【事件の表示】
　特許第３２６９４０１号「免疫測定方法及びその測定試薬」の請求項１ないし６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３２６９４０１号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．　手続の経緯
　特許第３２６９４０１号の請求項１ないし６に係る発明の出願は、平成８年９月６日に出願され、平成１４年１月１８日にその発明について特許権の設定登録がなされた。
　その後、申立人アボット・ラボラトリーズにより特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１５年３月１１日に訂正請求がなされたものである。
　
II．　訂正の適否についての検討
　平成１５年３月１１日付け訂正請求書による訂正（以下、「本件訂正」という。）の適否について検討する。
１．　訂正事項
　本件訂正の訂正事項は、次のとおりである。
＜訂正事項ａ＞
　特許請求の範囲の請求項１の「サンドイッチ免疫測定法において、感作固相の抗体にそれぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上の抗体を使用し、標識抗体には感作固相の抗体と抗原性物質との結合によってその抗原決定基に影響を受け反応性が向上する抗体を使用する検体中の前記抗原決定基を有する抗原性物質の該測定法。」を、
「
抗原性ポリペプチドの
前記抗原性ポリペプチドが少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドであり、
ポリペプチド
１種
ポリペプチド
＜訂正事項ｂ＞
　特許請求の範囲の請求項２を削除し、「【請求項３】抗原性物質がカルシトニンである請求項２記載の測定方法。」を、
「【請求項
２
ポリペプチド
＜訂正事項ｃ＞
　特許請求の範囲の「【請求項４】それぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上のモノクローナル抗体と固相とが結合した感作固相と、前記抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応し、かつ感作固相の抗体と抗原性物質との結合によってその抗原決定基に影響を受け反応性が向上するモノクローナル抗体と標識物とが結合した標識抗体とからなる抗原決定基を有する抗原性物質のサンドイッチ免疫測定試薬。」を、
「【請求項
３
少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドのサンドイッチ免疫測定試薬であって、
ポリペプチド
１種
ポリペプチド
＜訂正事項ｄ＞
　特許請求の範囲の請求項５を削除し、「【請求項６】抗原性物質がカルシトニンである請求項５記載の測定試薬。」を、
「【請求項
４
ポリペプチド
＜訂正事項ｅ＞
　明細書の段落【０００１】、【０００５】、【０００６】および【００１０】における「抗原性物質」を、「抗原性
ポリペプチド
＜訂正事項ｆ＞
　明細書の段落【０００１】および【０００８】の「反応性が向上する抗体」を、「反応性が向上する
１種
＜訂正事項ｇ＞
　明細書の段落【０００１】および【０００５】の「反応性が向上するモノクローナル抗体」を、「反応性が向上する
１種
　
２．　訂正の目的
　上記訂正事項ａ〜訂正事項ｄにおける、「抗原性物質」をより下位概念である「抗原性ポリペプチド」、あるいは「少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチド」に限定する訂正は、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであるし、訂正事項ａならびに訂正事項ｃの標識抗体として使用する「反応性が向上する（モノクローナル）抗体」をより限定して「反応性が向上する１種の（モノクローナル）抗体」とする訂正、および訂正事項ｂならびに訂正事項ｄの請求項の削除も、特許請求の範囲の減縮を目的とするである。
　また、上記訂正事項ｅ〜訂正事項ｇは、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正事項ａ〜訂正事項ｄの訂正に伴い、発明の詳細な説明の記載を整合させるもので、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　
３．　新規事項の有無、拡張・変更について
　本件発明の測定対象物として「抗原性物質」の中でも「ポリペプチド」が好ましいことは、明細書の段落【００１０】（本件特許公報３頁５欄２２行〜２７行）に、「抗原性物質」が「少なくとも３つの抗原決定基」を有するものであることは、訂正前の請求項２、請求項５に明示されているし、「標識抗体」として使用する「反応性が向上する（モノクローナル）抗体」が「反応性が向上する１種の（モノクローナル）抗体」であることは、実施例に例示されている。
