(57)【要約】      （修正有）【課題】B細胞過剰増殖に対する被験体のワクチン接種に用いるための、または、被験体における免疫応答のモジュレーションに用いるためのポリペプチドの提供。【解決手段】CD22、CD19、CD20、およびCD21からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質と結合する結合ペプチド、ならびに少なくとも１つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドを含む、B細胞過剰増殖に対する被験体のワクチン接種に用いるためのポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)CD22、CD19、CD20、およびCD21からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質と結合する結合ペプチド、ならびに
b)少なくとも１つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチド
を含む、B細胞過剰増殖に対する被験体のワクチン接種に用いるためのポリペプチド。
【請求項２】
結合ペプチドが抗体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
免疫原性ペプチドが、前記被験体によく感染するか、または前記被験体がそれに対してワクチン接種されているウイルスのタンパク質から選択される少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
免疫原性ペプチドがエプスタイン・バーウイルス（EBV）の潜在遺伝子由来の少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、請求項１〜３のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
免疫原性ペプチドが腫瘍抗原由来の少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、請求項１〜４のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
a)CD22、CD19、CD20、およびCD21からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質と結合する結合ペプチド、ならびに
b)少なくとも１つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチド
を含む、被験体における免疫応答のモジュレーションに用いるためのポリペプチド。
【請求項７】
結合ペプチドが抗体である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
免疫原性ペプチドが腫瘍抗原由来の少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、請求項６または７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
免疫原性ペプチドがエプスタイン・バーウイルス（EBV）の潜在遺伝子由来の少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、請求項６〜８のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
免疫応答のモジュレーションが活性化である、請求項６〜９のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
結合ペプチドがCD21に対する抗体またはEBV gp350のCD21結合ペプチドを含むペプチドである、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
免疫応答のモジュレーションが抑制である、請求項６〜９のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
結合ペプチドがCD22に対する抗体である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
結合ペプチドが一本鎖抗体である、請求項１〜１３のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記結合ペプチドの少なくとも一部分が前記免疫原性ペプチド、または前記免疫原性ペプチドと結合するアダプターとアミノ酸配列において隣接する、請求項１〜１４のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
抗原特異的T細胞を刺激する方法であって、
a）抗原提示細胞（APC）を請求項１〜１５のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載のベクターと接触させるステップ、
b）前記APCをT細胞と接触させるステップ、および
c）それにより前記少なくとも１つのT細胞エピトープに特異的な抗原特異的T細胞を刺激するステップ
を含む前記方法。
【請求項２０】
APCがB細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
APCがリンパ芽球細胞株（LCL）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
in vitroの方法である、請求項１９〜２１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
被験体をB細胞過剰増殖に対して免疫化する方法であって、
a)前記被験体を、免疫原性ペプチドとして強力なT細胞エピトープを含むポリペプチド、強力なT細胞エピトープをコードする配列を含む請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または強力なT細胞エピトープをコードする配列を含む請求項１７に記載のベクターと接触させるステップ、および
b)それにより、前記被験体をB細胞過剰増殖に対して免疫化するステップ
を含む前記方法。
【請求項２４】
被験体を感染病原体に対して免疫化する方法であって、
a）前記被験体を、請求項６〜１５のいずれか1項に記載のポリペプチドのプール、請求項１６に記載のポリヌクレオチドのプール、または請求項１７に記載のベクターのプールと接触させるステップ、および
b）それにより、前記被験体を感染病原体に対して免疫化するステップ
を含む前記方法。
【請求項２５】
被験体に寛容性を誘導する方法であって、
a）被験体を、請求項１２または１３に記載の寛容性を誘導するポリペプチド、請求項１２または１３に記載の寛容性を誘導するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または請求項１２または１３に記載の寛容性を誘導するポリペプチドをコードするベクターと接触させるステップ、および
b）それにより被験体に寛容性を誘導するステップ
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、a）CD22、CD19、CD20、およびCD21からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質と結合する結合ペプチド、ならびに、b）少なくとも１つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドを含む、B細胞過剰増殖に対する被験体のワクチン接種に用いるための、または被験体における免疫応答のモジュレーションに用いるためのポリペプチドに関する。本発明はさらに、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびベクターならびにそれらを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、a)抗原提示細胞（APC）を本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターと接触させるステップ、b)前記APCをT細胞と接触させるステップ、およびc)それにより、前記少なくとも１つのT細胞エピトープに特異的な抗原特異的T細胞を刺激するステップを含む抗原特異的T細胞を刺激する方法；B細胞過剰増殖に対して被験体を免疫化する方法、感染病原体に対して被験体を免疫化する方法、および被験体に寛容性を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫化により、被験体の免疫系は抗原に対して強化される。特に、適応免疫系、すなわち、潜在病原体を認識し、記憶し、そして対処する個体の免疫系の能力を与える免疫系の部分は医療における強い関心事であり続けている（Kaech et al. (2002), Nature Reviews Immunology 2(4):251-62; Pulendran and Ahmed (2006), Cell 124(4):849-63）。一方では、それがなければ潜在的に死に至る疾患に対する免疫を与えるワクチン接種が広範に開発されている。それはまた、腫瘍抗原の認識を介して癌細胞を排除するために用いられ、様々な成果を挙げている。他方、例えば、アレルギー、喘息、または自己免疫疾患のように、強い免疫応答が不適切である疾患においては、適応免疫系の減弱に関心が持たれている。
