【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年1月30日(2015.1.30)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】脂肪酸の２−ヒドロキシ誘導体のエナンチオマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸の２ヒドロキシ誘導体のラセミ生成物を合成し、（エナンチオマーＳに相当する）光学異性体［−］と（エナンチオマーＲに相当する）光学異性体［＋］を分離するための方法、それら自体の単離されたエナンチオマー、それらを含む薬効成分、および疾患の処置における薬剤としての使用に言及し、該疾患の共通の病因は、細胞膜の脂質の（どういう始まりであったにせよ）変化、例えば：前記脂質のレベル、組成、または構造の変化、また細胞膜内の脂質の組成および構造の制御によって病状の逆転を誘発することができる疾患の処置の変化、などに基づいている。治療効果は、好ましくは、セラミド：フォスフォコリンコリンホスホトランスフェラーゼ酵素（スフィンゴミエリンのシンターゼまたはＥＣ ２．７．８．２７， ＩＵＢＭＢ Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅとしても知られる）の、あるいはその生成物、スフィンゴミエリン（ＳＭ）のレベルを制御（活性化または阻害）することによって達成される。この酵素の活性およびＳＭ生成、および細胞膜内、腫瘍細胞内でのその蓄積の結果として、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の増加（６００％までの増加）およびジヒドロ葉還元酵素（ＤＨＦＲ）レベルの（９０％以上までの）低下がもたらされる。それ故、ＧＦＡＰとＤＨＦＲの両方は、スフィンゴミエリンのシンターゼ活性またはＳＭ自体によって媒介された疾患の処置のための薬物の治療効果の検出に使用することができる。本発明はまた、前記疾患の検出のためのキットの開発に言及する。
【０００２】
さらに、ＥＣ ２．７．８．２７酵素およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）の両方は、前述の疾患に対する本発明の化合物の効果の分子マーカーとして使用されてもよい。したがって、本発明はまた、前記ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性またはレベル及び／又はＳＭ、ＧＦＡＰまたはＤＨＦＲのレベルの制御の評価に基づいた、これらの疾患の診断／予後のためのインビトロでの方法に加えて、前記診断／予後を行うために特別に設計された手段を含むキットも含む。これらの方法およびキットは、本明細書に言及される分子による処置によって誘発された変化の決定に、または前記処置での上述の分子実体を変更する可能性に基づくであろう。
【０００３】
さらに、ＥＣ ２．７．８．２７酵素及び／又はＳＭは、治療上の標的として使用され得、該治療上の標的に対して、変更した状態を逆転させることができる分子は配向され、故に、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の異常な活性またはＳＭの不十分なレベルの結果として発達してきたであろう又は今後発達するところであり得る、これらの病理過程を処置する。この方法で、両方のＥＣ ２．７．８．２７酵素およびＳＭ自体は、例えば、本発明の脂肪酸の２−ヒドロキシ誘導体の（Ｓとしても知られる）［−］および（形態Ｒに相当する）［＋］のエナンチオマーのように、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性及び／又はＳＭのレベルを制御する能力を有し、治療効果を発揮する分子を得るために、潜在的な化合物に対するスクリーニング選択の過程を設計するための基礎として使用され得る。
【０００４】
したがって、その適用の範囲のために、本発明は、一般に、医療および薬学の分野に含まれ得る。医薬の規制当局が、特定の治療活性を有する化合物の有効性をモニタリングする方法またはキットの存在を必要とするため、前記化合物だけでなく、その合成、その治療上の範囲およびその検出の記述も、本発明の一部と考えられるべきであることを指摘することは重要である。
【背景技術】
【０００５】
細胞膜は、細胞の及びそれらの内部の細胞小器官の実体を定義する構造である。ほとんどの生物学的過程は、細胞膜内で、またはそれらの近位で行われる。脂質は、構造的な役割を果たすだけでなく、重要な過程の活性をも制御する。その上、細胞膜の脂質組成の制御はまた、Ｇタンパク質またはＰＫＣなどの、細胞生理の制御に関係する重要なタンパク質の位置または機能に影響を与える（Ｅｓｃｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｅｓｃｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。これらの研究および他の研究は、重要な細胞機能の制御における脂質の重要性を示す。実際、（とりわけ）癌、循環器疾患、神経変性過程、肥満症、代謝障害、炎症、感染性および自己免疫性疾患などの、多くのヒト疾患は、生体膜中に存在する脂質のレベルまたは組成の変化に関連し、これは加えて、本発明で提示されるものとは異なり、前記疾患を逆転させるために使用され得る膜脂質の組成および構造を制御する、他の脂肪酸での処置の有益な効果を証明している（Ｅｓｃｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。我々が食事ともに摂取する脂質は、細胞膜の脂質組成を制御する（Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。同時に、異なる生理学的および病理学的な状況は、細胞膜に存在する脂質を変化させ得る（Ｂｕｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｅｓｃｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。細胞膜の脂質組成の変化は、細胞のシグナル伝達に影響を与え、疾患を進行させるか、またはそれらを逆転させる（Ｅｓｃｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。
【０００６】
近年にわたって行われてきた異なる研究は、膜脂質が、現在までに割り当てられたものよりもはるかに重要な役割を果たすことを示す（Ｅｓｃｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。この重要性の一例は、様々な温度を有する川に住む魚によって提供され：それらの脂質は、温度が２０℃（夏）から４℃（冬）まで落ちるときに、（細胞膜内の脂質の量およびタイプの）重要な変化を受ける（Ｂｕｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。これらの変化によって、非常に多様な細胞タイプが、その機能を維持することができる。この理由のために、膜脂質が、細胞のシグナル伝達の多数の機構の正確または不正確な機能化を決定することができると言えるであろう。病変した生体が、その細胞が罹患したため罹患するとすれば、膜脂質の変化は、疾患を生じさせかねない。同じ方法で、膜脂質レベルの調整に焦点を置く、治療製剤、栄養補助製剤、または化粧料製剤は、病理過程を防ぐ且つ逆転させる（治療する）ことができる。さらに、多くの研究は、飽和脂肪およびトランス−単不飽和脂肪の消費が、健康の悪化に関連することを示す。血管疾患および腫瘍は、とりわけ、このタイプの脂質に直接関連している（Ｓｔｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。生体の悪化は、これらおよび他のタイプの病気の兆候によって示される。
【０００７】
細胞膜は、選択的な障壁を構成し、これを通って、細胞は、他の細胞およびその周囲と代謝物質および情報を交換する。しかしながら、細胞膜は、細胞レベルで他の重要な機能を発揮する。一方、それらは、重要な生体パラメーターを制御するメッセージの受け取りおよび伝達に関係するタンパク質のための支持として作用する。これらのメッセージは、他のタンパク質を介して細胞の内部に受け取った信号を伝搬する膜タンパク質を、多くのホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子などを介して、活性化させ、これらのいくつかは、細胞膜にも位置する。（１）これらのシステムが増幅のカスケードとして機能する及び（２）膜脂質が前述のタンパク質の位置および機能を制御することができるとすれば、細胞膜の脂質組成は、細胞機能にかなりの影響を及ぼし得る。具体的には、（Ｇタンパク質、キナーゼＣタンパク質、ＲＡＳタンパク質などのような、周辺タンパク質として知られる）特定のタンパク質と細胞膜との相互作用は、同じく脂質組成に依存する（Ｖｏｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｖｏｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。一方、細胞膜の脂質組成は、摂取される脂質の種類および量によって左右される（Ｐｅｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。このことから、脂質の摂取が、細胞膜の脂質組成を制御することができ、これが次々に、重要な細胞のシグナルタンパク質の相互作用（それ故活性）を制御することができると推定される（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。
【０００８】
膜脂質が細胞のシグナル伝達を制御することができるという事実は、膜脂質が細胞の生理学的な状態を制御することもできることを示している。実際、健康に対する脂質の陽性及び陰性の効果の両方は、文書化されている（Ｅｓｃｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｅｓｃｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。予備的研究は、一価不飽和脂肪酸である、２−ヒドロキシオレイン酸が、過体重、高血圧症および癌などの特定の病理学的状態を逆転させることができることを示している（Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｖｏｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。
【０００９】
循環器疾患は、心臓組織および維管束組織を作り上げる細胞の過剰増殖にしばしば関連する。心血管細胞のこの過剰増殖は、心臓血管系の脈管および空洞の内腔上で沈殿を生じさせ、これは、高血圧症、動脈硬化症、虚血、心臓発作などの、様々な疾患をもたらす（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。細胞増殖を回避する薬剤の開発が、実際に、循環器疾患を予防し処置するために提案されている（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【００１０】
肥満症または過体重は、部分的には、これらの過程を制御する機構の変更が原因である、エネルギー摂取とその使用との間のバランスの変化の結果である。一方、この病変は、脂肪組織の細胞である、脂肪細胞の過形成（細胞数の増加）または肥大（そのサイズの増加）に代表される。多くの研究は、両方の遊離ラジカルまたは他の分子の一部として、脂肪酸は、とりわけ、体脂肪、脂質代謝、熱産性、または摂取の量などの、エネルギーホメオスタシスに関連する一連のパラメーターに影響を与えることができると示している（Ｖｏｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。この意味で、脂肪酸の修飾は、エネルギーホメオスタシスおよび、したがって体重を制御するための方策であり得る。実際、本発明は、細胞内の低レベルのＳＭが、増大した細胞増殖にどう関連するか、およびこの変化が、ヒト細胞の病理学的状態に関連することを示す。さらに、本発明に記載される分子を介してＥＣ ２．７．８．２７酵素を制御することによって、病理学的細胞のＳＭレベルが標準化され、そのため、本発明に記載される病理学的−生理学的な変化を逆転することができる。代謝病変との関連で、肥満とは別に、脂質摂取も、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病またはメタボリック症候群などの、他の病理過程が発症するかどうかを決定づける（Ｓｌｏａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。
【００１１】
神経変性過程は、異なる症状を有する一連の疾患を生じさせるが、それらが、中枢神経系及び／又は末梢神経系の細胞の変性によって引き起こされるという共通の特徴を有する。これらの神経変性過程の幾つかは、アルツハイマー病または老人性認知症でのような、患者の認知能力の著しい低下を意味する。他の神経変性過程は、パーキンソン病または異なる型の硬化症でのような、運動技能の変化を引き起こす。最終的に、特定の神経変性病は、失明、難聴、見当識障害、気分動揺などの結果をもたらす過程につながりかねない。
【００１２】
特徴がはっきりした神経変性障害の１つの例は、アルツハイマー病であり、ここで、細胞の外部に蓄積する、不正確に処理された膜タンパク質（ペプチドβ−アミロイドなど）の残りから構成された老人斑、および細胞の内部で現われるタウタンパク質の神経フィラメントの球の形成が観察されている。この過程は、コレステロールの代謝の変化、および結果として生じる細胞膜内のコレステロールのレベルの変化に関連している（Ｓａｇｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。実際、この疾患の進行は、脂質代謝、より具体的には、心臓血管の場合でのような、コレステロール対する変化が記載された、他の疾患に関連する。
