(57)【要約】      （修正有）【課題】アルコール起因の脂肪肝、肝機能障害の悪化を改善し、体内の抗酸化能力を上昇させ、炎症反応を抑制する、菌糸体と発酵液を含めた霊芝の深層培養液体発酵物の提供。【解決手段】アルコールに起因する肝疾患の症状を改善する健康食品または医薬品の製造時に調製される組成物の用途であって、前記組成物は、霊芝菌種を液体培養して得る霊芝液体発酵生産物を含む、組成物。肝疾患とは、アルコール性肝疾患、アルコール性脂肪肝、アルコールに起因する肝蔵の抗酸化物濃度の低下等を意味する、霊芝液体発酵生産物を含む組成物の投与。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールに起因する肝疾患の症状を改善する健康食品または医薬品の製造時に調製される組成物の用途であって、前記組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）を液体培養して得る霊芝液体発酵生産物を含むことを特徴とする、組成物の用途。
【請求項２】
肝疾患とは、アルコール性肝疾患、アルコール性脂肪肝、アルコールに起因する肝臓の抗酸化物質濃度低下、アルコールに起因する肝臓の抗酸化酵素の活性低下を指すことを特徴とする、請求項1に記載の用途。
【請求項３】
アルコール性肝疾患とは、アルコールに起因する肝機能数値の異常な上昇または肝機能異常を指すことを特徴とする、請求項2に記載の用途。
【請求項４】
肝機能数値異常とは、血清中のAST値の上昇または血清中のALT値の上昇を指すことを特徴とする、請求項3に記載の用途。
【請求項５】
肝機能異常とは、空腹時の血清中のトリグリセリド値の上昇、コレステロール値の上昇、または血糖値の上昇を含むことを特徴とする、請求項3に記載の用途。
【請求項６】
アルコール性脂肪肝は、肝臓中のトリグリセリド、コレステロールまたは総脂質量の増加を含むことを特徴とする、請求項2に記載の用途。
【請求項７】
肝臓の抗酸化物質とはGlutathioneを指すことを特徴とする、請求項2に記載の用途。
【請求項８】
肝臓の抗酸化酵素は、SOD（Superoxide dismutase）、Catalase、GSH-Rd（GSH Reductase）、GSH-Px（GSH Peroxidase）またはGST（Glutathione S-transferase）を含むことを特徴とする、請求項2に記載の用途。
【請求項９】
マクロファージに関連する炎症を改善する健康食品または医薬品の製造時に調製される組成物の用途であって、前記組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）を液体培養して得る霊芝液体発酵生産物を含むことを特徴とする、組成物の用途。
【請求項１０】
マクロファージに関連する炎症とは、TNF-αとIL-6の分泌量増加による疾患を指し、肝炎、腎炎、敗血症、関節炎、または歯周病を含むことを特徴とする、請求項9に記載の用途。
【請求項１１】
炎症性腸疾患を改善する健康食品または医薬品の製造時に調製される組成物の用途であって、前記組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）を液体培養して得る霊芝液体発酵生産物を含むことを特徴とする、組成物の用途。
【請求項１２】
炎症性腸疾患とはIL-8分泌量増加による疾患を指し、クローン病、潰瘍性大腸炎またはロタウイルス胃腸炎を含むことを特徴とする、請求項11に記載の用途。
【請求項１３】
当該霊芝液体発酵生産物は、分子量23,000〜826,000Daの多糖、及び分子量827,000〜1,600,000Da以上の多糖を含むことを特徴とする、請求項1、9、11に記載の用途。
【請求項１４】
当該組成物は、風味付け物質または補助剤を添加してもよく、風味付け物質はシロップ、酸、果汁、香料または水を含むことを特徴とする、請求項1、9、11に記載の用途。
【請求項１５】
当該組成物の剤形としては、液体サプリメント、口服液剤、飲料、粉末、カプセル、錠剤、丸剤、顆粒剤、ゼラチン、咀嚼剤（ガムタイプ）、または他の経口投与剤形が考えられることを特徴とする、請求項1、9、11に記載の用途。
【請求項１６】
シロップは甘みを加える物質であり、スクロース、ブドウ糖またはスクラロースを含み、酸は酸味を加える物質で、レモン酸、リンゴ酸またはリン酸を含み、果汁は飲料水の味を調えるのによく使われる物質全般のことで、リンゴジュース、オレンジジュースまたはブドウジュースを含み、香料は香りを変える物質全般のことで、合成エッセンス、バニラビーンズまたはハッカエキスを含むことを特徴とする、請求項14に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール性脂肪肝、アルコール性肝疾患の症状改善、及び炎症の抑制に用いる霊芝の液体発酵生産物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓組織に障害が起きて正常に機能しなくなることを「肝疾患」という。肝疾患のよくある原因としては、ウイルス、薬物、アルコールなどがあり、アルコールの摂取は、医学的にいうアルコール性肝疾患（alcoholic liver disease、ALD）の代表的な病因である。
