(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製するための改善された方法の提供。【解決手段】抗原に特異的に結合する免疫グロブリンのヌクレオチド配列を得る方法であって、（ａ）少なくとも１つの動物の免疫グロブリン鎖をコードする核酸配列を準備するステップ；（ｂ）抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンのペプチド断片の質量スペクトル情報を得るステップ；（ｃ）ペプチド断片の質量スペクトル情報を、核酸配列からの予測質量スペクトル情報と関連づけてペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖を同定するステップ；および（ｄ）ペプチド断片による免疫グロブリン鎖またはその断片のアミノ酸配列包括度に基づいて、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン鎖の同定されたヌクレオチド配列から選択して抗原に特異的に結合する免疫グロブリンのヌクレオチド配列を得るステップ：を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得る方法であって、
（ａ）少なくとも１つの動物の免疫グロブリン鎖またはその可変領域をコードする核酸配列を準備するステップ；
（ｂ）抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンの集団を得、そして該集団の重鎖または軽鎖、またはその可変領域のペプチド断片の質量スペクトル情報を得るステップ；
（ｃ）ペプチド断片の質量スペクトル情報を、核酸配列からの予測質量スペクトル情報、該核酸配列によってコードされる予測アミノ酸配列から導き出された該予測質量スペクトル情報と関連づけてペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同定するステップ；および
（ｄ）ペプチド断片による免疫グロブリン鎖またはその断片のアミノ酸配列包括度に基づいて、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）の同定されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から選択して抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得るステップ：
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前記少なくとも１つの動物が抗原に暴露された動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸配列が発現された核酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸配列が、
（１）前記少なくとも１つの動物の白血球から核酸分子を単離すること；および
（２）免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子に隣接するポリヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いて、該免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子を増幅すること、および
（３）免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする該増幅された核酸分子のヌクレオチド配列を得ること：
によって該少なくとも１つの動物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドをコードする核酸分子がＲＮＡ分子であり、そして前記増幅ステップが最初の逆転写ステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫グロブリン鎖（または、その可変領域）をコードする核酸分子に隣接した前記ポリヌクレオチド配列が、ゲノムＤＮＡフランキング免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド配列、および免疫グロブリン鎖フレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
予測質量スペクトル情報が、
（ｉ）１つ又はそれ以上のプロテアーゼおよび／または１つ又はそれ以上の化学的タンパク質切断試薬を用いて、核酸配列のヌクレオチド配列によってコードされた予測されたアミノ酸配列の理論的消化を行って仮想ペプチド断片を生成するステップ；および
（ｉｉ）該仮想ペプチド断片の予測質量スペクトルを作製するステップ：
を含む方法を用いて得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の核酸配列、予測アミノ酸配列、および該核酸配列から誘導される予測
質量スペクトルが、遺伝物質データベース内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）の免疫グロブリンの前記ポリクローナル集団が動物の体液サンプルまたはその画分から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記体液が、血液、脳脊髄液、関節液、腹膜液、粘膜分泌液、涙、鼻汁、唾液、乳、および尿生殖器分泌液からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
動物が、以前に抗原に暴露された動物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
以前に抗原に暴露された動物が、以前に抗原で免疫化された動物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
動物がステップ（ａ）における前記少なくとも１つの動物と同じである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液サンプルまたはその画分から、ステップ（ｂ）の免疫グロブリンの前記ポリクローナル集団を精製する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
プロテインＡまたはプロテインＧ精製または抗原に基づくアフィニティー精製によって精製を実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）の免疫グロブリンの前記ポリクローナル集団が、in vitroで培養された細胞の培地から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
１つまたはそれ以上のプロテアーゼおよび／または１つまたはそれ以上の化学的タンパク質切断試薬を用いて集団を消化して断片を生成し、そして生成された断片を質量分析にかけることによって、免疫グロブリンのポリクローナル集団から、ステップ（ｂ）のペプチド断片の質量スペクトル情報が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｄ）における選択が、ペプチド断片による免疫グロブリンのＣＤＲ３配列のアミノ酸配列包括度に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｄ）における選択が、ペプチド断片による免疫グロブリンの可変領域のアミノ酸配列包括度に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｄ）における選択が、ペプチド断片によるＣＤＲ３配列のアミノ酸配列包括度および免疫グロブリンの可変領域のアミノ酸配列包括度に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）における選択が、マップされたユニークペプチドの数、スペクトル共用、総ペプチド計数、ユニークペプチド計数、コード核酸配列の頻度、およびクローン関連性からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーターにさらに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを作製する方法であって、
請求項１の方法を用いて重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得るステップ、
得られたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に基づいて、組換え分子生物学的手法または遺伝子合成手法によって該重鎖および該軽鎖を作るステップ、ならびに
該重鎖を該軽鎖とアセンブリングして抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを作製するステップ、
を含む方法。
【請求項２３】
免疫測定法において免疫グロブリンを評価して該免疫グロブリンが特異的に抗原に結合することを確認するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
免疫測定法が、フローサイトメトリーアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティングアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫蛍光測定法、放射免疫測定法、中和アッセイ、結合アッセイ、親和性アッセイ、タンパク質免疫沈降アッセイ、およびペプチド免疫沈降アッセイからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得る方法であって、
（ａ）少なくとも１つの動物の多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列を準備するステップ；
（ｂ）抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンの集団の免疫グロブリン鎖可変領域のペプチド断片の質量スペクトル情報を得るステップ；
（ｃ）ペプチド断片の質量スペクトル情報を、核酸配列の予測質量スペクトル情報、該核酸配列によってコードされる予測アミノ酸配列から導き出された該予測質量スペクトル情報と関連づけて、ペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同定するステップ；および
（ｄ）ペプチド断片による可変領域のアミノ酸配列包括度に基づいて、免疫グロブリン鎖可変領域の同定されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から選択して抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得るステップ：
を含む方法。
【請求項２６】
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に基づいて、組換え分子生物学的手法または遺伝子合成手法によって免疫グロブリン鎖可変領域を作るステップ、
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｆ）免疫測定法により免疫グロブリン鎖可変領域をスクリーニングして抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域を単離するステップ、
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫グロブリン鎖が重鎖である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
免疫グロブリン鎖が軽鎖である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合ドメインを作製する方法であって、
（ａ）請求項２５に記載の方法に従って抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得るステップ；および
（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域を免疫グロブリン軽鎖可変領域とアセンブリングして抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合ドメインを作製するステップ：
を含む方法。
【請求項３１】
動物がヒトである、請求項１、２２、２５、または３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
動物がウサギまたはマウスである、請求項１、２２、２５、または３０のいずれか１項に記載の方法
【請求項３３】
請求項２２に記載の方法に従って作製された、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン。
【請求項３４】
請求項２５に記載の方法に従って単離された、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域。
【請求項３５】
請求項３０に記載の方法に従って作製された、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合ドメイン。
【請求項３６】
請求項３３に記載の免疫グロブリンおよび薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項３７】
請求項３４に記載の免疫グロブリン鎖可変領域および薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項３８】
請求項３５に記載の抗原結合ドメインおよび薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項３９】
疾患抗原によって特徴づけられる疾患を有するか、または有することが疑われる動物を治療する方法であって、請求項３６、３７または３８のいずれか１項に記載の組成物の有効量を投与することを含み、抗原と疾患抗原とが同一である、方法。
【請求項４０】
動物がヒトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
疾患抗原の動物中に存在することによって特徴づけられる疾患の動物において発症の可能性を低減させる方法であって、請求項３６、３７または３８のいずれか１項に記載の組成物の有効量を投与することを含み、抗原と疾患抗原とが同一である、方法。
【請求項４２】
組成物がアジュバントをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
動物がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
抗原に暴露された対象の抗原特異的抗体集団をモニターする方法であって、
（ａ）抗原に暴露された対象から多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸配列を得るステップ；
（ｂ）抗原に特異的に結合する、対象からのポリクローナル免疫グロブリン集団の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のペプチド断片の質量スペクトル情報を得るステップ；
（ｃ）ペプチド断片の質量スペクトル情報を、核酸配列の予測質量スペクトル情報、該核酸配列によってコードされる予測アミノ酸配列から導き出された該予測質量スペクトル情報と関連づけて、抗原に特異的に結合する、対象からのポリクローナル免疫グロブリン集団の配列を同定するステップ；および
（ｄ）ペプチド断片による免疫グロブリン鎖またはその断片のアミノ酸配列包括度に基づいて、免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）の同定されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から選択して、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの重いまたは軽鎖のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得るステップ：
を含む方法。
【請求項４５】
ポリクローナル免疫グロブリンの核酸配列および集団が、それぞれ抗原に対する対象の暴露後の時点に対応する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ポリクローナル免疫グロブリンの核酸配列および集団が、それぞれ抗原に対する対象の暴露後の複数の時点に対応する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
疾患抗原によって特徴づけられる動物において疾患を治療するか、またはその可能性を低減させるのに有用な薬剤を製造するための、請求項３３に記載の免疫グロブリンの使用であって、抗原と疾患抗原とが同一である、使用。
【請求項４８】
疾患抗原によって特徴づけられる動物において疾患を治療するか、またはその可能性を低減させるのに有用な薬剤を製造するための、請求項３４に記載の免疫グロブリン鎖可変領域の使用であって、抗原と疾患抗原とが同一である、使用。
【請求項４９】
疾患抗原によって特徴づけられる動物において疾患を治療するか、またはその可能性を低減させるのに有用な薬剤を製造するための、請求項３５に記載の抗原結合ドメインの使用であって、抗原と疾患抗原とが同一である、使用。
【請求項５０】
動物がヒトである、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年３月９日に出願された特許文献１、２０１１年１１月１５日に出願された特許文献２、２０１１年１２月５日に出願された特許文献３、および２０１２年２月３日に出願された特許文献４の優先権を主張し、それらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、生物学、より詳しくは分子生物学および免疫学に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、大きな特異性および親和性により、抗原と称する特定のターゲット分子に結合する、生物学的および商業的に重要なポリペプチドである。抗体は、脊椎動物の免疫細胞によって産生され、そしてすべての天然の抗体は、同じ基本構造、すなわち、２本の同一の軽鎖に共有結合した２本の同一の重鎖を共有している。単一の重鎖および単一の軽鎖のＮ末端領域は、それぞれ個々の抗体に特定の抗原結合部位を形成する。重鎖のＣ末端領域は、抗体の特定のアイソタイプを決定し、そして同じ抗体産生細胞は、異なるアイソタイプの抗体を産生することができ、ここで、細胞によって産生されたすべて抗体は、同じ抗原結合部位を有する。異なるアイソタイプは、典型的に、動物において異なる機能を果たす。例えば、Ｅアイソタイプの抗体（すなわち、ＩｇＥ抗体）は、アレルギー反応に関与しているのに対して、Ａアイソタイプの抗体（すなわち、ＩｇＡ抗体中）は、粘膜、唾液、および母乳中に見いだすことができる。四鎖抗体分子は、それ自体（例えば、ＩｇＧ抗体）で存在することができ、またはさらなるモノマーと共に存在して二量体（例えば、ＩｇＡ抗体）もしくはさらに五量体（例えば、ＩｇＭ抗体）を形成することができる。
【０００４】
よく理解された抗体の基本構造により、標準分子生物学的手法を用いて、抗体の異なる領域を操作することによって組換え抗体を産生することができる。例えば、特許文献５および特許文献６（それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）は、分子生物学的手法を用いてヒト以外の抗体のさまざまな領域を操作することによってヒト以外の動物において天然の抗体をヒト化することを記載している。標準分子生物学的手法を用いた組換え抗体を操作または生成する他の方法が記載されている（例えば、特許文献７、特許文献８；特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、および特許文献１２を参照し、それらのすべては、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００５】
免疫応答中に、動物は、それぞれ異なる抗原結合特異性を有する多くの異なる抗体を生成する。この抗体集団を抗体のポリクローナル集団と称する。免疫応答が特定の抗原に向けられる場合、動物によって作られるポリクローナル抗体のほとんど（しかし、すべてでない）は、その抗原を特異的に結合する。しかし、ポリクローナル抗体のいくつかは、抗原における結合親和性および結合部位の違いにより、他のポリクローナル抗体よりも好ましい。KohlerおよびMilsteinは、１９７５年にノーベル受賞した彼らの発見において、ポリクローナル抗体産生動物から、興味の抗原を特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、単一の抗体産生細胞を単離および不死化する方法を発見した（非特許文献１）。この不死化技術は、抗体産生細胞を不死化細胞に融合させてモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを産生することを含んでおり、過去３５年間、モノクローナル抗体を作製するための業界標準となっている。
【０００６】
KohlerおよびMilsteinハイブリドーマ法は、その人気およびその長命にもかかわらず、多くの欠点を有する。例えば、それは非常に時間がかかり、かつ労働集約的である。より
適切には、それがどれくらい時間を要し、かつ労働集約的かというと、不死化されて、抗原に特異的に結合する抗体を産生するその能力についてスクリーニングされるのは、動物の抗体産生細胞のほんのわずかな画分でしかない。結局、所望の抗原特異性を有するハイブリドーマを単離しても、ヒト化のような、抗体のさらなる操作を容易にする、抗体のアミノ酸配列を得ることは、困難であり、かつ時間がかかる。
【０００７】
所望の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製するための改善された方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国仮出願第６１／４５０,９２２号
【特許文献２】米国仮出願第６１／５６０,００６号
【特許文献３】米国仮出願第６１／５６６,８７６号
【特許文献４】米国仮出願第６１／５９４,７２９号
【特許文献５】米国特許第６，１８０，３７０号
【特許文献６】米国特許第６，５４８，６４０号
【特許文献７】ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号
【特許文献８】ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号
【特許文献９】米国特許第５，９６９，１０８号
【特許文献１０】米国特許第６，３３１，４１５号
【特許文献１１】米国特許第７，４９８，０２４号
【特許文献１２】米国特許第７，４８５，２９１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497, 1975
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のさまざまな態様および実施態様は、興味の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を迅速かつ正確に作製する方法およびシステムを提供する。さらなる態様および実施態様において、本発明は、本発明のさまざまな方法を実施するための試薬および組成物、ならびに本発明のさまざまな方法の実施により生じる試薬および組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本明細書に開示された方法、試薬、および組成物は、対象の循環からモノクローナル抗体を作製するために有用である。
【００１１】
一態様において、本発明は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン（またはその可変領域）の配列を得るための方法であって、（ａ）少なくとも１つの動物の多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸配列を準備すること；（ｂ）抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンの集団の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖のペプチド断片の質量スペクトル情報を得ること；（ｃ）ペプチド断片の質量スペクトル情報を、核酸配列の予測質量スペクトル情報、前記核酸配列のヌクレオチド配列によってコードされた、予測アミノ酸配列から誘導された前記予測質量スペクトル情報と関連づけてペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードするヌクレオチド配列を同定すること；および（ｄ）ペプチド断片による免疫グロブリン鎖またはその断片のアミノ酸配列包括度（amino acid sequence coverage）に基づいて、免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）の同定されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から選択して抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得ること：を含む、方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施態様では、ステップ（ｄ）で選択された免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖（またはその可変領域）をアセンブリングして抗原に特異的に結合する免疫グロブリン（またはその可変領域）を作製する。
【００１３】
いくつかの実施態様では、ステップ（ｄ）で得た免疫グロブリン鎖可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を、アセンブリング前に組換え分子生物学的手法または遺伝子合成手法によって合成する。
【００１４】
いくつかの実施態様において、方法は、作製された免疫グロブリン（またはその可変領域）を免疫測定法でスクリーニングして、抗原に特異的に結合する前記免疫グロブリン（またはその可変領域）を確認することをさらに含む。いくつかの実施態様において、免疫測定法は、フローサイトメトリーアッセイ（flow cytometry assay）、酵素結合免疫吸着検定法（enzyme-linked immunosorbent assay）（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティ
ングアッセイ（Western blotting assay）、免疫組織化学的アッセイ（immunohistochemistry assay）、免疫蛍光測定法（immunofluorescence assay）、放射免疫測定法（radioimmunoassay）、中和アッセイ（neutralization assay）、結合アッセイ（binding assay
）、親和性アッセイ（affinity assay）、またはタンパク質もしくはペプチド免疫沈降アッセイ（protein or peptide immunoprecipitation assay）からなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施態様において、ステップ（ｄ）における免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の選択は、ペプチド断片によって鎖の一部（例えば、可変領域または相補性決定領域）のアミノ酸配列包括度に基づいて行う。
【００１６】
別の実施態様において、ステップ（ｄ）における免疫グロブリン重鎖または軽鎖の選択は、マップされたユニークペプチドの数（number of unique peptides mapped）、スペクトル共用（spectrum share）、総ペプチド計数（total peptide count）、ユニークペプ
チド計数（unique peptide count）、コードする核酸配列の頻度（frequency of the encoding nucleic acid sequences）、およびクローン関連性（clonal relatedness）からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーターと組み合わせて、ペプチド断片によって、免疫グロブリン鎖またはその断片のアミノ酸配列包括度に基づいて行う。
【００１７】
さまざまな実施態様において、核酸配列および核酸配列から誘導された情報（例えば、ヌクレオチド配列、予測アミノ酸配列および予測質量スペクトルを含む）は、遺伝物質データベース中にある。
【００１８】
いくつかの実施態様において、核酸配列が入手される動物は、抗原に暴露された動物である。
【００１９】
いくつかの実施態様において、動物からの多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする前記核酸配列によってコードされた予測アミノ酸配列は、（１）前記動物の白血球細胞から核酸分子を単離すること；（２）免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子に隣接するポリヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いて、前記免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子を増幅すること；（３）動物からの多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする前記増幅された核酸分子のヌクレオチド配列を得ること；および（４）遺伝暗号を用いてヌクレオチド配列を予測アミノ酸配列に翻訳すること：によって得られる。
【００２０】
いくつかの実施態様において、核酸配列は、発現された核酸配列である（例えば、ＲＮＡに転写され、および／または動物細胞中のタンパク質に翻訳される）。
【００２１】
いくつかの実施態様において、動物からの多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子によってコードされた予測アミノ酸配列は、（１）前記動物の白血球から核酸分子を単離すること；（２）免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子に隣接するポリヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いて前記免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子をシークエンシングして動物からの多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードするヌクレオチド配列を得ること；および（３）遺伝暗号を用いて核酸配列をアミノ酸配列に翻訳すること：によって得られる。いくつかの実施態様において、核酸分子はＲＮＡ分子であり、そして前記増幅ステップは最初の逆転写ステップを含む。
【００２２】
いくつかの実施態様において、免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子に隣接するポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡフランキング免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド配列、および免疫グロブリン鎖フレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施態様において、予測質量スペクトル情報は、（ｉ）１つまたはそれ以上のプロテアーゼおよび／または１つまたはそれ以上の化学的タンパク質切断試薬を用いて、核酸分子のヌクレオチド配列によってコードされた予測アミノ酸配列の理論的消化（theoretical digest）を実施して仮想ペプチド断片を生成するステップ；および（ｉｉ）前記仮想ペプチド断片の予測質量スペクトルを作製するステップを含む方法を用いて得られる。いくつかの実施態様において、ペプチド断片の観測質量スペクトル情報は、（ｉ）抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンの集団を単離するステップ；（ｉｉ）１つまたはそれ以上のプロテアーゼおよび／または１つまたはそれ以上の化学的タンパク質切断試薬を用いて集団を消化して断片を生成するステップ；および（ｉｉｉ）前記ペプチド断片の質量スペクトル情報を得るステップ：を含む方法を用いて得られる。いくつかの実施態様において、ポリクローナル抗体の集団は、（１）動物から体液またはその一部（例えば、血液、血清および／または血漿）を得るステップ；（２）体液またはその一部を、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンが抗原を結合する条件下で、抗原上に通過させるステップ；および（３）前記抗原に結合された前記免疫グロブリンを集めて抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンの集団を得るステップ：を含む方法を用いて単離する。いくつかの実施態様において、抗原は、固体支持体に結合されている（例えば、抗原は、固体支持体に共有結合的にまたは非共有結合的に結合されている）。いくつかの実施態様において、固体支持体は、ビーズ（例えば、アガロースまたは磁気ビーズ）、カラムの壁、またはプレート（例えば、組織培養プレート）の底部であってもよい。
【００２４】
いくつかの実施態様において、動物は、以前に抗原に暴露された動物である。
【００２５】
いくつかの実施態様において、以前に抗原に暴露された動物は、以前に抗原で免疫化された動物である。別の態様において、本発明は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域のアミノ酸配列を得る方法であって、（ａ）動物の多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列を準備すること；（ｂ）抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンの集団の免疫グロブリン鎖可変領域のペプチド断片の質量スペクトル情報を得ること；（ｃ）ペプチド断片の質量スペクトル情報を、核酸配列の予測質量スペクトル情報、前記核酸配列によってコードされた予測アミノ酸配列から誘導された前記予測質量スペクトル情報と関連づけてペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖可変領域のアミノ酸配列を得ること；および（ｄ）ペプチド断片によって、可変領域のアミノ酸配列包括度に基づいて、免疫グロブリン鎖可変領域の同定されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から選択して、抗原に特異的に結合する免疫グロブ
リンの可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得ること：を含む方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施態様において、方法は、さらにステップ（ｅ）免疫測定法を用いて前記免疫グロブリン鎖可変領域のアミノ酸配列をスクリーニングして、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域を単離することを含む。いくつかの実施態様では、ステップ（ｅ）スクリーニングステップの前に、ステップ（ｄ）において得られる免疫グロブリン鎖可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を、組換え分子生物学的手法または遺伝子合成手法によって合成する。いくつかの実施態様では、ステップ（ｄ）において産生された免疫グロブリン鎖可変領域を、第２の免疫グロブリン鎖可変領域と共にアセンブリングして抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの抗体結合ドメインを作製する。いくつかの実施態様では、免疫測定法は、フローサイトメトリーアッセイ（flow cytometry assay）、酵素結合免疫吸着検定法（enzyme-linked immunosorbent assay
）（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティングアッセイ（Western blotting assay）、および免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光測定法（immunofluorescence assay）、放射免疫測定法（radioimmunoassay）、中和アッセイ（neutralization assay）、結合アッセイ（binding assay）、親和性アッセイ（affinity assay）、またはタンパク質もしくはペプチ
ド免疫沈降アッセイ（protein or peptide immunoprecipitation assay）からなる群から選択する。
【００２７】
いくつかの実施態様において、免疫グロブリン鎖可変領域は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域である。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合ドメインを作製する方法であって、（ａ）動物からの多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列を準備すること；（ｂ）抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンの集団の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖のペプチド断片の質量スペクトル情報を得ること；（ｃ）ペプチド断片の質量スペクトル情報を、核酸配列の予測質量スペクトル情報、前記核酸配列によってコードされた予測アミノ酸配列から誘導された前記予測質量スペクトル情報と関連づけて、ペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得ること；（ｄ）ペプチド断片によって、可変領域のアミノ酸配列包括度に基づいて、免疫グロブリン鎖可変領域の同定されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から選択して、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの可変領域のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得ること；および（ｅ）選択された免疫グロブリン重鎖可変領域を、選択された免疫グロブリン軽鎖可変領域と共にアセンブリングして、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合ドメインを作製すること：を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明のすべての態様のさまざまな実施態様において、動物は、脊椎動物である。さまざまな実施態様において、動物は、哺乳動物である。いくつかの実施態様において、動物は、ヒトである。いくつかの実施態様において、動物は、ラット、ウサギまたはマウスである。いくつかの実施態様において、動物は、鳥類、飼いならされた動物、伴侶動物、家畜動物、齧歯動物または霊長類の動物である。いくつかの実施態様において、動物は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、ヒト抗体配列を発現する、および／または少なくとも部分的にヒトである抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物である。
【００３０】
また、さまざまな態様において、本発明は、免疫グロブリン（またはその可変領域）、または本発明のさまざまな非限定的な実施態様に従って単離または作製された抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域もしくは抗原結合ドメインを提供する。さまざまな実施態様において、免疫グロブリン（またはその可変領域）、または
抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域もしくは抗原結合ドメインを、単離するか、または組換える。また、さまざまな実施態様において、本発明は、薬学的に許容しうる担体および免疫グロブリン（またはその可変領域）、または本発明のさまざまな非限定的な実施態様に従って単離または作製された抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域もしくは抗原結合ドメインを提供する。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、疾患抗原によって特徴づけられる疾患を有するか、または有することが疑わしい動物を治療する方法であって、本発明のさまざまな実施態様による組成物の有効量を投与することを含み、免疫グロブリン（またはその可変領域）、または組成物の免疫グロブリン鎖可変領域もしくは抗原結合ドメインによって特異的に結合される抗原と疾患抗原とが、同一である、方法を提供する。いくつかの実施態様において、動物はヒトである。いくつかの実施態様において、動物は、齧歯動物、家畜動物、飼いならされた動物、伴侶動物、または霊長類の動物である。さらなる態様において、本発明は、疾患抗原の動物中に存在することを特徴とする疾患の動物において発生の可能性を低減する方法であって、本発明のさまざまな実施態様による組成物の有効量を投与することを含み、免疫グロブリン（またはその可変領域）、または組成物の免疫グロブリン鎖可変領域もしくは抗原結合ドメインによって特異的に結合された抗原と疾患抗原とが同一である、方法を提供する。いくつかの実施態様において、組成物はアジュバント（adjuvant）をさらに含む。いくつかの実施態様において、動物は、ヒトである。いくつかの実施態様において、動物は、齧歯動物、家畜動物、飼いならされた動物、伴侶動物、または霊長類の動物である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】２本の重鎖および２本の軽鎖を含む抗体の概略図である。２本の重鎖は、抗体のヒンジ領域にある２つのジスルフィド結合によって互いに結合している。それぞれの軽鎖は、単一のジスルフィド結合を介して重鎖に結合されている。抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のＮ末端で作製される。
