(57)【要約】      （修正有）【課題】増加した収量を示す事象ＭＯＮ８７７１２を含むトランスジェニックダイズ、及び関連する遺伝子配列の提供。【解決手段】前記事象に関する細胞、植物部分、種子、商品生産物の提供、および前記事象に特有であるトランスジェニックＤＮＡをダイズ植物のゲノムに挿入することによって作製されるＤＮＡ分子。試料中の前記ダイズ事象のヌクレオチド配列の存在を検出するための方法、前記ダイズ事象の存在に特徴的なヌクレオチド配列を検出する際に使用されるプローブおよびプライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１および配列番号２からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチド分子と、
ｂ）配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子と、
ｃ）ａ）またはｂ）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド分子と、を含む、
組み換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子が事象ＭＯＮ８７７１２から得られ、事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の代表試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子が、ダイズ植物、植物細胞、種子、子孫植物、植物部分、または商品生産物に含まれる、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分子が、事象ＭＯＮ８７７１２由来のＤＮＡから得られた鋳型分子から生成されたアンプリコンである、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡの存在に特徴的なポリヌクレオチドプローブであって、前記ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７もしくは配列番号８の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体を含む核酸分子と結合するのに十分な長さを有し、また前記ポリヌクレオチドプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２、または配列番号７もしくは配列番号８の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体を含むＤＮＡ分子とハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２、または配列番号７もしくは配列番号８の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体を含まないＤＮＡ分子とハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
ＤＮＡ試料中の事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、
ａ）前記ＤＮＡ試料を請求項５に記載のポリヌクレオチドプローブと接触させることと、
ｂ）前記ＤＮＡ試料および前記ポリヌクレオチドプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供することと、
ｃ）前記ＤＮＡ試料において、前記ポリヌクレオチドプローブの前記事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを検出することと、を含む、方法。
【請求項７】
第１のＤＮＡ分子と、前記第１のＤＮＡ分子と異なる第２のＤＮＡ分子とを含み、事象ＭＯＮ８７７１２から得られた鋳型と一緒に増幅反応に使用したときにＤＮＡプライマーとして機能して、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡに特徴的なアンプリコンを生成する、ＤＮＡ分子の対。
【請求項８】
前記アンプリコンが、配列番号１、配列番号２からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、配列番号７の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子と、配列番号８の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子とを含む、請求項７に記載のＤＮＡ分子の対。
【請求項９】
ＤＮＡ試料中の事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、
ａ）前記ＤＮＡ試料を請求項７に記載のＤＮＡ分子の対と接触させることと、
ｂ）増幅反応を実施して、配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子、または配列番号８の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子、あるいはそれらの相補体を含むアンプリコンを生成することと、
ｃ）前記アンプリコンを検出することと、を含む、方法。
【請求項１０】
事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡの存在の検出に特異的なＤＮＡプライマーまたはポリヌクレオチドプローブとして機能することができる少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含み、前記ＤＮＡの検出が試料中の前記ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡの存在に特徴的である、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチド分子が、配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子、および配列番号８の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子からなる群から選択される、請求項１０に記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項１２】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む、植物、種子、細胞、またはそれらのＤＮＡ含有部分。
【請求項１３】
花粉、胚珠、花、莢、葉、根、茎、および苗条からなる群から選択される、請求項１２に記載の植物の植物部分。
【請求項１４】
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の代表試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物、種子、細胞、またはそれらの植物部分。
【請求項１５】
前記植物または種子が収量の増加をもたらす、請求項１４に記載の植物または種子。
【請求項１６】
少なくとも１つの親が事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズから得られた、ハイブリッドダイズ植物または種子。
【請求項１７】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含むＭＯＮ８７７１２から得られた非生存植物材料。
【請求項１８】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む微生物。
【請求項１９】
前記微生物が植物細胞である、請求項１８に記載の微生物。
【請求項２０】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む商品生産物。
【請求項２１】
全種子または加工種子、動物用飼料、油、粗粉、粉、フレーク、ふすま、タンパク質濃縮物、ダイズタンパク質単離物、加水分解ダイズタンパク質、バイオマス、および燃料製品からなる群から選択される、請求項２０に記載の商品生産物。
【請求項２２】
ａ）ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ植物を自殖させ、それによって種子を生成することと、
ｂ）前記種子を栽培して、複数の子孫植物を生成することと、
ｃ）ＭＯＮ８７７１２を含む子孫植物または増加した収量を有する子孫植物を選択することと、を含む、増加した収量を有する大豆植物を生成する方法。
【請求項２３】
ａ）ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ植物を第２のダイズ植物と交配し、それによって種子を生成することと、
ｂ）前記種子を栽培して、複数の子孫植物を生成することと、
ｃ）ＭＯＮ８７７１２を含む子孫植物または増加した収量を有する子孫植物を選択することと、を含む、増加した収量を有するダイズ植物を生成する方法。
【請求項２４】
試料においてダイズ事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを含むダイズ植物ゲノムの接合状態を決定する方法であって、
ａ）前記試料を、３つの異なるプライマーであって、
ｉ）核酸増幅反応でダイズ事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡと一緒に使用したときに、ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２に特徴的な第１のアンプリコンを生成し、
ｉｉ）核酸増幅反応でＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡ以外のダイズゲノムＤＮＡと一緒に使用したときに、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡ以外のダイズ野生型ゲノムＤＮＡに特徴的な第２のアンプリコンを生成する、前記３つの異なるプライマーと接触させることと、
ｂ）核酸増幅反応を実施することと、
ｃ）前記第１のアンプリコンおよび前記第２のアンプリコンを検出することと、を含み、
前記第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンの存在は、前記試料中のヘテロ接合性ゲノムに特徴的であり、前記第１のアンプリコンのみの存在は、前記試料中のホモ接合性ゲノムに特徴的である、方法。
【請求項２５】
前記３つの異なるプライマーが、配列番号１０、配列番号１１または１５、および配列番号１３を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）事象ＭＯＮ８７７１２を含む作物植物または種子を植えることと、
ｂ）前記作物植物または種子を栽培することと、を含む、作物の収量を増加させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１０月１２日および２０１０年１０月１５日出願の米国仮出願第６１／３９２，２６７号および第６１／３９３，４４８号の優先権を主張するものであり、前記出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の組み込み
マイクロソフトウインドウズ・オペレーティング・システムの測定で２６．３キロバイトであり、２０１１年１０月５日に作成された、本出願に含まれる「ＭＯＮＳ２９９ＷＯ．ｔｘｔ」と称する配列表は、本出願とともに電子出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、トランスジェニックダイズ事象ＭＯＮ８７７１２、および収量の増加を示す前記事象を含む植物に関する。また、本発明は、前記事象に関する細胞、植物部分、種子、植物、商品生産物、および前記事象に特有であり、トランスジェニックＤＮＡをダイズ植物のゲノムに挿入することによって作製されたＤＮＡ分子も提供する。本発明は、試料中の前記ダイズ事象のヌクレオチド配列の存在を検出するための方法、前記ダイズ事象の存在に特徴的なヌクレオチド配列を検出する際に使用されるプローブおよびプライマーをさらに提供する。
【背景技術】
【０００４】
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）は、重要な作物であり、世界の多くの地域において主要な食物源である。農業形質および生産物の品質を向上させるためにバイオ技術の方法がダイズに応用されている。そのような農業形質の１つは収量の増加である。
【０００５】
トランスジェニック植物における収量の増加は、そのような収量の増加をもたらすことが可能なトランス遺伝子の発現によって達成することができる。植物における外来遺伝子の発現は、多くの因子、例えば、トランス遺伝子カセットに使用される調節要素、トランス遺伝子インサートの染色体位置、トランス遺伝子挿入部位付近の内因性調節要素、および環境因子、例えば光および温度に影響されることが知られている。例えば、同様に生じた事象間のトランス遺伝子発現の全体的レベルまたはトランス遺伝子発現の空間的もしくは時間的パターンは、大きく異なり得ることが観察されている。このため、商業的農業の目的で有用な１つの事象を最終的に特定するためには、しばしば数多くの独立した形質転換事象をスクリーニングする必要がある。このような事象は、一旦所望のトランス遺伝子発現、分子的特徴、および改善された形質を有すると特定されると、植物品種改良方法を用いて、その改善された形質を他の遺伝的背景に遺伝子移入するために使用することができる。得られた子孫は、このトランスジェニック事象を含み、したがって最初の形質転換体のその形質のトランス遺伝子発現特性を有するであろう。これを使用して、その改善された形質を含み、特定の地域の栽培条件にぴったりと適合した多数の異なる作物品種を生産することができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、代表種子試料がアメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、事象ＭＯＮ８７７１２を含むトランスジェニックダイズ植物および種子を提供する。この事象を含む植物は収量の増加を示す。
【０００７】
本発明は、この事象を含む植物、種子、細胞、子孫植物、または植物部分、および事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物、細胞、植物部分、または種子から得られた商品生産物を提供する。したがって、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、および配列番号６、ならびにそれらの相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む植物、種子、細胞、子孫植物、植物部分、または商品生産物を提供する。本発明は、例えばＤＮＡ増幅方法において本発明のＤＮＡ分子を含むアンプリコンを生成する組み換えＤＮＡ分子を含む、植物、種子、細胞、子孫植物、または植物部分を提供する。本発明の事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズの植物部分には、花粉、胚珠、花、苗条、根、茎、葉、莢、および種子が含まれるが、これらに限定されない。事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物のゲノムに含まれる新規の遺伝子組成、ならびに事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物から作製された生産物、例えば全種子または加工種子、動物用飼料、油、粗粉、粉、食品、タンパク質添加物、燃料製品、およびＭＯＮ８７７１２を含むダイズ植物が収穫されたバイオマスは、本発明の態様である。
【０００８】
本発明は、事象ＭＯＮ８７７１２に関連するＤＮＡ分子を提供する。これらのＤＮＡ分子は、事象ＭＯＮ８７７１２のトランス遺伝子挿入と隣接ゲノムＤＮＡの結合部を表すか、またはこれから得られたヌクレオチド配列、および／または挿入されたＤＮＡに隣接するゲノムＤＮＡの領域、および／または挿入部位に隣接する組み込まれたトランスジェニックＤＮＡの領域、および／または組み込まれたトランスジェニック発現カセットの領域、および／またはこれらの領域のいずれかの連続配列を含んでもよい。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、および配列番号６、ならびにそれらの相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。別の実施形態において、ＤＮＡ分子は、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列の少なくとも約５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するポリヌクレオチド分子を含んでもよい。また別の実施形態において、本発明は、配列番号１および配列番号２を含むＤＮＡ分子を提供する。さらに別の実施形態によると、配列番号１の３’末端と配列番号２の５’末端との間に最大５０００個の連続するヌクレオチドが存在する、例えば、配列番号１の３’末端と配列番号２の５’末端との間に最大４５００個、４０００個、３５００個、３０００個、２５００個、２２５０個、２１００個、２０５０個、２０００個、または１９９２個の連続するヌクレオチドが存在する。また別の実施形態によると、配列番号７の３’末端と配列番号８の５’末端との間に最大５０００個の連続するヌクレオチドが存在する、例えば、配列番号７の３’末端と配列番号８の５’末端との間に最大４５００個、４０００個、３５００個、３０００個、２５００個、２２５０個、２１００個、２０５０個、２０００個、または１９１４個の連続するヌクレオチドが存在する。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１または配列番号２を含み、ＢＢＸ３２コード配列をさらに含むＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態において、ＢＢＸ３２コード配列は、配列番号１または配列番号２に作用可能または遺伝的に結合する。他の実施形態において、ＢＢＸ３２コード配列は、配列番号１および配列番号２に隣接する。
【００１０】
また、本発明は、本事象に特徴的なプライマーおよびプローブとして有用なＤＮＡ分子も提供する。これらの分子を含む植物、細胞、植物部分、商品生産物、子孫、および種子が提供される。
