(57)【要約】【課題】Ｔ細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法を提供する。【解決手段】  T細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法であって、候補薬剤の存在下及び非存在下で、T細胞をインキュベートする工程とインキュベート後のSATB1の活性を、前記候補薬剤の存在下及び非存在下のそれぞれについて測定する工程と、候補薬剤の非存在下と比較して、有意に候補薬剤の存在下でSATB1活性が減少している候補薬剤をT細胞受容体に関連する疾病の治療及び診断のための薬剤として同定する工程とを含む、前記方法。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
T細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法であって、
候補薬剤の存在下及び非存在下で、T細胞をインキュベートする工程と
インキュベート後のSATB1の活性を、前記候補薬剤の存在下及び非存在下のそれぞれについて測定する工程と、
候補薬剤の非存在下と比較して、有意に候補薬剤の存在下でSATB1活性が減少している候補薬剤をT細胞受容体に関連する疾病の治療及び診断のための薬剤として同定する工程とを含む、前記方法。
【請求項２】
T細胞に関連する疾患はＭＳである請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応は感染症を引き起こす病原体から身を守る生体システムである。このシステムの異常により疾患が引き起こされる場合もある。その一つである自己免疫疾患は、自己組織を攻撃（殺傷）することで、特定臓器の機能不全が生じる疾病である。免疫系の殺傷対象が脳や脊髄などの中枢神経系であると運動麻痺や痛覚麻痺、および視神経障害等の病態が生じる。こうした病態のなかに多発性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）と呼ばれるものがあり、自己反応性T細胞（T cell）が引き金となる疾患である。
【０００３】
発明者らはT細胞の成熟について長年、鋭意研究を重ねてきており、その結果、SATB1(Special AT-rich sequence binding protein 1)と呼ばれるタンパク質が、胸腺におけるT細胞成熟過程に不可欠であることを見出した。具体的には、正の選択と負の選択、および細胞表面分子CD4とCD8の発現制御をSATB1は直接に調節していることを明らかにした。胸腺で成熟したＴ細胞は抹消でＴ細胞受容体（T cell receptor, TCR）を介して抗原刺激を受け取る。このＴＣＲ刺激の際も高発現することから、エフェクター機能を獲得する過程でもSATB１は必須であろうことが推測できるようになった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of Immunology 2016, 196:563-572SATB1 plays a critical role in establishment of Immune tolerance, Motonari Kondo, Yuriko Tanaka, Taku Kuwabara, Taku Naito, Terumi Kohwi-Shigematsu, and Akiko Watanabe
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本分野において、Ｔ細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定する要求が存在する。本発明は、その要求を満たすための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、次の知見を得た。すなわち、ヒト多発性硬化症は中枢神経組織を攻撃するT細胞が主たる原因となる自己免疫疾患であることは前述したとおりである。脳や脊髄の神経組織がT細胞により傷害されるため、運動麻痺や感覚麻痺が生じる。視神経も障害を示し、視野を欠くこともある。基礎研究ではこの疾患に類似した動物モデルが用いられる。マウスでは実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental allergic encephalomyelitis, EAE）とよばれる疾患モデルがある。EAEは中枢神経組織抗原をアジュバントと共に投与することで、マウスに麻痺を誘導できる。ヒト多発性硬化症と全くの同一の機序と病態ではないが、EAEの解析で得た知見がヒト疾患の予防や治療に反映されることもある。