【図２】本発明のさまざまな実施態様の非限定的な方法の例を示す概略図である。この例では、Ｂリンパ球（例えば、血液サンプルまたは組織サンプル）および血清および／または血漿を含むサンプルを、同じ動物（例えば、ヒト、マウス、またはウサギ）から集める。免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子をシークエンシングし、そしてこれらの核酸配列を用いて、核酸配列によってコードされた予測アミノ酸配列に基づいて、理論または予測質量スペクトル情報を生成する。血液血清からのポリクローナル抗体を、タンパク分解的に消化するか、または化学的に断片化し、そして生成したペプチド断片を質量分析による分析にかける。核酸配列からの情報（例えば、質量スペクトル）をペプチド断片の質量スペクトル情報と比較して抗体の免疫グロブリン鎖（またはその可変ドメイン）の配列を同定する。次いで、この抗体を、標準方法に従って組換え的に生成することができる。
【図３】本発明のさまざまな実施態様の非限定的な方法の別の例を示す概略図である。この例では、Ｂリンパ球および血清および／または血漿を、同じ動物（この場合、ウサギ）から集める。Ｂリンパ球からｍＲＮＡを抽出し、そして免疫グロブリン遺伝子特異的シークエンシングプライマーを用い、454 Life Sciencesから商業的に入手可能なGenome Sequencer FLX System装置を用いてシークエンシングにかける。この情報を用いて予測アミノ酸配列に基づく理論質量スペクトルを生成する。血清および／または血漿からポリクローナル抗体を単離し、そしてプロテアーゼを用いた消化および／または化学的タンパク質切断試薬を用いた切断にかける。生成したペプチド断片を、液体クロマトグラフィー、続いて質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によって分離する。ペプチド断片の質量スペクトルを、核酸配列の理論質量スペクトルと関連づけてペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列を得る。次いで、重鎖および軽鎖をアセンブリングして、免疫グロブリン鎖をコードする核酸配列を発現ベクター中にクローン化し、そして細胞中で発現ベクターを発現することによって組換え免疫グロブリンを作製することができる。次いで、発現された組換え免疫グロブリンを、さらに特徴づける。
【図４】本発明のさまざまな実施態様の非限定的な方法の別の例を示す概略図である。この例では、非限定的なＢ細胞源（例えば、脾細胞）およびポリクローナル抗体を、同じ動物（例えば、ヒト、マウスまたはウサギ）から集める。核酸分子をＢ細胞源から抽出し、そして免疫グロブリン遺伝子特異的シークエンシングプライマーを用い、ロシュ４５４装置を用いて次世代シークエンシング（ＮＧ）にかける。この情報は、遺伝物質データベースに置くことができ、それを用いて、核酸配列によってコードされた予測アミノ酸配列に基づく理論質量スペクトルを生成することができる。また、動物（例えば、ヒト、マウスまたはウサギ）から、ポリクローナル抗体（またはそのペプチド断片）を、分析用の質量分析計に装填する。カバット則（Kabat rules）を用いて核酸配列を分析して配列の可変領域（例えば、ＣＤＲ領域またはＦＲ領域の１つ）の配列を同定する。次いで、分析したポリクローナル抗体からのペプチド断片の配列をスクリーニングして、どのペプチドが、予測アミノ酸配列からの可変領域のすべてまたは部分に適合するか同定する。
【図５】良好な質量分析相関性を有する重鎖および軽鎖ＮＧＳ（すなわち、次世代シークエンシング）配列ならびに可変領域上のペプチドを示す表である。これらのペプチドのいくつかは、非常に頻繁に現れ（例えば、軽鎖参照番号Ｇ６２３ＦＫＢ０１Ａ３ＧＣ７を参照のこと）、そしていくつかは、高い核酸配列頻度数を有した（例えば、軽鎖参照番号Ｇ６２３ＦＫＢ０１ＡＸＪ１Ｃを参照のこと）。太字のイタリック体の列は、試験により、抗原を特異的に結合する配列を含むことが見いだされた免疫グロブリン鎖を表す（図６の試験結果を参照のこと）。
【図６−１】本発明の非限定的な方法を用いて作製した抗体を、ｐ−ＥｒｋペプチドでコートしたＥＬＩＳＡプレートに対してスクリーニングして試験するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す表である。図５に示した異なる軽鎖および重鎖を、互いにランダムに合わせた。図６から分かるように、多くの対形成により、ｐ−ＥＲＫコーティングプレートに特異的に結合することができる抗体が生じた（陰付きで示した陽性抗体）。
【図６−２】図６−１の続き。
【図７】ｐ−ＭＥＴ抗原で免疫化したウサギの脾細胞から生成したｃＤＮＡからの重鎖ならびにカッパおよびラムダ軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ反応（すなわち、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）の結果を示すアガロースゲルの写真の表示である。
【図８】アフィニティー精製抗体からのＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを用いて核酸配列から誘導された理論（すなわち、予測）質量スペクトルを組み合わせた後の抗体鎖の配列を示す表である。また、ＮＧＳ頻度に基づく抗体鎖存在量（antibody chain abundance）も示した。イタリック体で示した鎖を合成し、抗体中にアセンブリングし；そして太字のイタリック体の鎖は、ウエスタンブロッティング分析で試験して、ｐ−Ｍｅｔ抗原を特異的に結合することが見いだされたものである。
【図９】未処理（３つのすべてのブロットにおける−レーン）の、またはヒト増殖因子（ＨＧＦ）（３つのすべてのブロットにおける＋レーン）で処理したＨｅｌａ細胞から調製した溶解物を、本発明の非限定的な方法を用いて生成された２種の異なるウサギ抗体（１および２と表示したブロット）を用いておよび対照抗体（最も左のブロット）を用いて精査するウエスタンブロッティング実験の結果を示す写真の表示である。ウエスタンブロッティングで陽性結果の後、次いで、抗原特異的抗体（重鎖と軽鎖との対形成）を同定した。示したように、両レーン１および２で同定した抗体は、同じ重鎖を用いたが、異なる軽鎖を有した。２種のウサギ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、ウエスタンブロッティング結果の下に示し、重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域には、下線を引いた。
【図１０ａ】プロゲステロン受容体特異的ポリクローナルウサギＩｇＧのアフィニティー精製。（ａ）免疫化されたウサギの血清からの全ＩｇＧをプロテインＡで単離し、そしてさらに重力流によって固定化抗原ペプチド上でアフィニティー精製した。十分に洗浄して非特異的ＩｇＧを減らした後、ｐＨを徐々に酸性にする逐次的な溶離を用いて抗原特異性ポリクローナルＩｇＧを分別した。各画分を、適合する抗体濃度（２１．５ｎｇ／ｍｌ）でウエスタンブロッティングによって特異的活性について試験してＴ４７Ｄ細胞（＋）からの溶解物中のＰＲ Ａ／Ｂを検出した。また、ＨＴ１０８０からの陰性対照溶解物（−）も試験した。
【図１０ｂ】プロゲステロン受容体特異的ポリクローナルウサギＩｇＧのアフィニティー精製。（ｂ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のため、ｐＨ１．８の最も高い特異的活性を有する画分を４種のプロテアーゼで処理した。
【図１０ｃ】プロゲステロン受容体特異的ポリクローナルウサギＩｇＧのアフィニティー精製。（ｃ）ＳＥＱＵＥＳＴによって、５．５６０のＸＣｏｒｒおよび０．３９ｐｐｍのΔＭ（観測ｍ／ｚ−予想ｍ／ｚ）を有するＣＤＲＨ３（下線あり）を含むＶ領域完全トリプシンペプチドＧＦＡＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫ（配列番号：３０５）に適合したＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１０ｄ】プロゲステロン受容体特異的ポリクローナルウサギＩｇＧのアフィニティー精製。（ｄ）ＳＥＱＵＥＳＴによってＭＳ／ＭＳスペクトルをＶ領域ペプチドにマップし、そして≦２％のＦＤＲにフィルター処理した。次いで、サンプル調製に用いたプロテアーゼを考慮にいれ、そしてペプチドの総数、ユニークペプチド数（unique number）、スペクトル共有（spectrum share）、および全Ｖ領域のアミノ酸包括度の経過を追いながら、高信頼度ペプチドを、ＮＧＳによって生成したＶ領域データベースにリマップした（remapped）。高包括度Ｖ領域配列を選択し、モノクローナル抗体として発現させ、そして所望の活性についてスクリーニングした。
【図１０ｅ】プロゲステロン受容体特異的ポリクローナルウサギＩｇＧのアフィニティー精製。（ｅ）クローンＦ９の重鎖および軽鎖配列同定包括度。記載されたＶ領域配列は、対形成したときに、特異的にヒトＰＲ Ａ／Ｂ（図１１ａ〜ｅを参照）を結合する。１つまたはそれ以上のペプチドによってマップされたアミノ酸を太字で示す。Ｖ領域包括度を最大にし、そして高度に可変のアミノ酸組成を構成するため、相補的プロテアーゼを用いた（キモトリプシン、エラスターゼ、ペプシン、トリプシン。
【図１１ａ】プロゲステロン受容体Ａ／Ｂに対する機能性モノクローナル抗体の同定および特性評価。（ａ）重鎖および軽鎖のコンビナトリアル対形成により、黄色で示した１２の抗原特異的ＥＬＩＳＡ反応性クローンを得た。ＣＤＲ３配列を識別子として用い：チェック印は、ウエスタンブロット陽性クローンを示す（図１１ｂ参照）。
【図１１ｂ】プロゲステロン受容体Ａ／Ｂに対する機能性モノクローナル抗体の同定および特性評価。（ｂ）６種のクローン（Ｆ１  Ｆ９、Ｈ１、Ｃ１、Ｆ７、およびＨ９）は、ウエスタンブロッティングによるプロゲステロン受容体Ａ／Ｂ検出について特異的であった。クローンＥ６（ＥＬＩＳＡ陰性、ウエスタン陰性）およびＨ７（ＥＬＩＳＡ陽性、ウエスタン陰性）を対照として示す。＋、Ｔ４７Ｄ（ＰＲ Ａ／Ｂ陽性）；−、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＰＲ Ａ／Ｂ陰性）。すべての抗体を２１．５ｎｇ／ｍＬで試験した。
【図１１ｃ】プロゲステロン受容体Ａ／Ｂに対する機能性モノクローナル抗体の同定および特性評価。（ｃ）免疫組織化学によるアフィニティー精製されたポリクローナル混合物に対するクローンＦ９の特異的活性の比較。０．４μｇ／ｍＬのＦ９は、ＰＲ Ａ／Ｂ陽性組織または細胞系統（Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７）を特異的に染色したが、ＰＲ Ａ／Ｂ陰性細胞系統（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を染色しなかった。０．２μｇ／ｍＬのポリクローナル抗体を、陽性対照として用いた。
【図１１ｄ】プロゲステロン受容体Ａ／Ｂに対する機能性モノクローナル抗体の同定および特性評価。（ｄ）フローサイトメトリー分析。青色、Ｔ４７Ｄ細胞（プロゲステロン受容体Ａ／Ｂ陽性細胞系統）；黒色、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（プロゲステロン受容体Ａ／Ｂ陰性細胞系統）。ポリクローナル抗体信号／雑音比、１．６９；濃度、３．７μｇ／ｍＬ。モノクローナル抗体Ｆ９信号／雑音比＝３６．４；濃度０．５μｇ／ｍＬ。
【図１１ｅ】プロゲステロン受容体Ａ／Ｂに対する機能性モノクローナル抗体の同定および特性評価。（ｅ）共焦点免疫蛍光顕微鏡検査分析は、プロゲステロン受容体Ａ／Ｂ陽性細胞系統ＭＣＦ−７において特異的核染色パターンを示したが、０．４６μｇ／ｍＬのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において示さなかった。バックグラウンド染色対照として一次抗体は含まれなかった。また、ポリクローナル抗体を、１．８５μｇ／ｍＬの濃度で比較として用いた。
【図１２】クローンＣ３抗Ｌｉｎ２８Ａモノクローナル抗体の特徴づけ。（ａ）重鎖および軽鎖のコンビナトリアル対形成により、陰付きで示した５つの抗原特異的ＥＬＩＳＡ反応性クローンを得た。チェック印は、ウエスタンブロット陽性クローンを示す。ＣＤＲ３配列を、識別子として用いる。（ｂ）さまざまなＬｉｎ２８Ａ陽性細胞溶解物、ＮＣＣＩＴ、ＮＴＥＲＡ、ｍＭＥＳ、およびＩＧＲＯＶ１を用いてウエスタンブロット分析を実施した。（ｃ）Ｌｉｎ２８Ａ陰性細胞（ＨｅＬａ）およびＬｉｎ２８Ａ陽性細胞（ＮＴＥＲＡ）を用いて共焦点免疫蛍光検査分析を実施した。（ｄ）モノクローナル抗体のフローサイトメトリー分析。左のピーク、ＨｅＬａ細胞（Ｌｉｎ２８Ａ−）；右のピーク、ＮＴＥＲＡ細胞（Ｌｉｎ２８Ａ＋）。＊Ｖ領域は、同一のＶ領域配列でなく、同じＣＤＲ３配列を有した。
【図１３】ホスホＥｒＫに対する機能性マウスモノクローナル抗体の同定および特徴づけ。（ａ）３種のマウスのプール血清からのホスホＥｒＫポリクローナル抗体の精製。プール血清、プール血清からのプロテインＧ精製された全ＩｇＧ、プロテインＧ精製からの非結合画分、ならびにｐＨ３．５、２．７および１．８の酸溶出画分を、ジャーカット細胞溶解物中のホスホＥｒＫに対する結合特異性について、ウエスタンブロッティングによって検定した。＋、ＴＰＡで刺激されたジャーカット細胞；−、Ｕ０１２６で処理されたジャーカット細胞。（ｂ）重鎖および軽鎖のコンビナトリアル対形成により、ペプチド抗原ＥＬＩＳＡによって反応性である、陰付きで示した１５種のクローンを得た。チェック印は、ウエスタンブロット陽性クローンを示す（（ｃ）を参照のこと）。ＣＤＲ３配列を、識別子として用いる。重鎖配列について、下線を引いた部分は、フレーム枠領域３の末端を示す。（ｃ）３種のクローン（Ｃ１０、Ｆ１０およびＭ３）は、ウエスタンブロッティングによるホスホＥｒＫ検出について特異的であった。クローンＣ９（ＥＬＩＳＡ陽性、ウエスタン陰性）を、対照として示す。すべての抗体は、１００ｎｇ／ｍＬで試験した。
【００３３】
詳細な説明
本開示は、興味の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体のアミノ酸配列（およびコード化核酸配列）を迅速かつ正確に得るための方法およびシステムに関する。より詳しくは、本方法論は、完全長免疫グロブリン鎖または可変領域をコードする核酸分子を含む遺伝物質データベースに対して、動物の血清からの循環ポリクローナル抗体の直接的な質量分析ベースのプロテオミクス検査を含む。特定の実施態様では、核酸シークエンシング技術を用いることによって、動物（例えば、血清を採取してポリクローナル抗体を得る同じ動物）のＢ細胞レパートリーから遺伝物質データベースを生成する。したがって、本アプローチは、２つのソース：動物の実際の循環ポリクローナル抗体からの質量スペクトル情報と、遺伝物質データベースからの情報（例えば、予測質量スペクトルを含む）とを関連づけること（すなわち、相互比較すること（cross-comparing）または相互参照するこ
と（cross-referencing））を本質的に含む。次いで、血清からの実際の抗体に対応する
遺伝物質データベースから、重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列のリストを同定することができる。このような重鎖および軽鎖を、対で発現させて機能性モノクローナル抗体を得ることができる。
【００３４】
いくつかの実施態様において、本方法論は、Ｂ細胞の不死化、単一細胞の分類および分子クローニング、またはファージディスプレイを必要とせず、そして当て推量に基づく抗体配列のアセンブリーを含まない。質量分析技術および核酸シークエンシング技術（例えば次世代ＤＮＡシークエンシングまたはＮＧＳ）の両方の長所を活用することによって、本発明のアプローチは、ポリクローナル集団から抗原特異性モノクローナル抗体の配列を単離するために必要な時間を大幅に短縮することができ、それによって治療上使用しうる完全ヒト抗体またはヒト化抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）のような組換え抗体へのよ
り速い移行が可能になる。
【００３５】
さらにまた、本方法論は、既存の技術によって見落とされる可能性があるまれな抗体を同定することが可能である。本発明者らは、驚くべきことに、高度な選択的特異性を有する個別抗体（例えば、ポリペプチド内のリン酸化チロシン残基に特異的に結合する抗体）が、ポリクローナル集団内でごくまれに発生しうることを見いだした。抗体をコードするｍＲＮＡおよびＰＣＲ増幅の頻度に依存する方法は、それらの可変鎖が低頻度で発生するため、これらの抗体を見落とすことがありうる。これに対して、本方法論は、例えば、ポリクローナル抗体集団から誘導された実際のペプチド断片の質量分析ベースのプロテオミクス分析を用いるため、ＰＣＲ増幅後に頻度の誤差を生じることがない。
【００３６】
さらに、本方法論は、出発ポリクローナル集団中に存在しえない新規な抗原特異的抗体を迅速に作製することができる。例えば、最も所望の品質（例えば、抗原に対して最も高い結合親和性（または最も低いＫＤ）または所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２ａ））を有する、作製された免疫グロブリン分子は、ポリクローナル集団中の第１の抗体からの軽鎖をポリクローナル集団中の第２の抗体（すなわち、第１の抗体と異なる）の重鎖とアセンブリングした結果であってもよい。
【００３７】
本明細書に記載された方法は、基礎免疫学および治療法に用途を有する。例えば、本方法は、血清抗体多様性、動力学、動態学、クローン性、および抗原暴露後のＢ細胞の移動を含む免疫学の分野における中心的な問題を理解するための基盤を提供することができる。また、本方法を用いて、免疫化された、自然感染した、または罹患した人からの治療に関連するヒトモノクローナル抗体を追跡することもできる。
【００３８】
本明細書に示すように、本方法論は、実験動物種およびヒトの両方におけるいくつかの異なる抗原に適用することに成功しており、そして免疫化された対象の血清中に見いだされた最初のアフィニティー精製されたポリクローナル抗体の抗原特異的活性を反復するか、または上回る抗原特異的活性を有するモノクローナル抗体の単離が導かれている。
【００３９】
したがって、本開示は、さらに、疾患抗原に特異的な治療抗体を含む、抗原に特異的な単離された組換えモノクローナル抗体、および治療モノクローナル抗体の投与に基づいて疾患を治療する治療方法を提供する。
【００４０】
本発明のさまざまな態様および実施態様を、以下により詳細に記載する。本明細書に引用された特許、公開された出願、および科学文献は、当業者の知識を確立し、そしてそれぞれが詳細かつ個別に参照により組み込まれることを示すのと同程度にそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用された任意の文献と本明細書の具体的な教示との任意の矛盾は、後者を支持して解決するものとする。同様に、用語または成句の当分野で理解される定義と、本明細書において具体的に教示した用語または成句の定義との任意の矛盾は、後者を支持して解決するものとする。
【００４１】
定義
本明細書に用いるように、以下の用語は、示した意味を有する。本明細書に用いるように、単数形の用語は、その内容が明らかに別のものを指していなければ、それが指している用語の複数形を明確に包含する。「約」という用語は、近似的に、ほぼ、だいたい、またはおよそを意味するものとして本明細書において用いる。「約」という用語を、数値的な範囲に関連して用いるとき、それは、明記された数値より上およびそれより下に境界線を延長することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、２０％の変動によって記載された値より上およびその下に数値を変更するために本明細書において用いる。
【００４２】
「ペプチド」または「ペプチド断片」とは、一緒に結合している個々のアミノ酸残基から形成された短いポリマーを意味し、ここで、一方のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基との間の結合は、アミド結合またはペプチド結合と称する。ペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む。ペプチドは、それがより短いという点で、ポリペプチドと区別される。一方のペプチドのＣ’末端のアミノ酸残基と第２のペプチドのＮ’末端のアミノ酸残基との間のアミド結合またはペプチド結合によって一緒に結合された少なくとも２つのペプチドは、本発明のさまざまな実施態様に従ってポリペプチドを形成する。
【００４３】
「ポリペプチド」とは、結合している個々のアミノ酸残基から形成された長いポリマーを意味し、ここで、一方のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基との間の結合は、アミド結合またはペプチド結合と称する。ポリペプチドは、少なくとも４つのアミノ酸残基を含む。しかしながら、アミドまたはペプチド結合を介して多数のポリペプチドを一緒に結合してさらにより長いポリペプチドを形成することができる。
【００４４】
「核酸分子」とは、一緒に結合している個々のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）から形成されたポリマーを意味し、ここで、一方のヌクレオチドともう一方のヌクレオチドとの間の結合は、例えば、ホスホジエステル結合を含む共有結合である。したがって、その用語には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４５】
「核酸配列」とは、免疫グロブリン鎖の全部または一部（例えば、重鎖または軽鎖）をコードする核酸配列（またはそれに対して相補的なヌクレオチド配列）を意味する。いくつかの実施態様において、核酸配列は、ゲノムＤＮＡ（例えば、イントロンＤＮＡを有するまたは有しないエキソンＤＮＡ）である。いくつかの実施態様において、核酸配列は、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいくつかの形態（例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、など）である。いくつかの実施態様において、核酸配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡに転写されたＤＮＡ）に転写されるか、またはその核酸配列を含む細胞中のポリペプチドに翻訳されるか、のいずれかである発現された核酸配列である。したがって、発現された核酸分子には、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムエキソン配列が、含まれるがそれらに限定されるわけではない。核酸分子に関する「相補的」とは、単に、ヌクレオチドを含む２つの一本鎖核酸分子が、標準的なワトソン―クリックの塩基対を形成して二本鎖核酸分子を形成することを意味し、その二本鎖分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであるかどうかは関係ない。
【００４６】
本明細書に用いるように、「Ｂリンパ球」とは、免疫グロブリン鎖をコードする遺伝子を含む遺伝子座で遺伝子組換え（または遺伝子再構成）が起こり始めた任意の白血球を意味する。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子は、染色体１４（重鎖遺伝子座）、染色体２（カッパ軽鎖遺伝子座）、および染色体２２（ラムダ軽鎖遺伝子座）上で生じる。ヒト白血球が免疫グロブリン鎖遺伝子座において（例えば、染色体１４、染色体２、または染色体２２上）遺伝子再構成事象を受けた場合、その細胞はＢリンパ球とみなされる。したがって、Ｂリンパ球には、Ｂ細胞、プレＢ細胞、初期プロＢ細胞（例えば、ここでは、重鎖のＤおよびＪ領域遺伝子は、再構成を受けているが、軽鎖遺伝子は、生殖細胞系列である（すなわち、再編成されない））および後期プロＢ細胞（例えば、ここでは、重鎖遺伝子のＶ、ＤおよびＪ領域は、再編成されるが、軽鎖遺伝子は、なお生殖細胞系列であり、そして免疫グロブリンタンパク質は、細胞表面上で発現されない）を含むプロＢ細胞、大型プレＢ細胞および小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、活性Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、血漿細胞（形質芽球を含む）、および記憶Ｂ細胞を含むプレＢ細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４７】
明細書および特許請求の範囲を通じて、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、同じ意味で用いられ、そして任意の動物種、例えば霊長類の動物（例えば、ヒトまたはチンパンジー）、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）、ウサギ目の動物（例えば、ウサギまたはノウサギ）、家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、およびヒツジ）、魚（例えば、サメ）、鳥類（例えば、ニワトリ）もしくはラクダ科の動物（例えば、ラクダまたはラマ）からの、またはヒト抗体を産生するために遺伝子組換えされたトランスジェニック非ヒト動物（例えば、齧歯動物）からの、任意のアイソタイプまたはサブアイソタイプの無傷の免疫グロブリンポリペプチド分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２、ＩｇＡ）（例えば、Lonberg et al.、ＷＯ９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；Kucherlapati, et al.、ＷＯ９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号；ＵＳ２００９／００９８１３４；ＵＳ２０１０／０２１２０３５；ＵＳ２０１１／０２３６３７８；ＵＳ２０１１／０３１４５６３；ＷＯ２０１１／１２３７０８；ＷＯ２０１１／００４１９２；ＷＯ２０１１／１５８００９参照）；それらの抗原結合ドメイン断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２；それらの変種、例えばｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性ｓｃＦｖｓ、二重特異性抗体、線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号；Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062.1995参照）；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体；ならびに抗体結合ドメイン（本明細書の他の場所に定義した）であるか、またはそれと相同性である結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含むことを意味する。本発明のさまざまな実施態様の非限定的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性の抗体およびその断片、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体、およびヒト化抗体、例えばその定常および／またはＦＲドメインがヒト抗体由来の定常および／またはＦＲドメインで置換されたヒト以外の抗体（例えば、ウサギ抗体）（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第６，１８０，３７０号；および同第６，５４８，６４０号参照）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヒト（例えば、少なくとも部分的にヒト）抗体を産生するために遺伝子組換えされたトランスジェニック非ヒト動物は、Harbour Antibodies（ロッテルダム、オランダ）、Ablexis（サンフランシ
スコ、ＣＡ）、Kymab Ltd（ケンブリッジ、英国）、OMT, Inc.（パロアルト、ＣＡ）、Amgen（サウザンドオークス、ＣＡ）、Medarex（プリンストン、ＮＪ）およびRegeneron（
タリータウン、ＮＹ）から入手可能である。
【００４８】
天然の無傷の抗体は、２種類のポリペプチド鎖、軽鎖および重鎖でできている。本発明のさまざまな態様の非限定的な抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む無傷の４つの免疫グロブリン鎖抗体）であることができる。抗体の重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡもしくはＩｇＤを含む任意のアイソタイプまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２などを含むサブアイソタイプであることができる。軽鎖は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖であることができる。例えば、単一のＩｇＧ天然の（または無傷の）抗体は、軽鎖の２つの同一のコピーおよびＩｇＧ重鎖の２つの同一のコピーを含む。各重鎖が１つの可変ドメイン（ＶＨ）および１つの定常領域（ＣＨ、それは、それ自体、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む）を含むすべての天然抗体の重鎖は、それらの定常ドメイン内多数のジスルフィド結合を介して互いに結合して抗体の「幹」を形成する。各軽鎖が１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常領域（ＣＬ）を含むすべての天然抗体の軽鎖は、それぞれジスルフィド結合を介して１つの重鎖定常領域にその定常領域を通して結合している。４つの免疫グロブリン鎖抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）の略図を図１に示す。図１では、３つのＣＨドメインを薄い青色で示し、１つのＶＨドメインを、濃い青色で示し、１つのＣＬドメインを、薄い桃色で示し、そして１つのＶＬドメインを、濃い桃色で示す。図１に示すように、軽鎖および重鎖のＶＬおよびＶＨドメインは、それぞれ一緒になって抗体結合ドメイン
を形成する。
【００４９】
いくつかの実施態様において、無傷の免疫グロブリン鎖（例えば、重鎖または軽鎖）は、５’から３’への（核酸配列をコードする鎖について）またはアミノ末端からカルボキシ末端への（鎖のアミノ酸配列について）順序で：可変ドメインおよび定常ドメインを含んでもよい。可変ドメインは、分散したフレームワーク（ＦＲ）領域と共に３つの相補性決定領域（ＣＤＲ；超可変領域またはＨＶとも称する）を含んでもよい。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは、ＦＲ４領域への定常領域３’（またはＣ’）を有する、５’（またはＮ’）−ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４３’（またはＣ’）の構造について、さらに４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）の間にはさまれた３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、抗体の主要な抗原結合表面を含むループを形成しており（Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) および Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250 (1970)参照）、４つのフレームワーク領域は、主にベータシートの構造をとり、そしてＣＤＲは接続ループを形成し、そして場合によっては、ベータシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって接近して保たれており、そして他の鎖からのＣＤＲと共に、抗原結合ドメインの形成に寄与する。
【００５０】
「抗原」とは、抗体が特異的に結合できるターゲット分子（例えば、ポリペプチドまたは炭水化物）を意味する。抗体が特異的に結合する抗原の部分は、「エピトープ」と称する。「エピトープ」は、抗体の抗原結合ドメインが特異的に結合可能なターゲット分子の最も小さな部分である。エピトープの最小サイズは、約３〜７アミノ酸（例えば、５または６アミノ酸）であってもよい。１つの抗原上には、多数のエピトープがありうるため、１つの抗原には、多数の異なる抗体が特異的に結合することができ、それぞれ個々の抗体は、抗原上の異なるエピトープに特異的に結合するにもかかわらず、それらのすべて抗体は、抗原を特異的に結合する（すなわち、これらの抗体のすべては、抗原特異的抗体である）。
【００５１】
「疾患抗原」とは、疾患状態の動物中に生じる抗原を意味する。例えば、ウイルス抗原（例えば、ウイルスの遺伝物質の核酸分子によってコードされた抗原）は、そのウイルスに感染した動物の疾患抗原である。同様に、いくつかの疾患（例えば、がん）は、キメラタンパク質（例えば、ＢＲＣ−ＡＢＬ）を産生する遺伝子転座を特徴とする。従って、ＢＲＣ−ＡＢＬタンパク質は、疾患抗原である。疾患抗原は、必ずしもその疾患を患っている動物だけにみられるわけではないことを理解すべきである。
【００５２】
「疾患」とは、単に動物に影響を及ぼす任意の異常状態を意味する。疾患の非限定的な例には、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチまたはＩ型糖尿病）、がん（例えば、白血病、結腸がん、または前立腺がん、など）、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶウイルスの感染によって生じたＡＩＤＳまたは水痘帯状疱疹ウイルスの感染によって生じた水痘）、寄生生物による感染症（例えば、住血吸虫症または疥癬）、および細菌感染症（例えば、結核またはジフテリア）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５３】
「特異的に結合する」とは、その抗原（すなわち、その特異的抗原）と相互作用する、免疫グロブリンまたは抗体を意味し、ここで、相互作用は、抗原上の特定構造（例えば、エピトープ）の存在に依存している。換言すれば、抗体は、一般にすべての分子または構造というよりもむしろ特異的構造を認識して、それに結合する。抗原に特異的に結合する抗体は、「抗原特異的抗体」または「抗原に特異的な抗体」と称してもよい。いくつかの実施態様において、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原および他の分子を含む溶液（例えば、細胞溶解液）からその抗原を免疫沈降させることができる。いくつかの実施態様に
おいて、その抗原に特異的に結合する抗体は、１×１０-6Ｍまたはそれ未満のその抗原に対するＫDを有する。いくつかの実施態様において、その抗原に特異的に結合する抗体は
、１×１０-7Ｍもしくはそれ未満のその抗原に対するＫD、または１×１０-8Ｍもしくは
それ未満のＫD、または１×１０-9Ｍもしくはそれ未満のＫD、または１×１０-10Ｍもし
くはそれ未満のＫD、１×１０-11Ｍもしくはそれ未満のＫD、１×１０-12Ｍもしくはそれ未満のＫDを有する。特定の実施態様において、その抗原に特異的に結合する抗体の、そ
の特異的抗原に対するＫDは、１ｐＭから５００ｐＭまでの間、または５００ｐＭから１
μＭまでの間、または１μＭから１００ｎＭまでの間に、または１００ｍＭから１０ｎＭまでの間である。本明細書に用いるように、用語「ＫＤ」とは、２つの分子間の相互作用の解離定数（例えば、抗体とその特異的抗原との間の解離定数）のことをいうものとする。
【００５４】
「免疫グロブリン鎖の可変領域」または「免疫グロブリン鎖可変領域」とは、免疫グロブリンの重鎖（すなわち、ＶＨドメイン）または軽鎖（すなわち、ＶＬドメイン）の可変ドメインの少なくとも一部を含むポリペプチドであり、ここで、ＶＬおよびＶＨドメインの部分は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインを形成する（図１参照）。従って、免疫グロブリンの可変領域には、１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１）、１つのＦＲをはさんだ２つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＣＤＲ２）、２つのＦＲをはさんだ３つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３）、またはＦＲ１もしくはＦＲ４の一方もしくは両方が側面に位置する３つのＣＤＲ（例えば、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４）。が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの実施態様において、免疫グロブリン鎖可変領域は、無傷の免疫グロブリンの他の鎖（すなわち、軽鎖または重鎖）の免疫グロブリン鎖可変領域と組み合わせたときに、抗原結合ドメインを形成する、重鎖または軽鎖のいずれか一方における領域である。
【００５５】
「抗原結合ドメイン」とは、無傷の抗体の、その特異的抗原に対する特異的結合活性を保持する、免疫グロブリン中で１つの重鎖を１つの軽鎖とアセンブリングした領域を意味する。したがって、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む、無傷のＩｇＧ免疫グロブリンは、２つの抗原結合ドメインを有する。同様に、重鎖と軽鎖との間に共有結合を保持する、無傷の抗体の断片化は、抗原結合ドメインを有する免疫グロブリン断片も生じる。例えば、酵素パパインを用いた免疫グロブリンの消化は、Ｆ（ａｂ）断片を生成し、それらは、それぞれ単一の抗原結合ドメインを有する。もちろんＦ（ａｂ）全体は抗原結合ドメインではなく、むしろ、抗原を特異的に結合する能力を保持するＦ（ａｂ）断片の部分のみが抗原結合ドメインである。
【００５６】
本明細書に用いる技術的および科学的用語は、特に定義しない限り、本発明が関与する当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書においては、当業者に知られたさまざまな方法論および物質を参照する。抗体および／または組換えＤＮＡ技術の一般原理を説明する標準参考文献には、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)；Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (1991-2010)；Ausubel et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1987-2010)；Kaufman et al., Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995)；McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)；が含まれ、それらは、すべてそ
れらの全体として参照によって組み込まれる。薬理学の一般原理を説明する標準参考文献には、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., 
McGraw Hill Companies Inc., New York (2006)が含まれ、それは全体として参照により
組み込まれる。
【００５７】
抗原特異的免疫グロブリンの配列を得る方法
一態様において、本発明は、ポリクローナル抗体の集団から単一免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）のアミノ酸および／または核酸配列を得る方法に関する。
【００５８】
本方法によれば、動物から興味のポリクローナル抗体の集団を得、そして断片化してペプチド断片を生成し、それを質量分析によって分析する。次いで、ペプチド断片から観測された質量スペクトル情報を、完全長免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖（またはその可変領域）をコードする核酸配列を含む遺伝物質データベースから誘導された予測質量スペクトル情報と関連づける。このような関連づけの結果として、出発ポリクローナル抗体集団内の免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖（またはその可変領域）に対応する遺伝物質データベースから、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖（またはその可変領域）を同定することができる。
【００５９】
本方法のさまざまな態様は、以下により詳細に記載する。
【００６０】
ポリクローナル抗体の出発集団
興味の抗原と特異的に結合する免疫グロブリンは、ヒトのような任意の哺乳動物を含む動物から採取してもよい。免疫グロブリンは、例えば、血液、血液の血清または血漿、脳脊髄液、関節液、腹膜液、粘膜分泌液、涙、鼻汁、唾液、乳、および尿生殖器分泌液を含む動物の体液サンプルから集めることができる。
【００６１】
