【手続補正書】
【提出日】平成27年6月15日(2015.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）前記集団の第１部分を酸化又は還元すること、
（ｉｉｉ）酸化又は還元された前記集団の第１部分及び該集団の第２部分をバイサルファイトにより処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後、前記集団の第１部分及び第２部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含み、
修飾シトシンが、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）又は５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）である、
試料ヌクレオチド配列中の修飾シトシン残基を同定する方法。
【請求項２】
前記集団の第１部分を酸化すること、酸化された前記部分をバイサルファイトにより処理すること、及び前記集団の第２部分をバイサルファイトにより処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１部分が化学酸化剤を用いて酸化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１部分が過ルテニウム酸塩酸化剤を用いて酸化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列中の或る位置におけるウラシル、及び第２ヌクレオチド配列中の同一の位置におけるシトシンの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ヒドロキシルメチルシトシン（５ｈｍＣ）であることを示す、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の両方の配列中の或る位置におけるシトシンの同定、又は試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシンの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ｖｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団の第３部分を還元すること、
ｖｉｉ）集団の還元された第３部分をバイサルファイトにより処理すること、
ｖｉｉｉ）工程ｖｉ）及び工程ｖｉｉ）の後に、第３部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第３ヌクレオチド配列を産生すること、並びに
ｉｘ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第３ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含む、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の或る位置におけるウラシル、並びに第３ヌクレオチド配列中のこの位置におけるシトシンの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ホルミルシトシンであることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記集団の第１部分が工程ｉｉ）において還元される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシン、及び第２ヌクレオチド配列中の同一の位置におけるウラシルの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ホルミルシトシンであることを示し、かつ
試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の両方の配列中の或る位置におけるウラシルの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が非修飾シトシンであることを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団の第４部分を準備すること、及び
第４部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、試料ヌクレオチド配列を産生すること、
を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）前記集団を酸化すること、
（ｉｉｉ）酸化された集団をバイサルファイトにより処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後に集団中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、処理されたヌクレオチド配列を産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する、処理されたヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含み、
処理されたヌクレオチド配列中のシトシンの存在が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す、
試料ヌクレオチド配列中の５−メチルシトシンを同定する方法。
【請求項１３】
集団の第１部分、第２部分、第３部分及び第４部分の１又は複数が、配列決定の前に増幅される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の修飾シトシン残基を同定する方法において使用されるキットであって、
（ｉ）酸化剤及び／又は還元剤、並びに
（ｉｉ）バイサルファイト試薬、
