(57)【要約】【課題】配列対称形に修飾されたＩｇＧ４二重特異性抗体の提供。【解決手段】本開示は、可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＧ４の対称形二重特異性抗体であって、各重鎖において、：軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは別のアミノ酸で置換されており；任意で、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸はシステインで置換されており、各重鎖の定常領域配列は類似しているか又は同一であり、各重鎖の可変領域が異なっている上記対称形二重特異性抗体、それを含む製剤、処置における上記各々の使用、並びに前記抗体及び製剤を調製するプロセスに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＧ４の対称形二重特異性抗体であって、各重鎖において：軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており；
任意で、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されており、各重鎖の定常領域配列が類似しているか又は同一であり、各重鎖の可変領域が異なっている、上記対称形二重特異性抗体。
【請求項２】
ヒンジ領域がＩｇＧ１型ヒンジである、請求項１に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項３】
抗体が単離される、請求項１又は２に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項４】
重鎖の一方又は両方において、ＣＨ１ドメイン中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが、別のアミノ酸で置換されている、請求項１から３までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項５】
第１の重鎖の上部ヒンジ領域に位置する、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている、請求項１から４までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項６】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３０位のグリシンがシステインで置換されている、請求項５に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項７】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２９位のチロシンがシステインで置換されている、請求項５に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項８】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２８位のリシンがシステインで置換されている、請求項５に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項９】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７位のセリンがシステインで置換されている、請求項５に記載の対称形の抗体。
【請求項１０】
重鎖の一方又は両方において、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン及び２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から９までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１１】
第１の重鎖の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１２】
第１の重鎖の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１３】
可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＧ４の対称形二重特異性抗体であって、各重鎖において、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン及び／又は２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されており、各重鎖の定常領域配列が類似しているか又は同一であり、各重鎖における可変領域が異なっている上記対称形二重特異性抗体。
【請求項１４】
第１の重鎖の２３９位のシステイン及び／又は２４２位のシステインが、チオール非含有アミノ酸によって置換されている、請求項１０から１３までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１５】
チオール非含有アミノ酸がセリンである、請求項１４に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１６】
１２７位のシステインがチオール非含有アミノ酸によって置換されている、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１７】
チオール非含有アミノ酸がセリンである、請求項１６に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１８】
重鎖の一方又は両方が変異を受けて、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番でアミノ酸２２６〜２４３の間に３個のアミノ酸が挿入されている、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１９】
重鎖の一方又は両方が変異を受けて、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３８位と２３９位の間に３個のアミノ酸が挿入されている、請求項１８に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２０】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で第１の重鎖の２３８位と２３９位の間に３個のアラニンが挿入されている、請求項１９に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２１】
トレオニン、ヒスチジン及び更なるトレオニンが、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で重鎖の一方又は両方の２３８位と２３９位の間に挿入されている、請求項１９に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２２】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で重鎖の一方又は両方の２４１位のセリンが、プロリンで置換されている、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２３】
重鎖の一方又は両方において、２３０位のグリシンがシステインで置換され、２２７位のセリンがプロリンで置換され、２２９位のチロシンがセリンで置換され、２３７位のプロリンがアスパラギン酸で置換され、２３８位のプロリンがリシンで置換され、アミノ酸配列トレオニン−ヒスチジン−トレオニンが、２３８位と２３９位の間に挿入され、２４１位のセリンがプロリンで置換されている、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２４】
両方の重鎖がＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含む、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２５】
各重鎖のヒンジ領域が同一である、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２６】
各重鎖が、長さ１２〜１７アミノ酸、例えば長さ１５アミノ酸の上部ヒンジ領域及びコア領域を含む、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２７】
１本又は２本の軽鎖を更に含む、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項２８】
請求項１から２７までのいずれか一項に記載の抗体をコードする配列を含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
疾患又は障害の処置に使用する、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
重鎖交換を引き起こす条件下で、第１のＩｇＧ４抗体を第２のＩｇＧ４抗体とｅｘ  ｖｉｖｏで混合するステップを含む対称形二重特異性抗体を生成する方法であって、第１の抗体における可変領域の抗原特異性が、第２の抗体における可変領域の抗原特異性と異なる上記方法。
【請求項３２】
重鎖交換を引き起こす条件が還元条件、例えば適切な緩衝液の存在下である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から２６までのいずれか一項に記載の通り、第１のＩｇＧ４抗体及び第２のＩｇＧ４抗体が、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える、請求項３１又は請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型抗体と比較してジスルフィド結合の配置が変更されている二重特異性ＩｇＧ４抗体及び前記の改善された抗体を作製する方法に関する。更なる態様において、本開示は、二重特異性抗体を調製する効率的な方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及び核酸に基づいた薬物を取り巻く生物薬剤産業は急速に成長している。抗体操作により、抗体断片又は別の形態の設計及び産生がもたらされた。治療剤として抗体に基づくタンパク質を選択する場合、産生量、タンパク質の品質及び貯蔵安定性など他の態様と共に好ましい分子形態が考慮される。
【０００３】
全ての免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の基本的な構造は、ジスルフィド結合によりカップリングされる２本の同一の重鎖（ＨＣ）及び２本の同一の軽鎖（ＬＣ）を含む。各ＬＣは、可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）ドメインからなる。ＨＣに基づいて、５つの主要なＩｇクラスが認識されている：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ。ＩｇＧの場合、ＨＣは、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１〜３）からなる。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクター機能の刺激に関与してＩｇＧ分子に柔軟性を与えるヒンジ領域によってＦａｂフラグメント（ＶＨＶＬ及びＣＨＣＬ）に連結される分子のＦｃ部分を形成する。２つの抗原認識部位は、ＶＬ及びＶＨドメインの末端に位置する。ＩｇＧは、４つの異なるアイソタイプに更に細分される：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４。
【０００４】
Ｆｃ媒介エフェクター機能、すなわち抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、アイソタイプ依存性である。各アイソタイプは、体内で特定の機能を果たすように進化してきた。ＩｇＧ１アイソタイプは、長い半減期、強いＡＤＣＣ活性、補体活性のため、治療用として現在最も広く使用されている。他のアイソタイプは、標的及び望ましい効果に応じた治療剤として利用される。例えば、標的抗原が簡単に中和され、エフェクター機能があまり重要でない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４など別アイソタイプを使用できる。別法として、再操作されたＦｃ／エフェクター機能を備えるＩｇＧを考えることもできる。
【０００５】
ＩｇＧ２は、付随するするエフェクター機能を最小限しか持たないが、二量体化しやすく、これについては完全には理解されていない。
【０００６】
ＩｇＧ４は、エフェクター機能誘導の相対的欠如ゆえに、依然として有用なアイソタイプである。しかし、ＩｇＧ４にはいくつか特有の実用上の問題点もあり、すなわち短い血清半減期及び「Ｆａｂアーム交換」（力学的重鎖交換又は重鎖交換とも呼ぶ）を受ける能力であり、１つの抗体の重鎖及び付着している軽鎖は、別の抗体の重鎖及び付着している軽鎖で交換されて、２本の重鎖及び付着している２本の軽鎖からなる別の全抗体が形成される（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７巻、１５５４〜１５５７頁）。
【０００７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦａｂアーム交換の結果、可変ドメインが異なるため、異なる標的抗原を共に係合できる二重特異性抗体が得られる。これは、二重特異性であるが、機能的には一価であると観察された循環ＩｇＧ４を高いパーセンテージで作製する（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊ．、Ｖａｎ  Ｒｅｅ，Ｒ．、Ｐｅｒｄｏｋ，Ｇ．Ｊ．、Ｖａｎ  Ｄｏｏｒｎ，Ｈ．Ｒ．、Ｔａｎ，Ｋ．Ｙ．、Ａａｌｂｅｒｓｅ，Ｒ．Ｃ．、１９９９年、「ヒト正常免疫グロブリンＧ４は二重特異性になり得る：それは２つの異なる抗原結合部位を有する。（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ４  ｃａｎ  ｂｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ：ｉｔ  ｈａｓ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９７巻、６９３〜６９８頁）。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＩｇＧ４抗体を分析する場合、通常、ヒンジ領域内における重鎖内ジスルフィド結合形成のため重鎖間ジスルフィド結合を欠くことに起因して、共有結合的に会合した単一の重鎖−軽鎖対を各々含むいわゆる「半分子」が形成されることが観察された。「半分子」の重鎖は、その重鎖と対をなす相手と非共有結合的に会合することができ、その会合はＣＨ３：ＣＨ３ドメイン相互作用によって維持される。溶液において、サイズ排除クロマトグラフィーなどの方法を使用して、完全な大きさはおよそ１５０ｋＤａであるが非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは７５ｋＤａのＬＣ：ＨＣ対合（いわゆる「半分子」）を含むそのような「半分子」が実際に観察される。
【０００９】
ヒンジ内の２４１位（Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で）でのＳｅｒからＰｒｏへの変異は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるこれら「半分子」の出現を低下させる（Ａｎｇａｌ，Ｓ．ら、１９９３年、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において観察されるように、単一のアミノ酸置換が、キメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の異質性を無効にする（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  （ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｓ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０巻、１０５〜１０８頁）。加えて、この点突然変異はＩｇＧ４の小型構造には影響せず、それにより、ＩｇＧ４は補体を活性化する能力の低下を維持できる。
【００１０】
Ｓ２４１Ｐ変異の発見の後、ＩｇＧ４抗体における重鎖間相互作用を理解し、ＩｇＧ４エフェクター機能を低下させ、構造的な安定性を向上させるために、ＩｇＧ４に対する更なる変異が研究された。Ｓｃｈｕｕｒｍａｎら（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊら、２００１年、「ＩｇＧ４の重鎖間ジスルフィド結合は、重鎖内ジスルフィド結合と平衡している（Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒ−ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｏｆ  ＩｇＧ４  ａｒｅ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａ−ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８巻、１〜８頁）において、観察されたＩｇＧ４の重鎖間ジスルフィド結合の不安定性は、ＩｇＧ４変異体を使用して研究された。変異体Ｍ１において、重鎖−軽鎖間（ＣＬ−ＣＨ１）ジスルフィド結合に関わっているＣｙｓ１３１（ＥＵ付番方式に従った付番で、又はＫａｂａｔ付番方式に従ってＣｙｓ１２７）がセリンによって置きかえられ、この変異体が、軽鎖のダイマー及び重鎖のダイマーを形成することが見出された。変異体Ｍ２において、ヒンジにおける重鎖間ジスルフィド結合に関わっているシステイン２２６（ＥＵ付番方式に従った付番で２２６、又はＫａｂａｔ付番方式に従って２３９）はセリンによって置きかえられ、この変異体がＩｇＧ４と比較して重鎖間結合がより安定しており、重鎖内ジスルフィド結合の形成を防ぐことが見出された。
【００１１】
ＩｇＧ４抗体の凝集体形成を低下させるために、ＩｇＧ４抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインにおける変異についても研究した。米国特許出願公開第２００８／００６３６３５号Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、ＩｇＧ４の変異体について研究し、その変異体においてＣＨ３ドメインの４０９位（ＥＵ付番方式に従った付番で４０９、又はＫａｂａｔ付番方式に従った付番で４４０）のアルギニンがリシン、トレオニン、メチオニン又はロイシンで置換されており、低ｐＨにおける凝集体形成を阻害した。Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１（ＥＵ付番方式に従った付番でＬ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１、又はＫａｂａｔ付番方式に従った付番でＬ２４８、Ｄ２７８、Ｄ２８３、Ｋ３４１、Ｐ３４８及びＰ３５０）における更なる変異も教示され、ＣＤＣ活性が減弱される。ＷＯ２００８／１４５１４２  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌらは、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番方式に従った付番でＳ２２８、又はＫａｂａｔ付番方式に従ってＳ２４１）変異がなくても、４０９位のアルギニン残基、４０５位のＰｈｅ残基又は３７０位のＬｙｓ（ＥＵ付番方式に従った付番でＲ４０９、Ｆ４０５及びＫ３７０、又はＫａｂａｔ付番方式に従った付番でＲ４４０、Ｆ４３６及びＫ３９３）の置換によってＦａｂアーム交換を受ける能力が低下した安定なＩｇＧ４抗体について開示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、野生型抗体、特に野生型ＩｇＧ４抗体及び断片と比較して改善された生物物理学的特性を含めて有利な特性を有する新たな変異体抗体を提供する。特に、驚くべきことに、軽鎖中のシステインとジスルフィド結合を形成するＩｇＧ４抗体の重鎖内システイン残基の位置の交換は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して安定性が改善されたＩｇＧ４抗体をもたらすことが見出された。変異体ＩｇＧ４抗体は、有利なＦａｂアーム交換特性を有する二重特異性抗体を形成することが可能であることも見出された。
