(57)【要約】【課題】組換えイズロン酸２スルファターゼを製造するための細胞の提供。【解決手段】本発明は、数ある中で、Ｉ２ＳおよびＦＧＥタンパク質を共発現する細胞を使用して、改善された効力および活性を有する組換えＩ２Ｓタンパク質を製造するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に記載の細胞は、組換えＩ２ＳおよびＦＧＥタンパク質を同時に過剰発現するように操作される。本発明の細胞は、様々な細胞培養条件に適応できる。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は大規模な懸濁無血清培養に適応できる。【選択図】図２
2018088933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年６月２９日に提出した米国仮出願第６１／６６６，７１９号に基づく優先権を主張するものであり、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
配列表
本発明の明細書は、２０１３年６月２７日に「２００６６８５−００３４０＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ」と名付けたＡＳＣＩＩテキストファイルとして電子形式で提出された配列表を参照する。当該テキストファイルは２０１３年６月２５日に生成され、サイズは２５ＫＢである。配列表の全内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群）は、酵素イズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の欠損から生じるＸ染色体劣性リソソーム貯蔵障害である。Ｉ２Ｓは、末端２−Ｏ−硫酸部分をグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸から切断する。ハンター症候群の患者のＩ２Ｓ酵素が失われたか欠陥があることにより、ＧＡＧが、様々な細胞型のリソソームに進行的に蓄積し、細胞の拡張、臓器肥大、組織破壊、および臓器系の機能不全を引き起こす。
【０００４】
一般的に、ハンター症候群の人々の身体的徴侯には、身体的な症状とニューロンの症状の両方がある。例えば、ハンター症候群のいくつかの事例では、中枢神経系の関与が発育遅延および神経系の問題を引き起こす。ハンター症候群の非ニューロン症状は、誕生時には通常ないものの、時が経過するにつれて身体の細胞にＧＡＧが進行的に蓄積することによって、身体の周辺組織に劇的な影響をもたらす可能性がある。周辺組織のＧＡＧの蓄積は、患者の顔特徴に特有の粗悪さをもたらし、突起した額、平坦な鼻梁および肥大した舌を招き、ハンター患者の顕著な特徴である。同様に、ＧＡＧの蓄積は身体の臓器系に有害に影響する可能性がある。初期に、心臓、肺および気道の壁が厚くなり、肝臓、脾臓および腎臓の異常な肥大といった徴侯が見られ、これらの重大な変化は、究極的には、破滅的な臓器不全を拡散させる可能性がある。結果として、ハンター症候群は常に重症であり、進行性であり、寿命を制限する。
【０００５】
酵素補充療法（ＥＲＴ）はハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）を治療するための承認された療法であり、ハンター症候群の患者に、外因性補充Ｉ２Ｓ酵素を投与することを伴う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、数ある中で、ハンター症候群の酵素補充療法をより効果的にする組換えＩ２Ｓタンパク質を製造するための改善した方法および組成物を提供する。本発明は、組換えＩ２Ｓタンパク質およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現するために操作された哺乳類の細胞によって、もっと強力な組換えＩ２Ｓタンパク質を製造することができることを発見したことを包含する。意外なことに、このように操作された細胞によって産生された組換えＩ２Ｓタンパク質は、尋常でないほど高いレベルのＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）転換率（例えば、７０％超、最大１００％）を有し、組換えＩ２Ｓタンパク質の酵素活性を著しく向上させる。さらに、本発明のＩ２ＳおよびＦＧＥタンパク質を共発現する哺乳類細胞は、大規模の懸濁培養中でうまく適応した。したがって、本発明は、極めて強力な組換えＩ２Ｓタンパク質を、より効果的で大規模に製造することができる。
【０００７】
したがって、ある態様では、本発明は、配列番号１と少なくとも約５０％同一（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）のアミノ酸配列を有するイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質をコードする第一の核酸を含む細胞を提供し、および配列番号５と少なくとも約５０％同一の（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）のアミノ酸配列を有するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）タンパク質をコードする第二の核酸を提供し、ここで、第一および／または第二の核酸は外因性であり、細胞培養条件下（例えば、懸濁または付着性培養）で一度は培養した細胞は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）転換することを含むＩ２Ｓタンパク質を産生する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、配列番号１と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一のアミノ酸配列を有するイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質をコードする第一の核酸を含む細胞を提供し、および配列番号５と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一のアミノ酸配列を含むホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）タンパク質をコードする第二の核酸を提供し、ここで、第一および／または第二の核酸は外因性であり、細胞培養条件下で一度は培養した細胞は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）転換することを含むＩ２Ｓタンパク質を産生し、比生産率は約１０ピコグラム／細胞／日超（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ピコグラム超／細胞／日超）である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、第一の核酸は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有するＩ２Ｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第二の核酸は、配列番号５と同一のアミノ酸配列を有するＦＧＥタンパク質をコードする。
【００１０】
いくつかの実施形態では、第一および／または第二の核酸は、操作可能にｈＣＭＶプロモータと結合する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第一および／または第二の核酸では、コドンが最適化されている。いくつかの実施形態では、第一の核酸は、配列番号７と、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一の配列を有する。特定の実施形態では、第一の核酸は、配列番号７の配列を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第二の核酸は、配列番号８と、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、第二の核酸は配列番号８と同一の配列を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、第一および第二の両方の核酸は（組換えとして言及もされる）外因性である。いくつかの実施形態では、第一および／または第二の核酸は、細胞のゲノム内に（例えば安定して）組み込まれる。いくつかの実施形態では、第一および／または第二の核酸は、１つ以上の染色体外の構築物中に存在する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は哺乳類の細胞である。ある実施形態では、適した哺乳類の細胞はヒト細胞である。ある実施形態では、適した哺乳類の細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は懸濁培養に適応することができる。他の実施形態では、本発明の細胞は付着性である。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、組換えＩ２ＳおよびＦＧＥタンパク質が細胞内に共発現するような条件下で、本明細書の様々な実施形態に記載の細胞を培養することによって、組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞を大規模に培養する。いくつかの実施形態では、本発明に適した大規模とは、バイオリアクタープロセスである。いくつかの実施形態では、本発明に適したバイオリアクターの規模は１０Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、２０００Ｌから選択される。いくつかの実施形態では、本発明に適した大規模な（例えばバイオリアクター）プロセスは、灌流プロセスを伴う。いくつかの実施形態では、本発明に適した大規模な（例えばバイオリアクター）プロセスは、バッチ培養を伴う。いくつかの実施形態では、本発明に適した大規模なプロセスは、ローラーボトルプロセスである。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は懸濁中に培養される。他の実施形態では、本発明の細胞は付着性に培養される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、無血清培地（例えば、無動物、既知組成、または無タンパク質培地）中で培養される。他の実施形態では、本発明の細胞は、血清を含む培地中で培養される。
【００１８】
様々な実施形態では、本発明の方法は、組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するステップをさらに含む。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、本明細書の様々な実施形態に記載の細胞または方法によって製造される組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の調製を提供し、当該Ｉ２Ｓタンパク質は配列番号１と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一のアミノ酸配列を有し、および配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）転換することを含む。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、基質としてヘパリン二糖を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイによって決定されるように、少なくとも約２０Ｕ／ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、または１００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。
【００２１】
数ある中で、本発明は、本明細書の様々な実施形態に記載の組換えＩ２Ｓタンパク質を含む医薬組成物、および薬剤的に許容可能な担体、並びに本明細書に記載の組換えＩ２Ｓタンパク質または同タンパク質を含む医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与することによって、ハンター症候群を治療する方法も提供する。
【００２２】
本明細書に使用されるように、用語「Ｉ２Ｓタンパク質」、「Ｉ２Ｓ」、「Ｉ２Ｓ酵素」、または文法的に等価な用語は、別に特に示されなければ、組換えＩ２Ｓタンパク質分子を調製することを意味する。
【００２３】
当該出願に使用されるように、用語「約」および「およそ」は等価なものとして使用される。約／およそを付けたまたは付けていない当該出願に使用される数字は、関連技術分野の当業者によって認識される通常の増減を含むことを意味する。
【００２４】
本発明のその他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な記述で明らかにする。しかしながら、詳細な記述は、本発明の実施形態を示すが、説明のためだけにあり、限定することを意味しないことを理解されたい。本発明の範囲内での様々な変更または修正は、詳細な記述から、当業者に明白であろう。
上記に加え、本発明は以下を提供する。
（項目１）
配列番号１に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質をコードする第一の核酸；および
配列番号５に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）タンパク質をコードする第二の核酸を含む細胞であって、第一および／または第二の核酸は外因性であり、細胞は、細胞培養条件下で一度培養されると、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％転換することを含むＩ２Ｓタンパク質を産生する細胞。
（項目２）
配列番号１に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質をコードする第一の核酸；および
配列番号５に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）タンパク質をコードする第二の核酸を含む細胞であって、第一および／または第二の核酸は外因性であり、細胞は、細胞培養条件下で一度培養されると、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約６０％転換することを含むＩ２Ｓタンパク質を産生し、比生産率が約３０ピコグラム／細胞／日超である細胞。
（項目３）
細胞は、細胞培養条件下で一度培養されると、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約８０％転換することを含むＩ２Ｓタンパク質を産生する、項目１または２の細胞。
（項目４）
細胞は、細胞培養条件下で一度培養されると、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約９０％転換することを含むＩ２Ｓタンパク質を産生する、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目５）
細胞は、細胞培養条件下で一度培養されると、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約９５％転換することを含むＩ２Ｓタンパク質を産生する、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目６）
細胞は、細胞培養条件下で一度培養されると、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約９７％転換することを含むＩ２Ｓタンパク質を産生する、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目７）
第一および／または第二の核酸は操作可能にｈＣＭＶプロモーターと結合する、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目８）
第一の核酸は配列番号１に同一のアミノ酸配列を有するＩ２Ｓタンパク質をコードする、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目９）
第二の核酸は配列番号５に同一のアミノ酸配列を有するＦＧＥタンパク質をコードする、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１０）
第一の核酸は、配列番号７に少なくとも７０％同一の配列を含む、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１１）
第一の核酸は配列番号７の配列を含む、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１２）
第二の核酸は配列番号８に少なくとも７０％同一の配列を含む、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１３）
第二の核酸は配列番号８と同一の配列を含む、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１４）
第一の核酸と第二の核酸の両方が外因性である、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１５）
第一および／または第二の核酸は、細胞のゲノム内に組み込まれる、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１６）
第一および／または第二の核酸は１つ以上の染色体外の構築物中に存在する、前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１７）
細胞は哺乳類細胞である前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目１８）
哺乳類細胞はヒト細胞である項目１７に記載の細胞。
（項目１９）
哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である項目１７に記載の細胞。
（項目２０）
細胞は懸濁培養に適応することができる前記項目いずれか１つに記載の細胞。
（項目２１）
組換えＩ２ＳおよびＦＧＥタンパク質が細胞に共発現するような条件下で前記項目いずれか１つに記載の細胞を培養することを含む、組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の製造方法。
（項目２２）
細胞は大規模に培養される項目２１に記載の方法。
（項目２３）
大規模とはバイオリアクタープロセスである項目２２に記載の方法。
（項目２４）
バイオリアクタープロセスは灌流プロセスである項目２３に記載の方法。
（項目２５）
バイオリアクターは１０Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、または２０００Ｌから選択される規模である、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
大規模とはローラーボトルプロセスである項目２２に記載の方法。
（項目２７）
細胞は無血清培地で培養される項目２１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
（項目２８）
細胞は血清を含有する培地で培養される項目２１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
（項目２９）
細胞は懸濁液で培養される項目２１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
（項目３０）
細胞は付着性で培養される項目２１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
（項目３１）
方法は組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するステップをさらに含む、項目２１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
（項目３２）
項目２１〜３１のいずれか１つに記載の方法によって製造される組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質。
（項目３３）
項目１〜２０のいずれか１つに記載の細胞によって製造される組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
以下に記載の図は、一緒に図を構成し、説明のためだけにあり、限定することを意味しない。
【図１Ａ】ヒトのイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の成熟型をコードするアミノ酸配列（配列番号１）を記述し、Ｎ結合グリコシル化およびシステイン転換のために、タンパク質配列内に潜在的な領域を示す。
【図１Ｂ】ヒトのイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の成熟型をコードするアミノ酸配列（配列番号１）を記述し、Ｎ結合グリコシル化およびシステイン転換のために、タンパク質配列内に潜在的な領域を示す。
【図２】Ｉ２ＳおよびＦＧＥ（すなわち、ＳＵＭＦ１）の共発現のための例示的な構築設計図を記述する。（Ａ）（同時形質移入または続く形質移入についての）別個のベクター上の発現単位、（Ｂ）同じベクター上の発現単位（１つの形質移入）：（１）別個のシストロンおよび（２）転写的に結合されたシストロン。
【図３】ホルミルグリシンの転換率に相関するものとして観察されるＩ２Ｓ特異的活性の例示的なレベルを記述する。
【図４】参照の組換えＩ２Ｓ酵素と比較したときの無血清培養条件下で成長したＩ２Ｓ−ＡＦ  ２Ｄおよび４Ｄ細胞株を使用して製造された組換えＩ２Ｓ酵素のために生成された例示的なグリカンの特性を記述する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本発明をもっとわかり易く理解するために、初めに特定の用語を定義する。以下の用語およびその他の用語についての追加の定義は明細書全体にわたって記載する。
【００２７】
アミノ酸：用語「アミノ酸」は、本明細書で使用するとき、最も広義な意味でポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物および／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は通常の構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに多く認められる２０個の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸」は、合成的に調製されるか、天然資源から得られるかに関わらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。「合成アミノ酸」は、本明細書で使用するとき、化学修飾されたアミノ酸を含み、限定するものではないが、塩類、アミノ酸誘導体（アミド等）および／または置換を含む。アミノ酸は、ペプチドの中のカルボキシおよび／またはアミノ末端アミノ酸が挙げられ、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／または活性に有害な影響を与えることなく、ペプチドの循環半減期を変化させることができるその他の化学基で置換することよって修正することができる。アミノ酸はジスルフィド結合に関与してもよい。アミノ酸は、１つ以上の化学成分（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）と結合する等、１つまたは翻訳後修飾を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のアミノ酸は、細胞培養のための培地を補充するために提供または使用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地を補充するために提供または使用されるアミノ酸は、塩類として、または水和物の形態で提供されもよい。
【００２８】
およそ：目的の１つ以上の値に付けられる用語「およそ」または「約」は、本明細書で使用するとき、定められた基準値とほぼ同じ値を意味する。ある実施形態では、用語「およそ」または「約」は、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内にある値の範囲、または別に特に示されなければ、若しくは文脈から別に明白に示されなければ（ただし当該数字が可能な値の１００％を超える場合は除く）、定められた基準値のどちらかの方向でより少ない（超または未満）にある値の範囲を意味する。
【００２９】
バッチ培養：用語「バッチ培養」は、本明細書で使用するとき、細胞を培養するときに究極的には使用される全成分、そこには培地（以下の「培地」の定義を参照）および細胞それ自体を含むが、培養プロセスの最初に提供される細胞の培養方法を意味する。バッチ培養は典型的にいくつかの時点で停止し、培地中の細胞および／または成分が回収され、精製されてもよい。
【００３０】
生物学的利用能：用語「生物学的利用能」は、本明細書で使用されるとき、対象の血流に達する投与量の率を通常、意味する。
【００３１】
生物学的に活性：フレーズ「生物学的に活性な」は、本明細書で使用されるとき、生物系（例えば、細胞培養、有機体等）に活性を有する任意の物質の特徴を意味する。例えば、物質が有機体に投与され、有機体に生物学的影響をもたらすとき、生物学的に活性であると考えられる。生物学的活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって決定することもできる（例えば、硫酸塩放出アッセイ等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素試験）。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を分かち合うタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的に「生物学的に活性な」部分として意味する。いくつかの実施形態では、タンパク質は細胞培養系から産生および／または精製され、対象に投与されると生物学的活性を表す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、生物学的に活性になるために、更なる処理を必要とする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、限定されないが、生物学的に活性になるために、グリコシル化（例えば、シアリル化）、ファルネシル化、切断、折りたたみ、ホルミルグリシン転換およびその組み合わせ等の翻訳後修飾を必要とする。いくつかの実施形態では、プロ形態（すなわち未成熟形態）として産生されるタンパク質は、生物学的に活性になるために、追加の修飾を必要とし得る。
【００３２】
バイオリアクター：用語「バイオリアクター」は、本明細書で使用するとき、宿主細胞培養の増殖に使用される容器を意味する。バイオリアクターは、哺乳類細胞の培養に有用であれば、サイズは問わない。典型的には、バイオリアクターは少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００リットルまたはそれ以上、またはその間の容量であってもよい。バイオリアクターの内部条件は、限定されないが、ｐＨ、モル浸透圧濃度、ＣＯ２飽和、Ｏ２飽和、温度およびその組み合わせが挙げられるが、典型的には培養期間中に制御される。バイオリアクターは、本発明の培養条件下、培地中で細胞を保持するのに適した任意の材料から構成することができ、ガラス、プラスチックまたは金属が挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは動物細胞を培養するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは哺乳類細胞を培養するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、限定されないが、哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物細胞、イースト細胞およびヒト細胞等の有機体に由来する細胞および／または細胞株と使用してもよい。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは大規模な細胞培養の製造に使用し、典型的には少なくとも１００リットルであり、２００、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００リットルまたはそれ以上、またはその間の容量であってもよい。当業者は本発明を実施するときに使用する適切なバイオリアクターを知っており、選択することができるだろう。
【００３３】
細胞培養：本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団の生存および／または成長に適した条件下で、培地中で成長する細胞集団を意味する。当業者に明白なように、本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団を含む組み合わせ、およびその集団が成長する培地を意味してもよい。
【００３４】
培養：用語「培養」または文法的に等価な用語は、本明細書で使用するとき、増殖または生存に好ましい条件下で細胞を保持するプロセスを意味する。用語「培養」および「細胞培養」または同意語は、本明細書では交換可能に使用する。
【００３５】
培養容器：用語「培養容器」は、本明細書で使用するとき、細胞を培養するための無菌の環境を提供することのできる容器を意味する。例示的な培養容器として、限定されないが、ガラス、プラスチックまたは金属の容器が挙げられる。
【００３６】
酵素補充療法（ＥＲＴ）：用語「酵素補充療法（ＥＲＴ）」は、本明細書で使用するとき、失われた酵素を提供することによって酵素欠損を直す治療戦略を意味する。いくつかの実施形態では、髄腔内の投与によって失われた酵素を提供する。いくつかの実施形態では、血流に注入することによって失われた酵素を提供する。一度投与されると、酵素は細胞によって取り込まれ、リソソームに輸送され、そこで酵素は、酵素欠損のためにリソソーム内に蓄積された物質を取り除くように作用する。典型的にはリソソーム酵素補充療法が効果的であり、治療用酵素が、蓄積欠陥が現れる標的細胞の適切な細胞内のリソソームに運ばれる。
【００３７】
発現：核酸配列の「発現」は、本明細書で使用するとき、以下の１つ以上の事象を意味する。（１）ＤＮＡ配列から（例えば、転写によって）ＲＮＡテンプレートの作製。（２）（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成および３’エンド形成によって）ＲＮＡ転写物のプロセッシング。（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳。および／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【００３８】
流加培養法：用語「流加培養法」は、本明細書で使用するとき、培養プロセスの開始後にいくらかの時間に追加の成分を培地に与える細胞の培養方法を意味する。与える成分は、典型的に、培養プロセス中に枯渇した細胞のための栄養補助を含む。典型的に、いずれ流加培養法を停止し、培地中の細胞および／または成分を回収し、任意に精製してもよい。
【００３９】
断片：用語「断片」は、本明細書で使用するとき、ポリペプチドを意味し、そのポリペプチドに特有または特徴的な所与のポリペプチドの分離した部分として定義される。この用語は、本明細書で使用するとき、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部分を保持する所与のポリペプチドの分離した部分も意味する。好ましくは、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。より好ましくは、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。より好ましくは、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の１００％である。本明細書で使用されるときのこの用語は、完全長ポリペプチドに認められる少なくとも確立された配列要素を含む所与のポリペプチドの部分も意味する。好ましくは、配列要素は少なくとも４〜５に及び、より好ましくは、完全長ポリペプチドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個以上のアミノ酸に及ぶ。
【００４０】
遺伝子：用語「遺伝子」は、本明細書で使用するとき、任意のヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡ、別個の最終産物、典型的に、限定されないが、ポリペプチドをコードする少なくともいくつかの部分を意味し、細胞プロセスのいくつかの態様で機能する。この用語は、ポリペプチドまたはその他の別個の最終産物をコードするコード配列のみを意味するものではないが、発現の基礎レベルを調整するコード配列および個々のコードセグメント（「エキソン」）間の介在配列（「イントロン」）に先行しおよび続く領域も含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、制御配列（例えば、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化配列、終止配列、コザック配列、ＴＡＴＡボックス等）および／または修飾配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、タンパク質をコードしないがｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導剤等の機能的ＲＮＡ分子をコードする核酸への参照を含んでもよい。
【００４１】
遺伝子産物または発現産物：用語「遺伝子産物」または「発現産物」は、通常、遺伝子（プロセッシング前および／または後）から転写されるＲＮＡ、または遺伝子から転写されるＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前および／または後）を意味する。
【００４２】
遺伝子制御要素：用語「遺伝子制御要素」は、本明細書で使用するとき、操作可能に結合される遺伝子の発現を調整する配列要素を意味する。遺伝的な制御要素は、発現レベルを増加させるか減少させるかによって機能してもよく、コード配列の前、内、または後に位置してもよい。遺伝子制御要素は、例えば、転写の開始、伸長若しくは終止、ｍＲＮＡスプライシング、ｍＲＮＡエディティング、ｍＲＮＡ安定性、細胞内のｍＲＮＡ局在、翻訳の開始、伸長、若しくは終止、または遺伝子発現のその他のステージを調整することによって任意のステージで作用してもよい。遺伝子制御要素は、独立して機能してもよいし、互いに組み合わせて機能してもよい。
【００４３】
相同性：用語「相同性」は、本明細書で使用するとき、高分子分子の間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）の間、および／またはポリペプチド分子の間の全体的な関連性を意味する。いくつかの実施形態では、高分子分子は、配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であれば、互いに「相同」であると考えられる。いくつかの実施形態では、高分子分子は、配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同様であれば、互いに「相同」であると考えられる。
【００４４】
