(57)【要約】【課題】対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることが可能な光シート顕微鏡の技術を提供する。【解決手段】光シート顕微鏡１００は、対物レンズ７と、対物レンズ７の光軸方向とは異なる方向からサンプルＳに光シートを照射するシート照明光学系４と、光シートＬＳが形成される光シート面と対物レンズ７との相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する第１の調整手段であるＺ駆動部８と、光シート面とサンプルＳとの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調節する第２の調節手段であるステージ６と、ステージ６により光シート面とサンプルＳとの相対位置を変化させたとき対物レンズ７を介して検出される光シート面からの光に基づいてＺ駆動部８を制御する制御装置２０と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズと、
前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射する照明光学系と、
前記光シートが形成される光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整する第１の調整手段と、
前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調節する第２の調節手段と、
前記第２の調節手段により前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を変化させたとき前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記第１の調整手段を制御する制御装置と、を備える
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
受光面を有し、前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上の位置であって前記受光面に対応する位置より後方に配置される、開口を有する第１の遮光板と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上の位置であって前記受光面に対応する位置より前方に配置される、開口を有する第２の遮光板と、
前記第１の遮光板を通過した前記光シート面からの光を検出する第１の光検出器と、
前記第２の遮光板を通過した前記光シート面からの光を検出する第２の光検出器と、を備え、
前記制御装置は、前記第１の光検出器からの出力信号と前記第２の光検出器からの出力信号に基づいて、前記第１の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項３】
請求項２に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、前記第１の光検出器からの出力信号と前記第２の光検出器からの出力信号から算出される評価値が所定値に近づくように、前記第１の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の光シート顕微鏡において、
前記第１の遮光板と前記第２の遮光板は、前記基準位置からの距離が変化する様に前記光路に沿って可動自在に設けられている
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記第１の遮光板と前記第２の遮光板の位置を調整する第３の調整手段を備え、
前記制御装置は、前記対物レンズの倍率に応じて、前記第３の調整手段を制御する
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項６】
請求項１に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
受光面を有し、前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上の位置であって前記受光面に対応する位置に配置される、開口を有する遮光板と、
前記遮光板を通過した前記光シート面からの光を検出する光検出器と、を備え、
前記制御装置は、前記光検出器からの出力信号に基づいて、前記第１の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項７】
請求項６に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、前記光検出器からの出力信号が増加するように、前記第１の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項８】
請求項２乃至請求項７のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、
前記開口は、ピンホールアレイである
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項９】
請求項２乃至請求項８のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記対物レンズと前記撮像装置の間の光路上にダイクロイックミラーを備える
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項１０】
請求項２乃至請求項８のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記対物レンズと前記撮像装置の間の光路上の前記対物レンズの光軸から逸れた位置に配置されたミラーを備える
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
位相差評価用画素を含む、前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置を備え、
前記制御装置は、前記位相差評価用画素からの出力信号に基づいて、前記第１の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上に設けられた位相差ＡＦセンサと、を備え、
前記制御装置は、前記位相差ＡＦセンサからの出力信号に基づいて、前記第１の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、前記光シート面と前記サンプルとの相対位置毎に前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記第１の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項１４】
対物レンズを備える光シート顕微鏡の制御方法であって、
