(57)【要約】【課題】フィルム状であり、光照射により力学特性を変化させることが可能な細胞足場材料を提供する。フィルム状であり、弾性率が異なる領域を有する細胞足場材料を提供する。細胞足場材料と前記細胞足場材料で培養される細胞とを備える細胞モデルを提供する。【解決手段】１）高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲルを備え、前記網目構造は、光照射により前記網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものであり、前記ゲルへ光照射によって領域Ａと領域Ｂとが分けられたとき、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低くなるよう変化する、細胞足場材料。２）高分子化合物を含むフィルム状のゲルを備え、前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い、細胞足場材料。３）前記細胞足場材料と前記細胞足場材料で培養される細胞とを備える細胞モデル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲルを備え、
前記網目構造は、光照射により前記網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものであり、
前記ゲルへ光照射によって領域Ａと領域Ｂとが分けられたとき、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低くなるよう変化する、細胞足場材料。
【請求項２】
高分子化合物を含む網目構造を有するフィルム状のゲルを備え、
前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い、細胞足場材料。
【請求項３】
前記高分子化合物が、ポリアクリルアミド系樹脂を含む、請求項１又は２に記載の細胞足場材料。
【請求項４】
前記ゲルが、光異性化構造を有し光照射によって二本鎖が解離及び／又は形成される核酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞足場材料。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞足場材料と、前記細胞足場材料で培養される細胞と、を備える、細胞モデル。
【請求項６】
前記細胞が神経細胞及び／又はグリア細胞を含む請求項５に記載の細胞モデル。
【請求項７】
高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲル、又は前記ゲルの構成材料を含有する培養材料組成物の一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させる光照射工程を有し、
前記網目構造は、光照射により前記網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものである、細胞足場材料の製造方法。
【請求項８】
前記光照射工程の前に、光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分を含む再膨潤液に、前記ゲルを含浸させる再膨潤工程を有する、請求項７に記載の細胞足場材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞足場材料、細胞モデル、及び細胞足場材料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体を構成している細胞は、細胞外マトリクス（Extracellular Matrix、以下ＥＣＭ）の化学・力学特性を認識し、細胞機能を変化させていることが明らかになってきた。細胞は、細胞表面のタンパク質を介してECMと結合、接着し、ECMの硬さを認識していると考えられているが、そのメカニズムの詳細は不明である。特に、力学特性に関しては、生体組織の弾性率が不均一であることや加齢とともに弾性率が変化することが報告されているが、このような特性変化が細胞・組織に及ぼす影響は明らかになっていない（非特許文献１）。例えば、中枢神経系を構成する神経細胞やグリア細胞は、疾患や外傷による損傷を受けると再生が困難な組織であることが知られており、その原因の一端が損傷部位周辺のECM力学特性の変化である可能性が示唆されているが、未だ明らかになっていない（非特許文献２）。上記の、中枢神経系の再生も含め、再生医療の分野では、組織再生の際に細胞の足場となる基材が必要となるため、その基材の力学特性が細胞組織に与える影響を解明することは、基材の材料設計に重要となる。
【０００３】
このような観点から、ポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane、PDMS）を代表とするエラストマや、水溶性高分子から構成されるハイドロゲルといった、ソフトマテリアルからなるフィルムの力学特性を制御し、フィルムの硬さに対する細胞応答を調べる方法が提案されている。今後は、加齢や、組織損傷などによる生体内の動的な力学特性変化を再現することで、組織再生の際に用いられる足場材料の力学特性をスクリーニングするためのin vitroモデルとして利用することが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of neurotrauma, Benjamin S. Elkin et al. “Mechanical Heterogeneity of the Rat Hippocampus Measured by Atomic Force Microscope Indentation”, 2007, 24 (5) 812-822.
