【手続補正書】
【提出日】平成27年8月28日(2015.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
目的のオリゴヌクレオチドと結合する好適な交換体物質は、有機アミンと対アニオン、好適には第二級、第三級または第四級アンモニウム塩との塩である。このようなアンモニウム塩の例は一般式：
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−
式中、前記配列の第二、第三および第四、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれ２つ、３つまたは４つは独立にＣ１−２０アルキルもしくは置換アルキル（例えば、フルオロまたはトリフルオロメチル置換アルキル）、またはベンジルであり、残りは水素であり、Ｘ−はハリドアニオン、好適には塩素イオンである。好適な交換体物質は、塩化トリ−（ｎ−オクチル）メチルアンモニウムおよび塩化トリ−（ｎ−デシル）メチルアンモニウムの混合物であり、この場合、ｎ−オクチル化合物が優位であるのが好適である。このような混合物はＡｌｉｑｕａｔ  ３３６（商標）の名称で市販されている。好適であると考えられるその他の交換体物質としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化メチルトリオクチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム（塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウムおよびＡＤＢＡＣとしても知られる、様々なアルキル鎖長の塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、およびプロトン化型のアンバーライトＬＡ２（遊離塩基型の液体として供給される高分子量の油溶性第二級アミン）が含まれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物との混合物から目的のオリゴヌクレオチドを分離する方法であって、
第一の液体移動相と、目的のオリゴヌクレオチドに除去可能に結合する、有機アミンの対アニオンとの塩である交換体物質を少なくとも１種類含有する液体固定相とを含んでなる、二相系移動相−固定相液−液クロマトグラフィーシステムを準備すること；
液−液クロマトグラフィー装置のカラム内の液体固定相に対する、その液体固定相と接触した流れにおいて、第一の液体移動相に目的のオリゴヌクレオチドを運ばせ、目的のオリゴヌクレオチドを液体固定相中の交換体物質に結合させること、そして、
目的のオリゴヌクレオチドを前記液体固定相から、カラム内を前記固定相に対して、前記固定相と接触して流れる第二の液体移動相へと、目的のオリゴヌクレオチドを前記液体固定相から前記第二の移動相へ移すことができる置換体物質の手段により移すこと
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程：
（１）溶液中に目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物とを含有する第一の液体相、および目的のオリゴヌクレオチドに除去可能に結合する交換体物質を含有する第二の液体相を準備し、ここで、第一の液体相と第二の液体相は、互いに接触した際に２つの明瞭な相を形成すること；
（２）前記第二の液体相を遠心分配クロマトグラフィー装置にその中の固定液体相として導入すること；
（３）溶液中に目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物とを含有する前記第一の液体相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に第一の移動相として導入し、この第一の液体相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に、前記第二の液体固定相と接触させて流し、目的のオリゴヌクレオチドを前記第二の液体固定相中の交換体物質に除去可能に結合させること；
（４）前記第二の液体相と接触した際に明瞭な相を形成し、かつ、溶液中に目的のオリゴヌクレオチドを前記第二の液体相から遠心分配クロマトグラフィー装置へ移すことができる少なくとも１種類の置換体物質を含有する第三の液体相を第二の移動相として導入し、この第二の移動相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に、第二の液体相と接触させて流し、目的のオリゴヌクレオチドを固定相から移し、前記第二の移動相の溶液に入れること；
（５）第二の移動相から移された目的のオリゴヌクレオチドを単離すること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的のオリゴヌクレオチドが１０〜３０塩基を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
目的のオリゴヌクレオチドが、配列５’−ＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＡ−３’を有する２０塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
目的のオリゴヌクレオチドが、それもまたオリゴヌクレオチドである１以上の不純物から分離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記固定相が、水と実質的に不混和性の１以上の有機液と水と混和性の１以上の有機液との混合物を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一および第二の移動相が、水と混和性の１以上の有機液と水との混合物を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記固定相および移動相が、Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステル、Ｃ１−８アルカノールおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステルが酢酸エチルであり、前記Ｃ１−８アルカノールが１−ブタノールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固定相および移動相が、Ｃ１−８アルカノールおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ１−８アルカノールが１−ペンタノールまたは１−ブタノールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記固定相および移動相が、Ｃ１−８アルカノール、ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃ１−８アルカノールが１−ブタノールであり、前記ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンがメチルイソブチルケトンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記固定相および移動相が、ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンがメチルイソブチルケトンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固定相および移動相が、Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルキルエーテルまたはＣ４−１０環状エーテル、Ｃ１−８アルカノールおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルキルエーテルおよびＣ４−１０環状エーテルがメチル−第三級ブチルエーテルおよび２−メチルテトラヒドロフランから選択され、前記Ｃ１−８アルカノールが１−ペンタノールおよび１−ブタノールから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一の移動相がｐＨ７〜１４を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記カラム中の目的のオリゴヌクレオチドの濃度が２００ｍｇ〜８０ｇ／Ｌである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
有機アミンの対アニオンとの前記塩が、以下の一般式を有する第二級、第三級または第四級アンモニウム塩である、
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−
［式中、前記第二級、第三級および第四級の配列において、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれ２つ、３つまたは４つは独立にＣ１−２０アルキル、またはフルオロもしくはトリフルオロメチル置換アルキルなどの置換アルキル、またはベンジルであり、残りは水素であり、Ｘ−はハリドアニオンである。］
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ハリドアニオンは塩素イオンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記交換体物質が、塩化トリ−（ｎ−オクチル）メチルアンモニウムと塩化トリ−（ｎ−デシル）メチルアンモニウムとの混合物、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化メチルトリオクチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム（塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウムおよびＡＤＢＡＣとしても知られる、様々なアルキル鎖長の塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、およびプロトン化型のアンバーライトＬＡ２（遊離塩基型の液体として供給される高分子量の油溶性第二級アミン）から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記交換体物質が、塩化トリ−（ｎ−オクチル）メチルアンモニウムと塩化トリ−（ｎ−デシル）メチルアンモニウムとの混合物、および塩化ベンザルコニウムから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記固定相中の交換体物質の濃度が５〜５００ｍＭである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第二の液体移動相が前記第一の移動相と同じ液体組成を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記固定相が主としてＣ１−８アルカノールとＣ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステルとの混合物を含んでなり、前記第二の移動相が水とＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記固定相が主としてＣ１−６環状エーテルとＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなり、前記第二の移動相が主として水とＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第二の移動相のｐＨがｐＨ７〜１４の範囲である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記置換体物質が、一価であっても多価であってもよいアニオン部分を組み込んでいる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記置換体物質が、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、サッカリンナトリウム塩、サンセットイエローおよびアマランスから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第二の移動相中の置換体物質の濃度が５〜３０ｍＭである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。