【手続補正書】
【提出日】平成27年8月10日(2015.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の癌または前癌性変化を検出する方法であって、
前記対象の構成的ゲノムを取得し；
前記対象の生物試料の複数のＤＮＡフラグメントの各々の１つ以上の配列タグを受け入れ、前記生物試料が無細胞性ＤＮＡを含み；
前記配列タグのゲノム位置を決定し；
第一座位の第一数を決定するために、前記配列タグを、構成的ゲノムと比較し、ここで、
各第一座位において、構成的ゲノムと比べた配列異型を有する配列タグ数が、カットオフ値より上で、前記カットオフ値が１より大きい；
前記第一座位における配列異型を有する配列タグのカウントに基づいてパラメーターを決定し；および
前記対象の癌レベルの分類を決定するために、前記パラメーターを、閾値と比較すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記閾値が、１つ以上の他の対象からの１つ以上の試料から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記座位の前記カットオフ値が、前記座位におけるゲノム位置を有する配列タグの全数に依存する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
異なるカットオフ値が、少なくとも２つの前記第一座位に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一座位の１つの第一カットオフ値を動的に決定し、前記１つの座位が第一領域内に属することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第一カットオフ値が、前記第一座位の前記１つのシークエンス深度に基づいて決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一カットオフ値が、シーケンスエラー率、前記第一領域のシークエンス深度、および前記第一領域のヌクレオチド位置数に依存する偽陽性率に基づいて決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第一カットオフ値が、前記第一領域の真位置数に基づいて決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物試料のシークエンス深度Ｄおよび腫瘍由来ＤＮＡの分画濃度ｆに基づいて、前記第一カットオフ値の真位置数を算出することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記真位置数の算出が、式：
【数１】
2015527057.tif 000001
（式中、Ｐｂは、真位置を検出する確率であり、ｒは、前記第一カットオフ値であり、Ｍｐ＝Ｄｘｆ／２である）
に従ったポアソン分布確率を使用する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一カットオフ値が、次の基準： 
前記シークエンス深度が５０より小さいならば、前記第一カットオフ値が５である、
前記シークエンス深度が５０〜１１０ならば、前記第一カットオフ値が６である、
前記シークエンス深度が１１１〜２００ならば、前記第一カットオフ値が７であり、
前記シークエンス深度が２０１〜３１０ならば、前記第一カットオフ値が８であり、
前記シークエンス深度が３１１〜４５０ならば、前記第一カットオフ値が９であり、
前記シークエンス深度が４５１〜６２０ならば、前記第一カットオフ値が１０であり、
前記シークエンス深度が６２１〜８００ならば、前記第一カットオフ値が１０である、
のいずれか１つを使用して決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記パラメーターが、第一座位の前記第一数の加重和であり、各第一座位の分布が、前記各第一座位に割り当てられる重要度値に基づいて、重み付けされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記パラメーターが、第一座位の前記第一数における配列異型を示す前記配列タグの和を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記和が加重和であり、１つの前記第一座位が、第二前記第一座位の第二重みより異なる第一重みを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一重みが、前記第二重みより大きく、１つの第一座位が、癌と関連し、前記第二前記第一座位が、癌と関連しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記パラメーターが、第一座位の前記第一数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
配列タグのゲノム位置の決定が：
前記配列タグの少なくとも１つの位置を、参照ゲノムにアライメントさせ、前記配列タグのアライメントが、前記配列タグと前記構成的ゲノムとの間の１つ以上のミスマッチを可能にすること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記構成的ゲノムに対する前記配列タグの比較が、
前記参照ゲノムと比べた異型を有する第二座位の第二数を決定するために、前記構成的ゲノムを、前記参照ゲノムと比較し；
前記アライメントに基づいて、第三座位の第三数を決定し：
各第三座位において、前記参照ゲノムと関する配列異型を有する前記配列タグの数が、カットオフ値より上であり；および
第一座位の前記第一数を得るために、前記第三数と前記第二数の差を得ること
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第三数と前記第二数の前記差を得ることが、前記第一座位の前記特定の座位を特定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記パラメーターの決定が、
第一座位の前記第一数の各座位のために、
前記座位にアライメントし、前記座位に配列異型を有する配列タグをカウントし；および
前記各カウントに基づいて前記パラメーターを決定すること
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記構成的ゲノムが、５０％以上の構成的ＤＮＡを含む前記対象からの構成的試料に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
配列タグのゲノム位置の決定が、
