(57)【要約】【課題】納豆の優れた機能を損なうことなく、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかによる付加価値を高めた食品の製造方法を提供すること。【解決手段】納豆菌含有物と、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかとを混合し、前記乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかで前記納豆菌含有物を発酵する発酵工程を含むことを特徴とする食品の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆菌含有物と、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかとを混合し、前記乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかで前記納豆菌含有物を発酵する発酵工程を含むことを特徴とする食品の製造方法。
【請求項２】
前記乳酸菌が、少なくとも２種類の乳酸菌を含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記食品における前記納豆菌、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の濃度が、少なくとも以下のいずれかを満たす請求項１から２のいずれかに記載の製造方法；
前記納豆菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上である、
前記乳酸菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上である、
前記酪酸菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上である、又は
前記麹菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上である。
【請求項４】
前記食品におけるプロテアーゼ力価が、１，０００ｕ／ｇ以上である請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記発酵工程において、炭酸カルシウムを添加する請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記発酵工程において、ビタミンＣを添加する請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は、大豆を原料として、納豆菌により発酵させた食品であり、消化作用や栄養吸収作用を有するプロテアーゼ、抗炎症作用を有するポリアミン、セロトニンを生成するトリプトファン、腸管免疫に関与するグルタミン、ＧＡＢＡ、サポニン、イソフラボン、その他の抗酸化物質など、多くの有効成分を含むことが知られている。また、納豆の発酵過程では、ビタミンＢ２が増加することが知られており、脂肪燃焼、及びダイエット効果を有することが期待されている。
更に、前記納豆菌は、Ｏ−１５７などに対する抗菌物質を産生することが知られており、抗菌剤としての有用性も期待されている。
【０００３】
上記期待と一致して、納豆市場は拡大傾向にあるが、市場での価格競争を考慮して、付加価値を高めた納豆の開発が求められている。
【０００４】
乳酸菌、酪酸菌及び麹菌は、整腸効果を有することが知られており、古くからヨーグルト、ぬか漬け、日本酒などの食品の発酵に使用されている。
【０００５】
そこで、前記納豆の優れた機能を損なうことなく、前記乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかにより付加価値を高めた食品の開発が望まれるが、これまでに、納豆菌の強い抗菌作用のため、納豆菌と乳酸菌等との共存は不可能であることが示されてきた。
【０００６】
また、納豆、及び乳酸菌培養液を含む家畜用飼料の製造方法については開示されているが（特許文献１）、これは、米ぬか味噌と、納豆と、乳酸菌培養液と、土着菌が生息する腐葉土と、米ぬかとを混合して発酵させるものであり、納豆の優れた機能を損なうことなく、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかによる付加価値を高めた食品の簡便な製造方法については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２２３６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、納豆の優れた機能を損なうことなく、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかにより付加価値を高めた食品の簡便な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、納豆菌含有物と、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかとを混合し、前記乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかで前記納豆菌含有物を発酵することにより、納豆の優れた機能を損なうことなく、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかによる付加価値を高めた食品の簡便な製造方法が提供できることを確認した。