【事件の表示】
　特許第３０３２００４号「標的化リポソーム及びリポソーム―蛋白質カップリング方法」の請求項１〜２０に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０３２００４号の請求項１〜１０に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第３０３２００４号発明は、平成２年６月２２日（パリ条約による優先権主張、１９８９年６月２３日及び１９８９年９月２６日、アメリカ合衆国）を国際出願日とする出願に係るものであって、平成１２年２月１０日にその特許権の設定登録がなされ、その後、都野キヨコより特許異議の申立てがなされ、当審より取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１４年２月１５日に訂正請求書が提出され（後日取下）、再度取消しの理由が通知された後、その指定期間内である平成１４年８月２６日に訂正請求書が提出されたものである。
　　　
２．訂正の適否についての判断
（ａ）訂正の内容
訂正事項（i）
　特許請求の範囲の請求項１〜８、１１及び１７を削除する。
訂正事項（ii）
　請求項９が「ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、
　ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させることからなり、
　該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環された架橋剤を含まないものである、
複合リポソームを形成する方法。」とあるのを、
「ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、
　ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させ、
　ｃ）前記工程ｂ）で得られた生成物を押出し、より小さくて安定な非凝集複合リポソームを得ることからなり、
　該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環された架橋剤を含まないものである、
複合リポソームを形成する方法。」と訂正し、請求項１とする。
訂正事項（iii）
　請求項１０が「該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０.０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約９９.９５モルパーセント以下からなる請求の範囲９の方法。」とあるのを、
「該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも０.０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が９９.９５モルパーセント以下からなる請求の範囲１の方法。」
と訂正し、請求項２とする。
訂正事項（iv）
　請求項１２が「ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム形成脂質、
　ｂ．少なくとも約０.１モルパーセントの機能化された脂質、及び
　ｃ．該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り１０〜１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質
を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。」とあるのを、
「請求の範囲１の方法で製造された蛋白質−リポソーム複合体であって、
　ａ．少なくとも９０モルパーセントのリポソーム形成脂質、
　ｂ．少なくとも０.１モルパーセントの反応性脂質、
　該反応性脂質は、求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、実質的に開環された架橋剤を含まない反応性脂質である、及び
　ｃ．該反応性脂質に、リポソーム小胞当り１０〜１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質
を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。」と訂正し、請求項３とする。
訂正事項（v）
　請求項１３が「機能化された脂質が約０.２５ないし１モルパーセントの間の複合体の脂質を含有する請求の範囲１２の蛋白質−リポソーム複合体。」とあるのを、
「該反応性脂質が０.２５ないし１モルパーセントの間の複合体の脂質を含有する請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。」と訂正し、請求項４とする。
訂正事項（vi）
　請求項１４が「該機能化された脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＤＰ−ホスファチジルエタノールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる請求の範囲１２の蛋白質−リポソーム複合体。」とあるのを、
「該反応性脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。」と訂正し、請求項５とする。
訂正事項（vii）
　請求項１８が「サイズが約７５nmから約２００nmの範囲にある請求の範囲１２の蛋白質−リポソーム複合体。」とあるのを、
「サイズが７５nmから２００nmの範囲にある請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。」と訂正し、請求項８とする。
訂正事項（viii）
　請求項１５、１６、１９及び２０の請求項の番号をそれぞれ６、７、９及び１０と訂正し、これら請求項中で引用する請求項の番号１２及び１５をそれぞれ３及び６と訂正する。
訂正事項（ix）
　明細書５２頁２０行及び２２行並びに８４頁下から４行の「実施例」を「例」、５３頁２４行の「実施例１及び２」を「例１及び２」、５６頁１行の「実施例３」を「例３」、５６頁１８行の「実施例４」を「例４」、５６頁２０行の「実施例２」を「例２」、５９頁表の下１行の「実施例５」を「例５」、５９頁下から７行の「実施例１〜３」を「例１〜３」、６０頁１３行の「実施例６」を「例６」、６３頁表の下１行の「実施例７」を「例７」、６４頁１７行及び６６頁２２行の「実施例８」を「例８」、６５頁１４行の「実施例９」を「例９」、６６頁１０行の「実施例１０」を「例１０」、６７頁表の下１行の「実施例１１」を「例１１」、６８頁６行の「実施例１２」を「例１２」、７０頁１行「実施例１３」を「例１３」、７１頁９行の「実施例１４」を「例１４」、７１頁末行の「実施例１５」を「例１５」、７３頁６行及び７４頁２１行の「実施例１６」を「例１６」、７４頁９行の「実施例１７」を「例１７」、７４頁２４行の「実施例１８」を「例１８」、７５頁８行の「実施例１９」を「例１９」、７５頁１０行の「実施例１３〜１８」を「例１３〜１８」、７６頁２２行の「実施例２０」を「例２０」、７７頁１９行の「実施例２１」を「例２１」、７９頁１１行の「実施例２２」を「例２２」、８１頁１４行の「実施例２３」を「例２３」、８３頁１０行の「実施例２４」を「例２４」と訂正する。
訂正事項（x）
　明細書７７頁１行、６行、７行（２ヶ所）の「図１」を「図７」、７７頁１４行の「図２」を「図８」、７７頁２４行の「図３」を「図９」、７７頁２４行の「図４」を「図１０」、７８頁１〜２行の「（図３Ｂ及び４Ｂ）」を「（図９Ｂ及び１０Ｂ）」、７８頁２〜３行の「（図３Ａ及び４Ａ）」を「（図９Ａ及び１０Ａ）」、７９頁５行の「（図５）」を「（図１１）」、７９頁９行の「（図５Ｃ及び５Ｄ）」を「（図１１Ｃ及び１１Ｄ）」、７９頁１４行の「図６」を「図１２」、８１頁下から２行の「図７Ａ」を「図１３Ａ」、８２頁１行の「図７Ｂ」を「図１３Ｂ」と訂正する。
　　　
（ｂ）訂正の目的の適否、新規事項の追加の有無及び拡張・変更の存否
（i）訂正事項（i）の訂正は、請求項を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
（ii）訂正事項（ii）の訂正は、訂正前の請求項９のａ）及びｂ）の要件に、「ｃ）前記工程ｂ）で得られた生成物を押出し、より小さくて安定な非凝集複合リポソームを得る」と、訂正前の請求項１１、特許明細書３２頁２１〜２４行、３８頁１８〜２２行、実施例２１〜２２、及び１２頁１８行と１９行の間に挿入された平成９年６月２３日付け手続補正書の１３頁１８行〜１４頁１行及び１７頁２〜１２行（特許掲載公報３１欄３８〜４２行、３５欄１６〜２０行、実施例２１〜２２、１７欄３７〜４９行及び１９欄３７〜４８行）に記載された、ｃ）工程を加えるものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
（iii）訂正事項（iii）、（vii）及び（viii）の訂正は、配合割合等の数値の前の「約」を削除するもの、及び／又は訂正事項（i）に伴い請求項の番号を訂正するものであるが、これらの訂正は数値の意味を明確とするものであり、又は請求項の番号を連続番号とするために整合させたものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。
（iv）訂正事項（iv）の訂正は、訂正前の請求項１２の蛋白質−リポソーム複合体を請求項１のリポソーム形成方法で限定し、そして「機能化された脂質」を「反応性脂質」と訂正するものであるが、蛋白質−リポソーム複合体は製法で何等限定されてなかったものを請求項１の形成方法に限定し、訂正前の請求項１７に記載されているように非共有結合で蛋白質を結合するものを包含する「機能化された脂質」を、非共有結合を含まないことが明らかな訂正後の請求項１に記載の「反応性脂質」とするものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
（v）訂正事項（v）の訂正は、「機能化された脂質」を「反応性脂質」と訂正し、数値の前の「約」を削除するものであるが、上記（iii）及び（iv）に述べた理由により、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。
（vi）訂正事項（vi）の訂正は、「機能化された脂質」を「反応性脂質」と訂正し、機能化された脂質として記載されていた「ＰＤＰ−ホスファチジルエタノールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノールアミン」を削除し、請求項の番号を訂正するものであるが、上記（iv）に述べたように「反応性脂質」は「機能化された脂質」の一種であり、また訂正前の請求項に記載の物質を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当し、請求項番号の訂正は明りょうでない記載の釈明に該当する。
（vii）訂正事項（ix）の訂正は、明細書の記載の実施例番号を例番号と訂正するものであるが、特許請求の範囲の訂正に伴って実施例に該当しない実施例を例と訂正して、明細書の記載を整合させたものであるから、明りょうでない記載の釈明に該当する。
（viii）訂正事項（x）の訂正は、明細書中に記載の図面番号を訂正するものであるが、明細書の記載内容から明らかに誤記と認められるから、誤記の訂正に該当する。
　そして、これらの訂正は、特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもなく、願書に添付された明細書及び図面（以下、「特許明細書」という。）に記載された範囲内のものである。
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　　　　　
３．特許異議の申立てについての判断　
（ａ）本件発明
　本件の請求項１〜１０に係る発明は、訂正された特許明細書及び図面の記載からみて、特許請求の範囲に記載されたとおりの
「１．ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、
　ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させ、
　ｃ）前記工程ｂ）で得られた生成物を押出し、より小さくて安定な非凝集複合リポソームを得ることからなり、
　該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環された架橋剤を含まないものである、複合リポソームを形成する方法。
２．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも０．０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が９９．９５モルパーセント以下からなる請求の範囲１の方法。
３．請求の範囲１の方法で製造された蛋白質−リポソーム複合体であって、
　ａ．少なくとも９０モルパーセントのリポソーム形成脂質、
　ｂ．少なくとも０.１モルパーセントの反応性脂質、
　該反応性脂質は、求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、実質的に開環された架橋剤を含まない反応性脂質である、及び
　ｃ．該反応性脂質に、リポソーム小胞当り１０〜１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質
を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。
４．該反応性脂質が０.２５ないし１モルパーセントの間の複合体の脂質を含有する請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。
５．該反応性脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。
６．該蛋白質が、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体及び酵素からなる群より選ばれる請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。
７．蛋白質がストレプトアビジンであり、該ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合している請求の範囲６の蛋白質−リポソーム複合体。
８．サイズが７５ｎｍから２００ｎｍの範囲にある請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。
９．生物活性剤を含む請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。
１０．該複合体が脱水されている請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。」であると認められる。
　　　　
（ｂ）特許異議の申立ての概要
　異議申立人都野キヨコは、甲第１号証（特開昭６１−２２５６５８号公報）、甲第２号証（日本化学会編、実験化学講座２３　生物化学Ｉ、丸善、昭和３２年発行、４９０〜４９９頁）、甲第３号証（野島庄七ら著、医学・生物学のための有機化学４　脂質、朝倉書店、昭和４４年発行、１１〜１３頁）、甲第４号証（Pharmaceutisch Weekblad Scientific Edition, Vol.5, 1983, p.269-280.）、及び参考資料１〜４を提出して、（i）訂正前の本件特許の請求項１〜５、９〜１２、１５及び１８に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、（ii）訂正前の請求項６〜８、１３、１４、１６、１７、１９及び２０に係る発明は、甲第１〜４号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、また、（iii）本件特許明細書の記載が不備であるから、同法第３６条第３項又は第４項に規定する要件を満たしてない出願に対してされたものであり、及び（iv）本件特許出願が、同法第１８４条の４第１項の国際出願日における国際出願の明細書、請求の範囲若しくは図面（図面の中の説明に限る。）に記載されている発明以外の発明についてされたものである（特許異議申立人のいう同法第１１３条第５項は誤記と認められる。）から、本件特許は取り消されるべきであると主張している。
　なお、訂正請求により訂正前の請求項１〜８、１１及び１７が削除されたので、訂正前後における請求項の番号の対応関係は、訂正後の請求項１〜１０が、それぞれ、訂正前の請求項９、１０、１２〜１６、１８〜２０に対応する。この結果、理由（i）に関する異議申立ては請求項１〜３、６及び８に対してされたものであり、理由（ii）は、請求項４、５、７、９及び１０に対してされたものである。
　　
（ｃ）申立て理由（i）について
（ｃ−１）証拠記載の発明
　甲第１号証には、次の事項が記載されている。
(1)　コレステロール４８mg、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）１０４mg、架橋剤（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＤＳＰＥ−ＭＰＢ）３.７５mg、イソプロピルエーテル６.０ml、メタノール１.０mlを原料としてリポソームを調製したこと、及び調製した温リポソーム調製液を０.４ミクロン、次いで０.２ミクロンのポリカーボネート膜を通して押出したこと。（例１）
(2)　ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのクロロホルム溶液中にトリエチルアミンとスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートを添加し反応させ、上記ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−マレイミドフェニル−ブチレートの粗生成物を淡黄色ろう状固体として得たこと、これをさらに精製して生成物を白色固体として得たこと、及びそのＩＲのデータが記載されている。（例１Ａ）
(3)　例１の方法により製造されたリポソームをＨＣＧ鎖に対する抗体と室温で一夜反応させ、これを用いて尿を試料として妊娠試験を行い、可視スポットが妊娠陽性であることを確認したこと。（７頁左下欄５行〜８頁左下欄１行）
　　
（ｃ−２）対比・判断
（ｃ−２−１）請求項１に係る発明について
　請求項１に係る発明と甲第１号証に係る発明とを対比する。
　本件訂正後の特許明細書の「本発明の方法においては、リポソーム形成求核脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、を架橋剤、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）と反応させて、実質的に純粋な反応性脂質、例えば、ＭＰＢ−ＰＥ、を製造する。」（３８頁１１〜１５行）との記載、リポソーム製剤に用いるリン脂質としてジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、リポソームに併用可能なステロイド成分としてコレステロールがあげられていること（５８頁５行〜５９頁１１行）から、ＤＳＰＥ−ＭＰＢが反応性脂質に相当し、コレステロール及びＤＳＰＣがリポソーム形成脂質に相当する。甲第１号証におけるリポソームは、これらの成分でリポソームを形成しているのであるから、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質を含むことは明らかである。また、異議申立人が提出した都野キヨコ作成の実験成績書（参考資料１）によれば、甲第１号証の例１Ａに記載された方法に従って作成したジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−マレイミドフェニル−ブチレートが実質的に純粋であって、開環されたマレイミド部分を含まないものと認められ、さらに、ＨＣＧ鎖に対する抗体は、妊娠の検査に用いているのであるから、診断の標的化に有効な複合分子であることは明らかであり、この抗体を有するリポソームが有効な十分な数の複合分子が結合していること、すなわち、反応性脂質の側からみれば、有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の反応性脂質を含むこと、反応条件からみれば、反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間反応させていることは明らかである。
　そうすると、両者は「ａ）診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、
　ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質とを結合させるのに十分な時間、反応させ、
　該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環された架橋剤を含まないものである複合リポソームを形成する方法」である点で一致し、本件請求項１に係る発明が、ｂ）工程で得られた生成物を押出し、より小さくて安定な非凝集複合リポソームを得るｃ）工程を設けているのに対して、甲第１号証に係る発明は反応性リポソームを形成した後押出し、その後にＨＣＧ鎖に対する抗体（複合分子）と反応させている点、つまり、ｂ）工程の前に押出し工程を設けている点で相違する。
　したがって、請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明ではない。
　　
（ｃ−２−２）請求項２〜３、６及び８に係る発明について　
　上記各請求項に係る発明は、請求項１に係る発明をさらに技術的に限定したものであるから、甲第１号証に記載された発明ではない。
　　　
（ｄ）申立て理由（ii）について
（ｄ−１）証拠記載の発明
　甲第２号証には、複合脂質の分離および精製法が記載されており、４９０頁の図４・３には、溶媒により脂質を分割する方法が記載されている。
　甲第３号証には、脂質の溶解性が記載されており、１３頁の表２.２には、代表的溶媒における精製脂質のおよその溶解性の一覧が記載されている。
　甲第４号証の２７４頁の表IIには、サイズが５０〜２００nmである抗体結合リポソームが記載されている。
　　　　
（ｄ−２）対比・判断
（ｄ−２−１）請求項４について
　請求項４に係る発明は、請求項１に記載された製造方法によって特定された請求項３の蛋白質−リポソーム複合体を、さらに該複合体中の反応性脂質の含有割合で限定するものである。
　そこで、まず、請求項４の前提となる請求項３の特定事項である請求項１に係る発明の進歩性について判断する。
　請求項１に係る発明と、甲第１号証に係る発明を対比すると、上記（ｃ−２−１）で述べたように、前者が、ｂ）工程で得られた生成物（複合リポソーム）を押出し、より小さくて安定な非凝集複合リポソームを得るｃ）工程を設けているのに対して、後者は反応性リポソームを形成した後押出し、その後にＨＣＧ鎖に対する抗体（複合分子）と反応させている点、つまり、リポソームの押出し工程の後に複合分子と反応させている点で相違し、その他の点では一致する。
　そこで、この相違点について検討すると、甲第２〜３号証には、脂質についての性質が記載されているだけで、リポソームについては何等記載がなく、甲第４号証には抗体結合リポソーム自体は記載されているが、押出し工程をもつリポソームの製法は記載されていない。
　そして、リポソームを複合分子とインキュベーションした後は、著しい数の、サイズの大きい小胞（＞２００nm）が認められ、凝集に続き融合が起こったと考えられる（例２０）のに対して、複合分子とリポソームを反応させた後の複合リポソーム（サイズ：１５０から５００nmを越える）を押出すと、１２０〜１４０nmのサイズとなり、かつ、押出し後数時間もサイズが小さいままの安定なリポソームが得られるという顕著な効果を奏するものである。（特許明細書９２頁下から５行〜１００頁下から５行参照）
　そうすると、請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明におけるリポソームの押出し工程の順序を単に代えたものではなく、この押出し工程をｂ）工程の後に設けたことにより顕著な効果を奏したものと認められるから、甲第１号証に記載された発明に甲第２〜４号証に記載された事項を適用してもこの効果を予想できるものではない。したがって、請求項１に係る発明は甲第１〜４号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　次に請求項３に係る発明について検討すると、請求項３に係る発明は請求項１の方法で製造された蛋白質−リポソーム複合体に係る発明である上に、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体であり、これらについて甲第１〜４号証には何等記載されていない以上、請求項３に係る発明が甲第１〜４号証に記載された発明に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　そうすると、この請求項３をさらに限定した請求項４は、甲第１〜４号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　　　　
（ｄ−２−２）請求項５、７及び９〜１０
　上記各請求項に係る発明は、請求項３に係る発明を、さらに技術的に限定したものであるから、請求項３に係る発明が当業者が容易に発明することができたとは認められない以上、甲第１〜４号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　　　