前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射し、
前記光シートが形成された光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、
前記光シート面と前記サンプルとの相対位置が調整される度に前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、
前記光シートが照射された前記サンプルの画像を取得する
ことを特徴とする光シート顕微鏡の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、光シート顕微鏡、及び、光シート顕微鏡の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光顕微鏡の分野では、対物レンズの光軸に直交する方向からサンプルにレーザ光を照射して、サンプル中に対物レンズの光軸と直交する光シートを形成する技術が知られている。この技術を用いた光シート顕微鏡は、例えば、特許文献１、特許文献２に記載されていて、蛍光の退色を抑えてサンプルの良好な三次元立体像を高速に生成することができるという大きなメリットを有している。
【０００３】
近年では、この技術の用途は、蛍光タンパクをターゲット分子に標識したゼブラフィッシュのような生物の立体像を得るといった用途に限られない。この技術は、スフェロイド、オルガノイドのような３次元培養細胞の３次元立体像を取得し、画像解析技術を利用して薬効の評価を行う、所謂、“創薬スクリーニング”への適用を目的とした技術としても注目される等、幅広いアプリケーションへの応用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／０２８６０４２号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１５／１８４１２４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
光シート顕微鏡は通常、サンプルの３次元立体像を得るため、光シートとサンプルを観察光軸（対物レンズの光軸）に沿って相対的に移動させながら、複数の断層像を取得する。多くの場合、光シートが対物レンズの焦点面に形成されるように設定された後、光シートと対物レンズは固定され、サンプルを光軸方向に順次移動させることで、複数の断層像が取得される。
【０００６】
しかしながら、この方法でサンプルの観察場所（つまり、サンプル中の光シートが形成されている面、以降、光シート面と記す）を変更すると、対物レンズと光シート面との間の媒質の構成比率（例えば、空気と培養液とサンプル内部の比率）が変化する。これにより、対物レンズと光シート面の間の光路長が変化するため、対物レンズを動かしてないにも関わらず対物レンズの焦点面が光軸方向に移動し、対物レンズの焦点面が光シート面に一致しなくなってしまう。また、サンプル内部の屈折率分布によっても焦点面の移動量が変化してしまう。そして、このズレが及ぼす影響は、三次元立体像の光学的な分解能を上げようとすればするほど、つまり、光シートの厚さを薄くし、対物レンズの開口数を大きくすればするほど、焦点深度は浅くなるため大きくなる。
【０００７】
上述した特許文献１、特許文献２には、観察前に観察対象物を用いてキャリブレーションを行うことで、対物レンズの焦点面のズレを補正するデータを作成する技術が記載されている。この技術を用いることで、対物レンズの焦点面と光シート面のズレをある程度抑えることができる。
【０００８】
ただし、サンプルの屈折率が内部で急峻な変化を有する場合などには、十分な精度でズレを抑制することは難しい。キャリブレーションにおいてより多くの画像を取得することで補正精度を改善することは可能であるが、多くの画像を取得すると、キャリブレーションに時間がかかってしまう。また、キャリブレーションによってサンプルがダメージを受けてしまう虞がある。
【０００９】
以上のような実情を踏まえ、本発明の一側面は、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることが可能な光シート顕微鏡、及び、光シート顕微鏡の制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一側面に係る光シート顕微鏡は、対物レンズと、前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射する照明光学系と、前記光シートが形成される光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整する第１の調整手段と、前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調節する第２の調節手段と、前記第２の調節手段により前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を変化させたとき前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記第１の調整手段を制御する制御装置と、を備える。
【００１１】
本発明の別の側面に係る対物レンズを備える光シート顕微鏡の制御方法は、前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射し、前記光シートが形成された光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、前記光シート面と前記サンプルとの相対位置が調整される度に前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、前記光シートが照射された前記サンプルの画像を取得する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一側面によれば、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることが可能な光シート顕微鏡、及び、光シート顕微鏡の制御方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１の実施形態に係る光シート顕微鏡１００の構成を例示した図である。
【図２】制御装置２０のハードウェアの構成を例示した図である。
【図３】第１の実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。
【図４】ピンホールアレイ１９を備える遮光板１８の構成を例示した図である。
【図５】第２の実施形態に係る光シート顕微鏡２００の構成を例示した図である。
【図６】第３の実施形態に係る光シート顕微鏡３００の構成を例示した図である。
【図７】第３の実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。
