(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫反応を誘発してワクチンの調製に使用しうる、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ポリペプチド抗原の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる配列を持つアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）のポリペプチド抗原、該アミノ酸配列で２０％以下あるいは４０％以下のアミノ酸置換、削除或いは添加を行うアミノ酸配列、これらのアミノ酸配列に基づくフラグメントで、アシネトバクター・バウマニの共通抗原としてアシネトバクター・バウマニ感染を予防するワクチンの調製に応用する抗原。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離のアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ポリペプチド抗原であって、該ポリペプチド抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の内の第３９-３１３アミノ酸を含み、
該ポリペプチド抗原は、個体において免疫反応を誘発し、該個体がアシネトバクター・バウマニに感染した時、有効な保護力を生じることを特徴とする単離のアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ポリペプチド抗原。
【請求項２】
ポリペプチド抗原の、ワクチンの調製における使用であって、
前記ポリペプチド抗原は請求項１に記載のポリペプチド抗原であることを特徴とする、使用。
【請求項３】
アシネトバクター・バウマニワクチン組成物は、請求項１に記載のポリペプチド抗原を含むことを特徴とするアシネトバクター・バウマニワクチン組成物。
【請求項４】
単離の核酸は、請求項１に記載のアミノ酸配列をコードし、
該アミノ酸配列は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ポリペプチド抗原で、
該ポリペプチド抗原は、個体において免疫反応を誘発し、該個体がアシネトバクター・バウマニに感染した時、有効な保護力を生じることを特徴とする単離の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫反応を生じる抗原を用い、アシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原に関し、特にアシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原のワクチン組成物、及びアシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原と特異性結合する抗体を含み、同時に該アシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原をコーディングする単離核酸で、該単離核酸の発現ベクターを含み、及び該発現ベクターの宿主細胞を含む。
【背景技術】
【０００２】
アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）細菌は、自然界中に広く分布しており、およそ２０種に分けられ、グラム陰性桿菌に属する。その内、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は最もよくみられ、しかも研究されている菌種である。これらは各種湿潤な、或いは乾燥した物体表面上で生存でき、現在では最もよく院内感染を引き起こす病原の一つである。
【０００３】
アシネトバクター・バウマニは、日和見菌で、免疫力が正常な宿主にとっては無害であるが、宿主の免疫力が低下すると、この細菌は容易に感染を引き起こし、疾病をもたらす。
例えば、手袋、シリンジ、針、ワゴン、呼吸器、ベッドシーツ、棚、シンク、床、空調送風口、さらには聴診器、カルテなどにまでアシネトバクター・バウマニが存在する可能性がある。湿って暖かい排水管、飲料水、食物、或いは皮膚、腋下、結膜、口腔、上気道、鼻腔、及び消化器、尿道等の人体上では、さらに容易にアシネトバクター・バウマニを発見することができる。
これら細菌に接触した患者や家族は、抵抗力が弱くなると、発病の宿主となる。特に、挿管、手術などの侵襲性治療を行う際には、日和見菌の院内感染の確率は高まり、患者の健康と医療ケアにとって大きなリスクとなっている。
【０００４】
一般に細菌感染に対する治療では、抗生物質が用いられる。しかし、抗生物質の濫用により、該各細菌は、徐々に薬剤耐性を生じ消滅させにくくなっている。ますます増えている院内感染に対応し、抗生物質に対して薬剤耐性を持つ細菌に対抗するためには、現在では使用する抗生物質の種類を変えるか、或いは高価な新型抗生物質を使用するしかない。けれども、細菌の薬剤耐性が進化を続けるなら、将来は有効な抗生物質が見つからないという状況に陥ってしまう可能性がある。院内感染を引き起こすアシネトバクター・バウマニに対して、臨床において、多重の薬剤耐性を備える菌株がすでに特定されている。それは物体表面において一定期間生きられるため、適当な治療或いは予防措置を講じなければ、院内感染予防の難題となることは想像に難くない。
【０００５】
前述したように、アシネトバクター・バウマニはどこにでも存在し、その薬剤耐性は院内感染防止にとってすでに重大な課題となっている。よってもし、人体にワクチンを注射することで予防力を生み出すことができれば、アシネトバクター・バウマニの感染を効果的に予防することができる。
一般にワクチンは、活性を失った、或いは減毒した病原体を人体内に注入し、人体の免疫システムにより体液性（抗体など）と細胞性（細胞毒性、補助型或いは調節型Ｔ細胞など）等の免疫反応を生じるもので、病原体が宿主生物体に進入すると、該病原体を中和した後に取り除くものである。
しかし、活性を失った、或いは減毒した病原体を用いるワクチンは、ある種の疾病の予防にとっては危険であり、特に該各病原体関連の病理条件と減毒特性が欠乏している時にはよりいっそう危険である。
よって、病原体上において、病を引き起こす病原体全体を用いるのではなく、免疫刺激反応を生じる抗原をワクチン組成物とする方法は、比較的安全性が高いワクチンを調製するための主要な方法の一つとなっている。
【０００６】
