(57)【要約】      （修正有）【課題】試料の酸化還元反応を測定し、試料中の抗酸化剤の濃度及び容量を検出するための測定時間を大幅に短縮し、検出感度を上げる方法を提供する。【解決手段】本発明は、単層カーボンナノチューブ及び過酸化水素水の混合溶液の近赤外領域の波長における最初の発光・蛍光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、試料を混合溶液に加え、その後、２回目の発光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、前記１回目と前記２回目の発光強度、吸光度の値の違いを決定し、前記１回目と前記２回目の値の違いを試料の抗酸化濃度や抗酸化能力の指標にすることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単層カーボンナノチューブ及び過酸化水素水の混合溶液の近赤外領域の波長における最初の発光・蛍光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、
試料を混合溶液に加え、
その後、２回目の発光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、
前記１回目と前記２回目の発光強度、吸光度の値の違いを決定し、
前記１回目と前記２回目の値の違いを試料の抗酸化濃度や抗酸化能力の指標にすることを特徴とする酸化・還元反応のセンシング方法。
【請求項２】
（ａ）単層カーボンナノチューブ及び過酸化水素水の混合溶液の近赤外領域の波長における最初の発光・蛍光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、
（ｂ）既知の抗酸化物質の濃度として較正用試料を混合溶液に加え、
（ｃ）その後、２回目の発光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、
（ｄ）前記１回目と前記２回目の発光強度、吸光度の値の違いを決定し、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の測定を繰り返すことによって既知の抗酸化物質との違いを得、
（ｆ）前記１回目と前記２回目の測定の差と既知の抗酸化物質の濃度の関係を決定することを特徴とする酸化・還元反応のセンシング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、サンプル中の抗酸化剤の濃度及び容量を検出するための方法であって、より詳しくは、ＤＮＡ−ＳＷＮＴ（ＤＮＡで被覆した単層カーボンナノチューブ）とフォトルミネッセンス測定法を用いた酸化・還元反応の高感度・高速センシング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  果物や野菜から得られるビタミンＣのような酸化防止剤は５０以上の疾患の発症に関するフリーラジカルと戦うために重要な保護能力を提供する。食品や、血液を含めたその他の生体系中の酸化防止剤の濃度の決めることは、とても重要である（非特許文献１−７）。【０００３】  ビタミンＣを測定するための方法は、従来のヨウ素滴定分光光度法（非特許文献２）、スペクトルフォトメトリック法（非特許文献３）、クロマトグラフィー法（非特許文献４，５）、電気化学法（非特許文献６，７）など様々な測定方法がある。これらの方法は多くの場合、いくつかの段階を踏んだり、複数の化学薬剤などを用いたりして濃度を決定する。それらの測定は、時間がかかり、検出限界はμＭレベルもしくはそれ以上である（非特許文献４−７）。【０００４】  全体の抗酸化剤の容量を決定することには大きな関心がある（非特許文献８，９）。酸化防止剤の効力を測定するための代表的な方法には、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）アッセイが含まれる。ＯＲＡＣ分析アッセイは、その蛍光減衰ペルオキシラジカルなどのフリーラジカルなどとの反応による損傷の指標である蛍光プローブを使用している。抗酸化剤によってフリーラジカル損傷の阻害は、ＯＲＡＣアッセイにおける蛍光減衰に対する保護に反映されているように、フリーラジカルに対する抗酸化物質の抗酸化能力の尺度となっている。しかしながらこの方法にはいくつか弱点がある。１つ目は、必要とされるサンプルは比較的大きく、１グラム以上の個体と５０ｍｌ以上の液体ということである。さらに、蛍光プローブが発する可視光は生物種が放出することのできる領域であり、それゆえ干渉を引き起こす。プローブは光退色を受けるかもしれないし、フリーラジカルによるダメージを受けるため、再利用はできないとされている。プローブは親水性と疎水性の両方の抗酸化作用を持っていると動作しない可能性があるため、特別なプローブを設計しなければならない。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏアプリケーションに対して感度は低く、安定しない。したがって、酸化防止剤を検出するための方法を改善する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ２００６００４０３８１  Ａ１