【００１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、高濃度の抗体を利用する及び／又はグルタチオンなどの化学的刺激剤を利用することによってＦａｂ−アームの交換を促進して、治療剤用として安定且つ適切である二重特異性形態を生成することができる。二重特異性な実体は単一の構築物として発現させにくい可能性があるので、これは医薬生物学的製剤分野での適用を有する。
【００１４】
一態様において、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＧ４の対称形二重特異性抗体を提供し、各重鎖において：
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸はシステインで置換されており、各重鎖の定常領域配列は類似しているか又は同一であり、各重鎖の可変領域は異なっている。
【００１５】
一実施形態において、例えば図１ｂに示すように、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位のシステインである。
【００１６】
一実施形態において、重鎖の一方又は両方において、ＣＨ１ドメイン中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインは、別のアミノ酸で置換されている。
【００１７】
図１ｂに示すように、システインで置換されており、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３７及び２３８から選択できる（上部ヒンジ領域において下線を引いたアミノ酸）。一実施形態において、図１ｂ及び２ａに示すように、システインで置換されており、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置の１個又は複数のアミノ酸である。
【００１８】
一実施形態において、２２９位のシステインに対する変異は、Ｆａｂアーム交換を低下させる。
【００１９】
一実施形態において、２３０位のシステインに対する変異は、２４１位における例えばプロリン、アラニン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンから選択される無極性アミノ酸への変異と組合せて利用される。
【００２０】
一実施形態において、Ｆａｂアームは、例えばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、トレオニン及びチロシン、トレオニンなどから選択される極性残基に対する変異の利用を増大させることができる。
【００２１】
一実施形態において、２４１位における、例えばプロリン、アラニン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンから選択される無極性アミノ酸への変異が提供され、利用される。
【００２２】
更なる態様において、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＧ４の対称形二重特異性抗体も提供し、各重鎖において：
ａ．Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位のシステインは別のアミノ酸で置換されており、
ｂ．Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン又は２４２位のシステインは別のアミノ酸で置換されており、各重鎖の定常領域配列は類似しているか又は同一であり、各重鎖における可変領域は異なっている。
【００２３】
本発明によって提供される抗体は、エフェクター機能が全くなく、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して有利な特性、例えば熱的安定性の改善など、安定性の改善を示すことができる。
【００２４】
理論に束縛されるものではないが、本開示による抗体中の修飾されたヒンジはＩｇＧ４分子に固有の内部歪みを軽減し、それによって安定性の改善が促進されるという仮説が立てられる。
【００２５】
例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで高濃度の抗体を利用する及び／又はグルタチオンなど交換の化学的刺激剤を利用することによって、ＩｇＧ４抗体における重鎖交換の天然の過程を促進して、本開示による二重特異性ＩｇＧ４抗体の調製を容易にすることができる。
【００２６】
野生型ＩｇＧ４分子に勝って安定性が改善され及び／又は重鎖交換が改善されたという点で、本開示の抗体は有益になり得る。本発明の抗体は野生型ＩｇＧ４と比較して低下した重鎖交換を実証することができ、本抗体は、ＩｇＧ４と比較して低下した交換傾向のため、及び天然に循環しているＩｇＧ４抗体と比較してｉｎ  ｖｉｖｏにおいて二重特異性抗体濃度が相対的に低いため、ｉｎ  ｖｉｖｏで野生型ＩｇＧ４と殆ど又は全く交換しないことを実証する二重特異性抗体を提供する。
【００２７】
理論に束縛されるものではないが、本発明により記載される構築物に類似する型との交換の方が、本開示の構築物と野生型ＩｇＧ４との交換より有利と考えられる。
【００２８】
本発明の二重特異性抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ濃度より高い濃度、例えば０．５ｍＭ以下の濃度で、野生型ＩｇＧ４と比較して低下した重変化交換を実証し得る。本発明の二重特異性抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較して低下した重鎖交換を実証するが、ＩｇＧ１  ｗｔ及びＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なる抗原特異性を有する２つの抗体から二重特異性抗体を創出するのに十分な重鎖交換の程度を実証している。本明細書における構築物の定常領域における対称性は、抗体の内部歪みを最小限に抑え、従って安定性を助けるので有利である。
【００２９】
従って、本発明は、重鎖交換を引き起こす条件下で、第１のＩｇＧ４抗体を第２のＩｇＧ４抗体とｅｘ  ｖｉｖｏで混合するステップを含む対称形二重特異性抗体を生成する方法も提供し、第１の抗体における可変領域の抗原特異性は、第２の抗体における可変領域の抗原特異性と異なる。
【００３０】
本開示の方法は、日常の技術及び天然に存在するプロセスの刺激だけを利用する、二重特異性対称形抗体の効率的な調製を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１ａ】野生型ＩｇＧ１並びに野生型ＩｇＧ４のヒトＣＨ１及びヒンジ配列（ヒンジ残基に下線を引く）、並びにκ軽鎖定常配列を示す図である。
【図１ｂ】鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するシステインを示している（下線を引く）ヒトκ軽鎖定常配列；鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成する（ＩｇＧ１の上部ヒンジ並びにＩｇＧ２、３及び４のＮ末端ＣＨ１中の）システインの位置を示している（下線を引く）、ヒトＩｇＧ１、２、３及び４重鎖Ｎ末端ＣＨ１残基並びにヒンジ領域配列；鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するＮ末端ＣＨ１配列中のシステインの位置を示している（下線を引く）ヒトＩｇＤ重鎖Ｎ末端ＣＨ１残基及びヒンジ領域配列の一部；鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するＮ末端ＣＨ１中のシステインの位置を示している（下線を引く）ヒトＩｇＭ重鎖Ｎ末端ＣＨ１、Ｃ末端ＣＨ１残基及び選択されたＮ末端ＣＨ２残基；本発明の抗体において、下線を引いた残基が１個又は複数の残基がシステインで置換され得る位置を示している、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の上部ヒンジ、ＩｇＤのヒンジ並びにＩｇＭのＣ末端ＣＨ１及びＣＨ２中の残基を示す図である。
【図２ａ】軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、野生型ＩｇＧ１と野生型ＩｇＧ４の上部及びコアヒンジ残基、並びに本発明のＩｇＧ４抗体において変異が導入された位置を示す図である。
【図２ｂ】軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、野生型ＩｇＧ３のヒンジ残基、及び本発明のＩｇＧ３抗体において１個又は複数の残基がシステインで置換される位置を示す図である。
【図２ｃ】軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、野生型ＩｇＭの選択されたＣＨ１及びＣＨ２残基、並びに本発明のＩｇＭ抗体において１個又は複数の残基がシステインで置換される位置を示す図である。
【図２ｄ】軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２８）、野生型ＩｇＤのヒンジ残基、及び本発明のＩｇＤ抗体において１個又は複数の残基がシステインで置換されている位置を示す図である。
【図３ａ】本発明によるＩｇＧ４抗体に導入した変異を示す図である。
【図３ｂ】図３ａに示したＩｇＧ４抗体の変異した重鎖中の残基の位置、及び軽鎖（ＬＣ）又は変異した別の重鎖（ＨＣ）のいずれかにあるシステインと形成できると予測されるジスルフィド結合を示す図である。システインがＬＣ又はＨＣ中のシステインと結合できる場合、下線を引いた鎖が予測される主たるジスルフィド結合配置である。
【図４ａ】本発明によるＩｇＧ４抗体に導入した変異を示す図である。
【図４ｂ】図４ａに示したＩｇＧ４抗体のシステイン残基の位置、及び軽鎖（ＬＣ）又は重鎖（ＨＣ）のいずれかにあるシステインと形成できると予測されるジスルフィド結合を示す図である。システインがＬＣ又はＨＣ中のシステインと結合できる場合、下線を引いた鎖が予測される主たるジスルフィド結合配置である。
【図５】本発明によるＩｇＧ４抗体のＣＨ１及びヒンジ領域の配列を示す図である。
【図６】本発明によるＩｇＧ４抗体のＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３の配列を示す図である。
【図７】上のゲルが抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下のゲルが抗κ抗体を使用した結果を示す、本発明による抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図８】上のゲルが抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下のゲルが抗ヒトκ抗体を使用した結果を示す、本発明による抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図９】上のゲルが抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下のゲルが抗ヒトκ抗体を使用した結果を示す、本発明による抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図１０】上のゲルが抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下のゲルが抗ヒトκ抗体を使用した結果を示す、本発明による抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図１１】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの熱安定性を示す本発明の抗体の熱蛍光分析の結果を示す図である。
【図１２】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの熱安定性を示す本発明の抗体の熱蛍光分析の結果を示す図である。
【図１３】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの熱安定性を示す本発明の抗体の熱蛍光分析の結果を示す図である。
【図１４】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの熱安定性を示す本発明の抗体の熱蛍光分析の結果を示す図である。
【図１５】本発明の選択された抗体の熱安定性の順位を示す図である。
【図１６】２つのＧＳＨ濃度及び様々な時点における野生型ＩｇＧ１、野生型ＩｇＧ４並びに様々な変異体の重鎖交換を示す図である。
【図１７】２つのＧＳＨ濃度及び様々な時点における野生型ＩｇＧ４及び様々な変異体の重鎖交換を示す図である。
【図１８】２つのＧＳＨ濃度及び様々な時点における野生型ＩｇＧ４及び様々な変異体の重鎖交換を示す図である。
【図１９】野生型ＩｇＧ４と比較した、０．５ｍＭ  ＧＳＨでの様々な変異体の重鎖交換のパーセンテージ交換を示す図である。
【図２０】野生型ＩｇＧ４と比較した、５ｍＭ  ＧＳＨでの様々な変異体の重鎖交換のパーセンテージ交換を示す図である。
【図２１】２４１位に別の残基を有するＩｇＧ４変異体の対称的アーム交換分析を示す図である。ＩｇＧ４  ＷＴは、ＩｇＧ４  Ｐより多く交換した。Ｓ２４１ＧとＳ２４１Ａの交換活性は互いに同程度であり、ＩｇＧ４  ＷＴより著しく小さく、およそ半分であった。Ｓ２４１Ｔは、ＩｇＧ４  ＷＴと類似のレベルで交換した。
【００３２】
配列の簡単な説明
配列番号１〜２２３は、様々なヒンジを示す。
配列番号２２４は、天然のＩｇＧ１ヒンジを示す。
配列番号２２５は、天然のＩｇＧ４ヒンジを示す。
配列番号２２６は、野生型ＩｇＧ１抗体のＣＨ１及びヒンジ領域配列を示す。
配列番号２２７は、野生型ＩｇＧ４抗体のＣＨ１及びヒンジ領域配列を示す。
配列番号２２８は、ヒト野生型κ軽鎖の定常領域の一部を示す。
配列番号２２９は、ＩｇＧ４下部ヒンジ配列（２２ページに記載）を示す。
配列番号２３０は、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号２３１は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域を示す。
配列番号２３２は、ヒトＩｇＧ２抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号２３３は、ヒトＩｇＧ２抗体のヒンジ領域を示す。
配列番号２３４は、ヒトＩｇＧ３抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号２３５は、ヒトＩｇＧ３抗体のヒンジ領域を示す。
配列番号２３６は、ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号２３７は、ヒトＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を示す。
配列番号２３８は、ヒトＩｇＧＤ抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号２３９は、ヒトＩｇＧＤ抗体のヒンジ領域の一部を示す。
配列番号２４０は、ヒトＩｇＧＭ抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号２４１は、ヒトＩｇＧＭ抗体のＣＨ１ドメインのＣ末端配列の一部を示す。
配列番号２４２は、ヒトＩｇＧＭ抗体のＣＨ２ドメインの一部を示す。
配列番号２４３〜２７８は、抗体６、７、８、１５、１６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４５、４６、４７、２、３、４８、２８Ｐ、４４Ｐ、１、４、５、５Ｐ、９、１０、１１、１２、１３並びに１４それぞれの、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域配列を示す。
配列番号２７９は、野生型ＩｇＧ４  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を示す。
配列番号２８０は、野生型ＩｇＧ４  ＣＨ２及び野生型ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列を示す。
配列番号２８１〜３０６は、抗体６、７、８、１５、１６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４５、４６、４７、２、３、４８、２８Ｐ並びに４４ＰそれぞれのＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン配列を示す。
配列番号３０６〜３１６は、抗体１、４、５、５Ｐ、９、１０、１１、１２、１３並びに１４それぞれのＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン配列を示す。
配列番号３１７、３１８、３２０及び３２１は、様々なヒンジ配列を示す。
配列番号３１９は、抗体配列中の位置である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、ここでより詳細に記載される。
【００３４】
本明細書で使用する、対称形抗体とは、抗体又は抗体断片であり、可変領域の外側の領域において重鎖は類似の又は同一の配列を有する。
【００３５】
本明細書で使用する、類似とは、アミノ酸配列が、分析される配列全体に渡って９５％以上の同一性である、例えば９６、９７、９８又は９９％の同一性である。パーセンテージ同一性は、当業者に公知のソフトウェアを使用して評価することができる。
【００３６】
本明細書で使用する、同一とは、分析される配列に渡って、例えば配列全体に渡って１００％の配列同一性があることを指す。
【００３７】
一実施形態において、本開示の抗体の重鎖配列は、例えば鎖間ジスルフィド結合、例えば対応する野生型断片中に天然に存在する結合又は遺伝子操作されて鎖中の望ましい位置に存在する結合、を介して共有結合している。
【００３８】
一態様において、本開示の抗体は、両方の重鎖配列又は断片が、ＩｇＧ１型ヒンジを有するという点を特徴とする。
【００３９】
野生型ＩｇＧ１の上部及びコアヒンジは、配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２２４）を有する。
【００４０】
野生型ＩｇＧ４の上部及びコアヒンジは、配列ＥＰＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号２２５）を有する。
【００４１】
本明細書で使用する、ＩｇＧ１型ヒンジとは、１個又は複数、例えば１、２若しくは３個など１〜５個のアミノ酸がＩｇＧ４ヒンジ、特にＥＰＫＹＧＰＰ（配列番号３１９）とＣＰＳＣの間に挿入され及び／又はＩｇＧ４ヒンジ中の１個又は複数アミノ酸ＹＧＰＰが、例えばＩｇＧ１ヒンジ内のアミノ酸に対応するよう置きかえられ、特にＧ（ＩｇＧ４ヒンジ中のＹＧＰＰ由来）がＣで置きかえられ又はＹ（ＩｇＧ４ヒンジ中のＹＧＰＰ由来）がＣ若しくはＳで置きかえられることを指すものとする。
【００４２】
従って、本発明は、上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを持つＩｇＧ４重鎖を含む対称形二重特異性抗体も提供し、重鎖又はその中の各重鎖の前記上部ヒンジ及びコアは、１５アミノ酸など、長さ１３〜１７である。
【００４３】
一実施形態において、第１のＩｇＧ４重鎖を持つ対称形二重特異性抗体は、長さ１５アミノ酸の上部ヒンジ及びコアを有する。
【００４４】
一実施形態において、重鎖の上部ヒンジ及びコアは、ＩｇＧ４ヒンジに見出される天然の１２アミノ酸及び更なる３個のアミノ酸、例えば３個のアラニン残基若しくは３個のグリシン残基又はその組合せを含む。
【００４５】
一実施形態において、ヒンジは、以下の配列のうち１つである：
【化１】
2018117627.tif 000002
。
【００４６】
一実施形態において、本開示のＩｇＧ４重鎖中の上部ヒンジ及びコアは、ＩｇＧ１型ヒンジ、すなわちＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ配列番号２５又は
【化２】
2018117627.tif 000003
などその誘導体からなる。
【００４７】
一実施形態において、本開示による抗体は、上部ヒンジ及びコアを含む。
【００４８】
一実施形態において、上部ヒンジ及びコア領域は、以下の配列の１つから選択される：
【化３−１】
2018117627.tif 000004
【化３−２】
2018117627.tif 000005
【化３−３】
2018117627.tif 000006
。
【００４９】
一実施形態において、重鎖配列又はその断片の一方若しくは両方のコアヒンジ領域は、ＣＰＰＣＰ配列番号３１８配列を有する。
【００５０】
理論に束縛されるものではないが、この配列は、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」型濃度で抗体アームの動的交換を遮断する可能性があると考えられ、例えば０．５ｍＭ未満の還元剤の濃度、特に５μＭ程度の還元剤の濃度が生理的に妥当であると考えられる（Ｚｉｌｍｅｒら、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第２巻、２号、１２１〜１２７頁、２００５年）。
【００５１】
