【手続補正書】
【提出日】平成27年10月15日(2015.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする患者において、アミロイドの低減、アミロイド形成の阻害、アミロイド凝集の阻害、または毒性オリゴマーの形成の除去および／もしくは予防における使用のための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、医薬的に許容される担体、およびポリペプチド、または通常は結合しないタンパク質ドメインに融合した前記ポリペプチドを含む融合タンパク質のいずれかを含み；前記ポリペプチドは、アミロイドに結合し、そして少なくとも１個の野生型遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）、野生型ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、変異体もしくは変種ｇ３ｐ、または変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含み、ここで、前記組成物はバクテリオファージを含まない、医薬組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが野生型もしくは変異体もしくは変種ｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、請求項１記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが野生型もしくは変異体もしくは変種ｇ３ｐの全Ｎ２ドメインを含む、請求項１または２記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが野生型もしくは変異体もしくは変種ｇ３ｐのＮ１ドメインのフラグメントを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが野生型もしくは変異体もしくは変種ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメントを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが野生型もしくは変異体ｇ３ｐを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドに共有結合又は非共有結合のいずれかで結合し
た担体を更に含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
前記野生型ｇ３ｐまたは野生型ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントが、配列番号：１の対応する部分のアミノ酸配列と同一である、請求項１〜７のいずれか１項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項９】
前記変異体もしくは変種ｇ３ｐまたは変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントのアミノ酸配列が、配列番号：１の対応する部分のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメントを含み、Ｎ２のヒンジ領域が変異誘発されて、対応する野生型Ｍ１３ファージポリペプチドと比較して低下したヒンジＴｍおよびより高い親和性を有するポリペプチドをもたらす、請求項９記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの野生型ｇ３ｐ、野生型ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、変異体もしくは変種ｇ３ｐ、または変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む前記ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域を含むペプチドドメインに融合されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の使用のための、融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン定常領域がＦｃフラグメントである、請求項１１記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭのＦｃフラグメントから選択される、請求項１１または１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記使用が、アミロイドのミスフォールディングおよび／または凝集と関連した疾患の処置を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
前記使用が、アルツハイマー病、早発型アルツハイマー病、後発型アルツハイマー病、発症前アルツハイマー病、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、遺伝性アイスランド症候群、老衰、多発性骨髄腫、プリオン病、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、又はＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、前頭側頭葉型認知症、イギリス型／デンマーク型認知症、及び家族性脳症から選択される疾患の処置を含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１６】
前記使用が、バイオマーカーがポジトロン放出断層撮影においてイメージング剤として用いられるとき、バイオマーカーであるフロルベタピルに対して陽性である患者を処置することを含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１７】
前記使用が、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病の処置を含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１８】
アミロイド凝集の検出または画像化のための使用のための組成物であって、前記組成物は、アミロイドに結合するポリペプチド、または通常は結合しないタンパク質ドメインに融合した前記ポリペプチドを含む融合タンパク質のいずれかに結合した検出可能な標識を含み；前記ポリペプチドは、野生型ｇ３ｐ、野生型ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、変異体もしくは変種ｇ３ｐ、または変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項１９】
前記標識が、１８Ｆ、１１Ｃ、又は１２３Ｉから選択される放射性標識である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
アミロイドと関連した疾患または状態の診断における使用のためのものである、請求項１８または１９記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
