(57)【要約】【課題】  糖加水分解酵素を用いた糖転移反応によって、従来は困難であったＰＥＧ化された糖誘導体を効率的に製造する方法を提供すること。【解決手段】  糖転移酵素より安価である糖加水分解酵素を用い、糖供与体として糖ヌクレオチドよりも安定なオキサゾリン誘導体を使用することにより従来の問題点を解決した。本発明のＰＥＧ鎖が導入された化合物の製造方法は、糖を含む化合物を糖受容体とし、糖部位がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾された糖誘導体を糖供与体として、糖転移活性を有する糖加水分解酵素を用いて糖受容体中の糖部位にＰＥＧ修飾した糖を転移させることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖を含む化合物を糖受容体とし、糖部位がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾された糖誘導体を糖供与体として、糖転移活性を有する糖加水分解酵素を用いて糖受容体中の糖部位にＰＥＧ修飾した糖を転移させることを特徴とする、ＰＥＧ鎖が導入された化合物の製造方法。
【請求項２】
糖転移活性を有する糖加水分解酵素としてエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼを用いる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
糖供与体として下記一般式（１）で表されるオキサゾリン誘導体を用いる請求項１または２に記載の製造方法。
【化１２】
2018027078.tif 000013
（式（１）中、Ｘは存在するか存在せず、存在する場合には酸素、アミノ基、硫黄、有機基、糖を、Ｙは存在するか存在せず、存在する場合にはＰＥＧ鎖もしくは官能基や有機基で誘導化されたＰＥＧ鎖を、Ｚは存在するか存在せず、存在する場合には水素、有機基または官能基を示す。Ｘ−Ｙ、Ｙ−Ｚ間の結合は共有結合であり、Ｘ、Ｙ、Ｚはその表示各位において同一である必要はない。ただし、Ｙが全く存在しない場合は除く。）
【請求項４】
糖供与体として下記一般式（２）で表されるオキサゾリン誘導体を用いる請求項１または２に記載の製造方法。
【化１３】
2018027078.tif 000014
（式（２）中、ＹはＰＥＧ鎖もしくは官能基や有機基で誘導化されたＰＥＧ鎖を、Ｚは水素、有機基または官能基を示す。Ｙ−Ｚ間の結合は共有結合であり、Ｙ、Ｚはその表示各位において同一である必要はない。）
【請求項５】
糖受容体として糖誘導体または複合糖質を用いる請求項１または２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖転移活性を有する糖加水分解酵素を用いて、従来は困難であった、分子内にＰＥＧ鎖が導入された化合物を効率的に合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質やペプチド性薬物分子に水溶性高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させるＰＥＧ化医薬品の研究が盛んに行われている。このＰＥＧは無毒性かつ非免疫原性の高分子であり、ＰＥＧ化されたタンパク質治療薬は免疫原性の低下、各種酵素による分解からの保護、半減期の増大などにより、生体内での安定性を高める効果が得られることが知られている。
【０００３】
しかし、その主な方法としてはタンパク質の側鎖アミノ基へのＰＥＧ鎖の導入が用いられているが、タンパク質上に複数箇所存在するアミノ基にランダムに導入されるため、ＰＥＧ鎖の導入位置や数の異なる種々のＰＥＧ化タンパク質の混合物が生成物として得られる。このようなＰＥＧ鎖の導入位置が非選択的な方法ではタンパク質の高次構造の変化や生理活性の低下や喪失が懸念される。
【０００４】
この問題点を解決する方法の１つとして、糖タンパク質上の糖を足掛かりとして、糖転移酵素を用いた糖転移反応により位置選択的にＰＥＧ化する方法が既に報告されている（非特許文献１）。この方法は糖の結合した部分にのみ選択的にＰＥＧ鎖を導入することができるため、従来のランダムにＰＥＧ鎖を導入する方法よりも高い位置選択性を有する利点を持つ。さらにこの手法によりＰＥＧ化の導入された糖タンパク質はこれまで研究が行われているＰＥＧ化されたタンパクやペプチド性薬剤と同様に生体内半減期が延長されることが明らかになっている。
【０００５】