【００１３】
一方で、硬化症および他の神経変性過程は、「髄鞘形成不全」に関連し、最終的な結果として、ニューロン軸索のシェルから脂質が喪失され、これが暗示する電気信号を伝搬する過程の変化につながる。ミエリンは、多くのニューロンの軸索のまわりの脂質層であり、神経膠（シュヴァン細胞）中の細胞の原形質膜内の一連の螺旋状のひだによって形成される。このため、脂質が、神経変性病の進行に非常に重要な役割を果たすことは明らかである。その上、修飾されていない天然の多価不飽和脂肪酸が、神経変性過程の進行に対して適度な予防効果を有することが示されてきた（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。
【００１４】
代謝疾患は、特定の分子の蓄積または不足に代表される病変の群を作り上げる。代表例は、標準レベルを超えるコレステロール及び／又はトリグリセリドの蓄積である。全身性（例えば、血漿レベルの増加）および細胞性（例えば、細胞膜内）のレベル両方での、コレステロール及び／又はトリグリセリドのレベルの増加は、幾つかのレベルで機能障害につながる、および、通常、特定の酵素の活性または前記タンパク質の制御の誤りが原因である、細胞シグナル伝達の変化に関連する。主要な代謝病変の中でも、高コレステロール血症（高レベルのコレステロール）および高トリグリセリド血症（高レベルのトリグリセリド）が挙げられる。これらの疾患は、高い発症率、罹病率および死亡率を有するため、それらの処置が最優先事項である。さらに、摂取した脂質は、糖尿病が発症するかどうかを決定づけ得る（Ｓｌｏａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。
【００１５】
特定の疾患に対する特定の不飽和脂肪酸の保護的役割は、異なる研究者によって既に文書化されている。したがって、不飽和脂肪酸は、癌の進行を遅くし、循環器疾患、神経変性病変、代謝病変、肥満症、炎症などの進行に対する陽性効果を有する（Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８； （Ｆｌｏｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２００６））。しかしながら、これらの化合物の薬理活性は、それらの急速な代謝および血液中の不十分な半減期が原因で非常に限定的である。それ故、より遅い代謝を有する不飽和脂肪酸を発達させて、これまでに使用された不飽和脂肪酸と比較して、細胞膜におけるそれらの増加を結果的にもたらす必要性があり、これによって細胞のシグナル伝達のための周辺タンパク質間の相互作用が促進される。本明細書に記載される分子は、元の分子の効果を増強させ、加えて、その迅速な代謝を防ぐ分子修飾とともに、特定の天然の脂肪酸の健康に対する陽性効果を決定づける構造特性に合致しており、その両方の特徴が、その薬理活性を決定するために不可欠である。
【００１６】
細胞膜内の脂質の重要性をより深く掘り下げてみると、スフィンゴ脂質またはスフィンゴリン脂質は、細胞膜内の重要な種類の脂質であり、より複雑な生体の組織で最も豊富である。スフィンゴ脂質の分子は、両親媒性、すなわち、疎水性および親水性の両方を示し、これによって、それらは、生体膜の形成において重要な役割を果たすことができる。グリコスフィンゴ脂質の幾つかは、赤血球の表面上および他の細胞において見られ、抗原として作用し、血液群を確立する。
【００１７】
スフィンゴ脂質は、細胞のシグナル伝達において実行する役割のために、生物学的に非常に重要である。正確には、ＳＭは、すべての生体の細胞膜で豊富な一種のスフィンゴ脂質である（Ｈｕｉｔｅｍａｅｔ ａｌ．， ２００４）。それは、主に、原形質膜の外部の単層で見られ、ここで、それは、細胞のシグナル伝達において重要な役割を有する細胞膜の特殊な部分である、脂質ラフトとして知られるマイクロドメインの形成において不可欠な機能を有し、なぜなら、これらのドメインにおいて、脂質に対するそれらの結合に由来する近似のおかげで相互作用するタンパク質が濃縮するからである（Ｓｉｍｏｎｓ ｙ Ｔｏｏｍｒｅ， ２０００）。ＥＣ ２．７．８．２７酵素は、セラミドの主要なヒドロキシル基へのホスホコリンの移動を介するＳＭの合成の原因であり、ＳＭおよび１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を形成する。この酵素は、スフィンゴ脂質およびグリセロリン脂質の代謝において中央の位置を占める。ＥＣ ２．７．８．２７は、ゴルジ装置において、原形質膜内で見られ、その活性も、核膜および染色質において検知された（Ａｌｂｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ＥＣ ２．７．８．２７はまた、セラミドおよびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のレベルを調整し、これらの分子の両方は、順に、アポトーシスおよびオートファジーによるプログラム細胞死の制御因子となっている（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｖａｎ Ｈｅｌｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｔａｆｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。ＳＭの極性頭部は、非常に大きく、（イソプレニル、ファルネシルまたはゲラニルゲラニルの部分のような）分枝型脂質を有する、ＲＡＳのようなタンパク質の固着を妨げるが、（ミリスチン酸またはパルミチン酸のような）飽和脂肪酸の部分との他のタンパク質の固着を助ける。
【００１８】
そのため、細胞膜の正確な機能および構造に対するＥＣ ２．７．８．２７酵素およびＳＭの重要性を考慮すると、および例えば、癌、循環器疾患、肥満症、神経変性および代謝障害などの、様々な疾患の発症を伴う、細胞膜内に位置する脂質の構造的変化と機能的変化との間の関係性を知ると、酵素の異常活性及び／又はＳＭレベルの変化が原因で発生する病変を逆転できるように、この酵素の活性、および結果としてＳＭのレベルを制御することができる化合物を見つけることが非常に重要であろう。Ｓｐａｎｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｇｅｎｃｙ、ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｇｅｎｃｙ（ＥＭＡ）およびｔｈｅ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎなどの、製薬市場の規制当局が、薬剤の効果をモニタリングする方法論の存在を現在要求していることを考慮して、患者が適切な薬物治療を受けることを保証するために、発現または（とりわけ）活性の変化によって化合物の有効性が予測され得る分子の同定が望ましい。したがって、処置の正しい適用を可能にするこれらの発明は、関連する発明であると考えることができる。本発明は、一連の２−ヒドロキシ脂肪酸の誘導体の合成、それらのラセミ体の分離、およびそれらの治療上の適用に言及する。さらに、本発明はまた、その活性の標的である細胞、その活性の記載、およびその上、前記化合物の有効性の決定を可能にするバイオマーカーの他に、その目的に使用される過程の記載を含む。
【００１９】
その上、脂質代謝に関係する他の酵素、例えば、セリン−パルミトイルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ ２．３．１．５０）；またはオレイン酸の合成の要因であるステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ酵素（ＥＣＤ，ＥＣ １．１４．１９．１）の活性を制御することができる化合物を見つけることも重要である。ＥＣ ２．３．１．５０の活性によって生成されたセラミドは、大きな生物学的重要性のある脂質分子である。セラミドに関連する重要な役割は、それが、プログラム細胞死としても知られるアポトーシスの誘発に関係するということである（Ｌｌａｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。アポトーシスは、高度に制御された生物学的過程であり、その機能は、無益な細胞または生体の健康を危険にさらす細胞を除去することである。このように、腫瘍細胞は、しばしば、アポトーシスを回避するために分子の機構を発達させる（Ｌｌａｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。
【発明の概要】
【００２０】
好ましくは、本発明は、細胞内のＳＭのレベルの変化を解消し、その結果、（酵素が、下方発現されるか、または減少した活性を示す場合）活性化によって、または（酵素が、過剰発現されるか、または増加した活性を示す場合）阻害によって、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の発現の変化したレベルを逆転させることができる化合物をもたらし、前記酵素によって合成されたＳＭのレベルの制御を達成し、それ故酵素の調節解除または異常なレベルのＳＭによって引き起こされた病理学的過程を逆転させることに焦点を当てている。
【００２１】
それ故、この目的を達成するために、本発明では、以下の実施例において見られるように、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性、およびそれ故合成されたＳＭのレベルを制御することができる、脂肪酸の２−ヒドロキシ誘導体の［−］および［＋］のエナンチオマーのラセミ体での分子の合成および続く単離の手順を実行した。これらの脂肪酸は、天然の脂肪酸よりも血液中でより長い半減期を示している。実際、本発明は、疾患を処置するための、前記エナンチオマーを含む医薬組成物、および疾患の処置における薬剤としてのそれらの使用に言及し、該疾患の共通の病因は、例えば、これらの脂質のレベル、組成、または構造の変化、およびまた細胞膜の脂質構造および組成の制御が病理学的状態の逆転を誘発し得る疾患の処置の変化のような、（どういう始まりであったにせよ）細胞膜の脂質の変化に基づいている。治療効果は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性及び／又はその生成物、ＳＭのレベルまたはＧＦＡＰ及び／又はＤＨＦＲのレベルも制御（活性化または阻害）することによって、好ましくは達成される。ＥＣ ２．７．８．２７酵素に対して有効な制御に加えて、本発明は、化合物２ＯＨＯＡが、例えばＵ１１８細胞において、脂質代謝に関係する他の酵素の活性を制御することを示す。したがって、ＥＣ ２．３．１．５０酵素を研究した。本発明では、２ＯＨＯＡが、ＥＣ ２．３．１．５０の活性を刺激し（実施例８および図９）、ヒト白血病細胞のプログラム細胞死を誘発することを示している。一方、オレイン酸のレベルの重要な低下が、２ＯＨＯＡによって処置されたＵ１１８細胞の細胞膜内でも見られ、これは、２ＯＨＯＡが、ステアリン酸からのオレイン酸の合成の要因である、ＥＣ １．１４．１９．１酵素の強力な阻害剤であることを示している（実施例９および図１０）。この関連で、ＥＣ ２．７．８．２７およびＥＣ ２．３．１．５０の両方が、同じ型の分子の代謝経路に属することによって相互関係のある、スフィンゴ脂質代謝に対応する酵素であることを指摘することが重要である。一方、ＥＣ １．１４．１９．１酵素は、脂肪酸修飾因子である。他の２つの酵素とのその関連性は、スフィンゴ脂質がそれらの構造において脂肪酸連鎖を常に有しているということである。各脂肪酸が、スフィンゴ脂質に対して異なる特性を提供するために、それらが修飾され得るという事実は、それらの生物学的活性に対する効果を有する。したがって、本明細書に言及される３つの酵素が、密接に関連していると述べることは可能であり、それ故、ただ１つの分子が、３つの酵素の活性を制御することができることは一般的である。
【００２２】
本発明における［−］（異性体Ｓでもある）および［＋］（異性体Ｒでもある）のエナンチオマーは、偏光の偏向の方向によって識別される。もし光学異性体が偏光を右に（時計回りに）回転させると、それは、［＋］印（これは、右旋性の異性体または右旋体である）によって表わされる。しかしながら、もし光学異性体が偏光を左に（反時計回り）回転させると、それは、［−］印（これは、左旋性の異性体または左旋体である）によって表わされる。
【００２３】
具体的には、本発明は、脂肪酸の２−ヒドロキシ誘導体の［−］エナンチオマーが、上に説明されるように、ヒトおよび動物の細胞の細胞膜内で優性であり、脂質二重層の正確な構造化および細胞の機能化にとって不可欠であるスフィンゴリピドである、ＳＭの合成を正に制御する、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性化因子として作用することを示す。したがって、前記［−］エナンチオマーは、これらの病変の処置のための医薬組成物を調製するために使用され得、該病変の共通の病因は、言及されるＥＣ ２．７．８．２７酵素の異常に低い活性が原因である、癌、肥満症、高血圧症、高トリグリセリド血圧、高コレステロール血圧、または糖尿病などの、細胞膜内に位置する脂質に対する構造的な及び／又は機能的な変化である。さらに、ラセミ体は、活性異性体である［−］異性体の活性が、酵素活性を誘発しない［＋］異性体より優性であることを考慮すると、この酵素の活性化因子である。この関連で、ラセミ体の陽性の活性は、新しいＳＭ分子の合成を誘発する活性化が、以前に活性ではなかった酵素分子を静めることができる阻害よりも、この酵素の活性に対して重要であるという事実が原因であると考えられる。いかなる場合も、ラセミ体の活性化能は、［−］エナンチオマーの活性化能より低く、これは、前述のラセミ体のより低い治療活性を説明している。
【００２４】
