【事件の表示】
　特許第３１４１０８４号「単子葉植物の超迅速形質転換法」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１４１０８４号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３１４１０８４号についての出願は、平成１１年７月２１日に特願平１１−２０６９２２号として特許出願され、平成１２年１２月２２日にその特許の設定登録がなされ、その後、日本たばこ産業株式会社より特許異議の申立てがなされたところ、当審において取消理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１４年３月２５日に意見書が提出された。さらに平成１５年１０月２３日付けで当審において特許権者に対し審尋をおこなったところ、平成１６年１月６日付けで特許権者より回答書が提出され、また、同年１月３０日付けでさらに当審から取消理由を通知し、同年３月２４日付けで意見書と訂正請求書が提出された。
　
II．訂正の請求について
１．訂正事項
　特許請求の範囲の請求項１乃至２
「【請求項１】単子葉植物の形質転換方法であって、所望の組換え遺伝子を含むアグロバクテリウムで、無傷の種子を感染する工程を包含し、ここで、該種子は発芽種子である、方法。
【請求項２】前記種子が、播種後４〜５日目の種子である、請求項１に記載の方法。」を、
「【請求項１】単子葉植物の形質転換方法であって、所望の組換え遺伝子を含むアグロバクテリウムで、無傷の種子を感染する工程を包含し、ここで、該種子は２，４−Ｄを含む培地に播種後４〜５日間前培養して発芽させた発芽種子である、方法。
【請求項２】前記種子が、播種後５日目の種子である、請求項１に記載の方法。」
と訂正する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
（１）特許請求の範囲の請求項１について
　「発芽種子」を「２，４−Ｄを含む培地に播種後４〜５日間前培養して発芽させた発芽種子」とする訂正は、発芽種子を減縮するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　また、願書に添付された明細書の【００１４】段落、【００２８】段落には、それぞれ「アグロバクテリウムでの感染に供される種子は、播種後４〜５日目の種子であり得る。」、「オーキシン（例えば、２，４−Ｄ）を含む培地（例えば、N6D培地）に播種されて、代表的には４日〜５日間、好ましくは５日間、保温され得る」という記載がある。
　したがって、この訂正は、願書に最初に添付した明細書に記載した事項の範囲内においてするものであり、特許請求の範囲を拡張するものでも変更するものでもない。
　
（２）特許請求の範囲の請求項２について
　「播種後４〜５日目の種子」を「播種後５日目の種子」とする訂正は、種子を減縮するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　また、願書に最初に添付された明細書の【００２８】段落、【００３７】段落には、それぞれ「好ましくは５日間」、「（前培養）種子を、２，４−Ｄを含むN6D培地…に播種し、５日間、２７℃〜３２℃で保温した」という記載がある。
　したがって、この訂正は、願書に最初に添付した明細書に記載した事項の範囲内においてするものであり、特許請求の範囲を拡張するものでも変更するものでもない。。
　
　よって、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び第３項で準用する特許法第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立について
１．本件発明
　本件発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１〜４に記載された事項により特定されたとおりのものであり、それらの発明は下記のとおりである（以下、それぞれ「本件発明１〜本件発明４」ともいう。）。
「【請求項１】単子葉植物の形質転換方法であって、所望の組換え遺伝子を含むアグロバクテリウムで、無傷の種子を感染する工程を包含し、ここで、該種子は２，４−Ｄを含む培地に播種後４〜５日間前培養して発芽させた発芽種子である、方法。
【請求項２】前記種子が、播種後５日目の種子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記単子葉植物が、イネ科植物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】前記イネ科植物が、イネである、請求項３に記載の方法。」
　
２．特許異議申立理由の概要
　一方、特許異議申立人　日本たばこ産業株式会社は、甲第１号証〜甲第７号証ならびに甲第９号証〜甲第１５号証を提出し、
＜特許法第２９条第２項について＞
（理由１）訂正前の本件請求項１乃至４に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づいて、または、甲第１号証、及び、甲第２号証もしくは甲第３号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであること、
　
＜特許法第３６条について＞
（理由２）甲第１１号証の記載に鑑みると、訂正前の請求項１乃至４は実施不可能な発明を含んでおり、又は発明の詳細な説明に記載した発明でないものを含んでいるから、本件特許は特許法第３６条第４項及び／又は第６項第１号に規定する要件を満たしていないこと、
