溶化されたGLP-1レセプターとGLP-1との結合親和性（KD）が10nMであった旨が記載されている。
　また、架橋実験において、２官能性架橋剤ジサクシンイミジルスバレート（DSS）を用いて[125I]GLP-1をGLP-1レセプターに共有結合させたところ、1-Dゲル及び2-Dゲル電気泳動において、DSSは63000の見かけ分子量の位置に単一の蛋白質を標識した旨が記載されている。
　
（２）甲第２号証
　甲第２号証には、ラットのRINm5F細胞（インスリノーマ細胞由来）の形質膜中に存在する蛋白質と、125I標識化GLP-1(7-36)アミドとを、架橋剤により化学的に架橋した生成物が、SDS-PAGE電気泳動において分子量63000±1000ダルトンのところにバンドとして検出された旨が記載されている（ABSTRACT、FIGURE1）。
　この生成物を得るための具体的な方法は、
(i)ラットの細胞から形質膜を調製、
(ii)上記形質膜と125I-GLP-1(7-36)アミドとのインキュベーション、
(iii)上記の反応混合物に架橋剤DSSを添加した架橋反応、
(iv)架橋生成物を、上記形質膜から可溶化、
(v)可溶化された架橋物を電気泳動にかけて放射性の検出によりバンドを同定、
(vi)上記バンドの分子量が約63kDaであることを確認した、
旨が記載されている（第９４〜９５頁）。
　また、第９７頁左欄下から第９行〜末行には、GLP-1(7-36)アミドと、GLP-1レセプターとの複合体を酵素処理しても、そのSDS-PAGE上の移動度にはほとんど影響がなかったことから、当該GLP-1レセプターにはアスパラギン結合炭水化物が存在しないか、あったとしても全分子量に対する寄与は僅かなものにすぎないか、あるいはグリコシル化が脱グリコシル化に対して耐性となる異常な構造的特徴を採っているかのいずれかである旨が、記載されている。
　
（３）甲第３号証
　甲第３号証には、ラットの肺の形質膜に存在する蛋白質と、125I標識化GLP-1(7-36)アミドとを、架橋剤により化学的に架橋した生成物が、SDS-PAGE電気泳動において分子量66000±1000ダルトンのところにバンドとして検出された旨が記載されている（ABSTRACT、Fig.3）。
　
（４）甲第４号証
　甲第４号証には、ラット由来のGLP-1レセプターのcDNAを単離してその塩基配列を決定し（FIG.4）、これをCOS細胞に形質転換したところ、このレセプターはGLP-1に特異的に結合する旨やFIG.5に示されるアミノ酸配列からなることがわかった旨が記載されている。
　なお、甲第４号証は、本件の優先権主張日以降に頒布された文献である。
　
（５）甲第５号証
　甲第５号証には、グアニンヌクレオチドの存在下で、ラットのRINm5F由来の形質膜を125Iで標識化したGLP-1(7-36)アミドと一緒にインキュベートする架橋試験を行ったところ、グアニンヌクレオチドがGLP-1とそのレセプターとの結合を減少させた旨が記載されている（ABSTRACT、TABLE1、第G398頁のCross-linking exprerimentsの項、RESULTSのBinding experimentsの項）。
　
（６）甲第６号証
　甲第６号証には、ラットの肺の膜を、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（VIP）及びペプチド・ヒスチジン・イソロイシン（PHI）の存在下で、125Iで標識化したGLP-1(7-36)アミドと一緒にインキュベートした結果、ラットの肺の膜にあるGLP-1レセプターと125Iで標識化したGLP-1(7-36)アミドの結合をVIP及びPHIが阻害した旨が記載されている（Fig.2、DISCUSSION）。
　
（７）甲第７号証
　甲第７号証には、ラットのRINm5F細胞をデキサメタゾンで前処理すると、ラットのRINm5F細胞と125Iで標識化したGLP-1(7-36)アミドの結合が阻害され、デキサメタゾンの存在下でRINm5F細胞におけるGLP-1(7-36)アミドレセプターの数が減少すると解釈している旨が記載されている（ABSTRACT、RESULTS、第449頁右欄）。
　
（８）甲第８号証
　甲第８号証には、ヒトの胃癌細胞（HGT-1細胞）を用いて、切断されたGLP-1(7-36)（TGLP-1）がレセプターcAMPシステムに与える影響を検討した結果、TGLP-1がcAMP発生システムを活性化する能力が高い旨が記載されている（ABSTRACT、第119頁右欄、Fig.3）。
　
（９）甲第９号証
　甲第９号証には、ヒトの脂肪組織にGLP-1(7-37)アミドに特異的なレセプターが存在する旨が記載されている。
　なお、甲第９号証は、本件の優先権主張日以降に頒布された文献である。
　
（１０）甲第１０号証
　甲第１０号証には、GLP-1(7-37)アミドに特異的なレセプターをヒトの脂肪膜中に見つけた旨が記載されている。
　なお、甲第１０号証は、本件の優先権主張日以降に頒布された文献である。
　
（１１）甲第１１号証
　甲第１１号証には、ヒト由来のGLP-1レセプターのcDNAを単離したところ、ラット由来のGLP-1レセプターと90%同一性があったことが記載されており、さらに、ヒト由来の完全長のGLP-1レセプターのcDNAが463個の推定アミノ酸をコードしていることが記載されている。
　なお、甲第１１号証は、本件の出願日以降に頒布された文献である。
　
（１２）甲第１２号証
　甲第１２号証には、ヒトの胃癌細胞（HGT-1細胞）から、ヒト由来のGLP-1レセプターのcDNAを単離したことが記載されており（Abstract）、さらに、ヒト由来のGLP-1レセプターのcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列（463個の推定アミノ酸からなる）が記載されている。
　なお、甲第１２号証は、本件の出願日以降に頒布された文献である。
　
４．当審の判断
（１）訂正により削除された発明について
　IIで述べた訂正がなされたことで、訂正前の請求項２、６、及び、請求項３〜１５のうち請求項２又は６を引用する発明は本件発明に含まれないものとなったので、異議申立人の指摘する上記理由（４）、（５）、（７）(b)、（８）及び（９）に記載の、特許法第２９条第２項違反及び特許法第３６条に規定する要件を満たさないとする主張はもはや成り立たない。
