(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子の配列、メッセンジャーＲＮＡの配列、これらの制御配列の中から、遺伝子自体の転写／翻訳を調節するために最も有望であるオリゴヌクレオチド配列の提供。【解決手段】標的遺伝子のアンチセンスＤＮＡ鎖に相補的な一本鎖アンチジーンオリゴヌクレオチドであって、６〜３０ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも３つの群を含む配列により特徴付けられる、オリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが１２〜２４ヌクレオチを含み、少なくとも２つの連続するグアニンの群が互いに連続する。２つ連、ヌクレオチドが少なくても、１つのヌクレオチドで隔てられている、オリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチジーン機構を介して遺伝子の発現を調製するためのオリゴヌクレオチドであって、６〜３０ヌクレオチド、好ましくは１２〜２４ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも３つの群を含む配列により特徴付けられる、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも２つの連続するグアニンの群が、互いに連続する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも２つの連続するグアニンの群が、少なくとも１つのヌクレオチドにより隔てられ、前記ヌクレオチドはグアニンではない、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
少なくとも２つの連続するグアニンの群が、少なくとも４つ、５つ、又は６つである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’及び／又は５’末端において、担体配列、好ましくは配列番号４７〜５６からなる群から選択される担体と結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの天然の核酸分子、好ましくは場合により化学的に修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ、若しくは合成核酸、好ましくは場合により化学的に修飾されたＰＮＡ、ＬＮＡ若しくはモルホリノ、又は前記天然の核酸及び前記合成核酸の組み合わせである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記天然又は合成核酸が、一本鎖又は二本鎖である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＤＮＡ分子が、少なくとも１つのＬＮＡ、メチルホスホネート−ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＲＮＧ、ＤＮＧ、ＧＮＡ、ＵＮＡ、ＥＮＡ、ＡＮＡ、Ｆ−ＡＮＡ、ＰＮＡ、Ｇ−ＰＮＡ又はモルホリノヌクレオチドを含むか；あるいは、２’０−メチル、２’０−メトキシエチル又は２’−フルオロＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項６又は７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＲＮＡ分子が、２’０−エチルヌクレオチド、２’０−メトキシエチルヌクレオチド、２’−フルオロヌクレオチドの中から選択される前記少なくとも１つのＲＮＡヌクレオチド；あるいは、ＬＮＡ、メチルホスホネートＬＮＡ、ＢＮＡ、ＲＮＧ、ＤＮＧ、ＧＮＡ、ＵＮＡ、ＥＮＡ、ＡＮＡ、Ｆ−ＡＮＡ、ＰＮＡ、Ｇ−ＰＮＡ又はモルホリノの中から選択される核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項６又は７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＤＮＡ分子又は前記少なくとも１つのＲＮＡ分子が、ホスホロチオエート結合としてホスホジエステル結合のレベルにおいて修飾される少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＰＮＡが、修飾された主鎖を有し、α炭素が、置換基としてアルギニン又はリジンの側鎖を有する、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、遺伝子又はウイルス起源の疾患の原因である少なくとも１つの遺伝子、あるいは少なくとも１つの腫瘍遺伝子に対する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記遺伝子が、ＭＹＣファミリーに属する少なくとも１つの遺伝子、好ましくはＭＹＣ、ＭＹＣＮ又はＭＹＣＬｌ、ＢＩＲＣ５、ＢＣＬ２、ＰＬＫ４、ＡＬＫ、ＰＫＭ２、ＣＡＳＰ８及びＲＡＳＳＦ１からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２〜１５、配列番号２４、２５の中から選択され；好ましくは配列番号２、４、５及び６の中から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６６〜８４の中から選択され、好ましくは配列番号６８〜８４の中から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号２〜１５、６６〜６９、２４、２５、好ましくは配列番号２、４、５、６、６８及び６９が、ＭＹＣＮ遺伝子に対する、請求項１４又は１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号７０〜７４が、ＭＹＣ遺伝子に対する、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号７５、７６が、ＢＩＲＣ５遺伝子に対する、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号７７〜７９が、ＡＬＫ遺伝子に対する、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号８０〜８２が、ＢＣＬ２遺伝子に対する、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号８３、８４が、ＰＬＫ４遺伝子に対する、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２〜１５、好ましくは配列番号２〜１３、より好ましくは配列番号２〜８、さらにより好ましくは配列番号２〜６からなる群から選択されるＰＮＡである、請求項１４又は１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ＰＮＡが、配列番号５である、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
５’及び／又は３’末端において配列番号４７と結合している、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項２６】
薬理作用を有する、好ましくは、ＮＧＦ、ソマトスタチン、レチノイン酸、アクチノマイシンＤ、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シスプラチン、シタラビン、クロラムブシル（clorambucil）、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、塩酸ドキソルビシン、塩酸エピルビシン、エトポシド、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、塩酸イダルビシン、ヒドロキシ尿素、イソホスファミド（ifophosphamide）、塩酸イリノテカン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール‐ウラシル、テモゾロミド、チオグアニン、チオテパ（thiotepe）、トポテカン、ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンからなる群から選択された化合物と組み合わせた、配列番号１を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２７】
前記組み合わせが、配列番号１及びカルボプラチン又はエトポシド又はシスプラチン又はビンクリスチン；あるいは配列番号５及びカルボプラチン、又はエトポシド又はシスプラチン又はビンクリスチンである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
医薬又は診断薬として使用のための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
遺伝子及び／又はウイルス起源の疾患の治療に使用のための、あるいは腫瘍を治療するためのオリゴヌクレオチド又は組成物であって、前記遺伝子及び／又はウイルス起源の疾患並びに前記腫瘍が、遺伝子の過剰発現及び／又は阻害により引き起される、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド又は組成物。
【請求項３０】
前記遺伝子疾患が、ゴリーン症候群、ダウン症候群、ファインゴールド症候群、ヒルシュスプルング病、フォンヒッペル・リンダウ症候群、血管拡張性失調症、リー・フラウメニ症候群、ターコット症候群、家族性腫瘍及びパーキンソン病からなる群から選択され；前記腫瘍が、成人又は小児の腫瘍であり、好ましくは神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、髄芽細胞腫、上衣腫、褐色細胞腫、胚性癌、胚細胞腫瘍、肺胞横紋筋肉腫、胚性横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、腎臓の明細胞肉腫、滑膜肉腫、肝芽細胞腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性巨核芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞白血病、リンパ腫、小細胞肺癌（小細胞癌（microcytoma））、肺腺癌、扁平細胞肺癌、定型及び非定型原発性肺癌、大細胞肺癌、大細胞神経内分泌性肺癌、神経膠芽細胞腫、肝細胞癌、基底細胞癌、卵巣腫瘍、乳房腫瘍及び結腸癌からなる群から選択される、請求項２８又は２９に記載のオリゴヌクレオチド又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の発現を調節するための、特に、遺伝、腫瘍又はウイルス起源の病理に起因する遺伝子の発現を調節するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、前記疾患の治療及び／又は診断のための、場合により化学的に修飾された、前記オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、天然ＲＮＡ若しくはＤＮＡ核酸又は合成核酸、例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（ロックド核酸（Locked Nucleic Acid））及びモルホリノの短い配列である。
【０００４】
オリゴヌクレオチドは、転写及び翻訳の双方のレベルにおいて遺伝子の発現を調節するのに大変に有効的であることが、実験的に実証されている。この能力のために、オリゴヌクレオチドは、遺伝、腫瘍、又はウイルス起源の特定の疾患における多数の病理を治療するために有効な手段を代表する。
【０００５】
遺伝子の発現の調節とは、その阻害又は活性化を意味し得る。
【０００６】
例えば、遺伝子のアンチセンス鎖と相補的結合を形成することにより（Helene C, Bioch Bioph Acta 1990, 10 9 (2 ): 99-125）、あるいは目的の遺伝子の制御領域においてクロマチンの状態を改変することにより（Rossi JJ, Nat Chem Biol 2007, 3(3): 136-7）、遺伝子の転写を阻害することができるオリゴヌクレオチドが、知られている。他のオリゴヌクレオチドは、例えば標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）との相補的結合により、遺伝子転写を阻害することができる。一本鎖オリゴヌクレオチドの場合では、この結合は、ＲＮａｓｅ  Ｈ複合体によるｍＲＮＡの酵素的分解を引き起す。オリゴヌクレオチドが二本鎖「干渉」ＲＮＡ分子である場合では、オリゴヌクレオチドの標的ｍＲＮＡとの相補的結合は、ＲＩＳＣ複合体の「スライサー」酵素によりメッセンジャーの分解を引き起す。後者の場合、オリゴヌクレオチドは、不完全な相補性の効力により、ブロックされるそのｍＲＮＡの翻訳を引き起す標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域（３’非翻訳領域）と結合することができる内因性マイクロＲＮＡと同等のオリゴヌクレオチドであり得る。
