(57)【要約】      （修正有）【課題】新規メラノーマ治療法の提供。【解決手段】抗エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）抗体及びＭＡＰキナーゼ阻害剤の治療的組み合わせ、及びそれを使用し、メラノーマに罹患している被験体における腫瘍増殖阻外する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体へ抗エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）抗体の有効量をＭＡＰキナーゼ阻害剤の有効量と組み合わせて投与することを含む、メラノーマに罹患している被験体における腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の方法。
【請求項２】
前記組み合わせは相乗的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＧＩは、抗ＥＴＢＲ抗体単独を使用して観察されるＴＧＩよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＧＩは、ＭＡＰキナーゼ阻害剤単独を使用して観察されるＴＧＩよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＴＧＩは、抗ＥＴＢＲ抗体単独の使用よりも約１０％を超えて、又は約１５％を超えて、又は約２０％を超えて、又は約２５％を超えて、又は約３０％を超えて、又は約３５％を超えて、又は約４０％を超えて、又は約４５％を超えて、又は約５０％を超えて、又は約５５％を超えて、又は約６０％を超えて、又は約６５％を超えて、又は約７０％を超えて大きい、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＩは、ＭＡＰキナーゼ阻害剤単独の使用よりも約１０％を超えて、又は約１５％を超えて、又は約２０％を超えて、又は約２５％を超えて、又は約３０％を超えて、又は約３５％を超えて、又は約４０％を超えて、又は約４５％を超えて、又は約５０％を超えて、又は約５５％を超えて、又は約６０％を超えて、又は約６５％を超えて、又は約７０％を超えて大きい、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＶＬは配列番号８である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は細胞毒素にコンジュゲートする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞毒素は毒素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記毒素はメイタンシノイドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有する、請求項１６に記載の方法。
2018027948.tif 000039
【請求項１９】
前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＭＥＫ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する、請求項１９に記載の方法。
2018027948.tif 000040
【請求項２２】
ＭＡＰキナーゼ阻害剤及び抗ＥＴＢＲ抗体の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含むメラノーマを治療する方法。
【請求項２３】
前記組み合わせは相乗的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＧＩは、抗ＥＴＢＲ抗体単独を使用して観察されるＴＧＩよりも大きい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＧＩは、ＭＡＰキナーゼ阻害剤単独を使用して観察されるＴＧＩよりも大きい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＴＧＩは、抗ＥＴＢＲ抗体単独の使用よりも約１０％を超えて、又は約１５％を超えて、又は約２０％を超えて、又は約２５％を超えて、又は約３０％を超えて、又は約３５％を超えて、又は約４０％を超えて、又は約４５％を超えて、又は約５０％を超えて、又は約５５％を超えて、又は約６０％を超えて、又は約６５％を超えて、又は約７０％を超えて大きい、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＴＧＩは、ＭＡＰキナーゼ阻害剤単独の使用よりも約１０％を超えて、又は約１５％を超えて、又は約２０％を超えて、又は約２５％を超えて、又は約３０％を超えて、又は約３５％を超えて、又は約４０％を超えて、又は約４５％を超えて、又は約５０％を超えて、又は約５５％を超えて、又は約６０％を超えて、又は約６５％を超えて、又は約７０％を超えて大きい、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに特異的に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＶＬは配列番号８である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は細胞毒素にコンジュゲートする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞毒素は毒素である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記毒素はメイタンシノイドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有する、請求項３７に記載の方法。
2018027948.tif 000041
【請求項４０】
前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＭＥＫ阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する、請求項４０に記載の方法。
2018027948.tif 000042
【請求項４３】
前記メラノーマはＥＴＢＲ陽性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４４】
前記メラノーマは転移性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験体は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤による事前の治療を受けていない、請求項２２に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験体は、Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ遺伝子変異を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験体はＶ６００Ｅ野生型である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４８】
ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、それを必要とする被験体に最初に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は、前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤の投与後に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項５０】
抗ＥＴＢＲ抗体及びＭＡＰキナーゼ阻害剤が同時に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項５１】
抗ＥＴＢＲ抗体及びＭＡＰキナーゼ阻害剤が逐次に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項５２】
抗ＥＴＢＲ抗体は最初に被験体に投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、抗ＥＴＢＲ抗体の投与後に被験体に投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＭＡＰキナーゼ阻害剤は最初に被験体に投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤の投与後に被験体に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は静脈内に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗ＥＴＢＲ抗体が、約０．１ｍｐｋ、又は約０．２ｍｐｋ、又は約０．３ｍｐｋ、又は約０．５ｍｐｋ、又は約１ｍｐｋ、又は約５ｍｐｋ、又は約１０ｍｐｋ、又は約１５ｍｐｋ、又は約２０ｍｐｋ、又は約２５ｍｐｋ、又は約３０ｍｐｋで投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項５８】
ＭＡＰキナーゼ阻害剤は経口投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項５９】
ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、約１ｍｐｋ、又は約２ｍｐｋ、又は約３ｍｐｋ、又は約４ｍｐｋ、又は約５ｍｐｋ、又は約６ｍｐｋ、又は約７ｍｐｋ、又は約８ｍｐｋ、又は約９ｍｐｋ、又は約１０ｍｐｋ、又はｍｐｋ約１１、又は約１２ｍｐｋ、又は約１５ｍｐｋ、又は約２０ｍｐｋ又は約３０ｍｐｋで投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項６０】
抗ＥＴＢＲ抗体組成物及びＭＡＰキナーゼ阻害剤組成物を含むパッケージを含む、メラノーマに罹患した被験体におけるＴＧＩのための製造品。
【請求項６１】
抗ＥＴＢＲ抗体組成物及びＭＡＰキナーゼ阻害剤組成物を含むパッケージを含む、被験体においてメラノーマを治療するための製造品。
【請求項６２】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに特異的に結合する、請求項６０又は６１に記載の製造品。
【請求項６３】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６である、請求項６０又は６１に記載の製造品。
【請求項６４】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、前記ＶＨは配列番号７又は９である、請求項６０又は６１に記載の製造品。
【請求項６５】
前記ＶＬは配列番号８である、請求項６４に記載の製造品。
【請求項６６】
前記抗ＥＴＢＲ抗体は細胞毒素にコンジュゲートする、請求項６０又は６１に記載の製造品。
【請求項６７】
前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物である、請求項６６に記載の製造品。
【請求項６８】
前記細胞毒素は毒素である、請求項６７に記載の製造品。
【請求項６９】
前記毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される、請求項６８に記載の製造品。
【請求項７０】
前記毒素はメイタンシノイドである、請求項６９に記載の製造品。
【請求項７１】
前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤である、請求項６０又は６１に記載の製造品。
【請求項７２】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである、請求項７１に記載の製造品。
【請求項７３】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有する、請求項７１に記載の製造品。
2018027948.tif 000043
【請求項７４】
前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＭＥＫ阻害剤である、請求項６０又は６１に記載の製造品。
【請求項７５】
前記ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである、請求項７４に記載の製造品。
【請求項７６】
前記ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する、請求項７４に記載の製造品。
2018027948.tif 000044
【請求項７７】
メラノーマのＴＧＩのための医薬の調製における、請求項６０又は６１に記載の製造品の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
この出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１１年１０月２８日に提出された米国仮出願番号６１／５５２，８９３、及び２０１２年８月２日に出願された米国仮出願番号６１／６７８，９７８の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、特定の抗体及び小分子薬物の組み合わせを使用することによるメラノーマの治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
メラノーマは、発生率が驚くべき増加をたどっている皮膚癌の高悪性度の形態である(Thompson JF et al., Cutaneous melanoma in the era of molecular profiling. Lancet 2009;374:362−5)。治癒は、局所化した病変の外科的切除によって達成することができるが、メラノーマの進行期では現在承認され治療法にはわずかに応答するだけである。ステージＩＶの転移性メラノーマの５年生存率は約１０％である(Thompson, Lancet 2009)。Ｂｃｌ２に対するアンチセンス、ＣＴＬＡ４に対する抗体、小分子ＲＡＦキナーゼ阻害剤、及び養子免疫療法を含む新しい治療アプローチは、転移性メラノーマの臨床試験に入っている(Ascierto PA et al., Melanoma: a model for testing new agents in combination therapies. J Transl Med 2010;8:38-45)。これらの最近の研究の幾つかからの結果は有望であるように見えるが、全生存に対する永続的効果のためには、追加の新しい薬剤を含む治療の組み合わせを必要とし得る。
【０００４】
しかしながら、メラノーマは、例えば、成長因子に対する細胞の応答に必要な特定のシグナル伝達経路において分子変異を示すことができることが認識されている。従って、単一の疾患としてのメラノーマの治療よりも、最も適切な治療法により各サブタイプを治療するために、それを分子サブタイプに階層化する試みがなされている。
【０００５】
メラノーマのサブタイプの一つは、ＭＡＰキナーゼ経路における異常を有する。ＭＡＰＫ経路は、細胞表面受容体への成長因子の結合に対する細胞内応答に連結するリン酸化駆動型シグナル伝達カスケードである。この経路は、細胞の増殖及び分化を含むいくつかのプロセスを調節し、多くの場合、種々の癌において調節不全にされる(Sebolt-Leopold JS, Herrera R. 癌を治療するために、マイトジェン活性化プロテインキナーゼカスケードを標的とする（Targeting the mitogen-activated protein kinase cascade to treat cancer.） Nat Rev Cancer. 2004;4:937-947)。古典的ＭＡＰＫ経路は、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ及びＥＲＫからなり、ここでＲＡＳは、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼ複合体の形成を誘発し、次いで、タンパク質リン酸化を介して重要な制御因子の転写を駆動する。経路の重要なタンパク質を標的とした薬剤によるＭＡＰＫの阻害は、種々な腫瘍タイプの増殖を阻害する可能性を有する（Wong K-K et al., Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を標的とする抗癌剤における最近の進歩（Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/MEK/ERK pathway. )Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2009;4:28-35。
【０００６】
ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の不適切な活性化は、外因性成長因子の非存在下において細胞増殖を促進する。ＧＤＣ−０９７３（別名ＸＬ５１８）は、ＥＲＫ１／２を活性化するＭＡＰＫキナーゼであるＭＥＫ１／２の強力かつ高度に選択的な小分子阻害剤である（Johnston S. ＸＬ５１８は、強力で、選択的な、経口的に生物学的に利用可能なＭＥＫ１阻害剤であり、インビボでＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を下方制御し、前臨床モデルにおいて腫瘍増殖阻害及び退縮をもたらす。(XL518, a potent, selective, orally bioavailable MEK1 inhibitor, downregulates the Ras/Raf/MEK/ERK pathway in vivo, resulting in tumor growth inhibition and regression in preclinical models.)）: AACR-NCI-EORTC 分子標的及び癌治療に関するシンポジウム(Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics); 2007年10月22日; サンフランシスコ、カリフォルニア州。要旨C209にて発表）。その結果、細胞表面、Ｒａｓ及びＲａｆからＥＲＫへの発癌性シグナルは中断される。ＥＲＫ活性化の持続的阻害は、増殖の減少及びアポトーシスの誘導につながる。多数の前臨床試験において、ＧＤＣ−０９７３は、細胞増殖を阻害し、腫瘍退縮を誘導することが示されている。
【０００７】
近年、Ｂ−Ｒａｆの酵素阻害剤であり、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標）として知られるベムラフェニブは、後期メラノーマの治療のために米国食品医薬品局によって承認された。ベムラフェニブはメラノーマ細胞株においてプログラムされた細胞死を引き起こすことが示されている（Sala E, et al., ショートヘアピンＲＮＡ又はＰＬＸ４０３２による化学的遮断によるＢＲＡＦサイレンシングはメラノーマおよび甲状腺癌細胞において異なる応答をもたらす。(BRAF silencing by short hairpin RNA or chemical blockade by PLX4032 leads to different responses in melanoma and thyroid carcinoma cells.) Mol. Cancer Res. 6 (5): 751-9 (2008年5月)。ベムラフェニブは、Ｂ−Ｒａｆが共通のＶ６００Ｅ変異を有する場合、Ｂ−Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路上Ｂ−Ｒａｆ／ＭＥＫステップを中断する。ベムラフェニブは、癌がＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有する（すなわち、Ｂ−ＲＡＦタンパク質上のアミノ酸位置番号６００において、通常のバリンがグルタミン酸により置換される）メラノーマ患者に有効である。メラノーマの約６０％は、Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有する。この変異を持たないメラノーマ細胞は、ベムラフェニブによって阻害されるようには見えず；それは逆説的に正常なＢＲＡＦを刺激し、腫瘍増殖を促進することができる（Hatzivassiliou G et al., ＲＡＦ阻害剤は野生型ＲＡＦを刺激し、ＭＡＰＫ経路を活性化および増殖を高める。(RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.) Nature 464 (7287): 431-5; Halaban R et al., ＰＬＸ４０３２、選択的ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）キナーゼ阻害剤は、ＥＲＫ経路を活性化し、細胞遊走およびＢＲＡＦ（ＷＴ）メラノーマ細胞の増殖を高める。（PLX4032, a Selective BRAF (V600E) Kinase Inhibitor, Activates the ERK Pathway and Enhances Cell Migration and Proliferation of BRAF(WT) Melanoma Cells. )Pigment Cell Melanoma Res 23 (2): 190-200 (2010年2月)。臨床試験では、ＤＴＩＣと比較してベムラフェニブで治療された患者の生存率の改善、客観的奏効率の改善、および無増悪生存期間の改善が明らかになった一方で、疾患の再発可能性が高い。（Nazarian R. et al., メラノーマは、ＲＴＫ又はＮ−ＲＡＳの上方制御によって、Ｂ−ＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）阻害に対する耐性を獲得する。（Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E) inhibition by RTK or N-RAS upregulation.) Nature 468巻，頁：973-977 (2010年12月16日））。
【０００８】
メラノーマ癌治療における進歩にもかかわらず、腫瘍性細胞増殖を効果的に阻害することができるさらなる治療的処置の必要性が高い。従って、メラノーマ癌の治療的処置に有用な物質の組成物を生成するための治療剤の組み合わせを同定することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００９】
概要
本発明は、被験体へ抗エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）抗体薬剤コンジュゲートの有効量をＭＡＰキナーゼ阻害剤の有効量と組み合わせて投与することを含む、メラノーマに罹患している被験体における腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を意図する。
【００１０】
一態様において、抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲート及びＭＡＰキナーゼ阻害剤の組み合わせは相乗的である。別の態様において、相乗的組み合わせに関して、ＴＧＩは、抗ＥＴＢＲ抗体薬剤コンジュゲート単独を使用して観察されるＴＧＩよりも大きく、又はＭＡＰキナーゼ阻害剤単独を使用して観察されるＴＧＩよりも大きい。更に別の態様において、相乗的組み合わせに関して、ＴＧＩは、抗ＥＴＢＲ抗体薬剤コンジュゲート単独の使用よりも約１０％を超えて、又は約１５％を超えて、又は約２０％を超えて、又は約２５％を超えて、又は約３０％を超えて、又は約３５％を超えて、又は約４０％を超えて、又は約４５％を超えて、又は約５０％を超えて、又は約５５％を超えて、又は約６０％を超えて、又は約６５％を超えて、又は約７０％を超えて大きく、又はＭＡＰキナーゼ阻害剤単独の使用よりも約１０％を超えて、又は約１５％を超えて、又は約２０％を超えて、又は約２５％を超えて、又は約３０％を超えて、又は約３５％を超えて、又は約４０％を超えて、又は約４５％を超えて、又は約５０％を超えて、又は約５５％を超えて、又は約６０％を超えて、又は約６５％を超えて、又は約７０％を超えて大きい。
【００１１】
上述した本発明の別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに結合する。特許請求される方法のさらに別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６である。特許請求される方法のさらに別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９である。本方法の更なる態様はまた、配列番号８であるＶＬを有する抗ＥＴＢＲ抗体を含む。
【００１２】
上述される特許請求される方法の一態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、細胞毒素にコンジュゲートされ、ここで前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物であり、及び前記細胞毒素は毒素である。特許請求される発明の別の態様において、毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される。本発明のさらに別の態様では、毒素はメイタンシノイドである。
【００１３】
上述される特許請求される方法の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤である。上述される特許請求される方法の一態様において、ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである。別の態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有する。
2018027948.tif 000002
【００１４】
上述される特許請求される方法の別の態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤である。上述される特許請求される方法の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである。上述される特許請求される方法の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する。
2018027948.tif 000003
【００１５】
