【手続補正書】
【提出日】平成27年6月26日(2015.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞由来の細胞の代謝成熟度状態を改善するインビトロでの方法であって、本質的にグルコースを含まず、本質的に血清を含まず、１つ以上の脂肪酸を含む、定義された培地に、前記幹細胞由来の細胞を曝露し、それにより前記細胞の前記代謝成熟度状態を改善するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記定義された培地は、以下の成分のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
ａ）クレアチン、
ｂ）Ｌ−カルニチン、
ｃ）タウリン、
ｄ）Ｌ−グルタミン、
ｅ）ＩＴＳ−Ａ、および
ｆ）非必須アミノ酸。
【請求項３】
前記定義された培地は、ピルビン酸塩、β−メルカプトエタノール、オレイン酸、抗酸化物質またはフリーラジカル捕捉剤のうちの１つ以上を含み、好ましくは前記抗酸化物質は、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣおよびＥ、セレン、ならびにメラトニンからなる群から選択されるか、または前記フリーラジカル捕捉剤は、アスコルビン酸、ビタミンＥ、およびβ−カロテンからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞由来の細胞は、肝細胞または心筋細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、遺伝子組み換えが行われている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記曝露するステップはさらに、前記幹細胞由来の細胞の遺伝子組み換えを行うものとして定義される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、１つ以上の好気的呼吸酵素、１つ以上の好気的呼吸基質の発現を強化するように、および／または１つ以上の好気的呼吸酵素の機能もしくは発現を調節もしくは増強させるタンパク質の発現を強化するように、遺伝子組み換えが行われているか、または前記細胞は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、メチオニンレダクターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を発現させるように、遺伝子組み換えが行われている、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の好気的呼吸酵素は、脂肪酸トランスロカーゼ（Ｃｄ３６）、原形質膜関連脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ１、ＦＡＴＰ２、ＦＡＴＰ３、ＦＡＴＰ４、ＦＡＴＰ５、および／またはＦＡＴＰ６）、アシル‐ＣｏＡシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ２（ＣＰＴ２）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）α、ＰＰＡＲβ、ならびにＰＰＡＲδからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞由来の細胞は、少なくとも４日間、前記培地中で培養される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記曝露するステップに続いて、前記方法はさらに、１つ以上の特性に対して、前記幹細胞由来の細胞を分析するステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
測定されている前記１つ以上の特性は、前記細胞の代謝成熟度状態を必要とするか、またはそれによって強化されるか、あるいは前記１つ以上の特性は、１つ以上の遺伝子の発現又は細胞機能アッセイにおける反応を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子は、ＣＰＴ１、ＰＰＡＲａ、ＮＰＰＡ、およびＮＰＰｂからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
幹細胞由来の細胞の代謝成熟度状態を改善するインビトロでの方法であって、解糖から好気的呼吸へ前記細胞の前記代謝を変換する条件に前記幹細胞由来の細胞を曝露し、それにより、前記細胞の前記代謝成熟度状態を改善するステップを含む、方法。
【請求項１４】
前記曝露するステップはさらに、本質的にグルコースを含まず、本質的に血清を含まず、１つ以上の脂肪酸を含む、定義された培地中で、前記細胞を培養するものとして定義される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記定義された培地は、以下の特性のうちの１つ以上を有する、請求項１３または１４に記載の方法。
ａ）クレアチン、
ｂ）Ｌ−カルニチン、
ｃ）タウリン、
ｄ）Ｌ−グルタミン、
ｅ）ＩＴＳ−Ａ、及び
ｆ）非必須アミノ酸
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
特定の実施形態において、培地は、解糖の代わりに好気的呼吸の利用によって、幹細胞由来の細胞を成熟させるが、ある特定の実施形態において、幹細胞由来の幹細胞の成熟は、他または追加の機構によって生じる。本発明のある特定の実施形態において、幹細胞由来の細胞の代謝成熟度状態を改善する方法があり、本質的にグルコースを含まず、本質的に血清を含まず、１つ以上の脂肪酸を含む、定義された培地に、幹細胞由来の細胞を曝露し、それにより細胞の代謝成熟度状態を改善するステップを含む。特定の実施形態において、定義された培地は、以下の特性のうちの１つ以上：ａ）クレアチン、ｂ）随意に、ピルビン酸塩、ｃ）Ｌ−カルニチン、ｄ）タウリン、ｅ）Ｌ−グルタミン、ｆ）β−メルカプトエタノール、ｇ）ＩＴＳ−Ａ、およびｈ）非必須アミノ酸、を有する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
幹細胞由来の細胞の代謝成熟度状態を改善する方法であって、本質的にグルコースを含まず、本質的に血清を含まず、１つ以上の脂肪酸を含む、定義された培地に、前記幹細胞由来の細胞を曝露し、それにより前記細胞の前記代謝成熟度状態を改善するステップを含む、方法。
（項目２）
前記定義された培地は、以下の成分のうちの１つ以上を含む、項目１に記載の方法。
