【手続補正書】
【提出日】平成27年5月1日(2015.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌において抗生物質標的として機能する必須遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）前記細菌の抗生物質耐性変異体を、前記抗生物質の存在下での増殖について選択を行って抗生物質耐性変異体クローン（ＡｂＲ変異体）を得るステップを含む方法によって生成するステップと、
（ｂ）（ｉ）前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子と、（ｉｉ）細菌ＤＮＡを挿入により不活性化するトランスポゾンと、でＡｂＲ変異体を形質転換して、前記１つ又は複数の必須遺伝子について部分二倍体であるトランスポゾン変異体のプールを得るステップと、
（ｃ）種々の量の前記抗生物質の存在下で部分二倍体プールから細菌を増殖させて２種以上の試験培養物を得るステップと、
（ｄ）試験培養物間でトランスポゾン挿入の分布を比較して、前記細菌において前記抗生物質の標的として機能する推定必須遺伝子を同定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
（ａ）部分二倍体プールは、少なくとも０．５×１０５個の変異体、例えば、
（ｉ）少なくとも１×１０５個の変異体、
（ｉｉ）少なくとも５×１０５個の変異体、
（ｉｉｉ）少なくとも１×１０６個の変異体、
（ｉｖ）０．５×１０６〜２×１０６個の変異体、又は
（ｖ）約１×１０６個の変異体
を含む、及び／又は
（ｂ）ステップ（ｂ）におけるトランスポゾンでの形質転換は、
（ｉ）細菌ＤＮＡの５０塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン、
（ｉｉ）細菌ＤＮＡの３０塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン、
（ｉｉｉ）細菌ＤＮＡの２５塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン、
（ｉｖ）細菌ＤＮＡの１５塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン、又は
（ｖ）細菌ＤＮＡの１０塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン
の挿入率をもたらす、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の細菌ＤＮＡは、
（ａ）ゲノムＤＮＡ、
（ｂ）プラスミドＤＮＡ、又は
（ｃ）ゲノムＤＮＡとプラスミドＤＮＡとの混合物
である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＡｂＲ変異体は、前記細菌を突然変異誘発するステップを、前記抗生物質の存在下の増殖についての選択の前にさらに含む方法によって生成され、任意選択で、突然変異誘発ステップは（ａ）化学的突然変異誘発及び／又は（ｂ）放射性突然変異誘発である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）細菌はグラム陽性細菌であり、任意選択で、グラム陽性細菌は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、及びナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）から選択される、又は
（ｂ）細菌はグラム陰性細菌であり、任意選択で、グラム陰性細菌は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＳＴ１３１株、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、及びナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）から選択される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）において、
（ａ）部分二倍体プールの１０７〜１０９ｃｆｕ、例えば約１０８ｃｆｕを増殖培地に接種することによって部分二倍体プールから細菌を増殖させる、及び／又は
（ｂ）少なくとも２種の試験培養物が生成され、１種は抗生物質の非存在下で増殖したものであり、１種は（例えば約１〜約４×ＭＩＣの濃度の）抗生物質の存在下で増殖したものである、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試験培養物のトランスポゾン挿入の分布は、トランスポゾン挿入部位に隣接した又はその付近のＤＮＡを配列決定することによって比較される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、
任意選択で、
（ａ）挿入部位に隣接した又はその付近のＤＮＡの配列決定はトランスポゾン−細菌ＤＮＡ接合部の選択的増幅を含む、及び／又は
（ｂ）配列決定は、合成による配列決定（ＳＢＳ）の生化学を含む、及び／又は
（ｃ）挿入部位に隣接した又はその付近のＤＮＡの約２５、５０、７５、１００塩基対又は１００を超える塩基対が配列決定される、及び／又は
（ｄ）配列決定されるＤＮＡは挿入部位の５’及び／又は３’である、
方法。
【請求項８】
前記推定必須遺伝子に必須の機能を割り当てるステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、
（ａ）前記推定必須遺伝子への必須の機能の割り当ては、前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子との配列比較によって行われ、例えば、トランスポゾン指向性挿入部位配列決定によって前記必須遺伝子が同定される、及び／又は
