(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な発作関連６ホモログ（ＳＥＺ６）モジュレーターの提供。【解決手段】単離されたＳＥＺ６モジュレーター。ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含んでもよい。抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含んでもよい。モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択されてもよい。抗体及びその誘導体を含むモジュレーター、並びに増殖性障害を治療するためのかかるモジュレーターの使用方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＳＥＺ６モジュレーター。
【請求項２】
前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
【請求項３】
前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項２に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される、請求項３に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体又はその免疫反応性断片が、ＳＥＺ６タンパク質ｓｕｓｈｉドメイン又はｃｕｂドメインに結合する、請求項３又は４に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
【請求項６】
前記抗体又はその免疫反応性断片が、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖及び軽鎖相補性決定領域が、図１０Ａ又は図１０Ｂに示される少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項２〜５のいずれかに記載の単離ＳＥＺ６抗体モジュレーター。
【請求項７】
ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００からなる群から選択される参照抗体と、ＳＥＺ６タンパク質との結合について競合する、請求項２〜５のいずれかに記載の単離ＳＥＺ６抗体モジュレーターであって、前記ＳＥＺ６抗体モジュレーターと前記ＳＥＺ６タンパク質の結合が少なくとも３０％阻害される、単離ＳＥＺ６抗体モジュレーター。
【請求項８】
前記抗体がインターナライズ抗体を含む、請求項２〜７のいずれかに記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
【請求項９】
前記抗体が細胞傷害剤をさらに含む、請求項２〜８のいずれかに記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
【請求項１０】
請求項１〜８に記載の抗体又はその免疫反応性断片のアミノ酸重鎖可変領域又はアミノ酸軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１２】
式：
Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
の抗体薬コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩であって、式中、
ａ）ＭがＳＥＺ６モジュレーターを含み；
ｂ）Ｌが任意選択のリンカーを含み；
ｃ）Ｄが抗増殖剤であり；及び
ｄ）ｎが約１〜約２０の整数である、
抗体薬コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１３】
前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含み、前記抗体又はその免疫反応性断片が、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖及び軽鎖相補性決定領域が、図１０Ａ又は図１０Ｂに示される少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１２に記載の抗体薬コンジュゲート。
【請求項１４】
前記ＳＥＺ６モジュレーターがインターナライズ抗体を含む、請求項１２又は１３に記載の抗体薬コンジュゲート。
【請求項１５】
医薬に使用される、請求項１〜９のいずれかに記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター又は請求項１２若しくは１４に記載の抗体薬コンジュゲート。
【請求項１６】
患者における癌の治療用の、請求項１〜９のいずれかに記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター又は請求項１２若しくは１４に記載の抗体薬コンジュゲートであって、前記癌が、副腎癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選択される、単離ＳＥＺ６モジュレーター又は抗体薬コンジュゲート。
【請求項１７】
必要とする対象における小細胞肺癌の治療用医薬を製造するためのＳＥＺ６モジュレーターの使用。
【請求項１８】
前記ＳＥＺ６モジュレーターがモノクローナル抗体を含む、請求項１７に記載の医薬。
【請求項１９】
前記ＳＥＺ６モジュレーターがＳＥＺ６タンパク質ｓｕｓｈｉドメイン又はｃｕｂドメインと結合する、請求項１７又は１８のいずれかに記載の医薬。
【請求項２０】
前記ＳＥＺ６モジュレーターが細胞傷害剤を含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６０３，２０３号明細書からの優先権を主張し、この仮特許出願は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ−ＷｅｂからＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、これは本明細書によって全体として参照により援用される。２０１３年２月１９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは名称が１１２００．００１４−００３０４であり、サイズが４５０，０１３バイトである。
【０００３】
本願は、概して、増殖性障害及びその任意の拡大、再発、再燃又は転移の診断、予防、治療又は改善における新規化合物、組成物及びその使用方法に関する。広義の態様において、本発明は、新生物性障害の治療、診断又は予防のための、抗ＳＥＺ６抗体及び融合コンストラクトを含めた、発作関連６ホモログ（ＳＥＺ６）モジュレーターの使用に関する。本発明の選択された実施形態は、好ましくは腫瘍開始細胞頻度の低減を含む免疫療法的な悪性腫瘍治療のための、抗体薬コンジュゲートを含めたかかるＳＥＺ６モジュレーターの使用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞及び前駆細胞分化並びに細胞増殖は、正常な持続的過程であり、あらゆる生物の生存期間中ほとんどの組織の器官形成並びに細胞置換及び修復において、協働して作用することにより組織成長を支援する。通常のイベントの経過では、多数の因子及びシグナルが概して細胞運命決定及び組織構造を維持するように均衡を保つことにより、細胞分化及び増殖が制御される。従って、生物の必要性に基づき適切にシグナルを発生する細胞分裂及び組織成熟を調節するのは、この制御された微小環境によるところが大きい。これに関して、細胞増殖及び分化は、通常、損傷した若しくは瀕死の細胞を置換するのに必要か又は成長に必要な場合にのみ行われる。残念ながら、例えば種々のシグナル伝達化学物質の不足又は過剰、変化した微小環境の存在、遺伝子突然変異又はそれらの何らかの組み合わせを含む無数の要因により、細胞増殖及び／又は分化の破壊が起こり得る。正常な細胞増殖及び／又は分化が妨害され又は何らかの形で乱されると、癌などの増殖性障害を含む様々な疾患又は障害が引き起こされ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の癌治療には、化学療法、放射線療法、外科手術、免疫療法（例えば、生物学的反応修飾物質、ワクチン又は標的療法薬）又はそれらの組み合わせが含まれる。残念ながら、ある種の癌はかかる治療に対して非応答性であるか又は最小限の応答しか示さない。例えば、患者によっては、選択された治療法が一般的には有効であるにも関わらず、腫瘍が遺伝子突然変異を呈するために腫瘍が非応答性となる場合もある。さらに、癌のタイプ及び癌がどのような形態をとるかによっては、外科手術などの何らかの利用可能な治療が実行可能な選択肢ではなくなることもある。現行の標準治療の治療法に固有の限界は、過去に治療を受けた後再燃した患者を治療しようとするとき、特に顕著である。そのような場合、奏効しなかった治療レジメン及び結果として生じた患者の悪化が一因となって不応性の腫瘍となることがあり、このような腫瘍は、比較的侵攻性の疾患として顕在化し、最終的に不治の疾患であると判明することが多い。癌の診断及び治療は長年にわたり大幅に改善されてきたが、既存の治療法は再燃、腫瘍再発及び転移を防ぐことができず、そのため多くの固形腫瘍は全生存率がほとんど変化していない。従って、より標的性が高く強力な増殖性障害の治療法の開発が、依然として課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これら及び他の目的が本発明により提供され、本発明は、広義の意味では、ＳＥＺ６関連障害（例えば、増殖性障害又は新生物性障害）の治療に用いられ得る方法、化合物、組成物及び製品に関する。そのため、本発明は、腫瘍細胞及び／又は癌幹細胞を有効に標的化する、且つ幅広い種類の悪性腫瘍に罹患している患者の治療に用い得る新規発作関連６ホモログ（又はＳＥＺ６）モジュレーターを提供する。本明細書においてさらに詳細に考察するとおり、少なくとも２つの天然に存在するＳＥＺ６アイソフォーム又は変異体があり、本開示のモジュレーターは、それらのアイソフォームのいずれか一方又は両方を選択的に含み、又はそれと会合し得る。さらに、特定の実施形態では、本開示のＳＥＺ６モジュレーターは１つ以上のＳＥＺファミリーメンバー（例えば、ＳＥＺ６Ｌ又はＳＥＺ６Ｌ２）とさらに反応してもよく、又は他の実施形態では、ＳＥＺ６アイソフォーム（複数可）とのみ会合又は反応するように生成及び選択されてもよい。いずれの場合も、本モジュレーターは、ＳＥＺ６ポリペプチド又は遺伝子（又はその断片）を認識し、それと競合し、それを作動させ、それに拮抗し、それと相互作用し、それを結合し又はそれと会合する任意の化合物であって、１つ以上の生理学的経路に対するＳＥＺ６タンパク質の影響を調整し、適合させ、改変し、変化させ又は修飾する化合物を含み得る。従って、広義の意味では本発明は、概して、単離ＳＥＺ６モジュレーター及びその使用に関する。好ましい実施形態において、本発明はより詳細には、特に好ましい実施形態で１つ以上の細胞傷害剤と会合又はコンジュゲートされる、抗体を含む単離ＳＥＺ６モジュレーター（すなわち、ＳＥＺ６の少なくとも１つのアイソフォームと免疫選択的に結合、反応又は会合する抗体）に関する。さらに、以下で広範に考察するとおり、かかるモジュレーターを使用して、増殖性障害の予防、診断又は治療に有用な医薬組成物が提供され得る。
【０００７】
本発明の選択された実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターはＳＥＺ６ポリペプチド又はその断片を、単離された形態で、或いは他の部分と融合若しくは会合した形態で（例えば、Ｆｃ−ＳＥＺ６、ＰＥＧ−ＳＥＺ６又は標的部分と会合したＳＥＺ６）含み得る。他の選択された実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターはＳＥＺ６アンタゴニストを含んでもよく、本願の目的上、ＳＥＺ６アンタゴニストは、ＳＥＺ６を認識し、それと競合し、それと相互作用し、それと結合し又はそれと会合する任意のコンストラクト又は化合物であって、腫瘍開始細胞を含む新生物細胞の成長を中和し、除去し、低減し、感作させ、再プログラム化し、阻害し又は制御するコンストラクト又は化合物を意味すると考えられるものとする。好ましい実施形態において、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、予想外にも、腫瘍開始細胞が新生物細胞を伝播させ、維持し、拡大させ、増殖させ又は他の形でその生存、再発、再生及び／又は転移を促進する能力をサイレンシングし、中和し、低減し、低下させ、枯渇させ、緩和し、減少させ、再プログラム化し、除去し、又は他の形で阻害することが見出された抗ＳＥＺ６抗体、又はその断片若しくは誘導体を含む。特に好ましい実施形態では、抗体又は免疫反応性断片は、１つ以上の抗癌剤（例えば細胞傷害剤）と会合されるか、又はそれとコンジュゲートされ得る。
【０００８】
かかるモジュレーターに関して、適合性のある抗体が、例えば、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ、ＣＤＲグラフト化、ヒト化及びヒト抗体並びに上記の各々の免疫反応性断片及び／又は変異体を含む数多くの形態のうちのいずれか一つを呈し得ることが理解される。好ましい実施形態は、ヒト化又は完全ヒトコンストラクトなどの比較的非免疫原性の抗体を含む。当然ながら当業者であれば、本開示を踏まえて、ＳＥＺ６抗体モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域に関連する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を容易に同定し、必要以上に実験を行うことなくそれらのＣＤＲを使用してキメラ、ヒト化又はＣＤＲグラフト化抗体を工学的に改変し（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、又は作製することができる。従って特定の好ましい実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、図１０Ａ及び図１０Ｂに定義されるとおりの、且つそこに示される連続軽鎖（図１０Ａ）又は重鎖（図１０Ｂ）マウス可変領域（配列番号２０〜１６９）に由来する１つ以上のＣＤＲを組み込む抗体を含む。ヒトフレームワーク及びその変異体を有するかかるＣＤＲグラフト化可変領域もまた、配列番号１７０〜１９９を含む図１０に示される。好ましい実施形態において、かかる抗体はモノクローナル抗体を含み、さらにより好ましい実施形態では、キメラ、ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体を含む。
【０００９】
図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるアミノ酸配列の各々をコードする例示的核酸配列は、本明細書に配列表として添付され、配列番号２２０〜３９９を含む。この点において、本発明が、添付の配列表に示されるものを含めた本開示の抗体可変領域アミノ酸配列をコードする核酸分子（及び関連するコンストラクト、ベクター及び宿主細胞）をさらに含むことは理解される。
【００１０】
より詳細には、選択された実施形態において、適合性のあるＳＥＺ６モジュレーターは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを有する抗体を含んでもよく、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６及び配列番号１６８に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７及び配列番号１６９に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の好ましい実施形態では、選択されたモジュレーターは、上記のマウス配列と６５、７０、７５又は８０％の同一性を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態において、モジュレーターは、本開示のマウス配列と８５、９０又はさらには９５％の同一性を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
当然ながら、当業者であれば、本開示を踏まえて、上記の重鎖及び軽鎖可変領域の各々に関連するＣＤＲを容易に同定し、必要以上に実験を行うことなく、それらのＣＤＲを使用してキメラ、ヒト化又はＣＤＲグラフト化抗体を工学的に改変する又は作製することができる。このように、選択された実施形態において本発明は、図１０Ａ又は図１０Ｂに示される可変領域配列の１つ以上のＣＤＲを含む抗ＳＥＺ６抗体に関する。好ましい実施形態において、かかる抗体はモノクローナル抗体を含み、さらにより好ましい実施形態では、キメラ、ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体を含む。以下でさらに詳細に考察するとおり、さらに他の実施形態は、１つ以上の細胞傷害剤とコンジュゲート又は会合されたかかる抗体を含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００から得られた、又はそれに由来するモジュレーターを含む。
【００１３】
さらに他の適合性のある実施形態において、本発明は、ＣＤＲグラフト化又はヒト化ＳＥＺ６モジュレーターｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５５、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１及びＳＣ１７．２００を含む。さらに他の実施形態は、ヒト化抗体を含むＳＥＺ６モジュレーターに関し、ここで前記ヒト化抗体は軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８及び配列番号１９０に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９及び配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９及び配列番号１９１に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。加えて、軽鎖（配列番号１９２）及び重鎖（配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９）可変領域の特定のヒト化変異体が、本明細書の教示によって提供される。さらに、以上に説明したとおり、例示的なヒト化重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列が、本明細書に添付される配列表に配列番号３７０〜３９９として示される。
【００１４】
上記の態様に加え、本発明の他の好ましい実施形態は、１つ以上の薬物と会合又はコンジュゲートされることにより、特に増殖性障害の治療において（単独で、又は他の薬学的に活性な作用物質との組み合わせで）有効であり得るモジュレーターコンジュゲートを提供するＳＥＺ６モジュレーターを含み得る。より一般的には、本発明のモジュレーターは、作製及び選択された後、薬学的に活性な若しくは診断用の部分又は生体適合性修飾物質と（例えば、共有結合的又は非共有結合的に）連結、融合、コンジュゲートされ、又は他の形でそれと会合され得る。本明細書で使用されるとき、用語「コンジュゲート」又は「モジュレーターコンジュゲート」又は「抗体コンジュゲート」は、広義に用いられ、会合方法を問わず、本開示のモジュレーターと会合された任意の生物学的に活性な又は検出可能な分子又は薬物を意味すると考えられる。この点において、かかるコンジュゲートが、本開示のモジュレーターに加えて、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、生体内で活性薬剤に代謝されるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子及び放射性同位元素を含み得ることは理解される。さらに、上記に指摘したとおり、選択されたコンジュゲートはモジュレーターと共有結合的に又は非共有結合的に会合され、又は連結され、且つ少なくとも一部には、コンジュゲーションを生じさせるために用いられる方法に応じて、種々の化学量論的モル比を呈し得る。
【００１５】
本発明の特に好ましい態様は、増殖性障害の診断及び／又は治療に用いられ得る抗体モジュレーターコンジュゲート又は抗体−薬物コンジュゲートを含む。かかるコンジュゲートは、式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ（式中、Ｍは開示のモジュレーター又は標的結合部分を表し、Ｌは任意選択のリンカー又はリンカー単位であり、Ｄは適合性のある薬物又はプロドラッグであり、及びｎは約１〜約２０の整数である）によって表され得る。文脈によって別段指示されない限り、用語「抗体−薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」又は式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎは、治療用部分及び診断用部分の両方を含むコンジュゲートを包含すると考えられるものとすることは理解される。かかる実施形態において抗体−薬物コンジュゲート化合物は、典型的には、モジュレーター単位（Ｍ）としての抗ＳＥＺ６、治療用又は診断用部分（Ｄ）、及び場合により薬物と抗原結合剤とをつなぎ合わせるリンカー（Ｌ）を含む。好ましい実施形態において、抗体は、上記に記載したとおりの重鎖及び軽鎖可変領域由来の少なくとも１つのＣＤＲを含むＳＥＺ６  ｍＡｂを含む。
【００１６】
これまでに指摘したとおり、本発明の一態様は、ＳＥＺ６ポリペプチドと癌幹細胞との予想外の会合を含み得る。従って、特定の他の実施形態において本発明は、対象への投与時に腫瘍開始細胞の頻度を低減するＳＥＺ６モジュレーターを含む。好ましくは、頻度の低減は、インビトロ又はインビボ限界希釈解析法を用いて決定する。特に好ましい実施形態では、かかる解析は、免疫不全マウスへのヒト生腫瘍細胞の移植を含むインビボ限界希釈解析法を用いて行われ得る。或いは、限界希釈解析法は、インビトロコロニー支持条件へのヒト生腫瘍細胞の限界希釈堆積法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｓｉｏｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含むインビトロ限界希釈解析法を用いて行われてもよい。いずれの場合にも、頻度の低減の解析、計算又は定量化は、好ましくは精密な計算法を提供するようポアソン分布統計の使用を含む。かかる定量化方法が好ましいものの、その他の、フローサイトメトリー又は免疫組織化学など労力の少ない方法を用いて所望の値を提供してもよく、従ってそれらの方法もまた、本発明の範囲内にあるものとして明示的に企図されることは理解される。そのような場合、頻度の低減は、腫瘍開始細胞で高濃度になることが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析又は免疫組織化学的検出を用いて決定されてもよい。
【００１７】
このように、本発明の別の好ましい実施形態は、ＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与する工程であって、それにより腫瘍開始細胞の頻度を低減する工程を含む、ＳＥＺ６関連障害の治療方法を含む。好ましくは、ＳＥＺ６関連障害は新生物性障害を含む。この場合も同じく、腫瘍開始細胞頻度の低減は、好ましくはインビトロ又はインビボ限界希釈解析法を用いて決定される。
【００１８】
これに関して、本発明は、少なくとも一部には、様々な新形成の病因に関与する腫瘍不滅化細胞（すなわち癌幹細胞）がＳＥＺ６免疫原と関連するという発見に基づくことが理解される。より具体的には、本願は、予想外にも、様々な例示的ＳＥＺ６モジュレーターの投与が、腫瘍開始細胞による腫瘍原性シグナル伝達を調整し（ｍｅｄｉａｔｅ）、低減し、枯渇させ、阻害し又は除去し得る（すなわち、腫瘍開始細胞の頻度を低減し得る）ことを実証する。ひいてはこのシグナル伝達の低減が、腫瘍開始細胞の枯渇、中和、低減、除去、再プログラム化又はサイレンシングによるのか、それとも腫瘍細胞形態の修飾（例えば、誘導性分化、ニッチ破壊）によるのかに関わらず、腫瘍発生、腫瘍維持、拡大及び／又は転移並びに再発を阻害することにより、ＳＥＺ６関連障害のより有効な治療を可能にする。
【００１９】
上記の癌幹細胞との関連に加え、ＳＥＺ６アイソフォームが、神経内分泌学的な特徴を含む腫瘍の成長、再発又は転移能力に関係があるとし得るエビデンスがある。本発明の目的上、かかる腫瘍には神経内分泌腫瘍と偽神経内分泌腫瘍とが含まれる。従って、本明細書に記載される新規ＳＥＺ６モジュレーターを使用したかかる腫瘍原性細胞の増殖への介入は、２つ以上の機構（すなわち、腫瘍開始細胞の低減及び発癌経路シグナル伝達の破壊）により障害を改善又は治療して相加又は相乗効果を提供し得る。さらに他の好ましい実施形態は、細胞表面ＳＥＺ６の細胞インターナリゼーションを利用してモジュレーター媒介性抗癌剤を送達し得る。これに関して、本発明がいかなる特定の作用機序にも限定されることはなく、ＳＥＺ６関連障害（様々な新形成を含む）の治療に対する本開示のモジュレーターの幅広い使用を包含することは理解される。
【００２０】
従って、他の実施形態において本発明は、必要とする対象において神経内分泌特徴を含む腫瘍を治療するための本開示のモジュレーターの使用を含む。当然ながら、同じモジュレーターが、それらの同じ腫瘍の予防、予後判定、診断、セラグノーシス、阻害又は維持療法に用いられ得る。
【００２１】
本発明の他の様態は、本開示のモジュレーターが潜在的に発癌経路を破壊すると同時に腫瘍開始細胞をサイレンシングする能力を利用する。かかる多重活性ＳＥＺ６モジュレーター（例えば、ＳＥＺ６アンタゴニスト）は、標準治療の抗癌剤又はデバルキング剤と組み合わせて使用されるとき特に有効であることが判明し得る。従って本発明の好ましい実施形態は、初期治療後の維持療法のための抗転移剤として本開示のモジュレーターを使用することを含む。加えて、２つ以上のＳＥＺ６アンタゴニスト（例えば、ＳＥＺ６上の２つの異なるエピトープに特異的に結合する抗体）を本教示に従い併用してもよい。さらに、以下でいくらか詳細に考察するとおり、本発明のＳＥＺ６モジュレーターはコンジュゲート形態又は非コンジュゲート形態で、場合により様々な化学的又は生物学的抗癌剤と組み合わせた増感剤として使用されてもよい。
【００２２】
従って本発明の別の好ましい実施形態は、抗癌剤による治療のため対象において腫瘍を感作する方法であって、前記対象にＳＥＺ６モジュレーターを投与する工程を含む方法を含む。他の実施形態は、ＳＥＺ６モジュレーターを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、治療後の転移又は腫瘍再発を低減する方法を含む。本発明の特に好ましい態様において、ＳＥＺ６モジュレーターは特に腫瘍開始細胞頻度の低減をもたらし、これはインビトロ又はインビボ限界希釈解析法を用いて決定される。
【００２３】
より一般的には、本発明の好ましい実施形態は、必要とする対象においてＳＥＺ６関連障害を治療する方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを対象に投与する工程を含む方法を含む。特に好ましい実施形態では、ＳＥＺ６モジュレーターは抗癌剤と会合（例えば、コンジュゲート）される。さらに他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、細胞の表面上又はその近傍でＳＥＺ６と会合又は結合した後にインターナライズする。さらに、対象の腫瘍組織が正常な隣接組織と比較したときＳＥＺ６レベルの上昇を呈するか、それともＳＥＺ６レベルの低減若しくは降下を呈するかに関わらず、シグナル伝達経路の任意の破壊及び付随的な利益を含めた、本発明の有益な態様が実現され得る。特に好ましい実施形態は、正常組織細胞又は非腫瘍原性細胞と比較したとき腫瘍原性細胞に関してＳＥＺ６レベルの上昇を呈する障害の治療を含む。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、新生物性障害に罹患している対象を治療する方法であって、少なくとも１つのインターナライズＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含む方法を含む。好ましい実施形態は、インターナライズ抗体モジュレーターの投与を含むことができ、ここで他の選択された実施形態において、インターナライズ抗体モジュレーターは細胞傷害剤とコンジュゲート又は会合される。
【００２５】
他の実施形態は、ＳＥＺ６関連障害に罹患している対象を治療する方法であって、少なくとも１つの枯渇ＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含む方法に関する。
【００２６】
さらに別の実施形態において、本発明は、維持療法の方法を提供し、ここで本開示のエフェクター又はモジュレーターは、腫瘍塊の少なくとも一部分を除去するように設計された初期手技（例えば、化学療法、放射線又は外科手術）後にある期間にわたって投与される。かかる治療レジメンは、数週間、数ヶ月間又はさらには数年間にわたって投与されてもよく、ここでＳＥＺ６モジュレーターは予防的に作用して転移及び／又は腫瘍再発を阻害し得る。さらに他の実施形態において、本開示のモジュレーターを公知のデバルキングレジメンとともに投与することにより、転移、腫瘍維持又は再発を予防し又は遅延させてもよい。
【００２７】
さらに、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、ＳＥＺ６の既知の１つ若しくは複数のアイソフォーム又はタンパク質の単一のアイソフォームと反応するように生成及び選択されてもよく、又は逆に、ＳＥＺ６に加えて、少なくとも１つのさらなるＳＥＺ６ファミリーメンバー（例えば、ＳＥＺ６Ｌ又はＳＥＺ６Ｌ２及びそれらのアイソフォーム）と反応又は会合する汎ＳＥＺ６モジュレーターを含んでもよいことが理解される。より具体的には、本明細書に開示されるとおり、抗体などの好ましいモジュレーターは、ＳＥＺ６のみが呈するドメイン（又はその中のエピトープ）と反応するか、又はＳＥＺ６ファミリーメンバーの２つ以上の間で少なくともいくらか保存されているドメインと反応するように生成及び選択され得る。
【００２８】
さらに他の好ましい実施形態では、モジュレーターは、ＳＥＺ６の特異的なエピトープ、部分、モチーフ又はドメインと会合又は結合する。以下でいくらか詳細に考察するとおり、ＳＥＺ６アイソフォームはいずれも、少なくともＮ末端ドメインと、２つの交互のＳｕｓｈｉ及びＣＵＢドメインと、３つのさらなるタンデムＳｕｓｈｉドメインリピートとを含む同一の細胞外領域を組み込む（図１Ｅを参照）。加えて、ＳＥＺ６タンパク質は膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含む。従って、特定の実施形態においてモジュレーターは、ＳＥＺ６のＮ末端ドメイン（すなわち成熟タンパク質におけるアミノ酸１〜３３５）又はその中のエピトープに結合又は会合する。本発明の他の態様は、ＳＥＺ６の特定のＳｕｓｈｉドメインに位置する特異的なエピトープと会合又は結合するモジュレーターを含む。これに関して、特定のモジュレーターは、Ｓｕｓｈｉドメイン１（アミノ酸３３６〜３９５）、Ｓｕｓｈｉドメイン２（アミノ酸５１１〜５７２）、Ｓｕｓｈｉドメイン３（アミノ酸６９０〜７４８）、Ｓｕｓｈｉドメイン４（アミノ酸７５０〜８１３）又はＳｕｓｈｉドメイン５（アミノ酸８１７〜８７８）に位置するエピトープと会合又は結合してもよい。本発明の他の態様は、ＳＥＺ６の特定のＣＵＢ様ドメインに位置する特異的なエピトープと会合又は結合するモジュレーターを含む。これに関して、特定のモジュレーターは、ＣＵＢドメイン１（アミノ酸３９７〜５０８）又はＣＵＢドメイン２（アミノ酸５７４〜６８５）に位置するエピトープと会合又は結合してもよい。当然ながら、上記のドメインの各々が２つ以上のエピトープを含んでもよく、２つ以上のビンと関連付けられ得ることは理解される。
【００２９】
モジュレーター又は抗体の「ビン」に関して、タンパク質に沿って位置する特異的なビンを定義する当該技術分野で認められている技法を用いた競合的抗体結合によってＳＥＺ６抗原が分析又はマッピングされ得ることが理解される。本明細書でさらに詳細に考察され、且つ以下の実施例９及び１０に示されるが、２つの抗体（そのうち一方は「参照抗体」、「ビンデリニエイト抗体（ｂｉｎ  ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「デリニエイト抗体（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」と称され得る）は、それらが標的抗原との結合について互いに実質的に競合する場合、同じビンにあると見なされ得る。そのような場合、対象抗体エピトープは同じか、実質的に同じか、又は十分に似ているものであってよく（それらが数個のアミノ酸によって分けられている線形的な意味で、或いは立体構造的に）、従っていずれの抗体も抗原との結合を立体的又は静電的に阻害又は妨害される。かかる定義されたビンは、概してある種のＳＥＺ６ドメインと会合してもよく（例えば参照抗体が、特定のドメインに含まれるエピトープと結合し得る）、しかしながら相関は必ずしも正確ではない（例えば、あるドメインに２つ以上のビンがあり得るか、又はビンが立体構造的に定義され、２つ以上のドメインを含み得る）。当業者がＳＥＺ６ドメインと実験的に決定されたビンとの間の関係を容易に決定し得ることは理解される。
【００３０】
本発明に関しては、当該技術分野で認められている技法（例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法）を用いた競合的結合解析により、少なくとも７個の個別のビンが定義されており、その各々が複数の抗体モジュレーターを含むことが分かった。本開示の目的上、これらの７つのビンをビンＡ〜Ｆ及びビンＵと命名した。ビンＡ〜Ｆはユニークなビンであり、これらのビンの各々に含まれる抗体は、ＳＥＺ６タンパク質との結合について互いに競合する。ビンＵは、ビンＡ〜Ｆの抗体とは競合しないが、相互間で結合について競合し得る抗体を含む。従って、選択された実施形態において本発明は、ビンＡ、ビンＢ、ビンＣ、ビンＤ、ビンＥ、ビンＦ、及びビンＵからなる群から選択されるビンにあるモジュレーターを含む。他の実施形態において、本発明は、ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００からなる群から選択される参照抗体により定義されるビンにあるモジュレーターを含む。さらに他の実施形態において、本発明は、ビンＡからのモジュレーター、ビンＢからのモジュレーター、ビンＣからのモジュレーター、ビンＤからのモジュレーター、ビンＥからのモジュレーター、ビンＦからのモジュレーター又はビンＵからのモジュレーターを含む。さらに他の好ましい実施形態は、参照抗体モジュレーター、及び参照抗体と競合する任意の抗体を含む。
【００３１】
用語「競合する」又は「競合抗体」は、本開示のモジュレーターの文脈で使用されるとき、参照抗体又は免疫学的に機能性の断片が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を実質的に（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％超）阻止又は阻害するアッセイにより決定するときの抗体間の結合競合を意味する。かかる競合を決定するための適合性のある方法には、例えば、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合ＥＬＩＳＡ等の、当該技術分野で公知の技法が含まれる。
【００３２】
選択された実施形態において、本発明は、ＳＥＺ６及び少なくとも１つの他のＳＥＺ６ファミリーメンバー（例えば、ＳＥＺ６Ｌ又はＳＥＺ６Ｌ２）と会合する汎ＳＥＺ６モジュレーターを含む。他の選択された実施形態において、本発明は、ＳＥＺ６の１つ以上のアイソフォームと免疫特異的に会合するが、他のＳＥＺ６ファミリーメンバーとはいずれとも免疫特異的に会合しないＳＥＺ６モジュレーターを含む。さらに他の実施形態において、本発明は、汎ＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含む、それを必要とする対象を治療する方法を含む。さらに他の実施形態は、ＳＥＺ６の１つ以上のアイソフォームと免疫特異的に会合するが、他のＳＥＺ６ファミリーメンバーとはいずれとも免疫特異的に会合しないＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含む、それを必要とする対象を治療する方法を含む。
【００３３】
上記で考察される治療的使用に加えて、また、本発明のモジュレーターが、ＳＥＺ６関連障害、詳細には増殖性障害の検出、診断又は分類に用いられ得ることも理解される。一部の実施形態では、モジュレーターは対象に投与され、インビボで検出又はモニタリングされ得る。当業者は、かかるモジュレーターが、以下に開示するとおりのマーカー又はレポーターで標識され、又はそれと会合されて、数多くの標準的な技法のうちのいずれか一つ（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャン等）を使用して検出され得ることを理解する。
【００３４】
従って、一部の実施形態では本発明は、必要とする対象においてインビボでＳＥＺ６関連障害を診断、検出又はモニタする方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを投与する工程を含む方法を含む。
【００３５】
他の場合には、モジュレーターは、当該技術分野で認められている手順を用いてインビトロ診断環境で使用されてもよい。このように、好ましい実施形態は、必要とする対象において増殖性障害を診断する方法であって、
ａ．前記対象から組織試料を採取する工程；
ｂ．組織試料を少なくとも１つのＳＥＺ６モジュレーターと接触させる工程；及び
ｃ．試料と会合したＳＥＺ６モジュレーターを検出又は定量化する工程を含む方法を含む。
【００３６】
かかる方法は、本願と併せて容易に認識し得るとともに、自動プレートリーダー、専用レポーター系等の一般に利用可能な市販の技術を用いて容易に実施し得る。選択された実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、試料中に存在する腫瘍不滅化細胞と会合する。他の好ましい実施形態では、検出又は定量化する工程は、腫瘍開始細胞頻度の低減及びその検出を含む。さらに、上記に既に言及したとおり、限界希釈解析法が行われてもよく、好ましくは限界希釈解析法は、頻度の低減に関する精密な計算を提供するためポアソン分布統計の使用を用い得る。
【００３７】
同様の文脈（ｖｅｉｎ）で、本発明はまた、癌などのＳＥＺ６関連障害の診断及びモニタリングにおいて有用なキット又はデバイス及び関連する方法も提供する。この目的上、本発明は好ましくは、ＳＥＺ６モジュレーターを含む容器及び前記ＳＥＺ６モジュレーターを使用したＳＥＺ６関連障害の治療又は診断についての説明資料を含む、ＳＥＺ６関連障害の診断又は治療に有用な製品を提供する。選択された実施形態において、デバイス及び関連する方法は、少なくとも１つの循環腫瘍細胞を接触させる工程を含む。
【００３８】
本発明の他の好ましい実施形態はまた、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリー分析又はレーザーによる区分などの方法による腫瘍開始細胞の集団又は亜集団の同定、特徴付け、単離、区分又は濃縮に有用な手段として、本開示のモジュレーターの特性を利用する。
【００３９】
このように、本発明の別の好ましい実施形態は、腫瘍開始細胞の集団を同定し、単離し、区分し又は濃縮する方法であって、前記腫瘍開始細胞をＳＥＺ６モジュレーターに接触させる工程を含む方法に関する。
【００４０】
上記は概要であり、それ故必然的に詳細の単純化、一般化、及び省略が含まれる；従って、当業者は、この概要が例示的なものに過ぎず、いかなる形の限定も意味しないことを理解する。方法、組成物及び／又はデバイス及び／又は本明細書に記載される他の主題の他の態様、特徴、及び利点が、本明細書に示される教示の中で明らかとなる。本概要は、以下の詳細な説明にさらに記載する概念の選択を単純化した形で紹介するために提供される。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴又は本質的な特徴を特定することは意図しておらず、また特許請求される主題の範囲の確定に有用なものとして用いられることも意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｅは、核酸配列又はアミノ酸配列を含めた、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関するＳＥＺ６の様々な表現である。図１Ａ及び図１Ｂ（配列番号１及び２）は、それぞれＳＥＺ６変異体１及び２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（下線）を含む完全長ｍＲＮＡ配列を示す。図１Ｃ及び図１Ｄ（配列番号３及び４）は、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示されるＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提供し、ここで一重下線のアミノ酸残基は、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通スパニングドメインを示し、二重下線のアミノ酸残基はシグナルペプチドを示す；図１Ｅは、２つのタンパク質アイソフォーム（配列番号３及び４）のアラインメントを示して各アイソフォームの細胞質末端における配列の違いを説明し、ここでは下線の残基が２つの配列間の違いを示す；及び図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域の概略図を提供し、様々なドメインの位置を説明している。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｅは、核酸配列又はアミノ酸配列を含めた、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関するＳＥＺ６の様々な表現である。図１Ａ及び図１Ｂ（配列番号１及び２）は、それぞれＳＥＺ６変異体１及び２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（下線）を含む完全長ｍＲＮＡ配列を示す。図１Ｃ及び図１Ｄ（配列番号３及び４）は、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示されるＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提供し、ここで一重下線のアミノ酸残基は、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通スパニングドメインを示し、二重下線のアミノ酸残基はシグナルペプチドを示す；図１Ｅは、２つのタンパク質アイソフォーム（配列番号３及び４）のアラインメントを示して各アイソフォームの細胞質末端における配列の違いを説明し、ここでは下線の残基が２つの配列間の違いを示す；及び図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域の概略図を提供し、様々なドメインの位置を説明している。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｅは、核酸配列又はアミノ酸配列を含めた、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関するＳＥＺ６の様々な表現である。図１Ａ及び図１Ｂ（配列番号１及び２）は、それぞれＳＥＺ６変異体１及び２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（下線）を含む完全長ｍＲＮＡ配列を示す。図１Ｃ及び図１Ｄ（配列番号３及び４）は、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示されるＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提供し、ここで一重下線のアミノ酸残基は、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通スパニングドメインを示し、二重下線のアミノ酸残基はシグナルペプチドを示す；図１Ｅは、２つのタンパク質アイソフォーム（配列番号３及び４）のアラインメントを示して各アイソフォームの細胞質末端における配列の違いを説明し、ここでは下線の残基が２つの配列間の違いを示す；及び図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域の概略図を提供し、様々なドメインの位置を説明している。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｅは、核酸配列又はアミノ酸配列を含めた、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関するＳＥＺ６の様々な表現である。図１Ａ及び図１Ｂ（配列番号１及び２）は、それぞれＳＥＺ６変異体１及び２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（下線）を含む完全長ｍＲＮＡ配列を示す。図１Ｃ及び図１Ｄ（配列番号３及び４）は、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示されるＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提供し、ここで一重下線のアミノ酸残基は、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通スパニングドメインを示し、二重下線のアミノ酸残基はシグナルペプチドを示す；図１Ｅは、２つのタンパク質アイソフォーム（配列番号３及び４）のアラインメントを示して各アイソフォームの細胞質末端における配列の違いを説明し、ここでは下線の残基が２つの配列間の違いを示す；及び図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域の概略図を提供し、様々なドメインの位置を説明している。
【図１Ｅ】図１Ａ−１Ｅは、核酸配列又はアミノ酸配列を含めた、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関するＳＥＺ６の様々な表現である。図１Ａ及び図１Ｂ（配列番号１及び２）は、それぞれＳＥＺ６変異体１及び２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（下線）を含む完全長ｍＲＮＡ配列を示す。図１Ｃ及び図１Ｄ（配列番号３及び４）は、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示されるＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提供し、ここで一重下線のアミノ酸残基は、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通スパニングドメインを示し、二重下線のアミノ酸残基はシグナルペプチドを示す；図１Ｅは、２つのタンパク質アイソフォーム（配列番号３及び４）のアラインメントを示して各アイソフォームの細胞質末端における配列の違いを説明し、ここでは下線の残基が２つの配列間の違いを示す；及び図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域の概略図を提供し、様々なドメインの位置を説明している。
【図１Ｆ】図１Ａ−１Ｅは、核酸配列又はアミノ酸配列を含めた、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関するＳＥＺ６の様々な表現である。図１Ａ及び図１Ｂ（配列番号１及び２）は、それぞれＳＥＺ６変異体１及び２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（下線）を含む完全長ｍＲＮＡ配列を示す。図１Ｃ及び図１Ｄ（配列番号３及び４）は、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示されるＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提供し、ここで一重下線のアミノ酸残基は、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通スパニングドメインを示し、二重下線のアミノ酸残基はシグナルペプチドを示す；図１Ｅは、２つのタンパク質アイソフォーム（配列番号３及び４）のアラインメントを示して各アイソフォームの細胞質末端における配列の違いを説明し、ここでは下線の残基が２つの配列間の違いを示す；及び図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域の概略図を提供し、様々なドメインの位置を説明している。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは、ＳＥＺ６の最も近いヒトアイソフォームと、アカゲザル、カニクイザル、マウス又はラットＳＥＺ６タンパク質との間のタンパク質レベルでの同一性パーセントを表にした図（図２Ａ）；ＳＥＺ６遺伝子ファミリーの報告されているアイソフォームの各々について様々なｃＤＮＡ又はタンパク質配列受託番号を表にした一覧（図２Ｂ）；及びヒトＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ、及びＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の最も長いアイソフォームの間のタンパク質レベルでの同一性パーセント（図２Ｃ）を提供する。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｃは、ＳＥＺ６の最も近いヒトアイソフォームと、アカゲザル、カニクイザル、マウス又はラットＳＥＺ６タンパク質との間のタンパク質レベルでの同一性パーセントを表にした図（図２Ａ）；ＳＥＺ６遺伝子ファミリーの報告されているアイソフォームの各々について様々なｃＤＮＡ又はタンパク質配列受託番号を表にした一覧（図２Ｂ）；及びヒトＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ、及びＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の最も長いアイソフォームの間のタンパク質レベルでの同一性パーセント（図２Ｃ）を提供する。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは、ＳＥＺ６の最も近いヒトアイソフォームと、アカゲザル、カニクイザル、マウス又はラットＳＥＺ６タンパク質との間のタンパク質レベルでの同一性パーセントを表にした図（図２Ａ）；ＳＥＺ６遺伝子ファミリーの報告されているアイソフォームの各々について様々なｃＤＮＡ又はタンパク質配列受託番号を表にした一覧（図２Ｂ）；及びヒトＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ、及びＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の最も長いアイソフォームの間のタンパク質レベルでの同一性パーセント（図２Ｃ）を提供する。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供する。ヒトＳＥＺ６に関して、ＳＥＺ６タンパク質のデータベース参照配列ＮＰ＿８４９１９１（配列番号３）との既知の違い（図３Ｃ）を有する市販のｃＤＮＡクローン（ＢＣ１４６２９２；配列番号７）から、完全成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質（図３Ｂ；配列番号６）をコードする特異的ｃＤＮＡクローン（図３Ａ；配列番号５）を構築した。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供する。ヒトＳＥＺ６に関して、ＳＥＺ６タンパク質のデータベース参照配列ＮＰ＿８４９１９１（配列番号３）との既知の違い（図３Ｃ）を有する市販のｃＤＮＡクローン（ＢＣ１４６２９２；配列番号７）から、完全成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質（図３Ｂ；配列番号６）をコードする特異的ｃＤＮＡクローン（図３Ａ；配列番号５）を構築した。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供する。ヒトＳＥＺ６に関して、ＳＥＺ６タンパク質のデータベース参照配列ＮＰ＿８４９１９１（配列番号３）との既知の違い（図３Ｃ）を有する市販のｃＤＮＡクローン（ＢＣ１４６２９２；配列番号７）から、完全成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質（図３Ｂ；配列番号６）をコードする特異的ｃＤＮＡクローン（図３Ａ；配列番号５）を構築した。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインに融合したヒトＳＥＺ６のＥＣＤを含む、ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるＦｃ−ＳＥＺ６コンストラクトの発現及びタンパク質免疫原（図４Ｂ；配列番号９）の産生に使用したｃＤＮＡ（図４Ａ；配列番号８）を提供し、ここで下線の配列はヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインに対応し、二重下線の配列はＩｇＫシグナルペプチドに対応し、太字フォントのアミノ酸は、ｈＳＣＲｘ１７断片のクローニングに使用される制限部位が寄与する残基に対応する。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインに融合したヒトＳＥＺ６のＥＣＤを含む、ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるＦｃ−ＳＥＺ６コンストラクトの発現及びタンパク質免疫原（図４Ｂ；配列番号９）の産生に使用したｃＤＮＡ（図４Ａ；配列番号８）を提供し、ここで下線の配列はヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインに対応し、二重下線の配列はＩｇＫシグナルペプチドに対応し、太字フォントのアミノ酸は、ｈＳＣＲｘ１７断片のクローニングに使用される制限部位が寄与する残基に対応する。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｃ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｄ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｅ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｆ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｇ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｈ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｉ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図５Ｊ】図５Ａ−５Ｊは、本明細書に記載されるＳＥＺ６モジュレーターの生成又は特徴付けに用いた免疫原又は細胞株の産生に関連する核酸配列又はアミノ酸配列の様々な図を提供し、ここで下線の配列は、例示される特異的なＳＥＺ６又はＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを示し、これらの図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードするコンストラクトのｃＤＮＡ配列、又はこれらのｃＤＮＡコンストラクトによりコードされる対応するタンパク質、すなわち成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、又はヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、腫瘍細胞亜集団又は正常組織に由来するｍＲＮＡの全トランスクリプトーム（ＳＯＬｉＤ）配列決定法を用いて計測したときの、様々な遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの図である。図６Ａは、神経内分泌特徴を有する腫瘍に関連する遺伝子を表にした図であり；及び図６Ｂは、正常組織及び肺癌に由来するいくつかの非伝統的異種移植（ＮＴＸ）腫瘍におけるＳＥＺ６  ｍＲＮＡ発現のグラフ図である。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、腫瘍細胞亜集団又は正常組織に由来するｍＲＮＡの全トランスクリプトーム（ＳＯＬｉＤ）配列決定法を用いて計測したときの、様々な遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの図である。図６Ａは、神経内分泌特徴を有する腫瘍に関連する遺伝子を表にした図であり；及び図６Ｂは、正常組織及び肺癌に由来するいくつかの非伝統的異種移植（ＮＴＸ）腫瘍におけるＳＥＺ６  ｍＲＮＡ発現のグラフ図である。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｆは、マイクロアレイを用いて解析したｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ａは、４６個の腫瘍株及び２個の正常組織に関するマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングのグラフィック図である；図７Ｂ及び図７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路（図７Ｃ）に関する選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセル及び比較的小さい数値は、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃く、且つ数値が比較的大きいほど、より高い発現レベルを示す；図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて計測したときの、様々な腫瘍及び対照組織におけるＨＥＳ６  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ図である；図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、又は神経運命に向かう分化の指標となる選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセルは、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃いほど、より高い発現レベルを示す；及び図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍株におけるＳＥＺ６の相対発現に対応する正規化強度値のグラフ図である。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｆは、マイクロアレイを用いて解析したｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ａは、４６個の腫瘍株及び２個の正常組織に関するマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングのグラフィック図である；図７Ｂ及び図７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路（図７Ｃ）に関する選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセル及び比較的小さい数値は、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃く、且つ数値が比較的大きいほど、より高い発現レベルを示す；図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて計測したときの、様々な腫瘍及び対照組織におけるＨＥＳ６  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ図である；図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、又は神経運命に向かう分化の指標となる選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセルは、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃いほど、より高い発現レベルを示す；及び図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍株におけるＳＥＺ６の相対発現に対応する正規化強度値のグラフ図である。
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｆは、マイクロアレイを用いて解析したｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ａは、４６個の腫瘍株及び２個の正常組織に関するマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングのグラフィック図である；図７Ｂ及び図７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路（図７Ｃ）に関する選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセル及び比較的小さい数値は、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃く、且つ数値が比較的大きいほど、より高い発現レベルを示す；図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて計測したときの、様々な腫瘍及び対照組織におけるＨＥＳ６  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ図である；図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、又は神経運命に向かう分化の指標となる選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセルは、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃いほど、より高い発現レベルを示す；及び図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍株におけるＳＥＺ６の相対発現に対応する正規化強度値のグラフ図である。
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｆは、マイクロアレイを用いて解析したｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ａは、４６個の腫瘍株及び２個の正常組織に関するマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングのグラフィック図である；図７Ｂ及び図７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路（図７Ｃ）に関する選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセル及び比較的小さい数値は、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃く、且つ数値が比較的大きいほど、より高い発現レベルを示す；図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて計測したときの、様々な腫瘍及び対照組織におけるＨＥＳ６  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ図である；図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、又は神経運命に向かう分化の指標となる選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセルは、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃いほど、より高い発現レベルを示す；及び図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍株におけるＳＥＺ６の相対発現に対応する正規化強度値のグラフ図である。
【図７Ｅ】図７Ａ−７Ｆは、マイクロアレイを用いて解析したｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ａは、４６個の腫瘍株及び２個の正常組織に関するマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングのグラフィック図である；図７Ｂ及び図７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路（図７Ｃ）に関する選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセル及び比較的小さい数値は、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃く、且つ数値が比較的大きいほど、より高い発現レベルを示す；図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて計測したときの、様々な腫瘍及び対照組織におけるＨＥＳ６  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ図である；図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、又は神経運命に向かう分化の指標となる選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセルは、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃いほど、より高い発現レベルを示す；及び図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍株におけるＳＥＺ６の相対発現に対応する正規化強度値のグラフ図である。
【図７Ｆ】図７Ａ−７Ｆは、マイクロアレイを用いて解析したｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７Ａは、４６個の腫瘍株及び２個の正常組織に関するマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングのグラフィック図である；図７Ｂ及び図７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路（図７Ｃ）に関する選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセル及び比較的小さい数値は、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃く、且つ数値が比較的大きいほど、より高い発現レベルを示す；図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて計測したときの、様々な腫瘍及び対照組織におけるＨＥＳ６  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ図である；図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、又は神経運命に向かう分化の指標となる選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する正規化強度値を表にした図であり、ここで陰影のないセルは、発現がほとんど乃至全くないことを示し、セルが濃いほど、より高い発現レベルを示す；及び図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍株におけるＳＥＺ６の相対発現に対応する正規化強度値のグラフ図である。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、正常組織又はバルク神経内分泌ＮＴＸ腫瘍（図８Ａ）及び様々な他のＮＴＸ腫瘍（図８Ｂ）から単離した様々なＲＮＡ試料における、ＲＴ−ＰＣＲにより計測したときのＳＥＺ６  ｍＲＮＡ転写物の相対発現レベルを示すグラフ図である。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、正常組織又はバルク神経内分泌ＮＴＸ腫瘍（図８Ａ）及び様々な他のＮＴＸ腫瘍（図８Ｂ）から単離した様々なＲＮＡ試料における、ＲＴ−ＰＣＲにより計測したときのＳＥＺ６  ｍＲＮＡ転写物の相対発現レベルを示すグラフ図である。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、１８種の異なる固形腫瘍型のうちの一つを有する患者由来の全腫瘍標本（灰色の点）又は対応する正常な隣接組織（ＮＡＴ；白色の点）における、ＲＴ−ＰＣＲにより計測したときのヒトＳＥＺ６の絶対の（図９Ａ）又は正規化した（図９Ｂ）ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフ図である。
