【事件の表示】
　特願２００３−５０７２９０「電気穿孔による真核細胞への線形ポリヌクレオチドの改良された形質移入」拒絶査定不服審判事件〔平成１５年　１月　３日国際公開、ＷＯ０３／００９０７、平成１６年１２月　９日国内公表、特表２００４−５３６５９８〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯
　本願は、平成１４年６月２１日を国際出願日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００１年６月２１日　欧州特許庁）とする出願であって、平成２２年１月２１日付で手続補正がなされたが、平成２２年７月１５日付で拒絶査定がなされ、これに対して、平成２２年１１月２９日に審判請求がなされるとともに、同日付で手続補正がなされたものである。
　
２．平成２２年１１月２９日付手続補正についての補正却下の決定
［補正却下の決定の結論］
　平成２２年１１月２９日付の手続補正を却下する。
［理由］
（１）補正後の本願発明  
　上記補正により特許請求の範囲の請求項５〜７が削除されるとともに、請求項１は、補正前の、
「【請求項１】裸の線形ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物で造血細胞または幹細胞を形質移入する方法であって、造血細胞または幹細胞および形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドを含む懸濁液を１００〜２５０μＦの静電容量および２００〜３５０Ｖの電圧で電気穿孔することを含んでなる方法。」から、
「【請求項１】裸の線形ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物で造血細胞または幹細胞を形質移入する方法であって、
濃度が１００〜１×１０
９
細胞/ｍｌである
およびパルス時間が１〜４０ｍｓ
　
（２）目的要件について　
　上記補正前の請求項１の「造血細胞または幹細胞」は、上記補正により、「濃度が１００〜１×１０９細胞/ｍｌである造血細胞または幹細胞」に、また、「電気穿孔する」は、「およびパルス時間が１〜４０ｍｓで電気穿孔する」と補正された。
　補正前の請求項１には、発明特定事項としての細胞の濃度及び電気穿孔のパルス時間は記載されていないから、かかる補正は、発明特定事項を概念的により下位の特定事項とするものではなく、平成１８年改正前特許法第１７条の２第４項第２号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものではない。また、請求項の削除、誤記の訂正、又は明りょうでない記載の釈明の何れかを目的とするものでもないので、この補正は、同法第１７条の２第４項の規定に違反するものである。
　
（３）独立特許要件について
　上記（１）に記載した補正後の請求項１が、補正前の請求項１の懸濁液の「細胞」の濃度を限定し、かつ「電気穿孔」のパルス時間を限定していることから、それぞれ「細胞」及び「電気穿孔」について限定したものであると仮定した場合には、その補正前の当該請求項に記載された発明とその補正後の当該請求項に記載される発明の産業上の利用分野及び解決しようとする課題が同一であるから、平成１８年改正前特許法第１７条の２第４項第２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当することになる。
　一方、補正後の請求項１４は、
「【請求項１４】請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、
　（ｉ）造血細胞または幹細胞が哺乳動物細胞であり、ならびに／または
　（ｉｉ）幹細胞が該幹細胞の誘導体を含み、造血細胞が単核細胞、造血幹細胞およびそれらの誘導体、骨髄ＣＤ３４＋前駆体由来樹状細胞、ＣＤ３４＋前駆体由来ランゲルハンス細胞、および単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を含む、
前記方法。」であり、補正後の請求項１を直接引用する形式の補正後の請求項１４に係る発明（以下、「本願補正発明１４」という。）も、平成１８年改正前特許法第１７条の２第４項第２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当することになるから、本願補正発明１４が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか（平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するか）について、念のため検討しておく。　
　
（３−１）本願補正発明１４
　補正後の請求項１及び１４には、以下のとおり記載されている。
