(57)【要約】    【課題】フィルター等の複雑な構造を有するノズルが不要な固液分離方法、固液分離装置およびそれに用いるキットを提供する。    【解決手段】先端に開口が形成された吸引ノズルの内部へ前記開口から粒子を含む懸濁液を吸引し、吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を先端開口に至るまでの開口手前側に沈降させて前記吸引ノズル内で詰まらせ、先端開口を介して内部の液体を排出する固液分離方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端に開口が形成された吸引ノズルの内部へ前記開口から粒子を含む懸濁液を吸引し、
吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を沈降させて前記吸引ノズル内で詰まらせ、
前記粒子を詰まらせた吸引ノズルの開口を介して内部の液体を排出する固液分離方法。
【請求項２】
前記液体の排出は、吸引された粒子が略均一に分散した懸濁液の先端開口近傍と先端開口から最遠部とに沈降による粒子濃度の差が生じた後に行われ、排出に伴って粒子を詰まらせた吸引ノズルを通過し得る液体を排出する工程である請求項１に記載の固液分離方法。
【請求項３】
前記懸濁液は、標的物質を含む試料液と、標的物質を吸着させる粒子とが混合されたものであり、
前記液体の排出は、標的物質が吸着した粒子を開口手前側に残すようにする工程である請求項２に記載の固液分離方法。
【請求項４】
前記標的物質が、所望のペプチドまたは核酸であり、
前記液体が、前記所望のペプチドまたは核酸以外のペプチドおよび/または核酸、塩を含む請求項３に記載の固液分離方法。
【請求項５】
前記試料液が、全血、血清または血漿である請求項３に記載の固液分離方法。
【請求項６】
前記試料液が、全血、血清または血漿を電子レンジで加熱することにより得られる上清である請求項３に記載の固液分離方法。
【請求項７】
前記試料液が、全血、血清または血漿を電子レンジで加熱することにより得られる上清の脱塩処理液である請求項３に記載の固液分離方法。
【請求項８】
前記粒子が、前記標的物質を吸着させる多孔性材料の粒子である請求項３〜７の何れか一つに記載の固液分離方法。
【請求項９】
前記粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニアまたはポリスチレンを材料とする請求項３〜８の何れか一つに記載の固液分離方法。
【請求項１０】
前記粒子が、粒子径および粒子径分布について１２０μｍ以上のＤ90−Ｄ10を有し、かつＤ50が、１７０μｍ以上である請求項１〜９の何れか一つに記載の固液分離方法。
【請求項１１】
前記吸引ノズルの最小の開口径が、前記粒子の最大径より大きく、かつ、前記粒子の最大径の６倍よりも小さい請求項１〜１０の何れか一つに記載の固液分離方法。
【請求項１２】
前記液体を排出した後に、標的物質が吸着された粒子から標的物質を溶出させる溶出液を吸引ノズル内に吸引し、
吸引された溶出液により混ぜられる粒子の少なくとも一部を開口手前側に沈降させ、
溶出液と溶出した標的物質とを先端開口を介して排出させる請求項３に記載の固液分離方法。
【請求項１３】
前記懸濁液の吸引は、吸引ノズルの先端を懸濁液に浸し、吸引ノズル内の気圧を外部の気圧に対して負圧にする工程であり、
前記粒子の沈降は、吸引ノズル内の気圧を一定に保つ工程であり、
前記液体の排出は、吸引ノズル内の気圧を外部の気圧に対して正圧にする工程である請求項１〜１２の何れか一つに記載の固液分離方法。
【請求項１４】
吸引ノズル内の気圧の制御は、吸引ノズルの後端にプランジャを含むシリンジが接続された状態でプランジャの位置を制御する工程であり、
前記懸濁液の吸引は、プランジャを移動させて吸引ノズルを含むシリンジ内部の容積を増大させる工程であり、
前記粒子の沈降は、プランジャを静止させて同じ位置を保つ工程であり、
前記液体の排出は、プランジャを移動させて吸引ノズルを含むシリンジ内部の容積を減少させた後、プランジャを静止させて同じ位置を保つ工程である請求項１３に記載の固液分離方法。
【請求項１５】
ＢＦ分離のために用いられる請求項１〜１４の何れか一つに記載の固液分離方法。
【請求項１６】
前記懸濁液中の前記粒子の濃度が、１０〜１００ｍｇ／ｍＬである請求項１〜１５の何れか一つに記載の固液分離方法。
【請求項１７】
前記吸引部の先端の内径が先細りになっている、請求項１〜１６の何れか一つに記載の固液分離方法。
【請求項１８】
先端に開口が形成された吸引部の内部へ前記開口から標的物質を含む試料液と標的物質を吸着させる粒子を含む懸濁液を吸引し、
吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を沈降させて前記吸引ノズル内で詰まらせ、
前記粒子を詰まらせた吸引部の開口を介して内部の液体を排出し、
標的物質が吸着した粒子から標的物質を溶出させる溶出液を吸引部内に吸引し、
吸引された溶出液により混ぜられる粒子の少なくとも一部を沈降させて詰まらせ、
前記粒子を詰まらせた吸引部の開口を介して標的物質が溶出した溶出液を排出し、
前記溶出液に含まれる標的物質を測定する、標的物質の測定方法。
【請求項１９】
先端に開口が形成された吸引ノズルが装着される吸引部と、
前記吸引部の動作を制御する制御部と、
粒子を含む液体が収容された容器を支持する容器支持体と備え、
前記制御部は、前記懸濁液の少なくとも一部を前記開口から吸引ノズルの内部へ吸引し、吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を沈降させて前記吸引ノズル内で詰まらせ、前記粒子を内部に詰まらせた吸引ノズルの開口を介して内部の液体を排出するように前記吸引部を制御する固液分離装置。
【請求項２０】
前記制御部は、前記懸濁液の吸引後、吸引ノズル内で粒子が略均一に分散した懸濁液の先端開口近傍と先端開口から最遠部とに沈降による粒子濃度の差が生じるまでの期間に基づいて予め定められた静止期間において、前記懸濁液の吸引を停止して前記粒子の少なくとも一部を沈降させ、前記静止期間の経過後、前記粒子を内部に詰まらせた吸引ノズルの開口を介して内部の液体を排出するように前記吸引部を制御する請求項１９に記載の固液分離装置。
【請求項２１】
前記容器は、標的物質を含む試料液とその標的物質を吸着させる粒子とを収容するものであり、
前記制御部は、内部の液体を排出することにより標的物質が吸着された粒子を吸引ノズルの内部に残す請求項１９または２０に記載の固液分離装置。
【請求項２２】
前記吸引部は、プランジャを含むシリンジと、そのプランジャを移動させるアクチュエータとを含み、
前記制御部は、アクチュエータを制御して吸引ノズルを含むシリンジ内部の容積を増大させるようにプランジャを移動させて前記懸濁液の吸引を行った後、前記静止期間においては同じ位置を保つようにプランジャを静止させ、前記静止期間の経過後、吸引ノズルを含むシリンジ内部の容積を減少させるようにプランジャを移動させた後にプランジャを静止させる請求項１９〜２１の何れか一つに記載の固液分離装置。
【請求項２３】
前記制御部は、前記懸濁液を吸引するプランジャの移動速さよりもゆっくりと前記プランジャを移動させて、内部の液体を排出する請求項２１に記載の固液分離装置。
【請求項２４】
前記吸引ノズルは、吸引部に着脱可能である請求項１９〜２２の何れか一つに記載の固液分離装置。
【請求項２５】
吸引ノズルを、前記吸引部に装着される位置へ搬送するノズル搬送機構と、
前記吸引部に装着された吸引ノズルの先端を前記容器支持体に支持された容器内の懸濁液に向けて下降させる昇降機構とをさらに備える請求項１９に記載の固液分離装置。
【請求項２６】
請求項１〜１７の何れか一つに記載の方法に用いられ先端開口近傍にフィルターを有しない吸引ノズルとしてのピペットチップ。
【請求項２７】
請求項１〜１７の何れか一つに記載の方法に用いられる粒子。
【請求項２８】
請求項１〜１７の何れか一つに記載の方法に用いられ先端開口近傍にフィルターを有しない吸引ノズルとしてのピペットチップと、
前記方法に用いられる粒子と
を含む固液分離用キットであって、
前記ピペットチップの最小の開口径が前記粒子の最大径より大きくかつ前記粒子の最大径の６倍よりも小さい固液分離用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、固液分離方法、固液分離装置およびそれに用いるピペットチップ、粒子およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料液中の特定の成分を抽出する際、フィルターでろ過をするもしくは、特定の成分が吸着する固体を添加し、固体と液体を分離する方法（ＢＦ分離）が知られている。ＢＦ分離は一般に液体と個体を分離する固液分離の一つである。ＢＦ分離の方法として、遠心沈降法や磁力による分離などが行われている。
しかし、それらの方法を分析装置内で行う場合、複雑な機構と制御が必要であった。
そこで、分注ノズル（ピペットチップ）に吸着剤としての個体やフィルターを取り付け、吸引・排出動作時に特定の成分を抽出するものが提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−４７６８０号公報
【特許文献２】特開２００３−２５４８７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１、２のような分注ノズルは、ノズル内部に細かな加工を行う必要があるため、製造工程が複雑である。ひいては、製造コストがかかるという側面がある。
この発明は、以上のような事情を考慮してなされたものであって、フィルター等の複雑な構造を有するノズルが不要な固液分離方法、固液分離装置およびそれに用いるキットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この発明は、先端に開口が形成された吸引ノズルの内部へ前記開口から粒子を含む懸濁液を吸引し、吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を沈降させて前記吸引ノズル内で詰まらせ、前記粒子を詰まらせた吸引ノズルの開口を介して内部の液体を排出する固液分離方法を提供する。
【０００６】
さらに異なる観点から、この発明は、先端に開口が形成された吸引ノズルが装着される吸引部と、前記吸引部の動作を制御する制御部と、粒子を含む液体が収容された容器を支持する容器支持体とを備え、前記制御部は、前記懸濁液の少なくとも一部を前記開口から吸引ノズルの内部へ吸引し、吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を沈降させて前記吸引ノズル内で詰まらせ、前記粒子を内部に詰まらせた吸引ノズルの開口を介して内部の液体を排出するように制御する固液分離装置を提供する。
また、この発明は、上述の固液分離方法に用いられ先端開口近傍にフィルターを有しない吸引ノズルとしてのピペットチップを提供する。
さらに、この発明は、上述の固液分離方法に用いられる粒子を提供する。
さらにまた、この発明は、上述の固液分離方法に用いられ先端開口近傍にフィルターを有しない吸引ノズルとしてのピペットチップと、前記固液分離方法に用いられる粒子とを含む固液分離用キットであって、前記ピペットチップの最小の開口径が前記粒子の最大径より大きくかつ前記粒子の最大径の６倍よりも小さい固液分離用キットを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
この発明による固液分離方法は、吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を沈降させて詰まらせ、前記粒子を詰まらせた吸引ノズルの開口を介して内部の液体を排出するので、液体の排出に伴って、粒子が吸引ノズルの内部に残って、排出された液体と分離される。
この発明による固液分離装置についても同様の作用効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態の固液分離装置の一例を示す図である。
【図２】本実施形態の固液分離装置の(a)プランジャの動き、(b)シリンジ内圧を示すＰｔ曲線、(c)固液分離の様子を表した図である。
【図３】本実施形態のキットの外観の一例を示す図である。
【図４Ａ】本実施形態の固液分離の成功事例におけるＰｔ曲線の一例である。
【図４Ｂ】本実施形態の固液分離の失敗事例におけるＰｔ曲線の一例である。
【図４Ｃ】本実施形態の固液分離の失敗事例におけるＰｔ曲線の一例である。
【図５Ａ】実施例において用いた担体の作製に用いた篩の目開きサイズを示す図である。
【図５Ｂ】実施例において用いた担体１番〜１０番の粒度分布を示す表である。
【図５Ｃ】実施例において用いた担体および管の特徴を示す図である。
【図５Ｄ】実施例において固液分離が成功した担体と管との組合せを示す表である。
【図６Ａ】本実施形態の固液分離を１００回連続で繰り返した場合の１１〜１５回目のＰｔ曲線を示す図である。
【図６Ｂ】本実施形態の固液分離を１００回連続で繰り返した場合の１３回目のＰｔ曲線を示す図である。
【図６Ｃ】本実施形態の固液分離を１００回連続で繰り返した場合の１４回目のＰｔ曲線を示す図である。
【図７】本実施形態の固液分離において排液速さを変更した場合の、各排液速さにおけるＰｔ曲線を示す図である。