本発明の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤及び抗ＥＴＢＲ抗体の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含むメラノーマを治療する方法が記述される。上述される特許請求される方法の別の態様において、前記メラノーマはＥＴＢＲ陽性である。特許請求される方法の別の態様において、前記メラノーマは転移性である。特許請求される方法の更に別の態様において、前記被験体は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤による事前の治療を受けていない。特許請求される方法の更に別の態様において、前記被験体は、Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦの遺伝子変異を有し、又は、前記被験体は、Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦの変異を有さない、ＢＲＡＦ野生型である。特許請求される方法の更に別の態様において、被験体は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤による事前の治療を受けていない。
【００１６】
上述される特許請求される方法の別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体及びＭＡＰキナーゼ阻害剤の組み合わせは相乗的である。別の態様において、相乗的組み合わせに関して、ＴＧＩは、抗ＥＴＢＲ抗体単独を使用して観察されるＴＧＩよりも大きく、又はＭＡＰキナーゼ阻害剤単独を使用して観察されるＴＧＩよりも大きい。更に別の態様において、相乗的組み合わせに関して、ＴＧＩは、抗ＥＴＢＲ抗体単独の使用よりも約１０％を超えて、又は約１５％を超えて、又は約２０％を超えて、又は約２５％を超えて、又は約３０％を超えて、又は約３５％を超えて、又は約４０％を超えて、又は約４５％を超えて、又は約５０％を超えて、又は約５５％を超えて、又は約６０％を超えて、又は約６５％を超えて、又は約７０％を超えて大きく、又はＭＡＰキナーゼ阻害剤単独の使用よりも約１０％を超えて、又は約１５％を超えて、又は約２０％を超えて、又は約２５％を超えて、又は約３０％を超えて、又は約３５％を超えて、又は約４０％を超えて、又は約４５％を超えて、又は約５０％を超えて、又は約５５％を超えて、又は約６０％を超えて、又は約６５％を超えて、又は約７０％を超えて大きい。
【００１７】
上述した本発明の別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに結合する。特許請求される方法のさらに別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号６である。特許請求される方法のさらに別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９である。本方法の更なる態様はまた、配列番号８であるＶＬを有する抗ＥＴＢＲ抗体を含む。
【００１８】
上述される特許請求される方法の一態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、細胞毒素にコンジュゲートされ、ここで前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物であり、及び前記細胞毒素は毒素である。特許請求される発明の別の態様において、毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される。本発明のさらに別の態様では、毒素はメイタンシノイドである。
【００１９】
上述される特許請求される方法の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤である。上述される方法の一態様において、ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである。別の態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有する。
2018027948.tif 000004
【００２０】
上述される特許請求される方法の別の態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤である。上述される特許請求される方法の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである。上述される特許請求される方法の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する。
2018027948.tif 000005
【００２１】
本発明の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤及び抗ＥＴＢＲ抗体の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含むメラノーマを治療する方法が記述され、ここでＭＡＰキナーゼ阻害剤は、それを必要とする前記被験体に最初に投与される。本発明の別の態様において、前記抗ＥＴＢＲ抗体薬剤コンジュゲートは、前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤の投与後に投与される。あるいは、本発明の意図される方法は、抗ＥＴＢＲ抗体及びＭＡＰキナーゼ阻害剤が同時に投与される場合を含む。
【００２２】
本発明の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤及び抗ＥＴＢＲ抗体の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含むメラノーマを治療する方法が記述されることが意図され、ここで抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲート及びＭＡＰキナーゼ阻害剤は逐次に投与され、抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲートが最初に被験体に投与され、そしてＭＡＰキナーゼ阻害剤は、抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲートの投与後に被験体に投与される。
【００２３】
本発明の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤及び抗ＥＴＢＲ抗体の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含むメラノーマを治療する方法が記述されることが意図され、ここでＭＡＰキナーゼ阻害剤は最初に被験体に投与され、抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲートは、ＭＡＰキナーゼ阻害剤の投与後に被験体に投与される。
【００２４】
本発明の上記の企図される態様を促進するため、ＭＡＰキナーゼ阻害剤及び抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲートの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含むメラノーマを治療する方法が記述され、ここで前記抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲートは静脈内投与される。また、本発明の特許請求の範囲に記載の方法において、抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲートが、約０．１ｍｐｋ、又は約０．２ｍｐｋ、又は約０．３ｍｐｋ、又は約０．５ｍｐｋ、又は約１ｍｐｋ、又は約５ｍｐｋ、又は約１０ｍｐｋ、又は約１５ｍｐｋ、又は約２０ｍｐｋ、又は約２５ｍｐｋ、又は約３０ｍｐｋで投与されることが意図される。
【００２５】
本発明の上記の企図される態様を促進するため、ＭＡＰキナーゼ阻害剤及び抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲートの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含むメラノーマを治療する方法が記述され、ここでＭＡＰキナーゼ阻害剤は経口的に投与される。また、本発明の特許請求の範囲に記載の方法において、ＢＲＡＦ阻害剤が、約１ｍｐｋ、又は約２ｍｐｋ、又は約３ｍｐｋ、又は約４ｍｐｋ、又は約５ｍｐｋ、又は約６ｍｐｋ、又は約７ｍｐｋ、又は約８ｍｐｋ、又は約９ｍｐｋ、又は約１０ｍｐｋ、又はｍｐｋ約１１、又は約１２ｍｐｋ、又は約１５ｍｐｋ、又は約２０ｍｐｋ又は約３０ｍｐｋで投与されることが意図される。
【００２６】
本発明の一態様において、製造品は、抗ＥＴＢＲ抗体薬剤コンジュゲート組成物及びＭＡＰキナーゼ阻害剤組成物を含むパッケージを含む、メラノーマに罹患した患者におけるＴＧＩのために使用されることが意図される。前記抗ＥＴＢＲ抗体薬剤コンジュゲートは、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに特異的に結合することが更に意図される。あるいはまた、前記抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６であることが意図される。意図される更なる選択肢は、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９であることである。更に別の選択肢において、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９であり、ＶＬは配列番号８である。製造品の別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、細胞毒素にコンジュゲートされ、ここで前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物であり、及び前記細胞毒素は毒素である。別の一態様において、細胞毒素は毒素であり、ここで前記毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される。一態様において、毒素はメイタンシノイドである。
【００２７】
上述されるメラノーマを治療する方法の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤であることもまた意図される。上述される方法の一態様において、ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである。更に、ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有することが意図される。
2018027948.tif 000006
【００２８】
上述される特許請求される方法の別の態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＭＥＫ阻害剤である。上述される特許請求される方法の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである。上述される特許請求される方法の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する。
2018027948.tif 000007
【００２９】
本発明の一態様において、被験体においてメラノーマを治療するための製造品は、抗ＥＴＢＲ抗体薬剤コンジュゲート組成物及びＭＡＰキナーゼ阻害剤組成物を含むパッケージを含むことが意図される。前記抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに特異的に結合することが更に意図される。あるいはまた、前記抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６であることが意図される。意図される更なる選択肢は、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９であることである。更に別の選択肢において、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９であり、ＶＬは配列番号８である。製造品の別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、細胞毒素にコンジュゲートされ、ここで前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物であり、及び前記細胞毒素は毒素である。別の一態様において、細胞毒素は毒素であり、ここで前記毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される。一態様において、毒素はメイタンシノイドである。
【００３０】
上述される製造品の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤であることもまた意図される。上述される製造品の一態様において、ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである。更に、ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有することが意図される。
2018027948.tif 000008
【００３１】
上述される製造品の別の態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤である。上述される製造品の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである。上述される製造品の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する。
2018027948.tif 000009
【００３２】
本発明の一態様は、メラノーマのＴＧＩのための医薬の調製における抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲート及びＭＡＰキナーゼ阻害剤の使用であることが意図される。前記抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに特異的に結合することが更に意図される。あるいはまた、前記抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６であることが意図される。意図される更なる選択肢は、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９であることである。更に別の選択肢において、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９であり、ＶＬは配列番号８である。製造品の別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、細胞毒素にコンジュゲートされ、ここで前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物であり、及び前記細胞毒素は毒素である。別の一態様において、細胞毒素は毒素であり、ここで前記毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される。一態様において、毒素はメイタンシノイドである。
【００３３】
上述される医薬の使用の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤であることもまた意図される。上述される医薬の使用の一態様において、ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである。更に、ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有することが意図される。
2018027948.tif 000010
【００３４】
上述される医薬の使用の別の態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤である。上述される医薬の使用の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである。上述される医薬の使用の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する。
2018027948.tif 000011
【００３５】
本発明の一態様は、メラノーマのＴＧＩのための医薬の調製における抗ＥＴＢＲ抗体薬物コンジュゲート及びＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む製造品の使用であることが意図される。前記抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに特異的に結合することが更に意図される。あるいはまた、前記抗ＥＴＢＲ抗体は３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変経鎖ＣＤＲを有し、ここでＶＨ ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号２であり、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号３であり、及びＶＬ ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号５であり、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６であることが意図される。意図される更なる選択肢は、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９であることである。更に別の選択肢において、抗ＥＴＢＲ抗体は可変重鎖及び可変経鎖を有し、ここで前記ＶＨは配列番号７又は９であり、ＶＬは配列番号８である。製造品の使用の別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、細胞毒素にコンジュゲートされ、ここで前記細胞毒素は、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される細胞傷害性薬物であり、及び前記細胞毒素は毒素である。別の一態様において、細胞毒素は毒素であり、ここで前記毒素は、メイタンシノイド、カリケアマイシン及びオーリスタチンからなる群から選択される。一態様において、毒素はメイタンシノイドである。
【００３６】
上述される製造品の使用の一態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤であることもまた意図される。上述される製造品の使用の一態様において、ＢＲＡＦ阻害剤は、プロパン−１−スルホン酸｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロ−フェニル｝−アミドである。更に、ＢＲＡＦ阻害剤は以下の化学構造を有することが意図される。
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【００３７】
上述される製造品の使用の別の態様において、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤である。上述される製造品の使用の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンである。上述される製造品の使用の更に別の態様において、ＭＥＫ阻害剤は以下の化学構造を有する。
2018027948.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ＭＡＰキナーゼ経路の概略である。
【図２】図２は、インビトロにおけるＡＤＣ細胞死滅に対する受容体レベルの関係を実証する。受容体コピー／細胞の示された数は、スキャッチャード分析によって推定した。パネルＡは、メラノーマ細胞株ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２、及びパネルＢはメラノーマ細胞株Ａ２０５８の抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ滴定による細胞死滅を示す。指定された濃度の抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）、対照のＩｇＧ−ｖｃ−ＭＭＡＥ、又は等量のＰＢＳビヒクル対照は細胞とともに５日間インキュベートされ、相対的細胞生存率（ｙ軸）がＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを使用して評価された。
【図３】図３は、異種移植マウスモデルにおける抗ＥＴＢＲ ＡＤＣのインビボでの有効性を示す。皮下腫瘍は、ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２（パネルＡ）又はＡ２０５８（パネルＢ）の細胞を播種されたマウスにおいて確立された。腫瘍体積が約２００ｍｍ３（０日目）に達したとき、動物は、対照ＡＤＣ（コントロール−ＶＣ−ＭＭＡＥ）又は抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の何れかを示した用量で単回静脈内注射された。標準偏差と共に平均腫瘍体積を（グラフ上に示される）群あたり１０匹の動物から決定した。
【図４】図４は、様々な濃度のＢＲＡＦｉ−９４５で２４時間処理したＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２メラノーマ細胞でのＥＴＢＲ発現を示す。パネルＡは、ＲＰＬ１９転写物に規格化されたＥＴＢＲ転写物を示す。パネルＢは、５０μｇの全細胞溶解物中の全ＥＴＢＲ及びＧＡＰＤＨ（対照）のタンパク質の発現を示す。パネルＣは、フローサイトメトリーによって見られる生細胞における表面ＥＴＢＲタンパク質発現を示し、ここで第一のピークは二次検出試薬単独に対して処理された細胞を示し、中央のピークは、ＢＲＡＦ阻害剤により処理されていない細胞を示し、最後のピークは、ＢＲＡＦ阻害剤で処理した細胞を示している。
【図５】図５は、ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２メラノーマ異種移植マウスモデルに対しての、様々な用量での抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）とＢＲＡＦｉ−９４５のインビボでの組み合わせによる有効性を示す。皮下腫瘍はＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２細胞株を播種したマウスにおいて確立された。腫瘍体積が約２００ｍｍ３（０日目）に達したとき、動物は、ＢＲＡＦｉ−９４５又はビヒクル対照を２１日間経口で一日一回投与された。１日目に（ＢＲＡＦｉ−９４５を２回投与した後）、動物に、ビヒクル又は抗ＥＴＢＲ ＡＤＣの何れかを示された用量で単回静脈内注射が行われた。標準偏差と共に平均腫瘍体積を（グラフ上に示される）群あたり１０匹の動物から決定した。薬物と投与量の情報は示された通りである：パネルＡは、１ｍｐｋのＢＲＡＦｉ−９４５および１ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の組み合わせを示す；パネルＢは、１ｍｐｋのＢＲＡＦｉ−９４５と３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の組み合わせを示す；パネルＣは、６ｍｐｋのＢＲＡＦｉ−９４５および１ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の組み合わせを示す；パネルＤは、６ｍｐｋのＢＲＡＦｉ−９４５と３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の組み合わせを示す；パネルＥは２０ｍｐｋのＢＲＡＦｉ−９４５と３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の組み合わせを示す。
【図６】図６は、ＢＲＡＦ阻害剤ＲＧ７２０４の様々な濃度で２４時間処理したＣＯＬＯ８２９メラノーマ細胞におけるＥＴＢＲの発現を示す。パネルＡは、ＲＰＬ１９転写物に規格化されたＥＴＢＲ転写物を示す。パネルＢは、５０μｇの全細胞溶解物中の全ＥＴＢＲ及びＧＡＰＤＨ（対照）のタンパク質の発現を示す。パネルＣは、フローサイトメトリーによって見られる生細胞における表面ＥＴＢＲタンパク質発現を示し、ここで第一のピークは二次検出試薬単独に対して処理された細胞を示し、第二のピークは、ＢＲＡＦ阻害剤により処理されていない細胞を示し、第三のピークは、ＢＲＡＦ阻害剤で処理した細胞を示している。
【図７】図７は、ＣＯＬＯ８２９メラノーマ異種移植マウスモデルに対しての、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ及びＢＲＡＦ阻害剤ＲＧ７２０４のインビボでの組み合わせによる有効性を実証している。皮下腫瘍はＣＯＬＯ８２９メラノーマ細胞株を播種したマウスにおいて確立された。腫瘍体積が約２００ｍｍ３（０日目）に達したとき、動物は、ＲＧ７２０４を２１日間経口で一日一回投与された。１日目に（ＲＧ７２０４を３回投与した後）、動物に、ビヒクル又は抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の何れかを示された用量で単回静脈内注射が行われた。標準偏差と共に平均腫瘍体積を（グラフ上に示される）群あたり９匹の動物から決定した。薬物と投与量の情報は示された通りである：パネルＡは、３０ｍｐｋのＲＧ７２０４と組み合わせた３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示し；パネルＢは、３０ｍｐｋのＲＧ７２０４と組み合わせた１ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示し；パネルＣは、１０ｍｐｋのＲＧ７２０４と組み合わせた１ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示し；パネルＤは、１０ｍｐｋのＲＧ７２０４と組み合わせた３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。
