(57)【要約】【課題】  人為的突然変異導入技術、あるいは自然突然変異導入技術などの、時間がかかるばかりでなく、元の酵母の有用な形質が損なわれる可能性がある従来法に替わる、既存の有用物質生産酵母株にも適用できる、簡易かつ利便性の良い酵母の高温耐性付与方法を提供する。【解決手段】  Kluyveromyces marxianus由来の新規高温耐性付与遺伝子(KTP1遺伝子)の提供。当該遺伝子を酵母に導入することで、元の有用な形質を保持しつつ高温条件下での増殖が増強された遺伝子組換え酵母を得ることができ、当該遺伝子組換え酵母を用いて、従来よりも高い温度条件下で発酵反応を進行させることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示す蛋白質。
（ａ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列と少なくとも55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上又は95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質。
【請求項２】
下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）に示すDNA。
（ａ）配列番号１または７に記載の塩基配列を含むDNA。
（ｂ）配列番号１または７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
（ｃ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列と少なくとも55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上又は95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のDNAを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターにより形質転換された遺伝子組換え酵母。
【請求項５】
請求項２に記載のDNA上流に過剰発現プロモーターを含む組換えベクターにより形質転換されることにより、高温耐性、並びに過酸化水素、酢酸、塩酸、塩化ナトリウム、フルフラール、およびエタノールに対する耐性が増強された遺伝子組換え酵母。
【請求項６】
Saccharomyces cerevisiaeを宿主として作製される、請求項４又は５に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項７】
Kluyveromyces marxianusを宿主として作製される、請求項４又は５に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項８】
Scheffersomyces stipitisを宿主として作製される、請求項４又は５に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項９】
Issatchenkia orientalisを宿主として作製される、請求項４又は５に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１０】
Hansenula polymorpha を宿主として作製される、請求項４又は５に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子組換え酵母を用いて、高温条件下でエタノールを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温耐性酵母由来の新規高温耐性付与遺伝子、同遺伝子を含有するベクター、同ベクターで形質転換した遺伝子組換え酵母及びそれを用いてエタノールなどの有用物質を生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスを原料とするバイオエタノール生産等の有用物質の工業的な発酵生産には、Saccharomyces cerevisiaeをはじめとする酵母類が幅広く利用されている。しかし、酵母は一般に発酵の進行にともなって発生する発酵熱によって増殖が低下するため、発酵槽に冷却装置を施して酵母の至適培養温度(30℃付近)を維持する必要があった。また、バイオエタノール生産においては、エタノール生産の前工程となるバイオマスの糖化に用いる酵素の至適温度が50℃付近と高温であるため、これを原料としてエタノールを生産するためには、糖化されたバイオマスを酵母の至適培養温度まで冷却するための工程が必要となる。これらの冷却コストを低減するために、至適培養温度が高い高温耐性酵母株の開発が進められている。
従来の高温耐性Saccharomyces cerevisiae株の開発方法としては、人為突然変異処理を行って高温耐性能を獲得した突然変異株を取得する方法(特許文献１参照)、高温発酵性を持つ焼酎酵母と交雑する方法 特許文献２参照)、高温条件下での培養を繰り返す馴化によって自然突然変異株を取得する方法(非特許文献１参照)などがある。しかし、これらの方法では、高温耐性が付与されたSaccharomyces cerevisiae株が得られるまでに時間がかかることや、高温耐性以外の望まない形質をも併せ持つ株になる可能性があり、工業的に利用されている既存のSaccharomyces cerevisiae株の有する他の有用な形質を損なう可能性があること、などの問題点があった。
一方、Saccharomyces cerevisiaeと同様にGRAS認証を受けており、食品添加物として利用できる酵母の一つにKluyveromyces marxianusがあり、当該Kluyveromyces marxianusは49℃で増殖が可能な高温耐性酵母である。このKluyveromyces marxianusにおいて、活性酸素除去酵素をコードする遺伝子(CTT1遺伝子、CCP1遺伝子、CTA1遺伝子)を過剰発現させることで酸化ストレスが抑制され、高温条件下での増殖が向上することが明らかにされている(特許文献３参照)。