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  納豆菌含有物と、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかとを混合し、前記乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかで前記納豆菌含有物を発酵する発酵工程を含むことを特徴とする食品の製造方法である。
＜２＞  前記乳酸菌が、少なくとも２種類の乳酸菌を含む＜１＞に記載の製造方法である。
＜３＞  前記食品における前記納豆菌、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の濃度が、少なくとも以下のいずれかを満たす＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の製造方法；
前記納豆菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上である、
前記乳酸菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上である、
前記酪酸菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上である、又は
前記麹菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上である。
＜４＞  前記食品におけるプロテアーゼ力価が、１，０００ｕ／ｇ以上である＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の製造方法である。
＜５＞  前記発酵工程において、炭酸カルシウムを添加する＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の製造方法である。
＜６＞  前記発酵工程において、ビタミンＣを添加する＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、納豆の優れた機能を損なうことなく、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかにより付加価値を高めた食品の簡便な製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１−１及び１−２並びに比較例１−１及び１−２で得られた食品の乳酸菌数を示す図である。
【図２】図２は、実施例２−１〜２−３及び比較例２で得られた食品の乳酸菌数を示す図である。
【図３】図３は、実施例２−１〜２−３及び比較例２で得られた食品の納豆菌数を示す図である。
【図４】図４は、実施例３で得られた食品の酪酸菌数及び納豆菌数を示す図である。
【図５】図５は、実施例４で得られた食品の酪酸菌数を示す図である。
【図６】図６は、実施例５で得られた食品の写真である。
【図７】図７は、実施例５で得られた食品の顕微鏡写真である。
【図８】図８は、実施例６−１及び６−２で得られた食品の乳酸菌数を示す図である。
【図９】図９は、実施例６−１及び６−２で得られた食品の納豆菌数を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例７−１及び７−２で得られた食品の乳酸菌数及び納豆菌数を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例８−１及び８−２で得られた食品の乳酸菌数及びｐＨを示す図である。
【図１２】図１２は、実施例９で得られた食品の乳酸菌数及びプロテアーゼ力価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（食品の製造方法）
本発明の食品の製造方法は、発酵工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含むことができる。
【００１４】
＜発酵工程＞
前記発酵工程は、納豆菌含有物と、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかとを混合し、前記乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかで前記納豆菌含有物を発酵する工程である。
【００１５】
＜＜納豆菌含有物＞＞
前記納豆菌含有物としては、納豆を含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、更に必要に応じてその他の添加物を加えることができる。
【００１６】
−納豆−
前記納豆としては、市販品であってもよく、従来公知の手法に基づき、大豆及び納豆菌を用いて製造したものであってもよい。