【図８】図８は、ＢＲＡＦ阻害剤ＲＧ７２０４の様々な濃度で２４時間処理したＡ２０５８メラノーマ細胞におけるＥＴＢＲの発現を示す。パネルＡは、ＲＰＬ１９転写物に対して規格化されたＥＴＢＲ転写物を示し；パネルＢは、１００μｇの全細胞溶解物中の全ＥＴＢＲ及びＧＡＰＤＨ（対照）タンパク質の発現を示し；パネルＣは、フローサイトメトリーによって見られるように、生細胞における表面ＥＴＢＲタンパク質の発現を示す。第一のピークは、二次検出試薬単独に対して処理された細胞を示し、第二のピークは、ＢＲＡＦ阻害剤により処理されていない細胞を示し、第三のピークは、ＢＲＡＦ阻害剤で処理した細胞を示している。
【図９】図９は、Ａ２０５８メラノーマ異種移植マウスモデルに対しての、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）及びＢＲＡＦ阻害剤ＲＧ７２０４のインビボでの組み合わせによる有効性を実証している。皮下腫瘍はＡ２０５８メラノーマ細胞株を播種したマウスにおいて確立された。腫瘍体積が約２００ｍｍ３（０日目）に達したとき、動物は、ＲＧ７２０４を２１日間経口で一日二回投与された。１日目に（ＲＧ７２０４を３回投与した後）、動物に、ビヒクル又は抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の何れかを示された用量で単回静脈内注射が行われた。標準偏差と共に平均腫瘍体積を（グラフ上に示される）群あたり１０匹の動物から決定した。各グラフに示された薬物と投与量の情報は次の通りである：パネルＡは、１０ｍｐｋのＲＧ７２０４と組み合わせた６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示し；パネルＢは、３０ｍｐｋのＲＧ７２０４と組み合わせた６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示し；パネルＣは、１０ｍｐｋのＲＧ７２０４と組み合わせた３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示し；パネルＤは、３０ｍｐｋのＲＧ７２０４と組み合わせた３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。
【図１０】図１０は、ＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４により実施されたウエスタンブロット実験を示し、ＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞からの全細胞溶解物２５μｇから１００μｇにおける、総ＥＴＢＲ、Ｐｅｒｋ及びｅｒｋタンパク質及び対照タンパク質ＧＡＰＤＨとβ−チューブリンの発現を示している。
【図１１】図１１は、０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭのＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４とのインキュベーション後に（それぞれ、パネルＡ、Ｂ及びＣ）、フローサイトメトリーによって見られるＩＰＣ−２９８生細胞内での表面ＥＴＢＲタンパク質の発現を示す。第一のピークは、二次検出試薬単独に対して処理された細胞を示し、第二のピークは、ＢＲＡＦ阻害剤で処理された細胞を示し、第三のピークは、ＢＲＡＦ阻害剤で処理されていない細胞を示している。
【図１２】図１２は、ＭＥＫｉ−６２３（パネルＡ）及びＭＥＫｉ−９７３（パネルＢ）により０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ及び１μＭの濃度で実施されたウエスタンブロット実験を示し、ＣＯＬＯ８２９メラノーマ細胞からの全細胞溶解物５０μｇにおいて、総ＥＴＢＲ、Ｐｅｒｋ及びｅｒｋタンパク質及び対照タンパク質ＧＡＰＤＨとβ−チューブリンの発現を示している。
【図１３】図１３は、０．０１μＭ（パネルＡ及びＤ）、０．１μＭ（パネルＢ及びＥ）及び１μＭ（パネルＣ及びＦ）のＭＥＫｉ−６２３（それぞれパネルＡ、Ｂ及びＣ）又はＭＥＫｉ−９７３（それぞれパネルＤ、Ｅ及びＦ）とのインキュベーションの後で、フローサイトメトリーによって見られるＣＯＬＯ８２９生細胞中の表面ＥＴＢＲタンパク質の発現を示している。  第一のピークは、二次検出試薬単独に対して処理された細胞を示し、  第二のピークは、ＭＥＫ阻害剤により処理されていない細胞を示し、  第三のピークは、ＭＥＫ阻害剤で処理した細胞を示している。
【図１４】図１４は、ＭＥｋｉ−６２３（パネルＡ）又はＭＥＫｉ−９７３（パネルＢ）の様々な濃度で２４時間処理したＡ２０５８メラノーマ細胞における、ＲＰＬ１９転写物に対して正規化された、ＥＴＢＲ ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１５】図１５は、ＭＥＫｉ−６２３（パネルＡ）及びＭＥＫｉ−９７３（パネルＢ）により０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ及び１μＭの濃度で実施されたウエスタンブロット実験を示し、Ａ２０５８メラノーマ細胞からの全細胞溶解物５０〜１００μｇにおいて、総ＥＴＢＲ、Ｐｅｒｋ及びｅｒｋタンパク質及び対照タンパク質ＧＡＰＤＨとβ−チューブリンの発現を示している。
【図１６】図１６は、０．０１μＭ（パネルＡ及びＤ）、０．１μＭ（パネルＢ及びＥ）及び１μＭ（パネルＣ及びＦ）のＭＥＫｉ−６２３（それぞれパネルＡ、Ｂ及びＣ）又はＭＥＫｉ−９７３（それぞれパネルＤ、Ｅ及びＦ）とのインキュベーションの後で、フローサイトメトリーによって見られるＡ２０５８生細胞中の表面ＥＴＢＲタンパク質の発現を示している。第一のピークは、二次検出試薬単独に対して処理された細胞を示し、第二のピークは、ＭＥＫ阻害剤により処理されていない細胞を示し、第三のピークは、ＭＥＫ阻害剤で処理した細胞を示している。
【図１７】図１７は、Ａ２０５８メラノーマ異種移植マウスモデルに対しての、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）及びＭＥＫｉ−９７３のインビボでの組み合わせによる有効性を実証している。皮下腫瘍はＡ２０５８メラノーマ細胞株を播種したマウスにおいて確立された。腫瘍体積が約２００ｍｍ３（０日目）に達したとき、動物は、ＭＥＫｉ−９７３を２１日間経口で一日一回投与された。１日目に（ＭＥＫｉ−９７３を２回投与した後）、動物に、ビヒクル又は抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）の何れかを示された用量で単回静脈内注射が行われた。標準偏差と共に平均腫瘍体積を（グラフ上に示される）群あたり９匹の動物から決定した。各グラフに示された薬物と投与量の情報は次の通りである：パネルＡは、ビヒクル対照及び抗ｇＤ ＡＤＣ単独と比較して、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた７．５ｍｐｋの抗ｇＤ ＡＤＣ（対照）を示し；パネルＢは、ビヒクル対照及び７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３単独（ＧＤＣ−０９７３）又は６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ単独と比較して、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。
【図１８】図１８は、ＭＥｋｉ−６２３（パネルＡ）又はＭＥＫｉ−９７３（パネルＢ）の様々な濃度で２４時間処理したＳＫ２３−ＭＥＬメラノーマ細胞における、ＲＰＬ１９転写物に対して正規化された、ＥＴＢＲ転写物の発現を示す。
【図１９】図１９は、ＭＥＫｉ−６２３（パネルＡ）及びＭＥＫｉ−９７３（パネルＢ）により０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ及び１μＭの濃度で実施されたウエスタンブロット実験を示し、ＳＫ２３−ＭＥＬメラノーマ細胞からの全細胞溶解物５０μｇにおいて、総ＥＴＢＲ、Ｐｅｒｋ及びｅｒｋタンパク質及び対照タンパク質ＧＡＰＤＨとβ−チューブリンの発現を示している。
【図２０】図２０は、０．０１μＭ（パネルＡ及びＤ）、０．１μＭ（パネルＢ及びＥ）及び１μＭ（パネルＣ及びＦ）のＭＥＫｉ−６２３（それぞれパネルＡ、Ｂ及びＣ）又はＭＥＫｉ−９７３（それぞれパネルＤ、Ｅ及びＦ）とのインキュベーションの後で、フローサイトメトリーによって見られるＳＫ２３−ＭＥＬ生細胞中の表面ＥＴＢＲタンパク質の発現を示している。第一のピークは、二次検出試薬単独に対して処理された細胞を示し、第二のピークは、ＭＥＫ阻害剤により処理されていない細胞を示し、第三のピークは、ＭＥＫ阻害剤で処理した細胞を示している。
【図２１】図２１は、ＳＫ２３−ＭＥＬメラノーマ異種移植マウスモデルに対しての、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）及びＭＥＫｉ−９７３のインビボでの組み合わせによる有効性を実証している。各グラフに示された薬物と投与量の情報は次の通りである：パネルＡは、ビヒクル対照、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３及び６ｍｐｋの抗ｇＤ ＡＤＣ単独と比較して、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた６ｍｐｋの抗ｇＤ ＡＤＣ（対照）を示し；パネルＢは、ビヒクル対照及び７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３単独又は６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ単独と比較して、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた（「組み合わせ」）６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。パネルＣは、ビヒクル対照、３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）又は３ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と比較して、３ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた（「組み合わせ」）３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。パネルＤは、ビヒクル対照及び７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３単独又は３ｍｐｋの抗−ＥＴＢＲ−ＡＤＣ単独と比較して、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた（「組み合わせ」）３ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。パネルＥは、ビヒクル対照及び３ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３単独又は６ｍｐｋの抗−ＥＴＢＲ−ＡＤＣ単独と比較して、３ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた（「組み合わせ」）６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。
【図２２】図２２は、ＭＥＫｉ−６２３（パネルＡ）及びＭＥＫｉ−９７３（パネルＢ）により０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ及び１μＭの濃度で実施されたウエスタンブロット実験を示し、ＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞からの全細胞溶解物２５〜１００μｇにおいて、総ＥＴＢＲ、Ｐｅｒｋ及びｅｒｋタンパク質及び対照タンパク質ＧＡＰＤＨとβ−チューブリンの発現を示している。
【図２３】図２３は、０．０１μＭ（パネルＡ及びＤ）、０．１μＭ（パネルＢ及びＥ）及び１μＭ（パネルＣ及びＦ）のＭＥＫｉ−６２３（それぞれパネルＡ、Ｂ及びＣ）又はＭＥＫｉ−９７３（それぞれパネルＤ、Ｅ及びＦ）とのインキュベーションの後で、フローサイトメトリーによって見られるＩＰＣ−２９８生細胞中の表面ＥＴＢＲタンパク質の発現を示している。第一のピークは、二次検出試薬単独に対して処理された細胞を示し、第二のピークは、ＭＥＫ阻害剤により処理されていない細胞を示し、第三のピークは、ＭＥＫ阻害剤で処理した細胞を示している。
【図２４】図２４は、ＩＰＣ−２９８メラノーマ異種移植マウスモデルに対しての、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）及びＭＥＫｉ−６２３のインビボでの組み合わせによる有効性を実証している。各グラフに示された薬物と投与量の情報は次の通りである：パネルＡは、ビヒクル対照、１ｍｐｋのＭＥＫｉ−６２３及び６ｍｐｋの抗ｇＤ ＡＤＣ単独と比較して、１ｍｐｋのＭＥＫｉ−６２３と組み合わせた６ｍｐｋの抗ｇＤ ＡＤＣ（対照）を示し；パネルＢは、ビヒクル対照及び１ｍｐｋのＭＥＫｉ−６２３単独又は６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ単独と比較して、１ｍｐｋのＭＥＫｉ−６２３と組み合わせた（「組み合わせ」）６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。
【図２５】図２５は、ＩＰＣ−２９８メラノーマ異種移植マウスモデルに対しての、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）及びＭＥＫｉ−９７３のインビボでの組み合わせによる有効性を示す。各グラフに示された薬物と投与量の情報は次の通りである：パネルＡは、ビヒクル対照、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３及び６ｍｐｋの抗ｇＤ ＡＤＣ単独と比較して、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた６ｍｐｋの抗ｇＤ ＡＤＣ（対照）を示し；パネルＢは、ビヒクル対照及び７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３単独又は６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ単独と比較して、７．５ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３と組み合わせた（「組み合わせ」）６ｍｐｋの抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣ（Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を示す。
【図２６】図２６は、ビヒクル又は３０ｍｐｋのＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４のいずれかで処置したＣＯＬＯ８２９腫瘍中のリン酸化ＥＲＫ及び総ＥＲＫタンパク質の発現を示す。
【図２７】図２７は、ＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４で処理されたＣＯＬＯ８２９腫瘍（パネルＡ）、及びＭＥＫｉ−９７３で処理されたＡ２０５８腫瘍（パネルＢ）における３日間のＥＴＢＲ転写物の発現を示す。パネルＡは、ビヒクル対照又は１０ｍｐｋ若しくは３０ｍｐｋのＲＧ７２０４の何れかで処理されたＣＯＬＯ８２９腫瘍において、ＣＯＬＯ８２９細胞株中の対照ＧＡＰＤＨに対して規格化したＥＴＢＲ転写物を示す。パネルＢは、ビヒクル対照又は５ｍｐｋ若しくは１０ｍｐｋのＭＥＫｉ−９７３の何れかで処理されたＡ２０５８腫瘍において、対照Ｈｐｒｔ１に対して規格化されたＥＴＢＲ転写物を示す。
【００３９】
本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００４０】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００４１】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００４２】
用語「抗ＥＴＢＲ抗体」及び「ＥＴＢＲに結合する抗体」は、抗体が、ＥＴＢＲを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でエンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＥＴＢＲ抗体の、無関係な、非ＥＴＢＲタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＥＴＢＲへの結合の約１０％未満である。所定の実施態様において、ＥＴＢＲへ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。ある実施態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、異なる種由来のＥＴＢＲ間で保存されているＥＴＢＲのエピトープに結合する。
【００４３】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００４４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００４５】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００４６】
本明細書で使用される用語「ＢＲＡＦ」は、ヒトにおいてＢＲＡＦ遺伝子によりコードされるタンパク質であり、癌原遺伝子Ｂ−Ｒａｆ又はｖ−Ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１としても知られている、セリン／スレオニンプロテインキナーゼＢ−Ｒａｆを指す。Ｂ−Ｒａｆタンパク質は、細胞内でシグナルを送ること及び細胞増殖に関与している。
【００４７】
本明細書で使用される用語「ＢＲＡＦ阻害剤」又は「ＢＲＡＦｉ」は、Ｂ−Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路上でＢ−Ｒａｆ／ＭＥＫステップを阻害するか又は中断することができる任意の数の公知の小分子薬物化合物を意味する。適切なＢＲＡＦｉは、限定されないが、２０１０年８月２７日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７００７、２０１０年８月２７日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６９７５、２０１０年８月２７日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６９５２、２０１０年８月２７日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６９５５、及び２００６年６月２１日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２４３６１に記述されるものを含み得る。別の例としては、限定されないが、５−［２−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンオキシムとしても知られ、ＣＡＳ登録番号４０５５５４−５５−４を有する、ＧＳＫ ２１１８４３６が挙げられ得る。
【００４８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００４９】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００５０】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞障害性剤は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００５１】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化を含む。
【００５２】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００５３】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＥＴＢＲ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＥＴＢＲ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＥＴＢＲを含む。その用語はまた、天然に存在するＥＴＢＲの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。例示的なヒトＥＴＢＲのアミノ酸配列を配列番号１０に示す（Nakamuta M et al., エンドセリン受容体のヒト非選択型をコードするｃＤＮＡのクローニングと配列分析(Cloning and Sequence Analysis of a cDNA encoding Human non-selective type of endothelin receptor), Biochem Biophys Res Commun. 1991年5月31日:177(1):34-9を参照）。
【００５４】
本明細書で使用される用語「抗ＥＴＢＲ抗体−ＡＤＣ」は、毒素にコンジュゲートしている本明細書に記載の任意の抗ＥＴＢＲ抗体を指す。このような毒素としては、限定されないが、メイタンシノイド又は具体的にはモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）を含む。抗ＥＴＢＲ抗体−ＡＤＣは、「本発明の抗ＥＴＢＲ抗体」の一種として意図されている。  
【００５５】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００５６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００５７】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００５８】
本明細書で使用される用語「９４５」又は「ＢＲＡＦｉ−９４５」は、４−アミノ−Ｎ−（６−クロロ−２−フルオロ−３−（３−フルオロプロピルスルホンアミド）フェニル）チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−カルボキサミドであるＢ−Ｒａｆ酵素阻害剤を指し、２０１０年は８月２７日に提出され、その全体が参照により本明細書に援用される国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６９５５の実施例１５に開示されている以下の式を有する構造を有する。
2018027948.tif 000014
【００５９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００６０】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００６１】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabatら、免疫学的に興味のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）、第五版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)、1〜3巻にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００６２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００６３】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。 Kabatら、免疫学的に興味のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）、第五版、NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、略称（abbreviated-)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００６４】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
【００６５】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００６６】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００６７】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００６８】
「抗ＥＴＢＲ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００６９】
本明細書で使用する用語「マイトジェン活性化プロテインキナーゼ」（ＭＡＰキナーゼ）は、ＣＭＧＣ（ＣＤＫ／ＭＡＰＫ／ＧＳＫ３／ＣＬＫ）キナーゼ群に属するセリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼを指す。哺乳類のＥＲＫ１／２経路は、おそらく最も良特徴付けられたＭＡＰＫシステムである。この経路の最も重要な上流の活性化因子は、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ等）に対する応答の重要なメディエーターであるＲａｆタンパク質（Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ又はｃ−Ｒａｆ）である。
【００７０】
本明細書で使用する用語「ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ」（ＭＥＫ）は、ＭＡＰＫ経路における中心的役割を占めるチロシンキナーゼを指す。ＭＥＫの構成的に活性な形態の発現は、細胞株の形質転換をもたらす。
【００７１】
本明細書で使用される用語「ＭＥＫ阻害剤」は、ＭＡＰキナーゼ経路上でＭＥＫステップを阻害するか又は中断することができる任意の数の公知の小分子薬物化合物を意味する。適切なＭＥＫｉの例としては、限定されないが、ＭＥＫｉ−６２３、ＭＥＫｉ−９７３、又はＧＳＫ１１２０２１２として記載されるものを含み得る。
【００７２】
