(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療の利益を享受する患者を同定するための方法を提供する。【解決手段】患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いかどうかを判定する方法であって、（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出すること、および（ｂ）前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを前記少なくとも１つの遺伝子の基準発現レベルと比較することを含み、基準レベルに対する、患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者が同定される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いかどうかを判定する方法であって、
（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出すること、および
（ｂ）前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを前記少なくとも１つの遺伝子の基準発現レベルと比較することを含み、
基準レベルに対する、患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者が同定される、方法。
【請求項２】
患者に対するＶＥＧＦアンタゴニストの治療的有効性を最適化する方法であって、
（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出すること、および
（ｂ）前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを前記少なくとも１つの遺伝子の基準発現レベルと比較することを含み、
基準レベルに対する、患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者が同定される、方法。
【請求項３】
患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストへの応答性について検査を受けた患者の集団中に存在し、基準レベルが、前記患者集団における、前記少なくとも１つの遺伝子の発現の中央値レベルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化が、基準レベルに対して増大することである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化が、基準レベルに対して低下することである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
患者から得た生体試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現が、ｍＲＮＡを測定することによって検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
患者から得た生体試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現が、血漿タンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
生体試料が腫瘍組織である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
患者の生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも第２の遺伝子の発現を検出することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
患者の生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも第３の遺伝子の発現を検出することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
患者の生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも第４の遺伝子の発現を検出することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの遺伝子が、Ａｌｋ１、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、Ｃｏｌ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ２、Ｄｌｌ４、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦＬ７、ＥＳＭ１、ＬＡＭＡ４、ＮＧ２、Ｎｉｄ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＲＧＳ５、Ｓｅｍａ３ｆ、ＴＳＰ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３およびＶＩＭからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
患者が血管新生障害を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
患者が、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、神経膠芽細胞腫およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるがんを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｃ）基準レベルに対する、患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化が検出される場合に、前記患者の治療のためにＶＥＧＦアンタゴニストを選択することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
（ｄ）ＶＥＧＦアンタゴニストを患者に投与することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
療法が考慮される患者集団の特定の患者に対する療法を選択するための方法であって、
（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出すること、
（ｂ）前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを前記少なくとも１つの遺伝子の基準発現レベルと比較し、基準レベルに対する、患者の試料中の少なくとも前記１つの遺伝子の発現のレベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者が同定されること、および
（ｃ）患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いと同定される場合は、療法としてＶＥＧＦアンタゴニストを選択すること、または
（ｄ）患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いと同定されない場合は、ＶＥＧＦアンタゴニストではない療法を選択すること
を含む、方法。
【請求項２２】
基準レベルが、患者集団における、前記少なくとも１つの遺伝子の発現の中央値レベルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化が、基準レベルに対して増大することである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化が、基準レベルに対して低下することである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
患者の生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも第２の遺伝子の発現を検出することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
患者の生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも第３の遺伝子の発現を検出することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者の生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも第４の遺伝子の発現を検出することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ｃ）の療法が、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
（ｅ）患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いと同定される場合は、有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを患者に投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
有効量の少なくとも第２の薬剤を投与することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第２の薬剤が、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
（ｄ）の療法が、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
ＶＥＧＦアンタゴニストへの応答性を決定するためのバイオマーカーを同定する方法であって、
（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストの投与より前に患者から得た生体試料において、候補バイオマーカーの発現を検出すること、および
（ｂ）候補バイオマーカーの発現を候補バイオマーカーの基準発現レベルと比較することを含み、基準レベルに対する、患者の試料中の候補バイオマーカーの発現のレベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者のバイオマーカーとしての候補バイオマーカーが同定される、方法。
【請求項３６】
基準レベルが、患者がＶＥＧＦアンタゴニストに応答する確度について検査を受けた患者集団における、前記少なくとも１つの遺伝子の発現の中央値レベルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
基準レベルが、前もって患者から得た試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
患者が、以前にＶＥＧＦアンタゴニストで治療されており、現在転移に見舞われている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
（ｃ）ＶＥＧＦアンタゴニスト治療への応答性を決定するためのバイオマーカーとして使用するための基準に対して、発現のレベルが変化する候補バイオマーカーを選択することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
患者の血管新生障害を診断するための方法であって、
（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た試料において、表１もしくは表２に記載される少なくとも１つの遺伝子、または請求項３１に記載の方法に従って同定されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップ、および
（ｂ）前記少なくとも１つの遺伝子またはバイオマーカーの発現レベルを、前記少なくとも１つの遺伝子の基準レベルと比較するステップを含み、
基準レベルに対する、患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化によって、血管新生障害を有する患者が同定される、方法。
【請求項４３】
（ｃ）基準レベルに対する、患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化が検出される場合に、前記患者の治療のためにＶＥＧＦアンタゴニストを選択することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
（ｄ）ＶＥＧＦアンタゴニストを患者に投与することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
基準レベルに対する、患者の試料中の前記少なくとも１つの遺伝子またはバイオマーカーの発現のレベルの変化が、アルゴリズム：
2018082705.tif 000018
に従って、患者の試料に対するＶＤＶシグネチャースコア（ＶＤＶｉ）を計算することによって決定され、
式中、Ｚｇ＝１，ｉ、Ｚｇ＝２，ｉ、．．．Ｚｇ＝ｎ，ｉが、試料ｉの各遺伝子またはバイオマーカーｇ（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対する発現値の標準化されたｚ−スコアであり、
第１の定義された閾値より低いＶＤＶｉが、基準レベルに対する低下を示し、第２の定義された閾値を超えるＶＤＶｉが、基準レベルに対する増大を示す、請求項１、２、２１、３５または４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
各遺伝子またはバイオマーカーｇ（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対する発現値が、各遺伝子ｇ（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対するｑＲＴ−ＰＣＲの値である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第１の定義された閾値が、−４から−０．５であり、第２の定義された閾値が０．５から４である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
第１の定義された閾値が、−４から−１であり、第２の定義された閾値が１から４である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
第１の定義された閾値が−４から−１．５であり、第２の定義された閾値が１．５から４である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第１の定義された閾値が−４から−２であり、第２の定義された閾値が２から４である、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体での治療の利益を享受する患者を同定するための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
バイオマーカー（例えば血漿中の分泌タンパク質）の発現レベルを測定することは、例えば抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療を含めた、特定の療法に応答する患者および患者集団を同定するのに有効な手段であり得る。
【０００３】
どの患者がどの治療に応答するかを決定するため、および単剤として使用されようが他の薬剤と組み合わされようが、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法を用いる患者にとって有効な治療レジメンにそうした決定を組み入れるための有効な手段が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療の利益を享受する患者を同定するための方法を提供する。これらの患者は、表１または表２に記載される遺伝子の発現レベルに基づいて同定される。
【０００５】
したがって、本発明の一実施形態は、患者がＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いかどうかを決定する方法であって、（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出すること、および（ｂ）上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを上記少なくとも１つの遺伝子の基準発現レベルと比較することを含み、基準レベルに対する、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者が同定される方法を提供する。
【０００６】
本発明のさらなる実施形態は、患者に対するＶＥＧＦアンタゴニストの治療的有効性を最適化する方法であって、（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出すること、および（ｂ）上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを上記少なくとも１つの遺伝子の基準発現レベルと比較することを含み、基準レベルに対する、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者が同定される方法を提供する。
【０００７】
上記の実施形態を参照すると、幾つかのさらなる実施形態では、患者は、ＶＥＧＦアンタゴニストへの応答性について検査を受けた患者の集団に存在し、基準レベルは、患者集団における、上記少なくとも１つの遺伝子の発現の中央値レベルである。幾つかの実施形態では、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化は、基準レベルに対して増大することである。幾つかの実施形態では、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化は、基準レベルに対して低下することである。幾つかの実施形態では、患者から得た生体試料中の上記少なくとも１つの遺伝子は、ｍＲＮＡを測定することによって検出される。幾つかの実施形態では、患者から得た生体試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現は、血漿タンパク質レベルを測定することによって検出される。幾つかの実施形態では、生体試料は腫瘍組織である。幾つかの実施形態では、方法は、患者の生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも第２、第３、第４またはそれ以上の遺伝子の発現を検出することをさらに含む。幾つかの実施形態では、上記少なくとも１つの遺伝子は、Ａｌｋ１、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、Ｃｏｌ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ２、Ｄｌｌ４、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦＬ７、ＥＳＭ１、ＬＡＭＡ４、ＮＧ２、Ｎｉｄ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＲＧＳ５、Ｓｅｍａ３ｆ、ＴＳＰ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３およびＶＩＭからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体である。幾つかの実施形態では、患者は血管新生障害を有する。幾つかの実施形態では、患者は、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、神経膠芽細胞腫およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるがんを有する。
【０００８】
また、上記の実施形態を参照すると、方法は、（ｃ）基準レベルに対する、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化が検出される場合に、患者の治療のためにＶＥＧＦアンタゴニストを選択することをさらに含むことができる。さらに方法は、（ｄ）ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）を患者に投与することを含むことができる。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、療法が考慮される患者集団の特定の患者に対する療法を選択するための方法であって、（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出すること、（ｂ）上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルを上記少なくとも１つの遺伝子の基準発現レベルと比較し、基準レベルに対する、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者が同定されること、および（ｃ）患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いと同定される場合は、療法としてＶＥＧＦアンタゴニストを選択すること、または（ｄ）患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いと同定されない場合は、ＶＥＧＦアンタゴニストではない療法を選択することを含む方法を提供する。
【００１０】
幾つかの実施形態では、基準レベルは、患者集団における、上記少なくとも１つの遺伝子の発現の中央値レベルである。幾つかの実施形態では、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化は、基準レベルに対して増大することである。幾つかの実施形態では、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化は、基準レベルに対して低下することである。幾つかの実施形態では、方法は、患者の生体試料において、表１または表２に記載される少なくとも第２、第３、第４またはそれ以上の遺伝子の発現を検出することをさらに含む。幾つかの実施形態では、（ｄ）の療法は、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤である。幾つかの実施形態では、方法は、（ｅ）患者が、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いと同定される場合は、有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを患者に投与することをさらに含む。幾つかの実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体である。幾つかの実施形態では、方法は、有効量の少なくとも第２の薬剤を投与することをさらに含む。幾つかの実施形態では、第２の薬剤は、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、ＶＥＧＦアンタゴニストへの応答性を決定するためのバイオマーカーを同定する方法であって、（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストの投与より前に患者から得た生体試料において、候補バイオマーカーの発現を検出すること、および（ｂ）候補バイオマーカーの発現を候補バイオマーカーの基準発現レベルと比較することを含み、基準レベルに対する、患者の試料中の候補バイオマーカーの発現のレベルの変化によって、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者のバイオマーカーとしての候補バイオマーカーが同定される方法を提供する。幾つかの実施形態では、基準レベルは、患者がＶＥＧＦアンタゴニストに応答する確度について検査を受けた患者集団における、上記少なくとも１つの遺伝子の発現の中央値レベルである。幾つかの実施形態では、基準レベルは、前もって患者から得た試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルである。幾つかの実施形態では、患者は、ＶＥＧＦアンタゴニストで以前に治療されており、現在、転移に見舞われている。幾つかの実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体である。さらに方法は、（ｃ）ＶＥＧＦアンタゴニスト治療への応答性を決定するためのバイオマーカーとして使用するために、基準に対して発現のレベルが変化する候補バイオマーカーを選択することをさらに含むことができる。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、患者の血管新生障害を診断するための方法であって、（ａ）患者へのＶＥＧＦアンタゴニストのいかなる投与よりも前に患者から得た試料において、表１もしくは表２に記載される少なくとも１つの遺伝子または上記の方法などの方法に従って同定されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップ、および（ｂ）上記少なくとも１つの遺伝子またはバイオマーカーの発現レベルを上記少なくとも１つの遺伝子の基準レベルと比較するステップを含み、基準レベルに対する、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの変化によって、血管新生障害を有する患者が同定される方法を提供する。こうした方法は、（ｃ）基準レベルに対する、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの変化が検出される場合に、患者の治療のためにＶＥＧＦアンタゴニストを選択することをさらに含むことができる。加えて、方法は、（ｄ）ＶＥＧＦアンタゴニストを患者に投与することをさらに含むことができる。加えて、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のように、患者から試料を得るステップを含むことができる。さらに本明細書に記載の方法は、最適な治療レジメンを決定するために、本明細書に記載のように、がんと診断された患者について行うことができる。
【００１３】
上記の実施形態のいずれかでは、基準レベルに対する、患者の試料中の上記少なくとも１つの遺伝子またはバイオマーカーの発現のレベルの変化は、アルゴリズム：
2018082705.tif 000002
に従って、患者の試料に対するＶＤＶシグネチャースコア（ＶＤＶｉ）を計算することによって決定することができ、
式中、Ｚｇ＝１，ｉ、Ｚｇ＝２，ｉ、．．．Ｚｇ＝ｎ，ｉは、試料ｉの各遺伝子またはバイオマーカーｇ（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対する発現値の標準化されたｚ−スコアであり、第１の定義された閾値より低いＶＤＶｉは、基準レベルに対する低下を示し、第２の定義された閾値を超えるＶＤＶｉは、基準レベルに対する増大を示す。幾つかの実施形態では、各遺伝子またはバイオマーカーｇ（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対する発現値は、各遺伝子ｇ（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対するｑＲＴ−ＰＣＲの値である。幾つかの実施形態では、第１の定義された閾値は、−４から−０．５（例えば−４、−３．５、−３、−２．５、−２、−１．５、−１または−０．５）であり、第２の定義された閾値は、０．５から４（例えば０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５または４）である。幾つかの実施形態では、第１の定義された閾値は、−４から−１（例えば−４、−３．５、−３、−２．５、−２、−１．５または−１）であり、第２の定義された閾値は、１から４（例えば１、１．５、２、２．５、３、３．５または４）である。幾つかの実施形態では、第１の定義された閾値は、−４から−１．５（例えば−４、−３．５、−３、−２．５、−２または−１．５）であり、第２の定義された閾値は、１．５から４（例えば１．５、２、２．５、３、３．５または４）である。他の実施形態では、第１の定義された閾値は、−４から−２（例えば−４、−３．５、−３、−２．５または−２）であり、第２の定義された閾値は、２から４（例えば２、２．５、３、３．５または４）である。
【００１４】
以下の発明を実施するための形態によって、これらおよび他の実施形態をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】抗ＶＥＧＦでｍＡｂ治療後７２時間、７日および１４日での、マウス膵神経内分泌腫瘍（ＰＮＥＴ）細胞の微小血管密度（ＭＶＤ）および増殖指数の決定についての組織学的解析およびグラフ解析を示す図である。抗ＶＥＧＦ治療後の様々な時間でのＭＥＣＡ−３２染色による腫瘍血管密度の組織学的解析（左）およびＫｉ６７による増殖指数（右）の代表的な画像である（２０Ｘ拡大率）。いずれの場合にも４〜６個の腫瘍からの定量化を、平均＋／−ＳＥＭとして下の棒グラフに示す。＊Ｐ＜０．０５、ＮＳ＝有意でない。
【図１Ｂ】ＲＩＰ−ＴβＡｇモデルにおける、腫瘍量への抗ＶＥＧＦの効果のキネティクスを示すグラフである。抗ＶＥＧＦで治療したマウスの腫瘍量（赤色のバー）は、研究の２１日ではコントロールで治療したマウス（黒色のバー）より有意に低いが、１４日ではそうではない。＊＝ｐ＜０．０５（ｔ検定）、ｎ＝５〜８マウス／群／時点。
【図１Ｃ】ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答した、ＶＤＶ遺伝子の発現レベルの変化を示すグラフである。遺伝子（赤線として示す）の発現レベルは、全遺伝子（灰色のヒストグラム）と比べて有意に低下する。赤の破線は、これらの選択された遺伝子の平均変化を示す。黒色の破線は、残りの遺伝子に対する平均フォールドチェンジを示す。
【図１Ｄ】ｑＰＣＲで評価した場合の、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答した、遺伝子の亜群における遺伝子発現レベルの変化を示すグラフである。バーは、３つの独立した生物学的反復の発現の平均を表す。エラーバー＝ｌｏｇ２標準偏差。
【図２Ａ】確立された皮下乳がん腫瘍モデル（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における、ＶＥＧＦ遮断に応答した、ＶＤＶ遺伝子の変化を示すグラフのセットである。腫瘍試料は、抗ＶＥＧＦまたはコントロール治療の２４時間後に収集した。ＶＤＶシグネチャーの遺伝子（赤線）は、間質において全遺伝子（灰色のヒストグラムとして示す）と比べて有意に低下するが（上のグラフ、マウスチップ、ｐ＜０．０００１）、腫瘍細胞ではそうではない（下のグラフ、ヒトチップ、有意差なし）。個々のｐｒｏｘＶＤＶ転写産物のフォールドチェンジは、マイクロアレイ密度プロット中にブラックレターで注釈をつける。各治療コホートについてｎ＝５〜１０例。
【図２Ｂ】同所性の（頭蓋内）Ｕ８７神経膠芽細胞腫モデルにおける、ＶＥＧＦ遮断に応答した、ＶＤＶ遺伝子の変化を示すグラフのセットである。腫瘍試料は、抗ＶＥＧＦまたはコントロール治療の１３〜４２日後に収集した。ＶＤＶシグネチャーの遺伝子（赤線）は、全遺伝子（灰色のヒストグラムとして示す）と比べて、間質において有意に低下するが（上のグラフ、マウスチップ、ｐ＜０．０１０５）、腫瘍細胞ではそうではない（下のグラフ、ヒトチップ、有意差なし）。個々のｐｒｏｘＶＤＶ転写産物のフォールドチェンジは、マイクロアレイ密度プロット中にブラックレターで注釈をつける。各治療コホートについてｎ＝５〜１０例。
【図２Ｃ】皮膚創傷への抗ＶＥＧＦ局所適用の際にダウンレギュレーションが観察され（上のグラフ、ｐ＝０．０１２５）、組換えＶＥＧＦを１２時間適用したときに、逆のアップレギュレーションが観察される（ｐ＜０．０００１）ことを示すグラフのセットである。個々のｐｒｏｘＶＤＶ転写産物のフォールドチェンジは、ブラックレターで注釈をつける。
【図２Ｄ】ＶＥＧＦシグナル伝達がＶＤＶ遺伝子の発現を誘導することを示す、組織学的データおよびグラフを提供する図である。ＶＤＶ遺伝子シグネチャーの抗ＶＥＧＦダウンレギュレーション（右、上のグラフ、ｐ＜０．０００１）とは対照的に、抗Ｄｌｌ４治療は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいて、大部分のＶＤＶ遺伝子のアップレギュレーションを４８時間後に引き起こし（右、下のグラフ、ｐ＜０．０００１）、これは、コントロール治療と比較した場合の、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭに対する免疫蛍光染色による過剰血管新生顕性と一致する（左）。個々のｐｒｏｘＶＤＶ転写産物のフォールドチェンジは、ブラックレターで注釈をつける。各治療コホートについてｎ＝５〜１０例。
