【事件の表示】
　特許第２７７７６７８号「組換ヒト肝実質細胞増殖因子及びその製造方法」の請求項１ないし３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７７７６７８号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
〔１〕手続きの経緯
　特許第2777678号の請求項１乃至３に係る発明は、平成3年6月6日（優先権主張1990年6月11日）に特許出願され、平成10年5月8日にその特許権の設定の登録がされた後、三菱化学株式会社より特許異議の申立てがなされ、これを受けて取消理由が通知されたところ、その指定期間内である平成11年7月27日に訂正請求がなされたものである。
　　
〔２〕訂正の適否
　本件訂正請求は、請求項３に係る発明に対する取消理由に対応して、本件特許第2777678号の明細書を訂正明細書のとおりに訂正をすることを求めるものであって、その訂正の内容は、請求項３を削除するものであるが、当該訂正は、特許請求の範囲を減縮するものであり、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内のものであって、特許請求の範囲を実質的に拡張又は変更するものでもない。
　また、訂正後の特許請求の範囲の請求項１、２に係る発明は特許出願の際独立して特許を受けることができるものである（下記〔３〕〔４〕参照）。
　以上のとおりであるから、上記訂正は、平成11年改正前の特許法第120条の4第3項において準用する平成6年法律第116号による改正前の特許法第126条第1項ただし書、第2項及び第3項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　 
〔３〕特許異議の申立ての検討
１．本件発明について：
　本件訂正後の請求項１及び２に係る発明は、平成11年7月27日付け訂正明細書の特許請求の範囲に記載された下記のとおりのものと認める。
【請求項１】　以下の工程からなる肝実質細胞増殖因子（HGF）の製造方法。
（１）配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子を有する組換発現ベクターで動物細胞を形質転換し、
（２）メソトレキセートの濃度を上昇させながら上記形質転換体を培養して、HGF高生産株を選別し、
（３）このHGF産生株を培養し、産生されたHGFを回収し精製する。
【請求項２】　請求項１記載の動物細胞として、CHO細胞を使用することを特徴とするHGFの製造方法。
　
２．特許異議申立ての概要：
　特許異議申立人は、下記甲第１乃至３号証及び参考資料１を提出して、訂正前の請求項１、２に係る発明（いずれも訂正後と同じ）は、下記甲第１号証で示す先願の願書に最初に添付した明細書（以下「先願明細書」という。）に記載された発明と同一であるから、その特許は、特許法第29条の2の規定に違反してなされたものであり、取り消されるべきであると主張している。
　なお、特許異議申立人は、訂正前の請求項３に係る発明の特許に対しても異議申立てをしている（提出証拠甲第４乃至６号証）が、上記訂正により請求項３は削除されたので、当該主張の検討は要しないものとなった。
　　
　　　　　　　　　　　　　　記
　　
甲第１号証：特願平1-209449号（特開平3-72883号公報）
甲第２号証：特開平2-9388号公報
甲第３号証：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,　Vol.77,　pp.3567〜3570,　June　1980
甲第４号証：国際公開WO　90／10651号
甲第５号証：Nature,　Vol.342，No.23,　pp.440〜443,　Nov.　1989
甲第６号証：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,　Vol.88,　pp.415〜419,　Jan.　1991
参考資料１：本件特許の配列表２に記載されたアミノ酸配列と甲第１号証の第１図に記載されたアミノ酸配列を比較した図
　　
３．特許異議申立ての検討
　上記先願明細書には、その請求項１に「第１図のアミノ酸配列で表されることを特徴とする肝実質細胞増殖因子」と記載され、第１図には、特定のアミノ酸配列が示されている。
　また、発明の詳細な説明の項には、「肝実質細胞増殖促進活性を損なわない範囲で一部のアミノ酸または核酸を除去、変更あるいは追加する等改変を行ったものも本発明に含まれる。」（公開公報第3頁右上欄第3行〜同第7行）と記載されている。
　そこで検討するに、本件訂正後の請求項１でいう「配列番号２」のアミノ酸配列は、上記参考資料１からも明かなように先願明細書の第1図に記載されたアミノ酸配列から162〜166番目の5個のアミノ酸残基が欠失したものに相当しており、両者の配列は相違している。
　なるほど、先願明細書には、上述のように、「アミノ酸または核酸を除去、変更あるいは追加する」旨の記載はあるものの、当該記載はあくまで一部配列の改変が可能であるという一般的記載に留まるものであって、162〜166番目のアミノ酸配列という特定の部分配列の除去に言及するものではない。
　そして、本件優先日前に当該位置の部分配列の除去が、目的とするHGFにおけるHGF活性を損なわないという技術常識が存在したということもできない以上、先願明細書には、本件「配列番号２」のアミノ酸配列自体についての記載はないとするべきである。
　したがって、当該「配列番号２のアミノ酸をコードする遺伝子」を必須の要件とする本件訂正後の請求項１に係る発明は、他の構成要件を比較するまでもなく、先願明細書に記載された発明と同一であるということはできない。
　なお、特許異議申立人は、先願明細書に記載されていない工程（本件訂正後の請求項１の（２）の工程）自体が周知のものであることを立証するために甲第２号証、甲第３号証を提出しているが、たとえ、特許異議申立人のいうとおりであったとしても、結論に変わりがないことは、上記説示から明らかである。
　また、訂正後の請求項２に係る発明は同請求項１に係る発明における「動物細胞」を具体的に限定したものであるから、さらに検討するまでもなく、明らかに先願明細書に記載された発明と同一といえない。
　　
〔４〕結び
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠方法によっては、本件訂正後の請求項１及び２に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件訂正後の請求項１及び２に係る発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年５月２２日（２００３．５．２２）
【訂正の要旨】
　特許請求の範囲の請求項３を削除する。
（５４）【発明の名称】
組換ヒト肝実質細胞増殖因子及びその製造方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　以下の工程からなる肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）の製造方法。