【特許文献２】ＵＳ２００７００２６３８８  Ａ１
【特許文献３】ＵＳ２００９０１２３９５６  Ａ１
【特許文献４】ＵＳ２０１４８７９６６２５  Ｂ２
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌ．Ｐａｕｌｉｎｇ，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃｏｌｄ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ，１９７０．
【非特許文献２】Ｃ．Ｒ．Ｓｉｌｖａ，Ｊ．Ａ．Ｓｉｍｏｎｉ，Ｃ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．Ｏ．Ｖｏｌｐｅ，Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓ  ａ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  Ｉｏｄｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎｓ．Ａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．７６（１９９９）１４２１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｅｄ０７６ｐ１４２１．
【非特許文献３】Ａ．Ｐ．Ｓ．Ｐａｉｍ，Ｂ．Ｆ．Ｒｅｉｓ，Ａｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｒｕｉｔ  Ｊｕｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｏｆｔ  Ｄｒｉｎｋｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．１６（２０００）４８７−４９１．ｄｏｉ：１０．２１１６／ａｎａｌｓｃｉ．１６．４８７．
【非特許文献４】
2018096956.tif 000003
【非特許文献５】Ａ．Ｍ．Ｍａｉａ，Ａ．Ｒ．Ｂａｂｙ，Ｗ．Ｊ．Ｙａｓａｋａ，Ｅ．Ｓｕｅｎａｇａ，Ｔ．Ｍ．Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．Ｖ．Ｒ．Ｖｅｌａｓｃｏ，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＬＣ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｉｎ  ｓｅｍｉｓｏｌｉｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ／ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ａｎｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔａｂｉｓｕｌｆｉｔｅ，ａｓ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，Ｔａｌａｎｔａ．７１（２００７）６３９−６４３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔａｌａｎｔａ．２００６．０５．００６．
【非特許文献６】Ｒ．Ａ．Ｖｅｒｄｉｎｉ，Ｃ．Ｍ．Ｌａｇｉｅｒ，Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ  Ｉｏｄｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｅａｄ−Ｓｔｏｐ．Ｅｎｄ−Ｐｏｉｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｒｅｓｈ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ  ａｎｄ  Ｆｒｕｉｔ  Ｓａｍｐｌｅｓ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４８（２０００）２８１２−２８１７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｆ９９０９８７ｓ．
【非特許文献７】Ｔ．Ｒｏｈａｎｉ，Ｍ．Ａ．Ｔａｈｅｒ，Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｕ（ＩＩ）ｚｅｏｌｉｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ，Ｔａｌａｎｔａ．７８（２００９）７４３−７４７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔａｌａｎｔａ．２００８．１２．０４１．