本発明の実施例から見られ得るように、脂肪酸の２−ヒドロキシ誘導体の［−］エナンチオマーが、（均一量の両方のエナンチオマーを含んでいる）ラセミ化合物と比較して、改善された治療効果を示すと留意することが重要である。その上、脂肪酸の２−ヒドロキシ誘導体の［−］エナンチオマーが、ラセミ化合物および［＋］エナンチオマーより低い毒性および少ない副作用を有していることが強調されるべきである（表３、実施例７を参照）。
【００２５】
さらに、本発明はまた、脂肪酸の２−ヒドロキシ誘導体の［＋］エナンチオマーが、ＳＭの合成を負に制御する、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の阻害剤として作用し、ＥＣ ２．７．８．２７酵素自体の制御に関する研究、またはＥＣ ２．７．８．２７酵素の異常に高い活性、及び／又は例えば、嚢胞性線維症などの、異常に高いレベルのＳＭによって特徴付けられる疾患の処置のために、基礎研究において使用され得ることを示す（Ｓｌｏｍｉａｎｙ ｅｔ ａｌ．， １９８２）。一方で、高レベルのコレステロールおよびトリグリセリドは、重要な心臓血管の変化に関係している。この関連で、コレステロールは、科学文献では「脂質ラフト」または「Ｌｏ」（すなわち液体秩序相）として知られる、非常に秩序のある膜ドメインを形成するために、通常、ＳＭと関連している。コレステロールの増加は、これらの脂質領域の増加を促進し、これは結果的に、異なる循環器疾患、代謝変化または代謝疾患につながりかねない、細胞のシグナル伝達の変化をもたらす。それ故、高コレステロール血圧および高トリグリセリド血圧の場合のＳＭレベルの低下は、血漿および細胞膜内のコレステロールおよびトリグリセリドのレベルを下げるのに役立てることができる。したがって、［＋］エナンチオマーは、前記脂質の血清レベルの低下の他に、細胞内の脂質ラフトの密度の低下を同時発生させるＳＭレベルの低下を誘発するため、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症などの、特定のタイプの障害において保護的役割を果たすであろう。
【００２６】
さらに、ＥＣ ２．７．８．２７酵素が、ＳＭの合成、およびそれ故、細胞膜の正確な構造および機能化の要因であるとすれば、酵素およびＳＭ自体の両方は、細胞膜の変化に基づいて疾患のインビトロの診断及び／又は予後のための方法を実行するために使用される分子マーカーと見なされ得る。前記変化は、自然発生ではなく、むしろ、本明細書に記載される化合物の活性によって生じる。さらに、本発明の化合物がまた、ＧＦＡＰ及び／又はＤＨＦＲのタンパク質のレベルを制御することを証明することができた。結果として、本発明はまた、正常レベルに対するＤＨＦＲおよびＧＦＡＰのタンパク質の変化したレベルに関係する病変などの診断または予後を実行するための方法／キットにも言及する。前記キットは、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性及び／又はＳＭ、ＧＦＡＰまたはＤＨＦＲのレベルを評価することができ、患者の処置の有効性をモニタリングするための方法としての前記診断／予後を実施することができる試薬または手段を含む。
【００２７】
この理由のために、前記ＥＣ ２．７．８．２７酵素及び／又はその生成物、ＳＭは、治療上の標的として見られ得、そこで、酵素の活性及び／又はＳＭのレベルを制御することができる分子を配向し、そのため、酵素の活性またはＳＭ、ＧＦＡＰまたはＤＨＦＲのレベルの変化の結果として発達してきたであろう又は今後発達し得る、これらの病理過程を逆転させる。それ故、例として、本発明での［−］エナンチオマーは、その機能が通常レベルのＳＭを回復させるように不足している病理過程でのその酵素の機能を活性化させることによる、治療上の標的としてのＥＣ ２．７．８．２７酵素の起こり得る使用を例証する役割を果たす。一方、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性及び／又はＳＭのレベル、及び／又はＧＦＡＰのレベル及び／又はＤＨＦＲのレベルの測定はまた、本発明での［−］および［＋］のエナンチオマーのように、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性及び／又はＳＭのレベル、及び／又はＧＦＡＰのレベル及び／又はＤＨＦＲのレベルを制御することができるはずであり、それ故、病理過程を逆転させることができる、他の分子を得るために、候補化合物のためのスクリーニング過程を実行するのに有用であろう。
【００２８】
結果的に、本発明は、炭素（Ｃ）原子の総数が２０以下である、少なくとも１つの二重結合を有する脂肪酸、およびラジカル置換基、特に炭素２（またはα炭素）上のヒドロキシラジカル（ＯＨ）のような、唯一の（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ）構造的な特性を有する化合物を選択する特定の重要性を示す。
【００２９】
正確に言えば、本発明は、以下の式Ｉの［−］および［＋］のエナンチオマーである化合物に関する：
【００３０】
【化１】
2014530806.tif 000001
【００３１】
式中、ａ、ｂおよびｃは、０と６の間の独立した値をとり、分子中の炭素の総数が≦２０であると留意されたい。
【００３２】
さらに、本発明の好ましい治療上の形態は、ラセミ体より先んじて、ＥＣ ２．７．８．２７酵素のための最も有効な形態であることが示される、式Ｉの（立体配置Ｓに相当する）［−］エナンチオマー、およびＥＣ ２．７．８．２７酵素の阻害剤であると示される、式Ｉの（立体配置Ｒに相当する）［＋］エナンチオマーである。
【００３３】
好ましい実施形態として、本発明は、特に、以下のａ、ｂおよびｃの値を有する式Ｉの［−］および［＋］のエナンチオマーに関する：
【００３４】
【表１】
2014530806.tif 000002
【００３５】
本発明の特に好ましい実施形態は、本発明の目的のための［＋］２ＯＨＯＡとして言及される、以下の式の［−］エナンチオマーに関する。
【００３６】
【化２】
2014530806.tif 000003
【００３７】
本発明における別の特に好ましい実施形態は、本発明の目的のための［＋］２ＯＨＯＡとして言及される、以下の式の［＋］エナンチオマーに関する。
【００３８】
【化３】
2014530806.tif 000004
【００３９】
例として、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の欠乏によって、およびそのため、細胞膜内の異常に低いレベルのＳＭによって特徴付けられる、および本発明の［−］エナンチオマーによって処置され得る疾患は、以下を含む：
・  癌：前立腺癌、乳癌、膵臓癌、白血病、子宮癌、結腸癌、脳癌、肺癌、悪性黒色腫および肝臓癌（表２を参照）。
・  血管病変：高血圧症、動脈硬化症、心筋症、血管新生、心臓の過形成など。
・  代謝病変：糖尿病、メタボリック症候群または肥満症。
・  他の病変：髄病変、アルツハイマー病、硬化症、蜂巣炎など。
【００４０】
そのため、より具体的には、本発明の第一実施形態は、以下の式Ｉの化合物の［−］または［＋］のエナンチオマー、及び／又はその薬学的に許容可能な塩に関する：
【００４１】
【化４】
2014530806.tif 000005
【００４２】
ａ、ｂおよびｃは、０と６の間の独立した値をとり得ることを特徴とし、但し、分子中の炭素の総数が≦２０であることが条件である。本発明の好ましい実施形態では、化合物は、ａ、ｂおよびｃに対する値の以下の組み合わせの少なくとも１つの選択から生じる：ａ＝６、ｂ＝１ 、およびｃ＝６；ａ＝６、ｂ＝１ 、およびｃ＝４；ａ＝６、ｂ＝２ 、およびｃ＝３；ａ＝６、ｂ＝３ 、およびｃ＝０；およびａ＝３，ｂ＝３、およびｃ＝３。
【００４３】
さらに、本発明の好ましい実施形態は、以下の式の化合物に関する：
【００４４】
【化５】
2014530806.tif 000006
【００４５】
例として、過剰なＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性によって、および結果的に、細胞膜内の異常に高いレベルのＳＭによって特徴付けられる、および本発明の［＋］エナンチオマーによって処置または予防され得る、疾患は、嚢胞性線維症、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症である。
【００４６】
本発明の別の特に好ましい実施形態は、以下の式の化合物に関する：
【００４７】
【化６】
2014530806.tif 000007
【００４８】
本発明の第２実施形態は、病変の処置及び／又は予防用の医薬組成物の調製のための以前に言及された化合物の少なくとも１つの使用に関し、該病変の共通の病因は、一般に細胞における、および特に細胞膜における、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の調節解除による細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化及び／又はＳＭのレベルまたは濃度、ＧＦＡＰのレベル又はＤＨＦＲのレベルの構造的な及び／又は機能的な変化である。
【００４９】
その上、本発明は、病変の処置及び／又は予防における使用のための前述の化合物の少なくとも１つを包含し、該病変の共通の病因は、一般に細胞における、特に細胞膜における、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の調節解除による細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化及び／又はＳＭのレベルまたは濃度、ＧＦＡＰのレベル又はＤＨＦＲのレベルの構造的な及び／又は機能的な変化を示す。
【００５０】
本発明はさらに、前述の化合物、および随意に、薬学的に許容可能なビヒクルの少なくとも１つを含む、医薬組成物自体に関する。したがって、本発明での化合物は、独立して投与され得るか、または例えば、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、被覆剤、甘味料、香味料、着色剤、輸送体など、およびこれらの組み合わせなどの、賦形剤を組み合わせる医薬組成物中で製剤され得る。同時に、本発明での化合物は、他の活性成分と組み合わさって医薬組成物の一部を形成することができる。
【００５１】
本発明での化合物を薬剤とし使用するために、その投与は、上述される形態で、または例えば、メチル、エチル、リン酸塩、エステル、エーテル、アルキルの形態の他のラジカルなどの他の任意の薬学的に許容可能な形態で、例えば、経腸的に（消化系によって）、経口で（丸剤、カプセル剤またはシロップ剤によって）、直腸によって（浣腸剤、または坐剤によって）、局所的に（クリーム剤または硬膏剤によって）、吸入によって、非経口注射によって、静脈注射によって、筋肉注射によって、または皮下注射によってなどの、任意の形態で実行され得る。
【００５２】
好ましい実施形態では、本発明は、病変の処置及び／又は予防用の医薬組成物の調製のための化合物［−］ＨＯＯＣ−ＨＯＣＨ−（ＣＨ２）６−（ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２）１−（ＣＨ２）６−ＣＨ３の使用に関し、該病変の共通の病因は、細胞膜内の、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の欠乏、及び／又は異常に低いレベルのＳＭ、異常に低いレベルのＧＦＡＰ、または異常に高いレベルのＤＨＦＲによる細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化であり；好ましくは、癌、好ましくは、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、白血病、子宮癌、結腸癌、脳癌、肺癌、悪性黒色腫および肝臓癌；血管病変、好ましくは、高血圧症、動脈硬化症、心筋症、血管新生、心臓の過形成または代謝病変；代謝病変、好ましくは：糖尿病、メタボリック症候群または肥満症、の中から病変を選択する。
【００５３】
同様に、本発明は、病変の処置及び／又は予防における使用のための化合物［−］ＨＯＯＣ−ＨＯＣＨ−（ＣＨ２）６−（ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２）１−（ＣＨ２）６−ＣＨ３に関し、該病変の共通の病因は、細胞膜内の、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の欠乏、異常に低いレベルのＳＭ、異常に低いレベルのＧＦＡＰ、または異常に高いレベルのＤＨＦＲによる細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化であり、該病変は、癌、好ましくは、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、白血病、子宮癌、結腸癌、脳癌、肺癌、悪性黒色腫および肝臓癌；血管病変、好ましくは高血圧症、動脈硬化症、心筋症、血管新生、心臓の過形成、あるいは代謝病変；代謝病変、好ましくは：糖尿病、メタボリック症候群または肥満症、の中から好ましくは選択される。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、本発明は、病変の処置及び／又は予防用の医薬組成物の調製における以下の式の化合物の使用に関し、該病変の共通の病因は、細胞膜内の、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の過剰な活性、異常に高いレベルのＳＭ、異常に高いレベルのＧＦＡＰ、または異常に低いレベルのＤＨＦＲによる細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化であり：
【００５５】
【化７】
2014530806.tif 000008
【００５６】
該病変は、例えば、嚢胞性線維症、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症である。
【００５７】
同様に、本発明は、病変の処置及び／又は予防における使用のための以下の式の化合物に関し、該病変の共通の病因は、細胞膜内の、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の過剰な活性、細胞膜内の異常に高いレベルのＳＭ、異常に高いレベルのＧＦＡＰ、または異常に低いレベルのＤＨＦＲによる細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化であり、該病変は、例えば、嚢胞性線維症、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症である：
【００５８】
【化８】
2014530806.tif 000009
【００５９】
本発明の第３態様は、病変の処置及び／又は予防のための方法に関し、該病変の共通の病因は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の調節解除による細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化、ＳＭのレベル、ＧＦＡＰのレベル及び／又はＤＨＦＲのレベルの構造的な及び／又は機能的な変化であり、該方法は、治療上有効な量の少なくとも１つの以前に言及した化合物またはそれらを含む組成物を患者に投与する工程を含む。好ましい実施形態では、本発明は、病変を処置及び／又は予防するための方法に関し、該病変の共通の病因は、細胞膜内の、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の欠乏、及び／又は異常に低いレベルのＳＭによる細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化であり、該方法は、治療上有効な量の化合物［−］ＨＯＯＣ−ＨＯＣＨ−（ＣＨ２）６−（ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２）１−（ＣＨ２）６−ＣＨ３またはそれを含む組成物を患者に投与する工程を含む。好ましい実施形態では、病変は、好ましくは、癌、好ましくは、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、白血病、子宮癌、結腸癌、脳癌、肺癌、悪性黒色腫および肝臓癌；血管病変、好ましくは：高血圧症、動脈硬化症、心筋症、血管新生、心臓の過形成または代謝病変；代謝病変、好ましくは：糖尿病、メタボリック症候群または肥満症から選択される。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、病変を処置及び／又は予防するための方法に関し、該病変の共通の病因は、細胞膜内の、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の過剰な活性、及び／又は異常に高いレベルのＳＭによる細胞膜の構造的な及び／又は機能的な変化であり、該方法は、治療上有効な量の化合物［−］ＨＯＯＣ−ＨＯＣＨ−（ＣＨ２）６−（ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２）１−（ＣＨ２）６−ＣＨ３またはそれを含む組成物を投与する工程を含む。好ましい実施形態では、病変は、例えば、嚢胞性線維症、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症である。
【００６１】
本発明の目的のために、「治療上有効な量」は、疾患を逆転させるか、または副作用なしでそれを予防する量として理解される。「治療上有効な量」はまた、処置されている疾患が、非常に重症かまたは致死的な疾患であるときに、著しい治療効果をもたらしながら、許容可能なレベルの毒性を有する量として理解される。
【００６２】
本発明の第４実施形態は、病変を処置及び／又は予防するのに有用である候補化合物を選択するためのインビトロでの方法に言及し、該病変の共通の病因は、細胞膜内の構造的な及び／又は機能的な変化であり、該方法は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性に対してもたらされた変化、ＳＭのレベル、ＧＦＡＰのレベルの、または前記候補化合物がある状態でのＤＨＦＲのレベルの評価を含む。すなわち、本発明は、治療上の標的としての、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の使用、またはＳＭ、ＧＦＡＰまたはＤＨＦＲの使用を含み、活性またはそのレベルを変更することができる治療上のツールを設計する目的で（例えば図５）、該治療上の標的にて、上に記載される病変を処置及び／又は予防するように化合物を配向する。
【００６３】
本発明の第５実施形態は、病変の診断／予後のためのインビトロでの方法に関し、該病変の共通の病因は、細胞膜内に位置する脂質の構造的な及び／又は機能的な変化であり、該方法は、細胞膜内または他の細胞区画における、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の調節解除、及び／又はＳＭ、ＧＦＡＰ、またはＤＨＦＲの異常なレベルの存在を決定づけることを含む。すなわち、本発明は、上に記載される病変の予後及び／又は診断を可能にする分子マーカーとして、ＥＣ ２．７．８．２７酵素、またはＳＭ、ＧＦＡＰまたはＤＨＦＲの使用を含む。細胞膜の構造および活性におけるＳＭの重要性、およびこのリン脂質の生成の要因となる酵素ＥＣ ２．７．８．２７の重要性は、組織、血漿、脳脊髄液、尿及び／又は他の体液における両方の細胞の濃度／活性の検出することであり、これは例えば、癌、高血圧症、肥満症および代謝疾患などの、本発明に含まれる異なる病変を検知、分析およびモニタリングするためのキットの準備に利用され得る。この理由で、ＳＭだけでなく、ＥＣ ２．７．８．２７酵素、ＤＨＦＲおよびＧＦＡＰも、ヒト疾患を検出するためのバイオマーカーを構成し、上で言及されるように、ヒトのための新しい治療薬を設計するための治療上の標的である。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明は、病変の予後／診断のためのインビトロでの方法に関し、該病変の共通の病因は、細胞膜内に位置する脂質の構造的及び／又は機能的な変化であり、該方法は、細胞膜内のＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の欠乏、異常に低いレベルのＳＭ、細胞膜内の異常に低い細胞レベルのＧＦＡＰまたは異常に高い細胞レベルのＤＨＦＲの存在を決定づけることを含み、これによって、該病変を、好ましくは、癌、好ましくは、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、白血病、子宮癌、結腸癌、脳癌、肺癌、悪性黒色腫および肝臓癌；血管病変、好ましくは、高血圧症、動脈硬化症、心筋症、発作、血管新生、心臓の過形成または代謝病変；代謝病変、好ましくは：糖尿病、メタボリック症候群または肥満症の中から好ましくは選択する。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、本発明は、病変の予後／診断のためのインビトロでの方法に関し、該病変の共通の病因は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の過剰な活性、細胞膜内の異常に高いレベルのＳＭ、異常に低いレベルのＧＦＡＰまたは異常に高いレベルのＤＨＦＲの存在を決定づけることを含む、細胞膜内に位置する脂質に対する構造的な及び／又は機能的な変化であり、ここで、病変は、好ましくは、嚢胞性線維症、高トリグリセリド血症および高コレステロール血症である。
【００６６】
本発明の第６実施形態は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性、細胞膜内のＳＭのレベル、ＧＦＡＰのレベル／活性及び／又はＤＨＦＲのレベル／活性を決定づけるための有用な手段を含む、上に記載される予後／診断の方法に使用するためのキットに関する。前記有用な手段は、技術的なＴＬＣおよびＨＰＴＬＣ、ガスクロマトグラフィー、画像分析、吸収分光学法または蛍光分光学法、光学蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、免疫ブロット法、免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡまたは類似した技術（ＲＩＡ、ドット／スロットブロット、ＥＩＡなど）を含む。
【００６７】
好ましい実施形態では、キットは、予後／診断が、直接的なスフィンゴミエリンレベルの定量化、及び／又はその前駆体（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、セラミドなど）またはその誘導体（例えばスフィンゴリピド）によるその間接的な定量化を介して行われるという点で特徴づけられる。好ましくは、前駆体は、セラミドであり、誘導体は、ＮＢＤ−ＣｅｒまたはＮＢＤ−ＳＭであり、間接測定は、ライセニンによって行われる。
【００６８】
本発明の別の態様は、ラセミ化合物の合成、および下記の工程を含む、本発明の分子のエナンチオマーを単離する且つ精製する方法に関する：
１．ラセミ生成物を生成するための不飽和脂肪酸の酸性媒体中のヒドロキシル化。
２．ラセミの２−ヒドロキシ脂肪酸の、そのナトリウム塩形態での再結晶および沈澱による精製。
３．好ましくは１０％での、そのナトリウム塩形態での２−ヒドロキシ脂肪酸と、エタノール中の硫酸の溶液とのラセミ混合物のエステル化。
４．２５℃でｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ａｍａｎｅ Ｌｉｐａｓｅ，ｃａｓ＃９００１−６２−１）のリパーゼによって触媒された、エステルのエナンチオ選択的加水分解。
５．液体クロマトグラフィーによる反応の進行のモニタリング。
６．２未満のｐＨまで希釈されたＨＣｌとの混合物の加水分解。
７．メチル−三級ブチル−エーテル（ＭＴＢＥ）における生成物の抽出および有機相の洗浄。
８．酸とエステルの混合物を有する原料を得るための真空下での溶媒の除去。
９．酸とエステルの前者を水晶化することによる分離。
１０．酸の場合に工程１に戻り、所望のエナンシオメトリ−純度が得られるまで（９７．５％の所望されるエナンチオマーおよび２．５％の望まれないエナンチオマーと一致する、９５％のエナンシオメトリ−過剰）、各々の単離した画分（酸とエステル）の再処理を始めるためのエステルの場合に工程２に戻る。
【００６９】
２つの２ＯＨＯＡエナンチオマーの分離および単離は、現在まで知られていない。特に［−］エナンチオマーを分離する技術的困難が原因で、これは、現在まで実行できていない。
【００７０】
本発明はまた、同じ細胞過程または関連する細胞過程に作用する、本発明の化合物、または他の化合物の効果によって病的細胞上で生成された細胞の変化をモニタリングし、患者において影響を受けた細胞の治療または改善をもたらすための、インビトロでの方法に関する。すなわち、本発明は、分子マーカーとして、ＥＣ ２．７．８．２７酵素またはＳＭ、ＧＦＡＰまたはＤＨＦＲの使用を含み、本発明の分子による処置によって誘発されたその変化によって、患者が処置に反応しているかどうかを知り、それ故、その有効性および維持されるべき期間を決定づけることが可能となる。これらの方法によってまた、患者が本発明の分子による処置に反応する可能性を有しているかどうかを予測することが可能となり、それ故、これらの方法は、上述の病変の診断及び／又は予後を行うために使用され得る。膜組成の変更、および特にＳＭレベルの膜組成の変更が、ＧＦＡＰおよびＤＨＦＲのタンパク質のレベルの変化を誘発するとすれば、本発明の好ましい態様は、本発明の分子またはモニタリングされる病理学的細胞に対する類似した効果を有する他の分子によって誘発された変化を可能にする方法に関する。それ故、ＳＭ、ＥＣ ２．７．８．２７酵素、ＧＦＡＰ及び／又はＤＨＦＲの使用は、適用される治療が、そのレベルまたは活性を変化させ得る可能性を与えている。この決定の目的は、（１）潜在的に非反応性の患者が無効性の治療に従うことを防ぐために処置の有効性を予測すること、および（２）患者が治療に反応するかを確認するための、および処置段階によって、また前記処置段階の期間および全体としての処置自体によって、どの用量を送達するかを知るために、患者の発展を知ることである。これらの態様が、不必要な医薬的消費を回避するために、および最も起こり得る合理的な治療を適用することを可能にするために重要であるため、大きな医薬の規制当局は、本明細書に記載されるように、バイオマーカーおよび診断システムの存在を要求する。
【００７１】
同様に、本発明は、上述の病変に苦しむ患者を処置するための方法に関し、該方法は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の前記調節解除の存在、それら自体の、ＳＭのレベル、ＧＦＡＰのレベル、またはＤＨＦＲのレベルの存在、および本発明の化合物による前記調節解除を示す患者の処置の決定づけを含む。
【００７２】
さらに、本発明は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素中の前記調節解除の存在、ＳＭのレベル、ＧＦＡＰのレベル、またはＤＨＦＲのレベルの存在の決定づけを含む、本発明に記載される病変を有する患者のために治療を選択するための方法に関し、該選択は、前記決定づけに基づき、治療の選択は本発明の化合物に基づいている。
【００７３】
以下の定義が、本発明を例証する目的で含まれる：
・  ＥＣ ２．７．８．２７酵素の高い／低い活性：細胞膜内の、それぞれ、高いまたは低いレベルのＳＭの出現を結果的にもたらす酵素活性。
・  高／低レベルのスフィンゴミエリン：低レベルのスフィンゴミエリンは、細胞膜内の総リン脂質の１５％未満のレベルであることが考えられる。高レベルのスフィンゴミエリンは、総リン脂質に関して、このリン脂質の１５％以上のレベルであることが考えられる。
