(57)【要約】【課題】マンノオリゴ糖の製造に必要な耐熱性および活性を有するマンノオリゴ糖ホスホリラーゼを提供する。【解決手段】４℃にて２４時間保持した後にｐＨ５〜９の範囲で９０％以上の残存活性を示し、ｐＨ６．５の条件下で６０℃で１５分間保持した後に９０％以上の残存活性を示す、マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ５〜９の範囲で４℃にて２４時間保持した後に９０％以上の残存活性を示し、ｐＨ６．５の条件下で６０℃で１５分間保持した後に９０％以上の残存活性を示す、マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼ。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、または配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼ。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列、または配列番号２に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼ。
【請求項５】
サーモトガ門の微生物由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼをコードする核酸を含む、ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼをコードする核酸を含む、形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼを用いる、マンノオリゴ糖の製造方法。
【請求項９】
マンノオリゴ糖ホスホリラーゼによる反応が４０℃以上で行われる、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
マンノース１リン酸およびマンノースに、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼを作用させることを含む、請求項８または９に記載のマンノオリゴ糖の製造方法。
【請求項１１】
グルコース１リン酸を、グルコース６リン酸に変換する工程、グルコース６リン酸をマンノース６リン酸に異性化する工程、およびマンノース６リン酸をマンノース１リン酸に変換する工程をさらに含む、請求項１０に記載のマンノオリゴ糖の製造方法。
【請求項１２】
デンプンを脱分枝、加リン酸分解してグルコース１リン酸を生成する工程をさらに含む、請求項１１に記載のマンノオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、およびこれを用いたマンノオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンノオリゴ糖、特にマンノビオースは優れた免疫調節機能を持ち、飼料用途としては抗生物質の代替としても注目される機能性オリゴ糖である（特許文献１）。マンノオリゴ糖はコプラミール等に含まれる多糖マンナンの加水分解により製造されている（特許文献２、３）。しかしながら、これらの方法は、天然の原料を用いるため、気候変動などの外部要因によって価格が変動しやすい。またコーヒー抽出粕などは脱色等の精製にコストがかかる。
【０００３】
マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ（以下、ＭＯＰとも称する）は、β−（１→４）−マンノオリゴ糖（以下、ＭＯＳとも称する）を加リン酸分解する酵素である。本酵素反応は可逆的であり逆反応（合成反応）も触媒し、α−マンノース−１−リン酸（糖供与体、以下、Ｍａｎ１Ｐとも称する）とＭＯＳ（糖受容体）との反応により、受容体ＭＯＳにマンノシル基が連続的に転移されてより長鎖のＭＯＳを生成させる。
【０００４】
このようなＭＯＰとして、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）由来のＭＯＰ酵素（以下、ＲａＭＯＰとも称する）のみが報告されている（非特許文献１）。特許文献４には、非特許文献１のＲａＭＯＰをβ−マンノシド合成に用い得ることが記載されているが、ＭＯＳが実際に得られたことの開示はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／０４８５８７号公報
【特許文献２】特開平８−１７３０５５号公報
【特許文献３】特開平１１−１８７９３号公報
【特許文献４】特開２０１４−２３９６５１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kawahara R. et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 50, pp. 42389-42399, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来知られたＭＯＰであるＲａＭＯＰは、耐熱性（熱安定性）に乏しく、４０℃未満で反応を実施する必要があり、実用的な酵素反応には使用できない。特許文献４でも、非特許文献１に記載の酵素をβ−マンノシド合成に用い得る記載があるものの、実際にはＭＯＳは得られていない。このため、マンノオリゴ糖を製造するために必要な耐熱性および活性を有するＭＯＰが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題に対して鋭意研究を重ねた結果、マンノオリゴ糖を製造するために必要な耐熱性および活性を有するＭＯＰを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は、
