【事件の表示】
　特許第３１０００５７号「加水分解酵素阻害剤及び基質、並びにこれらを用いた分析方法及びキット」の請求項１ないし５、８、１０ないし１６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１０００５７号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯　
　本件特許第３１０００５７号の発明についての出願は、１９９０年８月１７日（パリ条約による優先権主張１９８９年８月２９日、米国）に国際出願され、平成１２年８月１８日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、株式会社　アズウェルより、特許異議の申立がなされ、平成１３年９月４日付けで取消の理由の通知がなされ、取消理由通知の延長された指定期間内である平成１４年３月１４日に訂正請求がなされ、平成１４年４月２２日付で再度の取消理由通知がなされ、その延長された指定期間内である平成１４年１０月１０日に新たな訂正請求がなされたものである。　
　
２．訂正の適否　
（１）訂正の内容　
特許権者が求めている訂正の内容は、以下のとおりである。　
ア．特許請求の範囲の請求項１の　
「化１で示される化合物であって、　
【化１】　ＡＸＣ（＝Ｏ）ＹＣ（＝Ｒ）ＸＢ　
　ここでＲは酸素またはＮＨ、それぞれのＸは無関係に酸素、硫黄あるいはＮＨ、Ｙは分子内環化反応に好適な立体環境を提供するリンカーであって、標的加水分解酵素の化学的近接部へインシトゥ（in situ）での接触によってＡＸグループが開裂した後、結果的に環状化合物の形成をするリンカー、Ａは（Ｃ＝Ｏ）ＹとＡＸをリンクする結合の特定の加水分解酵素による認識及びその加水分解を促進することのできる部位、そしてＢは開裂可能なマーカー部位で、分析する場合に、前記環状化合物の形成を伴う（Ｃ＝Ｒ）ＹとＢＸとをリンクする結合の開裂が起きたところで、検出及び測定に対して感応する部位であることを特徴とする化合物。」を、　
「化１で示される化合物であって、　
【化１】　ＡＸＣ（＝Ｏ）ＹＣ（＝Ｒ）ＸＢ　
　ここでＲは酸素またはＮＨ、それぞれのＸは酸素、Ｙは分子内環化反応に好適な立体環境を提供する
２個または３個の炭素原子のアルキレンまたはアルケニレンの置換体からなる
に
に
して
イ．特許請求の範囲の請求項２を削除する。　
ウ．特許請求の範囲の請求項３の　
「前記化１において、Ｙは一個あるいはそれ以上の低級アルキル基で任意に置換されるアルキレンあるいはアルケニレン骨格構造であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。」を、　
「前記化１において、
前記置換アルキレンまたはアルケニレンリンカーにおける置換は、
による置換
エ．特許請求の範囲の請求項４、５、８、１０〜１６を削除する。それに伴い、特許請求の範囲の請求項６、７、９の請求項の番号を繰り上げ、それぞれ請求項３、４、５とする。　
オ．明細書の段落【００１６】において、「…Ｙは分子内環化反応に好適な立体環境を提供する連鎖であって、標的加水分解酵素の化学的近接部へインシトゥ(in situ)での接触によってＡＸグループが開裂した後、結果的に環状化合物を形成する連鎖、…」とあるのを、「…Ｙは分子内環化反応に好適な立体環境を提供する
リンカー
に
に
して
リンカー
明細書の段落【００１９】において、「…Ｃ2，3は少なくとも２個あるいは３個の炭素原子をもつ連鎖種を表しており、それは飽和であっても不飽和であっても、あるいは置換されていなくても置換されていてもよい。」とあるのを  、「…Ｃ2，3
は２
アルキレンまたはアルケニレンの置換体からなるリンカー
もよ
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び、特許請求の範囲の拡張・変更の存否　
　上記アの訂正事項に関連する記載として、願書に添付した明細書（以下、「特許明細書」という。）には、化１のＸについて、請求項１等に「それぞれのＸは無関係に酸素、硫黄あるいはＮＨ」であると記載され、化１のＹについて、請求項２には「…Ｙは少なくとも２個あるいは３個の炭素原子を含む任意に置換されるリンカーである…」と、また、請求項３には「…Ｙは一個あるいはそれ以上の低級アルキル基で任意に置換されるアルキレンあるいはアルケニレン骨格構造である…」と記載され、更に、発明の詳細な説明の【００１８】には、請求項１の化１に相当する化２の化合物のサブグループとして、【化３】ＡＯＣ（＝Ｏ）Ｃ２，３Ｃ（＝Ｏ）ＯＢの化合物が記載され、【００１９】に当該【化３】の化合物において、「Ｃ２，３は少なくとも２個あるいは３個の炭素原子を持つ連鎖種を表しており、それは飽和であっても不飽和であっても、あるいは置換されていなくても置換されていてもよい。」と記載されており、また、第１図及び第６図に、リンカーが「２個または３個の炭素原子のアルキレンまたはアルケニレンの置換体」に該当する化合物が数種記載されている。また、請求項１の「標的加水分解酵素の化学的近接部へインシトゥ（in situ）での接触によってＡＸグループが開裂した後」という記載は、本来「標的加水分解酵素に化学的に近接してインシトゥ（in situ）での接触によってＡＸグループが開裂した後」を意味していたものと認められる。　
　従って、上記アの訂正は、特許明細書に記載された事項の範囲内において、特許請求の範囲第１項のＸを「酸素」に限定し、リンカーＹを「２個または３個の炭素原子のアルキレンまたはアルケニレンの置換体からなる」ものに限定するとともに、明瞭でない記載を明瞭になるように訂正したものであるから、特許請求の範囲の減縮及び明瞭でない記載の釈明に該当するものであって、新規事項の追加に該当しない。　
　上記イの訂正は、特許請求の範囲の請求項を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。　
　上記ウの訂正は、結局、訂正前の「…任意に置換される…」を「…置換される…」に訂正することに相当するから、特許明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮することに該当し、新規事項の追加に該当しない。請求項番号の訂正は、請求項２の削除に伴い請求項の番号を変更するものであるから、明瞭でない記載の釈明に該当するものである。　
　上記エの訂正は、特許請求の範囲の請求項を削除するものであり、それに伴い請求項の番号を変更するものであるから、特許請求の範囲の減縮および明瞭でない記載の釈明に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。　
　上記オの訂正は、上記特許請求の範囲の訂正に伴い、発明の詳細な説明の対応する記載を訂正するものであるから、明瞭でない記載の釈明に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。　
　そして、上記いずれの訂正も実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。　
（３）むすび　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。　
　
３．特許異議申立についての判断　
（１）申立の理由の概要　
ア．申立人　株式会社　アズウェルは、下記の甲第１〜３号証を提出し、訂正前の請求項１〜５、８、１０〜１６に係る発明は、甲第１号証に記載された発明と同一であるから、特許法第２９条の２の規定に違反して特許されたものであり、また、甲第２号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、さらに、甲２号証に記載された発明に基づいて、あるいは甲第２号証及び甲第３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるため、請求項１〜５、８、１０〜１６に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
甲第１号証：特開平２−３６６２号公報　
甲第２号証：特開昭６１−２５４１９７号公報　
甲第３号証：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ　８８巻　５３２８−５３３５頁（１９６０）　
