(57)【要約】【課題】  従来よりも高い効率で産子を得られるウシ卵子の凍結保存方法、及び当該方法を用いたウシの育種改良方法を提供すること。【解決手段】  （１）ウシ卵巣から未成熟卵子を回収する未成熟卵子回収工程、（２）前記未成熟卵子を体外で成熟させてウシ成熟卵子を得る体外成熟工程、（３）前記ウシ成熟卵子の周囲にある卵丘細胞を残した状態で凍結保存する凍結保存工程を備えることを特徴とするウシ卵子の凍結保存方法によって、課題が解決される。このとき、（３）凍結保存工程において、凍結保存を実施する前に、（４）前記ウシ成熟卵子をバラバラとする分散処理工程を備えることが好ましい。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ウシ卵巣から未成熟卵子を回収する未成熟卵子回収工程、（２）前記未成熟卵子を体外で成熟させてウシ成熟卵子を得る体外成熟工程、（３）前記ウシ成熟卵子の周囲にある卵丘細胞を残した状態で凍結保存する凍結保存工程を備えることを特徴とするウシ卵子の凍結保存方法。
【請求項２】
前記（３）凍結保存工程において、凍結保存を実施する前に、（４）前記ウシ成熟卵子をバラバラとする分散処理工程を備えた請求項１に記載のウシ卵子の凍結保存方法。
【請求項３】
請求項１または２の凍結保存方法によって凍結されたものであって、前記ウシ成熟卵子の周囲に複数の層にわたって卵丘細胞が備えられているウシ成熟卵子。
【請求項４】
（５）請求項１または２の方法によって凍結保存されたウシ卵子の一部を用いて体外受精した後、ウシ産子を得る産子取得工程、（６）当該ウシ産子を飼育してウシ成体とし、当該ウシ成体の特徴を評価する成体評価工程、（７）当該評価を利用して前記凍結保存されたウシ卵子を用いて、別のウシ産子を得るか否かを決定する評価後決定工程を含むことを特徴とするウシの育種改良方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ卵子の凍結保存方法ならび本手法による肉質情報を利用した育種改良手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の卵子を体外に取り出し、体外受精した後に子宮に戻し、産子まで生育する研究が知られている。例えば、ヒト、ウシ、マウスでは、卵子を体外に取り出した後、急速に凍結した状態で保存し、これを解凍して、体外受精を行うという方法が知られている（特許文献１，非特許文献１〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１２４９７８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Zengyan Wang et. al., (2009) A modified cryoloop vitrification protocol in the cryopreservation of mature mouse oocytes. Zygote 17, 217-224
【非特許文献２】Maria Giulia Minasi et. al., (2012) Efficiency of slush nitrogen vitrification of human oocytes vitrified with or without cumulus cells in relation to survival rate and meiotic spindle competence. Fertility and Sterility 97, 1220-1225
【非特許文献３】X.L. Zhou et. al., (2010) Bovine ooyte vitrification using the Cryotop method: Effect of cumulus cells and vitrification protocol on survival and subsequent development. Cryobiology 61, 66-72
【非特許文献４】AD Vieira et. al., (2008) Calves Born after Direct Transfer of Vitrified Bovine In Vitro-produced Blastocysts Derived from Vitrified Immature Oocytes. Reprod Dom Anim 43, 314-318