【００１１】
本発明の一態様によると、ＭＯＮ８７７１２を含む新規のダイズ植物からのトランス遺伝子／ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。配列番号１（配列番号６の位置３４９５〜３５１６に対応する、図１［Ｆ］）、配列番号２（配列番号６の位置５５０９〜５５３０に対応する、図１［Ｆ］）、配列番号７（配列番号６の位置３４５６〜３５５５に対応する）、配列番号８（配列番号６の位置５４７０〜５５６９に対応する）、およびそれらの相補体からなる群から選択される少なくとも１つのＭＯＮ８７７１２の結合配列を含むＤＮＡ配列であって、結合配列が、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡがダイズ細胞ゲノムＤＮＡと結合する地点にまたがるヌクレオチド配列であり、ダイズＤＮＡを含む生物試料中のこの配列の検出が、前記試料中のダイズ事象ＭＯＮ８７７１２の存在に特徴的である、ＤＮＡ配列が提供される（図１）。ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２およびこれらのＤＮＡ分子を含むダイズ種子は、本発明の態様である。
【００１２】
本発明の別の態様によると、ＤＮＡ検出方法において使用するための２つのＤＮＡ分子であって、増幅反応で事象ＭＯＮ８７７１２から得られた鋳型と一緒に使用したときにＤＮＡプライマーとして機能して、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡに特徴的なアンプリコンを生成する、ＤＮＡ分子が提供される。一実施形態において、第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子は、配列番号６またはその相補体の十分な長さの連続するヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む。
【００１３】
別の実施形態において、第１のＤＮＡ分子は、配列番号３または配列番号５のＤＮＡ分子のトランス遺伝子領域の任意の部分の十分な長さの連続するポリヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含み、第２のＤＮＡ分子は、配列番号３の５’隣接ダイズゲノムＤＮＡ領域の任意の部分の同様の長さのポリヌクレオチドを含む。配列番号３および配列番号５の任意の部分と相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されるあらゆるアンプリコン、ならびに配列番号１または配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含むあらゆるアンプリコンは、本発明の態様である。
【００１４】
本発明の別の態様によると、第１のＤＮＡ分子は、配列番号４または配列番号５のＤＮＡ分子のトランス遺伝子領域の任意の部分の十分な長さの連続するポリヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含み、第２のＤＮＡ分子は、配列番号４の３’隣接ダイズゲノムＤＮＡの任意の部分の同様の長さのポリヌクレオチドを含む。配列番号４および配列番号５の任意の部分と相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されるあらゆるアンプリコン、ならびに配列番号２または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含むあらゆるアンプリコンは、本発明の態様である。
【００１５】
本発明は、ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡの存在を検出するのに有用な方法、組成物、およびキットを提供する。一部の方法は、（ａ）核酸増幅反応で事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ由来のゲノムＤＮＡと一緒に使用したときにこの事象に特徴的なアンプリコンを生成するプライマーセットにＤＮＡを含む試料を接触させることと、（ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによってアンプリコンを生成することと、（ｃ）そのアンプリコンを検出することとを含み、前記アンプリコンは、配列番号１および／または配列番号２、あるいは配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含む。また、本発明は、（ａ）本事象由来のゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応に使用したときに本事象に特異的なＤＮＡ分子とハイブリダイズするプローブに、ＤＮＡを含む試料を接触させ、（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供し、（ｃ）プローブのＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを検出することによって、事象を検出するための方法も提供する。本事象から得られたＤＮＡの存在を検出するのに有用な本発明の方法および組成物を含むキットも提供される。
【００１６】
本発明の別の態様は、試料においてダイズ事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを含むダイズ植物ゲノムの接合状態を決定する方法であって、ａ）試料を３つの異なるプライマーであって、ｉ）核酸増幅反応でダイズ事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡと一緒に使用したときに、ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２に特徴的な第１のアンプリコンを生成し、ｉｉ）核酸増幅反応でＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡ以外のダイズゲノムＤＮＡと一緒に使用したときに、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡ以外のダイズ野生型ゲノムＤＮＡに特徴的な第２のアンプリコンを生成する、３つの異なるプライマーと接触させることと、ｂ）核酸増幅反応を実施することと、ｃ）第１のアンプリコンおよび前記第２のアンプリコンを検出することと、を含み、前記第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンの存在は、前記試料中のヘテロ接合性ゲノムに特徴的であり、前記第１のアンプリコンのみの存在は、前記試料中のホモ接合性ゲノムに特徴的である、方法である。一実施形態において、プライマーは、配列番号１０、配列番号１１または１５、および配列番号１３を含む。
【００１７】
一実施形態において、事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズの接合状態を決定する方法は、（ａ）核酸増幅反応で事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ由来のゲノムＤＮＡと一緒に使用したときに第１のアンプリコンを生成し、プライマー配列番号１０および配列番号１１または１５と６ＦＡＭ（商標）標識プローブ（配列番号１２）との組み合わせから、ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２に特徴的な蛍光シグナルを放出する、配列番号１０および配列番号１１または配列番号１５および配列番号１３のプライマー対ならびに６ＦＡＭ（商標）標識（配列番号１２）およびＶＩＣ（商標）標識（配列番号１４）のプローブセットに、ダイズＤＮＡを含む試料を接触させることと、（ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによって第１のアンプリコンを生成することと、（ｃ）前記第１のアンプリコンを検出することと、（ｄ）核酸増幅反応でダイズ植物由来のゲノムＤＮＡと一緒に使用したときに第２のアンプリコンを生成し、ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２として特定されるトランス遺伝子挿入のダイズゲノム領域と相同な野生型ダイズゲノムＤＮＡに特徴的な蛍光シグナルを放出するプライマーセットである、配列番号１０および配列番号１３ならびにＶＩＣ（商標）標識プローブ（配列番号１４）に、ダイズＤＮＡを含む試料を接触させることと、（ｅ）核酸増幅反応を実施し、それによって第２のアンプリコンを生成することと、（ｆ）前記第２のアンプリコンを検出することと、（ｇ）試料中の第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンを比較することと、を含み、このとき両アンプリコンの存在は、試料がトランス遺伝子挿入に対してヘテロ接合性であることを示す。
【００１８】
本発明は、増加した収量を有するダイズ植物を生成するための方法であって、（ａ）ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ植物を自殖させ、それによって種子を生成することと、（ｂ）前記種子を栽培して、複数の子孫植物を生成することと、（ｃ）ＭＯＮ８７７１２を含む子孫植物または増加した収量を有する子孫植物を選択することと、を含む方法をさらに提供する。本発明の別の態様は、増加した収量を有するダイズ植物を生成するための方法であって、（ａ）ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ植物を第２のダイズ植物と交配し、それによって種子を生成することと、（ｂ）前記種子を栽培して、複数の子孫植物を生成することと、（ｃ）ＭＯＮ８７７１２を含む子孫植物または増加した収量を有する子孫植物を選択することと、を含む方法を提供する。
【００１９】
また別の態様において、本発明は、作物の収量を増加させる方法であって、ａ）事象ＭＯＮ８７７１２を含む作物植物または種子を植えることと、ｂ）前記作物植物または種子を栽培することと、を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の前述および他の態様は、以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズのゲノム中のトランスジェニックインサートの図表示であり、［Ａ］は、ともにトランスジェニックインサートの５’部分と隣接ゲノムＤＮＡの３’部分との間の結合部を形成する配列番号１および配列番号７の相対位置に対応し、［Ｂ］は、ともにトランスジェニックインサートの３’部分と隣接ゲノムＤＮＡの５’部分との間の結合部を形成する配列番号２および配列番号８の相対位置に対応し、［Ｃ］は、ダイズゲノム隣接領域およびトランスジェニックＤＮＡインサートの任意に指定された５’末端の部分を含む配列番号３の相対位置に対応し、［Ｄ］は、ダイズゲノム隣接領域およびトランスジェニックＤＮＡインサートの任意に指定された３’末端の部分を含む配列番号４の相対位置に対応し、［Ｅ］は、事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ植物のゲノムに組み込まれたＢＢＸ３２発現カセットを含む、トランスジェニックＤＮＡインサートの配列である配列番号５を表し、［Ｆ］は、図中に左から右に示すように、５’隣接ゲノム配列、トランスジェニックインサート、および３’隣接ゲノム配列である配列番号３、配列番号５、および配列番号４を含む連続配列である配列番号６を表し、配列番号１および７、ならびに配列番号２および８は、これらの配列が事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物のゲノム中に存在するとき、上述のように組み込まれ、［Ｇ］および［Ｈ］は、それぞれＭＯＮ８７７１２および野生型対立遺伝子を特定するための事象特異的接合状態エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ用の順方向プライマー（配列番号１１または配列番号１５、および配列番号１３）を表し、［Ｉ］は、ＭＯＮ８７７１２および野生型対立遺伝子を特定するための逆方向プライマー（配列番号１０）を表し、［Ｊ］および［Ｋ］は、それぞれＭＯＮ８７７１２および野生型対立遺伝子を特定するための事象特異的接合状態エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲに使用されるプローブ（配列番号１２および配列番号１４）を表す。矢印は、５’から３’への方向を示す。ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡの左境界を指す；ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡの右境界を指す。
【図２】米国または南米における４作期のフィールド試験からの９つのトランスジェニック事象の収量データのメタ分析であり、ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを含む事象１の最も高い収量を示している。パネルＡ：トランスジェニック事象の平均収量のそれらの対応する陰性同質遺伝子系統と比較した増加（ブッシェル／エーカー）。パネルＢ：トランスジェニック事象の平均収量の野生型対照と比較した増加（ブッシェル／エーカー）。各バーの上の数字は、増加％を表す。
【００２２】
配列の簡単な説明
配列番号１−ダイズゲノムＤＮＡと組み込まれたＤＮＡインサートとの間の左境界結合部を表す２２ｂｐのヌクレオチド配列。この配列は、配列番号６の位置３４９５〜３５１６、および配列番号３（図１の［Ｃ］）の位置３４９５〜３５１６に対応する。さらに、配列番号１は、配列番号５（図１の［Ｅ］）の組み込まれた発現カセットの位置１〜１１の左境界に対応する。
【００２３】
配列番号２−組み込まれたＤＮＡインサートとダイズゲノムＤＮＡとの間の右境界結合部を表す２２ｂｐのヌクレオチド配列。この配列は、配列番号６の位置５５０９〜５５３０、および配列番号４（図１の［Ｄ］）の位置９０〜１１１に対応する。さらに、配列番号２は、配列番号５（図１の［Ｅ］）の位置２００４〜２０１４に対応する。
【００２４】
配列番号３−挿入された事象ＭＯＮ８７７１２のＤＮＡと隣接する５’ダイズゲノム配列（３５０５ｂｐ）と、組み込まれたＤＮＡの領域（１００ｂｐ）とを含む３６０５ｂｐのヌクレオチド配列。この配列は、配列番号６の位置１〜３６０５に相当する。配列番号３の位置３４５１〜３４６３の配列は、１３〜１００個の範囲の個々のｃ残基を連続して含み得ると考えられている。
【００２５】
配列番号４−挿入された事象ＭＯＮ８７７１２のＤＮＡと隣接する３’ダイズゲノム配列（１９６５ｂｐ）と、組み込まれたＤＮＡの領域（１００ｂｐ）とを含む２０６５ｂｐのヌクレオチド配列。この配列は、配列番号６の位置５４２０〜７４８４に相当する。
【００２６】
配列番号５−組み込み後の左境界配列および右境界配列を含む、増加した収量を付与する組み込まれた発現カセットの配列。配列番号５は、配列番号６のヌクレオチド位置３５０６〜５５１９に対応する。
【００２７】
配列番号６−挿入されたＭＯＮ８７７１２のＤＮＡと隣接する５’配列（配列番号３）と、組み込まれたＤＮＡインサートの配列（配列番号５）と、挿入されたＭＯＮ８７７１２のＤＮＡと隣接する３’配列（配列番号４）とのコンティグを表す７４８４ｂｐのヌクレオチド配列。配列番号６の位置３４５１〜３４６３の配列は、１３〜１００個の範囲の個々のｃ残基を連続して含み得ると考えられている。
【００２８】
配列番号７：ダイズゲノムＤＮＡと組み込まれたＤＮＡインサートとの間の左境界結合部を表す１００ｂｐのヌクレオチド配列。この配列は、配列番号６の位置３４５６〜３５５５、および配列番号３（図１の［Ｃ］）の位置３４５６〜３５５５に対応する。さらに、配列番号７は、配列番号５（図１の［Ｅ］）の組み込まれた発現カセットの位置１〜５０の左境界に対応する。
【００２９】
配列番号８−組み込まれたＤＮＡインサートとダイズゲノムＤＮＡとの間の右境界結合部を表す１００ｂｐのヌクレオチド配列。この配列は、配列番号６の位置５４７０〜５５６９、および配列番号４（図１の［Ｄ］）の位置５１〜１５０に対応する。さらに、配列番号８は、配列番号５（図１の［Ｅ］）の位置１９６５〜２０１４に対応する。
【００３０】
配列番号９−ｐＭＯＮ８３１３２のＢＢＸ３２発現カセットのヌクレオチド配列。
【００３１】
配列番号１０−ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡ／対立遺伝子および野生型ＤＮＡ／対立遺伝子の両者を特定するための事象特異的接合状態エンドポイントＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲアッセイに使用する逆方向プライマー配列。配列番号１０は、配列番号６のヌクレオチド位置５５１７〜５５４６に対応する。プライマー配列番号１０および配列番号１１または１５の組み合わせを用いたＰＣＲアンプリコンの生成は、事象ＭＯＮ８７７１２の存在の陽性結果である。
【００３２】
配列番号１１−ＭＯＮ８７７１２事象およびＭＯＮ８７７１２事象の接合状態を特定するために使用する順方向プライマー配列。配列番号１１は、配列番号６のヌクレオチド位置５４３５〜５４５８に対応する。
【００３３】
配列番号１２−ＭＯＮ８７７１２事象およびＭＯＮ８７７１２事象の接合状態を特定するために使用するプローブ配列。配列番号１２は、６ＦＡＭ（商標）標識合成オリゴヌクレオチドである。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイにおいて、プライマー配列番号１０および配列番号１１または１５を６ＦＡＭ（商標）標識プローブと組み合わせて使用する増幅反応で蛍光シグナルが放出されることは、事象ＭＯＮ８７７１２に特徴的である。
【００３４】
配列番号１３−野生型ＤＮＡ／対立遺伝子を特定するための事象特異的接合状態エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲに使用する順方向プライマー配列。プライマー配列番号１３および配列番号１０を使用したＰＣＲアンプリコンの生成は、野生型ＤＮＡに特徴的である。
【００３５】