【図３】大部分のｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子は、インビトロでｒＶＥＧＦによって明らかにアップレギュレーションされないことを示すヒートマップである。ＨＵＶＥＣのｒＶＥＧＦ刺激の遺伝子発現解析である。Ｈ（時間）は、ｒＶＥＧＦ刺激の長さを示す。ここに示すヒートマップは、選択されたＶＤＶプローブに対するマイクロアレイ発現解析の結果を強調する。暗青色は、最大の相対的ダウンレギュレーションを表し、暗赤色は、最大度の転写産物のアップレギュレーションを表す。ＰｒｏｘＶＤＶ遺伝子は、インビトロでｒＶＥＧＦによって顕著に調節されない。しかし、まだ特徴付けられていないＶＤＶ遺伝子の小集団（ＥＨＤ３、ＰＣＨＤ１７およびＴＨＢＤ）は、ＨＵＶＥＣのｒＶＥＧＦ刺激の際に強くアップレギュレーションされるように思われる。各時点の発現データは、３つの独立した反復に由来する。
【図４Ａ】ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子のＥＳＭ１は、腫瘍関連血管構造で特異的に発現するインビボでのＶＥＧＦの標的であることを示す、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の画像である。上部の写真（左および右）：センスオリゴを用いたＩＳＨの陰性コントロールは、意味のあるバックグラウンド（非特異的染色）を示さない。下部の写真は、抗ＶＥＧＦまたはコントロールで治療した動物由来のＨＭ７腫瘍切片における、ＥＳＭ１  ｍＲＮＡの発現（アンチセンスオリゴを用いたＩＳＨによる）を示す。黒色の矢印は、コントロールで治療した腫瘍のスライド（下部の写真の左のスライド）において、ＥＳＭ１  ｍＲＮＡの血管発現が強い幾つかの領域（褐色染色）を示す。それとは対照的に、ＥＳＭ１は、抗ＶＥＧＦで治療した動物由来の腫瘍スライドにおいてほとんど検出不可能であった（下部の写真、右）。すべてスライドはまた、ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）で対比染色した。
【図４Ｂ】コントロールおよび抗ＶＥＧＦで治療した動物由来の腫瘍スライドにおける、ＥＳＭ１（ＩＳＨ）染色の定量化を示すグラフである。ｎ＝１０。
【図４Ｃ】コントロールおよび抗ＶＥＧＦで治療した動物由来の腫瘍スライドにおける、ＭＥＣＡ３２（ＰＬＶＡＰ）染色の定量化を示すグラフである。ｎ＝１０。
【図４Ｄ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍におけるＶＥＧＦ経路阻害剤のインビボ活性に関する証拠を示す、組織学的画像セットおよび対応する定量的なグラフである。抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ、スニチニブまたはアキシチニブのインビボでの治療は、治療後７２時間で腫瘍のＭＶＤを効率的に低減する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を担持する動物は、材料および方法で示すように７２時間治療し、次いで腫瘍を収集して、組織学的解析および遺伝子発現解析を行った。上部の画像：ＭＥＣＡ−３２（ＰＬＶＡＰ）およびＣＤ３１染色（赤色）による腫瘍血管密度。核は、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。画像は、２０Ｘ拡大率で撮った。下部のグラフは、各治療群の８つの腫瘍からの定量化（平均＋／−ＳＥＭとして示す）を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【図４Ｅ】インビボでのＶＥＧＦ遮断またはＶＥＧＦＲ−２下流のシグナル伝達の阻害は、ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子の一貫性があるダウンレギュレーションを誘導することを示すグラフのセットである。ＶＥＧＦ阻害剤およびＶＥＧＦＲ−２阻害剤（スニチニブおよびアキシチニブ）で治療してから８時間（下部パネル）、１６時間（中央パネル）または７２時間（上部パネル）後に収集した４００ｍｍ３  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍における遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析である。値は、コントロール治療の平均遺伝子発現と比較したときの、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ−２阻害剤によって誘導される相対的遺伝子発現における平均ｌｏｇ２フォールドチェンジを表す。Ｅ−ｃａｄｈおよびＣＤ４５などの非血管マーカーは、これらの阻害剤に応答して有意に変化しない。下部パネル（治療後８時間）は、アキシチニブおよびスニチニブが、この特定の時点で明らかな活性がなかったので、抗ＶＥＧＦ治療のみを示す。遺伝子発現データは、各治療について８つの生物学的反復の平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図５Ａ】複数のＶＥＧＦ経路阻害剤による一貫性があるｐｒｏｘＶＤＶダウンレギュレーションを示すグラフである。ＶＥＧＦ阻害剤およびＶＥＧＦＲ−２阻害剤（スニチニブおよびアキシチニブ）で治療してから８時間、１６時間または７２時間後に収集したＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍における遺伝子発現解析である。値は、コントロール治療と比較した、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ−２阻害剤によって誘導される相対的遺伝子発現における、ｌｏｇ２フォールドチェンジの平均を表す。遺伝子発現データは、各治療について８つの生物学的反復のｌｏｇ２平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図５Ｂ】ブタクサまたは抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂで治療したＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍から選別した内皮細胞における、ｑＲＴ−ＰＣＲによるｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子の発現の定量化を示すグラフである。値は、３反復のｌｏｇ２フォールドチェンジの平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６】新たにＦＡＣＳで単離されたＴＡＥＣ対ＧＦＰ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞におけるＶＤＶ転写産物のエクスビボでの富化発現解析による、腫瘍関連内皮細胞（ＴＡＥＣ）でのＶＤＶマーカーの富化を示すグラフである。ＴＡＥＣ対腫瘍細胞の相対的遺伝子発現を、選択した遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。検査したすべてＶＤＶ遺伝子は、ＴＡＥＣで非常に富化していた（２５〜２００倍）。対照的に、Ｚｅｂ１  ｍＲＮＡの発現（上皮マーカー）は、ＴＡＥＣで低下し、腫瘍細胞で富化していた。値は、ＴＡＥＣを腫瘍細胞と比較したときの、相対的ｌｏｇ２フォールド遺伝子富化の平均を表す。ＴＡＥＣ細胞は、ＣＤ３１陽性、ＣＤ４５陰性およびＧＦＰ陰性細胞として選別した。腫瘍細胞はＧＦＰ陽性で選別した。遺伝子発現データは、各ＦＡＣＳソーティング実験についてプールされていた６つの腫瘍の平均を表す。ｑＲＴＰＣＲは３重で行った。エラーバーは標準偏差を表す。
【図７】１９人の炎症性乳がん患者由来の生検試料における遺伝子発現の変化（治療後対治療前）を示すグラフである。ＶＤＶシグネチャーの遺伝子（赤線）は、全遺伝子（灰色のヒストグラム）と比べて有意に低下する。ｐ＝０．０２７５。
【図８Ａ】ＮＯ１６９６６試験での利用可能な治療前のｍＲＮＡを有する１０３人の結腸直腸がん患者の無増悪生存（上部）および全生存（下部）を示すグラフのセットである。
【図８Ｂ】血管新生Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ｑＲＴ−ＰＣＲチップを用いて、２２種のＶＤＶ遺伝子の遺伝子発現を定量化するための実験概要の概略図である。
【図８Ｃ】結腸がん試料における２２種のＶＤＶ遺伝子の発現レベルの相関を示すグラフである。
【図８Ｄ】２２種の遺伝子のＶＤＶシグネチャーが、進行した結腸直腸がんの患者に対するベバシズマブ（ｂｅｖ）治療の効果を層別化することを示すグラフのセットである。ＸＥＬＯＸ（黒色）またはＸＥＬＯＸ＋ベバシズマブ（Ｍｕｌｌｅｎら、Ｃｅｌｌ．１４７（３）：５６５〜５７６、２０１１）で治療した「ＶＤＶ−高」患者（実線）対「ＶＤＶ−低」患者（破線）の無増悪生存（上部）または全生存（下部）を示す。ＰＦＳ（上部）のＶＤＶ遺伝子セットの効果は発現レベルで層別化し（相互作用ｐ＝０．０３６）、ＯＳ（下部）のＶＤＶ遺伝子セットの効果は発現レベルで層別化した（相互作用ｐ＝０．３７）。
【図９Ａ】完全なＶＤＶシグネチャー「ＶＤＶ」（ｘ軸）と保存の臨床材料を調べるのに使用された２２種の遺伝子の代表的なサブセット「ＶＤＶ−２２」（ｙ軸）の間の一致を検証するグラフのセットである。普及試料セットは、転移性のファーストライン試験設定（ＮＯ１６９６６に匹敵する）にふさわしいと思われる患者由来の保存試料と共に示される。保存試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＤＡＳＬビーズアレイで全ゲノムのＲＮＡ発現について評価した。ＮＳＣＬＣ＝非小細胞肺がん、ＢＲ＝乳房、ＣＲＣ＝結腸直腸がん。
【図９Ｂ】ＶＥＧＦ−Ａ発現レベルによる、ＮＯ１６９６６患者の層別化を示すグラフのセットである。ＰＦＳ（上部）、相互作用ｐ＝０．７６、およびＯＳ（下部）、相互作用ｐ＝０．３３。
【図９Ｃ】ＣＤ３１の発現レベルによる、ＮＯ１６９６６患者の層別化を示すグラフのセットである。ＰＦＳ（上部）、相互作用ｐ＝０．１５、およびＯＳ（下部）、相互作用ｐ＝０．９９。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．緒言
本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体での治療に感受性または応答性の患者をモニタリングおよび／または同定するための方法および組成物を提供する。本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト（抗ＶＥＧＦ抗体など）で治療する前の、表１または表２に記載される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の遺伝子の発現レベルの決定が、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体での治療に感受性または応答性の患者を同定するのに有用であるという発見に基づく。場合によっては、次いで、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法を患者のために選択することができ、さらに、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法を場合によっては患者に施すことができる。
【００１７】
ＩＩ．定義
用語「バイオマーカー」および「マーカー」は本明細書で互換的に使用されて、ＤＮＡ系、ＲＮＡ系、タンパク質系、炭水化合物系または糖脂質系の分子マーカーを指す。対象または患者の試料中のそれらの発現または存在は、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出することができ、ＶＥＧＦアンタゴニストに対する哺乳類対象の応答性または感受性をモニタリングするのに有用である。そうしたバイオマーカーには、これらに限定されないが、表１および表２に記載される遺伝子が含まれる。そうしたバイオマーカーの発現は、ＶＥＧＦアンタゴニストに感受性または応答性の患者から得た試料において、（例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストへの応答性について検査を受けた患者の群／集団由来の試料中のバイオマーカーの中央発現レベル；先の時点で前もって個体から得た試料中のそのレベル；または原発腫瘍状態でＶＥＧＦアンタゴニスト（抗ＶＥＧＦ抗体など）を用いる前治療を受け、現在転移に見舞われている可能性がある患者由来の試料中のそのレベルを含めた）基準レベルより高いまたはより低いと決定することができる。上記少なくとも１つの遺伝子、例えば表１および表２に記載される遺伝子などの基準発現レベルより大きいまたはその基準発現レベル未満の発現レベルを有する個体は、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い対象／患者として同定することができる。例えば、基準レベル（上記の中央値レベルなど）と比べて（すなわち、より高いまたはより低い）最大５０５、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％の遺伝子発現レベルを示すそうした対象／患者は、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い対象／患者として同定することができる。
【００１８】
用語「試料」および「生体試料」は互換的に使用されて、体液、体組織（例えば腫瘍組織）、細胞または他の供給源を含めた、個体から得た任意の生体試料を指す。体液は、例えばリンパ液、血清、新鮮全血、末梢血単核球、凍結全血、（新鮮または凍結を含めた）血漿、尿、唾液、精液、滑液および脊髄液である。試料には、胸部組織、腎組織、結腸組織、脳組織、筋組織、滑液膜組織、皮膚、毛包、骨髄および腫瘍組織も含まれる。組織生検物および体液を哺乳動物から得る方法は当技術分野で周知である。
【００１９】
ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に対する患者の「有効な応答」または患者の「応答性」もしくは「感受性」は、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療由来のまたはその治療の結果としての血管新生障害の危険性があるか、またはその障害を患っている患者にもたらされる、臨床的または治療的利益を指す。そうした利益には、このアンタゴニストでの治療由来のまたはその治療の結果としての、患者の細胞応答もしくは生物学的応答、完全奏効、部分奏効、安定（進行または再発がない）または晩期再発を伴う応答が含まれる。例えば、有効な応答は、表１または表２に記載されるバイオマーカーの１つまたは複数を発現すると診断された患者において、それらのバイオマーカーの１つまたは複数を発現しない患者に対する、腫瘍サイズの低減または無増悪生存であり得る。遺伝子バイオマーカー（複数可）の発現は、そうした有効な応答を効率的にまたは高感度で予測する。
【００２０】
本明細書で使用する「アンタゴニスト」は、それらが結合する分子の生物活性を阻害または低減する化合物または薬剤を指す。アンタゴニストには、ＶＥＧＦに結合し、場合によっては別の分子にコンジュゲートまたは融合した、抗体、合成または天然配列のペプチド、イムノアドヘシンおよび小分子アンタゴニストが含まれる。「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害または低減する抗体である。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「アゴニスト抗体」は、目的のポリペプチドの機能活性の少なくとも１つを部分的または完全に模倣する抗体である。
【００２２】
本明細書では、用語「抗体」は広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り抗体断片を、特にカバーする。
【００２３】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から同定され、分離および／または回収された抗体である。その自然環境の夾雑成分とは、その抗体に関する研究、診断または治療的使用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。幾つかの実施形態では、抗体は、（１）例えばローリー法によって測定されたときに抗体の９５重量％を超えるまで、幾つかの実施形態では９９重量％を超えるまで、（２）例えばスピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用してＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）例えばクマシーブルー染色もしくは銀染色を使用して、還元もしくは非低減条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製される。単離抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれ、これは、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかし通常は、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００２４】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖と軽鎖は、規則的間隔の鎖内ジスルフィド結合も有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に幾つかの定常ドメインが続く。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そのもう一方の端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００２５】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称することができる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称することができる。これらのドメインは、一般に抗体の最も可変な部分であり、抗原結合部位を含む。
【００２６】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖と重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、βシート構造に連結し、時としてβシート構造の一部を形成するループを形成する３つのＨＶＲにより連結された、大部分がβシート配置の形をとる、４つのＦＲ領域をそれぞれ含む。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域に近接して結合され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接的に関与しないが、抗体依存性細胞傷害での抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００２７】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、明らかに異なる２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。
【００２８】
抗体（免疫グロブリン）は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて種々のクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類することができる。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および３次元配置は周知であり、一般に、例えばＡｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．、２０００）に記載されている。抗体は、１種または複数の他のタンパク質またはペプチドとの抗体の共有または非共有結合によって形成される、大きな融合分子の一部でもよい。
【００２９】
用語「完全長抗体」「インタクト抗体」および「全抗体」は、本明細書で互換的に使用され、以下で定義される抗体断片ではなく、その実質的にインタクトな形態の抗体を指す。この用語は、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を特に指す。
【００３０】
本明細書において「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分または放射標識にコンジュゲートされていない抗体である。
【００３１】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部からなり、好ましくはその抗原結合領域からなる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００３２】
抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片がもたらされ、それぞれ、単一の抗原結合部位と、その名前が容易に結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片とを有する。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、抗原となおも架橋結合することができる、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００３３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。一実施形態では、２本鎖Ｆｖ種は、強い非共有結合の、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体から成る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、軽鎖および重鎖が２本鎖Ｆｖ種におけるものに類似した「二量体」構造中で会合することができるように、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとが可動性のペプチドリンカーによって共有結合することができる。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定めるのはこの配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗原結合特異性を抗体に与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、完全な結合部位よりも低い親和性においてではあるが、抗原を認識しかつ抗原に結合する能力を有する。
【００３４】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加する点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００３５】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原の結合に対して所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含む。ｓｃＦｖの総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏ−ｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅら編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：１９９４）、２６９〜３１５頁を参照されたい。
【００３６】
用語「ダイアボディ」は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指す。２つのドメイン間の対形成を同一鎖で可能にするには短すぎるリンカーを使用して、これらのドメインを別の鎖の相補的なドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を作出する。ダイアボディは二価でもよいし、二重特異性でもよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）にさらに十分に説明されている。トリアボディおよびテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）に記載されている。
【００３７】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団由来の抗体を指す。すなわち、少量で存在し得る起こり得る突然変異、例えば自然発生的な突然変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の特質を示す。ある種の実施形態では、そうしたモノクローナル抗体は、典型的には、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法によって得られた標的結合ポリペプチド配列を含有する抗体を含む。例えば、選択方法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンから唯一のクローンを選択することであり得る。選択された標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善する、標的結合配列をヒト化する、細胞培養でのその産生を改善する、インビボでのその免疫原性を低減する、多重特異性抗体を作出するなどのためにさらに改変することができること、および改変された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、他の免疫グロブリンの混入が典型的にはないという点において有利である。
【００３８】
修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の特質を示し、任意の特定の方法によって抗体を産生することを必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、以下を含めた種々の技法によって作製することができる。例えば、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４（３）：２５３〜２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版  １９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９〜３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３〜１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７〜１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９〜１３２（２００４）を参照されたい）、およびヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部またはすべてを有するヒトまたはヒト様抗体を動物で産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５〜５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２〜８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５〜８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３（１９９５）を参照されたい）。
【００３９】
本明細書では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残部が、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同な「キメラ」抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りそうした抗体の断片を、特に含む（例えば米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えば目的の抗原でマカクザルを免疫することによって産生された抗体に由来する、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれる。
【００４０】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲからの残基が、マウス、ラット、ウサギまたは所望の特異性、親和性および／もしくは能力を有する非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基に置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含むことができる。こうした修飾を行って、抗体の性能をさらに改良することができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、高頻度可変ループのすべてもしくは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてもしく実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。例えば、ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）；および米国特許第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０９号も参照されたい。
【００４１】
「ヒト抗体」は、ヒトで産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体、および／または本明細書で開示されるようなヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含めた当技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）に記載されている方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５：３６８〜７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原暴露に応答してそうした抗体を産生するように改変されているが、その内在性の遺伝子座は無能にされているトランスジェニック動物、例えば免疫化されたゼノマウスに抗原を投与することによって調製することができる（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、例えば米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関しては、例えばＬｉら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０３：３５５７〜３５６２（２００６）も参照されたい。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、配列において高頻度可変であり、かつ／または構造的に定まったループを形成する、抗体可変ドメイン領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然抗体では、Ｈ３およびＬ３は、６つのＨＶＲのうちで最大の多様性を示し、特にＨ３は、優れた特異性を抗体に与える際に独特の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７〜４５（２０００）；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１〜２５（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）を参照されたい。実際、重鎖のみからなる、天然に存在するラクダ科の抗体は、軽鎖がない状態で機能的かつ安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６〜４４８（１９９３）およびＳｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３〜７３６（１９９６）を参照されたい。
【００４３】
幾つかのＨＶＲの描写が使用されており、それらは本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＶＲは、配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造的なループの位置に言及している（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的なループとの間の折衷に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらのＨＶＲのそれぞれに由来する残基を以下に示す。