しかし、糖転移酵素を用いてＰＥＧ化された糖タンパク質を合成する場合は、糖供与体としてＰＥＧ化された糖ヌクレオチドが必要不可欠となる。当然そのような糖ヌクレオチドは市販されておらず、また合成する場合にもその安定性などから、大量に調製することは非常に困難であると言わざるを得ない。また反応に用いる糖転移酵素自体も高価である。これらの理由からこの方法は大変優れた手法ではあるが、一方で大量調製を考慮した場合、非現実的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓ．ＤｅＦｒｅｅｓら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６，  ８３３  （２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、糖加水分解酵素を用いた糖転移反応によってＰＥＧ化された糖誘導体を効率的に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、糖転移酵素より安価である糖加水分解酵素を用いることを考えた。一般に糖加水分解酵素は糖転移酵素と比べて格段に安価であり、また近年では糖加水分解酵素にも糖転移活性があるものが多く含まれていることが明らかになっている。そのような糖加水分解酵素の中の１つであるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼ （ＥＮＧａｓｅ）はエンド型加水分解酵素の１つであり、Ｎ−結合型糖タンパク質糖鎖のジアセチルキトビオース部分を切断して糖鎖部位とＧｌｃＮＡｃ１残基を有する糖タンパク質を生成する機能を有している。さらにある種のＥＮＧａｓｅは糖鎖を水酸基を有する化合物に付加するという糖鎖転移活性を有している。また、このＥＮＧａｓｅを用いる糖転移反応の基質としては糖オキサゾリン誘導体が有用であることが既に明らかになっている。一般に糖オキサゾリン誘導体は対応する糖ヌクレオチドと比較して合成も容易であり、さらに格段に安定である。この点からも従来の糖転移酵素を用いる手法よりも大量調製が容易になる。以上の点を改良することで本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりの製造方法である。
＜１＞  糖を含む化合物を糖受容体とし、糖部位がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾された糖誘導体を糖供与体として、糖転移活性を有する糖加水分解酵素を用いて糖受容体中の糖部位にＰＥＧ修飾した糖を転移させることを特徴とする、ＰＥＧ鎖が導入された化合物の製造方法。
＜２＞  糖転移活性を有する糖加水分解酵素としてエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼを用いる＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  糖供与体として下記一般式（１）で表されるオキサゾリン誘導体を用いる＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
【化１】
2018027078.tif 000002
（式（１）中、Ｘは存在するか存在せず、存在する場合には酸素、アミノ基、硫黄、有機基、糖を、Ｙは存在するか存在せず、存在する場合にはＰＥＧ鎖もしくは官能基や有機基で誘導化されたＰＥＧ鎖を、Ｚは存在するか存在せず、存在する場合には水素、有機基または官能基を示す。Ｘ−Ｙ、Ｙ−Ｚ間の結合は共有結合であり、Ｘ、Ｙ、Ｚはその表示各位において同一である必要はない。ただし、Ｙが全く存在しない場合は除く。）
＜４＞  糖供与体として下記一般式（２）で表されるオキサゾリン誘導体を用いる＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
【化２】
2018027078.tif 000003
（式（２）中、ＹはＰＥＧ鎖もしくは官能基や有機基で誘導化されたＰＥＧ鎖を、Ｚは水素、有機基または官能基を示す。Ｙ−Ｚ間の結合は共有結合であり、Ｙ、Ｚはその表示各位において同一である必要はない。）
＜５＞  糖受容体として糖誘導体または複合糖質を用いる＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法を用いれば、タンパク質上の決まった位置に糖を足掛かりとして決まった構造のＰＥＧ鎖を導入できるこれまでにない手法となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】カイコ絹糸腺産生トラスツズマブアクセプターの３種類の糖鎖構造を示す模式図。
【図２】化合物８が転移されたカイコ絹糸腺産生トラスツズマブアクセプターのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図３】ＰＥＧ化糖残基が導入されたトラスツズマブアクセプター、未反応体の糖鎖構造を示す模式図、およびＨＰＬＣによる解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の糖転移活性を有する糖加水分解酵素を用いる分子内にＰＥＧ鎖が導入されている化合物の合成法は、従来の一般的に行われているタンパク質のＰＥＧ化とは異なり、糖を足掛かりとすることでタンパク質上の決まった位置のみＰＥＧ鎖を導入することが可能になる。さらにすでに報告されている糖転移酵素を用いるＰＥＧ化では、高価な糖転移解酵素と不安定な糖ヌクレオチドを使用する問題点があったが、本手法では糖転移反応に安価な糖加水分解酵素を使用し、さらに糖供与体に比較的安定なオキサゾリン誘導体を用いることで従来法の問題点を解決することを特徴とする。
【００１３】
