(57)【要約】【課題】アルドケト還元酵素を選択的に阻害する新規な化合物又はその塩、及びそれらを含有する医薬組成物を提供する。【解決手段】式（Ｉ）：2018027897.tif 000082［式中、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基であり、Ｘは、アルキレン基であり、Ａｒは、置換されていてもよいアリール基である］で表される化合物又はその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2018027897.tif 000080
［式中、
Ｒ１は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｘは、アルキレン基であり、
Ａｒは、置換されていてもよいアリール基である］
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子であり、Ａｒが置換されていてもよいフェニル基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
前記フェニル基の置換基が、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基及びＣ１−６アルコキシ基からなる群より選択される１以上の置換基である、請求項２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
式（Ｉａ）：
【化２】
2018027897.tif 000081
［式中、
Ｒ１ａは、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、
Ｘａは、Ｃ２−４アルキレン基であり、
Ａｒａは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基及びＣ１−６アルコキシ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいフェニル基である］
で表される化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｒ１ａが水素原子である、請求項４に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｘａが１，３−プロピレン基である、請求項４又は５に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含有するアルドケト還元酵素阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含有する抗癌剤。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
白金製剤と組み合わせてなる、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルドケト還元酵素阻害作用を有する２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸アミド誘導体又はその塩、及びその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症、放射線、紫外線、喫煙などによる慢性的な酸化ストレスの暴露は、発癌と密接に関係している。癌細胞は自身が誘導する酸化ストレス環境に適応するために、細胞が備え持つ防御機能を流用し、さらなる増殖・転移能や薬剤耐性能を獲得する。このような癌細胞の生存戦略の一つとしてＮｒｆ２シグナルがあり、癌細胞においてＮｒｆ２が高頻度に活性型変異を起こしていること（非特許文献１）、また、活性型癌遺伝子産物がＮｒｆ２発現レベルを亢進させること（非特許文献２）が報告されている。
【０００３】
アルドケト還元酵素（ＡＫＲ）スーパーファミリーに属するＡＫＲ１Ｂ１０は、Ｎｒｆ２シグナルの下流に位置する抗酸化酵素であり、正常細胞での発現レベルが低い一方、肺癌など種々の癌で高発現し、癌細胞の増殖、抗癌剤耐性の獲得に関与することが知られている（非特許文献３）。そのため、ＡＫＲ１Ｂ１０を阻害する薬剤は、癌細胞の生存戦略を破綻させることで、抗癌作用に加えて抗癌剤耐性化抑制作用をも併せ持つ、新規な抗癌剤として期待されている。
【０００４】
一方、ＡＫＲ１Ｂ１０はアルドース還元酵素（ＡＲ）と７０％以上のアミノ酸配列相同性を示すところ、ＡＲはプロスタグランジンＦ２αの合成、糖化最終産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＡＧＥｓ）の前駆体の分解などに関与するため、ＡＫＲ１Ｂ１０を標的とする薬剤としては、ＡＲを阻害することなく、ＡＫＲ１Ｂ１０を選択的に阻害することが望ましい。
【０００５】
ＡＫＲ１Ｂ１０阻害作用を有する化合物として、例えば、カフェ酸誘導体（非特許文献４）、２−（フェニルイミノ）クロメン誘導体（非特許文献５、６）が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１２，２２，６６−７９．
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７５，１０６−１０９．
【非特許文献３】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００５，１１，１７７６−１７８５．
【非特許文献４】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，４８，３２１−３２９．
【非特許文献５】Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，１８，２４８５−２４９０．
【非特許文献６】Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，２１，６３７８−６３８４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献４に記載のカフェ酸誘導体は、ＡＫＲ１Ｂ１０を選択的に阻害する一方、生体内での安定性が懸念される。また、非特許文献５及び６に記載の２−（フェニルイミノ）クロメン誘導体は、ＡＫＲ１Ｂ１０とＡＲを同程度阻害するため、選択性の面で充分満足のいくものではない。
【０００８】
本発明の目的は、アルドケト還元酵素を選択的に阻害する新規な化合物又はその塩、及びそれらを含有する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の［１］〜［１７］を提供する。
［１］
式（Ｉ）：
【化１】
2018027897.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｘは、アルキレン基であり、
Ａｒは、置換されていてもよいアリール基である］
で表される化合物又はその塩。
［２］
Ｒ１が水素原子であり、Ａｒが置換されていてもよいフェニル基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］
前記フェニル基の置換基が、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基及びＣ１−６アルコキシ基からなる群より選択される１以上の置換基である、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］
式（Ｉａ）：
【化２】
2018027897.tif 000003
Ｒ１ａは、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、
Ｘａは、Ｃ２−４アルキレン基であり、
Ａｒａは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基及びＣ１−６アルコキシ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいフェニル基である］
で表される化合物又はその塩。
［５］
Ｒ１ａが水素原子である、［４］に記載の化合物又はその塩。
［６］
Ｘａが１，３−プロピレン基である、［４］又は［５］に記載の化合物又はその塩。
［７］
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド、及び
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
からなる群より選択される化合物又はその塩。
［８］
［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有するアルドケト還元酵素阻害剤。
［９］
［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する抗癌剤。
［１０］
［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する医薬組成物。
［１１］
白金製剤と組み合わせてなる、［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］
［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩の薬学的有効量を投与することを含む、癌の治療方法。
［１３］
抗癌剤としての使用のための、［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［１４］
抗癌剤の製造のための、［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩の使用。
［１５］
［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩、及び白金製剤の薬学的有効量を組み合わせて投与することを含む、癌の治療方法。
［１６］
抗癌剤としての使用のための、［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩、及び白金製剤の組み合わせ。
［１７］
抗癌剤の製造のための、［１］〜［７］のいずれかに記載の化合物又はその塩、及び白金製剤を組み合わせての使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の化合物又はその塩は、アルドケト還元酵素を選択的に阻害し、抗癌剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）に対する本発明化合物（実施例１）の増殖抑制効果を示すグラフである。（Ｂ）ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）に対する本発明化合物（実施例８）の増殖抑制効果を示すグラフである。
【図２】ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）に対する本発明化合物の浸潤抑制効果を示すグラフである。なお、図中の＊は５％の有意水準で、対照（ＤＭＳＯ添加群）と比較して有意差が認められたことを意味する。
【図３】シスプラチン抵抗性癌細胞（Ａ５４９／ＣＤＤＰ）における本発明化合物の感受性回復効果を示すグラフである。なお、図中の＊は５％の有意水準で、対照（ＤＭＳＯ添加群）と比較して有意差が認められたことを意味する。
【図４】（Ａ）ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）及びシスプラチン抵抗性癌細胞（Ａ５４９／ＣＤＤＰ）をシスプラチン含有培地で４８時間、及び９６時間培養した後の細胞数を示すグラフである。（Ｂ）シスプラチン抵抗性癌細胞（Ａ５４９／ＣＤＤＰ）に対する本発明化合物の増殖抑制効果を示すグラフである。なお、図中の＊は５％の有意水準で、対照（ＤＭＳＯ添加群）と比較して有意差が認められたことを意味する。
【図５】シスプラチン抵抗性癌細胞（Ａ５４９／ＣＤＤＰ）に対する本発明化合物の浸潤抑制効果及び転移抑制効果を示すグラフである。なお、図中の＊は５％の有意水準で、本発明化合物非存在時と比較して有意差が認められたことを意味する。
【図６】マウス肺転移モデルにおける本発明化合物の癌細胞増殖抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本明細書において記載する記号、用語等の定義、本発明の実施の形態等を示して、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本明細書において使用する「アルキル基」とは、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味する。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、１，１−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基等が挙げられる。
【００１４】
本明細書において使用する「アルキレン基」とは、前記「アルキル基」から任意の水素原子をさらに１個除いて誘導される二価の基を意味する。アルキル基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、１，２−プロピレン基、ｎ−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，３−ブチレン基、ｎ−ブチレン基、２，３−ブチレン基、ｎ−ペンチレン基、ｎ−ヘキシレン基、ｎ−ヘプチレン基、ｎ−オクチレン基、ｎ−ノニレン基、ｎ−デシレン基、ｎ−ドデシレン基等が挙げられる。
【００１５】
本明細書において使用する「アリール基」とは、芳香族炭化水素基を意味する。アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、フェナレニル基、インダニル基、インデニル基、アズレニル基、ヘプタレニル基等が挙げられる。
【００１６】
