【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年4月24日(2015.4.24)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法：
（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の１０％以下である、工程；及び
（ｂ）抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法：
（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの活性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの活性の１０％以下である、工程；及び
（ｂ）抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項３】
ミュータント治療抗体が、治療的抗ＩｇＥ抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ配列において１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸変異を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
治療的抗ＩｇＥ抗体がオマリズマブであり、ミュータント治療抗体が軽鎖のＣＤＲ１において１、２又は３つのアミノ酸変異を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ミュータント治療抗体が配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含み、位置３０、３２及び３４におけるアミノ酸Ａｓｐが軽鎖において置換されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ミュータント治療抗体が配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び位置３０、３２及び３４においてＡｓｐからＡｌａへのアミノ酸置換を有する配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ミュータント治療抗体が表面に接続されている、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
試料を、表面に接続されたミュータント治療抗体に接触させる、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
試料を、ミュータント治療抗体を表面に接続させる前にミュータント治療抗体に接触させる、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合が検出剤で検出される、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出剤が、ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
治療的抗ＩｇＥ抗体がオマリズマブである、請求項１から３、７から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試料がヒト血清又は血漿を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）で検出される抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を基準と比較する工程をさらに含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
基準が、ミュータント治療抗体とコントロール抗体との間で検出された結合である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コントロール抗体が、治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポジティブコントロール抗体が、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の１０％以下である抗体；及び
（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤；及び
（ｃ）治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体の双方に結合するポジティブコントロール抗体であって、ポジティブコントロール抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体への相対的結合親和性とミュータント治療抗体への相対的結合親和性の差異が５０％未満である抗体、
を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキット。
【請求項２０】
治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性が、ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の１０％以下である抗体；及び
（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤；及び
（ｃ）治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体の双方に結合するポジティブコントロール抗体であって、ポジティブコントロール抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体への相対的結合親和性とミュータント治療抗体への相対的結合親和性の差異が５０％未満である抗体、
を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキット。
【請求項２２】
以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法：
（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料と、（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドとを接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の１０％以下である工程；
（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び
（ｃ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【請求項２３】
工程（ａ）においてＦｃεＲＩαポリペプチドの少なくとも１０倍の過剰量を試料と接触させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合が、標識された抗ヒトＩｇＥ抗体により検出される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合がＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤により検出される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性が、ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の１０％以下である抗体；及び
（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチド；及び
（ｃ）治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体の双方に結合するポジティブコントロール抗体であって、ポジティブコントロール抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体への相対的結合親和性とミュータント治療抗体への相対的結合親和性の差異が５０％未満である抗体、
を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキット。
【請求項２７】
以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法：
（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を、過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドとプレインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）でプレインキューベートされた試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性と比較して減少している工程；及び
（ｃ）抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項２８】
ミュータント治療抗体が治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の１０％以下である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ａ）においてＦｃεＲＩαポリペプチドの少なくとも１０倍の過剰量を試料と共にプレインキュベートする、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体を、工程（ｂ）における試料とのインキュベートの前又は後に表面に接続する、請求項２７から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＦｃεＲＩαポリペプチドが標識されており、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合が標識を検出することにより検出される、請求項２７から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体又はそのミュータント治療抗体であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性はヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、抗体；及び
（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチド；及び
（ｃ）治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体の双方に結合するポジティブコントロール抗体であって、ポジティブコントロール抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体への相対的結合親和性とミュータント治療抗体への相対的結合親和性の差異が５０％未満である抗体、
を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキット。
【請求項３３】
抗ヒトＩｇＥ抗体をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法：
（ａ）患者の試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の１０％以下である工程；及び
（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【請求項３５】
以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法：
（ａ）患者の試料を治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の１０％以下である工程；及び
（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【請求項３６】
以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法：
（ａ）患者の試料を（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の１０％以下である工程；
（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び
（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【請求項３７】
以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法：
（ａ）患者の試料を過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）でプレインキュベートされた試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び
（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【請求項３８】
治療的抗ＩｇＥ抗体の有効量を含む、ＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療するための医薬であって、患者の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルは、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体を用いて測定され、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の１０％以下であり、患者の抗薬剤抗体のレベルは治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを示していない、医薬。
【請求項３９】
試料中の抗薬剤抗体のレベルが以下の工程を含む方法により測定される、請求項３８に記載の医薬：
（Ｉ）（ａ）患者の試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の１０％以下である工程；及び
（ｂ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程、又は
（ＩＩ）（ａ）患者の試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の１０％以下である工程；及び
（ｂ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程、又は
（ＩＩＩ）（ａ）患者の試料を（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の１０％以下である工程；及び
（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び
（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程、又は
（ＩＶ）（ａ）患者の試料を過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）でプレインキューベートされた試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び
（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【請求項４０】
ミュータント治療抗体が、治療的抗ＩｇＥ抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ配列に１、２、３、４、５又は６のアミノ酸変異を含む、請求項２２、２７、３４、３５、３６、３７及び３９の何れか一項に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的な抗体を検出するためのアッセイ及びアナフィラキシーにおけるそれらの使用
【発明の開示】
【０００１】
関連出願についてのクロスリファレンス
本出願は２００９年１０月２６日に出願の米国仮出願番号第６１／２５５，０５２号の優先権の利益を請求し、その全てが本願明細書に出典明示により援用されるものとする。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的に、治療的抗ＩｇＥ抗体に対する、ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法及び試薬及びアナフィラキシーのリスクを評価するための方法の分野に関連する。
【０００３】
背景
ＩｇＥは、アレルギー反応（例えば広範囲にわたって患われる喘息、食物アレルギー、Ｉ形過敏症及びよく知られている副鼻腔炎）を媒介する免疫グロブリンファミリーのメンバーである。ＩｇＥは、Ｂ細胞又はＢリンパ球により分泌され、その表面に発現する。ＩｇＥは、そのＦｃ領域のＦｃεＲＩＩとして知られる低親和性ＩｇＥ受容体への結合を介して、Ｂ細胞（単核細胞、好酸球性及び血小板も同様）に結合する。アレルゲンへの哺乳動物の暴露により、抗原に特異的な表面結合ＩｇＥ抗体を生じるＢ細胞は、「活性化され」、ＩｇＥを分泌するプラズマ細胞となる。生じたアレルゲン特異的なＩｇＥは、血流を循環し、ＦｃεＲＩとして知られる高親和性受容体を介して、組織中でマストセル表面に、血液中で好塩基球表面に結合する。マストセル及び好塩基球は、それによりアレルゲンに感作される。アレルゲンへの後の暴露によって、これらの細胞の脱顆粒及び臨床過敏症及びアナフィラキシーの原因となるヒスタミン、ロイコトリエン及び血小板活性化因子、好酸球性及び好中球走化性因子及びサイトカインＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦの放出を引き起こす好塩基球及びマスト細胞ＦｃεＲＩの架橋結合が生じる。
【０００４】
ＩｇＥ−受容体複合体形成をブロックするアンタゴニストは、アレルギー反応を予防するための治療剤として有用である。いくつかの治療的抗ＩｇＥ抗体が開発された。これらの抗ＩｇＥ抗体は、好塩基球及びマストセルに見いだされる高親和性受容体ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合をブロックし、それによって、ヒスタミン及び病的状態を引き起こす他のアナフィラキシー因子の放出を予防する。
【０００５】
アナフィラキシーは、オマリズマブなどの抗ＩｇＥ抗体（例えばＸｏｌａｉｒ（登録商標））を受けた後に患者において発生することが報告された。アナフィラキシーは、急性全身性（マルチシステム）及び非常に重度のＩ型過敏症アレルギー反応である。それは、マストセル及び好塩基球の脱顆粒によって生じ、ＩｇＥによって媒介される。２００６年まで、５７，２６９人の喘息患者のうちの１２４人（約０．２％）が、オマリズマブ投与後にアナフィラキシーを有した。オマリズマブの結果としての致命的なアナフィラキシーの報告はないが、いくつかのケースは重篤で、潜在的に生死にかかわるものであった。このために、ＦＤＡはオマリズマブを受けている患者をオマリズマブ投与後しばらくの間診療室において監視することを推奨しており、オマリズマブを投与する健康管理提供者は生死にかかわり得るアナフィラキシーを管理するために準備されるべきである。事例の６０パーセント（１２４）で、オマリズマブの最初の２回の投与後であったことが報告されている。したがって、薬剤の投与後に起こる抗薬物反応とは対照的に、反応は患者中に先に存在したオマリズマブ上のエピトープを認識する抗体によるものかもしれない。アナフィラキシーがＩｇＥアイソタイプの抗体と関連しているように、好ましくは抗ＩｇＥ抗体治療前にアナフィラキシーのリスクを評価し、ハイリスクな患者を同定するために、治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的な患者のＩｇＥ量を検出及び定量するためのアッセイを開発するというニーズが存在する。
【０００６】
本願明細書に引用される特許出願及び刊行物を含む全ての文献は、その全てが出典明示により援用されるものとする。
【０００７】
発明の要約
一つの態様では、本発明は、以下の工程を含む、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法を提供する：ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と、抗薬剤抗体を含み得る試料とを接触させる工程であって、ＩｇＥ（例えばヒトＩｇＥ）へのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、ＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的な結合親和性の約１０％以下である工程；及びｂ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【０００８】
いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的な結合親和性の約７．５％以下、約５％以下、約２．５％以下、約２．０％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以下、約０．５％以下、約０．２５％以下、約０．１％以下である。
【０００９】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、試料中で治療的抗ＩｇＥに結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法を提供する：ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と、抗薬剤抗体を含み得る試料とを接触させる工程であって、ＩｇＥ（例えばヒトＩｇＥ）へのミュータント治療抗体の活性は、ＩｇＥに対する治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及びｂ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００１０】
いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体の活性は、治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約７．５％以下、約５％以下、約２．５％以下、約２．０％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以下、約０．５％以下、約０．２５％以下、約０．１％以下である。
【００１１】
本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、治療的抗ＩｇＥ抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ配列中に１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブであり、ミュータント治療抗体はオマリズマブの軽鎖の第１のＣＤＲにおいて１、２又は３つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブであり、ミュータント治療抗体はオマリズマブの軽鎖（配列番号：１）の位置３４（Ａｓｐ）にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含み、軽鎖の位置３０（Ａｓｐ）及び３４（Ａｓｐ）、又は３２（Ａｓｐ）及び３４（Ａｓｐ）のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含み、位置３０、３２及び３４のアミノ酸Ｄ（Ａｓｐ）が軽鎖において置換されている。いくつかの実施態様において、アミノ酸Ａｓｐは、Ａｌａで置換される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖の位置３０、３２及び３４のＡｓｐのＡｌａへの置換を伴った配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブであり、ミュータント治療抗体はオマリズマブの重鎖の第３のＣＤＲにおいて１、２又は３つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含み、重鎖（配列番号：２）の位置１０１（Ｈｉｓ）、１０５（Ｈｉｓ）及び１０７（Ｈｉｓ）のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施態様において、アミノ酸Ｈｉｓは、Ａｌａで置換される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、重鎖の位置１０１、１０５及び１０７のＨｉｓからＡｌａへのアミノ酸置を伴った換配列番号：２の重鎖アミノ酸配列及び配列番号：１の軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、表面に固定又は接続される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、表面に直接固定される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は標識にコンジュゲートされ、標識に特異的に結合する捕捉剤により表面に固定又は接続されており、捕捉剤は表面に固定される。いくつかの実施態様において、標識はビオチンであり、捕捉剤はストレプトアビジンである。いくつかの実施態様において、標識はジゴキシゲニンであり、捕捉剤は抗ジゴキシゲニン抗体である。
【００１３】
いくつかの実施態様において、試料を表面に固定又は接続されたミュータント治療抗体と接触させる。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体を表面に接続させる前に、試料をミュータント治療抗体と接触させる。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、試料をミュータント治療抗体と接触させた後、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する前に、表面に接続させる。
【００１４】
いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合は、検出剤で検出される。いくつかの実施態様において、検出剤は、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドである。本願明細書において提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている。いくつかの実施態様において、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ルテニウム、放射線標識、フォトルミネセンス標識、化学発光標識、蛍光標識、電気化学発光標識及び酵素標識からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはビオチンで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合はストレプトアビジン−ＨＲＰによって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはジゴキシゲニンで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合はＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはルテニウムで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合は電気化学発光アッセイによって検出される。
【００１５】
いくつかの実施態様において、試料はヒト血清又は血漿を含む。いくつかの実施態様において、試料は治療的抗ＩｇＥ抗体を含む。いくつかの実施態様において、試料は治療的抗ＩｇＥ抗体を含まない。いくつかの実施態様において、血清又は血漿はオマリズマブを含む。他の実施態様において、血清又は血漿はオマリズマブを含まない。
【００１６】