本発明に用いる糖転移活性を有する糖加水分解酵素としては特に制限はないが、ＧＨ１８、ＧＨ２０、ＧＨ５６、ＧＨ８４、ＧＨ８５ファミリーが好ましく、特にＧＨ１８、ＧＨ８５ファミリーが好ましい。
本発明に使用する糖加水分解酵素は緩衝溶液中に可溶化していても良いし、不溶性でも良い。また、固体担体に固定化されていても良い。  
【００１４】
本発明に使用する緩衝溶液の種類には特に制限はないが、リン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、トリス−塩酸緩衝溶液などが好ましい。
当該反応の際に溶媒となる緩衝溶液に有機溶媒を混合させる場合は、当該反応において不活性な溶媒の１種または２種以上を用いうる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド、エチレングリコールジメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの水溶性有機溶媒を使用する。また用いる溶媒の量に特に制限はない。
【００１５】
当該反応のｐＨには何ら制限はないが、ｐＨ３から１０が好ましく、特に４から８が好ましい。
当該反応の圧力は、減圧下、大気圧下、または加圧下のいずれであってもよい。
当該反応の反応時間には何ら制限はないが、５分〜７２時間が好ましい。
当該反応の反応温度には何ら制限はないが、０℃〜６０℃が好ましい。
本発明に用いる糖供与体として、下記一般式（１）で表されるオキサゾリン誘導体を用いることが好ましい。
【化３】
2018027078.tif 000004
【００１６】
一般式（１）においてＸは存在するか存在せず、存在する場合には酸素、アミノ基、硫黄、有機基、糖を示す。糖の構造に特に制限はないが、ヘキソース、ヘキソサミンが好ましい。
一般式（１）においてＹは存在するか存在せず、存在する場合にはポリエチレングリコール鎖もしくは官能基や有機基で誘導化されたポリエチレングリコール鎖を示す。ポリエチレングリコール鎖の構造としては直鎖構造でも分岐構造であっても特に制限はない。ポリエチレングリコール鎖の重合度についても特に制限はないが、重合度３から１００００が好ましく、特に重合度５から２０００が好ましい。
一般式（１）においてＺは存在するか存在せず、存在する場合には水素または有機基または官能基である。
【００１７】
一般式（１）のＸ、Ｙ、Ｚにおいて有機基とは、炭素原子を必須とする原子の集合体であり、例えばアルキル基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基が挙げられ、特にアルキル基、アルキニル基が好ましい。アルキル基、アルケニル基の構造に特に制限はなく飽和または不飽和の鎖式炭化水素基または脂環式炭化水素基となってもよい。アルキル基、アルケニル基の炭素数に特に制限はないが１〜３０が好ましく特に１〜２０が好ましい。
一般式（１）のＹ、Ｚにおいて官能基とは、有機化合物の性質を決定する原子の集合体であり、例えば水酸基、アミノ基、アジド基、アルデヒド基、ケトン基、ボロン酸、アミド基、チオール基が挙げられ、特に水酸基、アミノ基、アジド基、カルボキシル基、アルデヒド基が好ましい。
Ｘ−Ｙ、Ｙ−Ｚ間の結合は共有結合であり、Ｘ、Ｙ、Ｚはその表示各位において同一である必要はない。ただし、Ｙが全く存在しない場合は除く。
本発明に用いる糖供与体として、下記一般式（２）で表されるオキサゾリン誘導体を用いることが特に好ましい。
【化４】
2018027078.tif 000005
【００１８】
一般式（２）においてＹはポリエチレングリコール鎖もしくは官能基や有機基で誘導化されたポリエチレングリコール鎖を示す。ポリエチレングリコール鎖の構造としては直鎖構造でも分岐構造であっても特に制限はない。ポリエチレングリコール鎖の重合度についても特に制限はないが、重合度３から１００００が好ましく、特に重合度５から２０００が好ましい。
一般式（２）においてＺは水素または有機基または官能基である。
一般式（２）のＹ、Ｚにおいて有機基とは、一般式（１）のＸ、Ｙ、Ｚにおける有機基と同様である。
一般式（２）のＹ、Ｚにおいて官能基とは、一般式（１）のＹ、Ｚにおける官能基と同様である。
Ｙ−Ｚ間の結合は共有結合であり、Ｙ、Ｚはその表示各位において同一である必要はない。
【００１９】
一般式（１）あるいは（２）で示されるオキサゾリン誘導体に、糖加水分解酵素による糖転移反応を行うことで目的のＰＥＧ化された糖誘導体は合成される。
一般式（１）あるいは（２）で示されるオキサゾリン誘導体と反応させる糖受容体の構造、分子サイズに何ら制限はないが、分子内にＮ−アセチルグルコサミン残基を有していることが好ましい。
糖転移反応の際に使用する一般式（１）あるいは（２）で示されるオキサゾリン誘導体の使用量に特に制限はないが、使用する糖受容体に対してモル比で１．０モルから３００モル当量が好ましく、１．０から１５０モル当量がさらに好ましい。
本発明に用いる糖受容体として、糖誘導体または複合糖質を用いることが好ましい。
【実施例】
【００２０】
以下に、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明するが、この実施例は本発明の具体例を示すもので、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２１】