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１には、静磁場及び交流電磁場を作用させた環境下で哺乳動物の胚または卵子を凍結することで、融解後の受胎率を向上させるという技術が開示されている。しかしながら、ウシ産子までに飼育した実施例は含まれていない。
また、非特許文献１には、マウスの成熟卵子を超急速ガラス化凍結するときに、卵丘細胞を除去した卵子（裸化卵子）を凍結すると、胚の分割率や胚盤胞の発生率は凍結しない場合と差がなかったことが示されている。
非特許文献２には、ヒトの成熟卵子を超急速ガラス化凍結するときに、卵丘細胞の有無は卵子の生存性に影響がなかったことが示されている。但し、卵丘細胞を取り去った裸化卵子を凍結した場合には、正常な紡錘体の形成率が高かったことから、ヒトでは体外受精の観点から、裸化卵子での凍結が望ましいとの結論が提示されている。
非特許文献３には、ウシの成熟卵子を超急速ガラス化凍結するときに、卵丘細胞の有無は、胚の分割率や胚盤胞の発生率に影響がなかったことが示されている。また、胚盤胞の発生率は、卵丘細胞の有無にかかわらず4.4〜5.0％であること及び、凍結した卵子は、凍結しない卵子に比べ、胚の分割率や胚盤胞の発生率が低下することが開示されている。
【０００６】
非特許文献４には、640個のウシの成熟卵子を超急速ガラス化凍結し、得られた29個の胚盤胞（胚盤胞の発生率4.5%）のうち、良質な胚16個を移植し、5頭の産子を得たとの報告がある。このことから、ウシ1頭の生産に凍結卵子が約128個必要であったことが分かる。また、凍結した卵子は、凍結しない卵子に比べ、胚の分割率や胚盤胞の発生率が低下したことが示されている。
このように、特に哺乳動物として、ウシを使用した場合には、ウシ卵子を凍結した後に、解凍し、体外受精した場合には、個体としての子牛を得ることは非常に困難であった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来よりも高い効率で産子を得られるウシ卵子の凍結保存方法、及び当該方法を用いたウシの育種改良方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ウシ卵子を凍結処理する際に卵丘細胞の有無が与える影響を調べたところ、卵丘細胞が残っている卵子の方が、高い効率で産子を得られることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
なお、ウシ卵子を凍結保存しない場合には、卵丘細胞の有無は、胚の分割率や胚発生率には、有意な影響を与えないことが分かった。しかし、ウシ卵子を（凍結せずに）そのまま用いる場合に比べると、凍結保存した後に解凍してウシ産子を得る方が、産業上の有効性が格段に高くなる。このため本発明は、特にウシの育種改良に際して、非常に有効な方法となる。
【０００８】
こうして、本発明に係るウシ卵子の凍結保存方法は、（１）ウシ卵巣から未成熟卵子を回収する未成熟卵子回収工程、（２）前記未成熟卵子を体外で成熟させてウシ成熟卵子を得る体外成熟工程、（３）前記ウシ成熟卵子の周囲にある卵丘細胞を残した状態で凍結保存する凍結保存工程を備えることを特徴とする。
本発明で凍結保存されたウシ成熟卵子は、従来の方法で凍結されたウシ成熟卵子に比べると、非常に高い効率で胚の分割が続き、産子まで成長させられる。
卵丘とは、哺乳動物における卵巣の成熟卵胞（濾胞）において、卵胞の内壁を被う顆粒細胞の一部が卵母細胞と透明帯を包んで卵胞腔に丘状に突出している部分を言う。この部分の顆粒細胞を特に卵丘細胞と言う。すなわち、卵丘細胞とは、卵子の周囲を取り囲む（卵子よりも小型の）顆粒状の細胞を意味する。哺乳動物において、ウサギ・ネズミ類及び食肉類の多くでは、排卵後数時間にわたって卵子の周囲に卵丘細胞が付着しているが、有蹄類やヒトでは、排卵後比較的短時間内に消失することが知られている。インビトロ試験において、ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸分解酵素）やプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）を用いることで、卵丘細胞を取り除くことができる。これまでのマウス・ヒト・ウシの卵子を用いた実験に依れば、取扱いの容易性や、卵丘細胞の有無が胚分割や胚盤胞の発生率に与える影響を調べた結果として、卵丘細胞を除去した卵子を急速に凍結処理することが一般的な方法として知られていた。
