【手続補正書】
【提出日】平成26年12月18日(2014.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてＨＩＶ−１に対する広く中和する抗体の産生を誘導する組成物であって、以下の：
ｉ）前記の対象に生殖細胞系列Ｂ細胞受容体に結合する非ＨＩＶ−１抗原、ここにおいて、前記の非ＨＩＶ−１抗原はＨＩＶ−１  Ｅｎｖと交差反応する抗体を分泌するＢ細胞の中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与され、そして
ｉｉ）ＨＩＶ−１抗原、ここにおいて、前記のＨＩＶ−１抗原は、前記の広く中和する抗ＨＩＶ−１抗体を分泌するナイーブＢ細胞または前記のＢ細胞の中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与される
を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記の対象がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が脂質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記の脂質がカルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、またはそれらの誘導体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記の脂質が１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記の脂質がリン脂質の六方ＩＩ相である、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記の非ＨＩＶ−１抗原がフィコエリトリン（ＰＥ）、Ｃ−フィコシアニン（Ｃ−ＰＣ）、アポフェリチン、または嫌気性もしくは好気性腸細菌叢もしくはその構成要素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が細菌または真核生物のＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記の非ＨＩＶ−１抗原がキヌレニナーゼ（ＫＹＮＵ）またはその抗原性断片である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記のＫＹＮＵがＣＨＯまたは２９３Ｔ細胞で発現させた組換えＫＹＮＵ、またはその抗原性断片である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
さらにアジュバントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記のアジュバントがスクアレンに基づくアジュバント、ＴＲＬ作動薬、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ）（ｏＣｐＧ）またはＲ８４８である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記のＨＩＶ−１抗原が膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）抗原、またはその変種である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記のＨＩＶ−１抗原が図１６Ｂ、１６Ｃ、１７、１８、２０、２５または２６において示した免疫原である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記の変種がＬ６６９Ｓ変異を有するＭＰＥＲエピトープペプチドである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記のＨＩＶ−１抗原が伝染始祖ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、またはその抗原性断片である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記の断片がｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の一部、ＭＰＥＲ配列、またはｇｐ１２０のＶ２もしくはＶ３領域を含むｇｐ１２０の一部を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が脂質、嫌気性または好気性腸細菌叢の細菌の構成要素、フィコビリタンパク質、またはＫＹＮＵもしくはその断片を含み、前記のＨＩＶ−１抗原がマラウイからの伝染始祖Ｅｎｖ  １０８６．Ｃ、マラウイからの０８９．Ｃ、米国からの０４０＿Ｃ９およびクレードＢ急性ＨＩＶ−１に感染した米国の患者からの６３５２１からなるグループから選択されるＨＩＶ−１  Ｅｎｖ抗原を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記の非ＨＩＶ抗原または前記のＨＩＶ抗原がタンパク質を含み、前記のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、前記のＤＮＡ配列が発現し、それにより前記のタンパク質が生成されるような条件の下で前記の対象に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が前記のＨＩＶ−１抗原および少なくとも１種類のアジュバントと共にリポソーム中に存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が前記のＨＩＶ−１抗原にコンジュゲートしており、１種類以上のアジュバントと配合されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
ＣＨＯ１、ＣＨＯ２、ＣＨＯ３、ＣＨＯ４、およびＣＨＯ５、またはその抗原結合断片からなるグループから選択される抗体。
【請求項２３】
核酸配列１３、１９又は２２を含む核酸配列を有する核酸。
【請求項２４】
核酸配列１３、１９又は２２に由来する第２核酸配列を有し、ｇｐ１２０エンベロープをコードする核酸。
【請求項２５】
核酸配列１３、１９又は２２に由来する第２核酸配列を有し、ｇｐ１４０ＣＦエンベロープをコードする核酸。
【請求項２６】
核酸配列１３、１９又は２２に由来する第２核酸配列を有し、ｇｐ１４０ＣＦＩエンベロープをコードする核酸。
【請求項２７】
核酸配列１３、１９又は２２の核酸配列、あるいは、請求項２４−２６のいずれか１項の第２核酸配列を有する核酸。
【請求項２８】
配列番号１２、１８又は２３をコードするヌクレオチドを含む核酸。
【請求項２９】