アミロイドに結合するポリペプチド、または通常は結合しないタンパク質ドメインに融合した前記ポリペプチドを含む融合タンパク質のいずれかに結合した検出可能な標識を含む組成物であって、前記ポリペプチドは、野生型ｇ３ｐ、野生型ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、変異体もしくは変種ｇ３ｐ、または変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含み、前記ポリペプチドがバクテリオファージを含まない、組成物。
【請求項２２】
通常は結合しない少なくとも一つのタンパク質ドメインに融合したアミロイド結合ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、野生型ｇ３ｐ、全Ｎ２ドメインを含む野生型ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、変異体もしくは変種ｇ３ｐ、またはｇ３ｐの全Ｎ２ドメインを含む変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含み；前記変異体もしくは変種が、前記野生型ｇ３の対応する部分とアミノ酸置換および／または挿入のみが異なる、組成物。
【請求項２３】
前記野生型もしくは変異体もしくは変種ｇ３ｐ、または前記野生型もしくは変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントが、以下：
ａ）免疫グロブリン定常領域；
ｂ）免疫グロブリンＦｃフラグメント；
ｃ）ＩｇＧのＦｃフラグメント；または
ｄ）ＩｇＭのＦｃフラグメント
から選択されるタンパク質に融合されたものである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
医薬的に許容される担体、およびアミロイドに結合する治療上有効量のポリペプチドを含む、医薬組成物であって、前記ポリペプチドは、野生型ｇ３ｐ、全Ｎ２ドメインを含む野生型ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、または変異体もしくは変種ｇ３ｐ、または全Ｎ２ドメインを含む変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含み；前記ポリペプチドがバクテリオファージを含まない、医薬組成物。
【請求項２５】
前記アミロイド結合フラグメントが、野生型もしくは変異体もしくは変種ｇ３ｐの全Ｎ１−Ｎ２ドメインを含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記変異体もしくは変種ｇ３ｐまたは変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントのアミノ酸配列が、配列番号：１の対応する部分と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である、請求項２４または２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
必要とする患者において、アミロイドの低減、アミロイド形成の阻害、アミロイド凝集の阻害、又は毒性オリゴマーの形成の除去及び／又は予防において使用するための医薬組成物であって、変異体もしくは変種ｇ３ｐを発現する単離糸状ファージを含む、医薬組成物。
【請求項２８】
生物学的試料におけるアミロイドを検出する方法であって、
ａ）前記生物学的試料を、検出可能な標識およびアミロイドに結合するポリペプチドを含む組成物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、野生型ｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、変異体もしくは変種ｇ３ｐ、または変異体もしくは変種ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントを含み、前記ポリペプチドは、バクテリオファージを含まない、工程；
ｂ）標識されたポリペプチド−アミロイド複合体を検出する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドは融合タンパク質である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記標識がポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）により検出される、請求項２８または２９記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
しかしながら、この開示は、作用の代替（必ずしも相互排他的でない）メカニズムの証
拠を提供する。本発明者は、ファージｇ３ｐがアミロイド線維に直接結合すること、及び
ファージにより仲介される脱凝集が、この最初の結合工程に依存することを見出した。ｇ
３ｐが糸状ファージにより仲介されるアミロイド結合に関与するという本発明者の認識は
、バクテリオファージの治療上の有効性についてのメカニズムを提供し、並びに治療及び
診断の新規分類の基礎を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
アミロイドに結合するポリペプチドを含む医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１個の遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）又はそのアミロイド結合フラグメント、及び医薬的に許容される担体を含み、ここで、前記組成物がバクテリオファージを含まない、医薬組成物。
（項目２）
前記ポリペプチドがｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、項目１記載の医薬組成物。
（項目３）
前記ポリペプチドがｇ３ｐの全Ｎ２ドメインを含む、項目２記載の医薬組成物。
（項目４）
前記ポリペプチドがｇ３ｐのＮ１ドメインのフラグメントを更に含む、項目２または３に記載の医薬組成物。
（項目５）
前記ポリペプチドがｇ３ｐの全Ｎ１ドメインを更に含む、項目２または３に記載の医薬組成物。
（項目６）
前記ポリペプチドがｇ３ｐを含む、項目１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
（項目７）
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドに共有結合又は非共有結合のいずれかで結合した担体を更に含む、項目１〜６のいずれか１項記載の医薬組成物。
（項目８）
前記ポリペプチド中に存在する少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントのアミノ酸配列が、野生型ｇ３ｐの対応する部分のアミノ酸配列と同一である、項目１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
（項目９）
前記ポリペプチド中に存在する少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントが、変異体ｇ３ｐである、項目１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
（項目１０）
ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントのアミノ酸配列が、配列番号：１〜２０のいずれか１つの対応する部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％同一である、項目１〜９のいずれか１項記載の医薬組成物。
（項目１１）
前記ポリペプチドがｇ３ｐのＮ１及びＮ２ドメインを含み、Ｎ２のヒンジ領域が、ヒンジＴｍが野生型Ｍ１３ファージのヒンジＴｍより低くなるよう、変異誘発され、前記ポリペプチドがＭ１３より高い親和性でアミロイドに結合する、項目９又は１０記載の医薬組成物。
（項目１２）
アミロイドに結合する第１のドメインを含む融合タンパク質であって、第１のドメインが、少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント；及び第２のドメインを含む、融合タンパク質。
（項目１３）
前記第１のドメインがｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、項目１２記載の融合タンパク質。
（項目１４）
前記第１のドメインが全Ｎ２ドメインを含む、項目１２又は１３記載の融合タンパク質。
（項目１５）
前記第１のドメインがｇ３ｐのＮ１ドメインのフラグメントを更に含む、項目１３又は１４記載の融合タンパク質。
（項目１６）
前記第１のドメインがｇ３ｐの全Ｎ１ドメインを更に含む、項目１３又は１４記載の融合タンパク質。
（項目１７）
前記第１のドメイン中に存在する少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントのアミノ酸配列が、野生型ｇ３ｐの対応する部分のアミノ酸配列と同一である、項目１２〜１６のいずれか１項記載の融合タンパク質。
（項目１８）
前記融合タンパク質中に存在する少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントが変異体又は変種ｇ３ｐである、項目１２〜１７のいずれか１項記載の融合タンパク質。
（項目１９）
前記第１のドメインが、アミロイドに結合する能力を保持し、配列番号：１〜２０のいずれか１つのアミノ酸配列の対応する部分で整列させたとき、わずか７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を含むアミノ酸配列を有するｇ３ｐの変異体又は変種、又はそのフラグメントを含む、項目１８記載の融合タンパク質。
（項目２０）
前記第１のドメインが、ｇ３ｐのＮ１及びＮ２ドメインフラグメントを含み、Ｎ１及びＮ２ドメインの少なくとも１つが、アミロイドに結合するフラグメントの能力を破壊しない変異を含み、Ｎ１及びＮ２ドメインフラグメントが、配列番号：１〜２０のいずれか１つの対応するアミノ酸で整列させたとき、わずか７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を含むアミノ酸配列を有する、項目１８記載の融合タンパク質。
（項目２１）
前記第２のドメインが免疫グロブリン定常領域を含む、項目１２〜２０のいずれか１項記載の融合タンパク質。
（項目２２）
前記免疫グロブリン定常領域がＦｃフラグメントである、項目２１記載の融合タンパク質。
（項目２３）
前記Ｆｃフラグメントが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭのＦｃフラグメントから選択される、項目２２記載の融合タンパク質。
（項目２４）
配列番号：９、配列番号：１１、又は配列番号：１３に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１２記載の融合タンパク質。
（項目２５）
配列番号：９、配列番号：１１、又は配列番号：１３と同一であるアミノ酸配列を含む、項目２４記載の融合タンパク質。
（項目２６）
項目１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
（項目２７）
変異体又は変種ｇ３ｐを発現する単離糸状ファージを含む、医薬組成物。
（項目２８）
変異体又は変種ｇ３ｐのアミノ酸配列が、配列番号：１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である、項目２７記載の医薬組成物。
（項目２９）
５以上のコピーのｇ３ｐ、又は５以上のコピーの変異体又は変種ｇ３ｐを発現する単離糸状ファージを含む、医薬組成物。
（項目３０）
必要とする患者において、アミロイドの低減、アミロイド形成の阻害、アミロイド凝集
の阻害、又は毒性オリゴマーの形成の除去及び／又は予防において使用するための、項目１〜１１又は２６〜２９のいずれか１項記載の医薬組成物、又は項目１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質。
（項目３１）
早発型アルツハイマー病、後発型アルツハイマー病、及び発症前アルツハイマー病を含むアルツハイマー病；パーキンソン病；ＳＡＡアミロイド症；シスタチンＣ；遺伝性アイスランド症候群；老衰；多発性骨髄腫；クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピー、及びウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含むプリオン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、又はＳＣＡ７）；ハンチントン病；歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症；球脊髄性筋萎縮症；遺伝性脳アミロイド血管症；家族性アミロイドーシス；前頭側頭葉型認知症；イギリス型／デンマーク型認知症；及び家族性脳症から選択される疾患又は状態の処置において用いるための、項目１〜１１又は２６〜２９のいずれか１項記載の医薬組成物、又は項目１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質。
（項目３２）
患者が、バイオマーカーがポジトロン放出断層撮影においてイメージング剤として用いられるとき、バイオマーカーフロルベタピルに対して陽性である、項目３０又は３１記載の医薬組成物。
（項目３３）
疾患又は状態がパーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である、項目３０〜３２のいずれか１項記載の医薬組成物。
（項目３４）
疾患又は状態がアルツハイマー病である、項目３３記載の医薬組成物。
（項目３５）
疾患又は状態がプリオン病である、項目３１記載の医薬組成物。
（項目３６）
プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、致死性家族性不眠症、及びゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群から選択される、項目３５記載の医薬組成物。
（項目３７）
必要とする患者におけるアミロイドの低減方法であって、患者に有効量の項目１〜１１又は２６〜２９のいずれか１項記載の医薬組成物、又は項目１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
（項目３８）
患者が、アミロイドの存在と関連する神経変性疾患の症状を示している、項目３７記載の方法。
（項目３９）
患者が、バイオマーカーがポジトロン放出断層撮影においてイメージング剤として用いられるとき、バイオマーカーフロルベタピルに対して陽性である、項目３７又は３８記載の方法。
