(57)【要約】      （修正有）【課題】非相同組換えの発生を阻害し、相同組換えが生じた、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類の形質転換体の取得確率を向上させる方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は特定のアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合性タンパク質の機能を抑制、阻害又は欠失させたナンノクロロプシス属に属する藻類を宿主として用いて形質転換を行い、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失させたナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類を宿主として用いて形質転換を行い、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法。
（Ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなる、DNA結合性タンパク質。
【請求項２】
ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類において下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失させ、相同組換えにより前記藻類のゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行う形質転換体の作製に用いる宿主を作製する方法。
（Ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなる、DNA結合性タンパク質であるKuの機能を有するタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子をダウンレギュレートすることにより、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又は下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子がダウンレギュレートしたナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類を宿主として用いて形質転換を行い、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法。
（Ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなる、DNA結合性タンパク質。
【請求項５】
ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類において下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又は下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子がダウンレギュレートさせ、相同組換えにより前記藻類のゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行う形質転換体の作製に用いる宿主を作製する方法。
（Ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなる、DNA結合性タンパク質であるKuの機能を有するタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記DNA（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるDNA。
（ｂ）前記DNA（ａ）の塩基配列と同一性が５５％以上の塩基配列からなる、DNA結合性タンパク質をコードするDNA。
【請求項７】
前記藻類がナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能が抑制、阻害又は欠失されている、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類。
（Ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなる、DNA結合性タンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が欠失若しくは不活性化、又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子がダウンレギュレートされていることで、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能が抑制、阻害又は欠失されている、請求項８に記載の藻類。
【請求項１０】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が欠失若しくは不活性化、又は下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子がダウンレギュレートされている、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類。
（Ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなる、DNA結合性タンパク質。
【請求項１１】
前記藻類の野生株との比較で、相同組換えが生じる確率が向上している、請求項８〜１０のいずれか１項記載の藻類。
【請求項１２】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記DNA（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の藻類。
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるDNA。
（ｂ）前記DNA（ａ）の塩基配列と同一性が５５％以上の塩基配列からなる、DNA結合性タンパク質をコードするDNA。
【請求項１３】
前記藻類がナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の藻類。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の藻類を宿主として用いて、相同組換えにより、前記藻類のゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行う、形質転換体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類における相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究、開発が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
この中で、とりわけ、バイオ燃料や食品素材の生産に有用であるとして、ナンノクロロプシス属などに属する微細藻類が注目を集めている。微細藻類は、バイオディーゼル燃料や食品素材として利用可能な油脂を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。
【０００３】
前記背景から、微細藻類において、ゲノムDNA上の各種遺伝子を改変する研究が盛んに行われている。例えば、非特許文献１には、油脂生産能を有するナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp. ）において、相同組換えにより標的遺伝子を欠損できることが記載されている。