（２）本件発明　
　訂正後の本件請求項１及び２に係る発明（以下、それぞれ本件発明１、２という。）は、平成１４年１０月１０日付けの訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１及び２に記載された、上述のとおりのものと認める。　
　なお、訂正後の本件請求項３、４、５は、訂正前の請求項６、７、９であるから、本件異議申立の対象外のものである。　
（３）甲各号証に記載された発明　
　甲第１号証（特開平２−３６６２号公報）は、本件発明と発明者及び出願人が異なり、本件出願の優先日以前に出願され、その後公開された、特願平１−４６７１７号の公開公報であり、当該公報に掲載された当該出願の当初明細書には、ジカルボン酸　ＨＯＯＣ−Ａ−ＣＯＯＨ　の一方のカルボキシ基が芳香族ヒドロキシ化合物とエステル結合を形成し、他方のカルボキシ基がホスホコリンなどで置換されたグリセリン誘導体とエステル結合を形成した化合物であって、Ａが炭素原子数１〜１６を有するアルキレンまたはアルケニレン基である化合物が記載され（特許請求の範囲の請求項１参照）、当該化合物がホスホリパーゼの基質となること（請求項１）、および、「ホスホリパーゼが作用した際に、当該基質が芳香族ヒドロキシ化合物の遊離下に分解され、当該芳香族ヒドロキシ化合物は直接光学的に定量されるか、適当な発色団等とカップリングさせ、カップリング化合物を測定する等して定量される」旨が記載されている（公開公報４頁右下欄）。そして、「Ａが誘導される酸の例は、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、コルク酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、デカンジカルボン酸およびウンデカンジカルボン酸である。」と記載されている（公開公報５頁右上欄）が、これら例示された酸は、すべてｎ−アルキレンジカルボン酸であり、アルキレン鎖に置換基を有しないものである。　
　甲第２号証（特開昭６１−２５４１９７号公報）には、ジカルボン酸　ＨＯＯＣ−Ａ−ＣＯＯＨ　の一方のカルボキシ基が芳香族ヒドロキシ化合物とエステル結合を形成し、他方のカルボキシ基がアルコキシ基などで置換されたグリセリン誘導体とエステル結合を形成した化合物であって、Ａが炭素原子数１〜１６を有するアルキレンまたはアルケニレン基である化合物が記載され（特許請求の範囲の請求項１参照）、当該化合物がリパーゼの基質となること（請求項１参照）、および、「リパーゼの作用下に、当該基質が芳香族ヒドロキシ化合物の遊離下に切断され、当該芳香族ヒドロキシ化合物を直接視覚的に測定するか又は適当な発色団等とカップリングさせ、カップリング生成物を測定する」旨が記載されている（３頁左下欄〜右下欄）。そして、「Ａが誘導される酸の例は、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、デカンジカルボン酸およびウンデカンジカルボン酸である。」と記載されており（４頁左上欄）、これらはすべてｎ−アルキレンジカルボン酸であり、アルキレン鎖に置換基を有しないものであることは、上述のとおりである。　
　甲第３号証（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ　８８巻　５３２８−５３３５頁（１９６０））には、ｐ−ニトロフェニルグルタレートが加水分解され、グルタル酸無水物とｐ−ニトロフェノキシアニオンが生じることが記載されている（５３２９頁左欄１０行〜第１段落の終了部）。　
（４）対比・判断　
（４−１）特許法第２９条の２について　
　異議申立人の提出した甲第１号証には、本件発明１の化１におけるＹが「２個または３個の炭素原子のアルキレンまたはアルケニレンの置換体」からなるリンカーである化合物は記載されていない。　
　従って、本件発明１、及び当該発明を引用し、リンカーの置換基を更に限定したものである本件発明２は、上記甲第１号証に記載された発明と同一ではない。　
（４−２）特許法第２９条第１項第３号および第２項について　
　異議申立人の提出した甲第２号証及び甲第３号証のいずれにも、本件発明１の化１におけるＹが「２個または３個の炭素原子のアルキレンまたはアルケニレンの置換体」からなるリンカーである化合物は記載されていない。　
　そして、本件発明１は、甲第２号証に記載された発明のように、単に、酵素の作用により基質化合物から遊離する芳香族化合物を検出、測定することにより、酵素の検出、定量を行うことを目的とするものではなく、本件特許明細書の【００１１】に、「本発明の目的は、自殺性の非活性化あるいは阻害剤の機構的なレベルにおける特定の加水分解酵素活性の分子間作用を介して疾病の状態あるいは条件を抑制することのできる物質を生産することにある。」と記載され、また、【００２９】に、「酵素特異性を運ぶ集団にリンクを結合しているボンドの酵素的な加水分解によって、結果として生じた加水分解生成物のカルボキシアニオンが求核性の触媒として働き、脱離基とリンクしているボンドを解裂するものと考えられる。最終的な結果としては、触媒的に活性のある部位に反応性の環状無水物を生成することである。酵素の求核性グループを無水物によってアシル化すると、その酵素は不可逆的に不活性化される。」と記載されているように、加水分解酵素の働きにより化１の化合物から結果的に生じる環状無水物が当該酵素の活性部位に結合する性質を利用して、その酵素の活性を有効に阻害することができる酵素阻害剤を得ることをもその目的とするものであり、そのために、同じく本件特許明細書の【００２９】に、「無水物の生成速度は…リンクの介在原子上へのアルキル基あるいは他の置換基の導入…によって調節できる。」と記載されているように、リンカーＹに置換基を導入することにより、酵素活性の阻害効果を調節するものである。　
　一方、甲第２号証および甲第３号証には、酵素反応の結果として生じる環状無水物が当該酵素の活性部位に結合することについて、記載も示唆もされていない。　
　そして、本件特許明細書【００５９】の表１には、リンカーが炭素数２個または３個のｎ−アルキレンにメチル基が２個置換したものである化１の化合物の酵素反応速度、環化反応時間等が、メチル基で置換しないものとともに示されており、これによれば、本件発明１の化１の化合物においてＹが「２個または３個の炭素原子のアルキレンまたはアルケニレンの置換体」であることにより、化１の化合物の環化反応に要する時間が短縮される一方、酵素反応速度は減少し、酵素活性の阻害作用が高まることが理解でき、このことは甲第２号証および甲第３号証の記載から予期しがたい効果といえる。　
　従って、本件発明１、および本件発明１においてリンカーの置換基を低級アルキル基に限定したものである本件発明２は、甲第２号証に記載された発明ではなく、甲第２号証及び甲第３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものでもない。　
（６）むすび　
　以上のとおりであるから、特許異議の申立の理由及び証拠によっては、本件発明１、２の特許を取り消すことはできない。　
　また、他に本件発明１、２の特許を取り消すべき理由を発見しない。　
　よって、結論のとおり決定する。　
【異議決定日】
平成１４年１１月２１日（２００２．１１．２１）
【訂正の要旨】
１．特許請求の範囲の請求項１を、
「化１で示される化合物であって、
　【化１】　ＡＸＣ（＝Ｏ）ＹＣ（＝Ｒ）ＸＢ
　ここでＲは酸素またはＮＨ、それぞれのＸは
酸素
２個または３個の炭素原子のアルキレンまたはアルケニレンの置換体からなる
に
に
して
２．特許請求の範囲の請求項２を削除する。
３．特許請求の範囲の請求項３を、
「前記化１において、
前記置換アルキレンまたはアルケニレンリンカーにおける置換は、
による置換
４．特許請求の範囲の請求項４、５、８、１０〜１６を削除する。それに伴い、特許請求の範囲の請求項６、７、９の請求項の番号を繰り上げ、それぞれ請求項３、４、５とする。
５．明細書の段落【００１６】において、「…Ｙは分子内環化反応に好適な立体環境を提供する連鎖であって、標的加水分解酵素の化学的近接部へインシトゥ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）での接触によってＡＸグループが開裂した後、結果的に環状化合物を形成する連鎖、…」とあるのを、「…Ｙは分子内環化反応に好適な立体環境を提供する