（理由３）甲第１１号証〜甲第１５号証の記載に鑑みると、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、訂正前の請求項１乃至４に記載の発明の実施に関し、矛盾した記載を含んでおり、当業者が実施できる程度に記載されていないから、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていないこと、
（理由４）訂正前の請求項１乃至４に関して、甲第１１号証の記載に鑑みると、本件明細書の発明の詳細な説明にはアグロバクテリウム感染させる際の具体的な条件等が記載されておらず、また、その条件が出願時の技術常識に基づいても当業者が理解することができないから、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていないこと、
を主張している。
　
甲第１号証：The Plant Journal(1994)Vol.6, No.2, p.271-282
甲第２号証：特開昭６３−８７９２１号公報
甲第３号証：特開平１０−５２１８６号公報
甲第４号証：Bio/Technology, Vol.8(1990)P.33-38
甲第５号証：Plant Molecular Biology, Vol.22(1993)P.491-506
甲第６号証：Planta(1996)Vol.199, P.612-617
甲第７号証：Plant Science, Vol.130(1997)P.87-95
甲第９号証：Rice Genetics III, Proceedings of the Third International Rice Genetics Symposium(1996)( Symposium Manila, Philippines (Oct. 16-20, 1995))P.697-702
甲第１０号証：Plant Molecular Biology Reporter, Vol.15, No.1(1997)P.16-21
甲第１１号証：平成１３年９月３日付け樋江井祐弘氏宣誓書、実験成績書
甲第１２号証：星川清親　著「解説図解　イネの生長」（昭和５８年９８月１０日第１４版発行）Ｐ．２６〜２７、３２〜３３、３６〜３９、４２〜４３　
甲第１３号証：日本作物学会記事、Vol.46、No.2（1977）P.275-285
甲第１４号証：異議申立人抽出の「脱分化」に関する下記文献リストおよびそれらの文献
１．「岩波生物学辞典　第４版」(1996)岩波書店　P.870左欄第14〜29行
２．Plant Anatomy. Second Edition(1995)p.69, 35-36
３．日本組織培養学会・日本植物組織培養学会編(1993)「組織培養辞典」学会出版センター　P.196左欄第31行〜右欄第26行、P.283右欄第25〜41行
４．駒嶺穆ら編(1990)「植物バイオテクノロジー事典」朝倉書店　P.179左欄第30行〜右欄第33行、P.263左欄第13〜23行
５．駒嶺穆(1993)「植物組織培養の生物学−植物バイオテクノロジーの基礎−」　P.4第13行〜P.5第3行
５．原膿(1984)「植物の形態（増訂版）」　P.38第20〜23行、P.108第8〜14行
甲第１５号証：異議申立人抽出の「２，、４−Ｄ等のオーキシン含有培地で５日間前培養したイネ種子と脱分化に関する下記文献リストおよびそれらの文献
１．Plant Mol. Biol., Vol.26(1994)P.899-907 
２．Japan Jour. Crop Sci.(1982)Vol.51, No.4,P.553-560
３．American Journal of Botany, Vol.83, No.1(1996)P.28-44
４．Plant Science, Vol.66(1990)P.51-57
５．Planta(1991)Vol.185, P.304-310
６．Journal Experimental Botany, Vol.46, No.289(1995)P.965-972
７．長田敏行　外１編「植物の遺伝子発現　第１版」（1995年）（講談社サイエンティフック）P.69〜81
　　
３．特許異議申立についての判断
（１）理由１について
　甲第１号証には、種々の植物組織を用いる、アグロバクテリウム法による単子葉植物イネの形質転換方法が記載されており、第271頁右欄下から第４行〜第272頁左欄最下行、Table1及び第278頁左欄第１５行〜右欄第１１行には、「イネの種々の組織、すなわち実生からの茎頂及び根部分、胚盤（種子を５日間培養し（第279頁右欄下から5〜4行）、得られた発芽種子から胚乳と幼芽とを除去したもの）、未熟胚、実生の根から誘導されたカルス、胚盤から誘導されたカルス、胚盤から誘導された懸濁培養細胞が、A. tumefaciensにEHA101(plG121Hm)が組み込まれた物（このEHA101はGUS発現とハイグロマイシン耐性に寄与）と共に培養されて、これらの組織すべてにおいて、培養直後にGUS発現が見られた（茎頂５０〜９０％、胚盤９％、未熟胚３３％、根カルス２１％、胚盤カルス９３％、懸濁細胞２５％）」旨、しかし「ハイグロマイシン入り培養液で３週間培養する耐性選抜においては、胚盤カルス（２３％）、懸濁培養細胞（９％）、未熟胚（６％）においてしか耐性イネ細胞（組織）を得ることができなかった」旨が記載されている。そして、この結果に基づき、胚盤誘導カルスが、アグロバクテリウム法によるイネ形質転換体取得に最適の材料であることが示されており、これらの供試材料については、傷をつけたり、細胞壁を酵素溶解する、といった操作も不要であることが記載されている。
