【事件の表示】
　特許第３１７１５９５号「ルシフェラーゼ組成物及び方法」の請求項１ないし１３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１７１５９５号の請求項１ないし１３に係る特許を維持する。
【理　由】
 ［１］手続の経緯
　本件特許3171595号の請求項１乃至１３に係る発明についての出願は、1991年9月9日に国際出願された（PCT/US91/06474、優先権主張1990.9.10,US）特願平3-517581号の特許出願であって、平成13年3月23日に特許権の設定登録がなされ、その後、その特許について、特許異議申立人土井　清暢により特許異議の申立てがなされたところ、当審において、まず平成14年4月16日付で取消理由を通知し、審尋後、平成16年6月4日付再度の手交による取消理由通知に対して、同日付で明細書の訂正請求がなされたものである。
　
［２］訂正の適否についての判断
１．訂正の内容
　特許権者が求めている訂正の内容は以下のa乃至eのとおりである。
　
（１）訂正事項a
　特許請求の範囲の請求項３の(a)の
「更に補酵素A、補酵素A以外のチオール試薬及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれるチオール試薬を含み、」を
「更に補酵素Aと補酵素A以外のチオール試薬との組み合わせを含み、ここで補酵素A以外のチオール試薬は5mMから200mMの濃度で存在し、」と訂正する。
（２）訂正事項b
　特許請求の範囲の請求項４の
「(b) 補酵素A、補酵素A以外のチオール試薬及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれるチオール試薬を含み、」を
「(b) 補酵素Aと補酵素A以外のチオール試薬との組み合わせを含み、ここで補酵素A以外のチオール試薬は5mMから200mMの濃度で存在し、」と訂正する。
（３）訂正事項c
　特許請求の範囲の請求項７の
「補酵素A、補酵素A以外のチオール試薬及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれるチオール試薬」を
「5mMから200mMの濃度の補酵素A以外のチオール試薬」と訂正する。
（４）訂正事項d
　特許請求の範囲の請求項８の
「チオール試薬として補酵素Aを」を
「補酵素Aを更に」と訂正する。
（５）訂正事項e
　特許請求の範囲の請求項９の
「更に補酵素A以外のチオール試薬を5〜200mM」を
「補酵素A以外のチオール試薬を20〜200mM」と訂正する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　上記訂正事項a、bは、それぞれ訂正前の請求項３、４に記載の発明において用いられるチオール試薬を規定する択一的記載を「補酵素Aと補酵素A以外のチオール試薬との組合わせ」へと限定し、さらにかかる組合わせにかかる補酵素A以外のチオール試薬の濃度を「5mMから200mM」へと限定するものである。かかる訂正は、択一的記載の選択肢の一つに限定したものであり、また特許設定登録時の請求項１における発明特定事項である補酵素A以外のチオール試薬の濃度をそのまま請求項３、４に加えたものである。
　上記訂正事項cは、訂正前の請求項７に記載の発明において用いられるチオール試薬を規定する択一的記載を「補酵素A以外のチオール試薬」へと限定し、さらに特許設定登録時の請求項１における発明特定事項である補酵素A以外のチオール試薬の濃度をそのまま請求項７に加えたものである。
　上記訂正事項eは、訂正前の請求項９の補酵素A以外のチオール試薬の濃度をさらに限定するものであり、願書に添付した明細書第28頁第12行目を根拠とするものである。
　よって、訂正事項a、b、c、eは、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当し、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、また、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではない。
　上記訂正事項dは、上記訂正事項cの訂正に伴って、請求項７を引用する請求項８の記載を適合させるものであるから、明瞭でない記載の釈明を目的とする明細書の訂正に該当し、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、また、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではない。
　
３．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法等の一部を改正する法律（平成6年法律第116号）附則第6条第1項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第120条の4第3項において準用する平成6年法律第116号による改正前の特許法第126条第1項ただし書、第2項及び第3項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
［３］特許異議申立てについての判断
１．特許異議申立ての理由の概要
　特許異議申立人土井　清暢は、訂正前の本件請求項３、４及び１１乃至１３に記載された発明は、甲第１号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に該当するものであるか、または、甲第１乃至６号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるので、特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであるから、当該特許は取り消されるべきものである旨主張している（以下、「主張１」という。）。
　また、訂正前の本件請求項１、５に記載された発明は、甲第１、２、４及び５号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるので、特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであるから、当該特許は取り消されるべきものである旨主張している（以下、「主張２」という。）。
　さらに、訂正前の本件請求項２、６乃至１０に記載された発明は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるので、特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであるから、当該特許は取り消されるべきものである旨主張している（以下、「主張３」という。）。
　
甲第１号証：Journal of Applied Biochemistry, 1980, Vol.2, p.469-479
甲第２号証：Analytical Biochemistry, 1988, Vol.171, p.404-408
甲第３号証：Biochimica et Biophysica Acta, 1958, Vol.27, p.519-532
甲第４号証：Enzyme and Microbial Technology, 1984, Vol.6, p.482-490
甲第５号証：特表昭63-501571号公報
甲第６号証：Advanced in Enzymology, 1963, Vol.25, p.131-144
　
２．本件発明
　上記［２］で示したとおり、上記訂正は認められるから、本件請求項１乃至１３に係る発明は、平成16年6月4日付けの訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１乃至１３に記載された事項により特定される下記のとおりのものである（以下、それぞれを「本件発明１」乃至「本件発明１３」という。）。
【請求項１】サンプル中の甲虫ルシフェラーゼを検出する方法であって、
（a）溶液と甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルとを混和して混合液を製作する工程、ここで該溶液はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において有効な活性を示すために十分な濃度のルシフェリン、更に5mMから200mMの濃度の補酵素A以外のチオール試薬を含み、そしてルシフェラーゼを含まず、該混合液はさらにアデノシン三リン酸およびマグネシウムイオンを含む；
（b）得られた混合液からの発光を測定する工程；
から成る検出方法。
【請求項２】混合液が更に補酵素Ａを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】サンプル中の甲虫ルシフェラーゼを検出する方法であって、
（a）溶液と甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルとを混和して混合液を製作する工程、ここで該溶液はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において有効な活性を示すために十分な濃度のルシフェリン、更に補酵素Aと補酵素A以外のチオール試薬との組合わせを含み、ここで補酵素A以外のチオール試薬は5mMから200mMの濃度で存在し、そしてルシフェラーゼを含まず、該混合液はさらにアデノシン三リン酸およびマグネシウムイオンを含む；
（b）得られた混合液からの発光を測定する工程；
から成る検出方法。
【請求項４】（a）ルシフェリン
（b）補酵素Aと補酵素A以外のチオール試薬との組合わせ
を含み、ここで補酵素A以外のチオール試薬は5mMから200mMの濃度で存在し、ルシフェラーゼを含まないルシフェラーゼの検出用分析試薬。
【請求項５】（a）ルシフェリン
（b）5mMから200mMの濃度の補酵素A以外のチオール試薬
から成り、かつルシフェラーゼを含まないルシフェラーゼ検出用分析試薬。
【請求項６】更に補酵素Aを含む請求項５に記載の分析試薬。
【請求項７】一種類以上の溶液中に存在する反応組成物を含むサンプル中の甲虫ルシフェラーゼを分析する検査キットであり、該反応組成物がルシフェリンと、5mMから200mMの濃度の補酵素Ａ以外のチオール試薬とを含み、ルシフェラーゼを含まないことを特徴とするキット。
【請求項８】補酵素Aを更に含む請求項７に記載の検査用キット。
【請求項９】補酵素A以外のチオール試薬を20mMから200mMの濃度で含む請求項７または８に記載の検査用キット。
【請求項１０】反応組成物が更にアデノシン三リン酸およびマグネシウムイオンを含む請求項７から９のいずれか１項に記載の検査用キット。
【請求項１１】補酵素A以外のチオール試薬がジチオトレイトールである請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】補酵素A以外のチオール試薬がジチオトレイトールである請求項４から６のいずれか１項に記載の分析試薬。
【請求項１３】補酵素A以外のチオール試薬がジチオトレイトールである請求項９に記載の検査用キット。
　
３．判断
（１）「主張１」について：
　異議申立人は、訂正前の本件請求項３、４及び１１乃至１３に対して、甲第１号証に記載された発明であるか、または、甲第１乃至６号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明することができたものである旨主張しているが、以下に述べるように、当該主張は採用できない。
　
(1-1)　本件発明３について
　甲第１号証には、甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェリン、0.5mM ジチオトレイトール（DTT；本件発明３における「補酵素A以外のチオール試薬」に相当する。）、アデノシン三リン酸(ATP)及びマグネシウムイオンを含む反応系において発光反応を行うことにより、ATPを検出することが記載されている。
