【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年7月2日(2015.7.2)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置内で分子反応を実施するための方法であり、前記方法は次のステップ：
（ａ）前記装置に、１又は複数の試薬溶液及び非混和性中間流体を導入するステップであって、前記装置は基板を含み、前記基板上に化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が固定化されるステップ；
（ｂ）前記固定化された化学的にもしくは生化学的に認識可能な実体物と前記試薬溶液との間で；又は前記試薬溶液の存在下で前記固定化された化学的にもしくは生化学的に認識可能な実体物上で分子反応を実施するステップ：
（ｃ）前記基板上に存在する前記試薬溶液を前記非混和性中間流体により移動させるステップ；
（ｄ）前記非混和性中間流体と前記試薬溶液とを、好ましくは回収及び再生ゾーンで分離するステップ；及び
（ｅ）ステップ（ａ）から（ｄ）を１回以上繰り返すために前記試薬溶液及び／又は非混和性中間流体を再使用するステップ、を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であり、前記基板を洗浄緩衝液で洗浄するステップであって、前記洗浄緩衝液は、前記試薬溶液から前記非混和性中間流体により脱離されるステップを追加して含む、方法。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法であり、前記分子反応の状態又は結果を、好ましくは光学的及び／又は電気的手段により測定するステップを追加して含む、方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法であり、前記移動ステップ（ｃ）が、空気圧流体駆動、蠕動駆動、ピストンと作動膜駆動又はベクタ真空の適用により実施される、方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法であり、前記分離ステップ（ｄ）が、前記試薬溶液と前記非混和性中間流体とを重力分離により分離させることにより実施される、方法。
【請求項６】
分子反応を実施するための装置であり、前記装置は：
（ａ）基板を含む反応ゾーンであって、前記基板上に化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が固定化される反応ゾーン；
（ｂ）試薬溶液、非混和性中間流体及び場合により洗浄緩衝液が前記反応ゾーンを通過できるようにする貯蔵容器及び流体接続であって、前記非混和性中間流体が、前記反応ゾーンから前記試薬溶液を移動させることができる貯蔵容器及び流体接続；及び
（ｃ）回収及び再生ゾーンであって、前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液が重力分離で分離される回収及び再生ゾーンを含み、
前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液を、前記分離された流体を前記反応ゾーンへチャンネルバックさせることで、再使用することを可能にし、
前記回収及び再生ゾーンは、場合により、前記反応ゾーンと接続される１つの入口と、前記試薬溶液のための貯蔵容器と、前記非混和性中間流体のための貯蔵容器と接続される２つの出口をそれぞれ含む、装置。
【請求項７】
分子反応を実施するための装置であり、前記装置は：
（ａ）基板を含む反応ゾーンであって、前記基板上に化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が固定化される反応ゾーン；
（ｂ）試薬溶液、非混和性中間流体及び場合に洗浄緩衝液が、前記反応ゾーンを通過することができるようにする貯蔵容器及び流体接続であって、前記非混和性中間流体が前記反応ゾーンから前記試薬溶液を除去することが可能である貯蔵容器及び流体接続；及び
（ｃ）方向変換及び分配モジュールを含み、
前記非混和性中間流体から前記試薬溶液への遷移が検出され、及び前記流体及び溶液が分離され、
前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液を、前記分離された流体を前記反応ゾーンへチャンネルバックすることで、再使用することを可能にし、
前記方向変換及び分配モジュールが場合により、前記反応ゾーンと接続される１つの入口と、前記試薬溶液のための貯蔵容器及び前記非混和性中間流体のための貯蔵容器と接続される２つの出口を含む、装置。
【請求項８】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法、又は請求項６又は７のいずれか一項に記載の装置であり、前記装置がミクロ流体装置、好ましくは統合ミクロ流体カートリッジである、方法又は装置。
【請求項９】
請求項１乃至５又は８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項６乃至８のいずれか一項に記載の装置であり、前記分子反応が配列決定反応又は核酸合成反応である、方法又は装置。
【請求項１０】
非混和性中間流体の、ミクロ流体装置の反応ゾーンに存在する試薬溶液を、前記反応ゾーンから移動させるための使用であり、前記反応ゾーンが、化学的に又は生化学的に認識可能な実体物を持つ基板を含み、及び前記化学的に又は生化学的に認識可能なユニットを（再）活性化させる、使用。
【請求項１１】
請求項１乃至５、８又は９のいずれか一項に記載の方法、請求項６乃至９のいずれか一項に記載の装置であり、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が、核酸、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、これらの変性物、核酸、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、これらの変性物の配列、又はこれらのいずれかの組み合わせである、方法又は装置。
【請求項１２】
請求項１乃至５、８、９又は１１のいずれか一項に記載の方法、請求項６乃至９又は１１に記載の装置、又は請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の使用であり、前記非混和性中間流体が、（パー）フッ素化炭化水素及び／又は（パー）フルオロシリコーンを含むか、それらからなり、好ましくは（パー）フルオロ飽和炭化水素を含むか、それからなる、方法、装置又は使用。
【請求項１３】
請求項１乃至５、８、９又は１１のいずれか一項に記載の方法、請求項６乃至９又は１１に記載の装置、又は請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の使用であり、前記非混和性中間流体の、粘度が約０．１Ｐａ．ｓ未満、密度が約１１００ｋｇ／ｌを超え、沸点が約５０℃を超え、及び水溶性が約１％未満である、方法、装置又は使用。
【請求項１４】
請求項１乃至５、８、９、又は１１乃至１３のいずれか一項に記載の方法、請求項６乃至９、１１、１２又は１３のいずれか一項に記載の装置、請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載の使用であり、前記非混和性中間流体が、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＦＣ−４０である、方法、装置又は使用。
【請求項１５】
請求項６乃至９又は１１乃至１４のいずれか一項に記載の装置の、配列決定反応又は核酸合成反応のための使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】非混和性中間流体を用いる分子反応を実施するための方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は、装置内で分子反応を実施する方法に関し前記方法は：（ａ）前記装置に１又は複数の試薬溶液と非混和性中間流体を導入することを含み、前記装置が基板を含み、前記基板上に化学的又は生化学的に認識可能な実体物が固定化され；（ｂ）前記固定化された化学的又は生化学的に認識可能な実体物と前記試薬溶液とを反応させるか；又は前記試薬溶液の存在下で前記固定化された化学的又は生化学的に認識可能な実体物を反応させ；（ｃ）前記基板上に存在する前記試薬溶液を前記非混和性中間流体により移動させ；（ｄ）前記非混和性中間流体と前記試薬溶液とを、好ましくは回収及び再生領域で分離し；及び（ｅ）のステップ（ａ）から（ｅ）の１回以上繰り返しのために前記試薬溶液及び／又は非混和性中間流体を再使用する、ステップを含む。本発明はさらに、分子反応を実施するための装置に関し、反応ゾーン、貯蔵容器及び流体接続及び回収及び再生領域を含み、前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液が、重力分離により分離され；又は方向変換及び分配モジュールを含み、前記非混和性中間流体及び試薬溶液が分離される。本発明はまた、非混和性中間流体の、ミクロ流体装置の反応ゾーン内に存在する試薬溶液を移動させるための使用に関し、同様に対応する装置を配列決定反応又は核酸合成反応を実施するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の分子反応装置は、しばしば、離散的流体液滴又は流体のユニットサイズのパケットのマイクロマニピュレーションに基づく。これらのパケットは、一組の基本的指示を用いて離散的方法で、移送、保存、混合、反応及び／又は分析され得る。前記流体のパッケージ性を確保し、隣接する液滴が混ざり合わないようにするために、非混和性キャリア流体が使用される（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２３、２２５５−２２６０）。そのような非混和性キャリア流体は、通常は、高沸点、高密度、高粘度及び大きな非水溶性を持つ安定なフッ化炭素系流体である。Ｃｈｅｎら（２００７）によると、ＦＣ−３２８３及びＦＣ−４０を含むフッ素化炭素系流体は、分離された試薬プラグ中でタンパク質結晶化反応のためのスペーサー流体として使用され得る。しかし、この方法の実施は、少数の例で示されたに過ぎず、これにはミクロ流体（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４４、７２４−７２８）、又はダブルエマルジョン（Ｕｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０８、５３７−５４１）の合成を含む。
【０００３】
他の分子技術分野、例えばＤＮＡ配列決定の分野では、現在の方法は、大きな配列（アレイ）を用いて比較的短い読み取り長さで、高度に平行化された分子反応に基づくものである。これは、ＤＮＡへの塩基の添加は、塩基対当たり約１時間未満を要するという事実による。従って、約１００塩基対の添加は、約３．５から４日の実施時間を要し、現在の配列決定装置で通常は１週間連続実施のかなりの割合を占めることとなる。配列決定が速度が遅い理由のひとつは、制限されたヌクレオチド導入の反応速度であり、これは、前記反応混合物中で使用される酵素及び他の反応物の濃度が費用の点から制限されている。より重要なことは、ヌクレオチド導入の各ステップの後、全表面が洗浄される必要があることであり、これにより全ての試薬は通常洗浄除去される。前記試薬消費は従って、前記読み取り長さに大きく比例し、費用に対する主な原因となる。これはまた、反応試薬濃度をできるだけ低くする傾向を生じ、これにより反応時間がより長くなるという欠点を生じることとなる。
【０００４】
従って、試薬溶液を廃棄することなく装置内で分子反応を実施でき、かつ同時に全体の費用を節減しかつ反応速度を加速することを可能にする、新たな方法が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２３、２２５５−２２６０
【非特許文献２】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４４、７２４−７２８
【非特許文献３】Ｕｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０８、５３７−５４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、この必要性に対応するものであり、分子反応を、全費用を低減しかつ大きく改善された速度で実施することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は、試薬の再使用により達成され、より具体的には、分子反応を装置で実施するための方法により達成され、前記方法は次のステップを含む：
（ａ）前記装置内に、１又複数の試薬溶液及び非混和性中間流体を導入するステップを含み、前記装置が基板を含み、前記基板上に化学的又は生物化学的に認識可能な実体物（エンティティ）が固定化され；
（ｂ）前記固定化された化学的又は生物化学的に認識可能な実体物と前記試薬溶液との間で；又は前記反応試薬の存在下で、前記固定化された化学的もしくは生物化学的に認識可能な実体物上で分子反応を実施するステップ；
（ｃ）前記基板上に存在する前記試薬溶液を前記非混和性中間流体で置換するステップを含み；
（ｄ）前記非混和性中間流体と前記試薬溶液を、好ましくは回収及び再生領域で分離し；及び
（ｅ）前記試薬溶液及び／又は非混和性中間流体を、１又は複数のステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すために再使用するステップ、を含む。
【０００８】
この方法はいくつかの利点を与える：非混和性中間流体の採用は、分子反応で通常使用される試薬の汚染及び／又は希釈を防止し、その結果これらの試薬を有効に再利用する方法を与える。さらに、試薬が再使用可能になることで、反応物の濃度、特に、酵素やラベル化ヌクレオチドなどの律速化学物質の濃度を増加することを可能にする。これは、また、ある条件下では反応速度を桁違いに増加させ、さらに、繰り返しリサイクル作用による全体に試薬コストを低減させる利点を与える。配列決定の範囲では、このことは、配列決定反応がずっと安価で速く実施され、サンプル調製及びバイオインフォマティクス分析を含む全配列決定過程を一日で終了することを可能にする。同じ利点は他の分子反応条件、例えば核酸又はタンパク質合成研究においても可能である。
【０００９】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、前記記載の方法はさらに、洗浄緩衝液で前記基板を洗浄するステップを含み、前記洗浄緩衝液は、前記試薬溶液から前記非混和性中間流体により脱離される。
【００１０】
前記記載の方法に他の好ましい実施態様では、さらに、前記分子反応の状態及び結果を測定するステップを含む。特に好ましい実施態様では、前記測定は、光学的及び／又は電気的手段で実施され得る。
【００１１】
本発明の他の好ましい実施態様では、ここで記載された方法での置換ステップ（ｃ）は、空気圧式流体駆動、蠕動作動（ペリスタルチック）、ピストン及び作動膜駆動又はベクタ真空の適用で実施され得る。
【００１２】