【０００３】
ワクチン接種は全般的に成功しているにも関わらず、ワクチン接種の適用から逃れるいくつかの病原体、例えば、ウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン・バーウイルス）、細菌（例えば、Staphylococcus属、Borellia属）、真核生物病原体（例えば、Trypanosoma属）、及び、癌細胞も存在する。この理由は複雑であり、ほとんどの場合、特定病原体の性質に、しかしまた、ワクチン接種を受ける個体の生理学的状態にも依存する。いくつかの疾患を引き起こす病原体については、ワクチン接種中の免疫応答を強化する方法、例えば、可溶性抗原に代えてのウイルス様粒子の使用、アジュバントの封入、生ワクチンの使用などが考案されている。また、適切なエピトープ、典型的にはペプチドを専門の抗原提示細胞、すなわち、マクロファージ、樹状細胞、およびB細胞に送達することによる免疫応答の強化も提案されている。
【０００４】
免疫系におけるB細胞の主な役割はその活性化時の抗原特異的抗体の産生である。活性化には、B細胞表面のB細胞受容体（BCR）がそのコグネイト抗原と結合することが必要である。BCRのこの活性化はB細胞の活性化をもたらし、このB細胞が成熟しかつクローン増殖し、その後、こうして産生された細胞の一部が前記抗原に特異的な抗体を産生する形質細胞になる。BCRはこの活性化を媒介する；BCRはCD21およびCD19を含むいくつかの共受容体と共に、1つの抗原構造を特異的に認識できる膜結合抗体分子から構成される。B細胞の2つの他の表面分子であるCD20およびCD22は、少なくとも一時的にBCRと相互作用し、それぞれポジティブおよびネガティブなレギュレーターとして作用することは公知である。従って、これらは広い意味でBCR複合体（BCRC）のメンバーであると考えることができる。4つの分子全てに共通するのは、リガンド結合時に、細胞質小胞中に内部移行し、エンドソームと融合することである。
【０００５】
適応免疫系の重要な他の手段はエピトープ特異的T細胞である。ヒトにおいて、これらの細胞はその表面上にT細胞受容体を有し、その認識ドメインは抗原ペプチド（T細胞エピトープ）と主要組織適合性複合体（MHC）タンパク質の間の規定された複合体に対して特異的である。もしT細胞受容体がコグネイト相互作用に関われば、T細胞は活性化され、増殖し、免疫応答におけるその賦活または阻害作業を実施する。
【０００６】
MHC分子は2つの型を生じる：MHCクラスIは全てのヒト細胞の表面上に発現され、本質的に無作為に、細胞のサイトゾル中に存在するタンパク質由来のペプチドを提示する；従って、これらは細胞のタンパク質レパートリーの連続的な概観を与え、例えば、細胞のウイルス感染中または発癌時の非正常タンパク質発現の認識を可能にする。MHCクラスI分子-ペプチド複合体を認識するために、T細胞受容体は共受容体としてCD8表面タンパク質を必要とする。従って、CD8共受容体を発現するT細胞のサブクラス（CD8+T細胞と名付けられる）が存在する；それらの、排他的ではないが主な機能は、前記細胞における潜在的病原性プロセス、例えば、ウイルス感染を示すペプチドを提示する体細胞を排除することにあり、そのためそれらは細胞傷害性T細胞とも呼ばれている。
【０００７】
MHCクラスIIは専門の抗原提示細胞（APC）においてのみ発現される。これらには、APCによって主にエンドサイトーシスにより摂取されたタンパク質由来のペプチドが提示される。MHCクラスIIの認識は、CD4+T細胞の表面上にのみ発現される共受容体CD4を必要とする。Tヘルパー細胞とも呼ばれるこれらのT細胞の主な役割は、CD8+T細胞、マクロファージ、およびB細胞の活性化である。好適なエピトープのAPCへの送達は、このようにこれらのエピトープのMHCクラスIIを介するヘルパーT細胞への提示をもたらし、次に、これらのT細胞を活性化し、そして免疫系の他の手段を活性化する。重要なこととして、CD19/CD21複合体の共関与は、B細胞受容体単独の抗原による関与と比較して、抗原ペプチド／クラスII複合体のより迅速かつ効率的な産生をもたらすという実験的証拠が存在する（Fearon DT et al. (2000), Annu Rev Immunol 18:393-422）。
【０００８】
これまでにエピトープをAPCに送達するために使われた方法には、APCの可溶性抗原とのインキュベーション、弱毒化生微生物による感染、ワクシニアもしくは他のウイルス由来のウイルスベクターによる感染、およびDNAワクチンの注射が含まれる。しかしこれらの方法の結果は全ての事例において満足なものではなかった。
【０００９】
また、過剰反応（例えば、アレルギー）あるいは誤った反応（例えば自己免疫疾患）が存在する場合、APC、特にB細胞の枯渇または抑制が、疾患における適応免疫応答の減弱のために用いられている。しかし、利用し得る現行の治療では、これらの疾患は多くの場合満足な治療ができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kaech et al. (2002), Nature Reviews Immunology 2(4):251-62
【非特許文献２】Pulendran and Ahmed (2006), Cell 124(4):849-63
【非特許文献３】Fearon DT et al. (2000), Annu Rev Immunol 18:393-422
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ワクチンおよび他の免疫モジュレーターの改善の必要性は今なお存在する。本発明の根底にある技術的問題は、ワクチン接種および免疫モジュレーションの改善を可能にする手段と方法の提供とみなし得る。この技術的問題は、特許請求の範囲および以下の明細書で特徴付けられる実施形態により解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は、a)CD21、CD19、CD20、およびCD22からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質と結合する結合ペプチド、ならびに、b)少なくとも１つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドを含む、被験体における免疫応答のモジュレーションに用いるためのポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】EBV EBNA3Cタンパク質由来の5H11エピトープと融合した抗体またはそれらのそれぞれの重鎖（HC）の様々な量でパルスし、抗原提示細胞としてEBVで形質転換したB細胞（LCL）を用いて実施したT細胞アッセイ。試験した抗体はCD21、CD19およびCD22に特異的である。ポジティブ対照は5H11ペプチドエピトープとインキュベートした細胞を含み、ネガティブ対照は抗原を欠く抗CD19、抗CD21または抗CD22抗体を含む。結果はml当たりのピコグラムIFN-γで示す。
【図２】EBV EBNA3Cタンパク質由来の3H10エピトープと融合したCD21特異的抗体の様々な量でパルスし、抗原提示細胞としてEBVで形質転換したB細胞（LCL）またはバーキットリンパ腫細胞株AG876のいずれかを用いて実施したT細胞アッセイ。ポジティブ対照は3H10ペプチドエピトープとインキュベートした細胞を含み、ネガティブ対照は3H10を欠く抗CD21抗体または軽鎖を欠く3H10抗CD21融合タンパク質を含む。結果はml当たりのピコグラムIFN-γで示す。
【図３】EBNA3C-3H10を含む本発明に従うポリペプチドによる、EBVで形質転換したB細胞（LCL）およびバーキットリンパ腫細胞株の処理は、抗原提示と効率的なT細胞活性化をもたらす。B細胞を24時間、1ngのEBNA3Cエピトープを搭載したB細胞標的化抗体（αCD-21、-20、-19、および-22）により処理した。ポジティブ対照は増加する量（1ng〜1μg）の3H10ペプチド単独でパルスした細胞を含み、ネガティブ対照は無処理細胞、またはEBNA3C-3H10エピトープを含有しない抗体でパルスした細胞を含む。処理後、B細胞をEBN3C-3H10-特異的T細胞クローンと1：2の比で混合した。24時間後、T細胞活性化の指標としてIFNγの分泌をELISAにより測定した。結果をpg/mlで示す。
【図４】EBNA3C-3H10を含む本発明に従うポリペプチドによる抗原提示は、CD4+T細胞によるペプチド特異的細胞死をもたらす。LCLをEBNA3C-3H10を搭載したαCD19抗体（CD19-3H10Ab；1ngおよび10ng）、エピトープを含有しないαCD19抗体（CD19Ab）、またはEBNA3Cペプチドで処理するか、または無処理で放置した。これらの標的細胞を次いで 51Crで標識し、4時間、EBNA3C-3H10-特異的エフェクターT細胞と共に、増加するエフェクター：標的比（1：1、3：1、6：1、12：1、25：1、50：1）にてインキュベートした。51Cr-放出アッセイを実施し、特異的細胞殺滅の尺度として標的LCL集団の％溶解を測定した。