本明細書で使用される用語「ＭＥＫｉ−９７３」は、ＭＥＫ阻害剤、（Ｓ）−（３，４−ジフルオロ−２−（（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ）フェニル）（３−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−２−イル）アゼチジン−１−イル）メタノンを指し、次の構造を有する。
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【００７３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００７４】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００７５】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００７６】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００７７】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００７８】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００７９】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００８０】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、ビヒクル、安定剤、又は保存剤を含む。
【００８１】
用語「ＲＧ７２０４」は、Ｃ２３Ｈ１８ＣＩＦ２Ｎ３Ｏ３Ｓの分子式及び以下の構造を有するＢ−Ｒａｆ酵素阻害剤を指す。
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【００８２】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（treat）」または「治療している（treating）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００８３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００８４】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００８５】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、一部が、ＥＴＢＲに結合する抗体に基づく。本発明の抗体は、例えば、メラノーマの治療のために有用である。
【００８６】
典型的な抗ＥＴＢＲ抗体
一態様において、本発明は、ＥＴＢＲに結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、（ａ）ＣＤＲ−Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ，配列番号７）、（ｂ）ＣＤＲ−Ｌ２（ＬＶＳＫＬＤＳ、配列番号８）、（ｃ）ＣＤＲ−Ｌ３（ＷＱＧＴＨＦＰＹＴ；配列番号９）、（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１（ＧＹＴＦＴＳＹＷＭＱ；配列番号１）、（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ２（ＴＩＹＰＧＤＧＤＴＳＹＡＱＫＦＫＧ；配列番号２）、及び（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＹＡＹＤＩＤＮ；配列番号３）から選択される少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＣＤＲを含む。
【００８７】
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＥＴＢＲ抗体はヒト化される。一実施態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＣＤＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。別の態様において、抗体は、配列番号８のＶＬアミノ酸配列及び配列番号７のＶＨアミノ酸配列を有する単離された抗ＥＴＢＲ抗体を提供する。更に別の態様において、本発明は、配列番号８のＶＬアミノ酸配列及び配列番号９のＶＨアミノ酸配列を有する抗ＥＴＢＲ抗体を提供する。
【００８８】
別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号７又は９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＥＴＢＲ抗体は、ＥＴＢＲへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号７又は９において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。
【００８９】
別の態様において、配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＥＴＢＲ抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＥＴＢＲ抗体は、ＥＴＢＲへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号８において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。
【００９０】
別の態様において、抗ＥＴＢＲ抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号７又は９及び配列番号８のそれぞれＶＨとＶＬを、それらの配列の翻訳後修飾を含んで含む。
【００９１】
更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗ＥＴＢＲ抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号７又は９のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗ＥＴＢＲ抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲのＮ末端細胞外ドメイン＃１内のエピトープに結合する抗ＥＴＢＲ抗体が提供される。
【００９２】
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＥＴＢＲ抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＥＴＢＲ抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【００９３】
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＥＴＢＲ抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【００９４】
抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
【００９５】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体被覆プレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例えば、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を、５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Packard）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）γ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【００９６】
他の実施態様に従って、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。速度論の測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００９７】
抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113巻, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), 頁269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【００９８】
ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【００９９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。
【０１００】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による生産を含む。
【０１０１】
キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１０２】
ある実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１０３】
ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１０４】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【０１０５】
ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に一般的に記載されている。
【０１０６】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【０１０７】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、頁51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１０８】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０１０９】
ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１１０】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のように如何なる免疫化を伴うことなく、幅広い非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一源を提供することが可能である。最終的には、ナイーブライブラリーは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードせしめ、インビトロでの再配列を達成させることによって合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０を含む。
【０１１１】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０１１２】
多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＥＴＢＲに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＥＴＢＲの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＥＴＢＲを発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１１３】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブインホール（knob-in-hole）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）、２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992）を参照）、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１１４】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号Ａ１を参照）。  
【０１１５】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＥＴＢＲ並びにその他の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Dual Acting）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。
【０１１６】
抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【０１１７】
置換、挿入、および欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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【０１１８】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１１９】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１２０】
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１２１】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１２２】
所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１２３】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１２４】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１２５】
グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０１２６】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【０１２７】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、または２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。フコース非修飾抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１、Adamsら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０１２８】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１２９】
Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１３０】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５，８２１，３３７号（例えば、Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができるＣ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【０１３１】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１３２】
ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)）。
【０１３３】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０１３４】
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【０１３５】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号Ａ１（Hinton et al.）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１３６】
Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１３７】
システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ（複数）」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Kabatの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１３８】
抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
【０１３９】
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005））。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０１４０】
組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＥＴＢＲ抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＥＴＢＲ抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１４１】
抗ＥＴＢＲ抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１４２】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 頁245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、さらに精製することができる。
【０１４３】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０１４４】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１４５】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照。
【０１４６】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 頁255-268 (2003)を参照。
【０１４７】
アッセイ
本明細書で提供される抗ＥＴＢＲ抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
【０１４８】
結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１４９】
その他の態様において、競合アッセイを、ＥＴＢＲへの結合について、例えばＨｕ５Ｅ９ｖ．１又はＨｕ５Ｅ９ｖ．２と競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様において、このような競合する抗体は、Ｈｕ５Ｅ９ｖ．１又はＨｕ５Ｅ９ｖ．２により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996)「エピトープマッピングのプロトコル」（“Epitope Mapping Protocols,"） in Methods in Molecular Biology 66巻 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。本発明の一態様において、本明細書に記載される抗ＥＴＢＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号６４から１０１からなるＥＴＢＲエピトープに特異的に結合する。
【０１５０】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＥＴＢＲは、ＥＴＢＲに結合する第一の標識された抗体（例えば、Ｈｕ５Ｅ９ｖ．１又はＨｕ５Ｅ９ｖ．２）、及びＥＴＢＲへ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＥＴＢＲが、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＥＴＢＲへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化ＥＴＢＲに結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＥＴＢＲに結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＥＴＢＲへの結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) 抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０１５１】
活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、抗ＥＴＢＲ抗体及び／又はＢＲＡＦｉ化合物は、生物学的活性を有するか否かを同定するために与えられる。生物学的活性は、実施例に記載されるもの、例えば、インビトロメラノーマ細胞生存アッセイ、又はメラノーマ細胞株がヌードマウスに移植され、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）が評価されるインビボ異種移植モデルを含むことができる。
【０１５２】
イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬剤、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＥＴＢＲ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１５３】
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの一又は複数の細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む、免疫コンジュゲート（「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される）を提供する。
【０１５４】
イムノコンジュゲートは、細胞傷害性薬物、すなわち、癌の治療において、細胞の成長又は増殖を死滅させたり又は阻害する薬剤の局所送達のために使用されている（Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172；米国特許第４，９７５，２７８号）。イムノコンジュゲートは、腫瘍への薬剤成分の標的送達とそこでの細胞内集積を可能にし、ここでコンジュゲートしていない薬剤の全身投与は、正常細胞並びに除去されることが求められる腫瘍細胞への許容できないレベルの毒性をもたらしうる（Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986)頁603-05; Thorpe (1985) 「癌治療における細胞傷害性薬物の抗体の担体：総括」（"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,"） in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al.,編）頁475-506。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87)。この方法に用いる薬剤には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる（Rowland等，(1986)、上掲）。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン（Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581;Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028;Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド（ＥＰ １３９１２１３；Liu等，(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン（Lode等，(1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などの小分子毒素が含まれる。ＡＤＣを設計し、そして改良する取り組みは、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の選択性並びに薬剤の作用機序、薬剤結合、薬剤／抗体比（ローディング）、及び薬剤放出特性に焦点をあてている(McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel.; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070)。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含むメカニズムによりそれらの細胞毒性効果を発揮する。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０１５５】
