【事件の表示】
　特許第３２０２０１８号「高濃度のアスタキサンチンと低濃度の３−ヒドロキシ−３’、４’−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン（ＨＤＣＯ）を含むパフィア　ロドツィマの新規株」の請求項１ないし１１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３２０２０１８号の請求項１ないし１０に係る特許を維持する。
【理　由】
〔１〕手続きの経緯：
　本件特許3202018号は、平成4年12月17日に国際出願された（PCT/NL92/00231、優先権主張1991.12.17,EP）特願平5-510802号の特許出願であって、平成13年6月22日に特許権の設定登録がなされ、その後協和発酵株式会社外１名から特許異議の申立てがなされたところ、当審において平成14年7月1日付で取消理由の通知がなされ指定期間内に意見書が提出されると共に明細書の訂正請求がなされたものである。
　
〔２〕訂正の請求について：
　本件訂正の要旨は、まず、特許請求の範囲の減縮を目的として請求項１〜１１を訂正明細書に記載された請求項１〜１０の通りに訂正しようとするものであり、具体的には請求項１および８におけるカロチノイド量の測定時期・測定方法を請求項６に記載された通りに規定すると共に当該請求項６を削除し、それに伴い請求項数を繰り上げるものである。また、誤記の訂正を目的として、発明の詳細な説明の欄の「パフィア　ロデツィマ」を「パフィア　ロドツィマ」に訂正しようとするものである。
　当該訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮するか、もしくは誤記を訂正するものであり、いずれも特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められるので、適法なものである。
　
〔３〕異議申立について：
１．本件特許に係る発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１〜１０に記載された事項により特定されたとおりのものであり、そのうち請求項１に記載された発明は下記の通りである（以下、「本件発明」ともいう。）。
　
「【請求項１】　1乾燥重量g当り少なくとも852μgのアスタキサンチンの細胞内濃度と、アスタキサンチンの前記量に対して10％未満の3-ヒドロキシ-3'、4'-ジデヒドロ-β、Ψ-カロテン-4-オン（HDCO）の百分率を有し、カロテノイドの量が、アセトン抽出後のHPLCにより測定されたものである、パフィア　ロドツィマ(Phaffia　rhodozyma)株。」
　
２．一方、特許異議申立人は、(1)本件訂正前の請求項１〜１１に係る発明は、下記甲第１〜６号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１〜１１に係る特許は特許法第29条第2項の規定に違反してなされたものであること、及び(2)本件訂正前の請求項１には「発明の構成に欠くことのできない事項」が記載されておらず、本件発明の詳細な説明中には当業者が本件訂正前の請求項１〜１１に係る発明を容易に実施できる程度に記載されていないので、本願は特許法第36条第4項又は第5項及び第6項に規定する要件を満たしていないことを主張している。
　
　　　　　　 記                            
　
甲第１号証：Applied　and　Environmental　Microbiology，56(9)，2944-2945(1990)
甲第２号証：特表平2-504101号公報
甲第３号証：PCT国際公開パンフレットWO91/02060号
甲第４号証：Critical　Reviews　in　Biotechnology，11(4)，297-326(1991)
甲第５号証：Mikrobiol.J.(Kiev)，39，22-25(1977)
甲第６号証：Applied　and　Enviromental　Microbiology，36(5)，639-642(1978)
　
３．第29条第2項違反の主張について：
　
(3-1)　異議申立人の、本件訂正前の請求項１〜１１に記載された発明が甲第１〜６号証の記載に基づいて容易に発明をすることができたとする主張は概ね下記の通りである。
　甲第１号証には、アスタキサンチンを725μg/g産生し、アスタキサンチン量に対するHDCO比が7.8％に相当するパフィア　ロドツィマ(P.ロドツィマ)株が記載されており、訂正前の請求項１には増殖条件及び測定法が規定されてないので、甲第１号証のP.ロドツィマ株は訂正前の請求項１に記載された発明におけるP.ロドツィマ株と実質的に差異はない。
　甲第２，３号証に記載される852μg/g以上のアスタキサンチン生産性を有するP.ロドツィマ突然変異株が、本件明細書表１記載のそれぞれのHDCO比（CBS224.87株を親株とする高アスタキサンチン産生突然変異株CBS225.87株、CBS225.88株はいずれも親株よりHDCO比が低い）によると、HDCO比は必ずしも突然変異に伴い増加するわけでもないから、P.ロドツィマのアスタキサンチン生合成経路はβ-カロチンを経由する経路とHDCOを経由する２種類の経路が存在することが甲第４号証により公知である以上、甲第５，６号証記載のβ-カロチン生産量が増加した変異株を得る酵母の突然変異技術を用い、甲第２，３号証に記載された高アスタキサンチン産生P.ロドツィマ株を親株としてβ-カロチンを経由する経路が優先する変異株を取得すればHDCOをほとんど産生しないことは容易に予測できる。
