【手続補正書】
【提出日】平成27年7月15日(2015.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオアッセイにおいて検出すべき標的分子を特異的に認識し結合する親和性分子を外表面に有するカプセルを用い、前記カプセルはさらに、有意なシグナルを生成しない潜在的形態から検出可能なシグナルを生成する形態へ加水分解されるシグナル前駆物質を有する、バイオアッセイにおけるシグナル生成の発動を制御する方法であって、
（ｉ）シグナル前駆物質の有意な加水分解を生じない温度でありかつ
（ａ）シグナル前駆物質が周囲温度にて有意な酸触媒加水分解を生じるには高すぎるが、高温で有意に加水分解が生じるｐＨ、又は、
（ｂ）シグナル前駆物質が周囲温度にて有意な塩基触媒加水分解を生じるには低すぎるが、高温で有意に加水分解が生じるｐＨ
のいずれかに調整されたｐＨ値をもつ調整済みｐＨ処理溶液により前記カプセルを処理するステップと、
（ｉｉ）続いて、検出可能なシグナルを生成可能な形態とするべくシグナル前駆物質の加水分解を開始するために、前記処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップと、を含む
シグナル生成発動制御方法。
【請求項２】
前記調整済みｐＨが、
（ａ）前記シグナル前駆物質を含む前記カプセルを異なるｐＨの周囲温度の一連の溶液に追加するステップと、
（ｂ）一連の周囲温度の溶液を励起光で照射するステップと、
（ｃ）周囲温度にて強いシグナルを出す溶液を排除するステップと、
（ｄ）周囲温度にて有意なシグナルを出さない溶液を加熱するステップと、
（ｅ）加熱後に有意なシグナルを出さない溶液を排除するステップと、
（ｆ）加熱後に強いシグナルを出す１又は複数の溶液のｐＨ値を調整済みｐＨとして認めるステップと、により予め決定される
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが、４５℃〜７５℃の範囲の温度に前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが、４５℃〜６５℃の範囲の温度に前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが、抵抗加熱装置、輻射加熱装置、マイクロウェーブ加熱装置、誘導加熱装置、ペルティエ素子からなる群から選択される加熱装置を用いて前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが、超音波により加熱するステップを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記超音波が、周波数２０〜６０ｋＨｚの範囲の低周波超音波である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記超音波が、周波数１〜８ＭＨｚの範囲の高周波超音波である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記カプセルに前記調整済みｐＨ処理溶液を追加することに続いて、１００秒〜５００秒の間隔の後、前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記カプセルに含まれる前記シグナル前駆物質が有機材料である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記カプセルが、1カプセル当たり１０７〜１０９の前記シグナル前駆物質の分子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナル前駆物質が、加水分解性蛍光団、加水分解性発光団、加水分解性発色団、加水分解性生物発光タンパク質、及び加水分解性蛍光性タンパク質からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナル前駆物質が、加水分解性蛍光団である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記シグナル前駆物質が、フルオレセイン二酢酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
試料中の１又は複数の標的分子を検出するためのバイオアッセイを行う方法において、
（i）前記標的分子に対する親和性を有する複数の捕捉分子を基板上に付着させるステップと、
（ii）有意なシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成できる形態へと加水分解可能なシグナル前駆物質を含むカプセルであってその外表面に、前記試料中のいずれかの標的分子を特異的に認識し結合して標的カプセル複合体を形成できる親和性分子を搭載する前記カプセルと前記試料を溶液中で混合するステップと、
（iii）前記溶液を前記基板上の前記捕捉分子と接触させていずれかの標的カプセル複合体を前記捕捉分子と結合させるステップと、
（iv）前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体から、標的分子と複合体を形成していないカプセルを分離するステップと、
（ｖ）前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を、有意にシグナル前駆物質の加水分解が生成しない温度でありかつ、
（ａ）シグナル前駆物質が周囲温度にて有意な酸触媒加水分解を生じるには高すぎるが、高温で有意に加水分解が生じるｐＨ、又は、
（ｂ）シグナル前駆物質が周囲温度にて有意な塩基触媒加水分解を生じるには低すぎるが、高温で有意に加水分解が生じるｐＨ
のいずれかにｐＨを調整された調整済みｐＨ処理溶液により処理するステップと、
（vi）前記調整済みｐＨ処理溶液中の、前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を加熱し、前記カプセルに含まれる前記シグナル前駆体を検出可能なシグナルを生成できる形態へと加水分解するステップと、
（vii）前記調整済みｐＨ処理溶液を、前記基板上の前記捕捉分子の近傍にて励起光により照射するステップと、
（viii）生成されたシグナルを検出するステップと、
を有するバイオアッセイを行う方法。
【請求項１６】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を加熱するステップが、４０℃〜７５℃の範囲の温度に前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【請求項１７】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を加熱するステップが、４５℃〜６５℃の範囲の温度に前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、前記調整済みｐＨ処理溶液を４０℃〜６５℃に加熱するステップを有する、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【請求項１８】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を加熱するステップが、抵抗加熱装置、輻射加熱装置、マイクロウェーブ加熱装置、誘導加熱装置及びペルティエ素子からなる群から選択される加熱装置を用いて前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【請求項１９】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を加熱するステップが、周波数２０〜６０ｋＨｚの範囲の低周波超音波により前記処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【請求項２０】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を加熱するステップが、周波数１〜８ＭＨｚの範囲の高周波超音波により前記処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【請求項２１】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を加熱するステップが、前記カプセルに前記調整済みｐＨ処理溶液を加えた後１００秒〜５００秒のインターバルののちに行われる、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【請求項２２】