【図１０Ａ−１】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ａ−２】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ａ−３】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ａ−４】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ａ−５】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ｂ−１】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ｂ−２】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ｂ−３】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ｂ−４】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１０Ｂ−５】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書の実施例に記載されるとおり単離、クローニング及び工学的に改変した多数のマウス及びヒト化例示的ＳＥＺ６モジュレーターの重鎖及び軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を、表形式で提供する。
【図１１Ａ】図１１は、本発明の例示的モジュレーターの様々な特性を示す。図１１Ａは、表形式で表すとおりの、例示的ＳＥＺ６モジュレーターの生化学的及び免疫学的特性を示す；及び図１１Ｂは、インビトロ死滅アッセイにおける、抗体が結合するドメインと抗体の有効性との間の相関を提供する。
【図１１Ｂ】図１１は、本発明の例示的モジュレーターの様々な特性を示す。図１１Ａは、表形式で表すとおりの、例示的ＳＥＺ６モジュレーターの生化学的及び免疫学的特性を示す；及び図１１Ｂは、インビトロ死滅アッセイにおける、抗体が結合するドメインと抗体の有効性との間の相関を提供する。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＳＥＺ６の発現の検出を示す。図１２Ａは、抗ＳＥＺ６抗体ＳＣ１７．３３を使用した、ヒトＳＥＺ６タンパク質を過剰発現するように工学的に改変したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ｈ２９３Ｔ−ＨｕＳＥＺ６）におけるＳＥＺ６発現を示す；図１２Ｂは、電気化学発光アッセイを用いて計測したときの、様々なＮＴＸ腫瘍及び正常組織ライセートにおけるヒトＳＥＺ６の相対タンパク質発現を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＳＥＺ６の発現の検出を示す。図１２Ａは、抗ＳＥＺ６抗体ＳＣ１７．３３を使用した、ヒトＳＥＺ６タンパク質を過剰発現するように工学的に改変したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ｈ２９３Ｔ−ＨｕＳＥＺ６）におけるＳＥＺ６発現を示す；図１２Ｂは、電気化学発光アッセイを用いて計測したときの、様々なＮＴＸ腫瘍及び正常組織ライセートにおけるヒトＳＥＺ６の相対タンパク質発現を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ及び１３Ｂは、様々な抗ＳＥＺ６抗体を使用したＮＴＸ腫瘍細胞上のＳＥＺ６タンパク質発現のフローサイトメトリーによる検出を示す（図１３Ａ）；一方、図１３Ｂは、様々な抗ＳＥＺ６抗体を使用した、ＮＴＧ亜集団と比較したＣＳＣにおけるＳＥＺ６タンパク質の発現の増強を示す（図１３Ｂ）。
【図１３Ｂ】図１３Ａ及び１３Ｂは、様々な抗ＳＥＺ６抗体を使用したＮＴＸ腫瘍細胞上のＳＥＺ６タンパク質発現のフローサイトメトリーによる検出を示す（図１３Ａ）；一方、図１３Ｂは、様々な抗ＳＥＺ６抗体を使用した、ＮＴＧ亜集団と比較したＣＳＣにおけるＳＥＺ６タンパク質の発現の増強を示す（図１３Ｂ）。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＳＥＺ６を発現するＣＳＣが、ＳＥＺ６を発現しないＣＳＣと比較して腫瘍形成能の増強を呈することを示す。図１４Ａは、ＣＤ３２４（ＣＳＣのマーカー）及びＳＥＺ６の発現に基づく肺腫瘍（ＬＵ３７）における細胞のＦＡＣＳによる細胞選別を示す等高線プロットである；図１４Ｂは、免疫不全マウスに移植した後の、ＣＤ３２４＋ＳＥＺ６＋（黒丸）又はＣＤ３２４＋ＳＥＺ６−（白丸）のいずれかである腫瘍細胞の成長をグラフにした図である。ＣＤ３２４及びＳＥＺ６の両方を発現する腫瘍細胞は、腫瘍形成能の増強を呈する。
【図１５Ａ−１】図１５Ａおよび１５Ｂは、本開示のモジュレーターが、ＳＥＺ６を発現するように工学的に改変した細胞（図１５Ａ）及びインビトロで成長させたＮＴＸ肺腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ３７及びＬＵ１００）（図１５Ｂ）へと細胞傷害性ペイロードを指向させるための標的化部分として有効に用いられ得ることを示す表及びグラフ図をそれぞれ提供し、ここでは正規化した相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）の減少が、サポリン毒素のインターナリゼーションを介した細胞死滅を示す。
【図１５Ａ−２】図１５Ａおよび１５Ｂは、本開示のモジュレーターが、ＳＥＺ６を発現するように工学的に改変した細胞（図１５Ａ）及びインビトロで成長させたＮＴＸ肺腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ３７及びＬＵ１００）（図１５Ｂ）へと細胞傷害性ペイロードを指向させるための標的化部分として有効に用いられ得ることを示す表及びグラフ図をそれぞれ提供し、ここでは正規化した相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）の減少が、サポリン毒素のインターナリゼーションを介した細胞死滅を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、本開示のモジュレーターが、ＳＥＺ６を発現するように工学的に改変した細胞（図１５Ａ）及びインビトロで成長させたＮＴＸ肺腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ３７及びＬＵ１００）（図１５Ｂ）へと細胞傷害性ペイロードを指向させるための標的化部分として有効に用いられ得ることを示す表及びグラフ図をそれぞれ提供し、ここでは正規化した相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）の減少が、サポリン毒素のインターナリゼーションを介した細胞死滅を示す。
【図１６】図１６は、様々なＮＴＸ腫瘍でのＳＥＺ６の発現を示す免疫組織化学結果を表にした図である。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび１７Ｂは、コンジュゲート型抗ＳＥＺ６マウス抗体がＮＴＸ腫瘍細胞のインビトロ及びインビボ成長を遅延させる能力を示す。図１７Ａは、ＳＥＺ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗ＳＥＺ６  ＡＤＣを使用したインビトロ死滅アッセイの結果を示す；一方、図１７Ｂは、ＳＣＬＣ（ＬＵ８６）及びＬＣＮＥＣ（ＬＵ５０）腫瘍のインビボ成長に対する抗ＳＥＺ６  ＡＤＣの効果を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、コンジュゲート型抗ＳＥＺ６マウス抗体がＮＴＸ腫瘍細胞のインビトロ及びインビボ成長を遅延させる能力を示す。図１７Ａは、ＳＥＺ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗ＳＥＺ６  ＡＤＣを使用したインビトロ死滅アッセイの結果を示す；一方、図１７Ｂは、ＳＣＬＣ（ＬＵ８６）及びＬＣＮＥＣ（ＬＵ５０）腫瘍のインビボ成長に対する抗ＳＥＺ６  ＡＤＣの効果を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび１８Ｂは、コンジュゲート型ヒト化抗ＳＥＺ６抗体が免疫不全マウスにおいて４つのＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ６４、ＬＵ１１１及びＬＵ１１７）のインビボ成長を遅延させ、長期寛解を実現する能力を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび１８Ｂは、コンジュゲート型ヒト化抗ＳＥＺ６抗体が免疫不全マウスにおいて４つのＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ６４、ＬＵ１１１及びＬＵ１１７）のインビボ成長を遅延させ、長期寛解を実現する能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
Ｉ．序論
本発明は多くの異なる形で具体化され得るが、本明細書には、本発明の原理を例証するその具体的な例示的実施形態を開示する。本発明は例示される具体的な実施形態に限定されないことが強調されなければならない。さらに、本明細書で使用される節見出しはいずれも、あくまでも編成のためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。最後に、本開示の目的上、識別する配列受託番号は全て、特に注記されない限り、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース及び／又はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースに見出され得る。
【００４３】
これまでに言及したとおり、意外にも、ＳＥＺ６の発現が新生物成長及び増殖性障害と、特に神経内分泌特徴を有する腫瘍の場合に関連すること、並びにＳＥＺ６及びその変異体又はアイソフォームが、関連疾患の治療において利用され得る有用な腫瘍マーカーを提供することが見出された。さらに、本願に示されるとおり、予想外にも、細胞表面ＳＥＺ６タンパク質などのＳＥＺ６マーカー又は決定因子が癌幹細胞（腫瘍不滅化細胞としても知られる）と関連し、その除去又はサイレンシングに有効に利用され得ることが見出された。癌幹細胞を（例えばコンジュゲート型ＳＥＺ６モジュレーターを使用することにより）選択的に低減又は除去可能であることは、かかる細胞が概して多くの従来の治療に抵抗性であることが知られている点で、特に意外である。すなわち、標的治療方法の有効性は、伝統的な方法も最近の方法も、多くの場合に、こうした多様な治療方法に直面しても癌の成長を永続させる能力を有する抵抗性の癌幹細胞の存在及び／又は出現によって制限されている。さらに、癌幹細胞に関連する決定因子は、低い又は一定しない発現が原因となって治療標的とするには不十分で、腫瘍原性細胞との会合を維持できない、又は細胞表面に存在できないことも多い。先行技術の教示とは際立って対照的に、本開示の化合物及び方法はこの固有の抵抗性を有効に解消してかかる癌幹細胞の分化を特異的に除去し、枯渇させ、サイレンシングし、又は促進することにより、根底にある腫瘍成長を持続し又は再誘導するその能力を無効にする。
【００４４】
より具体的には、本明細書に開示されるようなＳＥＺ６モジュレーターが、有利には、必要としている対象における増殖性障害（例えば新生物性障害）の予後判定、診断、セラグノーシス、治療又は予防に用いられ得ることが発見された。従って、以下に本発明の好ましい実施形態を、特に特定のドメイン、領域若しくはエピトープの観点で、又は神経内分泌特徴を含む癌幹細胞若しくは腫瘍及びそれらと本開示のモジュレーターとの相互作用の文脈で広範に考察するが、当業者は、本発明の範囲がかかる例示的実施形態によって限定されないことを理解する。むしろ、最も広範囲の本発明の実施形態及び添付の特許請求の範囲は、詳細な作用機序又は具体的に標的化される腫瘍、細胞若しくは分子成分が何であれ、ＳＥＺ６モジュレーター（コンジュゲート型モジュレーターを含む）及び新生物性又は増殖性障害を含めた、様々なＳＥＺ６に関連する又はそれにより媒介される障害の予後判定、診断、セラグノーシス、治療又は予防におけるその使用を、広義に且つ明示的に対象とする。
【００４５】
そのため、本願で実証するとおり、予想外にも、本開示のＳＥＺ６モジュレーターを有効に使用することにより、増殖性細胞又は腫瘍原性細胞を標的化して除去し、又は他の形で無能力化し、ＳＥＺ６関連障害（例えば新形成）を治療できることが見出された。本明細書で使用されるとき「ＳＥＺ６関連障害」は、疾患又は障害の経過又は病因におけるＳＥＺ６遺伝子成分又は発現の表現型又は遺伝子型の異常によって特徴付けられ、診断され、検出され又は同定される任意の障害又は疾患（増殖性障害を含む）を意味すると考えられるものとする。これに関してＳＥＺ６表現型異常又は決定因子には、例えば、ＳＥＺ６タンパク質発現レベルの上昇若しくは降下、ある種の定義可能な細胞集団での異常なＳＥＺ６タンパク質発現又は不適切な細胞周期相若しくは段階での異常なＳＥＺ６タンパク質発現が含まれ得る。当然ながら、ＳＥＺ６の遺伝子型決定因子（例えば、ｍＲＮＡ転写レベル）の同様の発現パターンを使用してＳＥＺ６関連障害を分類又は検出し得ることは理解される。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「決定因子」又は「ＳＥＺ６決定因子」は、特定の細胞、細胞集団又は組織と識別可能に関連付けられるか、又はその中若しくはその上に特異的に見出される任意の検出可能な性質、特性、マーカー又は因子、例えば、ＳＥＺ６関連疾患又は障害に罹患した組織、細胞又は細胞集団の中若しくはその上に同定されるものを意味するものとする。選択された好ましい実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、ＳＥＺ６決定因子（例えば、細胞表面ＳＥＺ６タンパク質又はＳＥＺ６  ｍＲＮＡ）と直接会合、結合又は反応し、それにより障害を改善し得る。より一般的には、決定因子は本質的に形態学的、機能的又は生化学的な決定因子であってよく、遺伝子型又は表現型の決定因子であってよい。他の好ましい実施形態では、決定因子は、特定の細胞型（例えば、癌幹細胞）により、又は一定の条件下にある細胞（例えば、細胞周期の中の特定の時点における又は特定のニッチにある細胞）により差次的又は優先的に発現する（又は発現しない）細胞表面抗原又は遺伝子成分である。さらに他の好ましい実施形態において、決定因子は、特定の細胞又は個別的な細胞集団で異なる（上方又は下方）調節を受ける遺伝子若しくは遺伝的実体、その物理的構造及び化学組成に関して差次的に修飾を受ける遺伝子、又は差次的化学修飾を示す遺伝子と物理的に関連付けられるタンパク質若しくはタンパク質の一群を含み得る。本明細書で企図される決定因子は、特異的に陽性又は陰性であるものと見なされ、細胞、細胞亜集団又は組織（例えば腫瘍）をその存在（陽性）又は非存在（陰性）によって表し得る。
【００４７】
同様の文脈で本発明の「ＳＥＺ６モジュレーター」は、広義には、ＳＥＺ６変異体又はアイソフォーム（又はその特定のドメイン、領域若しくはエピトープ）又はその遺伝子成分を認識し、それと反応し、それと競合し、それに拮抗し、それと相互作用し、それと結合し、それを作動させ、又はそれと会合する任意の化合物を含む。これらの相互作用により、ＳＥＺ６モジュレーターは、有利には、腫瘍原性細胞（例えば、腫瘍不滅化細胞又は癌幹細胞）の頻度、活性、再発、転移又は移動度を除去、低減又は緩和し得る。本明細書に開示される例示的モジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドを含む。特定の好ましい実施形態において、選択されたモジュレーターは、ＳＥＺ６タンパク質アイソフォーム又はその免疫反応性断片若しくは誘導体に対する抗体を含む。かかる抗体は本質的に拮抗性又は作動性であってよく、場合により治療剤又は診断剤とコンジュゲートされ、又は会合されていてもよい。さらに、かかる抗体又は抗体断片は、枯渇抗体、中和抗体又はインターナライズ抗体を含み得る。他の実施形態において、本発明の範囲内のモジュレーターは、ＳＥＺ６アイソフォーム又はその反応性断片を含むＳＥＺ６コンストラクトを構成する。かかるコンストラクトが融合タンパク質を含み得るとともに、免疫グロブリン又は生物学的反応修飾物質などの他のポリペプチド由来の反応性ドメインを含み得ることは理解される。さらに他の態様において、ＳＥＺ６モジュレーターは、ゲノムレベルで所望の効果を及ぼす核酸部分（例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスコンストラクト等）を含む。本教示と適合性があるさらに他のモジュレーターについて、以下に詳細に考察する。
【００４８】
より一般的には、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、広義に、細胞表面ＳＥＺ６タンパク質を含む（遺伝子型又は表現型の）ＳＥＺ６決定因子を認識し、それと反応し、それと競合し、それに拮抗し、それと相互作用し、それと結合し、それを作動させ、又はそれと会合する任意の化合物を含む。いずれのモジュレーター形態が最終的に選択されるのであれ、好ましくはそれは、対象への導入前に単離及び精製された状態となっている。これに関して用語「単離ＳＥＺ６モジュレーター」又は「単離ＳＥＺ６抗体」は、広義の意味で、且つ標準的な薬務に従い、実質的に（生物学的又は他の形態の）望ましくない夾雑物がない状態のモジュレーターを含む任意の調製物又は組成物を意味すると解釈されるものとする。さらにこれらの調製物は、当該技術分野で認められている様々な技法を用いて所望のとおりに精製及び製剤化され得る。当然ながら、かかる「単離」調製物を所望のとおりに不活性成分又は活性成分と共に意図的に製剤化し、又は組み合わせることにより、最終製品の市販、製造又は治療に関する側面を改善し、医薬組成物を提供し得ることは理解される。広義の意味で、同じ一般論が「単離」ＳＥＺ６アイソフォーム若しくは変異体又はそれをコードする「単離」核酸にも適用され得る。
【００４９】
さらに、意外にも、特定のＳＥＺ６ドメイン、モチーフ又はエピトープと相互作用、会合又は結合するモジュレーターが、腫瘍原性細胞の除去において、及び／又は腫瘍成長又は伝播に対する癌幹細胞の影響のサイレンシング若しくは減弱において特に有効であることが見出された。すなわち、細胞表面に近接したドメイン（例えばＳｕｓｈｉ又はＣＵＢ様ドメインの一つ）と反応又は会合するモジュレーターは、腫瘍原性細胞の枯渇又は中和において有効であるが、予想外にも、細胞表面から比較的遠位にあるドメイン、モチーフ又は領域と会合又は結合するモジュレーターもまた、腫瘍原性細胞の除去、中和、枯渇又はサイレンシングにおいて有効であることが発見された。これは特に、コンジュゲート型モジュレーター、例えば、細胞傷害剤を含む抗ＳＥＺ６抗体薬コンジュゲートに当てはまる。
【００５０】
本発明は、任意の種類の新形成を含めた、任意のＳＥＺ６障害の治療における任意のＳＥＺ６モジュレーターの使用を明示的に企図するが、特に好ましい実施形態では、本開示のモジュレーターを使用して、神経内分泌腫瘍を含めた、（遺伝子型又は表現型の）神経内分泌特徴を含む腫瘍が予防、治療又は診断され得る。真正な又は「カノニカルな神経内分泌腫瘍」（ＮＥＴ）は、散在内分泌系から生じ、典型的には極めて侵襲的である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頚部、及び子宮内膜）、胃腸管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様癌）、及び肺（小細胞肺癌及び大細胞神経内分泌癌）に起こる。さらに、本開示のモジュレーターは、有利には、カノニカルな神経内分泌腫瘍と共通の遺伝子型又は表現型性質を模倣する、それを含む、それと似ている、又はそれを呈する偽神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）の治療、予防又は診断に用いられ得る。「偽神経内分泌腫瘍」は、散在神経内分泌系の細胞又は発癌過程の中で神経内分泌分化のカスケードが異常に再活性化された細胞から生じる腫瘍である。かかるｐＮＥＴは、一般に、一部の生理活性アミン、神経伝達物質、及びペプチドホルモンの産生能を含め、特定の遺伝子型、表現型又は生化学的特性を、伝統的な定義の神経内分泌腫瘍と共有する。従って、本発明の目的上、語句「神経内分泌特徴を含む腫瘍」又は「神経内分泌特徴を呈する腫瘍」は、文脈によって別段指示されない限り、神経内分泌腫瘍及び偽神経内分泌腫瘍の両方を含むと考えるものとする。
【００５１】
上記で概して考察される腫瘍との関連性に加え、選択された腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）とＳＥＺ６決定因子との間の表現型又は遺伝子型の関連性もまた示唆される。これに関して、選択されたＴＩＣ（例えば、癌幹細胞）は、正常組織及び非腫瘍原性細胞（ＮＴＧ）と比較したときＳＥＺ６タンパク質を高いレベルで発現することができ、これらは併せて、典型的に固形腫瘍の大半をなす。従って、ＳＥＺ６決定因子は腫瘍関連マーカー（又は抗原又は免疫原）を含んでもよく、本開示のモジュレーターは、細胞表面上又は腫瘍微小環境内のそのタンパク質レベルが変化するゆえに、ＴＩＣ及び関連する新形成を検出及び抑制するのに有効な薬剤を提供し得る。従って、ＳＥＺ６モジュレーターは、タンパク質と会合、結合又は反応する免疫反応性のアンタゴニスト及び抗体を含め、腫瘍開始細胞の頻度を有効に低減することができ、患者におけるそうした腫瘍開始細胞の分化を除去、枯渇、無能力化、低減、促進し、又は他の形でそれが潜伏する能力及び／又は腫瘍成長、転移若しくは再発を刺激し続ける能力を妨げ又は制限するのに有用であり得る。これに関して当業者は、本発明がさらに、ＳＥＺ６モジュレーター及び腫瘍開始細胞の頻度の低減におけるその使用を提供することを理解する。
【００５２】
ＩＩ．ＳＥＺ６の生理学
ＳＥＺ６（発作関連６ホモログとしても知られる）は、元来、痙攣薬ペンチレンテトラゾール（ｐｅｎｔｙｌｅｎｔｅｔｒａｚｏｌｅ）によって処置されたマウス大脳皮質由来細胞からクローニングされたＩ型膜貫通タンパク質である（Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，１９９５；ＰＭＩＤ：７７２３６１９）。代表的なＳＥＺ６タンパク質オルソログとしては、限定はされないが、ヒト（ＮＰ＿８４９１９１；ＮＰ＿００１０９２１０５）、チンパンジー（ＸＰ＿５１１３６８、ＮＰ＿００１１３９９１３）、マウス（ＮＰ＿０６７２６１）、及びラット（ＮＰ＿００１０９９２２４）が挙げられる。ヒトでは、ＳＥＺ６遺伝子は、染色体１７ｑ１１．２に位置する５１．１ｋＢｐにわたる１７個のエクソンからなる。最後のエクソン内で僅か１６塩基対しか離れていない選択的スプライス受容体部位が、２つのプロセシングされた転写物を生じ、１つは約４２１０塩基（ＮＭ＿１７８８６０；図１Ａ）であり、１つは約４１９４塩基（ＮＭ＿００１０９８６３５、図１Ｂ）である。前者の転写物は９９４アミノ酸タンパク質（ＮＰ＿８４９１９１；図１Ｃ）をコードし、一方、後者は９９３アミノ酸タンパク質（ＮＰ＿００１０９２１０５；図１Ｄ）をコードする。ＳＥＺ６のこれらの２つのタンパク質アイソフォームは、それらの細胞外ドメイン及びそれらの膜貫通ドメインにわたり全体で１００％の同一性を共有し、違いは最後の１０アミノ酸残基のみである（図１Ｅ）。分泌型のＳＥＺ６を生じる第３のスプライス変異体が報告されているが（Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，１９９５；ＰＭＩＤ：７７２３６１９）、しかしながらこれは、ＮＣＢＩデータベース遺伝子ページエントリ内の関連するＲｅｆＳｅｑには含まれていない。本発明のモジュレーターは、これらのスプライス変異体のいずれかと結合し得る。
【００５３】
これらのアイソフォームの生物学的な関連性は不明であるが、ある研究では、マウスＳＥＺ６ノックアウトマウス由来のニューロンにおいて発現が回復されたとき、膜タンパク質と、対する可溶性タンパク質とでは逆に作用することが示唆された（Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７，ＰＭＩＤ：１８０３１６８１）。ＳＥＺ６タンパク質の異種間タンパク質配列同一性を図２Ａに掲載する。ヒトゲノムでは、２つの近縁の遺伝子−発作関連６ホモログ様（ＳＥＺ６Ｌ）及び発作関連６ホモログ様−２（ＳＥＺ６Ｌ２）があり、その各々が、多数のアイソフォームをコードする複数のスプライス変異体を有する（図２Ｂ）。ヒトにおけるＳＥＺ６様タンパク質のこのファミリーの各メンバーの最も長いタンパク質に関する同一性パーセントを、図２Ｃに示す。ＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２はまとめて、それらの様々なアイソフォームを含め、本願の目的上ＳＥＺ６ファミリーと称される。本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、ＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ又はＳＥＺ６Ｌ２の各々に特異的なモジュレーターを含む。或いは、本発明のモジュレーターは、ＳＥＺ６並びにＳＥＺ６Ｌ及び／又はＳＥＺ６Ｌ２の一方又は両方と交差反応してもよい。
【００５４】
成熟ＳＥＺ６タンパク質は、一連の構造ドメイン：細胞質ドメインと、膜貫通ドメインと、唯一のＮ末端ドメイン、続いて２つの交互のＳｕｓｈｉ及びＣＵＢ様ドメイン、及び３つのさらなるタンデムＳｕｓｈｉドメインリピートを含む細胞外ドメインとから構成される。ＳＥＺ６抗原の２つのアイソフォームが存在し、最もカルボキシ端側の細胞質ドメインのみが異なる。
【００５５】
図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域の概略図を提供し、Ｓｕｓｈｉ及びＣＵＢドメイン、及びＮ末端ドメインの概略的な並びを示す。概してこれらのドメインは、およそアミノ酸残基３３６〜３９５（Ｓｕｓｈｉドメイン１）、３９７〜５０８（ＣＵＢドメイン１）、５１１〜５７２（Ｓｕｓｈｉドメイン２）、５７４〜６８５（ＣＵＢドメイン２）、６９０〜７４８（Ｓｕｓｈｉドメイン３）、７５０〜８１３（Ｓｕｓｈｉドメイン４）、８１７〜８７８（Ｓｕｓｈｉドメイン５）に現れるものとして認識され、Ｎ末端ドメインがおよそアミノ酸残基１〜３３５にあり、且つプロリンリッチ残基の組成バイアスがおよそアミノ酸残基７１〜１６９にある。
【００５６】
Ｓｕｓｈｉリピートは、他のヒト補体調節タンパク質に見られる短いコンセンサスリピート（すなわち、補体Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ結合部位）と同様である。ＣＵＢ様ドメインは、他の哺乳類補体結合タンパク質に見られるＣＵＢドメインと同様であり、限定はされないが、パターン形成、軸索ガイダンス、炎症、及び腫瘍抑制を含めた、補体活性化以外の多数の生物学的過程に関与する多様なタンパク質と関連付けられる（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｍａｎ，１９９３，ＰＭＩＤ：８５１０１６５）。Ｓｕｓｈｉ及びＣＵＢドメインの両方とも、細胞外における他のタンパク質の結合が関わるＳＥＺ６の機能を暗示する。ＣＵＢドメインを含むタンパク質はまた、細胞シグナル伝達経路とも関連付けられており、この機能と一致して、ＳＥＺ６  Ｃ末端細胞質ドメインは、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリーメンバーによるリン酸化の潜在的な標的であるＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒモチーフ（配列番号４０３）を含む。これが本当であるならば、ＳＥＺ６がＲａｓの活性化に至る細胞シグナル伝達経路と関係付けられることになり、ＳＥＺ６が神経栄養因子受容体であり得ることが示唆される。
【００５７】
用語「成熟タンパク質」又は「成熟ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、細胞表面発現前に切断され得る１９アミノ酸のシグナルペプチドを含まずに産生されるＳＥＺ６タンパク質の形態（複数可）を指すことに留意されたい。特に指示されない限り、ＳＥＺ６アミノ酸付番（ドメイン、領域、エピトープ等に関する）は、リーダーを含まない成熟タンパク質との関連におけるものである。
【００５８】
ＳＥＺ６は、げっ歯類の腎臓、肝臓、心臓、肺及び胸腺では低レベルでＲＴ−ＰＣＲにより検出可能であるが、脳においてのみ強力なタンパク質発現が見られており、精巣では有意なレベルの発現であった（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｎｉｃｋｌｉｎ，１９９７，ＰＭＩＤ：９０７３１７３）。ＳＥＺ６に対するポリクローナル血清を使用して、発生中のマウス前脳の１３日目におけるタンパク質発現を検出した。発生中の皮質板及びサブプレートの有糸分裂後成熟ニューロンで、強い染色が検出された。この染色は成体脳では減少し、海馬、小脳、及び嗅球などの継続中の形態的可塑性と関連付けられる他の脳領域、並びに網膜及び脊髄のニューロンにＳＥＺ６発現を検出することができる（Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＰＭＩＤ：１８０３１６８１）。神経細胞体濃度が最も高い領域に、最も高密度のシグナルが見出される。ＳＥＺ６の広範な網膜発現にも関わらず、ＳＥＺ６の非存在下での網膜機能は影響を受けなかった（Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＭＩＤ：１９６６２０９６）。ＳＥＺ６染色パターンは、新皮質層及び海馬の出現と密接な関係があり、発生中におけるこの遺伝子の前脳特異的な役割を意味する。ヒト及びマウスでは、ＳＥＺ６は、新皮質の高度に特異的な領域において差次的に発現することが見出された（Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、上掲）。
【００５９】
ヒトＳＥＺ６遺伝子における突然変異は、体温上昇を伴う痙攣であって、且つ小児において最も一般的なタイプの発作である熱性痙攣（ＦＳ）と関係付けられている（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＰＭＩＤ：１７０８６５４３）。ＦＳは、持続期間、再発、及び発作により冒される体の範囲に応じて単純性又は複雑性に分類され得る。中国人コホートでは、１５人の健常対照群でＳＥＺ６の突然変異は認められなかったが、６０人中２１人のＦＳ患者に突然変異が認められ、最も一般的な突然変異のタイプは、ｃＤＮＡの１４３５位におけるヘテロ接合性のシトシン挿入（フレームシフト突然変異）であった。この突然変異発生率は、複雑性ＦＳ患者及び家族歴陽性患者において有意に高かった。複雑性ＦＳ小児が後年発作を有する可能性は８０％であるため、著者らは、ＳＥＺ６における突然変異のスクリーニングが、ＦＳ再発又は癲癇発症の予測に役立ち得ることを示唆している（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、上掲）。その後の研究で、発生率、関連性、及びこの研究が因果関係を意味するのに十分な検出力を有し得るかが疑問視されているが、ＳＥＺ６が発作性障害において役割を果たし得る多くの遺伝子のうちの一つであり得ることは、確かに支持されている（Ｍｕｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＭＩＤ：２１７８５７２５）。
【００６０】
ＳＥＺ６の具体的な分子機能は未だ不明である。上記に考察したとおり、相同性及び配列分析により同定されるタンパク質の構造モジュール分析からは、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション、及び神経発生において果たし得る役割が示唆される。脳の回路を構成するシグナル伝達網を形成するニューロンの樹状分岐及び結合性は、神経細胞の内因性分子プログラム並びに外因性シグナルの両方によって生じ、特定される。哺乳類の前脳における主要なニューロンである錐体ニューロンの樹枝状成長過程では、特有の形態のニューロン−錐体細胞体、及び２つの異なる複合的樹状ツリー（一方は細胞体の尖端から現れ、他方は基底から現れる）が生じる。Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７、上掲）は、ＳＥＺ６ヌルマウスがこれらのニューロンの樹状ツリーに過剰の短い樹状突起を呈し、しかし所与のニューロンが結合するニューロンの範囲である樹状場（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ）全体の増加は示さないことを示した。ノックアウトニューロンにおいて膜結合ＳＥＺ６アイソフォームの発現を回復すると、抗分岐効果がもたらされる。行動試験では、ＳＥＺ６ヌルマウスは特定の探査、運動、及び認知障害を示す。これらのデータは、発生中に複雑な樹状分枝が精緻化されていく中で樹状突起の伸長と分岐との間の必要なバランスを実現するのにＳＥＺ６が重要であることを示唆している。
【００６１】
まとめると、上記の諸研究は、ＳＥＺ６タンパク質が神経発生のコンテクストで重要であり、細胞間コミュニケーション及びシグナル伝達において何らかの役割を担っている可能性があることを強く示唆している。発生シグナル伝達経路の不適切な再活性化又は正常なシグナル伝達経路の調節欠如は、一般に腫瘍に認められる（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。発生プログラムの部分的再活性化の指標となる特徴を共有する一腫瘍群は、神経内分泌表現型を有する腫瘍であり（Ｙａｏ  ２００８；ＰＭＩＤ：１８５６５８９４）、ここでは様々なホルモン及び内分泌マーカーが発現し及び／又は分泌され、且つ神経発生、神経コミットメント、又は神経運命に向かう分化の指標となる様々な神経マーカーが発現する。神経内分泌特徴を有する腫瘍は広範な原発部位にまれに生じ、その網羅的な分類は依然として問題であるが（Ｙａｏ；ＰＭＩＤ：１８５６５８９４；Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ２０１０；ＰＭＩＤ：２０６６４４７０；Ｋｌｏｅｐｐｅｌ，２０１１；ＰＭＩＤ：２２００５１１２）、４つの主要なタイプに分類され得る：低悪性度の良性カルチノイド、悪性挙動を伴う低悪性度の高分化型神経内分泌腫瘍、混合性の神経内分泌及び上皮特徴を有する腫瘍、及び高悪性度の低分化型神経内分泌癌。これらの分類のうち、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のサブセットを含む低分化型神経内分泌癌は、予後不良の癌タイプである。ＳＣＬＣは気管支原性で、一部には肺神経内分泌細胞から生じることが仮定されてきた（Ｇａｌｌｕｚｚｏ  ａｎｄ  Ｂｏｃｃｈｅｔｔａ，２０１１；ＰＭＩＤ：２１５０４３２０）。これらの腫瘍の細胞の出所が何であれ、それらが低分化型内分泌表現型を示し、多くの場合に高度に増殖性で侵襲的であり、且つしばしば神経タンパク質を過剰発現することが明らかである。従って、本来主に神経系に限定されているか又は発生中に限られた発現しか示さないものであり得る神経発現マーカー（ＳＥＺ６はその典型である）の、これらの腫瘍において生じる上昇は、神経内分泌表現型を有する腫瘍に対する固有の治療標的を提供し得る。
【００６２】
ＩＩＩ．癌幹細胞
上記で言及したとおり、意外にも、異常な（遺伝子型及び／又は表現型の）ＳＥＺ６発現が様々な腫瘍原性細胞亜集団と関連付けられることが発見された。この点において本発明は、かかる細胞、特に腫瘍不滅化細胞を標的化して、それにより新生物性障害の治療、管理又は予防を促進するのに特に有用であり得るＳＥＺ６モジュレーターを提供する。従って、好ましい実施形態において、有利には、本教示に従い（表現型又は遺伝子型の）ＳＥＺ６決定因子のモジュレーターを使用して腫瘍開始細胞頻度を低減し、それにより増殖性障害の治療又は管理を促進し得る。
【００６３】
本願の目的上、用語「腫瘍開始細胞」（ＴＩＣ）は、「腫瘍不滅化細胞」（ＴＰＣ；すなわち、癌幹細胞又はＣＳＣ）及び高増殖性「腫瘍前駆細胞」（ＴＰｒｏｇと称される）の両方を包含し、これらは併せて、概して、バルク腫瘍又は腫瘍塊のユニークな亜集団（すなわち０．１〜４０％）を構成する。本開示の目的上、用語「腫瘍不滅化細胞」及び「癌幹細胞」又は「新生幹細胞」は等価であり、本明細書では同義的に使用され得る。ＴＰＣが腫瘍内に存在する腫瘍細胞の組成を完全に再現することができ、且つ少数の単離細胞の累代移植（マウスで２代以上の継代）により実証されるとおり無制限の自己複製能を有する一方、ＴＰｒｏｇは無制限の自己複製能を呈しない点で、ＴＰＣはＴＰｒｏｇと異なる。
【００６４】
当業者は、適切な細胞表面マーカーを用いる蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が、少なくとも一部には、単一細胞と細胞塊（すなわちダブレット等）との間を区別するその能力により、高濃度癌幹細胞亜集団（例えば、＞９９．５％純度）を単離するのに信頼のおける方法であることを理解する。かかる技法を用いて、少ない細胞数の高度に精製したＴＰｒｏｇ細胞を免疫不全マウスに移植すると、それらの細胞が一次移植で腫瘍成長を刺激できることが示されている。しかしながら、精製ＴＰＣ亜集団と異なり、ＴＰｒｏｇにより生じた腫瘍は、表現型の細胞不均一性の点で親腫瘍を完全には反映せず、続く移植で連続的な腫瘍形成を再開するのに明らかに不十分である。対照的に、ＴＰＣ亜集団は親腫瘍の細胞不均一性を完全に再構成し、連続的に単離及び移植したとき腫瘍を効率的に惹起することができる。従って、当業者は、ＴＰＣとＴＰｒｏｇとの間の決定的な違いが（いずれも一次移植では腫瘍生成性であり得るが）、少ない細胞数で累代移植したときに不均一な腫瘍成長を絶えず刺激するＴＰＣのユニークな能力であることを認識する。ＴＰＣを特徴付ける他の一般的な手法は、形態学並びに細胞表面マーカー、転写プロファイル、及び薬物反応の調査を含むが、マーカー発現はインビトロでの培養条件及び細胞株継代によって変化し得る。
【００６５】
従って、本発明の目的上、正常組織において細胞階層を支持する正常幹細胞のような腫瘍不滅化細胞は、好ましくは多系列分化能を維持しながらも無制限に自己複製するその能力によって定義される。従って腫瘍不滅化細胞は、腫瘍原性子孫（すなわち腫瘍開始細胞：ＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ）及び非腫瘍原性（ＮＴＧ）子孫の両方を生じさせることができる。本明細書で使用されるとき「非腫瘍原性細胞」（ＮＴＧ）は、腫瘍開始細胞から生じるが、それ自体は自己複製能力や腫瘍を含む異種性の腫瘍細胞系列を生じさせる能力を有しない腫瘍細胞を指す。実験的にＮＴＧ細胞は、過剰な細胞数で移植したとしても、マウスにおいて再現性よく腫瘍を形成することができない。
【００６６】
指摘されるとおり、ＴＰｒｏｇはまた、マウスにおいて腫瘍を生じさせるその能力が限られているため、腫瘍開始細胞（又はＴＩＣ）としても分類される。ＴＰｒｏｇはＴＰＣの子孫であり、典型的には有限回の非自己複製細胞分裂を行うことができる。さらに、ＴＰｒｏｇ細胞は、初期腫瘍前駆細胞（ＥＴＰ）と後期腫瘍前駆細胞（ＬＴＰ）とにさらに分けられてもよく、その各々は表現型（例えば細胞表面マーカー）及び腫瘍細胞構成を再現する能力の違いによって区別され得る。かかる技術的な違いにも関わらず、ＥＴＰ及びＬＴＰの両方とも、それらが概して少ない細胞数で移植されたとき腫瘍を連続的に再構成する能力が低く、且つ典型的には親腫瘍の不均一性を反映しない点で、機能的にはＴＰＣと異なる。上記の違いにも関わらず、ごくまれに様々なＴＰｒｏｇ集団が、通常は幹細胞に帰される自己複製能を獲得することができ、それ自体がＴＰＣ（又はＣＳＣ）になることも示されている。いずれにしろ、両タイプの腫瘍開始細胞とも単一の患者の典型的な腫瘍量で表され、本明細書に開示されるとおりのモジュレーターによる治療に供される可能性がある。すなわち本開示の組成物は、詳細な実施形態又は腫瘍において表される混合に関わらず、概して、かかるＳＥＺ６陽性腫瘍開始細胞の頻度を低減し、又は化学的感受性を変化させるのに有効である。
【００６７】
本発明の文脈では、ＴＰｒｏｇ（ＥＴＰ及びＬＴＰの両方）、ＮＴＧ細胞及び腫瘍の大半を含む腫瘍浸潤性非ＴＰＣ由来の細胞（例えば、線維芽細胞／間質、内皮及び造血細胞）と比べて、ＴＰＣは腫瘍原性がより高く、比較的静止した状態にあり、且つ多くの場合に化学的抵抗性がより高い。従来の治療法及びレジメンが、主に、腫瘍をデバルキングするとともに急速に増殖する細胞を攻撃するように設計されてきたことから、ＴＰＣは、より速く増殖するＴＰｒｏｇ及び他のバルク腫瘍細胞集団と比べて従来の治療法及びレジメンに対する抵抗性がより高い可能性がある。さらに、ＴＰＣは多くの場合に、多剤耐性輸送体の発現上昇、ＤＮＡ修復機構の増強及び抗アポトーシスタンパク質など、従来の治療法に対して比較的高い化学的抵抗性となるような他の特徴を発現する。これらの特性（その各々がＴＰＣによる薬物耐性に寄与する）は、進行期の新形成を有するほとんどの患者について標準的な腫瘍学治療レジメンが長期利益を確実にできない；すなわち持続的な腫瘍成長及び再発を刺激するそれらの細胞（すなわちＴＰＣ又はＣＳＣ）を適切に標的化及び根絶できない主な理由をなしている。
【００６８】
多くの先行技術の治療と異なり、本発明の新規組成物は、選択されたモジュレーターの形態又は具体的な標的（例えば、遺伝物質、ＳＥＺ６抗体又はリガンド融合コンストラクト）に関係なく、好ましくは対象への投与時に腫瘍開始細胞の頻度を低減する。上記のとおり、腫瘍開始細胞頻度の低減は、ａ）腫瘍開始細胞の除去、枯渇、感作、サイレンシング又は阻害；ｂ）腫瘍開始細胞の成長、拡大又は再発の制御；ｃ）腫瘍開始細胞の惹起、伝播、維持、又は増殖の遮断の結果として；又はｄ）その他の形で、腫瘍原性細胞の生存、再生及び／又は転移を妨げることにより起こり得る。一部の実施形態では、腫瘍開始細胞の頻度の低減は、１つ以上の生理学的経路が変化する結果として起こる。この経路の変化は、それが腫瘍開始細胞の低減又は除去によるのであれ、又はその潜在能力（例えば、誘導性分化、ニッチ破壊）の修飾、若しくは他の形の、腫瘍環境又は他の細胞に影響を及ぼすその能力の妨害によるのであれ、ひいては腫瘍発生、腫瘍維持及び／又は転移及び再発を阻害することによりＳＥＺ６関連障害のより有効な治療を可能にする。
【００６９】
腫瘍開始細胞の頻度のかかる低減を評価するために用いることのできる当該技術分野で認められている方法の中には、インビトロ或いはインビボでの限界希釈解析法と、好ましくはそれに続く、インビボで腫瘍を生じる能力がある又はないなどの、予め定義された決定的事象のポアソン分布統計を使用した計数又は頻度の評価がある。かかる限界希釈解析法は、腫瘍開始細胞頻度の低減を計算する好ましい方法をなすが、所望の値を有効に決定するには、やや不正確ではあっても、本明細書の教示と全体に適合性がある、他の要求が低い方法を用いてもまたよい。従って、当業者により理解されるとおり、周知のフローサイトメトリーによる又は免疫組織化学的な手段によって頻度値の低減を決定することもまた可能である。上記の方法に関しては全て、例えば、Ｄｙｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００８，ＰＭＩＤ：１８５６０５９４  ＆  Ｈｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００９，ＰＭＩＤ：１９６６４９９１を参照；この各々は全体として、詳細には本開示の方法に関して、参照により本明細書に援用される。
【００７０】
限界希釈解析法に関して、腫瘍開始細胞頻度のインビトロ計数は、分画された、或いは分画されていないヒト腫瘍細胞（例えばそれぞれ処置腫瘍及び未処置腫瘍由来）を、コロニー形成を育成するインビトロ成長条件に置くことにより達成し得る。このようにして、コロニーの単純な数え上げ及び特徴付けによるか、又は、例えば、段階希釈でヒト腫瘍細胞をプレートに置き、且つプレーティングの少なくとも１０日後のコロニー形成に関して陽性或いは陰性として各ウェルをスコア化することからなる分析により、コロニー形成細胞が計数され得る。インビボ限界希釈実験又は解析は、概して腫瘍開始細胞頻度を決定するその能力がより正確なものであり、未処置対照集団又は処置集団のいずれか由来のヒト腫瘍細胞を、例えば段階希釈で免疫不全マウスに移植し、続いて移植の少なくとも６０日後に腫瘍形成に関して陽性或いは陰性として各マウスをスコア化することを包含する。インビトロ又はインビボでの限界希釈解析法による細胞頻度値の導出は、好ましくは陽性及び陰性事象の既知の頻度にポアソン分布統計を適用し、それにより陽性事象；この場合、それぞれコロニー又は腫瘍形成の定義を満たす事象の頻度を求めることにより行われる。
【００７１】
腫瘍開始細胞の頻度計算に用い得る、本発明と適合性のある他の方法に関して、最も一般的なものには、定量化可能なフローサイトメトリー法及び免疫組織化学染色法が含まれる。これらの方法は、以上に記載した限界希釈解析法ほど正確ではないものの、労力がはるかに少なくてすみ、比較的短い時間内に正当な値を提供する。従って、当業者が、腫瘍開始細胞で高濃度化することが知られている当該技術分野で認められている細胞表面タンパク質（例えば、全体として本明細書に援用されるＰＣＴ出願第２０１２／０３１２８０号明細書に示されるとおりの潜在的に適合性のあるマーカー）と結合する１つ以上の抗体又は試薬を用いるフローサイトメトリー細胞表面マーカープロファイル測定を使用して、それにより様々な試料のＴＩＣレベルを計測し得ることが理解される。さらに別の適合性のある方法では、当業者は、これらの細胞を区別すると考えられる細胞表面タンパク質と結合可能な１つ以上の抗体又は試薬を使用した免疫組織化学法により、インサイチューで（例えば、組織切片において）ＴＩＣ頻度を計数することもできる。
【００７２】
当業者は、多数のマーカー（又はそれらの非存在）が様々な癌幹細胞集団と関連付けられ、且つ腫瘍細胞亜集団の単離又は特徴付けに用いられてきたことを認識する。この点において、例示的癌幹細胞マーカーには、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＮＢ８４、ＴｒｋＡ、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２９、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ４６、トランスフェリン受容体、ＪＡＭ３、カルボキシペプチダーゼＭ、ＡＤＡＭ９、オンコスタチンＭ、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ネスチン、Ｓｏｘ１、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄ、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ｍｆ２、ｙｙ１、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃｋＡ５、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｍｌｌｔ３、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＡＸＩＮ１、ＢＣＬ９、ＭＹＣ、（ＴＣＦ４）ＳＬＣ７Ａ８、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＥＭ８、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＵＣ１６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１１、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＰＴＰＮ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＭＰＺＬ１、ＦＬＪ１００５２、Ｃ４．４Ａ、ＥＤＧ３、ＲＡＲＲＥＳ１、ＴＭＥＰＡＩ、ＰＴＳ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＮＩＤ２、ＳＴＥＡＰ、ＡＢＣＡ３、ＣＲＩＭ１、ＩＬ１Ｒ１、ＯＰＮ３、ＤＡＦ、ＭＵＣ１、ＭＣＰ、ＣＰＤ、ＮＭＡ、ＡＤＡＭ９、ＧＪＡ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＡＢＣＡ１、ＰＣＤＨ７、ＡＤＣＹ９、ＳＬＣ３９Ａ１、ＮＰＣ１、ＥＮＰＰ１、Ｎ３３、ＧＰＮＭＢ、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＬＳＲ１、ＬＲＰ３、Ｃ２０ｏｒｆ５２、ＴＭＥＰＡＩ、ＦＬＶＣＲ、ＰＣＤＨＡ１０、ＧＰＲ５４、ＴＧＦＢＲ３、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＰＣＤＨＢ２、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１６６、ＡＦＰ、ＢＭＰ−４、β−カテニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、デコリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ１０５、ＣＤ６４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＣＤ４９ｂ、及びＣＤ４９ｆが含まれる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、米国特許第７，６３２，６７８号明細書及び米国特許出願公開第２００７／０２９２４１４号明細書、同第２００８／０１７５８７０号明細書、同第２０１０／０２７５２８０号明細書、同第２０１０／０１６２４１６号明細書及び同第２０１１／００２０２２１号明細書（この各々が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。さらに、上記のマーカーの各々はまた、本発明の二重特異性抗体又は多重特異性抗体のコンテクストにおける二次標的抗原としても用いられ得ることが理解される。
【００７３】
同様に、特定の腫瘍型の癌幹細胞に関連する細胞表面表現型の非限定的な例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋並びに当該技術分野において公知の他の癌幹細胞表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、上掲、Ｖｉｓｖａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＭＩＤ：１８７８４６５８及び米国特許出願公開第２００８／０１３８３１３号明細書（この各々が参照により全体として本明細書に援用される）を参照のこと。当業者は、上記に例示したようなマーカー表現型を標準的なフローサイトメトリー分析及び細胞選別技術と併せて用いて、さらなる分析のためＴＩＣ及び／又はＴＰＣ細胞又は細胞集団を特徴付け、単離し、精製し又は高濃度化し得ることを理解する。本発明に関して興味深いことに、ＣＤ４６、ＣＤ３２４、及び場合によりＣＤ６６ｃは、分析されている腫瘍標本が一次患者腫瘍標本であったか、それとも患者由来のＮＴＸ腫瘍であったかに関わらず、多くのヒト結腸直腸（「ＣＲ」）、乳房（「ＢＲ」）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺（ＳＣＬＣ）、膵臓（「ＰＡ」）、黒色腫（「Ｍｅｌ」）、卵巣（「ＯＶ」）、及び頭頸部癌（「ＨＮ」）腫瘍細胞の表面上に高度に発現するか、或いは不均一に発現するかのいずれかである。
【００７４】
上記で参照した方法及び選択されたマーカーのいずれかを当該技術分野において公知のとおり使用することで、本明細書の教示に従い本開示のＳＥＺ６モジュレーター（細胞傷害剤とコンジュゲートしたものを含む）により提供されるＴＩＣ（又はその中のＴＰＣ）の頻度の低減を定量化することが可能となる。ある場合には、本発明の化合物はＴＩＣ又はＴＰＣの頻度を（除去、誘導性分化、ニッチ破壊、サイレンシング等を含めた、上記に指摘した様々な機構によって）１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又はさらには３５％低減し得る。他の実施形態において、ＴＩＣ又はＴＰＣの頻度の低減は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％程度であってよい。特定の実施形態では、本開示の化合物は、ＴＩＣ又はＴＰＣの頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はさらには９５％低減し得る。当然ながら、ＴＩＣ又はＴＰＣの頻度の任意の低減が、新形成の腫瘍形成能、持続性、再発及び侵襲性の対応する低減をもたらし得ることが理解される。
【００７５】
ＩＶ．ＳＥＺ６モジュレーター
いずれの場合も、本発明は、数多くのＳＥＺ６関連悪性腫瘍のうちのいずれか一つを含めた様々な障害の診断、セラグノーシス、治療及び／又は予防のための、ＳＥＺ６アンタゴニストを含むＳＥＺ６モジュレーターの使用に関する。本開示のモジュレーターは、単独で、又は化学療法剤若しくは免疫療法剤（例えば、治療用抗体）又は生物学的反応修飾物質などの多種多様な抗癌化合物と併せて使用され得る。他の選択された実施形態では、２つ以上の個別のＳＥＺ６モジュレーターを組み合わせて使用して抗新生物効果の増強を提供してもよく、又はそれらを使用して多重特異性コンストラクトを作製してもよい。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドを含む。より詳細には、本発明の例示的モジュレーターは、抗体及びその抗原結合断片又は誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質類、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、アンチセンスコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、生物有機分子、ペプチドミメティクス、薬理学的作用物質及びそれらの代謝物、転写及び翻訳制御配列などを含み得る。特定の実施形態では、モジュレーターは、可溶性ＳＥＺ６（ｓＳＥＺ６）又はその形態、変異体、誘導体若しくは断片、例えば、ＳＥＺ６融合コンストラクト（例えば、ＳＥＺ６−Ｆｃ、ＳＥＺ６−標的部分等）又はＳＥＺ６−コンジュゲート（例えば、ＳＥＺ６−ＰＥＧ、ＳＥＺ６−細胞傷害剤、ＳＥＺ６−ｂｒｍ等）を含む。また、他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは抗体又はその免疫反応性断片若しくは誘導体を含むことも理解される。特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターは、中和抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、インターナライズ抗体又はその断片を含み得る。さらに他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、枯渇抗体又はその断片を含み得る。さらに、上記の融合コンストラクトと同様に、これらの抗体モジュレーターは、選択された細胞傷害剤、ポリマー、生物学的反応修飾物質（ＢＲＭ）などとコンジュゲートされ、連結され又は他の形で会合されることにより、様々な（及び場合により複数の）作用機序を有する指向的な免疫療法を提供し得る。上記で言及したとおり、かかる抗体は汎ＳＥＺ６抗体であって、２つ以上のＳＥＺ６ファミリーメンバー（例えば、図１１Ａに示されるとおりのＳＥＺ６及びＳＥＺ６Ｌ）と会合してもよく、又はＳＥＺ６の一方若しくは両方のアイソフォームと選択的に反応する免疫特異的抗体であってもよい。さらに他の実施形態において、モジュレーターは遺伝子レベルで機能し、ＳＥＺ６決定因子の遺伝子型成分と相互作用又は会合するアンチセンスコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどとして化合物を含み得る。
【００７７】
さらに、本開示のＳＥＺ６モジュレーターは、例えばＳＥＺ６モジュレーターの形態、任意の関連するペイロード又は投与量及び送達方法に応じて、選択された経路を作動させ若しくはそれに拮抗すること、又は特定の細胞を除去することを含め、様々な機構を介して、ＴＰＣ、及び／又は関連する新形成を含めた腫瘍細胞の成長、伝播又は生存を枯渇させ、サイレンシングし、中和し、除去し又は阻害し得ることが理解される。従って、本明細書に開示される好ましい実施形態は、腫瘍不滅化細胞などの特定の腫瘍細胞亜集団の枯渇、阻害若しくはサイレンシングに関し、又は特異的なエピトープ若しくはドメインと相互作用するモジュレーターに関するが、かかる実施形態は単に例示に過ぎず、いかなる意味においても限定するものではないことは強調されなければならない。むしろ、添付の特許請求の範囲に示されるとおり、本発明は、いかなる特定の機構、結合領域又は標的腫瘍細胞集団にも関係なく、広くＳＥＺ６モジュレーター及び様々なＳＥＺ６関連障害の治療、管理又は予防におけるその使用に関する。
【００７８】
選択されたモジュレーターの形態とは無関係に、選ばれた化合物が本質的に拮抗性であり得ることは理解される。本明細書で使用されるとき「アンタゴニスト」は、受容体とリガンドとの結合又は酵素と基質との相互作用を含めた特定の又は特異的な標的（例えばＳＥＺ６）の活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は妨害することができる分子を指す。この点において、本発明のＳＥＺ６アンタゴニストが、ＳＥＺ６タンパク質又はその断片を認識し、それと反応し、それを結合し、それと組み合わさり、それと競合し、それと会合するか、又は他の形でそれと相互作用し、且つ腫瘍開始細胞又はバルク腫瘍若しくはＮＴＧ細胞を含む他の新生物性細胞の成長を消失させ、サイレンシングし、低減し、阻害し、妨げ、抑制し又は制御する任意のリガンド、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体又はその免疫学的に活性な断片若しくは誘導体を含み得ることが理解される。適合性のあるアンタゴニストには、ＳＥＺ６遺伝子型又は表現型決定因子を認識し又はそれに会合することにより発現パターンを変化させる又は基質、受容体又はリガンドとのその結合又は相互作用を封じ込める小分子阻害因子、アプタマー、アンチセンスコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど、受容体又はそのリガンド分子及び誘導体がさらに含まれ得る。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、アンタゴニストは、受容体とリガンドの結合又は酵素と基質の相互作用を含めた、特定の又は特異的なタンパク質の活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は妨害することができる分子を指す。より一般的には、本発明のアンタゴニストは、抗体及びその抗原結合断片又は誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質類、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、アンチセンスコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、生物有機分子、ペプチドミメティクス、薬理学的作用物質及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などを含み得る。アンタゴニストにはまた、タンパク質に特異的に結合して、それによりその基質標的とのその結合を封じ込める小分子阻害因子、融合タンパク質、受容体分子及び誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、タンパク質に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びタンパク質に対するリボザイムも含まれ得る。
【００８０】
本明細書で使用され、且つ２つ以上の分子又は化合物に適用されるとき、用語「認識する」又は「会合する」は、一方の分子が他方の分子に効果を及ぼすような分子の共有結合的又は非共有結合的な反応、結合、特異的結合、組み合わせ、相互作用、連結、連鎖、一体化、合体、合併（ｍｅｒｇｅｒ）又は接合を意味すると考えられるものとする。
【００８１】
さらに、本明細書の例において実証されるとおり（例えば、図１１を参照）、一部のヒトＳＥＺ６のモジュレーターは、ある場合に、ヒト以外の種由来（例えばラット、またはカニクイザル）のＳＥＺ６と交差反応する。別の場合には、例示的モジュレーターはヒトＳＥＺ６の１つ以上のアイソフォームに特異的であってよく、他の種由来のＳＥＺ６オルソログとの交差反応性は呈しない。当然ながら、本明細書の教示と併せて、かかる実施形態は、単一の種由来の２つ以上のＳＥＺ６ファミリーメンバーと会合する汎ＳＥＺ６抗体又はＳＥＺ６のみと会合する抗体を含み得る。
【００８２】
いずれの場合も、及び以下でさらに詳細に考察するとおり、当業者は、本開示のモジュレーターがコンジュゲート形態又は非コンジュゲート形態で用いられ得ることを理解する。すなわち、モジュレーターは、薬学的に活性な化合物、生物学的反応修飾物質、抗癌剤、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤、診断部分又は生体適合性修飾物質と（例えば共有結合的又は非共有結合的に）会合され又はコンジュゲートされ得る。この点において、かかるコンジュゲートがペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子及び放射性同位元素を含み得ることは理解される。さらに、本明細書において指摘するとおり、選択されたコンジュゲートはＳＥＺ６モジュレーターと、少なくとも一部には、コンジュゲーションを生じさせるために用いられる方法に応じて、様々なモル比で共有結合的又は非共有結合的に連結され得る。
【００８３】
Ｖ．モジュレーターの作製及び供給
Ａ．抗体モジュレーター
１．概要
これまでに言及したとおり、本発明の特に好ましい実施形態は、ＳＥＺ６の１つ以上のアイソフォームと優先的に会合する（及び、場合により、他のＳＥＺ６ファミリーメンバーと交差反応し得る）抗体の形態のＳＥＺ６モジュレーターを含む。当業者は、例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２０１０）又はＭｕｒｐｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）（この各々が全体として参照により本明細書に援用される）に示されるような抗体に関する十分に開発された知識ベースを認識している。
【００８４】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化及び霊長類化抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、例えばこれらのムテイン及び変異体；抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖ＦｖＦｃ、単鎖Ｆｖ；及びこれらの誘導体、例えばＦｃ融合物及び他の修飾、及び任意の他の免疫学的に活性な分子を、それらが所望の生物学的活性（すなわち、抗原の会合又は結合）を呈する限り、包含するように意図される。さらに、この用語は、文脈によって別段指示されない限り、あらゆるクラスの抗体（すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）及びあらゆるアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、並びにそれらの変種をさらに含む。異なるクラスの抗体に相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ、及びμで示される。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプの一方に割り当てることができる。
【００８５】
かかる抗体は全て本発明の範囲内にあるが、本明細書では、単に例示を目的として、免疫グロブリンのＩｇＧクラスを含む好ましい実施形態をいくらか詳細に考察する。しかしながらかかる開示が、単に例示的な組成物及び本発明の実施方法を例証するものに過ぎず、本発明の範囲又は本明細書に添付される特許請求の範囲をいかなる形であれ限定するものではないことは理解される。
【００８６】
周知のとおり、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の部分の可変ドメインが抗原認識及び特異性を決定し、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインが、分泌、経胎盤移動度、循環半減期、補体結合などのような重要な生物学的特性を付与及び調節する。
【００８７】
「可変」領域は、軽鎖及び重鎖のいずれの可変ドメインにおいても、一般に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントとして現れる超可変部位を含む。可変ドメインのうち、ＣＤＲが隣接するより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。例えば、天然に存在する単量体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体では、「Ｙ」字形の各アームに存在する６つのＣＤＲは短い不連続なアミノ酸配列であり、抗体が水性環境でその三次元配置をとると、特異的に位置決めされて抗原結合部位を形成する。従って、天然に存在するＩｇＧ抗体の各々は、Ｙ字形の各アームのアミノ末端の近位に２つの同一の結合部位を含む。
【００８８】
ＣＤＲの位置が、当業者により標準的な技術を用いて容易に同定され得ることは理解される。また、当業者には、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）に記載される付番方式もよく知られている。これに関して、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．は、どの抗体にも適用可能な可変ドメイン配列の付番方式を定義した。当業者は、配列それ自体を越えたいかなる実験データにも頼ることなく、この「Ｋａｂａｔ付番」方式を任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。特記されない限り、抗体における特定のアミノ酸残基位置の付番に対する参照は、Ｋａｂａｔ付番方式に従う。
【００８９】
従って、Ｋａｂａｔに従えば、ＶＨでは、残基３１〜３５がＣＤＲ１を含み、残基５０〜６５がＣＤＲ２を構成し、且つ９５〜１０２がＣＤＲ３を含む一方、ＶＬでは、残基２４〜３４がＣＤＲ１であり、５０〜５６がＣＤＲ２を含み、且つ８９〜９７がＣＤＲ３を構成する。関連して、ＶＨでは、ＦＲ１が、アミノ酸１〜３０を包含する可変領域のドメインに対応し；ＦＲ２が、アミノ酸３６〜４９を包含する可変領域のドメインに対応し；ＦＲ３が、アミノ酸６６〜９４を包含する可変領域のドメインに対応し、且つＦＲ４が、アミノ酸１０３から可変領域の末端までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のＦＲも同様に、軽鎖可変領域ＣＤＲの各々によって分けられる。
【００９０】
ＣＤＲは抗体毎に著しく異なる（及び定義からして、Ｋａｂａｔコンセンサス配列との相同性を呈しない）ことに留意されたい。加えて、任意の所与のＫａｂａｔ部位番号における特定の個別の残基のアイデンティティは、種間の又は対立遺伝子の相違に起因して、抗体鎖毎に異なり得る。別の付番が、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）に示され、しかしながらＫａｂａｔのように、ＦＲ境界は上記に記載したとおりそれぞれのＣＤＲ末端によって分けられる。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，ｐｐ．８７７−８８３（１９８９）及びＳ．Ｄｕｂｅｌ，ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．（２００７）も参照されたく、これらの定義は、互いに比較したとき重複するアミノ酸残基又はアミノ酸残基のサブセットを含む。上記の文献の各々は全体として参照により本明細書に援用され、上記で引用した文献の各々により定義されるとおりの結合領域又はＣＤＲを含むアミノ酸残基を、以下に比較のため示す。
