【事件の表示】
　特願２００５−５１０８２９「中胚葉および成体型内胚葉細胞集団」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年１１月１８日国際公開、ＷＯ２００４／０９８４９０、平成１８年　４月２７日国内公表、特表２００６−５１３７２７〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　
　この出願は，２００３年５月１９日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００２年５月１７日米国（ＵＳ），２００３年２月４日米国（ＵＳ））を国際出願日とする出願であって，以降の手続の経緯は以下のとおりのものである。
　
　平成２０年　９月１８日付け　拒絶理由通知書
　平成２１年　３月２４日　　　意見書・手続補正書
　平成２２年　２月１２日付け　拒絶理由通知書
　平成２２年　８月１８日　　　意見書
　平成２３年　２月　８日付け　拒絶査定
　平成２３年　６月　８日　　　審判請求書・手続補正書
　平成２４年　９月　５日付け　審尋
　平成２４年１２月　５日　　　回答書
　
第２　平成２３年６月８日付けの手続補正についての補正の却下の決定
　
[補正の却下の決定の結論]　
　平成２３年６月８日付けの手続補正は却下する。
　
[理由]
１　本件補正
　
　平成２３年６月８日付けの手続補正（以下，「本件補正」という。）は，本件補正前の請求項１を削除し，本件補正前の請求項２を繰り上げて請求項１とすると共に，本件補正前の
　
「【請求項８】
 短尾を発現する細胞を得るのに十分な時間，血清の存在下で哺乳動物由来の胚性幹細胞を培養すること，および短尾を発現する前記細胞を単離することを含む，請求項１に記載の細胞集団を単離する方法。」を，
　
「【請求項７】
　短尾を発現する細胞を得るのに十分な時間，血清の存在下で哺乳動物由来の胚性幹細胞を培養すること，および
少なくとも５０％の細胞が短尾を発現する細胞集団を単離する
　
とする補正を含むものである。なお，下線は補正箇所を示す。
　
２　本件補正の適否
　
（１）補正の目的の適否
　
　本件補正は，本件補正前の請求項１を削除し，本件補正前の請求項２を繰り上げて請求項１としたことに伴い，本件補正前の請求項８において，発明を特定するために必要と認める事項である「短尾を発現する前記細胞を単離すること」を，本件補正後の請求項１と整合させるべく「少なくとも５０％の細胞が短尾を発現する細胞集団を単離すること」に限定するものである。
　そして，その補正前の請求項８に記載された発明と補正後の請求項７に記載される発明の産業上の利用分野及び解決しようとする課題が同一であるから，平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法（以下，「平成１８年改正前特許法」という。）第１７条の２第４項第２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。
　
（２）独立特許要件について
　
　そこで，本件補正後の前記請求項７に記載されている事項により特定される発明（以下，「本願補正発明」という。なお，本件補正後の明細書を，以下，「本願補正明細書」という。）が，特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか（平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するか）否かについて，以下検討する。
　
（２−１）本願補正発明
　
　本願補正発明は，請求項１を引用して特定されている事項を書き下すと，以下のとおりである。
　
「短尾を発現する細胞を得るのに十分な時間，血清の存在下で哺乳動物由来の胚性幹細胞を培養すること，および少なくとも５０％の細胞が短尾を発現する細胞集団を単離することを含む，少なくとも約５０％の中内胚葉および中胚葉細胞を含む，中内胚葉および中胚葉細胞が濃縮されている哺乳動物由来の細胞集団を単離する方法。」
　
（２−２）刊行物及びその記載事項
　
ア　刊行物
　
　Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５６，（１９９３），ｐ．２４７−２５６（原査定における引用文献１。以下，「刊行物１」という）
　Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１０５，（２００１），ｐ．１６９−１７２（原査定における引用文献２。以下，「刊行物２」という。）
　蛋白質核酸酵素，ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１０，（１９９８），ｐ．１３４７−１３５４（原査定における引用文献４。以下，「刊行物３」という。）
　
イ　刊行物の記載事項
　
　本願優先日前に頒布された刊行物である刊行物１ないし３には，以下の事項が記載されている。なお，提示した翻訳は，当審での翻訳であり，下線は当審で付与した。以下，同様。
　
（ア）刊行物１　
　
１ａ「Secretion of transforming growth factor-beta isoforms by embryonic stem cells: isoform and latency are dependent on direction of differentiation.」（２４７頁タイトル）
　（翻訳）
「
胚性幹細胞によるＴＧＦ−βアイソフォームの分泌
　
１ｂ「Murine embryonic stem (ES) cells are maintained in an undifferentiated state when cultured in medium conditioned by Buffalo rat liver (BRL) cells. BRL conditioned medium (CM) contains a differentiation inhibitory activity (DIA) that is synonymous with leukemia inhibitory factor (LIF). ES cells in monolayer culture can be induced to differentiate by addition of all-trans retinoic acid (RA) to the BRL CM, when they mainly form cells resembling parietal endoderm, or by culture in medium not conditioned by BRL cells. ES cells thus deprived of LIF/DIA differentiate spontaneously to a cell type that expresses Brachyury (T), a marker of early mesoderm.」（２４７頁要約１〜９行）
　（翻訳）
「
バッファロー・ラット肝臓（ＢＲＬ）細胞により調整された培地中で培養される時，マウス胚性幹（ＥＳ）細胞は未分化状態に維持される。ＢＲＬ調整培地（ＣＭ）は，白血病抑制因子（ＬＩＦ）と同義の分化阻害活性（ＤＩＡ）を含んでいる
ＢＲＬ細胞により調整されない培地で培養することにより，単層培養のＥＳ細胞は分化誘導され得る。ＬＩＦ／ＤＩＡを除去されたＥＳ細胞は，初期中胚葉マーカーである短尾（Ｔ）を発現する細胞型に自然に分化する
　
１ｃ「　　　　　　　MATERIALS AND METHODS　
　　　　　　　　　　　　　　ES cells　　　
   The ES line (ES-5) used in this study was isolated from the inner cell mass of a nondelayed blastocyst of a 129 Sv strain mouse(Hsiao-Chien and Mummery,1990). ES cells were cultured in 80% BRL-CM containing 20% fetal calf serum (FCS) and 10-4 M β-mercaptoethanol. Differentiation to parietal endoderm was induced by RA, essentially as described previously (Mummery et al.,1990a,b). In short, 4hr after plating RA was added to the BRL-CM at a final concentration of 10-7 M. The medium, including RA, was refreshed at day 3. For mesenchymal differentiation by LIF/DIA deprivation the BRL-CM was replaced by minimal essential medium (MEM) containing 20% FCS and 10-4 M β-mercaptoethanol 4hr after plating in BRL-CM. At day 3 the medium was refreshed. Plating density in both cases was 5,000 cells/cm2 of gelatinized surface area. 　
