【手続補正書】
【提出日】平成27年2月19日(2015.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ培養物中の初代細胞または胚を、ＴＡＬＥＮをコードする核酸に接触させることを含み、前記細胞は家畜の細胞であり、前記胚は家畜の胚である、遺伝子改変を行う方法。
【請求項２】
初代細胞がインビトロ培養物中で核酸に接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＡＬＥＮをコードする核酸がｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞または胚を、レポーターまたは選択マーカーをコードするベクターに接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ベクターがプラスミドまたはレポーターをコードするトランスポゾンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
レポーターを発現する細胞または胚を選択すること、および前記細胞または胚を使用して遺伝子改変動物を作製することをさらに含み、前記遺伝子改変がＴＡＬＥＮにより特異的に結合されるＤＮＡ部位にある、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
動物を繁殖させること、および遺伝子改変を発現し、かつ外来性レポーターを含まない子孫を選択することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培養物の細胞から遺伝子改変動物をクローニングすることをさらに含み、前記細胞がＴＡＬＥＮにより特異的に結合されるＤＮＡ部位に遺伝子改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子改変が、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入、逆位、天然のアレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、および新規なアレルへの遺伝子変換からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞または胚にリコンビナーゼを送達することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、家畜の細胞、偶蹄目動物の細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、始原生殖細胞または幹細胞および接合体からなる群から選択され、あるいは、胚が胚盤胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
形質を選択すること、および家畜動物の創始体として使用される細胞または胚において前記形質をコードするＤＮＡの領域を逆位させることを含む、家畜動物を遺伝子改変する方法。
【請求項１３】
逆位が１０００塩基対を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
逆位が１メガベースの染色体ＤＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前駆細胞または胚を第１のＤＮＡ部位で特異的に結合する第１のＴＡＬＥＮ、および第２のＤＮＡ部位で特異的に結合する第２のＴＡＬＥＮに接触させることを含み、前記部位の間の領域が欠失される、動物を遺伝子改変する方法。
【請求項１６】
第１のＴＡＬＥＮが第１のＴＡＬＥＮペアを含み、第２のＴＡＬＥＮが第２のＴＡＬＥＮペアを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前駆細胞を含み、前記前駆細胞からの体細胞核移植またはクロマチン移植が動物を作製するために使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＡＬＥＮを前駆細胞に導入すること、およびレポーターを含むベクターをさらに導入すること、ならびに前記レポーターが発現する場合に限り、動物の作製のため前駆細胞または胚を選択することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
アレルを第１の家畜品種から第２の家畜品種に移す方法であって、
前記第１の家畜品種の前記アレルをコードする核酸の存在下でＴＡＬＥＮを前記第２の家畜品種の細胞または胚に導入することを含み、前記アレルが前記細胞または前記胚にコピーされ、さらに前記細胞または前記胚から前記第２の品種の動物を作製すること
を含む、方法。
【請求項２０】
アレルがベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）に存在するミオスタチンアレルを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＡＬＥＮがｍＲＮＡまたはベクターによりコードされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＴＡＬＥＮがｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮであり、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＴＡＬＥＮと独立にレポーターベクターを導入することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
アレルが第１の家畜品種の形質に連鎖する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
細胞または胚にリコンビナーゼを送達することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
リコンビナーゼがタンパク質、ｍＲＮＡとして、またはリコンビナーゼをコードするベクターにより、送達される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
リコンビナーゼが核酸と組み合わさってフィラメントを形成する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
第２の品種の家畜動物のアレルを含む第１の品種の家畜動物
を含み、
前記第１の品種の家畜動物は前記第２の品種の動物との減数分裂組換えを含まない、遺伝子改変家畜動物。
【請求項２９】
動物が、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギおよび魚からなる群から選択される、請求項２８に記載の動物。