いくつかの実施態様において、方法は、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を基準と比較する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、基準は、ミュータント治療抗体とコントロール抗体との間の検出された結合である。いくつかの実施態様において、コントロール抗体は、治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体である。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、ヒトＩｇＥの重鎖及び軽鎖定常領域をさらに含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ＩｇＥ（例えばヒトＩｇＥ）へのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、ＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である抗体；及びｂ）ＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、検出剤はＦｃεＲＩαポリペプチドである。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドがキットに包含されてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている（例えばビオチン、ジゴキシゲニン、ルテニウムなどによる標識）。いくつかの実施態様において、キットはストレプトアビジン−ＨＲＰ又はＡｍｄｅｘ  ＳＡ−ＨＲＰをさらに含む。いくつかの実施態様において、キットは、ジゴキシゲニン標識ＦｃεＲＩαポリペプチドを検出するためのＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、キットは、治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、ヒトＩｇＥの重鎖及び軽鎖定常領域をさらに含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ＩｇＥ（例えばヒトＩｇＥ）へのミュータント治療抗体の活性は、ＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である抗体；及びｂ）ＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、検出剤は、ＦｃεＲＩαポリペプチドである。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドがキットに包含されてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＩｇＧ定常領域に融合したＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている（例えばビオチン、ジゴキシゲニン、ルテニウム、などによる標識）。いくつかの実施態様において、キットはストレプトアビジン−ＨＲＰ又はＡｍｄｅｘ  ＳＡ−ＨＲＰをさらに含む。いくつかの実施態様において、キットは、ジゴキシゲニン標識ＦｃεＲＩαポリペプチドを検出するためのＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体とミュータント治療抗体とに同程度の親和性で結合するポジティブコントロール抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、ヒトＩｇＥの重鎖及び軽鎖定常領域をさらに含む。
【００１９】
別の態様においては、本発明は、以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法を提供する：（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料と、（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する及びＦｃεＲＩαポリペプチドとを接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び（ｃ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００２０】
いくつかの実施態様において、工程（ａ）で過剰量のＦｃεＲＩαポリペプチドを試料と接触させる。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドの少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍の過剰量を、工程（ａ）において試料と接触させる。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含む。ＦｃεＲＩαポリペプチドは、標識されていても、されていなくてもよい。
【００２１】
本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、標識され、標識に特異的に結合する捕捉剤によって表面に接続される。いくつかの実施態様において、標識はビオチンであり、表面はストレプトアビジンで被覆されている。いくつかの実施態様において、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合は、標識抗ヒトＩｇＥ抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されており、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合はＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはジゴキシゲニンで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合はＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはルテニウムで標識され、抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合は電気化学発光アッセイによって検出される。
【００２２】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性がＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である抗体；及びｂ）ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドを含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。本願明細書に記載されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。いくつかの実施態様において、過剰量のＦｃεＲＩαポリペプチドがキットに提供される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている。いくつかの実施態様において、キットは、ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤をさらに含む。いくつかの実施態様において、キットは、抗ヒトＩｇＥ抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、抗ヒトＩｇＥ抗体は標識されている。
【００２３】
別の態様においては、本発明は、以下の工程を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するための方法を提供する：（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドとプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキューベートされた試料を治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性と比較して減少している工程；及び（ｃ）抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出する工程。
【００２４】
本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は治療的抗ＩｇＥ抗体の前記ヒトＩｇＥへの相対的結合親和性の約１０％以下である。
【００２５】
いくつかの実施態様において、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍の過剰なＦｃεＲＩαポリペプチドが工程（ａ）において試料と共にプレインキュベートされる。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。
【００２６】
いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は、工程（ｂ）における試料とのインキューベーションの前又は後に、表面に接続される。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は、工程（ｂ）における試料とのインキューベーションの前に、表面に直接固定される。
【００２７】
いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は標識され、標識に特異的に結合する固定された捕捉剤によって表面に接続される。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は、ビオチンで標識され、ストレプトアビジン被覆表面に接続される。
【００２８】
いくつかの実施態様において、抗薬剤抗体の治療抗体又はミュータント治療抗体への結合は、ＨＲＰがコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されており、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合は標識を検出することによって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはジゴキシゲニンで標識されており、抗薬剤抗体の治療抗体又はミュータント治療抗体への結合はＨＲＰでコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体によって検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはルテニウムで標識されており、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合は電気化学発光アッセイによって検出される。
【００２９】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体又はそのミュータント治療抗体であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性はヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、抗体；及び（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドを含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。本願明細書で提供されるいかなるミュータント治療抗体が用いられてもよい。いくつかの実施態様において、キットは抗ヒトＩｇＥ抗体をさらに含む。いくつかの実施態様において、抗ヒトＩｇＥ抗体は標識されている。本願明細書で提供されるいかなるＦｃεＲＩαポリペプチドが用いられてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識されている。いくつかの実施態様において、キットは、ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識に特異的に結合する検出剤をさらに含む。
【００３０】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供する：（ａ）患者の試料を治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００３１】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供する：（ａ）患者の試料を治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００３２】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供する：（ａ）患者の試料を（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続させる工程；及び（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００３３】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供する：（ａ）患者の試料を過剰量のヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキュベートされた試料を治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００３４】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、ＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療する方法を提供する：（ａ）患者の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルを測定する工程；（ｂ）試料中の抗薬剤抗体のレベルが、患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示さない場合、患者に治療的抗ＩｇＥ抗体の有効量を投与する工程。抗薬剤抗体のレベルは、本願明細書で提供されるいかなる方法によって測定されてもよい。
【００３５】
別の態様において、本発明は、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットの調製における、治療的抗ＩｇＥにおいて少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体の使用を提供し、検出は以下の工程を含む：（ａ）抗薬剤抗体を含みうる試料をミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００３６】
別の態様において、本発明は、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットの調製における、治療的抗ＩｇＥにおいて少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体抗体の使用を提供し、検出は以下の工程を含む：（ａ）抗薬剤抗体を含みうる試料をミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００３７】
別の態様において、本発明は、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットの調製における（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドの使用を提供し、検出は以下の工程を含む：（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料と、（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ＦｃεＲＩαポリペプチドを接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である、工程；（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続する工程；及び（ｃ）ミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００３８】
別の態様において、本発明は、試料中で治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットの調製における（ｉ）治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ工程において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体、及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドの使用を提供し、検出は以下の工程を含む：（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を過剰量のＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキューベートされた試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は、前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び（ｃ）治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への抗薬剤抗体の結合を検出する工程。
【００３９】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するためのキットの調製における、治療的抗ＩｇＥ工程において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体の使用を提供し、同定は以下の工程を含む：（ａ）患者の試料をミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性が前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００４０】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するためのキットの調製における、治療的抗ＩｇＥ工程において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体の使用を提供し、同定は以下の工程を含む：（ａ）患者の試料をミュータント治療抗体と接触させる工程であって、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の活性が前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である工程；及び（ｂ）ミュータント治療抗体へのＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００４１】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するためのキットの調製における（ｉ）ミュータント治療抗体、及び（ｉｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドの使用を提供し、同定は以下の工程を含む：（ａ）患者の試料と、（ｉ）ミュータント治療抗体及び（ｉｉ）ＦｃεＲＩαポリペプチドを接触させる工程であって、ミュータント治療抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、ヒトＩｇＥへのミュータント治療抗体の相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性の約１０％以下である、工程；（ｂ）表面にミュータント治療抗体を接続する工程；及び（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であった、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルが、患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００４２】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するためのキットの調製における（ｉ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチド、及び（ｉｉ）治療的抗ＩｇＥ抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体において少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体の使用を提供し、同定は以下の工程を含む：（ａ）患者の試料を過剰量のＦｃεＲＩαポリペプチドと共にプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキュベートされた試料を治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体と共にインキュベートする工程であって、ミュータント治療抗体のヒトＩｇＥへの相対的結合親和性は前記ヒトＩｇＥへの治療的抗ＩｇＥ抗体の相対的結合親和性と比較して減少している、工程；及び（ｃ）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程であって、試料中の抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す、工程。
【００４３】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体を含むＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療するための組成物であって、患者の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルが測定され、試料の抗薬剤抗体のレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示さない、組成物を提供する。別の態様においては、本発明は、ＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療するための治療的抗ＩｇＥ抗体であって、患者の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルが測定され、試料の抗薬剤抗体のレベルは患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示さない、治療的抗ＩｇＥ抗体を提供する。
【００４４】
本明細書に記載される様々な実施態様の特性の一つ、一部又は全ては、本発明の他の実施態様と組み合わせてもよいことは理解されるべきである。本発明のこれら及び他の態様は、当業者にとって明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
図１Ａは、抗体Ｅ２５の軽鎖アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。図１Ｂは、抗体Ｅ２５の重鎖アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。Ｋａｂａｔに定義されるＣＤＲ領域が括弧で表されているのに対して、Ｃｈｏｔｈｉａに定義されるＣＤＲ領域はボールドで示されている。
【００４６】
図２Ａは、精製されたヒトＩｇＥへのＥ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントの結合親和性を比較するＥＬＩＳＡアッセイの図表示である。図２Ｂは、ヒトＩｇＥへのＥ２５の結合と比較したヒトＩｇＥへのＥ２５−ＡＡＡミュータントの結合を示すグラフである。Ｅ２５−ＡＡＡミュータントは、ＩｇＥに対してＥ２５より約１００ｘ少ない親和性を有した。
【００４７】
図３は、治療的抗ＩｇＥ抗体についての活性アッセイの図表示である。
【００４８】
図４Ａは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ２の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ２の結合を示すグラフである。図４Ｂは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ１０の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ１０の結合を示すグラフである。図４Ｃは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ１の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ１の結合を示すグラフである。図４Ｄは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ７の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ７の結合を示すグラフである。図４Ｅは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ９の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ９の結合を示すグラフである。図４Ｆは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ１３の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ１３の結合を示すグラフである。図４Ｇは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ４の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ４の結合を示すグラフである。図４Ｈは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＡＭＥ５の結合と比較したＥ２５へのＡＭＥ５の結合を示すグラフである。
【００４９】
図５は、アッセイ系のポジティブコントロール抗体として設計されたＥ２５特異的なＩｇＥキメラ抗体を示す。キメラ抗体の可変領域は、Ｅ２５のＦａｂ断片に特異的に結合する抗体ＡＭＥ２からのものであり、キメラ抗体の定常領域はヒトＩｇＥ抗体からのものである。
【００５０】
図６Ａは、Ｅ２５抗体又はＥ２５−ＡＡＡミュータント抗体へのキメラＥ２５特異的ＩｇＥポジティブコントロール抗体の結合を試験するためのアッセイ系の図表示である。図６Ｂは、キメラＥ２５特異的なＩｇＥポジティブコントロール抗体が同程度の親和性でＥ２５及び２５−ＡＡＡミュータントと結合することを示すグラフである。
【００５１】
図７は、Ｅ２５−ＡＡＡミュータント抗体を用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５−特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５２】
図８は、Ｅ２５−ＡＡＡミュータント抗体を用いたＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの感度を測定するためのＥ２５特異的ＩｇＥ標準曲線を示す。この図は、図７に記載されるアッセイフォーマットを用いた結果を示す。
【００５３】
図９は、漸増濃度のＥ２５存在下で、Ｅ２５−ＡＡＡミュータント抗体を用いたＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの薬剤耐性を示す。
【００５４】
図１０は、半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５５】
図１１は、半均一系ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５６】
図１２は、「ブロッキング」均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５７】
図１３は、「ブロッキング」均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５８】
図１４は、均一系ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。