同一性：用語「同一性」は、本明細書で使用するとき、高分子分子の間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子の間の全体的な関連性を意味する。２つの核酸配列の同一性の割合の計算は、例えば、最適な比較のために（例えば、最適な配列比較のために第一および第二の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非同一配列は比較のために無視することができる）２つの配列比較をすることによって実施することができる。ある実施形態では、比較のために配列比較された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。対応するヌクレオチド部分のヌクレオチドをその後比較する。第一の配列内の位置が、第二の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列の同一性の割合は、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮し、２つの配列の最適な配列比較のために導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定することができ、ＰＡＭ１２０重量残基表を使用したＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ギャップ長ペナルティーは１２であり、ギャップペナルティーは４である。あるいは、２つのヌクレオチド配列の同一性の割合をＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。様々なその他の配列比較プログラムが利用可能であり、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ等で配列同一性を決定するために使用することができる。
【００４５】
改善する、増加するまたは減少する：用語「改善する」、「増加する」、若しくは「減少する」、または文法的に等価な用語は、本明細書で使用するとき、本明細書に記載の治療を開始する前の同じ個体の測定、または本明細書に記載の治療のない対照個体（若しくは複数の対照個体）の測定等の基線測定に関連がある値を示す。「対照個体」は、治療を受けている個体と同じ形態のリソソーム蓄積病に苦しむ個体であり、（治療を受けている個体と対照個体の疾患のステージを確実に比較できるように）治療を受けている個体とほぼ同じ年齢である。
【００４６】
脊髄内投与：用語「脊髄内投与」または「脊髄内注射」は、本明細書で使用するとき、脊柱管（脊髄を囲む髄腔内の空間）への注射を意味する。限定されないが、穿頭孔若しくは大槽、または腰椎穿刺等によって脳室側部の注射を含む様々な手技を使用してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の「脊髄内投与」または「脊髄内送達」は、大槽範囲または領域を経由した脊髄内投与または送達を意味する。用語「大槽範囲」または「大槽領域」は、本明細書で使用するとき、第３および第４番目の大槽（下背）脊椎の間の領域、およびもっと含めると脊椎のＬ２−Ｓ１領域を意味する。
【００４７】
単離された：用語「単離された」は、本明細書で使用するとき、（１）（天然および／または実験的設定のいずれかで）最初に製造したときに結合された少なくともいくつかの成分から分離された、および／または（２）人の手によって生産、調製、および／または製造された物質および／または実体を意味する。単離された物質および／または実体は、最初に結合されたその他の成分から、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約９９％以上単離してもよい。いくつかの実施形態では、単離された剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％，若しくは約９９％以上純粋である。本明細書で使用するとき、物質にその他の成分が実質的に存在しない場合、物質は「純粋」である。本明細書で使用するとき、単離された物質および／または実体の純度の計算は、賦形剤（例えば、バッファ、溶剤、水等）を含むべきではない。
【００４８】
培地：この用語は本明細書で使用するとき、成長している細胞に栄養を与える栄養物を含む溶液を意味する。典型的には、これらの溶液は、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、並びに最小限の増殖および／または生存に細胞が必要とする微量元素を提供する。溶液は、ホルモンおよび成長因子を含む最小限の割合を超える成長および／または生存を促す成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、培地は細胞の生存および増殖に適したｐＨおよび塩濃度に処方される。いくつかの実施形態では、培地は、「既知組成の培地」、すなわちタンパク質、加水分解産物または未知の組成物の成分を含まない無血清培地であってもよい。いくつかの実施形態では、既知組成の培地は動物由来の成分がなく、培地内の全成分は、周知の化学構造を有する。いくつかの実施形態では、培地は「血清に基づいた培地」、すなわち、限定されないがウシ胎仔血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清および／またはその組み合わせ等の動物由来の成分を補充した培地であってもよい。
【００４９】
核酸：用語「核酸」は、本明細書で使用するとき、広義にはオリゴヌクレオチド鎖に組み込むまたは組み込むことができる化合物および／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオチド鎖に組み込むまたは組み込むことができる化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、独立した核酸残基を意味する（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）。いくつかの実施形態では、「核酸」は、独立した核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用するとき、交換可能に使用することができる。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ並びに単一鎖および／または二重鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または同様の用語は核酸類似体、すなわちホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当業者に周知であり、骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するいわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内に考えられる。用語「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの変性したバージョンであり、および／または同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。核酸は天然資源から精製され、組換え発現系を使用して製造することができ、精製しても、化学的に合成してもよい。適切な場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学修飾塩基または糖類、骨格修飾等を有する類似体等のヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、特に断りがない限り５’末端から３’末端の方向で表される。用語「核酸断片」は、本明細書で使用するとき、より長い核酸配列の一部である核酸配列を意味する。多くの実施形態では、核酸断片は少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基；修飾糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であり、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、特に、送達を促進または達成するために、化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含むポリヌクレオチドおよび残基）を意味する「無修飾核酸」に関する。
【００５０】
灌流プロセス：用語「灌流プロセス」は、本明細書で使用するとき、培養プロセスの開始後に、追加の成分が、連続してまたは半連続して培養に提供される細胞の培養方法を意味する。提供される成分は、典型的に、培養プロセス中に枯渇した細胞のための栄養補助物を含む。培地中の細胞および／または成分の部分は、典型的に、連続的または半連続的に回収され、精製されてもよい。典型的に、灌流プロセスを伴う細胞培養プロセスは、「灌流培養」として意味する。典型的に、栄養補助物は灌流プロセスの最中に新鮮な培地に提供される。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は細胞培養プロセスに使用されるベース培地と同一または同様であってもよい。いくつかの実施形態では、新鮮な培地はベース培地と異なるが、所望の栄養補助物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は、既知組成の培地である。
【００５１】
タンパク質：用語「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに結合される一続きの少なくとも２つのアミノ酸）を意味する。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含んでもよく（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン等であってもよい）、および／またはさもなければ処理されまたは改変されてもよい。当業者は、「タンパク質」が（シグナル配列があってもなくても）細胞によって産生されるように、完全なポリペプチド鎖であってもよく、またはその特徴的な部分であってもよいことを認識するだろう。いくつかの実施形態では、タンパク質は１つ以上のポリペプチド鎖を含むときがあり、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって結合されても、その他の方法によって結合されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、またはその両方を含んでもよく、当該技術分野に周知の様々なアミノ酸修飾または類似体を含んでもよい。有用な修飾として、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化等が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質は天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、合成アミノ酸、およびその組み合わせを含んでもよい。用語「ペプチド」は、通常、長さが約１００個未満のアミノ酸、約５０個未満のアミノ酸、約２０個未満のアミノ酸、または約１０個未満のアミノ酸を有するポリペプチドを意味するために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は抗体、抗体断片、その生物学的に活性の部分、および／またはその特徴的な部分である。
【００５２】
組換えタンパク質および組換えポリペプチド：これらの用語は、本明細書で使用するとき、宿主細胞から発現されるポリペプチドを意味し、そのポリペプチドを発現するように遺伝学的に操作されている。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、動物に由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は昆虫に由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質はイーストに由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は原核生物に由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は哺乳類に由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質はヒトに由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え発現されたポリペプチドは、宿主細胞内で正常に発現されたポリペプチドと同一、または同様であってもよい。いくつかの実施形態では、組換え発現されたポリペプチドは、宿主細胞に対して外来であってもよく、宿主細胞内で正常に発現されるペプチドと異種性であってもよい。あるいは、いくつかの実施形態では、組換え発現されたポリペプチドは、キメラであってもよく、ポリペプチドの部分が宿主細胞内で正常に発現されるペプチドと同一または類似のアミノ酸配列を含むことができ、その他の部分は宿主細胞に対して外来である。
【００５３】
置換酵素：用語「置換酵素」は、本明細書で使用するとき、治療対象の疾患で酵素が欠損または喪失した酵素を少なくとも部分的に置換するように作用することができる酵素を意味する。いくつかの実施形態では、用語「置換酵素」は、治療対象のリソソーム蓄積疾患で酵素が欠損または喪失した酵素を少なくとも部分的に置換するように作用することができる酵素を意味する。いくつかの実施形態では、置換酵素は、哺乳類のリソソームに蓄積された物質を減少することができ、または１つ以上のリソソーム蓄積疾患の症状を救うまたは寛解させることができる。本発明に適した置換酵素として野生型または改変型リソソーム酵素の両方が挙げられ、組換えおよび合成方法を使用して製造することができ、または天然資源から精製することができる。置換酵素は、組換えの、合成の、遺伝的に活性のまたは天然の酵素であってよい。
【００５４】
ベクター：「ベクター」は本明細書で使用するとき、別の核酸を、結合される場所まで輸送することのできる核酸分子を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核および／または原核生物の細胞等の宿主細胞内で結合する核酸を染色体外複製および／または発現をすることができる。操作可能に結合された遺伝子の発現を方向付けることができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００５５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、とりわけ、Ｉ２Ｓタンパク質とＦＧＥタンパク質を同時発現する細胞を用いて、改善された効能と活性を持つ組換えＩ２Ｓを作出するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に係る細胞は組換えＩ２Ｓタンパク質とＦＧＥタンパク質を同時に過剰発現するように操作される。本発明に係る細胞は種々の細胞培養条件に適合可能である。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は大規模の懸濁無血清培養に適合可能である。
【００５６】
以下の小節にて本発明の種々の態様をさらに詳細に説明する。小節の使用は本発明を限定するものではない。各小節は本発明の任意の態様に適用され得る。本出願では「又は」の使用は、言及されない限り、「及び／又は」を意味する。
イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）
【００５７】
本明細書で使用されるとき、Ｉ２Ｓタンパク質は、天然に存在するイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の少なくとも部分的な活性と置き換わることができる又はＩ２Ｓ欠損に関連した１以上の表現型若しくは症状を救済することができるタンパク質又はタンパク質の一部である。本明細書で使用されるとき、用語「Ｉ２Ｓ酵素」及び「Ｉ２Ｓタンパク質」及び文法的な同等物は交換可能に使用される。
【００５８】
通常、ヒトのＩ２Ｓタンパク質は前駆体形態として産生される。ヒトＩ２Ｓの前駆体形態は、シグナルペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基１〜２５）と、プロペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基２６〜３３）と、さらに４２ｋＤａの鎖（完全長前駆体の残基３４〜４５５）にプロセシングされ得る鎖（完全長前駆体の残基３４〜５５０）と、１４ｋＤａの鎖（完全長前駆体の残基４４６〜５５０）を含有する。通常、前駆体形態は、５５０のアミノ酸を含有する完全長前駆体又は完全長Ｉ２Ｓタンパク質とも呼ばれる。通常野生型の又は天然の存在するヒトのＩ２Ｓタンパク質のシグナルペプチドが除去された成熟形態（配列番号１）及び完全長前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列を表１に示す。シグナルペプチドには下線を引く。加えて、ヒトＩ２Ｓタンパク質アイソフォームａ及びｂの前駆体のアミノ酸配列もそれぞれ、表１の配列番号３及び４にて提供する。
【００５９】
【表１−１】
2018088933.tif 000003
【表１−２】
2018088933.tif 000004
【００６０】
従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）である。本明細書で開示されるとき、配列番号１はヒトのＩ２Ｓタンパク質の標準的なアミノ酸配列を表す。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、Ｉ２Ｓ遺伝子の５’ＵＴＲ内での選択的出発部位での転写の結果生じる配列番号１のスプライスアイソフォーム及び／又は変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、好適な置換酵素はヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するＩ２Ｓタンパク質（たとえば、配列番号１）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）に実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の断片又は一部を含有する。
【００６１】