【非特許文献２】Biomaterials, “The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nerve system” 2014, 35, 3919-3925.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
脳組織のようにＥＣＭの深さが組織構造の重要な指標となる場合など、細胞が認識可能なＥＣＭ力学特性の深さを明らかにする必要がある。そのためには、厚さが制御された足場材料が求められる。
従来、様々な弾性率の足場材料上で細胞培養が行われてきたが、生体組織の弾性率は不均一であるため、生体内での細胞のＥＣＭ力学特性認識をin vitroで再現・検討するためには、同一基板上で弾性率が異なる領域を有する足場材料を用いることが望ましい。
また、生体内では外的刺激などで弾性率が変化するのに対し、これまでの足場材料は弾性率を変化させることが困難であった。ＥＣＭの力学特性に対する細胞・組織の応答をより詳細に調べるためには、細胞培養下においてin situで弾性率を変化させることができる機能的な足場材料が求められる。
【０００６】
このような問題を解決するために、本発明は、フィルム状であり、光照射により力学特性を変化させることが可能な細胞足場材料を提供する。また本発明は、フィルム状であり、弾性率が異なる領域を有する細胞足場材料を提供する。また本発明は、前記細胞足場材料と前記細胞足場材料で培養される細胞とを備える細胞モデルを提供する。また本発明では前記細胞足場材料の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲルを備え、前記網目構造は、光照射により前記網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものであり、前記ゲルへ光照射によって領域Ａと領域Ｂとが分けられたとき、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低くなるよう変化する、細胞足場材料である。
【０００８】
本発明の一態様は、高分子化合物を含む網目構造を有するフィルム状のゲルを備え、前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い、細胞足場材料である。
【０００９】
本発明の一態様は、上記細胞足場材料であって、前記高分子化合物が、ポリアクリルアミド系樹脂を含む。
【００１０】
本発明の一態様は、上記細胞足場材料であって、前記ゲルが、光異性化構造を有し光照射によって二本鎖が解離及び／又は形成する核酸を含む。
【００１１】
本発明の一態様は、上記細胞足場材料と、上記細胞足場材料で培養される細胞と、を備える、細胞モデルである。
【００１２】
本発明の一態様は、上記細胞モデルであって、前記細胞が神経細胞及び／又はグリア細胞を含む。
【００１３】
本発明の一態様は、高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲル、又は前記ゲルの構成材料を含有する足場材料組成物の一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させる光照射工程を有し、前記網目構造は、光照射により前記網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものである、細胞足場材料の製造方法である。
【００１４】
本発明の一態様は、上記細胞足場材料の製造方法であって、前記光照射工程の前に、光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分を含む再膨潤液に、前記ゲルを含浸させる再膨潤工程を有する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、光照射により力学特性を変化させることが可能な細胞足場材料を提供できる。
また本発明によれば、弾性率が異なる領域を有する細胞足場材料を提供できる。
また本発明によれば、前記細胞足場材料と前記細胞足場材料で培養される細胞とを備える細胞モデルを提供できる。
また本発明によれば、前記細胞足場材料の製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アゾベンゼンが導入されたＤＮＡ二重らせん（アゾＤＮＡ）を説明する模式図である。
【図２】実施形態の細胞足場材料のゲルの製造に用いることのできるガラス基板の模式図である。
【図３】参考例１の定弾性フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
【図４】実施例１のパターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
【図５】実施例１のパターン化フィルムの画像である。
【図６】実施例２の光反応性パターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
【図７】実施例３の再膨潤パターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