（１）配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を有する組換発現ベクターで動物細胞を形質転換し、
（２）メソトレキセートの濃度を上昇させながら上記形質転換体を培養して、ＨＧＦ高生産株を選別し、
（３）このＨＧＦ産生株を培養し、産生されたＨＧＦを回収し精製する。
　【請求項２】　請求項１記載の動物細胞として、ＣＨＯ細胞を使用することを特徴とするＨＧＦの製造方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチド、さらに詳しくは、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で肝実質細胞の維持、増殖を可能にする生理活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を発現し得る組換発現ベクター、形質転換体、および該ポリペプチドの製造法に関するものである。
　本発明により製造されたポリペプチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生促進剤、肝機能の基礎的研究、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作用の研究、肝癌の発癌研究用、さらに該ポリペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬、肝疾患治療薬などへの利用が期待できる。
　【０００２】
　【従来技術】
　従来、細胞増殖活性を有するポリペプチドとして、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）などが知られている。これらの増殖因子の他に、生体外において肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチドが１９８４年に中村らによって再生肝ラット血清より部分精製され、肝実質細胞増殖因子（以下ＨＧＦと略す）と命名された。
　【０００３】
　このＨＧＦの発見まで肝実質細胞は各種の株化細胞が活発に増殖する哺乳動物血清存在下でも該細胞の増殖が全く認められず、通常約１週間で培養容器壁からの脱落が起こり、生体外での長期培養は不可能であった。ところがこのＨＧＦの存在下において肝細胞は極めて良好に増殖し、該細胞の培養が可能となった（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，
１２２
　【０００４】
　このような状況の下で、本発明者らは、先にラット血小板からＨＧＦを分離精製して研究を重ね、このラット血小板由来のＨＧＦが２種のサブユニットからなることを見出し、かつＨＧＦに含有される一部のアミノ酸配列２７残基の同定に成功した（特願昭６３−３１１８６６号明細書）。
　【０００５】
　【発明が解決しようとする課題】
　生体内ＨＧＦは、肝組織あるいは血小板などから極微量分泌されるポリペプチドであるため、原材料組織の入手の困難さにより、安定供給することはほとんど不可能に近い。特に、ヒトＨＧＦにおいては現在までに唯一活性が確認されているのは劇症肝炎患者血清中のみである。このヒトＨＧＦを肝実質細胞の培養や肝細胞の研究用、ひいては肝疾患治療薬として利用するためには、ヒトＨＧＦと同様な活性を有するポリペプチドを遺伝子組換技術を応用して大量に供給することが望まれる。
　【０００６】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ラット血小板由来ＨＧＦのアミノ配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてラット肝臓ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリーよりラットＨＧＦポリペプチドをコードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを見出した。さらにラット由来の該ｃＤＮＡをプローブとしてヒト肝臓ｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡライブラリーよりヒトＨＧＦポリペプチドをコードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを見出した。（Ｎａｔｕｒｅ，
３４２
　【０００７】
　さらにヒト肝臓由来の該ｃＤＮＡの一部または全部をプローブとして肝臓を除いた種々のヒト組織由来のｍＲＮＡとのノザーンハイブリダイゼイションを行ったところ、胎盤及び白血球ｍＲＮＡにもＨＧＦ様転写産物の存在が認められることを見出した。本発明者らは、このうち白血球由来のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーより、ヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有するｃＤＮＡを単離しその塩基配列を明らかにし、さらに該ｃＤＮＡを含有する組換発現ベクターを作製し、該組換発現ベクターによって形質転換された形質転換体を得、該形質転換体を培養してヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子が発現することを見出し本発明を完成させるに至った。
　【０００８】
　即ち、本発明はヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを発現しうる組換発現ベクター、該組換発現ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養し、該培養物から組換ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子を採取、製造する方法及び組換ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子に関するものである。
　【０００９】
　本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードするＤＮＡ組換発現ベクター、及び形質転換体は例えば次のようにして調製される。
　即ち、（１）ヒトの白血球よりｍＲＮＡを単離し、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製し、（２）すでに単離されているヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡの全部または一部をプローブとして上記ヒト白血球由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、単離されたクローンより目的とするｃＤＮＡを抽出する。（３）このヒト白血球由来ＨＧＦのｃＤＮＡよりヒトＨＧＦをコードするｃＤＮＡ断片を制限酵素を用いて切り出し発現用ベクターに組み込み、（４）得られた組換発現ベクターにより宿主細胞を形質転換して形質転換体を得、（５）この形質転換体を培養して、その培養上清からヒト白血球ＨＧＦを採取、製造することができる。
