(57)【要約】      （修正有）【課題】個々の細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリーの収量および平均長の両方を増大するために逆転写、鋳型切り替えおよび予備増幅が改善されたｃＤＮ’Ａ合成のための方法を開示する。【解決手段】鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）の３’末端において単一のヌクレオシド残基をロックド核酸（ＩＮＡ）と交換すること、メチル基供与体を使用すること、および／または従来使用されているよりも高いＭｇＣｂ濃度を使用する単一細胞トランスクリプトーム解析は、全長カバレッジ、改善された感度および精度を有し、より小さいバイアスを有し、かつ費用効果的な自動化に対してより修正可能である。前記ＴＳＯの最も３’側のヌクレオチドのみがロックド核酸を含むｃＤＮＡ分子、これらのｃＤＮＡ分子を含む組成物およびｃＤＮＡライブラリー、ならびに単一細胞トランスクリプトームプロファイリングのための方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡを調製するための方法であって、
前記ＲＮＡ分子にｃＤＮＡ合成プライマーをアニールし、および第１ｃＤＮＡ鎖を合成して、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ中間体を形成する工程と、
前記ＲＮＡ分子に相補的な前記第１ＤＮＡ鎖の伸長に好適な条件下で前記ＲＮＡ−ｃＤＮＡ中間体を鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）と接触させることにより逆転写酵素反応を行い、前記第１ＤＮＡ鎖をさらに前記ＴＳＯに対して相補的にする工程であって、前記ＴＳＯは、その３’末端にロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記逆転写反応が、メチル基供与体および金属塩の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチル基供与体が、ベタインである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記金属塩が、マグネシウム塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記マグネシウム塩が、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、または少なくとも９ｍＭの濃度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個または２個のリボヌクレオチド残基および前記ＬＮＡ残基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１個または２個のリボヌクレオチド残基が、リボグアニンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド５−メチルシトシンからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ロックド核酸残基が、最も３’側の位置にある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、前記３’末端に、式ｒＧｒＧ＋Ｎ（式中、＋Ｎは、ロックドヌクレオチド残基を表す）により特徴付けられる３個のヌクレオチド残基を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、ｒＧｒＧ＋Ｇを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記メチル基供与体がベタインであり、かつ前記金属塩が少なくとも９ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２である、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記ＲＮＡ分子および前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドに相補的な前記ＤＮＡ鎖を増幅することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、表Ｓ２中のオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｃＤＮＡが、固定されたオリゴ−ｄＴプライマーを含むビーズ上で合成される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴ−ｄＴプライマーが、５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ３０ＶＮ−３’の配列を含み、ここで、「Ｎ」は任意のヌクレオシド塩基であり、かつ「Ｖ」は「Ａ」、「Ｃ」および「Ｇ」からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＣＲ予備増幅、タグメンテーション、および最終ＰＣＲ増幅をさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＣＲ予備増幅が、逆転写反応から得られた前記ｃＤＮＡを精製することなしに行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＮＡが、細胞中の全ＲＮＡである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法により作製されるｃＤＮＡライブラリー。
【請求項２２】
単一細胞トランスクリプトームプロファイリングのための、請求項２１に記載のｃＤＮＡライブラリーの使用。
【請求項２３】
複数の単一細胞中の遺伝子発現を解析するための方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製する工程と、前記ｃＤＮＡライブラリーを配列決定する工程とを含む、方法。
【請求項２４】
鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）であって、その３’末端にロックドヌクレオチド残基を含む、鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）。
【請求項２５】
前記３’末端に＋Ｎ＋Ｎ＋Ｎ、Ｎ＋Ｎ＋Ｎ、ＮＮ＋Ｎ、ｒＮ＋Ｎ＋Ｎ、およびｒＮｒＮ＋Ｎからなる群から選択される３個のヌクレオチド残基を含む請求項２４に記載のＴＳＯであって、Ｎは、各存在において独立して、デオキシリボヌクレオチド残基であり、ｒＮは、各存在において独立して、リボヌクレオチド残基であり、および＋Ｎは、各存在において独立して、ロックドヌクレオチド残基である、ＴＳＯ。
【請求項２６】
前記ロックドヌクレオチド残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド５−メチルシトシンからなる群から選択される、請求項２４または２５に記載のＴＳＯ。
【請求項２７】
前記３個のヌクレオチド残基が、ＮＮ＋ＧまたはｒＮｒＮ＋Ｇである、請求項２５に記載のＴＳＯ。
【請求項２８】
前記３個のヌクレオチド残基が、ｒＧｒＧ＋ＮまたはＧＧ＋Ｎである、請求項２５に記載のＴＳＯ。
【請求項２９】
前記３個のヌクレオチド残基が、ｒＧｒＧ＋ＧまたはＧＧ＋Ｇである、請求項２５に記載のＴＳＯ。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従う二本鎖ｃＤＮＡの合成における、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載のＴＳＯの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／８６９，２２０号明細書に対する優先権を主張するものであり、その仮特許出願の内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、収量および平均長が改善された二本鎖ｃＤＮＡの合成方法と、合成されるｃＤＮＡ分子と、個々の細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリーとに関する。
【背景技術】
【０００３】
単一細胞遺伝子発現解析は、細胞異質性を特徴付けることが期待されるが、現行の方法は、カバレッジ、感度または処理量のいずれかを犠牲にする。キャップ富化手順をはじめとする大量のＲＮＡからの全長ｃＤＮＡ構築のためのいくつかの方法が存在する（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．＆Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  １３８，１７１−１７４（１９９４）（非特許文献1）；Ｃａｒｎｉｎｃｉ，Ｐ．＆Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｙ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３，１９−４４（１９９９）（非特許文献2）；Ｄａｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６，５７−８０（２００１）（非特許文献3））が、単一細胞量のＲＮＡから全長カバレッジを得ることは依然として難しい。既存の方法は、ｃＤＮＡの３’末端ポリＡテーリング（例えば、Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３７７−３８２（２００９）（非特許文献4）；Ｓａｓａｇａｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１４，Ｒ３１（２０１３）（非特許文献5））または鋳型切り替え（Ｚｈｕ，Ｙ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０，８９２−８９７（２００１）（非特許文献6）；Ｒａｍｓｋｏｅｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，７７７−７８２（２０１２）（非特許文献7））のいずれかを使用するが、他の方法は、早期のマルチプレックス化のために全長カバレッジを完全に犠牲する（Ｉｓｌａｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（２０１１）．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１１０８８２．１１０（非特許文献8）；Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２，６６６−６７３（２０１２）（非特許文献9））。ｎａｎｏＣＡＧＥ（Ｐｌｅｓｓｙ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７，５２８−５３４（２０１０）（非特許文献10））およびＳＴＲＴ（Ｉｓｌａｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（２０１１）．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１１０８８２．１１０（非特許文献8））をはじめとするＲＮＡの５’末端を直接捕捉するように設計された用途における鋳型切り替えの一般的な使用と一致して、鋳型切り替えに依拠するＳｍａｒｔ−Ｓｅｑの方が、ポリＡテーリング法よりも均一な転写物全体のリードカバレッジを有することが近年明らかになった（Ｒａｍｓｋｏｅｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，７７７−７８２（２０１２）（非特許文献7））。鋳型切り替えを利用する単一細胞用途は、代表的なｃＤＮＡを配列決定のために十分な量で得るために、逆転写、鋳型切り替え反応の効率、および均一なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）予備増幅に依存する。これらの反応の広範囲の使用にもかかわらず、単一細胞量からのｃＤＮＡライブラリーの収量および平均長を改善するための体系的な取り組みは報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．＆Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  １３８，１７１−１７４（１９９４）