【図８】第４の実施形態に係る光シート顕微鏡４００の構成を例示した図である。
【図９】第４の実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。
【図１０】第５の実施形態に係る光シート顕微鏡５００の構成を例示した図である。
【図１１】撮像装置７１の画素の配列を例示した図である。
【図１２】第６の実施形態に係る光シート顕微鏡６００の構成を例示した図である。
【図１３】第６の実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。
【図１４】第７の実施形態に係る光シート顕微鏡７００の構成を例示した図である。
【図１５】第８の実施形態に係る光シート顕微鏡８００の構成を例示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［第１の実施形態］
図１は、本実施形態に係る光シート顕微鏡１００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡１００は、培養液、透明化溶液などの媒質Ｍに浸されているサンプルＳの断層像を取得する装置であり、サンプルＳは、例えば、蛍光色素により標識されていた生体細胞である。サンプルＳは、ステージ６に載置された、例えばキュベットなどのサンプル容器５に収容されている。  
【００１５】
光シート顕微鏡１００は、レーザ１と、光ファイバー２と、シート照明光学系４と、ステージ６と、乾燥系の対物レンズ７と、Ｚ駆動部８と、結像レンズ９と、ダイクロイックミラー１０と、エミッションフィルタ１１と、撮像装置１２を備える。
【００１６】
シート照明光学系４は、例えば、コレクタレンズとシリンドリカルレンズを含み、対物レンズ７の光軸方向とは異なる方向からサンプルＳに光シートを照射する。より具体的には、シート照明光学系４は、シート照明光学系４の出射光軸が対物レンズ７の光軸と略直交するように配置されていて、対物レンズ７の光軸と略直交する方向からサンプルＳに光シートＬＳを照射するように構成されている。ここで、光シートとはシート形状の照明領域を形成する照明光のことである。光シートＬＳは、サンプルＳ内で対物レンズ７の光軸方向に薄いシート形状を有する。また、略直交とは、直交した状態から当業者が設定上又は製造上の誤差と認識し得るような範囲をいう。
【００１７】
ステージ６は、対物レンズ７の光軸方向へ移動する電動ステージであり、光シート面とサンプルＳとの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する第２の調整手段である。ステージ６の移動は後述する制御装置２０によって制御される。
【００１８】
Ｚ駆動部８は、対物レンズ７を対物レンズ７の光軸方向に動かす電動部であり、光シートＬＳが形成される光シート面と対物レンズ７との相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する第１の調整手段である。Ｚ駆動部８を介した対物レンズ７の移動は後述する制御装置２０によって制御される。
【００１９】
ダイクロイックミラー１０は、レーザ光を反射することで、レーザ光と蛍光を分離する。エミッションフィルタ１１は、レーザ光を遮断し蛍光を透過させる。ダイクロイックミラー１０及びエミッションフィルタ１１により、撮像装置１２へのレーザ光の入射が制限される。
【００２０】
撮像装置１２は、光シートＬＳが照射されたサンプルＳの画像を、対物レンズ７を介して取得する。撮像装置１２は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）などの２次元イメージセンサを備えたデジタルカメラである。撮像装置１２は、受光面Ｓ１を有し、対物レンズ７の前側焦点位置が受光面Ｓ１に投影されるように配置されている。図１に示す受光面Ｓ１上の位置Ｐ１は、対物レンズ７の前側焦点位置が投影される位置、即ち、対物レンズ７の前側焦点位置と光学的に共役な位置である。
【００２１】
光シート顕微鏡１００は、さらに、ダイクロイックミラー１０の反射光路（ダイクロイックミラー１０により撮像装置１２と対物レンズ７の間の光路から分岐した光路）上に、ビームスプリッタ１３と、２つの遮光板（ピンホール板１４、ピンホール板１６）と、２つの光検出器（光検出器１５、光検出器１７）を備える。
【００２２】
ビームスプリッタ１３は、ダイクロイックミラー１０で反射したレーザ光を５０：５０の割合で分離する。ピンホール板１４及び光検出器１５は、ビームスプリッタ１３で分岐した一方の光路上に配置され、ピンホール板１６及び光検出器１７は、ビームスプリッタ１３で分岐した他方の光路上に配置されている。
【００２３】
ピンホール板１４は、開口を有する第１の遮光板であり、対物レンズ７の前側焦点位置が投影される位置Ｐ２よりも後方に配置されている。一方、ピンホール板１６は、開口を有する第２の遮光板であり、対物レンズ７の前側焦点位置が投影される位置Ｐ３よりも前方に配置されている。位置Ｐ２及び位置Ｐ３は、対物レンズ７の前側焦点位置と光学的に共役な位置であり、換言すると、撮像装置１２の受光面Ｓ１（位置Ｐ１）に対応する位置である。以降では、位置Ｐ２及び位置Ｐ３のことを、それぞれ必要に応じて基準位置とも記す。ここで、前方とは光の進行方向を基準にして手前側のことであり、後方とは光の進行方向を基準にして奥側のことである。
【００２４】
光検出器１５は、ピンホール板１４を通過した光シート面からの光を検出する第１の光検出器であり、専らレーザ光を検出する。光検出器１７は、ピンホール板１６を通過した光シート面からの光を検出する第２の光検出器であり、専らレーザ光を検出する。光検出器１５及び光検出器１７は、例えば、光電子増倍管（PMT：Photomultiplier Tube）であり、検出光量に応じた信号を出力する。
【００２５】
光シート顕微鏡１００は、さらに、制御装置２０を備える。制御装置２０は、サンプルＳの複数の断層像を取得する断層像取得処理を実行するように構成されている。断層像取得処理の詳細については後述するが、その概要は次のとおりである。
【００２６】
断層像取得処理では、制御装置２０は、光シートをサンプルＳの異なる位置に照射して複数の断層像を取得するために、ステージ６を制御して光シート面とサンプルＳとの相対位置を変化させる。このとき、光シート面と対物レンズ７の間の媒質（空気と媒質ＭとサンプルＳ内部を含む）の屈折率分布が変化するため、対物レンズ７を動かしてないにも関わらず対物レンズ７の焦点面が光軸方向に動いてしまう。従って、ステージ６を制御するだけでは、光シート面と対物レンズの焦点面にズレが生じてしまうため、制御装置２０は、ステージ６を制御すると、さらに、対物レンズ７を介して検出される光シート面からの光に基づいて、Ｚ駆動部８を制御し、光シート面と対物レンズ７の相対位置を調整する。より具体的には、対物レンズ７の焦点面を光シート面に近づけることで、これらの位置が合うようにＺ駆動部８を制御する。これにより、対物レンズ７の焦点面と光シート面が高精度に合った状態で、複数の断層像を取得することができる。