【００５９】
図１５は、半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。図１５の左パネルは、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。図１５の右パネルは、Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。
【００６０】
図１６は、半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。図１６の左パネルは、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。図１６の右パネルは、Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。
【００６１】
図１７は、半均一系ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを用いた、ＩｇＥアイソタイプのＥ２５特異的抗体を検出するためのアッセイの図表示である。図１７の左パネルは、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。図１７の右パネルは、Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント）を用いたアッセイを示す。
【発明の詳細な説明】
【００６２】
本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体（例えばオマリズマブ、ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））に特異的なＩｇＥアイソタイプ抗薬剤抗体を検出するのに有用な方法及び試薬を提供する。内因性ＩｇＥが治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的なＩｇＥの検出を干渉することから、そのようなアッセイの開発に伴う課題には、内因性ＩｇＥ（抗ＩｇＥ治療抗体による結合に利用可能なＦｃ領域を有するＩｇＥ）と治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的なＩｇＥとを区別することの困難性が含まれる。本発明は、内因性ＩｇＥと、治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的なＩｇＥとを識別することができ、治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的なＩｇＥを特異的に検出することができる方法及び試薬を提供する。
【００６３】
Ａ．一般的な技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を用いる。このような技術は、例えば次のような文献に詳しく説明されている：「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版 (Sambrook 等, 1989); 「Oligonucleotide Synthesis」 (M. J. Gait編, 1984); 「Animal Cell Culture」 (R. I. Freshney編, 1987); 「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.); 「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel等編,1987, 及び定期的更新版); 「PCR: The Polymerase Chain Reaction」,(Mullis等編,1994）。
【００６４】
特に明記しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。Singleton等, Dictionary of Microbiology 及び Molecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons (New York,  N.Y. 1994), 及び March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms 及びStructure  第4版, John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992) は、本願において使用される多くの用語に対する一般的な指針を当業者に提供する。
【００６５】
Ｂ．定義
本明細書で使用される「抗薬剤抗体」とは、可変領域が治療的抗ＩｇＥ抗体に結合している抗体である。例えば、本明細書に記載の治療用抗体オマリズマブ（Ｅ２５）に結合する可変領域を有する抗体は、抗薬剤抗体である。
【００６６】
用語「抗体」とは、本明細書で最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の生物活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００６７】
「抗体断片」とは、完全長抗体の一部分、一般に完全長抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００６８】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと重鎖の可変ドメイン及び第一定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ）’２抗体断片には一対のＦａｂ断片が含まれ、これは通常、ヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有結合する。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００６９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、一本の重鎖及び一本の軽鎖可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなしたダイマーからなる。これら二つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ）が生じる。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識し結合する能力を有している。
【００７０】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る変異体（通常少量で存在する変異体など）を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないことを意味するものではない。本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例: Kohler等, Nature,256:495(1975); Harlow等, Antibodies: Laboratory Manual, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 第2版1998 ); Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y.,1981)のHammerling等)、組換えDNA法(参照例:米国特許第４８１６５６７号)、ファジーディスプレイ法(参照例: Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991); Marks等, J.Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu等, J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee等, J.Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee等J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004)、及びヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部もしくは全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生するための技術（参照例: 国際公開第１９９８／２４８９3号; 国際公開第１９９６／３４０９６号; 国際公開第１９９６／３３７３５号; 国際公開第１９９１／１０７４1号; Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann等, YearinImmuno., 7:33 (1993); 米国特許第５５４５８０６号; 第５５６９８２５号；第５５９１６６９号 (全てGenPharm); 第５５４５８０７号；国際公開第１９９７／１７８５２号；米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；及び第５６６１０１６号; Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg等, Nature ,368:856-859(1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); ��びLonberg及びHuszar, Intern. Rev .Immunol., 13:65-93 (1995）のような種々の手法によって作られる。
【００７１】
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体を含む。「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体、又は特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応配列と同一又は相同であり、一方、該鎖の残部が、別の種に由来する抗体、又は別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体、及び所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片における対応配列と同一又は相同である(米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 6851-6855 (1984))。ここで使用されるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【００７２】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント又は受容体抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見い出されない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、通常は２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが上ヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性を改良する一又は複数のアミノ酸置換を含み得る。ＦＲにおけるこのようなアミノ酸の置換数は通常、重鎖で６、軽鎖で３にすぎない。．また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、Jones 等., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann等, Nature 332: 323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００７３】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はヒト抗体を製造するための任意の周知技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００７４】
本明細書で使用される用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に高度な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例として、Xu等, Immunity 13: 37-45 (2000); Methodsin Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, 編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)のJohnsonand Wuを参照のこと。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は、軽鎖の不存在下で機能的で安定である。例として、Hamers-Casterman等 ,Nature363:446-448 (1993); Sheriff 等, Nature Struct .Biol. 3:733-736(1996)を参照のこと。
【００７５】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの位置に言及してい(Chothia及びLesk J.Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの間の妥協を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の解析に基づく。これらの各ＨＶＲからの残基は以下に記される。
2013508740.tif 000001
【００７６】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる：ＶＬの２４−３６又は４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）と、ＶＨの２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基には、これら各々を定義するために上掲のＫａｂａｔ等に従って番号を付した。
【００７７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義しているＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７８】
用語「Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基ナンバリング」又は「Ｋａｂａｔのアミノ酸位置のナンバリング」及びそれらの変形は、上掲のＫａｂａｔ等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに対して用いられるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを用いると、実際の線状のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮物又はそれらへの挿入物に相当する、より少ないアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列と、抗体の配列相同性がある領域において配列比較することによって、所与の抗体について決定され得る。
【００７９】
Ｋａｂａｔナンバリングシステムは一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３）を指す場合に用いられる(例として、Kabat等, Sequences of Immunological Interest. 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) 参照)。免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、一般に「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる（参照例：上掲のＫａｂａｔ等に記載のＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。本明細書では、特に明記しない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって番号付けする残基を意味する。本明細書では、特に明記しない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵナンバリングシステムによって番号付けする残基を意味する（参照例：米国特許仮出願第６０／６４０３２３号、ＥＵナンバリングの図）。
【００８０】
用語「Ｆｃ領域」は、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域又は変異Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によってＣＨ４ドメインを含む。本明細書中の「Ｆｃ領域鎖」は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
【００８１】
一般的に、「結合」又は「特異的結合」とは、２つの分子が十分な親和性をもって結合することを指す（抗体と一又は複数の標的、抗ＩｇＥ抗体とＩｇＥ、及び抗薬剤抗体と薬剤など）。無関係な分子への抗体の結合の程度は、好ましくは、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体の標的への結合の約１０％未満である。いくつかの実施態様において、標的に結合する抗体の解離定数（Ｋｄ値）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭである。
【００８２】
一般的に、「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の一価の相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は通常、抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は通常、抗原により速く結合し、より長く結合を維持する傾向がある。結合親和性の種々の測定方法は当該技術分野において周知であり、それらの何れも本発明の目的ために用いることができる。結合親和性を測定するための具体的な実例であって例示的な実施態様を以下に記載する。
【００８３】
一実施態様では、本発明に記載の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイで説明するように、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施する放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原とＦａｂとを平衡させた後、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートに捕捉することによって、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen 等, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイ条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ））のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの（１２５Ｉ）−抗原を段階希釈した目的のＦａｂと混合させる（例えば、Presta等, Cancer Res. 57: 4593-4599(1997) の抗VEGF抗体、Fab-12の評価と一致）。次いで目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまで長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温でインキュベートする（例えば１時間）。次いで、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ−２０ＴＭを含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ社製）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ社製）で１０分間計測する。それぞれ最大結合の２０％以下の濃度のＦａｂを選択して競合結合アッセイに用いる。
【００８４】
他の実施態様に従って、−１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（−０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。反応速度論的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ））を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えば流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される漸増濃度の抗原の存在下、２５℃、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。
【００８５】
本発明に記載の「会合速度（「ｏｎ−ｒａｔｅ」、「ｒａｔｅ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」、「ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ」、又は「ｋｏｎ」）」は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００システム（ＢｌＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して上に記載の通り決定することもできる。
【００８６】
本明細書で使用される用語「実質的に類似」又は「実質的に同じ」は、当業者が、二つの値の間の差異が、前記値（例えば、相対結合親和性値）によって測定される生物学的特性という脈絡の中で、わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意性がないと考えるであろうほどの、二つの数値（例えば、一つは本発明の抗体に関連するもの、他方は参照／比較抗体に関連するもの）の間の十分に高い類似性を意味する。前記二つの値の間の差異は、参照／比較値に応じて、例えば約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び／又は約１０％以下である。
【００８７】
用語「試料」は、本明細書で用いているように、目的の被検体から得た組成物を指す。試料には、限定されないが、個体の全血、血清又は血漿が含まれる。
【００８８】
「全ＩｇＥ」は、非結合遊離ＩｇＥ及び結合パートナーとの複合体を形成するｇＥを含む、試料中に存在するＩｇＥの総量を指す。「遊離ＩｇＥ」は、結合パートナーに結合しないＩｇＥを指す。
【００８９】
本明細書で用いる「被検体」、「個体」又は「患者」は、哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類には、限定されないが、ヒト、霊長類、家畜、競技用動物（例えば、ウマ）、げっ歯類並びにペット（例えば、イヌ及びネコ）が挙げられる。
【００９０】
「評価を補助する」ための方法は、本明細書で用いているように、臨床的判断（例えばアナフィラキシーのリスク）を下す際の支援の方法を指し、最終的な評価に関して決定的であってもなくてもよい。
【００９１】
「基準値」は、本明細書で用いているように、絶対値；相対値；上限及び／又は下限を有する値；数値の範囲；算術平均値（ａｖｅｒａｇｅ  ｖａｌｕｅ）；中央値；平均値（ｍｅａｎ  ｖａｌｕｅ）、又は特定のコントロール値もしくはベースライン値と比較した場合の値であり得る。
【００９２】
用語「検出すること」又は「検出」は、特定の分子の定性的及び定量的測定の両方、本明細書においては例えばＩｇＥ又は抗薬剤抗体などの特定の被分析分子の測定を含むようにもっとも広い意味で使用される。一態様において、本明細書に記載の検出方法は、試料中の目的の被分析分子の存在を単に確認するために用られる。別の態様において、検出方法は、試料中の被分析分子の量を定量するために用いられる。更に別の態様において、該方法は、目的の被分析分子の標的分子への相対的結合親和性を決定するために用いられる。
【００９３】
用語「検出剤（「ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ」、「ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ」）及び「検出試薬（「ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ」、「ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ」）は互換的に使用され、検出剤に結合可能な、蛍光標識、酵素標識、放射性標識又は化学発光標識等の標識を介して直接的に、あるいは検出剤と特異的に結合する抗体又は受容体等の標識結合パートナーを介して間接的に、被分析分子を検出する薬剤を指す。検出剤の例には、限定されないが、抗体、抗体断片、可溶型受容体、受容体断片などが含まれる。
【００９４】
「相関」又は「相関する」は、任意の方法で、第一の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果を、第二の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコルを行う際に第一の分析又はプロトコルの結果を用いてもよいし、及び／又は第一の分析又はプロトコルの結果を用いて、第二の分析又はプロトコルを行うかどうかを決定してもよい。
【００９５】
用語「アッセイ表面」又は「表面」は、イムノアッセイで使用するために、捕捉剤が表面上に固定化されている基質を意味する。好適なアッセイ表面としては、重合アッセイプレート、流動性カード（ｆｌｕｉｄｉｔｙ  ｃａｒｄｓ）、電磁ビーズ、樹脂、セルロースポリマースポンジなどが挙げられる。
【００９６】
用語「結合ドメイン」は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を指す。Ｆｃ受容体ポリペプチドすなわちＦｃＲの場合に結合ドメインは、免疫グロブリン又は他のＦｃ領域を含む分子のＦｃ領域への結合を担っているそのポリペプチド鎖（例えばそのα鎖）の一部分を含むことができる。一つの有用な結合ドメインはＦｃ受容体α鎖ポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である。本明細書に記載するように、ＦｃεＲＩα鎖の細胞外ドメインは、Ｉｇ、例えばＩｇＥのＦｃ領域に結合する結合ドメインを含む。
【００９７】
用語「捕捉剤」又は「捕捉試薬」は、試料中の標的分子又は被分析分子を結合し捕捉することができる薬剤を指す。通常、捕捉剤又は捕捉試薬は、微小粒子又はビーズ、マイクロタイタープレート、カラム樹脂、チップ、流動性カード、磁気ビーズ、セルロースポリマースポンジなどの固体基質上に、例えば、固定化されている。捕捉剤は、抗原、可溶性受容体、抗体、異なる抗体の混合物などであり得る。
【００９８】
「キメラ」ポリペプチドとは、その中のポリペプチド配列の一部分が一つの種に由来し、一方、他の少なくとも一つの部分が異なる種由来の配列に相当している、ポリペプチドである。
【００９９】
用語「標識」は、本明細書に用いる場合、例えば核酸プローブ、ポリペプチド又は抗体などの試薬に直接的もしくは間接的にコンジュゲート又は縮合している化合物又は組成物を指し、それがコンジュゲート又は縮合している試薬の検出又は捕捉を容易にする。標識は、それ自体が検出可能なもの（例えば放射性標識、蛍光性標識、光輝標識、化学発光標識又は電気化学発光標識）、他の分子と結合した後に検出可能なもの、あるいは酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変成を触媒するものであってもよい。
【０１００】
用語「標的分子」は、被分析分子の特定の結合標的を指す。被分析分子が抗体の場合、標的分子は、例えば抗原であり得る。標的分子は例えば、治療活性を有するポリペプチド又は抗体であり得る。一実施態様において、標的分子は治療的抗体であり、被分析分子は治療的抗体に結合する抗薬剤抗体である。