【０００９】
上記（３）凍結保存工程において、卵丘細胞を残す場合に、余りにも多くの卵丘細胞が残っていると、卵子がバラバラにならずに取り扱いが困難となる。本発明者の検討によれば、卵丘細胞をなくしてしまうと、解凍後の成熟卵子の胚分割や胚盤胞の発生率が非常に低下してしまう。このため、各卵子がバラバラになるが、十分な卵丘細胞が卵子の周囲に残っている状態（例えば、卵丘細胞が複数の層（3層〜7層程度）をなして、卵子を取り囲んでいる状態）程度にすることが好ましい。上記（３）凍結保存工程において、凍結保存を実施する前に、（４）前記ウシ成熟卵子をバラバラとする分散処理工程を実施することが好ましい。分散処理工程では、ヒアルロニダーゼまたはプロテアーゼを用いた酵素処理を行うことが好ましい。このとき、酵素処理は、従来実施されていた卵丘細胞が殆ど無くなってしまう条件に比べると、相当程度に緩やかな条件（すなわち、低温度、低酵素濃度、短時間）で実施する。卵丘細胞は、非常に弱いために、少し強い条件で反応すると、殆どの卵丘細胞が除去されてしまい、裸の卵子となってしまう。このため、各ウシ成熟卵子がバラバラになる程度の条件で十分である。
上記方法によって凍結保存されたウシ卵子は、ウシ成熟卵子の周囲に複数の層にわたって卵丘細胞を備えている。このような形態は、従来は用いられておらず、本発明に特有の形態である。
【００１０】
次に、本発明に係るウシの育種改良方法は、（５）上記発明に係るウシ卵子の凍結保存方法によって凍結保存されたウシ卵子の一部を用いて体外受精した後、ウシ産子を得る産子取得工程、（６）当該ウシ産子を飼育してウシ成体とし、当該ウシ成体の特徴を評価する成体評価工程、（７）当該評価を利用して前記凍結保存されたウシ卵子を用いて、別のウシ産子を得るか否かを決定する評価後決定工程を含むことを特徴とする。
上記（６）成体評価工程とは、ウシ成体の特徴、例えば「肉質」を評価することができる。肉質を評価するには、食肉処理後に検査により判明する「脂肪交雑（いわゆる霜降り）」、「歩留り（食用となる部分の割合）」、「ロースなどの高付加価値部位の多さ」、理化学検査により判明する「脂肪の柔らかさ（不飽和脂肪酸の含有量）」、画像診断により判明する「筋間脂肪の細かさ（肉の霜降りをより細かく調べた指標）」、「牛肉の香り」、「アミノ酸等のうまみ」などをパラメータとして利用することができる。これらのパラメータの全部または一部について評価を行う。（７）評価後決定工程としては、（６）成体評価工程を経て、各パラメータについての評価が確定した後に、その値に基づいて、望ましい特徴を持つウシの卵子のみを選択して融解し、体外受精・胚培養の工程を行う。
上記発明によれば、ウシ成体の特徴（例えば、肉質、乳量など）を評価した後に、良好な結果を得られるウシ卵子から、別のウシ産子を得ることができる（結果を見た後に、「後出しジャンケン」を実施できる）。このため、望む結果が得られる可能性が高いウシ産子を得られるので、従来のウシ成体飼育方法に比べると、相当程度に確率の高い育種改良方法を提供できる。
なお、遺伝率が関係するため、一世代で望ましい特徴を持つウシ成体を得られない可能性はあるが、本発明のウシの育種改良方法を複数世代にわたって繰り返すことにより、従来の方法に比べれば、望ましい形質を備えたウシに改良できる可能性は飛躍的に高められる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来よりも高い効率で産子を得られるウシ卵子の凍結保存方法、及び当該方法を用いたウシの育種改良方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】下記試験方法１において、反応条件１で処理した後の卵丘細胞が付着したウシ成熟卵子（卵丘卵母細胞複合体（Cumulus oocyte complex：COC））の顕微鏡写真図である（卵子の直径は、約150μm程度である。図２〜図４についても同じ）。
