(57)【要約】【課題】微生物を用いて、アスタシンに加えて他のカロテノイドを同時に含むカロテノイド組成物又はアスタシンを生産するための手段、及び、有用な複数のカロテノイドを含むカロテノイド組成物を提供する。【解決手段】本発明は、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物又はアスタシンを製造する方法であって、前記カロテノイド組成物又はアスタシンを生産する能力を有する微生物を培養する工程と、前記工程で得られた培養物から前記カロテノイド組成物又はアスタシンを取得する工程とを含むことを特徴とする方法に関する。本発明はまた前記微生物に関する。本発明はまた前記カロテノイド組成物に関する。本発明はまたアスタシンを生産する能力を有する微生物の微生物体とアスタシンとを含む培養物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物を製造する方法であって、
前記カロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から前記カロテノイド組成物を取得するカロテノイド組成物取得工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
アスタシンを製造する方法であって、
アスタシンを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物からアスタシンを取得するアスタシン取得工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
オーランチオキトリウム属に属し、且つ、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物を生産する能力を有することを特徴とする微生物。
【請求項４】
オーランチオキトリウム属に属し、且つ、アスタシンを生産する能力を有することを特徴とする微生物。
【請求項５】
ＲＨ−７Ａ−３（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３２０）、ＲＨ−７Ａ−７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３２１）、又は、ＲＵ−１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３５３）。
【請求項６】
アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物。
【請求項７】
アスタシンを生産する能力を有する微生物の微生物体とアスタシンとを含む培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種のカロテノイドを含むカロテノイド組成物、前記カロテノイド組成物の製造方法、及び、前記カロテノイド組成物を生産する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは色素として有用であるとともに、抗酸化作用等の種々の有用な作用を有するため、医薬品、化粧品、食品などの分野において利用価値が高い。
【０００３】
カロテノイドのうちアスタシンは、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン等の他のカロテノイドと比較して産業的応用はやや遅れているが、例えば以下のようなアスタシンの応用例が報告されている。
【０００４】
特許文献１では、カロテノイドが抗酸化作用を有することに着目し、脂質、リポタンパク質、タンパク質、ＤＮＡ等の酸化等の、酸化機構が関与する疾患の予防、治療のために親水性カロテノイドを使用することが開示されており、親水性カロテノイドの具体例としてアスタシンが挙げられている。特許文献１ではアスタシンを、ビタミンＣ、α−トコフェロール、レシチン、大豆油と混合した混合物を封入したカプセルが開示されている。
【０００５】
特許文献２では、メラニン芽細胞合成インヒビターとして、アスタシンが、アスタキサンチン等とともに例示されている。特許文献２の実施例１では、線維芽細胞をエストラジオール溶液で処理すると細胞質の強い収縮が観察され、紡錘状外観は認められなかったのに対して、アスタシンの存在下で細胞を培養すると、その後にエストラジオール溶液で処理しても細胞の表現型は変化せず、細胞は透明細胞質と紡錘状外観を維持したことが開示されている。
【０００６】
特許文献３では、アスタシンが人体に安全な着色剤等として利用可能であることが記載されている。
【０００７】
また、アスタシン等のカロテノイドは半導体の分野における利用も検討されている（非特許文献１）。
【０００８】
アスタシン以外のカロテノイド、すなわちβ−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、エキネノン等のカロテノイドについては、それを生産する能力を有する微生物を培養することにより生産する技術が開発されている（特許文献４〜６）。
【０００９】
アスタシンの製造方法の報告は少ないが、例えば特許文献７には、アスタキサンチンと塩基とをアルコール溶媒中に分散させ、撹拌しながら酸素を供給して酸化反応を行い、アルコール溶媒を除去することによりアスタシンを合成する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ９５／００１３０
【特許文献２】特開平５−２５０３６号公報
【特許文献３】ＣＮ１０４２６２２２１Ａ
【特許文献４】特開２０１１−１８８７９５号公報
【特許文献５】特開２００１−９５５００号公報
【特許文献６】特開２０１５−１８８３４２号公報
【特許文献７】ＣＮ１８１７８５８Ａ
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  １９８０，１９（１），２０７
【非特許文献２】Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，４８，１９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
