(57)【要約】【課題】免疫沈降法を用いた目的物質の定量において、ロット間や条件の異なる試料間の比較のための新たな内部標準分子の提供。【解決方法】免疫沈降用の内部標準分子であって、免疫沈降で用いられる抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドと、それに結合した核酸とを含む、内部標準分子。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫沈降用の内部標準分子であって、
免疫沈降で用いられる抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドと、それに結合した核酸とを含む、内部標準分子。
【請求項２】
前記免疫沈降がクロマチン免疫沈降であって、
前記タンパク質がクロマチン上のＤＮＡに結合するタンパク質であり、
前記核酸の配列は、被検試料が由来する生物種のゲノムに含まれない配列からなる、請求項１に記載の内部標準分子。
【請求項３】
前記核酸の配列が酵母に由来する、請求項１又は２に記載の内部標準分子。
【請求項４】
前記酵母に由来する核酸の配列が配列番号１〜４のいずれかで表される、請求項３に記載の内部標準分子。
【請求項５】
前記核酸がビオチンで標識されており、前記タンパク質又はその部分ペプチドがアビジン又はストレプトアビジンとの融合タンパク質又はペプチドであり、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンの相互作用により前記核酸が前記タンパク質又はその部分ペプチドと結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の内部標準分子。
【請求項６】
前記核酸が当該核酸へのアミン修飾を介してＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ-4-
（Ｎ-ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ-1-ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ)で標識されており、前記タンパク質又はその部分ペプチドが当該タンパク質または
その部分ペプチドの末端にシステイン残基が付加されたシステイン付加タンパク質又はその部分ペプチドであり、ＳＭＣＣとシステイン残基との相互作用により前記核酸が前記タンパク質又はその部分ペプチドと結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の内部標準分子。
【請求項７】
前記タンパク質が転写因子、転写制御因子、ヒストンタンパク質、またはクロマチン制御因子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の内部標準分子。
【請求項８】
前記転写因子又は転写制御因子がＩＲＦ４タンパク質、ｐ５３タンパク質、ＮＦ−κＢ、Ｒｂタンパク質、ＢＲＣＡ１タンパク質、ＭＹＣタンパク質、またはＰａｘ５タンパク質である、請求項７に記載の内部標準分子。
【請求項９】
以下の工程を含む免疫沈降方法。
被検試料と請求項１〜８のいずれか１項に記載の内部標準分子とを混合する工程、
免疫沈降工程、及び、
前記内部標準分子の核酸部分を検出することによって免疫沈降結果の標準化を行う工程。
【請求項１０】
以下の工程を含むクロマチン免疫沈降方法。
被検試料と請求項１〜８のいずれか１項に記載の内部標準分子とを混合する工程、
クロマチン免疫沈降工程、
前記クロマチン免疫沈降工程で得られた試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程、及び、
前記増幅工程で得られた内部標準分子のＤＮＡ部分の増幅ＤＮＡの量を指標として、試料中の目的断片ＤＮＡの増幅ＤＮＡの量を補正する工程。
【請求項１１】
以下の工程を含むクロマチン免疫沈降方法。
被検試料と請求項１〜８のいずれか１項に記載の内部標準分子とを混合する工程、
クロマチン免疫沈降工程、
前記クロマチン免疫沈降工程で得られた試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程、
前記増幅工程で増幅した試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列を解析する工程、及び、
前記塩基配列を解析する工程で得られた内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列のシーケンス量を指標として、試料中の目的ＤＮＡの塩基配列のシーケンス量を補正する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫沈降用の内部標準分子及び免疫沈降方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定のタンパク質に特異的に結合する抗体は、ライフサイエンス分野の研究ツールとして汎用されている。中でも、特定のタンパク質を分離精製するために免疫沈降法は非常に利用される方法であり、様々な試薬が開発されている。また、例えば、細胞ライセート中に存在するタンパク質とタンパク質の複合体を分離精製するために共免疫沈降法も発展を遂げ、様々な共免疫沈降ツールが開発されている。
【０００３】
近年、転写因子などの特定のタンパク質が結合するＤＮＡ上の部位、およびその部位の塩基配列を明らかにする研究がなされている。その方法として、転写因子などの特定のタンパク質に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降法（Chromatin immunoprecipitation,
ChIP）が用いられている（特許文献１）。
【０００４】
最近では、このクロマチン免疫沈降法と次世代シーケンサーによるＤＮＡシーケンシングとを組み合わせたChIP-seq法も広く用いられている。ChIP-seq法では、まず、転写因子などの特定のタンパク質に結合する抗体を用いた免疫沈降法で得られたＤＮＡ断片の塩基配列を、次世代シーケンサーを用いて決定し、例えばヒトの全ゲノムであるリファレンス配列へマップする。そして、リファレンス配列にマップされた塩基配列の数（リード数）が多いほど、当該ＤＮＡ領域はクロマチン免疫沈降法に用いた抗体と結合するタンパク質がより多く複合体を形成する領域であって、何らかの発現制御を受けている領域であると同定される。例えば、特定の物質の投与により、特定のＤＮＡ領域の塩基配列のリード数が増加すれば、そのＤＮＡ領域は、その特定の物質により抗体が認識するタンパク質がより多く複合体を形成し、発現制御に変化が生じたと評価される。
【０００５】
しかし、このリード数は、タンパク質と抗体との交叉率や実験操作などによる誤差に起因して、抗体等の試薬のロット間や条件の異なる試料間、同一実験条件で実施した複数の実験間において変動してしまうのが通常である。この問題に対し、２群のマップされた状態を比較して差があるものを検出する手法が開発されているが（非特許文献１、２）、この方法では変動幅は小さくても意味のある差を出力し損じるリスクがあり、定量というよりも半定量に近いのが実情である。このことは、ChIP-seq法において、得られるデータに影響を与える誤差要因を適切に補正する手段の開発と、その手段による適切に補正された定量的データの取得と、さらに複数の実験に由来する適切に補正された定量的データを用いた適切な定量的比較解析とが、観察された変動が生物学的に意味のある変動と理解する上で必要かつ重要であることを示している。
【０００６】
生体由来試料に含まれる標的タンパク質を定量する方法としては、内部標準ペプチドを用いた方法が開発されている（特許文献２）。本方法では、標的タンパク質に結合するペプチドを合成し、内部標準として生体由来試料に既知量を添加する。その後、プロテアーゼにてタンパク質をペプチドへ消化後、ペプチドの分離を行い、質量分析計で分析を行う。そして、既知量の内部標準ペプチドとタンパク質由来ペプチドのシグナル面積を比較することで、定量を行っている。しかし、本方法は、上記した免疫沈降法や共免疫沈降法、ChIP-seq法に適用できる方法ではない。
【０００７】
また、従来ChIP-seq法では、例えば、ポジティブコントロール実験として抗ヒストンH3抗体を用いた免疫沈降を行う系が使用され、ChIP-seq法用キットのなかに抗ヒストンH3抗
体が含まれるものも市販されている。このヒストンH3と抗ヒストンH3抗体との結合による免疫沈降で得られる結果はChip-seq法またはそのためのキットに問題が無いことを確認するためのものであり、本発明が課題とする補正に供することはできない。その理由は第一に、ヒストンH3と抗ヒストンH3抗体の交叉率と、解析対象とする例えば転写因子タンパク質のその抗体との交叉率が等しいとはみなせないことにある。交叉率の差は沈降効率にも影響する点である。つまり、解析対象と異なるタンパク質に対する抗体を用いたChIP-seqデータは、本発明が課題とするデータの補正には使用できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−１５６２６６号公報
【特許文献２】特開２００６−３００７５８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zhang et al, Genome Biology 2008, 9:R137
【非特許文献２】Park PJ, Nature Reviews Genetics 10, 669-680 (October 2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、免疫沈降法を用いた目的物質の定量において、ロット間や条件の異なる試料間の比較のための新たな内部標準分子の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討したところ、免疫沈降後に検出可能な特定の塩基配列を有する核酸と、前記免疫沈降で用いる抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドとが結合した内部標準分子を用いることで、上記課題を解決できることを見出した。本発明は以下の通りである。
【００１２】
（１）免疫沈降用の内部標準分子であって、
免疫沈降で用いられる抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドと、それに結合した核酸とを含む、内部標準分子。
（２）前記免疫沈降がクロマチン免疫沈降であって、
前記タンパク質がクロマチン上のＤＮＡに結合するタンパク質であり、
前記核酸の配列は、被検試料が由来する生物種のゲノムに含まれない配列からなる、（１）に記載の内部標準分子。
（３）前記核酸の配列が酵母に由来する、（１）又は（２）に記載の内部標準分子。
（４）前記酵母に由来する核酸の配列が配列番号１〜４のいずれかで表される、（３）に記載の内部標準分子。
（５）前記核酸がビオチンで標識されており、前記タンパク質又はその部分ペプチドがアビジン又はストレプトアビジンとの融合タンパク質又はペプチドであり、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンの相互作用により前記核酸が前記タンパク質又はその部分ペプチドと結合している、（１）〜（４）のいずれかに記載の内部標準分子。
（６）前記核酸が当該核酸へのアミン修飾を介してＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ-4-（Ｎ-ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ-1-ｃａｒｂｏｘ
ｙｌａｔｅ)で標識されており、前記タンパク質又はその部分ペプチドが当該タンパク質
またはその部分ペプチドの末端にシステイン残基が付加されたシステイン付加タンパク質又はその部分ペプチドであり、ＳＭＣＣとシステイン残基との相互作用により前記核酸が前記タンパク質又はその部分ペプチドと結合している、（１）〜（４）のいずれかに記載の内部標準分子。
（７）前記タンパク質が転写因子、転写制御因子、ヒストンタンパク質、またはクロマ
チン制御因子である、（１）〜（６）のいずれかに記載の内部標準分子。
（８）前記転写因子又は転写制御因子がＩＲＦ４タンパク質、ｐ５３タンパク質、ＮＦ−κＢ、Ｒｂタンパク質、ＢＲＣＡ１タンパク質、ＭＹＣタンパク質、またはＰａｘ５タンパク質である、（７）に記載の内部標準分子。
（９）以下の工程を含む免疫沈降方法。
被検試料と（１）〜（８）のいずれかに記載の内部標準分子とを混合する工程、
免疫沈降工程、及び、
前記内部標準分子の核酸部分を検出することによって免疫沈降結果の標準化を行う工程。
（１０）以下の工程を含むクロマチン免疫沈降方法。
被検試料と（１）〜（８）のいずれかに記載の内部標準分子とを混合する工程、
クロマチン免疫沈降工程、
前記クロマチン免疫沈降工程で得られた試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程、及び、
前記増幅工程で得られた内部標準分子のＤＮＡ部分の増幅ＤＮＡの量を指標として、試料中の目的断片ＤＮＡの増幅ＤＮＡの量を補正する工程。
（１１）以下の工程を含むクロマチン免疫沈降方法。
被検試料と（１）〜（８）のいずれかに記載の内部標準分子とを混合する工程、
クロマチン免疫沈降工程、
前記クロマチン免疫沈降工程で得られた試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程、
前記増幅工程で増幅した試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列を解析する工程、及び、