前記納豆の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粗挽きした納豆、粗挽きしていない納豆、これらの併用などが挙げられるが、発酵効率の点から、粗挽きした納豆が好ましい。
前記粗挽きした納豆は、前記納豆を市販の挽肉機を用いて粗挽きすることにより得ることができる。
前記納豆菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｎａｔｔｏなどが挙げられる。
【００１７】
−その他の添加物−
前記その他の添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、米粉などが挙げられる。
【００１８】
＜＜乳酸菌＞＞
前記乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓなどが挙げられる。
これらの乳酸菌は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよいが、発酵効率の点から、少なくとも２種類の乳酸菌を含むことが好ましい。
前記乳酸菌としては、熱や化学物質、エックス線などに高い耐久性を有し、保存性の向上を図ることができる点から、有胞子乳酸菌が好ましい。前記有胞子乳酸菌は、栄養の枯渇、温度や湿度などの変化、老廃物の蓄積など、菌の生存に不利な環境に置かれた場合に芽胞を形成する。前記不利な環境としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、低湿度（乾燥）環境、高温環境などが挙げられる。
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓは、有胞子乳酸菌である。
前記乳酸菌は、市販品であってもよい。
【００１９】
前記乳酸菌の前記納豆に対する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、納豆１００質量部に対して、乳酸菌０．１〜１０質量部が好ましく、０．３〜５質量部がより好ましく、０．３〜２質量部が更に好ましい。
【００２０】
＜＜酪酸菌＞＞
前記酪酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍなどが挙げられる。
前記酪酸菌としては、熱や化学物質、エックス線などに高い耐久性を有し、保存性の向上を図ることができる点から、有胞子酪酸菌が好ましい。前記有胞子酪酸菌は、栄養の枯渇、温度や湿度などの変化、老廃物の蓄積など、菌の生存に不利な環境に置かれた場合に芽胞を形成する。前記不利な環境としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、低湿度（乾燥）環境、高温環境などが挙げられる。
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍは、有胞子酪酸菌である。
前記酪酸菌は、市販品であってもよい。
【００２１】
前記酪酸菌の前記納豆に対する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、納豆１００質量部に対して、酪酸菌０．１〜１０質量部が好ましく、０．３〜５質量部がより好ましく、０．３〜２質量部が更に好ましい。
【００２２】
＜＜麹菌＞＞
前記麹菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、黄麹菌、白麹菌、黒麹菌などが挙げられる。
前記麹菌は、種麹であってもよい。
前記種麹としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清酒用種麹などが挙げられる。
前記麹菌は、市販品であってもよい。
【００２３】
前記麹菌の前記納豆に対する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、納豆１００質量部に対して、麹菌０．０１〜１０質量部が好ましく、０．１〜５質量部がより好ましく、０．１〜２質量部が更に好ましい。
【００２４】
＜＜発酵＞＞
前記発酵の方法としては、前記納豆菌含有物を、前記乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかで発酵できる方法であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、好気発酵、嫌気発酵などが挙げられる。更に必要に応じてその他の添加物を加えて発酵することができる。
【００２５】
−好気発酵−
前記好気発酵としては、好気条件下での発酵であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、好気条件下において、培養機内で静置する方法などが挙げられる。
前記好気発酵の発酵温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜５０℃が好ましく、２０℃〜４０℃がより好ましく、３０℃〜４０℃が更に好ましい。
前記好気発酵の発酵時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１時間〜７日間が好ましく、１２時間〜９６時間がより好ましく、２４時間〜４８時間が更に好ましい。
