【手続補正書】
【提出日】平成26年11月25日(2014.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(I)若しくは式(II)の化合物、又は、それらの医薬として許容し得る塩であって、それらの任意の互変異性体、又は、トランスとして示されているC26、27のC=C結合がシスである、それらの異性体を含み、かつ、C-53ケト及びC-15ヒドロキシル基及びメタノールの組み合わせによりケタールが形成されている、それらのメタノール付加物を含む、前記化合物、又は、それらの医薬として許容し得る塩:
【化１】
2014501752.tif 000001
（式中、  
R1、R2、R3、R4及びR5は、独立に、H、F、Cl、Br、C2-6アルケニル又はC1-10アルキルを表し、ここで、該アルキル基の1以上の炭素原子は、O、N及びS(O)p（pは0、1又は2を表す。）から選択されるヘテロ原子によって任意に置き換えられており、かつここで、該アルキル基の1以上の炭素原子は、カルボニルによって任意に置き換えられており、かつ該アルキル基は、1以上のハロゲン原子によって任意に置換されていてもよく;
X1、X2、X3、X4及びX5は、独立に、C又はNを表し、かつこれらの基のうちNを表すものについては、結合される置換基が存在せず;
ただし、R1、R3、R4及びR5が全てHを表し、かつX1、X2、X3、X4及びX5が全てCを表す場合、R2はOHを表すことができない。）。
【請求項２】
X1がCを表す、請求項1記載の式(I)若しくは式(II)の化合物、又はそれらの医薬として許容し得る塩。
【請求項３】
X2がCを表す、請求項1記載の式(I)若しくは式(II)の化合物、又はそれらの医薬として許容し得る塩。
【請求項４】
X3がCを表す、請求項1記載の式(I)若しくは式(II)の化合物、又はそれらの医薬として許容し得る塩。
【請求項５】
X4がCを表す、請求項1記載の式(I)若しくは式(II)の化合物、又はそれらの医薬として許容し得る塩。
【請求項６】
X5がCを表す、請求項1記載の式(I)若しくは式(II)の化合物、又はそれらの医薬として許容し得る塩。
【請求項７】
R1、R3、R4及びR5が、独立に、H、F、Cl、CF3、OH及びC1-6アルキルから選択される、請求項1〜6のいずれか1項記載の式(I)若しくは式(II)の化合物、又はそれらの医薬として許容し得る塩。
【請求項８】
R2が、H、F、Cl、CF3、OH、NH2及びC1-6アルキルから選択される、請求項1〜7のいずれか1項記載の式(I)若しくは式(II)の化合物、又はそれらの医薬として許容し得る塩。
【請求項９】
R2がOHを表す、請求項8記載の式(I)若しくは式(II)の化合物、又はそれらの医薬として許容し得る塩。
【請求項１０】
以下から選択される、請求項1記載の式(I)若しくは式(II)の化合物であって、それらの任意の互変異性体、又は、トランスとして示されているC26、27のC=C結合がシスである、それらの異性体を含み、かつ、C-53ケト及びC-15ヒドロキシル基及びメタノールの組み合わせによりケタールが形成されている、それらのメタノール付加物を含む、前記化合物、又は、それらの医薬として許容し得る塩：
【化２】
2014501752.tif 000002
2014501752.tif 000003
2014501752.tif 000004
（上記式は以下のように表すこともできる。）
【化３】
2014501752.tif 000005
2014501752.tif 000006
2014501752.tif 000007
（上記式は以下のように表すこともできる。）
【化４】
2014501752.tif 000008
。
【請求項１１】
以下から選択される、請求項1記載の式(I)若しくは式(II)の化合物であって、それらの任意の互変異性体、又は、トランスとして示されているC26、27のC=C結合がシスである、それらの異性体を含み、かつ、C-53ケト及びC-15ヒドロキシル基及びメタノールの組み合わせによりケタールが形成されている、それらのメタノール付加物を含む、前記化合物、又は、それらの医薬として許容し得る塩：
【化５】
2014501752.tif 000009
。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１３】
HCV若しくはHIV感染などのウイルス感染症、又は、筋ジストロフィーを治療するための医薬として使用するための、請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１４】
請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物を、医薬として許容し得る希釈剤又は担体とともに含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物を、医薬として許容し得る希釈剤又は担体とともに含み、さらに第2の又は二次の有効成分を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物を含む、対象のHCV若しくはHIV感染などのウイルス感染症、又は、筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物を含む、対象の炎症性障害を治療するための医薬組成物。
【請求項１８】
炎症性障害を治療するための医薬として使用するための、請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１９】
ストレプトマイセス属種などのサングリフェリン産生細菌に、式(III)の化合物：
【化６】
2014501752.tif 000010