ループ Kabat AbM Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H3 H30-H35B (Kabatの番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothiaの番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
【００４４】
ＨＶＲは、以下のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる：ＶＬの２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨの２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）および９３〜１０２、９４〜１０２または９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの拡大ＨＶＲのそれぞれを定めることを目的として、Ｋａｂａｔら、上記、に従って番号付けされる。
【００４５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４６】
表現「Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基の番号付け」または「Ｋａｂａｔのアミノ酸位置の番号付け」およびそれらの変形は、Ｋａｂａｔら、上記、における、抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮または可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲへの挿入に相当する、より少ないまたはさらなるアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一アミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲの残基８２の後ろに挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃ）を含み得る。Ｋａｂａｔの残基番号付けは、「標準的」Ｋａｂａｔ番号付け配列と、抗体配列の相同領域でアライメントすることによって、所与の抗体について決定することができる。
【００４７】
「親和性成熟」抗体は、これらの１つまたは複数のＨＶＲに１つまたは複数の改変を有し、こうした改変が、それらの改変（複数可）を保有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体である。一実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル濃度さらにはピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野で既知の手順によって産生される。例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのシャッフリングによる親和性熟成を記載している。ＨＶＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７〜１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４〜２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０〜９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６（１９９２）によって記載されている。
【００４８】
「成長阻害性」抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を阻止または低減する抗体である。
【００４９】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化および／または（アポトーシス小体と呼ばれる）膜小胞の形成などの標準的なアポトーシスアッセイによって決定されるようなプログラム細胞死を誘導する抗体である。
【００５０】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因し得る生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーションならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００５１】
本明細書での用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域および変異型Ｆｃ領域を含めた、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界部位は変動する可能性が高いが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７）は、例えば、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換えで操作することによって、除去することができる。したがって、インタクトな抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含むことができる。
【００５２】
本明細書で別段指示がない限り、免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、上記、のＥＵインデックスの番号付けである。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００５３】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ−受容体結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。そうしたエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせる必要があり、例えば本明細書の定義で開示されるような様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００５４】
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然界に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非ＡアロタイプおよびＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、ならびに天然に存在するそれらの変異型が含まれる。
【００５５】
「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸の修飾、好ましくは１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）によって天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異型Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは、それらと約９０％の相同性、より好ましくは、それらと約９５％の相同性を保有する。
【００５６】
用語「Ｆｃ領域含有抗体」は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７）は、例えば抗体の精製の間に、または抗体をコードする核酸を組換えで操作することによって、除去することができる。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体を含む組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７が除去された抗体、またはＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体との混合物を含むことができる。
【００５７】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。幾つかの実施形態では、ＦｃＲは、天然ヒトＦｃＲである。幾つかの実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するＦｃＲであり、これには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、そうした受容体の対立遺伝子変異型および選択的スプライシングを受けた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、主にそれらの細胞質ドメインが異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）をその細胞質ドメインに含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）をその細胞質ドメインに含む（例えばＤａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲは、例えばＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）に概説されている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲは、本明細書の用語「ＦｃＲ」に包含される。
【００５８】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」には新生児受容体、ＦｃＲｎも含まれ、これは、母親由来のＩｇＧの胎児への移入（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、および免疫グロブリンの恒常性の調節に関与する。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は、既知である（例えばＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１８（１２）：５９２〜８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５（７）：６３７〜４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（８）：６２１３〜６（２００４）；ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎら）を参照されたい）。
【００５９】
ヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドのヒトＦｃＲｎへのインビボでの結合および血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞系統で、または変異型Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類でアッセイすることができる。ＷＯ２０００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合が改善されたまたは減少した変異型抗体を記載している。例えばＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）も参照されたい。
【００６０】
「ヒトエフェクター細胞」は、１種または複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を遂行する白血球である。ある種の実施形態では、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能（複数可）を遂行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれる。エフェクター細胞は、天然供給源から、例えば血液から単離することができる。
【００６１】
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えばＮＫ細胞、好中球およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて標的細胞を細胞毒で死滅させることができるようにする、細胞傷害の形態を指す。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２（１９９１）の４６４頁の表３に概説されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号または米国特許第６，７３７，０５６号（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されているアッセイなどのインビトロでのＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そうしたアッセイに有用なエフェクター細胞には、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２〜６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルで、インビボで評価することができる。
【００６２】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体システムの第１の成分（Ｃ１ｑ）が、コグネイト抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することにより惹起される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。Ｆｃ領域のアミノ酸配列が改変され（変異型Ｆｃ領域を有するポリペプチド）、およびＣ１ｑ結合能力が増大または低下したポリペプチド変異型が、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号およびＷＯ１９９９／５１６４２に記載されている。例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４（２０００）も参照されたい。
【００６３】
「結合親和性」は、一般に、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）の間の非共有相互作用の総計の強度を指す。別段指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原の）間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載の方法を含めた、当技術分野で既知の慣用法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般にゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に抗原により速く結合し、より長く結合したままという傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野で知られており、それらのいずれかを本発明の目的に使用することができる。結合親和性を測定するための特定の例示的かつ代表的な実施形態を以下に記載する。
【００６４】
一実施形態では、本発明による「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下のアッセイによって記載されるように、Ｆａｂ型の目的の抗体およびその抗原を用いて行われる放射標識性抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、一連の漸増量の非標識抗原の存在下で、最小の濃度の（１２５Ｉ）標識抗原でＦａｂを平衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで結合抗原を捕獲することによって測定される（例えばＣｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイ条件を確立するために、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）に入れた５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で、マイクロタイタープレート（ＤＹＮＥＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を一晩コーティングし、続いて２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを用いて、室温（約２３℃）で２から５時間ブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ  ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を目的のＦａｂの段階希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３〜４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価に相当する）。次いで、目的のＦａｂを、一晩インキュベートする。しかし、インキュベーションは、平衡に達するのを確実にするために、さらに長い期間（例えば約６５時間）続けることができる。その後、この混合物を捕獲プレートに移して、室温で（例えば１時間）インキュベートする。次いで、この溶液を除去し、プレートを、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤を含むＰＢＳで８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、このプレートを、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）γカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計測する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を選択して、競合的結合アッセイで使用する。
【００６５】
別の実施形態によれば、ＫｄまたはＫｄ値は、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップと共にＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００装置（ＢＩＡＣｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を２５℃で使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定される。簡単に述べると、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を活性化する。抗原を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を用いて５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈してから、約１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得るように、５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入に続いて、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。キネティクス測定のために、Ｆａｂの２倍階段希釈物（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０（商標）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、約２５μｌ／分の流速で２５℃で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時に適合させることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する。例えばＣｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が、１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるような、ＰＢＳ、ｐＨ７．２に入れた２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光放射強度（励起＝２９５ｎＭ；放射＝３４０ｎＭ、１６ｎＭのバンドパス）の増大または低下を漸増濃度の抗原の存在下で測定する蛍光クエンチング法を使用して、オン速度を決定することができる。
【００６６】
本発明による「オン速度」、「会合の速度」、「会合速度」または「ｋｏｎ」は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、上記のように決定することもできる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、用語「実質的に類似」または「実質的に同一」は、２つの数値間の差が、前記値（例えばＫｄ値）によって測定された生物学的特徴に関して、ほとんどまたは全く生物学的および／または統計的有意性がないと当業者が見なすような、２つの数値（例えば、一方は本発明の抗体と関係があり、他方は基準／比較抗体と関係がある）間の十分に高い程度の類似性を意味する。前記２つの値の間の差は、基準／比較値に応じて、例えば約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満および／または約１０％未満である。
【００６８】
本明細書で使用する場合、フレーズ「実質的に低減した」または「実質的に異なる」は、２つの数値間の差が、前記値（例えばＫｄ値）によって測定された生物学的特徴に関して、統計的有意性があると当業者が見なすような、２つの数値（一般に、一方はある分子と関係があり、他方は基準／比較分子と関係がある）間の十分に高い程度の差を意味する。前記２つの値の間の差は、基準／比較分子の値に応じて、例えば約１０％より大きい、約２０％より大きい、約３０％より大きい、約４０％より大きい、および／または約５０％より大きい。
【００６９】
ある種の実施形態では、本明細書で有用なヒト化抗体は、ＩｇＧ  Ｆｃのアミノ酸改変をさらに含み、野生型のＩｇＧ  Ｆｃを有する抗体と比較して、ヒトＦｃＲｎに対して、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、さらにより好ましくは少なくとも１５０倍から約１７０倍増大した結合親和性を示す。
【００７０】
「障害」または「疾患」は、本発明の物質／分子または方法での治療の利益を享受するであろう任意の状態である。これは、問題になっている障害に哺乳動物を罹りやすくする病態を含めた、慢性および急性の障害または疾患を含む。本明細書で治療される障害の非限定例としては、悪性腫瘍および良性腫瘍；非白血病およびリンパ系悪性腫瘍；ニューロン障害、グリア障害、星状細胞障害、視床下部および他の腺の障害、マクロファージ障害、上皮障害、間質および割腔の障害；ならびに炎症性障害、免疫性障害および他の血管新生障害が挙げられる。
【００７１】
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、ある程度の異常細胞増殖を伴う障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害はがんである。一実施形態では、細胞増殖性障害は血管新生である。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長および増殖を、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書で言及する場合、相互排他的でない。
【００７３】
用語「がん」および「がん性」は、制御されていない細胞増殖を典型的には特徴とする、哺乳動物の生理的状態を指すか、または説明する。がんの例としては、これらに限定されないが、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。そうしたがんのより具体的な例としては、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がんおよび肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃がんまたは腹部がん（胃腸がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーム、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がんまたは腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がんおよび様々なタイプの頭頸部がん、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性の白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に付随するものなど）およびメイグス症候群に付随する異常な血管増殖、が挙げられる。
【００７４】
用語「抗腫瘍性組成物」または「抗がん組成物」または「抗がん剤」は、少なくとも１つの活性な治療剤、例えば「抗がん剤」を含む、がんを治療する際に有用な組成物を指す。治療剤（抗がん剤）の例としては、これらに限定されないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物、放射線療法で使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤およびがんを治療するための他の薬剤、例えば抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、血小板由来の成長因子阻害剤（例えばＧｌｅｅｖｅｃ（商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ  ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体（複数可）の１種または複数に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ならびに他の生理活性剤および有機化合物剤などが挙げられる。それらの組み合わせも本発明に含まれる。
【００７５】
「血管新生因子または血管新生剤」は、血管の発達を刺激する、例えば血管新生、内皮細胞の成長、血管の安定性および／または脈管形成などを促進する成長因子である。例えば血管新生因子には、これらに限定されないが、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、エフリン、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／散乱係数（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、血小板由来の内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来の成長因子、特にＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦＲ−β、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）などが含まれる。また、創傷の治癒を速める因子、例えば、成長ホルモン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、ならびにＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βも含まれるであろう。ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、５３：２１７〜３９（１９９１）；ＳｔｒｅｉｔおよびＤｅｔｍａｒ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２：３１７２〜３１７９（２００３）；Ｆｅｒｒａｒａ＆Ａｌｉｔａｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９〜１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２：６５４９〜６５５６（２００３）（例えば既知の血管新生因子を列挙している表１）；ならびにＳａｔｏ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、８：２００〜２０６（２００３）を参照されたい。
【００７６】
本明細書で使用する用語「ＶＥＧＦ」は、Ｌｅｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１３０６（１９８９）およびＨｏｕｃｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、５：１８０６（１９９１）によって記載されているような、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子および関連する１２１、１８９および２０６アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子を、それらの天然に存在する対立遺伝子形態およびプロセッシングを受けた形態と共に指す。用語「ＶＥＧＦ」は、マウス、ラットまたは霊長類などの非ヒト種由来のＶＥＧＦも指す。特定の種由来のＶＥＧＦを、ヒトＶＥＧＦに対するｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦに対するｍＶＥＧＦなどのような用語で示すこともある。用語「ＶＥＧＦ」は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８から１０９または１から１０９を含有する、トランケートされた形態のポリペプチドを指すのにも使用される。任意のそうしたＶＥＧＦ形態への言及は、例えば「ＶＥＧＦ（８〜１０９）」、「ＶＥＧＦ（１〜１０９）」または「ＶＥＧＦ１６５」で、本出願中で識別することができる。「トランケートされた」天然ＶＥＧＦに対するアミノ酸位置は、天然ＶＥＧＦ配列で示される通りに番号がつけられる。例えば、トランケートされた天然ＶＥＧＦでのアミノ酸位置１７（メチオニン）も、天然ＶＥＧＦでの位置１７（メチオニン）である。トランケートされた天然ＶＥＧＦは、天然ＶＥＧＦに匹敵する、ＫＤＲ受容体およびＦｌｔ−１受容体に対する結合親和性を有する。好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。
【００７７】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦもしくは１種もしくは複数のＶＥＧＦ受容体またはそれらをコードする核酸へのその結合を含め、ＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減または干渉することができる分子を指す。好ましくは、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に結合する。ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦ抗体およびそれらの抗原結合性断片、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体に結合し、リガンド−受容体相互作用を遮断するポリペプチド（例えばイムノアドヘシン、ペプチボディ）、抗ＶＥＧＦ受容体抗体およびＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤、ＶＥＧＦに結合するアプタマー、およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体をコードする核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸（例えばＲＮＡｉ）が含まれる。好ましい一実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、インビトロで、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ誘導性内皮細胞増殖を阻害する。好ましい一実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、非ＶＥＧＦまたは非ＶＥＧＦ受容体よりも高い親和性で、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に結合する。好ましい一実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、１ｕＭから１ｐＭの間のＫｄで、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に結合する。他の好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、５００ｎＭから１ｐＭの間で、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に結合する。
