(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚の状態を改善する有効成分を評価及び選定する方法、及び当該方法により格段にすぐれた皮膚生理活性を有する有効成分を提供する。【解決手段】皮膚の状態（保湿、透明感）を改善する物質の評価方法であって、細胞に被験物質を投与する工程と、被験物質を投与した細胞におけるケラトヒアリン顆粒の合成を測定する工程とを含む評価方法、及びケラトヒアリン顆粒合成を促進する剤を有効成分として含有する皮膚外用剤である。【選択図】図１
2018004454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の状態を改善する物質の評価方法であって、細胞に被験物質を投与する工程と、被験物質を投与した細胞におけるケラトヒアリン顆粒の合成を測定する工程とを含む評価方法。
【請求項２】
ケラトヒアリン顆粒の合成を測定する工程が、さらに、被験物質を投与した細胞におけるフィラグリン生成量を測定する工程と、被験物質を投与した細胞内の顆粒状構造を確認する工程とを含むことを特徴とする請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
ケラトヒアリン顆粒合成を促進する剤を有効成分として含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラトヒアリン顆粒合成促進効果を指標とする皮膚外用剤の有効成分の評価方法及びケラトヒアリン顆粒合成促進剤を有効成分として含む皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、加齢や外的環境の変化により、皮膚の角層中に存在する天然保湿因子（ＮＭＦ）の量が減少すると、角層の保湿機能が低下し、皮膚が乾燥状態になることが知られている。このＮＭＦの合成には、皮膚のターンオーバーの過程で合成されるタンパク質（フィラグリン）が関与している。フィラグリンは皮膚の顆粒層に存在するケラトヒアリン顆粒の構成要素であるプロフィラグリンが脱リン酸化されて生成されるものであり、角質細胞内でさらにアミノ酸にまで分解される（非特許文献１）。そして、この分解反応により生成された遊離アミノ酸がＮＭＦとして機能する。以上の点を考慮して、従来、皮膚の乾燥を改善する目的で、フィラグリン又はその前駆体であるプロフィラグリンの合成を促進する成分や、フィラグリン遺伝子の発現を促進する成分の研究、開発が行われてきた（例えば、特許文献１〜３）。
【０００３】
【非特許文献１】標準皮膚科学(第6版)，池田重雄監修，195頁、医学書院2002
【特許文献１】特開2002-363054号
【特許文献２】特開2001-261568号
【特許文献３】国際公開公報2002/053127号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、非特許文献１に示すように、乾癬等の皮膚疾患や、慢性的な炎症によりターンオーバーが異常に亢進されると、プロフィラグリンの合成が間に合わず、ケラトヒアリン顆粒が認められなくなることがあり、その結果、皮膚は乾燥する。このことから、フィラグリン又はプロフィラグリンの合成を促進する成分や、フィラグリン遺伝子の発現を促進する成分を用いても、皮膚の悪化状態が十分に改善されないことがあるという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記課題を解決するためのものであって、皮膚の状態をより効果的に改善する物質の評価方法、及び当該物質を含む皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、皮膚の状態を改善する物質の評価方法であって、細胞に被験物質を投与する工程と、被験物質を投与した細胞におけるケラトヒアリン顆粒の合成を測定する工程とを含む評価方法である。
また、本発明において、ケラトヒアリン顆粒の合成を測定する工程は、さらに、被験物質を投与した細胞におけるフィラグリン生成量を測定する工程と、被験物質を投与した細胞内の顆粒状構造を確認する工程とを含むことを特徴とする。
また、本発明は、ケラトヒアリン顆粒合成を促進する剤を有効成分とする皮膚外用剤である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ケラトヒアリン顆粒合成を促進し、皮膚の状態（保湿、透明感）を改善し、向上させる物質を評価することができる。
また、ケラトヒアリン顆粒合成を促進し、皮膚の保湿機能及び透明感を向上させる剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明に係る被験物質を投与した細胞内の顆粒状構造を示す写真である。
【図２】コントロールであるＰＢＳ（−）を投与した細胞内の顆粒状構造を示す写真である。
【図３】塩化カルシウムを投与した細胞内の顆粒状構造を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、皮膚の状態（保湿機能、透明感等）を改善する物質をケラトヒアリン顆粒の合成能を指標として評価する方法、及びケラトヒアリン顆粒の合成を促進する剤を有効成分として含む皮膚外用剤である。
【００１０】
本発明において、ケラトヒアリン顆粒の合成を測定する方法としては、例えば、被験物質を投与した細胞におけるフィラグリン生成量を測定する工程と、被験物質を投与した細胞内の顆粒状構造を確認する工程と、フィラグリンの合成と顆粒状構造の形成の両方を促進することが確認された被験物質を、ケラトヒアリン顆粒合成促進効果を有するものであると評価する工程を含む方法が挙げられる。また、細胞によるフィラグリン合成量を測定する方法として、フィラグリン抗体を用いる免疫的検出方法や、ケラトヒアリン顆粒を染色する方法としてヘマトキシリンによる染色方法が挙げられるが、本発明はこれに限るものではない。
【００１１】
本発明において、ケラトヒアリン顆粒の合成を促進する評価する物質としては、皮膚外用剤に配合可能なものであればいずれのものでも好ましく、例えば、天然物（動植物、海藻、乳酸菌や酵母等の微生物等）由来の成分や、糖（単糖、オリゴ糖、多糖、ムコ多糖等）、糖アルコール、ポリフェノール又はその誘導体、有機酸又はその塩、アミノ酸、ペプチド、ビタミン類又はその塩或いは誘導体、タンパク質又はその誘導体、脂質（コレステロール、脂肪酸等）、糖脂質、高級アルコール等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明において、天然物を評価する場合は、以下のように、天然物由来の抽出物若しくはその加水分解物、又は発酵物を評価する方法が挙げられる。
【００１３】
以下に本発明に係る抽出物若しくはその加水分解物、又は発酵物を得るための方法を示す。まず、本発明において、上記各植物や海藻の抽出を行う場合には、必要ならば使用部位を予め水洗して異物を除いた後、そのまま又は乾燥した上、必要に応じて細切又は粉砕し、抽出溶媒と接触させる処理を行う。抽出方法は、浸漬法等の常法に従って抽出溶媒と接触させることで行うことが可能であるが、超臨界抽出法や水蒸気蒸留法を用いることも可能である。