先に、本発明者らはKluyveromyces marxianus種の中でも特に高温耐性に優れているDMB1株を独自に単離し(非特許文献２)、次世代シークエンサーによってこの株のゲノム配列解析を行った(非特許文献３)。得られたゲノム情報から、Saccharomyces cerevisiaeにはないKluyveromyces marxianus DMB1株特有の遺伝子が複数存在することが予想された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−１９８４０７号公報
【特許文献２】特開２０１２−１４７６８０号公報
【特許文献３】特開２０１６−０３４２５９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Edgardo Aら、Enzyme and Microbial Technology, Vol.45, pp.120-123 (2008)
【非特許文献２】Goshima Tら、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.77, pp.1505-1510(2013)
【非特許文献３】Suzuki Tら、Genome Announcements, Vol.2, e00733-14(2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のとおり、従来の高温耐性酵母の取得は、人為的突然変異導入技術、あるいは高温条件下での培養・馴化による自然突然変異導入技術などによりなされており、このような手法では、高温耐性酵母の取得に時間がかかるばかりでなく、元の酵母の他の有用な形質が損なわれる可能性があるなど、既存の工業的に利用されている酵母株に幅広く適用するには問題があった。
本発明は、このような従来技術の有する問題を有さず、既存の有用物質生産酵母株にも適用できる、簡易かつ利便性の良い酵母の高温耐性付与方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Kluyveromyces marxianusから高温耐性付与に関わる遺伝子を見出した。本発明者らは、さらに、当該遺伝子を単離し、同遺伝子によりSaccharomyces cerevisiaeを形質転換することで、高温耐性のみならず、過酸化水素、酢酸、塩酸、塩化ナトリウム、フルフラール、及びエタノールに対しても耐性が付与されたSaccharomyces cerevisiae株が得られること、そして当該耐性Saccharomyces cerevisiaeを用いることで、高温条件下でのエタノール生産を効果的にできることを見出した。
Kluyveromyces marxianusから高温耐性に関わる遺伝子を探索し、これを用いて至適培養温度が通常である酵母に高温耐性を付与する検討は、これまで行われていない。
【０００７】
具体的には、本発明者らは、Kluyveromyces marxianus DMB1株のゲノムライブラリーをSaccharomyces cerevisiae BY4742株に導入し、Kluyveromyces marxianus DMB1株では生育可能でSaccharomyces cerevisiae BY4742株では生育が著しく低下する41℃の高温条件下において、良好な生育を示す高温耐性酵母株を取得し、この高温耐性酵母株から高温耐性付与に寄与するKTP1遺伝子を同定・単離した(図１参照)。
本発明者らが見出したKTP1遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列を有する、配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子であり、他の酵母由来の遺伝子と相同性がほとんど見られない。また、この遺伝子は、先にKluyveromyces marxianusにおいて酸化ストレスの抑制を通じて高温条件下での増殖に寄与することが明らかとされたCTT1遺伝子、CCP1遺伝子およびCTA1遺伝子とも塩基配列が異なる。したがって、この遺伝子は、Kluyveromyces marxianusに特有の、高温耐性付与に寄与する新規遺伝子である。
本発明者らは、さらに、当該KTP1遺伝子を至適培養温度が通常の30℃付近であるSaccharomyces cerevisiaeに導入し、恒常的に発現させることで、当該形質転換Saccharomyces cerevisiaeが、41℃の高温条件下で良好な増殖を示すとともに、当該高温条件下で、より多くのエタノールを発酵・生産することを見出し、上記遺伝子の導入により、至適培養温度が通常の酵母が、元の有用な形質を保持しつつ、高温耐性を獲得することができることを確認した。
【０００８】
本発明者らは、また、上記高温耐性酵母株から採取したDMB1株由来のゲノムDNA断片の上記配列番号１の塩基配列の上流側に、さらに同じ読み枠の開始コドンATGを見出した。当該開始コドンから始まる塩基配列は、配列番号１の塩基配列の5’末端にさらに27塩基が追加された配列番号７の塩基配列であり、配列番号１がコードする配列番号６のアミノ酸配列のN末端側に追加の９アミノ酸を有する、配列番号９のアミノ酸配列をコードするものである。
本発明者らは、当該配列番号７の塩基配列を有するDNAについても、これをSaccharomyces cerevisiaeに導入し、発現させることで、当該DNAが、配列番号１の塩基配列を有するKTP1遺伝子と同様に、形質導入された酵母に高温耐性をもたらすことを確認した。この結果から、このDNAは、先に見出したKTP1遺伝子の全長に相当するものと考えられる(以後、これを全長KTP1遺伝子という)。
