(57)【要約】【課題】安全で食品に多く含まれる物質で運動機能を維持、向上させる、運動機能向上剤を提供することを課題とする。【解決手段】本願発明者らは、グルタチオンに筋肉中のｐＨの低下を抑制する機能と、ＰＧＣ−１αを活性化し、ミトコンドリアＤＮＡの産生量が増加することを見出し、本願発明を完成させた。本願発明は、運動機能の維持だけでなく、体内の脂肪代謝を促進する効果を有する。そのため、糖尿病などの生活習慣病を予防する効果も有する【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタチオンを用いた、運動時にミトコンドリアを活性化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオンを有効成分として含む運動機能性向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、運動を行なうと、筋肉にあるグリコーゲン由来のグルコースが利用され、無酸素的な解糖反応が進行して筋肉の収縮に必要なＡＴＰが合成される。その代謝産物である乳酸が蓄積することで筋肉中のｐＨ低下し、筋収縮の効率が落ちてくる。このため、筋肉中のpＨを低下させないことが運度機能を持続させるためには必要となる。
【０００３】
また、骨格筋のエネルギー代謝制御に関与する因子ＰＧＣ−１αが知られている（非特許文献１）。マウスを寒冷環境下におくと骨格筋でのＰＧＣ−１αが増加する。そのため骨格筋組織での熱産生の制御に関わることが知られている。また、ＰＧＣ−１αを強制発現させると、ミトコンドリア呼吸鎖に関わる因子の転写を促すＮＲＦや、ミトコンドリアにおいてエネルギー消費を起こすと考えられている脱共役蛋白質、ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＵＣＰ）の発現が誘導されるほか、ミトコンドリアのゲノム複製や転写反応過程に重要な役割を果たすｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ（ｍｔＴＦＡ）の発現が誘導され、これら分子の機能発現によって細胞内のミトコンドリア数が増加し、また細胞の酸素消費量が増大することも明らかとなった。このことから、ヒト由来細胞内において、ミトコンドリアの機能が活性化することで、熱産生、即ちエネルギー消費を引き起こし、さらには細胞内でエネルギー源となる糖や脂質の代謝を活性化させることが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
これまで、運動機能改善剤について、抗疲労剤として、ビタミン類（特許文献１）、カツオやマグロの多量に含まれるイミダゾール化合物（特許文献２）、オルニチン（特許文献３）などが知られている。抗酸化物質として知られているグルタチオンは、特許文献３では、オルニチンと相乗効果により、ストレス性抗疲労効果があることが記載されている。
【０００５】
しかし、グルタチオンが、運動機能を維持、向上させることについては、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１３８１７０号公報
【特許文献２】特開２００２−３３８４７３号公報
【特許文献３】国際公開番号WO2007/142286
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ，９２，８２９−８３８，１９９８
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ，９８，１１５−１２４，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明は、安全な物質で運動機能を維持、向上させる、運動機能向上剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、グルタチオンに筋肉中のpＨの低下を抑制する機能と、ＰＧＣ−１αを活性化し、ミトコンドリアＤＮＡの産生量が増加することを見出し、本願発明を完成させた。 
【００１０】
本発明は、
（１）グルタチオンを有効成分として含む、ミトコンドリア活性（ミトコンドリアDNA量増加）による運動機能性向上剤、
（２）グルタチオンを有効成分として含む、筋肉ｐH低下抑制による運動機能性向上剤、
（３）グルタチオンを有効成分として含む、ミトコンドリア活性（ミトコンドリアＤＮＡ量増加）及び筋肉ｐＨ低下抑制による運動機能性向上剤。
を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、筋肉中のpＨ低下を抑制する効果により、運動機能を持続させることができる。また、PGC-1αの活性化によりミトコンドリアが活性化するため、体内中の脂肪の取り込みや脂肪の燃焼が効率的に進むため、運動機能の維持だけでなく、体内の脂肪代謝を促進する効果を有する。そのため、糖尿病などの生活習慣病を予防する効果も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】骨格筋におけるpH（グルタチオン）