しかし、アシネトバクター・バウマニ中の特異性抗原を探し出し、ワクチンを製造するのは、困難である。
従来の研究では、Ｐａｎｔｏｐｈｌｅｔ氏等はアシネトバクターＬＰＳボディのＯ抗原と相互に対応する抗体を利用し、アシネトバクター菌株を鑑定している（Ｐａｎｔｏｐｈｌｅｔ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ９，  ６０-６５，  ２００２）が、その他抗原及びワクチンに関する何らかの応用については未開示である。特許文献１では、約４０００種の、アシネトバクター・バウマニと関連するヌクレオチドとアミノ酸配列を公開しているが、これら配列の大部分は、それが発現可能な遺伝子であるかははっきりせず、またその機能がどうであるかも未解明である。
よって、アシネトバクター・バウマニの感染を予防すると同時に正確な検査／測定診断方式を確立し、有効な免疫反応を生じる抗原目標及び特異性を備える検査／測定、治療用抗体を見つけ出し利用することは、差し迫った課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許公告第６,５６２,９５８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主要目的は、ワクチン組成物を調製しアシネトバクター・バウマニ或いは類似抗原を備える病原菌の感染を予防するアシネトバクター・バウマニ間共有のポリペプチド抗原に関し、検査／測定或いは治療に用いる該ポリペプチド抗原に特異性対抗可能な抗体に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するために、本発明による単離のアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ポリペプチド抗原において、該ポリペプチド抗原は、以下に組成するグループ中から選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含む。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から５のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、５に基づき２０％以下のアミノ酸置換、削除或いは添加を行うアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に基づき４０％以下のアミノ酸置換、削除或いは添加を行うアミノ酸配列、
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のアミノ酸配列に基づくフラグメント、
その内、（ｂ）から（ｄ）のアミノ酸配列のポリペプチドは、免疫刺激活性を備える。
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から５のアミノ酸配列は、配列表を参照されたい。
【００１０】
本発明が提供するアシネトバクター・バウマニに対抗する抗体の実施形態において、該抗体は、前記のポリペプチド抗原と特異性結合を行う。その内、該抗体は、多株抗体或いはモノクローナル抗体である。また、該抗体は、二軽鎖、二重鎖を備える一般の完全抗体構造の他に、組換えクローニングを経るが、相同抗原識別特異性を備えるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ或いはＳｃＦｖフラグメント抗体などの抗体フラグメント（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。
【００１１】
別種の実施形態において、本発明が提供する医薬組成物は、前記アシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原に対抗する抗体及び薬学上受け入れ可能なキャリアを含む。
【００１２】
さらに別種の実施形態は、アシネトバクター・バウマニを検査／測定する方法を提供し、そのステップは以下を含む。
前記の特異性を備え、前記のポリペプチド抗原と結合する抗体を提供し、それを被検査／測定サンプルと接触後、検出試薬或いは検査機器を使用し、該抗体の結合状況を分析し、被検査／測定サンプル中にアシネトバクター・バウマニが存在するかどうかを判定する。
該検査／測定方式は、ウエスタンブロット法或いはＥＬＩＳＡ等常用される免疫反応検査／測定方法である。
【００１３】
実施形態は、アシネトバクター・バウマニを検査／測定するキットを同時に提供し、それは前述の抗体を含む。
【００１４】
別種の実施形態において、本発明は前記アシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原をワクチンとする用途、及び少なくとも１個の前記アシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原を含むワクチン組成物を提供する。
該ワクチン組成物は、薬学上受け入れ可能なキャリア及び／或いはアジュバントを含む。その内、「薬学上受け入れ可能なキャリア」とは、有効成分薬理活性に影響せず、しかも投予される生物体に対して毒性を持たない何らかのキャリアで、剤型種類に基づき選択される賦形剤の他に、希釈剤、安定剤、防腐剤、抗酸化剤、分散剤、増溶剤、抗菌剤、抗真菌剤とアジュバント等の免疫刺激剤、及び以上の組合せを含むが、これに限定されない。
「アジュバント」とは、ワクチンが使用する抗原組成分とは異なるが、抗原反応を増強できる物質である。
アジュバントは、ゴルブアジュバント（Ｇｅｒｂｕ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、分枝桿菌或いは棒状桿菌、コレラ毒素、破傷風類毒素或いは各種乳化物（ＩＤＥＣ-ＡＦなど）であるが、これに限定されない。
このほか、該アジュバントは、鉱物塩或いは鉱物ジェル（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、カルシウムリン酸塩など）、表面活性物質（レシチンなど）及び免疫刺激物質（サポニンなど）、オリゴヌクレオチド、インターロイキン-２等を含む。
【００１５】
