(57)【要約】      （修正有）【課題】ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーに対して耐性または抵抗性のある、非トランスジェニック植物の作製する方法の提供。【解決手段】組換え原性オリゴ核酸塩基の使用し、5−エノールピルビルシキメート-3-リン酸合成酵素（EPSPS）をコードする遺伝子内の植物染色体または染色体外の配列に所望の突然変異をもたらし、所望の突然変異型タンパク質を得る。該タンパク質は野生型タンパク質と比較して触媒活性を実質的に維持しており、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対する植物の耐性または抵抗性を増大させ、かつ、該植物、その期間、組織もしくは細胞の野生型植物と比較して、除草剤が存在するか否かに関係なく、正常な成長または発達をもたらす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異型EPSPS遺伝子産物を発現し、野生型EPSPS遺伝子産物を発現する植物と比較して実質的に正常な成長を示す、非トランスジェニック除草剤耐性植物。
【請求項２】
突然変異型EPSPS遺伝子産物を発現し、該遺伝子産物が野生型EPSPS遺伝子産物と比較して実質的に同レベルの触媒活性を有する、非トランスジェニック除草剤耐性植物。
【請求項３】
除草剤が、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーである、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーがグリホサートである、請求項３記載の植物。
【請求項５】
EPSPS遺伝子が、シロイヌナズナのLeu173、Gly177、Thr178、Alal79、Metl80、Arg181、Pro182、Ser98、Ser255およびLeul98からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸位またはEPSPSパラログ内の相同なアミノ酸残基に突然変異を有している、請求項１または２に記載の植物。
【請求項６】
トウモロコシのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu97、Gly101、Thr102、Ala103、Met104、Arg105、Pro106、Ser23、Ser179およびLeu122からなる群より選択されたものである、請求項５記載の植物。
【請求項７】
アブラナのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu169、Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194からなる群より選択されたものである、請求項５記載の植物。
【請求項８】
ペチュニアのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu169、Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194からなる群より選択されたものである、請求項５記載の植物。
【請求項９】
トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、綿花、テンサイ、アブラナ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レンズマメ、ブドウおよびシバからなる群より選択される、請求項１または２に記載の植物。
【請求項１０】
突然変異型遺伝子が、EPSPS酵素内に、野生型の配列と比較して、下記の： 
(i) Leu173-Phe、
(ii) Gly177-AlaまたはIle、
(iii) Thr178-IleまたはValまたはLeu、
(iv) Ala179-Gly、
(v) Met180-Cys、
(vi) Arg181-LeuまたはSer、
(vii) Pro182-LeuまたはSer、
(viii) Ser98-Asp、
(ix) Ser255-Ala、
(x) Leu198-Lys：
の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす、請求項５記載の植物。
【請求項１１】
突然変異型遺伝子が、EPSPS酵素内に、野生型の配列と比較して、下記の：
(i) Leu97-Phe、
(ii) Gly101-AlaまたはIle、
(iii) Thr102-IleまたはValまたはLeu、
(iv) Ala103-Gly、
(v) Met104-Cys、
(vi) Arg105-LeuまたはSer、
(vii) Pro106-LeuまたはSer、
(viii) Ser23-Asp、
(ix) Ser179-Ala、
(x) Leu122-Lys：
の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす、請求項６記載の植物。
【請求項１２】
突然変異型遺伝子が、EPSPS酵素内に、野生型の配列と比較して、下記の：
(i) Leu169-Phe、
(ii) Gly173-AlaまたはIle、
(iii) Thr174-IleまたはValまたはLeu、
(iv) Ala175-Gly、
(v) Met176-Cys、
(vi) Arg177-LeuまたはSer、
(vii) Pro178-LeuまたはSer、
(viii) Ser94-Asp、
(ix) Ser251-Ala、
(x) Leu194-Lys：
の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす、請求項７記載の植物。
【請求項１３】
突然変異型遺伝子が、EPSPS酵素内に、野生型の配列と比較して、下記の：
(i) Leu169-Phe、
(ii) Gly173-AlaまたはIle、
(iii) Thr174-IleまたはValまたはLeu、
(iv) Ala175-Gly、
(v) Met176-Cys、
(vi) Arg177-LeuまたはSer、
(vii) Pro178-LeuまたはSer、
(viii) Ser94-Asp、
(ix) Ser251-Ala、
(x) Leu194-Lys：
の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす、請求項８記載の植物。
【請求項１４】
非トランスジェニック除草剤耐性または抵抗性植物を作製する方法であって、
a. 組換え原性オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入して、突然変異型EPSPS遺伝子を作製すること；および  b. 突然変異EPSPS遺伝子を有し、かつ対応する野生型植物細胞と比較して実質的に正常な成長を示す細胞を特定すること；
を含む、上記方法。
【請求項１５】
非トランスジェニック除草剤耐性または抵抗性植物を作製する方法であって、
a. 組換え原性オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入して、突然変異型EPSPS遺伝子を作製すること；および
b. 突然変異型EPSPS遺伝子を有し、該遺伝子にコードされる突然変異型EPSPSタンパク質は対応する野生型EPSPSタンパク質と比較して実質的に同じ触媒活性を有する細胞を特定すること；
を含む、上記方法。
【請求項１６】
組換え原性オリゴ核酸塩基が混合二本鎖ヌクレオチドまたはSSMOVである、請求項14または15記載の方法。
【請求項１７】
混合二本鎖ヌクレオチドが第１相同領域、第２相同領域、および介在領域を含み、該第１領域が標的EPSPS遺伝子の第１フラグメントの少なくとも６塩基対からなる配列に同一の配列を有しており、第第２領域は標的EPSPS遺伝子の第２フラグメントの少なくとも６塩基対からなる配列に同一の配列を有しており、上記介在配列はEPSPS遺伝子とは異種の少なくとも１核酸塩基を含み、第１相同領域と第２相同領域とを連結するものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
組換え原性オリゴ核酸塩基をエレクトロポレーションにより導入する、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１９】
突然変異型EPSPS遺伝子が、シロイヌナズナのLeu173、Gly177、Thr178、Ala179、Met180、Arg181、Pro182、Ser98、Ser255およびLeu198からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸位、またはEPSPSパラログ内の相同なアミノ酸残基に突然変異を有する、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項２０】
トウモロコシのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu97、Gly101、Thr102、Ala103、Met104、Arg105、Pro106、Ser23、Ser179およびLeu122からなる群より選択されたものである、請求項１９記載の植物。
【請求項２１】
アブラナのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu169、Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194からなる群より選択される、請求項１９記載の植物。
【請求項２２】
ペチュニアのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu169、Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194からなる群より選択される、請求項１９記載の植物。
【請求項２３】
トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、綿花、テンサイ、アブラナ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レンズマメ、ブドウ、シバおよびアブラナ種からなる群より選択される、請求項１４または１５に記載の植物。
【請求項２４】
配列番号２に示す配列においてアミノ酸位Leu173がPheで、Gly177がAlaまたはIleで、Thr178がIleまたはValまたはLeuで、Ala179がGlyで、Met180がCysで、Arg181がLeuまたはSerで、Pro182がLeuまたはSerで、Ser98がAspで、Ser255がAlaで、またはLeu198がLysで置換されているアミノ酸配列を含んでおり、該突然変異型EPSPSタンパク質は、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーである除草剤に対する耐性または抵抗性が増大している、単離された突然変異型EPSPSタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の属する技術分野