（ｅ）申立て理由（iii）について
　異議申立人は、訂正前の請求項１、９及び１２には特許を受けようとする発明の構成に欠くことができない事項が記載されていない、請求項６に係る発明を裏付ける事項が発明の詳細な説明に記載されていないと主張している。
　しかし、訂正請求により訂正前の請求項１及び６は削除され、訂正前の請求項９及び１２はそれぞれ請求項１及び３と訂正された。そして、請求項１は、上記（ｄ）で述べたように、ｃ）工程を加えて限定することにより、すなわち、工程ｂ）で得られた複合リポソームを押出すことから、押出前よりサイズが小さく、安定な非凝集複合リポソームが得られるのであり、また、請求項３の蛋白質−リポソーム複合体は請求項１に記載された製造方法によって特定されたものであるから、異議申立人のいう不備はない。
　
（ｆ）申立て理由（iv）について
　異議申立人は、訂正前の請求項６は特許法第１８４条の４第１項の国際出願日における国際出願の明細書、請求の範囲若しくは図面（図面の中の説明に限る。）に記載されている発明以外の発明である旨主張しているが、訂正により請求項６は削除されたので、本申立て理由は解消した。
　　　
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件特許が特許法第２９条第１項第３号又は第２９条第２項の規定に違反してされたものではなく、同法第３６条第５項に規定する要件を満たしていない出願に対してされたものではない。また、本件特許出願が、同法第１８４条の４第１項の国際出願日における国際出願の明細書、請求の範囲若しくは図面（図面の中の説明に限る。）に記載されている発明以外の発明についてされたものではない。
　そして、本件特許については、他に取消理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年９月６日（２００２．９．６）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
・訂正事項１
　特許請求の範囲の請求項１〜８、１１及び１７を、特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。
・訂正事項２
　請求項９が「ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させることからなり、該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環された架橋剤を含まないものである、複合リポソームを形成する方法。」とあるのを、特許請求の範囲の減縮を目的として、「ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させ、ｃ）前記工程ｂ）で得られた生成物を押出し、より小さくて安定な非凝集複合リポソームを得ることからなり、該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環された架橋剤を含まないものである、複合リポソームを形成する方法。」と訂正し、請求項１とする。
・訂正事項３
　請求項１０が「該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０．０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約９９．９５モルパーセント以下からなる請求の範囲９の方法。」とあるのを、明りょうでない記載の釈明を目的として、「該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも０．０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が９９．９５モルパーセント以下からなる請求の範囲１の方法。」と訂正し、請求項２とする。
・訂正事項４
　請求項１２が「ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム形成脂質、ｂ．少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、及びｃ．該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り１０〜１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。」とあるのを、特許請求の範囲の減縮を目的として、「請求の範囲１の方法で製造された蛋白質−リポソーム複合体であって、ａ．少なくとも９０モルパーセントのリポソーム形成脂質、ｂ．少なくとも０．１モルパーセントの反応性脂質、該反応性脂質は、求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、実質的に開環された架橋剤を含まない反応性脂質である、及びｃ．該反応性脂質に、リポソーム小胞当り１０〜１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。」と訂正し、請求項３とする。
・訂正事項５
　請求項１３が「機能化された脂質が約０．２５ないし１モルパーセントの間の複合体の脂質を含有する請求の範囲１２の蛋白質−リポソーム複合体。」とあるのを、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的として、「該反応性脂質が０．２５ないし１モルパーセントの間の複合体の脂質を含有する請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。」と訂正し、請求項４とする。
・訂正事項６
　請求項１４が「該機能化された脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＤＰ−ホスファチジルエタノールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる請求の範囲１２の蛋白質−リポソーム複合体。」とあるのを、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的として、「該反応性脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。」と訂正し、請求項５とする。
・訂正事項７
　請求項１８が「サイズが約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲にある請求の範囲１２の蛋白質−リポソーム複合体。」とあるのを、明りょうでない記載の釈明を目的として、「サイズが７５ｎｍから２００ｎｍの範囲にある請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。」と訂正し、請求項８とする。
・訂正事項８
　明りょうでない記載の釈明を目的として、請求項１５、１６、１９及び２０の請求項の番号をそれぞれ６、７、９及び１０と訂正し、これら請求項中で引用する請求項の番号１２及び１５をそれぞれ３及び６と訂正する。
・訂正事項９
　明りょうでない記載の釈明を目的として、明細書５２頁２０行及び２２行並びに８４頁下から４行の「実施例」を「例」、５３頁２４行の「実施例１及び２」を「例１及び２」、５６頁１行の「実施例３」を「例３」、５６頁１８行の「実施例４」を「例４」、５６頁２０行の「実施例２」を「例２」、５９頁表の下１行の「実施例５」を「例５」、５９頁下から７行の「実施例１〜３」を「例１〜３」、６０頁１３行の「実施例６」を「例６」、６３頁表の下１行の「実施例７」を「例７」、６４頁１７行及び６６頁２２行の「実施例８」を「例８」、６５頁１４行の「実施例９」を「例９」、６６頁１０行の「実施例１０」を「例１０」、６７頁表の下１行の「実施例１１」を「例１１」、６８頁６行の「実施例１２」を「例１２」、７０頁１行「実施例１３」を「例１３」、７１頁９行の「実施例１４」を「例１４」、７１頁末行の「実施例１５」を「例１５」、７３頁６行及び７４頁２１行の「実施例１６」を「例１６」、７４頁９行の「実施例１７」を「例１７」、７４頁２４行の「実施例１８」を「例１８」、７５頁８行の「実施例１９」を「例１９」、７５頁１０行の「実施例１３〜１８」を「例１３〜１８」、７６頁２２行の「実施例２０」を「例２０」、７７頁１９行の「実施例２１」を「例２１」、７９頁１１行の「実施例２２」を「例２２」、８１頁１４行の「実施例２３」を「例２３」、８３頁１０行の「実施例２４」を「例２４」と訂正する。
・訂正事項１０
　誤記の訂正を目的として、明細書７７頁１行、６行、７行（２ヶ所）の「図１」を「図７」、７７頁１４行の「図２」を「図８」、７７頁２４行の「図３」を「図９」、７７頁２４行の「図４」を「図１０」、７８頁１〜２行の「（図３Ｂ及び４Ｂ）」を「（図９Ｂ及び１０Ｂ）」、７８頁２〜３行の「（図３Ａ及び４Ａ）」を「（図９Ａ及び１０Ａ）」、７９頁５行の「（図５）」を「（図１１）」、７９頁９行の「（図５Ｃ及び５Ｄ）」を「（図１１Ｃ及び１１Ｄ）」、７９頁１４行の「図６」を「図１２」、８１頁下から２行の「図７Ａ」を「図１３Ａ」、８２頁１行の「図７Ｂ」を「図１３Ｂ」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
標的化リポソーム及びリポソーム−蛋白質カップリング方法
【発明の詳細な説明】
　　　
発明の分野
　本発明は、例えばＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチリル］ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＰＥ）及び関連組成物を含む実質的に純粋な反応性脂質を合成する方法に関するものである。本発明の組成物は、カップリング剤として有用であり、リポソーム内に取り込み、次いで蛋白質、補因子及び多数の他の分子と結合することができる。
　更に、本発明は、ＳＭＰＢ及び関連架橋剤で改質された脂質、並びにＭＰＢ−ＰＥを始めとする実質的に純粋な反応性脂質及び関連カップリング組成物を脂質内に取り込むことにより得られたリポソームに関するものである。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、リポソームを治療及び診断の標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）に用いることができる。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、それらの膜をはさんで膜内外電位差を有していてもよく、脱水されてもよい。更に、複合体は、イオン化しうる生物活性剤、例えば抗腫瘍剤を含んでもよく、診断検査に用いてもよい。
　本発明は、高血液循環時間を示す、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造する一般的な方法に関するものである。また、本発明は、本発明方法によって作られた、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体組成物に関するものである。本発明の複合体は、サイズが３０ｎｍから１５０ｎｍまでの範囲内にあることが好ましく、良好な血液循環時間を示す。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、生体内又は診断での活性剤の搬送を標的化するのに用いてもよい。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、それらの膜をはさんで膜内外電位差を有していてもよく、脱水されてもよい。更に、複合体は、イオン化しうる生物活性剤、例えば抗腫瘍剤を含んでもよく、診断検査に用いてもよい。
　　　
発明の背景
　リポソームは、取り込まれた水性容積を含む脂質二分子膜からなる完全に閉鎖された構造体である。リポソームは、水性相により分離された、多くの同心脂質二分子膜を含んでもよく（多重ラメラ小胞、ＭＬＶ）、あるいは１個の膜状二分子膜を含んでもよい（単ラメラ小胞）。脂質二分子膜は、疎水性“尾”領域と親水性“頭”領域とを有する２つの脂質単分子膜で構成されている。膜状二分子膜においては、脂質単分子膜の疎水性（非極性）“尾”が二分子膜の中心に向かって配向し、一方、親水性（極性）“頭”は水性相に向かって配向している。リポソームの基本的な構造は、種々の公知技術により作ることができる。
　代表的には、リポソームは、Ｂａｎｇｈａｍ等の方法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，２３８−２５２（１９６５）］を用いて調製されており、有機溶剤中に懸濁した脂質を減圧下に蒸発させて、反応容器中で乾燥膜とする。次いで、適当量の水相を容器に加え、混合物を撹拌する。その後、多重ラメラ小胞が形成するのに十分な時間、実質的にかき乱さずに、混合物を放置する。リポソーム内に取り込まれる水性相は、とりわけ、薬剤、ホルモン、蛋白質、染料、ビタミン、造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などの生物活性剤を含んでもよい。
　現在利用できる多数の技術を用いて、リポソームを再現可能に調製することができる。多数のこれらの技術を用いて生成することのできるリポソームの種類としては、小単ラメラ小胞（ＳＵＶ）［Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ及びＭｉｌｌｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３５，６２４−６３８（１９６７）参照］、逆相蒸発小胞（ＲＥＶ）［米国特許第４，２３５，５８７号、１９８０年１１月２５日発行、参照］、安定複ラメラ小胞（ＳＰＬＶ）［米国特許第４，５２２，８０３号、１９８５年６月１１日発行、参照］、及び同時係属中の米国特許出願番号第６２２６９０号、１９８４年６月２０日出願、Ｇｕｌｌｉｓ等、名称“単ラメラ小胞製造のための押し出し手法”に記載されている押し出し手法で作られる大単ラメラ小胞を挙げることができ、それらの関連部分をここに参照のために記載した。
　リポソームは、種々の物質、とりわけ、例えば薬剤、化粧品、診断試薬、生物活性化合物の担体として、用いることができる。蛋白質を複合するリポソーム組成物は、診断用及び生体内用の両用に設計されることができる。例えば、特定の受容体又はその他の細胞表面部分に向かわせるような、抗体指向小胞を生成する能力は、同様の非指向系に優る明白な利点であろう［Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓｃｉ．４，３０４−３０７（１９８３）］。これらの蛋白質−リポソーム複合体は、小胞内に取り込まれた細胞毒性化合物の循環腫瘍細胞に対する選択的標的化に有効に適用されるであろうし［Ｗｏｌｆｆ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　８０２，２５９−２７３（１９８４）］、あるいはこれらのイムノグロブリン結合小胞が、診断検査の発展に適用されるであろう。更に、患者の特定部位に活性剤を搬送するための特定の蛋白質−リポソーム相互作用の標的化によって更に、適用が行われることができるものであろう。事実、蛋白質が結合する患者の系内の部位へ任意の活性剤の搬送を標的化するために、蛋白質が複合したリポソームを理論的に用いることができよう。イムノリポソーム［Ｌｅｓｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ２８８，６０２（１９８０）、Ｈｅａｔｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０，１３７７（１９８３）及びＨｕａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，１４０３４（１９８３）参照］、診断プロトコル［Ｉｓｈｉｍｏｒｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　７５，３５１（１９８４）及びＲｏｄｎｅｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４，４０３５（１９８５）参照］並びにリポソームワクチン［Ａｌｌｉｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　２５２，２５２（１９７４）参照］を介して薬剤を目的の部位に向かわせることを始めとする種々の目的のために、リポソームに蛋白質を複合させる多数の技術がすでに開発されている。
　リポソームは、蛋白質、抗体及びイムノグロブリンに共有結合で結合することができる。Ｈｅａｔｈ等［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．６４０，６６−８１（１９８１）］は、グリコスフィンゴリピドを含むリポソームとイムノグロブリンとの共有結合について述べている。Ｌｅｓｅｒｍａｎ等［リポソーム技術ＩＩＩ、２９〜４０頁、１９８４年、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ．；Ｎａｔｕｒｅ　２８８，６０２−６０４（１９８０）］及びＭａｒｔｉｎ等［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７　２８６−２８８（１９８２）］は、チオール化ＩｇＧ又はプロテインＡを脂質小胞に共有結合させ、チオール化抗体とＦａｂ’断片をそれぞれリポソームに結合させる方法について述べている。これらのプロトコル及び変更した種々のもの［Ｍａｒｔｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０，４２２９−４２３８（１９８１）；及びＧｏｕｎｄａｌｋｅｒ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６，４６５−４６６（１９８４）］は、カップリングに対する最も有用なアプローチを示している。アクチノマイシンＤを含有するアビジン結合、及びアビジン、ビオチニン結合リン脂質リポソームは、ガングリオ−Ｎ−トリオシルセラミドを発現する腫瘍細胞へと向けられることに成功している［Ｕｒｄａｌ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，１０５０９−１０５１６（１９８０）］。Ｈｕａｎｇ等［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７１６，１４０−１５０（１９８２）］は、主要組織適合抗原Ｈ−２（Ｋ）に対するマウスモノクローナル抗体の結合、あるいはモロニー白血病ウイルスの主要糖蛋白、パルミチン酸に対する山羊抗体の結合について示している。これらの脂肪酸変性ＩｇＧをリポソームに取り込み、適当な抗原を発現する細胞に対するこれらのリポソームの結合が確認された。特定のイムノグロブリンで被覆されたリポソームの特定の結合について、生体外における他の検討が行われている［Ｓｈａｒｋｅｙ等、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．３８，１０８９（１９７９）］。更に他のカップリングの研究において、Ｒａｈｍａｎ等は、リポソームの組織取り込みを、リポソームへの糖脂質の結合により変更できることを見いだした［Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．８３，２６８ａ（１９７９）］。
　リポソームの第一の用途によれば、抗腫瘍剤をリポソーム二分子膜内に取り込むことにより、薬剤の直接投与に比べて、より有効な治療が行えるようになっている［Ｆｏｒｓｓｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４３，５４６（１９８３）；及びＧａｂｉｚｏｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４２，４７３４（１９８２）］。抗腫瘍剤及び他の薬剤のカプセル化に伴う大きな問題は、これらの薬剤の多くが、カプセル化後、リポソームから急速に放出されることが分かっているということである。直接投与に比較して、リポソームカプセル化により、多くの抗腫瘍剤の毒性を著しく低減することができるという事実を考えると、このことは、望ましくない効果である。例えば、Ｆｏｒｓｓｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４３，５４６（１９８３）及びＲａｈｍａｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４２，１８１７（１９８２）参照。更に、徐放形式で好ましく搬送されるある種の医薬は、標準リポソーム搬送系に適合しない。多くのリポソーム組成物は、薬剤をあまりにも急速に放出してしまうので、徐放搬送を行うことができない。
　上記問題に対する一つの解答は、リポソーム系の安定性及び徐放特性を維持する予め形成された安定なリポソームを用いることである。米国特許出願番号第８１１，０３７号、１９８５年１２月１８日出願、名称“リポソームの標的化、貯蔵及び装填用の新規な組成物”に記載されているように、蛋白質結合リポソームを含むリポソーム組成物により、いつまでも安定に貯蔵できる貯蔵安定性リポソームが製造されている。これらのリポソームは、リポソームに結合したストレプトアビジン及びイムノグロブリンを含み、“必要に応じて”リポソームに装填して、脱水状態で貯蔵されてもよい。これらの蛋白質結合リポソームには、イオン化しうる抗腫瘍剤が装填されており、リポソームの壁をはさんで膜内外電位差が生じ、この膜内外電位差により、リポソーム内に抗腫瘍剤が装填される。例えば、米国特許出願番号第７４９，１６１号、Ｂａｌｌｙ等、１９８５年６月２６日出願、名称“リポソーム内への抗腫瘍剤のカプセル化”（この関連部分をここに参照のために記載した）参照。
　上で説明したように、蛋白質−リポソーム複合体は、診断系から生体内の病気の部分への標的化に至るまでの多くの適用可能性を有している。他の所［Ｌｏｕｇｈｅｒｙ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０１，１５７（１９８７）］で示したように、ストレプトアビジンをリポソームに結合させると、後で種々の蛋白質を簡単に複合させる適応性のある基本的な系となる。しかし、リポソーム−蛋白質複合体は、複合工程中、特に脂質に対する蛋白質の割合が高い場合に、凝集する傾向がある。例えば、リポソームに複合される蛋白質［Ｆ（ａｂ）断片］の量が多くなると、小胞個体群の多分散性が増加する結果となることが見いだされている［Ｒ．Ｂｒｅｄｅｈｏｒｓｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５，５６９３（１９８６）参照］。カップリングインキュベーション工程において、脂質濃度及び脂質に対する蛋白質の割合を高めるといったような、リポソームに対する蛋白質のカップリング効率を高める条件では、ネガティブ染色で観察した場合の小胞凝集の程度が増大することが認められている［Ｈｅａｔｈ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５９９，４２（１９８０）参照］。
　蛋白質カップリング中の蛋白質−リポソーム複合体の凝集は、残念ながら、この系の一般的な適用性を阻害する特性である。この凝集現象は、リポソームのサイズが大きくなることと関連している。（血液）循環からのリポソームの排出速度は、製剤のサイズに依存すること、即ち、リポソームが大きければ大きいほど、循環から速く取り除かれることが認められている［Ａ．Ｃ．Ｈｕｎｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７１９，４５０（１９８２）及びＳｏｔａ等、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３４，４２４４（１９８６）参照］。蛋白質リポソーム複合体が凝集する傾向があるために、このような製剤のサイズは大きくなり易く、従って、循環時間が多少不利である。蛋白質−リポソーム複合体の血液からの浄化は、同じサイズの非複合リポソームよりも速くなる傾向がある。更に、凝集した蛋白質−リポソーム複合体は、エンドサイトーシス法での細胞による吸収が悪くなる傾向があり、細胞に入る薬剤の量が減少するかもしれない。診断においては、凝集した複合体が溶液から析出し易く、診断が不正確になる可能性がある。
　従って、当該技術においては、一般的なターゲッティング用途に利用することのできる一定のサイズ分布の蛋白質−リポソーム複合体を製造する一般的な方法が、要求されている。このようなサイズを揃えた蛋白質−リポソーム複合体は、凝集蛋白質−リポソーム複合体の実質的な析出を示さず、高細胞吸収を始めとする、活性剤搬送を標的化するための又は診断で使用するための蛋白質−リポソーム製剤の好ましい特性を示すと期待されるであろう。
　本発明の目的は、良好な特性の、サイズの揃った、一般標的化用の蛋白質−リポソーム複合体系を達成するために、リポソームへ蛋白質分子を結合させる一般的な方法を提供することである。
　本発明の他の目的は、リポソームが複合している蛋白質の結合活性に影響を与えることなく、リポソームへの蛋白質の複合を容易にする、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を生成する技術を提供することである。
　また、本発明の目的は、種々の量の蛋白質を適合させることのできる一定のサイズ分布の蛋白質−リポソーム複合体を生成する一般的な方法を提供することである。
　更に、本発明の目的は、本発明の方法で製造された安定な蛋白質−リポソーム複合体を提供することである。