前記のポリペプチド抗原を調製するため、実施形態において、単離の核酸をさらに提供し、以下に組成されるグループ中から選択される少なくとも１個のアミノ酸配列をコードし、該アミノ酸配列は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ポリペプチド抗原である。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から５のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、５に基づき２０％以下のアミノ酸置換、削除或いは添加を行うアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に基づき４０％以下のアミノ酸置換、削除或いは添加を行うアミノ酸配列、
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のアミノ酸配列に基づくフラグメント、
その内、（ｂ）から（ｄ）のアミノ酸配列のポリペプチドは、免疫刺激活性を備える。
【００１６】
実施形態において、前記の単離の核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６から１０が組成するグループから選択する少なくとも１個の配列を含む。
【００１７】
本発明が提供する発現ベクターは、前記の核酸を該ベクター中においてクローニングし、その発現をレギュレーション可能な転写調節因子を連接し、これによりポリペプチド抗原を発現させる。
ここでいう「レギュレーション」とは、直接レギュレーション、調節プロモーター（ｌａｃ  ｏｐｅｒｏｎなど）を指し、ＤＮＡの転写及び後続のトランスレーション、或いは間接レギュレーション、調節転写、或いはトランスレーション過程で必要な酵素（ポリメラーゼなど）或いはその他調節子の発現を起動する。これにより、ＤＮＡの転写或いはトランスレーションは進行可能となり、最後にポリペプチド抗原が発現する。
【００１８】
実施形態において、本発明はさらに宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、前記の発現ベクターをトランスフェクションでき、或いは前記のポリペプチド抗原を発現できる核酸を導入でき、これにより該宿主細胞は必要なポリペプチド抗原を発現できる。
【００１９】
別種の実施形態において、本発明はさらにアシネトバクター・バウマニを検査／測定するキットを提供し、それはプライマーペアを含む。
該プライマーペアは、ポリメラーゼ連鎖反応を経て、アシネトバクター・バウマニを含む被検査／測定サンプル中のテンプレート核酸に対して、前記の単離の核酸或いは該核酸のフラグメントを増幅し、また該プライマーペアは、該核酸の全長或いはその中のフラグメントを増幅できる。
これにより、前記アシネトバクター・バウマニ菌体の存在を抗体により探知できる他、分子レベルより、アシネトバクター・バウマニの核酸が存在するか否かを検査／測定でき、アシネトバクター・バウマニのスクリーニングの目的を達成できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明はワクチン組成物を調製しアシネトバクター・バウマニ或いは類似抗原を備える病原菌の感染を予防する。検査／測定或いは治療に用いる該ポリペプチド抗原に特異性対抗可能な抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明実施形態１において、二次元電気泳動後に、ウエスタンブロット法と銀染色法を利用し、アシネトバクター・バウマニ外膜が免疫誘導活性の抗原を備えるか否かを検査した結果図であり、（ａ）と（ｂ）図は異なる人類血清によりそれぞれ反応を行い、各図中の左側はウエスタンブロット法分析結果図で、右側は銀染色法結果図で、矢印は相互に対応するタンパク位置を示す。
【図２】本発明実施形態１中のｐＥＴ-ＮｃｓＰとｐＥＴ-ＴｏｎＢ-Ｒプラスチド発現の組換えタンパク質をピーコックブルー染色と人体血清によりウエスタンブロット法で分析した結果図であり、その内、（ａ）図はｐＥＴ-ＮｃｓＰプラスチドの発現で、（ｂ）図はｐＥＴ-ＴｏｎＢ-Ｒプラスチドの発現で、「Ｍ」はタンパク質分子量標記を示し、「-」はＩＰＴＧの未添加を示し、「＋」はＩＰＴＧを添加し後続タンパク質の発現誘導を示し、ＣＢはピーコックブルーを示し、ＨＳ-ＡＢは人類血清を示し、「＊」は発現した組換えタンパクを示す。
【図３】本発明実施形態３において、抗原ＮｃｓＰ、ＴｏｎＢ-Ｒ、Ｐａｓｅ１、Ｐａｓｅ２によりそれぞれマウスに免疫を与えた後の生存率試験結果の比較図であり、その内、（ａ）はＴｏｎＢ-Ｒを注射し、（ｂ）はＮｃｓＰを注射し、（ｃ）はＰａｓｅ１を注射し、（ｄ）はＰａｓｅ２を注射し、ＰＢＳは対照組である。
【図４】本発明実施形態４において、ポリペプチド抗原のＭＴＴ試験に関する結果図である。
【図５】本発明実施形態６において、ａｎｔｉ-ＧＰ１抗血清の殺菌力試験結果図である。
【図６】本発明実施形態６において、人体血清による組換えＧＰ１抗原に対するウエスタンブロット法分析の結果図であり、行１はアシネトバクター・バウマニ外膜タンパクＡ（制御グループ）で、行２はＴｏｎＢ-Ｒ抗原で、行３はＧＰ１抗原であり、左図は正常人血清（対照組）で、右図はアシネトバクター・バウマニ感染の病人血清である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に本発明の技術内容、構造特徴、達成する目的及び作用効果について、以下に例を挙げ並びに図面を組み合わせて詳細に説明する。
【００２３】
本発明による単離のアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ポリペプチド抗原の該ポリペプチド抗原は、以下に組成するグループ中から選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含む。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から５のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、５に基づき２０％以下のアミノ酸置換、削除或いは添加を行うアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に基づき４０％以下のアミノ酸置換、削除或いは添加を行うアミノ酸配列、
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のアミノ酸配列に基づくフラグメント。
その内、（ｂ）から（ｄ）のアミノ酸配列のポリペプチドは、免疫刺激活性を備える。
【００２４】