本発明者らは、また、当該遺伝子を用いた形質導入実験において、形質転換された酵母が、高温耐性を示すとともに、1.5mM過酸化水素、0.3%酢酸、0.1%塩酸、2M塩化ナトリウム、15mMフルフラール、および8%エタノールに対する耐性をも示すことを見出した。
本発明は、本発明者らにより得られたこれらの知見に基づいてなされたものである。
【０００９】
すなわち、この出願は以下の発明を提供するものである。
[ １ ]  下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示す蛋白質。
（ａ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列と少なくとも55％以上、60％以上、65%以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、又は95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質。
[ ２ ]  下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は(ｄ)に示すDNA。
（ａ）配列番号１または７に記載の塩基配列を含むDNA。
（ｂ）配列番号１または７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
（ｃ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列と少なくとも55％以上、60％以上、65%以上、70％以上、75%以上、80％以上、85％以上、90％以上、又は95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
[ ３ ] [２]に記載のDNAを含む組換えベクター。
[ ４ ] [３]に記載の組換えベクターにより形質転換された遺伝子組換え酵母。
[ ５ ] [２]に記載のDNA上流に過剰発現プロモーターを含む組換えベクターにより形質転換されることにより、高温耐性、並びに過酸化水素、酢酸、塩酸、塩化ナトリウム、フルフラール、およびエタノールに対する耐性が増強された遺伝子組換え酵母。
[ ６ ] Saccharomyces cerevisiaeを宿主として作製される、[４]または[５]に記載の遺伝子組換え酵母。
[ ７ ] Kluyveromyces marxianusを宿主として作製される、[４]または[５]に記載の遺伝子組換え酵母。
[ ８ ] Scheffersomyces stipitisを宿主として作製される、[４]または[５]に記載の遺伝子組換え酵母。
[ ９ ] Issatchenkia orientalisを宿主として作製される、[４]または[５]に記載の遺伝子組換え酵母。
[ １０ ] Hansenula polymorpha を宿主として作製される、[４]または[５]に記載の遺伝子組換え酵母。
[ １１ ] [５]〜[１０]のいずれかに記載の遺伝子組換え酵母を用いて、高温条件下でエタノールを生産する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により見出された、Kluyveromyces marxianus由来の新規高温耐性付与遺伝子 (KTP1遺伝子または全長KTP1遺伝子)を酵母に導入することで、元の有用な形質を保持しつつ高温条件下および過酸化水素、酢酸、塩酸、塩化ナトリウム、フルフラール、エタノール存在下での増殖が増強された遺伝子組換え酵母を得ることができる。
これにより、当該遺伝子組換え酵母を、従来よりも高い温度条件下で、元の酵母の使用目的に利用することができ、例えば高温条件下での各種の発酵反応をより効率的に進行させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明における高温耐性酵母Kluyveromyces marxianus由来の高温耐性遺伝子を単離・同定するまでの流れを示す説明図である。
【図２】(Ａ)は、スクリーニングによって取得した高温耐性酵母株における、プラスミド上のKluyveromyces marxianus DMB1由来ゲノムDNAの模式的な構造を示す図であり、(Ｂ)は、41℃におけるSC-Ura寒天培地上での５種類の遺伝子組換え酵母(BY4742-Con株、BY4742-KmClone1株、BY4742-reTrans株、BY4742-KTP1株、BY4742-DOM34株)の生育能 を示す特性図である。
【図３】(Ａ)は、２種類の遺伝子組換え酵母(BY4742-Con株、BY4742-KTP1株)の、41℃におけるSC-Ura液体培地での好気的増殖を示す特性図であり、(Ｂ)は、2種類の遺伝子組換え酵母(IR2-Con株、IR2-KTP1株)の、43℃におけるSC-Ura液体培地での好気的増殖を示す特性図である。
【図４】(Ａ)は、２種類の遺伝子組換え酵母(BY4742-Con株、BY4742-KTP1株)の、41℃におけるグルコースを含む発酵培地での嫌気的増殖を示す特性図であり、(Ｂ)は、２種類の遺伝子組換え酵母(BY4742-Con株、BY4742-KTP1株)の、41℃におけるグルコースを含む発酵培地での嫌気的エタノール発酵能(グルコース消費量及びエタノール生産量)を示す特性図である。
【図５】1.5mM過酸化水素、0.3%酢酸、0.1%塩酸、2M塩化ナトリウム、15mMフルフラール、または、8%エタノールをそれぞれ含むSC-Ura寒天培地上での、２種類の遺伝子組換え酵母 (BY4742-Con株、BY4742-全長KTP1株)の生育能を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らが見出したKTP1遺伝子は、上述のとおり、配列番号１に記載の塩基配列を有する、配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である。また、本発明者らが見出した全長KTP1遺伝子は、上述のとおり、配列番号７に記載の塩基配列を有する、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