【０００７】
オリゴヌクレオチドは、例えば、長いアンチセンス非コーディングＲＮＡとの相補的結合を介して（Morris KV, Epigenetics, 2009, 4(5): 296-301）、あるいは相補的マイクロＲＮＡを阻害することにより、遺伝子の活性化又はこれの転写の増加を誘導し得、結果としてマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡの翻訳が増加する。
【０００８】
オリゴヌクレオチドは、治療及び／又は診断期間において、これらの有効性を増加させるために化学的に修飾され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、その特異性及び／又は相補的配列と対になる強さを改善するために修飾され得、あるいはオリゴヌクレオチドは、酵素消化を受けにくくするために、その薬物動態学／薬力学的プロファイルを改善するために、又はその細胞膜の透過を容易にするために修飾され得る。
【０００９】
天然の核酸のオリゴヌクレオチド（即ち、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの短い配列）に加えて、合成核酸のオリゴヌクレオチド、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）が存在し、とりわけアンチジーン戦略（即ち遺伝子を直接攻撃するために設計される）により遺伝子の発現を調節するために、大変に研究され、特徴付けられている。ＰＮＡ及びＬＮＡオリゴヌクレオチド、全て修飾されたようなオリゴヌクレオチドは、一般的に、ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドよりも化学的に安定している。これらの安定性は、キメラオリゴヌクレオチドを合成することによりさらに改善され得る。キメラオリゴヌクレオチドは、典型的なモノマー（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）及び合成核酸塩基（モノマー）、例えばＬＮＡモノマーの双方が挿入されるオリゴヌクレオチド配列である。
【００１０】
ＬＮＡは、標的遺伝子の転写を阻害することにより遺伝子をサイレンシングする、アンチセンス戦略に用いられる（Braasch DA, Nucl Acids Res, 2002, 30 (23) : 5160-7）。あるいは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドはまた、「Ｚ型」構造（「ゾロ」オリゴヌクレオチドとして定義される）を形成するための、「鎖侵入」機構により核酸の双方の鎖上で相互作用することができるような方法で、オリゴヌクレオチド配列を設計したSmithと同僚により行なわれたように、アンチジーン戦略に用いられ得る（Ge R, Faseb J, 2007, 1902-14）。
【００１１】
ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオシド構造と比較した場合、酵素的により安定的である。ＰＮＡは、「鎖侵入」を介して二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡｄｓ）と結合し得、あるいは相補的な態様において、一本鎖ＤＮＡの分子（ＤＮＡｓｓ）と対になり得、さもなければ、これらは、ホモデュプレックス（Homoduplex）構造（例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖）と比較して熱力学的に大変に安定であるハイブリッドダブルヘリックスＰＮＡ／ＤＮＡ又はＰＮＡ／ＲＮＡ構造を生じるＲＮＡの鎖と結合し得る。
【００１２】
ＰＮＡは、とりわけアンチジーン戦略を用いた遺伝子の発現を調節するための非常に有利なシステムを表す。実際、ＰＮＡは、標的配列について高い特異性を示し、これによりタンパク質の発現が有効的な態様において阻害されることを可能にすること示した。
【００１３】
それ故、ＰＮＡは、遺伝子又はウイルス疾患の治療のための有望な治療的アプローチを示す。
【００１４】
ＰＮＡの唯一の不都合な点は、これらは、細胞膜を透過する限定された能力を有するという事実である。しかしながら、この限定は、一般的にオリゴヌクレオチド、特に細胞膜透過をより有効的にすることができる分子（担体）をＰＮＡと結合させることにより解決される。
【００１５】
実際、オリゴヌクレオチド及びＰＮＡは、具体的には、一般的に、それらと結合される担体（又は「タグ」）、例えば、１〜３０個のアミノ酸の様々な長さを有するペプチド配列を用いて投与され得る。
【００１６】
オリゴヌクレオチドのある特定の適用は、腫瘍を活性化又は抑制する遺伝子の発現を調節することに関する。
【００１７】
腫瘍は、様々な遺伝子の調節不全により引き起されることがよく知られている。通常、損傷は、腫瘍において活性化又は過剰発現するＭＹＣ遺伝子（ｔｒａ  ｃｕｉ  ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＬ１）、サバイビン（ＢＩＲＣ５）、ＢＣＬ２、ＰＬＫ４、ＡＬＫ及びＰＫＭ２のような原癌遺伝子（又は単に癌遺伝子）に影響を及ぼす。さらに、腫瘍において、抗腫瘍又は癌抑制遺伝子、例えばカスパーゼ−８及びＲＡＳＳＦ１はまた、通常不活性である。
【００１８】
特に、ＭＹＣファミリーの癌遺伝子は、多数のヒト腫瘍の発達に関与しており、なかでも新生物の発症及び進行の最も原因となる遺伝子である。これらの遺伝子の増幅及び／又は過剰発現は、殆どの場合、小児型（例えば、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫及び横紋筋肉腫）及び成人型（例えば、小細胞肺癌又は神経膠芽細胞腫）の双方の腫瘍と関連している（Pession A, Cur Cancer Drug Target, 2005, 5 ( 4 ) : 273-83）。実際、これらは、腫瘍増殖、例えば細胞増殖の誘導、アポトーシス抵抗性、転移の形成、及び化学療法薬抵抗性の基本である機構により作用する。
【００１９】
抗腫瘍効果を有する多数のオリゴヌクレオチドは、文献において知られている。
【００２０】
例えば、アンチセンス戦略において、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＢＣＬ２、ＢＩＲＣ５遺伝子に対するオリゴヌクレオチド（EV Prochownik, Exp Rev Antic Ther 2004, 4(2):289- 302; Felsher DW, Drug News Persp, 2003, 16(6):370-4; CF Bennet, Exp Opin Investig Drugs, 1999, 8(3): 237-53）、又はアンチジーン戦略において、ＭＹＣＮ及びＭＹＣに対するオリゴヌクレオチド（LC Boffa, Oligonucleotides 2005, 15(2) :85- 93）が存在する。
【００２１】
ＤＮＡ型ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、神経芽腫細胞中のＭＹＣＮ遺伝子の翻訳を阻害するために生成され（Burkhart CA, JNCI, 2003, 95 (18) : 1394-403）、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、神経芽腫細胞中のＭＹＣＮ遺伝子の翻訳を阻害するために、「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」を介して生成される（Kang JH, Bioch Bioph Res Com, 2006, 351 (1) : 192-197）。
【００２２】
しかしながら、強力な治療的及び／又は抗腫瘍効果を有し得るような、非常に特異的且つ選択的な態様において、遺伝子の発現を調節することができる更なるオリゴヌクレオチドを同定する強い需要が未だ存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
治療的及び／又は診断的手段として利用可能なオリゴヌクレオチドを得るために、標的遺伝子又は標的メッセンジャーＲＮＡ、及び／又は転写及び／又は翻訳の双方の期間において、遺伝子それ自身の発現に関する著しく且つ選択的な調節効果を決定することができるこれらのそれぞれの制御配列を同定することが必要である。
【００２４】
従って、遺伝子の配列、メッセンジャーＲＮＡの配列、これらの制御配列の中から、遺伝子自体の転写／翻訳を調節するために最も有望であるオリゴヌクレオチド配列を同定する方法を支配する一般的な法則を定義する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上述のように、この節における必要性は、本発明により満たされ、第一の態様によれば、これは、遺伝子の発現を調節するためのオリゴヌクレオチドであって、６〜３０ヌクレオチド（モノマー）、好ましくは１２〜２４ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも１つの群を含む配列により特徴付けられる、オリゴヌクレオチドに関する。配列番号１を有するオリゴヌクレオチドは、単に与えられる定義から排除されるものとして理解される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
天然の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の場合、各モノマー（ヌクレオチド）は、窒素塩基、糖及び三リン酸からなる。該塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及び（ＲＮＡにおいてのみ）ウラシルの中から選択される。糖は、ＤＮＡの場合においてデオキシリボースであり、ＲＮＡの場合においてリボースである。モノマーは、ホスホジエステル結合により、連結されてポリマーとなる。
【００２７】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの連続するグアニンの少なくとも１つの群を含む配列を含む。配列番号１を有するオリゴヌクレオチドは、この定義から排除されるとして理解される。
【００２８】
より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも４つの連続するグアニンの少なくとも１つの群を含む配列を含む。
【００２９】
さらにより好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５つの連続するグアニンの少なくとも１つの群を含む配列を含む。
【００３０】
少なくとも６つの連続するグアニンの少なくとも１つの群を含む配列を含むオリゴヌクレオチドは、本発明の目的に特に好ましい。
【００３１】
本発明の実施形態によっては、該オリゴヌクレオチドは、２〜６つの連続するグアニンからなる少なくとも１つの群を含む配列を含む。
【００３２】
更なる実施形態によれば、少なくとも１つのグアニンの群は、好ましくは、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも２つの群を含む。
【００３３】
あるいは、少なくとも１つのグアニンの群は、好ましくは、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも１つの群、及び少なくとも３つの連続するグアニンの少なくとも１つの群を含む。
【００３４】
更なる実施形態によれば、少なくとも１つのグアニンの群は、好ましくは、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも３つの群を含む。
【００３５】
更なる実施形態によれば、少なくとも１つのグアニンの群は、好ましくは、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも４、５又は６つの群を含む。
【００３６】
あるいは、少なくとも１つのグアニンの群は、好ましくは、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも１つの群、及び少なくとも３つの連続するグアニンの少なくとも２つの群を含む。
【００３７】