【００２７】
図２は、制御装置２０のハードウェアの構成を例示した図である。制御装置２０は、例えば、標準的なコンピュータであり、プロセッサ２１、メモリ２２、入出力インターフェース２３、ストレージ２４、及び、可搬記録媒体２６が挿入される可搬記録媒体駆動装置２５を備え、これらがバス２７によって相互に接続されている。なお、図２は、制御装置２０のハードウェア構成の一例であり、制御装置２０はこの構成に限定されるものではない。
【００２８】
プロセッサ２１は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＭＰＵ（Micro Processing Unit）、ＤＳＰ（Digital Signal Processor）などであり、プログラムを実行してプログラムされた処理、例えば、上述した断層像取得処理を行う。メモリ２２は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）であり、プログラムの実行の際に、ストレージ２４または可搬記録媒体２６に記録されているプログラムまたはデータを一時的に記憶する。
【００２９】
入出力インターフェース２３は、制御装置２０以外の装置（例えば、ステージ６、Ｚ駆動部８、光検出器１５、光検出器１７など）と信号をやり取りする回路である。ストレージ２４は、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリであり、主に各種データやプログラムの記録に用いられる。可搬記録媒体駆動装置２５は、光ディスクやコンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記録媒体２６を収容するものである。可搬記録媒体２６は、ストレージ２４を補助する役割を有する。
【００３０】
図３は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図３を参照しながら、光シート顕微鏡１００で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
【００３１】
光シート顕微鏡１００は、まず、断層像を取得する高さ範囲の指定を受け付ける（ステップＳ１０１）。ここでは、利用者が図示しない入力装置を用いて断層像を取得する高さ範囲を入力することで、制御装置２０が高さ範囲の指定を受け付ける。制御装置２０は、さらに、受け付けた高さ範囲に基づいて、断層像を取得する位置、つまり、サンプルＳ中における光シート面の位置を決定する。
【００３２】
次に、光シート顕微鏡１００は、サンプルＳに光シートＬＳを照射し（ステップＳ１０２）、サンプルＳの画像を取得する（ステップＳ１０３）。ここでは、サンプルＳ中における光シート面の位置は特に限定されない。このため、光シートＬＳを任意の位置に照射し、サンプルＳの画像、つまり、光シート面の画像を、撮像装置１２で取得すればよい。
【００３３】
その後、光シート顕微鏡１００は、取得した画像に基づいて、合焦判定を行う（ステップＳ１０４）。ここでは、対物レンズ７の焦点面が光シート面に合っているか否かを、例えば、制御装置２０が画像のコントラストに基づいて判定する。また、制御装置２０が判定する代わりに、人間が画像を目視することで判定し、その判定結果に従って制御装置２０が合焦状態か否かを判定してもよい。
【００３４】
合焦状態に無いと判定されると（ステップＳ１０４ＮＯ）、光シート顕微鏡１００は、光シート面と対物レンズ７の相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ１０５）。ここでは、制御装置２０がＺ駆動部８を制御して光シート面と対物レンズ７の相対位置を調整する。その後、再びサンプルＳの画像を取得する（ステップＳ１０３）。そして、合焦状態にあると判定されるまで（ステップＳ１０４ＹＥＳ）、ステップＳ１０３からステップＳ１０５の処理を繰り返す。なお、この合焦判定処理は取得した画像全体に対して行う必要はない。撮像装置１２の部分的な撮像素子で取得された画像の一部分に対して行っても良い。
【００３５】
合焦状態にあると判定されると、光シート顕微鏡１００は、合焦評価値を算出する（ステップＳ１０６）。ここでは、制御装置２０が光シート面で散乱したレーザ光を検出した光検出器１５及び光検出器１７からの出力信号に基づいて所定の演算を行うことで、合焦評価値を算出する。合焦評価値は、対物レンズ７の焦点面と光シート面の一致度合いに応じて変化する値である。合焦評価値は、光検出器１５からの出力信号値をＡとし、光検出器１７からの出力信号値をＢとすると、特にこれに限定されないが、例えば、（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）で算出される。
【００３６】
その後、光シート顕微鏡１００は、ステップＳ１０６で算出した値を基準値として記録する（ステップＳ１０７）。ステップＳ１０６で算出した値は、合焦状態において算出される合焦評価値であり、合焦評価値がステップＳ１０６で算出した値に一致しているかによって合焦状態にあるか否かを判断することが可能である。このため、ステップＳ１０７では、ステップＳ１０６で算出した値を後述するステップで利用するために、基準値として記録する。
【００３７】
次に、光シート顕微鏡１００は、光シート面が初期位置に移動するように、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ１０８）。ここでは、制御装置２０は、ステージ６を制御して、ステップＳ１０１で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである初期位置に光シート面を動かす。
【００３８】
その後、光シート顕微鏡１００は、合焦評価値を算出し（ステップＳ１０９）、合焦評価値がステップＳ１０７で記録した基準値に実質的に一致しているか否かを判定する（ステップＳ１１０）。この処理は、ステップＳ１０８でのステージ６の移動により対物レンズ７の焦点面が移動している可能性があるために行われる。なお、ステップＳ１１０の処理は、合焦判定が行われる点はステップＳ１０４と同様であるが、光検出器１５及び光検出器１７からの出力信号に基づいて合焦判定を行う点が、撮像装置１２で取得した画像に基づいて合焦判定を行うステップＳ１０４とは異なる。また、制御装置２０は、合焦評価値が基準値を含む所定範囲内の値であれば、合焦評価値が基準値に実質的に一致していると判定してもよい。
【００３９】
ステップＳ１１０で合焦評価値が基準値に一致しないと判定されると（ステップＳ１１０ＮＯ）、光シート顕微鏡１００は、光シート面と対物レンズの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ１１１）。ここでは、制御装置２０は、合焦評価値が基準値に近づくようにＺ駆動部８を制御して、光シート面と対物レンズ７の相対位置を調整する。