アスタシンを含むカロテノイドを微生物により生産する方法はこれまでに提供されていない。
【００１３】
一方、複数種のカロテノイドを含むカロテノイド組成物は、個々のカロテノイドを単離して利用するための出発原料として用いることができる。また、数種のカロテノイドを含むカロテノイド組成物は、複数種のカロテノイドを同時に供給するために用いることができる。このように、複数種のカロテノイドを含むカロテノイド組成物は有用性が高いと本発明者らは考えた。
【００１４】
そこで本発明では、微生物を用いて、アスタシンに加えて他のカロテノイドを同時に含むカロテノイド組成物を生産するための手段、及び、有用な複数のカロテノイドを含むカロテノイド組成物を提供する。本発明はまた、微生物を用いて、アスタシンを生産するための手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物を製造する方法であって、
前記カロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から前記カロテノイド組成物を取得するカロテノイド組成物取得工程と
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、アスタシンを製造する方法であって、
アスタシンを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物からアスタシンを取得するアスタシン取得工程と
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、オーランチオキトリウム属に属し、且つ、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物を生産する能力を有することを特徴とする微生物に関する。
【００１８】
本発明はまた、オーランチオキトリウム属に属し、且つ、アスタシンを生産する能力を有することを特徴とする微生物に関する。
【００１９】
本発明はまた、ＲＨ−７Ａ−３（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３２０）、ＲＨ−７Ａ−７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３２１）、又は、ＲＵ−１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３５３）に関する。
【００２０】
本発明はまた、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物に関する。
【００２１】
本発明はまた、アスタシンを生産する能力を有する微生物の微生物体とアスタシンとを含む培養物に関する。
【００２２】
本発明はまた、
カンタキサンチンを製造する方法であって、
オーランチオキトリウム属に属する微生物（特に、オーランチオキトリウム属に属し、且つ、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物）をコバルトイオンの存在下で培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物からカンタキサンチン又はカンタキサンチンを含むカロテノイド組成物を取得するカンタキサンチン取得工程と
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００２３】
本発明はまた、
オーランチオキトリウム属に属する微生物（特に、オーランチオキトリウム属に属し、且つ、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物）によるカンタキサンチンの生産量を向上させる方法であって、
前記微生物をコバルトイオンの存在下で培養する培養工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のカロテノイド組成物の製造方法では、アスタシン等の複数種のカロテノイドを含むカロテノイド組成物を、微生物を用いて製造することが可能である。
【００２５】
本発明のアスタシンの製造方法では、アスタシンを、微生物を用いて製造することが可能である。
【００２６】
本発明の微生物は、アスタシン等の複数種のカロテノイドを含むカロテノイド組成物を生産するために、又はアスタシンを生産するために、利用することができる。
【００２７】
本発明のカロテノイド組成物は、アスタシン、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンのうち１種以上の化合物を個別に単離して利用するための出発原料として用いることや、複数種のカロテノイドを同時に供給するための素材として用いることが可能である。
【００２８】
本発明の培養物は、アスタシンを単離して利用するための出発原料として用いることや、アスタシンを供給するための素材として用いることが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
＜１．カロテノイド組成物＞
本発明のカロテノイド組成物は、複数種のカロテノイドの混合物であり、具体的には、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを少なくとも含む。本発明のカロテノイド組成物はこれら以外のカロテノイドを更に含んでもよい。
【００３０】
本発明のカロテノイド組成物は、好ましくは、アスタシン、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンを少なくとも含む。
【００３１】
本発明のカロテノイド組成物における各カロテノイドの含有量の比率は特に限定されない。本発明のカロテノイド組成物の典型的な例として以下の第２の実施形態、第３の実施形態、第４の実施形態、第５の実施形態、及び、第６の実施形態が挙げられる。
【００３２】