（式中、X1、X2、X3、X4、X5、R1、R2、R3、R4及びR5は、請求項1〜11のいずれか1項において定義したとおりであり、かつR7は、H又はエステル形成基を表す。）又はそれらの塩を供給する工程、及び、変異合成サングリフェリンが産生されるように該細菌を培養する工程を含む、変異合成サングリフェリンの製造方法。
【請求項２０】
前記サングリフェリン産生細菌が、sfaA遺伝子又はsfaA遺伝子のホモログが不活化されているか又は欠失しているストレプトマイセス属種である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記変異合成サングリフェリンを単離する工程をさらに含む、請求項19又は20記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
（肝細胞安定性評価）
予め液体窒素中に保存しておいた凍結保存肝細胞を、37±1℃の振盪水浴に2分±15秒間置く。次いで、該肝細胞を、10X体積の予め温めておいたKrebs-Henseleit重炭酸塩(KHB)緩衝液(2000mg/Lグルコース。炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウム不含。Sigma社)に加え、穏やかにかき混ぜ、500rpmで3分間遠心分離する。遠心分離後、該上清を注意深く除去し、10X体積の予め温めておいたKHB緩衝液を加えて細胞ペレットを再懸濁する。これを穏やかにかき混ぜて、500rpmで3分間遠心分離する。次いで、該上清を除去し、廃棄する。次いで、細胞生存率及び収率を、細胞数により決定し、これらの値を利用してヒト肝細胞懸濁液を作成し適切な播種密度(生存細胞密度=2×106細胞/mL)にする。2Xの投薬溶液を、予め温めておいたKHB(1%DMSO)中で調製する(200μM添加溶液:DMSO 980μLに基質ストック溶液(10mM)20μL、2X投薬溶液:KHB 990μLに200μM添加溶液10μL(希釈後2μM))。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
予め温めておいた2X投薬溶液50μLをウェルに添加し、予め温めておいた肝細胞溶液(2×106細胞/mL)50μLを添加して、計時を開始する。次いで、プレートを37℃でインキュベートする。内部標準を含むアセトニトリル100μLを、インキュベーション時間(0、15、30、60及び120分)の終了後に各ウェルに添加し、穏やかにかき混ぜ、予め温めておいた肝細胞溶液50μLを添加する(2×106細胞/mL)。インキュベーション終了時に、細胞生存率を測定する。試料を、4℃、4000rpmで15分間遠心分離し、上清を超純水で2倍に希釈し、化合物レベルをLC-MS/MSにより分析する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
プラスミドpSGK268を、標準技術を用いて大腸菌DH10Bに形質転換し、アプラマイシン(50μg/ml)を含むプレート上で選別した。該欠失コンストラクトの導入は、本質的に前記Gene Bridges社のキットのプロトコルに従って行った。単一コロニーを2TY（アプラマイシン(50μg/ml)）中で一晩増殖させ、pRedET(tet)プラスミドで形質転換し、30℃でアプラマイシン(50μg/ml)及びテトラサイクリン(3μg/ml)で選別した。単一コロニーを使用して、この株の一晩培養物を、3mlの2TY（アプラマイシン(50μg/ml)及びテトラサイクリン(3μg/ml)）において30℃で調製した。この培養物0.5mlを使用して、10mlの2TY（アプラマイシン(50μg/ml)及びテトラサイクリン(3μg/ml)）に30℃で播種し、OD600nm〜0.5まで増殖させた。この培養物1.4mlを、2つのエッペンドルフチューブの各々に移し、10%アラビノース50μLを一方のチューブに加えて、Red/ET組換えタンパク質の発現を誘導した。チューブを37℃で〜1時間振盪した。誘導細胞及び非誘導細胞をベンチトップ遠心機でペレット化し、冷却滅菌水で2回洗浄した（毎回、再懸濁し、遠心分離して細胞をペレット化する）。得られたペレットを約30〜40μLの水に懸濁し、氷上に保持した。氷上で、先に単離した1.7kbの分断フラグメントを前記誘導及び非誘導チューブに加え、1mmのBiorad社製エレクトロキュベットに移した。該試料を電気穿孔し(Biorad Micropulser、1.8kV、時定数〜4ms)、2TY 1ml(抗生物質不含)を加えて混合し、細胞を該キュベットから移した。細胞を、37℃で〜3時間、振盪しながら(1100rpm、エッペンドルフサーモミキサーコンパクト)インキュベートし、その後、アプラマイシン(50μg/ml)及びカナマイシン(25μg/ml)を含む2TYプレート上に蒔き、37℃で一晩インキュベートした。誘導試料プレート由来のコロニーを、50μg/mlのカナマイシンを含む2TYプレート上に画線して純化し、カナマイシン耐性カセットの導入を確認した。それぞれの細菌コロニーについてのPCRを利用して該カセットの導入を確認した。これらの培養物からプラスミドを調製し、消化して、期待されるプラスミドpSGK270を確認した。次いで、プラスミドをNsiIで消化して前記マーカーフラグメントを除去し、残部を再ライゲートして、sfaAインフレーム欠失コンストラクト、pSGK271を作製した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
【表１０】
2014501752.tif 000011
2014501752.tif 000012
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014501752000001.app