【図８Ａ】実施例において担体濃度６０％とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図８Ｂ】実施例において担体濃度５％とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図８Ｃ】実施例において担体濃度０．１％とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図９Ａ】実施例において担体の比重を７．９とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図９Ｂ】実施例において担体の比重を６．０とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図９Ｃ】実施例において担体の比重を４．０とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図９Ｄ】実施例において担体の比重を１．１とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１０Ａ】実施例において溶媒の比重を１．９とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１０Ｂ】実施例において溶媒の比重を１．２とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１０Ｃ】実施例において溶媒の比重を０．７とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１１Ａ】実施例において溶媒の粘度を４００ｃＰとした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１１Ｂ】実施例において溶媒の粘度を６０ｃＰとした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１１Ｃ】実施例において溶媒の粘度を１ｃＰとした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１１Ｄ】実施例において溶媒の粘度を０．３ｃＰとした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１２Ａ】実施例において懸濁液の温度を０．５℃とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１２Ｂ】実施例において懸濁液の温度を２５℃とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１２Ｃ】実施例において懸濁液の温度を９８℃とした場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１３Ａ】実施例において界面活性剤を２０％含む懸濁液を用いた場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１３Ｂ】実施例において界面活性剤を８％含む懸濁液を用いた場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１３Ｃ】実施例において界面活性剤を含まない懸濁液を用いた場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１４Ａ】実施例において不合格の担体と合格の支持体とを組み合わせて用いた場合の閉塞(詰まり)の概念図である。
【図１４Ｂ】実施例において不合格の担体を用いた場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１４Ｃ】実施例において合格の支持体を担体として単独で用いた場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１４Ｄ】実施例において不合格の担体と合格の支持体とを組み合わせて用いた場合のＰｔ曲線を示す図である。
【図１５】実施例においてシリアルダイリューション式のＢＦ分離操作を説明する図である。
【図１６】実施例１３の蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図１７】実施例１４の蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図１８】実施例１５のゲル蛍光イメージングの写真である。
【図１９】実施例１５の銀染色の写真である。
【図２０】実施例１６のゲル蛍光イメージングの写真である。
【図２１】実施例１６の銀染色の写真である。
【図２２】実施例１７のTMR-ACTH部分ペプチドの蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図２３】実施例１７の全血由来ペプチドの蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図２４】リテンションバック式のＢＦ分離操作を説明する図である。
【図２５】実施例１８の無修飾シリカ担体を用いての脱塩処理前後のTMR-ACTH部分ペプチドの蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図２６】実施例１８の無修飾シリカ担体を用いての脱塩処理前後の全血由来ペプチドの蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図２７】実施例１８のODS修飾シリカ担体を用いての脱塩処理前後のTMR-ACTH部分ペプチドの蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図２８】実施例１８のODS修飾シリカ担体を用いての脱塩処理前後の全血由来ペプチドの蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図２９】実施例１８のアミノシリル基修飾シリカ担体を用いての脱塩処理前後のTMR-ACTH部分ペプチドの蛍光強度測定の結果を示す図である。
【図３０】実施例１８のアミノシリル基修飾シリカ担体を用いての脱塩処理前後の全血由来ペプチドの蛍光強度測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
≪固液分離方法≫
本実施形態の固液分離方法は、先端に開口が形成された吸引ノズルの内部へ前記開口から粒子を含む懸濁液を吸引する工程を含む。
吸引ノズルは、先端に開口が形成され、先端へ向かうにつれて内径が先細りになっていることが好ましい。吸引ノズルは、略管状であり得る。前記吸引ノズルの先端に形成された開口を先端開口とも呼ぶ。前記先端開口の径を開口径と呼ぶ。開口径は、内径が先細りになっている前記吸引ノズルの先端の内径に対応する。先端へ向かうにつれて内径が先細りになっていることにより、粒子を詰まらせる(閉塞させる)ことが可能になる。その結果、詰まった粒子が吸引ノズルの先端の開口から排出されなくなる一方で、懸濁液の溶媒である液体は開口から排出されることにより、固液分離が達成される。ここで、「詰まる」とは、先端開口の手前側の箇所に粒子が集中し管壁や他の粒子に制約されて自由に移動できない状態になり、他の粒子がその箇所を通過できないこという。ただし、詰まった粒子よりも十分小さな分子は、粒子と粒子の隙間あるいは粒子と管壁の隙間を通過できるため、排出された液体に粒子が混入することは妨げない。また、本明細書でいう粒子が「詰まる」とは、液体が通過できる程度の状態を意味する。本発明者らは、吸引ノズル、特にピペットチップの先端へのフィルターの取付けを要することなく、粒子の詰まりを利用して、高い再現性をもって、粒子と液体とを分離することに成功した。
【００１０】
吸引ノズルの最小の開口径は、粒子の最大径より大きく、かつ、粒子の最大径の６倍よりも小さいことが好ましい。吸引ノズルの「最小の」開口径とは、吸引ノズルがシリンジに固定されている場合には、その固定された吸引ノズルの開口径の値をいう。一方、吸引ノズルが取外し可能なノズルである場合、吸引ノズルの「最小の」開口径とは、一連の固液分離操作において用いられる１以上の吸引ノズルの開口径のうち、最小の値を示すノズルの開口径をいう。吸引ノズルの開口径は、公知の方法に従って測定することができる。
【００１１】
吸引ノズルは、吸引ノズル内の圧力変化に応じて、その先端の開口から液の吸引および排出ができるように設計されたものであればよい。前記圧力変化は、例えば、吸引ノズルの後端にシリンジが取り付けられ、そのシリンジ内をプランジャが移動することで生じてもよい。吸引ノズルは、シリンジに固定されていてもよいし、取外し可能なものであってもよい。吸引ノズルとしては、ピペットチップを取り付けずに吸引する吸引管や取外し可能なノズル、例えばピペットチップなどが挙げられ、好ましくは取外し可能なピペットチップであり、より好ましくは先端開口近傍にフィルターを有しない取外し可能なピペットチップである。
【００１２】
吸引ノズルの開口径は、好ましくは0.70〜2.4 mm、より好ましくは0.80〜1.6 mmである。
吸引ノズルの最大容量は、好ましくは500〜2000μL、より好ましくは1000〜1500μLである。
【００１３】
懸濁液は、肉眼で見える程度の粒子が液体中に分散したものをいう。ここで、肉眼で見える程度の粒子とは、一般に、平均粒径が１０μｍオーダーのものをいう。懸濁液は、好ましくは、標的物質を含む試料液と、標的物質を吸着させる粒子とが混合されたものである。
【００１４】
粒子の材質は、固液分離を妨げない限り、特に限定されない。例えばシリカ、アルミナ、ジルコニアなどの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどの有機材料、多孔性材料、磁性材料などが挙げられる。
粒子の形状は、固液分離を妨げない限り、特に限定されない。例えば球状、略球状、正多面体、正多角形状の開口形状を有するハニカム構造などが挙げられる。
粒子は、例えばアミノシリル基やオクタデシルシリル基(ODS)などにより、表面修飾されていてもよい。
なお、本実施形態の固液分離はＢＦ分離に応用できるため、粒子は、所望のペプチド又は核酸を精製するのに適した粒子であることが好ましい。
【００１５】
粒径は、固液分離を妨げない限り特に限定されないが、その最大径が吸引ノズルの最小の開口径より小さく、かつ、最小の開口径の６分の１よりも大きいことが好ましい。具体的な粒径の数値としては、好ましくは70〜700μm、より好ましくは100〜700μmである。本実施形態において、粒径は、公知のレーザー回折・散乱法により測定する。
粒子の最大径とは、粒径の最大値を意味する。粒子の最大径は、固液分離を妨げない限り特に限定されず、好ましくは150μm以上、より好ましくは250μm以上である。
【００１６】
粒子のＤ90は、固液分離を妨げない限り、特に限定されない。Ｄ90とは、粒子径に係る数値であって粒子径の累積分布が90%となる点、即ち、粉体をある粒子径を基準に大小二つに分けた場合に大きな側と小さな側とが1:9となる粒子径を示す。Ｄ90は、好ましくは105μm以上、より好ましくは110μm以上である。
粒子のＤ10は、固液分離を妨げない限り、特に限定されない。Ｄ10とは、粒子径に係る数値であって粒子径の累積分布が10%となる点、即ち、粉体をある粒子径を基準に大小二つに分けた場合に大きな側と小さな側とが9:1となる粒子径を示す。Ｄ90は、好ましくは150μm以上、より好ましくは170μm以上である。
粒子のＤ90−Ｄ10は、Ｄ90とＤ10との差である。Ｄ90−Ｄ10は、固液分離を妨げない限り特に限定されず、好ましくは90μm以上、より好ましくは120μm以上である。
【００１７】
粒子のＤ50は、固液分離を妨げない限り、特に限定されない。Ｄ50とは、累積分布が50%となる点、即ち、粉体をある粒子径を基準に大小二つに分けた場合に大きな側と小さな側とが等量となる粒子径を示す。粒子のＤ50は、好ましくは150μm以上、より好ましくは170μm以上である。
【００１８】
粒子の比重は、固液分離を妨げない限り特に限定されず、溶媒となる液体の比重などを考慮して当業者が適宜設定することができる。粒子の比重は、溶媒となる液体の比重よりも大きいことが好ましい。
【００１９】
本実施形態では、最小の開口径が0.80 mmの吸引ノズルが用いられる。この実施形態において、粒子は、好ましくは１２０μｍ以上のＤ90−Ｄ10を有する。また、この実施形態において、粒子は、好ましくは１７０μｍ以上のＤ50を有する。
【００２０】
懸濁液の溶媒となる液体は、粒子を分散可能な限り特に限定されず、標的物質を解離させないものが好ましい。液体としては、例えば水、リン酸緩衝液(PBS)などが挙げられる。液体は、排出に伴って粒子を詰まらせた吸引ノズルを通過し得るものであることが好ましい。液体は、標的物質、好ましくは精製されることが望まれる所望のペプチドまたは核酸を含んでいてもよい。また、このような液体は、所望のペプチドまたは核酸以外のペプチドおよび/または核酸、塩を含んでいてもよい。さらに、液体は、固液分離を妨げない範囲で、好ましくは２０％以下、より好ましくは８％以下の界面活性剤を含んでいてもよい。このような液体は、好ましくは全血、血清または血漿であり、より好ましくは全血、血清または血漿を加熱することにより、好ましくは電子レンジで加熱することにより、より好ましくは電子レンジで１５０〜１８０℃に加熱することにより得られる上清である。このような上清は、さらに脱塩されて、脱塩処理液とされてもよい。