（１）化合物２の調製
化合物１（３．８３  ｇ，１１．７  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６０  ｍＬ）−ピリジン（１０  ｍＬ）混合溶媒に溶解し、トシルクロライド（３．３３  ｇ，１７．５  ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、残査に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機相を１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄後、硫酸マグネシウムを加え乾燥させた。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）で精製し、化合物２（４．９３  ｇ、８８％）を得た。
【化５】
2018027078.tif 000006
【００２２】
化合物２  １Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：δ＝２．４４（ｓ，  ３Ｈ），  ３．５７（ｓ，  ４Ｈ），  ３．５９−３．７０（ｍ，  １４Ｈ），  ４．１５（ｔ，  Ｊ＝４．８  Ｈｚ，２Ｈ），  ４．５６（ｓ，  ２Ｈ），  ７．２５−７．２９（ｍ，  １Ｈ），  ７．３０−７．３６（ｍ，  ６Ｈ），  ７．３３（ｄ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ，  ２Ｈ）．
【００２３】
（２）化合物４の調製
化合物３（１８２  ｍｇ，１９７  μｍｏｌ）をメタノール（８  ｍＬ）に溶解し、エチレンジアミン（２  ｍＬ）を加え、一晩加熱還流した。反応液を濃縮後、残査にピリジン（２  ｍＬ）と無水酢酸（１  ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応液にメタノール（２  ｍＬ）を加え過剰な試薬を分解した後、酢酸エチルで２回抽出した。有機相を１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄後、硫酸マグネシウムを加え乾燥させた。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、化合物４（１６０  ｍｇ，８８％）を得た。
【化６】
2018027078.tif 000007
【００２４】
化合物４  １Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：δ＝１．６９（ｓ，  ３Ｈ），  １．９１（ｓ，  ３Ｈ），  １．９２（ｓ，  ３Ｈ），  ３．３６（ｄｄｄ，  Ｊ＝２．８  Ｈｚ，４．８  Ｈｚ，９．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６４−３．７５（ｍ，  ３Ｈ），  ３．８１（ｄｄ，  Ｊ＝３．４  Ｈｚ，  １０．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８４（ｔ，  Ｊ＝９．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９３（ｄ，  Ｊ＝３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９８（ｔ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０４（ｔ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１８（ｄｄ，  Ｊ＝４．８  Ｈｚ，  １１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２１（ｄｄ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ，  １１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４７−４．６８（ｍ，  ８Ｈ），  ４．７６（ｄｄ，  Ｊ＝３．４  Ｈｚ，  ８．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７８（ｄ，  Ｊ＝１１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８５（ｄ，  Ｊ＝１３．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８７（ｄ，  Ｊ＝１２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８８（ｄ，  Ｊ＝６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．７６（ｄ，  Ｊ＝８．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１７−７．３９（ｍ，  ２５Ｈ）．
