【手続補正書】
【提出日】平成27年10月22日(2015.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの異種カーゴ分子を封入する、腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）からなるＶＬＰを精製するプロセスであって、（ａ）複数のＶＬＰを含む細胞溶解物を得ること、（ｂ）細胞溶解物を、ＶＬＰ以外の細胞溶解産物を加水分解するのに十分な時間及び条件下でプロテアーゼと接触させて、加水分解物を形成すること、並びに（ｃ）加水分解物からＶＬＰを単離することを含む、プロセス。
【請求項２】
プロテアーゼが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）のプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケンフォルミス）のプロテアーゼ、ペプシン及びパパインから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
工程（ｂ）が、約３０分間実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
工程（ｂ）が、約３７℃で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
加水分解のための時間および条件が、全細胞溶解物に存在するが、カプシドにより封入されていない個別のポリペプチド１００個あたり、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個又は少なくとも９０個が切断されるが、そのような加水分解の前の全細胞溶解物に存在するカプシド１００個あたり少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個又は少なくとも９０個が、加水分解の後に無傷のまま残るのに十分なものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
工程（ｂ）が、細胞溶解物をヌクレアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼからなる群のうちの少なくとも１つと接触させることを更に含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
工程（ｃ）が、加水分解物を遠心分離して、少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む沈殿物を得ることを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
工程（ｃ）が、（ｉ）硫酸アンモニウムによる加水分解物の第１沈殿、続いて第１遠心分離を実施して、第１沈殿物及び第１上澄みを得ること、並びに（ｉｉ）硫酸アンモニウムによる第１上澄みに対する第２沈殿、続いて第２遠心分離を実施して、第２沈殿物を得ることを含み、第２沈殿物が少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
工程（ｃ）が、（ｉ）エタノールによる加水分解物の第１沈殿、続いて第１遠心分離を実施して、第１沈殿物及び第１上澄みを得ること、並びに（ｉｉ）硫酸アンモニウムによる第１上澄みに対する第２沈殿、続いて第２遠心分離を実施して、第２沈殿物を得ることを含み、第２沈殿物が少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
異種カーゴ分子が、異種カーゴ分子とＶＬＰとを結合するオリゴヌクレオチドリンカーを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドリンカーがオリゴリボヌクレオチドである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
異種カーゴ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選択されるオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
異種カーゴ分子が、リボザイムを含むオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１６】
加水分解物から単離されたＶＬＰが、組成物に存在するカプシド１００グラムあたり４グラム未満の１つ以上の細胞溶解産物を含み、細胞溶解産物が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
異種カーゴ分子が、短ＲＮＡ、リボザイム及びパッキング配列を含むオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１８】
異種カーゴ分子が、生体活性分子に特異的に結合する第１アプタマー配列及びカプシドのパッキング配列に結合するための第２アプタマー配列を少なくとも含む多官能性ポリヌクレオチドを含む二分子カーゴ分子を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
生体活性分子が、除草剤又は殺虫剤を含む、請求項１８に記載の生体活性分子。
【請求項２０】
細胞溶解物が、プロテアーゼ耐性カプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む第１ベクター、及び異種カーゴ分子をコードする核酸配列を含む第２ベクターを含む細胞から得られたものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２１】
細胞溶解物が、プロテアーゼ耐性カプシドタンパク質をコードする核酸配列、及び異種カーゴ分子をコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞から得られたものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２２】
細胞溶解物が、原核宿主細胞から得られたものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２３】
細胞溶解物が、真核宿主細胞から得られたものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２４】
加水分解から標的分子を保護する方法であって、（ａ）カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドを形成するカプシドタンパク質を選択すること、（ｂ）そのようなカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター、及び標的分子をコードする核酸配列を含むベクターにより、宿主細胞を安定的に形質移入すること、（ｃ）形質転換された細胞にとって十分な時間及び条件下で宿主細胞を維持して、標的分子を包むカプシドを発現及び組み立てること、（ｄ）請求項１に記載のプロセスによって、標的分子を包むＶＬＰを精製することを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
そのようなカプシドタンパク質は、例えば、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４
によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。例えば、カプシ
ドは、カプシドタンパク質を含んでもよく、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）
ｘ−（ｘ＝１）であり、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加
水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。カプシドは、カプシドタンパク質を含
んでもよく、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−（ｘ＝２）であり、ペプチ
ド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプ
シドに組み立てる。カプシドは、カプシドタンパク質を含んでもよく、一方又は両方のリ
ンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−（ｘ＝３）であり、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３
．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。カプシドは
、１〜３残基によって切り捨てられたＮ末端である１つ以上の外皮タンパク質配列を含ん
でもよく、本明細書中に記載されているようなリンカー配列は、除去された残基の数によ
って延長され、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に
対して耐性がある。カプシドは、１残基によって切り捨てられたＣ末端である１つ以上の
外皮タンパク質配列を含んでもよく、本明細書中に記載されているようなリンカー配列は
、１つの残基によって延長され、そのカプシドは、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３
．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、１残基及び１つの残
基によって延長されたリンカー配列によって切り捨てられたＣ末端である連結された二量
体の第１の外皮タンパク質配列を含んでもよく、又は連結された三量体の第１の及び／又
は第２の外皮タンパク質配列が１残基によって切り捨てられたＣ末端であり、カプシドは
、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性が
ある。カプシドは、Ｎ末端切り捨て及びＣ末端切り捨てを有するカプシドタンパク質を含
んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対
して耐性がある。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも１つの異種カーゴ分子及びパッキング配列を封入するカプシドを含む、ウイ
ルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目２）
カプシドに封入された少なくとも１つのリボザイムを更に含む、項目１に記載のＶＬ
Ｐ。
（項目３）
異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、項目２に記載のＶＬＰ。
（項目４）
異種カーゴ分子がオリゴリボヌクレオチドを含む、項目３に記載のＶＬＰ。
（項目５）
リボザイムが、パッキング配列およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核
酸構築物を形成する、項目４に記載のＶＬＰ。
（項目６）
複数の核酸構築物を含む、項目５に記載のＶＬＰ。
（項目７）
オリゴリボヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及
びｍｉＲＮＡから選択される短ＲＮＡである、項目４に記載のＶＬＰ。
（項目８）
少なくとも２つのリボザイムを含み、それぞれのリボザイムが短ＲＮＡの一端を切断す
るために選択される、項目７に記載のＶＬＰ。
（項目９）
少なくとも１〜１００個のヌクレオチドからなるリンカーを更に含み、リンカーが少な
くとも４０％のＡ又は少なくとも４０％のＵを含み、リンカーが、オリゴリボヌクレオチ
ドとパッキング配列又はオリゴリボヌクレオチドとリボザイムを結合させる、項目４に
記載のＶＬＰ。
（項目１０）
リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタＶリボザイムから選択される
、項目２に記載のＶＬＰ。
（項目１１）
リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも６個の隣接ヌクレオチドに相補的
なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、項目２に
記載のＶＬＰ。
（項目１２）
リボザイムが、野生型肝炎デルタＶリボザイムの速度の最大で約５０％の速度でオリゴ
リボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタＶリボザイムであ
る、項目２に記載のＶＬＰ。
（項目１３）
リボザイムが、配列番号１０〜１８から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デル
タＶ（ＨＤＶ）リボザイムである、項目２に記載のＶＬＰ。
（項目１４）
カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性がある野生型ウイルスカプシドを含む、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１５）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも４０％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載
のＶＬＰ。
（項目１６）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも４１％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載
のＶＬＰ。
（項目１７）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも４５％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載
のＶＬＰ。
（項目１８）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも５２％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載
のＶＬＰ。
（項目１９）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも５３％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載
のＶＬＰ。
（項目２０）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも５６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載
のＶＬＰ。
（項目２１）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも５９％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載
のＶＬＰ。
（項目２２）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも８６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載
のＶＬＰ。
（項目２３）
カプシドが、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシ
ドタンパク質を含む、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目２４）
カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージ
ＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも１５％の配列同一性を有する
カプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触
媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目２５）
カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージ
ＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも１６％の配列同一性を有する
カプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触
媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目２６）
カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージ
ＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも２１％の配列同一性を有する
カプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触
媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目２７）
異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目２８）
異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカーを更に含む
、項目２７に記載のＶＬＰ。
（項目２９）
オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである
、項目２８に記載のＶＬＰ。
（項目３０）
異種カーゴ分子が、約１，５００Ｄａ以下の分子量を有する生体活性小分子に特異的に
結合する第１アパタマー（apatamer）配列及びカプシドのパッキング配列に結合する第２
アパタマー配列を含む二官能性ポリヌクレオチドを含む二分子カーゴ分子を含む、項目
１に記載のＶＬＰ。
（項目３１）
第１アプタマー配列に結合している生体活性小分子を更に含む、項目３０に記載のＶ
ＬＰ。
（項目３２）
生体活性小分子が、及び除草剤又は殺虫剤を含む、項目３１に記載のＶＬＰ。
（項目３３）
生体活性小分子が、アトラジン、アセタミプリドホレート（acetamipridphorate）、
プロフェノホス（profenofos）、イソカルボホス（isocarbophos）及びオメトエートアス
（omethoateas）からなる群から選択される、項目３２に記載のＶＬＰ。
（項目３４）
短ＲＮＡ、リボザイム及びパッキング配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸
構築物。
（項目３５）
短ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、項目３４に記載の核酸構築物。
（項目３６）
少なくとも４０％がＡであるか、少なくとも４０％がＴであるか又は少なくとも４０％
がＵである、４〜１００個のヌクレオチドの結合ヌクレオチド配列を更に含み、結合ヌク
レオチド配列が、パッキングコード配列により及びｓｉＲＮＡコード配列によりフランク
されている、項目３４に記載の核酸構築物。
（項目３７）
リボザイムが、短ＲＮＡ及びパッキング配列によりフランクされている、項目３４に
記載の核酸構築物。
（項目３８）
短ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、項目３７に記載の核酸構築物。
（項目３９）
項目３４に記載の核酸構築物を含むベクター。
（項目４０）
項目３９に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目４１）
宿主細胞がベクターにより安定して形質移入されている、項目４０に記載の宿主細胞
。
（項目４２）
細菌細胞である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目４３）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）細胞である、項目４０に
記載の宿主細胞。
（項目４４）
植物細胞である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目４５）
哺乳類細胞である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目４６）
真菌細胞である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目４７）
酵母細胞である、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目４８）
宿主細胞が、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性があるウイルスカプシドをコードする第２核酸配列を含む第２ベクターにより
安定して更に形質移入されている、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目４９）
第２核酸配列が、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）の
アミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するウイルスカプシドをコードするウ
イルスタンパク質をコードし、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより
触媒される加水分解に耐性がある、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５０）
核酸配列が、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）をコー
ドする、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目５１）
リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである、項目３４に記載の核酸構築物。
（項目５２）
リボザイムが、短ＲＮＡの少なくとも６個の隣接ヌクレオチドに相補的な核酸の隣接セ
ットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、項目３４に記載の核酸構築物。
（項目５３）
リボザイムが肝炎デルタＶリボザイムである、項目３４に記載の核酸構築物。
（項目５４）
リボザイムが、野生型肝炎デルタＶリボザイムの速度の最大で５０％の速度で短ＲＮＡ
との連結を切断することができる突然変異肝炎デルタＶリボザイム又は配列番号１０〜１
８から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デルタＶ（ＨＤＶ）リボザイムである、
項目３４に記載の核酸構築物。
（項目５５）
項目３４に記載の核酸構築物を含有するように形質転換された、植物又は植物組織。
（項目５６）
種又は子孫が核酸構築物を含む、項目５５に記載の植物又は植物組織の種又は子孫。
（項目５７）
ａ）少なくとも１つの異種カーゴ分子を封入するウイルスカプシドをそれぞれ含む複数
のウイルス様粒子と、ｂ）組成物に存在するカプシド１００グラムあたり４グラム未満の
量で存在する１つ以上の細胞溶解産物とを含み、細胞溶解産物が、タンパク質、ポリペプ
チド、ペプチド及びこれらの任意の組み合わせから選択される、組成物。
（項目５８）
カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性がある、項目５７に記載の組成物。
（項目５９）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と
少なくとも４０％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目５７に記
載の組成物。
（項目６０）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）を含む
、項目５７に記載の組成物。
（項目６１）
異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、項目５７に記載の組成物。
（項目６２）
異種カーゴ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲ
ＮＡから選択されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目５７に記載の組成物。
（項目６３）