【非特許文献２】Ｃａｒｎｉｎｃｉ，Ｐ．＆Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｙ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３，１９−４４（１９９９）
【非特許文献３】Ｄａｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６，５７−８０（２００１）
【非特許文献４】Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３７７−３８２（２００９）
【非特許文献５】Ｓａｓａｇａｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１４，Ｒ３１（２０１３）
【非特許文献６】Ｚｈｕ，Ｙ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０，８９２−８９７（２００１）
【非特許文献７】Ｒａｍｓｋｏｅｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，７７７−７８２（２０１２）
【非特許文献８】Ｉｓｌａｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（２０１１）．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１１０８８２．１１０
【非特許文献９】Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２，６６６−６７３（２０１２）
【非特許文献１０】Ｐｌｅｓｓｙ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７，５２８−５３４（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、個々の細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリーの収量および平均長の両方を増大するために、特に、鋳型切り替え反応を利用する単一細胞用途の逆転写、鋳型切り替えおよび予備増幅が改善された、ｃＤＮＡの合成のための改善された方法を提供する。これらの相違点を組み込んだ単一細胞トランスクリプトーム解析は、改善された感度および精度を有し、かつよりバイアスが小さく、かつ費用効果的な自動化に対してより修正可能である。
【０００６】
特に、単一細胞からの全長トランスクリプトームプロファイリングを改善するために、本出願は、逆転写、鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）およびＰＣＲ予備増幅の多くの変形の評価、ならびに市販のＳｍａｒｔ−Ｓｅｑ（以後ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）と呼ぶ）とのｃＤＮＡライブラリーの収量および長さに関する結果の比較を開示する。本明細書に開示される改変は、１ｎｇほどの僅かな出発全ＲＮＡから得られるｃＤＮＡの収量および長さの両方を驚くほど著しく増大させた。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡを調製するための方法であって、ロックド核酸残基を含む鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）の存在下で逆転写反応を行うことを含む方法を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、ｃＤＮＡ合成におけるメチル基供与体などの添加剤の使用を含む、ｃＤＮＡの収量を増大する方法を提供する。一実施形態において、メチル基供与体は、ベタインである。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、ｃＤＮＡの合成における増大した濃度の金属塩（例えば、ＭｇＣｌ２）の使用を含む、ｃＤＮＡの収量を増大する方法を提供する。
【００１０】
好ましい実施形態において、方法は、ｃＤＮＡ合成における増大した濃度のＭｇＣｌ２と組み合わせてのメチル基供与体の使用を含む。特に好ましい実施形態において、方法は、ｃＤＮＡの収量に対して著しい良い効果を示している、増大した濃度のＭｇＣｌ２と組み合わせてのメチル基供与体ベタインの使用を含む。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、逆転写酵素（ＲＴ）マスターミックスにおいてではなくＲＮＡ変性の前にｄＮＴＰを投与することを含む、予備増幅されたｃＤＮＡの平均長を増大する方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従う方法によって作製されるｃＤＮＡライブラリーを提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、単一細胞トランスクリプトームプロファイリングのための、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って作製されたｃＤＮＡライブラリーの使用を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に開示される任意の実施形態に従う方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製する工程と、そのｃＤＮＡライブラリーを配列決定する工程とを含む、複数の単一細胞における遺伝子発現を解析するための方法を提供する。
【００１５】
精製されたＲＮＡに対して行われたこれらの方法が、個々の後生動物細胞（例えば、哺乳動物細胞を含む）に適用可能であることが、本発明によって実証された。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）であって、その３’末端にＬＮＡを含む鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、二本鎖ｃＤＮＡの合成のための、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従うＴＳＯの使用を提供する。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図面および詳細な説明を参照することによってより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ｃＤＮＡライブラリーの収量および長さの改善を図示する。（Ａ）ｒＧ３オリゴを用いて得られたものと比較した、異なる鋳型切り替えオリゴヌクレオチドを用いた１ｎｇの全ＲＮＡからの予備増幅されたｃＤＮＡの収量の中央値。全てのオリゴ配列は表１に見出される。（Ｂ）ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）のような条件（ベタインおよび６ｍＭ  Ｍｇ２＋）を用いて得られたｃＤＮＡ収量と比較した、ベタインを用いた（黒色）または用いない（灰色）反応における１ｎｇの全ＲＮＡからの、増大していくＭｇ２＋濃度の関数としての、予備増幅されたｃＤＮＡの収量の中央値。（Ｃ）ＲＮＡ変性の前に（早）またはＲＴマスターミックスにおいて（遅）ｄＮＴＰを利用した反応において１ｎｇの全マウス脳ＲＮＡから生成された予備増幅されたｃＤＮＡの長さ。（Ｄ）最適化されたプロトコルを用いてＬＮＡ−ＧおよびＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＩＩＡ鋳型切り替えオリゴを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの予備増幅されたｃＤＮＡの収量の中央値。破線は市販のＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）反応からの収量の中央値を示している。（Ｅ）ベタインを用いたまたは用いない反応におけるＤＧ−７５細胞からの予備増幅されたｃＤＮＡの収量の中央値。（Ｆ）ビーズ抽出を用いたまたは用いない反応において単一ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリーの長さ。元来脳ｍＲＮＡの方が、細胞系ｍＲＮＡよりも長いことに留意されたい。（Ａ〜Ｆ）反復試験測定値を箱形図として表しており、条件ごとの反復試験の数を括弧内に示している。平均収量または長さの有意差は、スチューデントｔ検定を用いて判定した。
【図２】図２は、単一細胞における高感度の全長トランスクリプトームプロファイリングを図示する。（Ａ）発現レベルに従って値域ごとにまとめられた、反復試験細胞において再現可能に検出された遺伝子の百分率。最適化されたプロトコルおよびＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）についての反復試験内で全ての対比較を行い、平均値および９０％信頼区間として報告した。（Ｂ）発現レベルに従ってまとめられた遺伝子の各値域における反復試験内の遺伝子発現推定量における標準偏差。エラーバー、標準誤差（ｎ≧４）。（Ｃ）ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）および最適化されたプロトコルを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出された遺伝子の、異なるＲＰＫＭカットオフにおける平均数。最適化されたプロトコルにおける遺伝子検出の有意な増加が、全てのＲＰＫＭ閾値において得られた（全てｐ＜０．５；スチューデントｔ検定）。（Ｄ）ＧＣ含量に従ってまとめられた遺伝子の各値域における発現したものとして検出された遺伝子（ＲＰＫＭ＞１）の平均割合。ヒト組織からのｍＲＮＡ−Ｓｅｑデータを、予備増幅なしコントロールとして含めた。エラーバーは標準誤差（ｎ≧４）を表し、下方のパネルは各値域における遺伝子についてのＧＣ範囲を示す。（Ｅ）異なるプロトコルを用いて生成された単一細胞データについての、遺伝子の最も３’側の２０％、最も５’側の２０％および中央の６０％に対してアライメントしたリードの平均割合。（Ｆ）２つの最も重要な成分を示す単一細胞遺伝子発現データの主成分分析。予備増幅酵素およびプロトコル変形に応じて細胞が着色されている。
