【手続補正書】
【提出日】平成27年7月22日(2015.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼの標的部位を同定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）二本鎖の核酸標的部位を切断し、５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼを準備するステップであって、前記標的部位が、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含み、前記ヌクレアーゼが、スペーサー配列内の標的部位を切断するステップと、
（ｂ）前記ヌクレアーゼが前記ヌクレアーゼの標的部位を含む候補核酸分子を切断するのに適切な条件下で、候補核酸分子のライブラリーに前記ヌクレアーゼを接触させるステップであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列を含む配列のコンカテマーを含むステップと、
（ｃ）前記ヌクレアーゼにより２回切断され、一方の側に左ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接し、他方の側に右ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接した一定の挿入配列を含む核酸分子の５’オーバーハングを充填し、それによって平滑末端を作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の核酸分子の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および／またはスペーサー配列の配列を決定することにより、前記ヌクレアーゼにより切断された前記ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップとを含み、
任意に、ステップ（ｄ）の配列決定が、ステップ（ｃ）の核酸分子の平滑末端にシークエンシングアダプターを連結し、前記核酸分子の増幅および／またはシークエンシングを行うステップを含んでいてもよく、
任意に、前記方法が、前記シークエンシングアダプターの連結後、ＰＣＲにより前記核酸分子を増幅するステップを含んでいてもよい、前記方法。
【請求項２】
単一の一定挿入配列を含む分子について、ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）の核酸分子を濃縮するステップをさらに含み、
任意に、前記濃縮ステップがサイズ分画を含んでいてもよく、
任意に、前記サイズ分画がゲル精製によりなされていてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、５’オーバーハングが充填された相補対を前記核酸分子が含まなかった場合、ステップ（ｄ）で決定されたいかなる配列も廃棄するステップをさらに含む、および／または、
ステップ（ｄ）で同定された複数のヌクレアーゼ標的部位を編集し、それによってヌクレアーゼ標的部位のプロファイルを作成するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼが、疾患に関連した遺伝子中の特定のヌクレアーゼ標的部位を切断する治療用ヌクレアーゼであり、
任意に、前記方法が、前記治療用ヌクレアーゼが、前記特定のヌクレアーゼ標的部位を切断し、かつ１０を超える、５を超える、４を超える、３を超える、２を超える、１を超える、さらなるヌクレアーゼ標的部位を切断しないか、またはまったく切断しない前記治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定するステップをさらに含んでいてもよい、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼが非特異的核酸切断ドメインを含み、
任意に、前記ヌクレアーゼがＦｏｋＩ切断ドメインを含んでいてもよく、
任意に、前記ヌクレアーゼが、切断ドメインが二量体形成すると標的配列を切断する核酸切断ドメインを含んでいてもよく、
任意に、前記ヌクレアーゼが、核酸配列に特異的に結合する結合ドメインを含んでいてもよく、
任意に、前記結合ドメインがジンクフィンガーを含んでいてもよく、
任意に、前記結合ドメインが、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのジンクフィンガーを含んでいてもよく、
任意に、前記ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼであるか、または、前記結合ドメインが転写活性化因子様エレメントを含んでいてもよく、
任意に、前記ヌクレアーゼが、転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であるか、または、前記ヌクレアーゼが有機化合物を含んでいてもよく、
任意に、前記ヌクレアーゼがエンジインを含んでいてもよく、
任意に、前記ヌクレアーゼが抗生物質であってもよく、
任意に、前記化合物が、ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体であるか、または、前記ヌクレアーゼがホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
複数の核酸分子を含む、核酸分子のライブラリーであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列スペーサー配列のコンカテマーを含み、
任意に、前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含んでいてもよく、
任意に、前記左ハーフサイトおよび／または前記右ハーフサイトが、１０〜１８ヌクレオチド長の間であってもよく、
任意に、前記ライブラリーが、ＦｏｋＩ切断ドメインを含むヌクレアーゼにより切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含んでいてもよく、
任意に、前記ライブラリーが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、および／またはブレオマイシンにより切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含んでいてもよく、
任意に、前記ライブラリーが、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、または少なくとも１０１２の異なる候補ヌクレアーゼ標的部位を含んでいてもよく、
