【手続補正書】
【提出日】平成26年12月19日(2014.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続的進化の方法であって、
（ａ）宿主細胞の集団を、進化させる目的の遺伝子を含み感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされるウイルス遺伝子を欠損しているウイルスベクターの集団と接触させること、ここで、
（１）前記宿主細胞は、前記ウイルスベクターによる感染が可能であり；
（２）前記ウイルスベクターは、前記宿主細胞における前記目的の遺伝子の発現を可能にし、前記宿主細胞により複製され、ウイルス粒子へとパッケージングされることができ；
（３）前記宿主細胞は、感染性ウイルス粒子の産生のために必要とされる前記ウイルス遺伝子を、その活性が前記目的の遺伝子の機能に依存するプロモーターから発現する；
（ｂ）前記宿主細胞の集団を、前記目的の遺伝子の変異および感染性ウイルス粒子の産生を可能にする条件下においてインキュベートすること、ここで、宿主細胞は、前記宿主細胞の集団から取り除かれ、前記宿主細胞の集団は、新たな未感染の宿主細胞で補充される；
（ｃ）前記宿主細胞の集団から、進化したタンパク質をコードする前記ウイルスベクターの変異した複製産物を単離すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
ファージにより補助される連続的進化の方法であって、
（ａ）細菌宿主細胞の集団を、進化させる目的の遺伝子を含み全長pIII遺伝子を欠損しているファージの集団と接触させること、ここで
（１）前記ファージは、前記宿主細胞における前記目的の遺伝子の発現を可能にし；
（２）前記宿主細胞は、ファージの感染、複製およびパッケージングのために好適な宿主細胞であり；および
（３）前記宿主細胞は、pIIIタンパク質をコードする発現コンストラクトを含み、ここで、pIII遺伝子の発現は、前記目的の遺伝子の遺伝子産物の機能に依存する；
（ｂ）前記宿主細胞の集団を、前記目的の遺伝子の変異、感染性ファージの産生、およびファージによる宿主細胞の感染を可能にする条件下においてインキュベートすること、ここで、感染した細胞は、前記宿主細胞の集団から取り除かれ、ここで、前記宿主細胞の集団は、ファージにより感染していない新たな宿主細胞で補充される；
（ｃ）前記宿主細胞の集団から、進化したタンパク質をコードする変異したファージの複製産物を単離すること
を含む、前記方法。
【請求項３】
ウイルスベクターがファージである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ファージが線状ファージである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ファージがM13ファージである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ファージが、全長pIII遺伝子を除くファージ粒子の生成のために必要とされるすべてのファージ遺伝子を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされるすべてのファージ遺伝子をヘルパーファージの形態で含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ファージ粒子の生成のために必要とされるファージ遺伝子が、pI、pII、pIV、pV、pVI、pVII、pVIII、pIXおよび／またはpXである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞がアクセサリープラスミドを含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
アクセサリープラスミドが、pIIIタンパク質をコードする発現コンストラクトを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞がアクセサリープラスミドを含み、かつ同時に、ファージゲノムおよび前記アクセサリープラスミドが、感染性ファージの生成のために必要とされるすべての遺伝子を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞がヘルパーファージおよびアクセサリープラスミドを含み、かつ同時に、前記ヘルパープラスミドおよびアクセサリープラスミドが、ファージゲノムの存在下において感染性ファージの生成のために必要とされるすべての遺伝子を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
pIII発現コンストラクトが、pIII遺伝子の発現を制御するコンディショナルプロモーターを含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
コンディショナルプロモーターの活性が、目的の遺伝子によりコードされる遺伝子産物の所望の機能に依存する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
宿主細胞が、ドミナントネガティブpIIIタンパク質（pIII-neg）をコードする発現コンストラクトを含む、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
pIII-negタンパク質の発現がプロモーターにより駆動され、該プロモーターの活性が目的の遺伝子によりコードされる遺伝子産物の所望されない機能に依存する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
目的の遺伝子の機能が、結合活性または酵素活性である、請求項１４または１６に記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞が変異誘発プラスミドをさらに含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
変異誘発プラスミドが、変異誘発を促進する遺伝子産物をコードする遺伝子発現カセットを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞を、該宿主細胞において変異誘発を促進する遺伝子産物の発現を誘導するインデューサーと接触させることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）が、宿主細胞の集団を、少なくとも１０の、継続的なウイルスベクターまたはファージの生活環のために十分な時間にわたりインキュベートすることを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞がE. coli細胞である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞の集団が、新たな未感染の宿主細胞で連続的に補充される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞集団において実質的に一定の細胞数をもたらす速度または実質的に一定のウイルスもしくはファージの負荷をもたらす速度で、新たな細胞が補充され、細胞が細胞集団から取り除かれる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が変異原に暴露される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
変異誘発によりファージの集団を多様化させる相を含み、ここで、細胞は、目的の遺伝子の変異誘発のために好適な条件下、目的の遺伝子における機能獲得型変異を獲得しているファージについてのストリンジェントな選択の非存在下で、インキュベートされる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
目的の遺伝子の連続的進化のための装置であって、
（ａ）以下を含むラグーン：
進化させる目的の遺伝子を含むファージの集団およびファージの宿主細胞の集団を含む、細胞培養容器；
タービドスタットに連結した流入路；
任意に、変異原を含む容器に連結した流入路；
任意に、インデューサーを含む容器に連結した流入路；
流出路；
流入および流出速度を制御するコントローラー、
（ｂ）以下を含むタービドスタット：
新たな宿主細胞の集団を含む細胞培養容器；
ラグーンの流入路に連結した流出路；
液体培地を含む容器に連結した流入路；
タービドスタット中の新たな宿主細胞の培養物の濁度を測定する濁度計；
培養液の濁度に基づいて無菌の液体培地の流入および廃棄物容器中への流出を制御するコントローラー、
（ｃ）任意に、変異原を含む容器、ならびに
（ｄ）任意に、インデューサーを含む容器
を含む、前記装置。
【請求項２８】
ファージベースの連続的定向進化のためのベクターシステムであって、
（ａ）進化させる目的の遺伝子を含む選択ファージ、ここで、ファージゲノムは、感染性ファージを生成するために必要とされる遺伝子を欠損している；
（ｂ）感染性ファージ粒子を生成するために必要とされる遺伝子をコンディショナルプロモーターの制御下に含むアクセサリープラスミド、ここで、前記コンディショナルプロモーターは、目的の遺伝子によりコードされる遺伝子産物の機能により活性化される；
（ｃ）任意に、ヘルパーファージをさらに含み、ここで、選択ファージは、ファージ粒子の生成のために必要とされるすべての遺伝子を含まず、かつ、前記ヘルパーファージは、ヘルパーファージゲノムと選択ファージゲノムとが一緒になってファージ粒子の生成のために必要とされるすべての遺伝子の少なくとも１つの機能的コピーを含むが、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる少なくとも１つの遺伝子を欠損するように、選択ファージのゲノムを補完する；および
（ｄ）任意に、変異誘発プラスミド
を含む、前記ベクターシステム。
【請求項２９】
感染性ファージの生成のために必要とされるファージタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子をコンディショナルプロモーターの制御下に含む発現コンストラクト；
任意に、選択ファージ、ここで、前記選択ファージは、感染性ファージの生成のために必要とされるファージタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含まず；かつ、細胞の感染性ファージの生成のために必要とされるファージタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を制御するコンディショナルプロモーターを活性化する遺伝子産物をコードする、目的の遺伝子を含む；および
任意に、変異誘導性タンパク質をコードする遺伝子を含む発現コンストラクト
を含む、細胞。