【図３】図３は、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドにおいてＬＮＡ塩基を用いたｃＤＮＡ収量を示す。
【図４】図４は、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑの感度および変動性を図示する。（Ａ）反復試験細胞において再現可能に検出された遺伝子の百分率。（Ｂ）遺伝子発現推定量における標準偏差。
【図５】図５は、別の分析経路を用いた単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ結果の妥当性確認を図示する。（Ａ）反復試験細胞において再現可能に検出された遺伝子の百分率。（Ｂ）遺伝子発現推定量における標準偏差。（Ｃ）検出された遺伝子の平均数。（Ｄ）発現したものとして検出された遺伝子の平均割合。（Ｅ）異なるプロトコルを用いて生成された単一細胞データについての、遺伝子の最も３’側の２０％、最も５’側の２０％および中央の６０％に対してアライメントしたリードの平均割合。
【図６】図６は、Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２、Ｑｕａｒｔｚ−ＳｅｑおよびＳＭＡＲＴｅｒを用いて生成された単一細胞トランスクリプトームデータの比較を図示する。（Ａ）反復試験細胞において再現可能に検出された遺伝子の百分率。Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２およびＱｕａｒｔｚ−ｓｅｑについて全ての対比較を行い、平均値および９０％信頼区間として報告した。（Ｂ）（Ａ）における遺伝子発現推定量における標準偏差。（Ｃ）反復試験細胞において再現可能に検出された遺伝子の百分率。Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２およびＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）について全ての対比較を行い、平均値および９０％信頼区間として報告した。（Ｄ）（Ｃ）における遺伝子発現推定量における標準偏差。（Ｅ）反復試験細胞において再現可能に検出された遺伝子の百分率。Ｑｕａｒｔｚ−ｓｅｑについて全ての対比較を行い、平均値および９０％信頼区間として報告した。（Ｆ）（Ｅ）における遺伝子発現推定量における標準偏差。
【図７】図７は、ＳＭＡＲＴｅｒ、最適化されたＳｍａｒｔ−Ｓｅｑおよび最適化されたプロトコルの変形を用いて生成された単一細胞ライブラリーについてのマッピング統計を図示する。（Ａ）各単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーについての１〜９個のミスマッチを有する一意的にアライメントされたリードの割合。（Ｂ）全ての単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーについての、一意的にアライメントしたリード、複数のゲノム座標にアライメントしたリード、またはアライメントしなかったリードの百分率。（Ｃ）エクソン領域、イントロン領域または遺伝子間領域にマッピングした一意的にアライメントされたリードの割合。（Ｄ）細胞およびライブラリー調製プロトコルごとの配列決定されたリードの数。
【図８】図８は、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑプロトコルにおける遺伝子発現およびＧＣレベルを図示する。
【図９】図９は、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑの感度および変動性を図示する。（Ａ）反復試験細胞において再現可能に検出された遺伝子の百分率。（Ｂ）遺伝子発現推定量における標準偏差。
【図１０】図１０は、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおける遺伝子全体のリードカバレッジを図示する。
【図１１】図１１は、転写物全体のリードカバレッジを図示する。（Ａ）全ての遺伝子についてのカバレッジリードの平均割合。（Ｂ）〜（Ｆ）長さにより５つの同サイズの値域にグループ分けされた転写物。
【図１２Ａ】図１２は、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおけるリードピークを図示する。（Ａ）単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーごとの１つ以上の高密度ピークを有する遺伝子の数。
【図１２Ｂ】図１２は、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおけるリードピークを図示する。（Ｂ）最高数のライブラリーにおいてピークを有する遺伝子全体のリード密度のヒートマップ。
【図１３】図１３は、Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２を用いた単一細胞トランスクリプトミクスにおける技術的および生物学的変動性の評価を図示する。（Ａ）ＨＥＫ細胞の希釈物において再現可能に検出された遺伝子の百分率。（Ｂ）（Ａ）についての遺伝子発現推定量における標準偏差。（Ｃ）ＨＥＫ全ＲＮＡの希釈物において再現可能に検出された遺伝子の百分率。（Ｄ）（Ｄ）についての遺伝子発現推定量における標準偏差。（Ｅ）個々の細胞の対比較を含む、（Ｄ）についての遺伝子発現推定量における標準偏差。
【図１４】図１４は、市販のＴｎ５（Ｎｅｘｔｅｒａ）を用いて生成されたライブラリーの社内生産したＴｎ５との比較を図示する。（Ａ）社内条件を用いて再現可能に検出された遺伝子の百分率。（Ｂ）（Ａ）についての遺伝子発現推定量における標準偏差。（Ｃ）市販の緩衝液および条件を用いて再現可能に検出された遺伝子の百分率。（Ｄ）（Ｄ）についての遺伝子発現推定量における標準偏差。（Ｅ）（Ａ）で実施した反応における相違点。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本出願は、個々の細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリーの収量および平均長の両方を増大するために逆転写、鋳型切り替えおよび予備増幅が改善されたｃＤＮＡ合成のための方法を開示する。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡを調製するための方法であって、
ＲＮＡ分子にｃＤＮＡ合成プライマーをアニールし、および第１ｃＤＮＡ鎖を合成して、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ中間体を形成する工程と、
ＲＮＡ分子に相補的な第１ＤＮＡ鎖の伸長に好適な条件下でＲＮＡ−ｃＤＮＡ中間体を鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）と接触させることにより逆転写酵素反応を行い、第１ＤＮＡ鎖をさらにＴＳＯに対して相補的にする工程であって、ＴＳＯは、その３’末端にロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、工程と
を含む、方法を提供する。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、逆転写反応は、メチル基供与体および金属塩の存在下で行われる。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、メチル基供与体は、ベタインである。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、金属塩は、マグネシウム塩である。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、マグネシウム塩は、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、または少なくとも９ｍＭの濃度を有する。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドは、任意選択で、１個または２個のリボヌクレオチド残基を含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個または２個のリボヌクレオチド残基およびＬＮＡ残基を含む。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、その少なくとも１個または２個のリボヌクレオチド残基は、リボグアニンである。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、ロックド核酸残基は、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド５−メチルシトシンからなる群から選択される。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、ロックド核酸残基は、ロックドグアニンである。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、ロックド核酸残基は、最も３’側の位置にある。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドは、３’末端に、式ｒＧｒＧ＋Ｎ（式中、＋Ｎは、ロックドヌクレオチド残基を表す）により特徴付けられる２個のリボヌクレオチド残基および１個のロックドヌクレオチド残基を含む。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドは、ｒＧｒＧ＋Ｇを含む。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、メチル基供与体はベタインであり、かつ金属塩は少なくとも９ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２である。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、方法は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡ分子および鋳型切り替えオリゴヌクレオチドに相補的なＤＮＡ鎖を増幅することをさらに含む。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドは、表Ｓ２中のオリゴヌクレオチドから選択される。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、ｃＤＮＡ合成プライマーは、オリゴ−ｄＴプライマーである。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、ｃＤＮＡは、固定されたオリゴ−ｄＴプライマーを含むビーズ上で合成される。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、オリゴ−ｄＴプライマーは、５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ３０ＶＮ−３’の配列を含み、ここで、「Ｎ」は任意のヌクレオシド塩基であり、かつ「Ｖ」は「Ａ」、「Ｃ」および「Ｇ」からなる群から選択される。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、方法は、ＰＣＲ予備増幅、タグメンテーション、および最終ＰＣＲ増幅をさらに含む。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、ＰＣＲ予備増幅は、逆転写反応から得られたｃＤＮＡを精製することなしに行われる。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、ＲＮＡは、細胞中の全ＲＮＡである。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に開示される任意の実施形態に従う方法により作製されるｃＤＮＡライブラリーを提供する。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、単一細胞トランスクリプトームプロファイリングのための、本明細書に開示される任意の実施形態に従う方法により作製されるｃＤＮＡライブラリーの使用を提供する。