それぞれのウイルス様粒子が、少なくとも１つのリボザイムを更に含み、リボザイムが
、パッキング配列およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築物を形成
する、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
それぞれのウイルス様粒子が複数の核酸構築物を含む、項目６３に記載の組成物。
（項目６５）
リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタＶリボザイムから選択される
、項目６３に記載の組成物。
（項目６６）
リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも６個の隣接ヌクレオチドに相補的
なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、項目６３
に記載の組成物。
（項目６７）
リボザイムが、野生型肝炎デルタＶリボザイムの速度の最大で約５０％の速度でオリゴ
リボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタＶリボザイム又は
配列番号１０〜１８から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デルタＶ（ＨＤＶ）リ
ボザイムである、項目６３に記載の組成物。
（項目６８）
オリゴリボヌクレオチド及びパッキング配列が、長さが１〜１００個のヌクレオチドの
ヌクレオチド配列により結合されており、そのような結合配列が、４０％を超えるＡ又は
４０％超えるＵを含む、項目６３に記載の組成物。
（項目６９）
異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、項目５７に記載の組成物。
（項目７０）
異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカーを更に含む
、項目６９に記載の組成物。
（項目７１）
オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである
、項目７０に記載の組成物。
（項目７２）
細胞溶解産物が０．５グラム未満の量で存在する、項目５７に記載の組成物。
（項目７３）
細胞溶解産物が０．２グラム未満の量で存在する、項目５７に記載の組成物。
（項目７４）
細胞溶解産物が０．１グラム未満の量で存在する、項目５７に記載の組成物。
（項目７５）
標的カーゴ分子を単離及び精製する方法であって、（ａ）少なくとも１つの標的カーゴ
分子を封入するカプシドをそれぞれ含む複数のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む全細胞溶
解物を得ることであり、カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼ
により触媒される加水分解に耐性があること、（ｂ）ＶＬＰを、カテゴリーＥＣ３．４の
ペプチド結合ヒドロラーゼを使用する加水分解に、全細胞溶解物に存在するが、カプシド
により封入されていない個別のポリペプチド１００個あたり、少なくとも６０個、少なく
とも７０個、少なくとも８０個又は少なくとも９０個が切断されるが、そのような加水分
解の前の全細胞溶解物に存在するカプシド１００個あたり少なくとも６０個、少なくとも
７０個、少なくとも８０個又は少なくとも９０個が、加水分解の後に無傷のまま残るのに
十分な時間及び条件下で付すことを含む、方法。
（項目７６）
カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）のアミ
ノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するウイルスカプシドタンパク質をそれぞ
れ含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に
耐性がある、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
カプシドが、それぞれ野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３
）を含む、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
標的カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、項目７５に記載の方法。
（項目７９）
標的カーゴ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲ
ＮＡから選択されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目７５に記載の方法。
（項目８０）
それぞれのウイルス様粒子が、リボザイムを更に含み、リボザイムが、パッキング配列
およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築物を形成する、項目７５
に記載の方法。
（項目８１）
加水分解の後にカプシドの精製を更に含む、項目７５に記載の方法。
（項目８２）
精製が、液−液抽出工程、結晶化工程、分別沈殿工程及び限外濾過工程の少なくとも１
つを含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
標的カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、項目７５に記載の方法。
（項目８４）
項目７５に記載の方法により生成される組成物。
（項目８５）
宿主細胞における標的細胞の細胞内産生の後で、全細胞溶解物における加水分解から標
的分子を保護する方法であって、（ａ）カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラー
ゼにより触媒される加水分解に耐性があるウイルスカプシドを選択すること、（ｂ）ウイ
ルスカプシドを形成するウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む第１ベクターと
、パッキング配列及びｓｉＲＮＡ配列によりフランクされているリボザイムを含む核酸配
列を含む第２ベクターにより、宿主細胞を安定的に形質移入すること、並びに（ｃ）パッ
キング配列及びｓｉＲＮＡ配列によりフランクされているリボザイムを包むカプシドを発
現及び組み立てるために、形質転換された細胞にとって十分な時間及び条件下で細胞を維
持することを含む、方法。
（項目８６）
少なくとも１つの異種カーゴ分子を封入するＶＬＰを精製するプロセスであって、（ａ
）複数のＶＬＰを含む細胞溶解物を得ること、（ｂ）細胞溶解物を、ＶＬＰ以外の細胞溶
解産物を加水分解するのに十分な時間及び条件下でプロテアーゼと接触させて、加水分解
物を形成すること、並びに（ｃ）加水分解物からＶＬＰを単離することを含む、プロセス
。
（項目８７）
工程（ｃ）が、（ｉ）硫酸アンモニウムによる第１沈殿、続いて第１遠心分離を実施し
て、第１沈殿物及び第１上澄みを得ること、並びに（ｉｉ）硫酸アンモニウムによる第１
上澄みに対する第２沈殿、続いて第２遠心分離を実施して、第２沈殿物を得ることを含み
、第２沈殿物が少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目８８）
工程（ｃ）が、（ｉ）エタノールによる第１沈殿、続いて第１遠心分離を実施して、第
１沈殿物及び第１上澄みを得ること、並びに（ｉｉ）硫酸アンモニウムによる第１上澄み
に対する第２沈殿、続いて第２遠心分離を実施して、第２沈殿物を得ることを含み、第２
沈殿物が少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目８９）
工程（ｃ）が、加水分解物を超遠心分離して、少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む
沈殿物を得ることを含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目９０）
ＶＬＰが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分