　そうすると、上記訂正事項ａ〜訂正事項ｇは、いずれも願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内である。
　また、上記訂正事項ａ〜訂正事項ｇは、実質上特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもない。
　
４．　訂正事項の検討結果
　以上訂正事項を検討したところによれば、本件訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する特許法第１２６条第２項から第４項までの規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
III．異議申立てについて
１．　本件発明
　請求項１ないし４に係る発明は、上記訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし４に記載された事項により特定されるつぎのとおりのものである。
「【請求項１】モノクローナル抗体と固相とが結合した感作固相と、前記抗体の抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応するモノクローナル抗体と標識物とが結合した標識抗体と、検体とを混合して免疫複合体を形成し、固相に結合した標識物又は未結合の標識物を測定する抗原性ポリペプチドのサンドイッチ免疫測定法において、前記抗原性ポリペプチドが少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドであり、感作固相の抗体にそれぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上の抗体を使用し、標識抗体には感作固相の抗体と抗原性ポリペプチドとの結合によってその抗原決定基に影響を受け反応性が向上する１種の抗体を使用する検体中の前記抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドの該測定法。
【請求項２】抗原性ポリペプチドがカルシトニンである請求項１記載の測定方法。
【請求項３】少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドのサンドイッチ免疫測定試薬であって、それぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上のモノクローナル抗体と固相とが結合した感作固相と、前記抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応し、かつ感作固相の抗体と抗原性ポリペプチドとの結合によってその抗原決定基に影響を受け反応性が向上する１種のモノクローナル抗体と標識物とが結合した標識抗体とからなる抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドのサンドイッチ免疫測定試薬。
【請求項４】抗原性ポリペプチドがカルシトニンである請求項３記載の測定試薬。」
　
２．　特許異議申立ての理由の概要
　申立人アボット・ラボラトリーズの申立ては、概要以下のようなものである。
（１）　申立理由１
　本件明細書の発明の詳細な説明には、次の点で、当業者が訂正前の請求項１ないし６に記載された発明の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されていない。
（イ）  抗原性物質
　多数の抗原性物質から本件特許発明の対象となり得る抗原性物質をどの様に選択すればよいのか記載されていない。
　本件特許では、本件特許発明が対象とする抗原性物質について、明細書段落【００１０】に特に制限はないとしており、特許請求の範囲においても一定の蛋白質等に制限されているものではないから、全ての抗原性物質、特に蛋白質がその対象とされているものと解される。
　本件特許発明で使用される固相抗体は、これらが認識し結合する抗原性物質の構造を変化させることのできる抗体であることになるが、これを抗原性物質から眺めるならば、本件特許発明における抗原性物質は、２種の異なるモノクローナル抗体との結合によってその構造が変化し得る物質でなければならないことになる。
　しかし、抗原性物質において特許権者の言うような変化が生じるか否かは、その抗原性物質それ自身の物性、あるいは蛋白質であればそのアミノ酸配列とこれに規定される本来の構造に依存することは言うまでもなく、全ての抗原性物質が例外なくかかる特性を有しているとは、技術常識からして到底理解することができない。
（ロ）  感作固相の抗体
　感作固相の抗体に使用する２種以上の抗体をどの様に選択すればよいのか記載されていない。
（ハ）  標識抗体