　さらに、第274頁Table3には、この方法でジャポニカイネの複数の品種のイネ胚盤から誘導されたカルスを形質転換すると、その形質転換効率は、品種「月の光」では13.4〜28.8%、品種「朝の光」では12.8〜19.5%、そして品種「コシヒカリ」では17.6〜18.8%であったことが記載されている。
　甲第２号証には、アグロバクテリウム法による単子葉植物であるホモノ科植物の効率的な形質転換方法において、発芽種子を用いることが記載されており、甲第３号証には、アグロバクテリウム法による単子葉植物であるホモノ科植物及びイネの形質転換方法において、発芽種子を用いることが記載されている。
　
　これに対し、異議申立人は、訂正前の請求項１に係る発明と甲第１号証に記載の発明とは、前者が無傷の発芽種子を用いているのに対し、後者は発芽種子から得られた無傷の胚盤を用いている点で相違するが、本件出願時には、単子葉植物がアグロバクテリウムにより形質転換可能であることは甲第１号証乃至甲第７号証、ならびに、甲第９号証乃至甲第１０号証に示されるとおり周知であり、かつ、その際の労力を軽減し、より迅速で、より効率のよい形質転換方法を見出すことも自明の課題であるから、甲第１号証においてアグロバクテリウムの感染対象として用いられている無傷胚盤の代わりに、甲第２号証、甲第３号証等にも記載されている「発芽種子」を無傷の状態で用いることは当業者が通常試みることである、旨主張する。また、異議申立人は、本件出願時に、アグロバクテリウムによる形質転換に際して、遺伝子導入組織として無傷又は傷を付けた胚盤が慣用されており、さらに、甲第１１号証の実験２の結果を示し、発芽種子を用いて形質転換をさせても遺伝子の導入される組織は結局胚盤細胞であるから、本件発明と甲第１号証に記載の発明とは遺伝子導入対象が胚盤細胞である点で異なることはなく、ゆえに、甲第１号証に記載された発明において、無傷胚盤の代わりに「胚盤」を有する「無傷の発芽種子」を用いることは当業者が通常試みることである旨も、主張する。そして、異議申立人は、本件訂正前の請求項に係る発明における形質転換効率や迅速性も従来の方法によるものと変わらないか、むしろ劣っており、格別な効果を奏するものとは認められないとも主張している。
　すなわち、異議申立人は、甲第１号証における供試材料「無傷の胚盤」を用いて形質転換した場合を成功例として、その前提にたった上で甲第１号証に記載された発明を認定し、上記のような主張をしているものと解される。
　しかしながら、「細胞の形質転換に成功した」と評価するには、組み込んだベクターが安定に細胞内の染色体に組み込まれて発現し、その増殖細胞にも組み込まれて同様に発現し、細胞系全体としてベクターの発現物に基づいて奏される性質を長期にわたって保持し、継代されても受け継がれていくことが最低限必要である。また、「植物の形質転換に成功した」と評価するには、さらに進んで、細胞系から植物体を再生し、その再生植物体の細胞においてもベクターが安定に発現して、その植物体はもとより、子孫においても、発現物質に基づいて現れる性質が受け継がれることが求められる。
　これを甲第１号証についてみると、異議申立人が甲第１号証において「形質転換成功例」として採り上げる「無傷の胚盤」を供試材料とした場合は、アグロバクテリウム・テュメファシエンスとの共培養による直後の早期段階においてGUS発現が観察されるに留まり、他方、３週間にわたるハイグロマイシン耐性試験においては、耐性を得て生き残ることができなかったものであるから、結局のところ組み込みを目的とするベクターが安定的に形質転換された成功例とは評価できないものである。ましてや、早期GUS発現した胚盤を用いて植物体の再生なども行われていないから、これをもって「植物の形質転換」に成功した例などとは評価することができない。甲第１号証には、胚盤カルス、懸濁培養細胞、未熟胚は形質転換においてハイグロマイシン耐性を獲得しており、また、胚盤カルスについては植物体の再生にも成功していることが記載されているから、同甲号証は、「胚盤カルス」が最適な材料であると述べており、むしろ形質転換には、脱分化された細胞もしくは未分化の細胞を用いることが好適である、との思想が示されたものということができる。
　してみると、異議申立人は、甲第１号証に記載の発明の認定において誤っているから、その誤った認定を前提とする上記異議申立人の主張を理由があるものとして採用することはできない。一方、本件発明１は、「２，４−Ｄを含む培地に播種後４〜５日間前培養して発芽させた無傷の発芽種子」という材料をはじめてアグロバクテリウムの単子葉植物の形質転換用供試材料として用いることに成功したものである。
　また、甲第２号証乃至甲第７号証、甲第９号証乃至甲第１０号証に記載の発明も、それらはいずれも、傷の付与などの物理的人為操作を施した組織か、カルスのような脱分化処理を行った組織における形質転換であるから、本件発明のような「２，４−Ｄを含む培地に播種後４〜５日間前培養して発芽させた無傷の発芽種子」を用いることについては、これらの甲号証に記載も示唆もされておらず、また、甲第１号証に記載の発明と併せ考慮しても、それらを組み合わせて本件発明を当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　よって、本件発明１は、甲第１号証乃至甲第７号証、甲第９号証乃至甲第１１号証の記載内容をいかように組み合わせてみてもその進歩性を否定することはできないから、異議申立人の当該主張は採用することはできない。
　
　そして、本件発明２〜４は本件発明１をさらに技術的に限定したものであるから、本件発明１と同様に進歩性を有するものといえる。
　