本発明の他の好ましい実施態様では、前記記載の方法の前記分離ステップ（ｄ）が、前記試薬溶液及び前記非混和性中間流体が重力的分離により分離され得ることで実施され得る。
【００１３】
他の側面では本発明は分子反応を実施するための装置に関し、前記装置は：
（ａ）基板を含む反応ゾーンを含み、前記基板上に化学的又は生物化学的に認識可能な実体物が固定され；
（ｂ）反応溶液、非混和性中間流体及び場合により洗浄緩衝液が、前記反応ゾーンを通過できるようにする貯蔵容器及び流体接続を含み、前記非混和性中間流体が、前記試薬溶液を前記反応ゾーンから移動させることを可能にし；及び
（ｃ）回収領域及び再生領域を含み、ここで前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液が重力分離により分離可能であり、前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液が、前記分離された流体を前記反応ゾーンにチャンネルバック（チャンネルを介して戻される）することで再使用が可能になる。特に好ましい実施態様では、前記回収及び再生領域は、前記反応ゾーンに接続された１つの入口を含み、さらなる好ましい実施態様では、追加して、前記試薬溶液のための貯蔵容器と前記非混和性中間流体のための貯蔵容器と接続された２つの出口を含む。
【００１４】
他の側面では、本発明は、分子反応を実施するための装置に関し、前記装置は、
（ａ）基板を含む反応ゾーンを含み、そこで化学的又は生物化学的に認識可能な実体物が固定化され；
（ｂ）貯蔵容器と流体接続を含み、これらにより試薬溶液、非混和性中間流体及び場合により洗浄緩衝液が前記反応ゾーンを通過可能となり、そこで前記非混和性中間流体が前記試薬溶液と前記反応ゾーンから移動させることを可能にし；及び
（ｃ）方向変更モジュール及び分配モジュールを含み、そこで前記非混和性中間流体から前記試薬溶液への遷移が検出され及び前記流体と溶液が分離され、前記分離された流体を前記反応ゾーンにチャンネルバックすることで、前記非混和性中間流体と前記試薬溶液の再使用が可能となる。特に好ましい実施態様では、前記方向変更及び分配モジュールが、前記反応ゾーンと接続される１つの入口及び、さらに好ましくはこれに加えて、前記試薬溶液のための貯蔵容器と前記非混和性中間流体のための貯蔵容器と接続される２つの出口を含む。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様では、ここで記載された装置はミクロ流体装置である。特に好ましい実施態様では、前記装置は統合されたミクロ流体カートリッジである。
【００１６】
さらに好ましい実施態様において、ここで記載された分子反応は配列決定反応又は核酸合成反応である。
【００１７】
他の側面において、本発明は、非混和性中間流体を、ミクロ流体装置の反応ゾーンに存在する試薬溶液を、化学的又は生物化学的に認識可能な実体物を含む基板を含む前記反応ゾーン基板から移動させ、前記化学的に又は生物化学的に認識可能なユニットを（再）活性化するための使用に関する。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様では、前記化学的又は生物化学的に認識可能な実体物は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、それらの変性物、核酸、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物又はそれらの変性物の配列、又はそれらの組み合わせである。
【００１９】
本発明の他の実施態様では、前記記載の非混和性中間流体は、（パー）フッ素化（フルオロ）炭化水素及び／又は（パー）フッ素化（フルオロ）シリコーンを含むか、それらからなる。特に好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体は、（パー）フッ素化（フルオロ）飽和炭化水素である。
【００２０】
本発明のさらに好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体は、粘度が約０．１Ｐａ．ｓ未満、密度が約１１００ｋｇ／ｌを超え、沸点が約５０℃を超え、及び水溶解性が約１％未満である。
【００２１】
本発明のさらに特に好ましい実施態様は、ここで記載の非混和性中間流体が、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＦＣ−４０である。
【００２２】
他の側面で、本発明は、ここで記載された装置の、配列決定反応又は核酸合成反応を実施するための使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明の方法を実施するための流体スキームを示し、１＝洗浄緩衝液（ＷＢ）貯蔵容器、２＝試薬溶液（ＲＳ）及び非混和性中間流体（ＩＦ）貯蔵容器、３＝反応チャンバ、４＝反応溶液（ＲＳ）及び非混和性中間流体（ＩＦ）回収及び再生チャンバ、５＝廃棄チャンバ及びＸ＝弁を表す。
【図２】図２は、本発明の方法を実施するための上面からみた流体スキームを示し、１＝洗浄緩衝液（ＷＢ）貯蔵容器、２＝試薬溶液（ＲＳ）及び非混和性中間流体（ＩＦ）貯蔵容器、３＝反応チャンバ、４＝反応溶液（ＲＳ）及び非混和性中間流体（ＩＦ）回収及び再生チャンバ、５＝廃棄チャンバ及びＸ＝弁を表す。
【図３】図３は、ＦＣ−４０の化学構造を示す。
【図４】図４は、ハイブリダイゼーションシグナルへのＦＣ−４０の効果を示す。
【図５】図５は、末端修復ＰＣＲ反応へのＦＣ−４０の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者は、試薬溶液を再利用することに基づき、分子反応を、より迅速に、かつ全費用をより安価に実施し得る手段及び方法を開発した。
【００２５】
本発明は、特定の実施態様に関して記載されてきたが、この記載は限定的ではない。本発明の詳細な例示的実施態様を記載する前に、本発明の理解に重要な定義を以下に与える。
【００２６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数を意味する「ひとつの」、「１つの」は、特に記載がない限り、それぞれの複数を含む。
【００２７】
本発明において、用語「約」、「略」は、当業者が、問題となる構成の技術的効果がなお保証されると理解し得る精度の間隔を示す。前記用語は通常は、指示された数値から、±２０％、好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％の変動を示す。
【００２８】
理解されるべきことは、用語「含む」は、限定することを意味するものではない、ということである。本発明の目的で、前記用語「からなる」とは、用語「含む」の１つの好ましい実施態様と考えられるべきである。以下、ある群が、少なくともある数の実施態様を含むように定められる場合、これはまた、好ましくはこれらの実施態様のみからなる群を含むものと意味される。
【００２９】
さらに、明細書及び特許請求の範囲に記載される用語「第１」、「第２」、「第３」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」などは、類似の要素を識別するために使用されるものであり、必ずしも順序又は時間的順序を意味しない。理解されるべきことは、そのように使用される用語は、適切な条件下では交互に交換可能であるということ、またここで記載される本発明の実施態様は、ここで記載され説明される以外の順序でも実施され得る、ということである。
【００３０】
用語「第１」、「第２」、「第３」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」などは方法及び使用のステップに関連し、これらのステップの間の時間又は時間間隔には一貫性はなく、即ち、前記ステップは同時に実施され得るし、又はここで説明される出願において特に断りがない限り、それらのステップの間は、秒、分、時間、日、週、月又は数年の間隔であり得る。
【００３１】
理解されるべきことは、本発明は具体的に方法、手順、試薬等ここに記載されたものに限定されることはなく、これらは変更され得る、ということである。
【００３２】
また理解されるべきことは、ここで使用される技術用語は、具体的な実施態様を説明するためだけのものであり、特許請求の範囲でのみ限定されるべき本発明の範囲をなんら限定することを意図するものではない、ということである。特に断りの無い限り、ここで使用される全ての技術的、科学的用語は、当該技術分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を持つ。
【００３３】
前記記載のとおり、本発明はひとつの側面で、装置において分子反応を実施する方法に関し、前記方法は：
（ａ）前記装置に１又は複数の試薬溶液と非混和性中間流体を導入するステップであって、前記装置が基板を含み、前記基板上に化学的又は生化学的に認識可能な実体物が固定化されるステップ；
（ｂ）前記固定化された化学的又は生化学的に認識可能な実体物と前記試薬溶液との間で；又は前記固定化された化学的もしくは生化学的に認識可能な実体物上で前記試薬溶液の存在下で反応させるステップ；
（ｃ）前記基板上に存在する前記試薬溶液を前記非混和性中間流体により移動させるステップ；
（ｄ）前記非混和性中間流体と前記試薬溶液とを、好ましくは回収及び再生領域で分離するステップ；及び
（ｅ）前記試薬溶液及び／又は非混和性中間流体をステップ（ａ）から（ｅ）を１回以上繰り返すために再使用する、ステップを含む。
【００３４】
ここで使用される用語「装置」は、ある構成、例えばレセプタクル、チャンバ又は容器、又は装置であって分子反応の実施を可能にする好適であるものを意味する。前記装置はそれに対応して、１つ又は複数の入口及び／又は出口要素を持ち、また１つ又は複数の表面、例えば反応性表面又は特定的機能を有する表面を持ち、また、反応ゾーン、洗浄ゾーン、混合ゾーン、待機ゾーン、測定ゾーン、廃棄ゾーン、貯蔵容器ゾーン、回収及び再生ゾーン又は任意のサブ部分もしくはその組み合わせを含む。前記装置は、さらに、これらの要素間の接続、例えばチューブやジョイントを含み及び／又は前記装置は、液体、流体、化学物質、含有成分、サンプル又は前記装置内で使用される任意の他の実体物のための貯蔵容器及びリポジトリを含み得る。
【００３５】
好ましくは前記装置は反応ゾーンを含み得る。そのような「反応ゾーン」は、前記ゾーンのサイズと比較して小さなサイズである入口及び／又は出口構造のみを含む閉鎖実体物であって、「反応チャンバ」として理解され得るものであるか、又は、装置内に存在するさらなる実体物と接続される開構造であり得る。前記反応ゾーンは、前記の分子反応を可能とする好適なゾーンか、又はある実施態様では、反応を前記実体物内で起こすことを可能にする要素を備えるか、含むことができる。反応を可能にするために好適にするために、１又は複数のパラメータが反応ゾーンで設定又は調節され得る。例えば、反応ゾーンの温度が、当業者に知られる好適な値に調節され得る。前記値は、選択される目標分子、起こる反応又は反応タイプに大きく依存し、かつ反応のタイプ、反応の種類、想定される速度、反応終点の考慮、さらには当業者に知られるパラメータに依存して異なる。
【００３６】
反応が起こることを可能にする要素は、基板、化学的、生化学的、生物的又は他の実体物、触媒などの配列であり得る。さらには、反応ゾーンは、測定又は移動作用に好適な領域を含み、例えば、移動可能な表面を含み、閉鎖空間を減少させることを可能にし、及び／又は導電性ゾーン又はキャパシターゾーンを含み、及び／又は光学的検出を可能にする１以上の透明表面を含み得る。ある実施態様では、前記反応の寸法及び／又は形状は、上で示された機能に１つに適合され得る。さらなる実施態様では、前記装置はこれらに追加して又は代えて１又は複数の検出ゾーンを含む。この領域は、他のゾーンと同じであってよく、又は、例えば前記反応ゾーン又は混合ゾーンなどの他のゾーンから分離されていてもよい。本発明の意味において検出ゾーンは、例えば電気的、光学的、臭覚的、音響的に検出可能な反応生成物、反応結果のための、又は反応ステップが完了したかどうかをチェックするための、センサー又は検出要素を含み得る。これらの領域は、例えば、導電性ゾーン又はキャパシターゾーンなどを含むか、又は例えばラベル化反応などの性能又は強度などの反応結果を、光学的に検出することを可能にする１又は複数の透明表面を含み得る。
【００３７】
本発明のさらなる実施態様では、前記装置はこれらに加えて又は代えて、温度を制御及び／又は調節するための加熱モジュール又は制御ユニットを含み、例えば温度が望ましい値に一定に保持され得るか、又は反応のタイプ及び反応サイクルなどに依存して望ましい値に設定される加熱ゾーンである。さらなる実施態様では、前記装置は、これらに加えて又は代えて冷却モジュールを含み、例えば温度が望ましい値に一定に保持され得るか、又は反応のタイプ及び反応サイクルなどに依存して望ましい値に設定される冷却ゾーンを含み得る。これらのゾーンはさらにまた、好適なセンサー要素が設けられて、温度変化又は温度勾配の測定を可能にする。
【００３８】
これに加えて又は代えて、前記装置は、荷電実体物の存在、イオンの存在などのさらなるパラメータの変更を可能にし、又は機械的またせん断力を与え得る。例えば、前記要素は、電流また電気泳動電流を確立するために好適なものであり、前記要素は特定のｐＨ又は例えばある酸、塩、溶媒などの特定の化学的又は物理的実体を与えるために好適であり、及び／又は前記要素は強い媒体移動を与えるために好適であり得る。前記記載の追加の機能のいずれもが、装置の部分のいずれにおいても、例えば反応ゾーンや反応チャンバなどで利用可能である。
【００３９】
さらに具体的な実施態様では、前記装置はこれらに加えてまた代えて、流速、粘度又は密度値、状態間の移動、試薬の有無、中間非混和性流体の存在の有無を検出することが可能になるモジュールを含む。
【００４０】
ここで使用される用語「分子反応」は、分子に基づく、又はある実施態様では、巨大分子に基づく、好ましくは化学又は生物的反応による、化学的、生化学的、生物的又は物理的相互作用又はこれらの任意の組み合わせである。またある実施態様では、分子下（ｓｕｂ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）での相互作用、例えば前記分子の一部又は部分、又は単一原子又はイオンを含む相互作用を意味する。前記反応は、前記装置の表面でおこり得るものであり、その表面に結合を持たない場合は前記装置内の実体内で起こり得るものであり、又は前記装置の両方の区分で起こり得る。例えば、分子反応は好ましくは、ここで説明した反応ゾーン又は反応チャンバ内で起こる。
【００４１】