いくつかの実施態様において、免疫グロブリンは、個々の単一動物に由来する必要はなく、むしろ、異なる個体から集めた異なる抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）のカクテルであってもよい。いくつかの実施態様において、免疫グロブリンは、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、ヒト抗体配列を発現するおよび／または少なくとも部分的にヒトである抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物から集める。
【００６２】
いくつかの実施態様において、これらの免疫グロブリンは、興味の抗原に特異的であり、その理由は、免疫グロブリンが集められる動物が、抗原であらかじめ免疫化されているためであるか、または免疫グロブリンが集められる動物が、その動物が抗原特異的抗体を生成しそうな条件にあらかじめ暴露されているためのいずれかである。後者の場合の例では、動物は、ウイルス（例えば、エプスタイン・バー・ウイルス（Epstein Barr Virus））感染していてもよく、ここで興味の抗原は、ＥＢＮＡ１タンパク質であり、それはエプスタイン・バー・ウイルスのゲノムによってコードされている。
【００６３】
さまざまな実施態様において、免疫グロブリンが集められる（すなわち、得られる）動物は、Ｂリンパ球核酸配列を集めて参照データベースが作製される動物と同じ種のものである。いくつかの実施態様において、ペプチドデータベース用に免疫グロブリンが集められる動物と、参照データベース用にＢリンパ球核酸が集められる動物とは、同じ動物である。
【００６４】
図２に示すように、動物が同じ動物である場合、動物から採取した血液を、核酸配列（例えば、血液中の細胞から）およびポリクローナル抗体（例えば、血液の血清または血漿から）の両方に提供することができる。
【００６５】
動物から集めた免疫グロブリンは、異なるＢリンパ球が集団のメンバーを産生するため
、免疫グロブリンのポリクローナル集団を形成する。このようなポリクローナル集団では、そのポリクローナル集団内の個々の抗体のすべてが同じ抗原を特異的に結合するわけではないことに留意する必要がある。実際、集団内の抗体は、それぞれ異なる抗原を結合してもよい。しかし、それでも、ポリクローナル集団の少なくとも１つの個々の抗体、好ましくは多数の抗体が、その抗原を結合する場合、このポリクローナル集団は、特定の抗原を特異的に結合すると言われている（例えば、下の実施例３参照）。別の実施例において、ポリクローナル集団中のいくつかの抗体は、低い親和性で抗原を結合してもよい。しかし、その集団中の抗体のいくつか（例えば、少なくとも１つのまたはそれ以上）が抗原を特異的に結合する場合、ポリクローナル集団は、抗原を特異的に結合すると言われる。
【００６６】
「抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体（または免疫グロブリン）」という成句は、ポリクローナル集団内で、少なくとも１つの抗体が抗原に特異的に結合するが、しかし、その１つの抗体が、抗原に特異的に結合しない、ポリクローナル集団内の他の抗体から必ずしも単離されないことを意味することに留意する必要がある。当然、いくつかの実施態様では、ポリクローナル集団内の複数の異なる抗体が抗原に特異的に結合する。
【００６７】
また、異なる抗体分子は、異なるＢ細胞によって産生された抗体分子であることに留意する必要がある。例えば、血清を集めた後、１０００個の抗体分子のポリクローナル集団を血清から単離してもよい（例えば、他の血清成分から抗体を単離するためにプロテインＡカラムへの抗体の接着（adherence）を用いる）。１０００個の抗体分子のその集団内
で、９００個は同一であってもよく（すなわち、同じＢ細胞によって分泌される）、したがって、実際には、そのポリクローナル集団内に１０１種の異なる抗体しかない。ポリクローナル集団に関して、９００個の同一の抗体分子がすべて抗原を特異的に結合する場合、１０００個の抗体分子のポリクローナル集団は、抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体である。同様に、残りの１００個の異なる抗体分子のうちのさらに５個の異なる抗体分子も抗原に特異的に結合する場合、１０００個の抗体分子のポリクローナル集団は、同様に、抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体である。
【００６８】
「抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体」と称するその集団に関して、ポリクローナル集団内の多くの抗体分子は、抗原に特異的に結合する必要はない。その用語を本明細書に用いるときは、例えば、１０００個の抗体分子のポリクローナル集団内で、たとえ１個の抗体分子しか抗原に特異的に結合しなくて、９９９個の抗体分子が結合しなくても、その１０００個の抗体分子の集団は、なお「抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体」である。
【００６９】
また、ポリクローナル抗体集団中の抗体のすべてが抗原上の同じエピトープを結合する必要はないことに留意する。例えば、集団内のすべての異なる抗体が、抗原上の異なるエピトープを特異的に結合する場合、ポリクローナル集団は、抗原に特異的であることができる。
【００７０】
本発明の非限定的な方法のさまざまな実施態様において、ポリクローナル免疫グロブリンの集団は、例えば、集団内に少なくとも２種の異なる免疫グロブリン、または集団内に少なくとも３種、もしくは少なくとも５種、もしくは少なくとも１０種、もしくは少なくとも２０種、もしくは少なくとも５０種、もしくは少なくとも１００種もしくは少なくとも５００種の異なる免疫グロブリンを有してもよい。また、本発明は、in vitroで増殖したＢ細胞の組織培養上清から免疫グロブリンのポリクローナル集団を集めることを企図する（例えば、ここでは、核酸配列をＢ細胞それ自体から集める）。例えば、Ｂ細胞の集団は、エプスタイン・バー・ウイルスに罹患した動物から集めてもよい。例えば、他の白血球と比較して集団中のＢリンパ球を富化するために集団を拡大する（expand）ことができる。これらの細胞のこの培地（細胞によってポリクローナル抗体がその中に分泌される）
から、抗体のポリクローナル集団を単離することができる。
【００７１】
動物から、またはＢ細胞の組織培養上清から集めた免疫グロブリンのポリクローナル集団は、まず精製した後、ペプチド断片に消化することができる。例えば、集めたポリクローナル抗体を、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースカラムにかけることができ、それにより、例えば、他の血液血清タンパク質から抗体を分離することができる。例えば、図２および図３を参照のこと。別法としてまたは追加的に、集めたポリクローナル抗体を抗原アフィニティー精製にかけて高い特異的活性を有する抗体を富化する。必ずしも必要なわけではないが、精製ステップ、特に抗原アフィニティー精製は、ポリクローナル混合物の複雑さを低減し、そして最終的に、潜在的に偽陽性または陰性の候補免疫グロブリンの数を低減することができる。集めたポリクローナル抗体は、精製の前または後のいずれかに、濃縮するか、もしくは緩衝液の交換をするか、またはその両方を行ってもよい。
【００７２】
１つの具体的な実施態様では、動物から興味の抗原と特異的に結合する免疫グロブリンを集めるため、末梢血を動物から採血し、そして血清および／または血漿抗体を、標準方法（例えば、プロテインＡに対する抗体の接着（adherence））に従って集める。次いで
、血清および／または血漿抗体を精製またはスクリーニングして抗原に特異的に結合する免疫グロブリンについて富化する。このスクリーニングは、例えば、固相表面（例えば、セファロースビーズまたはプラスチックウェルの底部）を抗原でコーティングし、そして血清および／または血漿を、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンが結合する条件下で抗原コーティングされた表面上に通過させることによるものであることができる。結合した抗体を、プロテアーゼ（例えば、パパイン）または免疫グロブリンのヒンジ領域付近を特異的に切断する化学的タンパク質切断試薬で処理して非接着Ｆｃ部分を除去してもよい。非結合の血清および／または血漿タンパク質（非特異的免疫グロブリンを含む）をすすいだ後、抗原特異的免疫グロブリンを集めることができ、そのため、その量は、抗原に特異的に結合しない抗体と比較して富化されている。
【００７３】
集めたポリクローナル抗体の観測質量スペクトル
観測（すなわち、実際の）質量スペクトルを得るため、集めたポリクローナル抗体（または、その断片）を、タンパク質分析方法（例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、など）によって分析する。
【００７４】
いくつかの実施態様において、観測質量スペクトル情報は、ポリクローナル抗体から生成したペプチド断片から得られる。ポリクローナル抗体は、例えば、１つまたはそれ以上のプロテアーゼおよび／または化学的タンパク質切断試薬、例えば臭化シアンを用いて断片化することができる。ある種のプロテアーゼは、特異的部位でそれらの基質を切断することが知られている。表１は、一般的に用いられるプロテアーゼおよびそれらの切断部位（３文字のアミノ酸コードで）の非包括的なリストを提供する。
【００７５】
【表１】
2018027090.tif 000002
【００７６】
タンパク質をより小さな断片に消化するために用いることができるプロテアーゼのより包括的リストは、RiviereおよびTempstの表１１．１．１および１１．１．３（Riviere LR, Tempst P. Enzymatic digestion of proteins in solution. Curr Protoc Protein Sci. 2001 May; Chapter 11:Unit 11.1. PubMed PMID: 18429101；全体として参照により本明細書に組み込まれる）に示されている。特定の実施態様では、多数の（すなわち、２つ又はそれ以上）プロテアーゼを用いて（例えば、独立してまたは一緒に）ポリクローナル抗体を消化してＶ領域包括度を最大にし、そして免疫グロブリンの高度に可変のアミノ酸組成を構成する。例えば、本明細書の実施例７に説明するように、キモトリプシン、エラスターゼ、ペプシンおよびトリプシンの組合せを用いることができる。いくつかの実施態様において、１つまたは複数のプロテアーゼは、それらが、遺伝物質データベースにおける核酸分子の分析に基づく予測ＣＤＲ３領域内で切断しないという基準において選択される。タンパク質は、タンパク質分解酵素よりむしろ特定の化学的タンパク質切断試薬を用いた処理によって質量分析に適した、より小さな断片に消化してもよい。例えば、G. Allen. Sequencing of Proteins and Peptides, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 9. Elsevier 1989の第３章を参照のこと。このような化学
的タンパク質切断試薬には、臭化シアン、ＢＮＰ−スカトール、ｏ−ヨードソ安息香酸、希酸（例えば、希ＨＣｌ）、などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば、タンパク質は、臭化シアンを用いてＭｅｔ残基のところで、シアニル化後にＣｙｓ残基のところで、ＢＮＰ−スカトールまたはｏ−ヨードソ安息香酸などを用いてＴｒｐ残基の後で、切断することができる。タンパク質断片は、希酸（例えば、ＨＣｌ）への暴露によって生成することもできる。質量分析によってタンパク質配列を決定する部分的酸加水分解の使用例は、Zhongら（全体として参照により組み込まれた、Zhong H, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16(4):471-81, 2005. PubMed PMID: 15792716）によって示されている。前出のZhongらは、質量分析によるシークエンシングのため、水中２５％トリフ
ルオロ酢酸によるバクテリオロドプシン断片へのマイクロ波アシスト酸加水分解を用いた。また、Wang N, and Li L., J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 21(9):1573-87, 2010.PubMed PMID: 20547072（全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００７７】
タンパク質は、質量分析により適したものにするために、１つのプロテアーゼで処理することによって、複数のプロテアーゼを組み合わせて処理するによって、化学的切断試薬で処理することによって、複数の化学的切断試薬を組み合わせて処理することによって、
またはプロテアーゼと化学的切断試薬との組合せで処理することによって、断片化することができる。反応は、高められた温度または高められた圧力で行ってもよい。例えば、Lpez-Ferrer D, et al., J. Proteome. Res. 7(8):3276-81, 2008. PubMed PMID: 18605748; PubMed Central PMCID: PMC2744211（全体として参照により組み込まれる）を参照のこと。断片化は、タンパク質が、消化試薬により切断可能であるすべての結合で切断されるように完了させることができる；または消化条件は、抗体可変領域配列の解読に特に役に立ちうるより大きな断片を産生するために、断片化が故意に完了しないように調整することができる；または消化条件は、タンパク質が部分的に消化されてドメインになるように、例えば、クレノー断片を作るためにE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行われるように調整してもよい。消化レベルを調節するために変更してもよい条件には、とりわけ、期間、温度、圧力、ｐＨ、タンパク質変性試薬の欠如もしくは存在、特異的タンパク質変性剤（例えば、尿素、グアニジンＨＣｌ、界面活性剤、酸切断可能な洗浄剤、メタノール、アセトニトリル、他の有機溶媒）、変性剤の濃度、切断試薬の量もしくは濃度または消化されるタンパク質に対するその質量比が含まれる。
【００７８】
いくつかの実施態様において、タンパク質を切断するために用いる試薬（すなわち、プロテアーゼまたは化学的タンパク質切断試薬）は、完全に非特異的試薬である。このような試薬を用いると、ペプチドのＮ末端、ペプチドのＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方で制約（constraint）がなくなることがありうる。例えば、ペプチド配列の両端ではなく一端またはもう一端でトリプシン切断部位を有するように制約された、部分的にタンパク質分解された配列を、本明細書に記載されたさまざまな方法に用いてもよい。
【００７９】
生成したペプチド断片は、観測質量スペクトルを生成する質量分析計に接続されたＨＰＬＣを用いて検出および分析することができる。この方法は、「ボトムアップ」プロテオミクスアプローチと称することもあり、その場合、タンパク質を比較的小さなペプチド、例えば、長さ３〜４５残基に小さくした後、プロテオーム成分を分離および同定する。
【００８０】
別の実施態様では、別法、「トップダウン」プロテオミクスアプローチを用いて観測質量スペクトルを得ることができ、それは、無傷のタンパク質または大きなタンパク質断片またはタンパク質ドメインまたは大きなポリペプチドの質量分析を含む。例えば、特定のポリクローナル抗体分子に特異的抗原認識をもたらす抗体可変領域の部分を同定するためには、ＣＤＲが一緒に結合したままである十分に大きな断片を直接分析することによって、可変領域の大きな部分を配列決定してそのＣＤＲを同定することが役立つ。
【００８１】
「ボトムアップ」および「トップダウン」戦略の両方を説明する総説については、Han X, Aslanian A, Yates JR 3rd. Mass spectrometry for proteomics. Curr Opin Chem Biol. 2008 Oct;12(5):483-90. Review. PubMed PMID: 18718552; PubMed Central PMCID: PMC2642903（全体として参照により組み込まれる）を参照のこと。抗体配列の決定に適用されるトップダウンプロテオミクスの最近の総説については、Zhang Z. et al., Mass Spectrom Rev. 2009 Jan-Feb;28(1):147-76. Review. PubMed PMID: 18720354（全体として参照により組み込まれる）を参照のこと。トップダウンプロテオミクスによるモノクローナル抗体の広範なシークエンシングを示す最近の論文については、Tsybin et al, Anal Chem. 2011 Oct 21. PubMed PMID: 22017162（全体として参照により組み込まれる）を参
照のこと。
【００８２】
上の非限定的な方法のいくつかの実施態様において、抗原特異的免疫グロブリンは、抗原コーティングされた表面に結合するのに対して、免疫グロブリンを、パパインまたはペプシンのいずれかで消化すると、それぞれＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）２断片を生成することができる。免疫グロブリン鎖可変領域の全体は、Ｆ（ａｂ）断片の鎖上にあるため、パパインおよび／またはペプシンによるこの前処理により、免疫グロブリン鎖可変領域に
ついて富化される。免疫グロブリンの非結合部分をすすいだ後、免疫グロブリン鎖可変領域を集めることができる。
【００８３】
免疫グロブリン断片を質量分析計に通過させた後、多くの観測質量スペクトルが生成される。しかし、ポリクローナル集団内の潜在的に多数の異なる免疫グロブリンが、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、それを質量分析計で分析するとすれば、生成した観測質量スペクトルは、機能性免疫グロブリン鎖可変領域にアセンブリングするには困難である。本発明のさまざまな実施態様の方法において、根底にある核酸配列（underlying nucleic
acid sequence）が利用できるため、観測質量スペクトルデータをアセンブリングする必要がない。そのかわりに、単一ペプチド断片の観測質量スペクトルを核酸配列の予測質量スペクトルと関連づけて、出発ポリクローナル免疫グロブリン集団から、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの全免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）のアミノ酸（および根底にあるヌクレオチド）配列を得ることができる。この関連づけステップを、以下にさらに記載する。
【００８４】
質量スペクトル情報に加えて、ポリクローナル抗体のペプチド断片から誘導されたさらなる情報は、本発明のさまざまな実施態様において有用である。この情報には、各ペプチドの質量、各ペプチドの長さ（アミノ酸残基中）、各ペプチドの観測質量スペクトル（例えば、ＭＳ２またはＭＳ３スペクトルのようなタンデム型質量分析から）、各ペプチドの質量電荷比、各ペプチドのイオン性電荷、各ペプチドのクロマトグラフィープロファイル、および各ペプチドのアミノ酸配列が限定されることなく含まれる。
【００８５】
質量分析
本発明の方法において、質量スペクトル情報は、集めた免疫グロブリンまたはそこから生成した断片の質量分析によって得ることができる。質量分析計は、研究者が未知の化合物を同定すること、既知の化合物を定量化すること、および分子の構造および化学的性質を解明することができる、個々のイオン化分子の質量電荷（ｍ／ｚ）比を測定可能な機器である。いくつかの実施態様では、サンプルを単離し、それを機器上へ装填することによって質量分析を開始する。装填したら、サンプルを気化し、次いでイオン化する。その後、磁場への暴露を経てその質量電荷比に従ってイオンを分離する。いくつかの実施態様では、セクター機器（sector instrument）を用い、そしてイオンが機器の電磁場を通過す
るときのイオン軌道の偏向の規模に従ってイオンを定量化し、それをイオン質量電荷比に直接関連づける。別の実施態様では、イオンが四重極子を通過したときに、または三次元もしくは線状イオントラップもしくはオービトラップ（Orbitrap）における、もしくはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計の磁場におけるイオンの運動に基づいて、イオン質量電荷比を測定する。機器は、各イオンの相対存在量を記録し、それを用いて最初のサンプルの化学的、分子的および／または同位体的組成を決定する。いくつかの実施態様では、飛行時間型機器を用い、そして電場を利用して同じ電位（potential）によ
りイオンを加速し、そして各イオンが検出器に達するのにかかる時間を測定する。このアプローチは、各イオンの運動エネルギーが同一となるように、各イオンの電荷を均一にすることに依存している。この場合、速度に影響を与える唯一の変数は、質量であり、より軽いイオンは、より大きな速度で移動し、結果的により速く検出器に達する。生成したデータは、質量スペクトルまたはヒストグラム、強度対質量電荷比で表され、ピークはイオン化化合物または断片を表す。
【００８６】
タンパク質サンプルの質量スペクトルデータを得るには、サンプルを機器に装填し、そしてイオン化する。イオン化は、例えばエレクトロスプレーイオン化およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）によって行うことができる。例えば、Zenobi, “Ion Formation in MALDI Mass Spectrometry”, 17 Mass Spectrometry Review,
337 (1998)を参照のこと。タンパク質の特徴づけは、２つのやり方、トップダウンまた
はボトムアップのうちの１つで行うことができる。トップダウンアプローチは、無傷のタンパク質またはより大きなタンパク質断片をイオン化すること含む。例えば、Allison Doerr, “Top-down Mass Spectrometry”, 5 Nature Methods, 24 (2008)を参照のこと。ボトムアップアプローチは、プロテアーゼを用いて酵素的または化学的にタンパク質をペプチド成分に消化することを含む。Biran Chait, “Mass Spectrometry: Bottom-Up or Top-Down?”, 6 Science 65 (2006)を参照のこと。生成したペプチドを機器に導入し、そし
て最終的にペプチドマスフィンガープリンティングまたはタンデム型質量分析によって同定する。
【００８７】
いくつかの実施態様では、質量分析を、クロマトグラフィー分別（例えば、液体クロマトグラフィー）と組み合わせてもよい。
【００８８】
本発明に有用な質量スペクトルデータは、ペプチドマスフィンガープリンティングによって得ることができる。ペプチドマスフィンガープリンティングは、タンパク分解によって生成したペプチド混合物のスペクトルからの観測質量をデータベースに入力すること、および観測質量を、インシリコでの（in silico）既知タンパク質の消化から生じる断片
の予測質量と関連づけることを含む。サンプル質量に相当する既知質量は、既知タンパク質が試験サンプル中に存在する証拠を提供する。
【００８９】
質量スペクトルデータは、タンデム型質量分析によって得ることができる。いくつかの実施態様において、タンデム型質量分析は、典型的に衡突誘起解離を利用し、ペプチドイオンをガスとおよび断片に衝突させる（例えば、衝突によってもたらされた振動エネルギーによる）。断片化プロセスにより、タンパク質に沿ったさまざまな部位のペプチド結合で切断された切断生成物を生じる。観測断片の質量を、得られた多くのペプチド配列の１つについて予測質量のデータベースと適合させてもよく、そしてタンパク質の存在を予測してもよい。例えば、Eng, 5 An Approach to Correlate Tandem Mass Spectral Data of
Peptides with Amino Acid Sequences in a Protein Database, JASMS, 976 (1994)を参照のこと。
【００９０】
別の実施態様では、タンデム型質量分析を、高エネルギー衝突誘起解離（ＨＣＤ）によって実施し、それは、質量分光計において、衝突誘起解離よりもペプチド末端により近い断片生成物イオンを示す。Olsen JV, Macek B, Lange O, Makarov A, Horning S, Mann M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nat. Methods. 2007 Sep;4(9):709-12. Epub 2007 Aug 26. PubMed PMID: 17721543を参照のこと。
【００９１】
別の実施態様では、タンデム型質量分析を、電子移動解離（ＥＴＤ）によって実施し、それはイオン−イオン反応に基づいており、ここでは、異なる化学的イオン試薬がペプチドイオンにラジカルを供与し、次いで、直ちに分解して生成物イオンを形成する。Mikesh
LM, Ueberheide B, Chi A, Coon JJ, Syka JE, Shabanowitz J, Hunt DF. The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis. Biochim Biophys Acta. 2006 Dec;1764(12):1811-22. Epub 2006 Oct 30. Review. PubMed PMID: 17118725; PubMed Central
PMCID: PMC1853258を参照のこと。特定の断片化方法、例えばＥＴＤは、特に「トップダウン」プロテオミクス戦略に適している。他の断片化機構は、特定のイオン化機構に特異的であり、例えば、ポストソース分解（ＰＳＤ）などは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）と適合性があり、そして「トップダウン」プロテオミクス戦略にも適している。
【００９２】
遺伝物質データベース
本発明によれば、出発ポリクローナル免疫グロブリン集団からの免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）のアミノ酸（および根底にあるヌクレオチド）配列
を得るために、出発ポリクローナル免疫グロブリン集団からの観測質量スペクトル情報を、遺伝物質データベースから誘導した予測質量スペクトル情報と関連づける。
【００９３】
本明細書に用いるように、遺伝物質データベースは、複数の免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸配列を含む。したがって、このような遺伝物質データベースから得るまたは誘導することができる情報は、例えば、各核酸分子のヌクレオチド配列情報、各核酸分子の長さ（ヌクレオチド中）、各核酸分子によってコードされたポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列情報、各核酸分子によってコードされたポリペプチドまたはペプチドの質量、各核酸分子によってコードされたポリペプチドまたはペプチドの長さ（アミノ酸残基中）、各核酸分子によってコードされたポリペプチドまたはペプチドの質量スペクトル情報（例えば、ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列に基づく予測質量スペクトル情報）、および各核酸分子によってコードされたポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列を含む。
【００９４】
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝物質データベースは、完全長免疫グロブリン鎖（そしてちょうどその可変領域でない）をコードする核酸配列の遺伝情報を含む。いくつかの実施態様において、核酸配列は、前記配列が誘導された細胞によって発現される（すなわち、ＲＮＡに転写されるおよび／またはタンパク質に翻訳される）。特定の実施態様において、遺伝物質データベースは、動物からの多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域をコードする、発現された核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝物質データベースは、少なくとも１００個の異なる発現された核酸配列を含む。別の実施態様において、遺伝物質データベースは、少なくとも１，０００個の異なる発現された核酸配列を含む。
【００９５】
免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子は、Ｂリンパ球を含む細胞（例えば、末梢白血球）の集団から容易に入手可能である。いくつかの実施態様において、核酸分子は、脾細胞または単核細胞（例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））から得られる。いくつかの実施態様において、Ｂリンパ球は、実験未使用の動物（例えば、抗原特異的抗体が探索される抗原に暴露されたことがない動物）由来である。いくつかの実施態様において、実験未使用の動物は、極めて少しの抗原にしか暴露されていない（例えば、滅菌または病原体のいない環境で飼育された動物）。いくつかの実施態様において、実験未使用の動物は、典型的な抗原に暴露されたことがあるが、選択の抗原に暴露されたことがない典型的な動物である。
【００９６】
いくつかの実施態様において、免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子が得られる動物は、以前に抗原に暴露された動物である。例えば、動物は、抗原（例えば、アジュバントと混合された抗原、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような免疫原性キャリアに結合した抗原）で免疫化された動物であってもよく、抗原を含む病原体に感染した動物（例えば、選択抗原がＨＩＶｐ２４抗原であるときに、ＨＩＶウイルスに感染した動物）であってもよく、または別のやり方で以前に抗原に暴露されていてもよい。いくつかの実施態様において、動物は、鳥類（例えば、ニワトリまたはシチメンチョウ）または哺乳動物、例えば霊長類の動物（例えば、ヒトまたはチンパンジー）、齧歯動物（例えば、マウス、ハムスター、またはラット）、ウサギ目の動物（例えば、ウサギまたはノウサギ）、ラクダ科の動物（例えば、ラクダまたはラマ）、または伴侶動物のような飼いならされた哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、またはウマ）、または家畜動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、またはウシ）である。
【００９７】
さまざまな態様および本発明の実施態様の核酸配列は、単一の動物に由来する必要はないことを理解しなければならない。例えば、本発明のさまざまな実施態様のいくつかの核酸配列は、以前に抗原に暴露された動物由来であってもよく、そしていくつかの核酸配列
は、実験未使用の動物由来であってもよい。本発明のいくつかの実施態様において、核酸配列は、単一の種の動物由来である。例えば、核酸配列が得られる動物が、多数いる場合、それらの動物は、すべて同じ種であってもよい（例えば、すべてウサギである、またはすべてヒトである）。いくつかの実施態様において、核酸配列は、単一種の動物から得られる。別の実施態様では、複数種の動物から核酸配列を得てもよい。例えば、核酸配列をマウスおよびラットから得てもよく、そしてこれらの配列からに基づく予測質量スペクトルを用いて、ポリクローナル抗体のペプチド断片の実際の質量スペクトル情報と関連づけておよび／または比較して、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン（または可変領域、抗原結合ドメイン、もしくはその鎖）を作製することができる。いくつかの実施態様において、核酸配列は、一方の性別の動物から得られる（例えば、すべての動物はメスである）。
【００９８】
ポリクローナル抗体が集められる動物および核酸配列が集められる動物は、同じ動物、または同種の動物、または同系の動物（例えば、両方ともＢａｌｂ／ｃマウスである）、または同じ性別の動物（例えば、両方ともメス動物である）であってもよい。したがって、抗原結合性抗体をコードする核酸配列を同定するために、ポリクローナル抗体の抗原結合性成分からのＭＳ２スペクトルを、動物から得た核酸配列から誘導された理論ＭＳ２スペクトルと関連づけることができる。
【００９９】
また、核酸配列およびポリクローナル抗体は、動物の細胞から集めることができ、その場合、細胞を動物から取り出した後、ならびにポリクローナル抗体を（例えば、培養細胞の上清または培養培地から）集める前、および細胞から核酸配列を集める前に、細胞をin
vitroで培養することを理解しなければならない。この培養ステップは、例えば、他の血液または組織細胞と比較してＢリンパ球を拡大または富化する（例えば、赤血球または上皮細胞よりもＢリンパ球を富化する）のに有用である。本発明のさまざまな実施態様において理論質量スペクトルを作製するために用いる個々の核酸配列の数は、制限がない。例えば、５もしくは１０もしくは５０、または１００、または１０００、または１００万、または１０億、または１兆またはそれ以上の異なる核酸配列を得ることができ、そしてそれを用いて理論質量スペクトルを作製することができる。核酸配列は、任意のソースに由来してもよく、そしてソースの組合せからであってもよい。例えば、核酸配列は、本明細書に記載した免疫グロブリン鎖可変領域をコードする、発現された核酸分子（または、可変領域および定常領域を含む完全長免疫グロブリン鎖全体）をシークエンシングすることによって得ることができる。また、核酸配列は、十分なＶ（Ｄ）Ｊ組換えを受けたことがあってもよい、またはなくてもよいゲノムＤＮＡから得ることもできる。また、核酸配列は、公的に入手可能なソースから得ることもできる。例えば、多くの動物種からの免疫グロブリン鎖可変領域（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の多くのアミノ酸配列（およびヌクレオチド配列）が知られている（例えば、以下のＵＳおよびＰＣＴ特許公報（発行された米国特許を含む）を参照し、それらは、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる：ＵＳ２０１０００８６５３８；ＷＯ２０１０／０９７４３５；ＵＳ２０１００１０４５７３；ＵＳ７，８８７，８０５；ＵＳ７，８８７，８０１；ＵＳ７，８４６，６９１；ＵＳ７，８３３，７５５；ＵＳ７，８２９，０９２。
【０１００】
核酸配列が得られるＢリンパ球は、骨髄、胎児血、胎児肝臓、炎症部位（例えば、リウマチ様患者の炎症を起こした関節を囲んでいる滑液）、腫瘍（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）、末梢血、リンパ節中、パイエル板中、扁桃腺中、および脾臓中、または任意のリンパ系器官中を含むが、それらに限定されない任意の血液または組織ソースからであることができる。いくつかの実施態様では、組織全体（例えば、骨髄またはリンパ節）を処理して（例えば、細胞を互いに分離し、そして溶解する）、遺伝物質を取り出し、そして免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子をシークエンシングすることができる。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、Ｂリンパ球から遺伝物質を単離する前に、Ｂリンパ球を含む、組織または細胞の集団（例えば、末梢血）から、Ｂリンパ球を富化する。本発明のさまざまな実施態様によれば、動物からのＢリンパ球を富化する方法は、よく知られている。Ｂリンパ球は、骨髄、胎児血、胎児肝臓、炎症部位（例えば、リウマチ様患者の炎症を起こした関節を囲んでいる滑液）、腫瘍（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）、末梢血、リンパ節中、および脾臓中を含むが、それらに限定されない、多くの器官および体の領域に見いだすことができる。これらの組織サンプル（例えば、末梢血または動物の脾臓）から、標準方法に従って白血球を単離してもよい（例えば、GE Healthcare, Piscataway, NJから商
業的に入手可能なFicoll-Paque PLUSまたはFicoll-Paque PREMIUM試薬を用いて製造元の
説明書に従って）。次いで、例えば、Ｂリンパ球上に見いだされる細胞表面マーカーを用いて、他の白血球からＢリンパ球自体をさらに単離することができる。Ｂリンパ球細胞表面マーカーには、細胞表面で発現された免疫グロブリン鎖（例えば、ラムダ軽鎖、カッパ軽鎖および重鎖、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらなるＢリンパ球細胞表面マーカーには、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ１３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７２、およびＣＤ７９Ａが含まれるが、それらに限定されるわけではない。なおさらなるＢリンパ球細胞表面マーカーには、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＤＰＰ４、ＦＣＥＲ２、ＩＬ２ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ｂ、ＣＲ２、ＩＬ１Ｒ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＭＳ４Ａ１、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１３８、およびＣＨＳＴ１０が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０２】
これらのＢリンパ球表面マーカーを、逐次的に用いてＢリンパ球について富化することができる。例えば、Ｂリンパ球細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１９）に特異的な抗体を磁性ビーズ（例えばInvitrogen Corp., Carlsbad, CAから商業的に入手可能なDynabeads
）、および非ＣＤ１９発現細胞から単離された、ビーズに接着している細胞（例えば、ＣＤ１９陽性細胞）に結合させることができる。Ｂリンパ球は、例えば、その細胞表面で免疫グロブリン鎖を発現する細胞のフローサイトメトリーソーティング（flow cytometry sorting）によってＣＤ１９陽性細胞からさらに富化することができる。したがって、これらの富化Ｂリンパ球は、本発明のさまざまな実施態様の方法に使用するために単離することができる。
【０１０３】
また、抗原特異的Ｂリンパ球は、抗原特異的Ｂ細胞受容体（膜免疫グロブリン）を発現するＢ細胞を単離するベイト（bait）として所望の抗原を用いて直接精製することもできる。例えば、Ｂ細胞を、所望の抗原が接着されたカラムに加えることができる。抗原特異的Ｂ細胞は、非特異的Ｂ細胞または他の細胞（例えば、赤血球、マクロファージ、など）よりゆっくりカラムの中を流れる。したがって、この方法を用いて、抗原特異的Ｂ細胞を富化することができる。
【０１０４】
動物からの富化または非富化Ｂリンパ球（例えば、さまざまな方法によって富化される）は、核酸抽出前に１日または２日または３日または４日またはそれ以上の日数の間、in
vitroで細胞培養にかけることもできる。このようなin vitro培養によりＢリンパ球の数を拡大してもよく、したがって、非Ｂリンパ球細胞よりもＢリンパ球が富化される。１つの非限定的な例において、Ｂリンパ球からの核酸抽出前にＢリンパ球の増殖および／または分化を刺激するために、核酸抽出前に、ＣＤ２７単離ヒトＢリンパ球をさまざまなサイトカインおよび細胞外分子カクテル（例えば、限定されるわけではないが、活性化Ｔ細胞馴化培地、またはＢ細胞増殖、および／もしくは分化因子の任意の組合せ）にさらすことができる。また、in vitro培養中に、他の生物学的分子を組織培地に加えて、増殖、分化、および／またはin vitro免疫化および／または上記の任意の組合せを助けることもできる。
【０１０５】
これらの単離された、富化された、または刺激されたＢリンパ球から、標準方法（例えば、フェノール：クロロホルム抽出；Ausubel et al.,前出参照）を用いて核酸配列（例
えば、ゲノムＤＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、など）を抽出することができる。次いで、シークエンシングのためのさまざまな方法を用いて、この核酸をシークエンシング分析にかけることができる。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、核酸配列を、生物学的物質から直接（すなわち、シークエンシングの前に増幅することなしに）シークエンシングすることができる。核酸配列から直接シークエンシングするためのサービスおよび試薬は、例えば、Helicos BioSicences Corp.（Cambridge, MA）から商業的に入手可能である。例えば、Helicos' True Single Molecule Sequencingは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡの直接シークエンシングが可能である。また、米国特許第７，６４５，５９６号；同第７，０３７，６８７号、同第７，１６９，５６０号；ならびに刊行物Harris et al., Science 320: 106-109, 2008; Bowers et
al., Nat. Methods 6: 493-494, 2009; および Thompson and Milos, Genome Biology 12: 217, 2011（それらの特許および刊行物は、すべてそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１０７】
別の実施態様では、配列情報を得る前に、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって）核配列を増幅する。