本発明の一実施形態において、二重特異性抗体の各重鎖は、上記の配列から選択される同一の上部及びコアヒンジ領域を有し、同一の下部ヒンジ領域を有してもよい。更なる実施形態において、二重特異性抗体の各重鎖は、同一のＣＨ１領域を有し、同一のＣＨ２及びＣＨ３領域を有してもよい。従って、各重鎖は、同一の重鎖定常領域配列を有してもよい。
【００５２】
本明細書で使用する「異なる可変領域」とは、前記可変領域が異なる抗原に対して特異性を有する場所を指すものとする。すなわち各可変領域に特異的な抗原は、異なる抗原又は異なる抗原部分、例えば異なるエピトープである。
【００５３】
本明細書で使用する「特異的」とは、結合ドメインが、特異的でない他の抗原に対するより大きい親和性及び結合活性（例えば１０、２０、５０、１０又は１０００倍大きい）で標的抗原を認識したという事実のことを指す。特異的結合領域は、どんな非標的抗原にも結合しないことを意味するものではなく、むしろ、標的との相互作用とは、それを使用して、同じファミリータンパク質の抗原を含む複雑な抗原の混合物から標的抗原（特異的である）を精製することができるような相互作用である。
【００５４】
一実施形態において、本開示による抗体は、単離されている。
【００５５】
本明細書で使用する、単離されているとは、人体から単離された抗体、例えば、組換え技術によって調製され、クロマトグラフィーなどの技術を使用して精製され、及び／又は医薬製剤である抗体を指すものとする。
【００５６】
本発明は、本発明の抗体をコードする配列を含む発現ベクター及び発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００５７】
本発明は、疾患又は障害の処置に使用する、上で定義した抗体も提供する。上で定義した抗体を治療上有効な量で投与するステップを含む、疾患又は障害の処置方法が更に提供される。
【００５８】
一実施形態において、本開示による抗体は、本明細書に開示される重鎖配列からそれぞれ独立に選択される１つ又は２つの重鎖配列を含む。文脈上別段の指示がない限り、用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。「ペプチド」とは、１０個以下のアミノ酸を指すものとする。
【００５９】
文脈上別段の指示がない限り、用語「ポリヌクレオチド」は、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含む。
【００６０】
本明細書では、本明細書の文脈において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のことと解釈されるべきである。
【００６１】
本発明の文脈において用語「野生型」とは、天然に存在できる又は環境から単離できる抗体を意味し、遺伝子工学によって生産されるいかなる変異も含まない。
【００６２】
本明細書における置換変異体の指定は、文字の後の番号とその後の文字からなる。最初の文字は、野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定している。番号はアミノ酸置換が作られるアミノ酸位置を指し、２番目の文字は、野生型アミノ酸を置きかえるために使用されるアミノ酸を指定している。抗体の可変及び定常ドメインの残基は、Ｋａｂａｔらによって考案された方式に従って、従来通り付番される。この方式は、Ｋａｂａｔら、１９８７年「免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」米国保健社会福祉省、ＮＩＨ、米国（以下「Ｋａｂａｔら（上記）」）に規定される。
【００６３】
Ｋａｂａｔ残基指定は、アミノ酸残基の線形付番とそのまま一致するわけではない。基本的な可変ドメイン構造の、フレームワークか相補性決定領域（ＣＤＲ）かに関わらず、実際の線形アミノ酸配列は構成成分の短縮又はそれへの挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔ付番より少ない若しくは追加のアミノ酸を含有することができる。「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列と抗体の配列中の相同性残基との整列によって、所与の抗体について残基の正しいＫａｂａｔ付番を決定できる。別法として、アミノ酸残基の付番は、ＥＵインデックス又はＥＵ付番方式よって実行されてもよい（Ｋａｂａｔら、「免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１年）にも記載される）。抗体のアミノ酸残基の更なる付番方式は、ＩＭＧＴ付番方式である（Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．−Ｐ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９巻、１８５〜２０３頁（２００５年））。
【００６４】
ＥＵ付番方式又はＩＭＧＴ付番方式が使用されると指示した場合を除き、本明細書においてはＫａｂａｔ付番方式が使用される。
【００６５】
４つのＩｇＧ４アイソタイプの間で、鎖間ジスルフィド結合配置は各アイソタイプにとって固有であるのに対して、重鎖及び軽鎖内の鎖内ジスルフィド結合配置は類似している［（Ｗｙｐｙｃｈ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｍ．、Ｇｕｏ，Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｔ．、Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．、Ｋｅｌｎｅｒ，Ｄ．Ｎ．、Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．、Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．、Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ，Ｐ．Ｖ．、Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．Ｓ．、Ｄｉｌｌｏｎ，Ｔ．Ｍ．、Ｂａｌｌａｎｄ，Ａ．、２００８年。「ヒトＩｇＧ２抗体は、ジスルフィド媒介構造的アイソフォームを示す（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ）」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８３巻、１６１９４〜１６２０５頁）に概説される］。
【００６６】
図１ｂに示すように、４つのＩｇＧ４アイソタイプのヒンジ領域配列は異なっている。完全な又は遺伝的ヒンジ領域は、通常、残基２２６〜２５１（Ｋａｂａｔ付番方式に基づく付番）からなる。図１ｂは、４つのＩｇＧ４アイソタイプのヒンジ領域の上部、コア及び下部部分を示す。ＩｇＧ１アイソタイプの場合、上部ヒンジ領域は残基２２６〜２３８であり、コアヒンジ領域は残基２３９〜２４３であり、下部ヒンジ領域は残基２４４〜２５１である。ＩｇＧ４アイソタイプの場合、上部ヒンジ領域は残基２２６〜２３８であり、コアヒンジ領域は残基２３９〜２４３であり、下部ヒンジ領域は残基２４４〜２５１である。ＩｇＧ４内の鎖間ジスルフィド結合配置を修飾することによって本発明による新たな変異体ＩｇＧ４抗体が開発され、特に軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）の間のＣＬ−ＣＨ１鎖間ジスルフィド結合配置が修飾された。
【００６７】
図１ｂは、ＩｇＧアイソタイプ１〜４についてヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖配列の部分を示し、ＣＬ−ＣＨ１鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインの位置（下線を引く）を示している。ＩｇＧ１のＣＬ−ＣＨ１間のジスルフィド結合は、ＬＣ  Ｃ２１４（Ｋａｂａｔ付番方式）とヒンジ領域の直前にあるＨＣのＣ２３３（Ｋａｂａｔ付番方式）との間で形成される。対照的に、ＩｇＧ２、３及び４のＣＨ１−ＣＬジスルフィド結合は、ＬＣ  Ｃ２１４とＨＣの鎖内ジスルフィド結合に対するＮ末端Ｃ１２７との間で形成される。ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合形成に関わるシステイン残基を囲むＬＣ及びＨＣ配列が、図１ｂに示され、整列された。
【００６８】
本発明は、ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合が熱安定性、構造安定性及び抗体の親和性を含めたＩｇＧ４抗体の特性にどのような影響を及ぼすかについて研究した。
【００６９】
ＩｇＧ４の変異体は、ＣＨ１の１２７位のシステイン残基の別のアミノ酸での置換、並びに上部ヒンジ領域内の１個又は複数のアミノ酸、好ましくは、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置のアミノ酸をシステインで置換することによって生成された。２２７、２２８、２２９又は２３０位は、ＩｇＧ１システイン２３３が置かれている位置か又はその近傍である。
【００７０】
各重鎖は、ＩｇＧ４ヒンジ領域のシステイン残基２３９と２４２の一方又は両方の、別のアミノ酸での置換を含めて更なる変異を含んでもよい。２３８と２３９位の間の３個のアミノ酸によりＩｇＧ４ヒンジ領域を延長して、ＩｇＧ１ヒンジと同じ長さにする変異が、いくつかの抗体にも含まれた。Ｓ２４１Ｐ変異も、いくつかの抗体に導入された。
【００７１】
ヒンジ内の２４１位（Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で）でのＳｅｒからＰｒｏへの変異の導入によって、ＩｇＧ４の半分子の形成を低下させることができる（Ａｎｇａｌ，Ｓ．ら、１９９３年、「単一のアミノ酸置換が、キメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の異質性を無効にする（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  （ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０巻、１０５〜１０８頁）。加えて、この点突然変異はＩｇＧ４の小型構造には影響せず、それにより、ＩｇＧ４は補体を活性化する能力の低下を維持できた。
【００７２】
しかし、これらの変異した抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける交換は、例えば２、３、４、５、６、７、８、９ｍＭなど１〜１０ｍＭ以上の高濃度の抗体を使用することによって促進することができる。本発明による変異体ＩｇＧ４抗体が有利な特性、例えば安定性の改善、を示すことが見出された。
【００７３】
一実施形態において、本発明による変異体ＩｇＧ４抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して増大した熱安定性を示す。驚くべきことに、変異を受けて、ＣＨ１ドメインの１２７位のシステインが別のアミノ酸で置きかえられ、重鎖ヒンジ領域の２２７〜２３０位の間にシステインが導入された変異体ＩｇＧ４抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して熱安定性が改善されることが見出された。１２７位のシステインを取り除く変異により、重鎖と軽鎖の間で鎖間ジスルフィド結合（ＣＬ−ＣＨ１）が形成される位置が変更され、軽鎖は、重鎖ヒンジ領域の２２７〜２３０位の間に導入されるシステインとジスルフィド結合を形成するようになる。従って一実施形態において、システイン１２７が別のアミノ酸と置換されているＩｇＧ４抗体が提供され、軽鎖のシステインは、２２７、２２８、２２９又は２３０位の操作されたシステインにジスルフィド結合で連結されている。
【００７４】
驚くべきことに、熱安定性の更なる改善はＩｇＧ４ヒンジ領域に３個のアミノ酸を追加して、ＩｇＧ４ヒンジ領域を長くすることによっても見出された。
【００７５】
驚くべきことに、変異を受けて、ＣＨ１ドメインの１２７位システインが別のアミノ酸で置きかえられ、重鎖ヒンジ領域の２３９位又は２４２位のシステインが別のアミノ酸で置きかえられた変異体ＩｇＧ４抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して熱安定性が改善することも見出された。
【００７６】
一実施形態において、本発明の抗体はいわゆる半分子形成の低下を示し、半分子は１本の軽鎖と１本の重鎖（ＨＬ）の形状をなす。Ｃ２３９に変異を含むがＣ２４２に変異を持たない本発明の抗体は一般に、半分子形成の低下を示す。理論に束縛されるものではないが、これは、２３９位のシステインの除去により重鎖内での鎖内ジスルフィド結合の形成が低下し、従って、Ｃ２３９又はＣ２４２に変異を持たない抗体と比較して半分子の数が低下するためと考えられる。Ｃ２４２に変異を持つがＣ２３９に変異を持たない抗体は、Ｃ２３９に変異を持つがＣ２４２に変異を持たない抗体と比較して、より多くの半分子を形成するように見える。理論に束縛されるものではないが、２３９位のシステインは、２４２位のシステインと比較してより反応性があり、重鎖ヒンジシステイン又は軽鎖システインのいずれかとジスルフィド結合を形成することが可能であると考えられる。
【００７７】
Ｃ２３９とＣ２４２両方の変異を持つ抗体は、２本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合形成がないため半分子を高い割合で形成する。しかし、Ｃ２３９とＣ２４２両方の変異を含む抗体は、非共有結合による重鎖結合のため全抗体分子を形成することがなお可能である。半分子形成の低下は、Ｓ２４１Ｐ変異を持つ抗体においても観察される。
【００７８】
本発明による抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して、標的抗原に対して同等の親和性も示す。
【００７９】
本発明の二重特異性抗体の重鎖定常領域への変異については、以下に詳細に記載される。アミノ酸を置きかえる方法は、分子生物学の技術分野で周知である。そのような方法には、例えば、アミノ酸を削除及び／若しくは置換するためにＰＣＲなどの方法を使用する部位特異的突然変異誘発法又は合成配列の新規の設計がある。
【００８０】
図２ａは、野生型ＩｇＧ１、野生型ＩｇＧ４のヒンジ残基及び本発明の抗体において変異が導入された位置を示す。Ｋａｂａｔ付番方式に基づく付番。
【００８１】
本発明による抗体は１２７位（Ｃ１２７）に変異を含み、システイン残基は別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含有しないアミノ酸に置きかえられる。置きかえ又は置換とは、抗体重鎖において本来なら鎖間システイン１２７が見出されるはずの場所で別のアミノ酸がその位置にあることを意味する。Ｃ１２７位の変異は、システインから別の適切なアミノ酸にアミノ酸残基を変える、１２７位のアミノ酸をコードしているヌクレオチドのうち１つ、２つ又は３つに対する任意の適切な変異であることができる。適切なアミノ酸の例としては、セリン、トレオニン、アラニン、グリシン又は任意の極性アミノ酸があげられる。特に好ましいアミノ酸は、セリンである。
【００８２】
１２７位のシステインの別のアミノ酸での置換により、通常、野生型ＩｇＧ４の軽鎖中のシステインとジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが取り除かれる。従って、鎖間ジスルフィド結合によって軽鎖と重鎖の対合を形成するには、軽鎖は、重鎖のヒンジ領域に位置するシステインとジスルフィド結合を形成しなければならない。
【００８３】
本発明の第１の態様において、本発明による抗体は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置で１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている重鎖を含む。従って、本発明による抗体は、以下の変異の１つ又は複数を保有してもよい：Ｓ２２７Ｃ；Ｋ２２８Ｃ；Ｙ２２９Ｃ；Ｇ２３０Ｃ。
【００８４】
一実施形態において、２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される残基の１個だけが、システイン残基で置換されている。
【００８５】
一実施形態において、本発明の抗体は、変異Ｙ２２９Ｃ又はＧ２３０Ｃを保有する。
【００８６】
重鎖ヒンジ領域の２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置にシステイン残基を含むことにより、鎖間ジスルフィド結合のための新たな位置が提供されて、重鎖と軽鎖の間に形成される。この新たな鎖間ジスルフィド結合配置により野生型ＩｇＧ４抗体と比較して熱安定性が改善されたＩｇＧ４抗体が提供されることが、本発明者によって見出された。
【００８７】
更なる変異が、本発明のこの態様の抗体に導入されてもよい。一実施形態において、重鎖の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン（Ｃ２３９）及び／又は２４２位のシステイン（Ｃ２４２）は、別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含有しないアミノ酸で置換されている。置きかえ又は置換とは、抗体重鎖において本来ならシステイン２３９及び／又はシステイン２４２が見出されるはずの場所で別のアミノ酸がその位置にあることを意味する。Ｃ２３９及び／又はＣ２４２の変異は、システインから別の適切なアミノ酸にアミノ酸残基を変えるアミノ酸をコードしているヌクレオチドのうち１つ、２つ又は３つに対する任意の適切な変異であることができる。適切なアミノ酸の例としては、セリン、トレオニン、アラニン、グリシン又は任意の極性アミノ酸があげられる。特に好ましいアミノ酸は、セリンである。
【００８８】
一実施形態において、重鎖の２３９位のシステインは別のアミノ酸で置換されており、重鎖の２４２位のシステインは別のアミノ酸で置換されている。この実施形態において、Ｃ２３９とＣ２４２両方の置換により、本来なら別の重鎖の対応するシステインと重鎖間ジスルフィド結合を形成する重鎖ヒンジ領域中の両方のシステイン残基が取り除かれる。得られた半分子は、２本の重鎖間での非共有結合により全抗体分子を形成することができる。
【００８９】
別の実施形態において、重鎖の２３９位のシステインは、別のアミノ酸で置換されている。この実施形態において、２４２位のシステインは、別のアミノ酸で置換されていない。
【００９０】
更に別の実施形態において、重鎖の２４２位のシステインは、別のアミノ酸で置換されている。この実施形態において、２３９位のシステインは、別のアミノ酸で置換されていない。
【００９１】
Ｃ２３９又はＣ２４２のいずれか置換は、重鎖中に１個のシステインが残っており、そのシステインは別の重鎖中のシステインと重鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。理論に束縛されるものではないが、ヒンジ領域における１個のシステインの置換、特にＣ２３９の置換は、ヒンジ領域における鎖内ジスルフィド結合の形成を低下させ、従って、半抗体分子の形成を低下させ得ると考えられる。
【００９２】
本発明の一実施形態において、２２７位のセリンがシステインで置換されている場合、好ましくは、抗体はＣ２３９及びＣ２４２位に変異を含まない。別の実施形態において、２２７位のセリンがシステインで置換されている場合、好ましくは、重鎖の２３９位のシステインは別のアミノ酸で置換されているが、２４２位のシステインは別のアミノ酸で置換されていない。
【００９３】
一実施形態において、本発明の抗体は、変異を受けて、アミノ酸２２６〜２４３の間に１個又は複数のアミノ酸が挿入されているＩｇＧ４重鎖を含む。挿入されるアミノ酸の数は、１〜１０、１〜５、１〜３個であってよく、好ましくは１、２、３又は４個のアミノ酸が挿入される。アミノ酸は、好ましくはアミノ酸２３８と２３９の間に挿入される。アラニン、グリシン、セリン又はトレオニン及びその組合せなど任意の適切なアミノ酸をヒンジ領域に挿入できる。好ましくは３個のアラニン（ＡＡＡ）、３個のグリシン（ＧＧＧ）、３個のセリン（ＳＳＳ）若しくは３個のトレオニン（ＴＴＴ）又はトレオニン、ヒスチジン及び別のトレオニン（ＴＨＴ）が挿入される。変異を受けて、ヒンジ領域に３個のアミノ酸が挿入されているＩｇＧ４重鎖を含む本発明の抗体は、熱安定性が改善することが見出された。
【００９４】