　そして、当該訂正がなされたことにより、本件発明１〜１３に記載の発明は上記本件優先権主張の効果を享受することのできるもののみとなったと認められるところ、甲第１１号証、甲第１２号証のみならず、本件優先権主張日より後に頒布された甲第４号証、甲第９号証及び甲第１０号証も、本件発明１〜１３に対しては頒布された刊行物としてではなく参考文献として取り扱われるものとなった。また、甲第８号証は、上記理由（４）についてのみ引用されている文献なので、訂正後の本件発明に対してはもはや引用文献として取り扱わない。
　
（２）特許法第２９条第１項第３号について
（２−１）本件発明１及び２について（異議申立理由（１））
　異議申立人は、「本件発明１と甲第１号証に記載された発明を対比すると、後者には、単独の蛋白質の形態としてのラット由来の、GLP-1(7-36)アミドをリガンドとするGLP-1レセプター（分子量63000）が記載されており、前者もGLP-1(7-36)アミドをリガンドとするラット由来のGLP-1レセプターであるから、両者は同一である」旨、主張する。
　しかしながら、本件発明１又は２に記載の配列番号１のアミノ酸配列で特定されるGLP-1レセプターの分子量は、そのアミノ酸配列から算出すると53059Da（約53kDa）にすぎない。そして、その「アナログ」の分子量も、特許権者の主張するとおりアナログを天然のGLP-1レセプターから高々９個程度のアミノ酸が欠失又は付加するものと解し、１個のアミノ酸の分子量を平均約110Daとして計算した場合、52〜54kDaと算出される。
　他方、上述のとおり甲第１号証に記載のGLP-1レセプターはGLP-1と結合した状態で約63kDaであるから、約3kDaのGLP-1アミドの分子量を減じたレセプター単独の分子量は約60kDaと推定される。
　そうしてみると、本件発明１又は２に記載の配列番号１のアミノ酸配列で特定されるGLP-1レセプター又はそのアナログと、甲第１号証に記載のGLP-1レセプターとは、その分子量が約6〜8kDaも異なっており、当該数値はSDS-PAGEによる測定値の誤差を勘案しても十分に大きな差異であるとするのが相当である。
　しかも、甲第２号証に記載のGLP-1レセプターは、甲第１号証に記載のGLP-1レセプターと同じラットRINm5F細胞の形質膜から得られるものであって由来が共通しており、さらに、同じ見かけ分子量を有するものであるから、両者は同じものである蓋然性が極めて高い。甲第２号証では、そのGLP-1レセプターについて、その電気泳動の移動度が酵素によっても影響を受けなかったことから、それが糖鎖をもたないか、もつとしても分子量に影響を与えない程度のものであるか、又は、グリコシル化が脱グリコシル化に対して耐性となる異常構造を採っていると推測されることが記載されている。通常複数箇所存在するグリコシル化部位のすべてが異常構造を採るとは技術常識的に考えにくく、かつ、同甲号証には、そのような異常構造について何ら言及がなされていないことも併せ考慮すると、これらのGLP-1レセプターは糖鎖をもたないか、たとえもっていたとしても分子量にはほとんど影響を与えない程度のものであると解する方が自然である。
　してみると、本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプターと甲第１号証に記載のGLP-1レセプターとの約6〜8kDaの分子量の差は、糖鎖の有無や大きさに拠るものではなく、両者のアミノ酸配列の相違に基づくものであることをうかがわせる。
　さらに、本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプターは、GLP-1と10nM未満の親和定数をもって結合するものであるのに対し、甲第１号証に記載のGLP-1レセプターは同親和定数が10nMであるから、有する性質においても両者は相違する。
　したがって、これらの点を併せ考慮すると、このような相違点があるものについて、両者を同一のものと解することはできない。
　
（２−２）本件発明９〜１１について（異議申立理由（２））
　異議申立人は、「甲第５号証〜甲第７号証には、被験物質（グアニンヌクレオチド、VIP、PHI、デキサメタゾン等）の存在下で、GLP-1と一緒にインキュベーションした場合、これらの被験物質が、GLP-1レセプターとGLP-1との結合を減少もしくは阻害したことが記載されており、このことはGLP-1活性のアゴニスト等をスクリーニングしていることになるから、本件発明９〜１１に記載の発明は、これらの文献に記載の発明と同一である」旨、主張する。
　しかしながら、本件発明９〜１１に記載の発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列で特定されるGLP-1レセプター又はそのアナログにかかる本件発明１又は２を引用するものであり、これらの発明では、アゴニスト等のスクリーニングにおいて特定のGLP-1レセプター又はそのアナログを特に選んで別個に用いることを明確に表現しているものと認められる。してみると、甲第５号証〜甲第７号証に記載されるような、現に存在する膜や細胞上に単離や同定もなされていないGLP-1レセプター様の蛋白質があるであろうというだけの生物材料をそのまま用いて行うスクリーニングとは自ずと異なるものと解される。
　実際、本件明細書に記載の実施例においても、本件発明３に記載のDNA配列を有する遺伝子構築物を特定の細胞に形質転換させて、本件発明１に記載のGLP-1レセプターを新たに発現させた細胞を用いてアゴニスト等のスクリーニングを行う方法が具体的に示されており、そのような実施例を参酌しても、本件発明９〜１１に記載の方法は、甲第５号証〜甲第７号証に記載の生物材料をそのまま使用する方法とは異なるものであることが明らかである。
　してみると、両者を同一の発明とすることはできない。
　
　よって、特許法第２９条第１項第３号違反に関する異議申立人の上記主張は採用できない。
　
（３）特許法第２９条第２項について
（３−１）本件発明１〜８及び１２について（異議申立理由（３））
　異議申立人は、「本件発明のGLP-1レセプターは甲第１号証に可溶化して単離されたものとして記載されており、当業者が容易に提供し得たものであり、また、甲第２号証及び甲第３号証には、ラット由来のGLP-1レセプターとGLP-1(7-36)アミドとの複合体が記載されており、当業者であれば該複合体からレセプター蛋白質を単離することは容易であったから、本件発明１及び２は当業者が容易に発明をすることができたものである」旨、主張する。