　本発明の更に他の目的は、蛋白質の結合活性に影響を与えることなく、蛋白質結合リポソームのサイズを物理的に揃える操作を容易に行える一般的な方法を提供することである。
　本発明の更にもう一つ別の目的は、複合体の生体内性能及び安定性を高めて、カプセル化された物質をより効率的に細胞へ搬送するために、安定な架橋と組み合わせて有効なカップリング技術を提供することにより、サイズの揃った蛋白質リポソーム複合体の製造効率を高めることである。
　更に、本発明の目的は、長期間安定に貯蔵できるサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を提供することである。
　本発明の更にもう一つ別の目的は、膜内外イオン電位差を用いて、活性剤を装填できるサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を提供することである。
　形質転換された細胞と結合しているもののような細胞表面抗原に向けられている抗体に対するリポソームの共有結合は、治療に用いられる可能性がかなりある。しかし、現在では、このような標的に向けられるリポソーム系は、診断検査のような生体外用途に主として用いられている［Ｍａｒｔｉｎ及びＫｕｎｇ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｐｐ．４４３−４４９（１９８５）］。例えば、リポソーム−蛋白質カップリング及びリポソーム−補因子カップリングなどの他の系のほかに、抗体に向けられた担体系の可能性を全部利用するために、改良された有用で信頼できるカップリングのための方法論を開発すべきである。
　現在まで、蛋白質、抗体、その他の分子をリポソームに結合する一般的な方法は、まだ得られていない。Ｌｅｓｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２８８，６０２−６０４（１９８０）及びＢａｒｂｅｔ等、Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６，２４３−２５８（１９８１）は、チオール化ＩｇＧを、ジスルフィド結合を介して、Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニル］ホスファチジルエタノールアミン（ＰＤＰ−ＰＥ）を含むリポソームに共有結合する方法について記載している。この方法のより一般的なバージョンは、プロテインＡを小胞にカップリングさせることにより開発され［例えば、Ｌｅｓｅｒｍａｎ（１９８０）、前出、参照］、これは、あるクラスのＩｇＧのＦｃ部分を結合するプロテインＡの能力を利用している。この方法の一つの大きな制限は、多くのモノクローナル抗体が、この適当なクラスではないということである。
　カップリングに対する上記アプローチとは別のものに、Ｍａｒｔｉｎ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，２８６−２８８（１９８２）のアプローチがあり、彼らは、マレイミド基とのチオエーテル結合、Ｌｅｓｅｒｍａｎ法のジスルフィド結合よりも血清中に見られる還元条件をかなり受けにくい結合、の形成により、Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチリル］ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＰＥ）を含むリポソームに抗体及びＦａｂ’断片を共有結合する技術を開発した。Ｍａｒｔｉｎ／Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓのアプローチ及びこのアプローチの種々の変形［例えば、Ｗｏｌｆｆ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．８０２，２５９（１９８４）；Ｍａｒｔｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０，４２２９（１９８１）；及びＧｏｕｎｄａｌｋａｒ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６，４６５（１９８４）］は、現在得られるカップリングに対する最も有用なアプローチを示している。
　リポソームを蛋白質、抗体、補因子、その他の分子に架橋するこの方法において、マレイミド基を含む架橋剤、とりわけ、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）が、脂質を含むホスファチジルエタノールアミン及び他のアミンを複合分子、例えば反応性チオールを含む蛋白質、抗体、補因子及び他の分子に架橋させるのに用いられる。文献処方に従って、ホスファチジルエタノールアミン及び他の脂質と反応させる従来の架橋剤、例えばＳＭＰＢは、スクシンイミジル基の置換中にマレイミド環が開環し、開環ＭＰＢ−脂質誘導体が反応生成物に混入することになる。蛋白質、抗体、補因子、その他の分子に対する架橋は、従来の文献処方を用いる理想的なものよりも少ない。本発明の方法は、実質的に純粋なＭＰＢ−ＰＥ、即ち従来法を用いて作られる開環ＭＰＢ−脂質が存在していないことを示すＳＭＰＢ誘導ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームを提供することにより、問題を解迅するのに役立つ。実質的に純粋なＭＰＢ−ＰＥを含むリポソームを、種々の蛋白質、とりわけ、例えばストレプトアビジン、抗体、補因子及びその他の分子と更に反応させて、本発明の複合リポソームを製造することができる。
　本発明の第一の態様、即ち、治療部位への生物活性剤の搬送によれば、リポソーム二分子膜内へ抗腫瘍剤を取り込むことにより、薬剤の直接投与に比較して、治療がより有効になる［Ｆｏｒｓｓｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４３，５４６（１９８３）；及びＧａｂｉｚｏｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４２，４７３４（１９８２）］。抗腫瘍剤及び他の薬剤のカプセル化に伴う大きな問題は、これらの薬剤の多くが、カプセル化後、リポソームから急速に放出されることが分かっているということである。直接投与に比較して、リポソームカプセル化により、多くの抗腫瘍剤の毒性を著しく低減することができるという事実を考えると、このことは、望ましくない効果である。例えば、Ｆｏｒｓｓｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４３，５４６（１９８３）及びＲａｈｍａｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４２，１８１７（１９８２）参照。更に、徐放形式で好ましく搬送されるある種の医薬は、標準リポソーム搬送系に適合しない。多くのリポソーム組成物は、薬剤をあまりにも急速に放出してしまうので、徐放搬送を行うことができない。
　本発明によれば、蛋白質、抗体、補因子又はその他の分子を、有効量の実質的に純粋なＭＰＢ−ＰＥと関連マレイミド含有誘導体とからなるリポソームに複合化することにより作られた複合リポソームは、“必要なように”リポソームに装填して、脱水状態でいつまでも安定に貯蔵されることができる。
　本発明の目的は、実質的に純粋なＭＰＢ−脂質、特に実質的に純粋なＭＰＢ−ＰＥ、関連マレイミド含有誘導体及び関連化合物を合成する一般的な方法を提供することである。
　本発明の他の目的は、実質的に純粋なＭＰＢ−ＰＥと関連マレイミド含有誘導体を含むリポソームを提供することである。このようなリポソームを、更に蛋白質、抗体、補因子及びその他の分子と反応させて、複合リポソームを生成することができる。
　更に、本発明の目的は、薬剤のような少なくとも一つの生物活性剤を取り込んだ本発明の複合リポソームを提供することである。
　本発明の更にもう一つ別の目的は、カプセル化された物質をより効率的に細胞へ搬送するリポソーム複合体を製造するために、安定な架橋と組み合わせて有効なカップリング技術を提供することである。
　本発明のまた別の目的は、従来法よりもより有効にリポソームに結合した蛋白質を有し、長期間にわたって安定に貯蔵できる安定な複合リポソームを提供することである。
　　　発明の要旨
　本発明は
１．求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物を含む実質的に純粋な反応性脂質であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まないことを特徴とする実質的に純粋な反応性脂質、
２．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである上記１の反応性脂質、
３．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上記２の反応性脂質、
４．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］ＭＰＢ基を含む上記１の脂質、
５．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）である上記４の脂質、
６．ａ）少なくとも一つの非求核溶剤の存在下、かつ求核溶剤の不存在下で、求核脂質を反応性脂質に完全に変換するのに十分な時間、求核リポソーム形成脂質をマレイミド含有架橋剤と反応させて、反応性脂質溶液を作り、
　ｂ）真空中で該溶液を濃縮することにより該溶液から該反応性脂質を分離して、固体残渣を生成し、該固体残渣を溶剤で粉末化して、実質的に純粋な反応性脂質を製造することからなる実質的に純粋な反応性脂質を合成する方法、
７．工程（ａ）の反応溶液を、追加的な求核溶剤で希釈し、次いで工程（ｂ）の分離に先立ち洗浄する上記６の方法、
８．該非求核溶剤が、クロロホルム、塩化メチレン、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ及び１、４−ジオキサンからなる群より選ばれる上記６の方法、
９．ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、
　ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させることからなり、該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まないものである、複合リポソームを形成する方法、
１０．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０．０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約９９．９５モルパーセント以下からなる上記９の方法、
１１．反応性脂質が押出されるものである上記９の方法、
１２．ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム生成脂質、
　ｂ．少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、及び
　ｃ．該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質
を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体、
１３．機能化された脂質が約０．２５ないし１モルパーセントの間の複合体の脂質を含有する上記１２の蛋白質−リポソーム複合体、
１４．該機能化された脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＤＰ−ホスファチジルエタノールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる上記１２の蛋白質−リポソーム複合体、
１５．該蛋白質が、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体及び酵素からなる群より選ばれる上記１２の蛋白質−リポソーム複合体、
１６．蛋白質がストレプトアビジンであり、該ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合している上記１５の蛋白質−リポソーム複合体、
１７．該蛋白質が、非共有結合で機能化された脂質に結合し、該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエタノールアミンである上記１２の蛋白質−リポソーム複合体、
１８．サイズが約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲にある上記１２の蛋白質−リポソーム複合体、
１９．生物活性剤を含む上記１２の蛋白質−リポソーム複合体、及び
２０．該複合体が脱水されている上記１２の蛋白質−リポソーム複合体、
に関するものである。
　更に本発明の態様としては次のようなものが挙げられる。
１．求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物を含む実質的に純粋な反応性脂質であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まないことを特徴とする実質的に純粋な反応性脂質、
２．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである上記１の反応性脂質、
３．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上記２の反応性脂質、
４．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］ＭＰＢ基を含む上記１の脂質、
５．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）である上記４の脂質、
６．求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノールアミンとＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）との反応生成物を含む上記１の脂質、
７．該反応生成物が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又はＭＰＢ−ＥＰＥである上記１の反応性脂質、
８．治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む、複合リポソームを形成するのに使用する反応性リポソーム、
９．該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まない上記８の反応性リポソーム、
１０．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである上記９の反応性リポソーム、
１１．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上記１０の反応性リポソーム、
１２．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］ＭＰＢ基を含む上記９の反応性リポソーム、
１３．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）である上記１０の反応性リポソーム、
１４．該反応性脂質が求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノールアミンとＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）との反応生成物を含む上記１０の反応性リポソーム、
１５．該反応性脂質が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又はＭＰＢ−ＥＰＥである上記１４の反応性リポソーム、
１６．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０．０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約９９．９５モルパーセント以下からなる上記８の反応性リポソーム、
１７．ａ）治療及び診断の標的化に有効な多数の複合分子を結合する有効量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームと、
　ｂ）治療及び診断の標的化に有効な量の、該反応性リポソームに結合した複合分子
との反応生成物を含む複合リポソーム、
１８．該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まない上記１７の複合リポソーム、
１９．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである上記１８の複合リポソーム、
２０．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上記１９の複合リポソーム、
２１．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］ＭＰＢ基を含む上記１８の複合リポソーム、
２２．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）である上記２１の複合リポソーム、
２３．該反応性脂質が求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノールアミンとＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）との反応生成物を含む上記１７の複合リポソーム、
２４．該反応性脂質が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又はＭＰＢ−ＥＰＥである上記２３の複合リポソーム、
２５．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０．０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約９９．９５モルパーセント以下からなる上記１７の複合リポソーム、
２６．該複合分子が蛋白質、抗体又は補因子から選ばれる上記１７の複合リポソーム、
２７．該複合分子がストレプトアビジンである上記２６の複合リポソーム、
２８．該抗体がＩｇＧ、ＩｇＥ及びモノクローナル抗体から選ばれる上記２６の複合リポソーム、
２９．該補因子がビオチンである上記２６の複合リポソーム、
３０．該補因子に非共有結合した蛋白質を更に含む上記２６の複合リポソーム、
３１．該ビオチンに非共有結合したストレプトアビジンを更に含む上記２９の複合リポソーム、
３２．該複合リポソームが生物活性剤を含む上記１７の複合リポソーム、
３３．該複合リポソームが膜内外電位差を有する上記１７の複合リポソーム、
３４．該複合リポソームが生物活性剤を含む上記３３の複合リポソーム、
３５．脱水されている上記１７の複合リポソーム、
３６．脱水されている上記３４の複合リポソーム、
３７．生物活性剤を含む上記２７の複合リポソーム、
３８．生物活性剤を含む上記２８の複合リポソーム、
３９．該複合分子が蛋白質であり、該複合リポソームが凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃ったリポソームである上記２６の複合リポソーム、
４０．上記３２の複合リポソーム及び薬理学的に許容できる担体又は希釈剤を含む医薬組成物、
４１．該生物活性剤が抗腫瘍剤である上記４０の組成物、
４２．該抗腫瘍剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シスプラチニウム、シクロホスファミド並びに薬理学的に許容できる塩、誘導体及びそれらの混合物からなる群より選ばれる上記４１の組成物、
４３．ａ）少なくとも一つの非求核溶剤の存在下、かつ求核溶剤の不存在下で、求核脂質を反応性脂質に完全に変換するのに十分な時間、求核リポソーム形成脂質をマレイミド含有架橋剤と反応させて、反応性脂質溶液を作り、
　ｂ）真空中で該溶液を濃縮することにより該溶液から該反応性脂質を分離して、固体残渣を生成し、該固体残渣を溶剤で粉末化して、実質的に純粋な反応性脂質を製造することからなる実質的に純粋な反応性脂質を合成する方法、
４４．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである上記４３の方法、
４５．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上記４４の方法、
４６．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］ＭＰＢ基を含む上記４３の方法、
４７．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）である上記４６の方法、
４８．求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノールアミンとＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）との反応生成物を含む上記４３の方法、
４９．該反応性脂質が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又はＭＰＢ−ＥＰＥである上記４８の方法、
５０．該反応工程（１）の後に、該反応溶液を該非求核溶剤で希釈し、次いで少なくとも１回洗浄して、副生成物を除去する抽出工程を更に含む上記４３の方法、
５１．該非求核溶剤が、クロロホルム、塩化メチレン、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ及び１、４−ジオキサンからなる群より選ばれる上記４３の方法、
５２．ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、
　ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させることからなる複合リポソームを形成する方法、
５３．該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まない上記５２の方法、
５４．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである上記５３の方法、
５５．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上記５４の方法、
５６．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］ＭＰＢ基を含む上記５３の方法、
５７．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）である上記５６の方法、
５８．求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノールアミンとＮ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）との反応生成物を含む上記５２の方法、
５９．該反応性脂質が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又はＭＰＢ−ＥＰＥである上記５８の方法、
６０．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０．０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約９９．９５モルパーセント以下からなる上記５２の方法、
６１．該反応工程（２）をｐＨ約７５及び室温で行う上記５２の方法、
６２．該複合分子が蛋白質、抗体及び補因子から選ばれる上記５３の方法、
６３．該複合分子がストレプトアビジンである上記６２の方法、
６４．該複合分子がＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びモノクローナル抗体から選ばれる抗体である上記６２の方法、
６５．該補因子がビオチンである上記６２の方法、
６６．１．ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム生成脂質、
　ｂ．少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、及び
　ｃ．該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質
を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体、
６７．該機能化された脂質が該複合体の約０．２５と１モルパーセントの間からなる上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
６８．該蛋白質がリポソーム小胞当り約５５〜約８０の蛋白質分子に等しい量で結合している上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
６９．該機能化された脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＤＰ−ホスファチジルエタノールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
７０．該蛋白質が共有結合により該機能化された脂質に結合されている上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
