【手続補正書】
【提出日】平成27年5月20日(2015.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、成体幹細胞集団を拡大させるための培養培地:
i. Lgr5アゴニスト; ならびに
ii. ヒトPAI-1プロモーターを含むレポーター構築物が細胞に安定にトランスフェクトされている細胞アッセイにおいて阻害剤がTGF-βシグナル伝達を阻害することができる場合に該阻害剤はTGF-β阻害剤である、1種または複数種のTGF-β阻害剤。
【請求項２】
1種または複数種の阻害剤が、ALK5、ALK4、およびALK7からなる群より選択される1種または複数種のセリン/スレオニンプロテインキナーゼに結合し、かつその活性を低減する、請求項1記載の培養培地。
【請求項３】
1種または複数種のTGF-β阻害剤が、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、SD-208、LY-36494、およびSJN-2511からなる群より選択される、請求項1または請求項2記載の培養培地。
【請求項４】
TGF-β阻害剤が1nM〜100μM、10nM〜100μM、100nM〜10μM、または約1μMの濃度で添加される、例えば、1種または複数種の阻害剤の総濃度が10nM〜100μM、100nM〜10μM、または約1μMである、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項５】
Lgr5アゴニストがRスポンジン1〜4のいずれか一つである、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項６】
BMP阻害剤、Wntアゴニスト、受容体型チロシンキナーゼリガンド、ニコチンアミド、p38阻害剤、Rock阻害剤、ガストリン、プロスタグランジンシグナル伝達経路アクチベーター、およびテストステロンより選択される1種または複数種の付加的な成分を含む、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項７】
ヒト腸幹細胞、ヒト小腸陰窩、またはヒト結腸陰窩を培養するためのものであり、基本培地を含み、且つ追加で、BMP阻害剤、Rスポンジン、TGFβ阻害剤、Wntアゴニスト、EGF、p38阻害剤、ガストリン、およびニコチンアミドを含む、請求項6記載の培養培地。
【請求項８】
膵臓幹細胞を培養するためのものであり、基本培地、Rスポンジン1〜4のいずれか一つ、ノギン、TGFβ阻害剤、EGF、FGF10、ガストリン、および好ましくはエキセンディン4およびWnt-3aを含む、請求項6記載の培養培地。
【請求項９】
前立腺細胞を培養するためのものであり、基本培地、Rスポンジン1〜4のいずれか一つ、ノギン、TGFβ阻害剤、ニコチンアミド、EGF、テストステロン、および好ましくはWnt-3aおよびFGF10を含む、請求項6記載の培養培地。
【請求項１０】
胃細胞を培養するためのものであり、基本培地、ノギン、Rスポンジン1〜4のいずれか一つ、TGFβ阻害剤、Wnt-3a、EGF、ガストリン、ニコチンアミド、FGF10、および好ましくはp38阻害剤を含む、請求項6記載の培養培地。
【請求項１１】
癌細胞を培養するためのものであり、Wnt-3a、EGF、ノギン、Rスポンジン、TGFβ阻害剤、p38阻害剤、ニコチンアミド、ガストリン、FGF10、およびHGFのうちの1つまたは複数が培地から排除されている、請求項7〜10のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項記載の培養培地、および細胞外マトリックス、またはインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって細胞外マトリックスを模倣する3Dマトリックス、例えばMatrigel(商標)(BD Biosciences)などのラミニン含有細胞外マトリックスを含む、組成物。
【請求項１３】
前記請求項のいずれか一項記載の培養培地または組成物を含有する、密閉封止された容器。
【請求項１４】
幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドを拡大させるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の培養培地の使用。
【請求項１５】
単一の幹細胞または幹細胞集団を請求項1〜11のいずれか一項記載の培養培地中で培養する工程を含む、単一の幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を拡大させるための、好ましくはオルガノイドを得るためにそれらを拡大させるための方法。
【請求項１６】
以下の工程を含む、請求項15記載の方法:
幹細胞、幹細胞集団、または単離された組織断片を用意する工程;
請求項1〜11のいずれか一項記載の培養培地を用意する工程;
該幹細胞を該培養培地と接触させる工程; および
適切な条件下で該細胞を培養する工程。
【請求項１７】
細胞外マトリックス、またはインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって細胞外マトリックスを模倣する3Dマトリックス、例えばMatrigel(商標)(BD Biosciences)などのラミニン含有細胞外マトリックスと、幹細胞、幹細胞集団、または単離された組織断片、および培養培地とを接触させる工程を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程を含む、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法:
幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を第1の拡大培地中で培養する工程;
該幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を培養し続け、かつ該培地に、TGF-β阻害剤、p38阻害剤、ニコチンアミド、およびWntより選択される因子の1つまたは複数、好ましくは全てを含まない分化培地を補充する工程。
【請求項１９】
Rock阻害剤が、最初の1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、または7日間、任意で1日おきに培養培地に添加される、請求項15〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
請求項15〜19のいずれか一項記載の方法によって得ることができるオルガノイドまたは細胞集団。
【請求項２１】
少なくとも3ヶ月間、例えば少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間、またはそれより長く培養されている、請求項20記載のオルガノイドまたは細胞集団。
【請求項２２】
1週間につき少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍の割合で拡大する、請求項20または21記載のオルガノイドまたは細胞集団。
【請求項２３】
-5℃より低い、-10℃より低い、-20℃より低い、-40℃より低い、-60℃より低い、-80℃より低い、-100℃より低い、または-150℃より低い温度で、例えば約-180℃で凍結および保存される、請求項20〜22のいずれか一項記載のオルガノイドまたは細胞集団。
【請求項２４】
以下を含む組成物:
i) 請求項20〜23のいずれか一項記載の1つまたは複数のオルガノイドまたは細胞集団; ならびに
ii) 請求項1〜11のいずれか一項記載の培養培地および/または細胞外マトリックス。
【請求項２５】
薬物スクリーニング、ターゲットバリデーション、ターゲット発見、毒物学、毒性スクリーニング、個別化医療、再生医療、またはエクスビボ細胞/臓器モデルにおける使用のための、例えば疾患モデルとしての使用のための、請求項20〜23のいずれか一項記載のオルガノイド、または請求項20〜23のいずれか一項記載の細胞集団、または請求項12もしくは24記載の組成物。
【請求項２６】
再生医療または個別化医療が、哺乳動物、好ましくはヒトへのオルガノイド、細胞集団、または組成物の移植を含む、請求項25記載の使用のためのオルガノイド、細胞集団、または組成物。
【請求項２７】
以下の工程を含む、治療用または予防用の薬物または化粧料をスクリーニングするための方法:
請求項20〜23のいずれか一項記載のオルガノイドまたは細胞集団を、例えば請求項1〜11のいずれか一項記載の培養培地で培養する工程;
該オルガノイドまたは細胞集団を候補分子の1つまたは候補分子のライブラリーに曝露する工程;
該オルガノイドまたは細胞集団を、任意の効果について、例えば、増殖の低減もしくは消失などの任意の細胞変化、形態学的変化、および/または細胞死について評価する工程; ならびに
該効果を引き起こす候補分子を、潜在的な薬物または化粧料として特定する工程。
【請求項２８】
細胞が上皮細胞である、請求項1〜14のいずれか一項記載の培養培地、請求項15〜19もしくは27のいずれか一項記載の方法、または請求項20〜26のいずれか一項記載のオルガノイド。