あるいは、少なくとも１つのグアニンの群は、好ましくは、少なくとも３つの連続するグアニンの少なくとも１つの群、及び少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも２つの群を含む。
【００３８】
あるいは、少なくとも１つのグアニンの群は、好ましくは、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも１つの群、少なくとも３つの連続するグアニンの少なくとも１つの群、及び／又は少なくとも６つの連続するグアニンの少なくとも１つの群を含む。
【００３９】
一般的に、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは標的配列に完全に相補的であり、好ましくは連続するグアニンの群は、例えば２つの連続するグアニンの３つの群は、６つの連続するグアニンの群であるように、互いに連続し得る。あるいは、連続するグアニンの群は、少なくとも１つのヌクレオチドにより隔てられ得る。
【００４０】
一般的に、本発明の少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも１つの群は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに、あるいはオリゴヌクレオチドの３’端の近くに、さもなければオリゴヌクレオチド配列の中央に位置し得る。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、好ましくはその３’及び／又は５’末端において、好ましくは短いアミノ酸配列である担体配列と結合される。
【００４２】
前記の短いアミノ酸配列（担体）は、好ましくは、１〜３０、好ましくは１〜１０、さらにより好ましくは１〜７個の数のアミノ酸からなる。該アミノ酸は、Ｌ又はＤ体、好ましくはＤ体であり得る。
【００４３】
本発明の目的に好ましい担体は、配列番号４７（ＰＫＫＫＲＫＶ）；配列番号４８（ＶＫＲＫＫＫＰ）；配列番号４９（ＫＫＫＫＫＫ）；配列番号５０（ＰＫＲＫＲＫＶ）；配列番号５１（ＫＲＫＲＫＲＫ）；配列番号５２（ＫＫＫＲＫＶ）；配列番号５３（ＰＫＫＫＲＫ）；配列番号５４（ＫＫＫＲＫ）；配列番号５５（ＲＲＲＲ）及び配列番号５６（ＰＫＫＫＲＫＶＨＨＨＨＨ）からなる群から選択される。
【００４４】
本発明の目的に特に好ましい担体は、配列番号４７を有するペプチドである。
【００４５】
本発明の文脈において、「担体」とは、薬物動態学的及び／若しくは又は薬力学的プロファイル並びに／又はオリゴヌクレオチドの細胞及び／若しくは核透過を好ましく改変することができるペプチドを意味する。
【００４６】
本発明の文脈において、「遺伝子の発現を調節する」とは、遺伝子の発現を阻害又は活性化（増加）させることを意味する。遺伝子発現の前記阻害又は活性化（増加）は、転写又は翻訳レベルで生じ得る。
【００４７】
遺伝子発現の阻害又は活性化は、アンチジーン機構（又はアンチジーンオリゴヌクレオチド、即ち遺伝子のアンチセンス鎖に対する、即ちアンチジーン戦略）により作用するオリゴヌクレオチドにより転写レベルにおいて達成され得る。あるいは、遺伝子発現の阻害は、アンチセンス機構（又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、即ちメッセンジャーに対する、即ちアンチセンス戦略）を介して作用するオリゴヌクレオチドを用いて翻訳レベルにおいて達成され得る一方で、翻訳レベルに関する発現の増加は、メッセンジャーＲＮＡを分解するマイクロＲＮＡを阻害することにより達成され得る。
【００４８】
オリゴヌクレオチドが、出願人により同定され、且つ上述される遺伝子の発現を有効的に調節するために満たすべきパラメータ、又は法則、又は必要条件は、何であれ遺伝子により変更され、従って、例えば、遺伝子及び／若しくはウイルス起源の疾患の原因である遺伝子、又は腫瘍病理の発症に関与する遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドの配列を同定するために、適用される。
【００４９】
このように同定されたオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子、ウイルス、又は腫瘍性疾患の治療のための治療的アプローチにおいて、好ましくは薬物として用いられ得る。
【００５０】
あるいは、該オリゴヌクレオチドは、診断目的のために用いられ得る。
【００５１】
実際、本発明の主題は、治療及び／又は診断目的のための、場合により修飾された本発明のオリゴヌクレオチドの使用にさらに関する。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、６〜３０、好ましくは１２〜２４残基（ヌクレオチド又はモノマー）の短いオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、天然の核酸塩基、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は合成核酸塩基、例えばＰＮＡ、ＬＮＡ若しくはモルホリノからなってもよい。あるいは、該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又は合成核酸、好ましくはＰＮＡ又はＬＮＡ（ハイブリッド又はキメラオリゴヌクレオチド）の組み合わせを含み得る。さらに、該オリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。
【００５３】
本発明の実施形態によっては、該オリゴヌクレオチドは、例えば、これらの治療及び／又は診断的有効性を改善するために、化学的に修飾され得る。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態によれば、該オリゴヌクレオチドは、α位の炭素（Cアルファ(α)）が、グリシンの典型的な水素原子以外の置換基と結合している主鎖を有するＰＮＡ分子でもあり得る。例えば、グリシンの側鎖の代わりに、好ましくはアルギニン、リジン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、バリン、アラニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、プロリン、トリプトファン、及びオルニチンからなる群から選択される天然若しくは合成起源の別のアミノ酸の側鎖が用いられ得る。前記アミノ酸は、右旋性配置（Ｄ）又は左旋性配置（Ｌ）であってもよい。
【００５５】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、該オリゴヌクレオチドは、相互に相補的な一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ分子である（相互に相補的二本鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉（small interfering）ＲＮＡ」の頭文字ｓｉＲＮＡとして定義される）。
【００５６】
他の実施形態によれば、前記「低分子干渉ＲＮＡ」は、ＲＮＡモノマー（リボヌクレオチド）及び少なくとも１つのリボースの２’位において修飾されたモノマー、好ましくは２’−０−メトキシエチル、２’−０−メチル若しくは２’−フルオロモノマーを含み；あるいは前記「低分子干渉ＲＮＡ」は、ＲＮＡモノマー（リボヌクレオチド）並びに少なくとも１つの合成核酸のモノマーは、好ましくは、メチルホスホネートＬＮＡ、ＢＮＡ（架橋型核酸）、ＵＮＡ（アンロックド（unlocked）核酸）、ＥＮＡ（エチレン架橋型核酸）、ＡＮＡ（アラビノース核酸）及びＦ−ＡＮＡ（フルオロ−アラビノシド核酸）の中から選択される。
【００５７】
好ましい実施形態によれば、前記「低分子干渉ＲＮＡ」は、相補的二本鎖の末端において、二本鎖の１つのみが、少なくとも１つ、少なくとも２つの突出した、即ち対にならない天然若しくは合成核酸のモノマーを有するように設計される。更なる実施形態によれば、天然又は合成の突出した核酸は、好ましくは、２’−０−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル及び２’−フルオロモノマー、あるいはＬＮＡ、メチルホスホネートＬＮＡ、ＢＮＡ、ＵＮＡ（アンロックド核酸）、ＥＮＡ（エチレン架橋化核酸）、ＡＮＡ（アラビノース核酸）及びＦ−ＡＮＡ（フルオロ−アラビノシド核酸）のモノマーの中から選択される。
【００５８】
更なる実施形態によれば、該オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド又はキメラとして定義され、好ましくはＲＮＡモノマー（リボヌクレオチド）及びＬＮＡモノマーを含む一本鎖又は二本鎖である（このオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ／ＬＮＡとして表される）。あるいは、該ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡモノマー（リボヌクレオチド）並びに２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）モノマー、２’−Ｏ−メチルモノマー及び２’−フルオロモノマーの中から選択される少なくとも１つのＲＮＡモノマーを含み；あるいは該ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡモノマー（リボヌクレオチド）並びに好ましくは、ＬＮＡ、メチルホスホネートＬＮＡ、ＵＮＡ（アンロックド核酸）、ＢＮＡ、ＥＮＡ（エチレン核酸）、ＡＮＡ（アラビノース核酸）及びＦ−ＡＮＡ（フルオロ−アラビノシド核酸）の中から選択される合成核酸の少なくとも１つのモノマーを含み得る。
【００５９】
更なる実施形態によれば、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ型オリゴヌクレオチドは、典型的な（即ち、化学的に修飾されていない）リボヌクレオチド、及びホスホジエステル結合、例えばホスホロチオエート結合のレベルにおいて修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、又はＤＮＧ（デオキシリボ核酸グアニジン）、ＲＮＧ（リボ核酸グアニジン）、ＧＮＡ（グリセロール核酸）、Ｇ−ＰＮＡ（ガンマ−ＰＮＡ）又はＰＭＯ（モルホリノ）を含み得る。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態によれば、該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡモノマー（デオキシリボヌクレオチド）及びＬＮＡモノマーを含むキメラ一本鎖配列である。
【００６１】
転写レベルにおける遺伝子発現の調節を意味するアンチジーン戦略のために、好ましくは、以下の１つ：
・任意で、好ましくは３’末端及び／又は５’末端において、担体（一般的に１〜３０残基からなる）と結合したＰＮＡ型オリゴヌクレオチド；又は
・ＰＮＡ型オリゴヌクレオチドであって、前記ＰＮＡは標準的なグリシンのＨ原子以外の置換基を有する少なくとも１つのα炭素（Ｃ−α）の主鎖を含む、ＰＮＡ型オリゴヌクレオチド；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）及び任意で少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド（モノマー）（例えば２’−０−メチルＲＮＡモノマー、２’−フルオロＲＮＡモノマー）、又はＬＮＡ、メチルホスホネートＬＮＡ、ＢＮＡ、ＵＮＡ、ＧＮＡ、ＡＮＡ、ＦＡＮＡ、ＥＮＡ、ＤＮＧ及びＲＮＧの中から選択される核酸の少なくとも１つのモノマー、又はホスホジエステル結合のレベルにおいて修飾されたリボヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチド；又は
・相互に相補的な二本鎖ＲＮＡ型オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）及び少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含む部分的に相補的な二本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）及び少なくとも１つの２’−０−（２−メトキシエチル）ＲＮＡモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＤＮＡモノマー（典型的なデオキシリボヌクレオチド）及び少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含む一本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＤＮＡモノマー（典型的なデオキシリボヌクレオチド）並びに少なくとも１つの２’−フルオロＲＮＡモノマー、又はＬＮＡ、メチルホスホネートＬＮＡ、ＢＮＡ、ＵＮＡ、ＧＮＡ、ＥＮＡ、ＡＮＡ、ＦＡＮＡ、ＤＮＧ及びＲＮＧの中から選択される核酸の少なくとも１つのモノマーを含むオリゴヌクレオチド；