７１．該共有結合がジスルフィド結合である上記７０の蛋白質−リポソーム複合体、
７２．該蛋白質が、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体及び酵素からなる群より選ばれる上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
７３．該蛋白質がストレプトアビジンである上記７２の蛋白質−リポソーム複合体、
７４．ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合している上記７３の蛋白質−リポソーム複合体、
７５．該蛋白質が、非共有結合で該機能化された脂質に結合している上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
７６．該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエタノールアミンである上記７５の蛋白質−リポソーム複合体、
７７．サイズが約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲にある上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
７８．該機能化された脂質がビオチンを含む上記７７の蛋白質−リポソーム複合体、
７９．該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエタノールアミンである上記７９の蛋白質−リポソーム複合体、
８０．生物活性剤を含む上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
８１．該複合体が脱水されている上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
８２．該複合体が膜内外電位差を有する上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
８３．該複合体が生物活性剤を含み、膜内外電位差を有し、脱水されている上記６６の蛋白質−リポソーム複合体、
８４．該生物活性剤が抗腫瘍剤である上記８０の蛋白質−リポソーム複合体、
８５．該蛋白質がＩｇＧである上記７２の蛋白質−リポソーム複合体、
８６．該蛋白質がモノクローナル抗体である上記７２の蛋白質−リポソーム複合体、
８７．上記６６の蛋白質−リポソーム複合体及び薬理学的に許容できる担体又は希釈剤を含む医薬組成物、
８８．１）ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム生成脂質、
　ｂ．少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、を含むリポソーム小胞を形成し、
　２）リポソーム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子に等しい量で該蛋白質が結合している該機能化された脂質に、蛋白質を結合して、凝集した蛋白質リポソーム複合体をつくり、
　３）該凝集した蛋白質−リポソーム複合体を押し出すことを含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造する方法、
８９．該機能化された脂質が該複合体の約０．２５と１モルパーセントの間からなる上記８８の方法、
９０．該蛋白質がリポソーム小胞当り約５５〜約８０の蛋白質分子に等しい量で結合している上記８８の方法、
９１．該機能化された脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＤＰ−ホスファチジルエタノールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる上記８８の方法、
９２．該蛋白質が共有結合により該機能化された脂質に結合されている上記８８の方法、
９３．該共有結合がジスルフィド結合である上記９２の方法、
９４．該蛋白質が、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体及び酵素からなる群より選ばれる上記８８の方法、
９５．該蛋白質がストレプトアビジンである上記９４の方法、
９６．ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合している上記９５の方法、
９７．該蛋白質が、非共有結合で該機能化された脂質に結合している上記８８の方法、
９８．該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエタノールアミンである上記９７の方法、
９９．サイズが約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲にある上記８８の方法、
１００．該複合体が、該押出工程（工程３）後、脱水される上記８８の方法、
１０１．該蛋白質がＩｇＧである上記９４の方法、
１０２．該蛋白質がモノクローナル抗体である上記９４の方法、
１０３．該押出工程（工程３）が、細孔サイズが約３０ｎｍから約１１ｎｍまでの範囲にあるポリカーボネートフィルターを通して行われる上記８８の方法、
１０４．該押出工程が、高圧下で行われる上記１０３の方法、
１０５．（ａ）生物活性剤を蛋白質−リポソーム複合体内に装填することができる方向で、上記６６による蛋白質−リポソーム複合体内に膜内外電位差を生成する工程、及び
　（ｂ）外部水性媒質内で、生物活性剤を蛋白質−リポソーム複合体と混合する工程、
を含む、外部水性媒質で囲まれた蛋白質−リポソーム複合体に生物活性剤を装填する方法、
１０６．該生物活性剤が抗腫瘍剤である上記１０５の方法、
１０７．該抗腫瘍剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン並びに薬理学的に許容できる塩及びそれらの誘導体からなる群より選ばれる上記１０６の方法、
１０８．工程（ｂ）の得られた蛋白質−リポソーム複合体を脱水して、脱水組成物を得る追加工程を含む上記１０５の方法、
１０９．該蛋白質がストレプトアビジンである上記１０５の方法、
１１０．該蛋白質がＩｇＧである上記１０５の方法、
１１１．該蛋白質がモノクローナル抗体である上記１０５の方法、
１１２．該蛋白質−リポソーム複合体が上記８８の方法により作られる上記１０５の方法、
１１３．（ａ）上記６６の蛋白質−リポソーム複合体を脱水して、脱水組成物を得る工程、及び
　（ｂ）脱水組成物を再水和する工程、
を含む、蛋白質−リポソーム複合体を貯蔵する方法、
１１４．組成物が保護糖類の存在下で脱水される上記１１３の方法、
１１５．保護糖類が二糖類である上記１１４の方法、
１１６．該二糖類が、トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース及びデキストランからなる群より選ばれる上記１１５の方法、
１１７．該二糖類がトレハロースである上記１１５の方法、
１１８．該蛋白質−リポソーム複合体が膜内外電位差を有する上記１１３の方法、
１１９．該蛋白質−リポソーム複合体が生物活性剤を含む上記１１３の方法、
１２０．該生物活性剤が抗腫瘍剤である上記１１９の方法、
１２１．上記８０の蛋白質−リポソーム複合体を被験者に投与することを含む、生物活性剤の搬送を標的化する方法、
１２２．該蛋白質がストレプトアビジンである上記１２１の方法、
１２３．該蛋白質がＩｇＧである上記１２１の方法、
１２４．該蛋白質がモノクローナル抗体である上記１２１の方法、
１２５．該生物活性剤が抗腫瘍剤であり、該被験者がヒトの患者である上記１２１の方法、
１２６．上記６６の蛋白質−リポソーム複合体をサンプルと接触させることを含む、抗体用サンプルを測定する方法、
１２７．該蛋白質がストレプトアビジンである上記１２６の方法、
１２８．該蛋白質がＩｇＧである上記１２６の方法、
１２９．該蛋白質がモノクローナル抗体である上記１２６の方法、および
１３０．１．ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム生成脂質、
　ｂ．少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、及び
　ｃ．該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質
を含むリポソーム小胞を含む、凝集した蛋白質−リポソーム複合体を形成し、
　２．該凝集した蛋白質−リポソームを押し出すこと
を含む方法により製造された、複合体凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。
　本発明の方法においては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又は関連リポソーム形成求核脂質を、少なくとも一つのマレイミド基及びアミン反応性機能を有する架橋剤、例えばＳＭＰＢと反応させ、実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥを生成する。本発明の方法においては、求核脂質、例えばＰＥ、の反応は、加水分解条件が存在しないときに起こり、従来技術の方法によって生成される開環副生成物を回避する。純粋反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥの製造後、チオール含有複合分子、例えば抗体又は補因子のような蛋白質又はその他の分子を、この反応性脂質に共有結合させて、蛋白質、抗体、補因子又はその他の分子と架橋したリポソームを製造する。ここで用いる場合、このような架橋リポソームを複合リポソームという。
　驚くべきことに、従来法（メタノール、エタノール又はその他のアルコールを塩基性条件下で用いる条件）を用いるＳＭＢＰと求核リポソーム形成脂質、例えばＰＥ、との反応により、反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、に加えて、アルコールによってマレイミド環が開かれたかなりの量の副生成物（“開環副生成物”）が作られることが発見された。アルコールを用いるクロマトグラフ及びその他の分離技術によっても、かなりの量の開環副生成物が作られることが発見された。
　本発明の実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、を製造する本発明の方法においては、次の工程が利用される。
　１．非求核アミンを含有する溶剤中で、求核溶剤の不存在下に、求核脂質がＭＰＢ−ＰＥのような反応性脂質へ完全に変換するのに十分な時間、ＳＭＰＢのような架橋剤を求核脂質と反応させる。
　２．反応性脂質を形成する反応が実質的に完了した後、溶液を溶剤で希釈し、少なくとも１回、水、好ましくは食塩水で洗浄して、副生成物を除去する。
　３．（２）からの溶液を真空中で濃縮し、固体残渣を粉末にして未反応ＳＭＰＢとスクシンイミド副生成物を除去し、反応性脂質、例えばＭＰＢ−脂質、を製造する。
　実質的に純粋な反応性脂質は、工程２を用いず、工程１と３を続けて用いることによっても作れることが指摘されるべきである。本発明の反応性脂質の多くは、上記３つの工程を全て用いて作られるが、ある種の反応性脂質では、変換工程１後、溶液から粉末にして、実質的に純粋な反応性脂質を作ってもよい。
　本発明の方法態様の工程においては、更に純粋な反応性脂質を再結晶し、続いてリポソーム内に取り込み、反応性リポソームを形成してもよい。反応性リポソームを複合分子、例えば、チオール含有蛋白質、抗体、補因子又は関連分子と反応させ、本発明の複合リポソームを作ってもよい。本発明の複合リポソームは、種々の生物活性剤の搬送を標的化するのに、あるいは診断用途に用いることができる。例えば、これらの複合されたものの標的化及び診断法への適用は、このような複合体が、標的である抗原の細胞分散を反映する態様で、規定されたビオチン化モノクローナル抗体を介して、リンパ球に特異的に結合していることにより説明されるであろう［例えば、Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５，１６７８（１９８０）及びＨｏｗａｒｄ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６，２１１７（１９８１）参照］。
　求核脂質の純粋なＳＭＰＢ誘導体を合成する新しい処方をここに示す。リポソームに蛋白質を複合するためのカップリング条件を、反応性脂質、例えばＭＰＢ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＤＰＰＥ）、のマレイミド機能を完全に維持するように最適化した。本発明において詳述する最適条件下では、５０％を越えるカップリング効率が容易に達成される。リポソーム内のＭＰＢ　ＥＰＥの濃度が高いことと結び付いた場合にのみ、従来法を用いて、同じような効率が達成されている［５モル％、例えば、Ｂｒａｇｍａｎ等、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．７３，１２７（１９８４）参照］。実質的に純粋な反応性脂質、例えば本発明のＭＰＢ　ＰＥ、の使用と関連する効率的なカップリングは、リポソーム内の反応性脂質の濃度が約２．５モル％よりも高くなると、リポソームの安定性に劇的な影響を及ぼすので、特に重要である［例えば、Ｂｒａｄｅｈｏｒｓｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５，５６９３（１９８６）参照］。
　本発明は、少なくとも一つの実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＢＰ−ＰＥを、少なくとも一つの別のリポソーム形成脂質と組み合わせて含む反応性リポソームに関するものでもある。本発明のリポソームは、一般に、少なくとも約０．０５モル％のＭＰＢ−ＰＥのような実質的に純粋な反応性脂質と、約９９．９５モル％以下の少なくとも一つのリポソーム生成脂質を含む。本発明の複合リポソームは、更に、リポソームに共有結合又は非共有結合している種々の蛋白質、抗体、補因子又はその他の分子を含む。本発明の一つの態様においては、本発明の複合リポソームを形成するのに、ストレプトアビジンが用いられる。これらのストレプトアビジン被覆リポソームは、急速かつ効率的にビオチン化蛋白質を結合し、生体内で特異的な標的化性を示す複合リポソームとなる。このようなリポソームは、治療及び診断の標的化用に利用することができる。
　本発明の別の方法においては、リポソームが、共有結合又は非共有結合を介して、蛋白質、例えば他の蛋白質の中でも、ストレプトアビジン又はイムノグロブリン、と結合し、凝集蛋白質−リポソーム複合体を生成する。次いで、この凝集複合リポソーム調製物を、約３０ｎｍから約１００ｎｍまでの範囲の細孔サイズを有するフィルターから押し出し、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を生成する。カップリング後、蛋白質−リポソーム複合体を押し出すことにより、蛋白質がリポソームに結合したときに生ずる凝集が逆になり、容易に凝集しない一定のサイズの安定、非凝集蛋白質−リポソーム複合体が作られる。凝集蛋白質−リポソーム複合体を濾別せずに、押出過程が生ずるということは、驚くべき結果である。
　本発明の方法は、蛋白質結合リポソームのサイズを物理的に揃える操作を容易にし、蛋白質の結合活性に影響を与えることを避けることができる。この技術により、一定のサイズ分布の安定な蛋白質−リポソーム複合体を、種々の量の蛋白質をリポソームに結合した状態で、容易に調製することができる。行った実験において、押し出された複合体の血液循環時間が長くなり、結合能力が維持されたことは、蛋白質−リポソーム複合体の押出製剤が、生体内で蛋白質結合部位に結合できるあろうということを示している。
　本発明は、蛋白質−リポソーム複合体に関するものでもある。本発明のこの態様の種々の成分の重量パーセントは、大きく変わるかもしれないが、一般に、本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、次のものを含む。
　１．ａ）少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム生成脂質；及び
　ｂ）少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質；及び
　ｃ）リポソーム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子に等しい量で該機能化された脂質に結合した蛋白質
を含むリポソーム小胞。
　本発明のリポソームには、他の多くの医薬の中でも、例えば局所麻酔剤、気管支拡張薬、β−アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗ヒスタミン薬、抗マラリア薬及び鎮痛薬などの医薬に加えて、生物活性剤を装填してもよい。本発明のリポソーム内に活性剤を装填するためには、濃度勾配に対して、それらのラメラをはさんで、膜内外電位差が生じるような方法でリポソームを調製するのが好ましい。この濃度勾配は、Ｎａ＋／Ｋ＋電位かあるいはｐＨ勾配（Ｈ＋）のいずれかにより作られる。内部対外部の電位の差は、イオン化しうる生物活性剤をリポソームに装填させる機構である。膜内外電位差に応じて、行われたリポソームの装填に遅延が生じるであろう。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、一つ又はそれ以上の保護糖類の存在下で脱水し、その脱水状態で貯蔵し、次いで、イオン勾配及び関連性能を維持して再水和し、生物活性剤を蓄積することができる。更に、本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査に用いることができる。
　本発明のリポソーム複合体は、一つ又はそれ以上の保護糖類の存在下で脱水し、その脱水状態で貯蔵し、次いで、イオン勾配及び関連性能を維持して再水和し、生物活性剤を蓄積することができる。更に、本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査に用いることができる。
　　　図面の簡単な説明
　図１は、ＰＤＰ−ＥＰＥとＭＰＢ−ＥＰＥを含むリポソームに対するチオール化ＩｇＧのカップリングの比較を、リポソームに含まれるコレステロールの濃度の関数として示す。示されているように、２０モル％よりも多いコレステロールがリポソーム内に取り込まれるまでは、ＰＤＰ−ＥＰＥを含むリポソームに対するチオール化ＩｇＧの顕著なカップリングは起こらなかった。始めの対比では、ＭＰＢ　ＰＥを含むリポソームについては、コレステロールが存在しないときでも、１２ｕｇ　ＩｇＧ／ｕｍｏｌｅ脂質の水準が得られた。
　図２は、純ＭＰＢ−ＤＰＰＥのＮＭＲスペクトルを示し、これは本発明の方法により合成される。
　図３は、ＭＰＢ−ＰＥ合成の従来技術に記載されているものに対する条件下での、２−メトキシエチルアミンとＳＭＰＢとの提案された反応機構（開環副生成物、ＰＥの化学等量決定する目的で）の構造図を示す。この図は、反応によって、一方は構造がＭＰＢ−ＰＥ（構造Ｂ）と同様なものであり、他方の生成物は構造がマレイミド基のケト基へのメタノール性攻撃により生じる開環副生成物と同様なものである、２つの生成物が作られることを示している。
　図４及び５は、純粋なＭＰＢ　ＤＰＰＥを含むリポソームに、チオール化ストレプトアビジンをカップリングさせるための最適条件の研究を示す。図４に示すように、リポソームに複合される蛋白質の量は、７よりも大きいｐＨ値において急速に増大するが、それに対応して、反応性脂質のマレイミド基が急速に分解する。図５は、マレイミド脂質の反応性に対する、リポソームに結合しているストレプトアビジンを反応させる時間経過を示す。この結果は、ｐＨ７．５、室温で８時間のインキュベーション後に、マレイミドの分解が最小で、最適水準のリポソーム複合ストレプトアビジン（約３７ｕｇ／ｕｍｏｌｅ脂質）が得られたことを示している。
　図６Ａ、Ｂ及びＣは、ビオチン化抗体が存在しないとき（図６Ａ）と存在するとき（図６Ｂ及びＣ）の、リポソームストレプトアビジン複合体による標的細胞に対するリポソームの標的化を、フローサイトメトリー技術で測定して比較する。
　図７は、リポソームへストレプトアビジンをカップリングさせることの小胞サイズに及ぼす影響を示すグラフである。
　例２０に記載されているように、リポソーム（５４％ＥＰＣ、４５％ＣＨＯＬ、１％ＭＰＢ−ＰＥ、５ｍＭ最終脂質濃度、１００ｎｍ）を、ｐＨ７．５で時間をかけて、ストレプトアビジン（１００ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌｅ脂質）とインキュベートした。グラフに示すように、種々の時間において、Ｎ−エチルマレイミド（蛋白質に対して５００モル比）を加えて反応を冷却し、セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により遊離のストレプトアビジンを除去した。結合したストレプトアビジンの量を３Ｈビオチン結合によって求め（グラフＡ）、小胞サイズをＱＥＬＳにより評価した（グラフＢ）。
　図８は、ストレプトアビジン−脂質製剤のフリーズフラクチャーである。ストレプトアビジン−脂質サンプルを、０．２（Ａ）、２（Ｂ）、４（Ｃ）及び１８（Ｄ）時間目にＮ−エチルマレイミドで冷却し、例２０及び上記図７で説明したように調製し、フリーズフラクチャーにより調べた。
　図９は、例２１に記載のストレプトアビジン−脂質複合体の押出を示すグラフである。ストレプトアビジンを、最終脂質濃度２０ｍＭで、１％ＭＰＢ−ＰＥを含むリポソーム（１００ｎｍ）と結合させた。種々の時間に、反応混合物の一部をＮ−エチルマレイミドで冷却し、１００ｎｍポリカーボネートフィルターから押し出す前に、５ｍＭ脂質濃度に希釈した。セファロースＣＬ−４Ｂで脂質サンプルからゲルを除去した後、ストレプトアビジン脂質への３Ｈビオチン結合により、結合したストレプトアビジンの量（Ａ）を測定した。押出前後に、ＱＥＬＳによりストレプトアビジン−脂質複合体のサイズを測定した（Ｂ）。
　図１０は、例２１記載の抗体リポソーム複合体の押出を示すグラフである。フルオレセイン標識抗体を、最終脂質濃度２０ｍＭで、１％ＭＰＢ−ＰＥを含むリポソーム（１００ｎｍ）と結合させた。種々の時間に、反応混合物の一部をＮ−エチルマレイミドで冷却し、１００ｎｍポリカーボネートフィルターから押し出す前に、５ｍＭ脂質濃度に希釈した。セファロースＣＬ−４Ｂでの脂質サンプルの交換後、リポソームに結合した蛍光の濃度を測ることにより、結合した抗体の量（Ａ）を求めた。押出前後に、ＱＥＬＳにより抗体リポソームのサイズを測定した（ｂ）。
　図１１は、例２１記載の押出前後のストレプトアビジンリポソームのフリーズフラクチャーである。図７及び例２１に記載のように、最終脂質濃度２０ｍＭで８時間、ストレプトアビジンをリポソームに結合させた。押出前に、サンプルを５ｕｍｏｌｅ／ｍｌに希釈した。例１３に記載のように、最終脂質濃度５ｍＭで、ビオチン−ＰＥ（０．２５％）含有リポソームにストレプトアビジンを非共有結合させた。押出前（Ａ）及び後（Ｂ）のＭＰＢ−ＰＥ含有ストレプトアビジン−リポソーム並びに押出前（Ｃ）及び後（Ｄ）のビオチン−ＰＥ含有ストレプトアビジン−リポソームを図に示す。１００ｎｍポリカーボネートフィルターからの押出前及び後に、フリーズフラクチャーによりサンプルを調べた。
　図１２は、押し出されたストレプトアビジン−リポソーム複合体の安定性の試験をＱＥＬＳにより示す。チオール化ストレプトアビジンを１％ＭＰＢ−ＰＥ含有リポソームと、最終脂質濃度２０ｍＭで８時間インキュベートすることにより、約５１ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌｅ脂質のストレプトアビジン−リポソームを調製した。セファロースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により未結合ストレプトアビジンを除去した後、サンプルを５ｍＭ脂質に希釈し、２枚重ねの１００ｎｍポリカーボネートフィルターから１０回押し出した。示された種々の時間に、押し出された製剤のサイズをＱＥＬＳにより測定した（○）。図７で調製したストレプトアビジン−リポソーム複合体のサイズを、比較のためにグラフで示す（○）。
　図１３は、例２３に記載のリポソーム製剤の生体内浄化速度を示す。最終脂質濃度３０ｍＭ及びインキュベーション時間１５分で、ストレプトアビジンをリポソーム（５０及び１００ｎｍ）と結合させ、Ｎ−エチルマレイミドで２時間冷却し、次いで、Ｂ−メルカプトエタノールと一晩インキュベートした。ＭＰＢ−ＰＥを含む対照リポソームをｐＨ７．５に滴定し、ＨＢＳで平衡化したセファデックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０で交換した。ＥＰＣ／ＣＨＯＬリポソームが、ＨＢＳ内に調製された。マウス（１時点当り４〜８匹）に１００ｍｇ／ｋｇの投与量で脂質を注射した。特定時点におけるＥＤＴＡ全血から血漿を調製し、例１３の材料及び方法の項に記載のシンチレーション計数により、一部を分析した。押し出されたサンプルのサイズをＱＥＬＳにより測定した。（Ａ）：ＥＰＣ／ＣＨＯＬ、１２５ｎｍ（黒丸）；ＥＰＣ／ＣＨＯＬ、１９７ｎｍ（黒四角）；ＭＰＢ−ＰＥリポソーム、１７０ｎｍ（冷却黒逆三角、未冷却（黒三角）；（Ｂ）：凝集１００ｎｍストレプトアビジン−リポソーム、５３０ｎｍ（白四角）；１００ｎｍフィルターから押し出されたストレプトアビジン−リポソーム、１８７ｎｍ（白三角）；５０ｎｍから押し出されたストレプトアビジン−リポソーム、１３９ｎｍ（白丸）。
　　　発明の詳細な説明