【００２５】
（３）化合物５の調製
化合物４（１５９  ｍｇ，  １７３  μｍｏｌ）をメタノール（１０  ｍＬ）に溶解し、触媒量の２８％ナトリウムメトキシドメタノール溶液を滴下し、室温で一晩撹拌した。反応液にＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０（Ｈ＋  ｆоｒｍ）を加えて中和後、樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮し、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製し、化合物５（１３２  ｍｇ，９２％）を得た。
【化７】
2018027078.tif 000008
【００２６】
化合物５  １Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１．７６（ｓ，  ３Ｈ），  ２．０６（ｂｒｓ，  １Ｈ），  ２．３０（ｄ，  Ｊ＝８．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．０８−３．１４（ｍ，  １Ｈ），  ３．４１−３．５３（ｍ，  ４Ｈ），  ３．６０−３．６６（ｍ，  ２Ｈ），  ３．６９（ｄｄ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ，  １１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．７２（ｄｄ，  Ｊ＝４．１  Ｈｚ，  １１．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．７７（ｄｄ，Ｊ＝２．７  Ｈｚ，  １０．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９０（ｔ，  Ｊ＝８．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４９（ｄ，Ｊ＝１２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５４−４．６２（ｍ，  ５Ｈ），  ４．６４（ｄ，  Ｊ＝１２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８２（ｄ，  Ｊ＝１１．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８９（ｄ，  Ｊ＝１１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９４（ｄ，  Ｊ＝１１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９４（ｄ，  Ｊ＝１１．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９８（ｄ，  Ｊ＝６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．６２（ｄ，  Ｊ＝７．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１９−７．４２（ｍ，  ２５Ｈ）．
【００２７】
（４）化合物６の調製
化合物５（１３２  ｍｇ，１５８  μｍｏｌ）および化合物２（３０６  ｍｇ，６３３  μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．６  ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（１６．６  ｍｇ，３８０  μｍｏｌ）を加え、０  ℃で１５分、次いで室温で一晩撹拌した。反応液に５％クエン酸水溶液（１  ｍＬ）を加え反応を停止させた後、水を加え酢酸エチルで２回抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄後、硫酸マグネシウムを加え乾燥させた。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  トルエン：酢酸エチル＝１：５）で精製し、化合物６（１４７  ｍｇ，６４％）を得た。
【化８】
2018027078.tif 000009
【００２８】
化合物６  １Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１．６５（ｓ，  ３Ｈ），  ３．２２−３．３０（ｍ，  ２Ｈ），  ３．３８−３．７６（ｍ，  ４５Ｈ），  ３．７７−３．８２（ｍ，  ２Ｈ），  ３．８４（ｑ，  Ｊ＝６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９１（ｔ，  Ｊ＝６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０６（ｔ，  Ｊ＝６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４５（ｄ，  Ｊ＝１１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４８（ｓ，  １Ｈ），  ４．５１−４．６１（ｍ，  ７Ｈ），  ４．６４（ｄ，  Ｊ＝１１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７３−４．９４（ｍ，  ６Ｈ），  ６．１１（ｄ，  Ｊ＝８．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１９−７．３６（ｍ，  ３３Ｈ），  ７．４０（ｄ，  Ｊ＝７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ）．