【０００３】
アルコール性肝疾患は、症状の進展と深刻度によって、いくつかの段階に分かれる。まず、脂質が大量に肝臓に蓄積して「脂肪肝（fatty liver）」となり、肝臓が炎症を起こして「肝炎（hepatitis）」が発生し、線維化が進んで「肝硬変（liver cirrhosis）」を起こし、これが悪化して最終的には命にかかわる「肝腫瘍」を形成する。従って、脂肪肝と肝炎の症状を改善できれば、肝疾患の悪化を予防できることになる。
【０００４】
アルコールが肝疾患を引き起こすメカニズムとしては、長期にわたる飲酒がアルコール性肝疾患を引き起こすのだが、アルコール性肝疾患の第一段階として肝臓に大量の脂肪が蓄積する脂肪肝が発生し、肝炎を起こして、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase、AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（alanine aminotransferase、ALT）といった肝機能数値が上昇するとともに、高血脂、血糖コントロール不良といった肝機能異常が発生する。アルコールの摂取がアルコール性肝疾患を引き起こす病理のメカニズムは完全に解明されていないが、脂肪肝、肝炎は次のような経過をたどることがわかっている。（1）アルコールが肝臓でアセトアルデヒド、酢酸に代謝される過程において、ミトコンドリアの機能が抑制されて脂質を代謝する働きが鈍り、肝細胞によるトリグリセリド、コレステロールの分解代謝機能が弱められた結果、大量の脂質が肝臓に蓄積し、この病変が炎症反応、肝細胞の壊死を引き起こす。（2）大量のアルコールが肝臓で代謝されてアセトアルデヒドになる過程において発生する過酸化物が、フリーラジカル反応を引き起こして大量の過酸化物を形成するとともに、肝臓の抗酸化物質と抗酸化酵素を使い果たす。また、アセトアルデヒド自体に酸化を促す作用があり、これが肝細胞を損傷させる。（3）アルコールによって腸の粘膜が荒らされ、腸の中の微生物が粘膜を通過して肝臓の門静脈経由で肝臓に入り、クッパー細胞（肝臓に特有のマクロファージ）を刺激し、大量の炎症性サイトカイン（腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-α、TNF-α）、インターロイキン6（Interleukin-6、IL-6）など）を放出して、肝臓に炎症を起こさせる。以上3つのメカニズム以外に、アルコールの代謝は肝臓内を酸欠状態にして、肝臓の循環障害につながることも、アルコール性肝疾患の病状を進展させる要因のひとつである。
【０００５】
霊芝子実体（Ganoderma lucidum）は、東アジアで常用されている真菌類の薬材で、滋養強壮、不老延年、免疫力向上に効き目があるとされ、漢方薬に広く利用されている。最近は深層培養液体発酵の技術で霊芝の菌糸体、及び菌糸体の発酵濾液を量産し、市場における霊芝生産物に対する需要を満たしている。この方法だと、従来の栽培方法に較べて生産のリードタイムを大幅に短縮できる。液体発酵により得た霊芝菌糸体、発酵濾液は、これまで食用としてきた霊芝子実体と較べて、部位、外観、化学的な活性成分（参考文献1、2参照）、薬理作用、いずれも異なり（参考文献3、4参照）、最終的に得られる生理的作用や活性も、従来の霊芝子実体と較べて大差がある。従って、霊芝の液体発酵物の効能は、霊芝子実体のそれとは異なる。
【０００６】
従来の霊芝研究成果によると、子実体のエキスまたはトリテルペノイド成分は、体外（in vitro）試験で、肝細胞を保護する働きあることがわかっている（参考文献5―9参照）。また、文献によると、霊芝の子実体、菌糸体、発酵液またはそのエキスは、非アルコール性の肝疾患試験において、たとえば、化学的肝障害試験（四塩化炭素、tert-Butyl hydroperoxide誘発、参考文献10―14参照）、B型肝炎ウイルス試験（参考文献15参照）、免疫試験（カ介苗GCBワクチン単独、BCGワクチン併用によるリポ多糖誘発、参考文献13、16―19参照）、細胞合成代謝干渉試験（ガラクトサミン、alpha-amanitin誘発、参考文献20、21参照）、高脂肪飲食試験（参考文献22―26参照）において、肝細胞保護の働きが報告されている。霊芝の子実体多糖、霊芝の胞子粉が、急性アルコール性肝障害において肝臓を保護する働きをすることも文献報告されている（参考文献27―28参照）。異なる方法で生産された霊芝が、さまざまな試験モデルで肝臓保護の働きをするとはいえ、霊芝の液体発酵物がアルコールに起因する肝障害、ましてや脂肪肝に至るまで改善できることはまだ実証されていない。
【０００７】
中華民国特許（公開番号201221134）、肝機能を改善し、肝障害を低減する組成物においては、霊芝は配合成分のひとつに過ぎず、しかも、ここにいう霊芝は霊芝子実体であり、その実験は、四塩化炭素及びクロロホルムといった毒素でHepG2ヒト肝癌由来細胞株を誘発するモデルで細胞生存率を比較する方法を用いている。
【０００８】
中国特許（公開許諾番号CN 103272146 B）、アルコール性脂肪肝を予防する医薬組成物においては、霊芝は配合成分のひとつに過ぎず、しかも、ここにいう霊芝は子実体のエキスを指す。
【０００９】