　【００１０】
　以下、本発明の各工程について詳細に説明する。
１）ｍＲＮＡの単離とノーザンハイブリダイゼーション
　ヒト白血球のｍＲＮＡは常法に従って得ることができる。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１８
　【００１１】
２）ｃＤＮＡの調製
　上記によりＨＧＦ転写産物の存在が確認されたヒト白血球ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例えばＨ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
２
３
２５
１
　【００１２】
３）ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
　ｃＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやファージなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な宿主細胞に保持される。宿主となりうる大腸菌としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５１４，Ｃ６００（ストラタジーン社）、ＮＭ５２２，ＪＭ１０１（ファルマシア社）などを例示することができる。ｃＤＮＡのベクターがプラスミドの場合、塩化カルシウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法などを用いて、またｃＤＮＡのベクターがファージの場合、インビトロパッケージング法などを用いてあらかじめ増殖させた宿主細胞に保持させることができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，２４９，１９８２）。このようにして得られた形質転換体から、ヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡを３２Ｐ標識したプローブを使用してコロニーハイブリダイゼーション法（Ｇｅｎｅ，
１０
１９６
１
　【００１３】
　次に該形質転換体から常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８２）に従ってプラスミドやファージなどの組換ＤＮＡを単離し、そのままあるいは制限酵素で消化してからｃＤＮＡ塩基配列が決定される。塩基配列はマクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，
７４
７４
７６
　【００１４】
４）ヒトＨＧＦ組換発現ベクターの構築
　クローン化されたヒト白血球ＨＧＦのアミノ酸配列の全部あるいはその一部をコードするｃＤＮＡを含有する数種のプラスミドやファージなどの組換ベクターから制限酵素によってｃＤＮＡを切り出し、ヒト白血球由来ＨＧＦの発現に適したベクターのプロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて再結合して組換発現ベクターを作製することができる。
　より詳しくは、ヒト白血球由来ＨＧＦを効率良く発現させるために組換発現ベクターは転写の下流方向に順番に必要により（１）プロモーター、（２）リボゾーム結合部位、（３）開始コドン、（４）ヒト白血球由来ＨＧＦをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、（５）終止コドン、（６）ターミネーターを含むように構築される。本発明で用いることができるＤＮＡのベクターとして大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８（東洋紡績）、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０（シグマ社）、酵母由来のプラスミドｐＲＢ１５（ＡＴＣＣ　３７０６２）、バクテリオファージλｇｔ１０、λｇｔ１１（ストラタジーン社）、ウィルスＳＶ４０（ＢＲＬ社）、ＢＰＶ（ＡＴＣＣ　ＶＲ−７０３）、レトロウィルスの遺伝子由来のベクターなどが列挙出来るが、宿主内で複製、増幅可能なベクターであれば特に限定はない。特に、ヒト白血球由来ＨＧＦを簡便に発現させるには、ＳＶ４０のようなウィルスの遺伝子由来のベクターを用いるのが好ましい。例えば、前述のクローン化されたヒト白血球由来ＨＧＦをコードするＤＮＡをＳＶ４０ベクターの後期領域に結合した組換発現ベクターは、ＣＯＳ細胞（Ｃｅｌｌ，
２３
　【００１５】
５）宿主細胞の形質転換とその培養
　このようにして構築されたヒトＨＧＦ白血球組換発現ベクターは、コンピテント細胞法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
５３
７５
２２１
２１５
８１
７２
３７
１５３
２６
７７
　得られた形質転換体は、目的とする組換ヒト白血球ＨＧＦを産生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤などが含有される。培地の１例としては、形質転換体の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）Ｍ９培地（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７２，ｐ．４３１）などを、宿主が酵母の場合、ＹＥＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７９，ｐ．１１７）などを、宿主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）などを挙げることができる。形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。また、宿主が接着性の動物細胞などの場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビーズ、あるいはアセチルセルロースフォローファイバーなどの担体が用いられる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育すれば実施でき、これらに限定されるものではない。
　【００１６】
６）ヒトＨＧＦの精製
　このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換体中に生成した組換ヒト白血球ＨＧＦは、公知の塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどを組み合わせて分離精製することができる。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースアフィニテイクロマトグラフィおよびフェニルセファロース逆相クロマトグラフィの組み合わせ、あるいは硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、および抗ＨＧＦ抗体セファロースアフィニティクロマトグラフィの組み合わせなどが好ましく有効な精製法である。