（１）ｐＨ５〜９の範囲で４℃にて２４時間保持した後に９０％以上の残存活性を示し、ｐＨ６．５の条件下で６０℃で１５分間保持した後に９０％以上の残存活性を示す、マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号２に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、（１）のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、または配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、（１）のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または配列番号２に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、（１）のマンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、
（５）サーモトガ門の微生物由来である、（１）〜（４）のいずれかのマンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、
（６）（１）〜（５）のいずれかのマンノオリゴ糖ホスホリラーゼをコードする核酸を含む、ベクター。
（７）（１）〜（５）のいずれかのマンノオリゴ糖ホスホリラーゼをコードする核酸を含む、形質転換体。
（８）（１）〜（５）のいずれかのマンノオリゴ糖ホスホリラーゼを用いる、マンノオリゴ糖の製造方法、
（９）マンノオリゴ糖ホスホリラーゼによる反応が４０℃以上で行われる、（８）の製造方法。
（１０）マンノース−１−リン酸およびマンノースに、（１）〜（５）のいずれかのマンノオリゴ糖ホスホリラーゼを作用させることを含む、（８）または（９）のマンノオリゴ糖の製造方法、
（１１）グルコース−１−リン酸を、グルコース−６−リン酸に変換する工程、グルコース−６−リン酸をマンノース−６−リン酸に異性化する工程、およびマンノース−６−リン酸をマンノース−１−リン酸に変換する工程をさらに含む、（１０）のマンノオリゴ糖の製造方法。
（１２）デンプンを脱分枝、加リン酸分解してグルコース−１−リン酸を生成する工程をさらに含む、（１１）のマンノオリゴ糖の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来酵素では不可能であった高温域で酵素反応が可能となり、マンノオリゴ糖を酵素的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例のＭＯＰの合成反応生成物の分析結果を示す図である。Ｍ１Ｐ：マンノース−１−リン酸、Ｍ：マンノース、Ｍ２〜Ｍ８：マンノオリゴ糖（数字は重合度を示す）、−：酵素無添加、＋：酵素添加。
【図２】実施例のＭＯＰのｐＨ活性曲線を示す図である。●：酢酸ナトリウム緩衝液、○：ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、■：ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、□：トリシン−ＨＣｌ緩衝液、▲：ビシン−ＮａＯＨ緩衝液、△：ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液。
【図３】実施例のＭＯＰのｐＨ安定性を示す図である。◆：ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液、◇：グリシン−ＨＣｌ緩衝液、●：酢酸ナトリウム緩衝液、○：ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、■：ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、□：トリシン−ＨＣｌ緩衝液、▲：ビシン−ＮａＯＨ緩衝液、△：ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、×：ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液。
【図４】実施例のＭＯＰの温度活性曲線および安定性を示す図である。●：活性、○：安定性
【図５】実施例のＭＯＰによるＭＯＳ生産を示す図である。黒：錯体形成なし、白：錯体形成あり、Ｍａｎ：マンノース、Ｍａｎ２〜Ｍａｎ６：マンノオリゴ糖（数字は重合度を示す）（略称について、以下同じ）
【図６】上段：グルコース−１−リン酸（以下、Ｇｌｃ１ＰまたはＧ１Ｐとも称する）からマンノビオースを合成する経路の一例を示す図である。下段：デンプンからマンノビオースを合成する経路の一例を示す図である。Ｇｌｃ６Ｐ：グルコース−６−リン酸、Ｆｒｕ６Ｐ：フルクトース−６−リン酸、Ｍａｎ６Ｐ：マンノース−６−リン酸、Ｍａｎ１Ｐ：マンノース−１−リン酸、Ｐｉ：リン酸、Ｍａｎ２：マンノビオース、α−ＰＧＭ：α−ホスホグルコムターゼ、ＧＰＩ：グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ＭＰＩ：マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、ＰＭＭ：ホスホマンノムターゼ、ＩＳＡ：イソアミラーゼ、ＧＰ：グルカンホスホリラーゼ（略称について、以下同じ）