【００４０】
光シート顕微鏡１００は、その後、再び合焦評価値を算出する（ステップＳ１０９）。そして、合焦評価値が基準値に実質的に一致していると判定されるまで、即ち、合焦評価値が基準値を含む所定範囲内の値になるまで（ステップＳ１１０ＹＥＳ）、ステップＳ１０９からステップＳ１１１の処理を繰り返す。即ち、制御装置２０は、ステップＳ１０９からステップＳ１１１において、光検出器１５からの出力信号と光検出器１７からの出力信号に基づいて、Ｚ駆動部８を制御する。
【００４１】
そして、合焦評価値が基準値に実質的に一致していると判定されると（ステップＳ１１０ＹＥＳ）、光シート顕微鏡１００は、サンプルＳの断層像を取得する（ステップＳ１１２）。これにより、対物レンズ７の焦点面と光シート面が合った状態で断層像が取得される。
【００４２】
その後、光シート顕微鏡１００は、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する（ステップＳ１１３）。ここでは、制御装置２０は、ステップＳ１０１で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである最終位置にまで光シート面が移動済みか否かを判定する。
【００４３】
最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡１００は、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ１１４）。ここでは、制御装置２０は、ステージ６を制御して、ステップＳ１０１で決定した断層像を取得する位置のうちの別の位置に光シート面を移動する。その後、光シート顕微鏡１００は、ステップＳ１０９からステップＳ１１４の処理を繰り返し、ステップＳ１１３で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図３に示す断層像取得処理を終了する。
【００４４】
光シート顕微鏡１００では、光シート面とサンプルＳの相対位置を変更後に取得される光検出器からの出力信号に基づいて合焦状態が判定される。このため、人間が画像に基づいて合焦状態を判定する場合よりも、光シート面を対物レンズ７の焦点面に素早く合わせることができる。制御装置が画像に基づいて合焦状態を判定する場合と比較しても計算量が少ないため、光シート面を対物レンズ７の焦点面に素早く合わせることができる。
【００４５】
また、光シート顕微鏡１００では、２つの検出器と２つのピンホール板の組み合わせによって、いわゆる、前ピン状態と後ピン状態とを判別することができる。これにより、対物レンズ７の焦点面と光シート面の間でズレが生じている方向を知ることが可能であり、光シート面と対物レンズの相対位置を調整する方向を特定することができる。この点も、光シート面を対物レンズ７の焦点面に素早く合わせることに寄与する。
【００４６】
さらに、光シート顕微鏡１００では、光シート面とサンプルＳの相対位置を変更する度に、その相対位置で実際に検出された信号に基づいて合焦処理が行われる。このため、キャリブレーションデータに基づいて合焦処理を行う場合よりも、光シート面を対物レンズ７の焦点面に高精度にあわせることができる。
【００４７】
以上のように、光シート顕微鏡１００によれば、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。なお、本実施形態では、サンプルＳを対物レンズ７の光軸の方向に動かしたときのみを説明したが、サンプルＳが大きなときは、シート光を照明光軸の方向に動かして撮像する必要がある。この場合、サンプルＳの位置によって屈折率が変化し対物レンズ７の焦点面がずれる可能性があるが、このときも本方法で光シート面に合焦させることが可能である。また、光シート顕微鏡１００では、制御装置２０がソフトウェア処理により合焦評価値を算出してＺ駆動部８を制御する例を示したが、例えば、制御装置２０の代わりにコンパレータなどの回路によって合焦評価値を評価して評価結果に応じた制御信号をＺ駆動部８へ出力してもよい。この場合、ソフトウェア処理よりも更に高速に合焦処理を行うことができる。また、光シート顕微鏡１００では、ピンホール板１４及びピンホール板１６を備える例を示したが、ピンホール板１４及びピンホール板１６のそれぞれの代わりに、例えば、図４に示すピンホールアレイ１９を有する遮光板１８を備えてもよい。遮光板１８を用いることで、サンプルＳ中の多点からの光を検出することができる。これにより、サンプルＳ中の特異な点（散乱が少ない場所）が及ぼす影響を軽減することができるため、より信頼性の高い合焦判定結果を得ることができる。
【００４８】
［第２の実施形態］
図５は、本実施形態に係る光シート顕微鏡２００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡２００は、シート照明光学系４の代わりに、シート照明光学系３１、スキャンミラー３２、リレー光学系３３、ミラー３４、及びスキャンレンズ３５を備える点、ステージ６の代わりにステージ６ａを備える点、制御装置２０の代わりに制御装置３０を備える点が、光シート顕微鏡１００とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡１００と同様である。
【００４９】
光シート顕微鏡２００では、シート照明光学系３１が形成した光シートは、スキャンミラー３２、リレー光学系３３、ミラー３４、及びスキャンレンズ３５を介して、対物レンズ７の光軸と略直交する方向からサンプルＳに照射される。また、スキャンミラー３２の振り角を変更することで、サンプルＳに照射される光シートＬＳは、対物レンズ７の光軸方向に移動する。従って、光シート顕微鏡２００では、スキャンミラー３２は、光シート面とサンプルＳとの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する第２の調整手段である。スキャンミラー３２の振り角は制御装置３０によって制御される。このため、ステージ６ａは、制御装置３０によって制御可能な電動ステージでなくてもよい。
【００５０】
制御装置３０は、ステージ６の代わりにスキャンミラー３２に接続されている点が制御装置２０と異なるが、制御装置３０のハードウェア構成は、制御装置２０のハードウェア構成と同様である。また、制御装置３０は、サンプルＳの複数の断層像を取得する図３に示す断層像取得処理を実行するように構成されている点も制御装置２０と同様である。ただし、制御装置３０は、制御装置２０とは異なり、スキャンミラー３２を制御することで光シート面とサンプルＳとの相対位置を調整する（ステップＳ１０８、ステップＳ１１４）。
【００５１】
