【事件の表示】
　平成７年特許願第２８０２５４号「競合免疫検定における使用のための生物発光標識ハプテン」拒絶査定に対する審判事件（平成８年８月２０日出願公開、特開平８−２１１０５８）について、次のとおり審決する。
【結論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理由】
１．本願発明
　本願は、平成７年１０月２７日（パリ条約による優先権主張、１９９４年１０月２８日、ドイツ）に出願された。
　本願の請求項１の発明は、平成９年１２月２６日付手続補正書により補正された明細書および図面の記載から見て、その請求項１に記載された事項により構成される。
　その請求項１は、次のとおりである。
　【請求項１】
　競合免疫検定の原理に基づく液体試料中の被検体の検出方法であって、
（ａ）液体試料を反応性固相の存在下で、
　（ｉ）被検体と免疫学的に競合するハプテンの少なくとも１つが、カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質のアミノ基にカップリングしている複合体、および
　（ｉｉ）反応性固相に結合しているかまたは固相に結合することができ、被検体およびハプテンと免疫学的に特異的に反応し得るレセプター、
とともに最大で４５分間インキュベートし、
（ｂ）インキュベート液体から固相を分離し、
そして
（ｃ）固相および／またはインキュベート液体中の発光測定によって、液体試料中の被検体の存在および／または量を決定する、
ことを含む方法。
２．拒絶理由の概要
　これに対して、原査定の拒絶理由の概要は、次のとおりである。
「　本願の請求項１の発明は、下記の引用例１〜３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明できたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。」
［引用例］
　引用例１：特開昭６１−２２２５４号公報
　引用例２：特開昭５９−２０６７６５号公報
　引用例３：特開昭６０−１５２４９７号公報
３．引用例の記載事項
　引用例１〜３には、下記の事項が記載されている。
（１）　引用例１の記載事項
（１ａ）　競合的結合定量法
　競合的結合定量法は腔腸動物由来発光タンパク質たとえばイクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）を式（６）に示すように抗原と共有結合的にカップリングさせることによって確立された。
抗体（Ａｂ）は固体支持体に結合され、上清またはペレット中に見出される発光タンパク質標識抗原の量は、混合物中にＣａ２＋を加えついで単位時間あたりの総光量またはピーク光強度を測定することにより簡単に定量できる。（９頁左上欄〜右上欄）
（１ｂ）　タンパク質−ハプテンカップリング
　天然の発光タンパク質は、標識のタンパク質−タンパク質またはタンパク質−ハプテンカップリング操作を用いて抗原または抗体にカップリングさせてきた［・・・］。（９頁右上欄〜左下欄）
（１ｃ）　標識の安定性、組換えＤＮＡ技術
　免疫定量法における標識として、腔腸動物由来のタンパク質を用いると、以上概説した問題は回避される。たとえば、腔腸動物由来のタンパク質は、ホタルのルシフェラーゼの多重ポリペプチド鎖と比較的大きい分子量に比べて、低分子量、単一ポリペプチドタンパク質である。この差により、▲１▼カップリング過程での標識の安定性増大、▲２▼本技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いた容易かつ無限の供給が可能になる。（６頁右上欄）
（１ｄ）　プロゲステロン−イクオリン抱合体の合成
　プロゲステロン−１１α−ヘミスクシネート５ｍｇを乾燥ジメチルホルムアミド１４０　ｌにとり、これにジシクロヘキシルカルボジイミド２．４ｍｇおよびＮ−ヒドロキシスクシイミド４．０ｍｇを加えた。反応混合物を室温で１２時間インキュベートし、ついで生成したジシクロヘキシル尿素の結晶を遠心分離によって除去した。
　プロゲステロンの活性化エステルを含むこの溶液２μｌを、６５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）２００　ｌに溶解したイクオリン１ｍｇに加えた。室温で２０分インキュベートしたのち、５ｍＭＥＤＴＡ含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５によってゲルろ過を行い、プロゲステロン−イクオリン抱合体を単離した。
　プロゲステロン−イクオリン抱合体は生物発光性で、かつ固相抗プロゲステロンＩｇＧと反応する能力により免疫学的に活性であった（例２参照）。この抱合体は−７０℃で４ヵ月以上、４℃で２ヵ月以上安定であった。（１１頁左下欄〜右下欄）
（１ｅ）　化学式（９）
　プロゲステロン−イクオリン抱合体の合成が化学式で示されている（１２頁左上欄）。
（１ｆ）　例２
　プロゲステロン−イクオリン抗体希釈曲線
　プロゲステロン−イクオリン抱合体（５０μｌ；１．７×１０−１６モル、総ルミネッセンスカウント：３，３００）を緩衝液５０μｌおよびジアゾセルロースにカップリングした抗プロゲステロンＩｇＧ（固相抗体）の各種希釈液５０μｌと２時間インキュベートした（１２頁右上欄）。
