(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも1種の膜トランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、または細胞ストレス応答経路タンパク質の乱された発現を含む細胞の提供。【解決手段】薬物の吸収、分布、代謝および排出および/または毒物学的プロセスに関与する少なくとも1種のタンパク質の乱された発現を含み、タンパク質は、膜トランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、細胞ストレス応答経路タンパク質、およびその組合せから選ばれる、ヒト細胞系。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物の吸収、分布、代謝および排出および/または毒物学的プロセスに関与する少なく
とも1種のタンパク質の乱された発現を含み、タンパク質は、膜トランスポーター、薬物
代謝酵素、生体異物センサー、細胞ストレス応答経路タンパク質、およびその組合せから
選ばれる、ヒト細胞系。
【請求項２】
膜トランスポーターは、ABCA2、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4
、ABCC5、ABCC6、ABCC7、ABCC8、ABCC9、ABCC10、ABCC11、ABCC12、ABCC13、ABCG2、SLC1
0A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A7、SLC
16A8、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1C1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SL
C22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7 、SLC22A8、SLC22A9、
SLC22A11、SLC47A1、SLC47A2、OSTAおよびOSTBから選ばれる、請求項1のヒト細胞系。
【請求項３】
薬物代謝酵素は、CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D
6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、POR、FMO1、FMO2、FMO3、FMO4、FMO5、ADH、AOX、
ALDH3A1、ALDH3A2、AKR、CES1CES2、EPHX1、EPHX2、MAOA、MAOB、MPO、PTGS2、LPO、UGT1
A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7、UGT2B15、SULT1A1、SULT1A2、SULT1A3、
SULT1B1、 SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、NAT1、NAT2、TPMT、COMT、GSTA1、GSTA2、GSTA3
、GSTA4、GSTK1、GSTM1、GSTM2、GSTM3、GSTM4、GSTM5、GSTP1、GSTT1、およびGSTT2から
選ばれる、請求項1のヒト細胞系。
【請求項４】
生体異物センサーは、AhR、PXR、CAR、LXR、FXR、およびPPARから選ばれる、請求項1の
ヒト細胞系。
【請求項５】
細胞ストレス経路タンパク質は、HSF1、Hsp90、Hsp27、Hsp70、HIF1、VHL、VEGF、PDK1
、GLUT1、XBP1、ATF4、ATF6、BiP/Grp78、PERK、IRE1、CHOP、P58、p53、ATM、ATR、MDM2
、p21、GADD45、BAX、RAD51、Nrf2、Keap1、HMOX1、PRDX1、GSTA2、p66Shc、NFKB、IKB、
COX2、iNOS、ICAM、IL-6、およびIL-8から選ばれる、請求項1のヒト細胞系。
【請求項６】
さらに、少なくとも１種のレポータータンパク質の発現を含む、請求項1のヒト細胞系
。
【請求項７】
発現は、実質機能しないタンパク質、低下したレベルのタンパク質、増大したレベルの
タンパク質、またはタンパク質の改変バージョンを細胞が生じるように乱される、請求項
1のヒト細胞系。
【請求項８】
タンパク質をコードする染色体の配列は、少なくとも1種のヌクレオチドの欠失、少な
くとも1種のヌクレオチドの挿入、少なくとも1種のヌクレオチドの置換、またはその組合
せによって修飾される、請求項1のヒト細胞系。
【請求項９】
細胞は、修飾された染色体の配列についてヘテロ接合、ホモ接合、またはヘミ接合であ
る、請求項８のヒト細胞系。
【請求項１０】
発現は、ターゲティングエンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集、RNA干渉、および相同組
換えから選ばれる技術によって乱される、請求項1のヒト細胞系。
【請求項１１】
ターゲティングエンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項10
のヒト細胞系。
【請求項１２】
細胞は、それがBCRPタンパク質を実質生じないように不活化ABCG2の染色体の配列を含
み、および/または細胞は、それがMDR1タンパク質を実質生じないように不活化ABCC1の染
色体の配列を含む、請求項1のヒト細胞系。
【請求項１３】
さらに、少なくとも１種のレポータータンパク質の発現を含む、請求項12のヒト細胞系
。
【請求項１４】
さらに、膜トランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、細胞ストレス応答経
路タンパク質、およびその組合せから選ばれる少なくとも1種の追加のタンパク質の乱さ
れた発現を含む、請求項12または請求項13のいずれかのヒト細胞系。
【請求項１５】
薬剤の効果を評価するための方法であって、
ａ）薬物の吸収、分布、代謝および排泄および/または毒物学的プロセスに関与する少
なくとも1種のタンパク質の乱された発現を含む細胞であり、タンパク質が、膜トランス
ポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、細胞ストレス応答経路タンパク質、および
その組合せから選ばれるものを薬剤と接触させること、および
ｂ）選ばれたパラメーターの結果を、比較用野生型細胞を同じ薬剤と接触させることか
ら得られる結果と比較すること
を含む、方法。
【請求項１６】
薬剤は、製薬上の活性成分、治療薬、毒素、および化学物質から選ばれる、請求項15の
方法。
【請求項１７】
膜トランスポーターは、ABCA2、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4
、ABCC5、ABCC6、ABCC7、ABCC8、ABCC9、ABCC10、ABCC11、ABCC12、ABCC13、ABCG2、SLC1
0A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A7、SLC
16A8、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1C1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SL
C22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8 、SLC22A9、
SLC22A11、SLC47A1、SLC47A2、OSTAおよびOSTBから選ばれる、請求項15の方法。
【請求項１８】
薬物代謝酵素は、CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D
6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、POR、FMO1、FMO2、FMO3、FMO4、FMO5、ADH、AOX、
ALDH3A1、ALDH3A2、AKR、CES1、CES2、EPHX1、EPHX2、MAOA、MAOB、MPO、PTGS2、LPO、UG
T1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7、UGT2B15、SULT1A1、SULT1A2、SULT1A3
、SULT1B1、 SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、NAT1、NAT2、TPMT、COMT、GSTA1、GSTA2、GST
A3、GSTA4、GSTK1、GSTM1、GSTM2、GSTM3、GSTM4、GSTM5、GSTP1、GSTT1、およびGSTT2か
ら選ばれる、請求項15の方法。
【請求項１９】
生体異物センサーは、AhR、PXR、CAR、LXR、FXR、およびPPARから選ばれる、請求項15
の方法。
【請求項２０】
細胞ストレス経路タンパク質は、HSF1、Hsp90、Hsp27、Hsp70、HIF1、VHL、VEGF、PDK1
、GLUT1、XBP1、ATF4、ATF6、BiP/Grp78、PERK、IRE1、CHOP、P58、p53、ATM、ATR、MDM2
、p21、GADD45、BAX、RAD51、Nrf2、Keap1、HMOX1、PRDX1、GSTA2、p66Shc、NFKB、IKB、
COX2、iNOS、ICAM、IL-6、およびIL-8から選ばれる、請求項15の方法。
【請求項２１】
細胞はさらに、少なくとも1種のレポータータンパク質の発現を含む、請求項15の方法
。
【請求項２２】
発現は、実質機能しないタンパク質、低下したレベルのタンパク質、増大したレベルの
タンパク質、またはタンパク質の改変バージョンを細胞が生じるように乱される、請求項
15の方法。
【請求項２３】
タンパク質をコードする染色体の配列は、少なくとも1種のヌクレオチドの欠失、少な
くとも1種のヌクレオチドの挿入、少なくとも1種のヌクレオチドの置換、またはその組合
せによって修飾される、請求項15の方法。
【請求項２４】
細胞は、修飾された染色体の配列についてヘテロ接合、ホモ接合、またはヘミ接合であ
る、請求項23の方法。
【請求項２５】
細胞は、それがBCRPタンパク質を実質生じないように不活化ABCG2の染色体の配列を含
み、および/または細胞は、それがMDR1タンパク質を実質生じないように不活化ABCC1染色
体の配列を含む、請求項15の方法。
【請求項２６】
細胞はさらに、少なくとも１種のレポータータンパク質の発現を含む、請求項25の方法
。
【請求項２７】
細胞はさらに、膜トランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、細胞ストレス
応答経路タンパク質、およびその組合せから選ばれる少なくとも1種の追加のタンパク質
の乱された発現を含む、請求項25または請求項26のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野を記載する。本開示は、概して薬物の吸収、分布、代謝および排泄（ADME
）および/または毒物学的プロセスに関与する少なくとも1種のタンパク質の乱された発現
を有する細胞に関する。特に、乱された発現を有するタンパク質には、制限はないが、膜
トランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、および細胞ストレス応答経路タン
パク質類が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を記載する。新薬候補の薬物動態、有効性および安全性のプロファイルは
、膜トランスポーター、薬物代謝酵素（DMEs）、および細胞ストレス応答経路との相互作
用によって著しく影響を受けることがありうる。たとえば、膜トランスポーターとの相互
作用は、薬物の腸内吸収、全体分布および腎クリアランスに影響を及ぼし、その一方、薬
物代謝経路は、薬物動態プロファイル、親分子の代謝クリアランスおよび潜在的に有害な
代謝産物の形成において主要な役割を果たす。これらの二つのシステム（トランスポータ
ーおよび薬物代謝経路）はまた、有害な薬物-薬物相互作用（DDIs）の可能性を評価する
主な決定要因である。生体異物センサーおよび細胞ストレス応答経路は、細胞が生体異物
への曝露に対する反応を可能にし、そしてその化合物の毒性および副作用を媒介すること
が多い。したがって、これらのシステム上での新薬候補の潜在的な相互作用および副作用
のより一層良好な理解は、全体的な初期創薬スクリーニングプロセスを改善するための鍵
となる。加えて、規制当局からのこれらのシステムに関する追加情報の要求が高まってい
ると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
膜トランスポーター、薬物代謝、生体異物センサーおよびストレス応答経路の膨大な数
のメンバーがある。これらの多くのものについては、特定の機能、基質、および/または
インヒビターがいまだに説明されていない。たとえば、400よりも多くのトランスポータ
ーが存在し、そして少なくとも57のチトクロームP450（薬物代謝）遺伝子がヒトゲノムに
おいて知られている。より多くのものが上記の各システムについて知られれば、より一層
正確な前臨床薬物スクリーニングプロセスが可能になる。薬物の大部分（およそ91％）は
、ヒトでの薬物検査の第三相を好首尾に完了するのに失敗する。それらの薬物の失敗する
大部分は、ヒト患者における予見できない毒性のために、これらの薬物のすべてを動物モ
デルで試験して安全であることが分かったという事実にもかかわらず、そうなる。これは
、一部分では、毒性試験が動物において行われ、そして動物性タンパク質がヒトにおいて
オーソロガスタンパク質とは異なるという事実に、また、ヒト細胞を使用する適切なテス
トシステムの不足にも起因する。
【０００４】
したがって、この技術分野で必要とされるのは、ADMEおよび毒物学的プロセスに関し、
たとえば、トランスポーター、DMEs、生体異物センサー、および細胞ストレス応答経路の
ようなものに関与する内在性遺伝子について変異しているヒト細胞であり、その変異がノ
ックアウト、ノックダウン、ノックイン、過剰発現、またはSNPsを有する臨床的に有意な
変形、またはそれらの任意の組合せとして乱された発現につながるかどうかにかかわらな
いものである。そのような遺伝的に修飾された細胞は、前臨床創薬プロセスを改善し、そ
して共に安全、かつ、有効な新たな化合物を識別するために使用することができる強力な
新しいツールを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明の概略を記載すると、簡潔には、本開示は、膜トランスポーター、
薬物代謝酵素、生体異物センサー、細胞ストレス応答経路タンパク質、およびその組合せ
から選ばれる少なくとも一種のタンパク質の乱された発現を含むヒト細胞系を提供する。
【０００６】
本開示のもう一つの見地は、薬剤の効果を評価するための方法を包含し、そこではその
方法は、少なくとも一種のトランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサーまたは細
胞ストレス反応経路の乱された発現を有する細胞を、薬剤と接触させること、および選ば
れたパラメーターの結果を、比較用野生型細胞と同じ薬剤との接触から得られる結果と比
較することを含む。
【０００７】
開示の他の見地およびイテレーション（反復）を、以下にさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】野生型（WT）腸上皮細胞系C2BBe1におけるもの（オープンバー）の、ABCG2（BCRP）トランスポーター機能的ノックアウト（BCRP/KO）を有する同じ系（ソリッドバー）に対しての三つの化合物（エストロン-3-サルフェート、ジゴキシンおよびCDCFDA）の流出比を示す。アテノロールおよびメトプロロールをコントロール化合物として用いた。
【図２】二つのシングルトランスポーターノックアウト細胞系（BCRP KOおよびMDR1 KO）およびダブルノックアウト細胞系（MDR1/BCRP KO）におけるものの、親細胞系（C2BBe1、WT）に対してのエストロン-3-サルフェートおよびジゴキシンの流出比を比較する。メトプロロールをコントロール化合物として用いた。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の詳細な記載を行う。本開示の様々な見地（以下、「態様」とも言う。）の中で
、膜トランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、細胞ストレス応答経路タンパ
ク質から選択される少なくとも一つのADME/Toxタンパク質の乱された発現を含む細胞の集
団が提供される。本発明の細胞は、少なくとも一つのADME/Toxタンパク質の発現が実質排
除されるように、不活性化された染色体の配列（複数可、以下「群」とも言う。）を含ん
でもよい。また、薬剤をスクリーニング（選別）するために、またはADME/Toxタンパク質
またはタンパク質群の乱された発現を含む細胞において薬剤の効果を評価するために、本
発明の細胞を使用する方法も提供される。
【００１０】
（I）ADME/Toxタンパク質（群）の乱された発現を含む細胞
【００１１】
本開示の一態様には、薬物の吸収、分布、代謝、および排泄（ADME）および/または毒
物学的〔Tox（トックス）〕プロセスに関与する少なくとも一つのタンパク質の乱された
（disrupted、崩壊された）発現を含む細胞が包含される。ここで用いるように、用語「A
DME/Tox」は、薬物の吸収、分布、代謝、および排泄および/または毒物学的プロセスに関
与するタンパク質（およびそれらの対応する遺伝子）に言及する。ADME/Toxタンパク質に
は、制限されないが、膜トランスポーター（膜輸送体）、薬物代謝酵素、生体異物センサ
ー、および細胞ストレス応答タンパク質が含まれる。少なくとも一つのADME/Toxタンパク
質の乱された発現のため、ここに開示した細胞は、薬物の吸収、処分、および/または応
答に関して応答を改変され（altered）ていることがある。
【００１２】
ここに開示した細胞において、少なくとも一つのADME/Toxタンパク質は、細胞が、実質
機能しない（substantially no functional）タンパク質を生じ（すなわち、細胞はノッ
クアウトと名付けられることができ）、タンパク質の低下したレベルを生じ（すなわち、
細胞はノックダウンと名付けられることができ）、タンパク質の増大したレベル、または
タンパク質の修飾バージョンを生じるように、発現を乱される。
【００１３】
好適具体化（好適実施形態）では、少なくとも一つのADME/Toxタンパク質の乱された発
現は、ADME/Toxタンパク質をコードする染色体の配列の修飾に起因することができる。細
胞は、修飾された染色体の配列についてホモ接合、ヘテロ接合、またはヘミ接合であって
よい。
【００１４】
ADME/Toxタンパク質をコードする染色体の配列は、少なくとも一つのヌクレオチドの欠
失、少なくとも一つのヌクレオチドの挿入、または少なくとも一つのヌクレオチドの置換
によって修飾されうる。若干の実施形態において、興味あるまたは関心のあるADME/Toxタ
ンパク質をコードする染色体の配列は、関心のあるタンパク質が細胞によって実質的に作
成されないように、少なくとも一つの欠失により不活性化することができる。たとえば、
関心のあるADME/Toxタンパク質をコードする染色体の配列は、コーディング領域のすべて
、または一部の欠失、コントロール領域のすべて、または一部の欠失、スプライス部位の
欠失または崩壊、成熟前（premature）コドンを導入する置換、またはその組合せを、細
胞が本質的に機能性でないタンパク質を生じるように含むことができる。
【００１５】
他の実施形態において、関心のあるADME/Toxタンパク質をコードする染色体の配列は、
タンパク質の減少したレベルが形成されるように修飾されうる。たとえば、関心のあるAD
ME/Toxのタンパク質をコードする染色体の配列は、コード領域における欠失、挿入および
/または置換、および/または制御領域における欠失、挿入および/または置換を、細胞が
タンパク質を減少したレベルで生成するように含みうる。
【００１６】
さらに他の実施形態において、関心のあるADME/Toxタンパク質をコードする染色体の配
列は、タンパク質の改変されたバージョンが生成されるように修飾することができる。た
とえば、染色体の配列は、シングルヌクレオチド変化（例は、SNP）を含むように修飾し
うる。SNPの位置に応じて、タンパク質の改変されたバージョンは、細胞によって産生さ
れうる。あるいはまた、関心のあるADME/Toxタンパク質をコードする染色体の配列は、細
胞がタンパク質の改変されたバージョンを生成するようにコーディング領域における欠失
、挿入、または置換によって修飾されうる。改変された（以降単に「改変」と称す）タン
パク質は、改変基質特異性、改変結合相互作用、改変動力学、改変輸送速度、改変指向性
、改変細胞局在、改変タンパク質相互作用、改変安定性、などを有することができる。
【００１７】
さらなる実施形態において、関心のあるADME/Toxタンパク質をコードする染色体の配列
は、細胞がタンパク質を増加したレベルで生成するように、欠失、挿入、および/または
置換を介して修飾されうる。すなわち、タンパク質は過剰発現させることができる。
【００１８】
一実施形態において、細胞は、一つのADME/Toxタンパク質の乱された発現を含むことが
できる。別の実施形態では、細胞は、二つのADME/Toxタンパク質の乱された発現を含みう
る。さらに別の実施形態では、細胞は、三つのADME/Toxタンパク質の乱された発現を含ん
でもよい。さらなる実施形態では、細胞は、四つのADME/Toxタンパク質の乱された発現を
含むことができる。さらに別の実施形態では、細胞は五つ以上のADME/Toxタンパク質の乱
された発現を含んでもよい。
【００１９】
別の実施形態において、細胞は、一つのADME/Toxタンパク質の発現が実質的に排除され
る（すなわち、ノックアウトの）ように一つの不活性化された染色体の配列を含むことが
できる。さらに別の実施形態では、細胞は、二つのADME/Toxタンパク質の発現が実質的に
排除される（すなわち、ノックアウトの）ように二つの不活性化された染色体の配列を含
んでもよい。別の実施形態では、細胞は、三つのADME/Toxタンパク質の発現が実質的に排
除される（すなわち、ノックアウトの）ように三つの不活性化された染色体の配列を含ん
でもよい。さらに別の実施形態では、細胞は、四つ以上のADME/Toxタンパク質の発現が実
質的に排除される（すなわち、ノックアウトの）ように、四つ以上の不活性化された染色
体の配列を含んでもよい。
【００２０】
さらなる実施形態において、細胞は少なくとも一つの膜トランスポーターの乱された発
現、および随意に、少なくとも一つの追加のADME/Toxタンパク質の乱された発現を含んで
もよい。さらに別の実施形態では、細胞は少なくとも一つの薬物代謝酵素の乱された発現
、および随意に、少なくとも一つの追加ADME/Toxタンパク質の乱された発現を含むことが
できる。代わりの実施形態、実施態様では、細胞は、少なくとも一つの生体異物センサー
の乱された発現、および随意に、少なくとも一つの追加ADME/Toxタンパク質の乱された発
現を含むことができる。さらに別の実施形態では、細胞は、少なくとも一つの細胞ストレ
ス応答タンパク質の乱された発現、そして、随意に、少なくとも一つの追加ADME/Toxタン
パク質の乱された発現を含みうる。
【００２１】
適切な膜トランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、および細胞ストレス応
答タンパク質の非制限的な例を、以下に詳述する。
【００２２】
ここで用いる遺伝子名称は、ヒト遺伝子を参照する一方、他の動物、無脊椎動物で、た
とえば、C. elegans〔Caenorhabditis elegans（カエノラブディティス・エレガンス）、
線虫〕およびD. melanogaster〔Drosophila melanogaste（ドロソフィラ・メラノガスタ
ー）、キイロショウジョウバエ〕のようなもの、および哺乳動物で、制限されないが、マ
ウス、ラット、ハムスター、ネコ、イヌおよびサルが含まれるようなものを含むものの中
で同定されたこれらのうちの任意のものの近いホモローグが包含されることを理解すべき
である。近いホモローグは、配列分析、系統発生解析、機能アッセイ、などによって識別
することができる。
【００２３】
（a）トランスポータータンパク質
【００２４】
種々の実施形態において、ADME/Toxタンパク質は膜トランスポーターであってよい。ト
ランスポーターは細胞膜を通過する分子の動きに関与する。薬物吸収および処分に関与す
るトランスポータータンパク質は、2つの主要なグループ、すなわち、ATP結合カセット（
ABC）トランスポータースーパーファミリーおよび溶質キャリヤー（SLC）スーパーファミ
リーからのメンバーを意味する。知られている少なくとも49の遺伝子を有するABCトラン
スポーターの七つのサブファミリーが目下のところ存在する。ABCトランスポーターのス
ーパーファミリーのいくつかのメンバーは、薬物耐性に関与することが知られている（例
は、BCRP、MDR1）。比較すると、SLCトランスポーターには、少なくとも362の機能性タン
パク質のコーディング遺伝子を有する55のファミリーを含む。ADME/Toxアプリケーション
に関してABCおよびSLCトランスポーターファミリーの双方の最も関連性の高いメンバーを
以下の表AおよびBにリストする。
【００２５】
【表１】
2018078905.tif 000002
【００２６】
【表２−１】
2018078905.tif 000003
【表２−２】
2018078905.tif 000004
【００２７】
（ｉ）ABCトランスポータースーパーファミリー
【００２８】
ABCトランスポータータンパク質は、膜輸送タンパク質の大規模で、重要なスーパーフ
ァミリーであり、動物界に遍在する。これらの貫膜タンパク質はATPを加水分解し、そし
てしばしば濃度勾配に対して、細胞内および細胞外の膜を通過する分子のトランスロケー
ション（移行）を含む様々な他の機能に動力供給するためにエネルギーを用いる。〔レビ
ューのために、Higgins（ヒギンズ）, C. F.、ABC transporters: from microorganisms 
to man（ABCトランスポーター：微生物から人間まで）、Annu. Rev. Cell Biol.（アニュ
アル・レビュー・オブ・セル・バイオロジー）867-113（1992）；Dean（ディーン）M.、H
uman ABC Transporter Superfamily（ヒトABCトランスポータースーパーファミリー）、B
ethesda（ベセスダ）（MD、メリーランド州）：National Center for Biotechnology Inf
ormation（ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション）
（US、米国）；2002年11月18日、www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=mono_0
01にてオンライン利用可能；およびVasiliou（バシリウ）Vら、Human ATP-binding casse
tte (ABC) transporter family｛ヒトATP結合カセット（ABC）トランスポーターファミリ
ー｝、Hum Genomics（ヒューマン・ゲノミクス）3、281-290（2009）を参照。〕。ADME/T
oxアプリケーションに関連するヒトABCトランスポーター遺伝子の非制限的な例を表Aに挙
げる。
【００２９】
ABCトランスポーター遺伝子における遺伝的変動は、ヒト疾患の多種多様な原因または
要因となるかもしれない。たとえば、CFTR〔嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（cy
stic fibrosis transmembrane conductance regulator）〕タンパク質における変異は、
嚢胞性線維症に関与する。加えて、一定のABCトランスポーターの過剰発現は、多剤耐性
であるガン細胞系または腫瘍において生じ、明らかに、一定のガン細胞が一定の化学療法
剤を追出すことを可能にする。疾患または状態に関連する非制限的な例のABCトランスポ
ーターには、たとえば、タンジール（Tangier）病および家族性ハイポアポタンパク質血
症（familial hypoapoproteinemia）に関連するABCA1；Stargardt's disease（シュタル
ガルト病）、黄色斑眼底（fundus flavimaculatis）、網膜色素変性（retinitis pigment
osum）、錐体杆体（コーンロッド）ジストロフィー、および加齢黄斑変性に関連するABCA
4；イベルメクチン感受性およびジゴキシンの取込みに関連するABCB1；免疫不全に関連す
るABCB2；免疫不全に関連するABCB3；プログレッシブ（進行性）家族性肝内胆汁うっ滞お
よび妊娠の肝内胆汁うっ滞に関連するABCB4；X連鎖鉄芽球症（X-linked sideroblastosis
）および貧血に関連するABCB7；プログレッシブ家族性肝内胆汁うっ滞に関連するABCB11