「【請求項１】裸の線形ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物で造血細胞または幹細胞を形質移入する方法であって、濃度が１００〜１×１０９細胞/ｍｌである造血細胞または幹細胞および形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドを含む懸濁液を１００〜２５０μＦの静電容量、２００〜３５０Ｖの電圧およびパルス時間が１〜４０ｍｓで電気穿孔することを含んでなる方法。」
「【請求項１４】請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、
　（ｉ）造血細胞または幹細胞が哺乳動物細胞であり、ならびに／または
　（ｉｉ）幹細胞が該幹細胞の誘導体を含み、造血細胞が単核細胞、造血幹細胞およびそれらの誘導体、骨髄ＣＤ３４＋前駆体由来樹状細胞、ＣＤ３４＋前駆体由来ランゲルハンス細胞、および単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を含む、
前記方法。」
　そこで、請求項１を引用した場合の本願補正発明１４において、造血細胞として単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を選択した場合のものである、
「裸の線形ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物で単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を形質移入する方法であって、濃度が１００〜１×１０９細胞/ｍｌである単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）および形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドを含む懸濁液を１００〜２５０μＦの静電容量、２００〜３５０Ｖの電圧およびパルス時間が１〜４０ｍｓで電気穿孔することを含んでなる方法。」（以下、「本願補正発明１４’」という。）について、その進歩性の有無を検討する。
　
（３−２）引用例
（３−２−１）引用例１
　原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願優先日前の２０００年に頒布された刊行物であるGene Therapy (2000)Vol. 7, p. 2028-2035（以下、「引用例１」という。）には、次の事項が記載されている（注：下線は当審による）。
(i)「樹状細胞（ＤＣ）に載せられた癌抗原の使用は、生体内で癌特異的な免疫応答を誘起するための、最も有望な手段の１つである。癌抗原をＤＣに載せるために、複数の戦略が設計されてきた。この研究では、電気穿孔やリポフェクションを含む複数の非ウイルス性のトランスフェクション法を用いて、
単核球由来の、すなわち非増殖性ヒトＤＣへの、生体外（in vitro）転写されたＲＮＡ
ＲＮＡとの組み合わせで電気穿孔を用いたところ、ＤＣの１１％までがＧＦＰ陽性だった
　
(ii)「最初の一連の実験では、電気穿孔技術が試行された。単核球由来ＤＣのための効率的な電気穿孔条件を決定するために、電場を決定する以下の変数が試験された。：（１）静電容量と電圧をそれぞれ３００μＦと２５０Ｖの一定に固定し、細胞密度を２×１０６−４×１０７細胞／mlの範囲で試験したところ、細胞密度の増加が致死率を減少させることが示された。（２）電圧の影響を、静電容量と細胞密度を３００μＦと４×１０７細胞／mlの一定に固定し、電圧を250から350Vの範囲で調査したところ、電圧の上昇は高い致死率を生じた。（３）細胞密度と電圧をそれぞれ４×１０７細胞／mlと250Vで一定に固定し、静電容量を３００から１５００μＦの範囲で評価した。静電容量の増加は致死率の増加を生じた。２２m秒以下のパルス時間は細胞の生存率が増加させるが、非常に低い外来遺伝子の発現率が検出された。逆に２８m秒を超えるパルス時間は一過性の遺伝子発現を増加させるが、細胞の高度な損失も生じた。総合すると、
未成熟な単核球由来ＤＣに対する最適な電気穿孔条件は、以下のとおりである：（１）細胞密度は４×１０
７
細胞／ml；（２）電圧は２５０Ｖ；（３）静電容量は３００−５００μＦ；及び（４）パルス時間は２２−２８msの間
　これらの最適化された電気穿孔条件を用いてＧＦＰのＲＮＡがトランスフェクトされた場合、ＤＣの１１％までが４８時間後にＧＦＰ陽性であった。同程度のトランスフェクション効率がＧＦＰのＤＮＡを用いた場合でも観察された（表１参照）。」（第２０２９頁左欄第１３行〜第４１行）
　
(iii)「トランスフェクション方法