を用いることができる。
【００６２】
翻訳レベルにおける遺伝子発現の調節を意味するアンチセンス戦略のために、好ましくは、以下の１つ：
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）を含む相互に相補的な二本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）並びにリボースレベル及び／又はホスホジエステル結合のレベルにおいて修飾される少なくとも１つのＲＮＡモノマーを含む一本鎖オリゴヌクレオチド；又は
・ＤＮＡモノマー（典型的なデオキシヌクレオチド）及び少なくとも１つのホスホロチオエートＤＮＡモノマーを含む一本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）及び少なくとも１つの２’−０−（２−メトキシエチル）ＲＮＡモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）及び少なくとも１つの２’０−メチル化ＲＮＡモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）及び少なくとも１つの２’−フルオロＲＮＡモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）及び少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＲＮＡモノマー（典型的なリボヌクレオチド）及び少なくとも１つのアラビノシドＲＮＡモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・ＤＮＡモノマー（典型的なデオキシヌクレオチド）及び少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含む一本鎖キメラオリゴヌクレオチド；又は
・モルホリノモノマを含む一本鎖オリゴヌクレオチド；又は
・ＰＮＡ型オリゴヌクレオチドであって、前記ＰＮＡは標準的なグリシンのＨ原子以外の置換基を有する、少なくとも１つのα炭素（Ｃ−α）の主鎖を含み、好ましくは該置換基はアルギニン又はリジンの側鎖である、ＰＮＡ型オリゴヌクレオチド；又は
・ＤＮＡモノマー（典型的なデオキシヌクレオチド）並びにＰＮＡ、ＬＮＡ、ＬＮＡメチルホスホネート、ＢＮＡ、ＵＮＡ、ＧＮＡ、ＥＮＡ、ＤＮＧ及びＲＮＧの中から選択される核酸の少なくとも１つのモノマーを含むオリゴヌクレオチド；
を用いることができる。
【００６３】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、遺伝子及び／若しくはウイルス起源の疾患又は腫瘍の進行に関与する遺伝子に対する。前記遺伝子は、好ましくは、ＭＹＣファミリーの遺伝子（好ましくはＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＬ１）、サバイビン遺伝子（ＢＩＲＣ５）、ＢＣＬ２、ＰＬＫ４、ＡＬＫ、ＰＫＭ２、カスパーゼ−８及びＲＡＳＳＦ１からなる群から選択される。
【００６４】
特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＭＹＣファミリーの遺伝子、好ましくはＭＹＣＮに対する。
【００６５】
前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号２〜１５、６６〜８４、配列番号２４、２５、３１及び３２、並びに配列番号２６及び５７を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号２７及び５８を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号２８及び５９を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号２９及び６０を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号３０及び６１を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号３３及び６２を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号３４及び６３を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号３５及び６４を有する相補的オリゴヌクレオチド対、並びに配列番号３６及び６５を有する相補的オリゴヌクレオチド対からなる群から選択される。
【００６６】
他の実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡオリゴヌクレオチドであり、好ましくは前記ＰＮＡは、ＭＹＣＮに対する。
【００６７】
好ましい実施形態では、ＰＮＡは、配列番号２〜１５からなる群から選択される。
【００６８】
さらに好ましい実施形態では、ＰＮＡは、配列番号６６〜８４からなる群から選択される。
【００６９】
さらに好ましい実施形態では、ＰＮＡは、配列番号２〜１５、６６〜８４からなる群から選択される。
【００７０】
好ましくは、ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２〜１３、より好ましくは配列番号２〜８、さらにより好ましくは配列番号２〜６からなる群から選択される。本発明の目的に特に好ましいＰＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５である。
【００７１】
好ましくは、配列番号５は、５’又は３’末端において、配列番号４７と結合する。より好ましくは、配列番号４７は、Ｄ体のアミノ酸からなる。
【００７２】
配列番号２〜１５のＰＮＡは、好ましくはＭＹＣＮに対し、より好ましくは、これらは、アンチジーン戦略を用いてＭＹＣＮの発現を調節する。
【００７３】
配列番号６６〜６９のＰＮＡはまた、好ましくはＭＹＣＮに対し、より好ましくは、これらは、アンチジーン戦略を用いてＭＹＣＮの発現を調節する。
【００７４】
配列番号７０〜７４のＰＮＡは、好ましくはＭＹＣに対し、より好ましくは、これらは、アンチジーン戦略を用いてＭＹＣの発現を調節する。
【００７５】
配列番号７５、７６のＰＮＡは、好ましくはＢＩＲＣ５に対し、より好ましくは、これらは、アンチジーン戦略を用いてＢＩＲＣ５の発現を調節する。
【００７６】
配列番号７７〜７９のＰＮＡは、好ましくはＡＬＫに対し、より好ましくは、これらは、アンチジーン戦略を用いてＡＬＫの発現を調節する。
【００７７】
配列番号８０〜８２のＰＮＡは、好ましくはＢＣＬ２に対し、より好ましくは、これらは、アンチジーン戦略を用いてＢＣＬ２の発現を調節する。
【００７８】
配列番号８３、８４のＰＮＡは、好ましくはＰＬＫ４に対し、より好ましくは、これらは、アンチジーン戦略を用いてＰＬＫ４の発現を調節する。
【００７９】
更なる実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、好ましくはＲＮＡモノマーを含む。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ＭＹＣＮに対する。
【００８０】
あるいは、前記二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２６及び５７を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号２７及び５８を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号２８及び５９を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号２９及び６０を有する相補的オリゴヌクレオチド対、配列番号３０及び６１を有する相補的オリゴヌクレオチド対からなる群から選択される。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＭＹＣＮに対する。より好ましくは、これらは、アンチセンス戦略を介して、遺伝子の発現を調節する。
【００８１】
更なる実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＬＮＡキメラオリゴヌクレオチドであり、好ましくは前記オリゴヌクレオチドは、ＭＹＣＮに対する。
【００８２】
好ましい実施形態によれば、前記ＤＮＡ−ＬＮＡキメラオリゴヌクレオチドは、配列番号２４及び２５からなる群から選択される。
【００８３】
配列番号２４及び２５は、好ましくはＭＹＣＮ遺伝子に対する。
【００８４】
配列番号２４及び２５は、好ましくはアンチジーン戦略を介して遺伝子の発現を調節する。
【００８５】
更なる実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡモノマー及び／又は少なくとも１つのホスホロチオエートＤＮＡモノマーを含む一本鎖キメラオリゴヌクレオチドである。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくはＭＹＣＮに対する。
【００８６】
配列番号３１及び３２からなる群から選択されるメラオリゴヌクレオチドは、特に、本発明の目的に好ましい。配列番号３１及び３２は、好ましくは、ＭＹＣＮ遺伝子に対する。配列番号３１及び３２は、好ましくは、アンチセンス戦略を介してＭＹＣＮの発現を調節する。
【００８７】
更なる実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡモノマー及び少なくとも１つのモノマー、好ましく２’−０−（２−メトキシエチル）又は２’−メチルＲＮＡを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチドである。
【００８８】
前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＭＹＣＮに対する。配列番号３３及び６２を有する相補的キメラオリゴヌクレオチド対は、本発明の目的に特に好ましい。前記オリゴヌクレオチド対は、好ましくは、アンチセンス機構を介する遺伝子の発現を調節する。
【００８９】
更なる実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡモノマー及び好ましくは２’−フルオロＲＮＡの少なくとも１つのモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチドである。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ＭＹＣＮに対する。
【００９０】
配列番号３４及び６３を有する相補的キメラオリゴヌクレオチド対は、本発明のために特に好ましい。前記オリゴヌクレオチド対は、好ましくは、アンチセンス機構を介して遺伝子の発現を調節する。
【００９１】
更なる実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡモノマー及び少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチドである。
【００９２】
前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＭＹＣＮに対する。配列番号３５及び６４を有する相補的キメラオリゴヌクレオチド対は、本発明のために特に好ましい。前記オリゴヌクレオチド対は、好ましくは、アンチセンス機構を介して遺伝子の発現を調節する。
【００９３】
更なる実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡモノマー及び少なくとも１つのアラビノシドＲＮＡモノマーを含む二本鎖キメラオリゴヌクレオチドである。
【００９４】
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ＭＹＣＮに対する。配列番号３６及び６５を有する相補的キメラオリゴヌクレオチド対は、本発明のために特に好ましい。前記オリゴヌクレオチド対は、好ましくは、アンチセンス機構を介して遺伝子の発現を調節する。
【００９５】
本発明の更なる態様は、治療及び／又は診断目的のための上述のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００９６】