或いは、Ｉ２Ｓ酵素は完全長のＩ２Ｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在する完全長のＩ２Ｓタンパク質（たとえば、配列番号２）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾された完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号２）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素は配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素はヒトの完全長のＩ２Ｓタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、完全長のＩ２Ｓタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質である。いくつかの実施形態では、好適なＩ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質（たとえば、配列番号３）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質（配列番号３）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号３と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素は、配列番号３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質（たとえば、配列番号４）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質（配列番号４）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号４と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。
【００６４】
ヒトのＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、そのような方法を蓄積する参考文献にて見いだされるような当業者に既知のポリペプチド配列を変える方法に従って調製することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸の保存的置換には、以下の群：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄの範囲内でのアミノ酸の間で行われる置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、「保存的なアミノ酸の置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対電荷又はサイズ特性を変えないアミノ酸の置換を指す。
【００６５】
いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、細胞の表面上の受容体に結合して細胞の取り込み及び／又はリソソームの標的化を促進する部分を含有する。たとえば、そのような受容体は、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を結合するカチオン依存性のマンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）であり得る。加えて、ＣＩ−ＭＰＲはＩＧＦ−ＩＩを含む他のタンパク質も結合する。好適なリソソーム標的化部分は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、及びその変異体、同族体又は断片（たとえば、ヒトの野生型成熟ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である配列を有するそれらのペプチドを含む）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｍ６Ｐ残基が結合する好適な受容体はカチオン依存性であり得る。
ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）
【００６６】
通常、Ｉ２Ｓの酵素活性は、保存されたシステイン（たとえば、ヒトの成熟Ｉ２Ｓ（配列番号１）のアミノ酸５９に相当する）の２−アミノ−３−オキソプロピオン酸又はオキソ−アラニンとも呼ばれるホルミルグリシンへの翻訳後修飾によって影響を受ける。この翻訳後修飾は一般的にタンパク質合成の間に小胞体にて生じ、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によって触媒される。Ｉ２Ｓの特異的な酵素活性は通常、Ｉ２Ｓがホルミルグリシン修飾を有する程度と正の相関を示す。たとえば、相対的に高い量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓタンパク質調製物は通常、相対的に高い酵素比活性を有し；相対的に低い量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓタンパク質調製物は通常、相対的に低い酵素比活性を有する。
【００６７】
従って、本発明に従って組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させるのに好適な細胞は通常、ＦＧＥタンパク質も発現する。いくつかの実施形態では、好適な細胞は内在性のＦＧＥタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、好適な細胞は組換えＩ２Ｓと組み合わせて外来性（組換えともいう）ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、好適な細胞は、ＦＧＥタンパク質の発現レベル又は活性が高まるように内在性のＦＧＥ遺伝子を活性化するように操作される。
【００６８】
通常、ヒトのＦＧＥタンパク質は前駆体の形態で産生される。ヒトのＦＧＥタンパク質の前駆体形態は、シグナルペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基１〜３３）及び鎖（完全長前駆体の残基３４〜３７４）を含有する。通常、前駆体形態は、完全長の前駆体又は完全長のＦＧＥタンパク質とも呼ばれ、３７４アミノ酸を含有する。典型的な野生型の又は天然に存在するヒトのＦＧＥタンパク質のシグナルペプチドを取り除いた成熟形態（配列番号５）及び完全長の前駆体（配列番号６）のアミノ酸配列を表２に示す。
【００６９】
【表２】
2018088933.tif 000005
【００７０】
従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素はヒトの成熟ＦＧＥタンパク質（配列番号５）である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの成熟ＦＧＥタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトの成熟ＦＧＥタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するＦＧＥタンパク質（配列番号５）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＦＧＥタンパク質活性を保持する修飾されたヒトの成熟ＦＧＥタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの成熟ＦＧＥタンパク質（配列番号５）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの成熟ＦＧＥタンパク質（配列番号５）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素はヒトの成熟ＦＧＥタンパク質の断片又は一部を含有する。
【００７１】
或いは、本発明に好適なＦＧＥ酵素は完全長ＦＧＥタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＦＧＥ酵素は、ヒトの完全長ＦＧＥタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトの完全長ＦＧＥタンパク質の同族体又は類似体は野生型の又は天然に存在する完全長ＦＧＥタンパク質（配列番号６）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＦＧＥタンパク質活性を保持する修飾されたヒトの完全長ＦＧＥタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの完全長ＦＧＥタンパク質（配列番号６）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号６に対して実質的に同一である。本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの完全長ＦＧＥタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、完全長ＦＧＥタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。
【００７２】
例となるＦＧＥタンパク質をコードする例となる核酸配列及びアミノ酸配列は米国特許公開番号２００４０２２９２５０にて開示されており、その全内容が参照によって本明細書に組み入れられる。
Ｉ２ＳとＦＧＥを同時発現する細胞
【００７３】
本発明は、細胞培養系を用いた生物学的に活性のあるＩ２Ｓの高レベルな商業的製造の必要性を認識している。多数の製造因子が特定の宿主細胞の選択に影響を及ぼし得るので、本明細書で開示される核酸分子は、多種多様な原核細胞及び真核細胞及び／又は細菌株、酵母株、昆虫細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞に由来する細胞株を含むが、これらに限定されない細胞株に向けられる。本発明の態様はまた、本明細書で開示される天然に存在する及び修飾されたＩ２Ｓタンパク質及び／又はＦＧＥタンパク質を発現させるのに有用な発現用構築物及び組換えの安定な細胞株の生成を提供する。加えて、本発明の態様はまた、本明細書の開示される核酸配列を用いてＩ２Ｓ及びＦＧＥを発現する細胞株を作出する方法を提供する。
Ｉ２Ｓタンパク質及び／又はＦＧＥタンパク質をコードする核酸
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書の種々の実施形態で記載されるＩ２Ｓタンパク質及び／又はＦＧＥタンパク質のような当該の組換え遺伝子（本明細書では導入遺伝子と呼ぶ）をコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子をコードする核酸を修飾してコードされるＩ２Ｓタンパク質及び／又はＦＧＥタンパク質の高い発現を提供し得るが、それはコドン最適化と呼ばれる。たとえば、コーディング配列のオープンリーディングフレームを変えることによって導入遺伝子をコードする核酸を修飾することができる。本明細書で使用されるとき、用語「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と同義語であり、タンパク質又はタンパク質の一部を潜在的にコードすることができるヌクレオチド配列を意味する。オープンリーディングフレームは普通、開始コドン（たとえば、標準のコードではＲＮＡ分子についてはＡＵＧとして及びＤＮＡ分子についてはＡＴＧとして表される）で開始し、停止コドン（たとえば、標準のコードではＲＮＡ分子についてはＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧとして及びＤＮＡ分子についてはＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧとして表される）によるフレーム末端までコドン−トリプレットで読まれる。本明細書で使用されるとき、用語「コドン」は、タンパク質合成の間特定のアミノ酸を特定する核酸分子における３つのヌクレオチドの配列を意味し、トリプレット又はコドン−トリプレットとも呼ばれる。たとえば、標準の遺伝子コードにおける考えられる６４のコドンのうち、２つのコドンＧＡＡ及びＧＡＧはアミノ酸グルタミンをコードするが、コドンＡＡＡ及びＡＡＧはアミノ酸リジンを特定する。標準の遺伝子コードでは３つのコドンが停止コドンであり、アミノ酸を特定しない。本明細書で使用されるとき、用語「同義コドン」は単一のアミノ酸をコードするコドンのいずれか及びすべてを意味する。メチオニン及びトリプトファンを除いて、アミノ酸は２〜６の同義コドンによってコードされる。たとえば、標準の遺伝子コードでは、アミノ酸アラニンをコードする４つの同義コドンはＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵであり、グルタミンを特定する２つの同義コドンはＧＡＡ及びＧＡＧであり、リジンをコードする２つの同義コドンはＡＡＡ及びＡＡＧである。
【００７５】
いくつかの実施形態では、標準のコドン最適化法を用いて、Ｉ２Ｓタンパク質及び／又はＦＧＥタンパク質のオープンリーディングフレームをコードする核酸を修飾し得る。コドン最適化のための種々の市販のアルゴリズムが利用可能であり、本発明を実践するのに使用することができる。通常、コドン最適化はコードされるアミノ酸配列を変えることはない。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、たとえば、置換、欠失又は挿入のようなアミノ酸の変化をもたらし得る。通常、そのようなアミノ酸の変化がタンパク質の活性を実質的に変えることはない。
【００７６】
Ｉ２Ｓタンパク質及びＦＧＥタンパク質をコードする例となる核酸配列をそれぞれ以下の配列番号７及び８にて示す。
配列番号７：イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）をコードする例となる核酸配列ＡＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＴＧＧＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＣＣＴＡＧ
配列番号８：完全長前駆体のホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）をコードする例となる核酸配列
ＡＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＧＧＧＴＴＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＧＡＴＡＣＴＣＧＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＣＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＴＣＧＣＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＧＡＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＧＡＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＣＧＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧＧＧＡＡＴＡＣＡＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＡＡＴＡＧＡＣＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＴＣＣＧＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＴＴＡＴＡＣＡＡＣＡＴＡＧＴＧＧＧＧＡＡＣＧＣＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＣＧＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＡＴＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡ
【００７７】
いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ及び／又はＦＧＥを発現するように選択される特定の非相同の細胞にて見いだされる内在性のコドン使用頻度に合わせるためにオープンリーディングフレームの範囲内でヌクレオチドの変化が同義コドンを変更し得る。代わりに又はさらに、ヌクレオチドの変化はオープンリーディングフレームの中でのＧ＋Ｃ含量を変えて、非相同の宿主細胞に存在する内在性の核酸配列に見いだされるオープンリーディングフレームの平均Ｇ＋Ｃ含量によりよく一致させ得る。ヌクレオチドの変化はまた、Ｉ２Ｓ配列又はＦＧＥ配列の中で見いだされるポリモノヌクレオチド領域又は内部調節部位又は内部構造部位も変化させ得る。従って、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞にてＩ２Ｓタンパク質及び／又はＦＧＥタンパク質の高い発現を提供する核酸配列を含むが、限定されない種々の修飾された又は最適化されたヌクレオチド配列が想定される。
【００７８】
従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥタンパク質をコードする核酸は、配列番号８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるヌクレオチド配列を有する。通常、修飾された核酸は、アミノ酸配列の変化を伴った又は伴わないＩ２Ｓタンパク質及び／又はＦＧＥタンパク質をコードする。アミノ酸の変化がある事象では、そのような変化は通常Ｉ２Ｓタンパク質及又はＦＧＥタンパク質の活性を実質的に変えることはない。
発現ベクター
【００７９】