ここで「相同組換え」とはDNAの修復メカニズムの１種であり、二本鎖DNAの互いによく似た相同配列を持つ部分で発生する。
【０００４】
しかし相同組換えは必ず起きるわけではなく、一定頻度で非相同組換えも起こる（非特許文献１参照）。よって、ゲノム上の所望の領域に存在する各種遺伝子の改変を効率よく行うには、導入した相同組換え用プラスミドまたはDNAカセットが標的ゲノム箇所とは別の箇所で非相同組換えによってゲノム上に取り込まれる発生頻度を低下させ、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を上昇させることが重要である。
【０００５】
ヒトや酵母、動物細胞では、非相同組換えに関連するタンパク質や、これをコードする遺伝子について研究が進んでいる（例えば、特許文献１及び非特許文献２参照）。しかし、ナンノクロロプシス属に属する藻類では、非相同組換えに関連するタンパク質や、これをコードする遺伝子について、未だ特定されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８３０９０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Oliver Kiliana, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, vol. 108(52), p. 21265-21269
【非特許文献２】Takashi Ochi1, et al., Science, 2015, Vol. 347, Issue 6218, p. 185-188
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述のように、ゲノム上の各種遺伝子の改変を効率よく行うには、非相同組換えの発生頻度を低下させ、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を上昇させることが重要である。しかし、ナンノクロロプシス属に属する藻類では、非相同組換えを抑制させた報告や相同組換えの頻度を向上させた報告がほとんど報告されていない。
【０００９】
そこで本発明は、非相同組換えの発生を阻害し、相同組換えが生じた、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体の取得確率を向上させる方法の提供を課題とする。
さらに本発明は、相同組換えが生じる確率を向上させたナンノクロロプシス属に属する藻類の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ナンノクロロプシス属に属する藻類から、非相同組換えに関連するタンパク質を新たに特定した。そして、新たに特定した非相同組換えに関連するタンパク質の機能を抑制、阻害又は欠失させた藻類を宿主として用いることで、前記藻類における相同組換えが生じる確率が上昇し、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率が顕著に向上することを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【００１１】
本発明は、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失させたナンノクロロプシス属に属する藻類を宿主として用いて形質転換を行い、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法に関する。
（Ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなる、DNA結合性タンパク質。
【００１２】
また本発明は、ナンノクロロプシス属に属する藻類において前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失させ、相同組換えにより前記藻類のゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行う形質転換体の作製に用いる宿主を作製する方法に関する。
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能が抑制、阻害又は欠失されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類に関する。
さらに本発明は、前記藻類を宿主として用いて、相同組換えにより、前記藻類のゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行う、形質転換体の作製方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明で用いるナンノクロロプシス属に属する藻類は、非相同組換えの発生が阻害され、相同組換えが生じる確率が有意に向上している。よって、本発明によれば、非相同組換えの発生を阻害し、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（ａ）は、ナンノクロロプシス・オキュラータの野生株における、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子周辺のゲノム配列を模式的に示す図である。図１（ｂ）は、実施例１で作製した、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の相同組換え用プラスミドのインサート配列の模式図である。
【図２】図２（ａ）は、相同組換え用カセットを用いた前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の欠損株の作製方法を模式的に示す図である。図２（ｂ）は、ナンノクロロプシス・オキュラータの野生株と、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の欠損株について、相同組換え用カセットの導入を確認するために増幅するDNA断片のサイズを比較する模式図である。
【図３】図３（ａ）は、ナンノクロロプシス・オキュラータの野生株又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の欠損株における、アシルCoAデヒドロゲナーゼ（acyl-CoA dehydrogenase）の１種をコードする遺伝子（以下、「ACDH1遺伝子」ともいう）周辺のゲノム配列を模式的に示す図である。図３（ｂ）は、実施例２で作製したACDH1遺伝子相同組換え用プラスミドのインサート配列の模式図である。
【図４】図４（ａ）は、ナンノクロロプシス・オキュラータの野生株又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の欠損株における、図３（ａ）に示す遺伝子とは別のアシルCoAデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下、「ACDH2遺伝子」ともいう）周辺のゲノム配列を模式的に示す図である。図４（ｂ）は、実施例２で作製したACDH2遺伝子相同組換え用プラスミドのインサート配列の模式図である。
【図５】図５（ａ）は、ACDH1遺伝子相同組換え用カセットを用いたACDH1遺伝子周辺ゲノム相同組換え株の作製方法を模式的に示す図である。図５（ｂ）は、ナンノクロロプシス・オキュラータの野生株若しくは前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の欠損株と、ACDH1遺伝子周辺ゲノム相同組換え株について、相同組換え用カセットの導入を確認するために増幅するDNA断片のサイズを比較する模式図である。