ステップ（ａ）では、１又は複数の試薬溶液と非混和性中間流体が前記装置に導入され、そこで前記装置は基板を含み、前記基板上に化学的又は生化学的に認識可能な実体物が固定化されている。ここで使用される用語「試薬溶液」とは、１又は複数の反応物を含む液体又は流体を意味し、これらは、前記溶液の成分自体の間で、又は前記溶液の成分と前記装置の構造、要素又は形状、例えば反応ゾーン又は反応チャンバの構造、要素又は形状との間での相互作用に必要か相互作用を可能にする、１又は複数の反応物を含む液体又は流体を意味する。前記試薬溶液は、例えば、化学的、生化学的又は生物的実体物、例えば、核酸又はその断片、ペプチド、ポリペプチド、例えば抗体、酵素など、ヌクレオチド、化学ラベル、特定の濃度の塩又はイオン、１又は複数の緩衝液又は緩衝液成分など、又は移動可能なビーズ、ポリマー性構造などの巨大分子構造要素などを含む水溶液である。さらに、前記試薬溶液は光学的に検出可能な色素を含み、これは例えば試薬溶液と非混和性中間流体との間の移動、又は２以上のタイプの試薬溶液間の移動を検出するために使用され得る。本発明によれば、単一の試薬溶液が適用され得る。又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる試薬溶液が適用され得る。ここで使用される用語「異なる試薬溶液」とは、上で示された含有成分のいかなる違いをも意味し、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、イオン、塩、緩衝液成分、色素などの存在の有無又は濃度の違いを意味する。濃度の違いは、例えば、約５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％又はそれ以上又はそれらの値の間の任意の値での増加又は減少であり得る。さらには、違いはまた、前記試薬溶液の温度、その粘度、密度、導電性又は当業者に知られるフローパラメータなどの違いである。異なる試薬溶液は、例えば、アニーリング溶液、結合溶液、変性溶液、ブロック化溶液、脱ブロック化溶液又はこれらのいずれかの組み合わせを含み得る。
【００４２】
ここで使用される用語「非混和性中間流体」とは、ここで定義された試薬溶液とは実質的に混和できないか、完全に混和できない流体を意味する。「実質的に混和できない」とは、異なる流体、特に試薬溶液、例えばここで記載された水溶性試薬溶液などの、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８又は１％までを含む。好ましくは、非混和性中間流体は、水又は水溶性溶液を、１％未満、より好ましくは０．５％未満、さらに好ましくは０．１％未満の割合で含む。通常は、前記非混和性中間流体は、例えばここで定められて水溶液である試薬溶液と接触すると分離相を形成する。前記非混和性中間流体と前記試薬溶液との分離は、好ましくは実質的に完全又は完全であり、例えば前記非混和性中間流体と試薬溶液との分離は、少なくとも９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％又は１００％である。具体的な本発明の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体は、前記中間流体中で前記試薬溶液の成分が不溶性を示すか、又は前記中間流体中で前記試薬溶液の成分が実質的に不溶性を示す。ここで使用される用語「前記試薬溶液の成分の不溶性」とは、前記試薬溶液の成分が前記中間流体と接触することで変化しないことを意味する。ここで使用される用語「前記中間流体中の前記試薬溶液の成分の実質的に不溶性」とは、前記中間流体が、前記試薬溶液の１又は複数の成分の約０．０１、０．０２、０．０５、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８％まで、又は１％まで含み得ることを意味する。さらなる実施態様では、前記不溶性は特に表面領域を意味し、そこで前記試薬溶液の成分が実質的に変化せず、従って再使用され得る。本発明の特に好ましい実施態様では、例えば化学的及び生化学的認識可能な実体物の基板上の反応サイトの割合は、溶液中に大過剰で存在する。
【００４３】
非混和性中間流体は、例えば単一構造又は配置、及び／又は単一物理的性質、例えば沸点、単一粘度、単一密度、単一導電性の単一化学実体物の分子を含み得るか、又は２以上のタイプ又は種類、例えば異なる化学的同一性の分子タイプなどを含み得る。好ましくは、かかる異なる分子タイプは類似の又は同様の物理的性質、例えば類似の沸点や粘度、密度又は導電性を持つ。さらに好ましい分子タイプは、その化学及び／又は物理的性質が、両方の分子を組み合わせることが組み合わせ非混和性中間流体を与えることを可能にし、平均的沸点、粘度又は密度を持つものである。
【００４４】
ここで「非混和性中間流体」の用語「中間」とは、前記流体の機能であり、前記１又は複数の試薬溶液又は他の任意の流体実体物をお互いに脱離する又は分離する機能を意味する。例えば、２つの異なる試薬溶液又は流体物が、例えば液滴、流体ユニット又はプラグの形で与えられる場合、本発明の前記非混和性中間流体は、これらの試薬溶液ユニット又は流体ユニットの間、例えば２つの液滴又はプラグの間の空間を埋める。従って、本発明による１又は複数の試薬溶液は、前記非混和性流体により離され、これにより前記試薬溶液の間の中間流体、又は前記非混和性流体と非混和性の前記装置内の任意の他のタイプの流体内容物の間に中間流体を構成する。この作用を実施することで、非混和性中間流体は、流体ユニット、液滴またはプラグ自体の形で分離される。本発明の具体的な実施態様では、同一の試薬溶液のユニットは、反応ゾーン内またはその上を通過し、それは非混和性流体により脱離又は分離される。好ましくは、前記脱離は前記第１の試薬溶液と前記非混和性流体との、及び／又は前記第１の試薬溶液と前記第２又は続く試薬溶液との、完全な非混和性又は完全な非混合物を与えるものである。さらなる具体的な実施態様では、かかる試薬溶液ユニットは、異なる成分、異なる成分濃度を含み、異なる温度、異なる粘度、異なる導電性を持ち、異なる色、異なるｐＨ、異なる酵素濃度を持ち、またブロック化材料、界面活性剤、イオン、塩の存在の有無を示し、またその他の好適なパラメータの違いを持つ。かかるさらなるパラメータは、当業者に知られたものであるか、適切な教科書から導き出せる。
【００４５】
本発明のさらに具体的な実施態様では、前記装置に導入される第１の試薬溶液は、ここで説明された装置部分、例えば基板領域、特に反応ゾーン又は反応チャンバでの分子変性を生じ得るものである。または、かかる変性は続いて導入される試薬溶液により生じ得る。対応する分子変性は、例えば、結合サイト、相互作用ドメイン、活性サイトまたはドメインを占めること、又は表面領域又は基板を、好ましく液体の薄膜で濡らすこと、より好ましくは薄い水の膜で濡らすことであり得る。ここで説明された方法で変性されることで、前記非混和性中間流体の存在は、第１及び第２の試薬溶液ユニットの非混和性を完全に与えるものではなくなる、というのは例えば、結合サイトへ結合された前記因子又はそれ自体、又は前記薄い液体膜がインシチュで維持されそれにより第２の続く試薬溶液と混合され得るからである。
【００４６】
さらに具体的な実施態様では、非混和性中間流体は、追加成分、即ち１又は複数のタイプまたは種類の分子からなる成分を含み得るが、これらは表面活性剤、洗剤、色素又は好適な安定化剤などである。
【００４７】
ここで使用される用語「導入」とは、前記装置内に試薬溶液及び／又は非混和性中間流体を提供することを意味する。この提供は、前記試薬溶液及び／又は非混和性中間流体を前記装置に注入することで実施され得る。例えば、装置の混合ゾーン又はＴ−形状領ゾーンで、試薬溶液が、貯蔵容器の外側又は内側から注入されるか、又はシリンジ又はその他の好適なレセプタクルから注入され得る。同様に、かかる装置に混合ゾーン又はＴ−形状ゾーンで、非混和性中間流体は、貯蔵容器の外側又は内側から注入されるか、又はシリンジ又はその他の好適なレセプタクルから注入され得る。好ましくはこれらの実体物の導入は順番に又は交互になされる。
【００４８】
ここで使用される用語「基板」は、当業者に知られる任意の好適な基板を意味する。前記基板は、任意の好適な形状又はフォーマットを持つことができ、例えばそれは、平坦、曲面、例えば相互作用が起こる領域に向かって凹状又は凸状に曲がる曲面などであり、カールされるか、又は波状のフォーマットを含み得る。これはまた、円形状構造として構成され、又はビーズ状要素又はビーズの形状で構成され得るものであり、例えばこれは配列（アレイ）として配列され得る。前記ビーズは強く基板に設置されているか、又は前記反応ゾーンに、ロッド、リンカーなどの接続要素で固定化され得るものであり、又は捕捉分子を含む磁性粒子であり得るが、これは特異的ブロック化剤で覆われている。
【００４９】
さらに、具体的な実施態様では、当業者に知られるコーティングビーズが使用され得る。さらなる実施態様では、前記基板はミクロ構造化表面、コーティング又は前記反応ゾーン又は反応チャンバ内に保持され得る可動キャリア、又は異なる形状を持つビーズ状要素を含むか、それらからなる。
【００５０】
通常は、前記基板は固体支持体であり、即ち、主に液体とは一体化しない支持材料を含み、従って、前記支持材料上に前記実体物の正確にかつ追跡可能に配置することを可能にする。基板の例は、機能的化学基、例えばアミン基又はアミン官能性基などを持つ固体材料又は基板である。本発明に含まれる基板のさらなる例は、ナイロンなどの多孔性支持材料又は多孔性基板であり、例えば、Ｎｙｔｒａｎ  Ｎ（登録商標）又はＮｙｔｒａｎ  ＳＰＣ（登録商標）又はＢｉｏｄｙｎｅ  Ｃ（登録商標）である。さらなる通常の支持材料又は基板タイプは非多孔性基板である。非多孔性基板の好ましいものは、ガラス、シリコーン、溶融シリカ、ポリエチレングリコール、アミン、エポキシド、イソチオシアネートなどの官能基を持つシラン層でコーティングされたもの、ポリ−Ｌ−リジンコーティング材料、ニトロセルロース、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリプロピレン、ポリエチレン及びポリカーボネートである。基板のさらなる例は、ペプチド／ポリペプチド実体物の固定化に特に有用である、アルギン酸カルシウム又はそれらの変性体を含む。通常は、核酸は、ポリマー性又は無機性表面基板、例えば上で記載されたような基板へ、共有結合で結合され得るものであり、一方でペプチド、ポリペプチド又はタンパク質実体物は、例えば上で説明したポリマー性又は無機性表面基板へ、共有結合で又は共有結合を持たずに結合され得る。
【００５１】
ここで使用される用語「認識可能な実体物」とは、実体物特に分子又は高分子を意味し、これは他の分子、緩衝液、イオン、塩又は他の化学物と相互作用することが可能であり、これにより出発状態から、又はそれまでの状態と、例えば、共有結合形成、活性中心専有、好適な領域又はドメインへの結合、立体構造や表面構造の変更、ヌクレオチド、色素などの化学実体物の導入、又は当業者に知られる任意の区別を導入することで、区別されるようになる。
【００５２】
ここで使用される「化学的に認識可能な実体物」とは、有機分子の反応基、又は無機元素又は分子、又は生化学的又は生物的分子などの化学基を意味し、これは化学的相互作用、反応、結合相互作用又はその他の任意のタイプの相互作用であって、化学的に前記出発状態又はそれまでの状態と区別される状態を与えるものである。例えば、かかる実体物は、特定の化学反応に反応性であり、又はそれらは化学的結合相互作用、触媒、変化又は化学製品の製造を可能にする。ここで使用される用語「生化学的に認識可能な実体物」とは、実質的に高分子相互作用を意味し、例えば、リガンドとそれに対応するレセプターとの相互作用、又は酵素とその基質との相互作用又はブロック化剤との相互作用を意味する。これらの相互作用は、生化学的又は生物的関連実体物を含み、例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、酵素及びその基質、コファクター、結合因子などである。ある実施態様では、化学的に及び生化学的に認識可能な実体物は類似するか同一であってもよく、又は生化学的相互作用が、化学的に認識可能な実体物に基づくものであってもよく、その逆もあってもよい。
【００５３】
ここで使用される用語「固定化」とは、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物を支持基板へ分子相互作用を介して関連付けることを意味し、これにより前記実体物を前記基板の特定の領域に配置し、それに付随して前記実体物が、例えば洗浄、すすぎ洗浄又は相互作用ステップなどの際に脱離されることを妨げる。通常はかかる分子相互作用は、前記基板材料の構造化要素又は官能基と、固定化される化学的に又は生化学的に認識可能な実体物との間の共有化学結合に基づくものであり、例えば、核酸、ペプチド／ポリペプチド、炭化水素又はそれらの変性物又はこれらの組み合わせ物の官能基に対応する。かかる官能基及び固定化工程でのそれらの使用について好適な化学を適用することは、当業者に知られているものである。
【００５４】
前記固定化は、ひとつの実施態様では、化学的に又は生化学的に認識可能な実体物を熱又は光で架橋することで実施することができ、即ち、両方の構造要素を、熱又は光などのエネルギー源を与えることで開始され駆動されるか、又は化学的固定化を介してなされる分子相互作用又は結合を形成することである。通常は、熱による架橋を介する固定化は、化学的に又は生化学的に認識可能な実体物を基板上で乾燥してある温度で加熱することで実施される。この方法は好ましくは、核酸の固定化のために使用される。乾燥及び加熱は、分子を前記基板へ疎水性相互作用により結合させる結果となる。この方法は、物理吸着の二次形として分類される。用語「物理吸着」は、最初の分離及び吸着ステップを含む工程に関係し、それにより化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が前記反応基に接近することであり、これは物理的吸着に基づくものである。核酸などの生体分子の、固体支持体への吸着は、実際上いかなる支持材料でも生じるものであり、というのはいかなるかかる支持材料もほとんどいかなる表面でも相互作用するからである。
【００５５】
通常は、支持材料と固定化される化学的に又は生化学的に認識可能な実体物との相互作用の程度は、前記支持材料の性質及び形状及び化学的に又は生化学的に認識可能な実体物の化学的／物理的／生物的性質に依存して変化し得る。前記相互作用は通常は５段階の手順であり、次のステップ：
（ｉ）前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物を前記基板の表面へ移動するステップ、
（ｉｉ）前記表面へ吸着させるステップ、
（ｉｉｉ）前記吸着された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物の再配列するステップ、
（ｉｖ）前記吸着された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物の潜在的脱吸着させるステップ、及び
（ｖ）前記脱吸着された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物を前記表面から移動させるステップ、を含む。前記手順は、ある程度、前記脱吸着の可能性が内在することを意味するが、前記結合は通常は非可逆的であり、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物のサイズに依存する。吸着相互作用において、用語「化学的に又は生化学的に認識可能な実体物のサイズ」とは、存在する結合サイトの数に関連する。ひとつの結合サイトは、原理的に、前記基板表面からいつでも解離し得るけれど、多数の結合サイトの効果は、化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が全体として結合が維持される、ことである。例えば、温度が約４０から１５０℃、好ましくは５０から１２０℃、より好ましくは６０から１１０℃、さらに好ましくは７０から１００℃及び最も好ましくは８０から９０℃で熱の形でエネルギーを供給することで、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物の前記支持材料への物理的吸着が強化され、効果的に固定化するための時間が短縮される。熱による架橋は、当業者に知られる好適な時間、例えば２分から１２時間、好ましくは１時間から３時間で実施され得る。熱又は加熱（ベーキング）による架橋は、当業者に知られる任意の好適な手段で実施され得るものであり、例えば乾燥チャンバ又はオーブン内である。温度に加えてまた、湿度、通気又は換気が、当業者に知られる好適な値に調節され得る。熱又は加熱による架橋はまた、光による架橋などの固定化や化学的固定化などの他の形と組み合わせることも可能である。