光シート顕微鏡２００によっても、光シート顕微鏡１００と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡２００によれば、サンプルＳを移動することなく光シート面とサンプルＳの相対位置を変更することができる。このため、サンプルＳの移動によって生じる刺激（例えば、加速度変化など）を与えることなく、複数の断層像を取得して、三次元立体像を生成することができる。
【００５２】
［第３の実施形態］
図６は、本実施形態に係る光シート顕微鏡３００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡３００は、レボルバ４２に倍率の異なる複数の対物レンズ（対物レンズ７、対物レンズ４１）が装着されている点、２つの遮光板（ピンホール板４３、ピンホール板４５）が基準位置（位置Ｐ２、位置Ｐ３）からの距離が変化する様に光路に沿って可動自在に設けられている点、２つの遮光板を光路に沿って動かす２つの駆動機構（駆動機構４４、駆動機構４６）を備える点、制御装置２０の代わりに制御装置４０を備える点が、光シート顕微鏡１００とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡１００と同様である。
【００５３】
駆動機構４４及び駆動機構４６は、ピンホール板４３及びピンホール板４５の位置を調整する第３の調整する手段であり、駆動機構４４及び駆動機構４６を介したピンホール板４３及びピンホール板４５の移動は、制御装置４０によって制御される。
【００５４】
制御装置４０は、駆動機構４４及び駆動機構４６に接続されている点が制御装置２０と異なるが、制御装置４０のハードウェア構成は、制御装置２０のハードウェア構成と同様である。また、制御装置４０は、図３に示す断層像取得処理の代わりに、図７に示す断層像取得処理を実行する。
【００５５】
図７は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図７を参照しながら、光シート顕微鏡３００で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
【００５６】
光シート顕微鏡３００は、まず、使用する対物レンズの指定を受け付ける（ステップＳ３０１）。ここでは、利用者が図示しない入力装置を用いて対物レンズを選択することで、制御装置４０が対物レンズの指定を受け付ける。
【００５７】
その後、光シート顕微鏡３００は、指定された対物レンズに切り替える（ステップＳ３０２）。ここでは、制御装置４０がレボルバ４２を制御することで、レボルバ４２が光路上に配置される対物レンズを指定された対物レンズに切り替える。
【００５８】
対物レンズが切り替ると、光シート顕微鏡３００は、対物レンズの倍率に応じて、２つのピンホール板（ピンホール板４３、ピンホール板４５）の基準位置からの距離を変更する（ステップＳ３０３）。ここでは、制御装置４０が、対物レンズの倍率に応じて駆動機構４４及び駆動機構４６を制御することで、２つのピンホール板の位置を調整する。より具体的には、対物レンズの倍率が大きいほど２つのピンホール板が基準位置から離れるように、２つのピンホール板の位置が調整される。これは、光シート面が投影される位置（像位置）は光シート面の位置の変化量に対物レンズの倍率の２乗を乗じた大きさで変化するためである。
以降のステップＳ１０１からステップＳ１１４については、光シート顕微鏡１００で行われる図３に示す断層像取得処理と同様である。
【００５９】
光シート顕微鏡３００によっても、光シート顕微鏡１００と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、対物レンズの倍率に応じて遮光板の位置が調整されるため、倍率によらず安定的に合焦判定を行うことができる。さらに、ピンホール径を可変可能に構成し、光路に入れる対物レンズに最適なピンホール径に設定することで、より精度の高い焦点合わせを行うこともできる。
【００６０】
［第４の実施形態］
図８は、本実施形態に係る光シート顕微鏡４００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡４００は、乾燥系の対物レンズ７の代わりに液浸系の対物レンズ５１を備える点、ビームスプリッタ１３、ピンホール板１６、及び光検出器１７が省略されている点、ピンホール板１４の代わりにピンホール板５２を備える点、制御装置２０の代わりに制御装置５０を備える点が、光シート顕微鏡１００とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡１００と同様である。
【００６１】
ピンホール板５２は、受光面Ｓ１に対応する基準位置Ｐ２に配置されている。制御装置５０は、ピンホール板５２を通過した光シート面からの光を検出した光検出器１５からの出力信号に基づいてＺ駆動部８を制御する点が制御装置２０とは異なるが、そのハードウェア構成は、制御装置２０のハードウェア構成と同様である。また、制御装置５０は、図３に示す断層像取得処理の代わりに、図９に示す断層像取得処理を実行する。
【００６２】
図９は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図９を参照しながら、光シート顕微鏡４００で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
【００６３】
光シート顕微鏡４００は、まず、断層像を取得する高さ範囲の指定を受け付ける（ステップＳ４０１）。この処理は、図３のステップＳ１０１と同様である。ここでは、制御装置５０は、受け付けた高さ範囲に基づいて、断層像を取得する位置、つまり、サンプルＳ中における光シート面の位置を決定する。
【００６４】
次に、光シート顕微鏡４００は、光シート面が初期位置に移動するように、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ５１の光軸方向に調整する（ステップＳ４０２）。ここでは、制御装置５０は、ステージ６を制御して、ステップＳ４０１で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである初期位置に光シート面を動かす。
【００６５】
さらに、光シート顕微鏡４００は、サンプルＳに光シートＬＳを照射し（ステップＳ４０３）。その後、光シート顕微鏡４００は、検出光量が最大となるように光シート面と対物レンズ５１の相対位置を対物レンズ５１の光軸方向に調整する（ステップＳ４０４）。ここでは、制御装置５０は、光検出器１５からの出力信号が増加するようにＺ駆動部８を制御する処理を繰り返すことで、光検出器１５からの出力信号に基づいて検出光量が最大となる相対位置を特定する。
【００６６】
光シート面と対物レンズ５１の相対位置の調整が終了すると、光シート顕微鏡４００は、サンプルＳの断層像を取得する（ステップＳ４０５）。これにより、対物レンズ５１の焦点面と光シート面が合った状態で断層像が取得される。