【図５】実施例5のマウス実験に対するMCMV感染、リンパ腫細胞送達および抗体処理の全体スケジュール。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は本明細書で以下に記載した、少なくとも１つの結合ペプチドおよび少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含むあらゆる化学分子に関する。結合ペプチドと免疫原性ペプチドの間の化学結合は必ずしもペプチド結合である必要がないことは理解されよう。また、本発明では、結合ペプチドと免疫原性ペプチドの間の化学結合はエステル結合、ジスルフィド結合、または当業者に公知のあらゆる他の好適な共有結合であることも考えられる。また、解離定数が低いために免疫原性ペプチドが結合ペプチドから無視し得る程度しか解離しない非共有結合も考えられる。好ましくは、前記非共有結合の解離定数は、（Strep-Tag：Strep-Tactin結合の場合と同様に）10-5mol/l未満、（Strep-TagII：Strep-Tactin結合の場合と同様に）10-6mol/l未満、10-8mol/l未満、10-10mol/l未満、または（ストレプトアビジン：ビオチン結合の場合と同様に）10-12mol/l未満である。解離定数を決定する方法は当業者には周知であり、例えば、分光滴定、表面プラズモン共鳴測定、平衡透析などが含まれる。好ましくは、結合ペプチドと免疫原性ペプチドの間の化学結合はペプチド結合であり、すなわち、ポリペプチドは、本発明の結合ペプチドと免疫原性ペプチドを含むかまたはそれらから成る融合ポリペプチドである。好ましくは、ポリペプチドは抗原提示を阻害することが知られる1以上のペプチド配列を含まない。さらに、好ましくは、ポリペプチドは遺伝子材料、すなわち、ポリヌクレオチドを含まない。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは本明細書に記載の成分から成る。
【００１５】
本明細書で使用される用語「結合ペプチド」は、B細胞受容体複合体（BCRC）の少なくとも１つのタンパク質と結合するあらゆるペプチドに関し、ここで、BCRCのタンパク質は、好ましくは、B細胞による前記結合ペプチドの内部移行を可能にするアフィニティを有するCD21、CD19、CD20およびCD22である。好ましくは、前記結合ペプチドの前記B細胞受容体複合体のタンパク質との結合についての解離定数は、10-5mol/l未満、10-6mol/l未満、10-7mol/l未満、10-8mol/l未満、または10-9mol/l未満である。好ましくは、結合ペプチドはエプスタイン・バーウイルス（EBV、ヒトヘルペスウイルス4とも呼ばれる）糖タンパク質gp350/220（gp350、遺伝子：配列番号1、Genbank受託番号：NC_009334.1GI：139424470、タンパク質産物：配列番号2、Genbank受託番号：YP_001129462.1GI：139424497）のN-末端由来のペプチドであり、より好ましくはこの結合ペプチドはEBV gp350の最初の470アミノ酸またはEBV gp350の他のCD21-結合ペプチドを含む。他の好ましい実施形態において、結合ペプチドは、上記B細胞受容体複合体タンパク質（BCRCタンパク質）の少なくとも１つと結合する抗体である。好ましい結合ペプチドは、次の通りである：
・Genbank受託番号：GQ850526.1 GI：282721923、配列番号13によってコードされる重鎖（配列番号25）を含み、Genbank受託番号：GQ850527.1 GI：282721925、配列番号14によってコードされる軽鎖（配列番号26）を含むマウス抗ヒトCD21抗体；
・Genbank受託番号：X99230.1 GI：1435158、配列番号37によってコードされる重鎖可変部フラグメント（例えば、配列番号15によってコードされる配列番号27の重鎖）を含み、Genbank受託番号：X99232.1 GI：1435165、配列番号38によってコードされる軽鎖可変部フラグメント（例えば、配列番号16によってコードされる配列番号28の軽鎖）を含むマウス抗ヒトCD19抗体；
・Genbank受託番号：S77347 GI：998423、配列番号39によってコードされる重鎖可変部フラグメント（例えば、配列番号17によってコードされる配列番号29の重鎖）を含み、Genbank受託番号：S77340 GI：998421、配列番号40によってコードされる軽鎖可変部フラグメント（例えば、配列番号18によってコードされる配列番号30の軽鎖）を含むマウス抗ヒトCD22抗体；
・Genbank受託番号：AY058907.1 GI：16902039、配列番号41によってコードされる重鎖可変部フラグメント（例えば、配列番号19によってコードされる配列番号31の重鎖）を含み、Genbank受託番号：AY058906.1GI：16902037、配列番号42によってコードされる軽鎖可変部フラグメント（例えば、配列番号20によってコードされる配列番号32の軽鎖）を含むマウス抗ヒトCD20抗体。
【００１６】
本明細書で使用する用語「抗体」は、クラスIgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMのいずれか由来の可溶性免疫グロブリンに関する。BCRCタンパク質に対する抗体は周知の方法により精製タンパク質またはそれ由来の好適なフラグメントを抗原として用いて調製することができる。抗原として好適なフラグメントは当技術分野で周知の抗原性決定アルゴリズムにより同定することができる。かかるフラグメントは本発明のポリペプチドからタンパク質分解消化により得てもよく、または合成ペプチドであってもよい。好ましくは、抗原として好適なペプチドはその自然環境においてB細胞の外部に位置している。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒトもしくはヒト化抗体またはそれらの霊長類化、キメラ化抗体またはそれらのフラグメントである。より好ましくは、抗体は１本鎖抗体である。二重特異性抗体、合成抗体、抗体フラグメント、例えば、Fab、FvまたはscFvフラグメントなど、またはこれらのいずれかの化学的に改変された誘導体もまた、本発明の抗体として含まれる。好ましくは、本発明の抗体は、本発明のBCRCタンパク質と特異的に結合する（すなわち、他のポリペプチドもしくはペプチドと交差反応しない）。特異的結合は様々な周知の技術により試験することができる。抗体またはそれらのフラグメントは、例えば、Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載の方法を用いて得ることができる。モノクローナル抗体は、マウス骨髄腫細胞と免疫化哺乳動物由来の脾臓細胞との融合を含む、最初にKohler and Milstein (1975), Nature 256, 495；およびGalfre (1981), Meth. Enzymol. 73, 3に記載された技術により調製することができる。
【００１７】
好ましくは、結合ペプチドは免疫原性ペプチドとアミノ酸配列において隣接する、すなわち、結合ペプチドと免疫原性ペプチドは融合ポリペプチドを形成する。より好ましくは、融合ポリペプチドは、抗体の重鎖または軽鎖と融合した免疫原性ペプチドを含む。最も好ましくは、融合ポリペプチドはBCRCタンパク質と結合するマウス抗体の重鎖と融合したEBV EBNA3C由来の免疫原性ペプチド、例えば、配列番号33（配列番号21によってコードされる、EBNA3C-5H11エピトープと融合した抗CD21重鎖））、配列番号34（配列番号22によってコードされる、EBNA3C-5H11エピトープと融合した抗CD19重鎖）、配列番号35（配列番号23によってコードされる、EBNA3C-5H11エピトープと融合した抗CD22重鎖）、または配列番号36（配列番号24によってコードされる、EBNA3C-5H11エピトープと融合した抗CD20重鎖）の融合タンパク質を含む。しかし、好ましくは、結合ペプチドが、本明細書に記載の免疫原性ペプチドと結合するアダプター分子にアミノ酸配列において隣接することもまた、本発明によれば考えられる。かかる場合、免疫原性ペプチドが、好ましくは、結合ペプチドと融合したアダプター分子と共有または非共有結合で結合するのに好適なアダプター分子を含むことは当業者には明らかであり、例えば、好ましくは、結合ペプチドはStrep-Tagと融合しかつ免疫原性ペプチドはStrep-Tactinと融合している。
【００１８】
本明細書で使用する用語「CD21」は、補体受容体2（CR2）としても知られるヒト表面抗原分類タンパク質（cluster of differentiation protein）21、（転写変異体1：配列番号3、Genbank受託番号：NM_001006658.2 GI：260099695、タンパク質産物 配列番号4、Genbank受託番号：NP_001006659.1 GI：54792123；転写変異体2：配列番号5、Genbank受託番号：NM_001877.4 GI：260099700、タンパク質産物 配列番号6、Genbank受託番号：NP_001868.2 GI：42544177）に関する。用語「CD19」はヒト表面抗原分類タンパク質19（転写物 配列番号7、Genbank受託番号：NM_001178098.1 GI：296010920；タンパク質産物 配列番号8、Genbank受託番号：NP_001171569.1 GI：296010921）に関する。用語「CD20」はヒト表面抗原分類タンパク質20（転写物 配列番号9、Genbank受託番号：NM_152866.2 GI：68348720；タンパク質産物 配列番号10、Genbank受託番号：NP_068769.2 GI：23110987）に関する。用語「CD22」はヒト表面抗原分類タンパク質（転写物 配列番号11、Genbank受託番号：NM_001771.3 GI：297374826、タンパク質産物 配列番号12、Genbank受託番号：NP_001762.2 GI：157168355）に関する。BCRCタンパク質CD21、CD19、CD20、およびCD22に対する用語はまた、哺乳動物におけるそれぞれのタンパク質のホモログ、オーソログ、および天然変異体（例えばスプライス変異体から翻訳された変異体）を含むことが、本発明により考えられる。