前記塩基配列を解析する工程で得られた内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列のシーケンス量を指標として、試料中の目的ＤＮＡの塩基配列のシーケンス量を補正する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の内部標準分子を用いることで、免疫沈降法を用いた目的物質の定量において、ロット間や条件の異なる試料間の比較のための補正を従来よりも正確に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】非ビオチン化DNAおよびビオチン化DNAをストレプトアビジンで沈降させた後の上清と沈殿のそれぞれを用いたPCRの結果を示すアガロースゲル電気泳動写真。
【図２】融合タンパク質のウエスタンブロットによる確認結果を示す写真。
【図３】表１の各試料を用いて免疫沈降を行った時の上清と沈殿を鋳型にした定量PCRの結果を示す図。
【図４】内部標準の量を変化させたときに免疫沈降される標的DNAの沈降量を示す図。
【図５】未結合ビオチン化DNAを除去する操作を行ったときと行わないときに、内部標準の量を変化させたときに免疫沈降される内部標準酵母DNAの沈降量を示す図。
【図６】薬剤によるIRF4タンパク質発現誘導を示すウエスタンブロットの結果を示す図（写真）。
【図７】薬剤によるIRF4遺伝子発現誘導に伴う標的遺伝子の発現誘導を示す定量RT-PCRの結果を示す図。
【図８】薬剤によるIRF4遺伝子発現誘導を示す内因性配列の免疫沈降の結果を示す図。
【図９】薬剤の濃度を変え、内部標準分子を加えて免疫沈降したときの各内部標準分子の配列のマッピング結果を示す図。
【図１０】薬剤によるIRF4遺伝子発現誘導を示す内因性配列の免疫沈降の結果を示す図。
【図１１】免疫沈降によるＩＤ１又はＩＤ２の酵母ＤＮＡの回収量を示す図。
【図１２】免疫沈降により得られた、薬剤により誘導されたＩｒｆ４タンパク質が結合するＩｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域のＤＮＡをマウスゲノム上へマップした結果を示す図。
【図１３】各ＤＯＸ濃度の場合のマップに基づいて、結合ピーク範囲内のリード数をカウントした結果を示す図。
【図１４】ピーク範囲内のリード数を全リード数で除する補正（左）および内部標準分子を用いた補正（右）の結果を示す図。
【図１５】リジン２７がアセチル化されたヒストンＨ３タンパク質のクロマチン免疫沈降において内在性配列と内部標準配列の沈降結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、免疫沈降用の内部標準分子に係る発明（第一の発明）、及び、免疫沈降方法に係る発明（第二の発明）を含む。
【００１６】
＜１．第一の発明＞
本発明の第一の発明は、
免疫沈降用の内部標準分子であって、
前記免疫沈降で用いられる抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドと、それに結合した核酸とを含む、内部標準分子である。
【００１７】
［免疫沈降］
免疫沈降は、当該技術分野において公知の技術である。要すれば、可溶性の抗原を抗原特異的抗体に特異的に反応させて沈殿させる免疫沈降反応を利用して抗原を検出、分離、および／または精製する手法のことである。本発明における免疫沈降は特段限定されず、例えば、一般的な免疫沈降、共免疫沈降、クロマチン免疫沈降などが挙げられる。本発明においては、免疫沈降の前後に他の実験系が組まれてもよく、実験系全体のうちの一の系として免疫沈降の系が組まれてもよい。
【００１８】
（クロマチン免疫沈降）
本発明における免疫沈降は好ましくはクロマチン免疫沈降である。上記した通り、本発明の第一の発明の内部標準分子を使用した免疫沈降法では、目的物質の定量において、ロット間や条件の異なる試料間の比較のための補正を従来よりも正確に行うことができる。
クロマチン免疫沈降の場合には、クロマチン上のＤＮＡと結合する転写因子などのタンパク質のように、解離定数が大きいタンパク質や、結合が安定しないタンパク質が対象となるところ、ロット間や条件の異なる試料間の比較のための補正を従来よりも正確に行うことができることの効果は大きい。
【００１９】
［内部標準分子］
本発明の第一の発明の内部標準分子は免疫沈降用の内部標準分子であり、核酸と、前記免疫沈降で用いる抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドとが結合したものである。以下に、本発明の第一の発明の内部標準分子の詳細を記載する。
【００２０】
［核酸］
本発明の第一の発明の内部標準分子は核酸を含む。
【００２１】
核酸の種類としては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ、人工核酸などが挙げられる。合成の容易さ、他の実験系との関連性、分解しにくい安定性を有する等の観点から、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは２本鎖ＤＮＡである。修飾塩基を含むものでもよい。
【００２２】
核酸の塩基配列としては、ハイブリダイゼーションやＰＣＲで検出可能であれば特段限定されないが、被験試料中の物質との結合などの相互作用を極力小さくするために、被検試料が由来する生物種のゲノム中に含まれない配列からなることが好ましい。すなわち、クロマチン免疫沈降に使用する場合、試料の染色体上には含まれない配列とすることが好ましい。さらに、被験試料中の物質との結合などの相互作用を極力小さくするために、被検試料が由来する生物種の遺伝子制御配列等のタンパク質結合配列を含まないことが好ましい。
【００２３】
例えば、酵母などの菌類、大腸菌などの細菌、ショウジョウバエなどに由来する配列が挙げられる。中でも、被検試料として哺乳動物の試料を使用する場合、好ましくは酵母、大腸菌などの細菌に由来する配列であり、より好ましくは酵母に由来する配列である。
酵母に由来する核酸の配列としては、例えば、配列番号１〜配列番号４で表される配列が挙げられる。
なお、どの生物種にも由来しない人工配列でもよい。
【００２４】
また、ＰＣＲで増幅する際のプライマー設計の都合上、リピート配列を含まないことが好ましい。
【００２５】
その他、核酸としては、ＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応で検出可能であれば、その種類、ＧＣ含量、塩基配列の長さ等に特に制限はないが、ＧＣ含量としては、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上であり、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下である。当該範囲内のＧＣ含量にあることで、非特異的配列の増幅を抑制し、目的配列を効率的に増幅することができる。
【００２６】
核酸の塩基配列の長さとしては、後述するＰＣＲでＤＮＡが増幅すれば特段限定されないが、通常１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２５塩基以上であり、通常２００塩基以下、好ましくは１００塩基以下である。
【００２７】
（核酸の製造方法）
選択された塩基配列を有する核酸の製造方法は特段限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、塩基配列の長さが短ければ、公知の方法で人工的に合成してもよく、公知の受託サービスを利用してもよい。
また、公知の遺伝子工学的手法により製造することもできる。例えば、選択した塩基配列が由来する生物種のゲノムＤＮＡを鋳型とし、目的とする塩基配列を増幅できるように設計したプライマーセットを使用したＰＣＲを行うことによって得ることもできる。
【００２８】
［タンパク質］
本発明の第一の発明の内部標準分子はタンパク質を含む。前記タンパク質は、前記免疫沈降で用いる抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドである。また、前記タンパク質は、当該抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドにさらにタグ配列が付与されたタンパク質又はその部分ペプチドであってもよい。ここで、タグ配列とは、該抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドの標識として機能するタンパク質またはペプチドをいう。タグ配列の具体的なものとしては、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＦＬＡＧタグが挙げられる。当該タグ配列は、市販される当該タグ配列との融合タンパク質を発現する発現ベクターを用いた遺伝子組み換え技術を使用することにより、当該抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドに付与することができる。タグ配列は、例えば、当該抗体が認識するエピトープを含むタンパク質又はその部分ペプチドの回収や精製に利用することができる。
【００２９】
本発明の第一の発明の内部標準分子が含むタンパク質とは、通常、アミノ酸配列全長を意味するが、シグナル配列が除かれた成熟型タンパク質の全長や変異型タンパク質も含まれる。全長の場合、本発明の第一の発明の内部標準分子が含むタンパク質は、前記免疫沈降で用いる抗体が認識するエピトープを当然に含んでいる。
【００３０】
本発明の第一の発明の内部標準分子が含むタンパク質としては特段限定されず、アミノ配列やその長さ等に制限はない。内部標準分子が含むタンパク質としては、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質が好ましく、具体的には、転写因子、転写制御因子、ヒストンタンパク質、クロマチン制御因子などが挙げられる。
【００３１】
転写因子としては特段限定されないが、例えば、ＩＲＦ４タンパク質、ｐ５３タンパク質、ＮＦ−κＢ、ＭＹＣタンパク質、Ｐａｘ５タンパク質などが挙げられる。転写制御因子としては特段限定されないが、Ｒｂタンパク質、ＢＲＣＡ１タンパク質などが挙げられる。
【００３２】
ヒストンタンパク質としては特段限定されないが、例えば、Ｈ２Ａタンパク質、Ｈ２Ｂタンパク質、Ｈ３タンパク質、Ｈ４タンパク質などのコアヒストンタンパク質、Ｈ１タンパク質などのリンカーヒストンなどが挙げられる。
【００３３】
また、これらはバリアントであってもよい。さらに、これらのヒストンタンパク質は化学修飾を受けていてもよい。例えば、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化がされていてもよい。メチル化の場合、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化されていてもよい。
【００３４】
Ｈ３タンパク質であれば、例えば、９番目のリジン残基がメチル化されている場合（Ｈ３Ｋ９ｍｅ）、２７番目のリジン残基がメチル化されている場合（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ）、９番目のリジン残基がアセチル化されている場合（Ｈ３Ｋ９Ａｃ）などが挙げられる。また、９番目のリジン残基がトリメチル化されている場合（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、２７番目のリジン残基がトリメチル化されている場合（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）なども挙げられる。
【００３５】
同様に、Ｈ２Ａタンパク質であれば、例えば、５番目のリジン残基がアセチル化されている場合（Ｈ２ＡＫ５Ａｃ）、１番目のセリン残基がリン酸化されている場合（Ｈ２ＡＳ１ｐｈ）、１２０番目のスレオニン残基がリン酸化されている場合（Ｈ２ＡＴ１２０ｐｈ）、１１９番目のリジン残基がユビキチン化されている場合（Ｈ２ＡＫ１１９ｕｂ）などが挙げられる。
【００３６】
同様に、Ｈ２Ｂタンパク質であれば、例えば、５番目のリジン残基がアセチル化されている場合（Ｈ２ＢＫ５Ａｃ）、１４番目のセリン残基がリン酸化されている場合（Ｈ２ＢＳ１４ｐｈ）、１２０番目のリジン残基がユビキチン化されている場合（Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ）などが挙げられる。
【００３７】
同様に、Ｈ４タンパク質であれば、例えば、５番目のリジン残基がアセチル化されている場合（Ｈ４Ｋ５Ａｃ）、１番目のセリン残基がリン酸化されている場合（Ｈ４Ｓ１ｐｈ）、３番目のアルギニン残基がメチル化されている場合（Ｈ４Ｒ３ｍｅ）などが挙げられる。
【００３８】
クロマチン制御因子としては特段限定されないが、例えば、Ｂｒｇ１、ｐ３００、Ｐｃ４などが挙げられる。
【００３９】
［部分ペプチド］
本発明の第一の発明の内部標準分子が含むタンパク質の部分ペプチドとしては、免疫沈降で用いる抗体が認識するエピトープを含んでいれば特段限定されないが、例えば、２０〜１００アミノ酸の部分ペプチドが例示される。
【００４０】
（タンパク質又はその部分ペプチドの製造方法）
タンパク質又はその部分ペプチドのアミノ酸配列の長さが短い場合、その製造方法は特段限定されず、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。例えば、固相合成法、液相合成法が挙げられる。精製方法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせることでき、これにより、ペプチドを単離精製できる。得られるペプチドが遊離体である場合には、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には、公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することもできる。ペプチドに抗体が認識するリン酸化、アセチル化、メチル化などの修飾を入れることもできる。
