【手続補正書】
【提出日】平成27年3月30日(2015.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物における複数の遺伝的バリアントの存在、非存在、または量を検出するための方法であって、該方法が
（ａ）複数の標的核酸種またはその一部分に由来する複数のアンプリコンを調製するステップであって、それぞれの標的核酸種が、第１のバリアントおよび第２のバリアントを含むステップ、
（ｂ）オリゴヌクレオチド種に該アンプリコンをハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種に由来するアンプリコンにハイブリダイズし、それによって、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を生成するステップ、ならびに
（ｃ）伸長条件下で、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む伸長組成物と、該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を接触させるステップであって、
（ｉ）該１つ以上の終結ヌクレオチドの少なくとも１つが、捕捉剤を含み、該捕捉剤が、アビジン、ストレプトアビジン、アビジンもしくはストレプトアビジンのフラグメント、ビオチンまたはビオチンのフラグメントを含み、
（ｉｉ）該第１のバリアントにハイブリダイズする該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長され、該第２のバリアントにハイブリダイズする該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長されず、それによって、伸長オリゴヌクレオチド種を生成するステップ、
（ｄ）（ｃ）の該捕捉剤の結合パートナーを含む固相に該伸長オリゴヌクレオチド種を捕捉するステップであって、該結合パートナーは、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンからなる群より選択される、ステップ、
（ｅ）上昇した温度条件において該固相を競合因子と接触させることによって、該固相から、（ｄ）において該固相に結合した該伸長オリゴヌクレオチド種を放出させるステップであって、ここで、該競合因子は、（ｄ）における該固相と相互作用する遊離形態の該捕捉剤を含む、ステップ、ならびに
（ｆ）（ｅ）において該固相から放出されたそれぞれの該伸長オリゴヌクレオチド種を検出するステップを含み、それによって、該遺伝的バリアントの存在、非存在、または量が、検出される、方法。
【請求項２】
それぞれの前記伸長オリゴヌクレオチド種を検出することが、質量分析法によってそれぞれの伸長オリゴヌクレオチド種の質量を検出することである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
それぞれのオリゴヌクレオチド種が、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のバリアントが、より低度の存在量のバリエーションであり、前記第２のバリアントが、より高度な存在量のバリエーションである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝的バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）バリアントであり、前記第１のバリアントが、より低度の存在量の対立遺伝子であり、前記第２のバリアントが、より高度な存在量の対立遺伝子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、１つの終結ヌクレオチドからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、２つの終結ヌクレオチドからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、３つの終結ヌクレオチドからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから独立して選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉剤が、ビオチンを含み、該固相が、ストレプトアビジンまたはアビジンを含み、かつ該放出剤が、遊離したビオチンを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記上昇した温度条件が約８０℃〜約１００℃である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記上昇した温度条件が約８９℃〜約１００℃である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記上昇した温度条件が約９０℃である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記上昇した温度条件が、摂氏約９０度での約５分間の処理を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の標的核酸種が、２０以上の標的核酸種である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の標的核酸種が、２００以上の標的核酸種である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の標的核酸種が、２００〜３００の標的核酸種である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｃ）における伸長条件が、２０〜３００回のサイクリングを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｃ）における伸長条件が、２００〜３００回のサイクリングを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
該伸長条件が、競合因子オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記伸長オリゴヌクレオチド種が捕捉された後に、前記固相を洗浄することを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項２２】
前記洗浄が、質量分析法分析において妨害付加生成物を産生する塩を除去する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
伸長オリゴヌクレオチドが、イオン交換樹脂と接触されない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｆ）における検出が、競合因子との競合を伴わない放出後の検出についての信号対雑音
比よりも大きな信号対雑音比によるものである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
（ｆ）における検出が、第１のバリアントおよび第２のバリアントの伸長についての信号対雑音比および／または感度よりも大きな、第１のバリアントのみの伸長についての信号対雑音比および／または感度によるものである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記遊離したビオチンが、約１０〜約１００ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される、請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記遊離したビオチンが、約２５ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、合成鋳型を含み、前記組成物における第１のバリアントの量および／またはパーセンテージが決定され、該合成鋳型が、該第１のバリアントおよび第２のバリアントと異なるバリアントを含み、同じオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズする、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上の終結ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが１つ以上の非環式ターミネーターを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
ある実施形態が、以下の説明、請求項、および図面においてさらに説明される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
組成物における複数の遺伝的バリアントの存在、非存在、または量を検出するための方法であって、該方法が
（ａ）複数の標的核酸種またはその一部分に由来する複数のアンプリコンを調製するステップであって、それぞれの標的核酸種が、第１のバリアントおよび第２のバリアントを含むステップ、
（ｂ）オリゴヌクレオチド種に該アンプリコンをハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種に由来するアンプリコンにハイブリダイズし、それによって、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を生成するステップ、ならびに