　本発明は、リポソーム内に取り込み、次いで蛋白質、抗体、補因子又はその他の分子と反応させて、複合リポソームを製造することができる実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、を合成する改善された方法に関するものである。本発明の複合リポソームは、生物活性剤搬送及び診断用標的化を始めとする多数の標的化用途に利用できる。
　本発明の方法においては、リポソーム形成求核脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、を架橋剤、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）と反応させて、実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、を製造する。本発明の方法態様においては、架橋剤とリポソーム形成求核脂質との反応を、非求核溶剤及び任意には第三級アミンのような非求核塩基の存在下で行う。非求核塩基の存在下でアルコール性溶剤を利用する従来法によるＭＰＢ−ＰＥの合成では、かなりの量の開環副生成物が作られることが発見されている。この開環副生成物は、マレイミド基よりもチオール基との反応性が著しく小さく、その結果、本発明のＭＰＢ−ＰＥよりも蛋白質、抗体、補因子及びその他の分子をカップリングする効率が低い、従来技術の不純反応性脂質ＭＰＢ　ＰＥとなる。
　本発明で用いられる場合、複合分子を反応性脂質に結合させるのに用いる架橋剤は、マレイミド含有架橋剤、例えば、ｐ−マレイミドフェニルブチレート基又はその他の基、特に、例えばＳＭＰＢである。このような剤は、反応性リポソームと複合分子、特に蛋白質を架橋する好ましい試薬であることが分かっている。ＳＭＰＢは本発明で使用するのに好ましい試薬であるが、マレイミド基を含む他の架橋剤を使用してもよい。本発明で使用できるこれらの架橋剤の中には、他のマレイミド含有架橋剤の中でも、Ｎ−スクシンイミジル　３−マレイミドベンゾエート（ＳＭＢ）、Ｎ−スクシンイミジル　３−マレイミジブチレート（ＧＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル　６−マレイミドカプロエート（ＥＭＣＳ）、Ｎ−スクシンイミジル　３−マレイミドプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル　トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）及びＮ−スクシンイミジルマレイミジルアセテート（ＡＭＡＳ）が挙げられる。
　ここで用いる場合、リポソーム形成求核脂質という用語は、ＳＭＰＢ又は同等のマレイミド含有架橋剤と反応して、マレイミド含有脂質又は同等の脂質を作り、他のリポソーム形成脂質と共にリポソーム内に取り込まれることができる任意の脂質を意味する。このような求核脂質としては、とりわけ、ホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）及び卵ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）のような天然、合成、半合成脂質が挙げられる。一般に、より好ましい求核脂質としては、アミン基、好ましくは第一級アミン基、を含むものが挙げられるが、他の求核基の中でも、オキシアニオンのようなアルコール性アニオンを含む合成脂質を始めとする他の求核脂質を、本発明で用いることを考えてもよい。純粋な反応性脂質を生成するために、求核基の求核脂質への反応性並びに求核脂質及びＳＭＰＢの量及び濃度を変えてもよいことは、当業者により認識されるであろう。一般に、１対１よりも大きいＳＭＰＢ対求核脂質モル比を用いると、マレイミド開環副生成物ができることが認識されるであろう。反応性脂質を製造する反応は、非求核溶剤中で進行する。ここで用いる場合、非求核溶剤という用語は、反応性成分を溶解する好ましい特性を有する任意の溶剤を意味し、例えば非求核アミンが挙げられるが、これ自身は開環副生成物を生成しない。本発明の方法態様で用いることのできる溶剤の例としては、他の溶剤の中でも、クロロホルム、塩化メチレン及びより高度に塩素化、ハロゲン化された溶剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）並びにその他のエーテルが挙げられる。多数のその他の非求核溶剤も、本発明において用いることができる。
　本発明に使用する溶剤を選択する際の目的としては、反応性脂質を生成する反応を最大にすること、及びＳＭＰＢのマレイミド基への溶剤の攻撃により生成する副生成物を最小にすることが挙げられると理解されよう。反応性脂質を製造する従来法の条件は避けるべきであり、他の反応性アルコールの中でも、メタノール及びエタノールのような求核性溶剤は、特に塩基の存在下では、避けるべきであるということが認識されるべきである。
　反応性脂質を置換Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びその他の副生成物から分離するに際し、アルコール性及びその他の求核溶剤の使用を避けるべきであるということに注目するのは、重要である。従って、より極性の大きい副生成物から反応性脂質を分離するためには、非求核溶剤を用いる粉末化又は抽出技術が好ましい。ここで用いる場合、実質的に純粋な反応性脂質という用語は、マレイミド基がもともと完全である、即ち求核剤と反応して開環副生成物を生成することのない反応性脂質を意味する。実質的に純粋な反応性脂質という用語は、実質的に完全なマレイミド基を有しているが、少量の不純物及び開環副生成物以外の副生成物も含有する反応性脂質を排除するものと解釈されるべきではない。本発明の反応性リポソームは、本発明の反応性リポソームが実質的に純粋である点、即ちそれらが実質的な量の開環反応性脂質、例えばＰＢ−脂質、を含んでいないという点で、従来の反応性リポソームとは異なる。理論によって制限されることはないが、このような開環反応性脂質は、複合リポソームを形成する反応性リポソームの能力に影響を及ぼすと信じられており、相当量の開環反応性脂質を含有する反応性リポソームは、蛋白質又はその他の分子に複合するリポソームの効率を著しく低減させる。この効率の低減に加えて、反応性脂質は複合リポソームを不安定にする傾向があるという事実から、高安定性及び高結合特性を始めとする、従来の複合リポソームよりもはるかに好ましい特性を有する反応性脂質及びそれから生成されるリポソームが得られることになる。
　実質的に純粋な反応性脂質を単離した後、それをリポソーム内に取り込んで、反応性リポソーム、即ち蛋白質、抗体、補因子、その他の分子のような複合分子と更に反応して、複合リポソームを生成することのできるリポソーム、を生成する。一般に、反応性リポソームは、少なくとも約０．０５モルパーセントの反応性脂質と少なくとも約９０重量％のリポソーム形成脂質を含む。しかしながら、反応性リポソームの安定性を促進するためには、反応性脂質の量が、反応性脂質の全重量の約２．５モルパーセント以下であることが好ましい。反応性リポソームは、リポソームを形成するのに当該技術において用いることのできる任意の方法を実質的の使用して、蛋白質、抗体又は補因子に共有結合するように作用して複合リポソームを生成する反応性部分、例えばＭＰＢ、を破壊しないように注意しながら、形成されることができる。
　一般に、反応性リポソームを形成後、反応性脂質上のマレイミド基を介して、反応性リポソームに蛋白質又はその他の基を結合させる。分子が十分に求核的で、好ましくはチオール基を含んでいれば、任意の蛋白質、抗体、補因子又は関連分子をマレイミド基に結合させることができる。本研究は、チオール基が、他の求核基、例えばアミン基又はアルコール基、よりも明らかに好ましく、カップリング反応の好ましいｐＨ及び温度条件下で、他の基よりもはるかに反応性に富んでいることを証明した。
　生物活性剤又はその他の分子を搬送する目的で、ある標的化機能を有する、即ちある活性部位、受容対部位又はその他の結合部位に結合しうる複合分子を結合することが、明らかに好ましい。本発明において有用な蛋白質としては、とりわけ、ストレプトアビジン、種々の酵素、免疫調節剤、例えばインターロイキン−１、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、種々のペプチド及びペプチド断片、特にワクチン注射に使用するためのもの、抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥのようなイムノグロブリン、モノクローナル抗体並びに関連蛋白質が挙げられる。本発明は、好ましくは、リポソームに共有結合又は非共有結合し、反応性リポソームに結合後、受容体部位、抗原決定基あるいはその他の標的結合部位のようなターゲットにも蛋白質が結合するような自然の完全性（ｎａｔｕｒａｌ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を維持するこれらの蛋白質を用いることを意図している。本発明において有用な補因子としては、ストレプトアビジン及びアビジンを始めとする多数の蛋白質を非共有結合する能力があるため、特にビオチンを挙げることができる。
　本発明において有用な蛋白質は、反応性リポソームの反応性脂質に共有結合することができるし、一方、補因子、例えばビオチンを介して、反応性脂質に非共有結合することもできる。複合分子と反応性脂質との間の共有結合は、蛋白質内に存在するチオール基又はその他の分子と反応性脂質のマレイミド基との反応により、形成されることができる。複合分子がチオール基を含まない場合は、分子がリポソームに共有結合するように、チオール基を合成により導入してもよい。複合分子が蛋白質である例においては、その蛋白質を二官能性試薬、例えばＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、で変性して、反応性脂質のマレイミド基と反応することのできる２つのチオール基を含む蛋白質を作ってもよい。
　反応性脂質への結合のために複合分子を変性するのに有用な二官能性試薬としては、複合分子と反応する少なくとも一つの基と、反応性脂質のマレイミド基と反応する少なくとも一つの基を有するこれらの剤が挙げられる。上に示したように、本発明においては、多数の二官能性試薬が有用であり、とりわけ、例えばＳＰＤＰ、スクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＳ）及びスクシンイミジルアセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）が有用である。
　本発明の他の態様では、複合分子において、例えば、蛋白質が反応性脂質に共有結合する前に、蛋白質が先ず補因子、例えばビオチン、に共有結合してもよい。ビオチンを用いるこの発明の態様においては、ストレプトアビジンのような蛋白質をＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン又はｐ−ニトロフェニルビオチンと反応させて、蛋白質−リポソーム複合体を製造する際に用いる共有結合でビオチン化した蛋白質を生成することができる。
　本発明の他の態様においては、ストレプトアビジン又はその他のビオチン結合蛋白質を含む蛋白質−リポソーム複合体を、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンでのビオチンへのカップリングによりビオチン化されたＩｇＧ又はモノクローナル抗体のような蛋白質に、更に結合することができる。蛋白質をリポソームと標的部位の間の吸引カプラー（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ　ｃｏｕｐｌｅｒ）にする蛋白質−リポソーム複合体の安定性が認められたことは、全く驚くべきことである。
　蛋白質が反応性リポソームに非共有結合している本発明の態様においては、最も好ましくは、約０．１モルパーセントと約１モルパーセントとの間の反応性脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、を用いて、先ずリポソームを形成し、補因子又は変性補因子と反応することのできるマレイミド含有架橋剤と共有結合させる。ある種の蛋白質、例えばアビジン及びストレプトアビジンが、実際に結合できる補因子の好ましい例は、ビオチンである。ビオチンを用いる本発明のある態様においては、ＭＰＢ−ＰＥに共有結合して、ビオチン含有複合リポソームを生成するチオール基を含むように、ビオチンを変性することによって、ＭＰＢ−ＰＥ上にビオチンを導入することができる。ストレプトアビジンのような蛋白質を、複合リポソームのビオチンに非共有結合させてもよい。
　蛋白質をリポソームに共有結合又は非共有結合させて、蛋白質−リポソーム複合体を製造する場合、リポソームが凝集して、サイズが大きくなるかもしれない。このような場合、リポソームを押し出して、サイズの揃ったリポソーム複合体を作るのが好ましいであろう。サイズの揃ったリポソームを作り、凝集を減少させる方法は、当該技術において利用可能であり、従来、ここに参照のために記載した米国特許出願番号第３７０，６５０号、名称“一定のサイズ分布の標的化されたリポソーム系の調製”、１９８９年６月２３日出願、に記載されている。
　本発明の方法態様においては、次の工程が用いられる。
　１．非求核溶剤中で、求核脂質の反応性脂質への変換が完了するのに十分な時間、ＳＭＰＢを求核脂質と反応させる。
　２．求核脂質が反応性脂質へ完全に変換した後、溶液を真空中で濃縮し、固体残渣を溶剤で粉末化して未反応ＳＭＰＢ及び置換されたスクシンイミドを除去し、実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、を生成する。
　工程１の後の反応で、抽出工程を用いて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのような副生成物を除去するのが好ましい。その工程では、工程１からの反応混合物を非求核溶剤で希釈し、次いで数回洗浄して副生成物を除去することができる。抽出工程を実施した後、上記工程２、粉末化工程が一般に行われる。
　本出願の発明から逸脱することなく、即ち実質的に純粋な反応性脂質を生成するために、上記反応工程の種々の変形を実施することは、当業者の認識するところであろう。例えば、粉末化工程（上記工程２）を実施する代わりに、非求核溶剤及びマレイミド開環を回避する条件を用いるクロマトグラフ分離を実施できることが認識されよう。
　本発明は、本発明の実質的に純粋な反応性脂質を取り込んでいる反応性リポソームに関するものでもある。本発明の反応性リポソームは、複合分子を結合するのに十分な量の少なくとも一つの実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、を他のリポソーム形成脂質と組み合わせて含むものである。一般に、本発明の反応性リポソームは、少なくとも約０．０５モルパーセントのＭＰＢ−ＰＥのような反応性脂質を、一般に反応性リポソームの約９９．９５モルパーセント以下の量の少なくとも一つのリポソーム形成脂質と組み合わせて含むものである。本発明の反応性リポソーム及び複合リポソームに用いることのできるリポソーム形成脂質の検討については、以下に詳述する。
　本発明は、反応性リポソームを含むＭＰＢ−脂質上に蛋白質を結合させる改善された方法に関するものでもある。蛋白質を反応性リポソームに結合させる反応は、ｐＨ７．５、約室温、即ち２３℃、の温度の条件を用いた場合に、最も効率的であることが分かっている。ｐＨ又は温度を上げると、反応は高まるが、ＭＰＢ　ＰＥの完全性は低下するであろう。同様に、温度又はｐＨを下げると、反応性リポソームに対する蛋白質の結合が減少するであろう。本発明の条件、即ち約２３℃の温度及び約７．５のｐＨのとき、蛋白質を反応性リポソームにカップリングさせて蛋白質複合リポソームを生成する効率が、最も高くなる。更に、これらの条件下では、反応性脂質の完全性が最高になる。本発明方法の最適条件下では、５０％を越えるカップリング効率が容易に達成される。同様の効率は、リポソーム内に高濃度のＭＰＢ−ＰＥを取り込んだ場合に達成されているだけである［５モル％、Ｂｒａｇｍａｎ等、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．７３，１２７（１９８４）］。
　本発明は、蛋白質、抗体、補因子及びその他の分子のような複合分子へのリポソームのカップリングにより生ずるリポソーム複合体に関するものでもある。このようなリポソームは、複合分子を結合するのに有効な量の反応性脂質、その反応性脂質と組み合わせて安定なリポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成及び受容体、活性部位又は抗原決定基のような標的化部位にリポソームを標的化するのに有効な量の、反応性リポソームに結合する少なくとも一つの複合分子、例えば蛋白質、抗体、補因子及びその他の分子、を含む。
　本発明のリポソーム複合体には、生物活性剤を装填することができる。複合分子が蛋白質であるリポソーム複合体の場合、サイズの揃ったリポソームを形成し、リポソームの凝集を避けるために、このようなリポソームを押し出してもよい。本発明のリポソーム複合体を形成後、脱水及び再水和し、あるいは４℃で安定に貯蔵することができる。一方、再水和工程又はそれに続く工程中、形成後の二分子膜をはさむイオンの電位差により、選ばれた生物活性剤を装填する前に、リポソーム複合体を押し出して、サイズの揃ったリポソームを作ることができる。リポソーム内へ生物活性剤を装填する好ましい方法としては、Ｍａｄｄｅｎ等により、米国特許出願番号第３５２，４９７号、１９８９年５月１５日出願、名称“プロトン勾配によるリポソーム内への薬剤の蓄積”に記載されている方法が挙げられ、その関連部分をここに参照のために記載した。一方、脱水前に、リポソーム複合体に生物活性剤を加えてもよい。
　本発明のリポソーム複合体は、被験者、例えばヒトを始めとする哺乳動物、に投与することができる。組成物は、薬理学的に許容できる担体又はリン酸緩衝生理食塩水のような希釈剤でこのような被験者に非経口的に搬送することができる。リポソームに結合された蛋白質は、リポソーム及びそれらの内容物を体の特定部位に標的化する際に、助けとなる。抗腫瘍剤のような生物活性剤の場合のごとく、非経口的に用いられる場合、使用量は医者によって定められ、治療方法は腫瘍の大きさ及びその他の条件により決定される。
　上述のごとく、本発明は、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造する方法を示す。本発明の方法においては、少なくとも０．１パーセントの機能化された脂質及び少なくとも９０モルパーセントのリポソーム生成脂質を含むリポソームを、最初に形成する。このようなリポソームを反応性リポソームと言う。反応性リポソームは、蛋白質に共有結合又は非共有結合することのできる機能化された脂質を含むリポソームである。反応性リポソームを形成した後、蛋白質がリポソームに結合して、蛋白質−リポソーム複合体を製造する。蛋白質−リポソーム複合体を形成した後、約３０ｎｍから約１００ｎｍまでの範囲の細孔を有するフィルターから押し出して、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造する。蛋白質−リポソーム複合体を形成した後の押出工程の使用が、比較的サイズの小さい非凝集蛋白質−リポソーム複合体をもたらし、その複合体は安定で、好ましい血液循環時間を示すことが分かっている。驚くべきことに、押出工程中、凝集蛋白質−リポソーム複合体が濾別されるようなことがない。
　蛋白質を反応性リポソームに共有結合又は非共有結合して、本発明の蛋白質−リポソーム複合体形成するために、任意の数の従来法を用いることができる。しかし、一般に、反応性リポソームは、少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、好ましくは約１０モルパーセント以下、最も好ましくは約０．２５〜約１モルパーセントの機能化された脂質を含むように調製される。本出願の明細書を通じて用いる場合、機能化された脂質は、他のリポソーム生成脂質と組み合わせてリポソームを形成することができ、（共有又は非共有的に）蛋白質に結合することのできる任意のリポソームである。本発明では、多数の機能化された脂質が意図され、リポソームを形成するのに用いられる多数の標準脂質の内のどれか、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、を二官能性剤、とりわけ、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル　トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）及びＮ−スクシンイミジル　３−マレイミドベンゾエート（ＳＭＢ）、と反応させて、例えば機能化された脂質ＭＰＢ−ＰＥ及びＰＤＰ−ＰＥを作ることにより、一般に形成される。
　本発明において有用な機能化された脂質は、２つの方法で形成される。第一の方法は、脂質を少なくとも二つの官能基を含む二官能性剤と反応させることによるものであり、その官能基の内の一つは、脂質と共有結合し、他のものは蛋白質と更に反応して、共有結合した蛋白質−リポソーム複合体を生成する。この明細書を通じて用いられる場合の二官能性剤は、脂質を蛋白質又は補因子に架橋させるように機能する少なくとも二つの明白な反応性の基を含む化学剤である。用いられる機能化された脂質の化学的性質に応じて、二官能性試薬は、活性化されたエステルのような少なくとも二つの親電子基、アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールのような少なくとも二つの求核基又は少なくとも一つの親電子基と一つの求核基を含むことができる。もちろん、当業者は、二官能性試薬と脂質又は蛋白質との間の共有結合の生成が最大になるように、二官能性試薬を選択することができるであろう。必要な場合は、当該技術において容易に利用できるブロッキング剤を用いて、共有結合を最大にし、二つの異なる二官能性試薬間の反応を防止すべきである。
　一方、機能化された脂質は、アミン又はヒドロキシル基のような反応性の基を含む脂質、例えばＰＥ、を中間体、例えばＮ−スクシンイミジルビオチン又はｐ−ニトロフェニルビオチン、と反応させて、ある蛋白質が容易に非共有結合する補因子又はその他の基、例えばビオチン、をこの脂質上に導入して、ビオチン−ＰＥを形成することにより、形成されることもできる。補因子が結合している機能化された脂質は、ストレプトアビジン又はアビジンのようなビオチンを必要としている蛋白質と非共有結合して、本発明の非共有結合蛋白質−リポソーム複合体を製造することができる。
　機能化された脂質は、他の従来のリポソーム生成脂質と混合されて、反応性リポソームを生成する。機能化された脂質は、一般に、反応性リポソームの全脂質含有量の少なくとも約０．１モルパーセント、好ましくは約１０モルパーセント以下、最も好ましくは約０．２５〜約１モルパーセントを含む。リポソーム内に導入されることのできる機能化された脂質の量が１０モルパーセントよりも大きいと認識される限り、このような量は、本発明において何等有用な機能を果たさない。
　本発明の一般的な方法においては、機能化された脂質を含むリポソーム小胞が形成された後、その機能化された脂質を介して、反応性リポソームに蛋白質が結合する。リポソームには、任意の蛋白質を結合させることができる。しかし、本発明では、リポソームに共有結合又は非共有結合し、反応性リポソームに結合後、受容体部位、抗原決定基又はその他の結合部位のような標的にも結合できるようにそれらの自然の完全性を維持するこれらの蛋白質が好ましく意図される。本発明において有用な蛋白質としては、とりわけ、ストレプトアビジン、抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥのようなイムノグロブリン、モノクローナル抗体、酵素、免疫調節剤、例えばインターロイキン−１、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びワクチン注射に使用するためのペプチドが挙げられる。
　本発明において有用な蛋白質は、リポソームの機能化された脂質に共有結合することができ、一方、例えばビオチンのような補因子を介して、機能化された脂質に非共有結合することができる。蛋白質と機能化された脂質との間の共有結合は、蛋白質内に天然に存在するシステイニルチオール基と機能化された脂質との反応により形成されることができ、一方、蛋白質は、二官能性試薬、例えばＳＰＤＰ、で変性されて、反応性の基、例えば機能化された脂質と反応することのできるチオール、を有する変性蛋白質を生ずることができる。機能化された脂質に共有結合されるべき蛋白質が、比較的露出されている、即ち、標的部位への蛋白質の結合に影響を及ぼすことなく、リポソームの機能化された脂質と反応するのに十分なだけ蛋白質の外面に露出されている場合は、二官能性試薬で蛋白質を変性する必要はないかもしれない。しかし、リポソームに共有結合されるべき蛋白質が、システイニル残基を含んでいない場合、又はシステイニル残基が、標的との蛋白質の結合を阻害することによってのみ、露出されることができる場合は、蛋白質を二官能性試薬で機能化する必要があるかもしれない。蛋白質二官能性試薬の機能は、蛋白質を機能化された脂質に共有結合させることである。
　本発明のこの態様において有用な二官能性試薬としては、脂質に結合して機能化された脂質を生成するのに用いられる同じ二官能性試薬が挙げられる。本発明のこの態様においては、二官能性試薬は、蛋白質と反応する少なくとも一つの基と、機能化された脂質と反応する少なくとも一つの基とを含む。上に示したように、本発明においては、多数の二官能性試薬が有用である。本発明のこの態様において有用な特に好ましい二官能性試薬は、ＳＰＤＰである。