【００９１】
【表５】
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【００９２】
本発明の文脈では、図１０Ａ又は図１０Ｂに示されるマウス可変領域アミノ酸配列に由来する本開示の軽鎖及び重鎖ＣＤＲのいずれかを組み合わせて又は再配列して、本教示に従う最適化された抗ＳＥＺ６（例えばヒト化、ＣＤＲグラフト化又はキメラ抗ｈＳＥＺ６）抗体を提供し得ることが理解される。すなわち、図１０Ａに示される軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２０〜１６８、偶数）又は図１０Ｂに示される重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２１〜１６９、奇数）に由来するＣＤＲの１つ以上を、ＳＥＺ６モジュレーター、特に好ましい実施形態では、１つ以上のＳＥＺ６アイソフォームと免疫特異的に会合するＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体に、組み込むことができる。かかるヒト化モジュレーターの軽鎖（配列番号１７０〜１９２、偶数）及び重鎖（配列番号１７１〜１９３、奇数及び１９４〜１９９）可変領域アミノ酸配列の例もまた、図１０Ａ及び図１０Ｂに示される。
【００９３】
ｈＳＣ１７．２００ｖＬ１（配列番号１９２）は、ヒト化軽鎖コンストラクトｈＳＣ１７．２００（配列番号１９０）の変異体であり、ｈＳＣ１７．１５５ｖＨ１〜ｖＨ６（配列番号１９３〜１９８）は、ＳＣ１７．９０（配列番号１２７）に由来する重鎖コンストラクトｈＳＣ．１５５（配列番号１８４）の変異体であり、ｈＳＣ１６１ｖＨ１（配列番号１９９）は、重鎖コンストラクトｈＳＣ１７．１６１（配列番号１８９）の変異体であることに留意されたい。以下でさらに詳細に考察するとおり、これらの変異体は、親抗体の１つ以上の生化学的特性を最適化するように構築及び試験した。
【００９４】
まとめると、これらの新規アミノ酸配列は、本発明に従う７５個のマウス及び１１個のヒト化例示的モジュレーターを（報告される変異体と共に）示す。さらに、図１０Ａ及び図１０Ｂに示される７５個の例示的マウスモジュレーター及び１１個のヒト化モジュレーター並びに変異体の各々の対応する核酸配列が、本願の配列表に含まれる（配列番号２２０〜３９９）。
【００９５】
図１０Ａ及び図１０Ｂにおいて、アノテートされたＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ付番を用いて定義される。しかしながら、本明細書において考察され、及び以下の実施例８で実証されるとおり、当業者であれば、図１０Ａ又は図１０Ｂに示されるそれぞれの重鎖及び軽鎖配列の各々についてＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．又はＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．によって定義されるとおりＣＤＲを定義し、同定し、導出し及び／又は計数することが容易に可能である。従って、あらゆるこのような命名法により定義されるＣＤＲを含む対象ＣＤＲ及び抗体の各々が、本発明の範囲内に明示的に含まれる。より広義には、用語「可変領域ＣＤＲアミノ酸残基」又はさらに単純に「ＣＤＲ」は、上記のとおりの任意の配列又は構造に基づく方法を用いて同定されるとおりのＣＤＲにおけるアミノ酸を含む。
【００９６】
２．抗体モジュレーター生成
ａ．ポリクローナル抗体
ウサギ、マウス、ラット等を含めた様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知である。一部の実施形態では、動物を出血させるか又は犠牲にすることにより、ポリクローナル抗ＳＥＺ６抗体含有血清が採取される。血清は動物から採取した形態で研究目的に用いてもよく、或いは抗ＳＥＺ６抗体を部分的に又は完全に精製して、免疫グロブリン画分又は均一な抗体調製物を提供してもよい。
【００９７】
手短に言えば、選択された動物を、例えば、選択されたアイソフォーム、ドメイン及び／又はペプチド、又はＳＥＺ６若しくはその免疫反応性断片を発現する生細胞若しくは細胞調製物を含み得るＳＥＺ６免疫原（例えば、可溶性ＳＥＺ６又はｓＳＥＺ６）で免疫する。接種される種に応じた、免疫応答を増加させるために用いられ得る当該技術分野で知られているアジュバントとしては、限定はされないが、フロイント（完全及び不完全）、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。かかるアジュバントは、抗原を局所沈着した状態に捕捉することにより抗原が急速に分散しないよう保護し得るか、又はマクロファージ及び他の免疫系成分にとって走化性の因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有し得る。好ましくは免疫スケジュールは、所定の期間にわたって展開される選択された免疫原の２回以上の投与を含む。
【００９８】
図１Ｃ又は図１Ｄに示されるとおりのＳＥＺ６タンパク質のアミノ酸配列を解析することにより、抗体生成用にＳＥＺ６タンパク質の特定の領域を選択することができる。例えば、ＳＥＺ６アミノ酸配列の疎水性及び親水性解析を使用して、ＳＥＺ６構造中の親水性領域が同定される。免疫原性構造を示すＳＥＺ６タンパク質の領域、並びに他の領域及びドメインは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ又はＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析などの当該技術分野において公知の様々な他の方法を用いて容易に同定することができる。Ｂｈａｓｋａｒａｎ  Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を用いて平均可動性プロファイルを作成することができる。Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ  Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：２８９−２９４の方法を用いてβターンプロファイルを作成することができる。従って、これらのプログラム又は方法のいずれかによって同定される各ＳＥＺ６領域、ドメイン又はモチーフは本発明の範囲内であり、同定又は工学的に改変することにより、所望の特性を含むモジュレーターを生じる免疫原が提供され得る。ＳＥＺ６抗体を生成するための好ましい方法が、本明細書に提供される実施例によってさらに例示される。免疫原として使用されるタンパク質又はポリペプチドの調製方法は、当該技術分野において周知である。また、ＢＳＡ、ＫＬＨ又は他の担体タンパク質などの担体を有するタンパク質の免疫原性コンジュゲートの調製方法も、当該技術分野において周知である。状況によっては、例えばカルボジイミド試薬を使用する直接のコンジュゲーションが用いられる；他の場合には、連結用の試薬が有効である。ＳＥＺ６免疫原の投与は、当該技術分野で理解されているとおり、多くの場合に注射により、好適な期間にわたり、且つ好適なアジュバントの使用を伴い行われる。以下の実施例に記載されるとおり、免疫スケジュールの間に抗体力価を測ることにより、抗体形成の妥当性を決定することができる。
【００９９】
ｂ．モノクローナル抗体
加えて、本発明は、モノクローナル抗体の使用を企図する。当該技術分野において公知のとおり、用語「モノクローナル抗体」（又はｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在する可能性のある突然変異（例えば天然に存在する突然変異）を除いて同一である。特定の実施形態では、かかるモノクローナル抗体は、抗原と結合又は会合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで抗原結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む過程によって得られたものである。
【０１００】
より一般的には、及び本明細書の実施例６に例示されるとおり、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））又はそれらの何らかの組み合わせを含めた、当該技術分野において公知の多種多様な技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１ｓｔ  ｅｄ．２００９；Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ．ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＋  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ，１ｓｔ  ｅｄ．２０１０；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（この各々が参照により全体として本明細書に援用される）にさらに詳細に記載されるような、ハイブリドーマ並びに当該技術分野で認められている生化学的及び遺伝子工学技術を使用して産生することができる。選択された結合配列は、例えば、標的に対する親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養におけるその産生の向上、インビボでのその免疫原性の低減、多重特異性抗体の作成等のため、さらに改変してもよく、この改変した標的結合配列を含む抗体もまた、本発明の抗体であることが理解されなければならない。
【０１０１】
ｃ．キメラ抗体
別の実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる種又はタイプの抗体から共有結合的につなぎ合わされたタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含み得る。当該技術分野において公知のとおり、用語「キメラ」抗体は、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにかかる抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である一方、鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにかかる抗体の断片の対応する配列と同一又は相同であるコンストラクトに関する（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１０２】
一実施形態において、本明細書の教示に従うキメラ抗体は、マウスＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と、ヒト供給源に由来する定常領域とを含み得る。他の適合性のある実施形態において、本発明のキメラ抗体は、以下に記載するとおりのヒト化抗体を含み得る。別の実施形態、いわゆる「ＣＤＲグラフト化」抗体において、抗体は、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する１つ以上のＣＤＲを含む一方、抗体鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である。ヒトでの使用には、選択されたげっ歯類ＣＤＲをヒト抗体にグラフト化して、ヒト抗体の天然に存在する可変領域又はＣＤＲの１つ以上を置き換えてもよい。これらのコンストラクトは、概して、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながらも完全な強度のモジュレーター機能（例えば、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）等）を提供するという利点を有する。
【０１０３】
ｄ．ヒト化抗体
ＣＤＲグラフト化抗体と類似しているのが、「ヒト化」抗体である。本明細書で使用されるとき、「ヒト化」形態の非ヒト（例えばマウス）抗体は、１つ以上の非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント又はアクセプター抗体）であって、レシピエントのＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類のＣＤＲ由来の残基に置き換えられているものである。特定の好ましい実施形態では、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインにおける１つ以上のＦＲの残基が、ドナー抗体由来の対応する非ヒト残基に置き換えられ、グラフト化ＣＤＲ（複数可）の適切な三次元配置の維持及びそれによる親和性の向上が促進される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含んでもよく、それにより例えば、抗体性能がさらに改良され得る。
【０１０４】
ＣＤＲグラフト抗体及びヒト化抗体については、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書に記載されている。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリンＦｃ（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分も含み得る。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；及び米国特許第６，９８２，３２１号明細書及び同第７，０８７，４０９号明細書を参照のこと。さらに別の方法は、「ヒューマニアリング」と称され、これについては、例えば、米国特許出願公開第２００５／０００８６２５号明細書に記載されている。加えて、非ヒト抗体はまた、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的な欠失すなわち「脱免疫化」により修飾されてもよい。上記の文献の各々は、全体として本明細書に援用される。
【０１０５】
ヒト化抗体はまた、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリン可変領域の全て又は一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、及び発現させるなど、一般的な分子生物学的技法を用いて生物工学的に操作されてもよい。上記に指摘したかかる核酸の供給源に加えて、例えばＴｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８−４６３８に開示されるとおり、ヒト生殖系列配列が利用可能である。Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３；６７１−６７４，２００５）は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（編纂Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。また、例えば米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されるとおり、コンセンサスヒトＦＲも使用することができる。
【０１０６】
選択された実施形態において、及び以下の実施例８に詳述するとおり、ヒト化抗体重鎖又は軽鎖可変領域アミノ酸残基の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％が、レシピエントＦＲ及びＣＤＲ配列のものに相当する。他の実施形態において、ヒト化抗体可変領域残基の少なくとも８５％又は９０％が、レシピエントＦＲ及びＣＤＲ配列のものに相当する。さらに好ましい実施形態において、ヒト化抗体可変領域残基の９５％超が、レシピエントＦＲ及びＣＤＲ配列のものに相当する。
【０１０７】
ｅ．ヒト抗体
別の実施形態において、抗体は完全ヒト抗体を含み得る。用語「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体及び／又はヒト抗体の作製技法のいずれかを用いて作製されている抗体を指す。
【０１０８】
ヒト抗体は、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて産生することができる。一つの技法はファージディスプレイであり、ここではファージ上に（好ましくはヒト）抗体のライブラリが合成され、このライブラリが目的の抗原又はその抗体結合部分によりスクリーニングされ、抗原を結合するファージが単離されて、そこから免疫反応性断片を得ることができる。かかるライブラリの調製及びスクリーニング方法は当該技術分野において周知であり、ファージディスプレイライブラリの作成用キットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。また、抗体ディスプレイライブラリの作成及びスクリーニングに使用することのできる他の方法及び試薬もある（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、国際公開第９２／２０７９１号パンフレット、国際公開第９２／１５６７９号パンフレット、国際公開第９３／０１２８８号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９２／０９６９０号パンフレット；及びＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２（１９９１）を参照のこと）。
【０１０９】
一実施形態において、組換えヒト抗体は、上記のとおり調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることにより単離され得る。一実施形態において、ライブラリは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して作成されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリである。
【０１１０】
ナイーブライブラリ（天然であれ、又は合成であれ）によって産生された抗体は、中程度の親和性であり得るが（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫａ）、当該技術分野で記載されるとおり二次ライブラリから構築及び再選択することにより、親和性成熟もまたインビトロで模倣させることができる。例えば、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）に報告される）。加えて、親和性成熟は、例えば目的のＣＤＲにかかるランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを用いて、選択された個々のＦｖクローンにおいて１つ以上のＣＤＲをランダムに突然変異させ、より高い親和性のクローンについてスクリーニングすることにより実施し得る。国際公開第９６０７７５４号パンフレットは、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するための、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲにおける突然変異誘発の誘導方法について記載している。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるとおり、ファージディスプレイにより選択されたＶＨ又はＶＬドメインを、未免疫のドナーから得た天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーで組み換え、数ラウンドの鎖リシャッフリングでより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技法は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約１０−９Ｍ以下の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１１１】
他の実施形態では、その表面上に結合ペアを発現する真核細胞（例えば酵母）を含むライブラリを使用する、同様の手法が用いられ得る。例えば、米国特許第７，７００，３０２号明細書及び米国特許出願第１２／４０４，０５９号明細書を参照のこと。一実施形態において、ヒト抗体はファージライブラリから選択され、ここで当該のファージライブラリはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４（１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２（１９９８）。他の実施形態において、ヒト結合ペアは、酵母などの真核細胞で作成されたコンビナトリアル抗体ライブラリから単離されてもよい。例えば、米国特許第７，７００，３０２号明細書を参照のこと。かかる技法は、有利には多数の候補モジュレーターのスクリーニングを可能にし、候補配列の（例えば親和性成熟又は組換えシャッフリングによる）比較的容易な操作をもたらす。
【０１１２】
ヒト抗体はまた、トランスジェニック動物にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されていて、且つヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されているマウスにより作製することができる。攻撃後、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再構成、構築、及び抗体レパートリーを含め、あらゆる点でヒトに見られるものとよく似ている。この手法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書、並びにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号明細書及び同第６，１５０，５８４号明細書；及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。或いは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化によっても調製され得る（かかるＢリンパ球は、新生物性障害に罹患した個体から回収されてもよく、又はインビトロで免疫化されたものであってもよい）。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（ｌ）：８６−９５（１９９１）；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照のこと。
【０１１３】
３．さらなる処理
モジュレーター産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニー等）は、どのように得られるにしろ、選択され、クローニングされ、さらに、望ましい特性、例えば、ロバストな成長、高い抗体産生、及び以下でさらに詳細に考察するとおり、望ましい抗体特性についてスクリーニングされ得る。ハイブリドーマはインビボで同系動物において、免疫系が欠損している動物、例えばヌードマウスにおいて、又は細胞培養物においてインビトロで拡大させることができる。ハイブリドーマ及び／又はコロニー（その各々が個別の抗体種を産生する）の選択、クローニング及び拡大方法は、当業者に周知である。
【０１１４】
Ｂ．組換えモジュレーターの作製
１．概要
供給源が完成すると、所望のＳＥＺ６モジュレーターをコードするＤＮＡを、従来の手順を用いて（例えば、抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離し、配列決定し得る。モジュレーターが抗体である場合、単離及びサブクローニングされたハイブリドーマ細胞（又はファージ又は酵母由来コロニー）が、かかるＤＮＡの好ましい供給源として働き得る。必要であれば、本明細書に記載されるとおり核酸をさらに操作して、融合タンパク質を含む作用物質、又はキメラ、ヒト化若しくは完全ヒト抗体を作製してもよい。より詳細には、単離されたＤＮＡ（これは修飾されていてもよい）を使用して、抗体製造のため定常及び可変領域配列をクローニングすることができる。
【０１１５】
従って、例示的実施形態において、抗体は、従来の手順を用いて（Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ；Ａｎ、及びＳｈｉｒｅ  ｅｔ．ａｌ．（全て上掲）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）に示されるものなど）組換え産生されてもよく、ここでは単離及びサブクローニングされたハイブリドーマ細胞（又はファージ又は酵母由来コロニー）が、核酸分子の好ましい供給源として働く。
【０１１６】
用語「核酸分子」は、本明細書で使用されるとき、一本鎖か又は二本鎖かに関わらず、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子並びにその人工変異体（例えばペプチド核酸）を含むように意図される。核酸は本発明の抗体の一方又は両方の鎖、又はその断片若しくは誘導体をコードし得る。本発明の核酸分子はまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ又は増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー又は配列決定プライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、並びに相補配列も含む。核酸は任意の長さであってよい。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００ヌクレオチド長又はそれ以上であってよく、及び／又は１つ以上のさらなる配列、例えば調節配列を含んでもよく、及び／又はより大きい核酸、例えばベクターの一部であってもよい。かかる核酸配列をさらに操作して、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体を含むモジュレーターを作製し得ることは理解される。より詳細には、米国特許第７，７０９，６１１号明細書に記載されるとおり、単離核酸分子（これは修飾されていてもよい）を使用して抗体製造のため定常及び可変領域配列をクローニングすることができる。
【０１１７】
用語「単離核酸」は、核酸が（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された、（ｉｉ）クローニングにより組換え産生された、（ｉｉｉ）例えば切断及びゲル電気泳動分画により、精製された、又は（ｉｖ）例えば化学合成により、合成されたことを意味する。単離核酸は、組換えＤＮＡ技法による操作に利用可能な核酸である。
【０１１８】
抗体の所望の免疫反応性部分をコードする核酸の供給源が、ファージディスプレイ技術、酵母ライブラリ、ハイブリドーマベースの技術、又は合成によって入手され、又はそれに由来するのであれ、本発明は、抗体又はその抗原結合断片若しくは誘導体をコードする核酸分子及び配列を包含することが理解されるべきである。さらに、本発明は、かかる核酸分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。
【０１１９】
２．ハイブリダイゼーション及び配列同一性
指摘されるとおり、本発明はさらに、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。より具体的には、本発明は、中程度又は高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例えば、以下に定義するとおりの）、本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を包含する。核酸をハイブリダイズする方法は、当該技術分野において周知である。周知のとおり、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、及びハイブリダイゼーション温度５５℃（又は他の同様のハイブリダイゼーション溶液（約５０％ホルムアミドを含有するものなど）で、ハイブリダイゼーション温度４２℃）、且つ、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６０℃の洗浄条件を含む。比較として、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、４５℃での洗浄と、続く０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中６８℃での１回以上の洗浄を含む。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーション条件及び／又は洗浄条件を操作することにより、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が典型的には互いにハイブリダイズしたまま留まるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加又は低下させることができる。
【０１２０】
本発明はまた、記載される核酸分子と「実質的に同一の」核酸分子も含む。一実施形態において、核酸配列に関して実質的に同一という用語は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％の配列同一性を呈する核酸分子の配列を意味し、そのように解釈され得る。他の実施形態において、核酸分子は基準核酸配列と９５％又は９８％の配列同一性を呈する。
【０１２１】
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本パラメータ及び好適な条件を考案する際の指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９及び１１；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０及び６．３−６．４）によって説明されており、当業者により、例えば核酸の長さ及び／又は塩基組成に基づいて容易に決定され得る。
【０１２２】
配列同一性とも称されるポリペプチドの配列類似性は、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して計測される。タンパク質解析ソフトウェアは、様々な置換、欠失及び保存的アミノ酸置換を含む他の修飾に割り当てられた類似度の尺度を使用して、類似した配列を対応させる。例えば、配列解析ツールＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）は、「ＧＡＰ」及び「ＢＥＳＴ−ＦＩＴ」などのプログラムを含み、それらをデフォルトパラメータで使用して、異なる生物種由来の相同ポリペプチドなど、近縁ポリペプチドの間、又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定することができる（例えば、ＧＣＧ  バージョン６．１又はＤｕｒｂｉｎ  ｅｔ．Ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照のこと）。
【０１２３】
ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧ  バージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して、既定の又は推奨されるパラメータを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、アラインメント及び問い合わせ配列と探索配列との間で最良に重なり合う領域のパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上掲）。本発明の配列を種々の生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較するときの別の好ましいアルゴリズムは、既定のパラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３  ４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９  ４０２（これらの各々は本明細書において参照により援用される）を参照のこと。
【０１２４】
これに関して、本発明はまた、抗体可変領域ポリペプチド配列（例えば、ドナー軽鎖又は重鎖可変領域、アクセプター軽鎖又は重鎖可変領域、又は得られたヒト化コンストラクトのいずれか）に関して「実質的に同一の」ポリペプチドをコードする核酸分子も含む。かかるポリペプチドに適用するとき、用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一の」は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ加重を使用するプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴ−ＦＩＴによるなどして最適に整列されたとき、少なくとも６０％又は６５％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基に置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換によっては、タンパク質の機能特性は実質的に変化しない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は類似度は、置換の保存的な性質を補正して上方に調整され得る。
【０１２５】
３．発現
組換え発現、すなわちＲＮＡの、又はＲＮＡ及びタンパク質／ペプチドの産生の様々なプロセスは、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２０００）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合弁事業，（２００６年増補版）に説明されるとおり、周知されている。
【０１２６】
関連のある特定の用語に「発現制御配列」が含まれ、これは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー及び遺伝子の転写又はｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。周知のとおり、「プロモーター」又は「プロモーター領域」は、概して発現する核酸配列の上流（５’側）に位置する核酸配列であって、ＲＮＡポリメラーゼに対する認識及び結合部位を提供することにより配列の発現を制御する核酸配列を指す。
【０１２７】
本発明に係る適合性のある例示的プロモーターとしては、ＳＰ６、Ｔ３及びＴ７ポリメラーゼのプロモーター、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びそれらの人工ハイブリッドプロモーター（例えばＣＭＶ）（ここでは１つ又は複数の部分が、例えばヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）などの他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターの１つ又は複数の部分と融合している）が挙げられ、且つ１つ又は複数のさらなるイントロンを含む又は含まないものである。
【０１２８】
特定の実施形態では、核酸分子はベクター中に、適切な場合には核酸の発現を制御するプロモーターを伴い存在していてもよい。周知の用語「ベクター」は、核酸用の任意の介在媒体を含み、前記核酸の、例えば原核細胞及び／又は真核細胞への導入、及び適切な場合には、ゲノムへの組込みを可能にするものである。哺乳類細胞の形質転換方法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、同第４，９１２，０４０号明細書、同第４，７４０，４６１号明細書、及び同第４，９５９，４５５号明細書を参照のこと。ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体（例えば、全抗体、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体のＶＨ若しくはＶＬ、又はそれらの一部分、又は重鎖若しくは軽鎖ＣＤＲ、単鎖Ｆｖ、又はこれらの断片若しくは変異体）をコードするヌクレオチド配列を含み得る（例えば、国際公開第８６／０５８０７号パンフレット；国際公開第８９／０１０３６号パンフレット；及び米国特許第５，１２２，４６４号明細書を参照のこと）。
【０１２９】
様々な宿主−発現ベクター系が市販されており、多くは本明細書の教示と適合性があり、本発明のモジュレーターの発現に用いることができる。かかる系としては、限定はされないが、微生物、例えば、モジュレーターコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））；モジュレーターコード配列を含む組換え酵母発現ベクターをトランスフェクトした酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；モジュレーターコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；モジュレーターコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス；タバコモザイクウイルス）に感染させるか又は組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）をトランスフェクトした植物細胞系（例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ等）；又は哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞等）が挙げられる。
【０１３０】
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、本発明のポリペプチド及び抗原結合分子が生成されるように工学的に改変することのできるあらゆる種類の細胞系を包含する。一実施形態において、宿主細胞は、修飾されたグリコフォームを有する抗原結合分子の産生を可能にするように工学的に改変される。好ましい実施形態において、抗原結合分子、又は変異体抗原結合分子は、抗体、抗体断片、又は融合タンパク質である。特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）活性を有する１つ以上のポリペプチドを高いレベルで発現するようにさらに操作されている。適合性のある宿主細胞には、ほんの数例を挙げると、培養細胞、例えば、哺乳類培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれ、また、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物若しくは動物組織の中に含まれる細胞も含まれる。
【０１３１】
組換えタンパク質を長期にわたり高収率で産生するには、安定発現が好ましい。従って、当該技術分野で認められている標準的な技法を用いて、選択されたモジュレーターを安定的に発現する細胞株が工学的に改変され得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されるＤＮＡ、及び選択可能なマーカーで形質転換することができる。一定の条件下で発現を増強させるための効率的な手法を提供するグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含め、当該技術分野で周知されている選択系のいずれが使用されてもよい。ＧＳ系については、全て又は一部が、欧州特許第０  ２１６  ８４６号明細書、同第０  ２５６  ０５５号明細書、同第０  ３２３  ９９７号明細書及び同第０  ３３８  ８４１号明細書及び米国特許第５，５９１，６３９号明細書及び同第５，８７９，９３６号明細書（この各々が参照により本明細書に援用される）に関連して考察されている。別の好ましい発現系、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−ＳキットがＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号Ａ１３６９６−０１）によって商業的に提供され、これもまた、モジュレーター産生に用い得る安定細胞株の開発を可能にする。
【０１３２】
かかる宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製され得る媒体に相当するが、また、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換又はトランスフェクトされたとき、本発明の分子をインサイチューで発現し得る細胞にも相当する。宿主細胞には、例えば、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、且つ第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする本発明の２つの発現ベクターをコトランスフェクトしてもよい。
【０１３３】
従って、特定の実施形態では、本発明は、抗体又はその一部分の発現を可能にする組換え宿主細胞を提供する。かかる組換え宿主細胞での発現により産生された抗体は、本明細書では組換え抗体と称される。本発明はまた、かかる宿主細胞の子孫細胞、及びそれにより産生される抗体も提供する。
【０１３４】
Ｃ．化学合成
加えて、本モジュレーターは、当該技術分野で公知の技法を用いて化学的に合成されてもよい（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．、及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１０５−１１１を参照のこと）。さらに、必要であれば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体（共通アミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸など）を、置換又は付加としてポリペプチド配列に導入することができる。
【０１３５】
Ｄ．トランスジェニック系
他の実施形態においてモジュレーターは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列などの組換え分子についてトランスジェニックな、且つ所望の化合物を回収可能な形態で産生する哺乳動物又は植物を生成することによって遺伝子導入により作製されてもよい。これには、例えば、ヤギ、雌ウシ、又は他の哺乳類の乳中におけるタンパク質モジュレーター（例えば抗体）の産生、及びそこからの回収が含まれる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号明細書、同第５，７５６，６８７号明細書、同第５，７５０，１７２号明細書、及び同第５，７４１，９５７号明細書を参照のこと。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物が免疫されて、抗体が産生される。
【０１３６】
他のトランスジェニック技法が、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）；及びＰｉｎｋｅｒｔ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）並びに米国特許第６，４１７，４２９号明細書に示される。一部の実施形態では、非ヒト動物はマウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマであり、所望の産物は血液、乳、尿、唾液、涙、粘液及び他の体液中に産生され、そこから当該技術分野で認められている精製技法を用いて容易に得ることができる。
【０１３７】
他の適合性のある産生系には、例えば、米国特許第６，０４６，０３７号明細書及び同第５，９５９，１７７号明細書（これらは、かかる技法に関して本明細書に援用される）に記載されるような、植物における抗体の作製方法が含まれる。
【０１３８】
Ｅ．単離／精製
本発明のモジュレーターは、組換え発現によるか又は開示される技法のうち任意の他の技法によって産生された後、免疫グロブリン又はタンパク質の精製について当該技術分野で公知の任意の方法により精製されてもよい。この点において、本モジュレーターは「単離されている」ものであってよく、これは、それがその天然の環境の成分から同定され、且つ分離及び／又は回収されていることを意味する。その天然の環境の夾雑物成分とは、ポリペプチドの診断的又は治療的使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を挙げることができる。ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離モジュレーターには、組換え細胞内のインサイチューでのモジュレーターが含まれる。
【０１３９】
所望の分子が細胞内で産生される場合、第１の工程として、粒子状デブリが、宿主細胞又は溶解断片のいずれも、例えば遠心分離又は限外ろ過によって取り除かれ得る。モジュレーターが培地中に分泌される場合、かかる発現系からの上清が、概して、初めに市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を使用して濃縮される。不溶性の夾雑物が取り除かれた後、モジュレーター調製物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーなどの標準的な技法を用いてさらに精製されてもよく、アフィニティークロマトグラフィーが特に興味深い。これに関して、プロテインＡを使用すると、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖をベースとする抗体を精製することができ（Ｌｉｎｄｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ６２：１（１９８３））、一方、プロテインＧは、あらゆるマウスアイソタイプ及びヒトＩｇＧ３に推奨される（Ｇｕｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ５：１５６７（１９８６））。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂でのセファロースクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫安塩析などのタンパク質精製の他の技法もまた、回収する抗体に応じて利用可能である。特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターは、少なくとも一部には、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。
【０１４０】
ＶＩ．ＳＥＺ６モジュレーター断片及び誘導体
どのような生成及び産生方法が選択されるにせよ、本発明のモジュレーターは、標的決定因子（例えば抗原）との反応、結合、組み合わせ、複合体化、連結、付着、接合、相互作用又は他の形の会合を行い、それにより所望の結果を提供する。モジュレーターが抗体又はその断片、コンストラクト若しくは誘導体を含む場合、かかる会合は、抗体上で発現する１つ以上の「結合部位」又は「結合成分」を介してもよく、ここで結合部位は、目的の標的分子又は抗原との選択的な結合に関与するポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは少なくとも１つの結合部位を含む（例えば、インタクトなＩｇＧ抗体は２つの結合ドメインと２つの結合部位とを有する）。例示的結合ドメインとしては、抗体可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン又は酵素的ドメインが挙げられる。
【０１４１】
Ａ．抗体
上記のとおり、用語「抗体」は、少なくとも、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化及び霊長類化抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、並びに合成抗体を包含するように意図される。
【０１４２】
Ｂ．断片
本発明の実施にどの形態のモジュレーター（例えばキメラ、ヒト化等）が選択されるかに関係なく、本明細書の教示に従いその免疫反応性断片が用いられ得ることは理解される。「抗体断片」は、インタクトな抗体の少なくとも一部分を含む。本明細書で使用されるとき、抗体分子の「断片」という用語には、抗体の抗原結合断片が含まれ、用語「抗原結合断片」は、選択された抗原又はその免疫原性決定因子と免疫特異的に結合又は反応するか、又は断片が得られた元のインタクトな抗体と特異的抗原結合について競合する免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。
【０１４３】
例示的断片には、以下が含まれる：ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成される多重特異性抗体。加えて、活性断片は、抗原／基質又は受容体と相互作用するその能力を維持し、且つインタクトな抗体と同様の方法で（いくらか効率は低いかもしれないが）それらを修飾する抗体の一部分を含む。
【０１４４】
他の実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ領域を含むものであって、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調整、ＡＤＣＣ機能及び補体結合などの、通常インタクトな抗体に存在するときＦｃ領域と関連付けられる生物学的機能の少なくとも１つを維持しているものである。一実施形態において、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に同程度のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、かかる抗体断片は、断片にインビボ安定性を付与することができるＦｃ配列と連結された抗原結合アームを含み得る。
【０１４５】
当業者であれば十分に認識するとおり、断片は、インタクト抗体若しくは完全抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理（パパイン又はペプシンなど）によって、又は組換え手段により得ることができる。抗体断片のさらに詳細な説明については、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照のこと。
【０１４６】
Ｃ．誘導体
本発明は、さらに、１つ以上の修飾を含む免疫反応性モジュレーター誘導体及び抗原結合分子を含む。
【０１４７】
１．多価抗体
一実施形態において、本発明のモジュレーターは一価又は多価（例えば、二価、三価等）であってよい。本明細書で使用されるとき、用語「価数」は、抗体に関連する潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位が、１つの標的分子又は標的分子上の特定の位置若しくは座位と特異的に結合する。抗体が一価である場合、分子の各結合部位は、単一の抗原位置又はエピトープに特異的に結合する。抗体が２つ以上の標的結合部位を含む（多価である）場合、各標的結合部位は同じ又は異なる分子と特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗原と結合しても、又は同じ抗原上の異なるエピトープ若しくは位置と結合してもよい）。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１３０１０５号明細書を参照のこと。いずれの場合も、結合部位の少なくとも１つは、ＳＥＺ６アイソフォームに関連するエピトープ、モチーフ又はドメインを含む。
【０１４８】
一実施形態において、モジュレーターは二重特異性抗体であり、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９に記載されるとおり、ここでは２本の鎖が異なる特異性を有する。他の実施形態は、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体を含む。他のさらに高性能の適合性のある多重特異性コンストラクト及びそれらの作製方法が、米国特許出願公開第２００９／０１５５２５５号明細書、並びに国際公開第９４／０４６９０号パンフレット；Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０；及び国際公開第９６／２７０１１号パンフレットに示される。
【０１４９】
上記で言及したとおり、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合してもよく、又は標的分子並びに異種エピトープ、例えば異種ポリペプチド又は固体支持体材料の両方に免疫特異的に結合してもよい。抗ＳＥＺ６抗体の好ましい実施形態は２つの抗原のみと結合するが（すなわち二重特異性抗体）、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体もまた本発明に包含される。二重特異性抗体にはまた、架橋された抗体すなわち「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方がアビジンとカップリングされ、他方がビオチンとカップリングされ得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化させるために（米国特許第４，６７６，９８０号明細書）、及びＨＩＶ感染の治療に向けて（国際公開第９１／００３６０号パンフレット、国際公開第９２／２００３７３号パンフレット、及び欧州特許第０３０８９号明細書）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の従来の架橋結合方法を用いて作製されてもよい。好適な架橋剤は当該技術分野において周知されており、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に、数多くの架橋結合技法と共に開示される。
【０１５０】
さらに他の実施形態において、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが、当業者に周知の方法を用いて、ヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン定常ドメイン配列、例えば免疫グロブリン重鎖定常ドメインと融合される。
【０１５１】
２．Ｆｃ領域修飾
上記の本開示のモジュレーター（例えば、Ｆｃ−ＳＥＺ６又は抗ＳＥＺ６抗体）の可変又は結合領域に対する様々な修飾、置換、付加又は欠失に加え、当業者は、本発明の選択された実施形態が、定常領域（すなわちＦｃ領域）の置換又は修飾もまた含み得ることを理解する。より詳細には、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、とりわけ１つ以上のさらなるアミノ酸残基置換、突然変異及び／又は修飾を含んでもよく、それにより、限定はされないが：薬物動態の変化、血清中半減期の増加、結合親和性の増加、免疫原性の低減、産生の増加、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対するＦｃリガンド結合の変化、「ＡＤＣＣ」（抗体依存細胞媒介性細胞傷害）又は「ＣＤＣ」（補体依存性細胞傷害）活性の増強又は低減、グリコシル化及び／又はジスルフィド結合の変化及び結合特異性の修飾を含めた、好ましい特性を有する化合物がもたらされることが企図される。これに関して、有利には、これらのＦｃ変異体を使用して、本開示のモジュレーターの有効な抗新生物特性を増強し得ることは理解される。
【０１５２】
この目的上、本発明の特定の実施形態は、Ｆｃ領域の置換又は修飾、例えば増強された又は好ましいＦｃエフェクター機能を有する化合物が産生されるような１つ以上のアミノ酸残基の付加、置換、突然変異及び／又は修飾を含み得る。例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＢ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎ）との間の相互作用に関わるアミノ酸残基を変更すると、細胞傷害性の増加及び／又は薬物動態の変化、例えば血清中半減期の増加がもたらされ得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）（この各々が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０１５３】
選択された実施形態において、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると特定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失又は付加）することにより、インビボ半減期が増加した抗体を生成することができる（例えば、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット；国際公開第０４／０２９２０７号パンフレット；米国特許第６，７３７，０５６号明細書及び米国特許出願公開第２００３／０１９０３１１号明細書を参照のこと。かかる実施形態に関して、Ｆｃ変異体は哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日超、１０日超、１５日超、好ましくは２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２ヶ月超、３ヶ月超、４ヶ月超、又は５ヶ月超の半減期を提供し得る。半減期が増加することにより血清力価が高くなり、そのため抗体の投与頻度が低下し、及び／又は投与するべき抗体の濃度が低下する。ヒトＦｃＲｎとのインビボでの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清中半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又はトランスフェクトヒト細胞株で、又は霊長類に変異体Ｆｃ領域を含むポリペプチドを投与してアッセイすることができる。国際公開第２０００／４２０７２号パンフレットは、ＦｃＲｎとの結合が向上又は減少した抗体変異体について記載する。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照のこと。
【０１５４】
他の実施形態において、Ｆｃの改変は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性の増強又は低減をもたらし得る。当該技術分野において公知のとおり、ＣＤＣは、補体の存在下で標的細胞を溶解することを指し、ＡＤＣＣは、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃＲに結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることが可能となる細胞傷害性の一形態を指す。本発明の文脈では、抗体変異体は、親抗体若しくは非修飾抗体又は天然配列ＦｃＲを含む抗体と比較したとき結合が増強されているか、或いは減少している「改変された」ＦｃＲ結合親和性を伴い提供される。結合の低下を示すかかる変異体は、例えば当該技術分野において周知の技法により決定するとき、天然配列と比較してＦｃＲとの感知できるほどの結合がほとんど又は全くなく、例えば０〜２０％の結合を有し得る。他の実施形態において変異体は、天然免疫グロブリンＦｃドメインと比較したとき結合の増強を呈する。有利には、これらのタイプのＦｃ変異体を使用して、本開示の抗体の有効な抗新生物特性を増強し得ることは理解される。さらに他の実施形態では、かかる改変により、結合親和性の増加、免疫原性の低減、産生の増加、グリコシル化及び／又はジスルフィド結合の（例えば、コンジュゲーション部位についての）改変、結合特異性の修飾、食作用の増加；及び／又は細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御等がもたらされる。
【０１５５】
３．グリコシル化の改変
さらに他の実施形態は、１つ以上の工学的に改変されたグリコフォーム、すなわち、タンパク質（例えばＦｃドメイン）に共有結合的に結合する改変したグリコシル化パターン又は改変した炭水化物組成を含むＳＥＺ６モジュレーターを含む。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照のこと。グリコフォームの工学的改変は、限定はされないが、エフェクター機能の増強又は低減、標的に対するモジュレーターの親和性の増加又はモジュレーターの産生の促進を含め、様々な目的に有用であり得る。エフェクター機能の低減が望ましい特定の実施形態では、分子が非グリコシル化形態を発現するように工学的に改変され得る。１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によって当該の部位におけるグリコシル化をなくすことのできる置換が周知されている（例えば米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書を参照）。逆に、１つ以上のさらなるグリコシル化部位で工学的に改変することにより、エフェクター機能の増強又は結合の向上がＦｃ含有分子に付与され得る。
【０１５６】
他の実施形態は、フコシル残基の量が低下している低フコシル化抗体又は二分岐ＧｌｃＮＡｃ構造が増加した抗体などの、改変したグリコシル化組成を有するＦｃ変異体を含む。かかるグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。工学的に改変されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により、例えば、工学的に改変された株又は変異体発現株を使用することによるか、１つ以上の酵素（例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１））と共発現させることによるか、様々な生物又は様々な生物由来の細胞株においてＦｃ領域を含む分子を発現させることによるか、又はＦｃ領域を含む分子を発現させた後に炭水化物（複数可）を修飾することにより、生成され得る（例えば、国際公開第２０１２／１１７００２号パンフレットを参照のこと）。
【０１５７】
４．さらなるプロセシング
モジュレーターは、例えば、既知の保護基／ブロック基、タンパク質分解切断、抗体分子又は他の細胞性リガンドとの連結等によるグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化により、産生中又は産生後に差次的に修飾してもよい。多数の化学修飾のいずれかが、限定はされないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成等による特異的な化学的切断を含めた公知の技法によって実行され得る。
【０１５８】
同様に本発明に包含される様々な翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型又はＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ端側又はＣ端側末端のプロセシング、化学的部分とアミノ酸骨格との結合、Ｎ結合型又はＯ結合型炭水化物鎖の化学修飾、及び原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加又は欠失が挙げられる。さらに、モジュレーターはまた、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素標識又はアフィニティー標識などの検出可能な標識で修飾して、モジュレーターの検出及び単離を可能にしてもよい。
【０１５９】
ＶＩＩ．モジュレーター特性
モジュレーターがどのように得られようとも、又は上記の形態のうちどれをとろうとも、本開示のモジュレーターの様々な実施形態は、特定の特性を呈し得る。選択された実施形態では、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ又は酵母コロニー）が選択され、クローニングされ、さらに、例えばロバストな成長、高いモジュレーター産生、及び以下でさらに詳細に考察するとおりの、望ましいモジュレーター特性を含めた好適な特性についてスクリーニングされ得る。別の場合には、モジュレーターの特性は、動物接種用の特定の抗原（例えば、特異的ＳＥＺ６アイソフォーム又はその断片）又は標的抗原の免疫反応性断片を選択することによって付与され、又は影響を受け得る。さらに他の実施形態において、選択されたモジュレーターを上記に記載したとおり工学的に改変することにより、親和性又は薬物動態などの免疫化学的特性を増強又は改良してもよい。
【０１６０】
Ａ．中和モジュレーター
特定の実施形態では、モジュレーターは「中和」抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。すなわち、本発明は、特異的なドメイン、モチーフ又はエピトープと結合してＳＥＺ６の生物学的活性を遮断、低減又は阻害することが可能な抗体分子を含み得る。より一般的には、用語「中和抗体」は、標的分子又はリガンドに結合し又はそれと相互作用して、標的分子と受容体又は基質などの結合パートナーとの結合又は会合を防ぎ、それにより本来それらの分子の相互作用によって生じる生物学的反応を妨害する抗体を指す。
【０１６１】
当該技術分野において公知の競合的結合アッセイを用いて、抗体又はその免疫学的に機能性の断片若しくは誘導体の結合及び特異性を評価し得ることは理解される。本発明に関して、抗体又は断片は、過剰な抗体によってＳＥＺ６に結合する結合パートナーの量が、例えば障害神経栄養因子リガンド活性によるか又はインビトロ競合的結合アッセイにおいて計測するとき、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれ以上減少するとき、ＳＥＺ６と結合パートナー又は基質（例えば、神経栄養因子リガンド）との結合を阻害又は低減するものと考える。例えばＳＥＺ６に対する抗体の場合、中和抗体又はアンタゴニストは、好ましくはリガンド活性を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれ以上改変する。この修飾された活性は、当該技術分野で認められている技法を用いて直接計測されてもよく、又は改変した活性が下流（例えば、発癌、細胞生存又は経路活性化）に及ぼす影響により計測されてもよいことが理解される。
【０１６２】
Ｂ．インターナライズモジュレーター
エビデンスは、ＳＥＺ６又はその選択されたアイソフォームが可溶性の形態で存在し得ることを示しているが、少なくとも一部のＳＥＺ６は、おそらく細胞表面と会合したままであり、それにより本開示のモジュレーターのインターナリゼーションが可能となる。従って、本発明の抗ＳＥＺ６抗体は、少なくともある程度、ＳＥＺ６を発現する細胞によりインターナライズされ得る。例えば、腫瘍開始細胞の表面上のＳＥＺ６と結合する抗ＳＥＺ６抗体は、腫瘍開始細胞によってインターナライズされ得る。特に好ましい実施形態では、かかる抗ＳＥＺ６抗体は、インターナライズされると細胞を死滅させる細胞傷害性部分などの抗癌剤と会合又はコンジュゲートされ得る。特に好ましい実施形態では、モジュレーターは、インターナライズ抗体薬コンジュゲートを含む。
【０１６３】
本明細書で使用されるとき、「インターナライズする」モジュレーターとは、関連する抗原又は受容体と結合すると細胞によって（任意のペイロードと共に）取り込まれるものである。理解されるとおり、インターナライズモジュレーターは、好ましい実施形態において、抗体（その抗体断片及び誘導体を含む）、並びに抗体コンジュゲートを含み得る。インターナリゼーションはインビトロ又はインビボで起こり得る。治療適用では、インターナリゼーションは好ましくは、それを必要とする対象においてインビボで起こる。インターナライズされる抗体分子の数は、抗原発現細胞、特に抗原発現癌幹細胞を死滅させるのに十分又は適切であり得る。抗体又は抗体コンジュゲートの効力に応じて、ある場合には、細胞への単一の抗体分子の取込みが、その抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある種の毒素は極めて強力であるため、抗体にコンジュゲートされた毒素の数個の分子のインターナリゼーションが、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である。抗体が哺乳類細胞との結合時にインターナライズするかどうかは、以下の実施例（例えば、実施例１５、１７及び１８）に記載するものを含め、様々なアッセイにより決定することができる。抗体が細胞にインターナライズするかどうかを検出する方法はまた、米国特許第７，６１９，０６８号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）にも記載される。
