【手続補正書】
【提出日】平成27年1月27日(2015.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【図１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図１はまた、「ＶＨ１−１８＿ＪＨ５＿Ｖｂａｓｅ」配列および「ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＱ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９〜６０として開示する。
【図２】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図２はまた、「ＶＨ１−１８＿ＪＨ５＿Ｖｂａｓｅ」配列および「ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＱ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９〜６０として開示する。
【図３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図３はまた、「ＶＨ１−６９＿ＪＨ３＿Ｖｂａｓｅ」配列、「ＶＨ１−６９＿ＪＨ２＿Ｖｂａｓｅ」配列、および「ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＱ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１〜６２および６０として開示する。
【図４】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図４はまた、「ＶＨ１−６９＿ＪＨ３＿Ｖｂａｓｅ」配列、「ＶＨ１−６９＿ＪＨ２＿Ｖｂａｓｅ」配列、および「ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＱ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１〜６２および６０として開示する。
【図５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図５はまた、「ＶＨ４−６１＿ＪＨ４＿Ｖｂａｓｅ」配列、「ＶＨ４−６１＿ＪＨ１＿Ｖｂａｓｅ」配列、および「ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＱ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３〜６４および６０として開示する。
【図６】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図６はまた、「ＶＨ４−６１＿ＪＨ４＿Ｖｂａｓｅ」配列、「ＶＨ４−６１＿ＪＨ１＿Ｖｂａｓｅ」配列、および「ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＱ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３〜６４および６０として開示する。
【図７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４を構成する軽鎖可変領域（Ｖκ）のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図７はまた、「ＶＫ３−１５＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５および６７として開示する。
【図８】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図８はまた、「ＶＫ３−１５＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５および６７として開示する。
【図９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図９はまた、「ＶＫ１−０５＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８および６７として開示する。
【図１０】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図１０はまた、「ＶＫ１−０５＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８および６７として開示する。
【図１１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図１１はまた、「ＶＫ１−３３＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９および６７として開示する。
【図１２】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図１２はまた、「ＶＫ１−３３＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９および６７として開示する。
【図１３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を構成する軽鎖可変のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図１３はまた、「ＶＫ３−１１＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０および６７として開示する。
【図１４】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図１４はまた、「ＶＫ３−１１＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０および６７として開示する。
【図１５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図１５はまた、「ＶＫ４−１＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１および６７として開示する。