（１ｇ）　第１図
　第１図には、各種希釈度における固相抗体に結合したルミネッセンスのカウントをプロゲステロン−イクオリン抗体希釈曲線として示す（１２頁右上欄）。
（１ｈ）　第２図
　第２図は、各種プロゲステロン濃度において固相抗体に結合したルミネッセンスカウントを、プロゲステロンＢＬＩＡ標準曲線として示す（１２頁左下欄）。
（２）　引用例２の記載事項
（２ａ）　尿素結合免疫原複合体
　アミノ基を含有した特定のハプテンに対する抗体を産生するために用いられる免疫原複合体であって、
　次式：
（式中、ハプテン−はアミノ基を介して結合されたハプテンを表し、−（ＮＨ）キャリアはそのアミノ基を介して直接結合された抗原性タンパク質もしくはポリペプチドを表し、ｐは、平均して、１からキャリア中の有効なアミノ基の数までを表す）
で示されることを特徴とする免疫原複合体。（引用例２の請求項１）
（３）　引用例３
（３ａ）　ハプテンが被分析体である場合
　アッセイに際して、アッセイに用いられるトレーサーのリガンド部分は採用されるアッセイの型により定められる。たとえばアッセイが抗原またはハプテンである被分析体に関するものである場合、トレーサーのリガンド部分はアッセイすべき抗原もしくはハプテンまたはそれらの適宜な同族体である（”適宜な同族体”という語はアッセイに用いられる結合剤に結合した被分析体の同族体を意味する）。（引用例３の５頁左下欄〜右下欄）
４．本願発明の概要
４．０１　発明の属する技術分野
　本発明は、ハプテンとカルシウムによって活性化され得る発光タンパク質との複合体を使用し、競合免疫検定の原理に基づいて液体試料中の被検体を検出する方法、該複合体を含有する免疫学的試薬、および新規ハプテン−発光タンパク質複合体に関するものである。
４．０２　従来の技術
　免疫学的試験手法における検出系としての発光標識の使用は、例えば放射性マーカー類などの他の試験系よりも、高感度であるという利点を有する。免疫検定に適用するのに好適な発光標識の例として、カルシウムによって活性化され得るエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）群の発光タンパク質がある。
４．０３　エクオリン
　エクオリンは、触媒活性を有するタンパク質成分であるアポ−エクオリン、酸化して発光する成分であるコエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎ）およびおそらくヒドロペルオキシドとしてタンパク質に結合している酸化剤である酸素分子からなっている発光タンパク質である。Ｃａ２＋イオン（トリガー（ｔｒｉｇｇｅｒ））の添加によって、反応複合体の各成分間で発光反応が生じる。エクオリンの生物発光の、特色はきわめて高い光子収率（≧２５％）および速度（＜５秒）である（例えば、Ｂｌｉｎｋｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　２８（１９．．），１−９３参照）。
４．０４　化学修飾に対して敏感
　しかし、エクオリンおよび関連する発光タンパク質の欠点は、どのような化学修飾に対してもきわめて敏感なことである。その結果、通常、触媒活性が減失し、および／またはトリガーを添加する前に発光エネルギーが放出されてしまう。
　ＷＯ９４／１８３４２に、ＳＨ基を付加導入することによるエクオリンの温和な修飾が記載されている。タンパク質またはハプテンは、例えばマレイミド基などの好適な反応性基を介してこれらのＳＨ基にカップリングすることができる。この手法によって、発光タンパク質活性の多くを保持したままでタンパク質−エクオリン複合体を生成させることが可能である。
４．０５　現技術水準の複合体の欠点
　しかし、現技術水準の複合体はかなり欠点を有することがわかった。そのため、固相に結合するかまたは標識されたハプテンがレセプターに関して被検体と競合するという、競合免疫検定の原理、に基づく免疫試験操作の場合、これらは実際上は、標識抗体形式の試験においてしか使用することができない。この形式の試験においては、固定化されたハプテンと液体試料中の遊離被検体が、例えば抗体−エクオリン複合体などの標識レセプター上の限られた数の結合部位に関して競合する。こうした形式の試験においては、壁面に結合しているシグナルは、遊離の被検体の濃度に逆比例する。
４．０６　低分子量被検体（ハプテン）
　しかし、多くの低分子量被検体（ハプテン）に関しては、競合免疫検定を標識類似体形式で実施すること、すなわち、例えば抗体などのレセプターを固相に固定し、そして遊離の被検体を含有する液体試料と不足量の標識被検体（トレーサー）とを、限られた数の抗体の結合部位に関して競合させる方が望ましい。この試験操作は典型的な放射性免疫検定法に一致する。この場合、固相に結合した標識被検体の量は、測定すべき遊離被検体の濃度に逆比例する。
４．０７　ハプテン−エクオリン複合体
　現技術水準において知られているハプテン−エクオリン複合体は、感度および精度があまりにも低いため、標識類似体形式の競合免疫検定を実施するためには限られた範囲でしか使用することができない。その上、複合体の合成はＳＨ基を付加導入する点で複雑であり、十分な再現性もない。