本発明は、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤、たとえばグリホサートに対して耐性または抵抗性の非トランスジェニック植物の生産に係る。また本発明は、組換え原性(recombinagenic)オリゴ核酸塩基を用いて、植物の染色体またはエピソーム配列内の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードしている遺伝子中に所望の突然変異を起こす方法に係る。この変異したタンパク質は野生型のタンパク質の触媒活性を実質的に維持しており、野生型植物と比較して、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤の存否に関わらず、植物のその除草剤に対する耐性または抵抗性を増大することができ、また植物、その器官、組織または細胞の実質的に正常な成長または生育が可能になる。さらに本発明は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に突然変異を有する非トランスジェニック植物細胞、それから再生される非トランスジェニック植物、および変異したＥＰＳＰＳ遺伝子を有する再生された非トランスジェニック植物を用いて交配により選られる植物にも係る。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
２．１  ホスホノメチルグリシン除草剤
除草剤耐性植物は雑草を駆除する耕作技術の必要性を低減することにより土壌侵食を有効に低減することができる。この点で多くの研究の主題となる一つの除草剤は一般にグリホサートといわれるＮ−ホスホノメチルグリシンである。グリホサートは、アミノ酸、ホルモンおよびビタミンを始めとする芳香族化合物の生合成に至るシキミ酸経路を阻害する。特に、グリホサートは、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（以下、ＥＰＳＰシンターゼまたはＥＰＳＰＳという）という酵素を阻害することにより、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）と３−ホスホシキミ酸から５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸への変換を抑制する。本発明の目的から、「グリホサート」という用語は、Ｎ−ホスホノメチルグリシン（そのあらゆる塩を含む）の除草剤として有効ないかなる形態も包含し、植物内でグリホサートアニオンを生成することになる他の形態その他ホスホノメチルグリシンファミリーのあらゆる除草剤を包含する。
【０００３】
植物のグリホサートに対する抵抗性は、ＥＰＳＰＳアミノ酸コード配列中に変異を有する突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を植物のゲノム中に導入することによって増大させることができる。グリホサート抵抗性を誘発するＥＰＳＰＳ遺伝子の突然変異のいくつかの例が米国特許第５，３１０，６６７号、同第５，８６６，７７５号、同第５，３１２，９１０号および同第５，１４５，７８３号に記載されている。これらの提案された突然変異は一般にグリホサート抵抗性表現型を付与する野生型ＥＰＳＰＳ酵素よりグリホサートに対するＫiが高いが、これらの変異体はまたＰＥＰに対するＫmが高いことも特徴であり、そのため酵素は反応論的な効率が落ちている（Kishoreら, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663; Schulzら, 1984, Arch. Microbiol. 137:121-123; Sostら, 1984, FEBS Lett. 173:238-241; Kishore ら, 1986, Fed. Proc. 45:1506; Sost and Amrhein, 1990, Arch. Biochem. Biophys. 282:433-436）。ＥＰＳＰＳ遺伝子の突然変異の多くが除草剤に対して耐性のＥＰＳＰＳ酵素を生産するように選択されているが、残念なことに、そのようなＥＰＳＰＳ遺伝子により生産されるＥＰＳＰＳ酵素は野生型のＥＰＳＰＳより酵素活性がずっと低い。たとえば、大腸菌に由来する野生型ＥＰＳＰＳのＰＥＰに対するみかけのＫmとグリホサートに対するみかけのＫiはそれぞれ１０μＭと０．５μＭであるが、位置９６のグリシンがアラニンに置換された単一のアミノ酸置換を有するグリホサート抵抗性単離体はこれらの値がそれぞれ２２０μＭと４．０ｍＭである。たくさんのグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ遺伝子が突然変異誘発によって構築されている。ここでも、ＰＥＰに対するＫmが増大し、野生型植物酵素のＶmaxが多少低下することにより示されるように（Kishore ら, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663）、このようなグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳは触媒効率（Ｖmax／Ｋm）が低い。
【０００４】
これら変異酵素の反応定数はＰＥＰに関して損なわれているので、グリホサートの存在下で植物の正常な触媒活性を維持するためには変異酵素の高レベルの過剰生産、すなわち４０〜８０倍が必要であろうという提案がなされている（Kishore ら, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663）。細胞の葉緑体中でより高いレベルのＥＰＳＰシンターゼを生産する能力を植物のゲノム中に挿入することによってグリホサート抵抗性植物を製造することができるということが示されており（Shahら, 1986, Science 233, 478-481）、この酵素は好ましいことにグリホサート抵抗性である（Kishoreら, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663）。
【０００５】
外因性の突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子の植物中への導入は文献に充分記載されている。たとえば、米国特許第４，５４５，０６０号によると、植物のグリホサートに対する耐性を増大するために、酵素の競合阻害剤、すなわちグリホサートに対するその酵素の耐性を高くする突然変異を少なくとも１つ有するＥＰＳＰＳ変異体をコードしている遺伝子を植物ゲノム中に導入する。しかし、これらの例については複雑な問題が多く伴っている。そのような突然変異の多くは、変異したＥＰＳＰＳ遺伝子産物の発現が低くなるか、または野生型と比べて触媒活性がずっと低いＥＰＳＰＳ遺伝子産物が生成する。この変異した酵素の低い発現または低い酵素活性のため、植物の成長と生育のレベルが異常に低くなる。
【０００６】
ＥＰＳＰシンターゼのそのような変異はグリホサートに対して抵抗性のトランスジェニック植物を得るのに有用であることが立証されているが、グリホサート抵抗性が高いが、それでも反応論的に効率がよく、野生型の発現レベルで改良された抵抗性を得ることができるような変異したＥＰＳＰＳ遺伝子産物が得られればさらに有益であろう。
【０００７】
２．２  組換え原性オリゴ核酸塩基
組換え原性オリゴ核酸塩基およびこれを用いて真核細胞の遺伝子を変化させることはKmiecの米国特許第５，５６５，３５０号（Kmiec I）に記載されている。Kmiec Iは特定の遺伝的変化を標的遺伝子に導入する方法を教示している。特に、Kmiec Iは、２つのストランドを有する組換え原性オリゴ核酸塩基を開示しており、ここで、第一のストランドは少なくとも８個のＲＮＡ様ヌクレオチドからなる２つのセグメントを含有しており、これらセグメントは「介在ＤＮＡセグメント」と称される４〜約５０個のＤＮＡ様ヌクレオチドからなる第三のセグメントによって分離されている。この第一ストランドのヌクレオチドは第二のストランドのＤＮＡ様ヌクレオチドと塩基対を形成する。この第一と第二のストランドはさらに一本鎖のヌクレオチドセグメントによって結合されていて、これら第一と第二のストランドが単一のオリゴヌクレオチド鎖の一部となっている。Kmiec Iはさらに、特定の遺伝的変化を標的遺伝子に導入する方法を教示している。Kmiec Iによると、ＲＮＡセグメントの配列は、標的遺伝子の第一と第二のフラグメントの配列と相同、すなわち同一であるように選択される。介在ＤＮＡセグメントの配列は、「異種領域」と称される差がある領域を除いて、標的遺伝子の第一と第二のフラグメントの間の配列と相同である。この異種領域は挿入もしくは欠失となることができ、または置換となるように標的遺伝子の配列と整合していない塩基を1個以上含有していることができる。Kmiec Iによると、標的遺伝子の配列は異種領域により指令されるように変更されていて、標的遺伝子が組換え原性オリゴヌクレオチドの配列と相同になるようになっている。Kmiec Iは特に、２’−Ｏ−メチルリボース、すなわち２’−メトキシリボースを含有するヌクレオチドが組換え原性オリゴ核酸塩基に使用することができること、および天然のデオキシリボースを含有するヌクレオチドがＤＮＡ様ヌクレオチドとして使用することができることを教示している。
【０００８】
Kmiecの米国特許第５，７３１，１８１号（Kmiec II）は、特に、組換え原性オリゴ核酸塩基を用いて植物細胞で遺伝的変化を起こさせることを開示しており、また、特定の標的遺伝子で遺伝的変化を起こさせるのに使用することができるＲＮＡ様およびＤＮＡ様ヌクレオチドの類似体および誘導体の別の例を開示している。組換え原性オリゴ核酸塩基の使用について論じている別の特許として、米国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号および同第６，０１０，９０７号ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７号および国際公開第９８／４９３５０号、同第９９／０７８６５号、同第９９／５８７２３号、同第９９／５８７０２号および同第９９／４０７８９号がある。組換え原性オリゴ核酸塩基には、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、Kmiec IIに教示されている非ヌクレオチド含有分子ならびに上記特許および出願公開に教示されている他の分子が包含される。
【０００９】