【００１４】
抽出溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール類；エチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等のエステル類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；エチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類；ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルム等の炭化水素系溶媒等が挙げられ、それらは単独で又は二種以上混合して用いられる。
【００１５】
それら抽出溶媒のうちでも、得られる抽出物の有効性、さらには、皮膚刺激性の観点から、又皮膚外用組成物等への幅広い適用が可能であるという点からも、本発明においては、水、低級アルコール類又は多価アルコール類等の親水性溶媒が好適である。この親水性溶媒を用いる場合の好ましい例としては、例えば、水、低級アルコール類（特にエタノール）、又は多価アルコール（特に、１，３−プロパンジオール、１，３−ブチレングリコール）の単独使用、或いは、水と低級アルコール類（特にエタノール）との混合溶媒、又は水と多価アルコール類（特に１、３−ブチレングリコール、１，３−プロパンジオール、グリセリン）との混合溶媒の使用等が挙げられる。
【００１６】
混合溶媒を用いる場合の混合比は、例えば水と１、３−ブチレングリコール若しくは１，３−プロパンジオールとの混合溶媒であれば、容量比（以下同じ）で１：１〜２０：１、水とエタノールとの混合溶媒であれば、１：１〜２５：１、水とグリセリンとの混合溶媒であれば１：１〜２０：１の範囲とすることが好ましい。
【００１７】
また、乾燥部位と抽出溶媒との重量比は好ましくは１：１〜１：５０の範囲であり、より好ましくは、１：５〜１：２０の範囲である。
【００１８】
抽出物の調製に際して、そのｐＨに特に限定はないが、一般には４〜９の範囲とすることが好ましい。かかる意味で、必要であれば、前記抽出溶媒に、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ性調整剤、又はクエン酸、塩酸、リン酸、硫酸等の酸性調整剤を配合し、所望のｐＨとなるように調整してもよい。
【００１９】
抽出温度、抽出時間等の抽出条件は、用いる溶媒の種類やｐＨによっても異なるが、例えば、水、１，３−ブチレングリコール、若しくは１，３−プロパンジオールを単独で溶媒とする場合、又は水と１，３−プロパンジオール若しくは１，３−プロパンジオールとの混液を溶媒とする場合であれば、抽出温度は好ましくは０℃〜９０℃の範囲であり、又抽出時間は好ましくは１時間〜１週間であり、より好ましくは４時間〜３日の範囲である。
【００２０】
以上のように抽出した抽出物には、酵素により加水分解処理を施しても良い。酵素としては、蛋白分解酵素、澱粉分解酵素、ペクチン質分解酵素、及びリパーゼ等の脂肪分解酵素のいずれかの酵素群から選ばれた１種又は２種以上を用いてもよいが、それらの酵素群からそれぞれ選ばれた１種又は２種以上の酵素を組み合わせて用いることがより好ましい。
【００２１】
ここで蛋白分解酵素としては、例えば、アクチナーゼ等のアクチナーゼ類、ペプシン等のペプシン類、トリプシン、キモトリプシン等のトリプシン類、パパイン、キモパパイン等のパパイン類、グリシルグリシンペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ等のペプチダーゼ類、ブロメライン等を用いることができる。
【００２２】
また。糖質分解酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を用いることができる。
【００２３】
また、ペクチン質分解酵素としては、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンデメトキシラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ポリガラクチュロナーゼ等を用いることができる。
【００２４】
酵素の使用量は、懸濁液中の各植物の固形分に対して、合計で０．０００１〜１０重量％が好ましく、より好ましくは０．００１〜２．０重量％である。
【００２５】
また、本発明においては、上記各植物を発酵しても良い。それら植物の発酵に用いる微生物としては、乳酸菌、麹菌、納豆菌、テンペ菌、酵母等が挙げられ、一般にはそれら各菌種のいずれかから選ばれた１種又は２種以上を用いるが、場合によっては、又相互に発酵の妨げとならない限り、別の菌種に属するもの同士を組み合せて用いるようにしてもよい。
【００２６】
例えば、乳酸菌としては、例えばラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラクトバシルス ブレビス（L.brevis)、ラクトバシルス カゼイ（L.casei)、ラクトバシルス デルブルッキー（L. delbrueckii）等のラクトバシルス（Lactobacillus）属の乳酸菌；カルノバクテリウム ディバージェンス（Carnobacterium divergens)、カルノバクテリウム ピシコーラ(Carnobacterium piscicola)等のカルノバクテリウム（Carnobacterium）属の乳酸菌；ロイコノストック メセンテロイズ（Leuconostoc mesenteroides)、ロイコノストック シトレウム（Leuconostoc citreum)等のロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌； ストレプトコッカス フェーカリス（Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス ピオジェネス（Streptococcus pyogenes)等のストレプトコッカス属の乳酸菌；エンテロコッカス カゼリフラバス（Enterococcus caseliflavus)、エンテロコッカス サルフレウス（Enterococcus sulfreus)等のエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌；ラクトコッカス プランタラム（Lactococcus plantarum)、ラクトコッカス ラフィノラクティス（Lactococcus rafinolactis)等のラクトコッカス属の乳酸菌；ヴェイセラ コンフューザ（Weissella confusa)、ヴェイセラ カンドウレリ（Weissella kandleri)等のヴェイセラ属の乳酸菌；アトポビウム ミニュタム（Atopobium minutum)、アトポビウム パービュラス（Atopobiumparvulus)等のアトポビウム（Atopobium）属の乳酸菌；バゴコッカス フルビアリス（Vagococcus fluvialis）、バゴコッカス サーモニナラム（Vagococcus salmoninarum)等のバゴコッカス（Vagococcus）属の乳酸菌；ペディオコッカス ダムノサス（Pediococcus damnosus)、ペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus)等のペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌、マリニラクトバシルス・フィコロトレランス（Marinilactobacillus phychrotolerans）のような海洋起原の乳酸菌等が挙げられる。