　Ｓｔｕｌｔｓらの文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１　（１９９２），１４３３−１４４２）には、エクオリンの遊離アミノ基へのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのカップリングが記載されている。生成した複合体は高い発光タンパク質活性を有する。しかし、この複合体の免疫反応活性に関して詳細な記載はない。このビオチン−エクオリン複合体は、これを大過剰に添加する免疫学的試験においては一般的な複合体として使用することができる。しかし、正確に限定された不足量の添加を必要とする、標識類似体形式の競合試験における試験用特異的トレーサーとしては使用することができない。
４．０８　アクリジニウムエステルなどの他の発光系
　例えばアクリジニウムエステルなどの他の発光系での実験によれば、好適な抗体複合体を製造しても、競合免疫検定用の活性トレーサー複合体もまた製造され得る保証はない。こうして、この発光系の場合には、これまで述べられてきた感度のよい競合試験手法は、標識抗体形式に限定されてきた（Ｗｅｅｋｓ　Ｉ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９（１９８３），ｐ．１４７４−１４７９　；　Ｓｔｕｒｇｅｓｓ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３２（１９８６），ｐ．５３２−５３５　；　Ｓｔｕｒｇｅｓｓ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　２７（１９８７），ｐ．３８３−３９３　；　ＭｃＣａｐｒａ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　４（１９８９），５１−５８）。
これに対し、同一のまたは類似の官能基をつけたアクリジニウムエステルのハプテンヘのカップリングは、非特異的結合と精度および感度の減少という点において、かなり問題がある。
４．０９　発明が解決しようとする課題
　本発明の目的は、温和な方法でできるだけ簡単にエクオリンをハプテンにカップリングさせ、それによって、実用上十分高い分析試験用感度を得るための、高い免疫反応性と高い発光タンパク質活性を有する、標識類似体形式での競合免疫検定用のトレーサー複合体を得ることであった。
４．１０　課題を解決するための手段
　この目的は、
（ａ）液体試料を反応性固相の存在下で、
　（ｉ）被検体と免疫学的に競合するハプテンの少なくとも１つと、カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質との複合体（ハプテンは発光タンパク質のアミノ基にカップリングしている）、および
　（ｉｉ）反応性固相に結合しているかまたは固相に結合することができ、被検体およびハプテンと免疫学的に特異的に反応し得るレセプター、
とともにインキュベートし、
（ｂ）インキュベート液体から固相を分離し、並びに
（ｃ）固相および／またはインキュベート液体中の発光測定によって、試料中の被検体の存在および／または量を決定する、
ことを含む、競合免疫検定の原理に基づく液体試料中の被検体の検出方法によって達成された。
４．１１　ハプテンと発光タンパク質の複合体
　驚くべきことに、ハプテンとカルシウムによって活性化され得る発光タンパク質とで構成される複合体が、競合免疫検定において、感度、精度および変動幅の点で、一般的ですでに自動化され最適化されているＥｎｚｙｍｕｎ試験系と少なくとも同程度に良好であることがわかった。それどころか、ハプテンが発光タンパク質のアミノ基にカップリングしている本発明の複合体は、チオール基を付加導入した後マレイミドとカップリングさせることによって合成した、現技術水準において知られている複合体よりもかなり優れている。これは、本発明の複合体が高免疫学的活性と高発光活性を同時に有しているという事実によるものである。したがって、本発明の試験形式は、競合標識類似体試験形式における被検体、特にハプテン被検体の検出に極めて好都合であり、そして現在までこの分野でなお優位を保ってきた放射性免疫検定に代わり得るものである。
４．１２　カップリング
　活性化され得る発光タンパク質のアミノ基にハプテンをカップリングすることは、ハプテンを例えば活性エステルなどの活性化カルボン酸基を介して発光タンパク質にカップリングさせることによって実施するのが好ましい。好適な活性エステルの例は、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イミダゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが特に好適である。複合体の製造において、ハプテンを、好ましくは１：１〜６：１のモル比で発光タンパク質にカップリングさせる。
４．１３　発光タンパク質