【０００７】
これまでの研究で発明者らは、核内タンパク質SATB1がT細胞の分化や機能に必須である事を明らかにしてきた。この事実をさらに発展させて解析するため、血球系細胞でのみSATB1を欠損するマウス作製（Vav-Creマウス；SATB1-cKOv）した。このマウスはEAEを発症しないことが判った。T細胞でSATB1を欠損するLck-マウス（SATB1-cKOl）でも同様の結果であった。
【０００８】
発明者らはヒト臨床の現実に即した知見を得るためのアプローチをとった。具体的には、麻痺発症後の治療標的としての有益性を見出すために、EAE発症後のマウスT細胞からSATB1を欠損させた。非欠損群は症状の悪化をたどるのに対して、欠損群の悪化は軽微であった。
【０００９】
これによりSATB1はT細胞の機能を調節することを通じて自己免疫疾患に必須の役割を担っていることが判った。これはT細胞内SATB1が自己免疫疾患の治療標的になることを示唆していることから本発明を完成するに至った。すなわち、たとえば多発性硬化症（MS）のような疾患の治療及び診断のための薬剤を同定する際に、SATB1機能を指標にして判断することが可能と考えた。
【００１０】
すなわち、T細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法であ
って、候補薬剤の存在下及び非存在下で、T細胞をインキュベートする工程と
インキュベート後のSATB1の活性を、前記候補薬剤の存在下及び非存在下のそれぞれに
ついて測定する工程と、候補薬剤の非存在下と比較して、有意に候補薬剤の存在下でSATB1活性が減少している候補薬剤をT細胞受容体に関連する疾病の治療及び診断のための薬剤として同定する工程とを含む、前記方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、上記したT細胞に関連する疾患はＭＳである方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、T細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】養子移入法によりEAEを誘導する方法を示す図である。
【図２】養子移入EAEの結果を示す図表である。
【図３】養子移入EAEの結果を示す図表である。
【図４】養子移入法によりEAEを誘導する方法を示す図である。
【図５】養子移入EAEの結果を示す図表である。
【図６】養子移入法によりEAEを誘導する方法を示す図である。
【図７】養子移入EAEの結果を示す図表である。
【図８】養子移入EAEの発症率を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本分野において、SATB1はT細胞の機能を調節することを通じて自己免疫疾患に必須の役割を担っていることが判ったことから、T細胞内SATB1が自己免疫疾患の治療標的になることが示唆された。その可能性は、次の実施例によってさらに明確になろう。
【実施例】
【００１５】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものでないことは言うまでもない。
【００１６】
C57BL/6マウスのメス8〜12週齢個体に中枢神経組織抗原としてミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の部分ペプチド（MOG 35-55）１５０μｇ／マウスをフロイント完全アジュバントとともに皮下に免疫した。10日後に調製した所属リンパ節細胞をMOG 35-55ペプチドとインターロイキン-23（ＩＬ−２３，和光純薬）とを含むRPMI1640培地で3日間培養した。全細胞からCD4陽性T細胞を磁気ビーズ法（ミルテニー社）により分画した。これをドナーとしレシピエントマウスへ5 x 10^6 細胞/マウスの細胞数で移植した。移植されたレシピエントマウスの全個体で尾や四肢の麻痺が生じた。すなわちEAEが発症した。これを養子移入EAEという。麻痺は尾の麻痺、後肢の脱力、後肢の完全麻痺と徐々に増悪する（麻痺程度をスコア化した）（図１ないし３参照）。
【００１７】
なお、図１に示す「条件付きSATB１欠損マウス」は、図２のVav-Creマウス、Lck-Creマウス（図２、３）のことを示す。Vav-Creマウスは血球系の細胞でSATB1が欠損する。Lck-CreマウスはT細胞でSATB1が欠損する。欠損集団の規模はVav-Cre > Lck-Creであり、両者ともに養子移入EAEを発症している。なお、図２は、レシピエントマウスが野生型マウス、血球系細胞でSATB1を欠損するマウス、およびT細胞でSATB1を欠損するマウスのいずれであっても同程度の発症経緯となることを示している。図３は、レシピエントマウスが野生型マウス、血球系細胞でSATB1を欠損するマウス、およびT細胞でSATB1を欠損するマウスのいずれであっても、発症に必要な移入後の時間は同程度となることを示している。