【００２６】
−嫌気発酵−
前記嫌気発酵としては、嫌気条件下での発酵であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、嫌気条件下において、培養機内で静置する方法などが挙げられる。
前記嫌気発酵の発酵温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜５０℃が好ましく、２０℃〜４０℃がより好ましく、３０℃〜４０℃が更に好ましい。
前記嫌気発酵の発酵時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１時間〜７日間が好ましく、１２時間〜９６時間がより好ましく、２４時間〜４８時間が更に好ましい。
【００２７】
−その他の添加物−
前記その他の添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炭酸カルシウム、ビタミンＣ、クエン酸、ＮａＣｌ溶液、蒸留水などが挙げられる。
これらのその他の添加物は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよいが、乳酸菌の代謝産物である乳酸の中和の促進、嫌気性発酵効率、納豆菌の増殖抑制などの点から、炭酸カルシウム、又はビタミンＣを加えることが好ましく、炭酸カルシウム、及びビタミンＣを加えることがより好ましい。
【００２８】
前記炭酸カルシウムの前記納豆に対する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、納豆１００質量部に対して、炭酸カルシウム０．１〜２０質量部が好ましく、０．１〜１０質量部がより好ましく、０．５〜５質量部が更に好ましい。
前記ビタミンＣの前記納豆に対する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、納豆１００質量部に対して、ビタミンＣ０．１〜１０質量部が好ましく、０．１〜５質量部がより好ましく、０．５〜３質量部が更に好ましい。
前記クエン酸の前記納豆に対する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、納豆１００質量部に対して、クエン酸０．１〜１０質量部が好ましく、０．１〜５質量部がより好ましく、０．５〜３質量部が更に好ましい。
【００２９】
前記ＮａＣｌ溶液の濃度としては、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１〜１０％溶液が好ましく、０．１〜１．０％溶液がより好ましく、０．５〜１．０％溶液が更に好ましく、０．９％溶液が特に好ましい。
前記ＮａＣｌ溶液の前記納豆に対する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、納豆１００質量部に対して、ＮａＣｌ溶液０．１〜２０質量部が好ましく、１．０〜１０質量部がより好ましく、３．０〜１０質量部が更に好ましい。
前記蒸留水の前記納豆に対する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、納豆１００質量部に対して、蒸留水１〜１００質量部が好ましく、１０〜１００質量部がより好ましく、２０〜４０質量部が更に好ましい。
【００３０】
＜その他の工程＞
前記食品の製造方法における、前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真空凍結乾燥工程、通風乾燥工程などが挙げられる。
【００３１】
＜食品＞
以上の工程により本発明の食品の製造方法により製造される食品を得ることができる。
前記食品は、少なくとも、納豆菌と、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の少なくともいずれかとを含み、更に必要に応じて、その他の成分を含むことができる。
【００３２】
前記食品における、納豆菌、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記納豆菌、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の濃度の少なくともいずれかが、生菌で、１×１０８個／ｇ以上であることが好ましく、前記納豆菌、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の濃度の少なくともいずれかが、生菌で、１×１０９個／ｇ以上であることがより好ましく、納豆菌の濃度が、生菌で、１×１０８個／ｇ以上であり、かつ、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の濃度の少なくともいずれかが、生菌で、１×１０８個／ｇ以上であることがさらに好ましく、納豆菌の濃度が、生菌で、１×１０９個／ｇ以上であり、かつ、乳酸菌、酪酸菌、及び麹菌の濃度の少なくともいずれかが、生菌で、１×１０９個／ｇ以上であることが特に好ましい。
【００３３】
