(57)【要約】【課題】  溶液中に含まれる細胞を、損傷少なく、かつ高効率に保持させる方法を提供すること。【解決手段】  細胞を含む溶液を細胞保持手段に導入した後、振盪させることで、前記課題を解決する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
保持部を有した細胞保持手段に細胞を含む溶液を導入する工程と、
前記細胞を含む溶液を導入後に前記細胞保持手段を振盪させる工程と、
を含んでなる細胞保持方法。
【請求項２】
前記保持部が前記細胞を保持可能な凹部または貫通孔である、請求項１に記載の細胞保持方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中に含まれる細胞を保持部で高効率に保持する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中に同じ種類の細胞が含まれていたとしても、当該細胞の性質が個々に異なることが知られている（非特許文献１）。一方で、溶液中に含まれる細胞から通常得られる情報は、個々の細胞の情報が平均化された情報となるため、個々の細胞の情報を得ることは難しい。そのため、溶液中に含まれる細胞を個別に解析し、個々の細胞の情報を得ることへの関心が高まっている。
【０００３】
溶液中に含まれる細胞を個々に解析する方法として、微細孔からなる細胞保持部を有した細胞保持手段に前記細胞を展開することで、個々の保持部に細胞を保持させる方法が知られている。一例として特許文献１には、誘電泳動によって保持部内に細胞を保持する方法が開示されている。また、特許文献２には、間欠的な送液によってマイクロチャンバーに細胞を保持させる方法が開示されている。しかしながら、特許文献１の方法では、細胞を懸濁させる溶液への塩添加（例えば生理食塩水に相当する濃度となるよう塩を添加）が困難という問題があり、特許文献２の方法では間欠的な送液によるマイクロチャンバーへの細胞の衝突が発生する問題があった。すなわち、特許文献１および特許文献２に記載の方法を用いても、溶液中に含まれる細胞を損傷なくまたは損傷少なく、保持手段が有する保持部へ保持させるのは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２９６５１０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／０６１６７５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｒｏｒｉａ，Ｈ．Ｈ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，２２５９−２２６５（１９８４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、溶液中に含まれる細胞を、損傷少なく、かつ高効率に保持させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明の態様は、
保持部を有した細胞保持手段に細胞を含む溶液を導入する工程と、前記細胞を含む溶液を導入後に前記細胞保持手段を振盪させる工程と、を含んでなる細胞保持方法である。前記保持部は前記細胞を保持可能な凹部または貫通孔であることが好ましい。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明において、細胞を含む溶液は特に限定されるものではなく、一例として、血液、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前記生体試料または前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、細胞株を含む培養細胞を懸濁させた細胞懸濁液があげられる。また、前述した試料、懸濁液または画分に含まれる細胞を緩衝液、生理食塩水または培養液に懸濁させて得られた液も、本発明における細胞を含む溶液に含まれる。緩衝液、生理食塩水または培養液は、細胞への損傷が少ない溶液であればよい。中でも培養液は、細胞への損傷がほとんどなく、細胞培養に好適な溶液であることから、細胞を懸濁させる溶液として好ましい。細胞を懸濁させる溶液として培養液を用いる場合は、細胞の増殖に適した培地を用いればよい。
【００１１】
また、培養液に、細胞接着因子を１種類以上、添加してもよい。なお、これらの因子は、その断片、または一部の領域を含む融合物であってもよい。さらに、培養液には、ナトリウム塩、カリウム塩、血清、脂肪酸、糖などの細胞培養に適した物質が１種類以上含まれていてもよい。
【００１２】
本発明における細胞とは、前述した生物試料や組織懸濁液から抽出された任意の細胞や、細胞株を含む培養細胞を指し、白血球、血管内皮細胞、血中循環内皮前駆細胞、幹細胞、腫瘍細胞、グラム陰性菌、ブドウ球菌、髄膜炎菌が例示できる。癌の早期診断や転移診断に本発明を適用する場合は、主に腫瘍細胞を保持部への保持対象の細胞とすることが好ましく、急性白血病の診断に本発明を適用する場合は、白血病細胞を保持部への保持対象の細胞とすることが好ましい。また、微生物等単細胞生物の培養液中に含まれる当該単細胞生物を保持部への保持対象の細胞としてもよい。