本発明のカロテノイド組成物の第２の実施形態では、液体クロマトグラフ質量スペクトル分析で得られる抽出イオンクロマトグラムのピーク面積の比率として、アスタキサンチンに対しアスタシンが好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは０．１〜５．０％、特に好ましくは０．１〜１．０％であり、且つ、４５０ｎｍを検出波長とする紫外光検出器を用いる液体クロマトグラフィー測定でのクロマトグラムにおけるピーク面積の比率として、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンの合計に対して、好ましくはアスタキサンチンが１７〜３９％、フェニコキサンチンが９〜３０％、カンタキサンチンが２〜２４％、エキネノンが１〜１５％、β−カロテンが２７〜４７％であり、より好ましくはアスタキサンチンが２２〜３４％、フェニコキサンチンが１４〜２５％、カンタキサンチンが７〜１９％、エキネノンが１〜１０％、β−カロテンが３２〜４２％である。
【００３３】
本発明のカロテノイド組成物の第３の実施形態では、液体クロマトグラフ質量スペクトル分析で得られる抽出イオンクロマトグラムのピーク面積の比率として、アスタキサンチンに対しアスタシンが好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは０．１〜５．０％、特に好ましくは０．１〜１．１％であり、且つ、４５０ｎｍを検出波長とする紫外光検出器を用いる液体クロマトグラフィー測定でのクロマトグラムにおけるピーク面積の比率として、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンの合計に対して、好ましくはアスタキサンチンが６０〜９５％、フェニコキサンチンが２〜２９％、カンタキサンチンが０．１〜１５％、エキネノンが０．１〜１１％、β−カロテンが１〜１７％であり、より好ましくはアスタキサンチンが６５〜９０％、フェニコキサンチンが７〜２４％、カンタキサンチンが０．１〜１０％、エキネノンが０．１〜６％、β−カロテンが１〜１２％である。
【００３４】
本発明のカロテノイド組成物の第４の実施形態では、液体クロマトグラフ質量スペクトル分析で得られる抽出イオンクロマトグラムのピーク面積の比率として、アスタキサンチンに対しアスタシンが好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは３．０〜７．０％であり、且つ、４５０ｎｍを検出波長とする紫外光検出器を用いる液体クロマトグラフィー測定でのクロマトグラムにおけるピーク面積の比率として、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンの合計に対して、好ましくはアスタキサンチンが６０〜９５％、フェニコキサンチンが２〜２９％、カンタキサンチンが０．１〜１５％、エキネノンが０．１〜１１％、β−カロテンが１〜１７％であり、より好ましくはアスタキサンチンが６５〜９０％、フェニコキサンチンが７〜２４％、カンタキサンチンが０．１〜１０％、エキネノンが０．１〜６％、β−カロテンが１〜１２％である。
【００３５】
本発明のカロテノイド組成物の第５の実施形態では、液体クロマトグラフ質量スペクトル分析で得られる抽出イオンクロマトグラムのピーク面積の比率として、アスタキサンチンに対しアスタシンが好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは０．５〜５．５％であり、且つ、４５０ｎｍを検出波長とする紫外光検出器を用いる液体クロマトグラフィー測定でのクロマトグラムにおけるピーク面積の比率として、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンの合計に対して、好ましくはアスタキサンチンが０．１〜１０％、フェニコキサンチンが１〜３０％、カンタキサンチンが５０〜９０％、エキネノンが０．１〜１０％、β−カロテンが１〜２０％であり、より好ましくはアスタキサンチンが０．５〜５％、フェニコキサンチンが１０〜２０％、カンタキサンチンが６０〜８０％、エキネノンが０．５〜５％、β−カロテンが５〜１５％である。
【００３６】
本発明のカロテノイド組成物の第６の実施形態では、液体クロマトグラフ質量スペクトル分析で得られる抽出イオンクロマトグラムのピーク面積の比率として、アスタキサンチンに対しアスタシンが好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは０．５〜５．５％であり、且つ、４５０ｎｍを検出波長とする紫外光検出器を用いる液体クロマトグラフィー測定でのクロマトグラムにおけるピーク面積の比率として、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンの合計に対して、好ましくはアスタキサンチンが２〜２２％、フェニコキサンチンが５〜３５％、カンタキサンチンが２０〜６０％、エキネノンが０．１〜１０％、β−カロテンが５〜４５％であり、より好ましくはアスタキサンチンが７〜１７％、フェニコキサンチンが１０〜３０％、カンタキサンチンが３０〜５０％、エキネノンが０．５〜５％、β−カロテンが１５〜３５％である。
【００３７】
本発明のカロテノイド組成物の第２、第３、第４、第５、第６の実施形態は、更に、未同定のカロテノイドを含んでいる場合があり、その量は、４５０ｎｍを検出波長とする紫外光検出器を用いる液体クロマトグラフィー測定でのクロマトグラムにおけるピーク面積の比率として、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンの合計に対する割合で表すことができる。
【００３８】