【非特許文献８】Ｘ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｕ，Ｊ．Ｈｏｌｄｅｎ，Ｄ．Ｂ．Ｈａｙｔｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｅ．Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｇ．Ｂｅｅｃｈｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｐｒｉｏｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｏｔａｌ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｉｎ  ｆｏｏｄｓ：ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｕｄｙ，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｓ．Ａｎａｌ．１７（２００４）４０７−４２２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｆｃａ．２００４．０３．００１．
【非特許文献９】Ｄ．Ｈｕａｎｇ，Ｂ．Ｏｕ，Ｒ．Ｌ．Ｐｒｉｏｒ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｅｈｉｎｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５３（２００５）１８４１−１８５６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｆ０３０７２３ｃ．
【非特許文献１０】Ｐ．Ａｖｏｕｒｉｓ，Ｍ．Ｆｒｅｉｔａｇ，Ｖ．Ｐｅｒｅｂｅｉｎｏｓ，Ｃａｒｂｏｎ−ｎａｎｏｔｕｂｅ  ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｎａｔ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ．２（２００８）３４１−３５０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｈｏｔｏｎ．２００８．９４．
【非特許文献１１】Ｐ．Ｃｈｅｒｕｋｕｒｉ，Ｓ．Ｍ．Ｂａｃｈｉｌｏ，Ｓ．Ｈ．Ｌｉｔｏｖｓｋｙ，Ｒ．Ｂ．Ｗｅｉｓｍａｎ，Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（２００４）１５６３８−１５６３９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ０４６６３１１．
【非特許文献１２】Ｚ．Ｌｉｕ，Ｃ．Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｃａｉ，Ｌ．Ｈｅ，Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｄａｉ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ，ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｗａｌｌｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｐｒｏｂｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５（２００８）１４１０−１４１５．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７０７６５４１０５．
【非特許文献１３】Ｃ．Ｓｏｎｇ，Ｐ．Ｅ．Ｐｅｈｒｓｓｏｎ，Ｗ．Ｚｈａｏ，Ｒｅｃｏｖｅｒａｂｌｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨｉＰｃｏ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．１０９（２００５）２１６３４−２１６３９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｐ０５３０７７０．