【図２】卵丘細胞を除去したウシ成熟卵子（裸化卵子（Denuded oocytes：DO））の顕微鏡写真図である。
【図３】室温条件下（25℃）で0.01％ヒアルロニダーゼに5秒浸漬処理したウシ成熟卵子の顕微鏡写真図である。
【図４】加温条件下（37℃）で0.1％ヒアルロニダーゼに30秒浸漬処理したウシ成熟卵子の顕微鏡写真図である。
【図５】超急速ガラス化凍結したウシ成熟卵子由来の子牛の写真図である。（Ａ）表４中の個体１由来の雌子牛の写真図、（Ｂ）表４中の個体２由来の雄子牛の写真図をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく、様々な形態で実施できる。
＜試験方法＞
１．ウシ成熟卵子の作出
食肉処理されたウシ卵巣から卵子を回収し（未成熟卵子回収工程）、TCM199（Gibco）、10%新生子ウシ血清、10 ng/ml硫酸ゲンタマイシン、0.02 AU/ml卵胞刺激ホルモン（アントリンR・10；共立製薬）、50 ng/ml EGF、5.0 μg/ml dbcAMPおよび0.6 mg/ml L-カルニチンを含有する溶液中で38.5℃、5%CO2、95%空気かつ飽和湿度条件下で21時間培養させ、体外成熟を行った（体外成熟工程）。
【００１４】
２．凍結前処理
ウシ成熟卵子を次の２種類の条件で反応させて、各卵子をバラバラとした（分散処理工程）。
反応条件１：室温条件下（25℃）で0.01%ヒアルロニダーゼに5秒浸漬した後に、基本液で5回洗浄した。この反応条件は、従来よりも緩やかな反応条件であった。
反応条件２：加温条件下（37℃）で0.1%ヒアルロニダーゼに30秒浸漬した後に、10%新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含有するTCM199（以下、基本液という）で5回洗浄した。この反応条件は、これまでウシ卵子を処理するために実施されていたものであった。
【００１５】
３．ウシ成熟卵子の超急速ガラス化凍結処理と融解方法
ウシ成熟卵子の超急速ガラス化凍結処理は、上記の卵子を室温条件下で卵子平衡液（3%エチレングリコールを含有する基本液）に12分間浸漬させ、次いで、卵子ガラス化液（30%エチレングリコールと1.0 Mスクロースを含有する基本液）に30〜40秒間浸漬させた後、5〜10個の卵子を最小量の卵子ガラス化液と共にクライオトップ（クライオトップAG；北里コーポレーション）の先端に乗せ、ただちに液体窒素に投入することで行った（凍結保存工程）。
卵子の融解は、液体窒素からガラス化した卵子を含むクライオトップを取り出し、ただちに加温条件下（37℃）の0.5 Mスクロースを含む基本液に1分間、0.25 Mスクロースを含む基本液に3分間、0.125 Mスクロースを含む基本液に3分間、0.0625 Mスクロースを含む基本液に3分間、基本液に5分間浸漬させることで行った。融解した卵子は、基本液中で38.5℃、5%CO2、95%空気かつ飽和湿度条件下で2時間修復培養した。
【００１６】
４．体外受精と胚発生培養
ウシ成熟卵子は、媒精液（IVF100；機能性ペプチド研究所）を用い、常法により体外受精を行った。体外受精後の胚は、5%新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含むCR1aa溶液中で、38.5℃，5%CO2，5%O2，90%空気かつ飽和湿度条件下で8日間培養した。
【００１７】
５．ウシ体外胚の超急速ガラス化凍結処理および加温融解
ウシ体外胚の超急速ガラス化凍結処理は、室温条件下で胚平衡液（7.5%ジメチルスルホキシドと7.5%エチレングリコールを含む基本液）に12分間浸漬させ、次いで、胚ガラス化液（15%ジメチルスルホキシド、15%エチレングリコールおよび0.5 Mスクロースを含有する基本液）に1分30秒間浸漬させた後、1個の胚を最小量の胚ガラス化液と共にクライオトップの先端に乗せ、ただちに液体窒素に投入することで行った。
胚の融解は、液体窒素からガラス化した胚を含むクライオトップを取り出し、ただちに加温条件下（37℃）の0.5 Mスクロースを含む基本液に1分間、0.25 Mスクロースを含む基本液に3分間、基本液に5分間、さらに新たな基本液に1分間浸漬させることで行った。
【００１８】
６．受胚牛への移植