　さらに異議申立人は、「単離GLP-1レセプター蛋白質からアミノ酸配列を決定し、その配列情報に基づいてプローブ等を設計し、適当なライブラリーからGLP-1レセプターをクローニングすることは当業者が容易に為し得たことであるから、本件発明３及び４に記載のGLP-1レセプターをコードするDNA配列を含むDNA構築物に係る発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、また、該DNA構築物をベクターに組み込むことにより組換え発現ベクターを得ること、それを形質転換させた細胞を得ること、及び、該DNA構築物をGLP-1レセプターの組織及び／又は臓器特異的変異体の単離のために使用することも当業者が容易に為し得たことであるから、本件発明５〜８及び１２に係る発明も特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである」旨、主張する。
　
　しかしながら、上記（２−１）で述べたとおりの理由で、本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプターは、甲第１号証に記載されたGLP-1レセプターと同一のものと解することはできないものである。
　
　甲第２号証に記載のGLP-1レセプターもGLP-1アミドと結合した状態の分子量は約63kDaであるが、約3kDaのGLP-1アミドの分子量を減じたレセプター単独の推定分子量は約60kDaと、配列番号１のアミノ酸配列から推定される本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプター又はそのアナログの分子量52〜54kDaとは大きく乖離するものである。
　また上述のとおり、甲第２号証に記載のGLP-1レセプターは糖鎖をもたないか、もっていたとしても分子量にはほとんど影響を与えない程度のものであると解する方が自然であり、本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプターと同甲号証に記載のGLP-1レセプターとの分子量の差は、糖鎖の有無や大きさに拠るものではなく、両者のアミノ酸配列の相違に基づくものであると解されるところ、結合糖鎖の点を考慮したとしても、両者が同じアミノ酸配列を有するGLP-1レセプターであると解することはできない。
　
　甲第３号証に記載のGLP-1レセプターもGLP-1アミドと結合した状態の分子量は約66kDaであるが、約3kDaのGLP-1アミドの分子量を減じたレセプター単独の推定分子量は63kDaと、配列番号１のアミノ酸配列から推定される本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプター又はそのアナログの分子量52〜54kDaとは、さらに大きく乖離するものである。
　その上、甲第３号証に記載のGLP-1レセプターはラットの肺細胞から得られたものであり、一方、本件発明GLP-1レセプターはラットの膵島細胞から得られたものであって由来も異なる。乙第４号証（Peptides, Vol.13(1992)P.13-16）、乙第５号証（J. Cell. Physiol., Vol.172(1997)P.275-283）には、ラット脂肪細胞において膵島とは異なるタイプのGLP-1レセプターが存在することが示唆ないし記載されており、また、乙第６号証（Peptides, Vol.16(1995)P.225-229）にはラット骨格筋など種々の組織に、異なるタイプのGLP-1レセプターが存在することが示唆ないし記載されているところ、由来細胞が異なれば、得られるGLP-1レセプターも異なるタイプのものとなる蓋然性が極めて高いと認められる。
　ゆえに、当該由来の相違の点も考慮すると、なおいっそう本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプターは、甲第３号証に記載のGLP-1レセプターとは同一のものと解することはできない。
　
　このように、甲第１号証〜甲第３号証に記載のGLP-1レセプターは、本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプターとは同一のものということができないものである。その上、上述の乙第４号証〜乙第６号証、甲第１号証〜甲第３号証に示されるとおり、ラットGLP-1レセプターについては種々の類似のタイプが存在する。
　類似の配列を有するものが生体内に多く存在すると、それだけクローニングは難しくなるところ、たとえ甲第１号証、甲第２号証又は甲第３号証に記載のGLP-1レセプターのアミノ酸配列を読むことができ、その配列から設計した縮重プローブ等を用いて通常のクローニング手法を試みたとしても、必ずしも、本件発明３に示される特定の配列を有するGLP-1レセプターの遺伝子、又は、GLP-1と特定の結合定数を有するそのアナログをコードする遺伝子を、種々のGLP-1レセプター遺伝子の中から適切に釣ってくることが当業者に容易に為し得たとすることはできない。
　そしてそもそも、甲第１号証〜甲第３号証に記載のSDS-PAGEにバンドとして得られるGLP-1レセプターは、GLP-1アミドとDSS架橋剤によってアミド結合で共有結合された複合体であり、当該複合体からアミノ酸配列を適切に読むことのできる量のGLP-1レセプターを単離することが当業者に容易であったとは解することができない。そして、甲第１号証に記載の可溶化GLP-1レセプターについても、アミノ酸配列を特定することが可能な純度のものを十分量得る方法については、甲第１号証を含め、いずれの甲号証にも具体的に示されておらず当業者に困難を強いるものと認められる。してみると、これらの甲号証に記載の、本件発明GLP-1レセプターとは同じものと解することのできないGLP-1レセプターについてさえも、それらのアミノ酸配列を読むことが当業者に容易に為し得たとすることはできないのであるから、そこからプローブを設計して本件発明のGLP-1レセプター遺伝子のクローニングを行うことなどは当業者が容易に為し得たとすることはできない。
　そして、本件発明３に記載の、配列番号１を有するGLP-1レセプター遺伝子、又は、GLP-1と特定の結合定数を有するそのアナログをコードする遺伝子を得たことではじめて、本件発明１又は２に記載の特定の配列を有するGLP-1レセプターやそのアナログを形質転換細胞表面で発現させることができるものであるといえるところ、本件発明１又は２が当業者にとって容易に為し得るものではないことは上述の如くであるから、当該遺伝子を組み込んだDNA構築物をGLP-1レセプターの組織及び／又は臓器特異的変異体の単離のために使用することも当業者が容易に為し得たとすることはできない。