　しかしながら、本件発明３は、そもそもATPではなくルシフェラーゼを検出する方法である点で甲第１号証に記載された発明と異なるばかりか、甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルと混合するための溶液であることから当然にルシフェラーゼを含まない溶液に対して、補酵素A及び5mMから200mMの濃度の補酵素A以外のチオール試薬を存在させる点で、明らかに甲第１号証に記載された発明と相違する。
　したがって、本件発明３は、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。
　
　また、ルシフェラーゼを含まない溶液に対して、補酵素Aと共に補酵素A以外のチオール試薬を併用することはもちろん、補酵素A以外のチオール試薬を5mMから200mMの濃度で存在させることすら甲第２乃至６号証のいずれにも教示されていない。
　そして、本件発明３においては、ルシフェラーゼを含まない溶液に対して、補酵素A以外のチオール試薬を5mMから200mMの濃度で存在させることにより、明細書に記載される優れた「発光速度改善効果」が奏せられるばかりか、両チオール試薬を併用したことによる相乗効果（第１、２及び４図等参照）もさらに奏せられたものと認められる。
　したがって、本件発明３は、甲第１号証と甲第２乃至６号証に記載された発明とを組み合わせたとしても、到底、当業者が容易に発明することができたものということはできない。
　
(1-2)　本件発明４について：
　本件発明４における「ルシフェラーゼの検出用分析試薬」は、本件発明３における「溶液」に相当するから、上記(1-1)と同様の理由で、甲第１号証に記載された発明であるとも、また、甲第１乃至６号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明することができたものであるともいえない。
　
(1-3)　本件発明１１乃至１３について：
　本件発明１１乃至１３は、それぞれ本件発明１乃至３、４乃至６及び９における「補酵素A以外のチオール試薬」を「DTT」に限定したものであるが、甲第１号証に記載される「補酵素Ａ以外のチオール試薬」はまさに当該「DTT」である。　
　そして、本件発明１乃至３、４乃至６及び９は、いずれもルシフェラーゼを含まない溶液に対して、補酵素A以外のチオール試薬を5mMから200mM（本件発明９では20mMから200mM）の濃度で存在させることを必須の要件としており、甲第２乃至６号証の記載事項はこの点を教示するものではない。
　本件発明１乃至３、４乃至６及び９においては、この点により明細書に記載されるような優れた「発光速度改善効果」という各甲号証からは予測できない効果が奏せられたものと認められる。
　したがって、本件発明１１乃至１３も、甲第１号証に記載された発明であるとも、また、甲第１乃至６号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明することができたものであるとも、いうことはできない。
　
（２）主張２について：
　異議申立人は、訂正前の本件請求項１、５に記載された発明は、甲第１、２、４及び５号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明することができたものである旨主張しているが、以下に述べるように当該主張は採用できない。
(2-1)　本件発明１について：
　本件発明１は、甲第１号証と比較すると、本件発明３の場合と同様に、まずATPの検出ではなくルシフェラーゼを検出する方法である点で相違するだけでなく、甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルと混合するためのルシフェラーゼを含まない溶液に対して、補酵素A以外のチオール試薬を5mMから200mMの濃度で補酵素A以外のチオール試薬を存在させる点で、明らかに相違している。
　なるほど、甲第１号証に記載された発明は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用するものであることから、検出対象をATPに代えて甲虫ルシフェラーゼとすることは、当業者であれば容易に想到し得る可能性はあり、そのような場合には、反応系を構成するルシフェラーゼ以外の成分を、測定対象であるルシフェラーゼを含むサンプルに添加するから、サンプルと混合する溶液中に「ルシフェラーゼを含まない」点も自然に導かれるといえる。
　しかしながら、甲第１号証及び甲第２、４および５号証のいずれにも、DTT等の「補酵素A以外のチオール試薬」をルシフェラーゼを含んでいない溶液中に存在させることを示唆する記載はなく、むしろ甲第１号証における「DTTは、全てルシフェラーゼを安定化させ、再現性ある結果を生じる」（要約）との記載、及び甲第４号証の「固定化ルシフェラーゼに対して、DTTは酵素を10倍安定化する」との記載は、明らかにDTT等をルシフェラーゼと共存させることを前提とするものである。さらに、DTTの濃度は、甲第１号証では0.5mM、甲第２号証では1mM、甲第４号証では2mM及び6.5mM、甲第５号証では80mM（80mMとの記載は、国際公開第87/02667号パンフレットの記載からみて翻訳時の誤りであると認められる。）という微量であることからみても、本件優先日前にはDTTに対してはルシフェラーゼの安定化作用のみが期待され、ルシフェラーゼを含む溶液中に数mM以下の微量を添加するという用い方がなされていたとするのが相当である。
　これに対して本件発明１は、補酵素A以外のチオール試薬が、ルシフェラーゼ酵素の生物発光反応の触媒反応中にルシフェラーゼ酵素反応の安定化作用を発揮するという発光速度改善作用を有すること、及び該発光速度改善作用を奏するには5mMから200mMの濃度範囲が好適であることを新たに見いだし、この知見に基づいて、ルシフェラーゼの検出を目的として「5mMから200mMの濃度の補酵素A以外のチオール試薬を含み、そしてルシフェラーゼを含ま」ない溶液を用いるという構成に至ったものであるということができる。
　そして、本件発明１は、当該構成を採用することで、はじめて明細書に記載されるような優れた「発光速度改善効果」という、上記各甲号証からは予測できない効果が奏せられたものと認められる。
　したがって、本件発明１は、当業者であっても、甲第１、２、４及び５号証に記載された発明に基いて容易に発明することができたではないとするのが相当である。
　
(2-2)　本件発明５について：
　本件発明５も、本件発明１について述べたと同様の理由で、甲第１、２、４及び５号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明することができたものであるとはいえない。
　
（３）主張３について：
　異議申立人は、訂正前の本件請求項２、６乃至１０に記載された発明は、甲第１乃至６号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明することができたものである旨主張しているが、以下述べるように当該主張も採用できない。
　
(3-1)　本件発明２について：
　本件発明２は、本件発明１における「混合液」が更に補酵素Aを含む場合に限定されたものである。
　甲第３及び６号証には、「補酵素A」がルシフェラーゼによる発光反応を促進することが記載されているものの、「補酵素A以外のチオール試薬」と組合わせることによる相乗効果については何ら教示するものではない。
　そして、本件発明２においては、本件発明１と同様の5mMから200mMの濃度の「補酵素A以外のチオール試薬」に基づく優れた発光速度改善効果に加えて、さらに補酵素Aをルシフェラーゼ酵素反応系に存在させることでその発光速度改善作用が相乗的に増強されるという格別な効果が奏せられたものと認められる（第１、２及び４図等参照）。
　したがって、本件発明２は、甲第１乃至６号証に記載された発明からは、当業者であっても容易に発明することができたものではない。
　
(3-2)　本件発明６乃至１０について：
　本件発明６乃至１０も、本件発明２について述べたと同様の理由で、甲第１乃至６号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明することができたものであるとはいえない。
　
（４）まとめ：
　以上述べたように、請求項１乃至１３に係る発明は、いずれも異議申立人の申立て理由によっては、特許を受けることができないとすることができない。
　
［４］むすび
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
ルシフェラーゼ組成物及び方法
【発明の詳細な説明】
　　　
技術分野
　本発明は全般的には生物発光に係わる。特に本発明は、甲虫ルシフェラーゼ活性由来の優れた光生成方法及び該方法を実施するための組成物に係わる。本発明は、所定の生物特異的反応の生産物または発生を定量化するためのリポーターまたはマーカーとしてルシフェラーゼを使用するアッセイ及び試験キットに特によく適している。
　　　
発明の背景
　分子事象を定性的または定量的にモニターするためにリポーター分子またはラベルを使用することは、医療診断のため、工業環境において毒素及び他の物質を検出するため、並びに、生物学、生物医学及び生化学における基礎及び応用研究のために使用されるアッセイにおいて十分に確立されている。このようなアッセイとしては、イムノアッセイ、核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイ、リポーター分子の産生が特定のプロモーターからの転写に起因するアッセイを挙げることができる。このようなアッセイ系におけるリポーター分子またはラベルとしては、放射性同位元素、蛍光物質、酵素及び化学発光物質を挙げることができる。
　問題の事象をモニターまたは測定するために化学発光物質が使用されるアッセイ系のなかに、生物発光酵素ルシフェラーゼの活性を測定するものがある。しかしながらルシフェラーゼアッセイの使用は、アッセイにおける発光の短時性及びパターンが原因となって、普及していない。甲虫ルシフェラーゼでは、この発光は極めて急速にピーク強度に達し、即ち閃光が放たれ、次いでよりゆっくりと、しかし尚問題のあるほど急速に減衰してから、ピーク強度の約１０％程度の“定常状態”に至って更にゆっくりと減衰する。強い発光は短時間であるので、アッセイを実施する上で生物発光反応混合液を調製するためには、通常は酵素を基質溶液に迅速に注入するような特別の苦労を要する作業を必要とする。“閃光”の間に発せられた光を測定する必要性は、実験上の問題として残っている。今日のルミノメーターをもってしてもこのような光を正確に測定することは依然として困難である。
　発光系はよく知られており、ある種の細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚類、多足類、ハエ、菌類、蠕虫、甲殻類及び甲虫を含む多くの発光生物、特に
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ
Ｐｈｏｔｕｒｉｓ
Ｌｕｃｉｏｌａ
Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ
　甲虫ルシフェラーゼ、特にホタル種
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ
Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ
　生物発光を与える甲虫ルシフェラーゼ触媒反応（以降は単に“甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応”と表記する）は、ホタルルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び酸素分子を含む２段階プロセスとして記述されている。初期反応においては、反応：
　　Ｅ＋ＬＨ２＋ＡＴＰ＋Ｍｇ＋２→Ｅ・ＬＨ２−ＡＭＰ＋ＰＰｉ
