【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、標的を検出するための方法：
(a) 以下を用いて第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)を標的認識イベントから生成する段階：
(1) 多成分核酸(MNAザイム(MNAzyme))の触媒活性；または
(2)合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(Synthetic Initiator Oligonucleotide, SIO)と標的とのハイブリダイゼーションによって形成される二重鎖の標的依存的ヌクレアーゼ切断であって、第1のDFが標的とは異なる、切断；
(b) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(c) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFに接触させる段階であって：
(1) 第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2との組織化、ならびに
(2) 第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成、
ここで、第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、段階；
(d) 第1のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(e) 第1のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第1のヌクレアーゼを第1のCESA複合体と接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【請求項２】
第1のヌクレアーゼが、第1のヌクレアーゼの認識部位および/または切断部位を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
以下の段階により、第1のDFが生成される、請求項1記載の方法：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイム(partzyme)および少なくとも1つの多成分核酸(MNAザイム)基質を提供する段階であって、該パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；および
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料にパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、前記少なくとも1つのMNAザイム基質から第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)が産生される、段階。
【請求項４】
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項3記載の方法。
【請求項５】
MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、前記MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片が該ヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項3記載の方法。
【請求項６】
以下の段階により、第1のDFが生成される、請求項1記載の方法：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては標的依存的ヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；および
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る標的依存的ヌクレアーゼを提供する段階であって、標的依存的ヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断により第1のDFが生成される、段階。
【請求項７】
第1のDFが標的とは異なる、請求項6記載の方法。
【請求項８】
第1のCESA複合体の切断によりさらなるDFの放出が可能になり、かつさらなるDFがさらなる酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドと組織化してさらなるCESA複合体を形成し、かつ少なくとも1つのヌクレアーゼを用いてさらなるCESA複合体が切断されて、さらなる検出可能な影響がもたらされ、かつさらなるDFが放出され、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつ以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
(f) 第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)を提供する段階であって、
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4を提供する段階；
(g) 以下の段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDFを接触させる段階；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼを接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断部位での切断により第2のDFが放出される、段階；ならびに
(h) 以下の段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDFを接触させる段階；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼを接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断する、段階；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【請求項１０】
任意の第1のDFが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTより選択されるヌクレアーゼを用いて生成される、請求項6または請求項7記載の方法。
【請求項１１】
標的が、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つが、アプタマーまたはその一部をさらに含み、該アプタマーまたはその一部は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項3記載の方法。
【請求項１３】
EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む、標的を検出するための組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的であり、かつ第1のDFが該標的とは異なる、組成物。
【請求項１４】
多成分核酸酵素(MNAザイム)およびMNAザイム基質をさらに含む、請求項13記載の組成物：
ここで、MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子(assembly facilitator)の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、かつ第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分が会合するように近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、かつ触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
かつここで、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができ、かつ第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列または切断配列を完成する。
【請求項１５】
第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)および標的依存的ヌクレアーゼをさらに含む、請求項13記載の組成物：
ここで、SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、標的依存的ヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ； 
かつここで、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、かつ第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列または切断配列を完成する。
【請求項１６】
(a) 異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体；ならびに／または
(b)部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体、酵素阻害性複合体（EIC）、阻害性断片（InF）、触媒性核酸、MNAザイム組織化助長因子、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、基質、アプタマー、および／もしくはヘアピンオリゴヌクレオチドのうち任意の1つまたは複数
を含む、請求項13〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
MNAザイム基質、パートザイム、PESA、CESA、EAS、DF、EIC、InF、SIO、制限酵素、ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、アプタマー、ヘアピンオリゴヌクレオチド、MNAザイム組織化助長因子および/または標的の1つもしくは複数が、不溶性支持体または固体支持体に連接される、請求項16記載の組成物。