；Dubin-Johnson Syndrome（デュビン・ジョンソン症候群）に関連するABCC2；弾力線維
性仮性黄色腫（pseudoxanthoma elasticum）に関連するABCC6；嚢胞性線維症、精管、膵
炎、および気管支拡張の先天性両側性欠如（congential bilateral absence）に関連する
ABCC7；幼少期の家族性の永続的な高インスリン性低血糖に関連するABCC8；副腎脳白質ジ
ストロフィーに関連するABCD1；シトステロール血症に連結されるABCG5が含まれる。
【００３０】
ABCトランスポーターのスーパーファミリーは、さらに系統解析およびイントロン構造
に基づいてサブファミリーに細分される。
【００３１】
1）ABCAサブファミリー
【００３２】
このサブファミリーには、六つの異なる染色体にわたり散見される七つの遺伝子の第一
のサブグループ（ABCA1、ABCA2、ABCA3、ABCA4、ABCA7、ABCA12、ABCA13）および染色体1
7q24上で一緒にクラスター化された五つの遺伝子の第二のサブグループ（ABCA5、ABCA6、
ABCA8、ABCA9、ABCA10）を含め、十二のフルトランスポーターが含まれる。ABCA1およびA
BCA4（ABCR）は、徹底的に調査され、コレステロール輸送およびHDL生合成の疾患におけ
るABCA1タンパク質の、および視覚におけるABCA4タンパク質の関与が明らかにされ、それ
は、それがビタミンA誘導体を杆体視細胞（ロッド光受容体）の外側のセグメントにおい
て輸送するからである。模範的なメンバーを以下に詳述する。
【００３３】
ABCA2：全長ヒトABCA2のcDNAおよびその詳細な発現パターンは十分に特徴付けられてい
る。ABCA2は、胎仔および成体の脳、脊髄、卵巣、前立腺および白血球において最高レベ
ルを示した。ABCA2の発現は、肺、腎臓、心臓、肝臓、骨格筋、膵臓、精巣、脾臓、結腸
および胎仔肝臓を含め、他の組織において検出されている。ABCA2タンパク質の細胞免疫
学的局在性は、ペルオキシソームであるという仮説を立てた小胞に対応する明確な、点状
の染色を明らかにした。小胞特異的な抗体を用いたさらなる分析は、レイトエンドソーム
（late endolysomes）およびトランスゴルジ（transgolgi）小器官を伴うABCA2の局在を
明らかにした。ABCA2タンパク質はABCA1、ABCA3、ABCA、ABCA6、ABCA7を含め、他のAサブ
ファミリータンパク質とほとんどの相同性を共有する。ABCA2配列におけるリポカリンシ
グネチャーモチーフは、脂質、ステロイドおよび構造的に類似した分子で、エストラムス
チンおよびエストラジオールなどのようなものの輸送における機能を示唆する。一実施形
態では、乱された発現を有するトランスポーターはABCA2でありうる。
【００３４】
2）ABCB（MDR / TAP）サブファミリー
【００３５】
このサブファミリーには、4つのフルトランスポーターおよび7つのハーフトランスポー
ターが含まれる。ABCB2およびABCB3（TAP）の遺伝子は、ヘテロダイマー（ヘテロ二量体
）を形成するハーフトランスポーターであり、それはER中にペプチドを輸送し、次いでそ
れはクラスIのHLA分子によって抗原として提示される。ABCB9ハーフトランスポーターは
リソソームに局在される。ABCB6、ABCB7、ABCB8、およびABCB10、すべてのハーフトラン
スポーターは、ミトコンドリア内に位置しており、そこでそれらは鉄代謝およびFe / Sタ
ンパク質前駆体の輸送に機能する。模範的なABCBサブファミリーのメンバーを、以下に詳
述する。
【００３６】
ABCB1：ABCA1はまた、MDR1またはPGY1として知られ、血液脳関門にて、および肝臓にお
いて機能トランスポータータンパク質がコードし、およびガン細胞にMDR表現型を与える
ことが知られている。ABCB1は染色体7q21.1に対してマップされ、そしてよく特徴付けら
れたABCトランスポーターであり、化学療法薬への耐性を発達させたガン細胞に対して多
剤耐性の表現型を与えることが知られている。トランスポーターは、コルヒチン、エトポ
シド（VP16）、アドリアマイシン（Adriamycin）、およびビンブラスチン、およびまた脂
質、ステロイド、生体異物、およびペプチドなどのような薬物を含め、疎水性基質を移動
する。それは血液脳関門での細胞において発現され、拡散による配送に適していない脳内
へ化合物を輸送すると考えられる。タンパク質はまた、腎臓、肝臓、腸、および副腎、な
どのような多くの分泌細胞型において発現され、そこではその正常な機能は、おそらく毒
性代謝産物を排出することに関与する。 ABCB1はまた、造血幹細胞で高度に発現され、細
胞毒の影響から細胞を保護することができる。ABCB1はまた、樹状細胞の移動にかかわっ
ている。ABCB1発現は、腸、肝臓および腎臓で検出されている。別の実施形態では、乱さ
れた発現を有するトランスポーターはABCB1でありうる。
【００３７】
ABCB4：またMDR3として知られるが、ABCB4タンパク質は肝臓で発現し、そして胆汁酸の
分泌に関与する。ABCA4は腸内で発現される。ABCB4タンパク質は一定のリン脂質を、細胞
膜を横切って輸送する。多量の胆汁酸は、もしそれらがリン脂質に結合していないならば
、潜在的に細胞に有害である。若干のABCB4遺伝子変異は、細胞膜を横切るリン脂質の動
きを損ない、胆汁酸に結合するのに利用可能なリン脂質の欠如を導く。遊離胆汁酸の蓄積
は肝細胞を損傷し、それは肝疾患の徴候および症状を引き起こす。したがってABCA4は、
肝細胞機能での重大な役割を果たすと考えられる。ABCB4遺伝子での変異の別のグループ
は、プログレッシブ家族性肝内胆汁鬱滞（うっ滞）タイプ3（PFIC3）を引き起こすことが
見出された。一定のABCB4遺伝子変異を有する女性は、妊娠中の肝内胆汁うっ滞の条件（I
CP）を有する危険性がある。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポ
ーターは、ABCB4でありうる。
【００３８】
ABCB11：またBSEP（胆汁酸塩排出ポンプ）またはSPGPとして知られるが、ABCB11は肝臓
および腎臓において発現する。ABCB11遺伝子での100よりも多い変異はプログレッシブ家
族性肝内胆汁うっ滞タイプ2（PFIC2）を引き起こすことが見出された。機能しない（no f
unctional）BSEPタンパク質を有する人々はまた、肝細胞ガンを発症するリスクがより一
層高いように見える。ABCB11遺伝子での変異は、BSEPタンパク質が胆汁酸塩を肝臓から効
果に輸送することを防ぐ。輸送のこの欠如は、胆汁酸塩を肝細胞中に蓄積させ、肝疾患お
よびそれに関連する徴候および症状が導かれる。このような良性反復性肝内胆汁うっ滞（
BRIC）、妊娠の肝内胆汁うっ滞（ICP）などのような他の疾患は、またABCB11遺伝子に関
係する。さらなる実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターは、ABCB11であ
りうる。
【００３９】
3）ABCC（CFTR/MRP）サブファミリー
【００４０】
ABCCサブファミリーには、CFTRタンパク質を含め、十二のフルトランスポーターが含ま
れ、それはすべての外分泌液での役割を果たす塩化物イオンチャネルである。模範的なメ
ンバーを以下に詳述する。
【００４１】
ABCC1：ABCC1は多剤耐性関連タンパク質1（MRP1）をエンコードし、それは多選択性（m
ultispecific、多特異性）アニオントランスポーターに機能する。ABCC1遺伝子は染色体1
6p13.1にマップされ、そして腫瘍細胞において発現される。ABCC1（MRP1）ポンプは、ド
キソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、コルヒチン、およびいくつかの他の化
合物に対する耐性を、ABCB1のものと同等（comparable、比較用）の効果と共に付与する
。しかし、ABCB1と違い、ABCC1は、グルタチオンレダクターゼ（グルタチオン還元酵素）
経路によってグルタチオンにコンジュゲートされる薬物を輸送する。マウスにおけるAbcc
1遺伝子の混乱は、それらの炎症反応を阻害し、そして抗ガン剤エトポシドに対する過敏
性を付与する。ABCC1タンパク質はまた、化学的毒性および酸化ストレスから細胞を保護
するのに役立ち、およびシステイニルロイコトリエンに関与する炎症性応答を媒介すると
考えられる。証拠はABCC1が腸、肝臓および腎臓で発現されることを示した。一実施形態
では、乱された発現を有するトランスポーターはABCC1でありうる。
【００４２】
ABCC2：またMRP2として知られており、ABCC2は染色体10q24にマップされ、そして肝臓
において小管細胞（canalicular cells）に局在する。それは、肝臓から胆汁中への有機
アニオンの主要なエクスポーター（輸出体）である。MRP2遺伝子は、TR-ラット、黄疸お
よび有機イオン輸送での欠乏によって特徴付けられるラット系統において変異することが
知られる。その遺伝子はまた、ヒトDubin-Johnson syndrome（デュービン・ジョンソン症
候群）の患者において変異し、その者は有機イオン輸送の混乱の症状に苦しむ。また、証
拠は薬剤耐性においてMRP2過剰発現に関係しているとみる。ABCC2の発現は、腸、肝臓お
よび腎臓においって検出された。別の実施形態において、乱された発現を有するトランス
ポーターはABCC2でありうる。
【００４３】
ABCC3：またMRP3として知られ、ABCC3は腸、肝臓および腎臓に発現する。ABCC3によっ
てコードされるタンパク質は、小管多選択性有機アニオントランスポーター2である。ABC
C2およびABCC3は、薬物および発ガン性物質などのような毒性化合物の除去を媒介し、お
よび基質特異性において大きな重複部分を有する。たとえば、ABCC3タンパク質は、抗ガ
ン剤メトトレキサート（MTX）およびその毒性代謝物7 ヒドロキシメトトレキサートを肝
臓からその循環中に輸送することが示され、増加した血しょうレベルおよび尿中排泄が導
かれ、そして従ってMTXの毒性の除去および重症度において非常に大きな影響を有する。A
BCC3もまたトラベクテジン媒介肝毒性から保護する。加えて、ABCC3は小腸における腸細
胞から門脈血へのさまざまなグルクロン酸抱合体の排出輸送に大きな役割を果たす。さら
に別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはABCC3でありうる。
【００４４】
ABCC4：また、多剤耐性関連タンパク質4（MRP4）または多選択性有機アニオントランス
ポーターB（MOAT-B）として知られ、ABCC4は、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルの
レギュレーター（制御因子）として、および核へのcAMP依存性シグナル伝達のメディエー
ター（媒介物質）としてふるまう。ヒドロクロロチアジド（HCT）およびフロセミドの尿
中排泄におけるMRP4の機能的重要性は、遺伝子ノックアウトマウスを用いて調べられた。
HCTおよびフロセミドの腎クリアランスは大幅に減少したが、Mrp4ノックアウトマウスに
おいて消滅されなかった。したがって、Mrp4は、他の未知のトランスポーターと一緒に、
近位尿細管上皮細胞からHCTおよびフロセミドの管腔排出（luminal efflux）を説明する
。加えて、脳からのトポテカンの除去が遅れ、しかもその上、脳脊髄液中のトポテカンの
濃度がMrp4ノックアウトマウスで大いに高められ、それは、脳血液関門を横切るトポテカ
ンの取込みおよび排出でのABCC4の役割を示す。さらに別の実施形態では、乱された発現
を有するトランスポーターはABCC4でありうる。
【００４５】
ABCC5：ABCC5（MRP5）は典型的な有機アニオンポンプであるが、他のABCCタンパク質と
比較してN末端貫膜ドメインを有さない。インビトロでの輸送の研究は、cGMP、ヌクレオ
シド一リン酸類似体、重金属化合物および蛍光色素を含め、多数の化合物のための細胞の
輸出ポンプとしてABCC5を識別した。ABCC5トランスフェクトされた細胞はまた、抗ガン剤
および抗ウイルス薬に耐性を示す。ABCC5遺伝子は、広く、心臓、脳、骨格筋、腎臓およ
び精巣において最高レベルを伴ってヒト組織中で転写される。さまざまなABCC5転写産物
、潜在ドナースプライス部位（cryptic donor splice site）の代替使用により形成され
たスプライスバリアント（スプライス変異）が、豊富にヒトの網膜に発現するが、他の多
くの組織にも、さまざまなレベルで存在する。ABCC5 mRNAの選択的スプライシングは、AB
CC5遺伝子発現の組織依存性調節のためのエレガントなメカニズムを提供することができ
る。代わりの実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはABCC5でありうる
。
【００４６】
ABCC6：またMRP6として知られるが、ABCC6は、膜トランスポーターであり、その欠乏は
結合組織疾患を導く。具体的には、弾性線維性仮性黄色腫（PXE）や、皮膚、心臓血管系
および眼の弾性線維の石灰化と断片化によって特徴付けられる遺伝病は、ABCC6遺伝子の
変異によって引き起こされる。Abcc6（マウス）の発現は、局所鉱化制御システム（local
mineralization regulatory system）および石灰化の全身的な調節に関与することが知
られているBMP2-Wntシグナル伝達経路と大いに相関し、心筋石灰化におけるAbcc6の作用
のための潜在的な経路が示唆される。ABCC6はまた、ステロール輸送に関与し、それはス
テロールがABCAトランスポーター活性および発現の優先的な調節因子だからである。さら
なる実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはABCC6でありうる。
【００４７】
ABCC7：また、CFTR（膜コンダクタンス制御因子）として知られているが、ABCC7は、ク
ロライドチャネルとして機能し、他の輸送経路の調節をコントロールする。ABCC7もまた
、SLC4A7トランスポーターを調節することによって、上皮細胞における重炭酸塩分泌およ
びサルベージ（再利用）を調節することができる。この遺伝子における変異は、常染色体
劣性遺伝疾患の嚢胞性線維症および輸精管の先天性両側性形成不全（congenital bilater
al aplasia）と関係する。CFTR遺伝子における千よりも多くの異なる変異が世界的に検出
されている。選択的にスプライスされた転写産物変異体（トランスクリプトバリアント）
がまた説明されており、その多くはこの遺伝子における変異からの結果である。CFTRの不
存在または機能不全は、呼吸器、腸および生殖器系、ならびに他の分泌および再吸収性上
皮の上皮表面での異常なイオンおよび液体ホメオスタシス（liquid homeostasis）をもた
らす。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはABCC7であり
うる。
【００４８】
ABCC8：またSUR1（スルホニル尿素受容体1）として知られており、ABCC8タンパク質は
、ATP感受性カリウムチャネル［K（ATP）チャネル］の成分の一つとして、スルホニル尿
素を結合し、そしてモジュレーティング（調節性）インスリン分泌に関与するカリウムチ
ャネルを調節する。これらの遺伝子に共通の多型は、耐糖能異常、タイプ2糖尿病、グル
コース障害（impaired glucose）からタイプ2糖尿病への素因になりやすい変換（predisp
osed conversion）、および高インスリン症の常染色体劣性形式に可変的に関係する。ABC
C8遺伝子における若干のSNPsはまた、タイプ2糖尿病および高められた血圧レベルに関係
する。ABCC8もまた、幼少の家族性の持続的な高インスリン性の低血糖症との関係が実証
された。代わりの実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはABCC8であり
うる。
【００４９】
ABCC9：またSUR2（スルホニル尿素受容体2）として知られるが、ABCC9タンパク質はま
た、心臓の、骨格の、および脈管の、および非脈管の平滑筋におけるATP感受性カリウム
チャネルのコンポーネントである。タンパク質の構造は、膵外ATP感受性カリウムチャネ
ルの薬物結合チャネル調節性サブユニットとしての役割を示唆する。最近の知見は、睡眠
時間をABCC9遺伝子と関連付ける。この遺伝子の選択的スプライシングは、いくつかの生
成物をもたらし、その2つは、2つの端子エクソンの差動的な用法（differential usage）
に起因し、およびその1つはエクソンの削除に起因する。さらに別の実施形態では、乱さ
れた発現を有するトランスポーターはABCC9でありうる。
【００５０】
ABCC10：またMRP7として知られるが、ABCC10タンパク質は、両親媒性の陰イオンを輸送
し、そしてドセタキセル、ビンクリスチンおよびパクリタキセルなどのような多種多様な
薬剤に耐性を与える。MRP7はまた、抗ガン剤のシタラビン〔Ara（アラ）-C）およびゲム
シタビン、および抗ウイルス薬の2’,3’-ジデオキシシチジンおよびPMEAのようなヌクレ
オシド系薬剤に対する耐性を与えることができる。加えて、ABCC10は自然な生成物の薬剤
のための広範な耐性プロファイルを有する。MRP1およびMRP2とは異なり、MRP7媒介薬物輸
送はグルタチオンに関係しない。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトラン
スポーターはABCC10でありうる。
【００５１】
ABCC11：ABCC11は、多剤耐性タンパク質8（MRP8）をエンコードするが、フルオロピリ
ミジンへの、および排出メトトレキサートへの耐性を付与するための能力に基づいて、お
よび胸部腫瘍での発現によって、胸部ガンの薬剤耐性にかかわる。ABCC11発現はエストラ
ジオール（E2）によって負に調節されるが、ABCC11発現は、高発現エストロゲン受容体−
α胸部ガン（ER-α陽性胸部ガン）において高い。ABCC11の発現は、タモキシフェン（TAM
）の存在下でアップレギュレートされ（上方制御され）、TAM耐性細胞系において過剰発
現された。したがって、高発現性ABCC11は、化学療法の組合せに対する低下した感度に貢
献しえ、そしてTAMに対して耐性のER陽性胸部ガンにおいて抗ガン療法の選択肢の潜在的
な予測ツールでありうる。代わりの実施形態において、乱された発現を有するトランスポ
ーターはABCC11でありうる。
【００５２】
ABCC12：ABCC12は多剤耐性タンパク質9（MRP9）をエンコードする。ABCC11およびABCC1
2は染色体16q12上でタンデムに複製される。ABCC11およびABCC12遺伝子の転写産物は、肝
臓、肺、および腎臓を含め、様々な成体ヒト組織において、およびまた、いくつかの胎仔
組織においてそれによって検出された。ABCC12の増加した発現は、胸部ガンと関係する。
さらに、ABCC11およびABCC12は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼのための遺伝子（群）
をかくまう領域（region harboring gene）にマッピングされ、それで従って二つの遺伝
子はこの障害についての位置的候補を表す。別の実施形態では、乱された発現を有するト
ランスポーターはABCC12でありうる。
【００５３】
ABCC13：ABCC13遺伝子は、組織特異的発現を、胎仔肝臓、骨髄、および結腸において最
も高く有する。ABCC13は、骨髄中で発現された一方、成体ヒトの末梢血白血球におけるそ
の発現は非常に低く、そして検出可能なレベルは分化した造血細胞において観察されなか
った。ABCC13の発現は細胞分化の間に減少した。これらの結果は、ヒトABCC13の発現が造
血と関連することを示唆する。ABCC13の選択的スプライシングは遺伝子の複数の転写産物
変異体をもたらす。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターは
ABCC13でありうる。
【００５４】
4）ABCGサブファミリー
【００５５】
ヒトABCGサブファミリーには、厳密に研究されたABCG遺伝子で、これはショウジョウバ
エ（Drosophila、ドロソフィラ属）の白色ローカスにあるが、これを含め、N末端でのNBF
およびC末端TMドメインを有する6つの「リバース」のハーフトランスポーターが含まれる
。ショウジョウバエでは、ホワイトタンパク質は、眼の細胞において眼の色素細胞（eye 
pigments）（グアニンおよびトリプトファン）の前駆体を輸送する。哺乳類ABCG1タンパ
ク質は、コレステロール輸送調節に関与する。ABCGサブファミリーはまた、ABCG2（BCRP
）、薬剤耐性遺伝子を含み、腸、腎臓、肝臓、脳、脾臓前立腺およびその他の組織におい
て発現される。他のABCGサブファミリーのメンバーには、ABCG3で、これまでのところ唯
一、げっ歯類において見出されたもの；ABCG4遺伝子で、主に肝臓において発現されるも
の；ABCG5およびABCG8で、腸および肝臓においてステロールのトランスポーターをコード
するものが含まれる。模範的なメンバーを以下に詳述する。
【００５６】
ABCG2：ABCG2タンパク質は生体異物輸送ATPアーゼとして機能し、および乳房新生物、
細胞腫、メルケル細胞、胆嚢新生物、白血病、黒色腫および他の疾患などのような多くの
疾患との関連付けのために試験された。また、ABCG2は、BRCPとして知られ、MHCクラスI
分子の構成要素であり、それらはすべての有核細胞上に存在する。BRCP遺伝子は、染色体
4q22にマップされ、そしてハーフトランスポーターをコードする。ミトキサントロンに抵
抗性ではあるが、ABCB1またはABCC1を過剰発現しない細胞系は、薬物トランスポーターと
してのBRCP遺伝子の識別を導いた。その遺伝子は、アンスラサイクリン系抗ガン剤の耐性
を付与し、そして増幅され、または染色体転座において、トポテカン、ミトキサントロン
、またはドキソルビシンへの曝露を乗り切る細胞系において関与することが示された。BR
CPはまた、ローダミンおよびHoechst（ヘキスト）33462などのような色素を輸送する。そ
の遺伝子はまた、胎盤のトロホブラスト（栄養膜）細胞において、および腸内で発現され
る。腸でのトランスポーターの抑制は、基質を経口的に利用可能にするのに有用である可
能性がある。哺乳動物細胞における薬剤耐性に関与する三つの主要なトランスポーター遺
伝子の一つとして、BCRPのありそうな関与を支持する証拠は、これらのABCトランスポー
ターの抑制または不活化が、薬剤耐性腫瘍の発症を予防するのに有用であり得ることを示
す。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはABCG2でありう
る。
【００５７】
（ii）SLCトランスポータースーパーファミリー
【００５８】
SLCトランスポータースーパーファミリーには、受動的トランスポーター、シンポータ
ー（共輸送体）およびアンチポーター（対向輸送体）、ならびにミトコンドリアトランス
ポーターおよび小胞トランスポーター（小胞輸送体）が含まれる。受動的トランスポータ
ーは、単純に濃度勾配を下がるように化合物を移動させ、その一方、能動的トランスポー
ターは濃度勾配に逆らって分子を輸送するためにエネルギー的に有利な補助基質（co-sub
strate）（非ATP）を利用する。〔レビューのために、He（ヒー）L.ら、Analysis and up
date of the human solute carrier (SLC) gene superfamily｛ヒトの溶質キャリヤ（SLC
）遺伝子スーパーファミリーの分析とアップデート｝、Hum Genomics（ヒューマン・ゲノ
ミクス）3、195-206（2009）；およびHediger（ヘディガー）MAら、The ABCs of solute 
carriers: Physiological, pathological and therapeutic implications of human memb
rane transport proteins（溶質のキャリヤのABCs：ヒト膜輸送タンパク質の生理学的、
病理学的および治療的な意味）、Pfleugers Arch（プフリューガー・アチーブ）447、465
-468（2004）を参照〕。ADME/Toxのアプリケーションに関連するヒトSLCトランスポータ
ーの非制限的な例を、表Bにリストする。
【００５９】
1）SLC10サブファミリー
【００６０】
SLC10サブファミリーはナトリウム/胆汁コトランスポーターのグループを含む。模範的
なメンバーを以下に詳述する。
【００６１】
SLC10A1：またNTCPとして知られるが、SLC10A1は、胆汁酸の腸肝循環に加わるナトリウ
ム/胆汁酸コトランスポーターをコードし、そして肝細胞の基底外側膜に見出される。一
実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLC10A1でありうる。
【００６２】
SLC10A2：SLC10A2は、ASBT、IBAT、ISBT、PBAM、NTCP2などのような一般名を有する。S
LC10A2トランスポーターは、腸管腔、胆管、および腎臓において頂端細胞による腸の胆汁
酸の取り込みのための主要なメカニズムである。胆汁酸は、コレステロール代謝の異化生
成物であり、それでこのタンパク質はまた、コレステロールの恒常性のために重要である
。この遺伝子における変異は、一次胆汁酸吸収不良（PBAM）を引き起こし、そしてこの遺
伝子の変異はまた、たとえば、家族性高トリグリセリド血症（FHTG）などのような肝臓お
よび腸の他の疾患と関係することがある。別の実施形態では、乱された発現を有するトラ
ンスポーターはSLC10A2であることができる。
【００６３】
2）SLC15サブファミリー
【００６４】
SLCサブファミリーは、プロトン結合ペプチドトランスポーター（PEPTs）のグループを
含み、それらのメンバーは消化管における栄養素取得におけるそれらの役割について最も
よく知られている。ペプチドトランスポーターは、多様なペプチド模倣薬に加えて、ジペ
プチドおよびトリペプチドの細胞取り込みを媒介する完全な形質膜タンパク質である。そ
れらのキャリヤは、小腸、肺、脈絡叢および腎臓の上皮細胞の刷子縁膜において主に発生
し、それらの基質の吸収、分布および排泄に寄与する。ペプチドおよびペプチド模倣薬の
細胞の取り込みは、駆動力を提供し、そしてトランスロケーションステップの電気発生性
を引き起こす、内側に向けて下方への、電気化学的プロトン勾配でのプロトンの共輸送を
伴う。模範的なメンバーを以下に詳述する。
【００６５】
SLC15A1：SLC15A1はPEPT1タンパク質をコードし、それは、H+依存性、電気化学的な能
動輸送機構による広範囲の中性、酸性、および塩基性のジ-およびトリペプチドおよびペ
プチド模倣薬物の輸送を可能にすることができる。SLC15A1は、腎臓および肝臓における
発現も検出されているが、腸内で主に発現される。たとえば、潰瘍性大腸炎、Crohn's di
sease（クローン病）、および短腸症候群などのような腸の疾患は、結腸でのPEPT1過剰発
現と関係すると考えられている。研究はPEPT1でのHis-57がトランスポーターの触媒機能
のために必要な最も重要なヒスチジン残基であることを示した。腸のタンパク質消化は、
PEPT1トランスポーターによって腸上皮細胞中に吸収される短鎖ペプチドの多様で膨大な
量を生成する。同様に、ジ-あるいはトリペプチドで、アミノセファロスポリンおよびア
ミノペニシリンのようなもの、選定されたアンジオテンシン変換酵素インヒビター（アン
ジオテンシン変換酵素抑制物質）、およびアミノ酸共役ヌクレオシド系抗ウイルス剤の似
た基本構造を有する様々な薬物は、PEPT1によって輸送される。細胞内への輸送後、小さ
なペプチドおよびペプチド様構造は、主に門脈血中への配送のための遊離アミノ酸にまで
細胞内加水分解を受ける。PEPT1は、栄養的および薬理学的な療法において重要な役割を
果たすことが示された。さらなる実施形態において、乱された発現を有するトランスポー
ターはSLC15A1である。
【００６６】
SLC15A2：SLC15A2は、PEPT2タンパク質や、腸、腎臓、脳、肺、肝臓および乳腺で発現
する高親和性H+/ジペプチドトランスポーターをコードする。PEPT2は、PEPT1と比較して
、基質認識および輸送のために、類似しているが同一ではない構造上の必要条件を有する
ことが知られる。腸のキャリヤPEPT1は、アイソフォームPEPT2よりもほとんどの基質に対
して低い親和性を有する。腎臓におけるPEPT2の生理的役割は、内腔のペプチダーゼ（ペ
プチド加水分解酵素）によって生成される小さなペプチドを再吸収することである。PDZK
1（PDZドメイン含有の1）は直接的にPEPT2と相互作用し、PEPT2輸送活性の機能的調節が
発揮される。PDZK1の共発現はPEPT2輸送活性を増強する。研究はPEPT2でのHis-87がトラ
ンスポーターの触媒機能のために必要な最も重要なヒスチジン残基であることを示した。
さらに、PEPT2は、特に腎臓および脳において、体内のペプチド様薬物のインビボ体内動
態および半減時間に及ぼす重要な影響を有する。代わりの実施形態において、乱された発
現を有するトランスポーターはSLC15A2である。
【００６７】