〔式中、Ｅはルシフェラーゼであり、ＬＨ２はルシフェリンであり、Ｍｇ２＋はマグネシウムイオンであり、ＰＰｉはピロリン酸塩である。〕
で示されるように、ルシフェリンとＡＴＰが反応してルシフェリルアデニレートを形成し、無機ピロリン酸塩が放出される。ルシフェリルアデニレートＬＨ２−ＡＭＰはルシフェラーゼの触媒部位にしっかりと結合したままである。この形態の酵素が酸素分子に暴露されると、酵素に結合していたルシフェリルアデニレートが酸化されて、電気的に励起された状態のオキシルシフェリン（Ｌ＝０）を生じる。励起した酸化ルシフェリンは、反応：
　　Ｅ−ＬＨ２−ＡＭＰ＋Ｏ２→（Ｅ・Ｌ＝Ｏ・ＡＭＰ）＊＋２Ｈ＋＋ＣＯ２
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　　　　　Ｅ・Ｌ＝Ｏ・ＡＭＰ＋光
で示されるように、基底状態に戻るときに光を発する。酸化されていたルシフェリン１分子ごとに１つの光子が放出される。酸化ルシフェリンの電気的励起状態は、甲虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に特徴的な状態であり、酸化ルシフェリンが基底状態に戻るときに発せられる光の色（即ちエネルギー）は、同じルシフェリンを有する異なる甲虫種が異なる色の光を発することから、酵素によって決定される。
　ルシフェラーゼ、Ｍｇ２＋及びルシフェリンを含む反応混合物にＡＴＰを注入することにより発光が開始されるとき、全ての成分が飽和濃度に近いかまたは飽和濃度である場合、強度が急速に増大し、次いで最初の数秒間で急速に減少し、次いで更に減衰するが、この減衰は数時間も継続することがある。この反応速度の減少は、生産物阻害によるものと考えられている。
　ルシフェラーゼは微小濃度のＡＴＰをアッセイする手段として使用されており、１０−１６モルほどの微量のＡＴＰを、高品質の酵素調製物を用いて検出することができる。ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応はＡＴＰに高度に特異的なものである。例えば、デオキシＡＴＰは、ＡＴＰによって生成される光の２％未満しか生成しないし、他のヌクレオシド三リン酸は０．１％未満しか生成しない。
　ＡＴＰ濃度を他の酵素の活性と組み合わせると、ルシフェラーゼは、かかる他の酵素及び他の化合物に対する生化学リポーター分子となり得る。
　甲虫ルシフェラーゼを他のアッセイにリポーターとして使用し得る可能性は十分にある。しかしながらこのような使用は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の発光速度の問題によって制限されている。このような速度の問題がなければ、直ちに使用可能な甲虫ルシフェラーゼは、例えば酵素がリポーターとして作用するＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙｓ）や、酵素がリポーターとして作用する核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイのようなイムノアッセイのごとき用途に使用されるであろう。
　甲虫の発光器官から直接単離される結晶質ルシフェラーゼを使用し得るほかに、数種の甲虫のルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡ（特に、
Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ
Ｐ．ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ
Ｌ．ｃｒｕｃｉａｔａ
Ｌ．ｌａｔｅｒａｌｉｓ
　更に、甲虫ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを入手できることと、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒する酵素をコードするｃＤＮＡを迅速にスクリーニングできること〔ｄｅ　Ｗｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，上掲　及びＷｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，上掲　参照〕から、当業者は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による生物発光を触媒する活性を保持する突然変異ルシフェラーゼを、大量に且つ純粋な形態で製造及び入手し得る。このような突然変異ルシフェラーゼは、天然甲虫ルシフェラーゼの配列と１カ所以上で異なるアミノ酸配列を有する。本明細書中の“甲虫ルシフェラーゼ”なる用語は、甲虫に天然に存在するルシフェラーゼのみならず、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒することにより生物発光を提供する活性を保持する、天然ルシフェラーゼの突然変異体をも含むと理解されたい。
　甲虫ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを容易に入手し得ることで、このようなｃＤＮＡの発現、結果的には該酵素の産生をかかる遺伝事象と組み合わせることにより、転写及び翻訳に関係する遺伝事象をシグナル分析、モニターまたは測定するのに使用されるアッセイに、ルシフェラーゼをリポーターとして使用することができる。
　甲虫ルシフェラーゼをリポーター分子として使用し得る可能性は益々重要となると共にかなり変化している一方で、実際には、酵素によって生じる発光の短時性及びパターンがそれらの使用を制限している。甲虫ルシフェラーゼを用いてより効率的な光生成、即ちより継続的でしかも高い速度で発光を行なうことにより、甲虫ルシフェラーゼのリポーターとしての有用性を増強することが望まれる。
　ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の速度及び閃光の間に放出される光を正確に測定することの関連問題を解決するための、幾分普及している１つの方法は、閃光が発生するのを防いだり、光生成を延長すると報告されている種々の酵素阻害剤を使用することである。酵素阻害剤の１例としてヒ酸塩がある。ヒ酸塩は閃光の強度（ｈｅｉｇｈｔ）を下げ、所与の量のＡＴＰに対する発光を延長する傾向にあるが、ＡＴＰを検出する感度を低下させる。ヒ酸塩を含むルシフェラーゼ調製物は最近まで市販されていたが、このような調製物の使用はもはや好まれていない。それは一部には、用途によっては精巧な光測定装置を使用して、ヒ酸塩を使用する必要性が避けられ得るからである。
　しかしながら、そのような精巧な装置を用いてさえ、酵素と基質を迅速に混合するための注入方式のような特定の実験作業は依然として必要とされている。このような特定のやっかいな作業の必要性を回避するため、酵素反応における光生成速度を改善することは、ルシフェラーゼのリポーターとしての有用性を大幅に拡大する。
　ヒ酸塩のほかにも多数の化合物が、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成パターンに影響すると報告されている。ヒ酸塩と同じ目的でリン酸塩が使用されたが、リン酸塩を使用する場合にはアッセイにマグネシウムイオンを存在させることが必要となり、不本意にもリン酸マグネシウムが沈澱するという結果となるため、歓迎されなかった。
　補因子、即ち補酵素Ａ（ＣｏＡ）も、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応における発光パターンに影響すると報告されている。Ａｉｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，ｖｏｌ．２７（１９５８）ｐｐ．５１９−５３２は、ＣｏＡをホタルルシフェリン−ホタルルシフェラーゼ混合物に加えると、光強度の初期ピークには影響しないが、発光がより高いレベルで、加えた合計ＣｏＡに比例する時間だけ継続すると報告している。Ａｉｒｔｈらは、全発光量がＣｏＡの不在下よりも存在下でより大きいことも示した。
　Ａｉｒｔｈらは更に、システイン及びグルタチオンは発光を刺激せず、詳細は与えていないが、ヒドロキシルアミンはＣｏＡと同様に発光を刺激し、チオエタノールアミンは僅かに刺激すると報告している。
　ルシフェリン、ＡＴＰ及び酸素の甲虫ルシフェラーゼ触媒反応による発光に及ぼすＣｏＡの影響に係わるＡｉｒｔｈらの教示は疑わしい。Ａｉｒｔｈらの報告に続き、ルシフェラーゼに及ぼすＣｏＡの影響が、デヒドロルシフェリンによる酵素阻害をＣｏＡが防ぐことに基づいて説明された。デヒドロルシフェリンは、ホタル由来のルシフェリンを精製したＡｉｒｔｈら及びこれに続く研究者によって使用されたルシフェリンの有意な夾雑物であると考えられている化合物である。より最近及び今日使用されているルシフェリンは合成によって製造されており、従ってそれ自体はデヒドロルシフェリンを実質的に含まない。ルシフェリンの合成調製物には、ルシフェリンに対して典型的には１重量％未満、好ましくは０．３重量％未満のデヒドロルシフェリンしか混入していない。従ってＣｏＡは、合成によって製造されたルシフェリンにおいてはルシフェラーゼ活性に影響しないと推定される。甲虫ルシフェラーゼによる発光をＣｏＡ（及びＡｉｒｔｈらの文献に記載されている他の化合物）が刺激するというＡｉｒｔｈら及びそれに続く研究者らの教示は、ルシフェラーゼ触媒発光に基づくアッセイの実用性を拡張しようという努力において３０年以上も完全に無視されてきた。例えば、ヒ酸塩は望ましくないと認識されているにも拘わらず、ＣｏＡがヒ酸塩の代替物として示唆されたことはない。
　更に、他のスルフヒドリル化合物が、酵素の調製及び貯蔵の際のルシフェラーゼの安定性に貢献すると報告されている。米国特許第４，８３３，０７５号は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）が、新たに調製したルシフェラーゼ溶液と比較して、ＤＴＴなしではたった１０％の残留酵素活性しか持たないであろう熟成
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　Ｐｙｒａｌｉｓ
　しかしながら当分野においては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び同様のチオール試薬は、約５ｍＭ以上の濃度ではルシフェラーゼによって触媒される発光を阻害すると考えられている。
　ルシフェラーゼの化学的機構（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の種々の局面が認識及び研究されているにも拘わらず、従来技術は、実用的技術面で、検出モードとしての得られる発光の有用性を増大するようなルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による、より効果的な光生成をほとんど提供していない。
　　　
発明の要約
　本発明は、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光生成速度を改善し、かかる光生成の化学的機構に係わる種々の新規知見をもたらす。光生成速度の改善は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェラーゼの生産物阻害を減速または低減し、光生成触媒反応の間に起こるルシフェラーゼ失活を減速する化学的機構に関係する。
　速度改善は、一部には、これまで認識されていなかった２種類の組成物、即ちＣｏＡ及びルシフェリンのチオエステルと、ＣｏＡ、ルシフェラーゼ及び励起状態の酸化ルシフェリンの結合体との作用による。本発明はこれらの組成物をも含む。
　甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合液に、ＣｏＡもしくはＤＴＴのようなチオール試薬またはこれら両方を含めると、反応による光生成速度及び反応による全発光量が驚くほど向上することが見い出された。更に、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合物にＣｏＡを含め、次いで混合物を、反応による生物発光のピーク強度を少量だけ低下させる何等かの他の化学的または物理化学的条件に暴露すると、反応による生物発光の全発光量を増大するという有利な効果があることも見い出された。従って本発明は、甲虫ルシフェラーゼの存在について、試料（例えば細胞）中で甲虫ルシフェラーゼの生成をもたらす遺伝事象について、ＡＴＰの存在について、またはＡＴＰの生成をもたらす化学的もしくは生化学的事象について、試料を試験またはアッセイするために、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応及びそれによって生起される生物発光を使用するための優れた方法と、該方法を実施するための組成物及び試験キットとを提供する。本発明の方法においては、本発明の組成物及び試験キットを用いて、かかる光の全発光量に対するピーク強度の比を小さくすると共に全発光量を増大することにより、またはピーク強度に達した後に強度が低下する速度を遅くすることにより、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成速度を改善する。
　本発明の利点は、従来技術において反応に災いしていた“閃光”は著しく低減されるが、全発光量は著しく増大、典型的には従来技術におけるかかる反応の１０倍以上に増大する光生成速度を有する甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を提供することである。甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成される光の生成速度及び全光量の向上によって、ルシフェラーゼを、またはルシフェラーゼを使用してＡＴＰをアッセイすることが、従来の方法よりずっと単純に、しかもより高感度になる。例えば本発明の方法及び組成物または試験キットを用いると、通常のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の急激な閃光において発せられる光を測定するための、迅速に試料を注入するような特別の作業や精巧なルミノメーターのような特別の装置が、アッセイに必要ではなくなる。
　実際、本発明の方法及び組成物またはキットを使用し、他のタイプの測定のために実験室で既に使用可能であるシンチレーションカウンターのような装置を、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成される光を測定する必要があるアッセイに使用することができる。これは、ルミノメーターはないがシンチレーションカウンターまたは他の光生成を測定する装置は所有する実験室において該アッセイの使用を容易にすることにより、科学及び技術分野におけるこのようなアッセイの適用を著しく拡張し得る。以前は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成速度は、このような光を測定する必要があるアッセイにおけるシンチレーションカウンターの使用を阻んでいた。
　本発明によれば、甲虫ルシフェラーゼをマーカーまたはリポーター分子として使用し得る全可能性が実際に実現され得る。
　特定の適応、組成物の変形態様及び物理的属性の他の利点及び更なる理解は、添付の図面を参照して与えられる以下の本発明の詳細説明を検討することにより得られるであろう。
　　　
図面の簡単な説明
　以下、本発明を添付の図面を参照して説明する。全図面を通して、同じ参照符号は同じエレメントを指す。
　図１は、補酵素Ａの存在下及び不在下での甲虫ルシフェラーゼ活性による発光を比較したグラフである。
　図２は、ジチオトレイトールの存在下及び不在下での甲虫ルシフェラーゼ活性による発光を比較したグラフである。
　図３ａ及び図３ｂは、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成の触媒の不在下及び触媒中の、甲虫ルシフェラーゼ安定性に及ぼすジチオトレイトール濃度の変化の影響を示すグラフである。
　図４は、補酵素Ａ、ジチオトレイトール及びウシ血清アルブミンの存在下での甲虫ルシフェラーゼ活性による発光を、補酵素Ａ、ジチオトレイトール及びウシ血清アルブミンの不在下での同活性による発光と比較したグラフである。
　図５は、酵素をコードするｃＤＮＡの発現によりルシフェラーゼが産生された培養哺乳動物細胞由来の抽出物における甲虫ルシフェラーゼ活性による発光を、本発明のアッセイと慣用の従来技術のアッセイとにおいて比較したグラフである。
　図６は、（１）甲虫ルシフェラーゼ濃度の対数値と、本発明に従って実施したアッセイにおける甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成された光の対数値との一次相関と、（２）甲虫ルシフェラーゼを検出するアッセイの感度とを示すグラフである。
　図７は、ＣｏＡの存在下に実施した甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成に、３６ｍＭ　２−アミノエタノールは影響するが３６ｍＭ　エタノールは影響しないことを示すグラフである。
　図８は、ＣｏＡの存在下に実施した甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成に及ぼす種々のリン酸塩濃度の影響を示すグラフである。グラフ中、リン酸濃度が増加するにつれてピーク強度は低下している。
　　　
発明の詳細
　以下の説明においては、特に記載のない限り、室温（約２０℃〜約２５℃）及び大気圧下で処理ステップを実施し且つ濃度を測定した。
　本明細書中“ルシフェラーゼ”なる用語は、特に記載のない限り、天然または突然変異甲虫ルシフェラーゼを指す。ルシフェラーゼは、天然である場合には、甲虫自体、特にその発光器官から当業者は容易に入手することができる。ルシフェラーゼが、天然に存在するもの、またはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において活性を保持する天然ルシフェラーゼの突然変異体であるならば、ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを発現するように形質転換された細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞などの培養体から、またはルシフェラーゼをコードする核酸からルシフェラーゼを作製するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞系から、容易に入手し得る。好ましいルシフェラーゼはホタル
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ
　“ルシフェリン”なる用語は先に定義してある。
　本発明は、その態様の１つにおいて、ルシフェラーゼを含むと推定される試料において甲虫ルシフェラーゼの存在を検出する方法であって、（ａ）前記試料のアリコートを用いて、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェラーゼの活性に有効な濃度の、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、チオール試薬及びＭｇ２＋を含む溶液を調製し、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた溶液からの発光を測定することからなる方法を提供する。この本発明の第１態様は、単に、分析すべき試料（例えば、その細胞中で、ルシフェラーゼ発現を制御するプロモーターが活性または不活性であった場合にそれぞれルシフェラーゼが発現されたまたはされなかったと推定される哺乳動物細胞培養体の抽出物）の一部（即ちアリコート）を取り、該アリコートを、存在するとすればその中でルシフェラーゼがルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において活性である、チオール試薬を含む溶液と混合し、溶液（またはその一部）を測定して、生物発光がその中で行われているか確認することを含む。試料のアリコートをこのような溶液と混合することは、好ましくは、また一般的には、アリコートの全ての成分を溶液中に単純に溶解するだけでよい。どんな場合でも混合は、ルシフェラーゼがアリコート中に存在するならば、それが、アッセイ法の基礎をなす反応がその中で起こる溶液中に溶解するようなものである必要がある。当業者には理解されるように、アッセイ法である本発明の方法は通常は適当な対照または基準と一緒に実施され（例えば分析される試料がルシフェラーゼを含まない溶液及び既知濃度のルシフェラーゼを含む溶液と並行して分析される）、適当な基準をもってして該方法は、試験試料（即ち分析されている試料）中の甲虫ルシフェラーゼの濃度を定量化するのに適合され得る。
　後述するように、本発明によってルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成速度が改善されるが故に、本発明のルシフェラーゼアッセイ法は、約１０−１８Ｍ〜約１０−６Ｍの酵素を検出することができ、下限は、使用可能な最高の検出装置においてさえノイズによってのみ制限される。
　甲虫ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応においてルシフェラーゼが活性であるｐＨ、イオン強度、温度、ＡＴＰ濃度、マグネシウムイオン濃度、ルシフェリン濃度などの条件の範囲が幾分異なる。しかしながら、任意の特定の甲虫ルシフェラーゼに対するかかる範囲、場合によっては最適範囲でさえ確定することは当業者には簡単なことである。
　当業者は、例えば酵素の活性を維持または増強するために、またはアッセイ作業を行なう試料アリコートを入手するのに使用する手順に必要なものとして、特に上述したもの以外の組成物もアッセイ反応混合液中に存在させ得ることに気付くであろう。例えばトリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓ、グリシルグリシン、リン酸塩などの典型的な緩衝剤を、ｐＨ及びイオン強度を維持するために存在させ、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェラーゼの活性を増強するタンパク質性材料、例えば哺乳動物血清アルブミン（好ましくはウシ血清アルブミン）またはラクトアルブミンもしくはオボアルブミンを存在させることもでき、アッセイすべきルシフェラーゼを抽出する系（例えば細胞）中に存在し得て且つルシフェラーゼまたはＡＴＰに悪影響を及ぼし得る金属含有プロテアーゼまたはホスファターゼの活性を抑制するためには、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡ（シクロヘキシレンジアミンテトラアセテート）などを存在させ得る。ルシフェラーゼを安定化するグルセロールまたはエチレングリコールを存在させることもできる。同様に、洗剤または界面活性剤、特に非イオン性洗剤、例えばオクトキシノール（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００のようなＲｏｈｍ＆Ｈａａｓの商品名“Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ”で販売されているもの）を、典型的にはルシフェラーゼをアッセイ用に抽出する細胞を溶解するのに使用する溶液の、本発明のアッセイに使用する溶液に混合される残りの部分として含めることができる。マグネシウムに対する対イオンは勿論存在させる。当業者には理解されるように、かかる対イオンの化学的特性及び濃度は、マグネシウムイオンを与えるのに使用されるマグネシウム塩、使用する緩衝液、溶液のｐＨ、ｐＨ調節に使用される物質（酸または塩基）、並びに、マグネシウム塩、緩衝液及びｐＨ調節に使用する酸または塩以外の資源から出た溶液中に存在するアニオンに従って、広範に変化し得る。１つの方法においては、所望のマグネシウムイオン濃度を与えるために、使用する緩衝液（例えばトリシン）の溶液中の炭酸塩としてマグネシウムイオンを供給し、次いで緩衝溶液のｐＨを強酸、例えば硫酸を加えることにより調節することができ、そうするとほとんどの炭酸塩（及び重炭酸塩）が二酸化炭素として失われ、かかるアニオンをスルフェート、ビスルフェート、トリシンアニオン、場合によっては（溶液中に存在し得て、アニオンを与える他の物質（例えばリン酸塩）によって）他のタイプのアニオンで置き換える結果となる。アッセイ法を実施する溶液の空気からの酸素飽和は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に必要とされる酸素分子を与えるに十分である。どんな場合でも、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェラーゼの活性に有効である該方法の説明において特に上述した成分を含む、アッセイ反応混合液中の種々の成分の濃度を容易に確定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。光生成速度向上に必須の成分はチオール試薬である。