【非特許文献１４】Ｘ．Ｔｕ，Ｐ．Ｅ．Ｐｅｈｒｓｓｏｎ，Ｗ．Ｚｈａｏ，Ｒｅｄｏｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ−Ｅｎｃａｓｅｄ  ＨｉＰｃｏ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ：Ａ  Ｎｅａｒ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｔａｌ  Ｓｅｎｓｉｔｉｔｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｕｄｙ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ．１１１（２００７）１７２２７−１７２３１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｐ０７５９６６ｃ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  従来技術によれば、試料の酸化還元反応を測定するためには、いくつかの段階を踏んだり、複数の化学薬剤などを用いたりして濃度を決定しているが、それらの測定は時間がかかり、検出限界はμＭレベルもしくはそれ以上であり、そのため、測定時間を大幅に短縮することと検出感度を上げる必要とがあった。【０００８】  本発明は、このような従来技術の課題に鑑みてなされたもので、サンプル中の抗酸化剤の濃度及び容量を検出するための方法であって、より詳しくは、ＤＮＡ−ＳＷＮＴ（ＤＮＡで被覆した単層カーボンナノチューブ）の光学測定であるフォトルミネッセンス測定法や光吸収スペクトル測定法を用いた酸化・還元反応の高感度・高速センシング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明は、単層カーボンナノチューブ及び過酸化水素水の混合溶液の近赤外領域の波長における最初の発光・蛍光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、試料を混合溶液に加え、その後、２回目の発光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、前記１回目と前記２回目の発光強度、吸光度の値の違いを決定し、前記１回目と前記２回目の値の違いを試料の抗酸化濃度や抗酸化能力の指標にすることを特徴とする酸化・還元反応のセンシング方法である。【００１０】  また本発明は、
（ａ）単層カーボンナノチューブ及び過酸化水素水の混合溶液の近赤外領域の波長における最初の発光・蛍光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、
（ｂ）既知の抗酸化物質の濃度として較正用試料を混合溶液に加え、
（ｃ）その後、２回目の発光強度、吸光度を少なくとも１回測定し、
（ｄ）前記１回目と前記２回目の発光強度、吸光度の値の違いを決定し、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の測定を繰り返すことによって既知の抗酸化物質との違いを得、
（ｆ）前記１回目と前記２回目の測定の差と既知の抗酸化物質の濃度の関係を決定することを特徴とする酸化・還元反応のセンシング方法である。
【発明の効果】
【００１１】  本発明によれば、サンプル中の抗酸化剤の濃度及び容量を検出するための方法であって、より詳しくは、ＤＮＡ−ＳＷＮＴ（ＤＮＡで被覆した単層カーボンナノチューブ）の光学測定であるフォトルミネッセンス測定法や光吸収スペクトル測定法を用いた酸化・還元反応の高感度・高速センシング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、試料の総抗酸化能を決定するための方法を示すフローチャート。
【図２】図２（ａ）−（ｅ）は、図１のフローチャートにおけるステップを示す概略図であり、図２（ａ）−（ｅ）は、図１のフローチャートの工程（ＳＴ−ａ）−（ＳＴ−ｅ）にそれぞれ対応している。図２（ｆ）は反応サイクルを示している。
【図３】図３は、ｐＨ６．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶またはエピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外発光スペクトルを示している。
【図４】図４は、ｐＨ７．３の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶またはエピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外発光スペクトルを示している。
【図５】図５は、ｐＨ８．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶またはエピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外発光スペクトルを示している。
【図６Ａ】図６Ａは、ｐＨ６．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶を加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｐＨ６．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）エピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。
