(57)【要約】【課題】抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする技術及び抗真菌剤の原料を精製する技術を提供する。【解決手段】本開示のエルゴステロール修飾担体は、エルゴステロールがリンカーを介して担体に化学修飾されている。本開示のスクリーニング方法は、エルゴステロール修飾担体と被検試料とを接触させる第１工程、エルゴステロール修飾担体に吸着されなかった夾雑物を除去する第２工程、及びエルゴステロール修飾担体から抗真菌剤の候補物質を遊離させる処理を施して、候補物質の回収を試行する第３工程とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されているエルゴステロール修飾担体。
【請求項２】
請求項１に記載のエルゴステロール修飾担体であって、
前記担体はシリカゲルである、エルゴステロール修飾担体。
【請求項３】
請求項２に記載のエルゴステロール修飾担体であって、
式（Ｉ）に表される、エルゴステロール修飾担体。
（ただし、式（Ｉ）中、Ｒは炭化水素鎖を示す。）
【化１】
2018004603.tif 000008
【請求項４】
請求項２に記載のエルゴステロール修飾担体であって、
式（ＩＩ）に表される、エルゴステロール修飾担体。
（ただし、式（ＩＩ）中、Ｘはエルゴステロールとシリカゲルとの間を連結する原子又は原子団を示す。）
【化２】
2018004603.tif 000009
【請求項５】
エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されているエルゴステロール修飾担体と、前記エルゴステロールに吸着される特性を有する抗真菌剤の候補物質が含まれている可能性のある被検試料と、を接触させる第１工程と、
前記第１工程によって接触させた前記エルゴステロール修飾担体及び前記被検試料から、前記エルゴステロール修飾担体に吸着されなかった夾雑物を除去することによって、前記候補物質が吸着されている可能性がある前記エルゴステロール修飾担体を選別する第２工程と、
前記候補物質が吸着された前記エルゴステロール修飾担体から前記候補物質を遊離させる処理を、前記第２工程によって選別された前記エルゴステロール修飾担体に対して施すことにより、前記候補物質の回収を試行する第３工程と、
を含む、抗真菌剤の候補物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項５に記載のスクリーニング方法であって、
前記第１工程においては、前記エルゴステロール修飾担体を主成分として充填したカラムに、前記被検試料を通すことにより、前記エルゴステロール修飾担体と前記被検試料とを接触させる、スクリーニング方法。
【請求項７】
請求項５又は請求項６に記載のスクリーニング方法であって、
前記第３工程においては、前記候補物質が吸着された前記エルゴステロール修飾担体から、前記候補物質をメタノールによって遊離させる、スクリーニング方法。
【請求項８】
請求項５から請求項７までのいずれか１項に記載のスクリーニング方法であって、
前記被検試料は、放線菌を一定時間培養した後に回収された培養液である、スクリーニング方法。
【請求項９】
エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されているエルゴステロール修飾担体と、前記エルゴステロールに吸着される特性を有する抗真菌剤の原料が含まれる精製前原料と、を接触させる第１工程と、
前記第１工程によって接触させた前記エルゴステロール修飾担体及び前記精製前原料から、前記エルゴステロール修飾担体に吸着されなかった夾雑物を除去することによって、前記抗真菌剤の原料が吸着された前記エルゴステロール修飾担体を選別する第２工程と、
前記抗真菌剤の原料が吸着された前記エルゴステロール修飾担体から前記抗真菌剤の原料を遊離させる処理を、前記第２工程によって選別された前記エルゴステロール修飾担体に対して施すことにより、前記抗真菌剤の原料を回収する第３工程と、
を含む、抗真菌剤の原料の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする技術及び抗真菌剤の原料を精製する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の生産する物質から抗真菌剤の候補物質をスクリーニングすることで、新規な抗真菌剤の開発が行われている（非特許文献１参照）。例えば、抗真菌剤の１つであるアンホテリシンＢは、放線菌の培養液等から抽出され、深在性真菌症の治療薬として使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１９８１，６４，１７５２−１７６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のアンホテリシンＢは、真菌の細胞膜の主成分であるエルゴステロールに結合して、細胞膜に小孔を作ることにより真菌を破壊する作用がある。しかしながら、アンホテリシンＢは動物の細胞膜の主成分であるコレステロールにも作用するため、腎毒性等の重篤な副作用を発現する場合がある。このような事情から、アンホテリシンＢに代わる新規な抗真菌剤の開発が望まれている。
