(57)【要約】【課題】哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の内部に毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体を簡便に製造する方法を提供する。【解決手段】本発明の毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる毛包原基形成工程を備えることを特徴とする毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項２】
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる、請求項１に記載の毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項３】
前記血管を構築し得る細胞が血管内皮細胞である、請求項１又は２に記載の毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項４】
前記毛包原基形成工程において、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地を混合した培地を用いて間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を混合培養する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項５】
間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を含む毛包原基と、
生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、
前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されており、
前記毛包原基は内部に毛細血管構造を有することを特徴とする毛包組織含有シート。
【請求項６】
さらに、前記毛包原基が分化し、毛包を形成している、請求項５に記載の毛包組織含有シート。
【請求項７】
前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、請求項５又は６に記載の毛包組織含有シート。
【請求項８】
前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、請求項７に記載の毛包組織含有シート。
【請求項９】
前記毛包原基の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の毛包組織含有シート。
【請求項１０】
規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を播種し、混合培養することにより内部に毛細血管構造を有する毛包原基を形成させる毛包原基形成工程と、
前記微小凹部内に形成された内部に毛細血管構造を有する毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する転写工程と、
を備えることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項１１】
前記血管を構築し得る細胞が血管内皮細胞である、請求項１０に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項１２】
前記毛包原基形成工程において、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地を混合した培地を用いて間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を混合培養する、請求項１０又は１１に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項１３】
前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法、毛包組織含有シート、及び毛包組織含有シートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床応用に足る毛包再生医療の確立には、再生毛包が正常な組織構造を有し、移植部位に適した毛幹を有する毛が、形成、伸長することが必要である。毛等の皮膚付属器を含む外胚葉性付属器官は、通常、胎児期において、上皮系細胞及び間葉系細胞の相互作用により発生する。外胚葉性付属器官の一つである毛包は、個体の生涯にわたって成長と退行（毛周期）を繰り返し、成長期における毛球部の再生は、毛包器官発生期と同様な分子機構により誘導されることが知られている。また、このような毛周期における毛球部の再生は、間葉系細胞である毛乳頭細胞により誘導されると考えられている。すなわち、成長期において、毛包上皮幹細胞が間葉系細胞である毛乳頭細胞により分化誘導され毛球部が再生される。
【０００３】
これまでに毛包再生に向けて間葉系細胞（毛乳頭細胞及び真皮毛根鞘細胞）を置換することによる毛包可変領域の再生や毛包誘導能を有する間葉系細胞による毛包新生、上皮系細胞及び間葉系細胞による毛包の再構築などが試みられてきた。具体的には、上皮系細胞及び間葉系細胞の２種類の細胞集合体をゲル内で区画化して配置することで毛包原基を構築し、化学繊維等のガイドを挿入した後、それを移植することで毛包器官を再生する方法（例えば、特許文献１参照）、体性に由来する複数種の細胞にＷｎｔシグナル活性剤を添加した培養液を用いて混合培養することで、原始的な毛包器官を形成する方法（例えば、特許文献２参照）、毛包間葉系細胞の細胞集塊（スフェロイド）の外側に上皮細胞が接着している人工毛球体を作製する方法（例えば、特許文献３参照）等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】再公表ＷＯ２０１２／１０８０６９号公報
【特許文献２】特開２０１３−７８３４４号公報
【特許文献３】特開２００３−７０４６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１〜３では、上皮系細胞及び間葉系細胞の２種類の細胞集合体を作製し、これらを融合させることで毛包原基を一つ一つ作製しており、数万本の毛髪を再生するには、作製効率及び移植効率に問題があった。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の内部に毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体を簡便に製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる毛包原基形成工程を備えることを特徴とする毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法。
［２］前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる、［１］に記載の毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法。
［３］前記血管を構築し得る細胞が血管内皮細胞である、［１］又は［２］に記載の毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法。
［４］前記毛包原基形成工程において、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地を混合した培地を用いて間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を混合培養する、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法。
［５］間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を含む毛包原基と、生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されており、前記毛包原基は内部に毛細血管構造を有することを特徴とする毛包組織含有シート。
［６］さらに、前記毛包原基が分化し、毛包を形成している、［５］に記載の毛包組織含有シート。
［７］前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、［５］又は［６］に記載の毛包組織含有シート。
［８］前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、［７］に記載の毛包組織含有シート。
［９］前記毛包原基の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［５］〜［８］のいずれか一つに記載の毛包組織含有シート。
［１０］規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を播種し、混合培養することにより内部に毛細血管構造を有する毛包原基を形成させる毛包原基形成工程と、前記微小凹部内に形成された内部に毛細血管構造を有する毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する転写工程と、を備えることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
［１１］前記血管を構築し得る細胞が血管内皮細胞である、［１０］に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