【００４５】
別の実施形態において、本発明は、複数の単一細胞中の遺伝子発現を解析するための方法であって、本明細書に開示される任意の実施形態に従う方法により作製されるｃＤＮＡライブラリーを調製する工程と、ｃＤＮＡライブラリーを配列決定する工程とを含む、方法を提供する。
【００４６】
別の実施形態において、本発明は、鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）であって、３’末端にロックドヌクレオチド残基を含む、鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を提供する。本発明のＴＳＯは、ｃＤＮＡの合成において、収量および長さを改善するために使用され得る。
【００４７】
別の実施形態において、ＴＳＯは、３’末端に３個のヌクレオチド残基を含み、前記３個のヌクレオチド残基は、＋Ｎ＋Ｎ＋Ｎ、Ｎ＋Ｎ＋Ｎ、ＮＮ＋Ｎ、ｒＮ＋Ｎ＋Ｎ、およびｒＮｒＮ＋Ｎからなる群から選択され、ここで、Ｎは、各存在において独立して、デオキシリボヌクレオチド残基であり、ｒＮは、各存在において独立して、リボヌクレオチド残基であり、および＋Ｎは、各存在において独立して、ロックドヌクレオチド残基である。
【００４８】
一実施形態において、本明細書において５’部分とも称される、３’末端の３個のヌクレオチド残基の５’側にあるＴＳＯの部分は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの混合物からなる任意のヌクレオチド配列を含む。１つの好ましい実施形態において、ＴＳＯの５’部分は、全てのリボヌクレオチドを含む。別の好ましい実施形態において、ＴＳＯの５’部分は、全てのデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００４９】
別の実施形態において、ＴＳＯ中のロックドヌクレオチド残基は、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド５−メチルシトシンからなる群から選択される。
【００５０】
別の実施形態において、ＴＳＯの３’末端の３個のヌクレオチド残基は、ＮＮ＋ＧまたはｒＮｒＮ＋Ｇであり、ここで、Ｎは、各存在において独立して、デオキシリボヌクレオチド残基であり、およびｒＮは、各存在において独立して、リボヌクレオチド残基である。
【００５１】
別の実施形態において、ＴＳＯの３’末端の３個のヌクレオチド残基は、ｒＧｒＧ＋Ｎであり、ここで、＋Ｎは、ロックドヌクレオチド残基である。
【００５２】
別の実施形態において、ＴＳＯの３’末端の３個のヌクレオチド残基は、ｒＧｒＧ＋Ｇである。
【００５３】
ＴＳＯは、好ましくは、約１０〜約５０ヌクレオチド長、または約１５〜約４５ヌクレオチド長、または約２０〜約４０ヌクレオチド長、または約２４〜約３５ヌクレオチド長、または約３０ヌクレオチド長を有する。
【００５４】
別の実施形態において、本発明は、ｃＤＮＡの合成における、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに従うＴＳＯの使用を提供する。
【００５５】
本発明にとって有用な金属カチオンの例としては、これらに限定されないが、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋が挙げられ、Ｍｇ２＋の方が好ましく、それらの濃度は、０〜３０（０と３０とを含む）μＭの範囲内であり得、好ましい範囲は３〜２０μＭであり、より好ましい範囲は９〜１２μＭである。
【００５６】
メチル供与体ベタインに加えて、本発明のｃＤＮＡ合成において添加され得る他の添加剤としては、トレハロース、スクロース、グルコース、マルトース、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ホルムアミド、非イオン界面活性剤、ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロリド）、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン（ｄＣ７ＧＴＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびＴ４遺伝子３２タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明は、鋳型切り替え活性を有する全てのＭＭＬＶ関連逆転写酵素を用いる反応に適用可能である。ＭＭＬＶ関連逆転写酵素には、野生型モロニーマウス白血病ウイルスおよびその変異体（例えば、ＳＵＰＥＲ−ＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＯＷＥＲ  ＳＣＲＩＰＴ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳＭＡＲＴ  ＳＣＲＩＢＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などのＲＮアーゼＨ活性を欠く誘導体を含む）が含まれる。本発明にとって有用なＴＳＯは、バーコード（分子バーコードまたは試料バーコードが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。
【００５８】
本発明に従って合成されるｃＤＮＡは、任意の文献方法に従って合成されるｃＤＮＡとしての用途（少量ｃＤＮＡライブラリーの構築、単一細胞ｃＤＮＡ解析、単一細胞遺伝子発現解析、少数細胞ｃＤＮＡ解析、少数細胞遺伝子発現解析、（この予備増幅工程を用いる）単一細胞ｑＰＣＲ解析、およびキャップ捕捉に基づく増幅が挙げられるが、これらに限定されない）を有し得る。
【００５９】
以下の非限定的な実施例は、本発明の特定の態様を説明するものである。
【実施例】
【００６０】
実施例１
方法
全ＲＮＡを用いた実験
ＲＮＡ実験を、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に供給される、マウス脳から抽出されたＣｏｎｔｒｏｌ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて行った。１マイクロリットルの１ｎｇ／μｌ溶液を各実験において使用し、１μｌの固定されたオリゴ−ｄＴプライマー（１０ｍＭ、５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ３０ＶＮ−３’（「Ｎ」は任意の塩基であり、「Ｖ」は「Ａ」、「Ｃ」または「Ｇ」のいずれかである））および１μｌのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）と混合し、７２℃で３分間変性させ、その後、氷の上に即座に置いた。０．５０μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ  ｍｌ−１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（２０Ｕ  ｍｌ−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（５×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのベタイン（５Ｍ、Ｓｉｇｍａ）、０．９μｌのＭｇＣｌ２（１００ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、１μｌのＴＳＯ（１０μＭ、オリゴの完全な一覧は表Ｓ１に見出され得る）および０．１μｌのヌクレアーゼ非含有水（Ｇｉｂｃｏ）を含有する７μｌの第１鎖反応混合物を、各試料に添加した。逆転写反応を、４２℃での９０分間のインキュベーション、続いて１０サイクルの（５０℃２分間、４２℃２分間）を行うことより実施した。最後に、７０℃での１５分間のインキュベーションにより、ＲＴを不活性化した。
【００６１】
ＰＣＲ予備増幅
元のＳｍａｒｔ−Ｓｅｑプロトコルでは、第１鎖ｃＤＮＡ合成後に、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズでの精製が行われる。次いで、２μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（５０×、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０×、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２μｌのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２μｌのＩＳ  ＰＣＲプライマー（１２μＭ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および５０μｌの最終反応体積までの３９μｌのヌクレアーゼ非含有水を添加した後に、ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡに対して直接ＰＣＲが実施される。本実施例では、ＲＴ後のｃＤＮＡの精製は行わず、第１鎖ｃＤＮＡ合成後の体積が１０μｌであることを考慮し、それに応じて水量を調整しながら、同じＰＣＲマスターミックスの添加のみを行った。反応物を９５℃で１分間インキュベートし、次いで、（９５℃１５秒、６５℃３０秒、６８℃６分）の間を１５回循環させ、７２℃で１０分間最終伸長させた。
【００６２】
ｃＤＮＡ収量を著しく改善した第２の改変は、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅミックスをＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に置き換えることであった。この場合もまた、第１鎖ｃＤＮＡ合成後の精製を省略した。ＰＣＲマスターミックスは、次の組成を有していた：２５μｌのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（２×、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μｌのＩＳ  ＰＣＲプライマー（１０ｍＭ、５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’）および１４μｌのヌクレアーゼ非含有水（Ｇｉｂｃｏ）。使用したプログラムは次のとおりであった：９８℃３分、次いで１５サイクルの（９８℃１５秒、６７℃２０秒、７２℃６分）、７２℃での５分間の最終伸長。
