(57)【要約】【課題】抽出液中の内包物質の濃度が低くなることを抑制し、反応領域の損傷を防止してウェル内の抽出液を分析用ケースに効率的に移し替えることができる検出対象物質捕捉ユニットを提供する。【解決手段】検出対象物質捕捉ユニット１００は試料分析用ディスク２００とカートリッジ３００とを備える。カートリッジ３００は試料分析用ディスク２００に装着され、カートリッジ本体３０１とリム３１０と貫通孔３０２とを有する。リム３１０はカートリッジ本体３０１の試料分析用ディスク２００に装着されている面とは反対側の第１の面３０１ａに形成され、カートリッジ本体３０１の中心部側で最も高く、外周部側で最も低くなるように斜めに切断された円筒形状を有する。貫通孔３０２はカートリッジ本体３０１及びリム３１０を貫通する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料分析用ディスクと、
前記試料分析用ディスクに装着されているカートリッジと、
を備え、
前記カートリッジは、
カートリッジ本体と、
前記カートリッジ本体の前記試料分析用ディスクに装着されている面とは反対側の第１の面に形成されているリムと、
前記リム及び前記カートリッジ本体を貫通する貫通孔と、
を有し、
前記リムは、前記第１の面に対して前記カートリッジ本体の中心部側が高く、外周部側が低くなるように斜めに切断された円筒形状を有する
ことを特徴とする検出対象物質捕捉ユニット。
【請求項２】
前記リムは、前記円筒形状の斜めに切断された第２の面と前記貫通孔の内周面との角度が前記カートリッジ本体の中心部側で鋭角になるように、前記円筒形状の内周部から外周部に向かって傾斜している先端形状を有することを特徴とする請求項１に記載の検出対象物質捕捉ユニット。
【請求項３】
前記試料分析用ディスク及び前記貫通孔は、検出対象物質を捕捉するためのウェルを構成することを特徴とする請求項１または２に記載の検出対象物質捕捉ユニット。
【請求項４】
検出対象物質捕捉ユニットと、
前記検出対象物質捕捉ユニットが装着されるターンテーブルと、
前記ターンテーブルを回転させるターンテーブル回転駆動部と、
前記ターンテーブルを傾斜させるターンテーブル傾斜駆動部と、
を備え、
検出対象物質捕捉ユニットは、
試料分析用ディスクと、
前記試料分析用ディスクに装着されているカートリッジと、
を有し、
前記カートリッジは、
カートリッジ本体と、
前記カートリッジ本体の前記試料分析用ディスクに装着されている面とは反対側の第１の面に形成されているリムと、
前記リム及び前記カートリッジ本体を貫通する貫通孔と、
を有し、
前記リムは、前記第１の面に対して前記カートリッジ本体の中心部側が高く、外周部側が低くなるように斜めに切断された円筒形状を有する
ことを特徴とする抽出装置。
【請求項５】
ケース本体を有する分析用ケースが装着されるケースホルダと、
前記ケース本体が挿通される貫通孔を有する押し当て板と、
前記押し当て板を前記ケースホルダと共に前記ターンテーブルに接近する方向及び離隔する方向に移動させる押し当て板駆動部と、
をさらに備え、
前記ケース本体は、前記ケースホルダが前記ターンテーブルに接近することにより、前記リムに装着される
ことを特徴とする請求項４に記載の抽出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原、抗体等の生体物質の内包物質を抽出するための検出対象物質捕捉ユニット及び抽出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病に関連付けられた特定の抗原または抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見及び治療の効果等を定量的に分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。
【０００３】
特許文献１には、試料分析用ディスク上の反応領域に固定された抗体と試料中の検出対象物質である抗原とを結合させ、抗体を有する微粒子によって検出対象物質を標識し、光ピックアップから照射されるレーザ光を走査することにより、反応領域に捕捉された微粒子を検出する分析装置が記載されている。
【０００４】
特許文献１に記載されているような従来の分析装置では、試料分析用ディスクに貫通孔を有するカートリッジを装着することにより、試料分析用ディスクの表面とカートリッジの貫通孔の内周面とによってウェルが形成される。ウェルに試料液及び緩衝液を注入し、抗原抗体反応を進行させることにより反応領域が形成される。