［１２］前記毛包原基形成工程において、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地を混合した培地を用いて間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を混合培養する、［１０］又は［１１］に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
［１３］前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［１０］〜［１２］のいずれか一つに記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、簡便に、規則的且つ高密度の内部に毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の毛包組織含有シートの製造方法の一実施形態を示す概略図である。
【図２】実施例１における培養開始から１日目及び３日目の各混合スフェロイドを、倒立型蛍光顕微鏡を用いて暗視野で観察した結果を示す画像である。
【図３】（Ａ）実施例１における培養開始から３日目の各混合スフェロイドの抗Ｖｅｒｓｉｖａｎ抗体を用いた蛍光免疫染色後の切片を位相差顕微鏡により観察した際の画像である。（Ｂ）実施例１における培養開始から３日目の各混合スフェロイドの抗Ｖｅｒｓｉｖａｎ抗体を用いた蛍光免疫染色後の切片を、共焦点レーザ顕微鏡を用いて５３２ｎｍのレーザ光を照射した際のＲＦＰの蛍光（５８８ｎｍ）を捉えた画像である。（Ｃ）実施例１における培養開始から３日目の各混合スフェロイドの抗Ｖｅｒｓｉｖａｎ抗体を用いた蛍光免疫染色後の切片を、共焦点レーザ顕微鏡を用いて４８８ｎｍのレーザ光を照射した際のＲＦＰの蛍光（５８８ｎｍ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８の蛍光（５２５ｎｍ）を捉えた画像である。
【図４】実施例２における培養開始から１日目及び３日目の各混合スフェロイドを、倒立型蛍光顕微鏡を用いて暗視野で観察した結果を示す画像である。
【図５】（Ａ）実施例２における培養開始から３日目の各混合スフェロイドでのＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。（Ｂ）実施例２における培養開始から３日目の各混合スフェロイドでのＧＡＰＤＨの発現量に対するＮｅｘｉｎの相対的な発現量を示すグラフである。
【図６】実施例３における培養開始から１日目及び３日目の各混合スフェロイドを、倒立型蛍光顕微鏡を用いて暗視野で観察した結果を示す画像である。
【図７】（Ａ）実施例３における培養開始から３日目の各混合スフェロイドでのＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。（Ｂ）実施例３における培養開始から３日目の各混合スフェロイドでのＧＡＰＤＨの発現量に対するＡＬＰの相対的な発現量を示すグラフである。
【図８】（Ａ）試験例１における培養開始から３日目のマウス上皮系細胞及びヒト毛乳頭細胞の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１４日目のヌードマウスの様子を示す画像である。（Ｂ）試験例１における培養開始から３日目のマウス上皮系細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びヒト臍帯静脈血管内皮細胞の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１４日目のヌードマウスの様子を示す画像である。
【図９】試験例１における培養開始から３日目の各混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの一移植部における毛髪の平均再生本数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法＞
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる毛包原基形成工程を備える、毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法を提供する。
【００１２】
本実施形態の製造方法によれば、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞の混合細胞集塊（以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。）の構造を高密度に保つことで効率的に内部に毛細血管構造を有する毛包原基を形成させることができ、簡便に、規則的且つ高密度の内部に毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体を得ることができる。
【００１３】
本明細書において、「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞又はその細胞を培養して得られる細胞を意味する。例えば、毛乳頭細胞、真皮毛根鞘細胞、発生期の皮膚間葉系細胞、万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包間葉系細胞等が挙げられる。
本明細書において、「上皮系細胞」とは、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。例えば、バルジ領域の外毛根鞘最外層細胞、毛母基部の上皮系細胞、万能細胞万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包上皮系細胞等が挙げられる。
本明細書において、「血管を構築し得る細胞」とは、血管を構築することができる細胞を意味する。例えば、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞等が挙げられ、これらの細胞のいずれか、又は、その両方を含有していてもよい。また、中でも、血管を構築し得る細胞としては、血管内皮細胞であることが好ましい。
各細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００１４】
本明細書において、「毛包原基」とは、毛包のもととなる組織を意味し、上述の間葉系細胞、上述の上皮系細胞、及び上述の血管を構築し得る細胞から構成されている。毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞が肥厚し、間葉系細胞側に陥入することで、間葉系細胞及び血管を構築し得る細胞の細胞集塊（スフェロイド）を包み込む。続いて、間葉系細胞及び血管を構築し得る細胞のスフェロイドを包み込んだ上皮系細胞は毛母原基を形成し、間葉系細胞及び血管を構築し得る細胞のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成することで、毛母原基と毛乳頭等からなる毛包原基を形成する。この毛包原基では、毛乳頭細胞が毛母細胞に増殖因子を提供しており、毛母細胞の分化を誘導し、分化した細胞が毛を形成することができる。また、このとき、毛包原基の間葉系細胞側、すなわち毛乳頭の内部では、血管を構築し得る細胞が毛細血管構造を構築している。
本明細書において、「毛包」とは、表皮が内側に筒状に入り込んだ部分であって、毛を産生する皮膚の付属器官を意味する。
本明細書において、「再生毛包原基」とは、例えば、本実施形態の製造方法等により作製された毛包原基を意味する。
本明細書において、「毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体」とは、上述の再生毛包原基が複数集まっており、内部に毛細血管構造を有するものを意味する。本実施形態の製造方法では、簡便に、内部に毛細血管構造を有する複数の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列した再生毛包原基の集合体を得ることができる。本実施形態の製造方法で得られた集合体は各毛包原基の内部に毛細血管構造を有するため、移植後、移植体の血管と連通し、栄養分を得ることにより、高い毛包誘導能を発揮することができる。
また、毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体は毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００１５】
従来では、間葉系細胞のスフェロイドを高密度で規則的な配列で培養した後に、上皮系細胞を後から播種し、間葉系細胞のスフェロイドの周囲を覆わせる方法によって、高密度で規則的な配列の再生毛包原基の集合体を得ていた。
これに対し、本発明者らは、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を一緒に播種し、本実施形態の製造方法を用いて共培養することにより、簡便に、内部に毛細血管構造を有する複数の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列した再生毛包原基の集合体を得ることに初めて成功した。
【００１６】
本明細書において、規則的とは、等間隔で毛包原基が配置されている状態を表しており、哺乳動物の皮膚における毛穴と毛穴の間隔と同程度であればよい。また、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度とは、具体的には、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。
【００１７】
（マイクロ凹版）
毛包原基を形成させる際に使用するマイクロ凹版は、複数の微小凹部が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版は、市販のものを用いてもよいし、製造してもよい。