特に、該オリゴヌクレオチドは、遺伝子及び／又はウイルス起源の疾患の治療のために、特に、遺伝子の過剰発現又は阻害のいずれかにより引き起される遺伝子疾患、即ち、過剰発現又は阻害される遺伝子の発現の調節を要求する遺伝子疾患の治療のために、独立して、あるいは組み合わせて用いることができる。
【００９７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくはゴリーン症候群、ダウン症候群、ファインゴールド症候群、ヒルシュスプルング病、フォンヒッペル・リンダウ症候群、血管拡張性失調症、リー・フラウメニ症候群、ターコット症候群、家族性腫瘍及びパーキンソン病からなる群から選択される遺伝子疾患の治療的処置のために用いられる。
【００９８】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、子供又は大人において腫瘍性病理の治療的処置に用いられる。特に、参照される腫瘍は、好ましくは、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＬ１、サバイビン（ＢＩＲＣ５）、ＢＣＬ２、ＰＬＫ４、ＡＬＫ及びＰＫＭ２からなる群から選択される遺伝子又は癌遺伝子の過剰発現により引き起こされる。あるいは、腫瘍は、好ましくは、好ましくはカスパーゼ−８及びＲＡＳＳＦ１からなる群から選択される、癌抑制遺伝子又は抗腫瘍遺伝子の阻害（不活性化）により引き起される。
【００９９】
参照される腫瘍は、好ましくは、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、髄芽細胞腫、上衣腫、褐色細胞腫、胚性癌、胚細胞腫瘍、肺胞横紋筋肉腫、胚性横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、腎臓の明細胞肉腫、滑膜肉腫、肝芽細胞腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性巨核芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞白血病、リンパ腫、小細胞肺癌（小細胞癌（microcytoma））、肺腺癌、扁平細胞肺癌、定型及び非定型原発性肺癌、大細胞肺癌、大細胞神経内分泌性肺癌、神経膠芽細胞腫、肝細胞癌、基底細胞癌、卵巣腫瘍、乳房腫瘍及び結腸癌からなる群から選択される。
【０１００】
神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫、小細胞肺癌及び基底細胞癌からなる群から選択される腫瘍は、本発明の目的に特に好ましい。
【０１０１】
本発明の主題は、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含む組成物にさらに関する。好ましくは、前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ΡΝＡであり、好ましくは配列番号２〜１５、６６〜８４、好ましくは配列番号２〜１３、より好ましくは配列番号２〜８、さらにより好ましくは配列番号２〜６からなる群から選択される。特に好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号５である。好ましくは、配列番号５は、５’又は３’末端において、配列番号４７と結合する。より好ましくは、配列番号４７は、Ｄ体のアミノ酸からなる。
【０１０２】
前記ＰＮＡは、好ましくは、配列番号４７〜５６からなる群から選択される担体と、好ましくは５’又は３’末端において結合する。
【０１０３】
本発明の主題は、配列番号１を有するオリゴヌクレオチドを含む本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、少なくとも１つの化合物、好ましくは少なくとも１つの薬理効果を有する化合物、より好ましくは化学療法薬、及び任意で少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含む組み合わせにさらに関する。
【０１０４】
好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの化合物は、少なくとも１つの更なるアンチジーン及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は少なくとも１つの薬剤、又は生物学的若しくは生物工学的起源若しくは化学合成に由来する少なくとも１つの化合物、又はこれらの組み合わせである。生物学的若しくは生物工学的起源若しくは化学合成に由来する前記化合物は、好ましくは、モノクローナル抗体、化学療法薬、免疫調製剤、増殖因子、サイトカイン、ペプチド、血管新生阻害剤、腫瘍成長阻害剤、ステロイドホルモン及び／又は非ステロイドホルモン及びビタミンからなる群から選択される。
【０１０５】
本発明のために特に好ましい化合物の例は、神経成長因子（ＮＧＦ）、ソマトスタチン、レチノイン酸、アクチノマイシンＤ、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シスプラチン、シタラビン、クロラムブシル（clorambucil）、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、塩酸ドキソルビシン、塩酸エピルビシン、エトポシド、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、塩酸イダルビシン、ヒドロキシ尿素、イソホスファミド（ifophosphamide）、塩酸イリノテカン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ヌトリン（nutline）、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール‐ウラシル、テモゾロミド、チオグアニン、チオテパ（thiotepe）、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１０６】
より好ましくは、前記化合物は、カルボプラチン、シスプラチン、エトポシド、ビンクリスチン、シクロホスファミド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１０７】
出願人は、少なくとも１つの化合物、好ましくは少なくとも１つの上述の化学療法薬と組み合わせた、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの投与は、投与される前記化合物の濃度を減少させることを可能にする一方で、同時に治療的有効性の増加及び低い毒性を保証することを発見した。
【０１０８】
出願人は、これらの条件下で、前記化合物の濃度の減少は、特に病理に依存し；特に化学療法化合物の濃度は、腫瘍の種類に依存することを発見した。腫瘍、例えば：神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、髄芽細胞腫、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、肺胞横紋筋肉腫及び胚性横紋筋肉腫によっては、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与される少なくとも１つの化学療法薬の濃度は、最大１０倍まで減少させることができる一方で、化学療法薬の通常の用量と同様の治療的効果を保証する。
【０１０９】
本発明の少なくとも１つのＰＮＡ、好ましくは配列番号１〜１５、６６〜８４、好ましくは配列番号１〜１３、より好ましくは配列番号１〜８、より好ましくは配列番号１〜６、さらにより好ましくは配列番号１及び／又は５からなる群から選択される少なくとも１つのＰＮＡ、並びに好ましくは化学療法薬、より好ましくは、エトポシド（ＶＰ１６）、カルボプラチン、シスプラチン又はビンクリスチン、シクロホスファミド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の組み合わせは医薬的組み合わせとして、（改善された治療効果の点から）特に有効的である。
【０１１０】
配列番号１及びカルボプラチン若しくはエトポシド若しくはシスプラチン若しくはビンクリスチン；又は配列番号５及びカルボプラチン若しくはエトポシド若しくはシスプラチン若しくはビンクリスチンの中から選択される組み合わせは、本発明のために特に好ましい。
【０１１１】
前記ＰＮＡは、その３’及び／又は５’末端において、好ましくは配列番号４７〜５６からなる群から選択される担体と結合する。
【０１１２】
改善された効果は、好ましくは、組み合わせが同時に投与された場合、そして前記少なくとも１つの化合物が連続した時間おいて、好ましくは時間をおいて、より好ましくは、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、又は７２時間の一定間隔で投与される場合の双方において、見出される。
【０１１３】
他の好ましい実施形態では、配列番号１を有するオリゴヌクレオチドを含む本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１つの媒体粒子、少なくとも１つの媒体ポリマー又は少なくとも１つの自己組織化媒体オリゴヌクレオチド（アプタマーとしても知られる）と、結合又は複合体化させて投与され得る。
【０１１４】
さらに好ましい実施形態では、配列番号１を有するオリゴヌクレオチドを含む本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、例えば標的組織の好ましい透過のために、少なくとも１つのリポソームミセル、少なくとも１つのマイクロ粒子又は少なくとも１つのナノ粒子と、結合又は複合体化され、そして投与され得る。
【０１１５】
前記粒子は、通常球状であり、そして特定の送達の手段として用いられる前記粒子は、多くの異なる化合物で製剤化され得る。例えば、前記粒子は、ポリマー化合物、例えばキトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体ポリ（ＰＬＧＡ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）、多価不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、陽イオン性脂質、ＨＡＰ−ＰＬＡ、ＨＡＰ−ＰＬＡ／ＰＧＡ及びこれらの誘導体を製剤化又は共製剤化され得る。さらに好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、前述の種類の少なくとも１つの粒子、及び化学又は生物学的起源のいずれかの標的細胞（例えば、ＧＤ２、葉酸、ＴＲＡＩＬ、ＮＧＦ）の特定の受容体に対する少なくとも１つのリガンド又は少なくとも１つのリガンドの部分と結合又は複合体化させて投与され得、標的細胞における本発明の前記オリゴヌクレオチドの内在化を好むのに有用であるアジュバンドとしてポリマー膜に存在し得る。
【０１１６】
さらに好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標的細胞の受容体に特異的なリガンド又はリガンドの部分（例えば、ＧＤ２（ガングリオシドＧＤ２）、葉酸、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）、ＮＧＦ（神経成長因子）と結合し得る。
【０１１７】
さらに好ましい実施形態では、配列番号１を有するオリゴヌクレオチドを含む本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、好ましくは標的細胞及び／又は組織の透過を容易にすることにより、これらの有効性を増大させるために、少なくとも１つの更なる医薬用途に関連して、それ自体又は組み合わせて投与され得る。
【０１１８】
前記医療用途は、好ましくは、酸素療法、磁気療法、温熱療法、電気刺激、超音波、放射線療法、化学療法及び光線療法からなる群から選択される。
【実施例】
【０１１９】
実施例１
オリゴヌクレオチドの化学合成
オリゴヌクレオチドの化学合成は、保護基である５’−ＯＨ上の４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、及び３’−リン酸基上のβ−シアノエチルで修飾されたＤＮＡヌクレオシドホスホロアミダイトの使用に基づき；保護基はまた、さもなければ反応性が高すぎる第一級アミン（核塩基複素環）のために用いられる。