【００１３】
しかしながら、以下に示す蛋白質もまた、配列番号６または９に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同様に酵母に対して高温耐性付与能を有するものとして、本発明に含まれ、また、本発明に用いることができる。
（ｉ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列と少なくとも55％以上、60％以上、65%以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、又は95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質。
(ｉｉ)配列番号６または９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質。
ここで、アミノ酸配列又は塩基配列の同一性や相同性は、BLAST、ClustalXやGenetyxといった公知のソフトウェアを使用して決定することができる。
また、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなる蛋白質は、例えば部位特異的変異法によって、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列となるように改変することにより取得できる。また、従来公知の突然変異処理によっても取得することができる。
また、上記１若しくは数個のアミノ酸における「数個」の数は特には限定されないが、例えば20個以下、好ましくは10個以下、より好ましくは7個以下、さらに好ましくは5個以下程度を意味する。
【００１４】
また、以下に示すDNAもまた、配列番号１または７に記載の塩基配列を含むDNAと同様に酵母に対して高温耐性付与能を有するものとして、本発明に含まれ、また、本発明に用いることができる。
（ｉ）配列番号１または７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
（ｉｉ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列と少なくとも55％以上、60％以上、65%以上、70％以上、75%以上、80％以上、85％以上、90％以上、又は95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
（ｉｉｉ）配列番号６または９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、高温耐性付与能を有する蛋白質をコードするDNA。
ここで、上記ハイブリダイズにおける「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高いDNAと少なくとも80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNAの相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。
【００１５】
本発明の一実施形態において、これら目的の蛋白質を宿主細胞内にて発現させる。その方法は、当業者に公知である一般的な分子生物学的手法を用いて行うことができる(Sambrook J.ら、“Molecular Cloning A LBORATORY MANUAL /second edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照)。すなわち、当該蛋白質をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのベクターを用いて適当な宿主生物を形質転換することにより行うことができる。
【００１６】
ベクターとしては、遺伝子の導入及び発現のために当業者に公知である一般的な酵母発現ベクターを用いることができる。酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型(YEp型)、単コピー型(YCp型)、染色体組み込み型(YIp型)のいずれも用いることが可能である。
ベクターには、上記蛋白質をコードする遺伝子を一又は複数を含めることができる。また、ベクターには、目的の蛋白質をコードする遺伝子の他に、宿主細胞における複製を可能とする複製起点及び形質転換体を同定する選択マーカー遺伝子、さらに、好ましくは、酵母由来の適切な転写又は翻訳制御配列が、所望により蛋白質をコードする遺伝子配列に連結されて含まれ得る。
制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写及び翻訳開始及び終結を調節する適切な配列が含まれる。
本発明で用いられる過剰発現プロモーターは、構成的プロモーターまたは恒常的プロモーターとも称することができる。過剰発現プロモーターはその制御下にある遺伝子を宿主酵母の培養条件に限定されず恒常的に発現させるプロモーターを意味する。本発明において過剰発現プロモーターは、宿主酵母の種類に応じて適宜選択することができる。例えばGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH１プロモーター、AOX1プロモーター、TDH3プロモーター等を用いることができるが、PGKプロモーターを用いるのが好ましい。
選択マーカー遺伝子としては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシン又はスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子やURA3、HIS3、TRP1などの栄養要求性遺伝子などが例示される。
【００１７】