マイクロ凹版の製造方法として具体的には、まずＣＡＤソフト（Ｖ  Ｃａｒｖｅ  Ｐｒｏ  ６．５）等のパターン設計ソフトを用いて、作製するマイクロ凹版のパターンをコンピューターで設計する。次いで、切削機等を用いて、設計したパターン通りに基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製する。この凹鋳型に樹脂（例えば、エポキシ樹脂等）を流しこみ、硬化させた後、離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成する。次いで、形成した凸鋳型をディッシュ底面に固定し、マイクロ凹版の材料となるガラス又はポリマー材を流し込み、硬化する。次いで、離型することで、規則的なパターンが形成されたマイクロ凹版が作製できる。
【００１８】
また、マイクロ凹版における微小凹部の密度は、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された状態で培養することができる。後述するとおり、この規則的な配置且つ高密度の内部に毛細血管構造を有する毛包原基をそのままの配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植することで、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。
また、微小凹部の開口形状について、特別な限定はない。例えば、円形状、四角状、六角状、ライン状等であってもよく、中でも、毛穴に近い形状であるという観点から、円形状であることが好ましい。
【００１９】
微小凹部の開口部の直径及び深さについて、混合スフェロイドを収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさであってよく、例えば、２０μｍ以上１ｍｍ以下であってよい。また、深さについては、毛包組織含有シートの移植後の被験動物の皮膚への定着の観点から、１ｍｍ以下であってよい。
得られる毛包原基の配置及び大きさは、マイクロ凹版の微小凹部の開口形状、直径及び深さ等に依存するため、被験動物の種類、移植する部位等に合わせて、適宜マイクロ凹版の微小凹部を調製すればよい。
【００２０】
マイクロ凹版の材質は、細胞培養に適したものであればよく、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。マイクロ凹版は、酸素透過性を有する材質からなることが好ましく、より具体的には、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
本明細書において、「酸素透過性」とは、分子状の酸素を透過し、マイクロ凹版の微小凹部内まで到達させる性質を表している。具体的な酸素透過率としては、例えば１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であってよく、例えば１１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であってよく、例えば１２５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であってよい。
なお、「２４ｈｒ」は２４時間を意味し、「ａｔｍ」とは、気圧を意味しており、上記単位は、１気圧の環境下において、２４時間で透過する酸素の１ｍ２あたりの容量を表している。酸素透過率が上記範囲である材質からなるマイクロ凹版を使用することにより、十分な量の酸素を混合スフェロイドに供給でき、毛包原基を形成することができる。
【００２２】
［毛包原基形成工程］
まず、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞の混合懸濁液を上述のマイクロ凹版に播種する。このとき、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞の播種する細胞数の比率は、間葉系細胞及び上皮系細胞が同等の細胞数であり、血管を構築し得る細胞の細胞数が間葉系細胞又は上皮系細胞の細胞数よりも少なければよい。具体的な播種する細胞数の比率としては、間葉系細胞：上皮系細胞：血管を構築し得る細胞＝２：２：１〜８：８：１であることが好ましく、間葉系細胞：上皮系細胞：血管を構築し得る細胞＝４：４：１が特に好ましい。
【００２３】
次いで、播種した細胞を、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる。このとき、播種する上述の３種類の細胞の合計細胞数が多いほど、毛包原基の形成効率が高く、毛包原基の大きさも大きくなるが、播種する上述の３種類の細胞の合計細胞数はマイクロ凹版の微小凹部の大きさに応じて適宜調整すればよい。培養時間は、１日以上５日以下（好ましくは、３日）であってよく、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）であってよい。
【００２４】
酸素を供給しながら培養する方法としては、マイクロ凹版に酸素を直接吹きかける等して供給しながら培養する方法や、酸素透過性を有する材質からなるマイクロ凹版を用いて培養する方法等が挙げられる。
【００２５】
混合スフェロイドにおいて、毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞が肥厚し、間葉系細胞側に陥入することで、間葉系細胞及び血管を構築し得る細胞のスフェロイドを包み込む。続いて、間葉系細胞及び血管を構築し得る細胞のスフェロイドを包み込んだ上皮系細胞は毛母原基を形成し、間葉系細胞及び血管を構築し得る細胞のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成することで、毛母原基と毛乳頭等からなる毛包原基を形成する。この毛包原基では、毛乳頭細胞が毛母細胞に増殖因子を提供しており、毛母細胞の分化を誘導し、分化した細胞が毛を形成することができる。また、このとき、毛包原基の間葉系細胞側、すなわち毛乳頭の内部では、血管を構築し得る細胞が毛細血管構造を構築している。さらに、本実施形態の製造方法において、毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００２６】
間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞からなる混合スフェロイドを共培養する際に使用する培地は、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。
【００２７】
培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、および膜電位の調節を助けるためのものである。
無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。
【００２８】
一般的に、培地の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であればよく、例えば２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であればよく、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満（具体的には、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ）であればよい。
【００２９】
炭水化物としては、特別な限定はなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。
一般的に、培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ−グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００３０】
アミノ酸としては、特別な限定はなく、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びその組み合わせ等が挙げられる。
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下)である。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下)である。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００３１】
ビタミンとしては、特別な限定はなく、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）、塩化コリン、ｍｙｏ−イノシトール、等が挙げられる。
【００３２】
培地は、さらに抗生物質、血清、成長因子、又はホルモンを含んでいてもよい。
【００３３】
抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３４】
血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
一般的に、培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下であればよい。
【００３５】
成長因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。
成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３６】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン（ハイドロコーチゾン等）等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３７】
