(57)【要約】      （修正有）【課題】菌増殖を目的とした前培養を行うことを必要としない酵素含有液体培養、及び、難消化性糖質を液体培地中に使用せずに酵素を生産できる酵素含有液体培養方法の提供。【解決手段】調整液体培地に第一の穀類麹を添加すること、第一の穀類麹を添加した調整液体培地を用いて第一の通気培養を行うこと、第一の通気培養を行った調整液体培地に第二の穀類麹を添加すること、及び第二の穀類麹を添加した調整液体培地を用いて第二の通気培養を行うこと、を含む酵素含有液体培養方法。好ましくは、第一の穀類麹が、玄米麹、大豆麹、米糠麹、粟麹又は稗麹から一つ以上選定され、第二の穀類麹が、大豆麹である、酵素含有液体培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ｉ）調整液体培地に第一の穀類麹を添加すること、
（ｉｉ）前記第一の穀類麹を添加した前記調整液体培地を用いて第一の通気培養を行うこと、
（ｉｉｉ）前記第一の通気培養を行った前記調整液体培地に第二の穀類麹を添加すること、及び
（ｉV）前記第二の穀類麹を添加した前記調整液体培地を用いて第二の通気培養を行うこと、
を含む酵素含有液体培養方法。
【請求項２】
前記第一の穀類麹が、玄米麹、大豆麹、米糠麹、粟麹、及び稗麹の少なくとも１つから選定され、且つ前記第二の穀類麹が大豆麹である、請求項１に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項３】
前記第一の穀類麹が、前記調整液体培地の容積の２％〜１５％の量で添加され、且つ前記第二の穀類麹が、前記調整液体培地の容積の１％〜１０％の量で添加される、請求項１又は２に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項４】
前記第一及び第二の穀類麹が、前記調整液体培地において炭素分となる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項５】
前記第一及び第二の穀類麹が、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、アルペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、及びアルペルギルス・ソーヤの少なくとも１つから選定される麹菌により生産される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項６】
前記第一の通気培養が、２４時間〜６０時間、２０℃〜４０℃の温度で行われ、且つ前記第二の通気培養が、１２時間〜３０時間、１０℃〜４０℃の温度で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項７】
前記酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及びプロテアーゼの少なくとも１つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項８】
以下のステップ：
（ｉ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法により生産された酵素を含む培養液を濾布濾過することにより濾布濾過液を得ること、
（ｉｉ）前記濾布濾過液を精密濾過することにより精密濾過液を得ること、
（ｉｉｉ）前記精密濾過液を限外濾過することにより濃縮液を得ること、
（ｉV）前記濃縮液にエチルアルコールを添加して撹拌すること、
（V）撹拌した前記エチルアルコールと前記濃縮液の混合液を冷却することにより沈殿物を得ること、
（Vｉ）冷却した前記混合液から前記沈殿物を単離すること、
（Vｉｉ）単離した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること、及び
（Vｉｉｉ）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること、
を含む酵素含有粉末の製造方法。
【請求項９】
以下のステップ：
（ｉ）請求項８に記載の精密濾過液に大豆由来粉末を添加して撹拌することにより大豆由来粉末添加液を得ること、
（ｉｉ）前記大豆由来粉末添加液を冷却することにより沈殿物を得ること、
（ｉｉｉ）前記沈殿物から上澄み液を除去すること、
（ｉV）前記上澄み液を除去した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること、及び
（V）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること、
を含む酵素含有粉末の製造方法。
【請求項１０】
前記大豆由来粉末が、おからパウダー、豆乳パウダー、及びきな粉の少なくとも１つから選定される、請求項９に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【請求項１１】
前記大豆由来粉末が、前記精密濾過液の容積の２％〜２０％の量で添加される、請求項９又は１０に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【請求項１２】
前記酵素含有粉末が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及びプロテアーゼの少なくとも１つを含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素含有液体培養方法及び酵素含有粉末の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
