【手続補正書】
【提出日】平成27年8月12日(2015.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数のアミノ酸置換を含む配列番号３に対応する細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）と、ｉＬＢＰのＮ末端アミノ基であるリシン残基またはシステイン置換へと付着させたフルオロフォアとを含み、ビリルビンには結合するが脂肪酸に有意には結合しないプローブ。
【請求項２】
置換１４Ｒ、１８Ｌ、２５Ｃ、２７Ａ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｌ、１１５Ｒ、１１７Ｄをさらに含み、ローダミンＢと組み合わせてもよい、請求項１に記載のプローブ（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１）。
【請求項３】
置換１４Ｒ、１８Ｌ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｃ、１１５Ｒ、および１１７Ｄをさらに含み、ローダミンＢと組み合わせてもよい、請求項１に記載のプローブ（Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７）。
【請求項４】
細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）を含み、該ｉＬＢＰが、１４、１８、２３、２５、２７、３１、３６、３８、５５、６０、７２、７３、７４、７８、１０２、１０４、１０６、１１５、および１１７位から選択される位置において１または複数のアミノ酸置換を含む配列番号３に対応する、または、
前記フルオロフォアが、システイン置換へと付着し、該システイン置換が、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、および９８位からなる群から選択される、
請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記フルオロフォアが、リシン置換へと付着し、該リシン置換が、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、および９８位からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
２つのフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアが、リシン置換へと付着し、第２のフルオロフォアが、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、および９８位からなる群から選択されるシステイン置換へと付着している、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項７】
フルオロフォアの発光強度が、ビリルビンおよびヘモグロビンから選択される血液成分の吸光により影響されない、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項８】
第２のフルオロフォアをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項９】
第１のフルオロフォアが、システインへと付着し、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、および４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）からなる群から選択され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄからなる群から選択される、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
第１のフルオロフォアが、リシンへと付着し、アクリロダン、Ｂｉｏｔｉｕｍ  ＣＦ７５０ＳＥ、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ  ＩＲ  Ｄｙｅ  ６８０  ＬＴ、およびＬｉＣｏｒ  ＩＲ  Ｄｙｅ７００ＤＸからなる群から選択され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄからなる群から選択される、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１１】
第２のフルオロフォアが、溶液中に遊離しているか、またはプローブのアクセプタータンパク質もしくはペプチドドメインへと付着している、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記アクセプタータンパク質またはペプチドドメインが、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、およびＡＣＰタグから選択される、請求項１１に記載のプローブ。
【請求項１３】
置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ６）をさらに含む、請求項８〜１２のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１４】
置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ１４）をさらに含む、請求項８〜１２のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１５】
Ｎ末端のＭＡＦＤが
【化１】
2014526055.tif 000001
のいずれかで置換されており、さらに配列番号３のＣ末端Ｈｉｓタグが、１または２の６−Ｈｉｓタグと組み合わせて１または複数のリンカーにより置換されていてもよく、該リンカーが
【化２】
2014526055.tif 000002
およびこれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１６】
請求項６〜１５のいずれかから選択される少なくとも１つのプローブを含む組成物。
【請求項１７】
固体基質へと付着させた請求項１〜４のいずれかに記載のプローブを含み、場合により、鉄のコアおよび／またはマイクロ流体デバイスもしくはマルチウェルプレートを伴う、好ましくは、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズ、Ｎｉ−アガロースビーズである固体基質。
【請求項１８】
ビリルビンプローブをキャリブレートして、Ｋｄを決定する方法であって、
プローブを、ビリルビン濃度Ｂｔが既知である水性試料と混合するステップと、
蛍光を測定するステップと、
キャリブレーションパラメータを、以下の式２または３：
【数１】
2014526055.tif 000003
［式中、Ｉλｅｍは、ブランクの蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、Ｉ０は、ビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、ＰＴは、総ビリルビンプローブ濃度であり、ＢＴは、総ビリルビン濃度であり、Ｒは、測定された蛍光比（Ιλ１／Ιλ２）［式中、Ｉλ１は、波長λ１における第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ２は、波長λ２における第２のフルオロフォアからの蛍光強度である］であり、Ｒ０は、ビリルビンの非存在下における比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存在下におけるプローブのΙλ２／Ιλ１比であり、Ｋｄは、解離定数である］
でフィッティングすることにより測定された蛍光から決定するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
遊離ビリルビン濃度［Ｂｆ］を測定する方法であって、
場合により、試料の蛍光を測定するステップと、
プローブを、試料と混合するステップと、
蛍光を測定するステップと、
場合により、試料を伴うプローブの蛍光から試料の蛍光を減じるステップと、
濃度［Ｂｆ］を、測定された蛍光から決定するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
以下の式４〜５：
【数２】
2014526055.tif 000004
［式中、Ｉλｅｍは、ブランクの蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、Ｉ０は、ビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、Ｒは、測定された蛍光比（Ιλ１／Ιλ２）［式中、Ｉλ１は、波長λ１における第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ２は、波長λ２における第２のフルオロフォアからの蛍光強度である］であり、Ｒ０は、ビリルビンの非存在下における比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存在下におけるプローブのΙλ２／Ιλ１比であり、Ｋｄは、解離定数であり、Ｉｓは、プローブのビリルビン飽和時における発光強度である］
のうちの少なくとも１つを用いて、プローブをキャリブレートし、かつ／または［Ｂｆ］を測定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料を患者から回収するための１または複数の回収デバイスと、
請求項１〜１５のいずれかに記載の１もしくは複数のプローブ、または適切な担体中に１もしくは複数のプローブを含む請求項１６に記載の組成物と、
場合により、既知濃度の非結合ビリルビンを含む参照標準物質と
を含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
【表８−２】
2014526055.tif 000005