【手続補正書】
【提出日】平成27年7月24日(2015.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであり、標的ポリヌクレオチドの２本鎖が標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で架橋部（moiety）によって連結されているステップ；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖と架橋部によって連結されている標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｃ）一重鎖ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するように一重鎖ポリヌクレオチドを膜貫通ポアを通して移動させるステップ；および
（ｄ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含み、ステップ（ｂ）の分離ステップが、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するポリヌクレオチド結合タンパク質とコンストラクトを接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
架橋部が、（ａ）ポリマーリンカー、化学的リンカー、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むか、（ｂ）ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＰＥＧを含むか、または（ｃ）ヘアピンループである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一重鎖ポリヌクレオチド全体がポアを通って移動し、標的ポリヌクレオチド全体が配列決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチド結合タンパク質が膜貫通ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が
（ａ）ピコウイルス亜科（Picovirinae family）のウイスル由来である；
（ｂ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ由来である；または
（ｃ）ヘリカーゼ由来である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）コンストラクトが標的ポリヌクレオチドの架橋部とは反対側の端に少なくとも１つのポリマーをさらに含むか、または（ｂ）コンストラクトが標的ポリヌクレオチドの架橋部とは反対側の端に少なくとも１つのポリマーをさらに含み、かつ標的ポリヌクレオチドの一方の鎖にポリマーリーダーを含み、かつ標的ポリヌクレオチドの他方の鎖にポリマーテールを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
コンストラクトがコンストラクトを膜にカップリングする手段をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
膜貫通ポアが、（ａ）タンパク質ポアまたはソリッドステートポアであるか、または（ｂ）Ｍｓｐまたはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）コンストラクトが、ポアと相互作用するときに特有の電流を生じる１つまたは複数のマーカーをさらに含むか；または
（ｂ）コンストラクトが、ポアと相互作用するときに特有の電流を生じる１つまたは複数のマーカーをさらに含み、ここで、前記１つまたは複数のマーカーが脱塩基またはヌクレオチドの特異的配列であり、および／または前記１つまたは複数のマーカーが架橋部の中または付近にあり、および／または前記１つまたは複数のマーカーがポリマーリーダーまたはポリマーテール内に位置し、および／または前記１つまたは複数のマーカーが標的ポリヌクレオチドの供給源を同定する、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を一方の端またはその付近で連結できる架橋部；
（ｂ）少なくとも１つのポリマー；および
（ｃ）標的ポリヌクレオチドを膜にカップリングする手段
を含む、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製するためのキット。
【請求項１１】
（ａ）リーダーポリマーおよびテールポリマーを含むか、または
（ｂ）リーダーポリマーおよびテールポリマーを含み、かつ前記リーダーポリマーおよびテールポリマーがポリヌクレオチドであり、リーダーポリマーの一部およびテールポリマーの一部が二重鎖配列を形成する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
（ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を一方の端またはその付近で架橋部に連結するステップ；
（ｂ）１つのポリマーを標的ポリヌクレオチドの一方の鎖に他方の端で付着させ、それにより膜貫通ポアを用いて標的ポリヌクレオチドを配列決定することができるコンストラクトを形成するステップ；および
（ｃ）コンストラクトを膜にカップリングする手段をコンストラクトに付着させるステップ
を含む、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製する方法。
【請求項１３】
ポリマーがリーダーポリマーであり、方法が標的ポリヌクレオチドの他方の鎖のリーダーポリマーと同じ端にテールポリマーを付着させるステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）架橋部が別に合成され、標的ポリヌクレオチドに化学的に付着されるもしくは酵素的にライゲーションされる；または
（ｂ）架橋部が標的ポリヌクレオチドのプロセシングにおいて作製される、
請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであり、標的ポリヌクレオチドの２本鎖が標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で架橋部によって連結されているステップ；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖と架橋部によって連結されている標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｃ）一重鎖ポリヌクレオチドと相補物とが二重鎖ポリヌクレオチドを形成するように一重鎖ポリヌクレオチドの相補物を合成するステップ；
（ｄ）架橋部を用いて二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を二重鎖ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で連結するステップ；
（ｅ）二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、架橋部によって相補物に連結されているオリジナル一重鎖ポリヌクレオチドを含むさらなる一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｆ）相補物中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するように相補物を膜貫通ポアを通して移動させるステップ；および
（ｇ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含み、ステップ（ｅ）の分離ステップが、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するポリヌクレオチド結合タンパク質とコンストラクトを接触させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