【図７】実施例のＭＯＰを用いた、Ｇｌｃ１Ｐおよびデンプンを出発材料とするマンノオリゴ糖合成の結果を示す図である。反応条件：３７℃、６時間、両反応に共通：（１０μＬ）：２０μｇ／ｍＬ  Ｇｌｃ１６ＢＰ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７）、２０ｍＭＭｇＣｌ２、０．２Ｍ  ＭａｎおよびＭＯＰ、Ｇｌｃ１Ｐからの反応は下記を追加：０．２Ｍ  Ｇｌｃ１Ｐ、２．５Ｕ／ｍＬ  α−ＰＧＭ、２．５Ｕ／ｍＬ  ＧＰＩ、１．３Ｕ／ｍＬ  ＭＰＩ、０．５Ｕ／ｍＬ  ＰＭＭ、デンプンからの反応は下記を追加：２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、３％可溶性デンプン、２．５Ｕ／ｍＬ  α−ＰＧＭ、２．５Ｕ／ｍＬ  ＧＰＩ、３９Ｕ／ｍＬ  ＭＰＩ、３．５Ｕ／ｍＬ  ＰＭＭ、１００Ｕ／ｍＬ  ＩＳＡ、１．７Ｕ／ｍＬ  ＧＰ。
【図８】実施例のＭＯＰを用いた、Ｇｌｃ１Ｐおよびデンプンを出発材料とするマンノオリゴ糖合成・反応経過に伴うＭａｎ２の生成量変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を具体的に説明する。ある態様において、本発明は、マンノオリゴ糖を製造するために必要な耐熱性および活性を有するＭＯＰを提供する。
【００１３】
本明細書におけるオリゴ糖とは、単糖が２〜２０分子結合したものであり、好ましくは単糖が２〜１５分子結合したものであり、より好ましくは単糖が２〜１０分子結合したものである。好ましいオリゴ糖の例として、単糖が３〜２０、４〜２０、５〜２０、６〜２０、３〜１５、４〜１５、５〜１５、６〜１５、３〜１０、４〜１０、５〜１０、６〜１０分子結合したものが挙げられる。本明細書におけるマンノオリゴ糖とは、マンノースのみを構成糖とし、β−１，４結合で形成されたオリゴ糖である。マンノオリゴ糖の例として、マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース等が挙げられる。ある実施形態において、マンノオリゴ糖は、マンノース以外の構成糖を含むオリゴ糖に含まれるマンノオリゴ糖部分を含む。
【００１４】
本態様のＭＯＰは、ｐＨ約５〜９の範囲で４℃にて２４時間保持した後に９０％以上の残存活性を示す。この場合、ｐＨ約５〜９の範囲で９０％以上の残存活性を示せば、他のｐＨ範囲では９０％以上の残存活性を示しても示さなくてもよい。例えば、本態様のＭＯＰは、ｐＨ約４〜９、約４〜１０、約３．５〜９、または約３．５〜１０の範囲で４℃にて２４時間保持した後に９０％以上の残存活性を示す。
【００１５】
本態様のＭＯＰは、ｐＨ６．５の条件下で約６０℃またはそれ以上の温度で１５分間保持した後に、９０％以上の残存活性を示す。好ましくは、例えばｐＨ６．５の条件下で約６５℃もしくはそれ以上、約７０℃もしくはそれ以上、約７５℃もしくはそれ以上、約８０℃もしくはそれ以上、または約８５℃の温度で１５分間保持した後に９０％以上の残存活性を示す。
【００１６】
ある実施形態において、本態様のＭＯＰの至適ｐＨは、例えば約４．５〜８．５のいずれか、例えば約５．０〜８．０、約５．５〜７．５、約６．０〜７．０、例えば約６．５である。他の実施形態において、本態様のＭＯＰの至適温度は、例えば約４０〜８５℃のいずれか、例えば約４５〜８５℃、約５０〜８５℃、約６０〜８０℃、約６５〜８０℃である。
【００１７】
ある実施形態において、本態様のＭＯＰは３７℃において、マンノースに対してＲａＭＯＰよりも高いＫｃａｔ ａｐｐおよびＫｃａｔ ａｐｐ／Ｋｍ ａｐｐ、およびＲａＭＯＰよりも低いＫｍ ａｐｐを示し、ＭＯＳに対してＲａＭＯＰよりも低いＫｃａｔ ａｐｐおよびＫｍ ａｐｐを示し、およびＲａＭＯＰよりも高いＫｃａｔ ａｐｐ／Ｋｍ ａｐｐを示す。例えば、３７℃において、本態様のＭＯＰはＲａＭＯＰに比較して少なくとも約３倍、好ましくは少なくとも約４倍、さらに好ましくは少なくとも約５倍、例えば約３〜１２倍のＫｃａｔ ａｐｐ／Ｋｍ ａｐｐを示す。他の実施形態において、本態様のＭＯＰは、６０℃において、マンノースに対して少なくとも約２ｓ−１・ｍＭ−１、例えば少なくとも約３ｓ−１・ｍＭ−１、少なくとも約３．５ｓ−１・ｍＭ−１、約２〜１０、約３〜８、約３．５〜６ｓ−１・ｍＭ−１のＫｃａｔ ａｐｐ／Ｋｍ ａｐｐを示し、ＭＯＳに対して少なくとも約５ｓ−１・ｍＭ−１、例えば少なくとも約１０ｓ−１・ｍＭ−１、少なくとも約２０ｓ−１・ｍＭ−１、少なくとも約２５ｓ−１・ｍＭ−１、約５〜１００、約１０〜７５、約２０〜６０ｓ−１・ｍＭ−１のＫｃａｔ ａｐｐ／Ｋｍ ａｐｐを示す。
【００１８】
本明細書におけるＫｍ ａｐｐは、酵素の見かけのミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）定数を示し、所定の酵素が酵素触媒反応でその最大速度を半分にする特定の基質の濃度である。Ｋｃａｔ ａｐｐは酵素の見かけの分子活性を示し、酵素が最大の効率で機能する基質分子の数である。また、Ｋｃａｔ ａｐｐ／Ｋｍ ａｐｐは、酵素の見かけの特異性定数を示し、酵素が基質を産物に変換する効率の指標である。これらは、測定した反応速度をミカエリス−メンテンの速度式に回帰することで求められる。
【００１９】
ある実施形態において、ＭＯＰは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素が挙げられる。また例えば、配列番号２の塩基配列に対して、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む酵素が挙げられる。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