　また、アスタキサンチン高生産性P.ロドツィマ酵母を動物飼料、食品などに使用することも周知の技術であったことなどを考慮すれば、訂正前の請求項１〜１１に係る発明は、いずれも甲第１〜６号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
(3-2)　甲第１号証に記載されたP.ロドツィマの突然変異株NTG-3-7株自体は、そのHDCO比率が訂正後の請求項１で規定される範囲内であるといえるものの、アスタキサンチン産生量が725μg/gであって、本件発明の852μg/gには到底及ばないことから、測定方法、培養方法の若干の相違を勘案したとしても、本件発明のP.ロドツィマ株とはいえない。　
　ところで、甲第１号証におけるHDCOに関する記載をみると、HDCOはアスタキサンチンと共に総カロチノイドに含まれるカロチノイドの１種として位置づけられており、第2944頁右欄TABLE1.においても親株及び突然変異株の各種カロチノイド類の含有量が列記されている中の１つとして扱われている。甲第１号証の記載からでは、HDCOが、P.ロドツィマによるアスタキサンチン生産の際の構造類似副産物の１種であるとは認識されるものの、他のカロチノイド類と区別してHDCOが特記されているわけではないから、アスタキサンチン生産における夾雑物として特にHDCOのみが不都合であるとは認識できない。即ち、甲第１号証からは、高アスタキサンチン産生P.ロドツィマ菌株におけるアスタキサンチンに対するHDCO比率をできるだけ少なくしよう、という動機付けは出てこない。
　また、甲第２号証に記載されたCBS224.87株を親株とする高アスタキサンチン産生突然変異株CBS225.87株、CBS225.88株におけるHDCO比率が低い点を異議申立人は指摘しているが、本件発明の10％未満という値には及ばないばかりか、そもそもこれら菌株のHDCO産生量に関する測定値が示されているのは、まさに本件明細書中であって、甲第２号証中ではない。それどころか、甲第２号証中にはアスタキサンチン副産物としてのHDCOに関する記載は全くない。両突然変異株が、結果的には、突然変異処理により親株に比べてアスタキサンチンに対するHDCO比率が低くなったとしても、HDCO産生量についての測定すらなされていない甲第２号証の記載からは、その値をさらに少なくしようとする動機付けは出てこない。甲第３号証も同様である。
　なるほど、甲第４号証には、P.ロドツィマのアスタキサンチン生合成経路についての研究がなされ、従来から知られていたβ-カロチンを経由する経路以外にHDCO中間体を経由する経路の存在が推定されており、FIGURE6.に両経路を含めた全アスタキサンチン生合成経路が記載されている。
　しかしながら、当該両生合成経路の存在を確認するために用いた手法は、阻害剤で１経路をブロックする手法であり、β-カロチンを経由する経路が欠けた、もしくは優勢になった突然変異株が実際に作製されたわけでもなく、そのような突然変異株に関して検討された旨の記載もない。
　そして、上述の如く、当業者にはHDCOの産生量の少ないP.ロドツィマ株を得ようとする動機付けがないのであるから、例え甲第４号証により２つの生合成経路が存在することを知ったとしても、直ちに高アスタキサンチン産生能は失わず、かつβ-カロチンを経由する経路が優勢になる突然変異株を取得しようと発想するはずもない。
　なお、甲第５，６号証は、P.ロドツィマと同様酵母に属する突然変異株に関する文献であるとしても、これらの菌株は分類学上の種も異なる別異の微生物であり、単にβ-カロチン産生量が高いというだけで、アスタキサンチン産生量の言及すらないことから、これら文献においてβ-カロチンを経由するアスタキサンチン生合成経路が優勢な菌株が得られたわけではないから、これら文献の記載内容を勘案しても上記認定は変わらない。
　そうしてみると、甲第１〜６号証の記載からでは、アスタキサンチン産生能が高く、かつアスタキサンチンに対するHDCO比が低いP.ロドツィマ株を得ようとする発想自体が、当業者にとって容易だとはいえないから、いかに酵母の有用微生物作製法として突然変異技術が常套の手段であったとしても、訂正後の本件請求項１に記載された発明が、甲第１〜６号証の記載に基づいて容易になし得たとすることは、その前提に無理がある。
　したがって、特許法第29条第2項違反に関する異議申立人の上記主張は採用できない。
　
４．特許法第36条違反の主張について：
　
(4-1)異議申立人は、パフィア　ロドツィマ株中のアスタキサンチン濃度及び全色素に対するアスタキサンチンの比率は、増殖条件及び測定法により大きく異なるにもかかわらず、訂正前の請求項１にはパフィア　ロドツィマ株の増殖条件及び測定法が規定されていないから、「発明の構成に欠くことのできない事項」が記載されていない旨を主張する。