【００４１】
タンパク質又はその部分ペプチドのアミノ酸配列の長さが長い場合、又は、短い場合であっても、遺伝子工学的手法によって製造することもできる。例えば、タンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを作製し、該ＤＮＡを用いて組換え発現ベクターを構築し、宿主に導入して発現させ、精製して製造することができる。いずれも公知の方法を用いて行うことができる。
【００４２】
上記したタンパク質又はその部分ペプチドはストレプトアビジンタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｆｌａｇタグなどのタグ配列を含む融合タンパク質であってもよい。
【００４３】
［核酸とタンパク質又はその部分ペプチドとの結合］
（核酸の修飾）
本発明の第一の発明の内部標準分子は、核酸とタンパク質又は部分ペプチドとが結合しているものである。その結合態様は特段限定されないが、不可逆的な結合が好ましい。核酸側については、例えば、核酸の末端を、タンパク質又は部分ペプチドと結合できるように修飾することなどが挙げられる。
核酸の修飾の態様は、タンパク質又は部分ペプチドと結合するのであれば特段限定されないが、例えば、核酸の末端に、後述するタンパク質またはペプチドに導入した標識物質や官能基と反応して結合する標識物質や官能基を導入することが挙げられる。例えば、核酸の末端にビオチン、チオール基、アミノ基などの標識物質を導入することなどが挙げられる。尚、これらの標識物質や官能基はスペーサーを介して核酸に導入されてもよい。
【００４４】
（核酸の修飾方法）
核酸の修飾の方法は特段限定されず、核酸をＰＣＲで増幅する際に末端に標識塩基が導入されたプライマーを用いる方法、核酸合成機で核酸を合成する際に末端塩基として標識塩基を用いる方法など、公知の方法に従うことができる。
例えば、核酸をＰＣＲで増幅する際のプライマーとして、５’末端がビオチン化されたＤＮＡや５’末端がアミノ化された核酸を用いることなどが挙げられる。５’末端がアミノ化されたＤＮＡを用いる場合には、さらに、該アミノ基を介してＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと結合する方法が挙げられる。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルとマレイミド基を導入した二価性試薬であるＳＭＣＣ（succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活
性エステルと結合させる方法が挙げられる。
【００４５】
（タンパク質又は部分ペプチドの修飾）
本発明の第一の発明の内部標準分子は、その内部標準分子が含む核酸とタンパク質又は
部分ペプチドと結合しているものである。タンパク質又は部分ペプチド側については、核酸と結合できるように修飾される。
タンパク質又は部分ペプチドの修飾の態様は、核酸と結合し、免疫沈降で用いる抗体が認識できるのであれば、特段限定されないが、例えば、タンパク質又は部分ペプチドに、核酸に導入した前記標識物質や官能基と反応して結合する標識物質や官能基を導入することが挙げられる。また、タンパク質又は部分ペプチドの修飾は、タンパク質又は部分ペプチドの末端であってもよく、末端でなくてもよい。
【００４６】
タンパク質又は部分ペプチドの修飾としては、例えば、核酸としてビオチン標識核酸を用いる場合には、アビジン標識やストレプトアビジン標識が挙げられる。また核酸としてアミノ基を介してＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと結合した核酸を用いる場合には、システイン標識が挙げられる。システインは内在のシステインを標識してもよいし、新たにシステイン残基を導入してもよい。
【００４７】
（タンパク質又は部分ペプチドの修飾方法）
タンパク質又はその部分ペプチドを修飾する方法は特段限定されないが、遺伝子工学的手法を用いることができる。例えば、上記したタンパク質又はその部分ペプチドの製造方法において、ベクターを作製する際に、アビジンやストレプトアビジンなどの標識分子をコードするＤＮＡとタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡと連結するなどしてベクターに挿入し、融合タンパク質として発現させることができる。
このとき、タンパク質又は部分ペプチドが核酸と結合し、免疫沈降で用いる抗体が認識できるのであれば、標識分子をコードするＤＮＡは、タンパク質又は部分ペプチドをコードするＤＮＡの上流に配置されても下流に配置されても構わない。
【００４８】
（核酸とタンパク質又はその部分ペプチドとの結合方法）
核酸とタンパク質又はその部分ペプチドとの結合は公知の方法で行うことができる。
例えば、末端がビオチン修飾された核酸と、ストレプトアビジンとタンパク質との融合タンパク質との結合であれば、単に両者を溶液中で混合すればよい。その割合は実験により変えればよい。
【００４９】
＜２．免疫沈降方法＞
本発明の第二の発明の免疫沈降方法は、
被検試料と前記内部標準分子とを混合する工程、
免疫沈降工程、及び、
前記内部標準分子の核酸部分を検出することによって標準化を行う工程
を含む免疫沈降方法である。
【００５０】
［被検試料と内部標準分子とを混合する工程］
本工程における被検試料と内部標準分子との混合方法は特段限定されず、ピペッティングなどの当該技術分野で通常に行われる方法で行えばよい。
【００５１】
［免疫沈降工程］
免疫沈降の方法は特段限定されず、公知の免疫沈降法を用いることができる。抗体をビーズなどの担体に結合させ、それを被検試料と内部標準分子との混合液に添加し、一定時間、例えば、３０分〜１日インキュベートしたのち、遠心分離などで沈降物を取得する。沈降物をバッファーなどで洗浄したのち、次の工程に使用する。
【００５２】
免疫沈降における抗体としては、通常の免疫沈降法と同様に、目的の断片ＤＮＡに結合していることが予想されるタンパク質に対する抗体を使用すればよく、この抗体で免疫沈降することにより、目的のタンパク質とそれに結合している断片ＤＮＡの複合体、及び、
内部標準分子を沈降させることができる。
そして、内部標準分子の核酸部分を検出し、その検出結果に基づいて、免疫沈降の測定結果を標準化する。通常の共免疫沈降の測定結果についても、異なる試料間で実験条件間のばらつきなどを補正することが可能となる。
【００５３】
以下に、クロマチン免疫沈降の具体的な態様を説明する。ただし、これらの例には限定されない。
【００５４】
＜２−１．クロマチン免疫沈降の第一の実施態様＞
本発明の第二の発明のクロマチン免疫沈降方法の第一の実施態様は、
被検試料と前記内部標準分子とを混合する工程、
クロマチン免疫沈降工程、
前記クロマチン免疫沈降工程で得られた試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程、及び、
前記増幅工程で得られた内部標準分子のＤＮＡ部分の増幅ＤＮＡの量を指標として、試料中の目的断片ＤＮＡの増幅ＤＮＡの量を補正する工程
を含むクロマチン免疫沈降方法である。
【００５５】
［被検試料と内部標準分子とを混合する工程］
本工程における被検試料と内部標準分子との混合方法は特段限定されず、ピペッティングなどの当該技術分野で通常に行われる方法で行えばよい。
【００５６】
［クロマチン免疫沈降工程］
クロマチン免疫沈降の方法は特段限定されず、公知のクロマチン免疫沈降法を用いることができる。
例えば、被検試料中に存在するクロマチン上のＤＮＡとタンパク質との複合体をホルムアルデヒドなどの架橋剤で架橋して（例えば、室温、１０分の条件）、その後、細胞を回収し、ＤＮＡを１００〜５００ｂｐの長さに超音波破砕する。そして、その超音波破砕されたＤＮＡとタンパク質との複合体を含む試料を用いて免疫沈降を行うという方法が挙げられる。
被検試料と内部標準分子とを混合しておくと、クロマチン上のＤＮＡとタンパク質との複合体とともに内部標準分子も抗体によって沈降される。
【００５７】
［前記クロマチン免疫沈降工程で得られた試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程］
本工程における増幅方法は、目的のＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡを増幅させることができ、後工程における増幅ＤＮＡの定量ができれば特段限定されず、公知の方法を用いることができる。ＰＣＲ法が好適に使用され、例えば、リアルタイムＰＣＲ法などが挙げられる。
【００５８】
本工程では、試料中の目的ＤＮＡを増幅するプライマーセットと、内部標準分子のＤＮＡを増幅するプライマーセットとを用いればよく、それぞれのＤＮＡがそれぞれに増幅されるプライマーセットを用いればよい。
【００５９】
リアルタイムＰＣＲ法を用いて試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡを増幅させる場合の方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、インターカレーション法やハイブリダイゼーション法、ＬＵＸ法などが挙げられる。
インターカレーション法では、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉのように、二本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレートして蛍光を発する色素などを用いることができる。
ハイブリダイゼーション法では、例えば、ＴａｑＭａｎプローブのように、ＤＮＡ配列
に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光式を結合させたプローブなどを用いることができる。
【００６０】
［増幅工程で得られた内部標準分子のＤＮＡ部分の増幅量を指標として、試料中の目的ＤＮＡの量を補正する工程］
被検試料と混合した内部標準分子のＤＮＡ部分の量は既知である。よって、本工程において、増幅された内部標準分子のＤＮＡ部分が定量できれば、これを指標として、公知の方法、例えば、Ｃｔ値を比較する方法、微量流路電気泳動の方法を用いて、増幅された、試料中の目的ＤＮＡ量を補正し、定量することができる。
【００６１】
一般的にクロマチン免疫沈降法では、沈降するＤＮＡとタンパク質との複合体の量が多いほど、タンパク質の当該ＤＮＡ領域への結合量が多いと判定される。そこで、試料中の目的ＤＮＡとして、転写因子の結合配列として既知の配列を想定し、当該既知配列を増幅するためのプライマーセットを用いた場合は、免疫沈降後の増幅工程において得られる増幅量が多いほど転写因子の結合量が多いと判断することができる。そして、この量を内部標準の増幅量で補正することで、より正確に結合量を把握することができる。
例えば、特定の物質の投与により、沈降するＤＮＡとタンパク質との複合体の量が増加すれば、そのＤＮＡ領域に対するタンパク質の結合量がその特定の物質により増加した、すなわち、発現制御に変化が生じたと評価される。また、疾患患者と健常人での比較、および変異保有者と非保有者との比較を行うことで、疾患や変異とタンパク質結合量の関係を調べることもできる。
【００６２】
＜２−３．クロマチン免疫沈降の第二の実施態様＞
本発明の第二の発明のクロマチン免疫沈降方法の第二の実施態様は、
被検試料と前記内部標準分子とを混合する工程、
クロマチン免疫沈降工程、
前記クロマチン免疫沈降工程で得られた試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程、
前記増幅工程で増幅した試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列を解析する工程、及び、
前記塩基配列を解析する工程で得られた内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列のシーケンス量を指標として、試料中の目的ＤＮＡの塩基配列のシーケンス量を補正する工程
を含む免疫沈降方法である。
【００６３】
［被検試料と内部標準分子とを混合する工程］
本工程については、上記した第一の実施態様における「被検試料と前記内部標準分子とを混合する工程」の説明が適用される。
【００６４】
［クロマチン免疫沈降工程］
本工程については、上記した第一の実施態様における「免疫沈降工程」の説明が適用される。
【００６５】
［前記クロマチン免疫沈降工程で得られた目的の断片ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程］
本工程については、上記した第一の実施態様における「前記クロマチン免疫沈降工程で得られた試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分を増幅する工程」の説明が適用される。
【００６６】
［増幅した試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列を解析する工程］
前記増幅工程で増幅した試料中の目的ＤＮＡ及び内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列の解析方法は、特段限定されないが、例えば、次世代シーケンサーを用いて行うことができる。市販されている次世代シーケンサーとしては、例えば、Illumina社、SOLiD社、Helicos社、Complete Genomics社、Polonator社、Ion Torrent社、Pacific Biosciences社の次世代シーケンサーや次次世代シーケンサーが挙げられる（例えば、Mardis, Annu. Rev.