　本発明の方法においては、ハプテンと、カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質、好ましくはカルシウムによって活性化され得るエクオリン群の発光タンパク質とで構成される複合体が使用される。こうしたタンパク質の例は、エクオリン、オベリン（ｏｂｅｌｉｎ）、クリチン（ｃｌｙｔｉｎ）、ミトロコミン（ｍｉｔｒｏｃｏｍｉｎ）、ベロビン（ｂｅｒｏｖｉｎ）およびムネミオプシン（ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｎ）である。エクオリンが好ましく使用される。
４．１４　天然タンパク質、組換えタンパク質
　カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質は、起源生物から単離した天然タンパク質、または例えばＥ．ｃｏｌｉからの組換えタンパク質を使用することができる。組換え発光タンパク質の使用が好ましい。例えばエクオリンは生物体エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ）から誘導される。Ｅ．ｃｏｌｉ中でのエクオリンの組換え体の製造は、Ｓｔｕｌｔｓらによって述べられている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１（１９９２）１４３３−１４４２）。生物体オベリア・ロンギシマ（Ｏｂｅｌｉａ　ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）からの発光タンパク質オベリンの単離および精製がＶｙｓｏｔｓｋｉｉらによって述べられている（Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ　５４（１９８９）９６５−９７３）。オベリンのクローニング、発現および配列がＩｌｌａｒｉｏｎｏｖらによって述べられている（”Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｚｅｎｚ　ｕｎｄ　Ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｚｅｎｚ”８，（１９９３），ＶＩＩ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，　８８）。発光タンパク質であるクリチンおよびミトロコミンのクローニング、発現および配列の分析がＩｎｏｕｅ　ａｎｄ　Ｔｓｕｊｉ　（ＦＥＢＳ　３１５（１９９３）３４３−３４６）およびＦａｇａｎら（ＦＥＢＳ　３３３（１９９３），３０１−３０５）によって述べられている。エクオリン群中のさらに別の物質として、発光タンパク質であるベロビンおよびムネミオプシンがある（Ｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３（１９７４）１４９１−１４９９　ａｎｄ　１５００−１５１０）。カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質を得るため、上記の引用文献中に含まれる開示事項をここで引用する。
４．１５　被検体
　本発明の方法は液体試料中の被検体を検出するのに役立つ。被検体という用語は、例えば血清、血漿、尿、腸液その他の体液などの液体試料中において定性的におよび／または定量的に測定すべき免疫学的に検出し得る生物学的物質を網羅する。被検体の例は、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、単糖、オリゴ糖および多糖、ホルモン、神経伝達物質、メディエーター、代謝産物、ビタミン、医薬、核酸、並びに適当なレセプターとの特異的な反応によって検出され得るその他の生物学的被検体である。好ましい被検体は比較的低分子量の分子で、例をあげると、例えば性ホルモンおよびグルココルチコイドなどのステロイドホルモン、ペプチドホルモン、下垂体ホルモン、ヒスタミンなどのメディエーター、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコエンジインおよびリポキシンなどのエイコサノイド、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アドレナリンおよびノルアドレナリンなどの神経伝達物質、オピアートなどの医薬、例えばクレアチニンなどの代謝産物並びにビタミンである。
４．１６　ハプテン成分
　ハプテン−発光タンパク質複合体のハプテン成分としては、個々の場合の測定すべき被検体と免疫学的に競合する、すなわちハプテンもまたその被検体の特異的レセプターと反応するものが選択される。この目的のため、通常好ましくは分子量≦２，０００Ｄの比較的低分子量の有機化合物であるハプテンは、検出すべき被検体そのもの、被検体の免疫学的類似体、または被検体の免疫学的活性領域（エピトープ）のいずれかである。
４．１７　レセプター
　被検体を検出するために使用されるレセプターは、固相に結合しているレセプターか、または例えばストレプトアビジンで被覆された固相に結合し得るビオチニル化レセプターのような、固相に結合することができるレセプターである。さらに、レセプターが標識類似体形式の競合免疫検定における使用に適したものであるためには、レセプターが被検体およびハプテンと特異的な免疫学的反応をすることができなければならない。好適なレセプターの例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、または各場合において測定すべき被検体と特異的に反応し得るその他の物質である。例えば被検体が核酸である場合は、レセプターは、例えば、それぞれの試験条件下で、被検体および、この場合は同じく核酸であるハプテンと特異的にハイブリダイズする相補的核酸でもよい。