【０１０１】
「被分析物」及び「被分析分子」は、本明細書で用いているように、本発明の方法によって分析される分子を指し、限定されないが、それは抗薬剤抗体を含む。
【０１０２】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」治療されている個体又は細胞の自然の経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過においての何れかで実施できる。治療の望ましい効果は、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的帰結の低減、疾患の進行速度を遅らせること、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の治療的抗体は、疾患又は障害の発症を遅らせるため、あるいは疾患又は障害の進行を遅らせるために使用される。
【０１０３】
「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療剤の「治療的有効量」は、個体の病状、年齢、性別及び体重、また、個体に所望の反応を引き出すための本発明の抗体の能力等の要因によって変わり得る。また、治療的有効量とは、治療剤の毒性又は有害作用よりも治療的に有益な作用が上回る量である。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。必ずではないが、通常、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に被検体に使用されるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【０１０４】
「保守的置換」は、本明細書で用いているように、選択したアミノ酸を、特性において実質的に違いのない別のアミノ酸と置き換えることである。アミノ酸の特性による分類は、正荷電アミノ酸：Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ；負荷電アミノ酸：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；アミドアミノ酸：Ａｓｎ，Ｇｌｎ；芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ；疎水性アミノ酸：Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ；及び非荷電親水性アミノ酸：Ｓｅｒ，Ｔｈｒ。好ましい保守的アミノ酸置換を以下に示す：
保存的アミノ酸置換
2013508740.tif 000002
【０１０５】
用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、アミノ酸ポリマー又は二つ以上の相互作用もしくは結合したアミノ酸ポリマーのセットを表すために互換的に使用される。
【０１０６】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を指し、ペプチド、オリゴマー、タンパク質などを含む。ポリペプチドは、天然か、又は修飾されたか合成されたアミノ酸を含み得る。またポリペプチドは、例えば翻訳後プロセシングによって天然に、又はアミド化、アシル化、架橋など化学的に修飾され得る。
【０１０７】
本明細書で用いているように、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り、単数又は複数（すなわち、一又は複数）を意味する。
【０１０８】
本明細書における「およそ」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体に対する実施態様を含む（記載する）。例えば、「およそＸ」との記載には「Ｘ」の記載が含まれる。
【０１０９】
本明細書に記載の本発明の態様及び変形形態は、態様及び変形形態「からなる」及び／又は「本質的にからなる」を含む。
【０１１０】
Ｃ．発明の方法
本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体．に特異的に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するのに有用な方法及び試薬を提供する。本発明はまた、個体由来の試料中の治療的抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の存在及び／又は量を測定すること、並びに試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の存在及び／又は量に基づいてアナフィラキシーのリスクを評価することによって、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシーのリスクを有する個体を同定する方法を提供する。本発明は、ＩｇＥ媒介性疾患を有する個体を治療するための方法であって、個体由来の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に対する抗薬剤抗体の存在及び／又は量を決定すること、並びに、試料中の抗薬剤抗体の量により個体が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクをも持たないことが示される場合、その個体に対して治療的抗ＩｇＥ抗体の有効量を投与することを含む、方法を更に提供する。
【０１１１】
治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体
本発明の方法は、抗ＩｇＥ治療的抗体に特異的に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するのに有用である。このようなアッセイを展開することの難しさは、抗ＩｇＥ抗体が標的とする内因性ＩｇＥへの結合と、抗ＩｇＥ抗体に特異的に結合するＩｇＥ（すなわち、ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体）への結合を識別する能力にある。いくつかの実施態様において、ＩｇＥはヒトＩｇＥである。
【０１１２】
本明細書で用いているように、「抗ＩｇＥ抗体」又は「治療的抗ＩｇＥ抗体」は、ＩｇＥの高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）への結合を阻害するか又は実質的に減じるような方法でＩｇＥに結合する抗体である。例示的抗ＩｇＥ抗体には、例えば、Ｅ２５（オマリズマブ）、Ｅ２６、Ｅ２７、並びにＣＧＰ−５１０１（Ｈｕ−９０１）及びＨＡ抗体が含まれる。重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、並びにヒト化抗ＩｇＥ抗体Ｅ２５、Ｅ２６とＥ２７の完全長重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、例えば米国特許第６１７２２１３号（図２と１２）及び国際公開第９９／０１５５６号に開示されている。ＣＧＰ−５１０１（Ｈｕ−９０１）抗体はCorne等,1997,J.Clin.Invest.99(5):879-887、国際公開第９２／１７２０７号、及びＡＴＴＣ受託番号ＢＲＬ−１０７０６、１１１３０、１１１３１、１１１３２及び１１１３３に記載されている。図１に抗ＩｇＥ抗体Ｅ２５（オマリズマブ）の完全長アミノ酸配列を示す。ＨＡ抗体は、国際公開第２００４／０７００１１号及び国際公開第２００４／０７００１０号の実施例１０、表２に示されている抗体ＭＡｂ２（ＣＬ−２Ｃ）である。ＨＡ抗体を産生する細胞株は、２００３年１２月３日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）へ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５６７８として寄託された。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、本発明の方法は、ＩｇＥ（ヒトＩｇＥなど）に対して非修飾の治療的抗ＩｇＥ抗体よりも有意に低い結合親和性（相対結合親和性を含む）及び／又は有効性を有するミュータント抗ＩｇＥ抗体を用いる。ミュータント治療抗ＩｇＥ抗体は、次の特性を一つ以上有するように設計される：ａ）ミュータント抗体のＩｇＥへの結合親和性（相対的結合親和性を含む）が、治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥへの結合親和性（相対的結合親和性を含む）の約１０％以下である；ｂ）ミュータント抗体のＩｇＥへの活性が治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である；ｃ）ミュータント抗体が治療的抗ＩｇＥ抗体と同じが類似の三次構造を有する；ｄ）ミュータント抗体が治療的抗ＩｇＥ抗体と同じか同程度のグリカンレベルを有する；ｅ）ミュータント抗体が一つ以上のコントロールの抗薬剤抗体に対し、治療的抗ＩｇＥ抗体と同じが同程度の結合親和性を有する。ＩｇＥへの相対的結合親和性及び／又は活性を低下させるのに有効な可変領域におけるアミノ酸変異の最小数を有するミュータント治療抗体を、本明細書に記載のアッセイにおける使用のために選択することができる。いくつかの実施態様において、ミュータント抗体は、治療的抗ＩｇＥ抗体の重鎖及び／又は軽鎖の一つ以上のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のうちの１、２又は３つ）の１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸変異（例えば、置換、欠失又は付加）を含む。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、ＩｇＥに対するミュータント抗体の活性は、治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥに対する活性の約１０％以下、約７．５％以下、約５％以下、約２．５％以下、約２．０％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以又は約０．１％以下である。
【０１１５】
いくつかの実施態様においてミュータント治療抗体のＩｇＥへの相対的結合親和性は、治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥへの相対的結合親和性の約１０％以下、約７．５％以下、約５％以下、約２．５％以下、約２．０％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以又は約０．１％以下である。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブであり、ミュータント抗体は軽鎖の第一のＣＤＲにおいて１、２又は３つのアミノ酸変異、及び／又は重鎖の第三のＣＤＲにおいて一、二又は三つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブであり、ミュータント抗体は、配列番号２の重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号１の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、ここで配列番号１の３４位、３０位及び３４位、３２位及び３４位、又は３０位、３２位及び３４位のアミノ酸Ａｓｐは置換されている。いくつかの実施態様において、配列番号１の３０位、３２位及び／又は３４位のアミノ酸ＡｓｐはＡｌａで置換されている。．いくつかの実施態様において、ミュータント抗体は配列番号２の重鎖アミノ酸配列、及び配列番号１の３０位、３２位及び３４位においてＡｓｐからＡｌａへのアミノ酸置換を有する配列番号１の軽鎖アミノ酸配列を含む。ＩｇＥへの相対的結合親和性及び／又は活性が治療的抗体Ｅ２５の相対的結合親和性又は活性の約１０％以下である、Presta等(J.Immunol.151:2623-2632,1993)に記載の任意の抗ＩｇＥ抗体は本明細書に記載の方法においてミュータント治療抗体として使用される。
【０１１７】
抗薬剤抗体は、ミュータント抗体を選別するためのコントロールとして生成及び使用される。これらのコントロール抗体は、類似の親和性で、又は等しく十分にミュータント抗体及び非修飾の治療的抗ＩｇＥ抗体と結合する。いくつかの実施態様において、コントロールの抗薬剤抗体は抗ＩｇＥ抗体のＦａｂ断片に結合する。いくつかの実施態様において、コントロールの抗薬剤抗体は抗ＩｇＥ抗体．の一つ以上のＣＤＲに結合する。実施例２に記載の結合アッセイは、コントロールの抗薬剤抗体（例えば、図５に示すコントロール抗体など）を使用してミュータント抗体を試験及び選別するために用いられる。アッセイ方法については、図６Ａを参照のこと。
【０１１８】
治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体の活性は、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体が、基準コントロールと比較して高い親和性を示す受容体（ＦｃεＲＩ）と競合的にＩｇＥへ結合する能力を測定することによって決定される。一般的アッセイ方法には、例えばＥＬＩＳＡやＥＣＬＡなど、アッセイ表面に結合して所望の標的分子を捕捉及び固定化する捕捉剤を含むイムノアッセイが挙げられる。捕捉された標的分子は、標的分子に結合して定量化のための検出レベルを提供する検出剤を用いて検出される。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体の活性は、図３に示したような阻害ＥＬＩＳＡによって決定される。漸増濃度の抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体は、標識されたＩｇＥとともにインキュベートされる。混合物を、捕捉剤として固定化されたＦｃεＲＩαポリペプチドを含有するプレートに添加する。標識されたＩｇＥに結合する抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体は検出可能なシグナルを低減させ、標識されたＩｇＥの捕捉剤への結合を効率的に阻害する。したがって、試料の抗−ＩｇＥ活性は検出されるシグナルに逆相関する。
【０１２０】
本明細書に記載のＦｃεＲＩαポリペプチドは、このようなアッセイにおいてＩｇＥに結合する捕捉剤として使用可能である。捕捉されたＩｇＥの量は、例えばスタンダードロットもしくは既知量の抗ＩｇＥ抗体を有する他のスタンダード及び／又は抗ＩｇＥ抗体欠失コントロールなどのコントロールと比較可能である。標識されたＩｇＥから検出される低減シグナルはコントロールと比較され、また、阻害の量は抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体の活性に相関する。
【０１２１】
ミュータント治療抗体又は治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥへの結合親和性（相対的結合親和性を含む）はＥＬＩＳＡ又はＢＩＡコア（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｗａｙ  ＮＪ）を用いて測定することができる。相対的結合親和性は、薬剤のその標的への結合を他の薬剤と比較したものである。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、治療的抗ＩｇＥ抗体もしくはミュータント抗体、又はその断片（例えば、Ｆａｂ）を表面に固定化し、次いで上昇濃度（例えば、０．１ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌへ）の精製されたＩｇＥ（例えば、ヒトＩｇＥ）を固定化された治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体とともにインキュベートする。ＨＲＰで標識した検出剤（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体）を、固定化された治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体に結合した任意のＩｇＥと結合させる。ＨＲＰによって発せられるシグナルを測定する。例えば、図２Ａ及び２Ｂを参照。治療的抗ＩｇＥ抗体と比較して、ミュータント治療抗体の結合親和性の相対的低下を決定する。また、相対的な結合親和性は、ＩｇＥを直接表面（ＥＬＩＳＡプレート）に固定化し、様々な濃度の抗ＩｇＥ治療抗体又はミュータント抗体とともにインキュベートし、その後ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて結合した抗ＩｇＥ治療抗体又はミュータント抗体を検出することによっても測定可能である。固定化された治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体（例えば、Ｆａｂ断片）に対するヒトＩｇＥの結合親和性を測定するために、あるいはＢＩＡｃｏｒｅアッセイが使用され得る。
【０１２２】
治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体の他の特性、例えば、一次構造及び三次構造並びにグリカンレベルは既知の方法を用いて試験する。
【０１２３】
ＦｃεＲＩαポリペプチド
ＦｃεＲＩαポリペプチドは本明細書に記載のアッセイにおいて、捕捉剤、検出剤及び／又はブロッキング剤として使用可能である。用語「ＦｃεＲＩポリペプチド」は、ＩｇＥのＦｃ領域又はＩｇＥのＦｃ領域含有分子に結合するポリペプチド、及びＩｇＥのＦｃ領域又はＩｇＥのＦｃ領域含有分子に結合する受容体を形成するポリペプチドを表すために使用される。ＦｃεＲＩ受容体はＦｃ受容体ポリペプチドα鎖、及びε鎖のＦｃ受容体ポリペプチドホモダイマー又はヘテロダイマーを含み得る。ＦｃεＲＩα鎖は、Ｆｃドメイン含有物質、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）に結合する細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）を包含する。ＦｃＲは、Ravetch及びKinet,1991,Annu.Rev.Immunol.9: 457-492;Capel等,1994,Immunomethods 4:25-34;及びde Haas等,1995 J.Lab.Clin.Med.126 330-341に概説がある。高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）の生理学及び病理学は、Kinet,1999,Annu.Rev.Immunol.17 931(-972)に概説がある。
【０１２４】
いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩポリペプチドは、ヒト又は非ヒト霊長類（カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーなど）ＦｃεＲＩαポリペプチドのＦｃ結合ドメイン配列（細胞外ドメイン配列など）を含み得る。ＦｃεＲＩαポリペプチドはまた、合成ＦｃεＲＩαポリペプチド、ＦｃεＲＩαポリペプチドの変異体、ＦｃεＲＩαポリペプチドを含む融合タンパク質、及びＦｃεＲＩαポリペプチドを含むキメラタンパク質を含み得る。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、野生型のヒト又は非ヒト霊長類ＦｃεＲＩαと同様の親和性でヒトＩｇＥに結合し、ヒトＩｇＥのＣＤＲエピトープが治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するのをブロックしない。
【０１２５】
未成熟ＦｃεＲＩαポリペプチドは天然シグナル配列を含み、成熟ポリペプチドはシグナル配列を欠く。ＦｃεＲＩαポリペプチドは天然シグナル配列を含む未成熟ＦｃεＲＩαポリペプチド、及びシグナル配列を欠く成熟ポリペプチドを含む一実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、配列番号３（カニクイザル）、配列番号４（アカゲザル）、配列番号５（チンパンジー）、又は配列番号６（ヒト）のアミノ酸配列、及び配列番号３、４、５もしくは６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１２６】
ＦｃεＲＩα  ＩｇＥ結合断片ポリペプチド
いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはＦｃεＲＩαのＩｇＥ結合断片を含む。ＦｃεＲＩαのＩｇＥｊ結合断片は、好ましくはＩｇＥに対する高親和性を保持する。一実施態様において、ＩｇＥ結合断片は、ヒト又は非ヒト霊長類ＦｃεＲＩαの細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）を含み、配列番号３、４、５又は６のＥＣＤ又は配列番号３、４、５又は６と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体のＥＣＤであり得る。
【０１２７】
カニクイザル、アカゲザル及びヒトＦｃεＲＩαのアミノ酸配列を以下の表１に示す。国際公開第０８／０２８０６８号に記載の任意の非ヒト霊長類ＦｃεＲＩαポリペプチドを使用してよい。
表１．霊長類ＦｃεＲＩα成熟配列
2013508740.tif 000003
【０１２８】
ＦｃεＲＩα  ＥＣＤは例えば、表１で番号付けした残基Ｖ１からＫ１７１、Ａ１７２、Ｐ１７３、Ｈ／Ｒ１７４、Ｄ／Ｅ１７５、又はＦｃεＲＩαポリペプチドのＫ１７６へと、伸長可能である。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩポリペプチドは次のＦｃεＲＩα  ＥＣＤ断片：Ｖ１−Ｋ１７１、Ｖ１−Ａ１７２、Ｖ１−Ｑ／Ｐ１７３、Ｖ１−Ｈ／Ｒ１７４、Ｖ１−Ｄ／Ｅ１７５、又はＶ１−Ｋ１７６の何れをも含む。したがって例示的ＦｃεＲＩα  ＥＣＤポリペプチドは、配列番号３、４、５又は６のＶ１からＫ１７１、Ｖ１からＡ１７２、Ｖ１からＰ１７３、Ｖ１からＨ／Ｒ１７４、Ｖ１からＤ／Ｅ１７５又はＶ１からＫ１７６の残基、及び配列番号３、４、５又は６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の同一性を有するその変異体の残基を含むポリプチドである。
【０１２９】
更に断片には、ＩｇＥへの高結合親和性を保持するＥＣＤの切断ミュータント及び欠失ミュータントも含まれる。
【０１３０】
ＦｃεＲＩα変異体ポリペプチド
いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは変異体ＦｃεＲＩαポリペプチドを含む。変異体ＦｃεＲＩαポリペプチドは、天然ポリペプチドに比べて少なくとも一つのアミノ酸置換、欠失又は挿入を有する。ＦｃεＲＩα変異体は、標的残基を同じ一般的特性を有する対応する残基で置換する（例えばＬｙｓをＡｒｇに）一又は複数の保守的アミノ酸置換（本明細書に記載）が可能である。このようなアミノ酸置換はポリペプチドの全体的な機能を改変することなく行うことができる。ＦｃεＲＩα変異体ポリペプチドはまた、非保守的置換も含み得る。
【０１３１】
変異体ＦｃεＲＩαポリペプチドは、第一の種のＦｃεＲＩαのアミノ酸を第二の種のＦｃεＲＩαの対応するアミノ酸で置き換える一又は複数の置換を有する。例えば、コードされたポリペプチドは、表１に示した通り、２９、３７、４８、４９、５９、７３、７４、７５、８０、１４１、１５５、１６０、１７３、１７４又は１７５位で一又は複数のアミノ酸置換（但し１４以下）を含む。一又は複数の置換には、例えば、以下のアミノ酸置換のうち一又は複数（且つ１４未満）が挙げられる：
Ｓ２９Ｎ    Ｍ３７Ｔ    Ｖ４８Ｅ    Ａ４９Ｔ    Ｄ５９Ｋ
Ｆ７３Ｖ    Ｄ７４Ｎ    Ｄ７５Ｅ    Ｈ８０Ｖ    Ｔ１４１Ａ
Ｌ１５５Ｖ    Ｃ１６０Ｙ    Ｑ１７３Ｐ    Ｈ１７４Ｒ    Ｄ１７５Ｅ
【０１３２】
ヒトＩｇＥ−Ｆｃドメイン／ＦｃεＲＩ複合体の結晶構造由来の構造情報は、Ｔｙｒ１６０が受容体とリガンドの接触面付近に位置することを示す。この接触面においてＣｙｓが結合を妨げるため、ＦｃεＲＩαポリペプチドは突然変異してＣｙｓ１６０をチロシンと置き換え、カニクイザル及びアカゲザルＦｃεＲＩαのヒトＩｇＥへの結合を高める。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、Ｃｙｓ１６０からチロシンへの突然変異を含む変化したＦｃεＲＩαポリペプチドを含む。例えば、変異したカニクイザルの配列を以下に示す。
ｐＲＫｇＤ  ｃｙｎｏＦｃεＲＩ．６ｘＨｉｓＴｙｒ１６０
2013508740.tif 000004
【０１３３】
キメラＦｃεＲＩαポリペプチド
いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはキメラポリペプチド、例えば、異なるＦｃεＲＩαポリペプチドの二つ以上の部分で形成されるキメラポリペプチドである。例えば、キメラＦｃεＲＩαポリペプチドは配列番号３、４、５及び６のうちの二つ以上に由来する二つ以上の部分から形成される。例示的キメラポリペプチドは、アカゲザルＦｃεＲＩα  ＥＣＤの残基１−１４１及びカニクイザルＦｃεＲＩα  ＥＣＤの残基１４２−１７１を含み、且つ配列番号１２（すぐ下を参照）のアミノ酸配列を有するカニクイザル／アカゲザルキメラポリペプチドである。更にキメラポリペプチドは、ヒト／カニクイザル、ヒト／アカゲザル、ヒト／チンパンジー、カニクイザル／チンパンジー、アカゲザル／チンパンジーなどのキメラを含み、これは夫々名前を挙げた種のＦｃεＲＩα  ＥＣＤの一部を含む。
ｒｈｅｓｕｓＳＳｃｙｎｏＦｃｅＲＩ．６ｘｈｉｓ  ｔｙｒ１６０
2013508740.tif 000005
【０１３４】
融合タンパク質
いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは融合タンパク質、例えば、一つ以上の異種ポリペプチドと融合したＦｃεＲＩαポリペプチドである。そのような融合タンパク質はＦｃεＲＩα  ＩｇＥ結合断片、例えば、少なくとも、カルボキシ末端又はアミノ末端で異種ポリペプチドと融合したＦｃεＲＩα  ＥＣＤを少なくとも含む。異種ポリペプチドは、任意のポリペプチドであってもよく、一般的に、融合タンパク質に特異的な特性を付与するポリペプチドである。
【０１３５】
異種ポリペプチドは、ＦｃεＲＩαポリペプチドの分泌、改善された安定性をもたらし、あるいは精製を容易にすることができる。そのようなペプチドタグの非限定的な例としては、６−Ｈｉｓタグ、Ｇｌｙ／Ｈｉｓ６／ＧＳＴタグ、チオレドキシンタグ、ヘマグルチニンタグ、Ｇｌｙｌｈ１５６タグ及びＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。例えば、ＦｃεＲＩαポリペプチドの細胞外ドメインはＨｉｓタグ、例えばＧｌｙ（Ｈｉｓ）６−ｇｓｔタグを含む（Ｈｉｓ）６に融合することができる。Ｇｌｙ（Ｈｉｓ）６−ｇｓｔタグは、核酸にコードされたポリペプチドの精製を容易にする。
【０１３６】
上記のように夫々の種のＥＣＤの用いて、ＦｃεＲＩαポリペプチドの異なる形態、例えば、受容体の細胞外ドメイン（残基１−１７６）、６つのＣ末端ヒスチジン残基及びシグナル配列を含む単量体形態など、が構成され、哺乳類細胞において発現される。例えば、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、ＥＣＤの代わりにＮ末端の天然シグナル配列、及びＨＩＳ６タグを含む単量体形態を含む：
ｃｙｎｏ  Ｆｃ  Ｒ１  （１−１７６）  ｈｉｓモノマー
2013508740.tif 000006
【０１３７】
ＦｃεＲＩαポリペプチドはまた、以下に示す単純ペルペスウィルス（ＨＳＶ）ｇＤタンパク質のシグナル配列及び第一の２７アミノ酸配列に融合したＥＣＤを含んでもよい。
2013508740.tif 000007
【０１３８】
いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは三つの特異的融合タンパク質の何れでもよく、夫々がＦｃεＲＩα  ＥＣＤ及び６ＸＨｉｓタグ： 
ｇＤカニクイザル  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６Ｘｈｉｓ  （配列番号１５）、
ｇＤアカゲザル  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６Ｘｈｉｓ  （配列番号１６）、及び