・  高／低レベルのＧＦＡＰ：高レベルのＧＦＡＰは、タンパク質の総ミリグラムに関して、グリア細胞で存在する標準レベルの２倍以上のレベル（≧２００％）であることが考えられる。低レベルのＧＦＡＰは、タンパク質の総ミリグラムに関して、グリア細胞で存在する標準レベルの半分以下のレベル（≦５０％）を包含するレベルであることが考えられる。
・  高／低レベルのＤＨＦＲ：高レベルのＤＨＦＲは、タンパク質の総ミリグラムに関して、どのようなタイプであれ、休止細胞で存在する標準レベルの２倍以上のレベル（≧２００％）であることが考えられる。低レベルのＧＦＡＰは、タンパク質の総ミリグラムに関して、どのようなタイプであれ、休止細胞で存在する標準レベルの半分以下のレベル（≦５０％）を包含するレベルであることが考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】化合物２ＯＨＯＡは、異なるヒト大脳癌細胞株（Ｕ１１８、ＳＦ７６７および１３２１Ｎ１）、ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）、およびヒト白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）において、ＳＭの合成の著しい増加を誘発するが、非腫瘍細胞（ヒト肺ＭＲＣ５の線維芽細胞）においてはそうではない。同時に、これらの及び他の腫瘍株に対する抗腫瘍の効果が研究された（表２を参照）。細胞は、２００μＭの濃度で、２４時間、ビヒクル（５％のエタノールを有する水、対照）によって、または化合物２ＯＨＯＡによって処置された。縦軸の値は、未処置の細胞（対照）のレベルと比較した総脂質のパーセンテージとして、クロマトグラフ過程によって（ＴＬＣまたはＨＰ−ＴＬＣ後に、分光学的決定および画像分析による定量化）測定された、ＳＭレベル（総リン脂質のパーセント）の平均±ＥＳＭ（多くの実験ｎ＝３−５に対する標準誤差の平均）を表わす。腫瘍細胞において測定されたＳＭのレベルは、正常細胞におけるレベルより著しく低く、化合物２ＯＨＯＡのみが、癌細胞において著しい変化を誘発した。これらの結果は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素が、癌の処置の治療上の標的、適用される治療の間に、病変およびその発達をモニタリングするためのバイオマーカーであること、およびまた化合物２ＯＨＯＡが、この酵素の活性因子であり、癌細胞で示される低いレベルのＳＭを逆転させることを示している。上に記載される酵素活性およびＳＭのレベルを測定するための技術に加えて、ガスクロマトグラフィー、共焦点の顕微鏡法、蛍光分光学法などの非常に類似した結果につながる他の技術も試験されてきた。
【図１Ｂ】ビヒクル（対照）、または２ＯＨＯＡ（２００μＭ）によって処置された、ヒトグリオーマ細胞Ｕ１１８内のライセニンの結合による細胞のＳＭのタグ付けを示す共焦点の顕微鏡法の画像。腫瘍細胞では、細胞膜内のＳＭの量が不十分であり、２ＯＨＯＡによる処置が、細胞膜内のＳＭの量の劇的な増加を誘発することを認識することができ、これは、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性化の明確な指標である。さらに、この実験は、細胞のＳＭレベルの増加が、主として、腫瘍細胞の原形質膜内での蓄積が原因であることを明らかに示している。
【図１Ｃ】上のパネル：ＳＭ（左：Ａｌｅｘａ４８８の蛍光体で示された抗体によってモニタリングされたライセニン）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（中央：Ｈｏｅｃｈｓｔ）による核ＤＮＡ、またはその両方（右、融合）の免疫細胞科学的な技術による特定の標識化。図は、１日当たり６００ｍｇ／ｋｇまたは１日当たり９００ｍｇ／ｋｇ（経口、５０日）で、ビヒクル（対照）または［−］２ＯＨＯＡによって処置された、免疫抑制されたマウスにおいて形成された、ヒト肺腫瘍部分（Ａ５４９細胞）に対応している。これらの結果は、［−］２ＯＨＯＡによる処置の誘発後に、ＳＭのレベルが、どれほど著しく増加するかを明確に示すが、前記腫瘍においては本来増加しない。中央のパネル：ヒト肺癌に感染したマウス（Ａ５４９）において進行し、［−］２ＯＨＯＡ（１日当たり６００ｍｇ／ｋｇ、経口で、５０日）によって処置された、１切れの腫瘍中に存在する細胞における、ＳＭ（左）、核ＤＮＡ（中央）、またはその両方（右）の標識化の詳細。画像は、ＳＭの増加と平行する、細胞死の開始の明確な指標である、核ＤＮＡの損失を示す。下のパネル：縦軸は、５０日間にわたる（経口で）、１日当たり６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ６００）または１日当たり９００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ９００）でビヒクル（対照）または２ＯＨＯＡによって処置された動物からの、上のパネルに示される腫瘍の部分における共焦点の顕微鏡法（平均±平均標準誤差）による蛍光強度（恣意的な単位）の定量化を表わす。＊＊＊ ｐ＜０．００１。
【図１Ｄ】蛍光分光学法によるＳＭのレベルの決定。ＳＭの異なる内容物を有するモデル膜（リポソーム）は、最初、ライセニンの存在下でインキュベートされ、その後、抗ライセニンの抗体は、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光体によって標識化された。細胞膜（ＳＭレベル）に結合された蛍光体は、３０分間８０，０００ｘｇでの遠心分離によって結合されなかったものから分離された。ペレットは、洗浄剤（１％のドデシル硫酸ナトリウム）によって培地中で再懸濁され、蛍光は、ＳＭ（横軸）の濃度に応じて、各ペレット（縦軸）において定量化された（沈澱物中の恣意的な単位）。抗体またはライセニンに結合する任意の蛍光体は、この脂質の検出のために利用され得る。
【図２Ａ】化合物２ＯＨＯＡは、ＳＭの合成の、その濃度および処置の期間に依存した増加を誘発する。縦軸の値は、未処置の対照（ｎ＝３−５）と比較した、ＳＭのレベル（総リン脂質のパーセント）の平均±標準誤差を表わす。ＳＭレベルは、薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ、高性能薄層クロマトグラフィー）によって測定され、画像分析またはガスクロマトグラフィーによってモニタリングされた：Ａ．  異なる期間（２、６、１２、２４、４８および７２時間）の２００μＭの２ＯＨＯＡ濃度で処置されたヒトグリオーマＵ１１８の癌細胞。白いバーは、ビヒクル（対照）によって処置された細胞に相当する。
【図２Ｂ】化合物２ＯＨＯＡは、濃度および処置の期間に依存してＳＭの合成の増加を誘発する。 縦軸の値は、未処置の対照（ｎ＝３−５）と比較した、ＳＭのレベル（総リン脂質のパーセント）の平均±ＥＳＭを表わす。 ＳＭレベルは、薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ、高性能薄層クロマトグラフィー）および画像分析またはガスクロマトグラフィーによって測定された：Ｂ．  異なる２ＯＨＯＡ濃度（２５−４００μＭ）で２４時間処置されたＵ１１８細胞。
【図３】化合物２ＯＨＯＡは、核ＳＭの増加を誘発する。Ｕ１１８癌細胞は、２００μＭの濃度でビヒクル（対照）または２ＯＨＯＡによって２４時間処置された。縦軸の値は、未処置の対照（１００％）と比較した、ＳＭのレベルの平均±ＥＳＭ（ｎ＝３−５）を表わす。
【図４Ａ】化合物２ＯＨＯＡは、ＥＣ ２．７．８．２７酵素に対して直接作用する。図４Ａでは、すべての場合において、２ＯＨＯＡ（黒いバー）のある状態またはない状態（対照、白いバー）で、この酵素ＮＢＤ−Ｃｅｒ（ニトロ−ベンゾオキサジアゾール−イル）セラミドの蛍光基質とのインキュベーションによって、細胞または細胞抽出物はインキュベートされた。その後、脂質は抽出され、ＨＰＴＬＣ（高性能薄層クロマトグラフィー）によるＮＢＤ−ＳＭの形成のレベルが測定された。値は、平均±標準誤差（ｎ＝３−５）として縦軸上で示される。Ａ．  ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性のインビボでの実験：４時間ＮＢＤ−ＣｅｒによってＵ１１８細胞はインキュベートされ、次に、異なる期間（５、１５、６０分および２４時間）、化合物２ＯＨＯＡ（２００μＭ）によって処置された。その後、細胞は均質化し、ＮＢＤ−ＳＭに対するフルオロフォアＮＢＤ−Ｃｅｒの代謝が測定された。
【図４Ｂ】化合物２ＯＨＯＡは、ＥＣ ２．７．８．２７酵素に対して直接作用する。 図４Ｂでは、すべての場合において、２ＯＨＯＡ（黒いバー）のある状態またはない状態（対照、白いバー）で、この酵素ＮＢＤ−Ｃｅｒ（ニトロ−ベンゾオキサジアゾール−イル）セラミドの蛍光基質とのインキュベーションによって、細胞または細胞抽出物はインキュベートされた。その後、脂質は抽出され、ＨＰＴＬＣ（高性能薄層クロマトグラフィー）によるＮＢＤ−ＳＭの形成のレベルが測定された。値は、平均±標準誤差（ｎ＝３−５）として縦軸上で示される。Ｂ．  細胞抽出物におけるＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性のインビトロでの実験であり、ここで、細胞を死滅させた後の、酵素の活性が測定された。この実験は、化合物２ＯＨＯＡが直接的な相互作用によってＥＣ ２．７．８．２７酵素を活性化することができることを示す。これらの実験に関して、均質化された細胞は、２時間、化合物２ＯＨＯＡ（２００μＭ）およびＮＢＤ−Ｃｅｒによってインキュベートされた。
【図４Ｃ】化合物２ＯＨＯＡは、ＥＣ ２．７．８．２７酵素に対して直接作用する。 図４Ｃでは、すべての場合において、２ＯＨＯＡ（黒いバー）のある状態またはない状態（対照、白いバー）で、この酵素ＮＢＤ−Ｃｅｒ（ニトロ−ベンゾオキサジアゾール−イル）セラミドの蛍光基質とのインキュベーションによって、細胞または細胞抽出物はインキュベートされた。その後、脂質は抽出され、ＨＰＴＬＣ（高性能薄層クロマトグラフィー）によるＮＢＤ−ＳＭの形成のレベルが測定された。値は、平均±標準誤差（ｎ＝３−５）として縦軸上で示される。Ｃ．  ＥＣ ２．７．８．２７酵素のアイソフォーム１および２の活性に対する化合物２ＯＨＯＡの効果。アイソフォームＥＣ ２．７．８．２７（１）およびＥＣ ２．７．８．２７（２）の活性化は、細胞表面上のその活性のアッセイによって測定された。
【図５】ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性化における構造−機能間の関連性。異なる脂肪酸（２００μＭ、２４時間）によって誘発されたＵ１１８細胞のＳＭの増加。対照：ビヒクル；１８：１ｎ−９（オクタデセン酸）；２Ｍｅ−１８：１ｎ−９（２−メチルオクタデセン酸）；２ＯＨ−１６：１（２−ヒドロキシオクタデセン酸）；２ＯＨ−１８：０（２−ヒドロキシオクタデセン酸）；２ＯＨＯＡ（２ＯＨ−１８：１ｎ−９，２−ヒドロキシオクタデセン酸）；２ＯＨ−１８：２ｎ−６（２−ヒドロキシリノール酸）；２ＯＨ−１８：３ｎ−６（２−ヒドロキシ−γ−リノレン酸）；２ＯＨ−１８：３ｎ−３（２−ヒドロキシ−α−リノレン酸）；２ＯＨ−２０：４ｎ−６（２− ヒドロキシアラキドン酸）；２ＯＨ−２０：５ｎ−３（２−ヒドロキシエイコサペンタエン酸）；２ＯＨ−２２：６ｎ−３（２−ヒドロキシエイコサペンタエン酸）。縦軸の値は、未処置の対照（１００％）と比較された、薄層クロマトグラフィーによって測定された、ＳＭのレベルの平均±標準誤差（ｎ＝３−５）を表わす。２０以上の炭素原子の脂肪酸は、この酵素の活性の著しい変化をもたらさない。炭素２（ＨまたはＣＨ３のような）上の他のラジカルの存在および脂肪酸構造における二重結合の欠如が、不活性の分子に生じた。
【図６Ａ】これは、細胞膜組成の変化が、細胞膜から細胞質までのＲＡＳタンパク質の転位を誘発することを示す。細胞膜内の高いレベルの２ＯＨＯＡおよびＳＭは、細胞膜上のＲａｓタンパク質の固着を妨げる。図は、ビヒクル（対照）または化合物２ＯＨＯＡによる処置の１０分（共焦点１）および２４時間（共焦点２）後の、ヒトグリオーマ細胞（ＳＦ７６７）の位相コントラスト（Ｐｈ．Ｃ）における光学顕微鏡法の画像、および蛍光で標識化されるＲａｓに対して特異的な抗体を使用する、共焦点の顕微鏡法の画像を示す。
【図６Ｂ】Ｒａｓタンパク質の転位は、Ｒａｆタンパク質の不活性化およびまたシグナル伝達カスケードにおけるＭＥＫタンパク質の続く活性化を、１５０、２００または２５０μＭの２ＯＨＯＡの欠如（対照）または存在下で培養されたＵ１１８細胞の免疫ブロットによって測定された、両方のタンパク質の（活性な）リン酸化型の状態の低下から見られ得るように、妨げる。図６Ｂのパネルにおいて、縦軸は、未処置のＳＦ７６７細胞（対照）に対するリンタンパク質のパーセンテージを示す。横軸は、化合物２ＯＨＯＡの濃度（マイクロモル濃度）を示す。
【図６Ｃ】最終的に、図６Ｂで示される２ＯＨＯＡの濃度で特異抗体による免疫ブロットによって測定もされた、タンパク質マップキナーゼ（ＥＲＫ１およびＥＲＫ２）の活性の状態が劇的に低下する。図６Ｃのパネルにおいて、縦軸は、未処置のＳＦ７６７細胞（対照）に対するリンタンパク質のパーセンテージを示す。横軸は、化合物２ＯＨＯＡの濃度（マイクロモル濃度）を示す。
【図６Ｄ】ＡｋｔおよびＥＧＦＲの活性の状態（リン酸化型のレベル）もまた、２５０μＭの２ＯＨＯＡによるインキュベーション後に減少する。図６Ｄのパネルにおいて、縦軸は、未処置のＳＦ７６７細胞（対照）に対するリンタンパク質のパーセンテージを示す。横軸は、化合物２ＯＨＯＡの濃度（マイクロモル濃度）を示す。
【図６Ｅ】上のパネル：５０日間にわたる（１日当たり６００ｍｇ／ｋｇ、経口で）、２ＯＨＯＡによって処置された無毛のマウスに注入した、ヒトグリオーマ細胞（ＳＦ７６７）に由来する腫瘍におけるＤＨＦＲの発現レベル。左のグラフは、蛍光で標識化された特異抗体を使用して、免疫細胞化学によって測定された、蛍光の平均値（ｎ＝４）を示し、右の写真は、代表的な画像に相当する。下のパネル：ヒト肺癌細胞（Ａ４５９）におけるＤＨＦＲの発現。このグラフの実験条件および詳細のすべては、上のパネルと類似している。これらの結果は、ＤＨＦＲのレベルが本発明の分子による処置に応じて異なり、そのため、このタンパク質の活性またはレベルが、本明細書に記載される化合物または類似した方法で作用する化合物の治療上の有効性をモニタリングするためのバイオマーカーとして利用され得ることを実証している。さらに、ＤＨＦＲレベルが高い腫瘍が、本発明の化合物による処置に十分に反応することができ、そのため、このタンパク質が、脂肪酸に由来するエナンチオマーの起こり得る有効性を予測するのに優れたバイオマーカーであり、および後に、これらの化合物による処置の有効性を示すことが推定される。
