(57)【要約】      （修正有）【課題】NAD+に対する親和性が従来より高く、酵素の安定性も高いL-スレオニン脱水素活性を有し、L-スレオニン分析用に適したL-スレオニン脱水素活性を有するタンパク質（酵素）、そのスクリーニング方法、及びその調製方法の提供。【解決手段】データベースに登録されている酵素名に関わらず、アミノ酸配列データから目的活性を有する酵素のアミノ酸配列をスクリーニングし、それらスクリーニングしたアミノ酸配列を有する酵素を調製し、既存のタンパク質に限られず、目的酵素活性を有するタンパク質を調製する方法。上記の方法により見出されたL-スレオニン脱水素活性を有するタンパク質、および該タンパク質を用いたL-スレオニンの分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の何れかのＬ-スレオニン分析用タンパク質。
（１）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（２）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１から５０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（３）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（１）〜（３）の何れかのタンパク質。
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から５０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列表の配列番号１１〜８６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質から、Ｌ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質をスクリーニングする工程を含む、Ｌ-スレオニン脱水素酵素の調製方法。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）の段階を含む、目的酵素活性を有するタンパク質をスクリーニングする方法であって、
（Ａ）タンパク質のアミノ酸配列のシークエンスアラインメントを用いて、アミノ酸配列が既知のタンパク質群から、目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有する複数のタンパク質からなるライブラリーを作成する、
（Ｂ）目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列、及び（Ａ）で選択したタンパク質のアミノ酸配列から少なくとも２つの相関残基を特定する、
（Ｃ）（Ａ）で作成したタンパク質ライブラリーから、（Ｂ）で特定した相関残基を有するタンパク質を選択する、
（Ｄ）（Ｃ）で選択したタンパク質が、目的酵素活性を有するか否かを確認する。
【請求項５】
（Ａ）における、類似するアミノ酸配列とは、BLASTpを用いて得られる、目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性が、５〜９０％の範囲、好ましくは１０〜７０％の範囲、より好ましくは１５〜５０％の範囲であるアミノ酸配列である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（Ａ）において作成するタンパク質ライブラリーは、１０〜１００，０００個のタンパク質、好ましくは１００〜５０，０００個のタンパク質、より好ましくは５００〜１０，０００個のタンパク質を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
（Ｂ）における相関残基は、目的酵素活性を有する既知のタンパク質及び（Ａ）で選択した少なくとも２つのタンパク質についてのシーケンスアラインメント結果から、保存性が５０％以下であり、協同してアミノ酸残基の種類が変化しているアミノ酸残基のペアを選択することで特定する、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（Ｂ）における相関残基は、相関残基を構成する２つの残基の何れもが、目的酵素活性を有する既知のタンパク質の立体構造において、該タンパク質の活性中心から５Å以上離れた位置に存在する残基である、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
（Ｂ）において選択される相関残基は２つである、請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
（Ａ）における、アミノ酸配列が既知のタンパク質群は、
タンパク質の登録機関に登録されたタンパク質並びに核酸配列の登録機関に登録された核酸配列によりコードされるタンパク質である請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質の登録機関は、ジーンバンク及びPubMedから成る群から選ばれる少なくとも1つであり、核酸配列の登録機関は、DDBjである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれかに記載の方法でスクリーニングされたタンパク質を調製することを含む、目的酵素活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
（Ｅ）〜（Ｇ）の段階を含む目的酵素活性を有する人工タンパク質の製造方法。
（Ｅ）目的酵素活性を有する複数のタンパク質からなる候補ライブラリーを作成し、
但し、前記候補ライブラリーに含まれるタンパク質は、目的酵素活性を有することが推定されるタンパク質であっても良い、
（Ｆ）前記候補ライブラリーと目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列とをアラインメントして、最も高頻度に出現するアミノ酸残基をコンセンサス残基として同定し、
（Ｇ）前記コンセンサス残基のみで構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質を設計し、設計したタンパク質を調製する。
【請求項１４】
（Ｅ）における候補ライブラリーは、請求項４〜１１のいずれかに記載の方法でスクリーニングした目的酵素活性を有する複数のタンパク質からなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（Ｆ）におけるコンセンサス残基の同定は、マルチプルシーケンスアラインメントを実行可能なソフトウェアを用いて行う、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
ソフトウェアは、INTMSAlign又はClustalWである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
目的酵素活性は、BRENDAに登録されている酵素群であって、酵素番号(EC number)が与えられている酵素が有する酵素活性から選ばれる、請求項４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項２の（１）〜（３）の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
プラスミド及び該プラスミドに挿入された請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項２０】
宿主及び該宿主に含まれる請求項１８に記載のポリヌクレオチド又は請求項１９に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
【請求項２１】
請求項２０に記載の形質転換体又は請求項２の（１）〜（３）の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された宿主を培養し、培養物から請求項２に記載のＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、Ｌ-スレオニン脱水素酵素の製造方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のタンパク質、
請求項２に記載のタンパク質、
請求項３、１２〜１６及び２１のいずれかに記載の方法で調製したＬ-スレオニン脱水素酵素を用いて被検体中のL-スレオニン濃度を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の第一の態様は、
L-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質（L-スレオニン分析用を含む）、そのスクリーニング方法、及びその調製方法に関する（請求項１〜３、１８〜２１）。
本発明の第二の態様は、
目的活性を有するタンパク質のスクリーニング方法及び調製方法に関する（請求項４〜１２、１７）。
本発明の第三の態様は、
L-スレオニン脱水素酵素活性などの目的酵素活性を有する新規な合成タンパク質の調製方法に関する（請求項１３〜１７）。
本発明の第四の態様は、L-スレオニンの分析方法に関する（請求項２２）。
【背景技術】
【０００２】
L-スレオニン脱水素酵素 (EC 1.1.1.103，TDH) は、NAD+を補酵素としてL-スレオニン (L-Thr) のヒドロキシ基を脱水素して、2-アミノ-3-ケトブチル酸とNADHを生成する酵素である。TDHは亜鉛を要求する中鎖型脱水素酵素/還元酵素ファミリーに属するものと、金属を要求しない短鎖型脱水素酵素/還元酵素ファミリーに属するもの (SDR-TDH) に分類される。中鎖型脱水素酵素/還元酵素ファミリーに属する酵素は、基質特異性がスレオニンに特異的でないことが知られている。一方、短鎖型脱水素酵素/還元酵素ファミリーに属する酵素にはスレオニンに特異的な酵素の存在が知られている。この酵素として現在までに、Cupriavidus necator (CnTDH)、Flavobacterium frigidimaris (FfTDH) 及びThermoplasma volcanium (TvoTDH) 由来の原核生物由来TDHなどが報告されている(特許文献１, 非特許文献５, 非特許文献６)。
【０００３】
ところで、近年、新規な機能を持つ酵素の開発の方法として酵素遺伝子を含む大量の遺伝子に由来するアミノ酸配列データを用いる方法が報告されている。例えば、次世代シーケンサーに代表される遺伝子配列解析技術の発展により、酵素遺伝子を含む大量の遺伝子に由来するアミノ酸配列データが、PubMedなどのデータベースに登録されている。これらの登録された大量のデータから、BLASTpなどのデータベース解析ツールを用いて解析することにより、他の種から類似のアミノ酸配列を抽出することが可能である。しかし、抽出した配列の酵素が全て目的の機能を持っているとは限らない。従って抽出した配列から、目的の機能を持つ配列を更に選別することが必要である。この機能を持った配列を選別するには多大の労力が必要である。そのため、簡便化する方法として抽出した各配列のジェンバンク形式のファイルを確認し、目的酵素と同じ名前を持つ配列を選抜する方法が開発されてきた（非特許文献1）。
【０００４】
この手法を用いてトリオースリン酸イソメラーゼ (TIM) 活性を持つ配列を正しく選別できることが示された。しかし、この方法では、効率的な選別は困難であり、さらに簡便で効率的な選抜法の開発が望まれてきた。
【０００５】
そこで、現在までに蓄積されている多数のタンパク質の立体構造解析結果を組合わせる選抜方法が研究され、上記の手法で配列を選別した後、立体構造に基づいて配列を絞り込む方法の有用性が報告された。この方法は、具体的には、酵素と基質複合体の結晶構造から活性中心のアミノ酸残基（基質から5Å以内に位置するアミノ酸残基）を同定し、その残基を持つ配列を選別する方法である。R-アミントランスアミナーゼやPLP依存型酵素のスーパーファミリーの選別と分類がこの方法で行われている（非特許文献２、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2011/108727