を含む、キット。
【請求項１５】
酸化剤が過ルテニウム酸塩酸化剤である、請求項１４に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
５ｈｍＣ及び５ｆＣを含む修飾シトシン残基は、胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）及び神経細胞を含む細胞種の範囲で検出されている（２、３、１１、３７、３８）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
【図１Ａ】５ｈｍＣの一塩基分解能配列決定のための方法を示す。異なる時間点においてＮａＯＨによってクエンチされ、その後高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析される、２’−デオキシ−５−ホルミルシチジン（ｄ５ｆＣ）とＮａＨＳＯ３（バイサルファイト）との反応を示す。エラーバーは、３回分析を行った標準偏差である。
【図１Ｂ】５ｈｍＣの一塩基分解能配列決定のための方法を示す。酸化的バイサルファイト反応スキームを示す。すなわち、５ｈｍＣから５ｆＣへの酸化に続くバイサルファイト処理及びＮａＯＨにより５ｆＣをＵに変換する。Ｒ基はＤＮＡである。
【図１Ｃ】５ｈｍＣの一塩基分解能配列決定のための方法を示す。ＢＳ−Ｓｅｑ法及びｏｘＢＳ−Ｓｅｑ法の概要を説明する略図及び表を示す。ＢＳ−Ｓｅｑは、インプットＤＮＡのバイサルファイト処理とその後の増幅、続く配列決定からなる。ｏｘＢＳ−Ｓｅｑは、インプットＤＮＡの酸化、続くバイサルファイト処理及び増幅、その後の配列決定からなる。インプットを比較することにより、ＢＳ−Ｓｅｑアウトプット及びｏｘＢＳ−ＳｅｑアウトプットのＣ、５ｍＣ及び５ｈｍＣを区別し、マッピングし、また定量することができる。
【図２Ａ】全体的な脱カルボニル化に加え、ウラシルへの脱アミノ化を示す２’デオキシ−５−ホルミルシトシンのバイサルファイトプロファイルを示す。
【図２Ｂ】シトシンへの脱炭酸、その後のウラシルへの脱アミノ化を示す、２’デオキシ−５−カルボキシシトシンのバイサルファイトプロファイルを示す。
【図３】図３は、質量分析による酸化の定量（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｄ）及びイルミナシーケンシング（図３Ｃ）による酸化的バイサルファイト処理を示す。図３Ａは、ＫＲｕＯ４酸化の前後の１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド中の５ｈｍＣ及び５ｆＣ（Ｔに正規化されたピーク面積）のレベルを示す。図３Ｂは、２回の連続的なＫＲｕＯ４酸化の前後の１３５ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ断片中の５ｈｍＣ及び５ｆＣのレベル（プライマー配列中の５ｍＣに正規化された濃度）を示す。図３Ｃは、酸化的バイサルファイト処理（１ヌクレオチド当たり少なくとも９５００００のリードが得られた）後の、単一の５ｈｍＣｐＧ（１２２ｍｅｒ）又は複数の５ｈｍＣｐＧ（１３５ｍｅｒ）のいずれかを含む２つのｄｓＤＮＡ断片のイルミナシーケンシングによって決定されたＣからＴへの変換レベルを示す。また、変換率の比較のためにこれらの鎖には、５ｍＣが存在していた。図３Ｄは、ＫＲｕＯ４酸化の前後に測定されたＥＳ細胞ＤＮＡ（Ｊ１）における５ｈｍＣ及び５ｆＣのレベル（プライマー配列中の５ｍＣに正規化された濃度）を示す。エラーバーは全て、標準偏差である。
【図４】図４は、Ｃを含む合成１５ｍｅｒ一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（３回の反応試験）（図４Ａ）、５ｍＣを含む合成１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡ（３回の反応試験）（図４Ｂ）、及びゲノムＥＳ細胞Ｊ１  ＤＮＡ（超音波処理された２回の反応試験、及び超音波処理されていない２回の反応試験）（図４Ｃ）に対するＫＲｕＯ４による酸化後の、ヌクレオシド比率の変化を測定することにより決定された、酸化後のシトシン分解の程度を示す。パーセント変化は、酸化後のヌクレオシドピーク面積を、酸化前のヌクレオシドピーク面積で割ることでＨＰＬＣ分析により測定される。エラーバーは標準偏差である。
【図５Ａ】酸化前の５ｈｍＣを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図５Ｂ】酸化後の５ｈｍＣを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図６Ａ】バイサルファイト処理前の５ｆＣを含む１５ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図６Ｂ】バイサルファイト処理後の５ｆＣを含む１５ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図７Ａ】還元前の５ｆＣを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図７Ｂ】還元後の５ｆＣを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図８】ｏｘＢＳ処理後のＣ、５ｍＣ又は５ｈｍＣのいずれかを含むＣｌａＩ部位（ＡＴＣＧＡＴ）を有する１２２ｍｅｒ  ＤＮＡ鎖のサンガーシーケンシングを示す。クロマトグラムは、テンプレート鎖に対する逆配列を示す。Ｃ  ＤＮＡにおいて、逆鎖中のＣは完全にＵに変換され、クロマトグラムにおいてＧの代わりにＡとして示される。５ｍＣ  ＤＮＡは変換されず、クロマトグラムにおいてＧを示す。５ｈｍＣ  ＤＮＡは大部分が変換され、この分析の実行（run）において変換されていないＧのわずかなトレースを伴って、クロマトグラムにおいてＡを示す。