本発明による抗体に導入できる更なる変異は、変異Ｓ２４１Ｐである。この変異は半分子の形成を低下させると以前に示した（Ａｎｇａｌ，Ｓ．ら、１９９３年、「単一のアミノ酸置換が、キメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の異質性を無効にする（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  （ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０巻、１０５〜１０８頁）。驚くべきことに、Ｓ２４１Ｐ変異を含む本発明の変異体抗体は、ＩｇＧ４Ｐ（Ｓ２４１Ｐを含むＩｇＧ４）と比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける強力な還元条件下でいくつかの重鎖交換を実証することが見出された。これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の変異体ＩｇＧ４抗体から二重特異性抗体を創出可能になる。本発明による抗体は、ヒンジ領域に１つ又は複数の更なる変異を含んでもよい。例えば、抗体は、以下の変異Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｐ２３７Ｄ及びＰ２３８Ｋの１つ又は複数を更に含んでもよい。
【００９５】
一実施形態において、本発明による抗体は、残基２２６〜２４３（上部ヒンジ及びコアヒンジ）のＩｇＧ１ヒンジ領域を効果的に含む。従って、本発明の抗体はヒンジ領域を含み、２３０位のグリシンがシステインで置換されて、２２７位のセリンがプロリンで置換され、２２９位のチロシンがセリンで置換され、２３７位のプロリンがアスパラギン酸で置換され、２３８位のプロリンがリシンで置換され、アミノ酸配列トレオニン−ヒスチジン−トレオニンが２３８位と２３９位の間に挿入され、２４１位のセリンがプロリンで置換されている。図２ａに示すように、これらの変異は、Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｇ２３０Ｃ、Ｐ２３７Ｄ、Ｐ２３８ＫＴＨＴ及びＳ２４１Ｐと書くこともできる。ＩｇＧ４ヒンジ領域へのこれらの更なる変異の導入により、熱安定性が改善された抗体を得られることが見出された。
【００９６】
本発明による抗体は、好ましくは、残基２４４〜２５１（ＡＰＥＦＬＧＧＰ配列番号２２９）のＩｇＧ４下部ヒンジを有する。理論に束縛されるものではないが、ＩｇＧ４下部ヒンジ領域は、ＩｇＧ４抗体のエフェクター機能の欠如に寄与していると考えられる。
【００９７】
本発明の第２の態様において、対称形二重特異性抗体が提供され、重鎖の一方又は両方において、１２７位の鎖間システインは、上記の通り別のアミノ酸で置換されており、重鎖中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位システイン又は２４２位システインは別のアミノ酸で置換されている。この第２の態様において、２２７、２２８、２２９及び２３０位の残基のいずれも、システイン残基で置換されていない。
【００９８】
可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＧ４の対称形二重特異性抗体であって、各重鎖において、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインは別のアミノ酸で置換されており；Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン及び／又は２４２位のシステインは別のアミノ酸で置換されており、各重鎖の定常領域配列は類似しているか又は同一であり、各重鎖における可変領域は異なっている。
【００９９】
本発明の第２の態様による抗体は、驚くべきことに、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して熱安定性が改善されていることが見出された。
【０１００】
本発明の第２態様において、抗体は、１個又は複数の更なる変異を含んでもよい。一実施形態において、抗体は、上述の通り、変異を受けて、アミノ酸２２６〜２４３の間、好ましくはアミノ酸２３８と２３９の間に３個のアミノ酸が挿入されているＩｇＧ４重鎖を含む。更なる実施形態において、抗体は変異Ｓ２４１Ｐを含む。更なる実施形態において、抗体は、以下の変異Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｐ２３７Ｄ及びＰ２３８Ｋのうち１つ又は複数を更に含んでもよい。
【０１０１】
図３ａ及び４ａは、本発明によるＩｇＧ４抗体に導入された変異も示す。図３ｂ及び４ｂは、本発明のＩｇＧ４抗体中のシステイン残基の位置を示し、軽鎖（ＬＣ）又は別の重鎖（ＨＣ）中のシステインに対する予測されるシステイン結合も示す。（ＬＣ又はＨＣ）を示すシステイン残基の場合、システインは、軽鎖又は重鎖中のシステインに結合していることが可能だが、ＬＣ又はＨＣのいずれかに下線が引かれている場合、これが支配的に存在すると考えられるジスルフィド結合である。
【０１０２】
一実施形態において、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含む抗体を提供し、表１に示すように、各重鎖は２、３、６、７、８、１５、１６、２８、２８Ｐ、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４４Ｐ、４５、４６、４７及び４８から選択される抗体の変異を含む。従って、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含む抗体を提供し、各重鎖は、以下の配列の１つを含む：
【化４】
2018117627.tif 000007
。
【０１０３】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含み、以下の配列の１つを含む：
【化５】
2018117627.tif 000008
。より好ましくは、本発明の抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含み、各重鎖は、以下の配列の１つを含む：
【化６】
2018117627.tif 000009
。
【０１０４】
更に好ましい実施形態において、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを各々備える２本の重鎖を含む抗体を提供し、表１に示すように、各重鎖は、２、３、６、７、８、１５、１６、２８、２８Ｐ、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４４Ｐ、４５、４６、４７及び４８から選択される抗体の変異を含む。従って、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを各々備える２本の重鎖を含む抗体を提供し、各重鎖は、以下の配列の１つを含む：
【化７】
2018117627.tif 000010
。
【０１０５】
本発明の特に好ましい抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含み、重鎖は配列番号３６（抗体２８Ｐ）、配列番号３７（抗体４４Ｐ）又は配列番号３５（抗体４８）を含む。本発明の更に特に好ましい抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを各々備える２本の重鎖を含み、重鎖は配列番号６２（抗体２８Ｐ）、配列番号６３（抗体４４Ｐ）又は配列番号６１（抗体４８）を含む。抗体２８Ｐ、４４Ｐ及び４８は、熱安定性の著しい改善を呈し、半分子形成の低下を更に呈するので、特に好ましい。
【０１０６】
下の表１は、抗体の例を、野生型ＩｇＧ４配列と比較して導入された変異と共に列挙している。表１は、野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体及び対照抗体も含む。
【表１−１】
2018117627.tif 000011
【表１−２】
2018117627.tif 000012
【０１０７】
図３ａ及び４ａは、本発明によるＩｇＧ４抗体に導入された変異も示す。図３ｂ及び４ｂは、本発明のＩｇＧ４抗体中のシステイン残基の位置を示し、軽鎖（ＬＣ）又は別の重鎖（ＨＣ）中のシステインに対する予測されるシステイン結合も示す。（ＬＣ又はＨＣ）を示すシステイン残基の場合、システインは、軽鎖又は重鎖中のシステインに結合していることが可能だが、ＬＣ又はＨＣのいずれかに下線が引かれている場合、これが支配的に存在すると考えられるジスルフィド結合である。
【０１０８】
好ましい実施形態において、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含む抗体を提供し、表１に示すように、各重鎖は、２、３、６、７、８、１５、１６、２８、２８Ｐ、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４４Ｐ、４５、４６、４７及び４８から選択される抗体の変異を含む。従って、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含む抗体を提供し、各重鎖は、以下の配列の１つを含む：
【化８】
2018117627.tif 000013
。
【０１０９】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含み、以下の配列の１つを含む：
【化９】
2018117627.tif 000014
。より好ましくは、本発明の抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含み、各重鎖は、以下の配列の１つを含む：
【化１０】
2018117627.tif 000015
。
【０１１０】
更に好ましい実施形態において、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを各々備える２本の重鎖を含む抗体を提供し、表１に示すように、各重鎖は、２、３、６、７、８、１５、１６、２８、２８Ｐ、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４４Ｐ、４５、４６、４７及び４８から選択される抗体の変異を含む。従って、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを各々備える２本の重鎖を含む抗体を提供し、各重鎖は、以下の配列の１つを含む：
【化１１】
2018117627.tif 000016
。
【０１１１】
本発明の特に好ましい抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含み、重鎖は配列番号２６７（抗体２８Ｐ）、配列番号２６８（抗体４４Ｐ）又は配列番号２６６（抗体４８）を含む。本発明の更に特に好ましい抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを各々備える２本の重鎖を含み、重鎖は配列番号３０５（抗体２８Ｐ）、配列番号３０６（抗体４４Ｐ）又は配列番号３０４（抗体４８）を含む。抗体２８Ｐ、４４Ｐ及び４８は、熱安定性の著しい改善を呈し、半分子形成の低下を更に呈するので、特に好ましい。
【０１１２】
抗体２、３及び８が、いわゆる半分子（ＨＬ）を有意な量形成することが示された。これらの変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの非変性条件下で全抗体分子（Ｈ２Ｌ２）を形成するが、重鎖間及び／又は重鎖と軽鎖の間のどんな非共有結合性会合も、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で取り除かれる。半分子の形成を低下させることが望ましいとしばしば教示されるが、半分子を形成する傾向が増大した抗体は、特定の用途の場合に有利となり得る。安定な半分子（ＨＬ）を形成するが、抗体重鎖が、別の重鎖と共有結合性又は非共有結合性会合を形成できないため全抗体（Ｈ２Ｌ２）が殆ど若しくは全く形成されない抗体は特に興味深いものである。安定な半分子を形成する抗体は、一価の抗体の産生に有利になり得る。半分子を形成する抗体は、異なる特異性を有する半分子からの全抗体の形成により二重特異性抗体を作製するのに有用な方法を提供することもでき、その全抗体は二重特異性であり、各抗原に対しては一価である。そのような二重特異性抗体の重鎖は非共有結合的に会合することになる。
【０１１３】
おそらく軽鎖Ｃ末端システインとヒンジＣ２３９間のジスルフィドの効率的な形成から、抗体３は、ヒンジ領域にＣ２３９を保持するが、ヒンジ間重鎖ジスルフィド結合を形成できないと思われる。軽鎖ジスルフィドは、ヒンジ領域のＣ２４２よりもＣ２３９に効果的に接着するので、抗体２と３との比較から、軽鎖のＣ末端システインの「及ぶ範囲」の程度が示される。更に、抗体３は、抗体２と比較して安定性が増大している。
【０１１４】
本発明による変異抗体については、ＩｇＧ４アイソタイプに関連して前述されており、ＩｇＧ４抗体と同じジスルフィド結合配置を有する他の抗体アイソタイプ又はクラスにＩｇＧ４抗体で作られた変異を適用して、抗体を改善できることは当業者なら理解されよう。ＩｇＧ４抗体と同じジスルフィド結合配置を有する抗体の具体的な例は、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＭ抗体及びＩｇＤ抗体である。図１ｂに示すように、ＩｇＧ３及びＩｇＭはＣＨ１ドメインの１２７位にシステインを有し、ＩｇＤはＣＨ１ドメインの１２８位にシステインを有し、それは軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＩｇＧ４のＣＨ１ドメインのＣ１２７に相当する。更に、ＩｇＧ３及びＩｇＤの上部ヒンジ領域並びにＩｇＭのＣＨ１ドメインのＣ末端領域及びＣＨ２ドメインのＮ末端領域は、ＩｇＧ１の上部ヒンジ領域の残基に相当するシステイン残基を含有しないことも図１ｂから分かる。従って、本発明は、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＤ抗体及びＩｇＭ抗体を更に提供し、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは別のアミノ酸で置換されており、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の上部ヒンジ領域と構造的に類似した位置にある１個又は複数のアミノ酸はシステインで置換されている。
【０１１５】
従って、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＧ３の対称形二重特異性抗体も提供し、各重鎖において：
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸はシステインで置換されており、各重鎖の定常領域配列は類似しているか又は同一であり、各重鎖の可変領域は異なっている。
【０１１６】
本発明のＩｇＧ３抗体態様の好ましい実施形態において、図１ｂ及び２ｂに示すように、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位のシステインである。
【０１１７】
本発明のＩｇＧ３抗体態様の好ましい実施形態において、図１ｂ及び２ｂに示すように、システインで置換できる上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３２及び２３３から選択される位置の１個又は複数のアミノ酸である。
【０１１８】
本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインを各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＭの対称形二重特異性抗体を更に提供し、各重鎖において：
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．ＣＨ１ドメイン又はＣＨ２ドメインに位置する１個又は複数のアミノ酸はシステインで置換されており、各重鎖の定常領域配列は類似しているか又は同一であり、各重鎖の可変領域は異なっている。
【０１１９】
本発明のＩｇＭ抗体態様の好ましい実施形態において、図１ｂ及び２ｃに示すように、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位のシステインである。
【０１２０】
本発明のＩｇＭ抗体態様の好ましい実施形態において、ＣＨ１ドメインのＣ末端又はＣＨ２ドメインのＮ末端に位置する１個又は複数のアミノ酸は、システインで置換されている。図１ｂ及び２ｃで示すように、システインで置換できるＣＨ１ドメインのＣ末端に位置する好ましいアミノ酸は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２３、２２３Ａ、２２３Ｂ及び２２３Ｃから選択される位置の１個又は複数のアミノ酸である。図１ｂ及び２ｃに示すように、システインで置換できるＣＨ２ドメインのＮ末端に位置する好ましいアミノ酸は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２４３Ｇ、２４３Ｈ及び２４３Ｉから選択される位置の１個又は複数アミノ酸である。従って、アミノ酸２２３〜２４３のいずれか１個又は複数はシステインで置換されてもよい。
【０１２１】
本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＤの対称形二重特異性抗体を更に提供し、各重鎖において：
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸はシステインで置換されており、各重鎖の定常領域配列は類似しているか又は同一であり、各重鎖の可変領域は異なっている。
【０１２２】
本発明のＩｇＤ抗体態様の好ましい実施形態において、図１ｂ及び２ｄに示すように、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２８位のシステインである。
【０１２３】
ＩｇＤ抗体のヒンジ領域は、Ｋａｂａｔ付番方式に従って、Ｒ２２４〜Ｐ２４３と定義できる。
【０１２４】
本発明のＩｇＤ抗体態様の好ましい実施形態において、図１ｂ及び２ｄに示すように、システインで置換されておりヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２及び２３３から選択される位置の１個又は複数アミノ酸である。
【０１２５】
本発明によって提供されるＩｇＧ３、ＩｇＤ又はＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ４抗体に関連して前述した通りヒンジ領域に１つ又は複数の更なる変異を含んでもよい。
【０１２６】
本発明のこの態様において、抗体は、好ましくはクラスＩｇＧ４である。
【０１２７】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、完全な（全）抗体並びにＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含む機能的に活性な断片を含む。本発明による抗体は、好ましくは少なくとも１本の軽鎖を含む。従って、本発明における用語「抗体」とは、２、３又は４価の抗体、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片のダイマー並びに２組の軽鎖と重鎖の対合を含む全抗体分子に及ぶ。
【０１２８】
当技術分野で周知であるように、典型的なＦａｂ’分子は重鎖と軽鎖の対を含み、それにおいて重鎖は可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及びヒンジ領域を含み、軽鎖は可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む。
【０１２９】
一実施形態において、本開示によるＦａｂ’のダイマーが提供され、例えば二量体化はヒンジを介してもよい。
【０１３０】
一実施形態において、重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン並びに任意でＣＨ４ドメインを含む。一実施形態において、抗体は、２本の重鎖を含み、その各々が本発明の第１又は第２の態様において定義されている。本発明による抗体は、好ましくは２本の軽鎖も含み、軽鎖の定常領域は、好ましくは同一である。抗体が２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むこの実施形態において、好ましくは、本発明の第１又は第２の態様によって定義されているように重鎖定常領域配列の両方が同一であり、軽鎖定常領域配列の両方が同一である。
【０１３１】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む全抗体であり、各重鎖は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位のシステインが別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ４  ＣＨ１と、ＩｇＧ１の上部及び中間部ヒンジ領域と、ＩｇＧ４下部ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む。
【０１３２】