3）SLC16サブファミリー
【００６８】
このサブファミリーは、ラクタート（乳酸塩）、ピルベート（ピルビン酸塩）、D,L-3-
ヒドロキシブチラート（ヒドロキシ酪酸塩）、アセトアセタート（アセト酢酸塩）、アル
ファ-オキソイソへキサノアート（オキソイソへキサン酸塩）およびα-オキソイソバレラ
ート（オキソイソ吉草酸塩）、ケトン体、ベータ-ヒドロキシブチラートを含むが、ジカ
ルボン酸およびトリカルボン酸を含まない、モノカルボン酸の多種多様な可逆的輸送を媒
介するプロトン連結型トランスポーターのグループを含む。モノカルボン酸は、乳酸の代
謝に重要な役割を果たす。乳酸は、脳、心臓、赤色骨格筋および肝臓などのような組織の
細胞中に急速に輸送されなければならず、それらはいくつかの条件の下で主要な呼吸燃料
になることがある乳酸を容易に酸化する。このファミリーの模範的なメンバーを以下に詳
述する。
【００６９】
SLC16A1：またMCT1として知られるが、SLC16A1は普遍的に発現され、赤血球、心筋、お
よび基底外側腸上皮において特に豊富である。最近の研究では、ヒトの腸において短鎖脂
肪酸（SCFAs）の管腔取り込みにおけるMCT1の関与を例示する。結腸組織におけるMCT1タ
ンパク質の発現における著しい低下は、正常から悪性までの過渡期に観察された。結腸発
ガンの間のMCT1発現における低下は、結腸粘膜内の組織恒常性を維持するプロセスに関連
する遺伝子の発現を調節するために必要なブチラートの細胞内利用能を減少させうる。MC
T1はまた、血液脳関門および脳実質細胞の細胞膜を横切るモノカルボキシラートの輸送を
促進する。別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLC16A1である
ことができる。
【００７０】
SLC16A7：SLC16A7はモノカルボキシラートトランスポーター（モノカルボン酸トランス
ポーター）2（MCT2）をコードし、それは高親和性ピルバートおよびラクタートトランス
ポーターである。このトランスポーターは、精巣、脾臓、心臓、腎臓、膵臓、骨格筋、脳
、および白血球を含む複数のヒト組織においてL-ラクタート、DL-3-ヒドロキシブチラー
ト、3-ヒドロキシブチラート、およびDL-P-ヒドロキシブチラートによって抑制される。
さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLC16A7でありうる
。
【００７１】
SLC16A8：SLC16A8はMCT3、プロトン結合モノカルボキシラートトランスポーターをコー
ドする。MCT3は、たとえば、ラクタート、ピルベートや、ロイシン、バリン、イソロイシ
ン由来の分岐鎖オキソ酸、およびケトン体アセトアセタート、ベータヒドロキシブチラー
トおよびアセタートなどのような多くのモノカルボキシラートの、原形質膜を横切る迅速
な輸送を触媒する。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターは
SLC16A8であってよい。
【００７２】
SLC16A3：SLC16A3は、骨格筋、大脳皮質、海馬および小脳において、モノカルボキシラ
ートトランスポーター4（MOT4）をコードする。肥満は、インスリン抵抗性において高乳
酸塩血症の一因となるLDHアイソザイムの再配分と関係する筋肉MOT4発現における変化に
導く。代わりの実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLC16A3であっ
てもよい。
【００７３】
SLC16A4：SLC16A4は、細胞のグルコース代謝に重要な役割を果たすモノカルボキシラー
トトランスポーター5をコードする。さらなる実施形態では、乱された発現を有するトラ
ンスポーターはSLC16A4であってもよい。
【００７４】
SLC16A5：SLC16A5は、モノカルボキシラートトランスポーター6をコードし、それは様
々な薬物を輸送するが、他のMCTアイソフォームの典型的な基質は輸送せず、他のMCTsの
ものとは異なる基質特異性を示す。別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポ
ーターはSLC16A5であってもよい。
【００７５】
4）SLC21/SLCOサブファミリー
【００７６】
このサブファミリーは、胆汁酸、共役ステロイド、甲状腺ホルモン、エイコサノイド、
ペプチド、および多くの組織での多数の薬物の膜輸送に関与する有機アニオン輸送性ポリ
ペプチド（OATPs）を含む。このファミリーの模範的なメンバーを以下に詳述する。
【００７７】
SLCO1A2：またOATP1A2として知られるが、SLCO1A2は、エストロゲン代謝産物の細胞取
込みを媒介することができるタンパク質をコードする。胸部ガン細胞において、OATP1A2
は、隣接する健康な胸部組織におけるものに比べてほぼ10倍高く発現される。PXR（核レ
セプター、プレグナンX受容体）アゴニストリファンピンはOATP1A2発現を誘導する。PXR
応答要素は、ヒトOATP1 A2プロモーターで同定されたものであり、PXR-OATP1A2プロモー
ター相互作用の特異性が確認された。一実施形態では、乱された発現を有するトランスポ
ーターはSLCO1A2であってもよい。
【００７８】
SLCO1B1：SLCO1B1は、またOATP1B1としても知られ、肝臓および脾臓における有機アニ
オン輸送性ポリペプチドをコードする。OATP1B1は、胆汁酸、甲状腺ホルモンおよびメト
トレキサート、および多くのスタチンを含め、多数の内因性および外因性の物質を輸送す
ることが示された。SLCO1B1における多数の普通の変異体は、スタチン誘発性ミオパチー
のリスク増加と強く関係していることが確認された。スタチン療法の有効性および患者が
有害作用を経験する可能性は、OATP1B1の変動によって予測することができる。一実施形
態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLCO1B1であってもよい。
【００７９】
SLCO3A1：SLCO3A1はまたOATP-Dとして知られる。OATP-D mRNAは主に、心臓、精巣、脳
、および若干のガン細胞において豊富に存在する。OATP-Dは、特殊な組織および細胞にお
けるプロスタグランジンの移行で重要な役割を果たす。全ゲノム関連の研究は、注意欠陥
多動性障害と関係したSLCO3A1における多型を識別する。OATP-Dスプライスバリアントは
、異なった組織分布を見せ、そのうちの若干は、ヒト脳内の細胞外バソプレッシン濃度の
調節に関与し、そしてバソプレシンなどのような脳神経ニューロペプチドによって神経伝
達の神経調節に影響を及ぼす。別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポータ
ーはSLCO3A1であってもよい。
【００８０】
SLCO4A1：またOATP-Eとして知られ、SLCO4A1は、もともとヒトの脳から分離されたもの
だが、そのmRNAは、様々な末梢組織におけて豊富にある。OATP-Eは、3,3’,5-トリヨード
-L-チロニン、チロニンを輸送し、そして従って甲状腺ホルモンの代謝に重要な役割を果
たす。Slco4a1遺伝子は、ヒト、チンパンジー、イヌ、カウ（ウシ）、マウス、チキン（
ニワトリ）、ゼブラフィッシュ、フルーツフライ（ミバエ、ショウジョウバエ）、カ（蚊
、モスキート）、およびシノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans、線虫）
において保存されている。さらなる実施形態では、乱された発現を有するトランスポータ
ーはSLCO4A1であってもよい。
【００８１】
SLCO1C1：またOATP-Fとして知られ、この遺伝子は有機アニオントランスポーターファ
ミリーのメンバーをコードし、脳組織において、甲状腺ホルモンのナトリウム非依存性の
取込みが媒介される。このタンパク質は、甲状腺ホルモンのチロキシン、トリヨードチロ
ニンおよび逆位トライヨードチロニンのために特に高い親和性を有する。このタンパク質
をコードする遺伝子における多型は、甲状腺機能亢進症に罹患している受動体（患者）に
おける疲労および抑うつと関係しうる。選択的スプライシングは、複数の転写産物変異体
をもたらす。別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLCO1C1であ
ることができる。
【００８２】
SLCO4C1：またOATP-Hとしても知られるが、SLCO41はヒト腎臓固有の有機アニオントラ
ンスポーターをコードする。ヒトOATP-Hは、ナトリウム非依存性の様式において強心配糖
体（ジゴキシン）、甲状腺ホルモン（トリヨードチロニン）、cAMP、およびメトトレキサ
ートを輸送する。ラット腎臓におけるSLCO4C1の過剰発現は、腎不全の家系では、高血圧
、心肥大、および炎症を減少させた。SLCO4C1での若干のSNPsはアフリカ系の女性での子
癇前症のリスク増加と顕著に関係する。代わりの実施形態では、乱された発現を有するト
ランスポーターはSLCO4C1であってもよい。
【００８３】
SLCO1B3：SLCO1B3はまたOATP1B3、OATP8、またはLST3としても知られる。 OATP1B3タン
パク質は、エストロゲン依存性胸部ガン細胞に対するエストロゲン前駆エストロン-3-サ
ルフェート（エストロン3-硫酸塩）の供給に寄与するトランスポーターの一つである。SL
CO1B3多型は、日本腎移植レシピエントにおけるプラズマミコフェノール酸グルクロニド
の薬物動態に著しく影響を与える。SLCO1B3遺伝子の挿入変異型（insert-variant）対立
遺伝子は、たとえば、血液透析患者におけるジゴキシンのような強心配糖体の濃度対用量
比を増加させることがある。若干のSLC01B3変異は、軽度な非抱合型のビリルビン過剰血
症の一因になる。別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLCO1B3
であってもよい。
【００８４】
SLCO2B1：またOATP-Bとして知られ、SLCO2B1は、ステロイドホルモン共役体（結合体）
輸送の調節において機能しうるタンパク質をコードし、そしてたとえば、胎盤、脳および
皮膚のようなステロイド産生活性を有する器官で発現される。選択的スプライスされた転
写産物変異体は説明されている。OATP-Bは、骨格筋スタチン曝露および毒性のモジュレー
ターと識別された。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターは
SLCO2B1であってもよい。
【００８５】
5）SLC22サブファミリー
【００８６】
このサブファミリーは、2つのサブグループを含み、すなわち、1）有機アニオンのナト
リウム依存性の輸送および排出に関与している有機アニオントランスポーター（OATs）；
および2）OCTトランスポーターであり、それらは、多くの内因性の小さな有機カチオンな
らびに数々の広範な薬物および環境有害物質の除去のために重要である肝臓、腎臓、腸、
および他の器官における多特異性有機カチオントランスポーターである。このファミリー
の模範的なメンバーを以下に詳述する。
【００８７】
SLC22A6：またOAT1として知られ、SLC22A6は、有機アニオンで、そのうちの若干は潜在
的に有毒であるものの、ナトリウム依存性の輸送および排泄に関与するタンパク質をコー
ドする。コードされたタンパク質は、膜内在性タンパク質であり、そして側底膜に局在す
ることがある。四つの異なるアイソフォームをコードする四つ転写産物変異体は、この遺
伝子について見出された。さらなる実施形態では、乱された発現を有するトランスポータ
ーはSLC22A6であってもよい。
【００８８】
SLC22A7：またOAT2として知られ、SLC22A7は、膜内在性タンパク質であり、そして腎臓
の基底膜に局在していると考えられるタンパク質をコードする。異なるアイソフォームを
コードする選択的にスプライスされた転写産物変異体が説明された。ヒトOAT2トランスポ
ーターは、cGMPの高効率の、促進性トランスポーター（facilitative transporter）であ
り、そして多くの組織においてcGMPのシグナル伝達に関与しうる。別の実施形態では、乱
された発現を有するトランスポーターはSLC22A7であってよい。
【００８９】
SLC22A8：またOAT3として知られ、SLC22A7のように、SLC22A8はまた、腎臓の側底膜で
の膜内在性タンパク質でもあるタンパク質をコードする。ヒトOAT3トランスポーターは、
腎臓におけるエダラボンサルフェートの基底外側の取込みの原因となり、そしてそれはま
た、ロスバスタチンの腎取込みの一因である。ロスバスタチンは、低密度リポタンパク質
コレステロールを減らすのに非常に有効である。臨床試験は、腎排泄、特に、尿細管分泌
が、ロスバスタチンクリアランスの役割を果たしていることを実証した。さらに別の実施
形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLC22A8であってもよい。
【００９０】
SLC22A11：またOAT4として知られ、SLC22A11は、腎臓において、および胎盤において主
に見出されるトランスポータータンパク質をコードし、それは潜在的に有害な有機アニオ
ンが胎仔に達することを防止するために作用することができる。ヒトOAT4の遺伝的変異体
は、内因性基質の改変された輸送を実証する。いくつかの自然に生じるSNPsは、重要な薬
物基質の尿細管再吸収を損なうことがありうるOAT4変異体をもたらす。OAT4は、エストロ
ンサルフェートおよびデヒドロエピアンドロステロンサルフェートの高親和性輸送を媒介
する。閉経後の女性に起こる急激な骨量減少は、主としてエストロゲンの純減少による。
研究は、OAT4変異体がアニオン性薬物の取込みでの個体間の変動を発生させることがあり
、そして従って、骨粗しょう症を含む一定の疾患のためのマーカーとして使用することが
できることを示した。さらなる実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターは
SLC22A11であってもよい。
【００９１】
SLC22A9：またOAT7として知られるが、SLC22A9は、肝細胞におけるブチラートの代わり
に硫酸抱合体（sulfate-conjugates）を輸送する有機アニオントランスポーターをコード
する。一実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLC22A9でありうる。
【００９２】
SLC22A1：またOCT1として知られるが、SLC22A1は、肝臓、腎臓、腸、および他の器官に
おいて発現する多特異性有機カチオントランスポーターをコードする。SLC22A1トランス
ポーターは、多くの内因性の小さな有機カチオン、ならびに薬物および数々の広範な環境
有害物質の除去のために重要である。二つの異なるアイソフォームをコードする二つの転
写産物変異体は、この遺伝子について見出されたが、唯一のより一層長い変異は機能的ト
ランスポーターをコードする。ヒトOCT1転写産物レベルおよび一塩基多型は、慢性骨髄性
白血病におけるイマチニブへの応答と関係する。別の実施形態では、乱された発現を有す
るトランスポーターはSLC22A1であってもよい。
【００９３】
SLC22A2：またOCT2として知られるが、この遺伝子は、第6染色体上のクラスター内に位
置する三つの類似したカチオントランスポーター遺伝子の一つである。コードされたタン
パク質は、十二の推定膜貫通ドメインを含み、およびプラズマ膜内在性タンパク質である
。それは主に腎臓で見出され、そこではそれはカチオン再吸収での最初のステップを媒介
することができる。若干のSNPsは、クレアチニン産生および分泌に影響を及ぼす可能性が
あることが確認されている。代わりの実施形態では、乱された発現を有するトランスポー
ターはSLC22A2であってもよい。
【００９４】
SLC22A3：SLC22A3はまたOCT3として知られている。OCT3遺伝子（SLC22A3）における一
塩基多型（SNPs）の機能的特性が分析された。若干のSNPsは、基質の減少した取込みを示
し、そして一定の病気のプロセス、たとえば、高血圧症、アレルギー疾患、および生体ア
ミンなどのような内因性の有機カチオンのクリアランスによる精神神経疾患などのような
ものにおいて異なる。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーター
はSLC22A3であってもよい。
【００９５】
SLC22A4：SLC22A4はまたOCTN1として知られる。コードされたタンパク質は、有機カチ
オントランスポーターおよび形質膜内在性タンパク質であり、十一の推定膜貫通ドメイン
、ならびにヌクレオチド結合部位モチーフを含む。このタンパク質による輸送は、少なく
とも部分的にATP依存性である。SLC22A4の一つのSNPはクローン病と関係する。OCTN1は、
エルゴチオネインの全身および腸の曝露の維持のために極めて重要な役割を果たし、そし
て炎症性腸疾患を区別するための可能な診断ツールを提供することができる。さらなる実
施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLC22A4であってもよい。
【００９６】
SLC22A5：SLC22A5はまたOCTN2として知られる。コードされたタンパク質は、有機カチ
オントランスポーターとして、およびナトリウム依存性高親和性カルニチントランスポー
ターとしての両方として機能するプラズマ膜内在性タンパク質である。コード化されたタ
ンパク質は、カルニチンの活性な細胞取込みに関与する。この遺伝子での変異は、全身原
発性カルニチン欠乏症（systemic primary carnitine deficiency）（CDSP）と、ハイポ
ケトティック低血糖症（hypoketotic hypoglycemia）急性代謝代償不全によって人生の早
い段階で、およびミオパチー（筋障害）または心筋症によってその後の人生において明ら
かにされた常染色体劣性遺伝疾患と関係する。さらに別の実施形態では、乱された発現を
有するトランスポーターはSLC22A5であってもよい。
【００９７】
6）SLC47サブファミリー
【００９８】
SLC47サブファミリーは、尿および胆汁を通じて、内因性および外因性の両方の毒性電
解質の排泄に関与するトランスポーターのグループを含む。模範的なメンバーを以下に詳
述する。
【００９９】
SLC47A1：またMATE1〔マルチドラッグ・アンド・トキシン・エクストルージョン1（多
剤および毒素放出1）〕として知られるが、この遺伝子は第17染色体上のスミス - マゲニ
ス症候群（Smith-Magenis syndrome）領域内に位置する。一実施形態では、乱された発現
を有するトランスポーターはSLC47A1であってもよい。
【０１００】
SLC47A2：SLC47A1と同様に、SLC47A2は薬剤耐性の原因である。異なるアイソフォーム
をコードする選択的スプライスされた転写産物変異体は、この遺伝子について確認された
。別の実施形態では、乱された発現を有するトランスポーターはSLC47A2であってもよい
。
【０１０１】
7）種々のトランスポーター
【０１０２】
OSTα-OSTβ：有機溶質トランスポーター（OSTアルファ-OSTベータ）が腸、腎臓、肝臓
、精巣および副腎において上皮の側底膜上に発現するヘテロマーのトランスポーターであ
り、胆汁酸および他のステロイド溶質の流出を促進する。双方のサブユニットは、機能的
なトランスポーターの形質膜局在化に必要とされる。さらなる実施形態では、乱された発
現を有するトランスポーターはOSTα-OSTβであってもよい。
【０１０３】
（b）薬物代謝酵素
【０１０４】
他の実施形態では、ADME/Toxタンパク質は、薬物代謝酵素（DME）でありうる。薬物代
謝酵素（DMEs）は、生体異物が、尿または胆汁中に排泄されるためにより一層適切な親水
性分子に変換されるのを容易にする。薬物代謝は主に酸化、還元、加水分解、または抱合
酵素によって媒介され、そして直接に、薬物効果および毒性に影響を与える。薬物代謝酵
素は、2つのグループ：第I相酵素および第II相酵素に分けられる。
【０１０５】
第I相酵素は、シトクロムP450s（CYPs）およびフラビンモノオキシゲナーゼ（フラビン
一酸素原子付加酵素）（FMOs）を含む酸化的な薬物代謝酵素であり、それは、基質分子へ
の酸素原子の導入を触媒し、大抵は水酸化または脱メチル化がもたらされる。ADME/Toxア
プリケーションに関連する第I相酵素の非制限的な例を、表Cに提供する。
【０１０６】
【表３−１】
2018078905.tif 000005
【表３−２】
2018078905.tif 000006
【０１０７】
第II相酵素は、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（グルクロン酸転移酵素）（UG
Ts）、グルタチオントランスフェラーゼ（GSTs）、スルホトランスフェラーゼ（硫酸基転
移酵素）（SULTs）、N-アセチルトランスフェラーゼ（アセチル基転移酵素）（NATs）、
およびメチルトランスフェラーゼ（メチル基転移酵素）を含む複合酵素ファミリーであり
、それは、生体異物への内因性小分子の接合を触媒し、それは通常、より一層容易に排泄
される可溶性化合物の形成をもたらす。〔レビューのために、すなわち、Jancova（ヤン
コバ）ら、Phase II metabolizing enzymes（第II相代謝酵素）、Biomed Pap Med Fac Un
iv Palacky Olomouc Czech Repub（バイオメディカル・ペーパーズ・オブ・ザ・メディカ
ル・ファカルティー・オブ・ザ・ユニバーシティー・パラツキー・オロモウツ・チェコス
ロヴァキア共和国）154、103-116（2010）を参照〕。ADME/Toxのアプリケーションに関連
する第II相酵素の非制限的な例を表Dに提供する。
【０１０８】
【表４−１】
2018078905.tif 000007
【表４−２】
2018078905.tif 000008
【０１０９】
このように、薬物代謝酵素は、細胞中への生体異物の流入、または代謝性生体内変換の
触媒を介した細胞外空間への押出を媒介することによって薬物動態におけるトランスポー
ターと共に補完的な役割を果たす。以下のセクション（II）で詳述するように、遺伝子改
変された細胞で、乱された発現を有するDMEsが含まれ、非発現、過剰発現、または過小発
現を有するかどうかを問わないもの、および乱された発現を有するトランスポーターは、
インヒビターのスクリーニングを促進し、薬剤の速度パラメータ、および代謝産物毒性評
価を定める強力なツールを提供する。
【０１１０】
（i）第I相酵素
【０１１１】
第I相酵素には、チトクロームP450（CYP）酵素、フラビン含有モノオキシゲナーゼ（FM
O）酵素、アルコール/アルデヒド代謝酵素、カルボキシルエステラーゼ（CES）、エポキ
シドヒドロラーゼ（エポキシド加水分解酵素）（EPHX）、モノアミンオキシダーゼ（モノ
アミン酸化酵素）（MAO）、およびペルオキシダーゼ（過酸化酵素）が含まれ、それらを
以下に詳述する。
【０１１２】
1）シトクロムP450酵素
【０１１３】
シトクロムP450（CYP）酵素は、ヒトでは57のメンバーが含まれる触媒の多様なグルー
プである。CYPsは、通常、膜結合性であり、そしてミトコンドリア内または小胞体膜（en
doplasmic reticular membrane）に局在している。CYPsはオキシゲナーゼ活性を有し、お
よび一般に酸化還元反応を触媒し、基質の酸化および水の還元が含まれる。このグループ
の酵素には、活性部位内ヘムイオンが含まれ、それは触媒活性に不可欠である。CYPsは、
試験されたすべての有機体において見出され、そして遍在的に発現される。それらは肝臓
において高レベルで見出され、そこではそれらは薬物および内因性毒性化合物（たとえば
、ビリルビン）の代謝において重要な役割を有する。ほとんどのCYPsは、非常に多くの基
質を代謝することができ、そしてこれは薬物相互作用におけるそれらの主要な役割を占め
る。CYPsはまた、ステロイドホルモン合成、コレステロール合成およびビタミンD代謝に
おいて機能を有する。模範的なCYPsを以下に詳述する。
【０１１４】
CYP1A2：カフェインは、初期N3-脱メチル化を通じて肝臓において主にCYP1A2によって
代謝される。CYP1A2はまた、アフラトキシンB1およびアセトアミノフェンの代謝において
作用する。CYP1A2は、発ガン性芳香族および複素環アミン類の生体内活性化に関係する。
CYP1A2は複素環式アミンのN-ヒドロキシル化およびフェナセチンのO-脱メチル化を触媒す
る。大きな個体差がこの酵素のレベルにおいて見出され、それは主にオープンリーディン
グフレーム（ORF）に位置するいくつかの異なる多形遺伝子変異体の分布に起因する。一
実施形態では、乱された発現を有するDMEはCYP1A2であるかもしれない。
【０１１５】
CYP2A6：CYP2A6は、主要なニコチンC-オキシダーゼを構成している。それは高いクマリ
ン7-ヒドロキシラーゼ（水酸化酵素）活性を示す。それは、抗ガン剤のシクロホスファミ
ドおよびイホスファミドのヒドロキシル化に作用する。それは、アフラトキシンB1の代謝
活性化で反応能を有し、そしてそれは低フェナセチンO-脱メチル化活性を有する。別の実
施形態では、乱された発現を有するDMEはCYP2A6でありうる。
【０１１６】
CYP2B6：このタンパク質は小胞体に局在し、そしてその発現はフェノバルビタールによ
って誘導される。CYP2B6は、NADPH依存性電子伝達経路に関与する。その酵素は、たとえ
ば、抗ガン剤シクロホスファミドおよびイホスファミドなどのような若干の生体異物を代
謝することが知られる。この遺伝子転写産物バリアントが記載された。さらなる実施形態
において、乱された発現を有するDMEはCYP2B6でありうる。
【０１１７】
CYP2C8：この酵素は、抗けいれん薬メフェニトイン、ベンゾ（a）ピレン、7-エチオキ
シクマリン（ethyoxycoumarin）を含め、多くの生体異物を代謝することが知られる。そ
れは、抗ガン剤のパクリタキセル（タキソール）代謝の原因となる主要な酵素である。こ
の遺伝子は染色体10q24上のシトクロムP450遺伝子のクラスター内に位置する。少数の異
なるアイソフォームをコードするいくつかの転写産物変異体は、この遺伝子について見出
された。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するDMEはCYP2C8であってもよい。
【０１１８】
CYP2C9：この酵素は、フェニトイン、トルブタミド、イブプロフェンおよびS-ワルファ
リンを含む、多くの生体異物を代謝することが知られる。CYP2C9は、S-ワルファリン、ジ
クロフェナク、フェニトイン、トルブタミドおよびロサルタンなどのような薬物の代謝の
多種薬物動態変動性の一因となり、この遺伝子がポリモーフィック（多形性）であること
を示唆する。この遺伝子は染色体10q24上のシトクロムP450遺伝子のクラスター内に位置
する。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するDMEはCYP2C9であってよい。
【０１１９】
CYP2C19：CYP2C19は、抗けいれん薬のメフェニトイン、オメプラゾール、ジアゼパムお
よび若干のバルビツール酸塩を含む、多くの生体異物を代謝する。この遺伝子内の多型は
、メフェニトインを代謝する変動能力と関係し、不十分なメタボライザー（不全な代謝体
、poor metabolizer）および多数のメタボライザー（extensive metabolizer）の表現型
として知られる。この遺伝子は染色体10q24上のシトクロムP450遺伝子のクラスター内に
位置する。代わりの実施形態では、乱されたは発現を有するDMEはCYP2C19でありうる。
【０１２０】
CYP2D6：このタンパク質は、小胞体に局在し、そして一般に定められた薬物の20％ほど
も多くを代謝することが知られる。その基質には、デブリソキン、アドレナリン（受容体
）遮断薬；スパルテインおよびプロパフェノン、両方の抗関節炎（anti-arrythmic）薬；
およびアミトリプチリン（amitryptiline）、抗うつ薬が含まれる。この遺伝子は、集団
において高度に多型であり；一定の対立遺伝子は、不十分なメタボライザー表現型をもた
らし、酵素の基質を代謝する能力の低下によって特徴付けられる。この遺伝子は、染色体
22q13.1上の2つのチトクロームP450偽遺伝子の近くに位置する。選択的にスプライスされ
た転写産物変異体は、異なるアイソフォームをコードし、この遺伝子について見出される
。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するDMEはCYP2D6でありうる。
【０１２１】
CYP2E1：CYP2E1は、アセトアミノフェン肝毒性につながる事象のカスケードを開始させ
る律速チトクロームP450酵素である。CYP2E1の不存在下に、毒性は高濃度で明らかになる
だけであろう。CYP2E1は、アルコールおよび活性酸素種の産生および酸化ストレスを導く
ことがあるエタノール酸化を行うプライマリP450によって誘導される。この経路の活性化
は、反応性酸素を生じる化学物質によって刺激されたアポトーシス細胞死を抑制するが、
多価不飽和脂肪酸によって生成された壊死性細胞死を促進する。別の実施形態では、乱さ
れた発現を有するDMEはCYP2E1でありうる。
【０１２２】