【図６】図６（ａ）は、ACDH2遺伝子相同組換え用カセットを用いたACDH2遺伝子周辺ゲノム相同組換え株の作製方法を模式的に示す図である。図６（ｂ）は、ナンノクロロプシス・オキュラータの野生株若しくは前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の欠損株と、ACDH2遺伝子周辺ゲノム相同組換え株について、相同組換え用カセットの導入を確認するために増幅するDNA断片のサイズを比較する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'末端側の部位又はこれに続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'末端側の部位又はこれに続く領域を示す。
【００１６】
本発明において、形質転換体の作製に用いる宿主として、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失させた、ナンノクロロプシス属に属する藻類を使用する。前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来する、非相同組換えに関与するタンパク質の１種である。
前述の「非相同組換え」は、DNAの修復メカニズムの１つであり、非相同末端結合修復として知られている。非相同末端結合修復はまず、DNAの二重鎖切断によって生じたDNA末端にDNA結合性タンパク質であるKuが結合することで、DNA末端を保護する。そして、DNA依存性キナーゼがKuタンパク質を介してDNA末端に結合し、DNA、Kuタンパク質、及びDNA依存性キナーゼで構成される複合体を形成し、複合体同士が対合する。複合体近傍には、DNAリガーゼIV、XRCC4、及びXLFで構成されるリガーゼ複合体が招集され、リガーゼ複合体の作用によりDNA末端が再連結され、非相同末端結合修復が完結する。このように、非相同組換えは相同組換えとは異なり、DNA末端が再連結される際は、DNA末端の近傍同士の塩基配列の相同性に依らず、DNAの修復が行われる。そのため、標的箇所のゲノムDNAと相同的な塩基配列を含む各種遺伝子カセットを用いた場合、相同組換えでは所望のゲノム箇所に各種遺伝子カセットを導入することができるのに対して、非相同組換えでは、相同的な配列が認識されることなく、各種遺伝子カセットはゲノムDNA上に非特異的に導入される。
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）は、このような非相同末端結合修復に関与するタンパク質である。本発明では、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失することにより、前記藻類に相同組換え用プラスミド又はDNAカセットの導入に対して、非相同組換えの発生が抑制又は阻害され、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させることができる。
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能が抑制、阻害又は欠失されている前記藻類は、野生株との比較で、相同組換えが生じる確率が向上している。ここで「野生株」とは、タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制又は阻害させていない藻類をいう。
【００１７】
本発明で用いる藻類は、ナンノクロロプシス属に属する藻類である。ナンノクロロプシス属の藻類は、球形又は楕円形の形状を有する、２〜５μｍ程度の小さな藻類（微細藻）である。
本発明で用いる藻類としては、タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を有し、相同組換えを行うことが可能な藻類から、適宜選択することができる。本発明において、タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子は、藻類のゲノム上に存在していることが好ましい。
本発明で用いるナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー等が挙げられる。なかでも、ナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
【００１８】
タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）は非相同組換えに関与するタンパク質の１種であり、アミノ酸配列及び塩基配列のBlastの結果から、DNA結合性タンパク質であるKuタンパク質の１種であると推測された。すなわちタンパク質（Ａ）又は（Ｂ）は、Kuタンパク質の機能を有する。ここで、「Kuタンパク質の機能」とは、DNAの二重鎖切断によって生じたDNA末端を認識し、認識したDNA末端に結合し、DNA末端を保護する機能を言う。場合によっては、DNA依存性キナーゼとDNA末端とを連結する機能を意味する。そして、「タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能」とは、DNAの二重鎖切断によって生じたDNA末端を認識し、認識したDNA末端に結合し、DNA依存性キナーゼをDNA末端に召集する機能をいう。以下本明細書において、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）を単に「Ku」又は「NoKu」ともいう。
【００１９】
配列番号５０のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来の、Kuタンパク質の機能を有するタンパク質である。なお、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）より入手することができる。
【００２０】
タンパク質（Ｂ）は、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつKuタンパク質の機能を有する。
一般に、タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ機能しないのではなく、アミノ酸配列が変化してもタンパク質の機能に影響を与えない領域も存在することが知られている。このようなタンパク質の機能に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されてもタンパク質本来の機能を維持することができる。本発明で規定するタンパク質において、このようにKuタンパク質の機能が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質も包含する。
【００２１】
前記タンパク質（Ｂ）において、Kuタンパク質の機能の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１８０個以下、好ましくは１個以上１５０個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
【００２２】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）（NoKu）をコードする遺伝子として、下記DNA（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子（以下、「Ku遺伝子」又は「NoKu遺伝子」ともいう）が挙げられる。
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるDNA。