　
（３−２）本件発明９〜１１、１３（異議申立理由（６）、（７）(a)）
　（２−２）において述べたとおり、本件発明９〜１１、１３に記載の発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列で特定されるGLP-1レセプター又はそのアナログにかかる本件発明１又は２を引用するものであり、これらの発明では、アゴニスト等のスクリーニングにおいて特定のGLP-1レセプター又はそのアナログを特に選んで別個に用いることを明確に表現していると認められる。
　他方、甲第１号証〜甲第３号証、甲第５号証〜甲第７号証には、いずれの甲号証においても、本件発明１及び２に記載の特定のGLP-1レセプターを単離する方法も、また、それをコードする遺伝子をクローニングして別個に発現させる方法も記載されていないし、また、これらの甲号証をどのように組み合わせてみても、本件出願時にそれらを当業者が容易に為し得たとすることはできないものであること上述の如くであるから、本件発明１又は２に記載のGLP-1レセプターを特に選んで別個に使用してアゴニスト等をスクリーニングすることが当業者に容易に為し得たとすることはできない。
　したがって、本件発明９〜１１及び１３に記載の発明は、いずれの甲号証に記載の発明からも当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　
　よって、特許法第２９条第２項違反に関する異議申立人の上記主張は採用できない。
　
IV.むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては本件請求項１〜１３に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１〜１３に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年８月３０日（２００４．８．３０）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）レセプター
【発明の詳細な説明】
技術分野
　本発明は、組換えグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）レセプター、ＧＬＰ−１レセプターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物、ＧＬＰ−１活性のアゴニストをスクリーニングする方法およびＧＬＰ−１活性のアゴニストをスクリーニングするためのＧＬＰ−１レセプターの使用に関する。
発明の背景
　本明細書中に使用するとき、名称ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３６）アミドを含む。
　グルコース誘発インシュリン分泌は、多数のホルモンと神経伝達物質により調節される。特に、２つの消化管ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および胃の抑制性ペプチド（ＧＩＰ）はインシュリン分泌に対するグルコースの効果を高め、そしてこれ故にグルコ−インクレチンといわれる（デュプレ，ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｐａｎｃｒｅａｓ，Ｅ．サモイス編（ラベン出版社，ニューヨーク，（１９９１），２５３〜２８１）およびエベルト　アンド　クルーツフェルト、（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．
３
２
３０４
２６１
７９
３８
８４
２５７
８４
３９
８７
１５
発明の説明
　本発明は組換えグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）レセプターに関する。
　より好ましくは、本発明はＧＬＰ−１レセプターに関し、これは配列番号１に示すアミノ酸配列、又は親和定数ＫＤ　１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満を
もって
　他の側面において、本発明は、本発明のＧＬＰ−１レセプターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物、並びにそのＤＮＡ構築物を担持する組換え発現ベクターおよびその組換え発現ベクターを含む細胞に関する。
　本発明の一つの態様において、ＧＬＰ−１レセプター分子は、可溶化された形態および／又は再構成された形態で提供されることができる。
　本明細書中、「可溶化された」は、界面活性剤により可溶化された膜調製物中に存在するようなレセプターを指すことを意図される。「再構成された」は、必須の補因子、例えばＧ−プロテインの存在下で可溶化されたレセプターを指すことを意図される。この態様において、レセプターは再構成されたミセル形態にある。
　ＧＬＰ−１レセプターをコードする本発明のＤＮＡ構築物は、好ましくは配列番号１に示すＤＮＡ配列、又は少なくとも１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満の親和力を
もって
　本発明のＤＮＡ構築物の他の例は、可溶化および再構成に特に好適なＧＬＰ−１レセプター変異体をコードするＤＮＡ構築物である。
　本発明のＧＬＰ−１レセプターをコードする本発明のＤＮＡ構築物は、確立された標準法、例えばベアカーゲおよびカルテルスにより記載されたホスホアミダイト法、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　
２２
３
　本発明のＤＮＡ構築物は、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして標準的な技術（サムブルック他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版、コールド　スプリングハーバー、１９８９）に従い合成オリゴヌクレオチド・プローブを用いハイブリダイゼーションにより本発明のＧＬＰ−１−レセプターの全部又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られるゲノム又はｃＤＮＡ起源のものであることもできる。この場合、ＧＬＰ−１レセプターをコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列は、例えば、周知の手順に従い、相同的組換えのための所望のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発により、アミノ酸置換を導入することが望まれる部位に対応する部位で修飾されることができる。