【０１０８】
非限定的な１つの例では、ＲＴ−ＰＣＲのために、オリゴｄＴ ＰＣＲプライマーを用
いる。別の非限定的な例において、遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲは、本明細書に記載したＰＣＲプライマー、例えば４５４特異的融合マウスプライマー、４５４ウサギ免疫グロブリン鎖融合プライマーまたは可変重鎖および可変軽鎖領域プライマーを用いて実施する。別の例において、マウスの重鎖および軽鎖集団に対するＰＣＲプライマーは、参照により本明細書に組み込まれたＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０９７４３５号に記載された配列を有する。
【０１０９】
Ｂ細胞富化を用いてまたはなしで、精製された遺伝物質（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を、ＮＧＳシークエンシング前に、標準方法（例えば、Ausubel et al.,前出参照）に従って
、増幅（例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって）してライブラリーを作製することができる。
【０１１０】
また、さまざまな手段によって単離された上記Ｂリンパ球は、油乳剤カプセル化のような当分野の方法を用いることによって、またはRainDance technology（RainDance Technologies, Inc., Lexington, MA）のような市販機器によって、単一細胞カプセル化にかけ
ることもできる。次いで、これらのカプセル化Ｂリンパ球を、適当な増幅プライマーと共に適当な単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ試薬（例えば、Cat # 210210としてQiagenによって販売された試薬）と融合させて、それぞれ単一のＢ細胞から、結合された重鎖および軽鎖ＰＣＲ生成物を生成することができる。ライゲーションまたはオーバーラップＰＣＲは、当分野で知られており、そして２つのＤＮＡ断片を１つにまとめるさまざまな分子生物学的用途で日常的に行われている（例えば、オーバーラップＰＣＲについては、Meijer P.J. et al., J. Mol. Biol. 358(3):764-72, 2006を参照のこと）。このアプローチは、シークエ
ンシング中に同種の対形成の保存および同定が可能である。
【０１１１】
ＤＮＡシークエンシング法
本発明のさまざまな実施態様の核酸配列を得るには、当分野でよく知られており、かつ一般に利用可能なＤＮＡシークエンシングの方法を用いてもよい。その方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、SEQUENASE（R）（US Biochemical Corp, Cleveland, Ohio
）、Ｔａｑポリメラーゼ（Invitrogen）、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（Amersham, Chicago,
Ill.）、ＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４から）または組換えポリメラーゼとプルーフリ
ーディングエキソヌクレアーゼとの組合せ、例えばGibco BRL（Gaithersburg, Md.）によって販売されたELONGASE Amplification Systemといったような酵素を用いてもよい。そ
のプロセスは、Hamilton Micro Lab 2200（Hamilton, Reno, Nev.）、Peltier Thermal Cycler（PTC200; MJ Research, Watertown, Mass.）およびABI 377 DNAシーケンサー（Applied Biosystems）のような装置で自動化してもよい。
【０１１２】
核酸分子をシークエンシングして本発明のさまざまな実施態様の核酸配列を生成する（例えば、遺伝物質データベースを入力する）非限定的な方法には、サンガー法（Sanger method）（例えば、Sanger et al, Nature 24: 687-695, 1977参照）、マクサム・ギルバ
ート法（Maxam-Gilbert method）（例えば、Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564, 1977参照）、およびパイロシークエンシング（例えば、Ronaghi et al., Science 281 (5375): 363, 1998およびRonaghi et al., Analytical Biochemistry 242 (1): 84, 1996参照）が含まれる。ポリヌクレオチド配列を得るために用いることが
できる別の非限定的なシークエンシング法、パイロシークエンシングは、新生ＤＮＡに加えられた個々のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＣＴＰのいずれか、まとめて「ｄＮＴＰ」）を検出するために、ルシフェラーゼを用いて光を発生させ、そして合わせたデータを用いて配列読み出しを生成する。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、大規模シークエンシングまたは次世代シークエンシングを用いて核酸配列を得る。従来のＤＮＡシークエンシングにおける１つの律速段階は、ランダムに終結されたＤＮＡポリマーを、ゲル電気泳動によって分離する必要性から生じる。次世代シークエンシング装置は、例えば、固体表面上にＤＮＡ分子を物理的に配列し、そしてゲル分離の必要なしにその場でＤＮＡ配列を決定することによってこの制限を回避する。これらのハイスループットシークエンシング技術は、非常に多くの核酸分子を並行してシークエンシング可能である。
【０１１４】
したがって、数千または数百万の異なる核酸分子を、同時にシークエンシングすることができる（Church, G.M., Sci. Am. 294 (1): 46-54, 2006; Hall, N., J. Exp. Biol. 210(Pt. 9): 1518-1525, 2007; Schuster et al., Nature Methods 5(1): 16-18, 2008; 
および MacLean et al., Nature Reviews Microbiology 7: 287-296, 2009参照）。次世
代シークエンシングを実施するためのさまざまな異なる方法および装置が存在し、そのいずれかは、核酸配列を生成するために用いることができる。多くの次世代シークエンシング技術の概要については、Lin et al., Recent Patents on Biomedical Engineering 1:60-67, 2008を参照のこと。
【０１１５】
例えば、Shendure, J. et al., Science 309(5741): 1728-32, 2005および米国特許公
開第２００７００８７３６２号は、ライゲーションベースのシークエンシング法を用いるポロニー次世代シークエンシング法を記載している（また、米国特許第５７５０３４１号参照）。Applied Biosystems（LifeTechnolgies Corp. company, Carlsbad, CA）から商
業的に入手可能なＳＯＬｉＤ技術は、ライゲーションによるシークエンシングを用いる。ＳＯＬｉＤ技術を用いると、シークエンシングされるＤＮＡ断片のライブラリーが、エマルジョンＰＣＲによって増幅され、そしてライブラリー中の多数の断片のうち、単一の断片種が、単一の磁性ビーズ（いわゆるクローンビーズ）に結合される。磁性ビーズに結合された断片は、すべての断片の出発配列が知られており、かつ同一であるように、結合された汎用Ｐ１アダプター配列（universal P1 adapter sequence）を有する。次いで、ラ
イブラリーテンプレート内でＰ１アダプター配列にハイブリダイズされたプライマーが選択される。一組の四重蛍光標識ジ−ベースプローブ（a set of four fluorescently labeled di-base probes）は、シークエンシングプライマーへのライゲーションについて競合
する。ジ−ベースプローブの特異性は、各ライゲーション反応における第１および第２のベースごとに調べることによって達成される。
【０１１６】
別の次世代シークエンシング法である、Margulies et al., Nature 437: 376-380, 2005および米国特許第７，２１１，３９０号；同第７，２４４，５５９号；および同第７，
２６４，９２９号のものは、油溶液中の水滴内でＤＮＡを増幅する（エマルジョンＰＣＲ）パイロシークエンシングのパラレル処理バージョンを記載しており、各液滴は、単一プライマーコーティングビーズに結合された単一のＤＮＡテンプレートを含む。シークエンシング装置（454 Life Sciences, a Roche company, Branford, CTから商業的に入手可能であるGenome Sequencer FLX System装置）を用いて、オリゴヌクレオチドアダプターを
、断片化された核酸分子に結合し、次いで、油−液滴エマルジョン中のＰＣＲ増幅前に、微小ビーズの表面に固定化する。ビーズを、それぞれ単一ビーズ、シークエンシング酵素およびｄＮＴＰを含む、ピコリットル体積の多数のウェル中に単離する。相補鎖へのｄＮＴＰの組込みによりピロリン酸塩が放出され、それがＡＴＰを産生し、さらにそれが光を生成し、分析用の画像としてその時点で記録することができる。
【０１１７】
米国特許第７,１１５,４００号は、核酸分子を固相増幅する別の技術を記載している。これは、多数の異なる核酸配列を、同時に配列および増幅することが可能である。この技術は、Solexa（Illumina, Inc.）から商業的に入手可能なGenome Analyzerシステムに具
体化されている。この技術では、まず、ＤＮＡ分子をスライドガラス上のプライマーに結合させ、そして局所クローンコロニーが形成されるように増幅する（ブリッジ増幅（bridge amplification））。４タイプのｄｄＮＴＰを加え、そして、組み込まれてないヌクレオチドを洗浄する。パイロシークエンシングと異なり、ＤＮＡは、一度に１ヌクレオチドしか延長することができない。蛍光標識ヌクレオチドの画像をカメラで撮影し、次いで３’末端ブロッカーと共に色素をＤＮＡから化学的に除去すると、次のサイクルが可能になる。
【０１１８】
免疫グロブリン鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列を利用し、そしてプロモーターおよび調節要素のような上流配列を検出する当分野で知られたさまざまな方法を用いて延長してもよい。例えば、使用してもよい１つの方法、「制限部位（restriction-site）」ＰＣＲは、汎用プライマーを用いて、既知の遺伝子座に隣接した未知の配列を読み出す（Sarkar, G., PCR Methods Applic. 2: 318-322 (1993)）。特に、ゲノムＤＮＡを、まず、リンカー配列へのプライマーおよび既知領域に特
異的なプライマーの存在下で増幅する。例となるプライマーは、本明細書の実施例４に記載されたものである。次いで、増幅された配列を、同じリンカープライマーおよび最初のものに対して内側の別の特異的プライマーを用いて、ＰＣＲの第２ラウンドにかける。ＰＣＲの各ラウンドの生成物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、そして逆転写酵素を用いてシークエンシングする。
【０１１９】
また、インバースＰＣＲを用い、既知領域に基づく分岐プライマーを用いて配列を増幅または延長してもよい（Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16: 8186 (1988)）。OLIGO 4.06 Primer Analysisソフトウェア（National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.）または別の適当なプログラムを用いて長さ２２〜３０ヌクレオチドとなるように、５０％またはそれ以上のＧＣ含量を有するように、および約６８〜７２℃の温度でターゲット配列にアニールするように、プライマーを設計してもよい。その方法は、いくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知の領域に適した断片を生成する。次いで、断片を分子内ライゲーションによって環状にし、そしてそれをＰＣＲテンプレートとして用いる。
【０１２０】
使用してもよい別の方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接したＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む捕捉ＰＣＲ（capture PCR）である（Lagerstrom et al., 
PCR Methods Applic. 1: 111-119 (1991)）。この方法では、複数の制限酵素消化および
ライゲーションを用いて、設計された二本鎖配列をＤＮＡ分子の未知の部分に配置した後、ＰＣＲを実施してもよい。未知の配列の読み出しに用いてもよい別の方法は、Parker et al., Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060 (1991)）に記載されたものである。さらに、ＰＣＲ、ネスト化プライマーおよびPROMOTERFINDER（R）ライブラリーを用いてゲノムＤ
ＮＡに入ってもよい（Clontech, Palo Alto, Calif.）。この方法は、ライブラリーをス
クリーニングする必要がなく、そしてイントロン／エキソン境界を見いだすのに有用である。
【０１２１】
シークエンシングの前に、Ｂリンパ球からの核酸を、免疫グロブリンをコードするそれらの核酸分子について、さらにスクリーニングしてもよいことを理解しなければならない。これを行うには、免疫グロブリンをコードする核酸分子に特異的な（または、それに隣接する領域に特異的な）プライマーを用いてもよい。
【０１２２】
本明細書に用いるように、「プライマー」とは、少なくとも約１５個のヌクレオチド、または少なくとも約２０個のヌクレオチド、または少なくとも約３０個のヌクレオチド、または少なくとも約４０個のヌクレオチドの長さであってもよい核酸配列を意味する。特定の核酸分子に特異的であるプライマーは、ＰＣＲアニーリング条件下（例えば、６０℃３０秒間）で核酸分子の一部にハイブリダイズするプライマーを含むことを意味する。いくつかの実施態様において、特定の核酸分子に特異的なプライマーは、その核酸分子に相補的であるものである。
【０１２３】
核酸配列のシークエンシングに用いるプライマーは、シークエンシングプライマーと称してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってターゲット核酸配列の増幅に用いられるプライマーは、ＰＣＲプライマーまたは増幅プライマーと称してもよく（例えばSambrook et al.、前出、およびAusubel et al.、前出のＰＣＲの説明を参照のこと）、そ
の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
本発明のさまざまな実施態様による核酸配列を得るための１つの非限定的な例では、Ｂリンパ球からの全核酸を、（例えば、核酸を９４〜９８℃に少なくとも１分間加熱することによって一本鎖にしてもよい。次いで、免疫グロブリンをコードする核酸分子非可変領域またはそれに隣接する非コード領域（例えば、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、エンハンサー、および／またはイントロン）に特異的である一本鎖プライマーが接着された固体支持体（例えば、カラムまたはゲル）上に、一本鎖の核酸を通過させてもよい。免疫グロブリンのこれらの非可変領域のいくつかの非限定的な例には、重鎖の定常領域、および軽鎖の定常領域、および重鎖または軽鎖のＦＲ１領域が含まれる。核酸を、固相支持体に結合したプライマーにハイブリダイズさせ、そして非ハイブリダイズ核酸を除去する。除去後、ハイブリダイズされた核酸（それは免疫グロブリンをコードする核酸分子について富化される）を、例えば、熱を加えるか、または緩衝液中のＥＤＴＡの濃度を高めることによって、プライマーから解放する。
【０１２５】
本発明の別の実施態様において、Ｂリンパ球から核酸が免疫グロブリンをコードする核酸分子について富化されたかどうかにかかわらず、免疫グロブリンをコードする核酸分子を増幅してそのコピー数を高めてもよい。この増幅は、例えば、免疫グロブリンをコードする核酸分子の非可変領域またはそれに隣接する非コード領域に特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって実施することができる。
【０１２６】
本発明のさまざまな実施態様による核酸配列を得るための上の方法のすべてにおいて、免疫グロブリン鎖可変領域をコードする核酸配列を生成するために用いられるプライマー（例えば、シークエンシングまたはＰＣＲプライマー）は、汎用（例えば、ｐｏｌｙＡ尾
部）でもよく、または免疫グロブリンをコードする配列に特異的であってもよいことが理解される。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、免疫グロブリン遺伝子をコードする核酸配列情報が得られる出発物質は、ゲノムＤＮＡである。例えば、免疫グロブリン鎖可変領域がヒトからである場合、プライマー（例えば、シークエンシングプライマーおよび／またはＰＣＲプライマー）は、免疫グロブリン鎖遺伝子プロモーターと同一であるように選択してもよいし、またはそれにハイブリダイズしてもよい。例えば、ヒトゲノム配列は知られている。重鎖をコードする遺伝子は、染色体１４に存在し、そして軽鎖をコードする遺伝子は、染色体２２（ラムダ軽鎖）および２（カッパ軽鎖）に存在するため、重鎖をコードする遺伝子および軽鎖をコードする遺伝子の調節要素にハイブリダイズするプライマーを設計することは、通常の知識を有する生物学者にとってのルーチンである。このような調節する要素には、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１２８】
マウスのカッパ軽鎖遺伝子は染色体６にあることが知られており、そしてマウスの重鎖遺伝子は染色体１２にあることが知られているため、マウス免疫グロブリンについて、免疫グロブリン可変領域特異的プライマーを、同様に容易に決定することができる。
【０１２９】
別の非限定的な実施態様において、免疫グロブリン遺伝子をコードする核酸配列情報が得られる出発物質は、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから逆に翻訳されたｃＤＮＡである。この例において、免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列を得るには、プライマーを、ｍＲＮＡのｐｏｌｙＡ尾部またはｍＲＮＡの対応するｃＤＮＡの相補的ＴＴＴＴ（配列番号：３０６）リッチ配列と同一であるよう選択するか、または、それらにハイブリダイズさせることができる。別法として、またはさらに、プライマーを、ＦＲ１をコードする核酸配列と同一であるように選択するか、またはそれにハイブリダイズさせることもできる。別法として、またはさらに、プライマーを、ＣＨ領域（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）のものの一部（または全部）および／またはＶＨ領域をコードする核酸配列と同一であるよう選択するか、またはそれらにハイブリダイズさせることもできる。
【０１３０】
ハイブリドーマからの免疫グロブリンをコードする核酸分子をシークエンシングするために、汎用縮重プライマーを用いることからシークエンシング誤差が生じることがある。例えば、Essono et al, Protein Engineering, Design and Selection, pp. 1-8, 2009は、ハイブリドーマクローンによって産生されたモノクローナル抗体の正しい配列を決定するために、シークエンシングを対応するＩｇ鎖のペプチド質量分析フィンガープリンティングと組み合わせる方法を記載している。しかし、本発明のさまざまな実施態様の非限定的な方法において、シークエンシング誤差の存在は、単に異なる核酸配列の数を高めるだけである。Essono et al.、前出と異なり、本発明のさまざまな実施態様の方法は、抗体
の出発ポリクローナル集団から、単一抗体（重鎖および軽鎖の両方またはそれらの可変領域）の作製が可能であるため（ここで、作製された抗体は、抗体の出発ポリクローナル集団内で実際に生じなくてもよい）、ペプチドデータベースの観測質量スペクトルデータを関連づける遺伝物質データベース中に多数の配列を有することは、長所である。
【０１３１】
遺伝物質データベースからの予測質量スペクトル情報
本発明のさまざまな実施態様によれば、核酸分子のヌクレオチド配列が生成されたら、ヌクレオチド配列情報のみに基づいて、さらなる情報を生成してもよい。例えば、遺伝コードを用いて、ヌクレオチド配列情報を予測アミノ酸配列に翻訳することができる。当業者は、遺伝コードを用いてヌクレオチド配列をアミノ酸配列に容易に翻訳することができるが、いくつかの自動化翻訳ツール（それらは、公的に入手可能である）、例えば、Swiss Institute of BioinformaticsからのExPASy翻訳ツールまたはEMBL-EBIからのEMBOSS Tr
anseq翻訳ツールを用いることができる。
【０１３２】
同様に、核酸配列によってコードされた予測アミノ酸配列の予測質量スペクトル情報は、当業者によって容易に決定することができる。例えば、核酸配列によってコードされた予測ポリペプチドの仮想的な（すなわち、インシリコ）消化に従って、Sequestソフトウ
ェア（Thermo Fisher Scientific, Inc., West Palm Beach, FLから）、Sequest 3Gソフ
トウェア（Sage-N Research, Inc., Milpitas, CAから）、Mascotソフトウェア（Matrix Science, Inc., Boston, MAから；またElectrophoresis, 20(18) 3551-67 (1999)参照）
、およびX!Tandemソフトウェア（The Global Proteome Machine Organizationからオープンソース、その使用は、Baerenfaller K. et al., Science 320:938-41, 2008に記載されている）を含むが、それらに限定されない標準の公的に入手可能なソフトウェアアルゴリズムツールを用いることによって、ペプチド断片の予測質量スペクトルを生成することができる。
【０１３３】
本明細書に用いるように、「予測の」、「理論的な」、および「仮想的な」という用語は、同じ意味で用いられ、核酸配列からの情報の、インシリコ（すなわち、コンピュータにおける）転写および／または翻訳（予測ヌクレオチドおよびアミノ酸配列について）またはインシリコ消化および／または質量分析（予測質量スペクトルについて）から誘導されたヌクレオチド配列、アミノ酸配列または質量スペクトルのことをいう。例えば、核酸配列は、本明細書に記載されたＢリンパ球から得られたゲノム核酸分子から誘導される。例えば、ゲノムＤＮＡから誘導されたｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡのインシリコ翻訳に従って予測される。次いで、この予測されたｍＲＮＡ（または、ｃＤＮＡ）をインシリコ翻訳して予測アミノ酸配列を生成してもよい。次いで、予測アミノ酸配列を、その時点でプロテアーゼ（例えば、トリプシン）および／または化学的タンパク質切断試薬（例えば、臭化シアン）でインシリコ消化して予測（または、理論または仮想）ペプチド断片を生成してもよい。次いで、仮想ペプチド断片をインシリコ分析して予測質量スペクトル情報を生成することができる。したがって、予測質量スペクトル情報、予測ペプチド断片、予測アミノ酸配列、および予測ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列は、すべて、Ｂリンパ球から（例えば、動物から）集めた核酸配列から誘導することができる。
【０１３４】
特定の実施態様において、予測ペプチド断片および最終的な予測質量スペクトルを生成する予測ポリペプチドを消化するために用いられるプロテアーゼおよび／または化学的試薬は、上記のように、ポリクローナル抗体の出発集団を消化するために用いたのと同じプロテアーゼおよび／または試薬である。
【０１３５】
観測質量スペクトルと予測質量スペクトルとの関連づけ
上記のように、抗体の出発ポリクローナル集団から誘導された断片を質量分析計に通過させると、多くの観測質量スペクトルを生成する。ポリクローナル集団内で潜在的に多数の異なる免疫グロブリンが、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、それらを質量分析計で分析するとすれば、生成した観測質量スペクトルを、機能性免疫グロブリン鎖可変領域にアセンブリングすることは困難である。本発明のさまざまな実施態様の方法では、コード核酸配列が入手可能であるため、観測質量スペクトルデータをアセンブリングする必要がない。そのかわりに、観測質量スペクトルを、遺伝物質データベースの核酸配列から誘導された予測質量スペクトルと関連づけて出発ポリクローナル免疫グロブリン集団から、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの完全長免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）のアミノ酸（および根底にあるヌクレオチド）配列を得る。
【０１３６】
また、上記のように、遺伝物質データベースは、完全長免疫グロブリン重鎖および軽鎖およびその可変領域をコードする核酸分子を含む、免疫動物のＢ細胞レパートリーから単離された核酸分子から誘導することができる。遺伝物質データベースからの情報（例えば
、可変領域配列の頻度ランキング）のみに基づいて抗原特異的免疫グロブリンをコードする核酸を同定する試みは、低頻度であるが著しく優れた抗原特異的活性を生じる、それらの免疫グロブリンを見落とすことがある。しかしながら、本発明のさまざまな実施態様に従って、遺伝物質データベースからの予測質量スペクトル情報を、本明細書に開示された実際の循環ポリクローナル抗体からの観測質量スペクトル情報と関連づけることによって、循環ポリクローナル抗体内の免疫グロブリンに対応する、遺伝物質データベース中のそれらの免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）を選択することができる。
【０１３７】
「関連づける」とは、出発ポリクローナル集団中の抗原特異的免疫グロブリンの免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖（またはその可変領域）に対応する遺伝物質データベースから、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖（またはその可変領域）を同定または選択することができるように、出発ポリクローナル抗体から誘導された観測質量スペクトル情報と遺伝物質データベースから誘導された予測質量スペクトル情報とを相互参照し、そして互いに比較することを意味する。
【０１３８】
特定の実施態様において、関連づけのプロセスは、観測質量スペクトル情報を予測スペクトル情報と比較してマッチを同定することを含む。例えば、観測スペクトルのそれぞれを、遺伝物質データベースから誘導された予測質量スペクトルのコレクションに対して探索することができ、それぞれの予測スペクトルを、遺伝物質データベースからのペプチド配列と特定的に（identifiably）関連させる。マッチが見いだされたら、すなわち、観測質量スペクトルが予測質量スペクトルにマッチしたら、それぞれの予測質量スペクトルは、遺伝物質データベース中のペプチド配列と特定的に関連しているため、観測質量スペクトルは、そのマッチングペプチド配列を見いだしたということになる。また、このようなマッチは、本明細書において「ペプチドスペクトルマッチ」または「ＰＳＭ」と称する。探索およびマッチングさせるスペクトルの数が多いため、この探索およびマッチングプロセスは、コンピュータ実行機能およびソフトウェア、例えばSEQUESTアルゴリズム（Sage-N Research, Inc., Milpitas, CA）によって実施することができる。
【０１３９】
いくつかの実施態様では、探索およびマッチングは、免疫グロブリンの機能性ドメインまたは断片、例えば可変領域配列、定常領域配列および／または１つまたはそれ以上のＣＤＲ配列に向けられる。例えば、観測スペクトルは、Ｖ領域（および／またはＣＤＲ３）ＰＳＭを同定するため、免疫グロブリンのＶ領域（および／またはＣＤＲ３配列）から誘導された予測質量スペクトルに対して探索されるだけである。別の実施態様において、探索およびマッチングは、完全免疫グロブリン重鎖または軽鎖配列に向けられる。
【０１４０】
探索およびマッチングが終了した後、遺伝物質データベース中の免疫グロブリン重鎖または軽鎖を、以下のパラメーターの１つ又はそれ以上に基づいて分析し、そして選択する：ユニークペプチドの数、スペクトル共有、アミノ酸配列包括度、ペプチドの計数（総ペプチド計数またはユニークペプチド計数のいずれか）、コード核酸配列の頻度、およびクローン関連性。
【０１４１】
配列または領域（例えば、重鎖または軽鎖配列、Ｖ領域配列またはＣＤＲ配列）に関する「包括度」という用語は、配列または領域にマップし、そしてマッチング観測スペクトルを有する、ペプチド中で同定された配列内のアミノ酸の総数を、配列または領域中のアミノ酸の数によって割ったものとして定義される。包括度が高いほど、配列または領域が、実際のポリクローナル集団中に現れる可能性が高い。
【０１４２】
「ユニークペプチドの数」とは、単一タンパク質配列（例えば、単一の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはそれらの可変領域）へのマッピングが観測された明確なペプチドの数を意味する。数が大きいほど、ポリクローナル集団中に免疫グロブリン鎖が存在する
可能性が高い。特定の実施態様において、免疫グロブリン鎖の選択は、免疫グロブリン鎖またはその可変領域中の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のユニークペプチドの数に基づいて行う。
【０１４３】
「スペクトル共有」は、配列にマップされたペプチドの総数を、全遺伝子データベースにマップされた確信的ＰＳＭの総数で割ることによって定義される。スペクトル共有は、特異的Ｖ領域配列にマップするＰＳＭのパーセンテージとして表されるペプチドのヒト読み込み可能な計数を提供する。
【０１４４】
タンパク質配列（例えば、ＣＤＲ３領域または可変領域）に関する「ペプチド計数」という用語は、ペプチドがタンパク質配列にマッチする観測質量スペクトルから同定された回数を意味する。例えば、ＣＤＲ３領域の計数は、ペプチドが、ＣＤＲ３領域にマッチする観測質量スペクトルから同定された回数を意味する。可変領域の計数は、ペプチドが、可変領域にマッチする観測質量スペクトルから同定された回数を意味する。タンパク質配列に関する「総ペプチド計数」は、任意のペプチド（ユニークまたは非ユニーク）が、タンパク質配列にマッチする観測質量スペクトルから同定された回数を意味する。「ユニークペプチド計数」は、ユニークペプチドが、タンパク質配列にマッチする観測質量スペクトルから同定された回数を意味する。同じペプチドが観測質量スペクトルから複数回同定された場合、このペプチドが観測された総回数は、総ペプチド計数を決定する際に考慮されるが、このペプチドは、ユニークペプチド計数を決定する際には１回しか計数されない。
【０１４５】
特定の実施態様において、免疫グロブリン重鎖または軽鎖は、配列包括度に基づいて選択する。別の実施態様において、選択は、配列包括度と、ユニークペプチドの数、スペクトル共有、総ペプチド計数、ユニークペプチド計数、コード核酸配列の頻度、またはクローン関連性を含む１つまたはそれ以上の他のパラメーターとの組合せに基づいて行う。
【０１４６】
上のパラメーターは、完全長重鎖または軽鎖に関して、または免疫グロブリン重鎖または軽鎖の１つまたはそれ以上の部分、例えば、可変領域、およびＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３、特にＣＤＲ３）に関して、独立して決定することができる。特定の実施態様において、免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）の選択は、Ｖ領域包括度および／またはＣＤＲ包括度（例えば、ＣＤＲ３包括度）に基づいて行う。
【０１４７】
免疫グロブリン重鎖または軽鎖（またはその可変領域）の選択は、１つまたはそれ以上のパラメーターの絶対値に基づいて、または関連パラメーターの絶対値のランキングに基づいて行うことができる。特定のパラメーターについてのランキングを考える場合、トップにランキングされた１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の配列は、そのパラメーターの絶対値にかかわりなく選択することができる。いくつかの実施態様において、パラメーターの値、例えば、配列包括度のパーセンテージを考える場合、免疫グロブリン鎖の選択は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％またはそれ以上のＣＤＲ包括度（例えばＣＤＲ３包括度）；さらに、または代わりに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％またはそれ以上のＶ領域包括度に基づいて行う。
【０１４８】
いくつかの実施態様では、系統発生的分析を実施して重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または１つもしくはそれ以上のＣＤＲのもの（例えば、ＣＤＲＨ３またはＣＤＲＬ３）のクローン関連性を決定する。生殖細胞系配列と比較した重鎖および軽鎖の核配列の変化または突然変異は、抗原暴露後の抗体の親和性成熟の証拠を提供することができる。クローン
関連性は、抗体配列の選択における因子として用いることができる。系統発生的分析は、当分野で知られた方法、例えば、Dereeper et al., 2008, Nucl. Acids Res., 36(Web Server issue):W456-459; Dereeper et al., 2010, BMC Evol. Biol., 10:8、およびwww.phylogeny.fr/version2_cgi/index.cgi.でオンライン入手可能に記載されたものによって実施することができる。いくつかの実施態様では、重鎖または軽鎖可変領域全体を相同性によって分類し、次いで、さらにＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）相同性によって分類する。
【０１４９】
次に、選択された重鎖および軽鎖配列を対で発現させてモノクローナル抗体にアセンブリングし、それを分析して抗原特異的機能を確認することができる。選択された重鎖および軽鎖配列の対形成は、完全にランダムであることができ、または配列包括度、ユニークペプチドの数、スペクトル共有、総ペプチド計数およびユニークペプチド計数を含む上記の１つもしくはそれ以上のパラメーターを考慮に入れることができる。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、特定のペプチド配列を有する抗体の集団の存在量は、重元素標識ペプチド（例えば、ＡＱＵＡ）を用いて決定することができる。例えば、WO 03/016861 および Gerber et al., 2003, 100:6940-45を参照のこと。これらの方法は、ペプチド標準に対する比較によって、生物学的サンプル中に同じ配列およびタンパク質修飾を有するペプチドの絶対量を決定するために、既知量の少なくとも１つの重元素標識ペプチド標準（それは、ＬＣ−ＳＲＭクロマトグラフィーによって検出可能なユニーク特徴を有する）を、消化された生物学的サンプルに導入することを用いる。ペプチドは、１種に抗体に対してユニークであることができ、または多数の（例えば、クローン関連の）抗体中に見いだされる。いくつかの実施態様において、ペプチドは、少なくともＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）の一部を含むことができる。抗体集団の存在量の定量化は、例えば、対象のワクチン接種後に、血清抗体組成物をモニタリングする方法において有用でありうる。
【０１５１】
本発明のさまざまな実施態様の非限定的な方法を用いてアミノ酸性配列（または、核酸配列）が作製された、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンは、免疫グロブリンの出発ポリクローナル集団内に実際に存在する必要がないことに留意する必要がある。むしろ、本発明のさまざまな実施態様の非限定的な方法は、その免疫グロブリンが出発ポリクローナル集団に実際に存在したかどうかに関わらず、単に、抗原を特異的に結合する免疫グロブリンを迅速に作製することができる。例えば、抗原または所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２ａ））について最も高い所望の品質（例えば、最も高い結合親和性（または、最も低いＫＤ）を有する作製された免疫グロブリンは、ポリクローナル集団中の第２の抗体（すなわち、第１の抗体と異なる）の重鎖を用いてアセンブリングされたポリクローナル集団中の第１の抗体からの軽鎖の結果であってもよい。出来上がった作製された免疫グロブリンを、標準方法に従ってさらに特徴づけることができる（例えば、抗原またはアイソタイプに対する結合親和性）。
【０１５２】
組換え抗体を作る方法
抗原に特異的に結合する抗体の免疫グロブリン鎖（または、その可変領域）のヌクレオチド配列が解明されたら、その配列を含む核酸分子を生成することができる。
【０１５３】
例えば、免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸分子が得られる出発集団がｃＤＮＡライブラリーである場合、解明された配列を含む核酸分子は、ライブラリーから（例えば、解明された配列の一部と同一であるか、またはそれとハイブリダイズ可能なプライマーを用いてライブラリーをスクリーニングすることによって）、または解明された核酸配列を増幅するために設計されたプライマーを用いてライブラリーからの核酸分子をＰＣＲ増幅することによって、容易に得ることができる。
【０１５４】
別法として（またはさらに）、解明されたヌクレオチド配列を含む核酸分子は、標準Ｄ
ＮＡ合成装置を用いて、単に核酸分子を人工的に生成することによって産生できる。多くのＤＮＡ合成装置は、BioAutomation, Plano, TXから入手可能なMerMadeシリーズの合成
装置（例えばMerMade 4、Mermade 6、MerMade 384、など）；Applied Biosystemsから商
業的に入手可能なさまざまなＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（今ではLife Technologies, Corp., Carlsbad, CAの一部）を含めて商業的に入手可能であるが、それらに限定されるわけではない。また、いくつかの会社は、ＤＮＡ合成サービスも提供している（例えば、BioPioneer、Bio S&R、Biomatik、Epoch BioLabs、など）。
【０１５５】
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする核酸を発現させて組換え免疫グロブリンを産生する方法は、知られている（例えば、米国特許第６，３３１，４１５号；同第５，９６９，１０８号；同第７，４８５，２９１号；ＵＳ２０１１−００４５５３４；およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１１／０２２０７７号）。組換え免疫グロブリンは、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、ハムスター細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、マウス細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）、霊長類の動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）、ヒト細胞（例えば、Ｈｅｌａ細胞）、および原核細胞（例えば、E. coli細胞）を含むが、それらに限定され
ないさまざまな細胞中で作ることができる。いくつかの実施態様において、本発明のさまざまな実施態様の組換え免疫グロブリンを発現する細胞は、免疫グロブリンが最初に誘導された種のそれと類似したやり方で、組換え免疫グロブリンに２次的修飾（例えば、グリコシル化）を加えることができる。例えば、その断片が観測質量スペクトルデータを生成するために用いられるポリクローナル抗体の集団を、ヒトから集める場合、ヒト細胞（またはタンパク質をヒト細胞と似たようにまたは同じようにグリコシル化する細胞）を用いることができる。
【０１５６】
細胞中で抗原に特異的に結合する組換え免疫グロブリン（または、その抗原結合断片）の核酸配列を発現させるには、核酸配列が導入された細胞中で、挿入された核酸配列が発現するように、核酸配列を、適当な調節配列を含むベクター（例えば、プラスミドまたはレトロウイルスベクター）に結合してもよい。このような調節配列には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン受容体要素、ポリアデニル化部位、などが含まれる。組換え免疫グロブリン（または、それを含むベクター）の核酸配列を細胞に導入するには、エレクトロポレーション、化学的手段（例えば、ＣａＰＯ４、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン）によるトランスフェクション、感染、形質導入、リポソーム融合、などを含むが、それらに限定されない任意の方法を用いることができる（例えば、前出のAusubel et al.の方法を参照のこと）。