リンカー
に
に
して
リンカー
明細書の段落【００１９】において、「…Ｃ２，３は少なくとも２個あるいは３個の炭素原子をもつ連鎖種を表しており、それは飽和であっても不飽和であっても、あるいは置換されていなくても置換されていてもよい。」とあるのを、「…Ｃ２，３
は２
アルキレンまたはアルケニレンの置換体からなるリンカー
もよ
（５４）【発明の名称】
加水分解酵素阻害剤及び基質、並びにこれらを用いた分析方法及びキット
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　化１で示される化合物であって、
　【化１】
　ここで
　Ｒは酸素またはＮＨ、
　それぞれのＸは
酸素
　Ｙは分子内環化反応に好適な立体環境を提供する
２個または３個の炭素原子のアルキレンまたはアルケニレンの置換体からなる
に
に
して
　Ａは（Ｃ＝Ｏ）ＹとＡＸをリンクする結合の特定の加水分解酵素による認識及びその加水分解を促進することのできる部位、そして
　Ｂは開裂可能なマーカー部位で、分析する場合に、前記環状化合物の形成を伴う（Ｃ＝Ｒ）ＹとＢＸとをリンクする結合の開裂が起きたところで、検出及び測定に対して感応する部位である
ことを特徴とする化合物。
　【請求項２】　前記化１において、
　
前記アルキレンまたはアルケニレンの置換体における置換は、
による置換
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
　【請求項３】　前記Ｙが１，１−ジメチル−ｎ−プロピレンである
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
　【請求項４】　前記Ｙが２，２−ジメチル−ｎ−プロピレンである
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
　【請求項５】　前記Ｙが１，１−ジメチル−ｎ−エチレンである
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、そのあらゆる面で、分析のために加水分解酵素阻害剤（イナクチベーター（ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓ））及び酵素基質の新規な種類を基本的に属性として利用する。これらの阻害剤及び基質は三つの部分の集団として機能し、その第１番目は与えられた加水分解酵素の活性部位により認識される部分であり、その部分の付随する移動に伴って酵素が阻害剤と接触した場合に、その酵素が加水分解的に機能し、第２番目は発色団のようなマーカー部分で、それは検出されたり測定されたりでき、そして第３番目は、第１番目と第２番目の部分を結び付けている残りの部分で、第１番目と第２番目の部分が移動した後に環構造をとり、阻害剤の場合には酵素と更なる反応を伴い、活性部位の共有結合形成を介して酵素を不可逆に不活性化する。本発明にかかる新規な加水分解酵素阻害剤及び基質は、こうして加水分解酵素活性を検定するための手段、及び加水分解酵素活性が影響を与えているさまざまな疾病状態や条件のコントロールあるいは治療において加水分解酵素の活性を調節するための手段を創り出している。
　【０００２】
　【従来の技術】
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ　６１巻、４８頁（１９８３）に公開されたスペシャル　レポート（Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ）でアベルズ（Ａｂｅｌｅｓ）は、「自殺する酵素イナクチベーター（ｓｕｉｃｉｄｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）」または「機構に基づいたイナクチベーター（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ−ｂａｓｅｄ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）”と呼ぶ一種類の酵素阻害剤について一般的に論じた。これらのイナクチベーターは、天然物であろうと人工の生産物であろうと、天然の酵素の天然の基質に似た形態をとっている。したがって、酵素の活性部位によって認識される。酵素がこの認識可能な形態と反応するとき、そのイナクチベーターは化学的に修飾されて、酵素と反応する化合物に変換され、結果として酵素の非活性化になるが、これは天然において不可逆性である。自殺する基質（イナクチベーター）に作用することによって、酵素はそれ自身の破壊を引き起こす。著者は、特定の酵素の阻害剤やイナクチベーターの開発が、正常な酵素活性をじゃますることができる薬物の開発において重要な役割を果たすことで役にたちうることを主張している。このような酵素が疾病の状態に関わりを持っていることが確かめられている場合には、このような阻害剤あるいはイナクチベーターの利用は、酵素がかかわっている疾病状態の治療あるいは予防において酵素活性を調節することに役に立つであろう。
　【０００３】
　研究努力は、多くの重要な細胞機能の調節と関連しているホスホリパーゼＡ２のようなホスホリパーゼの作用あるいは機構に焦点が合わされた。参照として、Ｌａｐｅｔｉｎａ，Ｃｈａｐｔｅｒ　２１“Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ”、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９巻、２１３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．（１９８４）を挙げる。
　【０００４】
　ホスホリパーゼ酵素活性の不活性化あるいは阻害剤への研究における付随する目的は、なかでもＣｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｍａｃｏｌｏｇｙ　３６巻、２４２９頁（１９８７）から得ることができる。Ｄｅｎｎｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ　５巻、１２９４頁（１９８７）も参照として挙げる。これらの解説は、あるホスホリパーゼの構造および生化学の復習を提供し、この種の加水分解酵素による更に徹底的な治療を見いだすことができる他の論説へと読者を導く。著者はホスホリパーゼ活性化が、数種の疾病の状態あるいは条件の存在に関わっていることが判っている脂質メディエーター合成の全過程における反応速度の律速段階を表している可能性がある示唆を表明している。特に、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、プロスタグランジン、ロイコトリエン及びこれと関連して炎症時等の状態におけるエイコサノイド生合成のコントロールに影響を与えると思われている膜リン脂質からのフリーのアラキドン酸の放出の原因の酵素であると考えられている。
　【０００５】
　ＰＬＡ２活性の阻害は、そのような炎症及び他の組織の損傷の治療に対する新規な薬物のデザインへの魅力的な治療上のアプローチを提供することができると彼らは付は加えている。著者らは、多数のホスホリパーゼＡ２酵素の源及び構造の参考文献を提供し、これらの酵素の活性化の機構を検討している。最終的には彼らはそのような酵素活性の影響力を分析し、これにより薬物のデザインの研究者らに、ホスホリパーゼや他の加水分解酵素の活性のレベルで仲介することによってさまざまな疾病の状態あるいは条件の治療あるいはコントロールに役立つことのできる新規な種類の薬物を生み出すことができるという目的に対する基礎を提供している。
　【０００６】