（項目４０）
神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である、項目３７〜３９のいずれか１項記載の方法。
（項目４１）
神経変性疾患がアルツハイマー病である、項目４０記載の方法。
（項目４２）
患者が、プリオンにより仲介される疾患の症状を示している、項目３７記載の方法。
（項目４３）
プリオンにより仲介される疾患が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、致死性家族性不眠症、又はゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群から選択される、項目４２記載の方法。
（項目４４）
アミロイドに結合するポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドがｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントを含み、ポリペプチドが配列番号：１に対してｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント中に１個以上の変異を含み、変異がＱ１２９Ｈ、Ｇ１５３Ｄ、Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａからなる群より非限定的に選択される、核酸。
（項目４５）
ポリペプチドが、ｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、項目４４記載の核酸。
（項目４６）
項目４４又は４５記載の核酸を含む、ベクター。
（項目４７）
項目４６記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目４８）
アミロイドに結合するポリペプチドの製造方法であって、ポリペプチドがｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントを含み、ポリペプチドが配列番号：１に対してＮ２中に１個以上の変異を含み、変異がＱ１２９Ｈ、Ｇ１５３Ｄ、Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａからなる群より非限定的に選択され、項目４６記載のベクター中の核酸によりコードされるポリペプチドを発現させ、発現したタンパク質を単離する、を含む方法。
（項目４９）
ポリペプチドが、ｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、項目４８記載の方法。
（項目５０）
項目１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（項目５１）
項目５０記載の核酸を含む、ベクター。
（項目５２）
項目５１記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目５３）
項目１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質の製造方法であって、項目５１記載のベクター中の核酸によりコードされる融合タンパク質を発現させ、発現した融合タンパク質を単離する、を含む方法。
（項目５４）
組成物中のポリペプチド又は融合タンパク質が更に検出可能な標識を含む、項目１〜１１のいずれか１項記載の医薬組成物、又は項目１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質。
（項目５５）
標識が、１８Ｆ、１１Ｃ、又は１２３Ｉから選択される放射性標識である、項目５４記載の医薬組成物又は融合タンパク質。
（項目５６）
ａ）患者に項目５４記載の医薬組成物又は融合タンパク質を投与し；
ｂ）標識を検出する
工程を含む、患者におけるアミロイドの検出方法。
（項目５７）
標識がポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）により検出される、項目５６記載の方法。
（項目５８）
項目５４又は５５記載の組成物を含む、イメージング剤。
（項目５９）
患者におけるアミロイドと関連する疾患又は異常の診断方法であって、
ａ）患者に項目５８記載のイメージング剤を投与し；
ｂ）存在するアミロイドのいずれかに前記イメージング剤を結合させ；
ｃ）アミロイドに結合したイメージング剤を検出し；
ｄ）イメージング剤が検出された場合に、アミロイドと関連する疾患又は異常を診断する工程を含む、方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】図１は、ｇ３ｐのＮ１及びＮ２ドメイン、及びヒンジのリボン構造を表す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、及びＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）及びＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、及びＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）及びＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、及びＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）及びＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。
【図３】図３Ａは、ファージ結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）調査を表す。Ａβ原線維への結合を、Ａβモノマーへの結合と、バイオセンサーチップを横切って流した１０１４ファージ／ｍＬを用いて比較した。図３Ｂは、図３Ａに示すＳＰＲデータから計算したＫａ、Ｋｄ、及びＫＤを示す。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、結合研究を提示する。図４Ａは、増加モル量のｆＡβ４２を用いた２種のファージ用量（１０１１／ｍＬ及び１０１２／ｍＬ）についての直接結合アッセイを示す。図４Ｂは、結合競合研究であり、Ｍ１３結合のＫＤを決定する代替方法を提供する。コンストラクト１を用いた。
【図５】図５は、アミロイド線維結合競合アッセイにおいて加熱変性（四角−９０℃、１０分間）対天然の構造（丸）Ｍ１３（コンストラクト１）を用いた結合競合結果を示す。