４．１８　スペーサー
　複合体のハプテン成分は好ましくはスペーサーを介して発光タンパク質とカップリングする。このスペーサーの長さは使用するハプテンによって変更し得るが、好ましくは原子数２〜８である。スペーサーは好ましくは、必要ならば異種原子ＯまたはＮで置換されていてもよい、直鎖アルキレンを含む。スペーサーを使用すると、ハプテン−エクオリン複合体と抗体との相互作用に対する立体障害が減少され、またカップリングに際しての発光タンパク質の活性の低下が減少され、このため結合シグナル値が増加する。その結果、測定機器のバックグラウンドノイズまたは環境からの電気的干渉による精度への影響が減少する。
４．１９　インキュベート
　この複合体の免疫学的活性および発光活性は、きわめて高度の実施要件がある競合免疫検定に適切である。したがって、被検体を含有する液体試料と複合体およびレセプターのインキュベートは、非常に短いインキュベート時間及び極少量の反応容量でワンステップ同時インキュベートで実施することができる。インキュベートは好ましくは最長で４５分、特に好ましくは１０〜３０分間である。インキュベート容量は好ましくは多くとも５００μｌ、特に好ましくは２０〜２００μｌである。
４．２０　発光タンパク質のアミノ基
　さらに本発明は、ハプテンが発光タンパク質のアミノ基にカップリングしている、少なくとも１つのハプテンとカルシウムによって活性化され得る発光タンパク質とで構成される複合体の、標識類似体形式の競合免疫検定における被検体類似体として提供するための使用に関するものである。
　本発明の別の主題は、ハプテンが発光タンパク質のアミノ基にカップリングしている、被検体と免疫学的に競合するハプテンの少なくとも１つと、カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質との複合体を含有する、競合免疫検定の原理に基づく被検体検出用試薬である。本発明のさらに別の主題は、上記の試薬と、固相に結合しているかまたは固相に結合することができ、かつ、被検体およびハプテンとの免疫学的に特異的な反応に関与し得るレセプターで、この試薬と空間的に隔離されているレセプターとを含む、競合免疫検定の原理に基づく被検体検出用試薬キットである。
４．２１　発光活性
　ハプテン−発光タンパク質複合体中で残存する発光タンパク質の発光活性は、好ましくは対応する非修飾発光タンパク質の当初の活性の少なくとも３０％、特に好ましくは少なくとも４０％、そして最も好ましくは少なくとも５０％である。
　最後に本発明は、ハプテンが鎖長２〜８原子数のスペーサーを介して発光タンパク質のアミノ基にカップリングしている少なくとも１つのハプテンと、カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質とで構成される新規な複合体に関するものである。ハプテンは好ましくはカルボン酸基を介して発光タンパク質にカップリングしている。複合体の製造においては、発光タンパク質へのカップリングを好ましくは１：１〜６：１のモル比で実施する。
　以下の実施例によって、本発明をさらに明らかにする：
４．２２　（実施例１）
　免疫学的に反応性があるチロキシン（Ｔ４）の未修飾エクオリンとの複合体の製造
材料：
　組換えエクオリンをＳｅａＬｉｔｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｏ．Ａｔｌａｎｔａ，ＵＳＡより入手した。活性化ハプテンＴ４（ＯＭｅ）−Ｎ−ｈｓ−ＯＳｕ（チロキシン−Ｏ−メチル−Ｎ−ヘミスクシニル−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨより入手した。その他の化学物質はすべてＭｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔより入手した。Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｍｕｎｃｈｅｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ　ＧｍｂＨの　ＡｕｔｏＬｕｍａｔ　ＬＢ　９５３によって発光を測定した。
４．２３　複合体化：
　抱合中にエクオリンの発光活性を可能な限り保持するため、ヒドロキシスクシンイミドエステルを導入することによって活性化したＴ４を未修飾エクオリンのアミノ基にリアミニデーション（ｒｅａｍｉｎｉｄａｔｉｏｎ）によってカップリングさせた。導入したヘミスクシネートＣ４スペーサーによって特に好適であることがわかった活性化ハプテンであるＴ４（ＯＭｅ）−Ｎ−ｈｓ−ＯＳｕを使用した。
４．２４　モル比
　これはＴ４：エクオリン＝２：１のモル比で混合液中５％に相当する。
４．２５　発光活性