　このようにＰＬＡ２が活性化された後、おそらくそれはその生産物であるリゾリン脂質やアラキドン酸、及びプロスタグランジンやロイコトリエンのような数種の強い、生物学的に活性な物質を介して、さまざまな病理生理学的な反応を明らかに仲介している。また、リン脂質基質がアルキルエーテルやプラズマローゲン官能基を含有する場合、ＰＬＡ２作用の生産物はリソＰＡＦ（ＰＡＦ＝血小板活性化因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ））やアナログを含んでいる。それらはアセチル化されると、強い生物学的活性物質であるＰＡＦやアナログを生産する。ＰＬＡ２活性化のこれらの生産物あるいは共に生じる生産物（ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、細胞毒性の物質であることがわかっており、数種のヒトの炎症やアレルギー状態に関係している。前記及び他のデータは、ＰＬＡ２がおそらくさまざまな疾病に関連している炎症及び組織の損傷に関係していることを示唆している。
　【０００７】
　ＰＬＡ２レベルの増加は、リューマチ性関節炎症状や乾癬、膵炎、敗血症性のショックでも見られている。ＰＬＡ２は特に喘息のような肺特有の病気にも深く関係している可能性がある。
　【０００８】
　この全てのデータは、ＰＬＡ２の阻害あるいは不活性化が、さまざまな疾病の状態において関連している前記の活性化の生産物あるいは共に生じる生産物（ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の生産を妨げる有望な一段階のアプローチとなることができ、これによって疾病過程を可能性のある軽減に導くことを示唆している。
　【０００９】
　ホスホリパーゼ酵素の特徴についてかなり詳細に述べられたものもデニス、即ちＤｅｎｎｉｓ、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ＸＶＩ巻、３０７頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．（１９８３）によって提供されている。この論文は数種のホスホリパーゼの特徴データ及び精製を提供し、かつこれらのホスホリパーゼが原因であると信じられている動力学や生物学的影響、また活性部位を示す配列や配座構造の同定を提供している。
　【００１０】
　マノアライド（ｍａｎｏａｌｉｄｅ）によるホスホリパーゼＡ２の陽害及び緩和については米国特許明細書第４，４４７，４４５号及び４，６１６，０８９号の主題であった。マノアライドは海綿動物から単離された、海にある天然の産物で、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で抗炎症の活性があることが証明されている。この天然の産物についての研究は、これがホスホリパーゼＡ２のレベルにおいて作用することに関連づけ、かつ、コブラ及び蜜蜂の毒液のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の両方の阻害剤であることを示している。参照として、Ｌｏｍｂａｒｄｏ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻、７２３４頁（１９８５）及びＤｅｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９１７巻、２５８頁（１９８７）を挙げる。そこから広がった合成アナログの研究は、Ｒｅｙｎｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．１１０巻、５１７２頁（１９８８）によって述べられている。これらの研究からマノアライドが、リジン残基の修飾によって指示されたＰＬＡ２の時間依存性の不可逆性不活性化を引き起こすことがわかる。マノアライドの使用に伴う欠点は、さまざまなタンパク質と非特異的に反応することである。
　【００１１】
　【発明が解決しようとする課題】
　ホスホリパーゼのような加水分解酵素活性を調節できる内因性の物質を生産するこの目的に励まされて、本発明の目的は、自殺性の非活性化あるいは阻害剤の機構的なレベルにおける特定の加水分解酵素活性の分子間作用を介して疾病の状態あるいは条件を抑制することのできる物質を生産することにある。このような研究を基本として、代表例としてホスホリパーゼＡ２を用い、本発明の研究は、そのような酵素の活性部位による認識を介して機能し、酵素の機能性の阻害を引き起こす新規な加水分解酵素阻害剤（イナクチベーター）のデザインに焦点を合わせた。このようにここに記載する阻害剤は、酵素的な活性の機能的自殺をもたらす。
　【００１２】
　【課題を解決するための手段】
　色々な見方をしてみると本発明は、新規な種類の加水分解酵素阻害剤（イナクチベーター）及び基質に基礎を置く基本的な属性に由来している。これらの新規な化合物は特定の加水分解酵素によって基質として認識され、処理された後で機能し、前記酵素を不可逆的に非活性化する。同時にこの反応の副生産物は、サンブル中における加水分解酵素の活性量を測定する手段として用いることができる検出可能で測定可能な部分の形態で生産される。この手段は、加水分解酵素の活性を測定するための分析の基礎を形成する。この形態で用いられるとき、その化合物の抑制特性は最小限にされる。また、治療される特定の疾病の状態あるいは条件に関連している加水分解酵素の活性を調節することによってさまざまな疾病の状態あるいは条件を治療する手段が、新規な化合物によって提供される。更に本発明では、上記に詳しく述べた分析及び治療方法に適切に関連する手段及びキットが得られる。
　【００１３】
　関連分野の技術範囲内で同等であると説明できる関連する実施態様の全てにおける前述の見方の全ても、本発明の範囲内に含まれる。
　【００１４】
　本発明の新規な加水分解酵素阻害剤（イナクチベーター）及び基質は、下記の一般式（化２）によって表すことができる。
　【００１５】
　【化２】
　【００１６】
　ここで、Ｒは酸素（Ｏ）あるいはＮＨ、
　それぞれのＸは無関係に酸素、硫黄あるいはＮＨ、
　Ｙは分子内環化反応に好適な立体環境を提供する
リンカー
に
に
して
リンカー
　ＡはＡＸを（Ｃ＝Ｏ）Ｙとつなぐ結合の特定の加水分解酵素による認識及びその加水分解を促進することのできる部位、そして
　Ｂは開裂可能なマーカー部位で、前記環状化合物の形成を伴うＢＸを（Ｃ＝Ｒ）Ｙとつなぐ結合の開裂が起きたところで、分析する場合に、検出及び測定に対して感応する部位である。
　【００１７】
　更に特に、上記分子式（化２）で表したような本発明の新規な加水分解酵素阻害剤（イナクチベーター）及び基質は、下記の分子式（化３）の化合物からなる好ましいサブグループとして表すことができる。
　【００１８】
　【化３】
　【００１９】
　ここで、Ａ及びＢはそれぞれ、上記に定義したとおりであり、Ｃ２，３　
は２
アルキレンまたはアルケニレンの置換体からなるリンカー
もよ
　【００２０】
　上記分子式（化２）及び（化３）で表されたそれぞれの種類の化合物に関しては、Ｂは好ましくはｐ−ニトロフェノールのような発色基である。
　【００２１】
　上記分子式（化２）及び（化３）で表され、かつグループＢを更に上記のようにより特定的に定義したこの新規な化合物の種類のより好ましくは、グループＡが好ましくはグリセロール骨格を有している種類から選択され、このグリセロール骨格において一個の酸素原子が上記した化合物上のリンカーに結合され、グリセロール骨格についている他のヘテロ原子は、酸素、窒素、あるいは硫黄の内の一つであり、アルキル基や脂肪酸鎖に結合されている。また、もう一つの酸素は、極性の官能基である例えばコリンとのホスホジエステルあるいは他の適当なリンケージを介して結合されている。この脂肪酸鎖は、問題となっている特定の加水分解酵素のもしあれば基質特異性と一致する飽和あるいは不飽和の鎖であることができる。
　【００２２】
　第二の面として、本発明は、一つのサンプル、例えばヒトから採取された生物学的なサンプル中の特定の加水分解酵素の活性を測定する分析方法を含んでいる。これは、ここに示した新規な加水分解酵素の基質にこのサンプルを接触させることと、そのときの方法及び条件は、上記のように、この化合物がターゲットである特定の加水分解酵素がもしそのサンプルに存在しているときはその化学的隣接部へインシトゥにおいて接触し、これによってこの酵素と反応できるようになる方法及び条件であり、また、前記化合物の前記加水分解酵素活性との反応によるその化合物からのマーカー部位の開裂及びその検出と測定を介するこのような活性量の測定及び検出を行うことを含む。
　【００２３】