【０００５】
反応領域には、検出対象物質が試料分析用ディスク上に固定された抗体と微粒子とによりサンドイッチ捕獲されている。試料分析用ディスクとカートリッジとを分離させ、試料分析用ディスク上の反応領域に捕捉された微粒子を検出することで、検出対象物質を間接的に検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１２７６９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
検出対象物質であるエクソソーム（exosome）は、血液，リンパ液，唾液，尿，母乳，精液等の体液に含まれている。エクソソームは、液体中では概略球形であり、内包物質が脂質二重膜で包まれた構造を有する。内包物質は、細胞情報を伝達する物質とされるＤＮＡ（デオキシボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）等の高分子生体物質である。
【０００８】
検出対象物質を、界面活性剤を主成分とする抽出液と反応させることにより、エクソソームの表皮を構成する脂質二重膜を溶解させ、内包物質を抽出液中に遊離させることができる。検出対象物質は、試料分析用ディスク上の反応領域、及びカートリッジの貫通孔の内周面の反応領域にサンドイッチ捕獲されている。
【０００９】
ウェル内にサンドイッチ捕獲されている全ての検出対象物質から内包物質を抽出するためには、試料分析用ディスク上の反応領域、及びカートリッジの貫通孔の内周面の反応領域が満たされる高さまで抽出液をウェル内に注入しなければならない。抽出液の液量が多いと、抽出液中の内包物質の濃度が低くなるため、内包物質の分析精度を悪化させる要因となる。
【００１０】
従来では、ウェル毎に抽出液をピペッティングにより分析用ケースに移し替えるため、作業性を悪化させる要因となっている。また、ピペッティングによる移し替えはウェル内に抽出液が残りやすいため、残った抽出液を純水で希釈してからピペッティングする作業を繰り返すことになる。希釈の度合いに応じて抽出液中の内包物質の濃度が低くなるため、内包物質の分析精度を悪化させる要因となる。また、反応領域がピペッティングにより損傷する場合がある。
【００１１】
本発明は、抽出液中の内包物質の濃度が低くなることを抑制し、反応領域の損傷を防止してウェル内の抽出液を分析用ケースに効率的に移し替えることができる検出対象物質捕捉ユニット及び抽出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、試料分析用ディスクと、前記試料分析用ディスクに装着されているカートリッジとを備え、前記カートリッジは、カートリッジ本体と、前記カートリッジ本体の前記試料分析用ディスクに装着されている面とは反対側の第１の面に形成されているリムと、前記リム及び前記カートリッジ本体を貫通する貫通孔とを有し、前記リムは、前記第１の面に対して前記カートリッジ本体の中心部側が高く、外周部側が低くなるように斜めに切断された円筒形状を有することを特徴とする検出対象物質捕捉ユニットを提供する。
【００１３】
また、本発明は、検出対象物質捕捉ユニットと、前記検出対象物質捕捉ユニットが装着されるターンテーブルと、前記ターンテーブルを回転させるターンテーブル回転駆動部と、前記ターンテーブルを傾斜させるターンテーブル傾斜駆動部とを備え、検出対象物質捕捉ユニットは、試料分析用ディスクと、前記試料分析用ディスクに装着されているカートリッジとを有し、前記カートリッジは、カートリッジ本体と、前記カートリッジ本体の前記試料分析用ディスクに装着されている面とは反対側の第１の面に形成されているリムと、前記リム及び前記カートリッジ本体を貫通する貫通孔とを有し、前記リムは、前記第１の面に対して前記カートリッジ本体の中心部側が高く、外周部側が低くなるように斜めに切断された円筒形状を有することを特徴とする抽出装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検出対象物質捕捉ユニット及び抽出装置によれば、抽出液中の内包物質の濃度が低くなることを抑制し、反応領域の損傷を防止してウェル内の抽出液を分析用ケースに効率的に移し替えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】検出対象物質捕捉ユニットを示す斜視図である。
【図２Ａ】図１のＡ−Ａで切断した検出対象物質捕捉ユニットの断面図である。