【図６】図６は、２種の濃度のＭ１３ファージ（コンストラクト１）の存在下又は不存下でインキュベーションしたｆＡβ４２を用いたチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイを示す。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ＴｈＴ脱凝集アッセイにおいて個々のアッセイパラメーターを変動する作用を示す。図７Ａは、２種の塩濃度（０．１５Ｍ及び１．５Ｍ）の存在下での脱凝集パーセンテージを示す。図７Ｂは、２種の温度（４℃及び３７℃）で残存するｆＡβのパーセンテージを示す。コンストラクト１を用いた。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、ｆＡβ４２を用いたＭ１３アミロイド結合アッセイを表す。図８Ａにおいて、Ｍ１３結合は、温度１８℃〜５８℃、３時間のインキュベーションを用いて報告する。図８Ｂは、３７℃対５０℃でのインキュベーションについての結合速度論を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ファージとアミロイドの相互作用に対するｇ３ｐのタンパク分解性除去の作用を示す。タンパク質分解酵素ＡｒｇＣを用いて、ｇ３ｐをＭ１３ファージから取り出した（Ｍ１３Δｇ３ｐ）。図９Ａは、天然（ＡｒｇＣ処置ファージと同じだが、タンパク質分解酵素処置なしで処置した）ファージと比較した、Ｍ１３Δｇ３ｐファージを用いたＡβ結合競合研究の結果を示す。図９Ｂは、天然ファージと比較したＭ１３Δｇ３ｐファージの感染性に対するＡｒｇＣ処置の作用を示す。図９Ｃは、脱凝集アッセイにおいて、ＡｒｇＣ処置ファージを天然ファージに比較する。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメント（本明細書において、組み換え可溶性Ｎ１Ｎ２（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）；「コンストラクト３」としても言及される）、Ｍ１３Δｇ３ｐ（ＡｒｇＣ処置）、及びＭ１３をｆＡβ４２への標識Ｍ１３結合の競合相手として用いた、結合競合アッセイの結果を示す。図１０Ｂは、競合アッセイの繰り返しを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメント（本明細書において、組み換え可溶性Ｎ１Ｎ２（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）；「コンストラクト３」としても言及される）、Ｍ１３Δｇ３ｐ（ＡｒｇＣ処置）、及びＭ１３をｆＡβ４２への標識Ｍ１３結合の競合相手として用いた、結合競合アッセイの結果を示す。図１０Ｂは、競合アッセイの繰り返しを示す。
【図１１】図１１は、ファージｆｄ、ＩＩＨＹ、ＡＡＡ、及びＭ１３について競合データを示す。ファージｆｄ、ＡＡＡ、及びＩＩＨＹを、５０℃、１．５時間で予め活性化し、次に、活性化及び非活性化Ｆｄ、ＡＡＡ、及びＩＩＨＹを、３７℃、４５分間のインキュベーション中にＡβへの結合について標識Ｍ１３と競合する能力について比較した。
【図１２】図１２Ａは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）の模式図を示す。図１２Ｂは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）についてのイオン交換プロファイルを示す。図１２Ｃは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を用いたゲル濾過アッセイの結果を示す。図１２Ｄは、ｇ３ｐ及びｇ８ｐ対照を伴った、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のウエスタンブロットを示す。Ｍ１３ファージを、レーン１及び２においてポジティブコントロールとして泳動し、ｇ８ｐとｇ３ｐの両方を検出するポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。精製ｒｓ−ｇ３ｐを、レーン３及び４において泳動し、同じポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。
【図１３】図１３は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）を用いたＳＰＲデータを示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）は、ｆＡβ４２にＫＤ約１６０ｎＭで強く結合するが、モノマーと結合しない。
【図１４】図１４は、所定の試料中に存在するアミロイドを測定するために用いたＴｈＴ蛍光アッセイを示す。１０μＭ  Ａβ４２モノマーを、５種類の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）の存在下又は不存下、３７℃で３日間インキュベーションした。３日目の終わりに、形成された線維の量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定した。ＩＣ５０は約２０ｎＭであり、これは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がＡβ４２線維の形成を強く阻害することを示している。図はまた、結合が用量依存性であることを示す。
【図１５】図１５Ａは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）の存在下又は不存下でのｆＡβ４２のインキュベーションの透過電子ミクロ組織検査（ＴＥＭ）結果を示す。図１５Ｂは、３７℃で７日間インキュベーションしたＡβ４２及び２μＭ  ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）を用いたＴｈＴ蛍光アッセイの結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）はｆＡβ４２の形成を阻害する。
【図１６】図１６は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）がα−シヌクレイン線維の形成を強く阻害することを示す。２５μＭα−シヌクレインを、３００ｒｐｍ、４日間、３７℃での撹拌により構築した（バー１を参照）。グラフ上の第２のバーは、３７℃で３日間振盪したα−シヌクレインモノマー及び１×１０−１３５量体Ｍ１３ファージを表す。バー２に示される結果は、５量体Ｍ１３がα−シヌクレイン線維の構築を阻害することを示す。グラフ上の第３のバーは、α−シヌクレインモノマー及び８３ｎＭ  ｒｓｇ３ｐモノマーを表す。バー３に示される結果は、モノマーが、５量体Ｍ１３よりα−シヌクレイン線維形成の阻害においてほとんど有効でないことを示す。バー４は、時間０でのα−シヌクレインモノマーを示すネガティブコントロールである。バー５において、α−シヌクレイン線維のないｇ３ｐモノマーは、ｇ３ｐがｐＴＡＡに結合し、線維への結合から染料を隔離するかどうかを決定するために示される。バー５に示される結果は、ｇ３ｐがｐＴＡＡに結合しないことを示した。
【図１７】図１７は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）、Ｍ１３（コンストラクト２）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（コンストラクト４）、及びＩｇＧ４−Ｆｃネガティブコントロールについての競合結合データを示す。
【図１８】図１８は、Ｍ１３（コンストラクト２；四角形）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３；三角形）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（コンストラクト４；上下逆の三角形）、及び組み換えＩｇＧ４−Ｆｃネガティブコントロール（菱形）を比較した競合結合データを示す。