（ｂ）前記DNA（ａ）の塩基配列と同一性が５５％以上の塩基配列からなる、DNA結合性タンパク質をコードするDNA。
配列番号５１の塩基配列は、配列番号５０のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ａ））をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００２３】
前記DNA（ｂ）において、Kuタンパク質の機能の点から、前記DNA（ａ）の塩基配列との同一性は６０％以上が好ましく、６５％以上がより好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
また前記DNA（ｂ）として、前記DNA（ａ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上８０９個以下、好ましくは１個以上７１９個以下、より好ましくは１個以上６２９個以下、より好ましくは１個以上５４０個以下、より好ましくは１個以上４５０個以下、より好ましくは１個以上３６０個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上１８個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなる、DNA結合性タンパク質をコードするDNAも好ましい。
さらに前記DNA（ｂ）として、前記DNA（ａ）と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつDNA結合性タンパク質をコードするDNAも好ましい。
【００２４】
本発明において、NoKuの機能を抑制、阻害又は欠失する方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、NoKu遺伝子を欠失若しくは不活性化する方法、NoKu遺伝子をダウンレギュレートする方法、NoKuタンパク自体の欠損や変異の導入、薬剤の添加などによるNoKuタンパク質の機能を弱化する方法、NoKu遺伝子のプロモーターを改変する方法、アンチセンス、プロモーター競合などのゲノム編集技術を利用する方法、等が挙げられる。なかでも、NoKu遺伝子を欠失若しくは不活性化、又はNoKu遺伝子をダウンレギュレートすることにより、NoKuの機能を抑制、阻害又は欠失することが好ましい。
【００２５】
NoKu遺伝子を欠失又は不活性化することにより、NoKuの機能を抑制、阻害又は欠失する方法について説明する。
前記藻類のNoKu遺伝子を欠失又は不活性化することで、DNAの二重鎖切断によって生じたDNA末端に結合するKuタンパク質の発現が阻害され、非相同末端結合修復（非相同組換え）の発生が抑制又は阻害される。その結果、前記藻類での相同組換え発生頻度が上昇する。よって、これを宿主として用いて相同組換えにより形質転換を行うと、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率が向上する。
【００２６】
NoKu遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前記藻類自体が有する相同組換え能を利用した遺伝子破壊方法、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription activator-like effector nuclease、TALEN）やクリスパー（CRISPR、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）といったゲノム編集技術を利用した方法、突然変異等を利用した変異導入方法、など一般的な方法により、NoKu遺伝子を欠失又は不活性化することができる。
具体的には、NoKu遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミド（ベクター）にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを微細藻類の細胞内に取り込ませ、NoKu遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによってゲノム上のNoKu遺伝子の欠失や、これらを分断してNoKu遺伝子を不活性化することが可能である。
また、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの変異誘発剤の使用、紫外線やガンマ線等の照射によりNoKu遺伝子の突然変異を誘発する方法、NoKu遺伝子中（例えば、Kuの機能を発現するために重要な部位）に部位特異的点突然変異（例えば、フレームシフト突然変異、インフレーム突然変異、終止コドンの挿入など）を誘発する方法、NoKu遺伝子の全部又は一部を他の任意のDNA断片（例えば、任意の選択マーカー）で置換する方法、などによりKu遺伝子をランダムに不活性化することができる。
本発明において、相同組換えにより、ゲノム上のNoKu遺伝子を欠失又は不活性化することが好ましい。
【００２７】
相同組換えによりNoKu遺伝子を欠失又は不活性化するとき、前記藻類に、NoKu遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットを導入する。
ここで使用するNoKu遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、NoKu遺伝子の全部又は一部を標的領域とする。そして、標的領域をコードするゲノムの上流側の一部と相同的な塩基配列と、ゲノムの下流側の一部と相同的な塩基配列を有するプラスミド又はDNAカセットを構築し、これを前記藻類に導入することが好ましい。
また、NoKu遺伝子が相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットと置換され、NoKu遺伝子が欠失又は不活性化したことを確認するために、相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットに組み込まれる選択マーカーとして、通常用いられる選択マーカーから適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子をマーカー遺伝子として使用することもできる。
【００２８】
NoKu遺伝子を欠失又は不活性化するために用いる、前記相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、藻類へのDNA断片の導入に通常用いられるプラスミド（ベクター）を使用して作製することができる。使用できるプラスミドとしては、pUC19（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（Yangmin  Gong，et  al.，Journal  of  Basic  Microbiology，2011，vol．51，p．666-672参照）、pJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。このうち、pUC19、pUC118、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。
選択マーカーのベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
NoKu遺伝子の欠失又は不活性化に用いる相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットのサイズは、藻類への導入効率や、相同組換え効率などを考慮し、適宜設定することができる。例えば、相同配列として用いる標的領域の上流又は下流塩基配列はそれぞれ300bp以上が好ましく、500bp以上がより好ましい。またその上限値は、2.5kbpが好ましく、2kbpがより好ましい。