　　　　　　　　　　　　 ES cell CM and ECM
    After 5 days of culture, RA differentiated and LIF/DIA deprived cells were virtually 100% confluent; all flasks (80 cm2), including those with undifferentiated cells at approximately 90% confluence, were washed with MEM without serum once, incubated with a second wash for 1 hr at 37 ℃, and subsequently put into medium for conditioning (CM). Recombinant LIF (kind gift of Dr.Nicolas Gough) was included at 10,000 U/ml for undifferetiated cells and RA treated cells. RA was omitted during final conditioning as it would cause growth inhibition of ML-CCL64 cells in the bioassay (van Zoelen, 1990; data not shown). Recombinant LIF was without effect on 3H TdR incorporation of ML-CCL64 cells. From the RA differentiated and LIF/DIA deprived cultures 8-15 × 106 cells/80 cm2 were recovered and from undifferentiated cell cultures 25-35 × 106 cells/80 cm2. The medium to be conditioned was 18 ml/80 cm2 in each case. When CM was tested for TGF-β activity values were not corrected for cell number as the range is narrow enough to pool data from several experiments. In addition, after conditioning, free floating cells were observed in all cases which were not counted. The CM was centrifuged at 5,000 rpm and frozen in aliquots at -20℃ until use. For ECM extracts, cells were washed four times with phosphate-buffered saline (PBS) (without Ca2+ or Mg2+) and incubated with PBS containing 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) until cells detached from  the substrate. The culture flasks were washed four times with PBS and incubated with 1M acetic acid (HAC) for 1 hr at room temperature. The ECM/HAC extracts were freeze dried and the dry material was resuspended in Bes (N,N-bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethanesulfonic acid; 25 mM)-buffered Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) with 0.1% bovine serum albumin (BSA) so that 1 ml DMEM-Bes-BSA contained the ECM/HAC extract of 107 cells.」 （２４８頁右欄３３行〜２４９頁左欄２７行）
　（翻訳）
「　　　　　　　　　　　　材料と方法
　　　　　　　　　　　　　ＥＳ細胞
　こ
の研究の中で使用されるＥＳライン（ＥＳ−５）は，１２９ Ｓｖ系統マウスの非遅延胚盤胞の内部細胞塊から単離された(Hsiao-Chien and Mummery,1990)。ＥＳ細胞を，２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１０
−４
Ｍβ−メルカプトエタノールを含有する８０％ＢＲＬ−ＣＭで培養した
ＬＩＦ／ＤＩＡ除去による間葉への分化目的で，ＢＲＬ−ＣＭに細胞を播種４時間後，ＢＲＬ−ＣＭを，２０％ＦＣＳ及び１０
−４
Ｍβ−メルカプトエタノール含有最小基本培地（ＭＥＭ）に置き換えた。３日で培地をリフレッシュした。両ケースで細胞播種密度は，ゼラチン化表面の５，０００細胞／ｃｍ
２
であった
　　　　　　　ＥＳ細胞調整培地及び細胞間マトリックス　
　
５日間培養後
ＬＩＦ／ＤＩＡ除去の細胞は，実質的に１００％コンフルーエントとなった。すなわち，未分化細胞を含みおよそ９０％コンフルーエントな細胞を含んでいる全フラスコ（８０ｃｍ
２
）を，無血清最小基本培地で一回洗い，二回目洗って１時間３７℃で培養し，実質的に調整培地（ＣＭ）に載置した
ＬＩＦ／ＤＩＡ除去の培養から，８−１５×１０
６
細胞／８０ｃｍ
２
が再生され
　
１ｄ「　　　　　　　　　　Brachyury(T)