【０００５】
本開示の一側面は、抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする技術及び抗真菌剤の原料を精製する技術を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、後述するエルゴステロール修飾担体を使用して、抗真菌剤の候補物質をスクリーニング、及び抗真菌剤の原料を精製することに成功し、本開示を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本開示の一態様はエルゴステロール修飾担体であって、エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されている。
また、本開示の別の態様は、抗真菌剤の候補物質のスクリーニング方法であって、第１工程と、第２工程と、第３工程と、を含む。第１工程は、エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されているエルゴステロール修飾担体と、エルゴステロールに吸着される特性を有する抗真菌剤の候補物質が含まれている可能性のある被検試料と、を接触させる。第２工程は、第１工程によって接触させたエルゴステロール修飾担体及び被検試料から、エルゴステロール修飾担体に吸着されなかった夾雑物を除去することによって、候補物質が吸着されている可能性があるエルゴステロール修飾担体を選別する。第３工程は、候補物質が吸着されたエルゴステロール修飾担体から候補物質を遊離させる処理を、第２工程によって選別されたエルゴステロール修飾担体に対して施すことにより、候補物質の回収を試行する。
【０００８】
また、本開示のさらに別の態様は、抗真菌剤の原料の精製方法であって、第１工程と、第２工程と、第３工程と、を含む。第１工程は、エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されているエルゴステロール修飾担体と、エルゴステロールに吸着される特性を有する抗真菌剤の原料が含まれる精製前原料と、を接触させる。第２工程は、第１工程によって接触させたエルゴステロール修飾担体及び精製前原料から、エルゴステロール修飾担体に吸着されなかった夾雑物を除去することによって、抗真菌剤の原料が吸着されたエルゴステロール修飾担体を選別する。第３工程は、抗真菌剤の原料が吸着されたエルゴステロール修飾担体から抗真菌剤の原料を遊離させる処理を、第２工程によって選別されたエルゴステロール修飾担体に対して施すことにより、抗真菌剤の原料を回収する。
【０００９】
本開示のスクリーニング方法を用いれば、多くの物質が混在し得る被検試料中から、エルゴステロールに吸着される物質を回収することができる。エルゴステロールに吸着される物質は、その物質自体が抗真菌活性を有している可能性があり、その場合は、スクリーニングされた物質そのものを抗真菌剤として利用し得る。また、スクリーニングされた物質自体が顕著な抗真菌活性を有していない場合でも、エルゴステロールに吸着される特性を残したまま、抗真菌活性が発現又は向上するような官能基を付加することにより、スクリーニングされた物質に抗真菌活性を付与し得る。したがって、本開示のスクリーニング方法を用いれば、新規な抗真菌剤を開発することができる。
【００１０】
特に、本開示のスクリーニング方法を用いれば、エルゴステロールに吸着される物質を回収できるため、エルゴステロールの生合成を阻害するような抗真菌剤よりも強い抗真菌活性を有する物質を得られる可能性がある。
【００１１】
また、本開示のスクリーニング方法を用いれば、エルゴステロール修飾担体に吸着されなかった夾雑物が除去されるため、抗真菌剤の候補物質のスクリーニングと同時に精製も行うことができる。
【００１２】
また、本開示の精製方法を用いれば、エルゴステロールに吸着される物質を精製、回収することができる。エルゴステロールに吸着される物質は、上述の理由から、抗真菌剤の原料になる。したがって、本開示の精製方法によって精製された原料を利用して抗真菌剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａはサンプル１Ａのクロマトグラムである。図１Ｂはサンプル１Ｂのクロマトグラムである。図１Ｃはサンプル１Ｃのクロマトグラムである。図１Ｄはサンプル１Ｄのクロマトグラムである。