中華民国特許（特許番号I397415）、抗炎症、肝臓保護の医薬組成物においては、遺伝子組み換え技術で霊芝の免疫向上タンパクを得ており、霊芝核酸の序列を酵母菌に移植し、この組み換え遺伝子による発酵技術を用いて霊芝の免疫調節タンパクを量産している。
【００１０】
文献によると、霊芝は、化学的試験、細胞合成代謝干渉試験、放射線試験、過酸化食用油試験で抗酸化の作用があることが報告されているが（参考文献29―32参照）、霊芝の液体発酵物がアルコールに起因する抗酸化能力低下を改善できることはまだ実証されていない。
【００１１】
日本特許（特開2004-131482）によると、霊芝の胞子は抗酸化性があり、老化を遅らせ、男性の更年期障害を緩和する働きがある。
【００１２】
アルコール性肝疾患が起こるメカニズムは複雑なことから、化学的試験などの単純なモデルで代替することなく、実際のアルコール性肝疾患を対象として、アルコールに起因する肝障害、脂肪肝、抗酸化能力の低下に対する、ひとつの物質の改善効果を評価するべきである。また、急性アルコール性疾患の試験モデルは、アルコールによって誘発された肝障害や脂肪肝を使うとはいえ、投与方法は、短期間内に大量のアルコールを胃に流し込むというもので、大多数の人々の飲酒行為とは相違があり、アルコール性肝疾患の症状改善能力を評価するには不適合である。
【００１３】
正常時、身体は炎症性サイトカイン（pro-inflammatory cytokines）を分泌してバランスを保っているが、外来のウイルスに感染し、ウイルスの菌体が分解されると、免疫活性効果をもつリポ多糖（lipopolysaccharide、LPS）、ペプチドグリカン（peptidoglycan）といった内毒素が大量に生成され、マクロファージ、単球（monocyte）といった細胞を著しく活性化させる。或いは、免疫系統が異常に活性化したときも、大量の炎症性サイトカインが分泌されるが、過剰な炎症性サイトカイン（例：TNF-α、インターロイキン6 （interleukin-6，IL-6）とインターロイキン8（interleukin-8、IL-8））は、身体に障害をもたらす。TNF-αとIL-6は、炎症反応を発生、拡大させ、IL-8は好中性顆粒球、マクロファージ、好塩基性白血球、T細胞を炎症部分に移動させて、組織の炎症を拡大させ、障害を悪化させる。TNF-α、IL-6、IL-8は炎症メディエーターであり、よって炎症の程度を計るバロメーターとなる。
【００１４】
マクロファージが異常にTNF-α、IL-6を分泌すると、肝炎、腎炎、関節炎、敗血症といった炎症を引き起こし、ウイルス性肝炎、慢性肝炎の患者は、血清中のIL-6、TNF-αの濃度が顕著に高い（参考文献33、34参照）。マクロファージによるIL-6、TNF-αの分泌を中和または低減できれば、炎症の程度を抑えることができ、たとえば肝炎の臨床治療薬物infliximabは、抗腫瘍壊死因子α（anti-TNF-α）の薬物である（参考文献35参照）。
【００１５】
従って、マクロファージによるIL-6、TNF-αの分泌を抑制できれば、肝炎、腎炎、関節炎、敗血症といった炎症の症状を改善できる。
【００１６】
腸が異常に多くのIL-8を分泌すると、クローン病、潰瘍性大腸炎といった炎症性腸疾患を引き起こす。腸炎の患者は腸のIL-8 分泌量が顕著に高く、腸のIL-8 分泌量は、腸炎のレベル、及び進入した炎症細胞の数量と正比例している（参考文献36、37参照）。つまり、IL-8が腸炎を促すのだが、IL-8を中和する抗体は、炎症細胞の腸への侵入を抑制できるので（参考文献38参照）、腸の中のIL-8を抑制できれば、腸炎の症状を改善できることになる。
【００１７】
報道によると、霊芝子実体、霊芝の固体発酵生産物は炎症メディエーターであるTNF-αの発生を抑制するが（参考文献39―42参照）、霊芝の子実体、霊芝の液体発酵菌糸体が、TNF-αなどの炎症メディエーター分泌を促進するという正反対の結果の報道もいくつかなされている（参考文献4、43、44参照）。このことは、菌の種類、部位または生産方法が異なれば、霊芝による代謝の対象も異なり、よって炎症反応に対する効果も異なることを示している。しかし、霊芝の液体発酵生産物が炎症反応を抑制する効果についての報道は、いまだにされていない。
【００１８】
以上をまとめると、霊芝の子実体または液体発酵物を用いた脂肪肝や肝障害の症状改善はすでに行われているが、霊芝の液体発酵生産物を用いた、アルコール起因の脂肪肝、肝疾患、及び肝臓の抗酸化物質と酵素の減少の改善、炎症反応の抑制というのは、いまだ行われていない。従って、アルコール起因の脂肪肝、肝機能障害、抗酸化能力低下を改善し、炎症反応の抑制する、菌糸体と発酵液を含めた霊芝の深層培養液体発酵物というのが、本発明が解決しようとする課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