前記食品におけるプロテアーゼ力価としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１，０００ｕ／ｇ以上であることが好ましく、５，０００ｕ／ｇ以上であることがより好ましく、８，０００ｕ／ｇ以上であることが更に好ましい。
【００３４】
前記食品におけるプロテアーゼ力価は、５ｇの試料に、２５ｍＬの０．５％ＮａＣｌ溶液を加え撹拌し、遠心後の上清０．５ｍＬに、１．０ｍＬのマッキンベン緩衝液（ｐＨ６）を加えて、３８℃で５分間予熱し、１．５ｍＬの２％カゼイン溶液を加えて、３８℃で６０分間保温した後、３．０ｍＬの０．４Ｍトリクロロ酢酸を加えて、３０分後にろ過し、１．０ｍＬのろ液に、５．０ｍＬの０．４Ｍ炭酸ナトリウム溶液、１．０ｍＬのフェノール試薬を加えて、３８℃で３０分間発色させ、６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、チロシン標準液を用いて作成した検量線から、３８℃、６０分間に1μｇのチロシンを生成する活性を1単位として算出することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３６】
＜納豆の乳酸菌発酵による食品の製造＞
（実施例１−１）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。３０ｇの粗挽きした納豆と、３００ｍｇの有胞子乳酸菌  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ（三菱化学フーズ製）とを混合し、３５℃で好気発酵した。発酵後４８時間の乳酸菌の生菌数を、以下の方法で測定し、結果を図１に示した。
【００３７】
−好気発酵乳酸菌の生菌数の測定−
５ｇの試料に、１００ｍＬの滅菌済み０．９％ＮａＣｌ溶液を加え、室温で３０分間撹拌し、乳酸菌を抽出した。抽出物を、滅菌済み０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて希釈し、ロゴサ寒天培地(関東化学株式会社)を氷酢酸を加えずに調整した（ｐＨ５）プレート半面に５０μＬをコンラージした。３５℃で４８時間培養した後に、菌数を測定した。本条件下では納豆菌は繁殖しないため、全てのコロニーを乳酸菌として計測した。
【００３８】
（実施例１−２）
粗挽きした納豆と、有胞子乳酸菌に加えて、１．５ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）及び０．３ｇのビタミンＣ（中国  江蘇江山製薬製）を添加した点以外は、実施例１−１と同様の発酵及び測定を行った。結果を図１に示した。
【００３９】
（比較例１−１）
２００ｍｌ広口コルベンに６時間浸漬した８０ｇの大豆を入れて、３０分蒸煮した。冷却後に、蒸煮した大豆と、８００ｍｇの有胞子乳酸菌  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ（三菱化学フーズ製）とを混合し、３５℃で好気発酵した。発酵後４８時間の乳酸菌の生菌数を実施例１−１と同様の方法で測定し、結果を図１に示した。
【００４０】
（比較例１−２）
蒸煮した大豆と、有胞子乳酸菌に加えて、２．４ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）及び０．８ｇのビタミンＣ（中国  江蘇江山製薬製）を添加した点以外は、比較例１−１と同様の発酵及び測定を行った。結果を図１に示した。
【００４１】
（実施例２−１）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。４０ｇの粗挽きした納豆と、１２０ｍｇの有胞子乳酸菌  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ（三菱化学フーズ製）とを混合し、０．４ｇのビタミンＣ（中国  江蘇江山製薬製）、２ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）、及び蒸留水１２ｍＬを加え、３５℃で好気発酵した。発酵前、発酵後２４時間、及び発酵後４８時間の乳酸菌の生菌数を、実施例１−１と同様の方法で測定し、結果を図２に示した（マーカーが●の折れ線）。発酵前、発酵後２４時間、及び発酵後４８時間の納豆菌の菌数を以下の方法で測定し、結果を図３に示した（マーカーが●の折れ線）。
【００４２】
−納豆菌の生菌数の測定−
５ｇの試料に、１００ｍＬの滅菌済み０．９％ＮａＣｌ溶液を加え、室温で３０分間撹拌し、納豆菌を抽出した。抽出物を、滅菌済み０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて希釈し、シカメディアＢＣＰ加プレートカウント寒天培地(関東化学株式会社)で調製したプレート半面に５０μＬをコンラージした。３５℃で４８時間培養した後に、菌数を測定し、結果を図１に示した。小さい点のようなコロニーを乳酸菌として除外し、大きく広がるコロニーを納豆菌として計測した。
【００４３】
（実施例２−２）
炭酸カルシウムを添加しない点以外は、実施例２−１と同様の発酵及び測定を行った。結果を図２及び図３に示した（マーカーが▲の折れ線）。
【００４４】
（実施例２−３）