解に耐性があるカプシドをそれぞれ含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目９１）
ＶＬＰが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少
なくとも４０％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含む及びカテゴリーＥＣ３．
４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドをそれぞ
れ含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目９２）
ＶＬＰが、それぞれ野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）
を含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目９３）
工程（ｂ）が、約３７℃で少なくとも約３０分間実施される、項目８６に記載のプロ
セス。
（項目９４）
工程（ｂ）の前に、細胞溶解物をヌクレアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼの少なくとも
１つと約３７℃で少なくとも約３０分間接触させることを更に含む、項目８６に記載の
プロセス。
（項目９５）
プロテアーゼが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼである、項目８
６に記載のプロセス。
（項目９６）
プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ス
トレプトマイセス・グリセウス）のプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｆｏ
ｒｍｉｓ（バチルス・リケンフォルミス）のプロテアーゼ、ペプシン及びパパインから選
択される、項目８６に記載のプロセス。
（項目９７）
異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目９８）
異種カーゴ分子がオリゴリボヌクレオチドを含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目９９）
オリゴリボヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及
びｍｉＲＮＡから選択される短ＲＮＡである、項目９８に記載のプロセス。
（項目１００）
ＶＬＰが、パッキング配列及びオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築
物を形成するリボザイムをそれぞれ更に含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目１０１）
リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタＶリボザイムから選択される
、項目１００に記載のプロセス。
（項目１０２）
リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも６個の隣接ヌクレオチドに相補的
なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、項目１０
０に記載のプロセス。
（項目１０３）
リボザイムが、野生型肝炎デルタＶリボザイムの速度の最大で約５０％の速度でオリゴ
リボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタＶリボザイムであ
る、項目１００に記載のプロセス。
（項目１０４）
リボザイムが、配列番号１０〜１８から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デル
タＶ（ＨＤＶ）リボザイムである、項目１００に記載のプロセス。
（項目１０５）
オリゴリボヌクレオチド及びパッキング配列が、少なくとも１〜１００個のヌクレオチ
ドの、４０％を超えるＡ又は４０％超えるＵを含むリンカー配列により結合されている、
項目１００に記載のプロセス。
（項目１０６）
異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、項目８６に記載のプロセス。
（項目１０７）
ＶＬＰが、異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカー
をそれぞれ更に含む、項目１０６に記載のプロセス。
（項目１０８）
オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである
、項目１０７に記載のプロセス。
（項目１０９）
工程（ａ）の前に、細胞におけるＶＬＰの発現に続いて細胞を遠心分離すること、細胞
を再懸濁すること、細胞を溶解し、細胞溶解物を遠心分離して、上澄みを得ることによる
細胞溶解物の調製を更に含み、上澄みが工程（ａ）に細胞溶解物として使用される、請求
項８６に記載のプロセス。
（項目１１０）
カプシドが、１位のＡ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２
カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリー
ＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目
１に記載のＶＬＰ。
（項目１１１）
カプシドが、１位のＡ残基が欠失している及び２位のＳ残基が欠失していることを除い
て野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシ
ドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒され
る加水分解に耐性がある、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１１２）
カプシドが、１位のＡ残基が欠失している、２位のＳ残基が欠失している及び３位のＮ
残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）
のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結
合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１１３）
カプシドが、１２９位のＹ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭ
Ｓ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴ
リーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請
求項１に記載のＶＬＰ。
（項目１１４）
カプシドが、１１２〜１１７セグメントに単一のアミノ酸欠失を有する野生型腸内細菌
ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含
み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性
がある、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１１５）
カプシドが、１１２〜１１７セグメントに単一のアミノ酸欠失を有する野生型腸内細菌
ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含
み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性
がある、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１１６）
カプシドが、６５〜８３セグメントに１〜２つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファ
ージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、
カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があ