ｇＤチンパンジー  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６Ｘｈｉｓ  （配列番号１７）
に融合したＨＳＶ  ｇＤシグナル配列（下記の下線）を含む。
ｇＤｃｙｎｏ  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６ＸＨｉｓ
2013508740.tif 000008
ｇＤｒｈｅｓｕｓ  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６ＸＨｉｓ
2013508740.tif 000009
ｇＤｃｈｉｍｐ  ＦｃεＲＩα  １−１７６  ６ＸＨｉｓ
2013508740.tif 000010
【０１３９】
ＦｃεＲＩαポリペプチドは、イムノアドヘシン分子を形成するために抗体の免疫グロブリン定常ドメインへ融合することもできる。例えば、融合ポリペプチドはＦｃεＲＩαポリペプチドの細胞外ドメイン及びＩｇＧのＦｃ部分を含み、これらはここに提供する何れの方法でも用いられる。いくつかの実施態様において、融合ポリペプチドＦｃεＲＩα−ＩｇＧは以下の配列を含む：
2013508740.tif 000011
【０１４０】
いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドはＦｃεＲＩαのダイマー形態を形成するＩｇＧのＦｃドメインに融合するＦｃεＲＩαポリペプチドを含む融合タンパク質である。ＩｇＧ  Ｆｃドメインに存在するシステイン残基が融合ポリペプチドのダイマー化を可能にする。例えば、ＦｃεＲＩαをコード化する核酸断片は以下に示すＩｇＧのＦｃドメインに融合する。
ＩｇＧのＦｃドメイン
2013508740.tif 000012
【０１４１】
ＦｃεＲＩαポリペプチドは、免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃドメインに融合する、天然アカゲザルシグナル配列（ＳＳ）、アカゲザルＦｃεＲＩα  ＥＣＤ（残基Ｖ１−Ａ１４１）の一部及びカニクイザルＦｃεＲＩα  ＥＣＤ（残基Ｔ１４２−Ｋ１７１）の一部を含む。ＩｇＧドメインのシステイン残基がＦｃεＲＩαポリペプチドダイマーを形成するジスルフィド結合を可能にする。いくつかの実施態様においてＦｃεＲＩポリペプチドは、以下に示す配列を有するＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質を含む：
ｒｈｅｓｕｓ  （１−１４１）／ｃｙｎｏ  （１４２−１７１）  ＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質（１−１７１）
2013508740.tif 000013
【０１４２】
更にキメラアカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質は、配列１７１ＫＡＱＨＤＫＹＷ１７８の長さの増大に伴いキメラＦｃεＲＩαポリペプチドの長さを１−１７１から１−１７８へ変えることによって作られる融合タンパク質を含む。これらには以下が含まれる：
アカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質  （１−１７２）  （配列番号２１）
アカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質  （１−１７３）  （配列番号２２）
アカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質  （１−１７４）  （配列番号２３）
アカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質  （１−１７５）  （配列番号２４）
アカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質  （１−１７６）  （配列番号２５）
アカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質  （１−１７７）  （配列番号２６）
アカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質  （１−１７８）  （配列番号２７）
【０１４３】
例えば、ＦｃεＲＩαポリペプチドは以下に示す配列を有するアカゲザル／カニクイザルＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質（１−１７８）であってもよい：
ｒｈｅｓｕｓ／ｃｙｎｏ  ＦｃεＲＩα−ＩｇＧ融合タンパク質（１−１７８）
2013508740.tif 000014
【０１４４】
ＦｃεＲＩαポリペプチドは、種々のキメラＦｃεＲＩαポリペプチドを産生するアカゲザル、カニクイザル、シンパンジー及びヒトＦｃεＲＩαポリペプチの種々の組み合わせによって作られるポリペプチドを含む。例えば、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、以下に示すカニクイザル／ヒトＦｃεＲＩα−ＩｇＧ（１−１７８）を含む：
ｃｙｎｏ／Ｈｕｍａｎ  ＦｃεＲＩα−ＩｇＧ  （１−１７８）
2013508740.tif 000015
【０１４５】
いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識化されている（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、ルテニウム、放射線標識、フォトルミネセンス標識、化学発光標識、蛍光標識又は電気化学発光標識）。
【０１４６】
本発明はまた、本明細書に記載の任意のＦｃεＲＩαポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、完全長天然配列をコードする核酸配列、シグナル配列を欠く成熟配列、又は配列番号３、４、５又は６のポリペプチドの細胞外ドメインに少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり得、且つ完全長天然配列をコードする核酸配列、シグナル配列を欠く成熟配列、又は天然配列の細胞外ドメインに１００％未満同一である変異体ポリヌクレオチドを更に提供する。
【０１４７】
ＦｃεＲＩα核酸及びアミノ酸配列の改変は、多くの既知によって達成可能である。例えば、Walder等, 1986, Gene, 42:133; Bauer等, 1985, Gene 37:73; Craik, 1985, BioTechniques, 12-19;  Smith等, 1981, Genetic Engineeｒｉｎｇ: Principles 及び Methods, Plenum Press; 米国特許第４５１８５８４号，及び米国特許第４７３７４６号に記載のオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発のように、当業者に既知の方法によって特定の場所に突然変異を起こすことができる。
【０１４８】
哺乳類動物細胞においてＦｃεＲＩポリペプチド及びＦｃεＲＩポリペプチドの発現をコードするヌクレオチドの作製方法は当業者に知られている。例えば、上述のＦｃεＲＩポリペプチドの構築形態をコードするプラスミドを、リン酸カルシウム沈殿又はＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）トランスフェクション法の何れかを使用して２９３Ｓヒト胚腎臓細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされた細胞培養物からの上清を、数日間の増殖させた後に回収し、カラムマトリックスに固定された、ＨＳＶ  ｇＤタグに対する抗体（孔制御ガラスに固定化されたＭＡｂ５Ｂ６）、又は６Ｘのヒスチジン融合タグに対する金属キレート樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いた親和性クロマトグラフィーを用いてＦｃεＲＩポリペプチドを精製することができる。
【０１４９】
本明細書に記載のポリペプチド及びタンパク質（例えば、抗ＩｇＥ抗体、ミュータント抗体、コントロールの抗薬剤抗体、ＦｃεＲＩポリペプチドなど）は当該技術分野で知られている方法を用いて生産、単離及び精製することができる。「精製された」は、分子が試料中にそれが含まれる試料の少なくとも９５重量％、又は少なくとも９６、９７、９８もしくは９９重量％の濃度で存在していることを意味する。トランスフェクション、形質転換又は形質導入などを含むがこれらに限定されない任意の組換えＤＮＡ又はＲＮＡの手法が、本発明の標的ポリペプチドを発現する宿主細胞を作製するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチド（その断片及び変異体を含む）を用いて宿主細胞を遺伝子操作する方法及びベクターは、当該技術分野でよく知られており、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編 (Wiley & Sons, New York, 1988, 及び後続版)に見い出される。例示的ベクター及び宿主細胞は下記の実施例に記載している。
【０１５０】
宿主細胞を本明細書に記載のポリペプチドを発現するように遺伝子操作する。ベクターには、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来するものなど、好適な転写又は翻訳調節配列に動作可能に連結された、本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡのリボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳を制御する適切な配列が含まれる。調節配列が機能的に標的タンパク質をコードするＤＮＡに関連する場合、ヌクレオチド配列は動作可能に連結されている。
【０１５１】
そのようなポリペプチドは、ポリペプチドの例えば分泌、改善された安定性、容易な精製を可能にするために含まれていてもよい。適切なシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチドに対するＤＮＡ配列（分泌リーダー）を、標的配列に対するフレーム内に融合することができ、その結果標的タンパク質がシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳される。シグナルペプチドに対するＤＮＡ配列は、シグナルペプチドをコードする天然核酸と置換するか、あるいは天然配列シグナルペプチドをコードする核酸配列に付加することができる。目的の宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞該分泌を促進する。好ましくは、シグナル配列は、細胞からの分泌の際に標的ポリペプチドから切断される。本発明を実施するのに使用し得るシグナル配列の非制限的な例は、酵母Ｉ−因子及びｓｆ９昆虫細胞中のミツバチメラチン（ｍｅｌａｔｉｎ）リーダーを含む。
【０１５２】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子のクローニングに使用するのに適切なベクターの選択は、内部でベクターが形質転換される宿主細胞、及び、必要に応じて、標的ポリペプチドを発現する宿主細胞から決まる。ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、及び高等真核細胞が含まれる。
【０１５３】
原核生物宿主での使用のための発現ベクターは、通常、一つ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。そのような遺伝子は、通常、例えば抗生物質耐性を与えるタンパク質、又は栄養要求性を付与するタンパク質をコードする。このような多種多様なベクターは、商業的供給源から容易に入手可能である。例としては、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。
【０１５４】
宿主細胞から産生されるポリペプチド又はタンパク質は、周知の方法を用いて更に精製することができる。
【０１５５】
治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出する方法
一態様において、本発明は個体由来の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出する方法であって、（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を治療的抗ＩｇＥ抗体から少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程［ミュータント治療抗体のＩｇＥ（例えば、ヒトＩｇＥ）に対する相対結合親和性は、治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥに対する相対結合親和性の約１０％以下である］；及び（ｂ）抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程、を含む方法を提供する。
【０１５６】
別の態様において、本発明は個体由来の試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出する方法であって、（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を治療的抗ＩｇＥ抗体から少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体と接触させる工程［ミュータント治療抗体の活性は、治療的抗ＩｇＥ抗体の活性の約１０％以下である］；及び（ｂ）抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程、を含む方法を提供する。
【０１５７】
当技術分野で既知の方法が、抗薬剤抗体とミュータント治療抗体の間の結合を検出するために用いられ得る。ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、Ｉｍｍｕｎｏｃａｐ（登録商標）又はＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）アッセイが用いられ得る。アッセイは、均一、半均一、又は不均一であってよい。例えば、殆どのＥＬＩＳＡは標的タンパク質の捕捉もしくは検出用の抗体及び／又はリガンドを使用する。このようなＥＬＩＳＡでは、感度を最大化あるいはマトリックス干渉を低減するために、均一フォーマット、半均一フォーマット、又は不均一フォーマットの何れも使用することができる。
【０１５８】
均一アッセイでは、液相反応中の標的タンパク質を含有するマトリックス試料と同時に、捕捉剤及び検出剤（又はリガンド）の両方をプレインキュベートするフォーマットを使用する。次いで、捕捉剤−標的タンパク質−検出剤複合体を固相（例えば、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート）上に捕捉し、洗浄し、且つ表面に捕捉された検出剤の量を検出することによって定量する（例えば、検出剤が酵素で標識されている場合、適切な基質溶液を添加することによって）。半均一アッセイでは、捕捉剤のみを液相反応中のマトリックス試料と同時にプレインキュベートするフォーマットを使用する。次いで、この捕捉剤−標的タンパク質複合体を固相上に捕捉し、洗浄し、その後検出剤とともにインキュベートし、洗浄し、定量する。不均一アッセイではいかなる液相プレインキュベーション工程も用いないが、代わりに連続工程を用いる。捕捉剤を固相に捕捉し、洗浄し、次いで標的タンパク質を含有するマトリックス試料を添加して捕捉剤により結合させ、洗浄し、検出試薬により結合させ、洗浄し、最後に定量する。
【０１５９】
例えば、不均一アッセイにおいて、本明細書に記載のミュータント治療抗体を表面に固定化し、抗薬剤ＩｇＥ抗体への結合に対する捕捉剤として用いる。ミュータント治療的抗体は、直接又は間接的に表面に固定化される。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は標識にコンジュゲートし、表面に固定化されている、標識に特異的に結合する捕捉剤によって表面に捕捉される。直接又は間接的に固定化されたミュータント治療抗体をＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を含有し得る、個体由来の資料とともにインキュベートする。ミュータント抗体はＩｇＥへの結合親和性又は活性が低下しているように設計されているので、ミュータント治療抗体に結合したＩｇＥ抗体の量は、試料中の抗薬剤抗体と相関する。抗薬剤ＩｇＥ抗体の固定化されたミュータント抗体への結合は、検出剤（例えば、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩポリペプチド）を用いて検出する。そのようなアッセイの実施例を図７に示す。
【０１６０】
半均一アッセイはまた、試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するために使用される。いくつかの実施態様において、検出は、１）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を含み得る個体由来の試料を、標識されたミュータント治療抗体とともにプレインキュベートする工程；２）プレインキュベートした試料を、ミュータント治療抗体上の標識に結合する固定化された分子（例えば、ストレプトアビジン）とともインキュベートする工程；及び３）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出剤（例えば、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩポリペプチド）を用いて検出する工程、を含む。洗浄工程が、固相に結合していない分子を除去するために各インキュベーション工程の間に含まれる。そのようなアッセイの実施例を図１１及び１２に示す。
【０１６１】
「ブロッキング」均一アッセイもまた試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するために用いられる。例えば、本発明は、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出する方法であって、（ａ）抗薬剤抗体を含み得る試料を、（ｉ）ミュータント治療抗ＩｇＥ抗体及び（ｉｉ）ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩポリペプチド（例えば、ＦｃεＲＩαサブユニットの細胞外ドメインを含むＦｃεＲＩポリペプチド）とともにプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）で表面にミュータント治療抗体を捕捉する工程；並びに（ｃ）抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出する工程、を含む方法を提供する。
【０１６２】
「ブロッキング」半均一アッセイアッセイもまた、固体由来の試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するために用いられる。例えば、本発明は治療的抗ＩｇＥ抗体に結合する試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出する方法であって、（ａ）抗薬剤抗体を含み得る個体由来の試料を、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩポリペプチドとともにプレインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）でプレインキュベートした試料を、治療的抗ＩｇＥ抗体又はそのミュータントとともインキュベートする工程；及び（ｃ）抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体への結合を検出する工程、を含む方法を提供する。ミュータント治療抗体を表面に捕捉するのは、プレインキュベートされた試料とともにインキュベートする前又はインキュベートした後でもよい。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、試料はブロッキングアッセイにおいてＦｃεＲＩαポリペプチドの過剰量とプレインキュベートされる。その中で使用する場合、ＦｃεＲＩαポリペプチドの「過剰」量とは、添加するＦｃεＲＩαポリペプチドの量が試料中の予想されるベースライン総ＩｇＥの最高レベルよりも高いことを意味する。例えば、ベースライン総ＩｇＥは、体重３０−１５０ｋｇの患者では３０ＩＵ／ｍＬから７００ＩＵ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドの添加量は、試料中の総ＩｇＥ量の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍である。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体は、そのＩｇＥへの相対的結合親和性が治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥへの相対的結合親和性と比較して低減される治療的抗ＩｇＥ抗体からの少なくとも一つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、ミュータント治療抗体のＩｇＥへの相対的結合親和性は、治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥへの相対的結合親和性の約１０％以下である。本明細書に記載のミュータント治療抗体の何れを用いてもよい。
【０１６４】
いくつかの実施態様において、方法は、１）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を含み得る個体由来の試料を、少なくとも約１０倍過剰の非標識又は標識されたＦｃεＲＩαポリペプチドの存在下で標識されたミュータント治療抗体とともにプレインキュベートする工程；２）プレインキュベートした試料を、ミュータント治療抗体上の標識（例えば、ビオチン）に結合する固定化された分子（例えば、ストレプトアビジン）になるまでインキュベートする工程；及び３）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のミュータント治療抗体への結合を検出剤（例えば、標識された抗ヒトＩｇＥ抗体又はＦｃεＲＩポリペプチド上の標識に特異的な標識された抗体）を用いて検出する工程、を含む。洗浄工程が、固相に結合していない分子（例えば、内因性の非薬物特異的ＩｇＥ）を除去するために各インキュベーション工程の間に含まれる。そのようなアッセイの実施例を図１２、１３及び１４に示す。
【０１６５】
いくつかの実施態様において、方法は、１）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を含み得る個体由来の試料を、少なくとも約１０倍過剰の非標識又は標識されたＦｃεＲＩαポリペプチドとともにプレインキュベートする工程；２）工程１）でプレインキュベートした試料を、固定化された抗ＩｇＥ治療的抗体又は固定化されたミュータント治療抗体とともにインキュベートする工程；及び３）ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の治療的抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出剤（例えば、標識された抗ヒトＩｇＥ抗体、又はＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩポリペプチド上の標識に特異的な標識された抗体）を用いて検出する工程、を含む。洗浄工程が、固相に結合していない分子（例えば、内因性の非薬物特異的ＩｇＥ）を除去するために各インキュベーション工程の間に含まれる。そのようなアッセイの実施例を図１５、１６及び１７に示す。
【０１６６】
本明細書に記載する方法の何れにおいても、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体は標識を含んでもよく、あるいは標識にコンジュゲートしていてもよい。いくつかの実施態様において、方法は、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体への結合を検出する前に、標識された治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体を表面に捕捉する工程を含み、ここで、標識に特異的に結合する捕捉剤が表面に固定化される。本明細書中に記載の固相又は表面（例えば、小さなシート、セファデックス、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、微小粒子、アッセイプレート、又はポリエチレン製及びポリスチレン製試験管）の何れを用いてもよい。いくつかの実施態様において、表面はセルロースポリマースポンジ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標），Ｐｈａｄｉａ）である。いくつかの実施態様において、表面はセルロースポリマースポンジ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標），Ｐｈａｄｉａ）ではない。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体はビオチンで標識されており、また捕捉剤はストレプトアビジンである。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識を含み、また抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント抗体への結合は、ＦｃεＲＩαポリペプチドの抗薬剤抗体への結合を検出することにより検出される。
【０１６７】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、ＦｃεＲＩαポリペプチドは、抗ＩｇＥ抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合を検出するための検出剤として使用される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは標識を含むか、又は標識にコンジュゲートしている。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識はジゴキシゲニンであり、ＦｃεＲＩαポリペプチドの抗薬剤抗体への結合はＨＲＰでコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を用いて検出される。いくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチド上の標識はルテニウムであり、ＦｃεＲＩαポリペプチドの抗薬剤抗体への結合は電気化学発光を用いて検出される。
【０１６８】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様において、ＦｃεＲＩαポリペプチドは試料中の非薬物特異的ＩｇＥの治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合をブロックするためのブロッキング剤として用いられる。いくつかの実施態様において、抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体への結合は、ＨＲＰでコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出される。
【０１６９】
本明細書に記載した方法において使用される試料には、抗ＩｇＥ治療的抗体を用いた治療の前又は後に個体から採取した血液試料が含まれる。いくつかの実施態様において、血液試料は、抗ＩｇＥ抗体治療を少なくとも１６週間止めている個体から採取される。いくつかの実施態様において、血液試料は、抗ＩｇＥ抗体治療を少なくとも１６週間止めているが、最後の抗ＩｇＥ抗体の投与から１８か月を超えていない個体から採取される。いくつかの実施態様において、試料は血清又は血漿試料である。血清又は血漿試料は当該技術分野で知られている標準的な技術を用いて調製することができる。
【０１７０】
