(57)【要約】      （修正有）【課題】少数細胞の力学特性の測定から、それと同種の細胞の力学特性の細胞数分布を測定する方法と装置を提供する。【解決手段】マイクロパターン基板１１上に配列された細胞の一つにカンチレバー１２ａのプローブを近づけ、前記カンチレバー１２ａを加振信号に基づいて励振させて前記カンチレバー１２ａの変位を示す変位信号を生成し、カンチレバー１２ａを退避するＡＦＭ１２と、互いに異なる複数の周波数成分を重畳して前記加振信号を生成し、前記変位信号に基づいて、前記カンチレバーの前記各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、前記各周波数成分における前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するアナログ信号入出力デバイス１３と、前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記各周波数成分における細胞の複素弾性率を同時に計測するＰＣ１４と、からなる単一細胞の力学的診断装置計測システム。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原子間力顕微鏡法を用いて、少数の細胞の力学測定から、それと同種の細胞の力学特性の細胞数分布を計測する方法であり、マイクロパターン基板上に配列された細胞の一つにカンチレバープローブが近づくように前記カンチレバーを移動させるステップと、互いに異なる複数の周波数成分を重畳した加振信号を生成するステップと、前記カンチレバーを前記加振信号に基づいて励振させるステップと、前記カンチレバーの変位を検出し、前記変位を示す変位信号を生成するステップと、前記変位信号に基づいて、前記カンチレバーの前記各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、前記各周波数成分における前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するステップと、前記細胞から前記カンチレバープローブが退避するように前記カンチレバーを移動させるステップと、前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記全ての周波数成分における細胞の複素弾性率を同時に計測するステップと上記一連のステップを所定の回数繰り返し細胞の複素弾性率の時間変動分布を得るステップと、を含む原子間力顕微鏡による単一細胞の力学的診断方法と診断装置。
【請求項２】
前記細胞の複素弾性率の周波数特性を解析するステップをさらに含む、
請求項１に記載の原子間力顕微鏡による単一細胞の力学的診断方法と診断装置。
【請求項３】
前記原子間力顕微鏡は、パターン化した細胞の位置を観察できる光学顕微鏡と一体化したものである、
請求項１または２に記載の原子間力顕微鏡による単一細胞の力学的診断方法と診断装置。
【請求項４】
前記マイクロパターン基板は、ガラス基板、金属基板、または高分子系基板からなり、細胞の形状や運動を制御し、細胞を基板表面に配列するために用いる、
請求項１から３のいずれか１項に記載の原子間力顕微鏡による単一細胞の力学的診断方法と診断装置。
【請求項５】
マイクロパターン基板上に配列された細胞の一つにカンチレバープローブを近づけ、前記カンチレバーを加振信号に基づいて励振させて前記カンチレバーの変位を検出し、前記変位を示す変位信号を生成し、カンチレバープローブを退避する原子間力顕微鏡と、互いに異なる複数の周波数成分を重畳して前記加振信号を生成し、前記変位信号に基づいて、前記カンチレバーの前記各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、前記各周波数成分における前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するアナログ信号入出力デバイスと、前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記各周波数成分における細胞の複素弾性率を同時に計測するパーソナルコンピュータと、からなる原子間力顕微鏡による単一細胞の力学的診断方法と診断装置計測システム。
【請求項６】
前記パーソナルコンピュータは、さらに、前記細胞の複素弾性率の周波数特性を解析する、
請求項５に記載の原子間力顕微鏡による単一細胞の力学的診断方法と診断装置計測システム。
【請求項７】
前記原子間力顕微鏡は、細胞の位置を観察できる光学顕微鏡と一体化したものである、
請求項５または６に記載の原子間力顕微鏡による単一細胞の力学的診断方法と診断装置計測システム。
【請求項８】
前記マイクロパターン基板は、ガラス基板、金属基板、または高分子系基板からなり、細胞の形状や運動を制御し、細胞を基板表面に配列するために用いる、
請求項５から７のいずれか１項に記載の原子間力顕微鏡による単一細胞の力学的診断方法と診断装置計測システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原子間力顕微鏡を用いた単一細胞の力学特性の時間変動測定に基づく細胞診断方法と装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の力学特性は、細胞の機能と密接に関係しており、がん細胞等の疾患細胞診断の重要な指標になると考えられている（非特許文献１）。近年、様々な方法によって正常細胞と疾患細胞の力学特性の集団平均に有意差が存在することが明らかになっている。従って、細胞の力学特性から様々な細胞の診断を行うためには、細胞種固有の力学特性の集団分布を測定し、解析を行うことができるシステム・技術の発展が必要不可欠である。