【００１８】
図２および３から理解されるように、野生型マウス、Vav-Creマウス、およびLck-Creマウスをレシピエントに用いたがいずれも疾患が認められた。このことから、両欠損マウスはT細胞の機能を抑制するような生体内微小環境を形成していないことが考えられる。
【００１９】
ここではT細胞におけるSATB1の欠損の効果を明確にしたいため、血球系細胞全体でSATB1を欠損する場合（Vav-Creマウス）と、T細胞だけで欠損する場合（Lck-Creマウス）とを比較した。それぞれのケースで同様の結果であることから、T細胞で発揮されるSATB1の機能がEAE発症に密接であることが示唆される。
【００２０】
養子移入EAEの系を発展応用して次の検討を行った。SATB1遺伝子のエクソンを二つのloxP配列ではさんだトランスジェニックマウスと、エストロゲン受容体と組換え酵素Creの融合タンパク質遺伝子のトランスジェニックマウスとを交配してえたマウス（SATB1-cKOERマウス）の細胞をドナーに用いた（図6）。なお、図６に示す方法は、タモキシフェン投与によりEAE発症前の任意のタイミングでSATB1を欠損させている。
【００２１】
SATB1-cKOERマウス由来の細胞はタモキシフェンを作用させるとloxP配列で挟まれたSATB1が欠損する。図6乃至8で示した検討では、移植直後からタモキシフェンを投与した。図７の黒丸に示した様に対照オイル群は約10日後から麻痺を示した。タモキシフェン投与群は全く症状を示さなかった。この結果は、SATB1が自己免疫疾患を誘導しうる病原性T細胞の機能発揮に必須である事を物語る。しかしながら、この検討では移植と同時にSATB1欠損を誘導しているので、実際のヒト臨床に即して考えると現実的ではない。なお、図７は、タモキシフェンを投与することにより移入直後の病原性T細胞からSATB1を欠損させた場合と欠損させない場合の発症経緯をそれぞれ表している。発症前にSATB1を欠損させると発症しないことを示している。他方、欠損させない場合は、発症し麻痺が憎悪している。図８は、タモキシフェンを投与することにより移入直後の病原性T細胞からSATB1を欠損させた場合と欠損させない場合の発症経緯をそれぞれ表している。発症前にSATB1を欠損させると発症しないことを示している。他方、欠損させない場合は、約10日過ぎから発症個体が現れ、20日までに全個体で麻痺を呈する。
【００２２】
そこで、つぎの検討を試みた（図４乃至５）。上述の図６乃至８に示す過程と同様の過程で進めるが、タモキシフェン投与を症状発症後（スコア１；尾の麻痺）から開始した。つまり発症してからSATB1を欠損させた。図5に示した様に、対照のオイル群（黒丸）は症状の悪化を呈したが、SATB1欠損群（白丸）は軽微な麻痺で推移し、悪化を有意に抑制した。この結果はSATB1がT細胞の機能に必須である事を示すが（これ自体は、図１乃至３に示す考察と同じ）、同時にこの検討結果は発症後のSATB1機能がEAE憎悪に必須である事をも示す。T細胞の機能調節をとおして自己免疫疾患の病態緩和に向けた治療標的の候補にSATB1が挙がることを示唆している。なお、図４では、EAE発症後のタモキシフェン投与により任意のタイミングでSATB1を欠損させている。図５は、タモキシフェンを投与することにより症状を発症した後（尾の麻痺）で移入した病原性T細胞からSATB1を欠損させた場合と欠損させない場合の発症経緯をそれぞれ表している。発症後にSATB1を欠損させると症状の悪化がほとんど無いことを示している。他方、欠損させない場合は、麻痺が憎悪している。
【００２３】
以上のことから、T細胞特異的SATB１欠損マウスは、ＥＡＥ誘導に抵抗性であった。また、病原性Ｔ細胞の誘導不全により、ＥＡＥ誘導に抵抗性である可能性が示唆された。さらに、自己免疫性中枢神経脱髄疾患において、病原性Ｔ細胞のみでSATB１を欠損させると、臨床経過を修飾する可能性が示唆された。加えて、SATB１が自己免疫性中枢神経脱髄疾患において、治療標的となる可能性が示唆された。
【００２４】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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