【００７８】
好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗体、ペプチボディ、イムノアドヘシン、小分子またはアプタマーなどのポリペプチドから選択される。好ましい実施形態では、抗体は、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）抗体などの抗ＶＥＧＦ抗体、または抗ＶＥＧＦＲ２もしくは抗ＶＥＧＦＲ３抗体などの抗ＶＥＧＦ受容体抗体である。ＶＥＧＦアンタゴニストの他の例としては、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８およびＫＲＮ−６３３が挙げられる。
【００７９】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性および特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患または状態をターゲティングおよび干渉する際の治療剤として使用することができる。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦ相同体にも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦまたはｂＦＧＦなどの他の成長因子にも結合しない。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ１０７０９により産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体である。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３〜４５９９に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、これには、これらに限定されないが、ベバシズマブ（ＢＶ；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））として知られる抗体が含まれる。別の実施形態によれば、使用することができる抗ＶＥＧＦ抗体には、これらに限定されないが、ＷＯ２００５／０１２３５９に開示されている抗体が含まれる。一実施形態によれば、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＷＯ２００５／０１２３５９の図２４、２５、２６、２７および２９に開示されている抗体（例えばＧ６、Ｇ６−２３、Ｇ６−３１、Ｇ６−２３．１、Ｇ６−２３．２、Ｂ２０、Ｂ２０−４およびＢ２０−４．１）のうちのいずれか１つの可変重鎖領域および可変軽鎖領域を含む。別の好ましい実施形態では、ラニビズマブとして知られる抗ＶＥＧＦ抗体は、糖尿病性神経症およびＡＭＤなどの眼疾患に対して投与されるＶＥＧＦアンタゴニストである。
【００８０】
「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ（ＢＶ）」は、Ｐｒｅｓｔａら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３〜４５９９に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これは、ヒトＶＥＧＦがその受容体へ結合するのを遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の、変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域および抗原結合相補性決定領域を含む。フレームワーク領域の大部分を含む、ベバシズマブのアミノ酸配列の約９３％は、ヒトＩｇＧ１に由来し、その配列の約７％は、マウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは約１４９，０００ダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。他の抗ＶＥＧＦ抗体には、米国特許第６８８４８７９号およびＷＯ２００５／０４４８５３に記載されている抗体が含まれる。
【００８１】
抗ＶＥＧＦ抗体ラニビズマブすなわちＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）抗体またはｒｈｕＦａｂ  Ｖ２は、ヒト化親和性成熟抗ヒトＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片である。ラニビズマブは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターでの標準的な組換え技術方法および細菌発酵によって生産される。ラニビズマブは、グリコシル化されておらず、約４８，０００ダルトンの分子量を有する。ＷＯ９８／４５３３１およびＵＳ２００３０１９０３１７を参照されたい。
【００８２】
血管新生の調節障害は、異常な血管新生につながる可能性があり、すなわち疾患状態における新しい血管の過剰な、不十分な、またはそれ以外の不適切な成長（例えば、医学的見地から望ましくない血管新生の位置、タイミング、または発生）の場合に、または疾患状態、すなわち血管新生障害を引き起こすような、異常な血管新生につながる可能性がある。過剰な、不適切なまたは制御されていない血管新生は、疾患状態の悪化の一因となるかまたは疾患状態を引き起こす新しい血管成長が存在するときに生じる。新しい血管は、疾患組織に栄養を与え、正常組織を破壊し得、がんの場合には、新しい血管は、腫瘍細胞を循環中に抜け出させ、他の器官に定着させ得る（腫瘍転移）。異常な血管新生（すなわち血管新生障害）を伴う疾病状態には、非腫瘍性状態と腫瘍性状態の両方が含まれ、これらには、例えばがん、特に血管新生化した固体腫瘍および転移性腫瘍（結腸がん、乳がん、肺がん（特に小細胞肺がん）、脳腫瘍（特に神経膠芽細胞腫）または前立腺がんを含む）、望ましくないまたは異常な肥大、関節炎、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、炎症性腸疾患またはＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）、乾癬、乾癬プラーク、類肉腫症、アテローム性動脈硬化症、アテローム斑、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症を含めた他の増殖網膜症、後水晶体線維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、角膜移植後拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、虹彩前面の血管新生（ルベオーシス）、眼の血管新生性疾患、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺滲出、脳浮腫（例えば急性卒中／閉鎖性頭部損傷／外傷に付随する）、滑液炎症、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞卵巣、子宮内膜症、第三腔体液疾患（３ｒｄ  ｓｐａｃｉｎｇ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮筋腫、早期分娩、ＩＢＤなどの慢性炎症、腎臓同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないまたは異常な組織腫瘤成長（非がん）、血友病関節症、肥厚性瘢痕、毛髪成長阻害、オースラー・ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水症、心膜液貯留（心外膜炎に付随するものなど）ならびに胸水貯留が含まれる。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「治療」は、治療される個体または細胞の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のためまたは臨床病理の過程において行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理的帰結の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾病状態の回復または緩和、および寛解または改善した予後が含まれる。幾つかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患または障害の発達を遅らせるために使用される。
【００８４】
「有効量」は、必要な投薬量および期間での、所望の治療的または予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
【００８５】
本発明の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの「治療有効量」は、個体の疾病状態、年齢、性別および体重ならびに物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストが個体において所望の応答を惹起する能力などの要因に従って変動し得る。治療有効量は、治療的有益効果が、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの任意の毒性効果または有害効果を上回るものでもある。用語「治療有効量」は、哺乳動物（別名、患者）において疾患または障害を「治療する」のに有効な、本発明の抗体、ポリペプチドまたはアンタゴニストの量を指す。がんの場合には、治療有効量の薬物は、がん細胞の数を減少する、腫瘍サイズもしくは重量を低減する、末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害する（すなわち、ある程度緩徐し、好ましくは止める）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度緩徐し、好ましくは止める）、腫瘍成長をある程度阻害する、および／またはがんに付随する症状の１つもしくは複数をある程度やわらげることができる。薬物が既存のがん細胞の成長を防止および／または既存のがんを死滅させることができる限り、薬物は、細胞分裂停止性および／または細胞傷害性である。一実施形態では、治療有効量は成長阻害量である。別の実施形態では、治療有効量は、患者の生存を延ばす量である。別の実施形態では、治療有効量は、患者の無増悪生存期間を改善する量である。
【００８６】
「予防有効量」は、必要な投薬量および期間での、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、必ずしもそうではないが、予防的用量は、疾患に先立ってまたは疾患の初期段階で対象において使用されるので、予防有効量は治療有効量より少ない。
【００８７】
本明細書で使用する用語「細胞傷害性薬物」は、細胞機能を阻害するもしくは妨げる、および／または細胞破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、例えばメトトレキサート、アドリアミシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、ならびに細菌、真菌、植物もしくは動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素（それらの断片および／または変異型を含む）、ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍性または抗がん性の薬剤を含むことが意図される。他の細胞傷害性薬物は、以下に記載される。殺腫瘍性の薬剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００８８】
「化学療法剤」は、がんの治療で有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレン（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅ）チオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログのトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；エンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１（例えばＡｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｎｇｌ編、３３：１８３〜１８６（１９９４）を参照されたい）などの抗生物質；ジネミシンＡを含めたジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、��ピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）パクリタキセルのクレモホール無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａ���ｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組み合わせ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの組み合わせ療法の省略形であるＣＨＯＰ、および５−ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））での治療レジメンの省略形であるＦＯＬＦＯＸなどが挙げられる。さらなる化学療法剤には、抗体薬物コンジュゲートとして有用な細胞傷害性薬物、例えば、マイタンシノイド（例えばＤＭ１）ならびにオーリスタチンＭＭＡＥおよびＭＭＡＦなどが含まれる。
【００８９】
「化学療法剤」には、がんの成長を促進し得るホルモンの効果を調節、低減、遮断または阻害するように働き、全身性または全身治療の形態であることが多い、「抗ホルモン剤」も含まれる。化学療法剤は、それ自体ホルモンでもよい。例としては、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；卵巣を抑制または活動停止するように機能する薬剤、例えば黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸リュープロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）；他の抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；および副腎でのエストロゲン産生を調節するアロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどが挙げられる。加えて、化学療法剤のそうした定義には、ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネートまたはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）など；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；トシル酸ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６としても知られるＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲの二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；ならびに上記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸または誘導体が含まれる。
【００９０】
本明細書で使用する場合、「増殖阻害剤」は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞（例えばＲｏｂｏ４を発現する細胞）の成長および／または増殖を阻害する化合物または組成物を指す。したがって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＲｏｂｏ４を発現する細胞の割合を有意に低減するものでもよい。増殖阻害剤の例としては、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の所で）遮断する薬剤、例えばＧ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤が挙げられる。古典的なＭ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサンおよびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばアントラサイクリン抗菌剤ドキソルビシン（（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシル（ｈｅｘａｐｙｒａｎｏｓｙｌ））オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオン）、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤はＳ期停止にも波及し、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジ、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシルおよびａｒａ−Ｃである。さらなる情報は、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編、第１章、表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」、Ｍｕｒａｋａｍｉら（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５）、特に１３頁に見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方ともイチイに由来する抗がん薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成アナログである。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の構築を促進し、脱重合を防止することにより微小管を安定化し、このことによって、細胞の有糸分裂が阻害されることになる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「患者」は、治療が望まれる任意の単一の動物、より好ましくは（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジおよび非ヒト霊長類のような非ヒト動物を含めた）哺乳動物を指す。最も好ましくは、本明細書での患者はヒトである。
【００９２】
本明細書での「対象」は、血管新生障害の１種または複数の徴候、症状または他の指標に見舞われているまたは見舞われた、治療に適格な患者を含めた、任意の単一のヒト対象である。対象として含まれることが意図されるものは、疾患のいかなる臨床徴候も示さない、臨床研究試験に関与する任意の対象、または疫学的研究に関与する対象、またはコントロールとして一度使用された対象である。対象は、ＶＥＧＦアンタゴニストを用いて以前に治療されていてもよいし、そのような治療がされていなくてもよい。対象は、本明細書の治療が開始されるときに使用される第２の医薬に対してナイーブでもよく、すなわち、対象は、「ベースライン」（すなわち、本明細書の治療方法において、アンタゴニストの最初の用量を投与する前の設定時点、例えば治療を開始する前に対象をスクリーニングする日）において、例えば抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物で以前に治療されていなくてもよい。そうした「ナイーブ」対象は、そうした第２の医薬での治療の候補であると一般に見なされる。
【００９３】
表現「有効量」は、血管新生障害を治療するのに有効な医薬の量を指す。
【００９４】
用語「医薬製剤」は、医薬の生物活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与されることになる対象に対して許容されない毒性があるさらなる成分を含まない、無菌調製物を指す。
【００９５】
「無菌」製剤は、無菌的であり、またはすべての生きた微生物およびそれらの胞子を含まない。
【００９６】
「添付文書」は、適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌、パッケージ化された製品と組み合わされる他の治療的製品、および／またはそうした治療的製品もしくは医薬などの使用に関する警告についての情報などを含む、治療的製品または医薬の商業的パッケージに慣例上含まれる指示書を指すのに使用される。
【００９７】
「キット」は、少なくとも１つの試薬、例えば血管新生障害の治療のための医薬または本発明のバイオマーカー遺伝子もしくはタンパク質を特異的に検出するプローブを含む、任意の製造品（例えばパッケージまたは容器）である。製造品は、好ましくは、本発明の方法を行うためのユニットとして宣伝され、流通され、または販売される。
【００９８】
医薬（複数可）に対する非応答において、１種または複数の医薬での以前のまたは現在の治療から「臨床的に許容されない高いレベルの毒性」に見舞われている対象は、経験豊かな臨床医が重大と見なす、その毒性に付随する１種または複数の負の副作用または有害事象、例えば、重篤な感染症、うっ血性心不全、（多発性硬化症に至る）脱髄、重大な過敏症、神経病理学的な事象、高度の自己免疫、がん、例えば子宮内膜がん、非ホジキンリンパ腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がんまたは黒色腫、結核（ＴＢ）などに見舞われる
【００９９】
「負の副作用の危険性を低減する」とは、以前に投与された医薬での同一患者または別の患者の治療に起因して観察された危険性よりも低い程度まで、本明細書のアンタゴニストでの治療に起因する副作用の危険性を低減することを意味する。そうした副作用には、毒性に関する上記のもの、好ましくは、感染症、がん、心不全または脱髄が含まれる。
【０１００】
「相関する」または「相関すること」とは、第１の解析またはプロトコールの成績および／または結果を第２の解析またはプロトコールの成績および／または結果と任意の方法で比較することを意味する。例えば、第１の解析もしくはプロトコールの結果を、第２のプロトコールを実施する際に使用してもよいし、および／または第１の解析もしくはプロトコールの結果を、第２の解析もしくはプロトコールを行うべきかどうかを決定するのに使用してもよい。本明細書の様々な実施形態に関しては、解析アッセイの結果を、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストを使用する特定の治療レジメンを行うべきかどうかを決定するのに使用してもよい。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、単語「標識」は、核酸プローブまたは抗体などの試薬に直接的または間接的にコンジュゲートまたは融合され、それがコンジュゲートまたは融合された試薬を検出しやすくする、化合物または組成物を指す。標識は、それ自体検出可能でもよく（例えば放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい。この用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合させる（すなわち物理的に連結させる）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、および直接的に標識された別の試薬と反応させることによるプローブまたは抗体の間接標識を包含することが意図される。間接標識の例としては、蛍光標識された二次抗体による一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるような、ビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識が含まれる。
【０１０２】
用語「発現のレベル」または「発現レベル」は互換的に使用され、生体試料中のポリヌクレオチドまたはアミノ酸産物またはタンパク質の量を一般に指す。「発現」は、遺伝子にコードされた情報が、細胞中に存在し、細胞中で作動する構造に変換されるプロセスを一般に指す。したがって本発明によれば、遺伝子の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、またはタンパク質の翻訳後修飾さえ指し得る。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたタンパク質または翻訳後修飾されたタンパク質の断片も、それらが、選択的スプライシングまたは分解転写産物によって生成される転写産物に由来しようと、例えばタンパク質分解によるタンパク質の翻訳後プロセッシングに由来しようと、発現したと見なされるものとする。「発現遺伝子」には、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドへ転写され、次いで、タンパク質に翻訳されるものが含まれ、およびＲＮＡに転写されるが、タンパク質に翻訳されないもの（例えばトランスファーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ）も含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「共変量」は、患者に関するある種の変数または情報を指す。臨床エンドポイントは、回帰モデルにおいてしばしば考慮され、この場合、エンドポイントは従属変数に相当し、バイオマーカーは主変数または標的独立変数（リグレッサー）に相当する。臨床データプールからさらなる変数が考慮される場合は、それらは（臨床的）共変量として示される。
【０１０４】
用語「臨床的共変量」は、一般にベースラインで利用可能な、患者についてのすべての臨床情報を説明するのに本明細書で使用される。こうした臨床的共変量は、性別、年齢などの人口統計学的情報、他の既往情報、合併症、併用療法、身体検査の結果、得られた一般的な実験室パラメーター、血管新生障害の既知の特性、臨床疾患の病期分類、前治療のタイミングおよび結果、病歴、ならびに治療に対する臨床応答と関係があり得るすべての類似した情報を含む。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、用語「生分析」または「未調整分析」は、考慮されるバイオマーカーの他に、さらなる臨床的共変量が、独立因子としても階級化共変量としても回帰モデルで使用されない回帰分析を指す。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、用語「共変量によって調整済み」は、考慮されるバイオマーカーの他に、さらなる臨床的共変量が、独立因子または階級化共変量のいずれかとして回帰モデルで使用される回帰分析を指す。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「一変量」は、独立変数として、標的バイオマーカーのうちの１つのみがモデルの一部である、回帰モデルまたはグラフィックアプローチを指す。こうした一変量モデルは、さらなる臨床的共変量を用いて、およびそれを用いずに考慮することができる。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、用語「多変量」は、独立変数として、１つを超える標的バイオマーカーがモデルの一部である、回帰モデルまたはグラフィックアプローチを指す。こうした多変量のモデルは、さらなる臨床的共変量を用いて、およびそれを用いずに考慮することができる。
【０１０９】
ＩＩＩ．ＶＥＧＦアンタゴニストに応答性の患者を同定するための方法
本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）療法に応答性である可能性が高い患者を同定および／またはモニタリングするための方法を提供する。本方法は、特に、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）の患者への投与が有効である確度を高めるのに有用である。本方法は、患者由来の生体試料中の１種または複数の遺伝子バイオマーカーの発現の検出であって、１種または複数のそうしたバイオマーカーの発現が、患者が抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに感受性であるか、または応答性であるかの指標となる発現の検出を含む。より詳細には、患者由来の試料中の、表１または表２に記載される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３種の遺伝子の発現が、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに患者が応答性であるか、または感受性であるかをモニタリングするのに有用である。幾つかの実施形態では、以下の群：Ａｌｋ１、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、Ｃｏｌ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ２、Ｄｌｌ４、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦＬ７、ＥＳＭ１、ＬＡＭＡ４、ＮＧ２、Ｎｉｄ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＲＧＳ５、Ｓｅｍａ３ｆ、ＴＳＰ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３およびＶＩＭから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに患者が応答性であるか、または感受性であるかをモニタリングするのに有用である。本方法は、場合によっては、患者に投与するためのＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）の選択をさらに含むことができ、場合によっては、患者へのＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）の投与をさらに含むことができる。
【０１１０】
開示される方法およびアッセイは、患者を治療するための適切なまたは有効な療法を評価するのに有用なデータおよび情報を得るための、簡便、効率的かつ潜在的に費用効率が高い手段を提供する。例えば、患者は、ＶＥＧＦアンタゴニストで治療する前に組織試料（例えば腫瘍生検物または血液検体）を提供することができ、様々なインビトロでのアッセイを通して試料を調査して、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに患者の細胞が感受性であるかどうかを決定することができる。
【０１１１】
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに対する患者の感受性または応答性をモニタリングするための方法を提供する。本方法は、遺伝子またはタンパク質の発現を検出するアッセイ（ＰＣＲおよび酵素イムノアッセイなど）および適切な活性を検出する生化学的アッセイを含めた、種々のアッセイ形式で行うことができる。試料中のそうしたバイオマーカーの発現または存在の決定は、試料を提供する患者が、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストの生物学的効果に感受性であることの予測となる。本明細書の出願人らの発明は、患者由来の試料中の、表１または表２に記載される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の遺伝子の発現の変化（すなわち、増大または低下）が、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに対するそうした患者の観察された治療有効性と相関するということである。実施例１は、表２の遺伝子のレベルの増大がそうした治療有効性と相関することを示し、それにより、様々な実施形態で、本明細書に記載の方法におけるそうしたレベルの検出が、本発明に含まれる。他の実施形態では、本発明は、表１または表２の遺伝子の発現解析のためのテストパネル、例えば、これらの遺伝子またはそれらのサブセット（例えば表１または表２に記載される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の遺伝子）に対して特異的なプローブを含むテストパネルを含む。そうしたテストパネルは、例えば、この解析で使用するために、マイクロチップアレイ上にプローブを含むことができる。