文献によると、霊芝の子実体または液体発酵物を用いた非アルコール性の脂肪肝や肝障害の症状改善はすでに行われているが、霊芝の液体発酵生産物を用いた、アルコール起因の脂肪肝、肝疾患、及び肝臓の抗酸化能力低減の改善、炎症反応の抑制というのは、いまだ行われていない。従って、アルコール起因の脂肪肝、肝機能障害の悪化を改善し、体内の抗酸化能力を上昇させ、炎症反応を抑制する、菌糸体と発酵液を含めた霊芝の深層培養液体発酵物というのが、本発明が解決しようとする課題である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の目的は、アルコール起因の肝疾患の症状を改善する健康食品または医薬品の調製に用いる組成物を提供することであり、当該組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）の液体培養によって得た霊芝の液体発酵生産物を含んでいる。
【００２１】
上述の目的を達成するため、肝疾患とは、アルコール起因のアルコール性肝疾患、アルコール性脂肪肝、アルコールに起因する肝臓の抗酸化物質濃度低下、またはアルコールに起因する肝臓の抗酸化酵素の活性低下と定義する。
【００２２】
上述の目的を達成するため、アルコール性肝疾患とは、アルコールに起因する肝機能数値の異常な上昇または肝機能異常と定義する。
【００２３】
上述の目的を達成するため、肝機能数値異常とは、血清中のAST値の上昇または血清中のALT値の上昇と定義する。
【００２４】
上述の目的を達成するため、肝機能異常とは、血清中のトリグリセリド値の上昇、コレステロール値の上昇、または血糖値の上昇を含む。
【００２５】
上述の目的を達成するため、アルコール性脂肪肝は、肝臓中のトリグリセリド、コレステロールまたは総脂質量の増加を含む。
【００２６】
上述の目的を達成するため、抗酸化物質とはGlutathioneと定義する。
【００２７】
上述の目的を達成するため、抗酸化酵素は、SOD（Superoxide dismutase）、Catalase、GSH-Rd（GSH Reductase）、GSH-Px（GSH Peroxidase）またはGST（Glutathione S-transferase）を含む。
【００２８】
本発明の別の目的として、マクロファージに関連する炎症を改善する健康食品または医薬品の調製に用いる組成物の提供があり、当該組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）の液体培養によって得た霊芝の液体発酵生産物を含んでいる。
【００２９】
上述の目的を達成するため、マクロファージに関連する炎症とは、TNF-αとIL-6の分泌量増加による疾患と定義し、肝炎、腎炎、敗血症、関節炎、または歯周病を含む。
【００３０】
本発明の別の目的として、炎症性腸疾患を改善する健康食品または医薬品の調製に用いる組成物の提供があり、当該組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）の液体培養によって得た霊芝の液体発酵生産物を含んでいる。
【００３１】
上述の目的を達成するため、炎症性腸疾患とはIL-8分泌量増加による疾患と定義し、クローン病、潰瘍性大腸炎またはロタウイルス胃腸炎を含む。
【００３２】
上述の目的を達成するため、霊芝の液体発酵生産物は、分子量23,000〜826,000Daの多糖、及び分子量827,000〜1,600,000Da以上の多糖を含むことを特徴とする。
【００３３】
上述の目的を達成するため、当該組成物は、風味付け物質または補助剤を添加してもよく、風味付け物質はシロップ、酸、果汁、香料または水を含む。
【００３４】
上述の目的を達成するため、シロップは甘みを加える物質で、スクロース、ブドウ糖、フルクトース、またはスクラロースを含むが、この限りではなく、酸は酸味を加える物質で、レモン酸、リンゴ酸、酒石酸、またはリン酸を含むが、この限りではなく、果汁は飲料水の味を調えるのに使われる物質全般のことで、リンゴジュース、オレンジジュース、またはブドウジュースを含むが、この限りではなく、香料は香りを変える物質全般のことで、合成エッセンス、バニラビーンズ、またはハッカエキスを含むが、この限りではない。
【００３５】
上述の目的を達成するため、当該組成物の剤形としては、液体サプリメント、口服液剤、飲料、粉末、カプセル、錠剤、丸剤、顆粒剤、ゼラチン、咀嚼剤（ガムタイプ）、または他の経口投与剤形が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】霊芝の液体発酵と試験サンプル作製の流れ図
【図２】霊芝の液体発酵生産物がアルコール起因のマウス肝臓脂質蓄積に与える影響を示すマウス肝臓H&E染色病理切片
【図３】高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にGPCカラム（Gel permeation chromatography）を用い、RI（Refractive index）検出器で分析した標準品検量線と霊芝発酵液ピーク滞留時間
【図４】HPLCにGPCカラムを用い、RI検出器で分析した霊芝発酵液分子量の分析
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下は本発明の実施例の詳細説明だが、以下の実施例は本発明を制限するものではない。
【００３８】
実施例1、霊芝の液体発酵生産物が、アルコールに起因するアルコール性肝疾患、アルコール性脂肪肝、肝臓の抗酸化物質濃度低下と肝臓の抗酸化酵素活性低下を改善することの動物実験