【図１９】図１９は、５種類の濃度のＡβ４２線維＋又は−２種の濃度のＭ１３（コンストラクト２）、８００ｎＭ  ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）、及び３種の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（コンストラクト４）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。
【図２０】図２０は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３；「モノマー」）及びストレプトアビジン結合ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（「ＳＡ［ｇ３ｐＮ１Ｎ２］ｎ＝２−４」；「ＳＡ−ｇ３ｐ」；「テトラマー」）についての競合結合データを示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）及びＳＡ−ｇ３ｐを、３７℃での３時間のインキュベーション中のＡβへの結合について、標識Ｍ１３と競合する能力について比較した。
【図２１】図２１は、５種類の濃度のｆＡβ４２＋又は−２種の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３；「モノマー」）、及び２種の濃度のＳＡ−ｇ３ｐ（「テトラマー」）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。
【図２２】図２２Ａ及び２２Ｂは、時間０でのｆＡβ４２のＴＥＭ（図２２Ａ）、及びＳＡ−ｇ３ｐとのインキュベーションの３日後（図２２Ｂ）のＴＥＭを示す。
【図２３】図２３は、１つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃコンストラクト「コンストラクト４」のアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。「コンストラクト４」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト１」のＮ１Ｎ２領域に由来する（配列番号：１０）。
【図２４】図２４は、別のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃコンストラクト「コンストラクト５」のアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。「コンストラクト５」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト２」のＮ１Ｎ２領域に由来する（配列番号：１２）。
【図２５】図２５は、１つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃコンストラクト「コンストラクト６」のアミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。「コンストラクト６」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト２」のＮ１Ｎ２領域に由来する。
【図２６】図２６は、ｆｄ（配列番号：１４）、ｆ１（配列番号：１５）、Ｍ１３（配列番号：１６）、Ｉｋｅ（配列番号：１７）、Ｉ２−２（配列番号：１８）、及びＩｆ１（配列番号：１９）由来のＮ２のアミノ酸配列アライメントを示す。アスタリスク「＊」は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示す。コロン「：」は、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０マトリックスにおいて０．５より高い値を示す非常に類似する特性の群間の保存を示す。ピリオド「．」は、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０マトリックスにおいて０．５以下の値を示す若干類似する特性の群間の保存を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、コンストラクト３の図を示す。図２７Ｂは、コンストラクト３のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、コンストラクト３のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ａは、コンストラクト３の図を示す。図２７Ｂは、コンストラクト３のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、コンストラクト３のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図２７Ｃ】図２７Ａは、コンストラクト３の図を示す。図２７Ｂは、コンストラクト３のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、コンストラクト３のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図２８】図２８は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、アミロイドβを低減する能力について２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（コンストラクト５）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の両方が、アルツハイマー病マウスの海馬においてアミロイドβのレベルを有意に低減した。
【図２９】図２９は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、アミロイドβを低減する能力について、２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（コンストラクト５）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の両方が、アルツハイマー病マウスの大脳皮質においてアミロイドβのレベルを有意に低減することができた。
【図３０】図３０は、Ａβ４２のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）でのアセンブリー阻害を示す。図３０Ａは、ＳＤＳを用いないで作った「天然」アガロースゲルを示す。試料を、ＳＤＳを含まず、ボイルしていないＴＥＡバッファー中で泳動した。結果は、コンストラクト６がｆＡβ４２のアセンブリーを阻害できることを示す。図３０Ｂは、所定の試料中に存在するアミロイドを測定するために用いたＴｈＴ蛍光アッセイを示す。１０μＭ  Ａβ４２モノマーを、２種類の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の存在下又は不存下、３７℃で１日間インキュベーションした。１日目の終わりに形成された線維の量を、結合したＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定した。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図はまた、コンストラクト６での線維形成の阻害が用量依存であることを示す。
