(57)【要約】【課題】内科的治療が有効である心不全患者と、内科的治療が有効でない心不全患者を識別する技術を提供する。【解決手段】心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法であって、上記心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞中のミトコンドリアのサイズを測定する工程、上記心筋細胞中のミトコンドリアの密度を測定する工程、又は上記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子若しくはタンパク質の発現量を測定する工程を備える方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法であって、前記心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞中のミトコンドリアのサイズを測定する工程、前記心筋細胞中のミトコンドリアの密度を測定する工程、又は前記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子若しくはタンパク質の発現量を測定する工程を備える方法。
【請求項２】
心不全患者に由来する心筋生検試料の厚さ５０〜２００ｎｍの切片を用いて心筋細胞中のミトコンドリアの面積を測定し、前記ミトコンドリアの平均面積が０．２７μｍ２／個以上であれば内科的治療が有効であり、前記平均面積が０．２１μｍ２／個以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、前記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法。
【請求項３】
心不全患者に由来する心筋生検試料の厚さ５０〜２００ｎｍの切片を用いて心筋細胞中のミトコンドリアの平均密度を測定し、前記ミトコンドリアの平均密度が０．４個／μｍ２以上であれば内科的治療が有効であり、前記平均密度が０．３個／μｍ２以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、前記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法。
【請求項４】
心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量を測定し、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ６Ａ１（ＣＯＸ６Ａ１）遺伝子の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の相対値が０．７以上であれば内科的治療が有効であり、前記相対値が０．５以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、前記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法。
【請求項５】
Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質に対する特異的結合物質、
Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又は
Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡに相補的なプローブ、
を備える、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法に関する。より詳細には、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法、及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
重症心不全は予後が不良な疾患である。心不全については、心筋におけるエネルギー代謝の変化（心筋代謝リモデリング）が生じることにより、病態が促進することが明らかにされているが、その分子機序の多くは謎である（例えば、非特許文献１を参照。）。
【０００３】
心不全患者に対しては、β遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬等を投与する、内科的治療が標準的に行われている。内科的治療により、心不全患者の予後が改善される場合がある一方で、中には内科的治療が奏功しない患者群が存在し、これらの患者は予後が非常に不良である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Neubauer S., The failing heart - an engine out of fuel., N. Engl. J. Med., 356 (11), 1140-1151, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来、内科的治療が有効である心不全患者（レスポンダー）と、内科的治療が有効でない心不全患者（ノンレスポンダー）を識別する方法は存在しない。そこで、本発明は、内科的治療が有効である心不全患者と、内科的治療が有効でない心不全患者を識別する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法であって、上記心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞中のミトコンドリアのサイズを測定する工程、上記心筋細胞中のミトコンドリアの密度を測定する工程、又は上記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子若しくはタンパク質の発現量を測定する工程を備える方法。
［２］心不全患者に由来する心筋生検試料の厚さ５０〜２００ｎｍの切片を用いて心筋細胞中のミトコンドリアの面積を測定し、前記ミトコンドリアの平均面積が０．２７μｍ２／個以上であれば内科的治療が有効であり、前記平均面積が０．２１μｍ２／個以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、前記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法。
［３］心不全患者に由来する心筋生検試料の厚さ５０〜２００ｎｍの切片を用いて心筋細胞中のミトコンドリアの平均密度を測定し、前記ミトコンドリアの平均密度が０．４個／μｍ２以上であれば内科的治療が有効であり、前記平均密度が０．３個／μｍ２以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、前記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法。