（ａ）膜；（ｂ）前記膜中の複数の膜貫通ポア；および（ｃ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離する複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を含み、さらに、
前記膜および複数のポアを支持でき、前記ポアおよびタンパク質を用いてポリヌクレオチド配列決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
配列決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための複数の容器
を含み、前記流体系が前記容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択的に供給するように構成されている、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定するための装置。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）の後でステップ（ｃ）の前に、
（ｍ）一重鎖ポリヌクレオチドと相補物とが二重鎖ポリヌクレオチドを形成するように一重鎖ポリヌクレオチドの相補物を合成するステップ；
（ｎ）架橋部を用いて二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を二重鎖ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で連結するステップ；
（ｏ）二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、架橋部によって相補物に連結されているオリジナル一重鎖ポリヌクレオチドを含むさらなる一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ
を場合によりさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
結果：
ヘリカーゼと共にＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））に加えた場合にＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）は、ＤＮＡのアンジッピングおよびヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を多数の配列依存状態と共にもたらした（図２６から２８）。図２６は、２つの典型的なヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示し、オリジナルセンスセクション、オリジナルアンチセンスセクション、複製センス領域および複製アンチセンスセクションに対応する領域は１から４とそれぞれ表示される。図２７は図２６からのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内の１つの拡大図を示し、図２８はオリジナルセンス鎖とアンチセンス鎖との間の移行の別の拡大図を示す。アンチセンス鎖と比較したセンス鎖のヘリカーゼ制御移動での速度の変化は、明確に観察できる（図２６〜２８）。速度のこの変化は、ヘアピンターンに印をつけるためのマーカーの必要性を排除する。これは、ＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）周辺を、およびそれによりｄｓＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖両方の配列を２回読み取る能力を実証する。単一の位置を判定するために４回の機会を得ることからこれは塩基判定をより正確にする。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであり、標的ポリ
ヌクレオチドの２本鎖が標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で架橋部（moie
ty）によって連結されているステップ；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖と架
橋部によって連結されている標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオ
チドを提供するステップ；
（ｃ）一重鎖ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するよう
に一重鎖ポリヌクレオチドを膜貫通ポアを通して移動させるステップ；および
（ｄ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチド
の配列を決定するステップ
を含み、ステップ（ｂ）の分離ステップが、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するポ
リヌクレオチド結合タンパク質とコンストラクトを接触させるステップを含む、方法。
［２］
架橋部がポリマーリンカー、化学的リンカー、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを
含む、請求項１に記載の方法。
［３］
架橋部がＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＰＥＧを
含む、請求項２に記載の方法。
［４］
架橋部がヘアピンループである、請求項２または３に記載の方法。
［５］
一重鎖ポリヌクレオチド全体がポアを通って移動し、標的ポリヌクレオチド全体が配列
決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［６］
ポリヌクレオチド結合タンパク質が膜貫通ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を
制御する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［７］
ポリヌクレオチド結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離し、ポアを通
る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［８］
前記タンパク質が
（ａ）ピコウイルス亜科（Picovirinae family）のウイスル由来である；
（ｂ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ由来である；または
（ｃ）ヘリカーゼ由来である、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［９］
コンストラクトが標的ポリヌクレオチドの架橋部とは反対側の端に少なくとも１つのポ
リマーをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
コンストラクトが標的ポリヌクレオチドの一方の鎖にポリマーリーダーを含み、標的ポ
リヌクレオチドの他方の鎖にポリマーテールを含む、請求項９に記載の方法。
［１１］
一重鎖ポリヌクレオチドが（１）リーダーポリマー、（２）標的ポリヌクレオチドの一
方の鎖、（３）架橋部、（４）標的ポリヌクレオチドの他方の鎖、および（５）テールポ
リマーの順序でポアを通って移動する、請求項１０に記載の方法。
［１２］
コンストラクトがコンストラクトを膜にカップリングする手段をさらに含む、前記請求
項のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