【図８】実施例４の光応答性フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の細胞足場材料、細胞モデル、及び細胞足場材料の製造方法の実施形態を説明する。
【００１８】
≪細胞足場材料≫
（１）細胞足場材料の第一の実施形態
本実施形態の細胞足場材料は、高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲルを備え、前記網目構造は、光照射により網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものであり、前記ゲルへ光照射によって 領域Ａと領域Ｂとが分けられたとき、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低くなるよう変化するものである。
【００１９】
前記網目構造は、ゲルを構成する分散質の少なくとも一部として、実施形態に係るゲルに含有される。網目構造は、ゲルの分散質の少なくとも一部又は全部を構成可能で、光照射により網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものあれば特に制限されるものではない。
【００２０】
光照射により網目構造の化学結合が生成又は切断されることにより、光照射された部分の網目構造が生成又は変化する。これにより、光照射によって領域Ａと領域Ｂとが分けられたとき、領域Ａと領域Ｂとで、弾性率の値に違いが生じる。
領域Ａへの光照射により化学結合が生成されるとすると、領域Ａの網目構造の結合が密になり、領域Ａよりも領域Ｂの弾性率が低くなる。
領域Ｂへの光照射により化学結合が切断されるとすると、領域Ｂの網目構造の結合が疎になり、領域Ａよりも領域Ｂの弾性率が低くなる。
【００２１】
ここでの化学結合の種類としては、網目構造の形成に寄与するものであれば特に制限されず、例えば、共有結合、配位結合、イオン結合、水素結合等が挙げられる。
【００２２】
領域Ａと領域Ｂとは、光照射の有無、強度、照射時間、波長などの種々の光照射条件により分けることができる。これらの光照射条件を選択することで、フィルムの形状や力学特性の制御が容易に行える。
【００２３】
光の波長は、ゲルを構成する成分の種類等に応じて適宜定めればよく、２００〜５００ｎｍ程度とできる。
【００２４】
光照射により領域Ａと領域Ｂを分けることは、該領域に対して局所的に光照射を行うことにより実施できる。該領域に対し局所的に光を照射する方法は、特に制限されるものでなく、フォトマスクを利用する方法の他、光ファイバーやレーザーを用いて局所的に光を照射する方法等を用いることができる。
【００２５】
本発明および明細書におけるゲルの「弾性率」は原子間力顕微鏡を用いて、実施例に記載の方法により測定できる。
【００２６】
領域Ｂの弾性率は、例えば、１０Ｐａ以上８００Ｐａ未満であってよく、５０〜７００Ｐａであってよい。領域Ａの弾性率は、例えば、８００〜３００００Ｐａであってよく、９００〜２００００Ｐａであってよい。弾性率を上記値とすることで、ＥＣＭ力学特性を模倣することができる。
特に、実施形態の細胞足場材料を中枢神経系のモデルに適用する場合では、領域Ｂの弾性率が脳組織の弾性率１００〜５００Ｐａであり、領域Ａの弾性率が脳組織損傷時の弾性率１０００〜１００００Ｐａの範囲にあるフィルムを作製することで、ＥＣＭ力学特性を模倣することができる。
【００２７】
上記の観点から、領域Ａと領域Ｂとの弾性率の差は、１００〜９９００Ｐａであってよく、５００〜５０００Ｐａであってよい。
【００２８】
網目構造は１つの成分から構成されていてもよく、２つ以上の成分から構成されていてもよい。
【００２９】
網目構造を構成する成分の一例として、高分子化合物が挙げられる。高分子化合物は、前記網目構造の少なくとも一部又は全部を構成する。
高分子化合物は、合成高分子、生体高分子等であってもよい。合成高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン、（３，４−エチレンジオキシチオフェン）／ポリ（４−スチレンスルホン酸）（ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ）、ポリピロール系高分子、ポリアニリン系高分子、ポリヒドロキシエチルアクリレートなどのアクリル系高分子などを挙げることができる。生体高分子としては、例えば、デキストラン、アルギン酸等の多糖類；ゼラチン、シルクフィブロインなどのタンパク質；キトサン、コラーゲンなどの細胞外マトリクスなどが挙げられる。
【００３０】
これらのなかでも、高分子化合物はポリアクリルアミド系樹脂又はアクリル系樹脂を含むことが好ましく、透明性が良好でありモノマーと架橋剤との混合比で弾性率を容易に制御可能であるとの観点から、ポリアクリルアミド系樹脂を含むことがより好ましい。
ポリアクリルアミド系樹脂を構成するモノマーとしては、アミノ基を有する（メタ）アクリル酸エステルモノマーが挙げられ、アクリルアミド、メタクリルアミド等を例示できる。ポリアクリルアミド系樹脂は、上記モノマーの重合体であってよく、上記モノマーの重合体と該モノマーと共重合可能な他のモノマーとの共重合体であってよい。