CYP3A/3A5：CYP3A4は、シトクロムP450ファミリーの中で最も豊富に発現するメンバー
であり、そして定められた薬の50％よりも多くの代謝に関与した。CYP3A4は、肝臓および
小腸のような薬物動態の鍵となる部位で高度に発現される。しかし、CYP3A4の発現および
/または機能の個体間変動は、5-および20倍の間にあると推定された。CYP3A4の発現は、
多数の核受容体によって調節される。CYP3A5は、肝外組織で発現された優勢な形態である
。さらなる実施形態において、乱された発現を有するDMEはCYP3A/3A5でありうる。
【０１２３】
CYP3A7：CYP3A7はCYP3Aファミリーのメンバーである。CYP3A7は、大部分が胎仔形態で
あり、成体ではまれにしか発現されない。
【０１２４】
シトクロムp450オキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）（POR）：PORは、すべてのCYP
酵素のための還元当量を提供するオキシドレダクターゼである。これは、CYPの機能に不
可欠であり、そのため、CYP活性の全体的な抑制のために魅力的な標的である。さらに別
の実施形態では、乱された発現を有するDMEはPORでありうる。
【０１２５】
2）フラビン含有モノオキシゲナーゼ
【０１２６】
フラビン含有モノオキシゲナーゼ（FMOs）は、ヘテロ原子、特に、たとえば、アミンの
窒素、または様々な生体異物の硫黄およびリンのヘテロ原子などのような求核性原子の酸
化を触媒する。チトクロームP450と同様に、FMOsはNADPHおよび酸素を必要とするが、フ
ラビン部分を含む異なる触媒機構を利用する。それらはまた、CYPsと同じ調節機構下にな
い。FMO3は大部分がヒト肝アイソフォームであるが、FMO1は腎臓において優勢な形態であ
る。
【０１２７】
FMO1：FMO1はヒト腎臓における主要なFMOであるが；しかし、それは肝臓において、非
常に低いレベルで発現されているに過ぎない。FMO1は、FMO3のものとは異なる基質特異性
を有し、その一方、FMO1はN-酸素負荷性（N-oxygenating tertiary）第三級アミンで高効
率であるに過ぎない。双方のFMO1およびFMO3は、多数の求核性硫黄含有基質をS-酸素負荷
する。一実施形態では、乱された発現を有するDMEはFMO1でありうる。
【０１２８】
FMO3：FMO3はヒト肝ミクロソームにおける主要なFMOである。このアイソフォームは、
（S）-ニコチンを（S）-ニコチンN-1′酸化物に変換するのにもっぱら関与するのでない
としても、支配的であり、そしてまた、シメチジンのS-酸素負荷に関わる主要な酵素、胃
潰瘍を治療するのに一般的に使用される古いH2-拮抗薬である。食餌から由来するアミノ
トリメチルアミン（TMA）のN-酸化は、FMO3によって触媒され、そしてこの遺伝子の遺伝
性多型を有するヒトは、この基質に向けた活性が減少し、トリメチルアミン尿と呼ばれる
珍しい魚臭症候群がもたらされる。代わりの実施形態では、乱された発現を有するDMEはF
MO3でありうる。
【０１２９】
3）アルコール/アルデヒド代謝酵素
【０１３０】
アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコール脱水素酵素）（ADH）：ADHは、第一級および
第二級アルコールのアルデヒドおよびケトンへの酸化を、それぞれ触媒する。さらに別の
実施形態では、乱された発現を有するDMEはADHであってもよい。
【０１３１】
アルデヒドオキシダーゼ（アルデヒド酸化酵素）（AOX）：AOXは、アルデヒドからカル
ボン酸を生成する酵素である。それはヒト肝臓において存在し、そしてそれはファムシク
ロビルを含め、多数の薬物の代謝に関与する。また、この酵素は、多くの一般的に定めら
れた薬物による抑制の対象となり、そしてそのため、有害な薬物-薬物相互作用について
の潜在的な供給源である。さらなる実施形態において、乱された発現を有するDMEはAOXで
ありうる。
【０１３２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）：ALDHはまた、アルデヒドのカルボン酸への酸化
を触媒する酵素の多型ファミリーである。ALDHの三つの異なるクラスがあり、それらのす
べてには、構成型および誘導型が含まれる。ヒト肝臓での最も一般的なアイソフォームは
ALDH1およびALDH2である。脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼは、Sjogren-Larsson syndro
me（シェーグレン-ラルソン症候群）と関係するALDH酵素である。さらに別の実施形態で
は、乱された発現を有するDMEはALDHでありうる。
【０１３３】
アルド-ケトレダクターゼ（アルド・ケト還元酵素）（AKR）：また、アルデヒドレダク
ターゼとして知られ、この酵素は、生体アルデヒドおよび生体異物アルデヒドの還元に関
与しており、そして事実上あらゆる組織に存在する。さらに別の実施形態では、乱された
発現を有するDMEは、AKRであってもよい。
【０１３４】
4）カルボキシルエステラーゼ
【０１３５】
哺乳類カルボキシルエステラーゼ（哺乳類カルボキシルエステル分解酵素）（CES）は
、そのメンバーが多様な組織に広く分布する多重遺伝子族（多重遺伝子ファミリー）を表
す。これらの酵素は、エステルまたはアミド結合を含むほとんどの治療上の薬物の薬物動
態学的挙動の主な決定要因である。さらに、多くのプロドラッグは、特にカルボキシルエ
ステラーゼ活性によって開裂時に活性化するように設計される。代わりの実施形態では、
乱された発現を有するDMEはCESでありうる。
【０１３６】
5）エポキシドヒドロラーゼ
【０１３７】
エポキシドヒドロラーゼ（EPHX）は、アレーンおよびアルケン酸化物（エポキシド）を
、水の添加を介してジヒドロジオールに変換する。エポキシドは毒物学において重要であ
り、それは、それらが変異原性および発ガン性について知られているからである。エポキ
シドの加水分解は、一般的に、いくつかのケース（例は、ベンゾ〔a〕ピレン）では、解
毒反応であると考えられているが、エポキシドの代謝物は、さらにより一層変異原性およ
び発ガン性である。ヒトは、エポキシドヒドロラーゼの4つのアイソザイムを発現し、そ
れはミクロソームおよび細胞質の双方の細胞区画に位置する。さらなる実施形態において
、乱された発現を有するDMEはEPHXでありうる。
【０１３８】
6）モノアミンオキシダーゼ
【０１３９】
モノアミンオキシダーゼ（モノアミン酸化酵素）（MAO）は、肝臓、腎臓および脳のミ
トコンドリア画分に位置するフラビンタンパク質である。それらは、第一、第二、および
第三脂肪族アミンの脱アミノ化を触媒する。ヒトのMAO-AおよびMAO-BにおいてはMAOの2つ
の主要なタイプがある。MAOsは、神経伝達物質の不活性化において重要な役割を果たして
おり、そして多数の薬物がそれらの活性を抑制するために開発された。MAO-Aインヒビタ
ーは、抗うつ薬および抗不安剤として使用されるが、MAO-Bインヒビターは、Alzheimer's
disease（アルツハイマー病）およびParkinsons disease（パーキンソン病）を処置する
ために単独で、または組合せで使用される。さらに別の実施形態では、乱された発現を有
するDMEはMAOでありうる。
【０１４０】
7）ペルオキシダーゼ
【０１４１】
ペルオキシダーゼは、過酸化水素または有機ヒドロペルオキシドの還元を触媒する。多
数の哺乳類ペルオキシダーゼが、ミエロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼおよ
びプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ（PHSまたはCOX-2）を含め、存在す
る。過酸化物の還元は、ドナー分子の酸化と一体になり、それは内因性分子または様々な
生体異物化合物のいずれでもありうる。生体異物の酸化はしばしば共酸化（cooxidation
）と呼ばれ、広く文書化されている。たとえば、芳香族アミンが、PHSによって潜在的に
毒性の窒素および酸素中心フリーラジカルに共酸化されることは実証されている。しかし
ながら、薬物の全体的な生体内変換および毒性におけるペルオキシダーゼ触媒反応の最終
的な重要性は、大部分は依然として不明である。さらなる実施形態では、乱された発現を
有するDMEはペルオキシダーゼであってもよい。
【０１４２】
（ii）第II相酵素
【０１４３】
上記に詳述したように、第II相酵素には、グルタチオントランスフェラーゼ、UDP-グル
クロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラ
ーゼ、およびメチルトランスフェラーゼが含まれる。
【０１４４】
1）グルタチオンS-トランスフェラーゼ
【０１４５】
グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）の細胞質および膜結合形態は、二つの異な
る超遺伝子ファミリーによってコードされる。GST酵素は、発ガン性物質、治療上の薬物
、環境有害物質および酸化ストレスの生成物を含め、求電子化合物の解毒において、グル
タチオンとの抱合によって機能する。現時点で、可溶性細胞質性哺乳類グルタチオンS-ト
ランスフェラーゼの8つの異なるクラスが識別されており、それはすなわち、アルファ、
カッパ、ムー、オメガ、ピー（パイ）、シグマ、シータおよびゼータである。ADME/Toxの
適用に関連するGSTsの非制限的な例を、以下に詳述する。
【０１４６】
GSTA1：この遺伝子はアルファクラスに属するグルタチオンS-トランスフェラーゼをコ
ードする。アルファクラス遺伝子は、第6染色体にマッピングされるクラスターに位置し
、肝臓において最も豊富に発現されたグルタチオンS-トランスフェラーゼである。肝臓に
おいてビリルビンおよび一定の抗ガン剤を代謝することに加え、これらの酵素のアルファ
クラスは、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を示し、それによって、反応性酸素種およ
び過酸化の生成物から細胞が保護される。一実施形態では、乱された発現を有するDMEはG
STA1でありうる。
【０１４７】
GSTA2：求電子物質および活性酸素種に対する防御適応応答は、グルタチオンS-トラン
スフェラーゼ（GSTs）を含めて、遺伝子の第II相無害化の誘導によって媒介される。GSTA
2遺伝子発現は、Nrf2（NF-E2関連因子-2）を介した酸化ストレスによって誘導される。肝
細胞における（一）酸化窒素シンターゼ（酸化窒素合成酵素）は、GSTA2誘導のために必
要である。別の実施形態では、乱された発現を有するDMEはGSTA2でありうる。
【０１４８】
GSTA4：内皮細胞におけるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（transferees）（GSTs
）の過剰発現は、たとえば、4-HNEのようなアルデヒドからの酸化的損傷に対して保護す
る。GSTA4は4-HNEの解毒およびiNOSのアップレギュレーション（誘導型酸化窒素シンター
ゼ）を通じてアテローム発生に対して重要な防御的な役割を果たしうる。4-HNEは、アポ
トーシスを誘導し、そしてNF-カッパBの移行をトリガーし、そしてそれゆえに、iNOSのよ
うなNF-カッパBの媒介遺伝子発現をアップレギュレートする。さらに別の実施形態では、
乱された発現を有するDMEはGSTA4であってもよい。
【０１４９】
GSTM1：GSTM1はグルタチオンS-トランスフェラーゼ多重遺伝子ファミリーのミュー（ム
ー）サブファミリーのメンバーである。双方のGSTT1（シータサブファミリーのメンバー
）およびGSTM1は、候補ガン感受性遺伝子であり、排出可能な親水性代謝産物への発ガン
性化合物の結合を調節するそれらの能力のためである。酵素機能の欠如と関係する欠失体
は、これらの双方の遺伝子座に存在する。GSTM1またはGSTT1遺伝子のホモ接合型欠失のキ
ャリヤである個体は、代謝的に発ガン性化合物を除去する能力の障害があるかもしれず、
したがって、増加したガンリスクがありうる。GSTM1およびGSTT1の関係はガン感受性に影
響を及ぼす。ホモ接合GSTM1およびGSTT1欠失キャリヤの頻度は、ほとんどの集団において
非常に高い（すなわち、20-50％）。また、GSTM1および、おそらく、GSTT1は、1つよりも
多くの部位でのガンの病因に関与することができる。代わりの実施形態では、乱された発
現を有するDMEはGSTM1でありうる。
【０１５０】
2）UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ
【０１５１】
UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（UGT）は、ヒドロキシル基、アミノ基および
チオール基にグルクロン酸が付加することを触媒する膜結合酵素である。これらの酵素の
基質には、ステロイド、ビリルビン、ホルモン、および多くの薬物などのような内因性分
子が含まれ、典型的にそれらが水溶性、排泄可能な代謝産物（β-Dグルクロニド）に変換
する。四つのUGTファミリーはこれまでに説明された22の個々の酵素と共にヒトにおいて
識別されている（UGT1、UGT2、UGT3およびUGT8）。最も重要な薬物接合性UGTs（drug con
jugating UGTs）はUGT1およびUGT2のファミリーに属する。これらの形態の多くは、主要
な場所として肝臓に広い組織分布を有する。特に、UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A9、2B7お
よび2B15の酵素が最も重要なヒト肝UGTsであると考えられている。対照的に、UGT1A7、1A
8および1A10は、主に消化管において発現される。ADME/Toxのアプリケーションに関連す
るUGTsの非制限的な例を、以下に詳述する。
【０１５２】
UGT1A1：UGT1A1は、ビリルビンのグルクロン酸化（グルクロン酸抱合）の原因となるア
イソフォームである。また、単純フェノール、アントラキノン/フラボノン（flavonones
）およびC18ステロイドの接合において適度な活性および複合フェノールおよびクマリン
の接合において低活性を示す。UGT1A1遺伝子は、少なくとも9つのプロモーターおよび9つ
の異なるUGT1A1酵素をもたらすために4つの共通のエクソンによりスプライシングするこ
とができる第一のエクソンで構成される（第一エキソン3、11および12は偽遺伝子である
）。プロモーターにおける50よりも多くの遺伝的変異および遺伝子のコード領域は、目下
、酵素活性を低下することが知られており、体質性非抱合型黄疸〔Crigler-Najjar（クリ
グラー-ナジャー）またはGilbert's（ギルバートの）症候群〕が導かれる。UGT1 A1は、
抗ガン剤、イリノテカン（CPT-11）の骨髄および胃腸の副作用における役割を果たすこと
が知られている。イリノテカンは主に肝臓で変化せずに、マイナー程度に腎臓で除去され
る。肝臓では、薬物はCYP3A4によって不活性な代謝産物に、およびSN-38、カルボキシル
エステラーゼ酵素によって活性代謝産物に変換することができる。SN-38はさらに、UGT1A
1によって、SN-38グルクロニド（グルクロン酸抱合体）（SN-38G）に代謝される。血液中
のSN-38高濃度は毒性と関係する。一実施形態では、乱された発現を有するDMEはUGT1A1で
ありうる。
【０１５３】
UGT1A3：カルボン酸の結合に関与する主要なUGTsの一つである。さらなる実施形態にお
いて、乱された発現を有するDMEはUGT1A3でありうる。
【０１５４】
UGT2B7：UGT2B7は、ステロイドホルモンならびに胆汁酸および生体異物を抱合するUGT2
Bファミリーのメンバーである。UGT2Bsは、たとえば、皮膚、胸部、前立腺、脂肪、およ
び腸のような非常に多くのヒト組織で発現され、そしてステロイド代謝および排泄を調節
するために仮説として取り上げられる。UGT2B7はオピオイドのグルクロン酸抱合の原因と
なる主要酵素である。多型は、基質特異性またはUGT2Bファミリーアイソザイムの酵素活
性を修飾しうることが識別された。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するDME
はUGT2B7であってもよい。
【０１５５】
3）スルホトランスフェラーゼ
【０１５６】
スルホトランスフェラーゼ（SULT）酵素は、多くのホルモン、神経伝達物質、薬物、お
よび生体異物化合物の硫酸抱合を触媒する。これらの反応は、O-硫酸化が優性スルホン化
反応を表すが、適切な分子のO-、N-またはS-アクセプター基によって生じることができる
。硫黄ドナーは典型的に、3'-ホスホアデノシン5'-ホスホサルフェート（ホスホ硫酸）（
PAPS）である。現在までに、4つのヒトSULTファミリーが少なくとも13の個別のメンバー
と共に識別されている。これらの細胞質酵素は、それらの組織分布および基質特異性にお
いて異なる。遺伝子構造（エクソンの数および長さ）はファミリー間で類似する。ADME/T
oxの適用に関連するSULTsの非制限的な例を、以下に詳述する。
【０１５７】
SULT1A1：この酵素は、肝臓においてSULT1酵素の最も高い発現を示す。SULT1A1は、広
い基質範囲を有し、そして非常に多くのフェノール化合物の硫酸化に関与する。またそれ
は、フェノールスルホトランスフェラーゼ（フェノール硫酸転移酵素）および熱安定性フ
ェノールスルホトランスフェラーゼと称された。共通の遺伝的多型〔コーカサス人（白色
人種）で25-36％〕はArg213がHisに置き換えられたSULT1A1について知られている。この
部位でのHisについてのペイシェント（患者）ホモ接合体は著しく減少した血小板スルホ
トランスフェラーゼ活性を有する。一実施形態では、乱された発現を有するDMEはSULT1A1
でありうる。
【０１５８】
SULT1A2：SULT1A2はいくつかの芳香族ヒドロキシルアミン（aromatic hydoxylamines）
のスルホン化に関与する。この反応で形成された荷電種（ヒドロキシルアミンの硫酸抱合
体）は、化学反応性であり、変異原性である。代わりの実施形態では、乱された発現を有
するDMEはSULT1A2でありうる。
【０１５９】
SULT1A3：熱不安定性フェノールSULTおよびモノアミンスルホトランスフェラーゼとし
て予め知られる。それは単環フェノール類に対して高い親和性を示す。SULT1A3は、肝臓
を除いて、ほとんどの成体組織で発現される。SULT1A3また、カテコールアミンのスルホ
ン化において役割を果たし、それゆえ、神経伝達物質のレベルを調節するのに役立つ。ド
ーパミンはしばしばSULT1 A3の活性について選択的プローブとして使用される。さらなる
実施形態において、乱された発現を有するDMEはSULT1A3でありうる。
【０１６０】
SULT1B1：SULT1 B1の基質特異性は、甲状腺ホルモンおよび1-ナフトールおよび4-ニト
ロフェノールのような小フェノール化合物に制限される。さらに別の実施形態では、乱さ
れた発現を有するDMEはSULT1B1でありうる。
【０１６１】
SULT1E1：またエストロゲンスルホトランスフェラーゼと呼ばれる。この酵素は、任意
の他のSULTsよりもエストロゲンに高い親和性を有する。SULT1E1は、双方のエストロゲン
の代謝において、およびそれらの活性の調節において重要でありうる。この酵素はまた、
ヨードチロニン、プレグネノロン、1-ナフトール、ナリンゲニン、ゲニステインおよび4-
ヒドロキシタモキシフェンに向けた活性をも示す。代わりの実施形態では、乱された発現
を有するDMEはSULT1E1でありうる。
【０１６２】
4）N-アセチルトランスフェラーゼ
【０１６３】
ヒトゲノムでの二つのアリールアミンN-アセチルトランスフェラーゼ（NAT）遺伝子、N
AT1およびNAT2がある。これら二つの遺伝子によりコードされる酵素は、アセチルCoAから
様々なアリールアミンおよびヒドラジン基質へのアセチル基の転移を触媒する。この酵素
は、薬物および他の生体異物を代謝するのに役立ち、および葉酸異化において機能する。
異なるアイソフォームをコードする複数の転写産物変異体は、この遺伝子について見出さ
れている。
【０１６４】
NAT1：アリールアミンN-アセチル-1（NAT1）は、二分脊椎などのような葉酸代謝を伴う
疾患、ならびに非常に多くのヒトガンと関係している。NAT1活性の転写および転写後調節
に加え、ヒストンデアセチラーゼインヒビターのトリコスタチンA（TSA）は、後成的調節
を通して、ヒトガン細胞におけるNAT1活性を上昇させる。TSAはNAT1近接NATbプロモータ
ーと関係するヒストンのアセチル化を増加させた。これは、アセチル化ヒストンと共にプ
ロモーターに対するSP1、転写因子の漸増を可能にした。NAT1転写は、NATbの近傍で局所
クロマチン凝縮によって部分的に抑制され、そのヒストンデアセチラーゼ抑制は、クロマ
チンコンフォメーションにおける直接変化を介してNAT1発現のアップレギュレーションを
もたらす。さらに別の実施形態では、乱された発現を有するDMEはNAT1であってもよい。
【０１６５】
NAT2：アリールアミンN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）もまた、発ガン性物質
の生体内変換において重要な酵素であり、そして遺伝的多型を示す。N-アセチル化が解毒
ステップである、芳香族アミンに関連する膀胱ガンなどのようなガンについては、NAT2ア
セチル化遅行表現型（slow acetylator phenotype）は、より高い危険にさらされている
。複数の研究では、膀胱ガンのリスクが、最も遅いNAT2アセチル化表現型または遺伝子型
〔NAT2（*）5〕で特に高いことが示された。これとは対照的に、N-アセチル化は無視でき
、そしてO-アセチル化が複素環アミン関連の結腸ガンについてのように活性化ステップ工
程であるガンについては、NAT2アセチル化急速表現型（rapid acetylator phenotype）は
、より一層高い危険にさらされている。これとは対照的に、NAT1遺伝子型および様々なガ
ンとの間の関連はあまり一貫していない。代わりの実施形態では、乱された発現を有する
DMEはNAT2でありうる。
【０１６６】
5）メチルトランスフェラーゼ
【０１６７】
カテコールO-メチルトランスフェラーゼ（COMT）：COMTは、カテコールアミンの水酸基
の一つに、メチルドナー（メチル供与体）としてS-アデノシルメチオニンを用いて、メチ
ル基の付加を触媒する。この酵素は、内因性および生体異物の双方の基質メチル化する。
内在性基質の例としては、神経伝達物質のドーパミン、エピネフリンおよびノルエピネフ
リンが含まれる。別の実施形態では、乱された発現を有するDMEはCOMTでありうる。
【０１６８】
チオプリンS-メチルトランスフェラーゼ（TPMT）：TPMTは、たとえば、6-メルカプトプ
リン、アザチオプリンおよび6-チオグアニンのようなチオプリン抗ガン剤を含めて、チオ
プリン化合物のメチル化を触媒する。この酵素活性に影響する遺伝的多型は、個体内での
これらの薬物に対する感受性および毒性の変化と相関する。たとえば、TMPTの低下した活
性は、チオプリンヌクレオチドの蓄積を起こし、そして高められた骨髄毒性と相関する。
さらに別の実施形態では、乱された発現を有するDMEはTPMTであってもよい。
【０１６９】
（c）生体異物センサー
【０１７０】
他の実施形態では、乱された発現を有するADME/Toxタンパク質は、生体異物センサーで
あることができる。核レセプターは、組織特異的遺伝子発現のモジュレーター（調節因子
）として機能する転写因子の最大の既知のファミリーである。核レセプタースーパーファ
ミリーの49の既知のメンバーがある。ホルモン、胆汁酸、脂質、エイコサノイド（eicoso
noid）、薬物、または他の生体異物などのようなリガンドが細胞に入り、そしてサイトゾ
ル（細胞質）核レセプター（核内受容体）に結合するとき、受容体が活性化される。一旦
活性化されると、次いで、リガンド-核レセプター複合体は、核に移行し、そこではそれ
がコアクチベーターを補充し、そしてホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する他の
核レセプターに結合する。得られる二量体複合体は、標的遺伝子の調節領域に結合し、そ
こでそれは転写活性を調節することができる。したがって、核レセプターはまた、生体異
物センサーとして働く。また、核レセプタースーパーファミリー内のリガンド活性化転写
因子は、たとえば、腸、肝臓、および腎臓などのような器官におけるDMEsおよび薬物トラ
ンスポーターの協調的発現に重要である。
【０１７１】
核レセプター（例は、AhR、PXR、およびCAR）および細胞特異的因子（例は、HNF4α）
は、CYPsの発現および活性ならびに第II相酵素およびトランスポーターの双方を含め、酵
素誘導のために必要とされる。たとえば、CYP3A4、肝臓および小腸においてDMEシトクロ
ムP450ファミリーの最も豊富に発現するメンバーは、プレグナンX受容体（PXR）、構成的
アンドロスタン受容体（CAR）、グルココルチコイド受容体（GR）、肝細胞核因子4α（HN
F4α）、ファルネソイドX受容体（FXR）、およびビタミンD受容体（VDR）を含め、多数の
核レセプターによって誘導される。他の核レセプターとしては、制限されないが、肝臓X
受容体（LXR）、およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）が含まれる（表E
参照）。
【０１７２】
【表５】
2018078905.tif 000009
【０１７３】
AhR：AHR遺伝子によりコードされ、AhRは、3つのすべてのCYP1遺伝子、CYP1A1、CYP1A2
およびCYP1B1のアップレギュレーションを含め、数十の遺伝子を制御するリガンド活性化
転写因子である。AhRについてのリガンドには、ダイオキシン、PAHs（多環芳香族炭化水
素）、ポリハロゲン化芳香族炭化水素、インドールおよびトリプトファン由来の内因性リ
ガンド、特に、アブラナ科植物に見出されるベンゾフラボンが含まれる。AHRは、細胞型
または組織特異的な細胞周期制御およびアポトーシスに関与する。ヒトAHR遺伝子におけ
る、およびその近くの少なくとも九つの変異が見出されている。一実施形態では、乱され
た発現を有する生体異物センサーはAhRであってもよい。
【０１７４】
PXR：NR1 I2によってエンコードされ、PXRは、疎水性毒素の一般化されたセンサーとし
て（それらの生理的リガンドと選択的に相互作用する他の核レセプターとは対照的に）機
能する。PXRはチトクロームP450 3Aモノオキシゲナーゼ遺伝子および体内からの生体異物
の代謝および排泄に関与する他の多数の遺伝子の調節領域においてDNA応答エレメントに
対するレチノイン酸受容体（NR2B）とのヘテロ二量体として結合する。PXRはCYP3A遺伝子
の発現を誘導することが知られる化学物質のスペクトルによって活性化される。炎症性腸
疾患（IBD）は、遺伝因子と環境因子の相互作用、おそらく、管腔の細菌叢の一部に由来
する複合形質であり、制御不能な免疫活性化および慢性炎症につながる。PXRの発現は、
潰瘍性大腸炎（UC）を伴う患者の結腸において有意に減少したが、クローン病（CD）を伴
う患者においては影響を受けない。また、PXRリガンド結合ドメイン（LBD）の三次元構造
の解明は、この異常な核レセプターの乱雑なリガンド結合特性のための構造基盤を示唆す
る。さらなる実施形態では、乱された発現を有する生体異物センサーはPXRであってもよ
い。
【０１７５】
CAR：CARおよびPXRは、同じ核レセプターサブファミリーのメンバーであり（NR1）、そ
れらのリガンド結合ドメイン（LBDs）において約40％のアミノ酸同一性をシェアする。CA
Rは、NR1I3によってコードされ、そして肝臓で最も豊富に発現され、任意の追加されたリ
ガンドの非存在下に細胞ベースのレポーターアッセイにおいて強力な恒常的（構成的）活
性を有する。この恒常的活性は、テストステロンの代謝産物のアンドロスタノールおよび
アンドロステノールの超生理学的な（superphysiological）濃度によって抑制されること
が可能である。これらアンドロスタンは、CARとステロイド受容体コアクチベーター1（SR
C-1）との相互作用を抑制し、「非活性化」がオーファン受容体に直接結合することによ
って媒介されることを示唆される。CARは、初代肝細胞の核において存在しないが、代わ
りに細胞質に隔離される。さらに別の実施形態では、乱された発現を有する生体異物セン
サーはCARであってもよい。
【０１７６】
LXR：哺乳類には二つのLXRアイソフォームがあり、LXRa（NR1 H3）およびLXRb（NR1 H2
）と称される。LXRaは、主に、肝臓、腸、腎臓、脾臓、および脂肪組織において豊富に発
現する一方、LXRbは低いレベルで遍在的に発現する。二つのアイソフォームは、それらの
アミノ酸配列のほぼ80％の同一性をシェアする。リガンド結合の後、LXRsは遺伝子転写を
調節する。LXRsは、腸のコレステロール吸収を抑制することによってコレステロール過負
荷に対して保護するコレステロールセンサーとして動作し、ATP結合カセットトランスポ
ーターABCA1およびABCG1を通して細胞からの高密度リポタンパク質へのコレステロール流
出が刺激され、肝臓においてコレステロールの胆汁酸への変換が活性化され、胆汁性コレ
