(57)【要約】【課題】フィーダー細胞を用いず、簡便且つ安価な体細胞からの人工多能性幹細胞の製造方法の提供。【解決手段】本発明の体細胞からの人工多能性幹細胞の製造方法は、核初期化因子を体細胞に導入し、フィーダー細胞を用いず、低酸素環境下にて培養する培養工程を備え、前記培養工程において、少なくとも一つの無機塩と、少なくとも一つのアミノ酸と、少なくとも一つのビタミンと、Ｄ−グルコースと、フェノールレッドナトリウムと、ピルビン酸ナトリウムと、抗生物質と、血清と、を含む培地を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、
核初期化因子を体細胞に導入し、フィーダー細胞を用いず、低酸素環境下にて培養する培養工程を備え、
前記培養工程において、
塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも一つの無機塩と、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸と、
塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのビタミンと、
Ｄ−グルコースと、
フェノールレッドナトリウムと、
ピルビン酸ナトリウムと、
抗生物質と、
血清と、を含む培地を用いることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記核初期化因子がＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記体細胞が線維芽細胞である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記培養工程において、酸素濃度が１０％である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記培地中のＤ−グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地であって、
塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも一つの無機塩と、
アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸と、
塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのビタミンと、
Ｄ−グルコースと、
フェノールレッドナトリウムと、
ピルビン酸ナトリウムと、
抗生物質と、
血清と、を含むことを特徴とする培地。
【請求項７】
前記培地中のＤ−グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下である請求項６に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法及び人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞に、極少数の因子を導入し、培養することによって、様々な組織や臓器の細胞に分化する能力及びほぼ無限に増殖する能力をもつ多能性幹細胞に変化する。この細胞は「人工多能性幹細胞」と呼ばれ、英語では、「ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ」と表記される。このため、頭文字をとって「ｉＰＳ細胞」と呼ばれている。
【０００３】
２００６年に、京都大学の山中教授らは、ＥＳ細胞で特徴的に働いている４つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を見出し、レトロウイルスベクターを使って、これらの遺伝子をマウスの皮膚細胞（線維芽細胞）に導入し、数週間培養することで、マウスｉＰＳ細胞の作製に成功した（例えば、非特許文献１参照。）。さらに、２００７年には、同様に上記の４遺伝子を人間の皮膚細胞に導入してヒトｉＰＳ細胞の作製に成功したと発表した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yamanaka S., et al., “Induction of Pluripotent Stem Cells  from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors”, Cell, vol.126, p663-676, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
山中教授らの方法では、上記の４遺伝子を導入した細胞を、フィーダー細胞上に播種し、さらに、幹細胞作製に通常用いられる専用培地を用いて、ｉＰＳ細胞を作製している。フィーダー細胞を使用するため、夾雑物等の混入の虞があり、作製したｉＰＳ細胞をそのまま再生医療等の臨床使用することが難しかった。また、幹細胞作製用の専用培地は高価であり、大量のｉＰＳ細胞の作製が難しかった。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、フィーダー細胞を用いず、簡便且つ安価な体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法及び人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、一般的な成分を含有する培地を用いることで、フィーダー細胞を用いずに簡便にｉＰＳ細胞を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、核初期化因子を体細胞に導入し、フィーダー細胞を用いず、低酸素環境下にて培養する培養工程を備え、前記培養工程において、塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも一つの無機塩と、アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸と、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのビタミンと、Ｄ−グルコースと、フェノールレッドナトリウムと、ピルビン酸ナトリウムと、抗生物質と、血清と、を含む培地を用いることを特徴とする製造方法。
［２］前記核初期化因子がＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子である［１］に記載の製造方法。
［３］前記体細胞が線維芽細胞である［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記培養工程において、酸素濃度が１０％である［１］〜［３］のいずれか一つに記載の製造方法。
［５］前記培地中のＤ−グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下である［１］〜［４］のいずれか一つに記載の製造方法。
［６］人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地であって、塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも一つの無機塩と、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸と、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのビタミンと、Ｄ−グルコースと、フェノールレッドナトリウムと、ピルビン酸ナトリウムと、抗生物質と、血清と、を含むことを特徴とする培地。
［７］前記培地中のＤ−グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下である［６］に記載の培地。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、フィーダー細胞を用いず、簡便且つ安価な体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法及び人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）実施例１におけるリポフェクション法を用いて核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入したマウス尾部線維芽細胞を培養し、導入後２１日目に形成されたコロニーを示す画像である。（Ｂ）実施例１におけるエレクトロポレーション法を用いて核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入したマウス尾部線維芽細胞を培養し、導入後６日目に形成されたコロニーを示す画像である。