　以上に述べた方法によって得られた組換ヒト白血球由来ＨＧＦは、ラット肝、ラット血小板及び組換ヒト肝由来ＨＧＦと同様にラット肝実質細胞の増殖を顕著に促進する活性を示した。
　【００１７】
７）ＨＧＦ活性の測定
　ＨＧＦ活性は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８０
１９３
　【００１８】
　【発明の効果】
　本発明により肝実質細胞の生体外での増殖を可能とする新規な生理活性ペプチドの大量供給が可能となる。本発明により供給される組換ヒト白血球由来ＨＧＦは、臨床診断試薬や肝疾患治療薬として有用である。さらに、本発明によりつくられる組換ヒト白血球由来ＨＧＦの作用により増殖維持される肝実質細胞は、例えば肝機能の基礎的研究用肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作用の研究用、肝癌の発癌研究用あるいは肝炎ウィルスの生体外培養のための宿主細胞として極めて有用である。
　【００１９】
　【実施例】
　以下本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　【００２０】
実施例１
１）ヒト組織ｍＲＮＡとヒト肝由来ＨＧＦｃＤＮＡのノーザンハイブリダイゼーション
　ヒト脳、胎盤、白血球、肺、及び肝臓ｍＲＮＡ（クロンテック社）それぞれ２μｇをＭａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，２０２，１９８２）に準じて０．６６Ｍホルムアルデヒド含有アガロース電気泳動に供した後、ナイロンフィルター・ジーンスクリーンプラス（デュポン社）上に固定した。ヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡのＢａｍＨＩ―ＫｐｎＩ　２．２ｋｂ断片をアガロース電気泳動により分離、精製し、マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を用いて〔α３２ｐ〕ｄＣＴＰで標識することにより調製したプローブ、５×ＳＳＰＥ緩衝液（１×ＳＳＰＥ：１８０ｍＭ　ＮａＣｌ　１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸、４０％ホルムアルデヒド、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ大腸菌ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液に上記ナイロンフィルターを浸し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応した。反応後、ナイロンフィルターは６０℃で０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ緩衝液によって３回洗浄してから風乾した。このナイロンフィルターを増感スクリーン・ライトニングプラス（デュポン社）とＸ線フィルム、ＲＸ（富士写真フィルム）に密着させ、―８０℃で１６時間露光した。現像の結果、肝臓ｍＲＮＡと同様に胎盤及び白血球ｍＲＮＡにもＨＧＦ様転写産物の存在が認められた。
　【００２１】
２）ヒト白血球由来のｃＤＮＡライブラリーの作製
　ヒト白血球ｍＲＮＡ３μｇを鋳型にし、ヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡの３’非翻訳領域に含有する５’ＡＣＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴ３’の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｃＤＮＡ合成システムプラス（アマシャム社）を用いてＧｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ，
２５
１
　【００２２】
３）ヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子ｃＤＮＡの単離と塩基配列の決定
　マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を用いて〔α３２Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡの一部であるＨＡＣ６９の０．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をプローブとし、上記ｃＤＮＡライブラリーからヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子のクローニングを行った。ハイブリダイゼーション反応温度及び洗浄温度を６０℃、洗浄液は０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液とし、スクリーニングを行い、陽性クローンＨＬＣ２及びＨＬＣ３を得た。それぞれのファージから常法により単離、精製したＨＬＣ２及びＨＬＣ３ｃＤＮＡを塩基配列解析及び制限酵素切断解析に供した。図１にＨＬＣ３の制限酵素地図、配列表・配列番号１に塩基配列の一部及び演繹されるアミノ酸配列を示す。ヒト白血球由来ＨＧＦクローン、ＨＬＣ３は以前に決定されたヒト肝臓由来ＨＧＦ（Ｎａｔｕｒｅ，
３４２
　【００２３】
４）サルＣＯＳ細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターの構築
　サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターＣＤＭ〔ｄＬｅＨＧＦ〕およびＣＤＭ〔ＬｅＨＧＦ〕の構築図を図２に示す。上記３）で得られたＨＬＣ２及びＨＬＣ３ファージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化し、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を分離、精製した。ＨＬＣ２及びＨＬＣ３のＫｐｎＩ切断部位、その３’側に含有する配列及びＨｐａＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ切断部位から成るオリゴヌクレオチド５’ＣＡＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＡＡＣＣＣＧＧＧ３’、５’ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＡＣ３’を合成し、ＫｐｎＩ−ＳａｌＩアダプターとした。上記ＨＬＣ２及びＨＬＣ３のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ　ＤＮＡ断片、ＫｐｎＩ−ＳａｌＩアダプター及びあらかじめ制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したブルースクリプトＫＳＭ１３＋（ストラタジーン社）を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して２種類のプラスミドｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕を得た。得られたｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、あらかじめ制限酵素ＢｓｔＸＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端としたＣＯＳ細胞用発現ベクターＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ，