【００１９】
本明細書で使用する用語「免疫原性ペプチド」は少なくとも１つのT細胞エピトープを含むペプチドに関する。T細胞エピトープは、当業者に公知であるように、細胞（MHC-I）または専門の抗原提示細胞（MHC-II）の表面上に提示される主要組織適合性複合体（MHC）クラスIまたはクラスII分子と結合し得るペプチドに含まれるアミノ酸の隣接配列である。当業者はMHC-IまたはMHC-IIに提示される免疫原性ペプチドを予測する方法（Nielsen et al., (2004), Bioinformatics, 20 (9), 1388-1397)、Bordner (2010), PLoS ONE 5(12): e14383）および特異的ペプチドの結合を評価する方法（例えば、Bernardeau et al., (2011), J Immunol Methods, 371(1-2):97-105）を知っている。好ましくは、T細胞エピトープはMHC-IIエピトープである。好ましくは、T細胞エピトープは腫瘍抗原由来のエピトープ、すなわち、本質的に腫瘍細胞中もしくは上にのみ発現されるタンパク質に含まれるアミノ酸配列である。好ましい実施形態において、T細胞エピトープはB細胞リンパ腫の腫瘍抗原由来のエピトープである。より好ましくは、T細胞エピトープはEBVの潜在遺伝子産物由来のエピトープである。最も好ましくは、T細胞エピトープは細胞形質転換に寄与することが公知であるかまたは疑われるEBVの潜在遺伝子産物の1つに含まれるアミノ酸配列、すなわち、EBV EBNA2、LMP1、EBNA3A、-Bおよび-Cタンパク質のうちの1つである（Long et al. (2011), Curr Opin Immunol 23(2):258-64）。好ましい実施形態において、T細胞エピトープは以下に記載の強力なT細胞エピトープである。
【００２０】
本明細書で使用する用語「免疫応答のモジュレーション」は、本発明のポリペプチドの適用による被験体の適応免疫系の応答における変化の誘導に関する。モジュレーションは活性化、すなわち、T細胞エピトープに対する応答の増進の誘導であってもよく；またはモジュレーションは抑制、すなわち、応答の減少、例えば、T細胞エピトープに対する寛容性の誘導であってもよい。免疫応答のモジュレーションは、好ましくは、被験体において有意な程度、疾患もしくは障害またはそれらに付随する症状の寛解をもたらすか、または好ましくは、免疫応答のモジュレーションは、被験体において一定期間疾患または障害についての健康の維持ももたらす。本明細書で使用する前記免疫応答のモジュレーションの効果にはまた、疾患または障害についての健康の全体的復元も含まれる。本発明によって使用される免疫応答のモジュレーションは、治療される全ての被験体において有効でなくてもよいことは理解されよう。しかし、この用語は、疾患または障害を患う被験体の統計的に有意な部分がうまく治療され得るか、またはコホートもしくは集団の統計的に有意な患者の部分が、疾患もしくは障害もしくはそれらに付随する症候群を患うことから効果的に防止されることを必要とする。ある部分が統計的に有意であるかどうかは、当業者により様々な周知の統計評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値決定、スチューデントt検定、マン-ホイットニー検定などを用いて容易に決定され得る。好ましい信頼区間は少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%である。p値は好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。好ましくは、免疫応答のモジュレーションは、所与のコホートまたは集団の被験体の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%について有効である。好ましくは、免疫応答のモジュレーションは、感染病原体に対するワクチン接種、B細胞過剰増殖に対するワクチン接種、または自己免疫疾患を引き起こす抗原に対する寛容性の誘導に関する。
【００２１】
本明細書で使用する用語「感染病原体」は、好ましくは被験体の疾患を引き起こす微生物に関する。好ましくは、感染病原体は細菌、真核生物感染病原体、例えば、マラリア原虫（Plasmodium spp.）、より好ましくはウイルス、例えば、肝炎ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルス（HIV）である。好ましい実施形態において、感染病原体は慢性疾患を引き起こす病原体である。より好ましくは、感染病原体は慢性および／または持続性感染を引き起こす病原体である。さらにより好ましくは、感染病原体は前記感染病原体の少なくとも１つの抗原決定基のモジュレーションにより慢性および／または持続性感染を引き起こす病原体である。最も好ましくは、上記抗原決定基の少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20のモジュレートされた型が公知であり、好ましくは、被験体の体内に生じることが公知である。さらに好ましい実施形態において、上記のモジュレートされた抗原決定基はポリペプチドである。
【００２２】
本明細書で使用する用語「B細胞過剰増殖」は、正常と比較したB細胞増殖の増加に関する。好ましくは、B細胞過剰増殖は、感染性単核球症または移植後リンパ球増殖性障害（PTLD）、またはB細胞リンパ腫をはじめとするEBVに関連する疾患である。
【００２３】
本明細書で使用する用語「寛容性の誘導」は、被験体の免疫原性ペプチドに対する応答の減少の誘導に関する。好ましくは、寛容性は、自己免疫疾患を患うかまたは患うリスクのある被験体において誘導される。また好ましくは、寛容性は、それに対する免疫応答が前記自己免疫疾患を悪化させることが公知である免疫原性ペプチドに対して誘導される。好ましい自己免疫疾患は多発性硬化症、慢性関節リウマチ、もしくは自己免疫性甲状腺炎、またはそれに対する免疫反応性T細胞エピトープが同定されている他の自己免疫疾患である。
【００２４】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本明細書で以下に定義されるポリペプチドのプール、本明細書で以下に定義されるポリヌクレオチドのプール、および本明細書で以下に定義されるベクターのプールに関する。
【００２５】
本発明のポリペプチドの適用により達成されるモジュレーションの種類は、いくつかの因子に依存する：APCの型が免疫応答の結果に著しい影響を与え；休止Bリンパ球は典型的には寛容性を誘導するが、樹状細胞および免疫芽細胞などの活性化B芽細胞は活性化を誘導する。従って、B細胞リンパ腫などの活性化B細胞の標的化はT細胞の認識および最終的にはそれらの排除をもたらす。対照的に、自己抗原による休止B細胞の標的化はその寛容性をもたらす。送達する抗原の用量も重要な役割を果たし；非常に低いおよび高い量の抗原は寛容性を誘導しがちであり、中間の量はT細胞活性化をもたらす。さらに、CD19、CD21もしくはCD20を標的化する抗体もしくはポリペプチドの免疫刺激効果、または対照的にCD22に対する抗体のB免疫抑制効果も、抗原送達の結果に影響を与える。
【００２６】
用語「被験体」は、その生物にとって外来の分子に対する免疫応答を生じさせる能力を持ちかつ少なくとも１つのBCRCタンパク質を含む動物、好ましくは哺乳動物に関する。より好ましくは、被験体はウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、マウス、またはラット、最も好ましくはヒトである。
【００２７】
以上の定義は以下に準用し得る。
【００２８】
本発明はまた、免疫原性ペプチドと共有結合しているか、または免疫原性ペプチドと結合するアダプターを有する結合ペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００２９】
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、好ましくは、本明細書の上記の結合ペプチドおよび免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする、あるいは本明細書の上記の結合ペプチドおよびアダプターペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。上記の結合ペプチドおよび免疫原性ペプチドの活性を測定するための好適なアッセイは付随する実施例に、または（Adhikary et al. (2006), J. Exp. Med. 203(4):995-1006；Busse et al. (2010), J. Virology 84(2):1139-47；Gurer et al. (2008), Blood 112(4):1231-9）：1231-9）に記載されている。上記ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明に従って、周知の技術を用いて、免疫原性ペプチドをBCRCの結合タンパク質と特異的に結合するポリペプチド中にクローニングすることにより得た。