任意に、前記ライブラリーが、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも６ｋＤａ、少なくとも７ｋＤａ、少なくとも８ｋＤａ、少なくとも９ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１２ｋＤａ、または少なくとも１５ｋＤａの分子量の核酸分子を含んでいてもよく、
任意に、前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、無作為化されたスペーサー配列を含んでいてもよい、前記ライブラリー。
【請求項７】
コンセンサス標的部位を特異的に切断するヌクレアーゼを複数のヌクレアーゼから選択する方法であって、前記方法が、
（ａ）同じコンセンサス配列を切断する複数の候補ヌクレアーゼを準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の候補ヌクレアーゼのそれぞれについて、前記コンセンサス標的部位とは異なる、前記候補ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定された１つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位に基づいて、ヌクレアーゼを選択するステップと
を含み、
任意に、ステップ（ｃ）で選択されるヌクレアーゼが、最高の特異性で前記コンセンサス標的部位を切断するヌクレアーゼであってもよく、
任意に、最高の特異性で前記コンセンサス標的部位を切断する前記ヌクレアーゼが、前記コンセンサス部位とは異なる標的部位の切断数が最小である前記候補ヌクレアーゼであってもよく、
任意に、最高の特異性で前記コンセンサス標的部位を切断する前記候補ヌクレアーゼが、標的ゲノムの文脈において前記コンセンサス部位とは異なる標的部位の切断数が最小である前記候補ヌクレアーゼであってもよく、
任意に、ステップ（ｃ）で選択される候補ヌクレアーゼが、前記コンセンサス標的部位以外のいかなる標的部位も切断しないヌクレアーゼであってもよく、
任意に、ステップ（ｃ）で選択される候補ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼの治療有効濃度で、被験体のゲノム内の前記コンセンサス標的部位以外のいかなる標的部位も切断しないヌクレアーゼであってもよい、前記方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）で選択されたヌクレアーゼとゲノムを接触させるステップをさらに含み、
任意に、前記ゲノムが、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、爬虫類、両生類、魚類、線虫、昆虫、またはハエのゲノムであってもよく、
任意に、前記ゲノムが生細胞内にあってもよい、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コンセンサス標的部位が、疾患または障害に関連する対立遺伝子内にあり、任意に、前記疾患がＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患であってもよく、任意に、前記対立遺伝子が、ＣＣＲ５またはＶＥＧＦＡの対立遺伝子であってもよい、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択するための方法であって、前記方法が、
（ａ）候補ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、
（ｂ）汎用コンピューターを使用して、前記候補ヌクレアーゼ標的部位を前記ゲノム内の他の配列と比較するステップであって、前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、ゲノム内の他のいかなる配列とも、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド異なる場合、そのヌクレアーゼ部位を選択するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）で選択された候補ヌクレアーゼ部位を標的とするヌクレアーゼを設計および／または作製するステップをさらに含み、
任意に、設計および／または作製が、組換え技術により行われてもよく、
任意に、設計および／または作製が、前記選択された候補標的部位またはそのハーフサイトに特異的に結合する結合ドメインを設計するステップを含んでいてもよく、
任意に、設計および／または作製が、前記結合ドメインと核酸切断ドメインとをコンジュゲートするステップを含んでもよく、
任意に、前記核酸切断ドメインが非特異的切断ドメインであり、かつ／または前記核酸切断ドメインが核酸を切断するために二量体または多量体を形成しなければならなくてもよく、
任意に、前記核酸切断ドメインがＦｏｋＩ切断ドメインを含んでもよい、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼを単離するステップをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくはホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、任意に、抗生物質ヌクレアーゼ、任意に、エンジイン、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記候補標的部位が、その切断が疾患または障害の症候の緩和に関連することが知られているゲノム配列内にあり、
任意に、前記疾患がＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患であってもよく、
任意に、前記ゲノム配列がＣＣＲ５またはＶＥＧＦＡ配列であってもよい、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０または１１に記載の方法に従って選択された標的部位を切断し、および／または、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って、設計または操作され、および／または、単離された、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法に従って選択された、単離ヌクレアーゼ。
【請求項１６】
請求項１５に記載の単離ヌクレアーゼを含むキット。
【請求項１７】
被験体に投与するための医薬組成物であって、前記組成物が、請求項１５に記載の単離ヌクレアーゼまたは請求項１５に記載の単離ヌクレアーゼをコードする核酸と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。