【手続補正書】
【提出日】平成27年9月1日(2015.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式の化合物またはその塩、互変異性体もしくは光学異性体:
2014532043.tif 000001
式中、
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α-チオトリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3はアルキル(C≦8)または置換アルキル(C≦8)であり;
R4は
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
R5およびR6はそれぞれ独立して
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アルケニル(C≦6)、アルキニル(C≦6)、アリール(C≦6)、アラルキル(C≦8)、ヘテロアリール(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョン;
下記式の基:
2014532043.tif 000002
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である;あるいは
-リンカー-レポーターである。
【請求項２】
式Iの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
式IIの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
式IIIの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
式IVの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項６】
式Vの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項７】
式VIの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項８】
式VIIの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項９】
R3がイソプロピルまたはtert-ブチルである、請求項1記載の化合物。
【請求項１０】
R5が水素、ヨード、またはアルコキシ(C≦6)、特にメトキシである、請求項1〜9のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１】
R5が、
a)下記式の基:
2014532043.tif 000003
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
nは0〜6の整数である；
b)下記式の基:
2014532043.tif 000004
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数であるか、または
c)-リンカー-レポーターである、請求項1〜9のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２】
リンカーが、
i)
2014532043.tif 000005
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
nは0〜6の整数であるか；または、
ii)
2014532043.tif 000006
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である、請求項11記載の化合物。
【請求項１３】
i)Xがアルキンジイル(C2〜8)または-C≡C-であり；ii)Yが-CH2-であり；iii)nがゼロであり；および／またはiv)mがゼロである、請求項11または12記載の化合物。
【請求項１４】
レポーターが色素に基づき、該色素がキサンテン、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、またはスクアライン色素であるか；または
レポーターが下記式：
2014532043.tif 000007
2014532043.tif 000008
である、請求項11または12記載の化合物。
【請求項１５】
R6が水素である、請求項1〜14のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６】
星付きの炭素原子がS配置である、請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１７】
星付きの炭素原子がR配置である、請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１８】
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、請求項1記載の化合物：
2014532043.tif 000009
2014532043.tif 000010
2014532043.tif 000011
2014532043.tif 000012
2014532043.tif 000013
2014532043.tif 000014
2014532043.tif 000015
2014532043.tif 000016
2014532043.tif 000017
式中、Rは、=Oまたは=Sである。
【請求項１９】
以下の段階を含む、標的核酸を配列決定する方法:
(i) プライマーまたは核酸の5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) それぞれハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体を形成するために、標的核酸と該固体表面に結合したプライマーとをハイブリダイズさせる段階、またはプライマーと該固体表面に結合した核酸とをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 異なる式I〜VIIの化合物が異なるフルオロフォアを有するという条件で、ポリメラーゼ、および下記式およびその塩からなる群より選択される1つまたは複数の化合物を得る段階：
2014532043.tif 000018
式中
R1は、トリホスフェート、α-チオトリホスフェートまたはポリホスフェートであり；
R2 は水素、またはヒドロキシであり；
R3はアルキル(C≦8)または置換アルキル(C≦8)であり；
R4は水素であり；
R5は-リンカー-レポーターであり、該レポーターはフルオロフォアに基づき；
R6は水素である;