【図７Ａ】図７Ａは、ｐＨ７．３の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶を加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｐＨ７．３の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）エピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。
【図８Ａ】図８Ａは、ｐＨ８．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶を加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｐＨ８．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）エピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。
【図９】図９は、１２７０ｎｍでのｐＨ６．０のＳＷＮＴ懸濁液に０．９８Ｍの過酸化水素水を加えたときの時間依存性のスペクトル差ΔＡを示している。
【図１０】図１０は、１２７０ｎｍでのｐＨ６．０のＳＷＮＴ−過酸化水素水ハイブリッド懸濁液に３ｍＭのカテキンを含むお茶を加えたときの発光強度の時間依存性のスペクトルの差ΔＢを示している。
【図１１】図１１は、１２７０ｎｍでのｐＨ７．３のＳＷＮＴ懸濁液に０．９８Ｍの過酸化水素水を加えたときの時間依存性のスペクトル差ΔＡを示している。
【図１２】図１２は、１２７０ｎｍでのｐＨ７．３のＳＷＮＴ−過酸化水素水ハイブリッド懸濁液に３ｍＭのカテキンを含むお茶を加えたときの発光強度の時間依存性のスペクトルの差ΔＢを示している。
【図１３】図１３は、１２７０ｎｍでのｐＨ８．０のＳＷＮＴ懸濁液に０．９８Ｍの過酸化水素水を加えたときの時間依存性のスペクトル差ΔＡを示している。
【図１４】図１４は、１２７０ｎｍでのｐＨ８．０のＳＷＮＴ−過酸化水素水ハイブリッド懸濁液に３ｍＭのカテキンを含むお茶を加えたときの発光強度の時間依存性のスペクトルの差ΔＢを示している。
【図１５】図１５は、ｐＨ７．３のＳＷＮＴ−過酸化水素水ハイブリッド懸濁液に３μＭのエピガロカテキンガレートを加えたときの近赤外吸収スペクトルを示している。このときエピガロカテキンガレートの最終濃度は、３０ｎＭである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】  以下、本発明の実施の形態を図に基づいて詳説する。
本発明は、下記の実施形態の説明によって更なる理解ができるが、それは説明として提供するだけであり、実験方法を制限するものではない。また、以下の実施例、また以下の実施例による結果を説明する図面は例示の目的のみのためである。図面は、決して本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００１４】  ＳＷＮＴと過酸化酸素水を使った抗酸化作用を検出する方法は、図１と図２に示されている。すべての実験は、室温で行った。抗酸化物質及び総抗酸化能を測定するためのきわめて繊細な方法が提供される。この方法は、過酸化水素とＳＷＮＴのハイブリッドに基づいている。これは、食品や血漿中の抗酸化物質と総抗酸化能測定のために、サンプルの量が少なく、速く、そして強固な光検出方法である。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏやｉｎ  ｖｉｖｏ検出の小型分析として開発することができる。
【００１５】  果物や野菜から得られるビタミンＣやカテキンのような酸化防止剤は５０以上の疾患の発症に関するフリーラジカルと戦うために重要な保護能力を提供する。食品や、血液を含めたその他の生体系中の酸化防止剤の濃度の決めることは、とても重要である。単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）は、環境の変化に非常に敏感であるため、ナノスケールの一次元構造の電子及び光検出用途のための強力な材料である。高感度の抗酸化物質の検出のために使用することができる単層カーボンナノチューブに基づく光学センサは、以下に説明する。
【００１６】  単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）は、環境の変化（非特許文献１０−１４）に対して極めて敏感であるため、独自のナノスケールの一次元構造の電子及び光検出用途のための強力な材料として出現した。アプリケーションを検知するにあたり、単層カーボンナノチューブは、いくつかの利点を提供する。
【００１７】  （１）近赤外（ＮＩＲ）の機能は、現在の光通信で使用される半導体レーザの波長によって覆うことができ、重要なスペクトルウィンドウ（８００〜１５００ｎｍ）である。