本願明細書のこの第２欄または他の欄で引用した特許または文献はそのような文献が本発明に対する従来技術として利用されることを認めるものではない。
【発明の概要】
【００１０】
３．発明の概要
本発明は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の突然変異を有する非トランスジェニック植物または植物細胞に関し、この植物はホスホノメチルグリシンファミリーのものに対する耐性または抵抗性が増大しており、また対応する野生型植物または細胞と比較して植物、その器官、組織または細胞の実質的に正常な成長または生育を示す。また、本発明は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に突然変異を有する非トランスジェニック植物に関し、この植物はホスホノメチルグリシンファミリーのもの、たとえばグリホサートに対する抵抗性が増大しており、またこの変異したＥＰＳＰＳタンパク質は野生型ＥＰＳＰＳタンパク質と比べて実質的に同じ触媒活性をもっている。
【００１１】
本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤の存否に関わらず野生型のタンパク質の触媒活性を実質的に維持している変異したＥＰＳＰＳ遺伝子を有する非トランスジェニック植物を製造する方法にも関する。この方法は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に標的突然変異をもつ組換え原性オリゴ核酸塩基を触媒細胞中に導入し、変異したＥＰＳＰＳ遺伝子を有する細胞、種子または植物を同定することからなる。
【００１２】
組換え原性オリゴ核酸塩基の代表例は、米国特許第５，５６５，３５０号、同第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，７３１，１８１号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号および同第６，０１０，９０７号ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７号および国際公開第９８／４９３５０号、同第９９／０７８６５号、同第９９／５８７２３号、同第９９／５８７０２号および同第９９／４０７８９号に見られる。これら特許および公開は引用によりその内容全体が本明細書に含まれているものとする。
【００１３】
植物は、木もしくは低木として成長する任意の木質植物種を始めとする双子葉類、単子葉類もしくは裸子植物の任意の種、任意の草本性種、または食用果実、種子もしくは野菜を生じる任意の種、または着色もしくは芳香性の花を生じる任意の種であることができる。植物は、たとえば、カノラ、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴ、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、エンドウ、インゲンマメ(field bean)、ポプラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライ、オートムギ、芝生および牧草、アマ、アブラナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリーゴールド、ハス、キャベツ、デイジー、カーネーション、チューリップ、アイリス、ユリ、ならびにすでに挙げたものを除く木の実を生じる植物より成る群の中の植物の種から選択することができる。
【００１４】
組換え原性オリゴ核酸塩基は、限定されることはないがマイクロキャリアー（バイオリスティック送達）、マイクロファイバー、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションを始めとして当分野で一般的に用いられている何らかの方法を用いて植物細胞中に導入することができる。
【００１５】
本発明はまた、種子を生産する植物（以後「稔性植物」とする）を得るための、本発明の方法に従って突然変異させた細胞の培養、およびそのような稔性植物からの種子および別の植物の生産にも関する。
【００１６】
さらに本発明は、開示したＥＰＳＰＳ遺伝子の変異を有する触媒と雑草を含む圃場で雑草を選択的に防除する方法にも関し、この方法は前記の植物が耐性となっている除草剤をその圃場に施用することからなる。
【００１７】
また本発明は、ホスホノメチルグリシンファミリーのもの、たとえばグリホサートに対する耐性または抵抗性を植物に付与するＥＰＳＰＳ遺伝子内の新規な突然変異にも関しており、ここで、突然変異したＥＰＳＰＳは野生型のＥＰＳＰＳと比べて実質的に同じ酵素活性をもっている。
【００１８】
３．１  定義
本発明は以下の定義に従うものと了解されたい。
【００１９】
オリゴ核酸塩基は、核酸塩基のポリマーであり、ワトソンクリック塩基対形成により相補的な配列を有するＤＮＡとハイブリダイズすることができるものである。
【００２０】
核酸塩基は、プリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体もしくは類似体である塩基を含む。核酸塩基としては、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドがある。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル部分、たとえば任意に置換されたリボシドまたは2'-デオキシリボシドを含有する核酸塩基である。ヌクレオシドは、複数の結合部分（リンを含有していてもいなくてもよい）の１つにより結合していてよい。置換されてないホスホジエステル結合で結合したヌクレオシドはヌクレオチドといわれる。
【００２１】
オリゴ核酸塩基鎖は、そのポリマーの最終的な核酸塩基である５’末端と３’末端をひとつずつもっている。個々のオリゴ核酸塩基鎖はあらゆるタイプの核酸塩基を含有することができる。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的であってワトソンクリック塩基対形成によりハイブリダイズしている１つ以上のオリゴ核酸塩基鎖を含む化合物である。核酸塩基はデオキシリボ型またはリボ型のいずれかである。リボ型の核酸塩基はペントースフラノシルを含有する核酸塩基であり、2'炭素原子はヒドロキシ、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンである。デオキシリボ型の核酸塩基はリボ型の核酸塩基以外の核酸塩基であり、ペントースフラノシル部分を含有していないあらゆる核酸塩基を包含する。
【００２２】
オリゴ核酸塩基ストランドとは一般に、オリゴ核酸塩基鎖と、オリゴ核酸塩基鎖のセグメントまたは領域の両方を包含する。オリゴ核酸塩基ストランドは３’端と５’端とをもっている。オリゴ核酸塩基ストランドが鎖と同じ長さである場合、そのストランドの３’端と５’端はその鎖の３’末端と５’末端でもある。
【００２３】
本発明において、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な成長とは、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質を発現する対応する植物、植物器官、植物組織または植物細胞における成長速度または細胞分裂の速度の少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７５％に当たる植物、植物器官、植物組織または植物細胞の成長速度または細胞分裂の速度と定義される。
【００２４】
本発明において、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な発達とは、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質を発現する対応する植物、植物器官、植物組織または植物細胞において起こる発生・発達事象と実質的に同じ発生・生育事象の１つ以上がその植物、植物器官、植物組織または植物細胞で起こることと定義される。
【００２５】
本発明において、植物器官とは、葉、茎、根、植物の芽、花芽、分裂組織、胚芽、子葉、内乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、花粉、花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得られる切片、薄片もしくはディスクがあるが限定されることはない。植物組織としては、カルス組織、基本組織、維管束組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、ゴール(gall)組織、植物腫瘍組織、および生殖組織があるが限定されることはない。植物細胞としては、細胞壁を有する単離細胞、そのさまざまな大きさの凝集体およびプロトプラストがあるが限定されることはない。
【００２６】
植物は、これをグリホサートに暴露し、同様に暴露した非抵抗性の類似の植物で得られる用量／応答曲線と比較して右にシフトした用量／応答曲線が得られるときにグリホサートに対して実質的に「抵抗性」である。このような用量／応答曲線はＸ軸に「用量」をプロットし、ｙ軸に「殺草パーセント」、「除草効果」などをプロットして得られる。抵抗性の植物は、所与の除草効果を生じるために非抵抗性の類似の植物より多くの除草剤を必要とする。グリホサートに対して実質的に「耐性」である植物は、圃場で雑草を駆除するために農芸化学分野で通常用いられる濃度と割合でグリホサートに暴露したときに壊死性、溶解性、萎黄病その他の損傷をほとんど示さない。除草剤に対して耐性である植物はその除草剤に対して抵抗性でもある。「耐性」および「抵抗性」という用語は、本出願においては「抵抗性および／または耐性」と考えられたい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
４．図面の簡単な説明
【図１Ａ】シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のＥＰＳＰＳ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）である。太字の下線を付したヌクレオチド残基は標的残基である。
【図１Ｂ】シロイヌナズナのＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）である。太字の下線を付したアミノ酸残基は標的残基である。