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sullivan, B. J., Durani, V., Magliery, T. J., Triosephosphate isomerase by consensus design: dramatic differences in physical properties and activity of related variants. J. Mol. Biol. (2011) 413:195-208
【非特許文献２】Hohne, M., Schatzle, S., Jochens, H., Robins, K., Bornscheuer, U. T. Rational assignment of key motifs for function guides in silico enzyme identification. Nat. Chem. Biol. (2010) 6:807-813
【非特許文献３】Steffen-Munsberg, F., Vickers, C., Kohls, H., Land, H., Mallin, H., Nobili, A., Skalden, L., van den Bergh, T., Joosten, H. J., Berglund, P., Hohne, M., Bornscheuer, U. T. Bioinformatic analysis of a PLP-dependent enzyme superfamily suitable for biocatalytic applications. Biotechnol. Adv. (2015) 33:566-604
【非特許文献４】Morley, K. L., Kazlauskas, R. J. Improving enzyme properties: when are closer mutations better? Trends in Biotech. (2005) 23:231-237
【非特許文献５】Yoneda, K. Sakuraba, H. Muraoka, I. Oikawa, T. Ohshima, T. Crystal structure of UDP-galactose 4-epimerase-like L-threonine dehydrogenase belonging to the intermediate short-chain dehydrogenase-reductase superfamily. FEBS J. (2010) 277:5124-5132
【非特許文献６】Yoneda, K., Sakuraba, H., Araki, T., Ohshima, T. Crystal Structure of Binary and Ternary Complexes of Archaeal UDP-galactose 4-Epimerase-like L-Threonine Dehydrogenase from Thermoplasma volcanium. J. Biol. Chem. (2012) 287: 12966-12974
【非特許文献７】Jackel et al. J. Mol. Biol. 2010, 399:541-546
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
＜目的活性を有する酵素、L-スレオニン脱水素酵素＞
しかし、特許文献１、非特許文献５及び非特許文献６に記載のTDHはNAD+に対する親和性が低い、または酵素の安定性が低いなどの欠点があった。生体成分中のL-Thrを精度高く測定するために、これらの欠点を克服した、L-Thrの精度分析に適した新規なTDHの開発が望まれている。
【０００９】
本発明の第一の目的は、NAD+に対する親和性が従来より高く、酵素の安定性も高いL-スレオニン脱水素活性を有し、L-スレオニン分析用に適したL-スレオニン脱水素活性を有するタンパク質（酵素）を提供することにある。
【００１０】
ところで、現在、L-Thrを精度高く測定するために用いることができる高性能な酵素を見出す方法として、自然界からの探索や遺伝子情報を用いた方法がある。しかし、いずれの方法も高性能なL-スレオニン脱水素酵素を探索できる確率は低く、新しい探索方法や新規な酵素の開発方法が望まれている。
【００１１】
非特許文献１に記載の方法並びに非特許文献２及び３に記載の方法はいずれも、目的の酵素と同じ名前で登録されている配列群から新しい配列を見出す方法である。そのため、目的酵素と異なる名前で登録されている配列群から目的機能を持った配列を選択することは困難である。
【００１２】
そこで、本発明の第二の目的は、データベースに登録されている酵素名に関わらず、アミノ酸配列データから目的活性を有する酵素をスクリーニングする新たな方法、及びこの方法でスクリーニングした酵素の調製方法を提供することにある。
【００１３】
尚、活性中心から5Å以上離れた位置のアミノ酸残基が、酵素の特異性や基質選択性を発揮するのに重要であるという報告 (非特許文献４)がある。しかし、活性中心に結合した基質から5Å以上離れた位置のアミノ酸残基の情報を用いて、データベースから目的機能を持った酵素のアミノ酸配列を選抜した報告は見あたらない。
【００１４】
目的とする酵素活性を有するタンパク質を提供するための従来の方法は、前述のように既存のタンパク質（アミノ酸配列は既知だが、活性未知）の中から、当該目的とする酵素活性を有するタンパク質を探索する方法が中心である。しかし、この方法では、探索対象が既存のタンパク質に限られる。
【００１５】
そこで、さらに本発明の第三の目的は、既存のタンパク質に限らず、目的酵素活性を有するタンパク質を調製する方法を提供することにある。
【００１６】
さらに本発明の第四の目的は、新たに見出されたL-スレオニン脱水素活性を有するタンパク質を用いる、L-スレオニンの分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、以下の通りである。
［１］
下記（１）〜（３）の何れかのＬ-スレオニン分析用タンパク質。
（１）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（２）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１から５０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（３）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
［２］
下記（１）〜（３）の何れかのタンパク質。
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から５０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
［３］
配列表の配列番号１１〜８６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質から、Ｌ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質をスクリーニングする工程を含む、Ｌ-スレオニン脱水素酵素の調製方法。
［４］
以下の（Ａ）〜（Ｄ）の段階を含む、目的酵素活性を有するタンパク質をスクリーニングする方法であって、
（Ａ）タンパク質のアミノ酸配列のシークエンスアラインメントを用いて、アミノ酸配列が既知のタンパク質群から、目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有する複数のタンパク質からなるライブラリーを作成する、
（Ｂ）目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列、及び（Ａ）で選択したタンパク質のアミノ酸配列から少なくとも２つの相関残基を特定する、
（Ｃ）（Ａ）で作成したタンパク質ライブラリーから、（Ｂ）で特定した相関残基を有するタンパク質を選択する、
（Ｄ）（Ｃ）で選択したタンパク質が、目的酵素活性を有するか否かを確認する。
［５］
（Ａ）における、類似するアミノ酸配列とは、BLASTpを用いて得られる、目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性が、５〜９０％の範囲、好ましくは１０〜７０％の範囲、より好ましくは１５〜５０％の範囲であるアミノ酸配列である、［４］に記載の方法。
［６］
（Ａ）において作成するタンパク質ライブラリーは、１０〜１００，０００個のタンパク質、好ましくは１００〜５０，０００個のタンパク質、より好ましくは５００〜１０，０００個のタンパク質を含む、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］
（Ｂ）における相関残基は、目的酵素活性を有する既知のタンパク質及び（Ａ）で選択した少なくとも２つのタンパク質についてのシーケンスアラインメント結果から、保存性が５０％以下であり、協同してアミノ酸残基の種類が変化しているアミノ酸残基のペアを選択することで特定する、［４］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
（Ｂ）における相関残基は、相関残基を構成する２つの残基の何れもが、目的酵素活性を有する既知のタンパク質の立体構造において、該タンパク質の活性中心から５Å以上離れた位置に存在する残基である、［４］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
（Ｂ）において選択される相関残基は２つである、［４］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
（Ａ）における、アミノ酸配列が既知のタンパク質群は、
タンパク質の登録機関に登録されたタンパク質並びに核酸配列の登録機関に登録された核酸配列によりコードされるタンパク質である［４］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１１］
タンパク質の登録機関は、ジーンバンク及びPubMedから成る群から選ばれる少なくとも1つであり、核酸配列の登録機関は、DDBjである［１０］に記載の方法。
［１２］
［４］〜［１１］のいずれかに記載の方法でスクリーニングされたタンパク質を調製することを含む、目的酵素活性を有するタンパク質の製造方法。
［１３］
（Ｅ）〜（Ｇ）の段階を含む目的酵素活性を有する人工タンパク質の製造方法。
（Ｅ）目的酵素活性を有する複数のタンパク質からなる候補ライブラリーを作成し、
但し、前記候補ライブラリーに含まれるタンパク質は、目的酵素活性を有することが推定されるタンパク質であっても良い、
（Ｆ）前記候補ライブラリーと目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列とをアラインメントして、最も高頻度に出現するアミノ酸残基をコンセンサス残基として同定し、
（Ｇ）前記コンセンサス残基のみで構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質を設計し、設計したタンパク質を調製する。
［１４］
（Ｅ）における候補ライブラリーは、［４］〜［１１］のいずれかに記載の方法でスクリーニングした目的酵素活性を有する複数のタンパク質からなる、［１３］に記載の方法。
［１５］
（Ｆ）におけるコンセンサス残基の同定は、マルチプルシーケンスアラインメントを実行可能なソフトウェアを用いて行う、［１３］又は［１４］に記載の方法。
［１６］
ソフトウェアは、INTMSAlign又はClustalWである、［１５］に記載の方法。
［１７］
目的酵素活性は、BRENDAに登録されている酵素群であって、酵素番号(EC number)が与えられている酵素が有する酵素活性から選ばれる、［４］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］
［２］の（１）〜（３）の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１９］
プラスミド及び該プラスミドに挿入された［１８］に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