本出願にて記載されるようなＩ２Ｓタンパク質及び／又はＦＧＥタンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞での増殖又は発現に好適なベクターにて分子的にクローニングされ（挿入され）得る。原核細胞の発現ベクター、酵母の発現ベクター、昆虫の発現ベクター及び哺乳類の発現ベクターを含むが、限定されない多種多様な発現ベクターを用いて本発明を実践することができる。本発明に好適な例となるベクターにはウイルス系のベクター（たとえば、ＡＡＶ系ベクター、レトロウイルス系ベクター、プラスミド系ベクター）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、それぞれＩ２Ｓタンパク質及びＦＧＥタンパク質コードする核酸配列を別個のベクターに挿入することができる。いくつかの実施形態では、それぞれＩ２Ｓタンパク質及びＦＧＥタンパク質コードする核酸配列を同一のベクターに挿入することができる。通常、Ｉ２Ｓタンパク質又はＦＧＥタンパク質コードする核酸は種々の調節配列又は調節要素に操作可能に連結される。
調節配列又は調節要素
【００８０】
種々の調節配列又は調節要素を本発明に好適な発現ベクターに組み入れ得る。例となる調節配列又は調節要素には、プロモータ、エンハンサ、リプレッサ又はサプレッサ、５’非翻訳（非コーディング）配列、イントロン、３’  非翻訳（非コーディング）配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「プロモータ」又は「プロモータ配列」は、細胞にてＲＮＡポリメラーゼを結合し（たとえば、直接又は他のプロモータが結合するタンパク質若しくは物質を介して）、コーディング配列の転写を開始することが可能であるＤＮＡ調節領域である。プロモータ配列は一般に、転写開始部位によって３’末端で結合し、上流（５’方向）に伸長して任意のレベルで転写を開始するのに必要な最少数の塩基又は要素を含める。プロモータは、エンハンサ及びリプレッサ配列を含む発現制御配列に操作可能に会合し得る又はそれに操作可能に連結され得る、又は発現される核酸に操作可能に会合し得る。いくつかの実施形態では、プロモータは誘導可能であり得る。いくつかの実施形態では、誘導可能なプロモータは一方向性又は二方向性であり得る。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的なプロモータであり得る。いくつかの実施形態では、プロモータは、転写調節領域を含有する配列が１つの供給源から得られ、転写開始領域を含有する配列が第２の供給源から得られるハイブリッドプロモータであることができる。導入遺伝子の中でコーディング配列に制御要素を連結する系は当該技術で周知であり（一般的な分子生物学及び組換えＤＮＡ法は、参照によって本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている）。種々の増殖条件下及び誘導条件下で種々の宿主細胞での発現のために導入遺伝子を挿入するのに好適な市販のベクターも当該技術で周知である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＳＲα−プロモータ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｍｏｌｅｃ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏ．  ８：４６６−４７２  （１９８８））、ヒトのＣＭＶ最初期プロモータ（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０  （１９８５）；  Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｇｅｎｅ  ４５：１０１−１０５  （１９８６））、ヒトのＣＭＶプロモータ、ヒトのＣＭＶ５プロモータ、マウスのＣＭＶ最初期プロモータ、ＥＦ１−α−プロモータ、肝臓特異的な発現のためのハイブリッドＣＭＶプロモータ（たとえば、ＣＭＶ最初期プロモータをヒトのα−１−アンチトリプシン（ＨＡＴ）又はアルブミン（ＨＡＬ）のプロモータの転写プロモータ要素に結合することによって作製される）、又は肝臓癌特異的な発現のためのプロモータ  （たとえば、ヒトのアルブミン（ＨＡＬ；約１０００ｂｐ）又はヒトのα−１−アンチトリプシン（ＨＡＴ、約２０００ｂｐ）の転写プロモータ要素がヒトのα−１−ミクログロブリン及びビクニン前駆体遺伝子（ＡＭＢＰ）の長さ１４５のエンハンサ要素；ＨＡＬ−ＡＭＢＰ及びＨＡＴ−ＡＭＢＰと組み合わせられる）；ＳＶ４０早期プロモータ領域  （Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０  （１９８１））、Ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ最初期プロモータ、ヘルペスのチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ  ａｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５  （１９８１））；又はメタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２  （１９８２））のような、しかし、これらに限定されない特定のプロモータを用いて哺乳類宿主細胞にて導入遺伝子の発現を制御し得る。いくつかの実施形態では、哺乳類のプロモータは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）プロモータ、アデノシンデアミナーゼプロモータ、ピルビン酸キナーゼプロモータ、β−アクチンプロモータと同様に当業者に既知の他の構成的なプロモータのような、しかし、これらに限定されない構成的なプロモータである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、原核宿主細胞にてβ−ラクタマーゼプロモータ（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１  （１９７８））；ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２１−２５  （１９８３））；Ｔ７プロモータ、Ｔ３プロモータ、Ｍ１３プロモータ又はＭ１６プロモータのようなしかし、これらに限定されない特定のプロモータ用いて；  酵母宿主細胞にてＧＡＬ１、ＧＡＬ４又はＧＡＬ１０プロモータ、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモータ、アルカリホスファターゼプロモータ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素ＩＩＩ（ＴＤＨ３）プロモータ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素ＩＩ（ＴＤＨ２）プロモータ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素Ｉ（ＴＤＨ１）プロモータ、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、エノラーゼ（ＥＮＯ）、又はトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）のようなしかし、これらに限定されない特定のプロモータ用いて導入遺伝子の発現を制御し得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、プロモータはウイルスプロモータであってもよく、その多くは哺乳類細胞を含む幾つかの宿主細胞型にて導入遺伝子の発現を調節することができる。真核細胞においてコーディング配列の構成的な発現を行わせることが示されているウイルスプロモータには、たとえば、サルのウイルスプロモータ、単純性ヘルペスウイルスのプロモータ、パピローマウイルスのプロモータ、アデノウイルスのプロモータ、ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のプロモータ、ラウス肉腫ウイルスのプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータ、モロニーマウス白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、単純性ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのプロモータ、並びに当業者に既知の他のウイルスプロモータが挙げられる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、発現ベクターの遺伝子制御要素には、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５’非転写配列及び５’非翻訳配列、たとえば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、コザック配列等も挙げられ得る。エンハンサ要素を任意で用いて発現されるポリペプチド又はタンパク質の発現レベルを高めることができる。哺乳類細胞で機能することが示されているエンハンサ要素の例には、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されたようなＳＶ４０早期遺伝子エンハンサ及びＧｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されたようなラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサ／プロモータ及びＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されたようなヒトのサイトメガロウイルスが挙げられる。発現ベクターの遺伝子制御要素には、転写及び翻訳の終了に関与する３’非転写配列及び３’非翻訳配列も挙げられるであろう。それぞれ、たとえば、プロモータから転写されるｍＲＮＡの３’末端を安定化し、プロセシングするためのポリポリアデニル化（ポリＡ）シグナル。ポリＡシグナルには、たとえば、ウサギのβグロビンのポリＡシグナル、ウシの成長ホルモンのポリＡシグナル、ニワトリのβグロビンのターミネータ／ポリＡシグナル、又はＳＶ４０後期ポリＡ領域が挙げられた。
選択可能なマーカー
【００８６】
発現ベクターは好ましくは、しかし、任意で少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むであろう。いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーは、１以上の遺伝子調節要素に操作可能に連結されて、細胞傷害性の化合物及び／又は薬剤の存在下で増殖させる際、生存性を維持する能力を宿主細胞に付与する耐性遺伝子をコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、選択可能な剤を用いて宿主細胞の中で発現ベクターの保持率を維持し得る。いくつかの実施形態では、選択可能な剤を用いて発現ベクターの中で導入遺伝子配列の修飾（たとえば、メチル化）及び／又はサイレンシングを防ぎ得る。いくつかの実施形態では、選択可能な剤を用いて宿主細胞内でのベクターのエピソーム発現を維持し得る。いくつかの実施形態では、選択可能な剤を用いて宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子配列の安定な統合を促進し得る。いくつかの実施形態では、剤及び／又は耐性遺伝子には、真核宿主細胞のためのメソトレキセート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ，米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；同第４，６５６，１３４号；同第４，９５６，２８８号；同第５，１４９，６３６号；同第５，１７９，０１７号）、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ゼオマイシン、ミコフェノール酸又はグルタミン合成酵素（ＧＳ，米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号）；原核宿主細胞のためのテトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン又はクロラムフェニコール；及び酵母宿主細胞のためのＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＬＹＳ２、ＨＩＳ４、ＡＤＥ８、ＣＵＰ１又はＴＲＰ１が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００８７】
発現ベクターは、宿主細胞に形質移入され得るし、それを転換し得るし、又はそれに形質導入され得る。本明細書で使用されるとき、用語「形質移入」、「形質転換」及び「形質導入」はすべて外来性の核酸配列の宿主細胞への導入を指す。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ及び／又はＦＧＥをコードする核酸配列を含有する発現ベクターが宿主細胞に同時に形質移入され、それを転換し、又はそれに形質導入される。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ及び／又はＦＧＥをコードする核酸配列を含有する発現ベクターが宿主細胞に順次形質移入され、それを転換し、又はそれに形質導入される。たとえば、Ｉ２Ｓタンパク質をコードするベクターが先ず宿主細胞に形質移入され、それを転換し、又はそれに形質導入され、その後、ＦＧＥタンパク質をコードするベクターが形質移入され、それを転換し、又はそれに形質導入され、逆もまた同様である。当該技術で周知である形質転換法、形質移入法及び形質導入法の例には、リポソーム送達、すなわち、リポフェクトアミン（商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ、Ｆｏｃｕｓ１５：７３（１１９３）の方法、エレクトロポレーション、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４５７（１９７８）のＣａＰＯ４送達法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在の送達、微量注入、微粒子銃粒子送達、ポリブレン介在の送達、カチオン介在性の脂質送達、遺伝子導入、及びレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びバキュロウイルス（昆虫細胞）のようなウイルスの感染が挙げられる。細胞宿主の形質転換の一般的な態様は、たとえば、Ａｘｅｌによる米国特許第４，３９９，２１６号；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記，第１−４章及び第１６−１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ，上記，第１，９，１３，１５及び１６章のような当該技術に記載されている。哺乳類細胞を形質転換するための種々の技法については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９），Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）及びＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【００８８】
細胞内にいったん導入されると、発現ベクターはゲノムに安定的に統合されてもよいし、又は染色体外の構築物として存在してもよい。ベクターは増幅されてもよく、複数のコピーが存在してもよいし、又はゲノムに統合されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の細胞はＩ２Ｓタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０以上のコピーの核酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、本発明の細胞はＦＧＥタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０以上のコピーの核酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、本発明の細胞はＩ２Ｓタンパク質及びＦＧＥタンパク質の双方をコードする複数コピー（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０以上）の核酸を含有し得る。
宿主細胞
【００８９】
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、使用されて組換えＩ２Ｓ酵素を産生することができる細胞を指す。特に、宿主細胞は、大規模な組換えＩ２Ｓ酵素の産生に適している。好適な宿主細胞は、哺乳類、植物、鳥類（たとえば、鳥類系）、昆虫、酵母及び細菌を含むが、これらに限定されない種々の生物に由来することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、好適な宿主細胞はエンドソームの酸性化を欠損する細胞ではない。
哺乳類細胞株
【００９０】
細胞培養し易い及びポリペプチドを発現し易い哺乳類の細胞又は細胞型は本発明に従って宿主細胞として利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の非限定例には、ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３），ＨｅＬａ細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜細胞芽（ＰＥＲ．Ｃ６（オランダ、ライデンのＣｒｕＣｅｌｌ））；ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養での増殖するようにサブクローニングした２９３又は２９３細胞，Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、好適な哺乳類細胞はエンドソームの酸性化を欠損する細胞ではない。
【００９１】