アクリル系樹脂を構成するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸エステルモノマーが挙げられ、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシメチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の水酸基含有モノマー等を例示できる。ポリアクリルアミド系樹脂は、上記モノマーの重合体であってよく、上記モノマーの重合体と該モノマーと共重合可能な他のモノマーとの共重合体であってよい。
【００３１】
実施形態に係るゲルが含有する高分子化合物は、１種のみでもよいし、２種以上でもよい。
【００３２】
網目構造を構成する成分の一例として、架橋剤が挙げられる。架橋剤は前記高分子化合物同士を架橋し、網目構造を形成又は複雑化させる役割を果たし得る。
架橋剤は特に限定されるものではないが、メチレンビスアクリルアミドやエチレンビスアクリルアミド等のアクリルアミド系架橋剤が好ましい。アクリルアミド系架橋剤は、上記ポリアクリルアミド系樹脂と組み合わせて好適に用いることができる。
実施形態に係るゲルが含有してもよい架橋剤は、１種のみでもよいし、２種以上でもよい。
【００３３】
光照射により網目構造において生成又は切断される化学結合は、網目構造の任意の位置にあってよい。
例えば、化学結合が生成される場合、生成される化学結合は、高分子化合物の一部として生成されてよい。このような反応として、該化学結合が生成されることにより高分子化合物の主鎖又は側鎖が伸長する反応が挙げられる。又は、生成される化学結合は、高分子化合物の一部として生成されなくともよい。このような反応として、架橋剤が高分子化合物同士を架橋する反応が挙げられる。
例えば、化学結合が切断される場合、切断される化学結合の位置は高分子化合物の一部であってよい。このような反応として、該化学結合が切断されることにより高分子化合物の鎖が分解する反応が挙げられる。又は、切断される化学結合の位置は高分子化合物の一部でなくともよい。このような反応として、架橋剤が分解し、高分子化合物同士の架橋が外れる反応が挙げられる。
【００３４】
ゲルは、光照射により、自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分、又は該成分に由来する構造を含んでよい。由来するとは、該成分が網目構造を形成する際に必要な変化を受けたことを言う。化学結合が生成されることで網目構造の少なくとも一部の構造が形成される。化学結合が切断されることで網目構造の少なくとも一部が切断される。該成分としては、前記高分子化合物であってもよく、高分子化合物の原材料であってもよく、架橋剤であってもよい。
【００３５】
光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分として、光照射によって自らを構成する化学結合が生成または切断される官能基を有する成分が挙げられる。自らを構成する化学結合とは、自らと化学結合相手間との結合である。光照射によって化学結合が生成される官能基としては、下記式（１−Ａ）で表される構造を有するベンゾフェノン誘導体や、下記式（１−Ｂ）で表される構造を有するケイ皮酸誘導体などが挙げられる。光照射によって化学結合が切断される官能基として、例えば、下記式（１−Ｃ）で表されるニトロフェニル基を有する光解離性架橋剤や、下記式（１−Ｄ）で表される光解離性架橋剤などが挙げられる。
【００３６】
【化１】
2018134063.tif 000002
【００３７】
【化２】
2018134063.tif 000003
【００３８】
【化３】
2018134063.tif 000004
【００３９】
【化４】
2018134063.tif 000005
【００４０】
また、光照射により自らを構成する化学結合が生成される物質として、例えば光重合開始剤によって重合されるモノマー等の、高分子化合物の原材料が挙げられる。
光重合開始剤としては、下記式（２−Ａ）で表されるリチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＬＡＰ）、下記式（２−Ｂ）で表される２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９）、下記式（２−Ｃ）で表されるＥｏｓｉｎＹ、下記式（２−Ｄ）で表されるＮ−ビニルピロリドン（ＮＭＰ）、下記式（２−Ｅ）で表されるトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）が例示できる。
【００４１】
【化５】
2018134063.tif 000006
【００４２】
【化６】
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【００４３】
【化７】
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【００４４】
【化８】
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【００４５】
【化９】
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【００４６】