［２０］
宿主及び該宿主に含まれる［１８］に記載のポリヌクレオチド又は［１９］に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
［２１］
［２０に記載の形質転換体又は［２］の（１）〜（３）の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された宿主を培養し、培養物から［２に記載のＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、Ｌ-スレオニン脱水素酵素の製造方法。
［２２］
［１］に記載のタンパク質、
［２］に記載のタンパク質、
［３］、［１２］〜］１６］及び［２１］のいずれかに記載の方法で調製したＬ-スレオニン脱水素酵素を用いて被検体中のL-スレオニン濃度を測定する方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の第一の態様（請求項１〜３、１８〜２１）によれば、NAD+に対する親和性が従来品より高く、酵素の安定性も高いL-スレオニン脱水素活性を有し、L-スレオニン分析用に適したL-スレオニン脱水素活性を有するタンパク質（酵素）を提供することができる。NAD+に対する親和性が高い酵素を用いることで、併用するNAD+量を低減することができる。
本発明の第二の態様（請求項４〜１２、１７）によれば、データベースに登録されている酵素名に関わらず、目的活性を有するタンパク質をスクリーニング及び調製することができる。
本発明の第三の態様（請求項１３〜１７）によれば、L-スレオニン脱水素酵素活性などの目的酵素活性を有する新規な合成タンパク質を調製する方法を提供することができる。新規な合成タンパク質からは、例えば、既存のタンパク質（酵素）より熱安定性の高い、などの新たな機能を付与したタンパク質を提供することができる可能性がある。
本発明の第四の態様（請求項２２）によれば、新規なL-スレオニンの分析方法を提供することができる。この方法では、NAD+に対する親和性が従来品より高い酵素や、熱安定性が高いL-スレオニン脱水素酵素を用いることができ、NAD+に対する親和性が高い酵素を用いる場合には、併用するNAD+量を低減することができ、熱安定性が高い酵素を用いる場合には、高温での分析や長時間の分析も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】L-スレオニン脱水素活性を発揮するために必要と予測した4つのアミノ酸残基、Val143, Leu174, Tyr188, Met214のCnTDH構造上における位置づけを示す。
【図２】アミノ酸配列データベースよりL-スレオニン脱水素活性を有するアミノ酸配列の抽出法の工程(C)に関する概略図を示す。
【図３】TDH候補配列ライブラリーをINTMSAlignを用いて解析した出力ファイルの一部を示す。赤字で示した残基をコンセンサス残基と定義した。
【図４】TvTDHのpH 7.0における温度に対する安定性を示す。
【図５】TaTDHのpH 7.0における温度に対する安定性を示す。
【図６】mtTDHのpH 7.0における温度に対する安定性を示す。(▽), グルコース非添加時、(▼), 終濃度20%グルコース添加時の残存活性の変化を示す。
【図７】ThrDH_4fixのpH 7.0における温度に対する安定性を示す。
【図８】TvTDH (配列1) の異なるpHでのTDH活性を示す。(□), 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 3.5-5.5)、(○), Bis-tris-HCl緩衝液 (pH 6.0-7.0)、(△), Tris-HCl緩衝液 (pH 7.0-8.5)、(▽), BICIN緩衝液 (pH 9.0-9.5)、(◇), グリシン-KOH緩衝液 (pH 10.0-11.5)。
【図９】TaTDH (配列2) の異なるpHでのTDH活性を示す。緩衝液の種類の表記は図8と同様である。
【図１０】mtTDH (配列3) の異なるpHでのTDH活性を示す。緩衝液の種類の表記は図8と同様である。
【図１１】ThrDH_4fix (配列4) の異なるpHでのTDH活性を示す。緩衝液の種類の表記は図8と同様である。
【図１２】TvTDHを用いるL-スレオニンの酵素的検量線を示す。
【図１３】TaTDHを用いるL-スレオニンの酵素的検量線を示す。
【図１４】mtTDHを用いるL-スレオニンの酵素的検量線を示す。
【図１５】ThrDH_4fixを用いるL-スレオニンの酵素的検量線を示す。
【図１６】ThrDH_4fixを用いるL-スレオニンのエンドポイント法による酵素的検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
現在までに報告されているアミノ酸配列の選別方法は、BLASTpで抽出した配列が正しい酵素名で登録されており、さらに酵素の基質認識機構が立体構造から予測できる場合に限り適用可能である。しかし、BLASTpで抽出する配列が正しい酵素名で登録されている例は、極めて限定的であり、例えば、特許文献１, 0028には、TDH（SDR-TDH）を対象とした場合、多くの類似配列がNAD dependent epimerase_dehydrataseあるいはUDP glucose 4-epimerase (GalE) などの名前で登録されており、登録名からSDR-TDH活性を有することを類推することはできないと記述されている。本発明者らも、後述の本発明の手法でデータベースから選別した85配列の内、TDH活性を確認した3つの配列を含む約75%の配列名がL-スレオニン 3-デヒドロゲナーゼ以外の名前で登録されていた。
【００２１】
そこで、本発明では、立体構造が解明されているSDR-TDH、CnTDHの立体構造を参考に、TDHの機能を持つ配列を選別する新しい方法を開発し、目的酵素とは異なる名前で登録されている配列群も含む幅広い配列群から目的機能を持った配列を簡便に選択する方法を提供する。
【００２２】
具体的には以下の手順で選別を行った。実際の操作条件及び方法は、実施例に詳述する。
(i)第一段階：BLASTpでCnTDH類似配列を選ぶ（TDHとして登録されていない配列も含む）。
(ii)第二段階：第一段階で抽出した配列を用いて、活性中心から5Å以上離れているが、TDH活性に重要な役割を果たしていると推定される複数のアミノ酸残基（本発明ではVal143，Tyr188，Met214，Leu174の4残基）を予測する。
(iii)第三段階：予測した4残基を持つアミノ酸配列を計85個選抜する。
【００２３】
(iv)第四段階：選抜した85個からCnTDHと相同性の低い3個の配列を選び、基質特異性などの機能解析を行う。
(v)第五段階：抽出した85配列を基に、各アミノ酸残基において最も高頻度に出現するアミノ酸で作成した配列（コンセンサス残基による配列と称し、自然界に存在しないアミノ酸配列）を作成し、完全コンセンサス配列のタンパク質の基質特異性などを調べる。
【００２４】
(iv)は、(iii)で抽出した85配列の配列タンパク質が、TDH活性を持つことを実証するためであり、(v)の検討は、完全コンセンサス設計した人工タンパク質が、同一の機能を有する場合には、完全コンセンサス設計に利用した配列に系統学的な偏りがなく、設計に用いた配列のタンパク質は、いずれも目的の機能を持つ確率が高いとの知見（非特許文献１、非特許文献７）に基づくもので、本発明の方法で選抜した85個の配列のタンパク質がいずれもTDH活性を持つ可能性を示ためであり、かつ選抜した85個のタンパク質は、TDH活性を持つ、あるいはTDH活性を持つ蓋然性が高いことも実施例で示す。
【００２５】
さらに、上記85個のタンパク質の中には、新規なアミノ酸配列のタンパク質及び既知配列のタンパク質であって、L-Thrに特異的に作用し、かつ熱安定性に優れたタンパク質があること、さらには、これらのタンパク質は、L-スレオニンの優れた定量法に利用できることも見出した。
【００２６】
本発明は、上記知見に基づいてなされた発明である。
【００２７】
＜目的酵素活性を有するタンパク質をスクリーニングする方法＞
以下の（Ａ）〜（Ｄ）の段階を含む、目的酵素活性を有するタンパク質をスクリーニングする方法であって、
（Ａ）タンパク質のアミノ酸配列のシークエンスアラインメントを用いて、アミノ酸配列が既知のタンパク質群から、目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有する複数のタンパク質からなるライブラリーを作成する、
（Ｂ）目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列、及び（Ａ）で選択したタンパク質のアミノ酸配列から少なくとも２つの相関残基を特定する、
（Ｃ）（Ａ）で作成したタンパク質ライブラリーから、（Ｂ）で特定した相関残基を有するタンパク質を選択する、
（Ｄ）（Ｃ）で選択したタンパク質が、目的酵素活性を有するか否かを確認する。
【００２８】
（Ａ）における、類似するアミノ酸配列とは、例えば、BLASTpを用いて得られる、目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性が、５〜９０％の範囲であるアミノ酸配列であることができる。より類似するという観点からは、好ましくは１０〜７０％の範囲、より好ましくは１５〜５０％の範囲であるアミノ酸配列である。但し、（Ａ）において作成するタンパク質ライブラリーを構成するタンパク質の数が、適正になるように、上記配列同一性の範囲は適宜選択することができる。
【００２９】
（Ａ）において作成するタンパク質ライブラリーを構成するタンパク質の数に制限はない。但し、少なすぎると希望する目的酵素活性を有するタンパク質が得られない場合もあり、その一方で、数が多くなればなるほど操作に時間を要することになる。これらの点を考慮すると、タンパク質ライブラリーを構成するタンパク質の数は、例えば、１０〜１００，０００個の範囲、好ましくは１００〜５０，０００個の範囲、より好ましくは５００〜１０，０００個の範囲である。但し、これらはあくまでも例示であり、これらの範囲に限定される意図ではない。
【００３０】
（Ｂ）における相関残基は、目的酵素活性を有する既知のタンパク質及び（Ａ）で選択した少なくとも２つのタンパク質についてのシーケンスアラインメント結果から、保存性が例えば、５０％以下であり、協同してアミノ酸残基の種類が変化しているアミノ酸残基のペアを選択することで特定することができる。
保存性が低いことは、ClustalWなどに代表されるシーケンスアラインメントのソフトウェアを用いて、目的タンパク質とライブラリーの配列からなる、少なくとも2つの配列をアラインメントした際に、一致するアミノ酸残基の数が50%以下であることを意味し、そのような比較的保存性が低い（例えば、５０％以下）アミノ酸残基の中から、協同してアミノ酸残基の種類が変化しているアミノ酸残基のペアを選択する。比較的保存性が低いにも関わらず、協同してアミノ酸残基の種類が変化していることは、これらのアミノ酸残基が、このタンパク質の機能に重要な働きを有することを示唆するものであり、この機能に酵素活性が含まれるのであれば、これらのアミノ酸残基をメルクマーク (基準) として、目的酵素活性を有するタンパク質を探索することができる可能性があると推測されるからである。
【００３１】
保存性が５０％以下であり、かつ協同してアミノ酸残基の種類が変化しているアミノ酸残基のペアからなる相関残基の存在位置が、目的酵素活性を有する既知のタンパク質の立体構造における該タンパク質の活性中心からは、ある程度距離がある位置である場合、これまでに見出されていないタンパク質の活性を見出すことができる可能性が高いと考えられる。そこで、本発明では、（Ｂ）における相関残基は、相関残基を構成する２つの残基の何れもが、目的酵素活性を有する既知のタンパク質の立体構造において、該タンパク質の活性中心から、例えば、５Å以上離れた位置に存在する残基であることができる。
【００３２】
（Ｂ）において選択される相関残基は、少なくとも２つであり、好ましくは２つの相関残基を選択し、（Ｃ）で用いる。
【００３３】