ＩｇＧ４抗体の完全なヒンジ領域は、通常、残基２２６〜２５１（Ｋａｂａｔ付番方式に基づく付番）からなる。しかし、ヒンジ領域は必要に応じて短縮されても延長されてもよい。例えば、本発明の第１の態様による抗体、野生型アミノ酸が、２２７、２２８、２２９又は２３０位においてシステイン残基で置換されており、ヒンジ領域が、２２７、２２８、２２９又は２３０位の新たなシステイン残基の後で終わってもよい。本発明による抗体は、ヒンジ領域のＮ末端及び／又はＣ末端に位置する１個又は複数の更なるアミノ酸も含んでもよい。加えて、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステイン（単数又は複数）の距離、ヒンジのシステイン間の距離及び柔軟性などヒンジの特性に影響を及ぼし得るヒンジ中の他のアミノ酸の組成など、ヒンジの他の特性を制御することができ、例えばグリシンをヒンジに組み込んで回転柔軟性を増大させることができ、又はプロリンを組み込んで柔軟性を低下させることができる。別法として、ヒンジに荷電性又は疎水性残基の組合せを組み込んで、多量体化又は精製特性を与えることもできる。他の修飾されたヒンジ領域は、完全に合成でもよく、長さ、組成及び柔軟性など望ましい特性を持つように設計することもできる。
【０１３３】
本発明において利用される定常領域ドメインは、存在する場合、特にＦｃドメインにおいて、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプであり、抗体エフェクター機能は必要でない。従って、配列番号６４に示すように、好ましくは、各重鎖は、ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１３４】
Ｆｃ定常領域ドメインの配列バリアントも使用できることはいうまでもない。
【０１３５】
一実施形態において、各重鎖は、ＩｇＧ４  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、４０９位（ＥＵ付番）のアルギニンはリシン、トレオニン、メチオニン又はロイシンで置換されており、低ｐＨにおける凝集体形成を阻害した（米国特許出願公開第２００８／００６３６３５号Ｔａｋａｈａｓｈｉら）。Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ付番方式に従って付番される）における変異も教示されて、ＣＤＣ活性が減弱される（米国特許出願公開第２００８／００６３６３５号Ｔａｋａｈａｓｈｉら）。
【０１３６】
４０９位のアルギニン残基、４０５位のＰｈｅ残基又は３７０位のＬｙｓ（ＥＵ付番方式に従って付番される）の置換によってＦａｂアーム交換を受ける能力が低下した安定なＩｇＧ４抗体について開示しているＷＯ２００８／１４５１４２  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌら、に教示されるように、各重鎖は変異を含むことができる。
【０１３７】
一実施形態において、配列番号２８０に示すように、各重鎖はＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む。
【０１３８】
抗体が変異したＩｇＧ３、ＩｇＤ又はＩｇＭ抗体である本発明の実施形態において、各重鎖は、好ましくはＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン並びに任意でＣＨ４ドメインを含む。ＩｇＧ３抗体において、各重鎖は、好ましくはＩｇＧ３  ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ３  ＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＤ抗体において、各重鎖は、好ましくは、ＩｇＤ  ＣＨ２ドメイン及びＩｇＤ  ＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＭ抗体において、各重鎖は、好ましくはＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン、ＩｇＭ  ＣＨ３ドメイン及びＩｇＭ  ＣＨ４ドメインを含む。
【０１３９】
一実施形態において、ＣＨ１ドメインのＣ１２７の変異は、他のＩｇＧ同位体（１、２、３）又は他の抗体クラスの相当する位置に作られてもよい。これらの変異体抗体は、１つ又は複数の更なる変異を、例えばヒンジ領域並びに／又はＣＨ２ドメイン及び／若しくはＣＨ３ドメインに含んでもよい。ヒンジ領域並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインにおける特異的な変異の例については、本発明の他の態様と関連して以前に記載されている。
【０１４０】
上記の変異体抗体の具体的な例は、表１に列挙される変異体ＩｇＧ４抗体４、５、５Ｐ、９、１０、１１及び１４である。
【０１４１】
従って、本発明は２本の重鎖を含む抗体を提供し、各重鎖はＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含み、各重鎖は、表１に示すように、４、５、５Ｐ、９、１０、１１及び１４から選択される抗体の変異を含む。従って、本発明は２本の重鎖を含む抗体を提供し、各重鎖はＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含み、各重鎖は、以下の配列の１つを含む：
【化１２】
2018117627.tif 000017
。
【０１４２】
更なる実施形態において、本発明は２本の重鎖を含む抗体を提供し、各重鎖はＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、各重鎖は、表１に示すように、４、５、５Ｐ、９、１０、１１及び１４から選択される抗体の変異を含む。従って、本発明は２本の重鎖を含む抗体を提供し、各重鎖はＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、各重鎖は、以下の配列の１つを含む：
【化１３】
2018117627.tif 000018
。
【０１４３】
抗体４（Ｃ１２７Ｓ、Ｃ２３９Ｓ及びＣ２４２Ｓ）及び１４（Ｃ２３９Ｓ及びＣ２４２Ｓ）が、いわゆる半分子（ＨＬ）を有意な量形成することが示された。これらの変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの非変性条件下で全抗体分子（Ｈ２Ｌ２）を形成するが、重鎖間及び／又は重鎖と軽鎖の間のどんな非共有結合性会合も、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で取り除かれる。半分子の形成を低下させることが望ましいとしばしば教示されるが、半分子を形成する傾向が増大した抗体は、特定の用途、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける半分子の形成の場合に有利となり得え、重鎖交換を容易にし、本開示による二重特異性ＩｇＧ４抗体の調製を容易にすることができある。
【０１４４】
抗体２、３及び８が、上記の通り、有意な量の半分子を形成したことも示され、従って、半分子の形成が望まれる状況で使用することもできる。
【０１４５】
おそらく軽鎖Ｃ末端システインとヒンジＣ２３９間のジスルフィドの効率的な形成から、抗体３は、ヒンジ領域にＣ２３９を保持するが、ヒンジ間重鎖ジスルフィド結合を形成できないと思われる。軽鎖ジスルフィドは、ヒンジ領域のＣ２４２よりもＣ２３９に効果的に接着するので、抗体２と３との比較から、軽鎖のＣ末端システインの「及ぶ範囲」の程度が示される。更に、抗体３は、抗体２と比較して安定性が増大している。
【０１４６】
抗体５（Ｇ２３０Ｃ）、５Ｐ（Ｇ２３０Ｃ及びＳ２４１Ｐ）、９（Ｇ２３０Ｃ及びＣ２３９Ｓ）、１０（Ｇ２３０Ｃ及びＣ２４２Ｓ）及び１１（Ｇ２３０Ｃ、Ｃ２３９Ｓ及びＣ２４２Ｓ）は、軽鎖中のシステインがジスルフィド結合を形成することができる２個のシステイン（ＣＨ１の１２７位及び上部ヒンジの２３０位のシステイン）を含む。従って、これらの抗体は、重鎖ＣＨ１又はヒンジ領域に非ジスルフィド結合システインを含むことができ、そのシステインを都合よく使用して、非ジスルフィド結合システインでエフェクター分子を付着させることができる。更に抗体５は、Ｃ２３９及びＣ２４２に２個のヒンジシステインを含み、従って、非ジスルフィド結合のシステインの遊離チオールを活性化して、エフェクター分子を挿入するのに必要な穏やかな還元ステップに対して耐性になる。更に抗体１１は、２３９及び２４２にヒンジシステインを含まず、従って、ヒンジ中のこれらの位置にどのエフェクター分子が付着する機会も低下させる。
【０１４７】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、完全な（全）抗体並びにＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含む機能的に活性な断片を含む。本発明による抗体は、好ましくは少なくとも１本の軽鎖を含む。従って、本発明における用語「抗体」とは、２、３又は４価の抗体、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、１本の軽鎖と重鎖の対合を含む半抗体分子又は半分子並びに２本の軽鎖と重鎖の対合を含む全抗体分子に及ぶ。
【０１４８】
当技術分野で周知であるように、典型的なＦａｂ’分子は重鎖と軽鎖の対を含み、それにおいて重鎖は可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及びヒンジ領域を含み、軽鎖は可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む。一実施形態において、本開示によるＦａｂ’のダイマーが提供され、例えば二量体化はヒンジを介してもよい。
【０１４９】
一実施形態において、重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン並びに任意でＣＨ４ドメインを含む。一実施形態において、抗体は、２本の重鎖を含み、その各々が本発明の第１又は第２の態様において上で定義されている。本発明による抗体は、好ましくは２本の軽鎖も含む。抗体が２本の重鎖を含むこの実施形態において、好ましくは、本発明の第１又は第２の態様によって上で定義されているように重鎖配列の両方は同一である。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む全抗体であり、各重鎖は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位のシステインが別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ４  ＣＨ１と、ＩｇＧ１の上部及び中間部ヒンジ領域と、ＩｇＧ４下部ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む。
【０１５０】
ＩｇＧ４抗体の完全なヒンジ領域は、通常、残基２２６〜２５１（Ｋａｂａｔ付番方式に基づく付番）からなる。しかし、ヒンジ領域は必要に応じて短縮されても延長されてもよい。例えば、本発明の第１の態様による抗体、野生型アミノ酸が、２２７、２２８、２２９又は２３０位においてシステイン残基で置換されており、ヒンジ領域が、２２７、２２８、２２９又は２３０位の新たなシステイン残基の後で終わってもよい。本発明による抗体は、ヒンジ領域のＮ末端及び／又はＣ末端に位置する１個又は複数の更なるアミノ酸も含んでもよい。加えて、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステイン（単数又は複数）の距離、ヒンジのシステイン間の距離及び柔軟性などヒンジの特性に影響を及ぼし得るヒンジ中の他のアミノ酸の組成など、ヒンジの他の特性を制御することができ、例えばグリシンをヒンジに組み込んで回転柔軟性を増大させることができ、又はプロリンを組み込んで柔軟性を低下させることができる。別法として、ヒンジに荷電性又は疎水性残基の組合せを組み込んで、多量体化又は精製特性を与えることもできる。他の修飾されたヒンジ領域は、完全に合成でもよく、長さ、組成及び柔軟性など望ましい特性を持つように設計することもできる。
【０１５１】
本発明において利用される定常領域ドメインは、存在する場合、特にＦｃドメインにおいて、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプであり、抗体エフェクター機能は必要でない。従って、配列番号２７９に示すように、好ましくは、各重鎖は、ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１５２】
一実施形態において、抗体は、モノクローナル、完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗体断片である。一実施形態において、抗体は、完全ヒト又はヒト化である。
【０１５３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、２５６巻、４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９８３年、４巻、７２頁）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、７７〜９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５年）など当技術分野において公知のどんな方法によって調製されてもよい。
【０１５４】
本発明において使用する抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、９３巻（１５号）、７８４３〜７８４８頁、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載される方法により、特異的抗体を産生するために選択した単一リンパ球から生成される免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによる、単一リンパ球抗体法を使用して生成されてもよい。
【０１５５】
ヒト化抗体とは、ヒト以外の種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト以外の種由来の１つ又は複数のドナー残基を任意で含むヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有するヒト以外の種由来の抗体分子である（米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【０１５６】
本発明において使用する抗体は、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもでき、またＢｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、１８２巻、４１〜５０頁；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、１８４巻、１７７〜１８６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４年、２４巻、９５２〜９５８頁；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７年  １８７巻、９〜１８頁；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４年、５７巻、１９１〜２８０頁；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；、ＷＯ９５／２０４０１；米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号及び第５，９６９，１０８号に開示されているそれらを含むことができる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を含めた他の生物を使用して、ヒト化抗体を生成することができる。
【０１５７】
完全ヒト抗体とは、重鎖と軽鎖両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、全てヒト起源又はヒト起源の配列と実質的に同一な抗体のことであり、必ずしも同じ抗体由来ということではない。完全ヒト抗体の例としては、例えば上述のファージディスプレイ法によって作製された抗体並びにマウス免疫グロブリン可変及び／又は定常領域遺伝子がヒト対応物によって置きかえられたマウスによって作製された抗体があり得、例えば欧州特許第０５４６０７３号Ｂ１、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、欧州特許第０４３８４７４号Ｂ１及び欧州特許第０４６３１５１号Ｂ１に一般論として記載されている。本発明に使用する抗体出発材料は、抗体可変及び定常領域（単数又は複数）をコードしているＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。標準的な分子生物学技術を使用して、要望通りアミノ酸若しくはドメインを修飾、追加、削除することができる。可変又は定常領域に対するどんな変更も、本明細書で使用される用語「可変」及び「定常」領域になお包含される。
【０１５８】
抗体出発材料は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含めて、どんな種から得てもよい。抗体の部分は、１超の種から得られてもよく、例えば抗体はキメラであってもよい。１例において、定常領域は１つの種に由来し、可変領域は別に由来する。抗体出発材料は、修飾されていてもよい。別の例において、抗体の可変領域は、組換えＤＮＡ操作技術を使用して創出された。そのような操作された変形は、天然抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失若しくは交換によって、例えば天然抗体可変領域から創出されたものを含む。この型の特定の例としては、少なくとも１つのＣＤＲ及び、任意で、１つの抗体由来の１個又は複数のフレームワークアミノ酸並びに第２の抗体由来の可変領域ドメインの残りを含有するこれらの操作された可変領域ドメインがある。これらの抗体を創出し、製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第６，３３１，４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、３８３３頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３２２巻、３２３頁；Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３頁；Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０巻、１〜１４２頁；Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｈｏｄ、２１６巻、１６５〜１８１頁を参照のこと）。
【０１５９】
一実施形態において、結合ドメインを形成している可変ドメイン対を含む抗体は、同起源の対である。本明細書で使用する、同起源の対とは、可変ドメインの天然の対を指すものとし、すなわち単一抗体又は抗体発現細胞から単離される。
【０１６０】
可変ドメインは、最適化及び／又はヒト化することができた。
【０１６１】
同起源の対から得られる最適化／ヒト化された可変ドメインは、最適化／ヒト化後もなお同起源の対と見なされることになる。
【０１６２】
従って、本発明は、ヒト、ヒト化又はキメラ分子に及ぶ。
【０１６３】
一実施形態において、分子は、標的抗原を特異的に結合する。本明細書で使用する、特異的結合とは、標的抗原に対して高い親和性を有し（それに対して特異的である）、特異的でない抗原に低い又はかなり低い親和性（又は、全くない）で結合する分子を指すものとする。親和性を測定する方法は、当業者に公知であり、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）のようなアッセイを含む。
【０１６４】
本発明の抗体分子は、最適には高い結合親和性を有し、具体的にはナノモル又はピコモルである。親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）を含めた、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。一実施形態において、本発明の分子は、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の分子は、約５０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の分子は、約４０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の分子は、約３０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の分子は、完全ヒト又はヒト化であり、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。
【０１６５】