［４］心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量を測定し、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ６Ａ１（ＣＯＸ６Ａ１）遺伝子の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の相対値が０．７以上であれば内科的治療が有効であり、前記相対値が０．５以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、前記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法。
［５］Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質に対する特異的結合物質、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又はＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡに相補的なプローブ、を備える、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、内科的治療が有効である心不全患者と、内科的治療が有効でない心不全患者を識別する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１の結果を示す代表的な電子顕微鏡写真である。
【図２】実験例１の結果を示すグラフである。
【図３】実験例２の結果を示すグラフである。
【図４】実験例３の結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［データ収集方法］
１実施形態において、本発明は、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのデータを収集する方法であって、上記心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞中のミトコンドリアのサイズを測定する工程、上記心筋細胞中のミトコンドリアの密度を測定する工程、又は上記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子若しくはタンパク質の発現量を測定する工程を備える方法を提供する。本実施形態の方法は、患者の身体状態、治療計画について医療上の判断を行う工程を含まない。
【００１０】
実施例において後述するように、発明者らは、心不全患者に由来する心筋細胞中のミトコンドリアのサイズ、上記心筋細胞中のミトコンドリアの密度、上記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量、又は上記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量の測定値に基づいて、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測することができることを明らかにした。
【００１１】
したがって、本実施形態の方法により、内科的治療が有効である心不全患者と、内科的治療が有効でない心不全患者を識別するためのデータを得ることができる。すなわち、心筋細胞中のミトコンドリアのサイズ、心筋細胞中のミトコンドリアの密度、心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子若しくはタンパク質の発現量は、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのデータであるということができる。
【００１２】
そして、ミトコンドリアのサイズ、ミトコンドリアの密度、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量又はＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量が、所定の基準値よりも大きい場合には、心不全患者に対する内科的治療が有効であると判断することができ、基準値よりも小さい場合には、心不全患者に対する内科的治療が有効でないと判断することができる。
【００１３】
ミトコンドリアのサイズ、ミトコンドリアの密度、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量から選択されるパラメータの測定は、いずれか１つを単独で行ってもよいし、いずれか２つ以上を組み合わせて行ってもよい。複数のパラメータを組み合わせて測定し、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを総合的に判断することにより、より正確な予測が可能になる。
【００１４】
複数のパラメータを組み合わせて測定する場合、それぞれの測定値をスコア化し、合計スコアにより心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを総合的に判断してもよい。
【００１５】
本実施形態の方法により収集されたデータに基づいて、内科的治療が有効であると予測された患者には、内科的治療を行うことが効果的である。一方、内科的治療が有効でないと予測された患者には、内科的治療ではなく、心臓移植や人工心臓の装着を早期に行うことを検討する必要がある。
【００１６】
従来は、内科的治療が有効である心不全患者と、内科的治療が有効でない心不全患者を識別する方法が存在しなかった。このため、心不全患者が、内科的治療が有効でない患者であった場合、予後が非常に不良であった。これに対し、本実施形態の方法により、より効果的な治療法を早期に選択することが容易になる。
【００１７】
内科的治療としては、例えば、β遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬等を投与する治療が挙げられる。
【００１８】
［心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法］
１実施形態において、本発明は、心不全患者に由来する心筋生検試料の厚さ５０〜２００ｎｍの切片を用いて心筋細胞中のミトコンドリアの面積を測定し、上記ミトコンドリアの平均面積が０．２７μｍ２／個以上、例えば０．２７７μｍ２／個以上、例えば０．２７〜１．０μｍ２／個、例えば０．２７７〜１．０μｍ２／個であれば内科的治療が有効であり、上記平均面積が０．２１μｍ２／個以下、例えば０．２０６μｍ２／個以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、上記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法を提供する。
