(57)【要約】【課題】培養細胞の動態を柔軟に制御できる培養細胞の動態制御方法を提供する。【解決手段】培養細胞の動態制御方法は、アナタース構造を有する酸化チタンを表面に備える基材の該表面に接着させた細胞を培養する培養工程と、前記細胞の培養中に、前記酸化チタンが光触媒活性を示す波長域の光を前記表面に照射する照射工程と、前記表面に対する前記光の照射量を制御することで前記細胞の動態を制御する制御工程と、を含む。前記波長域は、４００ｎｍ以下である、こととしてもよい。【選択図】図１
2018078816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナタース構造を有する酸化チタンを表面に備える基材の該表面に接着させた細胞を培養する培養工程と、
前記細胞の培養中に、前記酸化チタンが光触媒活性を示す波長域の光を前記表面に照射する照射工程と、
前記表面に対する前記光の照射量を制御することで前記細胞の動態を制御する制御工程と、
を含む、培養細胞の動態制御方法。
【請求項２】
前記波長域は、
４００ｎｍ以下である、
請求項１に記載の培養細胞の動態制御方法。
【請求項３】
前記照射工程では、
細胞培養における誘導期、対数増殖期又は定常期に前記光を照射する、
請求項１又は２に記載の培養細胞の動態制御方法。
【請求項４】
前記酸化チタンは、
真空紫外線をチタンに照射することで得られた酸化チタンである、
請求項１から３のいずれか一項に記載の培養細胞の動態制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞の動態制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の性質又は機能の明確化、医薬品の開発及び製造等のために、細胞は培養される。近年研究が進んでいる再生医療においても、患者に移植する前に幹細胞等が培養される。培養細胞は、種々の用途において重要であるため、培養細胞の動態を制御する技術が求められている。
【０００３】
培養細胞の動態は、培養温度、培地の組成及び細胞の培養に用いられる基材等に影響される。細胞の培養に用いられる基材として、細胞接着性の観点等から酸化チタンが採用されている。例えば、特許文献１には、酸化チタン被膜を有する細胞接着性基材が開示されている。また、特許文献２には、細胞培養面に酸化チタン系光触媒を含む樹脂層を有する細胞培養容器が開示されている。当該細胞培養容器では、酸化チタン系光触媒が光照射によって親水化する特性を利用して、細胞培養面から培養細胞を容易に剥離させることが記載されている。
【０００４】
酸化チタンは、細胞の培養以外にも、生体インプラント等に用いられる。例えば、特許文献３には、表面が酸化チタンで被膜された生体インプラントが開示されている。当該生体インプラントに紫外線を照射することで、生体インプラント表面の有機化合物を光触媒作用により分解除去することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２５３２０４号公報
【特許文献２】特開２００４−５１号公報
【特許文献３】特開２０１４−１９３２４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１に開示された細胞接着性基材及び特許文献２に開示された細胞培養容器は、それぞれ細胞接着性の確保及び細胞の容易な剥離といった細胞培養における利便性の向上に酸化チタンを利用している。また、特許文献３に開示された生体インプラントでは、生体インプラント表面の洗浄に酸化チタンの有用性を見出している。しかしながら、特許文献１〜３では、酸化チタンが培養細胞の動態に及ぼす影響について一切検討されていない。
【０００７】
酸化チタンを利用して培養細胞の動態を柔軟に制御できれば、細胞培養における利便性に加え、生物学実験、医薬品の評価、並びに抗体医薬及び再生医療用材料の生産等の多岐に渡る用途に対して培養細胞を安定に供給でき有用である。
【０００８】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、培養細胞の動態を柔軟に制御できる培養細胞の動態制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、酸化チタンの光触媒活性に着目し、光触媒活性が培養細胞の動態に及ぼす影響について鋭意研究し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明の観点に係る培養細胞の動態制御方法は、
アナタース構造を有する酸化チタンを表面に備える基材の該表面に接着させた細胞を培養する培養工程と、
前記細胞の培養中に、前記酸化チタンが光触媒活性を示す波長域の光を前記表面に照射する照射工程と、
前記表面に対する前記光の照射量を制御することで前記細胞の動態を制御する制御工程と、
を含む。
【００１１】