【０１１２】
本発明の方法によれば、特定の個体（例えば患者）がＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答すると思われる確度は、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを検出し、その遺伝子の発現レベルを基準発現レベルと比較することによって決定することができる。例えば、基準発現レベルは、ＶＥＧＦアンタゴニストへの応答性について検査を受けた患者の群／集団における上記少なくとも１つの遺伝子の中央発現レベルでもよい。幾つかの実施形態では、基準発現レベルは、先の時点で前もって個体から得た試料中の上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルである。他の実施形態では、個体は、ＶＥＧＦアンタゴニストでの前治療を原発腫瘍状態で受けた患者である。幾つかの実施形態では、個体は、転移に見舞われている患者である。表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の基準発現レベルより大きいまたは小さい発現レベルを有する個体は、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い対象／患者として同定される。中央値と比べて（すなわち、より高いまたはより低い）最大５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％の遺伝子発現レベルを示す対象／患者は、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者として同定される。遺伝子発現レベルは、表１または表２に記載される遺伝子の少なくとも１つ、または表１もしくは表２に記載される遺伝子の任意の線形結合（例えば、平均、加重平均または中央値）を使用して、当技術分野で知られている方法、例えばＳｏｋａｌ  Ｒ．Ｒ．およびＲｈｏｌｆ，Ｆ．Ｊ．（１９９５）「Ｂｉｏｍｅｔｒｙ：ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ．に記載されている方法を使用して、決定することができる。上記のように、本方法は、場合によっては、患者に投与するためのＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）の選択をさらに含むことができ、場合によっては、患者へのＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）の投与をさらに含むことができる。
【０１１３】
上記の方法のいずれかでは、特定のセットの遺伝子の発現が中心平均値に対して集団的に過剰発現または低発現する程度に関する定量的な情報を提供する、ＶＤＶシグネチャースコア（ＶＤＶｉ）を計算することができる。例えば、ＶＤＶｉは、ＶＤＶ遺伝子のすべて（例えば表１または表２を参照されたい）が解析された各試料ｉについて計算することができ、これは、解析されたＶＤＶ遺伝子の全体にわたるｚ−スコアの加重平均を表し、アルゴリズム：
2018082705.tif 000003
によって与えられ、式中、Ｚｇ＝１，ｉ、Ｚｇ＝２，ｉ、．．．Ｚｇ＝ｎ，ｉは、試料ｉの各遺伝子またはバイオマーカーｇ（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対する発現値の標準化されたｚ−スコアであり、第１の定義された閾値より低いＶＤＶｉは、基準レベルに対して低下すること（例えば集団的な低発現）を示し、第２の定義された閾値を超えるＶＤＶｉは、基準レベルに対して増大すること（例えば集団的な過剰発現）を示す。各遺伝子またはバイオマーカーｇ（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対する発現値は、例えば各遺伝子ｇまたはバイオマーカー（ｇ＝１からｇ＝ｎ）に対するｑＲＴ−ＰＣＲの値でもよい。第１の定義された閾値は、−４から−０．５（例えば−４、−３．５、−３、−２．５、−２、−１．５、−１または−０．５）でもよく、第２の定義された閾値は、０．５から４（例えば０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５または４）でもよい。ある場合では、第１の定義された閾値は、−４から−１（例えば−４、−３．５、−３、−２．５、−２、−１．５または−１）でもよく、第２の定義された閾値は、１から４（例えば１、１．５、２、２．５、３、３．５または４）でもよい。他の場合では、第１の定義された閾値は、−４から−１．５（例えば−４、−３．５、−３、−２．５、−２または−１．５）でもよく、第２の定義された閾値は、１．５から４（例えば１．５、２、２．５、３、３．５または４）でもよい。あるいは、第１の定義された閾値は、−４から−２（例えば−４、−３．５、−３、−２．５または−２）でもよく、第２の定義された閾値は、２から４（例えば２、２．５、３、３．５または４）でもよい。
【０１１４】
一態様では、本発明は、血管新生障害の患者が抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答するかどうかをモニタリングする方法であって、任意のＶＥＧＦアンタゴニストが患者へ投与される前に得られた患者由来の試料において、バイオマーカーとして、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子（例えばＡｌｋ１、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、Ｃｏｌ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ２、Ｄｌｌ４、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦＬ７、ＥＳＭ１、ＬＡＭＡ４、ＮＧ２、Ｎｉｄ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＲＧＳ５、Ｓｅｍａ３ｆ、ＴＳＰ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３およびＶＩＭのうちの少なくとも１つ）の発現を評価することを含む方法を提供する。基準レベル（上記を参照されたい）に対する、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現の変化（すなわち増大または低下）は、患者が、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答することを示す。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに対する患者の感受性または応答性をモニタリングする方法を提供する。本方法は、表１または表２に記載される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現を患者の試料から評価すること、および抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに対する患者の感受性または応答性を予測することを含み、ここでは、表１または表２に記載される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の遺伝子の発現の変化（すなわち増大または低下）がＶＥＧＦアンタゴニストを用いる有効な治療に対する患者の感受性または応答性と相関する。本方法によれば、生体試料は、任意のＶＥＧＦアンタゴニストを投与する前に患者から得られ、表１または表２に記載される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の遺伝子の発現産物がこの試料に存在するかどうかを評価するためにアッセイにかけられる。基準レベル（例えば上記を参照されたい）に対して、表１または表２に記載される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の遺伝子の発現が変化（すなわち増大または低下）する場合は、患者は、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に感受性または応答性であると決定される。上記のように、本方法は、場合によっては、患者に投与するためのＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）の選択をさらに含むことができ、場合によっては、患者へのＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）の投与をさらに含むことができる。
【０１１６】
生物システムはいくらか可変性があり、必ずしも完全に予測可能とは限らず、そのため、多くの優れた診断検査または治療薬が時折効果的でないことを、医療分野の、特に診断検査および治療薬を用いる治療の適用に係る当業者なら認識するであろう。したがって、検査結果、患者の状態および病歴ならびに主治医自身の経験に基づいて、個々の患者に対する最も適切な治療方針を決定するのは、最終的に主治医の判断にかかっている。例えば、特に、他の明らかな治療選択のすべてまたは多くが失敗した場合、または別の治療と共に与えるときにいくらかの相乗作用が予測される場合に、診断検査のデータまたは他の判定基準からのデータに基づいて、患者がＶＥＧＦアンタゴニストに特に感受性であると予想されないときでさえ、医師が、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストで患者を治療することを選択する場合さえあり得る。
【０１１７】
さらに明示された実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に対する患者の感受性を予測する、またはＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に患者が効果的に応答するかどうかを予測する方法であって、本明細書で同定された試料中で発現する遺伝子バイオマーカーの１種または複数のレベルを評価すること、およびＶＥＧＦアンタゴニストによる阻害に対する患者の感受性を予測することと含み、これらの遺伝子バイオマーカーの１種または複数の発現レベルが、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療への有効な応答に対する患者の高感受性と相関する方法を提供する。
【０１１８】
本発明は、その発現レベルがＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに対する特定の患者の感受性または応答性を予測するバイオマーカーを同定する方法であって、（ａ）ＶＥＧＦアンタゴニストに対して様々な感受性を示す、細胞パネル中の候補バイオマーカーの発現レベルを測定すること、および（ｂ）細胞中の前記候補バイオマーカーの発現レベル、血清陽性、または存在と、ＶＥＧＦアンタゴニストに対する患者の感受性または応答性との間の相関を特定することを含み、相関が、前記バイオマーカーの発現レベル、血清陽性または存在がＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に対する患者の応答性を予測することを示す方法をさらに提供する。本方法の一実施形態では、細胞パネルは、患者または実験動物モデルに由来する試料から調製される試料のパネルである。追加的な実施形態では、細胞パネルは、マウス異種移植の細胞系統のパネルであり、応答性は、例えば、応答性の分子マーカー、例えばＡｌｋ１、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、Ｃｏｌ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ２、Ｄｌｌ４、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦＬ７、ＥＳＭ１、ＬＡＭＡ４、ＮＧ２、Ｎｉｄ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＲＧＳ５、Ｓｅｍａ３ｆ、ＴＳＰ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３およびＶＩＭの少なくとも１つをモニタリングすることによって決定することができる。
【０１１９】
本発明はまた、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストに対する感受性または応答性をモニタリングするのに有用なバイオマーカーを同定する方法であって、（ａ）任意の用量のＶＥＧＦアンタゴニストが患者へ投与される前に得られた血管新生障害の患者由来の試料において、候補バイオマーカーのレベルを測定することを含み、コントロールに対する、候補バイオマーカーの発現の変化（すなわち増大または低下）が、バイオマーカーが、ＶＥＧＦアンタゴニストを用いる血管新生障害のより有効な治療に対する診断であることを示す方法を提供する。幾つかの実施形態では、バイオマーカーは遺伝子であり、その発現が解析される。
【０１２０】
試料は、血管新生障害を患っていることが疑われるか、もしくは血管新生障害を患っていると診断され、それ故に治療を必要としていると思われる患者から、またはいかなる障害も疑われない正常な個体から、取得することができる。マーカー発現の評価については、患者の試料、例えば細胞またはこれらの細胞によって産生されたタンパク質もしくは核酸を含むものを本発明の方法で使用することができる。本発明の本方法では、バイオマーカーのレベルは、試料、好ましくは、組織試料（例えば腫瘍組織試料、生検物など）中のマーカー量（例えば絶対量または濃度）を評価することによって決定することができる。加えて、バイオマーカーのレベルは、検出可能なレベルのバイオマーカーを含む体液または排泄物において評価することができる。本発明で試料として有用な体液または分泌物には、例えば血液、尿、唾液、便、胸膜液、リンパ液、痰、腹水、前立腺液、脳脊髄液（ＣＳＦ）または任意の他の体分泌物またはそれらの誘導体が含まれる。血液という単語は、全血、血漿、血清または血液の任意の誘導体を含むことを意図する。そうした体液または排泄物におけるバイオマーカーの評価は、侵襲的サンプリング法が不適切なまたは不都合な状況で、好ましいこともあり得る。しかし、体液試料の場合には、本明細書で検査試料は、好ましくは、血液、滑液膜組織または滑液、最も好ましくは血液である。
【０１２１】
試料は、凍結物、新鮮物、固定（例えばホルマリン固定）物、遠心分離物および／または包埋（例えばパラフィン包埋）物などでもよい。当然ながら、細胞試料は、試料中のマーカーの量を評価するのに先立って、種々の周知の採取後の調製法および保存法（例えば核酸および／またはタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離など）にかけることができる。同様に、生検物も、採取後の調製法および保存法、例えば固定にかけることができる。
【０１２２】
上記のように、すべての方法は、場合によっては、患者に投与するためのＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）の選択をさらに含むことができ、場合によっては、患者へのＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）の投与をさらに含むことができる。
【０１２３】
Ａ．遺伝子発現の検出
本明細書に記載の遺伝子バイオマーカーは、当技術分野で既知の任意の方法を使用して検出することができる。例えば、哺乳動物由来の組織または細胞試料は、ノーザン、ドットブロットまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析、アレイハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを使用して、またはＤＮＡマイクロアレイスナップショットを含めた、市販品として入手可能なＤＮＡ  ＳＮＰチップマイクロアレイを使用して、例えば目的の遺伝子バイオマーカー由来のｍＲＮＡまたはＤＮＡについて好都合にはアッセイすることができる。例えば定量的ＰＣＲアッセイなどのリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが当技術分野で周知である。本発明の例示的実施形態では、生体試料中の目的の遺伝子バイオマーカー由来のｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して逆転写によって試料からｃＤＮＡを生成すること、およびそのようにして生成されたｃＤＮＡを増幅すること、および増幅ｃＤＮＡの存在を検出することを含む。加えて、そうした方法は、（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較コントロールｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調査することによって）生体試料中のｍＲＮＡレベルを決定することを可能にする１つまたは複数のステップを含むことができる。場合によっては、増幅ｃＤＮＡの配列を決定することができる。
【０１２４】
１．核酸の検出
特定の一実施形態では、表１または表２に記載される遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ技術によって行うことができる。ＰＣＲに使用されるプローブは、検出可能なマーカー、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素などで標識することができる。そうしたプローブおよびプライマーを使用して、試料において、表１または表２に記載される発現遺伝子の存在を検出することができる。当業者なら理解するように、非常に多くの異なるプライマーおよびプローブを、本明細書に提供する配列に基づいて調製することができ、表１もしくは表２に記載される発現遺伝子の増幅、クローニング、ならびに／または存在および／もしくはレベルを決定するために効果的に使用することができる。
【０１２５】
他の方法には、マイクロアレイ技術によって、組織または細胞試料の、表１または表２に記載される遺伝子の少なくとも１つに由来するｍＲＮＡ（例えばＡｌｋ１、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、Ｃｏｌ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ２、Ｄｌｌ４、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦＬ７、ＥＳＭ１、ＬＡＭＡ４、ＮＧ２、Ｎｉｄ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＲＧＳ５、Ｓｅｍａ３ｆ、ＴＳＰ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３およびＶＩＭのｍＲＮＡ）を調査または検出するプロトコールが含まれる。核酸マイクロアレイを使用して、検査およびコントロールの組織試料由来の検査およびコントロールのｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識して、ｃＤＮＡプローブを生成する。次いで、このプローブを、固体支持体上に固定化された核酸アレイにハイブリダイズする。アレイは、アレイの各メンバーの配列および位置が分かるように構成する。例えば、ある種の疾病状態で発現する可能性がある遺伝子を選択したものを固体支持体上に配列する。特定のアレイメンバーとの標識プローブのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。疾患組織の差次的遺伝子発現解析は、有用な情報を提供し得る。マイクロアレイ技術は、核酸ハイブリダイゼーション法およびコンピュータ技術を利用して、単一の実験で、何千もの遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを評価する（例えばＷＯ２００１／７５１６６を参照されたい）。アレイ製作の議論については、例えば米国特許第５，７００，６３７号、米国特許第５，４４５，９３４号および米国特許第５，８０７，５２２号、Ｌｏｃｋａｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１６７５〜１６８０（１９９６）；およびＣｈｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１（補遺）：１５〜１９（１９９９）を参照されたい。
【０１２６】
加えて、ＥＰ１７５３８７８に記載されているマイクロアレイを利用するＤＮＡプロファイリングおよび検出方法を用いることができる。本方法は、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）解析およびＤＮＡマイクロアレイを利用して、種々のＤＮＡ配列を迅速に同定かつ区別する。一実施形態では、標識ＳＴＲの標的配列を、相補的プローブを保持するＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせる。こうしたプローブは、見込まれるＳＴＲの範囲をカバーするために、長さが様々である。ＤＮＡハイブリッドの標識された一本鎖領域は、ハイブリダイゼーション後の酵素消化を利用して、マイクロアレイ表面から選択的に除去する。未知の標的における反復数は、マイクロアレイにハイブリダイズしたままの標的ＤＮＡのパターンに基づいて推定される。
【０１２７】
マイクロアレイプロセッサーの一例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）システムであり、これは市販品として入手可能であり、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することによって制作されたアレイを含む。当業者に知られているような他のシステムを使用してもよい。
【０１２８】
ＲＴ−ＰＣＲまたは別のＰＣＲベース方法以外のバイオマーカーのレベルを決定する他の方法には、プロテオミクス法、および分子レベルでの患者の応答に基づいて血管新生障害を治療するのに必要な、個別化された遺伝子プロファイルが含まれる。本明細書の特殊化したマイクロアレイ、例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイは、１種または複数の抗ＶＥＧＦ抗体に対する感受性または抵抗性のいずれかと相関する発現プロファイルを有する１種または複数のバイオマーカーを含むことができる。本発明で使用するために、核酸を検出するのに使用することができる他の方法は、例えばＲＮＡＳｅｑなどのＲＮＡベースの遺伝子解析を含めた、ハイスループットＲＮＡ配列発現解析を含む。
【０１２９】
上記の技法を適用する際の案内を提供するのに、多くの参考文献が利用可能である（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｉｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８４）；Ｈｕｒｒｅｌｌ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９８２）；およびＺｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７））。ノーザンブロット解析は、当該技術分野で周知の従来型の技法であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｃｈ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１０  Ｓｋｙｌｉｎｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ  １１８０３−２５００に記載されている。遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコールは、例えばＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ユニット２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、１５（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）および１８（ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）に見られる。
【０１３０】
２．タンパク質の検出
例えば、Ａｌｋ１、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、Ｃｏｌ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ２、Ｄｌｌ４、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦＬ７、ＥＳＭ１、ＬＡＭＡ４、ＮＧ２、Ｎｉｄ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＲＧＳ５、Ｓｅｍａ３ｆ、ＴＳＰ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３およびＶＩＭの少なくとも１つなどのタンパク質バイオマーカーの検出に関しては、様々なタンパク質アッセイが利用可能であり、これらには、例えば抗体ベースの方法ならびに質量分光法および当技術分野で既知の他の類似した手段が含まれる。抗体ベースの方法の場合は、例えば、試料を、抗体−バイオマーカー複合体が形成するのに十分な条件下で前記バイオマーカーに対して特異的な抗体と接触させ、次いで、前記複合体を検出することができる。タンパク質バイオマーカーの存在の検出は、血漿または血清を含めた多種多様の組織および試料をアッセイするための幾つかの方法で、例えばウェスタンブロット法（免疫沈降法と共にまたは無しで）、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、免疫沈降法、蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリ法およびＥＬＩＳＡ法によって達成することができる。そうしたアッセイ形式を使用する幅広いイムノアッセイ法が利用可能であり、例えば米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号および第４，０１８，６５３号を参照されたい。これらには、非競合型の単一部位および二部位または「サンドイッチ」アッセイ、ならびに伝統的な競合的結合アッセイの両方が含まれる。これらのアッセイは、標的バイオマーカーへの標識抗体の直接結合も含む。
【０１３１】
サンドイッチアッセイは、中でも最も有用で、一般に使用されているアッセイである。サンドイッチアッセイ法の幾つかの変形が存在し、すべてが本発明に包含されることが意図される。簡単に述べると、典型的なフォワードアッセイでは、未標識抗体を固体基板に固定し、検査試料をその結合分子に接触させる。適切なインキュベーション時間、すなわち抗体−抗原複合体を形成させるのに十分な時間の後、次いで、検出可能なシグナルを生成可能なレポーター分子で標識された、抗原に特異的な二次抗体を添加し、別の抗体−抗原−標識抗体複合体を形成させるのに十分な時間インキュベートする。いかなる未反応物質も洗い流し、レポーター分子によって生成されたシグナルを観察することによって、抗原の存在を決定する。結果は、可視シグナルの単純な観察による定性的なものでもよいし、既知の量のバイオマーカーを含むコントロール試料と比較して定量化してもよい。
【０１３２】
フォワードアッセイの変形には、試料と標識抗体の両方を結合抗体に同時に添加する同時アッセイが含まれる。容易に明らかになるような任意の軽微な変異を含めたこうした技法は、当業者に周知である。典型的なフォワードサンドイッチアッセイでは、バイオマーカーに特異性を有する一次抗体は、共有結合的または受動的のいずれかで固体表面に結合させる。固体表面は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスクの形態、またはイムノアッセイを行うのに適した任意の他の表面の形態でもよい。結合方法は、当技術分野で周知であり、一般に架橋共有結合または物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は、検査試料の調製中に洗浄される。次いで、検査試料の一定分量を固相複合体に添加し、十分な時間（例えば、２〜４０分、またはより好都合には一晩）、適切な条件下（例えば、２５℃から３２℃など（両数値を含む）、室温から４０℃）でインキュベートし、抗体に存在する任意のサブユニットを結合させる。インキュベーション時間に続いて、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥させ、バイオマーカーの一部に特異的な二次抗体と共にインキュベートする。二次抗体は、分子マーカーへの二次抗体の結合を示すのに使用されるレポーター分子に結合している。
【０１３３】
代替方法は、試料中の標的バイオマーカーを固定化し、次いでレポーター分子で標識されていても、標識されていなくてもよい特異的な抗体に、固定化された標的を曝露することを含む。標的の量およびレポーター分子のシグナル強度に応じて、結合した標的を、抗体を用いた直接標識によって検出することができる。あるいは、一次抗体に特異的な二次標識抗体を、標的−一次抗体複合体に曝露して、標的−一次抗体−二次抗体三重複合体を形成する。この複合体を、レポーター分子によって放射されるシグナルで検出する。本明細書で使用する場合、「レポーター分子」は、その化学的性質によって、抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルをもたらす分子を意味する。このタイプのアッセイで最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォアまたは放射性核種含有分子（すなわち放射性同位元素）および化学発光分子のいずれかである。
【０１３４】
酵素イムノアッセイの場合は、一般にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸によって、酵素を二次抗体にコンジュゲートする。しかし、容易に認識されるように、多種多様の異なるコンジュゲーション法が存在し、それらは、当業者が容易に利用可能である。一般に使用される酵素には、中でも、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコース酸化酵素、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。特異的酵素と共に使用される基質は、対応する酵素による加水分解時に検出可能な色調変化をもたらすために、一般に選択される。適切な酵素の例としては、がアルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。上記の発色基質の代わりに、蛍光産物を発生させる、蛍光発生基質を用いることも可能である。すべての場合で、酵素−標識抗体を一次抗体−分子マーカー複合体に添加し、結合させ、次いで過剰な試薬を洗い流す。次いで、適切な基質を含む溶液を抗体−抗原−抗体複合体に添加する。基質は、二次抗体に連結された酵素と反応し、定性的な可視シグナルを生じさせ、このシグナルは、通常分光光度的にさらに定量化して、試料中に存在したバイオマーカーの量の指標を与えることができる。代わりに、蛍光化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンを、それらの結合能力を変化させないで、化学的に抗体に結合させてもよい。特定の波長の光を用いた照明によって活性化されたときに、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子中に励起状態を誘発し、続いて、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を放射する。ＥＩＡと同様に、蛍光標識された抗体は、一次抗体−分子マーカー複合体へ結合することができる。未結合の試薬を洗い流した後、次いで、残存三重複合体を適切な波長の光にあてて、観察される蛍光によって、目的の分子マーカーの存在が示される。免疫蛍光法およびＥＩＡ法は、両方とも当技術分野で非常によく確立されている。しかし、他のレポーター分子、例えば放射性同位元素分子、化学発光分子または生物発光分子を用いることもできる。
【０１３５】
Ｂ．キット