【００１９】
本実施形態の方法において、ミトコンドリアの面積は、心筋生検試料の切片の電子顕微鏡画像に基づいて測定してもよい。また、心筋生検試料の切片の厚さは、例えば５０〜１００ｎｍであってもよく、例えば７０〜９０ｎｍであってもよい。
【００２０】
本実施形態の方法は、人体から収集された試料又はデータを用いて基準と比較する分析を行うものである。
【００２１】
実施例において後述するように、発明者らは、心不全患者に由来する心筋細胞中のミトコンドリアのサイズに基づいて、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の方法により、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験することができる。
【００２２】
ミトコンドリアのサイズとしては、例えば、心筋生検試料の薄切切片を用いて測定された、ミトコンドリア１個あたりの面積が挙げられる。この面積は、ミトコンドリア１個あたりの平面視における投影面積であるということもできる。あるいは、ミトコンドリアのサイズとして、ミトコンドリア１個あたりの体積を用いてもよい。
【００２３】
ミトコンドリアのサイズの平均値を算出する場合、患者１人あたり１００個以上、例えば２００個以上のミトコンドリアのサイズを測定し、平均値を算出することが好ましい。また、平均値は、相加平均であることが好ましい。
【００２４】
１実施形態において、本発明は、心不全患者に由来する心筋生検試料の厚さ５０〜２００ｎｍの切片を用いて心筋細胞中のミトコンドリアの平均密度を測定し、上記ミトコンドリアの平均密度が０．４個／μｍ２以上、例えば０．４４個／μｍ２以上、例えば０．４〜１．０個／μｍ２、例えば０．４４〜１．０個／μｍ２であれば内科的治療が有効であり、上記平均密度が０．３個／μｍ２以下、例えば０．２９個／μｍ２以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、上記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法を提供する。
【００２５】
本実施形態の方法において、ミトコンドリアの密度は、心筋生検試料の切片の電子顕微鏡画像に基づいて測定してもよい。また、心筋生検試料の切片の厚さは、例えば５０〜１００ｎｍであってもよく、例えば７０〜９０ｎｍであってもよい。
【００２６】
本実施形態の方法は、人体から収集された試料又はデータを用いて基準と比較する分析を行うものである。
【００２７】
実施例において後述するように、発明者らは、心不全患者に由来する心筋細胞中のミトコンドリアの平均密度に基づいて、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の方法により、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験することができる。
【００２８】
ミトコンドリアの平均密度としては、例えば、心筋生検試料の薄切切片を用いて測定された、単位面積あたりのミトコンドリアの数が挙げられる。あるいは、ミトコンドリアの平均密度として、例えば患者由来の心筋細胞中の単位体積あたりのミトコンドリアの数を用いてもよい。また、平均値は、相加平均であることが好ましい。
【００２９】
１実施形態において、本発明は、心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量を測定し、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の相対値が０．７以上であれば内科的治療が有効であり、上記相対値が０．５以下であれば内科的治療が有効でないという基準と比較することにより、上記心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験する方法を提供する。
【００３０】
実施例において後述するように、発明者らは、心不全患者に由来する心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子又はタンパク質の発現量に基づいて、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の方法により、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを試験することができる。
【００３１】
上記の基準において、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量は、各細胞において発現量のばらつきが少ないと考えられるハウスキーピング遺伝子の代表的なものとして使用している。しかしながら、ハウスキーピング遺伝子はこれに限定されず、例えば、β−アクチン遺伝子、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素遺伝子等の他の遺伝子を使用してもよい。その場合、使用したハウスキーピング遺伝子の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の相対値に基づいて内科的治療が有効であるか否かを判断する基準値は適宜調整すればよい。
【００３２】
あるいは、例えば、測定したハウスキーピング遺伝子がＣＯＸ６Ａ１以外の遺伝子であった場合であっても、測定したハウスキーピング遺伝子の発現量と、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量の比に基づいて、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の相対値を算出することができる。そして、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の相対値が０．７以上であれば内科的治療が有効であり、上記相対値が０．５以下であれば内科的治療が有効でないと判断することができる。
【００３３】
また、ハウスキーピング遺伝子及びＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量は、タンパク質レベルで測定することもできる。その場合、ハウスキーピング遺伝子にコードされるタンパク質の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量の相対値に基づいて内科的治療が有効であるか否かを判断する基準値は適宜調整すればよい。