【００２７】
麹菌としては、例えばアスペルギルス オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス ポリオキソジェネス（Aspergillus polyoxogenes）、アスペルギルス ソーヤ（Aspergillus sojae）等の黄麹菌、アスペルギルス アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス カワウチ（Aspergillus kawauchii）、アスペルギルス ウサミ（Aspergillus usami）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）等の黒麹菌、モナスカス アンカ（Monascus anka）、モナスカス ピロサス（Monascus pilosus）等の紅麹菌等が挙げられる。
【００２８】
納豆菌としては、例えばバシルス ナットー(Bacillus natto)、バシルス サブチルス(Bacillus subtilis)、バシルス サーキュランス(Bacillus circulans)等のバシルス属の細菌等が挙げられる。なかでも、食品に広く使用されており、安全性が高い点でバシルス ナットー(Bacillus natto)が最も好ましい。
【００２９】
テンペ菌としては、リゾプス アジゴスポラス(Rhizopus azygosporus)、リゾプス ミクロスポラス チネンシス(Rhizopus microsporus chinensis)、リゾプス ミクロスポラス オリゴスポラス(Rhizopus microsporus oligosporus)、リゾプス ニベウス(Rhizopus niveus)、リゾプス オリゼー(Rhizopus oryzae)等のリゾプス属の真菌（カビ）が挙げられる。
【００３０】
酵母としては、例えばサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス アワモリ(Saccharomyces awamori)、サッカロミセス チェバリエリ(Saccharomyces chevalieri)、サッカロミセス カールスバージェンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス バヨナス（Saccharomyces bayon us)等のサッカロミセス属の酵母、トルラスポラ デルブルエキ(Torulaspora delbruekii)、トルラスポラ ファーメンタチ(Torulaspora fermentati)、トルラスポラ ロゼイ(Torulaspora rosei)等のトルラスポラ属の酵母、ジゴサッカロミセス ローキシ(Zygosaccharomyces rouxii)、ジゴサッカロミセス ソーヤ(Zygosaccharomyces soya)、ジゴサッカロミセス サケ(Zygosaccharomyces sake)、ジゴサッカロミセス ミソ(Zygosaccharomyces miso)、ジゴサッカロミセス ラクティス(Zygosaccharomyces lactis)等のジゴサッカロミセス属の酵母、カンディダ ベルサチリス(Candida versatilis)、カンディダ エチェリシイ(Candida etchellsii)、カンディダ ケフィール（Candida kefyr）、カンディダ サケ（Candida sake）、カンディダ スコッティ（Candida scottii）等のカンディダ属の酵母、オーレオバシディウム プルランス（Aureobasidium Pullulans）、オーレオバシディウム マンソニー（Aureobasidium mansonii）、オーレオバシディウム マイクロスティクタム（Aureobasideium microstictum）等のオーレオバシディウム属の酵母等が挙げられる。上述の酵母のうち、安全性及び有効性の観点から、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が好ましいが、サッカロミセス セレビシエとしては、清酒、植物の花等に由来するものや、海洋起源のもの等、いずれの由来のものでも使用することができる。
【００３１】
本発明に係る評価方法にて評価された被験物質（ケラトヒアリン顆粒合成促進剤）は、皮膚外用剤（化粧料、医薬部外品及び外用医薬品）に配合することができる。例えば、乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、スリミング剤、毛髪用シャンプー、石けん等が挙げられ、また、育毛剤、さらには浴剤等も挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明に係るケラトヒアリン顆粒合成促進剤を、例えば、化粧料（医薬部外品を含む）に配合するに当たっては、その固形分として、スキンケア用品に場合は、一般に０．００２〜１．０重量％（固形分重量％、以下同じ）、好ましくは０．０２〜０．２重量％の範囲、メイクアップ用品の場合は、一般に０．００２〜１．０重量％、好ましくは０．０２〜０．２重量％の範囲、又清浄用品の場合は、一般に０．００２〜１０．０重量％、好ましくは０．０２〜７．０重量％の範囲である。また、毛髪用品の場合は、抽出物の固形分として、一般的には０．００００１〜５．０重量％であり、好ましくは、０．０００１〜３．０重量％である。
【００３３】
皮膚外用剤には、本発明に係るケラトヒアリン顆粒合成促進剤のほかに、通常、皮膚外用剤に用いられる成分、例えば油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明に係る抽出物、加水分解物又は発酵物の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分を組み合わせて配合することも何ら差し支えない。
【００３４】
ここで、油性成分としては、例えば、オリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、ベルガモット油、ラベンダー油、バラ油、ベルガモット油、カミツレ油等の植物由来スクワラン等の植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油等の動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリン等のロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸等の脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）等の合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。