本明細書で使用する、天然に存在するドメインの誘導体とは、天然に存在する配列中の１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸を置きかえ又は欠失させて、例えば望ましくない特性を取り除くことによってなどドメインの特性を最適化するが、ドメインを特徴づける特徴（単数又は複数）を保持し続けているものを指すものとする。一実施形態において、本発明の抗体分子は、１つ又は複数のアルブミン結合ペプチドを含む。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてペプチドはアルブミンを結合し、分子の半減期を増大させる。
【０１６６】
アルブミン結合ペプチドは、分子の１つ又は複数の可変領域、ヒンジ若しくはＣ末端又は分子抗原結合特性に干渉しない任意の位置から付加されてもよい。
【０１６７】
アルブミン結合ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０に提供されている。
【０１６８】
抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることは、当業技術者によってよく理解されよう。これらの修飾の型及び程度は、分子を発現させるのに使用する宿主細胞系及び培養条件によってしばしば決まる。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミドにおける変化があり得る。よくある修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端の塩基性残基（リシン又はアルギニンなど）の欠失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５巻：１２９〜１３４頁、１９９５年に記載の通り）。
【０１６９】
必要に応じて、本発明に使用する分子は、１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートされてもよい。いうまでもなく、エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体分子に付着できる単一部分を形成するように連結された２つ以上のそのような分子、を含むことができる。エフェクター分子に連結されている本発明による抗体を得ることが望ましい場合、これは抗体が直接に又はカップリング剤を介してエフェクター分子と連結される標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順によって調製できる。抗体にそのようなエフェクター分子をコンジュゲートする技術は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７年、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．  ６２巻：１１９〜５８頁及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻、６７〜１２３頁を参照のこと）。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載されるものがある。別法として、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えばＷＯ８６／０１５３３及び欧州特許第０３９２７４５号に記載の組換えＤＮＡ手順を使用して達成することができる。
【０１７０】
本明細書では用語エフェクター分子には、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、合成若しくは天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子並びに蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出できる化合物などのレポータ基がある。
【０１７１】
エフェクター分子の例としては、細胞に有害である（例えば、殺す）任意の薬剤を含めた、細胞毒素又は細胞毒性物質があり得る。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアスタリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン及びその類似体又はホモログがある。
【０１７２】
エフェクター分子としては、それだけには限らないが、代謝拮抗物質（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（thioepa）クロラムブシル、メルファラン、カルマスティン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び細胞分裂阻止剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）がある。
【０１７３】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；又は、それだけには限らないがアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物があり得る。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素がある。対象の酵素としては、それだけには限らないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼがある。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、それだけには限らないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリンなどのタンパク質、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤若しくは抗血管新生剤、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の増殖因子などの生物学的応答調節物質及び免疫グロブリンがある。
【０１７４】
他のエフェクター分子には、例えば診断に有用な検出可能な物質があり得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（ポジトロン断層撮影法用）、及び非放射性常磁性金属イオンがある。診断用としての抗体にコンジュゲートできる金属イオンについては、一般に米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。好適な酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼがあり；好適な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンがあり；好適な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンがあり；好適な発光物質には、ルミノールがあり；好適な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリンがあり；好適な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃがある。
【０１７５】
別の例において、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の半減期を増大させ、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ及び／又は上皮性関門を通る免疫系への抗体の送達を増強する。この型の好適なエフェクター分子の例としては、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されるポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物などがある。
【０１７６】
エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般的に、合成又は天然に存在するポリマーでもよく、例えば任意に置換された直鎖若しくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニルエン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝若しくは非分枝ポリサッカリド、例えばホモ−若しくはヘテロ−ポリサッカリドである。
【０１７７】
上述の合成ポリマー上に存在できる具体的な任意の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基がある。
【０１７８】
合成ポリマーの具体的な例には、任意で置換される直鎖若しくは分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニールアルコール）又はその誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体など任意で置換されるポリ（エチレングリコール））がある。
【０１７９】
具体的な天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体がある。
【０１８０】
本明細書では「誘導体」とは、反応性誘導体、例えばマレイミドなどチオール選択的反応基を含むものとする。反応基は、直接又はリンカー部分を介してポリマーと連結することができる。いうまでもなく、そのような基の残基は、場合によっては、開示の抗体とポリマーとの連結基として産物の一部を形成することになる。
【０１８１】
ポリマーのサイズは、要求通り変化させることができ、一般に、平均分子量５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａなど５０００〜４００００Ｄａになる。ポリマーサイズは、産物の使用目的、例えば、腫瘍など特定の組織に局在させる又は循環半減期を延長する能力、に基づいて特別に選択することができる（総説についてはＣｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４巻、５３１〜５４５頁を参照のこと）。従って、例えば腫瘍処置用として、例えば産物を循環させて組織に侵入させることを意図する場合、例えば約５０００Ｄａの分子量を持つ低分子量ポリマーを使用することが有利になり得る。産物を循環させておく用途の場合、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの分子量を有する高分子量ポリマーを使用することが有利になり得る。
【０１８２】
適切なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）若しくは、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体などのポリアルキレンポリマーがあり、特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの分子量を有する。
【０１８３】
１例において、本発明に使用する抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着される。一つの特定の例において、ＰＥＧ分子は、抗体中に位置する利用可能な任意のアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル若しくはカルボキシ基を介して付着させることができる。そのようなアミノ酸は、抗体中に天然に存在してもよく、組換えＤＮＡ法を使用して抗体中に操作されてもよい（例えば米国特許第５，２１９，９９６号；米国特許第５，６６７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１を参照のこと）。１例において、本発明の分子は修飾された抗体であり、その修飾は、重鎖のＣ末端に、エフェクター分子の付着を可能にする１個又は複数のアミノ酸を追加することである。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を付着させることができる。
【０１８４】
一実施形態において、ＰＥＧ分子は、軽鎖のシステイン１７１に連結されており、例えば参照により本願明細書に組み込むＷＯ２００８／０３８０２４を参照のこと。
【０１８５】
最適には、ＰＥＧ分子は、抗体中に位置する少なくとも１個のシステイン残基のチオール基を介して共有結合している。修飾抗体に付着する各ポリマー分子は、抗体中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合することができる。共有結合は、一般にジスルフィド結合、特に硫黄−炭素結合になる。チオール基を付着点として使用する場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミドなどのチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体を使用することができる。上記の通り、ポリマー修飾された抗体の調製における出発材料として、活性化ポリマーを使用することができる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン若しくはジスルフィド、などのチオール反応基を含有する任意のポリマーであってもよい。そのような出発材料は、商業的に入手することができ（例えばＮｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡ）又は従来通りの化学的手順を使用して市販の開始材料から調製することもできる。特定のＰＥＧ分子としては、２０Ｋのメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）がある。
【０１８６】
本発明は、本明細書に記載した抗体分子をコードしている単離されたＤＮＡも提供する。
【０１８７】
更なる態様において、前記ＤＮＡを含むベクターが提供される。
【０１８８】
ベクターを構築できる一般的な方法、トランスフェクション法及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作成されたＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。
【０１８９】
更なる態様において、前記ベクター及び／又はＤＮＡを含む宿主細胞が提供される。
【０１９０】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系を使用して、本発明の分子をコードしているＤＮＡ配列を発現させることができる。細菌、例えば大腸菌、及び他の微生物系を使用することができ又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系を使用することもできる。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞がある。
【０１９１】
本発明は、本発明の抗体分子をコードしているＤＮＡからタンパク質発現を導くのに適切な条件下で本発明のベクター（及び／又はＤＮＡ）を含有する宿主細胞を培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む、本明細書に記載の抗体分子を産生するプロセスも提供する。
【０１９２】
重鎖と軽鎖の両方を含む産物を産生する場合、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードしている第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードしている第２のベクター、で細胞系をトランスフェクトすることができる。別法として、単一のベクターを使用することができ、ベクターは軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードしている配列を含む。
【０１９３】
本開示による抗体分子を、それを作っている宿主細胞から適切なレベルで発現させ、製品化する。
【０１９４】
抗体は、どんな標的抗原に対して特異的であってもよい。抗原は、細胞結合型タンパク質、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞の細胞表面タンパク質でも可溶性タンパク質でもよい。対象の抗原は、疾患又は感染中に上方制御されるタンパク質、例えば受容体及び／又はそれに対応するリガンドなど、医学的に関連する任意のタンパク質でもよい。細胞表面タンパク質の特定の例としては、接着分子、例えばβ１インテグリンなどのインテグリン、例えばＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１−受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、ＰＤ−１、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＴＬ１Ａ、ＤＲ３、ＩＬ−７受容体Ａ並びに必要に応じてその受容体がある。
【０１９５】
可溶性抗原としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６若しくはＩＬ−１７など、ＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７Ｆなどのインターロイキン、ウイルス性抗原、例えばＲＳウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子αとして公知であり、本明細書においてＴＮＦ又はＴＮＦαと呼ぶ）、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、ＷＩＳＰ−１並びに必要に応じてその受容体がある。他の抗原としては、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロリズム剤、放射性核種及び重金属、ヘビ及びクモ毒並びに毒素がある。
【０１９６】
一実施形態において、重鎖交換を引き起こす条件下で、第１のＩｇＧ４抗体を第２のＩｇＧ４抗体とｅｘ  ｖｉｖｏで混合するステップを含む対称形二重特異性抗体を生成する方法が提供され、第１の抗体における可変領域の抗原特異性は、第２の抗体における可変領域の抗原特異性と異なる。
【０１９７】
重鎖交換を引き起こすｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件には、還元条件がある。適切な還元剤としては、ＧＳＨ、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン、ＴＢＰ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ及びＤＴＴがある。
【０１９８】
還元剤の適切な濃度は、０．５〜５ｍＭなど、０．０１〜１０ｍＭである。加えて、還元は、酸化還元緩衝液、すなわち異なる相対比率の酸化及び還元された試薬の変形、例えばＧＳＨ：ＧＳＳＧ及びＣｙｓ：ｄｉＣｙｓなどを使用して実現することができる。
【０１９９】
適切な条件は、抗体の比が１：１又は１：２など、０．５：５〜５：０５である。
【０２００】
適切な温度は、３７℃など、１５〜４０℃である。
【０２０１】
還元条件は、ホモ二量体とヘテロ二量体の間で還元的に安定するよう選択できる。
【０２０２】
別の実施形態において、本開示が混合細胞培養を利用して調製される場合、抗体には、例えば約５０％の交換が起こる。これは、望ましい二重特異性の１〜２ｇ／Ｌの間で生じ得る。
【０２０３】
一実施形態において、本明細書に記載されるプロセス若しくは方法から得た又は得られる抗体若しくは断片が提供される。
【０２０４】
一実施形態において、抗体を使用して、対象の抗原の活性を機能的に変更することができる。例えば、抗体は、前記抗原の活性を直接若しくは間接的に中和、拮抗又は作用することができる。
【０２０５】
本発明の抗体分子は、病状の処置及び／又は予防に有用である。
【０２０６】
従って、例えば医薬製剤において治療上有効な量を投与することにより処置に使用される本発明による抗体が提供される。一実施形態において、本発明による抗体は、例えば吸入により肺に局所的に投与される。
【０２０７】
本発明によって提供される抗体は、炎症性疾患及び障害、免疫疾性患及び障害、線維性障害及びがんを含めた疾患又は障害の処置に有用である。
【０２０８】
用語「炎症性疾患」又は「障害」及び「免疫性疾患又は障害」には、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、マックルウェルズ疾患、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脈管炎、Ｉ型糖尿病、移植並びに移植片対宿主病が含まれる。
【０２０９】
用語「線維性障害」としては、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は硬皮症）、腎線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧症、末期腎不全、腹膜線維症（連続携行式腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、心反応性線維症、瘢痕化、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠状動脈バイパス外科手術、関節形成及び白内障手術がある。