本明細書において使用する「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味する。Ｃ１−６アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、１，１−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基等が挙げられる。
【００１７】
本明細書において使用する「Ｃ２−４アルキル基」とは、炭素数２〜４個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味する。Ｃ２−４アルキル基としては、例えば、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
【００１８】
本明細書において使用する「Ｃ１−６アルコキシ基」とは、前記「Ｃ１−６アルキル基」の末端に酸素原子が結合した基であることを意味する。Ｃ１−６アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
【００１９】
本明細書において使用する「Ｃ２−４アルキレン基」とは、前記「Ｃ２−４アルキル基」から任意の水素原子をさらに１個除いて誘導される二価の基を意味する。Ｃ２−４アルキレン基としては、例えば１，２−エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，３−ブチレン基、１，４−ブチレン基、２，３−ブチレン基等が挙げられる。
【００２０】
本明細書において使用する「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
【００２１】
本発明の一つの実施形態は、一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」とも称す）又はその塩である。
【００２２】
化合物（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基である。Ｒ１として好ましくは、水素原子又はアルキル基であり、より好ましくは、水素原子、メチル基又はエチル基であり、更に好ましくは、水素原子又はメチル基であり、特に好ましくは、水素原子である。
【００２３】
化合物（Ｉ）において、Ｘは、アルキレン基である。Ｘとして好ましくは、Ｃ２−４アルキレン基であり、より好ましくは、エチレン基、ｎ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基であり、更に好ましくは、ｎ−プロピレン基である。
【００２４】
化合物（Ｉ）において、Ａｒは、置換されていてもよいアリール基である。Ａｒとして好ましくは、置換されていてもよいフェニル基であり、より好ましくは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基及びＣ１−６アルコキシ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、更に好ましくは、フッ素原子、塩素原子、ヒドロキシ基、メチル基及びメトキシ基からなる群より選択される１又は２個の置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、特に好ましくは、フルオロフェニル基、ジフルオロフェニル基、クロロフェニル基、ヒドロキシフェニル基、メチルフェニル基又はメトキシフェニル基である。
【００２５】
化合物（Ｉ）の好ましい態様として、Ｒ１は水素原子であり、Ａｒは置換されていてもよいフェニル基である。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、一般式（Ｉａ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉａ）」とも称す）又はその塩である。
【００２７】
化合物（Ｉａ）において、Ｒ１ａは、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ１ａとして好ましくは、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、水素原子又はメチル基であり、更に好ましくは、水素原子である。
【００２８】
化合物（Ｉａ）において、Ｘａは、Ｃ２−４アルキレン基である。Ｘａとして好ましくは、エチレン基、ｎ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基であり、より好ましくは、ｎ−プロピレン基である。
【００２９】
化合物（Ｉａ）において、Ａｒａは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基及びＣ１−６アルコキシ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいフェニル基である。Ａｒａとして好ましくは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基及びＣ１−６アルコキシ基からなる群より選択される１又は２個の置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、より好ましくは、フッ素原子、塩素原子、ヒドロキシ基、メチル基及びメトキシ基からなる群より選択される１又は２個の置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、更に好ましくは、フルオロフェニル基、ジフルオロフェニル基、クロロフェニル基、ヒドロキシフェニル基、メチルフェニル基又はメトキシフェニル基である。
【００３０】
化合物（Ｉ）又はその塩としては、具体的には、以下に示す化合物群から選択される化合物又はその塩である。
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（２−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  （３−フェニル−プロピル）−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［４−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ブチル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（２−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３，５−ジフルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メチル−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−クロロ−フェニル）−プロピル］−アミド、
７−ヒドロキシ−５−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド、及び
８−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【００３１】
化合物（Ｉ）の塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属との塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との塩；アルギニン、リジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩等が挙げられる。
【００３２】
化合物（Ｉ）が、互変異性体、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体などの異性体を有する場合には、いずれか一方の異性体も混合物も本発明の化合物に包含される。さらに、化合物（Ｉ）に光学異性体が存在する場合には、ラセミ体から分割された光学異性体も化合物（Ｉ）に包含される。
【００３３】
化合物（Ｉ）は、結晶であってもよく、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても化合物（Ｉ）に包含される。
【００３４】
化合物（Ｉ）は、溶媒和物（例えば、水和物など）であっても、無溶媒和物（例えば、非水和物など）であってもよく、いずれも化合物（Ｉ）に包含される。
【００３５】
同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３５Ｓ、１２５Ｉなど）などで標識又は置換された化合物も、化合物（Ｉ）に包含される。同位元素で標識又は置換された化合物（Ｉ）は、例えば、陽電子断層法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＰＥＴ）において使用するトレーサー（ＰＥＴトレーサー）として用いることができ、医療診断などの分野において有用である。
【００３６】
本実施形態に係る化合物の製造法について以下に説明する。
【化３】
2018027897.tif 000004
【００３７】
式中、Ｒ１、Ｘ及びＡｒは、上記と同意義を示す。Ｍｓは、メタンスルホニル基を示す。Ａｒ１は、置換基を有していてもよいフェニル基を示す。
【００３８】
（工程１）
工程１は、化合物（１）をメタンスルホニル化剤と反応させることにより、化合物（２）を製造する工程である。
化合物（１）は、市販品にて入手できるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基及びＣ１−６アルコキシ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいベンズアルデヒドを出発原料として、文献（例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，５５，８８３−８９２；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，７８，５００７−５０１７；ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．，２０１３，１４，９９３−１０００）等に記載の方法に従って製造することができる。なお、Ａｒがヒドロキシ基を有する場合、化合物（１）として、Ａｒ上のヒドロキシ基がメトキシメチル（ＭＯＭ）基、メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）等で保護された化合物を用いることもできる。
メタンスルホニル化剤としては、例えば、メタンスルホニルクロリド、メタンスルホニルブロミドが挙げられる。メタンスルホニル化剤の使用量は、化合物（１）に対して通常１〜５当量である。
本工程では、塩基を用いることが好ましい。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジンが挙げられる。塩基の使用量は、化合物（１）に対して通常１〜５当量である。
本工程では、通常溶媒が用いられる。このような溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類が挙げられる。
反応温度は、通常０℃〜還流温度であり、反応時間は１０分間〜４８時間である。
【００３９】
（工程２）
工程２は、化合物（２）をアジド化剤と反応させることにより、化合物（３）を製造する工程である。
アジド化剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、ジフェニルリン酸アジドが挙げられる。アジド化剤の使用量は、化合物（２）に対して通常１〜５当量である。
本工程では、通常溶媒が用いられる。溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類；水又はそれらの混合物が挙げられる。
反応温度は、通常０℃〜還流温度であり、反応時間は１０分間〜４８時間である。
【００４０】
（工程３）
工程３は、化合物（３）を接触水素化反応に付すことにより、化合物（４）を製造する工程である。
接触水素化反応は、水素雰囲気中、触媒存在下に行うことができる。触媒としては、例えば、パラジウム炭素、水酸化パラジウム炭素、酸化パラジウム等のパラジウム類；酸化白金、白金炭素等の白金類；ロジウム炭素等のロジウム類等が挙げられる。触媒の使用量は、化合物（３）に対して通常０．０１〜１当量である。
本工程では、通常溶媒が用いられる。溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類；ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類；ギ酸、酢酸等のカルボン酸類；水又はそれらの混合物が挙げられる。
反応が行われる水素圧は、通常１〜１０気圧である。反応温度は、通常０℃〜還流温度であり、反応時間は１０分間〜４８時間である。
【００４１】
（工程４）
工程４は、化合物（４）をシアノ酢酸と反応させることにより、化合物（５）を製造する工程である。
シアノ酢酸の使用量は、化合物（４）に対して通常１〜５当量である。
本工程では、縮合剤を用いることが好ましい。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が挙げられる。縮合剤の使用量は、化合物（４）に対して通常１〜５当量である。
本工程では、反応促進のため塩基を添加してもよい。塩基としては、４−ジメチルアミノピリジン等の芳香族アミン類が挙げられる。塩基の使用量は、化合物（４）に対して通常０．０１〜１０当量である。
本工程では、通常溶媒が用いられる。溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、酢酸エチル等のエステル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類が挙げられる。
反応温度は、通常０℃〜還流温度であり、反応時間は１０分間〜４８時間である。
【００４２】
（工程５）
工程５は、化合物（５）と化合物（６）とを反応させることにより、化合物（７）を製造する工程である。
化合物（６）の使用量は、化合物（５）に対して通常１〜５当量である。
本工程では、触媒として塩基を用いることが好ましい。塩基としては、ピロリジン、ピペリジン等のアミン類が挙げられる。
