(57)【要約】【課題】  培養容器にラミニンをコーティングすることなく、接着細胞を好適に培養することが可能な細胞培養方法及び細胞培養システムを提供する。【解決手段】  培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体等からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成し、培養容器に、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地と細胞とを収容して、接着細胞を培養する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養方法であって、
前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成し、
前記培養容器に、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地と前記細胞とを収容して、前記細胞を培養する
ことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記基材が、放射線処理又は親水化処理がなされた、ポリエチレン、環状オレフィンコポリマー、又はポリエチレンテレフタレートのいずれかであることを特徴とする請求項１記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記細胞が、多能性幹細胞、胚性幹細胞、又はそれらの分化細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記培養容器により閉鎖系で前記細胞を培養することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項５】
細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養システムであって、
前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成された培養容器と、
細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地を収容する培地容器と、を備え、
前記培地容器からの前記培地の前記培養容器への移送、及び、前記培養容器への前記細胞の注入を行って、前記細胞の培養が行われる
ことを特徴とする細胞培養システム。
【請求項６】
細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養システムであって、
前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成された培養容器と、
培地を収容する培地容器と、
細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを収容するラミニン供給容器と、を備え、
前記培地容器からの前記培地の前記培養容器への移送、前記培養容器への前記細胞の注入、及び、前記ラミニン供給容器からのラミニン又はそのフラグメントの前記培養容器への移送を行って、前記細胞の培養が行われる
ことを特徴とする細胞培養システム。
【請求項７】
前記ラミニン供給容器に収容されるラミニンの濃度が、0.1mg/ml以下であることを特徴とする請求項６記載の細胞培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養技術に関し、特に細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養方法、及び細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、培養容器に細胞と培地を注入して、細胞を培養することが行われている。
【０００３】
通常、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞など）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を培養容器で接着培養する場合には、培養容器の培養面にラミニンなどの細胞接着因子をコーティングすることが必要とされている（特許文献１参照）。具体的には、例えば、培養容器にラミニン溶液を入れて、３７℃で１時間以上静置させてラミニンのコーティングを行った後、培養容器からラミニン溶液を除去し、細胞と培地を培養容器に入れて、細胞の接着培養が行われていた。
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−１７８５２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このように細胞を接着培養するために、培養容器にラミニンをコーティングしなければならないことは煩雑であるという問題があった。また、ラミニンコーティング済みの培養容器を供給する場合には、その製造や品質管理が大変であるという問題があった。
そこで、本発明者らは、培養容器にラミニンをコーティングすることなく、ラミニンを培地に混合させて培養することで、細胞を培養容器に接着させて培養できるかについて、研究を行った。