麹菌に各種酵素を分泌生産させるための培養方法には、蒸煮等の処理後の原料に麹菌を接種して培養する固体培養方法と、水に原料及びその他の栄養源を添加して液体培地を調整し、その後に前培養した麹菌を調整した液体培地に接種し培養する液体培養方法がある。固体培養方法は、多種類の酵素を大量に大規模生産できる培養方法として確立されているが、製造設備の大型化及び温度や湿度の安定的な運転管理の困難性という問題がある。これに対し液体培養方法は、培養制御や品質管理が容易であるとされている。
【０００３】
しかしながら従来の液体培養方法では、十分な量の酵素を分泌生産させるために予め麹菌の菌数を増やす目的で本培養に先立ち前培養を行うことが必要とされるので、培養が長時間に及ぶことが問題になっている。
【０００４】
さらに、従来の液体培養方法の問題点として、培地中のアミラーゼの生産性の低下が挙げられている。麹菌は、増殖するときにアミラーゼをはじめとする多くの酵素を生産する。特に清酒用麹菌は、アミラーゼ、特にα−アミラーゼを多く生産する。しかしながら培地中のデンプンは、麹菌により生産されたアミラーゼにより分解、糖化されてしまい、それに伴い培地中のアミラーゼも消費されてしまう。この問題を解決するために、デンプンを難消化性の物質、例えば難消化性のデンプン質、玄米、粟、稗、又はアマランサス等に置き換える方法が報告されている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、麹菌の難分解性糖質である難消化性デキストリン、ポリデキストロース、水溶性セルロース、及びプルラン等を含有する液体培地を用いた麹菌の培養方法が開示されている。
【０００６】
また特許文献２には、麹菌を該麹菌の難分解性糖質である難消化性デキストリン、ポリデキストロース、水溶性セルロース、及びプルラン等を含有する液体培地を用いて培養することにより、グルコアミラーゼ活性が高い麹菌培養物を提供することが開示されている。
【０００７】
このように液体培養培地に難分解性糖質として難消化性デキストリン等を使用することにより、酵素類の生産性を高めるような試みが行われてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２９５８７１号公報
【特許文献２】特許第４０８７６２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、菌増殖を目的とした前培養を行うことを必要としない酵素含有液体培養方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、難消化性糖質を液体培地中に使用しなくても酵素を生産させることができる酵素含有液体培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、調整液体培地に炭素分として難消化性糖質の代わりに穀類麹を添加することにより、上記の目的を達成し得ることを見出した。さらに本発明者等は、本発明の酵素含有液体培養方法により得られる酵素が、従来方法により得られる酵素よりも有意に高い酵素活性を有することを見出した。
【００１１】
本発明は、例えば、以下の通りである。
１．以下のステップ：
（ｉ）調整液体培地に第一の穀類麹を添加すること、
（ｉｉ）前記第一の穀類麹を添加した前記調整液体培地を用いて第一の通気培養を行うこと、
（ｉｉｉ）前記第一の通気培養を行った前記調整液体培地に第二の穀類麹を添加すること、及び
（ｉV）前記第二の穀類麹を添加した前記調整液体培地を用いて第二の通気培養を行うこと、
を含む酵素含有液体培養方法。
【００１２】
２．前記第一の穀類麹が、玄米麹、大豆麹、米糠麹、粟麹、及び稗麹の少なくとも１つから選定され、且つ前記第二の穀類麹が大豆麹である、１に記載の酵素含有液体培養方法。
【００１３】
３．前記第一の穀類麹が、前記調整液体培地の容積の２％〜１５％の量で添加され、且つ前記第二の穀類麹が、前記調整液体培地の容積の１％〜１０％の量で添加される、１又は２に記載の酵素含有液体培養方法。
【００１４】
４．前記第一及び第二の穀類麹が、前記調整液体培地において炭素分となる、１〜３のいずれかに記載の酵素含有液体培養方法。
【００１５】
５．前記第一及び第二の穀類麹が、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、アルペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、及びアスペルギルス・ソーヤの少なくとも１つから選定される麹菌により生産される、１〜４のいずれかに記載の酵素含有液体培養方法。
【００１６】
６．前記第一の通気培養が、２４時間〜６０時間、２０℃〜４０℃の温度で行われ、且つ前記第二の通気培養が、１２時間〜３０時間、１０℃〜４０℃の温度で行われる、１〜５のいずれかに記載の酵素含有液体培養方法。
７．前記酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、及びプロテアーゼの少なくとも１つである、１〜６のいずれかに記載の酵素含有液体培養方法。
【００１７】
８．以下のステップ：
（ｉ）１〜７のいずれかに記載の酵素含有液体培養方法により生産された酵素を含む培養液を濾布濾過することにより濾布濾過液を得ること、
（ｉｉ）前記濾布濾過液を精密濾過することにより精密濾過液を得ること、
（ｉｉｉ）前記精密濾過液を限外濾過することにより濃縮液を得ること、