本工程では、通常溶媒が用いられる。溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類；ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類が挙げられる。
反応温度は、通常０℃〜還流温度であり、反応時間は１０分間〜４８時間である。
【００４３】
（工程６）
工程６は、化合物（７）と化合物（８）とを反応させることにより、化合物（９）を製造する工程である。
化合物（８）の使用量は、化合物（７）に対して通常１〜５当量である。
本工程では、通常溶媒が用いられる。溶媒としては、例えば、ギ酸、酢酸等のカルボン酸類が挙げられる。
反応温度は、通常０℃〜還流温度であり、反応時間は１０分間〜４８時間である。
【００４４】
（工程７）
工程７は、化合物（９）と酸とを反応させることにより、化合物（Ｉ）を製造する工程である。なお、Ａｒ上のヒドロキシ基がメトキシメチル（ＭＯＭ）基、メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）等で保護されている場合、本工程で保護基が脱保護される。
酸としては、例えば、塩酸、トリフルオロ酢酸が挙げられる。
本工程では、通常溶媒が用いられる。溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；水又はそれらの混合物が挙げられる。
反応温度は、通常０℃〜還流温度であり、反応時間は１０分間〜４８時間である。
【００４５】
化合物（Ｉ）又はその塩はアルドケト還元酵素を選択的に阻害することから、この作用に基づく医薬組成物としても有用である。
本実施形態に係る医薬組成物は、例えば、抗癌剤として用いることができ、好ましくは、ＡＫＲ１Ｂ１０の発現量が高い癌（例えば、肺癌、肝臓癌及び大腸癌からなる群より選択される１以上の癌）に対する抗癌剤として用いることができる。
【００４６】
本実施形態に係る医薬組成物は、医薬製剤の製造法として自体公知の方法（例、日本薬局方記載の方法等）に従って、化合物（Ｉ）又はその塩と薬学的に許容される担体とを混合した医薬組成物として使用することができる。本実施形態に係る医薬組成物は、例えば錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、放出制御製剤、エアゾール剤、フィルム剤、注射剤、点滴剤、経皮吸収型製剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤、点眼剤として、経口的又は非経口的に投与することができる。本実施形態に係る医薬組成物における化合物（Ｉ）又はその塩の含有量は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
【００４７】
本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、投与対象、投与ルート、疾患等により異なるが、例えば、癌の患者（体重約６０ｋｇ）に対し、経口剤又は非経口剤として、１日当たり、有効成分（化合物（Ｉ）又はその塩）として０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重を、１日１回〜数回に分けて投与することができる。
【００４８】
本実施形態に係る医薬組成物の製造に用いられてもよい薬学的に許容される担体としては、医薬素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
【００４９】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカが挙げられる。結合剤としては、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムが挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子が挙げられる。等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液が挙げられる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールが挙げられる。防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールが挙げられる。
【００５０】
また、化合物（Ｉ）又はその塩は白金製剤と組み合わせて使用することで、白金製剤に対する抵抗性を獲得した癌細胞に対して、当該抵抗性を抑制する作用を示すことから、化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤とを組み合わせてなる医薬組成物としても有用である。
白金製剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチンが挙げられる。
【００５１】
本実施形態に係る、化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤とを組み合わせてなる医薬組成物（以下、「併用医薬組成物」ともいう）において、化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤の投与時期は、化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤を、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。
【００５２】
本実施形態に係る併用医薬組成物の投与形態は、投与時に、化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤を同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）化合物（Ｉ）又はその塩と白金製剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明化合物を投与した後の併用薬物の投与、又はその逆の順序での投与）等が挙げられる。
時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、化合物（Ｉ）又はその塩を投与した後、１分〜１日以内、好ましくは１０分〜６時間以内、より好ましくは１５分〜３時間以内に白金製剤を投与する方法が挙げられる。
【実施例】
【００５３】
以下に、製造例、実施例及び試験例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の具体例により限定されるものではない。なお、以下の実施例における略号の意味は以下の通りである。
Ｍｅ：メチル
ＭＯＭ：メトキシメチル
Ｍｓ：メタンスルホニル
【００５４】
製造例１：メタンスルホン酸  ３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピルエステル
【化４】
2018027897.tif 000005
【００５５】
３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピルアルコール（１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に、メタンスルホニルクロリド（１．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５ｍｍｏｌ）を０℃にて加え、室温にて２時間攪拌した。反応を飽和塩化アンモニウム水溶液にて停止し、有機層を分離した。水層をジクロロメタン（５ｍＬ×３）で抽出した有機層と上記分離した有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇ、ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製して、標記化合物を得た。
収率９６％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.88 (2H, quint, J = 7.3 Hz), 2.65 (2H, t, J =7.3 Hz), 3.28 (2H, t, J = 7.3 Hz), 3.48 (3H, s), 5.18 (2H, s), 6.97 (2H, d, J =8.0 Hz), 7.09(2H, d, J = 8.0 Hz)
【００５６】
製造例１と同様の方法で、対応するアルコールから以下のメタンスルホニル化合物を得た。
メタンスルホン酸  ３−（３−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピルエステル
【化５】
2018027897.tif 000006
【００５７】
収率９６％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 2.08 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.73 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.00 (3H, s), 3.48 (3H, s), 4.23 (2H, t, J = 7.5 Hz), 5.17 (2H, s),6.83-6.91 (3H, m), 7.21 (1H, t, J = 8.0 Hz)
【００５８】
メタンスルホン酸  ３−（２−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピルエステル
【化６】
2018027897.tif 000007
【００５９】
収率９４％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.82 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.71 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.15 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.49 (3H, s), 5.21 (2H, s), 6.84 (1H, t, J =8.0 Hz), 7.08 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.10-7.17 (1H, m)
【００６０】
メタンスルホン酸  ２−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−エチルエステル
【化７】
2018027897.tif 000008
【００６１】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.87(3H, s), 3.00 (2H, t, J = 7.1 Hz), 3.47 (3H, s), 4.38 (2H, t, J = 7.1 Hz), 5.16(2H, s), 6.99 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.15 (2H, d, J = 8.5 Hz)
【００６２】
メタンスルホン酸  ３−（フェニル）−プロピルエステル
【化８】
2018027897.tif 000009
【００６３】
メタンスルホン酸  ４−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−ブチルエステル
【化９】
2018027897.tif 000010
【００６４】
収率９６％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.69-1.78 (4H, m), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.98(3H, s), 3.48 (3H, s), 4.23 (2H, t, J = 7.5 Hz), 5.15 (2H, s), 6.96 (2H, d, J =8.5 Hz), 7.08 (2H, d, J = 8.5 Hz)
【００６５】
メタンスルホン酸  ３−（４−メトキシ−フェニル）−プロピルエステル
【化１０】
2018027897.tif 000011
【００６６】
メタンスルホン酸  ３−（４−フルオロ−フェニル）−プロピルエステル
【化１１】
2018027897.tif 000012
【００６７】
メタンスルホン酸  ３−（３−フルオロ−フェニル）−プロピルエステル
【化１２】
2018027897.tif 000013
【００６８】
収率７８％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 2.89 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 3.11 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.35 (3H, s), 4.58 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.11-7.25 (3H, m), 7.61 (2H,d, J = 7.5 Hz)
【００６９】
メタンスルホン酸  ３−（２−フルオロ−フェニル）−プロピルエステル
【化１３】
2018027897.tif 000014
【００７０】
メタンスルホン酸  ３−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−プロピルエステル
【化１４】
2018027897.tif 000015
【００７１】
メタンスルホン酸  ３−（３，５−ジフルオロ−フェニル）−プロピルエステル
【化１５】
2018027897.tif 000016
【００７２】
1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 2.03-2.06 (2H, m), 2.72 (2H, t, J = 7.7 Hz), 2.98(3H, s), 4.21 (2H, t, J = 6.1 Hz), 6.62-6.70 (3H, m)