バイオマーカーの検出で使用するために、キットまたは製造品も本発明によって提供される。そうしたキットは、血管新生障害の対象がＶＥＧＦアンタゴニストに対して実際上応答性であるかどうかを決定するのに使用することができる。こうしたキットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器手段を厳重に閉じ込めて収容するように区分された運搬手段を含むことができ、各容器手段は、本方法で使用される別々の要素のうちの１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは、検出可能な程度に標識された、または検出可能な程度に標識可能なプローブを含むことができる。そうしたプローブは、抗体またはタンパク質もしくはメッセージに対してそれぞれ特異的なポリヌクレオチドでもよい。キットが、標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合は、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（複数可）を含む容器、および／またはレポーター分子、例えば酵素標識、蛍光標識もしくは放射性同位元素標識に結合したビオチン結合タンパク質などのレポーター手段、例えばアビジンもしくはストレプトアビジンを含む容器を有することができる。
【０１３６】
そうしたキットは、上記の容器、ならびにバッファー、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用のための指示を伴う添付文書を含めた、商業的および使用者の観点から望ましい材料を含有する、１つまたは複数の他の容器を典型的には含む。ラベルは、組成物が特定の用途に使用されることを示すように容器上に存在してもよく、インビボまたはインビトロのいずれかでの使用のための指示、例えば上記のものを示してもよい。
【０１３７】
本発明のキットは、幾つかの実施形態を有する。典型的な実施形態は、容器、前記容器上のラベルおよび前記容器に含まれた組成物を含むキットであり、組成物は、タンパク質または自己抗体バイオマーカーに結合する一次抗体を含み、前記容器上のラベルは、組成物が、試料中のそうしたタンパク質または抗体の存在を評価するのに使用することができることを示し、キットは、特定の試料タイプ中のバイオマーカータンパク質の存在を評価するために抗体を使用することについての指示書を含む。キットは、試料を調製し、試料に抗体をアプライするための一連の指示書および材料をさらに含むことができる。キットは、一次抗体および二次抗体の両方を含むことができ、二次抗体は、標識、例えば酵素標識にコンジュゲートされている。
【０１３８】
別の実施形態は、容器、前記容器上のラベルおよび前記容器に収容された組成物を含むキットであり、組成物は、表１または表２に記載されるバイオマーカーの相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズする１種または複数のポリヌクレオチドを含み、前記容器上のラベルは、組成物が、試料中の、表１または表２に記載されるバイオマーカーの存在を評価するのに使用できることを示し、キットは、特定の試料タイプ中のバイオマーカーＲＮＡまたはＤＮＡの存在を評価するためにポリヌクレオチド（複数可）を使用することについての指示書を含む。
【０１３９】
キットの他の任意成分には、１種または複数のバッファー（例えばブロッキングバッファー、洗浄バッファー、基質バッファーなど）、他の試薬、例えば酵素標識によって化学的変化を受ける基質（例えば色素原）、エピトープ回収溶液、コントロール試料（陽性および／または陰性コントロール）、コントロールスライド（複数可）などが含まれる。キットは、キットを使用して得られた結果を解釈することについての指示書を含むこともできる。
【０１４０】
抗体ベースのキットに関するさらなる特定の実施形態では、キットは、例えば、（１）バイオマーカータンパク質に結合する（例えば固体支持体に付着させられた）一次抗体、および場合によっては、（２）タンパク質または一次抗体のいずれかに結合し、かつ検出可能な標識にコンジュゲートされた第２の異なる抗体を含むことができる。
【０１４１】
オリゴヌクレオチドベースのキットに関しては、キットは、例えば、（１）オリゴヌクレオチド、例えば、バイオマーカータンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズする、検出可能な程度に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）バイオマーカー核酸分子を増幅するのに有用な１組のプライマーを含むことができる。キットは、例えば緩衝剤、防腐剤またはタンパク質安定化剤を含むこともできる。キットは、検出可能な標識を検出するのに必要な成分（例えば酵素または基質）をさらに含むことができる。キットは、アッセイされ、かつ検査試料と比較され得る、コントロール試料または一連のコントロール試料を含むこともできる。キットの各成分は、個々の容器内に封入することができ、様々な容器のすべてを、キットを使用して行われるアッセイの結果を解釈することについての指示書と共に、単一パッケージ内に入れることができる。
【０１４２】
Ｃ．統計
本明細書で使用する場合、予測ルールの一般的な形態は、応答または非応答を予測するための、またはより一般的には、適切に定義された臨床エンドポイントの点から利益または利益の欠如を予測するための臨床的共変量を潜在的に含む、１つまたは複数のバイオマーカーの関数の仕様にある。
【０１４３】
予測ルールの最も単純な形態は、共変量を有さない一変量モデルからなり、予測は、カットオフまたは閾値によって決定される。これは、特定のカットオフｃおよびバイオマーカー測定値ｘについてのヘビサイド関数の点から表すことができ、二値予測ＡまたはＢが作られることになり、次いで、Ｈ（ｘ−ｃ）＝０ならばＡを予測し、Ｈ（ｘ−ｃ）＝１ならばＢを予測する。
【０１４４】
これは、予測ルールで一変量バイオマーカー測定値を使用する最も単純な方法である。そうした単純なルールが十分である場合は、そのルールによって、効果の方向性、すなわち、高いまたは低い発現レベルが患者にとって有利であるかどうかを単純に特定することが可能になる。
【０１４５】
臨床的共変量を考慮する必要がある場合、および／または複数のバイオマーカーが多変量の予測ルールで使用される場合は、状況はより複雑になり得る。以下の２つの仮説例は、関係する問題点を例示する。
【０１４６】
共変量調整（仮説例）：
バイオマーカーＸに関して、高発現レベルが悪い臨床応答と関係があることが、臨床試験集団で見られる（一変量解析）。より厳密な解析によって、２つのタイプの臨床応答がこの集団中に存在し、その第１の群が第２の群より応答が悪く、同時に、第１の群についてのバイオマーカーの発現が、少なくとも１用量のＶＥＧＦアンタゴニストの投与後に一般に高いことが示される。調整された共変量解析によって、各群について、臨床的利益と臨床応答との関係が逆転すること、すなわち、群内でより低い発現レベルが、よりよい臨床応答と関係があることが明らかになる。全体的な反対の効果は、共変量タイプによってマスクされ、予測ルールの一部としての共変量を調整した解析は方向性を逆転させた。
【０１４７】
多変量予測（仮説例）：
バイオマーカーＸに関して、高発現レベルが悪い臨床応答とわずかに関係があることが、臨床試験集団において見出される（一変量解析）。第２のバイオマーカーＹに関して、類似した観察が一変量解析によって行われた。ＸとＹの組み合わせによって、両方のバイオマーカーが低い場合に優れた臨床応答が見られることが明らかになった。これにより、両方のバイオマーカーがあるカットオフよりも低い場合に利益を予測するためのルールが作られる（ヘビサイド予測関数のＡＮＤ−−接続）。この組み合わせルールに関しては、一変量の意味における単純なルールはもはやあてはまらず、例えば、Ｘの発現レベルが低くても、よりよい臨床応答を自動的に予測しない。
【０１４８】
これらの単純な例は、共変量を有するおよび有さない予測ルールが、各バイオマーカーの一変量レベルで判断できないことを示す。複数のバイオマーカーの組み合わせと共変量による潜在的な調整は、単一のバイオマーカーに対して単純な関係を割り当てさせない。マーカー遺伝子、特に血清のマーカー遺伝子は、他の臨床的共変量を含む可能性がある複数のマーカーの予測モデルで使用され得るので、そうしたモデル内の単一のマーカー遺伝子の有益効果の方向性は単純な方法で決定することができず、一変量解析で見出された方向性、すなわち単一のマーカー遺伝子について説明される状況と矛盾する可能性がある。
【０１４９】
臨床医は、当技術分野で既知の幾つかの方法のうちのいずれかを使用して、ＶＥＧＦアンタゴニストの特定の投薬計画の有効性を測定することができる。例えば、療法に対する相対的な有効な応答性を決定するために、インビボでの撮像（例えばＭＲＩ）を使用して、腫瘍サイズを決定し、任意の転移を特定することができる。最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するために、投薬レジメンを調整することができる。例えば、１用量を投与してもよいし、幾つかの分割用量を経時的に投与してもよいし、治療状況の緊急性により示される通りに、用量を比例的に低減または増大させてもよい。
【０１５０】
当分野で通常の技術を有する医師は、特定のアンタゴニストタイプなどの要因に応じて、必要とされる有効量の医薬組成物を容易に決定および処方することができる。例えば、医師は、所望の治療的効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで医薬組成物に用いられるそうしたアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投薬量を増大させることができる。アンタゴニストの所与の用量のまたは治療レジメンの有効性は、例えば、有効性の標準的な尺度を使用して患者の徴候および症状を評価することによって、決定することができる。
【０１５１】
さらに別の実施形態では、対象は、抗ＶＥＧＦ抗体などの同一のアンタゴニストで少なくとも２回治療される。したがって、初回および２回目のアンタゴニストの曝露は、好ましくは同一のアンタゴニストを用い、より好ましくはすべてのアンタゴニストの曝露は同一のアンタゴニストを用いる。すなわち、最初の２つの曝露に関する、好ましくはすべて曝露に関する治療は、１つのタイプのＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体などの、ＶＥＧＦに結合するアンタゴニストを用い、例えばすべてベバシズマブを用いる。
【０１５２】
本明細書に記載されるすべての本発明の方法では、アンタゴニスト（ＶＥＧＦに結合する抗体など）は、ネイキッド抗体のようにコンジュゲートされていなくてもよいし、さらなる有効性のために、例えば半減期を改善するために、別の分子でコンジュゲートされていてもよい。
【０１５３】
本明細書の好ましいアンタゴニスト抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体、より好ましくは抗ＶＥＧＦ抗体、最も好ましくはベバシズマブである。
【０１５４】
別の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）は、対象に投与される唯一の医薬である。
【０１５５】
一実施形態では、アンタゴニストは、約１００もしくは４００ｍｇの用量で、１、２、３もしくは４週毎に投与される、または約１、３、５、１０、１５もしくは２０ｍｇ／ｋｇの用量で、１、２、３もしくは４週毎に投与される、抗ＶＥＧＦ抗体である。この用量は、注入のように、単回用量としてまたは複数回用量として（例えば２または３用量）投与することができる。
【０１５６】
さらに別の態様では、本発明は、診断ステップの後に、血管新生障害の対象にＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）の投与を続けるかどうかを判定する方法であって、１回目のアンタゴニストを投与した後に、撮像法、例えばＸ線撮影および／またはＭＲＩを使用して、腫瘍サイズの低減を測定し、２回目のアンタゴニストを投与した後に、撮像法、例えばＸ線撮影および／またはＭＲＩを使用して、対象の腫瘍サイズの低減を測定することを含み、１回目および２回目の対象の画像所見を比較し、スコアが１回目よりも２回目で小さい場合は、アンタゴニストの投与を続ける方法を提供する。
【０１５７】
さらに別の実施形態では、応答レベルが血管新生障害を治療するのに有効であることを決定するために、投与ステップの後に、治療に対する対象の応答を検査するステップが治療方法に含まれる。例えば、投与後に画像（Ｘ線検査および／またはＭＲＩ）スコアを検査し、それを投与前に得たベースライン画像結果と比較して、スコアが変化したか、およびどの程度変化したかを測定することによって、治療が有効であるかどうかを決定するステップが含まれる。この検査は、投与後に、予定されたまたは予定されていない様々な時間間隔で反復して、任意の部分的または完全な寛解が維持されていることを決定することができる。あるいは、本明細書の方法は、上記のように、血管新生障害に関する１種または複数のバイオマーカーまたは症状が存在するかどうかを確かめるために、投与前に対象を検査するステップを含む。
【０１５８】
本発明の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニスト以外の他の医薬は、血管新生障害を治療するために対象に投与されない。
【０１５９】
本明細書の方法のいずれかでは、ＶＥＧＦアンタゴニストは、有効量の第２の医薬と組み合わせて投与することができる（この場合、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）が第１の医薬である）。適切な第２の医薬には、例えば抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１６０】
すべてのこれらの第２の医薬は、互いに組み合わせて、または単独で、第１の医薬と共に使用することができ、したがって、本明細書で使用する表現「第２の医薬」は、第１の医薬に加えてそれが唯一の医薬であることを意味しない。したがって、第２の医薬は、単一の医薬である必要はなく、１つより多いそうした薬物を構成しても含んでもよい。
【０１６１】
本明細書に記載されるこれらの第２の医薬は、一般に、上記で使用したのと同一の投薬量および投与経路で使用されるか、またはこれまでに用いられた投薬量の約１〜９９％で使用される。そうした第２の医薬が仮にも使用される場合は、それによって引き起こされる副作用を失くすまたは低減するために、好ましくは、それらは、特に第１の医薬を用いた初回の投薬の後の引き続く投薬において、第１の医薬が存在しない場合よりも低い量で使用される。
【０１６２】
本明細書に記載の再治療に関しては、第２の医薬が、アンタゴニストの曝露と共に有効量で投与される場合は、第２の医薬は、任意の曝露と共に、例えば１回の曝露のみまたは１回より多い曝露と共に投与することができる。一実施形態では、第２の医薬は、初回曝露と共に投与される。別の実施形態では、第２の医薬は、初回および２回目の曝露と共に投与される。さらに別の実施形態では、第２の医薬は、すべての曝露と共に投与される。プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンおよびシクロホスファミドなどの副作用がある薬剤への対象の暴露を低減するために、ステロイドなどの初回曝露の後に、そうした第２の医薬の量を低減するまたは無くすのが好ましい。
【０１６３】
第２の医薬の組み合わせ投与には、別々の製剤または単一の医薬製剤を使用する同時投与（併用投与）およびいずれかの順番での連続投与が含まれ、好ましくは、両方（またはすべて）の活性薬剤（医薬）が、それらの生物活性を同時に発現する期間が存在する。
【０１６４】
本明細書のアンタゴニストは、非経口、局所、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内および／または病巣内投与を含めた、任意の適切な手段で投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。髄腔内投与も企図される。加えて、アンタゴニストは、例えばアンタゴニストの用量を漸減させて、パルス注入によって適切に投与することができる。好ましくは、投薬は静脈内または皮下で投じられ、より好ましくは静脈内注入（複数可）によって投じられる。
【０１６５】
複数のアンタゴニスト曝露が提供される場合は、各曝露は、同一または異なる投与手段を使用して提供されてもよい。一実施形態では、各曝露は静脈内投与による。別の実施形態では、各曝露は、皮下投与によって与えられる。さらに別の実施形態では、曝露は、静脈内投与と皮下投与の両方によって与えられる。
【０１６６】
一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体などのアンタゴニストは、静脈内プッシュまたは静脈内ボーラスよりはむしろ緩徐静脈内注入として投与される。例えば、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロンなどのステロイド（例えば約８０〜１２０ｍｇ  ｉ．ｖ．、より具体的には約１００ｍｇ  ｉ．ｖ．）は、抗ＶＥＧＦ抗体の任意の注入の約３０分前に投与される。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体は、専用ラインを介して注入される。
【０１６７】
抗ＶＥＧＦ抗体への多用量暴露の初回用量、または曝露が１用量のみを要する場合の単回用量に関しては、そうした注入は、好ましくは約５０ｍｇ／時間の速度で開始される。これは、例えば、約３０分毎に約５０ｍｇ／時間の速度で最大約４００ｍｇ／時間まで増大させるなど、段階的に増大させてもよい。しかし、対象が注入関連反応に見舞われている場合は、注入速度は、好ましくは、例えば現在の速度の半分に、例えば１００ｍｇ／時間から５０ｍｇ／時間に減速する。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体のそうした用量（例えば約１０００ｍｇの総用量）の注入は、約２５５分（４時間１５分）で完了する。場合によっては、対象は、アセトアミノフェン／パラセタモール（例えば約１ｇ）およびジフェンヒドラミンＨＣｌ（例えば約５０ｍｇまたは等価用量の類似薬剤）の予防的治療を、注入の約３０から６０分前に経口で受ける。
【０１６８】
全曝露を達成するのに１回より多い抗ＶＥＧＦ抗体の注入（用量）が与えられる場合、本注入実施形態における第２のまたは引き続く抗ＶＥＧＦ抗体注入は、初回注入より高い速度で、例えば約１００ｍｇ／時間で、好ましくは開始される。この速度は、例えば、最大約４００ｍｇ／時間まで、約３０分毎に約１００ｍｇ／時間の速度で増大させるなど、段階的に増大させてもよい。注入関連反応に見舞われる対象は、好ましくは、注入速度をその速度の半分に、例えば１００ｍｇ／時間から５０ｍｇ／時間に減速させる。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体のそうした第２のまたは引き続く用量（例えば約１０００ｍｇの全用量）の注入は、約１９５分（３時間１５分）までに完了する。
【０１６９】
好ましい実施形態では、アンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体であり、約０．４から４グラムの用量で投与され、より好ましくは、抗体は、約０．４から１．３グラムの用量で、１から４用量の頻度で、約１カ月の期間内に投与される。さらにより好ましくは、用量は、約５００ｍｇから１．２グラムであり、他の実施形態では、約７５０ｍｇから１．１グラムである。そうした態様では、アンタゴニストは、好ましくは２から３用量で投与され、かつ／または約２から３週の期間内に投与される。
【０１７０】
一実施形態では、対象は、血管新生障害を治療するためのいかなる薬物（複数可）も以前に投与されたことがない。別の実施形態では、対象または患者は、血管新生障害を治療するための１種または複数の医薬（複数可）を以前に投与されている。さらなる実施形態では、対象または患者は、以前に投与された医薬の１種または複数に応答性でなかった。対象が非応答性であり得るそうした薬物には、例えば抗腫瘍剤、化学療法剤、細胞傷害性薬物、および／または増殖阻害剤が含まれる。より詳細には、対象が非応答性であり得る薬物には、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストが含まれる。さらなる態様では、そうしたアンタゴニストには、抗体またはイムノアドヘシンが含まれ、したがって、対象が以前に非応答性であった本発明の１種または複数の抗体またはイムノアドヘシンを用いる再治療が企図される。
【０１７１】
ＩＶ．アンタゴニストでの治療
アンタゴニストでの治療に最も応答性または感受性の患者集団が一旦同定されれば、単独または他の医薬と組み合わせた、本明細書でのこのアンタゴニストでの治療は、血管新生障害の改善をもたらす。例えばそうした治療は、腫瘍サイズの低減または無増悪生存をもたらすことができる。さらに、本明細書のアンタゴニストと少なくとも１つの第２の医薬（複数可）の組み合わせでの治療は、好ましくは、相加的な、より好ましくは相乗的な（または相加的より大きい）、治療的利益を患者へもたらす。好ましくは、本組み合わせ方法では、第２の医薬の少なくとも１回の投与と本明細書のアンタゴニストの少なくとも１回の投与の間のタイミングは、約１カ月以下、より好ましくは約２週間またはそれ以下である。本明細書に記載されるようなＶＥＧＦアンタゴニストの投与は、場合によっては本発明に含まれる。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストの投与（例えばベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）によって、患者のがん（例えば結腸直腸がん、乳がん、肺がんまたは神経膠芽細胞腫）を治療する方法であって、患者が本明細書に記載の方法によって、そうした治療の利益を享受するものとして同定されるまたは同定されている方法を提供する。
【０１７２】
患者がアンタゴニストに応答性の可能性が高いという診断後に、前記患者へ治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを投与する正確な方式は、主治医の裁量によることを医療分野の当業者なら理解されよう。投薬量、他の薬剤との組み合わせ、タイミングおよび投与頻度などを含めた投与様式は、患者がそうしたアンタゴニストに応答性の可能性が高いという診断、ならびに患者の状態および病歴に影響を受ける可能性がある。したがって、アンタゴニストに比較的非感受性であると予想される、血管新生障害と診断された患者でさえ、特にアンタゴニストに対する患者の応答性を変化させ得る薬剤を含めた他の薬剤と組み合わせたそのアンタゴニストでの治療の利益をなお享受し得る。
【０１７３】
アンタゴニストを含有する組成物は、優れた医療行為に矛盾しない様式で、製剤化され、用量決定され、投与される。これに関連して考慮する要因には、治療される血管新生障害の特定のタイプ、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、血管新生障害の原因、薬剤送達部位、起こり得る副作用、アンタゴニストのタイプ、投与方法、投与スケジュールおよび医師に知られている他の要因が含まれる。投与されるアンタゴニストの有効量は、そうした考慮事項に左右される。
【０１７４】
一般的な案として、用量毎に非経口的に投与されるアンタゴニストの有効量は、１または複数の投薬量で、約２０ｍｇから約５０００ｍｇの範囲である。抗ＶＥＧＦ抗体などの抗体に関する例示的投薬レジメンは、１、２、３または４週毎に１００または４００ｍを含むか、または１、２、３または４週毎に約１、３、５、１０、１５または２０ｍｇ／ｋｇの用量を投与する。この用量は、注入のように、単回用量としてまたは複数回用量（例えば２または３用量）として投与することができる。
【０１７５】
しかし、上記のように、アンタゴニストのこれらの提案量は、非常に多くの治療的裁量にかけられる。適切な用量およびスケジュールを選択する際の重要な要因は、前述のように、得られる結果である。幾つかの実施形態では、アンタゴニストは、血管新生障害の最初の徴候、診断、出現または発生にできるだけ近接して投与される。
【０１７６】
アンタゴニストは、非経口、局所、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内および／または病巣内投与を含めた、任意の適切な手段によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。髄腔内投与も企図される。加えて、アンタゴニストは、例えばアンタゴニストの用量を漸減させて、パルス注入によって適切に投与することができる。最も好ましくは、投薬は静脈内注射によって行われる。
【０１７７】
上記のように、本明細書のアンタゴニストと共に第２の医薬を投与することができる。組み合わせ投与には、別々の製剤または単一の医薬製剤を使用する同時投与、およびいずれかの順番での連続投与が含まれ、好ましくは、両方（またはすべて）の活性薬剤が、それらの生物活性を同時に発現する期間が存在する。
【０１７８】
上記のような伝統的な経路によるアンタゴニストの患者への投与とは別に、本発明は、遺伝子療法による投与を含む。アンタゴニストをコードする核酸のそうした投与は、表現「有効量のアンタゴニストを投与する」に包含される。例えば、細胞内抗体を生成する遺伝子療法の使用に関するＷＯ１９９６／０７３２１を参照されたい。
【０１７９】
（場合によってはベクターに含まれた）核酸を患者細胞へ到達させるための２つの主要なアプローチが存在する；インビボおよびエクスビボである。インビボ送達については、核酸を、通常アンタゴニストが必要とされる部位に直接的に患者へ注入する。エクスビボ治療については、患者の細胞を取り出し、この単離細胞に核酸を導入し、この改変した細胞を、直接的に、または例えば、患者へ植え込む多孔性膜内にカプセル化して、患者へ投与する（例えば米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照されたい）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技法が存在する。技法は、核酸をインビトロで培養細胞に移行させるか、または所期の宿主の細胞にインビボで移行させるかどうかによって変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技法には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が含まれる。遺伝子のエクスビボ送達に一般に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
【０１８０】
現在好ましいインビボでの核酸移入法には、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型またはアデノ随伴ウイルスなど）を用いるトランスフェクション、および脂質ベースのシステム（脂質媒介性遺伝子移入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）が含まれる。場合によっては、標的細胞に対して特異的な薬剤、例えば標的細胞の細胞表面膜タンパク質に対して特異的な抗体、標的細胞の受容体に対するリガンドなどを核酸供給源に与えることが望ましい。リポソームが用いられる場合は、エンドサイトーシスと関係がある細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、ターゲティングおよび／または取り込みやすくするために使用することができ、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質またはその断片、循環中に内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在をターゲティングし、細胞内半減期を高めるタンパク質である。受容体媒介性エンドサイトーシスの技法は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：３４１０〜３４１４（１９９０）によって記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子療法のプロトコールは、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８〜８１３（１９９２）およびＷＯ１９９３／２５６７３に記載されている。
【０１８１】
ＶＥＧＦアンタゴニストは、医薬的組み合わせ製剤中に、または組み合わせ療法としての投薬レジメン中に、抗がん特性を有する少なくとも１つのさらなる化合物と組み合わせることができる。医薬的組み合わせ製剤または投薬レジメンの上記少なくとも１つのさらなる化合物は、それらが互いに悪影響を及ぼさないように、好ましくは、ＶＥＧＦアンタゴニスト組成物に対して相補的な活性を有する。
【０１８２】
上記少なくとも１つのさらなる化合物は、化学療法剤、細胞傷害性薬物、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤およびそれらの組み合わせでよい。そうした分子は、所期の目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）を含有する医薬組成物は、治療有効量の抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬物またはそれらの組み合わせを含むこともできる。
【０１８３】
一態様では、第１の化合物は抗ＶＥＧＦ抗体であり、上記少なくとも１つのさらなる化合物は抗ＶＥＧＦ抗体以外の治療抗体である。一実施形態では、上記少なくとも１つのさらなる化合物は、がん細胞表面のマーカーに結合する抗体である。一実施形態では、上記少なくとも１つのさらなる化合物は、抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ（例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）である。一実施形態では、上記少なくとも１つのさらなる化合物は、抗ＨＥＲ２抗体、ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳ６９４９２４５を参照されたい）である。一実施形態では、上記少なくとも１つのさらなる化合物は、抗体（ネイキッド抗体またはＡＤＣのいずれか）であり、さらなる抗体は、第２、第３、第４、第５、第６またはそれ以上の抗体であり、その結果、そうした第２、第３、第４、第５、第６またはそれ以上抗体（ネイキッドまたはＡＤＣとしてのいずれか）の組み合わせが血管新生障害の治療に有効である。
【０１８４】
本発明における他の治療レジメンは、ＶＥＧＦ−アンタゴニスト抗がん剤投与を含むことができ、限定はされないが、放射線療法ならびに／もしくは骨髄および末梢血移植、ならびに／または細胞傷害性薬物、化学療法剤、もしくは増殖阻害剤を含む。そうした実施形態のうちの１つでは、化学療法剤は、例えばシクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｎｃｉｎ）、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（商標））、プレドニゾロン、ＣＨＯＰ、ＣＶＰもしくはＣＯＰ、または免疫療法剤、例えば抗ＰＳＣＡ、抗ＨＥＲ２（例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標））などの薬剤、または薬剤の組み合わせである。組み合わせ療法は、同時または連続的なレジメンとして投与することができる。連続して投与されるときは、組み合わせは、２回以上の投与で投与することができる。組み合わせ投与には、別々の製剤または単一の医薬製剤を使用する同時投与、およびいずれかの順番での連続投与が含まれ、好ましくは、両方（またはすべて）の活性薬剤が、それらの生物活性を同時に発現する時間が存在する。
【０１８５】
一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体での治療は、異なる化学療法剤のカクテルの同時投与を含めた、本明細書で特定された抗がん剤と１種または複数の化学療法剤または増殖阻害剤との組み合わせ投与を含む。化学療法剤には、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルなど）および／またはアントラサイクリン抗生物質が含まれる。そうした化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って、または熟練の医師が経験的に決定するように、使用することができる。そうした化学療法の調製および投薬スケジュールは、「Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ」、（１９９２）Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄにも記載されている。
【０１８６】
上記の同時投与される薬剤のいずれかの適切な投薬量は、現在使用されているものであり、新たに同定された薬剤と他の化学療法剤または治療との組み合わせ作用（相乗作用）のために、低下させてもよい。