　最後に、ＤＮＡ構築物は合成の、ゲノム又はｃＤＮＡ起源（適当な場合）の断片をライゲートすることによって得られる、混合された合成とゲノム、混合された合成とｃＤＮＡ又は混合されたゲノムとｃＤＮＡ起源を有することができ、その断片は標準的な技術に従いＤＮＡ構築物全体の種々の部分に相当する。ＤＮＡ構築物は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号又はサイキ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ　
２３９
　本発明のＤＮＡ構築物が挿入されている組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供されることができるいずれのベクターであってもよく、そしてベクターの選定は、それが導入されるべき宿主細胞にしばしば依存するであろう。かくして、ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外物として存在するベクター（この複製は染色体複製から独立している。）、例えばプラスミドであることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞ゲノムに組込まれそしてそれが組込まれた染色体と共に複製されるものでもよい。
　ベクター内では、本発明のＧＬＰ−１レセプターをコードするＤＮＡ配列は、好適プロモーターに作用可能な状態で連結されなければならない。プロモーターは、選ばれた宿主細胞内で転写活性を示し、そして宿主細胞に同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来することができるいずれかのＤＮＡ配列であることができる。哺乳動物の細胞内で本発明のＧＬＰ−１レセプターをコードするＤＮＡの転写を指令するための適当なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（サブラマニー他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．
１
２２２
３１１
２５５
１
ＴＰＩ１
３０４
４
ｔｐｉ
　本発明のＧＬＰ−１レセプターをコードするＤＮＡ配列は、好適なターミネーター、例えばヒト成長ホルモン・ターミネーター（パルミター他、
ｏｐ
ｃｉｔ．
ＴＰＩ１
ｏｐ
ｃｉｔ．
ＡＤＨ３
ｏｐ
ｃｉｔ．
　本発明の組換え発現ベクターは、更に、着目の宿主細胞内でベクターを複製せしめるＤＮＡ配列を含むことができる。このような配列の例は（宿主生物が哺乳動物細胞である場合）、ＳＶ４０の複製起点である。ベクターは、選択マーカー、例えば、その生成物が宿主細胞内の欠陥を補完するところの遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子、又は薬物、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキセートに耐性を付与する遺伝子を含むこともできる。
　本発明のＧＬＰ−１レセプターをコードするＤＮＡ配列、プロモーターとターミネーターを、それぞれ、ライゲートするために用いる手順およびそれらを、複製のために必要な情報をもつ好適なベクター内に挿入する手順は、当業者に周知である（例えばサンブルック他、
ｏｐ．ｃｉｔ．
　本発明の発現ベクターが導入される宿主細胞は、本発明のＧＬＰ−１レセプターを生産し得るいずれの細胞であってもよく、そして好ましくは真核細胞、例えば無脊椎動物（昆虫）細胞又は脊椎動物細胞、例えば
キセノプス・レビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ
１５９
１
１４
７
５２
１
　あるいは、菌類細胞（酵母細胞を含む）が本発明の宿主細胞として使用されることができる。好適な酵母細胞の例には、
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
　本発明に係るＧＬＰ−１レセプターは、ＧＬＰ−１レセプターの発現を誘導する条件下で好適な栄養培地中で前記の如き細胞を培養し、次いで培養物からＧＬＰ−１レセプターを回収することを含む方法によって生産できる。細胞を培養するために用いられる培地は、哺乳動物細胞を増殖させるために好適な慣用の培地例えば、適切な補強物を含む血清含有又は無血清培地である。好適な培地は、商業上の供給者から入手でき、あるいは又公にされた成分表（例えば、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションのカタログ中）に従って調製できる。
　もしもＧＬＰ−１レセプターが、生来の変異体のトランスメンブランおよび（恐らく）細胞質領域内に保持される場合、それは宿主細胞の膜内に固定され、そしてＧＬＰ−１レセプターを担持する細胞は、スクリーニング又は診断アッセイにおいてそのまま使用されることができる。あるいは、レセプターは、例えば、先に定義したような可溶化および／又は再構成された形態での、膜調製物の成分であることができる。
　更に別の側面において、本発明は、ＧＬＰ−１活性のアゴニストまたはエンハンサーをスクリーニングする方法に関し、この方法は、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のＧＬＰ−１レセプターを、ＧＬＰ−１活性のアゴニストと思われる物質と共にインキュベートし、引続きＧＬＰ−１またはそのアナログと共にインキュベートし、次いでＧＬＰ−１レセプターへのＧＬＰ−１の結合に対する上記の予想されたアゴニストからの効果を検出することを含む。エンハンサーは、例えばアデノシン・レセプターについて、記載されるように（ブラン他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　
３８