前記シグナル前駆物質が、加水分解性蛍光団、加水分解性発光団、加水分解性発色団、加水分解性生物発光タンパク質、及び加水分解性蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【請求項２３】
前記シグナル前駆物質が加水分解性蛍光団である、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【請求項２４】
前記シグナル前駆物質がフルオレセイン二酢酸である、請求項１５に記載のバイオアッセイを行う方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
＜工程２  −  複合体の固定化＞
第２の工程では、複合体５０が、捕捉分子７０を表面に付着させた基板６０上に固定化される。捕捉分子７０もまた、分析物１０に特異的に結合する能力故に選択されたものであり、よって、分析物に結合しなかったカプセルは捕捉分子７０と相互作用せず、固定化されないこととなる。固定化された複合体は、固定化位置において”サンドイッチ”を形成しており、固定化された捕捉分子７０、分析物１０及び親和性分子４０（カプセル２０に付着したままである）を有している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
この第３の工程は、固定化された複合体を、調整済みｐＨ溶液中の加熱工程で処理することにより行われる。調整済みｐＨ溶液は、シグナル前駆物質が酸性触媒による加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるよりも若干高すぎるｐＨか、又は、シグナル前駆物質が塩基性触媒による加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるよりも若干低すぎるｐＨをもつ。カプセルは、調整済みｐＨ処理溶液中で安定であり、かつ、カプセルに収容されたシグナル前駆物質は、認識可能な程度の加水分解を行わない。しかしながら、さらに熱が加えられると、反応速度は変化し、シグナル前駆物質の加水分解が生じてシグナル前駆物質はシグナル生成形態に変換する。シグナル前駆物質は、加水分解性蛍光団、加水分解性発光団、加水分解性発色団、加水分解性生物発光タンパク質、及び加水分解性蛍光タンパク質からなる群から選択される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
図９は、高ｐＨ値を有する処理溶液中のカプセルからの光出力を示す別のグラフである。この実験において、ｐＨ値は１２．５であった。２５０秒後、溶液温度は、室温（２３℃）から６５℃に上昇させられたが、高ｐＨでは、カプセルを溶液に投入するとほぼ即時にかつ加熱工程の前に活性化が発動された。励起曲線９ｅと非励起曲線９ｎは、約２５秒後に大きく分離しており、励起曲線９ｅでは２５０秒後に温度上昇させたときに蛍光出力に若干増加が見られたが、これは有意な増加ではない。この実験は、高ｐＨが、それ自体、遅延無く活性化を発動するために用いることができることを示している。これは、即時の活性化が望まれかつ活性化発動前の安定平衡の期間が不要な状況下では有用である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
リーダー装置１４０１は、ハウジング１４０２を有する。一端にて、ハウジングはスロット１４０３を具備し、その中にテストストリップ１４１０を矢印１４１８のように挿入可能である。スロットは、ハウジング１４０２の内部空間に設けられたトレイ１４０４に続いており、このトレイはテストストリップ１４１０がリーダー装置に挿入されたときガイドの役割を果たす。トレイの下方には加熱装置１４０６が配置され、トレイの上方には加熱装置１４０６に対向する位置に光学システム１４０７が配置され、これは挿入されたテストストリップに励起光を照射しかつ放出光を受けて処理するためのものである。ハウジング１４０２の上面は、開口すなわち観察窓１４０８を有しており、これを通して光学システム１４０７からの読み出しを見ることができる。トレイ１４０４は、面取り隅部１４０５を有する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
テストストリップ１４１０は、不浸透性の細長い支持基板１４１１を有し、支持基板１４１１はポリ塩化ビニル、ポリプロピレン等の熱可塑性樹脂から形成でき、その上にニトロセルロース又はガラス繊維等の吸収性材料で形成された多孔質膜１４１２が搭載され、多孔質膜１４０２は、毛細管作用、ウィッキング、単純な濡らしにより水溶性溶液を輸送することができる。テストストリップ１４１０は、リーダー装置１４０１内のトレイ１４０４の面取り隅部１４０５に対応する形状とされた切り欠き隅部１４１３を有する。この機能は、ユーザがテストストリップ１４１０を誤った方向でリーダー装置１４０１に挿入することを防止するためである。なぜなら、テストストリップ１４１０は、その切り欠き隅部１４１３がトレイ１４０４の面取り隅部１４０５と合致する場合にのみ完全に挿入することができるからである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
＜活性化発動後のカプセル挙動及びカプセルの別形態＞
活性化発動後のカプセル壁の挙動は、バイオアッセイの性能に影響を与えるとは思われない。特許文献１においては、カプセルは崩壊するが、現在は、カプセル挙動のより良い理解が得られており、それは、シグナル前駆物質が封入から放出されシグナル生成分子に活性化された後に特定のタイプのカプセルは無傷のままであることが判明していると報告された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
＜バイオアッセイの別形態＞
上述では、図１を参照してバイオアッセイ手順を説明し、その場合の第１ステップでは分析物１０を含むと思われる試料サンプルが、シグナル前駆物質３０を含むカプセル２０と溶液中で混合された。当然に理解されることだが、これがバイオアッセイを行う際の第１ステップでなければならないということではない。図１９〜図２２を参照して、別の手順をここで簡単に説明する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
この方式では、検出装置が、基板２２２上に固定化された第１の核酸断片（オリゴヌクレオチド）２２１を有し、図２１に示したハイブリダイゼーション方式で用いた装置とほぼ同じである。故に、オリゴヌクレオチド２２１は、図１４〜図１８に関連して上述したラレラルフローテスト装置のテストゾーンに用いた捕捉分子の例と考えることができる。