さらに、多数の商業的に利用可能な及び非商業的に利用可能な、ポリペプチド又はタンパク質を発現するハイブリドーマ細胞株を本発明に従って利用し得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養要求を有し得る及び／又は最適な増殖及びポリペプチド又はタンパク質の発現について異なる条件を有し得ることを十分に理解するであろうし、必要に応じて条件を改変することができるであろう。
非哺乳類細胞株
【００９２】
細胞培養し易い及びポリペプチドを発現し易い非哺乳類に由来する細胞又は細胞型は本発明に従って宿主細胞として利用され得る。本発明に従って使用され得る非哺乳類の宿主細胞及び細胞株の非限定例には、酵母についてはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ；昆虫についてはＳｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｓ  ｎｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇｏｓｔｅｒ及びＭａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ並びに細菌についてはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；並びに両生類に由来するＸｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓに由来する細胞及び細胞株が挙げられる。
懸濁増殖に比べた接着増殖への適合性
【００９３】
特定の実施形態では、宿主細胞は、細胞を培養するために選択される特定の条件下で特定の好ましい特質又は増殖に基づいて細胞株を生成するために選択される。そのような特質は、確立した株の既知の特徴及び／又は形質に基づいて確認されてもよく（すなわち、性状分析された市販の細胞株）、又は経験的な評価を介して確認されてもよいことが当業者には理解されるであろう。いくつかの実施形態では、細胞株は細胞の支持層上で増殖する能力について選択され得る。いくつかの実施形態では、細胞株は懸濁液で増殖する能力について選択され得る。いくつかの実施形態では、細胞株は細胞の接着単層として増殖する能力について選択され得る。いくつかの実施形態では、組織培養容器又は好適な接着基剤で処理した容器と共にそのような細胞を使用することができる。いくつかの実施形態では、好適な接着基剤は、コラーゲン（たとえば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ型コラーゲン）、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ＢＤマトリゲル（商標）、基底膜マトリクス、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ポリ−Ｄ−リジン及び／又はそれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、接着性宿主細胞は、懸濁液で増殖する特定の増殖条件下で選択され、改変され得る。接着性細胞を懸濁液で増殖するように改変するそのような方法は当該技術で既知である。たとえば、時間をかけて増殖培地から動物血清を徐々に取り除くことによって細胞は懸濁培養で増殖するように調整され得る。
細胞株の選択及び評価
【００９４】
本発明によれば、組換えＩ２Ｓタンパク質を発現するように操作される細胞は、商業的に生存可能な規模で組換えＩ２Ｓタンパク質を産生する能力について選択される。特に、本発明に従って操作される細胞は、高いレベルで及び／又は高い酵素活性を持って組換えＩ２Ｓを産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養条件下（たとえば、標準の大規模の懸濁液又は接着の培養条件）でいったん培養された望ましい細胞は約５ピコグラム／細胞／日を超える（たとえば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ピコグラム／細胞／日を超える）量でＩ２Ｓ酵素を産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養条件下（たとえば、標準の大規模の懸濁又は接着の培養条件）でいったん培養された所望の細胞は、約５〜１００ピコグラム／細胞／日（たとえば、約５〜９０ピコグラム／細胞／日、約５〜８０ピコグラム／細胞／日、約５〜７０ピコグラム／細胞／日、約５〜６０ピコグラム／細胞／日、約５〜５０ピコグラム／細胞／日、約５〜４０ピコグラム／細胞／日、約５〜３０ピコグラム／細胞／日、約１０〜９０ピコグラム／細胞／日、約１０〜８０ピコグラム／細胞／日、約１０〜７０ピコグラム／細胞／日、約１０〜６０ピコグラム／細胞／日、約１０〜５０ピコグラム／細胞／日、約１０〜４０ピコグラム／細胞／日、約１０〜３０ピコグラム／細胞／日、約２０〜９０ピコグラム／細胞／日、約２０〜８０ピコグラム／細胞／日、約２０〜７０ピコグラム／細胞／日、約２０〜６０ピコグラム／細胞／日、約２０〜５０ピコグラム／細胞／日、約２０〜４０ピコグラム／細胞／日、約２０〜３０ピコグラム／細胞／日）の範囲に及ぶ量でＩ２Ｓ酵素を産生することができる。
【００９５】
上記で議論したように通常、Ｉ２Ｓの酵素活性は、保存されたシステイン（たとえば、アミノ酸５９）のホルミルグリシンへの翻訳後修飾によって影響を受ける。この翻訳後修飾は一般にタンパク質合成の間に小胞体で生じ、ＦＧＥによって触媒される。Ｉ２Ｓの酵素活性は通常、Ｉ２Ｓがホルミルグリシン修飾を有する程度と正の相関を示す。たとえば、相対的に高い量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓ調製物は通常、相対的に高い酵素比活性を有し；相対的に低い量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓ調製物は通常、相対的に低い酵素比活性を有する。
【００９６】
Ｉ２ＳとＦＧＥのタンパク質又はｍＲＮＡの間の比が産生される組換えＩ２Ｓタンパク質でのホルミルグリシン修飾にも影響し得ることがさらに熟考される。いくつかの実施形態では、所望の細胞で発現されるＩ２ＳとＦＧＥは異なるタンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現レベルを有する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓのタンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルは、ＦＧＥのタンパク質又はｍＲＮＡのレベルよりも少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８、９、又は１０倍高い。いくつかの実施形態では、組換えＦＧＥのタンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルは、Ｉ２Ｓのタンパク質又はｍＲＮＡのレベルよりも少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８、９、又は１０倍高い。
【００９７】
いくつかの実施形態では、細胞培養条件下（たとえば、標準の大規模の懸濁又は接着の培養条件）でいったん培養された望ましい細胞は、配列番号１のＣｙｓ５９に相当するシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約５０％（たとえば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の変換を含むＩ２Ｓタンパク質を産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養条件下（たとえば、標準の大規模の懸濁又は接着の培養条件）でいったん培養された望ましい細胞は、配列番号１のＣｙｓ５９に相当するシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約５０％（たとえば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の変換を含み、約５ピコグラム／細胞／日の量または、を超える（たとえば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ピコグラム／細胞／日を超える）量でＩ２Ｓ酵素を産生することができる。
ＦＧｌｙ変換の比率
【００９８】
種々の方法が知られ、それを用いてＦＧｌｙ変換の比率を決定することができる。一般に、ホルミルグリシン変換（％ＦＧ）の比率は以下の式を用いて算出することができる：
【数１】
2018088933.tif 000006
たとえば、５０％ＦＧは、精製した組換えＩ２Ｓの半分が治療効果なしで酵素的に活性がないことを意味する。種々の方法を用いて％ＦＧを算出し得る。たとえば、ペプチドマッピング法を使用し得る。手短には、プロテアーゼ（たとえば、トリプシン又はキモトリプシン）を用いてＩ２Ｓタンパク質を短いペプチドに消化し得る。短いペプチドを分離し、対照（たとえば、ＦＧｌｙ変換のないＩ２Ｓタンパク質又は１００％ＦＧｌｙ変換したＩ２Ｓタンパク質）に比べて各ペプチド（特に成熟ヒトＩ２Ｓの５９位に相当する部分を含有するペプチド）の性質及び量を決定し得るように、クロマトグラフィ（たとえば、ＨＰＬＣ）を用いて性状分析し得る。ＦＧｌｙを含有するペプチドの量（活性のあるＩ２Ｓ分子の数に相当する）及びＦＧｌｙとＣｙｓの双方を伴ったペプチドの総量（Ｉ２Ｓ分子の総数に相当する）を決定し、％ＦＧを反映する比が算出され得る。
特異的活性
【００９９】
上記で議論したように通常、Ｉ２Ｓの酵素活性は、保存されたシステイン（たとえば、アミノ酸５９）のホルミルグリシンへの翻訳後修飾によって影響を受ける。従って、Ｉ２Ｓの酵素活性は通常、Ｉ２Ｓがホルミルグリシン修飾を有する程度と正の相関を示す。たとえば、相対的に高い量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓ調製物は通常、相対的に高い酵素比活性を有し；相対的に低い量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓ調製物は通常、相対的に低い酵素比活性を有する。
【０１００】
当業者によって十分に理解されるように、本発明の細胞によって産生される組換えＩ２Ｓタンパク質の酵素活性は種々の試験管内のアッセイ及び生体内でのアッセイによって測定され得る。いくつかの実施形態では、ヘパリン二糖を基質として用いた試験管内の硫酸塩放出活性アッセイによって測定されるとき、産生される組換えＩ２Ｓタンパク質の所望の酵素活性は、少なくとも約２０Ｕ／ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、又は１００Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、ヘパリン二糖を基質として用いた試験管内の硫酸塩放出活性アッセイによって測定されるとき、産生される組換えＩ２Ｓタンパク質の所望の酵素活性は、約２０〜１００Ｕ／ｍｇ（たとえば、約２０〜９０Ｕ／ｍｇ、約２０〜８０Ｕ／ｍｇ、約２０〜７０Ｕ／ｍｇ、約２０〜６０Ｕ／ｍｇ、約２０〜５０Ｕ／ｍｇ、約２０〜４０Ｕ／ｍｇ、約２０〜３０Ｕ／ｍｇ、約３０〜１００Ｕ／ｍｇ、約３０〜９０Ｕ／ｍｇ、約３０〜８０Ｕ／ｍｇ、約３０〜７０Ｕ／ｍｇ、約３０〜６０Ｕ／ｍｇ、約３０〜５０Ｕ／ｍｇ、約３０〜４０Ｕ／ｍｇ、約４０〜１００Ｕ／ｍｇ、約４０〜９０Ｕ／ｍｇ、約４０〜８０Ｕ／ｍｇ、約４０〜７０Ｕ／ｍｇ、約４０〜６０Ｕ／ｍｇ、約４０〜５０Ｕ／ｍｇ）の範囲に及ぶ。ヘパリン二糖を基質として用いた試験管内の硫酸塩放出活性アッセイを行うための例となる条件を以下に提供する。通常、このアッセイは天然に由来する基質であるヘパリン二糖から硫酸イオンを放出するＩ２Ｓの能力を測定する。放出された硫酸塩をイオンクロマトグラフィによって定量し得る。場合によっては、イオンクロマトグラフィには伝導率検出器が装備されている。非限定の例として、試料を先ず１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６に緩衝液交換して製剤化緩衝液におけるリン酸イオンによる阻害を取り除く。次いで試料を反応緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．４）で０．０７５ｍｇ／ｍｌに希釈し、３０μｌの反応容量にて０．３μｇのＩ２Ｓ／１００μｇの基質の酵素と基質の比でヘパリン二糖と共に３７℃で２時間インキュベートする。次いで試料を１００℃で３分間加熱することによって反応を止める。ＩｏｎＰａｃ  ＡＧ１８ガードカラムと共にＤｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１８分析用カラムを用いて分析を行う。１．０ｍｌ／分で１５分間の３０ｍＭ水酸化カリウムによる定組成法を使用する。Ｉ２Ｓ試料によって放出される硫酸塩の量は１．７〜１６．０ナノモルの範囲での硫酸塩基準の線形回帰分析から算出する。報告可能な値をタンパク質のｍｇ当たりの単位として表し、１単位は、時間当たり放出される硫酸塩の１マイクロモルとして定義され、タンパク質濃度はＡ２８０の測定によって決定する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞によって産生される組換えＩ２Ｓタンパク質の酵素活性は、当該技術で既知の種々の他の方法、たとえば、４−メチルウンベリフェリル−硫酸塩の硫酸塩と自然に蛍光を発する４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＦ）への加水分解を測定する４−ＭＵＦアッセイを用いても決定され得る。いくつかの実施形態では、試験管内での４−ＭＵＦアッセイによって測定するとき、産生される組換えＩ２Ｓタンパク質の所望の酵素活性は、少なくとも２Ｕ／ｍｇ、４Ｕ／ｍｇ、６Ｕ／ｍｇ、８Ｕ／ｍｇ、１０Ｕ／ｍｇ、１２Ｕ／ｍｇ、１４Ｕ／ｍｇ、１６Ｕ／ｍｇ、１８Ｕ／ｍｇ、又は２０Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、試験管内での４−ＭＵＦアッセイによって測定するとき、産生される組換えＩ２Ｓタンパク質の所望の酵素活性は、約０〜５０Ｕ／ｍｇ（たとえば、約０〜４０Ｕ／ｍｇ、約０〜３０Ｕ／ｍｇ、約０〜２０Ｕ／ｍｇ、約０〜１０Ｕ／ｍｇ、約２〜５０Ｕ／ｍｇ、約２〜４０Ｕ／ｍｇ、約２〜３０Ｕ／ｍｇ、約２〜２０Ｕ／ｍｇ、約２〜１０Ｕ／ｍｇ、約４〜５０Ｕ／ｍｇ、約４〜４０Ｕ／ｍｇ、約４〜３０Ｕ／ｍｇ、約４〜２０Ｕ／ｍｇ、約４〜１０Ｕ／ｍｇ、約６〜５０Ｕ／ｍｇ、約６〜４０Ｕ／ｍｇ、約６〜３０Ｕ／ｍｇ、約６〜２０Ｕ／ｍｇ、約６〜１０Ｕ／ｍｇ）の範囲に及ぶ。試験管内での４−ＭＵＦアッセイを行うための例となる条件を以下に提供する。通常、４−ＭＵＦアッセイは、４−メチルウンベリフェリル−硫酸塩（４−ＭＵＦ−ＳＯ４）を硫酸塩と自然に蛍光を発する４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＦ）に加水分解するＩ２Ｓタンパク質の能力を測定する。活性の１ミリ単位は、３７℃にて１分間で１ナノモルの４−ＭＵＦ−ＳＯ４を４−ＭＵＦに変換するのに必要とされる酵素の量として定義される。通常、活性が既知のＩ２Ｓ試験試料によって生成される平均蛍光単位（ＭＦＵ）を用いて検量線を生成することができ、それを用いて当該試料の酵素活性を算出することができる。
細胞培養の培地及び条件
【０１０２】
種々の細胞培養の培地及び条件を用いて、本発明に係る操作された細胞を用いて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。たとえば、血清含有培地又は無血清培地にて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。いくつかの実施形態では、無血清培地にて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。いくつかの実施形態では、動物成分を含まない培地、すなわち、動物由来の成分を欠く培地にて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。いくつかの実施形態では、化学的に定義された培地にて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。本明細書で使用されるとき、用語「化学的に定義された栄養培地」は化学的な成分の実質的にすべてが知られる培地を指す。いくつかの実施形態では、化学的に定義された栄養培地は、動物由来の成分、たとえば、血清、血清由来のタンパク質（たとえば、アルブミン又はフェチュイン）及び他の成分を含まない。場合によっては、化学的に定義された培地は１以上のタンパク質（たとえば、タンパク質の増殖因子又はサイトカイン）を含む。場合によっては、化学的に定義された栄養培地は１以上のタンパク質の加水分解物を含む。他の場合では、化学的に定義された栄養培地はタンパク質を含まない培地、すなわち、タンパク質、加水分解物又は未知の組成物の成分を含有しない無血清培地である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、化学的に定義された培地は１以上の動物に由来する成分によって補完され得る。そのような動物に由来する成分には、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清、ヒト血清及びたとえば、アルブミンのような血清に由来するタンパク質（たとえば、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
ロータビン培養、バイオ反応器バッチ培養及びバイオ反応器フェッドバッチ培養を含むが、これらに限定されない種々の細胞培養条件を用いて組換えＩ２Ｓタンパク質を大規模に製造し得る。いくつかの実施形態では、懸濁液で培養される細胞によって組換えＩ２Ｓタンパク質が産生される。いくつかの実施形態では、接着性細胞によって組換えＩ２Ｓタンパク質が産生される。
【０１０５】
例となる細胞培地及び培養条件は実施例の項で記載する。組換えＩ２Ｓタンパク質を作出するための追加の例となる方法及び組成物は、同日付で同封して出願された「組換えイズロン酸−２−スルファターゼを作出するための方法及び組成物」と題する仮特許出願にて記載されており、参照によってその開示全体が本明細書に組み入れられる。
発現されたＩ２Ｓタンパク質の精製
【０１０６】