【００５６】
光による架橋は通常は、通常波長、例えば１５０から５５０ｎｍの範囲、好ましくは２００から５００ｎｍの範囲での光を、化学的に又は生化学的に認識可能な実体物へ適用し、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物と支持材料との間の相互作用を誘導する。通常は、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物と前記支持材料との誘導された相互作用は、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物、例えば核酸の前記材料との共有結合である。光による架橋は、例えばＵＶ光を用いることで実施され得る。核酸の場合では、前記結合は核酸分子の塩基、例えばチミン、グアニン、アデニン、シトシン又はウラシル残基を通じて進行し、これらは当業者に知られる前記支持材料上の対応する及び好適な官能基と反応する。前記支持材料上又は前記支持材料内の官能基の存在及び数は、好適な化学的活性化工程で制御し調節することが可能である。そのような活性化工程は、例えば、支持材料上又は内に特異的に局在化された官能基を与えることが可能であり、これにより前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物と前記材料（これらの局在化された官能基の）と特異的相互作用を生じさせるものである。前記支持材料上又は前記支持材料内の官能基の存在及び数は、固定化された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物の方向及び自由度に影響を与える。
【００５７】
ここで意味する「化学的固定化」とは、前記支持材料と前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物との、化学反応に基づく相互作用を意味する。かかる化学反応は通常は、熱又は光によるエネルギー導入にはよらないが、例えばある化学反応のための最適なある温度又はある波長の光のいずれかを適用することで促進され得る。例えば、化学的固定化は、支持材料上の官能基と前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物の対応する官能基要素との間で生じる。前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物の対応する官能基要素は、前記分子の化学構造の一部であるか又は追加的に導入されるかのいずれかであり得る。かかる官能基に例はアミン基である。通常は、固定化される前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物、例えば核酸又はペプチド／ポリペプチドは、官能性アミン基を含むか、又は官能性アミン基を含むように化学的に変性される。かかる化学変性の手段及び方法は、当業者に知られている。
【００５８】
又は前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物は前記基板上に直接合成され得る。かかる方法に好適な方法は当業者には知られている。核酸においての例は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  Ｉｎｃ．又はＦｌｅｘｇｅｎ  ＢＶにより開発された製造技術であり、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．は、レチクルを通す照射を使用し、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  Ｉｎｃ．は、ピクセル化ミラーを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．は、適切な位置で４種類の異なるヌクレオチドを印刷する技術を提供する。Ｆｌｅｘｇｅｎ  ＢＶは走査レーザービームを用いる。通常は、特異的にヌクレオチド添加されるべきスポット（点）を特異的に活性化するレーザーと一組にミラーが使用される。かかる方法は、例えばスポットサイズが５から１００μｍの間、例えば約３０μｍ以上を与え得る。例えば核酸である、化学的に又は生化学的に認識可能な実体物は、従って約８０ヌクレオチドまでの長さを持ち得る。本発明に含まれる他の技術において、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物は、非接触インクジェット印刷工程を用いて堆積され得る。本発明の具体的な実施態様では、核酸、好ましくはオリゴマーが、特異的に調製されたガラススライド上に均一に堆積され得る。このインシチュ合成工程は通常は、６０量体(60-mer)長さのオリゴヌクレオチドプローブを生成し、一塩基ごとの合成方法によるか、又は前合成されたオリゴマーを印刷し、次いでそれらを結合させて表面に共有結合させるかのいずれかである。
【００５９】
ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の固定化、例えば酵素の固定化のためには、例えば化学反応を通じてマトリクスの形で基板への共有結合が好ましく含まれる。この技術は、好適なスペーサー分子の適用により補完されるか、又は支持され得る。かかるスペーサー分子の一例はポリエチレングリコールであり、これは通常は基板要素の立体障害を緩和するものである。
【００６０】
ステップ（ｂ）で、前記固定化された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物と前記試薬溶液との分子反応が実施され；又は分子反応は、前記試薬溶液の存在下で前記固定化された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物で実施される。ここで使用される用語「実施」とは、１つ又は複数の試薬溶液をここで定められた化学的に又は生化学的に認識可能な実体物と、前記固定化された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が局在化された前記装置のゾーン又は領域、好ましは反応ゾーン又は反応チャンバで接触させることを意味する。前記接触は、例えば１、５、１０、３０秒、１分、２分、５分、３０分、１時間又は数時間、又は数日又はこれらの時間の間の任意の時間で実施され得る。前記時間は実施される分子反応のタイプ、前記試薬溶液中の成分量及び／又は濃度に依存し、例えば、酵素基質、ヌクレオチド、ラベル、色素などの濃度、使用される温度、ブロック化試薬の存在の有無、反応速度及び当業者に知られる任意のさらなるパラメータなどである。前記接触はさらに、さらなる好適な条件下で実施され得る、例えば、特定の設定ｐＨ又は特定のｐＨの範囲で、特定の設定温度又は特定の温度範囲で、反応溶液中の含有成分濃度、例えば特定のイオン濃度、特定のポリペプチド／ペプチド濃度、好ましくは特定の酵素濃度などである。かかる条件は当業者に知られており、前記反応のタイプ及び／又は想定される反応生成物に適合させることが可能である。本発明の具体的な実施態様では、酵素の濃度、より好ましくはＤＮＡポリメラーゼの濃度は、配列決定反応でのＤＮＡポリメラーゼの現在使用されている量を実質的に上回る値を設定することが可能であり、例えば現在使用されている量の、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍又は５０倍である。同様に他の含有成分、例えばヌクレオチド、基板などの成分についてもより高濃度が使用され得る。
【００６１】
前記分子反応の性能は、本発明のある実施態様では、外部活性化で制御され得る。例えば、前記温度の設定は、上で説明したように、好適な加熱又は冷却モジュールを用いることで増加又は減少させることが可能である。さらには、前記ｐＨは、前記装置、好ましくは前記反応ゾーン又は反応チャンバに存在する好適なｐＨ測定装置により測定及び／又は変更され得る。
【００６２】
分子反応、好ましくは完全な分子反応の実行は、１つの試薬溶液の存在に依存し、又は２以上の試薬溶液の利用に基づき得る。例えば、第１の試薬溶液は、第１の反応ステップ、又は製造ステップ、例えば脱ブロック化ステップやブロック化ステップなどのために必要な成分を提供し得る。第２又は続く試薬溶液は、第２の又は続く反応ステップのために必要な成分、例えば特定の酵素などの相互作用のための成分、又は酵素のための基質、又は特定のラベル化剤又は色素などを提供することが可能である。
【００６３】
前記分子反応の実行は、前記固定化された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物、例えば核酸、ペプチド／ポリペプチド、炭化水素と、前記試薬溶液との間で実施され、これは通常は前記固定化された実体物の化学的又は生化学的変化、例えば前記固定化された実体物へ化学基を追加する変化を起こし、及び／又は前記試薬溶液の化学的又は生化学的変化を起こし得る。又は、前記分子反応の実行は、前記試薬溶液の存在下で、前記固定化された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物につき実施され得る。例えば、前記試薬溶液は、触媒的成分を与えることが可能であり、例えば酵素活性は、前記固定化された化学的に又は生化学的に認識可能な実体物の反応を実行するために必要とされるが、前記試薬溶液を変化させることはなく又は実質的に変化せることはない。前記分子反応は好ましくは、移動作用により開始及び／又は停止され得るものであり、これにより前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物と前記試薬溶液との接触を導き、及び／又は前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物と前記試薬溶液との接触を停止させる。かかる開始及び停止は、反応ゾーン又は反応チャンバを通る前記試薬溶液の移動、特に上で記載された試薬溶液ユニット又はプラグの移動に基づくものである。好ましくは前記移動は、本発明による非混和性中間流体を用いることで実施される。従って、例えば前記流速を制御すること、又は前記装置の特定の領域で前記移動を開始、加速、減速、中止又は停止させることで前記移動を制御することで、分子反応が制御され、その速度が変更され、反応生成物の量が変更され得る。本発明の具体的な実施態様では、前記分子反応の開始及び特に停止は、反応生成物の測定結果に依存してなされ得る。例えば、かかる測定に依存する停止工程は、適切なパラメータの存在又は不存在を反応状態、反応段階又は反応進行に結合するミクロ電子回路、例えばコンピュータ化モジュールにより実施される。ステップ（ｃ）では、前記基板上に存在する試薬溶液が本発明の前記非混和性中間流体で移動される。ここで使用される用語「移動」とは、前記装置に導入された試薬溶液ユニット又はプラグを、前記装置の特定にゾーン又は領域から排除することを意味する。好ましくは、前記移動は、前記装置の前記反応ゾーンの基板からの前記試薬溶液の排除をもたらし得る。これに加えて又は代えて、反応溶液の移動又は、前記非混和性中間流体とは同一ではなくかつ非混和性である任意の他の溶液ユニットの移動は、前記反応ゾーンで／反応チャンバ内で起こるだけではなく、チューブ内や、接続部、待機ゾーンやリポジトリゾーンなどの前記装置のいかなる他のサイト又は領域でも起こり得る。
【００６４】
本発明の具体的な実施態様では、前記移動は、完全に又は実質的に完全に、例えば前記反応ゾーンである前記基板から前記試薬溶液又は任意の他の溶液の例えば９９％、９９．９％、９９．９９％又は１００％を移動させるか、又は前記装置の任意の他のサイト又は領域から完全に又は実質的に完全に移動させることであり得る。さらに、他の実施態様では、前記移動は完全でなくても又は実質的に完全でなくてもよい。移動作用を実施することに代えて、既に存在する溶液、特に既に存在する試薬溶液のある部分を基板上に保持することが可能である。好ましい実施態様では、液体の膜、例えば試薬溶液の膜、又は水溶性膜が前記基板上に保持され、前記非混和性中間流体により移動されない。それに伴って、前記試薬溶液又はその他の任意の溶液の成分が、前記移動作用中に基板上に保持され得る。
【００６５】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、非混和性中間流体残留物又は膜が基板表面には残されず、又前記装置のその他の領域やサイトに残されない。非混和性中間流体の残留物の移動は従って、前記装置のある領域又はゾーンを通過する試薬溶液の次のユニットにより達成される。
【００６６】
ここで記載される方法による移動ステップは、前記試薬溶液及びまた移動する非混和性中間流体の、既に配置されていた前記装置の前記領域又は部分から離れた装置の領域又は部分への、移動をもたらす。かかる移動は、当業者に知られた任意の好適な手段で実施されることができ、試薬溶液ユニット又はプラグを移送することが可能であり、同様に、前記非混和性中間流体を、装置の異なるゾーン、例えば待機ゾーン、測定ゾーン、廃棄ゾーン、貯蔵ゾーン、回収及び再生ゾーン又は回収もしくは再生チャンバなどへ移送することが可能である。前記移動は、好適な手段、例えば弁、ゲート、ロック、接続部、合流部などで制御され、調節され得る。制御は、例えば、機械的又は電気的に又は任意のその他の好適な手段で実施され得る。
【００６７】
ステップ（ｄ）で、前記非混和性中間流体及び試薬溶液が分離される。ここで使用される用語「分離」は、非混和性中間流体ユニットと試薬溶液ユニットの混合物で実施される作用を意味する。さらなる実施態様では、前記分離は、また、前記装置に存在する任意の他の流体又は液体ユニットの間で実施され得る。従って、前記分離は、装置に存在する液体又は流体の手順又は順序の破壊を構成することができ、試薬溶液又は他の溶液が、本発明による前記非混和性中間流体より先行させたり、又は後続させたりすることが可能である。この分離は好ましくは、同一又は類似の液体又は流体ユニットの回収、例えば非混和性中間流体の回収、試薬溶液の回収、特定のタイプの反応溶液の回収又は前記装置内に存在する他の任意のタイプの流体ユニットの回収に導く。
【００６８】
本発明の好ましい実施態様では、前記分離は回収及び再生ゾーンで実施され得る。ここで使用される用語「回収及び再生ゾーン」は、前記装置の部分であっても、又は前記装置の外側に設けられてもよく、試薬溶液及び非混和性中間流体がここに捕捉され回収される。通常は、かかる回収及び再生ゾーンは、回収及び再生チャンバの形又は回収及び再生容器又はレセプタクルの形であり得る。前記試薬溶液と非混和性中間流体の前記回収に続いて、分離は、例えば重力の適用、遠心分離、電気的分離方法、電気泳動分離、密度勾配分離などの任意の好適な手段により実施され得る。
