【手続補正書】
【提出日】平成27年7月29日(2015.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣ４．２．１．−またはＥＣ４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を含む組換え微生物であって、標的脂肪族鎖長および／または改善された飽和特徴を有する脂肪酸誘導体組成物を生成する、組換え微生物。
【請求項２】
（ｉ）修飾された活性が、組換え微生物と同じ種類の微生物における、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする５'および３'末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＤ）と、ＯＲＦＤの５'末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５'非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＤ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＤ）の発現によって生成されるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なり；
（ｉｉ）組換え微生物が、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードするＳＰＳＤの１種または複数の変異体を含み、１種または複数の変異体が、それぞれ、ＯＲＦＤまたはＮＣＤに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＤおよび／または変異体ＮＣＤを含み、
（ｉｉｉ）組換え微生物によって生成された、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体組成物が、ＳＰＳＤを発現する組換え微生物と同じ種類の微生物によって生成された脂肪酸誘導体組成物よりも高い力価を含み、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＤが、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有するタンパク質をコードする、
請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
ＯＲＦＤが、配列番号１４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＤが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＤが、ＥＣ４．２．１．６０の酵素番号を有するタンパク質をコードする、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項５】
ＯＲＦＤが、配列番号１２に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＤが、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号１２）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする、請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
変異体ＮＣＤが、ＮＣＤの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項７】
ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有する、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を含む組換え微生物であって、
（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（ＦａｂＡ／Ｚ）をコードする５'および３'末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＥ）と、ＯＲＦＥの５'末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５'非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＥ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＳＰＥ）の発現によって生成される、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なり；
（ｉｉ）組換え微生物は、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、１種または複数のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、ＯＲＦＥまたはＮＣＥに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＥおよび／または変異体ＮＣＥを含み、
組換え微生物によって生成された好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物が、ＳＰＳＥを発現する組換え微生物と同じ種類の微生物によって生成された脂肪酸誘導体組成物よりも高力価の、好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体を含む、組換え微生物。
【請求項８】
ＯＲＦＥが、配列番号１４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＥが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
変異体ＮＣＥが、ＮＣＥの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１または７に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
さらなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含み、さらなるタンパク質が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；および補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
細菌である、請求項１または７に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
細菌がエシェリキア・コリである、請求項１４に記載の組換え微生物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明のこれらおよびその他の態様および実施形態は、本明細書における開示を考慮すれば当業者には容易に思い浮かぶであろう。
[本発明1001]
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え微生物培養物であって、組換え微生物培養物が組換え微生物を含み、
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作された組換え微生物が、
ＥＣ4．2．1．−または4．2．1．60の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を含み、（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする5’および3’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＤ）と、ＯＲＦＤの5’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む5’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＤ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＤ）の発現によって生成されるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物は、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードするＳＰＳＤの1種または複数の変異体を含み、1種または複数の変異体は、それぞれ、ＯＲＦＤまたはＮＣＤに対して100％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＤおよび／または変異体ＮＣＤを含み、
組換え微生物培養物によって生成された、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、ＳＰＳＤを発現する組換え微生物と同じ種類の微生物の培養物によって生成された脂肪酸誘導体組成物よりも高力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を含む、組換え微生物培養物。
[本発明1002]
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＤが、ＥＣ4．2．1．−の酵素番号を有するタンパク質をコードする、本発明1001の組換え微生物培養物。
[本発明1003]
ＯＲＦＤが、配列番号14に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（3Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＤが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号14）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する（3Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、本発明1002の組換え微生物培養物。
[本発明1004]
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＤが、ＥＣ4．2．1．60の酵素番号を有するタンパク質をコードする、本発明1002の組換え微生物培養物。
[本発明1005]
ＯＲＦＤが、配列番号12に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＤが、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号12）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする、本発明1004の組換え微生物培養物。