【図２】実施例１におけるエレクトロポレーション法を用いて核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入したマウス尾部線維芽細胞を培養し、経時的なコロニー数の変化を示すグラフである。
【図３】実施例１におけるリポフェクション法又はエレクトロポレーション法を用いて核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入したマウス尾部線維芽細胞を培養し、それぞれ導入後１３６〜１９０日目又は導入後４６〜５６日目にコロニーを回収してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより外因性遺伝子（Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ）の挿入を確認した画像である。
【図４】（Ａ）実施例１におけるリポフェクション法を用いて核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入したマウス尾部線維芽細胞を培養し、導入後１６２〜１６３日目にコロニーを回収してＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により初期化マーカー遺伝子の発現を確認した画像である。（Ｂ）実施例１におけるリポフェクション法又はエレクトロポレーション法を用いて核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入したマウス尾部線維芽細胞を培養し、それぞれ導入後１６２〜１６３日目又は導入後１４〜５７日目にコロニーを回収してＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により初期化マーカー遺伝子の発現を確認した画像である。（Ｃ）実施例１におけるエレクトロポレーション法を用いて核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入したマウス尾部線維芽細胞を培養し、導入後１４〜５７日目にコロニーを回収してＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により初期化マーカー遺伝子の発現を確認した画像である。
【図５】実施例２におけるエレクトロポレーション法を用いて核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入したマウス尾部線維芽細胞をＬＩＦ不含又はＬＩＦ含有ＤＭＥＭ（血清及び抗生物質含有）を用いて培養し、導入後３３日目又は導入後４３日目にコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法＞
一実施形態において、本発明は、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、核初期化因子を体細胞に導入し、フィーダー細胞を用いず、低酸素環境下にて培養する培養工程を備え、前記培養工程において、塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも一つの無機塩と、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸と、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのビタミンと、Ｄ−グルコースと、フェノールレッドナトリウムと、ピルビン酸ナトリウムと、抗生物質と、血清と、を含む培地を用いる製造方法を提供する。
【００１２】
本実施形態の製造方法によれば、フィーダー細胞を用いずに、簡便に人工多能性幹細胞を製造することができる。また、フィーダー細胞を使用しないことから、夾雑物の混入が少なく、臨床使用に適している。
【００１３】
本明細書において、「人工多能性幹細胞」とは、皮膚等の成体由来の細胞に数種類の遺伝子を人工的に導入し、培養することによって、様々な組織や臓器の細胞に分化する能力及びほぼ無限に増殖する能力をもつ多能性幹細胞となったものを意味する。また、英語では、「ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ」と表記される。以下、「人工多能性幹細胞」を「ｉＰＳ細胞」と称する場合がある。
本実施形態の製造方法について、以下に詳細に説明する。
【００１４】
［培養工程］
まず、予め必要な細胞数まで培養しておいた体細胞に核初期化因子を導入する。
【００１５】
本明細書において、「体細胞」とは、卵子、卵母細胞等の生殖系列細胞又はＥＳ細胞等の分化全能性細胞を除く全ての細胞を意味し、その種類は特に限定されない。例えば、胎児期の体細胞を用いてもよく、成熟した体細胞を用いてもよい。ヒトを含む哺乳類動物由来の体細胞が好ましく、マウス由来の体細胞又は霊長類由来の体細胞がより好ましく、ヒト由来の体細胞が特に好ましい。体細胞として、より具体的には、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝臓細胞、胃粘膜細胞等の分化した細胞等が挙げられる。中でも、体細胞としては、線維芽細胞であることが好ましい。
人工多能性幹細胞を疾病の治療に用いる場合には、患者自身から分離した体細胞や、ＨＬＡ抗原の型が同一である他人から分離した体細胞を用いることが望ましく、例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞等を用いることができる。
【００１６】
本明細書において、「哺乳動物」としては、すべての哺乳動物を含む。中でも、哺乳動物としては、霊長類（例えばヒト、サル、チンパンジー等）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター等）、有蹄類（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）、及びペット動物（例えばイヌ、ネコ、ウサギ等）が好ましい。
【００１７】
（核初期化因子）
本実施形態において用いられる核初期化因子としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子の３種の遺伝子が主に挙げられる。
Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子については国際公開ＷＯ２００７／６９６６６号にファミリー遺伝子の具体例が記載されている。Ｏｃｔファミリー遺伝子としてはＯｃｔ３／４が好ましく、Ｋｌｆファミリー遺伝子としてはＫｌｆ４が好ましく、Ｓｏｘファミリー遺伝子としてはＳｏｘ２が好ましい。これらの遺伝子としては、野生型の遺伝子であってもよく、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１又は２個）の塩基が置換、挿入、及び／又は欠失した変異遺伝子や、ファミリー遺伝子の適宜の組み合わせにより得られるキメラ遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能、又は改善された機能を有する遺伝子であってもよい。
【００１８】
また、上記３種の遺伝子に加えて、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＮａｎｏｇからなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子を用いてもよい。Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４からなる群から選ばれる遺伝子は核初期化の効率を高める作用を有する核初期化因子であり、核初期化のために不可欠な核初期化因子（例えば、Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、又はＯｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ等）と組み合わせて用いることにより、核初期化の効率を顕著に改善することができる。