【００２９】
（５）化合物７の調製
化合物６（１４７  ｍｇ，１０１  μｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１０  ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１２５  ｍｇ）の１，４−ジオキサン懸濁液（２  ｍＬ）に加えた後、水（３  ｍＬ）を加え、水素雰囲気下、室温にて一晩撹拌した。固形物を濾別し、５０％１，４−ジオキサン水溶液で洗浄後、濾液と洗液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．４）で精製し、化合物７（６０．９  ｍｇ，７３％）を得た。
【化９】
2018027078.tif 000010
【００３０】
化合物７  １３Ｃ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝２２．０２，  ２２．３３，  ５３．８４，  ５６．２２，  ６０．２４，  ６０．３７，  ６０．４９，  ６０．６１，  ６５．８５，  ６５．８８，  ６７．１８，  ６７．２１，  ６８．３０，  ６９．２４，  ６９．５７，  ６９．６９，  ６９．７１，  ６９．７６，  ６９．８４，  ６９．９９，  ７０．０３，  ７０．０８，  ７０．１６，  ７１．７０，  ７１．８４，  ７１．９８，  ７２．４８，  ７４．６７，  ７４．７６，  ７９．６０，  ７９．８３，  ８１．３１，  ９０．９２，  ９５．０２，  １００．２８，  １００．３２．
【００３１】
（６）化合物８の調製
化合物７（６０．９  ｍｇ，１１．２  μｍｏｌ）に０．７６０  Ｍの２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド水溶液（３．０２  ｍＬ，２．２９  ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（８０４  μＬ，５．７７  ｍｍｏｌ）を加え、０  ℃で一晩撹拌した。反応液をゲルろ過クロマトグラフィー（展開溶媒  ０．０５％トリエチルアミン水溶液）で精製し、化合物８（５７．８  ｍｇ，  ９６％）を得た。
【化１０】
2018027078.tif 000011
【００３２】
化合物８  １Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝１．９５（ｓ，  ３Ｈ），  ３．２８−３．３１（ｍ，  １Ｈ），  ３．３３（ｄｄ，  Ｊ＝３．４  Ｈｚ，  ９．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．３７−３．４４（ｍ，  １Ｈ），  ３．４７−３．６９（ｍ，  ４４Ｈ），  ３．７１−３．８１（ｍ，  ２Ｈ），  ４．０４−４．１０（ｍ，  ２Ｈ），  ４．２４（ｔ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５８（ｂｒｓ，  １Ｈ），  ５．９７（ｄ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ，  １Ｈ）．
【００３３】
（７）化合物１０の調製
Ｎ−結合型糖鎖に作用するＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼ(Ｅｎｄｏ−Ｍ)を酵素触媒として用いた。糖供与体は５０  ｍＭの化合物８水溶液を５０  μＬ使用した。糖受容体には１５  ｍＭの化合物９の１０％ＤＭＳＯ水溶液５５．５  μＬを使用した。この混合溶液に１．０  ＭのｐＨ７．０リン酸緩衝溶液１２．５  μＬ、水１０７  μＬおよびＥｎｄｏ−Ｍ酵素溶液（２  ｍＵ／μＬ）２５ μＬを加えた。これを１バイアルとして１０バイアル並列して３０  ℃で３０分間反応させた。その後反応液を６５  ℃で１０分間加熱して反応を停止させた後、すべてのバイアルをまとめてＨＰＬＣで精製し、化合物１０（３．９  ｍｇ，４１％）を得た。
【００３４】
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（１０  ｍｍＩＤ  ×２５０  ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社），流量：４．７  ｍｌ／ｍｉｎ，溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液−０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（９５：５→３０：７０、３０分、リニアグラジエント），検出波長３０１ｎｍ