【００６９】
分離されると、前記試薬溶液と非混和性中間流体とは、前記装置のゾーンへ戻され、そこで前記記載の分子反応が、回収及び再生ゾーン内の好適に配置された出口から前記反応ゾーンへ再チャンネリングされるか、又は他のいずれか好適なリサイクル技術により、生じる。
【００７０】
ここで記載される分離は、２以上の流体又は液体間で、例えば２以上の異なる非混和性中間流体及び試薬溶液の間、又は２以上の試薬溶液又は他の溶液と非混和性中間流体の間で分離を可能にする。２以上のこれらの流体の分離のための前提条件は、前記分離方法のいずれかの後異なる相の生成である。
【００７１】
好ましい実施態様では、前記分離は、完全又は実質的に完全な分離である。例えば、２以上の流体の分離、特に反応溶液と本発明による非混和性中間流体間の分離は、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％又は１００％であり得る。前記分離手順が実施され、２以上の液体相間で非分離ゾーンが残される場合、この非分離ゾーンは廃棄されるか、又は例えば重力過程が前記第１に実施された後遠心分離によるさらに強い異なる分離方法の対象とされ得る。
【００７２】
前記試薬溶液と前記非混和性中間流体との分離における本発明のさらに具体的な実施態様では、前記試薬溶液及び／又は前記非混和性中間流体は、例えば、回収及び再生ゾーン内の好適に配置された出口から前記反応ゾーンへ再チャンネリングさせるか、又はその他の任意のリサイクル技術により、前記分子反応が生じた前記装置のゾーンへ戻される前に、ｐＨの調節、粘度の調節、成分濃度の調節により再生されることができる。
【００７３】
本発明の具体的な実施態様では、前記分離は、回収又は再回収ステップを省略することができ、前記非混和性中間流体、特に前記非混和性中間流体ユニット又はプラグの前記試薬溶液から又は他の任意の溶液又は流体プラグからの直接空間分離に導き、これにより再チャンネルリング作用などの好適な手段でそれらの再使用を可能にする。例えば、非混和性中間流体ユニット又はプラグ、及び／又は試薬溶液ユニット又はプラグの分離されたチャンネル、チューブ又はゾーン内への方向変換、分岐、偏向が、本発明による装置内で実行され得る。
【００７４】
ステップ（ｅ）で、試薬溶液及び／又は前記非混和性中間流体が再使用される。従って、ひとつの実施態様では、ここで記載されたステップ（ｄ）により、装置のチャンネル区画などで、前記装置中の非混和性中間流体及び試薬溶液ユニット又はプラグの順序又は配列を変更した後に、前記分離された流体ユニットは、本発明の方法での第２の又は続く使用のために適用され得る。前記流体ユニットは、それらを再使用する前に再結合されるか、又はそれらの現在の形でユニットとして使用され得る。前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液の非混和性により、前記試薬溶液又は試薬溶液ユニットは、本発明により、前記装置内に存在する任意の他の流体又は液体、例えば異なる試薬溶液又は洗浄又はリンス緩衝液などで希釈も汚染もされないこととなる。通常はある量の成分を含む試薬溶液は、数回例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれ以上で、分子反応が起こるゾーン、例えば前記の反応ゾーン又は反応チャンバへ再チャネリングすることで、再使用され得る。ある実施態様では、試薬溶液の再使用は、１又は複数の成分の濃度に依存し、例えば前記装置の特定の部分で好適な手段で決定され得る。又は、再使用は、本発明による分子反応の品質及び／又は速度に依存し、例えばここで記載された前記反応生成物の測定により決定され得る。さらなる実施態様では、反応溶液は、足りない成分を追加されることができ、例えばイオン、例えば酵素などのタンパク質ヌクレオチド、色素又はその他の化合物の濃度を、再使用のある時間又はある回数経過した後に又は前記成分の濃度又は前記反応生成物の濃度を測定した後に、増加することができる。好適性が減少、即ち、成分の濃度の減少、分子反応の品質及び／又は速度が減少すると、ある試薬溶液ユニットなどの試薬溶液は廃棄され得る。かかる廃棄されたユニットは好ましくは、試薬溶液、例えば試薬溶液ユニットの再導入で置き換えられ得る。
【００７５】
前記非混和性中間流体は、例えば、前記反応ゾーン又は反応チャンバ、又は前記流体の導入が起こる前記装置のゾーンへ、例えばそれを分子反応が生じる前記装置のゾーン内に再チャンネリングさせることで、数回例えば５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００又はそれ以上再使用され得る。前記非混和性中間流体の再使用は、前記流体の非混和性品質、粘度、密度及び当業者に知られるさらなる好適なパラメータに依存し得る。これらのパラメータは、前記反応ゾーンで測定されるか、前記装置のその他の任意の好適な測定ゾーンで測定され得る。好適性が減少すると、即ち前記非混和性品質が減少、粘度や密度が変化すると、前記非混和性中間流体、例えばある非作用性又は定性的に劣化した非混和性中間流体ユニットなどは、廃棄される。かかる廃棄ユニットは好ましくは、非混和性中間流体の再導入により置き換えられ得る。
【００７６】
本発明の具体的な実施態様では、前記ステップ（ｄ）は省略され、非混和性中間流体のユニットで先行され及び／又は後続される一連の試薬溶液のユニットは、反応ゾーン又は反応チャンバを通過後、直接前記反応ゾーン又は反応チャンバへ、前記当初の順序で、又は、例えばさらに溶液及び／又は非混和性中間流体のユニットを導入することで変更された順序で、チャネリングされて戻され（チャンネルバック）得る。試薬溶液及び／又は非混和性中間流体は、好ましくは、ここで記載された方法でのステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すことで再使用され得る。本発明の他の実施態様では、再使用はこれらのステップの一部分のみの繰り返しに基づくものであってよく、例えば、分離ステップは省略され、一連の流体ユニットが直接反応ゾーン又は前記装置の任意の他のゾーンへ再チャンネリングされ得る。
【００７７】
前記ステップの繰り返しはいずれか好適な回数実施され得る。これは、実行される反応のタイプと数、反応溶液中の成分の品質と濃度、反応ステップの速度、前記装置のフローパラメータ又は当業者に知られるその他のいずれの好適なパラメータに依存し得る。例えば前記方法のステップは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれ以上繰り返され得る。
【００７８】
さらなる実施態様では、試薬溶液及び／又は非混和性中間流体は前記装置、装置ゾーン又は外部レセプタクル内に回収され保存されることができ、一方化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が固定化された基板は置換されるか又は変性され得る。従って、本発明はまた、前記試薬溶液及び非混和性中間流体を、複数の基板又は基板タイプで反応を実行することを含む。
【００７９】
本発明の他の好ましい実施態様では、ここで記載される方法は追加して、前記基板を洗浄緩衝液で洗浄するステップを含む。前記基板の洗浄は、好適な洗浄緩衝液、例えば１又は複数の洗剤及び／又は緩衝成分及び／又は塩及び／又は安定化剤を含む水溶液であり得る。例えば、洗浄緩衝液は、ＴＲＩＳ−Ｂａｓｅ、Ｔｗｅｅｎ、ホルムアミド、ＮａＣｌ及び安定化剤を含み、約７．０のｐＨを持つ。好適な洗浄緩衝液のさらなる例は、１０ｘＰＢＳ（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、２０ｘＰＢＳ、（０．２Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、１０ｘＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１Ｍ  ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）又は２０ｘＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．２Ｍ  ＰＢＳ、１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を含む。さらなる洗浄緩衝液及びその特定の反応又は条件での使用は当業者に知られており、又は好適な教科書から導き出せる。
【００８０】
前記洗浄緩衝液は、好ましくは、前記試薬溶液から、前記非混和性中間流体により脱離される。従って、１つの試薬溶液ユニット又は、例えば異なる成分や機能の２以上の試薬溶液ユニットが非混和性中間流体で移動された後、洗浄緩衝液が装置に導入され、前記基板を含む装置の前記領域を通じて又はその上を移送され得る。本発明の特に好ましい実施態様では、前記洗浄緩衝液ユニットは、その後に非混和性中間流体、例えばさらなる非混和性中間流体ユニットが続く。この続く非混和性中間流体ユニットは、続いて前記基板、例えば反応ゾーン又は反応チャンバに設けられる基板から前記洗浄緩衝液を置き換える。この置換は好ましくは完全なもの、又は実質的に完全なものであり得る。
【００８１】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、前記の分離手順により前記洗浄緩衝液は再使用され得る。または、前記洗浄緩衝液は、例えば分離工程又は前記方向変換工程の後にそれを除去することで廃棄され得る。
【００８２】
本発明の具体的な実施態様では、洗浄緩衝液作用は、移送、即ち前記流体ユニットの移動方向を逆転されることで促進され得る、前記反応ゾーン内で前記流体のそのような逆転は洗浄作用を改善し得る。本発明のさらなる具体的な実施態様では、例えば好適なストリンジェンシーを達成するために好ましくはある温度設定と組み合わせて前記洗浄緩衝液の流速が調節され得る。
【００８３】
本発明の他の好ましい実施態様では、前記方法は加えて、前記分子反応の状態又は結果を測定するステップを含み得る。ここで使用される用語「分子反応の状態又は結果を測定する」とは、前記分子反応からの最終生成物及び／又は中間生成物を決定することを意味する。例えば、ラベル化又は非ラベル化分子の存在、前記溶液中の色又は色素の有無、ｐＨ変化、核酸、ペプチド、ポリペプチドなどの濃度、導電性又はその他の任意の好適なパラメータが測定され得る。この測定は、前記反応ゾーン又はチャンバ内で、及び／又は本発明による装置の特定の測定又は検出ゾーンで実施され得る。前記測定位置は、例えば、反応タイプに依存し、例えば反応が、検出可能な変化を導く前記基板内で又は前記基板上に固定化された実体物で起こるか、又は検出可能な変化を導く前記試薬溶液内で起こるかどうかである。前記固定化された実体物が変化される場合には、測定はインシチュで実施され、一方試薬溶液内での分子反応状態又は結果の測定は、反応ゾーン又は反応チャンバ内又は前記装置の任意の他の位置でなされ、例えば前記反応ゾーンから分離された特定の測定ゾーン又は検出ゾーンにおいてである。
【００８４】
対応する測定は光学手段で実施され得る。例えば、ＣＣＤカメラ又は他の好適な光学装置が、溶液又は基板での光学的変化を検出するため、及び／又はかかる光学的変化の品質を確認するために使用され得る。これに代えて又は加えて、対応する測定は、例えば本発明による前記装置の位置又はゾーンで、導電性、容量又はイオン強度、ｐＨ及び／又は電気泳動パラメータなどに基づく電子的手段で実施され得る。対応する測定モジュールは、統合ステーション、例えばコンピュータ、コンピュータ化モジュール又はマイクロ電子装置に接続され、分子反応の段階、速度又は性能を評価することを可能にする。かかる統合ステーションはさらに、好適なソフトウェア又はプログラムを持ち、かかる制御作用及び評価を可能にする。かかる評価はさらに、例えば速度又はフローパラメータの増加減少、さらなる試薬溶液成分の導入、反応温度の増加減少、反応ステップに与えられた時間間隔の増加減少などの訂正ステップを適用するために使用され得る。
【００８５】
本発明の特に好ましい実施態様では、対応する光学測定は、例えばあるスポットでの発光色により、又はある応答の有無により、配列決定反応の場合に配列を決定するために使用され得る。
【００８６】
本発明のさらに好ましい実施態様では、前記移動ステップ（ｃ）は、空気圧式流体駆動、蠕動作動、ピストンと作動膜駆動又はベクタ真空の適用により実施され得る。
【００８７】
空気圧式流体駆動は、例えば前記装置の異なる位置で空気流又はガス流を用いることで実行され得る。前記モジュールは空気又はガスを前記装置に圧送する。対応するモジュール及び装置区画は、前記装置のチューブ又は接続部に設けられる。好ましくは気体化合物を用いることであり、これは実質的に前記試薬溶液及び／又は前記非混和性中間流体とは非混和性であり、及び／又はそれらから容易に除去され得るものである。この技術のさらなる詳細及び変法は、当業者に知られており、又は好適な教科書から導き出せる。本発明の具体的な実施態様では、前記気体化合物は、非混和性流体であるか、又は非混和性流体の形であり得る。ここで使用され得る他の非混和性流体の例は磁性流体である。
【００８８】
蠕動駆動（ペリスタルチック）は、例えば、装置内に柔軟性の接続部又はチューブを設けることで、又は前記装置に１又は複数の可動側壁又は隔壁を設定して蠕動運動を可能にすることで実行され得る。前記蠕動作用は、いずれの好適な手段、例えば前記柔軟性のあるチューブ又は隔壁への回転装置又はアクチュエーターにより、又は２つのかかるチューブや隔壁を対向方向に組み合わせることで、又は前記チューブ又は隔壁に液体媒介圧力、例えば本発明による前記チューブや隔壁と直接接触する水を充填したチューブを設けることで適用する、及び／又はペリスタポンプを用いることで、実行され得る。この技術のさらなる詳細は当業者には知られており、好適な教科書から導き出せる。
【００８９】
ピストン及び作動膜駆動は、例えば、装置又は前記装置の特定の領域、例えば反応ゾーン又は反応チャンバ、又は前記の混合又はレポジトリーゾーンの少なくとも１つの可動表面を適用することで実行され得る。この可動表面は、従って、柔軟性のある膜の形であり、前記装置内又は前記装置の前記ゾーン内の容積を減少させ、近くの材料を前記ゾーン又は領域の外側に移送させるピストンとして使用され得る。前記可動表面又はピストン構造は好適な拡張貯蔵容器又はゾーンと組み合わせることができ、前記装置内の流体の移動を可能にする。この技術のさらなる詳細は当業者に知られており、好適な教科書から導き出せる。
【００９０】
ベクタ真空は、例えば、空気又は流体を本発明の装置の特定のゾーン内、例えば拡張貯蔵容器又は目標貯蔵容器内に吸い込むか、又は特定の方向に吸い込むことで実行され、前記装置内の試薬溶液及び／又は非混和性中間流体をユニット又はプラグを移動させる。例えば圧縮空気及び真空が、前記流体と内部で接触する膜を動かすために使用され得る。この技術のさらなる詳細は当業者に知られており、好適な教科書から導き出せる。
【００９１】
本発明の具体的な実施態様によると、前記移動作用、流速及び速度は好適性により調節又は変更され得る。特に前記装置は２以上の前記移動又は駆動モジュールを前記装置内の異なる位置で備え、（ｉ）前記除去を微調節し、及び（ｉｉ）前記移動の方向を逆転することが可能となる。