　以上述べたとおり、本件発明１〜４の特許は、甲第１号証乃至甲第７号証、及び、甲第１１号乃至甲第１５号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできず、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものではない。
　
（２）理由２について
（２−１）異議申立人は、「本件明細書は、形質転換を行う種子を２，４−Ｄで処理しない実施態様について実施可能であるように記載されておらず、また、２，４−Ｄ等のオーキシンで処理することは本件特許発明の不可欠の要件であるから、本件発明のうち、２，４−Ｄを用いない態様は実施をすることができず、また発明の詳細な説明に記載した発明でもないこと、さらに、
（２−２）本件明細書は、実施例に記載されているジャポニカイネの品種「日本晴」以外の単子葉植物の形質転換が実施可能であるように記載されていないから、甲第１１号証の記載に鑑みると、本件は、特許法第３６条第４項又は第６項第１号に規定する要件を満たしていない旨、主張する。
　しかしながら、前記IIで述べた訂正がなされたことで、本件発明１乃至４に記載の「種子」は、２，４−Ｄで４〜５日間前培養して発芽させた種子のみに限定されたので、異議申立人の指摘する（２−１）に記載の主張はもはや成り立たない。
　（２−２）については、なるほど本件明細書には「イネ科植物」のうちの「日本晴」の成功例しか記載されておらず、また、特許異議申立人の提示した甲第１１号証に添付の「実験成績書」の「実験５」によると、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、IR64（インディカイネ）において形質転換細胞を得ることはできなかったようである。しかしながら、培養や形質転換の条件は、単子葉植物の種類ごとに少しずつ異なるものであり、たとえ明細書記載の各条件どおりに適用した場合に成功しなかった品種があったとしても、明細書中の記載が不備であるとまではいえない。明細書中に示されている成功した実施例の記載に基づき、さらに本件出願時の技術常識にも鑑み、それぞれの種に最適な方法を選択する程度のことは当業者にとって適宜なし得る範囲のことといい得るものである。
　なお、実際、特許権者の提出した乙第１０号証（平成１４年３月２２日付け田中宥司の宣誓書及び実験成績書）ならびに乙第１１号証（北陸生物学会会報、Vol.30(1995)P.80-82）によれば、コシヒカリ、インディカイネの品種であるバスマティにおいては本件明細書に記載の方法にしたがって形質転換に成功したことが記載されている。当該事実も考慮すれば、本件明細書に開示されている技術は、実施例に記載されているジャポニカイネの品種「日本晴」のみに限られるものではなく、本件発明１乃至４について明細書中に、当業者が容易に実施することができる程度に記載されているとするのが相当である。
　
（３）理由３について
（理由３）異議申立人は、本件発明の方法では「種子を脱分化させる処理が必要なく」「その結果、形質転換単子葉植物作出に要する日数を短縮化できる」旨が記載されており、さらに好ましい態様として「種子を、２，４−Ｄを含む培地に播種し５日間保温する」ことが実施例１と共に記載されているが、甲第１２号証乃至甲第１５号証の記載及び甲第１１号証の実験結果に鑑みると、当該好ましい態様を施したときにはイネは脱分化過程に入ると解されるから、両者の記載は矛盾しており、その結果、訂正前の請求項に記載の発明を当業者は実施することができなかったと主張する。
　しかしながら、IIで述べた訂正がなされたことで、本件発明１〜４に記載の「種子」は、２，４−Ｄで４〜５日間前培養して発芽させた種子のみに特定され、かつ、それは本件明細書において成功した実施例として記載されているものに相当するから、当業者はこの実施例及び本件明細書の発明の詳細な説明に基づいて当業者が容易に本件発明を実施することができたと解するところ、異議申立人の当該主張は採用できない。
　
（４）理由４について
（理由４）特許異議申立人は、本件明細書の発明の詳細な説明には、アグロバクテリウムを感染させる際の具体的な条件等が記載されておらず、また、その条件は出願時の技術常識に基づいても当業者には理解することができないから、訂正前の請求項１〜４に記載の発明を実施するにあたり、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度の実験を強いることとなる、と主張する。
　しかしながら、本件出願前に頒布された乙第１６号証（植物組織培養、Vol.13,No.1(1996)P.81-84）等に示されるように、アグロバクテリウムの植物細胞への感染条件は本件出願時において当業者にとっては周知の事項であったと認められ、また、本件明細書には具体的な成功した実施例についても記載されており、その条件を適宜変更して各種単子葉植物で形質転換を行うことが特に困難であるとする格別の根拠もないから、異議申立人の主張するような困難性があるということはできない。
　
　したがって、特許法第３６条違反に関する異議申立人の上記主張はいずれも採用できない。
　
IV.むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては本件請求項１〜４に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１〜４に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
　
【異議決定日】
平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