【００３０】
従って、該ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号33〜36に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号21〜24に示される核酸配列を含む。配列番号21〜24に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、縮重遺伝コードに応じて他のポリヌクレオチドによっても同様にコードされ得ることは理解されよう。
【００３１】
さらに、本発明に従って使用される用語「ポリヌクレオチド」は、さらに上記の特定のポリヌクレオチドの変異体を包含する。ポリヌクレオチド変異体は、好ましくは、その配列が配列番号21〜24に示される上記の特定の核酸配列から少なくとも１つのヌクレオチド置換、付加および／または欠失により誘導することができ、それによってその変異体核酸配列がまだ上記活性を含むポリペプチドをコードし得ることを特徴とする核酸配列を含む。変異体には、配列番号21〜24に示される核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。さらに、配列番号33〜36に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドもまた包含される。パーセント同一性の値は、好ましくは、アミノ酸または核酸配列領域全体にわたって計算される。当業者は様々な配列を比較するために、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムを利用し得る。これに関して、NeedlemanおよびWunschまたはSmithおよびWatermanのアルゴリズムが特に信頼し得る結果を与える。配列アラインメントを行うには、プログラムPileUp（J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987；Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153）またはプログラムGapおよびBestFit［Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)）およびSmith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))］が用いられ、これらはGCGソフトウエアパケット ［Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)］の一部分である。上記のパーセント（％）での配列同一性の値は、好ましくは、全配列領域にわたってプログラムギャップを次の設定：ギャップウエイト：50、長さウエイト：3、平均マッチ：10.000および平均ミスマッチ：0.000を用いて決定され、特に断らない限り、常にこれを配列アラインメントに対する標準設定として用いる。
【００３２】
上記の核酸配列のいずれかのフラグメントを含むポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドとして包含される。該フラグメントはなお上記の活性を有するポリペプチドをコードし得る。従って、該ポリペプチドは前記生物学的活性を与える本発明のペプチドを含むかまたはそれらから成り得る。本明細書で意味するフラグメントは、好ましくは、上記核酸配列の少なくとも50、少なくとも100、少なくとも250または少なくとも500の連続ヌクレオチドを含むか、または上記アミノ酸配列の少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも80、少なくとも100または少なくとも150の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、上記核酸配列から本質的に成るかまたは上記核酸配列を含むかのいずれかである。従って、それらは同様にさらなる核酸配列を含有し得る。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質の1つのパートナーが上記核酸配列によりコードされるポリペプチドである融合タンパク質をコードし得る。かかる融合タンパク質は追加部分として、発現をモニタリングするための他のポリペプチド（例えば、緑色、黄色、青色または赤色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼなど）または検出可能なマーカーとしてまたは精製目的のための補助手段として役立ち得る、いわゆる「タグ」を含んでもよい。様々な目的のタグは当技術分野で周知であり、FLAG-タグ、6-ヒスチジン-タグ、MYC-タグなどが含まれる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された（すなわち、その自然環境から単離された）ポリヌクレオチドまたは遺伝子改変した形で提供され得る。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、cDNAを含むDNAまたはRNAである。この用語は1本鎖ならびに2本鎖のポリヌクレオチドを包含する。さらに、天然の改変ポリヌクレオチド、例えば、グリコシル化またはメチル化ポリヌクレオチドまたは人工の改変ポリヌクレオチド、例えば、ビオチン化ポリヌクレオチドも含まれる。
【００３５】
本発明はさらに本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３６】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスもしくはレトロウイルスベクターならびに人工染色体、例えば、細菌または酵母の人工染色体を包含する。さらに、この用語はまた、標的化構築物のゲノムDNA中への無作為のもしくは部位特異的な組み込みを可能にする標的化構築物に関する。かかる標的構築物は、好ましくは、以下に詳しく記載した同種または異種のいずれの組換えに対しても十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、さらに宿主中の増殖および／または選択のための選択可能なマーカーを含む。ベクターは、当技術分野で周知の様々な技術によって、宿主細胞中に組み込まれ得る。例えば、プラスミドベクターをリン酸カルシウム沈殿物もしくは塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物に、または帯電脂質との複合体に、またはフラーレンなどの炭素系クラスタに導入することができる。あるいは、プラスミドベクターを熱ショックまたはエレクトロポレーション技術により導入してもよい。ベクターがウイルスであれば、宿主細胞に適用する前に、適当なパッケージング細胞株を用いてin vitroでパッケージングしてもよい。レトロウイルスベクターは複製コンピテントまたは複製不全であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に補完性宿主／細胞（complementing host/cell）でのみ起こり得る。
【００３７】
より好ましくは、本発明のベクターにおいて、ポリヌクレオチドは、原核もしくは真核細胞またはそれらの単離された画分における発現を可能にする発現調節配列と機能的に連結される。前記ポリヌクレオチドの発現はポリヌクレオチドの、好ましくは、翻訳可能なmRNAへの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする調節エレメントは当技術分野で周知である。それらは、好ましくは、転写の開始を確実にする調節配列および、任意に、転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリ-Aシグナルを含む。さらなる調節エレメントは転写ならびに翻訳エンハンサーを含み得る。原核生物の宿主細胞における発現を可能にする考えられる調節エレメントは、例えば、大腸菌中のlac、trpまたはtacプロモーターを含み、そして真核生物の宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母中のAOX1もしくはGAL1プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞中のCMV-、SV40-、RSV-プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサーまたはグロビンイントロンである。さらに、誘導可能な発現調節配列を本発明により包含される発現ベクターに用いてもよい。かかる誘導ベクターは、tetまたはlacオペレーター配列または熱ショックもしくは他の環境因子により誘導可能な配列を含んでもよい。好適な発現調節配列は当技術分野で周知である。転写開始に関わるエレメントに加えて、かかる調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、例えば、SV40-ポリ-A部位またはtk-ポリ-A部位を含み得る。この文脈において、好適な発現ベクター、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pBluescript（Stratagene）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（InVitrogene）またはpSPORT1（GIBCO BRL）が当技術分野で公知である。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターおよび遺伝子伝達または標的化ベクターである。ウイルス、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルス由来の発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの標的化細胞集団中への送達に用いてもよい。当業者に周知である方法を用いて組換えウイルスベクターを構築することができる：例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載の技術を参照されたい。