　ＧＬＰ−１活性のアゴニストをスクリーニングするための他の方法は、ＧＬＰ−１又はそのアナログを、ＧＬＰ−１活性のアゴニストと考えられる物質と共にインキュベートとし、そして引続き本発明のＧＬＰ−１レセプターと共にインキュベートし、次いでＧＬＰ−１レセプターへの結合に対する効果を検出することを含む。ＧＬＰ−１活性のそのようなアゴニストは、グルコース−誘導インシュリン分泌を刺激する物質であろうし、そしてＮＩＤＤＭの治療において使用されることができる。
　ＧＬＰ−１レセプターは固体支持体上に固定され、そしてそのまま本発明のスクリーニング方法において試薬として使用されることができる。ＧＬＰ−１レセプターは膜結合形において、すなわち細胞全体に結合した形で用いられるか又は固体支持体上に固定された膜調製物の成分として使用されることができる。
　本発明のスクリーニング方法において使用される固体支持体は、好ましくはポリマーを含む。支持体は、それ自身ポリマーから構成されるか又はポリマーでコートされたマトリックスから構成される。マトリックスは、ガラス、紙又はプラスチックの如きいずれの好適な材料であってもよい。ポリマーはプラスチック（例えば、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、ポリビニルアセテートおよびそれらのいずれかの好適なコポリマー）、セルロース（例えば、種々のタイプの紙、例えばニトロセルロース紙その他）、シリコンポリマー（例えばシロキサン）、多糖類（例えばアガロース又はデキストラン）、イオン交換樹脂（例えば、慣用のアニオン又はカチオン交換樹脂）、ポリペプチド、例えばポリリジン、又はセラミック材料、例えばガラス（例えば制御多孔ガラス）から成る群から選ばれることができる。
　固定支持体の物理的形状は限定されないが、いくつかの形状が、本発明の目的にとって他の形状よりも便利であることができる。従って、固体支持体は、プレート、例えば薄層又はマイクロタイター・プレート、又はフイルム、ストリップ、膜（例えばナイロン膜又はセルロース・フイルター）又は固体粒子（例えばラテックス・ビーズ又はデキストラン又はアガロース・ビーズ）の形態にあることができる。好ましい態様において、固体支持体は小麦胚芽アグルチニン被覆ＳＰＡビーズ（米国特許第４，５６８，６４９参照）の形態にある。
　あるいは、ＧＬＰ−１アゴニストのスクリーニングは、Ｇ−プロテインに機能的に結合したクローン化ＧＬＰ−１レセプターを発現する細胞系を用いて行うこともできる。生きている細胞内で、アゴニストに晒すことは、細胞内ｃＡＭＰ濃度の増加を生じさせるであろう。次いで、ｃＡＭＰ濃度は直接測定されることができる。ｃＡＭＰレベルの変化は、計測可能な信号が細胞内ｃＡＭＰ内の増加に応答して発生する適切な細胞系を用いて間接的に監視されることができる。
　更に、例えば（上記のような）生来のＧＬＰ−１レセプターの欠失または置換誘導体を調製しそして十分な長さのＧＬＰ−１レセプターを結合させるため公知のリガンドとこれらをインキュベートしそしてＧＬＰ−１レセプター欠失誘導体へのそのリガンドの結合を検出することにより、本発明のＧＬＰ−１レセプター上のリガンド結合部位を位置決めすることが企図される。一旦、リガンド結合部位が位置決めされたら、これは、リガンド結合部位の三次元構造についての更なる情報を得るために用いられることができる。そのような三次元構造は、例えば、タンパク質工学、コンピューター・モデリング、ＮＭＲ技術および／又は結晶学技術によって確立されることができる。リガンド結合部位の三次元構造に基づき、ＧＬＰ−１分子に対するアゴニストである物質を設計することができる。
　ＧＬＰ−１レセプターの特徴は、生理学的および病理学的にかなり重要である。それは、腸−島の軸についての基礎的側面を研究することに役立つであろう（アンガーおよびアイセントラウト、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．
１２３
１５
５５
２４５
３７
５５
２４５
図面の簡単な説明
　本発明を、添付の図面を参照して以下の実施例で更に説明する：
　図１Ａおよびこの図１Ａに続く図１Ｂは、ラットのセクレチン・レセプター（ＳＥＣＲ）、オポジウム（ｏｐｏｓｓｉｕｍ）上皮小体ホルモン・レセプター（ＰＴＨＲ）および豚カルシニン・レセプター（ＣＴＲ１）の配列と比較してラットＧＬＰ−１レセプターのアミノ酸配列を共に示す。ＧＬＰ−１レセプターは細胞外ドメイン（矢印）中に３個のＮグリコシル化部位を有する。４個のシステインは、４個のレセプター（ボックス）内の同一の場所で保存される。分子のこの部分並びにＣＯＯＨ−末端細胞質尾内の非常に異なる配列に注目のこと。配列の同一性は星印により示されそして同族体は点によって示される。推定トランスメンブラン・ドメインの位置は、配列上の水平線によって示される。
　図２は、ｐＧＬＰＲ−１６プラスミドを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞への１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の結合を示す。特異的結合は、１〜１０ｎＭ　ＧＬＰ−１で飽和に達する。挿入：ＧＬＰ−１結合のスカッチャード分析。
　図３はＩＮＳ−１細胞への１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の結合を示す。特異的結合は１〜１０ｎＭ　ＧＬＰ−１で飽和に達する。挿入：ＧＬＰ−１結合のスカッチャード分析。
　図２および図３における曲線の合致は、ＬＩＧＡＮＤプログラムを用いて行った（マクファーソン、カイネチック、ＥＢＤＡ、リガンド、ローリー。Ａ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｇｒａｍｓ（エルスビール、アムステムダム、１９８５））。
　図４はラットＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞への１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の結合の変位を示す。トランスフェクトされた細胞を、増加する濃度の非放射性ペプチドの存在下２０ｐＭの１２５Ｉ−ＧＬＰ−１と共にインキュベートした。各点を２回計測しそして実験をＧＬＰ−１，ＧＩＰおよびグルカゴンについて３回、そしてＶＩＰおよびセクレチンについて１回くり返した。
