【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年4月27日(2015.4.27)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養するための植込可能でない支持体であって、非接着性のディボットされた表面を有し、
前記表面は、実質的に平坦な上面、
前記支持体の表面は、実質的に平坦な上面がエッチングされた複数のディボットを含み、
各ディボットは、内部底面および内部側壁面を含み、
底面は、丸みを帯ており、
各ディボットは、直径１００〜２００μｍ、深さ５０〜１５０μｍであり、
細胞は個々のディボット中に分布され、細胞はディボット表面に接着せずそこから移動可能である支持体。
【請求項２】
請求項１記載の支持体を含む細胞を培養するためのデバイスであって、
前記平坦支持体を保持するための系をさらに含み、
前記系が底面および内部側壁面および内部容積を形成し、前記底および側壁が実質的に液密性であり、細胞および培地が内部容積中に分布される、デバイス。
【請求項３】
前記細胞が島細胞である請求項１記載の支持体。
【請求項４】
前記ディボットが直径１００μｍおよび深さ６０μｍである請求項１記載の支持体。
【請求項５】
前記平坦上面がガラス製である請求項１記載の支持体。
【請求項６】
滅菌性である請求項１記載の支持体。
【請求項７】
細胞の培養方法であって、
請求項１に記載の支持体に細胞を導入すること、
を含み、
前記支持体を細胞培養条件に曝露する、細胞の培養方法。
【請求項８】
前記細胞が島細胞であり、そしてデバイスおよび支持培養条件に曝露後に、前記細胞が小型島に再凝集する請求項７記載の細胞の培養方法。
【請求項９】
前記細胞が２０〜１５０細胞／１ディボットの比率でディボット中に沈下する請求項７記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
前記ディボットが直径１００μｍおよび深さ６０μｍである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
導入化学物質に対する応答に関して複数の細胞試料を試験するための方法であって、
（ａ）請求項２に記載のデバイス中で細胞を培養するステップと、
（ｂ）各ディボットに試験化学物質を導入するステップと、
（ｃ）試験化学物質に対する細胞の応答を分析するステップと、
を包含する方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の方法で製造される島の単離集団であって、
すべての島の少なくとも８０％は、直径９０μｍより小さく、前記島がネイティブの大型島に比して低い拡散バリアを有し、
前記島は、ネイティブの小型および大型島に比して高い細胞生存度を有し、
島インスリン産生は、ネイティブ単離島より１０倍以上大きいレベルにより特性化される、島の単離集団。
【請求項１３】
球形である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１４】
前記島が膵臓アルファ細胞、膵臓ベータ細胞および膵臓デルタ細胞である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１５】
前記島の少なくとも８５％が生存可能である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１６】
全島の少なくとも８０％が直径５０μｍ未満である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１７】
前記島の少なくとも５０％が直径３７μｍ未満である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１８】
前記島ベータ細胞が、ネイティブ小型島またはネイティブ大型島から単離されるベータ細胞と比較してより多量にインスリンを産生する請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１９】
前記島がネイティブ大型島に比して低拡散バリアを有する請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項２０】
前記細胞が、前記ディボットされた表面および支持培養条件に暴露した後３次元細胞凝集体に凝集する請求項７に記載の細胞の培養方法。
【請求項２１】
前記ディボット間の平均距離が３０μｍ未満である請求項１に記載の支持体。
【請求項２２】