【００１９】
Ｍｙｃファミリー遺伝子としてはｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＮ−Ｍｙｃが知られている。ｃ−Ｍｙｃは、がん関連転写因子である。ｃ−Ｍｙｃには２種の関連する遺伝子（Ｎ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃ）が存在する（Ａｄｈｉｋａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ６３５−６４５，２００５）。Ｌ−Ｍｙｃについては国際公開ＷＯ２００７／６９６６６号の表１に記載されている。
Ｌｉｎファミリー遺伝子としてはＬｉｎ２８及びＬｉｎ２８ｂが知られており、Ｌｉｎ２８が好ましい。
Ｓａｌｌ４については国際公開ＷＯ２００７／６９６６６号の表４及び表５に記載されている。
Ｓａｌｌ１はＥＳ細胞特異的発現遺伝子であり、かつｚｉｎｃフィンガー蛋白の一つとして知られており、腎臓の発生に関与していると考えられている。Ｓａｌｌ１のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０２１３９０（マウス）及びＮＭ＿００２９６８（ヒト）である。またＬｉｎ２８のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿１４５８３３（マウス）及びＮＭ＿０２４６７４（ヒト）である。
ＮａｎｏｇはＥＳ細胞特異的発現遺伝子であり、京都大学の山中教授らが同定した未分化マーカー遺伝子である（Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．１１３，Ｎｏ．５，  ｐ６３１−６４２，２００３）。
【００２０】
上記５種の遺伝子としては、野生型の遺伝子であってもよく、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１又は２個）の塩基が置換、挿入、及び／又は欠失した変異遺伝子や、ファミリー遺伝子の適宜の組み合わせにより得られるキメラ遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能、又は改善された機能を有する遺伝子であってもよい。
【００２１】
上記例示した遺伝子のうち、導入される核初期化因子として好ましい組み合わせについては、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号、国際公開ＷＯ２００９／０５７８３１号、特表２０１２−５０７２５８号公報等に記載の公知の組み合わせにて選択すればよい。例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−Ｍｙｃの４遺伝子を核初期化因子として導入すればよい。
なお、上記例示した遺伝子の各アミノ酸及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスすることによって入手することが可能である。
【００２２】
また、ある特定の哺乳動物由来の体細胞を初期化するときには、それと同一の哺乳動物由来の初期化因子を使用することが好ましい。例えば、ヒト由来の体細胞からｉＰＳ細胞を誘導するときには、ヒト由来の初期化因子を使用する。
【００２３】
上記例示した遺伝子を体細胞に導入する方法は特に限定されず、例えば、上記遺伝子を発現可能なベクターを用いることが一般的である。ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が「国際公開ＷＯ２００７／６９６６６号」、「Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６」、及び「Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７」に開示されている。また、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合についてはＳｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７に開示がある。また、非ウイルスベクターであるプラスミドを用いる場合については沖田らの論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：Ｏｃｔｏｂｅｒ  ９，２００８；１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６４２７０）に記載されているので、当業者はこれらのなかから適宜の手段を選択して採用することができる。
ベクターを用いる場合には、ベクターに上記の遺伝子から選ばれる２種以上の遺伝子を組み込んでもよく、１種類の遺伝子を組み込んだベクターを数種類用いてもよい。初期化すべき体細胞において上記の遺伝子のうちの１種又は２種がすでに発現している場合には、導入すべき上記の遺伝子の組み合わせから発現している１種又は２種の遺伝子を除くこともできる。
【００２４】
上記遺伝子を体細胞に導入する手段としてウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターを用いる場合には、まず導入すべきそれぞれの遺伝子を含むウイルスベクターを調製した後、各ウイルスベクターを別々のパッケージング細胞にトランスフェクトして該細胞を培養することにより各ウイルスを含む培養上清をそれぞれ独立に調製する。次いで、それらの培養上清の混合物を調製して、遺伝子を含むウイルスを感染させることにより遺伝子導入を行えばよい。この手段を採用することにより、遺伝子導入効率を顕著に高めることができる場合があり、特にｃ−Ｍｙｃを用いずに核初期化を行う場合に好ましい場合がある。
また、複数のウイルスベクターを単一のパッケージング細胞にトランスフェクトし、複数のウイルスベクターを含む培養上清を調製して遺伝子導入に用いてもよい。
【００２５】
また、上記遺伝子を体細胞に導入する手段として非ウイルスベクター、例えばプラスドベクターを用いる場合には、体細胞へのベクターの導入は、当業界で公知のいずれの方法でも可能であり、具体的にはリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等、微小核細胞融合法等が挙げられ、これらに限定されない。
リポフェクション法は、例えば、リポフェクタミン等のカチオン性リポソーム内に上記ベクターを封入し、得られたリポソームを体細胞と融合させ、これによって上記ベクターを体細胞内に導入すればよい。細胞は、通常、その表面がアニオン性となっているため、カチオン性リポソームを引き寄せる。リポソームとしては、例えば、糖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の分子で修飾したリポソームが挙げられる。
エレクトロポレーション法は、例えば、上記ベクターおよび体細胞を含む懸濁液に電気パルスをかけることによって細胞膜に微小な孔を開け、ベクターを細胞の中に導入すればよい。
微小核細胞融合法は、例えば、上記ベクターを含みかつ微小核形成能を有する哺乳動物細胞（例えばマウスＡ９細胞（ＡＴＣＣ  ＶＡ２０１１０−２２０９））を倍数体誘発剤（例えばコルセミド、コルヒチンなど）で処理して微小核多核細胞を形成し、次いで、サイトカラシン処理により微小核体を形成し、遠心分離等で回収し、得られた微小核体を体細胞と融合させ、これによって上記ベクターを体細胞内に導入すればよい。
【００２６】
タンパク質の形態で初期化因子を培養哺乳動物体細胞に導入する方法には、従来の方法、例えば、タンパク質デリバリー試薬を使用する方法、タンパク質輸送ドメイン（ＰＴＤ）又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）との融合蛋白質を使用する方法、マイクロインジェクション法、リポソーム法、リポフェクション法等が挙げられる。
タンパク質デリバリー剤は、例えば、カチオン性脂質ベースのBｉｏＰＯＴＥＲ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｐｒｏ−ＪｅｃｔＴＭＰｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）、ＰｒｏＶｅｃｔｉｎ（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）、脂質ベースのＰｒｏｆｅｃｔ−１（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）、膜透過性ペプチドベースのＰｅｎｅｔｒａｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｑ  ｂｉｏｇｅｎｅ社製）、Ｃｈａｒｉｏｔ  Ｋｉｔ  （Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社製）、及び（不活性化センダイウイルス由来の）ＨＶＪエンベロープを使用するＧｅｎｏｍＯＮＥ (石原産業、日本)として市販されているもの等が挙げられる。
細胞内へのタンパク質又はペプチドの導入は、それぞれの試薬に添付された使用説明書に従って行うことができ、その一般的な手順は以下のとおりである。すなわち、初期化因子を適当な溶媒 （例えば、ＰＢＳ又はＨＥＰＥＳ等のバッファー)で希釈し、その後、これにデリバリー試薬を加え、混合物を室温で５〜１５分間インキュベーションして、初期化因子とデリバリー試薬との間で複合体を形成する。この複合体を、予め交換された血清不含有培地中の細胞に添加し、その後、該細胞を３７℃、1時間〜数時間インキュベーションする。このあと、培地を除去し、血清含有培地と交換する。
【００２７】
使用されるＰＴＤとして開示されるものは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来ＡｎｔＰ；  ＨＩＶ由来ＴＡＴ（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９−１１９３  （１９８８））；  Ｇｒｅｅｎ，  Ｍ．と  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｐ．Ｍ．  Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９−１１８８  （１９８８））；  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  （Ｄｅｒｏｓｓｅｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ． Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：１０４４４−１０４５０  （１９９４））；  Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ  （Ｐａｒｋ，  Ｃ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：８２４５−８２５０  （２０００））；  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ  （Ｐｏｏｇａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １２：６７−７７  （１９９８）；  ＭＡＰ  （ｍｏｄｅｌ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）  （Ｏｅｈｌｋｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １４１４：１２７−１３９（１９９８））；  Ｋ−ＦＧＦ  （Ｌｉｎ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：１４２５５−１４２５８  （１９９５））；  Ｋｕ７０  （Ｓａｗａｄａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ５：３５２−３５７  （２００３））；  Ｐｒｉｏｎ  （Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９９：８５−９０  （２００２））；  ｐＶＥＣ  （Ｅｌｍｑｕｉｓｔ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２６９：２３７−２４４  （２００１））；  Ｐｅｐ−１  （Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｍ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：１１７３−１１７６  （２００１））；  Ｐｅｐ−７  （Ｇａｏ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １０：４０５７−４０６５  （２００２））；ＳｙｎＢ１  （Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５７：６７９−６８６  （２０００））；  ＨＮ−１  （Ｈｏｎｇ，  Ｆ．Ｄ．  ＆  Ｃｌａｙｍａｎ，  Ｇ．Ｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０：６５５１−６５５６  （２０００））；及びＨＳＶ由来ＶＰ２２などのタンパク質の細胞通過ドメインである。ＰＴＤ由来のＣＰＰには、１１Ｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：３８１−３８４  （２００９））及び９Ｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：４７２−４７６  （２００９））等のポリアルギニンが含まれる。
【００２８】
融合タンパク質を発現する、並びに、初期化因子をコードするｃＤＮＡ及びＰＴＤ又はＣＰＰ配列が組み込まれたベクターが作製されて、該融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現し、その後、該融合タンパク質を回収して細胞に導入する。該導入は、タンパク質デリバリー試薬を添加しないことを除いて上記と同様の方法で行うことができる。
【００２９】
マイクロインジェクションは、先端径約１μｍを有するガラス針の中にタンパク質溶液を入れ、針を細胞に刺すことによってこの溶液を細胞に導入し、これによってタンパク質を確実に細胞内に導入できる方法である。
【００３０】
タンパク質を導入する操作は、1回又はそれ以上、例えば１〜１０回、１〜５回等、好ましくは２回以上繰り返して行うことができる。操作の繰り返しの間の時間間隔は、例えば６〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間である。
【００３１】
次いで、核初期化因子導入後の体細胞を培養する。核初期化因子導入後の細胞の培養密度は通常の動物細胞培養の場合よりも低く設定することが好ましい。例えば、１．０×１０４細胞／ｃｍ２以上１．０×１０５細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で培養を継続することが好ましい。本実施形態の製造方法では、培養工程において、フィーダー細胞を用いない。
培養温度としては、２５℃以上４０℃以下が好ましく、３０℃以上３９℃以下がより好ましく、３５℃以上３９℃以下がさらに好ましい。
培養環境は、細胞の維持又は増殖に直接的に影響することなく、かつ、用いた細胞培養に適した環境を任意の期間保持できるものであれば、任意に設定してもよい。また、必要に応じて培養環境を著しく変化させなければ還流等の流体力学的な付加を加えてもよい。
また、培養環境は、低酸素環境であることが好ましく、具体的には、酸素濃度が１％以上１０％以下であることが好ましく、５％以上１０％以下であることがより好ましく、１０％であることが特に好ましい。
従来のｉＰＳ細胞の培養では、酸素濃度が２０％であるのに対し、本実施形態の培養工程では酸素濃度が１０％以下であるため、効率的にｉＰＳ細胞を未分化状態のままで増殖させることができる。
また、培養環境における二酸化炭素濃度は、例えば５％程度であればよい。
【００３２】
（培地）
培養工程に用いられる培地としては、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地にフェノールレッドナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、及び血清を加えたものであればよい。
培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、および膜電位の調節を助けるためのものである。
無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。
中でも、無機塩としては、塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことが好ましく、塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムの全てを含むことがより好ましい。
【００３３】
培地の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であればよく、例えば２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であればよく、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満（具体的には、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ）であればよい。
【００３４】
炭水化物としては、特別な限定はなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。中でも、炭水化物としては、グルコースであることが好ましく、Ｄ−グルコースであることがより好ましい。
培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ−グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌであることが好ましい。
従来のｉＰＳ細胞の培養に用いられる培地ではＤ−グルコースの濃度が４ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下程度であるのに対し、本実施形態の培養工程で用いられる培地ではＤ−グルコースの濃度が上記範囲であり、低グルコース濃度であることにより、効率的にｉＰＳ細胞を未分化状態のままで増殖させることができる。
【００３５】
アミノ酸としては、特別な限定はなく、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びその組み合わせ等が挙げられる。中でも、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンからなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことが好ましく、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンの全てを含むことがより好ましい。
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下)である。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下)である。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００３６】
ビタミンとしては、特別な限定はなく、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）、塩化コリン、ｍｙｏ−イノシトール、等が挙げられる。中でも、ビタミンとしては、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つ含むことが好ましく、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンの全てを含むことがより好ましい。
【００３７】
フェノールレッドナトリウムは、酸、塩基滴定指示薬であり、培地の液性を知るために使用される。
ピルビン酸ナトリウムは、解糖系の代謝物で、エムデン−マイヤーホフ経路（ＥＭ経路）でグルコースが有機酸として異化された最初の代謝産物である。よって、細胞のエネルギー源となり得る。
【００３８】
抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３９】
血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下であればよい。
【００４０】
本実施形態において用いられる培地としては、フェノールレッドナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、上記抗生物質、及び上記血清を添加した公知の基本培地であってもよく、より具体的には、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４１】
また培地は、さらに、成長因子、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）又はホルモンを含んでいてもよい。
成長因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。
成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００４２】
ＬＩＦは白血病細胞の増殖を阻害してマクロファージへの分化を誘導する因子として発見されたサイトカインで、ＩＬ−６ファミリーに属し、ＬＩＦＲ／ｇｐ１３０レセプターを介して、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２を活性化する。また、ＬＩＦはマウスＥＳ／ｉＰＳ細胞の未分化性を維持する機能を持つと共に、近年、ヒトＬＩＦはヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞をナイーブ化するために必要な因子の１つとしても注目されている。
培地に含まれるＬＩＦの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００４３】
ホルモンとしては、例えば、インシュリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００４４】
次いで、培地を適宜交換しながら、細胞を２０日以上３０日以下、又はそれ以上の後にｉＰＳコロニーを生じさせることができる。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から２〜３日に１回新鮮な培地と培地交換を行う。
【００４５】
得られたｉＰＳコロニーを同様の培養環境で培養することで、ｉＰＳ細胞を継代することができる。
【００４６】
ｉＰＳ細胞の同定は、ＥＳ細胞等の分化多能性細胞の特性に基づく試験によって行うことができる。具体的には、ＥＳ細胞特異的マーカー遺伝子の発現、半永久的細胞増殖能、分化多能性（三胚葉の形成）等の特性について細胞を試験し、細胞がこれらの特性をもつ場合に、該細胞がｉＰＳ細胞であると同定する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．ら，  Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２  （２００７））。
【００４７】
ＥＳ細胞特異的マーカー遺伝子としては、例えばＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＰＨ３４、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｎｏｄａ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、Ｔｒａ２−４９／６Ｆ（アルカリフォスファターゼ)等が挙げられる。
これらの遺伝子の増幅に特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ法によって、細胞内の上記マーカー遺伝子の発現を検出することができる。
【００４８】
半永久的細胞増殖能については、約４ヶ月〜６ヶ月以上にわたる細胞の培養試験において、該細胞が指数的増殖をすることを確認する。ヒトｉＰＳ細胞のコロニー倍加時間（又は集団倍加時間（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ））は、例えば４６．９±１２．４時間、４７．８±６．６時間又は４３．２±１１．５時間程度であることが知られているので、この値を増殖能の指標とすることができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．ら，  Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２  （２００７））。
また、ｉＰＳ細胞は、高いテロメラーゼ活性をもつため、例えばＴＲＡＰ（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｐｅａｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）法によって該活性を検出してもよい。
【００４９】
分化多能性（３胚葉の形成）は、例えばテラトーマの形成及びテラトーマ組織内の３胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）系の各組織（若しくは細胞）の同定によって確認することができる。具体的には、マウスｉＰＳ細胞の場合はヌードマウスの皮下に、またヒトｉＰＳ細胞の場合はＳｃｉｄマウスの精巣内に細胞を注射して腫瘍の形成を確認し、さらに腫瘍組織が、例えば軟骨組織（若しくは細胞）、神経管組織（若しくは細胞）、筋肉組織（若しくは細胞）、脂肪組織（若しくは細胞）、腸管様組織（若しくは細胞）等から構成されていることを確認する。
上記の各試験に基づいて、細胞がｉＰＳ細胞であることを確認し、ｉＰＳ細胞コロニーを選択することができる。
【００５０】
［人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の応用］
本実施形態の製造方法により得られたｉＰＳ細胞は、分化多能性を有し、ＥＳ細胞と非常に類似した特性を有している。このため、ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞の代替細胞として利用することが可能である。
【００５１】
ｉＰＳ細胞は、それが分化多能性をもつことから、種々の分化細胞、前駆細胞及び組織に誘導することができる。具体的には、ｉＰＳ細胞から、例えばａｃｔｉｖｉｎ Ａ／ＢＭＰ４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）等の因子の存在下で神経細胞、心筋細胞等の種々の分化細胞を誘導することができる。このようにして得られた分化細胞は、患者に、例えば患者の欠陥組織に、移植することによって患者の治療（いわゆる、再生医療）のために使用できる。
【００５２】
また、哺乳動物（ヒトを除く）由来の胚の胚盤胞にｉＰＳ細胞を導入し、その胚を、同じ動物種の仮親の子宮に移植することによって、ｉＰＳ細胞の遺伝子型及び形質の一部を受け継いだキメラ動物を作製することができる（国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号、参照。）。ｉＰＳ細胞における特定の遺伝子の改変、ノックアウト（ＫＯ）、又はノックイン（ＫＩ）による遺伝子機能の解明、疾患モデルの作製、物質(蛋白質等)生産等が可能になる。このとき、予め遺伝子改変した体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞も使用できる。
【００５３】
＜人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地＞
一実施形態において、本発明は、人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地であって、塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも一つの無機塩と、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸と、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのビタミンと、Ｄ−グルコースと、フェノールレッドナトリウムと、ピルビン酸ナトリウムと、抗生物質と、血清と、を含む培地を提供する。
【００５４】
本実施形態の培地によれば、フィーダー細胞を用いずに、人工多能性幹細胞を未分化のまま培養することができる。
【００５５】
本実施形態の培地としては、上述の＜体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法＞に例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態の培地に含まれる無機塩としては、塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことが好ましく、塩化カルシウム、硫酸第二鉄水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸一ナトリウムの全てを含むことがより好ましい。
【００５６】
本実施形態の培地の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であればよく、例えば２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であればよく、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満（具体的には、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ）であればよい。
【００５７】
本実施形態の培地に含まれる炭水化物としては、Ｄ−グルコースであることが好ましい。
培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ−グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌであることが好ましい。
一般的な培地ではＤ−グルコースの濃度が１ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下であるのに対し、本実施形態の培養工程で用いられる培地ではＤ−グルコースの濃度が上記範囲であり、低グルコース濃度であることにより、効率的にｉＰＳ細胞を未分化状態のままで増殖させることができる。
【００５８】
本実施形態の培地に含まれるアミノ酸としては、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンからなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことが好ましく、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンの全てを含むことがより好ましい。
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下)である。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下)である。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００５９】
本実施形態の培地に含まれるビタミンとしては、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つ含むことが好ましく、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、ピリドキシン、リボフラビン、及びチアミンの全てを含むことがより好ましい。
【００６０】
フェノールレッドナトリウムは、酸、塩基滴定指示薬であり、培地の液性を知るために使用される。
ピルビン酸ナトリウムは、解糖系の代謝物で、エムデン−マイヤーホフ経路（ＥＭ経路）でグルコースが有機酸として異化された最初の代謝産物である。よって、細胞のエネルギー源となり得る。
【００６１】
抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００６２】
血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下であればよい。
【００６３】
本実施形態において用いられる培地としては、フェノールレッドナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、上記抗生物質、及び上記血清を添加した公知の基本培地であってもよく、より具体的には、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６４】
また培地は、さらに、成長因子、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）又はホルモンを含んでいてもよい。
成長因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。
成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００６５】
ＬＩＦは白血病細胞の増殖を阻害してマクロファージへの分化を誘導する因子として発見されたサイトカインで、ＩＬ−６ファミリーに属し、ＬＩＦＲ／ｇｐ１３０レセプターを介して、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２を活性化する。また、ＬＩＦはマウスＥＳ／ｉＰＳ細胞の未分化性を維持する機能を持つと共に、近年、ヒトＬＩＦはヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞をナイーブ化するために必要な因子の１つとしても注目されている。
培地に含まれるＬＩＦの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００６６】
ホルモンとしては、例えば、インシュリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
［実施例１］
（１）マウス尾部線維芽細胞の採取
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢の雄、１３週齢の雄、及び４５週齢の雌）の尾部から線維芽細胞を採取し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）含有ダルベッコ変法イーグルメディウム（以下、「ＤＭＥＭ」と称する場合がある。）を用いて、予め培養した。
【００６９】
（２）核初期化因子の導入
次いで、培養し、３０×１０４細胞／ｃｍ２となるように播種されたマウス尾部線維芽細胞に、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃを搭載した２つのプラスミドベクター（ｐＣＸ−ＯＫＳ−２Ａ  ４μｇ、及びｐＣＸ−ｃＭｙｃ  ２μｇ）（ａｄｄｇｅｎｅ社製）を、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたリポフェクション法により導入した。
又は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃを搭載した２つのプラスミドベクター（ｐＣＸ−ＯＫＳ−２Ａ  ０．５μｇ及びｐＣＸ−ｃＭｙｃ  ０．５μｇ、又は、ｐＣＸ−ＯＫＳ−２Ａ  １．０μｇ及びｐＣＸ−ｃＭｙｃ  １．０μｇ）（ａｄｄｇｅｎｅ社製）を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ社製）を用いたエレクトロポレーション法により導入した。
【００７０】
（３）細胞の培養
次いで、導入後のマウス尾部線維芽細胞を、そのまま培養した。培地としては、１０％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」と称する場合がある。）及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）含有ダルベッコ変法イーグルメディウム（以下、「ＤＭＥＭ」と称する場合がある。）を用いた。また、培養条件は、３７℃、１０％酸素濃度、５％二酸化炭素濃度で行った。
【００７１】
（４）コロニーの形成
リポフェクション法により初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞では導入後２１日目にコロニーの形成が観察された（図１（Ａ）参照。）。一方、エレクトロポレーション法により初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞では導入後５日目にコロニーの形成が観察された（図１（Ｂ）参照。なお、図１（Ｂ）は導入後６日目の画像である。）。
【００７２】
（５）アルカリフォスファターゼ染色法による未分化状態の確認
次いで、また、形成されたそれぞれのコロニーについて、未分化状態が保たれていることをアルカリフォスファターゼ法により確認した。
具体的には、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  ＩＩＩ  ＜ＶＥＣＴＯＲ  Ｂｌｕｅ＞（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて行った。
まず、免疫組織化学分析のために、細胞を室温で１０分間４％のパラホルムアルデヒドを含有する１×ＰＢＳにより固定した。１×ＰＢＳにで洗浄後、基質溶液（沈殿物（反応生成物）は強い青色を呈色。）を添加し、２０分間室温で反応させた。次いで、１×ＰＢＳで洗浄し、観察した（図示せず）。
又は、ＡＰ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った。
まず、免疫組織化学分析のために、細胞を室温で５分間Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎにより固定した。１× ＰＢＳで洗浄後、基質溶液（沈殿物（反応生成物）は強い赤色を呈色。）を添加し、２０分間室温で反応させた。次いで、１× ＰＢＳで洗浄し、観察した。
その結果、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法、いずれの導入方法で初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞においても、未分化状態が保たれていることが確認された。
【００７３】
（６）外因性遺伝子挿入の確認
次いで、核初期化因子のベクターが挿入されているかを確認するために、細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により、挿入を確認した。
具体的には、まず、導入後１３６〜１９０日目又は導入後４６〜５６日目の各導入方法で形成されたマウス尾部線維芽細胞のコロニーからＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅキット（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、製造業者が推奨する方法に従ってＤＮＡを抽出した。次いで、マウスＫｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子をＰＣＲによって、増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社製）で行った。使用したプライマーの配列を以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
2018082639.tif 000002
【００７５】