(iv) ポリメラーゼ反応を経由して伸長するプライマー鎖を形成するために、ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体と段階(iii)のポリメラーゼおよび1つまたは複数の化合物とを反応させる段階;
(v) 段階(iv)の取り込まれた化合物をそのフルオロフォアによって同定するために、伸長するプライマー鎖を撮像する段階;
(vi)段階(iii)において言及された請求項で定義される変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を除去することによって、伸長プライマーを得るために、伸長するプライマー鎖を有する固体表面を、光源に曝露する段階:
2014532043.tif 000019
; ならびに
(vii)標的核酸中の複数の塩基を同定するために、段階(iv)〜(vi)を1回または複数回繰り返す段階であって、前回のサイクルの段階(vi)の伸長プライマーが後続のサイクルの段階(iv)においてハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体の代わりに反応する、段階。
【請求項２０】
段階(vi)がジチオスレイトール(DTT)の存在下で行われる、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが、対応する天然ヌクレオチドの取り込み効率の約70%〜約100%で生じ、式Iの化合物に対応する天然ヌクレオチドがデオキシチミジン5'-三リン酸、式IIおよびVIIの化合物に対応する天然ヌクレオチドがデオキシシチジン5'-三リン酸であり、式IIIおよびVの化合物に対応する天然ヌクレオチドがデオキシアデノシン5'-三リン酸であり、式IVおよびVIの化合物に対応する天然ヌクレオチドが、デオキシグアノシン5'-三リン酸である、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
段階(vi)において光開裂性末端部分の約85%〜約100%が光源に対する曝露によって除去される、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが約90%〜約100%の効率で生じた後、鎖伸長の終結が行われる、請求項19記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
[本発明1001]
下記式の化合物またはその塩、互変異性体もしくは光学異性体:
2014532043.tif 000020
式中、
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α-チオトリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3はアルキル(C≦8)または置換アルキル(C≦8)であり;
R4は
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
R5およびR6はそれぞれ独立して
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アルケニル(C≦6)、アルキニル(C≦6)、アリール(C≦6)、アラルキル(C≦8)、ヘテロアリール(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョン;
下記式の基:
2014532043.tif 000021
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である;あるいは
-リンカー-レポーターである。
[本発明1002]
式Iの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
式IIの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
式IIIの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1005]
式IVの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1006]
式Vの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1007]
式VIの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1008]
式VIIの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1009]
R1がヒドロキシである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1010]
R1がモノホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1011]
R1がジホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1012]
R1がトリホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1013]
R1がα-チオトリホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1014]
R1がポリホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1015]
R2が水素である、本発明1001〜1014のいずれかの化合物。
[本発明1016]
R2がヒドロキシである、本発明1001〜1014のいずれかの化合物。
[本発明1017]
R3がアルキル(C≦8)である、本発明1001〜1016のいずれかの化合物。
[本発明1018]
R3がアルキル(C3〜4)である、本発明1017の化合物。
[本発明1019]
R3がイソプロピルである、本発明1018の化合物。
[本発明1020]
R3がtert-ブチルである、本発明1018の化合物。
[本発明1021]
R4が水素である、本発明1001〜1020のいずれかの化合物。
[本発明1022]
R4がニトロである、本発明1001〜1020のいずれかの化合物。
[本発明1023]
R5が水素である、本発明1001〜1022のいずれかの化合物。
[本発明1024]
R5がヨードである、本発明1001〜1022のいずれかの化合物。
[本発明1025]
R5がアルコキシ(C≦6)である、本発明1001〜1022のいずれかの化合物。
[本発明1026]
R5がメトキシである、本発明1025の化合物。
[本発明1027]
R5が下記式の基である、本発明1001〜1022のいずれかの化合物:
2014532043.tif 000022
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