　規定の化学量論によると、エクオリン１ｍｏｌ当たりＴ４　０．５ｍｏｌが取り込まれ（Ｅｎｚｙｍｕｎ　Ｔｅｓｔ（登録商標）Ｔ４、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）、エクオリンは当初の発光活性の５０％をなお有していた。
４．２６　（実施例２）
　総チロキシン測定のための生物発光免疫検定
　エクオリン１ｍｏｌ当たりチロキシン約０．６ｍｏｌを含有し、ハプテンとエクオリンとの間にスペーサーとして４Ｃ原子数の鎖を入れた、実施例１に従って製造したトレーサー調製物を使用して、室温で撹拌せずにワンステップ同時インキュベートで１５分間インキュベートし、非結合画分から結合画分を分離した後、総容量４０μｌを２秒間測定することにより、生物発光免疫検定を実施した。検量線の０値は４回反復測定によって、すべての他の検量値は２回反復測定によって決定した。
４．２７　試験用担体
　ストレプトアビジンで被覆した小型丸底反応容器を試験用担体として供した。
４．２８
　トレーサーを、１７ｎｍｏｌ／ｌの免疫反応活性［＝最高検量値（自動　Ｅｎｚｙｍｕｎ　Ｔｅｓｔ（登録商標）によって測定）の１／２０］　に相当する濃度で試験用液に添加した。
　検量値は、ＢＳＡおよびチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）で構成されるマトリックス中のチロキシンを量り入れ、適当に希釈することによってそれぞれ作成した。
４．２９
　結果は、表に示す（段落番号【００２９】参照）。
４．３０　（実施例３）
　総チロキシン測定のための生物発光免疫検定
　エクオリン１モル当たりチロキシンを０．３モル含有するトレーサー調製物と新しい検量セットを使用した事実以外は、操作は実施例２と同様とした。測定時間は１秒であった。
４．３１
　結果は表に示す（段落番号【００３１】参照）。
４．３２　短い試験時間
　どちらの場合においても、市販のＥＬＩＳＡ試験レベルと同程度の検量線の変動幅（Ａ／Ｘ）と検量線感度を、しかもずっと短い試験時間、最少容量、徹底的に単純化されたシグナル生成／検出、そしてまた単純なワンステップ形式で得ることができた。
４．３３　（実施例４）
　Ｔ４に関する生物発光免疫検定（手動）と　Ｅｎｚｙｍｕｎ　Ｔｅｓｔ（登録商標）（　ＥＳ３００　での自動化）の方法の比較
　ＴＢＧ含有量を増量していった（４２μｇ／ｍｌまで）１０種類の血清の総計２０試料を、上記の生物発光免疫検定（ＢＬＩＡ）および　Ｅｎｚｙｍｕｎ　Ｔｅｓｔ（登録商標）Ｔ４によって測定した。前者は完全に手動で、後者は自動分析機ＥＳ３００で実施した。
４．３４　相関性
　標準主要成分分析によって、以下の回帰直線が得られた。
　ＢＬＩＡ（Ｙ）＝１．０２×　Ｅｎｚｙｍｕｎ（Ｘ）＋１．０４；ｒ＝０．９５９；ｎ＝２０。
この場合、血清は臨床的に適合するチロキシン濃度範囲である２．５〜２０μｇ／ｍｌを完全に包含していた。
　この見事な相関性はさらに次の方法の比較によって確認された。
４．３５　（実施例５）
　遊離チロキシン測定のための生物発光免疫検定
　実施例３にしたがって製造したトレーサー調製物を使用して、ワンステップ同時インキュベートで撹拌せずに室温で１５分間インキュベートし、非結合画分から結合画分を分離した後、総容量４０μｌ、測定時間を１秒として、生物発光免疫検定を実施した。０検量値を４回反復で、他のすべての検量値を２回反復測定によって決定した。
４．３６〜４．３８　下方検出限界
　検量値Ａ−２ＳＤを基準として線形回帰によって計算した下方検出限界＝０．２７ｎｇ／ｄｌ。
４．３９　（実施例６）
　遊離チロキシン測定のための生物発光免疫検定
　操作は実施例５と同様とした。エクオリン１モル当たりチロキシン０．５モルを含有するトレーサーおよび２００ｎｇ／ｍｌポリクローナル＜Ｔ４＞抗体（ビオチニル化）を使用した。
４．４０　下方検出限界
　検量値Ａ−２ＳＤを基準として線形回帰によって計算した下方検出限界＝０．１４ｎｇ／ｄｌ。
　こうして、感度の増強（μｇ／ｄｌではなくｎｇ／ｄｌまで）が必要とされたにもかかわらず、ここでも短縮された試験時間でより少ない試験容量で少なくともＥＬＩＳＡレベルと同程度のｆＴ４試験用の検量線が再び得られた。
４．４１　手動で動力学的に測定する免疫学的試験
　これは、エクオリントレーサーが手動で動力学的に測定する免疫学的試験においても優れた精度を示すことに基づくものである。
　　　　　ＣＶ＝√（Σｄ２／２ｎ）；
　　ｎ＝測定回数
で示される、検量線全体の２回反復測定から算出した検定内分散は、Ａｂｒａｈａｍ　Ｇ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，３２，６１９−６２４，１９７１）の方法によれば、わずか５〜１０％であった。
４．４２　（実施例７）
　ｆＴ４についての　Ｅｎｚｙｍｕｎ　Ｔｅｓｔ（登録商標）（自動）に対する生物発光免疫検定（手動）の方法の比較
　Ｅｎｚｙｍｕｎ（登録商標）との方法の比較を、上記のワンステップ形式とツーステップ遅延固相形式（ＤＥＳＰ）について実施した。
４．４３