炭水化物を、同等の熱量を有するアルコールで置き換えたLieber-DeCarli液体飼料を実験動物の基礎飼料とする。当該飼料のアルコール含有率は36％で、このようにヒトのアルコール摂取の習慣に模して、アルコール性脂肪肝とアルコール性肝疾患を誘発するモデルは、昨今のアルコール性脂肪肝とアルコール性肝疾患の誘発の主流である。ヒトのアルコール長期摂取を模するため、動物試験は8週間継続し、実験動物は8―10週齢、約20グラムのオスC57BL/6Jマウスを用い、1群12匹の4群に分ける。第1群：対照群、正常な液体飼料に加えて、水を与える。第2群：アルコール群、アルコールを含む液体飼料に加えて、水を与える。第3群：霊芝低用量群、アルコールを含む液体飼料に加えて、霊芝の発酵液冷凍乾燥粉末0.513 mg/g BWを与える。第4群：霊芝高用量群、アルコールを含む液体飼料に加えて、霊芝の発酵液冷凍乾燥粉末2.05 mg/g BWを与える。その間、マウスの摂取状態を毎週確認し、飼育前と終了後、空腹時の血清生化学検査値、肝臓における脂質の蓄積、肝臓の抗酸化物質含量、及び肝臓の抗酸化酵素の活性を分析する。
【００３９】
霊芝の発酵液冷凍乾燥粉末は、液体発酵の過程で発生する霊芝の発酵液（図1の作製プロセスによる）に、シロップ、酸、果汁、香料及び水を加えて調製した組成物を冷凍乾燥させると、本試験に用いる霊芝の発酵液冷凍乾燥粉末が形成される。
【００４０】
シロップは甘みを与える物質全般を指し、スクロース、ブドウ糖、フルクトース、ラクトース、イヌリン、ソルビトール、キシリトール、フラクトオリゴ糖、アスパルテーム、スクラロースなどを含むが、この限りではない。酸は酸味を与える物質全般を指し、レモン酸、リンゴ酸、リン酸、酒石酸などを含むが、この限りではない。果汁は飲料水の味を調えるのによく使われる物質全般のことで、リンゴジュース、オレンジジュース、ピーチジュース、ブドウジュース、マンゴージュース、パイナップルジュース、グレープフルーツジュース、レモンジュース、キーウィジュース、カキジュース、イチゴジュースなどを含むが、この限りではない。
【００４１】
実験期間における各群マウスの摂取量
表1によると、実験期間中におけるマウスの摂取量は変わっておらず、霊芝の組成物、アルコールは、マウスの飼料摂取量、カロリー摂取量に影響していない。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
肝機能を示す血清生化学検査値に対する霊芝発酵生産物の影響
飼育期間8週を終えた各群の実験動物の血清生化学検査値が表2に示されている。アルコール群は、肝障害の指標となるAST値、ALT値が著しく高く、血液中の脂肪を示すコレステロール値（Total cholesterol）、トリグリセリド値（Total triglyceride）が著しく高く、血糖値（glucose）が著しく高く、アルコールの長期摂取が肝障害を引き起こし、肝臓における正常な脂肪、血糖を維持できなくなっているのがわかる。低用量または高用量の霊芝発酵液冷凍乾燥粉末を与えた群はいずれも、ALD値は対照群と較べて大差なく（p>0.05）、霊芝サンプルの摂取がマウスのALT値を正常化したことを示している。血清中のAST値、コレステロール値、トリグリセリド値、及び血糖値も、霊芝の用量が増えると著しく低下している。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
長期にわたるアルコールの摂取は、肝臓にコレステロール（Liver cholesterol）とトリグリセリド（Liver triglyceride）を蓄積させるが、表3によると、霊芝の高、低用量群では、肝臓における脂質の蓄積が減って、脂肪肝の症状が改善されており、霊芝の用量が増えると、減少幅が大きくなっている。図2によると、霊芝を与えられたマウスの病理切片における脂質の蓄積（油滴）は小さく、霊芝の用量が増えると、脂質の蓄積が減っている。高用量の方が効果が優れており、本発明の霊芝液体発酵組成物はアルコール性脂肪肝の症状を改善する作用をもつことがわかる。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
マウスの肝臓を一旦冷凍してから解凍後、抗酸化物質の含量、抗酸化酵素の活性を測定する。表4によると、長期にわたるアルコールの摂取は、肝臓中の抗酸化物質GSH（Glutathione）の含量を減少させるのみならず、GSH-Rd（GSH Reductase）、GSH-Px（GSH Peroxidase）、GST（Glutathione S-transferase）、SOD（Superoxide dismutase）といった肝臓の抗酸化酵素の活性を低減させて、肝臓の抗酸化と解毒作用を鈍らせる。高、低用量の霊芝サンプルを与えられたマウスは、肝臓のGSH及びSODといった抗酸化酵素が活性化する傾向にあり、高用量の方が効果が優れており、特に高用量群は、GSH含量、GSH-RD、GSTの活性が対照群のレベルまで回復しており、本発明の霊芝液体発酵組成物は、アルコール摂取時の抗酸化機能を向上させ、酸化による破壊を受けにくくして肝臓を保護することがわかる。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
実施例2、霊芝が、Raw264.7マクロファージ、HT-29ヒト結腸癌細胞による炎症メディエーター分泌を抑制することの実験