  しかしながら、そのうちの測定法が規定されていない不備は、上記訂正により、カロチノイド類に属するアスタキサンチン及びHDCO量の測定時期及び測定方法について「カロテノイドの量が、アセトン抽出後のHPLCにより測定されたものである」旨規定されたことで解消され、本件発明における必須の構成であるアスタキサンチン量及び当該アスタキサンチンに対するHDCO比の数値範囲は十分に明確化された。
　そして、P.ロドツィマは周知のアスタキサンチン産生酵母であり、当該酵母菌を培養してアスタキサンチンを大量に生産させることは古くから行われていたことであって、本件出願の優先権主張日の３年以上も前に公表された甲第２号証に、既にP.ロドツィマによるアスタキサンチン産生の際に、「増殖条件」に依存してアスタキサンチン濃度、比率が異なることが記載されていることからみても、当該酵母についてそのアスタキサンチン産生能が最も高まるような増殖条件下での培養方法は本件出願時には既に確立されていたとするのが自然である。
　そうしてみると、そのような通常の培養条件を用いて増殖させた酵母菌株の細胞内色素含量を上記測定法に従って測定すればよいことは当業者にとって自明な事柄であるといえるから、訂正後の請求項１に当該菌株の増殖条件が明記されていないからといって、何らの記載不備にはあたらない。
　
(4-2)また、異議申立人は、本件明細書の実施例で得られたP.ロドツィマPF-12株を親株とする菌株以外の菌株については、取得するために当業者といえども過度な実験を要する旨主張している。
　しかしながら、P.ロドツィマPF-12株は本件発明を実施するための菌株の１つであり、当該PF-12株自身は特許施行規則第27条の2に則ってブダペスト条約上の国際寄託当局に寄託がなされている。
　本件発明を実施しようとする当業者は、同第27条の3の規定に従って当該寄託菌株の分譲を受けられるから、このようなとき、我が国微生物寄託制度の趣旨からみても、当業者は本件明細書の記載に従って本件発明を実施することができるものというべきである。
　なお、異議申立人も上記(3-1)で主張する如く、P.ロドツィマなど酵母類の突然変異手法自体は確立しており、しかも本件明細書中には、当該突然変異手段と共に、肉眼によるアスタキサンチン高産生株の選抜法、HDCO低比率菌株評価法も具体的に記載されている。
　そうしてみると、当該PF-12株の親株である公知のパフィア　ロドツィマ野生株(CBS6938)を親株とするか、もしくは上記甲第１〜３号証に記載されたアスタキサンチン高産生株を親株として突然変異処理した菌株に対して、本件明細書記載の、高いアスタキサンチン産生量で、かつHDCO低比率のP.ロドツィマ株を選抜する手法を適用することで、当業者は本件発明の突然変異株を取得することにさほどに過度な実験を要するとはいえないことからも、本件発明の詳細な説明中には十分に当業者にとって容易に実施できる程度に記載されているとするのが相当である。
　　
(4-3)したがって、本願は、異議申立人が主張するような特許法第36条上の瑕疵はない。
　　
５．まとめ：
　以上述べたように、訂正後の請求項１〜１０に係る発明は、いずれも申立人の申立て理由によっては、特許を受けることができないとすることができない。
　
〔４〕結語
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年７月３１日（２００３．７．３１）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
高濃度のアスタキサンチンと低濃度の３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン（ＨＤＣＯ）を含むパフィア　ロドツィマの新規株
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　１乾燥重量ｇ当り少なくとも８５２μｇのアスタキサンチンの細胞内濃度と、アスタキサンチンの前記量に対して１０％未満の３−ヒドロキシ−３’、４’−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン（ＨＤＣＯ）の百分率を有
し、カロテノイドの量が、アセトン抽出後のＨＰＬＣにより測定されたものである、
　【請求項２】　アスタキサンチンの前記量に対して５％未満の３−ヒドロキシ−３’、４’−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンの百分率を有する請求項２に記載のパフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）株。
　【請求項３】　アスタキサンチンの前記量に対して２％未満の３−ヒドロキシ−３’、４’−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンの百分率を有する請求項２に記載のパフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）株。
　【請求項４】　アスタキサンチンの前記量に対して１％未満の３−ヒドロキシ−３’、４’−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンの百分率を有する請求項３に記載のパフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）株。