ステロールおよび胆汁酸排泄が活性化される。LXRsの活性化は炎症および自己免疫反応を
抑制する。さらに、薬理学的研究および遺伝子操作は、これらの受容体がアテローム発生
を抑制することを示す。LX受容体はまた、レニン分泌の調節に関与し、中枢神経系におけ
るアミロイドベータの形成を抑制し、生殖腺および副腎の双方での生殖腺機能およびステ
ロイド産生を調節し、ケラチノサイト（ケラチン生成細胞）の増殖および分化に影響を与
え、そして腫瘍細胞の増殖を抑制する。これらの受容体の発現での、およびそれらのアゴ
ニストのレベルでの変化は、多くの疾患において観察される。LX受容体の複数の役割を考
慮すると、それらのアゴニストは、糖尿病、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化、アルツ
ハイマー病、および性機能低下を含め、多くの疾患の処置において、将来的に適用するこ
とができる。別の代わりの実施形態では、乱された発現を有する生体異物センサーはLXR
であってもよい。
【０１７７】
（d）のストレス応答経路タンパク質
【０１７８】
さらに他の実施形態では、ADME/Toxタンパク質は、細胞ストレス応答経路に関与するこ
とができる。細胞ストレス応答経路の例には、熱ショック、低酸素、小胞体（ER）ストレ
ス、DNA損傷、酸化、炎症、金属ストレス、および浸透圧ストレスが含まれる。細胞スト
レス応答を調査することは、吸収、代謝およびその処分の過程での薬物および環境化学物
質の挙動ならびに毒性についての試験を容易にする。表Fは、細胞ストレス応答経路を、
キー転写調節因子、細胞バイオセンサー、およびいくつかの既知の応答性遺伝子ターゲッ
トと一緒にリストで表示する。
【０１７９】
【表６】
2018078905.tif 000010
【０１８０】
（i）熱ショック
【０１８１】
高温、重金属、毒素、酸化剤、および細菌およびウイルス感染への曝露によって誘導さ
れ、熱ショック応答は、熱ショックタンパク質（Hsps）の増加した発現により特徴付けら
れる。熱ショックタンパク質は、ストレスの多い条件下で生存を確保するが、ストレスが
厳しすぎる場合には、プログラムされた細胞死に至るシグナルが活性化される。 Hspsは
、タンパク質の合成、輸送、およびフォールディング（折り畳み）において重要な役割を
果たし、それで分子シャペロンと称することが多い。細胞熱ショック応答に関与する模範
的な細胞ストレス関連タンパク質を、以下に詳述する。
【０１８２】
HSF1：真核細胞では、熱ショック応答は、熱ショック因子（HSF）として知られる転写
因子によって媒介される転写活性化を伴う。HSFファミリーのいくつかのメンバーは、脊
椎動物（ネズミおよびヒトHSF1、2、および4、ならびにユニークな鳥類HSF3）および植物
において見出された。HSF1、HSFプロトタイプ（HSF原型）、およびHSF3は、熱により誘導
されるHsp発現に関与する。ストレス無負荷の細胞では、HSF1はDNA結合活性をもたない単
量体の形態において細胞質および核の両方に存在する。細胞がストレスを受けるとき、HS
F1はホモ三量体化し（homotrimerizes）、DNA結合活性を取得し、細胞質から核へ移行し
、過剰リン酸化され、および転写的に適確性になる。一旦活性化したら、HSF1は、熱ショ
ックエレメント（HSE）で、熱ショック応答性遺伝中に位置する特定のDNA認識配列に温度
上昇の数分内に結合する。一実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク
質はHSF1であってもよい。
【０１８３】
HSP70：HSF1のストレス活性化のメカニズムはツーフォールド（二つ折り）でありうる
。まず、ストレスは、タンパク質アンフォールディング（タンパク質展開）を誘導し、そ
れは非天然タンパク質の蓄積をもたらす。非天然タンパク質は、HSF1活性の共通の近位誘
導因子（プロキシマルインデューサ）であり、そしてストレスを受けた細胞内でhsp遺伝
子発現を高めると思われる。第二に、Hsp、おそらくHsp70は、ストレスの非存在下での非
アクティブ状態にHSF1を保持することにおいて、および/またはストレスの多い事象に続
いて、その因子をこの状態に戻すことにおいて、その役割を果たすことができ、そこでは
Hsp70は、HSF1活性化のリプレッサーとして機能することができる。
【０１８４】
誘導性Hsp70の発現は、ストレスおよびアポトーシスを誘導する刺激の非常に多くのタ
イプに曝された哺乳動物細胞の残存を高めることが示された。Hsp70のメンバーは多くの
悪性のヒト腫瘍で豊富に発現される。HSP70ファミリーのメンバーのような分子シャペロ
ンは、熱ショック応答の自動調節において重要でありえ、それらは、新生タンパク質の中
間の折り畳み状態を安定化させることにより、タンパク質の折り畳みを容易にするからで
あり、このようにしてそれらが、不可逆的な、非特異的凝集に導かれうる不適切な相互作
用に関与することから防止される。また、Hsp70は、虚血傷害から心筋を保護するのに貢
献することが示された。Hsp70の心保護的な活性のための基礎は、虚血性ストレス中にタ
ンパク質の凝集を防止する能力に関連しているらしい。さらなる実施形態では、乱された
発現を有する細胞ストレスタンパク質はHsp70でありうる。
【０１８５】
HSP 27：Hsp27は、小さな熱ショックタンパク質（sHsps）のファミリーのメンバーであ
る。それらの共通の形質は、保存されたα-クリスタリンドメインであり、それは最も著
名なファミリーのメンバーで、アイレンズ（眼水晶体）タンパク質α-クリスタリンを指
す。機能的には、sHspsは、ATP-非依存（ATP-独立）シャペロンであり、それらは、スト
レス誘発展開の際、それらの凝集を防止するために部分的に折り畳まれた標的タンパク質
の多数と相互作用する。目下、sHspsが、展開されたタンパク質の保管庫として働き、そ
れがHsp70およびHsp100タンパク質のような他の大きなシャペロンの存在下でリフォール
ディングされうることが保たれる。sHspsは、それらの展開クライアントを伴う可溶性複
合体を形成することができるだけでなく、時々、タンパク質展開が細胞内で大規模な場合
は特に、それらは集合体に隔離されると考えられる。Hsp27のために特異的な追加機能に
は、アポトーシスの抑制（プロカスパーゼ-9の活性化を阻止し、ミトコンドリア外膜と相
互作用して、チトクロームc/Apaf-1の活性化を妨げる）、細胞骨格構造の保護、およびプ
ロテアソームの活性化（すなわち、ユビキチン化タンパク質に、および26Sプロテアソー
ムに結合すること）が含まれる。さらに別の実施形態では、乱された発現を有する細胞ス
トレスタンパク質はHsp27でありうる。
【０１８６】
（ii）低酸素ストレス
【０１８７】
酸素ホメオスタシス制御は、全体の生物のレベルならびに単一の細胞のレベルで起こる
。酸素の細胞内レベルは、多くの代謝過程におけるO2の必要性、および一定レベルを超え
たO2の高い毒性の間のバランスのためタイトな（厳しい）制限内に維持されなければなら
ない。細胞レベルで、減少したO2テンション（低酸素）は、分子状酸素を必要としない代
替代謝経路の活性化につながる。好気的代謝から嫌気的解糖への切り替えは、解糖酵素の
誘導およびグルコーストランスポーターの発現によって媒介される。加えて、細胞死また
は残存に関与する様々なストレスタンパク質の発現はアップレギュレートされる。さらに
、組織および全体レベルで起こるさらなる適応は、O2の配送における増加を導く。それら
には、赤血球生成の誘導（赤血球の生産）、血管新生（新しい血管形成）、および過換気
が含まれる。様々なアップレギュレートされたタンパク質のうちには、エリスロポエチン
（EPO）、赤血球の成熟を誘導する主要な増殖因子、および血管内皮増殖因子（VEGF）、
血管新生（脈管形成）および血管透過性の主要なメディエーターがある。これらの、およ
び他のタンパク質の低酸素依存性調節は、転写レベルで起こり、そして低酸素誘導性転写
因子（HIF-1）によって媒介される。HIF-1結合のためのコンセンサスDNA配列は、低い酸
素分圧によってアップレギュレートされた多くの遺伝子にとって一般的である。細胞の低
酸素ストレス応答に関与する模範的な細胞ストレス関連タンパク質を、以下に詳述する。
【０１８８】
HIF-1α：低酸素誘導性因子-1（HIF1）は、細胞および全体の酸素ホメオスタシスのキ
ーとなる重要な調節因子として機能する転写活性化因子である。HIF-1は減少した酸素利
用能に応じてだけでなく、酸化窒素、種々の増殖因子、またはプロリルおよびアスパラギ
ニルヒドロキシラーゼの直接インヒビターのような他の刺激剤によってでも誘導される。
したがって、障害性酸化、炎症、エネルギー不足、または強力な増殖などのようなストレ
スの広い範囲によって引き出される重大な転写因子であると考えられる。HIF-1はまた、
ガンの進行において、ならびに心血管疾患において重要な役割を果たす。
【０１８９】
HIF-1は、αおよびβサブユニットから構成されるヘテロダイマーである。HIF-1活性の
調節は、主にサブユニット（HIF-1α）に関し、そしてタンパク質安定化、翻訳後修飾（
プロリンおよびアスパラギニルヒドロキシル化）、核移行（核転座）、二量体化、転写活
性化、および他のタンパク質との相互作用などのような複数のレベルで生じた。また、mR
NA発現および双方のサブユニットの選択的スプライシングでの変化が観察された。しかし
、正常酸素圧条件下では、HIF-1αおよびHIF-1βが構成的に転写され、そして翻訳される
とき、HIF-1活性の抑止は主に構成的なHIF-1α分解からもたらされる。
【０１９０】
HIF-1αタンパク質のC末端部分は、正常酸素圧条件下ではHIF-1αの分解に関与する酸
素依存性分解ドメイン（ODD）が含まれる。正常酸素圧条件下で、HIF-1αの半減期は10分
未満であり、そしてタンパク質はほとんど検出することができない。HIF-1活性化、また
はHIF-1α安定化は、分子状酸素の欠乏によって誘導される。
【０１９１】
したがって、様々なレポーターシステムと共にHIF-1αノックインを含む細胞は、細胞
を、低酸素ストレスを誘導することができる刺激に接触させたとき、変化したHIF-1α安
定化、翻訳後修飾、核移行、二量体化、転写活性化、および他のタンパク質との相互作用
を検出することが可能でありうる。様々なレポーターシステムと共にHIF-1αノックイン
を含む細胞は、薬物の概略を細胞の酸素恒常性に対するその効果について描くのに用いる
ことができる。一つの代わりの実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパ
ク質はHIF-1αでありうる。
【０１９２】
ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ（ピルビン酸脱水素酵素）1（PDK1）：PDK1はリ
ン酸化を介してピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼを抑制するミトコンドリア酵素であ
る。呼吸鎖タンパク質の不活性化は酸素欠乏に対する重要な細胞応答である。グルコース
の代謝に重要なチェックポイントは、ピルベートで発生し、それはPDK1によってラクテー
ト（乳酸塩）にか、またはアセチルCoAにかのどちらかにも変換することができる。PDK1
遺伝子はHIF-1α依存的様式において低酸素状態の間に誘導され、それゆえ、ミトコンド
リアから離れるピルベートの入れ換えが導かれ、そして入れ替わりに、TCAサイクルの活
性が低減される。このメカニズムは、細胞内の酸素濃度を維持するために細胞によって使
用される。さらなる実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はPDK1
であってもよい。
【０１９３】
グルコーストランスポーター1（GLUT1）：低酸素下では、細胞は、嫌気的解糖を、糖分
解酵素の発現および活性をアップレギュレートし、そして膜レベルでのグルコース輸送を
増加させることによって劇的に増加させる。膜でのグルコース輸送は、主にGLUT-1、促進
性のNa+非依存性トランスポーターファミリーのメンバーによって達成される。GLUT-1は
、多様な組織および細胞タイプに見出され、そして酸化的リン酸化の減少にもかかわらず
、低酸素下で適切なエネルギー供給を提供するために機能する。GLUT1 mRNAおよびトラン
スポーター発現は、低酸素ストレスに応答して細胞において急速、かつ、著しくアップレ
ギュレートされる。さらに別の実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパ
ク質はGLUT1であってもよい。
【０１９４】
血管内皮増殖因子（VEGF）：細胞レベルでは、低酸素は、いくつかの脈管形成遺伝子、
最も注目に値するものには、血管内皮増殖因子（VEGF）の発現を誘導する。複数の因子に
よりVEGFの発現に影響を与えることができるが、低酸素の間にVEGFの発現は、直接的に転
写因子HIF-1によって制御される。別の代わりの実施形態では、乱された発現を有する細
胞ストレスタンパク質はVEGFとすることができる。
【０１９５】
（iii）ER（小胞体）ストレス
【０１９６】
真核細胞では、小胞体（ER）は、分泌、形質膜、または分泌小器官（secretory organe
lles）に予定された（destined）タンパク質のフォールディングおよび加工のための細胞
小器官である。これらのタンパク質は、それらが正確な折り畳み構造を取得するために修
飾され、そしてオリゴマー化されるER内腔中に移行される。これらの細胞における効率的
なタンパク質の折り畳み、および分泌プロセスに対する高い需要は、通常、タンパク質の
成熟プロセスの間に生成されるミスフォールドしたタンパク質の大量の存在によって惹起
されるストレスの一定の供給源を構成する。これらの折り畳みサブプロダクトは、ER関連
分解（ERAD）を通して排除され、そこでミスフォールドしたタンパク質は、細胞質ゾルに
移行し、そしてプロテアソームによって分解される。
【０１９７】
ERストレスはまた、タンパク質の成熟、一定の変異体タンパク質の発現、低下したシャ
ペロン機能、異常なERカルシウム含量レドックス代謝、変更された輸送、および多くの他
のものにおいて、撹乱と関係したタンパク質恒常性を変える条件によってトリガーされる
。小胞体（ER）ストレスは、分泌細胞およびガン、神経変性、糖尿病および炎症を含む多
くの疾患のホールマーク（特徴的な）特色である。小胞体ストレスへの初期応答として、
細胞は、展開タンパク質ロードを減少させ、そして恒常性を回復させるために、展開した
タンパク質応答（UPR）を活性化する。これを達成することができず、または修復処理が
圧倒される場合、プログラム細胞死（アポトーシス）が開始される。
【０１９８】
UPRは、ER膜に位置する三つの異なるストレスセンサー：IRE1α（イノシトール要求性
貫膜キナーゼ/エンドヌクレアーゼ）、ATF6（活性化転写因子6）、およびPERK（PKR様ER
キナーゼ）を通じて機能する。これらのセンサーを通して、UPRは、ER中へのタンパク質
エントリー、折り畳み、グリコシル化、ERAD、タンパク質クオリティーコントロール（品
質維持）、レドックス代謝、オートファジー（自食）、脂質生合成、および小胞輸送に関
与する遺伝子を調節する。小胞体ストレス応答は、少なくとも3つのコンポーネント：（1
）BiP/GRP78、GRP94などのようなERシャペロンおよび折り畳み酵素の転写誘導、およびタ
ンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ジスルフィド異性化酵素）、（2）小胞体にタンパ
ク質のさらなる負荷を防ぐために翻訳減衰、および（3）ERからミスフォールドタンパク
質を取り除くためにER-関連分解（ERAD）が含まれる。細胞の小胞体ストレス応答に関与
する模範的細胞ストレス関連タンパク質を、以下に詳述する。
【０１９９】
BiP/Grp78：ERシャペロンBiPは、UPRの発症の指標として広く用いられた。ATF6および
その本質的なコアクチベーターYY1、構成的に発現した多機能転写因子は、小胞体ストレ
ス条件下でだけBiP/Grp78プロモーターを活性化する。BiPは、PERKおよびIRE1活性化を、
それらをそれらの単量体の不活性状態に保つことによって抑え、そしてBiPの解離は、小
胞体ストレス間にIRE1およびPERK活性化と相関する。ATF6は、ストレスを受けていない細
胞でのBIPとの複合体中に存在し、および小胞体ストレスにより解離する。小胞体ストレ
ス間のBiP結合の損失は、ATF6の活性に対する抑制を軽減し、ATF6がゴルジ体にまで輸送
されることを可能にする。BiPの過剰発現は、ATF6の活性化を減衰させる。したがって、
これは自己調節的モデルであり、それによってERシャペロンがそれら自体の発現を制御す
る。さらなる実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はBiP/Grp78
であってもよい。
【０２００】
PERK：PERKはER-ストレス誘発翻訳減衰を媒介するER膜貫通eIF2αプロテインキナーゼ
である。eIF2αは翻訳開始因子である。活性化PERKは、eIF2αをリン酸化し、ERへのタン
パク質翻訳が抑制され、およびミスフォールドタンパク質の過負荷を減少させることによ
ってERストレスが緩和される。PERKはまた、ERストレスの標的遺伝子CHOP/GADD153を活性
化する転写因子ATF4の選択的な翻訳を促進することにより、転写誘導に寄与する。PERKノ
ックアウトは、ERストレス誘導性アポトーシスに対してより一層感受性である細胞系を作
成し、そしてそのようなシステムは、ERストレスを誘導する化合物をスクリーニングする
ために使用することができる。別の実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタ
ンパク質はPERKであってもよい。
【０２０１】
IRE1：転写誘導はIRE1によって媒介される。IRE1は、細胞質タンパク質キナーゼおよび
エンドリボヌクレアーゼドメインを伴うER膜貫通タンパク質である。IRE1活性の調節につ
いてはほとんど知られていない。ERストレスによるIRE1活性化のメカニズムは、その管腔
ドメインに対するBiPの結合に関与すると考えられる。これは、単量体の状態にそれを保
つことによりIRE1シグナル伝達を抑制する。ERストレスはその後、BiPの解離を引き起こ
し、IRE1のオリゴマー化および活性化が可能にされる。転写因子XBP1はIRE1スプライシン
グの哺乳類標的として同定された。さらに別の実施形態では、乱された発現を有する細胞
ストレスタンパク質はIRE1であってもよい。
【０２０２】
ATF4およびATF6：ATF4（活性化転写因子4）は、アミノ酸およびレドックス代謝におい
て機能するUPR遺伝子を、chop/gadd153およびgadd34を含めてアップレギュレートする転
写因子である。小胞体ストレス下のとき、活性化したPERKは、翻訳開始（トランスレーシ
ョンイニシエーター）因子eIF2αをリン酸化し、そして抑制し、タンパク質の合成および
ERでのミスフォールドタンパク質の過負荷が減少する。eIF2αのリン酸化はATF4の発現を
可能にする。第二UPR経路は、ATF6αおよびATF6、その細胞質ドメインがbZIP転写因子を
コードするII型ER膜貫通タンパク質によって開始される。ERストレス誘導の際、ATF6は、
ゴルジ体で処理され、その細胞質ドメインを解放し、とりわけERでのERADおよび折り畳み
に関連する多くのUPR遺伝子を制御する転写活性化因子として働く。ATF6は、BiPおよびGR
P94などのようなERストレスの標的遺伝子のプロモーターにおいてERストレス応答要素（E
RSE）に結合する。ATF6は、CCAATボックス結合因子NF-Y/CBFの存在下においてだけERSEに
結合する。代わりの実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はATF4
またはATF6でありうる。
【０２０３】
XBP1：第三のUPR経路はXBP1を伴う。ERストレスを受けている細胞では、IRE1αは自己
リン酸化され、そのエンドリボヌクレアーゼドメインの活性化につながる。この活性は、
XBP1をコードするmRNAのスプライシングを媒介し、それは、折り畳みおよびタンパク質の
品質維持に関与する多くの本質的UPR遺伝子をアップレギュレートし、そしてER/ゴルジ生
合成を調節する転写因子である。スプライスされたXBP1（XBP1s）は、タンパク質の折り
畳み、ER、ERADへのタンパク質のエントリー、およびタンパク質の品質維持に関与するUP
R関連遺伝子の広いスペクトルのアップレギュレーションを制御する。他のXBP-1調節遺伝
子は、細胞分化、シグナル伝達、およびDNA損傷経路、輸送経路、転写制御ネットワーク
、脂質およびイオン組成のモジュレーター（修飾物質）、および空胞機能に関連する。さ
らに別の実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はXBP1であっても
よい。
【０２０４】
（iv）DNA損傷
【０２０５】
遺伝的安定性には、細胞が分裂する前に、ゲノムによって維持された任意の損傷が修復
されている必要がある。DNA損傷の検出に起因するチェックポイント信号は、細胞の修復
システムのための時間が作用するのを可能にするために細胞周期を止め、代替成果として
アポトーシスを伴う。遺伝子増幅、移行（転座）、逆位および削除などのような染色体異
常は、しばしば腫瘍細胞で見られ、核型不安定性が腫瘍形成に関与していることが示唆さ
れる。これらの染色体の欠陥の発生に共通するのは、DNA鎖切断（DNA鎖ブレーク）の形成
および再結合である。DNAでの二重鎖切断（DSBs）は、電離放射線によって引き起こされ
る特に危険な病変であり、そして二つの主要な修復経路によって修復され、すなわち、非
相同末端結合（NHEJ）および相同組換え（HR）である。DNA傷害剤、ウイルス組み込みま
たは組み換えなどのような正常な細胞の事象によって生産された切断の解決の忠実度は、
野生型ゲノムが復元されるかどうかを決定する。このため、DNA鎖切断を修復するプロセ
スが厳しく規制されることが重要である。細胞のDNA損傷ストレス応答に関与する模範的
な細胞ストレス関連タンパク質を、以下に詳述する。
【０２０６】
p53：TP53は、p53腫瘍抑止タンパク質、p53をコードする。p53は、細胞周期、DNA修復
に影響を与える多官能分子であり、そして転写を調節し、および異常な組換え、および他
のタンパク質との直接的相互作用によるアポトーシスを抑制する。これらの機能は、p53
が変異原性環境の存在下でゲノム安定性の維持に寄与することができることを可能にする
。DNA損傷に続いて、p53は、G1細胞周期停止およびG2停止を果たし、損傷したDNAの複製
を防止するために、p21Waflタンパク質の発現をアップレギュレートする。p53はまた、結
合し、そしてヌクレオチド切除修復因子XPBおよびXPDのDNA修復活性を調節し、修復機構
に直接的に影響を及ぼす。これらの細胞周期停止およびDNA修復機能が野生型ゲノム状態
への復元に失敗した場合、p53はまた、アポトーシスを介して損傷した細胞の除去を指示
することができる。
【０２０７】
すべてのガンのほぼ50％はTP53での変異を有する。変異p53の主な機能の一つは、RAD51
をアップレギュレートすることである。細胞周期制御の損失に加えて、野生型p53の機能
の欠如はまた染色体異常に関する。遺伝子増幅は、p53機能の不存在下で上昇する。相同
組換えは、不活化したp53によりヒト線維芽細胞において増加する。p53はまた直接的に組
換えに影響を及ぼしうる。p53のC末端塩基性ドメインは、DNA一本鎖アニーリングおよび
鎖移転活性、組換えの間に発生する事象の両方を指示することができる。別の実施形態で
は、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はp53であることができる。
【０２０８】
ATMおよびATR：細胞周期チェックポイントは、別の開始前の細胞事象の完了を確実にす
るために、細胞周期移行の順序およびタイミングを支配する調節経路である。哺乳類のDN
A損傷応答におけるチェックポイント経路の重要な調節因子は、ATM（毛細血管拡張性運動
失調、変異）およびATR（ATMおよびRad3関連）プロテインキナーゼである。これらのタン
パク質の両方は、ホスファチジルイノシトール3 - キナーゼドメインを含むC末端触媒モ
チーフによって特徴付けられるセリン-スレオニンキナーゼの構造的にユニークなファミ
リーに属する。ATMは、電離放射線（IR）への曝露によって生じることがあるDNA二本鎖切
断（DSBs）に対する応答の一次（プライマリー）メディエーターである。ATRは、一方で
は、DSB応答においてバックアップの役割だけを果たすが、UV損傷およびDNA複製における
ストール（行き詰まり）に対する主要応答を指示する。
【０２０９】
一旦活性化すると、ATMおよびATRは、DNA修復/チェックポイント標的の重複セットをリ
ン酸化する。ATMのために、これらには、ゲノム損傷に対する細胞周期反応の主要なレギ
ュレーターであることと一致して、Gadd45、p53、複製タンパク質A、Chk2、NBS1、BRCA1
、およびc-AbIが含まれる。ATRのための標的には、p53およびCHK1が含まれる。これらの
リン酸化事象の一つの重要な効果は、細胞周期チェックポイントの制御である。DNA傷害
の性質に応じ、ATMおよびATRの両方がG1/S、G2/MおよびS期チェックポイントを誘導する
ことができる。そうすることによって、それらはDNAの複製または細胞分裂発生前に細胞
がDNA損傷を正確に修復していることを確実にする。
【０２１０】
ATRの場合、下流の基質をリン酸化する能力は、関連タンパク質（ATRIP）を必要とする
。ATMは、遍在的に発現されるが、異なる細胞および組織型において異質なレベルである
。ATMの画分はまた、細胞質内にも存在する。しかし、ATMは大部分は、培養したヒト細胞
の核内に存在し、DNA損傷に対する細胞応答におけるATMの提案された役割と一致する。
【０２１１】
胸腺では、p53は、IR（電離放射線）の後に核ATMによって直接リン酸化され、p21Waf1/
Cip1の転写活性化および結果として起こる細胞周期停止が導かれる。ATMの不存在下には
、この経路が乱され、そしてこの欠陥は、おそらく、AT（毛細血管拡張性運動失調）、常
染色体劣性遺伝疾患を有する患者において見られるIRに対する免疫不全および異常な細胞
応答をもたらす。神経、免疫および生殖系の遺伝的不安定性および異常はまた、ATの複雑
な臨床的特色の一つであり、それにはまた、リンパ系腫瘍および極端な放射線感受性に対
する素因が含まれる。さらに別の実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタン
パク質はATMまたはATRであってもよい。
【０２１２】
RAD51：Rad51は、もともと酵母において説明され、DNA鎖移行および組換えを触媒する
エシェリキア・コリ（Escherichia coli、大腸菌）RecAタンパク質に密接に関連する。酵
母Rad51の変異体は、二本鎖切断を修復するのに失敗し、自発的な、および放射線誘発さ
れた染色体の損失を見せ、および有糸分裂および減数分裂の組換えの両方において欠陥を
提供する。さらに、酵母Rad51は、組換え中間体への二本鎖切断の変換のために必要と考
えられ、および酵母の減数分裂における組換えの推定細胞増殖巣に局在する。酵母Rad51
のヒトホモログ（ヒト相同体）は、酵母タンパク質と83％の配列相同性を共有し、そして
RecAと共通の中央のDNA結合ドメインを共有する。ヒトRad51（hRad51）は、核に局在化し
、酵母Rad51によって形成されるものと構造的に類似した核タンパク質フィラメントを形
成し、これらのフィラメントにおいてDNAをアンダーワインドし（下方に巻き）、DNA依存
性ATPアーゼ活性を有し、およびATP依存相同対合および鎖移転反応を促進する。両方のタ
ンパク質は、姉妹染色分体交換（SCE）を媒介し、それは、無傷の姉妹染色分体との組換
えによって自発的なDNA損傷のポスト複製修復（post-replicational repair）を反映する
。
【０２１３】
RAD51は、多くの腫瘍において過剰発現される。野生型p53タンパク質は、RAD51の転写
発現を抑制することにおいて、およびRAD51タンパク質活性をダウンレギュレートするこ
とにおいての両方で重要な役割を果たす。RAD51の高レベルは、ゲノムを不安定化するこ
とによって腫瘍進行に関与する。高められたRAD51もまた、ガン遺伝子の活性化および腫
瘍抑圧因子の不活性化に従うより一層急速な細胞分裂間のDNA複製の利益を与えることが
できる。さらなる実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はRAD51
であることができる。
【０２１４】
GADD45：GADD45（増殖停止およびDNA損傷-45）遺伝子は、増殖停止およびDNA損傷-45タ
ンパク質、BRCA1の既知の転写標的をコードする。GADD45はストレスの多い増殖停止条件
およびDNA損傷薬剤による処置後にATR-依存的様式においてVprによってアップレギュレー
トされる。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、MTK1/MEKK4キナーゼを介して