【００３８】
好ましくは、ベクターは宿主細胞中の本発明のポリヌクレオチドの発現を媒介するベクターである。当業者は、ベクターの増殖のためおよび／またはベクターによりコードされるタンパク質の発現のための、ベクターと宿主細胞の組み合わせを選択する方法を知っている。
【００３９】
さらに、本発明は本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４０】
本明細書で使用する「宿主細胞」は本発明のベクターを増殖させるおよび／または本発明のベクターまたはポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを産生する能力を有する細菌、古細菌、または真核細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は大腸菌類由来の細菌細胞、鱗翅目類、マウス、ラット、またはヒト細胞である。好ましくは、宿主細胞はin vitroで培養した細胞、より好ましくは293HEK細胞である。また、好ましくは、宿主細胞はAPC、より好ましくはB細胞、最も好ましくはリンパ節由来の活性化B細胞、リンパ芽球細胞、休止B細胞、または例えばリンパ腫由来の新生物B細胞である。
【００４１】
本発明は、抗原特異的T細胞を刺激する方法であって、a)抗原提示細胞（APC）を本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターと接触させるステップ、b)前記APCをT細胞と接触させるステップ、およびc)それにより前記少なくとも１つのT細胞エピトープに特異的な抗原特異的T細胞を刺激するステップを含む前記方法を意図する。
【００４２】
本発明の方法は、好ましくは、in vitroの方法である。さらに、該方法は以上に明記したものに加えてさらなるステップを含み得る。例えば、さらなるステップは、例えば、ステップa)のために抗原提示細胞（APC）を単離すること、またはステップb)においてT細胞刺激剤を含むことに関し得る。
【００４３】
本明細書で使用する用語「抗原」は、本発明のT細胞エピトープの供給源として選ばれるタンパク質に関する。用語「抗原特異的T細胞」は、それらの表面上に、MHC分子との関連で提示される本発明のT細胞エピトープを特異的に認識、すなわち結合するT細胞受容体分子を提示するT細胞に関する。好ましくは、MHC分子はMHCクラスII分子であり、従って、好ましくは、T細胞はCD4+T細胞である。
【００４４】
本発明の方法の文脈で使用する用語「接触」は当業者に理解されている。好ましくは、この用語は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を被験体、または好ましくは、細胞と物理的に接触させること、すなわち、上記成分の相互作用を可能にすることに関する。
【００４５】
本明細書で使用する用語「抗原提示細胞」または「APC」はその表面上にBCRCタンパク質の少なくとも１つを発現するB細胞または濾胞性樹状細胞に関する。好ましくは、APCはB細胞、より好ましくはリンパ節由来の活性化B細胞、リンパ芽球細胞、休止B細胞、または例えばリンパ腫由来の新生物B細胞である。
【００４６】
さらに、被験体を感染病原体に対して免疫化する方法であって、a)前記被験体に本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターのプールを接触させるステップ、および、b)それにより前記被験体を感染病原体に対して免疫化するステップを含む前記方法が本発明に包含される。
【００４７】
本明細書で使用する用語「ポリペプチドのプール」は、特定の感染病原体に長期にわたり感染した患者に見出される免疫原性ペプチドのライブラリーから選択される少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100の異なる免疫原性ペプチドを含む本発明に従うポリペプチドのコレクションに関する。当業者は、前記免疫原性ペプチドのライブラリーを確立する方法を知っている（Reineke, U., et al. (2002) J. Immunol. Methods. 267(1):37-51；Milosevic, S., et al. (2006), J. Virol. 80(21):10357-10364；Pedroza-Roldan, C., et al. (2009), 47:270-282）。用語「ポリヌクレオチドのプール」および「ベクターのプール」は、準用して理解されるであろう。
【００４８】
本発明は、被験体をB細胞過剰増殖に対して免疫化する方法であって、a)前記被験体を、免疫原性ペプチドとして強力なT細胞エピトープを含むポリペプチド、強力なT細胞エピトープをコードする配列を含む本発明のポリヌクレオチド、または強力なT細胞エピトープをコードする配列を含む本発明のベクターと接触させるステップ、およびb)それにより、被験体をB細胞過剰増殖に対して免疫化するステップを含む前記方法に関する。
【００４９】
用語「強力なT細胞エピトープ」は、T細胞エピトープを認識するT細胞が被験体に存在する確率が高い前記T細胞エピトープに関する。好ましくは、強力なT細胞エピトープを認識するT細胞が被験体において高頻度で存在する。好ましくは、T細胞エピトープは、前記被験体によく感染するか、または、それに対して前記被験体がワクチン接種されたウイルスのタンパク質から選択される。より好ましくは、強力なT細胞エピトープは免疫化に用いたウイルスタンパク質から選択される。最も好ましい強力なT細胞エピトープは、例えば、EBNA-3C 3H10ペプチド（VVRMFMRERQLPQS、配列番号43）などのEBV潜在抗原由来である。
【００５０】
本発明はまた、被験体の寛容性を誘導する方法であって、a)前記被験体を、寛容性を誘導するポリペプチド、寛容性を誘導するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または寛容性を誘導するポリペプチドをコードするベクターと接触させるステップ、およびb）それにより被験体に寛容性を誘導するステップを含む前記方法に関する。
【００５１】
本明細書で使用する「寛容性を誘導するポリペプチド」は、被験体において免疫原性ペプチドに対する応答の減少を誘導する本発明のポリペプチドに関する。好ましくは、寛容性を誘導するポリペプチドは、結合ペプチドとしてCD22を認識する結合ペプチドを含み、より好ましくは、寛容性を誘導するポリペプチドは免疫原性ペプチドと融合した抗CD22抗体である。
【００５２】
本明細書に引用した全ての文献は、本明細書に参照によりその全開示内容および具体的に本明細書に記載した開示内容が組み込まれる。
【００５３】
以下の実施例は、単に本発明を説明するためのものである。これらは、いかなる意味でも、本発明の範囲を限定すると考えてはならない。
【実施例】
【００５４】
実施例１
CD21、CD19およびCD22に対する抗体を、エプスタイン・バーウイルス潜在抗原EBNA3C由来の抗原エピトープ（5H11）と融合した。この融合タンパク質を用いて該エピトープを、エプスタイン・バーウイルスにより形質転換したB細胞（リンパ芽球細胞株、LCL）のエンドソーム中に導入した。その後、パルスしたB細胞をEBNA3C 5H11エピトープに特異的であるT細胞クローンと共培養した。T細胞活性化を上清中のインターフェロン-γ放出を測定することにより評価した。
【００５５】
5H11エピトープと直接インキュベートしたLCLをポジティブ対照として用いた。軽鎖を欠く抗体-5H11融合タンパク質を、エピトープと融合していないネガティブ対照として用いた。
【００５６】
20pgの5H11を有する1ngのCD21-5H11融合タンパク質は、1μgのペプチドで得たのと同等の免疫応答を誘導した（図1）。従って、活性化B細胞の抗原提示効率は、CD21との融合後でエピトープ単独より50.000倍高かった。同様の結果がCD19、CD20、およびCD22特異的抗体により得られた。無処理のEBV不死化したB細胞がクラスII経路で5H11を提示できないことに注目することが重要である。
【００５７】
実施例２
LCLおよびAG876バーキットリンパ腫細胞株を抗原提示B細胞として用い、CD21特異的抗体と融合したEBNA3Cタンパク質由来の3H10エピトープを提示するそれぞれの能力を、インターフェロン-γ放出アッセイにより測定した。3H10ペプチド単独をポジティブ対照とし、重鎖または軽鎖を欠く非機能性融合タンパク質、偽処理した抗原提示細胞をネガティブ対照とした。