配列番号１４−ダイズ野生型ＤＮＡ／対立遺伝子の存在を決定するために使用するプローブ配列。配列番号１４は、ＶＩＣ（商標）標識合成オリゴヌクレオチドである。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイにおいて、プライマー配列番号１０および配列番号１３をＶＩＣ（商標）標識プローブと組み合わせて使用する増幅反応で蛍光シグナルが放出されることは、接合状態アッセイにおける野生型対立遺伝子に特徴的である。
【００３６】
配列番号１５−ＭＯＮ８７７１２事象およびＭＯＮ８７７１２事象の接合状態を特定するために使用する別の順方向プライマー配列。配列番号１５は、配列番号６のヌクレオチド位置５４３２〜５４５５に対応する。
【００３７】
配列番号１６−ＭＯＮ８７７１２事象を特定するために使用するプライマーＳＱ３９８３の配列。プライマーＳＱ３９８３およびＳＱ２２９８２（配列番号１７）の組み合わせを用いた９７ｂｐのＰＣＲアンプリコンの生成は、事象ＭＯＮ８７７１２の存在の陽性結果である。
【００３８】
配列番号１７−ＭＯＮ８７７１２事象を特定するために使用するプライマーＳＱ２２９８２の配列。
【００３９】
配列番号１８−ＭＯＮ８７７１２事象を特定するために使用するプローブＰＢ１０４５３の配列。これは６ＦＡＭ（商標）標識合成オリゴヌクレオチドである。
【００４０】
配列番号１９−エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで内部対照として使用するプライマーＳＱ１５３２の配列。
【００４１】
配列番号２０−エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで内部対照として使用するプライマーＳＱ１５３３の配列。
【００４２】
配列番号２１−エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで内部対照として使用するＶＩＣ（商標）標識合成オリゴヌクレオチドプローブＰＢ０３５９の配列。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下の定義および方法は、本発明をより明確に定義し、本発明の実施において当業者を指導するために提供される。特記しない限り、用語は、当業者による従来の用法に準じて理解すべきである。分子生物学における定義および一般用語は、Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４にも記載されている。
【００４４】
本発明は、トランスジェニックダイズ事象ＭＯＮ８７７１２を提供する。本明細書において使用する「事象」という用語は、植物のゲノムの染色体上の特定の位置にトランスジェニックＤＮＡを挿入した結果として生成されるＤＮＡ分子を指す。事象ＭＯＮ８７７１２は、本明細書において配列番号５として提示する配列を有するトランスジェニックＤＮＡをグリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）ゲノム中の特定の染色体位置に挿入した結果として生成されるＤＮＡ分子を指す。また、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物、種子、子孫、細胞、およびそれらの植物部分も本発明において提供される。ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に受入番号ＰＴＡ−１０２９６として、２００９年８月２０日に寄託されている。ＭＯＮ８７７１２を含む植物は収量の増加を示す。
【００４５】
本明細書において使用する「ダイズ」という用語は、グリシン・マックスを意味し、これには野生ダイズ種ならびに種間の交配を可能とするグリシン・ソヤ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｏｊａ）に属する植物を含む、大豆と交配することができる全ての植物品種が含まれる。
【００４６】
トランスジェニック「事象」は、異種ＤＮＡ、すなわち当該トランス遺伝子を含む核酸構築物によって植物細胞を形質転換し、植物のゲノムにトランス遺伝子を挿入することによって独立して形質転換されたトランスジェニック植物の集団を再生し、望ましい分子的特徴、例えば、特定のゲノム位置へのトランス遺伝子の単一コピーの挿入、トランスジェニックＤＮＡの完全性、および収量の増加などの改善された形質を有する特定の植物を選択することによって生成される。本事象を含む植物は、植物のゲノムの特定の位置に挿入されたトランス遺伝子を含む最初の形質転換体も指してよい。また、本事象を含む植物は、植物のゲノム中の同じ特定の位置にトランス遺伝子を保有する、最初の形質転換体の子孫も指してもよい。そのような子孫は、自殖、または形質転換体もしくはその子孫と別の植物との有性異系交配によって生成することができる。そのような別の植物は、同じまたは異なるトランス遺伝子を含むトランスジェニック植物であってもよく、または非トランスジェニック植物、例えば異なる品種のものであってもよい。得られる子孫は、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡ（挿入されたＤＮＡおよび隣接するＤＮＡ）に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であってよい。反復親への繰り返し戻し交配後でさえ、形質転換された親に由来する事象ＤＮＡは、その交配種の子孫の同じ遺伝子位置に存在する。
【００４７】
事象ＭＯＮ８７７１２を含むＤＮＡ分子とは、挿入されたトランスジェニックＤＮＡ（配列番号５として提供される）の少なくとも一部と、挿入されたＤＮＡと直接隣り合う隣接ゲノムＤＮＡの少なくとも一部とを含むＤＮＡ分子を指す。したがって、事象ＭＯＮ８７７１２を含むＤＮＡ分子は、トランスジェニックＤＮＡインサートの少なくとも一部と、トランスジェニックＤＮＡが挿入された植物のゲノムの特定の領域の少なくとも一部とに相当するヌクレオチド配列を有する。周囲の植物ゲノムと関連した事象ＭＯＮ８７７１２中の挿入されたＤＮＡの配列は、事象ＭＯＮ８７７１２に特有かつ固有であり、したがってそのようなＤＮＡのヌクレオチド配列は、事象ＭＯＮ８７７１２に特徴的であり、これを特定する。そのようなＤＮＡ分子の配列の例は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、および配列番号６として、本明細書において提供する。また、このようなＤＮＡ分子は、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物の染色体の必須部分であり、その植物の子孫に伝えることができる。
【００４８】
本明細書において使用する「組み換えＤＮＡ分子」という用語は、自然に一緒に存在しないであろうＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子であり、人の介入の結果であるが、これには例えば、互いに異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子の組み合わせからなるＤＮＡ分子、および／または人工的に合成された、自然界に通常存在するであろうポリヌクレオチド配列から逸脱するポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および／または宿主細胞のゲノムＤＮＡに人工的に取り込まれたトランス遺伝子とその宿主細胞のゲノムの関連する隣接ＤＮＡとを含むＤＮＡ分子がある。組み換えＤＮＡ分子の一例は、グリシン・マックスのゲノムにトランス遺伝子を挿入した結果生じる本明細書に記載されるＤＮＡ分子であり、これは最終的にその生物における組み換えＲＮＡおよび／またはタンパク質分子の発現をもたらすことができる。また、ヌクレオチド配列またはそれに由来する任意のフラグメントも、ＤＮＡ分子が、細胞、または組織、または植物もしくは種子もしくは植物組織のホモジネートから抽出できる場合、あるいは細胞、または組織、または植物もしくは種子もしくは植物組織のホモジネートから抽出したＤＮＡもしくはＲＮＡからアンプリコンとして生成できる場合（これらのいずれも事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物に由来する材料から得られる）、組み換えＤＮＡ分子とみなされるであろう。その点において、配列番号１、配列番号２、配列番号７、および配列番号８に記載した結合部配列、ならびにこれらの結合部配列を同様に含む事象ＭＯＮ８７７１２から得られたヌクレオチド配列は、これらの配列が事象ＭＯＮ８７７１２を含む細胞のゲノム中に存在しても、あるいは事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物から得られた組織、子孫、生物試料、または商品生産物中に検出可能な量で存在しても、組み換えＤＮＡであるとみなされる。本明細書において使用する「トランス遺伝子」という用語は、宿主細胞のゲノムに人工的に取り込まれたポリヌクレオチド分子を指す。そのようなトランス遺伝子は、宿主細胞に対して異種であってもよい。「トランスジェニック植物」という用語は、そのようなトランス遺伝子を含む植物を指す。「トランスジェニック植物」には、組み換えＤＮＡの安定な組み込みによってゲノムが変更された植物、植物部分、植物細胞、または種子が含まれる。トランスジェニック植物には、最初に形質転換された植物細胞から再生された植物、および形質転換植物の後世代または交配種からの子孫トランスジェニック植物が含まれる。そのようなゲノム変化の結果として、トランスジェニック植物は関連野生型植物と明確に異なる。トランスジェニック植物の一例は、事象ＭＯＮ８７７１２を含むとして本明細書に記載する植物である。
【００４９】
本明細書において使用する「異種の」という用語は、配列が現在認められる遺伝的背景において、所定の宿主ゲノム中に通常は存在しない配列を指す。この点において、配列は宿主ゲノム生来のものであってもよいが、宿主配列内の他の遺伝子配列に関して再配列してもよい。
【００５０】
本発明は、ＤＮＡ分子およびそれに対応するヌクレオチド配列を提供する。本明細書において使用する「ＤＮＡ配列」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指し、通常は５’（上流）末端から３’（下流）末端へと提示する。本明細書において使用する命名法は、連邦規則集（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）３７巻第１．８２２の条に規定されるものであり、ＷＩＰＯ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅｓ  １  ａｎｄ  ３の表に記載されている。本発明は、トランスジェニック事象ＭＯＮ８７７１２中に提供される２つのヌクレオチド配列鎖のうちの一方に関してのみ開示される。したがって、当分野で完全相補体または逆相補的配列とも称される相補的配列も暗示され、導き出されることにより、本発明の範囲に含まれ、したがって請求項に記載される対象の範囲に含まれるよう意図される。
【００５１】
挿入されたトランスジェニックＤＮＡの完全なヌクレオチド配列、および挿入されたトランスジェニックＤＮＡのいずれかの末端に隣接するグリシン・マックスゲノムＤＮＡの実質的なセグメントに対応するヌクレオチド配列が、本明細書において配列番号６として提供される。この小区分が、配列番号５として提供される挿入されたトランスジェニックＤＮＡである。挿入されたトランスジェニックＤＮＡの５’末端に隣接するゲノムＤＮＡ、および挿入されたＤＮＡの５’末端の一部のヌクレオチド配列が、本明細書において配列番号３として提供される。挿入されたトランスジェニックＤＮＡの３’末端に隣接するゲノムＤＮＡ、および挿入されたＤＮＡの３’末端の一部のヌクレオチド配列が、本明細書において配列番号４として提供される。トランスジェニックＤＮＡゲノムＤＮＡと連結および結合する位置にまたがる領域は、本明細書において結合部と称する。「結合部配列」または「結合部領域」は、挿入されたトランスジェニックＤＮＡと隣り合う隣接ゲノムＤＮＡとにまたがるＤＮＡ配列および／または対応するＤＮＡ分子を指す。事象ＭＯＮ８７７１２の結合部配列の例は、本明細書において配列番号１、配列番号２、配列番号７、および配列番号８として提供される。ダイズ植物または種子から得られたヌクレオチド分子におけるこれらの結合部配列のうちの１つの特定は、そのＤＮＡが事象ＭＯＮ８７７１２から取得されたことを確定し、またこれは事象ＭＯＮ８７７１２由来のＤＮＡの存在に特徴的である。配列番号１は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの５’末端との間の結合部にまたがる２２ｂｐのヌクレオチド配列である。配列番号７は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの５’末端との間の結合部にまたがる１００ｂｐのヌクレオチド配列である。配列番号２は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの３’末端との間の結合部にまたがる２２ｂｐのヌクレオチド配列である。配列番号８は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの３’末端との間の結合部にまたがる１００ｂｐのヌクレオチド配列である。配列番号１の連続するヌクレオチド、あるいは配列番号７の５１個の連続するヌクレオチド、５５個の連続するヌクレオチド、６０個の連続するヌクレオチド、６５個の連続するヌクレオチド、７０個の連続するヌクレオチド、７５個の連続するヌクレオチド、８０個の連続するヌクレオチド、８５個の連続するヌクレオチド、９０個の連続するヌクレオチド、９５個の連続するヌクレオチド、または全てのヌクレオチドを含む、トランスジェニック事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡのいかなるセグメントも本発明の範囲に含まれる。配列番号２の連続するヌクレオチド、あるいは配列番号８の５１個の連続するヌクレオチド、５５個の連続するヌクレオチド、６０個の連続するヌクレオチド、６５個の連続するヌクレオチド、７０個の連続するヌクレオチド、７５個の連続するヌクレオチド、８０個の連続するヌクレオチド、８５個の連続するヌクレオチド、９０個の連続するヌクレオチド、９５個の連続するヌクレオチド、または全てのヌクレオチドを含む、トランスジェニック事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡのいかなるセグメントも本発明の範囲に含まれる。さらに、本段落に記載する配列のいずれかに相補的な配列を含むいかなるポリヌクレオチド分子も本発明の範囲に含まれる。図１は、事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズのゲノム中のトランスジェニックＤＮＡインサート、および５’から３’に配列された配列番号１〜８の相対位置の図である。また、本発明は、配列番号６の全長と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子も提供する。
【００５２】
本発明は、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡの存在に特徴的であるプライマーまたはプローブのいずれかとして使用可能な例示的ＤＮＡ分子もさらに提供する。そのようなプライマーまたはプローブは、標的核酸配列に特異的であり、したがって本明細書に記載の本発明の方法による事象ＭＯＮ８７７１２核酸配列の特定に有用である。
【００５３】
「プローブ」は、検出可能な標識またはレポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、または酵素が結合した、単離された核酸である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本発明については、事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ由来（本事象由来のＤＮＡを含むダイズ植物由来であっても試料由来であっても）のゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、そのような結合の検出を用いて特定の試料中のその標的ＤＮＡ配列の存在を特定／決定／確認することが可能なポリアミドまたは他のプローブ材料も含む。
【００５４】
「プライマー」は、典型的には、相補的標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖とのハイブリッドを形成し、次いでポリメラーゼ、例えＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長させるための特定のアニーリングまたはハイブリダイゼーション方法において使用するために設計された、単離されたポリヌクレオチドである。プライマー対を鋳型ＤＮＡ、例えばグリシン・マックスゲノムＤＮＡの試料とともに、熱増幅もしくは等温増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または他の核酸増幅方法で用いて、アンプリコンを生成してもよく、そのような反応から生成されるアンプリコンは、プライマーが鋳型にハイブリダイズした２つの部位の間に位置する鋳型ＤＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有するであろう。本明細書において使用する「アンプリコン」とは、増幅手法を用いて合成されたＤＮＡの断片またはフラグメント、すなわち増幅反応の産物である。本発明の一実施形態において、事象ＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコンは、グリシン・マックスゲノム中に自然には見られない配列を含む。プライマー対とは、本発明において使用するとき、典型的には熱増幅もしくは等温増幅反応、または他の核酸増幅方法において、プライマー対の個々のメンバーに結合の標的とされる位置間のポリヌクレオチドセグメントを線形に増幅するために、二本鎖ヌクレオチドセグメントのそれぞれの鎖を結合する２つのプライマーの使用を指すことが意図される。プライマーとして有用な例示的ＤＮＡ分子は、配列番号１０〜１１、配列番号１３、および配列番号１５として提供される。配列番号１０および配列番号１１または１５として提供されるプライマー対は、第１のＤＮＡ分子および第１のＤＮＡ分子と異なる第２のＤＮＡ分子として使用してもよく、両分子は、それぞれＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さの配列番号４、配列番号５、または配列番号６、あるいはそれらの相補体の連続するヌクレオチドを有し、それにより事象ＭＯＮ８７７１２で得られた鋳型ＤＮＡと一緒に増幅反応に使用した場合に、トランスジェニック事象ＭＯＮ８７７１２に特有かつ固有のアンプリコンが生成されるであろう。「アンプリコン」という用語の使用は、ＤＮＡ増幅反応において形成され得るプライマーダイマーを明確に除外する。