【０２１０】
用語「がん」としては、上皮から生じ、皮膚やより一般的には、体器官の内膜、例えば：乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱又は腸に見出される悪性新生物がある。がんは、隣接する組織に浸潤し、遠くの器官、例えば：骨、肝臓、肺又は脳に拡散（転移する）する傾向がある。本発明は、本発明の抗体を薬学的に許容できる１つ又は複数の添加剤、賦形剤若しくは担体と組合せて含む医薬又は診断組成物も提供する。従って、薬剤の製造用として本発明の抗体の使用が提供される。通常、組成物は、薬学的に許容できる担体を通常は含むことになる無菌の医薬組成物の一部として供給されることになる。本発明の医薬組成物は、加えて、薬学的に許容できるアジュバントを含んでもよい。
【０２１１】
本発明は、薬学的に許容できる１つ又は複数の添加剤、賦形剤又は担体に本発明の抗体を添加し、一緒に混合するステップを含む医薬若しくは診断組成物の調製プロセスも提供する。本開示の抗体は、医薬若しくは診断組成物中の唯一の活性成分であってもよく、他の抗体成分、例えば抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ若しくは抗ＬＰＳ抗体又はキサンチンなどの非抗体成分を含めた他の活性成分を伴ってもよい。他の適切な活性成分としては、耐性を誘導可能な抗体、例えば、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体がある。
【０２１２】
更なる実施形態において、本開示による抗体若しくは組成物は、更なる薬学的に活性な薬剤、例えば副腎皮質ステロイド（フルチカゾンプロピオン酸など）並びに／又はβ２アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール又はフォルモテロールなど）、又は細胞成長及び増殖の阻害剤（ラパマイシン、シクロホスフミド（cyclophosphmide）、メトトレキセートなど）又は別のＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組合せて利用される。一実施形態において、阻害剤は小分子である。別の実施形態において、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０２１３】
医薬組成物は、治療上有効な量の本発明の抗体を適切に含む。本明細書で使用される用語「治療上有効な量」とは、標的となる疾患若しくは症状を処置、改善又は予防するのに、或いは検出可能な治療的又は予防的効果を呈するのに必要な治療剤の量のことを指す。治療上有効な量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類、のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適当な濃度範囲及び投与経路も決定できる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトに投与する場合の有用な用量及び経路を決定することができる。
【０２１４】
ヒト対象に対する正確な治療上有効な量は、病状の重症度、対象の全体的な健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、混合薬（単数又は複数）、療法に対する反応感度並びに耐性／応答によって決まることになる。この量は、日常の実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療上有効な量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇになる。医薬組成物は、用量当たり予め定められた量の本発明の活性薬剤を含有する単位用量形態で便利に存在してもよい。
【０２１５】
組成物は、患者に個別に投与されても、他の薬剤、薬物又はホルモンと組合せて（例えば同時に、順次、別々に）投与されてもよい。
【０２１６】
本発明の抗体が投与される用量は、処置しようとする症状の性質、例えば疾患／炎症が存在する範囲及び分子を予防的に使用するか又は現状の処置に使用するかで決まる。用量の頻度は、抗体の半減期及びその効果の継続時間で決まることになる。抗体の半減期が短い場合（例えば２〜１０時間）、１日当たり１回又は複数の用量を投与する必要があり得る。別法として、抗体の半減期が長い場合（例えば２〜１５日）、１日に１回、１週間に１回又は更に１〜２ヵ月間に１回の投薬量しか投与する必要がない場合もある。薬学的に許容できる担体は、それ自身が、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導するべきでなく、また毒性であるべきでもない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子など大きくて、ゆっくりと代謝される高分子であることができる。
【０２１７】
薬学的に許容できる塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸などの有機酸塩を使用することができる。
【０２１８】
治療用組成物中の薬学的に許容できる担体は、水、食塩水、グリセリン及びエタノールなどの液体も追加で含有できる。加えて、湿潤、乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのような組成物に存在していてもよい。そのような担体により、患者に経口摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤及び懸濁剤として医薬組成物を製剤化することが可能になる。
【０２１９】
好適な投与形態としては、例えばボーラス注射若しくは持続点滴による、例えば注射又は点滴による非経口投与に適切な形態がある。産物が注射又は点滴用である場合、油性又は水性媒体の懸濁剤、液剤若しくは乳剤の形態をとってもよく、懸濁、防腐、安定化及び／又は分散助剤などの製剤化剤を含有してもよい。別法として、本開示の分子は、使用前に適当な無菌の液体で再構成するための乾燥形態であってもよい。
【０２２０】
一旦製剤化されたら、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。処置される対象は、動物であり得る。しかし、１つ又は複数の実施形態において、組成物はヒト対象に対する投与に適合される。
【０２２１】
本開示による製剤において、適切には、最終製剤のｐＨは抗体の等電点の値と同等でない、例えば製剤のｐＨが７である場合、ｐＩは８〜９又はそれ以上が適当になる場合がある。理論に束縛されるものではないが、これにより、安定性が改善される、例えば抗体が溶液中に留まる、最終製剤を最終的に提供できると考えられる。
【０２２２】
この発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、心室内、経皮的、経皮的（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれに限定されない任意の数の経路で投与することができる。ハイポスプレーを使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。通常、治療用組成物は注射可能な液剤又は懸濁剤のいずれかとして調製することができる。注射する前に液体溶媒中の液剤又は懸濁剤に適する固形剤を調製することもできる。
【０２２３】
組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹膜内、静脈内若しくは筋肉内注射又は組織の間質腔に送達されることによって達成されることになる。組成物は、病変に投与することもできる。投薬処置は、単一用量計画でも複数用量計画でもよい。
【０２２４】
組成物中の活性成分が抗体になることはいうまでもない。従って、それは、消化管における分解の影響を受けやすいことになる。従って、組成物を、消化管を使用する経路で投与しようとする場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、一旦消化管から吸収されたら抗体を遊離する薬剤を含有する必要があろう。
【０２２５】
薬学的に許容できる担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１年）に利用可能である。
【０２２６】
一実施形態において、製剤は、吸入を含めた局所投与用の製剤として提供される。
【０２２７】
適切な吸入可能な調製物としては、吸入可能な粉剤、推進用ガスを含有する定量エアロゾル剤又は推進用ガスを含まない吸入可能な液剤がある。活性物質を含有する本開示による吸入可能な粉剤は、上述の活性物質単独から又は生理的に許容できる添加剤と上述の活性物質との混合物からなってもよい。
【０２２８】
これらの吸入可能な粉剤としては、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ及びポリサッカリド（例えばデキストラン）、多価アルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれら互いの混合物があり得る。モノ−又はジサッカリドが適切に使用され、ラクトース又はグルコースの使用は、特に限定されないが水和物の形態である。
【０２２９】
肺に沈着させるための粒子は、１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍなど１０ミクロン未満の粒子サイズを必要とする。活性成分（抗体など）の粒子サイズは、最も重要である。
【０２３０】
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用できる推進用ガスは、当技術分野において公知である。適切な推進用ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／若しくはフッ化誘導体などのハロゲン化炭化水素から選択される。上述した推進用ガスは、それ自身で又はその混合物で使用されてもよい。
【０２３１】
特に適切な推進用ガスは、ＴＧ  １１、ＴＧ  １２、ＴＧ  １３４ａ及びＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにその混合物が特に適している。
【０２３２】
推進体ガスを含有している吸入可能なエアロゾル剤は、共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、酸化防止剤、潤滑剤及びｐＨを調整する手段など他の成分を含有してもよい。これら成分の全ては、当技術分野において公知である。本発明による推進体ガスを含有している吸入可能なエアロゾル剤は、最大５重量％の活性物質を含有することができる。本発明によるエアロゾル剤は、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０２３３】
別法として、肺への局所投与は、例えばネビュライザなどの装置、例えば、圧縮器に接続されたネビュライザを利用する液剤又は懸濁剤製剤の投与によることもできる（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．によって製造される、Ｐａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）圧縮器に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネビュライザ）。
【０２３４】
本発明の抗体は、溶剤に分散されている、例えば液剤又は懸濁剤の形態で送達することができる。それは、適当な生理溶液、例えば生理食塩水又は他の薬理的に許容できる溶剤若しくは緩衝液に懸濁することができる。当技術分野において公知の緩衝液は、ｐＨ約４．０〜５．０になるように、二ナトリウムエデト酸０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇ、ＮａＣｌ  ８．０ｍｇ〜９．０ｍｇ、ポリソルベート０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇ、無水クエン酸０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇ及びクエン酸ナトリウム０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇを１ｍＬの水に含有できる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された分子を利用することができる。
【０２３５】
治療的な懸濁液又は溶液製剤は、１つ又は複数の添加剤を含有することもできる。添加剤は、当技術分野で周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセリンがある。液剤又は懸濁剤は、リポソーム若しくは生分解性微小球に封入することができる。一般に、製剤は無菌の製造プロセスを利用する実質的に無菌の形態で提供されることになる。
【０２３６】
これは、当業者になじみの方法によって、製剤に使用する緩衝した溶剤／溶液を濾過するステップと、無菌の緩衝した溶剤溶液に分子を無菌的に懸濁するステップと、無菌容器へ製剤を分注するステップとによる産生及び殺菌を含むことができる。
【０２３７】
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、アルミ箔包装材料に包装した単回用量単位（例えば、密封プラスチック製容器又はバイアル）として提供されてもよい。各バイアルは、例えば、２ｍＬの溶剤／溶液緩衝液に単位用量を含有する。
【０２３８】
本開示の抗体は、噴霧化による送達に特に適していると考えられる。
【０２３９】
本明細書の文脈において含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）とは、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。技術的には、本発明の適当な実施形態を組合せることができる。
【０２４０】
本発明を、以下の実施例を参照してここで記載するが、それは単なる例示であり、本発明の範囲を制限するものと決して解釈されるべきでない。
【実施例】
【０２４１】
１．ＩｇＧ４重鎖の突然変異生成及び変異ＩｇＧ４重鎖を生成する単一の遺伝子ベクター。
アミノ酸変異を、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＳＤＭ）キット又はＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ  ＤＳＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）から入手した）（それぞれ、カタログ番号２１０５１６及び２００５２１）を使用して実行し、製造業者の説明書に従って実行した。
【０２４２】
ＤＮＡ配列決定によって変異を確認した。以下の表にある抗体１〜４７のＩｇＧ４重鎖を作製した：
【表２】
2018117627.tif 000019
抗体４８（配列番号２６６）の重鎖を、ＰＣＲ及び制限酵素クローニングによって生成した。ＩｇＧ１上部及びコアヒンジ領域配列並びに制限部位ＢｇｌＩＩをコードしているフォワードオリゴと制限酵素ＤｒａＩＩＩをコードしているリバースオリゴによってＰＣＲ産物を生成した。次いでＰＣＲ断片を、上述の酵素で消化し、適当な可変領域を含有するｈＧ４単一遺伝子ベクターにライゲーションした。
【０２４３】
２．変異ＩｇＧ４抗体の発現
全ての変異体ＤＮＡを、ＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトした。細胞（２ｘ１０８個細胞／ｍＬ）を、Ｅａｒｌｅｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）１ｍＬに再懸濁し、ＤＮＡ  ４００μｇ（重鎖ＤＮＡ  ２００μｇ及びκ軽鎖ＤＮＡ  ２００μｇ）と混合した。一定分量８００μＬを、０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に移した。５００ｍＬ培養の場合、６個のキュベットを以下のパラメータで電気穿孔した：１ｍｓ、９．６アンペア；１０ｍｓ、０アンペア；４０ｍｓ、３．２アンペア）。トランスフェクトした細胞を、５％ＣＯ２加湿環境で、３７℃で、１４０ｒｐｍで振盪しながら２４時間インキュベートし、トランスフェクション２日後からは３２℃で１０〜１３日間継続した。トランスフェクション４日後に、培養物に１Ｍ酪酸ナトリウム１．６ｍＬを添加した。一旦細胞が生存率４０％になったら又は１３日目までに、上清を採取した。培養物を４０００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上清を０．２２μＭ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して精製した。
【０２４４】
３．変異ＩｇＧ４抗体の精製
上清（２００〜５００ｍＬ）を、プロテインＡ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＫ）５ｍＬを使用して精製した。上清の１／５０量の２Ｍ  トリスＨＣｌ  ｐＨ８．５を添加することによってサンプルを調製した。サンプルを、１ｍＬ／分でカラムにロードした。このカラムを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄した。サンプルを溶出するために、０．１Ｍクエン酸ナトリウム  ｐＨ３．４を１ｍＬ／分間でカラムに通し、０．５ｍＬの画分を採取した。各々に、２ＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８．５  ０．１２５ｍＬを添加することによってピーク画分を中和した。紫外線検出を、２８０ｎｍに設定した。
【０２４５】
４．精製した変異ＩｇＧ４抗体の特性評価
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析：
粗上清を、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＯＣＴＥＴで定量した。適当な量の抗体、４ｘローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００ｍＭ  ＮＥＭ  ２μＬを添加することによって、抗体サンプル（２５〜３０ｎｇ）を調製した。ｄＨ２Ｏを使用して総体積を２０μＬにした。次いで、サンプルを１００℃で３分間煮沸し、４〜２０％トリス−グリシンゲルの１．５ｍｍのウェル１５個にロードした。１ｘＴａｎｋ緩衝液中で、１５０Ｖで１．５時間ゲルを泳動した。８分間転写するよう設定したｉＢｌｏｔ乾式転写システムを使用して、ニトロセルロース膜に抗体を転写した。膜を、振盪プラットフォーム上のＰＢＳ−ＴＭ中で、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、続けてウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）又はヤギ抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）と振とうしながらＲＴで１時間インキュベートした。続けてＰＢＳ−Ｔを用いて各５分間、３回洗浄した。製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従ってＭｅｔａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔを使用して、ブロットを明らかにした。
【０２４６】
ウェスタンブロット分析の結果を、図７、８、９及び１０に示す。図７〜１０において、Ｈが重鎖を、Ｌが軽鎖を表す場合、Ｈ２Ｌ２は２本の重鎖と２本の軽鎖を含む全抗体分子であり、ＨＬは１本の重鎖と１本の軽鎖を含む半分子である。
【０２４７】
図７は、抗体１５、１６、６、７、８、１７、１８、１９、５、５Ｐ、９、１０、１１、１、２、３、４、１２、１３及び１４に対するウェスタンブロット分析を示す。図７から、ヒンジ変異Ｃ２３９ＳとＣ２４２Ｓの両方があるためＨ２Ｌ２がない又は極めて少ない抗体４、８及び１４を除いて、抗体は十分なレベルのＨ２Ｌ２を示すことが分かる。しかし、抗体４、８及び１４は、重鎖間での非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。変異体３もＨ２Ｌ２を殆ど示さず、おそらく軽鎖Ｃ末端（ＬＣ）システインとヒンジＣ２３９とのジスルフィドの効率的な形成のため、この変異体はＣ２３９を保持するがヒンジにおいて重鎖間ジスルフィドを形成することができない。変異Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓを含まない抗体（抗体２、６、９及び１２）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓを含まない抗体と比較して、ＨＬの形成が低下していることも分かる。Ｓ２４１Ｐ変異を含む抗体５Ｐ及び１６も、ＨＬ形成の低下を示す。変異体２と３の比較は、重鎖とジスルフィド結合を形成するための軽鎖のＣ末端システインの「及ぶ範囲」の程度を示し、軽鎖システインは、重鎖のＣ２４２よりＣ２３９に効果的に接着するように見える。