また、成長因子及びホルモンを含む培地添加剤として、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ：ＢＰＥ）を用いてもよい。
【００３８】
中でも、前記混合スフェロイドを共培養する際に使用する培地としては、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地を混合したものを用いることが好ましい。
間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地の混合比としては、容量比で、間葉系細胞増殖用培地：上皮系細胞増殖用培地：血管内皮細胞増殖用培地＝１：１：１であることが好ましい。
【００３９】
間葉系細胞増殖用培地としては、任意の抗生物質及び任意の血清、並びに、必要に応じて、任意の成長因子及び任意のホルモンを添加した公知の基本培地を用いればよい。
前記公知の基本培地としてより具体的には、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられる。
また、任意の抗生物質、任意の血清、任意の成長因子、及び任意のホルモンを含む間葉系細胞増殖用培地としては、例えば、毛乳頭細胞増殖培地（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＰＣＧＭ）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００４０】
上皮系細胞増殖用培地としては、塩化カルシウムを含み、無血清であって、上皮成長因子、並びに、必要に応じて任意の抗生物質及び任意のホルモンを添加した公知の上皮系細胞用基本培地を用いればよい。
前記公知の皮系細胞用基本培地としてより具体的には、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウ社製）、角化細胞基本培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）等が挙げられる。
また、上皮成長因子、任意の抗生物質、及び任意のホルモンを含む上皮系細胞増殖用培地としては、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）、角化細胞増殖培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００４１】
血管内皮細胞増殖用培地としては、血管内皮細胞増殖因子、並びに、必要に応じて任意の成長因子、任意の抗生物質、任意の血清、及び任意のホルモンを添加した公知の血管内皮細胞用基本培地を用いればよい。
前記血管内皮細胞用基本培地としてより具体的には、例えば、ＥＢＭ−２  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ社製）、内皮細胞基本培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、内皮細胞基本培地２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
また、血管内皮細胞増殖因子、任意の成長因子、任意の抗生物質、任意の血清、及び任意のホルモンを含む血管内皮細胞増殖用培地としては、例えば、ＥＧＭ２（Ｌｏｎｚａ社製）、内皮細胞増殖培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、内皮細胞増殖培地２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００４２】
＜毛包組織含有シート＞
一実施形態において、本発明は、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を含む毛包原基と、生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されており、前記毛包原基は内部に毛細血管構造を有する毛包組織含有シートを提供する。
【００４３】
本実施形態の毛包組織含有シートによれば、簡便に、規則的且つ高密度の毛包組織を再生することができる。また、本実施形態の毛包組織含有シートは各毛包原基の内部に毛細血管構造を有するため、移植後、移植体の血管と連通し、栄養分を得ることにより、高い毛包誘導能を発揮することができる。
【００４４】
本実施形態において、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞は上述のものと同様のものが挙げられる。また、本実施形態において、毛包組織含有シートは上述の毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００４５】
本明細書において、「生体適合性ハイドロゲル」とは、生体への適合性を有するゲルであって、高分子が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を意味する。より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
【００４６】
天然物由来の高分子としては、ゲル化する細胞外マトリックス成分等が挙げられる。ゲル化する細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。その他天然物由来の高分子として、ゼラチン、寒天、アガロースなどを使用することもできる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨなどを選択しハイドロゲルを作製することが可能である。また、これらの原料を組み合わせてもよい。
【００４７】
また、合成高分子としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅなどが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いてハイドロゲルを作製することも可能である。
【００４８】
中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、コラーゲン（特に、Ｉ型コラーゲン）であることがさらに好ましい。コラーゲンを含有することにより、より皮膚に近しい組成となり、高い毛包再生効率を実現できる。
【００４９】
本実施形態において、上述の毛包原基が、上述の生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることが好ましい。規則的とは、等間隔で毛包原基が配置されている状態を表しており、哺乳動物の皮膚における毛穴と毛穴の間隔と同程度であればよい。また、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度とは、具体的には、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。
【００５０】
＜毛包組織含有シートの製造方法＞
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を播種し、混合培養することにより内部に毛細血管構造を有する毛包原基を形成させる毛包原基形成工程と、前記微小凹部内に形成された内部に毛細血管構造を有する毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する転写工程と、を備える、毛包組織含有シートの製造方法を提供する。
【００５１】
本実施形態の製造方法によれば、簡便に、規則的且つ高密度の毛包組織含有シートを得ることができる。また、本実施形態の製造方法で得られた毛包組織含有シートは各毛包原基の内部に毛細血管構造を有するため、移植後、移植体の血管と連通し、栄養分を得ることにより、高い毛包誘導能を発揮することができる。
【００５２】
図１は、本発明の毛包組織含有シートの製造方法の一実施形態を示す概略図である。図１を参照しながら、本実施形態における毛包組織含有シートの製造方法について、以下に詳細を説明する。
【００５３】
（マイクロ凹版）
毛包組織含有シートを製造する際に使用するマイクロ凹版４は、上述のとおり、複数の微小凹部５が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版４は、市販のものを用いてもよいし、製造してもよい。マイクロ凹版の製造方法としては、上述の＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法＞の（マイクロ凹版）に記載の方法と同様の方法が挙げられる。
【００５４】
また、マイクロ凹版４における微小凹部５の密度は、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された毛包組織含有シートを得ることができる。
【００５５】
また、微小凹部の開口形状について、特別な限定はない。例えば、上述したものと同様の形状が挙げられ、中でも、毛穴に近い形状であるという観点から、円形状であることが好ましい。
微小凹部の開口部の直径及び深さについて、間葉系細胞１、上皮系細胞２、及び血管を構築し得る細胞３の混合スフェロイドを収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさであってよく、例えば２０μｍ以上１ｍｍ以下であってよい。また、深さについては、毛包組織含有シートの移植後の被験動物の皮膚への定着の観点から、１ｍｍ以下であってよい。
得られる毛包組織含有シートにおける毛包原基の配置及び大きさは、マイクロ凹版４の微小凹部５の開口形状、直径及び深さ等に依存するため、被験動物の種類、移植する部位等に合わせて、適宜マイクロ凹版４の微小凹部５を調製すればよい。
【００５６】