炭酸カルシウム及びビタミンＣに代えて、０．４ｇのクエン酸（クエン酸一水和物、和光純薬工業株式会社製）を添加した以外は、実施例２−１と同様の発酵及び測定を行った。結果を図２及び図３に示した（マーカーが■の折れ線）。
【００４５】
（比較例２）
乳酸菌を加えない点以外は、実施例２−３と同様の発酵及び測定を行った。結果を図２及び図３に示した（マーカーなしの折れ線）。
【００４６】
＜納豆の酪酸菌発酵＞
（実施例３）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。５００ｇの粗挽きした納豆と、２．５ｇの酪酸菌  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（東亜薬品工業製）とを混合し、１０ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）、及び５０ｍＬの０．９％ＮａＣｌを加え、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学製）、及び角型ジャー（三菱ガス化学製）を用いて３５℃で嫌気発酵した。発酵前、発酵後２４時間、発酵後４８時間、発酵後７２時間、及び発酵後９６時間の酪酸菌の生菌数を、以下の方法で測定し、結果を図４に示した（マーカーが▲の折れ線）。発酵前、発酵後２４時間、及び発酵後４８時間の納豆菌の生菌数を実施例２−１と同様の方法で測定し、結果を図４に示した（マーカーが●の折れ線）。
【００４７】
−酪酸菌の生菌数の測定−
５ｇの試料に、１００ｍＬの滅菌済み０．９％ＮａＣｌ溶液を加え、室温で３０分間撹拌し、酪酸菌を抽出した。抽出物を、滅菌済み０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて希釈し、標準寒天培地(日水製薬株式会社)をチオグリコール酸ナトリウムおよびL-システイン塩酸塩一水和物を０．３％加えて調整したプレート半面に５０μＬをコンラージした。アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学製）、及び角型ジャー（三菱ガス化学製）を用いて４８時間３５℃で嫌気培養した後に、菌数を測定し、結果を図１に示した。なお、本条件下では、納豆菌は繁殖しないのですべてのコロニーを酪酸菌として計測した。
【００４８】
（実施例４）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。５８０ｇの粗挽きした納豆と、２．９ｇの酪酸菌  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（東亜薬品工業製）とを混合し、１０ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）、及び５０ｍＬの０．９％ＮａＣｌを加え、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学製）、及び角型ジャー（三菱ガス化学製）を用いて３５℃で４８時間嫌気発酵し、得られた発酵物を、凍結保存した後、真空凍結乾燥及び通風乾燥した。乾燥前、及び乾燥後の酪酸菌の生菌数を、実施例３と同様の方法で測定し、結果を図５に示した。発酵乾燥物のプロテアーゼ力価を、以下の方法で測定したところ、乾燥粉末あたり８，８２９ｕ／ｇであり、原料あたり３，３２７ｕ／ｇであった。
【００４９】
−プロテアーゼ力価の測定−
５ｇの試料に、２５ｍＬの０．５％ＮａＣｌ溶液を加え、室温で３時間撹拌し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。遠心後の上清０．５ｍＬに、１．０ｍＬのマッキンベン緩衝液（ｐＨ６）を加えて、３８℃で５分間予熱した。１．５ｍＬのカゼイン溶液を加えて、３８℃で６０分間保温した。３．０ｍＬの０．４Ｍトリクロロ酢酸を加えて、３０分後にろ過した。１．０ｍＬのろ液に、５．０ｍＬの０．４Ｍ炭酸ナトリウム溶液、１．０ｍＬのフェノール試薬（関東化学株式会社製）を加えて、３８℃で３０分間発色させた。６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、２５、５０、７５μｇ／ｍＬのチロシン標準液を用いて作成した検量線から、３８℃、６０分間に1μｇのチロシンを生成する活性を1単位としてプロテアーゼ力価を算出した。
【００５０】
−−マッキンベン緩衝液（ｐＨ６）−−
７１．６３ｇのリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）を蒸留水に溶解し、１，０００ｍＬに定容し、Ａ液を作成した。
２１ｇのクエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏ）蒸留水に溶解し、１，０００ｍＬに定容し、Ｂ液を作成した。
Ａ液とＢ液とをｐＨメーター（ｐＨｓｉｏｎ  Ｃ−７３アズワン株式会社製）を用いて、ｐＨ６．０になるように混合した。
【００５１】
−−カゼイン溶液−−