【図９Ａ】ｏｘＲＲＢＳによるＣＧＩにおける５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を示す。ＲＲＢＳデータセット及びｏｘＲＲＢＳデータセット間のＣＧＩ当たりの変換されていないシトシン画分の比較を示す。すなわち、ｏｘＲＲＢＳデータセット（赤）における統計学的に有意に低い画分を含むＣＧＩはヒドロキシメチル化ＣＧＩであり、逆パターン（黒）のＣＧＩの数を用いて偽陽性率３．７％と推定した。
【図９Ｂ】ｏｘＲＲＢＳによるＣＧＩにおける５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を示す。有意なレベルの各修飾を有するＣＧＩ内の５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの分布を示す。
【図９Ｃ】ｏｘＲＲＢＳによるＣＧＩにおける５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を示す。（ｈ）ＭｅＤＩＰ−Ｓｅｑプロファイルと重複するゲノムＲＲＢＳプロファイル及びゲノムｏｘＲＲＢＳプロファイルの例を示す（６）。ＣＧＩは緑色のバーによって示され、データを明瞭にするため、外部ＣＧＩをマスクした（灰色領域）。ｏｘＲＲＢＳトラック中の各バーは（いずれかのＤＮＡ鎖における）単一のＣｐＧを表す。パネル下段の拡大領域は、この方法の一ヌクレオチド分解能を強調している。
【図９Ｄ】ｏｘＲＲＢＳによるＣＧＩにおける５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を示す。選択されたＣＧＩでの５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルが、ｇｌｕｃＭＳ−ｑＰＣＲを用いて検証されたことを示す。個々のＭｓｐＩ部位でのｏｘＲＲＢＳからの値を、９５％信頼区間を表すエラーバーと共に表示する。ＧｌｕｃＭＳ−ｑＰＣＲを２回実施し、棒グラフは平均値を表し、黒点は個々の反復測定値を表す。２つの手法が良好な相関を示している。
【図１０Ａ】ヌクレオシドへと消化されたＲＮＡ鎖（配列番号７）のＫＲｕＯ４による酸化の前のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＤＮＡ酸化と同一の条件を使用した。ヌクレオシドの保持時間は以下の通りであった：Ｃ−１．２分、Ｕ−１．７分、Ｇ−３．５分、Ａ−６．５分。
【図１０Ｂ】ヌクレオシドへと消化されたＲＮＡ鎖（配列番号７）のＫＲｕＯ４による酸化の後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＤＮＡ酸化と同一の条件を使用した。ヌクレオシドの保持時間は以下の通りであった：Ｃ−１．２分、Ｕ−１．７分、Ｇ−３．５分、Ａ−６．５分。
【図１１】図１１は、ＮａＢＨ４及びバイサルファイト処理（ｒｅｄＢＳ−Ｓｅｑ）による還元後の５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）（部分配列は、ＡＣＧＧＡ５ｆＣＧＴＡで示される）を含む合成１００ｍｅｒ  ＤＮＡ鎖に対するサンガーシーケンシングのトレースを示す。クロマトグラムは、部分配列（ＴＡＣＧＴＣＣＡＴ−ここで、下線位置は５ｆＣ又はＣ由来である）に対する逆相補配列を示す。５ｆＣ及びＣの位置（括弧書き）は、図１１中のテンプレート鎖上に示される。５ｆＣ及びＣは両方ともバイサルファイト条件下で脱アミノ化する。しかしながら、５ｆＣは還元工程によって５ｈｍＣに変換されて脱アミノ化されないのに対し、Ｃの脱アミノ化は影響を受けない。これは、一塩基分解能での５ｆＣ及びＣの区別を可能とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
図１１は、逆相補配列（ＴＡＣＧＴＣＣＡＴ）の一部を表す配列決定トレースを示す。図１１中、５ｆＣ及びＣの位置は太字で、テンプレート鎖上に括弧書きで示される。既に示したように、５ｆＣ及びＣは両方ともバイサルファイト条件下で脱アミノ化されてＵを形成し、これは図１１の逆相補配列中、Ａとして示される。しかしながら、ＮａＢＨ４による還元は、５ｆＣを５ｈｍＣに変換し、Ｕへと脱アミノ化せず、図１１の逆相補配列中Ｇとして示される。したがって、還元バイサルファイトシーケンシング（ｒｅｄＢＳ−Ｓｅｑ）は、一塩基分解能での５ｆＣ及びＣの区別を可能とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
また、５−ホルミルシトシンも、一ヌクレオチド分解能まで配列決定され得る。５ｆＣは、（ＨＰＬＣにより示されるように）ＮａＢＨ４を用いてゲノムＤＮＡ中で５ｈｍＣまで定量的に還元されてもよい。未処理、バイサルファイト処理、酸化及びバイサルファイト処理、並びに還元及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡの配列を比較することにより、３つ全ての既知のシトシン哺乳類修飾である５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン及び５−ホルミルシトシンの存在を、非修飾シトシンと共に決定することができる。例えば、ｉ）バイサルファイト処理、ｉｉ）酸化及びバイサルファイト処理、並びにｉｉｉ）還元及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中の同一位置におけるウラシル残基（ＵＵＵ）は、非修飾シトシンの存在を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
１００ヌクレオチドの５ｆＣ含有配列（配列番号８）
［５ｆＣ位置を下線で示す］
ＧＡＣＧＧＡＣＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＡＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＴＡＧＴＧＴＧＧＧＡＴＧＴＧ