【図２】シロイヌナズナの野生型と突然変異型のＥＰＳＰＳのアミノ酸位置１７３〜１８３の領域におけるヌクレオチド配列とアミノ酸配列のリストである。野生型ヌクレオチド配列（配列番号１）と野生型アミノ酸配列（配列番号２）、突然変異Ａ177のヌクレオチド配列（配列番号３）とアミノ酸配列（配列番号４）、突然変異Ｉ178のヌクレオチド配列（配列番号５）とアミノ酸配列（配列番号６）、突然変異Ａ177Ｉ178のヌクレオチド配列（配列番号７）とアミノ酸配列（配列番号８）、突然変異Ｉ178Ｓ182のヌクレオチド配列（配列番号９）とアミノ酸配列（配列番号１０）、突然変異Ａ177Ｓ182のヌクレオチド配列（配列番号１１）とアミノ酸配列（配列番号１２）、突然変異Ａ177Ｉ178Ｓ182のヌクレオチド配列（配列番号１３）とアミノ酸配列（配列番号１４）、突然変異Ｖ177Ｓ182のヌクレオチド配列（配列番号１５）とアミノ酸配列（配列番号１６）、突然変異Ｌ178Ｓ182のヌクレオチド配列（配列番号１７）とアミノ酸配列（配列番号１８）、突然変異Ａ177Ｖ178のヌクレオチド配列（配列番号１９）とアミノ酸配列（配列番号２０）、突然変異Ａ177Ｌ182のヌクレオチド配列（配列番号２１）とアミノ酸配列（配列番号２２）。
【図３Ａ】シロイヌナズナのＥＰＳＰＳ遺伝子のＤＮＡ（配列番号１）を、アブラナ（配列番号２３）、ペチュニア（配列番号２４）、およびトウモロコシのＥＰＳＰＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２５）と並べたものである。DNAStar (LaserGene)によって実施した。配列は、J. Hein法により重み付き残基重量表を用いて並べてある。
【図３Ｂ】図３Ａの続き。
【図３Ｃ】図３Ｂの続き。
【図４】シロイヌナズナのＥＰＳＰＳアミノ酸配列（配列番号２）を、アブラナ（配列番号２６）、ペチュニア（配列番号２７）、およびトウモロコシのＥＰＳＰＳアミノ酸配列（配列番号２８）と並べたものである。配列は、J. Hein法により重み付き残基重量表を用いて並べてある。
【図５】使用した突然変異誘発プライマーのリストであり、標的コドンを太字で示した。突然変異プライマーＡ177（配列番号２９）、突然変異プライマーＩ178（配列番号３０）、突然変異プライマーＡ177Ｉ178（配列番号３１）、突然変異プライマーＩ178Ｓ182（配列番号３２）、突然変異プライマーＡ177Ｓ182（配列番号３４）、突然変異プライマーＡ177Ｉ178Ｓ182（配列番号３５）、突然変異プライマーＶ177Ｓ182（配列番号３５）、突然変異プライマーＬ178Ｓ182（配列番号３６）、突然変異プライマーＡ177Ｖ178（配列番号３７）、突然変異プライマーＡ177Ｌ182（配列番号３８）。
【図６】１７ｍＭのグリホサートの存在下（＋）および不在下（−）においてシロイヌナズナクローンの６００ｎｍの光学密度で測定した成長の図である。
【図７】上のパネルは、細胞溶解産物（Ｌ）および溶出物（Ｅ）から単離されたＨｉｓで標識されたバシルス、シロイヌナズナ野生型（ＷＴ）および突然変異（ＡＳ）ＥＰＳＰＳタンパク質の発現を示すウェスタンブロットである。ネガティブコントロールとしての形質転換してないネズミチフス菌はＥＰＳＰＳ発現を示さない。下のパネルは銀染色した二重ゲルである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
５．詳細な説明
本発明は、対応する野生型の植物または細胞と比較して、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーに対する耐性または抵抗性が増大し、かつ植物、器官、組織または細胞の実質的に正常な成長または発達を示す、EPSPS遺伝子に突然変異を有する非トランスジェニック植物または植物の細胞に関するものである。本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバー（例えばグリホサート）に対して耐性であるかまたは抵抗性が増大しており、突然変異型EPSPSタンパク質が野生型EPSPSタンパク質と比較して実質的に同じ触媒活性を有する、EPSPS遺伝子に突然変異を有する非トランスジェニック植物に関するものである。
【００２９】
本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤が存在するか否かに関係なく野生型タンパク質の触媒活性を実質的に維持している突然変異型EPSPS遺伝子を有する非トランスジェニック植物を作成する方法に関する。この方法は、植物細胞に組換え原性オリゴ核酸塩基をEPSPS遺伝子に標的化突然変異を行うことによって導入し、かつ突然変異型EPSPS遺伝子を有する細胞、種子または植物を同定することを含む。
【００３０】
組換え原性オリゴ核酸塩基として例示できるものは、以下の特許公報：米国特許第5,565,350号；第5,756,325号；第5,871,984号；第5,760,012号；第5,731,181号；第5,888,983号；第5,795,972号；第5,780,296号；第5,945,339号；第6,004,804号；および第6,010,907号、ならびに国際特許PCT/US00/23457号；および国際特許公開WO 98/49350号; WO 99/07865号; WO 99/58723号; WO 99/58702号;およびWO 99/40489号; に見出され、それらは参照によりその本明細書中に全体を組み入れられるものとする。
【００３１】
植物は、双子葉植物、単子葉植物または裸子植物の何れの種であってもよく、高木または低木として成長するあらゆる木本植物種、あらゆる草本種、または食用果実、種子もしくは野菜を生産するあらゆる種、または色彩のあるもしくは芳香を産するあらゆる種が含まれる。例えば、植物は、カノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、綿花、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ種、サトウキビ、エンドウマメ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライムギ、オーツムギ、シバおよび飼料用草、アマ、アブラナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、ペッパー、ナス、マリーゴールド、ハス、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アイリス、ユリおよび豆を生産する植物であってよいが、上記に言及していないものでもよい。
【００３２】
組換え原性オリゴ核酸塩基は、当技術分野で一般的に用いられるあらゆる方法を用いて植物細胞に導入することができ、その方法には、限定するものではないが、微小担体法（バイオリスティック送達）、マイクロファイバー法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法が含まれる。
【００３３】
本発明はまた、種子を生産する植物（以下、「稔性植物」）を得る目的で本発明の方法に従って突然変異した細胞の培養、ならびにそのような繁殖植物からの種子および追加的な植物の生産に関する。
【００３４】
本発明はさらに、本明細書において開示するEPSPS遺伝子改変を有する植物と雑草とを含む圃場の雑草を選択的に制御する方法に関する。該方法は、上記植物が耐性を獲得した除草剤を圃場に適用することを含む。
【００３５】
本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバー（例えばグリホサート）に対する耐性もしくは抵抗性を植物に付与するか、または突然変異型EPSPSが野生型EPSPSと比較して実質的に同じ酵素活性を有する、EPSPS遺伝子における新規の突然変異にも関する。
【００３６】
５．１． 組換え原性オリゴ核酸塩基
本発明は、Kmiecの米国特許第5,565,350号(Kmiec I)および米国特許第5,731,181号(Kmiec II)の遺伝子に記載の高次構造および化学的性質を持つ組換え原性オリゴ核酸塩基を用いて実施することができる（上記米国特許は参照により本明細書に組み入れることとする）。Kmiec Iは特定の遺伝子の改変を標的遺伝子に導入するための方法を教示する。Kmiec Iおよび／またはKmiec II中の組換え原性オリゴ核酸塩基は２つの相補的な鎖を含んでおり、鎖の１つはもう一方の鎖のDNA型ヌクレオチドと対をなす塩基であるRNA型ヌクレオチドのセグメント（RNAセグメント）を少なくとも１つ含んでいる。
【００３７】
Kmiec IIは、プリンおよびピリミジン塩基を含む非ヌクレオチドをヌクレオチドと置換できることを開示する。米国特許第5,756,325号; 第5,871,984号; 第5,760,012号; 第5,888,983号; 第5,795,972号; 第5,780,296号; 第5,945,339号; 第6,004,804号; および第6,010,907号および国際特許公開WO 98/49350号; WO 99/07865号; WO 99/58723号; WO 99/58702号; およびWO 99/40789号（これらそれぞれの全体を本明細書に組み入れることとする）は、、本発明に用いることができるさらなるの組換え原性分子を開示する。本明細書中に用いる「組換え原性オリゴ核酸塩基」という用語は、本発明の方法に使用できる分子を意味し、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、Kmiec IIに示される分子を含む非ヌクレオチド、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび前掲の特許および特許公開に示されたその他の組換え原性分子を含む。
【００３８】
ある実施形態では、組換え原性オリゴ核酸塩基が、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのRNA型ヌクレオチドが、その2’-ヒドロキシル基をフッ素、塩素または臭素の官能基で置換することによって、またはその2’-O上に置換基を配置することによって、リボヌクレアーゼ耐性となった混合二本鎖オリゴヌクレオチドである。適切な置換基はKmiec IIに示される置換基を含む。代替できる置換基には、米国特許第5,334,711号(Sproat)に示される置換基および特許公開EP629387号およびEP679657号（全てMartinの出願）により示される置換基があり、それらは参照により本明細書中に組み入れられるものとする。本明細書中では、リボヌクレオチドまたはMartinの出願もしくはSproatにより記載される置換基で2’-OHを置換したリボヌクレオチドの2’-フルオロ、クロロ、ブロモ誘導体は、「2’-置換リボヌクレオチド」と称する。本明細書中で用いる「RNA型ヌクレオチド」という用語は、無置換のホスホジエステル結合またはKmiec IもしくはKmiec IIにより示される非天然の結合のいずれかによって混合二本鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドに連結された2’-ヒドロキシルもしくは2’-置換ヌクレオチドを意味する。本明細書中で用いる「デオキシリボ型ヌクレオチド」という用語は、無置換のホスホジエステル結合またはKmiec IもしくはKmiec IIにより示される非天然の結合のいずれかによってMDONの他のヌクレオチドに連結し得る2’-Hを有するヌクレオチドを意味する。