１００ｍＬビーカーに、２ｇのカゼイン、及び少量の蒸留水を加え、ガラス棒でよく混濁後、１３ｍＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウムを加え徐々に加熱し、沸騰溶解した。更に、沸騰加熱しながら２ｍＬの０．５Ｍ乳酸を一滴ずつ滴下し、十分に溶解させた。水で急冷させ、０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨ６．０に調整し、２０ｍＬのマッキンベン緩衝液（ｐＨ６）を加え、１００ｍＬに定容した。
【００５２】
＜納豆の麹菌発酵＞
（実施例５）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。２００ｇの粗挽きした納豆と、３００ｍｇの清酒用種麹（株式会社ビオック製）とを混合し、３５℃で好気発酵した。発酵後９６時間の発酵物の写真を図６に示した。図６に示したとおり、白色の麹菌が観察された。発酵物の顕微鏡写真を図７に示した。図７に示したとおり、糸状の麹菌が観察された。発酵後９６時間の納豆菌の生菌数を、実施例２−１と同様の方法で測定したところ、３．７×１０９個／ｇであった。発酵後９６時間のプロテアーゼ力価を、実施例４と同様の方法で測定したところ、乾燥粉末あたり１１，０００ｕ／ｇであった。
【００５３】
＜納豆の少なくとも２種類の乳酸菌による発酵＞
（実施例６−１）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。６００ｇの粗挽きした納豆と、６ｇの有胞子乳酸菌  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ（三菱化学フーズ製）とを混合し、６ｇのビタミンＣ（中国  江蘇江山製薬製）、３０ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）、及び１８０ｍＬの蒸留水を加え、３５℃で好気発酵した。発酵前、発酵後７２時間、及び発酵後１２０時間の乳酸菌の生菌数を、実施例１−１と同様に測定し、結果を図８に示した（マーカーが●の折れ線）。発酵前、発酵後７２時間、及び発酵後１２０時間の納豆菌の菌数を実施例２−１と測定し、結果を図９に示した（マーカーが●の折れ線）。発酵乾燥物のプロテアーゼ力価を、実施例４と同様の方法で測定したところ、乾燥粉末あたり９，２００ｕ／ｇであった。
【００５４】
（実施例６−２）
乳酸菌を、合計量が６ｇの、以下の乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ：有限会社ラヴィアンサンテ製）に代えた以外は、実施例６−１と同様の発酵及び測定を行った。結果を図８及び図９に示した（マーカーが▲の折れ線）。発酵乾燥物のプロテアーゼ力価を、実施例４と同様の方法で測定したところ、乾燥粉末あたり８，４００ｕ／ｇであった。
【００５５】
（実施例７−１）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。６２０ｇの粗挽きした納豆と、合計量が６．２ｇの乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ：有限会社ラヴィアンサンテ製）とを混合し、３０ｍＬの０．９％ＮａＣｌを加え、３５℃で好気発酵した。発酵後４８時間の乳酸菌の生菌数を、実施例１−１と同様に測定し、結果を図１０に示した（１）。発酵後４８時間の納豆菌の菌数を実施例２−１と同様の方法で測定し、結果を図１０に示した（２）。
【００５６】
（実施例７−２）
発酵工程において、５ｇのビタミンＣ（中国  江蘇江山製薬製）を加えた以外は、実施例７−１と同様の発酵及び測定を行った。結果を図１０に示した。
【００５７】
＜納豆の乳酸菌による嫌気発酵＞
（実施例８−１）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。６２０ｇの粗挽きした納豆と、合計量が６．２ｇの乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ：有限会社ラヴィアンサンテ製）とを混合し、６ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）、及び３０ｍＬの０．９％ＮａＣｌを加え、３５℃で嫌気パック（アネロパック・ケンキ、三菱ガス化学株式会社製）、及び嫌気ジャー（角型ジャー、三菱ガス化学株式会社製）を用いて嫌気発酵した。発酵前、発酵後２４時間、発酵後４８時間、発酵後７２時間、及び９６時間の乳酸菌の生菌数を以下の方法で測定し、結果を図１１に示した（マーカーが▲の点線）。発酵物のｐＨ値を以下の方法で測定し、結果を図１１に示した（マーカーが▲の折れ線）。
【００５８】
−嫌気発酵菌の生菌数の測定−
５ｇの試料に、１００ｍＬの滅菌済み０．９％ＮａＣｌ溶液を加え、室温で３０分間撹拌し、乳酸菌を抽出した。抽出物を、滅菌済み０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて希釈し、ロゴサ寒天培地(関東化学株式会社製)に、チオグリコール酸ナトリウム（関東化学株式会社製）及びＬ−システイン塩酸塩一水和物（関東化学株式会社製）を０．３％加え、氷酢酸を加えずに調整したプレート半面に５０μＬをコンラージした。３５℃で嫌気パック（アネロパック・ケンキ、三菱ガス化学株式会社製）、及び嫌気ジャー（角型ジャー、三菱ガス化学株式会社製）を用いて４８時間３５℃で嫌気発酵した後に、菌数を測定した。なお、本条件下では納豆菌は繁殖しないため、全てのコロニーを乳酸菌として計測した。