さらに具体的な実施形態において、上記のアミノ酸配列は、例えば配列番号１のアミノ酸配列に、１個または複数個の欠失、付加、および／または保存性もしくは非保存性アミノ酸による置換を有する配列を含む。保存性アミノ酸による置換として、例えば、疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシルアミノ酸ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド型アミノ酸ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性アミノ酸ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香属アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換などが挙げられる。また他の実施形態において、上記のアミノ酸配列は、配列番号２の塩基配列に１個または複数個の欠失、付加、および／または置換を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。これら形態における複数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を意味する。
【００２２】
さらに具体的な実施形態において、上記の実施形態における塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、および５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００２３】
ある実施形態において、上記の塩基配列またはアミノ酸配列の由来は特に限定されないが、例えば動物、植物または微生物由来、好ましくは植物または微生物由来、より好ましくは微生物由来である。より具体的に、好ましくは、ＭＯＰはサーモトガ門（Thermotogae）由来である。より具体的な微生物の例として、サーモトガ属（Thermotoga）、シュードサーモトガ属（Pseudothermotoga）、ビブリオ属（Vibrio）等が挙げられる。好ましい実施形態において、ＭＯＰはサーモトガ属またはシュードサーモトガ属由来、より好ましくは、サーモトガ属由来である。他の好ましい実施形態において、ＭＯＰは、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーモトガ種ＲＱ２（Thermotoga sp. RQ2）、サーモトガ・ペトロフィラ（Thermotoga petrophila）、サーモトガ種２８１２Ｂ（Thermotoga sp. 2812B）、サーモトガ種ＲＱ７（Thermotoga sp. RQ7）、サーモトガ・ネポリタナ（Thermotoga neapolitana）、シュードサーモトガ・ハイポゲア (Pseudothermotoga hypogea)、シュードサーモトガ・レッティンゲ（Pseudothermotoga lettingae）、またはビブリオ・フルヴィアリス（Vibrio flvialis）由来、より好ましくはサーモトガ・マリティマ由来である。
【００２４】
本態様のＭＯＰは、例えば、上述のアミノ酸配列をコードする塩基配列、または上述の塩基配列、すなわち本態様のＭＯＰをコードする核酸を含むベクターを導入して形質転換した形質転換体によって生産することができる。したがって、ある態様において、本発明はＭＯＰをコードする核酸を含むベクターを提供する。他の態様において、本発明はＭＯＰをコードする核酸を含む形質転換体を提供する。またさらに他の態様において、本発明はＭＯＰを製造する方法を提供する。
【００２５】
ベクターに導入する、ＭＯＰをコードする核酸は、上述の塩基配列（例えば、配列番号２の塩基配列、配列番号２の塩基配列に対して、約７０％以上の配列同一性を有する塩基配列など）に係る核酸を化学的に合成してもよく、遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。例えば、上述の微生物等の自然界に存在する試料をサンプリングし、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、目的とする塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。ベクターに導入する核酸は、ＭＯＰ領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、エンハンサー配列、プロモーター配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカー等をコードする領域を有していてもよい。
【００２６】
本態様のベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、特に限定されない。ベクターの例として、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、およびワクシニアウィルス等の種々のウイルスが挙げられる。本態様のベクターは、特に宿主中で自立複製可能なものが好ましく、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡの形態にあることが好ましい。核酸を大腸菌に導入するためのベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等のプラスミドＤＮＡ、およびＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔＩＩ等のファージＤＮＡ等を挙げることができる。また酵母に導入するためのベクターの例として、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を挙げることができる。
【００２７】
本態様の形質転換体は、上記態様のＭＯＰをコードする遺伝子が導入されている。例えば、上記態様のベクターが導入されている。これにより、当該形質転換体は上記態様のＭＯＰを発現する。ベクターを導入する宿主の例として、エシェキリア属（Escherichia）、バチルス属（Bacillus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）等の細菌、サッカロミセス属（Saccharomyces）等の酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、および植物細胞等の真核細胞が挙げられる。好ましくは、宿主は大腸菌（E. coli）である。形質転換体を培養することにより、ＭＯＰを、より簡便かつ大量に生産することができる。