「感作固相の抗体と抗原性物質との結合によってその抗原決定基に影響を受け反応性が向上するモノクローナル抗体」の入手方法が記載されていない。
（ニ）  明細書の開示による支持
　本件特許請求の範囲において発明特定事項の一部として記載されている各種抗体の機能は、明細書に開示された具体的事実に支持されたものとは言いがたい。
　したがって、訂正前の請求項１〜請求項６の各発明に係る特許は、特許法第３６条４項の規定を満たしていない特許出願に対してされたものである。
　
（２）　申立理由２　
　訂正前の請求項１、請求項２、請求項４、請求項５の各発明は、下記刊行物１に記載された発明と同一である。
　したがって、訂正前の請求項１、請求項２、請求項４、請求項５の各発明の各発明に係る特許は、特許法第２９条第１項の規定に違反してされたものである。
　
（３）　申立理由３
　そして、訂正前の請求項１〜請求項６の各発明は、下記刊行物１〜下記刊行物２に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　したがって、訂正前の請求項１〜請求項６の各発明の各発明に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。
＜引用刊行物＞
　刊行物１：　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．３４５，ｐｐ．１４０６〜１４０７，１９９５（甲第１号証）
　刊行物２：　米国特許第５１７３３９９号明細書（甲第２号証）
　
３．　引用刊行物の記載事項
（１）　刊行物１
  「モノクローナルＨＢｓＡｇ　ＥＬＩＳＡによる検出を免れたエンベロープ蛋白質突然変異体によるＢ型肝炎の突発性再発」と題する論文である刊行物１には、「抗原分析は、固相上のそれぞれ、ＡｕｓｒｉａＩＩまたはＡｕｓｚｙｍｅ　キットのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて患者血清について行った。Ａｕｓｚｙｍｅビーズ上のモノクローナル抗体（複数）は、ＨＢｓＡｇのａ，ｄおよびｙ抗原決定基への反応性に基づいて選択される。このビーズは洗浄され、ポリクローナル抗体または単一の抗ＨＢｓ（表）モノクローナル検出抗体でインキュベートされる。このモノクローナル抗体はａ決定基に対して広範囲な反応性を示す。」と記載されている（１４０６頁右欄１２行〜１９行）。
　
（２）　刊行物２
　ＨＩＶ−Ｉ　ｐ２４に対するマウスモノクローナル抗体およびそれを用いた診断用試験に関する刊行物２には、下記の事項が記載されている。
 （２ａ）  相乗的（３欄１９行〜２１行）
「モノクローナル抗体３１−４２−１９と３１−９０−２５は相乗的にＨＩＶ−Ｉ　ｐ２４に結合する。」
（２ｂ）　モノクローナル抗体の混合物（同欄６３行〜６５行）
「モノクローナル抗体の混合物を固相にコートして捕獲抗体として使用することもできる。」
（２ｃ）　アッセイ（１４欄２３行〜４４行）
「２．別アッセイ
　モノクローナル抗体３１−４２−１９と３１−９０−２５を、ＨＩＶ−Ｉ ｐ２４の捕獲抗体として使用するために、ポリスチレンビーズに好適にコートすることができる。要すれば、モノクローナル抗体の混合物を適当な濃度でポリスチレンビーズにコートすることができる。他の結合部位は牛血清アルブミンでオーバーコートする。アッセイ手順において、ＨＩＶ−Ｉ　ｐ２４を含む抗原試料をコートされたビーズとインキュベートする。適当なインキュベーシヨンの後、ビーズを洗浄し、結合したＨＩＶ−Ｉ　ｐ２４を適当なプローブを用いて検出する。使用される特に好ましいプローブは、「Ｆ（ａｂ’）2フラグメントをプローブとして用いたＨＩＶ−Ｉ抗原のイムノアッセイ」と題され、本願と共にＳｔｅｗａｒｔらにより出願された米国特許出願に開示された、精製された抗ＨＩＶ−ＩウサギＩｇＧから調製されるＦ（ａｂ’）2フラグメントを含んでいた。モノクローナル抗体３１−４２−１９は溶液中でプローブとして使用された場合も、ビーズ上で捕獲抗体として使用された場合も同様に、モノクローナル抗体３１−９０−２５との組合せで相乗的な特徴を示した。」
　
４．　申立理由１について
　申立理由１の（イ）〜（ニ）は、「抗原性物質」として全ての抗原性物質、特に広範囲な物質を包含する蛋白質を測定対象にしていることを前提としているが、上記訂正により、請求項１ないし４に係る発明の「抗原性物質」は、「抗原性ポリペプチド」で「少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチド」に限定された。
　通常、ポリペプチドは、蛋白質と呼ばれるものよりも低分子量のものを指して使用され、本件明細書の段落【００１０】の例示からみても、蛋白質と呼ばれるものよりも低分子量のものであるから、本件発明の「抗原性ポリペプチド」は、蛋白質を含まないものと認められる。