宿主細胞として用いることができるものとしては、特に限定するものではないがSaccharomyces属、Kluyveromyces属、Scheffersomyces属、Issatchenkia属、及びHansenula属などの酵母、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces marxianus、Scheffersomyces stipitis、Issatchenkia orientalis及びHansenula polymorphaなどが挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。
【００１８】
ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法又は塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃を用いる方法などの一般的な遺伝子導入手法を用いることができる。
【００１９】
好ましくは、KTP1遺伝子あるいはKTP1遺伝子の相同遺伝子、または全長KTP1遺伝子あるいは全長KTP1遺伝子の相同遺伝子は、宿主細胞において恒常的に発現させる。例えば、KTP1遺伝子あるいはKTP1遺伝子の相同遺伝子、または全長KTP1遺伝子あるいは全長KTP1遺伝子の相同遺伝子をマルチコピープラスミド上で発現させても良いし、染色体組込み型ベクター等に導入した後、酵母染色体上に組込み、シングル又は数コピーで発現させても良い。好ましくは、KTP1遺伝子あるいはKTP1遺伝子の相同遺伝子、または全長KTP1遺伝子あるいは全長KTP1遺伝子の相同遺伝子をマルチコピープラスミド上で発現させる。
上記KTP1遺伝子あるいはKTP1遺伝子の相同遺伝子、または全長KTP1遺伝子あるいは全長KTP1遺伝子の相同遺伝子を恒常的に過剰発現させることによって高温耐性を付与・強化することができ、これにより作製される高温耐性酵母を用いて、従来公知である発酵生産の優れた酵母を用いた場合よりも、高温条件下で増殖阻害や発酵阻害を回避して有用物質を効率良く生産できる遺伝子組換え酵母を得ることができる。
【００２０】
本明細書において高温耐性酵母とは、38℃以上の温度条件下、好ましくは41℃以上の温度条件下で培養した場合にKTP1遺伝子、または全長KTP1遺伝子を導入していない対照株と比較して増殖能力が高い酵母を意味する。
上記増殖能力は、例えば、酵母を一般的な酵母の培地で12〜48時間培養して培地の濁度を測定し、その濁度を指標として評価でき、具体的には上記条件で培養した場合に、KTP1遺伝子、または全長KTP1遺伝子を導入していない対照株と比較して培地の濁度が1.1倍、好ましくは1.2倍、より好ましくは1.5倍、さらに好ましくは2倍である酵母は、増殖能力が高い酵母と評価することができる。培地の濁度は、例えば分光光度計Biowave II (WPA社) を用いて測定することができる。
本明細書において酵母に高温耐性を付与する、とは、酵母にある遺伝子(例えばKTP1遺伝子あるいはKTP1の相同遺伝子、または全長KTP1遺伝子あるいは全長KTP1遺伝子の相同遺伝子)を導入して発現させることで、導入前と比べて高温条件下での増殖能力が増強されたことをいう。
【実施例】
【００２１】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２２】
実施例１：ゲノムライブラリー形質転換酵母株からの高温耐性形質転換酵母株の探索
Saccharomyces cerevisiaeは増殖できない49℃の高温下でKluyveromyces marxianusは増殖が可能であることから、本発明者らは、Kluyveromyces marxianus特有の高温耐性に関係する遺伝子が存在することを予想し、Kluyveromyces marxianusから高温耐性に有用な遺伝子を探索・同定することを試みた。
本発明において高温耐性酵母Kluyveromyces marxianus由来の高温耐性遺伝子を同定するまでの流れを図１に示した。
まず、Kluyveromyces marxianus DMB1株から抽出したゲノムDNAをDNA断片化装置(ハイドロシェアー、Gene machines社)でランダムに切断後、5kb以上のDNAを分画精製した。DNA末端を平滑化してプラスミド(pPGK)に挿入し、ゲノムDNAライブラリーを作製した。
作製したゲノムDNAライブラリーをゲノムカバー率が50倍以上になるようにSaccharomyces cerevisiae BY4742株に形質転換し、栄養要求性寒天培地(6.7g/L yeast nitrogen base w / 0o amino acids、20g/Lグルコース、2g/Lウラシルを除いたdrop out mix、18g/L agar : SC-Ura寒天培地)において41℃で培養した。尚、この温度ではKluyveromyces marxianus DMB1株は生育できるが、形質転換前のSaccharomyces cerevisiae BY4742株は生育が著しく低下することを確認している。
その結果、生育が良好な高温耐性酵母として５コロニー取得し、この中の１株をBY4742-KmClone1株と命名した。BY4742-KmClone1株からプラスミド(pPGK-KmClone1と命名)を単離し、再度Saccharomyces cerevisiae BY4742へ形質転換した株(BY4742-reTransと命名)が、41℃で、ゲノム断片を含まないpPGKにより形質転換された対照株(BY4742-Con)よりも優れた増殖を示すことを確認した(図２のＢ参照)。
【００２３】
実施例２：高温耐性遺伝子の探索
シークエンス解析によりpPGK-KmClone1に挿入されたゲノムDNAの塩基配列を決定した結果、２種類のコーディング領域と推定される塩基配列が含まれていることを確認した(図２のＡ参照) (遺伝子#1、#2)。これらの推定遺伝子のアミノ酸配列を基に他の出芽酵母種とのホモロジー検索を実施したところ、以下の結果となった。