【００７３】
メタンスルホン酸  ３−（４−メチル−フェニル）−プロピルエステル
【化１６】
2018027897.tif 000017
【００７４】
メタンスルホン酸  ３−（４−クロロ−フェニル）−プロピルエステル
【化１７】
2018027897.tif 000018
【００７５】
製造例２：１−（３−アジド−プロピル）−４−メトキシメトキシ−ベンゼン
【化１８】
2018027897.tif 000019
【００７６】
メタンスルホン酸  ３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピルエステル（１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び水（２：１）混合溶液に、アジ化ナトリウム（２ｍｍｏｌ）を加え、６０℃にて２４時間攪拌した。反応液を冷却後、反応を水にて停止し、有機層を分離した。水層をジクロロメタン（５ｍＬ×３）で抽出した有機層と上記分離した有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇ、ヘキサン：アセトン＝１００：１）にて精製して、標記化合物を得た。
収率９４％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.91 (2H, quint, J = 7.3 Hz), 2.73 (2H, t, J =7.3 Hz), 3.29 (2H, t, J = 7.3 Hz ), 3.49 (3H, s), 5.21 (2H, s), 6.94 (1H, t, J= 8.0Hz), 7.09 (1H,d, J = 8.0 Hz), 7.10-7.18 (1H, m)
【００７７】
製造例２と同様の方法で、対応する上記メタンスルホニル化合物から以下のアジド化合物を得た。
１−（３−アジド−プロピル）−３−メトキシメトキシ−ベンゼン
【化１９】
2018027897.tif 000020
【００７８】
収率７８％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.92 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.68 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.29 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.49 (3H, s), 5.17 (2H, s), 6.83-6.90 (3H,m), 7.21 (1H, t, J = 8.0 Hz)
【００７９】
１−（３−アジド−プロピル）−２−メトキシメトキシ−ベンゼン
【化２０】
2018027897.tif 000021
【００８０】
収率８９％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.91 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.73 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.29 (2H, t, J = 7.5 Hz ), 3.49 (3H, s), 5.21 (2H, s), 6.94 (1H, t, J= 8.0 Hz), 7.09 (1H,d, J = 8.0 Hz), 7.13-7.18 (1H, m)
【００８１】
１−（２−アジド−エチル）−４−メトキシメトキシ−ベンゼン
【化２１】
2018027897.tif 000022
【００８２】
（３−アジド−プロピル）−ベンゼン
【化２２】
2018027897.tif 000023
【００８３】
１−（４−アジド−ブチル）−４−メトキシメトキシ−ベンゼン
【化２３】
2018027897.tif 000024
【００８４】
収率８１％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.62-1.68 (4H, m), 2.59 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.28(2H, t, J = 7.5 Hz), 3.48 (3H, s), 5.15 (2H, s), 6.96 (2H, dd, J = 4.5, 2.0Hz), 7.08 (2H, dd, J = 4.5, 2.0 Hz)
【００８５】
１−（３−アジド−プロピル）−４−メトキシ−ベンゼン
【化２４】
2018027897.tif 000025
【００８６】
１−（３−アジド−プロピル）−４−フルオロ−ベンゼン
【化２５】
2018027897.tif 000026
【００８７】
１−（３−アジド−プロピル）−３−フルオロ−ベンゼン
【化２６】
2018027897.tif 000027
【００８８】
収率７２％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.90 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.71 (2H, t, J = 7.5Hz), 3.29 (2H, t, J = 7.5 Hz), 6.82-6.95 (3H, m), 7.25 (2H, q, J = 7.0 Hz)
【００８９】
１−（３−アジド−プロピル）−２−フルオロ−ベンゼン
【化２７】
2018027897.tif 000028
【００９０】
収率６２％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.91 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.74 (2H, t, J =7.5Hz), 3.30 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.04 (2H, m), 7.19 (2H, t, J = 7.0 Hz)
【００９１】
１−（３−アジド−プロピル）−３，４−ジフルオロ−ベンゼン
【化２８】
2018027897.tif 000029
【００９２】
１−（３−アジド−プロピル）−３，５−ジフルオロ−ベンゼン
【化２９】
2018027897.tif 000030
【００９３】
１−（３−アジド−プロピル）−４−メチル−ベンゼン
【化３０】
2018027897.tif 000031
【００９４】
収率７５％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.90 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.33 (3H, s), 2.67(2H, t, J = 7.5 Hz), 3.28 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.09 (2H, d, J = 8.7 Hz)
【００９５】
１−（３−アジド−プロピル）−４−クロロ−ベンゼン
【化３１】
2018027897.tif 000032
【００９６】
収率８１％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.89 (2H, quint, J = 7.3 Hz), 2.68 (2H, t, J =7.3 Hz), 3.28 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.11 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.26 (2H, d, J =8.5 Hz)
【００９７】
製造例３：２−シアノ−Ｎ−［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化３２】
2018027897.tif 000033
１−（３−アジド−プロピル）−４−メトキシメトキシ−ベンゼンのメタノール溶液に触媒量の１０％パラジウム炭素を加え、１気圧の水素雰囲気下で接触水素化反応を行い、１−（４−アジド−プロピル）−３−メトキシメトキシ−ベンゼンを得た。
１−（４−アジド−プロピル）−３−メトキシメトキシ−ベンゼン（１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に、シアノ酢酸（１ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２４時間攪拌した。反応液を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇ、ヘキサン：アセトン＝５：１）にて精製して、標記化合物を得た。
収率４９％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.86 (2H, quint, J = 7.3 Hz),2.62 (2H, t, J = 7.3 Hz), 3.32 (4H, q, J = 7.3 Hz), 3.47 (3H, s), 5.15 (2H, s),6.03 (1H, br), 6.97 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.09 (2H,d, J = 8.5 Hz)
【００９８】
製造例３と同様の方法で、対応する上記アジド化合物から以下のシアノ化合物を得た。
２−シアノ−Ｎ−［３−（３−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化３３】
2018027897.tif 000034
【００９９】
収率５４％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.90 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.65 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.32 (2H, s), 3.34 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.48 (3H, s),5.17 (2H, s), 6.82-6.90 (3H, m), 7.22 (1H, t, J = 8.0 Hz)
【０１００】
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化３４】
2018027897.tif 000035
【０１０１】
収率７０％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.86 (2H, quint, J = 7.0 Hz),2.72 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.33 (4H, q, J = 7.0 Hz), 3.49 (3H, s), 5.25 (2H, s),6.39 (1H, br), 6.96 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.09 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.14-7.18(2H, m)
【０１０２】
２−シアノ−Ｎ−［２−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−エチル］−アセタミド
【化３５】
2018027897.tif 000036
【０１０３】
２−シアノ−Ｎ−（３−フェニル−プロピル）−アセタミド
【化３６】
2018027897.tif 000037
【０１０４】
２−シアノ−Ｎ−［４−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−ブチル］−アセタミド
【化３７】
2018027897.tif 000038
【０１０５】
収率４９％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.56-1.65 (4H, m), 2.59 (2H, t, J= 7.5 Hz), 3.32 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.35 (2H, s), 3.45 (3H, s), 5.15 (2H, s),6.05 (1H, br), 6.97 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.07 (2H, d, J = 8.5 Hz)
【０１０６】
２−シアノ−Ｎ−［３−（４−メトキシ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化３８】
2018027897.tif 000039
【０１０７】
収率４５％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.88 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.62 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.31 (2H, s) , 3.33 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.80 (3H,s), 5.99 (1H, br), 6.84 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.10 (2H, d, J = 9.0 Hz)
【０１０８】
２−シアノ−Ｎ−［３−（４−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化３９】
2018027897.tif 000040
【０１０９】