【０１５７】
本発明のいくつかの実施態様によれば、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を、ランダムに選択して免疫グロブリン（または可変領域またはその抗体結合ドメイン）にアセンブリングする。例えば、ポリクローナル抗体のペプチド断片からの実際の質量スペクトルと、核酸配列によってコードされた予測ペプチドの予測質量スペクトルとの相関性を用いると、ペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖のヌクレオチド配列または予測アミノ酸配列が得られる。次いで、得られた免疫グロブリン鎖のヌクレオチド配列は、ランダムに、および／または無傷抗体の他の鎖をコードする、同様に得られた免疫グロブリン鎖の第２のヌクレオチド配列と共に、コードされた２つの免疫グロブリン鎖を、無傷抗体にアセンブリングする条件下で、共発現させることができる。
【０１５８】
無傷の免疫グロブリンがアセンブリングされるように、それぞれ免疫グロブリン鎖をコードする２つのヌクレオチド配列（例えば、細胞中）を共発現する条件は、知られている（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号；同第６，３３１，４１５号；同第７，４９８，０２４号；同第７，４８５，２９１号；および米国特許公開第２０１１００４５５３４号を参照し、すべてそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載された方法を用いて得ることができる異なるヌクレオチド配列の数のため、本発
明は、コードされた免疫グロブリンをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを作製するために、ロボット工学およびハイスループットな方法の使用を企図する。
【０１５９】
本明細書に用いるように、「アセンブリングする」または「アセンブリング」とは、２つの鎖が結合して抗体（またはその断片）を作製する手法で、抗体の軽鎖（またはその断片）と、抗体の重鎖（またはその断片）とを一緒に組み合わせることを意味する。いくつかの実施態様では、アセンブリングされた抗体（またはその断片）において、重鎖および軽鎖の両方からのアミノ酸残基は、アセンブリングされた抗体（またはその断片）の抗原結合ドメインに関与する。いくつかの実施態様において、アセンブリングされた抗体（またはその断片）は、重鎖（またはその断片）に共有結合した軽鎖（またはその断片）を含む。いくつかの実施態様において、アセンブリングされた抗体（またはその断片）は、重鎖（またはその断片）に非共有結合的に結合された軽鎖（またはその断片）を含む。
【０１６０】
いくつかの実施態様において、上記のプロテオミクス分析で同定された免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、組換え抗体のアセンブリー前に、組換え分子生物学的手法または遺伝子合成手法によって合成される。例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、アセンブリー前にヌクレオチドまたはペプチド合成装置において合成してもよい。あるいは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列を発現ベクター（例えばInvitrogen, Carlsbad, CAからのpCDNA3.1）中にクローニングし、そして発現ベクターでトランスフェクトされた細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、など）中でコードされたポリペプチドを発現することによって組換え発現させてもよい。いくつかの実施態様において、アセンブリーステップは、トランスフェクト細胞中で起こる（例えば、単一細胞を、１つの重鎖および１つの軽鎖をコードする核酸配列を含む、１つまたはそれ以上の発現ベクターでトランスフェクトし、ここで、重鎖および軽鎖は、トランスフェクト細胞中でポリペプチドとして発現される）。
【０１６１】
本発明のさまざまな実施態様では、組換え抗体を単離する。本明細書に用いるように、「単離した」（または「精製した」）とは、抗体が、自然に結合している他の生物学的物質を実質的に含まない、または誘導された他の生物学的物質、例えば、本発明の抗体を発現するために遺伝子組換えされた細胞を含まないことを意味する。例えば、単離された組換え抗体は、宿主細胞の他の成分から物理的に分離されたもの（例えば、小胞体または細胞質タンパク質およびＲＮＡ）である。同様に、血液の血清および／または血漿から精製された抗体は、他の血清または血漿成分（例えば、アルブミンまたは細胞）から単離された抗体である（例えば、プロテインＡに対する抗体の接着を用い、ここで、非抗体血清成分は、プロテインＡに接着しない）。したがって、本発明の単離された抗体（または単離された免疫グロブリン）には、少なくとも７０〜１００％純粋である抗体、すなわち、抗体が全組成物の７０〜１００質量％を構成する組成物中に存在する抗体が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の単離された抗体は、７５％〜９９質量％純粋、８０％〜９９質量％純粋、９０〜９９質量％純粋、または９５％〜９９質量％純粋である。本発明のさまざまな非限定的実施態様の抗体の相対的純度は、周知の方法によって容易に決定される。
【０１６２】
いくつかの実施態様では、組換え抗体（またはその可変領域）を、免疫測定法においてさらにスクリーニングまたは分析して、抗体が抗原に特異的に結合することを確認する。いくつかの実施態様において、免疫測定法は、標準免疫測定法、例えばフローサイトメトリーアッセイ（例えば、ＦＡＣＳスキャン）、酵素結合免疫吸着検定法（enzyme-linked immunosorbent assay）（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティングアッセイ（Western blotting assay）、免疫組織化学的アッセイ（immunohistochemistry assay）免疫蛍光測
定法（immunofluorescence assay）、放射免疫測定法（radioimmunoassay）、中和アッセイ（neutralization assay）、結合アッセイ（binding assay）、親和性アッセイ（affinity assay）、またはタンパク質もしくはペプチド免疫沈降アッセイである。これらの免
疫測定法は、すべてよく知られた標準アッセイであり、そして標準方法の書物（例えば、Ausubel et al.、前出；Coligan et al.、前出；Harlow and Lane、前出を参照のこと）
に詳しく記載されている。
【０１６３】
治療抗体
本発明のさまざまな非限定的な実施態様および方法は、例えば、治療価値を有する抗体の単離に有用である。例えば、病原体に対する動物の正常な免疫応答の経過において、病原体の抗原に最も高い特異性を有する抗体は、生じるのに数週間かかることがある。その理由は、動物のすべての有核細胞によって発現された主要組織適合性複合体に関して、抗体を産生するＢリンパ球が、抗原提示細胞上に提示された抗原も認識する適当なＴリンパ球によって、最初に刺激されなければならないためである。抗原に最初に反応するＢリンパ球は、特異的に抗原に結合する抗体を産生する。しかし、実際には、最も高い親和性抗体は、（細胞表面で発現された免疫グロブリンが、他の細胞表面抗原と複合体形成してＢ細胞受容体を形成することにより）その抗原に結合し、そしてＢ細胞受容体および他の細胞（Ｔリンパ球を含む）を通して刺激されると、親和性成熟を受けてその特異的抗原に対して高い親和性を有する抗体を産生するＢ細胞によって産生されたものである。親和性成熟を受けたこのようなＢリンパ球（または同じ抗体特異性を有するその子孫）は、動物において入手可能であり、動物が再び同じ病原体に遭遇したときに高い親和性抗体を迅速に産生する。
【０１６４】
抗原が最初に認められた時の抗原に応答するＴリンパ球およびＢリンパ球のこの緊密な調節（例えば、動物が特定の病原体に最初に感染した時）は、自己免疫または不適当な免疫応答を防ぐために必要である。しかし、１つの欠点は、抗原特異的Ｂリンパ球が、抗原に対して最も高い親和性および特異性の抗体を分泌する時間までに、急速に増殖する病原体が、もはや容易に一掃することができない程度にまで動物内で増殖しうるということである。本発明のいくつかの実施態様において、本方法は、迅速に抗原特異的抗体の発生が可能であり、最初に抗体を分泌する抗原特異的Ｂリンパ球単離し、そしてそのリンパ球を不死化するという時間のかかるプロセスを省略する。
【０１６５】
したがって、別の態様において、本発明は、薬学的に許容しうる担体と共に組換え抗体を含む治療組成物を提供する。
【０１６６】
本明細書に用いるように、「薬学的に許容しうる担体」には、活性成分（例えば、本発明のさまざまな実施態様に従って作られた組換え抗体）と組み合わせたときに、成分に生物活性を保持させることができ、そして対象の免疫系と非反応性であり、かつ送達時に対象に対して非毒性である、任意の物質が含まれる。例としては、任意の標準医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、およびさまざまなタイプの湿潤剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。エアゾール剤または非経口投与のための希釈剤の非限定的な例は、リン酸緩衝食塩水、標準（０．９％）生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液である。溶液のｐＨは、約５から約８まで、または約７から約７．５までであってもよい。さらなる担体としては、徐放性製剤、例えば、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形物品、例えば、膜、リポソームまたは微粒子の形態をしている。特定の担体が、例えば、投与経路および投与される抗体の濃度に応じてより好ましいものとなりうることは、当業者に明らかである。このような担体を含む組成物は、よく知られた慣用の方法によって処方される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition,
A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; および Remington, The 
Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. Mack Publishing, 2000参照）。
【０１６７】
当業者に知られた任意の適した担体を本発明の医薬組成物に用いてもよいが、担体のタイプは、投与方法に応じて変化する。本発明のさまざまな実施態様において、本明細書に記載された非限定的な医薬組成物の多くの送達技術（例えば、結合物質または結合物質をコードするポリヌクレオチドを含む）は、例えばRolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198およびその中の引用文献に記載されたものは、当分野で
よく知られている。
【０１６８】
治療の方法
別の態様において、本発明は、疾患抗原によって特徴づけられる疾患を有するか、または有することが疑われる動物を治療する方法であって、本発明のさまざまな実施態様の方法に従って作られた、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを含む治療組成物の有効量を投与することを含み、治療組成物の免疫グロブリンによって特異的に結合される抗原と疾患抗原とが同じである、方法を提供する。いくつかの実施態様において、動物は、ヒトまたは飼いならされた動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、シチメンチョウ、ラマ、エミュー、ゾウまたはダチョウ）である。本明細書に用いるように、疾患および示された疾患抗原（例えば、ＡＩＤＳからのＨＩＶｇｐ１２０抗原）に関して「特徴とする」という成句は、示された疾患抗原がその疾患を有する動物中に存在する疾患を意味する。いくつかの実施態様において、疾患抗原は、疾患の病原因子（例えば、ウイルス）由来の核酸によってコードされている。いくつかの実施態様において、疾患抗原は、動物のゲノム（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者においてフィラデルフィア染色体（Philadelphia chromosome）によってコードされたＢＣＲ−ＡＢＬ融合疾患抗
原によってコードされている。
【０１６９】
「治療」とは、疾患の進行を停止させること、遅延させること、もしくは抑制すること、または動物における疾患の発症を予防することを意味する。治療が成功するかどうかを検出する方法は、知られている。例えば、疾患が固形腫瘍である場合、本発明のさまざまな実施態様の方法を用いて産生された組換え免疫グロブリンを含む治療組成物の有効量を投与した後、腫瘍の退縮、転移の減少、腫瘍サイズの減少および／または腫瘍細胞計数の減少があれば、疾患の進行は、抑制、停止、または遅延されている。
【０１７０】
本明細書に用いるように、「有効量」とは、動物における疾患の進行を停止させること、減速させること、停止させる、遅延させること、または抑制すること、または動物における疾患の発症を予防することを含む有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量または用量である。有効量は、例えば、組換え免疫グロブリンを含む治療組成物が投与されることになっている対象の年齢および体重、症状の重症度ならびに投与経路に応じて変化し、したがって、投与は個別に決定される。一般に、経口投与の一日の成人投与量は、一回量として、または分割量で与えて約０．１〜１０００ｍｇである。連続的な静脈内投与では、組成物を、０．０１μｇ／ｋｇ／分〜１．０μｇ／ｋｇ／分、望ましくは０．０２５μｇ／ｋｇ／分〜０．１μｇ／ｋｇ／分の範囲で投与することができる。
【０１７１】
有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。例えば、本発明のさまざまな実施態様の方法を用いて産生された組換え免疫グロブリンの有効量は、動物における疾患（例えば、がん）の進行を、改善する、中断する、安定化する、逆転させる、減速するおよび／または遅延するのに十分な量であるか、またはin vitroで病変細胞（例えば、生検がん細胞）の増殖を改善する、中断する、安定化する、逆転させる、減速するおよび／または遅延するのに十分な量である。当分野で理解されるように、本発明のさまざまな実施態様の組換え抗体の有効量は、とりわけ、動物の医学的病歴および他の因子、例えば組換え抗体のアイソタイプ（および／または投与量）に応じて変化してもよい。
【０１７２】
本発明のさまざまな実施態様の非限定的な組換え抗体を含む組成物を投与するための有効量およびスケジュールは、経験的に決定してもよく、そしてこのような決定を行うことは、当業者の範囲内である。投与されるべき投与量が、例えば、本発明のさまざまな実施態様の組成物が投与される動物、投与経路、使用する組成物の特定のタイプ（例えば、組成物中の組換え抗体のアイソタイプ）および動物に投与される他の薬物に応じて変化することは当業者に理解される。動物（例えば、ヒト患者）に、抗体を含む組成物を投与する場合、抗体の適当な用量を選択する際の指針は、抗体の治療的使用における文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357;Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389に見いだされる。
【０１７３】
単独で用いる抗体の有効量の典型的な１日投与量は、上記の因子に応じて、１日当たり約１μｇ／ｋｇから最大１００ｍｇ／ｋｇ体重まで、またはそれ以上の範囲であってもよい。一般に、以下の用量のいずれかを用いてもよい：少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の用量を投与する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供する結合物質（例えば、抗体）の用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの間、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇまでの間、約０．１ｍｇから約３０ｍｇ／ｋｇまでの間、約０．１ｍｇから約２０ｍｇ／ｋｇまでの間、約０．５ｍｇから約１５ｍｇまでの間、または約１ｍｇから１０ｍｇまでの間である。いくつかの実施態様において、用量は、約１ｍｇから５ｍｇまでの間である。いくつかの別の実施態様において、用量は、約５ｍｇから１０ｍｇまでの間である。
【０１７４】
本明細書に記載された方法（治療方法を含む）は、１つのまたは複数の部位に、一時点または複数の時点で、一回の直接注射によって実施することができる。また、投与は、複数の部位にほとんど同時であることができる。投与の頻度を、決定し、そして治療経過中に調整してもよく、そしてそれは所望の結果の達成における基礎となる。いくつかの場合、本発明のさまざまな実施態様の組換え免疫グロブリンの持続連続放出製剤は、適当であってもよい。持続放出を達成するさまざまな製剤および装置は、当分野で知られている。
【０１７５】
本発明の組換え抗体を含む組成物は、例えば、全身、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下もしくは筋肉内投与を含む任意の適当な投与方法、または有効な形態で血流へのその送達を保証する、注入のような他の方法によって処方してもよい。また、組成物は、単独の灌流技術、例えば単独の組織灌流によって投与して局所治療効果を発揮してもよい。皮下注射のような非経口投与では、担体は、好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ロウまたは緩衝液を含む。経口投与では、任意の上の担体または固体担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムを用いてもよい。いくつかの実施態様において、経口投与では、組成物の製剤は、例えば、リポソーム内に本発明のさまざまな実施態様の組換え免疫グロブリンをカプセル化しているマイクロカプセルとして消化性管中の分解に対して抵抗性である。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）を、本発明の治療組成物の担体として用いてもよい。適した生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号に開示されている。
【０１７６】
本発明のいくつかの実施態様において、組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩液またはリン酸緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン、抗酸化剤、キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または防腐剤を含んでもよい。別法として、本発明のさまざまな実施態様の非限定的な組成物は、凍結乾燥物として処方してもよい。
【０１７７】
本発明のいくつかの実施態様において、組換え免疫グロブリンは、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、それぞれ）によって、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて調製されたマイクロカプセル中に封入してもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000に開示されている。本発明のさまざまな実施態様の組換え免疫グロブリンの血清半減期を増加させるには、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されたように、抗体（特に抗体断片）にエピトープを結合するサルベージ受容体を組み込んでもよい。本明細書に用いるように、用語「エピトープを結合するサルベージ受容体」とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を高める役割を担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープのことをいう。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施態様において、組換え免疫グロブリンは、リポソームとして処方してもよい。組換え免疫グロブリンを含むリポソームは、Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記
載されたような当分野で知られた方法によって製造される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを所定の孔径のフィルターを通して排出すると、所望の直径を有するリポソームが得られる。さらに、本発明のさまざまな実施態様の抗体（抗原結合ドメイン断片、例えばＦａｂ’断片を含む）は、ジスルフィド相互変換反応を経て、Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288に記載されたリポソームに結合することがで
きる。本発明のさまざまな実施態様の組換え抗体の投与は、注射、経口投与、パーティクルガンもしくはカテーテル挿入投与、および局所投与を含む、局所または全身投与を含む。当業者は、in vivoで外因性タンパク質を発現させるための発現ベクターの投与に精通
している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号、同第６，４１３，９４２号および同第６，３７６，４７１号を参照のこと。
【０１７９】
別の態様において、本発明は、動物中の疾患抗原の存在を特徴とする、疾患の動物における発症の可能性を低減する方法であって、本発明のさまざまな実施態様の組換え免疫グロブリンを含む、治療組成物の有効量を投与することを含み、治療組成物の免疫グロブリンによって特異的に結合される抗原と疾患抗原とが同一である、方法を提供する。
【０１８０】
ワクチン製剤は、Vaccine Design（“The subunit and adjuvant approach”（Powell M. F. & Newman M. J.編, (1995) Plenum Press New York）に一般に記載されている。
【０１８１】
別の態様において、本発明は、動物からの抗体のアミノ酸配列を決定するキットであっ
て、（ａ）動物からの多数の免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域をコードする核酸配列を得るための手段および（ｂ）質量分析によって分析された抗体からの質量スペクトル情報を核酸配列から誘導された予測質量スペクトル情報と関連づけて抗体のアミノ酸配列を決定するための説明書を含むキットを提供する。
【０１８２】
本明細書に開示された方法は、例えば、抗原で免疫化された対象において時間をかけて循環抗体をモニターするために用いることができる。これらの実施態様では、複数の時点で（例えば、免疫化の前および後に）対象からサンプルを採取することができ、そして本明細書に開示された方法を用いて、各時点での循環抗体を同定する。循環抗体の組成は、複数の時点で比較してワクチン接種の有効性および／または時間経過を決定することができる。これは、個々の対象おける免疫応答のモニタリングおよび、またワクチンの開発において有用でありうる。
【０１８３】
以下の実施例を提供して、本発明のさまざまな態様および実施態様を説明するが、それらに限定されるわけではない。
【０１８４】
実施例１
ポリクローナルからの個々の抗体重鎖の同定
抗原を特異的に結合する抗体の集団。
本実施例では、抗原を特異的に結合した抗体のポリクローナル集団から多数のモノクローナル抗体を誘導した。本発明のさまざまな実施態様の方法を用いて、その血清が出発ポリクローナル集団を含む動物の核酸分子から生成された遺伝物質データベースからの情報を、モノクローナル抗体の分析からのペプチドデータベース情報と比較した。
【０１８５】
ウサギ免疫グロブリン鎖をコードする配列に特異的なプライマーを用いて本明細書に記載された方法に従って、抗原で免疫化された動物の脾細胞から核酸配列を得た（例えば、下の実施例６のプライマー配列を参照のこと）。ポリクローナル抗体の重鎖からのＣＤＲ３領域を、それらがデータベース中に現れた回数、およびデータベース中のすべてのＣＤＲ３領域の中で現れた各ＣＤＲ３の回数のパーセンテージに基づいてランクを付けした。表２は、トップ２５のＣＤＲ３領域およびそれらの頻度を示す。これらの結果は、ポリクローナル混合物中の多くの異なる抗体において同じＣＤＲ３配列が見いだされたことを示す。この情報は、同じ抗原に特異的に結合する抗体が、多くの場合、それらのＣＤＲ３領域において（そして、おそらく他のＣＤＲ領域において）配列を共有することを示す。この情報は、本明細書に記載された方法が、抗原に特異的に結合するそれらの免疫グロブリン鎖（または、その断片）を同定および単離することができることを示す。
【０１８６】
【表２】
2018027090.tif 000003
【０１８７】
ペプチドデータベースの生成には、以下の方法を用いた。
【０１８８】
抗体のタンパク質分解消化
抗体のポリクローナル集団およそ１０μｇを濃縮し、そして限外ろ過によって緩衝液を交換した（０．５ｍｌ １０Ｋ Amicon：Millipore）。まず、初期体積を濃縮し、次いで
ｐＨ８の２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ４００μｌを加えることによって交換した。ｐＨ８のＨ
ｅｐｅｓ中の８Ｍ尿素８０μｌ中、室温で１５分間再懸濁することによってサンプルを変性させた。抗体を、１０ｍＭ ＤＴＴ中、室温で４０分間還元した。アルキル化は、２０
ｍＭ ＩＡＡを用いて１時間実施した。尿素濃度は、２Ｍの最終濃度に低下した。次いで
、サンプルを５等分し、そしてそれぞれトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ、ペプシン、またはキモトリプシンを用いて３７Ｃで一夜、別々に消化した。ペプシン消化物について、サンプルを濃縮し、そして３Ｍ酢酸と交換し、そして室温で１時間消化した。２０％ＴＦＡを加えることによって消化物をクエンチし、そしてＳｅｐ−Ｐａｃｋカートリッジ（Waters）を用いて精製した。洗浄したサンプルを凍結乾燥し、そしてLTQ Orbitrap Velos質量分析計における分析のため再懸濁した。
【０１８９】
質量分析
抗体画分をプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、またはＧｌｕ−Ｃで消化することによって産生されたペプチド混合物（すなわち、抗体画分を、これらのプロテアーゼのそれぞれで個々に消化することによってペプチドを産生した）を、LTQ Orbitrap Velos（Thermo-Fisher）ハイブリッド質量分析計を用いて、個々にＬＣ
−ＭＳ／ＭＳによって分析した。インラインフロースプリッターを有するAgilent1100シ
リーズバイナリーポンプを用い、MagicC18aQ樹脂（５ｍ、２００Å）で充填された、ハンドポワード（hand-poured）溶融シリカ毛細管カラム（内径１２５μｍ  １８ｃｍ）上へ
、Famosオートサンプラー（LC Packings）を用いて、サンプルを１５分間装填した。クロマトグラフィーは、８〜３０％溶媒Ｂ（溶媒Ａ、０．２５％ギ酸（ＦＡ）；溶媒Ｂ、０．１％ＦＡ、９７％アセトニトリル）４００ｎｌ／分で３５分間、バイナリー勾配を用いて展開した。ペプチドが液体クロマトグラフィーカラムから質量分析計中に溶出されたときに、ペプチドをイオン化し、そしてペプチドイオン質量電荷比測定してＭＳ１スペクトルを生成させた。次いで、質量分析計により、その時点で溶出しており、かつ過去３５秒以内にＭＳ２スペクトル獲得にかけなかった２０の最も豊富なペプチドイオンを選択し、次いで、それらの２０の前駆体ペプチドイオンのそれぞれを単離し、次に断片化して、２０のＭＳ２生成物イオンスペクトルを生成した。前駆体イオンの１つのＭＳ１スペクトルを獲得し、続いてデータ依存方式で２０のＭＳ２生成物イオンスペクトルを入手するサイクル全体を約１．６秒で実施し、次いで、ペプチドが液体クロマトグラフィーカラムから溶出されるように連続的に繰り返した。電荷状態スクリーニング（Charge-state screening）を用いて単独で荷電された種を拒絶し、そしてＭＳ／ＭＳスペクトルを誘発するには５００計数の閾値が必要であった。可能な場合、ＬＴＱおよびＯｒｂｉｔｒａｐは、パラレル処理方式で操作した。
【０１９０】
データベース探索およびデータ処理。
遺伝子データベースに対してＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムを用いてＭＳ／ＭＳスペクトルを探索した。探索パラメーターには、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、およびトリプシンに対する十分な酵素特異性（full enzyme specificity）、ならびに親質量
許容差（parent mass tolerance）５０ｐ．ｐ．ｍ．、システインにおける５７．０２１
４の静的修飾（static modification）およびメチオニンにおける１５．９９４９の動的
修飾（dynamic modifications）を伴うペプシンに対して酵素特異性がないことが含まれ
る。ＨＣＤスペクトルは、０．０２Ｄａの断片イオン許容差で探索したのに対して、ＣＩＤスペクトルは、１Ｄａの断片イオン許容差で探索した。線形判別関数を用いて、ターゲット−デコイアプローチを介してペプチドを１％ペプチドＦＤＲにフィルター処理して、パラメーター、例えばＸｃｏｒｒ、ΔＣｎ、および前駆体質量誤差に基づいて各ペプチドを評価した。
【０１９１】
結果
図４は、本実施例に従った方法を図式的に示す。核酸配列は、カバット則（Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) and Wu, T.T. and Kabat, E.A. J. Exp. Med. 132: 211-250 (1970)参照）を用いて分析し、配列内で可変領域およびＣＤＲ３領域（およびその配列）がどこにあるかを決定した。次に、質量分析によって同定された多数のモノクローナル抗体の重鎖のＣＤＲ３領域のパーセント包括度を解明した。表３に示すように、ＭＳ分析されたポリクローナル抗体混合物からの１６の異なるペプチド配列を同定し、ここで、１６のペプチドのそれぞれは、動物から集めた核酸配列から対応する配列のＣＤＲ３領域の全体（すなわち、１００％）を含んだ。
【０１９２】
【表３】
2018027090.tif 000004
【０１９３】
また、表３に記載されたペプチドのうち、質量分析によって最も頻繁に生成が観測されたペプチドのうちの５つを、核酸配列の情報から誘導された理論質量スペクトルとして参照した。したがって、本実験は、核酸配列から誘導された予測質量スペクトル（および根底にある配列）を、ポリクローナル抗体の実際のペプチド断片からの観測質量スペクトルと比較および関連づけることによって、多数のモノクローナル抗体（または少なくともその重鎖）の配列が容易に得られることを立証した。
【０１９４】
実施例２
インフルエンザ抗原特異的組換えヒト抗体の発現
２００９〜２０１０年の冬には、多数のヒトがＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に感染して、死亡したり永続的な損傷が生じたりした。本発明のさまざまな実施態様の非限定的な方法を用いて、中和抗体は、類似したウイルス株に以前に暴露されたヒトからクローニングしてもよく、そして現在疾患を患っているヒト患者を治療する組成物として用いてもよい。
【０１９５】
したがって、１９１８年のインフルエンザ流行中にインフルエンザウイルスに暴露されたことが知られている高齢者の人々を、１９１８年型ウイルスを中和できる血清抗体の存在についてスクリーニングする。これを行うため、Yu et al., Nature 455: 532-536, 2008に記載された方法（およびオンライン増補；論文および増補は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）に従う。
【０１９６】
血清および／または血漿がウイルス中和抗体を含む患者を同定し、そしてこれらの患者から血液を採取し、そして細胞および血清および／または血漿に分離する。
【０１９７】
標準方法（例えば、本明細書に記載された方法を参照のこと）に従って血液細胞からＢリンパ球を単離し、そしてＢリンパ球からの核酸分子を得る。ヒト免疫グロブリン重（Ｖ
Ｈ）鎖および軽（ＶＬ）鎖可変領域遺伝子の上流および下流領域にハイブリダイズさせたプライマーを用いてゲノムＤＮＡを増幅するＰＣＲによって、これらの細胞から、免疫グロブリン鎖をコードする核酸分子を単離する。このようなプライマーを作る方法は、免疫学分野の標準である（例えば、参照により本明細書に組み込まれた、Marks and Bradbury, “PCR Cloning of Human Immunoglobulin Genes” in Antibody Engineering: Methods
and Protocols, 248: 117-134, 2003に記載された方法を参照のこと）。
【０１９８】
ＰＣＲ増幅のためにこれらのプライマーを用いて得られたこれらの核酸分子を用いて遺伝物質データベースを追加する。遺伝子データベース内で、標準ソフトウェアパッケージを用いて核酸配列をさらに操作して、各核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を決定し、そしてコードされたポリペプチドをトリプシンで実質的に消化し、ここで、このような消化物から生成された予測生成ペプチドを用いて予測質量スペクトルを生成する。
【０１９９】
患者の血液から、血清および／または血漿を集める。血清および／または血漿中に存在する抗体を、標準方法によって単離する。例えば、免疫グロブリンは接着するが、非免疫グロブリンタンパク質は接着しないプロテインＡセファロースカラムに血清タンパク質を通過させる。血液が集められた人たちは、１９１８年型インフルエンザウイルスに新しく暴露されてないため、１９１８年型ウイルス（例えば、弱毒化ウイルスまたはその断片）でコーティングされた第２のカラムに血清抗体を通過させることによって、それらの血清抗体を、１９１８年型ウイルス抗原を特異的に結合する抗体についてさらに富化する。次に、結合した抗体を、プロテアーゼ（例えば、パパイン）またはヒンジの近くで免疫グロブリンの領域を特異的に切断する化学的タンパク質切断試薬で処理し、そして非接着Ｆｃ部分を除去する。最後に、結合したＦａｂまたはＦａｂ２断片をトリプシンで処理してペプチド断片を生成し、次いで液体クロマトグラフィーを用いてすべての断片を分別し、次いで断片を質量分析によって分析する。Sequestプログラムのようなアルゴリズムを用い
て、ペプチドの観測されたタンデム型質量スペクトルを、患者のＢリンパ球から抽出された核酸配列からの予測質量スペクトルと関連づける。この方法を用いて、遺伝物質データベースのユニーク免疫グロブリン鎖の予測アミノ酸配列内に見いだされた少なくとも１つのペプチドを同定してもよい。次いで、この免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）をコードする核酸配列を遺伝子データベースから読み出し、そして標準ＤＮＡ合成方法を用いて合成する。次いで、合成されたＤＮＡ配列を、発現ベクターにサブクローニングし、次いで、それをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトする。細胞によって産生された組換え抗体を、次に単離し、そして１９１８年型ウイルス（または、その断片）に結合する能力について試験する。
【０２００】
この方法を用いて産生された組換え抗体を、次いで薬学的に許容しうる担体と合わせ、そしてＨ１Ｎ１ウイルス感染症を患っている患者に投与する。これらの組換え抗体は、由来が完全にヒトであるため、患者の免疫系によって拒絶反応が示されないことが予想される。
【０２０１】
実施例３
核酸配列の獲得
このプロトコールは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用い、そして４５４ＮＧＳプラットフォーム（ＦＬＸ＋、ＦＬＸまたはジュニア；454 Life Sciences、Roche company、Branford, CTから商業的に入手可能）に基づく。他のハイスループットＮＧＳプラットフォームにはわずかな変更が必要となり、そしてＮＧＳ製造元の説明書に基づく。
【０２０２】
標準免疫化プロトコール（例えば、Coligan et al.、前出を参照のこと）を用いて、マウスを、興味の抗原（ペプチド、組換えタンパク質、ウイルス、毒素、など）で免疫化す
る。特異的抗原に対する血漿免疫グロブリンタイターによって免疫応答をモニターする。血液、脾臓、骨髄、リンパ節、または任意のリンパ系器官を集め、そして標準方法に従って処理してＢ細胞を単離することができる。物質が制限される場合、この単離手順を減らすこともでき、そして動物からの重鎖および軽鎖集団に対して免疫グロブリン可変領域特異的ＰＣＲプライマーを用いる直接ＲＴ−ＰＣＲ手順で置き換えることもできる。
【０２０３】
当然、いくつかの実施態様において、核酸配列は、生物学的物質からすぐに直接シークエンシングすることができる（すなわち、シークエンシング前に増幅することなく）。核酸配列からの直接シークエンシングするためのサービスおよび試薬は、例えば、Helicos BioSicences Corp.（Cambridge, MA）から商業的に入手可能である。例えば、Helicos' True Single Molecule Sequencingは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡの直接シークエンシングが可能である。また、米国特許第７，６４５，５９６号；同第７，０３７，６８７号、同第７，１６９，５６０号；ならびに刊行物Harris et al., Science 320: 106-109, 2008; Bowers et al., Nat. Methods 6: 493-494, 2009;およびThompson and Milos, Genome Biology 12: 217, 2011を参照のこと（これらの特許および刊行物は、すべてそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２０４】
いくつかの実施態様において、配列情報を得る前に、核の配列を増幅する（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって）。
【０２０５】
１つの非限定的な例では、オリゴｄＴＰＣＲプライマーを、ＲＴ−ＰＣＲに用いる。別の非限定的な例では、下記のＰＣＲプライマーを用いて遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲを実施する。別の例では、マウスの重鎖および軽鎖集団に対するＰＣＲプライマーは、参照により本明細書に組み込まれたＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０９７４３５号に記載された配列を有する。Ｂ細胞富化を用いてまたはなしで、精製された遺伝物質（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を、次いで標準方法に従ってＲＴ−ＰＣＲにかける（例えば、Ausubel et al.、前出を参照のこと）。これは、ＮＧＳシークエンシングを行う前の遺伝物質のライブラリー作製段階である。逆転写（ＲＴ）反応をオリゴｄＴまたは免疫グロブリン特異的プライマーに適用してｃＤＮＡを生成させることことができる。ポリメラーゼ連鎖反応手順を免疫グロブリン特異的プライマーに適用して、サンプルからの（再配列または／および発現された）重鎖および軽鎖可変領域を増幅する。これらの方法を、下にさらに詳細に記載する。
【０２０６】
ライブラリー作製
サンプル調製例：
マウスが抗原による最終的なブースト（boost）を受けた後、血液、脾臓、骨髄または
リンパ節を単離する。単核細胞を、前述のとおり、フィコール分離によって単離する。次いで、フィコールド細胞（Ficolled cells）をＰＢＳによって洗浄し、計数し、そして全ＲＮＡ調製のために瞬間凍結する。
【０２０７】
Qiagen RNeasyキット（Qiagen Inc., Hilden, Germanyから商業的に入手可能）を用い
て製造元の説明書に従って細胞から全ＲＮＡを単離し、そして全ＲＮＡを−８０℃で保存する。
【０２０８】
遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲまたは標準ＲＴ−ＰＣＲ（オリゴｄＴを用いる）のため、以下のプロトコールを用いてもよい。
１０μＭ ＣＳＴマウスＲＴ−ＩｇプライマーまたはオリゴｄＴ   １μｌ
２．５μｇ全ＲＮＡ（脾細胞）                                ｘμｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ                                           ２μｌ
滅菌、蒸留水                                                １４μｌまで
混合物を６５℃で５分間インキュベートし、次いで氷上に置く。
５×ｃＤＮＡ合成緩衝液                            ４μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ                                   １μｌ
Invitrogen Thermoscript RT（１５Ｕ／μｌ）        １μｌ
【０２０９】
内容物を穏やかに混合し、そして６０℃で６０分間インキュベートする。
８５℃で５分間加熱することによって反応を終結させる。
ｃＤＮＡは、ライブラリーの作製に使用するための準備ができている。
【０２１０】