【００１３】
本発明における細胞保持手段は、導入した溶液中に含まれる細胞を保持可能な保持部を有した構造体のことをいう。保持部の例として、細胞を保持可能な凹部または貫通孔や、細胞を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）で被覆した平面または凸部があげられるが、細胞保持の確実性の点から凹部または貫通孔が好ましい。凹部を保持部とした場合、一端が細胞の全て、またはその一部を保持可能な大きさの開口部を有しており他端が底部を形成している態様とし、貫通孔を保持部とした場合、一端が細胞の全て、またはその一部を保持可能な大きさの開口部を有し他端が当該開口部よりも狭い開口部とするか、両端が細胞の一部を保持可能な大きさの開口部である態様とする。なお、保持部の大きさ（径）を溶液中に含まれる細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、細胞の採取、解析（形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析など）および培養が容易に行なえる点で好ましい。
【００１４】
なお、細胞保持手段のうち、細胞を含む溶液を収容する領域については、細胞が保持部以外に吸着することを防ぐ目的で親水化してもよい。親水化を行なう方法として、コロナ放電処理、プラズマ処理、光触媒コーティング、シランカップリング剤等による化学修飾、タンパク修飾などがあげられるが、特に細胞保持手段を構成する基材を極短時間で簡便に親水化可能なタンパク修飾が好ましい。タンパク修飾による親水化はタンパク質含有溶液に、前記基材を浸漬または接触させればよい。親水化に用いるタンパク質に特に制限はないが一般的には、血清、乳汁、卵の白身などに含まれる可溶性タンパク質であるＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＯＶＡ（オボアルブミン）等が好ましい。
【００１５】
本発明で用いる細胞保持手段の一例として、図１および図２に示す細胞保持手段１００があげられる。図１および図２に示す細胞保持手段１００は、
貫通孔１１１を有した平板状の絶縁膜１１０と、
貫通孔１２１を有した平板状の遮光膜１２０と、
導入口１３１、排出口１３２および貫通部１３３を有した平板状のスペーサ１３０と、
遮光部材１２０の下面およびスペーサ１３０の上面と密着するよう設けた基板１４１・１４２と、
を備えている。絶縁膜１１０が有する貫通口１１１と遮光膜１２０が有する貫通孔１２１とは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう絶縁膜１１０および遮光膜１２０を備えている。貫通孔１１１、貫通孔１２１および遮光膜１２０の下部に密着して備えた基板１４１により、細胞保持手段１００内に細胞を保持可能な保持部１５０が構成され、導入口１３１から細胞を含む溶液を導入すると貫通部１３３を通じて保持部１５０へ細胞２００が導入される。遮光膜１２０は、絶縁膜１１０自体の自家蛍光に起因するバックグラウンドノイズや隣接する保持部１５０からの漏れ光に起因するクロストークノイズなどの光ノイズを低減させる効果があり、保持部１５０に保持された細胞２００の検出を当該細胞由来の光を用いて行なう際、各保持部１５０に保持された細胞２００由来の光のみを高感度かつ高精度に検出できる。基板１４２はスペーサ１３０上面に密着して備えており、導入口１３１から導入した、細胞２００を含む溶液の飛散や蒸発を防止している。なお、保持部１５０に保持した細胞の回収を容易にするため、基板１４２はスペーサ１３０から取り外し可能な構造となっている。また、基板１４１・１４２をガラスやポリメチルメタクリレート（ＭＭＭＡ）などの透光性材料にすると、保持部１５０に保持された細胞２００の検出が容易となる点で好ましい。
【００１６】
本発明では、保持部での細胞保持について振盪を利用して行なうことを特徴としている。振盪操作により、細胞をより多く保持部へ保持させることができる。振盪による保持部への細胞の保持は、振盪による慣性力および重力により起こる。これは、細胞保持手段内の保持部以外に細胞が存在する際、振盪による慣性力で保持部以外の領域から保持部の上部の領域に細胞を移動させることができ、細胞を保持部内に保持させる際に振盪による慣性力または重力により細胞を保持部に保持させることができるからである。細胞保持手段の振盪方法に特に限定はなく、細胞保持手段を傾けることで振盪させてもよく、細胞保持手段を水平方向（前後もしくは左右）および／または垂直方向（上下）に動かして振盪させてもよく、細胞保持手段を旋回させて振盪させてもよい。また、これらの動作を繰り返し行なってもよく、組み合わせてもよい。さらに、これら動作は、手動で行なってもよく、市販のローテータ、シェーカ、ミキサなどの振盪器を用いて行なってもよい。なお、振盪操作による細胞の保持部への保持を図１および２に示す細胞保持手段１００を用いて行なう場合、スペーサ１３０および保持部１５０を溶液で満たした状態で行なうと、溶液が細胞保持手段１００内で動かなくなり、前記溶液の動きによる細胞への損傷が低減するため好ましい。