収率４２％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.87 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.64 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.30-3.36 (4H, m), 6.96-7.00 (2H, m), 7.12-7.15 (2H,m)
【０１１０】
２−シアノ−Ｎ−［３−（３−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化４０】
2018027897.tif 000041
【０１１１】
収率５８％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.89 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.67 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.32-3.36 (4H, m), 6.10 (1H, br), 6.90-6.96 (3H, m),7.26 (1H, m)
【０１１２】
２−シアノ−Ｎ−［３−（２−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化４１】
2018027897.tif 000042
【０１１３】
収率６６％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.82 (2H, quint, J = 7.25 Hz),2.65(2H, t, J = 7.25 Hz), 3.26 (2H, t, J = 7.25Hz), 3.30-3.41 (2H, m), 6.90-7.26(4H, m)
【０１１４】
２−シアノ−Ｎ−［３−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化４２】
2018027897.tif 000043
【０１１５】
収率４２％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.87 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.63 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.33 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.36 (2H, s), 6.11 (1H,br), 6.80-6.94 (2H, m), 6.69 (1H, t, J = 8.5 Hz), 7.07 (1H, q, J = 8.5 Hz)
【０１１６】
２−シアノ−Ｎ−［３−（３，５−ジフルオロ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化４３】
2018027897.tif 000044
【０１１７】
収率４８％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.70 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.60 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.60 (2H, s), 6.94-7.03(3H, m), 8.24 (1H, br)
【０１１８】
２−シアノ−Ｎ−［３−（４−メチル−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化４４】
2018027897.tif 000045
【０１１９】
収率６６％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.88 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.32 (3H, s), 2.64 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.34(4H, q, J = 7.5 Hz), 7.11 (2H, q, J= 7.83 Hz)
【０１２０】
２−シアノ−Ｎ−［３−（４−クロロ−フェニル）−プロピル］−アセタミド
【化４５】
2018027897.tif 000046
【０１２１】
収率３５％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.87 (2H, quint, J = 7.3 Hz),2.64 (2H, t, J = 7.3 Hz), 3.34 (4H, q, J = 7.3 Hz), 7.11 (2H, d, J = 8.5 Hz),7.24-7.35 (2H, m)
【０１２２】
製造例４：７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化４６】
2018027897.tif 000047
【０１２３】
２−シアノ−Ｎ−［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アセタミドのエタノール溶液に、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド及び触媒量のピペリジンを加え、クネフェナーゲル縮合反応を行い、７−ヒドロキシ−２−イミノ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アミドを得た。
７−ヒドロキシ−２−イミノ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド（１ｍｍｏｌ）の酢酸（２ｍＬ）溶液に、４−メトキシアニリン（１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１２時間攪拌した。反応液を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇ、ヘキサン：ジクロロメタン）にて精製して、標記化合物を得た。
収率７６％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.93 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.68 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.35-3.46 (5H,m), 3.84 (3H, s), 5.13 (2H, s), 6.61(1H, s), 6.70 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.93 (4H, t, J = 8.5 Hz), 7.11 (2H, d, J =8.5 Hz), 7.37 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.62 (1H, d, J =8.5 Hz), 8.42-8.50 (1H, m),10.50 (1H, t, J =4.75 Hz)
【０１２４】
製造例４と同様の方法で、対応する上記シアノ化合物と２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドから以下のメトキシフェニルイミノ化合物を得た。
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化４７】
2018027897.tif 000048
【０１２５】
収率６７％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.96 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.70 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.45-3.50 (5H, m), 3.82 (3H, s), 5.13 (2H, s), 6.65(1H, s), 6.75 (1H, d, J = 7.5 Hz), 6.82-6.94 (4H, m), 7.14-7.18 (1H, m),7.25-7.27 (3H, m), 7.30 (1H, d, J = 7.5 Hz), 8.42 (1H, s), 10.75 (1H, br)
【０１２６】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（２−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化４８】
2018027897.tif 000049
【０１２７】
収率６３％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.95 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.77 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.41 (3H, s), 3.50 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.83 (3H, s),5.13 (2H, s), 6.65 (1H, d, J = 2.5 Hz), 6.74 (1H, dd, J = 6.0, 2.5 Hz),6.89-6.92 (3H, m), 7.05 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.12-7.16 (2H, m), 7.26-7.29 (3H,m), 7.33 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.44 (1H, s), 10.68 (1H, t, J = 5.5 Hz)
【０１２８】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチル］−アミド
【化４９】
2018027897.tif 000050
【０１２９】
収率６７％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2.72 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.54(2H, q, J = 7.0 Hz), 6.51 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.64 (2H, dd, J = 4.5, 2.0 Hz),6.71 (1H, dd, J = 6.0, 2.5 Hz), 6.91 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.04 (2H, d, J = 8.5Hz), 7.09 (2H, dd, J = 4.5, 2.0 Hz), 7.58 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.38 (1H, s),9.20 (1H, s), 10.14 (1H, t, J = 5.5 Hz)
【０１３０】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  （３−フェニル−プロピル）−アミド
【化５０】
2018027897.tif 000051
【０１３１】
収率６８％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.83 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.65 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.24-3.36 (2H,m), 3.76 (3H, s), 6.53 (1H, s), 6.70(1H, dd, J = 2.5, 8.5 Hz), 6.94 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.21-7.35 (7H, m), 7.57(1H, d, J = 8.5 Hz), 8.37 (1H, s), 10.23 (1H, t, J =5.3 Hz)
【０１３２】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［４−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−ブチル］−アミド
【化５１】
2018027897.tif 000052
【０１３３】
収率８３％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.62-1.75 (4H, m), 2.60 (2H, t, J= 7.5 Hz), 3.46-3.49 (5H, m), 3.83 (3H, s), 5.14 (2H, s), 6.63 (1H, s), 6.72(1H, d, J = 8.5 Hz), 6.89-6.93 (4H, m), 7.06 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.22 (2H, d, J= 8.5 Hz), 7.32 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.42 (1H, s), 10.59 (1H, t, J = 5.0 Hz)
【０１３４】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化５２】
2018027897.tif 000053
【０１３５】