（Ａ）における、アミノ酸配列が既知のタンパク質群は、特に制限はないが、例えば、タンパク質の登録機関に登録されたタンパク質並びに核酸配列の登録機関に登録された核酸配列によりコードされるタンパク質であることができる。タンパク質の登録機関は、ジーンバンク及びPubMedから成る群から選ばれる少なくとも1つであることができ、核酸配列の登録機関は、例えば、DDBjであることができる。但し、これらに限定される意図ではない。
【００３４】
（Ｃ）においては、（Ａ）で作成したタンパク質ライブラリーから、（Ｂ）で特定した相関残基を有するタンパク質を選択する。（Ａ）で作成したタンパク質ライブラリーに含まれるタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、（Ｂ）で特定した相関残基を有するタンパク質を選択することができる。
【００３５】
（Ｄ）においては、（Ｃ）で選択したタンパク質を合成し、目的酵素活性を有するか否かを確認する。タンパク質合成方法は、アミノ酸配列に基づいて常法により実施することができ、タンパク質の精製方法も常法により実施することができ、かつ精製した酵素が目的酵素活性を有するか否かの確認も、目的酵素活性に応じて、常法により実施することができる。
【００３６】
＜目的酵素活性を有するタンパク質の製造方法＞
本発明は、上記本発明の方法でスクリーニングされたタンパク質を調製することを含む、目的酵素活性を有するタンパク質の製造方法を包含する。即ち、上記本発明の方法でスクリーニングされたタンパク質を、そのアミノ酸配列に基づいて、公知の遺伝子工学的方法により調製することで、目的酵素活性を有するタンパク質を製造することができる。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法及び目的酵素活性を有するタンパク質の製造方法における目的酵素活性は、BRENDAに登録されている酵素群であって、既知の酵素活性から適宜選択することができる。また、既知の酵素活性に限らず、新規に見出された酵素活性を有するタンパク質であって、本発明のスクリーニング方法及び目的酵素活性を有するタンパク質の製造方法の対象となり得る。
【００３８】
酵素番号(EC number)が与えられている酵素は、例えば、EC番号1.-で表される酸化還元酵素、EC番号2.-で表される転移酵素、EC番号3.-で表される加水分解酵素、EC番号4.-で表される除去付加(脱離)酵素、EC番号5.-で表される異性化酵素及びEC番号6.-で表される合成酵素から成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素であることができる。
【００３９】
目的酵素活性の一例としては、L-スレオニンのCβ位に結合したヒドロキシ基を脱水素化する反応性、L-スレオニンに対して高い特異性及び反応性であることができる。
【００４０】
目的酵素活性が、TDH活性である場合を例に、スクリーニング方法及びタンパク質の製造方法について、以下に説明する。
【００４１】
新規なTDH活性を持つタンパク質をスクリーニングする方法、
(i)第一段階：BLASTpで目的酵素のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有するタンパク質からなるライブラリーを作成（スレオニン脱水素酵素として登録されていない配列も含む）。
(ii)第二段階：第一段階で得られたライブラリー中のタンパク質を用いて、少なくとも２つの相関残基を特定する。
(iii)第三段階：第二段階で特定した少なくとも２つの相関残基を持つアミノ酸配列を選抜する。具体的な例として、TDHについて以下に示す。
【００４２】
工程（Ａ）：CnTDHのアミノ酸配列を参照し、類似するアミノ酸配列をデータベースより5000個のタンパク質のアミノ酸配列を抽出した。CnTDHのアミノ酸配列をクエリー配列とし、BLASTpを用いてCnTDHのファミリー配列を抽出する方法で、最終的に5000個のCnTDHのファミリー配列を取得した。得られた配列を配列ライブラリーとして、工程(C)に用いた。データベースにはnon-redundant protein sequence (nr) を使用したが、使用するデータベースの種類は、BLASTpのウェブブラウザ上で選択できるものであれば限定されない。また使用可能なデータベースには、nr以外には,UniprotKB/Swiss-prot (swissprot), reference proteins (refseq_protein) などが挙げられる。アラインメントのスコア行列にはBLOSUM62を用いたが、使用するスコア行列の種類はBLASTpのウェブブラウザ上で選択できるものであれば限定されず、例えばBLOSUM80やPAM30なども使用可能である。
【００４３】
工程（Ｂ）：（Ａ）の5000個のアミノ酸配列を用いて、相関残基として4残基（Val143，Tyr188，Met214，Leu174）予測した。CnTDHの配列と工程(A)で作成したライブラリーからランダムに複数個(例えば、3〜9)の配列を抽出し、例えば、全4〜10配列からなる配列ペアを作成する。この過程を繰り返し行い、複数個の配列ペア (10以上) を作成する。すべての配列ペアについて、個別にアミノ酸シークエンスアラインメントを行う。アラインメントした結果を比較することで、相関残基を選別することができる。実施例の例では、解析の結果、CnTDH上の143-174, 188-214残基のペアが相関残基であることが予測された。なおCnTDHにおいてこれらの残基ペアはV143, L174, Y188, M214として保存されていた。CnTDHと同様の残基ペアを持つ配列は、CnTDHと同様の活性を有すると予測して、工程(C)を行うことができる。
【００４４】
尚、CnTDHのNAD+及びL-Thrが結合したX線結晶構造 (PDB ID: 3WMX) を基に得られる、V143, L174, Y188, M214と基質であるL-Thrとの距離を求めた。その結果、L-ThrのCβ炭素原子とV143, L174, Y188, M214のCα炭素原子の間の距離はそれぞれ12.7, 7.4, 11.6及び10.6Aであった。V143, L174, Y188, M214は、TDH活性を発揮するために必要な基質であるL-Thrとの距離が5A以上離れているアミノ酸残基であった。
【００４５】
工程（Ｃ）：BLASTpから抽出したCnTDHのファミリーに属する個々のアミノ酸配列とCnTDHについて配列アラインメントを行い、CnTDHの143, 174, 188, 及び214位に一致するアミノ酸がVal, Leu, Tyr及びMetになっている配列を持つ85個のタンパク質をTDH候補として選抜した。工程(A)で作成した5000個のアミノ酸配列ライブラリーから、一つずつアミノ酸配列を抽出し、CnTDHのアミノ酸配列との配列ペアを作成し、作成した5000個の配列ペアについて、アミノ酸シークエンスアラインメントを行った。次に、CnTDHのアミノ酸配列を基準にして、143, 174, 188及び214位のアミノ酸残基がVal, Leu, Tyr及びMetであるアミノ酸配列のタンパク質を選別した。この方法で、最終的に5000個のアミノ酸配列のタンパク質から、85個のタンパク質のアミノ酸配列を抽出し、TDH候補配列ライブラリーと定義した（抽出したアミノ酸配列のジェンバンク登録番号を表1に示す）。アミノ酸シークエンスアラインメントを行うためには、例えばClustalWなどのソフトウェアが使用できる。
【００４６】
【表１】
2018088864.tif 000002
【００４７】
【表１−２】
2018088864.tif 000003
【００４８】
工程（Ｄ）：この85個のTDH候補ライブラリーのアミノ酸配列とCnTDHの配列を比較して相同性の低い（CnTDHと50%以下の配列相同性）３候補を選び、各酵素のN-末端にHis-tagを付して大腸菌（E. coli）で発現させた後、精製して諸性質を調べた。尚、相同性が低いほどTDHと異なる配列なので、上記3種類でTDH活性があれば、選抜した85個の配列もTDH活性を有する可能性が高いと考えられる。
【００４９】
工程(C)で選抜した85個のタンパク質のTDH候補配列ライブラリーからCnTDHと配列相同性が50%以下であることを基準にしてZP_09413997.1：サーモビブリオ べロックス (Thermanaerovibrio velox) DSM 12556が産生するタンパク質のアミノ酸配列 (以下TvTDH)、YP_003318149.1：サーモアンアエロビブリオ アシダミノボランス (Thermanaerovibrio acidaminovorans) DSM 6589由来のタンパク質のアミノ酸配列 (以下TaTDH)、ADD93128.1：メタゲノムライブラリーから得られたタンパク質のアミノ酸配列(以下mtTDH)を選び、本タンパク質の遺伝子を大腸菌で発現させた後、得られたタンパク質をそれぞれ均一状態に精製し、基質特異性、熱安定性、最適ｐＨおよび最適温度を調べて、酵素化学的諸性質を明らかにして選抜した候補の特性を解明した。
その結果、TvTDH、TaTDH、mtTDHのアミノ酸配列は、配列表の配列番号1〜3に記載の通りであり、表2に示すように、いずれのタンパク質もCnTDHと50%以下の配列相同性であり、金属イオンを補因子として要求しなかった。また、実施例７に示すように、既存酵素よりもNAD+に対する親和性が高く、酵素の熱安定性も優れていた。
【００５０】
【表２】
2018088864.tif 000004
【００５１】
尚、TvoTDHのアミノ酸配列は、スレオニンに特異的な酵素として報告されている（Yoneda, K. et al., J. Biol. Chem., 2012, 12966-12974）。但し、本発明で示した143, 174, 188及び214位のアミノ酸残基がVal, Leu, Tyr及びMetではないアミノ酸配列のタンパク質である。さらに、TvTDH、TaTDH、mtTDHとは、50%以下の配列同一性である。ThrDH_4fixは、タンパク質自体が新規である。
【００５２】
＜タンパク質＞
上記方法により、請求項１及び２に記載のタンパク質を特定された。
即ち、本発明は、下記（１）〜（３）の何れかのＬ-スレオニン分析用タンパク質（請求項１、以下、タンパク質Ａと呼ぶことがある）を包含する。
（１）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（２）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１から５０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（３）配列表の配列番号１〜３、５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００５３】
本発明は、下記（１）〜（３）の何れかのタンパク質（請求項２、ThrDH_4fix、以下、タンパク質Ｂと呼ぶことがある）を包含する。
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から５０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質、
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００５４】
さらに本発明は、上記（１）〜（３）の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにこのポリヌクレオチドをプラスミドに挿入した組み換えベクターを包含する。加えて、本発明は、宿主及び該宿主に含まれる上記ポリヌクレオチド又は上記組み換えベクターを含む形質転換体も包含する。
【００５５】
本発明は、上記形質転換体又は上記タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された宿主を培養し、培養物からＬ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、Ｌ-スレオニン脱水素酵素の製造方法も包含する。
【００５６】
＜Ｌ-スレオニン脱水素酵素の調製方法＞