次いで、重鎖および軽鎖についてＣＳＴ ４５４特異的融合マウスプライマーを用いて
ｃＤＮＡをＰＣＲにかける。プライマーは、以下の配列を有する：
【０２１１】
マウス４５４アンプリコンプライマー
【化１】
2018027090.tif 000005
【０２１２】
【化２】
2018027090.tif 000006
【０２１３】
上の配列のすべてにおいて、下線が引かれた配列は、４５４シークエンシングのためであり、太字の配列は、多重化のためのバーコードであり、そして標準フォントの配列は、マウス特異的配列である。プライマーを用いて以下のような上記のライブラリーを増幅する：
重鎖ＰＣＲ：
ＣＳＴ４５４マウス重鎖プライマー混合物            １μｌ
ｃＤＮＡ                                          １μｌ
２×Phusion Master Mix                            １２．５μｌ
Ｈ２Ｏ                                            １０．５μｌ
軽鎖ＰＣＲ：
ＣＳＴ４５４マウス軽鎖プライマー混合物            １μｌ
ｃＤＮＡ                                          １μｌ
２×Phusion Master Mix                            １２．５μｌ
Ｈ２Ｏ                                            １０．５μｌ
【０２１４】
ＰＣＲ条件のサイクル条件は、表４の通りであってもよい：
【表４】
2018027090.tif 000007
【０２１５】
ステップ２〜４の２０サイクルを適用する。次いで、ＰＣＲ生成物を、製造元のプロトコール（例えば、Beckman Coulter Genomics' Agencourt AMPure XPシステムのプロトコ
ールを参照のこと）に従ってAgencourt Ampure DNA精製（Beckman Coulter Genomics, Danvers, MAから商業的に入手可能）に２回かける。ＰＣＲ／遺伝子ライブラリーを作製し
たら、その後のすべてのステップはｅｍＰＣＲおよびシークエンシング反応に関して４５４製造プロトコールに従う。454 Life Sciences Corp., a Roche Company, Branford, CT
06405による、“Sequencing Method Manual, GS Junior Titanium Series”（２０１０
年５月（rev.２０１０年６月））および“emPCR Amplification Method Manual - Lib-L,
GS junior Titanium Series（２０１０年５月（rev.２０１０年６月））と題する刊行物を参照し、それらは、いずれも全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
この段階で、多数のサンプルを、単一のシークエンシングランに合わせることができる。それらは、ユニークバーコード（または４５４プラットフォームからのＭＩＤ）によって区別される。例えば、バーコードを、ＰＣＲプライマーに組み込む。いくつかの実施態様では、emPCR Amplification Method Manual - Lib-L, GS junior Titanium Series（２０１０年５月（rev.２０１０年６月）；454 Life Sciences Corp.）に従う。いくつかの
実施態様では、次に、“Sequencing Method Manual, GS Junior Titanium Series”（２
０１０年５月（rev.２０１０年６月）；454 Life Sciences Corp.）に従う。
【０２１７】
シークエンシングデータは、ＦＡＳＴＡファイル（または任意の標準ファイルフォーマット）として産生し、そして遺伝物質データベースに保存することができる。これらの配列データを用いて予測質量スペクトルデータベースを生成し、同じ動物の血清および／または血漿免疫グロブリンから生成した観測ペプチド質量スペクトルを分析する。これを行うには、標準プログラムを用いることができる。本実施例では、Sequestソフトウェアパ
ッケージによって予測質量スペクトルを生成した。
【０２１８】
実施例４
ポリクローナル集団からの個々の抗体鎖の同定
次に、本明細書に記載された方法を用いていくつかの異なるポリクローナル集団から個々の抗体の配列を同定した。本実施例の方法を、図２および４に図式的に示す。
【０２１９】
実施例２に上記された方法を用いて、３種の異なる抗原を特異的に結合する抗体の３つの異なるポリクローナル集団を、３つの異なるライブラリーに作製した。ウサギ免疫グロブリン鎖をコードする配列に特異的なプライマーを用いて、上記の４５４シークエンシング法を用いた大規模シークエンシングを実施して、３つの異なる遺伝物質データベースを得た。
【０２２０】
同様に、上の実施例３に記載された方法を用い、遺伝物質データベースを用いて３つの異なるタンパク質データベースを生成した。
【０２２１】
第１の抗原についての結果を、表５（軽鎖）および６（重鎖）に示し；第２の抗原を、表７（軽鎖）および８（重鎖）に示し、そして第３の抗原を、表９（軽鎖）および１０（重鎖）に示す。
【０２２２】
【表５】
2018027090.tif 000008
【０２２３】
【表６】
2018027090.tif 000009
【０２２４】
【表７】
2018027090.tif 000010
【０２２５】
【表８】
2018027090.tif 000011
【０２２６】
【表９】
2018027090.tif 000012
【０２２７】
【表１０】
2018027090.tif 000013
【０２２８】
【表１１】
2018027090.tif 000014
【０２２９】
【表１２】
2018027090.tif 000015
【０２３０】
表５〜１０は、動物の抗体レパートリーから大規模シークエンシングによって生成された配列（特にＣＤＲ３領域）に対応する質量分析（ＣＤＲ３ペプチド）によって、高い信頼度（＞９９％確実性）で同定されたペプチドを示す。ＣＤＲ３計数は、ペプチドが、ＣＤＲ３領域にマッチしたポリクローナル抗体混合物から同定された回数を示す。ＣＤＲ３包括度は、ＣＤＲ３領域の総アミノ酸と比較して、質量分析によって同定されたペプチド中に現れるＣＤＲ３領域中のそれらのアミノ酸のパーセント（ＣＤＲ３の欄に示す）を示した。総ペプチドは、大規模シークエンシングによって決定された完全長可変領域配列に
対応する質量分析によって同定された配列によるペプチドの総数を表す。ユニークペプチドは、大規模シークエンシングによって決定された完全長可変領域配列に対応する質量分析によって同定された配列によるユニークペプチドの数を表す。
【０２３１】
実施例５
別の実施例では、以下のプロトコールを用いて核酸配列およびポリクローナル抗体を生成することができる。その結果は、これらの方法を用いて抗原特異的抗体を生成することに成功したことを示す。
【０２３２】
これらのプロトコールでは、マウスを免疫原性Ｐ−ＥＲＫ抗原で免疫化した。以下の方法を用いて、遺伝物質データベースおよびペプチドデータベースを生成することができる。
【０２３３】
Ｉ．遺伝物質データベース：
細胞単離。
シリンジおよび２１Ｇニードルを用いて５ｍＬのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳにより免疫化マウスの脾臓を５回フラッシュした。細胞を９０％ＦＣＳ／１０％ＤＭＳＯ中に凍結した。各脾臓から合計５０〜１００×１０6細胞を単離した。
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成。
【０２３４】
QIAshredder（Qiagen cat#79654）およびRNeasyミニキット（Qiagen, Hilden, ドイツ;
cat#74104）を用いて、製造元のプロトコールに従って脾細胞から全ＲＮＡを単離した。標準次世代シークエンシングプロトコールに従ってＲＮＡをカラム上でＤＮａｓｅ処理した。ＮＤ−１０００分光光度計（NanoDrop；Thermo Scientific, Wilmington, DEから商
業的に入手可能）を用いて全ＲＮＡ濃度を測定した。
【０２３５】
単離したＲＮＡを、Thermoscript RT-PCRシステム（Invitrogen（Life Technologiesの一部）、Carlsbad, CA cat#11146-024）を用いて、逆転写による一本鎖（first-strand）ｃＤＮＡ合成に用いた。１．５μｇのＲＮＡおよびオリゴｄＴプライマーを用いて製造元のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。
ＶHおよびＶL増幅。
【０２３６】
２ステップＰＣＲ反応を用いてＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅した。縮重センスおよびアンチセンスプライマーの混合物をＰＣＲの第１ラウンドに用い、そして汎用プライマーのセットをＰＣＲの第２ラウンドに用いた。多数のセンス縮重プライマーのため、重鎖ＰＣＲを、８つまでの別々の反応に分けた。用いたプライマーの配列を、下に示す。
【０２３７】
第１ラウンドのプライマー、汎用尾部（universal tail）は、下線が引かれている。
【化３】
2018027090.tif 000016
【０２３８】
【化４】
2018027090.tif 000017
【０２３９】
第２ラウンドのプライマー、汎用尾部は、下線が引かれている。
【化５】
2018027090.tif 000018
【０２４０】
上の配列において、下線およびイタリックの配列は２ステップＰＣＲ増幅のためであり、下線の配列は４５４シークエンシングのためであり、太字の配列は４５４の鍵（key）
であり、小文字の配列は多重化のためのバーコードであり、そして標準フォントの大文字の配列はマウス特異的配列である。
【０２４１】
ＰＣＲ反応は、表１１に説明したように上のプライマーを用いて設定した。
【０２４２】
【表１３】
2018027090.tif 000019
【０２４３】
第１ラウンドについて、重鎖ＰＣＲ反応液５０μＬは、０．２μＭの各センスプライマー（反応当たり５つのセンスプライマー）および０．２μＭの各アンチセンスプライマー（反応当たり４つのアンチセンスプライマー）、５×Phusion HF反応緩衝液（Finnzymes
（Thermos Scientificの一部），cat#F-518）１０μＬ、ｃＤＮＡ１μＬ、０．２μＭ ｄＮＴＰ（NEB, cat#N0447）、Phusion Hot Start II DNAポリメラーゼ（Finnzymes, cat#F-549L）１μＬならびにＲＴ−ＰＣＲグレードの水（Ambion（a Life Technologies company），Austin, TX, cat#AM9935）２８μＬを含んだ。第１ラウンドについて、軽鎖ＰＣＲ反応液５０μＬは、０．２μＭのセンスプライマーおよび０．２μＭのアンチセンスプライマー、５×Phusion HF反応緩衝液（Finnzymes, cat#F-518）１０μＬ、ｃＤＮＡ１μＬ、０．２μＭ ｄＮＴＰ（NEB, cat#N0447）、Phusion Hot Start II DNAポリメラーゼ（Finnzymes, cat#F-549L）１μＬならびにＲＴ−ＰＣＲグレードの水（Ambion, cat#AM9935）３５μＬを含んだ。ＰＣＲサーモサイクルプログラムは、以下のとおりであった：９８℃２分間；１５サイクル（９８℃０．５分間、５５℃０．５分間、７２℃１分間）；７２℃５分間；４℃貯蔵。ＤＮＡクリーン（clean）およびConcentrator -5 kit（Zymo Research Co., Irvine, CA, cat#DR014）を製造元のプロトコールに従って用いてＰＣＲ生成物を精製した。
【０２４４】
第２ラウンドについて、重鎖ＰＣＲ反応液５０μＬは、０．２μＭの汎用センスおよび汎用アンチセンスプライマー５×Phusion HF反応緩衝液（Finnzymes, cat#F-518）１０μＬ、精製された第１のラウンドＰＣＲ生成物１０μＬ、０．２μＭ ｄＮＴＰ（NEB, cat#N0447）、Phusion Hot Start II DNAポリメラーゼ（Finnzymes, cat#F-549L）１μＬおよびＲＴ−ＰＣＲグレードの水（Ambion, cat#AM9935）１９μＬを含んだ。ＰＣＲサーモサイクルプログラムは以下のとおりであった：９８℃２分間；１０サイクル（９８℃０．５分間、５５℃０．５分間、７２℃１分間）；７２℃５分間；４℃貯蔵。第２ラウンドについて、軽鎖ＰＣＲ反応液５０μＬは、０．２μＭの汎用センスおよび汎用アンチセンスプライマー５×Phusion HF反応緩衝液（Finnzymes, cat#F-518）１０μＬ、精製された第１ラウンドＰＣＲ生成物１０μＬ、０．２μＭ ｄＮＴＰ（NEB, cat#N0447）、Phusion Hot
Start II DNAポリメラーゼ（Finnzymes, cat#F-549L）１μＬならびにＲＴ−ＰＣＲグレードの水（Ambion, cat#AM9935）１９μＬを含んだ。ＰＣＲサーモサイクルプログラムは以下のとおりであった：９８℃２分間；８サイクル（９８℃０．５分間、５５℃０．５分間、７２℃１分間）；７２℃５分間；４℃貯蔵。AMPure XP（Agencourt; Beckman Coulter Genomics, Brea, CA, cat#A63881）を用いて製造元のプロトコールに従ってＰＣＲ生成物を精製し、そしてAgilent 2100 BioAnalyzerを用いて分析した。
【０２４５】
次いで、ＰＣＲ生成物の配列を予測アミノ酸配列に翻訳してから、それを理論的に消化して（例えば、プロテアーゼおよび／または化学的タンパク質切断試薬を用いて）仮想ペプチド断片を産生する。次いで、これらの仮想ペプチド断片を用いて予測質量スペクトルを生成する。
【０２４６】
ＩＩ．ポリクローナル抗体のペプチド断片からの実際の質量スペクトルの生成：
動物の血清および／または血漿から（例えば、核酸配列が得られた動物の血清および／または血漿から）ポリクローナル抗体を精製する。抗体を精製するために、以下の方法を用いる：
【０２４７】
プロテインＧ精製：
プロテインＧ磁性ビーズ（Millipore（Billerica, MA）, cat# LSKMAGG10）１ｍＬを、４つの１５ｍＬコニカルチューブのそれぞれ（Falcon（BD Biosciences, Franklin Lake,
NJ）, cat#352097）に加えた。各チューブ中のビーズを、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４
、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）１０ｍＬで２回およびＰＢＳ１０ｍＬで３回洗浄した。３種のマウス（ＩＤ１２６２−２、１２６２−４、１２６３−４）からの血清
を一緒に貯め、そしてＰＢＳ中の最終体積６ｍｌに１０倍希釈した。次いで、合わせた希釈血清１．５ｍｌをビーズの各チューブに加え、そして４℃で一夜インキュベートした。フロースルーを集め、そして精製プロセスをさらに２回行った。フロースルーを集めた後、各チューブを、ＰＢＳＴ１０ｍＬで２回およびＰＢＳ１０ｍＬで３回洗浄した。次いで、各チューブをｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン０．５ｍＬと共に４℃で３０分間インキュベートしてＩｇＧを溶出した。溶出を５回繰り返した。すべての溶出液を、１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ８．５で中和し、ＰＢＳに対して一夜透析し、そしてタンパク質濃度をＮＤ−１
０００分光光度計（Nanodrop）で測定した。合計２．５ｍｇのＩｇＧを精製した。
【０２４８】
抗原カラム調製：
新たなストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズ（Pierce, cat#88817）５．０ｍＬを、
ＰＢＳ１０ｍＬで３回洗浄し、そしてＰＢＳ５．０ｍＬ中に希釈したビオチンｐ−ＥＲＫペプチド（Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA.から商業的に入手可能なカ
タログ番号１１５０のビオチン化形態）の２０ｍｇ／ｍｌストック１０５μＬと共に４℃で一夜インキュベートした。フロースルーを捨て、そしてビーズをＰＢＳ１０ｍＬで３回洗浄し、そして１０個の１．７ｍＬ低結合性（low binding）チューブ（Axygen（Union City, CA）, cat# MCT-175-L-C）に等分した。等分されたビーズを磁性ラック（Invitrogen, DynaMag）上に置き、そしてＰＢＳを除去した後、希釈血清を加えた。
【０２４９】
抗原特異的精製：
上のプロテインＧ精製ＩｇＧを、ビオチンＰ−Ｅｒｋペプチドと結合したＳＡ磁性ビーズに加えた。４℃で一夜インキュベーション後、フロースルーを集め、そしてビーズをＰＢＳ含有緩衝液で洗浄した。次いで、ＩｇＧを、ｐＨ３．５の０．１Ｍグリシン１．５ｍＬの５画分、次いでｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン１．５ｍＬの５画分、次いでｐＨ１．８の０．１Ｍグリシン１．５ｍＬの５画分で溶出し、そしてｐＨ８．５の１ＭＴｒｉｓで中和した。ｐ−ＥＲＫ−ＢＳＡペプチドでコートされた９６−ウエルプレートを用いて、溶出液をＰ−ＥＲＫ（すなわち、リン酸化ＥＲＫキナーゼ、マウスを免疫化に用いる抗原）反応性について測定した。活性を有する画分を、ＥＬＩＳＡ（Thermo, cat#23300）に
よって定量化し、そして２０μＭ Ｕ０１２６で１時間または２００ｎＭ テトラデカノイル−ホルボール−ミリスチン酸（Tetradecanoyl-Phorbol-Myristic Acid）（ＴＰＡ）で
１５分間処理したジャーカットＴ細胞（例えば、American Type Culture Collection す
なわちＡＴＣＣ, Manassas, VAから商業的に入手可能）からの溶解物を用いたウエスタンブロットによってｐ−ＥＲＫ反応性について検定した。最も良好なｐ−ＥＲＫ−反応性を有する画分を質量分析によって分析した。
【０２５０】
質量分析
抗体含有画分を、少なくとも１つのプロテアーゼ（例えば、トリプシン）および／または少なくとも１つの化学的タンパク質切断反応で消化し、そして生成したペプチドを、質量分析を用いた分析にかけた。ペプチドを分析するために用いる質量分析方法は、標準のものであり、そして以前に詳細に記載されている。（例えば、米国特許第７,３００,７５３号；Geiger et al., Nature Methods 7: 383-385, 2010; Elias and Gygi, Nature Methods 4: 207-214, 2007; Keshishian et al., Molecular and Cellular Proteomics 6: 2212-2229, 2007を参照し、それらは、すべてそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２５１】
上記のように（例えば、実施例３参照）、遺伝物質データベースにおける情報を参照として用いて質量スペクトルを分析した。これを行うために、ＭＳ２スペクトルを集め、次いで、それが良好な品質スペクトルまたは良好なマッチでないときであっても、すべてのＭＳ２スペクトルについてマッチを見いだす標準計算プログラムを用いて、参照配列からの予測ＭＳ２スペクトル（すなわち、遺伝物質データベースから）と１つずつ関連づける
。このようなプログラムは商業的に入手可能である。例えば、Sequestソフトウェアは、Sage-N Research, Inc.（Milpitas, CA）からのSorcererソフトウェアパッケージの一部として得ることができる。遺伝物質データベースに対して良好な品質スペクトルまたは良好なマッチであると同定されたスペクトルを、遺伝物質データベースから参照配列上にマップする。
【０２５２】
ペプチドＭＳ２が遺伝子データベースの複数の明確な成分にマップすることができる場合、そのペプチドＭＳ２は、それらの同定された１つまたはそれ以上の成分である可能性があるため、どの成分が抗原結合性ポリクローナル抗体画分中に存在するか不明である。したがって、その処理を繰り返し、そして繰返しにより、証拠を集めて、いくつかの成分が、他のものよりも集めたＭＳスペクトルとより良好に関連があることを示すことができる。換言すれば、それらの可変領域配列の多くは、抗原結合による富化の後にＭＳ２スペクトルとして観測される。これらの要素は、真の抗原を結合する抗体をコードすると考えられ、したがって、それらの配列を作製し（例えば、合成オリゴヌクレオチド発生器において）、発現プラスミド（例えばInvitrogenからのｐｃＤＮＡ３．１）中にクローニングし、細胞中で発現させ、そして抗原結合について試験する。
【０２５３】
結果
図５に示すように、ペプチド断片からの実際の質量分析結果と、核酸配列からの理論質量分析情報との相関性により、重鎖および軽鎖断片の配列の同定が可能である。質量分析包括度に関する限り最も高い信頼度を有したそれらのペプチドおよび核酸配列に対する相関性が示されている。実際のペプチド断片を含む完全長鎖をコードする核酸配列を合成し、そして組換え発現ベクターにクローニングした。ランダム対形成によって重鎖と軽鎖とを組み合わせ、そして細胞中で一緒に発現させて組換え抗体を産生する（すなわち、作製する）（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号；同第４，８１６，５６７号；および米国特許出願第２０１１００４５５３４号の方法を参照のこと）。図６は、ｐＥＲＫコーティングされたプレートを用いるＥＬＩＳＡ実験の結果を示す表である。分かるように、図５に同定された鎖のいくつかの対形成により、ｐ−ＥＲＫコーティングされたプレートに特異的に結合することができる抗体が生じた（陽性抗体は図６に黄色で示し、そして陽性ペプチドは図５に赤色で示す）。驚くべきことに、これらの結果は、ペプチド出現頻度のみまたはＣＤＲ３計数頻度のみのいずれからも、抗原に特異的に結合する特定の抗体鎖の利用能が予測されなかったことを示した。例えば、軽鎖核酸配列参照番号Ｇ６２３ＦＫＢ０１Ａ３ＧＣ７は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析（すなわち、液体クロマトグラフィー、タンデム型質量分析）分析から２３５個のペプチドにマッチし、そして軽鎖核酸配列参照番号Ｇ６２３ＦＫＢ０１ＡＸＪ１Ｃは、１回のＮＧＳランで１０６８回現れた配列を有した（図５、下の表を参照のこと）。しかし、それらはいずれも重鎖と組み合わせたとき、ｐＥＲＫに抗原を特異的に結合できる抗体を実際に形成することができなかった。この結果は、非常に驚くべきであり、そしてＮＧＳ分析からの核酸配列頻度にのみ依存したReddy et
al., Nature Biotechnology 28(9):965-969, 2010の方法が、真の抗原結合性配列を見落とすことを示した。したがって、本明細書に記載された方法は、選択された抗原に特異的に結合する抗体を同定および単離するために信頼して用いることができる。
【０２５４】
実施例６
本明細書に記載された方法に従って抗原特異的ウサギ抗体を生成した。これを行うため、以下のプロトコールに従った。
【０２５５】
ウサギ脾細胞ＲＮＡ精製
標準方法を用い、ｐ−ＭＥＴ抗原（Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA Catalog # 1645）を用いてウサギを免疫化した。抗原特異的血清（すなわち、免疫化抗原
に特異的に結合したポリクローナル抗体を含む血清）を有する免疫化ウサギを、最終的な
抗原注射（ブースト）後に屠殺した。５０ｍｌの血液を集め、そして脾臓または他のリンパ系器官を集めた。１千万個の脾細胞をＲＮＡ精製に用いた。また、集めた血液５０ｍｌからの血清および／または血漿を、抗原特異的抗体親和性精製のために取っておいた。
【０２５６】
Qiagen's RNeasyキット（Qiagen cat# 74104）を用いて製造元のプロトコールに従ってＲＮＡを脾細胞から精製した。カラムにおいて、ＤＮａｓｅＩ消化ステップを組み込むことによってＤＮａｓｅＩ処理を行って、汚染ゲノムＤＮＡを除去した。ＲＷ１緩衝液洗浄後、ＲＤＤ緩衝液中に希釈したＤＮａｓｅＩ（Qiagen cat# 79254）をＲＮＡ精製カラム
にかけ、そして室温で２０分間インキュベートした。次いで、カラムをＲＷ１緩衝液でさらに１回洗浄し、続いてＲＰＥ緩衝液で２回洗浄し、そしてＲＮＡを水３０μｌまたは５０μｌで溶出した。Nanodrop分光光度計（Thermo Scientific）において波長４５０ｎｍ
で測定された吸光度によってＲＮＡの濃度を決定した。
【０２５７】
ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲによるアンプリコンの生成
以下に示すように、Invitrogen's Thermoscript（Invitrogen cat#12236-022）逆転写
酵素を用いてウサギ脾細胞から単離されたＲＮＡを最初に逆転写した：
ＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ：                       ５μＬ
オリゴｄＴプライマー（５０μＭ）：           １μＬ
ｄＮＴＰ’ｓ（１０ｍＭ）：                   ２μＬ
ｄＩＨ２Ｏ：                                 ４μＬ
６５℃で５分間インキュベートし、氷上に２分間置き、次いで以下を加えた：
５×ｃＤＮＡ緩衝液：                         ４μＬ
０．１ｍＭ  ＤＴＴ：                         １μＬ
ＲＮａｓｅＯＵＴ：                           １μＬ
ｄＩＨ２Ｏ：                                 １μＬ
ThermoScript：                               １μＬ
【０２５８】
混合物を５０℃で１時間インキュベートし、その後、８５℃で５分間熱不活性化ステップを続けた。最後に、ＲＮａｓｅＨ（Invitrogen（Carlsbad, CA）, cat#18021-071）１
μｌを加え、そして３７℃で２０分間インキュベートすることによって相補的ＲＮＡ鎖をｃＤＮＡから除去した。
【０２５９】
シークエンシングのため重鎖、カッパ鎖およびラムダ鎖可変領域のアンプリコンを、以下のようにＰＣＲによって生成した。
【０２６０】
【表１４】
2018027090.tif 000020
【０２６１】
上の配列において、下線の配列は４５４シークエンシングのためであり、太字の配列は４５４の鍵であり、小文字の配列は多重化のためのバーコードであり、そして標準フォントの大文字の配列はウサギ特異的配列である。ＰＣＲ増幅は、Finnzyme's Phusion Hot Start IIポリメラーゼ（Thermo Scientific cat# F-540S）を用いて行い、ここで、反応混合物および条件は、以下に示すように設定した：
【０２６２】
反応混合物：
ｃＤＮＡ：                                        ２．５μＬ
５× Buffer GC：                                  ５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ：                               ０．２５μＬ
Phusion HotStart II：                             ０．２５μＬ
プライマー（フォワード＋リバース）３０μＭ：      ０．２５μＬ
水：                                              １６．７５μＬ
【０２６３】
ＰＣＲプログラム：
ステップ１   ９８℃−１．５分
ステップ２   ９８℃−１０秒
ステップ３   ６０℃−３０秒
ステップ４   ７２℃−３０秒
ステップ５   ステップ２〜４を繰り返す、２０回
ステップ６   ７２℃−２分
ステップ７ −保持
【０２６４】
任意の試薬における汚染テンプレートからの任意の誤った増幅を確実になくすため、各混合物について二重反復反応（duplicate reactions）（重鎖について４つの別々の反応
、および各軽鎖について１つ）を設定し、ここで、ｃＤＮＡテンプレートを水で置き換えた。テンプレートのないこれらの陰性対照反応を、テンプレートを含むサンプルと同時に行った。ＰＣＲプログラム終了後、テンプレートを反応に加えたが、ｃＤＮＡが存在しない場合のアンプリコンの存在について、各反応液（陰性対照を含む）３μｌを１．５％ＴＡＥアガロースゲル上の電気泳動によって分析した。図７は、これらの電気泳動ゲルの結果を示す。
【０２６５】
４５４シークエンシングのためのアンプリコンの精製、分析、定量化、および調製
ＰＣＲサンプル中の過剰のプライマーおよび／またはプライマーダイマー（dimmers）
を除去するため、Agentcourt Ampure磁性ビーズ（Beckman Coulter cat#A63881）を用い
て製造元のプロトコール（０００３８７ｖ００１）に従ってアンプリコンを精製した。Ampure精製後の溶出されたアンプリコンを、次いで、Agilent 2100 Bioanalyzerにおいて、高感度ＤＮＡチップ（Agilent Technologies cat# 5067-4626）を用いて製造元のプロト
コールに従って、純度および汚染ＤＮＡ種の欠如について分析した。
【０２６６】
アンプリコンの純度を確認したら、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen
cat#P7589）を用いて製造元のプロトコールに記載されたとおり、蛍光光度計においてＤＮＡの濃度を定量化した。キットに提供されたラムダＤＮＡを、１００ｎｇ／ウェルから１．５６ｎｇ／ウェルまでの標準曲線を作製する濃度基準として用いた。ＴＥ緩衝液中で１００倍に希釈された各アンプリコンの蛍光を、２回繰り返して測定し、そして標準曲線の直線部分によりＤＮＡの濃度を決定した。すべての蛍光測定は、黒色９６ウエルプレートで行った。蛍光値が標準曲線の直線範囲から外れている場合、蛍光値を直線範囲内で捕捉するために、より大きなまたはより小さな希釈度を用いてサンプルを再測定した。各鎖タイプ（重鎖−５４０ｂｐ、カッパ鎖−４８５ｂｐおよびラムダ鎖−５１０ｂｐ）の塩基対におけるおよそのサイズを用い、以下の式を用いて濃度を決定した：
各アンプリコンの濃度（分子／μｌ）＝
［サンプル濃度（ｎｇ／μｌ）＊６．０２２×１０23］／［６５６．６×１０9＊アン
プリコン長（ｂｐ）］
【０２６７】
各アンプリコンを１×１０7分子／μｌに標準化し、次いで重鎖：カッパ鎖：ラムダ鎖
を３：３：１の体積比で混合し、ボルテックスし、そして最後に１：１０で希釈して最終濃度１×１０6分子／μｌの混合物を得た。
【０２６８】
エマルジョンＰＣＲ増幅、ビーズ富化、ビーズ計数およびシークエンシング
エマルジョンＰＣＲは、４５４公開プロトコール：“emPCR Amplification Method Manual - Lib-L”（編：２０１０年５月、（Ｒｅｖ．２０１１年４月、全体として参照によ
り本明細書に組み込まれる）以下の変更：セクション３．１．３ステップ２を伴う）に従って行った。
【０２６９】
【表１５】
2018027090.tif 000021
【０２７０】
“emPCR Amplification Method Manual - Lib-L”のステップ３．７から、シークエン
シングビーズが富化されたら、Beckman Coulter's Z2 Particle Counterにおいて以下の
設定でビーズを計数した：
アパーチャー（Aperture）：          ＜１００μｍ＞
アパーチャーＫｄ：                 ＜６０．０４＞
設定された上部カットオフ：         ＜３０．００μｍ＞
設定された下部カットオフ：         ＜１０．００μｍ＞
計数モード：                        ＜間＞
計量体積：                          ＜０．５ｍｌ＞
分解能：                            ＜２５６＞
【０２７１】
ビーズの濃度は、以下のように算出した：
ビーズの濃度＝［粒子カウンターからの平均読取り＊４］ビーズ／μｌ
【０２７２】
エマルジョンＰＣＲからの富化ビーズを、GS FLX+またはGS Juniorについて４５４シークエンシングプロトコールに従って４５４シークエンサー（Roche）においてシークエン
シングした。
【０２７３】
免疫化ウサギの血清から集めたポリクローナル抗体のペプチド断片を、マウスについて上に記載したように生成させた（例えば、実施例６を参照のこと）。
【０２７４】
簡潔には、以下のプロトコールを用いた。
ウサギＩｇＧのペプチド−アフィニティー精製
１．ペプチド親和性樹脂を再懸濁し、そしてスラリー０．４ｍｌを新たなカラム（Bio-rad, 731-1550, ０．８×４ｃｍ）中に取り、そしてこれを０．２ｍｌ沈降精製樹脂にしな
ければならない。必要に応じて、等体積のブランク樹脂または非関連ペプチド親和性樹脂の対照カラムを作製する。ブランク樹脂を、結合プロセスにおいてペプチドなしで作った。
２．ＰＢＳ１０ｍｌでカラムを洗浄し、そしてそれを完全に排出させる。
３．プロテインＡで精製した全ＩｇＧを装填する。まず底部にふたをかぶせ、そしてパラフィンでラップする。全ＩｇＧ３〜５ｍｌを加える。上部にふたをかぶせ、そしてパラフィンでラップする。
４．ローラー上で、室温で１５分間回転させる。
５．フロースルーを集める。まず上部、次いで底部のふたを取り、カラムを完全に排出させる。
６．ＰＢＳ１０ｍｌで３回洗浄する（カラム壁を洗浄し、すべての樹脂を確実に底部に充填する）。
７．１×ＲＩＰＡ１０ｍｌで洗浄する。
８．ｐＨ７．４のＰＢＳ中の２０％アセトニトリル１０ｍｌで洗浄する。
９．ｐＨ７．４のＰＢＳ中の６０％エチレングリコール１０ｍｌで洗浄する。
１０．ｐＨ７．４のＰＢＳ中の２．０Ｍ ＮａＣｌ１０ｍｌで洗浄する。
１１．ｐＨ３．５の０．１Ｍグリシン５ｍｌで溶出し、ｐＨ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ７０
μｌで直ちに中和する。
１２．ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン５ｍｌで溶出し、ｐＨ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ３０
０μｌで直ちに中和する。
１３．ｐＨ１．８の０．１Ｍグリシン５ｍｌで溶出し、ｐＨ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ８０
０μｌで直ちに中和する。
１４．ウサギＩｇＧＥＬＩＳＡプレート（Molecular assay/ELISA groupによって提供さ
れる）を用いて、ＩｇＧ濃度について、すべてのまたは興味の画分を測定する。
１５．抗原特異的活性は、ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロットを用いて評価することができる。特異的活性は、すべての画分を同じ濃度に標準化した後に評価することもできる。
１６．精製された抗体物質は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで処理する準備ができている。
【０２７５】
上記のように精製した抗体からのペプチドにおいて、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析を実施した（すなわち、精製した抗体を消化し、そしてペプチドを分析した）。生成した質量スペクトルを、遺伝物質データベース中の情報に基づく理論質量分析データと関連づけた。
【０２７６】
図８に記載した表に示すように、ペプチドの実際の（すなわち、観測された）質量分析を、核酸配列からの理論質量分析データと関連づけることによって多くの重鎖および軽鎖ペプチドを同定した。これらのペプチドの出現頻度は、表の最も右のレーンに示す。これらの鎖は、そのＣＤＲ３包括度（ほとんどの場合１００％で）、および遺伝物質データベースから読み出され、そして合成された根底にあるヌクレオチド配列に基づいて選択した。６つの重鎖を５つの軽鎖とランダムに組み合わせ（図８に赤色で示す）、そして生成した抗体を、ＥＬＩＳＡ（抗原コーティングされたプレートを用いて）およびウエスタンブロッティング分析を用いて（未処理の（−レーン）またはヒト増殖因子（＋レーン）で処理されたＨｅｌａ細胞に対して試験し、ここで、ＨＧＦ処理細胞は、ｐ−Ｍｅｔ抗原を発現することが知られている。ウエスタンブロッティング分析の結果を図９に示す。ｐ−Ｍｅｔ特異的抗体（Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA,カタログ番号３１２
６から商業的に入手可能である）を対照として用いた。細胞溶解物中の抗原に対する高い特異的結合を示した、本明細書に記載された方法に従って生成された抗体は、図８に太字の赤色で示す（すなわち、重鎖参照番号ＧＸＲＹＱＰ２０１ＢＩＱＤ２およびＧＸＲＹＱＰ２０１Ａ９７ＤＺならびに軽鎖参照番号ＧＸＲＹＱＰ２０１Ａ２９１ＴおよびＧＸＲＹＱＰ２０１ＢＲＩＷＫおよびＧＸＲＹＱＰ２０１ＡＬＤＦ５）。なお、図９は、本実施例で生成された抗原に特異的に結合する６つの異なる抗体のうちの２つしか示していないことに留意する（すなわち、図９は、ＧＸＲＹＱＰ２０１Ａ２９１Ｔ軽鎖およびＧＸＲＹＱＰ２０１ＢＲＩＷＫ軽鎖と結合されたＧＸＲＹＱＰ２０１ＢＩＱＤ２重鎖を用いる２つの抗体しか示していない。
【０２７７】
また、マウス抗体で観測されるように、最も高い頻度を有する鎖は、抗原特異的抗体の形成を行わなかった（９．１２％の頻度を有したが、抗原を特異的に結合しなかった重鎖ＧＸＲＹＱＰ２０１Ａ１Ｃ３Ｂを、０．１９％の頻度しかなかったが、抗原を特異的に結合した重鎖ＧＸＲＹＱＰ２０１  ＢＩＱＤ２と比較する）。
【０２７８】
実施例７
本実施例は、上に記載されたアプローチを用いた、４種の異なる抗原で免疫化されたウサギからのおよびさらなる異なる抗原で免疫化されたマウスからのモノクローナル抗体の生成（表１２）を記載し、本アプローチが、少なくとも２つの実験動物種において確実であり、かつ再現可能であることを示している。
【０２７９】
【表１６】
2018027090.tif 000022
【０２８０】
ニュージーランドホワイトウサギをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合したヒトプロゲステロン受容体Ａ／Ｂ特異的（ＰＲ Ａ／Ｂ）ペプチドで免疫化した。
各動物の粗血清中の抗原特異的抗体活性をスクリーニングしてＰＲ Ａ／Ｂに対して最も
高いＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットシグナルを有するウサギを選択した。この動物からの血清を、２０ｍＬの血液から集め、そして脾Ｂ細胞からＲＮＡを得た。プロテインＡセファロースカラムを用いて、血清から全γ免疫グロブリン（ＩｇＧ）を単離し、そしてセファロースビーズに結合した抗原特異的ペプチドからなるカスタムカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーによって抗原特異的ポリクローナル抗体を精製した。結合したＩｇＧをＰＢＳで十分に洗浄し、そして徐々に酸性の緩衝液（ｐＨ３．５、ｐＨ２．７およびｐＨ１．８）を用いる逐次的溶離にかけた（図１０ａ）。各溶離からの画分を集め、中和し、そしてＰＲ Ａ／Ｂ発現細胞系統Ｔ４７ＤおよびＰＲ Ａ／Ｂ陰性細胞系統ＨＴ１０８０からの溶解物の抗原特異的ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングによってスクリーニングした（図１０ａ）。ＰＲ Ａ／Ｂウエスタンブロット比活性は、ポリ
クローナル画分が適合した濃度であったときに、ｐＨ１．８の画分において非常に富化され、ｐＨ２．７の画分においてより少ない程度に富化され、そしてｐＨ３．５の画分において検出不可能であることが見いだされた。したがって、ｐＨ１．８の画分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いた。
【０２８１】
ＮＧＳによりＩｇＶ領域配列のカスタムデータベースを生成するため、ＰＲ Ａ／Ｂに
強い特異的活性を示した同じ動物から集めた全脾細胞からＲＮＡを単離した。Ｖ領域全体を増幅するためウサギＩｇ特異的γおよびκ鎖プライマーを用いて、Ｉｇ重鎖および軽鎖可変領域アンプリコンを生成させた。プライマーはバーコードを含み、そしてRoche４５
４ＮＧＳプラットフォーム用の４５４チタン融合プライマーデザインに対する特定の要求に従った。集めたＶ領域配列の数を増やすため、本発明者らは、γおよびκ鎖からなる３回の454 GS Juniorシークエンシングランを組み合わせ、合計８０，０００の通過したフ
ィルター読取り値を得、そのうちの４４，３６３は、全Ｖ領域を含んでおり、そして下記
のプロテオミクスアプローチのための基準を提供した。集めた配列は、５，２７９のユニークγ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列およびガウス分布に従う様々な長さの１１，６８１のユニークκ鎖ＣＤＲ３配列を含んだ。以前のデータと一致して、このウサギは、重鎖ＶＤＪ再構成においてＶＨ１（Ｖ１Ｓ６９＋Ｖ１Ｓ４０＞６４％）、続いてＶＨ４（Ｖ１Ｓ４４＋Ｖ１Ｓ４５約３０％）を優先して用いた
（Becker et al., Eur J Immunol 20: 397-402, 1990, Knight, Annu Rev Immunol 10: 593-616, 1992, Mage et al., Dev Comp Immunol 30: 137-153, 2006）。
【０２８２】
次に、ｐＨ１．８の画分を、その以前の活性に基づいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって試験した（図１０ａ）。配列包括度を最大にするため、ポリクローナル抗体５μｇを均等に分け、そしてキモトリプシン、エラスターゼ、ペプシンおよびトリプシンによって別々に消化した。Orbitrap Velos（Thermo Fisher）を用い、４５分の勾配を用いて４回のＬＣ−