【００１７】
本発明の方法で保持部に保持された細胞を、顕微鏡や光学検出器などを用いて検出することで、溶液中に含まれる細胞を定性的（存在の有無）および／または定量的に把握することができる。また、前記検出した細胞をピペットなどの採取手段で採取することで、当該細胞の培養や、形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析などの性状分析を一細胞単位で実施できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、細胞に大きな力を加える必要なく細胞を保持することができるため、保持部を有した細胞保持手段に細胞を損傷少なく保持させることができる。そのため、保持部に保持した細胞の劣化、生存能低下、遺伝子発現の変化等を防ぐことができ、その後の精度の良い細胞の性状解析や、高効率な細胞培養につながる。また、本発明の保持方法は手動でも実施可能な方法のため、誘電泳動装置など細胞保持に必要な装置が不要となり、より簡便な細胞保持が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の細胞保持方法で用いる、細胞保持手段の一例を示す図。
【図２】図１に示す細胞保持手段の正面図。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）
（１）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９）を、５％ＣＯ２環境下、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地を用いて３７℃で２４時間から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、蛍光染色色素（ＣＦＳＥ、同仁化学研究所社製）で標識した。蛍光で標識した前記細胞を含む懸濁液を遠心強度３００ｇで５分間遠心した後、上清を除去した。遠心によりペレットにした前記細胞をＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地で懸濁し、細胞濃度として２×１０５個／ｍＬに調整した。
（２）（１）で調整した前記細胞を含む懸濁液を、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）水溶液でコーティングした図１および図２に示す細胞保持手段１００に導入し、前記基板を３分間振盪させることで前記基板が有する保持部１５０に前記細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞保持手段１００は、直径３０μｍで深さ４０μｍの微細孔１１１・１２１および基板１４１から構成される複数の保持部１５０の上部に厚さ１ｍｍのスペーサー１３０を密着して備え、さらにスペーサー１３０の上部を基板１４２で密着して備えた構造である。
（３）（２）で保持部１５０に細胞を保持させた後、蛍光顕微鏡を用いてＰＣ９細胞に標識した蛍光が観察できる条件で細胞保持手段１００内を撮影した。
（４）（３）で撮影した画像から、細胞保持手段１００が有する保持部１５０に保持されたＰＣ９細胞数を計測し、前記チップ内に導入した全細胞数で除することで保持率を算出した。
【００２２】
（比較例１）
実施例１（２）において、前記基板を３分間振盪させる代わりに３分間静置させた以外は、実施例１と同様な方法で、細胞保持手段１００が有する保持部１５０に保持されたＰＣ９細胞の保持率を算出した。
【００２３】
実施例１および比較例１での保持率の結果をまとめて表１に示す。
【００２４】
【表１】
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細胞保持手段１００が有する保持部１５０に細胞を保持する工程において、実施例１の条件での細胞の保持率は７７％と、細胞保持手段１００を静置した比較例１の保持率４２％と比べて、高い細胞の保持率を示した。以上の結果から、細胞保持手段１００を振盪させることで、保持部１５０以外の領域に沈降した細胞を、高効率に保持部１５０へ保持できることがわかる。
【符号の説明】
【００２５】
１００：細胞保持手段
１１０：絶縁膜
１２０：遮光膜
１２１：貫通孔
１３０：スペーサ
１３１：導入口
１３２：排出口
１３３：貫通部
１４１・１４２：基板
１５０：保持部
２００：細胞
【図１】
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【図２】
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