また、光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分としては、任意の波長の光照射によって分子構造が可逆的に変化する光異性化構造が挙げられる。当該構造を有する異性化分子としては、アゾベンゼン分子又はアゾベンゼン誘導体分子が挙げられる。
ゲルは、光異性化構造を有し光照射によって二本鎖が解離及び／又は形成する核酸を含んでもよい。当該核酸としては、アゾベンゼン又はアゾベンゼン誘導体から一つの水素原子を除いた基を有する核酸が挙げられ、アゾベンゼン又はアゾベンゼン誘導体から一つの水素原子を除いた基を有するＤＮＡ二重らせん（アゾＤＮＡ）が好ましい（図１）。アゾベンゼン又はアゾベンゼン誘導体は核酸の架橋剤として導入されたものとみなすこともできる。アゾＤＮＡは波長３６０ｎｍ前後の光を吸収すると解離し、波長４００ｎｍ以上の光を吸収すると再形成することが知られている。この性質を利用し、ゲルへの局所的な光照射によって可逆的な弾性率制御が可能となる。
【００４７】
本実施形態の細胞足場材料は、ゲルを構成する分散媒の少なくとも一部として、液体成分を含有することができる。液体成分は、細胞培養に用いることのできるものであればよく、水、バッファー、液体培地等が挙げられる。液体成分は水を含有するものであることが好ましい。分散媒に水を含有するゲルはハイドロゲルと呼ばれる。
【００４８】
本実施形態の細胞足場材料は、上記成分のいずれにも該当しないその他の添加剤を含有してもよい。添加剤としては、防腐剤、酸化防止剤、着色料、増粘剤、架橋促進剤、糖類、ビタミン類、抗生物質、細胞接着分子等が挙げられる。
細胞接着分子としては、ポリリジン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、エラスチン、ヒアルロン酸、ラミニン等が挙げられる。細胞接着分子は、ゲルの最表面に配置されてもよい。ゲル表面に修飾された細胞接着分子により、任意の細胞を効果的に接着可能とできる。
本実施形態の細胞足場材料は、神経細胞及び／又はグリア細胞の培養に好適に使用される。そのため、これらの培養に有用なラミニンやＮ−カドヘリンなどの細胞接着因子等の成分を含むことができる。
【００４９】
実施形態に係るゲルは、フィルム状である。フィルム形状は特に限定されるものではなく、シート状、板状等の形状であることができる。
フィルム状のゲルの厚みは、１〜１０００μｍであってもよく、５〜５００μｍであってもよく、１０〜１００μｍであってもよい。
【００５０】
フィルム状のゲルは、単層であってもよく、複層であってもよい。複層の場合、各層は同一の種類及び／又は厚みのゲルが用いられていてもよく、互いに異なる種類及び／又は厚みのゲルが用いられていてもよい。
【００５１】
細胞足場材料は、フィルム状のゲルのみからなるものであってもよく、ゲルの他にその他の構造物を備えていてもよい。
その他の構造物としては、細胞培養に適用可能なものであれば特に制限はなく、ディッシュ、マルチディッシュ、フラスコ等の培養容器や、基板等を例示できる。一例として、細胞培養容器と、フィルム状のゲルを備え、培養容器内にゲルが配置された細胞足場材料が挙げられる。別の一例として、基板と、フィルム状のゲルを備え、基板上にゲルが積層された細胞足場材料が挙げられる。
【００５２】
培養容器及び基板の材質としては、金属、樹脂、セラミック、プラスチック、木材、布、紙、ガラス等が挙げられる。
【００５３】
培養容器及び基板の表面は、骨格内にＳｉ原子を含むシラン化合物等によって、表面修飾されていてもよい。
【００５４】
（２）細胞足場材料の第二の実施形態
本実施形態の細胞足場材料は、高分子化合物を含むフィルム状のゲルを備え、前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低いものである。
本実施形態の細胞足場材料に係るゲルは、上記第一実施形態の細胞足場材料の前記ゲルの一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させることで、得ることができる。
【００５５】
細胞足場材料を構成する成分や。細胞足場材料の構造としては、上記第一実施形態の細胞足場材料で説明したものが挙げられ、説明を省略する。
【００５６】
領域Ａ及び領域Ｂの面積は、それぞれ独立に０．０００１〜１０００ｍｍ２であってよく、０．００２５〜５００ｍｍ２であってよく、０．０１〜１０ｍｍ２であってよい。
【００５７】
領域Ａと領域Ｂとは、同一平面上に配置されていることが好ましい。領域Ａと領域Ｂとは、縦方向や横方向等に互い違いに並んでいることが好ましい。領域Ａと領域Ｂとの並びのパターンは、領域Ａと領域Ｂとが互い違いに並んだ、縞状、市松模様状、同心円状とすることができる。領域Ａと領域Ｂとは互いの境界を共有するよう直接に接して配置されていることが好ましい。領域Ａ及び領域Ｂの短手方向の長さは０．０５〜５０ｍｍとしてもよく、０．１〜５ｍｍとしてもよい。このような構成とすることで、領域Ａと領域Ｂとの間で培養される細胞特性の差が検出されやすい。また、神経細胞及び／又はグリア細胞を含む細胞の培養に使用される場合には、グリア細胞は高弾性領域（領域Ａ）で接着しやすく、神経細胞は低弾性領域（領域Ｂ）で接着しやすいため、両者を共培養する際に、接着領域の住み分けが可能になる。