Genom. Human Genet. (2008) vol.9, p.387-402およびPersson et al., Chem. Soc. Rev. (2010) vol.39, p.985-999）。次世代シークエンサーは、DNAポリメラーゼまたはDNAリガーゼによる逐次的DNA合成法を用いて、蛍光・発光など光検出により超並列的に塩基配
列を決定する原理のものである。DNAポリメラーゼを用いる方法として、GS FLX（Roche Diagnostics）、Solexa (Illumina)等が、またDNAリガーゼを用いる方法としてSOLiD（Applied Biosystems）、Polonator （Dover Systems）等が知られている。また、DNA1分子を鋳型としてDNAポリメラーゼによるDNA合成を行い、1塩基ごとの反応を蛍光・発光などの
光で検出することにより、１分子リアルタイム観察により塩基配列を決定するHeliScope (Helicos Biosciences)、SMRT (Pacific Biosciences)等が知られている。その他に、Post-light シークエンシングと称される蛍光・発光など光検出以外の検出方法により、超並列的に塩基配列を決定する原理も報告されており、半導体(CMOS)チップを用いて、DNA ポリメラーゼにより各塩基が取り込まれるときに放出される水素イオン(pH変化)を検出することで塩基配列を決定する、Ion Torrent Systems等がこれに該当する。他にもNanopore
（Oxford Nanopore Technologies）等が知られている。
【００６７】
［前記塩基配列を解析する工程で得られた内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列のシーケンス量を指標として、試料中の目的ＤＮＡの塩基配列のシーケンス量を補正する工程］
増幅された試料中の目的ＤＮＡの塩基配列を、被検試料が由来する生物種のゲノム配列（リファレンス配列）にマップすることにより、解析された、試料中の目的ＤＮＡの塩基配列それぞれのシーケンス量が分かる。
被検試料と混合した内部標準分子のＤＮＡ部分の量は既知である。よって、内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列のシーケンス量を指標として、試料中の目的ＤＮＡの塩基配列のシーケンス量を補正することができる。
【００６８】
一般的にChIP-seq法では、リファレンス配列にマップされた塩基配列の数（リード数）が多いほど、当該ＤＮＡ領域はクロマチン免疫沈降法に用いた抗体と結合するタンパク質と複合体を形成する領域であって、何らかの発現制御を受けている領域であると同定される。
【００６９】
しかし、このリード数は、タンパク質と抗体との交叉率や実験操作などによる誤差に起因して、ロットや条件の異なる試料間において異なるのが通常である。そのため、例えば、２群の被検試料に対して特定の物質を投与し、その結果、特定のＤＮＡ領域の塩基配列のリード数に差が生じた場合、その差が、該特定の物質が投与されたことに起因する有意な差なのか、または上記した誤差なのかが判断できない。
【００７０】
このような場合に本実施態様の免疫沈降方法を用いれば、内部標準分子のＤＮＡ部分の塩基配列のシーケンス量を指標として、２群の被検試料中の目的ＤＮＡの塩基配列のシーケンス量を補正することができ、得られた差が、該特定の物質が投与されたことに起因する有意な差なのか、または誤差なのかを判断することができる。例えば、特定のタンパク質の発現量が小さく、バックグラウンドとの差が顕著に表れない場合などに、誤差を有意な差と判断してしまうリスクや、逆に有意な差を誤差と判断してしまうリスクを低減することができる。
【００７１】
本発明の方法によれば、高い精度で、遺伝子発現制御と疾患との関係や治療効果などを評価することができる。
例えば、特定の物質の投与により、特定のＤＮＡ領域の塩基配列のリード数が増加すれば、そのＤＮＡ領域は、その特定の物質により発現制御に変化が生じたと評価される。例えば、癌遺伝子の発現を制御する転写因子とその結合配列との相互作用をクロマチン免疫沈降で評価することにより、病態の予測や評価、さらには治療効果などを調べることができる。
また、患者由来の試料と健常人由来の試料を用いて比較することで、転写因子等のＤＮＡ結合タンパク質による転写制御と疾患の関係を調べることができる。
さらに、遺伝子変異を有する対象と、変異を有しない対象とで、それぞれの試料を用いて比較することで、転写因子等のＤＮＡ結合タンパク質による転写制御と遺伝子変異との関係を調べることができる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を逸脱しない限り、下記の実施例に限定されるものではない。
【００７３】
［試験例１］
＜ＣｈＩＰ−ｓｅｑ法を用いたヒストンＨ３タンパク質リジン２７のトリメチル化状態の解析＞
（概要）
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）に、ヒトＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子を組み込んだウイルスベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏを感染させ、細胞内でＲａｓＧ１２Ｖタンパク質を発現させた。また、別途、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子を組み込んでいない対照ウイルスベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏを感染させた。それぞれの細胞群において、リジン２７がトリメチル化されたヒストンＨ３タンパク質（以下、「Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３」と称することがある。）を認識する抗体（抗ヒストンＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体）を用いてＣｈＩＰ−ｓｅｑ法を行い、塩基配列を解読した。
Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の量は、ウェスタンブロット法の結果によれば、ＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子の発現によって変化しないことが確認された。とすれば、それぞれの細胞群においてシークエンスされる、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３が結合するゲノムの量も同等であるはずである。
以下に、試験方法の詳細と試験結果を記載する。
【００７４】
（ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養）
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、３７℃にて９５％空気と５％の二酸化炭素ガスの環境下、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウムを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）中で培養した。
【００７５】
（ウイルスベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏへのＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子の挿入）
ウイルスベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏ（東京大学医科学研究所のＤｒ．Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａより分与を受けた。）のクローニングサイトを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（タカラバイオ社）で切断し、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社）で平滑末端とした。
一方、ヒトＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子（東北大学加齢医学研究所のＤｒ．Ｍ．Ｎａｒｉｔａより分与を受けた。）を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（タカラバイオ社）とＮｏｔ  Ｉ（タカラバイオ社）で処理し、その末端をＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社）で平滑末端として、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社）を用いてｐＭＸ−ｐｕｒｏに挿入した。
【００７６】
（ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのウイルス感染）
ヒトＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子を組み込んだウイルスベクターおよび対照ベクターを、Ｐｌａｔ-Ｅ細胞（東京大学医科学研究所のＤｒ．Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａより分与を受けた。
）に遺伝子導入し、上記同様に、ＤＭＥＭ培地中で培養することによりヒトＲａｓＧ１２Ｖ発現ウイルスを産生させた。遺伝子導入は、Ｈｏｓｏｇａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．PLoS Genet. Aug 2013; 9(8): e1003698.（２０１３）に記載の方法によって行った。培養に供し
たＤＭＥＭ培地を、ウイルス含有液として回収し、ポリブレン存在下、当該ウイルス含有液中でＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養し、感染を成立させた。
【００７７】
（免疫沈降）
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１．０％ホルマリンにより、撹拌しながら室温で５分間固定した。細胞を溶解した後、超音波発生装置Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２（Ｃｏｖａｒｉｓ社）を用いてゲノムＤＮＡを２００〜７００塩基に断片化した。
一方で、表面にＰｒｏｔｅｉｎ  Ａが固定された磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に、抗ヒストンＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社  カタログ番号０７−４４９）を結合させた。
そして、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを介して抗ヒストンＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体が結合した上記磁気ビーズと、上記断片化ゲノムＤＮＡとを４℃で１４時間混和して免疫沈降を行った。
【００７８】
（シークエンス解析）
免疫沈降物１０ｎｇをＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＬＴ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ
ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてシークエンスライブラリーを作製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００でシークエンス解析を行った。シークエンスライブラリーの作製およびシークエンス解析はそれぞれＩｌｌｕｍｉｎａ社が提供するプロトコルにしたがって行った。
【００７９】
（結果）
解読塩基数は、ＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子を組み込んだウイルスベクターを感染させた細胞では６．７９×１０９塩基であったのに対し、ＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子を組み込んでいない対照ウイルスベクターを感染させた細胞では３．６８×１０９塩基であった。
上記した通り、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の量はＲａｓＧ１２Ｖ遺伝子の発現とは関係しないことが想定されたことから、それぞれの細胞群においてＣｈＩＰ−ｓｅｑ法により配列を解読すれば同等の結果が得られるはずであった。しかし、実際には、細胞群間においては解読塩基数にばらつきがあることが分かった。
これは、従来のウェスタンブロット法では、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の量を正確に測定できないことを示していると考えられる。
【００８０】
［実施例１：転写因子Ｉｒｆ４タンパク質のクロマチン免疫沈降］
＜１．クロマチン免疫沈降用の内部標準分子の作成＞
以下の手法に従って、転写因子Ｉｒｆ４タンパク質のクロマチン免疫沈降に用いる内部標準分子を作成した。