加えて、上記で選抜した85個のタンパク質の内、上記タンパク質Ａ及びＢ以外のタンパク質も、Ｌ-スレオニン脱水素酵素である可能性は高く、本発明は、配列表の配列番号１１〜８６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質から、Ｌ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質をスクリーニングする工程を含む、Ｌ-スレオニン脱水素酵素の調製方法を包含する。
【００５７】
配列表の配列番号１１〜８６のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質から、Ｌ-スレオニン脱水素酵素活性を有するタンパク質をスクリーニングする方法は、前記タンパク質を合成し、かつ得られたタンパク質を必要により精製した後に、Ｌ-スレオニン脱水素酵素活性を有することを確認することで実施できる。タンパク質の合成、精製、活性試験は常法により実施できる。尚、タンパク質の調製方法等について後述する。
【００５８】
＜目的酵素活性を有する人工タンパク質の製造方法＞
本発明は、以下の（Ｅ）〜（Ｇ）の段階を含む目的酵素活性を有する人工タンパク質の製造方法を包含する。
（Ｅ）目的酵素活性を有する複数のタンパク質からなる候補ライブラリーを作成し、
但し、前記候補ライブラリーに含まれるタンパク質は、目的酵素活性を有することが推定されるタンパク質であっても良い、
（Ｆ）前記候補ライブラリーと目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列とをアラインメントして、最も高頻度に出現するアミノ酸残基をコンセンサス残基として同定し、
（Ｇ）前記コンセンサス残基のみで構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質を設計し、設計したタンパク質を調製する。
【００５９】
（Ｅ）における候補ライブラリーは、前記本発明の方法でスクリーニングした目的酵素活性を有する複数のタンパク質からなることができる。但し、（Ｅ）における候補ライブラリーは、これらのタンパク質に限定される意図ではなく、その他の目的酵素活性を有する複数のタンパク質からから適宜選択することもできる。
【００６０】
（Ｆ）におけるコンセンサス残基の同定は、例えば、マルチプルシーケンスアラインメントを実行可能なソフトウェアを用いて行うことができる。そのようなソフトウェアは、例えば、INTMSAlign又はClustalWであることができる。INTMSAlignの詳細は、Nakano, Shogo and Asano, Yasuhisa, Sci. rep. 5: 8193 (2015) （参考文献1）を参照のこと。
ClustalWの詳細は、Thompson JD et al., Nucleic. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994) を参照のこと。
【００６１】
人工タンパク質の製造方法を、前述のTDHの例の続きとして以下に説明する。
前述の（Ｄ）の次に、85個のTDH候補ライブラリーのアミノ酸配列とCnTDHの配列を比較して、各アミノ酸残基において最も高頻度に出現するアミノ酸で作成した配列（コンセンサス残基による配列と称し、自然界に存在しないアミノ酸配列）を作成し、上記と同様に大腸菌で発現させた後、精製して諸性質を調べた。コンセンサス残基による配列を有する人工タンパク質は、L-Thrに特異的に作用する酵素であることが明らかになった。
【００６２】
本発明の人工タンパク質の製造方法における目的酵素活性は、L-スレオニンのCβ位に結合したヒドロキシ基を脱水素化する反応性を有し、L-スレオニンに対して高い特異性及び反応性を示すことのみならず、BRENDAに登録されている酵素群であって、前記の酵素番号(EC number)が与えられている酵素の活性から適宜選択することができる。例えば、EC番号1.-で表される酸化還元酵素、EC番号2.-で表される転移酵素、EC番号3.-で表される加水分解酵素、EC番号4.-で表される除去付加(脱離)酵素、EC番号5.-で表される異性化酵素及びEC番号6.-で表される合成酵素から成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素であることができる。
【００６３】
工程(E)では、上記の本発明の.スクリーニング法」の工程 (A-D) と同じ手順を実施して、例えば、表1のTDH候補ライブラリーを作成する。続いてINTMSAlignやClustalWなどのマルチプルシーケンスアラインメントを実行可能なソフトウェアを用いて表1のTDH候補ライブラリーとCnTDHのアミノ酸列を解析してコンセンサス残基を同定する工程（下記の工程(F)）、および同定したコンセンサス残基のみで構成されるアミノ酸配列を設計する工程（下記の工程(G)）を行うものであり、本方法の工程 (F)と工程 (G)は下記の通りである。
【００６４】
工程(G)
CnTDHとTDH候補ライブラリーを用いてソフトウェア、INTMSAlign (参考文献1)によりアミノ酸配列解析を行い、TDH候補ライブラリーのアミノ酸配列をCnTDHの配列とともにアラインメントし、最も高頻度に出現するアミノ酸残基を、CnTDHの全ての残基番号について同定した。この手法で同定したアミノ酸残基をコンセンサス残基とした。
【００６５】
工程(F)
CnTDHの全てのアミノ酸残基を、工程(D)で同定したコンセンサス残基に置換したアミノ酸配列を作成した。本アミノ酸配列は、配列表の配列番号4に記載の配列（ThrDH_4fix）であり、表2に示すように、CnTDHのと配列相同性は70%以下であった。次に、本配列の遺伝子を合成して大腸菌で発現させた後、得られたタンパク質を精製し、基質特異性、熱安定性、最適ｐＨおよび最適温度を調べて、酵素化学的諸性質を明らかにして特性を解明した。その結果、本配列のタンパク質は、補酵素としNAD+を要求し、L-Thrに特異的であり、酵素の活性には金属イオンを補因子として要求しなかった。また、実施例７に示すように、既存酵素よりもNAD+に対する親和性が高く、酵素の熱安定性も優れていた。
【００６６】
本発明において、L-スレオニン脱水素酵素やその方の酵素の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよく、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するように当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質（例えば、L-スレオニン脱水素酵素）を産生することができる。
【００６７】
本発明のL-スレオニン脱水素酵素をコードする遺伝子の取得方法は特に限定されない。本発明のL-スレオニン脱水素酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列表に記載のアミノ酸配列に基づいて得られる塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００６８】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００６９】
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００７０】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌（E. coli）のlac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００７１】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の遺伝子を含む組換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。本発明の遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００７２】
本発明の遺伝子を含む組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００７３】
本発明の遺伝子を含む組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の遺伝子を含む組換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００７４】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌（E. coli）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００７５】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００７６】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００７７】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
【００７８】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００７９】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明のL-スレオニン脱水素酵素を精製標品として得ることができる。
【００８０】
＜L-スレオニンの分析方法＞
本発明は、Ｌ-スレオニン脱水素酵素を用いて被検体中のL-スレオニン濃度を測定する、L-スレオニンの分析方法を包含する。この方法は、被検体を含有するサンプルと本発明のL-スレオニン脱水素酵素および補酵素NAD+を混合し、所定時間後にNADH量を分析することを含むものである。
本発明のL-スレオニン脱水素酵素とは、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、上記本発明の方法で調製したタンパク質を包含する。
【００８１】
被検体は、特に制限はないが、例えば、ヒト血液や飲食品等であることができる。
【００８２】
被検体を含有するサンプルは、被検体を例えば、L-スレオニン脱水素酵素の至適ｐＨを示す緩衝液に混合したものであることできる。L-スレオニン脱水素酵素の至適ｐＨは、10.0である。分析の際には、被検体を含有するサンプルに所定量のL-スレオニン脱水素酵素を添加する。L-スレオニン脱水素酵素の添加量は、L-スレオニン脱水素酵素の精製度や力価等を考慮して適宜決定でき、例えば、0.001〜1U/200μLの範囲とすることができる。
【００８３】
被検体を含有するサンプルには、L-スレオニン脱水素酵素に加えて補酵素NAD+を混合する。補酵素NAD+は、ＮＡＤの塩、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩であることができる。補酵素NAD+の混合量は、サンプル中のL-スレオニン濃度やL-スレオニン脱水素酵素の力価等を考慮して適宜決定でき、例えば、0.001〜3mMの範囲とすることができる。尚、NAD+はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであって、β-NAD+と表記されることもあり、両者は同義である。また、NADP+はβ-NADP+と表記されることもあり、両者は同義である。
【００８４】
L-スレオニン脱水素酵素および補酵素NAD+を混合した後、所定時間後にNADH量を分析する。所定時間は、反応温度や被検体に含まれるL-スレオニン濃度、分析の精度等を考慮して適宜決定できる。通常は、例えば、５秒〜６０分の範囲、好ましくは１分〜６０分の範囲であることができる。
【００８５】
所定時間経過後、L-スレオニン脱水素酵素により生成されたNADH量を分析する。NADH量を分析は、例えば、340nmにおける吸光度(A340)測定により直接的に実施できる他、NADHにより色素を生成させる方法や、NADHにより蛍光を発生させる方法を用いることもできる。NADHにより色素を生成させる方法としては、例えば、NADH-テトラゾリウム系の電子キャリヤーを用いる方法を挙げることができ、電子キャリヤーとしては、例えば、PMS（フェナジンメトサルフェート、＋0.08Ｖ）やメルドラブルーを利用できる。NADHにより色素を生成させる方法としては、例えば、ジアホラーゼを用いる方法も挙げることかできる。ジアホラーゼを用いる方法では、ジアホラーゼがNADHの酸化と色素の還元を触媒し、発色を得る。色素としては、INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride), NBT (nitroblue tetrazolium) 等を利用できる。また、ジアホラーゼを用いる方法では、色素としてレサズリン[resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide)]のような蛍光色素を用いることもできる。