単子葉植物の超迅速形質転換法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】単子葉植物の形質転換方法であって、所望の組換え遺伝子を含むアグロバクテリウムで、無傷の種子を感染する工程を包含し、ここで、該種子は
２，４−Ｄを含む培地に播種後４〜５日間前培養して発芽させた
　【請求項２】　前記種子が、播種
後５
　【請求項３】　前記単子葉植物が、イネ科植物である、請求項１または２に記載の方法。
　【請求項４】　前記イネ科植物が、イネである、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、単子葉植物のアグロバクテリウム媒介性の形質転換方法に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　植物を改良するための手段の１つとして「形質転換法」が挙げられ、形質を改変するための所望の組換え遺伝子が植物に導入される。効率の良い、迅速な形質転換法は、有用な植物、特に、主食として重要な食糧である穀物を、分子育種するにおいて極めて重要である。
　【０００３】
　穀物の多く（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、およびトウモロコシ）は、単子葉植物に分類される。単子葉植物を形質転換するために、これまでに種々の形質転換法が開発されている。形質転換法は、直接的な形質転換法と間接的な形質転換法とに大きく分けられる。
　【０００４】
　直接的な形質転換法としては、例えば、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６、１９８９；およびＲｈｏｄｅｓ　Ｃ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：２０４−２０７、１９８９を参照）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　Ｐ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：９５７−９６２、１９９１を参照）ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：７３６−７４０、１９９０を参照）が挙げられる。エレクトロポレーション法およびパーティクルガン法は、遺伝子を比較的効率良く導入し得る方法として、単子葉植物を形質転換するために一般に使用されてきた。
　【０００５】
　間接的な形質転換法としては、アグロバクテリウム媒介性の形質転換法（以下、アグロバクテリウム形質転換法と呼ぶことがある）が挙げられる。アグロバクテリウムは、植物病原細菌の一種である。アグロバクテリウムは、植物に感染すると、自らが有するプラスミド（例えば、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド）上に存在するＴ−ＤＮＡ領域を、植物に組込む性質を有する。アグロバクテリウム形質転換法では、植物に遺伝子を導入するための手段として、このＴ−ＤＮＡ領域の植物への組込みを利用する。簡潔には、植物は、所望の組換え遺伝子含むアグロバクテリウムで感染される。感染後、所望の組換え遺伝子は、アグロバクテリウムから植物細胞内に移入され、そして植物ゲノムに組込まれる。
　【０００６】
　アグロバクテリウム形質転換法は、双子葉植物については、十分に確立されており、現在までに、所望の組換え遺伝子を発現する安定な形質転換植物が数多く作出されている。
　【０００７】
　対照的に、アグロバクテリウム形質転換法を単子葉植物に適用することは、従来、一般に困難であるとされてきた。例えば、Ｐｏｒｔｒｙｋｕｓら（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，　５３５−５４２，１９９０）は、アグロバクテリウムは、単子葉植物に感染しないと報告している。しかし、他方で、アグロバクテリウムを使用して単子葉植物を形質転換する試みは数多く行われ、その結果、アグロバクテリウム形質転換法を単子葉植物に適用できる可能性が見出されてきた。
　【０００８】
　例えば、Ｒａｉｎｅｒｉらは、イネの胚盤部分を取り出し、傷をつけて、脱分化を誘導する培地に置床し、数日後に、その胚盤部分をアグロバクテリウムで感染した。その結果、正常な再分化個体を得るまでには至らなかったものの、外来遺伝子が導入されたカルスを誘導することに成功した（Ｒａｉｎｅｒｉ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３３−３８、１９９０を参照）。
　【０００９】
　国際公開ＷＯ９４／００９７７号パンフレットは、イネおよびトウモロコシについての、アグロバクテリウム形質転換法を開示する。この方法では、アグロバクテリウムで形質転換するための植物試料として、脱分化過程にあるかまたは脱分化した培養組織（例えば、カルス）を使用することを必要とする。このため、アグロバクテリウムでの感染の前に、形質転換しようとする植物試料（例えば、葉切片）から脱分化された培養組織を作製するために、通常、３〜４週間の脱分化誘導期間を必要とする。
　【００１０】
　国際公開ＷＯ９５／０６７２２号パンフレットは、イネおよびトウモロコシの未熟胚をアグロバクテリウムで感染する方法を開示する。しかし、未熟胚を取り出すための作業は多大な労力を要する。
　【００１１】
　従って、より迅速で、効率の良い、単子葉植物のアグロバクテリウム形質転換法が利用できれば、イネなどの穀物を含む、有用な単子葉植物の分子育種に大いに貢献できる。