この場合、前記波長域は、
４００ｎｍ以下である、
こととしてもよい。
【００１２】
また、前記照射工程では、
細胞培養における誘導期、対数増殖期又は定常期に前記光を照射する、
こととしてもよい。
【００１３】
また、前記酸化チタンは、
真空紫外線をチタンに照射することで得られた酸化チタンである、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、培養細胞の動態を柔軟に制御できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１の使用の一態様の断面図を示す図である。
【図２】分光光度計で測定したマウス由来骨芽細胞試料の吸光度を示す図である。
【図３】吸光度計で測定したマウス由来骨芽細胞試料の吸光度を示す図である。
【図４】分光光度計で測定したマウス由来筋芽細胞試料の吸光度を示す図である。
【図５】吸光度計で測定したマウス由来筋芽細胞試料の吸光度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。
【００１７】
（実施の形態）
本実施の形態に係る培養細胞の動態制御方法は、培養工程と、照射工程と、制御工程と、を含む。まず、培養工程について説明する。培養工程では、アナタース構造を有する酸化チタンを表面に備える基材の該表面に接着させた細胞を培養する。好適には、アナタース構造を有する酸化チタンは、真空紫外線（Ｖａｃｕｕｍ  Ｕｌｔｒａ  Ｖｉｏｌｅｔ、以下単に「ＶＵＶ」ともいう）をチタンに照射することで得られる酸化チタンである。
【００１８】
以下、チタンからなる基材表面に酸化チタン層を生成させる場合を例に、ＶＵＶによるチタンの酸化について詳細に説明する。例えば、チタンからなる基材にＶＵＶを照射すると、ＶＵＶが照射された基材の表面は酸化される。ＶＵＶの波長は、好ましくは１０〜２００ｎｍ、より好ましくは５０〜１８０ｎｍ、さらに好ましくは１００〜１７５ｎｍである。基材上でのＶＵＶの照度は、特に限定されないが、例えば１〜１００ｍＷ／ｃｍ２、３〜５０ｍＷ／ｃｍ２、又は５〜２０ｍＷ／ｃｍ２である。ＶＵＶの照射時間は、特に限定されず、例えば、上記した照度の場合、３〜６０分間、５〜４０分間、又は１０〜３０分間である。
【００１９】
ＶＵＶが酸素を含む雰囲気中で照射された場合、雰囲気中の酸素は次式で示すように原子状の酸素に分解される。
Ｏ２＋ｈν  →  Ｏ（３Ｐ）＋Ｏ（３Ｐ）
【００２０】
ここで、Ｏ（３Ｐ）は基底状態の原子状酸素を示す。基底状態の原子状酸素は、次式のように、雰囲気中の酸素と反応の第三体Ｍとの三体衝突反応でオゾンを生成する。Ｍは反応によって生じた過剰なエネルギーを取り去ってオゾンを安定化する。
Ｏ（３Ｐ）＋Ｏ２＋Ｍ  →  Ｏ３＋Ｍ
【００２１】
さらにオゾンは、次式のように、ＶＵＶにより分解され、励起一重項酸素（Ｏ（１Ｄ））を生成する。
Ｏ３＋ｈν  →  Ｏ（１Ｄ）＋Ｏ２
生成した励起一重項酸素によって基材表面が酸化され、該表面に酸化チタン（ＴｉＯ２）層が生じると考えられる。
【００２２】
なお、上記した励起一重項酸素は、ＶＵＶの波長が１７５ｎｍ以下の場合、次式のように酸素分子の直接分解によっても生成される。
Ｏ２＋ｈν  →  Ｏ（１Ｄ）＋Ｏ（１Ｄ）
【００２３】
また、基材表面に水分が付着している場合、次式のようにＶＵＶと水分との反応により水酸化物イオン（ＯＨ−）が生じる。
Ｈ２Ｏ＋ｈν  →  Ｈ＋＋ＯＨ−
水酸化物イオンによっても、基材表面のチタンは酸化される。基材表面のチタンが酸化されることで、該基材表面の親水性が増加する。
【００２４】
本実施の形態に係る基材表面の酸化チタンは、すべてがアナタース構造を有するのが好ましいが、少なくとも一部がアナタース構造を有していてもよい。上述のようにＶＵＶを照射して基材表面のチタンを酸化させた場合、基材表面には、アナタース構造を有する酸化チタン及びルチル構造を有する酸化チタンが混在していると考えられる。基材表面の酸化チタンがアナタース構造であることは、例えば、ラマン分光法等で表面を分析すれば確認できる。
【００２５】
培養工程において、例えば、培地を保持する培養皿に上記基材を浸漬し、当該基材表面に細胞を播くことで、基材表面に播かれた細胞は、直接又は細胞外マトリックスを介して基材表面に接着する。細胞は、特に限定されず、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、幹細胞、ｉＰＳ細胞及び細菌等である。細胞は、プライマリ細胞でも継代された細胞株であってもよい。
【００２６】
細胞は公知の方法で培養される。培地の組成及び培養温度等の培養条件は、培養する細胞に応じて、適宜設定される。例えば、上記の培養皿をインキュベータ内に所定時間静置することで細胞を培養できる。培養時間は、細胞に応じて任意の時間でよい。
【００２７】