本実施例の実験は、Raw264.7マクロファージまたはHT-29ヒト結腸癌細胞を、霊芝液体発酵物とともに培養して培養上清液を得てから、OptEIATM Human ELISA Set（BD Biosciences, CA., USA）商用化セットに、酵素結合免疫分析装置（Model 680; BIO-RAD）を組み合わせて炎症メディエーター含量を分析し、炎症反応への影響を評価する。
【００５０】
Raw264.7マクロファージを濃度2×105 cells/mlに調整し、24穴プレートに接種して、37°C、5％CO2培養ボックスで48時間培養後、アルコール抽出霊芝エキス（図1の作製プロセスによる）とRaw264.7マクロファージを24時間ともに培養したとき、細胞培養上清液の含量を表5に示した。実験結果によると、アルコール抽出霊芝エキスはマクロファージのTNF-α分泌を著しく抑制し、アルコール抽出霊芝エキスの濃度が高いほど、抑制の効果が優れているのがわかる。アルコール抽出霊芝エキスの望ましい作製方法は、霊芝菌糸体粉末を20倍の重量の95％エタノールに加えて十分に混和し、室温で48時間連続して攪拌し、さらに65℃まで加熱して1時間煎じ出しし、冷却後、遠心分離器にかけて得た上澄み液を検品1とする。遠心分離後の沈殿物を、20倍の重量の95％エタノールに加えて十分に混和し、攪拌してから65℃で1時間煎じ出しし、冷却後、遠心分離器にかけて得た上澄み液を検品2とする。検品1と検品2を混和し、減圧濃縮してアルコール分と水分を除去し、最終的な霊芝菌糸体アルコール濃縮液を冷蔵して保管する。
【００５１】
【表５】
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【００５２】
マクロファージを24穴プレートに、1穴2x105 cellsで接種し、37 °C、5％CO2培養ボックスで48時間培養後、アルコール抽出霊芝エキスまたは水抽出霊芝エキス（図1の作製プロセスによる）、JPSとRaw264.7細胞とともに24時間培養したとき、細胞培養上清液のIL-6含量を表6及び表7に示した。アルコール抽出霊芝エキスの望ましい作製方法は上述のとおり。実験結果によると、水抽出、アルコール抽出、いずれの霊芝エキスも、マクロファージのIL-6分泌を著しく抑制し、サンプル濃度が高くなるほど、効果が優れているのがわかる。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
【表７】
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【００５５】
肝炎、腎炎、敗血症、関節炎または歯周病といった炎症を模したRaw264.7細胞実験で、マクロファージが異常に活性化して大量の炎症メディエーター、TNF-αとIL-6を分泌するとき、水抽出霊芝エキス、アルコール抽出霊芝エキス、いずれも、TNF-αとIL-6の分泌を抑制しており、霊芝の液体発酵物はマクロファージに関連する炎症を改善する効果があるのがわかる。
【００５６】
HT-29ヒト結腸癌細胞を、トリプシン（Trypsin EDTA）で培養プレートから剥離して単一細胞とした後、24穴プレートに接種し、1穴3x105 cells、37 °C、5％CO2培養ボックスで48時間培養して付着、増殖させ、結腸癌細胞が分泌するIL-8を測定した実験の結果を表8に示した。水抽出霊芝エキスは，炎症性腸疾患を引き起こす因子IL-8を著しく抑制し、水抽出霊芝エキスの濃度が高いほど、抑制の効果が優れているのがわかる。
【００５７】
【表８】
2018104308.tif 000010
【００５８】
クローン病、潰瘍性大腸炎またはロタウイルス胃腸炎といった炎症性腸疾患を模したHT-29細胞実験で、HT-29ヒト結腸癌細胞が異常に活性化して、炎症メディエーターのIL-8を大量に放出するとき、水抽出霊芝エキスはIL-8の分泌を抑制しており、霊芝液体発酵物は炎症性腸疾患の症状を改善する効果があることがわかる。
【００５９】
実施例3、霊芝発酵液多糖の分子量と比率の分析
文献によると、霊芝の有効成分として、トリテルペノイド、多糖、低分子ペプチドなどが報告されているが、霊芝発酵液には有効成分としての低分子ペプチドが含まれるという報告はない。霊芝の多糖類は、非アルコール性の肝臓保護試験モデルにおいて前向きの報告がかなり多く行われていることから、アルコール性の肝臓保護に対する発酵液の有効成分は、おそらく多糖である。天然の多糖の組成は複雑だが、多糖は、分子量が異なれば機能の強弱と関係してくることから、多糖の分子量は多糖の重要な特徴である。よって、HPLCにGPCカラム（Gel permeation chromatography）を取り付けて、RI（Refractive index）検出器で霊芝発酵液の分子量の分布を測定する。
【００６０】
実験条件：
1. サンプル前處理：霊芝発酵液（図1の作製プロセスによる）を脱イオン水で20倍に希釈後、透析膜（MWCO=6-8kD, Spectra/Por 1 Standard RC Dry Dialysis Tubing, Spectrum）に入れ、流水中で24時間透析し、透析液を0.45μMの膜をくぐらせてから機器で分析。
【００６１】
2. 器材：