　本件明細書には、比較例と実施例において、「抗原性ポリペプチド」であるカルシトニンと、カルシトニンのＮ末端を認識するモノクローナル抗体ＯＣＴ１、Ｃ末端を認識するモノクローナル抗体ＣＴ−０８の２種を固相抗体として使用し、およびカルシトニンの中央部分を認識するモノクローナル抗体ＣＴ−０２を標識抗体として使用することにより、サンドイッチアッセイにおいて、そのアッセイシグナルが、コントロールと比して２．７倍あるいは２８倍になる、という事実が開示されている（本件図面【図１】参照）。
　カルシトニン以外の「抗原性ポリペプチド」についても、本件明細書の段落【００１０】の例示から「抗原性ポリペプチド」を選択することができる。また、抗原性ポリペプチドの少なくとも３つの抗原決定基に対応する少なくとも３種のモノクローナル抗体を段落【０００７】に記載のように公知のモノクローナル抗体の製造方法に従い製造し、本件明細書の比較例と実施例に準じて、１種の固相抗体を用いたサンドイッチアッセイと２種の固相抗体を用いたサンドイッチアッセイとによりそれぞれ得られるシグナルを比較して、当業者が容易に「感作固相の抗体」を選択することができ、「標識抗体」を入手することができるものと認められる。
　そして、本件特許請求の範囲において発明特定事項の一部として記載されている各種抗体の機能は、明細書の実施例に支持されたものということができる。
  したがって、本件請求項１ないし４に係る発明の「抗原性物質」が「抗原性ポリペプチド」で「少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチド」に限定された結果、本件明細書の記載は申立理由１の（イ）〜（ニ）に該当しないものとなったので、申立理由１は、理由がない。
　
５．　申立理由２、３について
（１）　本件発明１と刊行物１記載発明との対比
　請求項１に係る発明（以下、「本件発明１」という。）と刊行物１に記載されたＡｕｓｚｙｍｅキットでＨＢｓＡｇをＥＬＩＳＡで免疫測定する方法とを対比する。
  刊行物１の「ＨＢｓＡｇ」及び本件発明１の抗原性ポリペプチドは、共に測定対象の「抗原性物質」であるが、刊行物１の「ＨＢｓＡｇ」は蛋白質であり、前述のように、本件発明１の「抗原性ポリペプチド」は、蛋白質ではない。
  刊行物１に記載のＨＢｓＡｇをＥＬＩＳＡで免疫測定するＡｕｓｚｙｍｅキットのビーズ上のモノクローナル抗体は、「Ａｕｓｚｙｍｅビーズ上のモノクローナル抗体（複数）は、ＨＢｓＡｇのａ，ｄおよびｙ抗原決定基への反応性に基づいて選択される。」と記載されているから、「Ａｕｓｚｙｍｅビーズ」は、「モノクローナル抗体と固相とが結合した感作固相」に相当し、そして、感作固相の抗体に「それぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上の抗体」を使用したものに相当する。
　一方、「単一の抗ＨＢｓ（表）モノクローナル検出抗体」は、「１種の抗体」に相当するが、ａ抗原決定基に反応するものであり、「感作固相の抗体の抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応するモノクローナル抗体」ということはできない。すなわち、ＨＢｓＡｇのｄおよびｙの抗原決定基は対立遺伝子に支配されるものであり（必要ならば、例えば小俣政男編「臨床医のための実験医学シリーズ１７　肝炎ウイルスと肝癌」（株）羊土社　１９９４年４月１５日初版発行、第３０頁参照）、Ａｕｓｚｙｍｅビーズ上のモノクローナル抗体が複数であるとしても、ｄおよびｙ抗原決定基を同時に有するＨＢｓＡｇが存在しない以上、同一ＨＢｓＡｇのそれぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上の抗体を使用するためには、ａ抗原決定基に反応するものを含むことになる。そうすると、感作固相の抗体の抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応するモノクローナル抗体が標識抗体として使用されているとはいえない。また、刊行物１には、「標識抗体」の反応性について、「感作固相の抗体と抗原性ポリペプチドとの結合によってその抗原決定基に影響を受け」ることについて記載されていない。
　
（２）　一致点、相違点
　そうすると、本件発明１と刊行物１記載の発明とは、
（一致点）
「モノクローナル抗体と固相とが結合した感作固相と、モノクローナル抗体と標識物とが結合した標識抗体と、検体とを混合して免疫複合体を形成し、固相に結合した標識物又は未結合の標識物を測定するのサンドイッチ免疫測定法において、前記抗原性物質が少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性物質であり、感作固相の抗体にそれぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上の抗体を使用し、標識抗体には１種の抗体を使用する検体中の前記抗原決定基を有する抗原性物質の該測定法。」