ポジティブコントロールはアッセイを展開するため、アッセイ感度及び薬剤耐性を評価するために用いられてもよく、及び／又はアッセイのためのコントロールとして用いられ得る。ポジティブコントロールは、本明細書に記載の任意の方法で使用することができる。いくつかの実施態様において、アッセイにはポジティブコントロール抗薬剤抗体が含まれる。治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体の双方に結合するポジティブ抗体を用いてもよい。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗薬剤抗体は抗ＩｇＥ抗体の抗ＩｇＥ抗体ｃ断片に結合する。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗薬剤抗体は抗ＩｇＥ抗体の一つ以上ののＣＤＲに結合する。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体の双方に、同程度の親和性で結合する。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体への相対的結合親和性は、ポジティブコントロール抗体のミュータント治療抗体への相対的結合親和性に比べて、約１０倍以内、約９倍以内、約８倍以内、約７倍以内、約６倍以内、約５倍以内、約４倍以内、約３倍以内又は約２倍以内の差異がある。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体への相対的結合親和性と、ミュータント治療抗体への相対的結合親和性の差異は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。例えば、ポジティブコントロール抗体は抗薬剤抗体（ＣＤＲ特異的抗薬剤抗体など）の可変領域及びＩｇＥ（例えば、ヒトＩｇＥ）の定常領域を含むキメラ抗体である。いくつかの実施態様において、コントロール抗薬剤抗体はオマリズマブ（Ｅ２５）に対するマウス抗体である。（例えばＡＭＥ２など）ポジティブコントロールとして使用され得る抗Ｅ２５抗体の例は、実施例２に記載されている。いくつかの実施態様において、試料中の抗薬剤抗体の固定化されたミュータント抗体への結合と、ポジティブコントロール抗体の固定化されたミュータント抗体への結合が検出され、比較される。
【０１７１】
重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列並びに抗体ＡＭＥ２の核酸配列を以下に示す。
ＡＭＥ２重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号７）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＨＷＩＥＷＶＫＱＲＳＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＩＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＹＣＧＲＥＧＡＤＹＧＹＤＶＡＭＤＹＷＧＱＧＡＳＶＴＶＳＳ
ＡＭＥ２軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号８）
ＱＩＶＩＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＩＴＣＳＡＴＳＳＶＮＹＭＨＷＦＱＱＫＰＧＴＳＰＫＬＷＩＹＧＴＳＨＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＲＳＲＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲ
ＡＭＥ２重鎖可変領域核酸配列（配列番号９）
ＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＣＣＧＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＣＧＡＣＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧ
ＡＭＥ２軽鎖可変領域核酸配列（配列番号１０）
ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＴＣＧＴＴＡＣＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧ
【０１７２】
いくつかの実施態様において、抗体ＡＭＥ２の重鎖可変領域は、キメラ抗体を形成するために、ヒトＩｇＥの重鎖定常領域及び抗体ＡＭＥ２の軽鎖可変領域に融合されている。例えば、以下のヒトＩｇＥの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を用いてもよい。
ヒトＩｇＥ重鎖定常領域アミノ酸配列（配列番号２９）
ＡＳＴＱＳＰＳＶＦＰＬＴＲＣＣＫＮＩＰＳＮＡＴＳＶＴＬＧＣＬＡＴＧＹＦＰＥＰＶＭＶＴＷＤＴＧＳＬＮＧＴＴＭＴＬＰＡＴＴＬＴＬＳＧＨＹＡＴＩＳＬＬＴＶＳＧＡＷＡＫＱＭＦＴＣＲＶＡＨＴＰＳＳＴＤＷＶＤＮＫＴＦＳＶＣＳＲＤＦＴＰＰＴＶＫＩＬＱＳＳＣＤＧＧＧＨＦＰＰＴＩＱＬＬＣＬＶＳＧＹＴＰＧＴＩＮＩＴＷＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＸＳＴＡＳＴＴＱＥＧＥＬＡＳＴＱＳＥＬＴＬＳＱＫＨＷＬＳＤＲＴＹＴＣＱＶＴＹＱＧＨＴＦＥＤＳＴＫＫＣＡＤＳＮＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬＶＶＤＬＡＰＳＫＧＴＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶＧＴＲＤＷＩＥＧＥＴＹＱＣＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳＴＴＫＴＳＧＰＲＡＡＰＥＶＹＡＦＡＴＰＥＷＰＧＳＲＤＫＲＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭＰＥＤＩＳＶＱＷＬＨＮＥＶＱＬＰＤＡＲＨＳＴＴＱＰＲＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦＳＲＬＥＶＴＲＡＥＷＥＱＫＤＥＦＩＣＲＡＶＨＥＡＡＳＰＳＱＴＶＱＲＡＶＳＶＮＰＧＫ
ヒトＩｇＥ軽鎖定常領域アミノ酸配列（配列番号３０）
ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
【０１７３】
いくつかの実施態様において、捕捉試薬（例えば、ミュータント抗体、抗ＩｇＥ抗体、ＦｃεＲＩαポリペプチド、又はストレプトアビジン）は、（米国特許第３７２０７６０号中に記載されているような）非水溶性マトリックスもしくは表面への吸着、又は米国特許第３６４５８５２号中もしくはRotmans等J.Immunol.Methods 57:87〜98頁(1983)中に記載されているような、硝酸及び還元剤を例えば用いた担体の事前の活性化有りもしくは無しで、グルタルアルデヒド又はカルボジイミド系架橋剤を例えば使用する非共有結合又は共有結合により、アッセイ手順前あるいはアッセイ手順後に不溶化されることにより固相へ固定化される。いくつかの実施態様において、固定化した後の捕捉試薬（例えば、ミュータント抗体）は、試料由来の標的分子（例えば、抗薬剤抗体）に結合させるのに利用可能である。
【０１７４】
固定化のために使用される固相又は表面は、本質的に非水溶性で、イムノアッセイに有用な、例えば表面、粒子、多孔性マトリックス、セルロースポリマースポンジ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標）、Ｐｈａｄｉａ）などの形態の担体を含む任意の不活性担体又は賦形剤であってよい。一般的に使用される担体の例としては、さなシート、セファデックス、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、微小粒子、アッセイプレート、又はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどから製造された試験管が挙げられる。いくつかの実施態様において、固相又は表面は、セルロースポリマースポンジ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標）、Ｐｈａｄｉａ）である。いくつかの実施態様において、固相又は表面は、セルロースポリマースポンジ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標）、Ｐｈａｄｉａ）ではない。そのような担体には９６ウェルマイクロタイタープレート、並びにろ紙、アガロース、架橋デキストラン、及び他の多糖類のような粒状材料が挙げられる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物や米国特許第３９６９２８７；３６９１０１６；４１９５１２８；４２４７６４２；４２２９５３７；及び４３３０４４０号に記述されている反応基質などの反応性非水溶性マトリックスを、捕捉試薬の固定化に使用するのが適している。実施態様において、固定化捕捉試薬でマイクロタイタープレート上を被覆する。好ましい固相は、一度に複数の試料を分析するために使用することができるマルチウェルマイクロタイタープレートである。固相は、一度に複数の試料を分析するために使用することができるマルチウェルマイクロタイタープレートである。
【０１７５】
固相は、非共有結合性もしくは共有結合性相互作用又は物理的結合によって所望のように結合可能な捕捉試薬（例えば、本明細書に記載のミュータント治療抗体）で被覆される。結合のための技術は、米国特許第４３７６１１０号及びそこに引用された文献に記載されたものを含む。プレートへの捕捉試薬の共有結合を利用すれば、プレート又は他の固相は捕捉試薬と一緒に、架橋剤とともにインキュベートすることができる。捕捉試薬を固相基質に付着させるために一般に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルをはじめとするホモ二官能性イミドエステル、更には、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。誘導体化剤（例えば、メチル?３?［（ｐ?アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートは、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生成する。
【０１７６】
ポリスチレンプレートを使用する場合、プレート中のウェルを少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも一晩、約４−２０℃の温度で、より好ましくは約４−８℃の温度で、また、ｐＨは約８−１２、より好ましくは約９−１０、及び最も好ましくは約９．６でのインキュベーションにより、捕捉試薬（通常、例えば０．０５Ｍ炭酸ナトリウム又は０．１５Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．２又は７．４のようなバッファー中に希釈）で好ましくは被覆する。より短い被覆時間（１−２時間）を望むならば、プレートを３７℃で被覆するか、又はプレートが、例えばミリポアＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮＴＭ等のニトロセルロースフィルター底部を有していてもよい。プレートは積層し、アッセイに先立って被覆し、手動、半自動、又は、例えばロボット工学を用いることにより自動様式にて、イムノアッセイを複数の試料について同時に実施できるようにしてもよい。ポリスチレンプレートを、上記の方法を使用して、ストレプトアビジンで被覆することができる。
【０１７７】
被覆したプレートは、プレートのウェル上の過剰な結合部位への遊離の非分析分子の所望しない結合が防止されるように、通常、結合部位に非特異的に結合してそれを飽和状態にするブロッキング剤で処理する。適切なブロッキング剤の例には、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、及びノンファットミルクがある。ブロッキング処理は通常、周囲温度の条件下で約１．５から３時間行う。
【０１７８】
被覆及びブロッキング後、分析する試料を適切に希釈し、固定化相に加える。好ましい希釈率は約５−１５体積％、好ましくは約１０体積％である。希釈のために使用することができるバッファーには、例えば（ａ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ、洗剤（Ｐ２０）、５ｍＭのＥＤＴＡ０．２５％チャップス界面活性剤、０．２％ベータ−ガンマグロブリン及び０．３５ＭのＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．０；（ｂ）０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｐ２０を含有するＰＢＳ；（ｃ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｐ２０、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．３５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ、ｐＨ６．３５；（ｄ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｐ２０、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ベータ−ガンマグロブリン及び０．３５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ；（ｅ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｐ２０、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％チャップス及び０．３５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ；及び（ｆ）０．５％のＰ２０を含有するＰＢＳが挙げられる。
【０１７９】
十分な感度のために、固定化捕捉試薬は、適切に希釈された後の試料中で予想される被分析物（例えば、ＩｇＥのアイソタイプの抗薬剤抗体）の最大モル濃度よりも過剰なモル濃度であることが好ましい。被分析分子によっては、捕捉試薬は検出抗体と結合部位に関して競合し、不正確な結果が生じるおそれがある。よって、捕捉試薬の最終濃度は、通常は、目的の範囲にわたってアッセイの感度が最大になるように実験的に決定されるであろう。
【０１８０】
いくつかの実施態様において、アッセイ系は抗薬剤ＩｇＥに対して約０．１ＩＵ／ｍｌから約０．５ＩＵ／ｍｌ（例えば、約０．１ＩＵ／ｍｌ、約０．２ＩＵ／ｍｌ、約０．３ＩＵ／ｍｌ、約０．４ＩＵ／ｍｌ又は約０．５ＩＵ／ｍｌ）の感度を有する。いくつかの実施態様において、アッセイ系は７００ＩＵ／ｍｌ以上の総ＩｇＥ耐性を有する。いくつかの実施態様において、アッセイ系は８００ＩＵ／ｍｌ以上の総ＩｇＥ耐性を有する。いくつかの実施態様において、アッセイ系は少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ（例えば約５０ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌ）の薬物耐性（例えばオマリズマブ耐性）を有する。いくつかの実施態様において、アッセイ系の薬物耐性は少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１２５ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌである。
【０１８１】
試料及び捕捉試薬のインキュベーション条件はアッセイの感度を最大にし、解離を最小にするように選択する。インキュベーション時間は主に温度に依存する。例えば、インキュベーション時間は２０−３８℃（３６−３８℃を含む）で約０．５から３時間（１．５−３時間を含む）、又は室温で一晩である。抗薬剤ＩｇＥ感度及びアッセイの抗ＩｇＥ薬物耐性を最大にするために、可能な場合は約１０時間以上のインキュベーション時間を用いる。試料が生体液である場合（例えば、血液又は血清）、生体液中のプロテアーゼが被分析物を分解するのを防止するために、試料にプロテアーゼ阻害剤を添加することによってインキュベーション時間を長くすることができる。
【０１８２】
インキュベーションバッファーのｐＨは、捕捉試薬の捕捉される被分析物への特異的結合を有意なレベルに維持するように選択される。いくつかの実施態様において、インキュベーションバッファーのｐＨは約６−９．５（ｐＨ約６−７を含む）である。いくつかの実施態様において、インキュベーションバッファーのｐＨは約７．２である。この工程の間、種々のバッファーが所望のｐＨを達成及び維持するために用いられるが、それらにはホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス塩酸塩又はトリスリン酸塩、酢酸塩、バルビタール、及び類似のものが含まれる。通常、用いられる特定のバッファーが重要というわけではないが、個々のアッセイにおいて、あるバッファーが他のバッファーより好ましいこともある。
【０１８３】
捕獲されなかった被分析物（抗薬剤抗体など）を系から除去するために、洗浄液を用いて試料を固定化された捕獲試薬から分離する。通常、洗浄液はバッファーである。上記したインキュベーションバッファーは、好適な洗浄液である。洗浄液のｐＨは、インキュベーションバッファーに関する上の記載の通りに決定される。一実施態様において、洗浄液のｐＨは約６−９、より好ましくは約６−７である。洗浄は一回又は複数回行ってよい。洗浄回数は最小限に抑えるが、低親和性で標的分子に結合する分子を保持することは、アッセイのバックグラウンドノイズを増加させる。いくつかの実施態様において、この系は３回洗浄される。洗浄液の温度は通常、約０−４０℃、より好ましくは約４−３０℃である。自動プレート洗浄機を使用してもよい。架橋結合剤又は他の適切な結合剤を洗浄液に添加し、捕捉された被分析物を捕捉試薬へ共有結合させる。
【０１８４】
捕捉されていない被分析物分子を系から除去した後、捕捉された被分析分子を、例えば約２０−４０℃、約３６−３８℃の温度又は室温で、例えば抗体又はＦｃεＲＩαポリペプチドなどの検出剤と接触させる。いくつかの実施態様において、被分析物はＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体であり、検出剤は標識されたＦｃεＲＩα−ＩｇＧキメラ受容体である。
【０１８５】
検出剤と被分析分子を接触させるための温度及び時間は、用いられる検出手段に主に依存している。例えば、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（ＳＡ−ＨＲＰ）が検出の手段として使用される場合、検出剤は、好ましくは約０．５−２時間、より好ましくは約１時間、捕捉された分析物とともにインキュベートされる。系を上述したように洗浄して非結合検出剤を系から除去し、ペルオキシダーゼ基質を添加し、室温で約１５分間、又は良好な色が見えるまでプレートをインキュベートすることによって、系を展開する。一実施態様において、非結合被分析物を系から洗浄した後、モル過剰の検出剤を系に添加する。
【０１８６】
検出剤の親和性は、被分析物が少量でも検出できるように、十分に高くなければならない。蛍光標識又は化学発光標識部位は、従来の比色標識に比べイムノアッセイにおいてより高い感度を有している。選択した検出剤の結合親和性は、検出剤が捕捉試薬から被分析物を奪わないように、捕捉剤の結合親和性の観点から考慮されなければならない。
【０１８７】
標識部位は、捕捉された被分析物の検出剤への結合を干渉しない任意の検出可能な機能性である。適切な標識部位の例は、直接的に検出され得る部位、例えば蛍光色素標識、化学発光標識及び放射性標識、並びに、検出のために反応又は誘導体化させなければならない部分、例えば酵素を含む。このような標識の例は、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ、例えば蛍光ルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素（例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ）と結合した複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン−ベータガラクトシダーゼ及びＭＵＧ、ジゴキシゲニン、ルテニウム、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどを含む。
【０１８８】
例えば、抗体又はＦｃεＲＩαポリペプチドのような検出剤への標識部位のコンジュゲートは、イムノアッセイ技術においては標準的な操作法である。例えば、 Methods in Enzymology, J. J. Langone 及び H. Van Vunakis編, 73巻 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166中の、O’Sullivan等 「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay」を参照のこと。標識部位をタンパク質又はポリペプチドに共有結合させるために、従来の方法が利用可能である。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベンジジンなどの結合剤が、上記の蛍光標識、化学発光標識及び酵素標識を用いて抗体を標識化するのに使用可能である。例えば、米国特許第３９４０４７５号（蛍光分析）及び米国特許第３６４５０９０号（酵素）；Hunter 等, 1962, Nature, 144:945;David 等, 1974, Biochemistry, 13:1014-1021; Pain 等, 1981, J. Immunol Methods, 40:219-230; 及び Nygren J., 1982, Histochem. 及び Cytochem., 30:407-412を参照のこと。本明細書における好ましい標識は、約５−１０ｐｇ／ｍｌまで増幅及び感度を増加させる、蛍光又は化学発光標識である。一実施態様において、標識部位はＨＲＰである。
【０１８９】
捕捉試薬に結合した被分析物の量は、固定化相から非結合検出剤を洗い流し、その標識に適した検出方法を用いて被分析物に結合した検出剤の量を測定することによって、決定される。一実施態様において、標識部位は酵素である。酵素部位の場合には、発色量が捕捉された被分析物の量の直接的な測定値となる。例えば、ＨＲＰが標識部位である場合、色は光学濃度（Ｏ．Ｄ．）吸光度を（例えば、４５０ｎｍで）定量することによって検出される別の実施態様において、捕捉試薬に結合した被分析物の量は、間接的に決定される。標識部位に結合した抗検出剤抗体を用いた検出のために、非標識検出剤のシグナルを増幅することができる。例えば、標的分子と結合する非標識マウス抗体のシグナルは、ＨＲＰで標識したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて増幅することができる。標識部位は、その標識に適した検出方法を用いて検出される。例えば、ＨＲＰは、発色（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）基質でＨＲＰを反応させ、反応させ、反応基質の光学濃度を４５０ｎｍの吸光度で測定することによって検出することができる。
【０１９０】
系のｐＨ及び／又は温度は、標的分子に結合する分子を同定するために変えることができる。
【０１９１】
治療的抗ＩｇＥ抗体治療に対するアナフィラキシー反応のリスク評価方法又は評価補助の方法
本明細書に記載の方法は、治療的抗ＩｇＥ抗体の投与に対するアナフィラキシー反応のリスクを評価するため、又は評価を補助するために使用され得る。本明細書に記載の方法はまた、治療的抗ＩｇＥ抗体の投与に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定するために使用することができる。
【０１９２】
治療的抗ＩｇＥ抗体（例えば、Ｅ２５、オマリズマブ）で治療されたアナフィラキシーを有する患者と、過敏性反応がない患者から血液試料を採取する。病歴、アレルギー皮膚テストの結果及び免疫原性の評価などのデータを収集する。試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の量は、本明細書に記載のアッセイを用いて試験される。アレルギー皮膚テスト、アナフィラキシー及びＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体レベルとの相関関係を明らかにする。試料は、アナフィラキシー後に収集するか、コントロールを含む全参加者が少なくとも１６週、但し１８ヶ月を超えない期間、抗ＩｇＥ治療を中止した後で収集する。明らかにされた相関は、基準レベルを確立するために使用することができ、患者が治療的抗ＩｇＥ抗体で治療される前に、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシーのリスクを評価するため、又は評価を補助するために使用することができる。
【０１９３】
一態様において、本発明は、患者における治療的抗ＩｇＥ抗体の投与に対するアナフィラキシー反応のリスクを評価する、又は評価を補助するための方法であって、ａ）抗ＩｇＥ抗体治療前の患者からの試料において治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプ抗薬剤抗体のレベルを検出する工程と、及びｂ）工程ａ）で検出されたレベルと基準レベルを比較する工程とを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、基準レベルよりも高いＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体レベルを有する患者は、抗ＩｇＥ抗体治療から除外される。
【０１９４】
別の態様において、本発明は、患者からの試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の存在及び／又はレベルを本明細書に記載の任意の方法を用いて検出することを含む、治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有する患者を同定する方法を提供し、ここで、試料中の抗薬剤抗体のレベルの存在及び／又はレベルは、患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示す。
【０１９５】
ＩｇＥ媒介性疾患の治療方法
患者におけるＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を、患者が抗ＩｇＥ抗体で治療される前又は後に本明細書に記載のアッセイ方法を用いて評価する。本発明は、個体由来の試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルを基準レベルと比較することと、試料中の抗薬剤抗体のレベルが基準レベルより低い場合に個体に抗ＩｇＥ抗体の有効量を投与することを含む、抗ＩｇＥ抗体を用いて個体のＩｇＥ媒介性疾患を治療する方法を提供する。一態様において、本発明は、個体由来の試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体のレベルを基準レベルと比較することを含むアナフィラキシーの高リスクを有する患者を同定する方法を提供し、ここで、個体は試料中の抗薬剤抗体のレベルが基準レベルよりも高い場合にアナフィラキシーのリスクが高いと同定される。別の態様において、本発明は、（ａ）患者由来の試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の治療的抗ＩｇＥ抗体に対するレベルを本明細書に記載の任意の方法を用いて決定する工程と、（ｂ）試料中の抗薬剤抗体のレベルが、患者が治療的抗ＩｇＥ抗体に対するアナフィラキシー反応のリスクを有することを示していない場合に患者へ治療的抗ＩｇＥ抗体の有効量を投与する工程とを含む、ＩｇＥ媒介性疾患を有する患者を治療する方法を提供する。
【０１９６】