ゼバリン（登録商標）（ＺＥＶＡＬＩＮ）（イブリツモマブチウキセタン（ibritumomab tiuxetan）, Biogen/Idec）は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである（Wiseman等、(2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77 ; Wiseman等、(2002) Blood 99(12):4336-42 ; Witzig等、(2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63 ; Witzig等、(2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ（商標）（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標））（ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals）は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された（Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第４９７０１９８号；同第５０７９２３３号；同第５５８５０８９号；同第５６０６０４０号；同第５６９３７６２号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；同第５７７３００１号）。トラスツズマブに連結したメイタンシノイド、ＤＭ１からなる抗体−薬剤コンジュゲートは、ＨＥＲ２過剰発現トラスツズマブ−感受性及び耐性腫瘍細胞株及びヒト癌の異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す。トラスツズマブ−ｍｃｃ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）は、疾患がＨＥＲ２指向療法に抵抗性である患者において第ＩＩ相臨床試験において現在評価を受けている（Beeram et al (2007) 「トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）の第Ｉ試験、ＨＥＲ２＋転移性乳癌（ＢＣ）の患者におけるファーストインクラスＨＥＲ２抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）」(A phase I study of trastuzumab-mcc-DM1 (T-DM1), a first-in-class HER2 antibody-drug conjugate (ADC), in patients (pts) with HER2+ metastatic breast cancer (BC))、第４３回米国臨床腫瘍学会６月１日（要旨１０４２；Ｋｒｏｐら，欧州癌会議ＥＣＣＯ、ポスター２１１８，９月２３−２７日，２００７，バルセロナ；米国特許第７０９７８４０号；米国特許第２００５／０２７６８１２号；米国特許第２００５／０１６６９９３号）。アウリスタチン（auristatin）ペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌細胞上のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）（Doronina等、(2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784）にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０１５６】
特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体および化学療法剤又は他の毒素を含む。免疫複合体（イムノコンジュゲート）の生成に有用な化学治療薬を本明細書中（例えば、上記）に記載した。酵素活性毒素及びその断片も使用することができ、本明細書に記載される。
【０１５７】
特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体及び、限定されないが、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、アントラサイクリン、タキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５などの小分子薬剤および細胞毒性活性を有するこれら薬剤の誘導体を含む小分子薬剤部分（毒素）の一又は複数を含む。これらのイムノコンジュゲートの例は、以下でより詳細に検討される。
【０１５８】
典型的なイムノコンジュゲート
本発明のイムノコンジュゲート（又は「抗体−薬剤コンジュゲート」（「ＡＤＣ」））は、下記式Ｉであって良く、ここで抗体は任意のリンカー（Ｌ）を通じて一又は複数の薬剤部分（Ｄ）にコンジュゲートしている。
2018027948.tif 000018
【０１５９】
従って、抗体は、直接又はリンカーを介して薬剤にコンジュゲートすることができる。式Ｉにおいて、ｐは抗体当たりの薬剤部分の平均数であり、例えば抗体あたり約１から約２０の薬剤分子に及ぶことができ、ある実施態様においては、抗体あたり約１から約８の薬剤分子に及びことができる。
【０１６０】
典型的なリンカー
リンカーは、一以上のリンカー成分を含んでもよい。例示的なリンカー成分は、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」又は「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボンイル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ−スクシンイミジル（４−イオド−アセチル）アミノ安息香酸エステル（「ＳＩＡＢ」）を含む。様々なリンカー成分は当分野で公知であり、そのうち幾つかは以下において記述される。
【０１６１】
リンカーは、細胞中への薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Chari等、 Cancer Research, 52:127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号）。
【０１６２】
ある実施態様において、リンカーは以下の式ＩＩに示される通りである：
2018027948.tif 000019
【０１６３】
ここでＡはストレッチャーユニットであり、ａは０から１の整数である；Ｗはアミノ酸ユニットであり、ｗは０から１２の整数である；Ｙはスペーサーユニットであり、ｙは０、１、又は２である；Ａｂ、Ｄ、及びｐは式Ｉに関して上記に定義される。このリンカーの例示的な実施態様は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１に記載されている。
【０１６４】
幾つかの実施態様において、リンカー成分は、抗体を別のリンカー成分に又は薬剤部分に連結する「ストレッチャーユニット」を含み得る。典型的なストレッチャーユニットは以下に示される（ここで波線は抗体に対する共有結合の部位を示す）：
2018027948.tif 000020
【０１６５】
いくつかの実施態様では、リンカー成分は、アミノ酸ユニットを含むことができる。このような一実施態様において、アミノ酸ユニットはプロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、それによりリソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼに暴露されると、イムノコンジュゲートからの薬物の放出を容易にする。例えばDoronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784を参照。典型的なアミノ酸ユニットは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びペンタペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。典型的なジペプチドは、バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）；フェニルアラニン−リジン（ｆｋ又はｐｈｅ−ｌｙｓ）；又はＮ−メチル−バリン−シトルリン（Ｍｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ）を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）を含む。アミノ酸ユニットは、天然に生じるアミノ酸残基、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含み得る。アミノ酸ユニットは設計され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断についての選択性において最適化できる。
【０１６６】
幾つかの実施態様では、リンカー成分は、直接又は、ストレッチャーユニット及び／又はアミノ酸ユニットにより、抗体を薬剤部分に連結する「スペーサー」ユニットを含みうる。スペーサーユニットは、「自己犠牲」又は「非自己犠牲」であってもよい。「非自己犠牲」のスペーサーユニットは、ＡＤＣの酵素的な（例えばタンパク質分解性の）切断によりスペーサーユニットの一部又はすべてが薬剤部分に結合したままとなるものである。非自己犠牲のスペーサーユニットの例には、限定するものではないが、グリシンスペーサーユニット及びグリシン−グリシンスペーサーユニットが含まれる。また、配列特異的な酵素的切断の影響を受けるペプチド性スペーサーの他の組合せも考慮される。例えば、グリシン−グリシンスペーサーユニットを含有するＡＤＣの腫瘍細胞関連のプロテアーゼによる酵素切断によって、残りのＡＤＣからグリシン−グリシン−薬剤部分が放出されるであろう。そのような実施態様では、グリシン−グリシン−薬剤部分は腫瘍細胞の異なる加水分解処理を受け、それによってグリシン−グリシンスペーサーユニットを薬剤部分から分離する。
【０１６７】
「自己犠牲」のスペーサーユニットは、異なる加水分解処置を経ずに薬剤部分を放出させる。ある実施態様では、リンカーのスペーサーユニットはｐ−アミノベンジルユニットが含まれる。このような実施態様では、ｐ−アミノベンジルアルコールはアミド結合によりアミノ酸ユニットに結合し、カルバメート、メチルカルバメート又はカルボネートがベンジルアルコールと細胞傷害性薬物との間に作られる。例としてHamann等 (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103を参照。一実施態様では、スペーサーユニットはｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。ある実施態様では、ｐ−アミノベンジルユニットのフェニレン部分はＱｍに置き換えられ、このＱは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、そしてｍは０〜４の範囲の整数である。自己犠牲のスペーサーユニットの例には、限定するものではないが、ｐ−アミノベンジルアルコールに電子的に類似している芳香族化合物（例として米国特許公開第２００５／０２５６０３０号Ａ１を参照）、例えば２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（Hay等 (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237）及びオルソ−ないしはパラ−アミノベンジルアセタール類が含まれる。アミド結合加水分解により環化されるスペーサー、例として、置換されたないしは置換されていない４−アミノ酪酸アミド類（Rodrigues等、Chemistry Biology, 1995, 2, 223）；適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環システム（Storm等、J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815）；及び、２−アミノフェニルプロピオン酸アミド類（Amsberry等、 J. Org. Chem., 1990, 55, 5867）が用いられうる。グリシンのａ−位置で置換されているアミン含有薬剤の除去（Kingsbury等、J. Med. Chem., 1984, 27, 1447)もまたＡＤＣに有用な自己犠牲のスペーサーの例である。
【０１６８】
一実施態様では、以下に示すように、スペーサーユニットは分岐したビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）ユニットであり、これを用いて複数の薬剤の取り込みと放出が行われうる。
2018027948.tif 000021
【０１６９】
ここで、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数であり、ｎは０又は１であり、そして、ｐは１〜およそ２０の範囲である。
【０１７０】
他の実施態様では、リンカーＬは、分岐状の、多機能リンカー成分により一又は複数の薬剤成分が抗体に共有結合するための樹枝型のリンカーであってもよい（Sun等 (2002) Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等 (2003) Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹枝状のリンカーは抗体に対する薬剤のモル比を増す、すなわち負荷することができ、これはＡＤＣの力価に関連がある。したがって、システイン操作抗体は１つの反応性のシステインチオール基のみを有する場合、多くの薬剤成分が樹枝状のリンカーを介して付着されうる。
【０１７１】
典型的なリンカー成分及びその組み合わせは、式ＩＩのＡＤＣに関連して以下に示される：
2018027948.tif 000022
【０１７２】
ストレッチャー、スペーサー及びアミノ酸ユニットを含むリンカー成分は、例えば、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１に記載されているものなど、当技術分野で公知の方法によって合成することができる。
【０１７３】
典型的な薬剤部分
メイタンシン及びメイタンシノイド
【０１７４】
幾つかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のメイタンシノイド分子とコンジュゲートした抗体を含む。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである（米国特許第３８９６１１１号）。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４１５１０４２号）。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
【０１７５】
メイタンシノイド薬剤部分は、抗体−薬剤コンジュゲートにおいて魅力的な薬剤部分である。なぜなら、これらは以下であるからである：（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的利用可能である、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを通しての抗体に対するコンジュゲーションに適している官能基を用いた誘導体化に適している、（ｉｉｉ）血漿中で安定である、及び（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効である。
【０１７６】
メイタンシノイド薬剤部分としての使用に適したメイタンシン化合物は当技術分野で周知であり、既知の方法に従って天然源から単離することができ、又は遺伝子操作技術を用いて生成することができる。メイタンシノール及びメイタンシノール類似体はまた、公知の方法に従って合成的に調製することができる。
【０１７７】
典型的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾された芳香環を有するもの、例えば、Ｃ−１９−脱クロロ（米国特許第４４２４２１９号）（アンサマイトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元によって調製される）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−ジメチル）＋／−Ｃ−１９脱クロロ（米国特許第４３６１６５０号及び４３０７０１６号）（ストレプトマイセスや放線菌を使用した脱メチル化又はＬＡＨを使用した脱塩素処理により調製される）及びＣ−２０−ジメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（ＯＣＯＲ）、＋／−脱クロロ（米国特許第４２９４７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化により調製）及びその他の位置に修飾を有するものが含まれる。
【０１７８】
典型的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾を有するもの、例えば、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４４２４２１９号）（Ｈ２Ｓ又はＰ２Ｓ５を有するメイタンシノールの反応により調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（脱メトキシ／ＣＨ２ ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシロキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシロキシ（米国特許第４３６４８６６号）（ストレプトマイセス属によるメイタンシノールの変換によって調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４３１３９４６号及び同第４３１５９２９号）（トレウィア ヌドロフローラ（Trewia nudlflora）より単離）；Ｃ−１８−Ｎ−脱メチル（米国特許第４３６２６６３号及び第４３２２３４８号）（ストレプトマイセス属によるメイタンシノールの脱メチル化により調製される）；及び、４，５−デオキシ（米国特許第４３７１５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）が含まれる。
【０１７９】
結合の種類に応じて、メイタンシン化合物上の多くの位置は結合位置として有用であることが知られている。例えば、エステル結合を形成するために、水酸基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルによって修飾されたＣ−１４位置、水酸基によって修飾されたＣ−１５位置、及び水酸基を有するＣ−２０位置はすべて適する。
【０１８０】
メイタンシノイド薬剤成分は、以下の構造を有するものを含む。
2018027948.tif 000023
【０１８１】
ここで、波線は、ＡＤＣのリンカーへのメイタンシノイド薬剤成分の硫黄原子の共有結合を示す。Ｒは、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであってもよい。硫黄原子にアミド基を付着しているアルキレン鎖は、メタニル、エタニル又はプロピルであってもよく、すなわち、ｍは１、２又は３である（米国特許第６３３４１０号；米国特許第５２０８０２０号；米国特許第７２７６４９７第；Chari et al (1992) Cancer Res. 52: 127-131;Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623)。
【０１８２】
メイタンシノイド薬剤成分のすべての立体異性体は、本発明の化合物、すなわちＤのキラルの炭素でのＲとＳ配位の任意の組み合わせが考慮される（米国特許第７２７６４９７号；米国特許第６９１３７４８号；米国特許第６４４１１６３号；米国特許第６３３４１０号（ＲＥ３９１５１）；米国特許第５２０８０２０号； Widdison et al (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408（これらはその全体が参考として援用される））。一実施態様では、メイタンシノイド薬剤成分は、以下の立体化学を有するであろう。
2018027948.tif 000024
【０１８３】
メイタンシノイド薬剤成分の典型的な実施態様には、以下の構造を有するＤＭ１；ＤＭ３；及びＤＭ４が含まれる。
2018027948.tif 000025
【０１８４】
ここで、波線は、抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への薬剤の硫黄原子の共有結合を示す。ＳＭＣＣによってＤＭ１に連結したハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）が報告されている（国際公開第２００５／０３７９９２号；米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号；米国特許出願公開第２００５／０１６９９３号）。
【０１８５】
他の典型的メイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲートは以下のような構造と略記号を有している。（ここでＡｂは抗体であり、ｐは１〜およそ８である。）
2018027948.tif 000026
【０１８６】
ＤＭ１が抗体のチオール基にＢＭＰＥＯリンカーにより連結されている典型的な抗体−薬剤コンジュゲートは、以下のような構造及び略記号を有する。
2018027948.tif 000027
ここで、Ａｂは抗体であり、ｎは０、１又は２であり、そして、ｐは１、２、３又は４である。
【０１８７】
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号Ａ１、欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等、Cancer Research, 52:127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性は、細胞当たり３×１０５のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌株化細胞ＳＫ−ＢＲ−３でインビトロで試験された。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０１８８】
抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号（この開示内容は出典明記により明確に援用される）を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０１８９】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１、Chari等、Cancer Research, 52:127-131(1992)、及び米国特許出願公開２００５／０１６９９３号Ａ１（これらの開示内容は出典明記により明確に援用される）に開示されているもの等を含め、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、米国特許公開第２００５／０２７６８１２号Ａ１の「抗体 - 薬剤コンジュゲート及び方法(Antibody-drug conjugates and Methods)」に開示されるように調製されうる。リンカーには、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれる。更なるリンカーを本願明細書中に記載し、例示する。
【０１９０】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。ある実施態様では、ジスルフィド結合を提供するＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）又はＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）(Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978))が含まれる。
【０１９１】
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じる。一実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノール類似体のＣ−３位で形成される。
【０１９２】
アウリスタチン類及びドラスタチン類
幾つかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチド性類似体又は誘導体、例えばアウリスタチン(auristatin)（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号）にコンジュゲートした抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分裂を妨げ（Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584）、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性（Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965）を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端により抗体に接着しうる（国際公開公報０２／０８８１７２）。
【０１９３】
典型的なアウリスタチンの実施態様には、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦが含まれる（米国特許第７４９８２９８号）。
【０１９４】
ペプチド性薬剤部分は以下の式ＤＥ及びＤＦから選択されうる。
2018027948.tif 000028
【０１９５】
ここで、ＤＥ及びＤＦの波線は、独立して各々の位置で、抗体又は抗体−リンカー成分への共有結合部位を示す。
【０１９６】
Ｒ２は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
【０１９７】
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環）から選択され；
【０１９８】
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環）から選択され；
【０１９９】
Ｒ５はＨ及びメチルから選択され；又はＲ４及びＲ５は共同で環状炭素を形成し、Ｒａ及びＲｂがＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル及びＣ３−Ｃ８炭素環から独立して選択される式−（ＣＲａＲｂ）ｎ−を有し、ｎは２、３、４、５及び６から選択され；
【０２００】
Ｒ６は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
【０２０１】