【０１８７】
組み合わせ療法は、「相乗作用」をもたらすことができ、「相乗的」をはっきりと示すことができる。すなわち、活性成分が一緒に使用される場合に達成される効果が、化合物を別々に使用することに起因する効果の合計より大きい。相乗的効果は、活性成分が、（１）組み合わされた単位投薬製剤で、同時処方され、同時に投与もしくは送達される場合、（２）別々の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合、または（３）ある種の他のレジメンによる場合に、達成され得る。交互療法で送達されるときは、相乗的効果は、例えば別々の注射器の異なる注入によって、化合物が連続して投与されるまたは送達される場合に、達成され得る。一般に、交互療法の間、有効投薬量の各活性成分は、連続して、すなわち順次投与されるが、組み合わせ療法では、有効投薬量の２つ以上の活性成分は一緒に投与される。
【０１８８】
疾患の予防または治療に関しては、さらなる治療剤の適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、ＶＥＧＦアンタゴニストおよびさらなる薬剤が予防的または治療的目的のために投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴ならびにＶＥＧＦアンタゴニストおよびさらなる薬剤に対する患者の応答、ならびに主治医の裁量によって決まる。ＶＥＧＦアンタゴニストおよびさらなる薬剤は、１回でまたは一連の治療にわたって適切に患者へ投与される。ＶＥＧＦアンタゴニストは、典型的には上記のように投与される。例えば１回または複数の別々の投与であろうと持続注入であろうと、疾患のタイプおよび重症度に応じて、約２０ｍｇ／ｍ２から６００ｍｇ／ｍ２のさらなる薬剤が患者に投与するための初回の候補投薬量である。１つの典型的な１日毎の投薬量は、上述の要因に応じて、約２０ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２またはそれ以上に及んでもよい。数日以上にわたるに反復投与に関しては、状況に応じて、治療は、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続される。したがって、約２０ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２（またはそれらの任意の組み合わせ）の１つまたは複数の用量を患者へ投与することができる。そうした用量は、（例えば、患者が約２から約２０、例えば約６用量のさらなる薬剤が与えられるように）、断続的に、例えば毎週または２、３、４、５または６週毎に投与することができる。初回の高負荷量、それに続く１または複数のより低い用量を投与することができる。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。本療法の進行は、従来の技法およびアッセイで容易にモニターされる。
【０１８９】
Ｖ．医薬製剤
本発明において使用されるアンタゴニストの治療製剤は、保存を目的として、所望の純度を有するアンタゴニストを随意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で調製される。製剤に関する一般的な情報は、例えばＧｉｌｍａｎら（編）（１９９０）、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ  （編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、（１９９０）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｒｉ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．；Ａｖｉｓら（編）、（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）、（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）、（１９９０）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ａ．Ｗａｌｔｅｒｓ（編）（２００２）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１１９巻、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒを参照されたい。
【０１９０】
許容可能な担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに毒性がなく、これには、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類および他の炭水化合物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば亜鉛−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１９１】
例示的な抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、米国特許第６，８８４１，８７９号に記載されている。ある種の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、単回使用のバイアルに２５ｍｇ／ｍＬで製剤化される。ある種の実施形態では、１００ｍｇの抗ＶＥＧＦ抗体が、２４０ｍｇのα，α−トレハロース二水和物、２３．２ｍｇのリン酸ナトリウム（一塩基性、一水和物）、４．８ｍｇのリン酸ナトリウム（二塩基性無水物）、１．６ｍｇのポリソルベート２０および注射用水、ＵＳＰ中に製剤化される。ある種の実施形態では、４００ｍｇの抗ＶＥＧＦ抗体が、９６０ｍｇのα，α−トレハロース二水和物、９２．８ｍｇのリン酸ナトリウム（一塩基性、一水和物）、１９．２ｍｇのリン酸ナトリウム（二塩基性無水物）、６．４ｍｇのポリソルベート２０および注射用水、ＵＳＰ中に製剤化される。
【０１９２】
皮下投与に適する凍結乾燥製剤は、例えば米国特許第６，２６７，９５８号（Ａｎｄｙａら）に記載されている。そうした凍結乾燥製剤は、適切な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成することができ、再構成製剤は、本明細書で治療される哺乳動物に皮下投与することができる。
【０１９３】
結晶化形態のアンタゴニストも企図される。例えばＵＳ２００２／０１３６７１９Ａ１を参照されたい。
【０１９４】
本明細書の製剤は、１種より多い活性化合物（上記の第２の医薬）、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含むこともできる。そうした医薬のタイプおよび有効量は、例えば製剤に存在するＶＥＧＦアンタゴニストの量およびタイプならびに対象の臨床パラメーターによって決まる。好ましいそうした第２の医薬を上に記載する。
【０１９５】
活性成分は、例えばコアセルベーション法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルのそれぞれに、コロイド性の薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに封入することもできる。そうした技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１９６】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、アンタゴニストを含有する、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品の形態、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げれらる。
【０１９７】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。
2018082705.tif 000004
2018082705.tif 000005
【実施例】
【０１９８】
以下の実施例を例示目的で提供するが、本願で請求している発明を限定するものではない。
実施例１．材料および方法
マウス系統＆マウスモデル
ＲＩＰ−ＴβＡｇマウスをＥｘｅｌｉｘｉｓ，Ｉｎｃ．から、Ｂｅｉｇｅ  Ｎｕｄｅ  ＸＩＤマウスをＨａｒｌａｎから入手した。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って、動物を飼育および世話した。
【０１９９】
治療レジメンおよび投薬
すべての投薬レジメンは、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って行った。研究動物は、毎日モニターし、体重は少なくとも週２回測定した。生物発光イメージングによって腫瘍成長および療法への応答をモニタリングすることを含めた、頭蓋内腫瘍の確立に使用される手順は、以前に記載されている（ＯｚａｗａおよびＪａｍｅｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．４１：１〜５、２０１０）。抗血管性内皮成長因子（ＶＥＧＦ）モノクローナル抗体Ｂ２０−４．１．１、抗ブタクサ（コントロール）および抗Ｄｌｌ４を、以前に記載（Ｆｕｈら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１：６６２５〜６６３１、２００６）されているように調製し、精製して、免疫無防備状態のマウスでのすべての実験に関して、５または１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって週２回、およびＲＩＰ−ＴβＡｇマウスでは、週１回（５ｍｇ／ｋｇで）投薬した。スニチニブは、経口強制飼養によって６０ｍｇ／ｋｇで毎日投薬した。創傷治癒アッセイは、Ｂａｉｓら（Ｃｅｌｌ．１４１：１６６〜１７７、２０１０）に以前に記載されているように行った。
【０２００】
免疫蛍光染色＆組織学的定量化
腫瘍担持ＲＩＰ−ＴβＡｇマウスから切断された膵臓全体を、ショ糖（３０％）中で５〜１０分４℃でインキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄した（２回、各１５分）。次いで、膵臓を最適切断温度（Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＯＣＴ、Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）培地を含有するクリオモールドに設置し、−７０℃で維持した。膵臓の切片（６μｍ）を、クリオスタット装置（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して各ＯＣＴブロックから切り取り、染色に使用するまで−７０℃で維持した。免疫蛍光染色に関しては、凍結切片を室温で風乾し、冷アセトンで５〜１０分間固定した。次いで、切片を再び乾燥し、ＰＢＳ中に２．５％ＢＳＡおよび５％ロバ血清を含むバッファーで３０〜６０分間ブロッキングした。ブロッキングバッファーで希釈（製造業者のガイドラインの通りに希釈）した一次抗体を用いた染色を一晩４℃で行った。次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、ブロッキングバッファーで１：３００に希釈した二次抗体に３０〜６０分間曝露し、次いで、ＰＢＳ中で再び洗浄した。最後に、切片を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有するＤＡＫＯ（ＤＡＫＯ）にマウントして、核を可視化した。
【０２０１】
以下の抗体を免疫蛍光染色に使用した。一次ラット抗マウスＭＥＣＡ−３２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ウサギ抗Ｋｉ６７およびクローンＳＰ６（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）。二次抗体は、Ａｌｅｘａ−５９４がコンジュゲートされたロバ抗ラットおよび抗ウサギ、ならびにＡｌｅｘａ−４８８がコンジュゲートされたロバ抗ウサギおよびヤギ抗ニワトリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を含む。染色したスライド上の腫瘍は、顕微鏡で同定し、ＡｘｉｏｓｋｏｐおよびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を使用して撮影し、画像上での組織学的定量化を、カスタマイズしたアルゴリズムを使用して、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で実施した。各時点で、平均測定値を、島／腫瘍あたり少なくとも３〜５画像×各マウス由来の５腫瘍×３マウス＝１５の独立した病変由来の４５〜７５画像／時点／治療から計算した。移植腫瘍モデルでの微小血管密度（ＭＶＤ）解析については、治療群あたり６匹のマウスからの腫瘍を収集し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．ブロックに包埋した。組織を、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓで１６μｍの厚さに凍結切片化し、ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。画像は、ＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳソフトウェアによって制御されたＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ１蛍光顕微鏡で取得した。画像ファイルをＴｉｓｓｕｅＳｔｕｄｉｏ解析パッケージ（ｖ１．５、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ）にロードした。壊死組織ならびに皮膚組織およびしわなどの染色アーティファクトは自動的に同定され、核染色に基づいて除外された。血管密度は、全生存腫瘍領域に対するＣＤ３１陽性画素の比として計算した。
【０２０２】
マイクロアレイ実験
以下のように、全ＲＮＡを、コントロールおよび抗ＶＥＧＦで治療したＲＩＰ−ＴβＡｇ腫瘍から、７日間の治療の後に抽出した。重量に応じて腹腔内に注入される０．２５％アバチンを使用して、マウスに麻酔をかけた。腹腔を開いて、膵管に接近し、総胆管を介して膵臓を灌流した。製造業者の指示の通りに希釈した約２．５ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ）で膵臓を灌流した。次いで、この膵臓を腹腔から切離し、さらに、腫瘍を膵外分泌部から大きく切離した。腫瘍を新鮮な潅流溶液に懸濁し、３７℃で５〜６分間撹拌し、次いで、解剖顕微鏡下で再度調査し、膵外分泌部のいかなる残存断片も除去した。次いで、きれいな腫瘍をＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に急速凍結した。免疫不全マウスでのすべての移植実験に関して、研究期間の終わりに動物を安楽死させ、腫瘍を切離し、および素早く凍結した。全ＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４４Ｋアレイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧＵ１３３−ｐｌｕｓ２またはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅアレイを使用して、製造業者の指示に従って、マイクロアレイを行った。
【０２０３】
細胞培養
Ｄ５５１（ＡＴＣＣ）皮膚線維芽細胞を、ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン（１００ユニット／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＭ１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。初代ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅから購入し、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）中で維持した。馴化培地：Ｄ５５１細胞を９０％コンフルエンスまで生育させ、培地をＥＧＭ−２に変え、７日のインキュベーション後上清を収集し、４℃で保存した。
【０２０４】
ＨＵＶＥＣトランスフェクションおよび出芽アッセイ
ＣＯＬ４Ａ２、ＮＩＤ２およびＭＥＳＴ遺伝子発現のサイレンシング：細胞を７０％コンフルエンスまで生育させ、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１を使用して、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従ってｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションのためのすべてのｓｉＲＮＡの終濃度は１２．５ｎＭであり、各遺伝子についてのｍＲＮＡのダウンレギュレーションをｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した。トランスフェクションしてから２４時間後に細胞をトリプシン処理し、Ｃｙｔｏｄｅｘマイクロキャリアビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、２，５００個のビーズあたり１×１０６細胞の比で混合した。３７℃で４時間コーティングを行い、混合物を２０分毎に手で振盪した。次いで、コーティングしたビーズを６ウェルディッシュに移し、３７℃および５％ＣＯ２で１８〜２０時間ＥＧＭ−２中に放置した。翌日、コーティングしたビーズをＥＧＭ−２で洗浄し、ＥＧＭ−２にフィブリノーゲン（２ｍｇ  ｍｌ−１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れた溶液に溶解した。約２００個のＨΜＶＥＣコーティングビーズを含む溶液を、２４ウェル組織培養プレートの１ウェル中の０．６２５Ｕ  ｍｌ−１のトロンビン（Ｓｉｇｍａ）に添加した。８×１０４皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１）を、クロットの上に蒔き、２０μｇ／ｍｌの抗体を含む２ｍｌのＤ５５１馴化培地／ＥＧＭ−２（１：３）でインキュベートした。２日毎に培地を交換し、４日目にアッセイを終わらせた。ＨＵＶＥＣの出芽を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で２時間室温で固定されたフィブリンゲル中で免疫染色によって可視化し、次いで、ブロッキングバッファー（ＤＡＫＯ）で４時間室温ブロッキングし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ファロイジン（１：１００）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１：１０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で一晩インキュベートし、続いて画像撮影した。Ｉｍａｇｅ  Ｘｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏを使用して画像を取り込み、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアでＨＵＶＥＣの出芽を解析した。血管成長の３要素を測定した。総成長は、ビーズあたりのすべての出芽の累積長を表し、平均成長は、ビーズあたりの出芽分枝数を表し、ビーズあたりの総プロセスは、ビーズ表面を覆う細胞から直接始まる出芽数を数えることによって決定した。統計的解析のために、各条件について４つのウェルを評価し、各実験を３回反復した。
【０２０５】
定量的遺伝子発現解析
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを調製した。５００ｎｇの全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して逆転写にかけた。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００機器でリアルタイムＰＣＲを行った。すべての検査遺伝子に対するＴａｑｍａｎプローブをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから取得した。各遺伝子の相対的発現レベルを、アクチンに対して標準化した。
【０２０６】
臨床試料におけるシグネチャー遺伝子発現の決定
ＮＯ１６９６６のＸＥＬＯＸ治療群に登録された患者からの保存用腫瘍試料由来の切片を病理医が評価し、高い腫瘍含量領域を大きく切離して、続いて、ＦＦＰＥ  ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ；患者あたり７〜１０切片）を使用してＲＮＡを単離した。標準的技法に従ってｃＤＮＡを合成した後に、製造業者のプロトコールに従ってＦｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏｍａｒｋプラットホームでｑＰＣＲプロトコールを用いて、ＲＮＡレベルを評価した。
【０２０７】
遺伝子シグネチャーの誘導および適用
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＷＭＧマイクロアレイからのｌｏｇ２比強度値およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ４３０．２マイクロアレイからのロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）標準化強度（対数スケールにも基づく）を、パッケージ「Ｂｉｏｂａｓｅ」を使用して、式セットとしてＲにインポートし、「ｌｉｍｍａ」パッケージの関数「ｌｍＦｉｔ」および「ｅＢａｙｅｓ」を使用して、線形モデルを各フィーチャに適合させた。抗ＶＥＧＦで治療した試料において（抗ブタクサコントロールで治療した試料と比較して）有意に（ｐ＜０．０５）ダウンレギュレーションしたフィーチャは保持し、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ識別子に変換した。これらの遺伝子の和集合を、ＶＥＧＦ応答性血管構造の代表と見なした。このＶＤＶ遺伝子発現シグネチャーが他の実験で変動する程度は、「ｌｉｍｍａ」（上記）パッケージを使用して、線形モデルをマイクロアレイデータに適合させ、ＦａｌｃｏｎおよびＧｅｎｔｌｅｍａｎ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２３：２５７〜２５８、２００７）の方法に従ってシグネチャー中の遺伝子由来のｔ−統計量の平均を計算することによって決定した。
【０２０８】
バイオマーカー選択の統計的方法
統計的タスクは、以下のステップを含むことができる：
１．候補バイオマーカーの事前選択
２．関連する臨床的有効性の応答性予測共変量の事前選択
３．一変量レベルでのバイオマーカー予測関数の選択
４．一変量レベルでの臨床的共変量を含むバイオマーカー予測関数の選択
５．多変量レベルでのバイオマーカー予測関数の選択
６．多変量レベルでの臨床的共変量を含むバイオマーカー予測関数の選択
【０２０９】
以下の文は、種々のステップを詳しく述べるものである。
【０２１０】
１：候補バイオマーカーの事前選択
候補バイオマーカーの統計的事前選択は、臨床的利益の尺度との関連性の強度に指向している。この目的のために、種々の臨床エンドポイントは、誘導された代用スコアに、例えば、観察打切りを回避するＴＴＰに関する臨床的利益スコアの程度の順序割当として変換することができる。これらの代用変換測定値は、例えばノンパラメトリックなスピアマンの順位相関アプローチによって、単純相関解析に容易に使用することができる。他の方法は、例えばＣｏｘ比例ハザード回帰のように、事象までの時間の回帰モデルにおけるメトリック共変量として、バイオマーカー測定値を使用することである。バイオマーカー値の統計的分布に応じて、このステップは、例えば、分散安定化変換および適切なスケールの使用として、あるいは生の測定値の代わりにパーセンタイルを使用するなどの標準化ステップとして、幾つかの前処理を必要とする場合がある。さらなるアプローチは、例えば、単一患者を基準にして、（ｘ軸＝バイオマーカー値、ｙ軸＝臨床的利益の測定値）の散布を示すことによる、二変量散布図の精査である。例えば、平滑化スプラインによって達成されるような幾つかのノンパラメトリックな回帰直線は、バイオマーカーと臨床的利益の関連を可視化するのに有用であり得る。
【０２１１】
これらの種々のアプローチの目的は、用いられる少なくとも１つの利益尺度の臨床的利益といくらかの関連性を示すが、他の測定値に対する結果は矛盾しないバイオマーカー候補の事前選択である。利用可能なコントロール群が存在するときは、異なる治療群における臨床的利益とバイオマーカーの関連性の差異が、バイオマーカー（複数可）をさらなる考慮事項に適したものとする差異予測の兆候になり得る。
【０２１２】
２：関連する臨床的有効性の応答性予想共変量の事前選択
本明細書で定義された臨床的共変量の統計的事前選択は、バイオマーカーを事前選択するためのアプローチに類似し、また、臨床的利益の尺度との関連性の強度に指向している。それ故、原則として、上記１で考慮したのと同じ方法が適用される。統計的判定基準に加えて、臨床経験および理論的知識に由来する判定基準を、関連する臨床的共変量を事前選択するのに適用することができる。
【０２１３】
臨床的共変量の予想値は、バイオマーカーの予想値と相互作用し得る。必要ならば、これらは予測ルールを改良するのに考慮される。
【０２１４】
３：一変量レベルでのバイオマーカー予測関数の選択
用語「予測関数」は、一般的に、標的予測を暗示するのにスケーリングされた数をもたらす、バイオマーカー測定値の数値関数を意味するのに使用される。
【０２１５】
簡単な例は、特定のカットオフｃおよびバイオマーカー測定値ｘについてのヘビサイド関数の選択であり、この場合、二値予測ＡまたはＢが作られることになり、次いで、Ｈ（ｘ−ｃ）＝０ならば、Ａを予測する。Ｈ（ｘ−ｃ）＝１ならば、Ｂを予測する。
【０２１６】
これは恐らく、予測ルールにおいて一変量バイオマーカー測定値を使用する最も一般的な方法である。上記の「予測関数」の定義は、予測可能性を探究するのに使用することができる既存の訓練データセットへの照会を含む。訓練セットから適切なカットオフｃを得るために、別の経路を取ることができる。最初に、１で述べた平滑化スプラインを用いた散布図を使用して、カットオフを定めることができる。あるいは、分布の幾つかのパーセンタイル、例えば中央値または４分位値を選択することができる。カットオフは、臨床的利益の尺度に関するそれらの予測可能性に従ってすべての可能なカットオフを検討ことによって、体系的に抽出することもできる。次に、マニュアル選択を可能にするか、または最適化のための幾つかの検索アルゴリズムを用いるために、これらの結果をプロットすることができる。これは、Ｃｏｘモデルを使用する、ある種の臨床エンドポイントに基づいて実現させることができ、各検定のカットオフにおいて、バイオマーカーは二値共変量として使用される。次いで、臨床エンドポイントの結果を一緒に考慮して、両エンドポイントに沿った予測を示すカットオフを選択することができる。
【０２１７】
予測関数を選択するための一般的でない別のアプローチは、共変量としてバイオマーカー値（可能ならば変換されたもの）を有する訓練セットから得られた固定パラメーターＣｏｘ回帰モデルに基づき得る。さらなる可能性は、幾つかの尤度比（またはその単調変換）に関する決定に基づくことであり、標的確率密度は、予測状態の分離用の訓練セットにおいて事前決定される。次いで、バイオマーカーは、予想判定基準の幾つかの関数に当てはめられることになる。
【０２１８】
４：一変量レベルでの臨床的共変量を含むバイオマーカー予測関数の選択
一変量は、１つのバイオマーカーのみの使用を指し、臨床的共変量に関しては、これは、多変量モデルであり得る。このアプローチは、この方法が関連する共変量情報の組み込みを可能にすべきことを除けば、臨床的共変量を用いない探索と類似している。カットオフを選択する散布図法によって、共変量の限られた使用のみが可能になり、例えば、二値共変量は、プロット内でコードされる色であり得る。解析が幾つかの回帰アプローチに依拠する場合は、共変量（また、一度にそれらの多く）を使用することは、通常容易である。上の３に記載したＣｏｘモデルに基づくカットオフ探索により、共変量を容易に取り込むことが可能になり、それによって、共変量調整された一変量カットオフ探索につながる。共変量による調整は、モデルにおける共変量として、または層別解析における包含を介して行うことができる。
【０２１９】
予測関数の他の選択も、共変量の取り込みを可能にする。
【０２２０】
これは、予測関数としてのＣｏｘモデル選択に対して直接的である。これは、相互作用レベルへの共変量の影響を推定するためのオプションを含み、これは、例えば、異なる年齢群に対して、異なる予測判定基準を適用することを意味する。
【０２２１】
予測関数の尤度比のタイプに関しては、予測密度は、共変量を含んで推定されなければならない。この目的のために、多変量パターン認識の方法論を使用することができ、またはバイオマーカー値を、（密度推定に先立って）共変量についての重回帰によって調整することができる。
【０２２２】
バイオマーカー（生の測定値レベル）と臨床的共変量を用い、応答としての臨床的利益尺度を利用して、ＣＡＲＴ技術（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅｓ；Ｂｒｅｉｍａｎら（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８４））をこの目的のために使用することができる。カットオフが探索され、決定木タイプの関数が予測のための共変量に関与していることが見出される。ＣＡＲＴにより選択されるカットオフおよびアルゴリズムは、しばしば最適に近く、種々の臨床的利益尺度を考慮することにより、組み合わされ、統合され得る。
【０２２３】
５：多変量レベルでのバイオマーカー予測関数の選択
異なる一変量予測関数選択内に、それらの予測可能性を維持する幾つかのバイオマーカー候補が存在するときは、バイオマーカーの組み合わせによって、すなわち多変量予測関数を考慮することによって、さらなる改善が達成され得る。
【０２２４】
単純なヘビサイド関数モデルに基づいて、例えば、最適カットオフが示されるバイオマーカー値の二変量散布図を考慮することによって、バイオマーカーの組み合わせを評価することができる。次いで、バイオマーカーの組み合わせは、予測が改善されるように、論理「ＡＮＤ」および「ＯＲ」演算子により異なるヘビサイド関数を組み合わせることで達成することができる。
【０２２５】
この目的のために、複数のバイオマーカー（生の測定レベル）および応答としての臨床的利益尺度を用いて、ＣＡＲＴ技術を使用して、バイオマーカー用のカットオフおよび予測用の決定木タイプの関数を得ることができる。ＣＡＲＴにより選択されるカットオフおよびアルゴリズムは、しばしば最適に近く、種々の臨床的利益尺度を考慮することによって、組み合わされ、統合され得る。
【０２２６】
Ｃｏｘ回帰は、種々のレベルで用いることができる。第１の方法は、複数のバイオマーカーを二値方法に組み込むことである（すなわち、幾つかのカットオフを有するヘビサイド関数に基づく）。他のオプションは、メトリック方法（適切な変換後）、または二値とメトリックの混合のアプローチにおいて、バイオマーカーを用いることである。発展的多変量予測関数は、上の３に記載したＣｏｘタイプのものである。
【０２２７】
多変量尤度比アプローチは、実行するのは困難であるが、多変量予測関数に関する別のオプションを提供する。
【０２２８】
６：多変量レベルでの臨床的共変量を含むバイオマーカー予測関数の選択
関連する臨床的共変量が存在するときは、複数のバイオマーカーと複数の臨床的共変量とを組み合わせることによって、さらなる改善を達成することができる。異なる予測関数の選択は、臨床的共変量を含む可能性に関して評価される。
【０２２９】
バイオマーカーに対するヘビサイド関数の単純な論理的組み合わせに基づいて、訓練セットにおいて得られたロジスティック回帰モデルに基づく予測関数にさらなる共変量を含めることができる。
【０２３０】
ＣＡＲＴ技術および発展的決定木は、さらなる共変量と共に容易に使用することができ、予測アルゴリズムにこれらを含むであろう。
【０２３１】
Ｃｏｘ回帰に基づくすべての予測関数は、さらなる臨床的共変量を使用することができる。相互作用レベルへの共変量の影響を推定するためのオプションが存在し、これは、例えば、異なる年齢群に対して、異なる予測判定基準を適用することを意味する。
【０２３２】
多変量尤度比アプローチは、さらなる共変量の使用に直接拡張可能ではない。
【０２３３】
組織学的および臨床的データ解析の統計的方法