配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１２０エンベロープをコードするヌクレオチドを含む核酸。
【請求項３０】
配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１４０ＣＦエンベロープをコードするヌクレオチドを含む核酸。
【請求項３１】
配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１４０ＣＦＩエンベロープをコードするヌクレオチドを含む核酸。
【請求項３２】
請求項２３−３１のいずれか１項の核酸を含むベクター。
【請求項３３】
ベクターがアデノウイルス又はマイコバクテリアである、請求項３２のベクター。
【請求項３４】
配列番号１２、１８又は２３のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３５】
配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１２０エンベロープのアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３６】
配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１４０ＣＦエンベロープのアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３７】
配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１４０ＣＦＩエンベロープのアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３８】
配列番号１２、１８又は２３の、配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１２０エンベロープの、配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１４０ＣＦエンベロープの、あるいは、配列番号１２、１８又は２３に由来するｇｐ１４０ＣＦＩエンベロープの、タンパク質。
【請求項３９】
請求項２３−３１の核酸、請求項３２−３３のベクター、あるいは、請求項３４−３８のタンパク質を含む、免疫原性組成物。
【請求項４０】
さらにアジュバントを含む、請求項３９の免疫原性組成物。
【請求項４１】
アジュバントがスクアレンに基づくアジュバント、ＴＲＬ作動薬、あるいはミョウバンおよびＱ５２１である、請求項４０の免疫原性組成物。
【請求項４２】
アジュバントが、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ）（ｏＣｐＧ）またはＲ８４８である、請求項４１の免疫原性組成物。
【請求項４３】
ＨＩＶ−１に対する抗体を誘導するために、請求項３９−４２のいずれか１項の免疫原性組成物。
【請求項４４】
誘導される抗体が広く中和する抗体である、請求項３２の免疫原性抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
この発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により与えられた助成金第ＡＩ２４３３５号および第ＡＩ８１５７９号の下での政府援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
稀な広く反応する中和抗体が結合するＨＩＶ−１エンベロープ上の４つのエピトープは、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ＢＳ）（ｍａｂ（モノクローナル抗体）ＩｇＧ１ｂ１２）(Zwick et al, J. Virol. 77(10):5863-5876 (2003))、ヒトｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０により定められる膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）エピトープ(Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54:915-920 (2004), Stieglerand Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 51:757-759 (2003), Zwicket al, Journal of Virology 79:1252-1261 (2005), Purtscheret al, AIDS 10:587 (1996))、ならびにヒトｍａｂ  ２Ｇ１２により定められるマンナングリカンエピトープ(Scanlan et al, Adv. Exper. Med. Biol. 535:205-218 (2003))である。これらの４種類の稀なヒトｍａｂは全て普通ではなく：２種類はＩｇＧ３であり（２Ｆ５および４Ｅ１０）、１種類は独特のＩｇ二量体構造を有し（２Ｇ１２）、１種類は非常に疎水性のＣＤＲ３を有し（２Ｆ５）(Ofek et al, J. Virol. 198:10724 (2004))、そして４種類全てにおいて、そのＣＤＲ３が異常に長い(Burton et al, Nature Immunol. 5(3):233-236 (2004), Kunert et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20(7):755-762 (2004), Zwick et al, J. Virol. 78(6):3155-3161 (2004), Cardoso et al, Immunity 22:163-172 (2005))。これらの内で、２Ｆ５および４Ｅ１０様のヒトｍａｂは極めて稀である。急性ＨＩＶ−１患者はＭＰＥＲまたは２Ｇ１２エピトープに対する抗体を作らず、ＭＰＥＲはＨＩＶエンベロープのアミノ酸６５２〜６８３として定義することができる(Cardoso et al, Immunity 22:163-173 (2005)（例えば、ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＫ）（配列番号１）。ＣＤ４結合部位（ＢＳ）抗体は一般にＨＩＶ−１感染の早期に作られるが、これらの抗体は一般にｍａｂ  ＩｇＧ１ｂ１２により示される広い中和のスペクトルを有しない(Burton et al, Nat. Immunol. 5(3):233-236 (2004))。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】図１．Ｈ１ソロモン諸島（Ｓｏｌｏｍａｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ）ヘマグルチニンに対する代表的なインフルエンザ抗体クローン。