る、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１１７）
カプシドが、４４〜５５セグメントに１〜２つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファ
ージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、
カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があ
る、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１１８）
カプシドが、３３〜４３セグメントに単一の残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージ
ＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテ
ゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、
項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１１９）
カプシドが、２４〜３０セグメントに１〜２つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファ
ージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、
カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があ
る、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１２０）
カプシドが、１０〜１８セグメントに単一の残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージ
ＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテ
ゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、
項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１２１）
カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる第２カプシドモノマー配列と連鎖してい
るカプシドタンパク質モノマー配列を含む、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１２２）
カプシドが、Ｃ末端が第２カプシドモノマー配列と連鎖している０〜６個の残基リンカ
ーセグメントによりＣ末端が延長されているカプシドタンパク質モノマー配列を含み、全
てが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐
性があるカプシドの中に組み立てられる、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１２３）
リンカー配列が、−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ここでｘ＝０〜６であるか又は−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−から選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、項目１２２に記載のＶＬＰ。
（項目１２４）
カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる第３カプシドモノマー配列と連鎖してい
るカプシドタンパク質を含む、項目１２２に記載のＶＬＰ。
（項目１２５）
カプシドが、Ｃ末端が第３カプシドモノマー配列と連鎖している０〜６個の残基リンカ
ーセグメントによりＣ末端が延長されているカプシドタンパクを含み、全てが、カテゴリ
ーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシ
ドの中に組み立てられる、項目１２２に記載のＶＬＰ。
（項目１２６）
カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ここでｘ＝０〜
６であるか又は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−から選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであり、カテ
ゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカ
プシドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、項目１２５に記載のＶＬＰ。
（項目１２７）
カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−、ｘ＝１であり、カテゴ
リーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプ
シドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、項目１２５に記載のＶＬＰ。
（項目１２８）
カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−、ｘ＝２であり、カテゴ
リーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプ
シドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、項目１２５に記載のＶＬＰ。
（項目１２９）
カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−、ｘ＝３であり、カテゴ
リーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプ
シドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、項目１３４に記載のＶＬＰ。
（項目１３０）
１つ以上のコートタンパク質配列が、１〜３つの残基によりＮ末端切断されており、リ
ンカー配列が、欠失された残基の数により延長され、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結
合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ
−であり、ここでｘ＝０〜６である、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１３１）
１つ以上のコートタンパク質配列が、１つの残基によりＣ末端切断されており、リンカ
ー配列が、１つの残基により延長され、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラー
ゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、こ
こでｘ＝０〜６である、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目１３２）
連鎖二量体における第１コートタンパク質配列が、１つの残基によりＣ末端切断されて
おり、リンカー配列が、１つの残基により延長されている、或いは連鎖三量体における第
１及び／又は第２コートタンパク質配列が、１つの残基によりＣ末端切断され、カテゴリ
ーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リン
カー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ここでｘ＝０〜６である、項目１に記載のＶＬＰ
。
（項目１３３）
Ｎ及びＣ末端切断を含有し、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより
触媒される加水分解に耐性がある、項目１に記載のＶＬＰ。