【００５９】
−ｐＨ値測定−
５ｇの試料に、２５ｍＬの０．５％ＮａＣｌ溶液を加え、ｐＨメーター（ｐＨｓｉｏｎ  Ｃ−７３アズワン株式会社製）を用いてｐＨ値を測定した。
【００６０】
（実施例８−２）
炭酸カルシウムを加えない以外は、実施例８−１と同様の発酵及び測定を行い、乳酸菌及び酪酸菌の生菌数を図１１に示した（マーカーが●の点線）。発酵物のｐＨ値の結果を図１０に示した（マーカーが●の折れ線）。
【００６１】
（実施例９）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。３００ｇの粗挽きした納豆と、合計量が４．３ｇの乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ：有限会社ラヴィアンサンテ製）とを混合し、６ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）、及び１５ｍＬの０．９％ＮａＣｌを加え、３５℃で嫌気パック（アネロパック・ケンキ、三菱ガス化学株式会社製）、及び嫌気ジャー（角型ジャー、三菱ガス化学株式会社製）を用いて嫌気発酵した。発酵前、発酵後２４時間、発酵後４８時間、発酵後７２時間、発酵後１４４時間の乳酸菌の生菌数を実施例８８−１と同様に測定し、結果を図１２に示した（マーカーが●の折れ線）。発酵物の納豆のプロテアーゼ力価を実施例４と同様の方法で測定し、結果を図１２に示した（マーカーが■の折れ線）。
【００６２】
（実施例１０：官能試験）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きした。５００ｇの粗挽きした納豆と、３ｇの有胞子乳酸菌  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎａｓ（三菱化学フーズ製）とを混合し、１０ｇのビタミンＣ（中国  江蘇江山製薬製）、５０ｇの炭酸カルシウム（関東化学株式会社製）、及び蒸留水３００ｍＬを加え、４８時間３５℃で好気発酵した。発酵物を凍結乾燥し、粉末を得た。粉砕粉末のｐＨは、６．０５であり、納豆菌数は、１１．３×１０９個／ｇであり、乳酸菌数は２．３×１０９個／ｇであり、プロテアーゼ力価は乾燥粉末あたり１１，４００ｕ／ｇであった。２８歳〜７２歳の男女６名により、粉末の味、香り、及び色について官能試験を行い、結果を表１に示した。
味、及び香りについては、下記の評価基準により評価した。評価基準の点数が高いほど、好ましい味、及び香りであることを示す。
【００６３】
−−評価基準−−
味
１：苦味
２：納豆の味
３：酸味、マイルドな味
【００６４】
−−評価基準−−
香り
１：納豆臭
２：納豆臭が少ない、発酵臭
３：納豆臭がしない
【００６５】
（比較例３：官能試験）
納豆（株式会社豆紀製）を挽肉機（ＨＥＬＴＨＹ  ＭＩＮＣＥＲ  貝印株式会社製）、及び径４ｍｍのディスクを用いて粗挽きし、凍結乾燥した。粉砕粉末のｐＨは、６．５７であり、納豆菌数は、８．３×１０９個／ｇであり、プロテアーゼ力価は１３，０００ｕ／ｇであった。２８歳〜７２歳の男女６名により、粉末の味、香り、及び色について官能試験を行い、結果を表１に示した。
味、及び香りについては、実施例１０と同様の評価基準により評価した。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
図１〜図３の結果から、納豆と乳酸菌とを混合して発酵することにより、大豆と乳酸菌とを混合して発酵した場合と比較して高濃度の乳酸菌の生菌を含有する食品が製造できることが分かった。更に、炭酸カルシウム及びビタミンＣを加えて発酵することにより、乳酸菌の生菌数が高くなることが分かった。
図４〜図５の結果から、納豆と酪酸菌とを混合して発酵することにより、納豆の生菌、及び高濃度の酪酸菌の生菌を含有する食品が製造できることが分かった。
図６〜７の結果から、納豆と麹菌とを混合して発酵することにより、納豆の生菌、及び高濃度の麹菌の生菌を含有する食品が製造できることが分かった。
図８〜図１０の結果から、納豆と、少なくとも２種類の乳酸菌とを混合して発酵することにより、納豆の生菌、及び高濃度の乳酸菌の生菌を含有する食品が製造できることが分かった。また、ビタミンＣを加えて発酵することにより、乳酸菌の比率が増加することが分かった。
図１１〜図１２の結果から、納豆と、乳酸菌とを混合して嫌気発酵することにより、高いプロテアーゼ活性を有し、納豆の生菌、及び高濃度の乳酸菌の生菌を含有する食品が製造できることが分かった。また、炭酸カルシウムを加えることで、乳酸菌の増殖が長期に維持されることが分かった。
表１の結果から、本発明の食品の製造方法により製造される食品は、好ましい味、及び香りを有することが分かった。
したがって、本発明の、食品の製造方法は、格別顕著な効果を奏するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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