HPLC system：HEWLETT PACKARD series 1100, Agilent
Detector：RI detector, Waters 2414, Waters
標準品：Pullulan、分子量2、5、10、20、40、80、160万
GPCカラム：OHpak SB-805 HQ (8mmID*300mmL, 13um)
濾過膜：PVDF、0.45μM
3. HPLC 分析条件：
Detector：RI detector
Mobile phase：0.03% NaN3 in ddH2O
Flow rate：0.6ml/min
Injection：100μL
Temperature：35℃
GPCカラムは、分子量の大きさを利用して測定対象を分離するもので、分子量が高い物質はカラムでの滞留時間が短く、分子量の低い物質はカラムのポアを通過するので滞留時間が長い。こうして測定対象の分子量の分布を分析できる。2万から160万の分子量の標準品検量線による霊芝発酵液多糖のピーク滞留時間を図3に示し、霊芝発酵液の分析とピーク特性を図4に示した。ピーク1（peak 1）の滞留時間11.5分によると、ピーク1の多糖分子量は、標準品検量線における標準品160万Daを大きく上回っており、検量線から外挿すると、分子量は100万Daに達し、総量の58.9％を占めている。ピーク2（peak 2）の滞留時間は16.4分、検量線から内挿すると、多糖の分子量は約21.5万Da、総量の41.1％を占めている。本作製プロセスを経て得た霊芝発酵液は、主に2つのグループの多糖から組成されており、上記のピーク滞留時間の両端から推測すると、両グループの分子量はそれぞれ、23,000〜826,000Daの多糖、827,000〜1,600,000Da以上の多糖となる。文献によると、霊芝発酵液、霊芝菌糸体、霊芝子実体の多糖の分子量は数千から数十万の間にあり、百万を超えるのは珍しい。当方の霊芝発酵液の多糖の分子量は160万を遥かに上回るものがあることから、この霊芝発酵液の作製方法は従来の技術では成し得なかった成果を出しており、特許の要件たる新規性、進歩性を備えているといえる。
【００６２】
本発明は、霊芝発酵生産物を用いたアルコール性脂肪肝、アルコール性肝疾患の症状、アルコール起因の肝臓抗酸化能力低下の改善、マクロファージに関連する炎症の改善、及び、炎症性腸疾患の症状改善という、従来の技術では解決できなかった課題を解決している。上述の実施例の結果によると、本発明の提供する、霊芝の菌糸体及び発酵代謝液を含む  霊芝の深層培養発酵液生産物は、分子量約23,000〜826,000Daと827,000〜1,600,000Da以上の2つのグループに分かれる多糖を含み、（1）肝機能を示すAST値、ALT値を低下させ、血清中のトリグリセリド値、コレステロール値、血糖値を低下させる（霊芝液体発酵生産物によるアルコール性肝疾患の症状改善）、（2）コレステロール、トリグリセリドといった肝臓に蓄積した脂質を減少させる（霊芝液体発酵生産物による脂肪肝の予防と改善）、（3）抗酸化物質GSTの含量と、抗酸化酵素GSH-Rd、GSH-Px、SOD、catalaseの活性の向上（霊芝液体発酵生産物によるアルコール起因の肝臓抗酸化能力低下の改善）、（4）マクロファージの炎症メディエーターTNF-α、IL-6の分泌抑制、（5）炎症性腸疾患を引き起こす因子IL-8の分泌抑制（霊芝液体発酵生産物によるアルコール起因の肝疾患の程度の抑制、並びにマクロファージ関連の炎症と炎症性腸疾患の症状改善）、を達成しているのが実証されている。
【００６３】
霊芝液体発酵プロセス
望ましい実施例における液体発酵プロセスは以下のとおり。一定量の霊芝（Ganoderma lucidum、寄託番号BCRC930182、CGMCC12517）菌種を取り、炭素源1〜10%、窒素源0.1〜2%、無機塩類0.01〜0.3%、微量ミネラル0.01〜0.3%の滅菌培養液内に接種し、攪拌、通気を維持する条件で3〜15日培養して、菌糸体と発酵液からなる液体発酵生産物を得る。この発酵生産物を固液分離するにあたり、固液分離は、3〜15%の珪藻土を発酵生産物中に加え、圧縮濾過して液状の霊芝発酵液を得る、という手順で行う。この場合、炭素源は、ブドウ糖、スクロース、フルクトース、麦芽糖、マルトデキストリン、デンプンを含むが、この限りではなく、窒素源は、動物性タンパク（カゼイン、乳清タンパク質、粉ミルク）、植物性タンパク、酵母を含むが、この限りではなく、固液分離方法は、珪藻土を入れての圧搾濾過、遠心分離を含むが、この限りではない。以上の液体発酵プロセスを図1に示した。発酵方法は深層培養液体発酵技術を用い、このようにして得る霊芝発酵液は、黄金色から褐色を呈する粘性のある液体で、淡いキノコの香りがする。
【００６４】
以上の詳細説明は本発明における実施例の具体的説明にとどまり、これをもって特許登録の範囲が限定されるべきではなく、本発明に係わる技能に精通した者が、本発明の趣旨に従って同等の効果を得た場合は、以下における本発明の特許登録の範囲内とする。
【００６５】
本案は技術的思想の創作に属し、従来の物品に上述の機能や効果が付加されており、新規性、進歩性という発明特許の要件を満たしていると思われることから、ここに特許登録を出願する。
【図１】