【００５５】
本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列に対して完全な配列同一性を有してもよいが、標的配列に選択的にハイブリダイズする能力を保持する標的配列と異なるプライマーおよびプローブを従来の方法によって設計してもよい。核酸分子がプライマーまたはプローブの役割を果たすためには、使用する特定の溶媒および塩の濃度で安定な二本鎖構造体を形成することができるように、配列が十分に相補的であることのみが必要とされる。いかなる核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いて、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２由来のトランスジェニックＤＮＡの存在を特定してもよい。プローブおよびプライマーは、一般に少なくとも約１１ヌクレオチド長、少なくとも約１８ヌクレオチド長、少なくとも約２４ヌクレオチド長、および少なくとも約３０ヌクレオチド長、またはそれ以上の長さである。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列に特異的にハイブリダイズする。
【００５６】
プローブおよびプライマーを準備および使用するための方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９」とする）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的に改定される）（以下、「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２」とする）、およびＩｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載されている。ＰＣＲ−プライマー対は、例えば、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．５，（Ｃ）１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて、既知の配列から得ることができる。
【００５７】
隣接ＤＮＡおよび本明細書において開示されるインサート配列に基づくプライマーおよびプローブは、既知の方法によって、例えばそのような配列を再クローニングおよび配列決定することによって、この開示される配列を確認するために使用することができる。
【００５８】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。いかなる核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いて、試料中のトランスジェニック事象由来のＤＮＡの存在を特定してもよい。核酸分子またはそのフラグメントは、特定の状況下で、他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書において使用するとき、２つの核酸分子は、それら２つの分子が逆平行二本鎖核酸構造体を形成できれば、互いに特異的にハイブリダイズできるとされる。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、その「相補体」であるとされる。本明細書において使用するとき、分子は、その分子のうちの一方のあらゆるヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的であるとき、「完全な相補性」を示すとされる。２つの分子は、少なくとも「低ストリンジェンシー」条件下でこれらが互いにアニールされた状態を維持するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合に、「最小限に相補的」であるとされる。同様に、分子は、「高ストリンジェンシー」条件下でこれらが互いにアニールされた状態を維持するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合に、「相補的」であるとされる。ストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、およびＨａｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）に記載されている。したがって、完全な相補性からの逸脱は、そのような逸脱が二本鎖構造体を形成する分子の能力を完全に排除しない限り許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブの役割を果たすためには、使用する特定の溶媒および塩の濃度で安定な二本鎖構造体を形成することができるように、配列が十分に相補的であることのみが必要とされる。
【００５９】
本明細書において使用するとき、実質的に相同な配列とは、高ストリンジェンシー条件下で比較される核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）後の５０℃で２．０×ＳＳＣ洗浄は、当業者に既知であり、あるいはこれはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでで選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温の低ストリンジェンシー条件、約２２℃から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件へと増加させることができる。温度および塩の両方を変更してもよく、あるいは温度または塩濃度のいずれか一方を一定に保ち、他方の変数を変化させてもよい。一実施形態において、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号７、および配列番号８に記載した核酸分子、またはそれらの相補体もしくはフラグメントの１つまたは複数に特異的にハイブリダイズする。標的ＤＮＡ分子に対するプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に既知の多数の方法のいずれを用いて検出してもよい。これには、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグ、および化学発光タグを含み得るが、これらに限定されない。
【００６０】
特定の増幅プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェント条件」は、ＤＮＡ増幅反応において、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーが結合するであろう標的核酸配列のみにハイブリダイズし、好ましくは固有の増幅産物であるアンプリコンを生成するのを可能にする条件である。ＤＮＡ増幅方法の例には、ＰＣＲ、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（例えば、米国特許第Ｎｏ．７，４８５，４２８号を参照）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４５５，１６６号および第５，４７０，７２３号を参照）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０）を参照）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４６４１−４６４５（１９９５）、Ｌｕｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４（１９９６）、Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２２５−２３２（１９９８）、米国特許第５，７１４，３２０号および第６，２３５，５０２号）を参照）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５（８）：７９５−８００（２００４）；米国特許第７，２８２，３２８号を参照）、および多置換増幅（ＭＤＡ）（例えば、Ｄｅａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：５２６１−５２６６（２００２）を参照）がある。
【００６１】
「（標的配列）に特異的な」という用語は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列のみとハイブリダイズすることを示す。
【００６２】
本明細書において使用する「単離された」という用語は、分子をその分子がその天然または自然状態で通常は会合している他の分子から少なくとも部分的に分離することを指す。一実施形態において、「単離された」という用語は、その天然または自然状態でＤＮＡ分子と通常は隣接する核酸から少なくとも部分的に分離されたＤＮＡ分子を指す。したがって、例えば組み換え手法の結果として、通常は会合していない調節配列またはコード配列と融合したＤＮＡ分子は、本明細書において単離されたものとみなされる。このような分子は、宿主細胞の染色体に組み込まれている場合、あるいは他のＤＮＡ分子を含む核酸溶液中に存在する場合にも、単離されたものとみなされる。
【００６３】
当業者に既知の多数の方法のいずれを用いて、本発明において開示されるＤＮＡ分子またはそのフラグメントを単離および操作してもよい。例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術は、特定の出発ＤＮＡ分子を増幅するため、および／または元の分子の変異体を生成するために使用可能である。また、ＤＮＡ分子、またはそのフラグメントは、他の手法を用いて、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて一般に実施されているように、化学的手法によってフラグメントを直接合成することによって取得することもできる。
【００６４】
有性交配種の子孫が当該トランス遺伝子／ゲノムＤＮＡを含むかどうかを決定するために、特定の植物のトランス遺伝子／ゲノムＤＮＡの存在を検出することができることは有利であろう。さらに、特定の植物を検出するための方法は、トランスジェニック作物植物に由来する食品の市販前承認およびラベル表示を要求する規制に従う際に有用であろう。
【００６５】
トランス遺伝子の存在は、核酸プローブを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションなど、いかなる周知の核酸検出方法によって検出してもよい。このような検出方法は、一般に、頻繁に使用される遺伝要素、例えばプロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などに重点を置いている。結果として、そのような方法は、異なる形質転換事象、特に同じＤＮＡ構築物を用いて生成されたものを区別するためには、挿入されたＤＮＡと隣り合う染色体ＤＮＡ（「隣接ＤＮＡ」）の配列が既知でない限り、有用ではないかもしれない。事象特異的ＰＣＲアッセイは、例えば、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５３：３０４１−３０５２，２００５）によって考察され、この中でトランスジェニックトウモロコシ系統Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６、およびＧＡ２１、ならびにキャノーラ事象ＧＴ７３に対する事象特異的追跡系が示されている。この研究において、事象特異的プライマーおよびプローブは、各事象について、ゲノム／トランス遺伝子結合部の配列に基づいて設計される。また、トランスジェニック植物事象特異的ＤＮＡ検出方法は、米国特許第６，８９３，８２６号、第６，８２５，４００号、第６，７４０，４８８号、第６，７３３，９７４号、第６，６８９，８８０号、第６，９００，０１４号、および第６，８１８，８０７号にも記載されている。
【００６６】
したがって、本明細書において提供されるＤＮＡ分子および対応するヌクレオチド配列は、とりわけ、事象ＭＯＮ８７７１２を特定し、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物の変種またはハイブリッドを選択し、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡの存在を検出し、事象ＭＯＮ８７７１２または事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物および植物部分の存在および／または不在について試料をモニターするために有用である。
【００６７】
本発明は、植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分（花粉、胚珠、莢、花、根または茎の組織、繊維、および葉）、および商品生産物を提供する。このような植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分、および商品生産物は、検出可能な量の本発明のポリヌクレオチド、すなわち配列番号１の連続するヌクレオチド、配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドとして提供される配列のうちの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドなどを含む。また、本発明の植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分、および商品生産物は、１つまたは複数の付加トランス遺伝子も含んでよい。そのようなトランス遺伝子は、虫害抵抗性の向上、水利用効率または乾燥耐性の向上、収量性の向上、窒素利用効率の向上または高いもしくは低い窒素供給量などの窒素ストレスに対する耐性の向上、種子品質の向上、病害抵抗性の向上、栄養品質の改善、および／または除草剤耐性、例えばグリホサートもしくはジカンバ耐性の向上を含むがこれらに限定されない望ましい形質を付与するタンパク質またはＲＮＡ分子をコードするいかなるヌクレオチド配列であってもよく、このとき望ましい形質は、そのような付加トランス遺伝子を含まない相当する植物に対して比較される。
【００６８】
本発明は、事象ＭＯＮ８７７１２を含むトランスジェニック植物から得られた植物、子孫、種子、植物細胞、および植物部分、例えば花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織、および葉を提供する。事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の代表試料は、本発明に権利を付与する目的で、ブダペスト条約に従って寄託されている。寄託先に選択したレポジトリーは、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）であり、その所在地は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＵＳＡ，Ｚｉｐ  Ｃｏｄｅ  ２０１１０である。ＡＴＣＣレポジトリーは、事象ＭＯＮ８７７１２含有種子に、受入番号ＰＴＡ−１０２９６を指定した。
【００６９】
本発明は、そのゲノム中に存在する、配列番号１の連続するヌクレオチド、配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む微生物を提供する。そのような微生物の例は、トランスジェニック植物細胞である。本発明の植物細胞などの微生物は、多くの産業用途において有用であり、これには、（ｉ）科学研究または産業調査のためのリサーチツールとしての使用、（ｉｉ）その後の科学調査に、または工業製品として使用可能な、内因性もしくは組み換え炭水化物、脂質、核酸、酵素、またはタンパク質産物、あるいは小分子を製造するための培養における使用、（ｉｉｉ）のちに農業研究および生成に使用可能なトランスジェニック植物または植物組織培養物を生成するための現代の植物組織培養手法での使用が含まれるが、これらに限定されない。トランスジェニック植物細胞などの微生物の製造および使用は、現代の微生物学的手法および人の介入を利用して、人工の固有の微生物を製造する。この過程において、組み換えＤＮＡを植物細胞のゲノムに挿入して、天然の植物細胞と異なる固有のトランスジェニック植物細胞を作成する。このトランスジェニック植物細胞は、次いで、現代の微生物学手法を用いて、細菌および酵母細胞と同じように培養することができ、未分化の単細胞状態で存在してもよい。この新しい植物細胞の遺伝子組成および表現型は、細胞のゲノムに異種ＤＮＡを組み込むことによって生じる技術的効果である。本発明の別の態様は、本発明の微生物を使用する方法である。トランスジェニック植物細胞などの本発明の微生物を使用する方法には、（ｉ）細胞のゲノムに組み換えＤＮＡを組み込むことによってトランスジェニック細胞を製造し、次いでこの細胞を使用して同じ異種ＤＮＡを有するさらなる細胞を得る方法、（ｉｉ）現代の微生物学手法を用いて、組み換えＤＮＡを含む細胞を培養する方法、（ｉｉｉ）培養細胞から、内因性もしくは組み換え炭水化物、脂質、核酸、酵素、またはタンパク質産物を製造および精製する方法、並びに（ｉｖ）現代の植物組織培養手法をトランスジェニック植物細胞に用いて、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物組織培養物を製造する方法が含まれる。
【００７０】
本明細書において使用する「子孫」とは、祖先植物から得た事象ＤＮＡおよび／または配列番号１の連続するヌクレオチド、配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、もしくは配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドとして提供される、少なくとも１つの連鎖を有するポリヌクレオチドを含むあらゆる植物、種子、植物細胞、および／または再生可能な植物部分を含む。植物、子孫、および種子は、トランス遺伝子に対して、ホモ接合性またはヘテロ接合性であってよい。子孫は、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物によって生成された種子から、および／または事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物の花粉で受精させた植物によって生成された種子から栽培してもよい。