【請求項３０】
第１の品種が和牛（Ｗａｇｙｕ  ｃａｔｔｌｅ）であり、第２の品種がベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）である、請求項２８に記載の動物。
【請求項３１】
アレルが挿入、欠失、多型および一塩基多型からなる群から選択される、請求項２８に記載の動物。
【請求項３２】
動物が外来性マーカー遺伝子を含まない、請求項２８に記載の動物。
【請求項３３】
変化したＲｅｌＡ活性を有する遺伝子改変動物であって、該動物のＲｅｌＡ遺伝子において、挿入、欠失、逆位、または一塩基多型の１つまたは複数を含む、遺伝子改変動物。
【請求項３４】
ブタである、請求項３３に記載の遺伝子改変動物。
【請求項３５】
挿入、欠失、逆位、および／または一塩基多型が、配列番号７との比較により決定される、ヌクレオチド１６およびヌクレオチド３３の間に位置する、請求項３４に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項３６】
挿入、欠失、逆位、および／または一塩基多型がヘテロ接合性である、請求項３５に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項３７】
挿入、欠失、逆位、および／または一塩基多型がホモ接合性である、請求項３５に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項３８】
遺伝子改変初代細胞または胚であって、該細胞または胚のＲｅｌＡ遺伝子において、挿入、欠失、逆位、または一塩基多型の１つまたは複数を含む、細胞または胚。
【請求項３９】
第１のＴＡＬＥＮおよび第２のＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３８に記載の細胞または胚であって、該第１のＴＡＬＥＮおよび該第２のＴＡＬＥＮがＲｅｌＡ遺伝子を標的とする、細胞または胚。
【請求項４０】
挿入、欠失、逆位、および／または一塩基多型が、配列番号７との比較により決定される、ヌクレオチド１６およびヌクレオチド３３の間に位置する、請求項３８に記載の細胞または胚。
【請求項４１】
挿入、欠失、逆位、および／または一塩基多型がヘテロ接合性である、請求項４０に記載の細胞または胚。
【請求項４２】
挿入、欠失、逆位、および／または一塩基多型がホモ接合性である、請求項４０に記載の細胞または胚。
【請求項４３】
請求項３８に記載の細胞または胚から作製されるブタ。
【請求項４４】
変化したＲｅｌＡ活性を有するブタを作製する方法であって、遺伝子編集のために該ブタにおけるＲｅｌＡ遺伝子を特異的に標的とすることを含む、方法。
【請求項４５】
遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、または同等のゲノム編集の使用を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
遺伝子編集が、第１のＴＡＬＥＮおよび第２のＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを初代細胞または胚に投与することを含み、該第１のＴＡＬＥＮおよび該第２のＴＡＬＥＮが該初代細胞または胚におけるＲｅｌＡ遺伝子を標的とする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
第１のＴＡＬＥＮが配列番号７のヌクレオチド１−１６を標的とし、第２のＴＡＬＥＮが配列番号７のヌクレオチド３３−４８を標的とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法により作製されるブタの子孫であって、該子孫が該子孫のＲｅｌＡ遺伝子において挿入、欠失、または逆位の１つまたは複数を含む、子孫。
【請求項４９】
遺伝子編集のためにＲｅｌＡ遺伝子を特異的に標的とすることを含む、ＲｅｌＡ活性を変化させる方法。
【請求項５０】
遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、または同等のゲノム編集の使用を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
遺伝子編集が、第１のＴＡＬＥＮおよび第２のＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することを含み、該第１のＴＡＬＥＮおよび該第２のＴＡＬＥＮが該細胞におけるＲｅｌＡ遺伝子を標的とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
第１のＴＡＬＥＮが配列番号７のヌクレオチド１−１６を標的とし、第２のＴＡＬＥＮが配列番号７のヌクレオチド３３−４８を標的とする、請求項５１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮによる遺伝子改変の図である。
【図２】複数のＤＮＡ遺伝子座で作用するＴＡＬＥＮの図である。
【図３】ウシ胚におけるＴＡＬＥＮ活性である。図（ａ）に実験の概要を示す。ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレアーゼホモ２量体の単量体が２量体を形成し、２つの単量体の間のＤＮＡを切断できるように、ＤＮＡ標的の対向する鎖に合わせて設計する。１日目（Ｄ１）に、インビトロで作製されたウシ接合体にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをインジェクトし、胚盤胞になるまでインビトロ培養する。８日目に各胚盤胞（ｂｌａｓｔ：胚盤胞）を集め、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に供し、ＰＣＲ増幅およびＣｅｌ−Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）処理によりインデルについて解析する。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮにより誘発されたウシ胚のインデルを解析したものである。単位複製配列の長さ、およびインデルを示唆すると予想されたＳＵＲＶＥＹＯＲ切断産物を上に示す。図ｃ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ｐ６５  ＴＡＬＥＮにより誘発されたブタ接合体のインデルを解析したものである。