   Northern blot analysis of RNA from undifferentiated ES cells shows no transcripts corresponding to Brachyury(T). Addition of RA does not induce the gene over the period examined (3 and 5 days of treatment). However deprivation of LIF/DIA clearly induces Brachyury(T) in ES cells. This is evident as two transcripts on day 5 (2.3 and 2.9kb; Fig.1). Murine embryos (8.5-9.5 days post coitum) express a major 2.1 kb transcript; a larger transcript is also detected but is less pronounced (Wilkinson et al.,1990). This result confirms the mesenchymal character of these cells, which was until now mainly based upon their morphology, in the absence of early mesenchymal/mesodermal markers. The following experiments can therefore be considered in terms of parietal endoderm (RA differentiation) and mesenchymal (LIF/DIA deprivation) differentiation.」（２４９頁右欄２９〜４６行）
　（翻訳）
「　　　　　　　　　　　　短尾（Ｔ）
　未分化ＥＳ細胞由来のＲＮＡのノーザンブロット解析には，短尾（Ｔ）に対応する転写物は示されない。レチノイン酸添加は，試験期間（処置後３，５日間），その遺伝子を誘導しない。しかし，
ＬＩＦ／ＤＩＡ除去は，明らかにＥＳ細胞に短尾（Ｔ）を誘導する。これは，５日目の２つの転写物として明らかである（２．３及び２．９ｋｂ；図１）
この結果は，これらの細胞の間葉の特徴，今まで初期間葉／中胚葉マーカーはなく，主にそれらの形態学に基づいていたもの，を確認する。したがって，次に続く実験では，体腔壁の内胚葉（レチノイン酸分化）及び間葉（ＬＩＦ／ＤＩＡ除去）の分化について検討し得る
　
（イ）刊行物２
　
２ａ「Mesendoderm : An Ancient Germ Layer?」（１頁標題）
　（翻訳）
「
中内胚葉
　
２ｂ「Vertebrate Mesendoderm
　　Labeling of single cells at the mid-blastula stage in zebrafish has shown that endoderm and mesoderm, including blood, heart, and muscle, derive from cells in the 3-4 tiers nearest to the vegetal margin of the blastoderm (Warga and Nusslein-Volhard, 1999 and references therein).We will refer to these cells as mesendoderm (Figure 2A).The mesendodermal nature of these cells is also suggested, in the late blastula, by the coexpression of genes expressed by and active in the formation of mesoderm and endoderm: the transcription factors, brachyury (bra, also known as no tail (ntl) in the zebrafish) and gata5 (faust in the zebrafish) (Rodaway et al., 1999).Perturbation of signaling at these early stages of development indicates common signal requirements for the expression of both bra and gata5 in the mesendoderm (Rodaway et al., 1999).」（１６９頁右欄２４〜末行）
　（翻訳）
「
脊椎生物の中内胚葉
　
ゼブラフィッシュの中間胞胚期での単離細胞のラベリングによって，血液，心臓及び筋肉を含んでいる内胚葉と中胚葉は，胞胚葉の植物極に最も近い３−４層の細胞に由来することが示された(Warga and Nusslein-Volhard,　1999年及び参考文献）。これらの細胞を中内胚葉（図２Ａ）と呼ぶ。中内胚葉の細胞の性質は，後期胞胚で，中胚葉と内胚葉の形成によって遺伝子が共発現し，活性化されることにより示唆される：すなわち，転写因子である短尾（bra，ゼブラフィッシュで短尾（ntl）としても知られている)及びgata5(ゼブラフィッシュでfaust)(Rodaway等1999年)によって示唆される
　
２ｃ「Figure 2.　Formation of the Mesoderm and Endoderm in Zebrafish
(A) Mid to late blastula. The blastoderm is a cap of cells covering the animal portion of the extraembryonic yolk cell. A signal from the yolk cell induces mesendoderm, which coexpresses bra and gata5, in the 3-4 tiers of cells nearest to the vegetal margin of the blastoderm.A signal (arrows) passes from these cells to blastomeres more distant from the margin to induce further expression of bra, but not of gata5.β-catenin is concentrated in nuclei toward the dorsal side of the embryo. Animal (A) and vegetal (V) poles are indicated.