【００８６】
本発明のL-スレオニンの分析方法は、マイクロプレートを用いる、所謂、マイクロプレートアッセイに適している。マイクロプレートとしては、例えば、96-穴マイクロプレートを用いることかできる、穴数は、特に制限はない。96-穴マイクロプレートを用いる場合には、反応総容量を例えば、200μLとし、100 mM グリシンKCl-KOH 緩衝液（pH 10.0）、2.5 mM NAD+、脱蛋白質化されたサンプルを添加する。反応は本発明の酵素を添加することで開始される。例えば、30℃で10-30分保温し、エンドポイントの340 nmにおける吸光度をUVマイクロプレート分光光度計で測定することができる。吸光度の変化(ΔA)は、最終吸光度から対照値を引いた値として得られる。脱蛋白質化されたサンプルの調製は、例えば、Centricon YM-10 による限外ろ過により実施できる。
【００８７】
本発明のL-スレオニンの分析方法は、上記のようにNADH量を分析する以外に、L-スレオニン脱水素酵素によりL-スレオニンから生成された2-アミノ-3-オキソ酪酸の量を分析することでも実施できる。上記スキーム１に示すように、L-スレオニンから生成された2-アミノ-3-オキソ酪酸(α-amino-β-ketobutyric acid)は、非酵素的に脱炭酸してアミノアセトンを生成する。このアミノアセトンは、モノアミンオキシダーゼにより酸化することでメチルグリオキザルになるが、その際、アンモニアと過酸化水素が生成する。これら生成したアンモニアまたは過酸化水素を既知の定量方法で定量することで、L-スレオニンを定量することができる。
【００８８】
本発明のL-スレオニンの分析方法は、上記のようにNADH量または2-アミノ-3-オキソ酪酸の量を分析する以外に、上記スキーム１に示すようにL-スレオニン脱水素酵素により、2-アミノ-3-オキソ酪酸およびNADHと共に生成するH+の量を分析することでも実施できる。H+の量の分析は既知の方法を利用できる。
【実施例】
【００８９】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００９０】
実施例１
アミノ酸配列データベースを用いてTDH活性を有する新規なタンパク質の迅速で簡便なスクリーニング法
アミノ酸配列データベースを用いてTDH活性を有する新規なタンパク質の迅速で簡便なスクリーニングは、(i)CnTDHのファミリーからなる配列ライブラリーの作製、(ii)基質であるL-Thrとの距離が5A以上離れているアミノ酸残基で、TDH活性を発揮するために必要なアミノ酸残基の選別、(iii)配列ライブラリーからTDH候補配列の抽出の3つの工程で行った。詳細な方法は以下の通りである。
【００９１】
工程１  CnTDHのファミリーからなる配列ライブラリーの作製
CnTDHのアミノ酸配列 (FASTA形式) をPubMedから入手し（CnTDH配列のジェンバンクIDは318609955）、このCnTDH配列をクエリー配列とし、以下の手順でBLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) を用いてCnTDHのファミリー配列を検索し抽出した。まず、CnTDH配列をBLASTpの"Enter Query Sequence"に入力した。次に、データベースとしてnon-redundant protein sequence (nr) 、AlgorithmとしてBLASTpを選択し、Webサイト上の"Algorithm parameters"のタブをクリックして、Max target sequencesを5000、Expected thresholdを1.0E-3を入力した。アラインメントのスコア行列にはBLOSUM62を用い、その他のパラメータは初期値のまま、検索を実行した。検索完了後に出現した画面について、"Descriptions" の項目が見えるまでスクロールバーを動かしたのち、"Select:" の項目の横にある "All" のタブをクリックした。次いで "Download" のタブをクリックし、"Fasta (complete sequence)" を選択して、"Continue" のタブをクリックしてCnTDHのファミリー配列を入手した。以上の本操作により、最終的に5000個のCnTDHのファミリー配列を取得し、これを配列ライブラリーとした。
【００９２】
工程２  TDH活性を発揮するために必要なアミノ酸残基となりうる相関残基の選別
CnTDHの配列と工程1で作成したライブラリーからランダムに複数個(3〜9)の配列を抽出した、全4〜10配列からなる配列ペアを作成する。この過程を繰り返し行い、複数個の配列ペア (10以上) を作成する。すべての配列ペアについて、個別にアミノ酸シークエンスアラインメントを行う。アラインメントした結果を比較し、相関残基を選別する。解析の結果、CnTDH上の143-174, 188-214残基のペアが相関残基であることが予測された。なおCnTDHにおいてこれらの残基ペアはVal143, Leu174, Tyr188, Met214として保存されていた。CnTDHと同様の残基ペアを持つ配列は、CnTDHと同様の活性を有すると予測して、工程3を行った。
【００９３】
考察１：Val143は、基質であるL-スレオニンのヒドロキシ基を直接脱水素化するアミノ酸残基（Tyr144）に隣接しており、さらにCnTDHの2量体形成部位の境界領域に位置しているアミノ酸残基である。よって、本残基はTyr144の動きに重要な役割を果たしていると予測し、本残基はCnTDHの活性に影響を及ぼす可能性が高いと考えた。
考察２：Tyr188とMet214は、基質であるL-スレオニンのアミノ基と水素結合を形成しているThr186の付近に存在しており、Tyr188とMet214の側鎖がThr186の側鎖との間に相互作用を生じさせ、基質であるL-スレオニンと結合できる環境を間接的に作っていると予測した。よって、Tyr188とMet214がCnTDHの活性に影響を及ぼすと考えた。
考察３：Leu174は、補酵素NAD+の近傍に位置しており、ニコチン環と相互作用して、基質であるL-スレオニンとCnTDHが反応できる環境を間接的に作ると予測した。よって、Leu174もCnTDHの活性発現に重要と考えた。
【００９４】
工程３  配列ライブラリーからTDH候補配列の抽出
工程(i)で作成した配列ライブラリーからTDH候補配列を抽出する方法の原理は、図2に示した。具体的には、まず5000個の配列の一番上の配列とCnTDHの配列をペアとするテキストファイル（temporary.fasta）を作成し、CentOS 6をオペレーションシステムとするコンピュータの、ローカル環境にインストールしたclustalw2を用いてtemporary.fastaの配列アラインメントを行った。このアラインメントで得られたtemporary.alnをgeditなどのテキストエディタで開き、アラインメントを行った配列中に、CnTDHのアミノ酸配列を基準として、工程(ii)で選抜した143, 174, 188及び214位がVal, Leu, Tyr及びMetで保存されているかを調べ、4残基が全て保存されている場合に限り、CnTDHとペアを作った配列として抽出して保存した。この作業を、5000個の配列すべてについて行い、最終的に工程(i)で作成した配列ライブラリー（5000個のアミノ酸配列）から、表1に示す85個の配列を選別した（TDH候補配列ライブラリーと定義した）。以上の作業は、Python script (Seqclustering.py) を作成して、コマンドライン上から実行した。
【００９５】
実施例２
アミノ酸配列データベースからL-スレオニン脱水素酵素を人工設計する方法
アミノ酸配列データベースからL-スレオニン脱水素酵素 (TDH) を人工設計するために、(i)TDH候補配列ライブラリーからTDHコンセンサス残基を同定し、続いて(ii)完全コンセンサスのタンパク質を設計し、さらに設計したタンパク質を大腸菌で発現させて酵素活性を確認することにより本発明を完成させた。具体的な手順を以下に示す。
【００９６】
工程１  TDH候補配列ライブラリーを用いたTDHコンセンサス配列の作成法
TDH候補配列ライブラリーからTDHコンセンサス残基を同定するために、CentOS 6をオペレーションシステムとするコンピュータの、ローカル環境にINTMSAlign (参考文献1参照) をインストールし、計算環境を整えた。次に、コマンドライン上から起動したINTMSAlign GUIに次の情報を入力した。まずINTMSAlign GUIの一行目の"dir…"タブから、TDH配列候補ライブラリーを選択し入力した。二行目の"dir…"タブからCnTDHの配列を選択・入力した。3行目はBLOSUMを選択した。4行目には500、5行目には8を入力し、6行目は初期設定のままにした。その後7行目に出力ファイルの名前を入力し、OKのタブをクリックすることでINTMSAlignを実行した。以上の操作を行うことにより、図3の形式を持つINTMSAlignの出力ファイルを得た(図3)。続いて、出力ファイルを開き、TDH候補配列ライブラリーの各アミノ酸配列からTDHのコンセンサス残基を決定した。コンセンサス残基は、INTMSAlignの解析で最も出現頻度が高かったアミノ酸残基と定義した（図3にその旨を示した）。
【００９７】
工程２  完全コンセンサスタンパク質ThrDH_4fixの設計方法
図3の出力ファイルを基に、CnTDHのアミノ酸配列を全てコンセンサス残基に置換し、完全コンセンサス配列を設計し、その配列をThrDH_4fixとした。完全コンセンサス配列の設計は、自作のPythonスクリプト (seqcreator_INTMSAlign.py) を用いて行った。設計した完全コンセンサス配列に対応する遺伝子配列を合成し、実施例6に示す方法で発現させ、性質を確認した。
【００９８】
実施例３
サーモビブリオ べロックス (Thermanaerovibrio velox) DSM 12556から選抜したタンパク質 (TvTDH)の生産と精製
実施例１で選抜した85個のタンパク質のTDH候補配列ライブラリーからCnTDHと配列相同性が50%以下であることを基準にして選んだZP_09413997.1：サーモビブリオ べロックス (Thermanaerovibrio velox) DSM 12556が産生するタンパク質のアミノ酸配列 (TvTDH，配列番号1のアミノ酸配列)をBackTranseq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/) を用いて大腸菌 (E. coli) のコドン使用頻度に適合する塩基配列に変換した。そして、この塩基配列の5'末端にNdeI及び3'末端に終止コドンとBamHIの切断配列を導入した塩基配列を作製し、全塩基配列を合成した。次に、この塩基配列を組み込んだpIDTSMARTベクター(pIDSMART-TvTDH) を、JM109を宿主としてサブクローニングした。サブクローニングされたpIDSMART-TvTDHを制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理したpET15(+)とライゲーションし、BL21(DE3) に導入した。尚、発現された酵素を簡便に精製するために、プラスミドはN末端に6残基のヒスチジンタグを導入した。
【００９９】