マイクロ凹版の材質は、細胞培養に適したものであればよく、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、マイクロ凹版は、酸素透過性を有する材質からなることが好ましく、より具体的には、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００５７】
［毛包原基形成工程］
上述の＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法＞と同様に、まず、間葉系細胞１、上皮系細胞２、及び血管を構築し得る細胞３の混合懸濁液を、マイクロ凹版４に播種し、混合培養することにより毛細血管構造７を有する毛包原基６ｂを形成させる。
このとき、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞の播種する細胞数の比率は、間葉系細胞及び上皮系細胞が同等の細胞数であり、血管を構築し得る細胞の細胞数が間葉系細胞又は上皮系細胞の細胞数よりも少なければよい。具体的な播種する細胞数の比率としては、間葉系細胞：上皮系細胞：血管を構築し得る細胞＝２：２：１〜８：８：１であることが好ましく、間葉系細胞：上皮系細胞：血管を構築し得る細胞＝４：４：１が特に好ましい。
【００５８】
次いで、播種した細胞を、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる。このとき、播種する上述の３種類の細胞の合計細胞数が多いほど、毛包原基の形成効率が高く、毛包原基の大きさも大きくなるが、播種する上述の３種類の細胞の合計細胞数はマイクロ凹版の微小凹部の大きさに応じて適宜調整すればよい。培養時間は、１日以上５日以下（好ましくは、３日）であってよく、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）であってよい。
【００５９】
間葉系細胞１、上皮系細胞２、及び血管を構築し得る細胞３の混合スフェロイド６ａにおいて、毛細血管構造７を有する毛包原基６ｂが形成される流れは、上述の＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法＞の［毛包原基形成工程］において記載されたとおりである。さらに、本実施形態の製造方法において、毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００６０】
本実施形態の製造方法において用いられる間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞は、上述の＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、中でも、血管を構築し得る細胞としては、血管内皮細胞であることが好ましい。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００６１】
間葉系細胞１、上皮系細胞２、及び血管を構築し得る細胞３の混合スフェロイド６ａを共培養する際に使用する培地８は、特別な限定はなく、上述の＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法＞の［毛包原基形成工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、前記混合スフェロイドを共培養する際に使用する培地としては、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地を混合したものを用いることが好ましい。
間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地の混合比としては、容量比で、間葉系細胞増殖用培地：上皮系細胞増殖用培地：血管内皮細胞増殖用培地＝１：１：１であることが好ましい。
間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地、及び血管内皮細胞増殖用培地の具体例としては、上述の＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法＞の［毛包原基形成工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６２】
［転写工程］
次いで、培地８を除去して、生体適合性ハイドロゲル９を含む溶液を添加して、生体適合性ハイドロゲル９をゲル化させる。溶液中の生体適合性ハイドロゲルの濃度は、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。また、ゲル化させるための時間についても、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。ゲル化させる温度等の条件については、特別な限定はなく、例えば３７℃のＣ０２インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。
次いで、マイクロ凹版４から毛包原基６ｂを含むゲル化した生体適合性ハイドロゲル９を取り外すことで、毛包組織含有シート１０が得られる。
【００６３】
本実施形態の製造方法において、生体適合性ハイドロゲルとは、上述の＜毛包組織含有シート＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、コラーゲン（特にＩ型コラーゲン）であることがさらに好ましい。コラーゲンを使用することにより、より皮膚に近しい組成となり、高い毛包再生効率を実現できる。
【００６４】
生体適合性ハイドロゲルを含む溶液は、Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１０又はＨａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１２等の無血清培地や、生体適合性ハイドロゲル再構成用の緩衝液（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸水水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ−Ｂｕｆｆｅｒからなる緩衝液等）等を含んでいてもよい。
【００６５】
本実施形態の製造方法において、生体適合性ハイドロゲルをゲル化させる際に、ゲルの強度を補強するために、支持体を内包させてもよい。
支持体の材質としては、移植後に、毛包原基の上皮系細胞側の部分と被験動物側の上皮系細胞との連結を促進させることができるものであれば、特別な限定はない。例えば、ナイロン等のポリマーや合成又は天然の生体吸収可能なポリマーより作られた繊維、ステンレス等の金属繊維、炭素繊維、及び、ガラス繊維等の化学繊維、並びに天然の動物繊維（生体由来の毛髪等）や植物繊維等を挙げることができ、より具体的には、ナイロン糸やステンレス線等を挙げることができる。支持体の直径および長さは、再生対象となる部分により適宜設計することができる。直径は、例えば５μｍ以上１００μｍ以下であってよく、例えば２０μｍ以上５０μｍ以下であってよい。また、長さは、例えば１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であってよく、例えば４ｍｍ以上６ｍｍ以下であってよい。
【００６６】
＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の移植方法＞
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞を播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、前記毛包原基を前記微小凹部の規則的な配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植する工程と、を備える毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の移植方法を提供する。
【００６７】
本実施形態の移植方法によれば、簡便に、規則的且つ高密度の毛包組織を再生することができる。また、本実施形態の移植方法において用いられる再生毛包原基の集合体は各毛包原基の内部に毛細血管構造を有するため、移植後、移植体の血管と連通し、栄養分を得ることにより、高い毛包誘導能を発揮することができる。
【００６８】
［毛包原基形成工程］
上述の＜毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法＞と同様に、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞の混合懸濁液を、マイクロ凹版に播種し、混合培養することにより毛細血管構造を有する毛包原基を形成させる。
【００６９】
［移植工程］
規則的な配置の微小凹部内において形成された毛細血管構造を有する毛包原基を、例えば、上述の微小凹部と同様の規則的な配置である複数のチップ、ニードル、又はノズルを有するマルチピペットを用いて吸引する。次いで、被験動物の毛包欠損部に規則的な配置のまま毛包原基を移植する。規則的な配置を保つことにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。マルチピペットは手動のものでも、全自動のものでもよい。
【００７０】
本明細書において、「マルチピペット」とは、複数のチップ、ニードル又はノズルを先端に有し、上述の微小凹部と同様の規則的な配置でチップ、ニードル、又はノズルが備えられており、間葉系細胞、上皮系細胞、及び血管を構築し得る細胞からなる毛髪原基を吸引及び排出できるものであれば、特別な限定はない。材質は、細胞に有害なものでなければ特別な限定はなく、また、マルチピペットに装着するチップ、ニードル、又はノズルの先端の口径は、マイクロ凹版の微小凹部に差し込むことができる程度の大きさであれば、特別な限定はない。