【図２】図２．ＨＩＶ−１の伝染の約２０日後の患者６８４−６における形質細胞抗体レパートリー。
【図３】図３．推定される中間クローン抗体の生成。
【図４】図４．そのクローンの発生のどこでｇｐ４１との反応性が獲得されたのかを決定するために、クレードＢ  ｇｐ４１、自己由来ｇｐ１４０およびグループＭコンセンサスｇｐ１４０との反応性に関してアッセイされた、推定される生殖細胞系列およびクローンメンバー中間体。
【図５】図５．２番目の中間前駆体抗体において獲得されたクローン６８４−６Ｂの反応性（図４も参照）。
【図６】図６．ｍｇの量で産生され、ｇｐ４１に対する抗体結合の解離定数（Ｋｄ）に関して分析された、追加の推定される中間抗体クローン。
【図７】図７．患者６８４−６のクローン６８４−６Ｂ生殖細胞系列におけるｇｐ４１反応性の獲得および推定される中間抗体。
【図８】図８．６８４６クローン５２の生殖細胞系列および推定される中間ｇｐ４１抗体の多反応性。
【図９】図９．好気性腸細菌叢のクローン６８４−６Ｂ抗体との反応性。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂ．腸抽出物のＢｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥおよびＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像。図１０Ａ．クーマシーブルー画像。図１０Ｂ．ウェスタンブロット画像。
【図１１】図１１．腸抽出物のＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像−非還元的、ＨＶ００２７６に対して。
【図１２】図１２．腸抽出物のＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像−還元的、ＨＶ００２７６に対して。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂ．１ｂ１２生殖細胞系列抗体は脂質（ＰＣ：ＣＬリポソーム）に結合する。図１３Ａ．ＨＩＶ８９．６  ｇｐ１２０への結合。図１３Ｂ．脂質（ＰＣ：カルジオリピン）への結合。
【図１４】図１４．４Ｅ１０  ＶＨノックインマウスでは、骨髄において４Ｅ１０  ＶＨを発現するＢ細胞の大部分がプレＢ〜未熟Ｂ細胞期において削除される（ｄｅｌｅｔｅｄ）。
【図１５】図１５．広く中和する抗体の誘導に関する２つの障害。第１の障害は、稀な広く中和する抗体を産生するＢ細胞を刺激するように現在設計されているワクチンは、免疫原に応答することが必要とされているナイーブＢ細胞の生殖細胞系列Ｂ細胞受容体と反応しないことである。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖに対する初期のＢ細胞応答は感染後早期に開始されるが、初期のｇｐ４１抗体応答を作るそのＢ細胞抗体クローンが既存の多反応性の自然Ｂ細胞クローン（それの生殖細胞系列はｇｐ４１とも反応せず、ｇｐ４１との交差反応性は宿主または外来の抗原に駆動されるクローン拡大により獲得されるため、それのｇｐ４１に対する反応性はクローン性抗体発生の後期に獲得される）に由来するような、ｇｐ４１の宿主または既存の外来分子との交差反応性が存在する。一度ｇｐ４１の反応性が獲得されたら、次いでｇｐ４１はクローンの拡張を駆動する。ワクチン開発に対する第２の障害は、これらの抗体の両方が中和するために脂質反応性を有する長い疎水性のＣＤＲ３を必要とすること(Alam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:20234-9 (2009))、ならびに２Ｆ５および４Ｅ１０  ＶＨはノックインマウスにおいて削除を促進するのに十分に自己反応性であることを示す研究から来ている(Verkoczy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:181-186 (2010))。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ  ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ  ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ  ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ  ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ  ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｆ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ  ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１７】図１７．ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０コンストラクトの設計。
【図１８】図１８．Ｂｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、急性ＨＩＶ−１  ＥｎｖおよびグループＭコンセンサスＨＩＶ−１  Ｅｎｖの分析。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび１９Ｂ．図１９Ａ．グループＭコンセンサスＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、ＣＯＮ−Ｓおよび亜型Ｃ急性ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、１０８６Ｃ、亜型Ｂ慢性ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、ＪＲＦＬの免疫原性。図１９Ｂ．方法。図１９Ｂは、記載順に各々、配列番号９−１０を開示する。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび１９Ｂ．図１９Ａ．グループＭコンセンサスＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、ＣＯＮ−Ｓおよび亜型Ｃ急性ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、１０８６Ｃ、亜型Ｂ慢性ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、ＪＲＦＬの免疫原性。図１９Ｂ．方法。図１９Ｂは、記載順に各々、配列番号９−１０を開示する。