p38/JNK経路の活性化を媒介することによって環境ストレスに応答する。この遺伝子のDNA
損傷誘導転写は、p53依存性および非依存性メカニズムの両方によって媒介される。さら
に別の実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はGADD45であっても
よい。
【０２１５】
（v）酸化ストレス
【０２１６】
反応性酸素種（ROS）は、好気的呼吸および正常な代謝過程の間に生成され、そしてそ
れらはまた、環境要因の広い範囲の代謝の副産物でもある。反応性酸素（活性酸素）（RO
S）および窒素種の高レベル（RNS）の生産は、一般に酸化ストレスとして導かれる条件で
ある。高レベルのROSは細胞に有害であり、それらは、細胞内の分子と容易に反応し、細
胞傷害および死が引き起こされるからである。酸化ストレスはまた、遺伝的不安定性をも
たらす反応性酸素種の不平衡生成を通した発ガンにおいて役割を果たしうる。
【０２１７】
酸化ストレスに応答した細胞保護抗酸化酵素の誘導は、細胞の酸化還元の恒常性の維持
のために重要である。細胞は、ROSレベルを最小にするために、並行して、または順次に
働く様々な防御機構を備える。これらの防御には、ROS代謝および生体異物の生体内変化
に関与する酵素が含まれる。これらの酵素の誘導は、主に転写レベルで調節される。これ
らの酵素の例には、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、チ
オレドキシン、およびヘムオキシゲナーゼならびに第二相酵素で、グルタチオンS-トラン
スフェラーゼなどのようなものが含まれる。酵素的防御に加えて、細胞はまた、グルタチ
オン、メタロチオネイン、およびROSおよび金属イオンをスカベンジする（回収する）フ
ェリチンのような分子を備える。細胞の酸化ストレス応答に関与する模範的な細胞ストレ
ス関連タンパク質を、以下に詳述する。
【０２１８】
Nrf2：酸化ストレスに対する細胞の防御における主要なメカニズムは、Nrf2-ARE（核因
子E2関連因子2-抗酸化応答エレメント）シグナル伝達経路の活性化であり、それは、遺伝
子の発現を制御し、そのタンパク質生成物は反応性オキシダント（反応性酸化体）の解毒
および除去に関与する。ARE活性の強力な誘導物質には、H2O2、酸化還元サイクリングを
受けるか、または反応性もしくは求電子中間体への代謝により変換される化学物質、およ
びジエチルマレアート（ジエチルマレイン酸塩）、イソチオシアナート（イソチオシアン
酸塩）、およびジチオチオン（dithiothiones）などのようなスルフヒドリル基と反応す
る化合物が含まれる。
【０２１９】
Nrf2は転写因子であり、AREによって媒介される誘導可能な、および構成的な遺伝子発
現の両方を制御することにより、細胞の酸化還元状態を調節する。Nrf2の遺伝的混乱は、
いくつかの重要な抗酸化酵素の基本的なおよび誘導可能な発現の両方のレベルを減少させ
る。重要な酵素の若干には：グルタマート-システインリガーゼ触媒サブユニット（Gclc
）、グルタマートシステインリガーゼ修飾サブユニット（Gclm）、グルタチオンペルオキ
シダーゼ2（Gpx2）、およびヘムオキシゲナーゼ1（Hmoxl）が含まれる。
【０２２０】
Nrf2-ARE経路の活性化は、グルタマートおよびH2O2誘発性細胞死からの保護を提供する
。Nrf2媒介性応答は、発ガン、急性化学毒性、酸化ストレス、喘息、急性炎症、敗血性シ
ョック、およびたとえば、アルツハイマー病およびパーキンソン病などのような神経変性
疾患に対する感受性を変化させる。Nrf2のシグナル伝達を活性化する天然および合成化学
誘導物質を用いた研究は、疾患の多くの動物モデルにおいて防御効果を示した。逆に、Nr
f2破壊マウスでの研究は、それらがこれらの病気の多くに対し増加した感受性を見せるこ
とを示す。したがって、Nrf2-AREシグナル伝達の活性化は、幅広い防御反応を構成し、Nr
f2およびその相互作用パートナーが化学予防のための重要な標的になる。別の実施形態で
は、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はNrf2でありうる。
【０２２１】
HMOX1：HMOX1は〔ヘムオキシゲナーゼ（デサイクリング）1〕は、酵素ヘムオキシゲナ
ーゼ1（HMOX1）をコードするヒト遺伝子である。ヘムオキシゲナーゼは、ヘム異化におい
てビリベルジンを形成するためにヘムを開裂する。ヘムオキシゲナーゼ活性は、その基質
ヘムによって、および様々な非ヘム物質によって誘発される。ヘムオキシゲナーゼには、
2つのアイソザイム、誘導性ヘムオキシゲナーゼ-1（HMOX1）および構成的ヘムオキシゲナ
ーゼ-2（HMOX2）がある。HMOX1は様々な固形腫瘍において高度に発現し、および急速な腫
瘍増殖において重要な役割を有する。さらに別の実施形態では、乱された発現を有する細
胞ストレスタンパク質はHMOX1であってもよい。
【０２２２】
PRDX1：PRDX1（ペルオキシレドキシン1）遺伝子は、抗酸化酵素のペルオキシレドキシ
ンファミリーのメンバーをコードし、それらは過酸化水素およびアルキルヒドロペルオキ
シドを減らす。コードされたタンパク質PRDX1は、レドックス調節における細胞での抗酸
化保護の役割を果たし、増殖効果を有することがあり、ガン発症または進行において役割
を果たしうる。PRDX1は、H2O2の細胞内濃度を調節することによって、増殖因子および腫
瘍壊死因子-アルファのシグナル伝達カスケードに参加することができる。まだ別の実施
形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はPRDX1であってもよい。
【０２２３】
GSTA2：GSTA2（グルタチオンS-トランスフェラーゼA2）はGSTA2遺伝子によってコード
される主要な解毒酵素である。酸化ストレスへの応答は、そのプロモーターにおけるARE
によって媒介される転写レベルで調節される。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST
）超遺伝子ファミリーは、哺乳動物組織の細胞質ゾルおよび膜において広く発現されるア
イソザイムをコードする遺伝子ファミリーを含む。GSTは、還元グルタチオン（GSH）と、
多種多様な求電子試薬および種々の化合物で、たとえば、発ガン性物質、治療上の薬物、
環境毒素、および酸化ストレスに起因する酸化DNAまたは脂質のようなものとの接合を触
媒する。
【０２２４】
これらの酵素をコードする遺伝子は、高度に多型であることが知られている。これらの
遺伝的変異は、発ガン性物質および毒素に対する個体の感受性を変え、および若干の薬物
の毒性および有効性に影響を与えることができる。現時点で、可溶性の細胞質性哺乳類グ
ルタチオンS-トランスフェラーゼの8つ異なるクラスが同定されている：アルファ、カッ
パ、ムー、オメガ、ピー、シグマ、シータおよびゼータである。GSTA2遺伝子は、アルフ
ァクラスに属するグルタチオンS-トランスフェラーゼ（tranferase）をコードする。6番
染色体にマッピングされたクラスター内のアルファクラス遺伝子は、肝臓において最も豊
富に発現するグルタチオンS-トランスフェラーゼである。肝臓中でのビリルビンおよび一
定の抗ガン剤を代謝することに加えて、これらの酵素のアルファクラスは、グルタチオン
ペルオキシダーゼ活性を見せ、それによって、反応性酸素種および過酸化の生成物から細
胞を保護する。さらなる実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質は
GSTA2であってもよい。
【０２２５】
Keap1：Keap1（Kelch様ECH関連タンパク質1）は、細胞においてNrf2の蓄積に影響を与
える。Nrf2は、タンパク質分解を受ける非常に不安定なタンパク質であることが見出され
ており、約15分の半減期を伴う。非ストレス細胞では、Nrf2タンパク質レベルは低い。Ke
aplは、構成的様式においてNrf2ユビキチン化を促進するものと考えられる。Keap1との相
互作用により、Nrf2は、ユビキチン化および分解のために直接的にターゲットにされる。
ストレス信号があるとき、Keap1-Nrf2の関連付けが乱され、Keap1核細胞質間シューティ
ング（輸送）またはNrf2移行のどちらを通しても、Nrf2は、安定化され、そして核におい
てその転写活性をもたらされる。
【０２２６】
Keap1は、その一次構造内に非常に多くの数のCys残基を有し、そのことにより、それは
その活性の抑制的調節（inhibitory modulation）が行えることを可能にされ、そして従
ってチオール反応性化学種によってNrf2活性化が導かれる。多数の反応性Cys残基には、K
eap1においてNrf2との相互作用の調節に重要な推定部位が位置257、273、288、および297
のものが含まれる。さらに別の実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパ
ク質はKeap1でありうる。
【０２２７】
p66Shc：p66Shc〔SHC（SRCホモロジー2ドメイン含有）変換タンパク質1〕遺伝子は、マ
イトジェンおよびアポトーシス応答におけるシグナル伝達のためのアダプターのファミリ
ーに属するタンパク質をコードする。通常、p66Shcは、EGFおよびインスリンを含む様々
な細胞外シグナルによってリン酸化（活性化）されるチロシンである。しかし、p66Shcの
セリンリン酸化は、チロシンリン酸化に伴ってか、または独立してかのいずれかの酸化的
ストレスの後に発生することができる。p66Shcセリンリン酸化は、フォークヘッド転写因
子のメンバーの不活性化にリンクされており、増加した細胞内酸化レベルおよびアポトー
シスに対する増加した感受性がもたらされる。ノックアウトp66Shcは、フォークヘッド転
写因子の適度に高められた活性、および細胞レベルでのより一層良好に装備された抗酸化
防御を可能にする。また、p66Shcプロモーターのメチル化は、その発現調節において重要
な潜在的重要性を有し、それは個体間で長命の変化に寄与しうる。遺伝的変異またはp66S
hcノックアウトは、酸化的ストレスに対する感受性が改変された細胞系を作成することが
でき、それは酸化ストレスを誘発する化合物のスクリーニングに用いることができる。一
実施形態では、乱された発現を有する細胞ストレスタンパク質はp66Shcであってもよい。
【０２２８】
（vi）炎症
【０２２９】
炎症は、組織損傷を制限し、および治癒反応を開始するために行われる、生物による防
御反応である。核因子カッパB（NFκB）は炎症反応を調節する重要な転写因子である。ほ
とんどの細胞において、NFκBは、IκBである、抑制的センサーとの相互作用によって細
胞質において潜伏状態に保持される。炎症反応を促進する（Proinflammatory）シグナル
は、IκB/NFκB複合体を不安定にし、そしてそれが著しく多くの数の標的遺伝子の発現を
トリガーする核へのNFκBの移行を可能にする。遺伝子標的には、炎症性遺伝子（例は、C
OX2、iNOS）、接着分子（ICAM、VCAM）、サイトカイン（IL-1、IL-6、TNFα）、ケモカイ
ン（IL-8、MCP-1）および他のストレス応答遺伝子が含まれる。炎症はまた、多くの薬物
代謝酵素をダウンレギュレートする（下方調節する）ことが知られる。
【０２３０】
（e）ADME/Tox遺伝子での一塩基多型
【０２３１】
薬物反応は、薬物代謝酵素、薬物トランスポーター、薬物標的および調節因子を含むい
くつかの異なる構成要素の相互作用が関与する複雑な現象である。薬物反応は、個人間で
大きく異なることがあり、そして遺伝的変異は、薬物の吸収、分布、代謝およびその標的
との相互作用を決定するのに重要な役割を果たす。一塩基多型（SNPs）は、ヒトの遺伝的
変異の最も一般的な形態である。SNPsは、コード領域または非コード領域でありえ、若干
のSNPsが、遺伝子の発現レベル、時間的または領域的な発現特異性、またはそのタンパク
質レベルでの機能獲得または機能喪失を変化させうる。しかし、若干のSNPsは、一般的に
はSNPsの臨床的重要性にもかかわらず、機能的には意義をもたない。
【０２３２】
薬物トランスポーター、薬物代謝酵素、調節核レセプターおよびストレス応答経路のた
めの遺伝子はすべて、SNPsを有するが、それらは様々な頻度であってもよい。遺伝的変動
は、種々の薬物に対して異なる基質特異性を付与することができ、薬物の吸収および分布
に影響を及ぼしえ、大きな母集団における薬物の有効性を変化させる可能性を有する。こ
れらのSNPsの多くは、臨床的意義がありうる。
【０２３３】
ここに開示したトランスポーター、薬物代謝酵素、核レセプター、およびストレス応答
経路内での識別されたSNPsの多数は、それらを有意義な方法でリストするためにそれを非
現実的にする。しかし、どのようにして、個々のSNPを選択し、そして適切な細胞系にお
いてモデル化することができるのかの一例として、表Gには、ヒトCYPsにおいて識別したS
NPsを、それらの相対的頻度および既知の機能的効果を含めて示す。たとえば、一実施形
態では、選定したSNPは、適切な肝細胞系において作成することができるCYP2D6*10であり
うる。
【０２３４】
【表７−１】
2018078905.tif 000011
【表７−２】
2018078905.tif 000012
【０２３５】
（f）レポータータンパク質（群）の随意発現
【０２３６】
特定の実施形態において、少なくとも一つADME/Toxタンパク質の乱された発現を有する
細胞は、少なくとも一つのレポータータンパク質の発現を含んでよい。したがって、細胞
はまた、少なくとも一つのレポータータンパク質を発現するように操作することができる
。別の言い方をすれば、細胞は、レポータータンパク質の発現（群）に関して 「ノック
イン」と呼ぶことができ、ならびに少なくとも一つのADME/Toxタンパク質の乱された発現
を有する。
【０２３７】
適切なレポータータンパク質には、制限はなく、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよ
びその変形（変異）体、エピトープタグ（例は、HA、FLAG、6xHis等のようなもの）、グ
ルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ベータ-ガラクトシダーゼ、マルトース結合
タンパク質（MBP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cloramphenico
l acetyltransferase）（CAT）、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）
が含まれる。適切な蛍光タンパク質の非制限的な例としては、緑色蛍光タンパク質〔例は
、GFP、GFP-2、tag（タグ）GFP、turbo（ターボ）GFP、EGFP、エメラルド、アザミグリー
ン（Azami Green）、モノマーアザミグリーン、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1〕、黄色蛍光
タンパク質（例は、YFP、EYFP、シトリン、ビーナス、YPet、PhiYFP、ZsYellow1）、青色
蛍光タンパク質（例は、EBFP、EBFP2、アズライト、mKalama1、GFPuv、サファイア、T-サ
ファイア）、シアン蛍光タンパク質（例は、ECFP、セルリアン、CyPet、AmCyan1、ミドリ
イシシアン）、赤色蛍光タンパク質（mKate、mKate2、mPlum、DsRedモノマー、mCherry、
mRFP1、DsRedエクスプレス、DsRed2、DsRedモノマー、HcRedタンデム、HcRed1、AsRed2、
eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred）、およびオレンジ色蛍光タンパク質（mOrange
、mKO、Kusabiraオレンジ、モノマーKusabiraオレンジ、mTangerine、tdTomato）が含ま
れる。好適レポータータンパク質には、GFPおよび他の蛍光タンパク質およびルシフェラ
ーゼが含まれる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、レポータータンパク質は、染色体に組み込まれた核酸配列か
ら発現させることができる。レポータータンパク質をコードする核酸は、よく知られた手
順を用いて細胞のゲノム中にランダムに組み込むことができる。あるいはまた、レポータ
ータンパク質をコードする核酸は、セクション（II）（a）に記載するターゲティング（
標的化）エンドヌクレアーゼ技術を用いて細胞のゲノムにおける対象の場所に組み込むこ
とができる。レポータータンパク質をコードする染色体に組み込まれた核酸配列は、操作
可能に転写制御要素に連結することができ、これは、細胞に対して内因性であるか、また
はそれは操作可能に外因性の転写制御要素（たとえば、構成的ウイルスプロモーター、な
どのようなもの）に連結することができる。
【０２３９】
他の実施形態では、レポータータンパク質は染色体外の核酸配列から発現され得る。た
とえば、レポータータンパク質をコードする核酸は、染色体外に残るベクター内にあるか
もしれない。適切なベクターは、細胞にそのようなベクターを導入するための手段として
、この技術でよく知られている。
【０２４０】
（g）細胞タイプ
【０２４１】
上に詳述したように、少なくとも一つのADME/Toxタンパク質の乱された発現を含む細胞
の種類は変動させることができ、変えられる。概して、細胞は哺乳動物細胞である。好適
な細胞はヒト細胞である。若干の例において、細胞は、初代細胞、培養細胞、幹細胞、ま
たは不死化細胞系でありうる。それらの細胞は、多種の細胞種類、例は、腸細胞、肝細胞
、腎細胞、神経細胞、筋肉細胞、肺細胞、頸部細胞、骨細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、筋
芽細胞、TまたはB細胞、マクロファージ、上皮細胞など種々のものであってもよい。ある
いはまた、細胞は幹細胞であってもよい。好適な幹細胞には、前駆細胞、成体幹細胞、多
能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、多分化能幹細胞、オリゴポテント（oligopotent）幹細
胞、および単能性幹細胞が含まれる。
【０２４２】
細胞が哺乳動物細胞系細胞であるとき、細胞系は、任意の樹立細胞株またはまだ記載さ
れていない一次細胞株でありうる。一次細胞株の場合には、これらの細胞は、細胞培養で
伝播し、分裂し続ける能力を増強するように改変されうる。これは、細胞老化を調節する
ことが知られているターゲティング経路、たとえば、p16、p53、pRb、等を含むことがで
きる。哺乳動物細胞株の広範なリストについては、この技術での通常の技量の者は、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ〔ATCC（R）（商法）マナッサス
（Mamassas）、VA（米国バージニア州）〕を指すことができる。
【０２４３】
模範的な細胞はヒト細胞またはヒト化細胞である。特に、模範的なヒト細胞は、腸細胞
もしくは腸細胞株、肝細胞または肝細胞株細胞、腎臓細胞または腎臓細胞株細胞、皮膚細
胞または皮膚細胞株でありうる。
【０２４４】
一実施形態では、腸細胞は、Caco-2、C2BBe1、COLO-205、COLO-320DM、COLO-60H、COLO
-94H、CX-1、CX-2、HRT-18、HT-29、HUTU-80、LOVO、LS-174T、LS-513、SW-1116、SW-403
、SW-480、SW-707、SW-948、T84、WiDr、IEC-18、IEC-6、およびその派生体細胞から選定
されるヒト細胞でありうる。模範的なヒト腸細胞は、C2BBe1細胞などのようなCaco-2細胞
株細胞またはその派生体でありうる。
【０２４５】
別の実施形態では、肝細胞はHepaRG、HEP-G2、Hep-G2-C3A、Hep3B、SK-HEP-1、Chang-L
iver、PLC-PRF-5、THLE-2、Huh7、HLE、Fa2N-4、HC-04、およびその派生体細胞から選ば
れるヒト細胞であってもよい。模範的な肝細胞はHepaRG細胞株細胞またはその派生体であ
ってもよい。HepaRG細胞の利点は、たとえば、多くの第I相薬物代謝酵素が発現されるこ
とである。たとえば、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP
2E1およびCYP3A4は、HepaRG細胞において発現される。
【０２４６】
さらに別の実施形態では、腎臓細胞はciPTEC、293（HEK-293）、HK-2、およびこの誘導
体細胞から選定されるヒト細胞であってもよい。模範的な腎臓細胞はciPTEC細胞またはそ
の誘導体でありうる。
【０２４７】
好ましい実施形態において、細胞は広く、腸、肝臓、腎臓、および脳などのような薬物
の吸収、配置および/または代謝を研究するために使用されるタイプのものである。模範
的な実施形態では、細胞はCaco-2細胞またはその誘導体であってもよい。別の模範的な実
施形態においては、細胞は、HepaRG細胞またはその誘導体であることができる。さらに別
の模範的な実施形態において、細胞はciPTEC細胞またはその誘導体であってもよい。
【０２４８】
（h）好適実施形態
【０２４９】
好ましい一実施形態では、細胞はBCRPの乱された発現（ABCG2によってコード化された
）を含むヒト細胞株であってもよい。別の好ましい実施態様において、細胞はMDR1の乱さ
れた発現（ABC1によってコード化）を含むヒト細胞株でありうる。さらに別の好ましい実
施態様において、細胞は、BCRPおよびMDR1の両方の乱された発現を含むヒト細胞株であっ
てもよい。模範的な実施形態においては、上記に詳述した細胞は、BCRPおよび/またはMDR
1の発現が実質的に除去（即ち、ノックアウト）されるように、BCRPおよび/またはMDR1を
コードする不活化染色体配列を含む。好ましい細胞株のそれぞれは、さらに少なくとも一
つのレポータータンパク質の 「ノックイン」発現を含むことができる。
【０２５０】
（II）ADME/Toxタンパク質（群）の乱された発現を有する細胞を調製するための方法
【０２５１】
本開示の別の態様は、少なくとも一つのADME/Toxタンパク質の乱された発現を有する細
胞を調製するための方法を提供する。発現は、ADME/Toxタンパク質をコードする染色体配
列を修飾または編集することによって乱されうる。あるいはまた、タンパク質の発現は、
RNAメッセージの翻訳を防止するか、またはRNAメッセージの分解を媒介することによって
破壊されてもよい。目的のタンパク質の発現を乱すための適切な手段は、ターゲティング
エンドヌクレアーゼ（標的化ポリヌクレオチド内部加水分解酵素）、RNA干渉、および相
同組換え技術を使用したゲノム編集を含む。
【０２５２】
大抵、この方法は、ADME/Toxタンパク質のうちの少なくとも一つの発現を修飾する少な
くとも一つの薬剤を細胞中に導入することを含む。発現が乱される細胞は、変動すること
ができ、変えられる。適した細胞は、セクション（I）（f）において上記に詳述する。
【０２５３】
（a）ターゲッティグエンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ADME/Toxタンパク質の発現は、ターゲティングエンドヌクレ
アーゼによって媒介されるように標的ゲノム編集を介したDNAのレベルで乱されうる。タ
ーゲティングエンドヌクレアーゼは、特定の二本鎖染色体DNA配列を認識し、それを結合
し、そして染色体配列中の標的開裂部位での二本鎖切断を導入するエンティティ（実体）
である。ここで用いるように、「ゲノム編集」または「染色体編集」は、タンパク質生産
が行われず、低下したレベルのタンパク質生産が行われ、またはタンパク質生産の改変バ
ージョンが行われるように、ゲノムまたは染色体配列の修飾または編集が参照される。編
集された染色体配列は、少なくとも一つのヌクレオチドの欠失、少なくとも一つのヌクレ
オチドの挿入、または少なくとも一つのヌクレオチドの置換を含むことができる。
【０２５５】
概して、標的ゲノム編集のための方法は、細胞に、少なくとも一つのターゲティングエ
ンドヌクレアーゼまたはターゲティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入する
ことを含み、それは、染色体配列において標的配列を認識し、そして染色体配列において
部位を開裂させることができ、および、随意に、（i）少なくとも一つのドナーポリヌク
レオチドが、統合のための配列を含み、その配列は、それらが開裂部位の両側で同一な実
質的配列をシェアする上流配列および下流配列によって側面を接し、そこでは、ターゲテ
ィングエンドヌクレアーゼは染色体配列に二本鎖切断を導入し、そして二本鎖切断は、（
i）非相同末端結合性修復プロセスによって、不活化変異が染色体配列中に導入されるよ
うに、または（ii）相同性指向修復プロセスによって、ドナーポリヌクレオチドにおける
配列が染色体配列中に統合されるように、修復される。この方法はさらに、ターゲティン
グエンドヌクレアーゼが染色体配列において標的部位で二本鎖切断を導入するように細胞
を培養することを含む。二本鎖切断の修復の際に、編集された染色体配列は、少なくとも
ヌクレオチドの欠失、少なくとも一つのヌクレオチドの挿入、少なくとも一つのヌクレオ
チドの置換またはそれらの組合せを含む。
【０２５６】
ここに開示する方法において使用されるターゲティングエンドヌクレアーゼのタイプは
、変動することができ、変えられる。ターゲティングエンドヌクレアーゼは、自然に発生
するタンパク質または工学的なタンパク質であってもよい。一実施形態において、ターゲ
ティングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであってもよい。メガヌクレアーゼは
、大きな認識部位によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、すな
わち、その認識部位は概して、約12塩基対から約40塩基対までの範囲に及ぶ。この必要条
件の結果として、認識部位は概して、任意の所定ゲノム中に一回だけ発生する。メガヌク
レアーゼのうちで、ホーミングエンドヌクレアーゼのLAGLIDADGファミリーは、ゲノムお
よびゲノム工学の研究のための貴重なツールとなった。メガヌクレアーゼは、この技術で
の熟練者によく知られた技術を用いて、それらの認識配列を修飾することによって、特定
の染色体配列をターゲットとすることができる。
【０２５７】
別の実施形態では、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェク
ター（TALE）ヌクレアーゼでありうる。TALEsは、新たなDNA標的を結合するように容易に
設計することができる植物病原体のキサントモナスからの転写因子である。TALEsまたは
その切断型バージョンは、Foklのようなエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに、TALEヌク
レアーゼまたはTALENsと称するターゲティングエンドヌクレアーゼを作成するために連結
することができる。
【０２５８】
さらに別の実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、部位特異的ヌク
レアーゼでありうる。特に、部位特異的ヌクレアーゼは、その認識配列がゲノムにめった
に発生しない「レアカッター」エンドヌクレアーゼであることができる。好ましくは、部
位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、ゲノム中に一回だけ発生する。代わりのさらなる実
施形態において、ターゲティングヌクレアーゼは、人工標的DNA二本鎖切断誘発剤であっ
てもよい。
【０２５９】
（i）ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介ゲノム編集
【０２６０】
好ましい実施形態では、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌク
レアーゼ（ジンクフィンガー核酸分解酵素）（ZFN）であってもよい。典型的には、ジン
クフィンガーヌクレアーゼは、DNA結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および
開裂ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、その双方を以下に記載する。
【０２６１】
ジンクフィンガー結合ドメイン。ジンクフィンガー結合ドメインは、選ばれた任意の核
酸配列を認識し、それに結合するように設計することができる。たとえば、Beerli（ビア
ーリ）ら、（2002）Nat. Biotechnol.（ネイチャー・バイオテクノロジー）、20:135-141
；Pabo（パボ）ら、（2001）Ann. Rev. Biochem.（アニュアル・レビュー・オブ・バイオ
ケミストリー）、70:313-340；Isalan（イサラン）ら、（2001）Nat. Biotechnol. 19:65
6-660；Segal（シーガル）ら、（2001）Curr. Opin. Biotechnol.（カレント・オピニオ
ン・イン・バイオテクノロジー）12:632-637；Choo（チュウ）ら、（2000）Curr. Opin. 