【図１６】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。図１６はまた、「ＶＫ４−１＿ＪＫ４＿ＩＭＧＴ」配列および「ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ」配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１および６７として開示する。
【図１７】図１７Ａ〜Ｄ：直接ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴による抗ＥＧＦＲ抗体のエピトープマッピング。図１７Ａ〜１７Ｃは、野生型（図１７Ａ）、ビン１エピトープ変異体（図１７Ｂ）、またはビン３エピトープ変異体（図１７Ｃ）のＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）を捕捉試薬として用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。Ｘ軸は、抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図１７Ｄは、ビン１、２、および３の抗体が、異なる非重複エピトープを有するＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合することを示す表面プラズモン共鳴アッセイの結果である。抗体ｃｈ（ビン３）を、ＢＩＡＣＯＲＥチップの表面に結合させた。野生型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（０．５μＭ）の注入後、抗体ｃｄ（ビン２）、ｃｂ（ビン１）を連続的に注入し、対照として、チップに結合させたのと同じ抗体であるｃｈ（ビン３）を注入した。その結果を、Ｘ軸が時間（秒）を示し、Ｙ軸がＢＩＡＣＯＲＥ応答単位（ＲＵ）を示すセンサーグラムとして表す。
【図１８】図１８Ａ〜Ｃ：非重複エピトープの２つの抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害。示した等モル濃度のビン１＋ビン３（図１８Ａおよび１８Ｂ）またはビン１＋ビン２の抗体（図１８Ｃ）の組み合わせとともにＡ４３１細胞を２時間インキュベートし、細胞溶解物をホスホ−ＥＲＫのＥＬＩＳＡによって分析した。Ｘ軸は、抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、＋ＥＧＦリガンド対照に観察される大きさに対して正規化されたホスホ−ＥＲＫの活性の大きさを示す。実線は、各組み合わせからのデータに対する５パラメータロジスティック当てはめを表す。各グラフの下の表は、データに当てはめるように用いられたロジスティック関数から計算した、各組み合わせの効力（抗体の飽和濃度でのホスホ−ＥＲＫの活性比）、ＩＣ５０値、およびＩＣ９０値を含む。
【図１９】図１９Ａ〜Ｂ：非重複エピトープの２つまたは３つの抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害。等モル濃度の３つのビン１、ビン２、およびビン３の抗体（図１９Ａ）の組み合わせを用いてＡ４３１細胞を処理した。次いで、抗体（ビン１）およびｃｄ（ビン２）の２つ組の組み合わせを既知の抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブと比較したところ（図１９Ｂ）、当該技術分野において既知であるこの抗体よりもホスホ−ＥＲＫを減少させるのにより効果的であることが示された。実験を行い、そのデータを図１８として図示する。
【図２０】図２０Ａ〜Ｄ：非重複エピトープの２つの抗ＥＧＦＲ抗体の等モル濃度および非等モル濃度の組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害。異なる比率（μｇ／ｍＬ）の抗体ペアｃｂおよびｃｄ（図２０Ａ）、ｃｂおよびｃｈ（図２０Ｂ）、ｃｂおよびｃｉ（図２０Ｃ）、ならびにｃａおよびｃｄ（図２０Ｄ）を用いてＡ４３１細胞を処理した。実験を行い、そのデータを図１８として図示する。
【図２１】図２０Ａ〜Ｄのホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害データをヒートマップに表す：Ｘ軸（列）は、抗体の濃度を示し、Ｙ軸（行）は、示す比率で組み合わせた抗体のペアを示し、Ｚ軸（平面内）は、ホスホ−ＥＲＫの活性比をグレースケールで示す。Ｚ軸のカラーマップは、高いホスホ−ＥＲＫ活性を白色で、低い活性を黒色で表し、そして中間的な活性を灰色の色調で表す。試料の値は、それらが分析されるＥＬＩＳＡプレート上の＋ＥＧＦリガンド対照の平均値に対して独立して正規化し、全プレートにわたるＥＧＦリガンド対照（＋／−）の平均値を左上に示す。
【図２２】図２２Ａ〜Ｃ：単一によるおよびビン１＋ビン２またはビン１＋ビン３の抗体のペアの組み合わせによるホスホ−ＥＧＦ受容体およびホスホ−ＥＲＫのシグナル伝達の阻害、ならびにセツキシマブ、ニモツズマブ、およびザルツムマブ等の他の既知の抗ＥＧＦＲ抗体との比較。図２２Ａは、ビン１／２の抗体ｃｂおよびｃｄによるＥＲＫ活性の阻害を示す。図２２Ｂは、ビン１／２の抗体およびｃｄによるＥＧＦＲ活性の阻害を示す。図２２Ｃは、ビン１／３の抗体ｃｂおよびｃｈによるＥＲＫ活性の阻害を示す。実験を行い、そのデータを図１８として図示する。
【図２３】図２３Ａ〜Ｄ：ＥＧＦありまたはなしで、ビン１／ビン２／ビン３のｍＡｂペアまたはトリオで処理した細胞のＣＴＧ発光細胞生存率アッセイの結果を示す４つのグラフである。図２３Ａは、ビン１／３の抗体ｃａおよびｃｈで処理したＨ１９７５細胞のＣＴＧアッセイの結果を示す。図２３Ｂは、ビン１／２の抗体ｃａおよびｃｄで処理したＨ１９７５細胞のＣＴＧアッセイの結果を示す。図２３Ｃ（Ｈ１９７５細胞）および２３Ｄ（Ａ４３１細胞）は、ビン１／２／３の抗体トリオｃａ＋ｃｄ＋ｃｈで処理した細胞のＣＴＧアッセイの結果を示す。対照は、１％ウシ胎仔血清（１％ＦＣＳ）を含む培地で処理した細胞および無血清培地（ＳＦＭ）で処理した細胞を含む。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂ：類表皮腫瘍細胞株Ａ４３１（図２４Ａ）およびＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）腫瘍細胞株Ｈ１９７５（図２４Ｂ）を用いたマウス異種移植片腫瘍モデルにおける、抗体ｃｂと、抗体ｃａ＋ｃｄまたはｃｂ＋ｃｈまたはｃａ＋ｃｈのペアによる腫瘍増殖の阻害を示す２つのグラフである。Ｘ軸は、移植後の日数を表し、Ｙ軸は、腫瘍サイズをｍｍ３で表す。