　図５はラットＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞内でのサイクリックＡＭＰ形成の刺激を示す。ＣＯＳ細胞を、ｐｃＤＮＡ−１ベクター単独で（空白線）又はｐＧＬＰＲ−１プラスミド（斜線）でトランスフェクトし、そして図示した濃度でＧＬＰ−１の不存在下又は存在下でインキュベートした。ｃＡＭＰ生産をラジオイムノアッセイ（アマースハム）により３連で測定した。
　図６は、異なる組織からのおよびＩＮＳ−１細胞系からのＲＮＡのノーザーン・ブロティングにより評価されたＧＬＰ−１レセプター発現の組織特異性を示す。１０μｇの全ＲＮＡを各レーンについて分析した。・７ｋｂおよび・６ｋｂの２個の主なＲＮＡ種を、レセプターが検出された組織のすべての内で検出した。リボソームＲＮＡｓの移動の位置は図面の左側に示される。
　図７はラットのＧＬＰ−１レセプター・アミノ酸配列（ラット）とヒトＧＬＰ−１レセプター（ヒト）の部分アミノ酸配列との比較である。
　本発明を以下の実施例で更に説明するが、これはいかなる方法によるかを問わず請求に係る本発明の範囲を制限することを意図されない。
実施例１
　
ラット島ＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡの分子クローニングおよび特性記述
　ラットの膵島ｃＤＮＡライブラリーを、ｐｃＤＮＡ−１発現ベクター内で構築した（ラットの膵島はゴトー他（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　
４３
８４
７８
８
９２
２１２
１３０
　ＣＯＳ細胞内で発現されるレセプターへのＧＬＰ−１の結合は、・５〜１ｎＭで達成された５０％置換をもって、非放射性ＧＬＰ−１により置換された（図４）。関連した構造を有する他のペプチドホルモン、例えばセクレチン、胃の抑制性ペプチド（ＧＩＰ）および血管作動性の腸管ペプチド（ＶＩＰ）（Ｄｕｐｒｅ　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｐａｎｃｒｅａｓ，Ｅ．サモイス編（ラベン出版社、ニューヨーク（１９９１），２５３−２８１）およびエベルトおよびクルーツフェルト、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｂ．
３
　ラットのＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡのＤＮＡ配列分析は、４６３個のアミノ酸ポリペプチド（配列番号１）をコードする主なオープン・リーディング・フレームを現した。ヒドロファフィ（Ｈｙｄｒｏｐｈａｐｈｙ）プロット分析は、たぶんリーダー配列を表わすアミノ末端疎水領域の存在を示した。この疎水セグメントに、３個のＮ−結合グリコシル化部位を有する約１２０個のアミノ酸の親水ドメインが続く。７個の疎水セグメントが存在し、これはトランスメンブラン・ドメインを形成することができる。配列同一性についてのサーチは、ＧＬＰ−１−レセプターがセクレチン・レセプター（石原他、ＥＭＢＯ　Ｊ．
１０
２５４
２５４
１０
２５４
２５４
６７
　ＧＬＰ−１レセプターの組織分布の測決は、ノザーン・ブロット分析により行なわれた。ノザーン・ブロット分析は１０μｇの全ＲＮＡ（チヨムゼニスキーおよびサシニー、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１２６
７４
７７
１３２
３４
２６０
１
　クローン化ラットＧＬＰ−１レセプターを発現する安定な細胞系は、ＣＨＬ細胞系（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ３９）のＣａ−ホスフェート仲介トランスフェクションにより確立された（マニアテイス他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）。プラスミド、ｐＧＬＰＲ−１（これはｐＣＤＮＡ−１ベクター内でクローン化された・６ｋｂのラットのＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡ挿入断片を含む。）は、ｐＷＬ−ｎｅｏプラスミド（ストラタジェン、Ｌａ　Ｊｏｅｌａ，ＣＡ）を用いてＣＨＬ細胞に同時トランスフェクトされた。ｐＷＬ−ｎｅｏプラスミドは、ネオマイシン耐性遺伝子を含む。細胞当り、推定７０，０００ラットＧＬＰ−１レセプターを発現する安定な形質転換体を、この方法により選択しそして更に８０μＭのＧ４１８の存在下で増殖させた。この形質転換体からの膜を引続き実施例３に記載するような高容量−スループット−スクリーニング（ＨＶＴＳ）において使用した。ＧＬＰ−１Ｒ／ＣＨＬ細胞系により発現されたレセプターの特徴化は、ラジオリガンドとして１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを用い、全細胞について・８ｎＭ、細胞膜について・３ｎＭの推定Ｋｄに至った。
実施例２
　
ヒト島ＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡの分子クローニング
　ヒト島を記載される如く（リコディ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　
３７
２
　ヒト島ｃＤＮＡライブラリーを、ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ラ　ヨラ、ＣＡ）からのλＺＡＰＩＩベクター内で構築した。簡単に言えば、二本鎖ｃＤＮＡを先に記載の如く合成し（アルフォ　アンド　シード、
８４
８９
Ｅｃｏ
Ｎｏｔ
　得られたｃＤＮＡ分子を、酢酸カリウム勾配上のサイズ分画（アルフォおよびシード、
８４
　ｃＤＮＡライブラリーを、先に記載された方法（マニアテス他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）によりラットＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡからの３２Ｐ標識ＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。用いた減少されたストリンジェント条件は次の通りであった：３０％のホルムアミド、５倍ＳＳＣ，５倍デンハルト、５０ｍＭホスフェート緩衝液ｐＨ・８，５ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．２％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中４２℃での事前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション（マニアティス他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）。