【００３４】
ヒトＣＯＸ６Ａ１遺伝子ｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００４３７３である。また、ヒトＣＯＸ６Ａ１タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿００４３６４である。
【００３５】
Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質は、ミトコンドリアの融合に不可欠な分子であることが知られている。ヒトＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿０３３５４０である。また、ヒトＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿２８４９４１である。
【００３６】
Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子及びＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量は、例えばリアルタイムＰＣＲにより測定してもよく、例えばＤＮＡアレイ等を用いて測定してもよく、例えばノーザンブロッティング等により測定してもよい。
【００３７】
また、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質及びＣＯＸ６Ａ１タンパク質の発現量は、例えば、心筋組織切片の免疫染色により測定してもよく、例えば、ＥＬＩＳＡ法により測定してもよく、例えば、ウエスタンブロッティング法等により測定してもよい。
【００３８】
なお、発明者らは、心不全患者に由来する心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−２遺伝子又はタンパク質の発現量は、内科的治療が有効である心不全患者（レスポンダー）と内科的治療が有効でない心不全患者（ノンレスポンダー）との間で差がないことを明らかにした。
【００３９】
［キット］
１実施形態において、本発明は、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質に対する特異的結合物質、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又はＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡに相補的なプローブ、を備える、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測するためのキットを提供する。
【００４０】
実施例において後述するように、発明者らは、心不全患者に由来する心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子又はタンパク質の発現量に基づいて、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測することができることを明らかにした。
【００４１】
本実施形態のキットは、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子又はタンパク質の発現量に基づいて心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測又は試験するために、好適に用いることができる。
【００４２】
（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【００４３】
上記の抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
【００４４】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００４５】
（プライマーセット）
Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットは、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ等により増幅することができるものであれば特に制限されず、例えば、配列番号１に示すセンスプライマー及び配列番号２に示すアンチセンスプライマーからなるプライマーセット等が挙げられる。
【００４６】
Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡは、上述したＩＤで特定されるＲｅｆＳｅｑデータベースのエントリーに記載された塩基配列を有している。なお、ｍＲＮＡにはスプライシングバリアント等が存在する場合があるため、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡは上述したＲｅｆＳｅｑ  ＩＤで特定されるものに限られるものではない。
【００４７】
例えば、被検者由来の心筋生検試料を用い、本プライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ等を行うことにより、試料中のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡを検出又は定量することができる。
【００４８】
（プローブ）
プローブとしては、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。例えば、上記のＤＮＡマイクロアレイに、被検者由来の心筋生検試料から抽出したｍＲＮＡを接触させ、プローブにハイブリダイズしたＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かの予測、又は心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かの試験を行うことができる。
【００４９】
本実施形態のキットは、ハウスキーピング遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、ハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又はハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡに相補的なプローブ、を更に備えていてもよい。ハウスキーピング遺伝子としては、上述したものと同様であり、例えば、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子が挙げられる。