【００９２】
本発明の他の好ましい実施態様では、前記分離ステップ（ｄ）は、前記試薬溶液又は他の溶液、例えば洗浄緩衝液及び前記非混和性中間流体を、重力分離で分離することを可能にする。ここで使用される用語「重力分離」とは、通常の強化されていない重力をある時間、試薬溶液又は他の溶液、例えば洗浄緩衝液と、前記非混和性中間流体との混合物に適用することを意味する。前記重力は、前記中間流体の性質、特にその非混和性により、特定のゾーン、チャンバ又は容器内で２以上の相を生成させる。１つの試薬溶液と１つの非混和性中間流体の場合では、重力の適用は２相の流体又は液体を生じ、１つの相は試薬溶液であり、他の相は非混和性中間流体である。水性試薬溶液が使用される場合、上相が前記試薬溶液相であり、下相が非混和性中間流体であり得る。
【００９３】
好ましい実施態様では、前記重力分離は、好適なゾーン、容器又はレセプタクルを充填した後は乱れを防止することで促進され得る。これは、例えば、前記ゾーン、容器又はレセプタクルを、いずれかの導入構造、例えば回転装置や移送構造から外すことで実行され得る。異なる試薬溶液と非混和性中間流体組み合わせ、又は他のかかる試薬溶液と非混和性中間流体組み合わせを機械的に分離することで、異なる試薬溶液間の容易な識別が実行され得る。従って、除去されたゾーン、容器又はレセプタクルは、続いて前記装置と、例えば導入ポートや入口構造を介して再結合され、前記分離された流体の効果的な再使用を可能にする。
【００９４】
２以上の異なる溶液／流体の重力分離の場合には、例えば対応する相の近くに位置された２以上の出口構造が設けられて使用され、前記分離された流体の効果的な再使用を可能にする。
【００９５】
分離が困難な流体は、さらに、例えば遠心力、流体の加熱や冷却、振り混ぜ運動又はその他の任意の好適な作用を使用する強化された重力分離により分離され得る。
【００９６】
本発明のさらに具体的な実施態様では、前記分離ステップ（ｄ）は、前記試薬溶液又は任意の他の溶液、例えば洗浄緩衝液又は前記非混和性中間流体が方向変換及び／又は分配されることで実行され得る。ここで使用される用語「方向変換及び／又は分配」とは、前記流体ユニットが異なる方向、例えば前記装置の分岐チューブやゾーンへ偏向されること、及びかかるユニットが、例えば装置のかかるチューブやチャンネルのネットワーク内に分配されることを意味する。この作用は、前記装置の特定の測定点で、非混和性中間流体から試薬溶液又は他の溶液への移動を決定することで実行され得る。続いて、例えば非混和性中間流体が検出された後、対応する流体ユニットは、分岐チューブ、チャンネル又はレセプタクルに移動されるか偏向され得る。同様に、例えば試薬溶液が検出された後、対応する流体ユニットは、例えば分岐チューブ、チャンネル又はレセプタクルに移動されるか偏向され得る。同様に、前記分岐チューブ、チャンネル又はレセプタクル内の流体ユニットは、再結合されるか、又は分離維持され、さらに本発明の装置の前記反応ゾーンに移送されるかチャンネルバックされ得る。
【００９７】
前記流体ユニット間の移動は、色、粘度、ｐＨ、電気的性質又はその他の好適なパラメータの違いにより検出され得る。センサー又は検出モジュールは、前記装置、例えば分岐チューブ近くに追加され得る。
【００９８】
本発明の他の側面は分子反応を実行するための装置に関し前記装置は：
（ａ）基板を含む反応ゾーンを含み、前記基板上には化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が固定化されており；
（ｂ）貯蔵容器と液体接続部を含み、これらは、試薬溶液、非混和性中間流体及び場合により洗浄緩衝液が、前記反応ゾーンを通過することを可能にし、前記非混和性中間流体が前記試薬溶液を前記反応ゾーンから移動させることが可能であり；及び
（ｃ）回収及び再生ゾーンを含み、そこで、前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液が重力分離で分離可能であり、前記分離された液体を前記反応ゾーンへチャンネルバックすることで前記非混和性中間流体及び前記試薬溶液の再使用を可能にする、装置である。
【００９９】
前記装置は好ましくは、前記反応ゾーンを含み、これは前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が前記技術により固定化されている。
【０１００】
前記装置はさらに、貯蔵容器を含み、例えば拡張ゾーン又は容器又は導入容器又はゾーンであり、これは前記装置の流体ユニットの動きを、例えば前記移送技術の１つにより可能にする。本書で述べられた貯蔵容器は、任意の好適な形状又はサイズを持ち、及び少なくとも１つの入口と１つの出口、又は複数の入り口及び１つの出口、又は複数の出口と１つの入口を持つ。前記貯蔵容器は前記装置から開放されていてもよく、また閉鎖されていてもよい。前記装置内に存在する１又は複数の貯蔵容器が、例えば異なる位置に設けられてよく、これは流体のなどの動きを可能にする。
【０１０１】
ここで使用される液体接続部は、任意のサイズ、直径又は好適な形状であり得る。例えば液体接続部はキャピラリーチューブであり得る。又はそれはより大きいサイズであり得る。又は、液体接続部は、液体で恒久的に満たされていることは必要ではなく、また気体成分が負荷されていてもよく、例えば空気圧変位方法が実行され得る。
【０１０２】
前記回収及び再生ゾーンが存在し得る。かかるゾーンは、好ましくは回収及び再生コンテナ、容器、チャンバ又はレセプタクルの形であってよい。かかる回収及び再生ゾーンは、例えば前記移動技術により駆動される、流体接続部又は本発明による装置の異なるゾーンからくる１又複数の流体ユニットを収容するために好適である。本発明のこの側面による前記回収及び再生ゾーンは、試薬溶液及び前記非混和性中間流体の１又は複数の流体ユニットの重力分離を可能にするように設計される。従って具体的な実施態様では、前記回収及び再生ゾーンは、例えば前記装置又は前記入口から前記ゾーンを除去する回転機構を設けることで、例えばさらなる回収及び再生ゾーンへ向かう入口接続部のための除去機構を設けること及び／又は前記回収及び再生ゾーンの充填を、重力分離及び／又は再使用ステップが起こるまで、例えば１０秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、２０分など停止させるための停止又は中止機構を設けることで、充填後の乱れを防止するために設計され得る。
【０１０３】
前記回収及び再生ゾーンは、これに代えて又はこれに加えて、前記の強化された分離を可能にする要素、例えば遠心力を適用すること、加熱冷却をおこなうこと、振るもしくは混合するモジュールなどの要素を設けることが可能である。これらの追加のモジュールは、前記回収及び再生ゾーンで前記流体の分離状態に依存して切り替えることが可能である。
【０１０４】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、前記回収及び再生ゾーンは、前記の反応ゾーンに接続された１つの入口及び前記試薬溶液と前記非混和性中間流体にそれぞれ接続される２つの出口を含む。ここで使用される用語「前記反応ゾーンに接続される入口」とは、前記反応ゾーンと前記回収及び再生ゾーンの間の直接又は間接的流体接続を意味する。この接続は、チューブ、チャンネル、キャピラリーチャンネル、ブリッジ又は任意の他の好適な接続要素により実行され得る。それはまた、前記反応ゾーンと前記回収及び再生ゾーンの間の直接接続であり、それはゲート又はロックで閉じられ得るものである。ここで使用される用語「前記試薬溶液のための貯蔵容器と接続された出口」とは、前記回収及び再生ゾーンと、追加の貯蔵容器であって試薬溶液のみ、好ましくは１つのタイプ又は定められた成分を含む容器との間の直接又は間接的流体接続を意味する。この接続は、チューブ、チャンネル、キャピラリーチャンネル、ブリッジ又は他の任意の好適な接続要素の存在で実行され得る。回収及び再生ゾーンは、ある実施態様では、試薬溶液のための１又は複数の貯蔵容器と接続され、又は装置で使用されるそれぞれの試薬溶液のタイプについての１つの貯蔵容器に接続され得る。ここで使用される用語「前記非混和性中間流体のための貯蔵容器と接続された出口」とは、前記の回収及び再生ゾーンと、追加の貯蔵容器であって本発明による非混和性中間流体のみを含む容器との間の直接又は間接的流体接続を意味する。この接続は、チューブ、チャンネル、キャピラリーチャンネル、ブリッジ又は他の任意の好適な接続要素の存在で実行され得る。
【０１０５】
試薬溶液のための貯蔵容器及び非混和性中間流体のための貯蔵容器は、前記装置の反応ゾーンと接続されており、前記それぞれの流体を再チャンネルさせて再使用させることが可能となり、又は前記装置の他の任意のゾーン又は領域、例えば前記の導入ゾーンと接続され得る。
【０１０６】
本発明の他の実施態様では、試薬溶液のための貯蔵容器と前記非混和性中間流体のための貯蔵容器が前記装置から取り外し可能であり、例えば冷蔵庫や冷却施設などの外部での保存を可能にする。かかる取り外し可能性は、前記入口及び／又は出口区画でゲート又はロック要素の存在で実行され得る。本発明による装置から前記貯蔵容器の取り外しの可能性は、さらに反応溶液、例えば貴重な酵素や他の成分の再利用性を、例えば保存期間後異なる装置又はことなる時点でさらに適用するために提供することで増加させる。又は、取り外し可能な貯蔵容器はまた、使用の前に貴重な酵素や他の成分を含む反応溶液の保存のために適用され得る。具体的な実施態様では、前記ロックはまた、永久的なものであり得る。前記の入口構造は、流体ユニットの効果的な導入を可能にするように設計されることができ、例えば回収及び再生ゾーンの上部に設けられる。従って出口構造は、試薬溶液及び非混和性中間流体の効果的な取り出しを可能にするように設計され得る。例えば、前記出口は、回収及び再生ゾーンの下部及び上半分、３分の１、又は４分の１に設けられ得る。前記入口はこれに代えて、前記回収及び再生ゾーン内の流体の量により取り外し可能に再配置され得る。これに代えて、前記回収及び再生ゾーンは、複数の出口構造を持つことができ、これは好ましくは閉鎖可能であり、流体の量と試薬溶液と非混和性中間流体相の位置により使用され得る。
【０１０７】
前記入口及び出口構造はさらに、好適な駆動要素、例えばポンプ又はゲート、ロックなどの好適な分岐実体物又は分岐細管を備えてよい。
【０１０８】
本発明のさらなる具体的な実施態様では、前記回収及び再生ゾーンは、前記装置の前記反応ゾーン又は導入ゾーンに直接接続されることができ、例えば前記試薬溶液及び前記非混和性中間流体を、直接的流体接続を介して直接再使用することを可能にする。
【０１０９】
本発明のさらなる実施態様では、洗浄緩衝液はまた、前記洗浄緩衝液が前記試薬溶液と非混和性である場合、前記非混和性中間流体及び／又は試薬溶液から分離され得る。洗浄緩衝液が装置内で使用される場合、回収及び再生ゾーンが設けられ、前記洗浄緩衝液と前記非混和性中間流体とを重力分離することを可能にする。対応する回収及び再生ゾーンは、従って、前記装置の反応ゾーン又は他のゾーンと接続される入口、前記使用された洗浄緩衝液を廃棄モジュールへ導くための出口、及び前記非混和性中間流体を貯蔵容器又は直接他の装置ゾーン、例えば前記反応ゾーンへ戻すための出口が設けられ得る。これに代えて、前記洗浄緩衝液はまた、再使用されることができ、従って、貯蔵容器及び／又は前記装置の他のゾーン、特に反応ゾーンへ直接移送されることができる。前記洗浄緩衝液の再使用のために、前記装置はフィルター又は滅菌モジュールを設けることが可能である。
【０１１０】
さらなる側面で、本発明は、分子反応を実施するための他の装置に関し、前記装置は：
（ａ）基板を含む反応ゾーンを含み、前記基板上に化学的に又は生化学的に認識可能な実体物が固定化され；
（ｂ）貯蔵容器と流体接続を含み、これは試薬溶液、非混和性中間流体及び場合により洗浄緩衝液を前記反応ゾーンに通過することを可能にし、前記非混和性中間流体が前記反応ゾーンから前記試薬溶液を移動させることが可能であり；及び
（ｃ）方向変換及び分配モジュールを含み、
そこで前記非混和性中間流体から前記試薬溶液への遷移が検出され、及び前記流体と溶液が分離されて、前記非混和性中間流体と前記試薬溶液が、前記分離された流体を前記反応ゾーンへチャンネルバックされることで、再使用されることを可能にする、装置である。反応ゾーン（ａ）及び貯蔵容器及び流体接続（ｂ）については上で既に説明されている。
【０１１１】
ここで「方向変換及び分配モジュール」とは、前記の流体ユニットを異なる方向、例えば前記装置の分岐チューブやゾーンの方向、例えば前記の装置の反応ゾーンへ偏向する技術的実体物を意味し、反応溶液ユニットは、１つの特定の方向に偏向され、非混和性中間流体は他の特定の方向、前記反応溶液ユニットが偏向された方向とは異なる方向へ偏向される。同様に、異なるタイプの試薬溶液の異なる偏向も可能である。対応する偏向は、移動又は前記の駆動技術、例えば空気圧駆動、ピストン駆動又はベクタ真空の適用、１又は複数の弁の使用により実行され得る。有効に偏向させるための前提は、非理想流体ユニット間の遷移の検出である。流体ユニット間の遷移は、前記のように検出可能であり、例えば、色、粘度、ｐＨ、電気的性質又は好適なセンサー、カメラ又はその他の当業者に知られる他の技術の好適なパラメータの差を決定することで検出可能である。かかる技術実体物は好ましくは、前記偏向モジュールと接続されており、例えばマイクロ電子回路又はコンピュータ化評価モジュールを介してであり、これにより例えば装置内の流体を自動的又は半自動的に分配することを可能にする。さらなるセンサー又は決定モジュールも、前記装置の他のゾーン、例えば分岐チューブの近くに設けられ得る。
【０１１２】
本発明の具体的な実施態様では、前記方向変換及び分配モジュールは、前記反応ゾーンと接続される１つの入口と、前記試薬溶液のための貯蔵容器と非混和性中間流体のための貯蔵容器のそれぞれと接続される２つの出口を含み得る。ここで意味する用語「反応ゾーンと接続される入口」とは、前記の反応ゾーンと前記方向変換及び分配モジュールとの間の直接的又は間接的流体接続を意味する。この接続は、チューブ、チャンネル、キャピラリーチャンネル、ブリッジ、又はその他の好適な接続要素で実行され得る。これはまた、前記反応ゾーンと前記方向変換及び分配モジュールとの間の直接接続であってもよく、これは例えばゲート又はロックにより閉じられ得る。ここで使用される用語「前記試薬溶液のための貯蔵容器と接続される出口」とは、前記の方向変換及び分配モジュールと、試薬溶液のみ、好ましくは１つのタイプの試薬溶液又は決められた成分のみを含む追加の貯蔵容器との間の直接又は間接的流体接続を意味する。この接続は、チューブ、チャンネル、キャピラリーチャンネル、ブリッジ、又はその他の好適な接続要素で実行され得る。方向変換及び分配モジュールは、ある実施態様では、試薬溶液の複数の貯蔵容器と接続されてもよく、又は装置で使用されるそれぞれのタイプの試薬溶液のための貯蔵容器に接続されてもよい。ここで使用される用語「前記非混和性中間流体のための貯蔵容器と接続される出口」とは、前記方向変換及び分配モジュールと、本発明による非混和性中間流体のみを含む追加の貯蔵容器との間の直接又は間接的流体接続を意味する。この接続は、チューブ、チャンネル、キャピラリーチャンネル、ブリッジ、又はその他の好適な接続要素で実行され得る。試薬溶液のための貯蔵容器及び前記非混和性中間流体のための貯蔵容器は、前記装置の反応ゾーンで接続され、前記それぞれの流体の再チャンネリング及び再使用を可能にし、又は前記装置の他の任意のゾーン又は領域、例えば前記の導入ゾーンと接続され得る。本発明の他の実施態様では、試薬溶液のための貯蔵容器及び前記非混和性中間流体のための貯蔵容器は前記のように前記装置から取り外し可能である。