【図２Ｂ】試料分析用ディスクからカートリッジが分離される状態を示す検出対象物質捕捉ユニットの断面図である。図１のＡ−Ａで切断した検出対象物質捕捉ユニットの断面図である。
【図３】図１のＢ−Ｂで切断したウェルを示す拡大斜視図である。
【図４】検出対象物質が抗体と微粒子とによってトラック領域にサンドイッチ捕獲されている状態を示す模式的な断面図である。
【図５】エクソソームを示す模式的な断面図である。
【図６】微粒子が検出対象物質と結合した状態でトラック領域に捕捉されている状態を示す模式的な平面図である。
【図７】一実施形態の抽出装置を示す斜視図である。
【図８】分析用ケースを示す斜視図である。
【図９】分析用ケースとケースホルダとの関係を示す斜視図である。
【図１０Ａ】検出対象物質から内包物質を抽出するための抽出方法を説明するためのフローチャートである。
【図１０Ｂ】検出対象物質から内包物質を抽出するための抽出方法を説明するためのフローチャートである。
【図１１】一実施形態の抽出装置に分析用ケースが装着されている状態を示す斜視図である。
【図１２】一実施形態の抽出装置のターンテーブルが回転している状態を示す斜視図である。
【図１３】図１２のＣ−Ｃで切断した抽出装置の部分断面図である。
【図１４】一実施形態の抽出装置のターンテーブルが傾斜している状態を示す斜視図である。
【図１５】図１４のＤ−Ｄで切断した抽出装置の部分断面図である。
【図１６】トラック領域上に捕捉されているエクソソームから内包物質が抽出液中に遊離する状態を示す模式的な断面図である。
【図１７】一実施形態の抽出装置のリムに分析用ケースが装着された状態を示す部分断面図である。
【図１８】一実施形態の抽出装置のターンテーブルを図１４に示す状態からさらに傾斜させた状態を示す斜視図である。
【図１９Ａ】図１８のＥ−Ｅで切断した抽出装置の部分断面図である。
【図１９Ｂ】ケースホルダ及び押し当て板が検出対象物質捕捉ユニットから離隔される状態を示す抽出装置の部分断面図である。図１８のＥ−Ｅで切断した抽出装置の部分断面図である。
【図２０】一実施形態の抽出装置の図１８に示す状態から、押し当て板及びケースホルダを検出対象物質捕捉ユニットから離隔させた状態を示す斜視図である。
【図２１】一実施形態の抽出装置のターンテーブル保持部を傾斜させる前に戻した状態を示す斜視図である。
【図２２】図２Ａに示す検出対象物質捕捉ユニットとは異なるウェル形状を有する検出対象物質捕捉ユニットの断面図である。
【図２３】図２２に示す検出対象物質捕捉ユニットが傾斜している状態を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［検出対象物質捕捉ユニット］
図１〜図３を用いて、検出対象物質捕捉ユニットの一例を説明する。図１は検出対象物質捕捉ユニットをカートリッジ側から見た状態を示している。図２Ａは図１のＡ−Ａで切断した検出対象物質捕捉ユニットの断面を示している。図２Ｂはカートリッジが試料分析用ディスクに対して取り外しできることを示している。図３は図１のウェルをＢ−Ｂで切断した状態を部分的に拡大して示している。
【００１７】
図１に示すように、検出対象物質捕捉ユニット１００は、試料分析用ディスク２００とカートリッジ３００とを備える。試料分析用ディスク２００は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。試料分析用ディスク２００は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂またはシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、試料分析用ディスク２００は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態または所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。
【００１８】
図１、図２Ａ、または図２Ｂに示すように、試料分析用ディスク２００は、中心部に形成された中心孔２０１と、外周部に形成された切欠き部２０２とを有する。切欠き部２０２は試料分析用ディスク２００の基準位置を識別するための基準位置識別部である。
【００１９】