【００６３】
使用したＰＣＲプロトコルに関係なく、ＰＣＲを１：１比のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、１５μｌのＥＢ溶液（Ｑｉａｇｅｎ）中で最終溶出を行った。１：５の希釈後に、ライブラリーサイズ分布をＨｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）上で調べた。予想される平均サイズは約１．５〜２．０ｋｂであるはずであり、３００ｂｐ未満の断片の割合は極僅かであるはずである。プロトコルに組み込んだ種々の改変の成果を評価するために、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒプロットにおいて区間３００〜９０００ｂｐに含まれたｃＤＮＡの量を評価した。
【００６４】
タグメンテーション反応および最終ＰＣＲ増幅
次いで、５ナノグラムのｃＤＮＡを、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて実施したタグメンテーション反応のために、２５μｌの２×Ｔａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒおよび５μｌのＴａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｅｎｚｙｍｅを添加して５０μｌの最終体積で使用した。タグメンテーション反応物を５５℃で５分間インキュベートし、続いてＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製し、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）キットからの２０μｌのＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＳＢ）中で最終溶出を行った。次いで、全体積を、１５μｌのＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＰＭ）、５μｌのＩｎｄｅｘ  １プライマー（Ｎ７ｘｘ）、５μｌのＩｎｄｅｘ  ２プライマー（Ｎ５ｘｘ）および５μｌのＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＰＣ）と一緒に、限られたサイクルの富化ＰＣＲのために使用した。第２の増幅ラウンドは、次のとおり行った：７２℃３分、９８℃３０秒、次いで、５サイクルの（９８℃１０秒、６３℃３０秒、７２℃３分）。１：１比のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて精製を行い、試料をＨｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップ上に負荷してライブラリーの品質を調べ、さらにＱｕｂｉｔ  Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量を行った。ライブラリーを２ｎＭの最終濃度に希釈し、プールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００で配列決定した。
【００６５】
単一細胞ｃＤＮＡの単離
単一のＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト）、ＤＧ−７５（ヒト）、Ｃ２Ｃ１２（マウス）およびＭＥＦ（マウス）細胞を、ＰＢＳへの再懸濁後に、顕微鏡下において手作業で採取した。液体の体積を、可能な限り小さく（通常は０．５μｌ未満、好ましくは０．３μｌ未満）維持した。次いで、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）および２Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からなる２μｌの穏やかな低張溶解緩衝液を含有する０．２ｍｌ薄壁ＰＣＲチューブに細胞を移した。既に採取された細胞は、プロセスの間中氷の上で維持したか、または即座に使用しない場合は−８０℃で貯蔵した。単一細胞ではＲＴから得られるｃＤＮＡの量が限られているため（希釈なしに）純粋な状態で試料を負荷したＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップでの品質管理のみを除いて、下流工程は全て、全ＲＮＡを用いた場合（上記参照）と同じであった。
【００６６】
全ＲＮＡを用いて研究した際には、ｃＤＮＡ収量は、２倍量のＴＳＯまたはＴＳＯおよびＰＣＲ酵素の異なる組み合わせを用いて増大され得ることが観察された（データは示されていない）。この所見を検証するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するいくつかの実験を、異なるＴＳＯ量（１または２μｌの１０μＭ溶液）、ＴＳＯの種類（ｒＧｒＧｒＧ、ｒＧｒＧ＋ＧまたはｒＧｒＧ＋Ｎ）またはＰＣＲ酵素（ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉまたはＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２）を用いて繰り返した。最も重要な比較についての配列決定結果を図Ｓ２〜Ｓ７に報告する。最終プロトコル（すなわち「最適化された」）とは、僅か１μｌの１０μＭ  ｒＧｒＧ＋Ｇ  ＴＳＯおよび第１のＰＣＲ（ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ精製なし）における酵素としてＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを使用するものを指す。
【００６７】
Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ実験
本方法の性能を評価および比較するために、Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑプロトコルを製造業者の指示（Ｃｌｏｎｔｅｃｈマニュアル参照）に従って用い、同じ全ＲＮＡおよび単一細胞を用いてｃＤＮＡライブラリーを生成した。ＰＣＲ予備増幅後に、５ｎｇのｃＤＮＡをタグメンテーション反応のために使用し、上に記載したのと全く同じ方法で処理した。
【００６８】
ｃＤＮＡの収量および長さの統計分析
異なるプロトコルの性能を、３００９，０００ｂｐの範囲において、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより、ｃＤＮＡ収量および平均ｃＤＮＡ長に関して評価した。マウス脳全ＲＮＡ試料については、各実験変数を、全ての他の変数が同一である１組の実験を選択して、対様式で評価した。その実験組内において、２つの変数間の収量または長さの変化についての有意性を、スチューデントｔ検定およびウィルコクソン順位和検定を用いて評価した（表１、シートＢ）。
【００６９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞実験において、各最適化された実験設定を、スチューデントｔ検定およびウィルコクソン順位和検定を用いて、互いに、およびＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）プロトコルと比較した（表３、シートＢ）。全ての分析結果および図は、Ｒを用いることにより生成した。
【００７０】
リードアライメントおよび遺伝子発現推定
単一細胞ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００でＮｅｘｔｅｒａデュアルインデックス（ｉ７＋ｉ５）を用いて配列決定し、デマルチプレックスおよび細胞バーコードの除去後に４３ｂｐのインサートリードを得た。これらのリードを、デフォルト設定を用いたＳＴＡＲ  ｖ２．２．０（Ｄｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１３  ２９（１）：１５−２１）を用いてヒト（ｈｇ１９）またはマウス（ｍｍ１０）ゲノムに対してアライメントし、一意的にマッピングするリードを得るためにフィルタリングした。遺伝子発現値は、ｒｐｋｍｆｏｒｇｅｎｅｓ（Ｒａｍｓｋｏｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｌ．，５，ｅ１０００５９８，２００９）を用いて、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ６９およびＲｅｆＳｅｑ（２０１３年２月）中の各転写物について、ＲＰＫＭ値として算出した。
【００７１】
単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑの感度および変動性
単一ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における遺伝子検出の分析結果（図２Ａ、図５Ａ、および７Ａ）は、各実験設定からの技術的反復試験の全ての可能な対に関して算出したものである。２つの試料において遺伝子を発現レベルによって値域ごとにまとめ、両方の試料においてＲＰＫＭが０．１より高かった場合に検出されたと見なした。修正Ｗａｌｄ法を用いて、１つのグループ内の技術的反復試験の全ての可能な対についての平均値を標準偏差と共に使用した。変動の分析結果（図２Ｂおよび図５Ｂ＆７Ｂ）もまた試料の対に関して算出したものであり、遺伝子をｌｏｇ発現の平均値によって値域ごとにまとめ、いずれかの試料において０．１ＲＰＫＭ未満の遺伝子を排除した。単一細胞全体の遺伝子発現レベルは、多くの場合、対数正規分布している（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００５  １５（１０）：１３８８−１３９２）ため、ｌｏｇ１０発現値における絶対差および標準偏差を、値域中の平均差に０．８８６を乗じることにより算出した。
【００７２】
リードカバレッジおよびＧＣ許容度の分析
遺伝子本体カバレッジを、全てのタンパク質コード遺伝子の最も長い転写物について、ＲＳｅＱＣ−２．３．４パッケージ（Ｗａｎｇ，Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１２；２８（１６）：２１８４−５）を用いて算出した（図２Ｅおよび図８）。異なるＧＣ含量における遺伝子検出を、ＧＣ含量によって１０個の同サイズの値域に値域ごとにまとめられた全てのタンパク質コードＲｅｆＳｅｑ遺伝子について最も長い転写物を用いて算出し、および検出されなかった、または異なるＲＰＫＭカットオフにおいて検出された遺伝子の数を算出した（図２Ｄおよび図６）。
【００７３】
リードピーク分析
