【手続補正書】
【提出日】平成27年6月11日(2015.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−カルニチンを生産する方法であって、４−（ハロメチル）オキセタン−２−オンであるβ−ラクトンがＬ−カルニチンに変換され、前記方法が、前記β−ラクトンの（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸への酵素的変換を含み、前記酵素的変換が水媒体中のリパーゼによって実施される方法。
【請求項２】
前記β−ラクトンがラセミ化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
鏡像異性的に過剰量の前記（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸が得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素的変換が２相溶液中で実施され、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸が前記水相中に富化される、請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
酵素的変換の後、残存しているβ−ラクトンが前記溶液から除去される、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記残存しているβ−ラクトンが、溶媒を用いた抽出によって除去される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リパーゼが、カンジダ属、シュードモナス属、アスペルギルス属、バチルス属もしくはサーモミセス属由来である、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記リパーゼが、シュードモナス・セパシア、シュードモナス・フルオレッセンス、カンジダ・アンタークティカ由来であり、好ましくは、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列を有するリパーゼ、または、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのようなリパーゼの誘導体であり、且つリパーゼ活性を有する、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素的変換が、０℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃の温度で実施される、および／または、前記酵素的変換が、０．１〜１０重量％のβ−ラクトンを含む水溶液中で実施される、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記β−ラクトンが、先行するステップにおける、ケテンと式Ｘ−ＣＨ2−ＣＨＯ（式中、ＸはＣｌ、ＢｒおよびＩから選択される）のアルデヒドとの［２＋２］環化付加において合成される、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素的変換で得られる前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸が、トリメチルアミンを用いてＬ−カルニチンに変換される、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素的変換における（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸の全収率が、β−ラクトンの全初期量に対して、４０％〜５０％である、および／または、前記（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸の鏡像体純度が、少なくとも９０％である、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
例１〜５
リン酸カリウム緩衝液５．０ｍＬ（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）中に酵素１２．５ｍｇを含んだ溶液または懸濁液に、４−（クロロメチル）−２−オキセタノン１  ５０ｍｇを添加し、反応混合物を３０℃で撹拌する。ｐＨを、０．５Ｍ  ＫＯＨを用いて絶えず７．５に調整する。一定の間隔でサンプル２００μＬを採取し、酢酸エチル４００μＬで抽出し、濾過し、キラルＧＣで分析する。（Ｒ）−鏡像異性体を完全に加水分解した後、酵素を遠心除去し、反応混合物を、酢酸エチル５．０ｍＬを用いて２回抽出する。（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸２を水溶液として得る。下記の表１に要約されているように、反応は異なるリパーゼを用いて実施された。変換および鏡像体純度が、表１に示される。（Ｓ）−１と（Ｒ）−２の両方が、高い鏡像体純度で得られる。３０℃での反応時間は、４〜８時間に過ぎなかった。
【表１】
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以下に、本願の種々の実施態様を付記する。
［１］
Ｌ−カルニチンを生産する方法であって、４−（ハロメチル）オキセタン−２−オンであるβ−ラクトンがＬ−カルニチンに変換され、前記方法が、前記β−ラクトンの（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸または（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルへの酵素的変換を含む方法。
［２］
前記β−ラクトンがラセミ化合物である、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［３］
鏡像異性的に過剰量の前記（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸または（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが得られる、［２］に記載の方法。
［４］
前記酵素的変換が水媒体中で実施され、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸が得られる、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［５］
前記酵素的変換が２相溶液中で実施され、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸が前記水相中に富化される、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［６］
酵素的変換の後、残存しているβ−ラクトンが前記溶液から除去される、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［７］
前記残存しているβ−ラクトンが、溶媒を用いた抽出によって除去される、［６］に記載の方法。
［８］
前記酵素がリパーゼである、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［９］
前記リパーゼが、カンジダ属、シュードモナス属、アスペルギルス属、バチルス属もしくはサーモミセス属由来であるか、または、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのようなリパーゼの誘導体である、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［１０］
前記リパーゼが、シュードモナス・セパシア、シュードモナス・フルオレッセンス、カンジダ・アンタークティカ由来であり、好ましくは、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列を有するリパーゼ、または、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのようなリパーゼの誘導体である、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［１１］
前記酵素的変換が、０℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃の温度で実施される、および／または、前記酵素的変換が、０．１〜１０重量％のβ−ラクトンを含む水溶液中で実施される、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［１２］
前記β−ラクトンが、先行するステップにおける、ケテンと式Ｘ−ＣＨ2−ＣＨＯ（式中、ＸはＣｌ、ＢｒおよびＩから選択される）のアルデヒドとの［２＋２］環化付加において合成される、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［１３］
前記酵素的変換で得られる前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸または（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが、トリメチルアミンを用いてＬ−カルニチンに変換される、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［１４］
前記酵素的変換における（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸もしくは（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの全収率が、β−ラクトンの全初期量に対して、４０％〜５０％である、および／または、前記（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸もしくは（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの鏡像体純度が、少なくとも９０％である、先行する態様の少なくとも１に記載の方法。
［１５］
（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸または（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生産する方法であって、前記方法が、４−（ハロメチル）オキセタン−２−オンであるβ−ラクトンの（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸または（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルへの酵素的変換を含む方法。