　本発明の方法及び組成物に使用されるチオール試薬は、ＣｏＡまたはＣｏＡ以外のチオール試薬である。ＣｏＡ以外のチオール試薬は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が起こる温度、ｐＨ、イオン強度、化学組成などの条件下で空気飽和水溶液中の還元剤として有効となり得る遊離スルフヒドリル基を有する試薬である。かかる試薬のなかで好ましいのはジチオトレイトールである。使用し得る他の試薬としては、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、２−メルカプトプロパノール（鏡像異性体または両鏡像異性体の任意の組合せ）、３−メルカプトプロパノール、２，３−ジチオプロパノール及びグルタチオンを挙げることができる。
　本発明の方法に従ってルシフェラーゼをアッセイし得る試料のタイプとしては、特に、イムノアッセイにリポーターとして使用されたルシフェラーゼを含む試料、または、核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイにリポーターとして使用されたルシフェラーゼを含む試料を挙げることができる。イムノアッセイ及び核酸プローブ技術において理解されているように、本発明に従ってアッセイされたルシフェラーゼは、それぞれイムノアッセイまたは核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイにおいて被分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）を検出するのに使用される抗体または核酸プローブに化学的に、該技術においては公知の多数の方法のいずれかによって結合されている。次いで、やはりよく知られた方法に従って、ルシフェラーゼ標識抗体または核酸プローブを分析すべき試料と混合し、試料中に存在する可能性があり検出が求められている被分析物質（例えばイムノアッセイの場合には抗原または抗抗原抗体、核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイの場合にはターゲット核酸）に結合させ、次いで、被分析物質と結合しなかったルシフェラーゼ標識抗体または核酸プローブを、もしあれば結合したものから分離する。本発明に従ってアッセイすべき試料は、ルシフェラーゼ標識抗体または核酸プローブの被分析物質に結合したかかる抗体またはプローブ上のラベルであったルシフェラーゼである。ルシフェラーゼは、本発明に従ってルシフェラーゼをアッセイする間、標識抗体またはプローブに化学的に結合したままとすることもできるし、ここでも公知の方法によって、本発明に従ってルシフェラーゼをアッセイする前に標識抗体または核酸プローブから分離することもできる。甲虫ルシフェラーゼをリポーターまたはラベルとして使用し得るイムノアッセイ及び核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイは、生物学、バイオテクノロジー、並びに病原体の検出、遺伝子異常の検出、疾患の診断などを含む医学の分野で多数の実用及び研究用途を有する。
　本発明の方法に従ってルシフェラーゼの存在をアッセイし得る別のタイプの試料は、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片に結合されたプロモーターまたは他の転写調節エレメントによる転写の活性化に応答して、またはルシフェラーゼをコードするＲＮＡの転写の結果として、ルシフェラーゼが発現した細胞の抽出物である。このような細胞においてはルシフェラーゼは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼのような他の酵素が、転写または転写調節のような遺伝事象をモニターするのに使用されるのと同様に使用される。このような甲虫ルシフェラーゼの使用は分子生物学及び生物医学において重要であり、例えば、特定のプロモーターまたは他の転写調節エレメントにおける転写活性化または転写抑制活性によって、治療作用に対して化合物をスクリーニングすることに使用され得る。
　本発明は、別の態様においては、ＡＴＰを検出する方法を提供する。この方法は、生物発光の生起にＡＴＰが必要であるという事実から、ルシフェラーゼをアッセイする方法からなる本発明の態様から派生したものであり、ＡＴＰではなくて甲虫ルシフェラーゼがアッセイ反応混合液の必須成分であることだけが、ルシフェラーゼをアッセイする方法とは異なる。アデノシン三リン酸を含むと推定される試料中の該化合物の存在を検出する本発明の方法は、（ａ）前記試料のアリコートを用いて、甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェリン、チオール試薬及びＭｇ２＋を、全てがルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェラーゼ活性に有効な濃度で含む溶液を調製し、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた溶液からの発光を測定することからなる。当業者には容易に理解されるように、ＡＴＰ濃度が既知の適当な可変基準と、ＡＴＰ濃度が未知の試料とを用いて本発明の方法を実施することにより、該方法は、未知濃度の試料中のＡＴＰ濃度を決定するように適合し得る。分析されている試料中のＡＴＰは、種々の生化学的事象または反応、例えば血小板凝集によって上昇し得る。従って本発明のＡＴＰをアッセイする方法は、ＡＴＰを生成する事象または反応をモニターすることにも使用し得る。
　好ましくは、本発明の方法（及び組成物）においては、使用するルシフェラーゼは合成によって製造し、ＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬の両方を使用または存在させ、溶液である本発明の組成物においては、ＣｏＡは約０．１ｍＭ〜約１．０ｍＭの濃度で存在させ、ＣｏＡ以外のチオール試薬は約２０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で存在させる。
　本発明は、更に別の態様において、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る甲虫ルシフェラーゼ、ＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬を含む組成物を提供する。かかる組成物は好ましくは水溶液であるが、例えば凍結乾燥成分混合物とすることもできる。“ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る”なる表現は、組成物中の酵素がそのままで反応を触媒できるか、または、酵素が反応を触媒することにおいて活性となるように組成物を再構成、溶解、またはその他化学的もしくは物理的に処理し得ることを意味する。酵素が不可逆的に失活または阻害されるならば、それは、“ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る”とは言えない。本発明の組成物は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光生成速度を著しく改善し、本発明のアッセイに、本発明の試験キットに、本発明のアッセイ及び試験キットにおける基準に、並びに、本発明のアッセイ混合液及び試験キットと混合液及びキットに使用するための基準を調製することに使用される。本明細書中に詳細に記載したように、本発明の組成物は、上述のごとき作用する能力のある甲虫ルシフェラーゼ、ＣｏＡ、及びＣｏＡ以外のチオール試薬の３種の必須成分のほかに多数の他の成分を含むことができる。
　本発明は更に、本発明のアッセイ法を実施するための試験キットをも提供する。かかるキットは、通常はアッセイに使用するのを容易にするよう都合良くパッケージされている１つ以上の容器内に、本発明のアッセイを実施するのに必須の種々の成分を所定量で含む。即ち、ルシフェラーゼをアッセイするためのキット内には、反応に不可欠であることがよく知られているマグネシウムイオン、ＡＴＰ及びルシフェリンに加えて、チオール試薬をも含む、“ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応組成物”と称される組成物が含まれる。かかる組成物は、ＣｏＡと、ＣｏＡ以外のチオール試薬、例えばＤＴＴとの両方を含むのが好ましく、例えばタンパク質性ルシフェラーゼ活性エンハンサー（例えばウシ血清アルブミン）、ＥＤＴＡもしくはＣＤＴＡ、リン酸塩もしくは２−アミノエタノール（下記参照）のような他の成分、または、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が適当な速度で進行するｐＨ及びイオン強度の溶液を与えるための緩衝液を含み得る。キット内のルシフェリンは合成によって製造されているのが好ましい。既に述べたように、種々の成分は例えば、溶液または凍結乾燥混合物で組合されていてもよいし、単一容器内またはそれぞれを含む複数容器内で組合されてもよい。ルシフェラーゼが発現される細胞中のルシフェラーゼをアッセイするための好ましいキットには、細胞は溶解するが、活性形態または活性になり得る形態で細胞中に存在し得るルシフェラーゼを（溶解の際に放出される種々の酵素の作用に対して）保存するのに有効な溶液（または溶液を調製するための成分）も含まれる。
　ＡＴＰをアッセイするための試験キットは、ルシフェラーゼをアッセイするためのものと類似であるが、但し、かかるキットはＡＴＰの代わりに甲虫ルシフェラーゼを含む。
　本発明の試験キットは更に、当業者には良く知られているように、該キットを使用して実施されるアッセイの信頼性及び精度を保証するため、及びキットの被分析物質（例えばルシフェラーゼ、ＡＴＰ）に対して試料を定量分析し得るように、種々の対照及び基準、即ちルシフェラーゼまたはＡＴＰを含まないもの（負の対照）含むルシフェラーゼまたはＡＴＰ濃度が既知の溶液を含むことができる。