　更なる面として、本発明は、特定の加水分解酵素活性が介在している病理学上の疾病の状態あるいは条件を治療する方法及び手段に向けられる。それは、上記のようなこの新規な加水分解酵素阻害剤（イナクチベーター）の所定量を、前記病理学上の疾病状態あるいは条件になりやすい、または罹っている患者に投与することからなり、その量は加水分解酵素活性を不可逆的に十分に不活性化あるいは阻害できるものであり、また、この加水分解酵素阻害剤（イナクチベーター）は薬剤的に受け入れ可能な形態で投与される。
　【００２４】
　そのさまざまな面において、上記に記載した本発明は、製薬的キットの形態での全ての関連する手段及び方法を含んでいる。そのキットは、アセンブルされ、本発明の分析及び治療方法の技術分野に適切な方式において有効に利用される。
　【００２５】
　本発明は、生物学的に機能すると想定される要領でメカニズム的に説明されている。しかしながら、そのような機構は、提案したメカニズムから詳細において実際には異なる場合は、本発明の範囲内に必ずしも含まれいないことは言うまでもない。
　【００２６】
　【発明の実施の形態】
　ここに参照として挙げた全ての報告書は、参考のためにここに援用することを表明するものである。
　【００２７】
　本発明は、モデルシステムによって説明されており、本発明の特定の新規な加水分解酵素阻害剤（イナクチベーター）及び基質がホスホリパーゼＡ２と関連して用いられる。本発明のアプローチは、そのモデルシステムによってここに示されているように、他の特定の加水分解酵素に対する分析あるいは治療法において、さまざまな他の加水分解酵素阻害剤や基質の開発を促進するために一般化でき、かつ一般化される。このような他の加水分解酵素の中にはホスホリパーゼ類、リパーゼ類、エステラーゼ類、プロテアーゼ類などが含まれる。これらの種類の酵素に対する本発明の阻害剤の治療上の応用例としては、炎症や高血圧症、脂質代謝、肥満症等の状態に及ぶ。本発明のアプローチを基礎とする分析は、これらの種類内の重要な酵素に対して選択的であり、安価かつ簡便である。
　【００２８】
　本発明の新規な化合物の必須の特徴は、二基作用性のリンクを使用して、一つの分子集団に機能的に結合しており、それは特定の加水分解酵素の活性部位によって認識されるのに必要な必須の構造的な特徴と、特定の加水分解酵素と本発明の新規な化合物との反応に付随して検出可能かつ測定可能である脱離基とからなっている。好ましい実施例では、そのリンクは環状無水物を形成することのできる二塩基酸である、リンクを酵素特異性を運ぶ部位にリンクを結合しているボンドの酵素的な加水分解によって、結果として生じた加水分解生成物のカルボキシルアニオンが、求核性の触媒として働き、脱離基とリンクとを結合しているエステルボンドを開裂して環状無水物を形成するものと考えられる。その無水物と活性部位との反応性が、この二つの間に共有結合を作りだし、かくして酵素活性を不活性化し、あるいは少なくとも阻害する。無水物の反応性は充分に大きく、酵素の活性部位から離れて拡散する場合に、圧倒的な可能性としては他のタンパク質と出会う前に水と反応してしまうことである。
　【００２９】
　このように機構的には、酵素特異性を運ぶ集団にリンクを結合しているボンドの酵素的な加水分解によって、結果として生じた加水分解生成物のカルボキシルアニオンが求核性の触媒として働き、脱離基とリンクを結合しているボンドを開裂するものと考えられる、最終的な結果としては、触媒的に活性のある部位に反応性の環状無水物を生成することである。酵素の求核性グループを無水物によってアシル化すると、その酵素は不可逆的に不活性化される。無水物の生成速度は１）脱離基のｐＫａの調整、及び２）リンクの介在原子上へのアルキル基あるいは他の置換基の導入、あるいは３）介在しているリンカー原子の芳香族化合物のような環状構造への組み込み、によって調節できる。
　【００３０】
　可能なリンカー構造の例が図６に示されている。これらの化合物はすべて、入手可能である。例えば、ジ　アルドリッヒ　ケミカル　カンパニー（ｔｈｅ　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）を参照されたい。
　【００３１】
　本発明の新規な化合物の主な利点は、１）基質のデザイン、２）主として環状化合物を生成する酵素−基質複合体内において酵素的なアシル化が起きること、によりターゲットの酵素に対する一般的な適用性を有しかつ高い特異性を有することである。
　【００３２】
　同じ構造的な特徴は、部位Ｂが発色団染料あるいは他のマーカーであること、及び十分にゆっくりと環化が起き、このため酵素と最初の加水分解生成物とがばらばらに拡散した後に無水物が生成することが必要条件であること以外は、分析において用いられる本発明の方法にとっても欠かせないことである。
　【００３３】
　同様の機構的原理はリンクがカルボニル／アミドである場合にも適用する。
　【００３４】
　発色団あるいは他の検出可能でかつ測定可能なグループは、一般に当業者にはよく知られている。そのようなものの例としては、ｐ−ニトロフェノール、アゾフェノール類、アゾナフトール類、ヒドロキシクマリン類である。それらの構造の例は、図７の（ｂ）部分に示されている、
　Ａ（分子の残りの部分への推定リンケージとともに描かれている。）がとりうる構造例は、図７の（ａ）部分に示されている、与えられた加水分解酵素に特異的な部位Ａのデザインでは、与えられた加水分解酵素の基質特異性の知識が利用される。そのような例としては、現存の文献から取り出すことができ、そこにはチモトリプシン、リパーゼ、プロテアーゼ類及びホスホリパーゼＡ２が含まれる。
　【００３５】
　プロテアーゼ類は、触媒部位の性質に照らし合わせて４つの主要な種類に細分化することができる。二種の分類は、アシル酵素中間体の形成を伴う求核性の触媒反応によりペプチド結合の加水分解を促進するものである。これらはセリン及びシスティンのプロテアーゼで、それぞれ活性部位でセリン残基の水酸基を利用するか、あるいはシスティン残基のチオール化を利用して基質のペプチド結合を開裂する。これらの酵素は、非ペプチド結合を加工し、したがって発色性の分析法が開発された。同様にこの基質の自由度は、機構に基づくさまざまな阻害剤の開発を可能にした。
　【００３６】
　残る二種は、活性部位にあいて結合した活性化された水分子を利用し、ペプチド結合を開裂する。通常はペプチド結合だけが加工され、これにより酵素活性の機能としての染料の放出を伴う発色性分析は可能とはならなかった。この二種はメタロ−プロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼがある。これら二種に対する機構に基づく良好な阻害剤は、基質の認識に対する厳しい基準を反映して、まだ知られていない。
　【００３７】
　一般的には、全てのプロテアーゼの活性部位は、開裂するペプチドリンケージを構成するアミノ酸残基の側鎖残基だけでなく、開裂するペプチド結合に先んじて及び続いて起きるアミノ酸残基の側鎖も収容する多数の結合ポケットを有している割れ目に存在しているものと考えられる。高い基質特異性は、活性部位の付近における結合必要条件の反映だけでなく、これらの付加的な結合部位におげる結合必要条件の反映でもある。基質のＮ−末端方向に向かって位置している側鎖残基に結合している部位は、活性部位から離れる方向にｓ１〜ｓｎとラベルされており、同様にｃ−末端方向に向かって延びている残基を結合している部位はｓ１’〜ｓｎ’とラベルされている。プロテアーゼは、エキソペプチダーゼ類（基質の始末端あるいは終末端のペプチド結合を開裂する）あるいはエンドペプチダーゼ類（基質において内部のペプチド結合を開裂する）のいずれであってもよい。
　【００３８】
　プロテアーゼの活性を調節するためには、阻害剤は、「Ａ」が基質を認識するのに必要なｓ１’〜ｓｎ’を占めるように適当な官能基を含んでいなければならない。「Ｙ」及び「Ｂ」はｓ１部位を占めるであろう。ある種のエンドペプチダーゼ類は、ｓ２及びｓ３部位の占有を要求している、これらの場合には「Ｙ」の構造が、基質の認識のためのこれらの必要条件を満たすという特徴を含んでいなくてはならない。このことは、Ｙが置換されたアスパラギン酸やグルタミン酸であることにより、最も容易に達成される。
　【００３９】
　以下は、治療上有用なターゲットの酵素分類による一部分のリストである。
　【００４０】
　メタロ−プロテアーゼ類
　１）コラゲナーゼ、関節炎
　２）エラスターゼ、気腫、炎症