懸濁液の溶媒となる液体の種類は、固液分離を妨げない限り特に限定されない。液体の比重は、固液分離を妨げない限り特に限定されず、粒子の比重などを考慮して当業者が適宜設定することができる。液体の比重は、粒子の比重よりも小さいことが好ましい。また、液体の粘度は、固液分離を妨げない限り特に限定されない。
【００２１】
粒子は、支持体と組み合わせて用いられてもよい。ここで、支持体とは、用いる吸引ノズルとの関係において、それ単独では吸引ノズルに詰まらない粒子を詰まらせることが可能な物質、特にそのような特性を示す粒状の物質をいう。支持体の材質および各種物性は、粒子について上記したことと同様である。このような支持体の使用は、用いる吸引ノズルとの関係において、それ単独では吸引ノズルに詰まらない粒子を用いて本実施形態の固液分離を行う場合に特に有利である。このような支持体は、好ましくは、粒子より比重が大きい物質または粒子と強固な塊を形成する物質である。当業者は、用いる粒子に適した支持体を適宜選択することができる。
【００２２】
後述する実施例１２では、吸引ノズルとして図５Ｃに記載の管Ｂ、粒子として担体１０番が用いられる場合に、支持体として担体２番が用いられる。この実施形態において、担体１０番はそれ自体では管Ｂ内に詰まらず液体と共に排出され、固液分離を達成できない。しかしながら、支持体としての担体２と組み合わせられることにより、担体２番が管Ｂに詰まることによって、あるいは、担体２番と一緒になって管Ｂに詰まることによって、排液時に吸引ノズル内に留まって固液分離を達成できるようになる。
【００２３】
懸濁液中の粒子の濃度は、固液分離を妨げなければ特に限定されず、好ましくは５〜１００ｍｇ／ｍＬである。また、懸濁液の温度は、固液分離が妨げられない限り特に限定されず、好ましくは０．５〜１００℃、より好ましくは２０〜９８℃である。
【００２４】
懸濁液の吸引は、例えば、吸引ノズルの先端を懸濁液に浸し、吸引ノズル内の気圧を外部の気圧に対して負圧にすることによって行われる。例えば吸引ノズル内の気圧の制御が、吸引ノズルの後端にプランジャを含むシリンジが接続された状態でプランジャの位置を制御することによって行われる場合、懸濁液の吸引は、プランジャを移動させて吸引ノズルを含むシリンジ内部の容積を増大させることによって行われる。
【００２５】
懸濁液の吸引工程は、吸引ノズルの内部に粒子と溶媒との混液を吸引し、排出することを繰り返すことによって粒子と溶媒との混液を撹拌(アジテーション)して懸濁液を調製することを包含していてもよい。吸引および排出は、例えば、吸引ノズルの先端を混液に浸し、吸引ノズル内の気圧を外部の気圧に対して負圧にすることによって混液を吸引し、その後吸引ノズル内の気圧を外部の気圧に対して正圧にすることによって混液を排出することによって行われる。このような吸引と排出を複数回繰り返してもよい。また、吸引ノズル内の気圧の制御は、吸引ノズルの後端にプランジャを含むシリンジが接続された状態でプランジャの位置を制御することによって行ってもよい。この場合の懸濁液の吸排の速さは特に限定されないが、好ましくは一定の速さで吸排を繰り返す。吸排の速さは、好ましくは液体の排出の速さより速い。また、この場合の吸引と排出の回数も特に限定されない。さらに、この場合の吸引と排出は、１以上の吸引ノズルを用いて行ってもよい。
【００２６】
別の方法としては、アジテーションは、ボルテックスなどにより、又は撹拌機を用いて、粒子と溶媒との混液を撹拌することにより行ってもよい。あるいは、アジテーションおよび吸引は、吸引のみに用いる第１の管(吸引管)と、吐出のみに用いる第２の管とをチューブやカテーテルなどを介して接続し、第１の管及び第２の管を粒子と溶媒との混液に浸して還流することにより行ってもよい。
【００２７】
本実施形態の固液分離方法は、吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を沈降させて詰まらせる工程を含む。沈降によって吸引ノズル内に粒子の塊(プラグ)が形成され、粒子が詰まると考えられる。粒子は、粒子の沈降中又は沈降後、後述する液体の排出前、あるいは液体の排出中のいずれかの時点で詰まると考えられる。
【００２８】
沈降とは、重力や遠心分離作用など粒子に対して一定方向に作用する力がブラウン運動による粒子の拡散作用に打ち勝つことにより、粒子がある箇所に集中し分散が不均一になる現象をいう。粒子の分散が不均一になっているか否かの判断は、先端開口から最遠部における粒子濃度の低下を観察することによって行ってもよいし、先端開口近傍と先端開口から最遠部との粒子濃度の差を観察することによって行ってもよい。あるいは、粒子と液体との境界が明確になることを観察することによって行ってもよい。また、このような観察は、目視によって行ってもよい。沈降は、好ましくは、吸引ノズルの内部へ吸引された粒子が略均一に分散した懸濁液の先端開口近傍と先端開口から最遠部とに沈降による粒子濃度の差が生じるのに十分な時間、放置することによって行われる。当業者は、このような粒子濃度の差を生じさせるために必要な放置時間を適宜設定することができる。なお、最遠部とは、吸引ノズルに吸引された液体のうち先端開口とは反対側の液相と気相との界面近傍をいう。
【００２９】
粒子の沈降は、例えば、吸引ノズル内の気圧を一定に保つことにより行われる。この間、懸濁液に対して加圧も減圧も行われることなく、懸濁液は放置あるいは静止され、懸濁液中の粒子が重力などの作用を受けて沈降する。吸引ノズル内の気圧の制御が、吸引ノズルの後端に、プランジャを備えたシリンジが接続された状態でプランジャの位置を制御することによって行われる場合、粒子の沈降は、プランジャを静止させて同じ位置を保つことによって行われる。
【００３０】
本実施形態の固液分離方法は、粒子を詰まらせた吸引ノズルの開口を介して内部の液体を排出する工程を含む。
液体の排出(イジェクション)は、好ましくは、吸引ノズルの内部へ吸引された粒子が略均一に分散した懸濁液の先端開口近傍と先端開口から最遠部とに沈降による粒子濃度の差が生じた後に行われる。本実施形態の固液分離では、沈降によって、あるいは、液体の排出に伴って、粒子は吸引ノズル内に詰まって留まる一方で、液体は吸引ノズル内に詰まった粒子を通過して排出される。これにより、本実施形態の固液分離が可能となる。液体の排出は、好ましくは、標的物質が吸着した粒子を開口手前側に残すようにして行われる。開口手前側とは、先端開口の最遠部から先端開口へと向かう方向のことをいう。
【００３１】
液体の排出は、例えば、吸引ノズル内の気圧を外部の気圧に対して正圧にすることによって行われる。吸引ノズル内の気圧の制御が、吸引ノズルの後端にプランジャを含むシリンジが接続された状態でプランジャの位置を制御することによって行われる場合、液体の排出は、プランジャを移動させて吸引ノズルを含むシリンジ内部の容積を減少させた後、プランジャを静止させて同じ位置を保つことによって行われる。液体の排出の速さは、好ましくは吸排の速さより遅い。
【００３２】
別の観点では、本実施形態の固液分離方法は、ＢＦ分離のために用いることもできる。
より具体的には、前記液体を排出した後に、標的物質が吸着された粒子から標的物質を溶出させる溶出液を吸引ノズル内に吸引し、吸引された溶出液により混ぜられる粒子の少なくとも一部を開口手前側に沈降させ、溶出液と溶出した標的物質とを先端開口を介して排出し、得られた液体を必要に応じて更に精製することにより、本実施形態の固液分離方法をＢＦ分離方法として用いることができる。
【００３３】
溶出液は、標的物質が吸着された粒子から標的物質を溶出させることができるものであれば特に限定されない。このような溶出液としては、アセトニトリルやヘキサンなどの有機溶媒、あるいは、緩衝生理食塩水やリガンド試料などの水溶液、あるいは、メタノールを含む水やトリフルオロ酢酸を含む水などの混合液、あるいは、イオン液体等が挙げられる。
【００３４】
この発明に係る吸引ノズルは略管状であり得る。先端へ向かうにつれて内径が先細りになるとは、吸引ノズルの一端（先端）における内径が他端（コネクタ端）の内径よりも小さく、かつ、少なくとも前記一端付近ではノズルの断面の内径が先端により近いほどより小さいことをいう。
【００３５】
この発明による固液分離装置の吸引部は、吸引ノズルの内部の圧力を変化させることによって吸引ノズル内に粒子を含む液体を外部から吸引したり外部へ排出したりするものである。
また、制御部は懸濁液の吸引後、吸引された懸濁液に含まれる粒子の少なくとも一部を吸引ノズルの内部に沈降させて詰まらせるが、ここで少なくとも一部の沈降とは、液体を排出する際に吸引ノズルが詰まる程度の沈降をいう。
ここで、少なくとも排出は、吸引ノズルの先端に形成された開口（先端開口）を介して行われる。吸引部は、装着された吸引ノズルの外部から内部へ、また、吸引ノズルの内部から外部へ液体を送るポンプとして作用する。吸引部の典型的な構造はプランジャを往復させて吸引と排出を行うプランジャ型のポンプであるが、それに限定されるものでない。例えば、ダイヤフラム型やギヤ型等、種々のタイプのポンプが適用可能である。
【００３６】
制御部は、前記吸引部を制御し、それによって粒子を含む液体の吸引ノズルへの吸引および排出を制御するものである。制御部は、例えば、ＣＰＵあるいはマイクロコンピュータ（以下、これらを総称してコンピュータという）が制御用のソフトウェアを実行することによりその機能が実現されてもよい。ただし、その構成に限定されるものでない。例えば、コンピュータ、即ちソフトウェア処理によらない構成として、ハードウェア回路を組み合わせて制御部の機能を実現する態様も考えられる。
【００３７】
上述の固液分離装置におけるいくつかの好ましい態様を述べる。
前記制御部は、以下のように前記吸引部を制御してもよい。即ち、前記懸濁液の吸引後、吸引ノズル内で粒子が略均一に分散した懸濁液の先端開口近傍と先端開口から最遠部とに沈降による粒子濃度の差が生じるまでの期間に基づいて予め定められた静止期間において、前記懸濁液の吸引を停止して前記粒子の少なくとも一部を沈降させる。さらに、前記静止期間の経過後、前記粒子を内部に詰まらせた吸引ノズルの開口を介して内部の液体を排出する。
上述のように、懸濁液を吸引ノズル内に吸引し、吸引ノズルの先端開口近傍と先端開口から最遠部とに沈降による粒子濃度の差が生じるまでの期間を予め測定して静止期間を定めておけば、その後の固液分離は、吸引を終了してから前記静止期間が経過した後に排出を開始することによって実現できる。即ち、静止期間中に粒子が沈降するので、吸引ノズルの内部に粒子が詰まった状態で内部の液体を排出することができ、固液分離が可能になる。
【００３８】
また、前記容器は、標的物質を含む試料液とその標的物質を吸着させる粒子とを収容してもよく、前記制御部は、内部の液体を排出することにより標的物質が吸着された粒子を吸引ノズルの内部に残してもよい。
【００３９】
さらにまた、前記吸引部は、プランジャを含むシリンジと、そのプランジャを移動させるアクチュエータとを含み、前記制御部は、アクチュエータを制御して吸引ノズルを含むシリンジ内部の容積を増大させるようにプランジャを移動させて前記懸濁液の吸引を行った後、前記静止期間においては同じ位置を保つようにプランジャを静止させ、前記静止期間の経過後、吸引ノズルを含むシリンジ内部の容積を減少させるようにプランジャを移動させた後にプランジャを静止させてもよい。
このようにすれば、プランジャの移動および静止を制御することによって、懸濁液を吸引し、吸引ノズル内に粒子を沈降させ、内部の液体を排出して吸引ノズル内に粒子を残すことができる。
【００４０】
前記制御部は、前記懸濁液を吸引するプランジャの移動速さよりもゆっくりと前記プランジャを移動させて、内部の液体を排出してもよい。
このようにすれば、吸引時は攪拌された粒子が懸濁液中に分散する程度の速さでプランジャを移動させ、排出時は沈降した粒子が攪拌されない程度の速さでプランジャを移動させることができる。ここでの速さは方向を含まず、単位時間当たりの位置の変化の大きさをいう。
【００４１】
また、前記吸引ノズルは、吸引部に着脱可能であってもよい。
さらにまた、吸引ノズルを、前記吸引部に装着される位置へ搬送するノズル搬送機構と、前記吸引部に装着された吸引ノズルの先端を前記容器支持体に支持された容器内の懸濁液に向けて下降させる昇降機構とをさらに備えていてもよい。
これらの好ましい態様は適宜組み合わせることができる。
以下、図面を用いてこの発明をさらに詳述する。なお、以下の説明は、すべての点で例示であって、この発明を限定するものと解されるべきではない。
【００４２】
≪固液分離装置の構成≫
図１は、この実施形態における固液分離装置の概略構成を示す説明図である。図１に示すように、固液分離装置１１は、吸引部１３、制御部１５および容器支持体１７を備え、それらは固液分離装置１１に必須の構成である。図１で、固液分離装置１１の固液分離に必要な構成を鎖線の枠で示している。
この実施形態において吸引部１３は、プランジャ１３ａを含み、下端に吸引ノズル２１（ピペットチップ）が装着されるシリンジ１３ｂを含む。
プランジャ駆動モータ１３ｃは、プランジャ１３ａをシリンジ１３ｂ内で移動させる駆動源である。
【００４３】
制御部１５は、コンピュータを中心としてメモリ、入出力回路等のハードウェアで構成される回路である。コンピュータがメモリに予め格納された制御プログラム（ソフトウェア）を実行することによりプランジャ駆動モータ１３ｃの制御が実現される。