（ｉV）前記濃縮液にエチルアルコールを添加して撹拌すること、
（V）撹拌した前記エチルアルコールと前記濃縮液の混合液を冷却することにより沈殿物を得ること、
（Vｉ）冷却した前記混合液から前記沈殿物を単離すること、
（Vｉｉ）単離した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること、及び
（Vｉｉｉ）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること、
を含む酵素含有粉末の製造方法。
【００１８】
９．以下のステップ：
（ｉ）８に記載の精密濾過液に大豆由来粉末を添加して撹拌することにより大豆由来粉末添加液を得ること、
（ｉｉ）前記大豆由来粉末添加液を冷却することにより沈殿物を得ること、
（ｉｉｉ）前記沈殿物から上澄み液を除去すること、
（ｉV）前記上澄み液を除去した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること、及び
（V）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること、
を含む酵素含有粉末の製造方法。
【００１９】
１０．前記大豆由来粉末が、おからパウダー、豆乳パウダー、及びきな粉の少なくとも１つから選定される、９に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【００２０】
１１．前記大豆由来粉末が、前記精密濾過液の容積の２％〜２０％の量で添加される、９又は１０に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【００２１】
１２．前記酵素含有粉末が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、及びプロテアーゼの少なくとも１つを含む、８〜１１のいずれかに記載の酵素含有粉末の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によると、前培養を行うことを必要としない酵素含有液体培養方法を可能にする。さらに本発明によると、難消化性糖質を液体培地中に使用せずに酵素を生産させる酵素含有液体培養方法を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の適用例である一実施形態について説明する。
（穀類麹）
本実施形態にかかる穀類麹は、以下の（ｉ）〜（V）のステップにより得られる。
（ｉ）穀類を数個に分割（例えば２分割〜４分割）すること、又は破砕すること。
（ｉｉ）前記穀類を常温水に約１２時間〜約４８時間（冬季であれば約４８時間）浸漬し、その後約１時間水切りをすること。
（ｉｉｉ）水切りをした前記穀類を後蒸しすることにより柔らかくし、その後に約２０℃〜約４０℃まで放冷すること。
（ｉV）放冷した前記穀類に麹菌アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、アルペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、及びアルペルギルス・ソーヤの少なくとも１つから選定される麹菌を散布すること。
（V）前記麹菌を散布した前記穀類を、約４８時間〜約７２時間、温度が４０℃以下に管理された麹室内に静置し、その後に出麹すること。
尚、本実施形態にかかる穀類麹は、（ｉ）〜（V）のステップ以外の方法で製造されたものであっても良く、又は商業的に入手可能なものでも良い。
【００２４】
本実施形態にかかる穀類麹は、既に穀類中で麹菌を増殖させた状態にあるので、後述の酵素含有液体培養方法では、調整液体培地に本実施形態にかかる穀類麹を添加することにより、前培養を行わずに酵素を生産させることが可能になる。
【００２５】
本実施形態にかかる穀類麹は、食品発酵等に有効な麹菌を穀類に増殖させたものであり、これらに限定されないが、玄米麹、大豆麹、米糠麹、粟麹、及び稗麹等が挙げられる。
【００２６】
本実施形態にかかる麹菌は、菌糸の先端からデンプンやタンパク質等を分解する様々な酵素を生産・放出する。生産・放出された酵素は、培地中の炭素分を分解してグルコースやアミノ酸を生産する。麹菌は、ここで生産されたグルコースやアミノ酸を栄養源として増殖する。本実施態様にかかる麹菌は、アスペルギルス属に分類される不完全菌の一群であり、これらに限定されないが、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、アルペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、及びアルペルギルス・ソーヤ等が挙げられる。特に好ましい麹菌は、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、又はアスペルギルス・ニガーである。
【００２７】
（酵素含有液体培養方法）
本実施形態は、以下のステップを含む酵素含有液体培養方法である。
（ｉ）調整液体培地に第一の穀類麹を添加すること。
（ｉｉ）前記第一の穀類麹を添加した前記調整液体培地を用いて第一の通気培養を行うこと。
（ｉｉｉ）前記第一の通気培養を行った前記調整液体培地に第二の穀類麹を添加すること。
（ｉV）前記第二の穀類麹を添加した前記調整液体培地を用いて第二の通気培養を行うこと。
【００２８】