【図２】骨格筋におけるpH（ビタミンＣ）
【図３】骨格筋におけるPGC-1α発現量（グルタチオン）
【図４】骨格筋におけるPGC-1α発現量（ビタミンＣ）
【図５】骨格筋におけるミトコンドリアDNA量 （グルタチオン）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の運動機能向上とは、疲労を抑制することではなく、競技等における運動実行力の向上から一般的なジョギング、ウオーキングのような軽度の運動実行力を向上させる機能である。また、運動時だけでなく平常時や歩行等の日常生活における体内の脂肪代謝を促進する機能も含む。
【００１４】
本願発明の筋組織中のpＨ低下抑制とは、一般的には、筋組織中の乳酸の蓄積により筋肉中のｐHが低下し、酸性化する。筋組織中のｐＨが低下することにより、筋組織の代謝活性が低下し、運動を持続することができなくなる。本発明は、筋組織中のｐＨ低下を抑制するため、運動を持続させることが可能であり、さらに運動だけでなく、日常生活における歩行等においても、同様な効果を有するため、日常生活におけるグルコース等の消費が活発化する。
【００１５】
pＧＣ1αとは、Peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator 1αであり、ミトコンドリアの合成を促進する働きを有すること、血液中のブドウ糖（血糖）を骨格筋に取り込む糖輸送体であるＧＬＵＴ４を増加させることがしられている。また、ヒトの筋肉でのＰＧＣ１α発現量が糖尿病や老化によってミトコンドリア機能とともに低下し、ＰＧＣ１αはエネルギー消費量の低下によるメタボリックシンドロームなどの生活習慣病の疾患治療標的となることが知られている。
【００１６】
本発明は、筋組織中のｐＨ低下抑制機能とＰＧＣ１αを活性化することで、ミトコンドリアＤＮＡ量を増加させ、結果的にミトコンドリアの合成を促進している。そのため、本発明は、生活習慣病の予防として使用することもできる。
【００１７】
本発明でいうグルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンの３アミノ酸から構成されるトリペプタイドである。また、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンあるいはこれらの混合物でもよい。還元型グルタチオンとはγ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙの構造を有するトリペプチドを表し、酸化型グルタチオンとは還元型グルタチオン２ 分子がＳＳ結合により結合したものである。グルタチオンの形態は、グルタチオンを有効成分として含有するものであれば何でもよい。
【００１８】
本願の運動機能改善効果を得るためには、前段のグルタチオンを有効成分として含むものを投与する。投与の方法は、特に限定されず、経口投与、静脈内、腹膜内もしくは皮下投与等の非経口投与をあげることができる。具体的には、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の非経口剤のいずれでもよい。
【００１９】
グルタチオンを含有する酵母を経口投与することもできる。グルタチオンを多く含有する酵母としては「ハイチオンコーボＭＧ」（興人ライフサイエンス社製）、グルタチオンを含有する酵母エキスとしては「ハイチオンエキスＹＨ」（興人ライフサイエンス社製）などがある。
【００２０】
本発明の投与量は、前述の機能が発現する量でれば特に限定されない。ヒトに投与する場合の投与量および投与回数は、投与形態、被投与者の年齢、体重等により異なるが、成人一日当り、グルタチオンを通常は５０ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇ、特に好ましくは２００ｍｇ〜３ｇとなるように一日一回乃至数回投与する。
【００２１】
投与間隔は、特に限定されない。継続的に投与することが好ましい。通常は１日間〜 １年間、好ましくは１週間〜３ヶ月間である。なお、本発明の製剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物に対しても使用することができる。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２３】
本発明及び実施例における測定条件は以下の通りである。
（筋組織ｐＨの測定）
麻酔後, 微小ガラス電極（ＣＭＮ−１４１, Chemical Instruments）を用いて前脛骨筋と腓腹筋の間質pHを測定した。
【００２４】
（ＰＧＣ−１α活性の測定）