収率８７％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.92 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.67 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.45 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.75 (3H, s), 3.82 (3H, s),6.64 (1H, s), 6.73 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.78 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.90 (2H, d, J= 9.0 Hz), 7.08 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.24-7.27 (3H, m), 7.32 (1H, d, J = 8.3Hz), 8.43 (1H, s), 10.65 (1H, br)
【０１３６】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化５３】
2018027897.tif 000054
【０１３７】
収率６８％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.94 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.70 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.46 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.84 (3H, s), 6.62 (1H, s),6.71 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.93 (4H, t, J = 8.5  Hz), 7.13 (2H, t, J = 8.5Hz), 7.24 (1H, s), (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.452 (1H, s), 10.54 (1H, s)
【０１３８】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化５４】
2018027897.tif 000055
【０１３９】
収率７５％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.85 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.68 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.17-3.29 (2H, m), 3.77 (3H, s), 6.53 (1H, s), 6.72(1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz), 6.84-6.97 (3H, m), 7.05 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.30(3H, d, J = 8.5 Hz), 7.60 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.38 (1H, s), 10.21 (1H, t, J =5.5 Hz)
【０１４０】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（２−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化５５】
2018027897.tif 000056
【０１４１】
収率８９％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.82 (2H, quint, J = 7.3Hz),2.68 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.27-3.39 (2H, m), 3.75 (3H, s), 6.50 (2H, s, J = 8.5Hz), 6.62 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.71 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz), 6.93 (2H, d, J =8.5 Hz), 7.09 (2H, quart, J = 8.5 Hz), 7.20 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.29 (2H, d, J= 8.5 Hz), 7.58 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.37 (1H, s), 10.22 (1H, t, J = 5.5 Hz)
【０１４２】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化５６】
2018027897.tif 000057
【０１４３】
収率７８％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.84 (2H, quint, J = 7.25 Hz),2.65 (2H, t, J = 7.25 Hz), 3.25-3.37 (2H, m), 3.77 (3H, s), 6.53 (1H, s), 6.72(1H, d, J = 8.5 Hz), 6.95 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.01-7.12 (2H, m), 7.22-7.33(4H, m), 7.60 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.38 (1H, s), 10.187 (1H, t, J =5.5 Hz)
【０１４４】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３，５−ジフルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化５７】
2018027897.tif 000058
【０１４５】
収率８５％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.86 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.68 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.29-3.56 (2H, m), 3.77 (3H, s), 6.52 (1H, d, J = 2.0Hz), 6.71 (1H, dd, J = 6.5, 2.0 Hz), 6.94-7.02 (5H, m), 7.30 (2H, d, J = 9.0Hz), 7.61 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.39 (1H, s), 10.18 (1H, t, J = 5.5 Hz), 10.65(1H, br)
【０１４６】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メチル−フェニル）−プロピル］−アミド
【化５８】
2018027897.tif 000059
【０１４７】
収率８２％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.81 (2H, quint, J = 7.3 Hz),2.28 (3H, s), 2.49 (2H, t, J = 7.3 Hz), 3.25-3.39 (2H, m), 3.76 (3H, s), 6.52(1H, s), 6.73 (1H, dd, J = 2.0, 8.5Hz), 6.49 (2H, d, J = 8.5  Hz), 7.06(4H, q, J = 8.5 Hz), 7.30 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.59 (1H, d, J =8.5 Hz), 8.38(1H, s), 10.20 (1H, t, J = 5.5 Hz)
【０１４８】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−クロロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化５９】
2018027897.tif 000060
【０１４９】
収率９３％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.83 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.67 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.19-3.31 (2H, m), 3.77 (3H, s), 6.54 (1H, s), 6.73(1H, d, J = 8. 5Hz), 6.96 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.23 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.31(4H, d, J = 8.5 Hz), 7.62 (1H, d, J =8.5 Hz), 8.39 (1H, s), 10.22 (1H, t, J =4.8 Hz)
【０１５０】
製造例４と同様の方法で、２−シアノ−Ｎ−［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アセタミドと２，４−ジヒドロキシ−５−メチルベンズアルデヒドから以下のメトキシフェニルイミノ化合物を得た。
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−５−メチル−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化６０】
2018027897.tif 000061
【０１５１】
収率７１％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.94 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.65 (2H, t, J = 7.5 Hz),3.30-3.52 (5H,m), 3.83 (3H, s), 5.13(2H, s), 5.29(3H,s), 6.45 (1H, s), 6.55 (1H, ), 6.84-6.95 (4H, m), 7.11 (2H, d, J =, 8.5 Hz ),7.25 (1H, d J =, 8.5 Hz), 8.63 (1H, s), 10.65 (1H, s)
【０１５２】
製造例４と同様の方法で、２−シアノ−Ｎ−［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アセタミドと２，３−ジヒドロキシベンズアルデヒドから以下のメトキシフェニルイミノ化合物を得た。
８−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化６１】
2018027897.tif 000062
【０１５３】
収率８９％（２工程）；1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.94 (2H, quint, J = 7.5 Hz),2.68 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.45-3.84 (5H, m), 3.85 (3H, s), 5.15 (2H, s),6.93-6.97 (5H, m), 7.06-7.13 (5H, m), 7.20-7.23 (2H, m), 8.53 (1H, s), 10.33(1H, br)
【０１５４】
実施例１：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化６２】
2018027897.tif 000063
【０１５５】
７−ヒドロキシ−２−（４−メトキシ−フェニルイミノ）−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシメトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド（１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）溶液に、１０％塩酸を５滴加え、４０℃にて２４時間攪拌した。反応液を冷却後、反応を水にて停止し、有機層を分離した。水層を酢酸エチル（５ｍＬ×３）で抽出し、得られた有機層と上記分離した有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇ、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１）にて精製して、標記化合物を得た。
収率９５％；1H-NMR(500 MHz, acetone-d6) δ 1.84 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.58 (2H, t, J= 7.5 Hz), 3.38 (2H, q, J = 7.5 Hz), 6.72 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.82 (1H, d, J =2.0 Hz), 6.94 (1H, dd, J = 6.5, 2.0 Hz), 6.04 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.76 (1H, d,J = 8.5 Hz), 8.69 (1H, br), 8.77 (1H, s)