【００２８】
宿主細胞への核酸またはベクターの導入は、当業者に知られた方法によって行うことができる。例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、接合伝達法、カルシウムイオンを用いる方法等が挙げられる。
【００２９】
上記の形質転換体から、上述の態様におけるＭＯＰを抽出または精製する方法は、ＭＯＰの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、ＭＯＰを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。抽出液と固形残渣を分離する方法の例として、濾過、圧縮濾過、または遠心分離処理等の公知の固液分離処理が挙げられる。また、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を圧搾してもよい。抽出液中のＭＯＰは、塩析法、限外濾過法、またはクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００３０】
ＭＯＰを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便にＭＯＰを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係るＭＯＰが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィー法により、抽出液や培養上清中のＭＯＰを簡便に精製することができる。
【００３１】
ある態様において、本発明は上記態様のＭＯＰを用いる、マンノオリゴ糖の製造方法を提供する。
【００３２】
ある実施形態において、本態様の製造方法は、出発原料としてＭａｎ１Ｐおよびマンノースを用いる。
【００３３】
他の実施形態において、本態様の製造方法は、Ｇｌｃ１Ｐを出発原料とし、（ｉ）Ｇｌｃ１Ｐを、Ｇｌｃ６Ｐに変換する工程、（ｉｉ）Ｇｌｃ６ＰをＭａｎ６Ｐに異性化する工程、例えば、Ｇｌｃ６ＰをＦｒｕ６Ｐに異性化し、Ｆｒｕ６ＰをＭａｎ６Ｐに異性化する工程、および（ｉｉｉ）Ｍａｎ６ＰをＭａｎ１Ｐに変換する工程をさらに含む。これらの工程は、必要な酵素を組み合わせて実施できる。例えばα−ＰＧＭ、ＧＰＩ、ＭＰＩ、およびＰＭＭ、および必要によりそれらの補因子の組合せによって実施される。これらの反応は順次実施することもできるし、一容器中にＭＯＰを含むすべての酵素を混合して実施することもできる。
【００３４】
さらに他の実施形態において、本態様の製造方法は、デンプンを出発原料とし、脱分枝、加リン酸分解してＧｌｃ１Ｐを生成する工程をさらに含む。この工程は、必要な酵素を組み合わせて実施できる。例えばＩＳＡ、およびＧＰ、および必要によりそれらの補因子の組み合わせによって実施できる。Ｇｌｃ１Ｐを出発原料とする上記実施形態と組み合わせることにより、デンプンからマンノオリゴ糖を生産できる。これらの反応は順次実施することもできるし、一容器中にＭＯＰを含むすべての酵素を混合して実施することもできる。
【００３５】
さらに他の実施形態において、本態様の方法は、セルロースを出発原料とし、Ｇｌｃ１Ｐを生産する工程をさらに含む。この工程は、必要な酵素を組み合わせて実施できる。例えば、Hiraishi et al.，Carbohydrate Research 344，2468-2473，2009に記載の方法によって実施できる。Ｇｌｃ１Ｐを出発原料とする上記実施形態と組み合わせることにより、セルロースからマンノオリゴ糖を生産できる。これらの反応は順次実施することもできるし、一容器中にＭＯＰを含むすべての酵素を混合して実施することもできる。
【００３６】
反応温度、ｐＨ、時間は当業者が適宜決定できる。例えば、反応温度は、約３０〜８５℃に設定できる。好ましい反応温度の例として、例えば、約３５℃以上、約４０℃以上、約４５℃以上、より具体的には、例えば約３５〜８０℃、約３７〜８０℃、約４０〜８０℃、約４０〜７５℃、約４０〜６５℃、約４５〜７５℃、約４５〜６５℃、約４５〜６０℃等が挙げられる。例えば、反応ｐＨはｐＨ約５〜９に設定できる。好ましい反応ｐＨの例として、約３．５〜１０、約４〜１０、約４〜９、約５〜１０、約５〜８、約６〜１０、約６〜８、約６〜７等が挙げられる。例えば、反応時間は約０．１〜３０００時間に設定できる。好ましい反応時間の例として、約０．５〜１０００時間、約１〜５００時間、約１〜１００時間、約１０〜１００時間、約２０〜６０時間等が挙げられる。
【００３７】
得られたマンノオリゴ糖を含む反応液はそのまま、または必要に応じて精製処理を施すことができる。精製処理する通常の方法として、活性炭処理、樹脂吸着処理、限外濾過法、逆浸透法、ゲル濾過法、透析法、イオン交換樹脂法、電気透析法、イオン交換膜法および各種クロマトグラフィー等が例示でき、これらの一法または二法以上の組み合わせにより行うことができる。
【００３８】
得られたマンノオリゴ糖を含む反応液またはさらに精製処理後の液は、そのまま製剤化しても良く、好ましくは加熱殺菌してから製剤化できる。製剤の形態は特に限定されず、例えば、濃縮液等の液体、粉末、錠剤等の固体、ペースト状等の形態とすることができる。例えば、濃縮および／または乾燥を行い、濃縮品または乾燥品とすることができる。加熱殺菌、濃縮、乾燥の手段は当業者に公知の方法を用いることができる。濃縮の例として、例えば蒸発、減圧、凍結濃縮等が挙げられる。また乾燥の例として、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥等が挙げられる。