　【請求項５】　突然変異生成により得られる請求項１〜４のいずれかに記載のパフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）株。
　
【請求項６】
　
【請求項７】
し、カロテノイドの量が、アセトン抽出後のＨＰＬＣにより測定されたものである、
　
【請求項８】
７
　
【請求項９】
８
　
【請求項１０】
９
【発明の詳細な説明】
　　　
発明の分野
　本発明は、アスタキサンチンの微生物生産に関する。特に、高アスタキサンチン生産濃度（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ）と低濃度（ｌｏｗ　ｌｅｖｅｌ）の３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン（ＨＤＣＯ）を有する酵母株が開示されている。
　　　
発明の背景
　アスタキサンチンは、サケ、マス、シーブリーム及びその他の魚の赤色の原因となる天然発生のカロテノイドである。天然の環境において、このカロテノイドは、甲殻類及びその他のアスタキサンチン含有有機体の形態でこれらの動物の飼料とともに得られる。
　養魚場においてまたは孵化場において飼養される魚は、一般的に青白く、天然に飼養された同族の魚の皮膚色及び新鮮な色に欠けているが、それは食餌上のアスタキサンチンの欠乏による。魚の飼料にアスタキサンチンを添加することは、非天然環境中で飼養される魚の着色の問題を克服するための適当な方法である。
　この目的のために与えられるアスタキサンチンは、半合成方法により得ることができる。規制の理由より及び消費者による圧力の増加により、天然源由来のアスタキサンチンを使用することが好ましい。
　アスタキサンチンの天然源は、オキアミ（ｋｒｉｌｌ）及びザリガニ、藻類、花及び酵母である。オキアミ及びザリガニから抽出されるアスタキサンチンは、非常に高価である。藻類中のアスタキサンチンの収量は高いが、藻類の大規模生産は困難である。従って、アスタキサンチンの生産のために酵母、特にパフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の用途に興味が移っている。
　アスタキサンチン含有酵母パフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）は、最初、日本やアラスカの山岳地域の落葉樹の滲出物から１９７０年代初期に単離された（パフら、（１９７２）、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　４ｔｈ　ＩＦＳ」中の：「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｔｏｄａｙ」，７５９〜７７４、Ｇ．テルイ編集、京都）。野生型のパフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）株において、アスタキサンチンの濃度が測定されている。ジョンソン及びルイス（（１９７９）、「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、
１５５
　好気条件において、ＨＤＣＯの量は、アスタキサンチン量の約０．５〜１．５％である。微好気条件において、この量は、約２６％まで増加し、（上記のジョンソン及びルイス）この量は高すぎる。
　野生型のパフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　上記したように、ジョンソン及びルイス（１９７９）は既に、パフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）中の細胞内アスタキサンチン濃度に影響を与える無数の種々の培養条件（ｐＨ、温度、炭素源、酸素圧及び光のほんのいくつかのファクターである）について開示している。高アスタキサンチン濃度を得るためのより確かな方法は、従来から行われている突然変異生成である。アン及びジョンソン（（１９９０），「Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ」、
５７
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　アン及びジョンソン（上記に引用）により記載された異なる条件において生長した株は、ＨＤＣＯの形態の全カロチノイドの１０〜１５％（アスタキサンチン量の約３０％）を含むことが判明している。また、ルイスら（（１９９０）、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、
５６
　ＨＤＣＯの生物学的効果は知られていない。事実、今日までＨＤＣＯは、パフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　従って、低ＨＤＣＯ含量を有するパフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）から得られるアスタキサンチンが望まれることは明らかである。