【００５８】
なお、本実施形態の細胞足場材料は、上記方法で得られたものに限定されるものではない。
【００５９】
以上に説明した第一〜第二の実施形態の細胞足場材料によれば、フィルム状であるため厚さが制御され、厚さの安定性に優れる。また、実施形態の細胞足場材料は、領域Ａよりも領域Ｂの弾性率が低い、又は低くなるよう変化するので、高弾性領域Ａと低弾性領域Ｂとの両方で細胞を培養でき、これまで明らかとなっていなかった、細胞・組織がＥＣＭ力学特性を認識・応答するメカニズムの解明が期待できる。
【００６０】
≪細胞足場材料の製造方法≫
（１）細胞足場材料の製造方法の第一の実施形態
本実施形態の製造方法として、上記第一の実施形態の細胞足場材料の製造方法について説明する。
【００６１】
第一の実施形態の細胞足場材料は、前記ゲルの構成材料である各成分を混合して、これら各成分を含有する足場材料組成物をフィルム状にゲル化させることで製造できる。
各成分としては、上記に例示した高分子化合物及び／又はその原材料、並びに液体成分を含み、必要により、上記に例示した架橋剤、添加剤等の各種成分を含んでもよい。高分子化合物、高分子化合物の原材料及び架橋剤は、上記に例示した自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分であってよい。
高分子化合物の原材料が、光重合開始剤によって重合されるモノマー等の原材料を含む場合、足場材料組成物は、該当する光重合開始剤を含むことが好ましい。
【００６２】
足場材料組成物をフィルム状にゲル化させる方法の一例としては、培養容器や基板等の上に足場材料組成物を注ぎ、その上で硬化させることを例示できる。
ゲルを硬化させるため、必要に応じ足場材料組成物に対し光照射を行ってもよい。当該光照射は、ゲル全体を硬化させる目的でなされるものであり、光照射して領域Ａと領域Ｂとに分けることには該当しない操作である。
【００６３】
図２は、その上で足場材料組成物を硬化させるガラス基板の模式図である。図２（Ａ）は、表面にスペーサーを有するガラス基板の上面図であり、図２（Ｂ）は図２（Ａ）の側面図である。ガラス基板の両端にスペーサーを配置することで、フィルム状のゲルの厚みを均一にすることができる（図２（Ａ），（Ｂ））。また、配置する複数のスペーサーの厚みを互いに異なるものとすることで、フィルム状のゲルの厚みに勾配をつけることができる（図２（Ｃ））。
スペーサーの厚みの範囲は、ガラス基板への影響がなく、かつ、ゲルの膨潤による皺構造形成の影響が少ない、１０〜５０μｍが望ましい。
スペーサーの素材として、厚さが均一で耐水性を有していればよいが、例として、サランラップ（登録商標、旭化成、１１μｍ）、スコッチテープ（登録商標、３Ｍ、５０μｍ）、ＰＥＴ基材片面接着テープ（日東電工，１０，２０，３０μｍ）が挙げられる。また、ＳＵ−８等のネガティブフォトレジストを用いて任意のスペーサー厚としてもよい。
【００６４】
（２）細胞足場材料の製造方法の第二の実施形態
本実施形態の製造方法として、上記第二の実施形態の細胞足場材料の製造方法について説明する。
【００６５】
（光照射工程）
本実施形態の製造方法は、光照射工程を有する。
光照射工程は、高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲル、又は前記ゲルの構成材料を含有する足場材料組成物の一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させる工程である。
第二実施形態のゲルは、第一実施形態のゲルに光照射工程を施すことにより製造できる。当該ゲル、足場材料組成物、及び光の照射については、上記の≪細胞足場材料≫および細胞足場材料の製造方法の第一の実施形態において例示したものが挙げられ、説明を省略する。
光照射して領域Ａと領域Ｂとに分けることについては以下の例が挙げられる。
１）領域Ａに光Ｌを照射し、光Ｌが照射されていない領域を領域Ｂとし、光Ｌによって領域Ａの弾性率を高める。
２）領域Ｂに光Ｌを照射し、光Ｌが照射されていない領域を領域Ａとし、光Ｌによって領域Ｂの弾性率を低下させる。
【００６６】
ゲルに対し光照射工程を行って細胞足場材料の備えるゲルを得てもよく、足場材料組成物に対し光照射工程を行って細胞足場材料の備えるゲルを得てもよい。足場材料組成物に対する前記光照射工程のみで、足場材料組成物がゲル化しない場合には、領域Ａと領域Ｂとの弾性率の違いが打ち消されないよう、足場材料組成物全体を硬化する操作を行ってもよい。
【００６７】
（再膨潤工程）
本実施形態の製造方法は、さらに再膨潤工程を有していてもよい。
再膨潤工程は、前記照射工程の前に、光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分を含む再膨潤液にゲルを含浸させる工程である。
【００６８】
光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分については、上記≪細胞足場材料≫で例示したものが挙げられる。当該成分は高分子化合物の原材料を含んでもよい。高分子化合物の原材料が、光重合開始剤によって重合されるモノマー等の原材料を含む場合、再膨潤液は、該当する光重合開始剤を含むことが好ましい。