【図２】図２Ａはサンプル２Ａのクロマトグラムである。図２Ｂはサンプル２Ｂのクロマトグラムである。図２Ｃはサンプル２Ｃのクロマトグラムである。図２Ｄはサンプル２Ｄのクロマトグラムである。
【図３】図３Ａは、Ｋ１５−０２５７株の放線菌を培養した培養液を用いて抽出された、５０％エタノール培養液抽出物及びメタノール抽出物のクロマトグラムである。図３Ｂは、Ｋ１５−０２６５株の放線菌を培養した培養液を用いて抽出された、５０％エタノール培養液抽出物及びメタノール抽出物のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．エルゴステロール修飾担体
本開示のエルゴステロール修飾担体は、エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されているものである。
【００１５】
本開示において用いられる担体としては、特に限定されないが、例えば、シリカゲル、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。ここで、担体をシリカゲルとした場合のエルゴステロール修飾担体であるエルゴステロール修飾シリカゲルの例を下記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）に示す。
【００１６】
本開示において用いられるリンカーは、エルゴステロールと担体との間を連結する原子又は原子団である。リンカーは、エルゴステロール修飾担体のエルゴステロールの機能を損なわない範囲であれば、特に限定されるものではない。また、リンカーの位置は、エルゴステロール修飾担体のエルゴステロールによる効果を損なわない範囲であれば、特に限定されるものではない。下記の式（Ｉ）に示すようにエルゴステロール修飾シリカゲルのリンカーは−Ｒ−Ｓ−であってもよい。Ｒは、炭化水素鎖（例えばＣｎＨ２ｎ）である。式（Ｉ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルのリンカーの具体例としては、−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｃ２Ｈ４−Ｓ−、−Ｃ３Ｈ６−Ｓ−、−Ｃ４Ｈ８−Ｓ−等を挙げることができる。また、下記の式（ＩＩ）に示すようにエルゴステロール修飾シリカゲルのリンカーは−Ｘ−であってもよい。Ｘは、エルゴステロールとシリカゲルとの間を連結する原子又は原子団である。式（ＩＩ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルのリンカーの具体例としては、−Ｃ３Ｈ６−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−、−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−、−Ｃ３Ｈ６−等を挙げることができる。
【００１７】
【化１】
2018004603.tif 000002
【００１８】
【化２】
2018004603.tif 000003
【００１９】
２．抗真菌剤の候補物質のスクリーニング方法
本開示のスクリーニング方法は、エルゴステロール修飾担体をアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用することにより、被検試料中から抗真菌剤の候補物質の回収を試行する方法である。
【００２０】
本開示における抗真菌剤とは、真菌に対して殺菌作用又は増殖阻害作用を有する薬剤を広く意味する。本開示の抗真菌剤は、真菌の細胞膜の主成分であるエルゴステロールを標的分子としたものである。また、本開示の抗真菌剤は、真菌症の治療薬や農薬として用いることができる。当該抗真菌剤としては、特に限定されないが、例えば、ヒトやペットへ感染する皮膚糸状菌症の治療薬、カンジダ症等の真菌症の治療薬、リーシュマニア属原虫を病因とするリーシュマニア症の治療薬、植物の真菌に由来する病気（例えばべド病やうどんこ病等）の農薬、お風呂等の水回りのカビの発生を抑制する防カビ剤等が挙げられる。
【００２１】
本開示における被検試料とは、本開示のスクリーニング方法を用いて、被検試料中にエルゴステロールに吸着される物質が存在するかどうかを評価するために用いる試料を意味する。被検試料の例としては、例えば、動物、植物及び微生物（例えば、乳酸菌、酵母、カビ、放線菌等）等から抽出された抽出物、微生物等を一定時間培養した後に回収された培養液、並びに化学的に合成した合成溶液等が挙げられる。ただし、被検試料は、これら例示したものに限定されない。特に、放線菌には抗生物質を生産する菌が多いため、放線菌が抗真菌剤に有用な物質を生産する可能性が高い。そのため、被検試料として、放線菌を一定時間培養した後に回収された培養液を用いると好ましい。