である点で一致するが、次の点で相違する。
（相違点１）  
　測定対象の抗原性物質が、本件発明１では、少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドであるのに対し、刊行物１記載の発明では、ＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）である点。
（相違点２）    
　標識抗体が、本件発明１では、感作固相の抗体の抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応するモノクローナル抗体であって、標識抗体には感作固相の抗体と抗原性ポリペプチドとの結合によってその抗原決定基に影響を受け反応性が向上する１種の抗体を使用するのに対し、刊行物１では、標識抗体のモノクローナル抗体が感作固相の抗体の抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応するものではないし、標識抗体に感作固相の抗体と抗原性ポリペプチドとの結合によってその抗原決定基に影響を受け反応性が向上するものを使用することは記載されていない点。
　
（３）　上記相違点についての検討
　本件発明１と刊行物１に記載された発明とは、上記相違点が存在する以上、同一のものとはいえない。
　そして、刊行物２には、２種類の感作固相の抗体にそれぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上のモノクローナル抗体を使用することは記載されているが、標識抗体にモノクローナル抗体を使用することがそもそも記載されていないし、さらに標識抗体に感作固相の抗体と抗原性ポリペプチドとの結合によってその抗原決定基に影響を受け反応性が向上するものを使用することを示唆する記載もない。
　本件発明１は、少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドを測定対象とする免疫測定法において、感作固相の抗体に、抗原性ポリペプチドのそれぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上の抗体を使用することにより、この感作固相の２種以上の抗体と抗原性ポリペプチドとの結合によって、抗原性ポリペプチドの抗原決定基と標識モノクローナル抗体との反応性が向上するという、顕著な効果を奏するものである。
　そうすると、本件発明１は、刊行物１〜刊行物２に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明できたものということはできない。さらに、当審の通知した取消理由において上記刊行物１，２に加えて刊行物３として引用した、ヒトカルシトニンのＮ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体と、該抗体を１種のモノクローナル抗体からなる感作固相抗体と該抗体と異なる抗原決定基に結合する１種のモノクローナル抗体からなる標識抗体を使用するサンドイッチ免疫測定法において使用し、ヒトカルシトニンを特異的に検出する方法が記載されている特開平５−１０３６８９号公報を勘案しても、本件発明１は、刊行物１〜刊行物３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明できたものということはできない。
　
（４）　請求項３に係る発明について
　刊行物１には、上記のように感作固相と標識抗体とからなるＨＢｓＡｇのサンドイッチ免疫測定試薬が記載されている。
　請求項３に係る発明と刊行物１に記載されたサンドイッチ免疫測定試薬発明との相違点は、測定法発明についての前記（２）の相違点とほぼ同様である。
　したがって、請求項３に係る発明は、刊行物１に記載された発明と同一ということはできないし、刊行物１〜刊行物２に記載された発明に基づいて、あるいは刊行物１〜刊行物３に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明できたものということもできない。
　
（５）　本件請求項２および請求項４に係る発明について
　請求項２および請求項４に係る発明は、それぞれ、「抗原性ポリペプチドがカルシトニンである」と特定された請求項１および請求項３記載の発明であるから、請求項２および請求項４に係る発明も、本件発明１と同様に、刊行物１〜刊行物２に記載された発明に基づいて、あるいは刊行物１〜刊行物３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明できたものということはできない。
　
６．　むすび
　以上のとおりであるから、請求項１ないし４に係る発明の特許は、特許異議申立ての理由および証拠によっては取り消すことができない。