【００３５】
界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩等のアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ、Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤；Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′、Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン等の両性界面活性剤等を使用することができる。
【００３６】
乳化剤及び／又は乳化助剤としては、酵素処理ステビア等のステビア誘導体、サポニン又はその誘導体、カゼイン又はその塩（ナトリウム等）、糖と蛋白質の複合体、ショ糖又はそのエステル、ラクトース、大豆由来の水溶性多糖、大豆由来蛋白質と多糖の複合体、ラノリン又はその誘導体、コレステロール、ステビア誘導体（ステビア酵素処理物等）、ケイ酸塩（アルミニウム、マグネシウム等）、炭酸塩（カルシウム、ナトリウム等）サポニン及びその誘導体、レシチン及びその誘導体（水素添加レシチン等）、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀等）等を配合することもできる。
【００３７】
保湿剤としては、保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等があり、さらにトレハロース、ラフィノース等の糖類、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、ヒアルロン酸発酵液、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体等）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、コラーゲンペプチド、ＮＭＦ関連物質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、シラン根（白及）抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体が挙げられる。
【００３８】
増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の褐藻、緑藻又は紅藻由来成分；シラン根（白及）抽出物；ペクチン、アロエ多糖体等の多糖類；トラガントガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体；カルボシキビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体等が挙げられる。
【００３９】
防腐・殺菌剤としては、例えば尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、１、２−ペンタンジオール、プロパンジオール、各種精油類、樹皮乾留物、大根発酵液、サトウキビ、トウモロコシ等の植物由来のエタノール又は１、３−ブチレングリコール等がある。
【００４０】
粉体成分としては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビ等）のパウダー、豆類（大豆、アズキ等）のパウダー等がある。
【００４１】
紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２、４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。
【００４２】
抗酸化剤としては、例えばブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ビタミンＥ及びその誘導体（例えば、ビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等）等がある。
【００４３】
美白剤としては、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、エラグ酸及びその誘導体、ニコチン酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、トラネキサム酸及びその誘導体、４−メトキシサリチル酸カリウム塩、マグノリグナン（5、5'−ジプロピル−ビフェニル−2、2’−ジオール）、ヒドロキシ安息香酸及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、α−ヒドロキシ酸、ＡＭＰ（アデノシンモノホスフェイト、アデノシン１リン酸）等が挙げられ、これらを単独で配合しても、複数を組み合わせて配合しても良い。
【００４４】
上記のコウジ酸誘導体としては、例えばコウジ酸モノブチレート、コウジ酸モノカプレート、コウジ酸モノパルミテート、コウジ酸ジブチレート等のコウジ酸エステル類、コウジ酸エーテル類、コウジ酸グルコシド等のコウジ酸糖誘導体等が、アスコルビン酸誘導体としては、例えばＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルマグネシウム等のアスコルビン酸エステル塩類、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸−５−グルコシド、アスコルビルトコフェリルマレイン酸、アスコルビルトコフェリルリン酸Ｋ、ミリスチル３−グリセリルアスコルビン酸、カプリリル２−グリセリルアスコルビン酸等のアスコルビン酸糖誘導体、それらアスコルビン酸糖誘導体の６位アシル化物（アシル基は、ヘキサノイル基、オクタノイル基、デカノイル基等）、Ｌ−アスコルビン酸テトライソパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸テトララウリン酸エステル等のＬ−アスコルビン酸テトラ脂肪酸エステル類、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸−６−Ｏ−パルミテートナトリウム、グリセリルアスコルビン酸又はそのアシル化誘導体、ビスグリセリルアスコルビン酸等のアスコルビン酸グルセリン誘導体、Ｌ−アスコルビン酸リン酸アミノプロピル、Ｌ−アスコルビン酸のヒアルロン酸誘導体、３−Ｏ−Ｄラクトース−Ｌ−アスコルビン酸、イソステアリルアスコルビルリン酸塩等が、ハイドロキノン誘導体としては、アルブチン（ハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド）、α−アルブチン（ハイドロキノン−α−Ｄ−グルコピラノシド）等が、トラネキサム酸誘導体としては、トラネキサム酸エステル（例えば、トラネキサム酸ラウリルエステル、トラネキサム酸ヘキサデシルエステル、トラネキサム酸セチルエステル又はその塩）、トラネキサム酸のアミド体（例えば、トラネキサム酸メチルアミド）等が挙げられ、レゾルシノール誘導体としては、例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、４−イソアミルレゾルシノール等が、２、５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体としては、例えば２、５−ジアセトキシ安息香酸、２−アセトキシ−５−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−プロピオニルオキシ安息香酸等が、ニコチン酸誘導体としては、例えばニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等が、α−ヒドロキシ酸としては、例えば乳酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、α−ヒドロキシオクタン酸等がある。
【００４５】
次に、被験物質の調製例、及び評価試験例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また％はすべて重量％を意味する。
【００４６】
試験例１．ケラトヒアリン顆粒合成効果の評価試験
（i）被験物質の調製
被験物質の調製例１．アッケシソウ抽出物の調製（１）
アッケシソウ（Salicornia herbacea）の全草の乾燥細切物２０ｇに精製水２００ｇを加え、４０℃で１時間抽出した。得られた抽出液をろ過して、褐色透明の抽出物溶液（固形分含量：２．０％）１５６ｇを得た。
【００４７】
被験物質の調製例２．アッケシソウ抽出物の調製（２）
アッケシソウ（Salicornia herbacea）の全草の乾燥細切物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液２００ｇを加え、４０℃で５時間抽出した。得られた抽出液をろ過して、淡褐色透明の抽出物溶液（固形分含量：２．１％）１６３ｇを得た。
【００４８】
被験物質の調製例３．アッケシソウ抽出物の調製（３）
アッケシソウ（Salicornia herbacea）の全草の乾燥細切物２０ｇに３０％１，３−プロパンジオール水溶液２００ｇを加え、４０℃で５時間抽出した。得られた抽出液をろ過して、淡褐色透明の抽出物溶液（固形分含量：１．９５％）１５７ｇを得た。
【００４９】
（ii）ケラトヒアリン顆粒合成評価試験方法
ケラトヒアリン顆粒には、プロフィラグリンが多量に含まれることから、フィラグリン抗体による免疫染色により得られた蛍光強度と、蛍光顕微鏡観察による表細細胞の顆粒状構造の観察結果から総合的に評価した。正常ヒト皮膚由来表皮細胞（NHEK）をHuMedia KG2培地（クラボウ社製）を入れた96穴マイクロプレートに4×103個／穴播種し、37℃，5.0％CO2の条件下に１日間プレ培養した後、製造例１〜３の抽出物を試料溶液として含むHuMedia KB2培地を添加し、同条件でさらに３日間培養した。ここで、試料溶液の濃度は、追添加する培地全量に対する溶液としての終濃度が2.0％となるように調整した。次に、培養後の細胞に対してフィラグリン抗体を用いた免疫的検出を行った。すなわち、PBS(-)洗浄後、15％中性緩衝ホルマリン液を用いて細胞を30分間処理して固定し、0.5％Triton X-100溶液で１時間浸透処理、５倍希釈ブロッキングワンＰ（ナカライテスク社）溶液で２時間処理によるブロッキングを行った後、フィラグリン抗体を添加し、室温で２時間静置した。その後、PBS(-)を用いて洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。その後、PBS(-)で洗浄し、蛍光強度の測定を行った。すなわち、蛍光マイクロプレートリーダー（フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて二次抗体の蛍光ラベル（Alexa Fluor546）をEx＝544nm、Em＝590ｎｍで測定し、その後、Hoechst33342によるDNA染色を行い、Ex＝355nm、Em＝460nmの測定を行った。それぞれの試験区のAlexa Fluor546の蛍光強度をHoechst33342の蛍光強度で割ることで、フィラグリンの生成度合いを求めた。試料溶液に代えてPBS(-)を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、ここに得られたフィラグリン生成度合いに対する各試料添加時のフィラグリン生成度合いの相対値を求め、フィラグリン合成量（％）とした。さらに蛍光顕微鏡観察を行いて、細胞内の顆粒状構造の形成を確認した。そして、上記蛍光強度測定によるフィラグリン生成量の増大と、顆粒状構造の形成という２つの条件を満たす被験物質をケラトヒアリン顆粒合成促進効果を有するものとして評価した。また、試験系が正常に機能しているかを確認するために、試料溶液の代わりに陽性対照として塩化カルシウム１．８ｍＭを添加した場合についても、同様の試験を行った。
【００５０】
試験例１の結果、まず、本発明の被験物質である抽出物を投与した試験区では、コントロール区に対してフィラグリンの合成量の増大が確認された。また、陽性対照である塩化カルシウムも同様にフィラグリンの合成量の増大が確認されたことから、本試験系が正常に行われたことが確認された。
【００５１】
また、本発明の被験物質（製造例１に係る抽出物）、コントロール「PBS(-)」及び陽性対照「塩化カルシウム」を投与した細胞の顆粒状構造の形成を確認した結果、本発明に係る被験物質を投与した細胞内では図１に示すように顆粒状構造が確認されたのに対して、PBS(-)を投与した細胞内では図２に示すように顆粒状構造が確認されなかった。また、塩化カルシウムを投与した細胞では、図３に示すように顆粒状構造が確認された。ここで、ケラトヒラリン顆粒の主な構成要素はプロフィラグリンであることから、図１にて確認された顆粒構造を有するものはケラトヒラリン顆粒と判断される。なお、本発明の製造例２，３に係る抽出物を投与した細胞においても、製造例１に係る抽出物を投与した細胞と同様に、顆粒構造の形成が確認された。
【００５２】
以上のように、細胞内の顆粒状構造の形成及びフィラグリン合成の両方を促進する被験物質を、ケラトヒアリン顆粒合成促進効果を有する物質として判定する。すなわち、表１に示すように、本発明に係る被験物質（製造例１〜３の抽出物）は、格段にすぐれたケラトヒアリン顆粒合成促進効果を有するものとして判定される。
【００５３】
［表１］
2018004454.tif 000003
【００５４】