前記ポリペプチド抗原のアミノ酸配列及びそれがそれぞれ相互に対応するヌクレオチド配列である配列識別番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）に関しては、表１に示すポリペプチド抗原名称を対照する。各配列識別番号のアミノ酸或いはヌクレオチド配列は、配列表を参照されたい。
【００２５】
【表１】
2018134103.tif 000002
【００２６】
その内、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から５は、本発明実施形態においてポリペプチド抗原のアミノ酸配列とでき、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６から１０は、それがそれぞれ相互に対応するヌクレオチド配列である。
本発明アシネトバクター・バウマニをポリペプチド抗原とする実施形態において、該ポリペプチド抗原は、（ａ）から（ｄ）のアミノ酸配列グループ中の任意のアミノ酸配列或いはその組合せの免疫刺激活性を備えるポリペプチド抗原である。
その内、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から５中の任意のアミノ酸配列を含む他、２０％以下の配列修飾を行うＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、５、或いは４０％以下の配列修飾を行うＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から５、或いは配列修飾を経たフラグメントを含む。
アミノ酸配列選択の方式或いは組合せ及びその比率に関しては、例示するだけで、特別な制限は設けない。
【００２７】
本願明細書でいう「単離の」とは、該物質の型態とそれが伴う組合せと自然界に存在するものとは異なり、該物質は、分離或いは純化を経て、自然に存在する形態下でそれが伴う組合せ分離、或いは人工方式により産生或いは製造されたものである。
【００２８】
本願明細書でいう「抗原」とは、生物体産生免疫反応を刺激できる物質で、「免疫刺激活性」（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を備える物質である。
「免疫刺激活性」とは、該抗原が生物体に進入後、体液性（ｈｕｍｏｒａｌ）反応を引き起こして抗体を生じ、或いは細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒ）反応を生じＴ細胞を起動する作用を言い、これにより認識でき、該抗原と結合作用し、及び関連する免疫分子等免疫反応の特性を生じることができる。
これら免疫反応は、該抗原により誘導を経て産生し、或いはアジュバントの補助を通して引き起こされる。
よって、「アシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原」とは、生物体内において、アシネトバクター・バウマニポリペプチド或いは該ポリペプチド類似のアミノ酸配列に対して、上述の免疫反応を引き起こす抗原を言い、即ち、該抗原は個体において免疫反応を誘発し、該個体がアシネトバクター・バウマニに感染した時、有効な保護力を生じ、しかも該抗原は一種のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）である。
【００２９】
本願明細書でいう「アミノ酸置換、削除或いは添加」とは、その他アミノ酸によりオリジナルのアミノ酸配列中のアミノ酸を置換し、或いはある位置のアミノ酸配列を削除し、或いはある位置において一個或いは数個のアミノ酸を挿入し配列を長くし、或いは以上の何らかの修飾後に組合せられた類似物をいう。
該各類似物ともとのアミノ酸配列は、比較対照後、一定比率の相似度を備える。
その内、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、４、５に基づき２０％以下のアミノ酸の置換、削除或いは添加を行うが、好ましくは１０％以下であり、最良は５％以下で、１から５個のアミノ酸の置換、削除或いは添加を加えれば、８０％以上の相似度を備える。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は４０％以下のアミノ酸の置換、削除或いは添加を行い、好ましくは２０％以下で、最良は５％以下で、１から５個のアミノ酸の置換、削除或いは添加を加えれば、６０％以上の相似度を備える。
【００３０】
本願明細書でいう「アミノ酸配列のフラグメント」とは、もとのアミノ酸配列中から取り出したある区域部分を言い、それはもとの配列中の任意の区域の取り出しで、或いは取り出し後の組合せで、その形態はここでは、前記２０％或いは４０％以下のアミノ酸の削除を含まない。
【００３１】
アミノ酸配列の相似度に関して、従来のコンピュータープログラムを利用して、比較対照分析を行う。
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ氏等人（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９-３４０２，  １９９７）が開示するＢＬＡＳＴ方式などにより行う。
ＢＬＡＳＴ分析ソフトは、米国国家生物技術情報センターＨＰ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／  ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）に基づき執行する。
【００３２】
本発明は、ｔＢＬＡＳＴを利用してアミノ酸分析を行う。
比較対照時に設定するパラメーターは、期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：１０、ワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）：３、クエリー範囲内の最大マッチ（Ｍａｘ  ｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ａ  ｑｕｅｒｙ  ｒａｎｇｅ）：０、マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ６２、既存（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）：１１、エクステンション（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）：１、組成調整（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ）：条件成分に応じたマトリックス調整（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、フィルター（Ｆｉｌｔｅｒ）：低複雑性区域選定（Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ）、マスク（Ｍａｓｋ）：未選択（ｎｏｔ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ）である。