【図４Ａ】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理したウシ胚から配列決定された欠失および挿入である。野生型配列を示し、ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示す  欠失現象および挿入現象の両方が同定された。
【図４Ｂ】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理したブタ胚から配列決定された欠失および挿入である。野生型配列を示し、ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示す  欠失現象および挿入現象の両方が同定された。
【図５】家畜線維芽細胞の遺伝子編集を行うためのＴＡＬＥＮスキャフォールドを比較する  図ａ）この実験で試験したＴＡＬＥＮスキャフォールドの図である。各スキャフォールド（＋２３１、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．２０１０｛Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，２０１０｝および＋６３、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１｛Ｍｉｌｌｅｒ，２０１１｝）は、ＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み、ＦｏｋＩホモ２量体ドメインのＣ末端融合体を有する。番号はＤＮＡ結合ドメインとの関係で付した。第１の可変領域２アミノ酸残基リピート（ＲＶＤ）の前のアミノ酸を「−１」と表記し、最後のＲＶＤリピートの後のアミノ酸を「＋１」と表記した。図ｂ）ＤＭＤＥ７．１  ＴＡＬＥＮペアまたはＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮペアのどちらかをトランスフェクトした線維芽細胞について、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行った。スキャフォールドおよび処理温度をゲルの上に示し、ＮＨＥＪの割合を下に示す。略語ＮＴ＝未処理。図ｃ）＋２３１または＋６３スキャフォールドのどちらかを有する４つの別のＴＡＬＥＮペアの活性を示す。
【図６】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理した細胞から配列決定された欠失および挿入である。野生型ＡＣＡＮ１２配列をイタリック体で示し、ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（相補）ＴＡＬＥＮ認識配列を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを灰色でハイライトし、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図７】インデル濃縮のためのトランスポゾン共選択である。実験スケジュールをパネル（ａ）に示す。０日目（Ｄ０）に、各ＴＡＬＥＮの発現カセット、選択マーカーをコードするトランスポゾン、およびトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。ＴＡＬＥＮのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である（４倍過剰量）。トランスフェクト細胞を継代前に３０℃あるいは３７℃で３日間培養し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのためのサンプルを集め、拡大培養によりトランスポゾン組み込みを＋／−選択するためリプレートする。３日目以降、全細胞を３７℃で培養する。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのため１４日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、単一細胞核移植のため凍結保存する。図ｂ）カチオン性脂質を使用して線維芽細胞にトランスフェクトした。３日目では活性が観察されなかったため（低トランスフェクション効率のため）、１４日目以降の集団のデータのみを示す。処理温度、選択およびＴＡＬＥＮ  ｉｄ（図（ｃ）に示したＡ〜Ｃの文字により識別）をゲルの上に示す。図ｃ）線維芽細胞にヌクレオフェクションによりトランスフェクトし、３日目、および１４日目以降の非選択（ＮＳ）および選択（Ｓ）集団におけるＮＨＥＪの割合を測定した。処理温度を各マトリックスの上に示す。略語：ｎｄ＝検出されず；ｗｔ＝野生型単位複製配列、ＳＵＲＶＥＹＯＲ処理済み。
【図８Ａ】インデルを同定するための直接ＰＣＲシーケンシングである。各線維芽細胞コロニー由来のＰＣＲ単位複製配列を精製し、配列決定し、野生型配列と比較した。１つのアレルの突然変異、または、両方のアレルの非重複突然変異が起こると、ＴＡＬＥＮ認識部位近傍が２つの配列になる（上部）。突然変異部位の両側にある２つのピークにより各アレル間の相違を同定できる場合、重複両アレル突然変異を同定することができる。ホモ接合性突然変異を有するコロニーは、インデル部位近傍に二重ピークを示さない。
【図８Ｂ】野生型クローンおよび図８Ａに示したようなホモ接合性インデルを有する両アレルクローンの配列比較である。
【図９Ａ】ＤＭＤによる両アレル性改変アレルである。ホモ接合性改変アレル（すなわち、両方のアレルが同じ突然変異を持つ）あるいは各アレルに異なる突然変異を持つ両アレル突然変異を有するコロニーを示す。２つのインデルを持つコロニーでは、各アレルが配列決定された回数を右側に示す。場合によっては、第３の突然変異または単一の野生型アレルが配列決定されたことから、すべてのコロニーが１００％クローンであるとは限らないことが示される。フレームシフトアレルを示し、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図９Ｂ】ＬＤＬＲによる両アレル性改変アレルであり、図９Ａと同様の表記法を用いる。
【図１０】ＴＡＬＥＮによる欠失および逆位である。ＤＭＤ遺伝子座の模式図を図（ａ）に示す。ＤＮＡの方向性を黒い山形模様で示す。雄ブタ線維芽細胞にコトランスフェクトされた、エクソン６および７（黒の矢頭）を標的とするＴＡＬＥＮにより、エクソン６とエクソン７との間でＮＨＥＪによる融合現象が起こり得る。これは、プライマー（黒い矢印）を用いて約５００ｂｐの単位複製配列を得ることにより確認することができる。図ｂ）エクソン６および７を標的とするＴＡＬＥＮを同時にトランスフェクトした細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、両部位でのＮＨＥＪによるインデルが明らかにされる。ＮＨＥＪの割合を下に示す。図ｃ）エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮを同時に導入すると、推定される欠失部位を挟むプライマーを用いたＰＣＲにより、約５００塩基対の産物が得られるのに対し、単独でトランスフェクトすると、得られない。図ｄ）ＴＡＬＥＮ標的部位間の配列の逆位現象の予想される結果を示す。ＤＮＡの方向性を黒い山形模様で示す。逆位遺伝子座の５’および３’末端の推定されるフランキング部位の外側のプライマー（黒い矢印）を、予想された産物の大きさと共に示す。ＰＣＲ産物は、エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮの両方を同時に導入したときのみ、５’および３’接合部の両方で観察された。