【図６Ｆ】左のパネル：免疫ブロット法によって測定された、ヒト腫瘍（グリオーマ）を有する動物の血清中のＧＦＡＰのレベル。無毛のマウスは、ＳＦ７６７細胞に感染され、ビヒクル（グリオーマ）または２ＯＨＯＡ（Ｔ、１日当たり６００ｍｇ／ｋｇ、経口で、２８日）によって処置された。パーセンテージとして表わす、これらの動物の血清中のＧＦＡＰ（写真を参照）からの細分化されたペプチドに対する免疫活性は、腫瘍のない動物および未処置（対照）の動物で見られる免疫活性と比較された。右のパネル：前と同様であるが、６００ｍｇ／ｋｇの２ＯＨＯＡ（経口で）によって、７日間（７ｄ６００）または２８日間（２８ｄ６００）にわたって処置された動物の血清中のＥＬＩＳＡによって測定された。ＧＦＡＰに対する特異抗体は、すべての実験において利用された。これらの結果は、ＧＦＡＰのレベルが本発明の分子による処置に応じて異なり、そのため、このタンパク質のレベルが、本明細書に記載される化合物または類似した方法で作用する化合物の治療上の有効性に従うためのバイオマーカーとして利用され得ることを実証している。さらに、ＧＦＡＰレベルが低い腫瘍が、本発明の化合物による処置に十分に反応することができ、そのため、このタンパク質が、脂肪酸の誘導体のエナンチオマーの起こり得る有効性を予測するのに優れたバイオマーカーであり、および続いて、これらの化合物による処置の有効性を示すことが推定される。幾つかの技術は、ＤＨＦＲおよびＧＦＡＰの測定のために使用され、これは、電気泳動、免疫ブロット法、ＥＬＩＳＡおよび類似した技術ＲＴ−ＰＣＲなどを含む。これらのすべての技術および他の類似した技術は、ＤＨＦＲおよびＧＦＡＰのレベルまたは活性の決定づけにおいて利用され得る。
【図７Ａ】ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性に対する、２ＯＨＯＡの＋／−ラセミ混合物の、［−］および［＋］のエナンチオマーの活性の特異性。図は、２−ヒドロキシオレイン酸のラセミ（＋／−）混合物による、化合物［−］２ＯＨＯＡおよび化合物［＋］２ＯＨＯＡとの処置後の、グリオーマＵ１１８細胞におけるＳＭのレベル（総脂質のＳＭのパーセント）を示す。細胞は、５０μＭ（５０）および１００μＭ（１００）の濃度で２４時間処置された。縦軸値は、未処置の細胞（対照）のレベルと比較した、総脂質のパーセンテージとしての薄層クロマトグラフィーによって測定されたＳＭのレベルの平均±ＥＳＭ（ｎ＝３−５）を表わす。見られ得るように、［−］エナンチオマーは、ＳＭの増加をもたらし、これは、それがＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性化因子であることを示し、エナンチオマーは、ＳＭのレベルの低下（１００μＭの濃度で特に明白、［＋］２ＯＨＯＡ）をもたらし、これは、それがこの酵素の阻害剤であることを示す。これに関連して、および他のレベルで影響することなく、このエナンチオマーを含む混合物が、ＥＣ ２．７．８．２７の酵素活性を誘発することが証明され、ラセミ化合物は、分子混合物の特別なケースであるが、陽性の効果も、［−］エナンチオマーと、異なるビヒクルまたは異なる治療上の化合物との間の混合物でも証明された。
【図７Ｂ】Ｕ１１８細胞の細胞膜内のＳＭのレベルに対する、［＋］形態（エナンチオマーＲでもある：黒いカラム）、［−］形態（エナンチオマーＳでもある：白いカラム）およびラセミ体（グレーのカラム）の効果（１００μＭでのインキュベーションの２４時間後に測定された値）。使用された治療剤は：ビヒクル（対照）、２−ヒドロキシパルミトレイン酸（２ＯＨ１６：１）、２−ヒドロキシオレイン酸（２ＯＨ１８：１）、２−ヒドロキシリノール酸（２ＯＨ１８：２）、２−ヒドロキシ−α−リノール酸（２ＯＨ１８：３ａ）、および２−ヒドロキシ−γ−リノール酸（２ＯＨ１８：３ｇ）であった。
【図８Ａ】この図は、動物モデルにおける異なる病理過程に対する、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡ酸および光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡの効果を示す。  Ａ．  ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）に由来する腫瘍の量に対する効果：免疫抑制されたマウスは、ヒト肺癌細胞に感染し、７日後に（腫瘍が観察可能となったときに）、ビヒクル（対照）、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡ、および光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡ（６００ｍｇ／ｋｇ・日、１５日、経口）による処置を開始した。バーは、腫瘍（ｎ＝６）の量（ｍｍ３）の増加の平均±平均標準誤差の平均値に相当する。ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡによる処置は、対照と比較して、著しい低下（Ｐ＜０．０１）を誘発した。光学異性体［−］２ＯＨＯＡは、すべての他の処置と比較して、著しい低下を誘発した（Ｐ＜０．０１）。
【図８Ｂ】この図は、動物モデルにおける異なる病理過程に対する、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡ酸および光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡの効果を示す。  Ｂ．  動脈圧に対する効果：極度に緊張したラット（株ＳＨＲ）は、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡおよびその光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡ（６００ｍｇ／ｋｇ、１２時間ごと、１５日、経口）によって処置された。分子はすべて、ＳＨＲラットの収縮期動脈圧（ｍｍＨｇ、縦軸、ｙ）の著しい低下（Ｐ＜０．０１）を誘発し、［−］２ＯＨＯＡ異性体は、低血圧効果を誘発するのに最も強力である。平均の収縮期圧±平均標準誤差（ｎ＝６）が示される。
【図８Ｃ】この図は、動物モデルにおける異なる病理過程に対する、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡ酸および光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡの効果を示す。  Ｃ．  体重に対する効果：ＳＨＲラットは、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡおよびその光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡ（６００ｍｇ／ｋｇ・日、５日、経口）によって処置された。分子はすべて、処置の３日目で動物の体重の著しい低下（Ｐ＜０．０１）を誘発し、［−］２ＯＨＯＡ異性体は、体重の低下を誘発するのに最も強力である。平均の体重±平均標準誤差（横軸、ｎ＝６）が示される。
【図８Ｄ】この図は、動物モデルにおける異なる病理過程に対する、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡ酸および光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡの効果を示す。  Ｄ．  コレステロールおよびトリグリセリドのレベルに対する効果：ＳＨＲラットは、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡおよびその光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡ（６００ｍｇ／ｋｇ、１２時間ごと、１５日、経口）によって処置された。分子はすべて、トリグリセリド（ＴＧ）および総コレステロール（ＣＨＯｔ）のレベルの著しい低下（Ｐ＜０．０１）を誘発し、光学異性体［−］２ＯＨＯＡは、これらの脂質のレベルの低下の誘発に最も強力である。ｍｇ／ｄｌ（縦軸；ｎ＝６）として表わされる平均の血清レベルの脂質±平均標準誤差が示される。
【図８Ｅ】この図は、動物モデルにおける異なる病理過程に対する、ラセミ（＋／−）２ＯＨＯＡ酸および光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡの効果を示す。  Ｅ．  血糖に対する効果（血漿グルコースレベル）：ＳＨＲラットは、ビヒクル（対照）、ラセミ２ＯＨＯＡ（２ＯＨＯＡ）およびその光学異性体［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡ（６００ｍｇ／ｋｇ、１２時間、１５日、経口で）によって処置された。ラセミ化合物および［−］２ＯＨＯＡ異性体は、血漿グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ、縦軸）の著しい低下（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）をもたらした。［＋］エナンチオマーは、これらの条件下で有意でない減少をもたらした。平均±血清脂質レベルの平均標準誤差の値は、ｍｇ／ｄｌ（縦軸；ｎ＝６）で表わされて示される。
【図９】酵素２．３．１．５０の活性の制御。縦軸（ｙ軸）は、２ＯＨＯＡの欠如（対照、白いバー）または存在（黒いバー）下でインキュベートされたＵ１１８細胞の異なる脂質画分における［３Ｈ］パルミタート（ｄｐｍ／ｍｇタンパク質）の取り込みのレベルを示す。放射活性の著しい増加が、スフィンゴミエリン（ＳＭ）およびセラミド（Ｃｅｒ）画分においてのみ見られ、これは、ＥＣ ２．７．８．２７酵素および２．３．１．５０の選択的な活性化を明確に示す。
【図１０】１．１４．１９．１酵素の活性の制御。縦軸（ｙ軸）は、２ＯＨＯＡの欠如（対照、白いバー）または存在（黒いバー）下でインキュベートされたＵ１１８細胞膜における［３Ｈ］オレアート（ｄｐｍ／ｍｇタンパク質）の取り込みのレベルを示す。２ＯＨＯＡの存在下でインキュベートされた細胞膜の脂質におけるトリチウム化されたオレアートの取り込みの減少は、１．１４．１９．１酵素の阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
以下は、本発明の保護の範囲を制限することなく、本発明の詳細な且つ好ましい実施形態を例証する実施例を提供する。
【実施例】
【００７６】
実施例１．ラセミ化合物を得るための及び２−ヒドロキシ脂肪酸の誘導体の［＋］および［−］のエナンチオマーの分離のための方法論。
＜手順＞
＜ラセミ化合物の合成＞
以下の方法論は、ＬＤＡとの反応および続く分子酸素とのヒドロキシル化によるオレイン酸ジアニオンの生成による、９９％の純度を有する２−ヒドロキシ脂肪酸ナトリウム塩の合成を詳述し；それ故、得た原料を、ナトリウム塩を形成するためにＮａＯＨによって処置し、（クロマトグラフカラムの使用を回避する）ＭｅＯＨ／水中で２回の再結晶によって精製する。
【００７７】
この方法論によって、グラムからトンの最終生成物を得ることが可能となる。
生成物の純度は、製剤品質を有することができ、「ＧＭＰ」（医薬品最適製造基準）の条件下でなされ得、これは、ヒトの摂取のために示唆されるものである。
【００７８】
＜模式図＞
以下では、２つの工程、ヒドロキシル化および精製において、反応の模式図を示す：
【００７９】
【化９】
2014530806.tif 000010
【００８０】
式中、Ｒは：−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−ＣＨ３であり、但し、Ｒにおけるすべての炭素の総計が、（１４乃至２０の炭素原子の合計の分子長さに対して）１２以上または１８以下であることを条件とする。
【００８１】
＜過程の説明＞
工程１：ヒドロキシル化
不活性雰囲気下での１００Ｌの、エナメルを施した反応器において、ＴＨＦ（１１Ｌ）中のジイソプロピルアミン溶液（１．７ｋｇ）を、５℃以下に冷却する。ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中に２３％）（４．６ｋｇ）を、温度が１７℃を超えることなく、小分けで溶液に加える。加えた後に、ＴＨＦ（２．６Ｌ）中のＤＭＰＵ（１．０ｋｇ）およびオレイン酸溶液（２．０ｋｇ）の同等物を、温度が２０−２５℃を超えることなく加える。反応混合物を、３０分間５０℃まで加熱し、その後、２０℃まで再び冷却する。この時点で、Ｏ２のシリンダーを、接続し、酸素を、２５ｌ／分の流量でおよそ４５分間、それに通して泡立たせる。一旦泡立ちが完了すれば、溶液を、１０℃まで冷却し、ｐＨ＝１まで３ＭのＨＣｌ（２０Ｌ）によって加水分解し、４０℃を超えないように温度を管理する。原料を、酢酸エチル（６Ｌ）中へと抽出し、（ｐＨが３以下になるまで）３ＭのＨＣｌ／ブライン（１：１）の混合物および亜硫酸水素ナトリウム（９Ｌ）およびブラインによって洗浄し、および溶液を、回転蒸発装置において濃縮乾固する。およそ２Ｋｇの原料を、≧７０％の純度とともに得る。
【００８２】
工程２：精製