上記の、アスタキサンチンに対するアスタシンの比率は、例えば、液体クロマトグラフ質量スペクトル分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いた次の方法により算出できる。前記カロテノイド組成物を試料とし、液体クロマトグラフィーカラムを通して前記組成物中の各成分を時間的に分離し、分離された各成分を、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）でイオン化し、生成したイオンを飛行時間型質量分析器（ＴＯＦＭＳ）により質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて分離し検出器で検出する。この操作により、時間経過に伴って繰り返し質量スペクトルデータを収集し記録する。そして、記録された質量スペクトルデータから、アスタキサンチンを代表する質量電荷比（［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ＝５９７．３９３０〜５９７．３９５０）のイオンの強度を時間の関数として表した抽出イオンクロマトグラム（アスタキサンチンＥＩＣ）と、アスタシンを代表する質量電荷比（［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ＝５９３．３６００〜５９３．３６４０）のイオンの強度を時間の関数として表した抽出イオンクロマトグラム（アスタシンＥＩＣ）とを作成する。そして作成されたアスタキサンチンＥＩＣのピーク面積を１００％としたときの、アスタシンＥＩＣのピーク面積の比率を、アスタキサンチンに対するアスタシンの比率とすることができる。
【００３９】
上記の「４５０ｎｍを検出波長とする紫外光検出器を用いる液体クロマトグラフィー測定」は、具体的には、以下の条件：
カラム：ＯＤＳカラム、特に、ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（ナカライテスク）、
移動相：アセトニトリルとメタノールとジクロロメタン混合溶媒、特に、アセトニトリルとメタノールとジクロロメタンが７：２：１の容積比で混合された混合溶媒、
流速：１ｍＬ／分、
カラム温度：２５℃、
検出器：紫外光検出器、
検出波長：４５０ｎｍ、
による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定が例示できる。
【００４０】
本発明のカロテノイド組成物は、どのような形態で提供されてもよい。本発明のカロテノイド組成物は、例えば、医薬品、飲食品、化粧品、微生物培養物等の組成物中に存在していてもよいし、精製（粗精製も含む）された状態であってもよい。
【００４１】
本発明のカロテノイド組成物は、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とのうち１種以上を個別に単離して利用するための出発原料として用いることができる。本発明のカロテノイド組成物はまた、複数種のカロテノイドを同時に供給するための素材として、医薬品、飲食品、化粧品等に配合することができる。
【００４２】
＜２．カロテノイド組成物又はアスタシンを生産する能力を有する微生物＞
本発明はまた、アスタシンを生産する能力を有する微生物を提供する。本発明はまた、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物を提供する。
【００４３】
ここで、カロテノイド組成物は上記「１．カロテノイド組成物」の欄に説明したものと同様である。
【００４４】
本発明の、前記カロテノイド組成物又はアスタシンを生産する能力を有する微生物は好ましくは微細藻類に属する微生物である。微細藻類としてはラビリンチュラ類、藍藻類、珪藻類、真正眼点藻類、クリプト藻類、渦鞭毛藻類、黄金色藻類、ハプト藻類、ラフィド藻類、ユーグレナ藻類、プラシノ藻類又は緑藻類が好ましく、特にラビリンチュラ類が好ましい。ラビリンチュラ類に属する微生物としてはオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属又はウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属に属する微生物が好ましく、なかでも、オーランチオキトリウム属に属する微生物が特に好ましい。
【００４５】
微生物がオーランチオキトリウム属に属することは以下の指標により判断することができる：１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列が、既知のオーランチオキトリウム属に属する微生物の１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列と実質的に同一であり、色素としてアスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテンを含み、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を主な脂肪酸成分として含むトリグリセリドを油滴として蓄積する（非特許文献２）。また、後述する微生物の具体的な３例の微生物のいずれか１つが有する１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列と、実質的に同一の塩基配列、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の配列同一性を有する塩基配列を、１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列として含む微生物も、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する微生物と判断することができる。ここで２つの塩基配列の同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ、及びＢＬＡＳＴ）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２５，  ３３８９−３４０２，  １９７７及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５，  ４０３−４１０，  １９９０を参照されたい。
【００４６】