容器支持体１７は、粒子を含む液体を収容する容器２３を支持する。そして、容器２３の位置を決める。容器２３は、容器支持体１７によって交換可能に支持される。容器２３に収容された粒子と液体を攪拌すると懸濁液になる。ただし、粒子と液体とは比重が異なり、静置すると徐々に粒子が沈降するものとする。
【００４４】
シリンジ１３ｂの下端には、下方に突出したコネクタが形成され、コネクタの下端に吸排口が開口している。吸引ノズル２１は管状であって、一端側は、先端へ向かうにつれて内径が先細りになりその先端に開口が形成されている。他端側は、シリンジ１３ｂの前記コネクタに着脱可能な形状に形成されている。吸引ノズル２１の他端がシリンジ１３ｂに装着されると、シリンジ１３ｂと吸引ノズル２１とが気密かつ液密に接合される。なお、吸引ノズル２１は、単なる管状のものである。即ち、粒子を濾過するフィルター等の構造を有していない。固液分離を行う際、シリンジ１３ｂに吸引ノズル２１が装着されて使用される。固液分離の終了後は、使用された吸引ノズル２１が固液分離装置１１から取り外されて、次の固液分離処理においては別の吸引ノズルがシリンジ１３ｂに装着されてもよい。即ち、吸引ノズル２１は、使い捨てあるいは交換可能である。具体的には、吸引ノズル２１は、溶媒の吸引や吐出などに使用されるいわゆるピペットに代表されるような使い捨てピペットチップであってもよい。シリンジ１３ｂのコネクタに装着された吸引ノズル２１は、取り外し自在である。
【００４５】
好ましくは、固液分離装置１１は、容器２３に収容された液体に吸引ノズル２１の下端を浸漬させるべく昇降機構２９をさらに備える。昇降機構２９は、スクリューシャフト２９ａ、スクリューナット２９ｂ、シャフト軸受２９ｃおよびシャフト駆動モータ２９ｄからなる。スクリューシャフト２９ａは鉛直方向に配置され、シャフト駆動モータ２９ｄによって正逆転可能に駆動される。スクリューシャフト２９ａが回転すると、嵌合するスクリューナット２９ｂが昇降する。スクリューナット２９ｂと一体でシリンジ１３ｂおよび吸引ノズル２１が昇降する。シャフト駆動モータ２９ｄは、制御部１５によって制御される。
【００４６】
また好ましくは、固液分離装置１１はノズルスタンド２５ａおよびテーブル駆動モータ２５ｂをさらに備える。ノズルスタンド２５ａは、シリンジ１３ｂに装着されるべき吸引ノズル２１を保持する。容器支持体１７は、ノズルスタンド２５ａを載せて移動する。それと共に、容器２３を載せて移動する。テーブル駆動モータ２５ｂは、容器支持体１７を移動させる。制御部１５は、テーブル駆動モータ２５ｂを制御する。ノズルスタンド２５ａおよびテーブル駆動モータ２５ｂは、ノズルスタンド２５ａに保持された吸引ノズル２１を、吸引部１３に装着されるべき位置、即ち、シリンジ１３ｂ下端のコネクタの直下へ移動させる。
【００４７】
ノズルスタンド２５ａおよびテーブル駆動モータ２５ｂは、吸引ノズル２１を、前記吸引部１３に装着されるべき位置へ搬送するノズル搬送機構を構成する。
吸引ノズル２１をシリンジ１３ｂに装着する際、制御部１５は、他端を上方に向けてノズルスタンド２５ａに保持された吸引ノズル２１がシリンジ１３ｂのコネクタの直下に位置するようにテーブル駆動モータ２５ｂを制御する。そして、制御部１５は、シャフト駆動モータ２９ｄを制御してシリンジ１３ｂ下端のコネクタが吸引ノズル２１の他端に挿入される位置までシリンジ１３ｂを降下させる。これらの動作によって、シリンジ１３ｂに吸引ノズル２１が装着される。
【００４８】
また固液分離装置１１は、圧力センサ３１を備えてもよい。圧力センサ３１は、シリンジ１３ｂ内の圧力を検出（計測）する。圧力センサ３１が検出した信号は、制御部１５に入力される。
制御部１５は、プランジャの１３ａの移動を制御することにより、容器２３に収容された粒子を含む液体の吸引および吐出を制御する。
【００４９】
また、好ましい構成によれば、制御部１５は、ノズルスタンド２５ａおよび容器支持体２７を載せた容器支持体１７の移動を制御する。これにより、吸引ノズル２１をシリンジ１３ｂに装着することが可能になる。また、容器２３に収容された粒子を含む液体を容器支持体１７に載せられた別の容器へ分注することが可能になる。
好ましい構成によれば、制御部１５は、圧力センサ３１が検出するシリンジ１３ｂの内圧Ｐに基づいて、プランジャ１３ａの移動、停止、動作期間等を制御してもよい。あるいは、時間の経過に伴うシリンジ内圧Ｐの変化（Ｐｔ曲線）を、例えば、図１に図示しない表示装置に表示してもよい。
【００５０】
≪プランジャの制御≫
続いて、制御部１５によるプランジャ１３ａの制御について説明する。
図２は、固液分離のために制御部１５がプランジャ１３ａを移動させる様子を示す説明図である。図２の（ａ）はシリンジ１３ｂ内のプランジャ１３ａの動きを示し、（ｂ）はシリンジ内圧Ｐの変化の例を示し、（ｃ）は吸引ノズル２１内の粒子と液体の様子の例を示している。（ｂ）の波形は、固液分離装置１１が圧力センサ３１を備える場合のＰｔ曲線に対応するものである。
【００５１】
図２（ａ）で、「ＴＤＣ」はプランジャ１３ａが移動可能な上端の位置（上死点）を示し、「ＢＤＣ」はプランジャ１３ａが移動可能な下端の位置（下死点）を示す。
制御部１５は、まず、プランジャ１３ａをシリンジ１３ｂの上死点と下死点の中間の位置で停止させる。ただし、一例であってこれ以外の位置で停止させても構わない。
その状態で、吸引ノズル２１の先端が容器２３に収容された粒子を含む液体に浸漬される。好ましい構成によれば、昇降機構２９が制御部１５の制御に基づいて吸引ノズル２１の先端を液体に浸漬させるが、固液分離装置１１が昇降機構２９を備えない場合はユーザが手動で吸引ノズル２１または容器２３の位置を移動させる。なお、昇降機構２９は、吸引ノズル２１を降下させることで浸漬させてもよいが、それに代えてあるいはそれに加えて、容器２３を上昇させることで浸漬させてもよい。
【００５２】
＜攪拌（アジテーション）および吸引＞
その後、制御部１５は、シリンジ内圧Ｐが負圧になる方向、即ち、プランジャ１３ａを上死点へ向けて移動させる。移動に伴って、吸引ノズル２１の内部に容器２３に収容された粒子と液体が吸引される。
さらに、制御部１５は、プランジャ１３ａを上死点と下死点との間で往復させる。以下、プランジャ１３ａが上死点から下死点へ向かう移動を前進、下死点から上死点へ向かう移動を後進ともいう。図２の例ではプランジャ１３ａを５回往復させた後に上死点で停止させている。
【００５３】
図２（ｂ）において、プランジャ１３ａが上死点に達した際のシリンジ内圧Ｐの極小値をＰｔｄｃで示し、プランジャ１３ａが下死点に達した際のシリンジ内圧Ｐの極大値をＰｂｄｃで示している。
プランジャ１３ａの往復動によって、粒子を含む液体が吸引ノズル２１と容器２３との間を往復して攪拌される。攪拌（アジテーション）前は粒子が容器２３内で沈殿していたとしても、プランジャ１３ａの往復による攪拌動作によって粒子と液体とが混ざり合い懸濁液になる。図２（ｂ）において攪拌動作の期間をΔｔａで示している。攪拌動作における内圧の極大値Ｐｂｄｃの平均をＰａで示している。攪拌動作の終了時、制御部１５はプランジャ１３ａを上死点に位置させており、懸濁液が吸引ノズル２１に吸引されている（図２（ｃ）参照）。
この実施形態において、制御部１５は予め定められた周期、予め定められた速さでプランジャ１３ａを往復動させて攪拌動作を行う。往復動のうち上死点へ向かう際のプランジャ１３ａの移動速さ、即ち、吸引時の速さをＲsuctionとする。プランジャ１３ａの移動速さは、シリンジの容積の変化の速さに対応する。吸引部としてプランジャ型以外のポンプを用いる態様においても、吸引ノズル２１の内部と連通する室の容積の変化として捉えて同様の動作を行うことが可能である。なお、この実施例において、アジテーションにおけるプランジャ１３ａの前進と後進（吸引）は、移動の方向が逆であるが速さが等しい。その速さをＲagitとする。プランジャ１３ａは、アジテーション工程の最後の段階において上死点で停止し、吸引が行われる。よって、Ｒsuction＝Ｒagitである。
【００５４】
＜静止＞
攪拌動作の後、制御部１５は、上死点にあるプランジャ１３ａを静止させる（図２（ａ）の期間Δｔｓにおける図参照）。静止は、所定の期間（図２（ｂ）に示すΔｔｓ）行う。なお、攪拌終了後に、吸引ノズル２１の先端を上昇させて、あるいは容器２３を降下させて、容器２３に収容された懸濁液の液面の上方へ移動させてもよい。ただし、ここで吸引ノズル２１を液面の上方に上昇させなくても固液分離は可能である。好ましい構成によれば、昇降機構２９が制御部１５の制御に基づいて吸引ノズル２１の先端を容器２３の液面の上に上昇させることができる。固液分離装置１１が昇降機構２９を備えない構成ではユーザが手動で吸引ノズル２１または容器２３の位置を移動させてもよい。
【００５５】
容器２３の液面より上に吸引ノズル２１の先端が位置しても、シリンジ内圧Ｐが大気圧に比べて負圧になっており、また表面張力の作用もあって、吸引ノズル２１内の懸濁液の大半は下端の開口から滴下しない。
一方、容器２３の液面より下に吸引ノズル２１の先端が位置する場合でも、シリンジ内圧Ｐが大気圧に比べて負圧になっており、吸引ノズル２１内の懸濁液は容器２３へ流出することがない。
図２（ｂ）にΔｔｓで示す静止期間中、吸引ノズル２１内に懸濁液が留まり、懸濁液中の粒子が下端部へ沈降を始める。そして、次第に懸濁液の下端部と上端部とで粒子濃度の差、即ち濁度の差が生じる。
【００５６】
静止期間Δｔｓは、吸引ノズル２１内で略均一に分散した懸濁液の粒子が沈降し、少なくとも懸濁液の下端部と上端部とで粒子濃度の差が生じるようになるまでの期間として定められる。静止期間Δｔｓは、例えば、実験に基づき予め定められる。その実験は、固液分離に用いるものと同型の吸引ノズル２１に固液分離に用いるものと同じ粒子と溶液を吸引し、その後プランジャ１３ａを静止させ、懸濁液の粒子が吸引ノズル２１内の下端部に沈降し下端部と上端部とで粒子濃度の差が生じるのを目視観察し、あるいはカメラやフォトセンサ等のセンサを用いて検出するものである。
後述するように、この実施形態による固液分離は現象の再現性が良好である。よって、吸引ノズル２１と粒子および液体を決め、予め実験によって好適な静止期間Δｔｓを定めれば、安定した固液分離が実現できる。
異なる態様として、固液分離装置１１がカメラやフォトセンサ等のセンサを備え、制御部１５がそれらのセンサの検出に基づいて適応的に静止期間Δｔｓを定めてもよい。即ち、吸引ノズル２１内の下端部と上端部とで粒子濃度の差が検出されるまで、プランジャ１３ａを上死点で静止させるように制御してもよい。
【００５７】
＜排出（イジェクション）＞
静止期間Δｔｓの経過後、制御部１５は、プランジャ１３ａを予め定められたΔｔ１の期間で下死点へ移動させる（図２（ａ）の「Ｉ」参照）。その際、プランジャ１３ａの移動の速さをＲejectとする。制御部１５は、好ましくは吸引時よりもゆっくりとした速さでプランジャ１３ａを移動させる。即ち、Ｒeject＜Ｒsuctionの関係が成り立つようにプランジャ１３ａの移動を制御する。
【００５８】
プランジャ１３ａの移動に伴ってシリンジ内圧Ｐが上昇する。シリンジ内圧Ｐの上昇を緩和すべく、吸引ノズル２１の内部から先端開口を介して液体が排出される（図２（ｃ）参照）。シリンジ１３ｂの懸濁液の上方は空気で満たされている。プランジャ１３ａが下死点に向けて移動すると、その空気が圧縮されシリンジ内圧Ｐが上昇するのである。シリンジ内圧Ｐの上昇により吸引ノズル２１内部の液体は吸引ノズル２１の先端開口から下方の容器２３へ排出される。吸引ノズル２１は、先端へ向かうにつれて内径が先細りになっているので、先端開口へ向かう流れに沿って、沈降した粒子およびまだ沈降していない粒子が先端開口の手前に集中する。そして、吸引ノズル内に粒子の塊（以下、プラグとも呼ぶ）が生じ、粒子が詰まる。ただし、液体は、粒子と粒子の間、あるいは管壁と粒子の間を抜けて先端開口から容器２３内へ排出される。ただ、プラグによって液体の流れに抵抗が生じるので、プランジャ１３ａが下死点へ向けて移動するにつれて、シリンジ内圧Ｐは、攪拌動作時よりも上昇する（図２（ｂ）のΔｔ１の期間を参照）。プランジャ１３ａが下死点に達した際のシリンジ内圧Ｐの極大値を図２（ｂ）にＰｅで示している。
【００５９】
期間Δｔ１の後、制御部１５は、プランジャ１３ａを下死点で停止させる（図２（ａ）にＩＩで示す）。図２（ｂ）において停止期間をΔｔ２で示している。期間Δｔ２は、吸引ノズル２１から液体が十分に排出されて固液分離が終了するまでの期間として決定される。
期間Δｔ１、速度Ｒeject、期間Δｔ２は、例えば、実験に基づき予め定められる。実験は、固液分離に用いるものと同型の吸引ノズル２１に固液分離に用いるものと同じ粒子と溶液を吸引し、プランジャ１３ａを上述の期間Δｔ１だけ静止させて粒子を沈降させ、開口先端の手間で粒子のプラグが形成されて粒子が詰まる好適な条件を目視観察あるいはカメラを用いた画像解析等センサを用いた検出により見出す。このようにして期間Δｔ１、速度Ｒejectを決定すればよい。期間Δｔ２については、決定された期間Δｔ１、速度Ｒejectでプランジャ１３ａを下死点に移動させた後、吸引ノズル２１から液体が十分に排出されるまでの期間を目視観察あるいは圧力センサ３１等のセンサを用いた検出により決定すればよい。
【００６０】