（２）８００〜１３００ｎｍでの生物学的に透明な近赤外領域にそのスペクトルの低下があり、１３００〜１５００の吸収・発光を持つＳＷＮＴを用いてのｉｎ  ｖｉｖｏでの生体光検出用途に魅力的である。
（３）イメージングのための生化学の標識マーカーの蛍光として高コントラストを持っている。
（４）非常に光安定であり、光退色しない。
（５）ＳＷＮＴは、動物の臓器からきれいに排泄され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的用途に適している。動物のために安全であることができる（非特許文献１２）。
（６）ＳＷＮＴのナノサイズの一次元構造は、電界効果トランジスタセンサのような他のナノセンサーを有する小型の機器に統合することを可能にする。
（７）単独の同じ材料の単層カーボンナノチューブは、高感度のフリーラジカルの検知に使用することができる（非特許文献１３）。
（８）フォトルミネッセンスでは、吸光測定で必要なバックグラウンド測定を必要としない。
【００１８】  ＳＷＮＴの光検出方法を用いると、８μＭ（非特許文献１４）と低い過酸化水素水を検出することができる。したがって、単層カーボンナノチューブとそのハイブリッドは、光バイオセンシングのための多機能性を提供することがある。
【００１９】  抗酸化作用と総抗酸化能の測定に対して、過酸化水素水−単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）をベースにすれば、高感度の光検出方法が提供される。このシステムでは、単層カーボンナノチューブ及び過酸化水素は、非常に低いバックグラウンド干渉を提供し、ＳＷＮＴ近赤外スペクトル強度の抑制に伴う電荷移動錯体を形成する。酸化防止剤としてカテキンを添加したときに、複合体が反応し、抑制されたスペクトル強度の瞬間回復が見られる。３０ｎＭでも数秒で回復が見られる。スペクトル強度の減衰率と減衰曲線の面積は、各試料中の総抗酸化物質濃度に敏感であるため、食品や血液などの生体系における抗酸化物質濃度の抗酸化能力を比較するための強力な手段を提供する。
【００２０】  ＳＷＮＴは、構造的に堅牢であり、反応はハイブリッドの再利用を可能にできるという可逆的である。ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッドシステムにおいては、単層カーボンナノチューブと過酸化水素ＳＷＮＴ特性ＮＩＲ吸収または蛍光スペクトル強度の抑制に伴う電荷移動錯体を形成する。カテキンなどの抗酸化剤を添加する場合、複合体は直ちに抑制スペクトル強度の回復と、それに反応する。回収されたスペクトル強度の量は、抗酸化剤の濃度に依存する。カテキンは３０ｎＭと微小であっても測定可能であるため、敏感であるとされてきたＨＰＬＣ法（非特許文献５）及び電気化学的方法（非特許文献７）の０．２７６μＭ、０．２８４μＭ（ビタミンＣ５０μｇ／Ｌ）よりも、より敏感である。したがって、このような様々なフルーツジュース、または唾液や血中の抗酸化物質濃度などの食品の抗酸化能力を比較するための強力な手段を提供する。ここで、唾液中のドーパミン検出をＳＷＮＴＦＥＴ特性で測定している例もあり、ここでは、１００ｎＭのドーパミンを検出している。
【００２１】  近赤外発光は、近赤外分光法で使用するための既知の機器を用いて測定することができる。この機器は、ソース、検出器、及びプリズムまたは異なる波長における強度を記録することができるように、回折格子などの分散素子を含む。近赤外線を発する任意の光源を使用することができる。分析アプリケーションのための近赤外放射の広帯域源の非限定的な例には、白熱電球と石英ハロゲン電球を含む。他の近赤外放射源を公知することができるように、発光ダイオード（ＬＥＤ）及びレーザダイオードを用いることもできる。適切な検出器としては、ＩｎＧａＡｓと高価ではあるが、それだけではない。
【００２２】  本明細書に記載の分析方法は、多くの利点を有する。ＳＷＮＴは、安定しており、試験サンプルと相互作用しない。これらは親水性及び疎水性酸化防止剤と一緒に使用することができる。これらは、例えば、食品や血液などの試料を広範囲に使用することができる。それらは、ｉｎ  ｖｉｖｏ検出のために使用することができる。ＳＷＮＴは、高感度でかつ少量で測定を可能にする。光学的及び電気的な変数を含む多目的な測定変数を提供するために使用することができる。光学的変数は、近赤外吸収、近赤外発光、近赤外共鳴ラマン散乱を含む。電気変数は、電界効果トランジスタ等の電子デバイスに基づいて電流、電圧及び導電率を含む。
【００２３】  ＜ＳＷＮＴの独特なＮＩＲ特性＞