様々な動物実験からの定量的な組織学的データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用してプロットした。スチューデントのｔ検定を適用して目的のデータセットを比較し、ｐ値＜０．０５を有する差異を有意であると見なした。ＮＯ１６９６６試験におけるＸＥＬＯＸ（カペシタビンおよびオキサリプラチン）を含む治療群由来の１０１７人の患者からの１０３個の生検物を、ＶＤＶ遺伝子の遺伝子発現について解析した。ｑＲＴ−ＰＣＲの値を、ハウスキーピング遺伝子によって、および一般的な基準試料に対して標準化して、δ−δＣｔ値を得た。続いて、２２個のＶＤＶ遺伝子のそれぞれのδ−δＣｔ値を、Ｚ−スコアに対して平均センタリングおよび分散スケーリングした。
【０２３４】
すべてのＶＤＶ遺伝子が解析された各試料ｉについて、ＶＤＶシグネチャースコア（ＶＤＶｉ）を計算した。ＶＤＶｉは解析されたＶＤＶ遺伝子の全体にわたるｚ−スコアの加重平均を表し、アルゴリズム：
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によって与えられ、式中、Ｚｇ，ｉは、試料ｉおよびｎの遺伝子ｇに対するｑＲＴ−ＰＣＲの値の標準化されたｚ−スコアであり、今回は２２である。ＶＤＶｉ値は、特定のセットの遺伝子の発現が、中心平均値に対して集団的に過剰発現または低発現する程度に関する定量的な情報を提供する。
【０２３５】
マーカーおよび／または治療亜群間の臨床転帰（ＰＦＳおよびＯＳ）を比較するために、ログランク検定およびＣｏｘ回帰を使用し、カプランマイヤー解析によって中央時間を計算した。すべての統計検定は両側性であった。
【０２３６】
実施例２．抗ＶＥＧＦの標的にされる血管コンパートメントで発現する遺伝子の同定
ＶＥＧＦ経路阻害活性の直接的なインビボバイオマーカーの同定への第１ステップとして、確立された、膵神経内分泌腫瘍（ＰＮＥＴ）のトランスジェニックマウスモデルにおいて、ＶＥＧＦ中和の生物学的結果を特徴付けた。高度に血管新生化したＲＩＰ−ＴβＡｇ遺伝子改変腫瘍マウスモデル（ＧＥＭＭ）において、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療は、抗腫瘍効力を有すること、および全生存を増大することが以前に示された（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２２７（４）：４１７〜４３０、２０１２）。ＲＩＰ−ＴβＡｇ末期腫瘍の組織学的解析によって、抗ＶＥＧＦ治療は微小血管密度（ＭＶＤ）の急速な低減を引き起こし、それは、治療後７２時間で検出可能であり、７日目にプラトーの約５０％に達することが示された（図１Ａ、左）。抗ＶＥＧＦ誘導性の、腫瘍血管構造のこの部分（以降、「ＶＥＧＦ依存性血管構造」またはＶＤＶと呼ぶ）の除去は、後の治療時点で、有意に逆行も増大もしない（図１Ａ、左）。これらの実験では、腫瘍血管密度および増殖指数を、それぞれＭＥＣＡ−３２染色（赤色、左）およびＫｉ６７染色（赤色、右）を介して、組織学的に評価した。ＤＡＰＩ（青色）で核を対比染色した。観察された急速な抗血管効果とは対照的に、ＶＥＧＦ中和の間接的な抗腫瘍効果は、よりゆっくり進んだ。コントロール（抗ブタクサ）治療群と比較した際の抗ＶＥＧＦ治療群における腫瘍増殖指数の低減は７日目には観察されなかったが、１４日目には明らかであり（図１Ａ、右）、結果としての腫瘍量の低減は、２１日目でのみで明らかあった（図１Ｂ）。これは、初期の時点において、このモデルでのＶＥＧＦ遮断の生物学的結果が主に血管特異的であることを示唆するものである。
【０２３７】
抗ＶＥＧＦで７日間治療した動物由来の全腫瘍の発現マイクロアレイ解析によって、大多数の遺伝子は、コントロール抗体で治療した動物由来の腫瘍と比較した場合、発現が変化しなかったことが示された。しかし、有意に（ｐ＜０．０１に適合）抗ＶＥＧＦ治療に応答した少数の遺伝子集団は、転写産物量が減少する（表３）。興味深いことに、一致した遺伝子発現のアップレギュレーションは観察されず、これは、遺伝子発現変化は、主として、ＶＥＧＦ依存性腫瘍関連内皮細胞の物理的排除によって引き起こされたことを示唆するものである（図１Ｃおよび表３）。以下の表３に記載するように、ＶＤＶシグネチャーの遺伝子を、ヒトＩＢＣ試験における抗ＶＥＧＦ応答度によって順序付けた。Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｂｉｏｍａｒｔを使用してヒトとマウスのオルソログを対応付けし、この場合、「Ｌｏｇ２ＦＣ」は、治療前と比較した場合の、ＡＶＡＳＴＩＮ治療後の遺伝子発現のｌｏｇ（２）フォールドチェンジを表す。１９対の患者の試料およびマウスのＰＮＥＴをＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイで解析した。少数のＶＤＶ遺伝子は、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ上にヒトプローブを有しておらず、表の終わりにＮＡで示される。加えて、幾つかのマウスＶＤＶ遺伝子に対するプローブは、Ａｇｉｌｅｎｔプラットホーム上に存在しなかった。これらの遺伝子に関しては、Ｌｏｇ２Ｆｃは、マウスＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイプラットフォーム上での反復実験から示され、アステリスク＊で印をつけた。
【０２３８】
差次的（低下した）発現を有するこのセット内の遺伝子の特徴付けによって、血管の発達に関与する既知の内皮特異的な遺伝子（表３）の富化が明らかになった（表４）。加えて、この遺伝子セットに関する発現の中央フォールドチェンジは、汎血管マーカーＣＤ３１およびＰＬＶＡＰで見られるものと類似しており、また、汎血管マーカーＰＬＶＡＰの免疫組織化学で測定した場合、ＭＶＤの低下の程度と一致していた（図１Ａおよび図１Ｃ）。
【０２３９】
全腫瘍の定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって、マイクロアレイの結果を確認し、腫瘍（インスリン）；上皮（Ｅ−ＣａｄおよびＥｐｃａｍ）；汎造血（ＣＤ４５）；またはマクロファージ（ＣＤ６８）細胞に特異的なマーカーが抗ＶＥＧＦ治療によって有意に変化しないことを確証した。さらに、マイクロアレイデータを確認すると、ｑＲＴ−ＰＣＲは、この治療によってＶＥＧＦの転写産物レベルは有意に変化しないが、複数の既知の内皮マーカーはダウンレギュレーションされることを示した（図１Ｄ）。
【０２４０】
マイクロアレイとｑＲＴ−ＰＣＲの両データによって、抗ＶＥＧＦに応答したダウンレギュレーションがシグネチャー中の他の遺伝子よりも顕著な遺伝子のサブセットが同定され（図１Ｄ）、このことは、シグネチャー遺伝子の幾つかは、抗ＶＥＧＦ治療に感受性の血管中でより選択的に発現する可能性があることを示唆するものである。低応答遺伝子および中間応答遺伝子（図１Ｄ、それぞれ黄色および赤色のバー）とは対照的に、超応答性遺伝子（図１Ｄ、紫色のバー）のこのセットは、端細胞マーカー、および発生的網膜血管新生と関連して、既知のＶＥＧＦ標的（Ｔｏｒｏら、Ｂｌｏｏｄ．１１６：４０２５〜４０３３、２０１０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２４：１０５１５〜１０５２８、２００４；Ｔｅｓｔｏｒｉら、Ｂｌｏｏｄ．１１７：２７３５〜２７４４、２０１１；Ｌｏｂｏｖら、Ｂｌｏｏｄ．１１７：６７２８〜６７３７、２０１１）を含む。したがって本発明者らは、これらの後者の遺伝子は、ＶＥＧＦ経路阻害活性の近位のバイオマーカー（ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子）の候補であり、ＶＥＧＦ依存性腫瘍血管構造でより選択的に発現するＶＥＧＦ標的である可能性が高いと仮定した。まとめると、これらの結果は、ＶＤＶ遺伝子発現シグネチャーは、少なくとも２つの関連する生物学的プロセス：（ｉ）ＶＥＧＦ下流のシグナル伝達の直接阻害、および（ｉｉ）引き続く、ＶＥＧＦシグナル伝達に残存を依存している血管の減少を反映することを示唆するものである。この作業仮説によれば、ＶＤＶ内皮遺伝子は、腫瘍関連内皮細胞におけるＶＥＧＦシグナル伝達阻害の近位の（ｐｒｏｘＶＤＶ）および遠位の（ｄｉｓｔＶＤＶ）下流の代用マーカーを含む可能性が高い。
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【０２４１】
実施例３．ＶＥＧＦシグナル伝達遮断への血管応答は、複数の腫瘍モデル全体にわたって保存されている。
ＶＥＧＦシグナル伝達遮断へのＶＤＶ応答は間質特異的であり、複数の腫瘍モデル全体にわたって保存されている。
本発明者らは、マウス末期ＰＮＥＴモデルで同定されたＶＤＶ転写シグネチャーが他の腫瘍モデルでも検出可能であるかどうかを決定しようとした。
【０２４２】
最初に、確立された（４００ｍｍ３）皮下ヒト乳がん腫瘍モデル（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）由来の試料において、抗ＶＥＧＦ治療への全腫瘍の応答を解析した。教師なし発現解析は抗ＶＥＧＦ治療試料とコントロール治療試料を区別できなかったが、短期（すなわち２４時間）の抗ＶＥＧＦ治療は、すべての他の遺伝子と比べて、大多数のＶＤＶ遺伝子の発現の有意な下方シフトを誘導するのに十分であった（ｐ＜０．０００１；図２Ａ、上のパネル）。ＶＤＶ遺伝子は内皮特異的であるという仮説に合致して、これらの遺伝子の発現変化は、マウスマイクロアレイ上のプローブでのみ検出され、ヒトマイクロアレイ上のプローブでは検出されず、これは、間質と腫瘍細胞の違いと一致する（図２Ａ）。また、ＲＩＰ−ＴβＡｇ  ＧＥＭＭ由来のデータに一致して、ＭＤＡ−ＭＢ２３１皮下異種移植乳がん腫瘍の抗ＶＥＧＦでの治療は、汎血管マーカーおよび他のＶＤＶ遺伝子と比べて、候補ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子の激しいダウンレギュレーションを誘導した。
【０２４３】
本発明者らは、第３のモデルである、同所性の頭蓋内Ｕ８７神経膠芽細胞腫における長期の抗ＶＥＧＦ治療の効果も、マウス特異的プローブによってのみ検出され、候補ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子がより顕著にダウンレギュレーションした、低下したＶＤＶ遺伝子発現パターンをもたらすことを発見した（図２Ｂ）。類似した、抗ＶＥＧＦ抗体への応答のＶＤＶパターンも、検査した複数の、抗ＶＥＧＦで治療したヒト異種移植およびマウス腫瘍モデル全体にわたって、一貫して観察された。
【０２４４】
したがって、腫瘍モデルおよび移植部位にかかわらず、かつ抗体治療の長さと無関係で、（ｐｒｏｘＶＤＶおよびｄｉｓｔＶＤＶ遺伝子からなる）ＶＤＶシグネチャーによって、全腫瘍のｍＲＮＡ試料において、ＶＥＧＦ経路阻害の血管下流の生物学的結果を反映する遺伝子発現変化の一貫性がある検出が可能になる。
【０２４５】
ＶＥＧＦシグナル伝達はＶＤＶ遺伝子発現を誘導する
次に、本発明者らは、ＶＥＧＦ刺激が、２つの異なる病理学的状況、すなわち、Ｄｌｌ４／Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達経路の遮断に応答した創傷治癒および腫瘍血管新生の増大において、内皮のＶＤＶ遺伝子発現を逆に増大させることによって、未熟な新生血管構造の形成を特色付けできる程度を評価した。
【０２４６】
インビボでのマウス皮膚創傷アッセイにおいて、組換えＶＥＧＦ（ｒＶＥＧＦ）の１２時間にわたる局所添加は、大部分のＶＤＶ遺伝子の発現を皮膚の創傷部位で増大させたが、抗ＶＥＧＦ治療は、反対の効果が予想された（図２Ｃ）。腫瘍で見られた応答に一致して、ＶＥＧＦ遮断および局所ＶＥＧＦの効果は、ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子候補において最も顕著であった。
【０２４７】
Ｄｌｌ４／Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達経路の阻害を介する新生血管形成誘導の結果を、抗Ｄｌｌ４、抗ＶＥＧＦまたはコントロールの抗ブタクサ抗体でＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスを４８時間治療することによって評価した。Ｄｌｌ４／Ｎｏｔｃｈ１経路は、ＶＥＧＦシグナル伝達の増強を介して非生産的な血管新生をある程度増大させる（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．３７：１２３３〜１２３６、２００９；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ．４４４：１０８３〜１０８７、２００６；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２（１０）：９４３〜９５３、２０１０）。組織学的解析によって、予想通り、抗ＶＥＧＦ治療は腫瘍血管構造の血管除去を誘導するが、抗Ｄｌｌ４で治療した腫瘍は、コントロールと比較したときにＭＶＤの増大を示すことが示された（図２Ｄ、左）。ＶＤＶ遺伝子の発現は、調和して変化し、抗ＶＥＧＦ治療の際に低下し、Ｄｌｌ４の遮断に応答して増大した（図２Ｄ、右）。この場合もやはり、他のモデルで見られるように、ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子候補の発現の変化は、他のＶＤＶ遺伝子のものよりも顕著である。
【０２４８】
全体的に見て、これらのデータは、ほとんどのＶＤＶ遺伝子はＶＥＧＦ主導の新生血管構造で発現すること、ならびにそれらの集団的な発現は、ＶＥＧＦの生物活性およびＶＥＧＦ依存性血管構造の相対的存在量を恐らく反映することを示唆するものである。
【０２４９】
注目すべきことに、ＶＥＧＦ経路活性化の転写効果が、インビトロとインビボの両方のシステムで以前に検討された。しかし、インビトロでの、内皮細胞におけるｒＶＥＧＦ刺激の転写の結果は、遺伝子が実際に本物のＶＥＧＦのインビボ標的であるかどうかを決定するための十分な情報を提供しない。実際、本発明者らは、インビトロでのＨＵＶＥＣのｒＶＥＧＦ刺激は、本発明者らが同定したほとんどのｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子の転写を誘導しないことを多くの条件下で発見した（図３）。この矛盾は、血流および機械的力を含めた多くの刺激のインテグレーターとしての血管構造の全身的な役割、ならびにＶＥＧＦ応答が用量および状況依存性であることを考慮すれば、驚くべきことではない。
【０２５０】
他方では、本明細書で同定した遺伝子の幾つか（ＥＳＭ１を含む）、および本発明者らが有望な標的として同定しなかった遺伝子（中でもＰｃｄｈ１７、ＥＨＤ３、ＰＲＤＭ１およびＴＨＢＤを含む；図３を参照されたい）は、インビトロでのＶＥＧＦ刺激によって確実にアップレギュレーションされる。したがって、本明細書に提示するｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子のリストは、包括的である可能性が低く、本発明者らは、さらなるインビボでのＶＥＧＦの標的を同定するために、インビボとインビトロのデータセットを現在統合している。
【０２５１】
実施例４．ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ−２下流の生物活性のインビボでの近位マーカーである。
インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）のデータによって、Ｅｓｍ１は、ＨＭ７結腸異種移植腫瘍由来の血管の重要な部分で高く発現しているが、抗ＶＥＧＦで治療した腫瘍由来の血管ではほとんど検出不可能であることが示された（図４Ａ〜図４Ｃ）。これはＥｓｍ１が本物のｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子であることと矛盾しない。しかし、ＥＳＭ１はＶＥＧＦ以外の他の刺激によって制御されおり（Ｓｃｈｅｒｐｅｒｅｅｌら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．３４（２）：５３２〜５３７、２００６）、かつＥＳＭ１は腫瘍細胞でも時折発現し得るので、本発明者らは、ＦＤＡが承認したＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ−２阻害剤に応答して、ＶＥＧＦ下流のシグナル伝達の生物活性をインビボで計測するために、集団的およびより特異的な手段としてのさらなるｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子候補を検証する必要があった。したがって、これらの実験では、確立されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を担持するマウスを、コントロールのｍＡｂ、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ（ベバシズマブに対する代用薬として）、スニチニブ（スーテント（登録商標）；Ｅｓｃｕｄｉｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１０（３）：３０５〜３１７、２０１０）、ＲＴＫの中でも特にＶＥＧＦＲ−２を標的にする小分子ＴＫＩ、またはより特異的なＶＥＧＦＲ−２阻害剤のアキシチニブ（Ｋｉｎｄｌｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．１２（３）：２５６〜２６２、２０１１；Ｇｒｕｎｗａｌｄら、Ｏｎｃｏ．Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｔｈｅｒ．５：１１１〜１１７、２０１２）で治療した。続いて、腫瘍を、治療後８、１６または７２時間で収集して、解析した（図５Ａ、上のパネル）。先の観察と一致して、３種の阻害剤すべてが、治療してから７２時間後に収集した腫瘍において、ＭＶＤの有意な低減を誘導した（図４Ｄ）。遺伝子発現レベルで、すべての場合において、ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子が、汎血管マーカーＣｄ３１およびＰｌｖａｐについて見られるよりも大きなダウンレギュレーションを示すことを本発明者らは発見した（図５Ａ）。重要なことに、Ｖｅｇｆａの発現ならびに非血管マーカー、Ｅ−ｃａｄ（上皮）およびＣｄ４５（造血性）の発現は、検査したＶＥＧＦ経路阻害剤のうちのいずれかによる顕著な影響を受けなかった（図４Ｅ）。このことは、ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子発現の変化は、「オンターゲット」および内皮特異的らしいことを示唆するものである。７２時間目では、スニチニブは、最強のＶＥＧＦ経路阻害剤であるように思われる（図５Ａ）。
【０２５２】
転写応答の動態は、小分子阻害剤と抗ＶＥＧＦ抗体治療で異なっていた。遺伝子発現の有意な変化は、治療してから８時間後で、スニチニブまたはアキシチニブによって誘導されなかった。治療後１６時間でのみ、ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることに対する２つのＳＭＩの効果は明らかであり、この効果は、治療してから７２時間後で増大した（図５Ａ）。それとは対照的に、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ（腹腔内投与）によるｐｒｏｘＶＤＶ（ｄｉｓｔＶＤＶではない）遺伝子のダウンレギュレーションは、投薬してから８時間後で明らかであり、治療後１６時間までにそのピークに達する。
【０２５３】
このｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子セットが、腫瘍関連内皮細胞（ＴＡＥＣ）でのＶＥＧＦシグナル伝達によって実際制御されるかどうかを確認するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ腫瘍担持動物を、抗ＶＥＧＦまたはコントロール抗体で治療し、次いで、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってＴＡＥＣ（Ｃｄ３１＋、Ｃｄ４５−、ＧＦＰ−）を単離し、２つの異なる治療群間で、エクスビボでの遺伝子発現を比較した。本発明者らは、検査したすべての汎血管マーカーおよびｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子が、他の選別した細胞集団と比較して、内皮細胞で非常に富化していることを発見した（図６）。ｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子のＰｒｎｄ、Ｅｓｍ１、Ｎｉｄ２、Ｋｃｎｅ３、Ａｐｊ、ＡｐｌｎおよびＭｅｓｔは、コントロールと比べて、抗ＶＥＧＦで治療した動物から単離されたＴＡＥＣ細胞において一貫してダウンレギュレーションされたが、Ｃｄ３１、Ｐｌｖａｐ、Ｅｔｓ−１およびＨｌｘなどの他のＶＤＶ遺伝子はそうでなかった（図５Ｂ）。このデータは、Ｐｒｎｄ、Ｅｓｍ１、Ｎｉｄ２、Ｋｃｎｅ３、Ａｐｌｎ、ＡｐｊおよびＭｅｓｔは、ＶＥＧＦ生物活性の近位かつ感受性のバイオマーカーであり、腫瘍関連内皮細胞内の経路の直接阻害に対するインビボでの候補レポーターであることを確認するものである。
【０２５４】
実施例５．ＶＥＧＦシグナル伝達遮断への血管の転写応答は、マウスとヒトの腫瘍で保存されている。
本発明者らがマウスモデルで同定したＶＥＧＦ中和への応答が、ヒト腫瘍血管構造で保存されているかテストするために、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））で治療した患者由来の腫瘍生検物において、ＶＤＶシグネチャー発現へのＶＥＧＦ遮断の効果を検討した。ここでは、本発明者らは、単剤として１用量のベバシズマブで治療した１９人の炎症性乳がん患者由来の治療前および治療後２１日目のマッチドペアの生検物からの、公表されたマイクロアレイデータ（Ｗｅｄａｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２４：７６９〜７７７、２００６）を活用した。先験的に、従来のバイオインフォマティクス解析では、これらの生検物おいてベバシズマブ治療に応答する最も特異的な血管遺伝子発現変化を区別することができなかった（Ｙａｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４：５８９３〜５８９９、２００８）が、ヒトオルソログのＶＤＶ遺伝子セットの焦点を合わせた発現解析は、治療前の生検物と比較して、ベバシズマブ治療後の臨床試料において、ＶＤＶ転写産物の明らかなダウンレギュレーションを示した（図７）。マウス腫瘍モデルと同様に、本発明者らは、ＥＳＭ１、ＮＩＤ２、ＰＲＮＤ、ＫＣＮＥ３およびＭＥＳＴなどの幾つかのｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子の発現が、ＶＥＧＦ治療の際により顕著に低下することを観察した。したがって、前臨床モデルにおいて本発明者らが同定したＶＤＶ遺伝子セットによって、臨床腫瘍試料におけるＶＥＧＦシグナル伝達阻害への進化的に保存された血管応答の検出が可能になる。
【０２５５】
実施例６．ヒト結腸直腸がんにおけるＶＤＶ遺伝子の治療前の発現レベルは、ベバシズマブへの臨床応答と相関する。
本発明者らのデータは、ＶＤＶ遺伝子が富化されたヒト腫瘍血管は、ＶＥＧＦシグナル伝達阻害に比類なく応答性であることを示す。本発明者らは、次に、治療前の腫瘍試料におけるこれらのマーカーの相対的富化が、抗ＶＥＧＦ療法への応答性を実際に予測することができるという仮説をテストした。
【０２５６】
化学療法と組み合わせたベバシズマブは、転移性結腸直腸がん（ＣＲＣ）の患者において無増悪生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）を増大させることが以前に示された（Ｈｕｒｗｉｔｚら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０：２３３５〜２３４２、２００４）。ＮＯ１６９６６は、プラセボまたはベバシズマブのいずれかと組み合わせたオキサリプラチンを主成分とする化学療法（ＸＥＬＯＸまたはＦＯＬＦＯＸ−４）を患者に与えた、ファーストラインの転移性ＣＲＣ試験であり、この特定の試験における化学療法へのベバシズマブの追加は、ＯＳの差異（副次的エンドポイント）は統計的有意性に届かなかったが、主要エンドポイントのＰＦＳを有意に改善した（Ｓａｌｔｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２６：２０１３〜２０１９、２００８）。ＶＤＶ遺伝子の発現が臨床転帰と相関し得るかどうかをテストするために、本発明者らは、ＸＥＬＯＸを含む治療群に登録された１０３人の患者（バイオマーカー評価可能な亜集団）由来の利用可能な治療前の保存腫瘍組織において、ＶＤＶ遺伝子の発現レベルを解析した。これらの臨床試料由来のＲＮＡの質および量が限られていたため、遺伝子発現は、４種の異なるハウスキーピング遺伝子（遺伝子発現のノーマライゼーション用）、ＶＥＧＦ（コントロールとして）、ならびに（ｉ）ＣＤ３１、ＣＤ３４およびＶＥ−ＣＡＤＨなどの、ＭＶＤの指標としての汎血管マーカー；（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、エフリンＢ２、ＮＲＰ、ＥＳＭ１、ＮＩＤ２、ＣＯＬ４ａ２およびＬＡＭＡ４ａを含めた、ＶＥＧＦ経路の重要な要素およびｐｒｏｘＶＤＶ遺伝子；および（ｉｉｉ）ＤＬＬ−４、Ｎｏｔｃｈ１、ＡＬＫ１およびＥＧＦＬ７を含めた、内皮シグナル伝達経路の成分であり、ＶＤＶ生物学の潜在的なモジュレーターであるさらなるＶＤＶ遺伝子を含む、２２種の代表的な近位および遠位ＶＤＶ遺伝子を含有する、以前に設計および検証した「血管新生」Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ｑＲＴ−ＰＣＲチップ（図８Ｂ）で解析した（このコンパクトな２２種のＶＤＶ遺伝子シグネチャーの検証のために図９Ａを参照されたい）。
【０２５７】
図８Ａは、本研究で調査したＮＯ１６９６６試験由来の１０３人の患者におけるＯＳおよびＰＦＳのカプランマイヤー分析を示す。これらの患者では、化学療法へのベバシズマブの追加は、統計的に有意なＰＦＳ（ＨＲ、０．５９；９５％ＣＩ、０．３７から０．９３；ｐ＝０．０２４）およびＯＳの利益（ＨＲ、０．４５；９５％ＣＩ、０．２３から０．８５；ｐ＝０．０１５）をもたらした。結腸がんの普及試料での予備的な実験によって、これらの２２種のＶＤＶ遺伝子の発現が高度に相関することが示されたので（図８Ｃ）、いずれかの個々の遺伝子の中央発現レベルまたは２２種のＶＤＶ遺伝子サブセットに対する中央発現スコアを、いずれの場合にも「高い」または「低い」のいずれかとしてＣＲＣ試料を分類するための根拠として使用することにした（図８Ｂ）。次いで、臨床転帰と「高い」または「低い」治療前の遺伝子発現との間の相関をテストした。以前に報告されたように、治療前のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベル単独による治療コホートの層別化は、ベバシズマブで治療した患者において、臨床転帰への差次的効果を示さなかった（図９Ｂ）。また、単一のｄｉｓｔＶＤＶ遺伝子（ＣＤ３１）の発現レベルによって「高い」および「低い」サブセットに分類された、ベバシズマブで治療した患者は、ＰＦＳの差異を示さなかったが、ＯＳの利益において傾向があった（図９Ｃ）。いずれの場合も、ＶＥＧＦまたはＣＤ３１と治療との間の相互作用は、いかなる予測効果も示さなかった。特に、同一患者集団を「ＶＤＶ高」集団対「ＶＤＶ低」集団に層別化したときに（図８Ｄ）、効果量および有意性は、ベースライン解析と比較して実質的に変化した。「ＶＤＶ低」患者（図８Ｄの点線）では、ベバシズマブと化学療法の組み合わせは、ＰＦＳ（ＨＲ、０．８８；９５％ＣＩ、０．４７から１．６２；ｐ＝０．６７）およびＯＳ（ＨＲ、０．５８；９５％ＣＩ、０．２５から１．３３；ｐ＝０．２）の両方において、化学療法単独と比較して軽度の増加を与えた。それとは対照的に、「ＶＤＶ高」患者（図８Ｄ、実線）では、化学療法へのベバシズマブの追加対化学療法単独は、顕著かつ有意なＰＦＳ（ＨＲ、０．３６；９５％ＣＩ、０．１７から０．７７；ｐ＝０．００７９）およびＯＳ（ＨＲ、０．３１；９５％ＣＩ、０．１１から０．９３；ｐ＝０．０３６）の利益をもたらした。治療とマーカー状態の間の相互作用は、ＰＦＳ（ｐ＝０．０３６）について有意な予測効果を示すが、「ＶＤＶ高」患者の相対危険率において改善が観察されたにもかかわらず、ＯＳ（ｐ＝０．３７）については統計的有意性に達しなかった。したがって、この比較的小さな１０３人の患者の試料セットでは、集団的なＶＤＶ遺伝子サブセットの高い発現は、特に化学療法へ追加したベバシズマブによってもたらされる臨床転帰の改善と相関し、ＰＦＳに関して予測効果を有する。
【０２５８】
実施例７．ＶＥＧＦアンタゴニストに対する患者の応答性または感受性のモニタリング
この実施例は、患者がＶＥＧＦアンタゴニストに対して応答性または感受性であるかどうかをモニターするためのアッセイを記載している。インフォームドコンセントと共に試料（例えば血液または組織生検物）を、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）で治療する前に１人または複数の患者から得る。周知の手順に従って、ＤＮＡおよび血清／血漿を単離する。この試料は、個体試料としてプールしてもよいし、維持してもよい。
【０２５９】
上記のように、表１または表２に記載される少なくとも１つの遺伝子の発現を、上記少なくとも１つの遺伝子についてｍＲＮＡを測定することによって、または上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされるタンパク質をＥＬＩＳＡを使用して検出することによって評価し、この評価は以下の置き換えを伴う：（１）マウス遺伝子（例えばＮｉｄ２）標準の代わりにヒト遺伝子（例えばＮｉｄ２）標準；（２）ビオチン標識化ヤギ抗マウス遺伝子（例えばＮｉｄ２）ポリクローナルＡｂの代わりにビオチン標識化ヤギ抗ヒト遺伝子（例えばＮｉｄ２）ポリクローナル抗体；および（３）０．５％ＢＳＡの代わりに１０％ＦＢＳ。本明細書に記載のように、試料が、コントロールと比べて、上記少なくとも１つの遺伝子の少なくとも２倍の発現増加を示す患者は、ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に応答性または感受性の患者として同定される。
【０２６０】
前述の発明は、理解を明瞭にする目的で、例示および実施例を通してある程度詳細に記載したが、その記載および実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、科学文献およびＧｅｎｂａｎｋの受託番号の開示は、あたかも各特許、特許出願、科学文献およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号が具体的かつ個別的に参照により組み込まれるように、すべての目的のために、その全体が参照により明示的に組み込まれる。そうした特許出願は、特に、本出願が利益を主張する、２０１２年１月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／５８６，６６０号を含む。
【図１Ａ】
2018082705.tif 000019
【図１Ｂ】
2018082705.tif 000020
【図１Ｃ】
2018082705.tif 000021
【図１Ｄ】
2018082705.tif 000022
【図２Ａ】
2018082705.tif 000023
【図２Ｂ】
2018082705.tif 000024
【図２Ｃ】
2018082705.tif 000025
【図２Ｄ】
2018082705.tif 000026
【図３】
2018082705.tif 000027
【図４Ａ】
2018082705.tif 000028
【図４Ｂ】
2018082705.tif 000029
【図４Ｃ】
2018082705.tif 000030
【図４Ｄ】
2018082705.tif 000031
【図４Ｅ】
2018082705.tif 000032
【図５Ａ】
2018082705.tif 000033
【図５Ｂ】
2018082705.tif 000034
【図６】
2018082705.tif 000035
【図７】
2018082705.tif 000036
【図８Ａ】
2018082705.tif 000037
【図８Ｂ】
2018082705.tif 000038
【図８Ｃ】
2018082705.tif 000039
【図８Ｄ】
2018082705.tif 000040
【図９Ａ】
2018082705.tif 000041
【図９Ｂ】
2018082705.tif 000042
【図９Ｃ】
2018082705.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月10日(2018.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2018082705000001.pdf