【００２９】
前記相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットを藻類に導入する形質転換方法は、藻類の種類やNoKu遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットに応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。また、本発明では、Randor  Radakovits,  et  al.，Nature  Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
NoKu遺伝子が欠失又は不活性化した藻類の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が宿主細胞中に導入された結果、藻類が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
【００３０】
NoKu遺伝子をダウンレギュレートして、NoKuの機能を抑制、阻害又は欠失する方法について説明する。
NoKu遺伝子の発現の抑制、又はNoKu遺伝子の上流に位置するプロモーターを特定しこれを欠失若しくは不活性化することで、NoKu遺伝子の発現量が減少する（NoKu遺伝子のダウンレギュレーション）。NoKu遺伝子の発現量が減少すると、DNAの二重鎖切断によって生じたDNA末端に結合するKuタンパク質の発現が阻害され、非相同末端結合修復（非相同組換え）の発生が抑制又は阻害される。その結果、前記藻類での相同組換え発生頻度が上昇する。よって、これを宿主として用いて形質転換体を行うと、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率が向上する。
【００３１】
NoKu遺伝子をダウンレギュレートさせる方法は、常法より適宜選択することができる。例えば、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの変異誘発剤、ＵＶ、ガンマ線等の照射によりNoKu遺伝子のプロモーターや転写・翻訳開始領域の突然変異を誘発する方法、NoKu遺伝子のプロモーター配列や転写・翻訳開始領域中に他の任意のDNA断片（例えば、任意のリプレッサー、任意の選択マーカー等）を挿入する方法、NoKu遺伝子のプロモーター配列や転写・翻訳開始領域の全部又は一部を他の任意のDNA断片（例えば、任意のリプレッサー、任意の選択マーカー等）で置換する方法、アンチセンス法、RNA干渉法、プロモーター競合等があげられる。
【００３２】
NoKuの機能を抑制、阻害又は欠失した前記藻類は、外来遺伝子、内在遺伝子問わず、任意のDNA配列を含む相同組換え用プラスミド又はDNAカセットを導入し、相同組換えによりゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行った形質転換体の作製に好適に用いることができる。前述のように、本発明の藻類では、相同組換えが起きる頻度が上昇する。よって、これを宿主として用いた場合、相同組換えが生じた形質転換体を取得できる確率が非常に高く、ゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行った形質転換体を効率的に作製できる。
つまり、NoKuの機能を抑制、阻害又は欠失した前記藻類を用いることで、相同組換えが高い頻度で起こり、任意の遺伝子が目的のゲノムDNAの標的箇所に組み込まれた形質転換体を効率よく作製することができる。
あるいは、NoKuの機能を抑制、阻害又は欠失した藻類は相同組換え頻度が高い確率で起きる。よって、前記藻類のゲノム上にコードされた任意の遺伝子を標的として、相同組換えにより任意の遺伝子の破壊も容易となる。
具体的には、本発明の藻類のゲノム上の改変対象領域の外側の5’末端側領域及び3’末端側領域それぞれと相同性の高い塩基配列を有する、相同組換え用プラスミド又はDNAカセットを本発明の藻類に導入し、ゲノムと相同組換え用プラスミド又はDNAカセットとの間で相同組換えを起こさせることにより、特定のDNA配列の破壊（分断、置換など）や、所望の遺伝子の導入など、ゲノムDNAの改変を行った形質転換体を効率よく作製できる。
【００３３】
本発明は、NoKu遺伝子の塩基配列及びその上流の塩基配列からなる領域の上流側の一部と相同的な塩基配列と、ゲノム上のNoKu遺伝子の塩基配列及びその下流の塩基配列からなる領域の下流側の一部と相同的な塩基配列を有する、NoKu遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットも提供する。この相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、前記NoKuの機能を抑制、阻害又は欠失させた藻類の作製に好適に用いることができる。
【００３４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、藻類、タンパク質、遺伝子、プラスミド若しくはDNAカセット、並びに形質転換体の作製方法を開示する。
【００３５】
＜１＞下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失させたナンノクロロプシス属に属する藻類を宿主として用いて形質転換を行い、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法。
（Ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなる、DNA結合性タンパク質。
【００３６】
＜２＞ナンノクロロプシス属に属する藻類において前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失させ、相同組換えにより前記藻類のゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行う形質転換体の作製に用いる宿主を作製する方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子をダウンレギュレートすることにより、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能を抑制、阻害又は欠失する、前記＜１＞又は＜２＞項に記載の方法。
【００３７】
＜４＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子がダウンレギュレートしたナンノクロロプシス属に属する藻類を宿主として用いて形質転換を行い、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法。
＜５＞ナンノクロロプシス属に属する藻類において前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子をダウンレギュレートさせ、相同組換えにより前記藻類のゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行う形質転換体の作製に用いる宿主を作製する方法。
【００３８】
＜６＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１５０個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上６個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜７＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記DNA（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるDNA。