【００２２】
本開示のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ１）、（ｂ１）、及び（ｃ１）を行うことによって実施することができる。
（ａ１）エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されているエルゴステロール修飾担体と、エルゴステロールに吸着される特性を有する抗真菌剤の候補物質が含まれている可能性のある被検試料と、を接触させる第１工程。
（ｂ１）第１工程によって接触させたエルゴステロール修飾担体及び被検試料から、エルゴステロール修飾担体に吸着されなかった夾雑物を除去することによって、候補物質が吸着されている可能性があるエルゴステロール修飾担体を選別する第２工程。
（ｃ１）候補物質が吸着されたエルゴステロール修飾担体から候補物質を遊離させる処理を、第２工程によって選別されたエルゴステロール修飾担体に対して施すことにより、候補物質の回収を試行する第３工程。
【００２３】
本開示のスクリーニング方法の工程（ａ１）としては、例えば、エルゴステロール修飾担体を主成分として充填したカラムに、被検試料を通すことにより、エルゴステロール修飾担体と被検試料とを接触させる工程（カラム法）、被検試料にエルゴステロール修飾担体を加えて撹拌する工程（バッチ法）等が挙げられる。
【００２４】
本開示のスクリーニング方法の工程（ｂ１）としては、例えば、カラムを洗浄液で洗浄する工程（カラム法）、工程（ａ１）によって接触させたエルゴステロール修飾担体及び被検試料を遠心分離し、エルゴステロール修飾担体を回収する工程（バッチ法）等が挙げられる。
【００２５】
本開示のスクリーニング方法の工程（ｃ１）において、候補物質が吸着されたエルゴステロール修飾担体から、候補物質を極性溶媒によって遊離させることができる。極性溶媒としては、例えばアルコール系溶媒のエタノール、メタノール等が使用できる。その他、極性溶媒のアセトニトリル、アセトン等も使用できる。
【００２６】
また、工程（ｂ１）及び工程（ｃ１）の間に、工程（ｂ１）によって選別されたエルゴステロール修飾担体を洗浄する工程を含んでもよい。
このようなスクリーニング方法を高速液体クロマトグラフィー等に利用すると、被検試料から抗真菌剤の候補物質を濃縮又は精製することができる。
【００２７】
３．抗真菌剤の原料の精製方法
本開示の精製は、エルゴステロールに吸着される特性を有する抗真菌剤の原料が含まれる精製前原料から、抗真菌剤の原料を回収する方法である。
【００２８】
本開示の抗真菌剤の原料としては、特に限定されないが、例えば、本開示のスクリーニング方法を用いてスクリーニングされた抗真菌剤の候補物質、新規な抗真菌剤、及び既存の抗真菌剤等が挙げられる。
【００２９】
本開示の精製方法は、下記の工程（ａ２）、（ｂ２）、及び（ｃ２）を行うことによって実施することができる。
（ａ２）エルゴステロールが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されているエルゴステロール修飾担体と、エルゴステロールに吸着される特性を有する抗真菌剤の原料が含まれる精製前原料と、を接触させる第１工程。
（ｂ２）第１工程によって接触させたエルゴステロール修飾担体及び精製前原料から、エルゴステロール修飾担体に吸着されなかった夾雑物を除去することによって、抗真菌剤の原料が吸着されたエルゴステロール修飾担体を選別する第２工程。
（ｃ２）抗真菌剤の原料が吸着されたエルゴステロール修飾担体から抗真菌剤の原料を遊離させる処理を、第２工程によって選別されたエルゴステロール修飾担体に対して施すことにより、抗真菌剤の原料を回収する第３工程。
【００３０】
本開示の精製方法の工程（ａ２）としては、例えば、エルゴステロール修飾担体を主成分として充填したカラムに、精製前原料を通すことにより、エルゴステロール修飾担体と精製前原料とを接触させる工程（カラム法）、精製前原料にエルゴステロール修飾担体を加えて撹拌する工程（バッチ法）等が挙げられる。
【００３１】
本開示のスクリーニング方法の工程（ｂ２）としては、例えば、カラムを洗浄液で洗浄する工程（カラム法）、工程（ａ２）によって接触させたエルゴステロール修飾担体及び精製前原料を遠心分離し、エルゴステロール修飾担体を回収する工程（バッチ法）等が挙げられる。
【００３２】
本開示のスクリーニング方法の工程（ｃ２）において、抗真菌剤の原料が吸着されたエルゴステロール修飾担体から、抗真菌剤の原料を極性溶媒によって遊離させることができる。極性溶媒としては、例えばアルコール系溶媒のエタノール、メタノール等が使用できる。その他、極性溶媒のアセトニトリル、アセトン等も使用できる。
【００３３】
また、工程（ｂ２）及び工程（ｃ２）の間に、工程（ｂ２）によって選別されたエルゴステロール修飾担体を洗浄する工程を含んでもよい。