本実施形態にかかる調整液体培地は、例えば、ポリペプトン（登録商標）、酵母エキスパウダー、シクロース、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄七水和物、及び水等の麹菌の繁殖に必要な成分を含んで成る濃縮培地組成に調整水等を加えることにより、培地中のｐＨが３〜６（好ましくはｐＨが４〜５）になるように調整した培地である。
【００２９】
ポリペプトン（登録商標）は、日本製薬株式会社から販売されている大豆生成物を原料とする培養基材であり、植物性タンパク質の分解物を供給するために培地に添加される。これに限らず、他の植物由来又は動物由来のペプトン等も使用され得る。
【００３０】
酵素エキスパウダーは、酵母の自己消化物で、アミノ酸等を供給するために培地に添加される。これに限らず、他の植物由来又は動物由来のエキス等も使用され得る。
【００３１】
シクロースは、糖質を供給するために培地に添加される。
【００３２】
硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸マグネシウム、及び硫酸鉄七水和物は、ミネラル等を供給するために培地に添加される。これらに限らず、他の無機塩等のミネラル源も使用され得る。
【００３３】
例えば、２０Ｌ用の調整液体培地は、表１に示す濃縮培地組成を、表２に示す調整液によりｐＨ４．４に調整したものである。各成分の量、割合は、培養を阻害しない範囲で、適宜変更することができる。
【００３４】
【表１】
2018134029.tif 000002
【００３５】
【表２】
2018134029.tif 000003
【００３６】
尚、本実施形態にかかる調整液体培地は、上記以外の組成でも良く、例えば一般的に麹菌の培養に用いられるＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）培地等も使用され得る。
【００３７】
本実施形態にかかる調整液体培地は、あらかじめ８０℃〜９５℃で、１０分間〜４０分間、好ましくは１５分間〜３５分間、より好ましくは２０分間〜３０分間加熱滅菌され、その後２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４５℃、より好ましくは３０℃〜４０℃に冷却されたものであり得る。
【００３８】
本実施形態にかかる第一の穀類麹は、調整液体培地の容積の２％〜１５％、好ましくは３％〜１２％、より好ましくは５％〜１０％の量で調整液体培地へ添加され得る。本実施形態にかかる第二の穀類麹は、調整液体培地の容積の１％〜１０％、好ましくは２％〜８％、より好ましくは３％〜５％の量で調整液体培地へ添加され得る。
【００３９】
本実施形態にかかる通気培養とは、撹拌を伴う培養であり、通気の目的は、空気を麹菌に与えることである。第一の通気培養を行う時間は、麹菌の繁殖状況に応じて２４時間〜６０時間、好ましくは２４時間〜５４時間、より好ましくは２４時間〜４８時間の間に設定され、そして第二の通気培養を行う時間は、麹菌の繁殖状況に応じて、１２時間〜３０時間、好ましくは１２時間〜２７時間、より好ましくは１２時間〜２４時間の間に設定され得る。第一の通気培養の温度は、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より好ましくは３０℃〜４０℃の間に設定され、第二の通気培養の温度は、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３５℃、より好ましくは２０℃〜３０℃の間に設定され得る。
【００４０】
本実施形態にかかる第一及び第二の穀類麹は、アスペルギルス属に分類される麹菌により作られたものであり得る。本実施形態にかかる麹菌は、これらに限定されないが、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、及びアスペルギルス・ソーヤの少なくとも１つから選定される麹菌であり得る。特に好ましい麹菌は、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、又はアスペルギルス・ニガーである。
【００４１】
本実施形態にかかる第一及び第二の穀類麹は、これらに限定されないが、それぞれ玄米麹、大豆麹、米糠麹、粟麹、及び稗麹等の少なくとも１つから選定され得る。好ましくは本実施形態にかかる第一の穀類麹は玄米麹、大豆麹、米糠麹、粟麹、及び稗麹等の少なくとも１つから選定され、且つ第二の穀類麹は大豆麹である。
【００４２】
本実施形態にかかる第一及び第二の穀類麹は、それ自体が調整液体培地において炭素分となるので難消化性糖質を炭素分として使用することなく酵素を生産させることができる。また本実施形態により得られる培養液には、アミラーゼやプロテアーゼをはじめとする多くの種類の酵素、特にα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ及びプロテアーゼが多く含まれる。
【００４３】
（酵素含有粉末の製造方法１）
本実施形態にかかる酵素含有粉末は、以下のステップにより得られる。
（ｉ）前記酵素含有液体培養方法により生産された酵素を含む培養液を濾布濾過することにより濾布濾過液を得ること。
（ｉｉ）前記濾布濾過液を精密濾過することにより精密濾過液を得ること。
（ｉｉｉ）前記精密濾過液を限外濾過することにより濃縮液を得ること。
（ｉV）前記濃縮液にエチルアルコールを添加して撹拌すること。
（V）撹拌した前記エチルアルコールと前記濃縮液の混合液を冷却することにより沈殿物を得ること。
（Vｉ）冷却した前記混合液から前記沈殿物を単離すること。
（Vｉｉ）単離した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること。