受胚牛は、ホルスタイン種未経産牛の発情日を0日目とし、7日目または8日目にガラス化保存した胚を融解後直ちに黄体側の子宮角へ1胚または2胚移植し、超音波画像診断装置（トリンガ-Vリニア；メディカルタスクフォース）を用いて30日目、60日目に胎児が確認できた場合を受胎とした。
７．統計解析
統計処理は、χ2検定を用いて行った。
【００１９】
＜試験結果＞
１．凍結保存しないウシ成熟卵子において、卵丘細胞の有無は、胚の分割率と胚発生率には有意な影響を与えない
卵丘細胞が多層付着したウシ成熟卵子（COC区：図１を参照）と、卵丘細胞を除去したウシ成熟卵子（DO区：図２を参照）について、体外受精及び胚発生培養を行った。体外受精2日後の分割率と体外受精7日目および8日目の胚発生率を表１に示した。その結果、両区において、分割率と胚発生率に有意な差は認められなかった（表１）。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
２．冷凍処理したウシ成熟卵子において、卵丘細胞の有無は、胚の分割率と胚発生率には有意な影響を与える
卵丘細胞の付着したウシ成熟卵子（COC区：図１を参照）と、卵丘細胞を除去したウシ成熟卵子（DO区：図２を参照）について、超急速ガラス化凍結処理を行い、加温融解後に体外受精及び胚発生培養を行った。表２には、体外受精２日後の分割率と体外受精7日目および8日目の胚発生率を示した。その結果、COC区がDO区と比較すると、分割率（56.7±4.9 vs 35.8±5.7）、7日目の胚発生率（28.1±3.2 vs 11.8±1.4）ならびに8日目の胚発生率（35.8±4.2 vs 15.5±1.9）が有意に高い値を示した（P<0.01）。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
３．卵丘細胞の付着が複数層の卵子を得るための条件は詳細に決定しなければならない
凍結前処理として、反応条件１（室温条件下（25℃）で0.01％ヒアルロニダーゼに5秒浸漬処理したウシ成熟卵子（25℃・0.01%・5sec区））と、反応条件２（加温条件下（37℃）で0.1％ヒアルロニダーゼに30秒浸漬処理したウシ成熟卵子（37℃・0.1%・30sec区））の２種類を用いた。
各試験区について、処理後の卵丘細胞の付着状態を評価した。
図３及び図４には、各試験区の成熟卵子を顕微鏡で観察したときの様子を示した。反応条件１で処理したウシ成熟卵子は、個々にバラバラに分散しているものの、各卵子の周囲には卵丘細胞が複数の層となって覆っていた（図３）。一方、反応条件２で処理したウシ成熟卵子は、卵丘細胞の付着が１層以下の卵子が多く含まれていた（図４）。成熟卵子の卵丘細胞の付着が１層以下の場合には、超急速ガラス化凍結および融解過程を経ることで卵丘細胞のほとんどが消失し、裸化卵子となってしまう。
表３には、各試験区における卵丘細胞の付着の状態を測定した結果を示した。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
その結果、25℃・0.01%・5sec区が37℃・0.1%・30sec区と比較すると、図１のように、卵丘細胞の付着が複数層の卵子（卵丘卵母細胞複合体：COC）の割合（69.2±1.1 vs 23.3±5.3）が有意に高い値を示した（P<0.01）。
本発明者は、従来の反応条件２に比べ、いくつかの緩やかな条件を試すことで、COCの割合が多くなる反応条件を求めようとした。しかし、卵丘細胞は非常に脆弱であるため、少し条件が強くなると殆ど無くなってしまい、卵丘細胞の付着が複数層の卵子の割合が大きく減少してしまい、卵丘細胞の付着が1層以下の卵子の割合が増加することが分かった。そこで、本実施形態では、卵丘細胞の付着が複数層の卵子を多く得られる反応条件の代表的なものとして、反応条件１を示した。
４．凍結保存したウシ成熟卵子から、非常な高率で子牛を得ることができた
食肉処理されたウシ卵巣から個体別に回収し、成熟培養後、室温条件下（25℃）で0.01％ヒアルロニダーゼに5秒浸漬処理した卵子に対して超急速ガラス化凍結処理を行い、加温融解後に体外受精、胚発生培養を行った。また、発生した胚は、再度超急速ガラス化凍結処理を行い、加温融解後に受胚牛へ胚移植を行った。さらに、子牛が生産された場合には、遺伝子検査による親子判定を実施した。