図３に示すように、試料分析用ディスク２００の表面には、凸部２０３と凹部２０４とが半径方向に交互に配置されたトラック領域２０５が形成されている。凸部２０３及び凹部２０４は、内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凸部２０３は光ディスクのランドに相当する。凹部２０４は光ディスクのグルーブに相当する。凹部２０４の半径方向のピッチに相当するトラックピッチは例えば３２０ｎｍである。
【００２０】
図１に示すように、カートリッジ３００は、カートリッジ本体３０１と、複数の円筒状のリム３１０と、複数の貫通孔３０２とを有する。リム３１０は、カートリッジ本体３０１の試料分析用ディスク２００に装着されている面とは反対側の面である上面３０１ａ（第１の面）に形成されている。貫通孔３０２は、リム３１０とカートリッジ本体３０１とを貫通する。
【００２１】
また、カートリッジ３００は、凸部３０３，３０４と、中心孔３０５と、複数の切欠き部３０６とを有する。凸部３０３はカートリッジ本体３０１の中心部に形成されている。凸部３０４はカートリッジ本体３０１の外周部に形成されている。中心孔３０５は、カートリッジ本体３０１の中心部に形成され、カートリッジ本体３０１と凸部３０３とを貫通する。切欠き部３０６はカートリッジ本体３０１の上面３０１ａと側面３０１ｂとの連接部に形成されている。
【００２２】
貫通孔３０２はリム３１０に対応して形成されている。リム３１０及び貫通孔３０２は、カートリッジ本体３０１の中心孔３０５の中心を中心点として、それぞれの中心が同一円周上に位置するように等間隔に形成されている。中心孔３０５の内周面３０５ａには中心孔３０５の中心軸に向かって凸部３０５ｂが形成されている。
【００２３】
図２Ａに示すように、リム３１０は、カートリッジ本体３０１の上面３０１ａに対して、カートリッジ本体３０１の中心部側が高く、外周部側が低くなるように斜めに切断されたような円筒形状を有する。リム３１０は、円筒形状の斜めに切断された面に相当する端面３１０ａ（第２の面）と貫通孔３０２の内周面３０２ａとの角度θａが、カートリッジ本体３０１の中心部側で鋭角（θａ＜９０°）になるように円筒形状の内周部から外周部に向かって傾斜している。即ち、リム３１０は、カートリッジ本体３０１の外周部側が低く、中心部側が高く、かつ、上方に向かって鋭利な先端形状を有する。
【００２４】
カートリッジ３００を試料分析用ディスク２００に取り付ける場合に、凸部３０３を試料分析用ディスク２００の中心孔２０１に挿入し、凸部３０４を切欠き部２０２に挿入することにより、カートリッジ３００と試料分析用ディスク２００とを位置決めすることができる。
【００２５】
図２Ａ及び図３に示すように、検出対象物質捕捉ユニット１００は、カートリッジ３００の貫通孔３０２と試料分析用ディスク２００のトラック領域２０５とによって形成される複数のウェル１０１を有する。貫通孔３０２の内周面３０２ａはウェル１０１の内周面１０１ａを構成し、試料分析用ディスク２００のトラック領域２０５はウェル１０１の底面１０１ｂを構成している。ウェル１０１は試料液、緩衝液、及び抽出液等の溶液を溜めるための容器である。
【００２６】
カートリッジ３００の試料分析用ディスク２００と接触する接触面が撥液性またはシール性を有するように表面処理を実施してもよい。例えば、接触面にシリコーンゴムまたはフッ素樹脂を形成することにより、ウェル内に溜められている溶液が接触面を伝って近傍のウェル内に浸入することを防止できる。なお、図１では、一例として８個のウェル１０１を示しているが、ウェル１０１の数はこれに限定されるものではない。
【００２７】
図２Ｂに示すように、カートリッジ３００を試料分析用ディスク２００から分離することができる。即ち、カートリッジ３００は試料分析用ディスク２００に着脱自在に装着されている。検出対象物質を標識する微粒子を検出及び計測する場合は、カートリッジ３００が分離された試料分析用ディスク２００単体で行われる。検出対象物質から内包物質を抽出液中に遊離して抽出する場合は、カートリッジ３００が試料分析用ディスク２００に装着された状態で行われる。
【００２８】
［反応領域の形成］
図２Ａ、図２Ｂ、及び図４を用いて、検出対象物質捕捉ユニット１００のウェル１０１内に反応領域を形成する方法の一例を説明する。
【００２９】
オペレータは、図２Ａに示すように、抗体１１１を含む緩衝液１１２を、検出対象物質捕捉ユニット１００のウェル１０１内に高さＨ１以上の高さまで注入する。オペレータは、検出対象物質捕捉ユニット１００を、適切な時間、適切な温度でインキュベートさせる。
【００３０】