　本発明の他の態様においては、蛋白質−リポソーム複合体を製造する前に、蛋白質が先ず補因子、例えばビオチン、に共有結合してもよい。次いで、蛋白質−ビオチン組成物が反応性リポソームの機能化された脂質に共有結合して、補因子が共有結合している蛋白質−リポソーム複合体を製造することができる。用いられる補因子がビオチンである発明のこの態様においては、ストレプトアビジンのような蛋白質をＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン又はｐ−ニトロフェニルビオチンと反応させて、蛋白質−リポソーム複合体を製造する際に使用するための共有結合でビオチン化された蛋白質を作ることができる。
　本発明の他の態様においては、ストレプトアビジン又はその他のビオチン結合蛋白質を含む蛋白質−リポソーム複合体を、更にイムノグロブリンＧ、又は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドでのビオチンへのカップリングによりビオチン化されたモノクローナル抗体へ結合させることができる。蛋白質をリポソームと標的部位との間の吸引カプラーにする蛋白質−リポソーム複合体の安定性が認められたことは、全く驚くべきことである。
　蛋白質が反応性リポソームに非共有結合している本発明の態様においては、最も好ましくは、約０．１モルパーセントと約１モルパーセントとの間の機能化された脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、を用いて、リポソームを先ず形成し、蛋白質が非共有結合できる補因子、基質又はその他の分子と共有結合させる。ある種の蛋白質、例えばアビジン及びストレプトアビジンが容易に結合できる補因子の好ましい例は、ビオチンである。ビオチンが用いられている本発明のある態様においては、ビオチンがホスファチジルエタノールアミン上に導入されて、機能化された脂質ビオチン−ＰＥを生成する。機能化された脂質は、反応性リポソーム内に導入され、蛋白質は、機能化された脂質の補因子に非共有結合する。本発明のある態様においては、機能化された脂質をビオチンへ共有結合するのに、蛋白質ストレプトアビジンが用いられる。
　蛋白質がリポソームに共有結合又は非共有結合して蛋白質−リポソーム複合体を製造する場合は、リポソームが凝集し、サイズが大きくなる傾向がある。理論により束縛されることなく、蛋白質−リポソーム複合体により示される凝集現象は、一つ以上のリポソーム上で機能化された脂質に結合する一つ以上の反応性の基を含む蛋白質間、又は一つ以上のリポソーム上で補因子を非共有結合する蛋白質間に生ずる架橋の結果であるかもしれないと信じられている。ストレプトアビジンの非共有結合の場合、凝集は、ストレプトアビジンが個別のリポソーム上の４つのビオチン単位に結合できることの結果であると信じられている。この架橋の結果、リポソームは凝集又は固まり易く、蛋白質が結合した反応性リポソームよりもサイズの大きいリポソームを生成する。行われた実験に基づくと、蛋白質−リポソーム複合体に取り込まれた蛋白質の量は、凝集に影響を及ぼす。多くの蛋白質が用いられるにつれて、架橋及び凝集の可能性は大きくなり、一般に、得られた蛋白質−リポソーム複合体のサイズは大きくなるであろう。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体で利用される蛋白質の量は、用いられる蛋白質のサイズ、蛋白質と標的部位との間の結合の強度及び用いられるリポソームのサイズに応じて変動する。一般に、リポソーム小胞当り約１０〜約１００個、最も好ましくはリポソーム小胞当り約５５〜約８０個の蛋白質分子に等しい量の蛋白質が、機能化された脂質に結合する。
　本発明の方法においては、蛋白質をリポソームに結合させた後、凝集リポソームを押し出すことにより、凝集リポソームのサイズが小さくなり、血液循環時間の著しい増大を示す、より小さくて安定な非凝集蛋白質−リポソーム複合体を生成することが発見されている。。“安定な”とは、蛋白質−リポソーム複合体が、押出後少なくとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、ほぼ同一のサイズ及び標的への蛋白質結合を維持することを意味する。蛋白質−リポソーム複合体が、押出工程中濾別されないということは、驚くべき結果である。
　本発明の押出態様においては、凝集蛋白質−リポソーム複合体を、一般に、約３０ｎｍから約１００ｎｍの細孔を有するフィルターに通して、サイズが直径約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲にある蛋白質−リポソーム複合体を製造する。蛋白質−リポソーム複合体が押し出されるフィルターの細孔サイズは、約５０ｎｍから約１００ｎｍの範囲にあることが好ましい。フィルターは、一般にポリカーボネート製であるが、蛋白質−リポソーム複合体と相互に反応せず、十分な圧力下で押出を行わせるのに十分強い耐久性のある物質で作られていてもよい。好ましいフィルターとしては、本発明の好ましい押出方法の高圧力に一般に耐えることができるために、“直路（ｓｔｒａｉｇｈｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ）”フィルターが挙げられる。好ましさでは劣るが、“屈曲路（ｔｏｒｔｕｏｕｓ　ｐａｔｈ）”も用いることができる。
　当該技術において用いることのできる任意の押出方法を使用して、本発明のサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造することができ、本発明の蛋白質−リポソーム複合体の押出を、高圧下で逐次的又は“直路”で実施することができる。本発明において使用するための特に好ましい押出方法としては、Ｃｕｌｌｉｓ等、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１、公開番号ＷＯ８６／００２３８、名称“リポソームを製造する押出技術”、１９８６年１月１６日公開に記載されたものが挙げられ、その関連部分をここに参照のために記載した。本発明は、蛋白質へのリポソームのカップリングに続く押出工程から生ずる蛋白質−リポソーム複合体に関するものでもある。本発明の蛋白質−リポソーム複合体を押し出した後、脱水及び再水和し、あるいは４℃で安定に貯蔵することができる。これらの組成物には、再水和工程又はそれに続く工程中、形成後の二分子膜をはさむイオンの電位差により、選ばれた生物活性剤を装填することができる。リポソーム内へ生物活性剤を装填する好ましい方法としては、Ｍａｄｄｅｎ等により、米国特許出願番号第３５２，４９７号、１９８９年５月１５日出願、名称“プロトン勾配によるリポソーム内への薬剤の蓄積”に記載されている方法が挙げられ、その関連部分をここに参照のために記載した。一方、脱水前に、蛋白質−リポソーム複合体に生物活性剤を加えてもよい。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、被験者、例えばヒトを始めとする哺乳動物、に投与することができる。組成物は、薬理学的に許容できる担体又はリン酸緩衝生理食塩水のような希釈剤でこのような被験者に非経口的に搬送することができる。リポソームに結合された蛋白質は、リポソーム及びそれらの内容物を体の特定部位にターゲットする際に、助けとなる。抗腫瘍剤のような生物活性剤の場合のごとく、非経口的に用いられる場合、使用量は医者によって定められ、治療方法は腫瘍の大きさ及びその他の条件により決定される。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査にも用いることができる。この場合、使用される蛋白質−リポソーム複合体の量は、サンプル中の標的化成分に対するリポソーム結合抗体の感度に依存するであろう。
　ある好ましい実施態様において、蛋白質−リポソーム複合体を形成するのに用いられる反応性リポソームは、同時係属中の米国特許出願、名称“単ラメラ小胞を製造する押出技術”、出願番号第６２２，６９０号、１９８４年６月２０日出願（その関連部分をここに参照のために記載した）に記載されているＬＵＶＥＴ装置を用いて、それ自体形成され、Ｌｅｓｅｒｍａｎ等の改良技術（リポソーム技術ＩＩＩ、２９〜４０頁、１９８４年、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）を用いて、ストレプトアビジンに結合される。リポソームは、膜内外電位差、即ち二分子膜をはさんでのＮａ＋／Ｋ＋又はＨ＋勾配で形成されることができる。同時係属中の米国特許出願番号第７４９，１６１号、Ｂａｌｌｙ等、名称“リポソーム内への抗腫瘍剤のカプセル化”１９８５年６月２６日出願（その関連部分をここに参照のために記載した）参照。この電位差は、リポソームの内部媒質対外部媒質のイオン濃度により達成される。リポソームに生物活性剤を装填した後、トレハロースのような糖類の存在下又は不存在下に、リポソームを脱水し、この状態で、いつまでも貯蔵することができる。同時係属中の米国特許出願番号第７５９，４１９号、Ｊａｎｏｆｆ等、名称“脱水リポソーム”、１９８５年７月２６日出願（その関連部分をここに参照のために記載した）参照。
　本発明で用いられる反応性リポソームは、各種の組成及び内部含有物を有することができ、多重ラメラ、単ラメラ又はその他の種類のリポソーム、より一般的には、現在知られているか又は今後開発される脂質含有粒子の形をとることができる。例えば、脂質含有粒子は、普通に譲渡された米国特許出願番号第４７６，４９６、５２１，１７６、５９１，５７６及び５９９，６９１、それぞれ、１９８３年３月２４日、１９８３年８月８日、１９８４年３月２０日及び１９８４年４月１２日出願（それらの関連部分をここに参照のために記載した）に記載された種類のステロイドリポソーム、安定複ラメラ小胞（ＳＰＬＶ）、単相小胞（ＭＰＶ）又は脂質マトリックスキャリヤー（ＬＭＣ）の形をとることができる。しかし、ここで規定されているように、リポソームは、少なくとも約０．１モルパーセント、好ましくは約１０モルパーセント以下の機能化された脂質を含まなければならないことを認識すべきである。
　本発明のリポソーム製剤に用いることのできるリポソームとしては、合成又は天然のリン脂質が挙げられ、とりわけ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）及びカルジオリピンを挙げることができ、単独又は組み合わせて用いられる。本発明において有用なリン脂質としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を挙げることもできる。他の実施態様においては、ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＣＰ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）又は水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を用いることもできる。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）とジアラキドノイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）を同様に用いてもよい。これらのリポソームを作るためには、ＤＳＰＣ（約６５℃のＴｃ）、ＤＰＰＣ（約４５℃のＴｃ）及びＤＡＰＣ（約８５℃のＴｃ）のように、脂質の転移温度（Ｔｃ）が高いので、このような脂質をそれらのＴｃ前後、あるいはＴｃよりもわずかに高い、例えば約５℃まで高い温度に加熱するのが好ましい。好ましい実施態様では、卵ホスファチジルコリンが用いられる。
　本発明の多数の実施態様において、リポソームにステロイド成分を添加してもよい。本発明の目的で、リポソームを作るために単独又はリン脂質と組み合わせて用いることのできる上記脂質を含む任意の成分を、リポソーム生成脂質と言う。本発明の好ましい実施態様においては、リポソーム生成脂質は、リポソームの脂質の全重量の少なくとも９０モルパーセントを含む。上記リン脂質は、いずれも、コレステロール、コレスタノール、コプロスタノール、コレスタンからなる群より選ばれた少なくとも一つの他の成分と併用することができる。更に、コレステロールのポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧ−コレステロール）及びステロールの有機酸誘導体、例えばコレステロールヘミスクシネート（ＣＨＳ）を、上記リン脂質のどれかと併用することもできる。アルファトコフェロールヘミスクシネート（ＴＨＳ）の有機酸誘導体を用いてもよい。ＣＨＳ、ＴＨＳ含有リポソーム及びそれらのトリス塩形態は、得られたリン脂質−ステロール混合物が蛋白質と架橋できる安定なリポソームを生成する限り、ステロールを含むリポソームを調製する任意の公知方法で調製することができる。特に、Ｊａｎｏｆｆ等、米国特許第４，７２１，６１２号、１９８８年１月２６日発行、名称“ステロイドのリポソーム”及びＪａｎｏｆｆ等、ＰＣＴ公開番号８７／０２２１９、１９８７年４月２３日公開、名称“アルファトコフェロールを基体とした小胞”の方法参照。好ましい実施態様においては、コレステロールが、４５：５４のＥＰＣに対するコレステロールの重量比で、ＥＰＣと併用される。
　逆相蒸発、温浸法及び界面活性剤希釈等の大単ラメラリポソーム（ＬＵＶ）を作るのに用いられる技術を、反応性リポソームを製造するのに用いることができる。リポソームを製造するこれら及びその他の方法の総説が、Ｍａｒｃ　Ｊ．Ｏｓｔｒｏ編、リポソーム、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）、第１章に見られ、その関連部分をここに参照のために記載した。
　反応性リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体を製造するために、いくつかの押出法を用いることができる。反応性リポソームを製造するためには、ＭＬＶは、使用されるフィルターサイズに応じたサイズの大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を形成するフィルターを通して、押し出されるのが好ましい。一般に、本発明のサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造するためには、３０、５０、６０又は１００ｎｍの細孔のポリカーボネートフィルターを用いることができる。この方法では、Ｃｕｌｌｉｓ等、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０００２３８、１９８６年１月１６日、に記載され、その関連部分をここに参照のために記載したように、リポソーム懸濁液を繰り返して押出装置に通すことにより、均一なサイズ分布のリポソーム個体群が生じる。例えば、濾過は、直路膜フィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　ポリカーボネートフィルター）若しくは屈曲路フィルター［例えば、０．１ｕｍサイズのＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　フィルターメンブラフィルフィルター（混合セルロースエステル）］を通して、又は均質化のような代わりの粉砕技術により行われる。反応性リポソームのサイズは、直径が約３０ｎｍから約２００ｎｍまで変わるかもしれないが、反応性リポソームは、サイズが約１００ｎｍから約２００ｎｍであることが好ましい。一般に、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体は、サイズが約７５ｎｍと約２００ｎｍの間の範囲にある。
　上述のごとく、室温よりも上の液晶Ｔｃに対してゲルを有する反応性脂質を形成するために、多数の脂質を用いることができる。このような場合、加熱バレル又は熱ジャケットを有する押出機を用いることができる。このような装置は、ＬＵＶの押出を行わせるリポソーム懸濁温度を高める働きをする。熱ジャケット付き押出機で用いられる脂質は、例えばＤＳＣＰ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＡＰＣであり、ある実施態様では、コレステロールが挙げられる。ＤＳＰＣを含むリポソームは、一般に約６５℃で、ＤＰＰＣは約４５℃で、ＤＡＰＣは約８５℃（脂質Ｔｃより約５℃高い）で押し出される。
　押出後、反応性リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体は、生物活性剤を装填してもよく、あるいは貯蔵のために脱水してもよい。しかし、蛋白質−リポソーム複合体の場合は、押出工程中に、生物活性剤の多少の損失が生ずるかもしれない。この起こりうる結果を避けるために、押出後に生物活性剤を装填するのが好ましい。本発明のリポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体は、標準凍結乾燥装置又は同等の装置を用いて脱水することができ、もし必要であれば、リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体とそれらの周囲の媒質とを、脱水前に液体窒素中で凍結させることができる。一方、リポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体は、前もって凍結せず、単に減圧下に置くことにより、脱水することもできる。前もっての凍結を伴う脱水には、試料中に一つ又はそれ以上の保護糖類が存在することが必要である。トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース及びデキストランを始めとする各種の糖類を用いることができる。一般に、二糖類の方が単糖類よりも良好に働くことが分かっており、二糖類については、トレハロース及びスクロースが最も有効である。
　リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体の内部又は外部媒質のいずれかの一部として、一つ又はそれ以上の糖類が含まれる。糖類が、リポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体の膜の内面と外面の両方と相互に作用できるように、糖類が内部及び外部媒質の両方に含まれることが最も好ましい。内部媒質への含有は、一つ又はそれ以上の糖類を、リポソームがカプセル化しようとする溶質に加えることにより達成される。ほとんどの場合、この溶質は、仕上げられたリポソームの外部媒質（ｂａｔｈｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ）を形成するものでもあるので、この溶質に糖類を含ませることにより糖類が外部媒質の一部となる。もちろん、例えば、膜内外電位差を生成するために、当初の溶質以外の外部媒質を用いる場合は（下記参照）、その新しい外部媒質も、一つ又はそれ以上の糖類を含まなくてはならない。
　前もって凍結せずに脱水する場合、脱水されるリポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体が多脂質層を有し、膜の実質的な部分が、再水和に際してそれらの完全性を維持するように、製剤中に水が十分残る終点まで、脱水が行われるならば、一つ又はそれ以上の保護糖類の使用は省略してもよい。脱水工程の終わりに、製剤が、脱水前に製剤中に存在する当初の水の少なくとも約２％、最も好ましくは約２％〜約５％を含んでいれば、好ましいことが分かっている。
　リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体が脱水されれば、それらを使用するまで、長期間にわたって貯蔵されることができる。脱水されたリポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体を使用する場合は、単に、リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体に水溶液、例えば蒸留水、を加え、それらを再水和することにより、再水和が行われる。
　上で論じたように、本発明のリポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体製剤にイオン化しうる薬理学的剤、例えば抗腫瘍剤、を装填するが、その際、リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体の二分子膜をはさんで膜内外電位差を生成し、膜内外電位差により抗腫瘍剤をリポソーム内に装填する。膜内外電位差は、リポソーム膜をはさんで、一つ又はそれ以上の帯電種（例えばＮａ＋、Ｋ＋及び／又はＨ＋）について濃度勾配を作ることにより、生成される。濃度勾配は、異なる内部及び外部媒質、即ち一つ又はそれ以上の帯電種の濃度が異なる内部及び外部媒質、を有するリポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体を製造することにより、作られる。
　具体的には、一つ又はそれ以上の帯電種の第一の濃度を有する第一の媒質をカプセル化する、本発明の蛋白質−リポソーム複合体を製造するために用いられる反応性リポソームが調製される。代表的なリポソーム調製技術（上記議論参照）については、リポソームが形成されるとき、この第一の媒質がリポソームを取り囲み、従って、リポソームの当初の外部媒質は、第一の媒質と同じ組成を有するであろう。濃度勾配を作るために、当初の外部媒質を、一つ又はそれ以上の帯電種の異なる濃度を有する新しい外部媒質と交換する。外部媒質の交換は、新しい媒質で平衡化されたゲル濾過カラム、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム、にリポソーム試料を通すこと、又は遠心分離、透析あるいは関連技術などの種々の技術により行うことができる。
　この発明によれば、イオン化しうる抗腫瘍剤を、リポソームあるいはサイズを揃えた蛋白質−リポソーム複合体内に装填するために、膜内外電位差が使用できることが分かっている。具体的には、濃度勾配を有するリポソーム、従って適当な向きの電位差が作られると、リポソーム内に医薬を装填する方法が、その剤を外部媒体に添加するという極めて簡単な工程に短縮される。添加すれば、膜内外電位差が、自動的に剤をリポソーム内に装填することになる。
　膜内外電位差装填法は、抗腫瘍剤を始めとする、適当な水性媒質（例えば、プロトン化されることのできるアミノ基を含む有機化合物）に溶解した際に帯電状態で存在することのできる事実上任意の薬理学的剤について用いることができる。好ましくは、この剤は、リポソーム膜内に分配するように、比較的親油性でなければならない。この方法によりリポソーム内に装填することのできる薬理学的剤のいくつかの例としては、多くの他の医薬の中でもとりわけ、抗腫瘍剤、例えばドキソルビシン、ミトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ストレプトゾシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、シクロホスファミド、トリエチレンチオホスファーアミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、チオグアニン、シタラビン、フロクスウリジン、デカルバジン、シスプラチン及びプロカルバジン；局所麻酔剤、例えばリドカイン、ジブカイン及びクロルプロマジン；気管支拡張薬、例えばメタプロテレノール、テルブタリン及びイソプロテレノール；べータ−アドレナリン遮断薬、例えばプロパノロール、チモロール及びラベトロール；抗高血圧薬、例えばクロニジン及びヒドララジン；抗うつ薬、例えばイミプラミン、アミトリプチリン及びドキセピン；抗けいれん薬、例えばフェニトイン；抗嘔吐薬、例えばプロカインアミド及びプロクロルペラジン；抗ヒスタミン薬、例えばジフェンヒドラミン、クロロフェニラミン及びプロメタジン；抗不整脈薬、例えばキニジン及びジソピラミド；抗マラリア薬、例えばクロロキン、キナクリン及びキニン；並びに鎮痛薬が挙げられる。
　一つの薬理学的剤を装填することに加えて、複数の薬理学的剤を同時又は逐次的に装填する方法を用いることができる。また、イオン化しうる抗腫瘍剤が装填される蛋白質−リポソーム複合体それ自体に、通常のカプセル化技術を用いて（例えば、リポソームが作られる緩衝液に薬剤を取り込むことにより）、他の抗腫瘍剤又は薬剤を前装填することができる。
　薬理学的剤を複合体内に維持するように向けられる蛋白質−リポソーム複合体膜をはさんでの膜内外電位差を作ることにより、薬理学的剤の放出速度を著しく低下させることができることが知られている。即ち、イオン化された際に正に帯電する剤については、外部電位に対して負である内部電位を有する膜内外電位差が、蛋白質−リポソーム複合体膜をはさんで作られ、一方、負に帯電する剤については、反対の向きが用いられる。
　この発明の膜内外装填態様に関しては、Ｎａ＋、Ｋ＋及び／又はＨ＋のような帯電種のリポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体の内側及び外側の濃度を調整することにより、薬剤放出速度を低下させるために用いられる膜内外電位差が作られる。事実、このような濃度勾配によって生成された膜内外電位差により、リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体が装填されたとすれば、当初の濃度勾配を維持する外部媒質中にリポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体を単に保持するだけで、所望の放出速度低下が得られるであろう。一方、膜内外電位差が、リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体膜をはさんで、まだ作られていなかったとすれば、例えば、リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体が、通常の方法を用いて装填されていたとすれば、上記交換技術を用いて、外部媒質の組成を変えることにより、所望の膜内外電位差を容易に作ることができる。