【０１６４】
Ｃ．枯渇モジュレーター
他の実施形態において、抗体は、枯渇抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。用語「枯渇」抗体は、好ましくは細胞表面上又はその近傍の抗原と結合又は会合し、且つ細胞の死滅又は除去を（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ又は細胞傷害剤の導入により）誘導し、促進し又は発生させる抗体を指す。一部の実施形態では、選択された枯渇抗体は細胞傷害剤と会合又はコンジュゲートされる。
【０１６５】
好ましくは枯渇抗体は、定義された細胞集団中のＳＥＺ６腫瘍原性細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％を取り除き、無能力化し、除去し又は死滅させることができる。一部の実施形態では、この細胞集団は、濃縮され、区分され（ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ）、精製され、又は単離された腫瘍不滅化細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、腫瘍不滅化細胞を含む全腫瘍試料又は不均一腫瘍抽出物を含み得る。当業者は、以下の実施例（例えば、実施例１４及び１５）に記載されるとおりの標準的な生化学的技法を用いることにより、本明細書の教示に従う腫瘍原性細胞又は腫瘍不滅化細胞の枯渇をモニタし、定量化し得ることを理解する。
【０１６６】
Ｄ．ビニング及びエピトープ結合
本開示の抗ＳＥＺ６抗体モジュレーターは、選択された標的又はその断片により提示される個別のエピトープ又は免疫原性決定因子と会合し、又は結合することがさらに理解される。特定の実施形態では、エピトープ又は免疫原性決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）を含み、特定の実施形態では、特異的な三次元構造特性、及び／又は特異的な電荷特性を有し得る。従って、本明細書で使用されるとき、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体と特異的に結合するか又は他の形で分子と相互作用することができる任意のタンパク質決定因子を含む。特定の実施形態では、抗体は、それがタンパク質の複合混合物及び／又は巨大分子中のその標的抗原を優先的に認識するとき、抗原と特異的に結合する（又は免疫特異的に結合又は反応する）と言われる。好ましい実施形態において、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が１０−６Ｍ以下又は１０−７Ｍ以下であるとき、より好ましくは平衡解離定数が１０−８Ｍ以下であるとき、及びさらにより好ましくは解離定数が１０−９Ｍ以下であるとき、抗原と特異的に結合すると言われる。
【０１６７】
より直接的には、用語「エピトープ」は、その一般的な生化学的意味で使用され、特定の抗体モジュレーターによって認識され、且つ特異的に結合されることが可能な標的抗原の一部分を指す。抗原がＳＥＺ６などのポリペプチドである場合、エピトープは、概して、隣接アミノ酸及びタンパク質の三次の折り畳みによって並んで位置する非隣接アミノ酸の両方から形成され得る（「立体構造エピトープ」）。かかる立体エピトープでは、相互作用する点は、タンパク質上で直線的には互いに離れているアミノ酸残基にわたって生じる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープ（「線状」又は「連続」エピトープと称されることもある）は、典型的にはタンパク質変性時にも保持されるが、一方、三次の折り畳みにより形成されたエピトープは、典型的にはタンパク質変性時に失われる。いずれの場合も、抗体エピトープは、典型的には、少なくとも３個、さらに通常は少なくとも５個又は８〜１０個のアミノ酸をユニークな空間配置で含む。
【０１６８】
この点において、特定の実施形態では、エピトープは、ＳＥＺ６タンパク質の１つ以上の領域、ドメイン又はモチーフ（例えば、成熟アイソフォーム１のアミノ酸１〜９０６）と関連付けられ、又はそこに存在し得ることは理解される。本明細書でさらに詳細に考察されるとおり、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域は、５つのＳｕｓｈｉドメインと、Ｎ末端ドメインに沿った２つのＣＵＢドメインとを含む一般に認識されている一連のドメインを含む。本開示の目的上、用語「ドメイン」は、その一般に受け入れられている意味に従い使用され、特徴的な二次構造含量を呈するタンパク質内の同定可能な又は定義可能な保存されている構造的実体を指すものと考えられる。多くの場合に、共通の機能を有する相同ドメインは、通常は配列類似性を示し、数多くの異なるタンパク質中に見られる（例えば、Ｓｕｓｈｉドメインは、報告によれば多数の異なるタンパク質中に見られる）。同様に、当該技術分野で認められている用語「モチーフ」は、その一般的な意味に従い使用され、概して典型的には１０〜２０個の隣接アミノ酸残基であるタンパク質の短い保存領域を指すものとする。全体を通じて考察されるとおり、選択された実施形態は、ＳＥＺ６の特異的な領域、ドメイン又はモチーフ内のエピトープと会合又は結合するモジュレーターを含む。
【０１６９】
いずれの場合も、抗原上の所望のエピトープが決定されると、例えば、本発明に記載される技法を用いてそのエピトープを含むペプチドで免疫することにより、当該のエピトープに対する抗体を生成することが可能である。或いは、発見過程で、抗体の生成及び特性決定により、特異的なドメイン又はモチーフに位置する望ましいエピトープに関する情報が明らかになり得る。この情報から、次に、同エピトープに対する結合について、抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するための手法は、競合試験を行い、互いに競合的に結合する抗体を見つけ出すことであり、すなわちそうした抗体は、抗原との結合について競合する。抗体をその交差競合性に基づきビニングするためのハイスループットプロセスが、国際公開第０３／４８７３１号パンフレットに記載されている。モジュレーター競合又は酵母上での抗原断片発現を含む他のビニング又はドメインレベル又はエピトープマッピング方法が、以下の実施例９及び１０に示される。
【０１７０】
本明細書で使用されるとき、用語「ビニング」は、抗原結合特性及び競合に基づく抗体のグループ化又は分類に用いられる方法を指す。この技法は本発明のモジュレーターを定義して特徴付けるのに有用であるが、ビンは必ずしもエピトープと直接相関せず、エピトープ結合のそのような初期決定が、本明細書に記載されるとおりの他の当該技術分野で認められている方法によってさらに精緻化され、確認され得る。しかしながら、以下の実施例で考察され、明らかにされるとおり、抗体モジュレーターが個々のビンに実験的に割り当てられることで、本開示のモジュレーターの潜在的治療能力の指標となり得る情報が提供される。
【０１７１】
より具体的には、選択された参照抗体（又はその断片）が第２の試験抗体と同じエピトープに結合し、又はそれと結合について交差競合する（すなわち同じビン内にある）かどうかを、当該技術分野において公知の、且つ本明細書の実施例に示す方法を用いることにより決定することができる。一実施形態では、参照抗体モジュレーターをＳＥＺ６抗原と飽和条件下で会合させ、次に、二次又は試験抗体モジュレーターがＳＥＺ６と結合する能力を、標準的な免疫化学的技法を用いて決定する。試験抗体が参照抗ＳＥＺ６抗体と同時にＳＥＺ６に実質的に結合可能である場合、二次又は試験抗体は一次又は参照抗体と異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が同時にＳＥＺ６と実質的に結合することができない場合、試験抗体は、一次抗体が結合したエピトープと同じエピトープ、それと重複するエピトープ、又はそれと（少なくとも立体的に）近接しているエピトープに結合する。すなわち試験抗体は抗原結合について競合し、参照抗体と同じビンにある。
【０１７２】
用語「競合する」又は「競合抗体」は、本開示のモジュレーターの文脈で使用されるとき、試験抗体又は供試の免疫学的に機能性の断片が共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を妨げ又は阻害するアッセイにより決定するときの抗体間の競合を意味する。典型的には、かかるアッセイは、固体表面に結合した精製抗原（例えば、ＳＥＺ６又はそのドメイン若しくは断片）又はそれらのうちいずれかを有する細胞、非標識の試験免疫グロブリン及び標識された参照免疫グロブリンの使用を伴う。試験免疫グロブリンの存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより、競合阻害が計測される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在し、及び／又は先に結合するようにされる。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び参照抗体が結合したエピトープに対して立体障害が起こるのに十分に近接している隣接するエピトープに結合する抗体が含まれる。競合的結合の決定方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供される。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合が少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害される。場合によっては、結合は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％又はそれ以上阻害される。
【０１７３】
逆に、参照抗体が結合する場合、好ましくは、続いて加えられた試験抗体（すなわちＳＥＺ６モジュレーター）の結合が少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害される。場合によっては、試験抗体の結合は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％又はそれ以上阻害される。
【０１７４】
本発明に関しては、以下の実施例９及び１０に示されるとおり、ＳＥＺ６の細胞外ドメインが本明細書で「ビンＡ」〜「ビンＦ」及びビンＵと呼ばれる競合的結合により少なくとも７個のビンを定義することが（表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって）決定されている。
【０１７５】
この点において、当該技術分野で公知であって、且つ以下の実施例に詳述するとおり、所望のビニング又は競合的結合データは、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００システム（すなわち表面プラズモン共鳴−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）分析器（すなわち、バイオレイヤー干渉法−ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）又はフローサイトメトリー法を用いて得ることができる。用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書で使用されるとき、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイムの特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。用語「バイオレイヤー干渉法」は、２つの表面、すなわちバイオセンサーチップ上の固定化されたタンパク質の層と、内部基準層から反射した白色光の干渉縞を解析する光学的分析技法を指す。バイオセンサーチップに結合した分子の数に変化があると、干渉縞のシフトが生じ、それをリアルタイムで計測することができる。特に好ましい実施形態では、解析は（表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法又はフローサイトメトリーのいずれであれ）、以下の実施例で実証するとおり、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＦｏｒｔｅＢｉｏ機器又はフローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ）を使用して実施される。
【０１７６】
本開示のＳＥＺ６抗体モジュレーターが会合又は結合するエピトープをさらに特徴付けるため、Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８７（１−２）：１４７−１５８（２００４）（参照により本明細書に援用される））により記載されるプロトコルの改良法を用いてドメインレベルエピトープマッピングを実施した。簡潔に言えば、特異的なアミノ酸配列を含むＳＥＺ６の個々のドメインを酵母の表面上に発現させて、フローサイトメトリーによって各ＳＥＺ６抗体による結合を決定した。結果は以下で実施例１０に考察し、図１４Ａ及び図１４Ｂに図示する。
【０１７７】
他の適合性のあるエピトープマッピング技法には、アラニンスキャニング突然変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）（本明細書で全体として参照により具体的に援用される）、又はペプチド切断解析が含まれる。加えて、エピトープの切除、エピトープの抽出及び抗原の化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）（本明細書で全体として参照により具体的に援用される）。他の実施形態において、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＡＳＡＰ）としても知られるモディフィケーション支援プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＭＡＰ）が、同じ抗原を標的とする多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性によって分類する方法を提供する（米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号明細書、本明細書で全体として参照により具体的に援用される）。各カテゴリーが、別のカテゴリーによって表されるエピトープと明確に異なるか、或いは部分的に重複しているユニークなエピトープを反映し得る。この技法により、遺伝的に同一の抗体を高速でふるい分けすることが可能となり、従って遺伝的に異なる抗体に集中して特徴付けを行うことができる。ＭＡＰを使用して、本発明のｈＳＥＺ６抗体モジュレーターを、異なるエピトープに結合する抗体グループに分別し得ることは理解される。
【０１７８】
固定化された抗原の構造を改変するのに有用な作用物質としては、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシン等）などの酵素が挙げられる。固定化された抗原の構造を改変するのに有用な作用物質はまた、化学的作用物質、例えば、スクシンイミジルエステル及びその誘導体、第一級アミン含有化合物、ヒドラジン及びカルボヒドラジン、遊離アミノ酸等であってもよい。
【０１７９】
抗原タンパク質は、バイオセンサーチップ表面か、或いはポリスチレンビーズに固定化され得る。後者は、例えば多重ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）などのアッセイで処理することができる。最大１００個の異なる種類のビーズによる多重分析を取り扱うＬＵＭＩＮＥＸの能力により、ＬＵＭＩＮＥＸは、ほぼ無制限に様々な修飾の抗原表面を提供するため、バイオセンサーアッセイと比べて抗体エピトーププロファイリングにおいて向上した分解能をもたらす。
【０１８０】
Ｅ．モジュレーター結合特性
本開示の抗体は、エピトープ特異性に加え、例えば結合親和性などの物理的特性を用いて特徴付けられ得る。これに関して、本発明は、１つ以上のＳＥＺ６アイソフォーム、又は汎抗体の場合にはＳＥＺ６ファミリーの２つ以上のメンバーに対して高結合親和性を有する抗体の使用をさらに包含する。
【０１８１】
用語「ＫＤ」は、本明細書で使用されるとき、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるとき、その標的抗原と免疫特異的に結合すると言われる。抗体は抗原と、ＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき高い親和性で特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき極めて高い親和性で特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は≦１０−９ＭのＫＤ、及び約１×１０−４／秒のオフ速度を有する。本発明の一実施形態において、オフ速度は＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は約１０−７Ｍ〜１０−１０ＭのＫＤでＳＥＺ６と結合し、さらに別の実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−２Ｍ未満、５×１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満又は５×１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
【０１８２】
具体的な実施形態において、ＳＥＺ６と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも２×１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５×１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも１０６Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５×１０６Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも１０７Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５×１０７Ｍ−ｌｓ−ｌ、又は少なくとも１０８Ｍ−ｌｓ−ｌの会合速度定数すなわちｋｏｎ（又はｋａ）速度（ＳＥＺ６（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←Ａｂ−Ａｇ）を有する。
【０１８３】
別の実施形態において、ＳＥＺ６と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、ｌ０−ｌｓ−ｌ未満、５×ｌ０−ｌｓ−ｌ未満、ｌ０−２ｓ−ｌ未満、５×ｌ０−２ｓ−ｌ未満、ｌ０−３ｓ−ｌ未満、５×ｌ０−３ｓ−ｌ未満、ｌ０−４ｓ−ｌ未満、５×ｌ０−４ｓ−ｌ未満、ｌ０−５ｓ−ｌ未満、５×ｌ０−５ｓ−ｌ未満、ｌ０−６ｓ−ｌ未満、５×ｌ０−６ｓ−ｌ未満、ｌ０−７ｓ−ｌ未満、５×ｌ０−７ｓ−ｌ未満、ｌ０−８ｓ−ｌ未満、５×ｌ０−８ｓ−ｌ未満、ｌ０−９ｓ−ｌ未満、５×ｌ０−９ｓ−ｌ未満又はｌ０−１０ｓ−ｌ未満の解離速度定数すなわちｋｏｆｆ（又はｋｄ）速度（ＳＥＺ６（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←Ａｂ−Ａｇ）を有する。
【０１８４】
本発明の他の選択された実施形態において、抗ＳＥＺ６抗体は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１又は少なくとも５×１０１５Ｍ−１の親和性定数すなわちＫａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を有する。
【０１８５】
上記のモジュレーター特性に加え、本発明の抗体は、例えば熱安定性（すなわち融解温度；Ｔｍ）、及び等電点を含めたさらなる物理的特性を用いてさらに特徴付けられ得る（例えば、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １４：１０２３；Ｖｅｒｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８：３９４−４０４；Ｖｅｒｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：２１５０−２１５４（この各々が参照により援用される）を参照のこと）。
【０１８６】
ＶＩＩＩ．コンジュゲート型モジュレーター
Ａ．概要
本発明のモジュレーターは、本明細書の教示により生成され、及び／又は作製及び選択された後、薬学的に活性な若しくは診断用の部分又は生体適合性修飾物質と（例えば、共有結合的又は非共有結合的に）連結、融合、コンジュゲートされ、又は他の形でそれと会合され得る。本明細書で使用されるとき、用語「コンジュゲート」又は「モジュレーターコンジュゲート」又は「抗体コンジュゲート」は、広義に用いられ、会合方法を問わず、本開示のモジュレーターと会合された任意の生物学的に活性な又は検出可能な分子又は薬物を意味すると考えられる。この点において、かかるコンジュゲートが、本開示のモジュレーターに加えて、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、インビボで活性薬剤に代謝されるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子及び放射性同位元素を含み得ることは理解される。さらに、上記に指摘したとおり、選択されたコンジュゲートはモジュレーターと共有結合的に又は非共有結合的に会合され、又は連結され、且つ少なくとも一部には、コンジュゲーションを生じさせるために用いられる方法に応じて、種々の化学量論的モル比を呈し得る。
【０１８７】
本発明の特に好ましい態様は、増殖性障害の診断及び／又は治療に用いられ得る抗体モジュレーターコンジュゲート又は抗体−薬物コンジュゲートを含む。文脈によって別段指示されない限り、用語「抗体−薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」又は式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎは、治療用部分及び診断用部分の両方を含むコンジュゲートを包含すると考えられるものとすることは理解される。かかる実施形態において抗体−薬物コンジュゲート化合物は、モジュレーターとしてのＳＥＺ６モジュレーター（典型的には抗ＳＥＺ６抗体）又は細胞結合単位（本明細書ではＣＢＡ、Ｍ、又はＡｂと省略される）、治療用部分（例えば抗癌剤）若しくは診断用部分（Ｄ）、及び場合により薬物と抗原結合剤とをつなぎ合わせるリンカー（Ｌ）を含む。本開示の目的上、「ｎ」は、１〜２０の整数を意味すると考えられるものとする。好ましい実施形態において、モジュレーターは、上記に記載したとおりの重鎖及び軽鎖可変領域由来の少なくとも１つのＣＤＲを含むＳＥＺ６  ｍＡｂである。
【０１８８】
当業者は、治療用又は診断用部分及び／又はリンカーを結合剤と結合又は会合させるのに、数多くの異なる反応を利用可能であることを理解する。選択された実施形態において、これは、結合剤、例えば抗体分子のアミノ酸残基、例えば、リジンのアミン基、グルタミン酸及びアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基並びに芳香族アミノ酸の様々な部分の反応により達成され得る。最も一般的に用いられる非特異的共有結合方法の一つは、化合物のカルボキシ基（又はアミノ基）を抗体のアミノ基（又はカルボキシ基）と連結するカルボジイミド反応である。加えて、ジアルデヒド又はイミドエステルなどの二官能性物質が、化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基と連結させるのに用いられている。また、薬物を結合剤と結合させるのに、シッフ塩基反応も利用可能である。この方法は、グリコール基又はヒドロキシ基を含む薬物を過ヨウ素酸酸化し、そのようにしてアルデヒドを形成した後、結合剤と反応させることを含む。シッフ塩基の形成により、結合剤のアミノ基との結合が起こる。イソチオシアン酸塩及びアズラクトンもまた、薬物を結合剤と共有結合させるためのカップリング剤として用いることができる。
【０１８９】
他の実施形態において、本発明の開示されるモジュレーターは、選択された特性（例えば、生体毒素、バイオマーカー、精製タグ等）を付与するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドとコンジュゲート又は会合され得る。特定の好ましい実施形態において、本発明は、異種タンパク質又はペプチドと組換え融合されるか又は化学的にコンジュゲート（共有結合性及び非共有結合性のいずれのコンジュゲーションも含む）されたモジュレーター又はその断片の使用を包含し、ここでタンパク質又はペプチドは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００アミノ酸を含む。コンストラクトは直接連結されなくてもよく、アミノ酸リンカー配列を介して行われ得る。例えば、本発明のモジュレーターを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合又はコンジュゲートして二重特異性コンストラクトを提供することにより、抗体を用いて、インビトロで、或いはインビボで、ＳＥＺ６を発現する特定の細胞型を異種ポリペプチドの標的とすることができる。さらに、異種ポリペプチドと融合又はコンジュゲートしたモジュレーターはまた、インビトロイムノアッセイで使用されてもよく、当該技術分野において公知のとおり精製方法（例えば、ｈｉｓタグ）と特に適合性があり得る。例えば、国際公開第９３／２１２３２号パンフレット；欧州特許第４３９，０９５号明細書；Ｎａｒａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９；米国特許第５，４７４，９８１号明細書；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９：１４２８−１４３２；及びＦｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２を参照のこと。
【０１９０】
Ｂ．リンカー
上記のペプチドリンカー又はスペーサーに加えて、本開示のモジュレーターを薬学的に活性な若しくは診断用の部分又は生体適合性修飾物質と会合するために、いくつかの他の種類又はタイプのリンカーを使用し得ることは理解される。一部の実施形態では、リンカーは細胞内条件下で切断され、従ってリンカーの切断により、細胞内環境において抗体から薬物単位が放出される。さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は、例えば抗体分解により放出される。
【０１９１】
ＡＤＣのリンカーは、好ましくは細胞外で安定であり、ＡＤＣ分子の凝集を防止し、且つＡＤＣを水性媒体に対して可溶自在に、且つ単量体状態に保つ。細胞への輸送又は送達前、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は好ましくは安定していてインタクトなままであり、すなわち抗体は薬物部分と連結したままである。リンカーは標的細胞の外部では安定しており、細胞内部では何らかの有効な速度で切断され得る。有効なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的な結合特性を維持し；（ｉｉ）コンジュゲート又は薬物部分の細胞内送達を可能にし；（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的部位に送達又は輸送されるまで安定且つインタクトなままであり、すなわち切断されず；及び（ｉｖ）ＰＢＤ薬物部分の細胞傷害性の細胞死滅効果又は細胞増殖抑制効果を維持するものである。ＡＤＣの安定性は標準的な分析法、例えば、質量分析、ＨＰＬＣ、及び分離／分析法ＬＣ／ＭＳにより計測することができる。抗体及び薬物部分の共有結合には、リンカーが２つの反応性官能基を有する、すなわち反応性の意味で二価性を備える必要がある。２つ以上の機能的又は生物学的に活性な部分、例えば、ペプチド、核酸、薬物、毒素、抗体、ハプテン、及びレポーター基を結合させるのに有用な二価リンカー試薬は知られており、コンジュゲートを得る方法が記載されている（ｍｅｔｈｏｄｓ  ｈａｖｅ  ｂｅｅｎ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ  ２３４−２４２）。
【０１９２】
このため、本発明の特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオラ内）に存在する切断作用物質により切断可能なリンカーの使用を含む。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えば限定はされないがリソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーであってもよい。一部の実施形態では、ペプチジルリンカーは少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断作用物質としてはカテプシンＢ及びＤ並びにプラスミンを挙げることができ、これらは各々、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞の内部に活性薬物を放出することが知られている。カテプシンＢは癌性組織で高度に発現することが分かっているため、チオール依存性プロテアーゼカテプシンＢにより切断可能な例示的ペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。かかるリンカーの他の例は、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／００７８０２８号明細書（この各々が全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。具体的な好ましい実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載されるようなＶａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ａｌａ−Ｖａｌリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク質分解性放出を用いる一つの利点は、薬剤がコンジュゲート時に典型的には減弱され、コンジュゲートの血清安定性が典型的には高いことである。
【０１９３】
他の実施形態において、切断可能なリンカーはｐＨ感受性であり、すなわち、ある種のｐＨ値での加水分解に対して感受性がある。典型的には、酸性条件下で加水分解性のｐＨ感受性リンカー。例えば、リソソームにおいて加水分解性である酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号明細書；同第５，８２４，８０５号明細書；同第５，６２２，９２９号明細書を参照のこと）。かかるリンカーは、血液中などの中性ｐＨ条件下では比較的安定しているが、ほぼリソソームのｐＨであるｐＨ５．５又は５．０未満では不安定である。
【０１９４】
さらに他の実施形態において、リンカーは還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。当該技術分野では、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成することができるものを含め、様々なジスルフィドリンカーが知られている。さらに他の具体的な実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、又は３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。さらに他の実施形態では、リンカー単位は切断可能でなく、薬物は抗体分解により放出される（全体としてあらゆる目的から参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書を参照のこと）。
【０１９５】
より詳細には、好ましい実施形態において（米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に示される）、適合性のあるリンカーは以下を含む：
【化１】
2018127469.tif 000003
式中、アスタリスクは細胞傷害剤との結合点を示し、ＣＢＡは細胞結合剤／モジュレーターであり、Ｌ１はリンカーであり、Ａは、Ｌ１を細胞結合剤と連結する連結基であり、Ｌ２は共有結合であるか、又は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｒ）を形成し、及びＬ１又はＬ２は切断可能なリンカーである。
【０１９６】
Ｌ１は好ましくは切断可能なリンカーであり、リンカーの切断を活性化するためのトリガーと称され得る。
【０１９７】
存在する場合にＬ１及びＬ２は、性質が幅広く異なり得る。これらの基はその切断特性に基づき選択され、切断特性は、コンジュゲートが送達される部位の条件に左右され得る。酵素の作用によって切断されるリンカーが好ましく、しかしながらｐＨの変化（例えば酸又は塩基に不安定なもの）、温度の変化により切断可能か、又は照射により（例えば感光性のもの）切断可能なリンカーもまた用いられ得る。還元又は酸化条件下で切断可能なリンカーもまた、本発明において利用が見出され得る。
【０１９８】
Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含み得る。このアミノ酸配列は、Ｎ１０位からのＲ１０の放出を可能にするための、酵素切断の標的基質であってもよい。
【０１９９】
一実施形態において、Ｌ１は酵素作用により切断可能である。一実施形態において、酵素はエステラーゼ又はペプチダーゼである。
【０２００】
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己犠牲リンカーを形成する。一実施形態において、Ｌ２は、Ｎ１０位からのＲ１０の放出を可能にするための、酵素活性の基質である。
【０２０１】
一実施形態において、式中、Ｌ１は酵素作用により切断可能であり、且つＬ２は存在し、酵素はＬ１とＬ２との間の結合を切断する。
【０２０２】
Ｌ１及びＬ２は、存在する場合、以下から選択される結合により連結され得る：
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−。
【０２０３】
Ｌ２に接続するＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であってもよく、又はアミノ酸側鎖、例えばリジンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来してもよい。
【０２０４】
Ｌ２に接続するＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であってもよく、又はアミノ酸側鎖、例えばグルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来してもよい。
【０２０５】
Ｌ２に接続するＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えばセリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来してもよい。
【０２０６】
用語「アミノ酸側鎖」は、以下に見られる基を含む：（ｉ）天然に存在するアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン；（ｉｉ）マイナーアミノ酸、例えばオルニチン及びシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、β−アミノ酸、天然に存在するアミノ酸の合成類似体及び誘導体；及び（ｉｖ）全ての鏡像異性体、ジアステレオマー、異性体濃縮形態、同位体標識形態（例えば２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護形態、及びこれらのラセミ混合物。
【０２０７】
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２とは一緒になって基：
【化２】
2018127469.tif 000004
を形成し、式中、アスタリスクは薬物又は細胞傷害剤位置との結合点を示し、波線はリンカーＬ１との結合点を示し、Ｙは−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、及びｎは０〜３である。フェニレン環は、場合により本明細書に記載されるとおりの１、２又は３個の置換基で置換されている。一実施形態において、フェニレン基は、場合によりハロ、ＮＯ２、Ｒ又はＯＲで置換されている。
【０２０８】
一実施形態において、ＹはＮＨである。
【０２０９】
一実施形態において、ｎは０又は１である。好ましくは、ｎは０である。
【０２１０】
ＹがＮＨであり、且つｎが０である場合、自己犠牲リンカーはｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
【０２１１】
自己犠牲リンカーは、遠隔部位の活性化時に、以下に示す線に沿って進行する（ｎ＝０について）保護された化合物の放出を可能にする：
【化３】
2018127469.tif 000005
式中、Ｌ＊は、リンカーの残りの部分が活性化した形態である。これらの基は、活性化の部位を保護されている化合物と分離するという利点を有する。上記に記載したとおり、フェニレン基は場合により置換されてもよい。
【０２１２】
本明細書に記載される一実施形態において、基Ｌ＊は、本明細書に記載されるとおりのリンカーＬ１であり、これはジペプチド基を含み得る。
【０２１３】
別の実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２とは、一緒になって、以下から選択される基を形成する：
【化４】
2018127469.tif 000006
式中、アスタリスク、波線、Ｙ、及びｎは上記に定義するとおりである。各フェニレン環は、場合により本明細書に記載されるとおりの１、２又は３個の置換基で置換されている。一実施形態において、Ｙ置換基を有するフェニレン環は場合により置換されており、Ｙ置換基を有しないフェニレン環は置換されていない。一実施形態において、Ｙ置換基を有するフェニレン環は置換されておらず、Ｙ置換基を有しないフェニレン環は場合により置換されている。
【０２１４】
別の実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２とは、一緒になって、以下から選択される基を形成する：
【化５】
2018127469.tif 000007
式中、アスタリスク、波線、Ｙ、及びｎは上記に定義するとおりであり、ＥはＯ、Ｓ又はＮＲであり、ＤはＮ、ＣＨ、又はＣＲであり、及びＦはＮ、ＣＨ、又はＣＲである。
【０２１５】
一実施形態において、ＤはＮである。
【０２１６】
一実施形態において、ＤはＣＨである。
【０２１７】
一実施形態において、ＥはＯ又はＳである。
【０２１８】
一実施形態において、ＦはＣＨである。
【０２１９】
好ましい実施形態において、リンカーはカテプシンに不安定なリンカーである。
【０２２０】
一実施形態において、Ｌ１はジペプチドを含む。ジペプチドは−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−と表されてもよく、式中、−ＮＨ−及び−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１及びＸ２のＮ末端及びＣ末端を表す。ジペプチド中のアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組み合わせであってもよい。リンカーがカテプシンに不安定なリンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介性切断の作用部位であってもよい。
【０２２１】
加えて、カルボキシル又はアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕ及びＬｙｓに関して、ＣＯ及びＮＨは当該の側鎖官能基を表す。
【０２２２】
一実施形態において、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−中の基−Ｘ１−Ｘ２−は、以下から選択される：
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−及び−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−（式中、Ｃｉｔはシトルリンである）。
【０２２３】
好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−中の基−Ｘ１−Ｘ２−は、以下から選択される：
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、及び−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−。
【０２２４】
最も好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−中の基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−又は−Ｖａｌ−Ａｌａ−である。
【０２２５】
Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１３，８５５−８６９（これは参照により本明細書に援用される）により記載されるものを含め、他のジペプチドの組み合わせが用いられてもよい。
【０２２６】
一実施形態において、適切な場合、アミノ酸側鎖は誘導体化される。例えば、アミノ酸側鎖上のアミノ基又はカルボキシ基が誘導体化されてもよい。
【０２２７】
一実施形態において、側鎖アミノ酸、例えばリジンのアミノ基ＮＨ２は、ＮＨＲ及びＮＲＲ’からなる群から選択される誘導体化形態である。
【０２２８】
一実施形態において、側鎖アミノ酸、例えばアスパラギン酸のカルボキシ基ＣＯＯＨは、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ及びＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される誘導体化形態である。
【０２２９】
一実施形態において、適切な場合、アミノ酸側鎖は化学的に保護されている。側鎖保護基は、以下で基ＲＬに関して考察するとおりの基であってよい。保護されているアミノ酸配列は、酵素により切断可能である。例えば、Ｂｏｃ側鎖で保護されたＬｙｓ残基を含むジペプチド配列が、カテプシンにより切断可能であることが確立されている。
【０２３０】
アミノ酸の側鎖に対する保護基は当該技術分野において周知されており、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍカタログに記載されている。さらなる保護基戦略が、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓに詳説されている。
【０２３１】
反応性側鎖官能基を有するアミノ酸について、可能な側鎖保護基を以下に示す：
Ａｒｇ：Ｚ、Ｍｔｒ、Ｔｏｓ；
Ａｓｎ：Ｔｒｔ、Ｘａｎ；
Ａｓｐ：Ｂｚｌ、ｔ−Ｂｕ；
Ｃｙｓ：Ａｃｍ、Ｂｚｌ、Ｂｚｌ−ＯＭｅ、Ｂｚｌ−Ｍｅ、Ｔｒｔ；
Ｇｌｕ：Ｂｚｌ、ｔ−Ｂｕ；
Ｇｌｎ：Ｔｒｔ、Ｘａｎ；
Ｈｉｓ：Ｂｏｃ、Ｄｎｐ、Ｔｏｓ、Ｔｒｔ；
Ｌｙｓ：Ｂｏｃ、Ｚ−Ｃｌ、Ｆｍｏｃ、Ｚ、Ａｌｌｏｃ；
Ｓｅｒ：Ｂｚｌ、ＴＢＤＭＳ、ＴＢＤＰＳ；
Ｔｈｒ：Ｂｚ；
Ｔｒｐ：Ｂｏｃ；
Ｔｙｒ：Ｂｚｌ、Ｚ、Ｚ−Ｂｒ。
【０２３２】
一実施形態において、側鎖保護は、存在する場合に、キャップ基として提供される基、又はその一部として提供される基に対して直交性となるように選択される。従って、側鎖保護基を取り除いても、キャップ基、又はキャップ基の一部である任意の保護基官能性は取り除かれない。
【０２３３】
本発明の他の実施形態において、選択されるアミノ酸は、反応性側鎖官能基を有しないものである。例えば、アミノ酸は以下から選択され得る：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、及びＶａｌ。
【０２３４】
一実施形態において、ジペプチドは自己犠牲リンカーと組み合わせて使用される。自己犠牲リンカーは−Ｘ２−に連結されてもよい。
【０２３５】
自己犠牲リンカーが存在する場合、−Ｘ２−は自己犠牲リンカーと直接連結される。好ましくは、基−Ｘ２−ＣＯ−はＹに連結され（式中、ＹはＮＨである）、それにより基−Ｘ２−ＣＯ−ＮＨ−を形成する。
【０２３６】
−ＮＨ−Ｘ１−はＡに直接連結される。Ａは官能基−ＣＯ−を含んでもよく、それにより−Ｘ１−とアミド結合を形成する。
【０２３７】
一実施形態において、Ｌ１及びＬ２は、−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって、基ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−ＰＡＢＣ−を含む。ＰＡＢＣ基は細胞傷害剤に直接連結される。好ましくは、自己犠牲リンカーとジペプチドとは、一緒になって基−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成し、これは以下に示される：
【化６】
2018127469.tif 000008
式中、アスタリスクは、選択された細胞傷害性部分との結合点を示し、波線は、リンカーＬ１の残りの部分との結合点又はＡとの結合点を示す。好ましくは、波線は、Ａとの結合点を示す。Ｌｙｓアミノ酸の側鎖は、上記に記載したとおり、例えばＢｏｃ、Ｆｍｏｃ、又はＡｌｌｏｃで保護されていてもよい。
【０２３８】
或いは、自己犠牲リンカーとジペプチドとは、一緒になって基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成し、これは以下に示される：
【化７】
2018127469.tif 000009
式中、アスタリスク及び波線は上記に定義するとおりである。
【０２３９】
或いは、自己犠牲リンカーとジペプチドとは、一緒になって基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成し、これは以下に示される：
【化８】
2018127469.tif 000010
式中、アスタリスク及び波線は上記に定義するとおりである。
【０２４０】
本発明の一部の実施形態では、保護されていないイミン結合が薬物部分に含まれる場合、例えば、部分Ｂが存在する場合、リンカーが遊離アミノ（Ｈ２Ｎ−）基を含有しないことが好ましいこともある。従ってリンカーが構造−Ａ−Ｌ１−Ｌ２−を有すれば、これは好ましくは遊離アミノ基を含有しないことになる。この選好性は、リンカーがジペプチドを、例えばＬ１として含有する場合に、特に適切である；この実施形態では、２つのアミノ酸のうちの一方がリジンから選択されないことが好ましいといえる。
【０２４１】
理論によって拘束されることは望まないが、薬物部分中の保護されていないイミン結合と、リンカー中の遊離アミノ基とが組み合わさると、薬物−リンカー部分の二量体化が生じることができ、それが、かかる薬物−リンカー部分と抗体とのコンジュゲーションを妨げ得る。これらの基の交差反応は、強酸（例えばＴＦＡ）を使用して遊離アミノ基が脱保護されるときなど、遊離アミノ基がアンモニウムイオン（Ｈ３Ｎ＋−）として存在する場合、加速され得る。
【０２４２】
一実施形態において、Ａは共有結合である。従って、Ｌ１と細胞結合剤とは直接連結される。例えば、Ｌ１が連続アミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端が細胞結合剤と直接連結されてもよい。
【０２４３】
従って、Ａが共有結合である場合、細胞結合剤とＬ１との間の連結は、以下から選択され得る：
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、及び＝Ｎ−ＮＨ−。
【０２４４】
ＳＥＺ６モジュレーターに連結するＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であってもよく、又はアミノ酸側鎖、例えばリジンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来してもよい。
【０２４５】
モジュレーターに連結するＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であってもよく、又はアミノ酸側鎖、例えばグルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来してもよい。
【０２４６】
細胞結合剤に連結するＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えばセリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来してもよい。
【０２４７】
モジュレーター剤に連結するＬ１のチオール基は、アミノ酸側鎖、例えばセリンアミノ酸側鎖のチオール基に由来してもよい。
【０２４８】
Ｌ１のアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基及びチオール基に関する上記の注釈はまた、細胞結合剤にも適用される。
【０２４９】
一実施形態において、Ｌ２は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって、以下を表す：
【化９】
2018127469.tif 000011
式中、アスタリスクは、Ｎ１０位との結合点を示し、波線は、Ｌ１との結合点を示し、ｎは０〜３であり、Ｙは共有結合基又は官能基であり、及びＥは、例えば酵素作用又は光による活性化が可能な基であり、それにより自己犠牲単位を生成する。フェニレン環は、場合により、本明細書に記載されるとおりの１、２又は３個の置換基によってさらに置換される。一実施形態において、フェニレン基は、場合により、ハロ、ＮＯ２、Ｒ又はＯＲによってさらに置換される。好ましくはｎは０又は１であり、最も好ましくは０である。
【０２５０】
Ｅは、この基が例えば光によるか又は酵素作用による活性化に感受性を有するように選択される。Ｅは−ＮＯ２又はグルクロン酸（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）であってもよい。前者はニトロレダクターゼの作用に感受性を有し、後者はβ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）の作用に感受性を有し得る。
【０２５１】
この実施形態において、自己犠牲リンカーは、Ｅが活性化されたとき、以下に示す線に沿って進行する（ｎ＝０について）保護された化合物の放出を可能にする：
【化１０】
2018127469.tif 000012
式中、アスタリスクは、Ｎ１０位との結合点を示し、Ｅ＊はＥの活性化形態であり、及びＹは上記に記載したとおりである。これらの基は、活性化の部位を保護されている化合物と分離するという利点を有する。上記に記載したとおり、フェニレン基は場合によりさらに置換されていてもよい。
【０２５２】
基Ｙは、Ｌ１との共有結合であってもよい。
【０２５３】
基Ｙは、以下から選択される官能基であってもよい：
−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、及び−Ｓ−。
【０２５４】
Ｌ１がジペプチドである場合、Ｙは−ＮＨ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−であって、それによりＬ１とＹとの間にアミド結合を形成することが好ましい。この実施形態において、ジペプチド配列は酵素活性の基質でなくてもよい。
【０２５５】
別の実施形態において、Ａはスペーサー基である。従って、Ｌ１と細胞結合剤とは間接的に連結される。
【０２５６】
Ｌ１及びＡは、以下から選択される結合により連結され得る：
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−。
【０２５７】
好ましくは、リンカーは、モジュレーター上の求核性官能基と反応する求電子性官能基を含有する。抗体上の求核基としては、限定はされないが、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）糖ヒドロキシル基又はアミノ基が挙げられ、ここで抗体はグリコシル化されている。アミン基、チオール基、及びヒドロキシル基は、求核性であり、且つ、（ｉ）マレイミド基（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物；（ｉｖ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド；及び（ｖ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルを含めた、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができ、及びこのうちの一部を以下のとおり例示する：
【化１１】
2018127469.tif 000013
。
【０２５８】
特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）などの還元剤で処理することにより、リンカー試薬とコンジュゲーション反応するようになり得る。このようにして、各システイン架橋が理論的には２つの反応性チオール求核種を形成する。リジンを２−イミノチオラン（トラウト試薬）と反応させてアミンをチオールに変換することにより、さらなる求核基を抗体に導入することができる。反応性チオール基は、１、２、３、４個、又はそれ以上のシステイン残基の導入（例えば、１つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含む突然変異体抗体の調製）により、抗体（又はその断片）に導入されてもよい。米国特許第７５２１５４１号明細書は、反応性システインアミノ酸の導入による工学的改変抗体を教示している。
【０２５９】
一部の実施形態では、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応する反応性求核基を有する。抗体上の有用な求電子基としては、限定はされないが、アルデヒド及びケトンカルボニル基が挙げられる。リンカーの求核基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応して抗体単位と共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核基としては、限定はされないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジンが挙げられる。抗体上の求電子基は、リンカーとの結合に好都合な部位を提供する。
【０２６０】
一実施形態において、基Ａは以下である：
【化１２】
2018127469.tif 000014
式中、アスタリスクはＬ１との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、及びｎは０〜６である。一実施形態において、ｎは５である。
【０２６１】
一実施形態において、基Ａは以下である：
【化１３】
2018127469.tif 000015
式中、アスタリスクはＬ１との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、及びｎは０〜６である。一実施形態において、ｎは５である。
【０２６２】
一実施形態において、基Ａは以下である：
【化１４】
2018127469.tif 000016
式中、アスタリスクはＬ１との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、ｎは０又は１であり、及びｍは０〜３０である。好ましい実施形態において、ｎは１であり、及びｍは０〜１０、１〜８、好ましくは４〜８、及び最も好ましくは４又は８である。別の実施形態において、ｍは１０〜３０、及び好ましくは２０〜３０である。或いは、ｍは０〜５０である。この実施形態において、ｍは好ましくは１０〜４０であり、及びｎは１である。
【０２６３】
一実施形態において、基Ａは以下である：
【化１５】
2018127469.tif 000017
式中、アスタリスクはＬ１との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、ｎは０又は１であり、及びｍは０〜３０である。好ましい実施形態において、ｎは１であり、及びｍは０〜１０、１〜８、好ましくは４〜８、及び最も好ましくは４又は８である。別の実施形態において、ｍは１０〜３０、及び好ましくは２０〜３０である。或いは、ｍは０〜５０である。この実施形態において、ｍは好ましくは１０〜４０であり、及びｎは１である。
【０２６４】
一実施形態において、細胞結合剤とＡとの間の連結は、細胞結合剤のチオール残基及びＡのマレイミド基を介する。
【０２６５】
一実施形態において、細胞結合剤とＡとの間の連結は、以下である：
【化１６】
2018127469.tif 000018
式中、アスタリスクはＡの残りの部分との結合点を示し、波線は、細胞結合剤の残りの部分との結合点を示す。この実施形態において、Ｓ原子は、典型的にはモジュレーターに由来する。
【０２６６】
上記の実施形態の各々において、以下に示すマレイミド由来の基の代わりに代替的な官能基を使用してもよい：
【化１７】
2018127469.tif 000019
式中、波線は、前出のとおり細胞結合剤との結合点を示し、及びアスタリスクはＡ基の残りの部分との結合を示す。
【０２６７】
一実施形態において、マレイミド由来の基は、以下の基に置き換えられる：
【化１８】
2018127469.tif 000020
式中、波線は細胞結合剤との結合点を示し、及びアスタリスクはＡ基の残りの部分との結合を示す。
【０２６８】
一実施形態において、マレイミド由来の基は、場合により細胞結合剤と一緒になる、ある基に置き換えられ、その基は、以下から選択される：
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、＝Ｎ−ＮＨ−及び−ＮＨ−Ｎ＝。
【０２６９】
一実施形態において、マレイミド由来の基は、場合により細胞結合剤と一緒になる、ある基に置き換えられ、その基は、以下から選択される：
【化１９】
2018127469.tif 000021
式中波線は、細胞結合剤との結合点又はＡ基の残りの部分との結合のうちの一方を示し、アスタリスクは、細胞結合剤との結合点又はＡ基の残りの部分との結合のうちの他方を示す。
【０２７０】
選択されたモジュレーターにＬ１を連結するのに好適な他の基は、国際公開第２００５／０８２０２３号パンフレットに記載される。
【０２７１】
別の好ましい実施形態において、本発明のモジュレーターは、薬物リンカー単位を含む生体適合性ポリマーと会合され得る。この点において、一つのかかる種類の適合性のあるポリマーには、Ｆｌｅｘｉｍｅｒ（登録商標）ポリマー（Ｍｅｒｓａｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が含まれる。かかるポリマーは、報告によれば生分解性であり、耐容性が良好であり、且つ臨床的妥当性が確認されている。さらに、かかるポリマーは、数多くのカスタマイズ可能なリンカー技術及び化学と適合性があり、薬物動態の制御、薬物放出の限局化及び体内分布の向上を可能にする。
【０２７２】
選択されたモジュレーターはまた、放射性同位元素と直接コンジュゲートすることができ、又は放射性金属イオン（本明細書に記載されるとおりの）とのコンジュゲーションに有用な大環状キレート剤を含み得る。特定の実施形態では、大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これは、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる。かかるリンカー分子は当該技術分野において一般に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：５５３；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３に記載されている。
【０２７３】
より一般的に、治療用部分又は細胞傷害剤をモジュレーターとコンジュゲートするための技法は周知である。上記に考察したとおり、限定はされないが、アルデヒド／シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸に不安定な結合、ｃｉｓ−アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素分解性の結合を含めた（一般に、Ｇａｒｎｅｔｔ，２００２，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５３：１７１を参照のこと）、任意の当該技術分野で認められている方法により、部分をモジュレーターとコンジュゲートすることができる。また、例えば、Ａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「癌治療における薬物のイムノターゲッティング用モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「ドラッグデリバリー用抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「癌治療における細胞傷害剤の抗体担体：レビュー（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ）」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「癌治療における放射性標識抗体の治療的使用の分析、結果、及び将来的展望（Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９を参照のこと。好ましい実施形態において、治療用部分又は細胞傷害剤とコンジュゲートされるＳＥＺ６モジュレーターは、細胞表面に会合したＳＥＺ６分子と結合すると、細胞によってインターナライズされ、それにより治療ペイロードを送達し得る。
【０２７４】
Ｃ．生体適合性修飾物質
選択された実施形態において、本発明のモジュレーターは、モジュレーター特性を所望のとおりに調整し、変化させ、改善し、又は抑えるために用いられ得る生体適合性修飾物質とコンジュゲートされるか、又は他の形で会合され得る。例えば、比較的高分子量のポリマー分子、例えば市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は同様の生体適合性ポリマーを結合させることにより、インビボ半減期が増加した抗体又は融合コンストラクトを生成することができる。当業者は、抗体に特定の特性が付与されるように（例えば半減期を個別に適合させてもよい）選択することのできる多くの異なる分子量及び分子配置のＰＥＧを入手し得ることを理解する。ＰＥＧはモジュレーター又は抗体断片若しくは誘導体と、ＰＥＧと前記抗体又は抗体断片のＮ末端又はＣ末端との部位特異的コンジュゲーションによるか、或いはリジン残基に存在するε−アミノ基を介するかして、多官能性リンカーを伴い又は伴わず結合することができる。生物学的活性の損失が最小限となる直鎖状又は分枝状ポリマー誘導体化が用いられてもよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によりコンジュゲーションの程度を詳しくモニタして、ＰＥＧ分子と抗体分子との最適なコンジュゲーションを確実にすることができる。未反応のＰＥＧは、例えばサイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートと分離することができる。同じようにして、抗体又は抗体断片のインビボ安定性を高めるため、又はインビボ半減期を延ばすため、本開示のモジュレーターをアルブミンとコンジュゲートすることができる。これらの技法は当該技術分野において周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、国際公開第９３／１５２００号パンフレット、及び国際公開第０１／７７１３７号パンフレット；及び欧州特許第０  ４１３、６２２号明細書を参照のこと。他の生体適合性コンジュゲートが当業者に明らかであり、本明細書の教示に従い容易に同定され得る。
【０２７５】
Ｄ．診断剤又は検出剤
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーター、又はその断片若しくは誘導体は、例えば、生体分子（例えば、ペプチド又はヌクレオチド）、小分子、フルオロフォア、又は放射性同位元素であってもよい診断剤又は検出可能な薬剤、マーカー又はレポーターとコンジュゲートされる。標識されたモジュレーターは、過剰増殖性障害の展開又は進行のモニタリングに、又は本開示のモジュレーターを含む特定の治療の有効性を判断するため（すなわちセラグノスティクス）、若しくは今後の治療コースを決定するための臨床試験手順の一環として、有用であり得る。かかるマーカー又はレポーターはまた、選択されたモジュレーターの精製、モジュレーター解析（例えば、エピトープ結合又は抗体ビニング）、ＴＩＣの分離若しくは単離において、又は前臨床手順若しくは毒性研究においても有用であり得る。
【０２７６】
かかる診断解析及び／又は検出は、モジュレーターを、限定はされないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む様々な酵素；補欠分子族、限定はされないが、ストレプトアビジン／ビオチン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｌｂｉｏｔｉｎ）及びアビジン／ビオチン；蛍光物質、例えば限定はされないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリン；発光物質、例えば限定はされないが、ルミノール；生物発光物質、例えば限定はされないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン；放射性物質、例えば限定はされないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎ；様々な陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放出金属、非放射性（ｎｏｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ）常磁性金属イオン、及び放射性標識されるか又は特定の放射性同位元素とコンジュゲートされた分子を含め、検出可能な物質とカップリングすることにより達成することができる。かかる実施形態において、適切な検出方法は当該技術分野において周知であり、多数の商業的供給元から容易に入手可能である。
【０２７７】
上記に指摘したとおり、他の実施形態では、モジュレーター又はその断片をマーカー配列又は化合物、例えばペプチド又はフルオロフォアと融合又はコンジュゲートすることにより、精製又は診断若しくは分析手順、例えば、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣｓ等を促進することができる。好ましい実施形態において、マーカーは、とりわけ、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）により供給されるようなｈｉｓ−タグ（その多くが市販されている）を含む。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定はされないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）及び「ｆｌａｇ」タグ（米国特許第４，７０３，００４号明細書）が挙げられる。
【０２７８】
Ｅ．治療用部分
これまでに言及したとおり、モジュレーター又はその断片若しくは誘導体はまた、「治療用部分」又は「薬物」、例えば抗増殖剤又は抗癌剤、例えば限定はされないが、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、デバルキング剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線療法剤、標的抗癌剤、ＢＲＭ、治療用抗体、癌ワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法及び抗転移剤及び免疫療法剤とコンジュゲート、連結若しくは融合され、又は他の形で会合されてもよい。
【０２７９】