【００５０】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを診断する方法であって、上記心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞中のミトコンドリアのサイズを測定する工程、上記心筋細胞中のミトコンドリアの密度を測定する工程、又は上記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子若しくはタンパク質の発現量を測定する工程を備える方法を提供する。
【００５１】
１実施形態において、本発明は、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを診断する方法であって、上記心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞中のミトコンドリアのサイズを測定する工程を備え、上記生検試料の厚さ５０〜２００ｎｍの切片を用いて測定された、上記ミトコンドリアの平均面積が０．２７μｍ２／個以上であれば内科的治療が有効であり、上記平均面積が０．２１μｍ２／個未満であれば内科的治療が有効でないと診断する方法を提供する。
【００５２】
１実施形態において、本発明は、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを診断する方法であって、上記心筋細胞中のミトコンドリアの密度を測定する工程を備え、上記生検試料の厚さ５０〜２００ｎｍの切片を用いて測定された、上記ミトコンドリアの平均密度が０．４個／μｍ２以上であれば内科的治療が有効であり、上記平均密度が０．３個／μｍ２未満であれば内科的治療が有効でないと診断する方法を提供する。
【００５３】
１実施形態において、本発明は、心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを診断する方法であって、上記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量を測定する工程を備え、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の相対値が０．７以上であれば内科的治療が有効であり、上記相対値が０．５未満であれば内科的治療が有効でないと診断する方法を提供する。
【００５４】
上記のいずれかの実施形態において、心不全患者に対する内科的治療が有効であると診断された場合には、内科的治療を行うことが効果的である。内科的治療としては、上述したもの等が挙げられる。また、心不全患者に対する内科的治療が有効でないと診断された場合には、心臓移植や人工心臓の装着を早期に行うことが効果的である。
【００５５】
１実施形態において、本発明は、心不全患者の治療方法であって、上記心不全患者に由来する心筋生検試料中の心筋細胞中のミトコンドリアのサイズに基づいて心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを診断する工程、上記心筋細胞中のミトコンドリアの密度に基づいて心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを診断する工程、又は上記心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子若しくはタンパク質の発現量に基づいて心不全患者に対する内科的治療が有効であるか否かを診断する工程を備え、心不全患者に対する内科的治療が有効であると診断された場合には内科的治療を行い、心不全患者に対する内科的治療が有効でないと診断された場合には心臓移植又は人工心臓の装着を行う方法を提供する。
【実施例】
【００５６】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５７】
［実験例１］
（ミトコンドリアのサイズの検討）
新潟大学医歯学総合病院循環器内科に入院した心不全患者のうち、２０１２〜２０１４年の間に、心臓超音波検査、心臓カテーテル検査及び心筋生検を行い、且つ、内科的治療を開始してから半年から１年後に、心臓超音波検査を再度行って心機能を再確認した患者を対象とした。
【００５８】
対象とした患者のうち、心機能の再確認時の心臓超音波検査において、心臓の収縮能（Ｅｊｅｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＥＦ）と左室拡張末期径が、いずれも１０％以上改善した患者をレスポンダー（内科的治療が有効である心不全患者）と定義し、心臓の収縮能と左室拡張末期径が、いずれも１０％未満の改善しか示さなかった患者をノンレスポンダー（内科的治療が有効でない心不全患者）と定義した。
【００５９】
対象とした患者の心筋生検試料をパラホルムアルデヒド固定してパラフィン包埋後、厚さ７０〜９０ｎｍの薄切切片を作製した。続いて透過電子顕微鏡（型式「ＪＥＭ１４００」、日本電子株式会社製）を用いて倍率１０００倍で心筋細胞の長軸像を観察した。続いて、最もミトコンドリアが密集していた領域を倍率２５００倍で観察し、ミトコンドリアのサイズ（面積）を測定した。なお、倍率２５００倍で観察した場合、１視野の面積は１０.２×１０.２μｍであった。患者１人あたり２００個以上のミトコンドリアについて面積を測定し、平均値を算出した。
【００６０】
図１（ａ）は、レスポンダー群（Ｒｅｓ）の患者の心筋生検試料の薄切切片の代表的な電子顕微鏡写真である。倍率は２５００倍である。スケールバーは２ｐｍを示す。図１（ｂ）は、ノンレスポンダー群（Ｎｏｎ−Ｒｅｓ）の患者の心筋生検試料の薄切切片の代表的な電子顕微鏡写真である。倍率は２５００倍である。スケールバーは２ｐｍを示す。
【００６１】
図２は、レスポンダー群（Ｒｅｓ）及びノンレスポンダー群（Ｎｏｎ−Ｒｅｓ）の患者の心筋細胞中のミトコンドリア１個あたりの平均面積の測定結果を示すグラフである。図２中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【００６２】
その結果、レスポンダー群の患者のミトコンドリア１個あたりの平均面積は０．２７７μｍ２であり、ノンレスポンダー群の患者のミトコンドリア１個あたりの平均面積は、０．２０６μｍ２であり、これらの値には有意差があることが明らかとなった。すなわち、心不全患者由来の心筋細胞中のミトコンドリアのサイズを測定することにより、その患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測することができることが明らかとなった。
【００６３】
［実験例２］
（ミトコンドリアの密度の検討）