【００３９】
本発明の特定の実施形態では、組換え原性オリゴ核酸塩基は無置換のホスホジエステル結合のみによって連結された混合二本鎖オリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、その結合は、置換されたホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体およびKmiec IIにより示されるようなリンが関与しない結合によるものである。さらにそれ以外の実施形態では、混合二本鎖オリゴヌクレオチド中のRNA型ヌクレオチドが2’-置換ヌクレオチドである。2’-置換リボヌクレオチドの特に好ましい実施形態は、2’-フルオロ、2’-メトキシ、2’-プロピロキシ、2’-アリルオキシ、2’-ヒドロキシルエチルオキシ、2’-メトキシエチルオキシ、2’-フルオロプロピルオキシおよび2’-トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。2’-置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、2’-フルオロ、2’-メトキシ、2’-メトキシエチルオキシおよび2’-アリルオキシ置換リボヌクレオチドである。もう一つの実施形態では、混合二本鎖オリゴヌクレオチドは無置換のホスホジエステル結合によって連結されている。
【００４０】
2’-置換RNA型ヌクレオチドを1種類のみ有する混合二本鎖オリゴヌクレオチドはより簡便に合成することができるが、本発明の方法は、RNA型ヌクレオチドを2種類以上有する混合二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて行うことも可能である。RNAセグメントの機能は、2つのRNA型トリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチドを導入することにより起こる分断によっても影響を受けない。従って、RNAセグメントという用語にはこのような「分断されたRNAセグメント」も包含する。分断の無いRNAセグメントは連続したRNAセグメントと称する。他の実施形態では、RNAセグメントには改変されたリボヌクレアーゼ耐性をもつ無置換の2’-OHヌクレオチドが含まれ得る。混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは100個未満のヌクレオチドを有し、より好ましくは85個未満のヌクレオチドであるが、51個以上のヌクレオチドを有する。第１鎖と第2鎖はワトソン-クリックの塩基対である。ある実施形態においては、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖が、一本鎖の６ヌクレオチド、５ヌクレオチドまたは４ヌクレオチドなどのリンカーにより共役結合されており、そのために第１鎖と第2鎖とが１つの3’末端と１つの5’末端を有する一本鎖オリゴヌクレオチドのセグメントとなっている。3’末端および5’末端は、「ヘアピンキャップ」を付加することで保護され得る。そうすることによって、3’末端および5’末端のヌクレオチドは隣接するヌクレオチドとワトソン-クリック型塩基対を形成する。加えて、第二のヘアピンキャップを3’末端および5’末端から離れた第１鎖および第2鎖のあいだの連結部に配置することができる。これにより、第１鎖と第2鎖の間のワトソン-クリック型対合が安定化される。
【００４１】
第１鎖および第2鎖は標的EPSPS遺伝子の2つの断片と相同な2つの領域を含んでいる。すなわち、標的遺伝子と同じ配列を有している。相同的な領域はRNAセグメントの領域のヌクレオチドを含んでおり、連結するDNAセグメントのDNA型ヌクレオチドを一個以上含んでいてもよく、また介在するDNAセグメントには含まれないDNA型ヌクレオチドも含んでいてよい。相同な二つの領域は、それぞれが標的遺伝子の配列とは異なる配列を有する領域（「非相同領域」と称す）に隣接しており、該領域によって分離されている。非相同領域は1個、2個または3個のミスマッチのヌクレオチドを含み得る。ミスマッチのヌクレオチドは連続的であってよく、または1または2個の標的遺伝子と相同のヌクレオチドにより分断されていてもよい。あるいは、非相同領域はまた、1個、2個、3個または5個以下のヌクレオチドの挿入を含み得る。あるいは、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、混合二本鎖オリゴヌクレオチドから1個、2個、3個または5個以下のヌクレオチドが欠失していることのみによって標的遺伝子の配列と異なっていてもよい。この場合、非相同領域の長さと位置は、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが非相同領域内に無いとしても、欠失され得る長さとみなすことができる。2つの相同領域に相補的な標的遺伝子の断片の間の距離は、置換が意図された場合は、非相同領域の長さと一致する。非相同領域が挿入部を含んでいる場合は、したがって相同領域は、それらに相補的な相同する断片の遺伝子中での位置よりも離れて混合二本鎖オリゴヌクレオチド中では分離されている。そして、非相同領域が欠失をコードする場合には、その逆のことが起こる。
【００４２】
混合二本鎖オリゴヌクレオチドのRNAセグメントはそれぞれ相同領域、すなわち標的遺伝子の断片と配列が同一の領域の一部分である。該セグメントは共に好ましくは13個以上のRNA型ヌクレオチドを含有しており、好ましくは16〜25個のRNA型ヌクレオチドを含有しており、またはより好ましくは18〜22個のRNA型ヌクレオチドを含有しており、または最も好ましくは20個のRNA型ヌクレオチドを含有している。ある実施形態においては、相同領域のRNAセグメントは、隣接する介在するDNAセグメントによって分割され、すなわち介在DNAセグメントによって「連結されている」。ある実施形態においては、非相同領域の各ヌクレオチドが介在DNAセグメントのヌクレオチドである。混合二本鎖オリゴヌクレオチドの非相同領域を含有する介在DNAセグメントを「突然変異セグメント」と称する。
【００４３】
標的EPSPS遺伝子にされる改変は、非相同領域によりコードされる。標的EPSPS遺伝子に導入される改変は、EPSPS遺伝子配列のうちの1以上の塩基の改変であってよく、または1以上の塩基の付加もしくは欠失であってよい。
【００４４】
本発明のもう一つの実施形態においては、組換え原性オリゴ核酸塩基は一本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド突然変異ベクターまたは、国際特許出願PCT/US00/23457（参照によりその全体を組み入れるものとする）に記載されるSSOMVである。SSOMVの配列は、米国特許第5,756,325号; 第5,871,984号; 第5,760,012号; 第5,888,983号; 第5,795,972号; 第5,780,296号; 第5,945,339号; 第6,004,804号;および第6,010,907号;ならびに国際特許公開WO 98/49350号; WO 99/07865号; WO 99/58723号; WO 99/58702号;およびWO 99/40789号に記載される突然変異ベクターと同じ原理に基づいている。SSOMVの配列は、所望の遺伝子の改変を有する突然変異領域と称する領域によって分断された、標的配列と相同な2つの領域を含有する。突然変異領域は、標的配列内で相同領域を分断するが配列と同じ長さであるが配列の異なる配列を有し得る。このような突然変異領域は置換を引き起こし得る。あるいは、同じ配列を有する標的遺伝子中の領域が1個、2個または3個のヌクレオチドにより分断されている場合には、SSOMV中の相同領域はお互いに一続きであることができる。そのようなSSOMVは、標的遺伝子からSSOMVに存在しないヌクレオチドの欠失を引き起こす。最後に、相同領域と同一の標的遺伝子の配列は、標的遺伝子中で隣接していながらSSOMV中の1個、2個またはそれ以上のヌクレオチドによって分断されていても良い。そのようなSSOMVは、標的遺伝子の配列に挿入を引き起こす。
【００４５】
SSOMVのヌクレオチドは、3’末端および/または5’末端のヌクレオチド間結合あるいは3’末端および/または5’末端の2つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートもしくはホスホアミドであり得るということを除いては、改変のないホスホジエステル結合により連結されているデオキシリボヌクレオチドである。本明細書中で用いる場合、ヌクレオチド間結合とはSSOMVのヌクレオチド間の結合であり、3’末端ヌクレオチドまたは5’末端ヌクレオチドと前出の保護置換基との間の結合は含まない。特定の実施形態では、SSOMVの長さは21〜55デオキシヌクレオチドであり、従って、相同領域の長さは、合計の長さが少なくとも20デオキシヌクレオチドであり、少なくとも2つの相同領域がそれぞれ少なくとも8デオキシヌクレオチドの長さを有するべきである。
【００４６】
SSOMVは標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のどちらかに相補的であるように設計することができる。所望の突然変異が1塩基置換である場合には、突然変異ヌクレオチドはともにピリミジンであることが好ましい。所望する機能的結果を達成するためには、突然変異ヌクレオチドと相補鎖中の標的ヌクレオチドは両方ともピリミジンであることが好ましい。特に好ましくは、塩基転換型突然変異をコードするSSOMVである。すなわち、CまたはT突然変異ヌクレオチドがそれぞれ相補鎖中のCまたはTヌクレオチドにミスマッチするものである。
【００４７】
オリゴデオキシヌクレオチドに加えて、SSOMVはリンカーを介して5’末端の炭素原子に結合した5’保護置換基を含むことができる。リンカーの化学的性質は、その長さが少なくとも6原子の長さであってリンカーは屈曲性があるべきだという点を除いては重要ではない。ビオチン、コレステロールもしくは他のステロイドなどの無毒性の各種置換基または非インターカレーティング(non-intercalating)陽イオン蛍光色素を利用することができる。SSOMVを調製する試薬として特に好ましいのは、Glen Research, Sterling VAによりCy3(商標)およびCy5(商標)として市販されている試薬である。それらは保護されたホスホロアミダイトであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、それぞれ、3,3,3’,3’-テトラメチルN,N’-イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン色素を生じる。Cy3が最も好ましい。インドカルボシアニンがN-オキシアルキル置換されている場合、5’末端リン酸とのホスホジエステルによってオリゴデオキシヌクレオチドの5’末端に容易に連結され得る。色素とオリゴデオキシヌクレオチドとの間の色素リンカーの化学的性質は重要ではなく、合成が容易になるように選択される。市販のCy3ホスホロアミダイトを指示どおり用いる場合、得られる5’の修飾は、ともにN-ヒドロキシプロピル、N’-ホスファチジルプロピル3,3,3’,3’-テトラメチルインドモノカルボシアニンである保護置換基およびリンカーからなる。