本発明の範囲には、本実施形態の固液分離方法に用いられる吸引ノズル、好ましくはピペットチップも包含される。吸引ノズルは、先端開口近傍にフィルターを有しないことが好ましい。吸引ノズルの最小の開口径は、粒子の最大径より大きく、かつ、粒子の最大径の６倍よりも小さいことが好ましい。
【００６１】
本発明の範囲には、本実施形態の固液分離方法に用いられる粒子も包含される。
【００６２】
本発明の範囲には、本実施形態の固液分離方法に用いられる吸引ノズル、好ましくはピペットチップと、本実施形態の固液分離方法に用いられる粒子とを含む固液分離用キットも包含される。
【００６３】
本実施形態では、上記の各種試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。この箱には、試薬キットの添付文書を同梱していてもよい。この添付文書には、たとえば、試薬キットの構成、プレセプシンの測定プロトコールなどが記載されることが好ましい。図３に、本実施形態の試薬キットの外観の一例を示す。図中、４０は、試薬キットを示し、４１は、取外し可能な吸引ノズル、好ましくはピペットチップを収容した第１容器を示し、４２は、粒子を収容した第２容器を示し、４３は、添付文書を示し、４４は、梱包箱を示す。
以上、固液分離方法、固液分離装置および固液分離用キットについて、好ましい態様を含めて実施の形態を述べた。好ましい態様は、適宜組み合わせることが可能である。
【実施例】
【００６４】
実施例１：Ｐｔ曲線と粒子の詰まり
Ｐｔ曲線は、吸引ノズル２１に粒子が詰まって固液分離が成功したか否かの状態を明確に示す。
図４Ａ〜図４Ｃは、図１に示す構成の固液分離装置１１を用いて測定したＰｔ曲線の実測例を示すグラフである。固液分離装置１１は、圧力センサ３１を備えており、圧力センサ３１が検出するシリンジ内圧Ｐ値を一定時間間隔でプロットした。
吸引ノズル２１（以下、単に管ともいう）は、後述する図５Ｃに記載の、管の名称が「Ｂ」のもの（以下、管Ｂあるいは管Ｂ型）を用いた。
この実施例で用いた粒子は、全血、血清または血漿を加熱して得られる上清を脱塩処理した液体から標的物質として所望のペプチドまたは核酸を吸着させる吸着剤（担体）を想定し、多孔質シリカを用いた。
【００６５】
具体的には
（ａ）後述する図５Ａ記載の担体の名称が「１」のもの（以下、担体１番あるいは担体１型）の日本化成社製メソ多孔質シリカ担体（商品名メソピュア：なお、図５Ａに示す担体２番〜１０番は担体１番の分級品）  を１００  ｍｇ、
（ｂ）図５Ａに記載の担体１０番を１００  ｍｇ、
（ｃ）図５Ａに記載の担体５番を１０  ｍｇ、
を秤量して容器２３（epppendorf社製Safe-Lock Tubes  ２．０  ｍＬ）（図１）へ移した。
なお、担体１番は、目開きサイズ75 μmの篩と900 μmの篩とを重ねて、原末としての上記メソ多孔質シリカ担体を篩って、篩間に残った粒子を回収することによって得た。担体２〜１０番は、図５Ａ所定の目開きサイズの篩を重ねて、原末としての担体１番を篩って、篩間に残った粒子を回収することによって得た。マイクロトラックFRA 9220装置(Leeds & Northrup社製)を用いてレーザー回折・散乱法により測定した担体１番〜１０番の粒度分布を図５Ｂに示す。
【００６６】
そこへ溶媒（液体）としてＰＢＳ（バイオラッド社製、商品コード：１６１０７８０）を１．５  ｍＬ添加した。そして、プランジャ１３ａを初期の位置から上死点へ移動させて容器２３に収容された粒子と液体を吸引した。
プランジャ１３ａが上死点から下死点へまたは下死点から上死点へ移動するとシリンジの容積は１０００  μＬ変化する、攪拌動作におけるプランジャ１３ａの移動速さＲsuctionは、２８００  μＬ／ｓである。
【００６７】
プランジャ１３ａは、図２と同様に５往復の攪拌動作を行った後に上死点で静止させ、その後、ゆっくりと下死点へ移動（前進）させ、下死点で所定の期間停止させた。アジテーションおよび吸引の工程（以下、単にアジテーション工程ともいう）に続くイジェクション工程においては、プランジャ１３ａを上死点から下死点へ前進させた。アジテーション工程およびイジェクション工程において１回の前進により変化するシリンジの体積は１０００  μＬであった（後進も同様）。前進時の、移動速度Ｒは８００  μＬ／ｓである。
【００６８】
攪拌および吸引の工程ならびに排出工程を通じて、ＰＢＳ溶媒と担体とが懸濁されたこと、管内で担体によるプラグ形成が完遂されたこと（固液分離成功）、あるいはプラグ形成が不成功に終わったこと（固液分離不成功）は、目視で観察し動画撮像も行って事後確認して判断した。
なお、固液分離成功は、アジテーション工程とイジェクション工程のあとで、上記担体１番と上記ＰＢＳ溶媒とを分けることができたと判断したことを示している。
【００６９】
図４Ａ〜図４Ｃは、それぞれ、上記(a)〜(c)の各種担体を用いた場合のPt曲線を示す。図４Ａ〜図４Ｃにおいて、グラフの右側に、固液分離成功時のパターン、および、固液分離不成功時の代表的な管内の様子をイラストで示している。
固液分離不成功と判断した管と担体の組み合わせにおいては、固液分離成功時と比べてＰｔ曲線に関して以下の特徴が挙げられる。
（１）アジテーション工程において計測されたＰａｇｉｔの値と比して、イジェクション工程の時間の前半部分のΔｔ１期間中に計測されたＰｅｊｅｃｔの値は、有意な差を示さなかった、
（２）イジェクション工程の後半部分のΔｔ２期間中に、プランジャ１３ａの前進移動が終了した以降に続く溶媒の管外への排出（以下「緩和」）が認められなかった。
【００７０】
一方、固液分離成功と判別された組み合わせでは、Ｐｔ曲線の中に、判別式
Ｐｅ ＝ａ×（ｔ＋ｂ）２＋ｃ
ただし、係数ａ≠０である。
を用いたカーブフィットで得られる曲線、即ち放物線にフィットする曲線が含まれていた。
なお、カーブフィットには、Synergy Software社製のKaleida Graphを用いた。
以上、Ｐｔ曲線が固液分離の成功と不成功を判断するツールの役割を果たすことが確かめられた。
【００７１】
実施例２：管と担体の組み合わせによる固液分離
図４Ａ〜図４Ｃを用いて説明した固液分離成否の判定手法を用いて、より多種類の管と担体について、固液分離を行って可否を判断した。
この実施形態で、担体の種類は固有のサイズ（粒度分布）および、混合液または懸濁液中での体積分率（担体濃度）で規定される。
【００７２】
図５Ａは、そのうち実験に用いた各担体の作製に用いた篩の目開きサイズを示す説明図である。図５Ａの右上にイラストで示しているが、担体の粒径をＳ４としている。
図５Ｂは、図５Ａ所定の目開きサイズを有する篩を用いて作製した担体１番〜１０番についてレーザー回折・散乱法より粒径を測定することによって得られた担体１番〜１０番の粒度分布を示す表である。
図５Ｃは、実験に用いた管の種類を示す説明図である。管の種類は、特に固有の先端開口のサイズ（液体通過断面積）で規定される。図５Ｃの右上にイラストで示しているが、管の先端の開口径をＳ０としている。
図５Ｄは、図５Ａに示す担体と、図５Ｃに示す管の組合せで固液分離の実験を行った結果を示す表である。表および以下の記載で「◎」は固液分離良好と判断したことを示し、「〇」は固液分離可能と判断したことを示す。
【００７３】
実験は、図５Ａに示す担体群（担体１番〜９番）と図５Ｃに示す管群（Ｎ、Ａ、Ｂ、Ｏ、Ｂ１およびＢ２型）との中からそれぞれ任意に選んだ担体および管の組み合わせを選択し、選択した管を固液分離装置１１のコネクタに装着した。そして、選択した担体とＰＢＳ溶媒とを容器２３に入れて静置した。
つぎに、図２に示すようにアジテーション工程とイジェクション工程を実施してＰｔ曲線を得た。目視観察および得られたＰｔ曲線およびに基づいて固液分離の成否を判定し、図５Ｄの表を得た。
【００７４】
実験の結果から、以下のことが導かれる。
（１）固液分離を可能とする組み合わせは、ひとつまたは限定された複数ではなく、多数に及ぶ、
（２）前記のとおり、管の形状（写真等）や担体の形状（担体１番〜担体９番は二次凝集体のため形状は不定形）よりも、管の先端開口と担体の粒径との相対的なサイズの方が固液分離の成否に大きく影響している。
【００７５】
より具体的に説明すると、担体７番と管B1との組合せを用いた場合には良好な固液分離を示した一方で、担体８番と管B1との組合せを用いた場合には固液分離の成功率が低くなった(図５Ｄ)。図５Ｃによれば、担体７番のupper diameterは0.25 mmに対して担体８番のupper diameterは0.18である。そして、図５Ｃによれば、管B1の最小の開口径は0.8 mmである。これらの数値に基づいて計算すると、管の最小の開口径が粒子のupper diameterより大きく、かつ、粒子のupper diameterの６倍より小さい場合には、良好な固液分離を示すことが明らかとなった。なお、本実施例において、粒子のupper diameterは、担体作製時に用いた２つの篩のうち、大きい方の篩目サイズをいう。
【００７６】
なお、成功率とは、ある管とある担体との組み合わせに対して前記の合否判定をｎ回繰り返して行った場合、固液分離が成功した場合の数ｍの割合（ｍ÷ｎ）のことを指す。前記合否判定をそれぞれ１０回繰り返し（ｎ＝１０）、固液分離の成功率を調べた。成功率は、ｍ÷ｎの割合が５０％以上１００％以下を示した場合に「◎」、１０％以上５０％未満を示した場合に「〇」、０％を示した場合に「×」として図５Ｄに表した。なお、本実施例で用いた管と担体の組合せについては、成功率０％を示したものはなかった(図５Ｄ)。
【００７７】
また、実験に使用された管群は、以下のとおりである。
管Ｎ型；Precision Science社製、Ｆ４１００、
管Ａ型；epppendorf社製、ep T.I.PS Standard  ５０−１０００μL、
管Ｂ型；Corning社製、１００−１０００μL  Universal Fit Pipet Tips、
管Ｏ型；GILSON社製、ＣＰ−１０００のキャピラリー部、
管Ｂ１型；管Ｂ型の先端を、精密アートナイフ１５７Ｂ型（オルファ社製）を用いて、開口面と平行に輪切り加工したもの。先端の開口径Ｓ０は、加工後にノギスＣＤ−１５ＰＳＸ（ミツトヨ社製）で計測し、0.8 mm〜1.6 mmの範囲であることを確認した。
管Ｂ２型；管Ｂ型の先端を、精密アートナイフ１５７Ｂ型（オルファ社製）を用いて、開口面と平行に輪切り加工したもの。先端の開口径Ｓ０は、加工後にノギスＣＤ−１５ＰＳＸ（ミツトヨ社製）で計測し、1.6 mm〜2.4 mmの範囲であることを確認した。
【００７８】
担体は、日本化成社製メソ多孔質シリカ担体（商品名メソピュアのメソ多孔質シリカ担体（担体１〜９番）を１００ｍｇを２５０ｍｇ秤量し、それぞれ容器に移したものである。
前述のとおり、溶液中の担体の濃度も担体の種類を決める因子であるが、この因子に基づいた組み合わせの実施例は、実施例６にて後述する。
【００７９】
実施例３：担体の分散及び集合の再現性
実施例２で得られた成功率について、その実際の値が非常に高いことを次に示す。図５Ａおよび図５Ｃに記載の管を図１に記載の装置に接続して、アジテーション工程とイジェクション工程を１００回連続して繰り返した。
その結果、いずれの回数においても、合格と判定されるＰｔ曲線を示した。つまり、成功率が１００％であった。図６Ａ〜Ｃは、そのことを示すPt曲線の例示である。すなわち、図６Ａは１１〜１５回目のＰｔ曲線を、図６Ｂは１３回目のＰｔ曲線を、図６Ｃは１４回目のＰｔ曲線を示す。これらの結果は、本実施形態の固液分離が再現性良く実施できることを表している。
【００８０】
実施例４：プランジャの移動速度の検討
以上のような合格と判定されるケースが、特定のプランジャの移動速さＲｅｊｅｃｔによって限定されるか否かを検証した。方法は、実施例１に記載の方法と同一である。詳しい検証条件は、次のとおりである。
【００８１】
図５Ｃ記載の担体１番100 mgを実施例１と同様の容器に秤量し、1 mLのPBSを添加して混合液とした。管は図５Ｃに記載の管B１型（口径1.5 mm）を使用し、図１の装置のコネクタを介してポンプと接続した。アジテーション工程にともなう溶媒の吸引と吐出は、次のプランジャの移動条件の下でなされた。後進と前進が５回交互に繰り返され、さらに、1回の後進を行った。１回の前進または後進の移動体積は１０００μＬ、移動速さＲａｇｉｔは２８００μＬ／ｓであった。イジェクション工程においては、１回の前進を行い、移動体積は１０００μＬであった。その際、３０〜１２００μL/sまでの範囲のＲｅｊｅｃｔで前進するようにプランジャの移動を制御した。各移動速さでのイジェクション工程においてそれぞれＰｔ曲線を記録した。実施例１記載の方法と同様にして合否判定を行った。
【００８２】
高低いずれのプランジャ移動速さＲｅｊｅｃｔにおいても、管内でプラグが形成されるのを観察した。つまり、固液分離が成し遂げられるＲｅｊｅｃｔの条件は、広範であることが例証された(図７)。
なお、Ｒｅｊｅｃｔの値がより大きい（より速くプランジャが前進する）とき、より高い管内圧力が生ずること、あるいは、Ｒｅｊｅｃｔの値がより小さい（より遅くプランジャが前進する）とき、より長い時間（Δｔ２）を費やす圧力降下（緩和）が生ずること、が確認された。
【００８３】
実施例５：多様な撹拌(アジテーション)方法の検討
本実施形態の固液分離の成否が撹拌方法(アジテーション工程)の多様性に影響されるか否かを調査するために、以下の実験を行った。