【０１２０】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドの化学合成は、３’−５’方向で行なわれる。第１のヌクレオチド塩基で機能化されたＣＰＧ（制御孔ガラス（controlled pore glass）の頭文字）樹脂又はポリスチレン支持体が使用される。合成は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中３％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の溶液を用いて、５’−ジメトキシトリチル基を脱保護する工程で開始される。エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）又はベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）０．３Ｍを用いた、配列に挿入される第二の塩基に対応するホスホロアミダイトの活性化が続き、これは先に脱保護された５’０Ηと結合し、これによりホスホジエステル結合を形成する。
【０１２１】
次の工程は、反応していない５’０Η基のアセチル化を果たす「キャッピング」である。キャッピングは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／ルチジン／無水酢酸（８：１：１）を含むものとＴＨＦ中メチルイミダゾールの１０％溶液を含むもの２つの溶液を用いて行なわれる。亜リン酸トリエステルの不安定な三価の結合は、これを５価のホスホジエステルに酸化するＴＨＦ／ピリジン溶液中ヨウ素により安定化される。
【０１２２】
酸化後、導入等される第二の単位の脱トリチルで開始するサイクルは繰り返される。このサイクルは、配列に挿入されることが必要な塩基の数に応じて、必要な回数繰り返される。最終的に、最後の５’−ＤＭＴｒ基は室温において酸での処理により除去される。
【０１２３】
塩基上に存在する保護基に応じて（同様に選択された塩基、ＰＴＯ、２’ＯＭｅ等の化学的特性に応じて）、シアノエチル基のβ−脱離によるりんの脱保護及び核塩基複素環上の保護基の除去のために、５５℃で１６時間水酸化ナトリウムと、あるいは５５℃で３５分間水酸化アンモニウム／メチルアミン（ＡＭＡ）溶液と放置し得る。
【０１２４】
あるいは、５’−ＤＭＴｒ基は、最終生成物を副産物からより精製し、そして最終的に酢酸での処理により除去するために、分析（ＨＰＬＣ、ＭＳ）及び分取クロマトグラフィーの期間を通して維持され得る。
【０１２５】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの化学合成は、リボース上に存在する２’ＯＨ基、及びこれによる各ホスホロアミダイトについてのさらなる保護基の存在により、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの化学的合成と異なる。
【０１２６】
結果として、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、長いカップリング時間、及びその基を脱保護する更なる工程を要求する。
【０１２７】
上述のように同様のプロトコールは、化学的に修飾されたモノマーを含むオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエート（ＰＴＯ）、２’０−メチル（２’ＯＭｅ）、２’フルオロ（２’−Ｆ）、アラビノシド核酸（ＡＮＡ）、及びロックド核酸（ＬＮＡ）の合成についても用いられる。
【０１２８】
各修飾された塩基についての特定の技術の詳細は、企業により提供され、該モノマー分子は、（Link Technologies Ltd.）から購入される。
【０１２９】
モルホリノは、製造者（Gene Tools, LLC）から購入される。
【０１３０】
ＰＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、１０μｍｏｌスケールで行なわれ、精製及び特性決定工程を含んだ。
【０１３１】
分子の合成を、Rink Amide-Chemmatrix（登録商標）樹脂及びSyro自動合成装置（MultiSynTech）を用いて、固相で行なった。合成の第一のモノマーは、手動で樹脂と結合される。自動合成サイクルは、３つの工程に分けられる。第１の工程は、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中２０％ピペリジンの溶液を用いて行なわれる脱保護である。
【０１３２】
第二の工程は、モノマーの導入と鎖伸長の間のカップリング反応である。この反応は、２，６−ルチジンの８％溶液及びＤＭＦ中ＤＩＰＥＡ（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）を含むアルカリ環境中で、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）中５  ０．２２Ｍ等量（ｅｑ）のモノマー（ＦＭＯＣ−ＰＮＡ−Ｇ（Ｂｈｏｃ）−０Ｈ、ＦＭＯＣ−ＰＮＡ−（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−ＰＮＡ−Ｃ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−ＰＮＡ−Ｔ−ＯＨ）、及び４．５  ０．３２Ｍ  ｅｑのＤＭＦ中活性化剤（この場合ＨＡＴＵ）を添加することにより行なわれる。カップリング反応は、ペプチド鎖からＰＮＡの１つまでの経路において、予めロードされた樹脂上で、及び最後のモノマー上で、１番目のモノマーと２番目のモノマーとの結合の点において、二重に繰り返される。
【０１３３】
第３の工程は、カップリング工程の間、反応しない部位をアセチル化により妨害するのに役立つ「キャッピング」反応である。該反応は、ＤＭＦ中６％ ２，６−ルチジン及び５％ 無水酢酸を含む溶液を用いることにより、達成される。合成が完了すると、該分子は、固体支持体から除去される。
【０１３４】
この反応は、４：１の比におけるＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）とメタクレゾールの溶液で得られる。
【０１３５】
このようにして得られる分子は、ジエチルエーテル中での沈殿により回収される。
【０１３６】
一度水中で回収され、それはＨＰＬＣで精製される。精製のために用いられるカラムは、Ｃ１８  ３００Ａ  ５ｕ  Ｊｕｐｉｔｅｒ（（著作権）Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｉｎｃ．）である。精製は、３０分、１００％Ａ（水９５％；アセトニトリル５％；０．１％ＴＦＡ）−０％Ｂ（水６０％；アセトニトリル４０％；０．１％ＴＦＡ）から６０％Ａ−４０％Ｂまでの線形勾配を用いておこなった。用いられる完全な勾配は、０〜５分  ０％Ｂ；５〜３５分  ４０％Ｂ；３５〜３７  １００％Ｂ；３７〜４２  １００％Ｂ；４２〜４４  ０％Ｂである。
【０１３７】
最終的に、精製産物は、ＥＳＩ質量分析計（（著作権）Waters）により分析される。
【０１３８】
遺伝子転写を妨害するためのアンチジーンオリゴヌクレオチド
本発明に記載されるパラメータに従って選択及び設計された本発明のオリゴヌクレオチドが、遺伝子の転写を選択的に妨害するために機能することを実証するために、ＭＹＣＮ遺伝子に対するＰＮＡ型オリゴヌクレオチドを設計及び合成した；これらを表１に示す。
【０１３９】
【表１−１】
2018078893.tif 000002
【表１−２】
2018078893.tif 000003
【０１４０】
ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、個別に、そして細胞膜透過を好適にする目的のために、３’及び／又は５’末端において担体と結合させて試験される。特に、オリゴヌクレオチドは、３’のカルボキシル末端において、配列番号４３のアミノ酸、即ち、プロリン−リジン−リジン−リジン−アルギニン−リジン−バリンと結合した。
【０１４１】
配列番号１を有するオリゴヌクレオチドは、欧州特許第１６１８１９５号の主題であった配列であり、対照配列、及び比較のために用いられる配列を表す。
【０１４２】
配列番号２〜１５を有するオリゴヌクレオチドは、２つの連続するグアニンの１つの群（配列番号１４、１５）、又は３つの連続するグアニンの１つの群（配列番号１３）、又は２つの連続するグアニンの２つの群（配列番号１２）、又は２グアニンの１つの群及び３つの連続するグアニンの１つの群（配列番号１１、１０、９、８及び７）、又は２つの連続するグアニンの２つの群及び３つの連続するグアニンの１つの群（配列番号６及び４）、又は２つの連続するグアニンの１つの群及び３つの連続するグアニンの２つの群（配列番号５）、又は６つの連続するグアニンの１つの群（配列番号３）、又は６つの連続するグアニンの１つの群、３つの連続するグアニンの１つの群及び２つの連続するグアニンの１つの群（配列番号２）を含む。
【０１４３】
連続するグアニンの群を、表１に下線で示す。
【０１４４】
配列番号１６〜２３を有するオリゴヌクレオチドは、連続するグアニンの群を有さない陰性対照である。
【０１４５】
さらに、遺伝子の転写を選択的に調節するために、配列番号２４〜２５を有するオリゴヌクレオチドを設計及び合成した；これらを表２に示す。
【０１４６】
【表２】
2018078893.tif 000004
【０１４７】
特に、ＤＮＡモノマー及びＬＮＡモノマー（配列番号２４及び２５）を含む一本鎖キメラオリゴヌクレオチドは、設計及び合成された。
【０１４８】
オリゴヌクレオチド配列中のＤＮＡ塩基は、太字で塩基として示される一方で、ＬＮＡモノマーは下線が引かれる。文献（Koch T, Biochem J 2001, 354 (Pt 3):481-4; Koji Nagahama, Bioorg Med Chem Lett, 2.009, 19 (10) : 2707-9）に報告されるように、内因性ヌクレアーゼにより迅速に分解されることを避けるために、各キメラオリゴヌクレオチド分子は、１、２又は３ＤＮＡ塩基の間隔を空けられたＬＮＡモノマーを挿入することにより設計及び合成された。
【０１４９】
遺伝子翻訳を妨害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明に記載されるパラメータに従って選択及び設計された本発明のオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子の翻訳を選択的に妨害するために機能することを実証するために、ＭＹＣＮ遺伝子に対する配列番号２６〜３６を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、合成し、そして実験的にインビトロで分析した。これらを表３に示す。
【０１５０】
【表３】
2018078893.tif 000005
【０１５１】
ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（配列番号２６〜３０）に基づく相補的二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子であるＭＹＣＮの翻訳を選択的に調節するために生産された。
【０１５２】
さらに、ホスホジエステル結合がホスホロチオエートに改変されたＤＮＡ型オリゴヌクレオチドである配列番号３１及び３２が生産された。
【０１５３】
二本鎖キメラオリゴヌクレオチド：ＲＮＡモノマー及びモノマー２’０−メチル（配列番号３３）に基づくもの；ＲＮＡモノマー及び２’−フルオロモノマー（配列番号３４）に基づくもの；ＲＮＡモノマー及びＬＮＡモノマー（配列番号３５）に基づくもの並びにＲＮＡモノマー及びアラビノシドＲＮＡモノマー（配列番号３６）に基づくものも生産された。配列番号３３〜３６のオリゴヌクレオチド配列では、２’０−メチル、２’−フルオロ、ＬＮＡ及びアラビノシド（ＡＮＡ）モノマーが太字で表される一方で、少なくとも２つの連続するグアニンの各群は、下線が引かれる。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡは二本鎖であるので、キメラは、３’及び５’の双方において相補鎖と対にならない２つの２’０−Ｍｅモノマー、又は２つの２’−フルオロモノマー、又は２つのＬＮＡモノマー、又は２つのＲＮＡアラビノシドモノマーを残すような態様において設計及び合成され、これにより細胞酵素により迅速に分解されるのを回避した。
【０１５５】
オリゴヌクレオチドを用いた処理−ＱＴ−ＰＣＲ
本発明のオリゴヌクレオチドの標的遺伝子の発現を調節する能力を評価するために、メッセンジャーＲＮＡの量を減少させるこれらの能力を、リアルタイムＰＣＲ技術を用いて分析した。
【０１５６】
この目的のために、２４ウェルプレートが用いられ、ウェルあたり、０．３ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GIBCO BRL）培地、４％ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンとともに５．０ｘ１０4細胞を播種した（三重に実験を行なった）。
