【手続補正書】
【提出日】平成27年3月18日(2015.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作されたイソブタノール生成経路と、
ｉ．ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）活性を有する異種ポリペプチドであって、
１．ビフィドバクテリウム・アンギュラツム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｇｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）又はアナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）に由来するＫＡＲＩ酵素、又はその活性断片と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチド；
２．配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、又は６５と少なくとも約９０％の同一性又は少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択される異種ポリペプチドか、又は
ｉｉ．上記ｉのＫＡＲＩ活性を有する異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドか
の少なくとも一方と
を含む組換え宿主細胞。
【請求項２】
ＫＡＲＩ活性を有する異種ポリペプチドが、配列番号２７、２９、１４１、１４３、２７５、又は２７７と少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％の同一性を有する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
ＫＡＲＩ活性を有する異種ポリペプチドが、配列番号２７のＳ５６及びＳ５８に対応するアミノ酸の置換を含む；又は
ＫＡＲＩ活性を有する異種ポリペプチドが、配列番号２７のＳ５６及びＳ５８に対応するアミノ酸に置換、並びに配列番号２７のＩ８６、Ｎ８７、Ｔ１３１、又はＴ１９１に対応するアミノ酸の１つ以上の置換を含む；又は
ＫＡＲＩ活性を有する異種ポリペプチドが、配列番号２７のアミノ酸Ａ４１、Ｓ５６、Ｓ５８、Ｉ８７、Ｔ１３１、Ｔ１９１、Ｒ２２７、又はＱ２４６に対応する位置の１つ以上にアミノ酸置換を含む；
請求項１又は２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が、約４８時間後に（この４８時間のうち少なくとも最後の約２４時間は嫌気性条件下にある）細胞１グラムあたり少なくとも約３、少なくとも約４、又は少なくとも約５グラムの有効イソブタノール生成能力を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
ＫＡＲＩ活性を有する異種ポリペプチドが、ｐＨ６．８で約３５０μＭ未満、約１００μＭ未満、約５０μＭ未満、又は約１０μＭ未満のＮＡＤＨに対するＫMを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、又はピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）から選択される酵母宿主細胞；好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
操作されたイソブタノール生成経路が、以下の基質から生成物への変換：
ａ．ピルベートからアセトラクテート
ｂ．アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート
ｃ．２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレート
ｄ．２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド；及び
ｅ．イソブチルアルデヒドからイソブタノール
を含み、
各基質から生成物への変換が、宿主細胞によって組換え発現される酵素により触媒される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
基質から生成物への変換の全てが、宿主細胞にとって異種の酵素により触媒される；又は
宿主細胞にとって異種の酵素の少なくとも１つをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれる；又は
基質から生成物への変換が、サイトゾルに実質的に局在化された酵素により触媒される；又は
イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換が、ＮＡＤＨを補因子として利用するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素により触媒される；
請求項７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、アセトラクテートを２，３−ジヒドロキシ−２−メチルブチレートに変換する低減、破壊又は排除された能力を含む；又は
宿主細胞が、低減、破壊又は排除されたピルビン酸デカルボキシラーゼ発現又は活性；好ましくは低減、破壊、又は排除されたＰＤＣ１、ＰＤＣ５、又はＰＤＣ６活性又はそれらの組み合わせを有する；又は
宿主細胞が、低減又は排除されたＮＡＤ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ発現又は活性を有する；又は
宿主細胞が、低減又は排除されたＦＲＡ２発現又は活性を有する；又は
それらの組み合わせである；
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が嫌気性条件下でイソブタノールを生成し、且つグリセリンに対するイソブタノールのモル比が１より大きい、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
イソブタノールの生成方法であって、
ａ．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
ｂ．イソブタノールが生成される条件下でａ）の宿主細胞を炭素基質に接触させるステップと
を含む方法。
【請求項１２】
接触させるステップの少なくとも一部が嫌気性条件下で行われる；又は
接触させるステップが抽出剤の存在下で行われる；又は
接触させるステップが、水相と有機相とを含む二相系を形成するのに十分な量の有機抽出剤の存在下で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
イソブタノールの有効率、有効力価、又は有効収率のうちの１つ以上が、ＫＡＲＩ活性を有する異種ポリペプチド又はＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含まない組換え宿主細胞と比較して増加する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
グリセリンに対するイソブタノールのモル比が１より大きい、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２又はその活性断片と少なくとも約９０％の同一性又は少なくとも約９５％の同一性又は少なくとも約９９％の同一性を含むポリペプチドであって、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチド。