(57)【要約】【課題】できるだけ場所を選ばず簡便かつ迅速にかび毒を分析すると共に、同一試料に含まれる複数種のかび毒を並行してそれぞれ分析する。【解決手段】かび毒を含む試料を採取し（ステップＳ１０１）、抽出、精製して分析用試料を生成する（ステップＳ１０２）。分析目的のかび毒の標品から、参照用スペクトルを取得する（ステップＳ１０３）。夾雑物由来の蛍光等の背景光から分離するようにして、分析用試料から分析用スペクトルを取得する（ステップＳ１０４）。参照用スペクトルと分析用スペクトルを入力として多変量解析を用いた演算処理を行い（ステップＳ１０５）、かび毒由来のスペクトルを抽出する。【選択図】図１
2018004252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
振動分光分析法を用いるかび毒の分析方法において、
分析の目的とする種類のかび毒が産生する可能性がある初期試料を採取し、
前記採取した初期試料から、前記分析の目的とする種類のかび毒を含む可能性がある分析用試料を生成し、
前記振動分光分析法を用いて、前記分析の目的とする種類のかび毒を含む標準試料から参照用スペクトルを取得し、
前記振動分光分析法を用いて、前記分析用試料から分析用スペクトルを取得し、
前記参照用スペクトルのデータ及び前記分析用スペクトルのデータを入力とする多変量解析を用いた演算処理を行うことにより、前記分析の目的とする種類のかび毒が前記初期試料に産生する場合において、前記分析用スペクトルから前記分析の目的とする種類のかび毒のスペクトルを抽出する
ことを特徴とするかび毒の分析方法。
【請求項２】
前記演算処理は、
前記参照用スペクトルのデータに複数通りの係数を乗算して得られた複数通りの積のデータのそれぞれを前記分析用スペクトルのデータに加算して得られた複数通りの和スペクトルのデータから、行列で表すことができる解析対象データを生成し、
多変量解析を用いて、前記解析対象データから前記分析の目的とする種類のかび毒のスペクトル及び信号強度プロファイルを抽出する
ことを特徴とする請求項１に記載のかび毒の分析方法。
【請求項３】
前記分析の目的とする種類のかび毒に複数の種類がある場合において、
前記複数の種類のかび毒ごとに前記参照用スペクトルを取得し、
前記複数の分析の目的とする種類ごとに前記演算処理を行う
ことを特徴とする請求項１に記載のかび毒の分析方法。
【請求項４】
前記振動分光分析法は、ラマン分光分析法及び赤外吸収分光分析法のいずれか１であることを特徴とする請求項１に記載のかび毒の分析方法。
【請求項５】
前記振動分光分析法がラマン分光分析法である場合において、
前記分析用試料に対して、連続する複数の時間インターバルにわたってレーザ光を照射し、
前記複数の時間インターバルごとに、前記分析用試料から散射されるラマン散乱光及び前記ラマン散乱光を除く背景光を集光すると共に、前記ラマン散乱光及び前記背景光を含むスペクトルを記録し、
前記複数の時間インターバルごとに記録されたスペクトルから、多変量解析を用いて、前記ラマン散乱光の強度及び前記背景光の強度のそれぞれの時間依存性を抽出すると共に前記ラマン散乱光のスペクトルを前記背景光のスペクトルから分離する分離処理を行うことにより、前記分析用スペクトルを取得する
ことを特徴とする請求項１に記載のかび毒の分析方法。
【請求項６】
前記分離処理における多変量解析は、
前記記録されたスペクトルを、前記ラマン散乱光のスペクトル及び前記背景光のスペクトルをそれぞれ列ベクトルとして含む第１の行列と、前記複数の時間インターバルごとの順序に対応する前記ラマン散乱光の信号強度プロファイル及び前記複数の時間インターバルごとの順序に対応する前記背景光の信号強度プロファイルをそれぞれ行ベクトルとして含む第２の行列に分解して表したとき、
少なくとも前記記録されたスペクトルが非負値行列で表されるという条件と、誤差に正則化項を加算する拘束条件とを課した最小二乗法を用いて、前記第１の行列及び前記第２の行列を交互に求める演算を所定の収束条件が満たされるまで反復する
ことを特徴とする請求項５に記載のかび毒の分析方法。
【請求項７】
前記初期試料に対して前記分析の目的とする種類のかび毒に適合した溶媒を用いた抽出操作及び精製操作を行うことにより、前記分析用試料を生成することを特徴とする請求項１に記載のかび毒の分析方法。
【請求項８】
前記かび毒は、アフラトキシン４種（Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１及びＧ２）、デオキシニバレノール並びにゼアラレノンのうち１種類以上を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載のかび毒の分析方法。
【請求項９】
振動分光分析法を用いてかび毒の分析を行うことができるかび毒の分析装置において、
分析の目的とする種類のかび毒が産生する可能性がある初期試料から生成された分析用試料から、前記振動分光分析法を用いて分析用スペクトルを取得することができる分光分析部と、
前記分析用スペクトルのデータ及び前記分析の目的とする種類のかび毒を含む標準試料から前記振動分光分析法を用いて取得された参照用スペクトルのデータを入力として、多変量解析を用いた演算処理を行うことにより、前記分析の目的とする種類のかび毒が前記試料に産生する場合において前記分析の目的とする種類のかび毒のスペクトルを抽出することができる演算処理部と
を備えたことを特徴とするかび毒の分析装置。
【請求項１０】
前記演算処理部は、
前記参照用スペクトルのデータに複数通りの係数を乗算して得られた複数通りの積のデータのそれぞれを前記分析用スペクトルのデータに加算して得られた複数通りの和スペクトルのデータから、行列で表すことができる解析対象データを生成することができる生成部と、
多変量解析を用いて、前記解析対象データから前記分析の目的とする種類のかび毒のスペクトル及び信号強度プロファイルを抽出することができる解析部と
を備えたことを特徴とする請求項９に記載のかび毒の分析装置。
【請求項１１】
前記振動分光分析法がラマン分光分析法である場合において、前記分光分析部は、
レーザ光を照射された前記分析用試料が散射するラマン散乱光及び前記ラマン散乱光を除く背景光を集光して、前記ラマン散乱光及び前記背景光を含むスペクトルを記録することができる記録部と、
連続する複数の時間インターバルにわたって前記分析用試料が連続してレーザ光を照射されたときに、前記複数の時間インターバルごとに記録されたスペクトルから、多変量解析を用いて、前記ラマン散乱光の強度及び前記背景光の強度のそれぞれの時間依存性を抽出すると共に前記ラマン散乱光のスペクトルを前記背景光のスペクトルから分離することにより、前記分析用スペクトルを取得することができる分離部と
を備えたことを特徴とする請求項９に記載のかび毒の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、振動分光分析法を用いるかび毒の分析方法及びかび毒の分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
かびが産生する代謝産物のうちヒトや動物に対する毒性を有するものを、かび毒（マイコトキシン）と呼ぶ。かび毒は、ヒトや家禽、家畜などに対して急性又は慢性の生理的又は病理的障害を引き起こすことが知られている。そのため国際的には、コーデックス委員会（消費者の健康の保護、食品の公正な貿易の確保等を目的として、１９６３年に国連食糧農業機関（ＦＡＯ）及び世界保健機関（ＷＨＯ）により設置された国際的な政府間機関）がかび毒汚染の防止・低減に関する各種の規範等を定めている。また国内では、食品衛生法や農林水産省の各種管理ガイドライン等に基づく規範が定められている。
【０００３】
食品や飼料の生産及び流通のさまざまな現場において、かび毒の許容値や規範の遵守状況が検査及び確認されなければならない。そのためには、できるだけ場所を選ばずにかび毒を簡便かつ迅速に分析する必要がある。分析は少なくとも定性的に行われる必要があり、可能であれば定量的に行われることが望ましい。また、同一試料に含まれる複数種のかび毒を並行してそれぞれ分析できるようにすることが、迅速かつ効率的な分析のために望ましい。
【０００４】
従来のかび毒の分析は、一般的な化学分析法と同じく、目的物質（かび毒）を含む試料の採取、試料から溶媒への目的物質の抽出、抽出物の精製及び目的物質の検出という手順で行われる。かび毒の検出には、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー等の方法が、蛍光検出器や質量分析計等の検出器と組み合わせて用いられている。しかし、これらの検出器は非常に高価であり、かつ、精製で除ききれなかった試料中の夾雑物により定量値が大きく増減する場合がある（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーを用いる従来技術では、測定結果が試料中の夾雑物の条件に左右されやすいという問題があり、また高価な検出器を食品等の生産や流通のさまざまな現場に持ち込むことは必ずしも現実的とはいえない。これに対して、比較的簡単な設備で分析を行える方法として酵素固定化免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が利用されているが、すべての特異性の高い抗原・抗体反応を1個のウェル内で行い、抗体に標識した酵素に基質を加えて反応、発色させ、その吸光度で結果を得ているために、夾雑物の影響を受けやすく擬陽性又は擬陰性の結果を得るなどの問題がある。
【０００６】
液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーに代わり、光学的手法を用いて煩雑な前処理を不要にするという技術が開示されている（例えば、特許文献１又は非特許文献２参照。）。特許文献１は、かび毒のような有害成分（危害要因）を含む測定対象物へ照射する光の励起波長と測定対象物から観測される蛍光の波長を段階的に変化させながら蛍光強度を測定して、蛍光指紋（又は、励起・蛍光マトリクス）と呼ばれるデータを取得し、当該蛍光指紋データに対して多変量解析を行うことにより危害要因を検知するという技術を開示する。
【０００７】
特許文献１に記載された発明によれば、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーを用いる方法よりも迅速かつ容易に危害要因を検知することができるという効果を奏することが記載されている。
【０００８】
ただし、特許文献１に記載された方法は蛍光分光分析法の一種であるから、励起波長と蛍光波長の組合せ（波長条件）を変えながら、それらの波長条件ごとに光信号強度のデータを取得する必要がある（例えば明細書の段落「００６９」に、５０４１波長条件が例示されている。）。また、有害物質の濃度の定量には、既知又は予め実測された検量線を用いる必要がある（明細書の段落「００７５」）。これらを考慮すると、できるだけ場所を選ばず簡便かつ迅速にかび毒を分析できるようにするには、もう一歩の技術的前進が望まれるといってよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−１７７６０６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】田端節子  「講座カビ検査法１０  カビ毒分析」  日本防菌防黴学会誌  Ｖｏｌ．４３、Ｎｏ．１０、ｐｐ．４８５−４９４、２０１５年
【非特許文献２】藤田、蔦、杉山「励起蛍光マトリクス計測を応用したデオキシニバレノールの新規判別法」  日本食品科学工学会誌  第５５巻、第４号、ｐｐ．１７７−１８２、２００８年４月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願発明が解決しようとする課題は、できるだけ場所を選ばず簡便かつ迅速にかび毒を分析できるようにすることである。また望ましくは、同一試料に含まれる複数種のかび毒を並行してそれぞれ分析できるようにすることである。
【００１２】
そのためには、光学的手法の中でも、蛍光分光分析のように多くの波長条件に対して計測を繰り返すことを必要としない振動分光分析法（分子の振動に伴う双極子モーメントの変化によって生じる赤外線の吸収を観測する赤外吸収分光分析法、分極率の変化によって生じるラマン効果を観測するラマン分光分析法等）が有望である。振動分光分析法に用いる装置は小型化されたものを入手しやすいので、ある程度場所を選ばずに済む。なお、例えば試料中の夾雑物由来の蛍光のような背景光の影響をできるだけ抑えられることが望ましい。
【００１３】
試料からスペクトルのデータが得られたならば、目的物質を含む標準試料から予め取得しておいた参照スペクトルのデータも利用して多変量解析を行い、検量線を実測するのではなく仮想的に求める方法が有望である。このような方法は、本願発明者のうち２者の発明に係る特許第５７８０４７６号公報に開示されている。当該方法によれば複数の定量目的成分の組成比を同時に決定できるという効果の得られることが、特許第５７８０４７６号公報の明細書の段落「００１１」に記載されている。すなわち、複数種のかび毒を並行してそれぞれ分析することが期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上述した課題を解決するため、本願発明に係るかび毒の分析方法は、振動分光分析法を用いるかび毒の分析方法において、分析の目的とする種類のかび毒が産生する可能性がある初期試料を採取し、前記採取した初期試料から、前記分析の目的とする種類のかび毒を含む可能性がある分析用試料を生成し、前記振動分光分析法を用いて、前記分析の目的とする種類のかび毒を含む標準試料から参照用スペクトルを取得し、前記振動分光分析法を用いて、前記分析用試料から分析用スペクトルを取得し、前記参照用スペクトルのデータ及び前記分析用スペクトルのデータを入力とする多変量解析を用いた演算処理を行うことにより、前記分析の目的とする種類のかび毒が前記初期試料に産生する場合において、前記分析用スペクトルから前記分析の目的とする種類のかび毒のスペクトルを抽出することを特徴とする。
【００１５】
また、本願発明に係るかび毒の分析装置は、振動分光分析法を用いてかび毒の分析を行うことができるかび毒の分析装置において、分析の目的とする種類のかび毒が産生する可能性がある初期試料から生成された分析用試料から、前記振動分光分析法を用いて分析用スペクトルを取得することができる分光分析部と、前記分析用スペクトルのデータ及び前記分析の目的とする種類のかび毒を含む標準試料から前記振動分光分析法を用いて取得された参照用スペクトルのデータを入力として、多変量解析を用いた演算処理を行うことにより、前記分析の目的とする種類のかび毒が前記試料に産生する場合において前記分析の目的とする種類のかび毒のスペクトルを抽出することができる演算処理部とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明によれば、ある程度場所を選ばず簡便かつ迅速にかび毒を分析することができる。また、同一試料に含まれる複数種類のかび毒を並行してそれぞれ分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は実施例の手順を示すフローチャートである。
【図２】図２は実施例に係る分析装置のブロック図である。
【図３】図３は分析用スペクトルの取得の手順をさらに詳しく示したフローチャートである。
【図４】図４はレーザ光照射とスペクトル記録の処理を説明するタイムチャートである。
【図５】図５は時系列的に記録されたスペクトルを例示する図である。
【図６】図６は互いに分離されたかび毒（ゼアラレノン）由来のラマンスペクトル及び蛍光スペクトル並びにそれらの強度の時間依存性の分析結果を表す図である。
【図７】図７は分析の条件を変えて図６と同じスペクトルが得られた結果を表す図である。
【図８】図８は演算処理の手順をさらに詳しく示したフローチャートである。
【図９】図９は演算処理の結果として抽出されたゼアラレノン由来のラマンスペクトルを表す図である。
【図１０】図１０はゼアラレノンの標品から得た参照用スペクトルの一例を示す図である。
【図１１】図１１は演算処理の結果として抽出されたアフラトキシン４種由来のラマンスペクトルを表す図である。
【図１２】図１２はアフラトキシン４種の標品から得た参照用スペクトルの一例を示す図である。
【図１３】図１３は演算処理の結果として抽出されたデオキシニバレノール由来のラマンスペクトルを表す図である。
【図１４】図１４はデオキシニバレノールの標品から得た参照用スペクトルの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照して、本願発明の実施例を説明する。以下に説明する本願発明の実施例は、食品等に目的物質（かび毒）を添加して初期試料を生成し、その初期試料から溶媒へ目的物質を抽出し、抽出物を精製して得た分析用試料から振動分光分析法の一つであるラマン分光分析法を用いて目的物質を検出するという手順で、食品等に添加したかび毒を分析するものである。図１は、実施例の手順を示すフローチャートである。
【００１９】
上記の手順のうち、試料の生成及び採取から抽出物の精製まで（図１のステップＳ１０１及びＳ１０２）を、例えば以下のように実施する（本実施例はかび毒の分析方法を実験的に実施するものであるから、かび毒を含む試料の生成を予め行う。）。とうもろこし試料１０．０ｇに４種（Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１及びＧ２）のアフラトキシン混合物を１０μｇ／ｋｇの重量比で、デオキシニバレノールを１ｍｇ／ｋｇの重量比で、又はゼアラレノンを１ｍｇ／ｋｇの重量比で添加する（ステップＳ１０１）。
【００２０】
さらに超純水（ＭｉｌｌｉＱ水（同一称呼のＭＩＬＬＩ−Ｑは登録商標、以下同じ。））４０ｍｌを加えて振盪し（２００ｒｐｍ、３０分）、さらにメタノール６０ｍｌを加えて振盪する（２００ｒｐｍ、３０分）。これを静置した後、上清５０ｍｌを遠心分離して（７０００ｒｐｍ， １０分）、その上清５ｍｌを窒素ガスで２ｍｌに濃縮する。
【００２１】
上記の２ｍｌの濃縮液にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５ｍｌを加え、かび毒濃縮カラム（Ｍｙｃｏ６ｉｎ１＋ＩＡＣカラム）を用いてカラムトラップする。これを１０ｍｌの超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）１０ｍｌで洗浄し、メタノール１．５ｍｌでかび毒をカラムより溶出させる。さらにカラムからメタノール１．５ｍｌでかび毒を溶出させると共に、水溶性又は不溶性の別が異なるかび毒を溶出するため超純水（ＭｉｌｌｉＱ）２ｍｌを加える。以上のプロセスを経て得られた全溶出液を窒素ガスで乾固し、分光分析の対象とする分析用試料（符号１０を付して表す。）を得る（ステップＳ１０２）。
【００２２】
ここでいったん図１から離れて、実施例に係るかび毒の分析装置１００の構成を説明する。図２は、分析装置１００のブロック図である。図２の左側に、ステップＳ１０２によって得られた分析用試料１０を示す。分析装置１００は、図１において一点鎖線で囲まれた構成を備える。それらの構成は、分光分析部１１０、演算処理部１２０及び制御部１３０である。分光分析部１１０は、受光部１１１、分光部１１２、記録部１１３及び分離部１１４を備える。演算処理部１２０は、生成部１２１及び解析部１２２を備える。
【００２３】
実施例では、レーザ光源を含む発光部２０も使用される。分析装置１００が発光部２０を含む構成であってもよい。発光部２０及び受光部１１１は、各種の商品化されたラマン分光分析装置の光学系に相当するように構成されることができる（ここでは詳しい説明を省略する。）。
【００２４】
上記の分析装置１００の構成は、ハードウェア又はソフトウェアを含む多様な手段を用いて実現され得るものであって、必ずしも上記の各構成のとおりに明りょうに区画されたハードウェア又はソフトウェアのブロックが存在することを限定的に意味するものではない。図１において、矢印付きの実線は計測及び処理される信号の流れを示し、矢印付きの破線は制御信号の流れを示す。
【００２５】
発光部２０は、分析用試料１０等の対象物に対してレーザ光を照射することができる。受光部１１１は、レーザ照射の結果として上記の対象物から散射されるラマン散乱光及び蛍光その他の背景光を集光する。分光部１１２は、受光部１１１が集光した光を分析して、ラマンシフトを一方の軸（例えば横軸）及び光の強度を他方の軸（例えば縦軸）とする平面上にそのスペクトルをプロットすることができる。ラマンシフトを表す軸は、光の波長及び振動数のいずれかを単位とする軸に替えてもよい。記録部１１３は、上記のプロットされたスペクトルのデータを記録することができる。
【００２６】
分離部１１４は、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）に組み込まれたソフトウェアによって実現され、記録部１１３に記録されたスペクトルのデータに対して後述する多変量解析を含む分離処理を行うことにより、ラマン散乱光若しくは背景光の信号強度の時系列並びに信号対雑音比（ＳＮＲ）が改善されたラマン散乱光を含む分析用スペクトルを得ることができる。
【００２７】
演算処理部１２０の生成部１２１及び解析部１２２は、例えばＰＣに組み込まれたソフトウェアによって実現される。生成部１２１は上記の分析用スペクトル及び後述する参照用スペクトルを得て、行列として表すことができる解析対象データを生成することができる。解析部１２２は上記の解析対象データを得て、後述する多変量解析を含む演算処理を行うことにより、分析用試料１０に含まれるかび毒のスペクトル及び信号強度プロファイル（一般に、検出されたかび毒の量に対して線形の関係にある。）を得ることができる。
【００２８】
制御部１３０は、例えばＰＣに組み込まれたソフトウェアによって実現される。制御部１３０は、上述した発光部２０、分光分析部１１０及び演算処理部１２０に対して、データの取得と解析を行うのに必要な指示を与えると共に結果を受け取ることができる。
【００２９】
分析装置１００の具体的な構成は、上述したものに限らない。それぞれの部分をハードウェア又はファームウェア主体に構成してもよく、ハードウェア又はファームウェアとソフトウェアを適宜組み合わせてもよく、本発明に係るプログラムを商品化された分光分析装置にインストールしたものであってもよい。
【００３０】
図１に戻り、実施例の手順をステップＳ１０３から説明する。このステップでは、図２において分析用試料１０に代えて分析の目的とする種類のかび毒を含む標準試料（例えば、当該かび毒の標品自体又は標品を既知の溶媒に混合したもの）に対して発光部２０からレーザ光を照射し、当該標準試料からのラマン散乱光を受光部１１１で受光する。受光されたラマン散乱光は分光部１１２で分光され、参照用スペクトルとして記録部１１３に記録される（ステップＳ１０３）。
【００３１】
なお、標準試料が溶媒を用いて調製されている場合は、標準試料から得たスペクトルと溶媒のみから得たスペクトルの差分を参照用スペクトルとして、記録部１１３に記録してもよい。かび毒の標準試料から得た参照用スペクトルの例を、後述する図１０等に示している。
【００３２】
次にステップＳ１０４に移り、まず発光部２０から分析用試料１０に対してレーザ光を照射し、分析の目的とするかび毒に由来するラマン散乱光、及び当該かび毒以外の成分（夾雑物という。）に由来する蛍光をはじめとする背景光を受光部１１１で受光し、さらに分光部１１２で分光して得たスペクトルを、記録部１１３に記録する。このステップでは、かび毒由来のラマンスペクトルは分析用試料１０に含まれる夾雑物由来の蛍光等の背景光のスペクトルに埋もれて、検出することが難しいという問題がある。
【００３３】
図３は、ステップＳ１０４における処理の手順をさらに詳しく示したフローチャートである。試料中の夾雑物に由来する蛍光の強度は、当該試料に対するレーザ光の照射を続けると時間と共に減衰することが知られている（この現象を消光という。）。図３のフローチャートに示した処理においては、以下のように蛍光の消光現象を利用する。
【００３４】
まず、発光部２０から分析用試料１０に対して、ある時間にわたり連続してレーザ光を照射する（ステップＳ３０１）。そしてレーザ光の照射時間を区切った時間インターバルごとに、分析用試料１０から得られるスペクトル（ラマン散乱光及び背景光のスペクトルを含む。）を記録部１１３に記録する（ステップＳ３０２）。
【００３５】
制御部１３０は、上記のレーザ光の照射時間を連続する複数の時間インターバルに区切ることができる。記録部１１３は、時系列に従って（すなわち、制御部１３０から指示された複数の時間インターバルの順で）、分光部１１２がプロットしたスペクトルを記録することができる。
【００３６】
図４は、ステップＳ３０１及びＳ３０２の処理を説明するタイムチャートである。図の横軸は、時間軸である。時間軸上の”０”点において、発光部２０から分析用試料１０に対してレーザ光の照射を開始する。制御部１３０は、時間軸上のＴ、２Ｔ、…、ＮＴ（Ｔは時間、Ｎは自然数）の各タイミングにおいて、分析用試料１０から得られるスペクトルを記録部１１３に記録させる。
【００３７】
図５は、上述のように時系列的に記録されたスペクトルを例示する図である（分析用試料１０は、トウモロコシにゼアラレノンを添加したサンプルのＩＭＣカラム抽出定容液を固化したものである。励起光の波長は５３２ｎｍ、Ｔ＝５秒、Ｎ＝２０とする。）。図５における各プロットは、時間の経過とともに上から下へ移行する。つまり、このスペクトル中の支配的な成分である夾雑物由来の蛍光の強度が時間の経過と共に低下していることがわかる。
【００３８】
すべての時間インターバルについて記録されたスペクトルのデータ（以下、全スペクトルデータという。）は、例えば行の番号をラマンシフト軸上の位置（ピクセルという。）により、列の番号を上記の時系列上の順序により、それぞれ定めた行列の形で表すことができる。ピクセル数をＭとすれば、全スペクトルデータはＭ行Ｎ列の行列（以下、符号Ａで表す。）として表される。
【００３９】
次に、分離部１１４が行う全スペクトルデータの処理（分離処理）を説明する。例えば分析用試料１０を構成する成分が、かび毒（ラマンスペクトルに寄与。）と夾雑物（蛍光スペクトルに寄与。）の２種類に分けられることが既知であるか又は推測される場合は、行列Ａを、上記のそれぞれの成分のスペクトルデータを表す列ベクトルからなるM行２列の行列Ｗと、それぞれの成分の強度の時系列データを表す行ベクトルからなる２行N列の行列Ｈに因子分解することを考える。そうすると、行列Ａは「数１」式、行列Ｗ及びＨは「数２」式でそれぞれあらわされる。なお、「数１」式中の「実測スペクトル（ｋＴ）」は、図４の時間軸上のタイミング「ｋＴ」（１≦ｋ≦Ｎ）において実測され記録されたスペクトルを表す。
【００４０】
【数１】
2018004252.tif 000003
【００４１】
【数２】
2018004252.tif 000004
【００４２】
上記の「数１」及び「数２」式から行列Ｗを求めることができれば、夾雑物由来の蛍光スペクトルから分離されると共に、時系列に沿って積分されることによりガウス雑音の影響が軽減されたかび毒由来のラマンスペクトルが得られる。「数１」式の解析的な解は得られないが、行列Ｗに初期値を与えて公知の最小二乗法により行列Ｈの近似解を求め、これからさらにＷの近似解を求めるという演算を所定の収束条件が満たされるまで反復する交互最小二乗法により、近似解を得られることが知られている。
【００４３】
上述した交互最小二乗法では、実測値を要素とする行列Ａ及び近似値を要素とする行列Ｗ・Ｈの残差の二乗ノルム||Ａ−Ｗ・Ｈ||２を行列Ｗ又はＨのいずれか一方について最小化することにより、行列Ｗ又はＨのもう一方の次の段階の近似値を求める。この最小化演算をよりシンプルで高精度なものにするための数学的な工夫として、少なくとも行列Ａの全要素が非負値で表される条件と、上記の残差の二乗ノルムに正則化項（例えばＬ１ノルム又はＬ２ノルム）を加算する拘束条件を課すことが知られている。また、ラマンスペクトルの強度の時系列データに時間依存性が顕著でないことから、行列Ｈの第１行の値を定数とする条件を課すことができる。
【００４４】
図６は、図５に示した全スペクトルデータから上記の分離処理を経て求めた、「数２」式の行列Ｗの各列ベクトル及び行列Ｈの各行ベクトルの近似解を示す図である。図６の左側の図は、ラマンシフトを横軸に、夾雑物由来の蛍光スペクトル（番号１）及びかび毒由来のラマンスペクトル（番号２）を表している。図６の右側の図は、時系列上の測定番号（１≦Ｎ≦２０）を横軸に、蛍光強度の時間依存性（番号１、実践）を表している（ラマンスペクトルの時間依存性（番号２、破線）はゼロと仮定した。）（ステップＳ３０３）。
【００４５】
分析用試料１０に含まれる成分が例えば４種類に分けられることが既知であるか又は推測される場合は、行列Aを、それぞれの成分のスペクトルデータを表す列ベクトルからなるM行４列の行列Ｗと、それぞれの成分の強度の時系列データを表す行ベクトルからなる４行N列の行列Ｈに因子分解することを考える。そうすると、行列Ｗ及びＨは「数３」式で表される。
【００４６】
【数３】
2018004252.tif 000005
【００４７】
「数１」及び「数３」式から、上記と同様の交互最小二乗法を用いて、行列Ｗ及びＨの近似解を求めることができる。この場合にも、行列Ａの全要素が非負値で表される条件と正則化項の拘束条件を用いる。また、行列Ｗ及びＨの全要素が非負値で表される条件を課すことができる。
【００４８】
図７は、図５に示した全スペクトルデータから上記の分離処理を経て求めた「数３」式の行列Ｗの各列ベクトル及び行列Ｈの各行ベクトルの近似解を示す図である。図７の左側の図は、ラマンシフトを横軸に、各成分（番号１ないし４）のスペクトルを表している。図７の右側の図は、時系列上の測定番号（１≦Ｎ≦２０）を横軸に、各成分（番号１ないし４）の時間依存性を表している。番号１及び番号２の成分は、それぞれ図６の蛍光スペクトル（番号１）及びラマンスペクトル（番号２）とよく一致していることがわかる。このように分析用試料１０に含まれる成分の種類が増えても、かび毒由来のラマンスペクトルを夾雑物由来の背景光から分離することができる（ステップＳ３０３）。
【００４９】
以上の通り、分析用試料１０に含まれる夾雑物由来の蛍光強度の時間依存性に着目して、かび毒由来のラマンスペクトルを分離して分析用スペクトルとして得ることができた（ステップＳ３０４、ステップＳ１０４）。続いて、ステップＳ１０３で得た参照用スペクトルとステップＳ１０４で得た分析用スペクトルを入力として、多変量解析を用いた演算処理を行うことにより、かび毒由来のラマンスペクトルを抽出する（ステップＳ１０５）。図８は、ステップＳ１０５における処理の手順をさらに詳しく示したフローチャートである。
【００５０】
生成部１２１は、ステップＳ１０３で得られた参照用スペクトルを記録部１１３から読み出して複数通りの係数（実数）を乗算し、複数通りの積データを得る（ステップＳ８０１）。生成部１２１は、次にステップＳ１０４（又はＳ３０４）で得られた分析用スペクトルを分離部１１４から得て、上記の複数通りの積データとそれぞれ加算することにより、複数通りの和スペクトルのデータを得る（ステップＳ８０２）。上記の複数通りの和スペクトルのデータは、実空間において検量線を引くため分析対象試料に複数通りの濃度の標準試料を添加し、その都度測定されるスペクトルのデータに等価である。
【００５１】