【００３９】
得られたマンノオリゴ糖は食品、機能性食品、食品添加物、医薬品、飼料組成物、または化粧品等の製品に用いることが出来る。得られたマンノオリゴ糖または製剤をそのまま用いても良いし、各製品に通常用いられる他の原料を添加してもよい。従って、ある態様において、本発明はマンノオリゴ糖を含有するこれらの製品、ならびにそれらの製造方法および利用方法を提供する。
【００４０】
本態様において、マンノオリゴ糖は自体公知の方法により各製品に配合することができ、その配合量や他の配合成分は特に限定されない。他の原料の例として、調味料、酸味料、甘味料、香辛料、着色料、香料、塩類、糖類、酸化防止剤、ビタミン、安定剤、増粘剤、担体、賦形剤、潤滑剤、界面活性剤、噴射剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、等が挙げられる。
【００４１】
本態様の製品の形態は特に限定されず、例えば、錠剤、粉末、顆粒、ペレット等の固体、ペースト等の半固体、および溶液、懸濁液、エマルジョン等の液体が挙げられる。また、これらがカプセルに封入されたものであってもよい。
【００４２】
本態様における製品は、マンノオリゴ糖により、老化防止、免疫向上、抗アレルギー、抗ウイルス、抗菌、ウイルス感染阻害、菌感染阻害等の作用が期待できる。
【００４３】
以下に実施例を記載するが、本発明が実施例により必ずしも限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ＭＯＰ−１の調製および分析
（酵素の調製）
サーモトガ・マリティマのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、下記表２のプライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＭＯＰ様タンパク質ＴＭ１２２５をコードする遺伝子を増幅した。これを発現プラスミドｐＥＴ２３ａにＮｄｅＩおよびＸｈｏＩサイトを介してサブクローニングした。得られた発現プラスミドにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して組換えタンパク質を生産した。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地１Ｌにより発現プラスミドを導入した形質転換体を３７℃にて培養し、Ａ６００が０．５となった時点で０．１Ｍイソプロピルβ−チオガラクトシドを１ｍＬ添加し（終濃度０．１ｍＭ）、組換えタンパク質の生産を誘導した。これを１８℃にてさらに２４時間培養した。
【００４７】
遠心分離により回収した菌体を２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍＬに懸濁し，ソニケーションにより破砕した。これを遠心分離して上清を回収し，７５℃で３０分間保持することにより熱処理を行なった。この処理液から遠心分離により得られた上清を用いてＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムクロマトグラフィーを行なった。２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化した２．５ｃｍ  ｉ．ｄ．×２０ｃｍのカラムを用いた。非吸着タンパク質を同緩衝液で溶出させた後、吸着タンパク質を０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ直線濃度勾配（溶出液量５００ｍＬ）により溶出した。目的タンパク質は吸着画分（ＮａＣｌ濃度０．２５Ｍ付近）に溶出された。回収した画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和になる様に添加し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィーの試料とした。３０％飽和硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化したカラム（２．５ｃｍ  ｉ．ｄ．×１０ｃｍ）を用いた。非吸着タンパク質を同緩衝液で溶出させ、吸着タンパク質を３０〜０％飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配（溶出液量４００ｍＬ）により溶出した。２０％飽和濃度付近に溶出した目的タンパク質を回収し、２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析した。得られた試料をＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ（１００００ＭＷＣＯ）を用いた限外濾過により濃縮し、酵素である組換えタンパク質（以下ＭＯＰ−１と称する）を得た。
【００４８】
（マンノオリゴ糖合成活性の測定）
Ｍａｎ１Ｐおよびマンノースからのマンノオリゴ糖合成反応における無機リン酸遊離速度を測定した。ＭＯＰ−１、１０ｍＭ  Ｍａｎ１Ｐ、１０ｍＭマンノースおよび８０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）からなる反応液５０μＬを６０℃に１０分間保持した。１０％アスコルビン酸水溶液を１２５μＬ添加して反応を停止した。この無機リン酸濃度をモリブデンブルー法（Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, 162, 421-428, 1946）により測定した。酵素活性１Ｕを上記条件下で１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を遊離する量と定義した。調製したＭＯＰ−１は、Ｍａｎ１Ｐおよびマンノースからのマンノオリゴ糖合成反応において無機リン酸遊離活性を示し、無機リン酸遊離速度から求めた活性は４．０３Ｕ／ｍｇであった。