本発明において、前記カロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物は、適切な条件で培養したときに、培養物中にアスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とをそれぞれ生成することができる微生物を指す。本発明において、アスタシンを生産する能力を有する微生物は、適切な条件で培養したときに、培養物中にアスタシンを生成することができる微生物を指す。培養条件の具体例は別途説明する。培養条件の具体例は別途説明する。
【００４７】
本発明で用いる微生物は野生株であってもよいし、変異株であってもよい。
本発明で用いるオーランチオキトリウム属に属し、アスタシン又は前記カロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物の好ましい具体例としては、ＲＨ−７Ａ−３（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３２０）、ＲＨ−７Ａ−７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３２１）、及び、ＲＵ−１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３５３）が例示できる。これらの微生物のうち２種以上が混合したものであってもよい。ＲＨ−７Ａ−３は、前記第２の実施形態に係るカロテノイド組成物を生産するのに適している。ＲＨ−７Ａ−７は、前記第３の実施形態に係るカロテノイド組成物を生産するのに適している。ＲＵ−１は、コバルト塩が存在しないｐＨ１．５〜４．５の条件下では、前記第４の実施形態に係るカロテノイド組成物を生産するのに適している。ＲＵ−１は、コバルト塩が存在する条件下では、前記第５の実施形態に係るカロテノイド組成物を生産するのに適している。ＲＨ−７Ａ−７は、コバルト塩が存在する条件下では、前記第６の実施形態に係るカロテノイド組成物を生産するのに適している。
【００４８】
本発明において、ＲＨ−７Ａ−３、ＲＨ−７Ａ−７、及び、ＲＵ−１はいずれも、その変異株であって、アスタシン又は前記カロテノイド組成物を生産する能力を有する変異株も包含する概念である。各株の変異株は、ＲＨ−７Ａ−３、ＲＨ−７Ａ−７、又は、ＲＵ−１に変異誘発処理を施して得られる変異株である。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで「変異原」なる語は、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、適切であれば、他の変異原も使用され得る。
【００４９】
＜３．カロテノイド組成物の製造方法＞
本発明は、アスタシンと、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンからなる群から選択される４以上の化合物とを含むカロテノイド組成物を製造する方法であって、
前記カロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から前記カロテノイド組成物を取得するカロテノイド組成物取得工程と
を含む方法を提供する。
【００５０】
本方法で製造される前記カロテノイド組成物は上記「１．カロテノイド組成物」の欄に説明したものと同様である。本方法で用いる前記微生物は「２．カロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物」の欄に説明したものと同様である。
【００５１】
前記培養工程では、前記微生物を培地に接種して培養する。培地は液体培地であってもよいし、固体培地であってもよいが、前記カロテノイド組成物の大量生産のためには液体培地であることが好ましい。
【００５２】
培地は天然海水塩又は人工海水塩を含んでもよく、含まなくてもよい。
培地は炭素源及び窒素源を少なくとも含む。
【００５３】
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、フコース、グルコサミン、デキストラン等の炭水化物、脂肪酸（オレイン酸等）、大豆油等の油脂類、並びに、グルタミン酸、糖蜜、グリセロール、酢酸ナトリウム等の従来使用されている炭素源から選択される１種以上を使用できるが、これらに限られるものではない。
【００５４】
窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆かす等の天然窒素源、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素源、並びに、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源から選択される１種以上を使用できるが、これらに限られるものではない。
【００５５】
前記培地は更に必要に応じて、硫酸鉄（特に硫酸鉄（ＩＩ））、コバルト塩（特に塩化コバルト（ＩＩ））、銅塩（硫酸銅等）、亜鉛塩、マグネシウム塩（硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等）、カルシウム塩（塩化カルシウム等）、モリブデン塩、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の無機塩、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸塩、並びにビタミン類から選択される１種以上の他の栄養成分を含有してもよい。特に、コバルト塩を含有する培地中で、前記カロテノイド組成物を生産する能力を有する微生物を培養すると、微生物により生産されるカロテノイド組成物中でのカンタキサンチンの比率を顕著に高めることができる。微生物としてＲＵ−１又はＲＨ−７Ａ−７をコバルト塩（特に塩化コバルト（ＩＩ））を含む培地を用いて培養するとき、カンタキサンチンを高比率で含むカロテノイド組成物を生産することができる。
【００５６】