【０１５６】
実施例１と同様の方法で、対応する上記メトキシフェニルイミノ化合物から以下の実施例２〜１５の化合物を得た。
実施例２：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化６３】
2018027897.tif 000064
【０１５７】
収率７１％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.91 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.64 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.44 (2H, q, J = 7.5 Hz), 6.65-6.66 (1H, m), 6.71-6.74 (2H, m), 6.85(1H, d, J = 2.5 Hz), 6.97 (1H, dd, J = 6.0, 2.5), 7.09 (1H, t, J = 8.0 Hz),7.79 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.74 (1H, br), 8.80 (1H, s)
【０１５８】
実施例３：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（２−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化６４】
2018027897.tif 000065
【０１５９】
収率６４％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.92 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.72 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.44 (2H, q, J = 7.5 Hz), 6.83-6.85 (2H, m), 6.96-7.03 (2H, m), 7.14(1H, d, J = 7.5 Hz), 8.80 (1H, s), 8.81 (1H, br)
【０１６０】
実施例４：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチル］−アミド
【化６５】
2018027897.tif 000066
【０１６１】
収率６５％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 2.81 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.61 (2H, q, J = 7.5Hz), 6.78 (2H, dd, J = 4.5, 2.0 Hz), 7.11 (2H, dd, J = 4.5, 2.0 Hz), 7.79 (1H,d, J = 8.5 Hz), 8.73 (1H, br), 8.80 (1H, s)
【０１６２】
実施例５：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  （３−フェニル−プロピル）−アミド
【化６６】
2018027897.tif 000067
【０１６３】
収率８４％；1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ 1.97 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.72 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.48 (2H, q, J = 7.5 Hz), 6.87-6.90 (2H, m), 7.17-7.22 (3H, m),7.27-7.30 (3H, m), 7.57 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.82 (1H, s), 8.87 (1H, br)
【０１６４】
実施例６：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［４−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ブチル］−アミド
【化６７】
2018027897.tif 000068
【０１６５】
収率６６％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.59-1.63 (4H, m), 2.55 (2H, t, J = 7.5 Hz),3.45 (2H, q, J = 7.5 Hz), 6.75 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.82 (1H, d, J = 2.0 Hz),6.95 (1H, dd, J = 6.5, 2.0 Hz), 7.01 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.76 (1H, d, J = 8.5Hz), 8.10 (1H, br), 8.76 (1H, s)
【０１６６】
実施例７：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メトキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化６８】
2018027897.tif 000069
【０１６７】
収率９５％；1H-NMR(500 MHz, acetone-d6) δ 1.95 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.69 (2H, t, J= 7.5 Hz), 3.47 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.79 (3H, s), 6.87-6.89 (3H, m), 7.02 (1H,dd, J = 6.0, 2.5 Hz), 7.21 (2H, d, J = 6.5 Hz), 7.84 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.76(1H, br), 8.84 (1H, s)
【０１６８】
実施例８：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化６９】
2018027897.tif 000070
【０１６９】
収率９６％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.95 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.70 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.49 (2H, q, J = 7.5 Hz), 6.88-6.91 (2H, m), 6.94-6.98 (2H, m),7.14-7.18 (2H, m), 7.20-7.23 (1H, m), 7.57 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.83 (1H, s),8.87 (1H, br)
【０１７０】
実施例９：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化７０】
2018027897.tif 000071
【０１７１】
収率９０％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.83 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.64 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.21-3.35 (2H, m), 6.79 (1H, s), 6.86 (1H, dd, J = 2.0, 8.5Hz), 6.98(1H, t, J = 8.5 Hz), 7.05 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.30 (1H, q, J = 8.5 Hz), 7.80(2H, d, J = 8.5 Hz), 8.66 (1H, t, J = 5.8 Hz), 8.75 (1H, s)
【０１７２】
実施例１０：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（２−フルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化７１】
2018027897.tif 000072
【０１７３】
収率９２％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.81 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.65 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.21-3.33 (2H, m), 6.79 (1H, s), 6.86 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz), 7.11(2H, t, J = 8.5 Hz), 7.22 (1H, q, J = 8.5 Hz), 7.31 (1H, t, J = 8.5 Hz), 7.80(2H, d, J = 8.5 Hz), 8.64 (1H, t, J = 8.5 Hz), 8.76 (1H, s), 11.04 (1H, br)
【０１７４】
実施例１１：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化７２】
2018027897.tif 000073
【０１７５】
収率８３％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.82 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.62 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.20-3.32 (2H, m), 6.79 (1H, s), 6.88 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz),7.01-7.13 (1H, m), 7.33 (2H, q, J = 8.5 Hz), 7.81 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.64(1H, t, J = 5.8 Hz), 8.75 (1H, s)
【０１７６】
実施例１２：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（３，５−ジフルオロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化７３】
2018027897.tif 000074
【０１７７】
収率９２％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.85 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.67 (2H, t, J =7.5 Hz), 3.27-3.41 (2H, m), 6.81 (1H, s), 6.88 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.99-7.02(3H, m), 7.82 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.67 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.78 (1H, s)
【０１７８】
実施例１３：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−メチル−フェニル）−プロピル］−アミド
【化７４】
2018027897.tif 000075
【０１７９】
収率９０％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.79 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.23 (3H, s),2.56 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.25-7.37 (2H, m), 6.78 (1H, s), 6.80 (1H, dd, J =2.0, 8.5 Hz), 7.05 (4H, q, J = 8.5 Hz), 7.79 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.64 (1H, t,J = 5.8 Hz), 8.74 (1H, s)
【０１８０】
実施例１４：７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−クロロ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化７５】
2018027897.tif 000076
【０１８１】