【００４９】
次に薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により合成生成物を分析した。ＭＯＰ−１、８０ｍＭ  Ｍａｎ１Ｐおよび４０ｍＭ各種ＭＯＳからなる反応液２５μＬ（ｐＨ６．５）を３７℃に９６時間保持し、このうち１μＬを分析に用いた。ＴＬＣでは展開溶媒にアセトン／酢酸エチル／１−プロパノール／水＝８５／２０／５０／６０を用い、糖の検出にアニスアルデヒド／硫酸／酢酸＝１／２／９７を用いた。検出液をＴＬＣプレートに噴霧後、加熱することで糖を検出した。その結果、いずれの受容体に対する反応においてもマンノシル基の転移が確認され、マンノースを受容体とした反応では７糖まで、Ｍａｎ２からＭａｎ４（数字は重合度を示す）との反応では８糖までのＭＯＳの生成が見られた（図１）。以上より、ＭＯＰ−１がＭＯＰ活性を持つことが確認された。
【００５０】
（ｐＨおよび温度の影響）
Ｍａｎ１Ｐおよびマンノースからのマンノオリゴ糖合成活性に関して、ＭＯＰ−１の当該活性に及ぼすｐＨおよび温度の影響を調べた。各ｐＨにおける活性を測定した結果、ＭＯＰ−１はｐＨ６．５において最大活性を示した（図２）。なお反応緩衝液には、８０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３〜６．５）、ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．８〜７．０）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．２）、トリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２〜８．７）、ビシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．７〜９．３）およびＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．３〜１０．３）を用いた。各ｐＨに４℃にて２４時間保持した後に残存活性を測定すると、ＭＯＰ−１はｐＨ４．１〜１０．１の範囲で９０％以上の残存活性を示した（図３）。なお、ｐＨ処理における緩衝液には８０ｍＭ  ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．１）、グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７〜３．３）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８〜６．１）、ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．７〜７．０）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．１〜８．１）、トリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．１〜８．６）、ビシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６〜９．１）、ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．１〜１０．１）、ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．９〜１０．９）を用いた。
【００５１】
次に、各温度にて活性を測定し、最適温度を求めた。その結果、ＭＯＰ−１は７５℃において最大活性を示した（図４）。各温度（ｐＨ６．５）に１５分間保持した後に、残存活性を測定し、安定性を評価した。ＭＯＰ−１は８５℃以下で９５％以上の残存活性を示した。このことより、ＭＯＰ−１は優れた耐熱性を備えたＭＯＰであると判断された。
【００５２】
（各種マンノオリゴ糖に対する合成反応速度の測定とＲａＭＯＰとの比較）
１０ｍＭ  Ｍａｎ１Ｐを糖供与体、１．０〜５．０ｍＭ  ＭＯＳ（マンノースについては２０〜１５０ｍＭ）を受容体とした６０℃における反応速度を測定した（表３）。得られた反応速度をミカエリス−メンテンの速度式に回帰することで速度パラメータを求めた（表３）。ＭＯＰ−１はＲａＭＯＰと同様にマンノースよりも２糖以上のＭＯＳに対して高い反応効率を示した。Ｍａｎ２〜Ｍａｎ６に対する反応効率はＭａｎに対する反応効率の７．４〜１１．２倍であった。ＭＯＳの中ではＭａｎ３を最も良い受容体とすることが明らかになった。ＲａＭＯＰとＭＯＰ−１の合成反応速度を比較するため、ＭＯＰ−１の３７℃におけるＭＯＳに対する速度パラメータを測定した（表４）。３７℃では６０℃のパラメータと比較してＫｃａｔおよびＫｍの低下が認められた。ＲａＭＯＰとＭＯＰ−１を比較すると、マンノースに対してはＭＯＰ−１のＫｃａｔ ａｐｐが高く、Ｋｍ ａｐｐは低いためＭＯＰ−１はＲａＭＯＰの１６．２倍の高いＫｃａｔ ａｐｐ／Ｋｍ ａｐｐを示した。より長鎖の受容体に対するＫｃａｔ ａｐｐは、ＭＯＰ−１よりＲａＭＯＰの方が高かったが、ＭＯＰ−１ではＲａＭＯＰよりも著しく低いＫｍ ａｐｐを示したため、ＭＯＰ−１はＲａＭＯＰより３．６〜１１．４倍の高いＫｃａｔ ａｐｐ／Ｋｍ ａｐｐを示した
【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
実施例２：ＭＯＰ−１を用いたＭＯＳの合成（Ｍａｎ１ＰおよびマンノースからのＭＯＳの合成）