再膨潤させたゲルの任意の領域に光照射を行うことで、ゲルの弾性率を局所的に変化させることが可能となる。再膨潤液の組成は、ゲルが膨潤する溶媒に溶解する分子でることが好ましい。再膨潤液中の分子組成によって、ゲルに様々な機能を付与することが可能となる。
【００６９】
実施形態の細胞足場材料の製造方法によれば、実施形態の細胞足場材料を容易に製造できる。
【００７０】
≪細胞モデル≫
本実施形態の細胞モデルは、本発明の細胞足場材料と、前記細胞足場材料で培養される細胞と、を備えるものである。
培養材料としては、上記の≪細胞足場材料≫において例示したものが挙げられ、説明を省略する。
細胞は、細胞足場材料のゲルの表面に位置していてもよく、ゲルの内部に位置していてもよい。
細胞としては、特に制限されるものではなく、動物細胞、植物細胞等の細胞や、微生物が挙げられる。前記細胞は、組織、器官等の細胞集合体を構成していてもよい。
実施形態の細胞モデルは、中枢神経系モデルとして好適に用いることができる。細胞は、神経細胞及び／又はグリア細胞を含むことが好ましい。
【００７１】
一態様として、細胞モデルの製造方法は、前記細胞モデルの第一の実施形態の細胞培養基材のゲルの一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させる光照射工程を含む、方法である。これにより、細胞足場材料と、前記細胞足場材料で培養される細胞と、を備え、前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い細胞モデルを製造することができる。光が照射される領域には、予め細胞が含まれていてもよく、含まれていないくともよい。
【００７２】
実施形態の細胞モデルによれば、領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い、又は低くなるよう変化するので、生体内のＥＣＭの力学特性を模倣し、細胞・組織が外部環境の力学特性を認識するメカニズムを解明するためのin vitroモデルとすることができる。特に、疾患や外的損傷の再生が困難な中枢神経系に注目し、中枢神経系のＥＣＭ力学特性を模倣した細胞モデルを提供でる。神経細胞またはグリア細胞の培養下、in situでゲルの力学特性変化を実現することで疾患・外傷のモデルとし、組織再生に最適な足場材料の力学特性をスクリーニングするための細胞モデルとして利用可能である。
再生医療の観点からは、中枢神経系の疾患・損傷モデルとすることで、組織再生に最適な足場材料の力学特性をスクリーニングできる。
【００７３】
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【実施例】
【００７４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７５】
＜弾性率測定方法＞
実施例で得られた各ゲルの弾性率は、下記方法により求めた。
原子間力顕微鏡を用い、温度２５℃の測定条件で測定を行った。なお、当該測定は、ヒトの体液とほぼ等張に調整したPBS水溶液中で行われるものとする。
【００７６】
［参考例１］弾性率が一定のハイドロゲルフィルム（定弾性フィルム）の製造
図３は、参考例１の定弾性フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
３−（トリメチルシリル）プロピルメタクリレートで表面修飾されたガラス基板（以下、「シラン化ガラス基板」という。）の両端に、スペーサーとしてサランラップ（登録商標）を配置した（図２（Ａ）参照）。アクリルアミドを５重量％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（以下、「ビスアクリルアミド」という。）を０．０５重量％又は０．５重量％、及び光重合開始剤ＬＡＰを１ｍＭ含む溶液（以下、「足場材料組成物」という。）を、シラン化ガラス基板中央に滴下した。足場材料組成物のビスアクリルアミド濃度を０．０５重量％とした場合、低弾性ゲル（１００〜３００Ｐａ）が生成され、０．５重量％とした場合、高弾性ゲル（１〜３ｋＰａ）が生成された。この基板に、カバーガラス（以下、「シール基板」という。）を上面からのせ、足場材料組成物をシラン化ガラス基板とシール基板とで挟み込んだ。波長３６０ｎｍのバンドパスフィルターを用い、１０ｍＷ／ｃｍ２で１０分間、足場材料組成物へ光照射し、ハイドロゲルフィルムとした。光照射終了後、ＰＢＳ溶液に浸漬し、未反応の成分を除去した。シール基板を取り除き、ハイドロゲルフィルム表面にポリ−Ｄ−リジンを提示するためのクロスリンカーとして２ｍＭのｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６-（４‘-ａｚｉｄｏ-２’-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ（以下、「ｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ」という。）溶液を１００ｕｌハイドロゲルフィルム表面に滴下した。波長３３０ｎｍバンドパスフィルターを介してハイドロゲルフィルムへ１０分間光照射した。１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（以下、「ＰＤＬ」という。）溶液を１００ｕｌ滴下し、ハイドロゲルフィルム表面にＰＤＬ分子を修飾し、ポリアクリルアミドを含むゲルからなる定弾性フィルムを得た。