次に、照射工程について説明する。照射工程では、細胞の培養中に、酸化チタンが光触媒活性を示す波長域の光を上記表面に照射する。酸化チタンが光触媒活性を示す波長域は、例えば４００ｎｍ以下又は３７８．５ｎｍ以下、好ましくは、２００〜４００ｎｍ、２５０〜４００ｎｍ、３００〜４００ｎｍ、又は３５０〜４００ｎｍである。
【００２８】
照射工程における光の照射は、培養中継続してもよいし、培養時間の一部に限定してもよい。例えば、照射工程では、細胞培養における誘導期、対数増殖期又は定常期に光を照射してもよい。この場合、光の照射は、例えば、誘導期及び対数増殖期にまたがってもよいし、誘導期及び定常期であってもよい。
【００２９】
続いて、制御工程について説明する。制御工程では、上記表面に対する光の照射量を制御することで細胞の動態を制御する。光の照射量は、例えば、光の照射時間及び基材上における照度の少なくとも一方を制御することで制御できる。光の照射時間及び光の照度は、細胞に付与したい動態に応じて適宜設定すればよい。
【００３０】
ここで、酸化チタンの光触媒活性の培養細胞への影響について説明する。アナタース構造の酸化チタンにおいて、価電子帯の上端と伝導帯の下端とのエネルギー差Ｅｇ（バンドギャップ）は、３．２ｅＶである。酸化チタンが光触媒活性を示す波長域の光、例えば紫外線（Ｕｌｔｒａ  Ｖｉｏｌｅｔ、以下単に「ＵＶ」ともいう）がアナタース構造の酸化チタンに照射されると、価電子帯の電子は伝導体へと移行し、伝導体には正孔（ホール）が生じる。この結果、酸化チタン表面は、光触媒反応が可能な状態となる。
【００３１】
ＵＶが照射されている酸化チタンにおいて生じた正孔の影響により、培地中の水が酸化分解され、水酸化物イオン（ＯＨ−）が生じる。水酸化物イオンは、例えばナトリウム−カリウムポンプを駆動する細胞膜の膜たんぱく質（Ｎａ＋−ＡＴＰａｓｅ）によって細胞外に排出されたナトリウムイオン（Ｎａ＋）を還元する。また、例えば、プロトンポンプを駆動する細胞膜の膜たんぱく質（Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）によって細胞外に排出された水素イオン（Ｈ＋）を還元する。そのため、細胞外と細胞質との電位差である膜電位が減少することになる。
【００３２】
例えば、ナトリウム−カリウムポンプは細胞外に３つのナトリウムイオンを排出し、細胞質内に２つのカリウムイオン（Ｋ＋）を取り込む。このイオン濃度差によって膜電位が減少すると、細胞内へ流れる電流量も減少する。よって、細胞内でのアデノシン三リン酸の合成が抑制される。
【００３３】
上述のように、アナタース構造を有する酸化チタンを表面に備える基材にＵＶが照射されると、該表面に接着している細胞の膜電位が光触媒活性によって減少すると考えられる。このため、制御工程では、光の照射量に応じて、細胞の動態を変化させることができる。なお、光触媒活性による膜電位の減少は、酸化チタンの光触媒活性の影響の一例であって、これに限定されない。
【００３４】
本実施の形態に係る培養細胞の動態制御方法によって、例えば、細胞周期、所定時間での細胞数の増減、増殖曲線、エネルギー代謝効率及び分化のタイミング等を柔軟に変化させることができる。例えば制御工程において、光の照射量を、予備実験等により決定した照射量に制御すれば、培養細胞の所望の動態を誘導する等、培養細胞の動態を制御できる。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３６】
（酸化チタンを表面に備える基板の作成）
支持台に設置したチタン基板（幅２０ｍｍ、奥行き２０ｍｍ、厚み１ｍｍ）に、上方からＶＵＶランプから放出される波長１７２ｎｍのＶＵＶを１５分間照射し、チタン基板の表面及び表面付近に含まれるチタンを酸化させ、酸化チタンを表面に備えるチタン基板（実施例１）を作成した。ＶＵＶランプとしては、Ｘｅエキシマランプ（Ｍｉｎ−Ｅｘｃｉｍｅｒ、ＳＵＳ７１３、ウシオ電機社製）を用いた。チタン基板の表面における波長１７２ｎｍ光の照度は、１０ｍＷ／ｃｍ２であった。なお、比較例として、ＶＵＶを照射しないチタン基板（幅２０ｍｍ、奥行き２０ｍｍ、厚み１ｍｍ）も使用した。
【００３７】
（細胞培養）
図１に示すように、底の表面にフッ素コーティング１が施された培養シャーレ２内の培地３中に実施例１を浸漬し、実施例１の表面４に細胞を播種して、細胞を培養した。培養シャーレ２をインキュベータ（ＡＰＣ−３０Ｄ、アステック社製）に静置し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で６７時間培養した。培養中は、培養シャーレ２内の実施例１に室内光が当たるようにした。比較例についても同様に細胞を培養した。
【００３８】