これらの培地成分の量は、成分の濃度が微生物の生育に有害な影響を与えない範囲で適宜調整することができ、特に限定されない。一般的には、炭素源は、総量として、培地１リットルあたり２０〜１８０ｇの濃度で添加することができる。窒素源は、総量として、培地１リットルあたり０.６〜１００ｇの濃度で添加することができる。好ましくは、窒素源の量は、炭素源の量の増加に伴って増加させる。培地に無機塩が添加される場合、無機塩は培地中に０．００５〜０．１００質量％の濃度で添加されることが好ましい。特に、硫酸鉄（硫酸鉄（ＩＩ））が培地中に０．００５〜０．１００質量％の濃度で添加されることが好ましく、０．０１０〜０．０５０の濃度で添加されることがより好ましい。
【００５７】
培地は適当な酸または塩基を添加してｐＨを調節することが好ましく、ｐＨの範囲としては１．５〜９．５が例示できる。ｐＨの更に具体的な範囲としては１．５〜４．５が例示できる。培地のｐＨ値としては、室温（例えば２５℃）において測定した値を採用することができる。培地のｐＨ値とは、特に限定しない限り、培養開始時の初期のｐＨ値を指す。特に、ＲＵ−１を用いて前記第４の実施形態に係るカロテノイド組成物を生産する場合、初期ｐＨが１．５〜４．５の培地を用いることが好ましく、初期ｐＨが３．５〜４．５の培地を用いることがより好ましい。
培地は培養に使用する前にオートクレーブ処理等の滅菌処理を施す。
【００５８】
前記培養工程において微生物の培養の条件は特に限定されない。液体培地中での培養の場合、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養のいずれかによって行うことができる。培地と接する雰囲気は空気、酸素が例示できる。培養温度は好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは１５〜３０℃が例示できる。培養時間は通常２４〜３３６時間、好ましくは４８〜１６８時間とすることができる。
【００５９】
炭素源、窒素源、他の栄養成分等は、培養工程の開始前または途中に培地へ添加することができる。これらの成分の添加は、一回、複数回、または連続的に行うことができる。
【００６０】
前記培養工程に続いて行うカロテノイド組成物取得工程は、前記培養工程で得られた培養物から前記カロテノイド組成物を取得する工程である。
【００６１】
ここで培養物とは、培養により得られた、前記微生物の微生物体と前記カロテノイド組成物とを含む、培養による産物を指す。培養物は、培地と微生物体との混合物であってもよいし、前記混合物から分離した微生物体であってもよい。微生物体の範囲には、未処理の微生物体だけでなく、処理された微生物体も包含される。処理された微生物体としては、例えば、水洗、破砕及び乾燥から選択される１種以上の処理により処理された微生物体が例示できる。培養物は殺菌処理されたものであってもよいし、殺菌処理されていないものであってもよい。
【００６２】
培養物から前記カロテノイド組成物を取得する方法は特に限定されない。典型的には、前記混合物を遠心分離、濾過等の固液分離手段により分離して微生物体を採取する。採取した微生物体は更に水洗、乾燥及び破砕から選択される１以上の処理を施してもよい。微生物体の乾燥は凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。微生物体の破砕は、ミルによる処理、超音波処理等によって行うことができる。
【００６３】
好ましくは、前記微生物体（好ましくは、前段落に記載の処理がされた微生物体）から、カロテノイドを有機溶媒によって抽出する。抽出に用いる有機溶媒としてはクロロホルム、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトン、アセトニトリル、ヘキサン、石油エーテル等が例示でき、これらの溶媒のうち２種以上の混合した混合溶媒であってもよい。好適な混合溶媒としてはクロロホルムとメタノールとの混合溶媒が例示できる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、高濃度のカロテノイド組成物が得られる。
【００６４】
また、前記培養工程で得られた培養物から前記カロテノイド組成物を分離することは必須ではなく、前記カロテノイド組成物を含む前記培養物自体を、前記カロテノイド組成物の用途に利用してもよい。前記培養工程で得られた培養物自体を、前記カロテノイド組成物の用途に利用するために取得することも、前記カロテノイド組成物を取得する工程の一態様である。
【００６５】
＜４．アスタシンの製造方法＞
本発明は、アスタシンを製造する方法であって、
アスタシンを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物からアスタシンを取得するアスタシン取得工程と
を含む方法を提供する。
【００６６】
本方法で用いる前記微生物は「２．カロテノイド組成物又はアスタシンを生産する能力を有する微生物」の欄に説明したものと同様である。
【００６７】
前記培養工程で用いる培地及び培養条件は、「３．カロテノイド組成物の製造方法」で詳述したカロテノイド組成物製造のための培養工程に用いる培地及び培養条件と同様の範囲から選択することができる。
【００６８】
前記培養工程に続いて行うアスタシン取得工程は、前記培養工程で得られた培養物からアスタシンを取得する工程である。
【００６９】
ここで培養物とは、培養により得られた、前記微生物の微生物体とアスタシンとを含む、培養による産物を指す。培養物は、培地と微生物体との混合物であってもよいし、前記混合物から分離した微生物体であってもよい。微生物体の範囲には、未処理の微生物体だけでなく、処理された微生物体も包含される。処理された微生物体としては、例えば、水洗、破砕及び乾燥から選択される１種以上の処理により処理された微生物体が例示できる。培養物は殺菌処理されたものであってもよいし、殺菌処理されていないものであってもよい。
【００７０】