本発明によれば、ケラトヒアリン顆粒自体の合成を促進する物質を評価することができる。先天的な疾患や慢性的な炎症等の理由により、ターンオーバーが異常に亢進した状態となり、ケラトヒアリン顆粒が認められない皮膚に対しても、保湿機能や透明感を改善する有効成分を選定する方法、及びこの方法により選定される有効成分を提供することが可能になる。また、ケラトヒアリン顆粒は、プロフィラグリン及びケラチンを主要構成成分とすることから、本発明に係るケラトヒアリン顆粒合成促進剤は、皮膚の保湿機能及び透明感等を顕著に改善することができる。
【００５５】
処方例１．化粧水
［成分］                                                        部
オリーブ油                                                    １．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール                  ５．０
ブチルパラベン                                                ０．１
製造例１の抽出物                                              ５．０
エタノール                                                    ５．０
グリセリン                                                    ５．０
１，３−ブチレングリコール                                    ５．０
水酸化カリウム                                                  適量
香料                                                            適量
精製水                                        全量が１００部となる量
【００５６】
処方例２．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例２の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
【００５７】
処方例３．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例３の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
【００５８】
処方例４．乳液
［成分］                                                        部
流動パラフィン                                                ６．０
ヘキサラン                                                    ４．０
ホホバ油                                                      １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート          １．０
親油型ステアリン酸グリセリル                                  １．０
大豆レシチン                                                  １．５
製造例１の抽出物                                              ３．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                            ２．０
水酸化カリウム                                                ０．５
グリセリン                                                    ３．０
１、３−ブチレングリコール                                    ２．０
カルボキシメチルセルロース                                    ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム                                        ０．０１
香料                                                            適量
精製水                                        全量が１００部となる量
【００５９】
処方例５．乳液
処方例４の成分中、製造例１の抽出物剤３．０に代えて、製造例２の抽出物を用いるほかは処方例４と同様にして乳液を得た。
【００６０】
処方例６．乳液
処方例４の成分中、製造例１の抽出物３．０に代えて、製造例３の抽出物を用いるほかは処方例４と同様にして乳液を得た。
【００６１】
処方例７．乳液
処方例４の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてアルブチン３．０部を用いるほかは処方例４と同様にして乳液を得た。
【００６２】
処方例８．乳液
処方例４の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてトラネキサム酸２．０部を用いるほかは処方例４と同様にして乳液を得た。
【００６３】
処方例９．乳液
処方例４の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてニコチン酸アミド３．０部を用いるほかは処方例４と同様にして乳液を得た。
【００６４】
処方例１０．乳液
［成分］                                                  部
スクワラン                                              ３．０
ベヘニルアルコール                                      ３．０
ヘキサラン                                              ４．０
ホホバ油                                                １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート    １．０
グリセリン脂肪酸エステル                                １．０
大豆レシチン                                            １．５