　３）アンジオテンシン転換酵素、高血圧症
　アスパラギン酸プロテアーゼ類（Ａａｐａｒｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）
　１）ＨＩＶプロテアーゼ、ＡＩＤＳ増殖
　２）レニン、高血圧症
　３）ペプシン、胃潰瘍
　システインプロテアーゼ類
　１）カテプシンＢ、炎症
　セリンプロテアーゼ類
　１）トリプシン、膵炎
　２）グラニュロサイト　エラスターゼ、炎症
　３）トロンビン、心筋梗塞症
　上記のそれぞれの酵素に対して、自殺する阻害剤のデザインは、既知の基質の必要条件によって、次に可能であればＸ線構造解析データによって導かれる。例えば、レニンは、ＨｉｓＰｒｏＰｈｅＨｉｓＬｅｕＶａｌＩｌｅＨｉｓ配列を認識し、Ｌｅｕ−Ｖａｌ結合を開裂する。末端カルボキシル基が脱離基「Ｂ」でエステル化されたアスパラギン酸残基によるＬｅｕ残基の置換は、加工によって環状無水物を生ずる基質を生じるであろうし、この環状無水物はレニンのアシル化によってこれを不活性化することができるであろう。参照として、Ｂａｒｒｅｔｔ　＆　Ｓａｌｖｅｓｅｎ　編、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　１２巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８６）及びＨｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、編　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　＆　Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８７）を挙げる。
　【００４１】
　この新規な加水分解酵素の阻害剤（イナクチベーター）及びこれの基質を調製する化学は、熟練した有機化学者には一般に知られている。例えば、好ましい実施例において二塩基酸を用いた場合には、部位Ａも部位Ｂも通常のエステル化反応を介して結合することができる。出発物質である二塩基酸は、当業者に周知のものであってもよいし、榎準的な二塩基の酸性化の方法によって準備されてもよい。
　【００４２】
　ＡＸ（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ−（Ｃ＝Ｏ）−ＸＢ集団のモジュール的性質が与えられれば、合成順序は１）活性化された二塩基酸とのＡＸＨの反応に続いて、ＢＸＨによる活性化及び反応、あるいは２）Ｇａｅｔｊｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２巻、３３３５頁（１９６０）の方法を用いて、ＢＸ（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ−ＣＯ２Ｈの合成に続いて、ＡＹＨによる活性化及び反応である。
　【００４３】
　この新規な化合物が、ＲがＮＨであり及び／またはそれぞれのＸが硫黄または再びＮＨである化合物から選択された場合には、標準的な有機化学反応が用いられる。手短にいうと、例えばＲがＮＨである場合には、塩化水素の気体を４−シアノブチル酸とｐ−ニトロフェノールの等モル混合物を含育するメチレンクロライド溶液中に通してバブリングさせ、イミノエーテルを生成させることができる。この化合物をメチレンクロライド中でオキサリルクロライドを用いて処理し、続いて減圧下オキサリルクロライドの除去を行い、それからＡＸＨ部位と一当量の塩基を添加することによって望ましい化合物を生成する。
　【００４４】
　Ｘが硫黄あるいは窒素のいずれかである場合も、Ｘ＝酸素の化合物として以下に記載したのと同じ方法が、ＡＯＨの代わりに適当なＡＳＨまたはＡＮＨ２に、あるいはＢＯＨの代わりにＢＳＨまたはＢＮＨ２に置換することを除いて行われる。
　【００４５】
　この加水分解酵素阻害剤の包括的種類を提供するために現在の研究で用いられている特定のモデル系を記述し、かつ一般によく知られている有機化学反応を基礎としてそれらを調製するための方法論を提供し、かつホスホリパーゼＡ２の場合にこのモデル系が使用できる分析系を示し、かつ関わりのある疾病状態あるいは条件の治療において役にたつ化合物の薬剤的に受け入れ可能の合成物を調製するのに有用である情報を提供したので、この開示は、他の阻害剤（イナクチベーター）及び基質の調製、さらに分析、処理の方法、キット等の発明を、等価で薬剤的に基本をおいた療法においての使用に対して何人にも十分に可能にする。このようにして、現存する文献、手法及び本概念を用いる研究者は、既に知られているかあるいはまだ発見されていないかいずれかの特定の加水分解酵素に対して本発明の阻害剤（イナクチベーター）及び基質を準備し、デザインする方法を十分によく理解するであろう。このようにして、１）天然の基質の構造的特徴を変化させて基本的必要条件を確認する、２）これらの特徴（部分Ａで具現される）を含む化合物を合成する、３）共有結合でＡ及びＹ（リンク）を結合する、及び４）基本的ＡＹ集団へＢを結合することが行われるであろう。
　【００４６】
　【定義】
　上記化学式において上記Ｙで示されているリンカーに関する用語により、二つの機能を果たす部分を意味している。それは、部分Ａと部分Ｂに対してリンケージを可能性にするように、それぞれの末端に適当な官能基を有している。さらに好ましい実施例としては、そのリンケージがカルボキシレート官能基を介している。第二番目の必要条件は、サイドグループのＡの酵素的な開裂、及びこれに付随するＢの放出に際して環状化合物の形成を助ける構造的特徴を有していることである。さらに好ましい実施例では、そのリンカーは少なくとも二個あるいは三個の炭素原子を含んでおり、それは飽和であっても不飽和であっても、あるいは置換されていても非置換であってもよい。それはフェニル基あるいはナフタレン基で示されているような芳香族配列の一部分であってもよい。予測される唯一の制限は、ターゲットの酵素に対し化学的に隣接部でインシトゥで、サイドグループのＡ及びＢの開裂に際して、それが環状化合物を形成するように分子内で結合することである。好適な実施例の場合では、その結果の環状化合物は、無水物であろう（例えば、図１参照）。
　【００４７】
　活性部位に結合することのできる部分に関する用語では、特定の加水分解酵素によって認識される活性部位特異性部分を意味している。リパーゼの場合では、そのような部分はグリセロール基本骨格を含んでおり、酸素原子の一個はリンカーにリンクしており、他の二個の酸素原子は問題となっている酵素に適応した飽和あるいは不飽和のアシル基に、またはアルキル鎖にリンクしている。ホスホリパーゼ加水分解酵素の場合においては、その二個の他の酸素原子の内の一個は、例えばコリン、エタノールアミン、セリン、イノシトール、グリセロール、メチル等の極性基を有しているホスホジエステルにリンクしているであろう。
　【００４８】
　検出及び測定可能であり、開裂可能な部分Ｂに関する用語の場合には、二つの必要条件がある。１）例えば図１に示したように、特異的に開裂可能なこと、及び２）薬剤であるためには、この反応が拡散の割合に迅速でなくてはならないこと、分析に対しては、検出可能及び測定可能であること、である。
　【００４９】
　さまざまな疾病の状態あるいは条件に関しての「調整」という用語では、加水分解酵素活性に作用することを意味しており、その場合そのような活性は、罹っている疾病の状態あるいは条件の症状に対して、始まりあるいは持続あるいは傾向に関係している。ここで好ましい実施例の場合には、さまざまな炎症状態が、本発明のホスホリパーゼＡ２阻害剤を使用することによって軽減でき、生成物あるるいは共に生じる生成物（ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、すなわちそれら自体、あるいは更に反応が起きたあと炎症状態を引き起こす生成物あるいは共に生じる生成物（ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の生成における前記酵素の作用を減じたり制限したりする。
　【００５０】