[本発明1006]
変異体ＮＣＤが、ＮＣＤの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、前記本発明のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1007]
好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え微生物培養物であって、組換え微生物培養物が組換え微生物を含み、
好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作された組換え微生物が、
ＥＣ4．2．1．−の酵素番号を有する、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を含み、（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（ＦａｂＡ／Ｚ）をコードする5’および3’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＥ）と、ＯＲＦＥの5’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む5’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＥ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＳＰＥ）の発現によって生成される、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物は、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、1種または複数のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、ＯＲＦＥまたはＮＣＥに対して100％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＥおよび／または変異体ＮＣＥを含み、
組換え微生物培養物によって生成された好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物が、ＳＰＳＥを発現する組換え微生物と同じ種類の微生物の培養物によって生成された脂肪酸誘導体組成物よりも高力価の、好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体を含む、組換え微生物培養物。
[本発明1008]
ＯＲＦＥが、配列番号14に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（3Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＥが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号14）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する（3Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、本発明1007の組換え微生物培養物。
[本発明1009]
変異体ＮＣＥが、ＮＣＥの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、本発明1007または1008の組換え微生物培養物。
[本発明1010]
組換え微生物が、ＥＣ2．3．1．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む1種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、前記本発明のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1011]
組換え微生物が、ＥＣ3．1．1．5またはＥＣ3．1．2．−の酵素番号を有するチオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む1種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、前記本発明のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1012]
組換え微生物が、ＥＣ6．2．1．3またはＥＣ1．2．1．42の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む1種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、前記本発明のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1013]
さらなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む1種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含み、さらなるタンパク質が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；および補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、前記本発明のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1014]
組換え微生物が細菌である、前記本発明のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1015]
細菌がエシェリキア・コリである、本発明1014の組換え微生物培養物。
[本発明1016]
高力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え微生物培養物であって、組換え微生物培養物が、組換え微生物を含み、
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作された組換え微生物が、
ＥＣ2．3．1．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の修飾された活性であって、（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードする5’および3’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＡ）と、ＯＲＦＡの5’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む5’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＡ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＡ）の発現によって生成されたβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、1種または複数のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、ＯＲＦＡまたはＮＣＡに対して100％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＡおよび／または変異体ＮＣＡを含む、修飾された活性と、
ＥＣ3．1．1．5またはＥＣ3．1．2．−の酵素番号を有するチオエステラーゼの修飾された活性であって、（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、チオエステラーゼをコードする5’および3’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＢ）と、ＯＲＦＢの5’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む5’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＢ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＢ）の発現によって生成されるチオエステラーゼの活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物は、チオエステラーゼおよび作動可能に連結している調節配列をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、1種または複数のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、ＯＲＦＢまたはＮＣＢに対して100％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＢおよび／または変異体ＮＣＢを含む、修飾された活性と
を含み、
組換え微生物培養物が、約30ｇ／Ｌから約250ｇ／Ｌの間の高力価で脂肪酸誘導体組成物を生成し、組成物が標的脂肪族鎖長を有する、組換え微生物培養物。
[本発明1017]
組換え微生物が、
ＥＣ4．2．1．−または4．2．1．60の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性をさらに含み、（ｉ）修飾された活性が、組換え微生物と同じ種類の微生物における、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする5’および3’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＣ）およびＯＲＦＣの5’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む5’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＣ）を含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＣ）の発現によって生成されるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物が、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、1種または複数のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、ＯＲＦＣまたはＮＣＣに対して100％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＣおよび／または変異体ＮＣＣを含む、本発明1016の組換え微生物培養物。