【００４８】
好ましい実施形態では、インドカルボシアニン色素はインドール環の3位および3’位が四置換されたものである。理論には拘束されないが、これらの置換は色素がインターカレーティング色素になることを防ぐ。これらの位置の置換基の同一性は重要ではない。SSOMVは加えて3’保護置換基を有していてもよい。3’保護基の化学的性質もまた重要ではない。
【００４９】
５．２  EPSPS遺伝子に導入した変異の部位および型
本発明の１つの実施形態において、シロイヌナズナEPSPS遺伝子（図１Ａ参照）およびそれに対応するEPSPS酵素（図１Ｂ参照）は、Leu173、Gly177、Thr178、Ala179、Met180、Arg181、Pro182、Ser98、Ser255およびLeu198から構成されるグループより選択された１もしくはそれ以上のアミノ酸残基、または、EPSPSパラログにおける相同な位置における変異を含み、そしてこの変異により野生型の配列と比較してEPSPS酵素において１つ以上の下記のアミノ酸置換がもたらされる：
（i）Leu173-Phe
（ii）Gly177-AlaあるいはIle
（iii）Thr178-IleあるいはValあるいはLeu
（iv）Ala179-Gly
（v）Met180-Cys
（vi）Arg181-LeuあるいはSer
（vii）Pro182-LeuあるいはSer
（viii）Ser98-Asp
（ix）Ser255-Ala
（x）Leu198-Lys。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、EPSPS遺伝子産物において置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Leu-Tyr-Leu-Gly-Asn（配列番号２９）中のLeuであり、これはPheに置換される。あるいは置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Asn-Ala-Gly-Thr-Ala（配列番号３０）中のGlyであり、これがAlaまたはIleに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Gly-Thr-Ala-Met（配列番号３１）中のThrであり、これはIle、ValあるいはLeuに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Gly-Thr-Ala-Met-Arg（配列番号３２）中のAlaであり、これはGlyに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Thr-Ala-Met-Arg-Pro（配列番号３３）中のMetであり、Cysに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Met-Arg-Pro-Leu（配列番号３４）中のArgであり、これはLeuあるいはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は以下の配列Met-Arg-Pro-Leu-Thr（配列番号３５）中のProであり、これはLeuあるいはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続したPro-Gly-Ser-Lys-Ser（配列番号３６）中のSerであり、これはAspに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は以下の配列Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr（配列番号３７）中のSerであり、これはAlaに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Tyr-Val-Leu-Asp-Gly（配列番号３８）中のLeuであり、これはLysに置換される。他の実施形態において、前記の１つ以上の置換が該EPSPSアミノ酸配列に導入されてもよい。
【００５１】
上記に代えて、かつ／または上記に加えて、変異は図１B（配列番号２）に示されているEPSPSタンパク質において256番目、284〜288番目および353〜356番目に対応する位置にあるいかなるアミノ酸の置換をもたらすものであってもよい。
【００５２】
本発明における特定の実施形態において、EPSPS遺伝子は177番目のアミノ酸位におけるGlyをAlaに置換された変異を有する。別の特定の実施形態は、178番目のアミノ酸位におけるThrからIleへの置換である。さらに他の特定の実施形態は、177番目のアミノ酸位においてGlyをAlaへ置換する変異に加え、さらに178番目のアミノ酸位におけるThrからIleへの置換を含む。本発明における他の特定の実施形態として、178番目のアミノ酸位におけるThrをIleに置換する変異に加え、さらに182番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換する変異が示されている。他の実施形態は、177番目のアミノ酸位におけるGlyからAlaへの置換に加え、さらに182番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換する変異を含む。他の変異EPSPS配列は、177番目のアミノ酸位におけるGlyからAlaへの置換に加え、178番目のアミノ酸位においてThrからIleへの置換、加えて182番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換するさらなる変異を含む。別の実施形態は、178番目のアミノ酸位におけるThrからValへの置換および182番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換するさらなる変異である。さらなる特定の実施形態は、178番目の位置におけるThrからLeuへの置換に加え、182番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換する変異を含む。さらなる実施形態は、177番目のアミノ酸位におけるGlyからAlaへの置換に加え、178番目の位置におけるThrからValへの置換を含む。本発明はまた177番目のアミノ酸位におけるGlyからAlaへの置換に加え、178番目のアミノ酸位におけるThrからLeuへの置換も包含する（図２参照）。
【００５３】
EPSPS遺伝子における前記の変異は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）EPSPS遺伝子（配列番号１）およびそのタンパク質（配列番号２）を用いて記載している。本発明はまた他の種（パラログ）の突然変異型EPSPS遺伝子も包含する。しかしながら、異なる種のEPSPS遺伝子の多様性により、ある種における置換されるアミノ酸残基の数が別の種においては異なることがある。しかしながら、当業者によって、配列相同性によって相同な位置が容易に同定される。例えば、図３Ａ-Ｃにはヌクレオチド配列のアライメントを示し、図４にはシロイヌナズナ、トウモロコシ（Zea mays）、ペチュニア（Petunia hybrida）およびアブラナ（Brassica napus）の４つのパラログのEPSPS遺伝子からのアミノ酸配列のアライメントが示されている。従って、トウモロコシにおける相同な位置は、Leu97、Gly101、Thr102、Ala103、Met104、Arg105、Pro106、Ser23、Ser179およびLeu122である。従って、トウモロコシEPSPSアミノ酸配列は、下記のアミノ酸位置：のうちの1つ以上の変異を有し、該変異により１つ以上の下記の置換がもたらされる：
（i）Leu97-Phe
（ii）Gly101-AlaあるいはIle（iii）Thr102-IleあるいはValあるいはLeu
（iv）Ala103-Gly
（v）Met104-Cys
（vi）Arg105-LeuあるいはSer
（vii）Pro106-LeuあるいはSer
（viii）Ser23-Asp
（ix）Ser179-Ala
（x）Leu122-Lys。
【００５４】
本発明における別の実施形態において、トウモロコシEPSPS遺伝子産物において置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Leu- Phe -Leu-Gly-Asn（配列番号３９）中のLeuであり、これがPheに置換される。あるいは置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Asn-Ala-Gly-Thr-Ala（配列番号３０）中のGlyであり、これがAlaまたはIleに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Gly-Thr-Ala-Met（配列番号３１）中のThrであり、これがIle、ValまたはLeuに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Gly-Thr-Ala-Met-Arg（配列番号３２）中のAlaであり、これがGlyに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Thr-Ala-Met-Arg-Pro（配列番号３３）中のMetであり、これがCysに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Met-Arg-Pro-Leu（配列番号３４）中のArgであり、これがLeuまたはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は以下の配列Met-Arg-Pro-Leu-Thr（配列番号３５）中のProであり、LeuまたはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続したPro-Gly-Ser-Lys-Ser（配列番号３６）中のSerであり、これがAspに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr（配列番号３７）中のSerであり、これがAlaに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Tyr-Val-Leu-Asp-Gly（配列番号３８）中のLeuであり、これがLysに置換される。他の実施形態において、１つ以上の前記の置換が該EPSPSアミノ酸配列に導入されても良い。