【０１５７】
細胞を、５％Ｃ０2を含む雰囲気下で、３７℃で２４時間インキュベートし、ウェルの塩基を付着させた。
【０１５８】
ＰＮＡオリゴヌクレオチドを除いて、分析される各オリゴヌクレオチドを予め、２μｌのリポフェクトアミン２０００（Invitrogen）、０．３ｍＬの無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GIBCO BRL）培地とインキュベートした。
【０１５９】
各ウェルについて、以下の最終濃度において、オリゴヌクレオチドを分析した。
・アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡギャップマー（即ち、３’又は５’末端において化学的に修飾された核酸の１又は複数のモノマーを含むオリゴヌクレオチドである一方で、中央の部分において、これらが、修飾されていない、又はホスホロチオエート結合としてホスホジエステル結合のレベルにおいて修飾される核酸のモノマーを有する）を２００ｎＭにおいて用い；
・ホスホロチオエートＤＮＡモノマー、ＲＮＡアンチジーンオリゴヌクレオチド（ａｇＲＮＡ）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにＤＮＡモノマー及びＬＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドを１０μΜにおいて用い；
・モルホリノオリゴヌクレオチドを１μΜの濃度において投与し；そして
・ＰＮＡオリゴヌクレオチドを１μΜの濃度において投与した。
【０１６０】
細胞をオリゴヌクレオチドで処理し、その投与の６時間後、最大４％のＦＢＳを添加した。２４時間後、合計のＲＮＡを各ウェルから抽出し、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
【０１６１】
アッセイをＭＹＣＮ発現と相関する５つの異なるヒト腫瘍から得られた８細胞株に関して行なった。即ち、
・神経芽細胞モデルとして、細胞株Ｋｅｌｌｙ、ＩＭＲ−３２（ＭＹＣＮ遺伝子を増幅及び過剰発現する）並びにＳＫＮＢＥ２ｃ及びＬＡＮｌ（ＭＹＣＮ遺伝子を増幅及び過剰発現し、そしてｐ５３遺伝子は突然変異誘導される）を使用し；
・横紋筋肉腫（rabdomiosarcoma）モデルとして、ＭＹＣＮ遺伝子を増幅及び過剰発現する細胞株ＲＨ３０を使用し；
・ウィルムス腫瘍（rabdomiosarcoma）モデルとして、ＭＹＣＮ遺伝子を増幅及び過剰発現する細胞株ＷｉＴ４９を使用し；
・網膜芽細胞腫（rabdomiosarcoma）モデルとして、ＭＹＣＮ遺伝子を増幅及び過剰発現する細胞株Ｙ７９を使用し；
・小細胞肺癌のモデルとして、ＭＹＣＮ遺伝子を増幅及び過剰発現する細胞株Ｈ６９を使用した。
【０１６２】
対照として、オリゴヌクレオチドの代わりに滅菌水で処理した上述の同じ細胞株を使用した。各ＲＮＡサンプルをNanoDrop ND-1000分光光度計（NanoDrop Technologies）を用いて（二重に）定量した。ｃＤＮＡの第一の鎖をcDNA Synthesis Kit for RT-PCR（Roche）を用いて生産した。ｃＤＮＡ反応については、合計１μｇのＲＮＡを用いた。リアルタイムＰＣＲについては、２０μｌの最終容量中１０ｎｇのｃＤＮＡをSYBR Green Master Mix 2X（Applied Biosystems）とともに用いた（３つの同一の実験を三重に行なった）。リアルタイムＰＣＲを実行するために用いられるプライマーの配列及び濃度を表４に示す。２つのハウスキーピング遺伝子；ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチン（ＡＣＴＢ）を陽性対照として用いた。
【０１６３】
ＱＴ−ＰＣＲ反応の条件は、９５℃１０分、９５℃２０秒、そして６０℃３０秒の５０サイクルであった。
【０１６４】
【表４】
2018078893.tif 000006
【０１６５】
オリゴヌクレオチドによる処理−細胞増殖アッセイ
本発明のオリゴヌクレオチドの遺伝子調節能力を評価するために、細胞生存率に関するこれらの投与の効果を測定した。
【０１６６】
この目的のために、ウェル当たり、４％ＦＢＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GIBCO BRL）培地とともに５ｘｌ０3細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した（実験は三重に行なわれた）。
【０１６７】
用量効果関係を観察するために、ＰＮＡオリゴヌクレオチドを様々な濃度（１μΜ−２．５μΜ−５μΜ−１０μΜ）において投与した。
【０１６８】
全て及び他のオリゴヌクレオチドに関して、これらが投与される濃度は、オリゴヌクレオチドでの処理−ＱＴ−ＰＣＲの段落に記載する。
【０１６９】
処理される細胞の生存率を、処理の４８、７２、９６及び１６８時間後に測定した。
【０１７０】
細胞生存率を、ATP-Lite assay（Luminescence ATP Detection Assay System、PerkinElmer）により評価し、未処理の対照細胞のウェルの平均値と比較した、処理されたウェルの平均シグナルとの割合として報告する。細胞を、キットにより提供される使用説明書に従って処理した。
【０１７１】
ＭＹＣＮ遺伝子メッセンジャーのレベルを決定するのに用いられる、オリゴヌクレオチドでの処理−ＱＴ−ＰＣＲの段落に記載されるのと同様の細胞株に関して、アッセイを行った。
【０１７２】
結果
ＰＮＡオリゴヌクレオチドに関する限り、ＭＹＣＮ遺伝子の転写を阻害するこれらの能力及びＫｅｌｌｙ細胞の増殖に関する結果を表１に示す。表６は、分析されるＰＮＡの様々な濃度において増殖するＫｅｌｌｙ細胞の値（パーセンテージの形態）を示す。
【０１７３】
【表５】
2018078893.tif 000007
【０１７４】
結果は、標的遺伝子の翻訳されたタンパク質に関するこれらのＰＮＡの阻害効果が、大変選択的、且つ特異的であることを実証する。さらに、アンチジーンＰＮＡの投与後、モデルとして用いられる腫瘍細胞の増殖の停止（ＭＹＣＮ遺伝子の増幅により特徴付けられる）に続いて、直接的にアポトーシスが起こることが観察された。
【０１７５】
一般的に、配列番号２〜配列番号１３（１つ又は複数のＧの群を含む）を有するＰＮＡアンチジーンオリゴヌクレオチドは、Ｇの群を欠くＰＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１６〜配列番号２３）と比較して、優れたアンチジーン効果（即ち、ＭＹＣＮｍＲＮＡ及びＭＹＣＮ発現に伴う腫瘍細胞の増殖の阻害）を有する。
【０１７６】
特に、表１及び表５に示される結果は、配列番号２〜配列番号１３の配列が、欧州特許第１６１８１９５号の主題である配列番号１の配列よりも優れたアンチジーン効果を有することを実証する。
【０１７７】
配列番号７〜配列番号１２（２又は３つの連続するＧの２つの群を含む）の配列は、配列番号１の配列、及び配列番号１３〜配列番号１５の配列（２又は３の連続するＧの１つの群のみを含む）よりも優れたアンチジーン効果を有することを示す。
【０１７８】
配列番号４〜配列番号６（２又は３つの連続するＧの３つの群を含む）の配列は、配列番号７〜配列番号１２の配列（２又は３つの連続するＧの２つの群を含む）よりも優れたアンチジーン効果を有することを示す。
【０１７９】
６つの連続するＧの１つの群を含む配列番号３は、配列番号１の配列、及びＧの１、２又は３つの群を含む配列番号４〜配列番号１２の配列（各群は、最大２又は３つの連続するＧからなる）よりも優れたアンチジーン効果を有することを示す。
【０１８０】
２又は３つの連続するＧの２つの群に加えて、連続するＧの３つの群を含み、６つの連続するＧの１つの群もまた含む配列番号２は、６つのＧの１つの群のみを含む配列番号３、及び配列番号１の配列、及びＧの１又は２又は３の群を含む配列番号４〜配列番号１２の配列（各群は、最大２又は３つの連続するＧからなる）の両者よりも優れたアンチジーン効果を有することを示す。
【０１８１】
さらに、配列番号１〜２３を有するオリゴヌクレオチドを、一連の線維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３及びＰｈｏｅｎｉｘ）に投与し、結果を表１に示す（最後の２列）。
【０１８２】
結果は、分析されたオリゴヌクレオチドが、これらの細胞（即ち、標的遺伝子、この場合ＭＹＣＮを発現しない細胞）に関して特別に有効的でなく、毒性を有しないことを明確に実証する。
【０１８３】
実際、非腫瘍性の線維芽細胞のこれらの２つの株における細胞増殖において変化は観察されず、そしてこの結果は、ＰＮＡオリゴヌクレオチドが、ＭＹＣＮの発現を阻害する特異的な効果をもって作用する一方で、これらは、ＭＹＣＮを発現しない細胞において、非特異的な毒性効果を有さないことを意味する。
【０１８４】
それ故、本発明に記載されるパラメータに基づいて設計されたＰＮＡオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子に関して、そしてこの遺伝子を発現／過剰発現する細胞に関して、特異的且つ有効的に作用することが推定され得る。
【０１８５】
配列番号１〜１２を有するＰＮＡはまた、ＭＹＣＮを過剰発現する様々な細胞株（Ｋｅｌｌｙ、ＳＫＮＢＥ２ｃ、ＲＨ３０、ＷｉＴ４９、ＷＥＲＩ−Ｒｂｌ  １及びＨ６９）に関しても試験された。結果を表６に示し、ＭＹＣＮ遺伝子のタンパク質翻訳の生産物に関してＰＮＡの阻害効果の選択性及び特異性を確認する。
【０１８６】
【表６】
2018078893.tif 000008
【０１８７】
配列番号５を有するアンチジーンＰＮＡオリゴヌクレオチドは、より詳細な態様において分析された。
【０１８８】
特に、グアニンの連続を中断するために、配列中に存在する連続するグアニンの群が修飾された、修飾されたオリゴヌクレオチド（連続するグアニンの群は下線を引かれる一方で、修飾されたグアニンの群は、太字で記載される）を合成し、そしてＫｅｌｌｙ細胞（ＭＹＣＮを発現する）に関してインビトロで分析した。
【０１８９】
結果（表７に要約される）は、グアニンの連続が、遺伝子の発現を調節する活性のために非常に重要であるという事実を明確に実証する。実際、配列番号５を有するＰＮＡの連続するグアニンの全ての群に突然変異が誘発された配列番号４３を有するＰＮＡはＰＮＡの阻害活性の喪失を引き起す一方で、連続するグアニンの３つの群のうち１つ又は２つの変異は、著しく損なわせるが、分子の阻害活性を完全に抑制しない。
【０１９０】
【表７】
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【０１９１】
ＤＮＡモノマー及びＬＮＡモノマーを含み、そしてこれらの標的としてＭＹＣＮ遺伝子を有するキメラオリゴヌクレオチドを横紋筋肉腫細胞（alveolar rabdomyosarcoma）（ＲＨ３０）に関してインビトロで試験した。結果を表８に要約し、これらのオリゴヌクレオチドが、強く、特異的なアンチジーン活性を有することを実証する。
【０１９２】
【表８】
2018078893.tif 000010
【０１９３】
本発明に記載されるパラメータに従って、出願人により設計及び合成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、横紋筋肉腫細胞（alveolar rabdomyosarcoma）（ＲＨ３０）に関してインビトロで分析した。結果を表９に要約し、オリゴヌクレオチドが、特定の且つ有効的な態様において、ＭＹＣＮ転写を阻害することができることを示し；さらに、これらは、また、ＭＹＣＮ遺伝子について現在入手可能である標準的なアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも、より有効的な態様において、腫瘍細胞増殖を選択的に阻害することができる（Chung DH, Bioch Bioph Res Commun, 2006, 351 (1): 192-7）。特に、表１１に記載され、出願人により同定され、且つＭＹＣＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、最低７０％〜最大８５％の範囲でＭＹＣＮｍＲＮＡを阻害するアンチセンス活性を発揮する。
【０１９４】
【表９】
2018078893.tif 000011
【０１９５】
本発明のオリゴヌクレオチドが、癌に対する治療プロトコールにおいて現在用いられる化学療法薬の濃度を低下させることができるか否かを確かめるために、それらを化学療法薬と同時に投与した。
【０１９６】
研究は、様々なヒト及びマウス神経線維芽腫瘍細胞株（ＳＭＳ−ＫＡＮ、ＬＡＮ  １、ＩＭＲ−３２、ＳＭＳ−ＫＣＮ、Ｋｅｌｌｙ、ＮＨ０２Ａ、ＳＫＮＢＥ２ｃ）に関してＰＮＡと化学療法薬（カルボプラチン、エトポシド（ＶＰ１６）、シスプラチン及びビンクリスチン）間の関連する効果に関して行なわれた。