ＩｇＥ媒介性疾患の予防又は治療のための抗ＩｇＥ抗体の適切な用量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗ＩｇＥ抗体が予防又は治療目的で投与されるかどうか、を左右される又は治療目的、以前の治療、患者の病歴及び薬剤に対する応答、及び主治医の裁量に依存する。抗ＩｇＥ抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。いくつかの実施態様において、抗ＩｇＥ抗体はオマリズマブである。抗ＩｇＥ抗体は液体製剤であってもよく、又は凍結乾燥製剤から再構成される。抗ＩｇＥ抗体に適した製剤は、米国特許第６８７５４３２号、並びに米国特許出願公開第２００４／０１９７３２４号及び第２００５／０１５８３０３号に記載されている。
【０１９７】
抗ＩｇＥ抗体は、治療を必要とする個体、好ましくはヒトに対して、ボーラス又はある期間にわたる連続的注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、口腔内、局所又は吸入経路による投与などの既知の方法に従って投与される。
【０１９８】
ＩｇＥ媒介性疾患としては、アレルギー性鼻炎、喘息（例えば、アレルギー性喘息及び非アレルギー性喘息）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患、過敏症（例えば、アナフィラキシー、じん麻疹、食物アレルギーなど）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫症、間質性膀胱炎、高ＩｇＥ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫及び移植片対宿主反応が挙げられる。また更に特定の態様では、ＩｇＥ媒介性疾患は食物アレルギー、アナフィラキシー、接触性皮膚炎及びアレルギー性紫斑病である。
【０１９９】
また、本発明の方法によって治療可能なＩｇＥ媒介性疾患には、毛細血管拡張性運動失調症、チャーグ・ストラウス症候群、湿疹、腸炎、胃腸症、移植片対宿主反応、高ＩｇＥ（ジョブ）症候群、過敏症（例えば、アナフィラキシー型過敏症、カンジダ症、血管炎）、ＩｇＥ骨髄腫、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定性大腸炎及び感染性大腸炎）、粘膜炎（例えば、口腔粘膜炎、胃腸粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性腸炎及び食道炎、寄生虫症（例えば、トリパノソーマ症）、過敏性血管炎、じん麻疹及びウィスコット・アルドリッチ症候群が含まれる。
【０２００】
本発明の方法によって治療可能なＩｇＥ媒介性疾患には、アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、脱毛症、遺伝性血管浮腫、血管浮腫（ａｎｉｇｉｏｅｄｅｍａ）（バニスター病、血管神経性浮腫）、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、動脈炎、アミロイドーシス、免疫不全、例えば、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性多発性内分泌症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血球減少（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、自己免疫性糸球体腎炎、ベーチェット病、気管支炎、バージャー病、水疱性類天疱瘡、カプラン症候群（リウマチ様塵肺症）、心臓炎、セリアックスプルー、チェディアック・東症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、コーガン・リース症候群（虹彩角膜内皮症候群）、ＣＲＥＳＴ症候群、疱疹状皮膚炎（ジューリング病）、糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性腎炎、上強膜炎、外因性アレルギー性肺胞炎、家族性発作性多漿膜炎、フェルティ症候群、線維性肺胞炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、顆粒球減少症、肉芽腫、肉芽種症、肉芽腫筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（多発性神経炎）、橋本甲状腺炎（リンパ節様甲状腺腫）、ヘモクロマトーシス、組織球増殖症（ｈｉｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、好酸球増多症候群、過敏性腸症候群、若年性関節炎、角膜炎、ハンセン病、紅斑性狼瘡、ライエル病、ライム病、混合性結合組織病、単発神経炎、多発性単神経炎、マックル・ウェルズ症候群、皮膚粘膜リンパ節（ｌｙｍｐｈｏｉｄ）症候群（川崎病）、多中心性細網組織球症（ｒｅｔｉｃｕｌｏｈｉｓｔｉｏｃｙｓｔｏｓｉｓ）、多発性硬化症、重症筋無力症、菌状息肉症、脂肪織炎（ｐａｎｎｉｎｃｕｌｉｔｉｓ）、類天疱瘡、天疱瘡、心膜炎、多発性神経炎、結節性多発動脈炎（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｎｏｄｏａｓ）、乾癬、乾癬性関節炎、肺性関節炎、肺腺腫症、肺線維症、再発性多発性軟骨炎、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻副鼻腔炎（副鼻腔炎）、サルコイドーシス、強膜炎、硬化性胆管炎、血清病、セザリー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、全身性肥満細胞症、移植片拒絶反応、血小板減少性紫斑病、胸腺リンパ形成不全症、ブドウ膜炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症も含まれる。
【０２０１】
ＩｇＥ媒介性疾患は、ＩｇＥ媒介性疾患の治療の既知の方法と組み合わせて、すなわち併用又は追加的治療工程としてか、治療用製剤の追加的成分としての何れかで治療することができる。例えば、治療は、抗ヒスタミン薬、交感神経様作用薬、気管支拡張剤、グルココルチコイド、非ステロイド系抗炎症薬、充血除去剤、鎮咳剤又は鎮痛剤と組み合わせた抗ＩｇＥ抗体を含む。別の特定の態様において、抗ＩｇＥ抗体は、アレルゲン脱感作の治療計画と組み合わせて投与される。
【０２０２】
Ｄ．キット
本発明はまた、本明細書に記載の方法で使用するためのキットを提供する。
【０２０３】
一態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体からの少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供し、ここで、ミュータント治療抗体のＩｇＥ（例えば、ヒトＩｇＥ）に対する相対的結合親和性は、治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥに対する相対的結合親和性の約１０％以下である。いくつかの実施態様において、キットはヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤（例えば、本明細書に記載のＦｃεＲＩαポリペプチド）を更に含む。
【０２０４】
別の態様において、本発明は、治療的抗ＩｇＥ抗体からの少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体を含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供し、ここで、ミュータント治療抗体のＩｇＥ（例えば、ヒトＩｇＥ）に対する活性は、治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥに対する活性の約１０％以下である。いくつかの実施態様において、キットはヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合する検出剤（例えば、本明細書に記載のＦｃεＲＩαポリペプチド）を更に含む。
【０２０５】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体からの少なくとも一つのアミノ酸変異を含むミュータント治療抗体であって、そのＩｇＥ（例えば、ヒトＩｇＥ）に対する相対的結合親和性が治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥに対する相対的結合親和性の約１０％以下であるものと、（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドを含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。
【０２０６】
別の態様において、本発明は、（ａ）治療的抗ＩｇＥ抗体、又はそのミュータント治療抗体であって治療的抗ＩｇＥ抗体から少なくとも一つのアミノ酸変異を含み、そのＩｇＥ（例えば、ヒトＩｇＥ）に対する相対結合親和性が、治療的抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥに対する相対結合親和性より低下しているミュータント治療抗体；及び（ｂ）ヒトＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεＲＩαポリペプチドを含む、試料中の治療的抗ＩｇＥ抗体に結合するＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体を検出するためのキットを提供する。
【０２０７】
いくつかの実施態様において、キットは、治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体の双方に結合するポジティブコントロール抗体を更に含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は治療的抗ＩｇＥ抗体及びミュータント治療抗体の双方に、同程度の親和性で結合する。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、抗ＩｇＥ抗体のＦａｂ断片及びヒトＩｇＥの定常領域に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域並びに軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、ポジティブコントロール抗体は、抗ＩｇＥ抗体のＦａｂ断片及びＩｇＥに結合する。
【０２０８】
キットの試薬（治療的抗ＩｇＥ抗体、ミュータント治療抗体、ポジティブコントロール抗体及び／又はＦｃεＲＩαポリペプチドなど）は容器に入れられる。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体、ミュータント治療抗体、ポジティブコントロール抗体及び／又はＦｃεＲＩαポリペプチドは標識を含む。
【０２０９】
いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は表面に直接的又は間接的に固定化される。いくつかの実施態様において、治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は（ビオチンなどの）標識にコンジュゲートされる。いくつかの実施態様において、標識にコンジュゲートされた治療的抗ＩｇＥ抗体又はミュータント治療抗体は、標識に特異的に結合する固定化された捕捉剤を介して表面に捕捉される。いくつかの実施態様において、標識はビオチンであり、捕捉剤はストレプトアビジンである。
【０２１０】
いくつかの実施態様において、検出剤又はＦｃεＲＩαポリペプチドは標識（ビオチン、ジゴキシゲニン又はルテニウム）にコンジュゲートされる。いくつかの実施態様において、検出剤は標識されたＦｃεＲＩポリペプチドである。いくつかの実施態様において、キットは、ストレプトアビジン−ＨＲＰ又はＡｍｄｅｘ  ＳＡ−ＨＲＰを更に含む。いくつかの実施態様において、キットは、ジゴキシゲニン標識ＦｃεＲＩαポリペプチドを検出するためのＨＲＰがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を更に含む。いくつかの実施態様において、キットは、標識された抗ヒトＩｇＥ抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）を更に含む。いくつかの実施態様において、標識された抗ヒトＩｇＥ抗体はＨＲＰがコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体である。
【０２１１】
本発明のキットは本明細書に記載の任意の方法に従う使用説明書を更に含むことができる。いくつかの実施態様において、これらの使用説明書は、本明細書に記載の任意の方法に従って、患者試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の量を試験する記述を含む。キットは、抗ＩｇＥ抗体を用いる治療の前に患者のアナフィラキシーのリスクを評価する記述を更に含んでもよい。説明書は、ラベル又は添付文書に提供されてもよい。キットは、本明細書に記載の方法を実施するためのバッファー及び試薬など、追加の構成要素を含んでいてもよい。
【０２１２】
本発明のキットは、適切に包装されている。適切な包装には、限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密封マイラー又はビニール袋）などがある。また、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるシグナル検出のための装置のような、特定の装置と組み合わせて使用するための包装も企図される。
【０２１３】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【実施例】
【０２１４】
実施例１．抗ＩｇＥ抗体オマリズマブのミュータント抗体の調製
抗体オマリズマブ（Ｅ２５又はｒｈｕＭＡｂＥ２５）は、米国特許出願公開第２００５／０１５８３０３号明細書及び米国特許第６，１７２，２１３号明細書に記載されるヒト化抗ヒトＩｇＥ抗体である。Ｅ２５の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は米国特許第６，１７２，２１３号明細書の図２において提供され、Ｅ２５の重鎖及び軽鎖の完全長アミノ酸配列は米国特許第６，１７２，２１３号明細書の図１２において提供される。抗体Ｅ２５の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、図１Ａ及び１Ｂに示される。Ｅ２５−ＡＡＡミュータントと称され、軽鎖ＣＤＲ１において３つのアミノ酸置換を含むミュータントＥ２５が生成された。変異は、配列番号：１に示される位置３０、３２、３４におけるＤからＡへの置換である。このミュータント抗体は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３−２６３２，  １９９３に記載される。
【０２１５】
Ｅ２５と比較したヒトＩｇＥへのミュータント抗体の結合親和性は、図２Ａに示すように試験された。Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントは、ＥＬＩＳＡプレートに固定され、漸増濃度の精製されたヒトＩｇＥはプレートに添加された。Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントへのヒトＩｇＥの結合は、ＨＲＰでコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＥによって検出された。４５０ｎｍにおけるＯＤが測定された。これらの実験は、公知の方法を用いて実施された。例えばＥｎｇｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：８７１−４，  １９７１；  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３−２６３２，  １９９３を参照。図２Ｂに示すように、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントは、ヒトＩｇＥに対してＥ２５よりも約１００倍少ない結合親和性を有する。
【０２１６】
Ｅ２５−ＡＡＡミュータントとＥ２５の一次構造を比較するために、Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングが用いられた。３つのアミノ酸置換の全てが同じペプチド内（軽鎖１−４３）となるように、Ｌｙｓ−Ｃ酵素は消化のために用いられた。ペプチドマッププロファイルは、ミュータントにおいて２つのピークの相違、親ペプチドＬＣ１−４３の消失及びＥ２５には存在しない新しいピーク、のみを示した。ＬＣ−ＭＳは実行され、ミュータントにおける新しいピークの主要部が３つのＡｓｐを置換した３つのＡｌａを有するＬＣ１−４３として確認された。したがって、この解析により、ＬＣにおける３つのＡｓｐを置換した３つのＡｌａを除いて、ミュータントがＥ２５の同じ一次構造を有することが確認された。
【０２１７】
Ｅ２５−ＡＡＡミュータントの電荷分布も研究された。モノクローナル抗体の電荷分布は、通常分子特異的である。ミュータントにおけるアミノ酸置換が分子のｐＩを有意に（７．６から９まで）変化させた場合、ミュータントの移動時間は非常に異なった。さらに、プロファイルの相違は、Ｅ２５の電荷分布の不均一性に寄与する（異性化する）Ａｓｐ３２の置換によるものであると予測される。酸性及び塩基性変異体の同程度の量について、Ｅ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントのｉＣＩＥＦ（イメージキャピラリー等電点電気泳動）プロファイルは同程度であったが同一ではなかった。
【０２１８】
実施例２．Ｅ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントへの抗薬剤抗体の結合の比較
Ｅ２５に特異的なミューリンモノクローナル抗体が生成された。下記の表２に示すように、ＡＭＥ１、ＡＭＥ７、ＡＭＥ９、ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ１３、ＡＭＥ４及びＡＭＥ５はＥ２５に結合する抗体である。ＡＭＥ１、ＡＭＥ７、ＡＭＥ９、ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ４及びＡＭＥ５はマウスＩｇＧ１であり、ＡＭＥ１３はマウスＩｇＧ２抗体である。Ｅ２５は、実施例１及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３−２６３２，  １９９３に記載されるように、ＭＡＥ１１から誘導されたヒト化抗体である。ＭＡＥ１は、コントロール抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体であって、ＭＡＥ１１とは異なるＣＤＲを有する。ＭＡＥ１及びＭＡＥ１１はマウスＩｇＧ抗体である。コントロール抗体（完全長）は、Ｅ２５に類似するフレームワーク残基を有するＩｇＧ抗体であるが、異なる抗原に結合する。ＭＡＥ１へのネガティブ結合は、ＡＭＥがＥ２５配列のみに特異的であることを証明した。これらの抗薬剤抗体がＥ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントに対して同様によく結合するかどうかを試験するために、結合アッセイは公知技術の方法を用いて実施された。例えばＥｎｇｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：８７１−４，  １９７１を参照。Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントはＥＬＩＳＡプレートに固定され、漸増濃度の精製された抗薬剤抗体（ＡＭＥ１、ＡＭＥ７、ＡＭＥ９、ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ１４、ＡＭＥ４又はＡＭＥ５）はプレートに添加された。Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントへの抗薬剤抗体の結合は、ＨＲＰがコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体によって検出された。４５０ｎｍにおけるＯＤが測定された。下記の図４Ａ−４Ｈ及び表２に示すように、ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ４及びＡＭＥ５はＥ２５Ｆａｂ及びＥ２５フレームワーク領域に特異的である；ＡＭＥ１、ＡＭＥ７及びＡＭＥ９は、Ｅ２５ＣＤＲに特異的である；ＡＭＥ１３は、Ｅ２５フレームワーク領域に特異的である。ＡＭＥ２、ＡＭＥ１０、ＡＭＥ１３、ＡＭＥ４、ＡＭＥ５及びＡＭＥ７がＥ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントの両方に結合するので、これらの抗体は本願明細書に記載されるアッセイにおいて用いられ得るミュータント抗ＩｇＥ抗体を試験し、スクリーニングするために用いられてもよい。
表２．Ｅ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントに結合するマウス抗体
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【０２１９】
実施例３．Ｅ２５特異的ＩｇＥポジティブコントロール抗体の調製
図５は、本願明細書に記載されるアッセイ系で用いられ得るポジティブコントロール抗体を示す。この抗体は、ＡＭＥ２の重鎖及び軽鎖可変領域及びヒトＩｇＥの定常領域を有する。
【０２２０】
ポジティブコントロール抗体は、図６Ａに示されるアッセイを用いて試験された。ＥＬＩＳＡプレートの表面をヒトＦｃεＲＩα  ＩｇＧキメラ受容体で被覆した。Ｅ２５特異的ＩｇＥポジティブコントロール抗体をプレートに添加し、固定された受容体に結合できるようにインキューベートした。漸増濃度のＥ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントの何れかをプレートに添加し、Ｅ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントの結合を可能とするためにインキューベートした。プレートへのＥ２５又はＥ２５−ＡＡＡミュータントの結合は、ＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて測定された。結果を図６Ｂに示す。実験は、図３に示されるポジティブコントロール抗体がＥ２５及びＥ２５−ＡＡＡミュータントに同様によく結合することを示し、アッセイ又はさらなるミュータント抗体のスクリーニングのためのポジティブコントロールとして本明細書に記載されるアッセイ系で用いられてもよい。
【０２２１】
実施例４．直接的ＥＬＩＳＡフォーマットを用いた試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の検出
図７は、Ｅ２５特異的ＩｇＥを検出するためのアッセイ系を示す。Ｅ２５−ＡＡＡミュータント抗体は、ＥＬＩＳＡプレートの表面を被覆するために用いられる。あるいは、ミュータント抗体は、セルロースポリマースポンジ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標）ｄｅｓｉｇｎ、Ｐｈａｄｉａ）の表面に固定される。患者血清試料は表面に添加され、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのあらゆるＥ２５特異的ＩｇＥの結合を可能とする条件下でインキューベートされた。ビオチン標識ヒトＦｃεＲＩα−ＩｇＧキメラ受容体（例えば国際公開第０８／０２８０６８号に記載される）は、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントに結合するあらゆるＥ２５特異的なＩｇＥを検出するために、ＥＬＩＳＡプレート（又はＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標））に添加される。ＳＡ−ＨＲＰ（ストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート）は、ビオチン−ＦｃεＲＩ−ＩｇＧを検出するために添加される。
【０２２２】
あるいは、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントへのＥ２５特異的ＩｇＥの結合を検出するために他の検出系が用いられる。以下の工程が直接的ＥＬＩＳＡアッセイのために用いられる：ａ）Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを用いて２−８℃、オーバーナイトでプレートを被覆する工程；ｂ）プレートにアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）を添加し、撹拌させながら室温で２時間インキューベートする工程；ｃ）プレートにＥ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む１：２希釈血清試料を添加し、撹拌させながら室温、オーバーナイトでインキューベートする工程；ｄ）プレートにビオチン標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧを添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートする工程；ｅ）プレートにＡｍｄｅｘ−ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートする工程；ｆ）プレートにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｇ）プレートに１Ｍリン酸を添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートは、工程ｆ）の前に、各々の工程間で３回洗浄される。
【０２２３】
実施例５．半均一系及び均一系アッセイを用いた試料中のＩｇＥアイソタイプの抗薬剤抗体の検出
図１０は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５−特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料を、ビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントと共に、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）ストレプトアビジンで被覆したプレートにアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）を添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする、又は、プレブロックしたストレプトアビジンで被覆したプレート（例えばＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  （ＨＢＣ）  Ｃｌｅａｒ  ９６−ｗｅｌｌ  ＰｌａｔｅとＳｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）を用いる工程；ｃ）プレートにプレインキュベートされた血清試料を添加し、撹拌しながら室温で０．５−２時間（例えば１時間）インキューベートする工程；ｄ）プレートにジゴキシゲニン標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧを添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートする工程；ｅ）プレートにＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体を添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートする工程；ｆ）プレートにＴＭＢ基質を添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｇ）プレートに１Ｍリン酸を添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｅ）の各工程の後に３回洗浄する。
【０２２４】