好ましい例示的抗癌剤としては、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ）、メイタンシノイド、例えばＤＭ−１及びＤＭ−４（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミド及びこれらの類似体又は同族体が挙げられる。さらなる適合性のある細胞毒には、ドラスタチン及びアウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アマニチン、例えばα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン又はε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えばデュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ，Ｂ．Ｖ．）及び修飾ピロロベンゾジアゼピン二量体（Ｓｐｉｒｏｇｅｎ，Ｌｔｄ．）、スプライシング阻害薬、例えばメアヤマイシン類似体又は誘導体（例えば、米国特許第７，８２５，２６７号明細書に記載されるとおりのＦＲ９０１４６４）、チューブリン結合剤（ｔｕｂｕｌａｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えばエポチロン類似体及びパクリタキセル及びＤＮＡ傷害剤、例えばカリケアマイシン及びエスペラミシンが含まれる。さらに、特定の実施形態では、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは抗ＣＤ３結合分子に会合して細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、それを腫瘍開始細胞に標的化させ得る（ＢｉＴＥ技術；例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．５６２５（２０１０）（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０２８０】
なおもさらなる適合性のある抗癌剤としては、限定はされないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル  ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。治療用部分のより詳細なリストは、国際公開第０３／０７５９５７号パンフレット及び米国特許出願公開第２００９／０１５５２５５号明細書（この各々が参照により本明細書に援用される）に見ることができる。
【０２８１】
上記に指摘したとおり、本発明の選択された実施形態は、細胞傷害剤としてピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む抗ＳＥＺ６抗体薬コンジュゲートなどのコンジュゲート型ＳＥＺ６モジュレーターに関する。ＰＢＤは、ＤＮＡの副溝に共有結合して核酸合成を阻害することにより抗腫瘍活性を発揮するアルキル化剤であることは理解される。この点において、ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有しながらも最小の骨髄抑制を呈することが示されている。本発明と適合性のあるＰＢＤは、数種類のリンカーのうちのいずれか一つ（例えば、遊離スルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用してＳＥＺ６モジュレーターに連結されてもよく、特定の実施形態では、二量体の形態（すなわちＰＢＤ二量体）である。本開示のモジュレーターとコンジュゲートされ得る適合性のあるＰＢＤ（及び任意選択のリンカー）が、例えば、米国特許第６，３６２，３３１号明細書、同第７，０４９，３１１号明細書、同第７，１８９，７１０号明細書、同第７，４２９，６５８号明細書、同第７，４０７，９５１号明細書、同第７，７４１，３１９号明細書、同第７，５５７，０９９号明細書、同第８，０３４，８０８号明細書、同第８，１６３，７３６号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号明細書及び国際公開第２０１１／１３０６１３号パンフレット、国際公開第２０１１／１２８６５０号パンフレット及び国際公開第２０１１／１３０６１６号パンフレット（この各々が参照により本明細書に援用される）に記載されている。従って、特に好ましい実施形態ではモジュレーターは、１つ以上のＰＢＤ二量体（すなわち、ＳＥＺ６−ＰＢＤ  ＡＤＣ）とコンジュゲート又は会合した抗ＳＥＺ６抗体を含む。
【０２８２】
特に好ましい実施形態では、本開示のモジュレーターとコンジュゲートされ得る適合性のあるＰＢＤは、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号明細書に記載される。本開示においては、ＰＢＤ二量体、すなわち２つのＰＢＤ部分を含むものが好ましいこともある。従って、本発明の好ましいコンジュゲートは、以下の式（ＡＢ）又は（ＡＣ）を有するものである：
【化２０】
2018127469.tif 000022
式中：
点線は、Ｃ１とＣ２との間又はＣ２とＣ３との間の二重結合の任意選択の存在を示し；
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立して選択され、場合によりハロ又はジハロからさらに選択され；
式中、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、及びハロから独立して選択され；
Ｒ６及びＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択され；
Ｒ１０は、上記に記載したとおり、モジュレーター又はその断片若しくは誘導体と連結されたリンカーであり；
Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立して選択され；
Ｒ１１は、Ｈであるか、或いはＲであるか、或いはＱがＯである場合、ＳＯ３Ｍ（式中、Ｍは金属カチオンである）であり；
Ｒ及びＲ’は、各々、場合により置換されているＣ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基から独立して選択され、場合により、基ＮＲＲ’に関して、Ｒ及びＲ’は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、場合により置換されている４員、５員、６員又は７員複素環式環を形成し；及び
式中、Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”及びＲ１１”は、それぞれＲ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、Ｑ及びＲ１１により定義されるとおりであり、及びＲＣはキャップ基である。
【０２８３】
二重結合
一実施形態において、Ｃ１とＣ２との間、及びＣ２とＣ３との間に二重結合は存在しない。
【０２８４】
一実施形態において、点線は、以下に示すとおりの、Ｃ２とＣ３との間の二重結合の任意選択の存在を示す：
【化２１】
2018127469.tif 000023
。
【０２８５】
一実施形態において、Ｒ２がＣ５〜２０アリール又はＣ１〜１２アルキルであるとき、Ｃ２とＣ３との間に二重結合が存在する。
【０２８６】
一実施形態において、点線は、以下に示すとおりの、Ｃ１とＣ２との間の二重結合の任意選択の存在を示す。
【化２２】
2018127469.tif 000024
【０２８７】
一実施形態において、Ｒ２がＣ５〜２０アリール又はＣ１〜１２アルキルであるとき、Ｃ１とＣ２との間に二重結合が存在する。
【０２８８】
Ｒ２
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立して選択され、場合によりハロ又はジハロからさらに選択される。
【０２８９】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立して選択される。
【０２９０】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤ、及び＝Ｃ（ＲＤ）２から独立して選択される。
【０２９１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立してＨである。
【０２９２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して＝Ｏである。
【０２９３】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して＝ＣＨ２である。
【０２９４】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して＝ＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物中、基＝ＣＨ−ＲＤは、以下に示されるいずれかの立体配置を有し得る。
【化２３】
2018127469.tif 000025
【０２９５】
一実施形態において、立体配置は立体配置（Ｉ）である。
【０２９６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して＝Ｃ（ＲＤ）２である。
【０２９７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して＝ＣＦ２である。
【０２９８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立してＲである。
【０２９９】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているＣ５〜２０アリールである。
【０３００】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているＣ１〜１２アルキルである。
【０３０１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているＣ５〜２０アリールである。
【０３０２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているＣ５〜７アリールである。
【０３０３】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているＣ８〜１０アリールである。
【０３０４】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているフェニルである。
【０３０５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているナフチル（ｎａｐｔｈｙｌ）である。
【０３０６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているピリジルである。
【０３０７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立して、場合により置換されているキノリニル又はイソキノリニルである。
【０３０８】
一実施形態において、Ｒ２は１〜３個の置換基を有し、１個及び２個がより好ましく、及び単一の置換基が最も好ましい。置換基は任意の位置であってよい。
【０３０９】
Ｒ２がＣ５〜７アリール基である場合、好ましくは化合物の残りの部分との結合に隣接しない環原子上に単一の置換基があり、すなわちそれは、好ましくは化合物の残りの部分との結合に対してβ位又はγ位にある。従って、Ｃ５〜７アリール基がフェニルである場合、置換基は、好ましくはメタ位又はパラ位にあり、より好ましくはパラ位にある。
【０３１０】
一実施形態において、Ｒ２は、以下から選択される。
【化２４】
2018127469.tif 000026
式中、アスタリスクは結合点を示す。
【０３１１】
Ｒ２がＣ８〜１０アリール基、例えばキノリニル又はイソキノリニルである場合、Ｒ２は、キノリン環又はイソキノリン環の任意の位置に任意の数の置換基を有し得る。一部の実施形態では、Ｒ２は、１個、２個又は３個の置換基を有し、それらはいずれも近位及び遠位の環上にあってもよく、又はその両方の上にあってもよい（２個以上の置換基がある場合）。
【０３１２】
一実施形態において、Ｒ２が場合により置換されている場合、置換基は、以下の置換基の節に提供される置換基から選択される。
【０３１３】
Ｒが場合により置換されている場合、置換基は、好ましくは以下から選択される：
ハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノ及びチオエーテル。
【０３１４】
一実施形態において、Ｒ又はＲ２が場合により置換されている場合、置換基は、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、及びＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される。
【０３１５】
Ｒ２がＣ１〜１２アルキルである場合、任意選択の置換基が、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基をさらに含み得る。
【０３１６】
Ｒ２がＣ３〜２０ヘテロシクリルである場合、任意選択の置換基が、Ｃ１〜１２アルキル基及びＣ５〜２０アリール基をさらに含み得る。
【０３１７】
Ｒ２がＣ５〜２０アリール基である場合、任意選択の置換基が、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ１〜１２アルキル基をさらに含み得る。
【０３１８】
用語「アルキル」は、サブクラスのアルケニル及びアルキニル並びにシクロアルキルを包含することが理解される。従って、Ｒ２が場合により置換されているＣ１〜１２アルキルである場合、アルキル基は場合により１つ以上の炭素−炭素二重又は三重結合を含み、それがコンジュゲート系の一部を形成し得ることが理解される。一実施形態において、場合により置換されているＣ１〜１２アルキル基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重又は三重結合を含み、この結合は、Ｃ１とＣ２との間、又はＣ２とＣ３との間に存在する二重結合とコンジュゲートされる。一実施形態において、Ｃ１〜１２アルキル基は、飽和Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、Ｃ２〜１２アルキニル及びＣ３〜１２シクロアルキルから選択される基である。
【０３１９】
Ｒ２上の置換基がハロである場合、それは好ましくはＦ又はＣｌ、より好ましくはＣｌである。
【０３２０】
Ｒ２上の置換基がエーテルである場合、それは、一部の実施形態ではアルコキシ基、例えばＣ１〜７アルコキシ基（例えばメトキシ、エトキシ）であってもよく、又は一部の実施形態ではＣ５〜７アリールオキシ基（例えばフェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）であってもよい。
【０３２１】
Ｒ２上の置換基がＣ１〜７アルキルである場合、それは好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル）であってもよい。
【０３２２】
Ｒ２上の置換基がＣ３〜７ヘテロシクリルである場合、それは一部の実施形態では、Ｃ６窒素含有ヘテロシクリル基、例えばモルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルであってもよい。これらの基は、ＰＢＤ部分の残りの部分に窒素原子を介して結合し得る。これらの基は、例えばＣ１〜４アルキル基によってさらに置換されていてもよい。
【０３２３】
Ｒ２上の置換基がビス−オキシ−Ｃ１〜３アルキレンである場合、これは好ましくはビス−オキシ−メチレン又はビス−オキシ−エチレンである。
【０３２４】
Ｒ２に特に好ましい置換基としては、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチル−ピペラジニル、モルホリノ及びメチル−チエニルが挙げられる。
【０３２５】
特に好ましい置換されているＲ２基としては、限定はされないが、４−メトキシ−フェニル、３−メトキシフェニル、４−エトキシ−フェニル、３−エトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−クロロ−フェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル、及びナフチルが挙げられる。
【０３２６】
一実施形態において、Ｒ２はハロ又はジハロである。一実施形態において、Ｒ２は−Ｆ又は−Ｆ２であり、これらの置換基は以下にそれぞれ（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）として例示する。
【化２５】
2018127469.tif 000027
【０３２７】
ＲＤ
一実施形態において、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、及びハロから独立して選択される。
【０３２８】
一実施形態において、ＲＤは、独立してＲである。
【０３２９】
一実施形態において、ＲＤは、独立してハロである。
【０３３０】
Ｒ６
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから独立して選択される。
【０３３１】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２及びハロから独立して選択される。
【０３３２】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ及びハロから独立して選択される。
【０３３３】
一実施形態において、Ｒ６は、独立してＨである。
【０３３４】
一実施形態において、Ｒ６及びＲ７は、一緒になって基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−を形成し、式中ｐは１又は２である。
【０３３５】
Ｒ７
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択される。
【０３３６】
一実施形態において、Ｒ７は、独立してＯＲである。
【０３３７】
一実施形態において、Ｒ７は、独立してＯＲ７Ａであり、式中Ｒ７Ａは、独立して、場合により置換されているＣ１〜６アルキルである。
【０３３８】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立して、場合により置換されている飽和Ｃ１〜６アルキルである。
【０３３９】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立して、場合により置換されているＣ２〜４アルケニルである。
【０３４０】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立してＭｅである。
【０３４１】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立してＣＨ２Ｐｈである。
【０３４２】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立してアリルである。
【０３４３】
一実施形態において、化合物は二量体であり、ここで各単量体のＲ７基は、一緒になって単量体を連結する式Ｘ−Ｒ”−Ｘを有する二量体架橋を形成する。
【０３４４】
Ｒ８
一実施形態において、化合物は二量体であり、ここで各単量体のＲ８基は、一緒になって単量体を連結する式Ｘ−Ｒ”−Ｘを有する二量体架橋を形成する。
【０３４５】
一実施形態において、Ｒ８は、独立してＯＲ８Ａであり、ここでＲ８Ａは、独立して、場合により置換されているＣ１〜４アルキルである。
【０３４６】
一実施形態において、Ｒ８Ａは、独立して、場合により置換されている飽和Ｃ１〜６アルキル又は場合により置換されているＣ２〜４アルケニルである。
【０３４７】
一実施形態において、Ｒ８Ａは、独立してＭｅである。
【０３４８】
一実施形態において、Ｒ８Ａは、独立してＣＨ２Ｐｈである。
【０３４９】
一実施形態において、Ｒ８Ａは、独立してアリルである。
【０３５０】
一実施形態において、Ｒ８及びＲ７は、一緒になって基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−を形成し、式中ｐは１又は２である。
【０３５１】
一実施形態において、Ｒ８及びＲ９は、一緒になって基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−を形成し、式中ｐは１又は２である。
【０３５２】
Ｒ９
一実施形態において、Ｒ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから独立して選択される。
【０３５３】
一実施形態において、Ｒ９は、独立してＨである。
【０３５４】
一実施形態において、Ｒ９は、独立してＲ又はＯＲである。
【０３５５】
Ｒ及びＲ’
一実施形態において、Ｒは、場合により置換されているＣ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基から独立して選択される。これらの基は、各々、以下の置換基の節に定義される。
【０３５６】
一実施形態において、Ｒは、独立して、場合により置換されているＣ１〜１２アルキルである。
【０３５７】
一実施形態において、Ｒは、独立して、場合により置換されているＣ３〜２０ヘテロシクリルである。
【０３５８】
一実施形態において、Ｒは、独立して、場合により置換されているＣ５〜２０アリールである。
【０３５９】
一実施形態において、Ｒは、独立して、場合により置換されているＣ１〜１２アルキルである。
【０３６０】
Ｒ２に関連して上記には、好ましいアルキル基及びアリール基並びに任意選択の置換基のアイデンティティ及び数に関する様々な実施形態が記載される。Ｒに適用されるときのＲ２に関して示される選択は、適切な場合には、他の全ての基Ｒに適用することができ、ここでは例えばＲ６、Ｒ７、Ｒ８又はＲ９がＲである。
【０３６１】
Ｒの選択はまた、Ｒ’にも適用される。
【０３６２】
本発明の一部の実施形態では、置換基−ＮＲＲ’を有する化合物が提供される。一実施形態において、Ｒ及びＲ’は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、場合により置換されている４員、５員、６員又は７員複素環式環を形成する。この環は、さらなるヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ又はＳを含み得る。
【０３６３】
一実施形態において、複素環式環はそれ自体が基Ｒにより置換されている。さらなるＮヘテロ原子が存在する場合、置換基はＮヘテロ原子上にあってもよい。
【０３６４】
Ｒ”
Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であり、その鎖は、１つ以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は芳香環、例えばベンゼン又はピリジン（これらの環は場合により置換されている）によって遮断されていてもよい。
【０３６５】
一実施形態において、Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であり、その鎖は、１つ以上のヘテロ原子及び／又は芳香環、例えばベンゼン又はピリジンによって遮断されていてもよい。
【０３６６】
一実施形態において、アルキレン基は、場合によりＯ、Ｓ、及びＮＭｅから選択される１つ以上のヘテロ原子及び／又は芳香環（これらの環は場合により置換されている）によって遮断されている。
【０３６７】
一実施形態において、芳香環はＣ５〜２０アリーレン基であり、ここでアリーレンは、芳香族化合物の２つの芳香環原子（この部分は５〜２０個の環原子を有する）から２個の水素原子を取り除くことにより得られる二価部分に関する。
【０３６８】
一実施形態において、Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であり、その鎖は、１つ以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は芳香環、例えばベンゼン又はピリジン（これらの環は場合によりＮＨ２によって置換されている）によって遮断されていてもよい。
【０３６９】
一実施形態において、Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基である。
【０３７０】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９及びＣ１１アルキレン基から選択される。
【０３７１】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３、Ｃ５及びＣ７アルキレン基から選択される。
【０３７２】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３及びＣ５アルキレン基から選択される。
【０３７３】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基である。
【０３７４】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ５アルキレン基である。
【０３７５】
上記に列挙するアルキレン基は、場合により１つ以上のヘテロ原子及び／又は芳香環、例えばベンゼン又はピリジン（これらの環は場合により置換されている）によって遮断されていてもよい。
【０３７６】
上記に列挙するアルキレン基は、場合により１つ以上のヘテロ原子及び／又は芳香環、例えばベンゼン又はピリジンによって遮断されていてもよい。
【０３７７】
上記に列挙するアルキレン基は、非置換直鎖状脂肪族アルキレン基であってもよい。
【０３７８】
Ｘ
一実施形態において，Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮ（Ｈ）から選択される。
【０３７９】
好ましくは、ＸはＯである。
【０３８０】
Ｒ１０
好ましくは、上記に記載されるような適合性のあるリンカーは、ＳＥＺ６モジュレーター（ＣＢＡ／Ａｂ／Ｍ）を、ＰＢＤ薬物部分Ｄと共有結合（複数可）によってＲ１０位（すなわちＮ１０）で結合する。リンカーは二官能基又は多官能基部分であり、これを使用して１つ以上の薬物部分（Ｄ）とモジュレーター（好ましくは抗体）とを連結し、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成することができる。リンカー（Ｌ）は、細胞の外部、すなわち細胞外で安定であってもよく、又は酵素活性、加水分解、若しくは他の代謝条件により切断可能であってもよい。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物部分との結合及び抗体との結合について反応性の官能基を有するリンカーを使用して好都合に調製することができる。抗体（Ａｂ）のシステインチオール、又はアミン、例えばＮ末端又はアミノ酸側鎖、例えばリジンは、リンカー又はスペーサー試薬、ＰＢＤ薬物部分（Ｄ）又は薬物−リンカー試薬（Ｄ−Ｌ）の官能基と結合を形成することができる。
【０３８１】
ＰＢＤ部分のＮ１０位に結合したリンカー上の多くの官能基が、細胞結合剤との反応に有用であり得る。例えば、エステル、チオエステル、アミド、チオアミド、カルバメート、チオカルバメート、尿素、チオ尿素、エーテル、チオエーテル、又はジスルフィド結合が、リンカー−ＰＢＤ薬物中間体と細胞結合剤との反応から形成され得る。
【０３８２】
別の実施形態において、リンカーは、凝集、溶解度又は反応性を調整する基によって置換されてもよい。例えば、スルホン酸置換基は、試薬の水溶性を増加させ、ＡＤＣの調製に用いられる合成経路に応じて、リンカー試薬と抗体又は薬物部分とのカップリング反応を促進し得るか、又はＡｂ−ＬとＤ、又はＤ−ＬとＡｂのカップリング反応を促進し得る。
【０３８３】
好ましい一実施形態において、Ｒ１０は基：
【化２６】
2018127469.tif 000028
であり、式中、アスタリスクはＮ１０位との結合点を示し、ＣＢＡは細胞結合剤／モジュレーターであり、Ｌ１はリンカーであり、Ａは、Ｌ１を細胞結合剤と連結する連結基であり、Ｌ２は共有結合であるか、又は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己犠牲リンカーを形成し、及びＬ１又はＬ２は切断可能なリンカーである。
【０３８４】
Ｌ１は好ましくは切断可能なリンカーであり、リンカーの切断を活性化するためのトリガーと称され得る。
【０３８５】
上記のリンカーの節に考察されるとおり、存在する場合にＬ１及びＬ２は、性質が幅広く異なり得る。これらの基はその切断特性に基づき選択され、切断特性は、コンジュゲートが送達される部位の条件に左右され得る。酵素の作用によって切断されるリンカーが好ましく、しかしながらｐＨの変化（例えば酸又は塩基に不安定なもの）、温度の変化により切断可能か、又は照射により（例えば感光性のもの）切断可能なリンカーもまた用いられ得る。還元又は酸化条件下で切断可能なリンカーもまた、本発明において利用が見出され得る。
【０３８６】
Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含み得る。このアミノ酸配列は、Ｎ１０位からのＲ１０の放出を可能にするための、酵素切断の標的基質であってもよい。
【０３８７】
一実施形態において、Ｌ１は酵素作用により切断可能である。一実施形態において、酵素はエステラーゼ又はペプチダーゼである。
【０３８８】
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己犠牲リンカーを形成する。一実施形態において、Ｌ２は、Ｎ１０位からのＲ１０の放出を可能にするための、酵素活性の基質である。
【０３８９】
一実施形態において、Ｌ１は酵素作用により切断可能であり、且つＬ２は存在する場合、酵素はＬ１とＬ２との間の結合を切断する。
【０３９０】
選択のリンカーを選択されたＰＢＤと結合させることに関して、基ＲＣは、特定のＰＢＤ部分のＮ１０位から除去可能であって、それによりＮ１０−Ｃ１１イミン結合、カルビノールアミン、置換カルビノールアミン、ＱＲ１１がＯＳＯ３Ｍである場合、亜硫酸水素塩付加物、チオカルビノールアミン、置換チオカルビノールアミン、又は置換カルビノールアミン（ｃａｒｂｉｎａｌａｍｉｎｅ）が残る。
【０３９１】
一実施形態において、ＲＣは、除去可能であって、それによりＮ１０−Ｃ１１イミン結合、カルビノールアミン、置換カルビノールアミン、又はＱＲ１１がＯＳＯ３Ｍである場合、亜硫酸水素塩付加物を残す保護基であってもよい。一実施形態において、ＲＣは、除去可能であって、それによりＮ１０−Ｃ１１イミン結合を残す保護基である。
【０３９２】
基ＲＣは、基Ｒ１０の除去に必要な条件と同じ条件下で除去可能であるように意図され、それにより例えば、Ｎ１０−Ｃ１１イミン結合、カルビノールアミンなどを生じる。キャップ基は、Ｎ１０位の意図された官能性に対する保護基として働く。キャップ基は、細胞結合剤に対して反応性を有しないように意図される。例えば、ＲＣはＲＬと同じでない。
【０３９３】
キャップ基を有する化合物を、イミン単量体を有する二量体の合成における中間体として使用してもよい。或いは、キャップ基を有する化合物をコンジュゲートとして使用してもよく、ここではキャップ基が標的部位で除去されると、イミン、カルビノールアミン、置換カルビノールアミンなどを生じる。従って、この実施形態では、キャップ基を、国際公開第００／１２５０７号パンフレットに定義されるとおり、治療的に除去可能な窒素保護基と称することができる。
【０３９４】
一実施形態において、基ＲＣは、基Ｒ１０のリンカーＲＬを切断する条件下で除去可能である。従って、一実施形態において、キャップ基は酵素作用によって切断可能である。
【０３９５】
代替的実施形態において、キャップ基は、リンカーＲＬのモジュレーターとの連結前に除去可能である。この実施形態において、キャップ基は、リンカーＲＬを切断しない条件下で除去可能である。
【０３９６】
化合物が官能基Ｇ１を含んで細胞結合剤との連結を形成する場合、キャップ基は、Ｇ１の添加前又は脱マスキング前に除去可能である。
【０３９７】
キャップ基を保護基戦略の一部として使用して、二量体中の単量体単位の一方のみが細胞結合剤に連結されることを確実にしてもよい。
【０３９８】
キャップ基を、Ｎ１０−Ｃ１１イミン結合のマスクとして使用してもよい。キャップ基は、化合物においてイミン官能性が必要となるタイミングで除去されてもよい。キャップ基はまた、上記に記載したとおり、カルビノールアミン、置換カルビノールアミン、及び亜硫酸水素塩付加物のマスクでもある。
【０３９９】
一実施形態において、ＲＣは、カルバメート保護基である。
【０４００】
一実施形態において、カルバメート保護基は以下から選択される：
Ａｌｌｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｐｓｅｃ、Ｃｂｚ及びＰＮＺ。
【０４０１】
場合により、カルバメート保護基は、Ｍｏｃからさらに選択される。
【０４０２】
一実施形態において、ＲＣは、細胞結合剤との連結用の官能基を欠いているリンカー基ＲＬである。
【０４０３】
本願は、特に、カルバメートであるＲＣ基に関する。
【０４０４】
一実施形態において、ＲＣは基：
【化２７】
2018127469.tif 000029
であり、式中、アスタリスクはＮ１０位との結合点を示し、Ｇ２は末端基であり、Ｌ３は共有結合又は切断可能なリンカーＬ１であり、Ｌ２は共有結合であるか又はＯＣ（＝Ｏ）と一緒になって自己犠牲リンカーを形成する。
【０４０５】
Ｌ３及びＬ２が共に共有結合である場合、Ｇ２及びＯＣ（＝Ｏ）は、一緒になって、上記に定義するとおりのカルバメート保護基を形成する。
【０４０６】
Ｌ１は、上記にＲ１０に関して定義するとおりである。
【０４０７】
Ｌ２は、上記にＲ１０に関して定義するとおりである。
【０４０８】
周知の保護基をベースとする末端基を含め、様々な末端基を以下に記載する。
【０４０９】
一実施形態において、Ｌ３は切断可能なリンカーＬ１であり、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）と一緒になって自己犠牲リンカーを形成する。この実施形態において、Ｇ２はＡｃ（アセチル）又はＭｏｃ、又は以下から選択されるカルバメート保護基である：Ａｌｌｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｐｓｅｃ、Ｃｂｚ及びＰＮＺ。場合により、カルバメート保護基はＭｏｃからさらに選択される。
【０４１０】
別の実施形態において、Ｇ２はアシル基−Ｃ（＝Ｏ）Ｇ３であり、ここでＧ３は、アルキル（シクロアルキル、アルケニル及びアルキニルを含む）、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル及びアリール（ヘテロアリール及びカルボアリールを含む）から選択される。これらの基は、場合により置換されていてもよい。アシル基は、適切な場合にはＬ３又はＬ２のアミノ基と一緒になって、アミド結合を形成し得る。アシル基は、適切な場合にはＬ３又はＬ２のヒドロキシ基と一緒になって、エステル結合を形成し得る。
【０４１１】
一実施形態において、Ｇ３はヘテロアルキルである。ヘテロアルキル基は、ポリエチレングリコールを含み得る。ヘテロアルキル基は、アシル基に隣接したヘテロ原子、例えばＯ又はＮを有し、それにより適切な場合にはカルバメート基又はカーボネート基を形成してもよく、適切な場合、ヘテロ原子は基Ｌ３又はＬ２に存在する。
【０４１２】
一実施形態において、Ｇ３は、ＮＨ２、ＮＨＲ及びＮＲＲ’から選択される。好ましくは、Ｇ３はＮＲＲ’である。
【０４１３】
一実施形態において、Ｇ２は基：
【化２８】
2018127469.tif 000030
であり、式中、アスタリスクはＬ３との結合点を示し、ｎは０〜６であり、及びＧ４は、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、及びハロから選択される。基ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２及びＮＨＲは保護されている。一実施形態において、ｎは１〜６であり、好ましくはｎは５である。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、及びＮＲＲ’である。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、及びＮＲＲ’である。好ましくはＧ４は、ＯＲ及びＮＲＲ’から選択され、最も好ましくはＧ４はＯＲである。最も好ましくはＧ４はＯＭｅである。
【０４１４】
一実施形態において、基Ｇ２は：
【化２９】
2018127469.tif 000031
であり、式中、アスタリスクはＬ３との結合点を示し、ｎ及びＧ４は上記に定義するとおりである。
【０４１５】
一実施形態において、基Ｇ２は：
【化３０】
2018127469.tif 000032
であり、式中、アスタリスクはＬ３との結合点を示し、ｎは０又は１であり、ｍは０〜５０であり、及びＧ４は、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、及びハロから選択される。好ましい実施形態において、ｎは１であり、及びｍは０〜１０、１〜２、好ましくは４〜８であり、最も好ましくは４又は８である。別の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１０〜５０、好ましくは２０〜４０である。基ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２及びＮＨＲは保護されている。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、及びＮＲＲ’である。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、及びＮＲＲ’である。好ましくはＧ４は、ＯＲ及びＮＲＲ’から選択され、最も好ましくはＧ４はＯＲである。好ましくはＧ４はＯＭｅである。
【０４１６】
一実施形態において、基Ｇ２は：
【化３１】
2018127469.tif 000033
であり、式中、アスタリスクはＬ３との結合点を示し、ｎ、ｍ及びＧ４は、上記に定義するとおりである。
【０４１７】
一実施形態において、基Ｇ２は：
【化３２】
2018127469.tif 000034
であり、式中、ｎは１〜２０であり、ｍは０〜６であり、Ｇ４は、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、及びハロから選択される。一実施形態において、ｎは１〜１０である。別の実施形態において、ｎは１０〜５０、好ましくは２０〜４０である。一実施形態において、ｎは１である。一実施形態において、ｍは１である。基ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２及びＮＨＲは保護されている。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、及びＮＲＲ’である。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、及びＮＲＲ’である。好ましくはＧ４は、ＯＲ及びＮＲＲ’から選択され、最も好ましくはＧ４はＯＲである。好ましくはＧ４はＯＭｅである。
【０４１８】
一実施形態において、基Ｇ２は：
【化３３】
2018127469.tif 000035
であり、式中、アスタリスクはＬ３との結合点を示し、ｎ、ｍ及びＧ４は、上記に定義するとおりである。
【０４１９】
上記の実施形態の各々において、Ｇ４は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２及びＮＨＲであってもよい。これらの基は、好ましくは保護されている。
【０４２０】
一実施形態において、ＯＨは、Ｂｚｌ、ＴＢＤＭＳ、又はＴＢＤＰＳで保護されている。
【０４２１】
一実施形態において、ＳＨは、Ａｃｍ、Ｂｚｌ、Ｂｚｌ−ＯＭｅ、Ｂｚｌ−Ｍｅ、又はＴｒｔで保護されている。
【０４２２】
一実施形態において、ＮＨ２又はＮＨＲは、Ｂｏｃ、Ｍｏｃ、Ｚ−Ｃｌ、Ｆｍｏｃ、Ｚ、又はＡｌｌｏｃで保護されている。
【０４２３】
一実施形態において、基Ｇ２は基Ｌ３との組み合わせで存在し、この基Ｌ３はジペプチドである。
【０４２４】
キャップ基は、モジュレーターとの連結用には意図されない。従って、二量体中に存在する他の単量体が、リンカーを介したモジュレーターとの連結点として働く。従って、キャップ基に存在する官能基は、モジュレーターとの反応には利用可能でないことが好ましい。従って、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨなどの反応性官能基は、好ましくは回避される。しかしながら、上記に記載したとおり保護される場合には、かかる官能基がキャップ基に存在してもよい。
【０４２５】
従って、本明細書の教示により、本発明の一実施形態は、以下の化合物を含むコンジュゲートを包含する。
【化３４】
2018127469.tif 000036
式中、ＣＢＡは細胞結合剤／モジュレーターであり、ｎは０又は１である。Ｌ１は前に定義したとおりであり、ＲＥ及びＲＥ”は、各々、Ｈ又はＲＤから独立して選択される。
【０４２６】
別の実施形態において、コンジュゲートは、以下の化合物を含む。
【化３５】
2018127469.tif 000037
式中、ＣＢＡは細胞結合剤／モジュレーターであり、Ｌ１は前に定義したとおりであり、Ａｒ１及びＡｒ２は、各々独立して、場合により置換されているＣ５〜２０アリールであり、ｎは０又は１である。
【０４２７】
当業者は、他の対称及び非対称ＰＢＤ二量体及びリンカーが本発明と適合性を有し、本明細書及び先行技術の教示に基づき必要以上に実験を行うことなく選択され得ることを理解する。
【０４２８】
本発明の別の態様は、放射性同位元素を含むＡＤＣを含む。かかる実施形態と適合性を有し得る例示的な放射性同位元素としては、限定はされないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、及び２１１Ａｔが挙げられる。他の放射性核種もまた、特にエネルギー範囲が６０〜４，０００ｋｅＶのものが、診断剤及び治療剤として利用可能である。治療される病態及び所望の治療プロファイルに応じて、当業者は、本開示のモジュレーターで使用する適切な放射性同位元素を容易に選択することができる。
【０４２９】
本発明のＳＥＺ６モジュレーターはまた、所与の生物学的反応を修飾する治療用部分又は薬物（例えば、生物学的反応修飾物質すなわちＢＲＭ）とコンジュゲートされてもよい。すなわち、本発明と適合性のある治療剤又は治療用部分は、古典的な化学治療剤に限定されるものと解釈されてはならない。例えば、特に好ましい実施形態では、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチド又はそれらの断片であってもよい。かかるタンパク質としては、例えば、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（又は別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第９７／３３８９９号パンフレットを参照）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号パンフレットを参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７）、及びＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号パンフレットを参照）、血栓症薬剤又は抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン；又は、生物学的反応修飾物質、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）など）、又は成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））が挙げられる。上記のとおり、モジュレーターとポリペプチド部分とを融合又はコンジュゲートする方法は、当該技術分野において公知である。これまでに開示した主題文献に加え、例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書；同第５，６２２，９２９号明細書；同第５，３５９，０４６号明細書；同第５，３４９，０５３号明細書；同第５，４４７，８５１号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書；欧州特許第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレット及び国際公開第９１／０６５７０号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４：５５９０；及びＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：１１３３７（この各々が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。さらに、上記のとおり、モジュレーターとかかる部分との会合は、必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して行われてもよい。これまでに言及したとおり、かかるリンカー分子は、当該技術分野において一般に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０：５５３；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２６：９４３；Ｇａｒｎｅｔｔ，２００２���Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５３：１７１（この各々は本明細書に援用される）に記載される。
【０４３０】
ＩＸ．診断法及びスクリーニング
Ａ．診断法
さらに他の実施形態において、本発明は、増殖性障害を検出、診断又はモニタリングするためのインビトロ又はインビボ方法、及び患者の細胞をスクリーニングしてＣＳＣを含む腫瘍原性細胞を同定する方法を提供する。かかる方法は、患者又は患者から採取した試料を（すなわちインビボ又はインビトロのいずれかで）本明細書に記載されるとおりのモジュレーターと接触させる工程、及び試料中の結合した又は遊離した標的分子に対するモジュレーターの会合の存在若しくは非存在、又は会合のレベルを検出する工程を含む、癌を有する個体を、治療のため同定する工程又は癌の進行をモニタリングする工程を含む。特に好ましい実施形態では、モジュレーターは、本明細書に記載されるとおりの検出可能標識又はレポーター分子を含む。
【０４３１】
一部の実施形態では、モジュレーター、例えば抗体の、試料中の特定の細胞との会合は、試料がＣＳＣを含み得ることを恐らく表すため、それにより、癌を有する個体が本明細書に記載されるとおりのモジュレーターによって有効に治療され得ることが示される。本方法は、結合レベルを対照と比較する工程をさらに含み得る。逆に、モジュレーターがＦｃコンストラクトである場合、試料と接触させたときの結合特性を（直接的又は間接的に、インビボ又はインビトロで）利用及びモニタリングして所望の情報が提供され得る。
【０４３２】
例示的な適合性のあるアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、競合的結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、免疫ブロットアッセイ、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリーアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。適合性のあるインビボセラグノスティクス又は診断法には、当業者が知っているとおりの、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法（例えばＣＡＴスキャン）、陽電子断層撮影法（例えば、ＰＥＴスキャン）Ｘ線撮影、超音波等の当該技術分野で認められているイメージング又はモニタリング技法が含まれ得る。
【０４３３】
別の実施形態において、本発明は、癌の進行及び／又は病因をインビボで分析する方法を提供する。別の実施形態において、インビボでの癌の進行及び／又は病因の分析は、腫瘍進行の程度を決定することを含む。別の実施形態において、分析は腫瘍の同定を含む。別の実施形態において、腫瘍進行の分析は、原発腫瘍に対して実施される。別の実施形態において、分析は、当業者に公知のとおり癌のタイプに応じて経時的に実施される。別の実施形態において、原発腫瘍の細胞の転移から生じる二次性腫瘍のさらなる分析が、インビボで分析される。別の実施形態において、二次性腫瘍のサイズ及び形状が分析される。一部の実施形態では、さらなるエキソビボ分析が実施される。
【０４３４】
別の実施形態において、本発明は、細胞転移を決定する工程又は循環腫瘍細胞のレベルを検出及び定量化する工程を含む、癌の進行及び／又は病因をインビボで分析する方法を提供する。さらに別の実施形態において、細胞転移の分析は、原発腫瘍と不連続な部位における進行性の細胞成長を決定する工程を含む。別の実施形態において、細胞転移分析の部位には、新生物が広がる経路が含まれる。一部の実施形態では、細胞は、血管系、リンパ管、体腔内又はそれらの組み合わせを介して分散し得る。別の実施形態では、細胞転移分析は、細胞遊走、播種、血管外遊出、増殖又はそれらの組み合わせを考慮して実施される。
【０４３５】
従って、特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを使用して、患者試料（例えば、血漿又は血液）中のＳＥＺ６レベルが検出及び定量化されてもよく、次にはそれを使用して、増殖性障害を含むＳＥＺ６関連障害が検出、診断又はモニタリングされてもよい。関連する実施形態では、本発明のモジュレーターを使用して、循環腫瘍細胞がインビボ又はインビトロのいずれかで検出、モニタリング及び／又は定量化され得る（例えば、国際公開第２０１２／０１２８８０１号パンフレット（参照により本明細書に援用される）を参照）。さらに他の好ましい実施形態では、循環腫瘍細胞は癌幹細胞を含み得る。
【０４３６】
特定の例では、対象又は対象からの試料における腫瘍原性細胞を、治療又はレジメンに先立ち本開示のモジュレーターを使用して評価又は特徴付けすることにより、ベースラインを確立してもよい。他の例では、試料は、治療した対象に由来する。一部の例において、試料は、対象が治療を開始又は終了してから少なくとも約１日、２日、４日、６日、７日、８日、１０日、１２日、１４日、１５日、１６日、１８日、２０日、３０日、６０日、９０日、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、又は＞１２ヶ月後に対象から採取される。特定の例では、腫瘍原性細胞は、一定数の用量（例えば、ある治療の２、５、１０、２０、３０用量又はそれ以上）の後に評価又は特徴付けされる。他の例では、腫瘍原性細胞は、１つ以上の治療を受けた後、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、１年、２年、３年、４年又はそれ以上経た後に特徴付け又は評価される。
【０４３７】
別の態様において、及び以下でさらに詳細に考察するとおり、本発明は、過剰増殖性障害を検出する、モニタリングする若しくは診断するための、可能な治療のため、かかる障害を有する個体を同定するための、或いは、患者における該障害の進行（又は退行）をモニタリングするためのキットを提供し、ここでキットは、本明細書に記載されるとおりのモジュレーターと、試料に対するモジュレーターの影響を検出するための試薬とを含む。
【０４３８】
本発明のさらに別の態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）用に標識されたＳＥＺ６の使用を含む。この点において、ＳＥＺ６  ＩＨＣを診断ツールとして使用して、様々な増殖性障害の診断を支援し、且つＳＥＺ６モジュレーター療法を含む治療に対する潜在的な応答をモニタリングし得る。適合性のある診断アッセイは、化学的に固定され（限定はされないが：ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化水銀、四酸化クロム及びピクリン酸を含む）、且つ包埋されているか（限定はされないが：メタクリル酸グリコール、パラフィン及び樹脂を含む）又は凍結保存されている組織に対して実施され得る。以下でさらに詳細に考察するとおり、かかるアッセイを用いることにより治療判断を誘導し、投与レジメン及びタイミングを決定することができる。
【０４３９】
Ｂ．スクリーニング
特定の実施形態では、モジュレーターを使用して、抗原（例えば、その遺伝子型又は表現型成分）との相互作用により腫瘍原性細胞又はその子孫の機能又は活性を改変する化合物又は作用物質（例えば薬物）をスクリーニング又は同定することもできる。かかる化合物及び作用物質は、例えば、増殖性障害の治療についてスクリーニングされる薬物候補であり得る。一実施形態において、システム又は方法には、ＳＥＺ６を含む腫瘍原性細胞及び化合物又は作用物質（例えば薬物）が含まれ、ここで細胞と化合物又は作用物質とは互いに接触している。かかる実施形態において、対象細胞は本開示のモジュレーターを使用して同定、モニタリング及び／又は濃縮されたものであってもよい。
【０４４０】
さらに別の実施形態において、方法は、腫瘍原性細胞又はその子孫を検査薬又は化合物と直接的又は間接的に接触させる工程と、検査薬又は化合物が抗原関連腫瘍原性細胞の活性又は機能を調整するかどうかを決定する工程とを含む。直接的な相互作用の一例は物理的相互作用であり、一方、間接的な相互作用には、組成物による中間分子に対する作用と、次にはそれによる参照される実体（例えば、細胞又は細胞培養物）に対する作用が含まれる。調整され得る例示的な活性又は機能には、細胞形態又は生存率、マーカーの発現、分化又は脱分化、細胞呼吸、ミトコンドリア活性、膜の完全性、成熟、増殖、生存率、アポトーシス又は細胞死の変化が含まれる。
【０４４１】
作用物質及び化合物をスクリーニング及び同定する方法には、ハイスループットスクリーニングに好適なものが含まれ、これは、場合により所定の位置又はアドレスに位置決め又は配置された細胞アレイ（例えばマイクロアレイ）を含む。例えば、細胞は、培養皿、チューブ、フラスコ、ローラーボトル又はプレート（例えば、８、１６、３２、６４、９６、３８４及び１５３６マルチウェルプレート又はディッシュなどの単一のマルチウェルプレート又はディッシュ）に位置決め又は配置され（事前に播種され）てもよい。ハイスループットロボット式又は手動式ハンドリング方法により、短時間で化学的相互作用をプローブし、多数の遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナル（例えば、フルオロフォアによる）及び超高速で情報を処理する自動解析を利用する技術が開発されている（例えば、Ｐｉｎｈａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．７：１３３（２００４）を参照のこと）。例えば、マイクロアレイ技術は、数千個の遺伝子の相互作用を同時にプローブする一方で特定の遺伝子についての情報を提供するため、広範に用いられている（例えば、Ｍｏｃｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５９３：１９（２００７）を参照のこと）。
【０４４２】
スクリーニングされ得るライブラリには、例えば、小分子ライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、完全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリ（Ａｄｉｍａｂ，ＬＬＣ）、ｓｉＲＮＡライブラリ、及びアデノウイルストランスフェクションベクターが含まれる。
【０４４３】
Ｘ．医薬調製物及び治療的使用
Ａ．製剤化及び投与経路
本発明の組成物は、あらゆる任意選択のコンジュゲート、意図される送達方法、治療又はモニタリングされる疾患及び多数の他の変数と共に、モジュレーターの形態に応じて、当該技術分野で認められている技法を用いて所望のとおりに製剤化され得る。一部の実施形態では、本発明の治療組成物は、ニートで又は最小量の追加成分と共に投与されてもよく、一方、他では、場合により当該技術分野において周知の賦形剤及び助剤を含む好適な薬学的に許容可能な担体を含有するように製剤化されてもよい（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．（２００３）；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４）；Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。媒体、補助剤、及び希釈剤を含む様々な薬学的に許容可能な担体が、多数の商業的供給元から容易に入手可能である。さらに、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤などの、薬学的に許容可能な補助物質の組み合わせもまた利用可能である。特定の非限定的な例示的担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【０４４４】
より詳細には、一部の実施形態では、本発明の治療組成物がニートで又は最小量の追加成分と共に投与されてもよいことは理解される。逆に本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、場合により、当該技術分野において周知された賦形剤及び助剤であって、且つモジュレーターの投与を促進し又は作用部位への送達に薬学的に最適化された調製物となるよう活性化合物の加工を補助する比較的不活性な物質である賦形剤及び助剤を含む好適な薬学的に許容可能な担体を含有するように製剤化されてもよい。例えば、賦形剤は形態若しくは稠度を与えることができ、又は希釈剤として働いてモジュレーターの薬物動態又は安定性を向上させることができる。好適な賦形剤又は添加剤としては、限定はされないが、安定化剤、湿潤剤及び乳化剤、容量オスモル濃度を変化させる塩、封入剤、緩衝剤、及び皮膚浸透促進剤が挙げられる。特定の好ましい実施形態において、医薬組成物は凍結乾燥形態で提供され、投与前に、例えば緩衝食塩水中に再構成されてもよい。
【０４４５】
本開示の全身投与用モジュレーターは、腸内投与、非経口投与又は局所投与用に製剤化され得る。代わりに、３種類全ての製剤化を同時に用いて、活性成分の全身投与を達成してもよい。非経口の及び非経口的でない薬物送達用の賦形剤並びに製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に説明される。非経口投与に好適な製剤は、水溶性形態の活性化合物、例えば水溶性塩の水溶液を含む。加えて、油性注射懸濁液に適したものとしての活性化合物の懸濁液が投与され得る。好適な脂溶性溶媒又は媒体としては、脂肪油、例えば、ヘキシル置換ポリ（ラクチド）、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリドが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質であって、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランが含まれる物質を含有し得る。場合により、懸濁液は安定剤も含有し得る。リポソームもまた、細胞への送達のための薬剤の封入に用いられ得る。
【０４４６】
腸内投与に好適な製剤としては、硬ゼラチン又は軟ゼラチンカプセル、丸薬、コーティング錠を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ又は吸入剤及びこれらの徐放形態が挙げられる。
【０４４７】
一般に、ＳＥＺ６モジュレーターを含む本発明の化合物及び組成物は、様々な経路によって、例えば限定はされないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、及び髄腔内に、又は他の形での植込み又は吸入により、それを必要とする対象にインビボで投与され得る。本組成物は、限定はされないが、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐薬、浣腸、注射剤、吸入剤、及びエアロゾルを含めた、固体、半固体、液体、又は気体の形態の調製物に製剤化され得る。適切な製剤及び投与経路は、意図される適用及び治療レジメンに従い選択され得る。
【０４４８】
Ｂ．投薬量
同様に、詳細な投薬量レジメン、すなわち、用量、タイミング及び反復は、個々の個体及び当該個体の病歴、並びに経験的な考慮事項、例えば薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度等）に依存する。投与の頻度は、治療の過程にわたって決定及び調整されてもよく、増殖性細胞又は腫瘍原性細胞の数を減少させること、かかる新生物性細胞の減少を維持すること、新生物性細胞の増殖を低減すること、又は転移の発生を遅延させることに基づく。他の実施形態では、投与される投薬量を調整又は減弱して、潜在的な副作用及び／又は毒性が管理され得る。或いは、本治療組成物の持続的連続放出性製剤が適切であり得る。
【０４４９】
一般に、本発明のモジュレーターは様々な範囲で投与され得る。これらには、約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／用量；約５０μｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／用量；約１００μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／用量が含まれる。他の範囲には、約１００μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／用量及び約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／用量が含まれる。特定の実施形態では、投薬量は少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０４５０】
選択された実施形態において、モジュレーターは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００μｇ／ｋｇ体重／用量で投与される。他の実施形態は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００又は９００μｇ／ｋｇ体重／用量でのモジュレーターの投与を含む。他の好ましい実施形態では、本開示のモジュレーターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態において、モジュレーターは、１２、１４、１６、１８又は２０ｍｇ／ｋｇ体重／用量で投与され得る。さらに他の実施形態より、モジュレーターは、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇ体重／用量で投与され得る。本明細書の教示において、上記の投薬量は、非コンジュゲート型モジュレーター及び細胞傷害剤とコンジュゲートされたモジュレーターの両方に適用可能であることは理解される。当業者であれば、様々なコンジュゲート型及び非コンジュゲート型モジュレーターについて、前臨床動物試験、臨床所見並びに標準的な医学的及び生化学的技法及び計測に基づき、適切な投薬量を容易に決定することができる。
【０４５１】
コンジュゲート型モジュレーターに関して、特に好ましい実施形態は約５０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／用量の投薬量を含む。これに関して、コンジュゲート型モジュレーターは、５０、７５又は１００μｇ／ｋｇで、又は０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１ｍｇ／ｋｇ体重／用量で投与され得る。他の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲート型モジュレーターは、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５又は５ｍｇ／ｋｇ体重／用量で投与され得る。特に好ましい実施形態では、かかるコンジュゲート型モジュレーターの投薬量は、ある期間にわたって静脈内投与される。さらに、かかる投薬量は定義された治療過程にわたり複数回投与されてもよい。
【０４５２】
他の投与レジメンは、米国特許第７，７４４，８７７号明細書に開示されるとおりの体表面積（ＢＳＡ）の計算に基づき得る。周知のとおり、ＢＳＡは、患者の身長及び体重を使用して計算され、その体の表面積によって表される対象の大きさの尺度を提供する。特定の実施形態では、モジュレーターは投薬量１０ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２で、及び１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２又は４５０ｍｇ／ｍ２の投薬量で投与されてもよい。
【０４５３】
また、当該技術分野で認められている経験的な技法を用いてコンジュゲート型モジュレーター（すなわち、ＡＤＣ）の適切な投薬量を決定し得ることも理解される。
【０４５４】
いずれの場合も、ＳＥＺ６モジュレーターは（コンジュゲート型及び非コンジュゲート型の両方とも）、好ましくは必要に応じてそれを必要とする対象に投与される。投与頻度の決定は、治療する病態、治療する対象の年齢、治療する病態の重症度、治療する対象の全般的健康状態などの考慮に基づき、主治医などの当業者によって行われ得る。概して、ＳＥＺ６モジュレーターの有効用量が、１回以上対象に投与される。より詳細には、モジュレーターの有効用量が、月１回、月１回超、又は月１回未満対象に投与される。特定の実施形態では、ＳＥＺ６モジュレーターの有効用量が、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、又は数年間を含め、複数回投与され得る。さらに他の実施形態において、本開示のモジュレーターの投与間に数日（２、３、４、５、６又は７日）、数週（１、２、３、４、５、６、７又は８週）又は数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７又は８ヶ月）又はさらには１年若しくは数年が経過してもよい。
【０４５５】
特定の好ましい実施形態において、コンジュゲート型モジュレーターを含む治療過程には、数週間又は数ヶ月にわたる選択された薬物製品（すなわち、ＡＤＣ）の複数用量が含まれる。より具体的には、本発明のコンジュゲート型モジュレーターは、１日毎、２日毎、４日毎、毎週、１０日毎、２週間毎、３週間毎、毎月、６週間毎、２ヶ月毎、１０週間毎又は３ヶ月毎に１回投与されてもよい。これに関して、患者の反応及び診療に基づき投薬量を変化させてもよく、又は間隔を調整してもよいことは理解される。
【０４５６】
投薬量及びレジメンはまた、本開示の治療組成物について、１回以上の投与を受けたことがある個体において経験的に決定されてもよい。例えば、個体は、本明細書に記載されるとおり生成された治療組成物の漸増投薬量を受けてもよい。選択された実施形態において、投薬量は、それぞれ経験的に決定されるか又は観察された副作用若しくは毒性に基づき、徐々に増加又は減少若しくは減弱され得る。選択された組成物の有効性を評価するには、特定の疾患、障害又は病態のマーカーを上記のとおり追跡することができる。個体が癌を有する実施形態において、マーカーとしては、触診又は視診による腫瘍サイズの直接的な計測、Ｘ線又は他のイメージング技術による腫瘍サイズの間接的な計測；直接の腫瘍生検及び腫瘍試料の顕微鏡検査により評価するときの改善；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺癌についてのＰＳＡ）又は本明細書に記載される方法により同定される抗原の計測、疼痛又は完全麻痺の低下；腫瘍に関連する発話、視覚、呼吸又は他の能力障害の改善；食欲亢進；又は認められているテストにより計測するときのクオリティ・オブ・ライフの増加又は生存の延長が挙げられる。当業者には、個体、新生物性病態の種類、新生物性病態の病期、新生物性病態が個体の他の部位に転移し始めているかどうか、並びに用いられる過去及び現在の治療に応じて投薬量が異なることは明らかである。
【０４５７】
Ｃ．併用療法
併用療法は、望ましくない新生物性細胞増殖の低下又は阻害、癌の発生の低下、癌の再発の低下又は予防、又は癌の伝播又は転移の低下又は予防において特に有用であり得る。そのような場合、本発明のモジュレーターは、本来であれば腫瘍塊を支持して不滅にするＣＳＣを除去することにより増感剤又は化学増感剤として機能し、それにより現在の標準治療デバルキング剤又は抗癌剤のより有効な使用を可能にし得る。すなわち、本開示のモジュレーターは、特定の実施形態では、別の投与治療剤の作用様式を強化する増強効果（例えば、相加的又は相乗的な性質の）を提供し得る。本発明の文脈では「併用療法」は、広義に解釈されるものとし、単に、特異的な手法及び非特異的な手法の両方を含め、モジュレーターと、限定はされないが、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、デバルキング剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線療法剤、標的抗癌剤（モノクローナル抗体及び小分子実体の両方を含む）、ＢＲＭ、治療用抗体、癌ワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法及び抗転移剤及び免疫療法剤を含む１つ以上の抗癌剤との投与を指すに過ぎない。
【０４５８】