【００７１】
子孫植物を自家受粉（「自殖」としても知られる）して、植物の真の育種系統、すなわちトランス遺伝子に対してホモ接合性の植物を作り出すこともできる。あるいは、子孫植物を異系交配して（例えば、別の植物と交配して）、変種もしくはハイブリッドの種子または植物を生成してもよい。他の植物は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであってよい。したがって、本発明の変種もしくはハイブリッドの種子または植物は、事象ＭＯＮ８７７１２の特有かつ固有のＤＮＡを含まない第１の親と、事象ＭＯＮ８７７１２を含む第２の親とを交配することにより、事象ＭＯＮ８７７１２の特有かつ固有のＤＮＡを含むハイブリッドを生じることによって得ることができる。各親は、交配または品種改良が本発明の植物または種子、すなわち事象ＭＯＮ８７７１２の特有かつ固有のＤＮＡおよび／または配列番号１もしくは配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１つの対立遺伝子を有する種子をもたらす限り、ハイブリッドまたは同系／変種であってよい。したがって、２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、２つの別々に分離する付加外来遺伝子を含むハイブリッドの子孫を生成してもよい。例えば、増加した収量を有する事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物を別のトランスジェニック植物、例えばグリホサートに対して耐性を有するものと交配して、両方のトランスジェニック親の特徴を有する植物を生成することができる。適切な子孫の自殖により、両方の追加外来遺伝子に対してホモ接合性の植物を生成することができる。また、親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との異系交配、また栄養繁殖も想定される。様々な形質および作物に一般に使用される他の品種改良法の説明は、いくつかの文献のうちの１つに記載されており、これには例えば、Ｆｅｈｒ，ｉｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ（１９８７）がある。１つの植物と別の植物との有性交配、すなわち他花受粉は、人の介入によって達成または促進することができるが、これは例えば：人の手で１つの植物の花粉を採取して、この花粉を第２の植物の花柱もしくは柱頭に接触させることによって；人の手および／または人の行為により、植物の雄しべもしくは葯を除去、破壊、または被覆して（例えば、手作業による介入によって、または化学的除雄剤の適用によって）、自然自家受粉を防止して、受精を行うためには他花受粉を行わなければならないようにすることによって；人が、花粉媒介昆虫を「計画受粉」のための位置に配置することによって（例えば、果樹園もしくは畑にミツバチの巣箱を配置することによって、または植物を花粉媒介昆虫と一緒にケージに入れることによって）；人が、花柱もしくは柱頭に外来花粉を配置または接触させられるように、花の部分を開放または除去することによって；植物の選択的配置によって（例えば、意図的に植物を受粉距離内に植える）；および／または化学物���を適用して、開花を促進するか、または（花粉に対する柱頭の）感受性を助長することによって行われる。
【００７２】
この方法の実施において、１つの植物をそれ自体と有性交配する、すなわち自家受粉または自殖するステップは、人の介入によって達成または促進することができるが、これは例えば：人の手で植物の花粉を採取して、この花粉を同じ植物の花柱もしくは柱頭に接触させ、場合によってはその後その植物のさらなる受精を防止することによって；人の手および／または人の行為により、他の付近の植物の雄しべもしくは葯を除去、破壊、または被覆して（例えば、雄穂除去によって、または化学的除雄剤の適用によって）、自然他花受粉を防止して、受精を行うためには自家受粉を行わなければならないようにすることによって；人が、花粉媒介昆虫を「計画受粉」のための位置に配置することによって（例えば、１つの植物のみを花粉媒介昆虫と一緒にケージに入れることによって）；自家受粉を可能にするように花またはその部分を人が操作することによって；植物の選択的配置によって（例えば、意図的に植物を受粉距離外に植える）；および／または化学物質を適用して、開花を促進するか、または（花粉に対する柱頭の）感受性を助長することによって行われる。
【００７３】
本発明は、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物から得られた植物部分を提供する。本明細書において使用するとき、「植物部分」とは、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物から得られた材料から構成される、植物のあらゆる部分を指す。植物部分には、細胞、花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織、繊維、および葉が含まれるが、これらに限定されない。植物部分は、生存可能、生存不能、再生可能、および／または再生不能であってよい。
【００７４】
本発明は、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物から得られた商品生産物を提供する。本明細書において使用するとき、「商品生産物」とは、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物、種子、植物細胞、または植物部分から得られた材料から構成される、組成物または生産物を指す。商品生産物は、消費者に販売されてもよく、また生存可能または生存不能であってよい。生存不能な商品生産物には、育成不能の種子および穀粒、加工された種子、種子部分および植物部分、脱水した植物組織、凍結した植物組織および加工された植物組織、陸生動物および／または水生動物が摂取するために加工された種子および植物部分の動物用飼料、油、粗粉、粉、フレーク、ふすま、繊維、およびヒトが摂取するための他のあらゆる食品、ならびにバイオマスおよび燃料製品が含まれるが、これらに限定されない。加工ダイズは、世界中でタンパク飼料および植物油の最大の原料である。ＭＯＮ８７７１２を含む植物由来のダイズおよびダイズ油は、多くの異なる生産物の製造に使用することができ、これには非毒性プラスチック、印刷用インク、潤滑剤、ワックス、油圧油、変圧器油、溶媒、化粧品、および頭髪用製品があるが、これらに限定されない。ＭＯＮ８７７１２を含む植物のダイズおよび油は、全ダイズから作製されたダイズ食品、例えば、豆乳、ダイズバター、納豆、およびテンペ、ならびに加工ダイズおよびダイズ油から作製されたダイズ食品、例えば、ダイズ粗粉、ダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質単離物、質感を与えたダイズタンパク質濃縮物、加水分解ダイズタンパク質、ホイップクリーム、料理用油、サラダ油、ショートニング、およびレシチンにおける使用に好適となり得る。また、全ダイズは食用に適し、通常は生で、炒って、または枝豆として、消費者に販売される。通常は全ダイズを浸漬し、粉砕することによって製造される豆乳は、他の加工をせずに、噴霧乾燥して、またはダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、もしくは湯葉を作製するために加工して摂取してもよい。生存可能な商品生産物には種子および植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。したがって、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物を用いて、ダイズ植物から通常得られるいかなる商品生産物を製造してもよい。事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物から得られるそのようないかなる商品生産物も少なくとも検出可能な量の事象ＭＯＮ８７７１２に対応する特有かつ固有のＤＮＡを含んでよく、また具体的には、配列番号１の連続するヌクレオチド、配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する検出可能な量のポリヌクレオチドを含んでもよい。本明細書において開示される検出方法を含む、ポリヌクレオチド分子を検出するためのいかなる標準的方法を用いてもよい。商品生産物は、任意の検出可能な量の配列番号１の連続するヌクレオチド、配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドがその商品生産物中に存在する場合、本発明の範囲に含まれる。
【００７５】
したがって、本発明の植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分（花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織、および葉など）、および商品生産物は、とりわけ、農業目的の事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子および／または植物部分を生成するための植物の栽培、植物の品種改良および研究用途での事象ＭＯＮ８７７１２を含む子孫の生成、産業および研究用途での微生物学的手法による使用、ならびに消費者への販売に有用である。
【００７６】
本発明は、増加した収量を有する植物および事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物を生成する方法を提供する。事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物は、構築物ｐＭＯＮ８３１３２（表１）を含む同系ダイズ系統を用いて、米国特許第５，９１４，４５１号に記載されている方法と類似する、アグロバクテリウム媒介形質転換方法によって生成した。構築物ｐＭＯＮ８３１３２は、ダイズ植物細胞におけるＢＢＸ３２タンパク質の発現のための植物発現カセットを含む。トランスジェニックダイズ細胞無傷ダイズ植物に再生し、独立して形質転換したトランスジェニック植物の集団から、望ましい分子的特徴、例えば、単一遺伝子座におけるトランス遺伝子カセットの単一コピー、トランス遺伝子カセットの完全性、構築物骨格配列の不在、結合していないグリホサート抵抗性選択カセットの不在を示す個々の植物を選択した。さらに、逆ＰＣＲおよびＤＮＡ配列分析を実施して、５’および３’のインサートと植物ゲノムとの結合部を決定して、インサート中の要素の構成を確認し（図１）、ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２中のインサート（配列番号５）の完全なＤＮＡ配列を決定した。さらに、実地条件での収量増加について、トランスジェニック植物をスクリーニングし、選択した。そのゲノム中にｐＭＯＮ８３１３２のＢＢＸ３２発現カセットを含むダイズ植物は、本発明の態様である。
【００７７】
本発明のトランスジェニック植物の収量の増加は、試験重量、１植物当たりの種子数、種子重量、単位エリア当たりの種子数（すなわち、１エーカー当たりの種子または種子の重量）、１エーカー当たりのブッシェル数、１エーカー当たりのトン数、またはヘクタール当たりのキロ数を含む多数の方法で測定することができる。事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物におけるＢＢＸ３２タンパク質の発現は、成長および繁殖発生能力の向上によってもたらされる収量の増加につながる。収量の増加は、１区画当たりのより多い種子、より大きい種子、１植物当たりのより多くの種子、および／または１区画当たりのより多くの植物を含む収量パラメータのうちの１つまたは複数において、成長の分配からもたらされる。本発明で使用する組み換えＤＮＡは、同じ遺伝的背景を有する非トランスジェニックダイズと比較したときの供給源化合物の増加によって収量の増加をもたらす。これらの生化学的変化および代謝性変化は、ＢＢＸ３２の活性の影響を受け、炭素代謝および窒素代謝を含む、日周性に調節される経路と関連している。
【００７８】
トランスジェニック事象ＭＯＮ８７７１２を含む増加した収量を有する植物を生成するための方法が提供される。これらの方法において使用されるトランスジェニック植物は、トランス遺伝子に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であってよい。これらの方法によって生成される子孫植物は、変種またはハイブリッドの植物であってよく、植物から生成された種子および／または事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物の花粉で受精させた植物によって生成された事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子から栽培してもよく、またトランス遺伝子に対して、ホモ接合性またはヘテロ接合性であってよい。子孫植物を続いて自家受粉して、植物の真の育種系統、すなわちトランス遺伝子に対してホモ接合性の植物を作り出してもよく、あるいは異系交配して、例えば別の非関連植物と交配して、変種もしくはハイブリッドの種子または植物を生成してもよい。本明細書において使用するとき、「接合状態」という用語は、植物中の特定の染色体位置（遺伝子座）におけるＤＮＡの類似性を指す。本発明において、ＤＮＡは、具体的には、結合部配列（事象ＤＮＡ）の他に、トランス遺伝子インサートを指す。結合部配列を含むトランス遺伝子インサートが、染色体対のそれぞれの染色体上の同じ位置に存在する場合（２つの対立遺伝子）、植物はホモ接合性である。結合部配列を含むトランス遺伝子インサートが、染色体対の１つの染色体上のみに存在する場合（１つの対立遺伝子）、植物はヘテロ接合性とみなされる。野生型植物は、事象ＤＮＡに対してヌルである。
【００７９】
増加した収量を有する植物は、配列番号１の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、および／または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含む事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物を別の植物と交配し、それによって種子を生成し、それを子孫植物に栽培することによって生成することができる。このような子孫植物は、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを含む子孫植物または増加した収量を有する子孫植物を選択するための特定法を用いて分析することができる。使用する他の植物は、トランスジェニックであっても、トランスジェニックでなくてもよい。生成される子孫植物および／または種子は、変種またはハイブリッドの種子であってよい。
【００８０】
増加した収量を有する植物は、配列番号１の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含む事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物を自殖し、それによって種子を生成し、それを子孫植物に栽培することによって生成することができる。このような子孫植物は、次いで事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを含む子孫植物を選択するための特定法を用いて分析することができる。
【００８１】
これらの方法に包含され、これらの方法を用いて生成される子孫植物および種子は他の植物とは異なるが、これは例えばこれらの子孫植物および種子が組み換えであり、したがって人の介入によって作成され、本発明のトランスジェニックＤＮＡからなる少なくとも１つの対立遺伝子を含み、および／または配列番号１の連続するヌクレオチド、配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、および配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドからなる群から選択される、検出可能な量のポリヌクレオチド配列を含むためである。種子は個々の子孫植物から選択することができ、種子が配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、および／または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含む限り、これは本発明の範囲に含まれる。
【００８２】
本発明の植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分（花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織、および葉など）、および商品生産物は、ＤＮＡ組成、遺伝子発現、および／またはタンパク質発現について評価することができる。そのような評価は、様々な方法、例えばＰＣＲ、配列決定、ノーザンブロット法、サザン分析、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、およびＥＬＩＳＡを用いて、あるいは本明細書において提供される検出方法および／または検出キットを用いて行ってもよい。
【００８３】