　また、他に請求項１ないし４に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年７月１日（２００３．７．１）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
免疫測定方法及びその測定試薬
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】モノクローナル抗体と固相とが結合した感作固相と、前記抗体の抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応するモノクローナル抗体と標識物とが結合した標識抗体と、検体とを混合して免疫複合体を形成し、固相に結合した標識物又は未結合の標識物を測定する
抗原性ポリペプチドの
前記抗原性ポリペプチドが少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドであり、
ポリペプチド
１種の
ポリペプチド
　【請求項
２
ポリペプチド
１
　【請求項
３
少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドのサンドイッチ免疫測定試薬であって、
ポリペプチド
１種の
ポリペプチド
　【請求項
４
ポリペプチド
３
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、抗原性
ポリペプチド
抗原性ポリペプチドの
前記抗原性ポリペプチドが少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドであり、
ポリペプチド
１種の
ポリペプチド
少なくとも３つの抗原決定基を有する抗原性ポリペプチドのサンドイッチ免疫測定試薬であって、
ポリペプチド
１種の
ポリペプチド
　【０００２】
　【従来の技術】
　免疫反応を用いた抗原の測定法として、抗原に対する１種又は２種の固相化されたモノクローナル抗体（ａ）及び該抗原に対して前記抗体（ａ）とは異なる標識モノクローナル抗体（ｂ）とを反応させ、標識物を測定する方法が知られている（特開平６−２５８３２５号参照）。この測定法は、固相に結合したモノクローナル抗体と標識モノクローナル抗体とにより測定対象物の抗原をサンドイッチ法で測定する方法であり、広く免疫測定に用いられている。しかしながら、１種の固相化されたモノクローナル抗体を用いて検体中のプロラクチンをサンドイッチ法で測定する方法の記載はあるものの、２種の固相化されたモノクローナル抗体を用いるサインドイッチ法については具体的記載がなく、いかなる抗体を用いて測定を行うか全く示されていない。
　【０００３】
　一方、種々の疾病の原因となる抗原、罹患時に誘導される抗原、抗体等が同定され、これらの物質を特異的に免疫測定するために前記サンドイッチ法が用いられている。
　【０００４】
　【発明が解決しようとする課題】
　近年、癌疾患、感染症等の早期診断、治療のモニター等を実施するために検体中の低濃度の抗原、抗体等の測定対象物を測定する方法が求められている。しかしながら従来のサンドイッチ法の測定では、できるかぎり測定対象物と特異的に結合し、親和力の高い抗体を選択して使用することが試みられたが、低濃度の測定対象物の測定では満足できるものではなかった。
　【０００５】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者らは鋭意研究した結果、それぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上のモノクローナル抗体と固相とが結合した感作固相と、前記抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応し、かつ感作固相の抗体と抗原性
ポリペプチド
１種の
ポリペプチド
　【０００６】
　本発明の感作固相は、測定対象物の抗原性物質に存在する異なる抗原決定基と反応する２種以上の抗体と免疫測定用の固相とを結合させて製造する。この抗体は、２種以上の抗体を使用することができるが、通常２種類の抗体を用いることが経済的にも、効率よく製造するためにも好ましい。この２種類の抗体は、モノクローナル抗体であって、測定対象物の抗原性物質のそれぞれ異なった抗原決定基と反応する。ポリペプチド等の抗原性物質の場合には、例えばこの抗体がポリペプチドのＣ末端部と反応する抗体とポリペプチドのＮ末端部と反応する抗体の組み合わせ等から選択することができる。固相に結合される抗体は、抗原性
ポリペプチド
　【０００７】