【００３３】
本願明細書でいう「アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）」とは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｅｄ．：Ｕｌｒｉｋｅ  Ｇｅｒｉｓｃｈｅｒ，  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８）により分類されたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ種で、それはＡＴＣＣ  １７９７８及び下表２中の６２００、ＳＤＦ…等菌株を含む（各株菌の詳細資料はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／Ｂｒｏｗｓｅｒ／ｗｗｗｔａｘ．  ｃｇｉ？ｍｏｄｅ＝Ｕｎｄｅｆ＆ｉｄ＝４７０＆ＩｖＩ＝３＆ｋｅｅｐ％２０＝１＆ｓｒｃｈｍｏｄｅ＝１＆ｕｎｌｏｃｋを参照されたい）。
【００３４】
表２は、本発明アシネトバクター・バウマニ中のＮｃｓＰ、ＴｏｎＢ-Ｒ、Ｐａｓｅ１、Ｐａｓｅ２及びＧＰ１の５種のポリペプチド抗原とその他２９株のアシネトバクター・バウマニ菌株中の同源のポリペプチド保留配列相似度の比較である。
表２の相似度比較結果から、ポリペプチド抗原ＮｃｓＰ、ＴｏｎＢ-Ｒ、Ｐａｓｅ１、Ｐａｓｅ２及びＧＰ１と、大部分のアシネトバクター・バウマニ株の相似度は、９８〜９９％以上に達し、ポリペプチド抗原ＴｏｎＢ-Ｒの一部のみ、６０％以上の相似度であることが分かる。
配列相似度が極めて高く、しかも後続殺菌力及びマウス免疫保護力の試験により、本発明中の五種のポリペプチド抗原は、確実にアシネトバクター・バウマニ間共有のポリペプチド抗原とでき、ワクチン組成物の調製に用い、アシネトバクター・バウマニの感染を予防できると証明することができる。
【００３５】
【表２】
2018134103.tif 000003
【００３６】
アシネトバクター・バウマニ抗原のポリペプチドは、一般の遺伝子エンジニアリング技術により調製される。
ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，  ＰＣＲ）は、該ペプチドの相互に対応するＤＮＡ配列の発現を増幅し、それをベクター発現にクローニングすれば良い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ-Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，  Ｓｅｃｏｎｄ  （１９９８）ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  （２０００）Ｅｄｉｔｉｏｎ、  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ＆  Ｆｉｎｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  １９９１，及びＨｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５５：１２０７３-１２０８０，  １９９０参照）。
このほか、合成方式を利用し、必要な配列のペプチドを調製する。調製方式は、所属技術領域の従来の方法を用いる。
【００３７】
本発明は、免疫タンパクプラスチド技術と逆ワクチン学の戦略をそれぞれ採用し、必要なアシネトバクター・バウマニ抗原を探す。
アシネトバクター・バウマニポリペプチド抗原のスクリーニング、確認、及び該抗原の免疫効果について以下に詳細に説明する。
【００３８】
＜実施形態１＞  抗原ＮｃｓＰとＴｏｎＢ-Ｒのスクリーニングと確認
本実施形態は、免疫タンパクプラスチド技術により、抗原ＮｃｓＰとＴｏｎＢ-Ｒを鑑定する。
先ず、病院中の数人の患者の血液を採取し、血清を分離する。前記血清により、台湾分離のアシネトバクター・バウマニ菌株の菌体総タンパク質に対してウエスタンブロット法分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を行い、アシネトバクター・バウマニに対して特異性を備える抗体を含む血清（以下称：ＨＳ-ＡＢ）の初歩スクリーニングを行う。
また、アシネトバクター・バウマニの外膜タンパク質の抽出、分離を行い、二次元電気泳動分析、一式二部を行い、続いてその内の一部のフィルムを銀染色法を施し、他はＨＳ-ＡＢにより免疫探知を行う。その結果は図１に示す。
免疫探知ドット及び銀染色法のフィルムを対照し、相対応位置のタンパク質を分離し、さらに該タンパク質を質量分析計で分析する。
分析結果において、該タンパク質サンプル点数が最高の目標タンパク質はそれぞれＡＢ  ＳＤＦ品系の「推定ＬｙｓＭドメインスーパーファミリー（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＬｙｓＭ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）タンパク質」（ＹＰ＿００１７０７８４７）及びＡＢ  ＡＣＩＣＵ品系の「外膜レセプター（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」（ＹＰ＿００１８４５１４４）である。
配列性質分析により、ＹＰ＿００１７０７８４７は非典型の分泌性タンパク（ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であると推測され、ＹＰ＿００１８４５１４４は鉄ベクターレセプタータンパク（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｆｅｒｒｉｃ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である推定される。
