【手続補正書】
【提出日】平成27年2月20日(2015.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
双方のビタミンが添加されたＺＷ８０１−４培養物は、ＭＭ−Ｇ５培地中で、対応するＺＷ８０１−４／ＰａｎＥＤ＃１培養物よりもわずかにより良く増殖したことに留意されたい（図７Ａ対７Ｂ）。この結果の最もふさわしい説明は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）およびその他の細菌系統で頻繁に観察される「プラスミド負荷」である（Ｋｉｍら（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６６：１８６−１９３、およびその中の参考文献）。そうでなければ増殖に利用できるエネルギーが、プラスミドの複製と維持に流用されるこの現象は、恐らく富栄養培地と比較して最少培地中ではるかにより明白であろう。
この実験における重要な発見は、増殖培地が飽和濃度のＰＡＢＡを含有する場合、ＺＷ８０１−４／ＰａｎＥＤ＃１が、パントテン酸添加の存在下と不在下において、同一動態で同一細胞密度に増殖したことである。総合すると、上の結果は、野性型および組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株中における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＥおよびｐａｎＤコード領域の同時発現が、パントテン酸が限定的であった条件下での増殖を可能にすることを明確に示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子とを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の組換え細菌株。
２．前記２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドが、ＥＣ１．１．１．１６９クラスに属する酵素である、上記１に記載の組換え細菌株。
３．前記２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号４の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素と比較して、位置７のＧ、位置９のＧ、位置１２のＧ、位置７２のＫ、位置９８のＮ、位置９９のＧ、位置１７６のＫ
、位置１８０のＮ、位置１８４のＮ、位置２１０のＥ、位置２４４のＳ、位置２４８のＤまたはＳ、および位置２５６のＥからなる群から選択される、少なくとも１０個の保存アミノ酸位置を有する、上記２に記載の組換え細菌株。
４．前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ１．４．１．１１クラスに属する酵素である、上記１に記載の組換え細菌株。
５．前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置１１のＨ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置２５のＳ、位置５２のＧ、位置５４のＲ、位置５７のＴ、位置５８のＹ、位置７２のＮ、位置７３のＧ、および位置８６のＩ、からなる群から選択される、少なくとも８個の保存アミノ酸位置を有する、上記４に記載の組換え細菌株。
６．前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置５７のＴ、および位置５８のＹの５個の保存アミノ酸位置を有する、上記４に記載の組換え細菌株。
７．パントテン酸を欠く培地中で増殖する、上記１に記載の組換え細菌株。
８．エタノールを産生する、上記１に記載の組換え細菌株。
９．エタノール生産量を高める遺伝子修飾を含んでなる、上記８に記載の組換え細菌株。１０．ａ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌株を提供するステップと；
ｂ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップと；
ｃ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップと
を含んでなり、ステップｂ）およびｃ）が、いずれの順序でも、または同時であってもよく、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性の双方が、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）によって作成される株中で発現される、パントテン酸を合成するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作成する方法。
１１．ａ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子とを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の組換え細菌株を提供するステップと；
ｂ）それによって株がエタノールを産生する条件下で、（ａ）の株を発酵培地に接触させるステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
１２．前記２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドが、ＥＣ１１．１．１．１６９クラスに属する酵素である、上記１１に記載の方法。
１３．前記２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号４の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）４−デヒドロパントイン酸還元酵素と比較して、位置７のＧ、位置９のＧ、位置１２のＧ、位置７２のＫ、位置９８のＮ、位置９９のＧ、位置１７６のＫ、位置１８０のＮ、位置１８４のＮ、位置２１０のＥ、位置２４４のＳ、位置２４８のＤまたはＳ、および位置２５６のＥからなる群から選択される、少なくとも１０個の保存アミノ酸位置を有する、上記１２に記載の方法。
１４．前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ１１．４．１．１１クラスに属する酵素である、上記１１に記載の方法。
１５．前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置１１のＨ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置２５のＳ、位置５２のＧ、位置５４のＲ、位置５７のＴ、位置５８のＹ、位置７２のＮ、位置７３のＧ、および位置８６のＩ、からなる群から選択される、少なくとも８個の保存アミノ酸位置を有する、上
記１４に記載の方法。
１６．前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置５７のＴ、および位置５８のＹの５個の位置に保存アミノ酸を有する、上記１４に記載の方法。
１７．ステップ（ｂ）に先だって、（ａ）の細菌株をパントテン酸を欠くまたは最適量以下を有する培地に接触させ、種培養を生成して、（ｂ）の発酵培地に接種する、上記１１に記載の方法。
１８．前記発酵培地が、パントテン酸を欠き、または最適量以下を有する、上記１１または１７に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子とを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の組換え細菌株。
【請求項２】
ａ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌株を提供するステップと；
ｂ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップと；
ｃ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップと
を含んでなり、ステップｂ）およびｃ）が、いずれの順序でも、または同時であってもよく、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性の双方が、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）によって作成される株中で発現される、パントテン酸を合成するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作成する方法。
【請求項３】
ａ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子とを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の組換え細菌株を提供するステップと；
ｂ）それによって株がエタノールを産生する条件下で、（ａ）の株を発酵培地に接触させるステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。