【図２０】図２０．ＪＲＦＬ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０  ＣＦのＰＮＧａｓｅによる糖鎖除去。
【図２１Ａ】図２１Ａおよび２１Ｂ．ＥＬＩＳＡにおけるＪＲＦＬ  ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０ＣＦの抗原性。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび２１Ｂ．ＥＬＩＳＡにおけるＪＲＦＬ  ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０ＣＦの抗原性。
【図２２】図２２．ＳＰＲにおけるＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖの抗原性。
【図２３】図２３．広く中和する抗体により標的とされるＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合中間体状態。図２３は、配列番号１１として“Ｈｉｓ６”を開示する。
【図２４Ａ】図２４Ａおよび２４Ｂ．図２４Ａ．膜に固定されたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒの設計。図２４Ｂ．２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂは、膜にコンジュゲートされたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒに、ｎＭのＫｄおよびほとんど不可逆的な解離速度で結合する。図２４Ａは、配列番号１１として“Ｈｉｓ６”を開示する。
【図２４Ｂ】図２４Ａおよび２４Ｂ．図２４Ａ．膜に固定されたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒの設計。図２４Ｂ．２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂは、膜にコンジュゲートされたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒに、ｎＭのＫｄおよびほとんど不可逆的な解離速度で結合する。図２４Ａは、配列番号１１として“Ｈｉｓ６”を開示する。
【図２５】図２５．リード候補免疫原。
【図２６】図２６．ＴＬＲリガンドおよび封入された免疫調節性リガンドを有するｇｐ４１−ｉｎｔｅｒリポソーム。
【図２７】図２７．ＨＩＶ−１の伝染始祖Ｅｎｖ  １０８６．Ｃ、０８９．Ｃ、０４０＿Ｃ９、および６３５２１に関するアミノ酸配列およびコドン最適化されたコーディング配列。図２７は、記載順に各々、配列番号１２−１９を開示する。
【図２８】図２８．クレードＢ  ＪＲＦＬおよび６２４０  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ配列およびコーディング配列。図２８は、記載順に各々、配列番号２０−２３を開示する。
【図２９−１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−３０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図３０】図３０．広く中和する抗体である２Ｆ５および４Ｅ１０は、系統発生的に保存されている自己抗原と反応する。
【図３１】図３１．２Ｆ５はウェスタンブロットにおいて４３ｋＤａ、５０ｋＤａ、７０ｋＤａおよび３５０ｋＤａの３Ｔ３（マウス）細胞タンパク質に特異的に結合する。
【図３２】図３２．２Ｆ５名目（ｎｏｍｉｎａｌ）エピトープを有する保存された自己抗原。図３２は、記載順に各々、配列番号２、２４および２４−２５を開示する。
【図３３】図３３．キヌレニナーゼ（ｋｙｎｕｅｒｅｎｉｎａｓｅ）（ＫＹＮＵ）のＨ３ドメインは高度に保存されている。図３３は、記載順に各々、配列番号２６−３６を開示する。
【図３４】図３４．ヒトＫＹＮＵ（ＰＤＢ  ２ＨＺＰ）の構造およびＥＬＤＫＷＡ（配列番号２）モチーフの位置。
【図３５】図３５．ヒトＫＹＮＵ中のＤＫＷ残基（ＥＬＤＫＷＡ）（配列番号２）の図説。
【図３６】図３６．２Ｆ５抗体のヒトＫＹＮＵへの結合は、そのＨ３ドメインの歪みを必要とする可能性がある。図３６は、配列番号２として“ＥＬＤＫＷＡ”を開示する。
【図３７】図３７．ＫＹＮＵ二量体はおそらく潜在的２Ｆ５結合部位を覆い隠す。図３６は、配列番号２として“ＥＬＤＫＷＡ”を開示する。
【図３８】図３８．２Ｆ５およびおそらく４Ｅ１０抗体は、ウェスタンブロットにおいて組換えヒトＫＹＮＵに結合する。
【図３９】図３９．ＫＹＮＵは２Ｆ５ファミリー抗体により認識される。
【図４０】図４０．２Ｆ５抗体は標準的なＥＬＩＳＡにおいてｒｈＫＹＮＵと強く（ａｖｉｄｌｙ）反応する。
【図４１】図４１．２Ｆ５抗体は２Ｆ５エピトープを含有するペプチド（ＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌ）と反応する−抗ＫＹＮＵ抗体は反応しない。
【図４２】図４２．ｒｈＫＹＮＵおよびＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌに対する２Ｆ５の結合は標準的なＥＬＩＳＡにおいて比較可能である。
【図４３】図４３．ＥＬＩＳＡプレートにおける抗体結合は抗原特異的である。
【図４４】図４４．１３Ｈ１１はｒｈＫＹＮＵに結合しない。
【図４５】図４５．１３Ｈ１１はＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌと反応するがＭＰＥＲ−６５６とは反応しない。図４５は、記載順に各々、配列番号２４および３７−３８を開示する。
【図４６】図４６．ＪＲＦＬ、ＤＰ１７８−Ｑ１６ＬおよびＲ４Ａによる、２Ｆ５のｒｈＫＹＮＵへの結合の競合阻害。
【図４７】図４７．２Ｆ５のｒｈＫＹＮＵおよびＪＲＦＬへの結合の競合阻害。
【図４８】図４８．可溶性ＫＹＮＵは２Ｆ５により結合される。
【図４９】図４９．表面に捕捉されたｍａｂへのｒｈＫＹＮＵの結合。
【図５０−１】図５０Ａ〜５０Ｃ．２Ｆ５  ｍＡｂおよび２Ｆ５  ＲＵＡ（復帰未変異祖先（ｒｅｖｅｒｔｅｄ  ｕｎｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｃｅｓｔｏｒ））抗体のＫＹＮＵへの結合、（図５０Ａ）２Ｆ５、（図５０Ｂ）２Ｆ５−ＧＬ１、（図５０Ｃ）２Ｆ５−ＧＬ３。