（ｃ）伸長条件下で、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む伸長組成物と、該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を接触させるステップであって、
（ｉ）該１つ以上の終結ヌクレオチドの少なくとも１つが、捕捉剤を含み、
（ｉｉ）該第１のバリアントにハイブリダイズする該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長され、該第２のバリアントにハイブリダイズする該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長されず、それによって、伸長オリゴヌクレオチド種を生成するステップ、
（ｄ）該捕捉剤を捕捉する固相に該伸長オリゴヌクレオチド種を捕捉するステップ、
（ｅ）該固相から、（ｄ）において該固相に結合した該伸長オリゴヌクレオチド種を放出させるステップ、ならびに
（ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において該固相から放出されたそれぞれの伸長オリゴヌクレオチド種の質量を検出するステップを含み、それによって、該遺伝的バリアントの存在、非存在、または量が、検出される、方法。
（項目２）
それぞれのオリゴヌクレオチド種が、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１のバリアントが、より低度の存在量のバリエーションであり、前記第２のバリアントが、より高度な存在量のバリエーションである、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記遺伝的バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）バリアントであり、前記第１のバリアントが、より低度の存在量の対立遺伝子であり、前記第２のバリアントが、より高度な存在量の対立遺伝子である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、１つの終結ヌクレオチドからなる、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、２つの終結ヌクレオチドからなる、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、３つの終結ヌクレオチドからなる、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから独立して選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記伸長組成物が、非終結ヌクレオチドを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記伸長組成物が、１つ以上の伸長ヌクレオチドを含み、該伸長ヌクレオチドが、捕捉剤を含まない、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、放出剤との該固相の接触を含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記捕捉剤が、ビオチンまたはビオチン類似体を含み、該固相が、ストレプトアビジンを含み、かつ該放出剤が、遊離したビオチンまたはビオチン類似体を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記放出剤が、該固相に対して前記捕捉剤よりも高い親和性を有する、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
（ｅ）における前記伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、約３０℃〜約１００℃の加熱を含む、項目１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
約６０℃〜約１００℃の加熱を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
約８９℃〜約１００℃の加熱を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
約９０℃までの加熱を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記複数の標的核酸種が、２０以上の標的核酸種である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記複数の標的核酸種が、２００以上の標的核酸種である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記複数の標的核酸種が、２００〜３００の標的核酸種である、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
（ｃ）における伸長条件が、２０〜３００回のサイクリングを含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
（ｃ）における伸長条件が、２００〜３００回のサイクリングを含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
該伸長反応が、競合因子オリゴヌクレオチドを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記伸長オリゴヌクレオチド種が捕捉された後に、該固相を洗浄することを含む、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
該洗浄が、質量分析法分析において妨害付加生成物を産生する塩を除去する、２４に記載の項目。
（項目２６）
伸長オリゴヌクレオチドが、イオン交換樹脂と接触されない、２５に記載の項目。
（項目２７）
（ｆ）における検出が、競合因子との競合を伴わない放出後の検出についての信号対雑音
比よりも大きな信号対雑音比によるものである、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
変異体対立遺伝子のみの伸長についての信号対雑音比が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についての信号対雑音比よりも大きい、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
（ｆ）において変異体対立遺伝子を検出する感度が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についてよりも、変異体対立遺伝子のみの伸長について大きい、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第２のバリアントの前記伸長オリゴヌクレオチド種が、検出されない、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、約１０〜約１００ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される、項目１２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、約２５ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される、３１に記載の項目。
（項目３３）
前記組成物が、合成鋳型を含み、前記組成物における第１のバリアントの量および／またはパーセンテージが決定され、該合成鋳型が、該第１のバリアントおよび第２のバリアントと異なるバリアントを含み、同じオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズする、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法が、
（ａ）増幅条件下で、該標的核酸またはその一部分を増幅することによって、該標的核酸のアンプリコンを調製するステップ、
（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中の該アンプリコンを接触させるステップであって、該セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、該アンプリコンが溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含む、ステップ、
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドによって、該アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、該１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドに添加されたヌクレオチドのうちの１つ以上が、該捕捉剤を含むステップ、
（ｄ）該捕捉剤が固相と相互作用する条件下で、該固相と該伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、
（ｅ）競合因子との競合によって、該固相と相互作用した該伸長オリゴヌクレオチドを放出させるステップ、ならびに
（ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において放出された該伸長オリゴヌクレオチドを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在によって決定される、方法。
（項目３１）
（ｉ）１つのオリゴヌクレオチド種の質量が、該セットにおける他のオリゴヌクレオチド種の質量と検出可能に異なり、（ｉｉ）それぞれのオリゴヌクレオチド種が、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応する、請
求項３０に記載の方法。
（項目３２）
組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法が、
（ａ）増幅条件下で、該標的核酸またはその一部分を増幅することによって、該標的核酸のアンプリコンを調製するステップ、
（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中の該アンプリコンを接触させるステップであって、
（ｉ）該セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、該アンプリコンが該溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含み、
（ｉｉ）該セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含み、
（ｉｉｉ）１つのオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量が、該セットにおける他のオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量と検出可能な程度に異なり、かつ
（ｉｖ）それぞれの質量による識別が可能なタグが、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応するステップ、
（ｃ）該アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを１つ以上のヌクレオチドによって伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、該１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドに添加されたヌクレオチドのうちの１つ以上が、該捕捉剤を含むステップ、
（ｄ）該捕捉剤が該固相と相互作用する条件下で、固相と該伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、
（ｅ）競合因子との競合によって、該固相から、該固相と相互作用した該伸長オリゴヌクレオチドと会合した、該質量による識別が可能なタグを放出させるステップ、ならびに
（ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において放出された、該質量による識別が可能なタグを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する、質量による識別が可能なタグの存在または非存在によって決定される、方法。
（項目３３）
競合因子との競合が、競合因子と該固相を接触させることを含む、項目３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記競合因子が、遊離した捕捉剤またはその競合断片もしくは多量体からなる、項目３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記競合因子が、遊離した捕捉剤からなる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記捕捉剤を含む前記ヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸にコンジュゲートされた捕捉剤である、項目３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記ヌクレオチド三リン酸が、ジデオキシヌクレオチド三リン酸である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記捕捉剤が、結合ペアのメンバーを含む、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記捕捉剤が、ビオチンを含む、項目３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記固相が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記捕捉剤が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、項目３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記固相が、ビオチンを含む、項目１１に記載の方法。
（項目４３）
遊離した捕捉剤との競合による、前記質量による識別が可能なタグの放出が、上昇した温度条件下で実行される、項目３０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記上昇した温度条件が、摂氏約９０度での約５分間の処理を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
（ｃ）が、１つの容器において実行され、前記方法が、前記放出された、質量による識別が可能なタグを、（ｅ）と（ｆ）との間に、別の容器に移動させるステップをさらに含む、項目３０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
（ａ）において産生されたアンプリコンを含有する前記溶液が、該アンプリコンの中に組み込まれていないあらゆるヌクレオチドから末端のリン酸を除去する作用物質により処理される、項目３０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記末端のリン酸が、ホスファターゼと前記溶液を接触させることによって除去される、項目３０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ホスファターゼが、アルカリホスファターゼである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記アルカリホスファターゼが、シュリンプアルカリホスファターゼである、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記伸長オリゴヌクレオチドにおける末端のヌクレオチドが、前記捕捉剤を含む、項目３０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記伸長オリゴヌクレオチドにおける１つ以上の非末端ヌクレオチドが、前記捕捉剤を含む、項目３０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記ハイブリダイゼーション配列が、約５〜約２００ヌクレオチド長である、項目３０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記固相が、平らな表面、ビーズ、シリコンチップ、または前述のものの組み合わせから選択される、項目３０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記固相が、常磁性である、項目３０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）質量分析法である、項目３０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記質量分析法が、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法である、項目３０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
約１〜約５０以上の標的核酸の存在または非存在が、検出される、項目３０〜５６のい
ずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記質量による識別が可能なタグが、ヌクレオチドからなる、項目３０〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記質量による識別が可能なタグが、ヌクレオチドコンポマーである、項目３０〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記ヌクレオチドコンポマーが、約５ヌクレオチド長〜約１５０ヌクレオチド長である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡである、項目３０〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記ゲノムＤＮＡが、ヒトゲノムＤＮＡである、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記放出ステップ（ｅ）が、競合因子との競合を含む場合、（ｆ）における前記検出が、競合因子との競合を含まない放出ステップと比較して、信号対雑音比における増加を含む、項目３０〜６２のいずれか一項に記載の方法。