前記支持体表面は個々の細胞を前記表面に接着できる細胞接着分子が存在しない請求項１に記載の支持体。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、細胞の培養方法であって、複数のディボットを含む表面に細胞を導入すること（各ディボットは、直径１００〜２００μｍ（±２０％）および深さ５０〜１５０μｍ（±２０％）である）、そして前記デバイスを細胞培養条件に曝露することを包含する方法である。好ましい一実施形態では、細胞は島細胞であり、そしてデバイスおよび支持培養条件に曝露後に、前記細胞は小型島に再凝集する。好ましい一実施形態では、細胞は約２０〜１５０細胞／１ディボットの比率でディボット中に沈下する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、導入化学物質に対する応答に関して複数の細胞試料を試験するための方法であって、（ａ）複数のディボット（各ディボットは、直径１００〜２００μｍ（±１０％）および深さ５０〜１５０μｍ（±１０％）である）を含むデバイス中で細胞を培養するステップ、（ｂ）各ディボットに試験化学物質を導入するステップ、ならびに（ｃ）試験化学物質に対する細胞の応答を分析するステップを包含する方法である。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５２】
足場は、足場への個々の細胞付着および／または小型島細胞クラスター付着を助長するためにそれに付着される１つ以上の島細胞接着分子（「ＣＡＭ」）も有し得る。他の用途では、ＣＡＭは、組織工学処理のためにポリマーとの細胞付着を助長することが示されている（Dunehoo et al., Cell adhesion molecules for targeted drug delivery, J. Pharm. Sci. 95: 1856-1872 (2006)）。細胞接着分子（ＣＡＭ）としては、インテグリン（例えば、ａｖｂ３、ａｖｂ５、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４）、カドヘリン（例えば、Ｅ−、Ｐ−およびＮ−カドヘリン）、セレクチン（例えば、Ｅ−、Ｌ−およびＰ−セレクチン）、免疫グロブリン・スーパーファミリー（例えば、ＩＣＡＭ−１、１ＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１）、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、ラミニンおよびフォン・ビレブランド因子）、線状および環状細胞接着ペプチドおよびＲＧＤペプチド由来のペプチド模倣物、ＩＣＡＭ−１ペプチド、ＶＣＡＭ−１ペプチド、カドヘリンペプチド、およびＬＦＡ−１ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＭは、組織再生、細胞形態、移動、有糸分裂、細胞質分裂、食作用、ならびに細胞極性の維持のための必須分子である。ＣＡＭは、細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）接着のための受容体として作用する細胞表面に見出される糖タンパク質である。細胞接着分子、例えばＲＧＤペプチドは、組織工学処理、組織再生、創傷治癒、再建手術、神経再生、骨移植および臓器移植のプロセスを手助けし得る、ということが従来示されてきた。さらに、Ｅ−カドヘリンは、β細胞接着において重要であることが示されている（Hauge-Evans et al., Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MINE pseudoislets, Diabetes, 48: 1402-1408 (1999)）。一態様では、細胞接着分子は、共有結合（単数または複数）、例えばペプチド、チオエーテル、ジスルフィドまたはエステル結合（これらに限定されない）を用いてポリマー上に固定される。スペーサー分子は、細胞接着分子とポリマーとの間に付加されて、ポリマー上の接着分子と細胞表面の細胞接着受容体との間の自由相互作用を可能にし得る。ＲＧＤペプチドをちりばめられたポリマーに異なる細胞を付着するための試験はポリマー間の最適スペーサーを示し、そしてＲＧＤポリペプチドは、細胞表面受容体によるＲＧＤペプチドの最適認識のためには、約１１〜４６オングストロームである。スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧＳ）、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｇｌｙ、ポリ−Ｌｙｓ、ポリ−Ａｌａ）、ポリアミノカプロン酸（ポリ−Ａｃａ）および２または３つのアミノ酸反復（例えば、ポリ−Ａｃａ−Ｇｌｙ）の組合せから作られ得るが、これらに限定されない。共有結合のほかに、細胞接着分子は、島細胞を付着する前に、ポリマー上のパッチのポリマー網状構造に吸着され得る細胞接着分子を先ず付着することにより（例えば、静電的に、疎水的に、または他の非共有的相互作用により）、吸着され得る。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６７】