（ｂ）前記推定必須遺伝子への必須の機能の割り当ては、前記推定必須遺伝子が抗生物質耐性遺伝子ではないことを決定することによって行われ、例えば、決定ステップは、挿入の際に不活性化するトランスポゾンを用いたトランスポゾン指向性挿入部位配列決定によって抗生物質耐性遺伝子を同定するステップを含む、
方法。
【請求項９】
（ａ）ステップ（ｂ）の１つ又は複数の必須遺伝子は直鎖ＤＮＡ（例えば、前記細菌のゲノムＤＮＡの断片）上で提供される、又は
（ｂ）ステップ（ｂ）の１つ又は複数の必須遺伝子は発現ベクター上で提供され、ここで、任意選択で、前記１つ又は複数の必須遺伝子は、（ｉ）形質転換後に細菌染色体中に挿入される組込み発現ベクター上、又は（ｉｉ）形質転換後に染色体外で安定に維持される単一又は低コピー数発現ベクター上で提供され、例えば、形質転換後に染色体外で安定に維持される単一又は低コピー数発現ベクターは、前記細菌の天然染色体の断片を含有するプラスミドの組み合わせ、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）である、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）ステップ（ｂ）の１つ又は複数の必須遺伝子は前記細菌の必須遺伝子のすべて又は所定のサブセットを含む、及び／又は
（ｂ）ステップ（ｂ）の１つ又は複数の必須遺伝子は、前記細菌の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０又は少なくとも３００の必須遺伝子を含む、及び／又は
（ｃ）ステップ（ｂ）の１つ又は複数の必須遺伝子は、トランスポゾン指向性挿入部位配列決定によって前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子を同定するステップを含む方法によって提供される、及び／又は
（ｄ）ステップ（ｂ）の１つ又は複数の必須遺伝子は、
（ｉ）細胞分裂、及び／又は
（ｉｉ）ＤＮＡ複製（例えば、重合又はスーパーコイル形成）、及び／又は
（ｉｉｉ）転写（例えば、プライミング、伸長及び／又は終結）、及び／又は
（ｉｖ）翻訳（例えば：リボソーム構成要素をコードする遺伝子；開始、伸長及び／又は放出に関与している遺伝子）、及び／又は
（ｖ）生合成経路（例えば、ペプチドグリカン及び／又は脂肪酸代謝）、及び／又は
（ｖｉ）プラスミドアディクション（例えば、プラスミド配列の細菌内維持）
に関与している遺伝子から選択される、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）において、
（ａ）ＡｂＲ変異体は、前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子とトランスポゾンとで同時に形質転換される、又は
（ｂ）ＡｂＲ変異体は、まずトランスポゾンで形質転換され、次いで前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子で形質転換される、又は
（ｃ）ＡｂＲ変異体は、まず前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子で形質転換され、次いでトランスポゾンで形質転換され、ここで、任意選択で、ＡｂＲ変異体は、まず、（ｉ）前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子と、（ｉｉ）１つ又は複数のトランスポゾン反復配列と、を含む染色体外要素（例えば、プラスミド又はＢＡＣ）で形質転換され、次いで、（ｉ）トランスポサーゼをコードする遺伝子と、（ｉｉ）逆方向反復トランスポサーゼ認識部位と、を含むトランスポゾン送達プラスミドで（例えば、ドナー細菌との接合によって）形質転換され、染色体外要素の１つ又は複数のトランスポゾン反復配列は、トランスポゾン送達プラスミドによって送達されるトランスポゾンに対するトランスポゾン免疫性を付与する、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において使用するためのトランスポゾン送達プラスミドであって、トランスポゾン送達プラスミドは、（ｉ）トランスポサーゼをコードする遺伝子と、（ｉｉ）逆方向反復トランスポサーゼ認識部位と、を含み、任意選択で、トランスポゾン送達プラスミドはキットに含まれ、例えば、キットは、（ｉ）細菌の１つ又は複数の必須遺伝子と、（ｉｉ）１つ又は複数のトランスポゾン反復配列と、を含むプラスミド又はＢＡＣを任意選択でさらに含み、反復配列は、トランスポゾン送達プラスミドによって送達されるトランスポゾンに対するトランスポゾン免疫性を付与する、プラスミド。
【請求項１３】
（ａ）活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）でのトランスポゾン突然変異誘発によって変異細菌のプールを生成するステップであって、ＴｎＡは、細菌ＤＮＡへのトランスポゾン挿入が挿入部位又はその付近の遺伝子の転写を増大するようなプロモーターを含む、ステップと、
（ｂ）種々の量の前記抗生物質の存在下で変異体プールから細菌を増殖させて２種以上の試験培養物を得るステップと、
（ｃ）試験培養物間でＴｎＡ挿入の分布を比較して、前記細菌において前記抗生物質の標的として機能する推定必須遺伝子を同定するステップと、
をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１及び１３のいずれか一項に記載の方法に従って、前記抗生物質の標的として機能する必須遺伝子を同定するステップを含む、抗生物質の同定方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法を含む、抗生物質の製造方法であって、
任意選択で、
（ａ）前記抗生物質を合成するステップをさらに含む、又は
（ｂ）前記抗生物質を合成するステップと、合成された抗生物質を薬学的に許容される賦形剤と混合して医薬組成物を得るステップと、をさらに含む、
方法。