　ＤＣは、それらの未成熟期である５日目または６日目にトランスフェクトされた。トランスフェクト後すぐに、ウェル当たり１×１０６細胞の密度で、６ウェルプレートの、400U／mlのＧＭ−ＣＳＦと500U／mlのIL-4を懸濁された最終体積３mlの培養培地にＤＣは再懸濁され、１２時間〜１６時間保温された。それ以後は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ２およびＴＮＦ−αを組み合わせたサイトカイン混合物が、最終的なＤＣの成熟を誘導するために添加された。さらなる２４時間の保温の後、トランスフェクション効率が決定され、形態学的な、表現型の、および機能の解析が実行された。
　電気穿孔
　ＤＣは、
ＰＢＳ
２５０μｌ
　
　上記記載事項(i)には、ＧＦＰのｍＲＮＡを用いて、単核球由来の樹状細胞（以下、「ＤＣ」という。）に対して電気穿孔によるトランスフェクションを行ったことが記載され、上記記載事項(ii)には、該電気穿孔の最適な条件を調査したこと、「未成熟な単核球由来ＤＣに対する最適な電気穿孔条件」を「（１）細胞密度は４×１０７細胞／ml；（２）電圧は２５０Ｖ；（３）静電容量は３００−５００μＦ；および（４）パルス時間は２２−２８msの間」としたことが記載され、上記記載事項(iii)には、キュベット内の細胞懸濁液にはＲＮＡが加えられたことが記載されているから、引用例１には以下の発明が記載されている。
　
「ｍＲＮＡで未成熟な単核球由来ＤＣを形質移入する方法であって、濃度が４×１０７細胞／mlである未成熟な単核球由来ＤＣおよびＲＮＡを含む懸濁液を３００−５００μＦの静電容量、２５０Ｖの電圧およびパルス時間が２２−２８msで電気穿孔することを含んでなる方法」（以下、「引用発明」という。）
　
（３−２−２）引用例４
　原査定の拒絶の理由で引用文献４として引用された本願優先日前の１９９３年に頒布された刊行物である社団法人日本生化学会編、新生化学実験講座２　核酸Ｖ−細胞工学的技術−、株式会社東京化学同人、１９９３年９月６日、p.160-167（以下、「引用例４」という。）は、当業者用の実験指南書であり、電気穿孔法の原理が記載され、バイオラッド社から専用の装置およびキュベットが市販されていること、該キュベットの奥行きが10mmであること、試料容量が0.8mlであることが記載されている。
　さらにこの当時の市販装置の仕様について、「パルス電圧は50〜2500V，コンデンサーの電気容量は，0.25〜25μFまで四段階選択でき，さらにオプションのエクステンダー（125〜950μF）まで四段階可変可能である。溶液の抵抗値により5μsecから1secまでパルスを発生することができる。」（第１６２頁第７行〜第１０行）と記載され、さらに導入効率について、
「効率を上げるための条件はいくつかあるが
パルス条件のほかに，細胞の種類，生育状態,成長速度，パルスをかける溶液の組成，温度
スクロースなどの入った溶液では比抵抗が高くなり，パルス幅が長くなる。つまり、同じ電圧をかけても溶液により導入条件が異なる（原理は後述する）。　（…途中省略…）
　パルス条件の至適化に関し，パルスおよび
トランスフェクションの有効性を決めるのは電場強度Ｅ
０
とパルス幅τ（μsec）
　　　E0(V/cm) = V0 / d　（V0：初期電圧，　d：電極間距離[cm]）
 パルス幅τ（電圧が初期電圧の1/e（37％）まで減衰するまでの時間）は次の式で表される。
　τ＝RC　（R：キュベット抵抗[Ω]，　C：コンデンサーの電気容量[μF]）
つまり抵抗値は，溶液の比抵抗と電極間距離に比例し,有効断面積に反比例する。
　実際にはコンデンサーの電気容量を一定にして，電圧を200〜1000Vの範囲で変化させ，トランスフェクションの効率と生存率の２点を考慮しながら試してみる。細胞がまず多量に死んでしまう電圧を最初におおまかに決め，その範囲内でより高い電圧，長いパルス条件幅で条件を設定するとよいであろう。一般的に細胞の生存率（細胞にパルスをかけなかったときの細胞数とかけた場合の細胞数の割合）と導入効率は逆比例するとされている。とにかく膜穿孔が非可逆になる条件の少し前の条件を見いだすことが重要であろう。」（第１６６頁第１３行〜第１６７頁第１１行：下線は当審による。）と、記載されている。
　
（３−３）対比・判断
　本願補正発明１４’と引用発明とを対比すると、引用発明の「ｍＲＮＡ」は、本願補正発明１４’の「裸の線形ポリヌクレオチドの一種」に、引用発明の「未成熟な単核球由来ＤＣ」は、本願補正発明１４’の「単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）」にそれぞれ相当し、引用発明の細胞の「濃度が４×１０７細胞／mlである」ことは、本願補正発明１４’の「濃度が１００〜１×１０９細胞/ｍｌ」に、引用発明の「２５０Ｖの電圧及びパルス時間が２２−２８msの間で電気穿孔すること」は、本願補正発明１４’の「２００〜３５０Ｖの電圧及びパルス時間が１〜４０ｍｓで電気穿孔すること」にそれぞれ相当する。