【０００３】
細胞力学特性の集団分布を計測することができる有力な方法として、細胞全体の力学測定ができる光ストレッチ法（非特許文献２）と流体力学的延伸法（非特許文献３）、そして、細胞の局所領域の測定位置を制御して力学測定ができる方法として原子間力顕微鏡法（Atomic Force Microscopy:ＡＦＭ）（非特許文献４、５）が知られている。
【０００４】
光ストレッチ法は、フローサイトメーターと光ピンセット法を組み合わせたもので、浮遊させた細胞を光の圧力で変形させ、その変形量から細胞の力学特性を計測する方法である。ただし、光ストレッチ法は、基質に接着して生きている細胞を、基質からはがして計測するため、接着性の細胞では自然な状態の力学特性を計測することができない。
【０００５】
流体力学的延伸法は、浮遊させた細胞を水流圧で変形させ、その変形量を計測する方法である。光ストレッチ法と同様に、細胞を基質からはがして計測するため、接着性の細胞では自然な状態の力学特性を計測することができない。
【０００６】
ＡＦＭ法は、カンチレバー先端の探針（プローブ）を細胞に接触させ、プローブが受ける引力あるいは斥力により生じるカンチレバーのたわみ量を測定することで細胞の力学特性を計測する方法である。ＡＦＭは、多数の細胞を配列することができるマイクロパターン基板技術と併用することにより、接着細胞の力学特性を精密に計測することができる。
【０００７】
細胞は、形状を維持する弾性と変形流動する粘性の両方の性質を併せ持つ粘弾性体であるため、細胞の弾性率は、一定ではなく時間や周波数の関数となる。周波数に対する細胞の弾性率は、複素弾性率で表される。なお、複素弾性率の実部を貯蔵弾性率、虚部を損失弾性率と呼ぶ。細胞の複素弾性率を精密に計測するためには、複数の周波数について各細胞の複素弾性率を計測し、複素弾性率の周波数特性を解析することが必要となる。
【０００８】
これまで、多くの細胞種において正常細胞と疾患細胞の静的な弾性率（ヤング率）の集団平均には有意差が存在するが、それらの細胞数分布には大きな重なりが存在する（非特許文献１）。その結果、この細胞数分布の重なり領域の硬さをもつ細胞を識別できないという重大な問題がある。
【０００９】
ＡＦＭ法にマイクロ加工基板を併用した細胞粘弾性（レオロジー）解析法を用いることで、細胞固有のばらつきと測定ノイズとを分離することができる（非特許文献５）。しかしながら、本方法を用いても、レオロジー物性の細胞数分布から、それらの重なりを十分に除去することは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Lekka, M. Bionanoscience, 6(2016), 65.
【非特許文献２】Guck, J. et al. Biophysical Journal, 88(2005), 3689-3698.
【非特許文献３】Gossett, D.R. et al. PNAS., 109(2012), 7630-7635.
【非特許文献４】Hiratsuka, S. et al. Ultramicroscopy, 109(2009), 937-941.
【非特許文献５】Cai P.G. et al. Biophysical Journal, 105(2013), 1093-1102.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
AFMを用いた疾患細胞の力学診断法において、早期発見技術および高精度スクリーニング技術を確立するためには、少数の細胞の測定から、正常細胞と疾患細胞を識別する方法と装置の開発が強く求められる。
【００１２】
そこで、本発明では、少数の細胞の力学特性の測定から細胞集団の力学特性を評価することができる計測方法および計測装置を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の計測方法は、原子間力顕微鏡を用いた単一細胞の複素弾性率の時間変動の計測方法であり、マイクロパターン基板上に配列された単一細胞群の一つの細胞にカンチレバープローブが近づくように前記カンチレバーを移動させるステップと、細胞に接触した前記カンチレバーを任意の時間同じ位置で制御するステップと、互いに異なる複数の周波数成分を重畳した加振信号を生成するステップと、前記加振信号を用いて前記カンチレバーを励振させるステップと、前記カンチレバーの変位を検出し、前記変位を示す変位信号を生成するステップと、前記変位信号に基づいて、前記各周波数成分における前記カンチレバーの振幅を示す振幅信号、および前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するステップと、前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記全ての周波数成分における細胞の複素弾性率を算出するステップと、前記細胞から前記カンチレバープローブが退避するように前記カンチレバーを移動させるステップと、上記一連のステップを所定の回数繰り返し細胞の複素弾性率の時間変動分布を得るステップを含む。