生成部１２１は、上記の複数通りの和スペクトルのデータに対して、ラマンシフト軸（又は対応する波長軸若しくは振動数軸）の向きにそれぞれ０回以上微分して得られたデータを列ベクトルとする行列を構成し、当該行列を解析対象データとして生成する（ステップＳ８０３）。解析対象データの行列は、ステップＳ３０２で得られた全スペクトルデータの行列と同様に、かび毒及びかび毒以外のそれぞれの成分のスペクトルデータを表す２列の列ベクトルからなる行列と、参照用スペクトルに乗算した係数（実空間における標準試料の濃度に相当する。）に対応するそれぞれの成分の強度プロファイルを表す２行の行ベクトルからなる行列の積に因子分解することができる。
【００５２】
解析部１２２は上記の解析対象データを得て、例えばかび毒以外の成分の強度プロファイルが一定である条件及び正則化項を加算する拘束条件を課した交互最小二乗法を用いることにより、かび毒由来のラマンスペクトル及び信号強度プロファイルを抽出することができる（特許第５７８０４７６号公報参照。）。
【００５３】
図９は、ステップＳ１０４（Ｓ３０４）で得られたゼアラレノン由来の分析用スペクトル及びゼアラレノン標品から得た参照用スペクトルを用いて、ステップＳ８０１ないしＳ８０４の処理によって抽出されたゼアラレノン由来のラマンスペクトルを示す図である。図中の実線（最上段のプロット）は、蛍光から分離された後の分析用スペクトルである。図中の点線（最上段のすぐ下のプロット）は、ゼアラレノン以外の成分由来のスペクトルである。図中の一点鎖線（最下段のプロット）は、ゼアラレノン由来のラマンスペクトルである。
【００５４】
図１０は、ゼアラレノンの標品から得た参照用スペクトルの一例を示す。図９の最下段のプロットが図１０のプロットと共通の特徴を示すことから、本実施例によりゼアラレノンのラマンスペクトルを抽出することができたことが確認される。
【００５５】
図１１は、かび毒としてアフラトキシン４種（Ｇ１、Ｇ２、Ｂ１及びＢ２）を含む試料から抽出されたそれらのカビ毒由来のラマンスペクトルを、図９と同様に示す図である。図中の実線（最上段のプロット）は、蛍光から分離された後の分析用スペクトルである。図中の点線（最上段のすぐ下のプロット）は、アフラトキシン４種以外の成分由来のスペクトルである。図中の一点鎖線（最下段のプロット）４本は、アフラトキシン４種由来のラマンスペクトルである。図１２のアフラトキシン４種の標品の参照用スペクトルと対比することにより、アフラトキシン４種のラマンスペクトルを抽出することができたことが確認される。これは、同一試料に含まれる複数種のかび毒を並行してそれぞれ分析し抽出した例である。
【００５６】
図１３は、かび毒としてデオキシニバレノールを含む試料から抽出されたデオキシニバレノール由来のラマンスペクトルを、図９と同様に示す図である。図中の実線（最上段のプロット）は、蛍光から分離された後の分析用スペクトルである。図中の点線（最上段のすぐ下のプロット）は、デオキシニバレノール以外の成分由来のスペクトルである。図中の一点鎖線（最下段のプロット）は、デオキシニバレノール由来のラマンスペクトルである。図１４のデオキシニバレノールの標品の参照用スペクトルと対比することにより、デオキシニバレノールのラマンスペクトルを抽出することができたことが確認される。
【００５７】
以上に説明した本発明の実施例によれば、試料中の夾雑物由来の蛍光等の背景光の影響を抑えて、かび毒由来のラマンスペクトルを抽出できることが確認された。実施例では、分析用スペクトルの取得（ステップＳ１０４）のためにステップＳ３０１ないしＳ３０４の処理を実行したが、試料の種類や特性によってはこれらの処理を省いて分析用スペクトルを取得してもよい。実施例ではラマン分光分析法を用いたが、図１のフローチャートに示した本発明の方法は、赤外吸収分光分析法を用いても実施することができる。
【００５８】
実施例では図１のステップＳ１０２において抽出物を精製することを説明したが、かび毒を含む初期試料の特性によっては抽出物の精製を省き、初期試料をそのまま分析用試料にしてもよい。
【符号の説明】
【００５９】
１０    分析用試料
２０    発光部
１００    分析装置
１１０    分光分析部
１１１    受光部
１１２    分光部
１１３    記録部
１１４    分離部
１２０    演算処理部
１２１    生成部
１２２    解析部
１３０    制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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