【０００６】
その結果、疎水性材料からなる培養容器を用いた場合、ラミニンを培地に混合させて培養しても、細胞を培養容器に接着させて培養することはできなかった。その理由は以下のように推測される。
図１に示すように、培地には雑多なタンパク質が含まれており、培養容器の培養面は、アルブミンなどのタンパク質に覆われた状態となっている。このとき、培養面が親水性材料からなる場合には、ラミニンとアルブミンなどが培養面に交換吸着することで、ラミニンは培養面にコーティングされると考えられる。一方、培養面が疎水性材料からなる場合、アルブミンなどが培養面に疎水結合するためにラミニンと交換吸着できず、ラミニンを培養面にコーティングできなかったと考えられる。
【０００７】
ここで、特許文献１に記載の発明では、培養容器にラミニンがコーティングされるが、ラミニンを添加した培地を用いて細胞を培養することについても記載がある。
しかしながら、これを実現するための具体的な構成については示されておらず、どのような特性の培養容器を用いれば、ラミニンを添加した培地を用いて細胞を培養することができるのかについては、検討されていなかった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、培養容器にラミニンをコーティングすることなく、接着細胞を好適に培養することが可能な細胞培養方法及び細胞培養システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の細胞培養方法は、細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養方法であって、前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成し、前記培養容器に、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地と前記細胞とを収容して、前記細胞を培養する構成としてある。
【００１０】
また、本発明の細胞培養システムは、細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養システムであって、前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成された培養容器と、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地を収容する培地容器と、を備え、前記培地容器からの前記培地の前記培養容器への移送、及び、前記培養容器への前記細胞の注入を行って、前記細胞の培養が行われる構成としてある。
【００１１】
また、本発明の細胞培養システムは、細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養システムであって、前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成された培養容器と、培地を収容する培地容器と、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを収容するラミニン供給容器と、を備え、前記培地容器からの前記培地の前記培養容器への移送、前記培養容器への前記細胞の注入、及び、前記ラミニン供給容器からのラミニン又はそのフラグメントの前記培養容器への移送を行って、前記細胞の培養が行われる構成としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、培養容器にラミニンをコーティングすることなく、接着細胞を好適に培養することができる細胞培養方法及び細胞培養システムの提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の細胞培養方法を疎水性の培養面を有する培養容器に適用できない理由についての説明図である。
【図２】本発明の実施形態に係る細胞培養システムの概略構成を示す説明図である。
【図３】本発明の実施形態に係る細胞培養システムの変形例の概略構成を示す説明図である。
【図４】比較例１〜４及び実施例１〜９における培養容器の培養面の処理条件、接触角、培養日数、及び細胞接着の結果を示す図である。
【図５】実施例１０〜１１における培養容器の培養面の処理条件、接触角、培養日数、及び細胞接着の結果を示す図である。
【図６】比較例１〜４の培養容器による培養結果（培養面の状態）の顕微鏡写真を示す図である。
【図７】実施例１〜４の培養容器による培養結果（培養面の状態）の顕微鏡写真を示す図である。
【図８】実施例５〜９の培養容器による培養結果（培養面の状態）の顕微鏡写真を示す図である。
【図９】実施例１０の培養容器による培養結果（培養面の状態）の顕微鏡写真を示す図である。
【図１０】実施例１１の培養容器による培養結果（培養面の状態）の顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムの実施形態について詳細に説明する。