【図５０−２】図５０Ａ〜５０Ｃ．２Ｆ５  ｍＡｂおよび２Ｆ５  ＲＵＡ（復帰未変異祖先（ｒｅｖｅｒｔｅｄ  ｕｎｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｃｅｓｔｏｒ））抗体のＫＹＮＵへの結合、（図５０Ａ）２Ｆ５、（図５０Ｂ）２Ｆ５−ＧＬ１、（図５０Ｃ）２Ｆ５−ＧＬ３。
【図５１】図５１．組換えＨＩＶ−１  ｇｐ１４０（ＪＲＦＬ）、ならびにＤＰ１７８およびＲ４Ａペプチドによる、２Ｆ５の３Ｔ３細胞への結合の阻害。
【図５２−１】図５２Ａ〜５２Ｄ．ｍＡｂ  ＨＶ００２７６と反応する腸細菌溶解物におけるタンパク質のバンドの濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）および同定。（図５２Ａ）Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥゲル泳動後のウェスタンブロット分析。（図５２Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後に集められた約５００ｋＤａの分子量を有する細菌溶解物からのタンパク質画分。（図５２Ｃ）ＳＥＣ画分は、クーマシーブルー（１）および銀染色（２）およびウェスタンブロッティング（３、矢印）により５２０ｋＤａのタンパク質の濃縮を示す。（図５２Ｄ）ｚｏｏｍ等電点分画法。
【図５２−２】図５２Ａ〜５２Ｄ．ｍＡｂ  ＨＶ００２７６と反応する腸細菌溶解物におけるタンパク質のバンドの濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）および同定。（図５２Ａ）Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥゲル泳動後のウェスタンブロット分析。（図５２Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後に集められた約５００ｋＤａの分子量を有する細菌溶解物からのタンパク質画分。（図５２Ｃ）ＳＥＣ画分は、クーマシーブルー（１）および銀染色（２）およびウェスタンブロッティング（３、矢印）により５２０ｋＤａのタンパク質の濃縮を示す。（図５２Ｄ）ｚｏｏｍ等電点分画法。
【図５３Ａ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（配列番号３９）のＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニット（配列番号４０）のＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニット（配列番号４１）のＬＣ−ＭＳ同定。
【図５３Ｂ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（配列番号３９）のＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニット（配列番号４０）のＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニット（配列番号４１）のＬＣ−ＭＳ同定。
【図５３Ｃ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（配列番号３９）のＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニット（配列番号４０）のＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニット（配列番号４１）のＬＣ−ＭＳ同定。
【図５４】図５４．Ｍａｂ  ＨＶ００２７６はＲＮＡポリメラーゼのコアタンパク質に結合する。
【図５５】図５５．Ｍａｂ  ＨＶ００２７６はＲＮＡポリメラーゼのコアタンパク質のαサブユニットに結合する。
【図５６】図５６．一次記憶Ｂ細胞培養物の中和スクリーニング。ＣＨＡＶＩ０８、慢性的にＨＩＶ−１に感染した志願者７０７−０１−０２１−９の末梢血からの記憶Ｂ細胞をＥＢＶで形質転換し、ＣＤ４０リガンド、ｏＣｐＧおよびＣＨＫ−２阻害剤の存在下で８細胞／ウェルの密度で１４日間刺激した。刺激の終了時に、上清をレポーターである２層（ｔｉｅｒ）クレードＣ  ＣＡＰ４５ウイルスに対する中和活性に関して試験した。黒い点は３，６００培養物のそれぞれの中和の百分率を表す。モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５は白い点の記号で表した培養物から分離された。陽性対照（ＨＩＶ  Ｉｇ）を右端の白い点として示す。
【図５７Ａ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（記載順に各々、配列番号４２−４７）（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（記載順に各々、配列番号４８−５２）（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（配列番号５３）（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５７Ｂ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（記載順に各々、配列番号４２−４７）（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（記載順に各々、配列番号４８−５２）（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（配列番号５３）（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５７Ｃ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（記載順に各々、配列番号４２−４７）（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（記載順に各々、配列番号４８−５２）（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（配列番号５３）（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５８】図５８．ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体のＶ重鎖の系統樹。
【図５９−１】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。図５９は、記載順に各々、配列番号５４−７８を開示する。
