【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年12月26日(2014.12.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）のリン酸化を判定する方法であって、
該方法は、
（ａ）細胞を利用するステップと、
（ｉ）前記細胞は、第１の酵素断片とＣ末端において融合したＲＴＫの融合体を発現する第１の発現コンストラクトを備え、
（ｉｉ）前記細胞は、第２の酵素断片と融合したホスホチロシン結合ペプチドの融合体を発現する第２の発現コンストラクトとを備え、前記第１および第２の酵素断片は、互いに親和性が低いβ‐ガラクトシダーゼの断片であり、
（ｂ）前記ＲＴＫが自己リン酸化せず且つ内因性活性サイトゾルチロシンキナーゼが存在しない場合は、前記ＲＴＫをリン酸化するサイトゾルチロシンキナーゼを発現する第３の発現コンストラクトも含む該細胞を利用するステップと、
（ｃ）（ｉ）第１の酵素断片とＣ末端において融合した前記ＲＴＫの融合体が、リン酸化ＲＴＫを形成するために、リン酸化するのに十分な時間であり、（ｉｉ）第２の酵素断片と融合した前記ホスホチロシン結合ペプチドが、前記リン酸化ＲＴＫに結合するのに十分な時間であり、且つ、（ｉｉｉ）前記ＲＴＫが前記ホスホチロシン結合ペプチドに結合することによって前記第１および第２の酵素断片同士が互いに近接するときに、前記第１および第２の酵素断片が弱く複合体を形成して活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するのに十分な時間で、前記細胞を培養するステップと、
（ｄ）検出可能な産物を形成するβ‐ガラクトシダーゼ基質を前記細胞に加えるステップと、
（ｅ）前記産物を前記ＲＴＫのリン酸化の指標として検出するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記第１の断片は、５０未満のアミノ酸を有するβ‐ガラクトシダーゼの小断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小断片は突然変異体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出するステップの前に前記細胞を溶解させる追加的なステップを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
受容体チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）のリン酸化に対する候補化合物の影響を判定する方法であって、
該方法は、
（ａ）細胞を利用するステップと、
（ｉ）前記細胞は、第１の酵素断片とＣ末端において融合したＲＴＫの融合体を発現する第１の発現コンストラクトを備え、
（ｉｉ）前記細胞は、第２の酵素断片と融合したホスホチロシン結合ペプチドの融合体を発現する第２の発現コンストラクトとを備え、前記第１および第２の酵素断片は、互いに親和性が低いβ‐ガラクトシダーゼの断片であり、
（ｂ）前記ＲＴＫが自己リン酸化せず且つ内因性活性サイトゾルチロシンキナーゼが存在しない場合は、前記ＲＴＫをリン酸化するサイトゾルチロシンキナーゼを発現する第３の発現コンストラクトも含む該細胞を利用するステップと、
（ｃ）前記細胞を前記候補化合物と接触させるステップと、
（ｄ）（ｉ）第１の酵素断片とＣ末端において融合した前記ＲＴＫの融合体が、リン酸化ＲＴＫを形成するために、リン酸化するのに十分な時間であり、（ｉｉ）第２の酵素断片と融合した前記ホスホチロシン結合ペプチドが、前記リン酸化ＲＴＫに結合するのに十分な時間であり、且つ、（ｉｉｉ）前記ＲＴＫが前記ホスホチロシン結合ペプチドに結合することによって前記第１および第２の酵素断片同士が互いに近接するときに、前記第１および第２の酵素断片が弱く複合体を形成して活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するのに十分な時間で、前記細胞を培養するステップと、
（ｅ）検出可能な産物を形成するβ‐ガラクトシダーゼ基質を前記細胞に加えるステップと、
（ｆ）形成された産物を前記ＲＴＫのリン酸化の指標として検出するステップとを含む方法。
【請求項７】
前記第１の酵素断片は、５０未満のアミノ酸を有するβ‐ガラクトシダーゼの小断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記小断片は突然変異体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は哺乳類細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出するステップの前に前記細胞を溶解させる追加的なステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記産物は化学発光体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補化合物はアンタゴニストとして試験され、前記ＲＴＫのリガンドは前記候補化合物を加える前に加えられる、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
試料内の受容体チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）の活性リガンドの存在を判定する方法であって、
該方法は、
（ａ）細胞を利用するステップと、
（ｉ）前記細胞は、第１の酵素断片とＣ末端において融合したＲＴＫの融合体を発現する第１の発現コンストラクトを備え、
（ｉｉ）前記細胞は、第２の酵素断片と融合したホスホチロシン結合ペプチドの融合体を発現する第２の発現コンストラクトとを備え、前記第１および第２の酵素断片は、互いに親和性が低いが、前記ホスホチロシン結合ペプチドの前記ＲＴＫの結合により互いに結合されたときに活性β‐ガラクトシダーゼを形成するβ‐ガラクトシダーゼの断片であり、
（ｂ）前記ＲＴＫが自己リン酸化せず且つ内因性活性サイトゾルチロシンキナーゼが存在しない場合は、前記ＲＴＫをリン酸化するサイトゾルチロシンキナーゼを発現する第３の発現コンストラクトも含む該細胞を利用するステップと、