【図１１】ＤＭＤによる欠失配列である。複製トランスフェクションで得られたＤＭＤ欠失接合部を示す。上方のエクソン６および７配列をそれぞれ緑色および黄色でハイライトし、ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを赤でハイライトする。
【図１２】ＤＭＤによる逆位配列である。ＤＭＤによる逆位アレルの模式図を、シーケンシングによる解析した５’および３’接合部（枠で囲む）と共に示す。下方に、各融合の予想された配列を示し、それぞれの融合は、ＴＡＬＥＮペアの各スペーサーの中央にある。ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。トランスフェクトされた集団から配列決定された逆位アレルを示す。各アレルが配列決定された回数を右側に示し、挿入されたヌクレオチドを下線で示す。ミスマッチヌクレオチドを小文字で示す。
【図１３】ウシ線維芽細胞におけるＨＤＲの誘導を示す。図ａ）二重鎖切断誘導性相同組換えにより、ウシＧＤＦ８のエクソン３に１１塩基対欠失（ベルギーブルー（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ）突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）およびｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型ではｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮの結合部位の半分が欠損しているため、ＴＡＬＥＮ切断に対して抵抗性を示すはずである。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃および３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性が立証される。本アッセイで使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂおよびｂ’を使用して作製した（図ａに示す）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型は、ｂｔＧＤＦ８３．１活性の推定を難しくすると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。図ｃ）アレル特異的ＰＣＲにより、ＨＤＲの誘導は、ＴＡＬＥＮとＢＢ−ＨＤＲ鋳型とのコトランスフェクションに依存することが立証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１塩基対欠失をまたぎ、野生型アレル（ｗｔ）を増幅できない。陽性対照「Ｃ」を含む各ＰＣＲ反応に５００細胞相当量を加えた。ＨＤＲ率は、実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーにより判定した。
【図１４】シーケンシングによるベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）遺伝子移入の確認である。和牛（Ｗａｇｙｕ）野生型ＧＤＦ８およびベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）の模式図を示す。５つのＰＣＲ陽性コロニーについて、ホモロジーアーム（ｃおよびｄ）の外側に位置するプライマーを使用してＰＣＲを行ってから、プライマーｂ’を用いてクローニングおよびシーケンシングを行った。野生型配列との比較から、５つのコロニーのうち４つのコロニーでベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）アレル（ヘテロ接合性）に特徴的な予想された１１塩基対欠失が明らかにされる。
【図１５】ＴＡＬＥＮを介したＨＤＲの模式図およびゲルである。ブタ（ｓｗｉｎｅ）低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
これらの細胞は、動物、家畜類および動物モデルの作製にも有用である。大きな欠失は、遺伝子不活性化を引き起こす。さらに、たとえば、細胞、家畜類または動物モデルから欠失株を作製してもよい。突然変異を持つ生物と欠失株を交雑して野生型と比較すると、突然変異の遺伝子座の位置を迅速かつ手軽に特定し同定しやすくなる。欠失株は、こうした技術分野では周知であり、遺伝子のいくつかの欠失から作られた生物のセットを含む。欠失マッピングでは、遺伝子に点突然変異がある株と欠失株との交雑が行われる。２つの株間で組換えが起こり、野生型（＋）遺伝子が生じる場合、突然変異は欠失の領域内にあり得ない。組換えにより任意の野生型遺伝子が生じない場合、点突然変異および欠失が  同じ一続きのＤＮＡ内に認められると結論するのが妥当である。これを用いて、たとえば、原因突然変異を同定したり、または量的形質遺伝子座の中にある多型を同定したりすることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
実施例８
家畜類細胞におけるＨＤＲの標的としての、ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断。
ブタ（ｓｗｉｎｅ）低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む（図１５）。培養から３日後、ＰＣＲ解析により、抗生物質選択を行わなくても、３０℃で標的遺伝子座（レーン４）にてＨＤＲ現象に対応するバンドを検出し得ることが明らかになった。ジェネティシン（Ｇ４１８）による１４日間の培養細胞集団の選択の結果、ＨＤＲ細胞が顕著に濃縮された（レーン１１および１３）。体細胞核移植により、こうして改変された細胞のクローニングが実施され、代理雌ブタは現在胚を妊娠している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】削除
【補正の内容】