#1遺伝子に関して、当該遺伝子がコードする蛋白質(326 aa)はKluyveromyces marxianus以外では唯一Kluyveromyces lactisのhypothetical protein KLLA0A08690p(311 aa)の9 aa-261 aa領域と幾分相同性を示したが、27%と低かった。このため、当該遺伝子がKluyveromyces marxianusに特有の新規高温耐性付与遺伝子であると仮定して、Kluyveromyces Thermotolerant Proteinをコードする遺伝子としてKTP1と命名した(配列番号１参照)。尚、KTP1遺伝子はKluyveromyces marxianus DMB1株と同種のNBRC1777株とDMKU3-1042株のhypothetical protein KLMA_10443(355 aa)の10aa-335aa領域とそれぞれ99%、100%の相同性を示したため、hypothetical protein KLMA_10443の一部(10aa-335aa領域)をコードしていることが判明した。
#2遺伝子に関して、当該遺伝子がコードする蛋白質(391 aa)はKluyveromyces marxianus以外ではKluyveromyces lactisのhypothetical protein XP_451380.1(388 aa)の1 aa-377 aa領域と85%、Saccharomyces cerevisiaeのDom34p(386 aa)の1 aa-382 aa領域と60%の高い相同性を示したため、#2遺伝子はDOM34であることが示唆された。
pPGK-KmClone1上に含まれる２種類の遺伝子(KTP1及びDOM34)のうち、どちらの遺伝子が高温耐性の機能に寄与するかどうかを検討するために、KTP1遺伝子とDOM34遺伝子のクローニングをそれぞれ行った。
【００２４】
実施例３：pPGK-KTP1の作製
野生型KTP1遺伝子を作製するため、pPGK-KmClone1のシークエンス解析で得られた塩基配列情報に基づいて、下記の２つのプライマーを設計した。尚、KTP1の5′末端にEcoR I切断部位、3′末端にBamH I切断部位を認識する配列(下記配列の小文字部分)をプライマーに付加した。
5′‐CTCgaattcATGAATGTTCCTCTTGAACAC‐3′ (配列番号２)
5′‐CTCggatccTTATAGATCGCAAATACGAGT‐3′ (配列番号３)
PCRは、PrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いて行った。20pmolの各プライマーと100ngのKluyveromyces marxianus DMB1株ゲノムDNAを用い、変性反応を98℃で10秒間、アニーリング反応を55℃で5秒間、伸長反応を72℃で10秒間の条件でKTP1遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpPGKのEcoR I及びBamH I制限酵素切断部位に導入し、これをpPGK-KTP1と名付けた。尚、pPGK-KTP1中のKTP1遺伝子の塩基配列がpPGK-KmClone1及びゲノムDNA中のKTP1遺伝子の塩基配列と同一であることをシークエンス解析で確認した。
【００２５】
実施例４：pPGK-DOM34の作製
野生型DOM34遺伝子を作製するため、pPGK-KmClone1のシークエンス解析で得られた塩基配列情報に基づいて、下記の２つのプライマーを設計した。尚、DOM34の5′末端にBamH I切断部位、3′末端にBamH I切断部位を認識する配列(下記配列の小文字部分)をプライマーに付加した。
5′‐CTCggatccATGAAGCTTATCAATAAGGTT‐3′ (配列番号４)
5′‐CTCggatccTTAATTATCTTCGTCACTAAC‐3′ (配列番号５)
PCRは、PrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いて行った。20pmolの各プライマーと100ngのKluyveromyces marxianus DMB1株ゲノムDNAを用い、変性反応を98℃で10秒間、アニーリング反応を55℃で5秒間、伸長反応を72℃で15秒間の条件でDOM34遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpPGKのBam I及びBamH I制限酵素切断部位に導入し、これをpPGK-DOM34と名付けた。尚、pPGK-DOM34中のDOM34遺伝子の塩基配列がpPGK-KmClone1及びゲノムDNA中のDOM34遺伝子の塩基配列と同一であることをシークエンス解析で確認した。
【００２６】
実施例５：遺伝子組換え酵母株の作製 (1) 
YEASTMAKER yeast transformation system 2(クロンテック社)を用いて酢酸リチウム法により、上記プラスミドpPGK-KTP1及びpPGK-DOM34をSaccharomyces cerevisiae BY4742株にそれぞれ形質転換した。pPGK-KTP1をBY4742株に形質転換して、遺伝子組換え酵母BY4742-KTP1株を作製した。また、pPGK-DOM34をBY4742株に形質転換して、遺伝子組換え酵母BY4742-DOM34株を作製した。一方、いずれの遺伝子も含まないpPGKを用いて、同様の方法でBY4742株に形質転換して遺伝子組換え酵母BY4742-Con株を作製し、対照株として用いた。
【００２７】
実施例６：遺伝子組換え酵母株の作製 (2) 