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環）から選択され；
【０２０２】
各々のＲ８は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環及びＯ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）から独立して選択され；
【０２０３】
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
【０２０４】
Ｒ１０は、アリール又はＣ３−Ｃ８ヘテロ環から選択され；
【０２０５】
ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、又はＲ１２がＣ１−Ｃ８アルキルであるＮＲ１２であり；
【０２０６】
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環、−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４、又は−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２から選択され；
【０２０７】
ｍは、１〜１０００の範囲の整数であり；
【０２０８】
Ｒ１３は、Ｃ２−Ｃ８アルキルであり；
【０２０９】
Ｒ１４は、Ｈ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
【０２１０】
各々のＲ１５の発生は、独立してＨ、ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ、又は−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
【０２１１】
各々のＲ１６の発生は、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、又は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨであり；
【０２１２】
Ｒ１８は−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−アリール、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環）、及び−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）から選択され；ｎは０から６の整数である。
【０２１３】
一実施態様において、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７は独立してイソプロピル又はｓｅｃ−ブチルであり、R5 は−Ｈ又はメチルである。例示的な実施態様では、Ｒ３及びＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ５は−Ｈであり、そしてＲ７はｓｅｃ−ブチルである。さらに他の実施態様では、Ｒ２及びＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ９は−Ｈである。さらに他の実施態様では、各々のＲ８の発生は-ＯＣＨ３である。例示的な実施態様では、Ｒ３及びＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ２及びＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ５は−Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ−ブチルであり、各々のＲ８の発生は−ＯＣＨ３であり、そしてＲ９は−Ｈである。一実施態様では、Ｚは−Ｏ−又は−ＮＨ−である。一実施態様では、Ｒ１０はアリールである。
ある例示的な実施態様では、Ｒ１０は−フェニールである。例示的な実施態様では、Ｚが−Ｏ−の場合、Ｒ１１は−Ｈ、メチル又はｔ−ブチルである。一実施態様では、Ｚが−ＮＨである場合に、Ｒ１１は−ＣＨ(Ｒ１５)２であり、ここでＲ１５は−(ＣＨ２)ｎ−Ｎ(Ｒ１６)２であり、Ｒ１６は−Ｃ１−Ｃ８アルキル又は−(ＣＨ２)ｎ−ＣＯＯＨである。
他の実施態様では、Ｚが−ＮＨである場合に、Ｒ１１は−ＣＨ(Ｒ１５)２であり、ここでＲ１５は−(ＣＨ２)ｎ−ＳＯ３Ｈである。
【０２１４】
式ＤＥの典型的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＥであり、ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す。
2018027948.tif 000029
【０２１５】
式ＤＦの典型的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＦであり、ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す（米国特許第７４９８２９８号及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124)を参照）。
2018027948.tif 000030
【０２１６】
他の典型的な実施態様には、ペンタペプチドアウリスタチン薬剤部分のＣ末端にフェニルアラニンカルボキシ修飾を有するモノメチルバリン化合物（国際公開第２００７／００８８４８号）及びペンタペプチドアウリスタチン薬剤部分のＣ末端にフェニルアラニン側鎖修飾を有するモノメチルバリン化合物（国際公開第２００７／００８６０３号）が含まれる。
【０２１７】
他の薬剤部分には以下のＭＭＡＦ誘導体が含まれ、ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す。
2018027948.tif 000031
2018027948.tif 000032
2018027948.tif 000033
【０２１８】
一態様では、限定するものではないが、上に示されるトリエチレングリコールエステル（ＴＥＧ）を含む親水基はＲ１１で薬剤部分に結合することができる。ある特定の理論に縛られるものではないが、親水基は薬剤部分の内在化及び非凝集に関与する。
【０２１９】
アウリスタチン／ドラスタチン又はその誘導体を含む式ＩのＡＤＣの典型的な実施態様は、米国特許第７４９８２９８号及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124に記載されており、これは出典明記によってここに明確に援用される。ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦと様々なリンカー成分を含む式ＩのＡＤＣの典型的な実施態様は、以下の構造及び略記号を有する（ここで、「Ａｂ」は抗体であり、ｐは１〜およそ８であり、「Ｖａｌ−Ｃｉｔ」はバリン−シトルリンジペプチドであり、そして「Ｓ」は硫黄原子である。
2018027948.tif 000034
【０２２０】
ＭＭＡＦと様々なリンカー成分を含む式ＩのＡＤＣの典型的な実施態様には、Ａｂ−ＭＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ及びＡｂ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦが更に含まれる。興味深いことに、タンパク質分解性の切断を受けないリンカーによって抗体に結合しているＭＭＡＦを含むイムノコンジュゲートは、タンパク質分解で切断可能なリンカーによって抗体に結合しているＭＭＡＦを含むイムノコンジュゲートに匹敵する活性を有することが示されている。例えば、Doronina 等、(2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124を参照。このような場合、薬剤放出は細胞内の抗体分解に影響を受けると思われる。同上。
【０２２１】
典型的には、ペプチドベースの薬剤部分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる（E. Schroder and K. Lubke, 「ペプチド（"The Peptides"）」、 1巻、 頁76-136, 1965, Academic Pressを参照）。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１；米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277;Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863；及びDoronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784の方法に従って調製されうる。
【０２２２】
特に、式ＤＦのアウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分、例えばＭＭＡＦ及びその誘導体は、米国特許第７４９８２９８号及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124に記載の方法を用いて調製されうる。式ＤＥのアウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分、例えばＭＭＡＥ及びその誘導体は、Doronina等 (2003) Nat. Biotech. 21:778-784に記載の方法を用いて調製されうる。薬剤−リンカー部分であるＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ＭＭＡＥ、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ、及びＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、例えばDoronina等 (2003) Nat. Biotech. 21:778-784、及び米国特許第７４９８２９８号に記載のような常套的な方法によって都合よく合成され、その後目的の抗体にコンジュゲートされてもよい。  
【０２２３】
カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ−ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ切断を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号（全て、American Cyanamid Company）を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Hinman等、Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許）が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易には通過しない。従って、抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０２２４】
他の細胞傷害性薬物
抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同第５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)（米国特許第５８７７２９６号）が含まれる。
【０２２５】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa））、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、アレウライツ・フォルディイ（Aleurites fordii）プロテイン、ジアンシン（dianthin）プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ（Phytolaca americana）プロテイン（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・キャランティア（momordica charantia）インヒビター、クルシン（curcin）、クロチン、サパオナリア（sapaonaria）オフィシナリスインヒビター、ゲロニン（gelonin）、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス（tricothecenes）が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０２２６】
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）との間に形成されるイムノコンジュゲートを更に検討する。
【０２２７】
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、Ｚｒ８９及びＬｕの放射性同位体を含む。イムノコンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
【０２２８】
放射−又は他の標識が、公知の方法でイムノコンジュゲートに導入され得る。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｚｒ８９及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57）は、ヨウ素−１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「免疫シンチグラフィーにおけるモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy)」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０２２９】
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号を参照）を抗癌剤などの活性な薬剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へコンジュゲートした抗体を含みうる。このようなイムノコンジュゲートは抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法（「ＡＤＥＰＴ」）に有用である。抗体にコンジュゲートされうる酵素には、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌剤５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ；β−ラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβ−ラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。酵素が、当分野で周知の組み換えＤＮＡ技術によって抗体に共有結合されてもよい。例として、Neuberger等、 Nature 312:604-608 (1984)を参照。
【０２３０】
薬剤ローディング（負荷、Drug Loading）
薬剤ローディングは、式Ｉの分子において、抗体当たりの薬剤部分の平均数であるｐによって表される。薬剤ローディングは抗体当たり１〜２０の薬剤部分（Ｄ）の範囲であってもよい。式ＩのＡＤＣには、１から２０の薬剤部分の範囲でコンジュゲートされる抗体の集まりが含まれる。コンジュゲート反応からのＡＤＣの調製において抗体当たりの薬剤部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ及びＨＰＬＣなどの従来の方法によって特徴付けられうる。ｐの観点からのＡＤＣの定量的分布も決定されうる。いくつかの場合では、ｐが他の薬剤ローディングを有するＡＤＣの一定の値である場合の均質なＡＤＣの分離、精製及び特徴づけは、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動などの手段によって達成されうる。
【０２３１】
一部の抗体−薬剤コンジュゲートに関して、ｐは抗体上の付加部位の数によって制限される場合がある。例えば、上記典型的な実施態様にあるように、結合がシステインチオールである場合、抗体はただ一つ又は複数のシステインチオール基を有する場合があり、又はリンカーが結合し得るただ一つ又は複数の十分に反応性のチオール基を有する場合がある。ある実施態様では、薬剤ローディングが高いと、例えばｐ＞５であると、特定の抗体−薬剤コンジュゲートの凝集、難溶性、毒性又は細胞透過性の喪失が起こりうる。ある実施態様では、本発明のＡＤＣの薬剤ローディングは、１からおよそ８の範囲、およそ２からおよそ６、又は、およそ３からおよそ５の範囲である。実際、あるＡＤＣでは、抗体当たりの薬剤部分の適切な比は、８未満であってもよいし、およそ２からおよそ５であってもよい。米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１を参照。
【０２３２】
ある実施態様では、理論的な最大よりも少ない薬剤部分がコンジュゲート反応の間に抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、以下に議論するように、薬剤−リンカー中間体又はリンカー試薬と反応しないリジン残基を含みうる。一般に、抗体は薬剤部分に結合しうる多くの遊離した反応性のシステインチオール基を含まず、実際、抗体のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在する。ある実施態様では、抗体は、反応性のシステインチオール基を生成するために、部分的ないしは完全に還元な条件下で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤により還元されうる。ある実施態様では、抗体は変性条件下に曝されるとリジンやシステインなどの反応性の求核基を現す。
【０２３３】
ＡＤＣのローディング（薬剤／抗体比率）は、例えば、（ｉ）抗体に対して薬剤−リンカー中間体又はリンカー試薬のモル過剰量を限定する、（ｉｉ）コンジュゲートの反応時間又は温度を限定する、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のために部分的又は限定的還元条件によるなど、異なる方法で制御しうる。
【０２３４】
１以上の求核基が薬剤部分試薬が続くリンカー試薬又は薬剤−リンカー中間体と反応する場合、その結果生じる生成物は、抗体に結合した一又は複数の薬剤部分の分布を有するＡＤＣ化合物の混合物であると考えられる。抗体当たりの薬剤の平均数は、抗体特異的かつ薬剤特異的である二重ＥＬＩＳＡアッセイによって混合物から算出されうる。個々のＡＤＣ分子は、質量分析によって混合物中で識別され、ＨＰＬＣ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィによって分離されうる（例としてMcDonagh等 (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307;Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070；Hamblett, K.J.,等 「薬理学、薬物動態学及び抗ＣＤ３０抗体−薬物コンジュゲートの毒性への薬物負荷の影響（"Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,"）」要旨番号624, 米国癌学会、2004年次総会（American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting）、 2004年3月27-31日、AACR予稿集（Proceedings of the AACR）、45巻、2004年3月；Alley, S.C.,等「抗体 - 薬物コンジュゲート中の薬物の結合位置を制御する（"Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,"）」要旨番号627, 米国癌学会、2004年次総会、2004年3月27-31日、AACR予稿集、45巻、2004年3月を参照）。ある実施態様では、単一のローディング値をもつ均質なＡＤＣは、電気泳動又はクロマトグラフィによってコンジュゲート混合物から単離してもよい。
【０２３５】
イムノコンジュゲートの所定の調製方法
式ＩのＡＤＣは、当業者に公知の有機化学的反応、条件及び試薬を用いた様々な手段、例えば、（１）共有結合によってＡｂ−Ｌを形成するための二価のリンカーと抗体の求核基との反応とその後の薬剤部分Ｄとの反応、及び（２）共有結合によってＤ−Ｌを形成するための二価のリンカーと薬剤部分の求核基との反応とその後の抗体の求核基との反応などによって調製されてもよい。後者の経路による式ＩのＡＤＣを調製するための例示的な方法は米国特許公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１に記載されており、出典明記によって本明細書中に明確に援用される。
【０２３６】
抗体の求核基には、限定するものではないが、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基が含まれる。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基により共有結合を形成することができる。このリンカー部分及びリンカー試薬には、（ｉ）活性エステル類、例えばＮＨＳエステル類、ＨＯＢｔエステル類、ハロギ酸類及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；（ｉｉｉ）アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、抗体が完全ないしは部分的に還元されるように、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）又はトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２つの反応性のチオール求核基を形成する。リジン残基の修飾によって、例えば、チオールにアミンを転換させる２−イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリジンを反応させることによって、抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する（例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する）ことによって抗体に導入されてもよい。
【０２３７】
また、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは、アルデヒドないしはケトンカルボニル基などの抗体上の求電子性基とリンカー試薬や薬剤上の求核基との間の反応によって生成してもよい。リンカー試薬上の有用な求核基には、限定するものではないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジドが含まれる。一実施態様では、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる求電子性の部分を導入するために抗体が修飾される。他の実施態様では、グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応しうるアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤（Hermanson, Bioconjugate Techniques）上の適当な基と反応することができる抗体のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含む抗体はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する（Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
【０２３８】
薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基が含まれる。このリンカー部分及びリンカー試薬には、（ｉ）活性エステル類、例えばＮＨＳエステル類、ＨＯＢｔエステル類、ハロギ酸類及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；（ｉｉｉ）アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
【０２３９】
本発明の化合物は、限定するものではないが、次の架橋剤：市販されている（例えば、Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.Aより）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）にて調製したＡＤＣが特に考えられる。
【０２４０】
抗体と細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などを使用して作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。
【０２４１】
別法として、抗体及び細胞傷害性薬物を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。組み換えＤＮＡ分子は、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの抗体と細胞障害性の部分をコードする領域を含みうる。
【０２４２】
さらに他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体−レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用して循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートする「リガンド」（例えばアビジン）を投与してもよい。
【０２４３】
薬学的製剤
一態様において、本発明は、本発明の少なくとも一抗体及び／又はその少なくとも一のイムノコンジュゲートを含む薬学的製剤を更に提供する。いくつかの実施態様では、薬学的製剤は、１）本発明の抗体及び／又はこのイムノコンジュゲートと、２）薬学的許容性のある担体とを含有する。いくつかの実施態様では、薬学的製剤は、１）本発明の抗体及び／又はこのイムノコンジュゲートと、場合によって２）少なくとも一の付加的治療剤とを含有する。更なる治療剤には以下に記載のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２４４】