　【００１２】
　【発明が解決しようとする課題】
　本発明は、上記課題の解決を意図するものである。本発明の目的は、単子葉植物のアグロバクテリウム形質転換法における改良を提供することにある。本発明の方法によれば、従来のアグロバクテリウム形質転換法よりも効率良く、はるかに迅速に、形質転換植物を作出することが可能である。
　【００１３】
　【課題を解決するための手段】
　本発明は、単子葉植物の形質転換方法に関し、所望の組換え遺伝子を含むアグロバクテリウムで、無傷の種子を感染する工程を包含する。本発明の方法において、種子は、無傷の状態で感染され、形質転換しようとする植物試料を脱分化するなどの処理は必要とされない。
　【００１４】
　アグロバクテリウムでの感染に供される種子は、播種後４〜５日目の種子であり得る。また、感染の時点で、種子は、発芽した状態であり得る。
　【００１５】
　形質転換される単子葉植物は、好ましくはイネ科植物であり、より好ましくはイネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）である。
　【００１６】
　【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明する。
　【００１７】
　本発明の方法が適用される「植物」は、単子葉植物である。好ましい単子葉植物としては、イネ科植物（例えば、イネおよびトウモロコシ）が挙げられる。本発明の方法が適用される最も好ましい植物は、イネであり、特に、ジャポニカイネである。また「植物」は、特に他で示さない限り、植物体、および植物体から得られる種子を意味する。
　【００１８】
（植物発現用ベクターの作製）
　単子葉植物に所望の組換え遺伝子を導入するために、所望の組換え遺伝子を含む適切な植物発現用ベクターが構築される。このような植物発現用ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。アグロバクテリウム形質転換法において使用するための植物発現用ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。
　【００１９】
　「所望の組換え遺伝子」は、植物に導入されることが所望される任意のポリヌクレオチドをいう。本発明における所望の組換え遺伝子は、天然から単離されたものに限定されず、合成ポリヌクレオチドも含み得る。合成ポリヌクレオチドは、例えば、配列が公知の遺伝子を、当業者に周知の手法によって合成または改変することにより入手し得る。本発明における所望の組換え遺伝子としては、例えば、形質転換される植物において発現が所望される、その植物に対して内因性または外因性である任意のポリヌクレオチド、および植物においてある内因性遺伝子の発現制御が所望される場合の、その標的となる遺伝子のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　【００２０】
　植物において発現が意図される場合、所望の組換え遺伝子は、自己のプロモーター（すなわち、天然において該遺伝子が作動可能に連結しているプロモーター）を作動可能な様式で含むか、または自己のプロモーターを含まない場合もしくは自己のプロモーター以外のプロモーターをさらに含むことが所望される場合、任意の適切なプロモーターと作動可能に連結される。使用され得るプロモーターとしては、構成的プロモーター、および植物体の一部において選択的に発現するプロモーター、ならびに誘導性のプロモーターが挙げられる。
　【００２１】
　植物発現用ベクターにおいて、さらに種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結され得る。調節エレメントは、好適には、選抜マーカー遺伝子、植物プロモーター、ターミネーター、およびエンハンサーを含み得る。使用される植物発現用ベクターのタイプおよび調節エレメントの種類が、形質転換の目的に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
　【００２２】
　「選抜マーカー遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするために使用され得る。ハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子、およびカナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子のような薬剤耐性遺伝子が好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
　【００２３】
　「植物プロモーター」は、選抜マーカー遺伝子に作動可能に連結される、植物で発現するプロモーターを意味する。このようなプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、およびノパリン合成酵素のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
　【００２４】
　「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
　【００２５】
　「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植物発現用ベクターあたり複数個用いられ得る。
　【００２６】
（植物の形質転換）