　陽性のλファージを再プレーティングしそしてハイブリダイゼーションにより精製し、λＺＡＰＩＩアーム中に存在するブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター内に含まれるｃＤＮＡ挿入断片をストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ラ　ヨラ、ＣＡ）から得られるヘルパー・ファージを用いて切り取った。挿入断片を部分的に配列決定した。３（２０）と称される一つのクローンは、ラットＧＬＰ−１レセプターに高い相同性を示しそしてその全長が配列決定された（タボールおよびリチャードソン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　
８４
　相同性分析（図７）より、このｃＤＮＡはヒトＧＬＰ−１レセプターの３′部をコードしていると結論された。このヒト・レセプターの演澤アミノ酸配列は、アミノ酸番号１７０からアミノ酸番号４６３（番号はラットの配列をいう）までの領域においてラットＧＬＰ−１レセプターに９２％の同一性を有する。
　単離されたヒトＧＬＰ−１ｃＤＮＡは、５′端でこのオープン・リーディング・フレームを有していない。しかしながら、全長クローンは、当業者に周知の方法により容易に得ることができる。選定されることができる別法の中で、次の例が挙げられるべきである：１）ヒト島ｃＤＮＡライブラリーはすでにクローン化された配列の５′端からプローブを用いて再スクリーニングされることができ、２）アンカー−ＰＣＲ又はＲＡＣＥ（
Ｒ
Ａ
ｃ
Ｅ
２０
　オープン・リーディング・フレームの５′端のクローン化後、ｃＤＮＡのこの部分はＰＣＲの使用により又は５′部分および３′部分の両方内で同定された適当な制限酵素認識配列における融合を通じて、ヒトＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡの残りの３′部分に融合されることができる。
　全長オープン・リーディング・フレームをコードするｃＤＮＡは、好適な哺乳動物の発現ベクター内でクローン化されそして発現のために哺乳動物細胞系にトランスフェクトされることができる。このような好適な細胞系の例は、ＣＨＯおよびＣＨＬ細胞であるがしかし、他の哺乳動物細胞もこのタイプのレセプターを発現するであろう。
　最近、昆虫細胞（バスデバン他、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．
３１１
２５０
　最近、かえるの皮膚のメラニン保有細胞がＧ−プロテイン結合レセプターを発現するために使用され（ロテンザ他、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０６，（１９９２），３１５−３２２）そしてアデニレート・シクラーゼへの機能結合が示された。
　
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｅ
コリー（ｃｏｌｉ
　従って、次の内容は当業者に明らかである：すなわち、多くの異なる発現系が機能的レセプター分子の発現に至るよう設計されることができる。
　実施例３に示されるように、ラット並びにヒトＧＬＰ−１レセプターは、新しい可能性のあるアゴニスト先導構造の検出のためのスクリーニング・アッセイにおいて使用されることができる。
実施例３
　
ＧＬＰ−１レセプター・アゴニストについての高処理能力スクリーニング・アッセイ
　潜在的なＧＬＰ−１アゴニスト活性を有する二次代謝産物についての微生物抽出物のスクリーニングは、ＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　Ａｓｓａｙ）技術（米国特許第４５６８６４９号，ハート　アンド　グリーンバルト（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１６
８２
１４５
　高処理能力アッセイが、９６個のウェル・マイクロタイター・プレートを用いて確立された。アッセイは、用いられるＷＧＡ粒子、膜およびトレーサーの量に関して最適化される（１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７−３６）アミド・トレーサーをラクト・ペルオキシダーゼ法（モリソン他、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．
７０
　これまで、１，２５０個の微生物抽出物がＳＰＡ　ＧＬＰ−１レセプター・アッセイを用いてスクリーニングされた。抽出物を１：４００の最終希釈で試験した。これらの条件下、１，２５０個の抽出物からの１５個が、選択されたカットオフ・レベル未満まで比計数の減少をもたらした。これらの１５個のヒットを、２次アッセイにおいてさらに特徴付けた。この２次アッセイは、ＧＬＰ−１レセプター担持細胞系におけるｃＡＭＰ合成が抽出物中の成分によって誘導されることができるかどうかを試験するよう計画された。９６個ウェル・マイクロタイター・プレート内で増殖されたβ−ＴＣ３細胞（ハナハン他、Ｎａｔｕｒｅ　
３１５
８５
　従って、以下のことが実行可能である：すなわち、本特許明細書中に記載されたスクリーニング法は、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を有する天然成分の単離をもたらすことができる。薬化学アプローチに対する先導構造としてのそのような化合物の使用は、新規ＧＬＰ−１アゴニストの設計においてかなりの重要なものとなるであろう。
（５７）【特許請求の範囲】
　１．配列番号１に示されるアミノ酸配列
から成る組換え
るア
１０ｎＭ未満の親和定数（ＫＤ）をもって
　
２
１記
　
３
１記
　
４
３
　
５
３又は４
　
６
５
　
７
３又は４
　
８
６
７
　
９
又は２
当該
アナログであって
る、上
　
１０
当該
アナログであって
を、Ｇ
又は２
　
１１
又は２
　
１２
に
又は４
　
１３
１２