【化１１】
2018027078.tif 000012
化合物１０  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ．  ：  Ｃａｌｃｄ  ｆоｒ  Ｃ４８Ｈ８１Ｎ３Ｏ２８Ｎａ  ｍ／ｚ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋：１１７１．２，  Ｆｏｕｎｄ：１１７０．６．
【実施例２】
【００３５】
カイコ絹糸腺産生トラスツズマブのＰＥＧ化
Ｎ−結合型糖鎖に作用するＳｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼ(Ｅｎｄｏ−Ｓ)を酵素触媒として用いた。糖供与体は５０  ｍＭの化合物８水溶液を１．１  μＬ使用した。糖受容体には特開２０１６−８２９６２の実施例９に記載の方法で調製したカイコ絹糸腺産生トラスツズマブアクセプターを使用した。本カイコ絹糸腺産生トラスツズマブアクセプターは、２つのＦｃ部位の両方にＮ−アセチルグルコサミン残基を有するＦｕｌｌｙ型と、２つのＦｃ部位の片方のみにＮ−アセチルグルコサミン残基を有するＨｅｍｉ型と、Ｆｃ部位にＮ−アセチルグルコサミン残基が存在しないＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の３種類の混合物であり、それらの割合はＦｕｌｌｙ型が７３％、Ｈｅｍｉ型が２３％、Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型が４％である（図１）。このカイコ絹糸腺産生トラスツズマブアクセプター（２１．２  μｇ／μＬ）水溶液を３．８  μＬに１．０  ＭのｐＨ７．０トリス塩酸緩衝液１．０  μＬ、水１０．１  μＬおよびＥｎｄｏ−Ｓ酵素溶液（１．０  μｇ／μＬ）４．０ μＬを加え、３７  ℃で３時間反応させた。その後反応液を−２０  ℃で凍結させて反応を停止させた。
【００３６】
反応液の一部（０．１８  μＬ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、化合物８がカイコ絹糸腺産生トラスツズマブアクセプターに転移されたために高分子側にシフトしたことが確認された（図２）。
【００３７】
さらに反応液の一部（２．５  μｇ）をトリプシン処理の後、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８  １．０Ｘ１５０ｍｍカラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ装置（ＬＴＱ−ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行ったところ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ＡｒｇのＡｓｎ側鎖にＰＥＧ化マンノシルキトビオースが結合した化合物ｍ／ｚ＝２１９６．９８が検出され、トラスツズマブアクセプターにＰＥＧ化糖残基が導入されたことが確認された。
【００３８】
さらに、反応液の一部（３．８  μＬ）を用いてＨＰＬＣによる解析を行った。分析条件は以下の通りである。カラム：ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０（４  ｍｍＩＤ×２５０  ｍｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，ＣＡ．，ＵＳＡ），流量：１．０  ｍｌ／ｍｉｎ，溶出液Ａ［１０  ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）］―溶出液Ｂ［１０  ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）＋１．０  Ｍ  ＮａＣｌ水溶液］，Ａ：Ｂ＝１００：０（０−５分），１００：０→０：１００％（５−１０５分、リニアグラジエント），０：１００（１０５−１２０分、洗浄），１００：０（１２０−１４０分、平衡化），検出波長２８０ｎｍ、分析温度２５℃。その結果、抗体の２つの重鎖部位の両方にＰＥＧ鎖が導入されたＦｕｌｌｙ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ型トラスツズマブの収率が５５％であることが確認された（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によって糖を足掛かりとして、分子内の決まった位置に決まった長さのＰＥＧ鎖を導入した化合物を容易に製造できる。この手法を応用すればタンパク質製剤の合成にも応用することが可能であり、従って本発明化合物の工業的価値や波及効果は極めて大である。
【図１】
2018027078.tif 000015
【図２】
2018027078.tif 000016
【図３】
2018027078.tif 000017