　本発明は、別の態様においては、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成される光を測定することからなる、試料中の物質（例えばＡＴＰ、ＡＴＰを生成する結果となる物質、ルシフェラーゼ）の存在をアッセイする方法の改良を含む。改良は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応をＣｏＡの存在下に、該反応において生成される光のピーク強度を少量だけ（例えばかかる条件の不在下でのピーク強度に対して約３％〜約３０％）低下させる条件下に実施することからなる。本発明のこの態様は、ＣｏＡの存在下でルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が進行する条件を反応による光生成のピーク強度が少量だけ低下するように変更すると、反応において放出される全光量（即ち強度対時間の曲線を積分することにより測定される量）が増大する結果となるという新規知見に基づいている。これは、反応において生成された光についての強度対時間の曲線を平坦化し、それによって全光出力をより単純に且つより正確に測定し得るという利点がある。勿論、同じ条件を各系に適用してもピーク強度を低下するのに使用される条件が種々の程度に変更されるが故にピーク強度が種々の程度に低下されることを除いては同じ一連の反応系において、条件が適用されず従ってピーク強度が低下されなかった系からの全出力と比較して、（強度対時間の曲線を反応開始から積分することにより測定される）全光出力の増加が実現されるには、ピーク強度がより大きく低下したならばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応はより長い時間進行する必要がある〔例えば図８参照〕。種々の条件を変更してピーク強度を少し低下させることができる。例えば反応のｐＨ、イオン強度または温度を、当業者には容易に確定され、また関与する特定の甲虫ルシフェラーゼに幾分従う方法で、ピーク強度が低下するように変更することができる。また、ルシフェラーゼの阻害物質である種々の物質を、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が行われる溶液中に、適当な濃度で含めることもできる。このような物質としては、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度の２−アミノエタノール、約５ｍＭ〜約６０ｍＭの濃度のリン酸塩を挙げることができる〔図７及び図８参照〕。この改良は本発明の新規の方法にも適用され、例えば３６ｍＭ　２−アミノエタノールまたは２５ｍＭ　リン酸塩を、ＣｏＡだけでなく、ＣｏＡ以外のチオール試薬をも存在するルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合液中に含めることができる。
　本発明の基礎をなすと考えられる機構は完全には理解されていないが、本明細書においてかかる機構に言及したことが本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
　ＣｏＡは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒する際に酵素及び電気的に励起されたオキシルシフェリンと相互作用し、この相互反応の１つの結果として、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の過程で酵素の生産物阻害を低下させる（本明細書中“酸化ルシフェリン（ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ｌｕｃｉｆｅｌｉｎ）”とも称するオキシルシフェリンは、ルシフェリンのチアゾリン環の４位置に水素及びカルボキシレートの代わりに酸素を有することでルシフェリンとは異なる）。従って本発明の１つの態様は、ＣｏＡ、甲虫ルシフェラーゼ、及び酵素上で励起状態にあるオキシルシフェリンの結合体である。
　ＣｏＡ−甲虫ルシフェラーゼ−励起オキシルシフェリン結合体の存在はこれまで認識されていなかった。かかる結合体は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生物発光が生起されるｉｎ　ｖｉｔｒｏ（例えばアッセイに使用されているルシフェラーゼ溶液中）及び甲虫の発光器官細胞中を含む、ＣｏＡ、ルシフェリン、ＡＴＰ、酸素及び酵素的活性形態の甲虫ルシフェラーゼが共在する任意の溶液中に存在する。本発明においては、結合体が実際に存在する環境の外、即ち甲虫においてルシフェラーゼが天然に存在する細胞の外にある甲虫ルシフェラーゼのみの、ＣｏＡ−酵素−励起オキシルシフェリン結合体を特許請求する。
　甲虫ルシフェラーゼは、ＣｏＡ及びルシフェリンのチオエステル、ルシフェリル−ＣｏＡの形成を触媒する。この化合物の存在もこれまでに認識されていない。従ってこのチオエステルは本発明の別の態様である。
　ＣｏＡ−甲虫ルシフェラーゼ−励起オキシルシフェリン結合体と同様に、ルシフェリル−ＣｏＡは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生物発光が生起されるｉｎ　ｖｉｔｒｏ（例えばアッセイに使用されているルシフェラーゼ溶液中）及び甲虫の発光器官細胞中を含む、ルシフェリン、ＡＴＰ、ＣｏＡ及び酵素的活性形態の甲虫ルシフェラーゼが共在する任意の溶液中に存在する。本発明においては、化合物が実際に存在する環境の外、即ちルシフェラーゼが天然に存在する細胞の外にあるルシフェリル−ＣｏＡのみを特許請求する。ルシフェリル−ＣｏＡは、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光生成速度に及ぼすＣｏＡの有益な効果を仲介することにおいて重要な化合物である。チオエステルの形成は、ＣｏＡの存在下での、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における生産物阻害の低下に関与する。
　ルシフェリル−ＣｏＡが生成された後のその行末は明らかではないが、チオエステルは酵素に結合したままであること、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒する過程でチオエステルからＣｏＡが再生されることが考えられる。
　還元剤として機能する遊離チオール基を有するチオール試薬、即ちＤＴＴまたはβ−ＭＥなどの物質は、甲虫ルシフェラーゼと、または酵素による触媒反応生成物と何等かの方法で相互作用する一方で、発光生起を触媒する。ルシフェラーゼに及ぼすこれらの試薬の作用は、触媒反応の間のこの相互作用によって、ＣｏＡの作用が飽和する濃度の約１０倍〜約１００倍の濃度で飽和するようである。触媒反応の間のチオール試薬と酵素または酵素による触媒反応生成物との相互作用によって、試薬は、チオール試薬の不在下で失活が生じるであろう速度より酵素の失活を遅らせる。
　ＣｏＡは、上記役割に関係する特定の結合部位を有する酵素の基質でもあり、関係酵素活性安定化特性を有するチオール試薬でもある。ＣｏＡを用いると、恐らくはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の際の生産物阻害の速度を減速することに関係して反応の間に生じる酵素失活速度をＣｏＡが増大するので、状況はより複雑となり得る。触媒反応の間にＣｏＡ基質結合部位を飽和するのに必要とされるより過剰な濃度のＣｏＡは、他のチオール試薬と同様に、失活速度を減速する。
　甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応速度に及ぼすＣｏＡの作用は、基質によって酵素に結合する飽和に典型的な範囲である約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの比較的低いＣｏＡ濃度で飽和する。
　甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の速度に及ぼすＣｏＡ以外のチオール試薬の作用は従来技術によって示されていない。作用は、タンパク質を製造及び貯蔵の間の失活から保護するために当分野において示されている１ｍＭ〜５ｍＭよりはるかに高く、またかかる速度に及ぼすＣｏＡの作用が飽和する０．１ｍＭ〜１ｍＭよりもずっと高い、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭで飽和する。チオール試薬の安定化作用は、従来技術によって示されているような通常の、単に酵素を酸化から保護することによるものではない。５ｍＭ以上でチオール試薬は、生物発光触媒反応のないところでは、安定化が単に酵素上の基を酸化から普通に保護することによるものであるならば該試薬が持つであろうような安定化作用は酵素に及ぼさないが、かかる触媒反応が進行している間は酵素を安定化する。
　従って本発明は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において、生産物阻害の低下またはルシフェラーゼ失活の低下の結果として光生成速度が改善されるルシフェラーゼ組成物を提供する。１つのこのような組成物は、甲虫ルシフェラーゼ、約０．１ｍＭ〜１．０ｍＭのＣｏＡ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＣｏＡ以外のチオール試薬を含む水溶液である。組成物は、約０．１ｍＭ〜１．０ｍＭのＡＴＰ；約０．１ｍＭ〜１．０ｍＭのルシフェリン；約２ｍＭ〜約１５ｍＭのＭｇ＋２イオン；ピーク強度を最高約３０％だけ低下させるのに有効な濃度のホスフェートイオン、２−アミノエタノールまたは他のピーク強度低下用化合物；溶液のｐＨ及びイオン強度を、甲虫ルシフェラーゼがルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において活性である範囲に維持するための、トリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓ、グリシルグリシン、リン酸塩などの緩衝液；約１０μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの、哺乳動物血清アルブミンまたはラクトアルブミンまたはオボアルブミン、好ましくはウシ血清アルブミンのようなタンパク質性ルシフェラーゼ活性エンハンサー；約０．１ｍＭ〜約１ｍＭのＥＤＴＡまたはＣＤＴＡのような他の物質を含むこともできる。本発明の組成物におけるルシフェリンは合成であるのが好ましい。
　更に別の態様においては本発明は、化合物を含むと考えられる試料中のＡＴＰを検出する方法及び試験キットを提供する。本発明の方法及びキットは、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による生物発光に依存しており、本発明に従って、かかる反応による光生成速度が改善される組成物を使用する。
　その中にルシフェリンが存在する水溶液である本発明の組成物、即ち本発明の方法に使用される組成物中には、ルシフェリンが典型的には約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、好ましくは約１ｍＭの濃度で存在する。同様に、ＡＴＰが存在するかかる組成物中のＡＴＰ濃度は、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、好ましくは約０．５ｍＭである。水溶液である本発明のかかる組成物、即ち本発明に使用されるかかる組成物中にＣｏＡが存在する場合は、ＣｏＡ濃度は約０．００１ｍＭ〜約１ｍＭ、好ましくは約１ｍＭである。同様に、存在するＤＴＴ濃度は約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、好ましくは約３０〜４０ｍＭであり、ＢＳＡ濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌである。
　ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の発光は、市販のルミノメーター、シンチレーションカウンター、光増幅器、光度計またはフォトエマルジョンフィルム（ｐｈｏｔｏｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｆｉｌｍ）を使用して測定することができる。