【００５８】
LCLおよびAG876の両方は3H10エピトープを同様の効率で提示した（図2）。AG876は、CD21抗体-3H10融合タンパク質とのインキュベーション後に、LCLより低い効率で3H10を提示したが、コンジュゲートしていない3H10よりおよそ100倍効率的なままであった。この相対的な効率の減少は、バーキットリンパ腫細胞における不完全な抗原プロセシング機構と一致する。それにも関わらず、CD21抗体-3H10融合タンパク質は腫瘍細胞に対して強力な免疫応答を誘導した。
【００５９】
実施例2.1：EBVで形質転換したB細胞および様々なバーキットリンパ腫細胞株における、本発明に従うポリペプチドのさらなる評価
様々なEBVエピトープを搭載した抗体のパネルを作製した。これらを、ペプチド特異的T細胞に抗原を提示しかつこれらのT細胞を活性化するその能力について評価した。図3に、EBNA3Cタンパク質由来のエピトープを含む本発明に従うポリペプチドを用いる処理の一例を示す。本発明者らは、本発明に従うこれらのポリペプチドを用いる処理がLCLおよびいくつかのバーキットリンパ腫細胞株における特異的なT細胞活性化をもたらすことを示すことができた。
【００６０】
実施例2.2：本発明に従うポリペプチドを用いる処理により活性化したT細胞の、標的細胞を殺滅する潜在能力の判定
本発明に従うポリペプチドはペプチド特異的T細胞を効率的に活性化できるので、本発明者らは、これらの活性化T細胞が、免疫原性ペプチド由来のエピトープを提示するB細胞を特異的に殺滅できるかどうかを判定しようとした。本発明者らは51Cr-放出アッセイを実施して活性化T細胞が実際にその標的を殺滅できることを実証した。図4はLCLにおけるこの一例を示す。
【００６１】
実施例2.3：マウスリンパ腫モデルにおけるin vivo研究
本発明に従うポリペプチドのパネルを、通常のマウス病原体由来のT細胞エピトープを含む「武装抗体（armed antibodies）」の形で作製する。B細胞表面受容体CD-19、-20、-21および-22を標的化し、そしてそれらの抗体をpp89ペプチド（マウスサイトメガロウイルス（MCMV）のIEIタンパク質由来の免疫優性T細胞エピトープ）とカップリングする。これらの抗体をマウスリンパ腫のA20モデルにおいて研究する。A20細胞株のMCMV-陽性BALB/cマウスへの注射は、ヒトびまん性大B細胞リンパ腫（DLBCL）に似た疾患の進行をもたらす。
【００６２】
研究開始前に、MCMVに対する動物の血清状態を血清学により評価する。血清陰性の動物を、セロコンバージョンおよびMCMV pp89ペプチドに対するT細胞の初回刺激を確実にするためにMCMVに感染させる。A20リンパ腫細胞による静脈内チャレンジの4週間前に、全ての動物をウイルスに再感染させる（図5）。リンパ腫細胞送達の5日後および15日後に、動物をpp89ペプチドを含む組換え体AgAbで処理する。続いてマウスを、生存および腫瘍進行についてリンパ腫細胞のチャレンジ後、120日間モニタリングする。「the Society of Laboratory Animal Science （実験動物科学協会、GV-SOLAS）」が推奨するガイドラインに従って、苦痛の外部徴候（運動性低下および挙動変化など）が存在する場合、または、細胞注入後120日に有害な症候群が現れなければ、マウスを屠殺する。この実験スケジュールの模式図は図5を参照されたい。
【００６３】
研究コース中の2つの時点において腫瘍進行をモニタリングするために、分子共鳴イメージング（MRI）を用いる。MRIは腫瘍の可視化および腫瘍の体積分析実施の両方を可能にする。無処理グループで腫瘍発達の徴候が明らかである場合、および屠殺の前に再び、全マウスのイメージングを実施する。さらに、マウスの屠殺時に解剖学的および組織学的試験を実施する。
【００６４】
図5に概説した実験スケジュールを用いて、抗体および処理レジームのパネルを研究する。最初に、B細胞表面受容体、CD19、-20、-21および-22の全パネルに対する抗体を、抗体とアジュバント（ポリI:C）の同時処理を用いて試験する。ペプチド搭載および非搭載抗体をこれらの表面受容体の標的化において比較する。腫瘍成長と動物生存を、処理効力のマーカーとしてモニタリングし、無処理対照動物およびリンパ腫の無い動物と比較する。さらなる実験には、i)抗体処理の最も有効な用量の決定；およびii)武装抗体とCD20／リツキシマブの共注入による治療効能の評価が含まれる。実際、CD21またはCD19に対する抗体は、代わりに抗CD20抗体が与え得る低い細胞傷害特性を示し、それ故に、リンパ腫細胞に対する攻撃の2つの異なる切り口の組み合わせが見出された。
【００６５】
抗体のパネルをA20リンパ腫モデルで試験し終わると、研究を他のリンパ腫モデルに拡げた。これには、接種経路（腹腔内または静脈内それぞれ）に応じて、BCL1細胞がDLBCL様またはCLL様リンパ腫を誘導し得るBCL1モデル、およびB6-mycトランスジェニックマウス由来の細胞を用いるバーキットリンパ腫様モデルが含まれる。
【００６６】
実施例3
Bリンパ球細胞の表面における微生物抗原の提示は、これらの抗原に特異的なT細胞を介する認識および破壊を誘導する。これらのT細胞は普通のウイルス、例えばヘルペスウイルスに以前に感染したほとんどの個体に存在する。慢性肝炎CまたはHIVに感染した個体は、効率的に抗原を提示できる活性化B細胞の比率が増加していた（Moir and Fauci, 2009, Nat Rev Immunol; Sugalski, Rodriguez, Moir, Anthony, 2010, J. Immunology）。これらの感染病原体はその表面抗原を改変する内因性能力を有し、その後、これらは宿主免疫系が適応し得るより速く進化することができる。結果として、感染した患者はその感染を一掃することができない。
【００６７】
この問題を克服するために、長期にわたる感染を経た患者に見出され、感染の過程で現れるウイルス抗原のスペクトルをカバーし、かつウイルス進化の全段階を含むC型肝炎抗原のライブラリーとカップリングした抗CD21抗体を含む、ポリペプチドのライブラリーを作製する。この抗体ライブラリーを最近C型肝炎になった患者に投与し、こうして全ての潜在ウイルス変異体に対する患者の免疫系を初回刺激し、それらの排除を可能にする。
【００６８】
同じ方法を、長期にわたる感染を経た患者に見出され、感染の過程で現れるウイルス抗原のスペクトルをカバーしかつウイルス進化の全段階を含むHIV抗原のライブラリーを用いて、HIVに最近感染した患者に適用する。
【００６９】
実施例4
通常のウイルスまたは細菌病原体由来の免疫優性ペプチド（例えば、EBV由来のEBNA3C）と融合した抗CD21抗体を含む抗体融合タンパク質を作成し、従来の方法により産生する。該抗体融合タンパク質をB細胞リンパ腫を患う患者に投与すると、それらはリンパ腫細胞により摂取される。リンパ腫細胞はEBNA3Cペプチドに含まれるT細胞エピトープを提示し、その後EBNA3C特異的T細胞を活性化し、次に、提示中のリンパ腫細胞を排除する。CD4+T細胞は「細胞傷害性」T細胞としても作用し、標的細胞の殺滅を調整し得る。CD8+T細胞への交差提示の可能性もある。
【００７０】
実施例5
ミエリン塩基性タンパク質（MBP）と融合した抗CD22抗体を含む抗体融合タンパク質を作成する。該融合タンパク質を高用量で患者に適用する。こうして、MBPに対する寛容性を誘導し、そして多発性硬化症の進行を抑制する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月26日(2018.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）CD22、CD19、CD20、及びCD21から成る群より選択される少なくとも1つのタンパク質と結合する結合ペプチドと、
b）少なくとも1つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドと、
を含むポリペプチドであって、前記免疫原性ペプチドがエプスタイン・バーウイルス(EBV)の潜在遺伝子由来の少なくとも1つのT細胞エピトープを含み、且つ前記T細胞エピトープがMHCクラスIIエピトープである、前記ポリペプチド。
【請求項２】
結合ペプチドが抗体である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
結合ペプチドが一本鎖抗体である、請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記結合ペプチドの少なくとも一部分が、前記免疫原性ペプチド、又は前記免疫原性ペプチドと結合するアダプターとアミノ酸配列において隣接する、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記T細胞エピトープが、EBVタンパク質EBNA2、LMP1、EBNA3A、EBNA3B及びEBNA3Cから成るリストより選択されるタンパク質に含まれるアミノ酸配列である、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記T細胞エピトープが配列番号４３のアミノ酸配列を含むエピトープである、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドが、配列番号３９によってコードされる重鎖可変部フラグメントを含み、且つ配列番号４０によってコードされる軽鎖可変部フラグメントを含むマウス抗ヒトCD22抗体を含むか、又は配列番号２３によってコードされる、EBNA3C-5H11エピトープと融合した抗CD22重鎖を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項８】