３２９
　【００２４】
５）サルＣＯＳ細胞の形質転換とヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子の発現
　得られたＣＤＭ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及びＣＤＭ〔ＬｅＨＧＦ〕プラスミドをエタノール沈澱した後、１０ｍＭＰＢＳ緩衝液に溶解し、２μｇ／ｍｌに調製した。次に１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）中で飽和細胞密度まで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）を１０ｍＭＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、トリプシン処理した。同緩衝液で３回洗浄後、細胞密度２×１０７個／ｍｌになるように再び同緩衝液に浮遊化した。先に調製したプラスミド溶液２５０μｌと細胞浮遊液２５０μｌを混合し、氷冷下で１０分間放置した。この氷冷したプラスミド細胞混液高電圧パルス遺伝子導入装置ＺＡ−１２００（ＰＤＳ社）を用いて、印加電圧４ＫＶ／１ｃｍパルス時間２０ミリ秒の条件下で高電圧パルスをかけた。得られた細胞を上記の培地で希釈し、３７℃５％ＣＯ２存在下にて３日間培養した。培養３日目の培養上清中のＨＧＦ活性を測定したところ、それぞれ２０単位／ｍｌ及び５単位／ｍｌであった。一方、ＨＧＦｃＤＮＡを挿入していない発現ベクターＣＤＭ８を同じ方法によりＣＯＳ−１細胞に導入して培養したが、その培養上清中にはＨＧＦ活性を認めなかった。
　【００２５】
実施例２
１）マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターの構築
　マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号）の構築を図３に示す。実施例１で得られたプラスミドｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧＦ〕をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したＣ１２７細胞用発現ベクターｐＢＰＭＴと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号）を得た。得られたヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターは、ＭＴ−１プロモーターとＳＶ４０初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間にヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子を有し、この発現ベクターによるマウスＣ１２７細胞の形質転換はウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）により行われる。また、形質転換された細胞の選択は、トランスポゾンＴｎ５のｎｅｏ遺伝子（Ｇｅｎｅ，
１９
　【００２６】
２）マウスＣ１２７細胞の形質転換とヒトＨＧＦ遺伝子の発現
　ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号）はＷｉｇｌｅｒらの方法（Ｃｅｌｌ，
１１
　上記（１）で得られた２９μｇのｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号）プラスミドおよびｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号）をそれぞれ２４０μｌの０．５Ｍ塩化カルシウムに溶解し、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，２８０ｍＭ　ＮａＣｌ及び１．５ｍＭリン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）、２４０μｌを攪拌しながら加えた。室温で３０分攪拌を続け、プラスミドとリン酸カルシウムの共沈澱を形成させた。あらかじめ、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）及び１０ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭ培地（日水製薬）を用いて５×１０５個のＣ１２７細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換した後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈澱を加え、室温で２０分間放置した。さらに３７℃で４時間インキュベートした後、培地を除去し、１５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、室温で５分間放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地交換し、さらに３７℃で２日間インキュベートした。細胞を１０倍に希釈して１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ社）を含む同培地を用いて５％ＣＯ２の存在下で３７℃、７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞株から培養上清中のＨＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスクリーニングし、ヒト白血球由来ＨＧＦ高生産株ＢＰＩ−１４株（ｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号））及びＢＰＤ−２７株（ｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号））を得た。これらの細胞の培養上清中のＨＧＦ生産能はそれぞれ１２万単位／１／日、１５万単位／１／日であった。