【図５９−２】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。図５９は、記載順に各々、配列番号５４−７８を開示する。
【図５９−３】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。図５９は、記載順に各々、配列番号５４−７８を開示する。
【図６０】図６０．ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３の４次の広く中和する抗体のＡ２４４  ｇｐ１２０への結合。
【図６１】図６１．ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３の４次の広く中和する抗体の復帰未変異祖先のＡ２４４  ｇｐ１２０への結合。
【図６２】図６２．ＰＧ９およびＰＧ１６はＡ２４４  ｇｐ１２０および６４２０  Ｔ／Ｆ  ｇｐ１４０の両方に結合する。
【図６３】図６３．Ａ２４４ｇＤ＋  ｇｐ１２０エンベロープと比較してＡ２４４ｇＤ−  ｇｐ１２０エンベロープへの結合親和性が減少したＣＨ０１モノクローナル抗体。
【図６４】図６４．４８パーセントの抗ｇＤ  ＩｇＡワクチン応答（９９人の対象）。
【図６５】図６５．８１パーセントの抗ｇＤ  ＩｇＧワクチン応答（９９人の対象）。
【図６６】図６６．ｇＤの免疫原性の強い関連性。図６６は、記載順に各々、配列番号７９−８０を開示する。
【図６７】図６７．ＨＥＰ−２の結合。
【図６８】図６８．キフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）処置の、ＣＨ０１の中和を仲介する能力への作用。
【図６９−１】図６９．ＣＨ０１（ここでは１−２７−Ｇ２と呼ぶ）の配列のＰＧ１６  Ｆａｂとの重ね合わせ（Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【図６９−２】図６９．ＣＨ０１（ここでは１−２７−Ｇ２と呼ぶ）の配列のＰＧ１６  Ｆａｂとの重ね合わせ（Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
実施例３で提供するデータに基づいて、この内在性のリガンドはＢおよびＴリンパ球の寛容化を招き、それによりＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープペプチドを投与されたヒトにおいてＨＩＶ−１に対する有効な免疫応答の生成を阻害することが予想される。本発明は、１態様において、この寛容を特異的に、すなわち他の無関係な自己抗原に対する寛容化に影響を及ぼすことなく壊す交差反応性抗原を投与することを含む、ＨＩＶ−１に対する免疫形成を達成する方法を提供する。適切な抗原には、例えば、ＣＨＯまたは２９３Ｔ細胞において発現させたＥＬＤＫＷＡ配列（配列番号２）またはＥＬＥＫＷＡ配列（配列番号３）（ＥＬＥＫＷＡ（配列番号３）はヒトのタンパク質には存在せず、従って寛容化されないと予想される）を有する変異ｇｐ４１もしくはＫＹＮＵ配列を有する組換えＫＹＮＵ分子が含まれる。用いることができる他の免疫原には、ＥＬＥＫＷＡ（配列番号３）またはＥＬＤＫＷＡ（配列番号２）配列のどちらかを有するリポソーム中の伝染／始祖または野生型慢性エンベロープｇｐ１４０もしくはｇｐ１６０またはＭＰＥＲペプチドが含まれる。ＥＬＤＫＷＡ（配列番号２）配列を有する免疫原は、強いアジュバント、例えばスクアレンに基づくモノホスホリル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）リピドＡ、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ）（ｏＣｐＧ）およびＲ８４８（ＴＲＬ−７／８作動薬）と共に投与するのが好都合である。これらのＴＬＲ作動薬およびＩＦＮαを含むリポソームも用いることができる。（下記の注釈も参照。）
本発明における使用に適したＨＩＶ−１抗原には、膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）抗原(Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54:915-920 (2004), Stieglerand Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 512:757-759 (2003), Zwicket al, Journal of Virology 79:1252-1261 (2005), Purtscheret al, AIDS 10:587 (1996))ならびにその変種、例えばＭＰＥＲ  Ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０に対する、または他の広く中和するＥｎｖに対するより高い中和感受性を与える変種、例えばＭＰＥＲ中にＬ６６９Ｓ変異を含有するＭＰＥＲ変異体Ｅｎｖペプチド脂質複合体が含まれる(Shen et al, J. Virology 83:3617-25 (2009))。好ましい免疫原には、図２５および２６、ならびに図１６Ｂ、１６Ｃ、図１７、図１８および図２０において示した免疫原が含まれる。別の好ましい態様において、その変種はＭＰＥＲ  ｍＡｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０に対するより高い中和感受性を与えるＬ６６９Ｓ変異を有するＭＰＥＲエピトープペプチドである(Shen et al, J. Virology 83: 3617-25 (2009))。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬有りまたは無しでＭＰＥＲ抗原を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）リポソーム(Dennison, et al, J. Virology 83:10211-23 (2009))が記述されている（例えばＷＯ  ２００８／１２７６５１を参照）。Ｇｐ４１中間体状態タンパク質（図２３）は、(Frey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105-3739-44 (2008))により記述されている。そのｇｐ４１中間体は、リポソームと配合して（図２４Ａおよび２４Ｂ）２Ｆ５および４Ｅ１０に十分に結合する安定な免疫原を形成することができる（図２５）。