Struct. Biol.（カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー）10:41
1-416；Zhang（チャン）ら、（2000）J. Biol. Chem.（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー）275（43）:33850-33860；Doyon（ドヨン）ら、（2008）Nat. Bio
technol. 26:702-708；およびSantiago（サンティアゴ）ら、（2008）Proc. Natl. Acad.
Sci. USA（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーテス・オブ・アメリカ）105:5809-5814を参照
。工学的ジンクフィンガー結合ドメインは、自然に発生するジンクフィンガータンパク質
と比較して、新規な結合特異性を有しうる。工学的方法には、制限はないが、合理的設計
および選択の様々な種類が含まれる。合理的設計には、ダブレット、トリプレット、およ
び/またはクワドラプレット（四つ）のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガー
のアミノ酸配列を含むデータベースを使用し、そこでは、各ダブレット、トリプレットま
たはクワドラプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクワドラプレッ
トの配列を結合するジンクフィンガーの一つまたはそれよりも多く（一以上）のアミノ酸
配列と関係する。たとえば、米国特許第6453242号および第6534261号を参照するが、それ
らの開示を、ここに参照することによりその全体を組み込む。一例として、米国特許第64
53242号に記載されたアルゴリズムは、ジンクフィンガー結合ドメインを設計し予め選定
した配列を標的とするために使用することができる。非縮退（nondegenerate）識別コー
ドテーブルを使用する合理的設計などのような代替方法はまた、ジンクフィンガー結合ド
メインを設計し、特定の配列を標的とするために使用することができる〔Sera（セラ）ら
、（2002）Biochemistry（バイオケミストリー）41 :7074-7081〕。 DNA配列の潜在的な
標的部位を特定し、ジンクフィンガー結合ドメインを設計するための公に利用可能なウェ
ブベースのツールは、それぞれ、http://www.zincfingertools.orgおよびhttp://bindr.g
dcb.iastate.edu/ZiFiT/で見出しうる〔Mandell（マンデル）ら（2006）Nuc. Acid Res.
（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）34：W516-W523；Sander（サンダー）ら（2007）N
uc. Acid Res.、35：W599-W605）。
【０２６２】
ジンクフィンガー結合ドメインは、約3個のヌクレオチドから約21個のヌクレオチドの
長さで、または好ましくは約9から約18までのヌクレオチドの長さに及ぶ範囲のDNA配列を
認識し、および結合するように設計しうる。概して、ここに開示するジンクフィンガーヌ
クレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインには、少なくとも3つのジンクフィンガー認
識領域（すなわち、ジンクフィンガー）が含まれる。一実施形態において、ジンクフィン
ガー結合ドメインには、4つのジンクフィンガー認識領域を含むことができる。別の実施
形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、5つのジンクフィンガー認識領域を含むこ
とができる。さらに別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、6つのジンク
フィンガー認識領域を含むことができる。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の適切
な標的DNA配列に結合するように設計されうる。たとえば、米国特許第6607882号；第6534
261号および第6453242号を参照し、その開示は、その全体をここで参照することにより組
み込む。
【０２６３】
ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的な方法は、ファージディスプレイおよびツ
ーハイブリッドシステムを含むことができ、そして米国特許第5789538号、第5925523号、
第6007988号、第6013453号、第6410248号、第6140466号、第6200759号、および第6242568
号、ならびに国際公開WO98/37186号；WO98/53057号、WO00/27878号；WO01/88197号および
英国特許GB 2338237号明細書に開示され、それらのそれぞれを、その全体において参照す
ることにより組み込む。また、ジンクフィンガー結合ドメインのための結合特異性の増強
は、たとえば、WO02/077227号に記載され、その開示を、参照することによりここに組み
込む。
【０２６４】
ジンクフィンガー結合ドメインおよび融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌ
クレオチド）の設計および構築ための方法は、この技術において熟練した者に既知であり
、米国特許出願公開第20050064474号および第20060188987号明細書に詳細に記載され、そ
れぞれを、その全体においてここに参照することにより組み込む。ジンクフィンガー認識
領域および/またはマルチフィンガードジンクフィンガータンパク質は、適切なリンカー
配列、たとえば、長さが5個以上のアミノ酸のリンカーを含め、互いに結合することがで
きる。米国特許第6479626号、第6903185号、および第7153949号明細書を参照し、それら
の開示は、長さが6以上のアミノ酸のリンカー配列の非制限的な例として、その全体にお
いてここに参照することにより組み込む。ここに記載のジンクフィンガー結合ドメインに
は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適切なリンカーの組合せを含むことがで
きる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、さらに、核局在シグナル
または配列（NLS）を含むことができる。NLSは、染色体において標的配列での二本鎖切断
を導入するために核内へのジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質をターゲティングす
るのを容易にするアミノ酸配列である。核局在化シグナルはこの技術で知られている。た
とえば、Makkerh（マーカー）ら、（1996）Current Biology（カレント・バイオロジー）
6：1025-1027を参照。
【０２６６】
開裂ドメイン。ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、開裂ドメインを含む。ジンクフ
ィンガーヌクレアーゼドメインの開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキ
ソヌクレアーゼから得ることができる。エンドヌクレアーゼは、それから開裂ドメインが
誘導されえ、その非制限的な例としては、制限はないが、制限エンドヌクレアーゼおよび
ホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。たとえば、2002-2003カタログ、New England
Biolabs（ニュー・イングランド・バイオラブズ社）、Beverly（ビバリー）、Mass.（マ
サチューセッツ州）；およびBelfort（ベルフォート）ら、（1997）Nucleic Acids Res.
（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）25：3379-3388またはwww.neb.com. を参照。DNA
を切断する追加する酵素が知られている（例は、S1ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレア
ーゼ；膵臓DNアーゼI；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母HOエンドヌクレアーゼ）。Lin
n（リン）ら、（編）Nucleases（ヌクレアーゼズ）、Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）、1993も参照。これら
の酵素のうちの1つ以上（またはその機能的フラグメント）は、開裂ドメインのソースと
して使用することができる。
【０２６７】
開裂ドメインはまた、その酵素または部分から誘導することができ、上述したように、
開裂活性のための二量体化を必要とする。2つのジンクフィンガーヌクレアーゼは、開裂
のために必要とされえ、各ヌクレアーゼは活性酵素ダイマーのモノマーを含むからである
。あるいはまた、単一ジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素ダイマー（活性酵素二
量体）を作成するために、両方のモノマーを含むことができる。ここで用いるように、「
活性酵素ダイマー」は、核酸分子を開裂させることが可能な酵素ダイマーである。2つの
開裂モノマーは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来して
よく、または各モノマーは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント
）から由来してよい。
【０２６８】
2つの開裂モノマーを、活性酵素ダイマーを形成するために用いるとき、2つのジンクフ
ィンガーヌクレアーゼの認識部位は、好適には、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼの
それぞれの認識部位への結合が、互いに空間的定位（spatial orientation）において開
裂モノマーを配置し、それによって、開裂モノマーが、活性酵素ダイマーを形成すること
を、例は、二量体化によって可能にする。結果として、認識部位の近縁（near edges）は
、約5から約18個までのヌクレオチドにより分けることができる。例として、近縁は、約5
、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18個のヌクレオチドによって分け
ることができる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、2
つの認識部位の間に介在してもよい（例は、約2から約50個までのヌクレオチド対、また
はそれよりも多い）ことが理解されるであろう。たとえば、ここに詳細に記載するものの
ような、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近縁は、6個のヌクレオチドによっ
て分けることができる。概して、開裂の部位は認識部位間にある。
【０２６９】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、そしてDNA（認識部位で
）に配列特異的に結合し、および結合部位で、またはその近くでDNAを開裂することが可
能である。一定の制限酵素（例は、タイプIIS）は、認識部位から取り出された部位でDNA
を開裂し、そして分離可能な結合および切断ドメインを有する。たとえば、タイプIIS酵
素Foklは、DNAの二本鎖開裂を、一方の鎖上のその認識部位から9個のヌクレオチドにて、
および他方でその認識部位から13個のヌクレオチドにて触媒する。たとえば、米国特許第
5356802号、第5436150号および第5487994号明細書；ならびにLi（リー）ら（1992）Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89：4275-4279；Liら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：
2764-2768；Kim（キム）ら（1994a）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：883-887；Kimら（
1994b）J. Biol. Chem. 269：31, 978-31, 982を参照。このように、ジンクフィンガーヌ
クレアーゼは、少なくとも一つのタイプIIS制限酵素および1つ以上のジンクフィンガー結
合ドメインからの開裂ドメインを含むことができ、それは操作されるか、またはされなく
てもよい。模範的なタイプIIS制限酵素は、たとえば、国際公開WO07/014275号に記載され
、その開示を、その全体においてここに参照することにより組み込む。追加的な制限酵素
はまた、分離可能な結合および開裂メインを含み、これらもまた、本開示により考慮され
る。たとえば、Roberts（ロバーツ）ら（2003）Nucleic Acids Res. 31：418-420参照。
【０２７０】
模範的なタイプIIS制限酵素は、その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能であり
、FokIである。この特定の酵素は、ダイマーとして活性である〔Bitinaite（バイティナ
イト）ら（1998）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：10, 570-10, 575〕。したがって、本
開示の目的として、ジンクフィンガーヌクレアーゼで使用するFokl酵素の一部分が開裂モ
ノマーと考えられる。それゆえ、FokI開裂ドメインを用いる標的二本鎖開裂のために、2
つのジンクフィンガーヌクレアーゼは、各々がFokI開裂モノマーを含み、活性酵素ダイマ
ーを再構成するために使用することができる。あるいはまた、ジンクフィンガー結合ドメ
イン含有単一ポリペプチド分子およびFokI開裂モノマーを用いうる。
【０２７１】
一定の実施形態において、開裂ドメインは、たとえば、米国特許出願公開第2005006447
4号、第20060188987号および第20080131962号明細書で、これらの各々が、その全体にお
いてここに参照することにより組み込まれるものに説明されるように、ホモ二量体化を最
小にするか、または防止する1以上の工学的開裂モノマーを含むことができる。非制限的
な例として、FokIの位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499
、500、531、534、537、および538でのアミノ酸残基は、Fokl開裂ハーフドメインの二量
体化に影響を与えるためのすべての標的である。偏性（絶対）ヘテロダイマーを形成する
FokIの模範的な人工開裂モノマーには、ペア（組）が含まれ、そこでは、第一の開裂モノ
マーは、FokIのアミノ酸残基位置490および538での変異を含み、および第二の開裂モノマ
ーはアミノ酸残基位置486および499での変異を含む。
【０２７２】
したがって、一実施形態では、アミノ酸位置490での変異は、Glu（E）をLys（K）に置
き換え；アミノ酸残基538での変異は、Iso（I）をLys（K）に置き換え；アミノ酸残基486
での変異は、Gln（Q）をGlu（E）に置き換え；および位置499での変異は、Iso（I）をLys
（K）に置き換える。具体的には、人口開裂モノマーは、「E490K：I538K」と称する人工
開裂モノマーを生産するために、1つの開裂モノマーにおいて位置490でEからKに、および
538で IからKに変異させることによって、および「Q486E：I499L」と称する人工開裂モノ
マー生産するために別の開裂モノマーにおいて位置486で QからEに、および499でIからL
に変異させることによって調製することができる。上述したように設計された開裂モノマ
ーは、偏性ヘテロ変異体であり、そこでは、異常な開裂が最小化または廃止される。人工
開裂モノマーは、たとえば、米国特許出願公開第20050064474号明細書に記載されている
ように、野生型開裂モノマーの部位特異的突然変異誘発（FokI）により、適切な方法を用
いて調製することができる。
【０２７３】
（ii）随意ドナーポリヌクレオチド
【０２７４】
標的ゲノム編集のための方法には、さらに染色体配列に統合される配列を含む少なくと
も1つのドナーポリヌクレオチドが細胞に導入されることを含むことができる。たとえば
、染色体配列（また興味ある配列とも呼ばれる）に統合される配列は、少なくとも1つの
ヌクレオチド置換を含みうる。ドナーポリヌクレオチドは、興味ある配列、ならびに組込
みの部位の上流の配列と実質同じ配列、および組込みの部位の下流の配列と実質同じ配列
を含む。このようにして、ドナーヌクレオチド内で、興味ある配列は、上流および下流の
配列に隣接され、そこでは、上流および下流の配列が、染色体での組込みの部位のいずれ
かの側で類似する配列を共有する。
【０２７５】
典型的には、ドナーのポリヌクレオチドはDNAである。 DNAは一本鎖または二本鎖であ
ってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、DNAプラスミド、バクテリア人工染色体（BAC）
、酵母人工染色体（YAC）、ウイルスベクター、DNAの線形部分、PCRフラグメント（断片
）、ネイキッド（裸）の核酸、またはリポソームまたはポロクサマーなどのようなデリバ
リービークルと複合体を形成した核酸であってよい。
【０２７６】
ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流の配列は、興味ある染色体配列とドナ
ーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選定される。上流の配列は、ここで
用いるように、統合の標的部位の上流の染色体配列との配列類似性を共有する核酸配列を
指す。同様に、下流の配列は、統合の標的部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有す
る核酸配列を指す。ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流の配列は、標的染色
体配列と、約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86
％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、または94％の配列同一性を共有するこ
とができる。他の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流の配列は
、標的染色体配列と、約95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を共
有することができる。模範的な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流
の配列は、標的染色体配列と約99％または100％の配列同一性を共有することができる。
【０２７７】
上流または下流の配列は、約20bpから約2500 bpまでを含むことができる。一実施形態
では、上流または下流の配列は、およそ20、50、100、200、300、400、500、600、700、8
00、900、1000、100 1、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100
、2200、2300、2400、または2500 bpを含みうる。好ましい上流または下流の配列は、約2
00bp乃至約2000 bp、約600bp乃至約1000bp、またはより一層具体的には約700bp乃至約100
0bpを含んでもよい。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはさらに、マーカーを含むことがで
きる。このようなマーカーは、それが標的化した統合についてスクリーニングすることを
容易にする。適切なマーカーの非制限的な例としては、制限部位、蛍光タンパク質、また
は選択マーカーが含まれる。
【０２７９】
この技術において熟練した者は、よく知られた標準的な組換え技術を用いて、ここに記
載したようにドナーポリヌクレオチドを構築することができるであろう〔たとえば、Samb
rook（サムブルック）ら、2001年およびAusubel（オースベル）ら、1996を参照〕。
【０２８０】
（iii）細胞へのデリバリー
【０２８１】
ターゲティングエンドヌクレアーゼは、標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸とし
て細胞に導入することができる。核酸はDNAまたはRNAでありうる。ターゲティングエンド
ヌクレアーゼがmRNAによってエンコードされる実施形態では、mRNAは5′キャッピングさ
れ、および/または3′ポリアデニル化されうる。ターゲティングエンドヌクレアーゼがDN
Aによってエンコードされる実施形態において、DNAは、線状または環状であることができ
る。DNAは、ベクターの一部分であってもよく、ここで、エンコーディングDNAは適切なプ
ロモーターに作動可能に連結しうる。この技術での熟練者は、適したベクター、プロモー
ター、他の制御要素、および関心のある細胞にベクターを導入する手段に精通している。
【０２８２】
この方法は、ターゲティングエンドヌクレアーゼまたはターゲティングエンドヌクレア
ーゼをコードする核酸、および随意に、ドナーポリヌクレオチドを細胞へ導入することを
含む。細胞に望ましい分子を導入する適切な方法には、マイクロインジェクション、エレ
クトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティクス（遺伝子銃）、リン酸カル
シウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトラン
スフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション
、ヌクレオフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェク
ション、オプティカル（光）トランスフェクション、独自薬剤で強化した核酸の取込み、
およびリポソーム、イムノリポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介したデリバ
リーが含まれる。
【０２８３】
ターゲティングエンドヌクレアーゼおよびドナーポリヌクレオチドをコードする核酸の
両方が細胞に導入される実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの、ジンクフィンガーヌ
クレアーゼをコードする核酸に対する比は、約1:10から約10:1までに及ぶことができる。
様々な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコー
ドする核酸に対する比は、約1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1: 3、1:2、1:1、2:
1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、または10:1であってもよい。一実施形態では、
この比は約1:1でありうる。
【０２８４】
ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードする一よりも多くの核酸および随意に、一
よりも多くのドナーポリヌクレオチドが細胞に導入される実施形態において、核酸は、同
時にまたは順次に導入することができる。たとえば、ターゲティングエンドヌクレアーゼ
をコードする核酸は、各々別個の認識配列について特異的であり、ならびに随意のドナー
ポリヌクレオチドは、同時に導入することができる。あるいはまた、ターゲティングエン
ドヌクレアーゼをコードする各核酸、ならびに随意のドナーポリヌクレオチドを順次導入
してもよい。
【０２８５】
（iv）細胞の培養
【０２８６】
ターゲティングエンドヌクレアーゼで染色体配列を編集する方法はさらに、ターゲティ
ングエンドヌクレアーゼの発現、必要に応じて、標的部位での切断、およびターゲティン
グエンドヌクレアーゼによって誘導される二本鎖切断の修復を可能にするために、細胞を
培養することを含む。細胞は、たとえば、Santiago（サンティアゴ）ら、（2008）PNAS 1
05：5809-5814；Moehle（モエール）ら、（2007）PNAS 104：3055-3060；Urnov（アーノ
フ）ら、（2005）Nature（ネーチャー）435：646-651；およびLombardo（ロンバルド）ら
、（2007）Nat. Biotechnology（ネーチャー・バイオテクノロジー）25：1298-1306に記
載されたように、標準的な細胞培養技術を用いて培養することができる。この技術での熟
練した者は、細胞を培養するための方法がこの技術において知られており、そして細胞の
タイプに応じて変化させることができることを認識する。ルーチンの最適化は、すべての
場合において、特定の細胞タイプのための最高の技術を決定するために使用することがで
きる。
【０２８７】
細胞が、ターゲティングエンドヌクレアーゼを含むが、ドナーポリヌクレオチドを含ま
ない実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、興味ある染色体配列にお
いて標的配列を認識し、結合し、そして開裂する。ターゲティングエンドヌクレアーゼに
よって導入される二本鎖切断は、変異性（エラーが発生しやすい）非相同末端結合DNA修
復プロセスによって修復される。結果的に、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失または
挿入は、染色体配列において導入することができる。欠失または挿入の結果として、染色
体配列は、機能的トランスポーターが形成されないよう不活性化されてよい。
【０２８８】
細胞がターゲティングエンドヌクレアーゼならびにドナーポリヌクレオチドを含む実施
形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、染色体の標的配列を認識し、結合
し、そして開裂させる。ターゲティングエンドヌクレアーゼによって染色体配列に導入さ
れた二本鎖切断は、ドナーポリヌクレオチドでの配列が染色体配列の一部分を交換するこ
とができるように、ドナーポリヌクレオチドでの相同組換えを介して修復される。ドナー
ポリヌクレオチドは、物理的に統合されてもよく、または代替的に、ドナーポリヌクレオ
チドは、切断修復のためのテンプレート（鋳型）として使用することができ、染色体配列
のその部分における配列情報によるドナーヌクレオチド配列における配列情報の交換がも
たらされる。そのように、内因性染色体配列の一部分はドナーヌクレオチドの配列に変換
することができる。変化したヌクレオチド（群）は、開裂の部位に、またはその近くにあ
る。代わりに、変化したヌクレオチド（群）は、交換した配列のどこにでもありうる。し
かし、交換の結果として、染色体配列は、ADME/Tox関連タンパク質の修飾バージョンが作
成されうるか、または、代わりに発現のレベルが変えられうるように修飾される。
【０２８９】
（b）RNA干渉
【０２９０】
他の実施形態では、少なくとも一つADME/Toxタンパク質の発現を、RNA干渉技術を用い
て破壊することができる。すなわち、発現は、標的mRNAまたは転写産物の発現を抑制する
RNA干渉（RNAi）薬剤を導入することによって乱されうる。RNAi薬剤は、標的mRNAまたは
転写産物の開裂および劣化を導くことができる。あるいはまた、RNAi薬剤は、タンパク質
への標的mRNAの翻訳を妨げるか、または破壊することができる。
【０２９１】
例として、RNAi薬剤は短い干渉RNA（siRNA）であることができる。概して、siRNAには
、長さが約15から約29ヌクレオチドまでに及ぶ二本鎖RNA分子が含まれる。siRNAは、長さ
が16-18、17-19、21-23、24-27、または27-29ヌクレオチドでありうる。好ましい実施形
態では、siRNAは長さが約21ヌクレオチドであってよい。siRNAは、随意に、一または二つ
の一本鎖オーバーハング、例は、一方または両方の端部に3′オーバーハングを含むこと
ができる。siRNAは、互いにハイブリダイズする2つのRNA分子から形成することができ、
またはあるいは、低分子ヘアピン型RNA（short hairpin RNA）（shRNA）から生成するこ
とができる（下記参照）。いくつかの実施形態では、siRNAの二本鎖は、ミスマッチまた
はバルジが、2つの配列の間に形成される二本鎖において存在しないように、完全に相補
的であることができる。他の実施形態では、siRNAの二本の鎖は、一またはそれよりも多
くのミスマッチおよび/またはバルジが、2つの配列の間に形成される二本鎖において存在
することができるように、実質相補的であってもよい。一定の実施形態では、siRNAの5′
末端の一方または両方は、リン酸基を有していてもよいが、その一方、他の実施形態では
、5′末端の一方または両方はリン酸基を欠くことができる。他の実施形態では、siRNAの
3′末端の一方または両方は、ヒドロキシル基を有していてよいが、その一方、他の実施
形態では、5′末端の一方または両方は、ヒドロキシル基を欠いていてもよい。
【０２９２】
siRNAの一つの鎖は、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖（guide strand）」と呼ば
れ、標的転写産物とハイブリダイズする部分を含む。好ましい実施形態では、siRNAのア
ンチセンス鎖は、標的転写物の領域と完全に相補的であってもよく、すなわち、それは、
長さが約15および約29個のヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも16個のヌクレオチ
ド、より好ましくは長さが約18-20個のヌクレオチドの間の標的領域上に単一ミスマッチ
またはバルジを伴うことなく標的転写産物にハイブリダイズする。他の実施形態において
、アンチセンス鎖は、標的領域に実質的に相補的であることができ、すなわち、1つまた
はそれよりも多くのミスマッチおよび/またはバルジが、アンチセンス鎖および標的転写
産物によって形成される二本鎖において存在しうる。典型的には、siRNAは、標的転写産
物のエクソン配列を標的にする。この技術に熟練した者は、標的転写産物のためにsiRNA
を設計するプログラム、アルゴリズム、および/または商業サービスに精通している。模
範的な例は、ロゼッタsiRNAデザインアルゴリズム〔Rosetta Inpharmatics, North Seatt
le, WA（ロゼッタ・インファルマティクス、ノースシアトル、ワシントン州）〕およびMI
SSION(R)〔ミッション（商標）〕siRNA〔Sigma-Aldrich, St. Louis, MO（シグマ-アルド
リッチ社、セントルイス、ミズーリ州）〕である。siRNAは、酵素的に、この技術に熟練
した者によく知られている方法を用いてインビトロにおいて合成することができる。ある
いはまた、siRNAは、この技術でよく知られるオリゴヌクレオチド合成技術を用いて化学
的に合成することができる。
【０２９３】
他の実施形態では、RNAi薬剤は、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）であることができる。
概して、shRNAは、十分に長い二本鎖構造を形成してRNA干渉を媒介する（上述の）ために
ハイブリダイズするか、またはハイブリダイズ可能な少なくとも2つの相補的な部分、お
よび二重鎖を形成するshRNAの領域が接続されるループを形成する少なくとも1つの一本鎖