　【００２７】
実施例３
１）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターの構築
　チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９９号）及びｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２９００号）の構築図を図４に示す。実施例１で得られたプラスミドｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧＦ〕をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したＣＨＯ細胞用発現ベクターｐＥＶＳＳＶと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９９号）及びｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２９００号）を得た。得られたヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターはＳＶ４０初期プロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルの間にヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子を有する。また、形質転換された細胞の選択は、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子にＳＶ４０初期プロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルで連結したＤＨＦＲキメラ遺伝子により可能となる。
　【００２８】
２）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の形質転換とヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子の発現
　ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９９号）及びｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２９００号）は実施例２と同様にしてチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ　ＤＵＫＸ細胞に導入した。得られた細胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、透析した１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と１％グルタミンと５０ｎＭメソトレキセートを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて、培養上清中のＨＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスクリーニングした。発生したコロニーは、安定なヒト白血球由来ＨＧＦ高生産株を得るために、同培地において９世代まで増殖させた。この細胞株は１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、及び１０００ｎＭとメソトレキセートの濃度を順次増加させながら同培地で生育させ、さらに安定なヒト白血球由来ＨＧＦ高産生株ＥＶＩ−６５株（ｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９９号））及びＥＶＤ−１０４株（ｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２９００号））を得た。これらの細胞のヒト白血球由来ＨＧＦ産生能はそれぞれ９万単位／１／日、１３万単位／１／日であった。
　【００２９】
実施例４
形質転換Ｃ１２７細胞培養上清からの組換ヒト白血球由来ＨＧＦの精製
　実施例２で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ産生マウスＣ１２７組換細胞株ＢＰＤ−２７（１５塩基欠失型ＨＧＦ産生株）の培養上清液より、組換ヒト白血球由来ＨＧＦを精製した。
１）陽イオン交換クロマトグラフィー
　ＢＰＤ−２７株の培養液５００ｍｌに終濃度０．０１％となるようにＴｗｅｅｎ８０を添加し、ステリベクスＨＶフィルター（日本ミリポア・リミテッド）により濾過した。この濾液に１／２０容の１Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　（ｐＨ８．５）緩衝液を加え、緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．５）で平衡化したＳ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１．６ｃｍ、高さ５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａで未吸着物質を洗浄後、０．１５Ｍから１．０ＭのＮａＣｌによる直線濃度勾配（全量１００ｍｌ）で吸着物を溶出した。クロマトパターンを図５に示す。
　ＨＧＦ活性をもつ画分を集め、Ｓ−セファロース溶出液とした。
　【００３０】
２）アフイニティークロマトグラフィー
　Ｓ−セファロース溶出液を１Ｎ酢酸でｐＨ７．５に調整後、２倍容の０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水で希釈し、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．５）で平衡化した。ヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１ｃｍ、高さ３ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、０．３Ｍから２．０ＭのＮａＣｌによる直線濃度勾配（全量３０ｍｌ）により溶出した。そのクロマトパターンを図６に示す。ＨＧＦ活性をもつ画分を集め、ヘパリン溶出液とした。
　【００３１】
３）逆相ＨＰＬＣ
　０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、ｖ／ｖ％）を含む蒸留水で平衡化したフェニル５ＰＷ　ＲＰカラム（トーソー社製、内径０．７５ｃｍ、高さ７．５ｃｍ）にヘパリン溶出液を添加し、０．１％ＴＦＡを含む０％から９０％へのアセトニトリルの濃度勾配により溶出を行った。組換ヒト白血球由来ＨＧＦは約４０％のアセトニトリル濃度にて溶出された。そのクロマトグラムを図７に示す。精製された組換ヒトＨＧＦの収量は約２０μｇであり、培養上清液からの活性回収率は１８％であった。