内径１８ｍｍの円筒状の容器に担体としてイオン交換樹脂バイオレックスＭＳＺ５０１Ｄ（バイオラッド社）４．９ｇを秤量し、溶媒としてミリポア社製水精製装置MilliQ型が供給する超純水３．２ｍＬを添加した。第１の管として図５Ｃ記載の管Ｂ２型（口径２．３４ｍｍ）、第2の管として図５Ｃ記載の管B2型（口径１．８ｍｍ）を用いて、それを図１の装置に接続した。第2の管による容器内の溶媒の吸引と吐出、あるいは、第1の管と第2の管の両者による容器内の溶媒の吸引と吐出によって、懸濁液を作製した。懸濁液を第1の管で吸引してから、プラグが形成されるのを観察した。その後、所定の命令によりプランジャを前進させて、第1の管の中の懸濁液から溶媒だけを管外へ排出した。目視観察により、また、Pt曲線を用いた合否判定により、固液分離が実施されたことを証明した。
以上の結果から、溶媒または混合液または懸濁液に接する管の本数とは関係なく、本実施形態の固液分離を達成できることが示された。
【００８４】
実施例６：担体の濃度の影響
担体の濃度の影響を調査するために、以下の実験を行った。使用した担体、溶媒、管の口径を表１に示す。
【００８５】
【表１】
2018205043.tif 000003
【００８６】
表１に記載の、担体１２番（バイオラッド社製、バイオレックスＭＳＺ５０１Ｄ）を実施例５に記載の容器に、図５Ｃと表１に記載の担体１番と、表１に記載の担体１３番（粒径０．５ｍｍのジルコニア球（アズワン株式会社  型番YTZ-0.5））を実施例１で使用した容器に秤量し、表１に記載の溶媒を添加した。
表１に記載の管を図１に記載の装置のコネクタ部に接続し、実施例１と同様のアジテーション工程とイジェクション工程を適用した。イジェクション工程の前進は、２５℃（室温）、大気圧下において行った。
その結果、いずれの濃度においても、期待された担体の分散や担体の塊化が観察され、固液分離が果たされることが確認された(図８Ａ〜図８Ｃ)。
【００８７】
実施例７：担体の比重の影響
担体の比重の影響を調査するために、以下の実験を行った。使用した担体と溶媒、イジェクション時のΔVｐｌｎｇｒ とRｅｊｅｃｔを表２に示す。
まず、実施例１で使用したものと同じ容器に表２に記載の各種担体(9A〜9D)を秤量し、比重１のリン酸緩衝液(PBS)を１．５ｍＬ添加して混合液とした。各種混合液について、図５Ｃに記載の管Bを接続した装置（図１）を用いて、実施例１と同様のアジテーション工程とイジェクション工程を行った。
【００８８】
イジェクション工程の前進によるプランジャの移動体積と移動速さＲは表２に記載の通りであった。この前進は、２５℃（室温）、大気圧下において行った。
図１記載の装置によって記録されたＰｔ曲線を図９Ａ〜Ｄに示す。それらの結果から、いずれの比重の担体を用いても、期待された担体の分散や担体の塊化が観察され、固液分離を達成できることが確認された。
【００８９】
【表２】
2018205043.tif 000004
【００９０】
上記の表２中の表記について以下に説明する。
担体14番；粒径０．５ｍｍのＳＵＳ３０４球  九州ベアリング株式会社
担体15番；粒径０．５  ｍｍのアルミナ球  アズワン株式会社  型番AL9-0.5
担体16番；粒径０．５  ｍｍのポリスチレン球
PBS；10×PBS（バイオラッド社製、１６１０７８０）を超純水で10倍に希釈
【００９１】
実施例８：溶媒の比重の影響
溶媒の比重の影響を調査するために、以下の実験を行った。使用した担体と溶媒、イジェクション時のΔVｐｌｎｇｒ とRｅｊｅｃｔを表３に示す。
【００９２】
まず、実施例１で使用したものと同じ容器に比重２の担体１を１００ｇを秤量し、表３に記載の各種担体(10A〜10C)を１．５ｍＬ添加して混合液とした。各種混合液について、図５Ｃに記載の管Bを接続した装置（図１）を用いて、実施例１と同様のアジテーション工程とイジェクション工程を行った。
図１記載の装置によって記録されたＰｔ曲線を図１０Ａ〜Ｃに示す。それらの結果から、いずれの比重の溶媒を用いても、期待された担体の分散や担体の塊化が観察され、固液分離を達成できることが確認された。
【００９３】
【表３】
2018205043.tif 000005
【００９４】
上記の表３中の表記について以下に説明する。
PBS；10×PBS（バイオラッド社製、１６１０７８０）を超純水で10倍に希釈
60%CsCl；CsCl（和光純薬社製、０３４−０８１６１）を超純水で溶解
Hexan；n-Hexan（和光純薬社、０８２−００４２１）
【００９５】
実施例９：溶媒の粘度の影響
溶媒の粘度の影響を調査するために、以下の実験を行った。使用した担体と溶媒、イジェクション時のΔVｐｌｎｇｒ とRｅｊｅｃｔを表４に示す。
まず、実施例１で使用したものと同じ容器に表４に記載の各種担体(11A〜11D)を秤量し、表４に記載の各種溶媒を１．５ｍＬ添加して混合液とした。各種混合液について、図５Ｃに記載の管Bを接続した装置（図１）を用いて、実施例１と同様のアジテーション工程とイジェクション工程を行った。
【００９６】
図１記載の装置によって記録されたＰｔ曲線を図１１Ａ〜Ｄに示す。それらの結果から、いずれの粘度の溶媒を用いても、期待された担体の分散や担体の塊化が観察され、固液分離を達成できることが確認された。
【００９７】
【表４】
2018205043.tif 000006
【００９８】
上記の表４中の表記について以下に説明する。
Tween；tween−20（ナカライテスク社製、２３９２６−３５）
80%Glycerol；Glycerol（ナカライテスク社製、１７０１８−２５）を超純水で希釈
超純水 95℃；超純水をホットバス（東京理化器械社製、ＳＢ−４５０型）中に30分間静置することで調製
【００９９】
実施例１０：温度の影響
実施例１で使用したものと同じ容器に図５Ｃに記載の担体６を１００ｍｇ秤量して、超純水を１．５ｍＬ添加して得られた混合液を（ａ）アイスバス（容器に水道水と、Ｓｃｏｔｓｍａｎ社製ＡＦＥ４００型の製氷砕氷器にて作製した氷で満たしたもの）に30分間静置することで０．５℃に調製した混合液、（ｂ）室温下に静置した２５℃の混合液、（ｃ）ホットバス（東京理化器械社製ＳＢ−４５０型）中に30分間静置することで９８℃に調製した各種混合液について、図５Ｃに記載の管Bを接続した装置（図１）を用いて、実施例１と同様のアジテーション工程とイジェクション工程を行った。
【０１００】
イジェクション工程の前進によるプランジャの移動体積は１０００μＬ、移動速さＲは８００μＬ／ｓ(ただし、(a)については２８００μＬ／ｓ)であった。この前進は、２５℃（室温）、大気圧下において行った。
図１記載の装置によって記録されたＰｔ曲線を図１２Ａ〜Ｃに示す。その結果、いずれの温度下においても、期待された担体の分散や担体の塊化が観察され、固液分離を達成できることが確認された。
【０１０１】
実施例１１：界面活性剤を含む溶媒の利用可能性
溶媒に界面活性剤が含まれる場合の影響を調査するために、以下の実験を行った。
図５Ｃに記載の担体１を１００ｍｇを実施例１で使用したものと同じ容器に秤量し、溶媒としてＴｒｉｔｏｎＸ（ナカライテスク社製、商品コード：３５５０１−１５）を超純水で所定の濃度(（ａ）２０％、（ｂ）８％、（ｃ）０％)に達するまで希釈したものを１ｍＬ添加して得られた混合液を作製した。これらの混合液について、図５Ｃに記載の管B１（Ｓ０＝１．３２）を接続した装置（図１）を用いて、実施例１と同様のアジテーション工程とイジェクション工程を適用した。
【０１０２】
イジェクション工程の前進は、２５℃（室温）、大気圧下において行った。
図１に記載の装置によって記録されたＰｔ曲線を図１３Ａ〜Ｃに示す。その結果、いずれの溶媒を用いても、期待された担体の分散や担体の塊化が観察され、固液分離を達成できることが確認された。
【０１０３】
実施例１２：固液分離に使用可能な担体の種類の範囲の拡大化
ある管との組み合わせにおいて固液分離が不成功、即ち、不合格と判別された担体が、支持体と併用されることによって、固液分離が可能になるか否かを調査するために、以下の実験を行った。
【０１０４】
まず、実施例１で使用したものと同じ容器に、管Ｂに対して不合格の担体として図５Ｃ記載の担体１０を、合格の担体(支持体)として図５Ｃ記載の担体２と同じ担体を用いた。担体１０を１００ｍｇ、担体２と同じ担体を１０ｍｇ秤量し、これらを混合して担体と支持体との混合物を作製した(図１４Ａ)。各種担体及び混合物にＰＢＳをそれぞれ１．５ｍＬ添加して混合液とした。得られた各種混合液について、図５Ｃに記載の管Bを接続した装置（図１）を用いて、実施例１と同様のアジテーション工程とイジェクション工程を行った。イジェクション工程の前進は、２５℃（室温）、大気圧下において行った。
【０１０５】
図１に記載の装置によって記録されたＰｔ曲線を図１４Ｂ〜Ｄに示す。その結果、事前の判定の通り、不合格となった担体に対しては塊化が観察されず（図１４Ｂ）、合格となった担体に対しては本発明の固液分離が観察された（図１４Ｃ）。また、上記の担体及び支持体の混合物を用いた場合には固液分離が果たされることが確認された（図１４Ｄ）。
不合格と判定された担体であっても、合格となった担体を支持体として添加することによって、固液分離を達成可能になることが実証された。つまり、支持体を添加するという簡単な操作のみで、本発明の固液分離において取り扱える担体の範囲を、大きく広げられることが明らかとなった。
【０１０６】
実施例１３：副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)ペプチドの精製
本実施形態の固液分離を利用することで、ＡＣＴＨペプチドを含む液体試料から塩を除去し、ＡＣＴＨペプチドを精製画分として回収することが可能であるか調査した。
（１）TMR-ACTHペプチドを含む液体試料の調製
標的分子として、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）の1位〜24位のアミノ酸からなるACTH部分ペプチドをテトラメチルローダミン（TMR）で標識したTMR-ACTHペプチド（株式会社スクラム製）を用いた。なお、ACTHは塩基性ペプチド（等電点pI=10.64）であり、配列番号１で表される。TMR-ACTHペプチドの最終濃度が50 nMとなるように、PBS（バイオラッド社製、１６１０７８０）に溶解し、TMR-ACTHペプチドを含む液体試料を調製した。
【０１０７】
（２）TMR-ACTHペプチドを含む液体試料の脱塩処理（シリアルダイリューション式）
TMR-ACTHペプチドを含む液体試料を、本実施形態の固液分離を用いる図１５に記載の工程（以下、シリアルダイリューション式のＢＦ分離操作という）により脱塩処理した。一連の工程は、図１に記載の装置を用いて行った。担体として、細孔径4 nmの日本化成社製のメソ多孔質シリカ担体の表面にアミノシリル基修飾を有するもの（以下、アミノシリル基修飾シリカ担体という）を用いた。図５Ｃ記載の管Ｂ型の管と、実施例１で使用したものと同じ容器を用いた。
【０１０８】
図１５に記載のシリアルダイリューション式のＢＦ分離操作の各工程(i)〜(iii)について以下に説明する。
(i)  吸着工程
TMR-ACTHペプチドを含む液体試料（F0）1.5 mLを、担体100 mgを収容した容器に添加した。アジテーション工程によりTMR-ACTHペプチドを担体に吸着させて、担体を含む液体試料を管内に吸引した。管を容器から引き上げ、管の口部へと担体を沈降させ、プラグが形成されるのを観察した。その後、イジェクション工程により液体のみを吐出した。吐出した液体をフロースルー画分（F1）として回収した。
【０１０９】
(ii)  水洗工程
吐出後の管をイオン交換水1 mLが入った実施例１と同様の容器に浸し、吸排操作を繰り返すことによって攪拌し、塩類を洗い流した。担体とイオン交換水との懸濁液を管内に吸引し、管を容器から引き上げ、管の口部へと担体を沈降させ、プラグが形成されるのを観察した。その後、イジェクション工程により液体のみを吐出した。吐出した液体をすすぎ水画分（F2-1）として回収した。同様の水洗工程をさらに2回繰り返し行った。図１５では、２回目及び３回目の水洗工程で得られたすすぎ水画分を、それぞれF2-2およびF2-3と表記している。
【０１１０】
(iii)  溶出工程
吐出後の管を、ペプチド溶出用の脱着液(溶出液)｛50％アセトニトリル（和光純薬社製、０１９−２１６９１）と０.１%トリフルオロ酢酸（和光純薬社製、２０６−１０７３１）とを含む水溶液｝1 mLの入った実施例１と同様の容器に浸し、アジテーションにより攪拌し、担体に吸着したペプチドを溶出させた。担体と脱着液との懸濁液を管内に吸引し、管を容器から引き上げ、管の口部へと担体を沈降させ、プラグが形成されるのを観察した。その後、イジェクション工程により液体のみを吐出した。吐出した液体を精製画分（F3）として回収した。
【０１１１】
（３）導電率の測定
脱塩処理前の液体試料（F0）及び脱塩処理後の精製画分（F3）について、導電率を測定した。導電率計はTwin Cond B-173（株式会社堀場製作所）を用いた。ここで、脱塩処理前の溶媒が水であるのに対して、脱塩処理後の溶媒は50％アセトニトリル／0.1％TFA溶液である。よって、脱塩処理後の導電率値は、測定値から50％アセトニトリル／0.1％TFA溶液の導電率値（2.0 mS/cm）を差し引いた値を示した。
【０１１２】
得られた導電率から、下記の式１に従って、本脱塩処理による脱塩効率を算出した。