【図３１Ａ】図３１は、Ａβ４２アセンブリーがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体及びβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２＋コンストラクト３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。コンストラクト３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのコンストラクト３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリーを阻害するコンストラクト３の能力を確認する。
【図３１Ｂ】図３１は、Ａβ４２アセンブリーがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体及びβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２＋コンストラクト３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。コンストラクト３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのコンストラクト３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリーを阻害するコンストラクト３の能力を確認する。
【図３１Ｃ】図３１は、Ａβ４２アセンブリーがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体及びβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２＋コンストラクト３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。コンストラクト３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのコンストラクト３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリーを阻害するコンストラクト３の能力を確認する。
【図３１Ｄ】図３１は、Ａβ４２アセンブリーがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体及びβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２＋コンストラクト３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。コンストラクト３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのコンストラクト３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリーを阻害するコンストラクト３の能力を確認する。
【図３２】図３２は、Ｍ１３（コンストラクト２）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）が、Ｎ２ａ細胞のオリゴマーにより誘導される毒性をブロックすることを示す代表的なデータを示す。例えば、Ｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８（１３）：  １１６１２−１１６２２、及びＳｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｅｒｉｋ  Ｄ．  Ｒｏｂｅｒｓｏｎ  （ｅｄ．）  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ６７０：  １３−３２を参照。処置前４８時間の血清飢餓状態により、Ｎ２ａ細胞を分化させた。Ａβ４２オリゴマー（２μＭ）を、Ｎ２ａ細胞に添加する前に、コンストラクト２及びコンストラクト６と、３７℃で３時間プレインキュベーションした。時間ゼロ（「ＴＯ」）複合体はプレインキュベーションしなかった。インキュベーション２４時間後、アデニル酸キナーゼ（「ＡＫ」）放出をモニターした。培地中へのＡＫ放出は細胞死／溶解を示す。Ａβ４２オリゴマーをＳｔｉｎｅ  ｅｔ．ａｌ．，  ２０１１により記載される通り作成した。結果は、Ｍ１３及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃは、毒性オリゴマーの強力な阻害剤であることを示す。
【図３３】図３３は、６種類の濃度のＡβ４２線維＋又は−１×１０１２／ｍｌ  Ｍ１３（コンストラクト２）；８０ｎｍ及び８００ｎＭ  ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃコンストラクト（コンストラクト５）；及び８０ｎｍ及び８００ｎＭ  ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。Ａβ４２線維を、コンストラクト２、５、及び６と３７℃で３日間インキュベーションし、その後濾過遅延した。フィルターを、フィルターにトラップされたＡβ４２線維を認識するｍＡｂ６Ｅ１０（１：１５０００）により調べた。８００ｎＭコンストラクト５又はコンストラクト６は、分子モル濃度５×１０１４／ｍｌコンストラクト２と同等である。結果は、コンストラクト２、５、及び６がβ−アミロイド線維を強力に脱凝集させることを示す。
【図３４】図３４Ａ及び３４Ｂは、ｆｔａｕとのプレインキュベーションの３時間後、ｆＡβ４２に結合したＭ１３（コンストラクト２）の量を測定するために用いた代表的アッセイを示す。コンストラクト２に結合した、５μＭ  Ａβ４２モノマーを、４種類の濃度のｆｔａｕの存在下又は不存下、３７℃で３時間インキュベーションした。ｆＡｂｅｔａ：Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８はペレット形成するが、ｆｔａｕ：Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８はペレット形成せず、ペレット形成した物質からの蛍光の消失の測定は、ｆｔａｕがｆＡｂｅｔａ結合と競合することを示す。故に、３時間後、形成されたＭ１３−ｆＡβの量を、ペレット形成結合競合反応におけるＡｌｅｘａ４８８蛍光を定量化することにより測定した。結果は、ｆｔａｕが、ｆＡβ４２結合に対してＭ１３−Ａｌｅｘａ４８８（コンストラクト２）と競合できることを示す。
【図３５】図３５は、ｆｔａｕに結合するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（コンストラクト４）の能力を試験する１つの代表的ＳＰＲアッセイの結果を示す。結果は、コンストラクト４がｆｔａｕと強力に結合することを示す。
【図３６Ａ】図３６は、ｆｔａｕを脱凝集させるｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す。タウ線維を、４０μＭ  タウの微小管結合反復領域（「ＭＴＢＲ」）を５０ｍＭスーパーオキシドジスムターゼ（「Ｓｏｄ」）に希釈することにより、調製した。種々の濃度のコンストラクト６及び予め調製したｆｔａｕを、酢酸バッファー中、ｐＨ７．０、３７℃、７２時間インキュベーションした。ＴｈＴ蛍光を、５倍を超えるＴｈＴの存在下で記録した。図３６Ａは、ｆｔａｕを脱凝集させるコンストラクト６の能力を示す代表的ＴｈＴアッセイの結果を示す。図３６Ｂは、タウを脱凝集させるコンストラクト６の能力を確認する別の代表的な実験を示す。図３６Ａ及び３６Ｂはまた、コンストラクト６によるｆｔａｕの脱凝集が用量依存性であることを示す。