培養物からアスタシンを取得する方法は特に限定されない。典型的には、前記混合物を遠心分離、濾過等の固液分離手段により分離して微生物体を採取する。採取した微生物体は更に水洗、乾燥及び破砕から選択される１以上の処理を施してもよい。微生物体の乾燥は凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。微生物体の破砕は、ミルによる処理、超音波処理等によって行うことができる。
【００７１】
好ましくは、前記微生物体（好ましくは、前段落に記載の処理がされた微生物体）から、アスタシンを有機溶媒によって抽出する。抽出は、他のカロテノイドも一緒に抽出される条件で行ってもよい。抽出に用いる有機溶媒としてはクロロホルム、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトン、アセトニトリル、ヘキサン、石油エーテル等が例示でき、これらの溶媒のうち２種以上の混合した混合溶媒であってもよい。好適な混合溶媒としてはクロロホルムとメタノールとの混合溶媒が例示できる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することによりアスタシンが得られる。
【００７２】
アスタシンを他のカロテノイドとともに含む組成物（例えば前記カロテノイド組成物）として前記培養物から分離する場合、必要に応じて、前記組成物からアスタシンを分離する工程を更に行ってもよい。前記組成物からアスタシンを分離する方法としてはカラムクロマトグラフィーを用いる方法が挙げられる。
【００７３】
また、前記培養工程で得られた培養物からアスタシンを分離することは必須ではなく、アスタシンを含む前記培養物自体を、アスタシンの用途に利用してもよい。前記培養工程で得られた培養物自体を、アスタシンの用途に利用するために取得することも、アスタシンを取得する工程の一態様である。
【００７４】
＜５．アスタシンを含む培養物＞
本発明の培養物は、アスタシンを生産する能力を有する微生物の微生物体とアスタシンとを少なくとも含み、好ましくは、「４．アスタシンの製造方法」の欄に説明した方法における培養工程で得られる培養物である。「アスタシンを生産する能力を有する微生物」の具体例は、「２．カロテノイド組成物又はアスタシンを生産する能力を有する微生物」の欄に説明したものと同様である。「培養物」の具体例は、「４．アスタシンの製造方法」の欄に説明したものと同様である。
【００７５】
本発明の培養物の好ましい一実施形態では、アスタシンとアスタキサンチンとを含み、アスタシンを、アスタキサンチンに対して、好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは０．１〜５．０％、特に好ましくは０．１〜１．０％の量で含む。本発明の培養物の他の好ましい一実施形態では、アスタシンとアスタキサンチンとを含み、アスタシンを、アスタキサンチンに対して、好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは０．１〜５．０％、特に好ましくは０．１〜１．１％の量で含む。本発明の培養物の他の好ましい一実施形態では、アスタシンとアスタキサンチンとを含み、アスタシンを、アスタキサンチンに対して、好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは３．０〜７．０％の量で含む。本発明の培養物の他の好ましい一実施形態では、アスタシンとアスタキサンチンとを含み、アスタシンを、アスタキサンチンに対して、好ましくは０．１〜１０．０％、より好ましくは０．５〜５．５％の量で含む。
【００７６】
ここで、アスタシンとアスタキサンチンとの比率は、「１．カロテノイド組成物」において説明した手順で求めることができる。本発明の培養物中のアスタシンは、より好ましくは、「１．カロテノイド組成物」の欄に詳述した組成物の形態で含まれる。本発明の培養物のより好ましい実施形態は、「３．カロテノイド組成物の製造方法」の欄に詳述した方法における培養工程で得られる培養物である。
【実施例】
【００７７】
１．オーランチオキトリウム属微生物
後述する実験ではオーランチオキトリウム属に属する微生物の株として「ＲＨ−７Ａ−３」、「ＲＨ−７Ａ−７」及び「ＲＵ−１」を用いた。これら３株はいずれも、形態及び代謝産物の特徴から、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に分類される。また、これら３株はいずれも、１８ＳｒＲＮＡをコードする塩基配列に基づいてオーランチオキトリウム属微生物に分類された微生物株の変異株であることからも、同属に属すると判断した。
【００７８】
また、上記微生物株の各々を、下記表２に示す組成の液体培地中で、２８℃の温度条件下、１５０ｒｐｍの振盪速度で４８時間振盪培養を行った。培養された微生物体の凍結乾燥物の脂質を、メチルエステルに変換しガスクロマトグラフィーにより分析したところ、クロマトグラフにおけるピーク面積比（各株３回の培養物からの平均値）は下記表１のようになった。上記の微生物株は、いずれも、脂肪酸としてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を主として生産することから、オーランチオキトリウム属微生物であることが裏付けられた。
【００７９】
【表１】
2018117619.tif 000002
【００８０】
ＲＨ−７Ａ−３は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３２０が付与されている（受託日：平成２８年（２０１６年）１２月１３日）。
【００８１】
ＲＨ−７Ａ−７は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３２１が付与されている（受託日：平成２８年（２０１６年）１２月１３日）。
【００８２】
ＲＵ−１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３５３が付与されている（受託日：平成２９年（２０１７年）１２月１９日）。
【００８３】
２．培養とカロテノイド抽出
（１）培養
フラスコ中で以下の組成の液体培地を調製し、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）を施した。