前記配列タグの少なくとも１つの位置を、前記構成的ゲノムにアライメントさせ、配列タグの前記アライメントが、前記配列タグと前記構成的ゲノムとの間の１つ以上のミスマッチを可能にすること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記構成的ゲノムへの前記配列タグの比較が、
前記アライメントに基づいて、前記対象の前記構成的ゲノムと関連する遺伝子位置において、配列異型を有する配列タグを特定し；
各遺伝子位置に、配列異型を示し；
前記遺伝子位置にアライメントし、前記遺伝子位置において配列異型を有する配列タグの各第一数をカウントし；
前記各第一数に基づいて、パラメーターを決定すること
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記各第一数に基づいて、前記パラメーターが、
第一和を得るために、前記各第一数を加算し；および
前記パラメーターを決定するために、前記第一和を使用すること
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記パラメーターを決定するために、前記第一和の使用が、配列異型を示す遺伝子位置の前記数を、前記第一和から引くことを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記パラメーターを決定するために、前記第一和の使用が、アライメントされた配列タグの量に基づいて、前記第一和を正規化することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
９０％以上の構成的ＤＮＡを含む前記対象の構成的試料を取得し；
前記構成的試料の複数のＤＮＡフラグメントの各々の１つ以上の第二配列タグを得るために、前記構成的試料のＤＮＡフラグメントのランダムシークエンシングを行い；
参照ゲノムに、前記第二配列タグの少なくとも１つの部分をアライメントさせ、前記第二配列タグの前記アライメントが、前記第二配列タグとＭまたはより小さい遺伝子位置における前記構成的ゲノムとの間のミスマッチを可能にし、Ｍが、１と等しいまたは大きい整数であり；および
前記第二配列タグおよび前記アライメントに基づいて、前記構成的ゲノムを構築すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記構成的試料が、前記生物試料であり、前記構成的ゲノムの構築が、
ホモ接合性座位または２つのアレルを有するヘテロ接合性座位の決定を含む共通配列を決定し；および
前記構成的ゲノムにおいて、前記共通配列を使用すること
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象の前記生物試料を受け；および
前記生物試料中の複数のＤＮＡフラグメントの各々の前記１つ以上の配列タグを生成するために、前記生物試料中のＤＮＡフラグメントの前記ランダムシークエンシングを行うこと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上の配列タグが、前記生物試料中のＤＮＡフラグメントのランダムシークエンシングから生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記生物試料が、尿、胸水、腹水（ascitic fluid）、腹水（peritoneal fluid）、唾液、脳脊髄液、または便試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記パラメーターが、腫瘍由来ＤＮＡの分画濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
対象の１つ以上の腫瘍の不均一性を解析する方法であって、
前記対象の構成的ゲノムを取得し；
前記対象の生物試料中の複数のＤＮＡフラグメントの各々の１つ以上の配列タグを受け、前記生物試料が、無細胞性ＤＮＡを含み；
前記配列タグのゲノム位置を決定し；
第一座位の第一数を決定するために、前記配列タグを、前記構成的ゲノムと比較し：
各第一座位において、前記構成的ゲノムに関する配列異型を有する前記配列タグの数が、カットオフ値より上であり、前記カットオフ値が１より大きく；および
第一遺伝子位置の前記セットの前記各第一数に基づいて、前記１つ以上の腫瘍の不均一性の測度を算出すること、
を含む方法。
【請求項３４】
不均一性レベルの分類を決定するために、前記不均一性測度を、１つ以上の閾値と比較することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の閾値が、その腫瘍が生検を行われ、不均一性レベル測定のための生検された腫瘍中の突然変異を決定するために解析された１つ以上の他の対象から決定され、および１つ以上の他の対象の無細胞性ＤＮＡを含む生物試料からの不均一性測度が、閾値を決定するために使用される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上の閾値に対する前記不均一性測度の比較が、前記不均一性測度に基づいて、不均一性レベルをアウトプットする校正機能に、前記不均一性測度をインプットすることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上の測度が、１つ以上のＤＮＡフラグメントが、その遺伝子位置における配列異型を有する間に、前記構成的ＤＮＡにアライメントされた第一ゲノム位置の全数を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
複数の不均一性測度が算出され、不均一性測度の算出が、
各第一座位で、配列変異を有する配列タグの比率を算出し；
前記比率の値の、第一座位の数のヒストグラムを作成し；および
前記ヒストグラム中の複数のピークを特定すること
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
不均一性測度が、特定したピークの前記数に対応する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