【００３９】
この二つの抗原が、ＨＳ-ＡＢと認識されるかをさらに確認するために、以下の遺伝子クローニングと発現タンパクの確認反応を行う。
先ず、それぞれコーディングＹＰ＿００１７０７８４７とＹＰ＿００１８４５１４４タンパク質の遺伝子配列に基づき、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマー設計を行い、前記台湾のアシネトバクター・バウマニ臨床分離株をテンプレートとし、コロニー-ポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｌｏｎｙ-ＰＣＲ）を行い、この二つの抗原のＤＮＡコーディングを増幅後ｐＧＥＭ-Ｔ  Ｅａｓｙベクターをクローニング後にシークエンシング分析を行う。
シークエンシング結果において、前者が増幅するＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）とＹＰ＿００１７０７８４７遺伝子配列との間の相似度は９８％に達し、後者が増幅するＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）とＹＰ＿００１８４５１４４遺伝子配列間の相似度は９９％に達する。
前記ＤＮＡ配列がトランスレーション後のアミノ酸配列をさらに比較対照する。前者（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とＹＰ＿００１７０７８４７アミノ酸配列間の相似度は９９％に達し、後者（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とＹＰ＿００１８４５１４４アミノ酸配列間の相似度は同様に９９％に達する。
スクリーニングされた発現可能なタンパク質サンプルは、ＹＰ＿００１７０７８４７とＹＰ＿００１８４５１４４であると証明された。よって、以下ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と２アミノ酸配列を備えるタンパク質を、それぞれ「ＮｃｓＰ」と「ＴｏｎＢ-Ｒ」と呼ぶ。
【００４０】
その後、前記ＰＣＲ増幅後のＤＮＡフラグメントをさらに、それぞれｐＥＴ-２１にクローニングしプラスチド（クローニング後はそれぞれｐＥＴ-ＮｃｓＰとｐＥＴ-ＴｏｎＢ-Ｒプラスチドと名付け）を発現し、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）中に入れ、ＩＰＴＧ間接レギュレーションで、組換えタンパクの発現を行う。最後に再びウエスタンブロット法で分析し、それぞれ人体血清ＨＳ-ＡＢにより探知し、その発現状況を確認する。その結果は図２に示す。
図中から分かるように、ＮｃｓＰとＴｏｎＢ-Ｒの遺伝子が発現する組換えタンパク質はともに人体血清ＨＳ-ＡＢに認識される。よって、ＮｃｓＰ  とＴｏｎＢ-Ｒは確実にＨＳ-ＡＢの目標抗原であると実証された。
この結果は、ＹＰ＿００１７０７８４７／ＮｃｓＰとＹＰ＿００１８４５１４４／ＴｏｎＢ-Ｒというこの二つのタンパク質が、確かに発現でき、アシネトバクター・バウマニ中に存在し、しかも抗原性を備え、病人抗血清で認識されることを初めて実証した。
【００４１】
また、ＮｃｓＰとＴｏｎＢ-Ｒの遺伝子が異なるアシネトバクター・バウマニ菌株間に存在するかどうかを確認するため、台湾で収集された数百株の臨床菌株に対してウエスタンブロット法分析を行う。すべての菌株においてこのタンパク質を探知できることが分かった。十株の菌をランダムに選択し、ＰＣＲとシークエンシング分析を行い、該各菌株がすべてこの二つの遺伝子配列を備えることを確認する。
さらに、ＮｃｓＰとＴｏｎＢ-Ｒのアミノ酸配列を、それぞれＧｅｎＢａｎｋ中の２９株のアシネトバクター・バウマニの配列と比較後、その配列の該各アシネトバクター・バウマニ間に非常に高い相似度があることを確認した。
表２に示すように、ＮｃｓＰ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）間の比較対照では９９％に達する相似度を備え、ＴｏｎＢ-Ｒ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）間の比較対照でもほとんどが９９％の相似度を備え、一部だけが６０％以上の相似度を備える。
よって、ＮｃｓＰとＴｏｎＢ-Ｒは、異なるアシネトバクター・バウマニ菌株間に普通に存在し、しかも極めて高い相似度を備える。
【００４２】
＜実施形態２＞  抗原Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２のスクリーニングと確認
本実施形態は、逆ワクチン学戦略により、抗原Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２をスクリーニングする。
先ず、ｐｒｏｔｅａｓｅをキーワードとしＡＴＣＣ  １７９７８の遺伝子体を検索する。２個の「分泌性トリプターゼのセリンプロテアーゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ-ｌｉｋｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）」のＡ１Ｓ＿２５４６  （以下「Ｐａｓｅ１」と呼称）と「推定グリコプロテイン内エンドペプチダーゼメタロプロテアーゼ（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）」のＡ１Ｓ＿０６９９  （以下「Ｐａｓｅ２」と呼称）それぞれ注釈されていると分かった。
比較対照を経て、Ａ１Ｓ＿２５４６／Ｐａｓｅ１とＡ１Ｓ＿０６９９／  Ｐａｓｅ２は、各アシネトバクター・バウマニの遺伝子体中において、ともにその配列相似度は約９６％以上に達する配列であるが、機能は未知で、命名は相同でない。
【００４３】
この二つのＤＮＡ配列が発現するかどうかを検証するため、先ずアシネトバクター・バウマニＡＴＣＣ  １７９７８の遺伝子組配列に基づきプライマーを設計し、ＲＴ-ＰＣＲを行い、大きさが予期される産物をｐＧＥＭ-Ｔ  Ｅａｓｙベクターにクローニング後、シークエンシング分析を行う。
ＲＴ-ＰＣＲ産物を得ることができるため、この２個の配列に基づき注釈されるＰａｓｅ１とＰａｓｅ２の遺伝子は確実に転写され発現されると実証された。
【００４４】