（ｂ）前記DNA（ａ）の塩基配列と同一性が５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、の塩基配列からなる、DNA結合性タンパク質をコードするDNA。
＜８＞前記DNA（ｂ）が、前記DNA（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上８０９個以下、より好ましくは１個以上７１９個以下、より好ましくは１個以上６２９個以下、より好ましくは１個以上５４０個以下、より好ましくは１個以上４５０個以下、より好ましくは１個以上３６０個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなる、DNA結合性タンパク質をコードするDNA、又は前記DNA（ａ）と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつDNA結合性タンパク質をコードするDNA、である、前記＜７＞項に記載の方法。
＜９＞前記藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、及びナンノクロロプシス・エスピーからなる群より選ばれる藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・ガディタナ、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株、である、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）が、DNAの二重鎖切断によって生じたDNA末端を認識し、認識したDNA末端に結合し、DNA依存性キナーゼをDNA末端に召集するタンパク質である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
【００３９】
＜１１＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能が抑制、阻害又は欠失されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類。
＜１２＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が欠失若しくは不活性化、又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子がダウンレギュレートされていることで、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の機能が抑制、阻害又は欠失されている、前記＜１１＞項に記載の藻類。
＜１３＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が欠失若しくは不活性化、又は前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子がダウンレギュレートされている、ナンノクロロプシス属に属する藻類。
＜１４＞前記藻類の野生株との比較で、相同組換えが生じる確率が向上している、前記＜１１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の藻類。
＜１５＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記＜６＞項で規定するタンパク質である、前記＜１１＞〜＜１４＞のいずれか１項に記載の藻類。
＜１６＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、前記DNA（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜１１＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載の藻類。
＜１７＞前記DNA（ｂ）が、前記＜８＞項で規定するDNAである、前記＜１６＞項に記載の藻類。
＜１８＞前記藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、及びナンノクロロプシス・エスピーからなる群より選ばれる藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・ガディタナ、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株、である、前記＜１１＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の藻類。
＜１９＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）が、DNAの二重鎖切断によって生じたDNA末端を認識し、認識したDNA末端に結合し、DNA依存性キナーゼをDNA末端に召集するタンパク質である、前記＜１１＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の藻類。
【００４０】
＜２０＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）。
＜２１＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子。
＜２２＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記＜６＞項で規定するタンパク質である、前記＜２０＞又は＜２１＞項に記載のタンパク質又は遺伝子。
＜２３＞前記DNA（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子。
＜２４＞前記DNA（ｂ）が、前記＜８＞項で規定するDNAである、前記＜２３＞項に記載の遺伝子。
【００４１】
＜２５＞ナンノクロロプシス属に属する藻類のゲノム上の前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の塩基配列及びその上流の塩基配列からなる領域の上流側の一部と相同的な塩基配列と、ゲノム上の前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の塩基配列及びその下流の塩基配列からなる領域の下流側の一部と相同的な塩基配列を有する、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセット。
＜２６＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記＜６＞項で規定するタンパク質である、前記＜２５＞項に記載のプラスミド又はDNAカセット。
＜２７＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、前記DNA（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜２５＞又は＜２６＞項に記載のプラスミド又はDNAカセット。
＜２８＞前記DNA（ｂ）が、前記＜８＞項で規定するDNAである、前記＜２７＞項に記載のプラスミド又はDNAカセット。