種々の方法を用いて、本明細書に記載される種々の方法に従って作出されるＩ２Ｓタンパク質を精製し、単離し得る。いくつかの実施形態では、精製過程の第１の工程として、発現されたＩ２Ｓタンパク質は培地に分泌されるので、たとえば、遠心又は濾過によって細胞及び他の固形物を取り除き得る。代わりに又はさらに、発現されたＩ２Ｓタンパク質は宿主細胞の表面に結合する。この実施形態では、ポリペプチド又はタンパク質を発現している宿主細胞が精製のために溶解される。ガラスビーズによる物理的な粉砕及び高いｐＨ条件への暴露を含む当業者に周知の多数の手段によって哺乳類宿主細胞の溶解を達成することができる。
【０１０７】
クロマトグラフィ（たとえば、イオン交換アフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ及びハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ）、ゲル濾過、遠心、若しくは示差溶解度、エタノール沈殿を含むが、これらに限定されない定法によって、又はタンパク質の精製に利用可能な他の技法によってＩ２Ｓタンパク質を単離し、精製し得る（たとえば、すべて参照によって本明細書に組み入れられるＳｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７；  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｓ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．  （ｅｄｓ．），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９；  ａｎｄ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｓｉｍｏｎ，  Ｍ．  Ｉ．，  Ａｂｅｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｎ．  （ｅｄｓ．），  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｖｏｌ  １８２），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７を参照のこと）。特に免疫アフィニティクロマトグラフィについては、タンパク質に対して作られ、固定支持体に取り付けられた抗体を含むアフィニティカラムにタンパク質を結合することによってそのタンパク質を単離し得る。或いは、標準の組換え法によって、たとえば、インフルエンザコーティング配列、ポリヒスチジン又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのようなアフィニティタグをタンパク質に結合させ、適当なアフィニティカラムを通すことによって容易な精製を可能にすることができる。精製過程の間でポリペプチド又はタンパク質の分解を減らす又は除外するために任意の段階又はすべての段階で、たとえば、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、リューペプチン、ペプスタチン又はアプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤を添加し得る。発現されたポリペプチド又はタンパク質を単離し、精製するために細胞を溶解しなければならない場合、プロテアーゼ阻害剤は特に所望である。
【０１０８】
例となる精製方法は以下の実施例の項で記載される。追加の精製方法は、その開示全体が参照によって本明細書に組み入れられる、同日付で同封して出願された「組換えＩ２Ｓタンパク質の精製」と題する仮特許出願にて記載されている。
医薬組成物及び投与
【０１０９】
精製された組換えＩ２Ｓタンパク質を既知の方法に従ってハンター症候群患者に投与し得る。たとえば、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、非経口で、経皮で又は経粘膜で（たとえば、経口若しくは経鼻）送達され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は静脈内投与によって対象に投与される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物はクモ膜下投与によって対象に投与される。本明細書で使用されるとき、用語「クモ膜下投与」又は「クモ膜下注入」は、脊柱管（脊髄を取り囲むクモ膜下空間）への注入を指す。穿頭孔又は大槽穿刺又は腰椎穿刺等を介した側脳室内注入含むが、限定されない種々の技法を使用し得る。いくつかの実施形態では、本発明に係る「クモ膜下投与」又は「クモ膜下送達」は、腰椎の域又は領域を介したＩＴ投与又は送達、すなわち、腰椎ＩＴ投与又は送達を指す。本明細書で使用されるとき、用語「腰椎領域」又は「腰椎域」は第３と第４の腰椎（腰背部）、さらに包括的には脊椎のＬ２〜Ｓ１の領域を指す。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は皮下（すなわち、皮膚の下）投与によって対象に投与される。そのような目的では、製剤は注射器を用いて注入され得る。しかしながら、たとえば、注入用具（Ｉｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅ（商標）Ｇｅｎｊｅｃｔ（商標）用具）；注入ペン（たとえば、ＧｅｎＰｅｎ（商標））；針なし装置（たとえば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ（商標）及びＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（商標））；及び皮下添付送達方式のような製剤の投与用の他の用具が利用可能である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、投与の他の経路（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、又は経粘膜（たとえば、経口若しくは経鼻））との併用でクモ膜下投与が使用され得る。
【０１１４】
本発明は、治療上有効な量の、本明細書で記載される組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物の単回投与と同様に複数回投与を熟考する。組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は、定期的な間隔で、対象の状態（たとえば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度及び程度に応じて投与することができる。いくつかの実施形態では、治療上有効な量の組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物が、定期的な間隔で（たとえば、毎年１回、６ヵ月ごとに１回、５ヵ月ごとに１回、３ヵ月ごとに１回、２ヵ月に１回（２ヵ月ごとに１回）、１ヵ月に１回（１ヵ月ごとに１回）、２週間に１回（２週間ごとに１回）、毎週、毎日又は連続的に）定期的に投与され得る。
【０１１５】
組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は、生理的に許容可能なキャリア又は賦形剤と共に製剤化されて医薬組成物を調製することができる。キャリア及び治療剤は無菌であることができる。製剤は投与の方式に適合すべきである。
【０１１６】
好適な薬学上許容可能なキャリアには、水、塩溶液（たとえば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール類、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、たとえば、ラクトース、アミロース又はデンプンのような炭水化物、たとえば、マンニトール、スクロース等のような糖類、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、と同様にそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤は所望であれば、活性化合物と有害に反応しない、又はその活性を妨害しない補助剤（たとえば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響するための塩、緩衝液、着色剤、風味剤及び／又は芳香物質等）と混合することができる。いくつかの実施形態では、静脈内投与に好適な水溶性キャリアが使用される。
【０１１７】
組成物又は薬物は所望であれば、軽微な量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含有することもできる。組成物は、液状溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は粉剤であることができる。組成物はまたトリグリセリドのような従来の結合剤又はキャリアと共に座薬として製剤化することもできる。経口製剤は、たとえば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準のキャリアを含むことができる。
【０１１８】
組成物又は薬物はヒトに投与するのに適合した医薬組成物として日常の手順に従って製剤化することができる。たとえば、いくつかの実施形態では、静脈内投与用の組成物は通常、無菌の等張の水性緩衝液における溶液である。必要に応じて組成物は可溶化剤及び局所麻酔剤を含んで注射の部位で痛みを軽くし得る。一般に、成分は別々に供給される、又は、たとえば、活性剤の量を示すアンプル若しくはサシェのような密封した容器にて凍結乾燥粉末若しくは水を含まない濃縮物として、単位剤形にて一緒に混合される。組成物が点滴で投与されるべきである場合、無菌の医薬等級の水、生理食塩水又はデキストロース／水を含有する点滴ビンでそれを調剤することができる。組成物が注射で投与される場合、投与に先立って成分が混合され得るように無菌の注射用水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１１９】
本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な量」は、本発明の医薬組成物に含有される治療剤の総量に基づいて主に決定される。一般に、治療上有効な量は、対象にとって意味のある利益（たとえば、根底にある疾患又は状態を治療すること、調節すること、治癒すること、予防すること及び／又は改善すること）を達成するのに十分である。たとえば、治療上有効な量は、所望の治療効果及び／又は予防効果を達成するのに十分な量、たとえば、リソソーム酵素受容体又はその活性を調節し、それによってリソソーム蓄積症又はその症状を治療する（たとえば、本発明の組成物の対象への投与に続く、「ゼブラ小体」又は細胞の空胞変性の存在又は発生の軽減又は排除）のに十分な量であり得る。一般に、それを必要とする対象に投与される治療剤（たとえば、組換えリソソーム酵素）の量は対象の特徴に左右されるであろう。そのような特徴には、対象の状態、疾患の重症度、全身状態、年齢、性別及び体重が挙げられる。当業者は、それら及び関連する因子に応じて適当な投与量を容易に決定することができるであろう。加えて、客観的なアッセイ及び主観的なアッセイの双方を任意で採用して最適な投与量範囲を特定し得る。
【０１２０】
治療上有効な量は一般に複数の単位用量を含む投与計画にて投与される。特定の治療用のタンパク質については、治療上有効な量（及び／又は有効な投与計画の範囲内での適当な単位用量）は、たとえば、投与経路、他の医薬剤との併用に応じて変化し得る。また、特定の患者のための具体的な治療上有効な量（及び／又は単位用量）は、治療される障害及び障害の重症度、採用される具体的な医薬剤の活性、採用される具体的な組成物、患者の年齢、体重、全身状態、性別及び食事、投与の時間、投与の経路及び／又は採用される具体的な融合タンパク質の排泄若しくは代謝の速度、治療の持続時間、及び医療技術で周知のような類似の因子を含む種々の因子に左右され得る。
【０１２１】
追加の例となる医薬組成物及び投与方法は、双方の開示全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年３月３０日に出願された「イズロン酸−２−スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法及び組成物」と題されるＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１６３６４９及び「イズロン酸−２−スルファターゼの皮下投与」と題される仮特許出願番号６１／６１８，６３８にて記載されている。
【０１２２】
特定の対象については、具体的な投与計画は、個々の必要性及び酵素補充療法を投与する又はその投与を監督する人の専門的な判断に従って時間をかけて調整されるべきであり、本明細書で述べられる投与量範囲は単に例となるだけであって、請求される本発明の実践の範囲を限定するようには意図されないことがさらに理解されるべきである。
【実施例】
【０１２３】
実施例１：組換えＩ２ＳおよびＦＧＥを共発現する最適化された細胞株の発生
当該実施例は、組換えＩ２Ｓタンパク質を製造するために使用することができる組換えＩ２ＳおよびＦＧＥを共発現する最適化された例示的な細胞株を説明する。複数の代替のアプローチ、発現ベクターおよびクローニング技術が利用可能であることは、当業者に明白だろう。
【０１２４】
ヒトイズロン酸２スルファターゼ酵素（Ｉ２Ｓ）の典型的な成熟形態は、グリコシル化およびホルミルグリシンへのシステイン転換（図１）等の酵素活性化について、広範囲なプロセッシングおよび翻訳後修飾を実施する５２５アミノ酸糖タンパク質である。哺乳類細胞では、Ｉ２Ｓ（いわゆるアミノ酸５９で）酵素内の保存されたシステイン残基は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によってホルミルグリシンに転換される。Ｉ２Ｓ酵素の活性部位内のホルミルグリシンへのシステインの転換は、ヒトスルファターゼ酵素の活性形態を発生させるのに重要なステップである。当該実験の目的は、活性組換えＩ２Ｓを発生させるためにＩ２ＳおよびＦＧＥを共発現する最適化されたヒト細胞株を操作することであった。
【０１２５】
図２は、Ｉ２ＳおよびＦＧＥの共発現について、いくつかの例示的な構築物の設計を示す。例えば、Ｉ２ＳおよびＦＧＥの発現単位は、別個のベクターに位置することができ、別個のベクターは同時形質移入することも、別個に形質移入こともできる（図２Ａ）。あるいは、Ｉ２ＳおよびＦＧＥの発現単位は、同じベクターに位置することができる（図２Ｂ）。ある構造では、別個のシストロンにも言及されるように、Ｉ２ＳおよびＦＧＥは、同じベクターにあるが、別個のプロモーターの制御下に置くことができる（図２Ｂ（１））。あるいは、Ｉ２ＳおよびＦＧＥを転写的に結合されたシストロンのように設計することができ、すなわち、同じプロモーターの制御下で、Ｉ２ＳおよびＦＧＥを１つのオープンリーディングフレームとして設計する（図２Ｂ（２））。典型的には、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を、メッセンジャーＲＮＡのキャップ非依存的翻訳開始を可能にするように設計する（図２Ｂ（２））。
【０１２６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列でヒトＩ２Ｓタンパク質を、および配列番号６に示されるアミノ酸配列でヒトホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現するように、ヒト細胞株を操作した。
配列番号２
完全長前駆体イズロン酸２スルファターゼ：
ＭＰＰＰＲＴＧＲＧＬＬＷＬＧＬＶＬＳＳＶＣＶＡＬＧＳＥＴＱＡＮＳＴＴＤＡＬＮＶＬＬＩＩＶＤＤＬＲＰＳＬＧＣＹＧＤＫＬＶＲＳＰＮＩＤＱＬＡＳＨＳＬＬＦＱＮＡＦＡＱＱＡＶＣＡＰＳＲＶＳＦＬＴＧＲＲＰＤＴＴＲＬＹＤＦＮＳＹＷＲＶＨＡＧＮＦＳＴＩＰＱＹＦＫＥＮＧＹＶＴＭＳＶＧＫＶＦＨＰＧＩＳＳＮＨＴＤＤＳＰＹＳＷＳＦＰＰＹＨＰＳＳＥＫＹＥＮＴＫＴＣＲＧＰＤＧＥＬＨＡＮＬＬＣＰＶＤＶＬＤＶＰＥＧＴＬＰＤＫＱＳＴＥＱＡＩＱＬＬＥＫＭＫＴＳＡＳＰＦＦＬＡＶＧＹＨＫＰＨＩＰＦＲＹＰＫＥＦＱＫＬＹＰＬＥＮＩＴＬＡＰＤＰＥＶＰＤＧＬＰＰＶＡＹＮＰＷＭＤＩＲＱＲＥＤＶＱＡＬＮＩＳＶＰＹＧＰＩＰＶＤＦＱＲＫＩＲＱＳＹＦＡＳＶＳＹＬＤＴＱＶＧＲＬＬＳＡＬＤＤＬＱＬＡＮＳＴＩＩＡＦＴＳＤＨＧＷＡＬＧＥＨＧＥＷＡＫＹＳＮＦＤＶＡＴＨＶＰＬＩＦＹＶＰＧＲＴＡＳＬＰＥＡＧＥＫＬＦＰＹＬＤＰＦＤＳＡＳＱＬＭＥＰＧＲＱＳＭＤＬＶＥＬＶＳＬＦＰＴＬＡＧＬＡＧＬＱＶＰＰＲＣＰＶＰＳＦＨＶＥＬＣＲＥＧＫＮＬＬＫＨＦＲＦＲＤＬＥＥＤＰＹＬＰＧＮＰＲＥＬＩＡＹＳＱＹＰＲＰＳＤＩＰＱＷＮＳＤＫＰＳＬＫＤＩＫＩＭＧＹＳＩＲＴＩＤＹＲＹＴＶＷＶＧＦＮＰＤＥＦＬＡＮＦＳＤＩＨＡＧＥＬＹＦＶＤＳＤＰＬＱＤＨＮＭＹＮＤＳＱＧＧＤＬＦＱＬＬＭＰ
配列番号６
完全長ヒトＦＧＥ前駆体：
ＭＡＡＰＡＬＧＬＶＣＧＲＣＰＥＬＧＬＶＬＬＬＬＬＬＳＬＬＣＧＡＡＧＳＱＥＡＧＴＧＡＧＡＧＳＬＡＧＳＣＧＣＧＴＰＱＲＰＧＡＨＧＳＳＡＡＡＨＲＹＳＲＥＡＮＡＰＧＰＶＰＧＥＲＱＬＡＨＳＫＭＶＰＩＰＡＧＶＦＴＭＧＴＤＤＰＱＩＫＱＤＧＥＡＰＡＲＲＶＴＩＤＡＦＹＭＤＡＹＥＶＳＮＴＥＦＥＫＦＶＮＳＴＧＹＬＴＥＡＥＫＦＧＤＳＦＶＦＥＧＭＬＳＥＱＶＫＴＮＩＱＱＡＶＡＡＡＰＷＷＬＰＶＫＧＡＮＷＲＨＰＥＧＰＤＳＴＩＬＨＲＰＤＨＰＶＬＨＶＳＷＮＤＡＶＡＹＣＴＷＡＧＫＲＬＰＴＥＡＥＷＥＹＳＣＲＧＧＬＨＮＲＬＦＰＷＧＮＫＬＱＰＫＧＱＨＹＡＮＩＷＱＧＥＦＰＶＴＮＴＧＥＤＧＦＱＧＴＡＰＶＤＡＦＰＰＮＧＹＧＬＹＮＩＶＧＮＡＷＥＷＴＳＤＷＷＴＶＨＨＳＶＥＥＴＬＮＰＫＧＰＰＳＧＫＤＲＶＫＫＧＧＳＹＭＣＨＲＳＹＣＹＲＹＲＣＡＡＲＳＱＮＴＰＤＳＳＡＳＮＬＧＦＲＣＡＡＤＲＬＰＴＭＤ
【０１２７】
Ｉ２Ｓ発現細胞株を発生するために、配列番号２に示されるアミノ酸配列でＩ２Ｓタンパク質をコードするコドン最適化核酸配列（配列番号７）および配列番号６に示されるヒトＦＧＥ酵素をコードする核酸配列（配列番号８）で、細胞を安定的に形質移入した。
配列番号７
ホモサピエンスコドン最適化イズロン酸２スルファターゼ（ＩＤＳ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ
ＡＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＴＧＧＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＣＣＴＡＧ
配列番号８
ホモサピエンスコドン完全長前駆体ホルミルグリシン生成酵素  （ＦＧＥ）、ｍＲＮＡＡＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＧＧＧＴＴＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＧＡＴＡＣＴＣＧＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＣＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＴＣＧＣＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＧＡＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＧＡＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＣＧＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧＧＧＡＡＴＡＣＡＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＡＡＴＡＧＡＣＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＴＣＣＧＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＴＴＡＴＡＣＡＡＣＡＴＡＧＴＧＧＧＧＡＡＣＧＣＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＣＧＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＡＴＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡ
【０１２８】
Ｉ２ＳとＦＧＥの両方をコードする核酸配列は、ヒトＣＭＶプロモーターによって制御される。Ｉ２ＳｍＲＮＡの翻訳は、５５０アミノ酸完全長のＩ２Ｓタンパク質（配列番号２）を合成し、２５アミノ酸シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは取り除かれ、可溶性の酵素は細胞から分泌される。
【０１２９】
細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）コード配列および／またはブラストサイジンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子を使用し、ネオマイシン類似体Ｇ４１８および／またはブラストサイジンをそれぞれ使用して、形質移入された細胞を選択することができる。さらに、マウスのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子をＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥコードベクター上で使用して、メトトレキサート（ＭＴＸ）選択によって増加したＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥコード配列の複製を含む細胞株を単離することができる。
【０１３０】
Ｉ２Ｓを産生する細胞を単離し、適切な薬物選択に供し、数が増加した形質移入されたＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥ遺伝子の複製で、細胞を単離する。Ｉ２Ｓの定量化はＥＬＩＳＡによって実施する。
【０１３１】
また、細胞集団をメトトレキサート（ＭＴＸ）のステップワイズ選択に供し、Ｉ２Ｓの増加した生産性で細胞を単離する。Ｉ２Ｓの生産性をＥＬＩＳＡによるＭＴＸ選択の間にモニターした。
【０１３２】
幾巡かの増殖後、１０％の仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭから無血清既知組成培地に段階的に還元させることによって、いくつかのＩ２Ｓを産生するクローンを無血清培地中の懸濁適合に供した。限界希釈クローニング（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）によって、いくつかの独立したクローン集団を確立した。コロニーをＩ２Ｓ酵素活性アッセイおよびＥＬＩＳＡによって選別した。２つの安定した細胞株２Ｄおよび４Ｄが高い生物能およびＩ２Ｓの強固な発現を示し、これをさらなる開発に選択した。
【０１３３】
実施例２：Ｉ２ＳおよびＦＧＥを共発現する安定した細胞株の評価
Ｉ２ＳおよびＦＧＥを共発現する２つの細胞株２Ｄおよび４Ｄを特徴付けるために、追加の実験を実施した。
【０１３４】
特異的活性
Ｉ２Ｓ酵素の第一の特異的活性を評価した。蛍光に基づく４−ＭＵＦアッセイを使用して、特異的活性について、２Ｄおよび４Ｄ細胞株から産生されたＩ２Ｓ酵素を分析した。端的には、アッセイではＩ２Ｓ基質４−メチルウンベリフェリル−硫酸（４−ＭＵＦ−ＳＯ４）の加水分解を測定する。Ｉ２Ｓによる４−ＭＵＦ−ＳＯ４基質の切除時に、分子は、硫酸塩および天然に蛍光性の４−メチルウンベリフェリル（４−ＭＵＦ）に転換する。結果として、経時的に蛍光性シグナルの全体的な変化を評価することによって、Ｉ２Ｓ酵素活性を決定することができる。当該実験について、Ｉ２Ｓ−ＡＦ  ２Ｄおよび４Ｄヒト細胞株から産生された精製されたＩ２Ｓ酵素を、４−メチルウンベリフェリル−硫酸（４−ＭＵＦ−ＳＯ４）、カリウム塩（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ−７１３３）の溶液でインキュベートした。一連の対照の標準試料を使用して、原液の１：１００、１：２００および１：２０，０００で希釈された市販のＩ２Ｓ酵素を使用して、アッセイの較正を行った。３７℃で酵素アッセイを実施し、較正した蛍光光度計を使用してアッセイした。各標準試料について、得られる蛍光値を使用して、以下の等式を使用して、変動係数率を決定した。
【数２】
2018088933.tif 000007
【０１３５】
その後、報告可能な酵素活性を決定するために、率ＣＶ値を使用して、各試料の補正した平均蛍光を計算し、以下の公式を使用してｍＵ／ｍＬで表した。
【数３】
2018088933.tif 000008
ＣＦＵ＝負に補正された平均蛍光
ＤＦ＝希釈係数
【０１３６】
活性の１ミリ単位は、３７℃、１分で、４−メチルウンベリフェリル−硫酸の１ナノモルを４−メチルウンベリフェロンに転換するのに必要とされる酵素の量である。
【０１３７】
ホルミルグリシンの転換率
ペプチドマッピングを使用して、ＦＧｌｙ転換率を決定した。Ｉ２Ｓ活性は、以下に示されるように、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によってホルミルグリシン転換するために、システイン（成熟したヒトＩ２Ｓの５９位に対応する）を必要とする。
【化１】
2018088933.tif 000009
したがって、ホルミルグリシン転換率（％ＦＧ）を以下の公式を使用して計算することができる。
【数４】
2018088933.tif 000010
【０１３８】
例えば、５０％のＦＧは、精製された組換えＩ２Ｓの半分は、任意の治療効果のない酵素的に不活性であることを意味する。
【０１３９】
ペプチドマッピングを使用して％ＦＧを計算した。端的には、組換えＩ２Ｓタンパク質は、タンパク分解酵素（例えば、トリプシンまたはキモトリプシン）を使用して、短いペプチドに消化された。短いペプチドを分離し、ＨＰＬＣを使用して特徴付けした。成熟したヒトＩ２Ｓの５９位に対応する位置を含むペプチドが、対照（例えば、ＦＧｌｙ転換のないＩ２Ｓタンパク質または１００％ＦＧｌｙ転換したＩ２Ｓタンパク質）と比較して、５９位のＣｙｓがＦＧｌｙに転換されるかどうかを特徴付けした。ＦＧｌｙを含むペプチドの量（活性Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）、およびＦＧｌｙとＣｙｓの両方を有するペプチドの全量（全Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）を、対応するピーク領域に基づいて特定してもよく、％ＦＧを反映する比を計算した。
【０１４０】
ＦＧｌｙ転換率と特異的活性の相関
ＦＧｌｙ転換率と特異的活性の例示的な相関を図３に示す。示されるように、ホルミルグリシンの転換率が高いと、Ｉ２Ｓ酵素活性がより高くなることをデータは示唆している。
【０１４１】
グリカンマップ
細胞株２Ｄおよび４Ｄによって産生される組換えＩ２Ｓタンパク質のグリカン組成物を決定した。アニオン交換クロマトグラフィーを使用してグリカン組成物の定量化を行った。以下に記載するように、これらの条件下で生成される組換えＩ２Ｓのグリカンマップは、７つのピーク群から構成され、負電荷の増加量に従って溶離し、少なくとも部分的に、酵素消化物から生じるシアル酸およびマンノース−６−リン酸グリコフォームに由来する。端的には、無血清細胞培養法（Ｉ２Ｓ−ＡＦ  ２Ｄ無血清およびＩ２Ｓ−ＡＦ  ４Ｄ無血清）を使用して得られる精製された組換えＩ２Ｓおよび参照の産生された組換えＩ２Ｓを、（１）シアル酸残基を取り除くための精製されたノイラミニダーゼ酵素（アルスロバクター・ウレアファシエンス（１０ｍＵ／μＬ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（インディアナポリス、インディアナ州）、カタログ番号２６９  ６１１（１Ｕ／１００μＬ）から単離）、（２）マンノース−６−リン酸残基を完全に放出するためのアルカリホスファターゼを、３７±１℃で２時間、（３）アルカリホスファターゼ＋ノイラミニダーゼ、または（４）処理なし、のいずれかで処理した。各酵素消化物を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１  Ｇｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎを備えたＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｌｕｍｎを使用して、Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｕｌｓｅｄ  Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）によって分析した。０．４〜２．０ナノモルの範囲の一連のシアル酸およびマンノース−６−リン酸標準を、各アッセイについて実施した。１００ｍＭの水酸化ナトリウム中の４８ｍＭの酢酸ナトリウムを使用して、定組成法を、雰囲気カラム温度、流速１．０ｍＬ／分で最小１５分間実施し、各ピークを溶離した。Ｉ２Ｓ−ＡＦとＩ２Ｓ標準試料の両方について、個別の実施から生成されたデータを、単一のクロマトグラフにそれぞれまとめ、各個別の組換えタンパク質についてグリカンマップを表した。図４に示されるように、細胞株２Ｄおよび４Ｄによって産生されたＩ２Ｓの例示的なグリカンマップは、代表的な溶離ピーク（溶離の順序で）を表し、中性、モノ、ジシアリル化、モノホスホリル化、トリシアリル化、およびハイブリッド（モノシアリル化およびキャップされたマンノース−６−リン酸）、テトラシアリル化、およびハイブリッド（ジシアリル化およびキャップされたマンノース−６−リン酸）並びにジホスホリル化グリカンを構成した。
【０１４２】
実施例３  無血清懸濁細胞培養
当該実施例は、大規模な無血清懸濁培養を開発し、最適化した細胞株を培養して、組換えＩ２Ｓを産生し得ることを説明する。
【０１４３】
無血清懸濁細胞培養系
端的には、実施例１の２Ｄまたは４Ｄ細胞株を使用して種培養を確立した。選択のためにＭＴＸを補充された無血清既知組成の拡張された培地を含む２５０ｍＬの組織培養振とうフラスコに、細胞を移動し、炭酸水素ナトリウムでｐＨを７．３に調整し、３７℃、５％のＣＯ２で、数日間増殖させた。培養が十分な細胞密度および生存能に達すると、最初の種培養を使用して５００ｍＬの組織培養振とうフラスコに、最初の一連の段階的な細胞培養拡張を播種し、次に１Ｌの組織培養振とうフラスコに播種した。
【０１４４】
各１Ｌの培養物を１０ＬのＣｅｌｌｂａｇ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（登録商標）（Ｗａｖｅ  Ｅｕｒｏｐｅ）に移動し、拡張培地を加えることによって、バッチ培養拡張を実施した。十分な細胞密度に達した後、新しい拡張培地を加え、細胞を十分な密度になるまで成長させた。１０ＬのＣｅｌｌｂａｇをＷａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（登録商標）系（Ｗａｖｅ  Ｅｕｒｏｐｅ）に移動し、連続的な灌流培地下で成長できるように培養条件を修正した。拡張成長培地を運び、ｐＨ、グルタミン、グルタミン酸、グルコース、アンモニウム、乳酸塩、ｐＣＯ２およびモル浸透圧濃度のオフラインの代謝物質解析を行うために、試料を回収した。
【０１４５】
十分な細胞密度に達したら、全ての１０Ｌの細胞培養物を、新鮮な拡張培地を含む５０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（登録商標）に移動し、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（登録商標）系を使用して、十分な細胞密度になるまで成長させた。
【０１４６】
次に、細胞を濃縮し、灌流中に媒介される細胞培養を再利用するために培地を浄化するよう設計された、２００Ｌの使い捨てのバイオリアクターおよび遠心分離灌流装置（Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ（登録商標）ＣＥＬＬ  ＩＩユニット、Ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  Ｓｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、細胞拡張を行った。拡張培地（ｐＨを７．１０に調整）を一部の５０Ｌの培養物で播種し、十分な細胞密度になるまで成長させた。
【０１４７】
次に、一部の２００Ｌ培養物を使用して、生産培地中（ｐＨを７．２０に調整）の２０００Ｌの使い捨てのバイオリアクターおよび遠心分離灌流装置（（Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ（登録商標）ＣＥＬＬ  ＩＩユニット、Ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  Ｓｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に蒔いた。バッチ成長条件下で細胞は成長した。２日間の成長の後、転換期に達するまで、条件を連続灌流に調整した。２４時間の転換期について、細胞は灌流成長条件下で成長した。
【０１４８】
生産期では、２つのＣｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  ＣＥＬＬ  ＩＩユニットを使用した。生産期は、転換期の開始から約２４時間後に開始し、流出速度を制御することによって、望ましい期間を保持した。
【０１４９】
本明細書に記載の特定の化合物、組成物および方法は、特定の実施形態に従って特定性を有して記載されているが、以下の実施例は、本発明の化合物を説明するためだけにあり、同化合物を限定することを意図しない。
【０１５０】
英語の冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および請求項で使用されるとき、逆であると明白に示されない限り、複数の指示物を含むことを理解されたい。１つ以上のメンバーの群の間で「または」を含む請求項または記述は、逆であると明白に示されない限り、または、文脈から他に明白的に示されない限り、１つ、１つ以上、または全ての群のメンバーが存在する場合、そこで使用される場合、さもなければ所与の生成物またはプロセスに関連する場合を満たすと考えられる。本発明は、群の厳密に１つのメンバーが存在する、そこで使用される、またはさもなければ所与の生成物またはプロセスに関連する実施形態を含む。本発明はまた、１つ以上、または全体の群のメンバーが存在する、そこで使用される、またはさもなければ所与の生成物またはプロセスに関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、すべての変形例、組み合わせ、および置換例を包含し、そうではないと示されない限り、または、矛盾または不一致が生じることが当業者に明白である限り、１つ以上の列挙される請求項からの１つ以上の制限、要素、節、記述用語等は、同じベースの（または、関連する他の任意の）請求項に依存する別の請求項に導入される。要素が列挙として表される場合（例えば、マーカッシュ群、または同様の形式）要素の副要素もそれぞれ開示され、どの要素も群から取り除くことができる。通常、本発明、または本発明の態様は、特定の要素、特性等を含むものとして意味され、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、当該要素、特性等から成り、または本質的に成る。簡潔さのために、これらの実施形態は、すべての場合において、特に本明細書の非常に多くの言葉に記載されていない。本発明の実施形態または態様は、特別な除外が明細書に記載されない限り、請求項から明示的に除外することができることも理解されたい。本発明の背景を説明するために、および実施について追加の詳述を提供するために、本明細書に参照される刊行物、ウェブサイト、およびその他の参考文献は、参照により本明細書に取り込まれる。
【図１Ａ】
2018088933.tif 000011
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
2018088933.tif 000014
【図４】
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【配列表】
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