脱塩効率（％）＝（脱塩処理前の導電率−脱塩処理後の導電率）／（脱塩処理前の導電率）×100  ・・・  式１
導電率と脱塩効率を下記の表５に示す。なお、F3の導電率は、アセトニトリル自体の導電率（2.0 mS/cm）を差し引いたためにマイナスの値になった。引き算前の値は1.72 mS/cmであった。
【０１１３】
【表５】
2018205043.tif 000007
【０１１４】
（４）蛍光強度の測定
脱塩処理前の液体試料（F0）及び脱塩処理後の精製画分（F3）について、蛍光強度を測定した。分光蛍光光度計はF-7000（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を用いて、励起波長480 nmおよび蛍光波長580 nmでの蛍光強度を測定した。
得られた蛍光強度から、下記の式２に従って、本脱塩処理によるペプチド回収率を算出した。
ペプチド回収率（％）＝（脱塩処理後における蛍光強度）／（脱塩処理前における蛍光強度）×100  ・・・  式２
蛍光スペクトルを図１６に、蛍光強度とペプチド回収率を下記の表６に示す。
【０１１５】
【表６】
2018205043.tif 000008
【０１１６】
表５に示されるように、ＢＦ分離操作によって精製画分F3は十分に脱塩されていた。また、表６に示されるように、脱塩処理後の精製画分F3からは、TMRに起因する蛍光が観測され、精製画分F3中にTMR-ACTHペプチドが含まれていた。これらの結果から、本実施形態の固液分離を利用したシリアルダイリューション式のＢＦ分離操作により、液体試料中の塩を取り除き、ＡＣＴＨペプチドを精製画分として回収できることが明らかとなった。
【０１１７】
実施例１４：癌胎児性抗原(ＣＥＡ)ペプチドの精製
本実施形態の固液分離を利用することで、ＣＥＡペプチドを含む液体試料から塩を除去し、ＣＥＡペプチドを精製画分として回収することが可能であるか調査した。
（１）TMR-CEAペプチドを含む液体試料の調製
標的分子として、癌胎児性抗原（CEA）の132位〜171位のアミノ酸からなるCEA部分ペプチドをTMRで標識したTMR-CEAペプチド（株式会社スクラム製）を用いた。なお、CEAは酸性ペプチド（等電点pI=4.38）であり、配列番号２で表される。TMR-CEAペプチドの最終濃度が2.5μMとなるように、PBSに溶解し、TMR-CEAペプチドを含む液体試料を調製した。
【０１１８】
（２）TMR-CEAペプチドを含む液体試料の脱塩処理
TMR-ACTHペプチドを含む液体試料に代えて上記（１）で調製したTMR-CEAペプチドを含む液体試料を用いたこと、担体として、細孔径4 nmの日本化成社製メソ多孔質シリカ担体（商品名メソピュア：図５Ａ記載の担体の名称が「１」のもの）の表面にオクタデシルシリル基（ODS）修飾を有するもの（ODS修飾シリカ担体）を用いたことを除いては、実施例１３と同様に、図１５に記載のシリアルダイリューション式のＢＦ分離操作で脱塩処理を実施した。
【０１１９】
（３）導電率の測定
脱塩処理前の液体試料F0及び脱塩処理後の精製画分F3について、実施例１３と同様の方法で導電率を測定した。得られた導電率から、実施例１３に記載の式１に従って、本脱塩処理による脱塩効率を算出した。導電率と脱塩効率を下記の表７に示す。なお、F3の導電率は、アセトニトリル自体の導電率（2.0 mS/cm）を差し引いたためにゼロになった。引き算前の値は2 mS/cmであった。
【０１２０】
【表７】
2018205043.tif 000009
【０１２１】
（４）蛍光強度の測定
脱塩処理前の液体試料F0及び脱塩処理後の精製画分F3について、実施例１３と同様の方法で励起波長480 nmおよび蛍光波長580 nmでの蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度から、実施例１３に記載の式２に従って、本脱塩処理によるペプチド回収率を算出した。
蛍光スペクトルを図１７に、蛍光強度とペプチド回収率を下記の表８に示す。
【０１２２】
【表８】
2018205043.tif 000010
【０１２３】
その結果、表７に示されるように、ＢＦ分離操作によって精製画分F3は十分に脱塩されていた。また、表８に示されるように、脱塩処理後の精製画分F3からは、TMRに起因する蛍光が観測され、精製画分F3中にTMR-CEAペプチドが含まれていた。これらの結果から、本実施形態の固液分離を利用したシリアルダイリューション式のＢＦ分離操作により、液体試料中の塩を取り除き、ＣＥＡペプチドを精製画分として回収できることが明らかとなった。
【０１２４】
実施例１５：ペプチドの選択的精製
ＢＮＰと比較してＡＣＴＨに対して高い親和性をもつ担体を使用して、ＡＣＴＨとＢＮＰペプチドを含む液体試料から、本実施形態の固液分離を利用したＢＦ分離操作による精製画分におけるＢＮＰとＡＣＴＨの回収率の差を調査した。
（１）ペプチド混合物を含む液体試料の調製
標的分子として、TMR-ACTHペプチドと脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）（株式会社スクラム製）を用いた。なお、BNPは塩基性ペプチド（等電点pI=10.95）であり、配列番号３で表される。TMR-ACTHペプチドの最終濃度が5μM、BNPペプチドの最終濃度が100μMとなるようにPBSに溶解し、ペプチド混合物を含む液体試料を調製した。
【０１２５】
（２）ペプチド混合物を含む液体試料からの対象ペプチドのBF分離処理
ペプチド混合物を含む液体試料を、実施例１３と同様の方法でBF分離処理した。用いた担体はODS修飾シリカ担体である。
【０１２６】
（３）ペプチドの検出
BF分離処理前後の各画分［BF分離処理前（F0）、BF分離処理工程中のフロースルー画分（F1）とすすぎ水画分｛F2； 3つのすすぎ水画分（F2-1、F2-2およびF2-3）を等量ずつ混合した｝、および、BF分離処理後の精製画分（F3）］について、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行った。具体的には、10xローディングバッファー（タカラバイオ株式会社）および60％(w/w)グリセロール溶液の1:1混合物であるサンプルバッファー（還元剤非添加）と上記の各画分とを混合し、ニューページ4-12％ビス-トリスゲルおよびニューページMES SDSランニングバッファー（共にライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて200 V（定電圧）で30分間、電気泳動を行った。泳動槽はエクセルシュアロックミニセル（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、電源装置はパワーステーション1000XP（アトー株式会社）を用いた。電気泳動後のゲルについて、TMR-ACTHペプチドを蛍光イメージャーPharos FX システム（バイオラッドラボラトリーズ株式会社）を用いて検出した。
【０１２７】
また、BNPペプチドを銀染色により検出した。銀染色には銀染色キット「イージーステインシルバー」（アトー株式会社）を用いた。染色の各工程は以下の通りである。固定；固定液 100 mL｛超純水40 mL＋メタノール（和光純薬工業株式会社） 50 mL＋酢酸（和光純薬工業株式会社）10 mL＋キット瓶S-1 1 mL｝で10分間振とう、洗浄；超純水100 mLで10分間振とう×3回、染色；染色液（超純水100 mL＋キット瓶S-2 1 mL）で10分間振とう、洗浄；超純水100 mLで30秒間振とう、発色液100 mL（超純水200 mL＋キット瓶S-3 1 mL＋キット瓶S-4 1 mL）で30秒間振とう、発色；発色液 100 mLで5〜10分間振とう、停止；停止液 100 mL（超純水100 mL＋酢酸1 mL）で10分間振とう、洗浄；超純水100 mLで5分間振とう×2回。振とう機はインビトロシェーカーWave-SI（タイテック株式会社）を用いた。
【０１２８】
ゲルの蛍光イメージング像および銀染色像について、画像処理ソフトウェアImageJ 1.46r（NIH）を用いてTMR-ACTHペプチドあるいはBNPペプチドのバンドのデンシトメトリー値を求め、回収率を下記の式３に従って算出した。
回収率（％）＝（各画分でのデンシトメトリー値）／（BF分離処理前のデンシトメトリー値）×100  ・・・  式３
ゲルの蛍光イメージング像と銀染色像を図１８および図１９に、TMR-ACTHペプチドあるいはBNPペプチドの回収率を下記の表９に示す。
【０１２９】
【表９】
2018205043.tif 000011
【０１３０】
その結果、本実施形態の固液分離を利用したシリアルダイリューション式のＢＦ分離操作により、ＡＣＴＨとＢＮＰペプチドを含む液体試料から、担体のＡＣＴＨとＢＮＰに対する親和性の差に従って、精製画分としてＢＮＰよりもＡＣＴＨが選択的に回収されることが示された。
【０１３１】
実施例１６：ペプチドの選択的精製
ＡＣＴＨに対して高い親和性をもち、λＤＮＡに対して低い親和性を持つ担体を使用して、本発明の固液分離を利用したＢＦ分離操作により、ＡＣＴＨとλＤＮＡを含む液体試料からＡＣＴＨを選択的に精製画分として回収可能であるかを調査した。
（１）ペプチドと核酸とを含む液体試料の調製
標的分子として、TMR-ACTHペプチドを用いた。夾雑物として、バクテリオファージλ由来の直鎖状核酸で、48,502塩基長からなるλDNA（タカラバイオ株式会社製、型番：３０１０）を用いた。TMR-ACTHペプチドの最終濃度が5μM、λDNAの最終濃度が50μg/mLとなるようにPBSに溶解し、ペプチドと核酸とを含む液体試料を調製した。
【０１３２】
（２）ペプチドと核酸とを含む液体試料からのペプチドのBF分離処理
ペプチドと核酸とを含む液体試料を、実施例１３と同様の方法でBF分離処理した。担体として、細孔径4 nmの、化学修飾を有さないメソ多孔質シリカ担体、すなわち部材表面にシラノール基を有する無修飾シリカ担体(日本化成社製)を用いた。
【０１３３】
（３）ペプチドおよび核酸の検出
BF分離処理前後の各画分［BF分離処理前（F0）、BF分離処理工程中のフロースルー画分（F1）とすすぎ水画分｛F2； 3つのすすぎ水画分（F2-1、F2-2およびF2-3）を等量ずつ混合した｝、および、BF分離処理後の精製画分（F3）］について、SDS-PAGEあるいはアガロースゲル電気泳動を行った。SDS-PAGEは実施例１５と同様の方法で行った。アガロースゲル電気泳動は、具体的には、アガロース（タカラバイオ株式会社）とトリス酢酸EDTA（TAE）バッファー（和光純薬工業株式会社）を混合し、加熱溶解後にゲルトレイ（株式会社ミューピッド）中で固めて1%アガロースゲルを作成した。6xローディングバッファー（タカラバイオ株式会社）と上記の各画分とを混合し、作製した1%アガロースゲルとTAEバッファーを用いて100 V（定電圧）で40分間、電気泳動を行った。電源装置付泳動槽はMupid-2plus（株式会社ミューピッド）を用いた。電気泳動後のゲルについて、核酸蛍光染色剤SYBR Green II（ロンザジャパン株式会社）でλDNAを染色し、蛍光イメージャーImage Quant LAS4000（GEヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて検出した。λDNAの染色は、1xSYBR Green II／TAEバッファー中でゲルを60分間振とうして行った。振とう機はインビトロシェーカーWave-SIを用いた。
【０１３４】
ゲルの蛍光イメージング像について、実施例１５と同様の方法でTMR-ACTHペプチドあるいはλDNAの回収率を算出した。
ゲルの蛍光イメージング像を図２０および図２１に、TMR-ACTHペプチドあるいはλDNAの回収率を下記の表１０に示す。
【０１３５】
【表１０】
2018205043.tif 000012
【０１３６】
その結果、本実施形態の固液分離を利用したＢＦ分離操作により、ＡＣＴＨペプチドとλＤＮＡを含む液体試料の中から、精製画分としてＡＣＴＨを選択的に回収できることが示された。
【０１３７】
実施例１７：血液試料からのペプチドの精製
特開２０１５−１４０３２０号に記載の方法に従って、全血を処理することにより得られたペプチドの液（以下、ペプチドスープともいう）中の塩を取り除き、精製画分としてペプチドを取り出すことが可能であるかを調査した。
（１）ペプチドと全血とを含む液体試料の調製
標的分子として、ＡＣＴＨの１位〜２４位のアミノ酸からなるＡＣＴＨ部分ペプチドを、赤色蛍光色素であるテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）で標識したＴＭＲ−ＡＣＴＨ部分ペプチド（株式会社バイオロジカ）を用いた。夾雑物として、抗凝固剤EDTA塩が添加された健常ボランティア血液（全血）をPROMEDDX社から購入して用いた。特開２０１５−１４０３２０号に記載の方法に従って、TMR-ACTHペプチドの最終濃度が5μM、全血が３倍希釈となるように、TMR-ACTH部分ペプチドおよび全血を、塩化亜鉛を含有するトリス−リン酸混合系緩衝液（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ［ｐＨ＝７．０］（最終濃度１００  ｍＭ）、リン酸ナトリウム（最終濃度０．４  ｍＭ）、ＮａＣｌ  （最終濃度６  ｍＭ）、そしてＺｎＣｌ2（最終濃度１００  ｍＭ））に溶解し、ペプチドと全血とを含む液体試料を調製した。