併用の結果が、各治療（例えば、抗体及び抗癌剤）が別々に行われたときに観察される効果を足し合わせたものである必要はない。少なくとも相加効果が概して望ましいが、単一の治療のうちの一つを上回る任意の抗腫瘍効果の増加が有益である。さらに、本発明において併用治療が相乗効果を呈する必要はない。しかしながら、当業者は、好ましい実施形態をなす特定の選択された組み合わせでは、相乗作用が観察され得ることを理解する。
【０４５９】
併用療法の実施において、モジュレーターと抗癌剤とは、単一の組成物で、又は２つ以上の個別の組成物として、同じ投与経路か、或いは異なる投与経路を使用して、同時に対象に投与され得る。或いはモジュレーターは、例えば数分から数週間の範囲の間隔だけ抗癌剤治療に先行し、又は後続してもよい。各送達の間の期間は、抗癌剤及びモジュレーターが腫瘍に複合効果を及ぼすことができるような期間である。少なくとも１つの実施形態において、抗癌剤及びモジュレーターの両方が、互いから約５分〜約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態において、モジュレーター及び抗癌剤の投与間に数日（２、３、４、５、６又は７日）、数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８週間）又は数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７又は８ヶ月）が経過し得る。
【０４６０】
併用療法は、１回、２回又は少なくとも病態が治療され、緩和され又は治癒されるまでのある期間にわたり投与され得る。一部の実施形態では、併用療法は、複数回、例えば毎日３回から６ヶ月に１回投与される。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、２日に１回、３日に１回、週１回、２週間に１回、月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回などのスケジュールであってもよく、又はミニポンプによって連続投与されてもよい。併用療法は、上で指摘したとおり、任意の経路で投与されてよい。併用療法は、腫瘍部位から離れた部位に投与されてもよい。
【０４６１】
一実施形態において、モジュレーターは、１つ以上の抗癌剤と組み合わせて短い治療周期でそれを必要とする対象に投与される。本発明はまた、数回の部分的な投与に分割された不連続な投与又は１日用量も企図する。モジュレーター及び抗癌剤は、交換可能に、隔日又は隔週で投与されてもよく；又は一連の抗体治療が与えられた後、続いて抗癌剤療法の１つ以上の治療が与えられてもよい。いずれの場合も、当業者により理解されるとおり、化学療法剤の適切な用量は、概して、化学療法薬が単独で、又は他の化学療法薬との組み合わせで投与される臨床治療で既に用いられている用量程度である。
【０４６２】
別の好ましい実施形態において、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは維持療法で用いられ、疾患が最初に発現した後の腫瘍再発の可能性を低減又は除去し得る。好ましくは障害は治療されて初期腫瘍塊が除去、低減又は他の形で改善されており、従って患者は無症候であり、又は寛解期にある。そのようなときに対象は、標準的な診断手法を用いて疾患の徴候がほとんど又は全くないとしても、本開示のモジュレーターの薬学的に有効な量を１回以上投与される。一部の実施形態では、モジュレーターは、毎週、２週間毎、毎月、６週間毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎又は毎年など、ある期間にわたって定期的に投与され得る。本明細書の教示を考慮して、当業者は、疾患再発の可能性を低減する好ましい投薬量及び投与レジメンを容易に決定することができる。さらに、かかる治療は、患者の反応並びに臨床及び診断パラメータに応じて数週間、数ヶ月間、数年間又はさらには無期限に継続され得る。
【０４６３】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明のモジュレーターを予防的に又は補助療法として使用して、デバルキング手技後の腫瘍転移の可能性を予防又は低減し得る。本開示で使用されるとき、「デバルキング手技」は広義に定義され、腫瘍又は腫瘍増殖を除去し、低減し、治療し又は改善する任意の手技、技法又は方法を意味するものとする。例示的なデバルキング手技としては、限定はされないが、外科手術、放射線治療（すなわち、ビーム放射）、化学療法、免疫療法又はアブレーションが挙げられる。当業者により本開示に鑑みて容易に決定される適切な時点で、腫瘍転移が低減するように臨床手技、診断手技又はセラグノーシス手技により示唆されるとおり本開示のモジュレーターが投与され得る。モジュレーターは、標準的な技法を用いて決定されるとおり薬学的に有効な投薬量で１回以上投与されてもよい。好ましくは、投与レジメンは、その修正を可能にする適切な診断法又はモニタリング法によって達成される。
【０４６４】
本発明のさらに他の実施形態は、無症候であるが増殖性障害の発症リスクを有する対象に本開示のモジュレーターを投与する工程を含む。すなわち、本発明のモジュレーターは、全く予防的な意味で使用され、検査又は試験を受けた患者であって、１つ以上の顕著なリスク要因（例えば、ゲノム徴候、家族歴、インビボ又はインビトロ試験結果等）を有するが、新形成は生じていない患者に投与され得る。そのような場合、当業者は、経験的な観察により、又は認められている臨床診療を通じて、有効な投与レジメンを決定することが可能である。
【０４６５】
Ｄ．抗癌剤
用語「抗癌剤」又は「抗増殖剤」は、癌などの細胞増殖性障害の治療に使用することができ、且つ、限定はされないが、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、デバルキング剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線療法剤、標的抗癌剤、ＢＲＭ、治療用抗体、癌ワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法及び抗転移剤及び免疫療法剤を含む任意の薬剤を意味する。上記に考察したとおり選択された実施形態において、かかる抗癌剤はコンジュゲートを含んでもよく、投与前にモジュレーターと会合され得ることは理解される。特定の実施形態では、本開示の抗癌剤はＳＥＺ６モジュレーターに連結され、本明細書に示されるとおりのＡＤＣを提供する。
【０４６６】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞傷害剤」は、細胞にとって毒性であり、細胞の機能を低下させ又は阻害し及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。典型的には、この物質は、生体に由来する天然に存在する分子である。細胞傷害剤の例としては、限定はされないが、細菌の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素（例えば、ジフテリア毒素（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）、緑膿菌内毒素及び外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌性（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスクミン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害因子、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害因子、ゲロニン、ミテゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ））又は動物（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば細胞外膵臓ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、例えばその断片及び／又は変異体を含む）が挙げられる。
【０４６７】
本発明の目的上「化学療法剤」は、癌細胞の成長、増殖、及び／又は生存を非特異的に低下させ又は阻害する化学的な化合物（例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤）を含む。かかる化学剤は、多くの場合に細胞成長又は分裂に必要な細胞内過程を標的とし、従って概して急速に成長及び分裂する癌性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは微小管を解重合させ、ひいては細胞が有糸分裂に入るのを阻害する。一般に、化学療法剤には、癌性細胞又は癌性になる若しくは腫瘍原性の子孫（例えば、ＴＩＣ）を生じる可能性のある細胞を阻害し、又は阻害するように設計されている任意の化学剤が含まれ得る。かかる薬剤は、組み合わせで、例えばＣＨＯＰ又はＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンで投与されることが多く、且つ最も有効であることが多い。この場合も同じく、選択された実施形態において、かかる化学療法剤は本開示のモジュレーターとコンジュゲートされ得る。
【０４６８】
本発明のモジュレーターと組み合わせて使用され得る（又はそれとコンジュゲートされ得る）抗癌剤の例としては、限定はされないが、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）、パンクラチスタチン、サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝物、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ，ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎薬、葉酸補充剤、例えばフォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃ���ｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を低減するＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ−Ａの阻害薬並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が挙げられる。また、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬（これは副腎におけるエストロゲン産生を調節する）、及び抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害薬及びＨＥＲ２発現阻害薬；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害薬；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体などの、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害する働きをする抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。
【０４６９】
他の実施形態において、本発明のモジュレーターは、現在臨床試験中であるか又は市販されている数多くの抗体（又は免疫療法剤）のうちのいずれか一つと組み合わせて使用されてもよい。この目的から、本開示のモジュレーターは、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、ドゥリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、ドゥシギツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムガツズマブ、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タカツズマブ、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用されてもよい。
【０４７０】
さらに他の特に好ましい実施形態は、限定はされないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｃｉｎ）、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブベドチンを含む、癌療法に承認されている抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示と適合性があるさらなる抗癌剤を容易に特定することができる。
【０４７１】
Ｅ．放射線療法
本発明はまた、モジュレーターと放射線療法（すなわち、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、紫外線照射、マイクロ波、電子放射などの、腫瘍細胞内で限局的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構）との併用も提供する。放射性同位元素を腫瘍細胞に指向性送達することを用いた併用療法もまた企図され、標的抗癌剤又は他の標的化手段と連係して用いられ得る。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週間の期間にわたってパルス投与される。放射線療法は、約６〜７週間にわたり頭頸部癌を有する対象に投与されてもよい。場合により、放射線療法は、単一用量として、又は複数回の逐次用量として投与されてもよい。
【０４７２】
ＸＩ．適応症
本発明のモジュレーターを使用して任意のＳＥＺ６関連障害の発生又は再発を診断、治療又は阻害し得ることは理解される。従って、単独で投与されるにしろ、又は抗癌剤若しくは放射線療法と組み合わせて投与されるにしろ、本発明のモジュレーターは、概して、良性又は悪性腫瘍（例えば、副腎癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌及び子宮癌；肉腫；膠芽腫；及び様々な頭頸部腫瘍）；白血病及びリンパ性悪性腫瘍；他の障害、例えばニューロン、グリア、アストロサイト、視床下部並びに他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の障害；及び炎症性、血管新生、免疫性の障害並びに病原体により引き起こされる障害を含み得る患者又は対象における新生物性病態の治療に特に有用である。特に、治療の主要な標的は、固形腫瘍を含む新生物性病態であるが、血液系悪性腫瘍は本発明の範囲内である。好ましくは、治療される「対象」又は「患者」はヒトであるが、しかしながら本明細書で使用されるとき、これらの用語は明示的に任意の哺乳類種を含むものと考えられる。
【０４７３】
より具体的には、本発明に従う治療に供される新生物性病態は、限定はされないが、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連癌、胞巣状軟部肉腫、星細胞性腫瘍、膀胱癌（扁平上皮癌及び移行上皮癌）、骨癌（アダマンチノーマ、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳脊髄癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頸動脈球腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨線維形成不全（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成、胆嚢癌及び胆管癌、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頸部癌、膵島細胞腫、カポジ肉腫、腎癌（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝癌（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺癌（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌等）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵癌、甲状腺乳頭癌、上皮小体腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、後部ブドウ膜悪性黒色腫（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｕｎｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、まれな血液障害、腎転移癌、桿状腫瘍、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌、及び子宮癌（子宮頸癌、子宮内膜癌、及び平滑筋腫）を含む群から選択され得る。
【０４７４】
特定の好ましい実施形態において、増殖性障害は、限定はされないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞及び非小細胞の両方）、甲状腺、癌腫、肉腫、膠芽腫及び様々な頭頸部腫瘍が含まれる固形腫瘍を含み得る。他の好ましい実施形態では、及び以下の実施例に示すとおり、本開示のモジュレーターは、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮非小細胞肺癌又は扁平上皮小細胞肺癌）の治療において特に有効である。一実施形態において、肺癌は、白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トポテカン）及び／又はタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル又はカバジタキセル）に対して不応性、再発性又は抵抗性である。さらに、特に好ましい実施形態では、本開示のモジュレーターは、小細胞肺癌の治療のためコンジュゲートされた形態で使用され得る。
【０４７５】
小細胞肺癌に関して、特に好ましい実施形態は、コンジュゲート型モジュレーター（ＡＤＣ）の投与を含む。選択された実施形態において、コンジュゲート型モジュレーターは、限局期疾患を呈する患者に投与される。他の実施形態において、本開示のモジュレーターは、進展期疾患を呈する患者に投与される。他の好ましい実施形態では、本開示のコンジュゲート型モジュレーターは不応性の患者（すなわち、初期治療コースの最中又はその完了直後に再発する患者）に投与される。さらに他の実施形態は、感受性の患者（すなわち、一次療法後のその再燃が２〜３ヶ月より長い患者）に対する本開示のモジュレーターの投与を含む。いずれの場合も、適合性のあるモジュレーターが、選択された投与レジメン及び臨床診断に応じてコンジュゲート形態であっても、又は非コンジュゲート形態であってもよいことは理解される。
【０４７６】
上記に考察したとおり、本開示のモジュレーターはさらに、神経内分泌腫瘍を含めた神経内分泌特徴又は表現型を有する腫瘍の予防、治療又は診断に用いられ得る。散在内分泌系から生じる真正な又はカノニカルな神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、比較的まれであり、１０万人に２〜５人の発生率であるが、極めて侵襲的である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、及び子宮内膜）、胃腸管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様癌）、及び肺（小細胞肺癌及び大細胞神経内分泌癌）に起こる。これらの腫瘍は、カルチノイド症候群として知られる衰弱性の症状を引き起こし得るセロトニン及び／又はクロモグラニンＡを含む数種のホルモンを分泌し得る。かかる腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、γエノラーゼとしても知られる、遺伝子記号＝ＥＮＯ２）、ＣＤ５６（又はＮＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、及びシナプトフィジン（ＳＹＰ）などの陽性の免疫組織化学的マーカーによるか、又はＡＳＣＬ１などの発現上昇を呈することが知られる遺伝子により示され得る。残念ながら、ＮＥＴの治療において伝統的な化学療法が特に有効であったことはなく、肝転移が一般的な予後である。
【０４７７】
本開示のモジュレーターは有利には神経内分泌腫瘍の治療に用いられ得るが、また、遺伝子型又は表現型についてカノニカルな神経内分泌腫瘍と共通の性質を模倣する、それと似ている、又はそれを呈する偽神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）の治療、予防又は診断にも用いられ得る。偽神経内分泌腫瘍又は神経内分泌特徴を有する腫瘍は、散在神経内分泌系の細胞又は発癌過程の中で神経内分泌分化のカスケードが異常に再活性化された細胞から生じる腫瘍である。かかるｐＮＥＴは、一般に、一部の生理活性アミン、神経伝達物質、及びペプチドホルモンの産生能を含め、特定の表現型特性又は生化学的特性を、伝統的に定義された神経内分泌腫瘍と共有する。組織学的に、かかる腫瘍（ＮＥＴ及びｐＮＥＴ）は、多くの場合に特徴のない細胞病理の細胞質が最小限しかなく、且つ円形乃至卵形の点状の核を有する密に結合した小細胞を示すという共通の外観を持つ。本発明の目的上、神経内分泌腫瘍及び偽神経内分泌腫瘍を定義するために用いられ得る共通して発現する組織学的マーカー又は遺伝子マーカーとしては、限定はされないが、クロモグラニンＡ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、ＰＧＰ９．５、ＡＳＣＬ１及びニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）が挙げられる。
【０４７８】
従って、本発明のモジュレーターを使用して、有利には、偽神経内分泌腫瘍及びカノニカルな神経内分泌腫瘍の両方を治療し得る。これに関して、モジュレーターを本明細書に記載されるとおり使用することにより、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、及び子宮内膜）、胃腸管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様癌）、及び肺（小細胞肺癌及び大細胞神経内分泌癌）で生じる神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ及びｐＮＥＴの両方）を治療し得る。さらに、本発明のモジュレーターを使用して、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、クロモグラニンＡ、ＡＳＣＬ１及びＰＧＰ９．５（ＵＣＨＬ１）からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する腫瘍を治療し得る。すなわち、本発明を用いることにより、ＮＳＥ＋又はＣＤ５６＋又はＰＧＰ９．５＋又はＡＳＣＬ１＋又はＳＹＰ＋又はＣＨＧＡ＋又はそれらの何らかの組み合わせである腫瘍に罹患している対象を治療し得る。
【０４７９】
血液系悪性腫瘍に関して、さらに、本発明の化合物及び方法が、低悪性度／ＮＨＬ濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非切れ込み細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ｌｙｍｐｈｏａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）、小リンパ球性、濾胞性、びまん性大細胞、びまん性小切れ込み細胞型、大細胞型免疫芽球性リンパ芽球腫、小型、非切れ込み、バーキット及び非バーキット、濾胞性、主に大型の細胞；濾胞性の、主に小切れ込み細胞；及び濾胞性、混合型小切れ込み細胞及び大細胞リンパ腫を含む様々なＢ細胞リンパ腫の治療において特に有効であり得ることが理解される。Ｇａｉｄｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ”，ＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＆  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２：２１３１−２１４５（ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．１９９７）を参照のこと。当業者には、これらのリンパ腫が多くの場合に分類方式の変更に起因して異なる名称を有すること、及び別の名称に分類されるリンパ腫の患者も、本発明の併用治療レジメンの利益を受け得ることが明らかでなければならない。
【０４８０】
本発明はまた、良性腫瘍又は前癌腫瘍を呈する対象の予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）又は予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）な治療も提供する。ＳＥＺ６関連障害であることの他には、いかなる特定のタイプの腫瘍又は増殖性障害も、本発明を使用する治療から除外されてはならないと考えられる。しかしながら、腫瘍細胞のタイプは、本発明と二次治療剤、特に化学療法剤及び標的抗癌剤との併用に関係したものであり得る。
【０４８１】
ＸＩＩ．製品
ＳＥＺ６モジュレーターの１つ以上の用量が入った１つ以上の容器を含む医薬品パック及びキットもまた提供される。特定の実施形態では、単位投薬量が提供され、ここで単位投薬量は、例えば抗ＳＥＺ６抗体を含む所定量の組成物を、１つ以上のさらなる薬剤を伴い又は伴わずに含有する。他の実施形態に関して、かかる単位投薬量は、注射用の使い捨てプレフィルドシリンジに供給される。さらに他の実施形態において、単位投薬量中に含まれる組成物は、食塩水、ショ糖など；バッファ、例えばリン酸塩などを含み得るか；及び／又は安定且つ有効なｐＨ範囲内に製剤化され得る。或いは、特定の実施形態では、組成物は凍結乾燥粉末として提供されてもよく、これは、適切な液体、例えば滅菌水を加えると再構成され得る。特定の好ましい実施形態において、組成物は、限定はされないが、ショ糖及びアルギニンを含めた、タンパク質凝集を抑える１つ以上の物質を含む。容器（複数可）上の、又は容器（複数可）と関連付けられた任意のラベルに、封入されている組成物が選択の疾患病態の診断又は治療に使用されることが指示される。
【０４８２】
本発明はまた、ＳＥＺ６モジュレーター、及び場合により１つ以上の抗癌剤の単回用量又は複数回用量投与単位を作成するためのキットも提供する。このキットは、容器、及び容器上の、又は容器と関連付けられたラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料で形成されてもよく、コンジュゲート形態又は非コンジュゲート形態の本開示のモジュレーターの薬学的に有効な量を収容する。他の好ましい実施形態では、容器（複数可）は、無菌アクセスポートを含む（例えば容器は、静脈内注射液バッグ又は皮下注射針で穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）。かかるキットは、概して、好適な容器の中にＳＥＺ６モジュレーターの薬学的に許容可能な製剤を含み、及び場合により、同じ又は異なる容器内の１つ以上の抗癌剤を含む。キットはまた、診断用の、或いは併用療法用の、他の薬学的に許容可能な製剤を含んでもよい。例えば、本発明のＳＥＺ６モジュレーターに加えて、かかるキットは、化学療法薬又は放射線療法薬；抗血管新生剤；抗転移剤；標的抗癌剤；細胞傷害剤；及び／又は他の抗癌剤などの種々の抗癌剤のうち任意の１つ以上を含み得る。かかるキットはまた、ＳＥＺ６モジュレーターを抗癌剤又は診断用薬剤とコンジュゲートするための適切な試薬も提供し得る（例えば、米国特許第７，４２２，７３９号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０４８３】
より具体的には、キットは、ＳＥＺ６モジュレーターを、さらなる成分を伴い又は伴わずに収容する単一の容器を有してもよく、又はキットは、所望の薬剤各々につき個別の容器を有してもよい。コンジュゲーション用に組み合わされた療法薬が提供される場合、モル等価の組み合わせで、或いは一方の成分を他方より過剰として、単一の溶液が予め混合されていてもよい。或いは、キットのＳＥＺ６モジュレーターといずれかの任意選択の抗癌剤とは、患者に投与するまで個別の容器内に別々に維持されてもよい。キットはまた、無菌の薬学的に許容可能なバッファ又は他の希釈剤、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液及びデキストロース溶液が入った第２／第３の収容手段も含み得る。
【０４８４】
キットの成分が１つ以上の溶液中に提供される場合、その溶液は好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。しかしながら、キットの成分は乾燥粉末（複数可）として提供されてもよい。試薬又は成分が乾燥粉末として提供される場合、その粉末は、好適な溶媒を加えることにより再構成することができる。その溶媒もまた別の容器に提供され得ることが想定される。
【０４８５】
上記に簡潔に指摘したとおり、キットはまた、動物又は患者に抗体及びいずれかの任意選択の成分を投与するための手段、例えば１本以上の針又はシリンジ、又はさらには点眼器、ピペット、又は他のそのような類似の、製剤を動物に注入若しくは導入し得るか又は体の患部に適用し得る器具も含み得る。本発明のキットはまた、典型的には、バイアルなど、及び他の構成要素を市販用に厳重に封じ込めて収容するための手段、例えば、望ましいバイアル及び他の器具が配置及び保持される射出成型又はブロー成形プラスチック容器なども含む。任意のラベル又は添付文書に、ＳＥＺ６モジュレーター組成物が癌、例えば小細胞肺癌の治療に使用されることが指示される。
【０４８６】
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターは、増殖性障害の診断又は治療において有用な診断又は治療デバイスと共に使用され得るか、又はそれを含み得る。例えば、好ましい一（ｏｎ）実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、増殖性障害の病因又は発現に関わる細胞又はマーカー化合物の検出、モニタリング、定量化又はプロファイリングに用いられ得る特定の診断デバイス又は機器と組み合わされ得る。選択された実施形態について、マーカー化合物には、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、クロモグラニンＡ、及びＰＧＰ９．５が含まれ得る。
【０４８７】
特に好ましい実施形態では、デバイスは、インビボ或いはインビトロでの循環腫瘍細胞の検出、モニタリング及び／又は定量化に用いられ得る（例えば、国際公開第２０１２／０１２８８０１号パンフレット（参照により本明細書に援用される）を参照）。さらに他の好ましい実施形態において、及び上記に考察したとおり、循環腫瘍細胞は癌幹細胞を含み得る。
【０４８８】
ＸＩＩＩ．研究試薬
本発明の他の好ましい実施形態はまた、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）又はレーザーによる区分などの方法による腫瘍開始細胞の集団又は亜集団の同定、モニタリング、単離、区分又は濃縮に有用な手段として、本開示のモジュレーターの特性も利用する。当業者は、癌幹細胞を含むＴＩＣの特徴付け及び操作のため、いくつかの適合性のある技法でモジュレーターを使用し得ることを理解する（例えば、米国特許出願第１２／６８６，３５９号明細書、同第１２／６６９，１３６号明細書及び同第１２／７５７，６４９号明細書（この各々が全体として参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０４８９】
ＸＩＶ．その他
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要でない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。より具体的には、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」との言及には複数のタンパク質が含まれ；「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」との言及には細胞の混合物が含まれるなどする。加えて、本明細書及び添付の特許請求の範囲に提供される範囲は、両方の端点及びそれらの端点間にある全ての点を含む。従って、２．０〜３．０の範囲には、２．０、３．０、及び２．０と３．０との間にある全ての点が含まれる。
【０４９０】
概して、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、及びそれらの技法は、当該技術分野で周知され、且つよく用いられるものである。本発明の方法及び技法は、概して、特に指示されない限り、当該技術分野において周知の、且つ本明細書全体を通じて引用及び考察される様々な一般的な及びより専門的な文献に記載されるとおりの従来方法に従い実施される。例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２０１０）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照のこと。酵素反応及び精製技法は、製造者の仕様に従い、当該技術分野で一般に達成されるとおり、又は本明細書に記載されるとおり実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び薬化学との関連で使用される命名法、並びにそれらの実験手順及び技術は、当該技術分野で周知され、よく用いられるものである。さらに、本明細書で使用される任意の節見出しは、あくまでも編成のためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０４９１】
ＸＶ．ＳＥＺ６参考文献
本明細書の中で開示又は引用される参考文献又は資料は全て、限定なしに、全体として参照により本明細書に援用される。さらに、本明細書で使用される任意の節見出しはいずれも、あくまでも編成のためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０４９２】
１．  Ｂｏｒｋ  Ｐ，  Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｇ．  （１９９３）．  Ｔｈｅ  ＣＵＢ  ｄｏｍａｉｎ．  Ａ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｍｏｄｕｌｅ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２３１：５３９−４５．  ＰＭＩＤ：  ８５１０１６５．  
２．  Ｇａｌｌｕｚｚｏ  Ｐ，  ａｎｄ  Ｂｏｃｃｈｅｔｔａ  Ｍ  （２０１１）．  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  １１：５３３−４０．    ＰＭＩＤ：  ２１５０４３２０．
３．  Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｓｅｚ−６  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｒｂｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｐｙｒａｍｉｄａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ．  ５６：６２１−３９．  ＰＭＩＤ：  １８０３１６８１．
４．  Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  Ｓｅｉｚｕｒｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ６  （Ｓｅｚ−６）  ｉｎ  ａｍａｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｄｅｎｔ  ｒｅｔｉｎａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ４：ｅ６５４６．  ＰＭＩＤ：１９６６２０９６．
５．  Ｈｅｒｂｓｔ  Ｒ，  Ｎｉｃｋｌｉｎ  ＭＪ  （１９９７）．  ＳＥＺ−６：  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ４４：３０９−２２．  ＰＭＩＤ：  ９０７３１７３．
６．  Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ＤＳ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，  ｇｒａｄｉｎｇ，  ａｎｄ  ｓｔａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｐａｎｃｒｅａｓ．  ３９：７０７−１２．  ＰＭＩＤ：  ２０６６４４７０．
７．  Ｋｌｏｅｐｐｅｌ  Ｇ．  （２０１１）．  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．  １８  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１−１６．  ＰＭＩＤ：  ２２００５１１２．
８．  Ｍｕｌｌｅｙ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｅｉｚｕｒｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  ＳＥＺ６  ａｓ  ａ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｆｅｂｒｉｌｅ  Ｓｅｉｚｕｒｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．  ２０１１：９１７５６５．  ＰＭＩＤ：  ２１７８５７２５．
９．  Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＥＺ−６，  ａ  ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｅｉｚｕｒｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃＤＮＡ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２８：２０１−１０．  ＰＭＩＤ：  ７７２３６１９．
１０．  Ｙａｏ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｏｎｅ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  “ｃａｒｃｉｎｏｉｄ”：  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ３５，８２５  ｃａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２６：３０６３−７２．  ＰＭＩＤ：  １８５６５８９４．
１１．  Ｙｕ  ＺＬ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）．  Ｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｉｚｕｒｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  （ＳＥＺ）  ６，  ａ  ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．  ８５：１６６−７２．  ＰＭＩＤ：  １７０８６５４３．
【０４９３】
ＸＶＩ．本発明の選択された実施形態
本明細書における開示及び実施例に加えて、本発明は、以下に具体的に示す選択された実施形態に関する。
【０４９４】
推定クレーム：
１．単離ＳＥＺ６モジュレーター。
２．ＳＥＺ６モジュレーターがＳＥＺ６アンタゴニストを含む、請求項１に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
３．ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
４．抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項３に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
５．モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される、請求項４に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
６．前記モノクローナル抗体が中和抗体を含む、請求項４に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
７．前記モノクローナル抗体が枯渇抗体を含む、請求項４に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
８．前記モノクローナル抗体がインターナライズ抗体を含む、請求項４に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
９．前記モノクローナル抗体が細胞傷害剤をさらに含む、請求項８に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１０．前記モノクローナル抗体が、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、重鎖及び軽鎖相補性決定領域が、それぞれ図１０Ａ又は図１０Ｂに示される少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項４に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１１．前記モノクローナル抗体が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６及び配列番号１６８に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７及び配列番号１６９に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１２．請求項１１に示される重鎖又は軽鎖可変領域のうちのいずれか一つ由来のＣＤＲを含む単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１３．競合抗体を含む単離ＳＥＺ６モジュレーターであって、前記競合抗体が、請求項１０又は１１に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーターとＳＥＺ６との結合を少なくとも約４０％阻害する、単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１４．請求項１１に記載のアミノ酸重鎖可変領域又はアミノ酸軽鎖可変領域をコードする核酸。
１５．請求項１４に記載の核酸を含むベクター。
１６．配列番号３、配列番号４及びそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１７．ＳＥＺ６モジュレーターが、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分をさらに含む、請求項１６に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１８．前記モジュレーターが、それを必要とする対象に投与したとき腫瘍開始細胞の頻度を低減する、請求項１に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１９．頻度の低減が、腫瘍開始細胞で高濃度化することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を用いて決定される、請求項１８に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
２０．頻度の低減が、腫瘍開始細胞で高濃度化することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項１８に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
２１．前記腫瘍開始細胞が腫瘍不滅化細胞を含む、請求項１８に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
２２．細胞傷害剤をさらに含む、請求項１に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
２３．請求項１に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーターを含む医薬組成物。
２４．前記単離ＳＥＺ６モジュレーターがモノクローナル抗体を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
２５．前記モノクローナル抗体がヒト化抗体を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
２６．前記ヒト化抗体が細胞傷害剤を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
２７．前記細胞傷害剤がピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項２６に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
２８．前記細胞傷害剤がアウリスタチンを含む、請求項２６に記載の単離ＳＥＺ６モジュレーター。
２９．ＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、ＳＥＺ６関連障害の治療方法。
３０．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＳＥＺ６アンタゴニストを含む、請求項２９に記載の方法。
３１．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項２９に記載の方法。
３２．抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項３１に記載の方法。
３３．モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
３４．前記モノクローナル抗体が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６及び配列番号１６８に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７及び配列番号１６９に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の方法。
３５．前記モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項３４に記載の方法。
３６．前記モノクローナル抗体が中和抗体を含む、請求項３２に記載の方法。
３７．前記モノクローナル抗体がインターナライズ抗体を含む、請求項３２に記載の方法。
３８．前記インターナライズ抗体が細胞傷害剤を含む、請求項３７に記載の方法。
３９．前記細胞傷害剤がピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項３８に記載の方法。
４０．前記細胞傷害剤がアウリスタチンを含む、請求項３８に記載の方法。
４１．前記ＳＥＺ６関連障害が新生物性障害を含む、請求項３９に記載の方法。
４２．前記新生物性障害が、神経内分泌特徴を呈する腫瘍を含む、請求項４１に記載の方法。
４３．神経内分泌特徴を呈する前記腫瘍が、神経内分泌腫瘍を含む、請求項４２に記載の方法。
４４．対象が、副腎癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、胃癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選択される新生物性障害に罹患している、請求項４１に記載の方法。
４５．対象が肺癌に罹患している、請求項４４に記載の方法。
４６．対象が小細胞肺癌に罹患している、請求項４５に記載の方法。
４７．前記新生物性障害に罹患している対象が、腫瘍開始細胞を含む腫瘍を呈する、請求項４１に記載の方法。
４８．前記対象における腫瘍開始細胞の頻度を低減する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
４９．頻度の低減が、腫瘍開始細胞で高濃度化することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、又は腫瘍開始細胞で高濃度化することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項４８に記載の方法。
５０．頻度の低減が、インビトロ及びインビボ限界希釈解析法からなる群からの方法を用いて決定される、請求項４８に記載の方法。
５１．頻度の低減が、免疫不全マウスへのヒト生腫瘍細胞の移植を含むインビボ限界希釈解析法を用いて決定される、請求項５０に記載の方法。
５２．頻度の低減が、ポアソン分布統計を用いた腫瘍開始細胞頻度の定量化を含むインビボ限界希釈解析法を用いて決定される、請求項５１に記載の方法。
５３．頻度の低減が、インビトロコロニー支持条件へのヒト生腫瘍細胞の限界希釈堆積を含むインビトロ限界希釈解析法を用いて決定される、請求項５０に記載の方法。
５４．インビトロ限界希釈解析法を用いて決定される頻度の低減が、ポアソン分布統計を用いた腫瘍開始細胞頻度の定量化を含む、請求項５３に記載の方法。
５５．抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
５６．前記ＳＥＺ６モジュレーターが、配列番号２０〜１６９のうちのいずれか一つ由来の１つ以上のＣＤＲを含む、請求項２９に記載の方法。
５７．前記ＳＥＺ６モジュレーターが汎ＳＥＺ６モジュレーターを含む、請求項２９に記載の方法。
５８．前記ＳＥＺ６モジュレーターが細胞傷害剤を含む、請求項５７に記載の方法。
５９．必要とする対象において腫瘍開始細胞の頻度を低減する方法であって、前記対象にＳＥＺ６モジュレーターを投与する工程を含む方法。
６０．腫瘍開始細胞が腫瘍不滅化細胞を含む、請求項５９に記載の方法。
６１．前記腫瘍不滅化細胞が、ＣＤ４４＋、ＣＤ３２４＋及びＣＤ１３３＋細胞からなる群から選択されるマーカーを発現する細胞から選択される、請求項６０に記載の方法。
６２．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体を含む、請求項５９に記載の方法。
６３．前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項６２に記載の方法。
６４．前記モノクローナル抗体が細胞傷害剤をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
６５．対象が、副腎癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選択される新生物性障害に罹患している、請求項５９に記載の方法。
６６．対象が肺癌に罹患している、請求項６５に記載の方法。
６７．対象が小細胞肺癌に罹患している、請求項６６に記載の方法。
６８．腫瘍開始細胞の頻度が少なくとも１０％低減される、請求項５９に記載の方法。
６９．頻度の低減が、腫瘍開始細胞で高濃度化することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、又は腫瘍開始細胞で高濃度化することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項５９に記載の方法。
７０．抗癌剤による治療のため対象における腫瘍を感作する方法であって、前記対象にＳＥＺ６モジュレーターを投与する工程を含む方法。
７１．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体を含む、請求項７０に記載の方法。
７２．前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項７０に記載の方法。
７３．前記抗癌剤が化学療法剤を含む、請求項７０に記載の方法。
７４．前記抗癌剤が免疫療法剤を含む、請求項７０に記載の方法。
７５．必要とする対象において増殖性障害を診断する方法であって、
ｉ．前記対象から組織試料を採取する工程；
ｉｉ．組織試料を少なくとも１つのＳＥＺ６モジュレーターと接触させる工程；及び
ｉｉｉ．試料と会合したＳＥＺ６モジュレーターを検出又は定量化する工程
を含む方法。
７６．ＳＥＺ６モジュレーターがモノクローナル抗体を含む、請求項７５に記載の方法。
７７．モノクローナル抗体がレポーターと作動可能に会合される、請求項７６に記載の方法。
７８．ＳＥＺ６関連障害の診断又は治療に有用な製品であって、ＳＥＺ６モジュレーターを含む容器と、前記ＳＥＺ６モジュレーターを使用したＳＥＺ６関連障害の治療又は診断についての説明資料とを含む製品。
７９．前記ＳＥＺ６モジュレーターがモノクローナル抗体である、請求項７８に記載の製品。
８０．前記容器が読み取り可能なプレートを含む、請求項７８に記載の製品。
８１．新生物性障害に罹患している対象を治療する方法であって、少なくとも１つのインターナライズＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含む方法．
８２．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体を含む、請求項８１に記載の方法。
８３．前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項８２に記載の方法。
８４．前記モノクローナル抗体がヒト化抗体を含む、請求項８３に記載の方法。
８５．モノクローナル抗体が細胞傷害剤をさらに含む、請求項８３に記載の方法。
８６．抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項８１に記載の方法。
８７．新生物性障害が、神経内分泌特徴を呈する腫瘍を含む、請求項８１に記載の方法。
８８．新生物性障害が、神経特徴を呈する腫瘍を含む、請求項８１に記載の方法。
８９．新生物性障害が肺癌を含む、請求項８１に記載の方法。
９０．新生物性障害が小細胞肺癌を含む、請求項８１に記載の方法。
９１．新生物性障害に罹患している対象を治療する方法であって、少なくとも１つの中和ＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含む方法。
９２．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体を含む、請求項９１に記載の方法。
９３．前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項９２に記載の方法。
９４．前記モノクローナル抗体がヒト化抗体を含む、請求項９３に記載の方法。
９５．前記ヒト化抗体が細胞傷害剤をさらに含む、請求項９４に記載の方法。
９６．抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項９１に記載の方法。
９７．新生物性障害が、神経特徴を呈する腫瘍を含む、請求項９１に記載の方法。
９８．新生物性障害が、神経内分泌特徴を呈する腫瘍を含む、請求項９１に記載の方法。
９９．新生物性障害が肺癌を含む、請求項９１に記載の方法。
１００．新生物性障害が小細胞肺癌を含む、請求項９９に記載の方法。
１０１．腫瘍開始細胞の集団を同定し、単離し、区分し又は濃縮する方法であって、前記腫瘍開始細胞をＳＥＺ６モジュレーターと接触させる工程を含む方法。
１０２．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体を含む、請求項１０１に記載の方法。
１０３．ヒト化抗体を含むＳＥＺ６モジュレーターであって、前記ヒト化抗体が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０及び配列番号１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択されるあるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＳＥＺ６モジュレーター。
１０４．必要とする対象において転移を阻害又は予防する方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターの薬学的に有効な量を投与する工程を含む方法。
１０５．ＳＥＺ６モジュレーターの投与前又は投与後に対象がデバルキング手技を受ける、請求項１０４に記載の方法。
１０６．前記デバルキング手技が、少なくとも１つの抗癌剤の投与を含む、請求項１０５に記載の方法。
１０７．必要とする対象に対する維持療法の実施方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターの薬学的に有効な量を投与する工程を含む方法。
１０８．前記対象が、ＳＥＺ６モジュレーターの投与前に新生物性障害の治療を受けた、請求項１０７に記載の方法。
１０９．増殖性障害に罹患している対象において腫瘍開始細胞を枯渇させる方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを投与する工程を含む方法。
１１０．必要とする対象においてインビボでＳＥＺ６関連障害を診断、検出又はモニタする方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを投与する工程を含む方法。
１１１．必要とする対象においてＳＥＺ６関連障害を診断、検出又はモニタする方法であって、循環腫瘍細胞をＳＥＺ６モジュレーターと接触させる工程を含む方法。
１１２．前記接触させる工程がインビボで行われる、請求項１１１に記載の方法。
１１３．前記接触させる工程がインビトロで行われる、請求項１１１に記載の方法。
１１４．必要とする患者における神経内分泌特徴を呈する腫瘍の治療方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターの治療有効量を投与する工程を含む方法。
１１５．神経内分泌特徴を呈する前記腫瘍が神経内分泌腫瘍である、請求項１１４に記載の方法。
１１６．ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００からなる群から選択される抗体に由来するＳＥＺ６モジュレーター。
１１７．ＳＥＺ６のＳｕｓｈｉドメイン１に関連するエピトープと結合する単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１１８．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１１７に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１１９．前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項１１８に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２０．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＡＤＣを含む、請求項１１９に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２１．前記ＡＤＣがピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１２０に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２２．リンカーをさらに含む、請求項１２１に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２３．ＳＥＺ６のＳｕｓｈｉドメイン２に関連するエピトープと結合する単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１２４．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１２３に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２５．前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項１２４に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２６．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＡＤＣを含む、請求項１２５に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２７．前記ＡＤＣがピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１２６に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２８．リンカーをさらに含む、請求項１２７に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１２９．ＳＥＺ６のＳｕｓｈｉドメイン３に関連するエピトープと結合する単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１３０．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１２９に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１３１．前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項１３０に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１３２．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＡＤＣを含む、請求項１３１に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１３３．前記ＡＤＣがピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１３２に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１３４．リンカーをさらに含む、請求項１３３に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１３５．ＳＥＺ６のＳｕｓｈｉドメイン４に関連するエピトープと結合する単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１３６．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１３５に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１３７．前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項１３６に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１３８．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＡＤＣを含む、請求項１３７に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１３９．前記ＡＤＣがピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１３８に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１４０．リンカーをさらに含む、請求項１３９に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１４１．ＳＥＺ６のＳｕｓｈｉドメイン５に関連するエピトープと結合する単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１４２．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１４１に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１４３．前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項１４２に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１４４．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＡＤＣを含む、請求項１４３に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１４５．前記ＡＤＣがピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１４４に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１４６．リンカーをさらに含む、請求項１４５に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１４７．ＳＥＺ６のＣＵＢドメイン１に関連するエピトープと結合する単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１４８．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１４７に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１４９．前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項１４８に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５０．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＡＤＣを含む、請求項１４９に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５１．前記ＡＤＣがピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１５０に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５２．リンカーをさらに含む、請求項１５１に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５３．ＳＥＺ６のＣＵＢドメイン２に関連するエピトープと結合する単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１５４．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１５３に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５５．前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項１５４に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５６．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＡＤＣを含む、請求項１５５に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５７．前記ＡＤＣがピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１５６に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５８．リンカーをさらに含む、請求項１５７に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１５９．ＳＥＺ６のＮ末端ドメインに関連するエピトープと結合する単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１６０．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１５９に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１６１．前記抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項１６０に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１６２．前記ＳＥＺ６モジュレーターがＡＤＣを含む、請求項１６１に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１６３．前記ＡＤＣがピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１６２に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１６４．リンカーをさらに含む、請求項１６３に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１６５．ビンＡ、ビンＢ、ビンＣ、ビンＤ、ビンＥ、ビンＦ及びビンＵからなる群から選択されるビンにある単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１６６．ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００からなる群から選択される参照抗体により定義されるビンにある単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１６７．式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎの抗体薬コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩であって、式中：
ａ．ＭがＳＥＺ６モジュレーターを含み；
ｂ．Ｌがリンカーを含み；
ｃ．Ｄが抗増殖剤であり；及び
ｄ．ｎが約１〜約２０の整数である、抗体薬コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
１６８．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１６７に記載の抗体薬コンジュゲート。
１６９．前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項１６８に記載の抗体薬コンジュゲート。
１７０．前記抗体が、ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００からなる群から選択される抗体に由来する、請求項１６９に記載の抗体薬コンジュゲート。
１７１．前記抗体がヒト化されている、請求項１６９に記載の抗体薬コンジュゲート。
１７２．前記リンカーが切断可能なリンカーを含む、請求項１６７に記載の抗体薬コンジュゲート。
１７３．前記切断可能なリンカーがペプチジルリンカーを含む、請求項１７２に記載の抗体薬コンジュゲート。
１７４．前記抗増殖剤が細胞傷害剤を含む、請求項１６７に記載の抗体薬コンジュゲート。
１７５．前記細胞傷害剤がピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１７４に記載の抗体薬コンジュゲート。
１７６．前記ピロロベンゾジアゼピンがピロロベンゾジアゼピン二量体を含む、請求項１７５に記載の抗体薬コンジュゲート。
１７７．ビンＡ、ビンＢ、ビンＣ、ビンＤ、ビンＥ、ビンＦ及びビンＵからなる群から選択されるビンにある単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１７８．ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００からなる群から選択される参照抗体により定義されるビンにある単離ＳＥＺ６モジュレーター。
１７９．式：
Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
の抗体薬コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩であって、式中
ａ）ＭがＳＥＺ６モジュレーターを含み；
ｂ）Ｌが任意選択のリンカーを含み；
ｃ）Ｄが、アウリスタチン、メイタンシノイド、アマニチン及びピロロベンゾジアゼピン二量体からなる群から選択される細胞傷害剤であり、
ｄ）ｎが約１〜約２０の整数である、抗体薬コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
１８０．前記ＳＥＺ６モジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１７９に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８１．前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項１８０に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８２．前記抗体が、ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００からなる群から選択される抗体に由来する、請求項１８１に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８３．前記抗体がヒト化されている、請求項１８２に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８４．リンカーが切断可能なリンカーを含む、請求項１８３に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８５．前記切断可能なリンカーがペプチジルリンカーを含む、請求項１８４に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８６．前記抗増殖剤が細胞傷害剤を含む、請求項１８５に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８７．前記細胞傷害剤がピロロベンゾジアゼピンを含む、請求項１８６に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８８．前記ピロロベンゾジアゼピンがピロロベンゾジアゼピン二量体を含む、請求項１８７に記載の抗体薬コンジュゲート。
１８９．配列番号２０〜２０３のうちいずれか一つ由来のＣＤＲを含むＳＥＺ６モジュレーター。
１９０．前記モジュレーターが、配列番号２０〜２０３のうちいずれか一つ由来のＣＤＲを複数含む、請求項１８９に記載のＳＥＺ６モジュレーター。
１９１．ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００からなる群から選択される参照抗体と、ＳＥＺ６タンパク質との結合について競合するＳＥＺ６抗体モジュレーターであって、ＳＥＺ６抗体モジュレーターとＳＥＺ６タンパク質との結合が少なくとも３０％阻害される、ＳＥＺ６モジュレーター。
１９２．アミノ酸Ｑ１２、Ｐ１４、Ｉ１６、Ｅ１７及びＥ１８を含むＳＥＺ６タンパク質エピトープ（配列番号４０１）と結合するＳＥＺ６モジュレーター。
１９３．アミノ酸Ｌ７３、Ｐ７４、Ｆ７５、Ｑ７６、Ｐ７７、Ｄ７８及びＰ７９を含むＳＥＺ６タンパク質エピトープ（配列番号４０２）と結合するＳＥＺ６モジュレーター。
１９４．増殖性障害に罹患している対象を治療する方法であって、Ｎ末端ドメイン、Ｓｕｓｈｉ  １ドメイン、Ｃｕｂ  １ドメイン、Ｓｕｓｈｉ  ２ドメイン、Ｃｕｂ  ２ドメイン、Ｓｕｓｈｉ  ３ドメイン、Ｓｕｓｈｉ  ４ドメイン及びＳｕｓｈｉ  ５ドメインからなる群から選択されるＳＥＺ６ドメインに含まれるエピトープに結合するＳＥＺ６モジュレーターを投与する工程を含む方法。
１９５．ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５５、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１及びＳＣ１７．２００からなる群から選択されるヒト化ＳＥＺ６抗体モジュレーター。
【実施例】
【０４９５】
このように上記に概して説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより理解がさらに容易となる。それらの実施例は例示として提供され、本発明を限定するように意図するものではない。本実施例は、以下の実験が全てである又は実施された実験のみであることを表すように意図するものでない。特に指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス度であり、及び圧力は大気圧又はその前後である。
【０４９６】
実施例１
全トランスクリプトーム配列決定法を使用した神経内分泌特徴を有する腫瘍の同定及びマーカー発現の分析
散在内分泌系から生じる神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）はまれであり、１０万人に２〜５人の発生率であるが、極めて侵襲的である。神経内分泌腫瘍は、副腎、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、及び子宮内膜）、膵臓、胃腸管（胃及び結腸）、甲状腺（甲状腺髄様癌）、及び肺（小細胞肺癌、大細胞神経内分泌癌、及びカルチノイド）に起こる。これらの腫瘍は、カルチノイド症候群として知られる衰弱性の症状を引き起こし得るセロトニン及び／又はクロモグラニンＡを含む数種のホルモンを分泌し得る。これらの腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、γエノラーゼとしても知られる、遺伝子記号＝ＥＮＯ２）、ＣＤ５６／ＮＣＡＭ１、及びシナプトフィジンなどの免疫組織化学的マーカーが陽性であることにより示され得る。ＮＥＴの治療において伝統的な化学療法が奏効したことはなく、転移拡散に起因する死亡が一般的な転帰である。残念ながら、ほとんどの場合、外科手術が唯一の可能性のある治癒的処置であり、但し、早期発見後、および腫瘍転移前に行われることが条件である。これに関連して、神経内分泌特徴を含む腫瘍に関連する新規治療標的を同定する研究を行った。
【０４９７】
かかる腫瘍を癌患者に存在するものとして同定及び特徴付けするため、当該技術分野で認められている技法を用いて大規模な非伝統的異種移植（ＮＴＸ）腫瘍バンクを開発及び維持した。多数の異なる腫瘍細胞株を含むＮＴＸ腫瘍バンクを、免疫不全マウスにおいて、元は様々な固形腫瘍悪性病変に罹患した多数の癌患者から採取した不均質の腫瘍細胞の複数の継代により増殖させた（本明細書における実施例及び図の一部では、試験された試料の継代数は、試料名に付くｐ０〜ｐ＃によって示されることに留意されたく、ここでｐ０は、患者腫瘍から直接得られた未継代の試料を示し、ｐ＃は、腫瘍が試験前にマウスを通じて継代された回数を示している）。明確に定義された系列を有する多数の異なる初期継代ＮＴＸ腫瘍細胞株が継続的に利用可能であることにより、そうした細胞株から精製された細胞の同定及び特徴付けが大幅に促進される。かかる研究では、継代が最小限であるＮＴＸ細胞株を使用することが、インビボ実験を単純化し、且つ容易に検証可能な結果をもたらす。さらに、初期継代ＮＴＸ腫瘍はイリノテカン（すなわちＣａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））及びシスプラチン／エトポシドレジメンなどの治療剤に応答し、腫瘍成長を駆動する根底にある機序、現行の治療法に対する抵抗性及び腫瘍再発に関して、臨床的に意義のある洞察を提供する。
【０４９８】
ＮＴＸ腫瘍細胞株が確立されたことに伴い、それらの表現型を様々な方法で特徴付けて、全般的な遺伝子発現を調べた。バンクのどのＮＴＸ株がＮＥＴであり得るかを同定するため、全トランスクリプトーム配列決定法及び／又はマイクロアレイ解析により遺伝子発現プロファイルを作成した。具体的には、データを調べ、ＮＥＴで上昇することが知られる、又は神経内分泌分化の組織化学的マーカー（例えば、ＡＳＣＬ１、ＮＣＡＭ１、ＣＨＧＡ）として使用される特異的な遺伝子を高いレベルで発現する腫瘍、並びにＮＯＴＣＨシグナル伝達の抑制を示すＮＯＴＣＨ経路遺伝子の変化（例えば、ＮＯＴＣＨ受容体レベルの低下、並びにリガンド及びエフェクター分子の変化）を伴う腫瘍を同定した。
【０４９９】
より詳細には、ヒト腫瘍について重度免疫不全マウスで通常行われるとおり様々なＮＴＸ腫瘍細胞株を確立した後、腫瘍を８００〜２，０００ｍｍ３に達したところで摘出し、当該技術分野で認められている酵素消化法を用いて細胞を解離し、懸濁液中に分散させた（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２９２４１４号明細書（これは本明細書に援用される）を参照）。これらのＮＴＸ株から解離された細胞調製物を、次にマウス細胞を枯渇させて、次にヒト腫瘍細胞亜集団を蛍光活性化細胞選別によりさらに単離し、ＲＬＴｐｌｕｓ  ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解した。次にこれらのライセートを、使用まで−８０℃で保存した。解凍後、販売業者の指示に従いＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、ここでも製造者のプロトコル及び推奨される機器設定を使用して定量化した。得られた全ＲＮＡ調製物は、遺伝子配列決定法及び遺伝子発現解析に好適であった。
【０５００】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）ＳＯＬｉＤ（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：オリゴライゲーション／検出による配列決定法）４．５又はＳＯＬｉＤ  ５５００ｘｌ次世代シーケンシングシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した全トランスクリプトーム配列決定法を、ＮＴＸ株由来のＲＮＡ試料に対して実施した。ローインプット全ＲＮＡ用に設計されたＡＢＩの改良全トランスクリプトーム（ＷＴ）プロトコル又はＯｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（商標）（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）のいずれかを使用して、全ＲＮＡ試料からｃＤＮＡを作製した。改良ローインプットＷＴプロトコルは、１．０ｎｇの全ＲＮＡを使用して３’末端でｍＲＮＡを増幅し、これがマッピングされた遺伝子発現の重度の３’バイアスをもたらし、一方、ＮｕＧｅｎのシステムは、転写物全体にわたってより一貫した増幅を可能にし、ランダムヘキサマーを使用したｍＲＮＡ及び非ポリアデニル化転写物ｃＤＮＡの両方の増幅を含む。ｃＤＮＡライブラリを断片化し、バーコードアダプターを付加することにより、異なる試料由来の断片ライブラリをプールできるようにした。
【０５０１】
ＡＢＩのＳＯＬｉＤ  ４．５及びＳＯＬｉＤ  ５５００ｘｌ次世代シーケンシングプラットフォームは、複数のＮＴＸ株及び選別された集団からのトランスクリプトームを並列で配列決定することが可能である。各ＲＮＡ試料からｃＤＮＡライブラリが作製され、これが断片化され、バーコードを付けられる。各断片ライブラリのバーコードにより、複数の試料を等濃度でプールし、且つ試料の特異性を確保しながらも同時に実行することが可能となる。試料はＡＢＩのＳＯＬｉＤ（商標）ＥＺ  Ｂｅａｄ（商標）ロボットシステムを使用したエマルジョンＰＣＲにより取られ、これにより試料の一貫性が確保される。ペアエンド配列決定法により、プール中に存在する単一のビーズ上の各クローン増幅断片につき５’から３’方向に５０塩基リード、及び３’から５’方向に２５塩基リードが生じる。５５００ｘｌプラットフォームの場合、上記の方法でプールされた８個の試料のセット毎に、ビーズが単一のチップに対して６本の単一チャネルレーンに均等に置かれる。これにより、８試料毎に平均して５千万個超の５０塩基リード及び５千万個超の２５塩基リードが生じることになり、腫瘍細胞におけるｍＲＮＡ転写レベルの極めて正確な表現が生じる。ＳＯＬｉＤプラットフォームにより作成されたデータは、公表されているヒトゲノムのＮＣＢＩ  バージョンｈｇ１９．２を使用してＲｅｆＳｅｑ  バージョン４７によりアノテートしたとき３４，６０９個の遺伝子にマッピングされ、ほとんどの試料におけるＲＮＡレベルの検証可能な計測が提供された。
【０５０２】
ＳＯＬｉＤプラットフォームは、発現のみならず、専らリードカバレッジ（これまでアノテートされていないゲノム位置にユニークにマッピングされたリード）に基づき、ＳＮＰ、既知及び未知の選択的スプライシングイベント、低分子非コードＲＮＡ、及び潜在的に新しいエクソンの発見も捕捉することができる。従って、この次世代シーケンシングプラットフォームを専用のデータ解析及び視覚化ソフトウェアと組み合わせて使用することにより、このように、差次的転写物発現並びに発現したｍＲＮＡ転写物の特定のスプライス変異体についての違い及び／又は選択性を見出すことが可能となる。ＳＯＬｉＤプラットフォームからの配列決定データは、公称上、測定基準ＲＰＭ（リード／１００万）及びＲＰＫＭ（リード／キロベース／１００万）を使用して転写物発現値として表され、標準的な手法のとおりの基本的な差次的発現分析が可能である。
【０５０３】
４つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）腫瘍（ＬＵ７３、ＬＵ６４、ＬＵ８６及びＬＵ９５）、１つの卵巣腫瘍（ＯＶ２６）及び大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ；ＬＵ３７）の全トランスクリプトーム配列決定法により、ＮＥＴで一般に見られる遺伝子発現パターンを決定した（図６Ａ）。より具体的には、これらの腫瘍では、いくつかのＮＥＴマーカー（ＡＳＣＬ１、ＮＣＡＭ１、ＣＨＧＡ）の発現が高かったとともに、Ｎｏｔｃｈ受容体及びエフェクター分子（例えば、ＨＥＳ１、ＨＥＹ１）のレベルが低下し、且つＮｏｔｃｈ抑制マーカー（例えば、ＤＬＬ３及びＨＥＳ６）が上昇していた。対照的に、４つの正常肺試料、３つの肺腺癌腫瘍（ＬＵ１３７、ＬＵ１４６及びＬＵ１５３）、及び３つの扁平上皮肺癌（ＬＵ４９、ＬＵ７０及びＬＵ７６）は全て、様々なＮｏｔｃｈ受容体及びエフェクター分子の発現を有し、且つＨＥＳ６及びＤＬＬ３などのＮｏｔｃｈ抑制因子の発現上昇を示さない。
【０５０４】
さらに、図６Ｂに見られるとおり、正常組織試料を、神経内分泌特徴を有する種々の肺ＮＴＸ集団と比較する全トランスクリプトームデータの分析から、神経内分泌特徴を有する４つの肺癌集団（ＬＵ７３、ＬＵ６４、ＬＵ８６及びＬＵ９５）では、試験した正常組織の転写物発現が極めて低いか又は全くないことと比較して、ｍＲＮＡ転写物レベルにおいてＳＥＺ６が上方調節されたことが示された。これらの結果は、特定の癌（神経内分泌特徴を有する肺癌を含む）の腫瘍発生及び維持においてＳＥＺ６が重要な役割を果たし得ることを示唆している。これに基づき、潜在的な免疫治療標的としてさらなる分析用にＳＥＺ６を選択した。
【０５０５】
実施例２
神経内分泌特徴を有する選択されたＮＴＸ腫瘍における遺伝子発現のマイクロアレイ及びＲＴ−ＰＣＲ解析  
ＳＯＬｉＤ全トランスクリプトームデータが存在するものに加え、上記のＮＴＸバンクにおいてさらなるＮＥＴを同定することを目的に、マイクロアレイ解析を用いて大規模な一組のＮＴＸ株を調べた。具体的には、４６個のＮＴＸ株における全腫瘍に由来するか又は２個の正常組織に由来する２〜６μｇの全ＲＮＡ試料を、ヒトゲノムの１９，３８０個の遺伝子に対して設計された２９，１８７個のプローブを含むＯｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）マイクロアレイプラットフォーム（Ｐｈａｌａｎｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ）を使用して解析した。より具体的には、結腸直腸癌（ＣＲ）、黒色腫（ＳＫ）、腎癌（ＫＤ）、肺癌（ＬＵ）、卵巣癌（ＯＶ）、子宮内膜癌（ＥＭ）、乳癌（ＢＲ）、肝癌（ＬＩＶ）、又は膵癌（ＰＡ）を含む４６個の患者由来全ＮＴＸ腫瘍からＲＮＡ試料を（実施例１に記載されるとおり）得た。正常結腸直腸組織（ＮｏｒｍＣＲ）及び正常膵臓組織（ＮｏｒｍＰＡ）を対照として使用した。さらにより具体的には、肺腫瘍を小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、又は大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）にさらに細分類した。製造者のプロトコルを使用してＲＮＡ試料をトリプケートで実行し、各試料の対象遺伝子について得られた強度計測値を正規化及び変換する業界の標準的な手法を用いて、得られたデータを分析した。ｈｃｌｕｓｔ．２と呼ばれるＲ／ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージスイートの不偏ピアソンスピアマン階層クラスタリングアルゴリズムを使用して、これらの４８個の試料の標準マイクロアレイ樹状図を作成した。当該技術分野において公知のとおり、Ｒ／ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒは、学術研究、金融及び製薬業界でデータ解析に広く使われているオープンソースの統計プログラミング言語である。概して、遺伝子発現パターン、発現強度等に基づき腫瘍を並べてクラスタリングした。
【０５０６】
図７Ａに示されるとおり、４８個の試料から導き出された全１９３８０個の遺伝子にわたる樹状図により、ＮＴＸ株がその腫瘍型又は原発組織に基づき共にクラスタリングされた。典型的に神経内分泌表現型と関連付けられるいくつかの腫瘍は、（１）で示される枝に共にクラスタリングされた；これらには、皮膚癌、多数の肺癌及び他のＮＥＴが含まれた。興味深いことに、（２）で示される小枝は、神経内分泌特徴を有する２つの大細胞肺癌（ＬＵ５０．ＬＣＮＥＣ及びＬＵ３７．ＬＣＮＥＣ）及び小細胞肺癌（ＬＵ１０２．ＳＣＬＣ）が卵巣腫瘍（ＯＶ２６）及び腎腫瘍（ＫＤ６６）と共にクラスタリングされたことを示しており（クラスターＣ）、これらの後者の腫瘍もまた神経内分泌表現型を有したことが示唆される。さらに、図７Ａは、３つのさらなるＳＣＬＣ腫瘍からなるクラスターＤを示し、その右側に、さらなるＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ１００）及び神経内分泌子宮内膜腫瘍（ＥＭ６）を含む小さいクラスター（クラスターＥ）がある。クラスターＤ及びＥの腫瘍は全て、学術文献及び臨床での病理学的経験に基づけば、概していくつかの神経内分泌特徴を有するものと理解される。ＳＣＣを含むクラスターＧが、図７Ａの樹状図の完全に異なる枝に見出され得るという事実は、このクラスタリングが腫瘍の原発器官のみによって駆動されるのではないことを示している。
【０５０７】
ＮＥＴと関連付けられる遺伝子マーカーの集合をよく調べると（図７Ｂ）、それらが、クラスターＣ及びＤを含む腫瘍で強力に発現する一方、クラスターＧの腫瘍（肺の扁平上皮癌）では最小限しか発現しないことが示され、クラスターＣ及びＤがＮＥＴ又は神経内分泌表現型を有する腫瘍を表すことが示唆される。より具体的には、クラスターＣ  ＮＥＴはＡＳＣＬ１、ＣＡＬＣＡ、ＣＨＧＡ、ＳＳＴ及びＮＫＸ２−１を高度に発現する一方、クラスターＤ  ＮＥＴはＣＨＧＡ、ＥＮＯ２、及びＮＣＡＭ１を高度に発現し、これらの腫瘍のクラスタリングに部分的に関与するのは、これらの神経内分泌表現型遺伝子の発現である。興味深い特徴は、クラスターＤにおけるＫＩＴの強力な発現であり、遺伝子は神経内分泌腫瘍に関連していると報告されることもあるが、しかし他のコンテクストでは明らかに発癌と関係付けられる遺伝子である。これは、これらの遺伝子のいずれの強力な発現も欠くクラスターＧのＳＣＣ腫瘍と対照的である（図７Ｂ）。
【０５０８】
クラスターＣの腫瘍は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の低下と一致した表現型：任意のＮｏｔｃｈ受容体の発現の欠如、ＪＡＧ１及びＨＥＳ１発現の相対的な欠如、及び強度のＡＳＣＬ１発現レベルを示す（図７Ｃ）。興味深いことに、クラスターＤは、ヘテロ二量体形成によりＨＥＳ１活性に拮抗することによってＡＳＣＬ１活性を支持できる転写因子であるＨＥＳ６の高い発現を示す。
【０５０９】
上記の結果を踏まえ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ機（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造者のプロトコルに従いＴａｑｍａｎリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実施して、種々のＮＴＸ株及び正常組織からのＨＥＳ６のｍＲＮＡ発現を調べた。ＲＮＡを上記に記載したとおり単離し、品質が遺伝子発現解析に好適であることを確実にするため検査した。正常組織由来のＲＮＡは購入した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ｃＤＮＡ合成には、ｃＤＮＡアーカイブキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２００ｎｇのＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡを、ＨＥＳ６のｍＲＮＡレベルを計測するためのＨＥＳ６  Ｔａｑｍａｎアッセイを含むＴａｑｍａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのｑＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した。  
【０５１０】
内在性対照に対して正規化した後のＮＴＸ株又は正常組織試料毎にＨＥＳ６  ｍＲＮＡレベルを示す（グラフ上の単一の点）。正規化した値を毒性の懸念のある正常組織（ＮｏｒｍＴｏｘ）における平均発現と比べてプロットする。この技法により、ＨＥＳ６及び他の関連マーカーを計測することで、ＮＴＸ腫瘍バンクからの神経内分泌特徴を有する様々な腫瘍の迅速な同定及び特徴付けが可能となった。図７Ｄは、正常組織、乳房、結腸、肝臓及び他の選択された腫瘍と比較して、サンプリングした神経内分泌特徴を有する腫瘍（例えば、ＬＵ−ＳＣＬＣ、ＬＵ−ＬＣＮＥＣ）ではＨＥＳ６が全般的に過剰発現していることを示す。顕著には、これらのマイクロアレイ及びｑＰＣＲデータは、少なくとも一部の子宮内膜、腎及び卵巣腫瘍が神経内分泌腫瘍特徴を呈し得ることを示している（図７Ａ及び図７Ｄ）。
【０５１１】
上記に記載したとおり生成したマイクロアレイデータは、クラスターＣ、Ｄ及びＥの腫瘍が様々な神経内分泌マーカーを呈したことを示したのみならず、それらのクラスターの腫瘍が、神経発生、神経コミットメント、又は神経運命に向かう分化の指標となるマーカーを発現したこともまた示した（図７Ｅ）。特に興味深いことに、クラスターＤの腫瘍は、他のクラスターと比べて多くの場合にこれらのマーカーの多く（例えば、ＢＥＸ１及びＢＥＸ４、ＣＤ５６、ＮＲＣＡＭ、ＳＥＭＡ受容体、ＳＯＸ及びＺＩＣ因子）のより強力でより一貫した上方調節を示し、且つ多くの場合にホルモン上方調節が低下したことから、より神経性の表現型が示唆される。
【０５１２】
実施例３
神経内分泌特徴及び神経特徴を有する腫瘍におけるＳＥＺ６  ｍＲＮＡの発現
全トランスクリプトーム配列決定法（実施例１）並びにマイクロアレイ及びｑＲＴ−ＰＣＲ（実施例２）を含む様々な技法を用いて、神経内分泌特徴を呈する腫瘍を同定した。非神経内分泌腫瘍及び正常組織と比較したとき神経内分泌腫瘍で高度に発現する潜在的な治療標的を見つけるため、このように生成されたデータをさらに分析した。実施例１に考察されるとおり、主に正常脳で発現する１回膜貫通タンパク質であるＳＥＺ６が、多くの神経内分泌腫瘍で高発現することが見出された（図６Ｂ）。
【０５１３】
実施例２で生成されたマイクロアレイデータから、クラスターＣ、Ｄ及びＥに位置する腫瘍が神経内分泌マーカー（図７Ｂ）及び神経マーカー（図７Ｅ）を発現したことが示された。著しいことに、これらの同じクラスターの腫瘍がまた、高レベルのＳＥＺ６転写物も示したことから、ＳＥＺ６が神経内分泌特徴及び神経特徴を有する腫瘍に関連することが示唆された（図７Ｆ）。これは、出生後の前脳発達及び成体における海馬の特定の領域での継続的な発現におけるＳＥＺ６の既知の役割と一致している。ＳＥＺ６は、細胞間認識及びシグナル伝達において重要な役割を果たすと考えられる。多くの場合に、腫瘍においては発生経路が不適切に発現する。
【０５１４】
様々な試料ＮＴＸ腫瘍株におけるＳＥＺ６  ｍＲＮＡ発現レベルを決定するため、本質的に上記の実施例２に記載されるとおりＳＥＺ６  Ｔａｑｍａｎアッセイを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。図８Ａは、正常組織における平均発現に対する、且つ内在性対照遺伝子ＡＬＡＳ１の発現に対して正規化したＳＥＺ６発現を示す。ＳＥＺ６遺伝子発現は、正常組織と比べて神経内分泌ＮＴＸ集団において１０，０００，０００倍超上昇する。図８Ａに示されるＳＣＬＣ  ＮＴＸ株のうち５個は、一次生検から直接抽出したｍＲＮＡ試料（ｐ０）である。これらの未継代の腫瘍におけるＳＥＺ６の発現は、ＳＥＺ６発現が、ヒト腫瘍がマウスで成長することにより生じるアーチファクトではないことを実証している。図８Ａには、ＮＳＣＬＣの３つのサブタイプもまた示される：ＬＵ２５は紡錘細胞癌腫であり、ＬＵ５０は大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）であり、及びＬＵ８５は扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。それぞれ腎腫瘍及び卵巣腫瘍であるＫＤＹ６６及びＯＶ２６は、マイクロアレイでＳＣＬＣ及びＬＣＮＥＣ腫瘍と共にクラスタリングされたことから（図７Ａ）、これらもまた神経内分泌特徴を有することが示唆された。
【０５１５】
ＳＥＺ６発現の分析をより幅広い腫瘍標本に拡張するため、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤシステムを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。簡潔に言えば、実施例１に記載されるとおり調製した１ｎｇのＲＮＡを、ｃＤＮＡアーカイブキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｃＤＮＡに変換した。ＳＥＺ６特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用してｃＤＮＡを予め増幅し、次にそれを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。正常組織（ＮｏｒｍＴｏｘ又はＮｏｒｍ）における発現を以下のＮＴＸ株における発現と比較したが、ここで括弧内の数字は、試験したユニークなＮＴＸ株の数を示す：ＢＲ（５）、ＣＲ（６）、ＫＤＹ（９）、ＯＶ（１６）、ＰＡ（９）、肺腺癌（ＬＵ−Ａｄｅｎｏ）（７）、ＬＣＮＥＣ（２）、ＳＣＣ（１１）及びＳＣＬＣ（１５）（図８Ｂ）。ＳＣＬＣ及びＬＣＮＥＣ  ＮＴＸは最も高いＳＥＺ６発現を示すが、ＯＶ、ＰＡ、ＣＲ及びＬＵ−Ａｄｅｎｏ  ＮＴＸ株にもまた、正常組織試料と比較してＳＥＺ６のいくらかの発現が見られた。
【０５１６】
「ＮｏｒｍＴｏｘ」は、以下の正常組織試料を表す：２つの結腸、２つの腎臓、２つの肝臓、２つの肺、２つの膵臓、２つの心臓、１つの食道、１つの骨格筋、１つの皮膚、１つの小腸、１つの脾臓、１つの胃、及び１つの気管試料。「Ｎｏｒｍ」と表示される別の一組の正常組織は、以下の正常組織試料を表す：脳、乳房、子宮頸部、卵巣、末梢血単核細胞、胎盤、前立腺、精巣、胸腺、及び甲状腺。ほとんどの正常組織はＳＥＺ６を発現しないが、膵臓、結腸、肝臓及び肺では低発現が見られ、及び脳では高発現が見られる。本質的に上記と同じ方法を用いた別のＳＥＺ６特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを、様々なＮＴＸ腫瘍株に対して実施した。各腫瘍型について試験した腫瘍株の数を分母として示し、一方、ＳＥＺ６を発現した腫瘍の数を分子として示す：１／５  ＣＲ、２／２  ＧＡ、１／１  ＧＢ（膠芽腫）、１／１  ＫＤＹ、２／６  ＳＫ、２／４  ＬＵ−Ａｄｅｎｏ、２／２  ＬＣＮＥＣ、３／１０  ＬＵ−ＳＣＣ、１０／１０  ＳＣＬＣ及び１／２  ＯＶ（データは示さず）。
【０５１７】
まとめると、これらのデータは、神経内分泌特徴及び神経特徴を呈する腫瘍においてＳＥＺ６が上方調節されることを示唆しており、これらの腫瘍型を治療するための治療標的となり得ることが示唆される。
【０５１８】
実施例４
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した様々な腫瘍及び正常組織標本におけるＳＥＺ６  ｍＲＮＡの発現
ＳＥＺ６発現の分析をより幅広い腫瘍標本に拡張するため、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）ｑＰＣＲ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３８４ウェルアレイで、実質的に前出の実施例に記載されるとおりＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。このアレイは、各腫瘍型につき複数の患者由来試料及び正常な隣接組織からの該試料と、１８種の異なる固形腫瘍型にわたる遺伝子発現との比較を可能にする。
【０５１９】
これに関して、図９Ａ及び図９Ｂは、１８種の異なる固形腫瘍型のうちの一つを有する患者由来の全腫瘍標本（灰色の点）又は正常な隣接組織（ＮＡＴ；白色の点）におけるＳＥＺ６の、それぞれ絶対的及び相対的な遺伝子発現レベルを示す。より具体的には、図９Ａは、様々な全腫瘍標本又は対応する正常な隣接組織におけるＳＥＺ６の絶対ｍＲＮＡ発現レベルを示す。図９Ｂは、分析した各腫瘍型についてβ−アクチンに対して正規化し、且つ正常な隣接組織における発現に対してプロットしたときのＳＥＺ６の発現レベルを示す。ＳＥＺ６が検出されなかった標本には５０のＣｔ値を割り当てたが、これは実験プロトコルにおける最後の増幅サイクルを表す。各点が単一の組織標本を表し、幾何平均値を黒色の線として表す。
【０５２０】
このＯｒｉｇｅｎｅアレイを使用して、一部の副腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、及び膵癌にＳＥＺ６の過剰発現が見られた。これらの癌の多くは神経内分泌腫瘍又は低分化型神経内分泌表現型を有する腫瘍に相当し得る。図９Ａの絶対遺伝子発現によって示されるとおり、ＳＥＺ６の高発現を有する正常組織は、正常精巣及び膵臓のみである。これは、ＳＥＺ６が、限定はされないが神経内分泌特徴及び神経特徴を有する腫瘍を含む多種多様な腫瘍の腫瘍発生及び／又は腫瘍進行において役割を果たし得ることを示唆している。
【０５２１】
実施例５
組換えＳＥＺ６タンパク質のクローニング及び発現
ヒトＳＥＺ６
ヒトＳＥＺ６に関連して本発明に必要な全ての分子及び細胞材料を生成及び開発するため、完全成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質（図３Ｂ、配列番号６）をコードするｃＤＮＡ（図３Ａ；配列番号５）を以下のとおり作製した。市販のヒトＳＥＺ６  ｃＤＮＡをＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入し、このｃＤＮＡ配列はＮＣＢＩ登録番号ＢＣ１４６２９２に対応した。配列アラインメントから、ＢＣ１４６２９２によりコードされるタンパク質が、内因性ヒトＳＥＺ６タンパク質をコードするＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿８４９１９１と数残基だけ異なることが示された（残基４１４、４１５及び４１７、図３Ｃを参照）。ＰＣＲを使用して、ＢＣ１４６２９２クローンからの２つの別個のｃＤＮＡ断片を増幅し、ここでは使用したプライマーが、オーバーラップＰＣＲのプロセス中にｃＤＮＡの残基４１４〜４１７に所望の変化を導入したことで、ＮＭ＿１７８８６０（内因性ヒトＳＥＺ６タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列）によってコードされるものと同一の配列を有する成熟ＳＥＺ６タンパク質をコードするｃＤＮＡが作製された。ｈＳＣＲｘ１７（図３Ａ）と称されるこの修復ｃＤＮＡクローンを、成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質又はその断片を発現するコンストラクトの以降の全ての工学的改変に使用した。
【０５２２】
ＳＥＺ６分子に対して免疫反応性の又は免疫特異的なモジュレーターを生成するため、キメラ融合遺伝子を生成し、ここではヒトＳＥＺ６タンパク質のＥＣＤ部分をヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインと融合した（図４Ａ、配列番号８）。これは以下のとおり行われた：ＳＥＺ６のＥＣＤをコードするｃＤＮＡをｈＳＣＲｘ１７ｃＤＮＡクローン（図３Ａ）からＰＣＲ増幅し、続いてこのＰＣＲ産物を、標準的な分子技法を使用して、ＣＭＶ駆動発現ベクターにインフレームでＩｇＫシグナルペプチド配列の下流且つヒトＩｇＧ２  Ｆｃ  ｃＤＮＡの上流にサブクローニングした。ｈＳＣＲｘ１７−Ｆｃ  ＯＲＦと称されるｈＳＥＺ６−Ｆｃ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、図４Ａに示す；ｈＳＣＲｘ１７−Ｆｃ  ＯＲＦによりコードされる対応するタンパク質配列を、図４Ｂに示す（配列番号９）。配列の下線の領域はヒトＩｇＧ２  Ｆｃに対応する。太下線の領域はＩｇＫシグナルペプチドに対応し、及び太字フォントの配列は、ＳＥＺ６  ＥＣＤが隣接するクローニング制限部位によりコードされる融合タンパク質の部分に対応する。
【０５２３】
組換えｈＳＥＺ６  ＥＣＤタンパク質を生成するため、同様のＰＣＲベースの戦略を用いた。ＳＥＺ６のＥＣＤをコードするｃＤＮＡ断片をｈＳＣＲｘ１７  ｃＤＮＡクローンから増幅し、ＣＭＶ駆動発現ベクターにインフレームでＩｇＫシグナルペプチド配列の下流且つインフレームで９−ヒスチジンエピトープタグ（配列番号４００）をコードする配列の上流にサブクローニングした。
【０５２４】
ＣＭＶ駆動発現ベクターにより、ＨＥＫ−２９３Ｔ及び／又はＣＨＯ−Ｓ細胞における高レベルの一過性発現が可能となる。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の懸濁液若しくは付着培養物、又は懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、ポリエチレンイミンポリマーをトランスフェクション試薬として使用して、ｈＳＥＺ６  ＥＣＤ−Ｆｃ又はｈＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質のいずれかをコードする発現コンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの３〜５日後、ｈＳＥＺ６  ＥＣＤ−Ｆｃ又はｈＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、それぞれＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はニッケル−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムのいずれかを使用して、清澄化した細胞上清から精製した。
【０５２５】
レンチウイルスベクターを使用してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を以下のとおり形質導入することにより、組換えヒトＳＥＺ６を過剰発現する安定細胞株を構築した：ｈＳＣＲｘ１７クローンを鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を作製した。生成された断片を、標準的な分子クローニング技術を用いて、ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の多重クローニング部位の上流に予め工学的に改変したＩｇＫシグナルペプチド及びＤＤＫエピトープタグをコードする配列の下流にインフレームでサブクローニングした。得られたバイシストロン性レンチウイルスベクターを使用してヒトＳＥＺ６−Ｔ２Ａペプチド−ＧＦＰポリペプチドを過剰発現する細胞株を工学的に改変した。Ｔ２Ａ配列はペプチド結合縮合のリボソームスキッピングを促進して、２つの独立したタンパク質、この場合ＳＥＺ６とＧＦＰとをもたらす。
【０５２６】
マウスＳＥＺ６
組換えマウスＳＥＺ６を過剰発現する安定細胞株を、本質的に組換えヒトＳＥＺ６に関して上記に記載したとおり工学的に改変した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、マウスＳＥＺ６を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。このベクターは、本質的に以下のとおり工学的に改変した。ＮＣＢＩデータベースにＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿０２１２８６として掲載される成熟マウスＳＥＺ６タンパク質（図５Ｂ；配列番号１１）をコードするｃＤＮＡ断片（図５Ａ；配列番号１０）を、市販のマウスＳＥＺ６  ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ；＃ＭＣ２０３６３４）からＰＣＲ増幅によって得て、標準的な分子クローニング技術を用いて、ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−ＲＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の多重クローニング部位の上流に予め工学的に改変したＩｇＫシグナルペプチド配列及びＤＤＫエピトープタグ配列の下流にサブクローニングした。これによりバイシストロン性レンチウイルスベクターが得られ、それを使用して、マウスＳＥＺ６及びＲＦＰを過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株を作製した。
【０５２７】
ラットＳＥＺ６
ラットＳＥＺ６タンパク質に関連して本発明に必要な全ての分子及び細胞材料を生成及び開発するため、完全成熟ラットＳＥＺ６タンパク質（図５Ｄ、配列番号１３）をコードするｃＤＮＡ（図５Ｃ、配列番号１２）を以下の通りに得た。完全長成熟ラットタンパク質（すなわち、野生型シグナルペプチドを含まない完全長タンパク質）をコードするｃＤＮＡを、ラット脳ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＃６３９４１２）から増幅した。配列アラインメントから、コードされたタンパク質のＥＣＤが、ＮＣＢＩデータベースにＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００１０９９２２４として掲載される内因性ラットＳＥＺ６タンパク質と相同であることが示された。ｒＳＣＲｘ１７（図５Ｄ）と称されるこのｃＤＮＡクローンを、ラットＳＥＺ６タンパク質断片を発現するコンストラクトの以降の工学的改変に使用した。
【０５２８】
カニクイザルＳＥＺ６
カニクイザルＳＥＺ６タンパク質に関連して本発明に必要な全ての分子及び細胞材料を生成及び開発するため、カニクイザルＳＥＺ６タンパク質（図５Ｆ、配列番号１５）をコードするｃＤＮＡ（図５Ｅ、配列番号１４）を以下のとおり得た：予測されるカニクイザルＳＥＺ６  ＯＲＦ配列を、バイオインフォマティクス解析によって以下の方法で構築した：ヒトＳＥＺ６遺伝子のＯＲＦをＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿１７８８６０から得て、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＮＣＢＩデータベースの全ゲノムショットガン配列決定用コンティグと比較した。次にＢＬＡＳＴの結果を使用して、推定カニクイザルＳＥＺ６  ＯＲＦを構築した。このＢＬＡＳＴにより導かれた配列から、カニクイザルＳＥＺ６の予測野生型シグナルペプチドをコードする配列を除去し、ＩｇＫシグナルペプチド配列をコードする配列に置き換えた。哺乳類細胞での産生用にコドンを最適化した後、この完成したハイブリッドＯＲＦ配列を合成遺伝子として注文した（ＧｅｎｅＷｉｚ）。ｃＳＣＲｘ１７と称されるこの最適化されたｃＤＮＡクローン（図３Ｅ）を、カニクイザルＳＥＺ６タンパク質断片を発現するコンストラクトの以降の工学的改変に使用した。
【０５２９】
ヒトＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２
ヒトゲノムには、ＳＥＺ６と近縁の２つの遺伝子−発作関連６ホモログ様（ＳＥＺ６Ｌ）と発作関連６ホモログ様−２（ＳＥＺ６Ｌ２）とがある。これらの３つのタンパク質間の全体的な同一性パーセントは比較的低いが（約４２％）、これらのタンパク質のうちの２つ又は３つ全ての間に、完全に同一のより短いストレッチがある。抗ＳＥＺ６モジュレーターとヒトＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２タンパク質とのあらゆる可能性のある交差反応性を調べるため、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質（ＮＰ＿００６６９３８）及びヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質（ＮＰ＿００１２３０２６１）のＥＣＤをコードするオープンリーディングフレームをコドン最適化し、合成した（ＧｅｎｅＷｉｚ）。ヒトＳＥＺ６Ｌ又はＳＥＺ６Ｌ２タンパク質のＥＣＤをコードするこれらの最適化ｃＤＮＡ配列は、図５Ｇ及び図５Ｉに示す。
【０５３０】
交差反応性試験の材料
本発明のＳＥＺ６モジュレーターがラット及び／又はカニクイザルＳＥＺ６相同体と交差反応するか、又は近縁のヒトＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２タンパク質と交差反応するかかどうかを試験するため、材料を生成した。ラット又はカニクイザルＳＥＺ６タンパク質のいずれかのＥＣＤ部分（それぞれ図５Ｄ及び図５Ｆの下線部）が９−ヒスチジンエピトープタグ（配列番号４００）と融合したキメラ融合遺伝子を設計した。ＰＣＲを使用して、ラット又はカニクイザルＳＥＺ６のいずれかのＥＣＤをコードするｃＤＮＡ断片を、それぞれｒＳＣＲｘ１７又はｃＳＣＲｘ１７のいずれかから増幅し、ＣＭＶ駆動発現ベクターにインフレームでＩｇＫシグナルペプチド配列の下流、及びインフレームで９−ヒスチジンエピトープタグ（配列番号４００）をコードする配列の上流にサブクローニングした。同様に、ヒトＳＥＺ６Ｌ又はＳＥＺ６Ｌ２タンパク質のＥＣＤ部分をコードするオープンリーディングフレームがＣＭＶ駆動発現ベクターにインフレームでＩｇＫシグナルペプチド配列の下流、及びインフレームで９−ヒスチジンエピトープタグ（配列番号４００）をコードする配列の上流にサブクローニングされたキメラ融合遺伝子を設計した。結果として得られた、これらの融合タンパク質についてコードされたタンパク質配列を、それぞれ図５Ｈ及び図５Ｊに示し、ここで下線の配列は、考察中の特定のタンパク質のＥＣＤを表す。
【０５３１】
上記で生成したラット及びカニクイザルＳＥＺ６  ＥＣＤ−Ｈｉｓベクターを使用して、それぞれ組換えｒＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質及びｃＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を以下のとおり作製及び精製した：当該技術分野で認められている技法を用いて、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の懸濁液若しくは付着培養物、又は懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、ｒＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓ又はｃＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトした。ポリエチレンイミンポリマーをトランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクションの３〜５日後、ｒＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓ又はｃＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ及びニッケル−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを使用して、清澄化した細胞上清から精製した。同様に、ヒトＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２  ＥＣＤ−Ｈｉｓベクターを使用して、ラット及びカニクイザル相同体について記載されるとおり、組換えヒトＳＥＺ６Ｌ及びヒトＳＥＺ６Ｌ２  ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を作製及び精製した。
【０５３２】
実施例６
抗ＳＥＺ６マウスモジュレーターの生成
マウス抗体の形態のＳＥＺ６モジュレーターを、本明細書の教示に従いヒトＳＥＺ６−Ｆｃの接種によって作製した。これに関して３つのマウス系統を使用することにより、様々な増殖性障害の予防及び／又は治療のためＳＥＺ６との会合及び／又はその作用の阻害に使用することのできる高親和性マウスモノクローナル抗体モジュレーターを生成した。具体的には、Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１及びＦＶＢマウス系統をヒト組換えＳＥＺ６−Ｆｃで免疫し、ハイブリドーマの作製に使用した。
【０５３３】
実施例５に記載されるとおりのコンストラクトＳＥＺ６−Ｆｃを過剰発現するＣＨＯ−Ｓ細胞の上清から、ＳＥＺ６−Ｆｃ抗原を精製した（図４Ａ及び図４Ｂ）。初回の免疫には１０μｇのＳＥＺ６−Ｆｃ免疫原を使用し、次に以降の３回の免疫及び５回の免疫に、それぞれ５μｇ及び２．５μｇのＳＥＺ６−Ｆｃ免疫原を使用した。全ての免疫を、等体積のＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又はミョウバンアジュバントとともに乳化した免疫原により実施した。６匹の雌マウス（各２匹のＢａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）を全ての注射について足蹠経路によって免疫することにより、マウス抗体を生成した。
【０５３４】
固相ＥＬＩＳＡアッセイを用いることにより、ヒトＳＥＺ６に特異的なマウスＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングした。バックグラウンドを上回る陽性シグナルが、ＳＥＺ６に特異的な抗体を示した。簡潔に言えば、９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号６１０７４４）に、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中０．５μｇ／ｍｌの組換えＳＥＺ６−Ｈｉｓを一晩コーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２００μＬ／ウェルにより室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。マウス血清をタイトレーションし（１：１００、１：２００、１：４００、及び１：８００）、ＳＥＺ６をコーティングしたプレートに５０μＬ／ウェルで添加して、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に、３％ＢＳＡ−ＰＢＳ又はＰＢＳ中２％ＦＣＳに１：１０，０００希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共にＲＴで１時間インキュベートした。再びプレートを洗浄し、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２８）をＲＴで１５分間添加した。発色後、等体積の２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して基質の発色を停止させ、分光光度計によりＯＤ  ４５０でプレートを分析した。
【０５３５】
血清陽性免疫マウスを犠牲にし、流入領域リンパ節（膝窩及び鼠径、及び拡げた場合には内側腸骨）を切り取って、抗体産生細胞の供給源として使用した。Ｂ細胞の単一細胞懸濁液（２２８．９×１０６細胞）を非分泌Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１５８０）と１：１の比で電気融合により融合させた。電気融合は、ＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ（商標）システム（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して製造者の指示どおり実施した。融合手順の後、１５％Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ  ペニシリン−ストレプトマイシン及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを含有するピルビン酸ナトリウム（Ｃｅｌｌｇｒｏ  カタログ番号１５−０１７−ＣＭ）を含む高グルコースＤＭＥＭ培地であって、アザセリン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ選択培地に細胞を再懸濁し、次に、３つのＴ２２５フラスコ中のフラスコ当たり９０ｍＬの選択培地に播いた。次にフラスコを、５％ＣＯ２及び９５％空気が入った加湿した３７℃のインキュベーターに６〜７日間置いた。
【０５３６】
６〜７日間の成長の後、Ｔ２２５においてバルク成長させた細胞からなるライブラリを、Ａｒｉａ  Ｉセルソーターを使用してＦａｌｃｏｎ９６ウェルＵ底プレートにウェル当たり１細胞で播いた。次に、１５％Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔａｍｙｃｉｎ）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、及び１００μＭ  ヒポキサンチンを含有する２００μＬの培養培地において、選択したハイブリドーマを成長させた。残りの未使用のハイブリドーマライブラリ細胞は全て、その後のライブラリ試験用に凍結した。１０〜１１日間成長させた後、播いた細胞の各ウェルからの上清を、ＳＥＺ６に対する抗体反応性についてＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳアッセイによりアッセイした。
【０５３７】
ＥＬＩＳＡによるスクリーニングのため、９６ウェルプレートをＰＢＳ中０．３μｇ／ｍＬのＳＥＺ６−Ｆｃにより４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中３％ＢＳＡにより３７℃で１時間ブロックし、直ちに使用するか、又は４℃で保存した。未希釈のハイブリドーマ上清を、プレートにおいてＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３％ＢＳＡ−ＰＢＳ中１：１０，０００希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧによりＲＴで１時間プローブした。次にプレートを上記に記載したとおりの基質溶液と共にインキュベートし、ＯＤ  ４５０で読み取った。バックグラウンドを上回るシグナルにより決定するとき、ヒトＳＥＺ６を優先に結合した免疫グロブリンが含まれるウェルを、移して拡大した。
【０５３８】
マウス免疫グロブリンを分泌する選択された成長陽性ハイブリドーマウェルはまた、前の実施例で作製した、選択された抗原又はコンストラクトを過剰発現するように工学的に改変した２９３細胞によるフローサイトメトリーベースのアッセイを用いて、ヒトＳＥＺ６特異性並びにカニクイザル、ラット及びマウスＳＥＺ６交差反応性についてスクリーニングした。
【０５３９】
フローサイトメトリーアッセイのため、それぞれヒト、カニクイザル、ラット又はマウスＳＥＺ６で形質導入した５０×１０４個のｈ２９３細胞を、２５〜１００μＬのハイブリドーマ上清と共に３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ、２％ＦＣＳで２回洗浄し、次に、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：２００希釈のＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９にコンジュゲートした５０μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ、２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを含む同じ緩衝液に再懸濁し、製造者の指示どおりＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩを使用してフローサイトメトリーにより分析した。ＳＥＺ６＋  ＧＦＰ＋細胞を優先的に結合した免疫グロブリンが含まれるウェルを移して拡大した。得られたｈＳＥＺ６特異的クローナルハイブリドーマをＣＳ−１０凍結培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に凍結保存し、液体窒素中に保存した。ヒト、カニクイザル、ラット又はマウスＳＥＺ６細胞と結合した抗体が、交差反応性を有するものと認められた（図１１Ａを参照）。
【０５４０】
ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー分析により、これらのハイブリドーマのほとんど又は全てからの精製抗体が、濃度依存的にＳＥＺ６と結合したことが確認された。ＳＥＺ６  ＧＦＰ細胞と結合した免疫グロブリンを含むウェルを移して拡大した。得られたクローナルハイブリドーマをＣＳ−１０凍結培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に凍結保存し、液体窒素中に保管した。
【０５４１】
１回の融合を実施し、４８プレートに播種した（約４０％のクローニング効率で４６０８ウェル）。初期スクリーニングにより、ヒトＳＥＺ６と会合した６３個のマウス抗体が得られた。続いて２回目のスクリーニングを実施し、ヒトＳＥＺ６と会合した１３４個の抗体を得た。
【０５４２】
実施例７
ＳＥＺ６マウスモジュレーターの配列決定
上記に基づき、配列決定及びさらなる分析のため、固定化したヒトＳＥＺ６又はｈ２９３−ｈＳＥＺ６細胞と見かけ上高い親和性で結合する複数の例示的な個別のモノクローナル抗体を選択した。図１０Ａ及び図１０Ｂに表形式で示されるとおり、実施例６で作成した選択されたモノクローナル抗体由来の軽鎖可変領域（図１０Ａ）及び重鎖可変領域（図１０Ｂ）の配列分析から、多くが新規の相補性決定領域を有し、多くの場合に新規ＶＤＪ配列を示したことが確認された。図１０Ａ及び図１０Ｂに示される相補性決定領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）に従い定義されることに留意されたい。
【０５４３】
例示的モジュレーターを配列決定する最初の工程として、選択されたハイブリドーマ細胞をＴｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ精製システム、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解してＲＮＡを調製した。これに関して、１０４〜１０５細胞を１ｍＬ  Ｔｒｉｚｏｌに再懸濁し、２００μＬのクロロホルムを添加した後、激しく振盪した。次に試料を４℃で１０分間遠心分離し、新しい微量遠心チューブに水相を移して、そこに等体積のイソプロパノールを添加した。チューブを再び激しく振盪し、ＲＴで１０分間インキュベートさせた後、４℃で１０分間遠心分離した。得られたＲＮＡペレットを１ｍＬの７０％エタノールで１回洗浄し、ＲＴで短時間乾燥させた後、４０μＬのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＲＮＡ調製物の品質を、１％アガロースゲルにおいて３μＬを分画することにより決定した後、使用まで−８０℃で保存した。
【０５４４】
完全なマウスＶＨレパートリーを標的とするように設計された、３２個のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む５’プライマーミックスを、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーと組み合わせて使用して、各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を増幅した。同じＰＣＲプライマーを使用して、ＶＨの４００ｂｐ  ＰＣＲ断片を両端から配列決定した。同様に、Ｖκマウスファミリーの各々を増幅するように設計された３２個の５’Ｖκリーダー配列プライマーのミックスを、マウスκ定常領域に特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用して、κ軽鎖を増幅及び配列決定した。１００ｎｇの全ＲＮＡから、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＶＨ及びＶＬ転写物を増幅した。
【０５４５】
各ハイブリドーマにつき、Ｖκ軽鎖について４ラン、Ｖγ重鎖（γ１）について４ランの、合計８ランのＲＴ−ＰＣＲ反応を実行した。増幅にはＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用した（Ｑｉａｇｅｎ）。このキットは、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ及びＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、緩衝液、及び「難しい」（例えば、ＧＣリッチの）鋳型の効率的増幅を可能にする新規添加剤であるＱ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎのブレンドを提供する。３μＬのＲＮＡ、０．５の１００μＭの重鎖プライマー或いはκ軽鎖プライマーのいずれか（ＩＤＴによりカスタム合成された）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μＬ  ｄＮＴＰ、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する１μＬの酵素ミックス、及び０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害薬ＲＮａｓｉｎ（１単位）を含む反応混合物を調製した。この反応混合物は、逆転写及びＰＣＲの両方に必要な全ての試薬を含む。サーマルサイクラープログラムは、ＲＴステップ５０℃で３０分、９５℃で１５分、続いて３０サイクルのＰＣＲ（９５℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１分）に設定した。次に７２℃で１０分の最終インキュベーションがあった。
【０５４６】
直接ＤＮＡ配列決定用のＰＣＲ産物を調製するため、製造者のプロトコルに従いＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、それらのＰＣＲ産物を精製した。５０μＬの滅菌水を使用してスピンカラムからＤＮＡを溶出させ、次に両鎖から直接配列決定した。特異的Ｖ領域プライマーを使用して、抽出したＰＣＲ産物を直接配列決定した。ＩＭＧＴを使用してヌクレオチド配列を解析し、最も高い配列相同性を有する生殖細胞系列Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子メンバーを同定した。得られた配列を、Ｖ−ＢＡＳＥ２（Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）を使用して、且つＶＨ及びＶＬ遺伝子をマウス生殖細胞系列データベースとアラインメントして図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるアノテートされた配列を提供することにより、Ｉｇ  Ｖ領域及びＪ領域の既知の生殖細胞系列ＤＮＡ配列と比較した。
【０５４７】
より具体的には、図１０Ａは、抗ＳＥＺ６抗体由来の７５個の新規マウス軽鎖可変領域（配列番号２０〜１６８、偶数）及び代表的なマウス軽鎖に由来する１１個のヒト化軽鎖可変領域（配列番号１７０〜１９２、偶数）の連続アミノ酸配列を示す。同様に、図１０Ｂは、同じ抗ＳＥＺ６抗体由来の７５個の新規マウス重鎖可変領域（配列番号２１〜１６９、奇数）及びヒト化軽鎖を提供するのと同じマウス抗体由来の１１個のヒト化重鎖可変領域（（配列番号１７１〜１９３、奇数）の連続アミノ酸配列を示す。従って、まとめると、図１０Ａ及び図１０Ｂは、７５個の動作可能なマウス抗ＳＥＺ６抗体（ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９及びＳＣ１７．２００と称される）及び１１個のヒト化抗体（ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ｈＳＣ１７．１５１、ｈＳＣ１７．１５５、ｈＳＣ１７．１５６、ｈＳＣ１７．１６１及びｈＳＣ１７．２００と称される）のアノテートされた配列を提供する。これらの同じ名称が、本抗体を産生するクローンを指すこともあり、そのため、いずれかの特定の名称の使用は、周辺の開示の文脈の中で解釈されなければならないことに留意されたい。
【０５４８】
加えて、ｈＳＣ１７．２００ｖＬ１（配列番号１９２）はヒト化軽鎖コンストラクトｈＳＣ１７．２００（配列番号１９０）の変異体であり、ｈＳＣ１７．１５５ｖＨ１〜ｖＨ６（配列番号１９３〜１９８）は、ＳＣ１７．９０（配列番号１２７）に由来する重鎖コンストラクトｈＳＣ．１５５（配列番号１８４）の変異体であり、及びｈＳＣ１６１ｖＨ１（配列番号１９９）は、重鎖コンストラクトｈＳＣ１７．１６１（配列番号１８９）の変異体である。以下でさらに詳細に考察するとおり、これらの変異体を構築及び試験して、親抗体の１つ以上の生化学的特性を最適化した。
【０５４９】
さらに、図１０Ａ及び図１０Ｂに示される７５個の例示的マウスモジュレーター及び１１個のヒト化モジュレーター並びに変異体の各々の対応する核酸配列が、本願の配列表に含まれる（配列番号２２０〜３９９）。
【０５５０】
本願の目的上、それぞれの特定の抗体の配列番号は連番である。従ってｍＡｂ  ＳＣ１７．１は、それぞれ軽鎖及び重鎖可変領域に対して配列番号２０及び２１を含む。これに関連して、ＳＣ１７．２は配列番号２２及び２３を含み、ＳＣ１７．９は配列番号２４及び２５を含む等となる。さらに、図１０Ａ及び図１０Ｂにおける各抗体アミノ酸配列の対応する核酸配列が、本明細書と共に提出された配列表として本願に添付される。本配列表では、含まれる核酸配列は、対応するアミノ酸配列（軽鎖又は重鎖）より２００大きい配列番号を含む。従って、ｍＡｂ  ＳＣ１７．１の軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列（すなわち、配列番号２０及び２１）をコードする核酸配列は、配列表では配列番号２２０及び２２１を含む。これに関して、本開示の軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列の全てをコードする核酸配列は、ヒト化コンストラクト及びその変異体をコードするものを含め、同様に付番され、配列番号２２０〜３９９を含む。
【０５５１】
実施例８
キメラ及びヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの生成
上記で言及したとおり、実施例７のマウス抗体のうち１１個は、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティングを用いてヒト化した。機能性のヒト生殖系列遺伝子に関する配列及び構造の類似度に基づき、重鎖及び軽鎖のヒトフレームワークを選択した。これに関して、構造の類似度は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）に記載されるとおり、マウスのカノニカルなＣＤＲ構造を同じカノニカルな構造を有するヒト候補と比較することにより評価した。
【０５５２】