nは0〜6の整数である。
[本発明1028]
Xがアルキンジイル(C2〜8)である、本発明1027の化合物。
[本発明1029]
Xが-C≡C-である、本発明1028の化合物。
[本発明1030]
nがゼロである、本発明1027〜1029のいずれかの化合物。
[本発明1031]
R5が下記式の基である、本発明1001〜1022のいずれかの化合物:
2014532043.tif 000023
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である。
[本発明1032]
Xがアルキンジイル(C2〜8)である、本発明1031の化合物。
[本発明1033]
Xが-C≡C-である、本発明1032の化合物。
[本発明1034]
Yが-CH2-である、本発明1031〜1033のいずれかの化合物。
[本発明1035]
nがゼロである、本発明1031〜1034のいずれかの化合物。
[本発明1036]
mがゼロである、本発明1031〜1035のいずれかの化合物。
[本発明1037]
R5が-リンカー-レポーターである、本発明1001〜1022のいずれかの化合物。
[本発明1038]
リンカーが下記式である、本発明1037の化合物:
2014532043.tif 000024
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
nは0〜6の整数である。
[本発明1039]
Xがアルキンジイル(C2〜8)である、本発明1038の化合物。
[本発明1040]
Xが-C≡C-である、本発明1039の化合物。
[本発明1041]
nがゼロである、本発明1038〜1040のいずれかの化合物。
[本発明1042]
リンカーが下記式である、本発明1037の化合物:
2014532043.tif 000025
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である。
[本発明1043]
Xがアルキンジイル(C2〜8)である、本発明1042の化合物。
[本発明1044]
Xが-C≡C-である、本発明1043の化合物。
[本発明1045]
Yが-CH2-である、本発明1042〜1044のいずれかの化合物。
[本発明1046]
nがゼロである、本発明1042〜1045のいずれかの化合物。
[本発明1047]
mがゼロである、本発明1042〜1046のいずれかの化合物。
[本発明1048]
レポーターが色素に基づき、該色素がキサンテン、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、またはスクアライン色素である、本発明1037〜1047のいずれかの化合物。
[本発明1049]
レポーターが下記式である、本発明1037〜1047のいずれかの化合物：
2014532043.tif 000026
2014532043.tif 000027
。
[本発明1050]
R6が水素である、本発明1001〜1049のいずれかの化合物。
[本発明1051]
星付きの炭素原子がS配置である、本発明1001〜1050のいずれかの化合物。
[本発明1052]
星付きの炭素原子がR配置である、本発明1001〜1050のいずれかの化合物。
[本発明1053]
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、本発明1001の化合物：
2014532043.tif 000028
2014532043.tif 000029
。
[本発明1054]
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、本発明1001の化合物:
2014532043.tif 000030
式中、Rは=Oまたは=Sである。
[本発明1055]
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、本発明1001の化合物:
2014532043.tif 000031
2014532043.tif 000032
2014532043.tif 000033
式中、Rは=Oまたは=Sである。
[本発明1056]
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、本発明1001の化合物：
2014532043.tif 000034
2014532043.tif 000035
2014532043.tif 000036
2014532043.tif 000037
。
[本発明1057]
以下の段階を含む、標的核酸を配列決定する方法:
(i) プライマーの5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体を形成するために、標的核酸と該固体表面に結合したプライマーとをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 異なる式I〜VIIの化合物が異なるフルオロフォアを有するという条件で、ポリメラーゼおよび本発明1001〜1056のいずれかの1つまたは複数の化合物を得る段階;
(iv) ポリメラーゼ反応を経由して伸長するプライマー鎖を形成するために、ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体と段階(iii)のポリメラーゼおよび1つまたは複数の化合物とを反応させる段階;
(v) 段階(iv)の取り込まれた化合物をそのフルオロフォアによって同定するために、伸長するプライマー鎖を撮像する段階;
(vi)段階(iii)において言及された本発明で定義される変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を除去することによって、天然成分を有する伸長プライマーを得るために、伸長するプライマー鎖を有する固体表面を、光源に曝露する段階:
2014532043.tif 000038
; ならびに
(vii)標的核酸中の複数の塩基を同定するために、段階(iv)〜(vi)を1回または複数回繰り返す段階であって、前回のサイクルの段階(vi)の伸長プライマーが後続のサイクルの段階(iv)においてハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体の代わりに反応する、段階。
[本発明1058]
段階(vi)がアジ化ナトリウムの存在下で行われる、本発明1057の方法。
[本発明1059]
アジ化ナトリウム濃度が0.1mM〜10mMである、本発明1058の方法。
[本発明1060]
アジ化ナトリウム濃度が約1mMである、本発明1059の方法。
[本発明1061]
段階(vi)が酢酸ナトリウムの存在下で行われる、本発明1057の方法。
[本発明1062]
酢酸ナトリウム濃度が0.1mM〜10mMである、本発明1061の方法。
[本発明1063]
酢酸ナトリウム濃度が約1mMである、本発明1061の方法。