表４には、体外受精2日後の分割率、体外受精7日目と8日目の胚発生率および胚移植により生産された子牛の数（妊娠中の胎児を含む）を示した。その結果、各個体で凍結保存した卵子からでも、遺伝的に親子関係が明らかな子牛が1頭以上生産できた（産子取得工程）。
【００２６】
【表４】
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【００２７】
図５（Ａ），（Ｂ）には、個体１，２由来の子牛の写真を示した。いずれの子牛も通常出産の子牛と同様の生育状態を示した。これを飼育して、ウシ成体を得ることができる。
従来の文献によれば、凍結したウシ成熟卵子からウシ1頭を生産するには、最も良好な結果でも、凍結卵子128個が必要であった（非特許文献４）。これに比べると、本実施形態では、10個程度の凍結卵子からウシ1頭を得られることが分かった。すなわち、従来の十倍以上の効率で、凍結したウシ成熟卵子から子牛を得る方法を提供できた。
【００２８】
５．本実施形態の方法によれば、ウシ成体の特徴を見た後に（いわゆる後出しジャンケンによって）育種改良を行える
上記実施形態によって、凍結したウシ成熟卵子から高効率でウシ産子を得られる（産子取得工程）。このウシ産子は、通常出産の子牛と同様の生育状態を示すので、これを飼育してウシ成体とした後、当該ウシ成体の特徴を評価する（成体評価工程）。ウシ成体の特徴としては、肉質、生産乳量などが例示される。肉質を評価するには、脂肪交雑（いわゆる霜降り）、歩留り（食用となる部分の割合）、ロースなどの高付加価値部位の多さ、脂肪の柔らかさ（不飽和脂肪酸の含有量）、筋間脂肪の細かさ（肉の霜降りをより細かく調べた指標）、香り、うまみ（アミノ酸等の種類・量などによる）などをパラメータとして利用する。これらのパラメータの全部または一部について評価を行うことで、成体評価を実施できる。
これらの特徴を評価し、各パラメータについての評価が確定した後に、その値に基づいて、望ましい特徴を持つウシの卵子のみを選択して融解し、体外受精・胚培養の工程を行う（評価後決定工程）。
本発明者の検討によれば、母牛の肉質は遺伝する（例えば、Ａ４及びＡ５の肉質を持つ母牛から生まれた子牛の肉質もＡ４及びＡ５となる確率が高い）。このため、肉質が優れた母牛から得られた卵子から子牛を得ることにより、肉質が良好なウシの系統を得られる可能性が高くなる。卵子を凍結しない条件では、肉質など各種パラメーターが判明する時点では、すでに体外受精、胚培養が実施されており、望ましい形質を持つウシのみを母牛として用いることは非常に困難であった。ところが、本実施形態によれば、望む特徴が良好な結果を得る可能性の高いウシ成熟卵子のみを解凍し、ここからウシ産子を得ることができる。従来の方法では、ウシ成体の結果を見て、これをフィードバックすることは非常に困難であった。しかし、本実施形態を応用することにより、望む結果が得られる可能性が高いウシ産子を得られるので、従来の育種改良で用いられてきた間接検定法に比べると、相当程度に確率の高い育種改良方法となる。
このように本実施形態によれば、従来よりも高い効率で産子を得られるウシ卵子の凍結保存方法、及び当該方法を用いたウシの育種改良方法を提供できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月27日(2017.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ウシ卵巣から未成熟卵子を回収する未成熟卵子回収工程、（２）前記未成熟卵子を体外で成熟させてウシ成熟卵子を得る体外成熟工程、（４）前記ウシ成熟卵子をバラバラとする分散処理工程、（３）前記ウシ成熟卵子を凍結保存する凍結保存工程を備えたウシ卵子の凍結保存方法であって、
前記分散処理工程は、ヒアルロニダーゼまたはプロテアーゼを用いた酵素処理を行い、前記ウシ成熟卵子の周囲に3層〜7層の卵丘細胞が備えられた状態として、前記凍結保存工程に供することを特徴とするウシ卵子の凍結保存方法。
【請求項２】
（５）請求項１の方法によって凍結保存されたウシ卵子の一部を用いて体外受精した後、ウシ産子を得る産子取得工程、（６）当該ウシ産子を飼育してウシ成体とし、当該ウシ成体の特徴を評価する成体評価工程、（７）当該評価を利用して前記凍結保存されたウシ卵子を用いて、別のウシ産子を得るか否かを決定する評価後決定工程を含むことを特徴とするウシの育種改良方法。