近赤外吸収発光領域の８００〜１５００ｎｍは、現在の光通信で使用される半導体レーザの波長を使用することができ、重要なスペクトルウィンドウである。８００〜１３００ｎｍに生物学的にはスペクトルの低下があるが、１３００〜１５００ｎｍの発光を持つＳＷＮＴは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生体光検出に魅力的である。標識マーカーとしての発光として高コントラストを持っている。非常に光安定で光退色しない。さらに、ＳＷＮＴは、動物の臓器からきれいに排泄され、生物学的用途にも適している。動物のために安全であることができる。ＳＷＮＴのナノサイズの一次元構造は、電界効果トランジスタセンサのような他のナノセンサーを有する小型の機器に統合することを可能にする。単独の同じ材料の単層カーボンナノチューブは、高感度のとのフリーラジカルの検知のために使用することができる。フォトルミネッセンスでは、吸光測定で必要なバックグラウンド測定を必要としない。ＳＷＮＴとそのハイブリッドは、光バイオセンシングのための多機能性を提供することがある。
【００２４】  ここでは、お茶とカテキンの二つのサンプルで説明していく。ヘルシア（登録商標）緑茶には、カテキンの重量が書いてあるので、それと同量のエピガロカテキンガレートの薬品で比較していく。市販のお茶には、ビタミンＣが添加されており、同量のカテキンよりも抗酸化物質が多く含まれている可能性がある。しかし、カテキンには、主に４種類あり、それぞれの抗酸化力が違うため、今回一番酸化力の強いエピガロカテキンガレートを用いたため、お茶よりも抗酸化力が強いという結果が得られた。さらに、抗酸化力を３秒ごとに検出し時間発展を測定できるため、指標となる物質との差も調べることができる。
【実施例１】
【００２５】  ＜ＳＷＮＴ懸濁液の作製＞
代表的な実験方法として、０．５ｍｇのＳＷＮＴを１ｍｇの二本鎖ＤＮＡ（鮭の精巣由来）を測り、ｐＨ６．０，７．３，８．０のｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎ（Ｔｒｉｓ）緩衝液１ｍｌに混ぜた。その混合液を氷浴しながら、２時間超音波（ＶＣＸ−１３０，５Ｗ）して溶液中にＳＷＮＴ分散した。その混合液は、１６，０００ｇで３時間、遠心処理した。その上澄み液１００μｌを約１０倍の９８０μｌにＴｒｉｓＨＣＬ緩衝液で希釈（ＳＷＮＴ濃度は４．９μｇ／ｍｌ）して発光強度測定した。通常販売されている吸光度測定装置や、フォトルミネッセンス装置にあわせて、溶液を１ｍｌ用意したので、本来であればもっと極少量で測定することが可能である。（同程度のＳＷＮＴ濃度のものであれば、今回使用したフォトルミネッセンス装置では、３μｌの量のみで測定可能である。）フォトルミネッセンスは、ＳＷＮＴのカイラリティごとに発光を示すため、それぞれのカイラリティにおけるＳＷＮＴの酸化還元をみることができる。ＳＷＮＴは、環境に対してとても敏感に反応する。この溶液を１ｍｍ角の石英セルに１ｍｌいれてフォトルミネッセンスを測定していった。フォトルミネッセンスとしては、励起光としてチタンサファイアレーザーを用い、ＩｎＧａＡＳ検出器で発光を検出した。
【実施例２】
【００２６】  ＜ＳＷＮＴ−過酸化水素水ハイブリッドの準備＞
過酸化水素水１０μｌをＤＮＡ−ＳＷＮＴ溶液に加えた。この量で十分にＳＷＮＴは酸化される。図３に酸化されて発光が抑えられているスペクトルを示している。混合したときから酸化が始まり、３０分以内には、酸化ＳＷＮＴとして安定する。最小単位は、ＳＷＮＴは１６０ｎｇあれば測定可能である。最近では、安価に近赤外を検出できる装置が販売されているため、それにあわせて溶液の量を調節すれば、測定することが可能である。
【実施例３】
【００２７】  ＜カテキンを使ったサンプルの抗酸化測定方法＞
カテキンは１００℃でも壊れないため市販のお茶にも含まれており、カテキンの量が掲載されているヘルシア緑茶ＴＭ（花王、カテキン含有量１．５ｍｇ／ｍｌ）を用いた。さらに、含有されているビタミンＣの効果ではないことを立証するために、同量のエピガロカテキンガレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。ヘルシア緑茶原液を１０μｌをＳＷＮＴ−過酸化水素水溶液９９０μｌに混合し、フォトルミネッセンスを測定していった。この方法では、吸光測定で必要なバックグラウンド測定を必要としない。
【実施例４】
【００２８】  ＜サンプルの時間依存性＞
酸化剤・抗酸化剤を混ぜた直後から反応がはじまった。フォトルミネッセンス測定は、一定の励起光を当てながら、発光を数秒で検出できるため、酸化・抗酸化の時間依存性がわかる。既知の酸化・抗酸化剤を用いて測定することにより、特定したい抗酸化能がわかる。
【実施例５】
【００２９】  ＜３０ｎＭのカテキンによる抗酸化測定方法＞
実地例１で作製したＤＮＡ−ＳＷＮＴ溶液５０μｌを約２０倍の９８０μｌにＴｒｉｓＨＣＬ緩衝液で希釈（ＳＷＮＴ濃度は２．５μｇ／ｍｌ）して吸光度測定した。過酸化水素水１０μｌをＤＮＡ−ＳＷＮＴ溶液に加えた。図１５に酸化されて吸収が抑えられているスペクトルを示している。３μＭのエピガロカテキンガレート１０μｌを混合し、吸光度測定を行った。このとき、エピガロカテキンガレートの最終濃度は３０ｎＭである。【００３０】  図１のフローチャートには、試料の総抗酸化能を決定するための方法を示している。そして図２（ａ）−２（ｅ）は、図１のフローチャートにおけるステップの概略を示している。図２（ａ）−（ｅ）は、図１のフローチャートの工程（ＳＴ−ａ）−（ＳＴ−ｅ）にそれぞれ対応している。図２（ｆ）は反応サイクルを示している。【００３１】  図３は、ｐＨ６．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶またはエピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外発光スペクトルを示している。ΔＡ、ΔＢ、ΔＣは過酸化水素水、お茶もしくはエピガロカテキンガレートを加えたことによる発光強度の変化である。