原料を、１０Ｌの反応器において４０℃で７．２Ｌのエタノール中に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（１．４Ｌの水中に１３４ｇ）によって処置し、均一溶液を得るために温度を５０℃まで増加させる。均一溶液を、ナトリウム塩を沈殿させるために少なくとも６時間にわたって５℃まで冷却し、それを、ろ過し、アセトンによって洗浄する。固形物を、全希釈が達成されるまで５０℃で（１０％）Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ（０．５ＬのＨ２Ｏ／５．０ＬのＭｅＯＨ）中で２回再結晶し、０−５℃で最小６時間冷却する。最終生成物を、ろ過し、アセトンによって洗浄し、および真空下で乾燥する。それを、メタノール中で懸濁し、造塩を、ナトリウムメトキシドを加えることによって完了する。生成物を、少なくとも１０時間０−５℃まで冷却した後、アセトン（５Ｌ）によって完全に沈殿させる。固形物を、ろ過し、アセトンによって洗浄し、および真空中で乾燥する。
【００８３】
＜［＋］（Ｒ）および［−］（Ｓ）エナンチオマーの生成＞
２ＯＨＯＡの１００ｇのナトリウム塩を、１Ｌの反応器に入れ、エタノール（１０重量％）中の５００ｍＬの硫酸を加える。混合物を１６時間還流させ、ＴＬＣを使用して転換が完了したかを確認する。反応が終了すると、それを、飽和した炭酸水素ナトリウムを使用して中和し、真空下で濃縮し、エタノールを除去する。２５０ｍＬのＡｃＯＥｔ（酢酸エチル）を、エチル（ｅｔｈｙｌｅ）２−ヒドロキシオレアート（ｈｙｄｒｏｘｙｏｌｅａｔｅ）を抽出するように水性乳剤に加え、それを、硫酸塩上で乾燥し、濃縮乾固する。
【００８４】
１００ｇのエチル２−ヒドロキシオレアート（ラセミ混合物）を、機械的に撹拌しながら、１Ｌの反応器において、５０ｍＬのＭＴＢＥ中で溶解する。２６７ｍＬのリン酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７）および１．３ｇのリパーゼＡＫシュードモナスを、溶液に加える。５０％の転換が達成されるまで（ＨＰＬＣ、ＬｕｎａＣ８、５μｍ、ＭｅＯＨ／水／ＨＣＯＯＨ）、乳剤を室温（２５℃）で撹拌する。酸性のｐＨ（２未満）が達成されるまで、反応を、３ＮのＨＣｌでの加水分解によって停止し、それを、ＭＴＢＥによって抽出し、水相のｐＨが５以上になるまで、生理食塩水によって洗浄する。未精製の生成物を、結晶化によって精製し、加水分解された酸の画分（６０％のエナンシオメトリ−過剰）、および加水分解されていないエステルの画分（７５％のエナンシオメトリ−過剰）を分離する。
【００８５】
各画分は、２回の再処理を必要とし、ｅｅ≧９５％が各エナンチオマーに対して達成されるまでエステル化／加水分解の手順を別々に繰り返し、これを、加水分解し、最終的なナトリウム塩に変換する。過程の収率は、４０−５０％（２０−２５％の各エナンチオマー）である。
【００８６】
＜使用される方法論＞
速度論的分割のために記載された条件は、２つのリパーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに由来するリパーゼ、およびＣａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａからの別のリパーゼ）、溶媒（水溶性、有機、二相性の）、温度、イオン強度、撹拌、ｐＨおよび希釈を研究した後に、最適化の過程において最良に得られる。生成物の加水分解反応および精製をモニタリングする最適な方法も決定した。そのため、脂肪酸のヒドロキシル化した誘導体を得るための方法は、文献で見られるものとは異なり、それらのほとんどは、クロマトグラフィーによる高い希釈および精製を必要とする。
【００８７】
＜過程のスケールアップ＞
方法を、類似した、再生可能な結果を得る、１−１５０ｇの規模で実行した。エナンチオマーは、結晶化によって分離され得、これは、ｋｇの規模で過程を促進する。収量の損失は、操作および精密検査の過程が原因である。しかしながら、新しい不純物は生じておらず、洗浄および水晶化の相が、再び混合され、再処理され得る。
【００８８】
実施例２．腫瘍細胞は、本発明の分子による処置後に増加された、それらの細胞膜内のより低いレベルのＳＭを有している。
２００μＭの［−］２ＯＨＯＡの欠如（対照）または存在下で培養された、ＳＭのレベルを、正常細胞膜（ＭＲＣ−５およびＩＭＲ９０）において、測定し、幾つかのタイプの腫瘍細胞においても測定した（表２を参照）。すべての場合において、腫瘍細胞の膜が、正常細胞におけるよりも、およそ半分または３分の１のＳＭレベルを含むことを検出した（図１）。それ故、ＳＭ濃度が、ヒト細胞の腫瘍形成を示すバイオマーカーであると主張することができる。一方、本発明の分子による処置は、自然発生でない腫瘍細胞においてＳＭの増加を誘発する。そのため、ライセニンによるＳＭ検出、および続く蛍光の抗体と共焦点の蛍光の顕微鏡法の検出とのカップリングは、本発明の分子によって処置された動物の腫瘍における、より大きな標識化（すなわち、より大量のＳＭ）を示した（図１Ｃ）。アナログ形態において、細胞膜のＳＭとのライセニンの結合に基づいた他の検出方法、および溶液中の分光分析試験による又はＥＬＩＳＡによる検出は、腫瘍細胞の膜が、本発明の分子の存在下でインキュベートされるときに限り、より大きなレベルのＳＭをどれほど示すかを示した（図１）。例えば、ＳＭレベルの溶液中の蛍光の分光測光の決定は、非常に簡素で、迅速な、および効果的な解析法である（図１Ｄ）。したがって、本発明の分子による処置が有効であるかどうかを予測するＳＭレベルが変更される、記載される病理過程および病変を検出するための、およびまた本発明の分子および類似した活性の他の分子を使用して、適用される治療の有効性をモニタリングするための、診断の方法を作り出した。この知識に基づいて、本発明はまた、この治療の先天的な潜在的有用性を評価するための、およびこれらの疾患の本発明の分子による処置の後天的な有効性をモニタリングするための診断キットを含む。
【００８９】
【表２】
2014530806.tif 000011
【００９０】
実施例３．２ＯＨＯＡは、酵素ＥＣ ２．７．８．２７を活性化することによってＳＭのレベルを増加させる。
２ＯＨＯＡは、上に説明されるように処置された腫瘍細胞におけるＳＭのレベルを増加させる。２ＯＨＯＡによって処置された腫瘍細胞におけるＳＭの増加は、処置の期間および使用される濃度に依存し（図２）、これは、この分子の特異性を示す。ＳＭは、ＲＡＳタンパク質などの、細胞の増殖に関係する特定の分子の結合を妨げる膜脂質である。このように、ＲＡＳのレベルを、蛍光でタグ付けされた抗体を使用して、共焦点の顕微鏡法によって測定し、タグが、ヒトのグリオーマ、肺癌および白血病細胞において、細胞膜（図６：処置前の細胞膜内の合計の検出された蛍光の９５−９９％）から細胞質（２ＯＨＯＡによる処置後に細胞内で検出された蛍光の９４−９７％）まで通ったことを検知することができた。細胞膜から細胞質までのＲＡＳの転位は、ＲＡＳとＲｅｃｅｐｔｏｒ−Ｔｉｒｏｓｉｎｅ−Ｋｉｎａｓｅ（ＲＴＫ）との間、またはＲＡＳとＲａｆとの間の生産的な相互作用の欠如を示唆し、そのため、ＭＡＰキナーゼ経路におけるタンパク質は活性化されず、腫瘍細胞は増殖するのを止め、プログラム細胞死が始まる。本発明の分子によって誘発された細胞生理の変化は、（癌細胞死または他の細胞における活性の制御の前に）中間効果として、ＤＨＦＲレベルの劇的な低下およびＧＦＡＰレベルの劇的な増加の誘発を有する（図６）。
【００９１】
細胞増殖の低下に関係する別の効果は、核ＳＭのレベルの増加である。２ＯＨＯＡによる処置は、核ＳＭのレベルの増加をもたらし（図３）、これは、処置が細胞増殖の阻害を誘発することを示す。
【００９２】
実施例４．ＥＣ ２．７．８．２７酵素の制御は、脂肪酸の分子構造に依存する。
ＥＣ ２．７．８．２７酵素，ＮＢＤ−Ｃｅｒの特異的な蛍光基質を使用するインビトロでの研究は、２ＯＨＯＡが、それと直接的に相互作用し、酵素の活性化が、細胞培養におけるインキュベーションの最初の数分から目に見えることを示す（図４Ａ）。事象の速度は、２ＯＨＯＡエナンチオマーとＥＣ ２．７．８．２７酵素との間の直接的および有効な相互作用を明確に示す。そのため、本発明は、活性化因子（［−］エナンチオマー）、またはＥＣ ２．７．８．２７酵素に特異的な阻害剤（［＋］エナンチオマー）としての前述の化合物の使用に言及する。
【００９３】
一方、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性化は、脂肪酸中の炭素原子数に依存し、その結果、２０を超える炭素原子の脂肪酸は、この酵素の活性の著しい変化をもたらさない（図５）。さらに、他のラジカル（ＨまたはＣＨ３など）の存在および脂肪酸の構造における二重結合の欠如は、不活性の分子をもたらすため、ＥＣ ２．７．８．２７酵素を活性化するための他の要件は、炭素２上のＯＨ基および１以上の二重結合の存在である（図５）。ＳＭは、細胞生理に対する効果を決定づけ、異なる病理過程の逆転を証明する分子構造を有する。その多量の極性頭部は、（ホスファチジルエタノールアミンのような小さな極性頭部を伴うリン脂質を有する細胞膜の領域を好む）そのイソプレニル部分を介する細胞膜へのＲＡＳの固着を妨げ、これによって、次々に、ＭＡＰキナーゼの連鎖におけるタンパク質を介する後のシグナル伝達が妨げられる。この経路の不活性化は、他の現象の中でも、腫瘍細胞の増殖の停止を誘発する（図８Ａおよび表２）。本発明の化合物は、陽性（増加）または陰性（減少）の方法で、細胞のＳＭのレベルを制御する能力を実証している。膜組成がその正確な機能のために重要であるとすれば、本明細書に示されるように、ＥＣ ２．７．８．２７酵素活性化剤（Ｓまたは−エナンチオマー）だけでなく、それらの阻害剤（Ｒまたは＋エナンチオマー）の両方は、治療活性を有する。この活性化は、構造的な原理に基づいており、治療活性を有する他の分子の構造−機能のパラメーターに従う。
【００９４】
実施例５．［−］２ＯＨＯＡのようなＣ１８脂肪酸の［−］異性体は、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の特異的な活性化因子である。
炭素１および２（Ｃ１およびＣ２）上のヒドロキシル基の相対的な構造的配座は、優性である２つのエナンチオマーまたは光学異性体［−］（それは構造的な配座Ｓに相当する）および［＋］（それは構造的な配座Ｒに相当する）を生じさせる。本発明に記載される過程によって（実施例１）、陽性または陰性の両方でＥＣ ２．７．８．２７酵素を制御する能力を有し、エナンチオマーおよび光学異性体が合成且つ分離されたラセミ化合物が証明され、ＥＣ ２．７．８．２７酵素を活性化するそれらの能力を測定した。図７Ａは、５０および１００ｍＭの各異性体、およびラセミ混合物（これは同じ量の異性体を多かれ少なかれ含有する）の存在下で、２４時間のインキュベーション後にヒトＵ１１８グリオーマ細胞膜におけるＳＭのレベルによって測定された、前記酵素の活性化を示す。図７Ａは、ラセミ２ＯＨＯＡが、Ｕ１１８細胞の膜内のＳＭレベルの著しい増加をどれほどもたらすかを示す。同時に、（光学異性体Ｓに相当する）光学異性体［−］２ＯＨＯＡは、ＳＭレベルのさらに大きな増加をもたらすことができる。それ故、この酵素の具体的な場合では、（ラセミ化合物および特殊な事例である）［−］２ＯＨＯＡの特定のパーセンテージを有する混合物の存在は、ＥＣ ２．７．８．２７の特異的な活性化因子として作用する。一方、光学異性体［＋］２ＯＨＯＡは、ＳＭの増加を誘発するだけでなく、細胞膜内のＳＭのレベルの低下ももたらす。このデータは、光学異性体［−］２ＯＨＯＡが、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の特異的な活性化因子であり、光学異性体［＋］２ＯＨＯＡ（即ち、Ｒエナンチオマー）が、この酵素の特異的阻止因子であることを示唆している。それ故、本発明は、治療上の用途のための、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性化因子としての光学異性体［−］２ＯＨＯＡ（Ｓ）、およびこの酵素の特異的阻止因子としての光学異性体［＋］２ＯＨＯＡ（Ｒ）の使用を保護する。これらの結果は、１４以上２０以下の炭素原子を含むすべての不飽和脂肪酸にまで及び、これは、１つ以上の二重結合および炭素Ｃ２（アルファ炭素：図７Ｂ）上のヒドロキシルラジカルを表わす。
【００９５】
実施例６．ヒト疾患を処置するための治療剤として使用された、［−］２ＯＨＯＡなどの、Ｃ１８脂肪酸の［−］異性体。
本発明で示されるエナンチオマー［−］２ＯＨＯＡおよびその誘導体は、処置する癌、肥満症、心臓血管の病変、糖尿病、メタボリック症候群、延髄病変、アルツハイマー病および他の過程の処置などの、異なる分野で治療適用されている（図６および８；表２−５）。一方、［＋］２ＯＨＯＡエナンチオマーは、コレステロールおよびトリグリセリドのレベルに対して陽性の効果を有し、なぜなら、その高いレベルがヒトの健康にとって陰性なものであると考えられる、これらの脂質の血漿レベルの脂質の著しい低下を誘発したからである（図８）。それ故、異なる疾病モデルにおいて、異性体のそれぞれ１つの治療効果を研究し、およびラセミ混合物の治療効果も研究した。
【００９６】
図８Ａは、裸のマウスにおけるヒト肺癌（Ａ５４９細胞）に由来する腫瘍の量に対する、ラセミ２ＯＨＯＡおよび［−］２ＯＨＯＡおよび［＋］２ＯＨＯＡのエナンチオマーによる、経口処置（１５日、毎日６００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）の効果を示す。見られ得るように、光学異性体［−］２ＯＨＯＡの効果は、ラセミ化合物よりも大きい。一方、光学異性体［＋］２ＯＨＯＡによる１５日間の処置後に、腫瘍の量でもたらされる著しい変化はなかった。これは、［−］２ＯＨＯＡ異性体が、ＥＣ ２．７．８．２７酵素を活性化する異性体であり、治療上の抗腫瘍活性を有することを示す。一方、これらの化合物の抗腫瘍活性を、ヒト癌の異なる株において調査した（表２、４および５を参照）。この関連で、本発明のすべての［−］エナンチオマーは、癌治療においてラセミ化合物および［＋］エナンチオマーより多くの効能を示し、これは、ヒト肺癌（Ａ５４９株）の成長を阻害するためのＩＣ５０のかなり低い値に相当する。さらに、これらのエナンチオマーの活性は、異なる性質の広範囲のヒト癌に対して証明され、その結果、２−ヒドロキシル化された脂肪酸の［−］エナンチオマーは、任意のタイプの癌の処置に高い効能を有していると明示され得る。この効能は、遊離脂肪酸に対するよりも塩（主として、これらの分子のナトリウム塩）に対する方が幾分さらに大きいと証明された（結果は示されていない）。何れの場合でも、酸性および塩の形態両方での［−］エナンチオマーは、腫瘍成長を阻害する際に、代替分子の形態のどれよりも大きな効能を常に示した。