製造例１の抽出物                                        ５．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                      ２．０
水酸化カリウム                                          ０．５
グリチルリチン酸ジカリウム                              ０．１
グリセリン                                              ３．０
１，３−ブチレングリコール                              ２．０
水溶性コラーゲン                                        ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム                                  ０．０１
精製水                                    全量が１００部となる量 
【００６５】
処方例１１．乳液
処方例１０の成分中、グリチルリチン酸ジカリウム１．０部に代えてトラネキサム酸２．０部を用いるほかは処方例１０と同様にして乳液を得た。
【００６６】
処方例１２．ローション
［成分］                                                        部
エタノール                                                  １０．０
グリセリン                                                    ３．０
１、３−ブチレングリコール                                    ２．０
メチルパラベン                                                ０．２
クエン酸                                                      ０．１
クエン酸ナトリウム                                            ０．３
カルボキシビニルポリマー                                      ０．１
キサンタンガム                                                ０．１
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                            ２．０
水酸化カリウム                                                ０．５
製造例１の抽出物                                            １０．０
米抽出物の加水分解物                                          ２．０
米糠抽出物の加水分解物                                        １．０
香料                                                            適量
精製水                                        全量が１００部となる量
【００６７】
処方例１３．エッセンス
［成分］                                                        部
エタノール                                                    ２．０
グリセリン                                                    ５．０
１、３−ブチレングリコール                                    ５．０
メチルパラベン                                                ０．１
ヒアルロン酸                                                  ０．１
製造例２の抽出物                                              ５．０
クエン酸                                                      ０．３
クエン酸ナトリウム                                            ０．６
精製水                                        全量が１００部となる量
【００６８】
実施例１４．リキッドファンデーション
［成分］                                                        部
ステアリン酸                                                  ２．４
モノステアリン酸プロピレングリコール                          ２．０
セトステアリルアルコール                                      ０．２
液状ラノリン                                                  ２．０
流動パラフィン                                                ３．０
ミリスチン酸イソプロピル                                      ８．５
プロピルパラベン                                              ０．０５
製造例３の抽出物                                              ５．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                          ０．２
ベントナイト                                                  ０．５
プロピレングリコール                                          ４．０
トリエタノールアミン                                          １．１
メチルパラベン                                                ０．１
酸化チタン                                                    ８．０
タルク                                                        ４．０