より詳細には、１１個のマウス抗体ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５５、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１及びＳＣ１７．２００を、コンピュータ支援ＣＤＲグラフティング方法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐｌｃ．）及び標準的な分子工学的改変技法を用いてヒト化することにより、ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ｈＳＣ１７．１５１、ｈＳＣ１７．１５５、ｈＳＣ１７．１５６、ｈＳＣ１７．１６１及びｈＳＣ１７．２００モジュレーターを提供した。可変領域のヒトフレームワーク領域は、対象マウスフレームワーク配列及びそのカノニカルな構造に対するそれらの最も高い配列相同性に基づき選択した。ヒト化解析の目的上、ＣＤＲドメインの各々に対するアミノ酸の割当ては、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．の付番（上掲）に従う。
【０５５３】
当該技術分野で認められている技法を用いて分子工学的改変手順を行った。そのために、上記の実施例７に記載されるとおりハイブリドーマから全ｍＲＮＡを抽出して増幅した。
【０５５４】
ヌクレオチド配列情報から、対象マウス抗体の重鎖及び軽鎖のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントに関するデータを得た。配列データに基づき、組換えモノクローナル抗体のクローニング用に、抗体のＩｇ  ＶＨ及びＶＫ軽鎖のリーダー配列に特異的な新しいプライマーセットを設計した。続いてＶ−（Ｄ）−Ｊ配列をマウスＩｇ生殖系列配列とアラインメントした。１１個のヒト化コンストラクトの各々について得られた遺伝子配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を、下掲の表１に示す。
【０５５５】
【表１】
2018127469.tif 000038
【０５５６】
表１に掲載されるヒト化抗体は、図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるアノテートされた軽鎖及び重鎖配列（配列番号１７０〜１９１）に対応する。軽鎖及び重鎖可変領域の対応する核酸配列は、配列表に示される。表１は、結合モジュレーターの好ましい特性を維持するのにフレームワーク変化はほとんど必要ないことをさらに実証している。この点において、フレームワーク変化又は復帰突然変異は重鎖可変領域の３つにのみ作製し、且つ軽鎖可変領域に２つのフレームワーク修飾を行ったのみである。
【０５５７】
一部のヒト化軽鎖及び重鎖可変領域（例えばｈＳＣ１７．２００、ｈＳＣ１７．１５５及びｈＳＣ１７．１６１）については、ＣＤＲに保存的アミノ酸突然変異を導入することにより、抗原結合を維持しながら安定性の懸念に対処したことに留意されたい。いずれの場合も、修飾されたＣＤＲを有する抗体の結合親和性は、対応するキメラ抗体或いはマウス抗体と同等であることが分かった。９個の例示的ヒト化変異鎖（軽鎖及び重鎖）の配列を図１０Ａ及び図１０Ｂの最後に掲載し（配列番号１９２〜１９９）、これらはヒト化親鎖の名称を引き継ぐとともに、変化していることを示す記号を伴う（例えばｈＳＣ１７．２００ｖＬ１、ｈＳＣ１７．１５５ｖＨ１〜６及びｈＳＣ１７．１６１ｖＨ１）。
【０５５８】
全ての選択された抗体をＣＤＲグラフティングによりヒト化した後、得られた軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列を分析して、マウスドナー及びヒトアクセプター軽鎖及び重鎖可変領域に関するそれらの相同性を決定した。以下の表２に示す結果により、ヒト化コンストラクトが一貫して、マウスドナー配列と比べてヒトアクセプター配列に対してより高い相同性を呈したことが明らかである。より詳細には、ヒト化重鎖及び軽鎖可変領域は、概して、ヒト化可変領域配列とドナーハイブリドーマタンパク質配列との相同性（７４％〜８９％）と比較したとき、ヒト生殖系列遺伝子の最近接マッチに対してより高い相同性パーセンテージを示す（８４％〜９５％）。
【０５５９】
【表２】
2018127469.tif 000039
【０５６０】
試験によって、且つ実施例９で考察するとおり、ヒト化コンストラクトの各々が、マウス親抗体が示すものとおよそ同等の好ましい結合特性を呈した（データは示さず）。
【０５６１】
ヒト化であろうと、又はマウスであろうと、可変領域の核酸配列が決定されると、本発明の抗体を、当該技術分野で認められている技法を用いて発現させ、単離することができる。そのために、選択された重鎖（ヒト化又はマウス）可変領域の合成ＤＮＡ断片をヒトＩｇＧ１発現ベクターにクローニングした。同様に、可変領域軽鎖ＤＮＡ断片（ここでもヒト化又はマウス）をヒト軽鎖発現ベクターにクローニングした。次に選択された抗体を、得られた重鎖及び軽鎖核酸コンストラクトをＣＨＯ細胞にコトランスフェクトすることにより発現させた。
【０５６２】
より詳細には、一つの適合性のある抗体産生方法は、選択されたヒト免疫グロブリン発現ベクターへのマウス又はヒト化可変領域遺伝子（ＰＣＲを用いて増幅した）のディレクショナルクローニングを含んだ。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲに使用した全てのプライマーが制限部位を含み、これにより、ヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖定常領域を含む発現ベクターへのダイレクトクローニングが可能であった。簡潔に言えば、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）と、続く、それぞれＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ（重鎖用）及びＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩ（軽鎖用）による消化により、ＰＣＲ産物を精製した。消化したＰＣＲ産物を精製した後、発現ベクターにライゲートした。ライゲーション反応は、２００Ｕ  Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化及び精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物及び２５ｎｇの線状化ベクターＤＮＡを含む総容積１０μＬで実施した。コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を４２℃で３μＬライゲーション産物によりヒートショックで形質転換し、アンピシリンプレート（１００μｇ／ｍＬ）に播いた。次にＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクターの同じ部位に挿入し、一方、合成ＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ  ＶＫインサートを、それぞれのｐＥＥ１２．４Ｈｕ−κ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位にクローニングした。
【０５６３】
２９３ｆｅｃｔｉｎを使用してＨＥＫ２９３細胞に適切なプラスミドをトランスフェクトすることにより、選択された抗体を産生する細胞を生成した。この点において、プラスミドＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。１５０ｍｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、標準条件下、１０％熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ（全て、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）でヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８）細胞を培養した。
【０５６４】
一過性のトランスフェクションのため、８０％コンフルエンシーまで細胞を成長させた。等量のＩｇＨ及び対応するＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（各１２．５μｇ）を、１．５ｍＬ  ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬ  ＨＥＫ  ２９３トランスフェクション試薬と混合した１．５ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに添加した。この混合物を室温で３０分インキュベートし、培養プレートに均一に分配した。トランスフェクションの３日後に上清を回収し、１０％ＦＢＳを補充した２０ｍＬの新鮮なＤＭＥＭに交換し、トランスフェクション後６日目に再び回収した。８００×ｇで１０分間遠心分離することにより培養上清から細胞デブリを取り除き、４℃で保存した。組換えキメラ及びヒト化抗体をプロテインＧビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、適切な条件下で保存した。
【０５６５】
実施例９
ＳＥＺ６モジュレーターの特性
様々な方法を用いて、上記のとおり生成された選択されたＳＥＺ６モジュレーターの結合及び免疫化学的特性を分析した。具体的には、複数の抗体モジュレーターを、ＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２タンパク質と共に、ヒト、カニクイザル、ラット及びマウスＳＥＺ６抗原に対する親和性、ビニング、及び交差反応性に関し、フローサイトメトリーを含む当該技術分野で認められている方法により特徴付けた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）でのバイオレイヤー干渉法分析又はＢｉａｃｏｒｅ  ２０００を用いた表面プラズモン共鳴を、各々製造者の指示に従い用いて、選択されたモジュレーターの親和性及び動力学定数ｋｏｎ及びｋｏｆｆを計測した。
【０５６６】
特性決定結果を表形式で図１１Ａに示し、ここでは、選択されたモジュレーターが概してナノモル濃度範囲の比較的高い親和性を呈したこと、及び多くの場合に、１つ以上のＳＥＺ６オルソログと交差反応性であったことが分かり得る。図１２は、対象モジュレーターが占める実験的に決定されたビンをさらに掲載する。まとめると、これらのデータは、本開示のモジュレーターの多様な結合特性並びに動物モデルにおけるそれらの反応性に基づく医薬開発に対するそれらの潜在的な適合性を実証している。
【０５６７】
これに関して、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩを製造者の指示どおり使用してフローサイトメトリーを実施することにより、選択されたＳＣ１７抗体モジュレーターがヒトＳＥＺ６と免疫特異的に会合できることの確認、及び同じモジュレーターが、ＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２に加え、カニクイザル、ラット及び／又はマウスＳＥＺ６と交差反応するかどうかの決定を行った。より詳細には、モジュレーターをマウスＳＥＺ６及びラットＳＥＺ６との交差反応性について、フローサイトメトリーにより、それぞれマウスＳＥＺ６及びラットＳＥＺ６を発現するＮｅｕｒｏ２ａ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ１３１）、及びＲＩＮ−ｍ５Ｆ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１１６０５）細胞株に対して試験した。カニクイザルＳＥＺ６との交差反応性を調べるため、カニクイザルＳＥＺ６の細胞外ドメインを提示する酵母（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）をフローサイトメトリー分析に使用した。
【０５６８】
手短に言えば、ウェル当たり１×１０５細胞のＮｅｕｒｏ２ａ、ＲＩＮ−５ｍＦ、又は酵母提示カニクイザルＳＥＺ６細胞を、５μｇ／ｍＬ抗体を含む５０μＬ  ＰＢＳ（２％ＦＣＳ）緩衝液と共に３０分間インキュベートした。細胞を同じ緩衝液で２回洗浄し、次に、ＰＢＳ緩衝液中１：２００希釈した試料当たり５０μＬのＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、Ｎｅｕｒｏ２ａ及びＲｉｎ−ｍ５Ｆのフローサイトメトリー分析用のＤＡＰＩを含む同じＰＢＳ緩衝液又はｃＳＥＺ６を有する酵母細胞のフローサイトメトリー分析用のＤＡＰＩを含まない緩衝液に再懸濁した。Ｎｅｕｒｏ２ａ又はＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞株、又は酵母が提示するカニクイザルＳＥＺ６と結合した抗体を、それぞれマウスＳＥＺ６、ラットＳＥＺ６、又はカニクイザルＳＥＺ６と交差反応性があると見なした。図１１Ａは、交差反応性の結果を示す。６個の抗体がヒト及びマウスＳＥＺ６について（ＳＣ１７．６、ＳＣ１７．７、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２６及びＳＣ１７．４２）；６個がヒト及びラットＳＥＺ６について（ＳＣ１７．６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２６、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．３４及びＳＣ１７．４２）；及び６個がヒト及びカニクイザルＳＥＺ６について（ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２６、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３６及びＳＣ１７．４５）交差反応性があった。ＳＣ１７．６はＳＣ１７．１６の複製であり、同じ結合特性を呈することに留意されたい。
【０５６９】
ラットＳＥＺ６に対する上記の交差反応性データを検証して、選択されたエフェクターの親和性並びに動力学定数ｋｏｎ及びｋｏｆｆを決定するため、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）でのバイオレイヤー干渉法分析又はＢｉａｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴を実施した。実施例５で生成したヒト組換えＳＥＺ６−Ｈｉｓ及びラット組換えＳＥＺ６−Ｈｉｓに対する親和性を決定した。図１１Ａにおいて分かるとおり、試験した抗体の複数がラットＳＥＺ６と交差反応した。選択されたモジュレーターは、ラット及びヒトＳＥＺ６の双方に対してナノモル濃度範囲で比較的高い親和性を呈した。
【０５７０】
ファミリーメンバータンパク質ＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２に対する交差反応性を決定するため、ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用した。プレートをＰＢＳ中０．２μｇ／ｍＬのＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ、又はＳＥＺ６Ｌ２タンパク質で一晩コーティングした。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）、１００μＬ／ウェルにより室温で１時間、ウェルをブロックした。次に１００μＬ  ＰＢＳＡ中１μｇ／ｍＬの抗体を、室温で１時間添加した。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＡ中１：２，０００希釈した１００μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、室温で１時間。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２８）を室温で１５分間添加した。発色後、等体積の２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して基質の発色を停止させ、分光光度計によりＯＤ  ４５０で分析した。図１１Ａは、１つの抗体がＳＥＺ６Ｌと交差反応性であり（ＳＣ１７．７）、５つがＳＥＺ６Ｌ２と交差反応性であった（ＳＣ１７．６、ＳＣ１７．７、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２６及びＳＣ１７．２８）ことを示している。上記に考察したとおり、かかる汎ＳＥＺ６抗体は、本明細書の教示と適合性があり、本開示の方法と併せて用いられ得る。
【０５７１】
実施例８の以下のヒト化コンストラクト、ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４及びｈＳＣ１７．４６の結合特性を分析することにより、ＣＤＲグラフトプロセスがそれらの結合特性を認め得るほどに変化させたかどうかを決定した。ヒト化コンストラクト（ＣＤＲグラフト化）を、ヒト化コンストラクトで使用されるものと実質的に等しいマウス親（又はドナー）重鎖及び軽鎖可変ドメインとヒト定常領域とを含む「伝統的な」キメラ抗体と比較した。これらのコンストラクトでＢｉａｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴を実施し、ヒト化プロセスによってもたらされた速度定数のいかなる僅かな変化も特定した。いずれの場合にも、ヒト化抗体は対応するマウス抗体と比べて同等か又はより良好な結合親和性を有した（データは示さず）。
【０５７２】
図１１Ａに示されるとおり様々なＳＥＺ６モジュレーターについて抗体ビニングを決定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＲＥＤを製造者の指示どおり使用して、同じ又は異なるビンに結合した競合抗体を同定した。簡潔に言えば、参照抗体（Ａｂ１）を抗マウス捕捉チップ上に捕捉し、次に高濃度の非結合抗体を使用してチップをブロックし、ベースラインを収集した。次に特異抗体（Ａｂ１）により単量体の組換えヒトＳＥＺ６（実施例５に記載される）を捕捉し、チップを、対照と同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェルか、或いは異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェルに浸漬した。新しい抗体でさらなる結合が観察される場合、Ａｂ１とＡｂ２とは異なるビンにあると決定した。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定するときに、それ以上の結合が起こらない場合、Ａｂ２は同じビンにあると決定した。当該技術分野において公知のとおり、このプロセスを拡張することにより、９６ウェルプレートにおいてユニークなビンに相当する抗体列の全幅を使用してユニークな抗体の大規模ライブラリをスクリーニングすることができる。この例の場合、このビニングプロセスから、スクリーニングされた抗体がＳＥＺ６タンパク質上の少なくとも７個の異なるビンに結合したことが示された。ビンＡ〜Ｆはユニークなビンであり、これらのビンの各々に含まれる抗体は、ＳＥＺ６タンパク質との結合について互いに競合する（しかし定義された他のビンの抗体とは競合しない）。ビンＵは、ビンＡ〜Ｆの抗体とは競合しないが、互いには結合が競合し得る抗体を含む。
【０５７３】
実施例１０
ＳＥＺ６モジュレーターのエピトープマッピング
本開示のＳＥＺ６抗体モジュレーターが会合又は結合するエピトープを特徴付けるため、参照により本明細書に援用されるＣｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８７（１−２）：１４７−１５８（２００４））により記載されるプロトコルの改良版を用いてドメインレベルエピトープマッピングを実施した）。ＳＥＺ６の個々のドメインを酵母の表面上に発現させて、各ＳＥＺ６抗体による結合をフローサイトメトリーによって決定した。
【０５７４】
以下のコンストラクトの発現用に、酵母ディスプレイプラスミドコンストラクトを作製した：ＳＥＺ６細胞外ドメイン（アミノ酸１〜９０４）；Ｓｕｓｈｉドメイン１（アミノ酸３３６〜３９５）、ＣＵＢドメイン１（アミノ酸２９７〜５０８）、Ｓｕｓｈｉドメイン２（アミノ酸５１１〜５７２）、ＣＵＢドメイン２（アミノ酸５７４〜６８５）、Ｓｕｓｈｉドメイン３（アミノ酸６９０〜７４８）、Ｓｕｓｈｉドメイン４（アミノ酸７５０〜８１３）、Ｓｕｓｈｉドメイン５（アミノ酸８１７〜８７８）、及びＳｕｓｈｉドメイン５＋Ｃ末端（アミノ酸８１７〜９０４）。加えて、Ｎ末端ドメイン（アミノ酸１〜３３５）を、Ｎ１（アミノ酸１〜７０）、Ｎ２（アミノ酸７１〜１６９）及びＮ３（アミノ酸１６９〜３３５）と称される３つの断片に分割し、その各々を酵母ディスプレイプラスミドにクローニングした。アミノ酸付番にはリーダーペプチドは含まれない。ドメイン情報については、概して、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースエントリＱ５３ＥＬ９を参照のこと。これらのプラスミドを酵母に形質転換し、Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるとおり、次にそれを成長させて誘導した。全てのアミノ酸付番が、１９ａａリーダー配列を含まない成熟ＳＥＺ６タンパク質に基づくことに留意されたい。
【０５７５】
特定のコンストラクトに対する結合を試験するため、所望のコンストラクトを発現する２００，０００個の誘導酵母細胞をＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）で２回洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのニワトリ抗ｃ−ｍｙｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、５０ｎＭ精製抗体か又は７日間培養したハイブリドーマからの未精製上清の１：２希釈物のいずれかとを含む５０μＬのＰＢＳＡ中でインキュベートした。細胞を氷上で９０分間インキュベートし、次にＰＢＳＡで２回洗浄した。次に細胞を、適切な二次抗体を含む５０μＬ  ＰＢＳＡ中でインキュベートした：マウス抗体については、Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート抗ニワトリ、及びＡｌｅｘａ  ６４７コンジュゲートヤギ抗マウス（双方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各１μｇ／ｍＬで添加し、ヒト化又はキメラ抗体については、Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲート抗ニワトリ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＲ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を各１μｇ／ｍＬで添加した。２０分間氷上でインキュベートした後、細胞をＰＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで分析した。
【０５７６】
全てのモジュレーターが、酵母細胞上に発現した単一のドメインとユニークに結合した。ある場合には、抗体クローンはＳｕｓｈｉドメイン５＋Ｃ末端を発現する酵母と特異的に結合したが、Ｓｕｓｈｉドメイン５を発現する酵母との特異的な結合はなかった。これらの抗体クローンは、Ｃ末端領域（アミノ酸８７９〜９０４）のみと結合すると結論付けられた。
【０５７７】
エピトープを立体構造（すなわち不連続）エピトープ又は線状エピトープに分類した。ＳＥＺ６  ＥＣＤコンストラクトを提示する酵母を８０℃で３０分間熱処理することにより抗原を変性させ、氷冷ＰＢＳＡで２回洗浄し、次に上記に記載したのと同じ染色プロトコル及びフローサイトメトリー分析に供した。変性酵母及び天然酵母の両方に結合した抗体を線状エピトープに結合するものとして分類し、一方、天然酵母とは結合するが変性酵母とは結合しない抗体を、立体構造特異的なものとして分類した。
【０５７８】
試験した抗体のドメインレベルエピトープマッピングデータの概要を、以下の表３に提供する。線状エピトープに結合する抗体には下線を引いており、ＳＥＺ６ファミリーメンバーＳＥＺ６Ｌ及びＳＥＺ６Ｌ２と結合する抗体には、それぞれアスタリスク及び／又は短剣符を表示している。
【０５７９】
【表３】
2018127469.tif 000040
【０５８０】
この実施例１０に記載されるドメインマッピングしたＳＥＺ６抗体モジュレーターを使用してインビトロ細胞死滅アッセイを実施したところ、興味深く且つ意外な傾向が認められた。本質的に以下で実施例１４に記載するとおり実施されるインビトロ死滅アッセイにより、インターナライズしてＨＥＫ−２９３細胞を死滅させる特定の抗体の能力を決定した。図１１Ｂは、試験抗体の有効性を、それらが結合するドメインに対してプロットしたものである。Ｎ１、Ｎ３、Ｓｕｓｈｉドメイン１、及びＳｕｓｈｉドメイン４を含む特定のドメインに結合する抗体は、インビトロでの死滅の増強を呈した。Ｓｕｓｈｉドメイン４と会合する抗体（これはインターナライズして細胞を死滅させるのに極めて有効である）は、ＩＧＨＶ１−３４及びＩＫＶ４−５９マウス生殖細胞系列フレームワーク領域との強力な相関を示す。
【０５８１】
選択された抗体に対する細密なエピトープマッピングをさらに実施して、それらが結合する特異的なアミノ酸を決定した。Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｅ８１１０Ｓ）を使用して、線状エピトープと結合した抗体をマッピングした。エピトープマッピング用に選択した抗体を、３ｍＬ  ０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液、ｐＨ８中５０μｇ／ｍＬでＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐチューブ（Ｎｕｎｃ）にコーティングし、一晩インキュベートした。チューブを重炭酸塩溶液中３％ＢＳＡ溶液でブロックした。次に、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中１０１１個のインプットファージを結合させ、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回連続して洗浄し、非結合ファージを洗い落とした。残りのファージを１ｍＬ  ０．２Ｍグリシンにより室温で１０分間、穏やかに撹拌しながら溶出させ、続いて１５０μＬ  １Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ９で中和した。溶出したファージを増幅し、選択ストリンジェンシーを高めるために、洗浄工程の間ずっと０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用して再び１０１１個のインプットファージでパニングした。第２ラウンドからの溶出したファージの２４個のプラーク由来のＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｍ１３  Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、配列決定した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用してクローナルファージの結合を確認し、ここでマッピングされる抗体又は対照抗体をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、ブロックし、各ファージクローンに曝露した。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してファージ結合を検出した。特異的に結合するファージからのファージペプチド配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抗原ＥＣＤペプチド配列に対してアラインメントして、結合するエピトープを決定した。
【０５８２】
Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）により記載される技法を用いて、不連続エピトープと結合した抗体をマッピングした。クローン当たり１つのアミノ酸突然変異の標的突然変異誘発率のため、ヌクレオチド類似体８−オキソ−２’デオキシグアノシン−５’−三リン酸及び２’−デオキシ−ｐ−ヌクレオシド−５’三リン酸（両方ともＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏから）を使用して、エラープローンＰＣＲによりＳＥＺ６  ＥＣＤ突然変異体を作製した。これらを酵母ディスプレイフォーマットに変換した。上記にドメインレベルマッピングについて記載した技法を用いて、ライブラリをｃ−ｍｙｃ及び抗体結合について５０ｎＭで染色した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ）を使用して、野生型ＳＥＺ６  ＥＣＤと比較して結合の欠損を呈したクローンを選別した。これらのクローンを再成長させ、標的抗体との結合の欠損についてのもう１ラウンドのＦＡＣＳ選別に供した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、個々のＥＣＤクローンを単離し、配列決定した。必要に応じて、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、突然変異体を単一突然変異体ＥＣＤクローンとして再フォーマット化した。
【０５８３】
次に個々のＥＣＤクローンをスクリーニングして、結合の欠損がエピトープの突然変異に起因するのか、それとも誤った折り畳みを引き起こした突然変異に起因するのかを決定した。システイン、プロリン、及び終止コドンが関与した突然変異は、誤った折り畳みの突然変異である可能性が高いため、自動的に廃棄した。次に残りのＥＣＤクローンを、非競合的立体構造特異的抗体との結合に関してスクリーニングした。非競合的立体構造特異的抗体との結合が欠損したＥＣＤクローンを、誤った折り畳みの突然変異を含むものと結論付け、一方、野生型ＳＥＺ６  ＥＣＤと同等の結合を保持したＥＣＤクローンを、適切に折り畳まれたものと結論付けた。後者の群におけるＥＣＤクローンの突然変異を、エピトープにあるものと結論付けた。単離したドメインのホモロジーモデルもまたＭＯＤＥＬＬＥＲを使用して構築し、そのエピトープにあると同定された残基が、１）折り畳まれたホモロジーモデルで互いに近接して位置したこと、及び２）溶媒に露出した、且つ埋没していない側鎖を有したこと（埋没した残基では誤った折り畳みが生じる可能性がより高く、結合のエピトープの一部となる見込みがないため）を確認した。抗体の概要を、それらのエピトープと共に表４に掲載する。
【０５８４】
【表４】
2018127469.tif 000041
【０５８５】
ＮＲは、エピトープが不連続であったため配列番号が割り当てられなかったことを示す。
【０５８６】
ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３６及びＳＣ１７．４６の場合、単離ドメインのＳｕｓｈｉドメイン１（これはドメインレベルエピトープマッピングにより結合のドメインであると決定された）に点突然変異が構築された。ＳＣ１７．４６の場合、ライブラリベースのスクリーンではスクリーニングの候補突然変異は同定されなかった；むしろそれらは、ドメインマッピング、カニクイザルＳＥＺ６  ＥＣＤ及びラットＳＥＺ６  ＥＣＤとの交差反応性の欠如、並びに種の一次配列における違いを同定するための異なる種の配列アラインメントに基づき同定された。これらの候補突然変異を他の抗体と同じ分析に供し、ＳＣ１７．４６のエピトープを確認した。
【０５８７】
実施例１１
フローサイトメトリーによるＳＥＺ６表面発現の検出
フローサイトメトリーを使用して、実施例５に記載されるとおり構築した工学的改変ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株の表面上にあるヒトＳＥＺ６タンパク質の存在を検出するため生成された抗ＳＥＺ６抗体の特異性を評価した。アイソタイプ染色及びフルオレセンス・マイナス・ワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ：ＦＭＯ）対照を用いて、染色特異性を確認した。簡潔に言えば、ヒトＳＥＺ６及びＧＦＰ（実施例５を参照）を形質導入したＨＥＫ−２９３Ｔ又は採取したＮＴＸ腫瘍試料を、当該技術分野で認められている酵素消化法（例えば、本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／０２９２４１４号明細書を参照）を用いて解離し、懸濁液中に分散させ、それを抗ＳＥＺ６抗体と共に３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ（２％ＦＣＳ）で２回洗浄し、次に、ＰＢＳ緩衝液中１：２００希釈した試料当たり５０μｌのＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰＢＳに再懸濁し、先に考察したとおりフローサイトメトリーにより分析した。
【０５８８】
図１２ＡにＳＣ１７．３３について示す代表的なデータにより実証されるとおり、ＳＥＺ６モジュレーターは、ＨＥＫ−２９３Ｔ−ＨｕＳＥＺ６細胞を強力に認識した。これらのデータは、細胞表面上に発現するヒトＳＥＺ６を特異的に認識したモジュレーターが作製されたことを実証している。
【０５８９】
いくつかの例示的ＳＣ１７抗体を使用して、選択されたＮＴＸ腫瘍の表面上のヒトＳＥＺ６タンパク質発現をフローサイトメトリーにより評価した。ＬＵ３７、ＬＵ８６及びＫＤＹ６６におけるＳＥＺ６の発現はＳＣ１７．６抗体を使用して試験し、一方、ＬＵ５０、ＬＵ１００及びＬＵ７３におけるＳＥＺ６の発現は、それぞれＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．４２及びＳＣ１７．２８抗体を使用して試験した。結果は図１３Ａに示す。ＮＴＸ腫瘍は採取し、解離して、市販の抗マウスＣＤ４５、抗マウスＨ−２Ｋｄ、抗ヒトＥｐＣＡＭ及び上記のマウス抗ヒトＳＥＺ６抗体のうちの一つで共染色した。図１３Ａに示すデータは、上記の抗マウス抗体に対して陽性染色されなかった細胞であって、しかし抗ヒトＥｐＣＡＭに対しては実に陽性染色された細胞を使用して作成した。上記に記載したＨＥＫ−２９３Ｔ染色実験と同様に、アイソタイプ染色及びフルオレセンス・マイナス・ワン（ＦＭＯ）対照を用いて染色特異性を確認した。図１３Ａに見られるとおり、ヒトＮＴＸ腫瘍細胞の全てにおいて、右への蛍光プロファイルシフトによって指摘され、且つ肺ＮＴＸ腫瘍ＬＵ３７、ＬＵ５０及びＬＵ８６並びに腎ＮＴＸ腫瘍ＫＤＹ６６について、平均蛍光強度（ＭＦＩ）値の変化によって指摘されるとおり、抗ＳＥＺ６染色はＦＭＯより高かった。これらのデータは、ＳＥＺ６タンパク質が様々なＮＴＸ腫瘍の表面上で発現し、従って抗ＳＥＺ６抗体を使用した調節を受け易いことを示唆している。
【０５９０】
実施例１２
様々な腫瘍におけるＳＥＺ６タンパク質の発現
様々な腫瘍に関連するＳＥＺ６  ｍＲＮＡ転写物レベルの上昇を考慮して、ＮＴＸ腫瘍においてＳＥＺ６タンパク質の発現が対応して増加することを実証する研究を行った。ＳＥＺ６タンパク質発現を、（ｉ）ＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォーム（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＬＬＣ）を使用した電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ）ＳＥＺ６サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ；及び（ｉｉ）免疫組織化学染色により検出した。
【０５９１】
マウスからＮＴＸ腫瘍を切除し、ドライアイス／エタノールで急速冷凍した。解凍した腫瘍断片にタンパク質抽出緩衝液（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を添加し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して腫瘍を微粉砕した。ライセートを遠心分離（２０，０００ｇ、２０分、４℃）により清澄化し、各ライセート中の総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸を使用して定量化した。タンパク質ライセートはアッセイまで−８０℃で保存した。正常組織ライセートはＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入した。
【０５９２】
精製組換えＳＥＺ６タンパク質（実施例５）を使用して作成した標準タンパク質濃度曲線から値を内挿することにより、ライセート試料のＳＥＺ６タンパク質濃度を決定した。ＳＥＺ６タンパク質標準曲線及びタンパク質定量化アッセイは、以下のとおり実施した：
【０５９３】
ＭＳＤ標準プレートを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの３０μＬのＳＣ１７．１７抗体により４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１５０μＬ  ＭＳＤ３％ブロッカーＡ溶液において１時間ブロックした。プレートを再びＰＢＳＴで洗浄した。次にＳＣ１７．３６抗体をＭＳＤスルホタグとコンジュゲートし、ＭＳＤ１％ブロッカーＡ中０．５μｇ／ｍＬの２５μＬのタグ標識ＳＣ１７．３６を、洗浄したプレートに添加した。ＭＳＤ１％ブロッカーＡ中２５μＬの１０×希釈ライセート又はＭＳＤ１％ブロッカーＡ含有１０％タンパク質抽出緩衝液中の段階希釈した組換えＳＥＺ６標準もまたウェルに添加し、２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。界面活性剤を含むＭＳＤ読取り緩衝液Ｔを水中に１×希釈し、各ウェルに１５０μＬを添加した。プレートを、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００で統合ソフトウェア分析プログラムを使用して読み取り、標準曲線から内挿することによってＮＴＸ試料中のＳＥＺ６濃度を求めた。次に値を総タンパク質濃度で除し、総ライセートタンパク質１ミリグラム当たりのＳＥＺ６のナノグラム数を得た。得られた濃度を図１２Ｂに示し、ここで各点は、単一のＮＴＸ腫瘍株から得られたＳＥＺ６タンパク質濃度を表す。各点は単一のＮＴＸ株から得られるが、ほとんどの場合、同じＮＴＸ株から複数の生体試料を試験し、値を平均してデータ点を提供した。
【０５９４】
図１２Ｂは、正常組織ライセートと比較して、選択された腎臓、卵巣及びＬＣＮＥＣ腫瘍試料が中程度のＳＥＺ６タンパク質発現を呈した一方、ＳＣＬＣ腫瘍で最も高いＳＥＺ６タンパク質発現が見られたことを示す。正常ヒト脳及び眼ライセートを除く全ての正常組織ライセートが、ＳＥＺ６タンパク質発現に関して陰性であった。
【０５９５】
ＰＤＸ腫瘍に対して免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施し、ＳＥＺ６が特定のＰＤＸ腫瘍の表面上で発現することを確認した；及びそれにより、腫瘍構造におけるＳＥＺ６タンパク質の位置を決定した。
【０５９６】
ＳＥＺ６に対するマウスモノクローナル一次抗体（クローン１７．１４０）、マウス特異的ビオチンコンジュゲート二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼとカップリングされたアビジン／ビオチン複合体、及びＤＡＢ検出が含まれた間接検出方法を使用して（Ｎａｋｅｎｅ  ＰＫ  １９６８；１６：５５７−６０）、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に対するＩＨＣを実施した。異種移植ＰＤＸ腫瘍を染色する際は、マウスＩｇＧ遮断剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号ＰＫ−２２００）を使用した。ＳＣ１７．１４０がＩＨＣに適切であることを、当該技術分野において公知のとおり調製したナイーブＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットと比較して、ＳＥＺ６を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットの切片で特異的に染色されることを示すことにより、検証及び確認した。特異性はさらに、ヒトＳＥＺ６を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞上の５モル過剰の精製組換えＳＥＺ６及びＩＨＣによりＳＥＺ６を発現することが示された異種移植腫瘍による競合シグナルにより確認された（データは示さず）。図１６は、ＳＣＬＣ  ＮＴＸ腫瘍においてＩＨＣにより計測したときのＳＥＺ６発現を示す。０（陰性）から３（強い染色）までの染色強度を考慮に入れて染色強度をスコア化した。結果は、試験したＳＣＬＣ  ＮＴＸ腫瘍の６４％がＳＥＺ６を発現したことを示す。
【０５９７】
これらのデータは、上記のＳＥＺ６発現に関するｍＲＮＡ転写データ（実施例４）、及びＳＥＺ６の細胞表面タンパク質発現（実施例１１）と併せて、ＳＥＺ６決定因子が治療介入に魅力的な標的を提供するという命題を強力に裏付けている。
【０５９８】
実施例１３
腫瘍開始細胞集団の高濃度化
腫瘍細胞は２種類の細胞亜集団、すなわち非腫瘍原性細胞（ＮＴＧ）と腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）とに大別することができる。ＴＩＣは、免疫不全マウスに移植されると腫瘍を形成する能力を有する。癌幹細胞（ＣＳＣ）はＴＩＣのサブセットであり、多系列分化能を維持しながら無限に自己複製することが可能である。ＳＥＺ６発現を腫瘍形成能の増強と相関付けることができるかどうかを決定するため、全トランスクリプトーム配列決定法、フローサイトメトリー及び腫瘍形成能（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）アッセイを実施した（これらは全て以下に記載する）。
【０５９９】
様々な腫瘍試料におけるＳＥＺ６発現の全トランスクリプトーム解析を実施例１に記載するとおり実施した。様々な腫瘍において幹細胞のマーカーであることが示されているＣＤ３２４の発現に基づきＣＳＣを同定した（ＰＣＴ出願第２０１２／０３１２８０号明細書を参照）。図６Ａの結果は、２つのＳＣＬＣ  ＮＴＸ腫瘍株（ＬＵ８６及びＬＵ９５）から単離したＮＴＧ細胞と比較して、ＣＳＣにおいてＳＥＺ６  ｍＲＮＡ発現が上昇したことを示している。
【０６００】
ＮＴＸ肺腫瘍由来の細胞に対して、本質的に実施例１１に記載されるとおりフローサイトメトリーを実施した。ＬＵ８６、ＬＵ１１７及びＬＵ６４細胞を、それぞれＣＳＣ集団のマーカーであるＣＤ３２４（ＰＣＴ出願第２０１２／０３１２８０号明細書を参照）と、抗ＳＥＺ６抗体ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．２８又はＳＣ１７．４２とで共染色し、これらの集団でＳＥＺ６が差次的に発現しているかどうかを決定した。図１３Ｂに示されるとおり、ＣＤ３２４及びＳＥＺ６の両方が染色陽性のＬＵ８６、ＬＵ１１７及びＬＵ６４細胞（黒色の実線）は、ＳＥＺ６のみ染色陽性の細胞（黒色の点線）と比較してさらに右にシフトしており、ＳＥＺ６がＮＴＧ細胞集団と比較してＣＳＣでより高度に発現することを示している。バルク集団アイソタイプ対照は、灰色で塗り潰されたヒストグラムとして示す（ＭＯＰＣ＝ＩｇＧ１）。
【０６０１】
細胞表面ＳＥＺ６発現を腫瘍生成能力の増強と相関付けることができるかどうかを決定するため、腫瘍形成能試験を実施した。当該技術分野で認められている酵素消化法を使用して、ＮＴＸ腫瘍試料を解離して懸濁液中に分散させた（例えば、本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／０２９２４１４号明細書を参照）。これらのＮＴＸ株から解離した細胞調製物を、マウスＣＤ４５、Ｈ２ｋＤ、ヒトＣＤ３２４、及びヒトＳＥＺ６のクローンＳＣ１７．４２を特異的に認識する蛍光コンジュゲート抗体で染色した。両方ともマウスＣＤ４５又はＨ２ｋＤによる染色がないことに基づき（細胞調製物からマウス細胞が枯渇していることが）同定された、ヒト細胞の２つのサブセットを、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して単離した。一方のサブセットをＣＤ３２４及びＳＥＺ６共発現に基づき単離すると同時に、他方のサブセットをＣＤ３２４＋ＳＥＺ６−表現型に基づき単離した。続いて個別のマーカー濃縮亜集団を雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスに対し、皮下注射によって乳房脂肪パッドにマウス当たり約５０細胞の用量で移植した。
【０６０２】
図１４Ａ及び図１４Ｂは、患者から採取したＮＳＣＬＣ腫瘍に由来する代表的なＮＴＸ細胞株を使用して実施したかかる実験の結果を示す。図１４Ａは、親腫瘍のｍＣＤ４５−Ｈ２ｋＤ−サブセットの分布及び選別された推定腫瘍原性細胞を示す散布図である（ＣＤ３２４及びＳＥＺ６を使用してゲーティングした）。図１４Ｂは、免疫不全マウスへの選別された細胞亜集団の移植により生じた腫瘍容積計測値をグラフで示す。括弧内の値は、移植したマウス当たりに生じた腫瘍の数を示す。
【０６０３】
顕著なことに、図１４のデータは、腫瘍形成能が、高いＣＤ３２４レベルと併せて、ＳＥＺ６を発現する細胞の亜集団と一貫して関連していたことを示している。逆に、これらの同じデータから、ＳＥＺ６を発現しないか、又はその発現レベルが低い腫瘍細胞の腫瘍原性が、それらが高い又は陽性の対応物と比べてはるかに低かったことが実証される。生成されたデータに基づくと、意外にも、ＣＤ３２４＋ＳＥＺ６＋表現型を発現する腫瘍細胞の亜集団が、概して腫瘍形成能の大部分を含むことが見出され、ＳＥＺ６が腫瘍原性細胞の調整に有効な治療標的を提供し得ることが示唆される。
【０６０４】
実施例１４
ＳＥＺ６モジュレーターはＳＥＺ６発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への細胞傷害剤の送達を促進する
本発明のＳＥＺ６モジュレーターが生細胞への細胞傷害剤の送達を媒介できることを実証するため、サポリン毒素に結合した選択されたＳＥＺ６抗体モジュレーターを使用してインビトロ細胞死滅アッセイを実施した。サポリンは、細胞質のリボソームを不活性化することにより細胞を死滅させる。従って以下のアッセイを使用した細胞死は、ＳＥＺ６抗体がインターナライズして標的細胞の細胞質に細胞傷害剤を送達することができることを示すものである。
【０６０５】
サポリンに共有結合的に連結した抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ断片（「Ｆａｂ−サポリン」）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＩＴ−４８）を、非標識ＳＥＺ６抗体と組み合わせて、ヒトＳＥＺ６を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（実施例５を参照）と共にインキュベートした。得られたサポリン複合体がインターナライズして細胞を死滅させる能力を、７２時間後に細胞生存度を計測することにより測定した。
【０６０６】
具体的には、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中のウェル当たり５００細胞を、９６ウェル組織培養処理済みプレートに播き、翌日、抗体及び毒素を添加した。ヒトＳＥＺ６を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、対照（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）又は精製マウスＳＥＺ６モジュレーターにより１００、５０又は１０ｐＭの濃度で、２ｎＭ  Ｆａｂ−サポリンと共に処理した。細胞を３日間培養し、その後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示どおり使用して生細胞数を計数した。サポリンＦａｂ断片を含む細胞を含有する培養物を使用した未加工のルミネセンス単位（ＲＬＵ）を１００％基準値として設定し、それに従い他の全てのカウントを計算した（正規化ＲＬＵ又は「％生細胞」と称される）。図１５Ａは、試験したＳＥＺ６モジュレーターの多くがＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の死滅を濃度依存的に媒介したことを示す。図１５Ａの最初の３行の結果により示されるとおり、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ１）は細胞カウントに影響を及ぼさなかった（ＮＤ＝未検）。
【０６０７】
このアッセイは、ＳＥＺ６特異抗体が細胞表面に結合すると、さらなる架橋結合や二量体化の必要なしにインターナリゼーションが起こり得ることを実証している。
【０６０８】
実施例１５
ＳＥＺ６モジュレーターはインビトロで肺腫瘍細胞において細胞傷害性を媒介する
実施例１４の結果を補強し、ＳＥＺ６モジュレーターが（工学的改変細胞とは対照的に）毒素インターナリゼーション及びヒト腫瘍細胞の細胞死滅を媒介できるかどうかを決定するため、マウス系統−枯渇ＮＴＸ細胞（ｍｏｕｓｅ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ＮＴＸ  ｃｅｌｌｓ）を播き、続いて抗ＳＥＺ６抗体及びＦａｂ−サポリンに曝露した。
【０６０９】
ＮＴＸ腫瘍を単一細胞懸濁物に解離し、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、当該技術分野において公知のとおりの成長因子を補充した無血清培地に播いた。細胞を３７℃／５％ＣＯ２／５％Ｏ２で１日間培養した後、実施例１４に記載されるとおり対照（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）又はマウスＳＥＺ６モジュレーター及びＦａｂ−サポリンで処理した。７日後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを使用して残存生細胞数を定量化することにより、モジュレーターの媒介によるサポリン細胞毒性を評価した。
【０６１０】
図１５Ｂに見られるとおり、ＮＳＣＬＣ腫瘍であるＬＵ３７、及びＳＣＬＣ腫瘍であるＬＵ８０をＳＣ１７．６（ＳＣ１７．１６の複製）及びＳＣ１７．３３  ＳＥＺ６モジュレーターに曝露したとき、腫瘍細胞数の低下が明らかであった。同様に、ＳＣＬＣ腫瘍であるＬＵ１００を４つのＳＥＺ６モジュレーターＳＣ１７．６、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．３３及びＳＣ１７．３４に５０及び５００ｐＭで曝露したとき、腫瘍細胞の減少が生じた。対照的に、アイソタイプ対照抗体は処理後の生細胞数に影響を及ぼさなかった。
【０６１１】
このデータは、本明細書に記載される例示的抗体が細胞表面上のＳＥＺ６抗原に結合可能であり、且つ細胞死をもたらす細胞傷害性ペイロードの送達を促進することを実証しているのみならず、上記のデータはまた、複数の抗ＳＥＺ６抗体が様々なＮＴＸ腫瘍細胞の死滅を媒介できることも実証している。
【０６１２】
実施例１６
ＳＥＺ６抗体−薬物コンジュゲートの調製
実施例１４及び１５のサポリンによるインビトロ死滅アッセイに基づき、及び本発明の多用途性をさらに実証するため、上記に記載したとおりのＭ−［Ｌ−Ｄ］構造を有する抗ＳＥＺ６抗体薬コンジュゲートを調製した。すなわち、共有結合的に連結した細胞傷害剤を使用して抗ＳＥＺ６抗体薬コンジュゲート（ＳＥＺ６−ＡＤＣ）を調製した。より具体的には、本明細書に記載されるとおりの、又は下掲の参考文献にあるリンカーと、本開示のモジュレーターに共有結合した選択されたピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体とを含むＳＥＺ６−ＡＤＣを調製した（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号明細書及び同第２０１２／００７８０２８号明細書及び米国特許第６，２１４，３４５号明細書（この各々が全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０６１３】
引用される文献を踏まえて、当該技術分野で認められている技法を用いてＰＢＤ薬物−リンカーの組み合わせを合成し、精製した。様々なＰＢＤ二量体及びリンカーを用いて選択された薬物−リンカーの組み合わせを作製したが、各リンカー単位は、遊離スルフヒドリルを有する末端マレイミド部分を含んだ。これらのリンカーを使用して、トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）によるｍＡｂの部分的還元と、続いて還元型Ｃｙｓ残基とマレイミド−リンカーペイロードとの反応により、コンジュゲーションを調製した。
【０６１４】
より詳細には、選択されたＳＥＺ６抗体モジュレーターを１．３ｍｏｌ  ＴＣＥＰ／ｍｏｌ  ｍＡｂにより、２５ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液中、３７℃で２時間還元した。反応を１５℃に放冷し、ＤＭＳＯ中のリンカーペイロードを２．７ｍｏｌ／ｍｏｌ  ｍＡｂの比で加え、続いて追加量のＤＭＳＯを加えて終濃度を６％（ｖ／ｖ）とした。反応は１時間進行させた。未反応の薬物−リンカーを、過剰量のＮ−アセチルシステインを添加することによりキャッピングした。次にＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣシステム（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＥＺ６−ＡＤＣ（又はＳＣ１７−ＡＤＣ）をイオン交換カラムにより精製し、凝集した高分子量抗体、共溶媒及び小分子を取り除いた。次に溶出したＡＤＣを、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）により製剤化緩衝液に緩衝液交換し、続いて濃度を調整し、デタージェントを添加した。最終的なＡＤＣのタンパク質濃度（ＵＶ計測による）、凝集（ＳＥＣ）、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによる薬物対抗体比（ＤＡＲ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ＨＰＬＣによるコンジュゲートされなかった抗体の存在、ＲＰ  ＨＰＬＣによる非タンパク質性物質及びＳＥＺ６発現細胞株を使用したインビトロ細胞傷害性を分析した。
【０６１５】
上記の手順、又は実質的に同様の方法を使用して、種々のＳＥＺ６モジュレーター及びＰＢＤ二量体を含む複数のＡＤＣ（すなわち、Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ）を生成し、種々のインビボ及びインビトロモデルで試験した。これらの実施例及び本開示の目的上、かかるＡＤＣは、概してＳＥＺ６−ＡＤＣ又はＳＣ１７−ＡＤＣと称され得る。個別のＡＤＣは、抗体（例えばＳＣ１７．１７）及び具体的なリンカー−細胞傷害剤の名称ＡＤＣ１、ＡＤＣ２等に従い命名される。従って、本発明と適合性のある例示的なモジュレーターは、ＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１又はＳＣ１７．２４−ＡＤＣ２を含んでもよく、ここでＡＤＣ１及びＡＤＣ２は、個々のＰＢＤ二量体細胞傷害剤（及び場合によりリンカー）を表す。
【０６１６】
最初のベンチマークとして、ＳＥＺ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に曝露したときのｈＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１のインビトロ細胞傷害性を１１ｎＭのＩＣ５０で計測した（データは示さず）。
【０６１７】
実施例１７
コンジュゲート型ＳＥＺ６モジュレーターはインビトロで肺腫瘍細胞において細胞傷害性を媒介する
上記の実施例１６で生成されたＡＤＣを試験して、それがインビトロでの毒素インターナリゼーション及び一次ヒト腫瘍細胞の細胞死滅を媒介することができるかどうかを決定した。
【０６１８】
マウス系統−枯渇ＮＴＸ腫瘍細胞を、Ｆａｂ−サポリンを加えなかったことを除き実施例１５に記載されるのと同じ方法を用いて、抗ＳＥＺ６  ＡＤＣ又はマウスアイソタイプ対照（ｍｓＩｇＧ１）に曝露した。ＳＣＬＣ腫瘍であるＬＵ６４、及びＮＥＴ卵巣腫瘍であるＯＶ２６を、抗ＳＥＺ６  ＡＤＣ（ＳＣ１７．２４−ＡＤＣ２、ＳＣ１７．２８−ＡＤＣ２及びＳＣ１７．３４−ＡＤＣ２）で処理したとき、対照ｍｓＩｇＧ１と比較して生細胞率低下の増進が観察された（図１７Ａ）。ｍｓＩｇＧ１は高濃度で細胞にとって細胞傷害性であり得るが、試験した３つ全ての抗ＳＥＺ６  ＡＤＣがより強力であったことから、ＰＢＤ細胞毒に対する全般的な反応というよりむしろ、ＳＥＺ６に対する免疫特異的な反応が示される。
【０６１９】
実施例１８
コンジュゲート型ＳＥＺ６モジュレーターはインビボ腫瘍成長を抑制する
上記の実施例１６で生成されたＡＤＣを試験することにより、免疫不全マウスでヒトＮＴＸ腫瘍成長を縮小させ及び抑制するその能力を実証した。
【０６２０】
患者由来のＮＴＸ腫瘍を、当該技術分野で認められている技法を用いて、雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスの側腹部において皮下成長させた。腫瘍容積及びマウス体重を週２回モニタした。腫瘍容積が１５０〜２５０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に治療群に割り当て、ＳＣ１７−ＡＤＣ１又は抗ハプテン対照ＭｓＩｇＧ１−ＡＤＣ１を腹腔内注射した。マウスには、７日間の期間にわたり１ｍｇ／ｋｇの注射を３回投与した（図１７Ｂ並びに図１８Ａ及び図１８Ｂにおける縦の線により示される）。処置後、腫瘍が８００ｍｍ３を超えるか、又はマウスが病気になるまで、腫瘍容積及びマウス体重をモニタした。
【０６２１】
図１７Ｂは、抗ＳＥＺ６  ＡＤＣがマウスにおいてＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ８６）及びＬＣＮＥＣ（ＬＵ５０）のインビボ成長を阻害可能であることを示す。ＬＵ８６の場合、試験した５つのＡＤＣ（ＳＣ１７．３−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．２４−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．２６−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．２８−ＡＤＣ１及びＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１）が、ある場合には治療後１２０日を超えて持続する長期寛解を生じた。詳細には、ＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１治療により、この用量での試験期間中にわたり腫瘍成長が阻害された一方、ＳＣ１７．２４−ＡＤＣ１は、増殖抑制期間が５０日を超える有意な腫瘍成長阻害をもたらした。同様に、５つの例示的なＡＤＣ（ＳＣ１７．３−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．２４−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１及びＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１）によるＬＵ５０の治療により、ＳＣ１７．４６では３５日間も持続する腫瘍成長抑制がもたらされた。さらに、ＳＣ１７−ＡＤＣ１で治療したマウスは、典型的に免疫不全の腫瘍担持ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで認められるものを超える有害な健康への作用は呈しなかった。これらの結果は、本開示のＡＤＣを使用して腫瘍成長を有効に抑制し得ること、及びＳＣ１７モジュレーターの結合の特質がインビボ有効性に影響を及ぼし得ることを示唆している。
【０６２２】
より直接的には、様々なコンジュゲート型モジュレーターがインビボで長期にわたり腫瘍成長を劇的に遅延させ又は抑制する能力が、増殖性障害の治療に対する治療標的としてのＳＥＺ６の使用をさらに実証する。
【０６２３】
実施例１９
ヒト化コンジュゲート型ＳＥＺ６モジュレーターはインビボで腫瘍成長を抑制する
マウス抗ＳＥＺ６  ＡＤＣモジュレーターで得られた目覚ましい結果を考慮して、インビボでのＳＣＬＣ腫瘍の治療における例示的ヒト化抗ＳＥＺ６  ＡＤＣモジュレーターの有効性を実証するさらなる実験を実施した。実施例１６に記載されるとおり作製した、選択されたヒト化抗ＳＥＺ６  ＡＤＣ（モジュレーターｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．３４及びｈＳＣ１７．４６を使用）、及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照ＡＤＣ（ｈｕＩｇＧ１）を、様々なＮＴＸ腫瘍を担持する免疫不全マウスに投与した。投与レジメンは実施例１８に記載するものと同じであった。
【０６２４】
これらの実験の結果を図１８Ａ及び図１８Ｂに提供する。４種のＳＣＬＣ腫瘍において、ヒト化抗ＳＥＺ６  ＡＤＣの投与により腫瘍塊の完全且つ持続的な消失が達成された。図１８Ａは、ｈＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１及びｈＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１によるＬＵ８０腫瘍の減少；及びｈＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１、ｈＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１及びｈＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１によるＬＵ６４腫瘍の消失を示す。図１８Ｂは、ｈＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１及びｈＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１によるＬＵ１１７腫瘍の減少；及びｈＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１及びｈＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１によるＬＵ１１１腫瘍の減少を示す。これらの試験の４例中３例で５０日間超にわたり腫瘍再発がないことが観察された。各試験につき、対照動物の腫瘍容積及びマウス体重を、腫瘍が８００ｍｍ３を超えるか、又はマウスが病気になるまでモニタした。
【０６２５】
これらの結果は、種々の腫瘍の成長を有効に遅延させる様々なヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの意外な適用性を実証している。
【０６２６】
当業者は、本発明がその趣旨又は中心的な特質から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得ることをさらに理解する。本発明の上記の説明がその例示的実施形態を開示しているに過ぎない点で、他の変形例が本発明の範囲内にあるものとして企図されることが理解されるべきである。従って、本発明は、本明細書に詳細に説明されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、本発明の範囲及び内容を指し示すものとしては、添付の特許請求の範囲が参照されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
2018127469.tif 000064
【図５Ｊ】
2018127469.tif 000065
【図６Ａ】
2018127469.tif 000066
【図６Ｂ】
2018127469.tif 000067
【図７Ａ】
2018127469.tif 000068
【図７Ｂ】
2018127469.tif 000069
【図７Ｃ】
2018127469.tif 000070
【図７Ｄ】
2018127469.tif 000071
【図７Ｅ】
2018127469.tif 000072
【図７Ｆ】
2018127469.tif 000073
【図８Ａ】
2018127469.tif 000074
【図８Ｂ】
2018127469.tif 000075
【図９Ａ−９Ｂ】
2018127469.tif 000076
【図１０Ａ−１】
2018127469.tif 000077
【図１０Ａ−２】
2018127469.tif 000078
【図１０Ａ−３】
2018127469.tif 000079
【図１０Ａ−４】
2018127469.tif 000080
【図１０Ａ−５】
2018127469.tif 000081
【図１０Ｂ−１】
2018127469.tif 000082
【図１０Ｂ−２】
2018127469.tif 000083
【図１０Ｂ−３】
2018127469.tif 000084
【図１０Ｂ−４】
2018127469.tif 000085
【図１０Ｂ−５】
2018127469.tif 000086
【図１１Ａ】
2018127469.tif 000087
【図１１Ｂ】
2018127469.tif 000088
【図１２Ａ】
2018127469.tif 000089
【図１２Ｂ】
2018127469.tif 000090
【図１３Ａ】
2018127469.tif 000091
【図１３Ｂ】
2018127469.tif 000092
【図１４Ａ−１４Ｂ】
2018127469.tif 000093
【図１５Ａ−１】
2018127469.tif 000094
【図１５Ａ−２】
2018127469.tif 000095
【図１５Ｂ】
2018127469.tif 000096
【図１６】
2018127469.tif 000097
【図１７Ａ】
2018127469.tif 000098
【図１７Ｂ】
2018127469.tif 000099
【図１８Ａ】
2018127469.tif 000100
【図１８Ｂ】
2018127469.tif 000101
【配列表】
2018127469000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月18日(2018.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＳＥＺ６モジュレーター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ａ−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ａ−１】
2018127469.tif 000102
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ａ−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ａ−２】
2018127469.tif 000103
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ａ−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ａ−３】
2018127469.tif 000104
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ａ−４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ａ−４】
2018127469.tif 000105
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ａ−５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ａ−５】
2018127469.tif 000106
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｂ−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｂ−１】
2018127469.tif 000107
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｂ−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｂ−２】
2018127469.tif 000108
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｂ−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｂ−３】
2018127469.tif 000109
【外国語明細書】
2018127469000001.pdf