【００５５】
アブラナにおいて、相同なアミノ酸位置は、Leu169、Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194である。従って、アブラナEPSPSアミノ酸配列は、下記のアミノ酸位置において1つ以上の変異を有し、該変異により１つ以上の下記の置換がもたらされる：
（i）Leu169-Phe
（ii）Gly173-AlaまたはIle
（iii）Thr174-IleまたはValまたはLeu
（iv）Ala175-Gly
（v）Met176-Cys
（vi）Arg177-LeuまたはSer
（vii）Pro178-LeuまたはSer
（viii）Ser94-Asp
（ix）Ser251-Ala
（x）Leu194-Lys。
【００５６】
本発明における別の実施形態において、アブラナ EPSPS遺伝子産物において置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Leu- Tyr -Leu-Gly-Asn（配列番号２９）中のLeuであり、これがPheに置換される。あるいは置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Asn-Ala-Gly-Thr-Ala（配列番号３０）中のGlyであり、これがAlaまたはIleに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Gly-Thr-Ala-Met（配列番号３１）中のThrであり、これがIle、ValまたはLeuに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Gly-Thr-Ala-Met-Arg（配列番号３２）中のAlaであり、これがGlyに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Thr-Ala-Met-Arg-Pro（配列番号３３）中のMetであり、これがCysに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Met-Arg-Pro-Leu（配列番号３４）中のArgであり、これがLeuまたはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Met-Arg-Pro-Leu-Thr（配列番号３５）中のProであり、これがLeuあるいはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続したPro-Gly-Ser-Lys-Ser（配列番号３６）中のSerであり、これがAspに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr（配列番号３７）中のSerであり、これがAlaに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Tyr-Val-Leu-Asp-Gly（配列番号３８）中のLeuであり、これがLysに置換される。他の実施形態において、１つ以上の前記の置換が該EPSPSアミノ酸配列に導入されても良い。
【００５７】
ペチュニア（Petunia hybrida）において、相同な位置は、Leu169、Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194である。従って、ペチュニア EPSPSアミノ酸配列は、下記のアミノ酸位置において1つ以上の変異を有し、該変異により１つ以上の下記の置換がもたらされる：
（i）Leu169-Phe
（ii）Gly173-AlaまたはIle
（iii）Thr174-IleまたはValまたはLeu
（iv）Ala175-Gly
（v）Met176-Cys
（vi）Arg177-LeuまたはSer
（vii）Pro178-LeuまたはSer
（viii）Ser94-Asp
（ix）Ser251-Ala
（x）Leu194-Lys。
【００５８】
本発明における別の実施形態において、ペチュニアEPSPS遺伝子産物において置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Leu- Phe -Leu-Gly-Asn（配列番号３９）中のLeuであり、これがPheに置換される。あるいは置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Asn-Ala-Gly-Thr-Ala（配列番号３０）中のGlyであり、これがAlaまたはIleに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Gly-Thr-Ala-Met（配列番号３１）中のThrであり、これがIle、ValあるいはLeuに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Gly-Thr-Ala-Met-Arg（配列番号３２）中のAlaであり、これがGlyに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Thr-Ala-Met-Arg-Pro（配列番号３３）中のMetであり、これがCysに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Met-Arg-Pro-Leu（配列番号３４）中のArgであり、これがLeuまたはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Met-Arg-Pro-Leu-Thr（配列番号３５）中のProであり、これがLeuまたはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は以下のPro-Gly-Ser-Lys-Ser（配列番号３６）中のSerであり、これがAspに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr（配列番号３７）中のSerであり、これがAlaに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Tyr-Val-Leu-Asp-Gly（配列番号３８）中のLeuであり、これがLysに置換される。他の実施形態において、１あるいはそれ以上の前記の置換がこのEPSPSアミノ酸配列に導入されても良い。
【００５９】
５．３  植物細胞への組換え原性オリゴ核酸塩基の送達
組換え原性オリゴ核酸塩基により植物細胞を形質転換するためには、本発明における方法において一般的に知られているいかなる方法をも用いることができる。方法の実例は以下に挙げる。
【００６０】
５．３．１  マイクロキャリアーおよびマイクロファイバー
セルロース細胞壁を持つ植物細胞内に発射貫通によって大きなDNA断片を導入するために、金属製のマイクロキャリアー（微小球）を用いることは、これに関連した技術（以下、バイオリスティック送達と言う）に精通する者にとって自明である。米国特許第４,９４５,０５０号、第５,１００,７９２号および第５,２０４,２５３号に、マイクロキャリアーを選択する一般的な技術や、それらを発射する装置について記載されている。
【００６１】
本発明の方法においてマイクロキャリアーを用いるための特定の条件は、国際公開公報WO９９／０７８６５号に記載されている。ある実例となる技術として、氷冷したマイクロキャリアー（60mg/ml）、混合二本鎖オリゴヌクレオチド（60mg/ml）、2.5M CaCl2および0.1Mスペルミジンをこの順序で加え、この混合物を例えばボルテックスで10分間穏やかに撹拌し、室温で10分間放置した上でマイクロキャリアーを5倍量のエタノールで希釈し、遠心分離して100%エタノールに再懸濁する。濃度が8〜10μg/μlのマイクロキャリアー、14〜17μg/mlの混合二本鎖オリゴヌクレオチド、1.1〜1.4 MのCaCl2および18〜22mMのスペルミジンの粘ちょう溶液を用いて良い結果が得られる。最良の結果は、8μg/μlのマイクロキャリアー、16.5μg/mlの混合二本鎖オリゴヌクレオチド、1.3MのCaCl2、21mMのスペルミジンの条件下で認められた。
【００６２】
本発明の実施により、組換え原性オリゴ核酸塩基はまた、細胞壁および細胞膜を貫通させるためにマイクロファイバーを用いて植物細胞内に導入することができる。Coffeeらの米国特許第５,３０２,５２３号には、Black Mexican Sweetトウモロコシ懸濁培養物の形質転換促進のために30×0.5μmおよび10×0.3μmのシリコンカーバイドファイバーを用いることが記載されている。トランスミューテーションのために組換え原性オリゴ核酸塩基を導入するためには、植物細胞を形質転換するためにマイクロファイバーを用いてDNAを導入することが出来るいかなる機械的な技術も用いることが可能である。
【００６３】
マイクロファイバーによる組換え原性オリゴ核酸塩基の送達の技術として例示できるものは以下のとおりである。滅菌したマイクロファイバー（2μg）を約10μgの混合二本鎖オリゴヌクレオチドを含む150μlの植物培養液に懸濁する。懸濁培養物を静置しておき、等量の濃縮細胞および滅菌したファイバー／ヌクレオチドの懸濁液を10分間ボルテックスにかけてからプレートに広げる。特定の性質に応じて適宜、選択培地を、直ちにまたは最大約１２０時間遅らせて適用する。
【００６４】
５．３．２  プロトプラストエレクトロポレーション
別の実施形態において、植物の一部分由来のプロトプラストのエレクトロポレーションによって、組換え原性オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入することが出来る。プロトプラストは、当業者にとって自明である技術に従って、植物の一部分、特に葉に酵素的処理を行うことで形成される。例えば、Galloisら、1996, Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, NJ、 Kippら, 1999, Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, NJを参照。プロトプラストは、エレクトロポレーションを行う前に育成培地中で培養する必要はない。エレクトロポレーションの条件として例示できるものは、0.6〜4μg/mlの濃度の組換え原性オリゴ核酸塩基を含む総量0.3mlに3×105のプロトプラストを含むものである。
【００６５】
５．３．３  ウィスカーおよびマイクロインジェクション