a）CD22、CD19、CD20、及びCD21から成る群より選択される少なくとも1つのタンパク質と結合する結合ペプチドと、
b）少なくとも1つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドと、
を含むポリペプチドの、被験体における免疫応答のモジュレーションのための薬剤の製造のための使用であって、前記免疫応答のモジュレーションが前記T細胞エピトープに特異的なCD4+T細胞の活性化を含む、前記使用。
【請求項９】
前記CD4+T細胞が細胞傷害性CD4+T細胞である、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記免疫応答のモジュレーションがB細胞過剰増殖に対する被験体のワクチン接種である、請求項８記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドである、請求項８記載の使用。
【請求項１２】
免疫応答のモジュレーションが活性化である、請求項８記載の使用。
【請求項１３】
免疫応答のモジュレーションが抑制である、請求項８記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項１４記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１７】
抗原特異的CD4+T細胞を刺激するin vitroの方法であって、
a）抗原提示細胞(APC)を、
(i)CD22、CD19、CD20、及びCD21から成る群より選択される少なくとも1つのタンパク質と結合する結合ペプチドと、
(ii)少なくとも1つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドと、
を含むポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させるステップ、
b）前記APCをT細胞と接触させるステップ、及び
c）それにより前記少なくとも1つのT細胞エピトープに特異的な抗原特異的CD4+T細胞を刺激するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
APCがB細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
APCがリンパ芽球細胞株(LCL)である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
a）CD22、CD19、CD20、及びCD21から成る群より選択される少なくとも1つのタンパク質と結合する結合ペプチドと、
b）少なくとも1つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドと、
を含むポリペプチドを含む、被験体における免疫応答のモジュレーションのための、好ましくはB細胞過剰増殖に対する被験体のワクチン接種のための医薬組成物であって、前記免疫原性ペプチドがエプスタイン・バーウイルス(EBV)の潜在遺伝子由来の少なくとも1つのT細胞エピトープを含む、前記医薬組成物。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドである、請求項２０記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本明細書に引用した全ての文献は、本明細書に参照によりその全開示内容および具体的に本明細書に記載した開示内容が組み込まれる。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）a)CD22、CD19、CD20、およびCD21からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質と結合する結合ペプチド、ならびにb)少なくとも１つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドを含む、B細胞過剰増殖に対する被験体のワクチン接種に用いるためのポリペプチド。
（２）結合ペプチドが抗体である、（１）に記載のポリペプチド。
（３）免疫原性ペプチドが、前記被験体によく感染するか、または前記被験体がそれに対してワクチン接種されているウイルスのタンパク質から選択される少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、（１）または（２）に記載のポリペプチド。
（４）免疫原性ペプチドがエプスタイン・バーウイルス（EBV）の潜在遺伝子由来の少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、（１）〜（３）のいずれか1に記載のポリペプチド。
（５）免疫原性ペプチドが腫瘍抗原由来の少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、（１）〜（４）のいずれか1に記載のポリペプチド。
（６）a)CD22、CD19、CD20、およびCD21からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質と結合する結合ペプチド、ならびにb)少なくとも１つのT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドを含む、被験体における免疫応答のモジュレーションに用いるためのポリペプチド。
（７）結合ペプチドが抗体である、（６）に記載のポリペプチド。
（８）免疫原性ペプチドが腫瘍抗原由来の少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、（６）または（７）に記載のポリペプチド。
（９）免疫原性ペプチドがエプスタイン・バーウイルス（EBV）の潜在遺伝子由来の少なくとも１つのT細胞エピトープを含む、（６）〜（８）のいずれか1に記載のポリペプチド。
（１０）免疫応答のモジュレーションが活性化である、（６）〜（９）のいずれか1に記載のポリペプチド。
（１１）結合ペプチドがCD21に対する抗体またはEBV gp350のCD21結合ペプチドを含むペプチドである、（１０）に記載のポリペプチド。
（１２）免疫応答のモジュレーションが抑制である、（６）〜（９）のいずれか1に記載のポリペプチド。
（１３）結合ペプチドがCD22に対する抗体である、（１２）に記載のポリペプチド。
（１４）結合ペプチドが一本鎖抗体である、（１）〜（１３）のいずれか1に記載のポリペプチド。
（１５）前記結合ペプチドの少なくとも一部分が前記免疫原性ペプチド、または前記免疫原性ペプチドと結合するアダプターとアミノ酸配列において隣接する、（１）〜（１４）のいずれか1に記載のポリペプチド。
（１６）（１５）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１７）（１６）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１８）（１６）に記載のポリヌクレオチドまたは（１７）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（１９）抗原特異的T細胞を刺激する方法であって、a）抗原提示細胞（APC）を（１）〜（１５）のいずれか1に記載のポリペプチド、（１６）に記載のポリヌクレオチド、または（１７）に記載のベクターと接触させるステップ、b）前記APCをT細胞と接触させるステップ、およびc）それにより前記少なくとも１つのT細胞エピトープに特異的な抗原特異的T細胞を刺激するステップを含む前記方法。
（２０）APCがB細胞である、（１９）に記載の方法。
（２１）APCがリンパ芽球細胞株（LCL）である、（２０）に記載の方法。
（２２）in vitroの方法である、（１９）〜（２１）のいずれか1に記載の方法。
（２３）被験体をB細胞過剰増殖に対して免疫化する方法であって、a)前記被験体を、免疫原性ペプチドとして強力なT細胞エピトープを含むポリペプチド、強力なT細胞エピトープをコードする配列を含む（１６）に記載のポリヌクレオチド、または強力なT細胞エピトープをコードする配列を含む（１７）に記載のベクターと接触させるステップ、およびb)それにより、前記被験体をB細胞過剰増殖に対して免疫化するステップを含む前記方法。
（２４）被験体を感染病原体に対して免疫化する方法であって、a）前記被験体を、（６）〜（１５）のいずれか1に記載のポリペプチドのプール、（１６）に記載のポリヌクレオチドのプール、または（１７）に記載のベクターのプールと接触させるステップ、およびb）それにより、前記被験体を感染病原体に対して免疫化するステップを含む前記方法。
（２５）被験体に寛容性を誘導する方法であって、a）被験体を、（１２）または（１３）に記載の寛容性を誘導するポリペプチド、（１２）または（１３）に記載の寛容性を誘導するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（１２）または（１３）に記載の寛容性を誘導するポリペプチドをコードするベクターと接触させるステップ、およびb）それにより被験体に寛容性を誘導するステップを含む前記方法。