　本発明はそのようなアスタキサンチンを提供する。
　　　
本発明の要約
　本発明は、高アスタキサンチン含量と低百分率のＨＤＣＯを有するパフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　本発明はまた、高アスタキサンチン含量と低百分率のＨＤＣＯを有する突然変異生成されたパフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　本発明はさらに、高アスタキサンチン含量と低百分率のＨＤＣＯを有するパフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　逆に本発明の方法は、減少された濃度のアスタキサンチンと低百分率のＨＤＣＯを有するパフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　　　
本発明の詳細な説明
　パフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）ＣＢＳ６９３８は、セントラルビューローフォアスシメルカルチャーズ（オランダ国バーン）から得た。
　一般的に言うと、本発明は、高アスタキサンチン濃度及び比較的低百分率のＨＤＣＯを有するパフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
−パフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
−増加した色強度を有する株を視覚的に選択するか、または赤色コロニー（高アスタキサンチン含量とアスタキサンチンの前記量と比較して高いＨＤＣＯ含量を有する）の固体群から、高アスタキサンチン含量と前記アスタキサンチン含量と比べて低ＨＤＣＯ含量を有する（強度に）着色したオレンジ色のコロニーを視覚的に選択し、
−前記選択された株を液体培地上で増殖させ、
−前記細胞からカロテノイドを抽出し、
−カロテノイドの量を測定し、
−増加した濃度のアスタキサンチンと低濃度の３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンを有する株を選択する。
　突然変異生成は、例えば、ＵＶ照射またはエチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくはその他のヌクレオチド塩基類似物質のような特定の突然変異生成物質による処理のような多数の方法により、パフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　突然変異生成した株は、色強度及び／または色の相違に基づいて選択され、カロチノイドは例えばアセトン抽出により抽出した。
色の相違に基づく選択は下記のようにして行う。
　突然変異生成した細胞懸濁液の適当な希釈物を合成培地を含む寒天プレート上で培養した。この希釈物を、４００〜４５０のコロニーが３．６インチのプレートの表面上で生育するように選択した。暗所で２０℃において４〜６週間インキュベートした後、オレンジ色のコロニーを、可視的に選択し（１０％より多いＨＤＣＯを含むコロニーは赤色であると考えられた）、振盪フラスコ実験に使用した。
　２５ｍｌの合成培地を含む１００ｍｌの振盪フラスコに、上記のようにして単離された株を植菌し、３日間インキュベートした（２０℃、２５０ｒｐｍ）。その後、細胞懸濁液１ｍｌを使用して、バッフル付きの５００ｍｌの振盪フラスコ中の合成培地１００ｍｌに植菌し、２０℃において４日間インキュベートした。その後、アスタキサンチン、ＨＤＣＯの量及び乾燥重量を測定した。
　特定のカロテノイドの量を、薄相クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣのような適当なクロマトグラフィー技術により測定した。
　高アスタキサンチン含量を有する株を得るために、繰り返された突然変異生成／選択工程を行う。
　一般的に、ＨＤＣＯの相対量は、アスタキサンチンの量の増加につれて増加することが、文献において及び本発明者らの実験において判明しているが、高アスタキサンチン含量及び低ＨＤＣＯ百分率を有する株を見出した。
　高濃度のアスタキサンチンは、その量が、約６５０μｇ／ｇ乾燥重量（ジョンソン及びルイス、「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、（１９７９）、
１１５
　野生型の株においてアスタキサンチン量に対して０．５〜１．０％であるＨＤＣＯの量は、突然変異により急速に増加して、アスタキサンチン濃度に対して３５％までに達する。ＨＤＣＯの低百分率は、アスタキサンチンに対して、１０％ＨＤＣＯ未満、好ましくは５％ＨＤＣＯ未満、より好ましくは２％未満または１％ＨＤＣＯ未満であるとさえも定義され、それにより、アスタキサンチンは、６５０μｇ／ｇ乾燥重量より高いアスタキサンチンの量を含む株から抽出される。
　本発明は、高濃度のアスタキサンチンと低百分率のＨＤＣＯを合わせ持つ株を提供する。好ましい株は、１５００μｇ／ｇ乾燥重量より高いアスタキサンチン濃度と、そのアスタキサンチン濃度の３％より低いＨＤＣＯ百分率を有する株である。
　これらの特性を合わせ持つパフィア（
Ｐｈａｆｆｉａ）
　しかしながら、野生型株を使用して開始し、最初にＨＤＣＯ百分率の増加に関して選択し、次いで、アスタキサンチンの増加した濃度（ＨＤＣＯ百分率を低く維持しながら）を求めて突然変異生成することも可能である。
　また、プロトプラスト融合を利用することにより、低ＨＤＣＯ濃度を有する高アスタキサンチン生成の所望の特性を有する株を得ることもできる。高濃度のＨＤＣＯを有する細胞から得たプロトプラストと低濃度のＨＤＣＯを有する細胞から得たプロトプラストの組合せにより所望の特性を有する細胞が得られる。
　単離されたまたは細胞中に含まれるアスタキサンチンは、動物飼料または食品中に処方されることができる。この食品または飼料の用途は、例えば、サケ科の魚、シーブリーム及びタマゴに所望の色をもたらす。従って、本発明は、少なくとも６５０μｇ／ｇ乾燥酵母重量の量のアスタキサンチンと、その細胞中のアスタキサンチンに対して１０％ＨＤＣＯ未満、好ましくは５％ＨＤＣＯ未満、より好ましくは２％ＨＤＣＯまたは１％ＨＤＣＯ未満でさえある３−ヒドロキシー３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン濃度を含む酵母細胞または酵母細胞の一部を含む動物飼料または食品を提供する。
　本発明の方法は、低アスタキサンチン濃度及び低百分率のＨＤＣＯを有する株を得るために使用されることもできる。
　下記の実施例は、本発明を説明するためのものであり、いかなる場合においても本発明を限定するものではない。その他の突然変異原及びその他のパフィア（
Ｐｈａｆｆｉａ）
実験
培地
バイオモルト培地
　１２２ｇのＭＥＸ１１（ジアスタティシュプロダクテンＢ．Ｖ．、オランダ国ライデン）を、脱イオン水１Ｌ中に溶解し、ｐＨを６．４に設定し、溶液を１２０℃において２０分間滅菌した。バイオモルト寒天培地の調製のために、寒天を最終濃度１．０％（ｗ／ｖ）に添加した。
　
ポテトデキストロース（ＣＭ１１−２）寒天培地
　　ポテトデキストロース（ディフコ）　　　　　　　　　　　　　　　３９ｇ
　　脱イオン水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ
　　寒天　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ
　　オートクレーブ前のｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．４
　１２０℃において２０分間加熱することによって滅菌を行う。
合成培地
　　培地成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃度
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ｇ／Ｌ）
　　ＫＨ−フタル酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
　　ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．６
　　ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０６
　　ＭｇＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．８８
　　ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２０
　　Ｈ２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０７１
　　ＮＨ４Ｃｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．８３
　　ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
　　クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０１５
　　（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２　　　　　　　　　　　　　　　０．０２７
　　ＺｎＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００５
　　ＣｕＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００７５
　　ＭｎＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０００６
　　Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０００６
　　Ｎａ−モルブデン酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０００６
　　ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０００１５
　　ミオ−イノシトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５９