使用した細胞は、マウス由来骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及びマウス由来筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２である。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の培地は、液体培地であるＭＥＭα（１３７−１７２１５、和光純薬試薬工業社製）を５ｍｌとした。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の播種密度は１．０×１０５細胞／ｍｌとした。一方、Ｃ２Ｃ１２の培地は、液体培地であるＤ−ＭＥＭ（０４３−３００８５、和光純薬試薬工業社製）を５ｍｌとした。Ｃ２Ｃ１２の播種密度は１．０×１０５細胞／ｍｌとした。
【００３９】
（培養した細胞の評価）
培養した細胞は、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）を用いた比色定量法で次のように評価した。評価試薬として、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（同仁化学研究所製）の試薬Ａ（ＷＳＴ−１／ＨＥＰＥＳ）及び試薬Ｂ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ）を用いた。まず、培養後の培養シャーレ２に、試薬Ａと試薬Ｂとの混合液を、５００μｌ添加した。次に、培養シャーレ２をインキュベータ内で１時間保持した。これにより、生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によって、ＷＳＴ−１がホルマザン色素に変換される。
【００４０】
その後、インキュベータから取り出した培養シャーレ２から培養液を４ｍｌ採取してキュベットに注入し、吸光度を測定した。吸光度の測定には、分光光度計Ｕ−５１００（日立製作所製）を使用した。測定波長は、４００ｎｍ、４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４３０ｎｍ、４４０ｎｍ及び４５０ｎｍとした。
【００４１】
吸光度の測定後、上記キュベットから一部採取したサンプルを吸光度計用ＰＣＲチューブに注入した。吸光度計ＰＡＳ−１１０（ウシオ電機社製）を用いて、４００〜５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
（結果）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１について、分光光度計で測定した吸光度及び吸光度計で測定した吸光度をそれぞれ図２及び図３に示す。図２によれば、実施例の４００ｎｍ及び４３０ｎｍにおける吸光度が比較例と同程度で、４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４４０ｎｍ及び４５０ｎｍにおける吸光度では、比較例よりも実施例１が低かった。図３に示すように、実施例１の４００〜５４０ｎｍの吸光度は、比較例よりも低かった。
【００４３】
同様に、Ｃ２Ｃ１２について、分光光度計で測定した吸光度及び吸光度計で測定した吸光度をそれぞれ図４及び図５に示す。図４に示すように、分光光度計で測定した吸光度は、すべての波長において実施例が比較例よりも低かった。また、図５に示すように、実施例１の４００〜５４０ｎｍの吸光度は、比較例よりも低かった。
【００４４】
以上の結果から、実施例１に接着させて培養した細胞におけるミトコンドリアの脱水素酵素の量が、比較例に接着させて培養した細胞におけるミトコンドリアの脱水素酵素の量よりも小さいことが示された。よって、実施例１に接着させて培養した細胞の動態が、比較例に接着させて培養した細胞と相違していると考えられる。これは、細胞培養中に実施例１及び比較例に照射されている室内光に含まれる酸化チタンが光触媒活性を示す波長域の光によって光触媒反応が発生し、実施例１に接着させて培養した細胞の膜電位が減少した影響であると考えられる。
【００４５】
本実施例に示したように、アナタース構造を有し、光触媒能を有する酸化チタン層を表面に備える基板の該酸化チタン層の表面で細胞を培養する際、細胞培養中に酸化チタン層の表面に光を照射して光触媒反応を起こさせることで、上記培養細胞の動態を変化させることが可能となる。すなわち、上記基板上での細胞培養中に、上記酸化チタン層表面への酸化チタンが光触媒活性を示す波長域の光の照射時間又は照度を制御することにより、培養細胞の動態を制御することが可能になる。
【００４６】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【符号の説明】
【００４７】
１  フッ素コーティング
２  培養シャーレ
３  培地
４  表面
【図１】
2018078816.tif 000003
【図２】
2018078816.tif 000004
【図３】
2018078816.tif 000005
【図４】
2018078816.tif 000006
【図５】
2018078816.tif 000007