【０１９７】
実行される治療において用いられる治療スケジュールは、ＰＮＡで処理される細胞に提供され、そして、その後予め見積もられた時間（６又は１２時間であり得る）において、化学療法薬が投与された。
【０１９８】
結果は、これらの化合物と本発明のオリゴヌクレオチドとの関連は、特定の濃度範囲において、同様の化合物を用いた個別の処理よりも優れた治療効果を示したことを実証する。
【０１９９】
特に、本発明のオリゴヌクレオチド及び薬理効果を有する他の化合物からなる組み合わせでの、同時（concomitant）及び同時（simultaneous）又は異なる時間間隔（３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間等）における処置が、所望の治療効果を増強するのに役立つことが観察され得る。
【０２００】
それ故、出願人により同定される１又は複数のオリゴヌクレオチドと化学療法薬との組み合わせは、同様の効果を与える一方で、現在の標準的な治療濃度と比較して、１０倍も化学療法薬の濃度を減少させることが可能となる。
【０２０１】
特に、この研究の結果は、配列番号１が、オリゴヌクレオチド又はそれ自身に関する前述の化学療法薬による処置において得られる効果と比べて、ビンクリスチン、又はエトポシド、又はカルボプラチン、又はシスプラチンとの組み合わせで投与される場合、細胞増殖の阻害の観点から、相乗効果を有することを実証する。
【０２０２】
実施例２
本発明をサポートするために、表１０に要約されるオリゴヌクレオチドも合成した。特に、表１０は、オリゴヌクレオチド配列、配列番号、（Ｇ＋Ｃ）含量のパーセンテージ値及び遺伝子を示し、合成されたオリゴヌクレオチドに対する。オリゴヌクレオチドの合成は、実施例１のように達成された。
【０２０３】
【表１０】
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【０２０４】
特に、ＭＹＣＮに対して配列番号６６〜６９、ＭＹＣに対して配列番号７０〜７４、ＢＩＲＣ５に対して配列番号７５、７６、ＡＬＫに対して配列番号７７〜７９、ＢＣＬ２に対して配列番号８０〜８２、及びＰＬＫ４に対して配列番号８３、８４が合成された。
【０２０５】
オリゴヌクレオチドを、目的の遺伝子が過剰発現する細胞モデルにおける遺伝子メッセンジャーのレベルを測定することにより、それらが対する遺伝子の転写を阻害するそれらの能力を決定するために、インビトロで（２．５μΜの濃度において）試験した。用いられる方法は、実施例１に記載したものである。
【０２０６】
特に、配列番号６６〜６９（ＭＹＣＮに対する）をＫｅｌｌｙ及びＨ６９細胞株においてインビトロで試験し；配列番号７０〜７４（ＭＹＣに対する）をＨ８２及びＲＤ細胞株においてインビトロで試験し；配列番号７５、７６（ＢＩＲＣ５に対する）をＫｅｌｌｙ細胞株においてインビトロで試験し；配列番号７７〜７９（ＡＬＫに対する）をＫｅｌｌｙ細胞株においてインビトロで試験し；配列番号８０〜８２（ＢＣＬ２に対する）をＫｅｌｌｙ細胞株においてインビトロで試験し；そして配列番号８３、８４（ＰＬＫ４に対する）をＫｅｌｌｙ細胞株においてインビトロで試験した。
【０２０７】
試験されるオリゴヌクレオチドの目的の遺伝子のメッセンジャーを阻害する能力を測定し、オリゴヌクレオチドの投与後の細胞の増殖能力も評価した。結果を表１１に要約する。
【０２０８】
データは、オリゴヌクレオチドの配列中に存在するＧの群の数の増加に伴って上昇する標的遺伝子のｍＲＮＡに対する有力な阻害活性及び細胞増殖の阻害を示す。
【０２０９】
【表１１−１】
2018078893.tif 000013
【表１１−２】
2018078893.tif 000014
【０２１０】
最終的に、配列番号６６〜８４を有するオリゴヌクレオチドを、線維芽細胞型（Ｐｈｏｅｎｉｘ及びＮＩＨ−３Ｔ３）の細胞株に投与した。これらの細胞において、試験されるオリゴヌクレオチドは、毒性を示さなかった。
【０２１１】
これらの結果は、ＰＮＡオリゴヌクレオチドが、目的の遺伝子の発現に関する特定の阻害効果を介して作用する一方で、これらは、遺伝子を発現しない細胞において、何らかの非特定の毒性効果を有さなかったことを示す。
【０２１２】
本発明に記載されたパラメータに基づいて設計されるＰＮＡオリゴヌクレオチドは、目的遺伝子、及びこの遺伝子を発現／過剰発現する細胞に関して特異的に且つ有効的に作用することが推測され得る。
【配列表】
2018078893000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月11日(2018.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子のアンチセンスＤＮＡ鎖に相補的な一本鎖アンチジーンオリゴヌクレオチドであって、６〜３０ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの連続するグアニンの少なくとも３つの群を含む配列により特徴付けられる、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、１２〜２４ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも２つの連続するグアニンの群が、互いに連続する、又は、少なくとも１つのヌクレオチドにより隔てられ、前記ヌクレオチドはグアニンではない、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
少なくとも２つの連続するグアニンの群が、少なくとも４つ、５つ、又は６つである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’及び／又は５’末端において、担体配列と結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記担体配列が、配列番号４７〜５６からなる群から選択される、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、天然の核酸、化学的に修飾された天然の核酸、合成核酸、化学的に修飾された合成核酸、又はそれらの組み合わせからなる少なくとも１つの分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記天然の核酸又は化学的に修飾された天然の核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡから選択され、前記合成核酸又は前記化学的に修飾された合成核酸が、ＰＮＡ、ＬＮＡ又はモルホリノから選択される、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＤＮＡ分子が、１）少なくとも１つのＬＮＡ、メチルホスホネート−ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＲＮＧ、ＤＮＧ、ＧＮＡ、ＵＮＡ、ＥＮＡ、ＡＮＡ、Ｆ−ＡＮＡ、ＰＮＡ、Ｇ−ＰＮＡ若しくはモルホリノヌクレオチドを含むか；又は、２’０−メチル、２’０−メトキシエチル若しくは２’−フルオロＲＮＡヌクレオチドを含む；あるいは、
２）前記少なくとも１つのＲＮＡ分子が、２’０−エチルヌクレオチド、２’０−メトキシエチルヌクレオチド、２’−フルオロヌクレオチドの中から選択される前記少なくとも１つのＲＮＡヌクレオチド；又は、ＬＮＡ、メチルホスホネートＬＮＡ、ＢＮＡ、ＲＮＧ、ＤＮＧ、ＧＮＡ、ＵＮＡ、ＥＮＡ、ＡＮＡ、Ｆ−ＡＮＡ、ＰＮＡ、Ｇ−ＰＮＡ若しくはモルホリノの中から選択される核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＤＮＡ分子又は前記少なくとも１つのＲＮＡ分子は、そのホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合として修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項８又は９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＰＮＡが、修飾された主鎖を有し、α炭素が、置換基としてアルギニン又はリジンの側鎖を有する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、遺伝子又はウイルス起源の疾患の原因である少なくとも１つの遺伝子、あるいは少なくとも１つの腫瘍遺伝子に対するものであって、前記遺伝子が、ＭＹＣファミリーに属する少なくとも１つの遺伝子、ＢＩＲＣ５、ＢＣＬ２、ＰＬＫ４、ＡＬＫ、ＰＫＭ２、ＣＡＳＰ８及びＲＡＳＳＦ１からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＭＹＣファミリーに属する少なくとも１つの遺伝子が、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ又はＭＹＣＬｌから選択される、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２、４、５、６及び６８〜８４の中から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号２、４、５、６、６８及び６９が、ＭＹＣＮ遺伝子に対する、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号７０〜７４が、ＭＹＣ遺伝子に対する；
配列番号７５、７６が、ＢＩＲＣ５遺伝子に対する；
配列番号７７〜７９が、ＡＬＫ遺伝子に対する；
配列番号８０〜８２が、ＢＣＬ２遺伝子に対する；
配列番号８３、８４が、ＰＬＫ４遺伝子に対する、
請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項１８】
薬理作用を有する、ＮＧＦ、ソマトスタチン、レチノイン酸、アクチノマイシンＤ、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シスプラチン、シタラビン、クロラムブシル（clorambucil）、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、塩酸ドキソルビシン、塩酸エピルビシン、エトポシド、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、塩酸イダルビシン、ヒドロキシ尿素、イソホスファミド（ifophosphamide）、塩酸イリノテカン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール‐ウラシル、テモゾロミド、チオグアニン、チオテパ（thiotepe）、トポテカン、ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンからなる群から選択された化合物と組み合わせた請求項１〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１９】
前記組み合わせが、配列番号１及びカルボプラチン又はエトポシド又はシスプラチン又はビンクリスチン；あるいは配列番号５及びカルボプラチン、又はエトポシド又はシスプラチン又はビンクリスチンである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬としての使用のための、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
腫瘍を治療するための組成物であって、前記腫瘍が、成人又は小児の腫瘍であり、好ましくは神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、髄芽細胞腫、上衣腫、褐色細胞腫、胚性癌、胚細胞腫瘍、肺胞横紋筋肉腫、胚性横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、腎臓の明細胞肉腫、滑膜肉腫、肝芽細胞腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性巨核芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞白血病、リンパ腫、小細胞肺癌（小細胞癌（microcytoma））、肺腺癌、扁平細胞肺癌、定型及び非定型原発性肺癌、大細胞肺癌、大細胞神経内分泌性肺癌、神経膠芽細胞腫、肝細胞癌、基底細胞癌、卵巣腫瘍、乳房腫瘍及び結腸癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用のための組成物。
【外国語明細書】
2018078893000001.pdf