ａ）クレアチン、
ｂ）Ｌ−カルニチン、
ｃ）タウリン、
ｄ）Ｌ−グルタミン、
ｅ）ＩＴＳ−Ａ、および
ｆ）非必須アミノ酸。
（項目３）
前記定義された培地は、ピルビン酸塩、β−メルカプトエタノール、またはオレイン酸のうちの１つ以上を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記培地はさらに、１つ以上の抗酸化物質を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記抗酸化物質は、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣおよびＥ、セレン、ならびにメラトニンからなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記培地はさらに、１つ以上のフリーラジカル捕捉剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記フリーラジカル捕捉剤は、アスコルビン酸、ビタミンＥ、およびβ−カロテンからなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記幹細胞由来の細胞は、肝細胞または心筋細胞である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記細胞は、遺伝子組み換えが行われている、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞は、１つ以上の好気的呼吸酵素の発現を強化するように、１つ以上の好気的呼吸基質の利用可能性を強化するように、および／または１つ以上の好気的呼吸酵素の機能もしくは発現を調節もしくは増強させるタンパク質の発現を強化するように、遺伝子組み換えが行われている、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞は、脂肪酸トランスロカーゼ（Ｃｄ３６）、原形質膜関連脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ１、ＦＡＴＰ２、ＦＡＴＰ３、ＦＡＴＰ４、ＦＡＴＰ５、および／またはＦＡＴＰ６）、アシル‐ＣｏＡシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ２（ＣＰＴ２）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）α、ＰＰＡＲβ、ならびにＰＰＡＲδからなる群から選択される、１つ以上のタンパク質の発現を増加させるように、遺伝子組み換えが行われている、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、メチオニンレダクターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を発現させるように、遺伝子組み換えが行われている、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記曝露するステップはさらに、前記幹細胞由来の細胞の遺伝子組み換えを行うものとして定義される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞は、１つ以上の好気的呼吸酵素、１つ以上の好気的呼吸基質の発現を強化するように、および／または１つ以上の好気的呼吸酵素の機能もしくは発現を調節もしくは増強させるタンパク質の発現を強化するように、遺伝子組み換えが行われている、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１つ以上の好気的呼吸酵素は、脂肪酸トランスロカーゼ（Ｃｄ３６）、原形質膜関連脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ１、ＦＡＴＰ２、ＦＡＴＰ３、ＦＡＴＰ４、ＦＡＴＰ５、および／またはＦＡＴＰ６）、アシル‐ＣｏＡシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ２（ＣＰＴ２）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）α、ＰＰＡＲβ、ならびにＰＰＡＲδからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、メチオニンレダクターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を発現させるように、遺伝子組み換えが行われている、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記幹細胞由来の細胞は、少なくとも４日間、前記培地中で培養される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記曝露するステップに続いて、前記方法はさらに、１つ以上の特性に対して、前記幹細胞由来の細胞を分析するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
測定されている前記１つ以上の特性は、前記細胞の代謝成熟度状態を必要とするか、またはそれによって強化される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記１つ以上の特性は、１つ以上の遺伝子の発現又は細胞機能アッセイにおける反応を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記遺伝子は、ＣＰＴ１、ＰＰＡＲａ、ＮＰＰＡ、およびＮＰＰｂからなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
幹細胞由来の細胞の代謝成熟度状態を改善する方法であって、解糖から好気的呼吸へ前記細胞の前記代謝を変換する条件に前記幹細胞由来の細胞を曝露し、それにより、前記細胞の前記代謝成熟度状態を改善するステップを含む、方法。
（項目２３）
前記曝露するステップはさらに、本質的にグルコースを含まず、本質的に血清を含まず、１つ以上の脂肪酸を含む、定義された培地中で、前記細胞を培養するものとして定義される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記定義された培地は、以下の特性のうちの１つ以上を有する、項目２３に記載の方法。
ａ）クレアチン、
ｂ）Ｌ−カルニチン、
ｃ）タウリン、
ｄ）Ｌ−グルタミン、
ｅ）ＩＴＳ−Ａ、及び
ｆ）非必須アミノ酸