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【図２】
2018104308.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月26日(2018.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールに起因する肝疾患の症状を改善する健康食品または医薬品の調製の用途のための組成物であって、前記組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）を液体培養して得る霊芝液体発酵生産物を含み、前記霊芝液体発酵生産物は、濾過又は遠心分離によって菌糸体が分離されていることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
肝疾患とは、アルコール性肝疾患、アルコール性脂肪肝、アルコールに起因する肝臓の抗酸化物質濃度低下、アルコールに起因する肝臓の抗酸化酵素の活性低下を指すことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
アルコール性肝疾患とは、アルコールに起因する肝機能数値の異常な上昇または肝機能異常を指すことを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
肝機能数値異常とは、血清中のAST値の上昇または血清中のALT値の上昇を指すことを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
肝機能異常とは、空腹時の血清中のトリグリセリド値の上昇、コレステロール値の上昇、または血糖値の上昇を含むことを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
【請求項６】
アルコール性脂肪肝は、肝臓中のトリグリセリド、コレステロールまたは総脂質量の増加を含むことを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
【請求項７】
肝臓の抗酸化物質とはGlutathioneを指すことを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
【請求項８】
肝臓の抗酸化酵素は、SOD（Superoxide dismutase）、Catalase、GSH-Rd（GSH Reductase）、GSH-Px（GSH Peroxidase）またはGST（Glutathione S-transferase）を含むことを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
【請求項９】
マクロファージに関連する炎症を改善する健康食品または医薬品の調製の用途のための組成物であって、前記組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）を液体培養して得る霊芝液体発酵生産物を含み、前記霊芝液体発酵生産物は、濾過又は遠心分離によって菌糸体が分離されていることを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
マクロファージに関連する炎症とは、IL-6の分泌量増加による疾患を指し、肝炎、腎炎、敗血症、関節炎、または歯周病を含むことを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
炎症性腸疾患を改善する健康食品または医薬品の調製の用途のための組成物であって、前記組成物は、霊芝菌種（Ganoderma lucidum）を液体培養して得る霊芝液体発酵生産物を含み、前記霊芝液体発酵生産物は、濾過又は遠心分離によって菌糸体が分離されていることを特徴とする、組成物。
【請求項１２】
炎症性腸疾患とはIL-8分泌量増加による疾患を指し、クローン病、潰瘍性大腸炎またはロタウイルス胃腸炎を含むことを特徴とする、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
当該霊芝液体発酵生産物は、分子量23,000〜826,000Daの多糖、及び分子量827,000〜1,600,000Da以上の多糖を含むことを特徴とする、請求項1、9、11に記載の組成物。
【請求項１４】
当該組成物は、風味付け物質または補助剤を添加してもよく、風味付け物質はシロップ、酸、果汁、香料または水を含むことを特徴とする、請求項1、9、11に記載の組成物。
【請求項１５】
当該組成物の剤形としては、液体サプリメント、口服液剤、飲料、粉末、カプセル、錠剤、丸剤、顆粒剤、ゼラチン、咀嚼剤（ガムタイプ）、または他の経口投与剤形が考えられることを特徴とする、請求項1、9、11に記載の組成物。
【請求項１６】
シロップは甘みを加える物質であり、スクロース、ブドウ糖またはスクラロースを含み、酸は酸味を加える物質で、レモン酸、リンゴ酸またはリン酸を含み、果汁は飲料水の味を調えるのによく使われる物質全般のことで、リンゴジュース、オレンジジュースまたはブドウジュースを含み、香料は香りを変える物質全般のことで、合成エッセンス、バニラビーンズまたはハッカエキスを含むことを特徴とする、請求項14に記載の組成物。