　反応溶液中で本発明のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を開始するためには、（通常は２種類の）溶液を単純に混合するか、または一方の溶液を他方の溶液中に注入して２つの溶液を迅速に混合することにより、反応溶液を調製することができる。本発明に従ってチオール試薬を使用すると、迅速な混合（注入）方式の必要性がほとんどの場合に回避される。
　通常のルシフェラーゼアッセイによる光生成を、本発明のアッセイ方法と比較するように計画された種々の実験によって、本発明の方法を試験した。
　また、光生成に及ぼすＣｏＡの作用を、それが不在の場合の光生成と比較した。混合前に、この補因子を酵素に加えた。かかる試験においては、２５ｍＭ　トリシン、７ｍＭ　Ｍｇ２＋及び１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる緩衝液中の３ｍＭ　ＣｏＡを含むまたは含まない、３ｍＭ　ルシフェリン及び３ｍＭ　ＡＴＰを含む溶液１００μｌを、ルシフェリン溶液について上記したのと同じ緩衝液中に０．８Ｎｍ　ルシフェラーゼを含む溶液２００μｌ中に注入した。図１は、ＣｏＡの存在する場合及びしない場合のルシフェラーゼの発光を示している。反応によって放出された全光量は、無限時間まで外挿した指数関数的減衰強度を積分することにより推定した。かかるデータは、アッセイ混合液にＣｏＡを加えるとより大きい初期光強度を与え、初期減衰速度はより小さく、全発光量は２倍以上に増大することを示している。特に合成ルシフェリンを使用したことから見て、このようなデータは予想外であった。
　スルフヒドリル基を有する他の試薬の作用を試験した。図２は、３３．３ｍＭ　ＤＴＴがアッセイ混合液中に存在する場合の発光曲線を示す。この試験においては、ＣｏＡを用いた実験について上述したのと同じ緩衝液中に３ｍＭ　ルシフェリン、３ｍＭ　ＡＴＰ及び１００ｍＭ　ＤＴＴを含む溶液１００μｌを、同じ緩衝液中に０．８ｎＭ　ルシフェラーゼを含む溶液２００μｌ中に注入した。曲線ははるかに高い“定常状態”を示しおり、全光生成はＤＴＴが存在しない場合の６．３倍に増大した。酵素を用いてＤＴＴをプレインキュベーションした場合も試験した。アッセイ前に１０ｍＭのＤＴＴを酵素に加えても、光生成に有意な増加はなかった。他のチオール試薬を用いた結果もＤＴＴに見られたものと同様であった。
　更に、従来技術において広く報告されているチオールの保護作用と比較したＤＴＴの作用モードをテストする試験を実施した。かかる試験においては、２０ｍＭ　トリシン（ｐＨ７．８）、８ｍＭ　Ｍｇ２＋、０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５３ｍＭ　ＡＴＰ及び０．２７ｍＭ　ＣｏＡを含み、更に、一方の溶液は５ｍＭ　ＤＴＴを含むが他方は４０ｍＭ　ＤＴＴを含む２種類の溶液をそれぞれ１０００μｌずつ調製した。同量のルシフェラーゼアリコートをそれぞれに加えた。種々の時点で、２００μｌの溶液を取り出し、ルシフェリンを濃度０．４７ｍＭまで加えて酵素活性を生起させた。ルシフェラーゼ溶液の条件は、ルシフェリンが存在しないので触媒反応が進行できないことを除いては、反応条件と同じである。光出力を１０分間測定した。結果を図３ａ及び図３ｂに示す。これらの結果から２つの結論を引き出すことができる。第一に、酵素活性の安定性は触媒反応の間はずっと低下し、第二に、ＤＴＴ濃度が５ｍＭ以上に増加しても触媒反応の不在下ではルシフェラーゼの安定性を増大しないが、触媒反応の間の安定性が増大される。ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒しないとき及び該反応を触媒するときで、ＤＴＴは酵素に異なるモードで作用するらしい。
　他の添加物の作用をテストする試験も実施した。例えば、ＢＳＡは光強度を約２０％増大したが、減衰速度は変えなかった。非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を加えた場合は初期光強度の増大が認められたが、減衰速度も増大した。他の非イオン性界面活性剤は酵素活性にわずかな作用しか示さなかった。
　図４は、ＣｏＡ、ＤＴＴ及びＢＳＡが混在したアッセイ、ＣｏＡが単独で存在したアッセイ、何も加えていない通常のアッセイにおける発光曲線を示す。ＣｏＡ、ＤＴＴ及びＢＳＡの併用効果は、何も添加しない場合の１５倍以上大きい全光生成量をもたらした。
　本発明の方法の驚くべき結果は、チオール試薬及び酵素安定化剤の不在下の発光と比較して、１０分間の全発光が１５〜１７倍に増大し得ることである。上記物質の併用効果は、ルシフェラーゼのリポーターとしての有用性を増大している。優れた光生成によって、所定の生物特異反応における生産物または事象を検出する高度に感受性で迅速な方法が可能となる。
　以下の実施例によって本発明を更に説明する。これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１
　外来宿主中のルシフェラーゼ合成を検出するための、溶解剤及びアッセイ試薬からなるキットを製造した。溶解剤は、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−リン酸塩（ｐＨ　７．８）、１０％グリセロール（エチレングリコールで置換し得る）、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００［商標；Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ　Ｃｏｒｐ．製．１分子当たり９〜１０個の平均エチレニルオキシ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ユニット数を有するオクトキシノール混合物である非イオン洗剤］、１ｍｇ／ｍｌウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍＭ　ＣＤＴＡ（シクロヘキシレンジアミン四酢酸塩）及び２ｍＭ　ＤＴＴからなっていた。アッセイ試薬は、２０ｍＭトリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）緩衝液（ｐＨ　７．８）、３３．３ｍＭ　ＤＴＴ、８ｍＭ　Ｍｇ＋２、０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５３ｍＭ　ＡＴＰ、０．４７ｍＭ　ルシフェリン及び０．２７ｍＭ　ＣｏＡからなっていた。
　細胞質抽出物を、プラスミドｐＲＳＶＬを含むＮＩＨ　３Ｔ３細胞、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドから、ラウス肉腫ウイルスゲノムに対応するプロウイルスＤＮＡの５’−ＬＴＲの転写制御下で誘導した。細胞を１００ｍｍペトリ皿の約１／３に生長させた。次いで細胞を当業界で公知の標準リン酸カルシウム法を使用して１０μｇプラスミドＤＮＡで形質転換させ、さらに４８時間生長させた。
　培養した細胞に溶解剤１ｍｌを添加して室温で２〜５分溶解した。溶解後、細胞破片を簡単に遠心分離（約１０秒）して除去し、ルシフェラーゼ活性に関して上清（即ち、細胞質抽出物溶液）を試験した。
　細胞質抽出物：アッセイ試薬約１：５〜１：２５の割合でアッセイ試薬と細胞質抽出物を混合し、酵素活性を試験した。混合する際に注入法は使用しなかった。
　本発明のアッセイの細胞抽出物−ルシフェリン反応の発光を、ルシフェラーゼ活性に関する通常のアッセイと比較した。本発明のアッセイは注入方法が必要ないが、通常の従来のアッセイで必要な混合用に注入−型フォーマットを使用して比較を実施した。これらの比較では、２０ｍＭ　トリシン、８ｍＭ　Ｍｇ＋２、０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡの緩衝液（ｐＨ　７．８）中、０．８ｍＭ　ＣｏＡ、１．４ｍＭ　ルシフェリン、１．５ｍＭ　ＡＴＰ及び９０ｍＭ　ＤＴＴを含む溶液１００μｌを、２０μｌ細胞質抽出物と２００μｌ緩衝液（２０ｍＭトリシン、０．８ｍＭ　Ｍｇ＋２、０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐＨ７．８）とを混合することにより作成した溶液２２０μｌに注入し、次いで発光を標準ルミノメーター（例えば、Ｔｕｒｎｅｒモデル　２０　ルミノメーター）を使用して測定した。遺伝学的事象［例えば、転写（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，７２５−７３７：１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４，８５６−８５９（１９８６））］のリポーターとして使用されるルシフェラーゼの最初の報告に記載されているアッセイを適用する通常の比較アッセイは、２５ｍＭ　グリシルグリシン、１２ｍＭ　Ｍｇ＋２の緩衝液（ｐＨ７．８）中０．６７ｍＭ　ルシフェリンを含む溶液１００μｌを、２０μｌ細胞質抽出物と５．８３ｍＭ　ＡＴＰを含む２００μｌ緩衝液（２５ｍＭ　グリシルグリシン、１２ｍＭ　Ｍｇ＋２，ｐＨ７．８）を混合して作成した溶液２２０μｌに注入することからなる。
　図５は、これらの試験結果を示している。図５のグラフに於いて、発光強度が注入時間からの時間の関数としてプロットされている。この結果は、０〜６０秒で強度対時間曲線の積分により出力を決定すると、本発明のアッセイが従来のアッセイの１０倍の光の出力（即ち、生起した発光）を出すことを示し、０〜５０分で強度対時間曲線の積分により出力を決定すると、従来のアッセイと比較して生起した発光が１７倍増加することを示している。従来のアッセイと比較して、本発明の方法のアッセイでの強度に強いピークがないことは、図５から明らかである。
実施例２
　１ｍｇ／ｍｌストックルシフェラーゼ溶液を、１０％　硫酸アンモニウム及び１０％グリセロール中の結晶質の純粋なＰ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼから調製した。反応に使用するルシフェラーゼ溶液を、実施例１に記載の溶解剤を１００倍に希釈してストック溶液から調製した。各希釈液から２０μｌを実施例１に記載のアッセイ試薬２００μｌに（注入せずに）添加し、発光を測定するために標準ルミノメーターにセットした。
　図６は、種々のサンプルに関してルシフェラーゼ濃度の対数の関数として生起した発光量（６０秒間の発光強度の積分により決定した）の対数をプロットしたものである。図６の曲線は、ルシフェラーゼ濃度に関して８オーダーにわたって良好な直線性を示している。このような最低濃度を示す図６のグラフ上のデータポイントのルシフェラーゼ濃度は、従来報告されたルシフェラーゼの最高感度のアッセイで検出可能のルシフェラーゼの最低濃度よりも５０倍も低い。従来法のシステムと比較して生起した発光量が多く、光測定装置中のランダムノイズの作用を平均化させる“平坦”機構により、本発明の方法は高感度となる。
　この実施例に記載の実験では、ルシフェラーゼの全濃度に於いて光生起機構は殆ど平坦である。又、各濃度（５レプリカ）に於ける測定の変動係数は、ルミノメーター中のノイズ由来のシグナルが顕著である最低濃度以外では、１．５％よりも良い。この精度レベルは、従来法即ち、注入型アッセイで通常報告されるレベルと等しいかまたはそれ以上に良好である。
　図６の曲線により表された直線性、曲線のデータポイントが測定され得る精度、及び比較的ルシフェラーゼ濃度の高い溶液（約１Ｍ）を使用して実施例４で報告された実験に基づいて、本発明のアッセイに関するルシフェラーゼ濃度の実際の範囲は、起こり得る最低のバックグラウンドを有する光検出方法が検出し得る最低濃度（現在、溶液２００μｌ容積中約１０−１８〜１０−１７Ｍ即ち、酵素約２００分子）から約１０μＭまでに広がる。実際、重要な総てのサンプル中のルシフェラーゼ濃度はこの範囲内に十分入る。
実施例３
　この実施例に於いては、ＣｏＡの存在下、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応由来の全発光に於ける反応由来の発光のピーク強度を少し減少させる好都合な作用を提供する。