　このような適当なグルーピングを介する加水分解酵素の活性の検出及び測定に関する用語では、上記に示したｐ−ニトロフェノールのように開裂可能であって、検出可能及び測定可能ないずれかのグルービングを意味している。一般的には、スペークトロフォトメーターが用いられるであろう。しかしながら、検出の別の手段である例えばフルオロメーター、あるいはシンチレーションカウンターによる検出は、ある応用においては有用であろう。
　【００５１】
　「低アルキル」あるいは「アルキル」は、１個から４個の炭素原子からなる全ての異性体を意味する。
　【００５２】
　【実施例】
　　　モデルのホスホリパーゼＡ２特異的阻害剤及び基質の調製
　化合物１ａ（図１参照）は、商業的に人手できる１−デカノイル−２−リソホスファチジルコリンをメチレンクロライド中、４０℃で過剰のグルタミン酸無水物とトリエチルアミンでアシル化することによって調製された。酢酸：水：メチルアルコール：トリクロロメタンの１：４：３０：６５の混合液を用いて、シリカゲル上で精製した後、その生成物の不完全な酸は２０℃でメチレンクロライド中で１）過剰のオキサリルクロライド、２）メチレンクロライド中で減圧下、揮発性成分を除去した後、３）過剰のｐ−ニトロフェノール／トリエチルアミンで順次処理されて化合物１ａに変換された。化合物１ａは、濃縮されたメチレンクロライド溶液をジエチルエーテルによって５０倍に希釈して誘導された二種の選択的な沈澱によって精製された。ｐ−ニトロフェノールの最後の痕跡を除去するため、一当量のトリエチルアミンがそのメチレンクロライド溶液に加えられて、フェノールのリン脂質に対する水素結合を分裂させた。化合物１ａの加水分解は、シリカゲル、フロリシル（ｆｌｏｒｉｓｉｌ）及びアルミナの上で触媒されるように見える。溶離剤としてメタノールを用いたＣ１８カラムを使用するプレパラティブＨＰＬＣによって、痕跡汚染物のない１ａが得られる。ＮＭＲ及び高分解能スペクトルは、構造的に化合物１ａと一致していた。
１ａ：１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ０．８６（ｔ，３Ｈ）、１．２９（ｓ，１２Ｈ）、１．６（ｍ、２Ｈ）、２．０５（ｔ，２Ｈ）、２．２８（ｍ，２Ｈ）、２．５（ｍ，２Ｈ）、２．７（ｍ，２Ｈ）、３．３５（ｓ，９Ｈ）、３．７２（ｍ，２Ｈ）、３．９５（ｍ，２Ｈ）、４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．３（ｍ，２Ｈ）、４．４（ｍ，１Ｈ）、５．２（ｍ，１Ｈ）、７．３（ＡＢｑ，２Ｈ）、８．２５（ＡＢｑ，２Ｈ）
ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ６４７Ｃ２９Ｈ４８Ｎ２Ｏ１２Ｐに対する正確な質量計算値（Ｅｘａｃｔ　Ｍａｓｓ　Ｃａｌｃ．）は６４７．２９４５；実測値（ｆｏｕｎｄ）は６４７．２９５２。
　【００５３】
　ペプチド官能基を含む部分Ａグルーピングに対しては、より緩和な濃縮条件が用いられるであろう。
　【００５４】
　化合物１ｂから１ｅ（図１及び上記の説明を参照）は、化合物１ａを調製するための上記に記載された方法と同じ方法を用いて調製された。化合物１ａと違って、これらのエステルは、溶離剤としてトリクロロメタン／メチルアルコール２：１の混合液を用い、シリカゲル上でクロマトグラフィーを行うことができた。痕跡量の不純物は、１ａで用いたのと同一の条件でＨＰＬＣによって除去することができた。ＮＭＲ及び高分解能マススペクトルは、全て、４種の構造と一致していた。
１ｂ：１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ０．９（ｔ，３Ｈ）、１．３（ｓ，１２Ｈ）、１．４（ｓ，６Ｈ）、１．６（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｔ，２Ｈ）、２．０５（ｔ，２Ｈ）、２．２５（ｔ，２Ｈ）、２．４５（ｔ，２Ｈ）、３．３（ｓ，９Ｈ）、３．７（ｍ、２Ｈ）、４．０（ｍ，２Ｈ）、４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．３（ｍ，２Ｈ）、４．４（ｍ，１Ｈ）、５．２（ｍ，２Ｈ）、７．３（ＡＢｑ，２Ｈ）、８．２５（ＡＢｑ，２Ｈ）
ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ６７５Ｃ３１Ｈ５２Ｎ２Ｏ１２Ｐに対する正確な質量計算値（Ｅｘａｃｔ　Ｍａｓｓ　Ｃａｌｃ．）は６７５．３２５８；実測値（ｆｏｕｎｄ）は６７５．３２６７。
１ｃ：１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ０．９（ｔ．３Ｈ）、１．２５（ｓ，６Ｈ）、１．３（ｓ，１２Ｈ）、１．６（ｍ、２Ｈ）、２．２５（ｔ，２Ｈ）、２．５５（ｓ，２Ｈ）、２．７５（ｓ，２Ｈ）、３．４（ｓ，９Ｈ）、３．７５（ｍ，２Ｈ）、４．０（ｍ、２Ｈ）、４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．３（ｍ，２Ｈ）、４．４（ｍ，１Ｈ）、５．２５（ｍ、１Ｈ）、７．３（ＡＢｑ，２Ｈ）、８．３（ＡＢｑ，２Ｈ）
ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ６７５Ｃ３１Ｈ５２Ｎ２Ｏ１２Ｐに対する正確な質量計算値（Ｅｘａｃｔ　Ｍａｓｓ　Ｃａｌｃ．）は６７５．３２５８；実測値（ｆｏｕｎｄ）は６７５．３２４５。
１ｄ：１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．９（ｔ，３Ｈ）、１．３（ｓ，１２Ｈ）、１．６（ｍ、２Ｈ）、２．２５（ｔ，２Ｈ）、２．７５（ｔ，２Ｈ）、２．９（ｔ，２Ｈ）、３．３（ｓ，９Ｈ）、３．７５（ｍ，２Ｈ）、４．０（ｍ、２Ｈ）、４．１５（ｍ、１Ｈ）、４．３（ｍ、２Ｈ）、４．４（ｍ，１Ｈ）、５．２５（ｍ，１Ｈ）、７．３（ＡＢｑ，２Ｈ）、８．３（ＡＢｑ，２Ｈ）
ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ６３３Ｃ２３Ｈ４６Ｎ２Ｏ１２Ｐに対する正確な質量計算値（ｅｘａｃｔ　Ｍａｓｓ　Ｃａｌｃ．）は６３３．２７８８；実測値（ｆｏｕｎｄ）は６３３．２８００。
１ｅ：１Ｈ　ＮｍＲ（ＣＤＣ１３）δ０．９（ｔ，３Ｈ）、１．３（ｓ，１２Ｈ）、１．４２（ｓ，３Ｈ）、Ｉ．４５（ｓ，３Ｈ）、１．６（ｍ，２Ｈ）、２．２５（ｔ，２Ｈ）、２．８（ｓ，２Ｈ）、３．３（ｓ，９Ｈ）、３．７５（ｍ，２Ｈ）、４．０（ｍ、２Ｈ）、４．１５（ｍ、１Ｈ）、４，３５（ｍ，２Ｈ）、４．４（ｍ，１Ｈ）、５．２５（ｍ、２Ｈ）、７．３（ＡＢｑ，２Ｈ）、８．３（ＡＢｑ，２Ｈ）
ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ６６１Ｃ３０Ｈ５０Ｎ２Ｏ１２Ｐに対する正確な質量計算値（Ｅｘａｃｔ　Ｍａｓｓ　Ｃａｌｃ．）は６６１．３１０１；実測値（ｆｏｕｎｄ）は６６１．３０７９。
　分析
　化合物１ａの全ての分析は、０．４ｍｌの緩衝液（１０ｍｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭのＣａＣ１２、及び１００ｍｌのＨＣｌ）中で測定された。
　【００５５】
　図２は、４０℃でトリトンＸ−１００及びリン脂質の３．２：１の混合ミセル中における化合物１ａの濃度の関数としての、コブラ毒（インドコブラ）から得られたホスホリパーゼＡ２，２０ｎｇに対する特異的活性のプロットを含んでいる。参照として、Ｄｅｎｎｉｓ、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓｅａｃｈ　１４巻、１５２頁（１９７３）及びＤｅｅｍｓ　ａｎｄ　Ａｄｅｎｎｉｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｙ　７１巻、７０３頁（１９８１）を挙げる。４：１のトリトン／リン脂質混合ミセル中では、５ｍＭの基質で滴定法による分析を行ったところ、化合物１ａと１，２−ジパルミトイル　ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）の相対的なＶ（複数）は、１：３であった。ｐ−ニトロフェノールエステル部分は、ＰＬＡ２の活性部位の近傍における親水性残基への結合性を強め、結果としてＤＰＰＣよりも化合物１ａについては半飽和に達するために必要とする基質の濃度が低い。
　【００５６】