[本発明1018]
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、好ましい飽和パーセントをさらに有する、本発明1017の組換え微生物培養物。
[本発明1019]
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、飽和および不飽和脂肪族鎖を含み、標的脂肪酸誘導体の少なくとも約90％が、飽和脂肪族鎖を有する、本発明1018の組換え微生物培養物。
[本発明1020]
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣが、ＥＣ4．2．1．−の酵素番号を有するタンパク質をコードする、本発明1017から1019のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1021]
ＯＲＦＣが、配列番号14に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＺ由来（3Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号14）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する（3Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、本発明1020の組換え微生物培養物。
[本発明1022]
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣが、ＥＣ4．2．1．60の酵素番号を有するタンパク質をコードする、本発明1020の組換え微生物培養物。
[本発明1023]
ＯＲＦＣが、配列番号12に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣが、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号12）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする、本発明1022の組換え微生物培養物。
[本発明1024]
変異体ＮＣＣが、ＮＣＣの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、本発明1017から1023のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1025]
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの組成物である、本発明1016から1024のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1026]
組換え微生物培養物が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を10％〜40％の収率で生成する、本発明1016から1025のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1027]
組換え微生物培養物が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物の700ｍｇ／Ｌ／時間〜3000ｍｇ／Ｌ／時間の生産性を特徴とする、本発明1016から1026のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1028]
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするＯＲＦＡが、ＥＣ2．3．1．41の酵素番号を有する3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質およびＥＣ2．3．1．179の酵素番号を有する3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、本発明1016から1027のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1029]
ＯＲＦＡが、配列番号2に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＢ由来3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＡが、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質（配列番号2）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する、3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードする、本発明1028の組換え微生物培養物。
[本発明1030]
ＯＲＦＡが、配列番号4に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＦ由来3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＡが、エシェリキア・コリｆａｂＦタンパク質（配列番号4）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードする、本発明1028の組換え微生物培養物。
[本発明1031]
変異体ＮＣＡが、ＮＣＡの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、本発明1016から1030のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1032]
チオエステラーゼをコードするＯＲＦＢが、ＥＣ3．1．1．5またはＥＣ3．1．2．−の酵素番号を有するｔｅｓＡタンパク質をコードする、本発明1016から1031のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1033]
ＯＲＦＢが、配列番号6に示される配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号6）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する、チオエステラーゼタンパク質をコードする、本発明1032の組換え微生物培養物。
[本発明1034]
ＯＲＦＢが、配列番号8に示される配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号8）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する、チオエステラーゼタンパク質をコードする、本発明1032の組換え微生物培養物。
[本発明1035]
ＯＲＦＢが、配列番号17に示される配列を有するエシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号17）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、本発明1032の組換え微生物培養物。
[本発明1036]
ＯＲＦＢが、配列番号19に示される配列を有するエシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号19）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、本発明1032の組換え微生物培養物。
[本発明1037]
変異体ＮＣＢが、ＮＣＢの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、本発明1016から1036のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1038]
組換え微生物が、ＥＣ6．2．1．3またはＥＣ1．2．1．42の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含む、本発明1016から1037のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1039]
カルボン酸レダクターゼタンパク質が、マイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＢタンパク質（配列番号10）、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスｆａｄＤ9タンパク質（配列番号21）およびマイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＡタンパク質（配列番号23）からなる群から選択されるカルボン酸レダクターゼタンパク質に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する、本発明1038の組換え微生物培養物。
[本発明1040]
組換え微生物が、ＥＣ1．1．−．−、ＥＣ1．1．1．1またはＥＣ1．2．1．10の酵素番号を有するアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含む、前記本発明のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1041]
標的脂肪族鎖長が、Ｃ8、Ｃ10、Ｃ12、Ｃ14、Ｃ16、Ｃ18、Ｃ20およびそれらの組合せからなる脂肪族鎖長の群から選択される、本発明1016から1040のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1042]
2つの選択された脂肪族鎖長の比（ＣＸ／ＣＹ）を使用して、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および標的脂肪族鎖長を特性決定し、比が、ＣＹの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価に対する、ＣＸの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価であり、ＸおよびＹが整数値であり、ＸがＹより小さい、本発明1016から1040のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1043]
ＣＸ／ＣＹが、2から4の間の値を有する、本発明1042の組換え微生物培養物。
[本発明1044]