【００１４】
本発明の計測システムは、マイクロパターン基板上に配列された細胞の一つにカンチレバープローブを近づけ、前記カンチレバーを加振信号に基づいて励振させて前記カンチレバーの変位を検出し、前記変位を示す変位信号を生成する原子間力顕微鏡と、互いに異なる複数の周波数成分を重畳して前記加振信号を生成し、前記変位信号に基づいて、前記カンチレバーの前記各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、前記各周波数成分における前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するアナログ信号入出力デバイスと、前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記各周波数成分における細胞の複素弾性率を同時に計測するパーソナルコンピュータと、を具備する構成を採る。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、少数細胞の力学特性の測定結果から、それと同種の細胞の力学特性の細胞数分布を得ることができる。
【００１６】
また、本発明によれば、外力印加時間に対する単一細胞の複素弾性率の時間変動分布を測定することで、細胞数分布を得るために必要な外力印加時間を決定できる。その結果、細胞の低侵襲測定が可能になるという利点がある。本測定は、任意の細胞種により測定できるため、異なる細胞種毎に適した印加時間を設定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施の形態に係る計測システムと計測手順の概念図
【図２】異なる外力印加時間によって得られる単一細胞の貯蔵弾性率（１５２Ｈｚ）の時間変動分布
【図３】細胞を異なる条件で測定することによって得られる平均貯蔵弾性率と標準偏差の周波数特性
【図４】異なる外力印加時間での細胞本来の標準偏差の周波数特性
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本実施の形態について、図面を用いて説明する。図１（ａ）は、本発明の一実施の形態に係る計測システムの構成図である。図１（ａ）に示すように、本実施の形態の計測システムは、マイクロパターン基板１１と、ＡＦＭ１２と、アナログ信号入出力デバイス１３と、ＰＣ（パーソナルコンピュータ）１４と、から主に構成される。
【００１９】
マイクロパターン基板１１は、ガラス基板、金属基板、または高分子系基板からなる。マイクロパターン基板１１の上面には、所定のパターン形状で配列された複数の細胞接着領域が形成される。パターン形状には、例えば、矩形、円形形状がある。各細胞接着領域には、細胞が播種され、培養される。細胞を各細胞接着領域に播種・培養することにより、細胞の形状や運動を制御し、細胞を所定の位置で配列させることができる。なお、マイクロパターン基板１１上に配列される各細胞接着領域の細胞の形状を可能な限り均一にすることが望ましい。細胞種は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、骨格筋細胞、およびそれらのがん化細胞など任意の接着性細胞種に適用することができる。また、浮遊細胞種においては、微小井戸のマイクロパターンを用いることができる。
【００２０】
ＡＦＭ１２は、カンチレバー１２ａを有する。カンチレバー１２ａは、ばね定数が低く、溶液の粘性の影響が小さい小型で、液中の共振周波数が高いものが適している。カンチレバー１２ａの一例として、生体用カンチレバー（Biolever mini、オリンパス社）がある。
【００２１】
ＡＦＭ１２は、マイクロパターン基板１１上に配列された細胞にカンチレバー１２ａのプローブを接触させる。また、ＡＦＭ１２は、マイクロパターン基板１１の上面に直交するｚ方向に、複数の周波数成分の振幅と周波数を任意に設定できるアナログ信号入出力デバイス１３から供給された加振信号に基づいて所定の振動周波数でカンチレバー１２ａを励振させる。なお、励振方法は、上記周波数重畳法が短時間測定に適しているが、公知の周波数掃引法でも測定は可能である。
【００２２】
カンチレバー１２ａのプローブを細胞に近づけることによって、細胞からプローブが受ける力により、カンチレバー１２ａは変形する。ＡＦＭ１２は、カンチレバー１２ａの変位量（たわみ量）を、公知の変位検出機構により検出する。ＡＦＭ１２は、検出した変位（カンチレバー１２ａの応答波形）を示す変位信号を生成し、アナログ信号入出力デバイス１３に出力する。
【００２３】
なお、ＡＦＭ１２として、原子間力顕微鏡と光学顕微鏡が一体化した装置を用いてもよい。当該装置の一例として、Ｎｉｋｏｎ社の光学顕微鏡（ＴＥ−２０００）に装着されたＡｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＡＦＭ装置（ＭＦＰ−３Ｄ−Ｂｉｏ）がある。当該装置を用いることにより、ユーザが、光学顕微鏡を用いてマイクロパターン基板上の細胞の位置を観察し、ＡＦＭ計測を開始する細胞の位置決めをすることができる。
【００２４】
アナログ信号入出力デバイス１３は、カンチレバー１２ａをその機械的共振周波数近傍の振動周波数で所定の振幅で励振させるための加振信号をＡＦＭ１２に供給する。本発明において、加振信号は、多重周波数成分からなる信号（互いに異なる複数の周波数成分を多重した信号）である。多重周波数のセットは、各周波数のｎ倍波（ｎ＞１）が他の周波数と一致しないように設定される。