本実施形態の細胞培養方法は、細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養方法であって、培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成し、培養容器に、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地と細胞とを収容して、細胞を培養することを特徴とする。
【００１５】
培養容器の培養面とは、細胞を接着して培養する、培養容器内の表面である。
接触角とは、静止した液体の表面が固体壁に接するところで液面と固体面がなす角であり、静的接触角とも称する。接触角が大きい場合には表面の疎水性が強く、接触角が小さい場合には表面の親水性が強いという関係がある。
【００１６】
本実施形態の細胞培養方法において、培養容器の培養面の少なくとも一部は、上記の各種材料から選択された基材を用いて形成される。また、培養面の全部をこれらの基材を用いて形成することも好ましい。さらに、培養容器の全体をこれらの基材を用いて形成することも好ましい。これらの基材を用いて培養容器を形成することで、接着細胞を培養するための柔軟な袋状（バッグ形状）の培養容器を好適に製造することが可能である。このような柔軟な袋状の培養容器を用いれば、培養容器内において培地の液厚を大きく変化させることが可能である。
【００１７】
また、本実施形態の細胞培養方法において、培養容器の培養面の少なくとも一部は、接触角が８４°以下となるように処理される。また、培養面の全部を接触角が８４°以下となるように処理することも好ましい。
具体的には、培養容器の培養面に対して、エキシマ照射又はコロナ処理による親水化処理、又は放射線処理による滅菌のいずれか、又はこれらの組み合わせを用いて処理することができる。このとき、エキシマ照射は処理速度、コロナ処理は処理回数などの条件を変更することにより、親水化の程度を調整することができる。
また、放射線処理は、電子線処理、又はγ線処理のいずれかを好適に用いることができる。
【００１８】
エキシマ照射により接触角が８４°以下となるように処理する場合、例えば、１２Ｖ、照射距離５ミリメートルで、処理速度を１〜１０ｍｍ／秒とすることが好ましく、２〜８ｍｍ／秒とすることがより好ましい。また、コロナ処理により接触角が８４°以下となるように処理する場合、例えば、電極間距離５ミリメートル、印可電流３．５Ａ、テーブル移動速度を５ｍ／分で、１〜３回程度行うことが好ましい。
【００１９】
また、本実施形態の細胞培養方法において、培養容器の培養面の接触角は、４０°以上８４°以下であることが好ましい。接触角がこの範囲内であれば、培養面に接着細胞をより好適に接着させることができるためである。
【００２０】
ここで、特に、培養容器の培養面をポリエチレンテレフタレートで形成する場合には、放射線処理又は親水化処理をしなければ、接触角が８４°以下であっても、培養容器に、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地と細胞とを収容して、細胞を接着培養することはできなかった。その理由は、以下のように考察される。
【００２１】
ポリエチレンテレフタレートは主鎖骨格に極性を持ったエステル結合を多数有しており、見かけ上の親水性が向上して、その接触角はポリエチレンなど他の樹脂と比較して低くなっているが、親水部の自由度が低く、多くが樹脂中に埋もれているためにアルブミンの吸着反応に影響することができない。
一方、ポリエチレンテレフタレートに対して親水化処理を行えば、その最表面に水酸基やカルボキシル基が付与されることでアルブミンの疎水結合を妨害できる。また、ポリエチレンテレフタレートに対して放射線処理を行えば、樹脂内部の分子鎖の切断・開裂により分子の運動性が上がるため、親水基が最表面へと移動することができるようになり、アルブミンの疎水結合を妨害できるようになると考えられる。
【００２２】
なお、本明細書及び特許請求の範囲に記載のポリエチレンテレフタレートは、一般的に「ＰＥＴ」として市販されているものを用いることができ、例えばイソフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、１，４−ブタンジオール、プロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、ＣＨＤＭ（シクロヘキサンジメタノール）などの補助成分を含むものも含まれる。
【００２３】
本実施形態の細胞培養方法により培養する細胞は、接着細胞であれば特に限定されないが、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞など）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等を挙げることができる。
本実施形態の細胞培養方法によれば、これらの細胞を培養面に接着して好適に培養することが可能である。
【００２４】
本実施形態の細胞培養方法において、細胞接着因子としては、ラミニン又はそのフラグメントのほか、フィブロネクチン、フィブリノーゲン等の接着タンパクを用いることができる。ラミニンのフラグメントとしては、例えばラミニン５１１−Ｅ８を好適に用いることができる。
【００２５】
本実施形態の細胞培養方法によれば、上記のように形成した培養容器に、ラミニン（又はそのフラグメント）を含有する培地と細胞を収容することによって、ラミニンを培養容器の培養面に吸着させることができる。