ＸおよびＹが、Ｘ＝8、Ｙ＝10；Ｘ＝12、Ｙ＝14；Ｘ＝14、Ｙ＝16；およびＸ＝18、Ｙ＝20からなる群から選択される、本発明1042または1043の組換え微生物。
[本発明1045]
組換え微生物が細菌である、本発明1016から1044のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1046]
細菌がエシェリキア・コリである、本発明1016から1045のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1047]
1種または複数のさらなるタンパク質をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含み、さらなるタンパク質が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；および補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、本発明1016から1046のいずれかの組換え微生物培養物。
[本発明1048]
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え微生物を作製する方法であって、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）からなる群から選択される2つの工程を含み、2つの工程は同一工程ではなく、2つの工程は、組換え微生物を作製するために任意の順序で実施され：
工程（Ａ）は：
5’および3’末端を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦＡ）と、ＯＲＦＡの5’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む5’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＡ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＡ）を使用して組換え微生物の出発群を調製することであって、各組換え微生物は、ＳＰＳＡの1種または複数の変異体を含み、（ｉ）ＯＲＦＡは、ＥＣ2．3．1．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＡは、それぞれ、ＯＲＦＡまたはＮＣＡに対して100％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＡおよび／または変異体ＮＣＡを含むことと、
組換え微生物の群から得られるクローンを炭素供給源の存在下で培養することと、
クローンをスクリーニングして、各クローンによって生成される脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および脂肪酸誘導体の力価を決定することであって、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の最大力価を生成するクローンがあることと、
組換え微生物の群から得られるクローンを選択することであって、選択されるクローンは、最大力価より少ない力価で、標的脂肪族鎖長より長い脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成し、選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＡ（ＯＲＦＶＡ）および／または変異体ＮＣＡ（ＮＣＶＡ）を含む変異体ＳＰＳＡ（ＳＰＳＶＡ）を含むこととを含み、
ただし、（ｉ）工程（Ａ）が、方法において、工程（Ｂ）に先行する場合には、工程（Ａ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＢをさらに含む、または（ｉｉ）工程（Ａ）が、方法において、工程（Ｃ）に先行する場合には、工程（Ａ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＣをさらに含み；
工程（Ｂ）は：
5’および3’末端を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦＢ）と、ＯＲＦＢの5’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む5’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＢ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＢ）を使用して組換え微生物の出発群を調製することであって、各組換え微生物は、ＳＰＳＢの1種または複数の変異体を含み、（ｉ）ＯＲＦＢは、ＥＣ3．1．1．5またはＥＣ3．1．2．−の酵素番号を有するチオエステラーゼをコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＢは、それぞれ、ＯＲＦＢまたはＮＣＢに対して100％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＢおよび／または変異体ＮＣＢを含むことと、
組換え微生物の群から得られるクローンを炭素供給源の存在下で培養することと、
クローンをスクリーニングして、各クローンによって生成される脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および脂肪酸誘導体の力価を決定することであって、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の最大力価を生成するクローンがあることと、
組換え微生物の群から得られるクローンを選択することであって、選択されるクローンは、最大力価にほぼ匹敵する力価で標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成し、選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＢ（ＯＲＦＶＢ）および／または変異体ＮＣＢ（ＮＣＶＢ）を含む変異体ＳＰＳＢ（ＳＰＳＶＢ）を含むことと
を含み、
ただし、（ｉ）工程（Ｂ）が、方法において、工程（Ａ）に先行する場合には、工程（Ｂ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＡをさらに含む、または（ｉｉ）工程（Ｂ）が、方法において、工程（Ｃ）に先行する場合には、工程（Ｂ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＣをさらに含み；
工程（Ｃ）は：
5’および3’末端を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦＣ）と、ＯＲＦＣの5’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む5’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＣ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＣ）を使用して組換え微生物の出発群を調製することであって、各組換え微生物は、ＳＰＳＣの1種または複数の変異体を含み、（ｉ）ＯＲＦＣは、ＥＣ4．2．1．−または4．2．1．60の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＣは、それぞれ、ＯＲＦＣまたはＮＣＣに対して100％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＣおよび／または変異体ＮＣＣを含むことと、
組換え微生物の群から得られるクローンを炭素供給源の存在下で培養することと、
クローンをスクリーニングして、各クローンの、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の飽和パーセントおよび脂肪酸誘導体の力価を決定することであって、標的脂肪族鎖長および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の最大力価を生成するクローンがあることと、
組換え微生物の群から得られるクローンを選択することであって、選択されるクローンは、最大力価にほぼ匹敵する力価で標的脂肪族鎖長および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体を生成し、選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＣ（ＯＲＦＶＣ）および／または変異体ＮＣＣ（ＮＣＶＣ）を含む変異体ＳＰＳＣ（ＳＰＳＶＣ）を含むこととを含み、
ただし、（ｉ）工程（Ｃ）が、方法において、工程（Ａ）に先行する場合には、工程（Ｃ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＡをさらに含み、または（ｉｉ）工程（Ｃ）が、方法において、工程（Ｂ）に先行する場合には、工程（Ｃ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＢをさらに含む、方法。
[本発明1049]
2つの選択された脂肪族鎖長の比（ＣＸ／ＣＹ）を使用して、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および標的脂肪族鎖長を特性決定し、比が、ＣＹの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価に対する、ＣＸの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価であり、ＸおよびＹが整数値であり、ＸがＹより小さい、本発明1048の方法。
[本発明1050]
標的脂肪族鎖長ＣＸ／ＣＹ比が、少なくとも約2の値を有する、本発明1049の方法。
[本発明1051]
標的脂肪族鎖長ＣＸ／ＣＹ比が、2から4の間の値を有する、本発明1049または1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
ＸおよびＹが、Ｘ＝8、Ｙ＝10；Ｘ＝12、Ｙ＝14；Ｘ＝14、Ｙ＝16；およびＸ＝18、Ｙ＝20からなる群から選択される、本発明1049から1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
標的脂肪族鎖長が、Ｃ8、Ｃ10、Ｃ12、Ｃ14、Ｃ16、Ｃ18、Ｃ20およびそれらの組合せからなる脂肪族鎖長の群から選択される、本発明1048の方法。
[本発明1054]