＜２９＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）が、DNAの二重鎖切断によって生じたDNA末端を認識し、認識したDNA末端に結合し、DNA依存性キナーゼをDNA末端に召集するタンパク質である、前記＜２６＞〜＜２９＞のいずれか１項に記載のプラスミド又はDNAカセット。
【００４２】
＜３０＞前記＜１１＞〜＜１９＞のいずれか１項に記載の藻類を宿主として用いて、相同組換えにより、前記藻類のゲノムDNAの標的箇所で任意の改変を行う、形質転換体の作製方法。
＜３１＞相同組換えにより任意の遺伝子をゲノムDNAの標的箇所に組み込む、前記＜３０＞項に記載の形質転換体の作製方法。
＜３２＞相同組換えにより任意の遺伝子を破壊する、前記＜３０＞項に記載の形質転換体の作製方法。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2018088902.tif 000002
【００４５】
実施例１  Ku遺伝子破壊株（以下、「ΔKu株」ともいう）の作製
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号１）を人工合成し、これを鋳型として表１に示すプライマー番号２及びプライマー番号３のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子を増幅した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所（NIES）より入手）のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号４及びプライマー番号５のプライマー対、並びにプライマー番号６及びプライマー番号７のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、VCP1プロモーター配列（配列番号８）及びVCP1ターミネーター配列（配列番号９）を増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC118（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１１のプライマー対を用いてPCRを行い、プラスミドベクターpUC118を増幅した。
これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製）を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドは、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC118ベクター配列からなる。
【００４６】
（２）ナンノクロロプシス内在性Ku遺伝子の相同組換え用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１２及びプライマー番号１３のプライマー対、プライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、図１（ａ）に示す Ku遺伝子周辺のゲノム配列（配列番号１６）の部分配列（ゲノム配列（Ａ）（配列番号１６の1120〜2650位（配列番号１７））、ゲノム配列（Ｂ）（配列番号１６の2930〜4520位（配列番号１８）））を増幅した。
また、前述のゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型に、表１に示すプライマー番号４及びプライマー番号７のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット断片（Pvcp1-ble-Tvcp1）を取得した。
さらに、プラスミドベクターpUC118を鋳型として、表１に示すプライマー番号１９及びプライマー番号２０のプライマー対を用いてPCRを行い、プラスミドベクターpUC118を増幅した。
これら増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnIにて処理し、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kitを用いて精製した。
【００４７】
その後、得られたゲノム配列（Ａ）断片、ゲノム配列（Ｂ）断片、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット断片、及び前述のプラスミドベクターpUC118をIn-Fusion  HD  Cloning  Kitを用いて融合し、Ku遺伝子相同組換え用プラスミド（以下、「Ku遺伝子KO用プラスミド」ともいう）を構築した。
なお、本プラスミドは、配列番号１６の上流ゲノム配列（ゲノム配列（Ａ）、配列番号１７）、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、及び配列番号１６の下流ゲノム配列（ゲノム配列（Ｂ）、配列番号１８）の順に連結したインサート配列（図１（ｂ）参照）と、pUC118ベクター配列からなる。
【００４８】
（３）Ku遺伝子相同組換え用カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
前記Ku遺伝子相同組換え用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２１及びプライマー番号２２のプライマー対を用いてPCRを行い、Ku遺伝子相同組換え用カセット（図１（ｂ）に示すインサート配列）を増幅した。
増幅したDNA断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kitを用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
【００４９】
約1×10８個の細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。前記Ku遺伝子相同組換え用カセット約500ngを宿主細胞と混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
ｆ／２液体培地（NaNO3  75mg、NaH2PO4・2H2O  6mg、ビタミンB12  0.5μg、ビオチン  0.5μg、チアミン  100μg、Na2SiO3・9H2O  10mg、Na2EDTA・2H2O  4.4mg、FeCl3・6H2O  3.16mg、FeCl3・6H2O  12μg、ZnSO4・7H2O  21μg、MnCl2・4H2O  180μg、CuSO4・5H2O  7μg、Na2MoO4・2H2O  7μg／人工海水1L）の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「N15P5培地」という）にて２４時間回復培養を行った。その後、2μg/mLのゼオシン含有N15P5寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。
【００５０】
（４）ΔKu株の選抜
得られたコロニーの中から、相同組換え用カセットによってナンノクロロプシス・オキュラータ由来のKu遺伝子が欠失したΔKu株をPCRにより選抜した。
ΔKu株は、図２（ａ）に示すように、野生（WT）株のゲノムDNAと、前記Ku遺伝子相同組換え用カセット（Ku遺伝子KO用断片）とが相同組換えを起こし、前記Ku遺伝子相同組換え用カセットをゲノムDNAに組み込むことで作製する。
ΔKu株の選抜は、表１に示すプライマー番号２３及びプライマー番号２４のプライマー対を用いてPCRを行い、増幅される断片の長さの違いを指標として行った（図２（ｂ）参照）。
【００５１】
実施例２  ΔKu株を用いた非相同末端結合修復の抑制と、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率の検討