（Vｉｉｉ）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること。
【００４４】
本実施形態にかかる培養液は、前記の酵素液体培養方法により生産されたものであり、１００メッシュ〜４００メッシュ、好ましくは１５０メッシュ〜３５０メッシュ、より好ましくは２００メッシュ〜３００メッシュの濾布を用いて濾過されることにより濾布濾過液が得られる。濾布濾過液は、その後に内部温度が４℃〜１４℃、好ましくは６℃〜１２℃、より好ましくは８℃〜１０℃に設定された沈澱タンクに入れられる。
【００４５】
濾布濾過液を入れた沈澱タンクは、澱下げ剤等を使用せずに冷蔵庫内で１２時間〜６０時間、好ましくは１８時間〜５４時間、より好ましくは２４時間〜４８時間静置されることにより澱下げされる。冷蔵庫内で澱下げされた濾布濾過液は、精密濾過されることにより精密濾過液が得られる。さらに精密濾過液は、限外濾過されることにより濃縮液が得られる。限外濾過では、濃縮液が精密濾過液の容積の５分の１〜２５分の１、好ましくは８分の１〜２０分の１、より好ましくは１０分の１〜１５分の１の量になるまで濃縮され、また限外濾過では、液温は１５℃以下、好ましくは１２℃以下、より好ましくは１０℃以下に設定される。限外濾過で濃縮された濃縮液はエチルアルコールとともに殺菌タンクに入れられ穏やかに撹拌される。
【００４６】
ここでエチルアルコールは、殺菌タンク内のエチルアルコールの濃度が少なくとも７０％以上（例えば７５％）になるように殺菌タンクに入れられる。その後殺菌タンク内のエチルアルコールと濃縮液の混合液は、冷蔵庫内で１２時間〜６０時間、好ましくは１８〜５４時間、より好ましくは２４〜４８時間静置される。このとき殺菌タンク内では、エチルアルコールと濃縮液の混合液中の酵素、タンパク質、又はその他物質が結晶化して沈澱する。その後に沈殿物は、エチルアルコールと濃縮液の混合液から分離される。
【００４７】
分離された沈殿物は、２０００回転〜４５００回転、好ましくは２５００回転〜４０００回転、より好ましくは３０００回転〜３５００回転で、３分〜２０分、好ましくは５分〜１５分、より好ましくは７分〜１０分間遠心分離にかけられることにより酵素を含む層とエチルアルコールを含む上澄み層とに分離される。エチルアルコールを含む上澄み層が酵素を含む層から除去されることにより固形分が得られる。ここで得られた固形分は乾燥機内で常温乾燥され、さらに粉砕されることにより酵素含有粉末が得られる。
【００４８】
（酵素含有粉末の製造方法２）
本実施形態にかかる酵素含有粉末は、以下のステップにより得られる。
（ｉ）酵素含有粉末の製造方法１に記載の精密濾過液に大豆由来粉末を添加して撹拌することにより大豆由来粉末添加液を得ること。
（ｉｉ）前記大豆由来粉末添加液を冷却することにより沈殿物を得ること。
（ｉｉｉ）前記沈殿物から上澄み液を除去すること。
（ｉV）前記上澄み液を除去した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること。
（V）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること。
【００４９】
本実施形態にかかる大豆由来粉末とは、大豆、豆乳、又は豆腐を作るときの副産物として製造されるおから等を乾燥させて、さらに細かい粉状にしたものである。本実施態様にかかる大豆由来粉末は、これらに限定されないが、おからパウダー、豆乳パウダー、及びきな粉等であり得る。
【００５０】
本実施形態にかかる大豆由来粉末添加液は、大豆由来粉末が精密濾過液の容積の２％〜２０％、好ましくは３％〜１５％、より好ましくは５％〜１０％の量で精密濾過液へ添加されることにより得られる。得られた大豆由来粉末添加液は、冷蔵庫内で３時間〜４０時間、好ましくは６時間〜３０時間、さらに好ましくは１２時間〜２４時間静置されることにより沈殿物が得られる。精密濾過液中に含まれる酵素等は、この間に大豆由来粉末に吸着され得る。得られた沈殿物から上澄み液が除去されることによりウェットな状態にある沈殿物が得られる。上澄み液が除去された沈殿物は、２０００回転〜４５００回転、好ましくは２５００回転〜４０００回転、より好ましくは３０００回転〜３５００回転で、１分〜１０分、好ましくは２分〜８分、より好ましくは３分〜７分間遠心分離にかけられて脱水される。その後に半乾燥状態にある沈殿物は、乾燥機内で常温乾燥されて、さらに粉砕されることにより酵素含有粉末が得られる。
【００５１】
本実施形態の製造方法１及び２により得られる酵素含有粉末には、低分子から高分子までの麹菌生産物をはじめとして、多くの種類の酵素が含まれる。特にα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ及びプロテアーゼが多く含まれる。
【実施例１】
【００５２】
次に、実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定されない。
（玄米麹の製造方法）
５ｋｇの玄米を２分割〜４分割にした。この分割した玄米を常温水に４８時間浸漬した後に約１時間水を切り、次いで玄米が柔らかくなるまで後蒸しした。後蒸し終了後の玄米を約３０℃まで放冷し、次いでこの玄米に麹菌アスペルギルス・オリゼーを散布した。その後麹菌を散布した玄米を麹室に入れ、麹室内の温度が４０℃以上にならないように６〜８時間毎に監視した。４８時間後に５ｋｇの玄米麹を出麹した。
【００５３】
（大豆麹の製造方法）