エルゴステロール修飾担体は、高速液体クロマトグラフィー等に利用しても、精製前原料から抗真菌剤の原料を精製することができる。
【００３４】
以下に、本開示を具体的に説明するが、本開示はこれらの実施例によって限定して解釈されるものではない。
［実施例１：製造例］
下記の化３で表されるように、式（ＩＩＩ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルを製造した。式（ＩＩＩ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルは、上記の式（Ｉ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルの一例である。具体的なの製造方法は以下の通りである。
【００３５】
球状シリカゲル（クロマトレックス  ＭＢ１００−７５／２００、富士シリシア化学株式会社製）２０ｇを秤取り、５００ｍＬフラスコに入れた。ここにトルエンを３００ｍＬ加え、スラリーを撹拌しながら３−メルカプトプロピルトリメトキシランを５．９ｇ加えて窒素雰囲気還流条件下で反応した。冷却後、脱液、有機溶媒で洗浄した。８０℃で乾燥させ、チオール基を表面に有するシリカゲルを２１．５ｇ得た。チオール基を表面に有するシリカゲルは、式（α）に示す。
【００３６】
さらに、チオール基を有するシリカゲルを２０ｇ秤取り、５００ｍＬフラスコに入れた。ここに１，４−ジオキサンを３００ｍＬ加え、スラリーを撹拌しながら、エルゴステロールを４．０ｇ加えて完全に溶解させた後、アゾビスイソブチロニトリルを８０ｍｇ加え、窒素雰囲気下、８５℃で加熱撹拌した。冷却後、スラリーをろ過し、有機溶媒で洗浄した後、脱液し、８０℃で乾燥させ、式（ＩＩＩ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルを２０．７ｇ得た。
【００３７】
【化３】
2018004603.tif 000004
【００３８】
［実施例２：製造例］
下記の化４で表されるように、式（ＩＩＩ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルを製造した。具体的なの製造方法は以下の通りである。
【００３９】
セパラブルフラスコに３−メルカプトプロピルトリメトキシラン１０ｍｍｏｌとエルゴステロール１０ｍｍｏｌを取り、１，４ジオキサンを２００ｍＬ入れて溶解させた。エルゴステロールに対して５％ｍｏｌのＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を添加し、撹拌しながら８５℃に加熱して反応させ、エルゴステロールが修飾されたシランカップリング剤を得た。エルゴステロールが修飾されたシランカップリング剤は、式（β）に示す。
【００４０】
さらに、この反応液に球状シリカゲル（クロマトレックス  ＭＢ１００−７５／２００、富士シリシア化学株式会社製）２０ｇを入れて還流反応を行いシリカゲルへ固定化した。反応後溶液を除去し、有機溶媒で洗浄した後、乾燥させ、式（ＩＩＩ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルを得た。
【００４１】
【化４】
2018004603.tif 000005
【００４２】
［実施例３：製造例］
下記の化５で表されるように、式（ＩＶ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルを製造した。式（ＩＶ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルは、上記の式（ＩＩ）に示すエルゴステロール修飾シリカゲルの一例である。具体的なの製造方法は以下の通りである。
【００４３】
エルゴステロール（８．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）を２００ｍＬフラスコに秤取り、乾燥したＴＨＦ（テトラヒドロフラン）６０ｍＬに溶解させた。窒素雰囲気下、氷浴上で冷却し、ＮａＨ（水素化ナトリウム）４５ｍｍｏｌを徐々に加えた。ＮａＨを添加後、３０分間撹拌し、ブロモアセチルブロミド（６．０５ｇ、３０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ１０ｍＬで希釈し滴下ロートにて１時間かけて添加した。全量を添加後、氷浴で冷却しながらさらに３時間反応させ、１Ｎ塩酸を添加して反応を終了させた。反応溶液中のＴＨＦをエバポレーターにて除去し、分液ロートを用いて水層から酢酸エチルで抽出した。有機層を５％炭酸水素ナトリウム溶液、１Ｎ塩酸、水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を留去し、残留物を酢酸エチル／ヘキサンで再結晶させて精製し、式（γ）で示す化合物を淡黄色固体として得た（収率４３％）。