【０１３８】
（２）ペプチドと全血とを含む液体試料の加熱処理
ペプチドと全血とを含む液体試料１．４  ｍＬを10 mL容のガラス試験管に移し、次にテフロン(登録商標)製の試験管用耐圧密封ホルダー（マイルストーンゼネラル株式会社）にて封じてから、マイクロ波照射装置MultiSYNTH（マイルストーンゼネラル株式会社）を用いて、室温(25℃)から100℃まで30秒間で昇温し、その後100℃から160℃まで１分間で昇温することにより加熱処理を行った。加熱処理後の冷却は、前記のマイクロ波照射装置に接続されたエアコンプレッサーYC-3R（株式会社八重崎空圧）から圧縮空気を前記の耐圧密封ホルダーに吹き付けることで行った。冷却速度は、毎分20℃とした。加熱処理後の上清画分であるペプチドスープを回収した。
【０１３９】
（３）ペプチドと全血とを含む液体試料の加熱処理上清の脱塩処理
ペプチドと全血とを含む液体試料の加熱処理上清（ペプチドスープ）を、実施例１３と同様のＢＦ分離操作で脱塩処理した。用いた担体はODS修飾シリカ担体である。
【０１４０】
（４）導電率の測定
脱塩処理前後の各画分｛脱塩処理前（F0）、脱塩処理工程中のフロースルー画分（F1）とすすぎ水画分（F2-1，F2-2，F2-3）、および、脱塩処理後の精製画分（F3）｝について、実施例１３と同様の方法で導電率を測定し、本脱塩処理による脱塩効率を算出した。
導電率と脱塩効率を下記の表１１に示す。
【０１４１】
【表１１】
2018205043.tif 000013
【０１４２】
（５）蛍光強度の測定
脱塩処理前後の各画分｛脱塩処理前（F0）、脱塩処理工程中のフロースルー画分（F1）とすすぎ水画分（F2-1，F2-2，F2-3）、および、脱塩処理後の精製画分（F3）｝について、実施例１３と同様の方法で蛍光強度を測定し、本脱塩処理によるペプチド回収率を算出した。蛍光強度測定において、TMR-ACTHペプチドの検出では励起波長540 nmおよび蛍光波長580 nm、また、全血由来ペプチドの検出では励起波長287 nmおよび蛍光波長350 nmとした。
蛍光スペクトルを図２２および図２３に、蛍光強度とペプチド回収率を下記の表１２に示す。
【０１４３】
【表１２】
2018205043.tif 000014
【０１４４】
その結果、本発明の固液分離を利用したシリアルダイリューション式のＢＦ分離操作によって、特開２０１５−１４０３２０号に記載の方法に従って全血から調製した液中の塩の除去を行い、ＡＣＴＨや全血由来のペプチドを精製画分として回収できることが示された。
【０１４５】
実施例１８：多様な担体を用いてのTMR-ACTHペプチドの精製
ＡＣＴＨに対して高い親和性をもつことが確認されている３種類の担体を使用して、特開２０１５−１３７９７８号に記載の試薬中で加熱処理を行って得られた液中の塩を、本発明の固液分離を利用したＢＦ分離操作によって除去することが可能であるかを調査した。さらに、３種類の担体による回収率の差を調査した。
【０１４６】
（１）ペプチドと全血とを含む液体試料の調製
標的分子として、TMR-ACTHペプチドを用いた。夾雑物として、実施例１７と同様の全血を用いた。両者を共に、グリシンを含有する０．５×リン酸緩衝性生理食塩水（０．５×ＰＢＳ［ｐＨ＝７．４］、塩化ナトリウム（最終濃度６８．５  ｍＭ）、リン酸水素二ナトリウム（最終濃度４  ｍＭ）、塩化カリウム（最終濃度１．３  ｍＭ）、リン酸二水素カリウム（最終濃度０．７  ｍＭ、そしてグリシン（最終濃度５００  ｍＭ））に溶解し、ペプチドと全血とを含む液体試料を調製した。
（２）ペプチドと全血とを含む液体試料の加熱処理
ペプチドと全血とを含む液体試料を実施例１７と同様の方法で加熱処理を行いさらにそのまま１６０℃で６０秒間保持することで、加熱処理後の上清画分を回収した。
【０１４７】
（３）ペプチドと全血とを含む液体試料の加熱処理上清の脱塩処理（リテンションバック式）
ペプチドと全血とを含む液体試料の加熱処理上清を、本実施形態の固液分離を用いた図２４に記載の工程（以下、リテンションバック式のＢＦ分離操作）により脱塩処理した。一連の工程は、図１記載の装置を用いて行った。担体として、無修飾シリカ担体、ODS修飾シリカ担体、あるいは、アミノシリル基修飾シリカ担体を用いた。管として図５Ｃ記載の管Ｂ１型（口径１．３４ｍｍ）を、容器として実施例１と同様の容器を使用した。一連の工程の概略図と工程中に生じる各画分の名称を図２４に示した。
【０１４８】
図２４に記載のリテンションバック式のＢＦ分離操作の各工程(i)〜(iii)について以下に説明する。
(i)  吸着工程
TMR-ACTHペプチドと全血とを含む液体試料（F0）1.5 mLを、担体100 mgを秤量した実施例１と同様の容器に添加した。混合液を攪拌し、TMR-ACTHペプチドを担体に吸着させて、担体を含む液体試料を管内に吸引した。担体を含む液体試料を吸引した後の容器内に僅かに残る担体を含む液体試料を残渣（R0）とした。管を容器から引き上げ、静置し、管の口部へと担体を沈降させ、プラグが形成されるのを観察した。その後、溶媒を吐出した。吐出した溶媒をフロースルー画分（F1）として回収した。
【０１４９】
(ii)  水洗工程
水洗用のイオン交換水1 mLを前述の残渣（R0）に添加した後、管内でプラグ形成した担体をイオン交換水中で攪拌し、塩類を洗い流した。撹拌された液を管内に吸引し、管を容器から引き上げ、静置し、管の口部へと担体を沈降させ、プラグが形成されるのを観察した。その後、溶媒を吐出した。吐出した溶媒をすすぎ水画分（F2）として回収した。担体を含むイオン交換水を吸引した後の1.5 mL容器内に僅かに残る担体を含むイオン交換水を残渣（R0）とした。同様の水洗工程をさらに2回繰り返した。
【０１５０】
(iii)  溶出工程
ペプチド溶出用の脱着液1 mLを、上記の水洗工程によって最終的に得られた残渣（R0）に添加した後、担体を脱着液中で攪拌し、担体に吸着したペプチドを溶出させた。担体と脱着液との混液を管内に吸引し、管を容器から引き上げ、静置し、管の口部へと担体を沈降させ、プラグが形成されるのを観察した。その後、溶媒を吐出した。吐出した液体を精製画分（F3）として回収した。
【０１５１】
（４）導電率の測定
無修飾シリカ担体、ODS修飾シリカ担体、あるいは、アミノシリル基修飾シリカ担体を用いた脱塩処理前後の各画分｛脱塩処理前（F0）および脱塩処理後の精製画分（F3）｝について、実施例１３と同様の方法で導電率を測定した。導電率を下記の表１３に示す。なお、F3の導電率は、アセトニトリル自体の導電率（2.0 mS/cm）を差し引いたためにマイナスの値になった。引き算前の値は1.18 mS/cm。
【０１５２】
【表１３】
2018205043.tif 000015
【０１５３】
（５）蛍光強度の測定
無修飾シリカ担体、ODS修飾シリカ担体、あるいは、アミノシリル基修飾シリカ担体を用いた脱塩処理前後の各画分｛脱塩処理前（F0）および脱塩処理後の精製画分（F3）｝について、実施例１３と同様の方法で蛍光強度を測定し、ペプチド回収率を算出した。
蛍光強度測定において、TMR-ACTHペプチドの検出では励起波長540 nmおよび蛍光波長580 nm、また、全血由来ペプチドの検出では励起波長287 nmおよび蛍光波長350 nmとした。
また、算出したペプチド回収率から、下記の式４に従って、本脱塩処理後のTMR-ACTHペプチドと全血由来ペプチドとの比率の違いを算出した。
TMR-ACTHペプチド／全血由来ペプチド回収率比＝（TMR-ACTHペプチドの回収率）／（全血由来ペプチドの回収率）・・・  式４
【０１５４】
無修飾シリカ担体を用いた本脱塩処理前後の蛍光スペクトルを図２５および図２６に、ODS修飾シリカ担体を用いた本脱塩処理前後の蛍光スペクトルを図２７および図２８に、アミノシリル基修飾シリカ担体を用いた本脱塩処理前後の蛍光スペクトルを図２９および図３０に示す。また、蛍光強度とペプチド回収率を下記の表１４〜１６に、TMR-ACTHペプチド／全血由来ペプチド回収率比を下記の表１７に示す。
【０１５５】
【表１４】
2018205043.tif 000016
【０１５６】
【表１５】
2018205043.tif 000017
【０１５７】
【表１６】
2018205043.tif 000018
【０１５８】
【表１７】
2018205043.tif 000019
【０１５９】
その結果、本実施形態の固液分離を利用したリテンションバック式のＢＦ分離操作によって、特開２０１５−１３７９７８号に記載の方法に従って、全血から得られた液中の塩の除去が可能であった。さらに、３種類の担体の間で、ＡＣＴＨの回収率に大きな差は無かったが、いずれの担体においても大量の全血由来ペプチドに対して、ＡＣＴＨを選択的に回収し、結果、精製画分中におけるペプチド中のＡＣＴＨの濃縮が可能であることが示された。
【０１６０】
この発明の好ましい態様には、上述した複数の態様のうちの何れかを組み合わせたものも含まれる。
前述した実施の形態の他にも、この発明について種々の変形例があり得る。それらの変形例は、この発明の範囲に属さないと解されるべきものではない。この発明には、請求の範囲と均等の意味および前記範囲内でのすべての変形とが含まれるべきである。
【符号の説明】
【０１６１】
１１：固液分離装置、    １３：吸引部、    １３ａ：プランジャ、    １３ｂ：シリンジ、    １３ｃ：プランジャ駆動モータ、    １５：制御部、    １７：容器支持体
２１：吸引ノズル、    ２３：容器、    ２５ａ：ノズルスタンド、    ２５ｂ：テーブル駆動モータ、    ２７：容器支持体、    ２９：昇降機構、    ２９ａ：スクリューシャフト、    ２９ｂ：スクリューナット、    ２９ｃ：シャフト軸受、    ２９ｄ：シャフト駆動モータ、    ３１：圧力センサ、    ４０：試薬キット、    ４１：第１容器、    ４２：第２容器、    ４３：添付文書、    ４４：梱包箱
【図１】
2018205043.tif 000020
【図２】
2018205043.tif 000021
【図３】
2018205043.tif 000022
【図４Ａ】
2018205043.tif 000023
【図４Ｂ】
2018205043.tif 000024
【図４Ｃ】
2018205043.tif 000025
【図５Ａ】
2018205043.tif 000026
【図５Ｂ】
2018205043.tif 000027
【図５Ｃ】
2018205043.tif 000028
【図５Ｄ】
2018205043.tif 000029
【図６Ａ】
2018205043.tif 000030
【図６Ｂ】
2018205043.tif 000031
【図６Ｃ】
2018205043.tif 000032
【図７】
2018205043.tif 000033
【図８Ａ】
2018205043.tif 000034
【図８Ｂ】
2018205043.tif 000035
【図８Ｃ】
2018205043.tif 000036
【図９Ａ】
2018205043.tif 000037
【図９Ｂ】
2018205043.tif 000038
【図９Ｃ】
2018205043.tif 000039
【図９Ｄ】
2018205043.tif 000040
【図１０Ａ】
2018205043.tif 000041
【図１０Ｂ】
2018205043.tif 000042
【図１０Ｃ】
2018205043.tif 000043
【図１１Ａ】
2018205043.tif 000044
【図１１Ｂ】
2018205043.tif 000045
【図１１Ｃ】
2018205043.tif 000046
【図１１Ｄ】
2018205043.tif 000047
【図１２Ａ】
2018205043.tif 000048
【図１２Ｂ】
2018205043.tif 000049
【図１２Ｃ】
2018205043.tif 000050
【図１３Ａ】
2018205043.tif 000051
【図１３Ｂ】
2018205043.tif 000052
【図１３Ｃ】
2018205043.tif 000053
【図１４Ａ】
2018205043.tif 000054
【図１４Ｂ】
2018205043.tif 000055
【図１４Ｃ】
2018205043.tif 000056
【図１４Ｄ】
2018205043.tif 000057
【図１５】
2018205043.tif 000058
【図１６】
2018205043.tif 000059
【図１７】
2018205043.tif 000060
【図１８】
2018205043.tif 000061
【図１９】
2018205043.tif 000062
【図２０】
2018205043.tif 000063
【図２１】
2018205043.tif 000064
【図２２】
2018205043.tif 000065
【図２３】
2018205043.tif 000066
【図２４】
2018205043.tif 000067
【図２５】
2018205043.tif 000068
【図２６】
2018205043.tif 000069
【図２７】
2018205043.tif 000070
【図２８】
2018205043.tif 000071
【図２９】
2018205043.tif 000072
【図３０】
2018205043.tif 000073