（ｃ）前記細胞を前記試料と接触させるステップと、
（ｄ）（ｉ）第１の酵素断片とＣ末端において融合した前記ＲＴＫの融合体が、リン酸化ＲＴＫを形成するために、リン酸化するのに十分な時間であり、且つ、（ｉｉ）第２の酵素断片と融合した前記ホスホチロシン結合ペプチドが、前記リン酸化ＲＴＫに結合するのに十分な時間で、前記細胞を培養するステップと、
（ｅ）検出可能な産物を形成するβ‐ガラクトシダーゼ基質を前記細胞に加えるステップと、
（ｆ）形成された産物を前記ＲＴＫの活性リガンドの存在の指標として検出するステップとを含む方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
ＲＴＫのリン酸化を判定するための方法を提供する。２つまたは随意選択で３つの発現コンストラクト、すなわち、（１）ＲＴＫのサイトゾルＣ末端におけるＲＴＫと酵素断片対のメンバーとの融合体と、（２）酵素断片対の相補メンバーと融合するリン酸化ＲＴＫ（ホスホチロシン結合ドメイン）と結合したポリペプチド配列と、ＲＴＫが自己リン酸化しない場合は、（３）一般に過発現のための強力なプロモータを有する非受容体チロシンキナーゼとを備える二重安定または三重安定形質転換細胞を利用する。この酵素対はβ‐ガラクトシダーゼに由来するものであり、各断片は、独立して複合体をつくることで活性酵素を形成することが相対的にできない、すなわち互いに親和性が弱いが、それらが融合するタンパク質同士が結合したときに活性β‐ガラクトシダーゼを形成することができる。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
細胞膜を横切る（cross）ことが可能なβ‐ガラクトシダーゼ基質を用いる場合は、基質を溶解固体としてまたは溶液中に加える。代案として、試薬溶液は細胞の透過化または溶解（lysis）および細胞中に形成された複合体のアッセイ培地への放出を実現することもできる。基質とのβ‐ガラクトシダーゼ反応に干渉しない任意の従来の溶解緩衝液を利用することができる。ＰＢＳやＨＥＰＥＳのような便利な緩衝液では１〜５％、一般的には３％を超えない割合でＣＨＡＰＳのような様々なイオン緩衝液を利用することができるが、当技術分野では他の様々な代用物が知られている。試薬溶液の体積は、一般的にアッセイ培地の体積の約０．５〜２倍である。β‐ガラクトシダーゼ基質を追加した後、溶液を通常５〜２００分間、一般的には１０〜１５０分間培養し、シグナルを読み取る。温度は一般に培養培地の温度または便宜上約２０〜４０℃の範囲とする。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
この検出システムはβ‐ガラクトシダーゼ酵素断片コンプリメンテーションの使用に依存する。このシステムでは、互いに親和性が低いβ‐ガラクトシダーゼの小断片と、より大きい大断片とを利用する。β‐ガラクトシダーゼの小断片（「ＥＤ」）は天然配列または突然変異配列を有し得る。ここで特に注目するのは、約３６〜６０、より一般的には５０以下のアミノ酸の小断片である。ＲＴＫペプチドとＰＴＢペプチドの結合がないときは大断片と小断片の間の複合体形成が殆ど生じないようにするために、ＥＤはβ‐ガラクトシダーゼの大断片（「ＥＡ」）と親和性が低いことが望ましい。これらの小断片の詳しい説明については米国特許第７，１３５，３２５号を参照されたい。突然変異ＥＤの詳しい説明については米国特許出願公開第２００７／０２７５３９７号を参照されたい。これらの特許文献の内容はいずれも参照により本明細書に援用する。当該アッセイまたは類似のアッセイにおける小ＥＤおよび突然変異ＥＤは、一般に野生型配列の活性のうち約０．５未満、少なくとも約０．１を有し、他のタンパク質との融合がないときは、従来使用される約９０のアミノ酸の商用配列のうち約６０％未満を有する。ＥＤとＥＡ間の親和性を高めるためにより長いＥＤを使用し、野生型配列からの突然変異が生じないようにする。ＲＴＫのＰＴＢペプチドの親和性が低いほど互いの親和性が高くなる２つの断片間の望ましい親和性レベルは、特定のアッセイに関して経験的に決定することができる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
一般に、融合タンパク質のための発現コンストラクトは、少なくともプロモータ（５’から３’の順）と、その後に続く受容体またはＳＨ２ドメインと、その後に続くリンカーと、その後に続くＥＡまたはＰＫを含む。すべてのアッセイで１ウェル当たり１０，０００セルを２０μＬの培地に播種し、０．１％ＢＳＡおよび適切な基本培地（Ｆ‐１２またはＤＭＥＭ）中で一晩培養した。アゴニストアッセイでは５μＬの化合物を細胞に加え室温で培養した。アンタゴニストアッセイでは５倍で５μＬの化合物を細胞に加え３７℃／５％ＣＯ２で１０分間培養し、その後６倍で５μＬのアゴニストを加え室温で６０分間培養した。５０％（ｖ／ｖ）のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄｘ ９３‐０００１、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ試薬はＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社（カリフォルニア州フリーモント）から入手可能）を用いてＳＨ２‐ＥＡのＲＴＫとの複合体形成を検出した（溶解緩衝液活性成分１％ＣＨＡＰＳ、Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩ（商標）およびＧａｌａｃｔｏｎ Ｓｔａｒ（商標）はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能）。Ｐａｃｋａｒｄ Ｖｉｃｔｏｒ ２（登録商標）またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＶｉｅｗＬｕｘ（登録商標）リーダまたは同等の計器上でデータを読み取り、このデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（登録商標）分析ソフトウェアを使用して分析した。