本発明のＧｐ４１  ＭＰＥＲ免疫原は、例えばモノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ  Ａ）（ＭＰＬ−Ａ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，アラバマ州アラバスター）およびＴＬＲ９作動薬、例えばｏＣｐＧ  １０１０３（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ−３’）（配列番号４）およびＲ８４８  ＴＬＲ７作動薬（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニューヨーク州ファーミングデール）を組み込むことにより抗原性を増強することができる（図２６）。加えて、Ｂ細胞クラススイッチのサイトカイン刺激物質、例えばＢＡＦＦ（ＢＬＹＳ）および／またはＡＰＲＩＬ(He et al, Immunity 26:812-26 (2007); Ceruttiand Rescigno, Immunity 28: 740-50 (2008))を、最適なＢ細胞の刺激のためにそのリポソーム中に組み込むことができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイによる抗体特異性に関するスクリーニング。上清中の組換えｍＡｂの濃度を、記述されたような方法(Liao et al, J. Virol. Meth. 158:171-179 (2009))を用いて決定した。発現した組換えｍＡｂの特異性を、ＨＩＶ−１抗原に対する、および一群の非ＨＩＶ−１抗原に対する抗体反応性に関してアッセイした。ＨＩＶ抗原には、Ｅｎｖペプチドｇｐ４１免疫優性領域（ＲＶＬＡＶＥＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＮＫ）（配列番号５）、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ領域（ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮ（配列番号６）、ＨＩＶ−１  ＭＮ  ｇｐ４１（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，マサチューセッツ州ウォバーン）、ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスｇｐ１２０(Liao et al, Virology 353:268-82 (2006))、ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスｇｐ１４０  ＣＦＩ(Liao et al, Virology 353:268-82 (2006))、ｐ６６（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ニュージャージー州レイクウッド）、ｐ５５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，コネチカット州メリデン）、ｐ３１（Ｇｅｎｗａｙ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ｎｅｆ（Ｇｅｎｗａｙ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ｔａｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，メリーランド州ケンシントン）、およびＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１  ＡＤＡビリオン(Rutebemberwa et al, AIDS Res. Human Retrovirol. 23:532-42 (2007))；ＮＩＨ，ＮＣＩ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ癌研究施設のJeffrey Lifsonから頂いたもの）が含まれていた。加えて、６８４−６  ｍＡｂを自己由来ｇｐ１４０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に対してアッセイし、ＦＩＫＥ  ｍＡｂを自己由来ｇｐ１４０およびｇｐ１２０に対してアッセイした。非ＨＩＶ−１抗原には、３価インフルエンザワクチン２００７（ＦＬＵＺＯＮＥ  ２００７）、Ｈ１Ａ／ソロモン諸島／０３／２００６からの組換えインフルエンザＨＡタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．コネチカット州メリデン）、破傷風トキソイド（ｔｏｘｉｏｄ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ＨＥＰ−２細胞（Ｉｎｖｅｒｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ニュージャージー州プリンストン）、カルジオリピン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，所在地（アラバマ州アラバスター）(Haynes et al, Science 308:1906-8 (2005)）およびリピドＡ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，アラバマ州アラバスター）が含まれていた。腸細菌叢と呼ばれる嫌気性および好気性細菌抽出物の全細胞溶解物を、下記で記述するように調製した。簡潔には、細菌を患者からの４つの便の標本から接種し、寒天プレート上で嫌気性または好気性条件下で３０℃において増殖させた。コンフルエントの細菌を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、商業的に入手可能な細菌タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，イリノイ州ロックフォード）を用いて処理した。得られた抽出物を０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、使用まで−８０℃で保管した(Kawatsu et al, J. Clin. Microbiol. 46:1226-31 (2008))。ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）、インフルエンザＨＡ、ｇｐ４１免疫優性およびＭＰＥＲ領域、ならびに腸���菌叢全細胞溶解物に対するアッセイを、ＥＬＩＳＡ(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))およびＬｕｍｉｎｅｘビーズアッセイ(Tomaraset al, J. Virology 82:12449-63 (2008))の両方により実施した。破傷風トキソイド、カルジオリピン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）、死菌クリプトコッカスおよびカンジダアルビカンスに対するアッセイはＨｅｐ−２上皮細胞との反応性に関するＥＬＩＳＡアッセイであり、間接的な免疫蛍光アッセイであった(Mietzner et al, Proc. Natl. Acad.. Sci. USA 105:9727-32 (2009))。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