　そうすると、本願補正発明１４’と引用発明は、
「裸の線形ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物でＭｏ−ＤＣを形質移入する方法であって、濃度が１００〜１×１０９細胞/ｍｌであるＭｏ−ＤＣおよび形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドを含む懸濁液を、２００〜３５０Ｖの電圧およびパルス時間が１〜４０ｍｓで電気穿孔することを含んでなる方法」である点で一致し、電気穿孔条件の静電容量が、本願補正発明１４’では、「１００〜２５０μＦ」であるのに対し、引用発明では「３００〜５００μＦ」である点で相違する。
　
　上記相違点について検討する。
　引用例４には、導入効率を決定するパルス条件は「電場強度Ｅ０とパルス幅τ（μsec）」であると記載されており、「τ＝RC　（R：キュベット抵抗[Ω]，　C：コンデンサーの電気容量[μF]）」であることも記載されている。すなわち静電容量は、あくまでキュベット抵抗と共にパルス時間を決定する二次的変数である。さらに、引用例４には、キュベット抵抗は、「溶液の比抵抗と電極間距離に比例し,有効断面積に反比例する」ことが記載されている。
　そうすると、引用例１および４に記載されているような特定の市販キュベットを使用する場合には、使用する細胞懸濁液の量は、キュベットの容量である0.8ml（引用例４）の範囲で当業者が適宜選択できたものであるから、キュベット中の液面の高さ、ひいては有効断面積もまた変更され得る。すると、当業者が、例えば引用例１の実験で250μlの懸濁液に対して与えられているパルスと同等のパルス条件を、液量208μl以下の試料に対して与えようとすれば、静電容量を250μF以下に削減して電気穿孔を行う必要があるから、250μF以下の静電容量のコンデンサを使用することは、当業者が必要に応じて適宜なし得ることである。
　また、「スクロースなどの入った溶液では比抵抗が高くなり，パルス幅が長くなるつまり、同じ電圧をかけても溶液により導入条件が異なる。」（引用例４）ことが本願優先日前既に周知の技術的事項であったから、当業者が比抵抗の高い溶液を選択した場合、パルス幅を引用発明と同等に保つために静電容量を削減することも、当業者が容易になし得ることである。
　さらに、本願明細書の実施例で使用した特定のキュベット、液量、および溶液を使用した場合に限定してみても、実施例１−Ａでは、白血病Ｋ５６２細胞へのmRNAの導入効率がそれぞれ、１５０μFで８９％、３００μFで８３％、１０５０μFで８１％であることが示され（表１）、実施例１−ＢのＤＣ細胞へのmRNAの導入実験においては、１５０μFでの結果（表２）しか示されていないから、１００μF及び２５０μFという数値に臨界的意義があるとはいえず、このような数値範囲の好適化は当業者の通常の創作活動の範囲内のことである。
　そして、本願補正請求項１４’に記載されている「１００〜２５０μFの静電容量」の範囲を採用することにより、引用例１、４の記載から予測できない程の格別な効果が奏せられたものとは認められない。
　したがって、本願補正発明１４’は、引用例１及び４の記載から当業者が容易になし得たことである。
　
（３−４）審判請求人の主張
　平成２３年１月２０日付審判請求書の手続補正書において審判請求人は、「本願発明や引用例１の方法が対象とする「造血細胞または幹細胞」は、上記のとおり非常に敏感な細胞であり、そして「裸のポリヌクレオチド」を用いる電気穿孔法において静電容量、細胞密度、パルス電圧、及びパルス時間の各々は複雑に関係するので、引用例１〜５及び本願出願時の技術常識に基づいても、本願発明の方法に記載の条件を見出すことは当業者の通常の創作能力の範囲内であるとはいえません。」（主張１）と主張するとともに、本願補正発明１４の効果について「引用例１に記載の電気穿孔法による未分化DC細胞への導入効率はRNAを導入する場合で平均7.6±1.9％であるのに対し、本願発明では未分化DCへの導入効率は63±9％と約8.3倍の差異があります（表２のiMo-DCの結果より）。」（主張２）と主張している。
　
　しかしながら、主張１については、上記引用例４に記載されているように、主張されるようなパラメーター間の複雑な関係自体が周知であり、そのような場合に、実験的に各パラメーターごとに数点の試行を行って至適範囲を定めることは、例えば引用例４に「コンデンサーの電気容量を一定にして，電圧を200〜1000Vの範囲で変化させ，トランスフェクションの効率と生存率の２点を考慮しながら試してみる。」と記載されているように、当業者の通常の創作能力の発揮にすぎない。一方、本願明細書を参酌しても、本願補正発明１４’の数値には臨界的意義が見出せず、顕著な効果を奏する数値範囲を見いだしたものとはいえない。