　蛋白質−リポソーム複合体の脱水に関するこの発明の方法態様においては、二つの基本的なアプローチが提供される。第一のアプローチでは、複合体に生物活性剤を装填し（例えば、通常の方法又は上述の膜内外電位差装填技術を用いて）、貯蔵、輸送等の目的で脱水し、次いで、使用時に再水和することができる。一方、前もって形成されたリポソーム複合体を、貯蔵等のために脱水し、使用時又はその近くで再水和し、上述の膜内外電位差装填技術を用いて、イオン化しうる生物活性剤を装填することができる。
　脱水された蛋白質−リポソーム複合体を使用する場合は、水性溶液、例えば蒸留水又は適当な緩衝液、を蛋白質−リポソーム複合体に単に加えて、再水和させることにより、再水和を行う。溶液を静かに渦巻かせることにより、水溶液中に複合体を懸濁させてもよい。再水和は、室温、又はリポソームの組成及びそれらの内部含有物に適当な他の温度で行うことができる。
　投与しようとする生物活性剤が、脱水前に蛋白質−リポソーム複合体内に取り込まれており、それ以上の変更が要求されないのであれば、再水和された複合体を、リポソームカプセル化薬剤を投与する公知の方法を伴う治療に直接使用することができる。
　一方、上に述べた膜内外電位差法を用いて、投与直前に、イオン化しうる生物活性剤を再水和された蛋白質−リポソーム複合体内に取り込むことができる。このアプローチに関連して、膜内外電位差を生成するのに用いられる濃度勾配は、上述の外部媒質交換技術を使用して、脱水前か再水和の後かのいずれかに作ることができる。
　同一の内部及び外部媒質を有する、即ち膜内外電位差のない蛋白質−リポソーム複合体は、調製、脱水、貯蔵、再水和され、その後、外部媒体を、膜内外電位差を生成することのできる組成を有する新しい媒質と交換し、この膜内外電位差を、リポソーム内にイオン化しうる抗腫瘍剤を装填するのに用いることができる。一方、膜内外電位差を生成することのできる内部及び外部媒質を有する蛋白質−リポソーム複合体は、調製、脱水、貯蔵、再水和され、その後、膜内外電位差を用いて装填することができる。
　本発明の蛋白質−リポソーム及びリポソーム複合体は、ヒトを始めとする哺乳動物のような被験者に投与することができる。病気の治療におけるヒトへの投与については、処方する医者が、特定のヒト被験者への適当な投与量を最終的に決めるであろう。そして、これは、患者の症状の性質及び重さと共に、個人の年齢、体重及び反応によって変わるものと予測することができる。
　投与の形態によって、化合物が搬送される生体内の部位が決まるであろう。例えば、感染の特定部位への搬送は、局所塗布（もし、感染が外部的、例えば、目、皮膚、耳内のような領域、又は創傷や火傷のような病気、であれば）又は上皮若しくは皮膚粘膜ライニングによる吸収（例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、胃腸内、粘膜等）により、最も容易に行うことができる。このような局所塗布は、クリーム又は軟膏の形で行うことができる。生物活性剤を含む蛋白質−リポソーム複合体は、単独で投与されてもよいが、一般には、目的とする投与経路及び標準製薬プラクティスに関連して選択された製薬担体と混合して投与されるであろう。本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、非経口で、例えば静脈内、筋肉内又は皮下に注射してもよい。非経口投与については、それらを、例えば、溶液を等張性にするのに十分な塩、グルコース又はぶどう糖のような他の溶質をを含んでもよい無菌水溶液の形で用いるのが最良である。
　経口投与形態については、本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、粉末薬、シロップ、エリキシル剤、水溶液、懸濁液等の形で使用することができる。錠剤の場合、使用できる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム及びリン酸の塩が挙げられる。デンプンのような種々の崩壊剤及び潤滑剤、例えばデンプン、を用いることができる。カプセル形態での経口投与については、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。経口用に水性懸濁液が必要な場合は、ある種の甘味及び／又は着香剤を加えることができる。
　本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査にも用いることができる。この場合、使用される組成物の量は、試料中の標的成分に対するリポソーム結合抗体の感度に依存するであろう。
　次の
例
　　　
例
　　　材料及び方法
　卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、卵ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．ＵＳＡ）から入手した。Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡから入手し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。ジチオスレイトル（ＤＴＴ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンーＮ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＦＩＴＣ−セライト、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カルボキシフルオレセイン、ストレプトアビジン、ビオチン化プロテインＡ、ビオチン化アルカリホスファターゼ、ビオチン化スクシニル化コンカナバリンＡ及びセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ５０は、Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡから入手した。抗ヒト赤血球ＩｇＧは、Ｃａｐｐｅｌ，Ｉｎｃ．ＵＳＡから購入し、ビオチン化抗Ｂ１（ＰＡＮ−Ｂ、ＩｇＧ　２ａ）及びビオチン化抗Ｔ１１（Ｅ−ロゼット、ＩｇＧ　１）は、Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，ＵＳＡから入手した。セファロースＣＬ−４Ｂ及びフィコールパーク（ｆｉｃｏｌｌ　ｐａｑｕｅ）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡから入手した。３Ｈビオチンは、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡから入手し、１４Ｃコレステロールは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ，ＵＳＡから入手した。
　　　
例
Ｎ−３［−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル−］ホスファチジルエタノールアミン（ＰＤＰ−ＰＥ）及びＮ−［４−（ｐ−マ
　Ｌｅｓｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２８８，６０２（１９８４）により記載されているように、ＰＤＰ−ＥＰＥを合成した。簡単に言うと、５０ｕｍｏｌのＥＰＥをクロロホルム／メタノール（９：１）３．５ｍｌに溶解し、６０ｕｍｏｌのＳＰＤＰと１０００ｕｍｏｌのトリエチルアミンを含むメタノール１５ｍｌに加えた。室温での４時間のインキュベーションの後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、ランニング溶剤：クロロホルム／メタノール／水、６５：２５：４）で分析すると、ＥＰＥの９９％がより速いランニング生成物に変換していた。反応混合物を、１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。減圧下で有機相を除去する前に、この洗浄を３回繰り返した。２ディメンジョンＴＬＣ及びプロトンＮＭＲで分析すると、９８％よりも純度の高い単一の生成物が得られていた。ＰＤＰ−Ｅを、窒素下、クロロホルム中、２０℃で数カ月貯蔵した。
　少し変更を加えたＭａｒｔｉｎ等（１９８２）の方法により、最初にＭＢＰ−ＰＥを合成した。ＥＰＥ（１００ｕｍｏｌ）を、１００ｕｍｏｌの新しく蒸留したトリエチルアミンと５０ｍｇのＳＭＰＢとを含む無水メタノール５ｍｌに溶解した。窒素下、常温で反応を行い、その進行をＴＬＣ（流出溶剤：クロロホルム／メタノール／水、６５：２５：４）でモニターした。１８時間のインキュベーションの結果、ＰＥＰの９５％が、より速い流出生成物に変換された。減圧下でメタノールを除去し、サンプルをクロロホルムに溶解し、１％ＮａＣｌで広範に（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）洗浄して、未反応ＳＭＰＢ及び残留トリエチルアミンを除去した。Ｍａｒｔｉｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，２８６（１９８２）により用いられた溶剤系を用いたＴＬＣ分析により、脂質生成物が、ニンヒドリンに敏感でなく（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）リン酸塩に陽性である（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ）単一成分として流出されたことが分かった。更に、２ディメンジョンＴＬＣ（第１ディメンジョン、塩基：クロロホルム／メタノール／Ｎｈ３／Ｈ２Ｏ、９０／５４／５．７／５．３；第２ディメンジョン、酸：クロロホルム／メタノール／酢酸／Ｈ２Ｏ、６０／３０／１８／２．８５）により反応生成物を確認したところ、ニンヒドリンに陰性で、リン酸塩に陽性である２つの脂質成分が存在することが分かった（酸ディメンジョンでのＲｆ値：０．９３及び０．７８３）。これらの観察は、１ＨＮＭＲ分析により確認され、全脂質画分の約６０％を含むより遅い流出生成物が、純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥとして同定された。
　上で合成された２つのチオール反応性脂質、ＰＤＰ−ＥＰＥとＭＰＢ−ＥＰＥを、従来技術によるチオール化ＩｇＧとのカップリング反応に供し、２つの架橋基のどちらがより効率的であるかを求めた。図１に示すように、２０モル％よりも多くのコレステロールがリポソーム内に取り込まれるまでは、ＰＤＰ−ＥＰＥを含むリポソームに対するチオール化ＩｇＧの顕著なカップリングは起こらなかった。これに対して、ＭＰＢ−ＥＰＥを含むリポソームについては、コレステロールが存在していなくても、１２ｕｇＩｇＧ／ｕｍｏｌ脂質の水準が得られた。リポソームに複合した蛋白質の水準は、小胞内に取り込まれたコレステロールの量に関して、直線的に増加した。ＥＰＥのマレイミド誘導体については、試験した全ての条件下で、著しく高いカップリング率が得られた。
　　　
例
　　　
純粋なＭＰＢ−ＰＥの合成
　トリエチルアミン（１０ｍｇ）を含むクロロホルム（５ｍｌ）中、４０℃で、ＤＰＰＥ（６９ｍｇ）をＳＭＰＢ（６５ｍｇ）と反応させることにより、純粋なＭＰＢ−ＰＥを合成した。２時間後、シリカでのＴＬＣにより、ＤＰＰＥがより速い流出生成物へ変換したことがわかった（溶剤系：クロロホルム／メタノール／アセトニトロール／水、７５：１６：５：４、Ｒｆ：０．６）。溶液をクロロホルム（１０ｍｌ）で希釈し、ＮａＣｌ（０．９％）で数回洗浄して反応の副生成物を除去した。この溶液を、真空中で更に濃縮し、固体残渣を粉末化し、ジエチルエーテルから再結晶して未反応ＳＭＰＢを除去した。更にジエチルエーテル／アセトニトリルから再結晶することにより、１ＨＮＭＲ分析（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｗ４０、４００ＭＨｚ）で示されるように、純粋な生成物が生じた。ブリティッシュコロンビア大学、ブリティッシュコロンビア地方質量分光学センターにおいて、ＡＥＩ　ＭＳ９で、高速作用衝撃（Ｆａｓｔ　Ａｃｔｉｎｇ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（ＦＡＢ）質量スペクトルを得た。
　　　
例
　　　
ＭＰＢ−ＰＥを形成する反応の分析
　
例
　ＳＭＰＢの１ＨＮＭＲスペクトルは、フェニル基の芳香族プロトンによる低フィールド共鳴（化学シフト（デルタ）：７．３及びビニルプロトン（デルタ：６．８６）並びにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基のメチレンに関する高フィールド共鳴（ＮＨＳ、デルタ：２．８６）を示す。ＭＰＢ−ＰＥの従来の合成について述べた同様な条件下で、２−メトキシエチルアミンをＳＭＰＢとインキュベートしたとき、ＳＭＰＢよりも極性の大きい２つの主要生成物が、ＴＬＣにより検出された（図３及び以下の表１参照）。ＳＭＰＢのＮＨＳ基の４つのメチレンプロトンについてのデルタ２．８６においてピークが喪失し、デルタ３．３５（ＯＣＨ３による）及びデルタ３．４５（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２；図３、構造Ｂによる）において新しいピークが出現したため、ＳＭＰＢからＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の置換により形成されたアミドとして、より極性の低い生成物が１ＨＮＭＲ分析により同定された。極性の大きい方の生成物を１ＨＮＭＲで分析することにより、環構造（図３、構造Ｃ）のメタノリシスによるマレイミド基の開環と一致するパターンがわかった。例えば、表１に示すように、４つの芳香族プロトンについてのシグナルが、デルタ７．５８における２つの明確な二重線（ｄ，Ｊ＝８Ｈ、２つのプロトン）として出現し、一方、２つのビニルプロトンについての共鳴が、上のフィールドに移動し、デルタ６．２２及びデルタ６．４５における２つの二重線（Ｊ＝１３Ｈｚ）として出現した。
　３つのプロトンについて統合されたデルタ３．８６におけるシャープなピークの出現は、マレイミド基にメタノールを添加したために生じたものと解釈され、その結果、環部分が開くことになった。これらの結果は、質量スペクトル分析（構造Ｂ：分子式Ｃ１７Ｈ２０Ｎ２Ｏ４、３１６において分子イオン；構造Ｃ：分子式Ｃ１８Ｈ２４Ｎ２Ｏ５、３４８において分子イオン）により更に支持された。Ｍａｒｔｉｎ等の従来法により合成されたＭＰＢ−ＤＰＰＥ脂質の１ＨＮＭＲ分析によっても、サンプル中に純粋及び開環ＭＰＢ−ＤＰＰＥ誘導体の混合物が存在することがわかった。
　塩基性条件下におけるメタノール性環開裂に対するマレイミド基の感受性は、ＳＭＰＢのメタノール溶液をトリエチルアミンで処理した場合、より極性の高い生成物が形成されることにより確認された（下記表１）。クロロホルム中において、ＳＭＰＢがはるかに安定であることがわかったので、１当量のトリエチルアミンを含むこの溶剤中で、ＳＭＰＢでのＤＰＰＥの誘導を行った。得られた脂質誘導体は、１ＨＮＭＲにより純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥであることがわかった（図２）。質量分光分析（ＦＡＢ）により、ＭＰＢ−ＤＰＰＥのナトリウム塩に対応するＣ５１Ｈ８４Ｏ１１ＰＮａの分子式に相当する９５５における分子イオンが存在することから、脂質誘導体の純度が確認された。
　　　
例
　　　
リポソームの調製
　Ｈｏｐｅ等（１９８５）により記載されたようにして、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を調製した。簡単に説明すると、クロロホルム中の脂質混合物の適当な一定量をチューブに入れ、窒素気流下で乾燥して脂質フィルムとし、次いで、２時間高真空にした。常法により、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ　ＭＥＳ、ｐＨ６．５中で、脂質サンプル（５０〜５４％ＥＰＣ、４５％コレステロール、
例
　　　
例
　　　
マレイミド反応性の測定
　ＭＰＢ−ＰＥのマレイミド基の反応性は、Ｓｅｄｌａｃｋ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５，１９２（１９６８）により記載されているようにして、脂質誘導体へのｂ−メルカプトエタノールのチオール結合、及びエルマン試薬（Ｅｌｌｍａｎ’ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）、ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、での未結合ｂ−メルカプトエタノールの逆滴定により測定した。リポソーム（５％ＭＰＢ−ＤＰＰＥ、５０％ＥＰＣ、４５％コレステロール、２００ｕｌ中１ｕｍｏｌ）を、ｐＨ８．２（０．２ＭトリスＣｌ、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ｐＨ８．２、１．６ｍｌ）、室温で３０分間、ｂ−メルカプトエタノール（１ｍＭの１００ｕｌ）とインキュベートした。ＤＴＮＢ（１００ｕｌ、メタノール中２０ｎＭ）を添加し、３０分後、４１２ｎｍにおいて吸光度を測定した。カップリング工程において蛋白質結合チオール基が必要であることを、下記表２に示す。ＭＰＢ−ＤＰＰＥリポソームを前もってｂ−メルカプトエタノールにさらすと、クエンチされたサンプルを対照ＭＰＢ−ＤＰＰＥと比較した場合、リポソーム複合ストレプトアビジンの量が低下することになる。これに平行して、脂質誘導体のマレイミド基の検出可能な反応性が低下した。更に、未処理ストレプトアビジンは、マレイミド脂質を含むリポソームと結合しなかった。
結果：リポソーム（１又は５％ＭＰＢ−ＤＰＰＥ、５４〜５０％ＥＰＣ、４５％コレステロール）を、ｐＨ７．５で５分間、ｂ−メルカプトエタノール（ＭＰＢ−ＤＰＰＥに対して１０モル過剰）でクエンチし、ＨＢＳ、ｐＨ７．５で平衡化したセファデックスＧ−５０にて交換して、ストレプトアビジンとあるいは単独でインキュベートした（ｐＨ７．５、室温で８時間）。８時間のインキュベーション後、対照（クエンチされていないＭＰＢ−ＤＰＰＥリポソーム又は未チオール化ストレプトアビジン）及びクエンチされたサンプルについて、リポソームに複合したストレプトアビジンの量及びマレイミド基の反応性を測定した。示したように、ストレプトアビジンのようなある場合は、他の蛋白質と同様に、反応性チオールの存在が、反応性リポソームへの蛋白質のカップリングを著しく促進する。事実、ストレプトアビジンの場合、チオール基の存在が必要であるように思われる。
　別に、Ｍａｒｔｉｎ等、前出、の従来法により合成されたＭＰＢ−ＰＥ脂質及び本発明の方法により合成されたＭＰＢ−ＰＥを、ｐＨ７．５におけるｂ−メルカプトエタノールでの滴定に供した。リポソーム（１又は５％ＭＰＢ−ＰＥ、５４〜５０％ＥＰＣ、４５％コレステロール）を、ｐＨ７．５で５分間、ｂ−メルカプトエタノール（ＭＰＢＶ−ＰＥに対して１０モル過剰）でクエンチし、ＨＢＳ、ｐＨ７．５で平衡化したセファデックスＧ−５０にて交換して、ストレプトアビジンと、あるいは単独でインキュベートした。８時間のインキュベーション後、対照（クエンチされていない）及びクエンチされたサンプルについて、リポソームに複合したストレプトアビジンの量及びマレイミド基の反応性を測定した（上記参照）。純粋なＭＰＢ−ＰＥは、従来法により作られたＭＰＢ−ＰＥよりもｂ−メルカプトエタノールでのクエンチングが大きくなった。結合したストレプトアビジンの量に大きな差がないのは、恐らく、ストレプトアビジンのチオール基がマレイミドと反応するのを妨げる立体相互作用の結果であろう。この実験の結果は、以下の表３に見られる。
　　　
例
　　　
カップリング用ストレプトアビジン及びＩｇＧの調製
　上述のごとく、ある場合には、ストレプトアビジン蛋白質をＭＰＢ−ＰＥ含有反応性リポソームに結合させるために、その蛋白質を変性して、反応性チオール基を導入することが必要である。
　ストレプトアビジン（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；ＨＢＳ、ｐＨ７．５、中５ｍｇ／ｍｌ）を、Ｃａｒｌｓｓｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３（１９７８）の公表された方法にしたがって、アミン反応性試薬、ＳＰＤＰ、で変性した。簡単に述べると、ＳＰＤＰ（メタノール中２５ｍＭ）を、室温で３０分間、ストレプトアビジンに対して１０モル比でインキュベートした。未反応ＳＰＤＰを、ＨＢＳ、ｐＨ７．５で平衡化したセファデックスＧ−５０でのゲル濾過により除去した。ＰＤＰ変性ストレプトアビジンをＤＴＴで還元した（２５ｍＭ、１０分）。チオール化生成物を、適切な緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−５０にて、ゲル排除により単離し、直ちにカップリング実験に使用した。ジチオスレイトル（ＤＴＴ）添加前に、２８０ｎｍ（吸光率、Ｅ２８０：２７７０）における蛋白質の濃度を、そしてＤＴＴの添加１０分後に、３４３ｎｍ（Ｅ３４３：７５５０）における２−チオピリドンの濃度を測定することにより、ストレプトアビジンの変性の程度を求めた。ＩｇＧの場合は、ストレプトアビジンについて述べたようにしてＳＰＤＰで変性後、蛋白質をＦＩＴＣ−セライトで蛍光標識した（ＩｇＧ　５０％重量、２０分）。蛋白質をＤＴＴで処理する前に、酢酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−５０にて、未反応試薬からサンプルを分離し、その分子の固有のジスルフィドの還元から保護した。両蛋白質資料は、ＳＰＤＰで同程度に変性された（蛋白質当り約５〜６ＳＰＤＰ分子）。
　　　
例
　　　
リポソームへの蛋白質のカップリング
　還元されたＰＤＰ変性蛋白質を、種々のｐＨ値で１００ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌ脂質（１ｍＭ最終濃度）の割合でＰＤＰ−ＰＥ、ＭＰＢ−ＥＰＥ又は純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥを含むリポソームとインキュベートすることにより、リポソームへの蛋白質のカップリングを実施した。ＨＢＳ、ｐＨ７．５で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により、未結合蛋白質を除去した。リポソームへのストレプトアビジンのカップリング量は、ストレプトアビジンへの３Ｈビオチンの結合をモニターすることにより測定された。簡単に述べると、ストレプトアビジン−リポソーム（０．５ｍｌ中０．２５ｕｍｏｌ脂質）を、３Ｈビオチン（２５ｕｌ中３．８５ｎｍｏｌ、１５．４ｕｍｏｌ／ｕＣｉ）で１０分間インキュベートし、ＨＢＳ、ｐＨ７．５で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂでのゲル排除により、未結合ビオチンを除去した。セファデックスＧ−５０でのゲル排除後のストレプトアビジンサンプル（１００ｕｇ）への３Ｈ結合の量を、カップリング率を計算するための参考として用いた。リポソームに結合した抗体の量を測定するために、サンプル（２００ｕｌ）をエタノール（１．８ｍｌ）に溶解し、リポソーム結合蛍光を既知量のフルオレセイン標識抗体と関連づけた。４９５の励起波長を有するＳＬＭ−ａｍｉｎｃｏ　ＳＰＦ−５００Ｃ蛍光分光光度計を用いて、５２０ｎｍにおいて蛍光をモニターした。
　　　
例
　　　
純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥを含むリポソームにチオール化ストレプトアビジンを結合させるための最適条件
　純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥを含むリポソームに、チオール化ストレプトアビジンを結合させるための最適条件を調べた。結果を図４及び５に示す。ＭＰＢ−ＤＰＰＥリポソームに対するチオール化ストレプトアビジン結合のｐＨ依存性及びマレイミド機能を、始めに決定した。図４に示すように、リポソーム複合蛋白質の量は、７．０よりも大きいｐＨ値において、急速に増大した。しかし、純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥを含むリポソームを、７．０以上のｐＨ値においてインキュベートすると、誘導された脂質のマレイミド基が、対応して急速に分解した。１８時間のインキュベーション後、ｐＨ７．５において、顕著な水準のストレプトアビジンがリポソームに結合し（４５％）、マレイミド反応性の喪失も許容できるものであった（６５％残存）。このため、カップリング条件を更に最適化するために、７．５のｐＨを選択した。
　図５には、リポソームに対するストレプトアビジン結合及びマレイミド脂質の反応性に関連する時間経過を示す。この結果から、ｐＨ７．５及び室温で８時間インキュベーション後に、リポソームに複合したストレプトアビジンの最適水準（脂質１ｕｍｏｌ当り約３７ｕｇ）が得られ、マレイミド基の分解も最小になることがわかる。
　　　
例
　　　
種々のビオチン化蛋白質へのカップリングの適用性