このため、細胞培養に先立って、培養容器の培養面にラミニンをコーティングすることなく、細胞を培養容器の培養面に接着させて培養することができるため、従来の煩雑な培養容器へのラミニンのコーティングを省略できると共に、ラミニンコーティング済みの培養容器の製造や品質管理を省略することが可能となる。
【００２６】
本発明の実施形態に係る細胞培養システムは、細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養システムであって、培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成された培養容器と、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地を収容する培地容器とを備え、培地容器からの培地の培養容器への移送、及び、培養容器への細胞の注入を行って、細胞の培養が行われることを特徴とする。
【００２７】
具体的には、例えば図２において模式的に示すように、本実施形態の細胞培養システムは、培養容器１０と培地容器２０とがチューブ３０により接続され、このチューブ３０にポンプ４０が取り付けられた構成とすることができる。
培養容器１０の培養面では、接着細胞１が接着して培養される。培地容器２０にはラミニン入り培地２が充填されており、ポンプ４０を駆動させることで、ラミニン入り培地２がチューブ３０を介して、培養容器１０に供給される。
培養容器１０の培養面は、上記の各種基材のいずれか又はその組み合わせを用いて形成され、接触角が８４°以下となるように親水化処理等がなされたものである。なお、培養面の一部のみをこのように形成して処理することで、当該一部のみで接着細胞を培養することもできる。
【００２８】
本実施形態の細胞培養システムをこのような構成すれば、培養容器１０の培養面にラミニンをコーティングしなくても、培地容器２０から培養容器１０に移送されたラミニン入り培地２に含まれるラミニンを、培養容器１０の培養面に吸着させることができるため、接着細胞１を培養面に接着させて好適に培養することが可能である。
【００２９】
培養容器１０は、熱可塑性樹脂シートをヒートシールなどの手段でシールすることで形成することができ、またブロー成形等の種々の成形方法によって形成することもできる。
また、培養容器１０は、ガス透過性を有する部材からなるものであることが好ましい。具体的には、酸素透過係数が４００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上、二酸化炭素透過係数が１２００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上のものであることが好ましく、酸素透過係数が１０００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上、二酸化炭素透過係数が３０００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上のものであることがより好ましい。培養容器１０がこのようなガス透過性を有すれば、優れた細胞増殖効率を得ることができる。
さらに、培養容器１０は、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有することが好ましい。また、本実施形態における培養容器１０は、可撓性部材を用いて形成されたものとすることが好ましい。
【００３０】
培地容器２０は、培養容器１０に注入するためのラミニン入り培地２を収容する容器である。ラミニン入り培地２は、培地とラミニン又はそのフラグメントとを混合することで作成することができる。
【００３１】
チューブ３０は、一般に常用されているものを用いることができ、例えば、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）等を用いて形成されたものを使用することができる。これらの材料は、ガス透過性に優れている。
【００３２】
ポンプ４０としては、チューブ３０をしごくことによって、培地容器２０から培養容器１０にラミニン入り培地２を移送できるペリスタルティック方式のポンプを好適に用いることができる。
【００３３】
また、本発明の実施形態に係る細胞培養システムは、その変形例として、培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が８４°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成された培養容器と、培地を収容する培地容器と、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを収容するラミニン供給容器とを備え、培地容器からの培地の培養容器への移送、培養容器への細胞の注入、及び、ラミニン供給容器からのラミニン又はそのフラグメントの培養容器への移送を行って、細胞の培養が行われることを特徴とするものとすることも好ましい。
【００３４】
具体的には、例えば図３において模式的に示すように、本実施形態の細胞培養システムの変形例は、培養容器１０と培地容器２０ａとラミニン供給容器５０とがチューブ３０ａにより接続され、このチューブ３０ａにポンプ４０とポンプ４０ａとを取り付けて構成することができる。