部分が含まれるRNA分子である。構造はまた、二重の部分であるステムを有する、ステム
ループ構造と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、構造の二重の部分は、ミスマ
ッチまたはバルジがshRNAの二重鎖領域内に存在しないように完全に相補的であってもよ
い。他の実施形態では、構造の二重の部分は、一つ以上のミスマッチおよび/またはバル
ジがshRNAの二重の部分に存在することができるように、実質的に相補的でありうる。構
造のループは、長さが約1から約20個のヌクレオチドまで、好ましくは長さが約4から約10
個のおよそのヌクレオチド、およびより好ましくは長さが約6から約9個のヌクレオチドで
ありうる。ループは、標的転写産物に相補的な領域の5′または3′末端のいずれか（すな
わち、shRNAのアンチセンス部分）に位置することができる。
【０２９４】
shRNAは、さらに、5′または3′末端上にオーバーハング（突出部）を含むことができ
る。随意のオーバーハングは、長さが約1から約20個のヌクレオチドまで、およびより好
ましくは長さが約2約〜15個のヌクレオチドでよい。いくつかの実施形態では、オーバー
ハングは、1以上のU残基、例は、約1および約5のU残基の間で含むことができる。他の実
施形態ではそうでないかもしれないが、いくつかの実施形態では、shRNAの5′末端はリン
酸基を有することができる。他の実施形態では、shRNAの3′末端は、ヒドロキシル基を有
していてもよいが、他の実施形態ではそうでないかもしれない。概して、shRNAsは、保存
された細胞のRNAi機構によってsiRNAに加工される。したがって、shRNAは、siRNAの前駆
体であり、およびshRNAの一部分（すなわち、shRNAのアンチセンスの部分）の相補的な標
的転写産物の発現を同様に抑制するのが可能である。この技術で熟練した者（当業者）は
、shRNAの設計および合成のための利用可能な供給源（上記に詳述する）に精通している
。模範的な例は、MISSION(R)shRNAs（Sigma-Aldrich）である。
【０２９５】
さらに他の実施形態では、RNAi薬剤は、RNAi発現ベクターであることができる。典型的
には、RNAiの発現ベクターは、siRNAsまたはshRNAsのようなRNAi薬剤の細胞内（インビボ
）合成のために使用することができる。一実施形態では、2つの別々の相補的なsiRNA鎖は
、2つのプロモーターを含む単一のベクターを用いて転写することができ、それらのそれ
ぞれは単一のsiRNA鎖の転写を指示する（すなわち、転写が起こりうるように、各プロモ
ーターは、siRNAのためのテンプレートに操作可能に連結される）。2つのプロモーターは
同じ向きにあることができ、その場合に、それぞれは相補的なsiRNA鎖のいずれかのテン
プレートに動作可能に連結される。あるいはまた、2つのプロモーターは、そのプロモー
ターの転写が2つの相補的siRNA鎖の合成をもたらすように、反対向きになり、単一のテン
プレートに隣接することができる。別の実施形態において、RNAi発現ベクターは、転写産
物がshRNAを形成するように、2つの相補的領域を含む単一のRNA分子の転写を駆動するプ
ロモーターを含むことができる。
【０２９６】
当業者は、1よりも多くの転写単位の転写を介してインビボで生産することが、siRNAお
よびshRNAの薬剤のために好ましいことを理解するであろう。一般的に言えば、一つ以上
のsiRNAまたはshRNAの転写単位のインビボ発現を指示するために利用されるプロモーター
は、RNAポリメラーゼIII（Pol III）のためのプロモーターであることができる。U6また
はH1プロモーターのような、特定のPol IIIプロモーターは、転写領域内のシス作用性調
節エレメントを必要とせず、そしてそれゆえ、一定の実施形態において好適である。他の
実施形態では、Pol IIのためのプロモーターは、一つ以上のsiRNAまたはshRNAの転写単位
の発現を駆動するために使用することができる。いくつかの実施形態では、組織特異的、
細胞特異的、または誘導性Pol IIプロモーターを使用することができる。
【０２９７】
siRNAまたはshRNAを合成するためのテンプレートを提供する構築物は、標準的な組換え
DNA法を用いて生産され、そして真核細胞における発現に適した多種多様な異なるベクタ
ーのいずれかに挿入することができる。ガイダンスは、Current Protocols in Molecular
Biology（分子生物学におけるカレントプロトコール）〔Ausubelら、John Wiley & Sons
（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）、New York（ニューヨーク）、2003〕、またはMo
lecular Cloning: A Laboratory manual（分子クローニング：ラボラトリー・マニュアル
）｛Sambrook アンドRussell（ラッセル）、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Ha
rbor, NY, 3rd edition（コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク、第3版）、2001｝〕で見出される。当業者はまた、ベク
ターが、追加の調節配列（例は、終結配列、翻訳調節配列、等）、ならびに選択可能マー
カー配列を含んでもよいことを認める。DNAプラスミドは、pBR322、PUC、などに基づくも
のなどを含め、この技術で知られる。多くの発現ベクターは、既に適切なプロモーターま
たはプロモーターを含んでいるので、プロモーター（群）に関して適切な位置で興味ある
RNAi薬剤がコードされる核酸配列を挿入しさえすれば十分でありうる。ウイルスベクター
はまた、RNAi薬剤の細胞内発現を提供するために使用することができる。適切なウイルス
ベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベク
ター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが含まれる。好まし
い実施形態では、RNAi発現ベクターは、shRNAレンチウイルスに基づくベクターまたはMIS
SION(R) TRC shRNAsプロダクト（Sigma-Aldrich）で提供されるようなレンチウイルス粒
子である。
【０２９８】
RNAi薬剤またはRNAi発現ベクターは、当業者によく知られる方法を用いて細胞内に導入
することができる。ガイダンスはたとえば、Ausubelら、前掲またはSambrook & Russell
、前掲で見出される。いくつかの実施形態では、RNAi発現ベクター、例は、ウイルスベク
ターは、例えば、細胞ストレス関連タンパク質の発現が後続の細胞世代にわたって乱され
るように、細胞のゲノムに安定に組み込まれてもよい。
【０２９９】
（c）相同組換え
【０３００】
他の実施形態では、相同組換え技術は、ゲノムDNAのレベルでのADME/Toxタンパク質/遺
伝子の発現を破壊するために使用することができる。したがって、これらの技術は、機能
的なバイオマーカーが作られえないように、核酸配列を欠失させ、核酸配列の一部を欠失
させ、または核酸配列の点突然変異を導入するために使用することができる。一実施形態
では、核酸配列は、Capecchi（カペッキ）〔Cell（セル）22：4779-488、1980）およびSm
ithies（スミティーズ）（Proc Natl Acad Sci USA 91：3612-3615、1994）の技術を用い
て相同組換えによって標的化することができる。他の実施形態において、核酸配列は、Cr
e-/oxP部位特異的組換えシステム、Flp-FRT部位特異的組換えシステム、またはそれらの
変形を用いて標的化することができる。そのような組換えシステムは商業的に入手可能で
あり、追加的なガイダンスはAusubelら、前掲に見出すことができる。
【０３０１】
（d）乱された発現の測定
【０３０２】
発現を乱すための上述の方法は、概して標的遺伝子（群）の発現が変えられたか（すな
わち、減少したか、または増加した）、またはそれがない、そしてその結果として、遺伝
子によってコードされるタンパク質の活性が変えられたか（すなわち、減少したか、また
は増加した）、またはそれがないように導かれる。この技術で既知の多種多様な方法には
、mRNAレベル、タンパク質レベル、または酵素活性を測定するために使用することができ
る。RNA検出方法の非制限的な例は、逆転写酵素PCR、逆転写酵素定量PCR、核酸マイクロ
アレイ、ハイブリダイゼーションに基づく方法、分枝DNA検出技術、ノーザンブロッティ
ング、およびヌクレアーゼ保護アッセイが含まれる。タンパク質検出方法の非制限的な例
には、ウエスタンブロッティング、ELISAアッセイ、およびその他の免疫アッセイが含ま
れる。これらの検出アッセイにおいて使用されるプローブの特異性に応じて、各々の標的
化されたADME/Toxタンパク質は単独で検出しえ、またはすべての標的化されたADME/Toxタ
ンパク質は同時に検出しうる。しかし、特異性にかかわらず、発現のレベルにおける減少
は、少なくとも一つのADME/Toxタンパク質の破壊された発現を含む細胞におけるレベル（
mRNAおよび/またはタンパク質のもの）を、ADME/Toxタンパク質の発現が破壊されていな
い細胞でのそれらと比較することによって決定することができる。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、ADME/Tox遺伝子のDNA配列は、発現が実質的に排除されるよ
うに修飾することができる。たとえば、DNA配列の若干またはすべては、機能的な生成物
が作られないように欠失され（または変えられ）うる。そのような細胞は、ノックアウト
細胞と呼ぶことができる。他の実施形態では、ADME/Toxタンパク質の発現は、低下された
レベルのmRNAおよび/またはタンパク質が作られるように破壊することができる。そのよ
うな細胞はノックダウン細胞と称することができる。たとえば、標的化されたADME/Tox遺
伝子のmRNAおよび/またはタンパク質のレベルは、発現が乱されていない細胞のものと比
較して、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、9
5％、または99％によって低減することができる。さらに他の実施形態では、ADME/Tox遺
伝子のDNA配列は、修飾されたタンパク質産物が作られるように改変されてもよい（例は
、SNPを介して）。修飾されたタンパク質産物は、改変された基質特異性、改変された結
合特性、変えられた安定性、変えられた動態、などを有することができる。
【０３０４】
（III）細胞において薬剤の効果を評価するための方法
【０３０５】
またここでは、薬剤の効果を評価するための方法を提供し、そこでは、方法は少なくと
も1つの膜トランスポーター、薬物代謝酵素、生体異物センサー、細胞ストレス応答経路
タンパク質、またはそれらの組合せの破壊された発現を有する細胞を、薬剤と接触させる
ことを含む。この方法はさらに、選択されたパラメーターを、比較用（comparable）野生
型細胞を同じ薬剤と接触することから得られた結果と比較することを含む。
【０３０６】
薬剤の同一性は、ADME/Toxタンパク質の同一性に応じて異なることができ、異なるであ
ろう。たとえば、薬剤は、製薬上活性な成分、治療剤、化学療法剤、抗生物質、抗微生物
剤、鎮痛剤、抗炎症剤、小分子、生物工学製品（biologic）、食品添加物、農薬、除草剤
、毒素、工業化学物質（化成物）、または環境化学物質でありうる。
【０３０７】
また、測定されるパラメーターは、ADME/Toxタンパク質の同一性に応じて変動する。た
とえば、薬剤の流出比は、腸トランスポーターについて測定することができる。測定に適
切なパラメーターの非制限的な例には、透過性、流出比、酵素活性、酵素反応速度論、基
質結合性、転写活性、タンパク質移行、酸化還元シグナリング、などが含まれる。
【０３０８】
概して、薬剤の効果（群）は、候補薬剤の吸収、分布、代謝、排泄、および/または毒
性学の関連内で評価することができる。たとえば、MDR1、BCRP、MRP1、およびMRP2のいず
れか1つ以上のノックアウトのような遺伝子改変は、疾患用、潜在的な治療上の化合物の
初期の同定用、およびリード最適化用の細胞株の細胞モデルにおいて候補薬物のADMEプロ
ファイルを特徴付けるために使用することができる。
【０３０９】
たとえば、薬物候補は、多剤耐性に関して評価することができ、それは、構造的および
/または機能的に無関係でありうる薬物の広い範囲に対する耐性を発達させる細胞の能力
に言及する。「多剤耐性」はまた、薬物の間の交差耐性を包含する。上記で詳述したよう
に、いくつかのトランスポーターは、多剤耐性の発達に関与し、それは薬物が細胞外に輸
送されるときに発生する。たとえば、化学療法剤に対する一定の腫瘍の多剤耐性は、ABC
トランスポータータンパク質に関与する。そのような輸送は、たとえば、MDR1a、MDR1b、
BCRP、MRP1、またはMRP2、またはそのホモログ（同族体）を含む、任意の1以上のABCトラ
ンスポーターによって媒介されてよい。それゆえ、遺伝子修飾で、ABCトランスポーター
タンパク質のノックアウトのようなものは、たとえば、ここに記載したように、流出ABC
トランスポータータンパク質またはそのホモログ（群）の活性を低減し、膜を通して薬物
の配送を促進し、そうでなければ薬物を排除するために使用することができる。具体的に
は、流出インヒビターは、血液脳関門を通して、または血液精巣関門を通して薬物の輸送
を助けるために使用することができる。
【０３１０】
さらに別の態様は、潜在的な遺伝子治療戦略の治療効率を評価するための方法を包含す
る。すなわち、ADME/Toxタンパク質をコードする染色体配列は、ADME/Tox遺伝子の変異に
関連する障害または症状が軽減または除去されるように修飾することができる。特に、こ
の方法には、変化したタンパク質産物が生産されるようにADME/Toxタンパク質をコードす
る染色体配列が編集されることを含む。遺伝的に修飾された細胞は、様々な試験条件およ
び細胞への曝露によってテストされ、および/または分子の応答が測定され、そして同じ
試験条件に曝露した野生型細胞のものに比べられうる。結果的に、ADME/Tox遺伝子治療の
レジーム（養生法）の治療上の可能性を評価することができる。
【０３１１】
定義
【０３１２】
別段の定めがない限り、ここで使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明
が属する技術の熟練者によって普通に理解される意味を有する。次の参考文献は、本発明
で使用する用語の多くの一般的な定義を、熟練の者に提供する：Singleton（シングルト
ン）ら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（微生物・分子生物学辞典
）(第2版、1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology（科学技術の
ケンブリッジ辞書）〔Walker（ウォーカー）編、1988〕；The Glossary of Genetics（遺
伝学用語集）、第5版、R. Rieger（リーガー）ら(編)、Springer Verlag（シュプリンガ
ー・フェアラーク社）(1991)；およびHale & Marham（ヘイル＆マラーム）、The Harper 
Collins Dictionary of Biology（生物学のハーパーコリンズ辞典）(1991)。ここで使用
するように、以下の用語は、特に断らない限り、それらに与えられる意味を有する。
【０３１３】
本開示の要素またはその好ましい実施形態（群）を導入するとき、冠詞 「ある（a）」
、「ある（an）」「その（the）」および「前記」は、1つまたはそれよりも多くの要素が
存在することを表す意味に意図される。「含む」 、「包含する」および「有する」とい
う用語は、包括的であることを意図し、そしてリストした要素以外の追加要素が存在しう
ることを意味する。
【０３１４】
用語「乱された発現」は、興味ある遺伝子/タンパク質の変化した発現に言及する。た
とえば、遺伝子産物の発現は、通常の（非破壊）状況に対して除去し、低減し、または増
加させることができる。あるいはまた、発現される遺伝子産物は、通常の（非破壊）遺伝
子産物に対して変え、または修飾することができる。
【０３１５】
ここで使用するように、用語「内因性」は細胞に対して自然な染色体配列に言及する。
【０３１６】
用語「編集」、「ゲノム編集」、または「染色体編集」は、それによって特定の染色体
配列が変えられるプロセスに言及する。編集された染色体配列は、少なくとも1つのヌク
レオチド挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、および/または少なくとも1つのヌ
クレオチドの置換を含むことができる。
【０３１７】
ここで用いる「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするDNA領域（エクソンおよびイント
ロンを含む）、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのDNA領域で、そのような調
節配列がコーディングおよび/または転写配列に隣接するか否かを問わないものに言及す
る。したがって、遺伝子は、必ずしも制限されないが、プロモーター配列、ターミネータ
ー、翻訳調節配列で、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位のようなもの、
エンハンサー、サイレンサー、インスレーター（絶縁要素）、境界要素、複製起点、マト
リックス付着部位、および遺伝子座調節領域が含まれる。
【０３１８】
ここで使用するように、用語「不活化配列」、「不活性化された染色体配列」または「
不活性化されたゲノム配列」は、コードされた生産物が実質的に排除されるように、少な
くとも1つのヌクレオチドの欠失、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、および/または
少なくとも1つのヌクレオチドの置換により修飾されたゲノムまたは染色体配列に言及す
る。
【０３１９】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、線形または環形のコンフォメーションで
、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーに言及する。本開示の目的
のために、これらの用語は、ポリマーの長さに対して制限されるものとして解釈されるべ
きではない。用語は、自然のヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および/ま
たはリン酸部分（例は、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包
含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対特異性を有し
；すなわち、Aの類似体はTと塩基対合する。
【０３２０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーに言及するた
めに互換的に使用される。
【０３２１】
ここで用いる用語「標的部位」または「標的配列」は、編集される染色体配列の一部分
を規定する核酸配列に言及し、およびそれに対し、もし結合のための十分な条件が存在す
るとすれば、ターゲティングエンドヌクレアーゼが認識され、結合するために設計される
。
【０３２２】
用語「上流」および「下流」は、定位置に関して核酸配列における位置に言及する。上
流は、位置に対し5′（すなわち、鎖の5′末端近く）である領域を指し、および下流は位
置に対し3′（すなわち、鎖の3′末端近く）である領域を指す。
【０３２３】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための方法は、この技術で知られる。典型的
には、そのような技術には、遺伝子についてのmRNAのヌクレオチド配列を決定すること、
および/またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配
列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対して比較することが含まれる。ゲノム配
列はまた、この様式で決定され、そして比較することができる。概して、同一性は、それ
ぞれ、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオ
チドまたはアミノ酸対アミノ酸対応に言及する。2つ以上の配列（ポリヌクレオチドまた
はアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較することができ
る。二つの配列の同一性パーセントは、核酸またはアミノ酸配列か否かを問わず、より一
層短い配列の長さによって割られ、そして100によって乗算され、2つの配列決定された配
列間の正確な一致の数である。核酸配列の近似アラインメント（配列比較）は、Smith（
スミス）およびWaterman（ウォーターマン）、Advances in Applied Mathematics（アド
バンシーズ・イン・アプライド・マスマティックス）2：482-489（1981）の局所的相同性
アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff（デイホフ）、Atlas o
f Protein Sequences and Structure（アトラス・オブ・プロテイン・シーケンシージ・
アンド・ストラクチャー）M. O. Dayhoff編、補遺5、3：353-358、National Biomedical 
Research Foundation, Washington, D.C., USA（ナショナル・バイオメディカル・リサー
チ・ファウンデーション）、ワシントンD.C.、米国）によって開発されたスコアリングマ
トリックスを使用して、アミノ酸配列に適用し、およびGribskov（グリバコフ）、Nucl. 
Acids Res. 14(6)：6745-6763（1986）によって正規化することができる。配列の同一性
パーセントを決定するためにこのアルゴリズムの例示的なインプリメンテーション（手段
）は、「BestFit（ベストフィット）」ユーティリティアプリケーションにおけるGenetic
s Computer Group（ジェネティクス・コンピューター・グループ）〔Madison（マディソ
ン）、Wis.（ウィスコンシン州）〕によって提供される。配列間の同一性または類似性パ
ーセントを算出するための他の適切なプログラムは、概してこの技術で知られ、たとえば
、別のアライメントプログラムは、デフォルトのパラメーターで使用されるBLASTである
。たとえば、BLASTNおよびBLASTPは、次のデフォルトのパラメーターを使用して用いるこ
とができる：遺伝コード=標準；フィルタ=なし；鎖=両方；カットオフ=60；予測=10；マ
トリクス=BLOSUM62；デスクリプション=50シーケンス；ソート・バイ=ハイスコア；デー
タベース=非冗長、GenBank（ジェンバンク）+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS変換+スイスプ
ロテイン+Spupdate+PIRである。これらのプログラムの詳細は、GenBankのウェブサイト上
で見出すことができる。ここに記載の配列に対して、配列同一性の所望度の範囲は、約80
％から100％までおよびそれらの間の任意の整数値である。典型的に、配列間の同一性パ
ーセントは、少なくとも、好ましくは70％-75％、好ましくは80-82％、より好ましくは85
-90％、さらにより好ましくは92％、さらにより好ましくは95％、および最も好ましくは9
8％の配列同一性である。
【０３２４】
本発明の範囲から離れることなく、様々な変化が上記の細胞、キット、および方法にお
いて行うことができるので、上記の説明および以下に与える実施例において含まれるすべ
ての事項は、例示的であり、そして制限する意味でないとして解釈されるべきことが意図
されている。
【実施例】
【０３２５】
例：以下の例は、本発明の一定の態様を例示する。
例1：C2BBe1細胞におけるBCRPトランスポーターノックアウトおよび検証
【０３２６】
野生型BCRP遺伝子は、C2BBe1細胞において、安定な細胞株を生成するためにジンクフィ
ンガーヌクレアーゼ技術を用いてノックアウトした。細胞を選別し、そして単一細胞をク
ローン化した。細胞を望ましい変異について分析し、および陽性クローンをさらなる増殖
および分析のために選定した。定量的PCRを、細胞のmRNA発現を評価するために使用し、
そして野生型細胞と比較した。これらのクローンから調製した全細胞溶解物を、BCRPタン
パク質発現レベルの分析のために免疫ブロットに供した。BCRPノックアウト細胞は、大幅
に低減したmRNAおよびタンパク質発現を示した。シングルBCRPノックアウト細胞クローン
を、いくつかの既知のトランスポーター選択的基質（例は、エストロン3-サルフェート、
ジゴキシンおよびCDCFDA）を使用して、流出活性の機能解析のために選定した。
【０３２７】
双方の野生型細胞（親C2BBe1細胞）およびBCRPノックアウト細胞を、Caco-2細胞を用い
て以前に開発した腸の流出トランスポーターアッセイのための標準プロトコルに従って、
24ウェルトランスウェルプレート上に播種し、そして21日間培養した。頂端から基底（A
からBへ）および基底から頂端（BからAへ）の両方向における試験化合物の透過性を、2時
間インキュベーション後測定し、そして流出値を算出した。結果を図1に示す。既知のBCR
P基質、エストロン3-サルフェートの流出比は、親細胞と比較して、ノックアウト細胞に
おいて大きく減少したが、その一方で、二つの他の基質の流出比は影響を受けなかった。
ジゴキシンは、既知のMDR1基質であるが、一方で、CDCFDAはMRP2トランスポーターに選択
的である。二つの追加の化合物は、コントロールとして使用したが、アテノロールおよび
メトプロロールは、これらのトランスポーターのいずれかの基質ではないことが知られて
いる。
【０３２８】
例2：C2BBe1細胞におけるシングルおよびダブル流出トランスポーターノックアウト
【０３２９】
BCRPおよびMDR1トランスポーター遺伝子を個別にノックアウトし、そしてMDR1/BCRPダ
ブルノックアウトもまた、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用してC2BBe1細胞にお
いて生成した。細胞を分析し、そして上述したように増殖させ、次いで標準トランスウェ
ルアッセイにおいて機能的活性について試験した。二つの基質は、-エストロン3-サルフ
ェートをBCRPのための選択的基質として、およびジゴキシンをMDR1のための選択的基質と
して利用した。メトプロロールをコントロールとして用いた。図2に示すように、4つの細
胞株を、親細胞株を含めて評価した。エストロン3-サルフェートにより、高い流出率を、
親株において、およびMDR1ノックアウトにおいて見出されたが、その一方で、BCRPシング
ルノックアウトおよびMDR1/BCRPダブルノックアウトの双方において流出が抑制された。
ジゴキシンについて、流出比は、親細胞株およびBCRP一単位のノックアウト細胞において
高かったが、MDR1ノックアウトおよびMDR1/BCRPダブルノックアウトの双方において、予
期したように抑制された。
【図１】
2018078905.tif 000013
【図２】
2018078905.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月15日(2018.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物の吸収、分布、代謝および排出および/または毒物学的プロセスに関与するタンパク質をコードする染色体配列の乱された発現を含み、
前記タンパク質が薬物代謝酵素又は生体異物センサーであり、
前記薬物代謝酵素がシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）酵素であり、前記生体異物センサーがＡｈＲ、ＰＸＲ、ＣＡＲ、又はＦＸＲである、遺伝的に修飾されたヒト細胞系。
【請求項２】
前記シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）酵素が、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、又はＣＹＰ３Ａ４である、請求項１に記載のヒト細胞系。
【請求項３】
さらに、少なくとも１種のレポータータンパク質の発現を含む、請求項１のヒト細胞系。
【請求項４】
発現は、実質機能しないタンパク質、低下した発現のレベルのタンパク質、またはタンパク質の改変バージョンを細胞が生じるように乱される、請求項１のヒト細胞系。
【請求項５】
前記タンパク質をコードする前記配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはその組合せによって修飾される、請求項１のヒト細胞系。
【請求項６】
前記細胞は、修飾された染色体の前記配列についてヘテロ接合、ホモ接合、またはヘミ接合である、請求項５のヒト細胞系。
【請求項７】
発現は、ターゲティングエンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集、RNA干渉、および相同組換えから選ばれる技術によって乱される、請求項１のヒト細胞系。
【請求項８】
前記ターゲティングエンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項７のヒト細胞系。
【請求項９】
薬剤の効果を評価するための方法であって、
ａ）薬物の吸収、分布、代謝および排出および/または毒物学的プロセスに関与するタンパク質をコードする染色体配列の乱された発現を含む遺伝的に修飾されたヒト細胞系と薬剤を接触させること、ここで、前記タンパク質が薬物代謝酵素又は生体異物センサーであり、前記薬物代謝酵素がシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）酵素であり、前記生体異物センサーがＡｈＲ、ＰＸＲ、ＣＡＲ、又はＦＸＲである、および
ｂ）ステップ（ａ）から得られる選ばれたパラメーターの結果を、比較用野生型ヒト細胞を同じ薬剤と接触させることから得られる結果と比較すること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記薬剤は、製薬上の活性成分、治療薬、毒素、および化学物質から選ばれる、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）酵素が、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、又はＣＹＰ３Ａ４である、請求項９の方法。
【請求項１２】
発現は、実質機能しないタンパク質、低下した発現のレベルのタンパク質、またはタンパク質の改変バージョンを細胞が生じるように乱される、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質をコードする前記配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはその組合せによって修飾される、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、修飾された染色体の前記配列についてヘテロ接合、ホモ接合、またはヘミ接合である、請求項１３の方法。
【外国語明細書】
2018078905000001.pdf