本発明の抗体又はイムノコンジュゲートを含有する治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体又はイムノコンジュゲートと、場合によっては薬学的に許容される担体、ビヒクル又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980））、凍結乾燥又は水溶液の形態に調製されて保存される。許容される担体、ビヒクル又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、アセテート、トリス、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；トレハロース及び塩化ナトリウム等のｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与に用いられる薬学的製剤は一般に滅菌されている。これは滅菌濾過メンブレンによる滅菌によって容易に達成される。
【０２４５】
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ−粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに封入させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２４６】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性調合物の適切な例は、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体又はイムノコンジュゲートが身体内に長時間残ると、それらは３７℃で水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０２４７】
抗体は、標的細胞／組織への送達のために任意の適切な様式で調製されてもよい。例えば、抗体はイムノリポソームとして調製されてもよい。「リポソーム」は、哺乳動物への薬剤の送達に有用である様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小さいベシクルである。リポソームの構成成分は、生物学的膜の脂質配置と類似して、二重層を形成して一般に配置される。抗体を含むリポソームは、Epstein等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日公開の国際公開９７／３８７３１に記載されるような、当分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
【０２４８】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等、J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等、J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０２４９】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（momordica charantia）インヒビター、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria oficinalis）インヒビター、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（ｒestrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）及びトリコテセン（tricothecene）が含まれる。
【０２５０】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ８９、Ｉ２１１、Ｉ１３１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のためにコンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０２５１】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などを使用して作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０２５２】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばPierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ  ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０２５３】
薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＥＴＢＲ抗体の薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０２５４】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２５５】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤又は抗ＣＴＬＡ−４抗体、イピリムマブを更に提供することが望ましい場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０２５６】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート(methylmethacylate)）マイクロカプセル）により、コロイド薬物送達系で（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２５７】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
【０２５８】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０２５９】
治療的方法及び組成物
本明細書で提供される抗ＥＴＢＲ抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。
【０２６０】
一態様では、医薬として使用するための抗ＥＴＢＲ抗体が提供される。別の態様において、方法は、医薬として有用であるＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせた抗ＥＴＢＲ抗体を提供する。更なる態様において、その組み合わせはメラノーマ及び／又は転移性メラノーマの治療に有用である。所定の実施態様において、治療の方法に使用のためのＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせた抗ＥＴＢＲ抗体が提供される。所定の実施態様において、本発明は、個体に対して抗ＥＴＢＲ抗体の有効量とＢＲＡＦ阻害剤の有効量を投与することを含む、メラノーマ及び／又は転移性メラノーマを有する個体を治療する方法における使用のための抗ＥＴＢＲ抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、記載される組み合わせに対して少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）において使用のためのＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせた抗ＥＴＢＲ抗体を提供する。所定の実施態様において、本発明は、腫瘍増殖を阻害するＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせて抗ＥＴＢＲ抗体の有効量を被験体に投与することを含む、被験体において腫瘍増殖を阻害する方法において使用のためのＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせた抗ＥＴＢＲ抗体を提供する。上記実施態様のいずれかに記載の「被験体」は、好ましくはヒトである。
【０２６１】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製においてＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせた抗ＥＴＢＲ抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬はメラノーマ又は転移性メラノーマの治療のためである。更なる実施態様において、医薬は、メラノーマ又は転移性メラノーマを有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、メラノーマ又は転移性メラノーマを治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、医薬は腫瘍増殖阻害のためである。更なる実施態様にて、医薬は、腫瘍増殖を阻害するために医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍増殖を阻害する方法で使用のためである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２６２】
更なる態様において、本発明は、上記治療法の何れかで使用のために、本明細書で提供される抗ＥＴＢＲ抗体のいずれかを、例えばＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせて含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせた本明細書で提供される抗ＥＴＢＲ抗体の何れかと、薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせた本明細書で提供される抗ＥＴＢＲ抗体の何れかと、例えば後述するような少なくとも１つの更なる治療剤を含む。
【０２６３】
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与され得る。所定の非限定的な実施態様において、追加の治療剤はＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、又は抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えばイピリムマブである。
【０２６４】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。
【０２６５】
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤、例えばＢＲＡＦ阻害剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。あるいは、ＢＲＡＦ阻害剤は、錠剤又はカプセル又は液体形態の何れかで経口投与されても良い。
【０２６６】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２６７】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。しかしながら、他の投与量レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２６８】
製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質をさらに含んでもよい。
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【実施例】
【０２６９】
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２７０】
実施例１：抗ＥＴＢＲ ＡＤＣによる特異的細胞死滅のインビトロでの評価
抗ＥＴＢＲ抗体−ＡＤＣの候補であるＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣは、細胞株Ａ２０５８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手）の場合、ＥＴＢＲの比較的低いコピー数、又は細胞株ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２の場合、ＥＴＢＲの高コピー数のどちらかを発現するメラノーマ細胞株においてインビトロで評価された。ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２細胞株は、インビボでの増殖に最適化された親のＵＡＣＣ−２５７細胞株の誘導体である。親のＵＡＣＣ−２５７は雌のＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下注射され、１腫瘍を採取して分離し、インビトロで増殖させ、ＵＡＣＣ−２５７Ｘ１．２細胞株を得た。ＵＡＣＣ−２５７Ｘ１．２株は、細胞株の増殖を改善する目的のため、再び雌のＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下注射された。この試験からの腫瘍は収集され、ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２細胞株を生成するために、再びインビトロでの増殖に適応させた。フローサイトメトリーによって決定されるように、この細胞株はＥＴＢＲを高レベルで発現する。これらの細胞株におけるＨｕ５Ｅ９ｖ１−ｖｃ−ＭＭＡＥの細胞殺傷に対する受容体レベルの関係を以下のように評価した。
【０２７１】
メラノーマ細胞株Ａ２０５８及びＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２は、３７℃、５％ＣＯ２で適当な培地中で増殖させた。細胞生存率に対するＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの作用を評価するために、細胞を９６ウェル透明底黒色プレート中の通常の増殖培地５０μＬ中でウェルあたり１，５００で蒔いた。２４時間後、Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの濃度の連続希釈液を含む培養培地の更に５０μＬを、三つぞろいのウェルに添加した。５日後、細胞生存を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存試薬（Ｇ７５７２、Promega社）を用いて、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０１マルチラベルリーダーにより決定した。
【０２７２】
細胞あたりの抗体結合部位の決定を行った（スキャッチャード分析）：各抗体において親和定数及び細胞表面結合部位の数は、１２５Ｉ−標識Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの濃度を固定し、非標識Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの濃度の増加を組み合わせて、氷上で４時間メラノーマ細胞をインキュベートすることによって評価した。データは、解析プログラム方式を用いた非線形カーブフィッティングにより分析した。
【０２７３】
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、スキャッチャード分析により、Ａ２０５８およびＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２上のＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣ結合部位の数は、それぞれ細胞あたり、１，５８２部位及び３３９３９部位と推定された。抗ＥＴＢＲ ＡＤＣの候補によるこれらの細胞株の滴定は、一般的にＥＴＢＲ発現のレベルに比例した対照のＡＤＣと比較して、特異的細胞死滅を示した。
【０２７４】
実施例２：抗ＥＴＢＲ ＡＤＣによる特異的腫瘍死滅のインビトロでの評価
上記実施例１に記載した試験に基づいて、メラノーマ細胞株Ａ２０５８およびＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２を、広範囲のＥＴＢＲの発現を意味するインビボにおける抗腫瘍活性の研究に適したモデルとして選択した。ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２メラノーマ細胞株は、インビボでの増殖に最適化された親のＵＡＣＣ−２５７メラノーマ細胞株（国立癌研究所（ＮＣＩ））の誘導体である。具体的には、親のＵＡＣＣ−２５７は雌のＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下注射され、１腫瘍を採取し、インビトロで増殖させ、ＵＡＣＣ−２５７Ｘ１．２細胞株を得た。ＵＡＣＣ−２５７Ｘ１．２株は、細胞株の増殖を改善する目的のため、再び雌のＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下注射された。この試験からの腫瘍は収集され、ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２細胞株を生成するために、再びインビトロでの増殖に適応させた。この細胞株及びこの株に由来する腫瘍は、親細胞株ＵＡＣＣ−２５７に匹敵するＥＴＢＲを発現する（データ非表示）。
【０２７５】
次に、有効性試験は、上述した異種移植マウスモデルにおいてメラノーマ細胞株を用いて行った。全ての研究は、実験動物の管理と使用に関する指針に従って行った（参考：Institute of Laboratory Animal Resources (NIH publication no. 85-23), Washington, DC: National Academies Press; 1996）。チャールズ・リバー・ラボラトリーズからの１０から１４週齢の雌のＣＲＬのＮｕ／Ｎｕ又はＮＣｒヌードマウスは、背側右脇腹に、マトリゲルを含むＨＢＳＳ中５×１０６のＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２細胞又はマトリゲルを含むＨＢＳＳ中５×１０６のＡ２０５８細胞のどちらかを皮下接種された。腫瘍体積が約２００ｍｍ３（０日目）に達したとき、動物を各々１０匹の群に無作為に分けた。
【０２７６】
単一薬剤の有効性試験のために、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣの候補であるＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣは、０日目に単回静脈内（ＩＶ）注射として、１ｍｐｋ、３ｍｐｋ又は６ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）で投与した。対照のＡＤＣ抗体及びビヒクル対照もまた投与した。標準偏差と共に平均腫瘍体積を（グラフ上に示される）群あたり１０匹の動物から決定した。腫瘍体積は、試験終了時まで、週に２回測定した。
【０２７７】
結果は、高ＥＴＢＲコピー数のＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２細胞株について図３Ａに、低ＥＴＢＲコピー数の細胞株Ａ２０５８について図３Ｂに示す。実施例１に記載したインビトロ細胞死滅実験と一致して、ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２異種移植腫瘍はＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣにより応答性であった。有効性は、１ｍｇ／ｋｇので投薬グループでは明らかではなかったが、持続的な腫瘍退縮が、３ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇの単一用量のＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣに応答して観察された（図３Ａ）。
【０２７８】
３及び６ｍｇ／ｋｇのＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣ、６ｍｇ／ｋｇの対照のＡＤＣ又はビヒクル対照が、低ＥＴＢＲコピー数のＡ２０５８腫瘍を有する動物に対して投与された。腫瘍量の部分的減少は、Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの６ｍｐｋの高用量で、対照のＡＤＣ又はビヒクルの一致する用量に比して観察された。有効性は、Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣを３ｍｇ／ｋｇで投薬された群では明らかではなかった。従って、ヒトメラノーマにおいてＥＴＢＲ発現のスペクトルの下限を表すＡ２０５８異種移植モデルにおける腫瘍量の減少は（Asundi et al, 2011）、ヒトのメラノーマで遭遇するＥＴＢＲの十分な発現範囲に対応する腫瘍においては、単一薬剤として候補のＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣを用いて、有効性を達成することができることを示唆している。
【０２７９】
実施例３：ＥＴＢＲの発現レベルに対するＢＲＡＦ阻害薬物の効果
ＥＴＢＲ転写物およびタンパク質（全タンパク質及び細胞表面タンパク質）の発現レベルに対するＢＲＡＦ阻害薬物の作用は、例えば、ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）の変異体、ＢＲＡＦの野生型及びＲＡＳ（Ｑ６１Ｌ）の変異体など、メラノーマの様々な遺伝的背景を表す様々なメラノーマ細胞で評価した。
【０２８０】
メラノーマ細胞株ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２、Ａ２０５８、ＣＯＬＯ８２９、ＩＰＣ−２９８（ＡＴＣＣ）は、ＢＲＡＦ阻害薬物（「ＢＲＡＦｉ」）で、具体的には、ＲＧ７２０４を、４つのウェルの皿の上で２４時間培養中の細胞に適切な薬物量を添加することによって、様々な濃度で処置した。
【０２８１】
ＥＴＢＲ及び対照のリボソームタンパク質Ｌ１９（ＲＰＬ１９）の転写物のレベルに対するＢＲＡＦｉの作用を決定するために、以下の実験を行った。ＲＧ７２０４で２４時間処置した細胞をプレートから掻き取ることにより採取し、Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙミニキット（７９６５４、７４１０４、Qiagen, Valencia, CAから）を用いて全ＲＮＡについて処理した。Ｔａｑｍａｎアッセイは、Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA)からの試薬を用いて準備され、ＡＢＩからの７５００リアルタイムＰＣＲ装置とソフトウエアを用いてアッセイした。プライマー−プローブセットは、レポーター色素ＦＡＭ及びクエンチャー色素ＴＡＭＲＡにより二重に標識された蛍光発生プローブに隣接するプライマーを考慮して設計された。
【０２８２】
ＲＰＬ１９のプライマー−プローブセットは、以下の通りである：
【０２８３】
順方向プライマー−５’ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  Ａ（配列番号１１）；逆方向プライマー−５’ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＴＴ（配列番号１２）及びプローブ−５’ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＡＧＧ（配列番号１３）。
【０２８４】
ＥＴＢＲのプライマー−プローブセットは、以下の通りである：
【０２８５】
順方向プライマー−５’ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  Ｃ（配列番号１４），逆方向プライマー−５’ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ（配列番号１５）及びプローブ−５’ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＣＡＡ（配列番号１６）。
【０２８６】
ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２についての結果は図４Ａに示され、Ａ２０５８についての結果は図８Ａに示され、ＣＯＬＯ８２９についての結果は図６Ａに示される。これらの結果は、２４時間のＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４での処置は、ＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４を添加していない対照細胞と比較して、試験した全ての細胞株においてＥＴＢＲ転写物を増加するように見えることを示している。
【０２８７】
ＢＲＡＦｉ処置に起因するＥＴＢＲ転写物の増加はまたＥＴＢＲ総タンパク質レベルの任意の変化をもたらすかどうかを試験するために、ウェスタンブロット実験を、上記のようにＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４で処置した同じ細胞株で実施した。ウェスタンブロッティングのために、以下の試薬を使用した：タンパク質の検出用：抗ＥＴＢＲの社内生成されたモノクローナル抗体１Ｈ１．８．５、抗−ホスホｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体（９１０１、 Cell Signaling Technology）、抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）抗体（９１０２、Cell Signaling Technology）、及び対照として、ウサギポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）抗体（ＰＡ１−９８７；Affinity Bioreagents）及びマウスモノクローナル抗β−チューブリン抗体（５５６３２１、BD Pharmingen）。ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２についての結果は図４Ｂに示され、Ａ２０５８についての結果は図８Ｂに示され、ＣＯＬＯ８２９についての結果は図６Ｂに示され、そしてＩＰＣ−２９８についての結果は図１０に示される。これらの結果は、２４時間のＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４による処置は、ＢＲＡＦｉを添加していない対照細胞と比較して、試験した全てのＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２、Ａ２０５８、及びＣＯＬＯ ８２９細胞株において総ＥＴＢＲタンパク質を増加するように見えることを示している。しかｈし、ＢＲＡＦについて野生型でＲＡＳ（Ｑ６１Ｌ）について変異体である細胞株ＩＰＣ−２９８に関して、ＢＲＡＦｉは、様々なＢＲＡＦｉ投薬レベルに比べて、ＥＴＢＲのレベルを増加させるようには見えず、むしろ、図１０に示すように、リン酸化ＥＲＫのレベルを活性化するように見える。