　単子葉植物の形質転換に用いられるアグロバクテリウムは、任意のアグロバクテリウム属細菌であり得、好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである。アグロバクテリウムは、所望の組換え遺伝子を含む植物発現用ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）形質転換される。形質転換されたアグロバクテリウムで種子を感染することにより、所望の組換え遺伝子を植物に導入し得る。導入された組換え遺伝子は、植物中のゲノムに組み込まれて存在する。なお、植物中のゲノムとは、核染色体のみならず、植物細胞中の各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるゲノムを含んでいう。
　【００２７】
　形質転換が意図される植物の種子は、籾殻を除去した後、無傷の状態で前培養される。種子に関して「無傷」とは、種子が、胚珠を除去すること、および胚盤を傷つけることなどの人為的な操作を受けていない状態であることをいう。
　【００２８】
　前培養において、種子は、適切な濃度のオーキシン（例えば、２，４−Ｄ）を含む培地（例えば、Ｎ６Ｄ培地）に播種されて、代表的には４日〜５日間、好ましくは５日間、保温され得る。前培養は、種子の組織が脱分化過程に入る前に完了される。このときの温度は、代表的には２５〜３５℃、好ましくは２７〜３２℃である。前培養の完了後、種子は殺菌され、次いで水で十分に洗浄される。次いで、種子は、無菌操作下で、形質転換されたアグロバクテリウムで感染され得る。
　【００２９】
　アグロバクテリウムでの感染（共存培養）の間、種子は、暗黒下で、代表的には２日間〜５日間、好ましくは３日間、保温される。このときの温度は、代表的には２６〜２８℃、好ましくは２８℃である。次いで、種子は、培地中のアグロバクテリウムを除菌するために、適切な除菌剤（例えば、カルベニシリン）による処理に供される。形質転換された種子が、選抜マーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性）を基準として選抜される。
　【００３０】
　適切な除菌条件および選抜条件下での培養後、選抜された形質転換種子は、適切な植物調節物質を含む再分化培地（例えば、ＭＳ培地）に移され、適切な期間、保温され得る。植物体を再生するためには、再分化した形質転換体は、発根培地（例えば、植物調節物質を含まないＭＳ培地）に移される。根の発育が確認された後、形質転換体は、鉢上げされ得る。
　【００３１】
　植物に導入された所望の組換え遺伝子は、植物において意図される目的（例えば、目的とされる新たな形質の発現、またはある内因性の遺伝子の発現の制御）のために作用し得る。
　【００３２】
　所望の組換え遺伝子が植物に導入されたか否かは、当業者に周知の手法を用いて、確認され得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、再生した植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、目的の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。あるいは、所望の組換え遺伝子の導入によって、植物における内因性遺伝子の発現制御が所望される場合、標的となる内因性遺伝子の発現を、例えば、上記のノーザンブロット解析を用いて、試験し得る。標的となる内因性遺伝子の発現が、非形質転換のコントロール植物におけるその発現に比べて有意に抑制されている場合、所望の組換え遺伝子は植物に導入され、そして発現の制御に作用したことが確認される。
　【００３３】
　従来の方法は、アグロバクテリウムでの感染の前に、通常、３〜４週間の脱分化誘導期間を必要とする。対照的に、本発明の方法は、脱分化を誘導する工程を必要としないので、形質転換単子葉植物を作出するために必要な日数を短縮することが可能である。さらに、本発明の方法によれば、従来法における選抜に要する期間を短縮することも可能となり、培養変異の影響を低減することが可能となる。
　【００３４】
　本発明の方法の好ましい１つの実施態様において、形質転換単子葉植物を作出するために必要とされる日数は約５０日であり、従来のアグロバクテリウム形質転換方法（例えば、下記実施例２を参照）において必要とされる日数（約９０日）の約３分の２以下である。また、本発明の方法によれば、日本晴の種子の場合で、１０〜１５％の形質転換効率が得られる。どんとこい、キタアケなどの他のイネ品種でも同程度に高い形質転換効率が達成可能である。従って、本発明の方法を使用することによって、従来の形質転換法よりも効率良く、および迅速に、形質転換植物を作出することが可能である。
　【００３５】
　【実施例】
　以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。この実施例は、本発明を限定するものではない。実施例で使用した、材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
　【００３６】
（実施例１：本発明の方法によるイネ植物の形質転換）
　イネの代表的品種である日本晴の種子を、籾殻の除去後、無傷の状態で、２．５％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）溶液中で殺菌した。水での十分な洗浄の後、イネを以下の無菌操作に供した。
　【００３７】
（前培養）
　種子を、２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ　２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間、２７℃〜３２℃で保温した。この間に種子は発芽した（図１）。