【００４４】
式（γ）で示す化合物（３．１３１ｇ、６．１ｍｍｏｌ）をフラスコに秤取り、ＴＨＦ２００ｍＬに溶解させた。球状シリカゲル（クロマトレックス  ＮＨ  ＭＢ１００−７５／２００、富士シリシア化学株式会社製）１１ｇを加え、撹拌しながら加熱還流条件下で反応させた。１２時間反応後、反応溶液を脱液、有機溶媒で洗浄し、乾燥させて、式（ＩＶ）で示すエルゴステロール修飾シリカゲルを得た。その収量を下記の表１に示す。
【００４５】
式（ＩＶ）で示すエルゴステロール修飾シリカゲルの炭素含有量を元素分析（元素分析装置「Ｖａｒｉｏ  ＥＬ  ＩＩＩ」〔Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ社製〕を使用）により求めた。また、式（ＩＶ）で示すエルゴステロール修飾シリカゲルの官能基量は、原料シリカゲル（クロマトレックス  ＮＨ  ＭＢ１００−７５／２００）の炭素量との差から計算により求めた。
【００４６】
炭素含有量と分子構造から計算した官能基量は、原料シリカゲルの官能基量９７０μｍｏｌ／ｇに比べて小さかった。しかし、官能基が立体的に大きいことを考慮すると、官能基の結合量は妥当である。
【００４７】
【化５】
2018004603.tif 000006
【００４８】
【表１】
2018004603.tif 000007
【００４９】
［実施例４：吸着試験］
市販のアンホテリシンＢを少量のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解し、メタノールで１００μｇ／ｍＬの濃度に調製した。その調整液を蒸留水で１０倍希釈し、濃度１０μｇ／ｍＬの溶液を調整した。実施例１で得られたエルゴステロール修飾シリカゲル（以下、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）と称す）を１．５ｍＬの遠心チューブに５０ｍｇを取り、少量のメタノールを加えて分散後、少量の蒸留水を加えて撹拌した。ここに、１ｍＬのアンホテリシンＢ水溶液を添加して、撹拌した。遠心分離後、上澄みを除去し、１ｍＬの蒸留水を加えて撹拌後、遠心分離し、上澄みを回収、当該上澄みをサンプル１Ｂとした。
【００５０】
上記のエルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）５０ｍｇの代わりに、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）１００ｍｇ、及び無修飾のシリカゲル１００ｍｇを用いて、上記と同様の方法により上澄みを回収し、当該上澄みをそれぞれサンプル１Ｃ、サンプル１Ｄとした。
【００５１】
このようにして回収されたサンプル１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、及び濃度１０μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ水溶液（サンプル１Ａ）を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと称す）で分析した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
装置：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｕｌｔｒａ（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製）
カラム：Ｉｎａｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４（内径３．０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）
溶媒条件：溶媒Ａ：水／０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：メタノール／０．１％ギ酸
溶媒Ｂの比率を５〜１００％（０〜１０分）、１００％（１０分以上）に連続的に変化させた。
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ４００ｎｍ
サンプル注入量：５μＬ
サンプル１Ａ、サンプル１Ｂ、サンプル１Ｃ、サンプル１ＤをＨＰＬＣで分析した結果をそれぞれ図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄに示す。
【００５２】