そして、ポンプ４０を駆動させることにより、培地容器２０ａから培地３（ラミニンを含まない）をチューブ３０ａを介して培養容器１０に移送し、またポンプ４０ａを駆動させることにより、ラミニン供給容器５０からラミニン４をチューブ３０ａを介して培養容器１０に移送することによって、培養容器１０にラミニン濃度調整培地５を供給する。
【００３５】
ポンプ４０とポンプ４０ａは、同時に駆動させることができるほか、ポンプ４０を駆動させるときに、ラミニン供給容器５０に接続されたチューブ３０ａの分岐部分をクリップなどで閉じた状態とし、またポンプ４０ａを駆動させるときに、培地容器２０ａに接続されたチューブ３０ａの分岐部分をクリップなどで閉じた状態として、それぞれ培地３とラミニン４の移送を行うこともできる。また、培養容器１０に接続されたチューブ３０ａの分岐部分にポンプを取り付けて、１つのポンプで培地３とラミニン４のそれぞれの移送を行っても良い。
【００３６】
具体的には、例えば培地容器２０ａに収容されている培地３（ラミニンを含まない）199mlと、ラミニン供給容器５０に収容されているラミニン４（例えば、濃度0.1mg/mlに調製されたラミニン溶液）1mlとを、それぞれポンプ駆動により、培養容器１０に移送して、培養容器１０に、濃度が0.5μg/mlのラミニン濃度調整培地５を供給することができる。培養容器１０における培養面の面積が200cm2の場合、液の厚み1cm、面積当たりのラミニン濃度を0.5μg/cm2となるよう調整することができる。
また、この面積あたりのラミニンの濃度を変えたくないが、高密度で細胞を培養したい等の理由で、仮に液の厚みを倍にしたいときは、濃度0.1mg/mlに調製されたラミニン溶液を1mlと、培地３を399mlで培養容器１０に移送することによって、これを行うことができる。
【００３７】
さらに、培養途中で細胞の接着の程度が弱まる場合がある。そのような場合には、ラミニン供給容器５０からラミニン４を培養容器１０に追加して、細胞の接着の強度を増加させることができる。
【００３８】
ここで、ラミニン供給容器５０におけるラミニンの濃度が高濃度であると、送り出すラミニン溶液の液量が極めて小さくなり、ポンプ駆動による送液時の精度が低下する懸念がある。例えば、培養面積200cm2の培養容器１０においてラミニンの濃度を0.5μg/cm2としたい場合、必要なラミニン量は0.1mgとなる。すなわち、ラミニン供給容器５０に収容されているラミニンの濃度が0.1mg/mlより大きい場合、送液量は1ml未満となり、汎用のポンプで精度良く送液するのが困難な液量となる。このため、ラミニン供給容器５０におけるラミニンの濃度は、0.1mg/ml以下とすることが好ましい。
【００３９】
本実施形態の細胞培養方法の変形例において、その他の点については、上述した本実施形態の細胞培養方法と同様のものとすることができる。
【００４０】
本実施形態の細胞培養システムをこの変形例のように構成すれば、培地３とラミニン４を別個に培養容器１０に移送することによって、培養容器１０の培養面におけるラミニン濃度を調整することができ、接着細胞１の培養環境を柔軟に調整することが可能となる。これは、従来のラミニンがコーティングされている培養容器を用いる場合には、得ることができない効果となっている。
【００４１】
以上説明したように、本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムによれば、培養容器にラミニンをコーティングすることなく、接着細胞を好適に培養することが可能となる。また、培養容器の培養面に吸着させるラミニンの濃度を調整することができ、接着細胞の培養環境を柔軟に調整することも可能である。
【実施例】
【００４２】
以下、本実施形態を評価するために行った試験について説明する。
各種材料を用いて形成された培養容器の培養面の接触角が様々な値となるように処理を行って、本実施形態の細胞培養方法による細胞培養を行った。具体的には、以下の通りである。
【００４３】
［培養容器］
培養容器として、ポリエチレン（ＰＥ，宇部丸善ポリエチレン株式会社製，品名ユメリット125FN）をフィルムに成膜した後にディッシュ型に加工したもの、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ，ポリプラスチック株式会社製，品名TOPAS8007F-04）をフィルムに成膜した後にディッシュ型に加工したもの、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ，ＳＫケミカル株式会社製，品名BR8040）を射出成形してディッシュ型に形成したものを用意した。ＰＥ、ＣＯＣのフィルムのディッシュ型への加工は、フィルムの端を折り、インパルスシーラーにて溶着することによって行った。
【００４４】
［培養面の処理］
図４及び図５に示されるように、各々の培養容器に対し、エキシマ照射装置（株式会社エム・ディ・コム製）による親水化処理、バッチ式コロナ処理装置（春日電機株式会社製）による親水化処理、又は電子線処理のいずれか、又はそれらの組み合わせを用いて処理を行った。電子線処理は、ラジエ工業株式会社に依頼して行った。