変異体ＮＣＶＺ（式中、Ｚ＝Ａ、ＢまたはＣ）が、ＮＣＶＺの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、本発明1048から1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
無作為化が、プロモーター配列のものである、本発明1054の方法。
[本発明1056]
無作為化が、翻訳制御配列のものである、本発明1054または1055の方法。
[本発明1057]
変異体ＯＲＦＶＺ（式中、Ｚ＝Ａ、ＢまたはＣ）が、ＯＲＦＶＺの突然変異誘発によって得られる、本発明1048から1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ａ）を含む、本発明1048から1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ａ）とそれに続く工程（Ｂ）を含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ａ）とそれに続く工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ｃ）を含む、本発明1059の方法。
[本発明1061]
工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ｃ）を含む、本発明1048から1057のいずれかの方法。
[本発明1062]
組換え微生物を炭素供給源の存在下で培養することによって、標的脂肪族鎖長および30ｇ／Ｌ〜250ｇ／Ｌの組成物の力価を有する脂肪酸誘導体組成物が生成される、本発明1048から1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
組換え微生物を炭素供給源の存在下で培養することによって、10％〜40％の収率の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が生成される、本発明1048から1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
組換え微生物を炭素供給源の存在下で培養することによって、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物の700ｍｇ／Ｌ／時間〜3000ｍｇ／Ｌ／時間の生産性が提供される、本発明1048から1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、好ましい飽和パーセントも有する、本発明1048から1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
好ましい飽和パーセントが、少なくとも約90％である、本発明1065の方法。
[本発明1067]
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの組成物である、本発明1048から1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするＯＲＦＡが、ＥＣ2．3．1．41の酵素番号を有する3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質およびＥＣ2．3．1．179の酵素番号を有する3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、本発明1048から1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
ＯＲＦＡが、配列番号2に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＢ由来3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＡが、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質（配列番号2）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードする、本発明1068の方法。
[本発明1070]
ＯＲＦＡが、配列番号4に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＦ由来3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＡがエシェリキア・コリｆａｂＦタンパク質（配列番号4）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する3−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードする、本発明1068の方法。
[本発明1071]
ＯＲＦＢが、ＥＣ3．1．1．5またはＥＣ3．1．2．−の酵素番号を有するチオエステラーゼタンパク質である、本発明1048から1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
ＯＲＦＢが、配列番号6に示された配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号6）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、本発明1071の方法。
[本発明1073]
ＯＲＦＢが、配列番号8に示される配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号8）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する、チオエステラーゼタンパク質をコードする、本発明1071の方法。
[本発明1074]
ＯＲＦＢが、配列番号17に示される配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号17）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、本発明1071の方法。
[本発明1075]
ＯＲＦＢが、配列番号19に示される配列を有するエシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号19）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、本発明1071の方法。
[本発明1076]
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣが、ＥＣ4．2．1．−の酵素番号を有するタンパク質をコードする、本発明1048〜1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
ＯＲＦＣが、配列番号14に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（3Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号14）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する、（3Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、本発明1076の方法。
[本発明1078]
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣが、ＥＣ4．2．1．60の酵素番号を有するタンパク質をコードする、本発明1076の方法。
[本発明1079]
ＯＲＦＣが、配列番号12に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣが、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号12）に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする、本発明1078の方法。
[本発明1080]
組換え微生物が、ＥＣ6．2．1．3またはＥＣ1．2．1．42の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、本発明1048から1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
カルボン酸レダクターゼタンパク質が、マイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＢタンパク質（配列番号10）、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスｆａｄＤ9タンパク質（配列番号21）およびマイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＡタンパク質（配列番号23）からなる群から選択されるカルボン酸レダクターゼタンパク質に対して少なくとも約90％の配列同一性を有する、本発明1080の方法。
[本発明1082]
組換え微生物が、ＥＣ1．1．−．−、ＥＣ1．1．1．1またはＥＣ1．2．1．10の酵素番号を有するアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、本発明1048から1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
組換え微生物が、1種または複数のさらなるタンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする1種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含み、さらなるタンパク質が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；および補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、本発明1048から1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
組換え微生物が細菌である、本発明1048から1083のいずれかの方法。
[本発明1085]
細菌がエシェリキア・コリである、本発明1084の方法。
[本発明1086]
本発明1048から1085のいずれかの方法によって作製された組換え微生物。
[本発明1087]
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する方法であって、本発明1001から1047のいずれかの組換え微生物培養物を炭素供給源の存在下で培養すること、または本発明1086の組換え微生物を炭素供給源の存在下で培養することを含む、方法。
[本発明1088]
培養することが、発酵を含む、本発明1087の方法。