【００８１】
＜１−１．酵母ＤＮＡの調製＞
（酵母ＤＮＡ配列の選択）
本実施例では、内部標準分子の核酸として出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＮＡ配列のうちの特定のＤＮＡ配列を選択した。即ち、出芽酵母のゲノムＤＮＡ配列情報を用いて、コンピュータ上で、リピート配列でなく、出芽酵母自身の遺伝子制御配列でもない、２５０塩基長のＤＮＡ配列を選択した。さらにその中からＧＣ含量が４０％以上６０％以下の配列を選択し、既知の転写因子の結合部位がより少ないものを４種類選択した（以下、これらの塩基配列をＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＩＤ４とする。）。ＩＤ１〜ＩＤ４は、それぞれ、配列番号１〜配列番号４で表される塩基配列である。
【００８２】
ＩＤ１（配列番号１）
CTGTCGTTCTCAACGTCAACCCGTACTTCCAACTGCAGGACGACCCAACCATCAAAGACACACCAGAGACGGCGGCACAGGGCCCCTATGGCGCACACACGGTGCAGGTTCGTCGTGCCGCACGACTCACCACCTCTATTCTCAAGTTCATCCGCCAGATTCGCCACGGCACACTCCGCACAGACACTGTGCGCGGCAAAACGCCGCTGTCGATGGACCAGTATGAGCGGCTATTCGGCTCCAGTAGAAT
【００８３】
ＩＤ２（配列番号２）
TGAATCTGGTGAAGAAGAAGTACGTACTGATGGGGTGCACGCTGGCCAAAGGGTTGTTCCTGAAAAGGACCTTTCTACGGACCCTGCGTATGGTTTGACTTCGGATGAAGTCGCCAGGAGAAGAAAGAAATATGGGTTAAATCAAATGGCTGAGGAGAATGAATCGTTGATTGTGAAGTTTTTGATGTTCTTCGTAGGGCCTATTCAATTCGTTATGGAGGCTGCTGCTATTTTGGCTGCCGGTTTGTCT
【００８４】
ＩＤ３（配列番号３）
CAAATGTCCCATCAATCACGCGCAAGCGCCGCCTTCTGCCGCTGCCGCCGCTACCAGAAAATGTCCTGTTGATCACTCCGCGTTTTCGTCTGGCATGGTGGCCCCAAAGGAGGAGACTCCTCTTCCTAGGAAATGTCCAGTTGACCACACCATGTTCTCTTCGGGAATGATTCCTCCCAGAGAGGACACTTCGTCCCAGAAGAGGTGTCCCGTTGACCACACCATGTATTCCGCAGGAATGATGCCGCCC
【００８５】
ＩＤ４（配列番号４）
TTCAAAAATAGTGTAAAATGGTACCATTTCGACCACAACGACAAAAAACTATCTATAAACTCTGCAGCAAGGAACATTCAACATCTTCTGTACGGGAAGAGGTTTTTCCCTTACTACGTTCATACGATCATTGCGGGTCTTGACGAAGATGGTAAGGGCGCTGTCTATTCGTTCGACCCAGTTGGCTCCTACGAAAGAGAACAGTGTAGAGCAGGTGGTGCTGCGGCATCATTGATCATGCCATTTTTGG
【００８６】
（ベクターへ挿入するＩＤ１〜ＩＤ４の酵母ＤＮＡの調製）
出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１株のＤＮＡを含有するクロマチン分画は、Ｄｒ．Ｍ．Ｈａｒａｄａ（東北大学農学部）から入手した。
ＢＹ４７４１株のＤＮＡを含有するクロマチン分画中のＤＮＡを鋳型として、ＩＤ１〜ＩＤ４の酵母ＤＮＡを、それぞれの５’末端および３’末端から増幅するように設計したプライマーセットを用いて、ＰＣＲにより増幅した。
【００８７】
ＩＤ１〜ＩＤ４の各酵母ＤＮＡを増幅するのに用いたプライマーセットは以下の通りである。
ＩＤ１の酵母ＤＮＡの増幅には、フォワードプライマー：５’−ＣＴＧＴＣＧＴＴＣＴＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＣ−３’（配列番号５）、リバースプライマー：５’−ＡＴＴＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣ−３’ （配列番号６）を用いた。
【００８８】
ＩＤ２の酵母ＤＮＡの増幅には、フォワードプライマー：５’−ＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣ−３’（配列番号７）、リバースプライマー：５’−ＡＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧ−３’ （配列番号８）を用いた。
【００８９】
ＩＤ３の酵母ＤＮＡの増幅には、フォワードプライマー：５’−ＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＣＡＣＧＣ−３’（配列番号９）、リバースプライマー：５’−ＧＧＧＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＧＧＡ−３’ （配列番号１０）を用いた。
【００９０】
ＩＤ４の酵母ＤＮＡの増幅には、フォワードプライマー：５’−ＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＴＡＡＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１１）、リバースプライマー：５’−ＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号１２）を用いた。
【００９１】
ＰＣＲ増幅は、高成功率ＰＣＲ酵素ＫＯＤ  ＦＸ  ＮＥＯ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、（９８℃で１０秒、５７℃で３０秒、６８℃で２０秒）×３５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ増幅後、１０ｘ  Ａ−ａｔｔａｃｈｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、増幅ＤＮＡの５’末端および３’末端にＡを付加した。
【００９２】
（ｐＴＡ２ベクターへのＩＤ１〜ＩＤ４の酵母ＤＮＡの挿入）
ｐＴＡ２ベクターへＩＤ１〜ＩＤ４の酵母ＤＮＡを挿入するライゲーションにおいては、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。上記ＰＣＲで増幅したＩＤ１〜ＩＤ４の各酵母ＤＮＡを、ｐＴＡ２ベクター（ＴＯＹＯＢＯ）へ、ＴＡクローニング法によって挿入し、組換えベクターを得た（以下、それぞれを「ｐＴＡ２−ＩＤ１ベクター」、「ｐＴＡ２−ＩＤ２ベクター」、「ｐＴＡ２−ＩＤ３ベクター」、「ｐＴＡ２−ＩＤ４ベクター」などと称することがある。）。
【００９３】
（ＩＤ１〜ＩＤ４のビオチン化酵母ＤＮＡの調製）
ＩＤ１〜ＩＤ４のビオチン化酵母ＤＮＡは、それぞれ、ｐＴＡ２−ＩＤ１ベクター、ｐＴＡ２−ＩＤ２ベクター、ｐＴＡ２−ＩＤ３ベクター、ｐＴＡ２−ＩＤ４ベクターを鋳型ＤＮＡとするＰＣＲにより得た。
ＰＣＲ増幅におけるプライマーセットとしては、ＩＤ１〜ＩＤ４の各酵母ＤＮＡの５’末端および３’末端から増幅するように設計したプライマーセット（ＩＤ１の増幅には、前記配列番号５及び配列番号６、ＩＤ２の増幅には、前記配列番号７及び配列番号８、ＩＤ３の増幅には、前記配列番号９及び配列番号１０、ＩＤ４の増幅には、前記配列番号１１及び配列番号１２）であって、各プライマーの５’末端がビオチン化されたものを用いた。 
【００９４】
ＰＣＲ増幅は、高成功率ＰＣＲ酵素ＫＯＤ  ＦＸ  ＮＥＯ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、（９８℃で１０秒、５７℃で３０秒、６８℃で２０秒）×３５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ増幅後、ＩＤ１〜ＩＤ４のビオチン化酵母ＤＮＡは、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００９５】
上記ＰＣＲにより生成されるビオチン化酵母ＤＮＡは、表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズを用いて免疫沈降を行った場合に磁気ビーズ分画に含まれることになる。
図１は、上記ＰＣＲによりビオチン化酵母ＤＮＡが生成されたことを示唆するアガロースゲル電気泳動の写真である。ここでは、酵母ＤＮＡとしてＩＤ１の酵母ＤＮＡを用い、ＰＣＲにおいては、配列番号５及び配列番号６で表されるプライマーセットを用いた。また、表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズとして、Dynal/Invitrogen社のDynabeads M-280 Streptavidin磁気ビーズを用い、添付のプロトコルに従って免疫沈降を行ったものである。
【００９６】
レーン１は、ＩＤ１の非ビオチン化酵母ＤＮＡと、表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズを用いて免疫沈降を行った場合の上清分画に含まれるＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅した場合に得られたＰＣＲ産物を電気泳動したレーンである。
【００９７】
レーン２は、ＩＤ１の非ビオチン化酵母ＤＮＡと、表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズを用いて免疫沈降を行った場合の磁気ビーズ分画に含まれるＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅した場合に得られたＰＣＲ産物を電気泳動したレーンである。
【００９８】
レーン３は、ＩＤ１のビオチン化酵母ＤＮＡと、表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズを用いて免疫沈降を行った場合の上清分画に含まれるＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅した場合に得られたＰＣＲ産物を電気泳動したレーンである。
【００９９】
レーン４は、ＩＤ１のビオチン化酵母ＤＮＡと、表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズを用いて免疫沈降を行った場合の磁気ビーズ分画に含まれるＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅した場合に得られたＰＣＲ産物を電気泳動したレーンである。
【０１００】
非ビオチン化酵母ＤＮＡを用いた場合、該酵母ＤＮＡは、表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズと結合しない。そのため、酵母ＤＮＡは上清分画に含まれる一方、磁気ビーズ分画には含まれないと考えられるところ、確かにレーン１にバンドが確認され、レーン２にはバンドが確認されなかった。
また、ビオチン化酵母ＤＮＡを用いた場合、該酵母ＤＮＡは表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズと結合する。そのため、酵母ＤＮＡはビーズ分画に含まれる一方、上清分画には含まれないと考えられるところ、確かにレーン４にバンドが確認され、レーン３にはバンドが確認されなかった。
以上より、本方法によって、ビオチン化酵母ＤＮＡの調製ができることが分かった。
【０１０１】
＜１−２．転写因子Ｉｒｆ４タンパク質の配列とストレプトアビジン配列と４ｘＦｌａｇ配列とを含む融合タンパク質の調製＞
（ベクターへ挿入するＩＲＦ４遺伝子の調製）
ＭｉｇＲ  ＬＶＰ  ＩＲＦ４ベクター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｈａｒｉｎｄｅｒ  Ｓｉｎｇｈ研究室より分与を受けた。）ＤＮＡを鋳型として、ＩＲＦ４遺伝子配列（配列番号１３）をＰＣＲにより増幅した。
【０１０２】
ＰＣＲに用いたプライマーセットは、ＩＲＦ４遺伝子配列（配列番号１３）の５’末端および３’末端から増幅するように設計したものであり、さらに、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトを付加したものである。具体的には、フォワードプライマー：５’−ｇｃｇＡＡＧＣＴＴａｔｇａａｃｔｔｇｇａｇａｃｇｇｇｃ−３’（配列番号１４）、リバースプライマー：５’−ｇｃｇＡＡＧＣＴＴｔｃａｃｔｃｔｔｇｇａｔｇｇａａｇａ−３’ （
配列番号１５）を用いた。尚、大文字で記載した塩基配列が制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトである。
【０１０３】
ＰＣＲ増幅は、高成功率ＰＣＲ酵素ＫＯＤ  ＦＸ  ＮＥＯ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、（９８℃で１０秒、５７℃で３０秒、６８℃で４０秒）×３５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ増幅後、ＩＲＦ４遺伝子配列は、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１０４】