一部の遺伝子は、遺伝子本体内において高密度のリードを有する原因不明のピークを呈した。これらの領域を特定するために、各遺伝子の遺伝子本体を１０１個の同サイズの値域に分割し、各遺伝子は、その遺伝子内に平均リード分布に対して＞５標準偏差のリード密度を有する少なくとも１つの値域を有していた。これらの分析において、低発現遺伝子（細胞ごとの配列決定深度によるが、約２，０００〜１０，０００リードよりも少ないリードを有するもの）を含む遺伝子は除いた。各細胞中のそのような遺伝子の数を図９Ａに示す。そして、最高数のＨＥＫ２３９Ｔ細胞においてピークを有する遺伝子を、図９Ｂにヒートマップとして表示しており、これらは、それらのピークが全ての実験において一貫して同じ位置で見出されることを図示している。
【００７４】
実施例２
単一細胞からの全長トランスクリプトームプロファイリングを改善するために、逆転写、鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）およびＰＣＲ予備増幅の多くの変形（合計４５７個の実験）を評価し、その結果を、ｃＤＮＡライブラリーの収量および長さに関して市販のＳｍａｒｔ−Ｓｅｑ（以後ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）と呼ぶ）と比較した（表１）。重要なことには、１ｎｇの出発全ＲＮＡから得られるｃＤＮＡの収量および長さの両方を著しく増大させる改変が特定された（表１）。
【００７５】
特に、ＴＳＯの３’末端において単一のグアニレートのみをロックド核酸（ＬＮＡ）グアニレートと交換すること（ｒＧｒＧ＋Ｇ）は、市販のＳｍａｒｔ−Ｓｅｑにおいて使用されるＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＩＩＡオリゴと比較して、ｃＤＮＡ収量の２倍の増加に繋がった（ｐ＝０．００３、スチューデントｔ検定；図１ａ、表２および図３）。
【００７６】
加えて、より高いＭｇＣｌ２濃度と組み合わせたメチル基供与体ベタインが、収量に対して著しい良い効果を有することを発見した（２〜４倍の増加、全ての比較について、ｐ＝０．００１２、スチューデントｔ検定）（図１ｂ）。市販のＳｍａｒｔ−Ｓｅｑ緩衝液は６ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度を有するが、濃度を９ｍＭ以上に増加させた場合により高い収量が得られることが、本発明において見出された。最後に、予備増幅されたｃＤＮＡの平均長は、ＲＴマスターミックスにおいてではなくＲＮＡ変性の前にｄＮＴＰを投与した場合に３７０ｎｔを加えて増大した（ｐ＝７．８×１０−９、スチューデントｔ検定；図１ｃ）。
【００７７】
さらに、精製されたＲＮＡを用いて得られたこれらの改善が、個々のヒトおよびマウス細胞の溶解産物において直接行われるｃＤＮＡ反応にまで及ぶことを実証した。この目的のために、異なる細胞サイズおよび全ＲＮＡ含量にわたる総計２６２個の個々のヒトまたはマウス細胞（１５９個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞、３４個のＤＧ−７５細胞、３０個のＣ２Ｃ１２細胞および３９個のＭＥＦ細胞）から、単一細胞ｃＤＮＡライブラリーを生成した（表３）。単一細胞ｃＤＮＡライブラリーの分析は、ＬＮＡ含有ＴＳＯの使用（３倍の増加、ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定；図１ｄ）および高Ｍｇ２＋濃度と共にベタインを用いること（４倍の増加、ｐ＝３．７×１０−６、スチューデントｔ検定；図１ｅ）の両方に関してより高いｃＤＮＡ収量を実証した。
【００７８】
単一細胞方法の感度および精度は、各試料処理工程の効率によって制限される。ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）プロトコルは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼ（Ａｄｖ２）による予備増幅の前に、組み込まれていないアダプターを第１鎖ｃＤＮＡ反応物から除去するためにビーズ精製を用いる。しかしながら、小体積でビーズ精製を行うことは、液体取扱い自動化に、重大な回収問題をもたらす。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ（ＫＡＰＡ）ＤＮＡポリメラーゼが、事前のビーズ精製の必要なしに、逆転写のすぐ後に、第１鎖ｃＤＮＡを効率的に増幅することが、本発明において確認された。ビーズ精製なしに予備増幅されたライブラリーは、収量が減少しておらず、平均ｃＤＮＡ長が４５０ｎｔを加えて増大した（ｐ＝２．６×１０−１２、スチューデントｔ検定；図１ｆ）。このことは、ＫＡＰＡ予備増幅が、ｃＤＮＡ生成を改善し、Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ自動化のための実行可能なアプローチを提供することを実証している。
【００７９】
下流用途に対する改善されたｃＤＮＡ生成の重要性を実証するために、単一細胞トランスクリプトームプロファイリングに対するその影響を評価した。この目的のために、市販のＳＭＡＲＴｅｒに従って生成されたもの（ｎ＝４）および本プロトコルの変形を用いて生成されたものの両方の単一ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ライブラリーを配列決定した（Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２、ｎ＝３５）（表４）。
【００８０】
ＲＮＡからｃＤＮＡへの改善された変換は、より多くの元のＲＮＡ分子が配列決定のために利用できるため、遺伝子発現プロファイリングを改善するはずである。実際に、遺伝子発現を検出する能力の著しい増大（図２ａ）ならびに低存在度および中存在度の転写物についての技術的変動の減少の両方が観察された（図２ｂおよび図４）。最適化されたプロトコルの改善された感度は、各細胞において２，３７２個多い遺伝子の平均検出に繋がった（ｐ＜０．０５  スチューデントｔ検定；図２ｃ）。全てのこれらの改善を、代替的なＲＮＡ−Ｓｅｑアライメントおよび分析戦略を用いて別個に検証した（図５）。さらに、Ｑｕａｒｔｚ−Ｓｅｑについて入手可能なデータに比べて良好な感度および低い変動性の両方が、Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２を用いて生成された単一細胞トランスクリプトームデータにおいて得られた（図６）。配列決定されたライブラリーは、ＳＭＡＲＴｅｒライブラリーと同様のマッピング特性を有していたが、マッピングされないリードの７％の増加が認められた（図７）。
【００８１】
いくつかの予備増幅酵素は、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）と共に使用されるＡｄｖａｎｔａｇｅ２（Ａｄｖ２）よりも小さいＧＣバイアスを有しており、このことは、単一細胞プロファイリングが、ＫＡＰＡを用いるｃＤＮＡ予備増幅でも改善し得るであろうことを示している。実際に、ＫＡＰＡにより予備増幅された単一細胞ライブラリーは、より高いＧＣレベルにおいてより多くの遺伝子を検出し（図２ｄおよび図８）、感度および精度を改善した（図９）。ＫＡＰＡにより予備増幅された単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、５’末端および３’末端におけるリードの予想される割合に近づいた（図２ｅおよび図１０〜１１）ことからして、それらはｃＤＮＡの３’末端ポリＡテーリングによって生成された単一細胞データにおける５’領域の低いカバレッジと比較して著しくより良好なカバレッジを転写物の全長の全体にわたって有していた（５’末端および３’末端についてそれぞれｐ＜１０−５、１．６×１０−３、スチューデントｔ検定）。重要なことには、ＫＡＰＡおよびＡｄｖ２により予備増幅された細胞からの網羅的遺伝子発現プロファイルが第１主成分で分離した（図２ｆ）。このことは、予備増幅バイアスが絶対発現レベルに対して著しい影響を及ぼしたことを実証している。予備増幅酵素に関係なくＳｍａｒｔ−Ｓｅｑにおいて組織的に現れた、フィルタリングを要した不自然に多い数のアライメントされたリード（すなわち、ピーク）を有する領域を、配列決定した（図１２）。全体として、データは、ＫＡＰＡを用いた予備増幅が、ＧＣ許容度および転写物全体のリードカバレッジを改善したことを示している。
【００８２】
Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２を用いての単一細胞トランスクリプトームプロファイリングにおける技術的変動性の程度を確認するために、配列決定用ライブラリーを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１００、５０および１０細胞）および全ＲＮＡ（１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ）の希釈系列から生成した。技術的損失および変動は、１０細胞以上を分析した場合は小さかったが、先に観察されたように、単一細胞レベルではかなりの変動性が存在する。その技術的変動性を同じまたは異なる細胞種起源の細胞において存在する生物学的変動性と対比することは有益である（図１３Ａ〜Ｄ）。この目的のために、さらなる単一細胞トランスクリプトームを、ＤＧ−７５（ｎ＝７）、Ｃ２Ｃ１２（ｎ＝６）およびＭＥＦ（ｎ＝７）細胞から配列決定した。細胞個体群間および細胞個体群内の生物学的変動性を分析することにより、細胞種特異的発現と関係する生物学的変動性は約５０ＲＰＫＭで技術的変動性を上回ることが明らかになったが、正確な閾値は、調査される細胞種において存在するＲＮＡ含量に依存するであろう（図１３Ｅ）。
【００８３】
本発明は、感度、精度および転写物全体のカバレッジを改善しかつ自動化に対してより修正可能な新規プロトコルを提供する。さらに、この新規プロトコルは、現在の１反応当たりのコストの１２％未満を要し、社内生産したＴｎ５を用いた場合は僅か３％を要するにすぎない（図１４）。
【００８４】
これらの結果はＳｍａｒｔ−Ｓｅｑ単一細胞遺伝子発現解析に関連して到達されたものであるが、これらの改変は、鋳型切り替えに依拠する他の単一細胞方法（マイクロ流路チップ（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１）上でまたはエマルジョン液滴内で実施されるものを含む）に適用可能である。
【００８５】
上述の実施例および好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものとしてではなく、例示するものとして解釈されるべきである。容易に理解されるように、上に述べられた特徴の数多くの変形形態および組み合わせが、特許請求の範囲において述べられる本発明から逸脱することなく利用され得る。そのような変形形態は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱とは見なされず、全てのそのような変形形態が、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【００８６】
本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００８７】
【表１】
2018088924.tif 000002
【００８８】
【表２】
2018088924.tif 000003
【００８９】
【表３】
2018088924.tif 000004
【００９０】
【表４】