試料中の事象ＭＯＮ８７７１２に特異的な組成物の存在を検出する方法が提供される。１つの方法は、事象ＭＯＮ８７７１２を含む細胞、組織、種子、植物、または植物部分に特異的な、またはそれらから得られたＤＮＡの存在を検出することからなる。本方法は、増幅に適した条件に供したときに事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡからアンプリコン、特に配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、および／または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体を含むアンプリコンを生成することが可能なプライマー対と接触させるための鋳型ＤＮＡ試料を提供する。このアンプリコンは、事象ＭＯＮ８７７１２から得られた鋳型ＤＮＡ分子から、この鋳型ＤＮＡ分子が配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、および／または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドの特有かつ固有のヌクレオチド配列を取り込む限り生成される。アンプリコンは、そのアンプリコンの生成に使用するために選択されたポリメラーゼに応じて、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。そのようなあらゆる増幅反応で生成されたアンプリコン分子を検出し、そのアンプリコンの配列中の配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、および／または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体に対応するヌクレオチドの存在を確認するための方法が提供される。アンプリコン中の配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、および／または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体に対応するヌクレオチドの検出は、事象ＭＯＮ８７７１２特異的ＤＮＡの存在、ひいては試料中に事象ＭＯＮ８７７１２を含む生物材料に決定的および／または特徴的である。
【００８４】
植物または植物組織から得られた材料からなる試料中の配列番号３または配列番号４に対応するＤＮＡ分子の存在を検出するための別の方法が提供される。本方法は、（ｉ）植物または異なる植物の群からＤＮＡ試料を取得することと、（ｉｉ）配列番号１または配列番号２のいずれかに記載されるヌクレオチドを含むＤＮＡプローブ分子に、そのＤＮＡ試料を接触させることと、（ｉｉｉ）プローブとＤＮＡ試料とをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせることと、その後（ｉｖ）プローブと標的ＤＮＡ試料との間のハイブリダイゼーション事象を検出することとからなる。このハイブリッド組成物の検出は、場合によってはＤＮＡ試料中の、配列番号３または配列番号４の存在に特徴的である。あるいはハイブリダイゼーションの不在は、適切な陽性対照が同時に試験されている場合、試料中のトランスジェニック事象の不在に特徴的である。あるいは、特定の植物が、配列番号１または配列番号２に対応する配列のいずれかまたは両方、あるいはそれらの相補体を決定することは、その植物が、事象ＭＯＮ８７７１２に対応する少なくとも１つの対立遺伝子を含むことを決定する。
【００８５】
したがって、核酸プローブを用いて、任意の周知の核酸増幅および検出方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、またはＤＮＡハイブリダイゼーションによって、本発明の核酸分子の存在を検出することが可能である。事象特異的ＰＣＲアッセイは、例えば、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５３：３０４１−３０５２，２００５）によって考察され、この中でトランスジェニックトウモロコシ系統Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６、およびＧＡ２１、ならびにトランスジェニック事象ＲＴ７３に対する事象特異的追跡系が示されている。この研究において、事象特異的プライマーおよびプローブは、各事象について、ゲノム／トランス遺伝子結合部の配列に基づいて設計されている。また、トランスジェニック植物事象特異的ＤＮＡ検出方法は、米国特許第６，８９３，８２６号、第６，８２５，４００号、第６，７４０，４８８号、第６，７３３，９７４号、第６，６８９，８８０号、第６，９００，０１４号、および第６，８１８，８０７号にも記載されている。
【００８６】
ＤＮＡ検出キットが提供される。１つのタイプのキットは、試料中のトランスジェニック事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡの存在の検出に特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号３、配列番号５、または配列番号６の連続ヌクレオチドを有する少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。このキットで検出されるＤＮＡ分子は、配列番号１に記載される配列の連続ヌクレオチドまたは配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含む。あるいは、キットは、試料中のトランスジェニック事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡの存在の検出に特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号４、配列番号５、または配列番号６の連続ヌクレオチドを有する少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでもよい。このキットで検出されるＤＮＡ分子は、配列番号２に記載される配列の連続ヌクレオチドまたは配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含む。
【００８７】
別のキットは、標的ＤＮＡ試料を上述のようなプライマー対と接触させ、次いで配列番号１、配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドを含むアンプリコンを生成するのに十分な核酸増幅反応を実施する方法を利用する。アンプリコンの検出、およびそのアンプリコン配列中の配列番号１、配列番号２の連続するヌクレオチド、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体の存在の決定は、ＤＮＡ試料中の事象ＭＯＮ８７７１２特異的ＤＮＡの存在に特徴的である。
【００８８】
試料中の事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡに特有かつ固有のＤＮＡの存在、またはさらには不在を決定、検出、または特定するのに有用な、ＤＮＡプローブとしての使用に十分なＤＮＡ分子が提供される。このＤＮＡ分子は、配列番号１の連続するヌクレオチド、またはその相補体、配列番号２の連続するヌクレオチド、またはその相補体、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、またはその相補体、配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。
【００８９】
核酸増幅は、熱増幅および等温増幅方法を含む当分野で既知の様々な核酸増幅方法のいずれによって達成してもよい。事象ＭＯＮ８７７１２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２９６として寄託された事象ＭＯＮ８７７１２を含む代表種子試料）由来の異種ＤＮＡインサートの配列、結合部配列、または隣接配列は、本明細書において提供する配列から得られたプライマーを用いて、本事象由来のかかる配列を増幅し、その後アンプリコンまたはクローン化ＤＮＡの標準的ＤＮＡ配列決定を行うことによって検証することができる。
【００９０】
このような方法で生成されたアンプリコンは、複数の手法によって検出することができる。そのような方法の１つは、遺伝子ビット分析（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４１６７−４１７５，１９９４）であり、この方法では隣り合う隣接ゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ配列の両方と重複するＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドをマイクロウェルプレートのウェル中で固定化する。当該領域の熱増幅（挿入配列中に１つのプライマー、隣り合う隣接ゲノム配列中に１つのプライマーを使用）後、一本鎖アンプリコンは固定化したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを用いた単一塩基伸長反応のための鋳型として機能することができる。読み出しは、蛍光性またはＥＬＩＳＡに基づいてもよい。蛍光シグナルまたは他のシグナルの検出は、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長の成功によるインサート／隣接配列の存在を示す。
【００９１】
別の方法は、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｅｃｈ．００：１８−２４，２０００）に記載されているようなピロシーケンス法である。この方法では、隣り合うゲノムＤＮＡとインサートＤＮＡとの結合部と重複するオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドを当該領域由来の一本鎖アンプリコン（挿入配列中に１つのプライマー、隣接ゲノム配列中に１つのプライマー）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸、およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄｄＮＴＰを個々に添加すると、取り込みが光シグナルを生じるので、これを測定する。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長または多塩基伸長の成功によるトランス遺伝子インサート／隣接配列の存在を示す。
【００９２】
Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．９：４９２−４９８，１９９９）により記載されているような蛍光偏光法は、アンプリコンを検出ために使用可能な方法である。この方法を用いて、ゲノムの隣接ＤＮＡと挿入ＤＮＡとの結合部と重複するオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドを当該領域由来の一本鎖アンプリコン（挿入ＤＮＡ中に１つのプライマー、隣接ゲノムＤＮＡ配列中に１つのプライマー）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。単一塩基伸長は、ｄｄＮＴＰの取り込みをもたらす。取り込みは、蛍光光度計を用いて、偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長の成功によるトランス遺伝子インサート／隣接配列の存在を示す。
【００９３】
また、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、製造業者により提供される説明書を用いて、ＤＮＡ配列の存在を検出および／または定量化してもよい。簡潔に述べると、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、ゲノムの隣接ＤＮＡと挿入ＤＮＡとの結合部と重複するよう設計される。熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、ＦＲＥＴプローブおよび増幅プライマー（インサートＤＮＡ配列中に１つのプライマー、隣接ゲノム配列中に１つのプライマー）のサイクルを実施する。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、ＦＲＥＴプローブ上の消光部分から蛍光部分が切断され、遠くに放たれる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功による、隣接／トランス遺伝子インサート配列の存在を示す。
【００９４】
分子指標は、Ｔｙａｎｇｉ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，１９９６）に記載されているように、配列検出における使用について記載されている。。簡潔に述べると、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、隣接ゲノムＤＮＡとインサートＤＮＡとの結合部と重複するように設計されている。ＦＲＥＴプローブの固有の構造は、それに含まれる二次構造をもたらし、これは蛍光部分と消光部分との近接を維持する。熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、ＦＲＥＴプローブおよび増幅プライマー（インサートＤＮＡ配列中に１つのプライマー、隣接ゲノム配列中に１つのプライマー）のサイクルを実施した。増幅の成功後、ＦＲＥＴプローブの標的配列とのハイブリダイゼーションにより、プローブの二次構造の除去、および蛍光部分と消光部分との立体的隔離がもたらされ、これは蛍光シグナルの生成につながる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功による、隣接／トランス遺伝子インサート配列の存在を示す。
【００９５】
記載されている他の方法、例えばマイクロフルイディクス（米国特許公開第２００６０６８３９８号、米国特許第６，５４４，７３４号）などは、ＤＮＡ試料を分離および増幅するための方法および装置を提供する。光学色素は、特定のＤＮＡ分子を検出および測定するために使用される（ＷＯ／０５０１７１８１号）。ナノチューブ素子は、ＤＮＡ分子または特定のＤＮＡ分子への結合後に検出可能なナノビーズを検出するための電子センサを含む（ＷＯ／０６０２４０２３号）。
【００９６】
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に記載される組成物およびＤＮＡ検出の分野で周知の方法を用いて開発することができる。このキットは、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２の特定に有用であり、適切な事象ＤＮＡを含む植物を育種するための方法に適用することができる。このキットは、配列番号１〜６に類似する、または相補的なＤＮＡプライマーまたはプローブ、あるいはそれらのフラグメントまたは相補体を含んでもよい。
【００９７】
したがって、本発明のキットおよび検出方法は、とりわけ、事象ＭＯＮ８７７１２を特定し、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物の変種またはハイブリッドを選択し、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡの存在を検出し、事象ＭＯＮ８７７１２または事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物、植物部分、もしくは商品生産物の存在および／または不在について試料をモニターするために有用である。
【００９８】
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態の例を示すために含める。当業者は、以下に示す実施例において開示される手法が、本発明を実施する際に良好に機能することを本発明者らが見出したアプローチを示し、したがってその実施のための好ましい様式の例をなすと考えられることを理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえ、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことが可能であり、依然として本発明の精神および範囲から逸脱することなく類似または同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【００９９】
実施例１：ｐＭＯＮ８３１３２によるダイズの形質転換および事象選択
この実施例は、形質転換およびトランスジェニックダイズ事象の発生、ならびに事象ＭＯＮ８７７１２の選択を説明する。
【０１００】
アグロバクテリウム媒介形質転換方法を用いて、ｐＭＯＮ８３１３２と指定された二成分構築物でダイズ細胞を形質転換した。この構築物は、２つの植物形質転換カセットまたはＴ−ＤＮＡを含む。各カセットは、右境界配列および左境界配列に隣接する。配列番号５に記載されるトランスジェニックインサートは、ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、ワタ）の繊維タンパク質Ｅ６遺伝子由来の３’非翻訳領域に作用可能に結合した、ＢＢＸ３２タンパク質をコードするＤＮＡ分子に作用可能に結合した、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の増強３５Ｓプロモーターを含む形質転換カセットを含む。第２の形質転換カセットは、伸長因子ＥＦ−１αをコードするシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＥＦ−１α遺伝子のプロモーターと組み合わせたゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ  ＲＮＡのプロモーター由来のエンハンサー配列からなるキメラプロモーターを含む。またこれは、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）由来のＲｂｃＳ２遺伝子の３’非翻訳領域に作用可能に結合した、ＣＰ４  ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするアグロバクテリウム菌種．（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）株ＣＰ４由来のａｒｏＡ遺伝子のコドン改変コード配列に融合した、シロイヌナズナＥＰＳＰシンターゼ由来の葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ２）をコードするＤＮＡ分子に作用可能に結合した、シロイヌナズナＥＦ−１α遺伝子の隣接スプライス部位を含むリーダー（エキソン１）およびイントロンも含む。ＣＰ４  ａｒｏＡ遺伝子はグリホサートに対する耐性を付与し、これを選択可能なマーカーとして使用した。表１は、ｐＭＯＮ８３１３２中の遺伝要素の要約である。
【０１０１】