【００７１】
＜毛包組織含有シートの移植方法＞
本実施形態の毛包組織含有シートは、当業者に公知の方法で対象となる部位に移植することができる。例えば、シャピロ式植毛術やチョイ式植毛器を用いた植毛、空気圧を利用したインプランター等を使用し、移植することができる。シャピロ式植毛術とは、移植部位をマイクロメス等で移植創を作った後に、ピンセットを用いて移植する方法である。
本実施形態の毛包組織含有シートの大きさは、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト）の年齢、性別、症状、治療部位、治療時間等を勘案して適宜調節される。
【００７２】
また、移植深度としては、再生対象となる部位により適宜変更することができる。例えば０．０５ｍｍ以上５ｍｍ以下であってよく、例えば０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であってよく、例えば０．３ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であってよい。
また、移植する部位としては、被検動物の真皮層内に移植することが好ましく、毛包形成及びその後の発毛効率の優れた真皮及び皮下組織の境界面より上方とすることがより好ましい。また、移植創上端部に毛包原基の上皮系細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節すると、さらに被検動物の上皮系細胞との連続性を高めることができるため、好ましい。
本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、皮膚接合用のテープやバンド、縫合等により、毛包組織含有シートと移植対象部位とを固定してもよい。
【００７３】
本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、上述の支持体を内包している場合は、再生器官原基を移植後しばらくして被検動物の上皮系細胞と、毛包原基の上皮系細胞由来の側との連続性が確保された後、移植部位より抜くことができる。移植後の状態により適宜設定することができるが、例えば、移植後３日以上７日以下で移植部位から抜くことが好ましい。または、支持体が、自然と移植部位より抜けるまで放置することもできる。生体吸収性の材料の支持体は、自然と移植部位より抜けるか、分解又は吸収されるまで放置することができる。
【００７４】
また、本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、上述の支持体を内包している場合は、毛包原基の上皮系細胞由来の細胞が、支持体に沿って伸長する。これにより、移植後の被検動物側の上皮系細胞と毛包原基の上皮系細胞側との連続性を向上させることができる。特に、支持体が移植部位の表皮より外に維持される場合には、被検動物側の上皮系細胞が、異物を排除するように、支持体に沿って移植部位の内側へ伸長するため、連続性をさらに向上させることができる。さらに、意図した方向へ毛包形成を促すことができる。その結果、毛包原基からの発毛率を向上させることができるとともに、発毛方向の制御も可能となる。
【００７５】
＜毛包組織の再生治療方法＞
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体を提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛包組織含有シートを提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法を提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛包組織含有シートの製造方法を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の毛包組織含有シートを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を製造するための上記毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の使用を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を製造するための上記毛包組織含有シートの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、上記毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
また、本発明の一側面は、上記毛包組織含有シートの有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
【００７６】
本明細書において、再生可能な毛包組織を含む組織としては、毛包を再生し、さらに毛髪を再生したい体表皮であれば、特別な限定はなく、例えば、頭皮等が挙げられる。
また、適用可能な疾患としては、脱毛を伴う任意の疾患であって、例えば男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ  Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、症候性脱毛症等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７７】
治療対象としては、特別な限定はなく、哺乳動物が好ましい、哺乳動物としては、例えば、霊長類（例えばヒト、サル、チンパンジー等）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター等）、有蹄類（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）、及びペット動物（例えばイヌ、ネコ、ウサギ等）が挙げられ、中でも、ヒトが好ましい。
【実施例】
【００７８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
［実施例１］マウス上皮系細胞及び間葉系細胞、並びにヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いた毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の作製（１）
（１）毛包原基の形成
マイクロ凹版として、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅを用いた。
まず、胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌマウス（日本クレア社から購入）から上皮系細胞及び間葉系細胞を採取した。次いで、遠心分離を行い、上清を除去後、培地に懸濁した。また、予め、ＲＦＰ遺伝子導入ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（以下、「ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ」と称する場合がある。）はコンフルエントになるまで培養しておいた。
次いで、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅに、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞、並びにＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合懸濁液を以下の表１に示す細胞数となるように播種した。
【００８０】
【表１】
2018082638.tif 000002
【００８１】
培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）含有）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製）を１：１で混合した培地（以下、「ＤＭ／ＫＧ２混合培地」と称する場合がある。）を用いた。培地交換は毎日行った。
【００８２】
（２）蛍光顕微鏡による観察
培養中の間葉系細胞、上皮系細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合細胞集塊（以下、「混合スフェロイド」と称する場合がある。）について、培養開始から１日目及び３日目に倒立型蛍光顕微鏡ＤＰ−７１（オリンパス社製）を用いて観察した。結果を図２に示す。
【００８３】
（３）蛍光免疫染色による観察
混合スフェロイドについて、培養開始から３日目に４％パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗Ｖｅｒｓｉｃａｎ抗体（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）（一次抗体）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差吸着抗体（Ｔｈｅｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（二次抗体）を用いて、蛍光免疫染色を行った。次いで、倒立型位相差顕微鏡ＩＸ−７１を用いた明視野での観察（図３（Ａ）参照。）、及び共焦点レーザ顕微鏡ＬＳＭ７００（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用いた暗視野での観察（図３（Ｂ）及び（Ｃ）参照。）を行った。結果を図３（Ａ）〜（Ｃ）に示す。なお、図３（Ａ）〜（Ｃ）は同じサンプルについての画像である。図３（Ａ）は位相差顕微鏡により観察した際の画像である。図３（Ｂ）は共焦点レーザ顕微鏡を用いて５３２ｎｍのレーザ光を照射した際のＲＦＰの蛍光（５８８ｎｍ）を捉えた画像である。図３（Ｃ）は共焦点レーザ顕微鏡を用いて４８８ｎｍのレーザ光を照射した際のＲＦＰの蛍光（５８８ｎｍ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８の蛍光（５２５ｎｍ）を捉えた画像である。