ＭＯＰ−１、１００ｍＭマンノース、１００ｍＭ  Ｍａｎ１Ｐおよび４０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）からなる反応液１２０μＬを６０℃に４８時間保持し、得られた反応液中のＭＯＳをＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより測定した（図５）。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤではカラムにＣａｒｂｏｐａｃ  ＰＡ１を用い、１８７ｍＭ  ＮａＯＨを移動相に用いた。流速を０．８ｍＬ／分とした。１０００倍希釈した反応液を１０μＬ注入し、分析した。各重合度のＭＯＳ（２５〜２００μＭ）を用いて作成した検量線に基づきＭＯＳ濃度を算出した。その結果、ＭＯＳ濃度はＭａｎ２  １９．２ｍＭ、Ｍａｎ３  ８．４ｍＭ、Ｍａｎ４  ３．３ｍＭ、Ｍａｎ５  １．５ｍＭ、Ｍａｎ６  １．２ｍＭであり、生成したＭＯＳに含まれるＭａｎ１Ｐ由来のマンノシル基は５７．９ｍＭと求められ，５７．９％のＭａｎ１ＰがＭＯＳ合成に消費された。
【００５６】
次に反応により生じる無機リン酸をアンモニウムイオンおよびマグネシウムイオンと不溶性錯体として反応系から除くことでＭＯＳ合成を高収率化できるか検討した。酵素、１００ｍＭマンノース、１００ｍＭ  Ｍａｎ１Ｐ、４０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１００ｍＭ酢酸マグネシウムおよび１００ｍＭ酢酸アンモニウムからなる反応液１２０μＬを６０℃に４８時間保持した。このＭＯＳ濃度を上記と同様に測定すると、Ｍａｎ２  ２８．８ｍＭ、Ｍａｎ３  １４．０ｍＭ、Ｍａｎ４  ６．１ｍＭ、Ｍａｎ５  ３．２ｍＭ、Ｍａｎ６  ３．０ｍＭであり、錯体を形成させずに反応させた場合より明らかにＭＯＳ合成量が増加した。ＭＯＳ合成に使用されたＭａｎ１Ｐ濃度を算出すると、１０１．９ｍＭとなり、基質のＭａｎ１ＰがＭＯＳ合成に完全に使用されたと考えられた。
【００５７】
ＭＯＰ−１は、優れた耐熱性を有し、従来酵素では不可能だった４０℃以上の高温域における酵素反応が可能であった。３７℃における反応速度パラメータを比較すると、ＭＯＰ−１のＫｃａｔ値はＲａＭＯＰに劣るもの、反応効率は３．６〜１１．４倍と高かった。６０℃における反応で得られたＭＯＰ−１のＫｃａｔ値は、ＲａＭＯＰの３７℃におけるＫｃａｔ値の１．６〜６１倍であった。
【００５８】
実施例３：ＭＯＰ−１を用いたＭＯＳの合成（Ｇｌｃ１ＰからのＭＯＳの合成）
０．２Ｍ  Ｇｌｃ１Ｐ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μｇ／ｍＬ  グルコース１，６−ビスリン酸（Ｇｌｃ１６ＢＰ）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７）、０．２Ｍ  Ｍａｎ、２．５Ｕ／ｍＬ  α−ＰＧＭ、２．５Ｕ／ｍＬ  ＧＰＩ、１．３Ｕ／ｍＬ  ＭＰＩ、０．５Ｕ／ｍＬ  ＰＭＭ、およびＭＯＰ−１からなる反応液１０μＬを３７℃で６０時間保持した。このうち、０．５μＬの試料を用いて、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により合成生成物を分析した。ＴＬＣでは展開溶媒にアセトニトリル／酢酸エチル／１−プロパノール／水＝８５／２０／５０／６０を用い、糖の検出にアニスアルデヒド／硫酸／酢酸＝１／２／１００を用いた。検出液をＴＬＣプレートに噴霧後、加熱することで糖を検出した。その結果、マンノビオース、およびわずかながらＭａｎ３の生成が見られた（図７、８）。
【００５９】
実施例４：ＭＯＰ−１を用いたＭＯＳの合成（デンプンからのＭＯＳの合成）
３％可用性デンプン、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μｇ／ｍＬ  グルコース１，６−ビスリン酸（Ｇｌｃ１６ＢＰ）、２５  ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７）、０．２Ｍ  Ｍａｎ、５Ｕ／ｍＬ  α−ＰＧＭ、２．５Ｕ／ｍＬ  ＧＰＩ，  ３９Ｕ／ｍＬ  ＭＰＩ、４Ｕ／ｍＬ  ＰＭＭ、１００Ｕ／ｍＬ  ＩＳＡ、１．７Ｕ／ｍＬ  ＧＰ、およびＭＯＰ−１からなる反応液１０μＬを３７℃で６０時間保持した。このうち、０．５μＬの試料を用いて、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により合成生成物を分析した。ＴＬＣでは展開溶媒にアセトニトリル／酢酸エチル／１−プロパノール／水＝８５／２０／５０／６０を用い、糖の検出にアニスアルデヒド／硫酸／酢酸＝１／２／１００を用いた。検出液をＴＬＣプレートに噴霧後、加熱することで糖を検出した。その結果、マンノビオース、およびわずかながらＭａｎ３の生成が見られた（図７、８）。
【００６０】
実施例３および４に示す通り、ＭＯＰ−１を用いることにより、Ｇｌｃ１Ｐ、またはデンプンを出発物質として、一容器中で簡便かつ容易にＭＯＳの製造が可能であった。なお実施例３および４では、ＭＯＰ−１以外の酵素について一部耐熱性を有しないものを使用したため、反応を３７℃で行ったが、全てを耐熱性酵素とすることにより、反応を４０℃以上で実施できる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、健康食品、サプリメント等を含む食品分野、医薬品分野、試薬研究分野、化粧品分野、および飼料分野等で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018134058.tif 000012
【図８】
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【配列表】
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