さらに別の態様では、微小鋳型で生成される島の集団は、高レベルのインスリン分泌により特性化され得る。例えば、微小鋳型中で再凝集される小型島は、ネイティブ小型島に比してより高いレベルのインスリン分泌、好ましくは２０倍より多いインスリン分泌、さらに好ましくは１００倍より多いインスリン分泌により特性化される。例えば、再凝集島は、図２３で示されている約１０ｎｇ／ＩＥという分泌が測定された。これは、Crim et al., 2010からの最良算定値の４１倍である。実験室間でインスリン分泌データを比較するに際して難しいことの１つは、多くの研究者が島容積当たりのそのインスリン分泌を報告できない、という点である。Crim等の場合、彼等は５０個の島当たりのインスリン分泌を報告したが、しかし島の平均サイズを示さなかった。したがって、その５０個の島が各々、１島当量（ＩＥ）という前に明示された島容積と等価であった、と推定し得るだけである。ＩＥで割ることにより、島および細胞の総容積に関して正規化されるインスリン分泌を、われわれの実験室は常に報告している。Crim論文に関してなされる推測によれば、本明細書中に記載される再凝集島は、Crim等が報告した最良条件の４０倍を超える高グルコースに応答したインスリンを放出する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７８】
別の態様では、本発明は、薬剤、化学物質または他の小分子の高処理量スクリーニングのための方法にも関する。本発明の微小鋳型の形状と寸法は、各ディボットにおける個々の相互作用に適応するように設計されることができると予期される。他の態様では、ディボット化された微小鋳型は、動物宿主に移植のために適したバイオポリマーから生産される。植込み可能な微小鋳型中に再凝集される細胞は、ディボット化支持体に接着し得るし、そうでないこともある、とわれわれは予見する。in vitro研究に関しては、非接着性支持体表面、例えばガラスが好ましい。しかしながら、植込み可能鋳型または生体ポリマーパッチに関しては、接着支持体は、移植プロセスの効率を増強し、移植中および移植後の島の損失を低減する。生体ポリマーへの細胞の接着は、試験され、表１および図８に記載されている。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７９】
本発明の付加的態様は、それに付随する利点および新規の特徴と一緒に、一部は以下の説明および実施例に記述され、そして一部は以下の検査時に当業者に明らかになるか、あるいは本発明の実行から習得され得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される手段および組合せにより実現され且つ獲得され得る。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８９】
大型または小型ラット島の移植を完了した（ｎ＝１０移植／群）。ストレプトゾトシン誘導性糖尿病ＤＡラットは、限界質量（１０００  ＩＥ）の大型（１５０μｍより大きい）または小型（１２５μｍより小さい）同系島を腎臓被膜下に受容した。血糖レベルを、８週間モニタリングした。図３（Ａ）および３（Ｂ）は、各群に関する最初の５つの移植片からの結果を示す。大型島のレシピエントはすべて、移植後に高血糖のままであった（１０匹中１０匹）。これに対比して、小型島の１０匹のレシピエントのうちの８匹は、移植の７〜１０日後に、正常レベルに近いかまたは正常レベルの血糖レベルを有し、これは全８週間中、正常のままであった。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９１】
同時に前記の実験は、小型島（１２５μｍ未満）が、生存度、in vivo機能検定において、ならびに移植片結果において、大型島（１２５μｍより大きい）より優れている、ということを示す。さらに、平均的膵臓は大型島より約３倍多い小型島を産生し、小型島は約２０％以上生存可能であった。最も重要なのは、糖尿病動物に移植された場合、小型島が大型島よりはるかに優れていたことである。
実施例２：個々の島細胞または小型島細胞クラスターへの大型島の変換
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０８】
生体物質上にプレート化し、その後、３回洗浄した後、付着細胞の数を計数することにより、細胞接着を確定した。以下のケイ酸を用いて、生体物質を欠いているウェル底（空ウェル、対照を参照）に付着する細胞の数に、計数を正規化した：当該ウェルに付着した細胞数／空ウェル中の細胞数。各実験を、三重反復実験で反復した。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５８】
インスリン産生    微小鋳型中で工学処理された島は新規のインスリン分子を産生し得る、ということを証明することは重要であった。インスリンは、先ず、プロインスリンと呼ばれる前駆体分子として合成される。６日齢再凝集島をプロインスリンレベルに関して染色して、それらが新規のインスリンを作っていたか否かを確定した。図２２は、成熟インスリン（緑色）およびプロインスリン分子（赤色）に関して染色された再凝集島の一例を示す。予測どおり、ベータ細胞は二重標識されている。画像は、新規インスリンは培養６日でも、再凝集島中で合成されている、ということを示す。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２３】
2013524787.tif 000001
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２５】
2013524787.tif 000002