(B) Early gastrula.　The mesendodermal cells in the margin become restricted to either mesoderm or endoderm.More endoderm forms dorsally, which is reflected in a gradient of expression of transcription factor Fkd2 (expressed in gut precursors).However, endoderm forms around the entire margin (see text).The bra expressing mesoderm cells distal to the margin are fated to form predominantly somitic mesoderm.」（１７０頁　図２説明）
　（翻訳）
「
図２
ゼブラフィッシュにおける中胚葉及び内胚葉形成
（
Ａ）中期から後期胞胚まで
胞胚葉は，胚体外の卵黄細胞の動物極をカバーする細胞のキャップである。卵黄細胞からのシグナルは，胞胚葉の植物マージンに最も近づくセルの３−４層に，braとgata5を共発現する中内胚葉を誘導する。gata5ではなくbraの更なる発現を誘導するため，シグナル(矢印)はこれらの細胞から極より遠く離れている割球まで行く
（
Ｂ）初期原腸胚
中内胚葉の細胞は，中胚葉か内胚葉のいずれかに制限されるようになる
　
２ｄ「Figure 3.　Conservation of Genes Involved in Mesendoderm Specification and Its Differentiation
　Mesendodermal fate in both zebrafish and C. elegans is regulated by GATA factors. Separating the mesendoderm into mesoderm and endoderm involves downstream genes which are also conserved between the two species (HNF4 has not been reported yet in zebrafish, but it is implicated in endoderm development in other vertebrates. pha-4/HNF3 is also required for pharynx formation in C. elegans). The cell types produced by the mesoderm derived from the mesendoderm are also similar in vertebrates and nematodes.」（１７１頁　図３説明）
　（翻訳）
「
図３
中内胚葉の特定と分化における遺伝子の保存
　
ゼブラフィッシュと線虫の両方における中内胚葉の運命は，ＧＡＴＡ因子によって制御される。中内胚葉の中胚葉と内胚葉への分離は，２つの種間で保存される下流遺伝子を含んでいる（ＨＮＦ４は，ゼブラフィッシュでは未だ報告されていないが，他の脊椎動物で内胚葉分化に関係している
　
２ｅ「Conclusions and Prospects　
・・・However, further fate mapping of single cells between blastula and gastrula stages will be needed to determine if there are truly bipotential mesendodermal cells in vertebrates.」
　（翻訳）
「　結論及び展望
　・・（略）・・
胞胚と原腸期の間の単一細胞の更なる分化マッピングは，脊椎動物において二分化能のある中内胚葉が本当に存在するかどうか決定するために必要であろう
　
（ウ）刊行物３
　
３ａ「Ｉ．Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子とその遺伝子産物の特徴 
　
１９９０年のマウスＢｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子のクローニングに続いて，翌９１年にアフリカツメガエル
８）
で，さらに９２年にゼブラフィッシュ
９）
から，９５年にニワトリ
１０）
からその相同遺伝子が単離された。これらの脊椎動物でのＢｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子の発現パターンはよく保存されており，その発現は初め陥入を開始したすべての中胚葉の細胞で認められる
　
（２−３）刊行物１に記載された発明
　
　刊行物１は，「胚性幹細胞によるＴＧＦ−βアイソフォームの分泌」（１ａ）に関し記載するものであり，この刊行物１には，マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を，白血病抑制因子（ＬＩＦ）と同義の分化阻害活性（ＤＩＡ）を含んでいるバッファロー・ラット肝臓（ＢＲＬ）細胞により調整された培地（ＢＲＬ−ＣＭ）中で未分化状態を維持しつつ培養した後，ＬＩＦ／ＤＩＡ除去による間葉への分化目的で，ＢＲＬ細胞により調整されない培地で培養することにより，ＥＳ細胞を分化誘導すること，及び，ＬＩＦ／ＤＩＡを除去したＥＳ細胞は，初期中胚葉マーカーである短尾（Ｔ）を発現する細胞型に自然に分化したこと（１ｂ，１ｄ）が記載されている。
　そこで，胚性幹細胞を初期中胚葉マーカーである短尾（Ｔ）を発現する細胞型へ分化させた，ＬＩＦ／ＤＩＡを除去した培養方法に着目すると，その具体的な培養方法は１ｃに記載されている方法である。そして，１ｃには，最終的に「ＬＩＦ／ＤＩＡ除去の培養から８−１５×１０６細胞／８０ｃｍ２が再生され」と記載されており，培養後の細胞数が分かるということは，培養した細胞を培地から分離しているといえることから，この培養方法は，実質的に，この培養方法により培養した細胞を分離することを含む，該細胞を取得する方法といえる。
　そうすると，この培養方法により取得された細胞は，初期中胚葉マーカーである短尾（Ｔ）を発現する細胞を含む細胞であることから（１ｂ，１ｄ），刊行物１の１ｃには，
　
