【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年10月21日(2015.10.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
【図１】図１は、（リアルタイムＰＣＲによって決定された）ＤＬＧ１に特異的な天然のアンチセンス転写物を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した後のＨＥＫ２３Ｔ細胞におけるＤＬＧ１ｍＲＮＡレベルの増加を示すものである。ＣＵＲ−１６９５〜ＣＵＲ１７０４は、ＤＬＧ１の天然のアンチセンスを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである（＊−Ｐ＜０．０５；＊＊−Ｐ＜０．０１；＊＊＊−Ｐ＜０．００１）。ＣＵＲ−１６９５〜ＣＵＲ１７０４と表示されたバーは、それぞれ配列番号３〜配列番号１２で処置されたサンプルに対応する。
【図２】図２は、ｃｌｏｓｕｒｅアッセイによって決定された、ＤＬＧ１に特異的な天然のアンチセンス転写物を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、単層の完全性の修復の促進を示すものである。ＣＵＲ−１６９６〜ＣＵＲ−１７０４は、ＤＬＧ１の天然のアンチセンスを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである（＊−Ｐ＜０．０５；＊＊−Ｐ＜０．０１；＊＊＊−Ｐ＜０．００１）。ＣＵＲ−１６９６、ＣＵＲ−１６９９、ＣＵＲ−１７００、ＣＵＲ−１７０３およびＣＵＲ−１７０４と表示されたバーは、それぞれ配列番号４、７、８、１１および１２で処置されたサンプルに対応する。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
［配列表の説明］
配列番号１：ヒトＤＩＳＣＳ  ＬＡＲＧＥ  ＨＯＭＯＬＯＧ１（ショウジョウバエ）（ＤＬＧ１）、転写変異体２、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００４０８７）；配列番号２：天然のＤＬＧ１アンチセンス配列（Ｈｓ.６３６１０３）；配列番号３〜配列番号１２：アンチセンスオリゴヌクレオチド。＊はホスホチオアート結合を示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３４】
ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃  ＣＲＬ−１５７３）由来のＨＥＫ−293Ｔ細胞を、増殖培地（ＭＥＭ／ＥＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ＃ＳＨ３００２４またはＭｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃ＭＴ−１０−０１０−ＣＶ）＋１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃ＭＴ３５−０１１−ＣＶ）＋ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃ＭＴ３０−００２−ＣＩ））中で、３７℃および５％ＣＯ２にて一晩増殖させた。実験の１日前に、該細胞を６ウェルプレートに１．５×１０５／ｍｌの密度で再播種し、３７℃および５％ＣＯ２にてインキュベートした。実験当日に６ウェルプレート中の培地を新鮮な増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、濃度２０μＭに希釈した。この溶液２μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）４００μｌおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１１６６８０１９）４μｌと室温で２０分間インキュベートし、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を含む６ウェルプレートの各ウェルに適用した。該オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水２μｌを含む同様の混合物を偽トランスフェクト対照に使用した。３７℃および５％ＣＯ２にて３〜１８時間インキュベーションした後、培地を新鮮な増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加から４８時間後に、培地を除去し、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｃａｔ＃Ｚ３１０５）またはＱｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（ｃａｔ＃７４１８１）を製造者の説明書に従って使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。６００ｎｇＲＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡキット（ｃａｔ＃ＡＢ１４５３Ｂ）またはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｃａｔ＃４３６８８１３）を製造者のプロトコルに記載のとおり使用して実施される逆転写反応系に加えた。この逆転写反応系からのｃＤＮＡを使用して、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）およびＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：Ｈｓ００９３８２０４＿ｍ１（ＤＬＧ１）によって設計されたプライマー／プローブを使用するリアルタイムＰＣＲによって遺伝子発現をモニタリングした。使用したＰＣＲサイクルは次の通り：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、（９５℃で１５秒間、６０℃で１分間）を４０サイクル、Ｍｘ４０００サーマルサイクラー（Stratagene）またはＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した後の遺伝子発現の倍率変化を、処置サンプルと偽トランスフェクトサンプルの間の１８Ｓ標準化ｄＣｔ値の差に基づいて計算した。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３５】
［結果］：リアルタイムＰＣＲの結果は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＤＬＧ１ｍＲＮＡのレベルが、ＤＬＧ１アンチセンスｍＲＮＡ  ＨＳ．６３６１０３に対して設計されたオリゴ類での処置から４８時間後に顕著に増殖することを示している（図１）。
実施例３；ＤＬＧＩに特異的な天然のアンチセンス転写物を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置後のＨＥＫ293Ｔ細胞の単分子膜完全性の促進修復
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３７】
［方法および処置］
ＤＬＧ１に特異的な天然のアンチセンス転写物を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣｌｏｓｕｒｅアッセイ
ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃  ＣＲＬ−  １５７３）由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を増殖培地［ＩＭＥ／ＥＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｃ  ｃａｔ  ＃ＳＨ３００２４）＋１０％ＦＢＳ（Ｍｃｄｉａｔｃｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３５−０１１−ＣＶ）＋ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３０−００２−Ｃ１）］中で３７°Ｃおよび５％ＣＯ２にて増殖させた。実験の前日に、細胞を５ｘ１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートへ再播種して、３７℃および５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。実験当日に、６ウェルプレート中の培地を新鮮な増殖培地（１．５ｍｌ／ウェル）に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、IDT Inc. (Coralville, IA)によって製造された。全てのオリゴヌクレオチドの配列は表１に記載されている。オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅフリーの無菌水で、濃度２０μＭに希釈した。１つのウェルに投与するために、この溶液２μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）４００μｌおよびリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１１６６８０１９）４μｌと室温で２０分間インキュベートし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む６ウェルプレートの１ウェルに液滴で添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水２μｌを含む同様の混合物を偽トランスフェクト対照に使用した。37℃及び５％ＣＯ２にて１８時間インキュベートした後、培地を、新鮮な増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加から４８時間後に、無菌の２００μｌチップもしくは綿棒を使用して細胞単層を引っ掻いた。引っ掻き部分の閉鎖（closure of the scratch）を、その後の３〜５日間追跡し、少なくとも３回の異なる場合にて３人の独立した観察者によって機械的にスコア化された。各観察者のスコアを、処置していない対象の％にて表し、その後、各オリゴヌクレオチドで処置された反復実験の結果を平均値化し、ＡＮＯＶＡおよびpost hocテストを使用して対照のウェルと比較した。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３８】
［結果］：ｃｌｏｓｕｒｅアッセイの結果は、実施例２でＤＬＧ１のｍＲＮＡをアップレギュレートすることが示された、ＤＬＧ１に特異的な天然のアンチセンス転写物を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置することにより、上皮の傷および状態の治療に有益であり得る単層の完全性の修復が促進されることを示す。