以上の方法で作成した発現株 [BL21(DE3)/pET15b(+)TvTDH] を終濃度50μg/mLのカルベニシリンを含むLB培地 (2 L) に植菌し、37℃で8時間と23℃で1時間培養した後、終濃度0.5mMのIPTGを加えて、さらに23℃で20時間培養した。培養液を7000×g, 10分間遠心分離後、LB液体培地を取り除き、80 mLの10mM リン酸カリウム (pH 7.0) と50mM NaClを含むバッファーに懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を12000×g, 40分遠心分離し、上清画分を粗酵素液とした。粗酵素液は直ちにNi Sepharose 6 Fast Flowカラム（GE Healthcare社製）に吸着させ、50 mLのバッファーで洗浄した後、10, 40, 70, 100, 300, 500mMのイミダゾールを含むバッファーを用いて溶出した。各溶出画分はSDS-PAGEを行い、35kDa付近にバンドを持つ溶出画分を回収した。必要に応じて回収した画分を濃縮し、Superdex75pg（GE Healthcare社製）を用いて精製を行った。
【０１００】
実施例４
サーモアンアエロビブリオ アシダミノボランス (Thermanaerovibrio acidaminovorans) DSM 6589から選抜したタンパク質 (TaTDH) の生産と精製
実施例１で選抜した85個のタンパク質のTDH候補配列ライブラリーからCnTDHと配列相同性が50%以下であることを基準にして選んだYP_003318149.1：サーモアンアエロビブリオ アシダミノボランス (Thermanaerovibrio acidaminovorans) DSM 6589由来のタンパク質のアミノ酸配列 (TaTDH, 配列番号2のアミノ酸配列) を実施例３と同様の方法で大腸菌のコドン使用頻度に適合する塩基配列に変換した。そして、この塩基配列の5'末端にNdeI及び3'末端に終止コドンとBamHIの切断配列を導入した塩基配列を作製し、全塩基配列を合成した。次にこの塩基配列を組み込んだpIDTSMARTベクター (pIDSMART-TaTDH)を、JM109を宿主としてサブクローニングした。サブクローニングされたpIDSMART-TaTDHを制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理したpET15(+)とライゲーションし、BL21(DE3) に導入した。尚、発現された酵素を簡便に精製するために、プラスミドはN末端に6残基のヒスチジンタグを導入した。以上の方法で作成した発現株 [BL21(DE3)/pET15b(+)TaTDH] を終濃度50μg/mLのカルベニシリンを含むLB培地 (2 L) に植菌し、37℃で8時間と23℃で1時間培養した後、終濃度0.5mMのIPTGを加えて、さらに23℃で20時間培養した。培養液を7000×g, 10分間遠心分離後、LB液体培地を取り除き、80 mLの10mM リン酸カリウム (pH 7.0) と50mM NaClを含むバッファーに懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を12000×g, 40分遠心分離し、上清画分を粗酵素液とした。粗酵素液は直ちにNi Sepharose 6 Fast Flowカラム（GE Healthcare社製）に吸着させ、50 mLのバッファーで洗浄した後、10, 40, 70, 100, 300, 500 mMのイミダゾールを含むバッファーを用いて溶出した。各溶出画分はSDS-PAGEを行い、35kDa付近にバンドを持つ溶出画分を回収した。必要に応じて回収した画分を濃縮し、Superdex75pg（GE Healthcare社製）を用いて精製を行った。
【０１０１】
実施例５
メタゲノムライブラリーから得られたタンパク質 (mtTDH) の生産と精製
実施例１で選抜した85個のタンパク質のTDH候補配列ライブラリーからADD93128.1：メタゲノムライブラリーから得られたタンパク質のアミノ酸配 (mtTDH, 配列番号3のアミノ酸配列) を実施例４と同様の方法で大腸菌のコドン使用頻度に適合する塩基配列に変換した。そして、この塩基配列の5'末端にNdeI及び3'末端に終止コドンとBamHIの切断配列を導入した塩基配列を作製し、全塩基配列を合成した。次に、この塩基配列を組み込んだpIDTSMARTベクター (pIDSMART-mtTDH) を、JM109を宿主としてサブクローニングした。サブクローニングされたpIDSMART-mtTDHを制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理したpET15(+)とライゲーションし、BL21(DE3) に導入した。尚、発現された酵素を簡便に精製するために、プラスミドはN末端に6残基のヒスチジンタグを導入した。以上の方法で作成した発現株[BL21(DE3)/pET15b(+)mtTDH] を終濃度50μg/mLのカルベニシリンを含むLB培地 (2 L) に植菌し、37℃で8時間と23℃で1時間培養した後、終濃度0.5mMのIPTGを加えて、さらに23℃で20時間培養した。培養液を7000 g, 10分間遠心分離後、LB液体培地を取り除き、80 mLの10mM リン酸カリウム (pH 7.0) と50mM NaClを含むバッファーに懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を12000×g, 40分遠心分離し、上清画分を粗酵素液とした。粗酵素液は直ちにNi Sepharose 6 Fast Flowカラム（GE Healthcare社製）に吸着させ、50 mLのバッファーで洗浄した後、10, 40, 70, 100, 300, 500 mMのイミダゾールを含むバッファーを用いて溶出した。各溶出画分はSDS-PAGEを行い、35kDa付近にバンドを持つ画分を回収した。必要に応じて回収した画分を濃縮し、Superdex75pg（GE Healthcare社製）を用いて精製を行った。
【０１０２】
実施例５−２
実施例1で選抜した85個のタンパク質のTDH候補配列ライブラリーから、以下の6つのタンパク質のアミノ酸配列を取得した。
・340787735: NAD-dependent epimerase/dehydratase [Collimonas fungivorans Ter331] CfuTDH
・390941828: nucleoside-diphosphate-sugar epimerase [Belliella baltica DSM 15883] BbaTDH
・375012635: nucleoside-diphosphate-sugar epimerase [Owenweeksia hongkongensis DSM 17368] OhoTDH
・373952659: NAD-dependent epimerase/dehydratase [Mucilaginibacter paludis DSM 18603] MpaTDH
・365875058: UDP-glucose 4-epimerase related protein [Elizabethkingia anophelis Ag1] EanTDH
・343085198: NAD-dependent epimerase/dehydratase [Cyclobacterium marinum DSM 745] CmaTDH
【０１０３】
これら6つのタンパク質のアミノ酸配列を実施例4と同様の方法で大腸菌のコドン使用頻度に適合する塩基配列に変換した。そして塩基配列の5'末端及び3'末端に終止コドンとBamHIの切断配列を導入した塩基配列を設計し、全塩基配列を合成した。次に、この塩基配列を、InFusion法を用いてそれぞれpET15bベクターに組み込んだ (pET15b-TDHs)。作成した発現プラスミドはBL21(DE3)に導入した。以上の方法で作成した発現株 [BL21(DE3)/pET15b-TDHs] を終濃度50μg/mLのカルベニシリンを含むLB培地 (5mL) に植菌し、37℃にて8時間と23℃で1時間培養したのち、終濃度0.5mMのIPTGを加えて、更に23℃で20時間培養した。培養液を7000×g, 10分間遠心分離後、LB液体培地を取り除き、500μLの10 mMリン酸カリウム (pH 7.0) と50 mM NaClを含むバッファーに懸濁後、超音波ホモジナイザー (Bioruptor UCD-250 (TOSHO DENKI CO., LTD) にて細胞を破砕した。この破砕液を12000×g, 10分間遠心分離したのち、上清画分を脱塩カラム (PD SpinTrap G-25, GE Healthcare) に通して脱塩したものを粗酵素液とした。
【０１０４】
実施例６
アミノ酸配列データベースから設計したコンセンサス配列タンパク質（ThrDH_4fix）の生産と精製
実施例２のアミノ酸配列データベースから設計したThrDH_4fix（配列番号4のアミノ酸配列）を実施例４と同様の方法で大腸菌のコドン使用頻度に適合する塩基配列に変換した。そして、この塩基配列の5'末端にNdeI及び3'末端に終止コドンとBamHIの切断配列を導入した塩基配列を作製し、全塩基配列を合成した。次にこの塩基配列を組み込んだpIDTSMARTベクター (pIDSMART-ThrDH_4fix) を、JM109を宿主としてサブクローニングした。サブクローニングされたpIDSMART-ThrDH_4fixを制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理したpET15(+)とライゲーションし、BL21(DE3) に導入した。尚、発現された酵素を簡便に精製するために、プラスミドはN末端に6残基のヒスチジンタグを導入した。以上の方法で作成した発現株[BL21(DE3)/pET15b(+)ThrDH_4fix] を終濃度50μg/mLのカルベニシリンを含むLB培地 (2 L) に植菌し、37℃で8時間と23℃で1時間培養した後、終濃度0.5mMのIPTGを加えて、さらに23℃で20時間培養した。培養液を7000 × g, 10分間遠心分離後、LB液体培地を取り除き、80 mLの10mM リン酸カリウム (pH 7.0) と50mM NaClを含むバッファーに懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を12000×g, 40分遠心分離し、上清画分を粗酵素液とした。粗酵素液は直ちにNi Sepharose 6 Fast Flowカラム（GE Healthcare社製）に吸着させ、50 mLのバッファーで洗浄した後、10, 40, 70, 100, 300, 500 mMのイミダゾールを含むバッファーを用いて溶出した。各溶出画分はSDS-PAGEを行い、35kDa付近にバンドを持つ画分を回収した。必要に応じて回収した画分を濃縮し、Superdex75pg（GE Healthcare社製）を用いて精製を行った。
【０１０５】
実施例７
実施例３〜６で均一状態に精製したタンパク質を用いて下記の方法で (i)基質特異性、(ii)L-スレオニンに対する反応動力学定数、(iii)熱安定性、及び (iv)至適pHを調べて、酵素化学的諸性質を明らかにした。尚、L-スレオニン脱水素酵素 (TDH) 活性は、2.5 mM NAD+ と100 mM L-スレオニンを含む100 mM グリシン-KOH 緩衝液 (pH 10.5) に酵素溶液を添加して反応を開始し、30℃で340nmの吸光度変化量を測定する方法で求めた（反応液量：0.2 mL）。タンパク質濃度は280nmの吸光度を測定する方法（タンパク質濃度は、表3のパラメータを用いた）、あるいはBioRad protein assayを用いてBSAの検量線を基に算出した。
【０１０６】
（ｉ）基質特異性
実施例３〜６で精製したタンパク質（配列1 〜 4のタンパク質）を用いて、L-スレオニンを含む20種類のタンパク質構成L-アミノ酸およびD-スレオニンに対する活性を検討した。酵素活性は、2.5 mM NAD+と50 mM 各アミノ酸を含む100 mM グリシン-KOH緩衝液 (pH 10.0) を30℃にて3分間保温した後、酵素液を加えて反応を開始し、直ちに、紫外可視分光光度計 (DU800 spectrometer, Beckman) で340 nmの吸光度変化を測定して求めた。その結果、表3に示すように、配列1〜4のタンパク質は、いずれもL-スレオニンに作用したが、D-スレオニン、及びL-スレオニン以外のL-アミノ酸には活性を示さなかった。よって、実施例３〜６で精製したタンパク質（配列1-4のタンパク質）はL-スレオニンに特異的に作用する酵素であることが明らかとなった。