　　ニコチン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００３
　　Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００３
　　ビタミンＢ１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００３
　　ｐ−アミノ安息香酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００２
　　ビタミンＢ６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０００３
　　ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００００１
　　グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３３
　１１０℃において３０分間滅菌を行った。
培養物の保存
　パフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
ａ．バイオモルト寒天培地を含有するスラントをパフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
ｂ．合成培地２５ｍｌを含む１００ｍｌの振盪フラスコ（バッフル付き）中で生長する培養物からバイアルを調製する（２０℃、２５０ｒｐｍ）。培養物を遠心分離し、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する脱イオン水中に懸濁し（ミリポアのミリｑフィルターシステム中で濾過した）、バイアルを液体窒素中で凍結し、−８０℃において保存した。
高速液体クロマトグラフィー
抽出方法
　培養物２．５ｇの試料を密閉可能な１５ｍｌのガラス遠心分離管中にピペットで入れ、遠心分離した（３２００×ｇ、２５分間、１５℃）。上清を除去した。冷アセトン（５℃）１．５ｍｌを添加し、ガラスビーズ（直径３ｍｍ）５ｇを添加し、渦巻き回転により混合した。遠心分離管をＶｉｂｒａｘＴＭミキサー（ＩＫＡモデルビブラックスＶＸＲ）上で混合し、そのミキサーを６０分間最大速度に設定した。
　その後、アセトン（２０℃）を添加して、最終懸濁容積を１０ｍｌ（ガラスビーズなし）とした。懸濁液を均質化し、遠心分離した（３２００×ｇ、５分間、２０℃）。上清をＨＰＬＣ分析に使用した。
装置
　　カラム：ノバパック（Ｎｏｖａｐａｃｋ）ＴＭＣ１８カートリッジ（５×１００ｍｍ）（ウォーターズアソシエエイツ、マサチューセッツ州ミルフォード）
　　検出器：ウォーターズ４８６ツナブルアブソーバンスディテクター
　　調整及び積分：積分は、ウォーターズインストルメンツから商業的に入手可能なソフトウェア「Ｍａｘｉｍａ　ｐａｃｋａｇｅ」を使用して行った。
　　自動サンプラー：冷却装置を有するウォーターズ７１２ウィスプ
溶媒
　アセトニトリル中のビスエチルヘキシルホスフェート（１６ｇ／Ｌ）及びギ酸（４０．ｍｌ／Ｌ）。
　この溶媒はＨＰＬＣ等級であった。
操作
　　流速：１ｍｌ／分
　　検出器：４７１ｎｍ
　　温度：１８℃
　　射出容積：２０μｌ
アスタキサンチン標準
　精製されたアスタキサンチン調製物（ジスト−ブロケード、Ｒ＆Ｄ部門ＣＭＡ、オランダ国デルフト）を標準として使用した。簡単に言うと、精製を下記のようにして行った；パフィア（
Ｐｈａｆｆｉａ）
２０
　アスタキサンチン含量を、アスタキサンチン／ｋｇブロスとして表わした。３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンの量を、アスタキサンチンと同様の方法で計算した。計算の間中、アスタキサンチンは３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンと同じ吸光係数を有すると推定された。３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンの量は、３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンｍｇ／ｋｇブロスとして表わした。
乾燥重量の測定
　プラスチック製の１２ｍｌの遠心分離管（グライナー）を、インキュベーター中で２４時間（１０５℃）乾燥した。管を乾燥シリカゲル上のエクシケーター中で冷却し、その後、重量（Ａ）をメトラーのＡＥ２００計量器上で小数点以下４位の単位で測定した。遠心分離管に約１０ｍｌの細胞懸濁液を入れ、重量（Ｂ）を上記のようにして測定した。細胞懸濁液を室温において遠心分離し（１０分間、４０００ｒｐｍ）、上清をデカンテーションにより除去した。遠心分離管とペレットをインキュベーター中で乾燥した（２４時間、１０５℃）。その後、管をエクシケーター中で冷却し、重量を上記のようにして測定した（Ｃ）。
　全ての乾燥重量測定を２回行った。
　　計算：乾燥重量（ｇ／ｋｇ）＝｛（Ｃ−Ａ）／（Ｂ−Ａ）｝＊１０００及びＡ、Ｂ、Ｃはグラムで表わした。
試薬