ＭＳ／ＭＳランの合計を集め、ラン当たり１０，０００スペクトルの平均を得た（図１０ｂ）。偽発見率（false-discovery rate）（ＦＤＲ）を算定するため、順方向および逆方向の配列の複合データベースを生成することによってターゲット／デコイアプローチを用い（Elias et al., Nat Methods 4: 207-214, 2007）、そしてＳＥＱＵＥＳＴ（Yates et
al., Anal Chem 67: 1426-1436, 1995）プログラムを用いて各ＬＣ−ＭＳ／ＭＳランを
探索した。可能ならば酵素特異性を考慮して（キモトリプシン／トリプシン）、線形判別分析（Huttlin et al., Cell 143: 1174-1189, 2010）を用いて、ペプチドスペクトルマ
ッチ（ＰＳＭ）を最終ＦＤＲ≦２％にフィルタリングする。この方法を用いて同定された高い信頼度の重鎖ＣＤＲ３ペプチドの例を図１０ｃに示す。個々のランを組み合わせ、そして合計２，３５６のＶ領域ＰＳＭを、１．８％のＦＤＲで同定した。
【０２８３】
抗体Ｖ領域配列のデータベースは、タンパク質アイソフォームのデータベースに類似している。結果として、少数のペプチドのみを用いてタンパク質を確信的に同定することが多い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによってショットガンシークエンシングを用いる従来のアプローチは、ポリクローナル抗体混合物中の抗体Ｖ領域配列を同定するには不十分である。さらに、抗体Ｖ領域配列は、たった１つのアミノ酸によって変化することがありうるため、高い質量精度は、ＰＳＭにおいてさらなる信頼度を提供するのに役立つ。ＳＥＱＵＥＳＴによって決定された質量誤差≧−５ｐｐｍおよび≦５ｐｐｍを有する各Ｖ領域ＰＳＭを、全Ｖ領域データベースに戻ってマップし、データセット全体でＰＳＭ冗長度および包括度に対処した（図１０ｄ）。リマップ後、ペプチドの総数、ユニークペプチド数、スペクトル共有（配列に対する全ペプチドマッピング／全Ｖ領域ＰＳＭ）、全Ｖ領域配列包括度、およびＣＤＲ３包括度を、各Ｖ領域配列について決定した。ポリクローナル混合物から富化されることが多い高い信頼度を有するＶ領域配列を同定するためにプロテオミクス分析では、以下を含む経験的に厳しい基準を適用する：ａ）全体的に高い包括度（≧６５％）、ｂ）Ｖ領域配列の高度の相同性のため、少なくとも１２のユニークペプチドおよびｃ）高い超可変領域包括度、特に≧９５％のＣＤＲ３包括度。Ｖ領域配列は、１つのプロテアーゼを単独で用いて同定することができるが、ポリクローナル混合物の予測不可能な複雑さと共にＶ領域配列における高い変動率のため、Ｖ領域包括度を高めるために多数のプロテアーゼを用いることが好都合であることが見出された。例えば、図１０ｅに示すように、異なるプロテアーゼからの多数のオーバーラップペプチド断片は、重鎖および軽鎖配列の両方の全ＣＤＲ３の同定に貢献した。同じＶ領域配列にマップする多数のプロテアーゼからの多数のランにわたってユニークＰＳＭを同定することで、スペクトル計数および全Ｖ領域配列にわたる包括度が増加し、特定のＶ領域配列がポリクローナル混合物中に存在する信頼度が高まり、そしてＮＧＳ配列品質における信頼度がさらに高まる（Kircher et al., Bioessays 32: 524-536, 2010）。上記のフィルタリング基準を用いて、高信頼度の
合計１０のγ鎖および８のδ鎖の配列を、ｐＨ１．８の溶出画分から同定した（表１３）。
【０２８４】
【表１７】
2018027090.tif 000023
【０２８５】
アフィニティー精製された血清中に存在する高い信頼度のＶ領域配列の存在についての証拠を提供するにもかかわらず、タンパク質分解およびサンプル調製中のジスルフィド結合の還元のため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータから、同種の重鎖および軽鎖対形成における直接情報は存在しない。結果として、ＮＧＳ頻度によって観測され、そしてＥＬＩＳＡによってＰＲ Ａ／Ｂペプチドに対する抗原特異的結合活性についてスクリーニングされた最
も高いランクの重鎖および軽鎖に加えて、重鎖および軽鎖対形成のすべての可能な組合せ（１つの９６−ウエルプレートトランスフェクション中、合計８０の抗体について８×１０マトリックス）を発現させた。合計１２の重鎖および軽鎖対が抗原特異的ＥＬＩＳＡによって陽性であった（図１１ａ）。次いで、各抗原特異的ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、細胞溶解物中で内因的に発現されたＰＲ Ａ／Ｂに対する特異性についてウエスタンブロッ
トによって試験した（図１１ｂ）。６つクローンが、ＰＲ Ａ／Ｂ（図１１ｂ）に特異的
に結合することが見いだされ；同じ抗体濃度で検定したときに、２つのクローンが、最初のポリクローナル混合物と比較して非常により強いシグナルを示した。ウエスタンブロッ
トによって陽性の抗原特異的クローンを、さらなるアッセイにおいてさらに特徴づけた。１つのモノクローナル抗体、クローンＦ９およびクローンＣ１は、ウエスタンブロッティングおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）（図１１ｂ〜ｃ）において優れたシグナルおよび特異性を示し、そしてまた、ポリクローナル混合物が失敗したフローサイトメトリー（ＦＣ）および免疫蛍光検査（ＩＦ）アッセイにおいても特異的に反応した（図１１ｄ〜ｅ）。これに対して、その最も高いＮＧＳランクによって選択されたγおよびκ鎖は、抗原特異的抗体を生じなかった。ＣＤＲ３含有ペプチドは、最も高いＮＧＳランクのγおよびκ鎖から観測されず、そして３０の最も高いランクのγまたはκ鎖からのＣＤＲ３配列は、本発明者らのプロテオミクスアプローチによって高い信頼度で同定された。活性の欠如は、同種の対形成の欠乏のためでありうるということは、除外できないが、これらの鎖がＬＣ−ＭＳ／ＭＳによってまったく観測されなかった事実は、最も高いランクのＮＧＳ鎖がいずれも抗原に対して特異的でなかったことを示唆している。したがって、これらの実験では、抗原特異的抗体を、ＮＧＳランクのみに基づいて同定することはできなかった。
【０２８６】
クローン多様性を視覚化するために、表１３に示す高い信頼度の重鎖および軽鎖Ｖ領域配列において、系統発生的分析（Dereeper et al., Nucleic Acids Res 36: W465-469, 2008）を実施した。重鎖または軽鎖のいずれかに密接に関連した配列は、離散性の群に集
まった。興味深いことに、この報告で発見されたすべてのＰＲ Ａ／Ｂ特異的モノクロー
ナル抗体は、おそらく免疫化中に密接に関連したＢ細胞からのクローン増殖のため、系統樹において密接に一緒に集まった。また、生殖細胞系列の使用は、この観測を支持した（表１３）。類似の観測を、異なる抗原を用いる独立した実験で行った（Ｌｉｎ２８Ａ、図１２）。
【０２８７】
本実施例に記載された実験に用いる方法は、以下のとおりである。
【０２８８】
動物の免疫化および取扱い。各ヒトタンパク質抗原の異なる領域のアミノ酸配列から誘導されたキーホールリンペットヘモシアニン結合ペプチドの混合物を用いて、それぞれ３週間隔で４回の別々の用量による皮内注射によってニュージーランドホワイトウサギを免疫化した。ペプチドを、Imjectマレイミド活性化ＫＬＨ（Thermo-Pierce）に結合した。
マウス免疫化は、免疫化の経路が腹腔内であり、そして注射が２週間隔であったことを除いて同じ方法で実施した。最終ブーストの３日後に血液を採血した。安楽死の時に、各動物からの全脾臓を集め、続いて、所望のポリクローナル活性を確定した。
【０２８９】
ウサギおよびマウスＢ細胞レパートリーの次世代ＤＮＡシークエンシング。高度免疫化されたウサギおよびマウスからの脾細胞を集め、そして全ＲＮＡ精製のため、Qiagen's RNeasyキットを用いて製造元のプロトコールに従って溶解した。提供されたプロトコール
を用いて、ＲＮＡをカラム上でＤＮａｓｅＩ（Qiagen cat# 79254）により処理してゲノ
ムＤＮＡを除去した。454 Life Sciencesプラットフォーム（Roche）でシークエンシングされるこの物質から重鎖および軽鎖アンプリコンライブラリーを生成するために、ＲＴ−ＰＣＲを、以下のとおり実施した。プライマーとしてオリゴｄＴを用い、Thermoscript逆転写酵素（Invitrogen cat# 12236014）を用いて、テンプレートとして脾細胞全ＲＮＡからｃＤＮＡを生成させた。ウサギＩｇＧシークエンシングのため、以下のステップでPhusion（R） Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes Oy, フィンランド）を用いてγ、κ１、κ２およびλ鎖の可変領域を、配列特異的４５４融合プライマーで増幅した（５’末端においてリーダーにハイブリダイズし、そして同定に必要な３’末端において配列を含み、そして４５４シークエンシングプラットフォームのＬｉｂ−Ｌフォーマットにおいてバーコード化する）：変性−９８℃９０秒間；２０サイクル［変性−９８℃１０秒間；アニーリング−６０℃３０秒間；伸長−７２℃３０秒間］。マウスＩｇＧシークエンシングのため、重鎖および軽鎖アンプリコンを、２ステップＰＣＲ法によって生成させた。第１のステップにおいて、センスプライマーとして遺伝子ファミリー特異的変
性オリゴヌクレオチド、および定常領域の始まりの高度に保存された領域にハイブリダイズされたアンチセンスプライマーの混合物であって、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーが、それぞれその５'末端で明瞭なアダプター配列を含む、混合物を用いて
、γまたはκ鎖可変領域を増幅した（ウサギについては上記と同じ条件で１５サイクル）。第１のラウンドから各反応物を、市販キット（Qiagen cat#28104）でカラム精製し、次いで、同定に必要な３’末端における配列を含むアダプター配列特異的プライマーおよび４５４シークエンシングプラットフォームのＬｉｂ−Ｌフォーマットにおけるバーコード化を用いて、第２のステップにおいて追加の１０（γ鎖）および８サイクル（κ鎖）によってさらに増幅した。いずれの種についても、各動物のすべての軽鎖増幅反応物をプールした。Agencourt AMPure XP DNA精製システムを用いて、提供されたプロトコールに従っ
て重鎖および軽鎖サンプルの過剰のプライマーを除去した。プライマー除去後のアンプリコンプールの品質および純度は、Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）において確認し、そしてＤＮＡの濃度は、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen）を用いて蛍光光度計において正確に定量化した。454 Life SciencesからのLib-L LV
、GS FLX Titanium Seriesプロトコールに従って、エマルジョンＰＣＲおよびビーズ富化を実施した。ビーズ数をBeckman Coulter Z2 Particle Counterにおいて計数し、そして
ライブラリーを454 GS Junior（Roche）においてシークエンシングした。
【０２９０】
抗原特異的ＩｇＧの親和性精製。高度免疫化されたウサギ（ニュージーランドホワイト）の血清からの全ＩｇＧを、プロテインＡセファロースビーズ（GE Healthcare）を用い
て精製し、そしてセファロースビーズに共有結合した免疫原ペプチドを有するカラム中で１５分間回転させてインキュベートした。重力流によって非結合画分を排出し、そしてカラムを１×リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄して非特異的ＩｇＧを除去した。抗原特異的ポリクローナルＩｇＧプールを、ｐＨ３．５、続いてｐＨ２．７、そして最後にｐＨ１．８の０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝液で順に溶離した。各溶出液を１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）で直ちに中和した。高度免疫化されたマウスの血清からの全ＩｇＧを、プロテインＧ磁性ビーズ（Millipore, cat# LSKMAGG10）を用いて精製し、次い
で、磁性ビーズ上に固定化された免疫原ペプチド（Pierce, cat#88817）を用いて４℃で
一夜回転させてインキュベートした。磁性チューブラック（Invitrogen, cat# 12３21D）を用いてビーズをＰＢＳで十分に洗浄し、次いでカラムに結合された抗体を、ウサギＩｇＧ精製について記載したように徐々に酸性のｐＨで順に溶離した。
【０２９１】
アフィニティー精製された抗体のプロテアーゼ消化。ポリクローナル抗体を、ｐＨ８の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中の８Ｍ尿素中で変性させ、そして１０ｍＭ ＤＴＴ中、５５℃で１時間還元した。還元されたポリクローナルを室温（ＲＴ）に冷却し、そして２０ｍＭヨードアセトアミドの存在下で１時間アルキル化を実施した。キモトリプシン、エラスターゼおよびトリプシン消化は、酵素対基質比１：５０で、ｐＨ８．０の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
中の２Ｍ尿素の存在下、３７℃で一夜実施した。ペプシン消化は、酵素対基質比１：５０で、３Ｍ酢酸の存在下、室温で一夜実施した。消化されたペプチドを、以前に公開されたように（Rappsilber et al., Anal Chem 75: 663-670, 2003）ＳＴＡＧＥ−ＴＩＰＳによって脱塩し、そしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０２９２】
質量分析。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、LTQ Orbitrap Velos（Thermo-Fisher）質量分析計を
用いて実施した。インラインフロースプリッターを有するAgilent 1100シリーズバイナリーポンプを用いてMagic C18aQ樹脂（５μｍ、２００Å）で充填されたハンドポワード（hand-poured）溶融シリカ毛細管カラム（内径１２５μｍ×２０ｃｍ）上へ、Famosオート
サンプラー（LC Packings）を用いて、サンプルを７分間装填した。クロマトグラフィー
は、バイナリー勾配を用いて５〜３０％溶媒Ｂ４００ｎｌ／分で４５分間展開した（溶媒Ａ、０．２５％ギ酸（ＦＡ）；溶媒Ｂ、０．１％ＦＡ、９７％アセトニトリル）。１０6
の自動利得調節（ＡＧＣ）ターゲットを有するOrbitrap（６×１０4の分解能設定で３０
０〜１，５００ｍ／ｚ）において、上記のマスタースペクトルからデータ依存的なやり方で、２０のＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。荷電状態スクリーニングを用いて単独で荷電された種を排除し、そしてＭＳ／ＭＳスペクトルを誘発するには５００計数の閾値が必要であった。可能な場合、ＬＴＱおよびOrbitrapは、パラレル処理方式で操作した。
【０２９３】
データベース探索およびデータ処理。ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズム（バージョン２８ｒｅｖ１２）（Yates et al., Anal Chem 67: 1426-1436, 1995）を用いて、２１，９３２
の完全長ガンマＶ領域配列および２２，４３１の完全長カッパＶ領域配列、ならびに６，３５８の酵母タンパク質（S. cerevisiae, NCBI）に結合されたガンマおよびカッパ定常
領域配列、ならびにいくつかのヒトケラチン、トリプシンおよびキモトリプシンを含む、４２の一般的な汚染物質で構成されるカスタムハイブリッドデータベースに対してＭＳ／ＭＳスペクトルを探索した。Ｖ領域配列は高度に関連づけられているため、酵母プロテオームは、参照データベースに対してより多様な配列を人工的に与えており（Beausoleil et al., Nat Biotechnol 24: 1285-1292, 2006）、そしてフィルタリングしたデータが酵
母から同定されたペプチドを含むはずがないため、最終データセットをフィルタリングした後、信頼度の別のソースを提供した。探索パラメーターには、キモトリプシンおよびトリプシンに対する部分的特異性ならびにエラスターゼおよびペプシンに対する特異性のなさ、質量許容差±５０ｐｐｍ、システインにおける５７．０２１４の静的修正（static modification）、およびメチオニンにおける１５．９９４９の動的修正（dynamic modification）が含まれる。データセットにおける偽発見率は、ターゲット／デコイアプローチ
（Elias et al., Nat Methods 4: 207-214, 2007）を用いて算定した。線形判別分析（Huttlin et al., Cell 143: 1174-1189, 2010）を用いて、データセットを≦２％のＦＤＲ
にフィルタリングした。Orbitrapの質量精度は、５０ｐｐｍを大きく超えるが、より広い前駆体イオン許容差で探索する場合、正確なペプチド同定により小さな前駆体質量誤差（±１ｐｐｍ）が生じるのに対して、間違ったペプチド同定により５０ｐｐｍウィンドウ全体にわたって広がる。結果として、ストリンジェント前駆体マスフィルター（stringent precursor mass filters）は、データセットからの多くの間違ったＰＳＭを選択的に除去する。
【０２９４】
獲得後の分析は、本明細書に記載されたとおり実施した。簡潔には、Ｖ領域配列から誘導された通過ペプチドを、ＮＧＳＩｇデータベースにリマップした。キモトリプシンおよびトリプシン消化物から生じたペプチドについて、マッチは、予想された切断から生じたものに制限された（トリプシンについてＫＲ、キモトリプシンについてＹＷＦＬＭＡ）。ＣＤＲ包括度は、カバットによって定義された法則（Wu et al., J Exp Med 132: 211-250, 1970）を用いてＣＤＲを同定することによって決定した。すべての場合において、包
括度は、高い信頼度ペプチドから同定されたアミノ酸の総数を、成熟したＶ領域配列中のアミノ酸の数で割ったものとして定義される。
【０２９５】
同定された免疫グロブリン鎖のクローニング、発現および特徴づけ。アフィニティー精製されたポリクローナルＩｇＧプールの質量分析を通して同定されたγおよびκ鎖を、以下のようにクローニングし、そして発現させた。それぞれ同定された鎖について、ＦＷＲ１からＦＷＲ４までの全可変ドメインをコードする核酸配列を合成した（Integrated DNA
Technologies, Coralville Iowa）。オーバーラップＰＣＲを用い、リボソームスキップ機構を用いて１つのオープンリーディングフレームから２つのポリペプチドを生成するウイルス性２Ａ配列により各重鎖−軽鎖の組合せ順列（combination permutation）を発現
した（Doronina et al., Mol Cell Biol 28: 4227-4239, 2008, Donnelly et al., J Gen
Virol 82: 1027-1041, 2001）。５’から３’の順序で、軽鎖の可変および定常領域、Thosea asignaウイルスからの２Ａペプチド配列、および重鎖可変ドメインの１つのオープ
ンリーディングフレームカセットを、インフレームのウサギγ鎖リーダー配列およびウサギγ鎖定常領域、クローニング部位の５’および３’をそれぞれ含む、ＣＭＶプロモータ
ー駆動型哺乳動物発現プラスミド中にクローニングした。ポリエチレンイミンを用いてこのようにアセンブリングされた各軽鎖−重鎖組合せをコードするプラスミドプレップを用いて、ＨＥＫ２９３をトランスフェクトした（Boussif et al., Proc Natl Acad Sci USA
92: 7297-7301, 1995）。トランスフェクション２〜５日後、コーティング抗原として免疫原ペプチドを用いるＥＬＩＳＡによって、抗原特異的抗体の分泌液について上清をスクリーニングし、そして反応性を示した軽鎖−重鎖順列をさらに特徴づけた。マウス抗体発現について、定常領域は、マウスＩｇＧ２ａであった。
【０２９６】
ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光検査および免疫組織化学によるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の特徴づけ。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光検査および免疫組織化学の詳細なプロトコールは、オンラインでCell Signaling Technology Inc.のウェブサイトに見いだすことができる。高結合性が保証されたポリスチレン９６−ウエルプレートCostar
cat#3369を、ＥＬＩＳＡに用いた。各ターゲットについてのＥＬＩＳＡ分析に用いた抗
原は、免疫化に用いたのと同じペプチドであった。プロゲステロン受容体抗体については、ウエスタンブロッティングをＴ４７Ｄ（ＰＲ＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＰＲ−）およびＨＴ−１０８０（ＰＲ−）細胞溶解物において実施し、フローサイトメトリー分析をＴ４７Ｄ（ＰＲ＋）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＰＲ−）において実施し、共焦点免疫蛍光検査分析をＭＣＦ−７細胞（ＰＲ＋）においてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＰＲ−）と比較して実施し、そして免疫組織化学的アッセイをパラフィン包埋原発性ヒト乳がん切片、Ｔ４７Ｄおよびパラフィン包埋ＭＣＦ−７細胞（ＰＲ＋）においてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＰＲ）と比較して実施した。ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫマウス抗体については、ウエスタンブロッティングを、Ｕ１０２６（Cell Signaling Technology,
Inc. cat# 9903）または１２―Ｏ―テトラデカノイルホルボール―１３―アセテート（
ＴＰＡ）（Cell Signaling Technology, Inc. cat# 4174）のいずれかで処理されたジャ
ーカット細胞からの溶解物において実施した。Ｌｉｎ２８Ａ抗体については、ウエスタンブロッティングを、ＮＣＣＩＴ、ＮＴＥＲＴＡ、ＭＥＳおよびＩＧＲＯＶ１細胞系統からの全溶解物において実施し、共焦点免疫蛍光検査およびフローサイトメトリー分析をＮＴＥＲＡ（Ｌｉｎ２８Ａ＋）およびＨｅＬａ（Ｌｉｎ２８Ａ−）細胞において実施した。ホスホ−Ｍｅｔ（ｐＭｅｔ）抗体については、未処理の（ｐＭｅｔ＋）ＭＫＮ４５細胞およびＳＵ１１２７４Ｍｅｔキナーゼ阻害剤で処理された（ｐＭｅｔ−）ＭＫＮ４５細胞からの溶解物を用いた。Ｓｏｘ１抗体については、マウス脳抽出物（Ｓｏｘ１＋）およびＮＩＨ−３Ｔ３（Ｓｏｘ１−）細胞からの溶解物を用いた。
【０２９７】
実施例８
本実施例では、Ｂ型肝炎ウイルス小型表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に特異的なヒトモノクローナル抗体を、本明細書に記載された方法に従って生成した。これを行うために、以下のプロトコールに従って遺伝物質データベースを生成した。ポリクローナル抗体を下記のように精製し、そしてマウスおよびウサギについて上に記載したように質量分析に従って分析した。
【０２９８】
Ｉ．核酸配列の生成。
抗原特異的、記憶および全Ｂ細胞単離ならびにＲＮＡ精製
フィコール勾配（Ficoll gradient）を用いて、ヘパリン真空チューブ中に集めた新た
なヒト全血から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。底部にHistopaque 1077（Sigma Aldrich cat#10771）２０ｍｌを含むGreiner Leucocep ５０ｍｌのコニカルチューブ
（Sigma Aldrich cat# Z642843）において、最大２５ｍｌの血液を上部に適用し、次いで、チューブを室温、１５００×ｇで２０分間遠心分離した。滅菌ピペットを用いて白血球（バフィーコート）を集め、５０ｍｌのＲＰＭＩ中に細胞を再懸濁することによってＲＰＭＩ培地中で２回洗浄し、次いで、４℃、３００×ｇで１０分間遠心分離した。洗浄後、
ＰＢＭＣを、ウシ胎児血清中の２０％ＤＭＳＯ中で低温保存するか、またはＢ細胞単離のため直ちに処理した。
【０２９９】
Ｂ細胞単離のため、陰性選択法を用い、Invitrogen's Dynabeads Untouched B-cell Isolationキット（Invitrogen cat#113-51D）を製造元のプロトコールに従って用いて、Ｐ
ＢＭＣからすべての非Ｂ細胞を除去した。生成した非標識Ｂ細胞集団を、さらに処理して抗原特異的または記憶Ｂ細胞のいずれかを単離した。抗原特異的Ｂ細胞単離のため、全標識Ｂ細胞を、ストレプトアビジン磁性ビーズ（Pierce-Thermo Scientific cat#88816）上に固定化されたビオチン化抗原と共に、ローテーター上、室温で２０分間インキュベートした。任意の抗原結合性Ｂ細胞を含むビーズを、次いで１×ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、洗浄したビーズを、ＲＮＡ単離のため、Qiagen's RNeasyキットＲＬＴ溶解緩衝液（
１％β−メルカプトエタノールで補充された）中に再懸濁した。
【０３００】
記憶Ｂ細胞単離のため、ＣＤ２７＋および表面ＩｇＧ＋細胞単離用のMiltenyiのＭＡＣキット（Miltenyi Biotec（Auburn, CA）cat#130-051-601 および130-047-501）を用いて、全非標識Ｂ細胞からＣＤ２７＋および表面ＩｇＧ＋細胞を単離した。ＣＤ２７＋およびｓＩｇＧ＋Ｂ細胞を同時に単離するために、両方の細胞表面マーカーに対する磁性ビーズ結合抗体を、インキュベーションステップ中に同時に加えた。精製したら、記憶Ｂ細胞を３００×ｇで１０分間遠沈させ、次いでＲＮＡ単離について上に記載したようにＲＮＡ用のＲＬＴ緩衝液中に溶解した。
【０３０１】
Qiagen's RNeasyキット（Qiagen cat# 74104）を用いて製造元のプロトコールに従って、選択された細胞からＲＮＡを精製した。ＤＮａｓｅＩ消化ステップを組み込むことによって、カラム上でＤＮａｓｅＩ処理を行って汚染ゲノムＤＮＡを除去した。ＲＷ１緩衝液洗浄後、ＲＤＤ緩衝液中に希釈されたＤＮａｓｅＩ（Qiagen cat# 79254）をＲＮＡ精製
カラムに適用し、そして室温で２０分間インキュベートした。次いで、カラムをＲＷ１緩衝液でさらに１回洗浄し、続いてＲＰＥ緩衝液で２回洗浄し、そしてＲＮＡを水３０μｌまたは５０μｌで溶離した。ＲＮＡの濃度は、波長４５０ｎｍでNanodrop分光光度計（Thermo Scientific）において測定された吸光度によって決定した。
【０３０２】
ＰＣＲによるアンプリコンのｃＤＮＡ合成および生成
まず、記憶または抗原特異的Ｂ細胞から単離されたＲＮＡを、以下に示すように、Invitrogen's Thermoscript逆転写酵素（Invitrogen cat#12236-022）を用いて逆転写した：
ＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ：                 ５μＬ
オリゴｄＴプライマー（５０μＭ）：     １μＬ
ｄＮＴＰ’ｓ（１０ｍＭ）：             ２μＬ
ｄＩＨ２Ｏ：                           ４μＬ
【０３０３】
６５℃で５分間インキュベートし、氷上に２分間置き、次いで、以下を加えた：
５×ｃＤＮＡ緩衝液：                   ４μＬ
０．１ｍＭ ＤＴＴ：                    １μＬ
ＲＮａｓｅＯＵＴ：                     １μＬ
ｄＩＨ２Ｏ：                           １μＬ
ThermoScript：                         １μＬ
【０３０４】
混合物を５０℃で１時間インキュベートし、その後、８５℃で５分間の熱不活性化ステップを続けた。最後に、ＲＮａｓｅＨ（Invitrogen cat#18021-071）１μｌを加え、そして３７℃で２０分間インキュベートすることによってｃＤＮＡから相補的ＲＮＡ鎖を除去した。
【０３０５】
シークエンシングのための重鎖、カッパ鎖およびラムダ鎖可変領域のアンプリコンを、以下のようにＰＣＲによって生成した。重鎖の増幅では、Ｂ細胞プール中のＶＨ遺伝子転写頻度（transcript frequency）の天然分布（natural distribution）を保存するため、以下に挙げるプライマーを用いて、各ｃＤＮＡサンプルについて４つの独立した反応（それぞれＶＨ１および７；ＶＨ２、５および６；ＶＨ３；ならびにＶＨ４の遺伝子ファミリーに特異的なもの）を行った。カッパ鎖およびラムダ鎖増幅では、各鎖について１つの反応を、各ｃＤＮＡサンプルについて行った。各反応では、フォワードプライマーの等モル混合物を、同濃度の以下に示すリバースプライマーと共に用いた。増幅は、Ｌｉｂ−Ｌプラットフォームによる４５４シークエンシングに適合しうる融合プライマー（Roche）を
用いて実施した。各鎖の定常領域の５’末端にハイブリダイズするようにリバースプライマーを設計した。これらのプライマーは、シークエンシングの読み取りが、各定常領域（リバースセンス）の先端の５'末端から可変領域の３’末端に開始されるように、Ｌｉｂ
−ＬプライマーＢおよびＭＩＤ配列を含む。重鎖およびカッパ鎖では、各ＭＩＤについて１つのリバースプライマーを用いるが、ラムダ鎖では、各ＭＩＤについて２つの異なるリバースプライマーが必要であった。
【０３０６】
重鎖融合プライマー:
【表１８】
2018027090.tif 000024
【０３０７】
【表１９】
2018027090.tif 000025
【０３０８】
【表２０】
2018027090.tif 000026
【０３０９】
カッパ鎖融合プライマー
【表２１】
2018027090.tif 000027
【０３１０】
ラムダ鎖融合プライマー
【表２２】
2018027090.tif 000028
【０３１１】
【表２３】
2018027090.tif 000029
【０３１２】
【表２４】
2018027090.tif 000030
【０３１３】
ＰＣＲ増幅は、Finnzyme's Phusion Hot Start IIポリメラーゼ（Thermo Scientific cat# F-540S）を用いて行い、ここで、反応混合物および条件は、以下に示すように設定した：
反応混合物：
ｃＤＮＡ：                                      ２．５μＬ
５×緩衝液ＧＣ：                                ５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物：                       ０．２５μＬ
Phusion HotStart II：                           ０．２５μＬ
プライマー（フォワード＋リバース）３０μＭ：    ０．２５μＬ
水：                                            １６．７５μＬ
ＰＣＲプログラム：
ステップ１  ９８℃−２分
ステップ２  ９８℃−１０秒
ステップ３  ６０℃−３０秒
ステップ４  ７２℃−３０秒
ステップ５  ステップ２〜４を繰り返す
ステップ６  ７２℃−２分
ステップ７−保持する
【０３１４】
各鎖について抗原特異的Ｂ細胞ｃＤＮＡからの十分な増幅には５回の余分なサイクルが必要であるため、記憶Ｂ細胞からまたは抗原特異的Ｂ細胞から生成されるｃＤＮＡテンプレートを増幅するときは、それぞれ、重鎖増幅では、２５または３０サイクル（ステップ５は、２４または２９回繰り返した）、そしてカッパおよびラムダ鎖では、２０または３０サイクル行った。任意の試薬の汚染テンプレートから任意の誤った増幅がないようにするため、各混合物について二重反復反応を設定し（重鎖については４つの別々の反応、そして各軽鎖については１つ）、ここでは、ｃＤＮＡテンプレートを水と交換した。テンプレートのないこれらの陰性対照反応を、テンプレートを含むサンプルと同時に行った。Ｐ
ＣＲプログラム終了後、テンプレートを反応に加えたが、ｃＤＮＡが存在しないときのアンプリコン（重鎖について、およそ５４０ｂｐ、カッパ鎖について、およそ４８５ｂｐそしてラムダ鎖について、およそ５１０ｂｐ）の存在について、１．５％ＴＡＥアガロースゲル上の電気泳動によって各反応物３μｌ（陰性対照を含む）を分析した。
【０３１５】
アンプリコンの精製、分析、定量化および４５４シークエンシングのための調製
ＰＣＲサンプル中の過剰のプライマーおよび／またはプライマーダイマーを除去するため、Agentcourt Ampure磁性ビーズ（Beckman Coulter cat#A63881）を製造元のプロトコ
ール（０００３８７ｖ００１）に従って用いてアンプリコンを精製した。重鎖については、すべての４つの反応物（ＶＨ１／７、ＶＨ２／５／６、ＶＨ３、ＶＨ４）をプールし、そして１つのサンプルとして精製し、したがって、３つのアンプリコンサンプルの全体（重鎖、カッパ鎖およびラムダ鎖）を、各ｃＤＮＡ増幅のために精製した。９６ウエルプレートフォーマット中の代わりに１．５ｍｌチューブに適した一般的な磁性ラックを用いて単一の１．５ｍｌマイクロチューブ中で精製を行うように、ampure精製のプロトコールを変更した。すべての体積および他の手順は、プロトコールに記載したとおりである。Ampure精製後に溶出されたアンプリコンを、次いで、高感度ＤＮＡチップ（Agilent Technologies cat# 5067-4626）を用いて製造元のプロトコールに従ってAgilent 2100 Bioanalyzerにおいて、純度および任意の汚染ＤＮＡ種の不在について分析した。
【０３１６】
アンプリコンの純度を確認したら、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen
cat#P7589）を用いて製造元のプロトコールに記載されたとおり蛍光光度計においてＤＮＡの濃度を定量化した。キット中に提供されたラムダＤＮＡを濃度基準として用い、それにより１００ｎｇ／ウェルから１．５６ｎｇ／ウェルまでの標準曲線を生成した。ＴＥ緩衝液中で１００倍に希釈され各アンプリコンの蛍光を２回繰り返して測定し、そして標準曲線の直線部分によりＤＮＡの濃度を決定した。すべての蛍光測定は、黒色９６ウエルプレート中で行った。蛍光値が標準曲線の直線範囲から外れている場合、直線範囲内に入る蛍光値を得るために、より大きなまたはより小さな希釈度でサンプルを再測定した。各鎖タイプの塩基対におけるおよそのサイズ（重−５４０ｂｐ、カッパ−４８５ｂｐおよびラムダ−５１０ｂｐ）を用い、以下の式を用いて濃度を決定した：
各アンプリコンの濃度（分子／μｌ）＝［サンプル濃度（ｎｇ／μｌ）＊６．０２２×１０23］／［６５６．６×１０9＊アンプリコン長（ｂｐ）］
【０３１７】
各アンプリコンを１×１０7分子／μｌに標準化し、次いでＨｃ：Ｋｃ：Ｌｃの体積比
３：３：１で混合し、ボルテックスし、そして最後に１：１０で希釈して１×１０6分子
／μｌで混合物の最終濃度を得た。
【０３１８】
エマルジョンＰＣＲ増幅、ビーズ富化、ビーズ計数およびシークエンシング
エマルジョンＰＣＲは、公開された４５４プロトコール：“emPCR Amplification Method Manual - Lib-L”（編：２０１０年５月（Ｒｅｖ．２０１１年４月））に以下の変更
を加えて実施した：
セクション３．１．３．ステップ２）
【０３１９】
【表２５】
2018027090.tif 000031
【０３２０】
“emPCR Amplification Method Manual - Lib-L”のステップ３．７から、シークエン
シングビーズが富化されたら、以下の設定でBeckman Coulter's Z2 Particle Counterに
おいてビーズを計数した：
アパーチャー（Aperture）：         ＜１００μｍ＞
アパーチャーＫｄ：                ＜６０．０４＞
設定された上部カットオフ：        ＜３０．００μｍ＞
設定された下部カットオフ：        ＜１０．００μｍ＞
計数モード：                      ＜間＞
計量体積：                        ＜０．５ｍｌ＞
分解能：                          ＜２５６＞
【０３２１】
ビーズの濃度は、以下のように算出した：
ビーズの濃度＝［粒子カウンターからの平均読取り値＊４］ビーズ／μｌ
【０３２２】
全体として参照により本明細書に組み込まれた４５４シークエンシングプロトコール：“Sequencing Method Manual - GS Junior Titanium Series”−２０１０年５月（Ｒｅｖ．２０１０年６月）に従って、４５４シーケンサー（Roche）において、エマルジョンＰ
ＣＲからの富化ビーズをシークエンシングした。
【０３２３】
ＩＩ．ペプチド断片の生成：
ヒトドナー血漿からの抗原特異的ＩｇＧの精製
ドナー血漿単離および特異的抗原に対する反応性についてのスクリーニング。
ＩＲＢガイドラインに従って、ヒト志願者からの全血をヘパリンチューブ中に集めた。ＰＢＭＣのフィコール勾配分離（上記のとおり）中に、血漿サンプルを同時に集め、そして−８０℃で保存した。さまざまな抗原に対する血漿ＩｇＧの反応性を、ＥＬＩＳＡによって試験した。簡潔には、炭酸塩緩衝液中に２μｇ／ｍｌで溶解された１００μｌ／ウェルの抗原を用いて、高結合性９６ウエルプレート（Costar cat#）を３７℃で２時間また
は４℃で一夜コートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）で３回すすぎ、次いで、３００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂粉乳を用いて３７℃で１時間ブロックした。血漿サンプルを、５％ミルクＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１／１００、１／５００および１／１０００および１／２０００で希釈し、そして各希釈１００μｌを９６ウエルプレートのブロックトウェルの二つ組で加え、そして３７℃で２時間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１／４０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Southern Biotech 2040-05）を各ウェル（１００μｌ）に加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、そしてＴＭＢ基質溶液
（BioFX cat#TMBW-1000-01）５０μｌ、続いて停止液（BioFX cat# STPR1000-01）５０μｌの添加により進めた。シグナルを４５０ｎｍの光学濃度で測定した。ＮＧ−ＸＭＴ法によるスクリーニングのため、血漿が１／５００またはそれを超える希釈度で有意なシグナルを示したドナーを選択した。Ｂ型肝炎ウイルス小型表面抗原（ＨＢｓＡｇ）ａｄｗサブタイプをProspec（Rehovot, Israel, cat# HBS-872）から購入した。
【０３２４】
全血漿ＩｇＧからの抗原特異的ＩｇＧの精製
プロテインＧ精製
１．Protein G Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare cat#17-0618-05）のビーズスラ
リー（ビーズカラム床体積２．５ｍｌ）５ｍｌを重力流カラムに適用し、そして１×ＰＢＳで２回洗浄した。
２．ヒト血漿５ｍｌを１×ＰＢＳ１５ｍｌで希釈して、ビーズ入りのカラムに適用し、そしてカラムを、ローテーター上、４℃で一夜、または室温で２時間インキュベートした。３．カラムを１×ＰＢＳ２０ｍｌで４回洗浄した。
４．ＩｇＧをｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝液２０ｍｌで溶離し、そして中和用にｐＨ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ １．２ｍｌを含むチューブ中に集めた。
５．１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを、中和された溶出液に加えて高濃度のＩｇＧに起因する沈殿を最小限にした。
６．精製したＩｇＧを、１０ｋＤａカットオフ透折カセット（Pierce cat#66456）中で４リットルの１×ＰＢＳに対して２回透析した。
７．Nanodrop分光測色計（Thermo Scientific）において２８０ｎｍで吸光度を測定する
ことによってＩｇＧ濃度を決定した。
アフィニティー精製
１．製造元のプロトコールに従って、ＨＢｓＡｇをビオチン（Pierce Cat #20217）と結
合させた。結合した抗原を１×ＰＢＳ中で十分に透析した。
２．ビオチン結合抗原２ｍｇを磁性ストレプトアビジンビーズ（Thermo Scientific cat#8816）５ｍｌと共にローテーター上で、４℃で一夜または室温で２時間インキュベートした。ビーズを１×ＰＢＳで２回すすぎ、次いで、９つの１．５ｍｌチューブに分けた。
３．ビーズに対する抗原の固定化の効率は、HBsAg Elisaによって評価し、そして一貫し
て８０％よりも大きい結合性を示した。
４．固定化抗原を含む各チューブに、単一ドナーからのプロテインＧ精製ＩｇＧ１ｍｇを加え、ビーズを、ボルテックスすることによって十分に再懸濁し、そして室温で１５分間回転しながらインキュベートした。
５．チューブを磁性ラック中に置き、上清を除去し、そしてビーズを１×ＰＢＳ１ｍｌで５回洗浄した。
６．最後の洗浄ステップ後、ｐＨ１．８の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液０．９ｍｌを１つのチューブに入れ、ボルテックスし、そして室温で５分間インキュベートした。５分後、第１のチューブを磁性ラック上に置き、そしてチューブ中の酸性緩衝液を取り出し、そして第２のチューブ中に入れた。９つのすべてのチューブを酸性緩衝液でインキュベートするまで、この手順を繰り返した。溶出されたＩｇＧを、中和用のｐＨ８．５の１Ｍ 