２ｋｇの大豆を２分割〜４分割にした。この分割した大豆を常温水に２４時間浸漬した後に約１時間水を切り、次いで大豆を指でつぶせる程度にまで後蒸しした。後蒸し終了後の大豆を約２０℃まで放冷し、次いでこの大豆に麹菌アスペルギルス・オリゼーを散布した。その後麹菌を散布した大豆を麹蓋にのせた状態で大豆麹箱に入れた。大豆麹箱内の温度が約２５℃〜約２７℃に保たれるように監視した。７２時間後に２ｋｇの大豆麹を出麹した。
【００５４】
（酵素含有液体培養方法）
表３に示す濃縮培地組成を、表４に示す調整液によりｐＨ４．４になるように調整して調整液体培地とした。
【００５５】
【表３】
2018134029.tif 000004
【００５６】
【表４】
2018134029.tif 000005
【００５７】
２０００ｍＬの調整液体培地をあらかじめ９５℃で３０分間加熱滅菌し、その後に３５℃まで冷却した。この冷却した調整液体培地に第一の穀類麹として２００ｇの玄米麹を添加した。この玄米麹を添加した調整液体培地を撹拌しながら４８時間、３５℃〜３７℃で第一の通気培養を行った。玄米麹の麹菌の繁殖が十分であることを確認した後に、第一の通気培養を行った調製液体培地に、さらに第二の穀類麹として１００ｇの大豆麹を添加した。この大豆麹を添加した調整液体培地を撹拌しながらさらに２４時間、２０℃〜３０℃で第二の通気培養を行った。
【００５８】
（酵素含有粉末の製造方法１）
前記酵素含有液体培養方法において生産された酵素を含む１０Ｌの培養液を３００メッシュの濾布を用いて濾過することにより７Ｌの濾布濾過液を得た。この濾布濾過液を沈澱タンクに入れて、次いで冷蔵庫内で２４時間静置することにより澱下げした。その後にこの濾布濾過液を孔径１μｍのフィルタを用いて濾過し、さらに０．４５μｍカートリッジフィルタを用いてプレ濾過し、次いで０．４５μｍメンブレンカートリッジフィルタを用いて精密濾過することにより６Ｌの精密濾過液を得た。
【００５９】
精密濾過液の一部（１Ｌ）を後述の酵素含有粉末の製造方法２で用いるために分取した。分取後、残りの５Ｌの精密濾過液を限外濾過（分子量：６，０００〜１００，０００）することにより５００ｍＬの濃縮液を得た。限外濾過の際には、液温が１５℃を上回らないようにした。限外濾過後の濃縮液及び冷却した８８％エチルアルコールを殺菌タンクに入れて穏やかに撹拌した。このときに殺菌タンク内のエチルアルコール濃度が７０％以下にならないようにした。その後に殺菌タンク内のエチルアルコールと濃縮液の混合液を２４時間冷蔵庫内で静置した。
【００６０】
このとき殺菌タンク内では、エチルアルコールと濃縮液の混合液中の酵素類、タンパク質、又はその他物質が結晶化して沈澱した。この沈殿物をエチルアルコールと濃縮液の混合液から分離した。さらにこの沈殿物を、３５００回転で１０分間遠心分離にかけることにより酵素等を含む層とエチルアルコールを含む上澄み層とに分離した。そして酵素等を含む層から上澄み層を除去することにより固形分を得た。ここで得られた固形分を乾燥機内で常温乾燥させて、さらに粉砕することにより５ｇの酵素含有粉末を得た。
【００６１】
（酵素含有粉末の製造方法２）
前記酵素含有粉末の製造方法１において分取した１Ｌの精密濾過液に、１００ｇのおからパウダーを添加して撹拌することによりおからパウダー添加液を得た。得られたおからパウダー添加液を冷蔵庫内で１２時間静置することにより沈殿物を得た。その後に沈殿物の上澄み液を除去し、ウェットな状態にある沈殿物を、３５００回転で５分間遠心分離にかけることにより脱水した。その後に半乾燥状態にある遠心分離後の沈殿物を、乾燥機内で常温乾燥させて、さらに粉砕することにより９５ｇの酵素含有粉末を得た。
【００６２】
前記酵素含有粉末の製造方法１及び前記酵素含有粉末の製造方法２で得られた酵素含有粉末には、低分子から高分子までの麹菌生産物をはじめとして、多くの種類の酵素、特にα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ及びプロテアーゼが多く含まれていた。
【００６３】
（酵素活性の測定）
本実施例において得られた精密濾過液のグルコアミラーゼ活性、α-グルコシダーゼ活性、α-アミラーゼ活性、及び酸性・中性・アルカリ性プロテアーゼ活性を測定した。比較検証のため、玄米麹より得られた精密濾過液、大豆麹より得られた精密濾過液、及び公知の液体培養方法により得られた精密濾過液の各活性についてもそれぞれ測定した。
【００６４】
比較検証用の精密濾過液の調製
玄米麹：
０．５％食塩水及び玄米麹を約５：１の容積比で混合した。この食塩水と玄米麹の混合液を冷蔵庫内で定期的に撹拌した後に約４時間静置した。その後に、この食塩水と玄米麹の混合液を、３００メッシュの濾布及び孔径１μｍのフィルタを用いて濾過し、次いで０．４５μｍメンブレンフィルタを用いて精密濾過することにより、比較検証用の精密濾過液を得た。
【００６５】
大豆麹：
０．５％食塩水及び大豆麹を約５：１の容積比で混合した。この食塩水と大豆麹の混合液を冷蔵庫内で定期的に撹拌した後に約４時間静置した。その後に、この食塩水と大豆麹の混合液を、３００メッシュの濾布及び孔径１μｍのフィルタを用いて濾過し、次いで０．４５μｍメンブレンフィルタを用いて精密濾過することにより、比較検証用の精密濾過液を得た。
【００６６】
公知の液体培養方法：
麹菌アスベルギルス・オリゼーの前培養を行い、麹菌が十分に繁殖した後に前培養液を本培養液に混合した。混合した培養液を４８時間撹拌しながら通気培養を行った。通気培養終了後に培養液を、３００メッシュの濾布及び孔径１μｍのフィルタを用いて濾過し、次いで０．４５μｍメンブレンフィルタを用いて精密濾過することにより比較検証用の精密濾過液を得た。
【００６７】
測定結果
糖化力：