　【００３８】
（植物発現用ベクター）
　アグロバクテリウムを形質転換するための植物発現用ベクターとして、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第１イントロンを含むＧＵＳ遺伝子と、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子とが連結されたプラスミドである、ｐＩＧ１２１Ｈｍを用いた（中村ら、植物バイオテクノロジーＩＩ、現代化学増刊、ｐｐ．１２３−１３２（１９９１））。ｐＩＧ１２１Ｈｍで、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１を形質転換した（Ｈｏｏｄら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１６８：１２９１−１３０１（１９８６））。ＥＨＡ１０１は、ヘルパープラスミドのｖｉｒ領域が強病原性アグロバクテリウムＡ２８１由来の菌である。
　【００３９】
（アグロバクテリウム感染）
　形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液に、前培養した上記種子を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ／ｌグルコース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ　２，４−Ｄ、１０ｍｇ／ｌ　アセトシリンゴン、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．２）に移植した。暗黒下で３日間、２８℃で保温して共存培養した。
　【００４０】
（除菌および選抜）
　共存培養の完了後、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、種子から、アグロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換された種子の選抜を、以下の条件で行った。
第１回目の選抜
第２回目の選抜
　【００４１】
（再分化）
　選抜された形質転換種子を、以下の条件で再分化させた。
第１回目の再分化
第２回目の再分化
　【００４２】
（鉢上げ）
　再分化した形質転換体を、発根培地（ハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした（図２）。
　【００４３】
（実施例２：従来の方法によるイネ植物の形質転換）
　実施例１に記載の方法との比較のために、日本晴を形質転換の材料として使用して、従来の方法によるイネ植物の形質転換を、以下のように行った。
　【００４４】
（カルス誘導）
　日本晴の種子を、籾殻の除去後、滅菌し、そしてカルス誘導培地（２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地）に播種し、これを明所下、３０℃で保温した。カルス誘導開始から約４週間後、胚盤由来の増殖したカルスを、形質転換に使用した。
　【００４５】
（形質転換）
　実施例１に記載されるように植物発現用ベクターｐＩＧ１２１Ｈｍで形質転換したアグロバクテリウムＥＨＡ１０１で、得られたカルスを感染し、２Ｎ６−ＡＳ培地上で、暗黒下で３日間、２８℃で保温して共存培養した。
　【００４６】
（除菌および選抜）
　５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、カルスから、アグロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換されたカルスの選抜を、以下の条件で行った。
第１回目の選抜
第２回目の選抜
　【００４７】
（再分化、発根および鉢上げ）
　選抜された形質転換種子を、実施例１と同様の条件で再分化させ、鉢上げまでを行った。
　【００４８】
（結果）
　従来の方法による形質転換の例と、本発明の方法による形質転換の例との比較を図３に示す。播種後、形質転換体の鉢上げまでに必要な日数は、従来法においては約９０日であったのに対して、本発明の方法においては約５０日であった（図３（ａ））。播種後約５０日目の時点で比較すると、本発明の方法における形質転換体は鉢上げ可能な状態であったのに対し、従来法における形質転換体は、未だ再分化の過程にあった（図３（ｂ））。まとめると、本発明の方法の実施により、形質転換に要する期間が、従来法の約３分の２以下に短縮された。
　【００４９】
　【発明の効果】
　本発明によれば、改良された、アグロバクテリウム媒介性の単子葉植物の形質転換方法が提供される。本発明の方法においては、形質転換を意図される植物の無傷の種子が、所望の組換え遺伝子を含むアグロバクテリウムで感染される。本発明の使用により、より効率良く、そしてより迅速に、形質転換植物を作出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】　アグロバクテリウムを感染する直前のイネ種子の状態を示す、生物の形態を示す写真である。
　【図２】　播種から約５０日目の、本発明の方法によりで得られたイネの再分化個体を示す、生物の形態を示す写真である。
　【図３】　（ａ）播種後約９０日目の従来法による形質転換体と、播種後約５０日目の本発明の方法による形質転換体とを比較した、生物の形態を示す写真である。（ｂ）播種後約５０日目の従来法による形質転換体と、播種後約５０日目の本発明の方法による形質転換体とを比較した、生物の形態を示す写真である。