【００７７】
［実施例１］同一基板上で異なる弾性率の領域を有するハイドロゲルフィルム（パターン化フィルム）の製造
図４は、実施例１のパターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
金またはアルミのフォトマスクを基板の片面に有するシール基板（以下、「フォトマスク付きシール基板」という。）を用い、足場材料組成物のビスアクリルアミド濃度を０．５重量％とした以外は、参考例１のハイドロゲルフィルムと同様にして、パターン化フィルムを得た。得られたパターン化フィルムでは、光照射の際のマスク下の部分の弾性率が３００〜５００Ｐａの低弾性領域、マスクのない部分の弾性率が２ｋ〜５ｋＰａの高弾性領域であることを確認した（図５）。
【００７８】
［実施例２］光解離性官能基を架橋剤としたパターン化フィルム（光反応性パターン化フィルム）の製造
図６は、実施例２の光反応性パターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
アクリルアミドを５重量％、ビスアクリルアミドを０．０５重量％、上記式（１−D）で表される化合物（光解離性架橋剤）を０．４５重量％、並びに重合開始剤としてＥｏｓｉｎＹを０．０１ｍＭ、ＴＥＯＡを１０重量％、及びＮＶＰを３７．５ｕＭの割合で含む溶液（以下、「光解離性官能基含有足場材料組成物」という。）を、シラン化ガラス基板中央に滴下した。この基板に、シール基板を上面からのせ、光解離性官能基含有足場材料組成物をシラン化ガラス基板とシール基板とで挟み込んだ。波長４００ｎｍのハイパスフィルタを介して１０分間、光解離性官能基含有足場材料組成物へ光照射し、ハイドロゲルフィルムとした。ＰＢＳ溶液で未反応の成分を取り除き、ハイドロゲルフィルムと基板を反転させ、基板の上面（ハイドロゲルフィルムと接していない面）にフォトマスクを設置した。波長３６０ｎｍの光を１０分間、ハイドロゲルフィルムへ照射し、ＰＢＳ溶液に再度浸漬した。シール基板を取り除き、２ｍＭのｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ溶液を１００ｕｌハイドロゲルフィルム表面に滴下した。波長４００ｎｍのハイパスフィルタを使用して、ハイドロゲルフィルムへ３０分間光照射した。その後は、前述の参考例１と同様にＰＤＬをハイドロゲル表面に修飾し、光反応性パターン化フィルムとした。
【００７９】
［実施例３］フィルムの再膨潤によるパターン化フィルム（再膨潤パターン化フィルム）の製造
図７は、実施例３の再膨潤パターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
上述と参考例１と同様の方法で、ポリアクリルアミドを含むゲルからなる定弾性フィルムを作製した。この定弾性フィルムを再膨潤溶液（アクリルアミドを５重量％、ビスアクリルアミドを０．０５重量％、及び光重合開始剤としてＬＡＰを１ｍＭ含む溶液）に１晩以上浸漬し、ハイドロゲルフィルムを膨潤させ、再膨潤フィルムとした。この再膨潤フィルム上にフォトマスクを設置して、再膨潤フィルムへ波長３６０ｎｍの光を照射した。ＰＢＳ溶液に浸漬し、未反応の再膨潤溶液を取り除くことで、再膨潤パターン化フィルムを得た。
【００８０】
［実施例４］光異性化分子を用いた光応答性パターン化フィルム（光応答性フィルム）の製造
図８は、実施例４の光応答性フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
アクリルアミドを５重量％、ビスアクリルアミドを０．０５重量％、アゾＤＮＡを２．９ｍＭ、並びに重合開始剤としてＥｏｓｉｎＹを０．０１ｍＭ、ＴＥＯＡを１０重量％、及びＮＶＰを３７．５ｕＭの割合で含む溶液（以下、「光異性化分子含有足場材料組成物」という）を、シラン化ガラス基板中央に滴下した。この基板に、シール基板を上面からのせ、光異性化分子含有足場材料組成物をシラン化ガラス基板とシール基板とで挟み込んだ。波長４００ｎｍのハイパスフィルタを介して１０分間、光異性化分子含有足場材料組成物へ光照射し、ハイドロゲルフィルムとした。光照射終了後、ＰＢＳ溶液に浸漬し、未反応の成分を取り除いた。２ｍＭのｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ溶液１００ｕｌをハイドロゲルフィルム表面に滴下し、波長４００ｎｍのハイパスフィルタを使用して、３０分間光照射した。その後は、参考例１のハイドロゲルフィルムと同様にＰＤＬをハイドロゲル表面に修飾し、光応答性フィルムを得た。次いで光応答性フィルム基板の底面（光応答性フィルムと接していない面）にフォトマスクを設置した。３６０ｎｍの光を光応答性フィルムへ１０分間照射することで、光照射部分が低弾性領域、未照射の領域が高弾性領域となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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