　さらに、本願補正発明１４’では、静電容量を特定しているだけで、キュベット抵抗、あるいはキュベット抵抗を決定する変数（溶液の比抵抗、電極間距離、有効断面積）については特定されていないから、静電容量のみを記載しても実質的な電気穿孔条件は特定されていないことになる。そして、電圧値とパルス時間は引用発明のものと相違していないので、静電容量についてのみの上記相違点は、パルス条件についての実質的な相違ではないともいえ、審判請求人の主張１は採用できない。
　次に、主張２については、比較されている引用例１では、緩衝液としてＰＢＳを使用して、氷温で電気穿孔を行っているのに対し、本願明細書の実施例は、市販されていた電気穿孔専用緩衝液（Optimix）等を使用して、室温で行われているのであるから、両者は、本願補正発明１４に記載された技術的特定事項以外の、効率に重要と当業者に周知であった条件（引用例４）のうち２つ（パルスをかける溶液の組成、温度）も相違しているから、導入効率に差異があったとしても、それが本願補正発明１４’と引用発明との上記相違点に基づくものであるとはいえない。このことは、ＤＣではなくＫ５６２細胞ではあるが、１５０μFで８９％、３００μFで８３％と導入効率に６％しか差がないことが、本願明細書の表１に示されており、実施例の条件では、３００μFでのＤＣへの導入においても、引用例１の約７％よりかなり高い導入効率になると予想できることからもうかがえる。
　したがって、本願補正発明１４’の全般にわたり顕著な効果が奏されるものであるとはいえず、審判請求人の主張２も採用できない。
　
（３−５）小括
　以上の理由により、本願補正発明１４’は、引用例１及び４の記載から当業者が容易にその発明をすることができたものであり、本願補正発明１４’を包含する本願補正発明１４も同様であるから、本願補正発明１４は、特許法第２９条第２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができるものではない。
　
（４）むすび
　以上のとおり、本件補正は、平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第４項の規定に違反するので、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
　さらに仮に、本件補正が、特許法第１７条の２第４項の規定に違反しないとした場合であっても、本件補正は、平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するので、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。　
　
３．本願発明について
　平成２２年１１月２９日付の手続補正は上記のとおり却下されたので、本出願に係る発明は、平成２２年１月２１日付手続補正により補正された明細書及び図面の記載からみて、その請求項１〜２５に記載された事項により特定されるとおりのものであり、そのうち請求項１及びび請求項１５には、それぞれ以下のとおり記載されている。
　
「【請求項１】裸の線形ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物で造血細胞または幹細胞を形質移入する方法であって、造血細胞または幹細胞および形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドを含む懸濁液を１００〜２５０μＦの静電容量および２００〜３５０Ｖの電圧で電気穿孔することを含んでなる方法。」
「【請求項１５】請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、
　（ｉ）造血細胞または幹細胞が哺乳動物細胞であり、ならびに／または
　（ｉｉ）幹細胞が該幹細胞の誘導体を含み、造血細胞が単核細胞、造血幹細胞およびそれらの誘導体、骨髄ＣＤ３４＋前駆体由来樹状細胞、ＣＤ３４＋前駆体由来ランゲルハンス細胞、および単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を含む、
前記方法。」
　
　そして、上記本願補正発明１４は、本願請求項１を引用した場合の本願請求項１５に係る発明（以下、「本願発明１５」という。）に包含されており、本願補正発明１４は上記２．（３−３）に記載した理由により、引用例１及び４の記載から当業者が容易にその発明をすることができたものであるから、本願発明１５も、本願補正発明１４と同様な理由により、引用例１及び４の記載から当業者が容易にその発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
４．むすび
  以上のとおりであるから、本願請求項１５に係る発明は、特許法第２９条２項の規定により特許を受けることができないので、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。