各処理において、エキシマ照射は処理速度、コロナ処理は処理回数などの条件を変更することによって親水化の程度を調整することができる。これらの条件を調整することによって、図４及び図５に示される接触角の培養面を有する培養容器を用意した。
なお、エキシマ照射は12V、照射距離5mm、コロナ処理は電極間距離5mm、印可電流3.5A、テーブル移動速度を5m/minとした。
【００４５】
［接触角の測定］
接触角の測定には、固液界面解析システムＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ  ７００（協和界面科学株式会社製）を使用した。接触角は、フィルム上に純水３μｌを滴下して測定した。
【００４６】
［細胞培養方法］
使用した接着細胞は、ｉＰＳ細胞（1231A3株）である。
使用した培地は、StemFit AK02N（品番RCAK02N，味の素株式会社製）である。
各培養容器に、10 mM Y-27632（品番253-00511，和光純薬工業株式会社製）を含む上記培地を注入すると共に、0.5 mg/mlラミニン511-E8（品番892012，株式会社ニッピ製）を各培養容器に0.5 μg/cm2となるように加えた。その後、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液を注入して、37℃で７日間培養を行った。このとき、培地は1.5 ml、細胞懸濁液5 μlであった。播種した細胞数は、およそ1.3×10４ｃｅｌｌｓであった。また、培養開始から１日経過後に、培地をY-27632不含有の培地に交換して、その後毎日培地交換を行った。
【００４７】
［接着性の評価］
培養１日、６日、又は７日後における細胞の接着状態を顕微鏡にて観察して、細胞の接着・伸展が見られるか否かを基準として、細胞の接着性を評価した。
なお、通常、培養容器における培養面に接着細胞を培養可能な適切な処理が行われている場合、細胞は１日で接着する。また、細胞が接着しない場合は、その後日数が経過しても接着しないことから、比較例１〜４では、培養１日後のみで各培養容器の培養適性（細胞接着の可否）を判断した。
【００４８】
［ラミニンの濃度の影響］
ラミニンの濃度が、それぞれ0.125, 0.5, 4.0 μg/cm2となるように各培養容器にラミニン511-E8を添加して、上記の手順で細胞培養を行った。
【００４９】
以上のように細胞培養を行った結果、図４及び図５において、細胞を接着培養できた場合を○、細胞を接着培養できなかった場合を×で示した。また、図６〜１０において、培養面の状態を撮影した顕微鏡写真を示した。
【００５０】
比較例１〜３において、ポリエチレン（ＰＥ）又は環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）からなる培養容器であって、その培養面の接触角が８４°より大きいものでは、接着細胞を適切に培養することができなかった。また、比較例４において、ポリエチレンテレフタレートからなる培養容器であって、放射線処理、親水化処理のいずれもなされていないものでは、接着細胞を適切に培養することができなかった。
【００５１】
これに対し、実施例１〜９において、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、又は環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）からなる培養容器であって、その培養面の接触角が８４°以下のもので、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされたものは、接着細胞を培養することができた。
また、実施例１０、１１において、ポリエチレン（ＰＥ）又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）からなる培養容器であって、その培養面の接触角が８４°以下のもので、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされたものは、ラミニン濃度が0.125, 0.5, 4.0 μg/cm2のいずれの場合でも、接着細胞を培養することができた。
【００５２】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施例では接着細胞としてｉＰＳ細胞を用いているが、これに限定されるものではなく、接着細胞であればその他の細胞を用いることができる。また、培地の種類等も適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、培養容器を用いて、接着細胞を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００５４】
１  接着細胞
２  ラミニン入り培地
３  培地（ラミニンを含まない）
４  ラミニン
５  ラミニン濃度調整培地
１０  培養容器
２０，２０ａ  培地容器
３０，３０ａ  チューブ
４０，４０ａ  ポンプ
５０  ラミニン供給容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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