（１）パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
パロモマイシン耐性遺伝子（配列番号２５）を人工合成し、これを鋳型として表１に示すプライマー番号２６及びプライマー番号２７のプライマー対を用いてPCRを行い、パロモマイシン耐性遺伝子を増幅した。
この増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、パロモマイシン耐性遺伝子、並びに前述のVCP1プロモーター配列、VCP1ターミネーター配列及びプラスミドベクターpUC118をIn-Fusion  HD  Cloning  Kitを用いて融合し、パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドは、VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC118ベクター配列からなる。
【００５２】
（２）アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を標的とした相同組換え用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号２８及びプライマー番号２９のプライマー対、並びにプライマー番号３０及びプライマー番号３１のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、図３（ａ）に示すACDH1遺伝子周辺のゲノム配列（配列番号３２）の部分配列（ゲノム配列（Ｃ）（配列番号３２の101〜1550位（配列番号３３））、ゲノム配列（Ｄ）（配列番号３２の1661〜3100位（配列番号３４）））を増幅した。
同様に、表１に示すプライマー番号３５及びプライマー番号３６のプライマー対、並びにプライマー番号３７及びプライマー番号３８のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、図４（ａ）に示すACDH2遺伝子周辺のゲノム配列（配列番号３９）の部分配列（ゲノム配列（Ｅ）（配列番号３９の111〜1700位（配列番号４０））、ゲノム配列（Ｆ）（配列番号３９の1951〜3500位（配列番号４１）））を増幅した。
また、前述のパロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型に、表１に示すプライマー番号４及びプライマー番号７のプライマー対を用いてPCRを行い、パロモマイシン耐性遺伝子発現カセット断片（Pvcp1-aphVIII-Tvcp1）を取得した。
【００５３】
これら増幅断片をそれぞれ実施例１と同様の方法にて精製し、得られたゲノム配列（Ｃ）断片、ゲノム配列（Ｄ）断片、パロモマイシン耐性遺伝子発現カセット断片、及びプラスミドベクターpUC118をIn-Fusion  HD  Cloning  Kitを用いて融合、ACDH1遺伝子相同組換え用プラスミドを構築した。同様に、ゲノム配列（Ｅ）断片、ゲノム配列（Ｆ）断片、パロモマイシン耐性遺伝子発現カセット断片、及びプラスミドベクターpUC118を融合し、ACDH2遺伝子相同組換え用プラスミドを構築した。
なお、本プラスミドは、各ACDH遺伝子の上流側DNA配列（ゲノム配列（Ｃ）断片又はゲノム配列（Ｅ）断片）、VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、及び各ACDH遺伝子の下流側DNA配列（ゲノム配列（Ｄ）断片又はゲノム配列（Ｆ）断片）の順に連結したインサート配列と（図３（ｂ）又は図４（ｂ）参照）、pUC118ベクター配列からなる。
【００５４】
（３）ACDH1遺伝子相同組換え用カセット又はACDH2遺伝子相同組換え用カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
前記ACDH1遺伝子相同組換え用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号４２及びプライマー番号４３のプライマー対を用いてPCRを行い、ACDH1遺伝子相同組換え用カセット（図３（ｂ）に示すインサート配列）を増幅した。
同様に、前記ACDH2遺伝子相同組換え用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号４４及びプライマー番号４５のプライマー対を用いてPCRを行い、ACDH2遺伝子相同組換え用カセット（図４（ｂ）に示すインサート配列）を増幅した。
増幅した各断片はそれぞれ、実施例１と同様の方法にて精製した。
【００５５】
ナンノクロロプシス・オキュラータの野生（WT）株、又は実施例１で作製したΔKu株を宿主とし、前記各カセットを実施例１と同様の方法でエレクトロポレーションにより宿主に導入した。回復培養後、300μg/mLのパロモマイシン含有N15P5寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養し、パロモマイシン耐性を指標にコロニーを取得した。
【００５６】
（４）相同組換えが生じた形質転換体の取得確率の検討
得られたコロニーの中から、ナンノクロロプシス・オキュラータのACDH1遺伝子又はACDH2遺伝子を標的とし、前記相同組換え用カセットによってゲノム上の所望の位置で相同組換えが起きた株をそれぞれPCRにより選抜した。
ACDH1遺伝子周辺ゲノム相同組換え株は、図５（ａ）に示すように、野生（WT）株又はΔKu株のゲノムDNAと、前記ACDH1遺伝子相同組換え用カセット（ACDH1遺伝子相同組換え用断片）とが相同組換えを起こし、前記ACDH1遺伝子相同組換え用カセットをゲノムDNAに組み込むことで作製する。ACDH1遺伝子周辺ゲノム相同組換え株の選抜は、表１に示すプライマー番号４６及びプライマー番号４７のプライマー対を用いてPCRを行い、増幅される断片の長さの違いを指標として行った（図５（ｂ）参照）。
ACDH2遺伝子周辺ゲノム相同組換え株は、図６（ａ）に示すように、野生（WT）株又はΔKu株のゲノムDNAと、前記ACDH2遺伝子相同組換え用カセット（ACDH2遺伝子相同組換え用断片）とが相同組換えを起こし、前記ACDH2遺伝子相同組換え用カセットをゲノムDNAに組み込むことで作製する。ACDH2遺伝子周辺ゲノム相同組換え株の選抜は、表１に示すプライマー番号４８及びプライマー番号４９のプライマー対を用いてPCRを行い、増幅される断片の長さの違いを指標として行った（図６（ｂ）参照）。
【００５７】
上記の手順に従い、パロモマイシン耐性を指標に取得した形質転換体のうち、相同組換えによって標的とするACDH遺伝子のゲノム部位で相同組換えが生じていた株数から、下記式により、相同組換え効率を算出した。その結果を表２に示す。
（相同組換え頻度）＝
（相同組換えが生じた株数／パロモマイシン耐性を有する形質転換株数）×100（％）
【００５８】
【表２】
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【００５９】
表２に示すように、WT株と比較して、相同組換えを行う遺伝子の位置に依らず、ΔKu株では相同組換え頻度が顕著に高いことが明らかとなった。
以上の結果から、ナンノクロロプシス属に属する藻類においてNoKuの機能を抑制、阻害又は欠失することで、相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を飛躍的に向上させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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