Ｔｒｉｓ ０．１４ｍｌを含むチューブ中に最終的に集めた。
７．各チューブを溶離にかけた後、ビーズを１×ＰＢＳで２回洗浄した後、プロテインＧ精製ＩｇＧ１ｍｇをビーズに加えたステップからの精製を再開した。その手順を複数回繰り返してＭＳ分析前にプロテアーゼ処理に十分な物質を生成した。
【０３２５】
ＩＩＩ．質量分析
質量分析は、上記のように実施した。簡潔には、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）および／または化学的タンパク質切断試薬（例えば、臭化シアン）による消化の後、ペプチドにおいて質量分析を実施した。Ｂ型肝炎ウイルス小型表面抗原に特異的に結合する抗体をコードする遺伝子配列を同定するために、生成したＭＳ２スペクトルを、遺伝物質デ
ータベース中の情報から誘導された理論ＭＳ２スペクトルと関連づけた。
【０３２６】
ＩＶ．モノクローナル抗体の発現および同定
２４の異なる重（ガンマ）鎖可変領域クローン、２０の異なるカッパ鎖可変領域クローンおよび１０の異なるラムダ鎖可変領域クローンを、コンビナトリアルフォーマットで発現させ、そして抗原特異的結合活性についてスクリーニングした（表１４〜１５を参照し、ここで、ガンマ鎖クローンは、最も左の縦の列に示し、そして軽鎖クローンは、一番上の横の行に示す）。各ガンマ鎖を、すべての軽（カッパおよびラムダ）鎖と対にして標準９６ウェル組織培養プレート中でＨＥＫ２９３Ｅ細胞の一過性トランスフェクションによって抗体を発現させた。
【０３２７】
各ウェル中のトランスフェクトされた細胞から分泌された抗体を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、精製された組換えＢ型肝炎表面抗原（Prospec, Ness-Ziona, ISRAELから購入したＨＢｓＡｇ−ａｄｗサブタイプ）に対する結合についてスクリー
ニングした。高結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Costar-3369）を、２μｇ／ｍｌ
で炭酸塩緩衝液中に希釈された５０μｌ／ウェルのＨＢｓＡｇを用いて、３７℃で２時間インキュベートすることによってコートし、次いで、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５％粉ミルク３００μｌ／ウェルを用いて３７℃で１時間インキュベートすることによってブロックした。一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｅ細胞からの上清を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りのＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の５％ミルク中で５倍に希釈し、そして希釈された上清５０μｌを、ＨＢｓＡｇコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れた。非特異的結合を評価するため、同じ上清を、ＰＢＳ中の５％ミルクのみでコーティングされたプレートにも入れた。上清の添加後、ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳ−Ｔ２５０μｌ／ウェルで３回洗浄した。抗体の任意の結合を検出するため、ＰＢＳ−Ｔ中で４０００倍に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ヒトＩｇＧ（Southern Biotech）５０μｌ／ウェルを、各ウェルに加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、上記のように６回洗浄し、次いでＨＲＰのための発色性基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン５０μｌ／ウェルを加え、それを、およそ１０分後に、酸５０μｌ／ウェルで中和した。酸で中和した発色性基質からのシグナルを、４５０ｎｍで吸光度（光学濃度）によって測定した。
【０３２８】
表１４〜１５は、ＨＢｓＡｇプレートの吸光度から各ウェル中のミルクのみのプレートの吸光度を減算して得られた値を示す。以下の上清サンプルを対照として用いた（値は、各場合における２つの独立したウェルの平均である）：陽性＝抗ＨＢｓＡｇヒト抗体重鎖および軽鎖のトランスフェクションからの上清；陰性＝ＰＥＩのみでトランスフェクトされた細胞からの上清。陰性対照シグナルよりも１０〜２０倍、２０〜４０倍、そして４０倍を超える大きなシグナルを有するウェルは、灰色の影を濃くして示した。３０の重−軽順列は、４つのウェルの中から２つ又はそれ以上において、バックグラウンドよりも４０倍を超えるＨＢｓＡｇに対する強い反応性を示し、２６は、バックグラウンドよりも２０倍から４０倍の間であり、そして１８は、バックグラウンドよりも１０倍から２０倍の間であった（その１８のうちの１つは、ＥＶＵＧＧガンマ鎖の組合せとして発現され、表において＊で示され、そしてＡＫＵＯＬラムダ鎖は、非反応性であることが後でわかった）。したがって、試験した２４の異なる可変領域ガンマ鎖クローンの中で、試験した３０の軽鎖クローンの少なくとも１つと対にしたときに、１７がＨＢｓＡｇ特異的抗体を発現した。
【０３２９】
【表２６】
2018027090.tif 000032
【０３３０】
【表２７】
2018027090.tif 000033
【０３３１】
【表２８】
2018027090.tif 000034
【０３３２】
【表２９】
2018027090.tif 000035
【０３３３】
実施例９
本実施例では、ヒト対象に興味の抗原を含むワクチンを投与し、そしてワクチン接種（週０）前、次いで週１および２に血液サンプルを採取する。その後のサンプルは、週５２まで４週間隔で採取する。ＰＢＭＣを実施例８に記載したように単離し、そしてウシ胎児血清中の２０％ＤＭＳＯ中に低温保存するか、またはＢ細胞単離のために直ちに処理する。質量分析によって後で分析するため、血漿サンプルを−８０℃で保存する。各サンプルについて、ＰＢＭＣおよび血漿を下記のように処理してワクチン接種後の時間にわたって抗原特異的抗体集団を評価する。
【０３３４】
Ｉ．核酸配列の生成。
抗原特異的、記憶および全Ｂ細胞単離およびＲＮＡ精製
Ｂ細胞単離のため、陰性選択法を用い、Invitrogen's Dynabeads Untouched B-cell Isolationキット（Invitrogen cat#113-51D）を用いて製造元のプロトコールに従ってＰＢ
ＭＣからすべての非Ｂ細胞を除去する。生成した非標識Ｂ細胞集団をさらに処理して抗原特異的または記憶Ｂ細胞のいずれか単離する。
【０３３５】
抗原特異的Ｂ細胞単離については、ストレプトアビジン磁性ビーズ（Pierce-Thermo Scientific cat#88816）上に固定化されたビオチン化抗原を用いて、全非標識Ｂ細胞をローテーター上、室温℃で２０分間インキュベートする。次いで、任意の抗原結合性Ｂ細胞を含むビーズを１×ＰＢＳで２回洗浄する。次いで、洗浄したビーズを、ＲＮＡ単離のためにQiagen's RNeasyキットＲＬＴ溶解緩衝液（１％β−メルカプトエタノールで補充され
た）中に再懸濁する。
【０３３６】
記憶Ｂ細胞単離については、ＣＤ２７＋および表面ＩｇＧ＋細胞単離のためのMiltenyi's MACSキット（Miltenyi Biotec（Auburn, CA）cat#130-051-601および130-047-501）を用いて、全非標識Ｂ細胞からＣＤ２７＋および表面ＩｇＧ＋細胞を単離する。ＣＤ２７＋およびｓＩｇＧ＋Ｂ細胞を同時に単離するには、両方の細胞表面マーカーに対する磁性ビーズ結合抗体をインキュベーションステップ中に同時に加える。精製したら、記憶Ｂ細胞を３００×ｇで１０分間遠沈させ、次いで、ＲＮＡ単離のために上記のようなＲＮＡ用のＲＬＴ緩衝液中に溶解する。
【０３３７】
Qiagen's RNeasyキット（Qiagen cat# 74104）を用いて製造元のプロトコールに従って、選択された細胞からＲＮＡを精製する。ＤＮａｓｅＩ消化ステップを組み込むことによって、カラム上のＤＮａｓｅＩ処理を実施して汚染ゲノムＤＮＡを除去する。ＲＷ１緩衝液洗浄後、ＲＤＤ緩衝液中に希釈されたＤＮａｓｅＩ（Qiagen cat# 79254）をＲＮＡ精
製カラムに適用し、そして室温で２０分間インキュベートする。次いで、カラムをＲＷ１緩衝液でさらに１回洗浄し、続いてＲＰＥ緩衝液で２回洗浄し、そしてＲＮＡを水３０μｌまたは５０μｌで溶離する。波長４５０ｎｍでNanodrop分光光度計（Thermo Scientific）において測定された吸光度によってＲＮＡの濃度を決定する。
【０３３８】
ＰＣＲによるアンプリコンのｃＤＮＡ合成および生成
記憶または抗原特異的Ｂ細胞から単離されたＲＮＡを、まず、実施例８に記載したように逆転写する。シークエンシングのための重鎖、カッパ鎖およびラムダ鎖可変領域のアンプリコンを、以下のようにＰＣＲによって生成する。重鎖の増幅では、Ｂ細胞プール中のＶＨ遺伝子転写頻度（transcript frequency）の天然分布（natural distribution）を保存するため、実施例８に記載されたプライマーを用いて、各ｃＤＮＡサンプルについて４つの独立した反応（それぞれＶＨ１および７；ＶＨ２、５および６；ＶＨ３；ならびにＶＨ４の遺伝子ファミリーに特異的なもの）を行う。カッパ鎖およびラムダ鎖増幅では、各鎖について１つの反応を、各ｃＤＮＡサンプルについて行う。各反応では、フォワードプライマーの等モル混合物を、同濃度の以下に示すリバースプライマーと共に用いる。増幅は、Ｌｉｂ−Ｌプラットフォームによる４５４シークエンシングに適合しうる融合プライマー（Roche）を用いて実施する。各鎖の定常領域の５’末端にハイブリダイズするよう
にリバースプライマーを設計する。これらのプライマーは、シークエンシングの読み取りが、各定常領域（リバースセンス）の先端の５'末端から可変領域の３’末端に開始され
るように、Ｌｉｂ−ＬプライマーＢおよびＭＩＤ配列を含む。重鎖およびカッパ鎖では、各ＭＩＤについて１つのリバースプライマーを用いるが、ラムダ鎖では、各ＭＩＤについて２つの異なるリバースプライマーが必要である。
【０３３９】
ＰＣＲ増幅は、Finnzyme's Phusion Hot Start IIポリメラーゼ（Thermo Scientific c
at# F-540S）を用いて実施し、ここで、反応混合物および条件は、実施例８に記載したとおり設定する。
【０３４０】
任意の試薬の汚染テンプレートから任意の誤った増幅がないようにするため、各混合物について二重反復反応を設定し（重鎖については４つの別々の反応、そして各軽鎖については１つ）、ここでは、ｃＤＮＡテンプレートを水と交換する。テンプレートのないこれらの陰性対照反応を、テンプレートを含むサンプルと同時に行う。ＰＣＲプログラム終了後、テンプレートを反応に加えるが、ｃＤＮＡが存在しないときのアンプリコン（重鎖について、およそ５４０ｂｐ、カッパ鎖について、およそ４８５ｂｐそしてラムダ鎖について、およそ５１０ｂｐ）の存在について、１．５％ＴＡＥアガロースゲル上の電気泳動によって各反応物３μｌ（陰性対照を含む）を分析する。
【０３４１】
シークエンシング中に抗体鎖の同種の対形成を保存するため、単離したＢ細胞を、単一細胞微液滴カプセル化（single-cell microdroplet encapsulation）（Raindance Technologies, Inc., Lexington, MA）を用いて単一細胞カプセル化にかける。カプセル化され
たＢ細胞を、次いで増幅プライマーを用いて単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ試薬（Cat # 210210としてQiagenによって販売された試薬）と融合させて、各単一Ｂ細胞からの結合した重鎖および軽鎖ＰＣＲ生成物を生成する。下流シークエンシングを通して抗体鎖対の保存のために、オーバーラップＰＣＲ（Meijer P.J. et al., J. Mol. Biol. 358(3):764-72, 2006
）を用いて重鎖および軽鎖ＰＣＲ生成物を１つのＤＮＡにつなぎ合わせる。
【０３４２】
アンプリコン精製、分析、定量化、および４５４シークエンシングのための調製
ＰＣＲサンプル中の過剰のプライマーおよび／またはプライマーダイマーを除去するため、Agentcourt Ampure磁性ビーズ（Beckman Coulter cat#A63881）を製造元のプロトコ
ール（０００３８７ｖ００１）に従って用いてアンプリコンを精製する。重鎖については、すべての４つの反応物（ＶＨ１／７、ＶＨ２／５／６、ＶＨ３、ＶＨ４）をプールし、そして１つのサンプルとして精製し、したがって、３つのアンプリコンサンプルの全体（重鎖、カッパ鎖およびラムダ鎖）を、各ｃＤＮＡ増幅のために精製した。９６ウエルプレートフォーマット中の代わりに１．５ｍｌチューブに適した一般的な磁性ラックを用いて単一の１．５ｍｌマイクロチューブ中で精製を行うように、ampure精製のプロトコールを変更する。すべての体積および他の手順は、プロトコールに記載したとおりである。Ampure精製後に溶出されたアンプリコンを、次いで、高感度ＤＮＡチップ（Agilent Technologies cat# 5067-4626）を用いて製造元のプロトコールに従ってAgilent 2100 Bioanalyzerにおいて、純度および任意の汚染ＤＮＡ種の不在について分析する。
【０３４３】
アンプリコンの純度を確認したら、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen
cat#P7589）を用いて製造元のプロトコールに記載されたとおり蛍光光度計においてＤＮＡの濃度を定量化する。キット中に提供されたラムダＤＮＡを濃度基準として用い、それにより１００ｎｇ／ウェルから１．５６ｎｇ／ウェルまでの標準曲線を生成する。ＴＥ緩衝液中で１００倍に希釈され各アンプリコンの蛍光を２回繰り返して測定し、そして標準曲線の直線部分によりＤＮＡの濃度を決定する。すべての蛍光測定は、黒色９６ウエルプレート中で行う。各鎖タイプの塩基対におけるおよそのサイズ（重−５４０ｂｐ、カッパ−４８５ｂｐおよびラムダ−５１０ｂｐ）を用い、以下の式を用いて濃度を決定する：
各アンプリコンの濃度（分子／μｌ）＝［サンプル濃度（ｎｇ／μｌ）＊６．０２２×１０23］／［６５６．６×１０9＊アンプリコン長（ｂｐ）］
【０３４４】
各アンプリコンを１×１０7分子／μｌに標準化し、次いでＨｃ：Ｋｃ：Ｌｃの体積比
３：３：１で混合し、ボルテックスし、そして最後に１：１０で希釈して１×１０6分子
／μｌで混合物の最終濃度を得る。
【０３４５】
エマルジョンＰＣＲ増幅、ビーズ富化、ビーズ計数およびシークエンシング
エマルジョンＰＣＲは、公開された４５４プロトコール：“emPCR Amplification Method Manual - Lib-L”（編：２０１０年５月（Ｒｅｖ．２０１１年４月））に、実施例８
に記載された変更を加えて実施する。
【０３４６】
“emPCR Amplification Method Manual - Lib-L”のステップ３．７から、シークエン
シングビーズが富化されたら、Beckman Coulter's Z2 Particle Counterにおいてビーズ
を計数し，そしてビーズの濃度を以下のように算出する：
ビーズの濃度＝［粒子カウンターから平均読取り値＊４］ビーズ／μｌ
【０３４７】
全体として参照により本明細書に組み込まれた４５４シークエンシングプロトコール：“Sequencing Method Manual - GS Junior Titanium Series”−２０１０年５月（Ｒｅｖ．２０１０年６月）に従って、４５４シーケンサー（Roche）において、エマルジョンＰ
ＣＲからの富化ビーズをシークエンシングする。
【０３４８】
ＩＩ．ペプチド断片の生成：
ヒトドナー血漿からの抗原特異的ＩｇＧの精製
抗原に対する反応性についてのスクリーニング。
さまざまな抗原に対する血漿ＩｇＧの反応性を、ＥＬＩＳＡによって試験する。簡潔には、炭酸塩緩衝液中に２μｇ／ｍｌで溶解された１００μｌ／ウェルの抗原を用いて、高結合性９６ウエルプレート（Costar cat#）を３７℃で２時間または４℃で一夜コートす
る。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）で３回すすぎ、次いで、３００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂粉乳を用いて３７℃で１時間ブロックする。血漿サンプルを、５％ミルクＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１／１００、１／５００および１／１０００および１／２０００で希釈し、そして各希釈１００μｌを９６ウエルプレートのブロックトウェルの二つ組で加え、そして３７℃で２時間インキュベートする。プレートを１×ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで３回洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１／４０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Southern Biotech 2040-05）を各ウェル（１００μｌ）に加え、そして３７℃で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、そしてＴＭＢ基質溶液（BioFX cat#TMBW-1000-01）５０μｌ、続いて停止液（BioFX cat# STPR1000-01）５０μｌの添加により進める。シグナルを４５０ｎｍの光学濃度で測定する。血清力価は、一般にワクチン接種後に時間と共に高まることが観測される。
【０３４９】
全血漿ＩｇＧからの抗原特異的ＩｇＧの精製
実施例８に記載したプロテインＧを用いて、各血清サンプルから全ＩｇＧを精製する。精製したＩｇＧを、１０ｋＤａカットオフ透折カセット（Pierce cat#66456）中で１×ＰＢＳ４リットルに対して２回透析し、そしてNanodrop分光測色計（Thermo Scientific）
において２８０ｎｍで吸光度を測定することによってＩｇＧ濃度を決定する。次いで、実施例８に記載する抗原に結合されたビーズを用いてプロテインＧ精製ＩｇＧをアフィニティー精製する。各サンプルからのアフィニティー精製された抗体を質量分析のために集める。
【０３５０】
ＩＩＩ．質量分析
質量分析は、上記のように実施する。簡潔には、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）および／または化学的タンパク質切断試薬（例えば、臭化シアン）による消化の後、ペプチドにおいて質量分析を実施する。興味の抗原に特異的に結合する抗体をコードする遺伝子配列を同定するために、生成したＭＳ２スペクトルを、遺伝物質データベース中の情報から誘導された理論ＭＳ２スペクトルと関連づける。サンプル中の抗体の配列を決定することによって、ワクチン接種後の複数の時点で対象における抗原特異的抗体集団の組成を
決定する。
【０３５１】
実施例１０
本実施例は、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニック動物を用いた抗原特異的ヒト抗体の作製を記載する。
ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ系統ＸＭＧ１−ｋｌマウス（Amgen, Thousand Oaks, CA）は、その内因性マウス抗体機構を不活性化しており、そしてヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座を含む（Jakobovits et al., 2007, Nature Biotechnol., 25:1134-43）。これら
のマウスは、完全ヒトＩｇＧ１κおよびＩｇＧ１γ抗体を産生する。マウスを興味のヒト抗原で免疫化し、そして以下の方法を用いて遺伝物質データベースおよびペプチドデータベースを生成させる。
【０３５２】
Ｉ．遺伝物質データベース：
細胞単離。
シリンジおよび２１Ｇニードルを用いて、免疫化マウスからの脾臓を５ｍＬのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで５回フラッシュする。細胞を９０％ＦＣＳ／１０％ＤＭＳＯ中で凍結させる。合計５０〜１００×１０6細胞を、各脾臓から単離する。
【０３５３】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成。
QIAshredder（Qiagen cat#79654）およびＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen, Hilden, Germany; cat#74104）を用いて製造元のプロトコールに従って脾細胞から全ＲＮＡを単離
する。標準次世代シークエンシングプロトコールに従ってカラム上でＲＮＡをＤＮａｓｅ処理する。ＮＤ−１０００分光光度計（NanoDrop；Thermo Scientific, Wilmington, DE
から商業的に入手可能）を用いて全ＲＮＡ濃度を測定する。
【０３５４】
単離したＲＮＡを、Thermoscript RT-PCRシステム（Invitrogen（Life Technologiesの一部）, Carlsbad, CA cat#11146-024）を用いて逆転写による一本鎖ｃＤＮＡ合成に用いる。１．５μｇのＲＮＡおよびオリゴｄＴプライマーを用いて製造元のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成する。
【０３５５】
ＶHおよびＶL増幅。
シークエンシングのための重鎖、カッパ鎖およびラムダ鎖可変領域のアンプリコンを、実施例８に記載したようにヒト抗体配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって生成する。重鎖の増幅では、Ｂ細胞プール中のＶＨ遺伝子転写頻度（transcript frequency）の天然分布（natural distribution）を保存するため、各ｃＤＮＡサンプルについて４つの独立した反応（それぞれＶＨ１および７；ＶＨ２、５および６；ＶＨ３；ならびにＶＨ４の遺伝子ファミリーに特異的なもの）を行う。カッパ鎖およびラムダ鎖増幅では、各鎖について１つの反応を、各ｃＤＮＡサンプルについて行う。各反応では、フォワードプライマーの等モル混合物を、同濃度の以下に示すリバースプライマーと共に用いる。増幅は、Ｌｉｂ−Ｌプラットフォームによる４５４シークエンシングに適合しうる融合プライマー（Roche）を用いて実施する。各鎖の定常領域の５’末端にハイブリダイズするよう
にリバースプライマーを設計する。これらのプライマーは、シークエンシングの読み取りが、各定常領域（リバースセンス）の先端の５'末端から可変領域の３’末端に開始され
るように、Ｌｉｂ−ＬプライマーＢおよびＭＩＤ配列を含む。重鎖およびカッパ鎖では、各ＭＩＤについて１つのリバースプライマーを用いるが、ラムダ鎖では、各ＭＩＤについて２つの異なるリバースプライマーが必要である。
【０３５６】
ＰＣＲ増幅は、Finnzyme's Phusion Hot Start IIポリメラーゼ（Thermo Scientific cat# F-540S）を用いて実施し、ここで、反応混合物および条件は、実施例８に記載したとおり設定する。
【０３５７】
任意の試薬の汚染テンプレートから任意の誤った増幅がないようにするため、各混合物について二重反復反応を設定し（重鎖については４つの別々の反応、そして各軽鎖については１つ）、ここでは、ｃＤＮＡテンプレートを水と交換する。テンプレートのないこれらの陰性対照反応を、テンプレートを含むサンプルと同時に行う。ＰＣＲプログラム終了後、テンプレートを反応に加えるが、ｃＤＮＡが存在しないときのアンプリコン（重鎖について、およそ５４０ｂｐ、カッパ鎖について、およそ４８５ｂｐそしてラムダ鎖について、およそ５１０ｂｐ）の存在について、１．５％ＴＡＥアガロースゲル上の電気泳動によって各反応物３μｌ（陰性対照を含む）を分析する。AMPure XP（Agencourt; Beckman Coulter Genomics, Brea, CA, cat#A63881）を用いて製造元のプロトコールに従ってＰＣＲ生成物を精製し、そしてAgilent 2100 BioAnalyzerを用いて分析する。
【０３５８】
次いで、ＰＣＲ生成物の配列を予測アミノ酸配列に翻訳し、それを、次いで理論的に消化して（例えば、プロテアーゼおよび／または化学滴タンパク質切断試薬を用いて）仮想ペプチド断片を産生する。次いで、これらの仮想ペプチド断片を用いて予測質量スペクトルを生成する。
【０３５９】
ポリクローナル抗体のペプチド断片からの実際の質量スペクトルの生成：
マウスの血清および／または血漿からポリクローナル抗体を精製する。抗体を精製するために、以下の方法は用いる：
【０３６０】
プロテインＧ精製：
プロテインＧ磁性ビーズ（Millipore（Billerica, MA）, cat# LSKMAGG10）１ｍＬを、４つの１５ｍＬコニカルチューブのそれぞれ（Falcon（BD Biosciences, Franklin Lake,
NJ）, cat#352097）に加える。各チューブ中のビーズを、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４
、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）１０ｍＬで２回およびＰＢＳ１０ｍＬで３回洗浄する。３種のマウス（ＩＤ１２６２−２、１２６２−４、１２６３−４）からの血清を一緒に貯め、そしてＰＢＳ中の最終体積６ｍｌに１０倍希釈する。次いで、合わせた希釈血清１．５ｍｌをビーズの各チューブに加え、そして４℃で一夜インキュベートする。フロースルーを集め、そして精製プロセスをさらに２回行う。フロースルーを集めた後、各チューブを、ＰＢＳＴ１０ｍＬで２回およびＰＢＳ１０ｍＬで３回洗浄する。次いで、各チューブをｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン０．５ｍＬと共に４℃で３０分間インキュベートしてＩｇＧを溶出する。溶出を５回繰り返す。すべての溶出液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で中和し、ＰＢＳに対して一夜透析し、そしてタンパク質濃度をＮＤ−１０００分光光度計（Nanodrop）で測定する。合計２．５ｍｇのＩｇＧを精製する。
【０３６１】
抗原カラム調製：
新たなストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズ（Pierce, cat#88817）５．０ｍＬをＰ
ＢＳ１０ｍＬで３回洗浄し、そしてＰＢＳ５．０ｍＬ中に希釈したビオチンに結合されたに興味の抗原の２０ｍｇ／ｍｌストック１０５μＬを用いて４℃で一夜インキュベートする。フロースルーを捨て、そしてビーズをＰＢＳ１０ｍＬで３回洗浄し、そして１０個の低結合性１．７ｍＬチューブ（Axygen（Union City, CA）, cat# MCT-175-L-C）中に等分する。等分されたビーズを磁性ラック（Invitrogen, DynaMag）上に置き、そしてＰＢＳ
を除去した後、希釈した血清を加える。
【０３６２】
抗原特異的精製：
上からのプロテインＧ精製ＩｇＧをビオチン化抗原と結合したＳＡ磁性ビーズに加える。４℃で一夜インキュベーション後、フロースルーを集め、そしてビーズを以下の緩衝液のそれぞれ合計１０ｍＬで順に洗浄する：
ＰＢＳ
ＲＩＰＡ緩衝液（すなわち、放射免疫沈降アッセイ緩衝液；Alcaraz et al., J. Vet. Diagn. Invest. 2(3): 191-196, 1990; Ngoka, L.C., Proteome Sci. 6(1): 30, 2008）
ＰＢＳ中の２０％アセトニトリル
ＰＢＳ中の６０％エチレングリコール
ＰＢＳ中の０．５Ｍ ＮａＣｌ
ＰＢＳ（すなわち、リン酸緩衝食塩水）
【０３６３】
次いで、ＩｇＧをｐＨ３．５の０．１Ｍグリシン１．５ｍＬの５画分、次いでｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン１．５ｍＬの５画分、次いでｐＨ１．８の０．１Ｍグリシン１．５ｍＬの５画分で溶離し、そしてｐＨ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓで中和する。抗原でコートさ
れた９６ウエルプレートを用いて、興味の抗原に対する反応性について溶出液を測定する。活性を有する画分をＥＬＩＳＡ（Thermo, cat#23300）によって定量化し、そしてウエ
スタンブロットによって抗原反応性について検定する。最も良好な反応性を有する画分を質量分析によって分析する。
【０３６４】
質量分析
質量分析は、上記のように実施する。簡潔には、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）および／または化学的タンパク質切断試薬（例えば、臭化シアン）による消化の後、ペプチドにおいて質量分析を実施する。興味の抗原に特異的に結合する抗体をコードする遺伝子配列を同定するために、生成したＭＳ２スペクトルを、遺伝物質データベース中の情報から誘導された理論ＭＳ２スペクトルと関連づける。
【０３６５】
モノクローナル抗体の発現および同定
異なる重（ガンマ）鎖可変領域クローン、カッパ鎖可変領域クローンおよびラムダ鎖可変領域クローンをコンビナトリアルフォーマットで発現させ、そして抗原特異的結合活性についてスクリーニングする。各ガンマ鎖をすべての軽（カッパおよびラムダ）鎖と対形成させ、標準９６ウェル組織培養プレート中のＨＥＫ２９３Ｅ細胞の一過性トランスフェクションによって抗体を発現させる。
【０３６６】
各ウェル中のトランスフェクト細胞から分泌された抗体を、上記のような酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、精製された組換え抗原に対する結合についてスクリーニングする。重鎖および軽鎖のいくつかの対形成により、抗原コーティングされたプレートに特異的に結合する抗体を生じる。これらの重鎖および軽鎖対を選択し、興味のヒト抗原に特異的に結合する完全ヒト抗体を作製する。
【０３６７】
同等物
当業者は、常用的な実験しか用いなくても、本明細書に具体的に記載された特定の実施態様に対する多くの同等物を認めるか、または確認することができる。このような同等物は、特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
2018027090.tif 000036
【図２】
2018027090.tif 000037
【図３】
2018027090.tif 000038
【図４】
2018027090.tif 000039
【図５】
2018027090.tif 000040
【図６−１】
2018027090.tif 000041
【図６−２】
2018027090.tif 000042
【図７】
2018027090.tif 000043
【図８】
2018027090.tif 000044
【図９】
2018027090.tif 000045
【図１０ａ】
2018027090.tif 000046
【図１０ｂ】
2018027090.tif 000047
【図１０ｃ】
2018027090.tif 000048
【図１０ｄ】
2018027090.tif 000049
【図１０ｅ】
2018027090.tif 000050
【図１１ａ】
2018027090.tif 000051
【図１１ｂ】
2018027090.tif 000052
【図１１ｃ】
2018027090.tif 000053
【図１１ｄ】
2018027090.tif 000054
【図１１ｅ】
2018027090.tif 000055
【図１２】
2018027090.tif 000056
【図１３】
2018027090.tif 000057
【配列表】
2018027090000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月13日(2017.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得る方法であって、
（ａ）少なくとも１つの動物の免疫グロブリン鎖またはその可変領域をコードする核酸配列を準備するステップ；
（ｂ）抗原に特異的に結合するポリクローナル免疫グロブリンの集団を得、そして該集団の重鎖または軽鎖、またはその可変領域のペプチド断片の質量スペクトル情報を得るステップ；
（ｃ）ペプチド断片の質量スペクトル情報を、核酸配列からの予測質量スペクトル情報、該核酸配列によってコードされる予測アミノ酸配列から導き出された該予測質量スペクトル情報と関連づけてペプチド断片を含む免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同定するステップ；および
（ｄ）ペプチド断片による免疫グロブリン鎖またはその断片のアミノ酸配列包括度に基づいて、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン鎖（またはその可変領域）の同定されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から選択して抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得るステップ：
を含む方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月15日(2017.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とする抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の核酸配列またはアミノ酸配列を得る方法であって、
（ａ）少なくとも1つの動物の免疫グロブリン鎖をコードする核酸配列を準備し、該核酸配列によってコードされる予測アミノ酸配列から予測質量スペクトル情報を導き出すステップ；
（ｂ）ポリクローナル免疫グロブリンの集団を得、該ポリクローナル免疫グロブリンの集団が、該対象とする抗原を用いた抗原アフィニティ精製によって得られたポリクローナル免疫グロブリンの精製された集団であり、該集団のプロテアーゼ切断によってペプチド断片を得、該ペプチド断片の質量スペクトル情報を得るステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得た該ペプチド断片の質量スペクトル情報を、ステップ（ａ）で核酸配列から導き出された予測質量スペクトル情報と関連付けて、１つまたはそれ以上の該ペプチド断片に対応するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン鎖をコードしている核酸配列を同定し；同定されたそれぞれの核酸配列によってコードされた可変領域およびＣＤＲ３領域について、該ペプチド断片によって可変領域のアミノ酸配列包括度を決定し、該ペプチド断片によってＣＤＲ３領域のアミノ酸配列包括度を決定するステップ；および
（ｄ）同定された核酸配列から、少なくとも６０％の可変領域のアミノ酸配列包括度および少なくとも６０％のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列包括度を有する核酸配列を選択して、該対象とする抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の核酸配列またはアミノ酸配列を得るステップ、
を含む方法。
【請求項２】
対象とする抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの免疫グロブリン鎖可変領域の核酸配列またはアミノ酸配列を得る方法であって、
（ａ）少なくとも1つの動物の複数の免疫グロブリンの免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列を準備し、該核酸配列によってコードされる予測アミノ酸配列から予測質量スペクトル情報を導き出すステップ；
（ｂ）ポリクローナル免疫グロブリンの集団を得、該ポリクローナル免疫グロブリンの集団が、該対象とする抗原を用いた抗原アフィニティ精製によって得られたポリクローナ
ル免疫グロブリンの精製された集団であり、該集団の免疫グロブリン鎖可変領域のペプチド断片を得、該ペプチド断片の質量スペクトル情報を得るステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得た該ペプチド断片の質量スペクトル情報を、ステップ（ａ）で核酸配列から導き出された予測質量スペクトル情報と関連付けて、１つまたはそれ以上の該ペプチド断片に対応するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン鎖可変領域をコードしている核酸配列を同定し；同定されたそれぞれの核酸配列によってコードされた可変領域およびＣＤＲ３領域について、該ペプチド断片によって可変領域のアミノ酸配列包括度を決定するし、該ペプチド断片によってＣＤＲ３領域のアミノ酸配列包括度を決定するステップ；および
（ｄ）同定された核酸配列から、少なくとも６０％の可変領域のアミノ酸配列包括度および少なくとも６０％のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列包括度を有する核酸配列を選択して、該対象とする抗原に特異的に結合する免疫グロブリンの可変領域の核酸配列またはアミノ酸配列を得るステップ、
を含む方法。
【請求項３】
可変領域が重鎖可変領域である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
可変領域が軽鎖可変領域である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の前記少なくとも１つの動物が、前記対象とする抗原に暴露された動物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
免疫グロブリン鎖をコードする核酸配列が、
（１）前記少なくとも１つの動物の白血球から核酸分子を単離すること；および
（２）免疫グロブリン鎖をコードする核酸分子に隣接するポリヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いて、該免疫グロブリン鎖をコードする核酸分子を増幅すること、および
（３）免疫グロブリン鎖をコードする該増幅された核酸分子の核酸配列を得ること：
によって該少なくとも１つの動物から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）免疫グロブリン鎖をコードする核酸分子がＲＮＡ分子であり、前記増幅ステップが最初の逆転写ステップを含む；または（ｉｉ）該免疫グロブリン鎖をコードする核酸分子に隣接する前記ポリヌクレオチド配列が、ゲノムＤＮＡフランキング免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド配列および免疫グロブリン鎖フレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予測質量スペクトル情報が、
（ｉ）１つまたはそれ以上のプロテアーゼおよび／または１つまたはそれ以上の化学的タンパク質切断試薬を用いて、核酸配列によってコードされた予測アミノ酸配列の理論的消化を行って仮想ペプチド断片を生成するステップ；および
（ｉｉ）該仮想ペプチド断片の予測質量スペクトルを作製するステップ、
を含む方法を用いて得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）の前記ポリクローナル免疫グロブリンの集団が、以前に前記対象とする抗原に暴露された動物の体液サンプルまたはその画分から得られ、場合により、該体液が、血液、脳脊髄液、関節液、腹膜液、粘膜分泌液、涙、鼻汁、唾液、乳、および尿生殖器分泌液からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
動物がステップ（ａ）における前記少なくとも１つの動物と同じである、請求項９に記
載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）のペプチド断片が、ポリクローナル免疫グロブリンの集団から、該集団を複数のプロテアーゼで消化することによって得られる、請求項１また２に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｄ）における選択が、マップされたユニークペプチドの数、スペクトル共用、総ペプチド計数、ユニークペプチド計数、コード核酸配列の頻度、およびクローン関連性からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーターにさらに基づく、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｄ）で選択された核酸配列が、少なくとも６０％の可変領域のアミノ酸配列包括度および少なくとも７５％のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列包括度を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｅ）得られた核酸配列またはアミノ酸配列に基づいて、組換え分子生物学的手法または遺伝子合成手法によって重鎖および軽鎖を作るステップ、
（ｆ）該重鎖を該軽鎖とアセンブリングして前記対象とする抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを作製するステップ、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られた核酸配列またはアミノ酸配列に基づいて、組換え分子生物学的手法または遺伝子合成手法によって免疫グロブリン鎖可変領域を作るステップ
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
動物がヒト、ウサギまたはマウスである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【外国語明細書】
2018027090000001.pdf