保存された哺乳類のタンパク質ＫＹＮＵはコア２Ｆ５エピトープを有し、５１ｋＤａの分子量を有する（図３２）。その２Ｆ５コアエピトープは多くの脊椎動物種のＫＹＮＵ中に存在し（図３３）、ＫＹＮＵの保存されたＨ３ドメイン中に存在している（図３４）。図３５で示したように、ＥＬＤＫＷＡ（配列番号２）領域は秩序正しいアルファらせん中にある。ＤＫＷモチーフは表面に露出していない。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
２Ｆ５抗体のヒトＫＹＮＵへの結合はＨ３ドメインの歪みを必要とする可能性があり、それは結果として遅くなったＫＯＮをもたらす可能性がある。図３６で示したように、Ｈ３において、ＤおよびＷ残基はおそらく露出した側鎖を有するが、Ｋは埋まっている。２Ｆ５抗体はＥＬＤＫＷＡ（配列番号２）エピトープに結合するために必然的にＨ３らせんを“歪める”可能性がある。生理的条件下では、ＫＹＮＵはホモ二量体であると考えられる。ＥＬＤＫＷＡ（配列番号２）モチーフはＫＹＮＵ単量体にとって利用可能である可能性があるが、ＫＹＮＵが２量体を形成した際はアクセス可能でありそうもない（図３７および３８）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
実施例４
２Ｆ５の固定された３Ｔ３細胞への反応性が、２Ｆ５  ＭＰＥＲコアエピトープ（ＥＬＤＫＷＡ）（配列番号２）を含有するタンパク質／ポリペプチドにより阻害され得るかどうかを決定するため、２Ｆ５モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を増大するモル濃度の同種（ＪＲＦＬおよびＤＰ１７８）または異種（Ｒ４Ａ）阻害剤と反応させた（１時間、２５℃）。続いてこれらの混合物を、メタノール／アセトンで固定した３Ｔ３細胞で覆われた水和された／ブロッキングされたスライドに添加した（２時間、２５℃）。スライドをすすぎ、次いで２５０ｍｌの（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で一夜洗浄した。洗浄されたスライドを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：４００）で覆った。１時間後、スライドを洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ中でカバーガラスを乗せた（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｅｄ）。２４時間後、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ共焦点顕微鏡を２００倍の倍率および固定された３００ｍｓｅｃの露光時間で用いて蛍光画像を得た。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
単量体性エンベロープへの結合はｇｐ１２０  Ａ２４４ｇＤ＋を除いて弱く、それはＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体により７．８μΜ（ＣＨ０１)から１５０μΜ（ＣＨ０２)までの範囲のＥＣ５０で結合された。加えて、そして広く中和する抗体を分泌することができるＢ細胞の前駆体の選択的標的化と非常に関連して、２種類の推定上のＲＵＡもいくらかの結合を示した（表６）。５種類の成熟した抗体全てにより結合された他のＨＩＶ−１エンベロープは、そのＥＣ５０の平均値はより高かったが、ｇｐ１２０  ＣＭ２４３であった。Ａ２４４（ＣＭ２４４）エンベロープの配列は、Ｌ１２４Ｐ、Ｎ１９６Ｓ、Ｋ１９８Ｅ、Ａ２１２ＰおよびＤ２８４Ｎのａａ置換を除き、ＭｃＣｕｔｃｈａｎら(AIDS Res. Hum. Retrovir. 8(11):1887-1895 (1992))からのものである。加えて、ｇｐ１２０  Ａ１４４（ＣＭ２４４）のＮ末端に、単純ヘルペスウイルスのｇＤタンパク質からの３０ＡＡ配列（ＫＹＡＬＶＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬＤＱ）（配列番号７）が存在する。この配列は、ＨＳＶの侵入および感染に必要なｇＤタンパク質の受容体結合部位を含む(Yoon et al, J. Virol. 77:9221 (2003), Connolly et al, J. Virol. 79:1282-1295 (2005), Campadelli-Fiume et al, Rev. Med. Virol. 17:313-326 (2007))。このＡ２４４  ｇｐ１２０が免疫原として用いられたＲＶ１４４タイワクチン試験において、その対象はＭＮ  ｇｐ１２０およびＡ２４４  ｇｐ１２０の両方においてそのｇＤタンパク質に、ＩｇＡ（図６０）およびＩｇＧ（図６１）ｇＤ抗体の両方で応答した。図６２は、ｇＤペプチド中に２個の可能性のある目的の部位が存在することを示しており、それはｇｐ１２０のアルファ４ベータ７結合部位であるＬＰＶおよびＬＤＱを模倣している可能性がある。従って、これは３つの可能性を生じさせる：
１．ｇｐ１２０のａ４ｂ７への結合のためのモチーフはＬＤＶおよびＬＤＩである
ＨＳＶ  ｇＤ  ＬＰＶおよびＬＤＱ
これは、ｇＤに対する抗体はＨＩＶ  ｇｐ１２０のａ４ｂ７への結合を妨害することができるかどうかという疑問を生じさせる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
４次抗体の興味深い特徴は、それらがＣＤ４ｉ抗体と同じ方法でチロシン硫酸化され得ることである(Huang et al, PNAS 101(9):2706-2711 (2004) Epub２００４年２月２３日、およびPejchal et al, PNAS 107(25):11483-8 (2010))。チロシン硫酸化予想プログラムである“ｓｕｌｆｉｎａｔｏｒ”を用いて実施されたＣＨ０１の配列分析は、硫酸化されそうな１個のチロシンを予想した（ＡＲＧＴＤＹＴＩＤＤＡＧＩＨＹＱＧＳＧＴＦＷＹＦＤＬ）（配列番号８）（表１１）。（ＣＨ０１が１−２７−Ｇ２と呼ばれていることに注意。）表１１は、記載順に各々、配列番号８１−８５、８５−８７、８６、８８−９４、９４−９５、９５−９６および９６を開示する。