凝集性実用酵母Saccharomyces cerevisiae IR-2株(二倍体)を用いて、相同組換えによる遺伝子破壊と四分子解析によって栄養要求性を持つ一倍体株を作製した。YEASTMAKER yeast transformation system 2(クロンテック社)を用いて酢酸リチウム法により、上記プラスミドpPGK-KTP1をIR-2由来の一倍体酵母株に形質転換し、遺伝子組換え酵母IR2-KTP1株を作製した。一方、いずれの遺伝子も含まないpPGKを用いて、同様の方法でIR-2由来の一倍体株に形質転換して遺伝子組換え酵母IR2-Con株を作製し、対照株として用いた。
【００２８】
実施例７：遺伝子組換え酵母の培養 (1)：各種形質転換株の高温耐性試験 
高温耐性能を調べるために、スクリーニングにより取得したBY4742-KmClone1株に加えて、pPGK-KmClone1を再形質転換したBY4742-reTrans株、BY4742-KTP1株及びBY4742-DOM34株とこれらの対照株(BY4742-Con株)を、SC-Ura寒天培地において30℃で生育させた後、5mLの栄養要求性液体培地(6.7g/L yeast nitrogen base w / o amino acids、20g/Lグルコース、2g/Lウラシルを除いたdrop out mix: SC-Ura液体培地)に植菌して30℃で1日培養した。培養液200μLを5mLのSC-Ura液体培地に植菌して30℃で5時間培養した。酵母の細胞濃度(OD)は分光光度計Biowave II(WPA社)を用いて660nmでの波長を測定した。培養液のOD660を測定し、細胞数が1×106、2×10５、4×104、8×103、1.6×103、3.2×102cells/5μLとなるように滅菌水で希釈した。これらの希釈液各5μLをSC-Ura寒天培地にスポットし、41℃で培養した。2日培養した結果を図２のＢに示す。それぞれのスポットは左から順に細胞数が減少するようにスポットしたものである。図２のＢに示すように、BY4742-KmClone1株、BY4742-reTrans株及びBY4742-KTP1株は対照株(BY4742-Con)と比較して41℃において良好な生育を示した。一方、BY4742-DOM34株は対照株と同程度の生育であった。この結果から、高温耐性に寄与する遺伝子はKTP1であることが判明した。
【００２９】
実施例８：遺伝子組換え酵母の培養 (2)：BY4742-KTP1株の高温耐性試験
41℃における増殖の挙動を調べるために、BY4742-KTP1株とその対照株(BY4742-Con)を、SC-Ura寒天培地において30℃で生育させた後、5mLのSC-Ura液体培地に植菌して30℃で1日培養した。酵母の細胞濃度(OD)は、分光光度計Biowave II(WPA社)を用いて600nmでの波長を測定した。培養液を5mLのSC-Ura液体培地に細胞濃度がOD600=0.1となるように植菌し、経時的に48時間OD600を測定した。図３のＡに示すように、41℃において、BY4742-KTP1株はBY4742-Con株と比べて、最大OD差が2.2倍(30時間後)増加し、良好に増殖した。
【００３０】
実施例９：遺伝子組換え酵母の培養 (3)：IR2-KTP1株の高温耐性試験
43℃における増殖の挙動を調べるために、IR2-KTP1株とその対照株(IR2-Con)を、SC-Ura寒天培地において30℃で生育させた後、5mLのSC-Ura液体培地に植菌して30℃で1日培養した。酵母の細胞濃度(OD)は分光光度計Biowave II(WPA社)を用いて600nmでの波長を測定した。培養液を5mLのSC-Ura液体培地に細胞濃度がOD600 = 0.1となるように植菌し、経時的に48時間OD600を測定した。図３のＢに示すように、43℃において、IR2-KTP1株はIR2-Con株と比べて、最大OD差が1.6倍(30時間後)増加し、良好に増殖した。
【００３１】
実施例１０：エタノール発酵条件下での遺伝子組換え酵母の培養
エタノール発酵実験のために、BY4742-KTP1株とその対照株(BY4742-Con)を、SC-Ura寒天培地において30℃で生育させた後、5mLのSC-Ura液体培地に植菌して30℃において好気的に16時間培養した。培養液5mLを50mLのSC-Ura液体培地に植菌して30℃において好気的に24時間培養した。酵母の細胞濃度(OD)は、分光光度計Biowave II(WPA社)を用いて600nmでの波長を測定した。集菌後、滅菌水で洗浄し、60g/Lのグルコースを含む20mLの発酵培地(6.7g/L yeast nitrogen base w / o amino acids、60g/Lグルコース、2g/Lウラシルを除いたdrop out mix)に細胞濃度がOD600 = 4となるように植菌した。各発酵液は撹拌棒を入れた容量50mLの密閉型のバイアルにおいて、緩やかに撹拌しながら、41℃で56時間、嫌気的に培養した。図４のＡに示すように、酵母の細胞濃度測定の結果、BY4742-KTP1株はBY4742-Con株と比べて41℃において良好に増殖した。
また、上記エタノール発酵条件下での培養中の、発酵液中のエタノール、およびグルコースの濃度は高速液体クロマトグラフィー(HPLC; 日本分光株式会社)を用いて測定した。分離カラムはHPX-87Hカラム(Bio-Rad社)を用い、HPLC装置は8mM H2SO4で0.6mL/minの流速で流し、65℃で運転した。
図４のＢは、２種類の遺伝子組換え酵母(BY4742-Con株及びBY4742-KTP1株)を用いて、60g/Lのグルコースを含む発酵培地を用いた嫌気培養における、これら遺伝子組換え酵母株のグルコース消費量及びエタノール生産量を経時的に示した図である。41℃において56時間発酵させることでBY4742-KTP1株はBY4742-Con株と比べてグルコースを1.6倍多く消費し、エタノールを1.7倍多く生産した。これらの結果から、Saccharomyces cerevisiaeにおいてKluyveromyces marxianusのKTP1遺伝子を過剰発現させることで、高温耐性及び高温条件下でのエタノール発酵性を向上させることが可能であることが明らかとなった。
【００３２】
実施例１１：全長KTP1遺伝子の同定