不均一性測度が、２つのピーク高さの比を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記比率各々が、特定の第一座位で測定した腫瘍ＤＮＡの分画濃度を表す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記不均一性測度が、配列変異を有する配列タグの第一特定量を有する第一座位の第一比率および配列変異を有する配列タグの第二特定量を有する第一座位の第二比率の比に対応する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記第一特定量が、前記第二特定量より小さい、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第一特定量が、第一範囲および前記第二特定量が、第二範囲であり、前記第一範囲が、前記第二範囲より下である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第一特定量および前記第二特定量が、分画濃度または配列変異を有する配列タグの絶対数に対応する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記不均一性測度が、前記各第一数の各々に対応する第一座位の数のヒストグラムから決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
第一特定遺伝子位置の前記セットが、第一サブセットおよび第二サブセットを含み、前記１つ以上の測度が、前記第一サブセットに対応する前記各第一数の第一ヒストグラムおよび前記第二サブセットに対応する前記各第二数の第二ヒストグラムを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記不均一性測度が、特定値以上の対応する第一数を有する第一座位の比率を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
無細胞性ＤＮＡを含む生物試料中の腫瘍ＤＮＡの分画濃度を決定する方法であって、
前記生物試料中の複数のＤＮＡフラグメントの各々の１つ以上の配列タグを受け；
前記配列タグのゲノム位置を決定し；
複数のゲノム領域の各々の：
前記ゲノム領域内のゲノム位置を有する配列タグから、前記ゲノム領域内のＤＮＡフラグメントの各量を決定し；
各密度を得るために、前記各量を正規化し；および
前記ゲノム領域が、１コピー欠失または１コピー獲得を示しているかどうか確認するために、参照密度に対して前記各密度を比較し；
１コピー欠失が示すと確認された１つ以上の各密度から、または１コピー獲得が示すと確認された１つ以上の各密度から第一密度を算出し；および
前記分画濃度を：
微分を得るために、別の密度に対して前記第一密度を比較し、前記微分を、前記参照密度で正規化することにより算出すること、
を含む方法。
【請求項５０】
様々な各密度を有するゲノム領域の数のヒストグラムを作成し；
前記ヒストグラムの複数のピークを特定し；および
１つ以上の第二ピークのゲノム領域の前記数に対する、１つ以上の第一ピークのゲノム領域の前記数の比から不均一性測度を算出すること、
をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ヒストグラムが、前記ヒストグラムを作成中に、各ゲノム領域を個別に決定された分画濃度値を使用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５２】
前記第一ピークが、第一特定量の各密度を有し、前記第二ピークが、第二特定量の各密度を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第一特定量が、第一範囲であり、前記第二特定量が、第二範囲であり、前記第一範囲が、前記第二範囲より小さい、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ゲノム領域が、１コピー欠失または１コピー獲得を示しているかどうか確認するために、前記参照密度に対する前記各密度の比較が、
前記各密度と前記参照密度との間の差をコンピューターで計算し；および
前記差を、カットオフ値と比較すること、
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記微分が、前記微分を、前記参照密度で割ることにより前記参照密度で正規化される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記別の密度が、前記参照密度である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記分画濃度の算出が、前記微分を２で掛けることをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記第一密度が、１コピー獲得を示すと確認された各密度を使用して算出され、前記別の密度が、１コピー欠失を示すと確認された各密度から算出された第二密度である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記微分が、
前記第一密度および前記参照密度の第一比をコンピューターで計算し；
前記第二密度および前記参照密度の第二比をコンピューターで計算し、前記微分が、前記第一比および前記第二比との間であること
により前記参照密度で正規化される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ゲノム領域が１コピー欠失または１コピー獲得を示しているかどうか確認するために、前記参照密度に対する前記各密度の比較が、
前記各密度のヒストグラムの分布曲線に、ピークを当てはめ、前記第一密度が、第一ピークに対応し、前記第二密度が、第二ピークに対応すること
を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記参照密度に関する前記各密度で、統計的に有意な増加を示すために決定された全ゲノム領域が、１コピー獲得を示すと確認される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
各密度を得るために、前記各量の正規化が、前記各密度および前記参照密度を決定するために、アライメントした参照タグの同じ全数を使用することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
各密度を得るために、前記各量の正規化が、アライメントした参照タグの全数により、前記各量を割ることを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数のゲノム領域が各々、同じ長さを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項６５】
前記ゲノム領域が、重複がない、請求項４９に記載の方法。
【請求項６６】
請求項１〜２６及び３０〜６５のいずれか１項の方法を実行するために、コンピューターシステム制御実行されたときの複数の指示を保存しているコンピューター読み取り可能媒体。