　基準として　Ｅｎｚｙｍｕｎ　Ｔｅｓｔ　（登録商標）ｆＴ４によって測定した血清試料は０．３２〜６．７０ｎｇ／ｄｌの，範囲のｆＴ４値を有しており、したがって臨床上適切な濃度範囲のすべてにわたっていた。ＤＥＳＰ形式の場合、まず反応混合物をエッペンドルフ管中で静かに撹拌しながら８分間、ストレプトアビジンの固相を添加せずにインキュベートした。その後反応溶液をストレプトアビジンで被覆した小型反応管（上記参照）に移し、さらに７分間撹拌せずにインキュベートした。この手法によって、第１ステップで溶液中に形成された免疫複合体の固定化が行なわれた。
４．４４　生物発光免疫検定（ＢＬＩＡ）
　生物発光免疫検定（ＢＬＩＡ）に関して、標準主要成分分析によって、以下の回帰直線が得られた：
　２−ステップＤＥＳＰ　形式、１００ｎｇ／ｍｌ抗体：
　ＢＬＩＡ（Ｙ）＝１．０８×　Ｅｎｚｙｍｕｎ（Ｘ）＋０．２４；ｒ＝０．９７９；ｎ　＝６。
　１−ステップ同時形式、１００ｎｇ／ｍｌ抗体：
ＢＬＩＡ（Ｙ）＝０．９２４×Ｅｎｚｙｍｕｎ（Ｘ）＋０．００７；ｒ＝０．９９８；ｎ　＝６。
　この見事な相関性はさらに次の方法の比較によって確認された。
　こうして、ハプテン−エクオリントレーサーは作用上の感度に関しても非常に良好なことがわかった。
４．４５　（実施例８）
　各種ハプテン−発光タンパク質複合体の比較
　ハプテンが鎖長４原子数のスペーサーを介して発光タンパク質にカップリングしている実施例１において合成したトレーサー調製物を、ハプテンがスペーサーを介さずに発光タンパク質の遊離ＮＨ２基にカップリングしているトレーサー調製物、およびハプテンがＣ９スペーサーを介して発光タンパク質に付加導入されたＳＨ基にカップリングしているさらに別のトレーサー調製物と比較した。
４．４６　スペーサーを介さないトレーサー
　スペーサーを介さずにエクオリンのアミノ基にカップリングしているトレーサー調製物の合成は、ヘミスクシネートスペーサーを省いた他は実施例１と同様に実施した。
４．４７　他の可能性
　エクオリンを生物学的物質にカップリングさせるさらに他の可能性を調べた。このために、ＩｇＧ分子がグルタルジアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレートおよびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを介してハプテンにカップリングしているＩｇＧ−エクオリン複合体を製造した。しかし、この手法によって得られた複合体は、発光タンパク質活性があまりにも低すぎるため、免疫検定での使用には極めて不適当であった。
４．４８　３種の複合体の試験
　前記の３種のハプテン−エクオリン複合体を同一の条件下（室温で１５分間インキュベート、１ステップ同時インキュベート、総容量４０μｌ、それぞれに２００ｎｇ／ｍｌビオチニル化ポリクローナル抗チロキシン抗血清添加、４３２ｐｍｏｌ／ｌトレーサー）でｆＴ４試験においてそれぞれ試験した。測定データを　ＲＬＵ／ｓｅｃ　±ＳＤで示す。
４．４９
　結果を表に示す（段落番号【００４９】参照）。
４．５０　比較結果
　ハプテンが未修飾エクオリンのＮＨ２基に４Ｃスペーサーを介してカップリングしている複合体を使用した場合は、ハプテンがＳＨ基にカップリングしている複合体よりも良好な結果が得られた。これは０検量値および最高検量値がより高い数値であることで示される。結合シグナル値がより高ければ、光子統計量に伴うバックグラウンド値の変化および環境からの電気的干渉の影響がずっと少なくなり、その結果、試験の精度が改善されることになる（０検量値については６．４％ＣＶに対して５．１％、最高検量値については３３．７％に対して１２．７％で、いずれについてもＮＨＳ直接カップリングの方がよい）。
４．５１　スペーサーを有するものと有しないものの比較
　未修飾エクオリンのＮＨ２基へのＮＨＳ直接カップリングについてスペーサーを有するものと有しないものの比較では、ハプテンとエクオリンとの間にスペーサーを取り入れたものは、発光タンパク質活性とともに免疫反応活性の保持が改善され、それによって検量線の変動幅およびＥｎｚｙｍｕｎ（登録商標）試験形式との相関性も改善されることが示される。鎖長２〜８原子数を有するスペーサーの場合に最良の結果が得られた。
４．５２　（実施例９）
　ＮＨＳ直接カップリング複合体とＭＨ−ＳＨカップリング複合体との比較
　表（段落番号【００５２】）に示した複合体を調べた：
　　ａ　＝ＭＡＤＯＯ　スペーサー
　　　　（１−マレイミド−８−アミノ−３，６−ジオキサ−オクチル−）
　　ｂ　＝ＭＨ　スペーサー
　　　　（１−マレイミド−６−アミノカプロイル−）
　この実験により、測定の正確度の範囲内において同一の取り込み率のものについて、発光タンパク質活性の回復百分率は、ハプテンの活性エステルが未修飾エクオリンのアミノ基に直接カップリングしたＮＨＳを使用した方が、ＭＡＤＯＯ−またはＭＨ−活性化ハプテンとＳＨ−活性化エクオリンをカップリングさせた場合よりも明らかにより良好であることが示される。同様に、［計数／ｍｇ］での比活性は、直接カップリングしたトレーサーの方がＭＡＤＯＯまたはＭＨ−ＳＨカップリングトレーサーの場合よりも高い。
４．５３　発明の効果
　本発明により、ハプテンとカルシウムによって活性化され得る発光タンパク質との複合体を使用し、競合免疫検定の原理に基づいて液体試料中の被検体を検出する方法、該複合体を含有する免疫学的試薬、および新規ハプテン−発光タンパク質複合体が提供される。