　【００３２】
４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
　前記３段のクロマトグラフィーで精製された１５塩基欠失型ヒト組換白血球由来ＨＧＦを２−メルカプトエタノール還元下及び非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。結果を図８に示す。精製組換ＨＧＦは非還元条件（２−ＭＥ（−））では分子量７万〜９万の単一バンドを示し、還元条件下（２−ＭＥ（＋））では、分子量６万〜７．５万のα鎖と分子量３万〜４万のβ鎖に分かれた。即ち組換ＨＧＦはα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーであることが示された。
　【００３３】
５）組換ヒト白血球由来ＨＧＦ（１５塩基欠失型）の肝細胞増殖活性
　ラット初代培養肝実質細胞は、現在知られているｉｎ　ｖｉｔｒｏの系の中では最もｉｎ　ｖｉｖｏに近い肝機能を持つ系である。「ＨＧＦ活性の測定法」に記述した方法に従って得たラット肝実質細胞に対し、精製した１５塩基欠失型組換ヒト白血球由来ＨＧＦを添加したところ、１〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で強い細胞増殖を誘起した。この培養系に増殖活性を示す因子としては他にもインスリンやＥＧＦがあるが、該組換ＨＧＦは単独で両者よりも強い活性を有し、かつこれら３者の共存下では相加的な作用を示した。
　【００３４】
実施例５
ヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子によるチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の形質転換とその発現
　ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ（ｄＬｅＨＧＦ）（微工研条寄第２９００号）はＷｉｇｌｅｒらの方法（Ｃｅｌｌ，１１，２３３，１９７７）によりチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損細胞に導入した。約３０μｇのｐＥＶＳＳＶ（ｄＬｅＨＧＦ）プラスミドをそれぞれ２４０μｌの０．５Ｍ塩化カルシウムに溶解し、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１．５ｍＭリン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衛液（ｐＨ７．１）、２４０μｌを攪拌しながら加えた。室温で３０分攪拌を続けプラスミドとリン酸カルシウムの共沈澱を形成させた。続いて、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と１％グルタミンとを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて５×１０５個のＣＨＯ細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換した後プラスミドとリン酸カルシウム共沈澱を加え室温で２０分間放置した。さらに３７℃で４時間インキュベートしたのち、培地を除去し、１５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５分間放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地交換しさらに３７℃で７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、透析した１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）、２％グルタミンを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて安定なＨＧＦ高生産株を得るために１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭとメソトレキセート濃度を順次増加させながら同培地で継代培養を繰り返した。得られたヒト白血球由来ＨＧＦ産生組換細胞をクローン選別を行い、安定なヒト白血球由来ＨＧＦ産生株５１５Ｃを得た。これらの細胞のＨＧＦ産生能は約８０万単位／１／日であった。
　【００３５】
実施例６
形質転換ＣＨＯ細胞培養上清からの組換ヒト白血球由来ＨＧＦの精製
　実施例５で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換細胞株５１５Ｃ（１５塩基欠失型ＨＧＦ産生株）をリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセートを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）で培養し、その培養上清液より、組換ヒト白血球由来ＨＧＦを精製した。
１）陽イオン交換クロマトグラフィー
　５１５Ｃ株の培養液５００ｍｌに最終濃度０．０１％となるようにＴｗｅｅｎ８０を添加し、ステリベックスＨＶフィルター（日本ミリポア・リミテッドにより濾過した。この濾液に１／２０容の１Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液を加え、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．５）で平衡化したＳ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１．６ｃｍ、高さ５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｃカラムを１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃおよび４００ｍＭ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃ（図９で矢印Ａで印した）で洗浄後１Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衛液Ｃ（図９で矢印Ｂで印した）で溶出した。クロマトパターンを図９に示す。１Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで溶出したピーク部分（図９で←→と印した）を集め、Ｓ−セファロース溶出液とした。
　【００３６】
２）アフイニティークロマトグラフィー