　図７は、ＣｏＡを含むルシフェラーゼ−ルシフェリン混合物中に３６ｍＭのルシフェラーゼインヒビター（２−アミノエタノール）を含むと、発光のピーク強度を約１２％減少させ、反応の開始から約３分以上の発光強度の積分で測定した場合、発光生起量を増加させることを示している。
　同様に、図８は、ＣｏＡを含むルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合物中にルシフェラーゼインヒビター（リン酸塩）も含むと、発光のピーク強度は（リン酸塩濃度に依存して）下がるが、リン酸塩イオン濃度によって異なるが発光強度を時間で積分して決定した全発光量は増加する。リン酸塩濃度が高いとピーク強度はかなり下がり、長時間にわたって強度の積分すると、全発光量の増加が顕著である。
　図７及び８のデータは、０．８ｍＭ　ＣｏＡ、　１．４ｍＭ　ルシフェリン、１．５ｍＭ　ＡＴＰ，　８ｍＭ　Ｍｇ＋２、　０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５．５ｍＭ　ＤＴＴ、　２０ｍＭ　トリシン、さらに
（１）他の化合物なしまたは
（２）１１０ｍＭ　２−アミノエタノールまたは
（３）１１０ｍＭ　エタノールまたは
（４）１１０ｍＭ　エタノールと３０ｍＭ，７５ｍＭ若しくは５０ｍＭリン酸ナトリウム
を含む溶液（ｐＨ７．８）１００μｌを緩衝液（２０ｍＭ　トリシン、　８ｍＭ　Ｍｇ＋２、０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐＨ７．８）２００μｌと細胞質抽出物２０μｌとを混合して製造した溶液２２０μｌに注入し、標準ルミノメーターを使用して発光を測定した以外には、細胞質抽出物中のルシフェラーゼに関する慣用の、従来アッセイと本発明のアッセイを比較する実施例１に記載の方法を使用して得た。図７及び８に記載の如く、３６ｍＭエタノールはＣｏＡの存在下のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応での発光の生起には効果がない。
実施例４
　この実施例に於いては、ＣｏＡの存在下、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に於いて、
（１）ルシフェリンのカルボキシルとＣｏＡのチオール基の硫黄との間に、ルシフェリル−ＣｏＡ、即ちチオエステルが形成する、及び
（２）ＣｏＡと励起状態の酸化ルシフェリンとルシフェラーゼの結合体も形成するということが確認できる。
　甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列と他の蛋白質のアミノ酸配列とを比較するとこれらは殆ど相同であり、従って植物酵素、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ及び酵素長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼと共通の祖先であることが明らかになった。他の２種類の酵素とルシフェラーゼを比較するＨｙｄｒｏ−ｐａｔｈｙプロット［Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５−１３２（１９８２），各点毎の１５残基値の平均］では、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼとの類似は特に顕著であるという類似点を示す。４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ及び長鎖アシル−ＣｏＡ−シンセターゼの両方は、ＣｏＡとその個々の置換体のカルボキシル基との間のチオエステル形成を触媒する。両方の酵素に関して、ＡＴＰは基質と反応してチオエステルの形成中にアシル−ＡＭＰ中間体を形成する。上記記載の如く、ルシフェラーゼも同様に、ＡＴＰとルシフェリンからルシフェリルアデニレートを形成する。
　１９５０年代の研究では、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に於ける光生起速度でのＣｏＡの作用に関して、酸化できないルシフェリン類似物、即ちデヒドロルシフェリンはＣｏＡとそのカルボキシル基を介してチオエステル結合を形成し得たことが示されている。
　甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に於ける光生起速度に影響するＣｏＡの活性は、特にそのチオール基によって仲介されることが知見された。デチオＣｏＡは、硫黄原子の無いＣｏＡと同一である。ＣｏＡでなくデチオＣｏＡをルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混合物に添加すると、反応由来の光生起速度には全く影響がない。さらにこのようにＣｏＡにより生じた反応での光生起量の増加は、デチオＣｏＡにより特異的に阻害される。一定濃度でデチオＣｏＡが存在する場合及び存在しない場合のＣｏＡ濃度の逆数の関数として光生起に於ける増加の逆数の逆数プロットに於いて、デチオＣｏＡはＣｏＡの競合インヒビターとして活性を示した。従って、デチオＣｏＡ及びＣｏＡはルシフェラーゼの同一部位に結合するが、チオール基を欠失しているデチオＣｏＡはＣｏＡ様の活性を持たない。
　逆数プロットを求めるための実験に於いて、発光アッセイ用の緩衝液は３０ｍＭトリシン、８ｍＭ　炭酸マグネシウム、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）であった。（１０％　硫酸アンモニウム及び５０％グリセロール中）結晶質Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ１０ｍｇ／ｍｌを、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール及び１ｍｇ／ｍｌウシ胎児血清アルブミンを補った緩衝液で１０，０００倍に希釈した。次いで、アッセイ用に、１０μｌ酵素希釈液（酵素１μｇ／ｍｌ）を２００μｌ緩衝液と混合し、３ｍＭ　ルシフェリン、１．５ｍＭ　ＡＴＰ及び種々の濃度のＣｏＡ及びデチオＣｏＡ（３ｍＭ　デチオＣｏＡ：０．０１２ｍＭ，０．０６ｍＭ及び０．３ｍＭ　ＣｏＡ；デチオＣｏＡなし：０．０１２ｍＭ，０．０６ｍＭ，０．３ｍＭ　ＣｏＡ及び１．０ｍＭ　ＣｏＡ）を補った緩衝液１００μｌを得られた２１０μｌに注入すると発光が開始する。Ｔｕｒｎｅｒモデル２０ルミノメーターで発光を測定した。
　甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応により光が生起する溶液中にＣｏＡが存在すると、生起した光の色を短波長にシフトすることが知見された。この光の色は、励起状態の酵素が結合した酸化ルシフェリンと、基底状態の酵素が結合した酸化ルシフェリンとの間のエネルギーの差により決定される。短波長へのシフトは、概して酸化ルシフェリンとルシフェラーゼの結合体中、エネルギーの差がＣｏＡにより増加されることを意味する。エネルギーがこのように増加するには、酵素と励起状態の酸化ルシフェリン及びＣｏＡの結合体が存在しなければならず、これによりＣｏＡが存在しない場合の増加に対し、励起状態のオキシルシフェリンと酵素の結合体のフラクション中でエネルギーが増加し、励起状態と基底状態のオキシルシフェリンとの間のエネルギー差がより高くなる。このような結合体中でのＣｏＡの作用がルシフェラーゼ−オキシルシフェリン結合体の構造を変えることは、異なるアミノ酸配列のルシフェラーゼ及びそれゆえ少なくともやや異なる三次元構造（例えば、甲虫の異種由来）が、種々の色の生物発光の生起を触媒する上記記載の観察と一致している。
　ＣｏＡが甲虫のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応中に生起した光の波長を減少させるということは、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼに関する以下の実験で発見された。これらの比較に於いて、第１の溶液を０．８ｍＭ　ＣｏＡ、１．４ｍＭルシフェリン、１．５ｍＭ　ＡＴＰ及び９０ｍＭ　ＤＴＴを含む溶液２５０μｌと、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（１０％　硫酸アンモニウム，５０％グリセロール中１０ｍｇ／ｍｌ）の溶液０．５μｌと５００μｌ緩衝液（２０ｍＭ　トリシン、８ｍＭ　Ｍｇ＋２、０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡ：ｐＨ７．８）を混合することにより作成した溶液とを混合することにより製造した。第２の溶液を、ＣｏＡもＤＴＴも使用しない以外には同様にして製造した。第１及び第２の溶液を、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応からの光が生成したら目視で観察した。第１の溶液はいくらかだがはっきりと、第２の溶液よりも緑がかっていた。
　本発明の範囲から逸脱することなく本発明を以下説明及び例示するが、当業者には、変化、付加及び省略を含む種々の変形が考えられ得よう。従って、これらの変形は本発明に包含され、本発明の範囲は付記請求項によってのみ限定され得る。
（５７）【特許請求の範囲】
１．サンプル中の甲虫ルシフェラーゼを検出する方法であって、
（ａ）溶液と甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルとを混和して混合液を製作する工程、ここで該溶液はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において有効な活性を示すために十分な濃度のルシフェリン、更に５ｍＭから２００ｍＭの濃度の補酵素Ａ以外のチオール試薬を含み、そしてルシフェラーゼを含まず、該混合液はさらにアデノシン三リン酸およびマグネシウムイオンを含む；
（ｂ）得られた混合液からの発光を測定する工程；
から成る検出方法。
２．混合液が更に補酵素Ａを含む請求項１に記載の方法。
３．サンプル中の甲虫ルシフェラーゼを検出する方法であって、
（ａ）溶液と甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルとを混和して混合液を製作する工程、ここで該溶液はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において有効な活性を示すために十分な濃度のルシフェリン、
更に補酵素Ａと補酵素Ａ以外のチオール試薬との組合わせを含み、ここで補酵素Ａ以外のチオール試薬は５ｍＭから２００ｍＭの濃度で存在し、
（ｂ）得られた混合液からの発光を測定する工程；
から成る検出方法。
４．（ａ）ルシフェリン
（ｂ）
補酵素Ａと補酵素Ａ以外のチオール試薬の組合わせ
を含み、ここで補酵素Ａ以外のチオール試薬は５ｍＭから２００ｍＭの濃度で存在し、
５．（ａ）ルシフェリン
（ｂ）５ｍＭから２００ｍＭの濃度の補酵素Ａ以外のチオール試薬
から成り、かつルシフェラーゼを含まない、ルシフェラーゼ検出用分析試薬。
６．更に補酵素Ａを含む請求項５に記載の分析試薬。
７．一種類以上の溶液中に存在する反応組成物を含むサンプル中の甲虫ルシフェラーゼを分析する検査キットであり、該反応組成物がルシフェリンと、
５ｍＭから２００ｍＭの濃度の補酵素Ａ以外のチオール試薬
８．
補酵素Ａを更に
９．
補酵素Ａ以外のチオール試薬を２０
１０．反応組成物が更にアデノシン三リン酸およびマグネシウムイオンを含む請求項７から９のいずれか１項に記載の検査用キット。
１１．補酵素Ａ以外のチオール試薬がジチオトレイトールである請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
１２．補酵素Ａ以外のチオール試薬がジチオトレイトールである請求項４から６のいずれか１項に記載の分析試薬。
１３．補酵素Ａ以外のチオール試薬がジチオトレイトールである請求項９に記載の検査用キット。