例えば、アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）中の１μｇ／ｍｌビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを、ヒト血清で１：１に希釈し、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。１：２のプレインキューベートされた血清試料を、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）に添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートし、次いで洗浄した。結合したＥ２５特異的ＩｇＥは、撹拌しながら室温で１時間、アッセイ希釈液中で、２５０ｎｇ／ｍＬのＤＩＧ標識ＦｃｅＲ１−ＩｇＧと共にインキュベートすることにより検出される。プレートを洗浄し、〜１：６０００のＨＲＰ標識マウス抗ＤＩＧ  ＭＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）と共に、アッセイ希釈液中で撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを最後に洗浄し、発色現像及び測定のためにＴＭＢ基質と共に１５−３０分間インキューベートした。
【０２２５】
図１１は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための半均一系ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを示す。以下のの工程が用いられる：ａ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料をビオチン標識ミュータントＥ２５（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント）と共に撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をＭＳＤストレプトアビジンで被覆したプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （ＭＳＤ），  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）に添加し、浸透しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｃ）プレインキュベートされた血清試料をストレプトアビジンで被覆したプレートに添加し、浸透しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｄ）ルテニウム標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧを添加し、浸透しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；及びｅ）ＭＳＤ  ＴＰＡリードバッファーを添加し、直ちにシグナルを読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｄ）の各工程後に洗浄する。
【０２２６】
図１２は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための「ブロッキング」均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料をビオチン標識ミュータントＥ２５（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント）及び１０倍以上の過剰なＦｃεＲ１−ＩｇＧと共に撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をストレプトアビジンで被覆したプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｃ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｄ）ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＥ抗体をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｅ）ＴＭＢ基質をプレートに添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｆ）１Ｍリン酸をプレートに添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｄ）の各工程後に洗浄する。
【０２２７】
図１３は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための「ブロッキング」均一系ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料をビオチン標識ミュータントＥ２５（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント）及び１０倍以上過剰なジゴキシゲニン標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共に撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をストレプトアビジンで被覆したプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｃ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｄ）ＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｅ）ＴＭＢ基質をプレートに添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｆ）１Ｍリン酸をプレートに添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｄ）の各工程後に洗浄する。
【０２２８】
図１４は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための均一系「ブロッキング」ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料をビオチン標識ミュータントＥ２５（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント）及び１０倍以上過剰なルテニウム標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共に撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をストレプトアビジンで被覆したプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｃ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｄ）ＭＳＤ  ＴＰＡリードバッファーを添加し、直ちにシグナルを読みとる工程。プレートを工程間、例えばｂ）からｃ）の各工程後に洗浄する。
【０２２９】
図１５は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための半均一系「ブロッキング」ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を用いて２−８℃、オーバーナイトでプレートを被覆するか（図１５、右パネル）、又はビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を予め被覆されたストレプトアビジンプレートに添加し（図１５、左パネル）、撹拌しながら室温で１−２時間インキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をプレートに添加し、撹拌しながら室温で２時間インキューベートする工程；ｃ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料を１０倍以上過剰な非標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共にプレインキュベートし、撹拌しながら室温、オーバーナイトでインキュベートする工程；ｄ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｅ）ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＥ抗体をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｆ）ＴＭＢ基質をプレート添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｇ）１Ｍリン酸をプレートに添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばａ）、ｂ）、ｄ）及びｅ）の各工程後に洗浄する。
【０２３０】
図１６は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するための半均一系「ブロッキング」ＥＬＩＳＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を用いて２−８℃、オーバーナイトでプレートを被覆するか（図１６、右パネル）、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を予め被覆されたストレプトアビジンプレートに添加し（図１６、左パネル）、撹拌しながら室温で１−２時間インキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をプレートに添加し、撹拌しながら室温で２時間インキューベートする工程；ｃ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料を１０倍以上過剰なジゴキシゲニン標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共にプレインキュベートし、撹拌しながら室温、オーバーナイトでインキュベートする工程；ｄ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｅ）ＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；ｆ）ＴＭＢ基質をプレート添加し、約１５分間インキューベートする工程；及びｇ）１Ｍリン酸をプレートに添加し、Ａ４５０−Ａ６５０の吸光度を読みとる工程。プレートを工程間、例えばａ）、ｂ）、ｄ）及びｅ）の各工程後に洗浄する。
【０２３１】
図１７は、試料中のＥ２５特異的ＩｇＥを検出するために半均一系「ブロッキング」ＭＳＤ−ＥＣＬＡフォーマットを示す。以下の工程が用いられる：ａ）Ｅ２５（又はＥ２５ミュータント（例えばＥ２５−ＡＡＡミュータント））を用いて２−８℃、オーバーナイトでプレートを被覆するか（図１７、右パネル）、ビオチン標識Ｅ２５（又はビオチン標識Ｅ２５ミュータント）を予め被覆されたストレプトアビジンプレートに添加し（図１７、左パネル）、撹拌しながら室温で１−２時間インキュベートする工程；ｂ）アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）をプレートに添加し、撹拌しながら室温で２時間インキューベートする工程；ｃ）Ｅ２５特異的ＩｇＥ及び非Ｅ２５特異的ＩｇＥを含む血清試料を１０倍以上過剰なルテニウム標識ＦｃεＲ１−ＩｇＧと共にプレインキュベートし、撹拌しながら室温、オーバーナイトでインキュベートする工程；ｄ）プレインキュベートされた血清試料をプレートに添加し、撹拌しながら室温で１−２時間インキューベートする工程；及びｅ）ＭＳＤ  ＴＰＡリードバッファーを添加し、直ちにシグナルを読みとる工程。プレートを工程間、例えばａ）、ｂ）及びｄ）の各工程後に洗浄する。
【０２３２】
実施例６．ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤特異的抗体のアッセイ感度
実施例４（図７）に記載されるアッセイ系のＥ２５特異的ＩｇＥ抗体の感度が測定された。マイクロタイタープレートを、０．０５ＭＮａ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中のＥ２５−ＡＡＡミュータントを用いて４℃、オーバーナイトで被覆し、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、次いで室温で２時間、アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）でブロッキングした。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（図５に示されるポジティブコントロール）標準曲線は、０．４−１０００ｎｇ／ｍｌのポジティブコントロール（ＰＣ）を正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に添加し、標準試料をアッセイ希釈液で１：２に希釈することによって調製された。１：２ポジティブコントロール標準曲線試料を、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温、オーバーナイトでインキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで６回洗浄した。
【０２３３】
アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００）で希釈されたビオチン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧを、マイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで６回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたＡｍｄｅｘストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｄｅｘ  ＳＡ−ＨＲＰ）をマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで６回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。
【０２３４】
Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ＰＣ）標準曲線を図８に示す。Ｅ２５特異的ＩｇＥ抗体の最小定量化可能濃度（ＭＱＣ）は、このアッセイ系では０．２ＩＵ／ｍｌ（０．４８ｎｇ／ｍｌ）であった。
【０２３５】
図１０に記載されるアッセイ系のＥ２５特異的ＩｇＥ抗体の感度が測定された。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（図５に示されるポジティブコントロール）標準曲線は、正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に０．１−１００ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）を添加し、次いで１μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを含むアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で１：２にそれぞれの標準試料を希釈することによって調製された。１：２のポジティブコントロール標準曲線試料を、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５１２５）は、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄された。プレインキューベートされた１：２のポジティブコントロール標準曲線試料を、ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたジゴキシゲニン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈した抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−Ａｎｔｉ−ＤＩＧ  ＭＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）を、マイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ＰＣ）標準曲線を下記の表３に示す。Ｅ２５特異的ＩｇＥ抗体の最小定量化可能濃度（ＭＱＣ）は、このアッセイ系では０．１ＩＵ／ｍｌ（０．２４ｎｇ／ｍｌ）であった。以下の表４の方法は、以下の変更を伴うが上記表３と同じである：１）Ｅ２５特異的ＩｇＥ（図５に示されるポジティブコントロール）標準曲線は、正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に、０．１−１００ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）の代わりに０．１−６．４ＩＵ／ｍＬを添加することによって調製された；及び２）予め被覆したストレプトアビジンプレートは、Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５１２５の代わりにＰｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００であった。
表３．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットの感度
2013508740.tif 000017
約１５９ＩＵ  ／ｍｌの総ＩｇＥを含むＮＨＳプールの標準曲線。
表４．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットの感度
2013508740.tif 000018
【０２３６】
実施例７．ＩｇＥアイソタイプの抗薬剤特異的抗体の検出のためのアッセイ系の薬剤耐性
実施例４（図７）に記載されるアッセイ系の薬剤耐性は、０．８ＩＵ／ｍｌ（２ｎｇ／ｍｌ）のポジティブコントロール（図５に示されるＥ２５特異的ＩｇＥ）及び漸増濃度のＥ２５の存在下で試験された。マイクロタイタープレートを、実施例６に記載されるように、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントで被覆した。Ｅ２５薬剤耐性試験試料は、１−１０００ｎｇ／ｍＬのＥ２５を２ｎｇ／ｍＬのＰＣを含むニートＮＨＳプールに添加し、次いで各々の薬剤耐性試料をアッセイ希釈液で１：２に希釈することによって調製された。１：２のＥ２５薬剤耐性試料を、Ｅ２５−ＡＡＡミュータントで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、さらに実施例６に記載されるように、Ｅ２５特異的抗体を検出するように処理した。このアッセイの結果を図９に示す。０．８ＩＵ（２ｎｇ／ｍｌ）のＥ２５特異的抗体の存在下では、アッセイのＥ２５耐性度は〜１３０ｎｇ／ｍｌのＥ２５であった。
【０２３７】
図１０に記載されるアッセイ系の薬剤耐性は、０．２、１及び５ＩＵ／ｍｌ（０．４８、２．４及び１２ｎｇ／ｍｌ）のポジティブコントロール（図５に示されるＥ２５特異的ＩｇＥ）及び０、１０、５０及び１５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＥ２５の存在下で試験された。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ポジティブコントロール）標準曲線は、０．１−６．４ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）を正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に添加することによって調製された。Ｅ２５薬剤耐性試験試料は、０、１０、５０及び１５０ｎｇ／ｍＬのＥ２５を、ニートＮＨＳプール又は０．２、１及び５ＩＵ／ｍｌのＰＣを含む８１２ＩＵ／ｍｌまでの非特異的ＩｇＥを含む３人のアレルギー性喘息ヒト血清に添加することによって調製された。標準曲線及び薬剤耐性試料は、１ｕｇ／ｍＬのビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを含むアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で１：２に希釈された。１：２の試料は、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）を洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。プレインキュベートされた１：２の試料を、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたジゴキシゲニン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈された抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−抗ＤＩＧ  ＭＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）をマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。このアッセイの結果を以下の表５に示す。０．２ＩＵ（０．４８ｎｇ／ｍｌ）のＥ２５−特異的抗体の存在下では、アッセイのＥ２５耐性度は〜５０ｎｇ／ｍｌのＥ２５であった。
表５．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットの薬剤耐性
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【０２３８】
図１０に記載されるアッセイ系の総ＩｇＥ干渉も試験された。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ポジティブコントロール）標準曲線は、０．１−６．４ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）を正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に添加することによって調製された。アレルギー性喘息と診断された個体からの９つのヒト血清試料（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  ＮＹ社から提供された血清）及び１０７−２４４６ＩＵ／ｍＬの様々なＩｇＥレベルを有する正常ヒト血清プールからなる１０の総ＩｇＥ干渉試料が、解析のために選択された。標準曲線及び１０の総ＩｇＥ干渉試料は、１μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを含むアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で１：２に希釈された。１：２の試料を、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）を洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。プレインキュベートされた１：２の試料を、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたジゴキシゲニン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈された抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−抗ＤＩＧ  ＭＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）をマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。
【０２３９】
以下の表６は、試料中の総ＩｇＥが８００ＩＵ／ｍｌ以下である場合、総ＩｇＥ干渉がなかったことを示す。
表６．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマット総ＩｇＥ干渉
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【０２４０】
図１０に記載されるアッセイ系の精度も試験された。図１０に記載されるアッセイ系の精度は、０、０．２、１及び５ＩＵ／ｍｌ（０．４８、２．４及び１２ｎｇ／ｍｌ）のポジティブコントロール（図５に示されるＥ２５特異的ＩｇＥ）存在下で試験された。Ｅ２５特異的ＩｇＥ（ポジティブコントロール）標準曲線は、０．１−６．４ＩＵ／ｍＬのポジティブコントロール（ＰＣ）を、正常ヒトニート血清プール（ＮＨＳプール）に添加することによって調製された。精度試験試料は、０、０．２、１及び５ＩＵ／ｍｌのＰＣをニートＮＨＳプール又は８１２ＩＵ／ｍｌまでの非特異的ＩｇＥを含む３個体のアレルギー性喘息ヒト血清に添加することによって調製された。標準曲線及び精度試料は、１μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｅ２５−ＡＡＡミュータントを含むアッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で１：２に希釈された。１：２の試料を、撹拌しながら室温、オーバーナイトでプレインキュベートした。ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．  ＃１５５００）を洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。プレインキュベートされた１：２の試料を、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈されたジゴキシゲニン標識ｒｈｕＦｃεＲ１−ＩｇＧをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイ希釈液で希釈された抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−抗ＤＩＧ  ＭＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ＃２００−０３２−１５６）をマイクロタイタープレートに添加し、撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。次いでＴＭＢ基質をマイクロタイタープレートに添加し、室温で１５分間インキューベートした。発色現像を止めるためにリン酸をマイクロタイタープレートに添加し、それぞれのウェルの吸光度シグナルを６５０ｎｍ基準で４５０ｎｍにおいてプレートリーダーを用いて読みとった。結果を以下の表７に示す。総ＩｇＥレベルの増加に伴って、ＩｇＥの過剰回収の傾向があるようである。
表７．半均一系ＥＬＩＳＡフォーマットの精度
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【０２４１】
個体のアレルギー性喘息血清の総ＩｇＥ（非特異的ＩｇＥ）レベルは、Ｐｈａｄｉａの市販用総ＩｇＥアッセイを用いて血清ベンダー（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）で測定された。
【０２４２】
ＮＨＳプールの総ＩｇＥレベルは、ヒト血清試料中の総遊離ＩｇＥを検出するための方法を用いて測定された。Ｅ２５の投与の前に抽出された試料を、ｒｈｕＦｃεＲＩ−ＩｇＧで被覆されたプレートと共にインキューベートした。試料のＩｇＥとｒｈｕＦｃεＲＩ−ＩｇＧとの間の結合は、プレートにビオチンがコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体を添加し、ストレプトアビジンがコンジュゲートされたβ−ガラクトシダーゼ試薬を添加することによって検出された。プレートを洗浄し、０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５中の０．３４ｍｇ／ｍＬＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−ガラクトシド）と共にインキューベートした。この反応を０．３Ｍグリシン、ｐＨ１０．５の添加により停止し、蛍光シグナルを読みとった。シグナルは、血清試料中のＩｇＥレベルと相関する。
【０２４３】
前述の発明は明確な理解のために図と例とを挙げて詳細に記載されているが、記載及び例は発明を限定するように解釈されるべきではない。