【００８４】
【表２】
2018117619.tif 000003
【００８５】
前記液体培地に前記微生物株の１つの前培養液を１／１０量植菌し、２８℃の温度条件下、１５０ｒｐｍの振盪速度で振盪培養を行った。培養時間は９６時間、１４４時間又は１６８時間とした。
【００８６】
表４、表５−１及び表５−２中で特に明示の無い実験では、表２に示す組成の前記液体培地を用いた。この液体培地の初期ｐＨは６であった。
【００８７】
表４の１）、表５−１の２）の実験では、表２に示す組成の前記液体培地中に、０．０１質量％の硫酸鉄（ＩＩ）を更に添加したものを液体培地として用いた。この液体培地の初期ｐＨは６であった。
【００８８】
表４の２）、表５−１の３）の実験では、表２に示す組成の前記液体培地中に、０．０４質量％の硫酸鉄（ＩＩ）を更に添加したものを液体培地として用いた。この液体培地の初期ｐＨは６であった。
【００８９】
表５−２の４）の実験では、表２に示す組成の前記液体培地中に、０．０１５質量％の硫酸鉄（ＩＩ）を更に添加したものを液体培地として用いた。この液体培地の初期ｐＨは６であった。
【００９０】
表４の３）、表５−２の６）の実験では、表２に示す組成の前記液体培地中に、０．０１質量％の塩化コバルト（ＩＩ）を更に添加したものを液体培地として用いた。この液体培地の初期ｐＨは６であった。
【００９１】
表４の４）、表５−２の７）の実験では、表２に示す組成の前記液体培地中に、５規定の塩酸を添加して初期ｐＨを４に調整した。
【００９２】
表５−２の５）の実験では、液体培地として、表２に示す組成においてグルコース３０ｇをフルクトース３０ｇに置換した組成の液体培地を用いた。この液体培地の初期ｐＨは６であった。
【００９３】
ここで用いた前培養液は、前記微生物株の１つを、試験管中の、前記液体培地と同じ組成の液体培地に植菌し、２８℃で１日間培養した培養液を指す。
【００９４】
（２）カロテノイド抽出
培養後の培養液を遠心分離し、上清を除去して微生物体を単離した。
単離した前記微生物体を凍結乾燥処理した。
【００９５】
クロロホルム／メタノールを２／１の容積比で混合した混合溶媒により前記微生物体の凍結乾燥処理物を処理して、カロテノイドを含む成分（カロテノイド成分）を前記混合溶媒中に抽出し、抽出液を得た。
【００９６】
前記抽出液を蒸留水により洗浄した。
前記洗浄後に前記抽出液から溶媒を留去し、カロテノイド成分を得た。
【００９７】
３．カロテノイド分析
高速液体クロマトグラフ−飛行時間型質量分析法（ＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳ）により、前記カロテノイド成分中のカロテノイドを分析した。ＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳは以下の条件で行った。
【００９８】
【表３】
2018117619.tif 000004
【００９９】
上記条件で得られる検出波長４５０ｎｍでのＨＰＬＣのクロマトグラムにおける、β−カロテン、エキネノン、カンタキサンチン、フェニコキサンチン及びアスタキサンチンに対応する各ピーク面積の割合（％）を求めた。各ピーク面積の割合（％）は、検出された全成分（全てカロテノイドと推定される）のピーク面積の合計に対する割合（％）と、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンのピーク面積の合計に対する割合（％）との両方を求めた。
【０１００】
更に、アスタシンについては、アスタキサンチンとアスタシンの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）での面積を比較することで、アスタキサンチンに対する割合（％）を求めた。
【０１０１】
更に、β−カロテン、カンタキサンチン及びアスタキサンチンについては、既知量の標準品と比較することで定量した。これら３成分の量は、前記液体培地１Ｌあたりの質量（ｍｇ）に換算した。
【０１０２】
アスタキサンチン及びアスタシンの分析結果を表４に示す。カロテノイドの分析結果を表５−１及び５−２に示す。
【０１０３】
なお、表４において、カッコ内に示す、アスタキサンチンの液体培地１Ｌあたりの質量（ｍｇ／ｍL）は、基礎出願時に記載していた結果であり、カッコ外に示す、アスタキサンチンの液体培地１Ｌあたりの質量（ｍｇ／ｍL）は、今回新たなアスタキサンチンの標準物質を用いて作成した検量線に基づき算出した結果である。基礎出願時の検量線作成の際の条件又は操作が適切でない可能性があったため、新たな標準物質を用いて検量線を再作成し、それに基づいてアスタキサンチン量を算出し直した。
【０１０４】
同様に、表５−１及び５−２において、カッコ内に示す、β−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチンの液体培地１Ｌあたりの質量（ｍｇ／ｍL）は、基礎出願時に記載していた結果であり、カッコ外に示す、β−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチンの液体培地１Ｌあたりの質量（ｍｇ／ｍL）は、今回新たなβ−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチンの標準物質を用いて作成した検量線に基づき算出した結果である。基礎出願時の検量線作成の際の条件又は操作が適切でない可能性があったため、新たな標準物質を用いて検量線を再作成し、それに基づいて各カロテノイド量を算出し直した。
【０１０５】
【表４】
2018117619.tif 000005
【０１０６】
【表５−１】
2018117619.tif 000006
【表５−２】
2018117619.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の、カロテノイド組成物の製造方法、微生物、及びカロテノイド組成物は、医薬品、飲食品、化粧品、半導体等の技術分野で利用可能である。