【００８４】
（４）結果及び考察
図２及び図３（Ａ）〜（Ｃ）から、播種した３種類の細胞は、１つの凝集体を形成した後、３日間の培養中に凝集体内で同種細胞どうしが集合しあい、間葉系細胞集塊内部に血管内皮細胞による毛細血管構造を有する毛包原基が形成されることが確かめられた。
また、細胞数を変えて毛包原基の形成を評価したところ、すべての細胞数で間葉系細胞集塊内部に血管内皮細胞による毛細血管構造を有する毛包原基の形成が観察された。
以上のことから、マイクロ凹版として、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅを用いることで、マウス胎児上皮系細胞及び間葉系細胞、並びに血管内皮細胞の３種類の細胞が各ウェルにおいて凝集し、均一に分散した１つの凝集体を形成した後、同種の細胞同士がその中で自発的に分離することで、間葉系細胞集塊内部に血管内皮細胞による毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体を製造できることが確かめられた。
【００８５】
［実施例２］マウス上皮系細胞及び間葉系細胞、並びにヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いた毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の作製（２）
（１）毛包原基の形成
マイクロ凹版として、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅを用いた。
まず、胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌマウス（日本クレア社から購入）から上皮系細胞及び間葉系細胞を採取した。また、予め、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣはコンフルエントになるまで培養しておいた。次いで、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅに、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞、並びにＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合懸濁液を以下の表２に示す細胞数となるように播種した。また、用いた培地についても表２に示す。
表２において、培地Ａとは、ＤＭ／ＫＧ２混合培地である。また、培地Ｂとは、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓ含有）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製）とＥＧＭ２（ＬＯＮＺＡ社製）とを１：１：１で混合した培地（以下、「ＤＭ／ＫＧ２／ＥＧＭ２混合培地」と称する場合がある。）である。培地交換は毎日行った。
【００８６】
【表２】
2018082638.tif 000003
【００８７】
（３）蛍光顕微鏡による観察
培養中の混合スフェロイドについて、培養開始から１日目及び３日目に倒立型蛍光顕微鏡ＤＰ−７１（オリンパス社製）を用いて観察した。結果を図４に示す。
【００８８】
（４）毛包誘導マーカー（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＮｅｘｉｎ遺伝子）のＲＴ−ＰＣＲ解析
培養開始から３日目の各混合スフェロイドについて、毛包誘導マーカーであるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＮｅｘｉｎ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。
【００８９】
（４−１）ＲＮＡの抽出
まず、培養開始から３日目の各混合スフェロイドを１．５ｍＬマイクロチューブに移しかえた。次いで、４℃、５０００ｒｐｍで、３分間遠心した。この操作は、残存する培地を捨てるため、混合スフェロイドを沈殿させると同時に、遠心分離機内の予冷のために行った。次いで、上清（培地）を捨てた後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを３５０μＬ加え、よくピペッティングした。続いて、ピペッティング後の溶液をＱＩＡ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに回収し、４℃、１００００ｒｐｍで、２分間遠心した。次いで、ＱＩＡ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムの上部を捨て、コレクションチューブ内の溶液に７０％エタノールを３５０μＬ加え、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに移した。次いで、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を７００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥを５００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥを５００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、２分間遠心した。次いで、新しい２ｍＬコレクションチューブに遠心後のカラムを移し、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心した。これは、残存するＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを除去するために行った。続いて、１ｍＬマイクロチューブに遠心後のカラムを移し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心した。次いで、遠心後のカラムが設置された１ｍＬマイクロチューブに、再度ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心し、ＲＮＡ溶解液を得た。
【００９０】
（４−２）分光光度計によるＲＮＡ濃度測定
次いで、Ｎａｎｏ  Ｖｕｅの電源を付け、希釈率を６０．０に設定した。ここで、希釈率とは、ＲＮＡ抽出における最終容量である。続いて、測定板を７０％エタノールで拭いた後、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ２μＬを測定板の中心にアプライし、［ＯＡ／１００％Ｔ］のボタンを押した。この操作でベースラインを得た。続いて、（４−１）で得られたＲＮＡ溶解液２μＬを測定板の中心にアプライし、測定ボタンを押した。Ａ２６０／Ａ２８０はサンプルの純度を表し、２．０に近い方が好ましい。次いで、次のサンプル（ＲＮＡ溶解液）を測定する際は、キムワイプで拭きとって７０％エタノールで拭いてから使用した。
【００９１】
（４−３）ＲＴ−ＰＣＲ
次いで、（４−２）で濃度を測定したＲＮＡ溶解液を１５０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、６５℃で、５分間インキュベートし、その後氷上で冷却した。続いて、マイクロチューブに下記表３に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表３において、ＲＮＡとは、各混合スフェロイド由来のＲＮＡ溶解液を示す。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
次いで、（サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。続いて、３７℃で１５分間、９８℃で５分間の逆転写反応を行い、各混合スフェロイド由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。
【００９４】
次いで、マイクロチューブに下記表４に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表４において、ＤＮＡとは、各混合スフェロイド由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを示す。さらに、ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列について、表５に示す。
【００９５】
【表４】
2018082638.tif 000005
【００９６】
【表５】
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【００９７】
次いで、サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。続いて、９５℃で４分間、（９５℃で５秒間、６０℃で６０秒間）×４５サイクル、７２℃で１０分間のプロトコールにてＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現量を測定し、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎ又はＮｅｘｉｎの相対的な発現量を算出した。結果を図５（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図５（Ａ）及び（Ｂ）において、「４：４：０（ＤＭ／ＫＧ２）」は、表２における混合スフェロイド（ｉ）を示し、「４：４：０」は表２における混合スフェロイド（ｉｉ）を示し、「４：４：１」は混合スフェロイド（ｉｉｉ）を示す。