【００６７】
その後、光シート顕微鏡４００は、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する（ステップＳ４０６）。ここでは、制御装置５０は、ステップＳ４０１で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである最終位置にまで光シート面が移動済みか否かを判定する。
【００６８】
最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡４００は、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ５１の光軸方向に調整する（ステップＳ４０７）。ここでは、制御装置５０は、ステージ６を制御して、ステップＳ４０１で決定した断層像を取得する位置のうちの別の位置に光シート面を移動する。その後、光シート顕微鏡４００は、ステップＳ４０４からステップＳ４０７の処理を繰り返し、ステップＳ４０６で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図９に示す断層像取得処理を終了する。
【００６９】
光シート顕微鏡４００によっても、各相対位置で実際に出力された光検出器からの出力信号に基づいて合焦状態が判定されるため、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡１００と比較して光学系の構成がシンプルであるため、安価に装置を構成することができる。さらに、本実施形態のように液浸系対物レンズの使用したときには、高解像で画像が取得でき、また、対物レンズとサンプルとの間に空気層が存在せず屈折率差による焦点面の変動が小さいので、対物レンズの移動範囲（補正範囲）が小さくて済む。従って、より高速に焦点合わせを行うことができる。また、上記実施形態では液浸系対物レンズが使用されているが、乾燥系の対物レンズが使用されてもよい。
【００７０】
［第５の実施形態］
図１０は、本実施形態に係る光シート顕微鏡５００の構成を例示した図である。図１１は、光シート顕微鏡５００に含まれる撮像装置７１の画素の配列を例示した図である。光シート顕微鏡５００は、撮像装置１２の代わりに撮像装置７１を備える点、ダイクロイックミラー１０、ビームスプリッタ１３、ピンホール板１４、光検出器１５、ピンホール板１６、及び光検出器１７が省略されている点、制御装置２０の代わりに制御装置７０を備える点が、光シート顕微鏡１００とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡１００と同様である。
【００７１】
撮像装置７１は、像面位相差センサを備える撮像装置であり、図１１に示すように、通常画素７２に加えて、位相差評価用画素７３を含む点が、撮像装置１２とは異なる。位相差評価用画素７３は、スリット７３ａが形成された遮光部材７３ｂを有している。位相差評価用画素７３には、画素中心に対するスリット７３ａの位置が異なる２種類が存在し、２種類の画素がペアとなって利用される。
【００７２】
制御装置７０は、位相差評価用画素７３からの出力信号に基づいてＺ駆動部８を制御する点が制御装置２０とは異なるが、そのハードウェア構成は、制御装置２０のハードウェア構成と同様である。また、制御装置７０は、サンプルＳの複数の断層像を取得する図３に示す断層像取得処理を実行するように構成されている点も制御装置２０と同様である。ただし、制御装置７０は、制御装置２０とは異なり、位相差評価用画素７３からの出力信号に基づいて合焦評価値の算出及び合焦判定が行われる。
【００７３】
光シート顕微鏡５００によっても、いわゆる前ピン状態と後ピン状態とを判別することができるため、光シート顕微鏡１００と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡１００と比較して光学系の構成がシンプルであるため、安価に装置を構成することができる。
【００７４】
［第６の実施形態］
図１２は、本実施形態に係る光シート顕微鏡６００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡６００は、エミッションフィルタ１１がフィルタターレット８２に収容されていて、ガラス板８１と切り替えて使用される点、制御装置７０の代わりに制御装置８０を備える点が、光シート顕微鏡５００とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡５００と同様である。
【００７５】
フィルタターレット８２は、光路上に配置される光学素子をエミッションフィルタ１１とガラス板８１の間で切り替える装置であり、切り替え動作は制御装置８０によって制御される。ガラス板８１は、蛍光及びレーザ光を透過する平板であり、ガラス板８１は、そのガラス板８１内での光路長がエミッションフィルタ１１内での光路長とおよそ一致するような厚さを有する。
【００７６】
制御装置８０は、フィルタターレット８２に接続されている点が制御装置７０とは異なるが、そのハードウェア構成は、制御装置７０のハードウェア構成と同様である。また、制御装置８０は、図３に示す断層像取得処理の代わりに、図１３に示す断層像取得処理を実行する。
【００７７】
図１３は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図１３を参照しながら、光シート顕微鏡６００で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
【００７８】
光シート顕微鏡６００は、まず、エミッションフィルタ１１を光路から取り除く（ステップＳ７０１）。ここでは、制御装置８０が、フィルタターレット８２の回転を制御して、エミッションフィルタ１１を光路から除いて、代わりに、ガラス板８１を光路に挿入する。
以降のステップＳ１０１からステップＳ１１１については、光シート顕微鏡１００で行われる図３に示す断層像取得処理と同様である。
【００７９】
そして、合焦評価値が基準値に実質的に一致していると判定されると（ステップＳ１１０ＹＥＳ）、光シート顕微鏡６００は、エミッションフィルタ１１を光路へ挿入する（ステップＳ７０２）。ここでは、制御装置８０が、フィルタターレット８２の回転を制御して、ガラス板８１を光路から除いて、代わりに、エミッションフィルタ１１を光路へ挿入する。
【００８０】
その後、光シート顕微鏡６００は、サンプルＳの断層像を取得し（ステップＳ１１２）、さらに、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する（ステップＳ１１３）。
【００８１】