構築物ｐＭＯＮ８３１３２での形質転換後、グリホサートを含有する培地上で、形質転換細胞を成長および増殖させた。植物を生存細胞から再生させた。合計４９４４個の個々のＲ０形質転換事象を生成し、詳細な分子分析によって特徴付けた。定量ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によって、事象をインサートの数（ダイズゲノム中の組み込み部位の数）、コピー数（１つの遺伝子座内のＴ−ＤＮＡのコピーの数）、挿入されたカセットの完全性および骨格配列の不在、ならびにＡｔＢＢＸ３２トランス遺伝子転写物の発現についてスクリーニングした。望ましくない分子的特徴、例えばトランス遺伝子の複数のコピーの存在および／またはインサートの分子の複雑性、形質転換ベクター骨格配列の存在を有する事象を排除した。さらに、連鎖サザン分析を実施して、ＢＢＸ３２発現カセットがＣＰ４選択可能なマーカーカセットと連鎖する事象を除外した。合計２８４個の事象が、上述の分析に基づいて、厳しい分子選択基準を満たした。さらに３個の事象をホモ接合性の原種が入手できないことからさらに排除し、その結果２８１個の事象をＲ１世代に進めた。
【表１−１】
2018082718.tif 000002
【表１−２】
2018082718.tif 000003
【表１−３】
2018082718.tif 000004
１Ｂ：境界
２Ｐ：プロモーター
３ＣＳ：コード配列
４Ｔ：転写終結配列
５Ｌ：リーダー
６Ｉ：イントロン
７ＴＳ：標的配列
８ＯＲ：複製起点
【０１０２】
Ｒ１世代において、ホモ接合性およびヘテロ接合性の植物のみを次に進めるために、事象に分離比分析を行った。さらに、ＣＰ４連鎖分析、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析、およびＢＢＸ３２発現分析を実施して、ＣＰ４がＢＢＸ３２トランス遺伝子と連鎖する事象、またはＯｒｉＶ複製起点の配列（骨格）が検出された事象、またはＢＢＸ３２トランス遺伝子発現レベルが望ましくない事象を除外し、結果として１２１個の事象が残った。様々なプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション分析は、単一コピーではない事象、または単一インサートではない事象、または骨格非含有でない事象の４２個の事象をさらに排除した。プローブは、無傷のＢＢＸ３２コード領域およびそれぞれのプロモーター、ポリアデニル化配列、ならびにプラスミド骨格を含んだ。先に進める十分な種子がないことから、さらに２個の事象を停止し、Ｒ２世代に進める７７個の事象が残った。
【０１０３】
Ｒ２世代において、１）Ｒ２栽培のための十分な種子の不足（１事象）、または２）望ましくない農学的表現型（２事象）、または３）ＢＢＸ３２発現レベルまたは代表的ホモ接合性系統の不在（Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により決定）（６事象）によって、さらに９個の事象を排除した。結果として、６８個の事象を米国における１年目収量フィールド試験に進めた。収量性に基づいて、１６個の事象を南米における第２期フィールド試験に進め、このうち９個の事象をさらなる収量試験用に選択した。米国または南米のそれぞれ複数の地点（表２）における４期のフィールド実験からの収量データのメタ分析は、事象ＭＯＮ８７７１２を含むと指定される１つの子孫系統が最も高収量の事象であることを示した（図２）。
【表２】
2018082718.tif 000005
【０１０４】
実施例２：逆ＰＣＲと用いた隣接配列の単離および配列決定による隣接配列の特定
この実施例は、事象ＭＯＮ８７７１２における逆ＰＣＲを用いたトランスジェニックＤＮＡインサートに隣接するダイズゲノムＤＮＡ配列の単離、および配列決定によるその隣接ゲノム配列の特定を説明する。
【０１０５】
事象ＭＯＮ８７７１２中のＴ−ＤＮＡ挿入と隣接する配列をＯｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載されるように、逆ＰＣＲを用いて決定した。野生型Ａ３５２５およびトランスジェニック系統の両者から、温室条件下で栽培した組織の植物ゲノムＤＮＡを単離した。液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて、または機械的粉砕によって凍結葉組織を粉砕し、その後当分野で既知の方法を用いてＤＮＡを抽出した。この方法は、種子を含むがそれに限定されない任意の組織からＤＮＡを抽出するように、当業者によって変更することができる。
【０１０６】
トランスジェニックＤＮＡの制限分析に基づいて選択された制限エンドヌクレアーゼで、それぞれの試料からの一定分量のＤＮＡを消化した。制限フラグメントのセルフライゲーション後、トランスジェニックＤＮＡの５’末端および３’末端から伸長する配列を増幅するであろうトランスジェニック配列から設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を実施した。様々なＴａｑポリメラーゼおよび増幅システムを使用することができる。表３は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ５３１ＳまたはＦ５３１Ｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ならびにＴｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００、ＡＢＩ  ９８００  Ｆａｓｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ、およびＭＪ  Ｏｐｔｉｃｏｎを用いた、隣接配列単離のためのＰＣＲ増幅の例を示している。
【表３】
2018082718.tif 000006
【０１０７】
アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分離し、ＱＩＡＧＥＮゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。その結果生じた産物を、標準的配列決定を用いて直接配列決定した。これら２つの方法を用いて、ＢＢＸ３２発現カセットを含む組み込まれたＤＮＡインサートの左境界配列内へと伸長する５’隣接配列を特定し、これを配列番号３として示す（図１の［Ｃ］）。ＢＢＸ３２発現カセットを含む組み込まれたＤＮＡインサートの右境界配列内へと伸長する３’接配列を特定し、これを配列番号４として示す（図１の［Ｄ］）。ダイズゲノムＤＮＡに組み込まれたトランスジェニックＤＮＡは、配列番号５として示す（図１の［Ｅ］）。
【０１０８】
単離された配列をＴ−ＤＮＡ配列と比較して、隣接配列および共単離されたＴ−ＤＮＡフラグメントを特定した。発現カセットの存在の確認は、推定隣接配列データおよび既知のＴ−ＤＮＡ配列に基づいて設計されたプライマーを用いたＰＣＲによって達成した。ＭＯＮ８７７１２中の隣接配列から設計されたプライマーを用いて、形質転換系統にＴ−ＤＮＡが組み込まれたのと同じ領域に対応する野生型配列を単離した。ＭＯＮ８７７１２中の隣接配列および野生型配列を複数のヌクレオチドおよびタンパク質データベースに対して分析した。この情報を使用して、トランス遺伝子の植物ゲノムとの関係を調べ、挿入部位完全性を検査した。隣接配列および野生型配列を用いて、実施例３に記載する、事象を特定し、接合状態を決定するためのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）エンドポイントアッセイのためのプライマーを設計した。
【０１０９】
実施例３：事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）および接合状態アッセイ
この実施例は、試料中のＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを特定するための事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅法を説明する。
【０１１０】
事象ＭＯＮ８７７１２特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）法で有用な条件の例を表４および表５に記載する。エンドポイントアッセイに使用するＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ３９８３（配列番号１６）およびＳＱ２２９８２（配列番号１７）であり、６−ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＢ１０４５３（配列番号１８）である。６ＦＡＭ（商標）は、ＤＮＡプローブに結合したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）製の蛍光色素製品である。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＭＧＢ（副溝結合）プローブでは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性が、フルオロフォアと消光剤との間で５’末端からプローブを切断する。標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズされると、消光剤とフルオロフォアとは、蛍光シグナルを発生するのに十分なだけ離れる。
【０１１１】
プライマーＳＱ３９８３（配列番号１６）およびＳＱ２２９８２（配列番号１７）は、プローブＰＢ１０４５３（配列番号１８）とともに記載のように使用したとき、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡに特徴的なアンプリコンを生成する。分析には、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを含むことが知られるダイズ由来の陽性対称、非トランスジェニックダイズ由来の陰性対称、および鋳型ＤＮＡを含有しない陰性対称が含まれる。
【０１１２】
これらのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、ＡＢＩ  ９８００  Ｆａｓｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ、およびＭＪ  Ｏｐｔｉｃｏｎで使用するために最適化する。当業者に既知の他の方法および装置を用いて、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを特定するアンプリコンを生成してもよい。
【表４】
2018082718.tif 000007
【表５】
2018082718.tif 000008
【０１１３】
以下の実施例は、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２の接合状態を決定するために開発された事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅法を説明する。接合状態アッセイは、事象を含む植物が事象ＤＮＡに対してホモ接合性であるか、すなわち染色体対の各染色体上の同じ位置に外来性ＤＮＡを含むか、または事象ＤＮＡに対してヘテロ接合性であるか、すなわち染色体対のうち１つの染色体のみに外来性ＤＮＡを含むか、または事象ＤＮＡに対してヌルであるか、すなわち野生型であるかを決定するために有用である。３つのプライマーの組（配列番号１０、１３、および１１または１５）、６ＦＡＭ（商標）標識プローブ（配列番号１２）、およびＶＩＣ（商標）標識プローブ（配列番号１４）をアッセイに使用した（表８）。６ＦＡＭ（商標）およびＶＩＣ（商標）は、ＤＮＡプローブに結合したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）製の蛍光色素製品である。プライマー配列番号１１または１５は、挿入された外来性ＤＮＡにハイブリダイズし、そこから特異的に伸長し、プライマー配列番号１０は、挿入された外来性ＤＮＡの３’側に隣接するＤＮＡにハイブリダイズし、そこから特異的に伸長し、プライマー配列番号１３は、トランスジェニック事象ＭＯＮ８７７１２のＴ−ＤＮＡ挿入時に欠失した領域に対応する野生型ＤＮＡにハイブリダイズし、そこから特異的に伸長する。これらのプライマーは特徴的である。この実施例において、プライマー配列番号１０および配列番号１１または１５、ならびに６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブ配列番号１２は、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡに特徴的である、プローブ配列番号１２からの蛍光シグナルの放出によって示されるＤＮＡアンプリコンを生成し、ゲノムＤＮＡ中に存在する挿入されたトランスジェニックＤＮＡのコピーを示す。プライマー配列番号１０および配列番号１３、ならびにＶＩＣ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブ配列番号１４は、野生型対立遺伝子に特徴的である、プローブ配列番号１４からの蛍光シグナルの放出によって示されるアンプリコンを生成し、ゲノムＤＮＡ中に存在する挿入された外来性ＤＮＡのコピーがないことを示す。ＰＣＲ反応において植物から抽出したＤＮＡとこれら３つのプライマーおよび２つのプローブが混合された場合、６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１２）のみからの蛍光シグナルの放出は、事象ＭＯＮ８７７１２に対してホモ接合性の植物の指標となり、これに特徴的である。ＰＣＲ反応において植物から抽出したＤＮＡとこれら３つのプライマーおよび２つのプローブが混合された場合、６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブ配列番号１２とＶＩＣ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブ配列番号１４とからの蛍光シグナルの放出は、事象ＭＯＮ８７７１２に対してヘテロ接合性の植物の指標となり、これに特徴的である。ＰＣＲ反応において植物から抽出したＤＮＡとこれら３つのプライマーおよび２つのプローブが混合された場合、ＶＩＣ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１４）のみからの蛍光シグナルの放出は、事象ＭＯＮ８７７１２に対してヌルである植物、すなわち野生型の指標となり、これに特徴的である。このアッセイにも事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを含むダイズ由来の陽性対称、非トランスジェニックダイズ由来の陰性対称、および鋳型ＤＮＡを含有しない陰性対称が含まれる。
【０１１４】
表６および表７は、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２の接合状態アッセイに使用する条件の例を提示する。これらのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００で使用するために最適化した。対立遺伝子の検出は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、またはＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ製のＰＨＥＲＡｓｔａｒで使用するために最適化した。事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを特定するアンプリコンを生成する当業者に既知の他の方法および装置は、当該技術の範囲内である。
【表６】
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＊ＭＧＢ：副溝結合
【表７】
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【表８】
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実施例４：任意のＭＯＮ８７７１２含有品種改良事象における事象ＭＯＮ８７７１２の特定
【０１１５】
この実施例は、任意の品種改良事象を含むＭＯＮ８７７１２ダイズの子孫中のＭＯＮ８７７１２事象をどのようにして特定することができるかを説明する。
【０１１６】
事象ＤＮＡプライマー対を用いて、ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコンを生成する。ＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコンは、配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチドとして本明細書において提供される少なくとも１つの結合部配列、あるいはそれらの相補体を含む（それぞれ図１に記載される［Ａ］または［Ｂ］）。配列番号１（図１の［Ａ］）は、５’隣接配列（配列番号３［Ｃ］の位置３４９５〜３５１６、図１を参照）と組み込まれたＤＮＡインサートの左境界（配列番号５［Ｅ］の位置１〜１１、図１を参照）との結合部に対応するヌクレオチド配列である。配列番号２（図１の［Ｂ］）は、組み込まれたＤＮＡインサートの右境界（配列番号５［Ｅ］の位置２００４〜２０１４、図１を参照）と３’隣接配列（配列番号４［Ｄ］の位置９０〜１１１、図１を参照）との結合部に対応するヌクレオチド配列である。配列番号７（図１の［Ａ］）は、５’隣接配列（配列番号３［Ｃ］の位置３４５６〜３５５５、図１を参照）とＤＮＡインサートの左境界（配列番号５［Ｅ］の位置１〜５０図１を参照）との結合部に対応するヌクレオチド配列である。配列番号８（図１の［Ｂ］）は、組み込まれたＤＮＡインサートの右境界（配列番号５［Ｅ］の位置１９６５〜２０１４、図１を参照）と３’隣接配列（配列番号４［Ｄ］の位置５１〜１５０、図１を参照）との結合部に対応するヌクレオチド配列である。
【０１１７】
ＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコンを生成する事象プライマー対には、隣接配列（配列番号３および配列番号４）および組み込まれたトランスジェニックＤＮＡ配列（配列番号５）を用いて設計されたプライマー対が含まれる。配列番号１の少なくとも１５個のヌクレオチドが認められる特徴的なアンプリコンを得るために、配列番号３の塩基１〜３４９４に基づいて順方向プライマーを、挿入された発現カセットのＤＮＡ配列である配列番号５の位置１２〜２０１４に基づいて逆方向プライマーを設計し得るが、これらのプライマーは、配列番号３および配列番号５に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの連続ヌクレオチドを有する。配列番号２の少なくとも１５個のヌクレオチドが認められる特徴的なアンプリコンを得るために、挿入された発現カセットのＤＮＡ配列である配列番号５の位置１〜２００３に基づいて順方向プライマーを、配列番号４である３’隣接配列の塩基１２〜２０６５に基づいて逆方向プライマーを設計し得るが、これらのプライマーは、配列番号４および配列番号５に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの連続ヌクレオチドを有する。実際上は、限定されたサイズ範囲、例えば１００〜１０００塩基のアンプリコンを生成するプライマーを設計すべきである。より小さいサイズ（より短いヌクレオチド長）のアンプリコンは、一般的にＰＣＲ反応においてより確実に生成することができ、サイクル時間を短縮することができ、またアガロースゲル上で容易に分離および可視化することができる、あるいはエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）のようなアッセイでの使用に適合させることができる。さらに、プライマー対を用いて生成したアンプリコンは、ベクターにクローン化、繁殖、単離、および配列決定することができ、あるいは当分野で十分に確立された方法を用いて直接配列決定することができる。ＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコン、ＭＯＮ８７７１２を含む植物、またはその子孫を生成するためのＤＮＡ増幅方法において有用な配列番号３と配列番号５の組み合わせ、または配列番号４と配列番号５の組み合わせから得られたあらゆるプライマー対は、本発明の態様である。ＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコン、ＭＯＮ８７７１２を含む植物、またはその子孫を生成するためのＤＮＡ増幅方法において有用な配列番号３の少なくとも１１個の連続ヌクレオチド、またはその相補体を含むあらゆる単一の単離されたＤＮＡプライマー分子は、本発明の態様である。ＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコン、ＭＯＮ８７７１２を含む植物、またはその子孫を生成するためのＤＮＡ増幅方法において有用な配列番号４の少なくとも１１個の連続ヌクレオチド、またはその相補体を含むあらゆる単一の単離されたＤＮＡプライマー分子は、本発明の態様である。ＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコン、ＭＯＮ８７７１２を含む植物、またはその子孫を生成するためのＤＮＡ増幅方法において有用な配列番号５の少なくとも１１個の連続ヌクレオチド、またはその相補体を含むあらゆる単一の単離されたＤＮＡプライマー分子は、本発明の態様である。
【０１１８】
この分析のための増幅条件の例は、表４および表５（実施例３）に示す。しかしながら、これらの方法、あるいはＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコンを生成する、事象ＭＯＮ８７７１２の配列番号３、配列番号４、またはトランスジェニックインサートＤＮＡ配列（配列番号５）と相同もしくは相補的なＤＮＡプライマーの使用のいかなる変更も本開示の範囲に含まれる。特徴的アンプリコンは、少なくとも１つのトランス遺伝子／ゲノム結合部ＤＮＡ（配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、または配列番号８の少なくとも５１個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体）と相同または相補的なＤＮＡ分子、あるいはそれらの実質的部分を含む。
【０１１９】
試料中の事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡの分析は、事象ＭＯＮ８７７１２由来の陽性対称、事象ＭＯＮ８７７１２を含まないダイズ植物由来の陰性対称、例えばこれには限らないが野生型対称、およびダイズゲノムＤＮＡを含まない陰性対称を含むべきである。内因性ダイズＤＮＡ分子を増幅するプライマー対は、ＤＮＡ増幅条件の内部対照としての役割を果たすことになる。ＤＮＡ増幅方法の当業者は、配列番号３、配列番号４、または配列番号５から他のプライマー配列を選択することができ、また表４および表５に示す方法によってアンプリコンを生成するために選択される条件は異なり得るが、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡに特徴的なアンプリコンをもたらす。表４および表５の方法を変更したこれらのＤＮＡプライマー配列の使用は、本発明の範囲に含まれる。事象ＭＯＮ８７７１２  に特徴的な、配列番号３、配列番号４、または配列番号５から得られた少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列によって生成されたアンプリコンは、本発明の態様である。
【０１２０】
ＤＮＡ増幅方法で使用したときに、ＭＯＮ８７７１２、ＭＯＮ８７７１２を含む植物、またはその子孫に特徴的なアンプリコンを生成する、配列番号３、配列番号４、または配列番号５から得られた少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含むＤＮＡ検出キットは、本発明の態様である。ＤＮＡ増幅方法で試験したときにゲノムＤＮＡがＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコンを生成するダイズ植物または種子は、本発明の態様である。ＭＯＮ８７７１２アンプリコンに対するアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、ＡＢＩ  ９８００  Ｆａｓｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ、およびＭＪ  Ｏｐｔｉｃｏｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ  Ｅｎｇｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラー、あるいはＭＯＮ８７７１２に特徴的なアンプリコンを生成するために使用可能な他の任意の増幅システムを用いて実施することができる。
【０１２１】
上記に開示され、特許請求の範囲に記載されるダイズ事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子は、ブダペスト条約の下、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．２０１１０）に寄託された。寄託日は２００９年８月２０日であり、ＡＴＣＣ受入番号はＰＴＡ−１０２９６である。寄託時の全ての制限事項は、特許の発行時に解除されるものであり、この寄託は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８０１−１．８０９の全ての要件を満たすことを意図する。この寄託は、３０年間または最新の要請から５年間、あるいは特許の有効期間のうち長い方の期間にわたり寄託期間に保持され、その期間中に必要に応じて交換される。
【０１２２】
本発明の原理を説明および記載したが、当業者は、かかる原理を逸脱することなく本発明の構成および詳細を変更できることを理解すべきである。本発明者らは、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる全ての変更形態を特許請求する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月24日(2018.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１および配列番号２からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチド分子と、
ｂ）配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子と、
ｃ）ａ）またはｂ）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド分子と、を含む、
組み換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子が事象ＭＯＮ８７７１２から得られ、事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子が、ダイズ植物、植物細胞、種子、子孫植物、植物部分、または商品生産物に含まれたＤＮＡ分子である、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡの存在に特徴的なポリヌクレオチドプローブであって、
前記ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１もしくは配列番号２のヌクレオチド、または配列番号７もしくは配列番号８の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体を含む核酸分子と結合するのに十分な長さを有し、また前記ポリヌクレオチドプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは配列番号２のヌクレオチド、または配列番号７もしくは配列番号８の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体を含むＤＮＡ分子とハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは配列番号２のヌクレオチド、または配列番号７もしくは配列番号８の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチド、あるいはそれらの相補体を含まないＤＮＡ分子とハイブリダイズせず、
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、ポリヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
ＤＮＡ試料中の事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、
ａ）前記ＤＮＡ試料を請求項４に記載のポリヌクレオチドプローブと接触させることと、
ｂ）前記ＤＮＡ試料および前記ポリヌクレオチドプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供することと、
ｃ）前記ＤＮＡ試料において、前記ポリヌクレオチドプローブの前記事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを検出することと、を含み、
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、方法。
【請求項６】
第１のＤＮＡ分子と、前記第１のＤＮＡ分子と異なる第２のＤＮＡ分子とを含み、事象ＭＯＮ８７７１２から得られた鋳型と一緒に増幅反応に使用したときにＤＮＡプライマーとして機能して、試料中の事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡに特徴的なアンプリコンを生成し、
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、ＤＮＡ分子の対。
【請求項７】
前記アンプリコンが、配列番号１、配列番号２からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、配列番号７の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子と、配列番号８の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子とを含む、請求項６に記載のＤＮＡ分子の対。
【請求項８】
ＤＮＡ試料中の事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、
ａ）前記ＤＮＡ試料を請求項６に記載のＤＮＡ分子の対と接触させることと、
ｂ）増幅反応を実施して、配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子、または配列番号８の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子、あるいはそれらの相補体を含むアンプリコンを生成することと、
ｃ）前記アンプリコンを検出することと、を含む、方法。
【請求項９】
事象ＭＯＮ８７７１２から得られたＤＮＡの存在の検出に特異的なＤＮＡプライマーまたはポリヌクレオチドプローブとして機能することができる少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含み、前記ＤＮＡの検出が試料中の前記ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡの存在に特徴的であり、
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチド分子が、配列番号１、配列番号２、配列番号７の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子、および配列番号８の少なくとも５１個〜１００個の連続するヌクレオチドを含む配列を有するポリヌクレオチド分子からなる群から選択される、請求項９に記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項１１】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む、植物、種子、細胞、またはそれらのＤＮＡ含有部分。
【請求項１２】
花粉、胚珠、花、莢、葉、根、茎、および苗条からなる群から選択される、請求項１１に記載の植物の植物部分。
【請求項１３】
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、事象ＭＯＮ８７７１２を含む植物、種子、細胞、またはそれらの植物部分。
【請求項１４】
前記植物または種子が収量の増加をもたらす、請求項１３に記載の植物または種子。
【請求項１５】
少なくとも１つの親が事象ＭＯＮ８７７１２を含むダイズから得られ、事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、ハイブリッドダイズ植物または種子。
【請求項１６】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含むＭＯＮ８７７１２から得られ、事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、非生存植物材料。
【請求項１７】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む微生物。
【請求項１８】
前記微生物が植物細胞である、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む商品生産物。
【請求項２０】
全種子または加工種子、動物用飼料、油、粗粉、粉、フレーク、ふすま、タンパク質濃縮物、ダイズタンパク質単離物、加水分解ダイズタンパク質、バイオマス、および燃料製品からなる群から選択される、請求項１９に記載の商品生産物。
【請求項２１】
ａ）ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ植物を自殖させ、それによって種子を生成することと、
ｂ）前記種子を栽培して、複数の子孫植物を生成することと、
ｃ）ＭＯＮ８７７１２を含む子孫植物または増加した収量を有する子孫植物を選択することと、を含み、
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、増加した収量を有するダイズ植物を生成する方法。
【請求項２２】
ａ）ＭＯＮ８７７１２を含むダイズ植物を第２のダイズ植物と交配し、それによって種子を生成することと、
ｂ）前記種子を栽培して、複数の子孫植物を生成することと、
ｃ）ＭＯＮ８７７１２を含み、増加した収量を有する子孫植物を選択することと、を含み、
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、増加した収量を有するダイズ植物を生成する方法。
【請求項２３】
試料においてダイズ事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡを含むダイズ植物ゲノムの接合状態を決定する方法であって、
ａ）前記試料を、３つの異なるプライマーであって、
ｉ）核酸増幅反応でダイズ事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡと一緒に使用したときに、ダイズ事象ＭＯＮ８７７１２に特徴的な第１のアンプリコンを生成し、
ｉｉ）核酸増幅反応でＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡ以外のダイズゲノムＤＮＡと一緒に使用したときに、事象ＭＯＮ８７７１２  ＤＮＡ以外のダイズ野生型ゲノムＤＮＡに特徴的な第２のアンプリコンを生成する、前記３つの異なるプライマーと接触させることと、
ｂ）核酸増幅反応を実施することと、
ｃ）前記第１のアンプリコンおよび前記第２のアンプリコンを検出することと、を含み、
前記第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンの存在は、前記試料中のヘテロ接合性ゲノムに特徴的であり、前記第１のアンプリコンのみの存在は、前記試料中のホモ接合性ゲノムに特徴的であり、
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、方法。
【請求項２４】
前記３つの異なるプライマーが、配列番号１０、配列番号１１または１５、および配列番号１３を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）事象ＭＯＮ８７７１２を含む大豆植物または大豆種子を植えることと、
ｂ）前記大豆植物または大豆種子を栽培することと、を含み、
事象ＭＯＮ８７７１２を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、大豆作物の収量を増加させる方法。
【外国語明細書】
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【配列表】
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