【図３６Ｂ】図３６は、ｆｔａｕを脱凝集させるｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す。タウ線維を、４０μＭ  タウの微小管結合反復領域（「ＭＴＢＲ」）を５０ｍＭスーパーオキシドジスムターゼ（「Ｓｏｄ」）に希釈することにより、調製した。種々の濃度のコンストラクト６及び予め調製したｆｔａｕを、酢酸バッファー中、ｐＨ７．０、３７℃、７２時間インキュベーションした。ＴｈＴ蛍光を、５倍を超えるＴｈＴの存在下で記録した。図３６Ａは、ｆｔａｕを脱凝集させるコンストラクト６の能力を示す代表的ＴｈＴアッセイの結果を示す。図３６Ｂは、タウを脱凝集させるコンストラクト６の能力を確認する別の代表的な実験を示す。図３６Ａ及び３６Ｂはまた、コンストラクト６によるｆｔａｕの脱凝集が用量依存性であることを示す。
【図３７Ａ】図３７は、経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋又は−種々の濃度のコンストラクト３及びコンストラクト６で凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは結果を概説する。
【図３７Ｂ】図３７は、経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋又は−種々の濃度のコンストラクト３及びコンストラクト６で凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは結果を概説する。
【図３７Ｃ】図３７は、経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋又は−種々の濃度のコンストラクト３及びコンストラクト６で凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは結果を概説する。
【図３７Ｄ】図３７は、経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋又は−種々の濃度のコンストラクト３及びコンストラクト６で凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは結果を概説する。
【図３８Ａ】図３８Ａ及び図３８Ｂは、ＰｒＰのＰｒＰ−Ｓｃへの変換を阻害するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す実験の結果を示す。コンストラクト６及びＩｇＧ細胞溶解物を、超遠心分離の対象にし、可溶性（上清）及び不溶性（ペレット）ＰｒＰ種を分離させた。ＰｒＰ種を、抗ＰｒＰモノクローナル抗体（６Ｄ１１）で生化学的に視覚化した。ＩｇＧの存在下、可溶性及び不溶性分画の両方にＰｒＰを分配する。コンストラクト６の存在下、可溶性ＰｒＰ中に限定される。データはｎ＝４を表す。
【図３８Ｂ】図３８Ａ及び図３８Ｂは、ＰｒＰのＰｒＰ−Ｓｃへの変換を阻害するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す実験の結果を示す。コンストラクト６及びＩｇＧ細胞溶解物を、超遠心分離の対象にし、可溶性（上清）及び不溶性（ペレット）ＰｒＰ種を分離させた。ＰｒＰ種を、抗ＰｒＰモノクローナル抗体（６Ｄ１１）で生化学的に視覚化した。ＩｇＧの存在下、可溶性及び不溶性分画の両方にＰｒＰを分配する。コンストラクト６の存在下、可溶性ＰｒＰ中に限定される。データはｎ＝４を表す。
【図３９Ａ】図３９Ａ及び図３９Ｂは、プリオン病の細胞培養モデルにおける、ＰｒＰＳｃの蓄積及び凝集を低減するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す実験の結果を示す。図３９Ａは、コンストラクト６及びＩｇＧでの処置後、生化学的に溶解された未切断及びＰＫ切断Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞溶解物を示す。ＰｒＰＳｃレベルの有意な低減を、増加濃度のコンストラクト６で処理した細胞において明確に観察する。ＰｒＰＳｃレベルの約５０％低減を、〜０．０８μｇ／ｍｌコンストラクト６の処置で達成する。１０μｇ／ｍｌコンストラクト６での処理は、ＰｒＰＳｃを５．７２５％、ｐ＜０．０００１まで低減する。ＰｒＰＳｃレベルの顕著な変化を、１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧで処理したＮ２Ａ２２ＬＳｃ細胞において観察しなかった。図３９Ｂについて、Ｘ線フィルムを続いてデジタル化し、１００％であると見なされる同一の継代由来のＩｇＧ処理Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞における効果に対して最初に正規化した。次に、ＰＫ切断ブロット由来の濃度測定データを、等しくブロッとした未切断の溶解物に対して分析し、パーセント変化ＰｒＰＳｃ／ＰｒＰｃとして表した。データはｎ＝４を表す。
【図３９Ｂ】図３９Ａ及び図３９Ｂは、プリオン病の細胞培養モデルにおける、ＰｒＰＳｃの蓄積及び凝集を低減するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す実験の結果を示す。図３９Ａは、コンストラクト６及びＩｇＧでの処置後、生化学的に溶解された未切断及びＰＫ切断Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞溶解物を示す。ＰｒＰＳｃレベルの有意な低減を、増加濃度のコンストラクト６で処理した細胞において明確に観察する。ＰｒＰＳｃレベルの約５０％低減を、〜０．０８μｇ／ｍｌコンストラクト６の処置で達成する。１０μｇ／ｍｌコンストラクト６での処理は、ＰｒＰＳｃを５．７２５％、ｐ＜０．０００１まで低減する。ＰｒＰＳｃレベルの顕著な変化を、１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧで処理したＮ２Ａ２２ＬＳｃ細胞において観察しなかった。図３９Ｂについて、Ｘ線フィルムを続いてデジタル化し、１００％であると見なされる同一の継代由来のＩｇＧ処理Ｎ２ａ２２ＬＳｃ細胞における効果に対して最初に正規化した。次に、ＰＫ切断ブロット由来の濃度測定データを、等しくブロッとした未切断の溶解物に対して分析し、パーセント変化ＰｒＰＳｃ／ＰｒＰｃとして表した。データはｎ＝４を表す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本明細書で用いられる「コンストラクト１」は、野生型Ｍ１３（Ｇｅｎｂａｎｋファイル：ＮＣ＿００３２８７．２、バージョンＧＩ：５６７１８４６３を参照）からもたされる。コンストラクト１において、野生型Ｍ１３と比較して、Ｓｅｒ３７８（ＡＧＣ）はＧｌｙ（ＧＧＣ）に変更され、Ｉｌｅ８７（ＡＴＴ）はＡｓｎ（ＡＡＣ））に変更される。コンストラクト１は、配列番号：１０の核酸を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
「コンストラクト２」は、野生型Ｍ１３単離物（ＧｅｎＢａｎｋ  ＪＸ４１２９１４．１）である。コンストラクト２は、配列番号：１２の核酸を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２７Ａ】
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