「１２９ Ｓｖ系統マウスの非遅延胚盤胞の内部細胞塊から単離されたＥＳ細胞を，２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１０−４Ｍβ−メルカプトエタノールを含有する８０％ＢＲＬ−ＣＭで培養し，ＬＩＦ／ＤＩＡ除去による間葉への分化目的で，ＢＲＬ−ＣＭに細胞を播種４時間後，ＢＲＬ−ＣＭを，２０％ＦＣＳ及び１０−４Ｍβ−メルカプトエタノール含有最小基本培地（ＭＥＭ）に置き換え，３日で培地をリフレッシュし，５日間培養後，ＬＩＦ／ＤＩＡ除去の細胞を実質的に１００％コンフルーエントとし，培養した細胞を培地から分離することを含む，初期中胚葉マーカーである短尾（Ｔ）を発現する細胞を含む細胞を取得する方法。」
　
の発明（以下，「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
（２−４）本願補正発明と引用発明との対比
　
ア　引用発明の「１２９ Ｓｖ系統マウスの非遅延胚盤胞の内部細胞塊から単離されたＥＳ細胞」は，マウスの胚性幹細胞であるから，本願補正発明の「哺乳動物由来の胚性幹細胞」に相当する。
　
イ　引用発明の「ＥＳ細胞を，２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１０−４Ｍβ−メルカプトエタノールを含有する８０％ＢＲＬ−ＣＭで培養し，ＬＩＦ／ＤＩＡ除去による間葉への分化目的で，ＢＲＬ−ＣＭに細胞を播種４時間後，ＢＲＬ−ＣＭを，２０％ＦＣＳ及び１０−４Ｍβ−メルカプトエタノール含有最小基本培地（ＭＥＭ）に置き換え，３日で培地をリフレッシュし，５日間培養後」について，胚性幹細胞を２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＢＲＬ−ＣＭで培養した後，ＬＩＦ／ＤＩＡ除去による間葉への分化目的で，ＢＲＬ−ＣＭを，２０％ＦＣＳ含有最小基本培地（ＭＥＭ）に置き換えて培養しており，血清の存在下で胚性幹細胞を培養している。
　そして，この培養後の細胞は，「ＬＩＦ／ＤＩＡ除去は，明らかにＥＳ細胞に短尾（Ｔ）を誘導する。これは，５日目の２つの転写物として明らかである（２．３及び２．９ｋｂ；図１）」（１ｄ）との記載より，短尾を発現している。それ故，これは短尾を発現する細胞を得るのに十分な時間，胚性幹細胞を培養しているといえる。
　そうすると，引用発明の「ＥＳ細胞を，２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１０−４Ｍβ−メルカプトエタノールを含有する８０％ＢＲＬ−ＣＭで培養し，ＬＩＦ／ＤＩＡ除去による間葉への分化目的で，ＢＲＬ−ＣＭに細胞を播種４時間後，ＢＲＬ−ＣＭを，２０％ＦＣＳ及び１０−４Ｍβ−メルカプトエタノール含有最小基本培地（ＭＥＭ）に置き換え，３日で培地をリフレッシュし，５日間培養後」は，上記アで述べたことを踏まえると，本願発明の「短尾を発現する細胞を得るのに十分な時間，血清の存在下で哺乳動物由来の胚性幹細胞を培養すること」に相当する。
　
ウ　引用発明の「ＬＩＦ／ＤＩＡ除去の細胞を実質的に１００％コンフルーエントとし，培養した細胞を培地から分離」された細胞は，初期中胚葉マーカーである短尾（Ｔ）を発現する細胞を含むものである。そして，「ＬＩＦ／ＤＩＡ除去の細胞を実質的に１００％コンフルーエントと」なった「細胞」は，刊行物１の「すなわち，未分化細胞を含みおよそ９０％コンフルーエントな細胞を含んでいる」（１ｃ）との記載より，具体的には，若干の未分化細胞を含み９０％コンフルーエントな細胞を含んでいるものであることから，若干の未分化細胞と短尾（Ｔ）を発現する細胞とを含む細胞集団といえる。
　また，本願補正発明の「単離すること」と引用発明の「分離すること」とは，共に，広義で，取得することといえる。
　そうすると，本願補正発明の「少なくとも５０％の細胞が短尾を発現する細胞集団を単離すること」と，引用発明の「ＬＩＦ／ＤＩＡ除去の細胞を実質的に１００％コンフルーエントとし，培養した細胞を培地から分離すること」とは，短尾を発現する細胞を含む細胞集団を取得することである点で共通する。
　
エ　本願補正発明の「少なくとも約５０％の中内胚葉および中胚葉細胞を含む，中内胚葉および中胚葉細胞が濃縮されている哺乳動物由来の細胞集団」は，本願補正明細書に「【０００６】本発明は，中内胚葉および中胚葉細胞の濃縮された細胞集団を提供する。中内胚葉細胞は，本明細書において，短尾(brach+)を発現し，分化誘導条件の存在下で，中胚葉および中胚葉誘導体(心筋および骨格筋，平滑筋，内皮および造血細胞を含む)を産生でき，また，内胚葉および内胚葉誘導体(肝臓細胞および膵臓細胞を含む)も産生できる細胞として定義されている。中胚葉細胞は，本明細書において，brach+であり，分化誘導条件の存在下で，心筋および骨格筋，血管平滑筋，内皮および造血細胞を産生でき，内胚葉および内胚葉誘導体は産生できない，細胞として定義されている」と記載されていることから，共通する性質として短尾陽性(Brach+)細胞すなわち短尾を発現する哺乳動物由来の細胞集団といえる。
　そうすると，本願補正発明の「少なくとも約５０％の中内胚葉および中胚葉細胞を含む，中内胚葉および中胚葉細胞が濃縮されている哺乳動物由来の細胞集団を単離する方法」と，引用発明の「初期中胚葉マーカーである短尾（Ｔ）を発現する細胞を含む細胞を取得する方法」とは，上記ア及びウで述べたことを踏まえると，短尾を発現する哺乳動物由来の細胞集団を取得する方法である点で共通する。
　
　そうすると，両者は，
　
「短尾を発現する細胞を得るのに十分な時間，血清の存在下で哺乳動物由来の胚性幹細胞を培養すること，および短尾を発現する細胞を含む細胞集団を取得することを含む，短尾を発現する哺乳動物由来の細胞集団を取得する方法。」
　
である点で一致し，以下の点でのみ相違するといえる。
　
ア　短尾を発現する哺乳動物由来の細胞集団が，本願補正発明では，少なくとも約５０％の中内胚葉および中胚葉細胞を含む，中内胚葉および中胚葉細胞が濃縮されているものであるのに対し，引用発明では，そのようなものであるか明らかでない点。(以下，「相違点ア」という。)
　
イ　（短尾を発現する哺乳動物由来の細胞集団を）取得する方法が，本願補正発明では，単離する方法であるのに対し，引用発明では，単離する方法であるか明らかでない点。(以下，「相違点イ」という。)
　
（２−５）相違点についての判断
　
ア　相違点について