実験例１で撮影した電子顕微鏡写真を用いて、単位面積あたりのミトコンドリアの数、すなわち、ミトコンドリアの平均密度を測定した。実験例１と同様にして、最もミトコンドリアが密集していた領域を倍率２５００倍で観察し、単位面積当たりのミトコンドリアの数（密度）を測定した。なお、倍率２５００倍で観察した場合、１視野の面積は１０.２×１０.２μｍであった。患者１人あたり５視野以上の領域について、ミトコンドリアの密度を測定し、平均値を算出した。
【００６４】
図３は、レスポンダー群（Ｒｅｓ）及びノンレスポンダー群（Ｎｏｎ−Ｒｅｓ）の患者の心筋細胞中のミトコンドリアの平均密度の測定結果を示すグラフである。図３中、「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。
【００６５】
その結果、レスポンダー群の患者のミトコンドリアの平均密度は０．４４個／μｍ２であり、ノンレスポンダー群の患者のミトコンドリアの平均密度は０．２９個／μｍ２であり、これらの値には有意差があることが明らかとなった。すなわち、心不全患者由来の心筋細胞中のミトコンドリアの平均密度を測定することにより、その患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測することができることが明らかとなった。
【００６６】
［実験例３］
（Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の検討）
実験例１の対象患者由来の心筋生検試料から全ＲＮＡ（最大５μｇ）を抽出しｃＤＮＡを合成した。続いて、リアルタイムＰＣＲ装置（型式「Ｌｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ」、ロシュ社）を用いて定量的ＰＣＲを行い、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子及びＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量を測定した。
【００６７】
Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のｃＤＮＡの増幅には配列番号１に示すセンスプライマー及び配列番号２に示すアンチセンスプライマーを用いた。また、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子のｃＤＮＡの増幅には配列番号３に示すセンスプライマー及び配列番号４に示すアンチセンスプライマーを用いた。測定されたＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量は、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量で基準化した。
【００６８】
図４は、レスポンダー群（Ｒｅｓ）及びノンレスポンダー群（Ｎｏｎ−Ｒｅｓ）の患者の心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の測定結果を示すグラフである。図４中、「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。
【００６９】
本実験例の結果から、ＣＯＸ６Ａ１遺伝子の発現量を１とした場合のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の発現量の相対値が０．７以上であれば内科的治療が有効であり、前記相対値が０．５以下であれば内科的治療が有効でないと判断できると計算された。
【００７０】
あるいは、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子の（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）Ｃｔ値からＣＯＸ６Ａ１遺伝子のＣｔ値を引いた値（以下、「α」とする。）から更に０．５２６２５（レスポンダー群におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１遺伝子のＣｔ値からＣＯＸ６Ａ１遺伝子のＣｔ値を引いた値の平均値）を引き（α−０．５２６２５、以下「β」とする。）、２のマイナスβ乗（２−β）により得られた計算値が１以上であれば内科的治療が有効であり、上記計算値が０．７５未満であれば内科的治療が有効でないということもできる。
【００７１】
なおＣｔ値とは、定量的ＰＣＲにおいて、閾値と増幅曲線が交わる点におけるＰＣＲサイクル数である。
【００７２】
［実験例４］
（Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量の検討）
実験例１の対象患者由来の心筋生検試料をパラホルムアルデヒド固定してパラフィン包埋後、厚さ７０〜９０ｎｍの薄切切片を作製した。続いて、抗Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質抗体を用いた免疫染色により、Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量を検討した。
【００７３】
図５（ａ）は、レスポンダー群（Ｒｅｓ）の患者の心筋生検試料の薄切切片の代表的な蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図５（ｂ）は、ノンレスポンダー群（Ｎｏｎ−Ｒｅｓ）の患者の心筋生検試料の薄切切片の代表的な蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。
【００７４】
その結果、レスポンダー群の患者の心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量は、ノンレスポンダー群の患者の心筋細胞におけるＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量と比較して顕著に高いことが明らかとなった。
【００７５】
すなわち、心不全患者由来の心筋細胞中のＭｉｔｏｆｕｓｉｎ−１タンパク質の発現量を測定することにより、その患者に対する内科的治療が有効であるか否かを予測することができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、内科的治療が有効である心不全患者と、内科的治療が有効でない心不全患者を識別する技術を提供することができる。
【図１】
2018027048.tif 000002
【図２】
2018027048.tif 000003
【図３】
2018027048.tif 000004
【図４】
2018027048.tif 000005
【図５】
2018027048.tif 000006
【配列表】
2018027048000001.app