実施例２でシークエンス解析により決定された、pPGK-KmClone1に挿入されたゲノムDNAの塩基配列において、KTP1遺伝子の27塩基上流側に、KTP1遺伝子と同じ読み枠の開始コドンATGがさらに存在することが確認された。
当該開始コドンから始まる塩基配列は、配列番号１の塩基配列の5′末端にさらに27塩基が追加された配列番号７の塩基配列であり、配列番号１がコードする配列番号６のアミノ酸配列のN末端側に追加の９アミノ酸を有する、配列番号９のアミノ酸配列をコードするものである。
本発明者らは、当該配列番号７の塩基配列を有するDNAについても、これをSaccharomyces cerevisiaeに導入し、発現させることで、どのような影響が生じるか確かめるため、以下の実験を行った。
当該塩基配列に対応する、Kluyveromyces marxianus DMB1株ゲノムDNA中に存在する野生型の塩基配列を作製するため、pPGK-KmClone1のシークエンス解析で得られた塩基配列情報に基づいて、下記の２つのプライマーを設計した。尚、KTP1の5′末端にEcoR I切断部位、3′末端にBamH I切断部位を認識する配列(下記配列の小文字部分)をプライマーに付加した。
5′‐CTCgaattcATGGTCATAAAATCTGAAAAG‐3′ (配列番号７)
5′‐CTCggatccTTATAGATCGCAAATACGAGT‐3′ (配列番号３)
なお、上記配列番号７のプライマーは、新たに確認された配列番号７の塩基配列の5′側に対応する、新たに設計したプライマーであり、一方、上記配列番号３のプライマーは、配列番号７の塩基配列の3′側に対応するプライマーであり、配列番号１の塩基配列のPCRに用いたものと同一のものである。
PCRは、PrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いて行った。20pmolの各プライマーと100ngのKluyveromyces marxianus DMB1株ゲノムDNAを用い、変性反応を98℃で10秒間、アニーリング反応を55℃で5秒間、伸長反応を72℃で10秒間の条件でKTP1遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpPGKのEcoR I及びBamH I制限酵素切断部位に導入した。また、当該プラスミド中に導入したDNAの塩基配列がpPGK-KmClone1及びゲノムDNA中の対応するDNAの塩基配列と同一であることをシークエンス解析で確認した。
このようにして得られたプラスミドを実施例５と同様の手法でBY4742株に導入し、実施例８と同様の手法で、当該DNAが、配列番号１の塩基配列を有するKTP1遺伝子と同様に、形質導入された酵母に高温耐性をもたらすことを確認した。
これらの結果から、このDNAは、先に見出したKTP1遺伝子と同様の特性を有する、その全長に相当するものと考えられる(以後、これを全長KTP1遺伝子といい、また、当該遺伝子が導入された上記プラスミドをpPGK-全長KTP1という)。
【００３３】
実施例１２：遺伝子組換え酵母の培養 (4)：各種試薬に対する耐性試験
実際の酵母の培養において培地に含まれる可能性があり、かつ酵母の増殖に悪影響を与える各種薬剤について、酵母をKTP1遺伝子により形質転換することにより当該薬剤の存在下における酵母の増殖にどのような影響があるか調べるために、以下の実験を行った。この実験では、KTP1遺伝子として、全長KTP1遺伝子を用いた。
BY4742-全長KTP1株とその対照株(BY4742-Con)を、SC-Ura寒天培地において30℃で生育させた後、5mLの栄養要求性液体培地(6.7g/L yeast nitrogen base w / o amino acids、20g/Lグルコース、2g/Lウラシルを除いたdrop out mix: SC-Ura液体培地) に植菌して30℃で1日培養した。培養液200μLを5mLのSC-Ura液体培地に植菌して30℃で5時間培養した。酵母の細胞濃度(OD)は分光光度計Biowave II(WPA社)を用いて660nmでの波長を測定した。培養液のOD660を測定し、細胞数が1×106、2×10５、4×104、8×103、1.6×103、3.2×102cells/5μLとなるように滅菌水で希釈した。これらの希釈液各5μLを1.5mM過酸化水素、0.3%酢酸、0.1%塩酸、2M塩化ナトリウム、15mMフルフラール、または8%エタノールをそれぞれ含むSC-Ura寒天培地にスポットし、30℃で2〜４日培養した結果を図５に示す。それぞれのスポットは左から順に細胞数が減少するようにスポットしたものである。図５に示すように、すべての寒天培地においてBY4742-全長KTP1株は対照株(BY4742-Con)と比較して良好な生育を示した。
これらの結果から、Saccharomyces cerevisiaeにおいてKluyveromyces marxianusのKTP1遺伝子を過剰発現させることで高温耐性能が付与された株は、同時に過酸化水素、酢酸、塩酸、塩化ナトリウム、フルフラール、およびエタノールに対する耐性が向上することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、Saccharomyces cerevisiaeをはじめとする酵母類に、従来公知の方法よりも効率良く、かつ元の有用な形質を損なうことなく高温耐性を付与できるため、例えばエタノールなどの有用物質の生産に用いられている既存の様々な有用物質生産酵母株に高温耐性を付与することが可能である。これによって、発酵時に発生する熱を冷却する工程を低減することが実現するため、冷却コストの削減につながり、エタノールや他の有用物質の製造コストの削減にも大きく貢献することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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