[本発明1064]
段階(v)または(vi)がチオ尿素の存在下で行われる、本発明1057〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
チオ尿素濃度が10mM〜500mMである、本発明1064の方法。
[本発明1066]
チオ尿素濃度が約100mMである、本発明1064の方法。
[本発明1067]
段階(vi)がジチオスレイトール(DTT)の存在下で行われる、本発明1058の方法。
[本発明1068]
以下の段階を含む、標的核酸を配列決定する方法:
(i) 核酸の5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体を形成するために、プライマーと該固体表面に結合した核酸とをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 異なる式I〜VIIの化合物が異なるフルオロフォアを有するという条件で、ポリメラーゼおよび本発明1001〜1056のいずれかの1つまたは複数の化合物を得る段階;
(iv) ポリメラーゼ反応を経由して伸長するプライマー鎖を形成するために、ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体と段階(iii)のポリメラーゼおよび1つまたは複数の化合物とを反応させる段階;
(v) 段階(iv)の取り込まれた化合物をそのフルオロフォアによって同定するために、伸長するプライマー鎖を撮像する段階;
(vi)段階(iii)において言及された本発明で定義される変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を除去することによって、天然成分を有する伸長プライマーを得るために、伸長するプライマー鎖を有する固体表面を、光源に曝露する段階:
2014532043.tif 000039
; ならびに
(vii)標的核酸中の複数の塩基を同定するために、段階(iv)〜(vi)を1回または複数回繰り返す段階であって、前回のサイクルの段階(vi)の伸長プライマーが後続のサイクルの段階(iv)においてハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体の代わりに反応する、段階。
[本発明1069]
段階(vi)がアジ化ナトリウムの存在下で行われる、本発明1068の方法。
[本発明1070]
段階(vi)がジチオスレイトール(DTT)の存在下で行われる、本発明1069の方法。
[本発明1071]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みがその天然ヌクレオチド対応物の取り込み効率の約70%〜約100%で生じる、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1072]
取り込み効率が約85%〜約100%で生じる、本発明1071の方法。
[本発明1073]
ポリメラーゼが逆転写酵素、末端転移酵素およびDNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1074]
段階(vi)において光開裂性末端部分の約85%〜約100%が光源に対する曝露によって除去される、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1075]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが約90%〜約100%の効率で生じた後、鎖伸長の終結が行われる、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1076]
パルスマルチライン励起検出器が段階(v)における撮像に使用される、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1077]
段階(iv)の後に伸長するプライマー鎖を洗浄する段階をさらに含む、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1078]
段階(vi)の後に伸長プライマーを洗浄する段階をさらに含む、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1079]
段階(iv)の前に、段階(iv)において反応しなかった任意のプライマーまたは伸長するプライマー鎖を封止する段階をさらに含む、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1080]
複数の標的核酸を同時に配列決定する段階をさらに含む、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1081]
以下の段階を含む、核酸分子中の非天然成分を天然成分に変換する方法:
(i) 本発明1001〜1056のいずれかの化合物を取り込む段階;
(ii)段階(iii)において言及された本発明で定義される変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を核酸から除去するために、得られた核酸を光源に曝露する段階：
2014532043.tif 000040
。
[本発明1082]
複数の核酸分子中の非天然成分を天然成分に同時に変換する段階をさらに含む、本発明1081の方法。
[本発明1083]
複数の核酸合成を同時に終結させる段階をさらに含む、本発明1082の方法。
[本発明1084]
ポリメラーゼの環境中に本発明1001の3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドを配置し、核酸分子中への3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドの取り込みを可能にする段階を含む、核酸合成を終結させる方法。
[本発明1085]
3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドの取り込み時のDNA合成の終結効率が約90%〜約100%の範囲である、本発明1084の方法。
[本発明1086]
3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドの取り込み効率が、3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドと同じ塩基を有する天然ヌクレオチドまたはヌクレオシドの取り込み効率に比べて約70%〜約100%の範囲である、本発明1084の方法。
[本発明1087]
本発明1001〜1056のいずれかの化合物を末端ヌクレオチド類似体として使用する段階を含む、サンガーまたはサンガー型配列決定を行う方法。
[本発明1088]