筋中のＰＧＣ−１α量をwestern-blottingにより測定した。安静群の平目筋をホモジナイズし,  ＢＣＡ法（BCATM Protein Assay Kit, Thermo SCIENTIFIC）を用いてタンパク質濃度を測定した。調製したタンパク質サンプルを１０％ゲル（Ｗａｋｏ）に流し込み, 電気泳動により分離し, 転写装置（iBlot, Invitrogen）を用いてメンブレンに転写した。３０分間のブロッキング後（EzBlockChemi, ATTO CORPORATION）, Tris buffered saline（BIO-RAD Laboratories）-Tween20（Wako）、ＴＢＳ−Ｔで５分間, ３回洗浄し, １次抗体にａｎｔｉ−ＰＧＣ−１α抗体（CHEMICON International）を用いて室温で６０分間反応させた。ＴＢＳＴで５分間, ３回洗浄し, ２次抗体にanti-rabbit抗体（GE Healthcare）を用いて室温で６０分間反応させた。ＴＢＳＴで５分間，  ３回洗浄し，  発色剤（ECL plus, GE Healthcare）を４分間反応させた。画像解析装置（ImageQuant LAS 4000, GE Healthcare）を用いてバンドを検出し, 数値化した。その後, コントロール群に対する相対比を求めた。
【００２５】
（ミトコンドリアＤＮＡの測定）
安静群の平目筋をＤＮＡ分離試薬（DNA zol  BD Reagent, Invitrogen）でホモジナイズした後,ＤＮＡを抽出した。β−ａｃｔｉｎ（核ＤＮＡコード）とcytochrome oxidase II（ＣＯＸ−II）（ミトコンドリアＤＮAコード）をpolymerase chain reactionで増幅し,  ＤＮＡコピー数を定量した。両者の比を用いてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）量を求めた。
【００２６】
以下の方法で、グルタチオンの運動機能性向上効果を測定した。
試験例１
飼育方法および実験プロトコール
実験動物には７週齢のＩＣＲ雄性マウス（清水実験材料）を用いて実験を行った。１週間の予備飼育後，  体重をもとにグルタチオン群（ｎ＝２１）と対照群（ｎ＝２１）の２群にわけた。グルタチオン（興人ライフサイエンス株式会社）を２．０％溶液に調整し，  グルタチオン群に５μｌ／ｇ体重を１日１回，２週間経口投与した。対照群には蒸留水を同量，同期間経口投与した。飼育室は１２時間の明暗サイクルが保たれ，プラスティックゲージ内で水と飼料は自由に摂取できるものとした。
最終日にさらに対照安静群（ｎ＝１３）, 対照運動群（ｎ＝８），グルタチオン安静群（ｎ＝１３）およびグルタチオン運動群（ｎ＝８）の４群にわけた。運動群にはトレッドミル走運動を負荷し, その後, 全群解剖を行った。
【００２７】
試験例２
運動および解剖プロトコール
運動負荷試験は, トレッドミル（ＭＫ６８０, 室町機械）を用いた。運動負荷実施日に, 安静群は運動負荷を行わず解剖し, 運動群には速度２５ｍ／分で３０分間のトレッドミル走運動を負荷し, 運動負荷終了直後に解剖を行った。麻酔下にて筋組織pHを測定した後, 両脚の平目筋を摘出した。筋肉はドライアイスで凍結後, 測定まで−８０℃で保存した。
【実施例１】
【００２８】
筋組織pH
筋組織pHは, 安静時と比較して運動後で有意に低値を示した（ｐ <  ０．００１）。また, 対照運動群と比較してグルタチオン運動群で有意に高値を示した（p < ０．０５）。（図１、図２）
比較として、ビタミンＣをグルタチオンと同様に投与したデータを取得した。
【実施例２】
【００２９】
骨格筋ＰＧＣ−１αおよびｍｔＤＮＡ
平目筋におけるＰＧＣ−１α発現量は対照群と比較してグルタチオン群で有意に高値を示した（p < ０．０５）。ｍｔＤＮＡ量（ＣＯＸ−ＩＩ／β−ａｃｔｉｎ）の相対比は、対照群と比較してグルタチオン群で有意に高値を示した（p < ０．０５）。（図３、図４）
比較としてビタミンＣのＰＧＣ−１αの発現量をグルタチオンと同条件でデータを取得した。
【００３０】
データはすべて平均値±標準誤差で示した。４群間の比較には二元配置分散分析を行った後, 多重比較検定（Bonferroni）を行った。２群間の比較にはStudentのｔ検定を行った。有意水準は５％とした。
【００３１】
測定の結果、グルタチオンを投与した群については、筋組織pＨの低下が見られず、ＰＧＣ−１α発現量の増加、ｍｔＤＮＡ量の増加が見られた。このことから、グルタチオンを投与することで、運動機能の向上が確認された。一方、ビタミンＣでは、グルタチオンの効果が確認されなかった。
【００３２】
以上より、グルタチオンを有効成分として含む、安全な運動機能性向上剤を提供することができる。また、ＰＧＣ−１αの活性化により、運動時だけでなく、安静時においても、筋肉組織中の代謝を活性化させ体内の脂肪代謝を促進するため、糖尿病などの生活習慣病を予防することも可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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