最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡６００は、エミッションフィルタ１１を光路から取り除き（ステップＳ７０３）、その後、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ１１４）。なお、ステップＳ７０３の処理は、ステップＳ７０１と同様である。最後に、光シート顕微鏡６００は、ステップＳ１０９からステップＳ１１４の処理を繰り返し、ステップＳ１１３で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図１３に示す断層像取得処理を終了する。
【００８２】
光シート顕微鏡６００によっても、光シート顕微鏡１００と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡１００と比較して光学系の構成がシンプルであるため、光シート顕微鏡５００と同様に、安価に装置を構成することができる。さらに、レーザ光が撮像装置７１に入射する状態で合焦判定処理が行われる。このため、レーザ光に比べて微弱で且つサンプルＳ中の位置等によって発生量が異なる蛍光のみが撮像装置７１に入射する状態で合焦判定処理が行われる光シート顕微鏡５００よりも、安定的に合焦判定を行うことができる。
【００８３】
なお、光シート顕微鏡６００では、エミッションフィルタ１１とガラス板８１をフィルタターレット８２で切り替える例を示したが、フィルタターレット８２には複数の異なる仕様のエミッションフィルタが収容されていても良く、蛍光波長に応じてエミッションフィルタをフィルタターレット８２を用いて切り替えても良い。また、光シート顕微鏡６００では、ガラス板８１を光路に挿入した状態で合焦判定を行う例を示したが、ガラス板８１の代わりにレーザ光のみが透過するバンドパスフィルタを光路に挿入した状態で合焦判定を行ってもよい。
【００８４】
［第７の実施形態］
図１４は、本実施形態に係る光シート顕微鏡７００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡７００は、撮像装置７１の代わりに撮像装置１２を備える点、ダイクロイックミラー１０と位相差オートフォーカス（以降、ＡＦと記す）センサ９１を備える点、制御装置７０の代わりに制御装置９０を備える点が、光シート顕微鏡５００とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡５００と同様である。
【００８５】
位相差ＡＦセンサ９１は、セパレータレンズ９２とセンサ９３を備える、位相差ＡＦ処理を実行するセンサユニットであり、光検出器１２と対物レンズ７の間の光路から分岐した光路上に設けられている。位相差ＡＦセンサ９１は、実質的には、光シート顕微鏡５００の撮像装置７１内に設けられた像面位相差センサと同等に機能する。
【００８６】
制御装置９０は、位相差ＡＦセンサ９１に接続されている点、及び、位相差ＡＦセンサ９１からの出力信号に基づいてＺ駆動部８を制御する点が制御装置７０とは異なるが、そのハードウェア構成は、制御装置７０のハードウェア構成と同様である。また、制御装置９０は、図２に示す断層像取得処理を実行するように構成されている点も制御装置７０と同様である。ただし、制御装置９０は、制御装置７０とは異なり、位相差ＡＦセンサ９１からの出力信号に基づいて合焦評価値の算出及び合焦判定が行われる。
【００８７】
光シート顕微鏡７００によっても、光シート顕微鏡５００と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、ダイクロイックミラー１０と位相差ＡＦセンサ９１との間に凸レンズを挿入し、位相差ＡＦセンサ９１に入射する光線のＮＡを大きくして合焦判定の精度を向上させることも考えられる。
【００８８】
［第８の実施形態］
図１５は、本実施形態に係る光シート顕微鏡８００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡８００は、ダイクロイックミラー１０の代わりにミラー９４を備える点が、光シート顕微鏡１００とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡１００と同様である。
【００８９】
ミラー９４は、対物レンズ７と撮像装置１２の間の光路上の対物レンズ７の光軸から逸れた位置に配置されている。より詳細には、撮像装置１２で検出されるべき光束を遮らない位置に配置されている。なお、顕微鏡でよく利用される２/３インチＣＣＤカメラは、顕微鏡が本来有する視野の半分程度しか使用していないのが通常である。
【００９０】
光シート顕微鏡８００によっても、光シート顕微鏡１００と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、ダイクロイックミラー１０を介すことなく断層像が取得されるため、光シート顕微鏡１００に比べて明るい断層像を取得することができる。
【００９１】
上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。光シート顕微鏡、及びその制御方法は、特許請求の範囲に記載された発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
【符号の説明】
【００９２】
１・・・レーザ、２・・・光ファイバー、４、３１・・・シート照明光学系、５・・・サンプル容器、６、６ａ・・・ステージ、７、４１、５１・・・対物レンズ、８・・・Ｚ駆動部、９・・・結像レンズ、１０・・・ダイクロイックミラー、１１・・・エミッションフィルタ、１２、７１・・・撮像装置、１３・・・ビームスプリッタ、１４、１６、４３、４５、５２・・・ピンホール板、１５、１７・・・光検出器、１８・・・遮光板、１９・・・ピンホールアレイ、２０、３０、４０、５０、７０、８０、９０・・・制御装置、２１・・・プロセッサ、２２・・・メモリ、２３・・・入出力インターフェース、２４・・・記憶装置、２５・・・可搬記録媒体駆動装置、２６・・・可搬記録媒体、２７・・・バス、３２・・・スキャンミラー、３３・・・リレー光学系、３４、９４・・・ミラー、３５・・・スキャンレンズ、４２・・・レボルバ、４４、４６・・・駆動機構、７２・・・通常画素、７３・・・位相差評価用画素、７３ａ・・・スリット、７３ｂ・・・遮光部材、８１・・・ガラス板、８２・・・フィルタターレット、９１・・・位相差ＡＦセンサ、９２・・・セパレータレンズ、９３・・・センサ、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００・・・光シート顕微鏡、Ｓ・・・試料、Ｓ１・・・受光面、ＬＳ・・・光シート、Ｍ・・・媒質、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３・・・位置
【図１】
2018004777.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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