収率８１％；1H-NMR(500MHz, DMSO-d6) δ 1.82 (2H, quint, J = 7.5Hz), 2.62 (2H, t, J =7.5Hz), 3.26-3.37 (2H, m), 6.80 (1H, s), 6.87 (1H, dd, J = 2.0, 8.5Hz), 7.25(2H, d, J = 8.5Hz), 7.32 (2H, d, J = 8.5Hz), 7.81 (1H, d, J = 8.5Hz), 8.86 (1H,t, J = 6.0Hz), 8.76 (1H, s)
【０１８２】
実施例１５：７−ヒドロキシ−５−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化７６】
2018027897.tif 000077
【０１８３】
収率８４％；1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 1.93 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.63-2.67 (5H,m), 3.47 (2H, q, J = 7.5 Hz), 6.73 (1H, s), 6.79 (2H, d, J = 8.0 Hz), 6.88 (2H,s), 7.11 (2H, d, J = 8.0 Hz), 8.79 (1H, br), 8.95 (1H, s)
【０１８４】
実施例１６：８−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸  ［３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピル］−アミド
【化７７】
2018027897.tif 000078
【０１８５】
収率８６％；1H-NMR (500 MHz, Acetone-d6)δ 1.93 (2H, quint, J = 7.5 Hz), 2.67 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.45 (2H, q, J = 7.5Hz), 6.80 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.12 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.29-7.41 (2H, m),7.45 (1H, t, J = 5.0 Hz), 8.14 (1H, s), 8.82 (1H, br), 8.89 (1H, s)
【０１８６】
試験例１：アルドケト還元酵素（ＡＫＲ１Ｂ１０）及びアルドース還元酵素（ＡＲ）に対する阻害活性試験
（大腸菌の培養）
ＡＫＲ１Ｂ１０のｃＤＮＡを組み込んだｐＣｏｌｄ  Ｉベクターのプラスミドによって形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、及びＡＲのｃＤＮＡを組み込んだｐＤＲ  Ｔ７／ＴＯＰＯベクターのプラスミドによって形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをそれぞれＬＢ培地で、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）誘導下にて２０℃で２４時間培養した。得られた菌液を遠心操作（４℃、５０００ｘｇ、１５分間）により集菌し、緩衝液Ａ（０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５））に懸濁した。この懸濁液を超音波処理（１５０ｗ、５分間)した後、溶菌液を４℃にて遠心分離（１２０００ｘｇ、１５分間）し、その上清を大腸菌抽出液とした。
（ＡＫＲ１Ｂ１０の調製）
上記大腸菌抽出液を緩衝液Ａで平衡化したＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦカラム（ベッド量：１０ｍＬ）に添加した。カラムを緩衝液Ａで洗浄後、吸着酵素を０−０．３Ｍ  イミダゾール勾配により溶出した。得られた活性画分を限外濾過により濃縮した後、緩衝液Ｂ（５ｍＭ  ２−ＭＥ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む１０ｍＬ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））に対して透析し、ＡＫＲ１Ｂ１０の最終精製酵素標品を得た。
（ＡＲの調製）
上記大腸菌抽出液を緩衝液Ｂで平衡化したＧ−１００  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ベッド量：５００ｍＬ）に添加した。溶出後の活性画分を緩衝液Ｂで平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ベッド量：３０ｍＬ）に添加した。カラムを緩衝液Ｂで洗浄後、吸着酵素を０−０．１５Ｍ  塩化ナトリウム勾配により溶出した。得られた活性画分を限外濾過により濃縮した後、透析処理により塩化ナトリウムを除去した濃縮液を、緩衝液Ｂで平衡化したＲｅｄ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ベッド量：１０ｍＬ）に添加した。カラムを緩衝液Ｂで洗浄後、吸着酵素を０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋により溶出した。得られた活性画分を限外濾過により濃縮した後、緩衝液Ｂに対して透析し、ＡＲの最終精製酵素標品を得た。
以上の酵素の精製操作は、０−４℃で行った。
（ＡＫＲ１Ｂ１０及びＡＲに対する阻害活性）
０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．２ｍＭ  ピリジン−３−アルデヒド、及びＡＫＲ１Ｂ１０又はＡＲを含む全量２．０ｍＬの反応系におけるＮＡＤＰＨの減少速度を分光学的（３４０ｎｍ）に測定することで、ＡＫＲ１Ｂ１０及びＡＲの還元活性を測定した。ＡＫＲ１Ｂ１０及びＡＲに対する各化合物のＩＣ５０は、５点の異なる濃度の各化合物を標準反応系に添加することで算出した。結果を表１に示す。
【０１８７】
【表１】
2018027897.tif 000079
【０１８８】
試験例２：ヒト肺癌細胞に対する増殖抑制試験
ヒト肺癌Ａ５４９細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＡＫＲ１Ｂ１０のｃＤＮＡを組み込んだｐＧＷベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてＡ５４９細胞内に導入し、限界希釈法にてＡＫＲ１Ｂ１０を過剰発現した細胞（Ａ５４９／１Ｂ１０細胞）を単離した。Ａ５４９／１Ｂ１０細胞におけるＡＫＲ１Ｂ１０の過剰発現は、抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いたウエスタンブロット法にて３．４倍増加したことにより確認した。
４８ウェルプレートに、Ａ５４９細胞又はＡ５４９／１Ｂ１０細胞を細胞数が５×１０３個／ウェルとなるように播種し、その１２時間後に実施例１又は実施例８の化合物（１０μＭ、２０μＭ；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液）又は対照としてＤＭＳＯを２．５μＬ添加した。添加してから４８時間後、及び９６時間後における生細胞数を、ＭＴＴアッセイにより測定した。結果を図１に示す。
【０１８９】
Ａ５４９／１Ｂ１０細胞群はＡ５４９細胞群と比較して、９６時間後に有意に細胞数が増加し、ＡＫＲ１Ｂ１０のＡ５４９細胞増殖への関与が示された。また、化合物添加群では、９６時間後におけるＡ５４９／１Ｂ１０細胞数が用量依存的に減少し、本発明化合物は癌細胞増殖抑制効果を示すことが確認された。
【０１９０】
試験例３：ヒト肺癌細胞に対する浸潤抑制試験
６ｃｍディッシュ上で試験例２に記載と同様の方法で培養したＡ５４９細胞に２００μＬチップの先を用いて傷をつけた後、実施例１又は実施例８の化合物（２０μＭ；ＤＭＳＯ溶液）又は対照としてＤＭＳＯを１０μＬ添加した。３７℃で２４時間インキュベートした後、創傷治癒アッセイにより浸潤能を評価した。結果を図２に示す。
【０１９１】
化合物添加群では、ＤＭＳＯ添加群と比較して有意に浸潤能が低下し、本発明化合物は癌細胞浸潤抑制効果を示すことが確認された。
【０１９２】
試験例４：シスプラチン抵抗性癌細胞における感受性回復試験
Ａ５４９細胞に対して、３継代ごとに、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、及び５μＭと段階的に濃度を上昇させたシスプラチン（和光純薬株式会社製）を約２ヶ月間投与することによって、５μＭ  シスプラチンに対して抵抗性を獲得したＡ５４９／ＣＤＤＰ細胞を樹立した。
増殖培地に懸濁したＡ５４９／ＣＤＤＰ細胞を、９６ウェルプレート中に細胞数が５×１０４個／２００μＬとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。培地を血清不含培地に交換し、実施例１又は８の化合物（１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ；ＤＭＳＯ溶液）又は陰性対照としてＤＭＳＯを０．５μＬ添加して２時間培養し、さらにシスプラチン（４０μＭ；ＤＭＳＯ溶液）を０．５μＬ添加して、２４時間培養した。また、後述の細胞生存率算出のため、細胞懸濁液の代わりに培地のみを添加し、実施例１又は８の化合物、及びシスプラチンを添加したもの（ブランク）を調製した。
次に、上記培養物に、５ｍＭ  ＷＳＴ−１及び０．２ｍＭ  １−メチル−５−メチルフェナジニウム  メチルサルフェートを含む、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）１０μＬを添加して、３７℃で２時間培養した後、マイクロプレートリーダーＭｏｄｅ１６８０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて、測定波長４１５ｎｍ及び対照波長６６０ｎｍでの吸光度を測定した。細胞生存率は、以下の式により算出した。
細胞生存率（％）＝｛（Ｓ−Ａ）／（Ｂ−Ａ）｝×１００
Ｓ:細胞及び実施例１又は８の化合物を添加したウェルの吸光度
Ａ:培地及び実施例１又は８の化合物を添加したウェルの吸光度（ブランク）
Ｂ:細胞及びＤＭＳＯを添加したウェルの吸光度（対照）
なお、Ａ５４９細胞をシスプラチンで２４時間処理した後の細胞生存率についても測定した。結果を図３に示す。
【０１９３】
Ａ５４９細胞では、２４時間のシスプラチン処理により生存率が約３５％に低下した一方、Ａ５４９／ＣＤＤＰ細胞では生存率がほとんど低下しなかった。また、化合物添加群では、用量依存的に細胞生存率の低下がみられ、本発明化合物はシスプラチン抵抗性癌細胞においてシスプラチンの感受性を回復させることが確認された。
【０１９４】
試験例５：シスプラチン抵抗性癌細胞に対する増殖抑制試験
Ａ５４９／ＣＤＤＰ細胞に実施例１又は８の化合物（１０μＭ、２０μＭ；ＤＭＳＯ溶液）又は対照としてＤＭＳＯを０．５μＬ添加し、シスプラチン（０．５μＭ）を含む培地で９６時間培養した後の細胞数をＭＴＴアッセイにより測定した。なお、Ａ５４９細胞及びＡ５４９／ＣＤＤＰ細胞を上記シスプラチン含有培地で４８時間、及び９６時間培養した後の細胞数についても測定した。結果を図４に示す。
【０１９５】
Ａ５４９細胞はシスプラチン含有培地でほとんど増殖しなかったのに対し、Ａ５４９／ＣＤＤＰ細胞は急激な増殖を示した。また、化合物添加群では、用量依存的にＡ５４９／ＣＤＤＰ細胞数の低下がみられ、本発明化合物はシスプラチン抵抗性癌細胞に対しても増殖抑制効果を示すことが確認された。
【０１９６】
試験例６：シスプラチン抵抗性癌細胞に対する浸潤及び転移の抑制試験
ボイデンチャンバー（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ社製）にポリカーボネート膜又はＩ型コラーゲンでコートしたポリカーボネート膜を装着し、それぞれの膜上にＡ５４９／ＣＤＤＰ細胞を播種した。実施例１又は８の化合物（１０μＭ、２０μＭ；ＤＭＳＯ溶液）の存在又は非存在時において４８時間培養した後に膜を通過した細胞数を計測した。細胞数の計測は、ギムザ染色後に顕微鏡を用いて視覚的に行い、化合物非存在時の細胞数を１００％とすることで評価した。なお、浸潤能はＩ型コラーゲンでコートしたポリカーボネート膜を、転移能はポリカーボネート膜を用いて、それぞれ評価した。結果を図５に示す。
【０１９７】
いずれの化合物においても、シスプラチン抵抗性癌細胞に対する浸潤能及び転移能の抑制効果が確認された。
【０１９８】
試験例７：マウス肺転移モデルにおける癌細胞増殖抑制試験
Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞は、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９細胞に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するベクターをリポフェクション法により導入し、ハイグロマイシンによる薬剤選択後に限界希釈法を経て樹立した。
上記樹立したＡ５４９−Ｌｕｃ細胞（濃度：５，０００，０００／ｍＬ）に実施例１又は８の化合物のＤＭＳＯ溶液（２０ｍＭ；１０μＬ）を培地（１０ｍＬ）に添加し、２４時間培養した。次いで、得られたＡ５４９−Ｌｕｃ細胞、又は対照として化合物処理を行わずに溶媒（ＤＭＳＯ；１０μＬ）を培地（１０ｍＬ）に添加して培養したＡ５４９−Ｌｕｃ細胞（濃度：５，０００，０００／ｍＬ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝５）の尾静脈に１００μＬ注入し、４日後にマウスの肺におけるルシフェラーゼ蛍光を測定した。結果を図６に示す。
【０１９９】
化合物での処理を行わなかったＡ５４９−Ｌｕｃ細胞の投与群と比較して、化合物での処理を行ったＡ５４９−Ｌｕｃ細胞の投与群で明確な肺転移形成の抑制が確認された。以上より、本発明化合物による癌細胞増殖抑制効果がｉｎ  ｖｉｖｏでも確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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