化合物が式(I)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
化合物が式(II)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1090]
化合物が式(III)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1091]
化合物が式(IV)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1092]
化合物が式(V)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1093]
化合物が式(VI)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1094]
化合物が式(VII)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1095]
以下の段階を含み、段階(i)〜(iii)が任意の順序で行われうる、標的核酸の配列を決定する方法:
(i) 標的核酸をサンガーまたはサンガー型配列決定装置に加える段階、
(ii) 2種以上の塩基が存在する場合に各塩基が異なるフルオロフォアに結合するという条件で、本発明1001〜1056のいずれかの1つまたは複数の化合物を配列決定装置に加える段階、
(iii) 相補的プライマーおよびポリメラーゼ酵素を加える段階、
(iv) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物を伸長する核酸鎖に取り込むポリメラーゼ反応を行う段階、ならびに
(v) 蛍光配列決定機器の使用またはパルスマルチライン励起蛍光によってサンガー配列決定反応の結果を分析する段階。
[本発明1096]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが約90%〜約100%の効率で生じた後、鎖伸長の終結が行われる、本発明1095の方法。
[本発明1097]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みがポリメラーゼ反応における同じ塩基を有する天然基質の取り込み効率の約70%〜約100%で生じる、本発明1095の方法。
[本発明1098]
取り込み効率が約85%〜約100%で生じる、本発明1097の方法。
[本発明1099]
ポリメラーゼが逆転写酵素、末端転移酵素およびDNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1095の方法。
[本発明1100]
以下の段階を含み、段階(i)〜(iii)が任意の順序で行われうる、非天然成分を核酸に取り込む方法:
(i) 標的核酸を配列決定装置に加える段階;
(ii) 2種以上の塩基が存在する場合に各塩基が異なるフルオロフォアに結合するという条件で、本発明1001の1つまたは複数の化合物を配列決定装置に加える段階;
(iii) ポリメラーゼ酵素を加える段階; および
(iv) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物を伸長する核酸鎖に取り込むポリメラーゼ反応を行う段階。
[本発明1101]
(v) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物の取り込みに関してポリメラーゼ連鎖反応の結果を分析する段階
をさらに含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが約90%〜約100%の効率で生じた後、鎖伸長の終結が行われる、本発明1100の方法。
[本発明1103]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みがポリメラーゼ反応における同じ塩基を有する天然基質の取り込み効率の約70%〜約100%で生じる、本発明1100の方法。
[本発明1104]
本発明1001の化合物をミニ配列決定またはミニ配列決定型配列決定方法に加える段階を含む、ミニ配列決定またはミニ配列決定型配列決定を行う方法。
[本発明1105]
化合物が式(I)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1106]
化合物が式(II)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1107]
化合物が式(III)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1108]
化合物が式(IV)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1109]
化合物が式(V)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1110]
化合物が式(VI)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1111]
化合物が式(VII)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1112]
以下を含むシステム:
複数のビーズを含むフローセルであって、
本発明1001〜1056のいずれかの化合物がポリメラーゼを使用して取り込まれたDNA分子に各ビーズが結合し;
フローセルが可視光線および紫外線に少なくとも部分的に透過性である、フローセル;
フローセルの画像を捕捉するように構成された撮像装置;
少なくとも4つのスペクトルフィルターを含み、各フィルターの間で循環するように構成されたフィルターホイール;
フローセルからフィルターホイール中のフィルターを通じて撮像装置までの光路を作り出すように構成されたランプ; ならびに
フローセル上のDNA分子に紫外線を与えるように構成された紫外線源。
[本発明1113]
フローセルが微小流体フローセルである、本発明1112のシステム。
[本発明1114]
フィルターホイールとフローセルとの間の対物レンズをさらに含む、本発明1112のシステム。
[本発明1115]
光路を撮像装置に向けるように構成された鏡をさらに含む、本発明1112のシステム。
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の真意および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになることから、本発明の具体的な態様を示す詳細な説明および具体例が例示のみを目的として示されると理解すべきである。単に特定の化合物が1つの特定の一般式に帰することをもって、それが別の一般式にも属することができないことを意味するわけではないことに留意されたい。