次いで、得られたＰＣＲ産物をそれぞれ、アガロース電気泳動法により確認した。結果を図３に示す。図３において、コロニー１、２、及び７はリポフェクション法により期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞のコロニーを用いた結果を示し、コロニー３〜６、及び８はエレクトロポレーション法により期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞のコロニーを用いた結果を示す。また、ポジティブコントロールとして一緒にアガロース電気泳動を行った「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ＤＮＡ」は、マウス尾部線維芽細胞から抽出された全ＤＮＡを意味し、「ｐＣＸ」はｐＣＸ−ＯＫＳ−２Ａ  又はｐＣＸ−ｃＭｙｃをそれぞれ意味する。
【００７６】
図１から、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法、いずれの導入方法で初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞においても、外因性遺伝子であるマウスＫｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子はインテグレーションされる場合とインテグレーションしない場合とがあることを確認した。
【００７７】
（７）初期化マーカー遺伝子発現の確認
次いで、初期化マーカー遺伝子の発現を確認するために、細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、発現を確認した。
具体的には、まず、導入後１３６〜１９０日目又は導入後４６〜５６日目の各導入方法で形成されたマウス尾部線維芽細胞のコロニーからＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡキット（ＴａＫａＲａ社製）、又はＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ＬＥＶ  ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、製造業者が推奨する方法に従ってＲＮＡを抽出した。次いで、抽出されたＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、逆転写反応を行った。次いで、ＰＣＲはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社製）で行った。初期化マーカー遺伝子として、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＲｅｘ１遺伝子の５遺伝子について検出した。使用したプライマーの配列を以下の表２に示す。
【００７８】
【表２】
2018082639.tif 000003
【００７９】
次いで、ＰＣＲ産物をそれぞれ、アガロース電気泳動法により確認した。結果を図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図４（Ａ）〜（Ｃ）において、コロニー１〜１２、及び１３〜２０はリポフェクション法により核初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞のコロニーを用いた結果を示し、コロニー２１〜２４、及び２５〜３５、及び８はエレクトロポレーション法により期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞のコロニーを用いた結果を示す。また、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｃＤＮＡ」は、マウス尾部線維芽細胞から抽出された相補的ＤＮＡを意味し、「Ｎ．Ｃ．」はネガティブコントロールとして一緒にアガロース電気泳動を行った滅菌水を意味し、「Ｐ．Ｃ．」はポジティブコントロールとして一緒にアガロース電気泳動を行ったｐＣＸ−ｃＭｙｃ（ｃＭｙｃ）、ｐＣＸ−ＯＫＳ−２Ａ（ＯＣＴ３／４及びＳｏｘ２）、並びにマウス尾部線維芽細胞から抽出されたＤＮＡ（Ｎａｎｏｇ及びＲｅｘ１）を意味する。
【００８０】
図４（Ａ）〜（Ｃ）から、リポフェクション法により初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞では、全てのコロニーにおいて上記４種の初期化マーカー遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの初期化マーカーが発現していた。また、エレクトロポレーション法により初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞では、コロニー２５〜３５において、上記４種の初期化マーカー遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの初期化マーカーが発現していた。
さらに、リポフェクション法により初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞では、コロニー２、及びエレクトロポレーション法により初期化因子を導入したマウス尾部線維芽細胞では、コロニー２７において、上記４種の初期化マーカー遺伝子のうち全ての発現が確認された。
以上のことから、１０％ＦＢＳ及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）含有ＤＭＥＭを用いた培養において、フィーダー細胞を用いずに、簡便にｉＰＳ細胞を製造できることが確かめられた。
【００８１】
［実施例２］
（１）マウス尾部線維芽細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、マウス尾部線維芽細胞を採取し、１０％ＦＢＳ及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）含有ＤＭＥＭを用いた予め培養した。
【００８２】
（２）核初期化因子の導入
次いで、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃを搭載した２つのプラスミドベクター（ｐＣＸ−ＯＫＳ−２Ａ  １．０μｇ、及びｐＣＸ−ｃＭｙｃ  １．０μｇ）（ａｄｄｇｅｎｅ社製）を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ社製）を用いたエレクトロポレーション法により導入した。
【００８３】
（３）細胞の培養
次いで、導入後のマウス尾部線維芽細胞を、フィーダー細胞を用いずに、１５０ｍｍシャーレに５０×１０４細胞ずつ播種した。培地としては、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）不含（−）又は含有（＋）ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）含有）を用いた。また、培養条件は、３７℃、１０％酸素濃度、５％二酸化炭素濃度で行った。ＬＩＦ（−）のＤＭＥＭを用いた細胞については、初期化因子の導入から３３日目まで、ＬＩＦ（＋）のＤＭＥＭを用いた細胞については、初期化因子の導入から４３日目まで培養を行った。
【００８４】
（４）アルカリフォスファターゼ染色法による未分化状態の確認
次いで、初期化因子の導入から３３日目のＬＩＦ（−）のＤＭＥＭを用いて培養した細胞、及び初期化因子の導入から４３日目のＬＩＦ（＋）のＤＭＥＭを用いて培養した細胞について、実施例１の（５）と同様の方法を用いて、アルカリフォスファターゼ染色を行った。結果を図５に示す。
【００８５】
図５から、ＬＩＦ（−）及びＬＩＦ（＋）のＤＭＥＭ、いずれの培地を用いて培養したマウス尾部線維芽細胞においても、未分化状態が保たれていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、フィーダー細胞を用いずに、簡便に人工多能性幹細胞を製造することができる。また、フィーダー細胞を使用しないことから、夾雑物の混入が少なく、臨床使用に適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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