さらに、Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２のアミノ酸配列をそれぞれＧｅｎＢａｎｋ中の２９株のアシネトバクター・バウマニの配列と比較すると、その配列は該各アシネトバクター・バウマニ間で非常に高い相似度があることが分かった。
表２に示すように、Ｐａｓｅ１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）間の比較対照は、９５％〜９９％の相似度があり、Ｐａｓｅ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）間の比較対照は、９２〜１００％の相似度を備える。
よって、Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２は同様に異なるアシネトバクター・バウマニ菌株間に普通に存在し、しかも極めて高い相似度を備える。
その後、前記ＰＣＲ増幅後のＤＮＡフラグメントをそれぞれｐＥＴ-２１にクローニングし、発現プラスチド（クローニング後それぞれｐＥＴ-Ｐａｓｅ１とｐＥＴ-  Ｐａｓｅ２プラスチドと命名）中において、以下の実施形態において該各遺伝子は発現する。
【００４５】
＜実施形態３＞  抗原ＮｃｓＰ、ＴｏｎＢ-Ｒ、Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２による免疫マウスの生存率試験
上述の四個のアシネトバクター・バウマニのタンパク質をアシネトバクター・バウマニワクチンの組成分とできるか評価するため、それぞれｐＥＴ-ＮｃｓＰ、ｐＥＴ-ＴｏｎＢ-Ｒ、ｐＥＴ-Ｐａｓｅ１とｐＥＴ-Ｐａｓｅ２をクローニングしベクターを発現した大腸桿菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ＯＤ６００で０．８〜１の間に培養する時、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）間接誘導を加え、組換えタンパク発現を行う。
その後、Ｎｉ２＋-親和管柱により前記発現ベクターが発現した組換えタンパク質（ＮｃｓＰ、ＴｏｎＢ-Ｒ、Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２）を純化し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりその純度を検査／測定後、免疫マウスに利用する。
また、ウエスタンブロット法及び酵素免疫分析法により、抗血清対各組換えタンパク質の特異性を確定後、アシネトバクター・バウマニＡＴＣＣ  １７９７８により肺部攻毒試験を行い、マウスの生存状況を観察する。その生存率結果は図３に示す。
【００４６】
結果に示すように、本発明実施形態抗原を注射したマウスの生存率は、ＰＢＳだけを注射した対照組より明らかに高く、各組の五日間生存率はそれぞれ：ＰＢＳ  （１０〜３０％）、ＮｃｓＰ  （９０％）、ＴｏｎＢ-Ｒ  （８０％）、Ｐａｓｅ１  （８０％）、Ｐａｓｅ２  （９０％）出ある。
本発明のポリペプチド抗原は、注射したマウスに対して優れた免疫保護力を持つことが分かったため、ワクチン組成物のポリペプチド抗原とすることができる。
特に、攻毒の菌株ＡＴＣＣ  １７９７８はＴｏｎＢ-Ｒのアミノ酸配列と注射した組換えＴｏｎＢ-Ｒ配列の相似度は、６１％であるが、顕著な保護効果を備える。
【００４７】
＜実施形態４＞  抗原ＮｃｓＰ、ＴｏｎＢ-Ｒ、Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２の安全性試験
本発明ポリペプチド抗原が生物体に対して毒性を備えるか否かを確認するため、先に純化した組換えタンパク質ＮｃｓＰ、ＴｏｎＢ-Ｒ、Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２をとり、細胞生存率試験（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）を行った。
ＭＴＴ試験は、一般所属技術領域が常用する方法で行う。例えば、前記のＳａｍｂｒｏｏｋ氏等人が著したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ書に開示する方法を利用し、人類Ａ５４９細胞を被験細胞とする。その結果は図４に示す。
結果に示すように、上述の四種のタンパクは人類Ａ５４９細胞に対して毒性がない。よって、安全性を備える抗原ペプチドであり、ワクチンの組成物とすることができ、アシネトバクター・バウマニ感染の予防に応用することができる。
また、Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２は「ｔｙｒｐｓｉｎ-ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（トリプターゼのセリンプロテアーゼ）」と注釈されているが、ＱｕａｎｔｉＣｌｅａｖｅＴＭ検査／測定キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ）により試験後に、０．５  ｍｇ／ｍＬ  の濃度ではこの二つのタンパク質のプロテアーゼ酵素の活性は探知されないことが分かった。この結果に前記ＭＴＴ試験結果を対応させ、この二つのタンパク質には細胞毒性がないことが確認された。
【００４８】
以上結果を総合すると、ＮｃｓＰ、ＴｏｎＢ-Ｒ、Ｐａｓｅ１とＰａｓｅ２の四個のポリペプチド抗原は、各アシネトバクター・バウマニ菌株において、可能なタンパクを発現可能で、しかも配列の相似度が極めて高いため、異なるアシネトバクター・バウマニの感染に対して、すべて優れた保護効果を備えることが確認された。さらに、細胞毒性を備えないため、安全性が高く、この四個のポリペプチドは、広効性アシネトバクター・バウマニワクチンの優良抗原とすることができる。
【００４９】
＜実施形態５＞  抗原ＧＰ１のスクリーニングと確認
本実施形態は同様に逆ワクチン学戦略により抗原ＧＰ１をスクリーニングする。