　Ｓ−セファロース溶出液を１Ｎ塩酸でｐＨ７．５に調製後、２倍容の０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水で希釈し、緩衛液Ｂ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．５）で平衡化した、ヘパリン・セファロースＣＬ―６Ｂ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１ｃｍ、高さ５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、０．３Ｍから２．０Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配（全量４０ｍｌ）により吸着物を溶出した。そのクロマトパターンを図１０に示す。ＨＧＦ活性を持つ画分を集め、ヘパリン溶出液とした。
　【００３７】
３）疎水性クロマトグラフィー
　４Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したフェニル５ＰＷカラム（トーソー製、内径０．７５ｃｍ、高さ７．５ｃｍ）にヘパリン溶出液を添加し、溶媒Ａ：４Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）から溶媒Ｂ：５０％エチレングリコールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）への濃度勾配により溶出を行った。ＨＧＦ活性は２Ｍ　ＮａＣｌ、２５％エチレングリコール濃度で溶出された。そのクロマトグラムを図１１に示す。精製された組換ヒト白血球由来ＨＧＦの収量は約５００μｇであり、培養上清液からの活性回収率は２５％であった。
　【００３８】
４）精製組換ヒト白血球由来ＨＧＦの特性
　３）項で得られた組換ヒト白血球由来ＨＧＦの生物学的、化学的および物理化学的特性について測定した。
▲１▼ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
　組換ＨＧＦを２−メルカプトエタノール還元下および非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。泳動後ゲルは銀染色法により染色したその結果を図１２に示す。組換ＨＧＦは非還元下で分子量７万〜９万ダルトン、還元下では分子量６万〜７．５万のα鎖と分子量３万〜４万のβ鎖に分かれた。またβ鎖は２本のバンドに分かれたが、これはβ鎖における結合糖鎖本数の差異を示している。
　【００３９】
▲２▼糖組成、分析（中性糖およびアミノ糖）
　精製組換ＨＧＦを蒸発乾固後、２．５Ｎのトリフロロ酢酸存在下で１１０℃、６時間加水分解した。加水分解物を蒸発乾固後、水に再溶解し、試料とした。試料をアニオン交換樹脂を用いるＨＰＬＣにより糖組成、分析を実施した。その結果フコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミンが検出され、組換ＨＧＦが糖タンパクであることが確認された。
　【００４０】
▲３▼生物活性
　精製組換ＨＧＦの肝細胞増殖活性を「ＨＧＦ活性の測定」の項に記載の方法に従って活性を測定した。その結果、精製組換ＨＧＦの比活性は２０〜５０万ｕｎｉｔ／ｍｇと測定された。
　【００４１】
実施例７
一本鎖型組換ヒト白血球由来ＨＧＦの製造
　実施例５で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ（１５塩基欠失型ＨＧＦ）産生ＣＨＯ５１５Ｃ株を１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセートを添加した。リボヌクレオシドとデオキシヌクレオシドを含有しないα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）で、３７℃、５％ＣＯ２下培養し、細胞をコンフルエントになるまで培養した。培養後、培養液を抜き取り、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。次で１％グルタミンと５００μＭメソトレキセートとプロテアーゼ阻害剤である４００ｕｎｉｔ／ｍｌアプロチニンを加えたα−ＭＥＭ培地（リボヌクレオシドとデオキシヌクレオシド不含）を加え、３７℃、５％ＣＯ２下培養した。約１日培養後、培養上清液を採取し、実施例６に示す方法とほぼ同様のクロマト操作により組換ＨＧＦを精製した。培養上清液からの活性回収率は約１５％であった。
　【００４２】
　精製した１５塩基欠失型組換ヒト白血球由来ＨＧＦをＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動にかけた。その結果を図１３に示す。精製された組換ＨＧＦは非還元条件下で分子量７万〜９万ダルトンのバンドを示し、更にメルカプトエタノール還元条件下でも、分子量８万〜９万５千ダルトンの単一バンドを示した。
　【００４３】
　この結果、得られた組換ＨＧＦは一本鎖型のものであることが示された。更に精製されたこの一本鎖型組換ＨＧＦの生物活性を測定した。即ち「ＨＧＦ活性の測定」の項に記載の初代培養ラット肝細胞に対する増殖活性を測定した。その結果一本鎖型組換ＨＧＦは肝細胞増殖活性を示し、その比活性は実施例６の４）の項で得られた活性とほぼ等しく、２０〜５０万ｕｎｉｔ／ｍｇであると測定された。
　【００４４】
　【００４５】
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　ＨＬＣ３の制限酵素地図である。
　【図２】
　ＣＯＳ細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターの構築図である。
　【図３】
　マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターの構築図である。
　【図４】
　チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターの構築図である。
　【図５】
　Ｓ−セファロース溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
　【図６】
　ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
　【図７】
　逆相ＨＰＬＣにおいて、通液したアセトニトリル濃度と、溶出した成分の吸光度との関係を示す線図である。
　【図８】
　精製組換ヒトＨＧＦの還元下および非還元下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。
　【図９】
　Ｓ−セファロース溶出液のクロマトパターンを示す線図である。
　【図１０】
　ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
　【図１１】
　フェニル５ＰＷカラムクロマトグラフィーにおける溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
　【図１２】
　精製組換ヒトＨＧＦの還元下および非還元下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。
　【図１３】
　精製一本鎖型組換ヒトＨＧＦの還元下および非還元下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。