【０２４８】
図８は、抗体１５、６、７、８、２８、２９、３０、３１、１７、１９、３２、３３、３３、３４、３５、３６、３７、３８及び３９に対するウェスタンブロット分析を示す。図８から、ヒンジ領域に変異Ｃ２３９Ｓ及びＣ２４２Ｓがあり、従って２本の重鎖間にジスルフィド結合が形成されないためＨ２Ｌ２がない又は極めて少ない抗体８、３１、３５及び３９を除いて、抗体は十分なレベルのＨ２Ｌ２を示すことが分かる。しかし、抗体８、３１、３５及び３９は、重鎖間での非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。変異Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓを含まない抗体（抗体６、２９、３３及び３７）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓを含まない抗体と比較して、ＨＬの形成が低下していることも分かる。変異体１５は、軽鎖とＣＨ１のＧ２３０Ｃとの間にジスルフィド結合を形成することができ、従って、重鎖間ジスルフィドが完全に組み立てられてジスルフィド結合されたタンパク質が得られる。更に、変異体１５（Ｃ１２７Ｓ  Ｇ２３０Ｃ）、２８（Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ）、３２（Ｃ１２７Ｓ  Ｋ２２８Ｃ）及び３６（Ｃ１２７Ｓ  Ｓ２２７Ｃ）の比較から、上部ヒンジに導入されたシステインの位置は、ＬＣ−ＨＣ間ジスルフィド結合形成を改善することが示された。Ｇ２３０及びＹ２２９は、システインを導入するのに特に好ましい位置である。変異体２８（Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ）は、低レベルのＨＬ及びＨ２を示し、従ってジスルフィド結合異質性が低い。
【０２４９】
図９は、抗体１５、６、７、８、４４、４５、４６、４７、１７及び１９に対するウェスタンブロット分析を示す。図９から、ヒンジ領域に変異Ｃ２３９Ｓ及びＣ２４２Ｓがあり、従って２本の重鎖間にジスルフィド結合が形成されないためＨ２Ｌ２がない又は極めて少ない抗体８及び４７を除いて、抗体は十分なレベルのＨ２Ｌ２を示すことが分かる。しかし、抗体８及び４７は、重鎖間での非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。変異Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓを含まない抗体（抗体６及び４５）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓを含まない抗体と比較して、ＨＬの形成が低下していることも分かる。特に、変異体４４は、上部ヒンジにおける３個のアミノ酸の挿入がＨＬ及びＨ２の形成も低下させ得ることを示し、従って、相当する変異体１５よりジスルフィド異質性は低レベルである。
【０２５０】
図１０は、抗体４８、１７、１８及び１９に対するウェスタンブロット分析を示す。図１０から、抗体４８が十分なレベルのＨ２Ｌ２及び極めて少ないＨＬを示すことが分かる。変異体４８は、ＩｇＧ４上部ヒンジ配列の代わりに、ＩｇＧ１上部ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ配列番号３２０を含有し、コアヒンジＳ２４１Ｐ変異を伴う。それゆえに、変異体４８は、上部及びコアヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ配列番号３２１を有する。変異体４８は、野生型ＩｇＧ４抗体１７と比較してジスルフィド結合異質性がより低レベルであり、ＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ変異体１８及び野生型ＩｇＧ１抗体１９と比較してジスルフィド結合異質性はおよそ同程度に低レベルである。
【０２５１】
熱蛍光アッセイ：
ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを使用する熱蛍光アッセイにおいて、精製したｍＡｂの熱安定性を分析して、タンパク質の熱的変性プロセスを観察した。１ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ  ５μＬ、３０ｘ色素５μＬ、及びＰＢＳ  ４０μＬを、一緒に添加した。混合物１０μＬを、３８４ウェルＰＣＲ光学プレートに４連で分注し、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ  ＵＫ）で行った。このＰＣＲシステムは、２０℃〜９９℃に設定される正確な温度制御のための加熱装置を含有し；電荷結合素子がウェル内の蛍光変化を同時に観察する。
【０２５２】
図１１、１２、１３、１４及び１５は、野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体と比較してＩｇＧ４抗体変異体の熱安定性分析の結果を示す。
【０２５３】
変異体１５と野生型ＩｇＧ４（変異体１７）との比較は、ジスルフィド配置の変更によるＦａｂ  Ｔｍの増大を示す。変異体１５と２８の比較は、Ｇ２３０Ｃ変異を含む変異体１５と比較してＹ２２９Ｃ変異を含む変異体２８のＦａｂ  Ｔｍの更なる改善を示す。変異体１５と４４の比較は、Ｇ２３０Ｃ変異体のＦａｂ  Ｔｍが、上部ヒンジにおける３個のアミノ酸の挿入によって更に更に増大し得ることを示す。変異体１７と１８の比較は、Ｓ２４１Ｐ中間部ヒンジ変異がＨＬ形成を著しく低下させるにもかかわらずＦａｂ  Ｔｍを増大させないことを示す。野生型ＩｇＧ４（変異体１７）と変異体１５の両方と比較した場合、変異体４８は、Ｆａｂ  Ｔｍも著しく改善されている。
【０２５４】
図１５は、本発明による選択されたＩｇＧ４変異体の熱安定性の全体の順位を示す。変異体４８、４４、４４Ｐ、４６、４５、６、２９、３０、２８、２８Ｐ、３１、８、４７及び１５の全ては、野生型ＩｇＧ４（変異体１７）及び野生型ＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ（変異体１８）と比較して著しく高いＦａｂ  Ｔｍ値を示す。
【０２５５】
５．Ｆａｂアーム交換
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ重鎖交換
第１のＩｇＧ４抗体とその潜在的交換相手を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｍＭで：１５０  ＮａＣｌ、１０  ＮａＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）中に、合計濃度１００μｇ／ｍＬで、１：１のモル比で混合した。ジスルフィド結合を還元できるように、最終濃度０、０．５又は５ｍＭになるように還元グルタチオン（ＧＳＨ；Ｓｉｇｍａ）をサンプルに補充した。実験開始時（ｔ＝０時間）に、一定分量の混合物を採取し、（潜在的な反応性のチオール基を不活性化するために）最終濃度１０ｍＭのＮーエチルマレイミド（ＮＥＭ；Ｓｉｇｍａ）で失活させ、残りの混合物と並行して３７℃で１６時間インキュベートした（ｔ＝１６時間）。インキュベーション後、ｔ＝１６時間のサンプルを上述の通り失活させた。
【０２５６】
ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける重鎖交換の検出及び定量化
ＰＢＳ中に１％ＢＳＡ（ＰＢ）で連続希釈した、実施例５ａ）にて得られた失活させた反応サンプルを、ＰＢ中で１μｇ／ｍＬビオチン化抗原１（第１の抗体の抗原）と撹拌（２００ｒ．ｐ．ｍ）しながらＲＴで１時間プレインキュベーションしたサンドイッチＭＳＤアッセイを使用して機能的に活性な二重特異性抗体の存在を決定した後に、ＰＢで予めブロッキングしたストレプトアビジンコートＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に移した。撹拌しながらＲＴで１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０でウェルを３回洗浄し、その後、１μｇ／ｍＬスルホタグ付き抗原２（ＰＢ中の第２の抗体の抗原）とインキュベートした。インキュベーション後、プレートを上述の通り洗浄し、製品のリード緩衝液及びＩｍａｇｅ  Ｓｅｃｔｏｒ  ６０００機器をそれぞれ使用して、シグナルを明らかにし、測定した。ビオチン化抗原を非ビオチン化代替物と置換した対照並行反応物からバックグラウンド値を得て、全てのシグナルから差し引いた。少なくとも３件の独立した実験からの複製値を、全ての計算に使用した。
【０２５７】
ＭＳＤシグナルが高いほど、起こった重鎖交換の量は多かった。
【０２５８】
以下の抗体を、分析した：
【表３】
2018117627.tif 000020
【０２５９】
図１６〜２０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦａｂアーム交換定量の結果を示し、ｙ軸はＭＳＤシグナルを示し、棒のレベルが高いほどＦａｂアーム交換量は多い。
【０２６０】
図１６は、２つのＧＳＨ濃度並びに様々な時点における野生型ＩｇＧ１、野生型ＩｇＧ４及び変異体ＩｇＧ４Ｐ、２８、２８Ｐ、１５、４４、４４Ｐ及び４８の重鎖交換を示す。
【０２６１】
図１７は、２つのＧＳＨ濃度並びに様々な時点における野生型ＩｇＧ４及び変異体１５、４４及び４８の重鎖交換を示す。リース（lease）交換を有する変異体４８で示されるように、ＩｇＧ４ヒンジがＩｇＧ１型になるよう変異を受けるほど交換は低下することが分かる。
【０２６２】
図１８は、２つのＧＳＨ濃度並びに様々な時点における野生型ＩｇＧ４及び変異体１５及び２８の重鎖交換を示す。２２９位の変異（変異体２８）は、２３０位の変異（変異体１５）と比較してより大きく、両方の還元剤濃度で４〜１６時間の間交換を低下させることが分かる。
【０２６３】
図１９は、野生型ＩｇＧ４と比較した、０．５ｍＭ  ＧＳＨにおける変異体ＩｇＧ４Ｐ、１５、２８、４４及び４８のパーセンテージ交換を示す。交換は、以下の通りに順位付けできる：ＩｇＧ４  ｗｔ＞１５＝４４＞４８＞２８。
【０２６４】
図２０は、野生型ＩｇＧ４と比較した、５ｍＭ  ＧＳＨにおける様々な変異体のパーセンテージ交換を示す。交換は、ＩｇＧ４  ｗｔ＞１５＝４４＞４８＞２８と順位付けできる。
【０２６５】
文献（Ｌａｂｒｉｊｎ  ２０１１年、Ｌｅｗｉｓ  ２００９年、Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ  ２０１０年、Ｌａｂｒｉｊｎ  ２００９年）とよく一致して、ＩｇＧ４コアヒンジのＳ２４１Ｐ変異が、Ｆａｂアーム交換を防ぐためのツールを意味することを示している。本発明の変異体二重特異性抗体は、血漿の生理的ＧＳＨ濃度４〜６μＭより１００倍高い０．５ｍＭ  ＧＳＨにおいて示された交換よりも少ないＦａｂアーム交換を実証できたことも分かる（Ｚｉｌｍｅｒ．ら、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）。従って、二重特異性抗体は、還元条件下でのＦａｂアーム交換によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで創出することができ、そしてその条件はＩｇＧ４  ｗｔと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦａｂアーム交換を著しく低下させることができた。
【０２６６】
抗体親和性：
標的となる可溶性サイトカインに対する本発明の選択された変異体ＩｇＧ４抗体の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）によって測定できる。アッセイ形態は、抗Ｆｃ表面におけるＩｇＧの捕捉、それに続く可溶性サイトカインの滴定である。
【０２６７】
用語「ｋｄ」（ｓ−１）とは、抗体抗原相互作用の解離速度定数のことを指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ぶ。
【０２６８】
本明細書で使用される用語「ｋａ」（Ｍ−１  ｓ−１）とは、抗体抗原相互作用の会合速度定数のことを指す。
【０２６９】
本明細書で使用される用語「ＫＤ」（Ｍ）又は「ＫＤ」（ｐＭ）とは、抗体抗原相互作用の解離平衡定数のことを指す。
【０２７０】
サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣ分析：
Ｓ２００カラムを使用して、およそ５０μｇの精製抗体をＨＰＬＣで処理した。Ａｂ１〜１９を使用して分析した。この結果は、ヒトＩｇＧ４分子のＤＳＢ配置に対する変更にもかかわらず、非共有結合的に会合したＨ２Ｌ２が形成されることを示している。
【図１ａ】
2018117627.tif 000021
【図１ｂ】
2018117627.tif 000022
【図２ａ】
2018117627.tif 000023
【図２ｂ】
2018117627.tif 000024
【図２ｃ】
2018117627.tif 000025
【図２ｄ】
2018117627.tif 000026
【図３ａ】
2018117627.tif 000027
【図３ｂ】
2018117627.tif 000028
【図４ａ】
2018117627.tif 000029
【図４ｂ】
2018117627.tif 000030
【図５−１】
2018117627.tif 000031
【図５−２】
2018117627.tif 000032
【図５−３】
2018117627.tif 000033
【図５−４】
2018117627.tif 000034
【図５−５】
2018117627.tif 000035
【図６−１】
2018117627.tif 000036
【図６−２】
2018117627.tif 000037
【図６−３】
2018117627.tif 000038
【図６−４】
2018117627.tif 000039
【図６−５】
2018117627.tif 000040
【図６−６】
2018117627.tif 000041
【図６−７】
2018117627.tif 000042
【図６−８】
2018117627.tif 000043
【図７】
2018117627.tif 000044
【図８】
2018117627.tif 000045
【図９】
2018117627.tif 000046
【図１０】
2018117627.tif 000047
【図１１】
2018117627.tif 000048
【図１２】
2018117627.tif 000049
【図１３】
2018117627.tif 000050
【図１４】
2018117627.tif 000051
【図１５】
2018117627.tif 000052
【図１６】
2018117627.tif 000053
【図１７】
2018117627.tif 000054
【図１８】
2018117627.tif 000055
【図１９】
2018117627.tif 000056
【図２０】
2018117627.tif 000057
【図２１】
2018117627.tif 000058
【配列表】
2018117627000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月13日(2018.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含むクラスＩｇＧ４の対称形二重特異性抗体であって、
各重鎖において：
、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；及び
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン又は２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されており、
各重鎖の定常領域配列が類似しているか又は同一であり、各重鎖の可変領域が異なっている、上記対称形二重特異性抗体。
【請求項２】
第１の重鎖の２３９位のシステイン及び／又は２４２位のシステインが、チオール非含有アミノ酸によって置換されている、請求項１に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項３】
チオール非含有アミノ酸がセリンである、請求項２に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項４】
１２７位のシステインがチオール非含有アミノ酸によって置換されている、請求項１又は２に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項５】
チオール非含有アミノ酸がセリンである、請求項４に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項６】
重鎖の一方又は両方が変異を受けて、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番でアミノ酸２２６〜２４３の間に３個のアミノ酸が挿入されている、請求項１から５までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項７】
重鎖の一方又は両方が変異を受けて、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３８位と２３９位の間に３個のアミノ酸が挿入されている、請求項６に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項８】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で第１の重鎖の２３８位と２３９位の間に３個のアラニンが挿入されている、請求項７に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項９】
トレオニン、ヒスチジン及び更なるトレオニンが、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で重鎖の一方又は両方の２３８位と２３９位の間に挿入されている、請求項７に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１０】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で重鎖の一方又は両方の２４１位のセリンが、プロリンで置換されている、請求項１から９までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１１】
重鎖の一方又は両方において、２３０位のグリシンがシステインで置換され、２２７位のセリンがプロリンで置換され、２２９位のチロシンがセリンで置換され、２３７位のプロリンがアスパラギン酸で置換され、２３８位のプロリンがリシンで置換され、アミノ酸配列トレオニン−ヒスチジン−トレオニンが、２３８位と２３９位の間に挿入され、２４１位のセリンがプロリンで置換されている、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１２】
両方の重鎖がＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１３】
各重鎖のヒンジ領域が同一である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１４】
各重鎖が、長さ１２〜１７アミノ酸、例えば長さ１５アミノ酸の上部ヒンジ領域及びコア領域を含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１５】
１本又は２本の軽鎖を更に含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の対称形二重特異性抗体。
【請求項１６】
請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗体をコードする配列を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
疾患又は障害の処置に使用する、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
重鎖交換を引き起こす条件下で、第１のＩｇＧ４抗体を第２のＩｇＧ４抗体とｅｘ  ｖｉｖｏで混合するステップを含む対称形二重特異性抗体を生成する方法であって、第１の抗体における可変領域の抗原特異性が、第２の抗体における可変領域の抗原特異性と異なる、上記方法。
【請求項２０】
重鎖交換を引き起こす条件が還元条件、例えば適切な緩衝液の存在下である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
第１のＩｇＧ４抗体及び第２のＩｇＧ４抗体が、請求項１〜１４までのいずれか一項に定義されるＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える、請求項１８又は１９に記載の方法。