図４は、ｐＨ７．３の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶またはエピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外発光スペクトルを示している。ΔＡ、ΔＢ、ΔＣは過酸化水素水、お茶もしくはエピカロカテキンガレートを加えたことによる発光強度の変化である。
図５は、ｐＨ８．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶またはエピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外発光スペクトルを示している。ΔＡ、ΔＢ、ΔＣは過酸化水素水、お茶もしくはエピガロカテキンガレートを加えたことによる発光強度の変化である。測定温度はいずれも室温である。【００３２】  図６Ａ、図６Ｂは、ｐＨ６．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶、（ｄ）エピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。ΔＤ、ΔＥは、お茶、エピガロカテキンガレートを加えたことによる吸光度の変化である。
図７Ａ、図７Ｂは、ｐＨ７．３の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶、（ｄ）エピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。ΔＤ、ΔＥは、お茶、エピガロカテキンガレートを加えたことによる吸光度の変化である。
図８Ａ、図８Ｂは、ｐＨ８．０の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）お茶、（ｄ）エピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。ΔＤ、ΔＥは、お茶、エピガロカテキンガレートを加えたことによる吸光度の変化である。【００３３】  図９は、１２７０ｎｍでのｐＨ６．０のＳＷＮＴ懸濁液に０．９８Ｍの過酸化水素水を加えたときの時間依存性のスペクトル差ΔＡである。
図１０は、１２７０ｎｍでのｐＨ６．０のＳＷＮＴ−過酸化水素水ハイブリッド懸濁液に３ｍＭのカテキンを含むお茶を加えたときの発光強度の時間依存性のスペクトルの差ΔＢである。
図１１は、１２７０ｎｍでのｐＨ７．３のＳＷＮＴ懸濁液に０．９８Ｍの過酸化水素水を加えたときの時間依存性のスペクトル差ΔＡである。
図１２は、１２７０ｎｍでのｐＨ７．３のＳＷＮＴ−過酸化水素水ハイブリッド懸濁液に３ｍＭのカテキンを含むお茶を加えたときの発光強度の時間依存性のスペクトルの差ΔＢである。
図１３は、１２７０ｎｍでのｐＨ８．０のＳＷＮＴ懸濁液に０．９８Ｍの過酸化水素水を加えたときの時間依存性のスペクトル差ΔＡである。
図１４は、１２７０ｎｍでのｐＨ８．０のＳＷＮＴ−過酸化水素水ハイブリッド懸濁液に３ｍＭのカテキンを含むお茶を加えたときの発光強度の時間依存性のスペクトルの差ΔＢである。【００３４】  図１５は、ｐＨ７．３の（ａ）ＳＷＮＴ懸濁液、（ｂ）ＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液、（ｃ）エピガロカテキンガレートを加えた後のＳＷＮＴ−過酸化水素ハイブリッド懸濁液からの近赤外吸収スペクトルを示している。ΔＡはエピガロカテキンガレートを加えたことによる吸光度の変化である。【００３５】  以上により、本発明の実施の形態によれば、ＳＷＮＴ表面上の消光、発光を検出することで、微量の酸化還元反応を計測することができる。またこの方法は、測定を高速で行えるため、時間変化も容易に測定することができる。これにより酸化剤、還元剤などの選定や、還元作用の持続時間などを容易に行うことができる。さらに、１本からの発光を確認できるため、より精度が高い測定でできる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】  本発明は、検定したい物質中の酸化、抗酸化作用を低濃度、高速で検出する技術として広く利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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