【００９７】
その上、ＳＨＲラットＳＨＲ（図８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄ、および８Ｅ）における、動脈圧、体重、およびコレステロール、トリグリセリド並びに血糖（血漿中のグルコース）のレベルに対する上述の異性体の効果を試験した。上に類似して、［−］２ＯＨＯＡ異性体が使用されたときに、血圧、体重および血糖の調節により大きな治療効果があったが、一方で、［＋］２ＯＨＯＡエナンチオマーは、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症の処置により大きな治療効果を有した。したがって、［−］２ＯＨＯＡ異性体によって処置された動物は、７９９８ Ｐａ（６０ｍｍ Ｈｇ）より大きな収縮期圧の低下を示したが、一方で、［＋］２ＯＨＯＡ異性体およびラセミ生成物によって処置された動物は、かなりの治療効果を有したが、その振幅は小さかった。同様に、１日から５日間の処置の間に、ラセミ化合物によって処置されたラットは、体重の１１グラム（それらの体重のおよそ３％）を失い、一方で、［−］２ＯＨＯＡエナンチオマーによって処置された群の動物は、２１グラムを失い、および［＋］２ＯＨＯＡエナンチオマーによって処置された群の動物は、体重の７グラムのみを失った。一方、トリグリセリド（ＴＧ）および総コレステロール（ＣＨＯｔ）のレベルの低下に対するより大きな効果が、［＋］２ＯＨＯＡエナンチオマーに対して観察された（図８Ｄ）。この関連で、ＳＨＲラットにおけるＴＧの血漿の基底のレベルは、１０８ｍｇ／ｄｌであり、［＋］２ＯＨＯＡエナンチオマーによる２週間の処置後に５６ｍｇ／ｄｌまで低下した。一方、［＋］２ＯＨＯＡエナンチオマーによる処置は、４７ｍｇ／ｄｌまでの血漿のＴＧレベルの低下を誘発したが、［−］２ＯＨＯＡエナンチオマーは、８１ｍｇ／ｄｌまでの適度の低下をもたらしただけであった。平行して、ＣＨＯｔのレベルは、７３ｍｇ／ｄｌから、それぞれ、４３ｍｇ／ｄｌ（ラセミ化合物）、３６ｍｇ／ｄｌ（［＋］２ＯＨＯＡエナンチオマー）および５９ｍｇ／ｄｌ（［−］２ＯＨＯＡエナンチオマー）まで低下した。最終的に、本発明のエナンチオマーによる処置はまた、血漿グルコースレベルの著しい低下をもたらした（図８Ｅ）。この場合、ラセミ化合物（２ＯＨＯＡ）および［−］２ＯＨＯＡエナンチオマーの両方は、それぞれ、ラットの血糖の著しい低下（Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０１）を誘発した：（図８Ｅ）。それにもかかわらず、Ｒ（［＋］２ＯＨＯＡ）エナンチオマーは、統計的に有意でない適度の低下を誘発した。
【００９８】
上述すべてについて、本発明は、１８の炭素原子の不飽和のヒドロキシ脂肪酸の［＋］［−］光学異性体が、上述の病変の処置に効果があり、それに対する治療活性を有する分子であることを証明している。すべての試験された事例において、エナンチオマーの１つおよび１つのみが、他の分子形態のものよりも高い活性を有すると示された（統計的有意差は、常にＰ＜０．０５である）。したがって、［−］エナンチオマーは、癌、肥満症、糖尿病、高血圧症などを治すことにより効果的であると示されたが、一方で、［＋］エナンチオマーは、高コレステロール血症または高トリグリセリド血症の調節により効果的であると示された。これらの場合では、ラセミ化合物は、光学異性体のそれぞれ１つの陽性の効果を模倣することが可能であるが、各場合での活性なエナンチオマーのより低い濃度が原因で、より低い効能を有する、中間の状況として示される。さらに、不十分なエナンチオマーの使用は、最も活性なエナンチオマーでの治療量で回避された、望まれない副作用を誘発した（表３）。
【００９９】
実施例７．本発明のエナンチオマーの有効性、毒性および副作用。
本実施例は、ヒトグリオーマ（ＳＦ７６７）細胞に感染し、指示された用量で１５日間にわたって（経口で）処置された、免疫抑制されたマウス上で行った研究について詳しく述べる（表３）。この表は、処置の終わりでの腫瘍の量および処置が続いた日の間に観察された症状を示す。再度、［−］２ＯＨＯＡエナンチオマーの有効性が、ラセミ２ＯＨＯＡ化合物の有効性より高く、［＋］２ＯＨＯＡエナンチオマーが、指示された用量での１５日間の処置後に活性を示さなかったことを留意すべきである。
【０１００】
一方、腫瘍の量の約３分の１の低下を誘発した用量は、［−］２ＯＨＯＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）によって処置された動物において副作用を誘発しなかったが、一方で、腫瘍の量（６００ｍｇ／ｋｇ）の同様の減少を誘発した用量でラセミ化合物２ＯＨＯＡによって処置された動物は、重大な副作用を示した（表３）。さらに、２００ｍｇ／ｋｇで、［−］２ＯＨＯＡエナンチオマーは、観察可能な有害な副作用なしで腫瘍の量の８９％の減少を誘発したが、一方で、ラセミ化合物は、腫瘍の量の２３％の減少を誘発しただけであり、および処置に対して副作用を示した動物もいた。
【０１０１】
これらの結果から、［−］２ＯＨＯＡエナンチオマーがより大きな効能を有し、最大の治療上の用量で副作用をもたらさないが、一方で、ラセミ化合物は、より適度な効果を有し、治療量で特定の望まれない副作用を誘発すると推測できる。［−］２ＯＨＯＡエナンチオマーとラセミ化合物との間の腫瘍過程を処置することの有効性の違いは、患者の平均余命の数か月または数年の違いを意味し得る。さらに、有効性の違いは、患者において特定の癌の治療する又は治療しないことの違いを意味し得る。一方、治療量での毒性の違いは、［−］２ＯＨＯＡのエナンチオマー形態を受ける患者のためのより大きな生活の質の違いを意味し得る。化合物の活性化の機構が、ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性に関連し、［−］および［＋］のエナンチオマーが、前記酵素（図７）に対して逆の効果を有するとすれば、ラセミ化合物の投与は、有効成分（［−］２ＯＨＯＡ）のそれに対して逆の効果を有している分子形態の存在を暗示し、有効成分の治療効果の一部を逆転させる。
【０１０２】
【表３】
2014530806.tif 000012
【０１０３】
本発明のラセミ化合物およびエナンチオマー化合物によって行われた研究は、すべての場合において、［−］エナンチオマーが、ヒト癌細胞（Ａ４５９、表４）の成長を阻害するために、他の分子形態よりも大きな抗腫瘍作用を有していることを証明している。この関連で、腫瘍細胞の成長を阻害する濃度（ＩＣ５０）は、すべての研究された腫瘍株において（［−］）エナンチオマーＳに対してより低い（表５）。これに反して、これらの化合物は、正常細胞（ＭＲＣ−５、ＩＭＲ９０）の死を誘発しなかった。すべての場合において、分子は、ナトリウム塩を利用した。
【０１０４】
【表４】
2014530806.tif 000013
【０１０５】
実施例８．ＥＣ ２．３．１．５０酵素の活性に対する本発明における化合物による制御。
２ＯＨＯＡ（２００μＭ、２４時間）の存在または欠如（対照）下で、ヒトグリオーマ細胞Ｕ１１８をインキュベートし、その後、５分間［３Ｈ］パルミタートによってそれらをインキュベートした。インキュベーションのこれらの期間の後、細胞脂質を抽出し、ＴＬＣによってそれらを分離した。バンドは、抽出した脂質の各々の種に対応し、組み込まれた放射性のパルミタートの量を、液体シンチレーションによって測定した。見られるように、ＳＭの画分の重要な取り込み（ＥＣ ２．７．８．２７酵素の活性の指標）があっただけでなく、セラミドの画分においても取り込みがあり、これは、ＥＣ ２．３．１．５０（セリンパルミトイルトランスフェラーゼ）酵素の活性を示す。それ故、２ＯＨＯＡが、ＥＣ ２．３．１．５０酵素の特異的な活性化因子であると結論付けることができる（図９）。
【０１０６】
【表５】
2014530806.tif 000014
【０１０７】
実施例９．ＥＣ １．１４．１９．１酵素の活性に対する本発明の化合物による制御。
オレイン酸は、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ酵素（ＥＣ １．１４．１９．１）の活性によってステアリン酸から合成される。この酵素は、脂肪酸の合成に限定されるため、脂質代謝において重要である。この低下がＥＣ １．１４．１９．１酵素の制御によるものであったかどうかを確かめるために、２ＯＨＯＡ（２００μＭ、２４時間）の存在または欠如下でＵ１１８細胞をインキュベートし、その後、［３Ｈ］オレアートの存在下でインキュベートした（５分）。２ＯＨＯＡの存在下でインキュベートしたＵ１１８細胞膜内の放射性のオレイン酸の取り込みが、対照細胞におけるよりも著しく少なかったことを確認することができた（図１０）。この結果は、２ＯＨＯＡが、ＥＣ １．１４．１９．１の強力な阻害剤であり、その制御が、異なるヒトの病変の処置に重要であると提案されたことを示す。
【０１０８】
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２０． Ｓｌｏａｎ， Ｆ．Ａ．， Ｂｅｔｈｅｌ， Ｍ．Ａ， Ｒｕｉｚ， Ｄ． Ｊｒ．， Ｓｈｅａ， Ａ． Ｍ ＆ Ｆｅｉｎｇｌｏｓ， Ｍ． Ｎ．Ｔｈｅ ｇｒｏｗｉｎｇ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１６８， １９２−１９９ （２００８）．
２１． Ｓｌｏｍｉａｎｙ Ａ， Ｍｕｒｔｙ ＶＬ， Ａｏｎｏ Ｍ， Ｓｎｙｄｅｒ ＣＥ， Ｈｅｒｐ Ａ ａｎｄ Ｓｌｏｍｉａｎｙ ＢＬ （１９８２） Ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｈｅｏｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１０：１０６−１１１ Ｄ． 
２２．Ｓｔｅｎｄｅｒ Ｓ， Ｄｙｅｒｂｅｒｇ Ｊ （２００４） Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｎ ｈｅａｌｔｈ．Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．４８：６１−６６．
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２４． Ｔａｆｅｓｓｅ， Ｆ． Ｇ．， Ｐ． Ｔｅｒｎｅｓ， ｅｔ ａｌ． （２００６）．Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｇｅｎｉｃ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆａｍｉｌｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１（：２９４２１−５．
２５． Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ａ， Ｍａｇｇｉｏｒａ Ｍ， Ｍａｒｔｉｎａｓｓｏ Ｇ， Ｃｏｔｏｇｎｉ Ｐ， Ｃａｎｕｔｏ ＲＡ， Ｍｕｚｉｏ Ｇ． （２００７）．Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｎｄ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａ５４９ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＰＡＲｓ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１６５：２３９−５０．
２６． Ｖａｎ Ｈｅｌｖｏｏｒｔ， Ａ．， Ｗ． ｖａｎ'ｔ Ｈｏｆ， ｅｔ ａｌ． （１９９４）．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｏ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ （Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ） ｃｅｌｌｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１７６３−９．
２７． Ｖｏｇｌｅｒ Ｏ， Ｃａｓａｓ Ｊ， Ｃａｐｏ Ｄ， Ｎａｇｙ Ｔ， Ｂｏｒｃｈｅｒｔ Ｇ， Ｍａｒｔｏｒｅｌｌ Ｇ ａｎｄ Ｅｓｃｒｉｂａ ＰＶ．（２００４） Ｔｈｅ Ｇ ｂｅｔａｇａｍｍａ ｄｉｍｅｒ ｄｒｉｖｅｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎｌａｍｅｌｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７９：３６５４０−３６５４５．
２８． Ｖｏｇｌｅｒ Ｏ， Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｌｌａｎ Ａ， Ａｌｅｍａｎｙ Ｒ， Ｔｏｆｅ Ｓ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｍ， Ｑｕｅｖｅｄｏ Ｊ， Ｐｅｒｅｇ Ｖ， Ｂａｒｃｅｌｏ Ｆ ａｎｄ Ｅｓｃｒｉｂａ ＰＶ．（２００８） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ１８ ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ．３２：４６４−４７３．
２９． Ｙａｎｇ， Ｑ， Ａｌｅｍａｎｙ， Ｒ， Ｃａｓａｓ， Ｊ， Ｋｉｔａｊｋａ， Ｋ， Ｌａｎｉｅｒ， ＳＭ， Ｅｓｃｒｉｂａ ＰＶ （２００５） Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｖｉａ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６８：２１０−７．