【０１１３】
本発明のさらなる具体的な実施態様では、前記方向変換及び分配モジュールは前記装置の反応ゾーン又は導入ゾーンに直接接続され、これにより例えば前記試薬溶液及び前記非混和性中間流体を直接流体接続を介して直接再使用することを可能にする。
【０１１４】
本発明のさらなる実施態様では、洗浄緩衝液はまた、前記非混和性中間流体及び／又は、前記洗浄緩衝液が試薬と非混和性であれば、前記試薬溶液から分離され得る。洗浄緩衝液が装置で使用される場合、方向変換及び分配モジュールが設けられ、前記洗浄緩衝液及び前記非混和性中間流体を方向変換させることが可能となる。対応する方向変換及び分配設モジュールは従って、前記装置の反応ゾーン又は他のゾーンと接続される入り口と、前記使用された洗浄緩衝液を廃棄モジュールに導くための出口が設けられ、及び前記非混和性中間流体が貯蔵容器に導き又は他の装置ゾーン、例えば前記の反応ゾーンへ直接戻されるように、前記非混和性中間流体のための出口が設けられてよい。または、前記洗浄緩衝液はまた再使用され、及び従って、貯蔵容器へ移送され、及び／又は直接前記装置の他のゾーン、特に前記の反応ゾーンへ戻され得る。前記洗浄緩衝液の再使用のためには、前記装置にはフィルター又は滅菌モジュールが設けられてよい。
【０１１５】
本発明のさらなる実施態様では、繰り返し使用された後に試薬溶液中の成分の再生が実行され得る。さらに前記試薬溶液の試薬の品質が、例えばインシチュ又は前記装置の外部の決定区画で決定され得る。
【０１１６】
本発明の装置及び方法においてさらなる好ましい実施態様は、ミクロ流体装置である。ここで使用される用語「ミクロ流体装置」とは、少量の、好ましくはサブミリリットルスケールの流体を正確に制御して操作し得る装置を意味する。通常ミクロ流体装置は、少量、例えばｎｌ、ｐｌ、ｆｌの範囲の容量を実装し、及び／又は小さい全体サイズを実装することができる。さらに、本発明によるミクロ流体装置は、より低いエネルギーを消費する。ミクロ流体装置においては、層流、比表面張力、電気浸潤、速い熱緩和、電気表面電荷の存在及び拡散効果が、本発明による方法を実行するため奏され及び／又は使用され得る。ある実施態様では、ミクロ流体装置は、外部資源又は外部要素、例えば再使用の目的のための分離又は貯蔵容器又は容器などと接続され得る。さらには、前記ミクロ流体装置は、電子的又はコンピュータインタフェースを含み、これにより前記装置内の作用の制御及び操作を可能にし及び／又は反応結果又は生成物の検出可能又は決定を可能にする。
【０１１７】
本発明の他の具体的な実施態様では、前記ミクロ流体装置は統合化ミクロ流体カートリッジであり得る。ここで使用される「統合化ミクロ流体カートリッジ」とは、ミクロ流体のコンパクト化及びサイズ縮小化を意味し、例えば任意の必要な接続、ゾーン、場合により又チャンバ又はフォーム状の容器内の必要な成分を含む。前記カートリッジは、例えば完全に閉鎖されているか、又は部分的に閉鎖されサンプルや成分を再封止可能な入口から導入することを可能にする。前記カートリッジはさらにスキャン又は検出装置のための整列構造を設けてよく、例えばスキャナーの認識部分、設けられた成分、製造日時などを示すバーコード又はマトリクスコードなどであり、又は検出ユニットへのインタフェースを設けて前記の反応結果を電子的又は光学的に決定することを可能にする。さらに好ましい実施態様では、前記カートリッジは、オンボード試薬溶液及び／又は非混和性中間流体を含み、例えば臨床応用での一回使用の目的であり、汚染を防止することを可能にする。
【０１１８】
本発明のさらに特に好ましい実施態様では、前記分子反応は配列決定反応又は核酸合成反応である。
【０１１９】
ここで使用される用語「配列決定反応」とは、配列決定のための方法で使用される１また複数の反応を意味する。かかる配列決定のための方法は当業者に知られている。これらの方法は、次世代配列決定方法、又は、ハイスループット配列決定方法を含み、例えば、Ｒｏｃｈｅの４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで提供される技術に基づくパイロシーケンスである。この方法は、油滴中の水滴内部でＤＮＡを増幅するものであり、それぞれの液滴は単一のＤＮＡテンプレートを含み、これは単一のプライマーコーティングビーズに結合されており、これはその後クローン化コロニーを形成する。パイロシーケンス方法は、新たなＤＮＡへ結合される個々のヌクレオチドの検出のために光を発光させるためにルシフェラーゼを用いる。他の例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ又はＳｏｌｅｘａシーケンス方法であり、これは可逆的色素−ターミネーターに基づく方法である。ＤＮＡ分子は通常はスライド上のプライマーへ結合され、増幅されて局所的にクローン化コロニーを形成する。続いて一回に１つのタイプのヌクレオチドが添加され、取り込まれなかったヌクレオチドは洗浄除去される。続いて蛍光ラベル化されたヌクレオチドの画像を取得することができ、前記色素は化学的に前記ＤＮＡから除去されて次のステップへ進めることを可能にする。さらなる例は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ技術であり、これはライゲーションによる配列決定を提供する。この方法は、固定長の任意の可能なオリゴヌクレオチドの集団の使用に基づくものであり、これは配列決定位置によりラベル化されている。かかるオリゴヌクレオチドをアニーリングしてライゲーションされる。続いて、配列をマッチングさせるためにＤＮＡリガーゼによる優先的ライゲーションにより、通常は、その位置での前記ヌクレオチドの単一情報が得られる。前記ＤＮＡは通常は、乳化ＰＣＲで増幅され、それぞれが前記同じＤＮＡ分子の増幅物のみを含む得られたビーズは、ガラススライド上に堆積させ、これはＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定と同様な配列決定量及び長さを与えることができる。さらに他の例はＨｅｌｉｃｏｓのＨｅｌｉｓｃｏｐｅ技術であり、ここでは配列（アレイ）に結合されたポリＴオリゴマーにより断片が捕捉される。それぞれの配列決定サイクルで、ポリメラーゼと単一の蛍光ラベル化ヌクレオチドが添加され、前記配列が画像化される。前記蛍光タグは続いて除去され前記サイクルが繰り返される。本発明に含まれる配列決定技術の他の例は、ミクロ流体Ｓａｎｇｅｒ配列決定方法、及びミクロチップ系配列決定方法である。本発明はまた、さらにこれらの技術の開発を含むものであり、例えば、配列決定の精度の改善、又は有機体のゲノム配列決定のための必要な時間を改善することを含む。これらの配列決定方法は、現在提供される方法論内に適合され得るものであり、前記反応の実行の際に、前記酵素及び／又はオリゴマー及び／又はヌクレオチドの量的増加により読み取り長さを大きく増加させ、かつ費用を低減させることが可能にする。前記方法のさらなる変更又は詳細は当業者に知られたものであり、好適な刊行物、例えばＭｅｔｚｇｅｒの「２０１０、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｇｅｎｅｔ���ｃｓ、Ｖｏｌ  １１」から導くことができる。
【０１２０】
ここで使用される用語「核酸合成反応」とは、基板上、例えば配列の形のオリゴヌクレオチド配列を直接製造する方法を意味する。通常の方法は、例えば、シリカ基板上のフォトリソグラフィー合成方法であり、光と光感受性マスク剤が利用されて、一回に１つのヌクレオチド配列を生成する。それぞれ適用可能なプローブは、単一ヌクレオチドの溶液に提供する前に脱マスクされ、次にマスク化反応をさせ、次のプローブセットを、異なるヌクレオチド暴露のための調製で脱マスクされる。数回の繰り返し後、想定されるプローブの配列が完全に構成される。従って、構成されたオリゴヌクレオチドは、望ましい目的に応じてより長く（例えば６０量体）又はより短く（例えば２５量体）し得る。前記方法のさらなる変更又は詳細は当業者に知られており、好適な刊行物、例えばＰｅａｓｅらの「１９９４、ＰＮＡＳ  ９１：５０２２‐５０２６」から導くことが可能である。
【０１２１】
他の側面で本発明は、前記非混和性中間流体を、前記のミクロ流体装置に存在する試薬溶液又は洗浄溶液又は緩衝液を移動させるための使用に関する。好ましくは、前記試薬溶液又は洗浄液又は緩衝液の移動は、完全であるか又は実質的に完全な移動であり、例えば前記試薬溶液又は任意の他の溶液を前記反応ゾーン基板から、９９９％、９９．９％、９９．９９％又は１００％除去し得る。
【０１２２】
本発明の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体は、前記試薬溶液、又は洗浄液又は緩衝液を反応ゾーンから移動させるために使用されることができ、前記反応ゾーンは化学的に又は生化学的に認識可能な実体物を持つ基板を含む。本発明のより好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体は、前記化学的に又は生化学的に認識可能なユニットが、試薬溶液又は洗浄液又は緩衝液を前記反応ゾーン基板から移動させることで、活性化し又は反応性の状態にするために使用され得る。ここで使用される用語「活性化又は反応性の状態にする」とは、前記基板中又は基板上の化学的に又は生化学的実体物に結合する又は覆う実体物を除去することを意味する。前記基板は従って、洗浄製品、結合実体物、緩衝液成分、酵素基質などから清浄化され得る。
【０１２３】
本発明の他の特に好ましい実施態様では、前記化学的に又は生化学的に認識可能な実体物は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物又はこれらの変性物であり、又は核酸、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物又はこれらの変性物の配列、又はこれらの組み合わせであり得る。
【０１２４】
ここで使用される用語「核酸」とは、当業者に知られるいかなる核酸をも意味し、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ又はＡＮＡである。前記ＤＮＡは、例えばＡ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ又はＺ−ＤＮＡの形であり得る。前記ＲＮＡは、例えば、ｐ−ＲＮＡの形であり、即ちピラノシル−ＲＮＡ又はヘパリンＲＮＡやステムループＲＮＡなどの構造的変形された形であり得る。用語「ＰＮＡ」は、ペプチド核酸に関連し、即ちＤＮＡやＲＮＡに類似する人工合成ポリマーであり、これは天然には生じないけれど、生物研究又は医学治療において使用される。前記ＰＮＡ骨格は通常は、ペプチド結合で結合されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の繰り返しからなる。前記種々のプリン及びピリミジン塩基が、メチレンカルボニル結合により前記骨格に結合されている。ＰＮＡは一般的には、ペプチドのように、第１の位置（左）をＮ−末端、及び右をＣ−末端として表される。用語「ＣＮＡ」はアミノシクロヘキシルエタン酸核酸に関連する。さらに、前記用語は、シクロペンタン核酸に関連する、即ち、例えば２’−デオキシカルバグアノシンを含む分子である。
【０１２５】
用語「ＨＮＡ」は、ヘキシトール核酸に関連し、即ちＤＮＡ類縁体であり、標準の核酸塩基とホスホリル化１、５−アンヒドロヘキトール骨格から構築される。用語「ＬＮＡ」はロック化核酸に関連する。通常はロック化核酸は変性され、従ってアクセスできないＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース残基は、２’及び４’炭素の結合する外部架橋接続で変性され得る。かかる架橋はリボースを３’−エンド構造立体配座にロック（固定）する。前記固定されたリボース立体配座は、塩基の重なりを促進し及び骨格の全組織化を促進する。これは熱安定性を大きく強化し得るものであり、即ちオリゴヌクレオチドの融点を高めることとなり得る。用語「ＡＮＡ」とは、アラビノ核酸又はその類縁体に関する。本発明において好ましいＡＮＡは、２’−デオキシ−２’−フルオロ−ベータ−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−Ｆ−ＡＮＡ）である。さらなる実施態様では、核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ及びＡＮＡの任意の組み合わせを含み得る。さらなる実施態様では、前記の核酸分子は、短いオリゴヌクレオチド、長いオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの形であり得る。
【０１２６】
ここで用語「ペプチド」とは、いずれかのタイプのアミノ酸配列であり、１以上のアミノ酸を含み、特に４０まで又は５０アミノ酸長さの短い配列を意味する。ある実施態様では、また、タンパク質構造又はその機能的類縁体を意味する。さらに、前記ペプチドは、さらなる化学的部分又は機能性と組み合わせることができる。
【０１２７】
ここで使用される用語「ポリペプチド」とは、中間的又は長いアミノ酸配列であり、好ましくは４０又は５０アミノ酸を含む。ある実施態様では、前記用語はまた、タンパク質構造又は機能的類縁体を意味する。さらにポリペプチドはさらなる化学基又は機能性と組み合わることが可能である。
【０１２８】
ここで使用される用語「炭水化物」は、経験式Ｃｍ（Ｈ２Ｏ）ｎを持つ有機化合物であり；即ち炭素、水素及び酸素からなり、水素：酸素の比が２：１である。前記群は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類及び多糖類を含む。好ましくはショ糖、即ち単糖類、二糖類である。
【０１２９】
本発明によるポリペプチド、タンパク質又はペプチドの「変性」は、アセチル化、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化、ホルミル化、リン酸化、アミド化、知られる保護基化／ブロック基化、特異的化学的開裂、タンパク質分解開裂、細胞リガンド又は他のタンパク質との結合、ＨＡＰ化、即ちグリシン豊富ホモアミノ酸ポリマ（ＨＡＰ）などを含む。かかる変性は当業者に知られる好適な技術で実施され得る。加えて、前記ポリペプチド、ペプチド又は変更物は１又は複数の従来のアミノ酸を含み得る。
【０１３０】
ここで使用される用語「配列（アレイ）」とは、前記配列に捕捉された分子と周辺環境、例えば前記媒体中の潜在的相互作用相手との間の相互作用を表すために、整列化された配列を意味する。配列は、アクセス可能な二次元又は三次元配列を含み、好ましくは２次元配列である。前記配列は、核酸、例えばオリゴヌクレオチド、ペプチド／ポリペプチド実体物、炭水化物又はこれらの混合物からなり得る。
【０１３１】