【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
（ｉｉ）配列1 〜 4のタンパク質のL-スレオニンおよびNAD+に対する反応動力学定数
実施例３〜６で精製したタンパク質（配列1〜4のタンパク質）を用いて、L-スレオニン及びNAD+に対する反応速度定数を非線形最小二乗法によるカーブフィッティングにより算出した。L-スレオニンに対する最大速度 (kcat [/sec]) とミカエリス定数 (Km, L-Thr) は、酵素活性測定と同じ条件で、2.5 mM NAD+共存下で、L-スレオニン濃度を2-100 mMの範囲で変化させて求めた。また、NAD+ に対するミカエリス定数 (Km, NAD+) は、50 mM L-スレオニン共存下で、NAD+ 濃度を5-500μMの範囲で変化させて求めた。その結果、表6に示すように、配列1-4の酵素は、いずれもNAD+ に対するKm値がCnThrDHおよび TvoTDHよりも著しく低い値であり、NAD+ との親和性が高いので、L-スレオニン測定におけるNAD+添加量は、従来の1/3以下の濃度で良いことが明らかになった。また、配列1-4の最大速度は、いずれも20.0 /sec以上の値を示し、L-スレオニン測定に利用できることが示唆された。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
（ｉｉｉ）熱安定性
実施例３〜６で精製したタンパク質（配列1〜4のタンパク質）をpH 7.0で、30〜80℃，5分間加温し、直ちに氷浴にて冷却した。この加熱処理した酵素液の酵素活性を実施例７の方法で測定し、その残存する酵素活性を求めた。その結果、TvTDHとTaTDHは65℃ 以下(図4及び図5)、ThrDH_4fixは60℃以下 (図7) で50%以上の活性が残存していた。また、mtTDHは40℃の加温で、残存活性は30%に低下したが、(図6、実線)、20% (w/v)グルコースを添加すると、40℃の加温でも50%以上活性が残存した。一方、既存のCnTDHおよびFfTDHは50℃で5分間加温すると酵素活性は、著しく失活した (特許文献1)。従って、本発明で取得したTvTDH、TaTDH及びThrDH_4fixは既存のCnThrDHおよびFfTDHよりも熱安定性に優れた酵素であることが明らかになった。
【０１１１】
（ｉｖ）最適pH
実施例３〜６で精製したタンパク質（配列1〜4のタンパク質）を用いて、下記の緩衝液で活性測定のpHを変えて、反応の最適pHを検討した（図8-11）。その結果、TvTDHはpH 7.5、TaTDHはpH 7.0、mtTDHはpH 8.5、ThrDH_4fixはpH 9.0で最大活性を示し、TvTDHとTaTDHは中性領域で活性が高く、またmtTDHとThrDH_4fixも既知のTDH（FtTDHは最適pH 9.5, TvoTDHは最適pH 10.0）よりも中性側で活性が高かった。よって、配列1 〜 4のタンパク質はNAD+ が安定なpH領域でL-スレオニンの測定に用いることが明らかになった。
使用した緩衝液：酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 3.5-5.5)、Bis-tris-HCl緩衝液 (pH 6.0-7.0)、Tris-HCl緩衝液 (pH 7.0-8.5)、BICIN緩衝液 (pH 9.0-9.5)、グリシン-KOH緩衝液 (pH 10.0-11.5)
【０１１２】
実施例７に示すように、実施例３〜６で得られた配列のタンパク質はいずれも、L-Thrに特異的であり、補酵素として用いるNAD+との親和性は既存の酵素よりも高く、また酵素反応に金属イオンを添加しなくても高い活性を示した。さらに、熱安定性も既存のCnTDHに比べて優れていた。よって、本発明の方法で取得したタンパク質の性質は、既存のTDHよりも優れていると推定された。そこで、実施例３〜６で得られた配列のタンパク質を用いて、以下の方法でL-スレオニンの測定を行った。
【０１１３】
2.5 mM NAD+ と50-500μM L-スレオニンを含む反応液を各酵素の最適反応pHで、30℃，3分間加温した後、精製TDHを添加して測定を開始した（反応液量：200μL）。添加した精製TDHの酵素濃度は、反応液中の終濃度で0.11 (TaTDH), 0.11 (TvTDH), 0.22 (mtTDH), 及び0.073 (ThrDH_4fix) mg/mLであった。測定は30℃で行い、反応開始後20秒間隔で180秒まで340 nmの吸光度を測定し、線形最小二乗法によりフィッティングして、1分あたりの吸光度変化量を算出してL-Thr濃度と吸光度変化量の関係を求めた。その結果、図12〜15で示すように、TvTDH、TaTDH、mtTDH、ThrDH_4fixのいずれのタンパク質でも500μMまで良好な直線関係が得られ、本発明の方法で取得した配列のタンパク質が、L-Thrの測定に利用できることが明らかになった。
【０１１４】
実施例８
実施例５−２で得た粗酵素液の濃度は、Bradford法 (Quick StartTM Bradford 1× Dye Reagent, Bio-rad) を用いて決定した。L-スレオニンに対する粗酵素液の比活性値について明らかにした。なお、L-スレオニン脱水素酵素 (TDH) 活性は、2.5mM β-NAD+, 50 mM L-スレオニン, 及び100 mM グリシン-KOH緩衝液 (pH 10.0) に粗酵素液を添加して反応を開始し、30℃で340nmの吸光度変化量を測定する方法で求めた。粗酵素液の活性はU/mg (1Uは1分間あたり1μMのNADHを生成できる酵素量) で算出した。なおpET15b-TDHsのプラスミドを導入した発現株から調製した粗酵素液に加え、コントロールとしてpET15bベクターを導入した株から調製した菌体抽出液についてもL-スレオニン活性を測定した。測定の結果、以下のような比活性値を得た。いずれも菌体抽出液の比活性値の2倍以上のL-スレオニン脱水素酵素活性を有していたことから、いずれのタンパク質もTDH活性を有すると結論づけた。
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
実施例９(Endopoint法による測定結果)
実施例８に示すように、実施例３〜６で得られた配列のタンパク質はいずれも、初速度法によりL-Thrの濃度測定に利用できることが明らかになった。そこで初速度法よりもより高い精度で測定が行えるエンドポイント法によって、以下の方法でL-スレオニンの測定を行った。測定に利用した酵素にはThrDH_4fixを用いた。
【０１１７】
2.5 mM NAD+と10-200μM L-スレオニンを含む反応液をThrDH_4fixの最適反応pHで、30℃, 30分間加温したのち、精製ThrDH_4fixを添加して反応を開始した (反応液量: 200μL）。添加した精製ThrDH_4fixの酵素濃度は、反応液中の終濃度で0.077 mg/mLであった。反応は30℃の条件下で60分加温することで行った。加温後直ちに340 nmの吸光度を測定し、その吸光度とNADHの340 nmにおけるモル吸光係数 (6300 M-1・cm-1) を基にサンプル中のL-スレオニン濃度を算出したのち、線形最小二乗法によりフィッティングして、濃度既知のL-スレオニン濃度と、NADH生成量から算出したサンプル中のL-スレオニン濃度の関係を求めた。その結果、図16で示すように、ThrDH_4fixはL-スレオニン濃度が200μMまで良好な直線関係が得られ、本発明の方法で取得したThrDH_4fixの配列のタンパク質が、エンドポイント法によるL-スレオニンのう濃度測定に利用できることが判明した。
【０１１８】
参考文献
[1] Nakano, S. and Asano, Y. Protein evolution analysis of S-hydroxynitrile lyase by complete sequence design utilizing the INTMSAlign software. Sci. rep. (2015) 5:8193
[2] Nakano, S., Okazaki, S., Tokiwa, H., Asano, Y. Binding of NAD+ and L-Threonine Induces Stepwise Structural and Flexibility Changes in Cupriavidus necator L-Threonine Dehydrogenase. J. Biol. Chem. (2014) 289:10445-10454
[3] Kazuoka, T., Takigawa, S., Arakawa, N., Hizukuri, Y., Muraoka, I.,
Oikawa, T., Soda, K. Novel psychrophilic and thermolabile L-threonine 
dehydrogenase from psychrophilic Cytophaga sp. strain KUC-1, J. 
Bacteriol. 185:4483-4489
[4] Yoneda, K., Sakuraba, H., Araki, T., Ohshima, T. Crystal structure
of binary and ternary complexes of archaeal UDP-galactose 4-epimerase-
like L-threonine dehydrogenase from Thermoplasma volcanium, J. Biol.
Chem. 287:12966-12974
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明では、アミノ酸配列データベースと立体構造から目的とする機能を持つ新規な酵素を、目的酵素とは異なる名前で登録されている配列群も含む幅広い配列群から迅速簡便にスクリーニングする方法を提供しており、新しい酵素を発見、開発するために有用である。また、参考文献1に示されているようにCnTDHが属するSDR-TDHは、ヒト血液などの生体試料や食品中のL-スレオニン濃度の測定を必要とする分野に有用であり、本発明で見出したタンパク質は、L-スレオニンの測定に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列番号１：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（TvTDH）のアミノ酸配列
配列番号２：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（TaTDH）のアミノ酸配列
配列番号３：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（mtTDH）のアミノ酸配列
配列番号４：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（ThrDH_4fix）のアミノ酸配列
配列番号５：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（CfuTDH）のアミノ酸配列
配列番号６：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（CmaTDH）のアミノ酸配列
配列番号７：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（MpaTDH）のアミノ酸配列
配列番号８：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（OhoTDH）のアミノ酸配列
配列番号９：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（EanTDH）のアミノ酸配列
配列番号１０：Ｌ-スレオニン脱水素酵素（BbaTDH）のアミノ酸配列
配列番号１１〜８５：表1中の配列番号１〜１０以外のタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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