【手続補正書】
【提出日】平成26年12月11日(2014.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて成長させた多能性幹細胞の自己再生を可能にする組成物であって、成長培地およびコーティングを含み、該コーティングが組換えラミニン５２１（ラミニン−１１）を含む、組成物。
【請求項２】
成長因子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞の多能性を維持するための方法であって、
成長培地およびその上のコーティングを含む基質を提供するステップであって、該コーティングが、組換えラミニン５２１（ラミニン−１１）のマトリックスを含む、ステップと、
多能性幹細胞を単細胞懸濁物へと解離させるステップと、
該コーティング上に、該単細胞懸濁物状態の該多能性幹細胞を配置するステップと
を含む、方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞が、単層として前記コーティング上に配置される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が、２つの幹細胞が互いに接触しないように前記コーティング上に配置される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞の多能性を維持する方法であって、
その上にコーティングを有する基質を得るステップであって、該コーティングが完全なラミニン−５２１を含有する、ステップと、
該基質上に多能性幹細胞および細胞培養培地を配置するステップと、
ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路を活性化するステップと、
を含む、方法。
【請求項７】
前記細胞培養培地がいかなる成長因子も含有しない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞培養培地がベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有しない、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記コーティングがカドヘリンも含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
単離された組換えラミニン−５２１でコーティングされている外表面を有する医療デバイスまたは移植片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
基質は、ラミニン−５２１またはラミニン−５１１を含有し得る。基質は、また、カドヘリンを含有してもよい。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含むアルファ鎖と、
配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含むベータ鎖と、
配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含むガンマ鎖と
を含み、該アルファ鎖、該ベータ鎖、および該ガンマ鎖が集合して組換えラミニン−５２１を構築する、単離された組換えラミニン−５２１。
（項目２）
前記アルファ鎖ポリペプチドが、前記配列番号１のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１に記載の単離された組換えラミニン−５２１。
（項目３）
前記ベータ鎖ポリペプチドが、前記配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目２に記載の単離された組換えラミニン−５２１。
（項目４）
前記ガンマ鎖ポリペプチドが、前記配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目３に記載の単離された組換えラミニン−５２１。
（項目５）
ａ）単離された組換えラミニン−５２１およびｂ）薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物。
（項目６）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて成長させた多能性幹細胞の自己再生を可能にする組成物であって、成長培地およびその上の（ｔｈｅｒｅｏｖｅｒ）コーティングを含み、該コーティングが組換えラミニン５２１（ラミニン−１１）を含む、組成物。
（項目７）
成長因子をさらに含む、項目６に記載の組成物。
（項目８）
分化阻害剤、フィーダー細胞、または分化誘導物質のいずれをも欠く、項目６に記載の組成物。
（項目９）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞の多能性を維持するための方法であって、
成長培地およびその上のコーティングを含む基質を提供するステップであって、該コーティングが、組換えラミニン５２１（ラミニン−１１）または組換えラミニン５１１のいずれかのマトリックスを含む、ステップと、
多能性幹細胞を単細胞懸濁物へと解離させるステップと、
該コーティング上に、該単細胞懸濁物状態の該多能性幹細胞を配置するステップと
を含む、方法。
（項目１０）
組成物が分化阻害剤、フィーダー細胞、または分化誘導物質のいずれをも欠く、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記多能性幹細胞が、単層として前記コーティング上に配置される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記多能性幹細胞が、２００細胞／ｍｍ２以下の密度で前記コーティング上に配置される、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記多能性幹細胞が、２００細胞／ｍｍ２以上の密度で前記コーティング上に配置される、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記多能性幹細胞が、２つの幹細胞が互いに接触しないように前記コーティング上に配置される、項目９に記載の方法。
（項目１５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞の多能性を維持する方法であって、
その上にコーティングを有する基質を得るステップであって、該コーティングが完全なラミニンを含有する、ステップと、
該基質上に多能性幹細胞および細胞培養培地を配置するステップと、
ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路を活性化するステップと、
を含む、方法。
（項目１６）
前記完全なラミニンがラミニン−５２１またはラミニン−５１１である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞培養培地がいかなる成長因子も含有しない、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞培養培地がベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有しない、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記コーティングがカドヘリンも含有する、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記多能性幹細胞が、２００細胞／ｍｍ２以下の密度で前記コーティング上に配置される、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
組換えラミニン−５２１を単離する方法であって、
組換えラミニン−５２１を発現する宿主細胞を提供するステップであって、該組換えラミニン−５２１は：
配列番号１のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む第１の鎖、
配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む第２の鎖、および
配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む第３の鎖を含み、
該第１の鎖、該第２の鎖、および該第３の鎖が集合して組換えラミニン−５２１を構築する、ステップと、
該組換えラミニン−５２１鎖の発現を刺激するための条件下、細胞培養培地中で宿主細胞を成長させるステップと、
該宿主細胞培養培地をカラムに通過させるステップであって、該カラムが、該組換えラミニン−５２１に結合する化合物を含有する、ステップと、
非結合物質を除去するために該カラムを洗浄するステップと、
該カラムから、結合した前記組換えラミニン−５２１を溶離するステップと
を含む、方法。
（項目２２）
前記カラムが、抗体アフィニティーカラム、ゲル濾過クロマトグラフィーカラム、またはイオン交換カラムである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
プロモーター配列に動作可能に連結された配列番号４の核酸を含む、組換え発現ベクター。
（項目２４）
ポリリンカー配列、ポリアデニル化シグナル配列、終止配列、選択マーカー、またはエピトープタグをさらに含む、項目２３に記載のベクター。
（項目２５）
単離された組換えラミニン−５２１でコーティングされている外表面を有する医療デバイスまたは移植片。
（項目２６）
単離された組換えラミニン−５２１と容器とを含む、キット。
（項目２７）
多能性幹細胞の初期培養物を受けるためのインプットエリアと、
該初期培養物から該幹細胞を取り出すための手段と、
該幹細胞を単細胞懸濁物中に配置するための手段と、
ラミニン−５２１を含有するマトリックス上に該単細胞懸濁物の状態の該幹細胞を再播種するための手段と
を含む、自動化されたロボットシステム。