　本発明の固相試薬を製造するには、前記した２種以上の抗体と固相とを公知の共有結合又は非共有結合を作る方法を利用して固相に結合させて行うことができる。これらの抗体は、前記モノクローナル抗体の他、これらの抗体を還元及び／又は酵素処理して製造したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗体フラグメントであってもよい。また固相としては免疫測定用の各種固相を挙げることができ、例えばプラスチック製の試験管内壁、マイクロタイタープレート、ガラスビーズ、ポリスチレン等から製造されたプラスチックビーズ、セルロース、ニトロセルロース等のメンブレン、フェライト粒子（例えば特開平３−１１５８６２号参照）等を挙げることができる。またさらに前記抗体と固相とを結合する方法としては、例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、公知の各種架橋剤を用いる方法等を挙げることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８５）参照）。共有結合による方法では、抗体に存在する官能基を利用できるほか、抗体に例えばチオール基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の基を導入した後、前記共有結合法に従い反応を行うことができる。また同様に固相に官能基を導入するための処理を行ったのち反応に用いることもできる。非共有結合による方法としては前記した少なくとも２種の抗体と固相とを混合して行う物理吸着法等を挙げることができる。
　【０００８】
　一方標識抗体は、感作固相に結合された抗体とは異なる抗原決定基と反応する抗体と標識物とを結合させて製造することができる。この抗体は固相に結合した２種以上の抗原性物質に対する前記抗体との反応部位とは異なる部位を認識する抗体である。更にこの抗体としては、感作固相の抗体と抗原性物質とが反応し結合することにより標識抗体が結合する抗原決定基に影響を与え、反応性が向上する
１種の
　【０００９】
　標識抗体の標識物としては、周知の標識免疫測定に用いられる標識物であり例えば酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、着色粒子、金属コロイド粒子等を挙げることができる。この標識抗体は前記感作固相の製造法に従い、共有結合又は非共有結合を作る方法を利用して製造することができる。
　【００１０】
　本発明の測定対象物としては、特に制限はなく各種の抗原性
ポリペプチド
　【００１１】
　本発明の抗原性物質の免疫測定方法は、前記感作固相及び標識抗体を用いて周知の１ステップ法、ディレイ１ステップ法、２ステップ法等のサンドイッチ法を組み合わせて行い、免疫反応により固相上に形成される免疫複合体の標識物を測定すること又は未結合の溶液中の標識物を測定することにより実施することができる。例えば２ステップ法では固相試薬とポリペプチドを含む検体とを緩衝液中でインキュベーション（例えば５〜５０℃、５分〜１日）した後、固相を洗浄する。次に標識抗体を含む緩衝液中に固相を移し、さらにインキュベーション（例えば５〜５０℃、５分〜１日）した後、固相を再び洗浄する。このようにして固相上に形成された免疫複合体から標識物の測定を行う方法である。
　【００１２】
　標識物の測定には、放射性同位元素を放射線測定装置で測定する他、発光、蛍光、発色等を目視又は比色計、蛍光光度計、フォトンカウンター、感光フィルム等の測定機器により測定を行うこともできる。さらに標識物がパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素の場合にはその酵素活性を発光基質、蛍光基質、発色基質等を加えて反応を行い前記測定機器により測定を行うことができる（例えば石川栄治著「酵素免疫測定法」医学書院発行参照）。本発明の免疫測定法に用いられる検体としては、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液を挙げることができる。
　【００１３】
　【実施例】
　以下、本発明を実施例及び比較例によりさらに詳細に説明する。
　【００１４】
実施例１　２種の抗カルシトニン抗体結合フェライト粒子
　ヒトカルシトニンのＮ末端と反応する抗ヒトカルシトニン抗体ＯＣＴ１及びヒトカルシトニンのＣ末端と反応する抗ヒトカルシトニン抗体ＣＴ−０８（株式会社関西新技術研究所）を固相結合用の抗体として用いた。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）５ｍｌに特開平３−１１５８６２号実施例４に記載の方法に従い製造した５％カルボキシル化フェライト粒子５０ｍｇを分散させ、これに水溶性カルボジイミド５０ｍｇを加えた。室温で２０分間反応させた後、上清を除去し、抗ヒトカルシトニン抗体ＯＣＴ１（１ｍｇ／ｍｌ，２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ３．０）２．５ｍｌと抗ヒトカルシトニン抗体ＣＴ−０８（１ｍｇ／ｍｌ，２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ３．０）２．５ｍｌの混合溶液を加え、エンドオーバーエンドミキサーで攪拌した。２時間後、この粒子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．５）で５回洗浄し、これを同じＢＳＡ溶液に分散させ２種抗カルシトニン抗体（ＯＣＴ１／ＣＴ−０８）結合フェライト粒子（以下ＯＣＴ１／ＣＴ−０８結合粒子という）を得た。