　ＨＰＬＣ測定に必要なアスタキサンチンの標準試料を、ギスト−ブロケードにおいて調製した（ＣＭＡ部門）。これらの実験において使用される全てのその他の試薬は、商業的に入手可能であり、分析等級である。
突然変異生成
　株の改良は、従来の突然変異により行った。突然変異は、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニン）、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）の使用または紫外線照射により誘発され、１０％の生存値は、十分な突然変異を誘発するものと考えられる。細胞−懸濁液の適当な希釈は、寒天プレート上で行い、インキュベーション後に、赤色コロニーの色強度を肉眼で比較し、最大赤色強度を示すコロニーを単離し、振盪フラスコ実験のために使用した。
　　　
実施例１
　高アスタキサンチン及び高３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量を有するパフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　　＊　３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン比率は、３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量と、アスタキサンチン含量及び３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量との比率として表現する。
　パフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）株ＣＢＳ２１５．８８、ＣＢＳ２２４．８７及びＣＢＳ２２５．８７並びにそれらが得られる方法は、ＷＯ８８／０８０２５中に開示されている。簡単に言うと、パフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　突然変異株ＰＦ１１−１２を親株ＰＦ１１−３と比較すると、ＰＦ１１−１２は、増加した量のアスタキサンチンを含み、一方、３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量はファクター１０まで減少することが注目される。ＰＦ１１−１２は、１９９１年１２月１６日に、ナンバーＣＢＳ７９７．９１で、セントラルビューローフォアシメルカルチャーズ（オランダ国バーン）に寄託された。
　　　
実施例２
　パフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　　＊表１と同様である
　本実施例において、高いアスタキサンチン含量を有する突然変異体は、低３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン（ＰＦ１１−１２）を含む親株から単離されることができ、一方、突然変異株（ＰＦ１１−１８）の３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量は低いままであることが明らかとなる。
　　　
実施例３
　パフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　　＊表１と同様である
　本実施例において、高アスタキサンチン含量を有する突然変異体は、低３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オンを含む親株（ＰＦ１１−１８）から単離されることができ、一方、突然変異株（ＰＦ１１−３０）の３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量は低いままであることが示される。
　　　
実施例４
　アスタキサンチンに対して高濃度の３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量を含む、パフィア　ロドツィマ（
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
　これらの結果は、色の選択により、親株のアスタキサンチン濃度と同等のアスタキサンチン濃度を有する突然変異体を選択することができることを明らかにしている。これらの株は、高濃度のアスタキサンチンを含むが、３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン比は、アスタキサンチンの量に関して著しく減少している。
パフィア　ロドツィマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）ＰＦ１１−３６の種々の単離された株のアスタキサンチン含量及び３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン比
　　＊：３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン比は、３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量と、アスタキンサン含量及び３−ヒドロキシ−３′、４′−ジデヒドロ−β、Ψ−カロテン−４−オン含量との比率として定義される。