【００２５】
また、アナログ信号入出力デバイス１３は、ＡＦＭ１２から出力された変位信号に基づいて、カンチレバー１２ａの各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、各周波数成分における加振信号と変位信号との位相差を示す位相差信号を生成し、ＰＣ１４に出力する。
【００２６】
アナログ信号入出力デバイス１３の一例として、National Instruments社のデータ集録（ＤＡＱ）デバイス(USB-6259)がある。また、各周波数成分の振幅および位相差は、ロックインアンプを多重化したソフトウェアを用いることにより、オンラインでもオフラインでも計測することができる。
【００２７】
ＰＣ１４は、アナログ信号入出力デバイス１３から出力された振幅信号と位相差信号に基づいて、全ての周波数成分において細胞の複素弾性率（貯蔵弾性率と損失弾性率）を同時に計測する。さらに、ＰＣ１４は、細胞の複素弾性率の周波数特性を解析する。
【００２８】
図１（ｂ）は、図１（ａ）の計測システムを用いた単一細胞測定の模式図である。マイクロパターン基板１１上の単一細胞にカンチレバー１２aで所定の時間、外力を印加した上で複素弾性率を測定する。同じ細胞に対して、複素弾性率を同様の方法で数十回計測することで、単一細胞の複素弾性率の時間変動量のデータを得ることができる。また、外力の印加時間を変化させることで、単一細胞の複素弾性率の時間変動量の変化を測定する。
【００２９】
図２は、図１（ａ）の計測システムで計測された異なる外力の印加時間１秒、１０秒、３０秒での所定の周波数（１５２Ｈｚ）における単一細胞の貯蔵弾性率の時間変動分布を示す図である。図３のそれぞれにおいて、横軸は貯蔵弾性率Ｇ'（対数表示）（単位［Ｐａ］）、縦軸は測定数である（単位無し）。また、実線２１は、対数正規分布によるフィット線である。
【００３０】
図２に示すように、細胞の複素弾性率の周波数特性の時間変動分布は、対数正規分布に従う。また、外力の印加時間の増加に伴って時間変動分布の標準偏差が増大している。そして、印加時間３０秒での時間変動分布は、多数細胞測定による細胞集団分布（非特許文献５）と良い一致を示す。このことは、本発明が、少数細胞の測定結果から、その細胞種の細胞数分布を得るために要する適切な外力の印加時間を決定できることを示している。上記の測定は、任意の接着性細胞種に適用できるため、細胞数分布を得るために適した外力の印加時間を各細胞種ごとに決定できることを示唆している。
【００３１】
図３は、本発明によって測定された異なる測定条件によって得られる単一細胞の時間平均貯蔵弾性率Ｇ'と標準偏差slogG'の周波数特性を示す図である。図３において、横軸は周波数（対数表示）（単位［Ｈｚ］）、縦軸は貯蔵弾性率Ｇ'と標準偏差slogG'である（対数表示）（単位無し）。
【００３２】
生細胞の貯蔵弾性率は周波数のべき乗則に従って増大する。べき指数の値は、細胞内測定位置や細胞内構造の計測条件に依存して変化する。計測条件が異なる計測データのべき乗曲線は任意の点（ｆ，ｇ）で交差する。また、標準偏差は周波数のべき乗則に従って減少して、その大きさは計測条件に依存して変化する。計測条件が異なる計測データの標準偏差においても交点（ｆ，ｓ）が存在し、この交点の周波数は貯蔵弾性率のものと同じ値となる。ここで、交点の周波数において、細胞力学特性は計測条件に依存せず一定の値を持つため、その標準偏差ｓは本来ゼロとなるが、測定における実験誤差が存在するため、正の値を持つ。
【００３３】
図４は、異なる計測条件結果から解析した実験誤差を除いた細胞本来の標準偏差〜slogG'の周波数特性を示す図である。図４において、横軸は周波数（対数表示）（単位［Ｈｚ］）、縦軸は細胞本来の標準偏差〜slogG'である（対数表示）（単位無し）。
【００３４】
図４で示すように、細胞本来の標準偏差は、外力の印加時間の増加に伴って増大している。また、印加時間３０秒での標準偏差の周波数特性は、多数細胞測定による細胞集団の結果と良い一致を示す。
【００３５】
以上のように、本発明によれば、時間変動分布の標準偏差が、外力の印加時間に強く依存していること、またこの結果から、印加時間を長くするにしたがって、少数の細胞の測定結果から、多数の細胞を測定した時の集団分布を得ることができる。
【００３６】
また、細胞種毎に、細胞数分布を得るための最小の外力印加時間を決定できるため、低侵襲な細胞診断測定ができる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明により、少数細胞の力学測定結果から細胞集団の力学測定から得られる力学特性の細胞数分布を得ることができる。従って、本発明は、種類、または状態が異なる細胞を少数細胞から力学的に識別する細胞診断技術に利用できる、特に希少な細胞サンプルにおいて有用な方法である。
【符号の説明】
【００３８】
１１  マイクロパターン基板
１２  ＡＦＭ
１３  アナログ信号入出力デバイス
１４  ＰＣ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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