相違点ア，イについて，相違点相互の関連性を考慮し，まとめて検討する。
　
（ア）引用発明の細胞が，中内胚葉及び中胚葉細胞を含むことについて
　
　まず，中胚葉を含むことについて，引用発明の細胞に発現している短尾（Ｔ）は，初期中胚葉マーカーである（１ｂ，１ｄ）ことから，引用発明の細胞は，少なくとも中胚葉細胞を含んでいるといえる。
　
　次に，中内胚葉を含むことについて，引用発明の細胞に発現している短尾（Ｔ）が，初期中胚葉マーカーであるということは，それを発現している細胞は，初期の中胚葉細胞といえる。
　初期の中胚葉については，一般に，脊椎動物であるゼブラフィッシュにおいて，中間胞胚期に中内胚葉細胞が存在し，この中内胚葉細胞の性質の一つとして，転写因子の遺伝子である短尾（bra：Brachyury）遺伝子を発現すること（２ｂ）は，刊行物２が総説であることからも明らかなように，本願優先日前，周知事項であった。
　そして，この短尾（bra：Brachyury）遺伝子の発現パターンは，ゼブラフィッシュのみならず，マウスやニワトリといった脊椎動物でよく保存されており，その発現は初め陥入を開始した総ての中胚葉の細胞で認められること（３ａ）も，本願優先日前，周知事項であったことから，短尾（bra）遺伝子発現がマーカーである中内胚葉は，脊椎動物に共通に存在すると考えられていたといえる。　
　そうすると，引用発明の細胞は，短尾（bra）遺伝子を発現していること（１ｂ，１ｄ）から，上述の周知事項である中内胚葉細胞の性質も有しており，中内胚葉は脊椎動物に共通に存在すると考えられていたから，引用発明の細胞中に中内胚葉細胞も含まれていると当業者であれば理解できたことといえる。
　
　したがって，引用発明の細胞は，中内胚葉及び中胚葉細胞を含む細胞集団といえる。
　
（イ）引用発明の細胞が，少なくとも５０％の中内胚葉及び中胚葉細胞を含むよう濃縮されることについて
　
　上記（ア）で述べたように，引用発明の細胞は，中内胚葉及び中胚葉細胞を含む細胞集団といえる。
　また，刊行物１には，引用発明の細胞である，ＬＩＦ／ＤＩＡ除去により胚性幹細胞から分化した短尾（Ｔ）を発現する細胞について「次に続く実験では・・間葉（ＬＩＦ／ＤＩＡ除去）の分化について検討し得る」（１ｄ）と記載され，該細胞を基に，間葉等の分化を検討しようという動機も示されている。
　
　一般に，脊椎動物の中内胚葉細胞における中胚葉や内胚葉へ分化する性質を検討しようという課題は，上記刊行物１の記載（１ｄ）のみならず刊行物２の記載（２ｅ）からも理解されるように，本願優先日前，周知の課題である。その課題の下，脊椎動物において中内胚葉細胞を用いて，内胚葉や中胚葉へ分化する性質を検討しようとして，中内胚葉細胞をできるだけ多く純度高く取得すべく単離しようすることは，当業者であれば当然に考え得たことである。　
　また，一般に，ある目的の細胞を単離する目的で，該細胞が発現するマーカーに基づいて濃縮することも，以下の刊行物Ａの記載からも明らかなように，本願優先日前，周知技術であった。　
　そうすると，上述のように，引用発明の細胞は，中内胚葉及び中胚葉細胞を含む細胞集団といえ，しかも該細胞を用いて内胚葉や中胚葉への分化する性質を検討しようという課題も，刊行物１の記載（１ｄ）のみならず周知の課題としてあることから，引用発明において，上記周知の課題の下，中内胚葉細胞を含む細胞集団を単離しようとして，上記周知技術を適用し，引用発明の細胞が発現している，短尾（bra）遺伝子に基づいて濃縮した細胞集団を得ることは，当業者が容易になし得たことである。
　そして，このように濃縮した細胞集団は，多くの細胞が短尾（bra）遺伝子を発現している細胞の集団であることから，少なくとも約５０％の中内胚葉及び中胚葉細胞を含むものとすることに，格別の困難性はない。
　
　また，中内胚葉及び中胚葉細胞の濃縮された細胞集団の単離方法について，本願補正明細書には，「【００１４】本発明によれば，選択マーカー遺伝子は，短尾遺伝子座に組換え標的されている。ＥＳ細胞分化開始後に，選択マーカーは，短尾発現を反映するパターンで発現されることが発見された。選択マーカーにより，ＥＢから短尾陽性(Brach+)細胞の選別が可能となり，これにより，中内胚葉および中胚葉細胞の濃縮された細胞集団の単離および特徴づけが可能となった。【００１５】本発明によれば例示される選択マーカーは，強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰまたはＧＦＰ）である。」と記載されている。
　
　この点について，一般に，所定の発生経路に沿った分化が決定付けられている多能性細胞を，特異的に発現する遺伝子の発現に応じて単離する方法，その際，選択マーカーの遺伝子を特異的に発現する遺伝子と連結させてること（刊行物Ｂ），遺伝子を連結させる方法として，胚性幹細胞の遺伝子座を遺伝的に改変する方法（刊行物Ｃ），これらの細胞の検出・単離は，選択マーカーの発現によってなされ，選択マーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）があること（刊行物ＡないしＣ），遺伝子的に改変された細胞は，新たな遺伝子型の機能的特徴を利用することにより濃縮され得，具体的な濃縮方法としては，該細胞を懸濁し，蛍光活性化細胞ソーティングにより分離し，再プレートすることにより濃縮され得ること（刊行物Ａ）は，本願優先日前，周知技術であった。
　
　そうすると，引用発明において，中内胚葉及び中胚葉細胞を含む細胞集団を単離しようとして，上記周知技術を適用し，引用発明の細胞が発現している短尾（bra）遺伝子の発現に応じて単離すること，その単離に際し，選択マーカーとしてＧＦＰを適用しようとし，胚性幹細胞の遺伝子座を遺伝的に改変する方法を適用すること，及び，選択マーカーの発現により細胞の単離を行い，濃縮した細胞集団を得ることは，当業者が容易になし得たことである。
　そして，このように濃縮した細胞集団として，少なくとも約５０％の中内胚葉及び中胚葉細胞を含むものであるとすることに，格別の困難性はない。
　
　刊行物Ａ：国際公開第２００１／０５１６１６号
　提示した翻訳は，対応する日本語出願の公表公報である特表２００３−５３０８２８号公報の記載に基づくものであり，該公表公報の段落番号も明示した。　
Ａ１「【００８８】 
　一
旦，分化されると，その集団は，細胞が発現するいずれかのマーカー（例えば，免疫標識および蛍光分類によって，磁気ビーズによる分類によって，または夾雑細胞の免疫特異的溶解によって）に従って培地馴化細胞について濃縮され得る