　種々のタイプのターゲッティング分子をリポソームに結合する際における、本発明の一般的な方法論の適用性を示すために、ストレプトアビジン−リポソームに対する種々のビオチン化蛋白質の結合を調べた。下記表４に示すように、種々のビオチン化蛋白質をストレプトアビジン複合リポソームとインキュベートした場合、ストレプトアビジン３分子毎に、およそ２つの蛋白質分子が結合する。ストレプトアビジン結合小胞に対するビオチン化蛋白質の結合量は、ビオチン化蛋白質のサイズには依存しない（分子量：４２，０００〜１５０，０００Ｄ）。簡単に言うと、脂質１ｕｍｏｌ当り４５．２ｕｇの蛋白質結合を有するストレプトアビジンリポソームを、
例
　　　
例
　　　
ストレプトアビジンリポソームへのビオチン化蛋白質の結合
　Ｂａｙｅｒ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．６８，２４０（１９７６）の方法により、抗赤血球ＩｇＧをビオチン化した。全てのビオチン化蛋白質を、ＩｇＧについて上述したように、ＦＩＴＣ−セライトで蛍光標識した。リポソームに結合したストレプトアビジンに対して２倍モル比で、１０分間、蛋白質をインキュベートした。ＨＢＳ、ｐＨ７．５で前もって平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂでのゲル排除により、未結合蛋白質を除去した。蛍光標識ＩｇＧについて上に述べたようにして、リポソーム結合蛋白質の量を求めた。全てのビオチン化蛋白質のバックグラウンド結合は、無視できるものであることがわかった。
　　　
例
　　　
ストレプトアビジンリポソーム複合体の生体内ターゲッティング
　ｐＨ７．５、最終脂質濃度２．５ｍＭで、上述のようにして、カルボキシフルオレスセイン（１５ｍＭ）を取り込んだリポソームをチオール化ストレプトアビジンに結合させた。Ｎ−エチルマレイミド（ストレプトアビジンに対して５００モル比）でカップリング反応をクエンチした。４時間後、セファロースＣＬ−４Ｂでのゲル排除により、ストレプトアビジンリポソーム複合体を単離し、上述のようにして、リポソーム結合ストレプトアビジンのレベルを求めた。
　ターゲッティング実験のために、ヒトの血液をＥＤＴＡ（ＰＢＳ中２５ｍＭ）中に集めた。フィコールパーク（Ｆｉｃｏｌｌ　ｐａｑｕｅ）を用いる標準プロトコルにより、ヒト末梢血白血球を単離し（Ｂｏｙｕｍ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２１，Ｓｕｐｐ．９７，９（１９６８）参照）、結合の検討を行う前に、２％ＢＳＡ及び０．０１％アジ化Ｎａを含むＰＢＳ中に４℃で懸濁させた。細胞（１０６）を丸底マイクロタイターウエルに分注し、洗浄して、ＰＢＳ中にて、４℃で１時間、抗体（Ｔ１１及びＢ１、それぞれ１００ｕｌＰＢＳ中５及び１０ｕｇ）と共にあるいは単独でインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をストレプトアビジンリポソーム複合体（２００ｕｌＰＢＳ中０．２ｕｍｏｌ）と共に、４℃で更に１時間インキュベートした。次いで、この細胞をＰＢＳで３回洗浄し、以下に述べる方法に従って、フローサイトメトリーにより分析した。
　簡単に説明すると、細胞結合蛍光を、ＥＰＩＣＳプロファイルアナライザーで測定した。アルゴンイオンレーザーの４８８ｎｍ線で細胞を照射した。５１５〜５３０ｎｍ帯域通過フィルターの後で、蛍光を測定した。直角対前方光散乱細胞所見（ｒｉｇｈｔ　ａｎｇｌｅ　ｖｅｒｓｕｓ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒ　ｃｙｔｏｇｒａｍ）に基づいて、蛍光信号をゲート制御し、分析を単一細胞から信号へ限定した。増幅器をログエリアモード（ｌｏｇ　ａｒｅａ　ｍｏｄｅ）にセットした。ヒストグラムの統計的解析のために、対照サンプルのヒストグラムの右肩の基部において、より低いチャンネルで、領域１を任意にセットした（最小２．０７５、最大１０２３）。
　図６に示すように、リポソームストレプトアビジン複合体（カプセル化されたカルボキシフルオレスセインを含む）を、末梢Ｂ細胞（Ｂ１）に特異的なビオチン化モノクローナル抗体で前もって標識した細胞とインキュベートすることにより、全リンパ球個体群の約２０％が、フルオレスセインで標識された（図６Ｂ）。比較のために、ビオチン化抗Ｔ細胞抗体（Ｔ１１）で同様な検討を行うと、リンパ球の約９０％が標識された（図６Ｃ）。これらの結果は、Ｔ１１［Ｈｏｗａｒｄ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６，２１１７（１９８１）参照］及びＢ１［Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５，１６７８（１９８０）参照］により規定される抗原の予測される細胞分布と一致する。これらの複合体の特異性は、ビオチン化抗体が存在しないとき、リンパ球に対するストレプトアビジンリポソーム複合体のバックグラウンド結合が無視できることにより示される（図６Ａ）。
　　　
例
　卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．ＵＳＡ）から入手した。ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン−ＰＥ）、Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡから入手した。ストレプトアビジン、ＦＩＴＣ−セライト、Ｎ−エチルマレイミド、ジチオスレイトル、コレステロール、Ｂ−メルカプトエタノール、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及びセファデックスＧ５０は、Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡから入手した。抗ヒト赤血球ＩｇＧは、Ｃａｐｐｅｌ，Ｉｎｃ．ＵＳＡから購入し、セファロースＣＬ−４Ｂは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｃａｎａｄａから入手した。１４Ｃコレステロール及び３Ｈコレステロール−ヘキサデシル−エーテルは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ，ＵＳＡから入手した。３Ｈ及び１４Ｃビオチンは、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｃａｎａｄａから入手した。体重が平均２１ｇのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手した。
　Ｎ−（４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル）ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＤＰＰＥ）の合成ＭＰＢ−ＤＰＰＥを、Ｍａｒｔｉｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，２８６−２８８（１９８２）の方法を改変したもので合成した。簡単に説明すると、完全なＭＰＢ−ＤＰＰＥの合成は、クロロホルム中１当量のトリエチルアミンの存在下で、１．５　ＳＭＰＢ：ＤＰＰＥのモル比にて行われた。３時間後、反応混合物を窒素下で蒸発乾固した。予備薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、アセトンの５０％クロロホルム溶液で展開されたシリカゲル）により、過剰の未反応ＳＭＰＢ及び主な副生成物を除去した。メタノールの約２０〜３０％クロロホルム溶液（Ｖ：Ｖ）で、脂質バンドの上部をシリカから抽出し、その結果、１Ｈ　ＮＭＲで確認されたように、純粋な完全ＭＰＢ−ＤＰＰＥが単離された。
　　　
例
　　　
リポソームの調製
　Ｈｏｐｅ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．８１２，５５（１９８５）により記載されたようにして、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を調製した。簡単に説明すると、クロロホルム中の脂質混合物の一定量をチューブに入れ、窒素気流下で乾燥して脂質フィルムとし、次いで、２時間高真空にした。次いで、２５ｍＭ　ＭＥＳ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５中で、脂質を水和し、２枚重ねの１００ｎｍ又は５０ｎｍフィルターから１０回押し出した。カップリング実験の前に、サンプルを、ＮａＯＨでｐＨ７．５に滴定した。Ｃ．Ｆｉｓｋｅ及びＹ．Ｓｕｂｂａｒｏｗ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６６，３７５（１９２５）の比色測定法又は脂質混合物内に微量の１４Ｃコレステロール若しくは３Ｈコレステロール−ヘキサデシルエーテルを取り込むことのどちらかにより、脂質を測定した。サンプルは、ＰａｃｋａｒｄＴｒｉ　Ｃａｒｂ液体又はＢｅｃｋｍａｎ　ＬＳ３８０１型シンチレーションアナライザーでのシンチレーション計数により測定された。
　　　
例
　　　
カップリング用蛋白質の調製
　ストレプトアビジン（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、ＨＢＳ、中１０ｍｇ／ｍｌ）を、Ｃａｒｌｓｓｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３（１９７８）の方法にしたがって、アミン反応性試薬、ＳＰＤＰ、で変性した。簡単に述べると、ＳＰＤＰ（メタノール中２５ｍＭ）を、室温で３０分間、ストレプトアビジンに対して１０モル比でインキュベートした。変性の程度を測定するために、反応混合物の一部を、ＨＢＳで平衡化したセファデックスＧ−５０に通して、未反応ＳＰＤＰを除去した。ジチオスレイトル（ＤＴＴ）添加前に、２８０ｎｍ［２８０ｎｍにおける吸光率（Ｅ２８０：２７７０）］における蛋白質の濃度を、そしてＤＴＴ（２５ｍＭ）の添加１０分後に、３４３ｎｍ（Ｅ３４３：７５５０）における２−チオピリドンの濃度を測定することにより、ストレプトアビジンの変性の程度を求めた。反応混合物の残部をＤＴＴで還元し（２５ｍＭ、１０分）、チオール化生成物を、２５ｍＭ　ＭＥＳ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、で平衡化したセファデックスＧ−５０にて、ゲル排除により単離した。生成物は、直ちにカップリング実験に使用した。
　ＩｇＧ（ＨＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌ）の場合は、蛋白質をＳＰＤＰで変性後、その蛋白質をＦＩＴＣ−セライトで蛍光標識した（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８、中ＩｇＧ５０％重量、２０分）。蛋白質をＤＴＴで処理する前に、酢酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−５０にて、未反応試薬からサンプルを分離し、その分子の固有のジスルフィドの還元から保護した。カップリング実験の前に、アクアサイド（ａｑｕａｃｉｄｅ）で脱水することにより、サンプルを５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ストレプトアビジンの変性の程度は、蛋白質当り約５〜６ＳＰＤＰ分子であり、一方、抗体試料の変性は、蛋白質当りＳＰＤＰ２〜３分子となった。
　　　
例
　　　
リポソームへの蛋白質の共有結合
　還元されたＰＤＰ変性蛋白質を、ｐＨ７．５、１００ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌ脂質（５ｍＭ−３０ｍＭ最終濃度）の割合で、リポソーム（５４％ＥＰＣ、４５％コレステロール、１％ＭＰＢ−ＰＥ、５０又は１００ｎｍの細孔のフィルターを通してサイズを揃えた）とインキュベートすることにより、リポソームへの蛋白質のカップリングを実施した。Ｎ−エチルマレイミド（蛋白質に対して５００モル比、メタノール中）の添加により、種々の時間において反応をクエンチした。生体内実験のために、反応混合物をＮ−エチルマレイミドと２時間インキュベートした後、Ｂ−メルカプトエタノール（Ｎ−エチルマレイミドに関して１０モル比）で更にサンプルをクエンチした。ＨＢＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により、未結合蛋白質を除去した。リポソームへのストレプトアビジンのカップリング量は、ストレプトアビジンへの３Ｈ又は１４Ｃビオチンの結合により測定された。簡単に述べると、ストレプトアビジン−リポソーム（０．５ｍｌ中０．２５ｕｍｏｌ脂質）を、３Ｈ又は１４Ｃビオチン（２５ｕｌ中３．８５ｎｍｏｌ、１５．４ｕｍｏｌ／ｕＣｉ）で１０分間インキュベートし、ＨＢＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により、未結合ビオチンを除去した。セファデックスＧ−５０でのゲル排除後のストレプトアビジン標準（１００ｕｇ）へのビオチンの結合の量を、カップリング率を計算するための参考として用いた。リポソームに結合した抗体（ＩｇＧ）の量を測定するために、サンプル（２００ｕｌ）をエタノール（１．８ｍｌ）に溶解し、リポソーム結合蛍光を既知量のフルオレセイン標識抗体と関連づけた。４９５ｎｍの励起波長を有するＳＬＣ−５００Ｃ蛍光分光光度計を用いて、５２０ｎｍにおいて蛍光をモニターした。
　　　
例
　　
　非共有結合したストレプトアビジンの調製
　リポソームへのストレプトアビジンの非共有結合の前に、ＩｇＧについて上に述べたように、ストレプトアビジンをＦＩＴＣ−セライトで蛍光標識した。ストレプトアビジン（４．１ｍｇ）を、１０分間、２０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ８）中のビオチン−ＰＥに対して１０モル過剰で、約３０分間、リポソーム（５４．７５％ＥＰＣ、４５％コレステロール、０．２５％ビオチン−ＰＥ）とインキュベートした。Ｌｏｕｇｈｅｒｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０１，１５７（１９８７）参照。種々の時間に、一部をセファロースＣＬ−４Ｂカラム（５ｍｌ）で分別して、リポソームに結合したストレプトアビジンを遊離のストレプトアビジンから分離した。ＩｇＧについて述べたように（上記
例
　　　
例
　　　
押し出された蛋白質−リポソームサンプルの調製と確認
　蛋白質−リポソーム複合体（５ｍＭ又は２０ｍＭ最終脂質濃度）を、２枚重ねのミリポアフィルター（１００ｎｍ又は５０ｎｍ）から１０回押し出した。押し出されたサンプルの一部のシンチレーション計数により、脂質回収率を測定した。押出前後の蛋白質結合小胞のサイズを、フリーズフラクチャー技術並びに６３２．８ｎｍ及び５ｍＷで働くＮｉｃｏｍｐ　Ｍｏｄｅｌ　２７０　サブミクロパーティクルサイズ（ｓｕｂｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｉｚｅ）を用いる準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）により測定した。
　　　
例
　　　
リポソーム試料の生体内の検討
　生体内の検討のために、
例
　生体内血漿脂質水準を測定するために、マウス（１時点当り４〜８匹）に、尾静脈から、全脂質１００ｍｇ／ｋｇの投与量でサンプルを注射した。血液をＥＤＴＡ処理ミクロコンテナー（ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｉｎｅｒ）（Ｂｅｃｔｉｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）内に集め、全血液を臨床遠心分離器で１０分間遠心分離する（２００Ｘｇ）ことにより、血漿を調製した。動物１匹当りの全血漿容積を、平均体重の４．５５％とした。既知量のリポソームを含む対照血液サンプルから、リポソームの脂質のわずかな画分がペレット化血液細胞と結合するだけであることがわかった。全血液又は血漿から求めると、リポソームの回収率は同様であった。生体内でリポソームと結合したストレプトアビジンの水準を、注射後１時間及び４時間目に単離された血漿サンプルに対する１４Ｃビオチンの結合により測定した。
　　　
例
　　　
小胞サイズでの蛋白質複合の確認
　リポソーム（５４％ＥＰＣ、４５％ＣＨＯＬ、１％ＭＰＢ−ＰＥ、５ｍＭ最終脂質濃度、１００ｎｍ）を、ｐＨ７．５で時間をかけて、上述のようにしてストレプトアビジン（１００ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌ脂質）とインキュベートした。図
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例
　　　
リポソーム複合体の凝集に及ぼす押出の影響
　小さくて、均一なサイズの蛋白質−リポソーム複合体を達成しようとする試みにおいて、凝集した複合小胞を１００ｎｍの細孔サイズを有するフィルターから押し出すことの影響を、上で調製したストレプトアビジン（図
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　同様に、抗体リポソーム複合体（１５〜３５ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌ脂質）を押し出すと、押出前の１３０〜２３０ｎｍのサイズ範囲と比較して、狭いサイズ分布（９０〜１１０ｎｍ）のより小さい小胞となった。両種の蛋白質結合小胞について、押出工程中の脂質の損失が最小であったということ（８５〜９０％の回収率）に注目するのは、重要である。これらの結果から、高濃度の複合蛋白質を有する小胞の高度に凝集した試料を有効に押し出すことができ、得られた試料が同様のサイズであることがわかる。
　更に、蛋白質−リポソーム凝集体の押出は、サイズの揃った蛋白質複合小胞を調製する穏やかな方法を意味する。このことは、押出後、ビオチンを結合するストレプトアビジン−リポソーム複合体が維持されていることにより説明された（結果は示さず）。
　リポソームへの蛋白質カップリング中に、リポソーム複合体が凝集することが認められることは、リポソームへの蛋白質の共有結合に特異的なものではない。小胞凝集は、ビオチン−ＰＥ含有リポソームへのストレプトアビジンの非共有結合中にも起こる［Ｌｏｕｇｈｅｒｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０１，１５７（１９８７）参照］。蛋白質−リポソーム複合体のサイズの揃った個体群を生成する手段として、押出法の一般的適用を示すために、ＭＰＢ−ＰＥを含むリポソームに共有結合した、又はビオチン−ＰＥを含むリポソームに非共有結合したストレプトアビジンの押出の影響を、フリーズフラクチャーにより調べた（図
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例
　　　
押し出されたリポソームの安定性
　サイズに関する、共有結合したストレプトアビジンを含む押し出されたサンプルの安定性を図
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　ａ　カップリング混合物（最終濃度２０ｍＭ）を種々の時間においてＮ−エチルマレイミドでクエンチすることにより、結合ストレプトアビジンの水準が異なるリポソームサンプル（５４％ＥＰＣ、４５％ＣＨＯＬ、１％ＭＰＥ−ＤＰＰＥ）を調製した。
　ｂ　３０ｍＭの最終脂質濃度及び１５分のインキュベーション時間で、ストレプトアビジン−リポソームを調製した。
　ｃ　Ｎ−エチルマレイミドでクエンチされたストレプトアビジン（５０ｕｇ）を、１％ＭＰＢ−ＤＰＰＥを含むリポソーム（１ｕｍｏｌ、２．５ｍＭ最終脂質濃度）と押し出した。
　ｄ　ＱＥＬ測定前に、押し出されたサンプルを氷上に３時間保持した。
　ｅ　押し出されたサンプルを、押出直後に凍結し、ＱＥＬ測定直前に解凍した。
　　　
例
　　　
蛋白質−リポソーム複合体の血液からの排出
　これまでの研究から、小さいリポソームに比較して、大きいリポソームは、急速に血液循環から除去されることがわかっている［Ａ．Ｃ．Ｈｕｎｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７１９，４５０（１９８２）及びＳｏｔａ等、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３４，４２４４（１９８６）参照］。生体内の標的化系について認められた急速な排出［Ｗｏｌｆｆ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．８０２，２５９（１９８４）及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等、“Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編、５０７，４０３５（１９８８）参照］は、一部はリポソームの凝集によるものとすることができるかもしれない。従って、この仮説をテストするために、マウス中のある対照リポソーム製剤（図
１３
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　ここに示すように、結合リポソームの凝集の量は、複合製剤の血液排出挙動を著しく変える。示されているように、凝集したストレプトアビジン−リポソーム（直径＞５３０ｎｍ）は、循環から急速に除去された（４時間後、＜３％残存）。これに比べて、押し出された複合体については、循環時間が長くなった。即ち、直径１８７ｎｍ及び１３９ｎｍのサンプルについて、注射後４時間で、それぞれ最初の脂質投与量の３２及び４８％が循環内に残った。小さい蛋白質−リポソーム複合体では、循環時間が長くなることから、製剤の凝集が、生体内の複合体の寿命を決定する大きな因子であることがわかる。しかし、蛋白質−リポソーム複合体の血液からの排出は、同様のサイズの対照サンプルについてよりも常に大きく、リポソームに蛋白質が存在することが、循環からのリポソーム排出の促進にある程度寄与することを示している点に注目すべきである。ＥＰＣ／ＣＨＯＬリポソームと比較すると、リポソームにチオール反応性カップリング脂質ＭＰＢ−ＰＥが存在することが、それらの生体内における排出挙動に著しい影響を与えることはなく、チオール含有血清蛋白質の結合が、リポソームの生体内性質に影響を及ぼさないことを示唆している。
　　　
例
　　　生体内共有結合複合リポソームの安定性
　生体内共有結合複合ストレプトアビジン−リポソームの安定性を、注射後１時間及び４時間して血漿から単離されたリポソームサンプルへのビオチンの結合により示した（下記表６）。血漿から単離されたサンプルについて、ストレプトアビジン結合リポソームのビオチン結合能のわずかな低下が認められ、これは、血清成分の小胞への吸収、蛋白質分解によるストレプトアビジンの不活性化又は製剤への内因性ビオチンの結合から生じたのかも知れない。
　リポソームに結合したストレプトアビジンの量を、脂質サンプル又は注射後１時間及び４時間して３匹のマウスからプールした血漿サンプルへの１４Ｃビオチンの結合により測定した。
　前記説明及び
例
（５７）【特許請求の範囲】
１．ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、
　ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させ、
　
ｃ）前記工程ｂ）で得られた生成物を押出し、より小さくて安定な非凝集複合リポソームを得ることからなり
　該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環された架橋剤を含まないものである、複合リポソームを形成する方法。
２．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも０．０５モルパーセント、該リポソーム形成脂質が９９．９５モルパーセント以下からなる請求の範囲１の方法。
３．
請求の範囲１の方法で製造された蛋白質−リポソーム複合体であって
　ａ．少なくとも９０モルパーセントのリポソーム形成脂質、
　ｂ．少なくとも０．１モルパーセントの
反応性
　
該反応性脂質は、求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であり、実質的に開環された架橋剤を含まない反応性脂質である
　ｃ．該反応性脂質に、リポソーム小胞当り１０〜１００の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質
を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。
４．該反応性脂質が０．２５ないし１モルパーセントの間の複合体の脂質を含有する請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。
５．該反応性脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミ
ンで
６．該蛋白質が、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体及び酵素からなる群より選ばれる請求の範囲３の蛋白質−リポソーム複合体。
７．蛋白質がストレプトアビジンであり、該ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合している請求の範囲６の蛋白質−リポソーム複合体。
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