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【００９１】
【表５】
2018088924.tif 000006
【００９２】
【表６】
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【００９３】
【表７】
2018088924.tif 000008
【００９４】
【表８】
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【００９５】
【表９】
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【００９６】
【表１０】
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【００９７】
【表１１】
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【００９８】
【表１２】
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【００９９】
【表１３】
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【０１００】
【表１４】
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【０１０１】
【表１５】
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【０１０２】
【表１６】
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【０１０３】
【表１７】
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【０１０４】
【表１８】
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【０１０５】
【表１９】
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【０１０６】
【表２０】
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【０１０７】
【表２１】
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【０１０８】
【表２２】
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【０１０９】
【表２３】
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【０１１０】
【表２４】
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【０１１１】
【表２５】
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【０１１２】
【表２６】
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【０１１３】
【表２７】
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【０１１４】
【表２８】
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【０１１５】
【表２９】
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【０１１６】
【表３０】
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【０１１７】
【表３１】
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【０１１８】
【表３２】
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【０１１９】
【表３３】
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【０１２０】
【表３４】
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【０１２１】
【表３５】
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【０１２２】
【表３６】
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【０１２３】
【表３７】
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【０１２４】
【表３８】
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【０１２５】
【表３９】
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【０１２６】
【表４０】
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【０１２７】
【表４１】
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【０１２８】
【表４２】
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【０１２９】
【表４３】
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【０１３０】
【表４４】
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【０１３１】
【表４５】
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【０１３２】
【表４６】
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【０１３３】
【表４７】
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【０１３４】
【表４８】
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【０１３５】
【表４９】
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【０１３６】
【表５０】
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【０１３７】
【表５１】
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【０１３８】
【表５２】
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【０１３９】
【表５３】
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【０１４０】
【表５４】
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【０１４１】
【表５５】
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【０１４２】
【表５６】
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【０１４３】
【表５７】
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【０１４４】
【表５８】
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【０１４５】
【表５９】
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【０１４６】
【表６０】
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【０１４７】
【表６１】
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【０１４８】
【表６２】
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【０１４９】
【表６３】
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【０１５０】
【表６４】
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【０１５１】
【表６５】
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【０１５２】
【表６６】
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【０１５３】
【表６７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月26日(2018.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡを調製するための方法であって、
前記ＲＮＡ分子にｃＤＮＡ合成プライマーをアニールし、および第１ｃＤＮＡ鎖を合成して、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ中間体を形成する工程と、
前記ＲＮＡ分子に相補的な前記第１ＤＮＡ鎖の伸長に好適な条件下で前記ＲＮＡ−ｃＤＮＡ中間体を鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）と接触させることにより逆転写酵素反応を行い、前記第１ＤＮＡ鎖をさらに前記ＴＳＯに対して相補的にする工程であって、前記ＴＳＯの最も３’側のヌクレオチドのみが、ロックド核酸（ＬＮＡ）である、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記逆転写反応が、メチル基供与体および金属塩の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチル基供与体が、ベタインである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記金属塩が、マグネシウム塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記マグネシウム塩が、少なくとも７ｍＭの濃度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個または２個のリボヌクレオチド残基および前記ＬＮＡ残基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１個または２個のリボヌクレオチド残基が、リボグアニンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド５−メチルシトシンからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、前記３’末端に、式ｒＧｒＧ＋Ｎ（式中、＋Ｎは、ロックドヌクレオチド残基を表す）により特徴付けられる３個のヌクレオチド残基を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、ｒＧｒＧ＋Ｇを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記メチル基供与体がベタインであり、かつ前記金属塩が少なくとも９ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２である、請求項２〜５のいずれか一項、または請求項２〜５のいずれか一項を引用する請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記ＲＮＡ分子および前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドに相補的な前記ＤＮＡ鎖を増幅することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド：