　
Ａ２「【０１６０】
（
多能性幹細胞の遺伝的改変
　本開示はまた，一時的または安定な様式のいずれかで，遺
伝子的に改変されたｐＰＳ細胞を得るための系を提供する。これは多くの目的に所望される
特定の分化した細胞集団の濃縮を促進するために，分化に影響するか，または未分化細胞の除去を補助する遺伝子を導入することが可能であり得る
【０１６７】
　多くの適用には，ｈＥＳ細胞の遺伝子改変は，２つの異なる協議事項への注意が必要である：
十分に高い効率の遺伝子改変を達成すること，および所望されない経路に沿ってｈＥＳ細胞の分化を促進しない様式でこの改変を実施することである。種々のトランスフェクションおよび形質導入系のスクリーニング，ならびに反応タイミングおよび反応条件の最適化は，検出可能な標識をコードする領域を持つ発現ベクターを用いる実験で首尾よく実施され得る。特に便利な標識は
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような本質的蛍光である
【０１７０】 
　遺
伝子改変の効率はまれに１００％であり，そして，通常，首尾よく改変された細胞について集団を濃縮することが所望される
遺伝子的に改変された細胞は，新たな遺伝子型の機能的特徴を利用することにより濃縮され得る。例えば，ｐＰＳ細胞が，ＧＦＰのような標識
ｐＰＳ細胞は，懸濁され，蛍光活性化細胞ソーティングにより分離され，そして再プレートされ得る
　
Ａ３「
【請求項１０】遺伝的に改変された霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を産生する方法であって
ａ）請求項１ないし３，７又は９による，本質的にフィーダー細胞を含まないｐＰＳ細胞の組成物を提供する工程；　
ｂ
）該組成物中のｐＰＳ細胞中にポリヌクレオチドを移入する工程；および
ｃ
）優先して，該ポリヌクレオチドで遺伝的に改変されている細胞を選択する工程
を
包含する，方法
　
　刊行物Ｂ：国際公開第００／３７６１１号
　提示した翻訳は，対応する日本語出願の公表公報である特表２００２−５３３０６９号公報の記載に基づくものであり，該公表公報の段落番号も明示した。
Ｂ１「【００７１】　
　Ｆ
ＡＣＳを用いてＳＯＸポリペプチドをコードする組換えＤＮＡによりトランスフェクトした細胞において遺伝子発現を測定しうる
または構築物中のリポーター遺伝子を用いて間接的に達成しうる。リポーター遺伝子の例としては
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる
　
Ｂ２「【
請求項１】所定の発生経路に沿った分化が少なくとも部分的に決定付けられている多能性細胞を単離する方法であって，次のステップ
　ａ
）多能性細胞の集団を選択すること
　ｂ
）該細胞をSox遺伝子発現に応じて選別すること
　ｃ
）所定のSox遺伝子を発現する細胞を単離すること
を
含んでなる，上記方法
【
請求項９】細胞の集団から目的の細胞型を単離する方法であって，次のステップ
（
ａ）細胞の集団を，ＳＯＸポリペプチドによるモジュレーションに対して感受性の制御領域と機能的に連結された検出可能なマーカーをコードするコード配列を含む遺伝子構築物を用いてトランスフェクトすること
（
ｂ）該選択マーカーを発現する細胞を検出すること
（
ｃ）細胞の集団から該選択マーカーを発現する細胞を選別すること
を
含んでなる，上記方法
【
請求項１１】選択マーカーが蛍光または発光ポリペプチド
　
刊行物Ｃ：国際公開第２００２／０３６７８９号
　提示した翻訳は，対応する日本語出願の公表公報である特表２００４−５３６５５６号公報の記載に基づくものであり，該公表公報の段落番号も明示した。
Ｃ１「【００３９】　
　「マーカー」または「選択マーカー」とは，集団における大部分の処理された細胞からマーカーを発現する稀なトランスフェクトされた細胞の単離を可能にする，
選択マーカーである
のようなマーカーの遺伝子としては
ＧＦＰのような蛍光タンパク質が挙げられる
　
Ｃ２「【請求項１５】　
　マ
ウス胚幹細胞中の目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変する方法であって
ａ
）目的のＤＮＡ配列を含む，２０ｋｂより大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程であって，ここで，該大きなクローン化ＤＮＡフラグメントが，該内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である，工程
ｂ
）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して，該マウス胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクターを産生するために，細菌相同性組換えを使用する工程であって，ここで，該遺伝的改変が，コード配列，遺伝子セグメント，または調節エレメントの欠失である，工程
ｃ
）（ｂ）の該大きな標的ベクターを該マウス胚幹細胞に導入して，該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する，工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の該マウス胚幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して，該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が，遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞を同定するために，定量的アッセイを使用する工程であって，該定量的アッセイが，定量的ＰＣＲである，工程，　
を包含する，方法
　
イ　本願補正発明の効果について
　
　本願補正発明の効果については，刊行物１ないし３の記載事項及び本願優先日前の周知技術から予測される範囲内のものであり，格別顕著なものではない。
　
ウ　請求人の主張について　
　