キッコーマン糖化力測定キットにより、糖化力（グルコアミラーゼ活性及びα-グルコシダーゼ活性）の測定を行った。公知の液体培養方法により得られた精密濾過液は、１６Ｕ／ｇ〜１９Ｕ／ｇ、玄米麹より得られた精密濾過液は、１５Ｕ／ｇ〜１７Ｕ／ｇ、そして本実施例により得られた精密濾過液は、２５Ｕ／ｇ〜２７Ｕ／ｇという結果であった。
【００６８】
α−アミラーゼ活性：
独立行政法人酒類総合研究所標準分析法により、α−アミラーゼ活性の測定を行った。公知の液体培養方法により得られた精密濾過液は、７０Ｕ／ｇ〜１２０Ｕ／ｇ、玄米麹より得られた精密濾過液は、６５Ｕ／ｇ〜１２０Ｕ／ｇ、そして本実施例により得られた精密濾過液は、１８０Ｕ／ｇ〜２００Ｕ／ｇという結果であった。
【００６９】
酸性・中性・アルカリ性プロテアーゼ活性：
独立行政法人酒類総合研究所標準分析法により、プロテアーゼの測定を行った。大豆麹より得られた精密濾過液は、酸性：１Ｕ／ｇ〜３Ｕ／ｇ、中性：８Ｕ／ｇ〜１０Ｕ／ｇ、アルカリ性：７Ｕ／ｇ〜９Ｕ／ｇであり、そして本実施例により得られた精密濾過液は、酸性：７Ｕ／ｇ〜１０Ｕ／ｇ、中性：８Ｕ／ｇ〜１２Ｕ／ｇ、アルカリ性：４Ｕ／ｇ〜８Ｕ／ｇという結果であった。
【００７０】
上記の結果より、本実施例により得られた精密濾過液は、比較検証で用いたいずれの精密濾過液よりも高い酵素活性を有し、特に有意に高いα−アミラーゼ活性を有することが認められた。
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月3日(2017.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ｉ）調整液体培地に玄米麹、米糠麹、粟麹、及び稗麹の少なくとも１つから選定される第一の穀類麹を添加すること、
（ｉｉ）前記第一の穀類麹を添加した前記調整液体培地を用いて第一の通気培養を行うこと、
（ｉｉｉ）前記第一の通気培養を行った前記調整液体培地に第二の穀類麹として大豆麹を添加すること、及び
（ｉV）前記第二の穀類麹を添加した前記調整液体培地を用いて第二の通気培養を行うこと、
を含む酵素含有液体培養方法。
【請求項２】
前記第一の穀類麹が、前記調整液体培地の容積の２％〜１５％の量で添加され、且つ前記第二の穀類麹が、前記調整液体培地の容積の１％〜１０％の量で添加される、請求項１に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項３】
前記第一及び第二の穀類麹が、前記調整液体培地において炭素分となる、請求項１又は２に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項４】
前記第一及び第二の穀類麹が、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、アルペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、及びアルペルギルス・ソーヤの少なくとも１つから選定される麹菌により生産される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項５】
前記第一の通気培養が、２４時間〜６０時間、２０℃〜４０℃の温度で行われ、且つ前記第二の通気培養が、１２時間〜３０時間、１０℃〜４０℃の温度で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項６】
前記酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及びプロテアーゼの少なくとも１つである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項７】
以下のステップ：
（ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法により生産された酵素を含む培養液を濾布濾過することにより濾布濾過液を得ること、
（ｉｉ）前記濾布濾過液を精密濾過することにより精密濾過液を得ること、
（ｉｉｉ）前記精密濾過液を限外濾過することにより濃縮液を得ること、
（ｉV）前記濃縮液にエチルアルコールを添加して撹拌すること、
（V）撹拌した前記エチルアルコールと前記濃縮液の混合液を冷却することにより沈殿物を得ること、
（Vｉ）冷却した前記混合液から前記沈殿物を単離すること、
（Vｉｉ）単離した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること、及び
（Vｉｉｉ）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること、
を含む酵素含有粉末の製造方法。
【請求項８】
以下のステップ：
（ｉ）請求項７に記載の精密濾過液に大豆由来粉末を添加して撹拌することにより大豆由来粉末添加液を得ること、
（ｉｉ）前記大豆由来粉末添加液を冷却することにより沈殿物を得ること、
（ｉｉｉ）前記沈殿物から上澄み液を除去すること、
（ｉV）前記上澄み液を除去した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること、及び
（V）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること、
を含む酵素含有粉末の製造方法。
【請求項９】
前記大豆由来粉末が、おからパウダー、豆乳パウダー、及びきな粉の少なくとも１つから選定される、請求項８に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項１０】