着色顔料                                                        適量
精製水                                        全量が１００部となる量
【００６９】
処方例１５．ボディシャンプー
［成分］                                                        部
Ｎ−ラウロイルメチルアラニンナトリウム                    ２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％）                          ２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                              ３．０
メチルパラベン                                              ０．１
製造例１の抽出物                                            ５．０
１，３−ブチレングリコール                                  ２．０
精製水                                      全量が１００部となる量
【００７０】
処方例１６．育毛料
［成分］                                                      部
グリチルリチン酸ジカリウム                                  ０．１
モノニトログアヤコールナトリウム                            ０．０２
塩酸ピリドキシン                                            ０．０３
ｌ−メントール                                              ０．８
タマサキツヅラフジ根エキス                                  ０．３
褐藻エキス                                                  ０．３
オタネニンジンエキス                                        ０．３
ゲンチアナエキス                                            ２．０
製造例１の抽出物                                            ３．５
トリメチルグリシン                                          ０．５
乳酸                                                        ０．２
１、３−ブチレングリコール                                １０．０
フェノキシエタノール                                        ０．２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                              ０．４
Ｌ−アルギニン                                                適量
エタノール                                                ２０．０
精製水                                      全量が１００部となる量
【００７１】
処方例１７．ヘアシャンプー
［成分］                                                      部
Ｎ−ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム                  １０．０
ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸ナトリウム    ２０．０
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン                        １０．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                              ４．０
メチルパラベン                                              ０．１
クエン酸                                                    ０．１
製造例１の抽出物                                            ２．０
１、３−ブチレングリコール                                  ２．０
精製水                                      全量が１００部となる量
【００７２】
実施例１８．ヘアコンディショナー
［成分］                                                      部
ポリオキシエチレン（１０）硬化ヒマシ油                      １．０
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム                        １．５
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム                        ２．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル                              １．０
セタノール                                                  ３．２
ステアリルアルコール                                        １．０
メチルパラベン                                              ０．１
製造例２の抽出物                                            ２．０
１，３−ブチレングリコール                                  ５．０
精製水                                      全量が１００部となる量
【図１】
2018004454.tif 000004
【図２】
2018004454.tif 000005
【図３】
2018004454.tif 000006