　請求人は，平成２４年１２月５日付け回答書の「２（２）Ｂ（ｃ）」において，「引用文献２は，「線虫とゼブラフィッシュからの最近のデータは，内胚葉および中胚葉のある部分が，中内胚葉と呼ばれる，細胞の二極性層に由来するかもしれないことを示唆する」ということを述べる総説文献であるといえます。・・・その上で，「本当に二分化能の中内胚葉細胞が存在する」か否かを決定する研究が必要であろうと結論しています。 つまり， 引用文献２には，哺乳動物細胞における中内胚葉の存在の可能性について何らの記載も，それを示唆する記載もありません。」と主張している。
　
　しかしながら，刊行物２には「胞胚と原腸期の間の単一細胞の更なる分化マッピングは，脊椎動物において二分化能のある中内胚葉が本当に存在するかどうか決定するために必要であろう」（２ｅ）と記載されており，これは，哺乳動物も含む脊椎動物につき，中内胚葉細胞が存在すること，及び，それが中胚葉及び内胚葉への分化能を有することを示唆した上で，確認のために分化マッピングが必要であると述べているのである。この点は，上記ア（イ）で述べたように，脊椎動物における中内胚葉に相当する細胞の中胚葉や内胚葉への分化を検討すべく，該中内胚葉に相当する細胞を多く単離しようという積極的な動機付けとなるといえる。
　そして，上記ア（ア）で述べたように，刊行物１に記載の引用発明の細胞は，中内胚葉細胞も含まれていると当業者であれば理解できたことであり，且つ，刊行物１には，該細胞を用いて内胚葉又は中胚葉への分化を検討しようという動機も記載されていることから，刊行物２の上記積極的な動機付けもあることを勘案すれば，上記ア（イ）で述べたように，引用発明において，該課題の下，中内胚葉細胞を含む細胞集団を多く単離しようとして，周知技術を適用し，引用発明の細胞が発現している中内胚葉の性質である短尾（bra）遺伝子に基づいて濃縮した細胞集団を得ることは，当業者が容易になし得たことである。
　したがって，請求人の上記主張を採用することはできない。
　
（２−６）独立特許要件のまとめ
　
　したがって，本願補正発明は，その優先日前に頒布された刊行物１ないし３に記載された発明及び本願優先日前の周知技術に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
　よって，本願補正発明は特許出願の際独立して特許を受けることができるものではないから，請求項７についての補正は，平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に適合しない。
　
３　補正の却下の決定のむすび
　
　以上のとおり，請求項７についての補正は，平成１８年改正前特許法第１２６条第５項の規定に適合しないから，本件補正は，その余の点を検討するまでもなく，同法第１５９条第１項の規定において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
　
第３　本願発明について
　
１　本願発明
　
　平成２３年６月８日付けの手続補正は，上記のとおり却下されることとなったので，この出願の請求項１ないし１２に係る発明は，平成２１年３月２４日付けの手続補正書により補正された明細書の記載からみて，特許請求の範囲の請求項１ないし１２に記載された事項により特定されるとおりのものと認められ，その請求項８に係る発明（以下，「本願発明」という。）は，請求項７を引用して特定されている事項を書き下すと，次のとおりのものである。
　
「短尾を発現する細胞を得るのに十分な時間，血清の存在下で哺乳動物由来の胚性幹細胞を培養すること，および短尾を発現する前記細胞を単離することを含む，中内胚葉および中胚葉細胞が濃縮されている哺乳動物由来の細胞集団を単離する方法。」
　
２　原査定の拒絶の理由の概要 
　
　本願発明についての原査定の拒絶の理由の概要は，本願発明は，その出願前日本国内又は外国において頒布された下記の刊行物に記載された発明又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった発明に基いて，その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない，というものである。　
　　　　　　　　　　　　　　　　記　
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５６，（１９９３），ｐ．２４７−２５６（「第２　２（２）（２−２）ア」に示した刊行物１と同じ）
Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１０５，（２００１），ｐ．１６９−１７２（「第２　２（２）（２−２）ア」に示した刊行物２と同じ。）
蛋白質核酸酵素，ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１０，（１９９８），ｐ．１３４７−１３５４（「第２　２（２）（２−２）ア」に示した刊行物３と同じ。）
以下，これらの刊行物を「刊行物１」ないし「刊行物３」と続けて用いる。
　
３　刊行物の記載事項
　
　前記「第２ ２（２）（２−２）イ」に記載したとおりである。
　
４　刊行物１に記載された発明
　
　前記「第２ ２（２）（２−３）」に記載したとおりである。
　
５　対比・判断
　
　本願発明は，上記「第２ ２（２）（２−４），（２−５）」で検討した本願補正発明における「中内胚葉および中胚葉細胞が濃縮されている哺乳動物由来の細胞集団」につき，「少なくとも約５０％の中内胚葉および中胚葉細胞を含む」ものも含まれる何ら限定のないものとする発明であるから，本願補正発明を包含する発明である。
　そうすると，本願発明の発明特定事項を全て含み，さらに他の発明特定事項を減縮したものに相当する本願補正発明が，前記「第２ ２（２）（２−４），（２−５）」に記載したとおり，この優先日前に頒布された刊行物１ないし３に記載された発明及び周知事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，本願発明も，同様の理由により，この優先日前に頒布された刊行物１ないし３に記載された発明及び周知事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであり，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
第４　むすび 
　
　以上のとおり，本願発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから，その余について言及するまでもなく，この出願は，拒絶すべきものである。
　
　よって，結論のとおり審決する。