【０２８８】
ＢＲＡＦｉ処置によるＥＴＢＲの総タンパク質レベルにおける観察された増加はまたＥＴＢＲ表面タンパク質レベルの増加を生じるかどうかを決定するため、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を実施した。細胞は、２．５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含むＰＢＳに回収し、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ緩衝液中で洗浄した。続く全ての工程は４０℃で行った。細胞は、３μｇ／ｍＬの抗ＥＴＢＲ抗体、Ｈｕ５Ｅ９ｖ１とともに１時間、続いて抗ヒトＩｇＧ蛍光検出試薬（Ａ１１０１３； Invitrogen）とともにインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。ＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２についての結果は図４Ｃに示され、Ａ２０５８についての結果は図８Ｃに示され、ＣＯＬＯ８２９についての結果は図６Ｃに示される。これらの結果は、２４時間のＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４による処置は、ＢＲＡＦｉを添加していない対照細胞と比較して、試験した全ての細胞株において発現したＥＴＢＲタンパク質の表面レベルを増加するように見えることを示している。しかし、細胞株ＩＰＣ−２９８に関して、ＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４は、図１１Ａ〜Ｃに示すように、試験された全ての投薬レベルでＥＴＢＲのレベルを減少させるように見える。
【０２８９】
実施例４：抗ＥＴＢＲ ＡＤＣのインビボでの有効性に対するＢＲＡＦ阻害薬物の効果
上の実施例３に示される結果を考慮し、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣのインビボ効力に対するＢＲＡＦ阻害薬物の影響を試験した。これを行うにため、Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣとＢＲＡＦｉ−９４５の様々な組み合わせためにおいてインビボでの有効性が、前述したＵＡＣＣ−２５７Ｘ２．２メラノーマモデルに対して評価された。腫瘍は、約２００ｍｍ３の平均サイズまで増殖させ、その上で動物を１０匹の群に無作為に分けた。適切なビヒクル対照（Ｋｌｕｃｅｌ ＬＦ）又はＢＲＡＦｉ−９４５は、試験日０日目に始まり２１日間１日１回、投与量が１ｍｐｋ、６ｍｐｋ、又は２０ｍｐｋで経口投与された。単回の１ｍｐｋ又は３ｍｐｋ投与量のＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣ又は対照、ヒスチジン緩衝液＃８が、試験日１日目に尾静脈を介して（９４５の２回投与量後に）静脈投与された。
【０２９０】
平均腫瘍体積は、群あたり１０匹の動物から決定した。腫瘍体積は、試験終了時まで、週に２回測定した。腫瘍体積は、ＵｌｔｒａＣａｌ ＩＶキャリパー（Ｍodel 54 10 111, Fred V. Fowler Company; Newton, MA）を用いて２つの寸法（長さと幅）で測定した。腫瘍体積を計算するために、以下の式をエクセルのバージョン１２．２．８（Microsoft; Redmond, WA）で用いた：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）×０．５
【０２９１】
ゆっくり時間をかけて、同じ動物からの腫瘍体積の反復測定を分析するため、ミックスド・モデリング線形混合効果（ＬＭＥ）アプローチを用いた（Pinheiro et al.2009）。このアプローチは、反復測定及び研究終了前の動物の非処置関連による中断率の両方に対処することができる。各投薬量レベルでｌｏｇ２腫瘍容積の時間経過に対する非線形プロファイルに適合するように、三次元回帰スプラインを使用した。次いでこれらの非線形プロファイルは混合モデル内で投与量に関連つけられた。ビヒクルの百分率としての腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、以下の式を用いて、ビヒクルに関して１日当たりの近似曲線（ＡＵＣ）下の面積率として算出した。
2018027948.tif 000037
【０２９２】
この式を用いて、１００％のＴＧＩ値は、腫瘍の静止状態を示し、＜１００％未満でなく、＞１％は腫瘍増殖遅延を示し、そして＞１００％は腫瘍の退縮を示す。％ＴＧＩの不確実性区間を得るため、近似曲線及び近似共分散マトリックスが、％ＴＧＩの分布の近似として無作為化サンプルを生成するために用いられた。無作為化サンプルは、近似混合モデルの１０００のシミュレートされた実現からなり、ここで％ＴＧＩは各実現について再計算される。ここで、報告されたＵＩにおいて９５％の時間の値があり、近似モデルを仮定すると、％ＴＧＩの再計算される値はこの領域に落ち着く。シミュレートされた分布の２．５および９７．５パーセンタイルを上限と下限のＵＩとして使用した。
【０２９３】
結果を図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅに示す。Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣとＢＲＡＦｉ−９４５の全ての組み合わせは、単一薬剤のみとして薬剤のいずれの薬物よりも優れた有効性を示した。最低レベルで組み合わされた２つの薬物は、試験された最高投薬レベルで達成された組み合わせ有効性とほとんど区別がつかない組み合わせ有効性を得るために試験された。
【０２９４】
実施例５：ＣＯＬＯ８２９異種移植片においてインビボにおける抗ＥＴＢＲ ＡＤＣとＢＲＡＦｉの組み合わせの投与量試験
上記実施例に記載される試験は、ＢＲＡＦ阻害薬物ＲＧ７２０４．とのＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの組み合わせによるインビボでの有効性の評価の精密化を可能とする。薬間間の拮抗作用の欠如が予想され、従って、薬物の組み合わせによる有効性は低用量で試験した。ＣＯＬＯ８２９異種移植モデルが、組み合わせ試験のストリンジェンシーを更に増加させる、ＥＴＢＲ発現の中庸なレベルの代表として選択された。腫瘍は、約２００ｍｍ３の平均サイズまで増殖させ、その上で動物を９匹の群に無作為に分けた。適切なビヒクル対照（Ｋｌｕｃｅｌ ＬＦ）又はＧ０００４４３６４．１−１２（ＲＧ７２０４）は、試験日０日目に開始し２１日間１日１回、投与量が１０ｍｐｋ又は３０ｍｐｋで経口投与された。Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの１ｍｐｋ或いは３ｍｐｋの何れかの、又は対照のヒスチジン緩衝液＃８の単一用量が１日目に静脈内投与された。結果を図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、及び７Ｄに示す。
【０２９５】
両方の薬物（３０ｍｇ／ｋｇのＲＧ７２０４及び３ｍｇ／ｋｇのＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣ）の中程度の用量が、何れかの薬物単独よりも大きな組み合わせによる有効性を得るために、一緒に良く混合された。他の低用量での２つの薬物の組み合わせは、組み合わせて試験した最低用量を唯一例外として、類似の傾向を示した。
【０２９６】
実施例６：Ａ２０５８異種移植片においてインビボにおける抗ＥＴＢＲ ＡＤＣとＢＲＡＦｉの組み合わせの投与量試験
Ａ２０５８異種移植モデルにおけるＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣ及びＲＧ７２０４の有効性を試験した。このモデルは、それが示す高レベルのストリンジェンシーのため特に重要である。Ａ２０５８異種移植モデルは、メラノーマ患者に見いだされるＥＴＢＲの発現スペクトルの下限を示し、それによって、それを抗ＥＴＢＲ ＡＤＣを実現するための挑戦的なモデルとしている。更に、そのＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異状態にも関わらず、このモデルは、インビトロでの致死効果が＞２０μＭを有し、ＲＧ７２０４に対して非応答性であることを示している。
【０２９７】
腫瘍は、約２００ｍｍ３の平均サイズまで増殖させ、その上で動物を１０匹の群に無作為に分けた。適切なビヒクル対照（Ｋｌｕｃｅｌ ＬＦ）又はＲＧ７２０４は、試験日０日目に開始し２１日間１日１回、投与量が１０ｍｐｋ又は３０ｍｐｋで経口投与された。Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの３ｍｐｋ或いは６ｍｐｋの何れかの、又は対照のヒスチジン緩衝液＃８の単一用量が１日目に尾静脈に静脈内投与された。結果を図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄに示す。
【０２９８】
結果は、試験された全てのケースにおいて、Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣとＲＧ７２０４の組み合わせが、任意の単一薬剤単独よりも大きな有効性を示したことを示している。ＲＧ７２０４単独の１０ｍｇ／ｋｇの投与量は、Ａ２０５８モデルに対して単一薬剤の有効性を示さなかった（図９Ａ及び９Ｃを参照）。しかし、６ｍｇ／ｋｇのＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣと組み合わせると、何れかの薬剤単独によるよりも良好な有効性を実現した。１０ｍｇ／ｋｇのＲＧ７２０４と６ｍｇ／ｋｇのＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣの組み合わせは、試験された最高投与量レベル、即ち、図９Ｂに示されるように３０ｍｐｋのＲＧ７２０４と６ｍｐｋのＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣで達成された組み合わせ有効性からほとんど区別できない組み合わせ有効性を実証した。
【０２９９】
表３は、単一薬剤として抗ＥＴＢＲ ＡＤＣのＴＧＩのパーセント又は単一薬剤としてＢＲＡＦ阻害剤のＴＧＩのパーセントの何れかと比較した場合の、ＢＲＡＦ阻害剤と抗ＥＴＢＲ ＡＤＣの組み合わせ用途の差分のパーセント（最後の列）として表される組み合わせ有効性を実証するために、上述したように様々な投与量で試験された３種のメラノーマ異種移植モデルを要約する。ＴＧＩのパーセントは、上述したように、線形混合効果（ＬＭＥ）モデリングアプローチを用いて計算した。
【０３００】
実施例７：ＥＴＢＲの発現レベルに対するＭＥＫ阻害薬物の効果
ＥＴＢＲ転写物及びタンパク質（総タンパク質及び細胞表面タンパク質）の発現レベルへのＭＥＫ阻害薬物の作用が、ＢＲＡＦ野生型或いは変異型及び／又はＲＡＳ野生型或いは変異型の何れかである様々なメラノーマ細胞：ＣＯＬＯ８２９（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）、Ａ２０５８（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）、ＳＫ２３−ＭＥＬ（ＢＲＡＦＷＴ／ＲＡＳＷＴ）、又はＩＰＣ−２９８（ＢＲＡＦＷＴ／ＲＡＳＣ６１Ｌ）で評価された。
【０３０１】
メラノーマ細胞株Ａ２０５８、ＣＯＬＯ ８２９、ＳＫ２３−ＭＥＬ及びＩＰＣ−２９８（ＡＴＣＣ）は、様々な濃度（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ又は１μＭ）でのＭＥＫ阻害薬物（「ＭＥＫｉ−９７３」又は「ＭＥＫｉ−６２３」）により、４つウェルの皿上で２４時間培養中の細胞に適切な薬物量を添加することによって処置された。
【０３０２】
ＥＴＢＲ転写物へのＭＥＫｉの作用を決定するために、以下の実験を実施例３に記載されるように実施した。一方のＭＥＫＩｉ−９７３で２４時間処置した細胞をプレートから掻き取ることにより採取し、Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙミニキット（７９６５４、７４１０４、Qiagen, Valencia, CAから）を用いて全ＲＮＡについて処理した。Ｔａｑｍａｎアッセイは、 Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA）からの試薬を用いて準備され、ＡＢＩからの７５００リアルタイムＰＣＲ装置とソフトウエアを用いてアッセイした。プライマー−プローブセットは、レポーター色素ＦＡＭ及びクエンチャー色素ＴＡＭＲＡにより二重に標識された蛍光発生プローブに隣接するプライマーを考慮して設計された。
【０３０３】
ＲＰＬ１９のプライマー−プローブセットは、以下の通りである：
【０３０４】
順方向プライマー−５’ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  Ａ（配列番号１１）；逆方向プライマー−５’ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＴＴ（配列番号１２）及びプローブ−５’ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＡＧＧ（配列番号１３）。
【０３０５】
ＥＴＢＲのプライマー−プローブセットは、以下の通りである：
【０３０６】
順方向プライマー−５’ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  Ｃ（配列番号１４），逆方向プライマー−５’ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ（配列番号１５）及びプローブ−５’ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＣＡＡ（配列番号１６）。
【０３０７】
指定された用量でＭＥＫｉ−６２３で処置されたＡ２０５８についての結果は図１４Ａに、ＭＥＫｉ−９７３で処置されたＡ２０５８についての結果は図１４Ｂに示す。これらの結果は、２４時間のＭＥＫ阻害剤での処置は、ＭＥＫ阻害剤を添加していない対照細胞と比較して、ＥＴＢＲ転写物を増加するように見えることを示している。
【０３０８】
ＭＥＫｉによる処置に起因するＥＴＢＲ転写物の増加はまたＥＴＢＲ総タンパク質レベルの変化をもたらすかどうかを試験するために、上述するように、ウェスタンブロット実験を、細胞株ＣＯＬＯ８２９（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）、Ａ２０５８（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）、ＳＫ２３−ＭＥＬ（ＢＲＡＦＷＴ／ＲＡＳＷＴ）、又はＩＰＣ−２９８（ＢＲＡＦＷＴ／ＲＡＳＣ６１Ｌ）について行った。ウェスタンブロッティングのために、以下の試薬を使用した：タンパク質の検出用：抗ＥＴＢＲの社内生成されたモノクローナル抗体１Ｈ１．８．５、抗−ホスホｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体（９１０１、Cell Signaling Technology）、抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）抗体（９１０２、Cell Signaling Technology）、及び対照として、ウサギポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）抗体（ＰＡ１−９８７；Affinity Bioreagents）及びマウスモノクローナル抗β−チューブリン抗体（５５６３２１、BD Pharmingen）。ＭＥＫｉ−６２３で処置されたＡ２０５８についての結果は図１５Ａに、ＭＥＫｉ−９７３で処置されたＡ２０５８についての結果は図１５Ｂに、ＭＥＫｉ−６２３で処置されたＣＯＬＯ８２９についての結果は図１２Ａに、ＭＥＫｉ−９７３で処置されたＣＯＬＯ８２９についての結果は図１２Ｂに、ＭＥＫｉ−６２３で処置されたＳＫ２３−ＭＥＬについての結果は図１９Ａに、ＭＥＫｉ−９７３で処置されたＳＫ２３−ＭＥＬについての結果は図１９Ｂに、ＭＥＫｉ−６２３で処置されたＩＰＣ−２９８についての結果は図２２Ａに、ＭＥＫｉ−９７３で処置されたＩＰＣ−２９８についての結果は図２２Ｂに示す。これらの結果は、２４時間のＭＥＫｉ−６２３又はＭＥＫｉ−９７３による処置は、ＭＥＫｉを添加していない対照細胞と比較して、試験した全ての細胞株においで総ＥＴＢＲタンパク質を増加するように見えることを示している。
【０３０９】
ＭＥＫｉ処置によるＥＴＢＲの総タンパク質レベルにおける観察された増加はまたＥＴＢＲ表面タンパク質レベルの増加を生じるかどうかを決定するため、上述されるように蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を実施した。細胞は、２．５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含むＰＢＳに回収し、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ緩衝液中で洗浄した。続く全ての工程は４０℃で行った。細胞は、３μｇ／ｍＬの抗ＥＴＢＲ抗体、Ｈｕ５Ｅ９ｖ１とともに１時間、続いて抗ヒトＩｇＧ蛍光検出試薬（Ａ１１０１３； Invitrogen）とともにインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。Ａ２０５８についての結果は図１６Ａ−Ｆに示し、ＣＯＬＯ８２９についての結果は図１３Ａ−Ｆに示し、ＳＫ２３−ＭＥＬについての結果は図２０Ａ−Ｆに示し、ＩＰＣ−２９８についての結果は図２３Ａ−Ｆに示す。これらの結果は、２４時間のＭＥＫｉ−６２３又はＭＥＫｉ−９７３による処置は、ＭＥＫｉを添加していない対照細胞と比較して、試験した全ての細胞株においでＥＴＢＲタンパク質の表面のレベルを増加するように見えることを示している。
【０３１０】
実施例８：抗ＥＴＢＲ ＡＤＣのインビボでの有効性に対するＭＥＫ阻害薬物の効果
上の実施例７に示される結果を考慮し、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣのインビボ効力に対する本明細書に記載されるＭＥＫ阻害剤の影響を試験した。これを行うために、Ｈｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣ及びＭＥＫｉ−６２３及び／又はＭＥＫｉ−９７３の様々な組み合わせについてのインビボ有効性を、インビボモデルにおけるＡ２０５８およびＳＫ−ＭＥＬ−２３およびＩＰＣ−２９８に対して、実施例４に上述されるように実施して評価した。適切なメチルセルローストゥイーンビヒクル対照（０．５％メチルセルロース、０．２％のＴｗｅｅｎ−８０（ＭＣＴ）又はＭＥＫ阻害剤は、試験日０日目に始まり２１日間１日１回、投与量が１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、又は７．５ｍｐｋで経口投与された。単回の３ｍｐｋ又は６ｍｐｋ投与量のＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣ又は対照、ヒスチジン緩衝液＃８が、試験日１日目に尾静脈を介して（ＭＥＫ阻害剤の２回投与量後に）静脈投与された。
【０３１１】
結果は、図１７Ａ−Ｂ、図２１，図２４及び図２５に示す。驚くべきことに、試験されたＨｕ５Ｅ９ｖ１−ＡＤＣ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の組み合わせの全てが単一薬剤単独としての一方の薬物の相加的有効性よりも高い有効性を示した。
【０３１２】
実施例９：Ａ２０５８及びＣＯＬＯ８２９メラノーマ異種移植片のＰＤ試験
図７に示される試験の終了時に収集した腫瘍（ＣＯＬＯ８２９対抗ＥＴＢＲ−ＡＤＣとＢＲＡＦｉ ＲＧ７２０４の組み合わせ）はＥＴＢＲの増加を示さなかった。これは、腫瘍収集のタイミングが投与されたＢＲＡＦｉ薬物のウオッシュ・アウト期間を十分過ぎていたことに起因するであろう。細胞株においてＢＲＡＦｉ／ＭＥＫｉのインビトロでの作用（即ちＥＴＢＲの増加及びＰｅｒｋの減少）はインビボでも生じるか、そしてそれゆえ、抗ＥＴＢＲ ＡＤＣとＢＲＡＦｉ／ＭＥＫｉの組み合わせにおいてより高い有効性を可能にするかどうかを評価するため、以下の実験を実施した。
【０３１３】
Ａ２０５８腫瘍又はＣＯＬＯ８２９腫瘍は、約２００ｍｍ３の平均サイズまで増殖させ、その上で動物を５−６匹の群に無作為に分けた。ＢＲＡＦｉ ＰＤ試験において、適切なビヒクル対照（Ｋｌｕｃｅｌ ＬＦ）又はＲＧ７２０４は、３日間１日１回、投与量が１０ｍｐｋ又は３０ｍｐｋで経口投与された（図２７Ａ）。ＭＥＫｉ ＰＤ試験において、適切なビヒクル対照又はＭＥＫｉ−９７３は、３日間１日１回、投与量が５ｍｐｋ又は１０ｍｐｋで経口投与された（図２７Ｂ）。試験終了時に採取した急速冷凍された腫瘍を均質化し、ＲＮＡ及び／又はタンパク質について処理した。Ｔａｑｍａｎアッセイは、Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA)からの試薬を用いて準備され、ＡＢＩからの７５００リアルタイムＰＣＲ装置とソフトウエアを用いてアッセイした。プライマー−プローブセットは、レポーター色素ＦＡＭ及びクエンチャー色素ＴＡＭＲＡにより二重に標識された蛍光発生プローブに隣接するプライマーを考慮して設計された。ＥＴＢＲ転写物のレベルは、これらの遺伝子のヒトの相同体に特異的であるプライマーとプローブの組を用いて、Ｈｐｒｔ１（ヒポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼ１）又はＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）などの参照遺伝子の転写物レベルに対して規格化した。
【０３１４】
参照遺伝子Ｈｐｒｔ１（ヒポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼ１）のプライマーとプローブの組は以下の通りである：
【０３１５】
順方向プライマー−５’ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＴＡＡ  ＧＡＡ（配列番号１７）；逆方向プライマー−５’ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  Ｔ（配列番号１８）及びプローブ−５’ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＡＧ  ＴＡＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  Ａ（配列番号１９）。
【０３１６】
ＥＴＢＲのプライマー−プローブセットは、以下の通りである：
【０３１７】
順方向プライマー−５’ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  Ｃ（配列番号１４），逆方向プライマー−５’ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ（配列番号１５）及びプローブ−５’ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＣＡＡ（配列番号１６）。
【０３１８】
参照遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）のプライマーとプローブの組は以下の通りである：
【０３１９】
順方向プライマー−５’ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＴＣ（配列番号２０）、逆方向プライマー−５’ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  Ｃ（配列番号２１）、及びプローブ−５’ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣ（配列番号２２）。
【０３２０】
図２７Ａは、ＢＲＡＦｉは、対照のビヒクルと比べてインビボでＥＴＢＲ ｍＲＮＡを誘導することを示す。図２７Ｂは、ＭＥＫｉ−９７３は、対照のビヒクルと比べてインビボでＥＴＢＲ ｍＲＮＡを誘導することを示す。
【０３２１】
リン酸化ｅｒｋおよび総ｅｒｋタンパク質レベルは、下記の試薬を用いたウエスタンブロット法によって腫瘍において評価した：抗−ホスホｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体（９１０１、 Cell Signaling Technology）、抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）抗体（９１０２、 Cell Signaling Technology）、及び対照としてマウスモノクローナル抗β−チューブリン抗体（５５６３２１、 BD Pharmingen）（図２６）。ここで、ＢＲＡＦｉは対照と比較して、インビボでＰｅｒｋを阻害するように思われる。
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【０３２２】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−Ｃ】
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【図２１Ｄ−Ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月20日(2017.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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