図１Ａに示すように、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）を含まないサンプル１Ａでは、溶出時間２７分辺りにピークが観察された。一方、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）を含むサンプル１Ｂ及びサンプル１Ｃの場合、サンプル１Ａに比べて溶出時間２７分辺りのピーク面積が減少していた。このことから、アンホテリシンＢがエルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）に吸着されることが分かった。
【００５３】
さらに、図１Ｃに示す溶出時間２７分辺りのピーク面積は、図１Ｂに示すピーク面積よりも減少したことから、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）の重量に依存して、アンホテリシンＢがエルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）に吸着されることが分かった。
【００５４】
また、図１Ｄに示すように、溶出時間２７分辺りにピークが観察されたことから、無修飾のシリカゲルにはアンホテリシンＢが吸着されないことが分かった。
［実施例５：吸着試験及び溶出試験］
北里生命科学研究所に保管されているストレプトミセス属ｓｐ．Ｋ０４−００３７株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０４−００３７株）を０．５％グルコース、  ０．５％Ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ、  １．０％オートミール、１．０％  Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ、  ０．５％  Ｋ２ＨＰＯ４、  ０．４％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む培養液で培養するとアンホテリシンＢが生産される。この培養液を用いて、実施例１で得られたエルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）へのアンホテリシンＢの吸着試験及び溶出試験を実施した。
【００５５】
Ｋ０４−００３７株を上記培養液で２７℃、６日間振とう培養した。その培養液に５０％エタノールを加え、激しく攪拌し、遠心分離後の上澄みである５０％エタノール培養液抽出物を回収し、サンプル２Ａとした。実施例１で得られたエルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）を１００ｍｇ取り、１．５ｍＬの遠心チューブに少量のメタノールを加えて分散させ少量の蒸留水を加えて撹拌した。ここに、１ｍＬの５０％エタノール培養液抽出物を添加して攪拌した。遠心分離後、上澄みを回収し、サンプル２Ｂとした。沈殿したシリカゲルを１ｍＬの蒸留水で洗浄し、遠心分離後、上澄みを回収し、サンプル２Ｃとした。沈殿したシリカゲルに１ｍＬのメタノールを加えよく攪拌し、遠心分離後の上澄みであるメタノール抽出物を回収し、サンプル２Ｄとした。
【００５６】
このようにして回収されたサンプル２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２ＤをそれぞれＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
装置：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｕｌｔｒａ（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製）
カラム：Ｍｏｎｏｂｉｓ（内径３．３ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、株式会社京都モノテック社製）
溶媒条件：溶媒Ａ：水／０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：メタノール／０．１％ギ酸
溶媒Ｂの比率を５〜１００％（０〜１０分）、１００％（１０分以上）に連続的に変化させた。
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ４００ｎｍ
サンプル注入量：５μＬ
サンプル２Ａ、サンプル２Ｂ、サンプル２Ｃ、サンプル２ＤをＨＰＬＣで分析した結果をそれぞれ図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄに示す。
【００５７】
図２Ａに示すように、溶出時間２７分辺りにピークが観察されたことから、５０％エタノール培養液抽出物（サンプル２Ａ）にアンホテリシンＢが含まれていることが分かった。
【００５８】