　【００１５】
比較例１　モノメリック抗カルシトニン抗体結合フェライト粒子
　２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）５ｍｌに前記特開平３−１１５８５２号実施例４に記載の方法に従い製造した５％カルボキシル化フェライト粒子５０ｍｇを分散させ、これに水溶性カルボジイミド５０ｍｇを加えた。室温で２０分間反応させた後、上清を除去し、前記抗カルシトニン抗体ＯＣＴ１（１ｍｇ／ｍｌ，２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ３．０）５ｍｌを加え、エンドオーバーエンドミキサーで攪拌した。２時間後、この粒子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．５）で５回洗浄し、これを同じＢＳＡ溶液に分散させモノメリック抗カルシトニン抗体（ＯＣＴ１）結合フェライト粒子（以下ＯＣＴ１結合粒子という）を得た。
　【００１６】
　また、抗カルシトニン抗体ＣＴ−０８を用いて同じ方法によってモノメリック抗カルシトニン抗体（ＣＴ−０８）結合フェライト粒子（以下ＣＴ−０８結合粒子という）を得た。
　【００１７】
実施例２　ＯＣＴ１／ＣＴ−０８結合粒子、ＯＣＴ１結合粒子又はＣＴ−０８結合粒子を用いたヒトカルシトニンの測定
　実施例１で製造したＯＣＴ１／ＣＴ−０８結合粒子及び比較例１で製造したＯＣＴ１結合粒子又はＣＴ−０８結合粒子２５０μｌにヒトカルシトニン５００ｐｇ／ｍｌを含むサンプル５０μｌを混合し、カートリッジ中３７℃で１０分間反応させた。このカートリッジに磁石に接して粒子を集磁させ、上清を廃液し洗浄を行った。
　【００１８】
　ヒトカルシトニンのＮ末端とＣ末端の中間部と反応する特開平５−１０３６８９号に記載の抗ヒトカルシトニン抗体（ＣＴ−０２，Ｆａｂ’）とアルカリ性ホスファターゼとをマレイミド・ヒンジ法（酵素標識法１８頁（石川栄治著；学会出版センター））に従い反応させてアルカリ性ホスファターゼ標識抗カルシトニン抗体（以下酵素標識抗体という）を得た。この酵素標識抗体２５０μｌ（０．５μｇ／ｍｌ，０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．５）を混合し、３７℃で１０分間反応させた。このカートリッジを前記方法で洗浄した。この粒子を含むカートリッジに発光基質である３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスフォリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ、２００μｇ／ｍｌを含む基質液（０．１Ｍ　ＤＥＡ−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，ｐＨ１０．０））を２００μｌ加え３７℃、５分間反応させ、フォトンカウンターで測定した。この測定は、全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルス１２００；富士レビオ社製）で行った。その各粒子の測定結果として、図１にシグナル値、図２にブランク値及び図３にシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）を示す。
　【００１９】
　図１〜３の結果から、ＯＣＴ１／ＣＴ−０８結合粒子はＯＣＴ１結合粒子の３０．６倍のシグナル値、ＣＴ−０８結合粒子の２．５倍のシグナル値であった。ブランク値はほぼ同程度であり、Ｓ／ＮではＯＣＴ１結合粒子の２８倍、ＣＴ−０８結合粒子の２．７倍であった。図３よりＯＣＴ１／ＣＴ−０８結合粒子では２Ｓ／Ｎ＝２．４ｐｇ／ｍｌであった。
　【００２０】
　【発明の効果】
　本発明の免疫測定方法では、従来の測定法に比べ検体に含まれる低濃度（２ｐｇ／ｍｌ程度）の抗原性物質を測定することができる。その結果、本測定法は各種癌疾患、感染症等の早期診断、治療のモニター等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】ＯＣＴ１／ＣＴ−０８結合粒子、ＯＣＴ１結合粒子又はＣＴ−０８結合粒子を用いてヒトカルシトニンを測定した結果のシグナル値を示す図である。
　【図２】ＯＣＴ１／ＣＴ−０８結合粒子、ＯＣＴ１結合粒子又はＣＴ−０８結合粒子を用いて測定した結果のブランク値を示す図である。
　【図３】ＯＣＴ１／ＣＴ−０８結合粒子、ＯＣＴ１結合粒子又はＣＴ−０８結合粒子を用いてヒトカルシトニンを測定した結果のＳ／Ｎ値を示す図である。