５．本願発明と引用例１発明との対比
５．１　複合体
　本願発明と引用例１発明とを対比する。
　プロゲステロンはハプテンであり、イクオリンは発光タンパク質であるから、引用例１に記載の「プロゲステロン−イクオリン抱合体」（前記（１ｄ）参照）は、ハプテンと発光タンパク質とがカップリングしている複合体である。
　この引用例１の「抱合体」は、イクオリン（カルシウムによって活性化されうる発光タンパク質）のアミノ基にカップリングしていることは、引用例１の１２頁左上欄の合成の化学式に示されている。
　そうすると、引用例１の「プロゲステロン−イクオリン抱合体」は、「被検体と免疫学的に競合するハプテンの少なくとも１つが、カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質のアミノ基にカップリングしている複合体」に該当する。
　そして、引用例１の発明には、この抱合体を固相抗体とインキュベートすることが記載されている（前記（１ｆ）参照）。これにより、プロゲステロン−イクオリン抗体希釈曲線を得ている（前記（１ｇ）参照）。この希釈曲線は、競合的結合定量法に使用することは、前記（１ａ）および（１ｂ）の記載から明らかである。
５．２　一致点
　そうすると、両発明は、次の点で一致している。
（一致点）
　競合免疫検定の原理に基づく液体試料中の被検体の検出方法であって、
（ａ）液体試料を反応性固相の存在下で、
　（ｉ）被検体と免疫学的に競合するハプテンの少なくとも１つが、カルシウムによって活性化され得る発光タンパク質のアミノ基にカップリングしている複合体、および
　（ｉｉ）反応性固相に結合しているかまたは固相に結合することができ、被検体およびハプテンと免疫学的に特異的に反応し得るレセプター、
とともにインキュベートし、
（ｂ）インキュベート液体から固相を分離し、
そして
（ｃ）固相および／またはインキュベート液体中の発光測定によって、液体試料中の被検体の存在および／または量を決定する、
ことを含む方法。
５．３　相違点
　そして、両発明は、次の点で一応相違する。
（相違点）
　本願発明がインキュベーション時間を「最大で４５分間」と限定しているのに対し、引用例１には、インキュベーション時間を特定する記載がない点。
　なお、引用例１の例中に記載のインキュベーション時間は２時間であるが、この記載があるからといって、引用例１の発明においては、インキュベーション時間は全て２時間に設定されているということはできない。
６．相違点についての検討
　そこで、この相違点について検討する。
　このインキュベーション時間は、固相のレセプターに対する、被検体と発光性複合体との競合反応の反応時間である。
　競合反応による被検体の測定は、原理的には、この反応の結果被検体と発光性複合体とがどのような存在比にあるかが分かれば、被検体の量が判定できるものである。そうすると、この反応に要する時間は当業者が必要に応じて適宜決定することのできるものであるから、インキュベーション時間を「最大で４５分間」と限定することは当業者が格別の創意を要することということができない。
７．請求人の主張について
７．１　主張（１）
　なお、請求人は、審判請求理由補充書において、本願発明は、均質な「組換え発光タンパク質」を使用するものであると主張している。
　本願の請求項１においては、「発光タンパク質」は「組換え発光タンパク質」に限定されてはいない。そして、発明の詳細な説明では「天然タンパク質」も「発光タンパク質」として使用可能であることが明記されている（前記４．１４参照）。
７．２　主張（２）
　また、請求人は、引用例１の発光タンパク質は天然源のもので均質でない、と主張している。
　しかしながら、引用例１には、「腔腸動物由来のタンパク質は、・・・、低分子量、単一ポリペプチドタンパク質である。この差により、▲１▼カップリング過程での標識の安定性増大、▲２▼本技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いた容易かつ無限の供給が可能になる。」と記載されており、引用例１の発光タンパク質は必ずしも天然源のもの、であるということはできない。
７．３　主張（３）
　そしてまた、請求人は、これらの主張に基づいて、本願発明のハプテン−発光タンパク質複合体が、引用例１発明のものに比較して、発光活性が優れていると主張している。
　請求人のこの主張（３）は、前記主張（１）〜（２）に基づくものであり、これらの主張（１）〜（２）は上述したようにいずれも妥当でないものであるから、この主張（３）が妥当でないことは明らかである。
　そして、引用例１に記載の「抱合体」は、本願の請求項１の発明の「複合体」に該当するものであることは、前記５．１で述べたとおりであり、本願発明の「複合体」が引用例１発明のもの比べて効果が優れているということはできない。
７．４　請求人の主張（１）〜（３）について
　以上検討したように、請求人の主張（１）〜（３）は、いずれも妥当でない。
８．むすび
　したがって、本願の請求項１の発明は、引用例１〜３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。
　よって、結論のとおり審決する。