（ベクターへ挿入するＰａｘ５遺伝子の調製）
ＭｉｇＲ  Ｐａｘ５ベクター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｈａｒｉｎｄｅｒ  Ｓｉｎｇｈ研究室より分与を受けた。）ＤＮＡを鋳型として、Ｐａｘ５遺伝子配列（配列番号１６）をＰＣＲにより増幅した。 
【０１０５】
ＰＣＲに用いたプライマーセットは、Ｐａｘ５遺伝子配列（配列番号１６）の５’末端および３’末端から増幅するように設計したものであり、さらに、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトを付加したものである。具体的には、フォワードプライマー：５’−ｇｃｇ  ＡＡＧＣＴＴａｔｇｇａｔｔｔａｇａｇａａａａａｔｔａｃｃ−３’（配列番号１７）、リバースプライマー：５’−ｇｃｇＡＡＧＣＴＴｔｃａｇｔｇａｃｇｇｔｃａｔａｇｇｃｇｇ−３’ （配列番号１８）を用いた。尚、大文字で記載した塩基配列が制限酵素Ｈｉ
ｎｄ  ＩＩＩサイトである。
【０１０６】
ＰＣＲ増幅は、高成功率ＰＣＲ酵素ＫＯＤ  ＦＸ  ＮＥＯ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、（９８℃で１０秒、５７℃で３０秒、６８℃で２０秒）×３５サイクルの条件で行った。Ｐ
ＣＲ増幅後、Ｐａｘ５遺伝子配列は、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１０７】
（ベクターへ挿入する４ｘＦｌａｇ遺伝子の調製）
ｐＭＳＣＶ  ４ｘＦｌａｇベクター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｈａｒｉｎｄｅｒ  Ｓｉｎｇｈ研究室より分与を受けた。）ＤＮＡを鋳型として、４ｘＦｌａｇ遺伝子配列（配列番号１９）をＰＣＲにより増幅した。
【０１０８】
ＰＣＲに用いたプライマーセットは、４ｘＦｌａｇ遺伝子配列（配列番号１９）の５’末端および３’末端から増幅するように設計したものであり、さらに、フォワードプライマーに制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉサイトを、リバースプライマーにＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトを付加したものである。具体的には、フォワードプライマー：５’−ｇｃｇＧＡＡＴＴＣｇｇｃｇｇｃａｔｇｇａｃｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇ−３’（配列番号２０）、リバースプライマー：５’−ｇｃｇＡＡＧＣＴＴｇｃｃｇｃｃｃｔｔａｔｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｔｔｔｇ−３’（配列番号２１）を用いた。尚、大文字で記載した塩基配列が制限酵素サイトである。
【０１０９】
ＰＣＲ増幅は、高成功率ＰＣＲ酵素ＫＯＤ  ＦＸ  ＮＥＯ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、（９８℃で１０秒、５７℃で３０秒、６８℃で１５秒）×３５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ増幅後、４ｘＦｌａｇ遺伝子配列は、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１１０】
（ベクターへ挿入するストレプトアビジン遺伝子の調製）
ｐＥＴ２１ａ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｉｖｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃２０８６０；  Ａｄｄｇｅｎｅ）ベクターＤＮＡを鋳型として、ストレプトアビジン遺伝子配列（配列番号２２）をＰＣＲにより増幅した。
【０１１１】
ＰＣＲに用いたプライマーセットは、ストレプトアビジン遺伝子配列（配列番号２２）の５’末端および３’末端から増幅するように設計したものであり、さらに、フォワードプライマーに制限酵素Ｘｈｏ  Ｉサイトを、リバースプライマーにＥｃｏＲ  Ｉサイトを付加したものである。具体的には、フォワードプライマー：５’−ｇｃｇＣＴＣＧＡＧＡＴＧｇｃｔｇａａｇｃｔｇｇｔａｔｃａｃ−３’（配列番号２３）、リバースプライマー：５’−ｇｃｇＧＡＡＴＴＣａｔｇｇｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇ−３’（配列番号２４）を用いた。尚、大文字で記載した塩基配列が制限酵素サイトである。
ＰＣＲ増幅は、高成功率ＰＣＲ酵素ＫＯＤ  ＦＸ  ＮＥＯ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、（９８℃で１０秒、５７℃で３０秒、６８℃で１５秒）×３５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ増幅後、ストレプトアビジン遺伝子配列は、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１１２】
（ｐｃＤＮＡ３ベクターへのストレプトアビジン遺伝子及び４ｘＦｌａｇ遺伝子、並びに、ＩＲＦ４遺伝子又はＰａｘ５遺伝子の挿入）
ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のマルチクローニングサイトを制限酵素Ｘｈｏ  ＩとＥｃｏＲ  Ｉで処理した。一方で、ＰＣＲで増幅したストレプトアビジン遺伝子を、同様に制限酵素Ｘｈｏ  ＩとＥｃｏＲ  Ｉで処理した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いてストレプトアビジン遺伝子をｐｃＤＮＡ３ベクターへ挿入し、組換えベクター（以下、「ｐｃＤＮＡ３  ＳＡベクター」と称することがある。）を作成した。
【０１１３】
次に、ｐｃＤＮＡ３  ＳＡベクターのマルチクローニングサイトを制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで処理した。一方で、ＰＣＲで増幅した４ｘＦｌａｇ遺伝子を、同
様に制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで処理した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いて４ｘＦｌａｇ遺伝子をｐｃＤＮＡ３  ＳＡベクターへ挿入し、組換えベクター（以下、「ｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇベクター」と称することがある。）を作成した。
【０１１４】
次に、ｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇベクターのマルチクローニングサイトを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで処理した。一方で、ＰＣＲで増幅したＩＲＦ４遺伝子または制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで処理したＰａｘ５遺伝子を、同様に制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで処理した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ、同様に制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで処理した。挿入し、組換えベクター（以下、それぞれ、「ｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇ−ＩＲＦ４ベクター」、「ｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇ−Ｐａｘ５ベクター」と称することがある。）を作成した。
【０１１５】
（試験管内翻訳）
ｐｃＤＮＡ３  ベクターは、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒを保持する。試験管内翻訳は、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
上で作成したｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇ−ＩＲＦ４ベクターまたはｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇ−Ｐａｘ５ベクターを鋳型とし、試験管内翻訳により、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＩＲＦ４タンパク質を含む融合タンパク質、または、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＰａｘ５タンパク質を含む融合タンパク質を産生した。
【０１１６】
次に、上記試験管内翻訳によって目的とするタンパク質が翻訳できているかどうかを確認した。結果を図２に示す。
ｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇ−ＩＲＦ４ベクター、またはｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇ−Ｐａｘ５ベクターを鋳型として試験管内翻訳した翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、抗ＩＲＦ４抗体（サンタクルズ社）、抗Ｐａｘ５抗体（サンタクルズ社）、または抗Ｆｌａｇ抗体（シグマ社）でウェタンブロット解析した。
ｐｃＤＮＡ３  ＳＡ−４ｘＦｌａｇ−ＩＲＦ４ベクターを鋳型として試験管内翻訳した場合には、抗ＩＲＦ４抗体と抗Ｆｌａｇ抗体で特異的なバンドが確認され、ｐｃＤＮＡ３
ＳＡ−４ｘＦｌａｇ−Ｐａｘ５ベクターを鋳型として試験管内翻訳した場合には、抗Ｐａｘ５抗体と抗Ｆｌａｇ抗体で特異的なバンドが確認されたことから、目的の融合タンパク質が試験管内翻訳されたことが分かった。
【０１１７】
＜１−３．内部標準分子の製造＞
（内部標準分子の製造）
次に、上で調製したＩＤ１〜ＩＤ４のビオチン化酵母ＤＮＡと、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＩＲＦ４タンパク質を含む融合タンパク質、または、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＰａｘ５タンパク質を含む融合タンパク質とを用いて、以下のように内部標準分子を製造した。
【０１１８】
（ビオチン−ストレプトアビジン結合）
ＩＤ１〜ＩＤ４のビオチン化酵母ＤＮＡと、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＩＲＦ４タンパク質を含む融合タンパク質、または、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＰａｘ５タンパク質を含む融合タンパク質を混和し、４℃、１時間静置してビオチンとストレプトアビジンとを結合させた。
【０１１９】
（ビオチン化酵母ＤＮＡ量と内部標準分子の生成量との関係）
次に、ビオチン化酵母ＤＮＡと、融合タンパク質との結合反応における、ビオチン化酵母ＤＮＡの添加量による内部標準分子の生成量の変化を確認した。ここでは、酵母ＤＮＡとしてＩＤ１の酵母ＤＮＡを用い、融合タンパク質として、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＩＲＦ４タンパク質を含む融合タンパク質を用いた。
【０１２０】
ビオチン化酵母ＤＮＡ（濃度１０ｎｇ／μＬ）、融合タンパク質、１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及び、蒸留水を、表１の容量で混合し、４℃で１時間、ビオチン−ストレプトアビジン反応をおこなった。
【０１２１】
尚、表中の（ａ）〜（ｄ）は以下を表す。
（ａ）：ビオチン化酵母ＤＮＡ（濃度１０ｎｇ／μＬ）の添加量（μＬ）
（ｂ）：融合タンパク質の添加量（μＬ）
（ｃ）：１０×ＰＢＳの添加量（μＬ）
（ｄ）：蒸留水の添加量（μＬ）
【０１２２】
【表１】
2018082622.tif 000003
【０１２３】
反応後、表面に抗Ｆｌａｇ抗体が固定された磁気ビーズ（抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体磁気ビーズ＞０．６ｍｇ／ｍＬ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ；シグマ−アルドリッチ）を５μＬ添加し、４℃で１時間反応させた。反応後、磁石で磁気ビーズを試験管内壁に引き寄せて磁気ビーズをＰＢＳで３回洗浄した。このとき上清画分は別途回収した。
【０１２４】
次に、上清画分と磁気ビーズ画分とに含まれる酵母ＤＮＡを、それぞれ、配列番号５及び配列番号６で表されるプライマーセットを用いて定量ＰＣＲにより定量した。ＰＣＲ反応は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）機器、ＳＹＢＲ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｑＰＣＲプレミックス（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で３３秒、９５℃で１５秒）×４０サイクルの条件で行った。