本発明の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はフッ素化炭化水素を含む。本発明の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はフッ素化炭化水素からなる。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はパーフルオロ炭化水素を含む。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はパーフルオロ炭化水素からなる。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はフッ素化シリコーンを含む。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はフッ素化シリコーンからなる。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はパーフルオロシリコーンを含む。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はパーフルオロシリコーンからなる。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はフッ素化飽和炭化水素を含む。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はフッ素化飽和炭化水素からなる。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はパーフルオロ飽和炭化水素を含む。本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はパーフルオロ飽和炭化水素からなる。
【０１３２】
本発明のある実施態様では、前記非混和性中間流体は、前記炭化水素からなるか、これらの組み合わせである。
【０１３３】
ここで使用される用語「炭化水素」とは、主として水素と炭素からなる分子を意味する。前記群は、ヒドロカルビル、芳香族炭化水素（アレーン）、アルカン、アルケン、シクロアルカン及びアルキン系化合物を含む。好ましくは前記用語は、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンなどのアルカン、又はペンテン、ヘキセン、ヘプテン、オクテン、ノネン、デセンなどのアルケンに関する。本発明のある実施態様では、炭化水素の群はまた、ヘテロ原子、特に窒素を含み得る、又は前記炭化水素群はさらに、官能基特にアミン基を含み得る。
【０１３４】
ここで使用される用語「シリコーン」とは、シロキサン又はポリシロキサンの重合体を意味し、即ち一般式［Ｒ２ＳｉＯ］ｎを持つ混合無機−有機ポリマーであり、ここでＲはメチル、エチル又はフェニールなどの有機基を表す。
【０１３５】
本発明による「フッ素化炭化水素、フルオロ炭化水素」又は「フッ素化シリコーン、フルオロシリコーン」は、炭化水素又はシリコーン上の１又は複数の、しかし全ての水素ではない水素がフッ素原子で置換された炭化水素又はシリコーンを意味する。より多くフッ素化された炭化水素又はシリコーンが好ましく、疎水的及び親水的物質への低溶解性を与える。
【０１３６】
「パーフルオロ化炭化水素」又は「パーフルオロシリコーン」は、炭化水素又はシリコーン上の全ての水素がフッ素原子で置換された炭化水素又はシリコーンを意味する。
【０１３７】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体が、約０．１Ｐａ．ｓ未満の粘度、約１１００ｋｇ／ｌを超える密度、約５０℃よりも高い沸点、及び約１％未満の水溶性を持つ。
【０１３８】
本発明のある実施態様では、前記非混和性中間流体は、例えば粘度が約０．０９Ｐａ．ｓ、０．０８Ｐａ．ｓ、０．０７Ｐａ．ｓ、０．０６Ｐａ．ｓ、０．０５Ｐａ．ｓ、０．０４Ｐａ．ｓ、０．０３Ｐａ．ｓ、０．０２Ｐａ．ｓ、０．０１Ｐａ．ｓなど、及び密度が約１１００ｋｇ／ｌを超え、沸点が約５０℃を超え、及び水溶性が約１％未満である。
【０１３９】
本発明のさらなる実施態様では、前記非混和性中間流体は、例えば、密度が約１２００ｋｇ／ｌ、１３００ｋｇ／ｌ、１４００ｋｇ／ｌ、１５００ｋｇ／ｌ、１７５０ｋｇ／ｌ、２０００ｋｇ／ｌ、２５００ｋｇ／ｌなどであり、粘度が約０．１Ｐａ．ｓ未満であり、沸点が約５０℃未満であり、水溶性が約１％未満である。
【０１４０】
本発明のさらなる実施態様では、前記非混和性中間流体は、例えば、沸点が約６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃又はそれ以上であり、粘度が約０．１Ｐａ．ｓ未満であり、密度が約１１００ｋｇ／ｌを超え、及び水溶性が約１％未満である。
【０１４１】
本発明のさらなる実施態様では、前記非混和性中間流体は、例えば、水溶性が約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又はそれ以下であり、粘度が約０．１Ｐａ．ｓ未満であり、密度が約１１００ｋｇ／ｌを超え、沸点が約５０℃を超えるものである。
【０１４２】
本発明のさらなる実施態様では、前記非混和性中間流体は、例えば、粘度が約０．０９Ｐａ．ｓ、０．０８Ｐａ．ｓ、０．０７Ｐａ．ｓ、０．０６Ｐａ．ｓ、０．０５Ｐａ．ｓ、０．０４Ｐａ．ｓ、０．０３Ｐａ．ｓ、０．０２Ｐａ．ｓ、または０．０１Ｐａ．ｓなど、密度が約２００ｋｇ／ｌ、１３００ｋｇ／ｌ、１４００ｋｇ／ｌ、１５００ｋｇ／ｌ、１７５０ｋｇ／ｌ、２０００ｋｇ／ｌ又は２５００ｋｇ／ｌなど、及び沸点が約６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃又はそれ以上、水溶性が約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又はそれ以下である。
【０１４３】
前記パラメータ及び／又は非混和性中間流体は、当業者に知られる好適なアッセイ及び手順により試験及び決定することが可能である。本発明は従って、好適な試験及びアッセイにより決定されて、前記与えられた群のパラメータを満たしかつ非混和性である流体を含む。
【０１４４】
本発明の他の好ましい実施態様では、前記非混和性中間流体はＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＦＣ−４０である。前記用語は、特に、図３に示される化合物を意味し、さらに次の性質を持つ：
（ｉ）外見：統計、無色；
（ｉｉ）平均分子量：６５０；
（ｉｉｉ）沸点（１気圧）：１６５℃；
（ｉｖ）流動点：−５７℃；
（ｖ）計算臨界温度：５４３Ｋ；
（ｖｉ）推定臨界圧：１．１８ｘ１０６パスカル；
（ｖｉｉ）蒸気圧：２８７パスカル；
（ｖｉｉ）蒸発潜熱（標準沸点）：６９Ｊ／ｇ；
（ｖｉｉ）液体密度：１８５５ｋｇ／ｍ３；
（ｖｉｉｉ）動粘度：２．２センチストークス；
（ｉｘ）絶対粘度：４．１センチポイズ；
（ｘ）液体比熱：１１００Ｊ．ｋｇ−１℃−１；
（ｘｉ）液体熱伝導率：０．０６５Ｗｍ−１℃−１；
（ｘｉｉ）膨張係数：１．２９０；
（ｘｉｉｉ）水溶性：＜７ｐｐｍｗ；
（ｘｉｖ）水への溶解度：＜５ｐｐｍｗ；
（ｘｖ）絶縁耐性：４６ｋＶ、０．１”ギャップ；
（ｘｖｉ）誘電率：１．９；及び
（ｘｖｉｉ）電気抵抗率（ＡＳＴＭＤ−２５７）：４．０ｘ１０５オーム・ｃｍ。
【０１４５】
本発明のさらなる具体的な実施態様では、ＦＣ−４０は、１又は複数の他の非混和性中間流体、例えば１又は複数の前記の非混和性中間流体と混合することができる。
【０１４６】
なおさらなる好ましい実施態様では、本発明は、前記の装置の、配列決定反応又は核酸合成反応のための使用に関する。本発明の使用に係る請求項において、配列決定反応は、前記の配列決定の反応であるか、又は当業者に知られる反応として理解されるべきである。本発明の使用に係る請求項において、核酸合成反応は、前記の核酸を合成する反応又は当業者に知られる反応として理解されるべきである。さらに、前記の分子反応、又は当業者に知られる分子反応のために前記の装置の使用が含まれる。
【０１４７】
以下の実施例及び図面の目的は、説明するためだけのものである。従って、かかる実施例及び図面は、制限するものとして解釈されるべきではない。当業者には、ここで開示された原理のさらなる変更等を想定することができる。
【実施例】
【０１４８】
実施例１−ハイブリダイゼーションシグナルへのＦＣ−４０の影響
ハイブリダイゼーションシグナルへのＦＣ−４０の影響を試験するために、ハイブリダイゼーションを、２つの異なるプローブ、即ちＰＣＲ１２及びＰＣＲ５を濃度１ｎＭで行った。
【０１４９】
ＰＣＲ生成物１２は、１１４塩基対を含み、これは寄託番号ＮＣＢＩ３６：１２：１１１３９９７０２：１１１４００６０２：１（２０１１年３月１１日）のヒト染色体の一部であり；以下配列番号１で示され、前記捕捉（キャプチャ）プローブに特異的に結合する領域は、下線部で示される。
ＡＧＴＴＡＣＡＴＴＧＣＣＡＣＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣＣＧＡＧＴＧＡＴＴＧＴＣＡＴＧＡＣＡＡＣＧＡＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡ  （配列番号１）
ＰＣＲ生成物５は、１０８塩基対からなり、これは、寄託番号ＮＣＢＩ３６：５：１２７６３７８１３：１２７６３８７１３：１（２０１１年３月１５日）のヒト染色体の一部であり；以下配列番号２で示され、前記捕捉（キャプチャ）プローブに特異的に結合する領域は、下線部で示される。
ＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴＡＣＡＧＧＴＡＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣ  （配列番号２）
ＰＣＲ生成物は、Ａｔｔｏ７７０（Ｂｉｏｌｅｇｉｏ）で合成され蛍光ラベル化された。合成オリゴヌクレオチドの２つのタイプは共に７６ヌクレオチド長さ（Ｂｉｏｌｅｇｉｏ）を持ち、これがＰＣＲ１２及びＰＣＲ５のための捕捉プローブとして使用された。
捕捉プローブ１２：
ＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＡＣ  ＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＴ
（配列３）
捕捉プローブ５：
ＣＴＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣ  ＣＴＣＴＧＴＧＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＧＧ
（配列４）
オリゴヌクレオチドを、ベタイン１．５Ｍを含む６μＭ濃度のＰＢＳ中に溶解させ、クリーンルーム内で、アミノシランガラススライド（Ｇｅｎｏｒａｍａ  ＳＡスライド）上に行にインクジェット印刷し、及びＵＶ架橋させた；それぞれのスポットは溶液３００ｐＬで生成された。
【０１５０】
Ａｔｔｏ７００で蛍光ラベル化した標準スポットを、ベタイン１．５Ｍを含む２μＭ濃度のＰＢＳ中に溶解し、平行行で印刷した。
【０１５１】
入口、出口及びＵ字形ミクロチャンネル（幅１．２ｍｍ、全長さ５０ｍｍ、高さ１００μｍ）を前記印刷領域に構築し、ＰＣＲ１２及びＰＣＲ５を用いてフローオーバーハイブリダイゼーション試験を実施した。ハイブリダイゼーション溶液を前記入口から前記ミクロチャンネル内のシリンジポンプ手段で注入した。
【０１５２】
ＰＣＲ１２及びＰＣＲ５はハイブリダイゼーション緩衝液（３ｘＳＳＣ、０．１１％ＳＤＳ）濃度１ｎＭで溶解させ、１０分間９５℃で変性させ、氷で冷却して、６μｌ／分でシリンジポンプ手段により前記ミクロ流体構造に注入した。前記フローを一定に３０分間維持した。
【０１５３】
前記システムをホットプレート上に保持してハイブリダイゼーションの間前記ミクロチャンネル内の温度を５４℃に維持した。
【０１５４】
５４℃でのフローオーバーハイブリダイゼーションの３０分後、前記流体を前記ミクロチャンネルから除去し、ラベル化ＰＣＲ生成物の結合を検出するために前記領域を共焦点スキャナーで分析した。
【０１５５】
前記ハイブリダイゼーション工程へのＦＣ−４０の不活性を評価するために、３つの並列実験研究を次の条件で行った：
（１）５分間ＦＣ−４０のフローオーバー、室温、６μｌ／分＋前記のＰＣＲ１２及びＰＣＲ５のハイブリダイゼーション；
（２）５分間ＦＣ−４０、６μｌ／分＋洗浄緩衝液（１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）５分間、室温、６μｌ／分＋ＰＣＲ１２及び前記のＰＣＲ５のハイブリダイゼーション；及び
（３）前記のＰＣＲ１２及びＰＣＲ５ハイブリダイゼーション、ＦＣ−４０との接触なし。
【０１５６】
図４の１、２、３（これは前記実験（１）、（２）、（３）に対応）から、ＦＣ−４０との接触はハイブリダイゼーションシグナルに影響を与えないことが分かる。
【０１５７】
図４の１、２、３（これは前記実験（１）、（２）、（３）に対応）から、ＦＣ−４０との接触はハイブリダイゼーションシグナルに影響を与えないことが分かる。
【０１５８】
実施例２−酵素末端修復ＰＣＲ反応へのＦＣ−４０の影響
酵素末端修復ＰＣＲ反応へのＦＣ−４０の影響を試験するために、Ｃｐ４０ａｍ、アミノ官能性を持つ合成オリゴヌクレオチド、５８ヌクレオチド長（Ｂｉｏｌｅｇｉｏ）とのハイブリダイゼーションが実施された。Ｃｐ４０ａｍの配列は以下のとおりである（配列番号５）。
Ｃｐ４０ａｍ：  ＡＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＡＧＣＧＣＡＣＧＴＴＴＴＣＧＡＴＴＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＴＡＣＣ
（配列番号５）
Ｃｐ４０ａｍをベタイン１．５Ｍを含むＰＢＳに溶解し、ＮｅｘｔｅｒｉｏｎスライドＰ（Ｓｃｈｏｔｔ）上に指示書に従って捕捉プローブとして印刷した。１６−ウェル上部構造（Ｓｃｈｏｔｔ）をプリントスライドへ適用した。
【０１５９】
４０＋４として、これは４オーバーハングヌクレオチド（ＧＣＴＡ−）を持つ相補的プローブであるが、これをハイブリダイゼーション緩衝液（３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に１０ｎＭの濃度で溶解し；５０μｌのハイブリダイゼーション溶液を前記ウェルに導入した。ハイブリダイゼーションは、５０℃で３０分間行った。
【０１６０】
洗浄緩衝液で洗浄（１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）後、末端修復反応を、ＮＥＢ緩衝液、ヌクレオチドｍｉｃｄＮＴＰ−Ｃ＊を含む０．１％ＢＳＡ中でＫｌｅｎｏｗポリメラーゼにより実施した；ここでＣヌクレオチドはＣｙｃ５でラベル化され、ｄＮＴＰ−Ｃ＊混合物は３００ｎＭ濃度に希釈された。この溶液は、標準溶液とされた（図５の「Ｒｅｆ」、標準）。
【０１６１】
末端修復反応へのＦＣ−４０の影響を試験するために、増加量のＦＣ−４０を次の比率、１：１０００、１：１００、１：１０、１：５で添加した。
【０１６２】
それぞれ５０μｌの溶液を異なるウェルに適用し、末端修復反応を、約３７℃で３０分間行った。
【０１６３】
図５の第３欄からわかるように、１：１００（容積／容積）までのＦＣ−４０の存在は、前記末端修復反応ステップには影響を与えない。驚くべきことに、ＦＣ−４０のより高濃度（第１及び第２欄）は前記ポリメラーゼ反応収率を増加させるように見える。