【図２５】セツキシマブまたはＥＧＦリガンド単独と比較した、抗体ｃａ、ｃｆ、ｃｈ、またはｃｂ単独（２μＭの濃度）によるＡ４３１細胞に結合するビオチン化ＥＧＦリガンドの阻害を示すフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析の結果のグラフである。Ｙ軸は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、Ｘ軸は、ビオチン化ヒトＥＧＦリガンドの様々な濃度（ｎＭ）を示す。抗体ｃｈは、ＥＧＦ結合のある程度の阻害を示し、抗体ｃｆは、ＥＧＦ濃度２０ｎＭまでＥＧＦ結合の本質的に完全な阻害を示し、ｃａおよびｃｂは、ＥＧＦ濃度２００ｎＭまでＥＧＦ結合の本質的に完全な阻害を示した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
詳細な説明
Ｉ．定義
「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」、および「ＥＧＦ受容体」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ヒトＥＧＦＲタンパク質（「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ００５３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）を参照）を指す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
ビンは、選択された抗体がＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上の３つの異なる非重複エピトープにまたがるように設計した。これらは、３つのビンにグループ化される：ビン１は、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩにマッピングされ、ｃ２２５エピトープを表し（セツキシマブが結合する部位）、ビン２は、ドメインＩにマッピングされ、ＩＣＲ１０エピトープを表し（Ａｂｃａｍ  Ａｂ２３１）（Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８７：１４７−１５８）、ビン３は、ドメインＩＩＩにマッピングされ、クローンＨ１１エピトープを表す（Ｓｐａｎｇｌｅｒ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．１０７：１３２５２−１３２５７，２０１０）。ＥＧＦＲ細胞外ドメイン中の、下に太字で示すアミノ酸位置でのエピトープマッピングのために、ビン１（Ｂ１−７ＭＴ−Ａｌａ）およびビン３（Ｂ３−４ＭＴ）変異体を産生させた。
ＥＧＦＲ  ＥＣＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）
2013533211.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ヒトＥＧＦＲ）
2013533211.tif 000002
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2013533211.tif 000003
【図２】
2013533211.tif 000004
【図３】
2013533211.tif 000005
【図４】
2013533211.tif 000006
【図５】
2013533211.tif 000007
【図６】
2013533211.tif 000008
【図７】
2013533211.tif 000009
【図８】
2013533211.tif 000010
【図９】
2013533211.tif 000011
【図１０】
2013533211.tif 000012
【図１１】
2013533211.tif 000013
【図１２】
2013533211.tif 000014
【図１３】
2013533211.tif 000015
【図１４】
2013533211.tif 000016
【図１５】
2013533211.tif 000017
【図１６】
2013533211.tif 000018
【図１７Ａ】
2013533211.tif 000019
【図１７Ｂ】
2013533211.tif 000020
【図１７Ｃ】
2013533211.tif 000021
【図１７Ｄ】
2013533211.tif 000022
【図１８Ａ】
2013533211.tif 000023
【図１８Ｂ】
2013533211.tif 000024
【図１８Ｃ】
2013533211.tif 000025
【図１９Ａ】
2013533211.tif 000026
【図１９Ｂ】
2013533211.tif 000027
【図２０Ａ】
2013533211.tif 000028
【図２０Ｂ】
2013533211.tif 000029
【図２０Ｃ】
2013533211.tif 000030
【図２０Ｄ】
2013533211.tif 000031
【図２１】
2013533211.tif 000032
【図２２Ａ】
2013533211.tif 000033
【図２２Ｂ】
2013533211.tif 000034
【図２２Ｃ】
2013533211.tif 000035
【図２３Ａ】
2013533211.tif 000036
【図２３Ｂ】
2013533211.tif 000037
【図２３Ｃ】
2013533211.tif 000038
【図２３Ｄ】
2013533211.tif 000039
【図２４Ａ】
2013533211.tif 000040
【図２４Ｂ】
2013533211.tif 000041
【図２５】
2013533211.tif 000042