【００９８】
（５）結果及び考察
図４から、混合スフェロイド（ｉｉｉ）においてのみ、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ由来のＲＦＰの蛍光が観察された。
また、図５（Ａ）及び（Ｂ）から、Ｖｅｒｓｉｖａｎ遺伝子及びＮｅｘｉｎ遺伝子の発現について、混合スフェロイド（ｉｉ）は混合スフェロイド（ｉ）よりも有意に高く、混合スフェロイド（ｉｉｉ）は混合スフェロイド（ｉｉ）よりも有意に高いことが明らかとなった。
このことから、血管内皮細胞増殖用培地であるＥＧＭ２の添加、及び血管内皮細胞の混合は、毛包原基の毛包誘導能の向上に有意に働くことが示された。
【００９９】
［実施例３］マウス上皮系細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いた毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の作製
毛包原基の形成
マイクロ凹版として、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅを用いた。
まず、胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌマウス（日本クレア社から購入）ら上皮系細胞を採取した。また、予め、ヒト毛乳頭細胞（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣはコンフルエントになるまで培養しておいた。
次いで、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅに、採取した上皮系細胞４．０×１０３細胞、ヒト毛乳頭細胞４．０×１０３細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ  １．０×１０３細胞、合計９．０×１０３細胞を含む混合懸濁液を播種した。対照群として、採取した上皮系細胞４．０×１０３細胞、及びヒト毛乳頭細胞４．０×１０３細胞、合計８．０×１０３細胞を含む混合懸濁液も準備し、播種した。
また、培地は、毛乳頭細胞増殖培地（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＰＣＧＭ）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製）とＥＧＭ２（ＬＯＮＺＡ社製）とを１：１：１で混合した培地（以下、「ＤＭ／ＫＧ２／ＥＧＭ２混合培地」と称する場合がある。）を用いた。培地交換は毎日行った。
【０１００】
（３）蛍光顕微鏡による観察
培養中の混合スフェロイドについて、培養開始から１日目及び３日目に倒立型蛍光顕微鏡ＤＰ−７１（オリンパス社製）を用いて観察した。結果を図６に示す。
【０１０１】
（４）毛包誘導マーカー（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＮｅｘｉｎ遺伝子）のＲＴ−ＰＣＲ解析
培養開始から３日目の各混合スフェロイドについて、毛包誘導マーカーであるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＡＬＰ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。
【０１０２】
（４−１）ＲＮＡの抽出
実施例２の（４−１）と同様の方法を用いて、各混合スフェロイドからＲＮＡ溶解液を得た。
【０１０３】
（４−２）分光光度計によるＲＮＡ濃度測定
実施例２の（４−２）と同様の方法を用いて、（４−１）で得られた各ＲＮＡ溶解液のＲＮＡ濃度を測定した。
【０１０４】
（４−３）ＲＴ−ＰＣＲ
ＰＣＲにおいて、以下の表６に示すプライマーを使用した以外は、実施例２の（４−３）と同様の方法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現量を測定し、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎ又はＡＬＰの相対的な発現量を算出した。結果を図７（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図７（Ａ）及び（Ｂ）において、「４：４：０」はマウス上皮細胞及びヒト毛乳頭細胞の混合スフェロイドを示し、「４：４：１」はマウス上皮細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合スフェロイドを示す。
【０１０５】
【表６】
2018082638.tif 000007
【０１０６】
（５）結果及び考察
図６から、マウス上皮細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合スフェロイドにおいてのみ、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ由来のＲＦＰの蛍光が観察された。また、マウス上皮細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの３種類の細胞が凝集し、均一に分散した１つの凝集体を形成した後、同種の細胞同士がその中で自発的に分離することで、間葉系細胞集塊内部に血管内皮細胞による毛細血管構造を有する毛包原基が形成されることが確かめられた。
また、図７（Ａ）及び（Ｂ）から、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＡＬＰ遺伝子の発現をについて、マウス上皮細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合スフェロイドはマウス上皮細胞及びヒト毛乳頭細胞の混合スフェロイドよりも有意に高いことが明らかとなった。これは血管内皮細胞の産生するサイトカイン（例えば、ＶＥＧＦ等）が毛乳頭細胞の毛包誘導能向上に寄与したためであると推察された。
【０１０７】
［試験例１］移植により再生した毛包組織の評価試験
（１）マウス皮下移植
実施例３で作製した培養開始から３日目のマウス上皮細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）（オリエンタル酵母社より購入）の皮下に２０ＧＶランスを用いて移植穴をあけて、マイクロピペットを用いて、１つずつ移植した。対照群として、実施例３で作製した培養開始から３日目のマウス上皮細胞及びヒト毛乳頭細胞の混合スフェロイドも移植した。
移植後、２日に１回肉眼による観察を行い、移植から１４日目のヌードマウスの様子を図８（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図８（Ａ）において、「ＨＦＧ」はマウス上皮細胞及びヒト毛乳頭細胞の混合スフェロイドを移植したマウスを示す。図８（Ｂ）において、「ＶＨＦＧ」はマウス上皮細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合スフェロイドを移植したマウスを示す。
また、移植から１８日目のヌードマウスの移植部を、デジタルマイクロスコープ（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて観察し、移植部における毛髪の再生本数を測定した。各ヌードマウスにおける毛髪の平均再生本数を図９に示す。
【０１０８】
（２）結果と考察
図８（Ａ）及び（Ｂ）から、いずれの混合スフェロイドを移植したマウスにおいても、ホクロ様の黒ずんだ部分が形成されており、一部の黒ずんだ部分から発毛が観察された。また、マウス上皮細胞及びヒト毛乳頭細胞の混合スフェロイドを移植したマウスにおける再生効率は５０％であり、マウス上皮細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合スフェロイドを移植したマウスにおける再生効率は５５％であり、大きな差は見られなかった。
また、図９から、移植部における平均再生本数は、マウス上皮細胞及びヒト毛乳頭細胞の混合スフェロイドを移植したマウスでは約１．４本であったのに対し、マウス上皮細胞、ヒト毛乳頭細胞、及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの混合スフェロイドを移植したマウスでは約２．１本であり、高い傾向が見られた。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明によれば、簡便に、規則的且つ高密度の内部に毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体を得ることができる。
【符号の説明】
【０１１０】
１…間葉系細胞、２…上皮系細胞、３…血管を構築し得る細胞、４…マイクロ凹版、５…微小凹部、６ａ…混合スフェロイド、６ｂ…毛包原基、７…毛細血管構造、８…培地、９…生体適合性ハイドロゲル、１０…毛包組織含有シート。
【図１】
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【図２】
2018082638.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
2018082638.tif 000012
【図６】
2018082638.tif 000013
【図７】
2018082638.tif 000014
【図８】
2018082638.tif 000015
【図９】
2018082638.tif 000016
【配列表】
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