図２Ｂに示すように、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）と接触させた５０％エタノール培養液抽出物（サンプル２Ｂ）には、溶出時間２７分辺りにピークが観察されたが、そのピーク面積は図２Ａに示すピーク面積よりも減少していた。エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）にアンホテリシンＢが飽和状態で吸着されているため、吸着されなかった過剰のアンホテリシンＢが、観察された。
【００５９】
図２Ｃに示すように、溶出時間２７分辺りにピークを示さなかったことから、蒸留水で洗浄液の上澄み（サンプル２Ｃ）にアンホテリシンＢは観察されなかった。
図２Ｄに示すように、溶出時間２７分辺りにピークが観察され、メタノール抽出物（サンプル２Ｄ）にアンホテリシンＢが確認された。そのため、５０％エタノール培養液抽出物（サンプル２Ａ）に含まれているアンホテリシンＢはエルゴステロ―ス修飾シリカゲル（ＩＩＩ）に吸着され、メタノールで溶出することができた。
【００６０】
［実施例６：スクリーニング］
様々な環境から分離した放線菌を実施例３で用いた培養液で培養して、エタノールを等量加え、５０％エタノール培養液抽出物を２０サンプル作成した。実施例１で得られたエルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）を１００ｍｇ取り、１．５ｍＬの遠心チューブに少量のメタノールを加えて分散させ少量の蒸留水を加えて撹拌した。ここに、１ｍＬの５０％エタノール培養液抽出物を添加して撹拌した。遠心分離後、沈降したシリカゲルを蒸留水１ｍＬで洗浄、遠心分離後、上澄みを除去した。１ｍＬのメタノールを加えてよく撹拌、遠心分離し、上澄みであるメタノール抽出物を回収した。５０％エタノール培養液抽出物及びメタノール抽出物をＨＰＬＣで分析した。
【００６１】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
装置：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｕｌｔｒａ（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製）
カラム：Ｍｏｎｏｂｉｓ（内径３．３ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、株式会社京都モノテック社製）
溶媒条件：溶媒Ａ：水／０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：メタノール／０．１％ギ酸
溶媒Ｂの比率を５〜１００％（０〜１０分）、１００％（１０分以上）に連続的に変化させた。
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ４００ｎｍ
サンプル注入量：５μＬ
Ｋ１５−０２５７株の放線菌を培養した培養液を用いて抽出された、５０％エタノール培養液抽出物（図中の培養液抽出物）及びメタノール抽出物をＨＰＬＣで分析した結果を図３Ａに示す。Ｋ１５−０２６５株の放線菌を培養した培養液を用いて抽出された、５０％エタノール培養液抽出物（図中の培養液抽出物）及びメタノール抽出物をＨＰＬＣで分析した結果を図３Ｂに示す。
【００６２】
図３Ａに示すように、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）に吸着される物質が含まれていない培養液を用いて抽出されたメタノール抽出物には、溶出時間６分に目立ったピークが観察されなかった。一方、図３Ｂに示すように、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）に吸着される物質が含まれている培養液を用いて抽出されたメタノール抽出物には、溶出時間６分にピークが確認された。
【００６３】
さらに、図３Ａに示す溶出時間約１０分及び図３Ｂに示す約３分に５０％エタノール培養液抽出物には大きなピークが観察されたが、エルゴステロール修飾シリカゲル（ＩＩＩ）処理後のメタノール抽出液には観察されず、エルゴステロールに吸着される物質のみメタノールで溶出されるため、精製が容易である。
【００６４】
実際、図３Ｂに示す溶出時間６分の物質はＳｔｒｅｐｔａｚｏｌｉｎ（分子量２０７、Ｃ１１Ｈ１４ＮＯ３）であることが分かった。本物質の生物活性に抗真菌活性が知られており、エルゴステロールとの親和性による活性発現があることが示唆された。
【図１】
2018004603.tif 000010
【図２】
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【図３】
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