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G（TSO名：rGrG+G）、および
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+N（TSO名：rGrG+N）
からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｃＤＮＡが、固定されたオリゴ−ｄＴプライマーを含むビーズ上で合成される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴ−ｄＴプライマーが、５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ３０ＶＮ−３’の配列を含み、ここで、「Ｎ」は任意のヌクレオシド塩基であり、かつ「Ｖ」は「Ａ」、「Ｃ」および「Ｇ」からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲ予備増幅、タグメンテーション、および最終ＰＣＲ増幅をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＣＲ予備増幅が、逆転写反応から得られた前記ｃＤＮＡを精製することなしに行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＮＡが、細胞中の全ＲＮＡである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
複数の単一細胞中の遺伝子発現を解析するための方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製する工程と、前記ｃＤＮＡライブラリーを配列決定する工程とを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法に従う二本鎖ｃＤＮＡの合成における、ＮＮ＋Ｎ、およびｒＮｒＮ＋Ｎからなる群から選択される３’末端に３個のヌクレオチド残基を含むＴＳＯの使用であって、Ｎは、各存在において独立して、デオキシリボヌクレオチド残基であり、ｒＮは、各存在において独立して、リボヌクレオチド残基であり、および＋Ｎは、各存在において独立して、ロックドヌクレオチド残基である、使用
【請求項２２】
前記ロックドヌクレオチド残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド５−メチルシトシンからなる群から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記３個のヌクレオチド残基が、ＮＮ＋ＧまたはｒＮｒＮ＋Ｇである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記３個のヌクレオチド残基が、ｒＧｒＧ＋ＮまたはＧＧ＋Ｎである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
前記３個のヌクレオチド残基が、ｒＧｒＧ＋ＧまたはＧＧ＋Ｇである、請求項２１に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
ＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡを調製するための方法であって、
前記ＲＮＡ分子にｃＤＮＡ合成プライマーをアニールし、および第１ｃＤＮＡ鎖を合成して、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ中間体を形成する工程と、
前記ＲＮＡ分子に相補的な前記第１ＤＮＡ鎖の伸長に好適な条件下で前記ＲＮＡ−ｃＤＮＡ中間体を鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）と接触させることにより逆転写酵素反応を行い、前記第１ＤＮＡ鎖をさらに前記ＴＳＯに対して相補的にする工程であって、前記ＴＳＯは、その３’末端にロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、工程と
を含む、方法。
［２］
前記逆転写反応が、メチル基供与体および金属塩の存在下で行われる、［１］に記載の方法。
［３］
前記メチル基供与体が、ベタインである、［２］に記載の方法。
［４］
前記金属塩が、マグネシウム塩である、［２］に記載の方法。
［５］
前記マグネシウム塩が、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、または少なくとも９ｍＭの濃度を有する、［４］に記載の方法。
［６］
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個または２個のリボヌクレオチド残基および前記ＬＮＡ残基を含む、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
前記少なくとも１個または２個のリボヌクレオチド残基が、リボグアニンである、［６］に記載の方法。
［８］
前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド５−メチルシトシンからなる群から選択される、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニンである、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
前記ロックド核酸残基が、最も３’側の位置にある、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、前記３’末端に、式ｒＧｒＧ＋Ｎ（式中、＋Ｎは、ロックドヌクレオチド残基を表す）により特徴付けられる３個のヌクレオチド残基を含む、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、ｒＧｒＧ＋Ｇを含む、［１１］に記載の方法。
［１３］
前記メチル基供与体がベタインであり、かつ前記金属塩が少なくとも９ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２である、［２］〜［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記ＲＮＡ分子および前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドに相補的な前記ＤＮＡ鎖を増幅することをさらに含む、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、表Ｓ２中のオリゴヌクレオチドから選択される、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
前記ｃＤＮＡが、固定されたオリゴ−ｄＴプライマーを含むビーズ上で合成される、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
前記オリゴ−ｄＴプライマーが、５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ３０ＶＮ−３’の配列を含み、ここで、「Ｎ」は任意のヌクレオシド塩基であり、かつ「Ｖ」は「Ａ」、「Ｃ」および「Ｇ」からなる群から選択される、［１６］に記載の方法。
［１８］
ＰＣＲ予備増幅、タグメンテーション、および最終ＰＣＲ増幅をさらに含む、［１３］〜［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
前記ＰＣＲ予備増幅が、逆転写反応から得られた前記ｃＤＮＡを精製することなしに行われる、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記ＲＮＡが、細胞中の全ＲＮＡである、［１］〜［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
［１］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法により作製されるｃＤＮＡライブラリー。
［２２］
単一細胞トランスクリプトームプロファイリングのための、［２１］に記載のｃＤＮＡライブラリーの使用。
［２３］
複数の単一細胞中の遺伝子発現を解析するための方法であって、［１］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製する工程と、前記ｃＤＮＡライブラリーを配列決定する工程とを含む、方法。
［２４］
鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）であって、その３’末端にロックドヌクレオチド残基を含む、鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）。
［２５］
前記３’末端に＋Ｎ＋Ｎ＋Ｎ、Ｎ＋Ｎ＋Ｎ、ＮＮ＋Ｎ、ｒＮ＋Ｎ＋Ｎ、およびｒＮｒＮ＋Ｎからなる群から選択される３個のヌクレオチド残基を含む［２４］に記載のＴＳＯであって、Ｎは、各存在において独立して、デオキシリボヌクレオチド残基であり、ｒＮは、各存在において独立して、リボヌクレオチド残基であり、および＋Ｎは、各存在において独立して、ロックドヌクレオチド残基である、ＴＳＯ。
［２６］
前記ロックドヌクレオチド残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド５−メチルシトシンからなる群から選択される、［２４］または［２５］に記載のＴＳＯ。
［２７］
前記３個のヌクレオチド残基が、ＮＮ＋ＧまたはｒＮｒＮ＋Ｇである、［２５］に記載のＴＳＯ。
［２８］
前記３個のヌクレオチド残基が、ｒＧｒＧ＋ＮまたはＧＧ＋Ｎである、［２５］に記載のＴＳＯ。
［２９］
前記３個のヌクレオチド残基が、ｒＧｒＧ＋ＧまたはＧＧ＋Ｇである、［２５］に記載のＴＳＯ。
［３０］
［１］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法に従う二本鎖ｃＤＮＡの合成における、［２４］〜［２９］のいずれか一項に記載のＴＳＯの使用。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図面および詳細な説明を参照することによってより良く理解されるであろう。