【０１２５】
定量ＰＣＲの結果を図３に示す。製造した内部標準分子のうち試料４〜７では、ＤＮＡが同程度に増幅されることが分かった。一方、融合タンパク質と結合せずに上清画分に含まれた未反応ビオチン化酵母ＤＮＡの量は、試料４以降では、ＩＤ１のビオチン化酵母ＤＮＡの添加量に依存して以降徐々に上昇した（Ｃｔ値が小さくなった）。つまり、使用した融合タンパク質に対するビオチン化酵母ＤＮＡは、試料４の１μＬで十分であることがわかった。
【０１２６】
＜１−４．製造した内部標準分子の評価＞
（内在性タンパク質の免疫沈降における内部標準分子の存在の影響）
次に、内在性タンパク質を免疫沈降した場合に、内部標準分子の存在がどのように影響するかを確認した。ここでは、酵母ＤＮＡとしてＩＤ１の酵母ＤＮＡを、融合タンパク質
として、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＩＲＦ４タンパク質を含む融合タンパク質を用いた。
【０１２７】
理化学研究所の黒崎知博教授より供与された抗体遺伝子トランスジェニックマウスＢ１-８Ｈｉ（オリジナルはＰｒｏｆ．  Ｍｉｃｈｅｌ  Ｃ．  Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ（The
Rockefeller University））より脾臓Ｂリンパ球を単離し、３７℃にて９５％空気と５
％の二酸化炭素ガスの環境下、試験管内で抗原ＮＰ（４０）−ｆｉｃｏｌおよびサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＣＤ４０Ｌ）存在下で３日間培養後、１．０％ホルマリンで室温１０分間固定した。
【０１２８】
2.5 M Glycineを最終濃度が1/20量となるように加えることで固定反応を止め、固定後
の細胞をPBSにて洗浄し、細胞質溶解バッファーを加え、氷上で10分間反応させた。遠心
にて細胞画分が含まれる上清を除去後、核画分である沈査を核画分溶解バッファーで溶解し、音波発生装置Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（コスモバイオ社、ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いてゲノムＤＮＡを１００〜５００塩基に断片化した。断片化されたゲノムＤＮＡと、表面にプロテインＡ／Ｇが固定された磁気ビーズ（Novex/life technologies社）とを４℃で１
時間反応させ、プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズへ非特異的に結合する画分の除去をおこなった。
【０１２９】
次に、磁石でプロテインＡ／Ｇ磁気ビーズを試験管内壁に吸着後、プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズに非特異的に結合しなかった上清画分を採取した。そして、内部標準分子を０、１、２、５、または１０μＬ添加後、抗Ｉｒｆ４抗体（ｓｃ−６０５９、サンタクルズ社）で４℃一晩反応させ、その後プロテインA/G磁気ビーズを加え４℃で２時間反応させて
免疫沈降を行った。尚、内部標準分子を１０μＬ添加し、抗体としてＩｇＧ抗体で免疫沈降したものをコントロールとした。
【０１３０】
ここで、内部標準分子の製造に際し、ビオチンを介して融合タンパク質中のストレプトアビジンと結合しない酵母ＤＮＡも存在する。そのため、結合しなかった酵母ＤＮＡを除去するために、ビオチン−ストレプトアビジン結合反応後、表面にストレプトアビジンが固定された磁気ビーズを添加し、撹拌しながら４℃で１時間反応させ、磁石を用いて試験管内壁に引き寄せられる磁気ビーズ画分を除去した。尚、コントロールとして、この操作をしなかったものも調製し、以降で相違を検討した。
【０１３１】
免疫沈降後、表面に抗Irf4抗体が固定された磁気ビーズを用いて、撹拌しながら４℃で１時間反応させ、磁石を用いて試験管内壁に引き寄せられる磁気ビーズ画分を免疫沈降物として回収した。
【０１３２】
次に、磁気ビーズ画分に含まれる酵母ＤＮＡを、配列番号５及び配列番号６で表されるプライマーセットを用いて、定量ＰＣＲにより定量した。ＰＣＲ反応は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）機器、ＳＹＢＲ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｑＰＣＲプレミックス（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で３３秒、９５℃で１５秒）×４０サイクルの条件で行った。
【０１３３】
結果を図４に示す。縦軸は、免疫沈降に用いた断片化したクロマチンＤＮＡの量を１００％としたときの免疫沈降されたＤＮＡの相対量（ｉｎｐｕｔ％）を表し、定量PCRによ
り算出した。この結果より、内部標準分子を添加しても細胞が内在的に有しているＩｒｆ４タンパク質は標的遺伝子であるＩｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域のＤＮＡに結合し、この結合は、内部標準分子の添加によっても大きく阻害されないことが分かった。
尚、融合タンパク１μＬの場合と２μＬの場合では、融合タンパク無添加の場合よりもｉｎｐｕｔ％が大きいが、これは実験の誤差範囲と考えられる。
【０１３４】
定量ＰＣＲの結果を図５に示す。この結果より、内部標準分子の添加量が増加すれば、免疫沈降される酵母ＤＮＡの量が増加することから、免疫沈降の工程において内部標準分子を免疫沈降できていることがわかった。また、前述した、ビオチンを介して融合タンパク質中のストレプトアビジンと結合しなかった酵母ＤＮＡを除去する工程を経ても経なくても、定量ＰＣＲの鋳型となる酵母ＤＮＡの量に差がないことも分かった。
【０１３５】
＜２．内部標準分子を用いたデータの補正＞
＜２−１．試験細胞株の樹立＞
本実施例では、以下のようにして、上記した転写因子Ｉｒｆ４タンパク質の発現量を調節できる細胞株（本明細書では、「Ｉｒｆ４誘導型Ｂ細胞株」や「ｐｒｅ−Ｂ細胞株」、「Ｂ細胞株」などと称することがある。）を樹立した。
【０１３６】
（Ｉｒｆ４誘導型Ｂ細胞株の樹立）
Ｉｒｆ４とその類似因子Ｉｒｆ８の両方を欠損するマウス（ｄＫＯ、Ｄｒ．Ｒ．Ｓｃｉａｍｍａｓ（Houston Methodist）より供与された。）に、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）
で誘導可能なＩｒｆ４発現遺伝子（ｒｔＴＡ：ＴｅｔＯ−Ｉｒｆ４）を、遺伝子改変マウスを交配させることで導入した。
【０１３７】
同マウスより、骨髄Ｂ細胞をB細胞表面マーカーであるＢ２２０でセレクションした。
セレクションした細胞を、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７含有ＯｐｔｉＭＥＭ培地（５％ＦＣＳ、５０μＭ  β−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシン添加）で、３７℃にて９５％空気と５％の二酸化炭素ガスの環境下、５〜１０日間培養し、Ｉｒｆ４誘導型Ｂ細胞株を樹立した。
【０１３８】
（ＤＯＸ濃度とＩｒｆ４タンパク質発現量との関係）
次に、上で樹立したＢ細胞株が、ＤＯＸ濃度依存的にＩｒｆ４タンパク質を高発現することを確認した。
Ｉｒｆ４誘導型でない細胞（ｄＫＯ）をコントロール細胞とし、Ｉｒｆ４誘導型細胞を、ＤＯＸ濃度の最終濃度が、０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、４８時間培養した。
【０１３９】
培養後に細胞を回収し、細胞の全抽出液を用いて、ウェスタンブロット法にてＩｒｆ４タンパク質の発現を確認した。その結果を図６に示す。
この結果より、上で樹立したＢ細胞株は、ＤＯＸ濃度依存的にＩｒｆ４タンパク質発現量が上昇することがわかった。
【０１４０】
（ＤＯＸ濃度とＩｇκ遺伝子の発現量との関係）
Ｉｒｆ４標的遺伝子としてＩｇκ遺伝子が知られている。そこで次に、ＤＯＸ濃度に依存したＩｇκ遺伝子の発現の変化を検討した。
【０１４１】
Ｉｇκ遺伝子の発現の変化は、定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により解析した。
Ｉｇκ遺伝子の増幅にはフォワードプライマー：５’−ＧＡＧＧＧＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＣＴＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号２５）、リバースプライマー：５’−ＧＴＴＡＴＧＴＣＧＴＴＣＡＴＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣ−３’ （配列番号２６
）を用いた。
【０１４２】
定量逆転写ＰＣＲは、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）機器およびＳＹＢＲ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｑＰＣＲプレミックス（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、９５℃を１０分、（９５℃で１５秒、６０℃を３３秒、９５℃を１５秒）×４
０サイクルの条件で行った。
【０１４３】
定量逆転写ＰＣＲの結果を図７に示す。この結果より、ＤＯＸ濃度に依存するＩｒｆ４タンパク質の発現量の上昇に伴い、Ｉｇκ遺伝子発現誘導が上昇することがわかった。ポジティブコントロールとして、異なる２個体のマウス骨髄より採取したＢ細胞ＢＭ１およびＢＭ２と比較している。
【０１４４】
（ＤＯＸ濃度と、Ｉｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域へのＩｒｆ４タンパク質の結合量との関係）
また、以下のようにして抗Ｉｒｆ４抗体を用いたクロマチン免疫沈降及び定量ＰＣＲを行い、ＤＯＸ濃度に依存した、Ｉｒｆ４タンパク質のＩｇκ遺伝子への結合の変化を検討した。
【０１４５】
上で樹立したＢ細胞株を、試験管内で、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７存在下、ＤＯＸ濃度が０、１００、２００、または４００ｎｇ／ｍＬという条件下で２日間培養後、１．０％ホルマリンで室温１０分間固定した。
細胞質画分を除去後、核画分を溶解し、超音波発生装置Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（コスモバイオ社、ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いてゲノムＤＮＡを１００〜５００塩基に断片化した。そこへ、抗Ｉｒｆ４抗体（ｓｃ−６０５９、サンタクルズ社）で添加し、免疫沈降を行った。尚、抗体としてＩｇＧ抗体で免疫沈降したものをコントロールとした。
免疫沈降後、表面に抗Irf4抗体が固定された磁気ビーズを用いて、撹拌しながら４℃で１時間反応させ、磁石を用いて試験管内壁に引き寄せられる磁気ビーズ画分を免疫沈降物として回収した。
【０１４６】
次に、磁気ビーズ画分に含まれるＩｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域のＤＮＡを定量ＰＣＲにより定量した。Ｉｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域のＤＮＡの増幅には、フォワードプライマー：５’−ＴＣＡＴＡＧＣＴＡＣＣＧＴＣＡＣＡＣＴＧ−３’（配列番号２７）、リバースプライマー：５’−ＡＡＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＴＡＡＧＧＴＴＣ−３’ （配列番号２８
）を用いた。
【０１４７】
ＰＣＲ反応は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）機器、ＳＹＢＲ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｑＰＣＲプレミックス（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、９５℃を１０分、（９５℃を１５秒、６０℃を３３秒、９５℃を１５秒）×４０サイクルの条件で行った。
【０１４８】
定量ＰＣＲの結果を図８に示す。縦軸は、免疫沈降に用いた断片化したクロマチンＤＮＡ量を１００％としたときの免疫沈降されたＤＮＡの相対量を表す。この結果より、ＤＯＸ濃度に依存するＩｒｆ４タンパク質の発現量の上昇に伴い、Ｉｒｆ４タンパク質による免疫沈降率の上昇、すなわち、Ｉｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域へのＩｒｆ４タンパク質の結合量が上昇することがわかった。
【０１４９】
＜２−２．ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ＞
（免疫沈降）
上記と同様に、Ｉｒｆ４誘導型Ｂ細胞株を種々のＤＯＸ濃度（０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地で４８時間培養し、１．０％ホルマリンで室温１０分間固定した。そして、細胞質画分を除去後、核画分を溶解し、超音波発生装置Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（コスモバイオ社、ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いてゲノムＤＮＡを１００〜５００塩基に断片化した。