先ず、ＢＬＰデータベース（ＤＯＬＯＰ）によりＡ１Ｓ＿０５５６  （以下ＧＰ１と呼称）を分析したところ、そのＮ端がエステル化信号の先導配列を帯びており、リポタンパクであることを示している。この他、Ｉｗａｓｈｋｉｗ氏等人（Ｉｗａｓｈｋｉｗ  ＪＡ，  Ｓｅｐｅｒ２  Ａ，  Ｗｅｂｅｒ  ＢＳ，．  Ｓｃｏｔｔ  ＮＥ，  Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  Ｅ，  Ｓｔｒａｔｉｌｏ  Ｃ，  Ｒｅｉｚ  Ｂｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  Ｏ-ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，  ２０１２）は、アシネトバクター・バウマニＡＴＣＣ  １７９７８中のこのタンパクが糖化修飾を備えることを発見した。
本実施形態はＰＣＲによりＧＰ１中第３９-３１３アミノ酸コーディングのＤＮＡフラグメントを増幅し、さらにそれをｐＥＴ２１発現プラスチド中にクローニングし、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に入れた後、ＩＰＴＧにより組換えタンパクの発現を間接誘導し、さらにＮｉ２＋-親和管柱により純化した組換えタンパク質をマウスに対して免疫注射し、得られた抗血清アシネトバクター・バウマニの菌体タンパク質に対してウエスタンブロット法分析を行う。結果により、すべての試験の菌株は、ＧＰ１タンパク質を探知することが分かった。
また、ＧＰ１アミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋ中の２９株アシネトバクター・バウマニの配列を比較すると、該各菌株のＧＰ１間には９５％〜９９％の相似度があることが分かった（表２参照）。こうして、ＧＰ１タンパク質もアシネトバクター・バウマニの保守抗原であることが証明された。
【００５０】
＜実施形態６＞  抗原ＧＰ１によりマウスを免疫後取得された抗血清の殺菌力分析
ＧＰ１が発現したポリペプチド抗原をアシネトバクター・バウマニワクチンの組成分とできるかどうかを評価するため、アシネトバクター・バウマニを利用しマウスに感染させて生存率分析を行う体内試験以外に、生物体外で、該抗原が誘発する抗体を利用し、アシネトバクター・バウマニに対して殺菌力試験を行い、その生存率を分析する。これも、ワクチン有効性を確認するために、常用される方式である。
よって、本実施形態においては、Ｎｉ２＋-親和管柱により純化後の組換えタンパクＧＰ１によりマウスを免疫後、取得された抗血清（ａｎｔｉ-ＧＰ１）の殺菌力分析を行う。
試験時には、約１００  ＣＦＵのアシネトバクター・バウマニを取り、５０％抗血清を含むＰＢＳ中に入れ、３７℃下で４時間培養し、生存菌数を観察する。その結果は、図５に示す。
免疫前の血清を対照組とすると、ａｎｔｉ-ＧＰ１処理後の菌数生存率は、明らかに対照組より低く、その効果はａｎｔｉ-ＮｃｓＰより高く、１８％だけであることが分かった。これは、ａｎｔｉ-ＧＰ１が優れた殺菌効果を備えることを示しており、ＧＰ-１は保護効果を備える免疫反応を誘発できると証明している。よって、有効なワクチン抗原とすることができる。
また、アシネトバクター・バウマニに感染した病人の血清を、組換えタンパクに対して、ウエスタンブロット法で分析した所、図６に示すように、特異性認識信号があることが発見された。これにより、このタンパク質は確かに、人類の免疫反応を誘発でき、さらにＧＰ１はワクチン組成分のポリペプチド抗原とできることが証明された。
【００５１】
＜実施形態７＞  モノクローナル抗体の調製
前記各組換えタンパク／ペプチド抗原を、それぞれＮｉ２＋管柱により純化後、ＢＡＬＢ／ｃを取りマウスの免疫注射を行う。毎月間隔を開けて３回行い、毎回の剤量は１０-１５  μｇである。
初回免疫時には、フリューウンド完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を加え、次にフリューウンド不完全アジュバントを行う。
最後の一回の注射の４日後に、マウスの脾臓を取り出し、その脾臓細胞とＳｐ２／０-Ａｇ１４骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞とを融合させる。
スクリーニングを行い、生存した融合細胞に、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット法により、特異性を備える細胞株をさらにスクリーニングする。
【００５２】
該各個別に本発明ペプチド抗原からスクリーニングされたモノクローナル抗体に対して、さらにキットの組成とし、アシネトバクター・バウマニを検査／測定する存在とする。
検査／測定時には、所属技術領域が熟知する方式を用いて行い、前記のモノクローナル抗体と被検査／測定サンプルを混合後、検出試薬の色或いは検査機器を用いて吸光値、蛍光値を検査／測定し、該抗体の結合状況を分析し、サンプル中にアシネトバクター・バウマニが存在するかどうかを判定する。
【００５３】
前記キット中のモノクローナル抗体は、本発明中の一種のポリペプチド抗原の単一モノクローナル抗体に対して、２種以上のその内の一種のポリペプチド抗原或いは２種以上のポリペプチド抗原が生じる調製の多種モノクローナル抗体を使用し、認識関係を多重確認し、検査／測定の正確性を担保する。
【００５４】
本発明ポリペプチド抗原のモノクローナル抗体であろうと、多株抗体であろう、その抗体フラグメントであろうと、アシネトバクター・バウマニ感染の治療に用いることができ、所属技術領域で熟知される一般的な方法で、適当な薬学上受け入れ可能なキャリアを加え、アシネトバクター・バウマニ感染が引き起こす疾病を治療できる医薬組成物を調製することができる。
【００５５】
アシネトバクター・バウマニ感染を治療する医薬組成物の利用時には、該各抗体はモノクローナル抗体が好ましい。同様に、使用するモノクローナル抗体は、本発明中の一種のポリペプチド抗原の単一のモノクローナル抗体で、２種以上を使用し、その中の一種のポリペプチド抗原或いは２種以上のポリペプチド抗原が生じる調製の多種モノクローナル抗体を使用し、組合せ治療を行うことができる。
【００５６】
上述の実施例は僅かに本発明の原理及びその作用効果を説明するものであり、本発明を制限するものではない。これにより、この発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が上述の実施例に対してなし得る修正或いは変化は、すなわち、本発明の精神より逸脱しない。本発明はすでに産業上の利用性、新規性及び進歩性を有し、並びに特許の要件を満たす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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