前記大豆由来粉末が、前記精密濾過液の容積の２％〜２０％の量で添加される、請求項８又は９に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【請求項１１】
前記酵素含有粉末が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及びプロテアーゼの少なくとも１つを含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月28日(2017.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を生産する酵素含有液体培養方法であり、
以下のステップ：
（ｉ）調整液体培地に、玄米麹、米糠麹、粟麹、及び稗麹の少なくとも１つから選定される第一の穀類麹を添加し、且つ、前記第一の穀類麹以外の難消化性糖質を添加しないこと、
（ｉｉ）前記第一の穀類麹を含有し、且つ、前記第一の穀類麹以外の難消化性糖質を含有しない前記調整液体培地を用いて第一の通気培養を２４時間〜６０時間、２０℃〜４０℃の温度で行うこと、
（ｉｉｉ）前記第一の通気培養を行った前記調整液体培地に第二の穀類麹として大豆麹を添加し、且つ、前記第一及び前記第二の穀類麹以外の難消化性糖質を添加しないこと、及び
（ｉV）前記第二の穀類麹を含有し、且つ、前記第一及び前記第二の穀類麹以外の難消化性糖質を含有しない前記調整液体培地を用いて第二の通気培養を１２時間〜３０時間、１０℃〜４０℃の温度で行うこと、
を含み、
前培養工程を含まない、
酵素含有液体培養方法。
【請求項２】
前記第一の穀類麹が、前記調整液体培地の容積の２％〜１５％の量で添加され、且つ前記第二の穀類麹が、前記調整液体培地の容積の１％〜１０％の量で添加される、請求項１に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項３】
前記第一及び第二の穀類麹が、前記調整液体培地において炭素分となる、請求項１又は２に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項４】
前記第一及び第二の穀類麹が、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・カワチ、アルペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、及びアルペルギルス・ソーヤの少なくとも１つから選定される麹菌により生産される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項５】
前記酵素が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及びプロテアーゼの少なくとも１つである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法。
【請求項６】
以下のステップ：
（i）請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素含有液体培養方法により生産された酵素を含む培養液を濾布濾過することにより濾布濾過液を得ること、
（ｉｉ）前記濾布濾過液を精密濾過することにより精密濾過液を得ること、
（ｉｉｉ）前記精密濾過液を限外濾過することにより濃縮液を得ること、
（ｉV）前記濃縮液にエチルアルコールを添加して撹拌すること、
（V）撹拌した前記エチルアルコールと前記濃縮液の混合液を冷却することにより沈殿物を得ること、
（Vｉ）冷却した前記混合液から前記沈殿物を単離すること、
（Vｉｉ）単離した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること、及び
（Vｉｉｉ）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること、
を含む酵素含有粉末の製造方法。
【請求項７】
以下のステップ：
（i）請求項６に記載の精密濾過液に大豆由来粉末を添加して撹拌することにより大豆由来粉末添加液を得ること、
（ｉｉ）前記大豆由来粉末添加液を冷却することにより沈殿物を得ること、
（ｉｉｉ）前記沈殿物から上澄み液を除去すること、
（ｉV）前記上澄み液を除去した前記沈殿物を遠心分離にかけることにより固形分を得ること、及び
（V）前記固形分を乾燥させることにより粉末を得ること、
を含む酵素含有粉末の製造方法。
【請求項８】
前記大豆由来粉末が、おからパウダー、豆乳パウダー、及びきな粉の少なくとも１つから選定される、請求項７に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【請求項９】
前記大豆由来粉末が、前記精密濾過液の容積の２％〜２０％の量で添加される、請求項７又は８に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【請求項１０】
前記酵素含有粉末が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及びプロテアーゼの少なくとも１つを含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の酵素含有粉末の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本実施形態にかかる穀類麹は、玄米麹、大豆麹、米糠麹、粟麹、及び稗麹等が挙げられる。