さらに別のそれに代わる実施形態において、植物細胞へのウィスカーまたはマイクロインジェクションによって、組換え原性オリゴ核酸塩基を植物細胞に送達することが出来る。いわゆるウィスカー技術は基本的に、Frameら, 1994, Plant J. 6:941-948の記載に従って実施する。組換え原性オリゴ核酸塩基をウィスカーに付着させ、植物細胞を形質転換するのに用いる。組換え原性オリゴ核酸塩基を、植物細胞内でリコンビナーゼを形成することが出来るタンパク質をコードする配列を含むプラスミドと共にインキュベートしてもよい。そうすることで、オリゴヌクレオチドとEPSPS遺伝子内の標的配列との間の組換え反応が触媒される。
【００６６】
５．４  グリホサート耐性植物の選択
当技術分野において一般的に知られた方法を用いて、植物または植物細胞のある除草剤に対する耐性または抵抗性を試験することができる。例えば、植物あるいは植物細胞を除草剤存在下で生育させて生育速度を測定し、除草剤非存在下における生育速度と比較する。
【実施例】
【００６７】
６．実施例
以下の実験は、除草剤グリホサートに耐性であり、植物細胞の増殖速度を維持させる変異型のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）EPSPS遺伝子の作製を説明するものである。
【００６８】
６．１  材料および方法
６．１．１  シロイヌナズナEPSPS cDNAの単離
プライマーAtEXPEXPM1およびAtEXPEXP2CM-2を用い、シロイヌナズナcDNA ライブラリーからPCRによって1.3kbのDNA断片を増幅した。この2つのプライマーは、成熟ペプチドから終止コドンまでのcDNAを増幅するように設計されている。5’プライマーのAtEXPEXPM1はXbaI認識部位（下線部）を含み、3’プライマーのAtEXPEXP2CM-2はBglII認識部位（下線部）を含み、これらの認識部位は発現ベクターにこの断片をクローニングするために用いられる。
AtEXPEXPM1
5’-GCTCTAGAGAAAGCGTCGGAGATTGTACTT-3’（配列番号４０）
AtEXPEXP2CM-2
5’-GCAGATCTGAGCTCTTAGTGCTTTGTGATTCTTTCAAGTAC-3’（配列番号４１）
【００６９】
PCRバンドをアガロースゲルから回収して精製した（GeneClean, Biol社製）。
次に、この配列がシロイヌナズナEPSPS遺伝子の成熟ペプチド配列であることを確認した。
【００７０】
６．１．２  発現ベクターの調製
以下のプライマー：
BsAroE5’Xba
5’-GCGTCTAGAAAAACGAGATAAGGTGCAG-3’（配列番号４２）
および
BsAroE3’BamHI
5’-GCGGATCCTCAGGATTTTTTCGAAAGCTTATTTAAATG-3’（配列番号４３）
を用いたPCRにより、AroE 枯草菌（Bacillus subtilis）遺伝子のEPSPSコード領域を得た。
【００７１】
開始コドン（ATG）を持たないPCR 断片を、pACLacIMH6RecAベクターのフレーム内に、XbaIおよびBamHIで切断してRecAのORFと入れ換えることによりクローニングした。pACLacIMH6RecA には、1440〜3176の部位にPet21のLacI領域、3809〜5188の部位にMH6 RecA、5445〜218（5446〜5885および1〜218）の部位に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子および581〜1424の部位にp15A複製起点が含まれている。RecA遺伝子のコード領域は、開始コドンおよびpUC19のLacZプロモーター下流にある6ヒスチジンリンカー（MH6）をフレーム内に有するように大腸菌からクローニングした。
【００７２】
６．１．３  シロイヌナズナEPSPS遺伝子の細菌発現ベクターへのクローニング  シロイヌナズナの1.3kbPCR断片をXbaIおよびBamHI（BglIIで代用可能）で切断し、枯草菌遺伝子の代わりにプラスミドpACYCLacIMH6EPSPSにクローニングした。
【００７３】
次に、（クロラムフェニコールで選択して）得られたクローンの配列を調べ、陽性であることを確認した。確認したクローンの１つ（pAtEPS-12）を選択し、さらにこのcDNAとクローニングプラスミド間の結合部が、予想した配列と同じであることを確認した。
【００７４】
６．１．４  EPSPS遺伝子における新規の点変異
シロイヌナズナEPSPS遺伝子の異なる１０の変異型を設計した（図２参照）。変異誘発実験のため、PCRプライマーに１、２あるいは３つの変異が含まれるように設計した。PCR反応は、通常の近傍のプライマー（5’ATEPS-198: 5’-GAAAGCGTCGGAGATTGTAC-3’（配列番号４４））および変異を持つプライマー（図５参照）の１つを用いて行った。
【００７５】
得られた353bpのPCR断片を精製し（Qiagen PCR Purification kit）、それらの配列を確認した。次に、それらの断片をPstI（プライマー配列中の下線部）およびBamHIで切断し、あらかじめPstIおよびBamHIで切断したpAtEPS-12ベクターにつないだ。形質転換にはJM109（Promega社製）コンピテントセルを用い、クロラムフェニコールを含むLB培地上で平板培養した。次に、各々の変異誘発実験で得られたクローンを単離し、それらの配列を確認した。
【００７６】
６．１．５  グリホサート耐性アッセイ
LacZ ネズミチフス菌（Salmonella typhi）株であるSA4247のエレクトロコンピテント細胞を通常の手順（Current Protocols in Molecular Biology（Wiley and Sons, Inc.）参照）に従って調製した。シロイヌナズナの野性型および変異型のEPSPSタンパク質、枯草菌の野生型EPSPSをコードする各々のプラスミドDNA 20ngを用い、対照としては擬似のトランスフェクションを用い、30μlのSA4247コンピテント細胞をエレクトロポレーションにかけた。エレクトロポレーションの設定は、25μF、2.5KVおよび200オームであった。エレクトロポレーションの後、細胞を15ml培養管に移し、970μlのSOC培地を加えた。この培養物を1.5時間、37℃、225rpmでインキュベートした。50μlの各培養物を17μg/mlのクロラムフェニコールを含む LBプレート上に平板培養し（二連で行った）、37℃で一晩インキュベートした。翌日、各々の培地から5つのコロニーを拾い、M9プレートに移して37℃で一晩インキュベートした。
【００７７】
M9固形培地上で一晩インキュベートしたコロニーを4mlのM9液体培地に接種し、37℃で一晩増殖させた。翌日、クロラムフェニコール、IPTGおよび17mMまたは0mMグリホサート（Aldrich社製, 33775-7）を含む25mlのM9液体培地に各々の一晩培養物1〜2 mlを接種し（二連で行った）、初期OD値（600nmにおける）を測定して全ての培養物が同じOD値で開始するように標準化した。OD値の測定は、1時間毎に7時間行った。細菌増殖の対照として、ネズミチフス菌の非形質転換体の培養物もまた通常のLB培地中に接種した。２つの独立した実験において、A177I178、A177V178、A177L178およびI177のクローンはM9培地で増殖せず、ゆえにこれらにおいてはグリホサート耐性アッセイが実行されなかった可能性があった。
【００７８】
６．１．７  細菌クローンからの発現タンパク質の単離および精製
各々の細菌クローンの一晩培養物１ミリリットルを、クロラムフェニコールを含む100mlのLB液体培地中に接種する。細胞をOD値が0.5〜0.7に達するまで（およそ3.5時間）37℃で増殖させた。次に、培養物に濃度が1.0mMとなるように IPTGを加えた。細胞をさらに５時間増殖させた。 次に、それらを4000rpmで20分間4℃で沈殿させた。
【００７９】
ヒスチジンで標識されたタンパク質の単離および精製は、Qiagen Ni-NTA Protein Purification Systemに従って行った。細胞溶解物および溶出物を二連で12.5％アクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルの１つは直ちに可視化するために銀染色を行い、２枚目のゲルはMillipore Immobilon-Pメンブレンに転写し、TBS-T中5％のミルク中で一晩ブロッキングを行った。次に、このメンブレンを抗ヒスチジン一次抗体溶液（Amersham Pharmacia biotech社、カタログ番号37-4710）にさらした後、抗マウスIgG二次抗体溶液（NIF825, Amersham Pharmacia biotech ECLウェスタンブロッティング解析システム、カタログ番号RPN2108）にさらした。洗浄および検出反応は製造元の説明に従って行った。放射線写真は5分間感光した後に現像した。
【００８０】
６．２  結果
EPSPS遺伝子内の変異を有する細胞は、除草剤グリホサートに耐性であり、野生型細胞と比較して、グリホサートの存在に関わりなくグリホサート非存在下あるいは存在下において、実質的に同じ増殖速度を有する細胞を作成した（図６参照）。
【００８１】
また、変異型のEPSPS遺伝子を含むシロイヌナズナクローンが、野生型のタンパク質と実質的に同水準で、変異型のタンパク質を発現していることも証明された（図７）。
【００８２】
本明細書中で特許請求し、記載した本発明は、特定の実施形態の範囲に制限されることはなく、限定されるものではないが寄託された微生物の実施形態を包含するものであり、これらの実施形態が本発明の各々の態様の実例となるように本明細書中に記載した。実際に、本明細書中に明記および記載したものに加えて、本発明の様々な改良が前記の記述から当業者によって明らかになるであろう。この様な改良もまた、本明細書中の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【００８３】
いくつかの参照がここに引用され、それらの開示の全ては参照によりそれらの全体を本明細書中に組み込まれるものとする。
【図１Ａ】
2018027076.tif 000002
【図１Ｂ】
2018027076.tif 000003
【図２】
2018027076.tif 000004
【図３Ａ】
2018027076.tif 000005
【図３Ｂ】
2018027076.tif 000006
【図３Ｃ】
2018027076.tif 000007
【図４】
2018027076.tif 000008
【図５】
2018027076.tif 000009
【図６】
2018027076.tif 000010
【図７】
2018027076.tif 000011
【配列表】
2018027076000001.app
【外国語明細書】
2018027076000001.pdf