【０１５０】
次に、クロマチン５０μｇに対して、酵母ＤＮＡとしてＩＤ１〜ＩＤ４の各酵母ＤＮＡ
、融合タンパク質として、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＩＲＦ４タンパク質を含む融合タンパク質を含む内部標準分子をそれぞれ０．１ｎｇ添加して抗Ｉｒｆ４抗体を用いた免疫沈降を行った。尚、抗体としてＩｇＧ抗体で免疫沈降したものをコントロールとした。
【０１５１】
（シークエンシング）
上記免疫沈降で得られた免疫沈降物を、次世代シークエンサーに適用して塩基配列の解読を行った。シークエンス解析は、ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＬＴ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてシークエンスライブラリーを作製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００で行った。ライブラリー作製およびシークエンス解析は、いずれもＩｌｌｕｍｉｎａ社が提供するプロトコルに従って行った。
【０１５２】
得られたシークエンスを酵母のゲノムＤＮＡにマップしたところ、ＩＤ１〜ＩＤ４の酵母ＤＮＡを含む内部標準分子において、それぞれ、図９のようなリード数が得られた。ＤＯＸ濃度にかかわらず、ほぼ一定量の酵母ＤＮＡが沈降していることが示された。ＩＤ１〜ＩＤ４の間のリード数の違いの原因は、ライブラリー作成時の増幅効率の違いなどが考えられる。
【０１５３】
（免疫沈降による目的のＤＮＡ断片の回収量）
上記と同様に、Ｉｒｆ４誘導型Ｂ細胞株を種々のＤＯＸ濃度（０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地で４８時間培養し、１．０％ホルマリンで室温１０分間固定した。そして、細胞質画分を除去後、核画分を溶解し、超音波発生装置Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（コスモバイオ社、ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いてゲノムＤＮＡを１００〜５００塩基に断片化した。
【０１５４】
次に、クロマチン５０μｇに対して、酵母ＤＮＡとしてＩＤ１〜ＩＤ２の各酵母ＤＮＡ、融合タンパク質として、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＩＲＦ４タンパク質を含む融合タンパク質を含む内部標準分子をそれぞれ０．１ｎｇ添加して抗Ｉｒｆ４抗体を用いた免疫沈降を行った。尚、抗体としてＩｇＧ抗体で免疫沈降したものをコントロールとした。
【０１５５】
その後、上記免疫沈降により得られた免疫沈降物中の、内在性Ｉｒｆ４タンパク質が結合するＩｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域のＤＮＡ量と、ＩＤ１又はＩＤ２の酵母ＤＮＡ量とを、定量ＰＣＲにより定量した。
【０１５６】
Ｉｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域のＤＮＡの増幅には、配列番号２７及び配列番号２８で表されるプライマーセットを用いた。
ＩＤ１の酵母ＤＮＡの増幅には、配列番号５及び配列番号６で表されるプライマーセットを用いた。
ＩＤ２の酵母ＤＮＡの増幅には、配列番号７及び配列番号８で表されるプライマーセットを用いた。
【０１５７】
ＰＣＲ反応は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）機器、ＳＹＢＲ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｑＰＣＲプレミックス（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、９５℃を１０分、（９５℃を１５秒、６０℃を３３秒、９５℃を１５秒）×４０サイクルの条件で行った。
【０１５８】
（免疫沈降による、内在性Ｉｒｆ４タンパク質が結合するＩｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域ＤＮＡの回収量）
結果を図１０に示す。内部標準分子の存在下であっても、ＤＯＸ濃度に依存するＩｒｆ
４タンパク質の発現量の上昇に伴い、Ｉｒｆ４タンパク質による免疫沈降率の上昇、すなわち、Ｉｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域へのＩｒｆ４タンパク質の結合量が上昇することがわかった。
【０１５９】
（免疫沈降によるＩＤ１又はＩＤ２の酵母ＤＮＡの回収量）
結果を図１１に示す。Ｉｎｐｕｔサンプルには内部標準分子が含まれないため、ＤＯＸ濃度がいずれの場合であってもＩＤ１、ＩＤ２の酵母ＤＮＡの増幅量は低い（Ｃｔ値が大きい）。一方で、各酵母ＤＮＡ、融合タンパク質として、ストレプトアビジン、４ｘＦｌａｇタンパク質、及びＩＲＦ４タンパク質を含む融合タンパク質を含む内部標準分子を添加した上で抗Ｉｒｆ４抗体を用いて免疫沈降した場合には、コントロール抗体ＩｇＧと比較してすべてのサンプルでＩＤ１、ＩＤ２の増幅量が多く（Ｃｔ値が小さい）、その割合はＤＯＸ濃度に依存しない。
この結果より、酵母ＤＮＡの免疫沈降は、ＤＯＸ濃度に大きく影響されないことが分かった。
【０１６０】
（ＤＯＸ濃度と次世代シーケンサーにおけるリード数の関係）
上記免疫沈降により得られた沈降ＤＮＡを次世代シークエンサーに適用して得られた配列リードをマウスゲノム上へマップしたなかの、ＤＯＸ誘導Ｉｒｆ４タンパク質が結合するＩｇκ遺伝子のκ３’Ｅ領域のマッピング結果を図１２に示す。
【０１６１】
次に、図１２で得られたようなＤＯＸ誘導Ｉｒｆ４結合ピークを、ゲノム全体で同定し、各濃度でピークを決定した。その後、各濃度のピーク範囲の和集合を取って、その範囲内にマップされるリード数をカウントした。
結果を図１３に示す。横軸はＤＯＸ濃度を表し、縦軸は上で決定された結合ピーク範囲内のリード数を表す。この結果より、上で決定された結合ピーク範囲内のリード数は、ＤＯＸ濃度依存的に増加することが分かった。
【０１６２】
（内部標準分子を用いたデータの補正）
本実施例の内部標準分子を用いたデータの補正について、図１４を用いて説明する。図１４のグラフにおいて、横軸は結合ピーク範囲内のリード数を表し、縦軸は結合ピーク範囲内の全リード数に対する特定のリード数の割合を示す密度分布である。
結合ピーク範囲内のリード数を全リード数で除する従来の補正を行ったときの密度分布を図１４左図に示す。また、結合ピーク範囲内のリード数を内部標準分子の一例である酵母ＤＮＡのリード数で除する本実施例の補正を行ったときの密度分布を図１４右図に示す。
本実施例の密度分布では、ＤＯＸ濃度が１００ｎｇ／ｍＬである場合と２００ｎｇ／ｍＬである場合との間で特に分離が明瞭になったことから、本実施例の補正は、ＤＯＸ濃度の異なるサンプル間での比較、換言すれば、Ｉｒｆ４タンパク質の量が異なるサンプル間での比較に有効であることが分かった。
【０１６３】
［実施例２：リジン２７がアセチル化されたヒストンＨ３タンパク質のクロマチン免疫沈降］
＜２．クロマチン免疫沈降用の内部標準分子の作成＞
以下の手法に従って、リジン２７がアセチル化されたヒストンＨ３タンパク質（以下、「Ｈ３Ｋ２７Ａｃ」と称することがある。）のクロマチン免疫沈降に用いる内部標準分子を作成した。
【０１６４】
＜２−１．ＩＤ１のアミノ化酵母ＤＮＡの調製＞
ＩＤ１のアミノ化酵母ＤＮＡは、ｐＴＡ２−ＩＤ１ベクターを鋳型ＤＮＡとするＰＣＲにより得た。ＰＣＲ増幅におけるプライマーセットとしては、ＩＤ１の酵母ＤＮＡの５’
末端および３’末端から増幅するように設計したプライマーセット（配列番号５及び配列番号６）であって、各プライマーの５’末端がアミノ基修飾されているものを用いた。尚、各プライマーの５’末端とアミノ基との間には、６炭素（Ｃ６）のスペーサーが存在するものを用いた。
【０１６５】
（ＩＤ１のアミノ化酵母ＤＮＡのＳＭＣＣ化）
増幅されたアミノ化酵母ＤＮＡを、尿素含有ゲルを用いて精製し、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．２）溶液後、２００ｎｍｏｌｅのＳＭＣＣを加えよく混和し室温で３０分間反応させた。
【０１６６】
＜２−２．リジン２７がアセチル化されたヒストンＨ３タンパク質の調製＞
Dr.木村（東京工業大学）よりH3K27アセチル化特異的修飾ペプチド情報を取得し、システインも含めたペプチドをシグマ社に合成依頼した。
【０１６７】
＜２−３．内部標準分子の製造＞
（内部標準分子の製造）
次に、上で調製したＩＤ１のＳＭＣＣ化されたアミノ化酵母ＤＮＡと、システイン標識されたＨ３Ｋ２７Ａｃとを結合させて、本実施例の内部標準分子を製造した。
【０１６８】
（ＳＭＣＣ−システイン結合）
ＳＭＣＣ化酵母ＤＮＡを１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）溶液に溶解し、システイン標識したＨ３Ｋ２７Ａｃを加え混合し、室温にて３時間以上反応させた。未反応ＳＭＣＣ化酵母ＤＮＡを除去するため、Ｍｇ２＋含有ＴＡＧゲルを用いて反応液を泳動しＰＯＣｓ（ＳＭＣＣ化酵母ＤＮＡ−Ｈ３Ｋ２７Ａｃ）を精製した。
【０１６９】
＜２−４．製造した内部標準分子の評価＞
（内在性タンパク質の免疫沈降における内部標準分子の存在の影響）
次に、内在性タンパク質の免疫沈降に、内部標準分子の存在がどのように影響するかを確認した。
【０１７０】
上記同様に、理化学研究所の黒崎知博教授より供与された抗体遺伝子トランスジェニックマウスＢ１／８Ｈｉ（オリジナルはＰｒｏｆ．  Ｍｉｃｈｅｌ  Ｃ．  Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ（The Rockefeller University））より脾臓Ｂリンパ球を単離し、３７℃にて９５％空気と５％の二酸化炭素ガスの環境下、試験管内で抗原ＮＰ（４０）−ｆｉｃｏｌおよびサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＣＤ４０Ｌ）存在下で３日間培養後、１．０％ホルマリンで室温１０分間固定した。
【０１７１】
細胞質画分を除去後、核画分を溶解し、超音波発生装置Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（コスモバイオ社、ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いてゲノムＤＮＡを１００〜５００塩基に断片化した。断片化されたゲノムＤＮＡと、表面にプロテインＡ／Ｇが固定された磁気ビーズとを４℃で１時間反応させ、プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズへ非特異的に結合する画分の除去をおこなった。
【０１７２】
次に、磁石でプロテインＡ／Ｇ磁気ビーズを試験管内壁に吸着後、プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズに非特異的に結合しなかった上清画分を採取した。そして、内部標準分子を０、０．０１、０．１、または１ｎｇ添加後、抗Ｈ３Ｋ２７Ａｃ抗体（アブカム社）で４℃一晩反応させたのち、プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズを加えて４℃で２時間反応させて免疫沈降を行った。尚、内部標準分子を０．１ｎｇ添加し、抗体として、抗Ｈ３Ｋ２７Ａｃ抗体ではなくＩｇＧ抗体で免疫沈降したものをコントロールとした。
【０１７３】
免疫沈降後、表面に抗ストレプトアビジン抗体が固定された磁気ビーズを用いて、撹拌しながら４℃で１時間反応させ、磁石を用いて試験管内壁に引き寄せられる磁気ビーズ画分を免疫沈降物として回収した。
【０１７４】
次に、磁気ビーズ画分に含まれる酵母ＤＮＡを、配列番号５及び配列番号６で表されるプライマーセットを用いて、定量ＰＣＲにより定量した。ＰＣＲ反応は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）機器、ＳＹＢＲ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｑＰＣＲプレミックス（ＴａＫａＲａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で３３秒、９５℃で１５秒）×４０サイクルの条件で行った。
【０１７５】
結果を図１５に示す。縦軸は、クロマチンＤＮＡを断片化したときのＤＮＡ量を１００％としたときの免疫沈降されたＤＮＡの相対量（ｉｎｐｕｔ％）を表す。この結果より、内部標準分子を添加しても細胞が内在的に有しているＨ３Ｋ２７Ａｃは標的遺伝子Ｉｇκのκ３’Ｅ領域のＤＮＡに結合し、内部標準分子の添加によっても大きく阻害されないことが分かった。
【０１７６】
また、定量ＰＣＲの結果より、内部標準分子の添加量が増加すれば、免疫沈降される酵母ＤＮＡの量が増加することから、免疫沈降の工程において内部標準分子を免疫沈降できていることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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