膜貫通ポアがタンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、前記請求項のいずれ
か一項に記載の方法。
［１４］
タンパク質ポアがＭｓｐまたはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である、請求項１３に
記載の方法。
［１５］
膜が両親媒性層またはソリッドステート層である、前記請求項のいずれか一項に記載の
方法。
［１６］
膜が脂質二重層である、請求項１５に記載の方法。
［１７］
コンストラクトが、ポアと相互作用するときに特有の電流を生じる１つまたは複数のマ
ーカーをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
１つまたは複数のマーカーが脱塩基またはヌクレオチドの特異的配列である、請求項１
７に記載の方法。
［１９］
１つまたは複数のマーカーが架橋部の中または付近にある、請求項１７または１９に記
載の方法。
［２０］
１つまたは複数のマーカーがポリマーリーダーまたはポリマーテール内に位置する、請
求項１７または１８に記載の方法。
［２１］
１つまたは複数のマーカーが標的ポリヌクレオチドの供給源を同定する、請求項１９か
ら２０のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
（ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を一方の端またはその付近で連結できる架橋部；
および
（ｂ）少なくとも１つのポリマー
を含む、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製するためのキット。
［２３］
リーダーポリマーおよびテールポリマーを含む、請求項２２に記載のキット。
［２４］
リーダーポリマーおよびテールポリマーがポリヌクレオチドであり、リーダーポリマー
の一部およびテールポリマーの一部が二重鎖配列を形成する、請求項２３に記載のキット
。
［２５］
標的ポリヌクレオチドを膜にカップリングする手段をさらに含む、請求項２２から２４
のいずれか一項に記載のキット。
［２６］
膜貫通ポアと相互作用するときに特有の電流を生じる１つまたは複数のマーカーをさら
に含む、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のキット。
［２７］
（ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を一方の端またはその付近で架橋部に連結するス
テップ；および
（ｂ）１つのポリマーを標的ポリヌクレオチドの一方の鎖に他方の端で付着させ、それに
より膜貫通ポアを用いて標的ポリヌクレオチドを配列決定することができるコンストラク
トを形成するステップ
を含む、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製する方法。
［２８］
ポリマーがリーダーポリマーであり、方法が標的ポリヌクレオチドの他方の鎖のリーダ
ーポリマーと同じ端にテールポリマーを付着させるステップをさらに含む、請求項２７に
記載の方法。
［２９］
コンストラクトを膜にカップリングする手段をコンストラクトに付着させるステップを
さらに含む、請求項２８に記載の方法。
［３０］
（ａ）架橋部が別に合成され、標的ポリヌクレオチドに化学的に付着されるもしくは酵
素的にライゲーションされる；または
（ｂ）架橋部が標的ポリヌクレオチドのプロセシングにおいて作製される、
請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであり、標的ポリ
ヌクレオチドの２本鎖が標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で架橋部によっ
て連結されているステップ；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖と架
橋部によって連結されている標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオ
チドを提供するステップ；
（ｃ）一重鎖ポリヌクレオチドと相補物とが二重鎖ポリヌクレオチドを形成するように一
重鎖ポリヌクレオチドの相補物を合成するステップ；
（ｄ）架橋部を用いて二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を二重鎖ポリヌクレオチドの一方
の端またはその付近で連結するステップ；
（ｅ）二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、架橋部によって相補物に連結されて
いるオリジナル一重鎖ポリヌクレオチドを含むさらなる一重鎖ポリヌクレオチドを提供す
るステップ；
（ｆ）相補物中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するように相補物を膜貫通
ポアを通して移動させるステップ；および
（ｇ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチド
の配列を決定するステップ
を含み、ステップ（ｅ）の分離ステップが、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するポ
リヌクレオチド結合タンパク質とコンストラクトを接触させるステップを含む、方法。
［３２］
（ａ）膜；（ｂ）前記膜中の複数の膜貫通ポア；（ｃ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖
を分離できる複数のポリヌクレオチド結合タンパク質；および（ｄ）請求項１に記載の方
法を実行するための説明書を含む、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定するための装
置。
［３３］
（ａ）膜；（ｂ）前記膜中の複数の膜貫通ポア；および（ｃ）標的ポリヌクレオチドの
２本鎖を分離できる複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を含み、請求項１に記載の方
法を実行するためにセットアップされている、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定す
るための装置。
［３４］
前記膜および複数のポアを支持でき、前記ポアおよびタンパク質を用いてポリヌクレオ
チド配列決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
配列決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給する
ように構成された流体系；および
各試料を受けるための複数の容器
を含み、前記流体系が前記容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択的に供給する
ように構成されている、請求項３２または３３に記載の装置。
［３５］
ステップ（ｂ）の後でステップ（ｃ）の前に、
（ｍ）一重鎖ポリヌクレオチドと相補物とが二重鎖ポリヌクレオチドを形成するように一
重鎖ポリヌクレオチドの相補物を合成するステップ；
（ｎ）架橋部を用いて二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を二重鎖ポリヌクレオチドの一方
の端またはその付近で連結するステップ；
（ｏ）二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、架橋部によって相補物に連結されて
いるオリジナル一重鎖ポリヌクレオチドを含むさらなる一重鎖ポリヌクレオチドを提供す
るステップ
を場合によりさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。