　図３は、ホスホリパーゼＡ２（特異的活性１４７０Ｍｍｏｌ　ｍｉｎ−１ｍｇ−１）に対して観察した初速度（λ＝４００ｎｍ、２０秒における△Ｏ．Ｄ．で表現されている）のプロットを記載しており、それは０．４ｍＭの化合物１ａを含んでいる４０℃のトリトン／リン脂質１．８：１の混合ミセルを用いて０．５から１００ｎｇのタンパク質濃度については直線性を示す。
　【００５７】
　加水分解反応速度は、トリトン／リン脂質混合ミセル中における基質のモルフラクションの比の関数である。その速度は、表面上の比率が１．６：１から３：１、４．５：１、７：１へと上昇するにつれて３分の１に減少する。化合物１ａの超音波分解に続いて遠心分離により準備された単一層状の小胞（ＳＵＶｓ）は、ホスホリパーゼＡ２により容易に加水分解された。ＳＵＶ’ｓの４００μＭに対して、Ｖは２６５μｍｏ１／ｍｉｎ／ｍｇであり、それは３．２：１のトリトン混合ミセル中で４００μＭの化合物１ａに対して測定した５５０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇと比較される。
　【００５８】
　化合物１ａ（白い三角印）、１ｂ（黒い丸印）、１ｃ（白い四角印）、１ｄ（黒い三角印）、及び１ｅ（白い丸印）のプレインキュベーションによるコブラ毒から得られたホスホリパーゼＡ２の不活性化の時間に対するカーブが図４に示されている。その条件は、１）阻害剤１とＰＬＡ２の２６０：１混合物を、５μｇ／ｍｌのＰＬＡ２、１００μＭの化合物１ａ〜１ｅからなる小胞、２０ｍＭのトリス−塩酸、１０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１ＭのＫＣｌを含み、ｐＨ８、２０℃に調整した１ｍｌの溶液中でプレインキュベーションする。２）５ｍＭの１，２−ジパルミトイル　ホスファチジルコリン、１０ｍＭのＣａＣ１２及び２０ｍＭのトリトンＸ−１００を含有し、４０℃に調整した分析媒体１．７ｍｌ中に、上記の溶液の２０μｌのアリコートを加えて開始された加水分解速度を滴定により測定する。
　【００５９】
　【表１】
　【００６０】
　表１は、加水分解の初め５％の間に基質１ａ〜１ｅからｐ−ニトロフェノール（ＡｒＯＨ）を放出する場合の初期の速度定数を含んでいる。また、表１は、５個の放出フラグメント２ａ〜２ｅに対する環化速度も含んでいる。コハク酸誘導体は、ｓｎ−２エステルリンケージに近いエステルの誘導効果に起因して、あるいは脂肪酸のγ位に何があるかに及ぼすカルボニルの酸素の立体効果に起因して、グルタミン酸相対物よりも効率のよくない基質であることは明かである。βあるいはγ位のいずれかにあるジェミナル（ｇｅｍｉｎａｌ）なメチル基は加水分解速度を遅らせるが、その効果はβ位の方が５０倍大きい。
　【００６１】
　酵素的な不活性化の効率は、表１において示したように分割比（Ｐ）として表すことができる。この分析から、ジメチルグルタミン酸１ｂ及び１ｃ、及びジメチルコハク酸１ｅは、より効果的な自殺的阻害剤である。おそらくジェミナルなメチル基が酵素へのより効果的な２の結合を促進するのであろう。平均して、酵素は、不活性化される前に１０〜２０の基質を加工する。阻害剤１ｄは、効果が劣るが、速度はより速い。阻害剤の程度は、プレインキュベーションの条件、即ち温度や基質の物理的状態（ミセル対小胞）の関数である。ＰＬＡ２と放出フラグメントの結合に有利な条件は、前記Ｐを低める。例えば、８．２：１のトリトン／リン脂質の混合ミセル中の１００μＭの１ｄでは、２ｄが酵素から抽出されるより大きな傾向を反映している小胞に対して３０から２５０にＰが上昇した。１ｂあるいは１ｄとともにＰＬＡ２をプレインキュベートする時の温度を２０℃から４０℃に上昇させると、その時間カーブにおいてはほとんど影響がないが、Ｐは上昇した。おそらく、ミセルで高温であることが加水分解生成物２が酵素から離れて拡散することに対して好都合なのであり、これによって結果的に環状無水物がバルクの溶液中に生じ、水との反応を引き起こしたのであろう。不活性化の全体にわたる速度は、分子内環化反応の速度及び酵素的な加水分解の受けやすさだけではなく、酵素からの２の拡散速度も反映されている。
　【００６２】
　阻害剤濃度の影響を図５において１ｄに対して示す。ＰＬＡ２の７０ｎＭ溶液の阻害は、阻害剤２０ｍＭ（黒い四角印）、５ｍＭ（黒い三角印）及び１．７μＭ（黒い丸印）においてさえかなり迅速に進行する。１ｄの濃度が０．５μＭ（白い丸印）あるいはそれ以下では、１ｄはＰＬＡ２が不活性化される前に消費された。阻害は、阻害剤／ＰＬＡ２の比が４０を超えれば低い濃度でも観察することができるが、これはこれらの阻害剤に対するＫの値が非常に低いことを示す。対照的に、１ｄの８．２：１のトリトン／リン脂質混合ミセルは、２０μＭ以下では阻害しない。阻害剤の表面濃度が減少するに連れて阻害の速度は減少する。
　【００６３】
　読者は、この明細書に記載された活性の測定のための具体的、代替的な分析手法について、関連ある詳細を提供している現存の文献をも参照されたい。また、この明細書において臨床的努力に本質的に関与することを目的として本発明の核心を提供しているので、読者は、疾病状態の効果的な治療のための薬剤的に受け入れ可能な合成物及び方法論を案出されたい。例えば、米国特許明細書４８２６９５８号、４８３３１５２号、４６１６０８９号、４７８８３０４号、４４４７４４５号、及びＷＯ８６／０６１００号（２３　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９８６）を参照されたい。
　【００６４】
　【付言】
　上記の記載は、本発明を実施するのに用いることができる具体的な方法について詳細に述べている。本発明の阻害剤（イナクチベーター）及び基質を特徴付け、調製し、かつ使用するためにまず用いられる具体的な方法と、具体的なモデル系についての更なる開示とを詳述したので、当業者は、同じ知識に到達するため及びこの知識を他の加水分解酵素系に拡張するための、別の信頼できる代替方法をいかにして案出するかを十分に知るであろう。このように、本文において上記の記述が以下に詳細に映ろうとも、それは本発明の全体の範囲を限定するものと解釈すべきではなく、本発明の範囲は前記の特許請求の範囲を法律的に解釈することによってのみ決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
　【図１】　機構の概略図であり、それによってこの多数の新規な加水分解酵素の阻害剤（イナクチベーター）が加水分解酵素との反応性に関して機能する。５種のそのような新規な化合物（ｌａ〜ｌｅ）がここでは示されており、それらは、グリセロールの基本骨格にベースを置く側鎖（上記に定義されているような部位Ａ）を介したもので、図１においてＰＬＡ２として示されたホスホリパーゼ加水分解酵素に対して特異的である。図示された反応の第１段階は、部位Ａのグリセロールにベースを置く酵素に特異的な側鎖のＰＬＡ２による開裂であって、結果として開裂されてパラ−ニトロフェノール発色団をリンカーの他の末端に含んでいるカルボキシレート　アニオンが放たれる。その後の非酵素的な触媒作用による分子内環化反応の結果、上記発色団が検出及び測定のために開裂して、環化した化合物が放たれる。その環化した化合物は、ＰＬＡ２との求核性反応を経てアシル化反応をするために役立ち、共有結合反応によって不活性化されるＰＬＡ２種を形成する。
　【図２】　４０℃でトリトンＸ−１００とリン脂質の３．２：１の混合ミセル中で化合物１ａ（図１参照）を濃度の関数として、コブラ毒（インドコブラ）から採取したホスホリパーゼＡ２に対する特異的な活性をプロットしたものである。
　【図３】　ＰＬＡ２の量の関数として、４０℃でトリトン：リン脂質の１．８：１混合ミセル中における化合物１ａ、０．４ｍＭの加水分解（２０秒において△Ｏ．Ｄ．λ４００）の速度を示している（図１参照）。
　【図４】　化合物ｌａからｌｅ（図１参照）のプレインキュベーションによるコブラ毒から得られたホスホリパーゼＡ２の不活性化に対しての時間経過に伴う曲線を示している。
　【図５】　化合物ｌｄ（図１参照）についてホスホリパーゼＡ２活性に及ぼす阻害剤の濃度の効果を示している。
　【図６】　ここで用いうるリンカー部分（Ｙ）のサンプルを示している。
　【図７】　（ａ）の部分はここで用い得るＡ部分、（ｂ）の部分はここで用い得るＢ部分のサンプルを示している。