図４に示すように、抗体１１１は、ウェル１０１の底面１０１ｂを構成する試料分析用ディスク２００のトラック領域２０５上に固定される。また、抗体１１１は、ウェル１０１の内周面１０１ａを構成する貫通孔３０２の内周面３０２ａに固定される。オペレータは、ウェル１０１から緩衝液１１２を排出し、ウェル１０１を別の緩衝液で洗浄する。固定されなかった抗体１１１はこの洗浄によって除去される。
【００３１】
オペレータは、図２Ａに示すように、検出対象物質であるエクソソーム１２１を含む試料液１２２を、検出対象物質捕捉ユニット１００のウェル１０１内に高さＨ１まで注入する。エクソソーム１２１の大きさは約１００ｎｍである。なお、試料液１２２にはエクソソーム１２１が含まれていない場合もある。説明をわかりやすくするために、試料液１２２にエクソソーム１２１が含まれている場合について説明する。
【００３２】
図５に示すように、エクソソーム１２１は、脂質二重膜１２３で覆われている。脂質二重膜１２３には、複数の種類の膜貫通型たんぱく質等のたんぱく質が表面分子１２４として存在する。たんぱく質の個数または脂質二重膜１２３における位置は、エクソソーム１２１の種類によって異なり、個体によっても異なる。
【００３３】
これらの表面分子１２４を抗原として抗原抗体反応を用いてエクソソーム１２１を認識する。抗原である表面分子１２４として、ＣＤ６３，ＣＤ９，Ｒａｂ−５ｂ等の他様々なたんぱく質等の分子の存在が多くの論文で報告されている。エクソソーム１２１には、細胞情報を伝達する物質とされるＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の高分子生体物質である内包物質１２５が脂質二重膜１２３で覆われた領域に内包されている。
【００３４】
オペレータは、検出対象物質捕捉ユニット１００を、適切な時間、適切な温度でインキュベートさせる。これにより、エクソソーム１２１は、ウェル１０１の底面１０１ｂ及び内周面１０１ａに固定されている抗体１１１と抗原抗体反応により特異的に結合する。その結果、エクソソーム１２１は、ウェル１０１の底面１０１ｂ及び内周面１０１ａに捕捉される。
【００３５】
オペレータは、ウェル１０１から試料液１２２を排出し、ウェル１０１を緩衝液で洗浄する。なお、抗体１１１と結合しないで試料液１２２中に分散しているエクソソーム１２１、及び、抗原抗体反応ではない非特異吸着によってウェル１０１の底面１０１ｂ及び内周面１０１ａに付着しているエクソソーム１２１は、この洗浄によって除去される。
【００３６】
オペレータは、図２Ａに示すように、標識となる微粒子１３１を含む緩衝液１３２をウェル１０１内に高さＨ１以上の高さまで注入する。微粒子１３１の表面にはエクソソーム１２１と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体が形成されている。微粒子１３１の大きさは約２００ｎｍである。
【００３７】
オペレータは、検出対象物質捕捉ユニット１００を、適切な時間、適切な温度でインキュベートさせる。これにより、微粒子１３１は、ウェル１０１の底面１０１ｂ及び内周面１０１ａに捕捉されているエクソソーム１２１と抗原抗体反応により特異的に結合する。その結果、微粒子１３１は、ウェル１０１の底面１０１ｂ及び内周面１０１ａにエクソソーム１２１と結合した状態で捕捉される。
【００３８】
オペレータは、ウェル１０１から緩衝液１３２を排出し、ウェル１０１を別の緩衝液で洗浄し、乾燥させる。なお、エクソソーム１２１と結合しないで緩衝液１３２中に分散している微粒子１３１は洗浄により除去される。オペレータは、図２Ｂに示すように、検出対象物質捕捉ユニット１００のカートリッジ３００と試料分析用ディスク２００とを分離する。
【００３９】
試料分析用ディスク２００には、複数のウェル１０１に対応して複数の円形の反応領域２１０が形成されている。図４に示すように、反応領域２１０では、エクソソーム１２１が微粒子１３１と結合した状態でトラック領域２０５の凹部２０４に捕捉されている。即ち、エクソソーム１２１は、抗体１１１と微粒子１３１とによってトラック領域２０５の凹部２０４にサンドイッチ捕獲されている。なお、図４に示す内包物質１２５は、図５に示す内包物質１２５を簡略化して模式的に示している。図６は、微粒子１３１がエクソソーム１２１と結合した状態でトラック領域２０５の凹部２０４に捕捉されている状態の一例を示している。
【００４０】
図２Ｂに示すように、カートリッジ３００の各貫通孔３０２の内周面３０２ａには、高さＨ１の円筒状の反応領域３２０が形成されている。反応領域３２０では、エクソソーム１２１が微粒子１３１と結合した状態で貫通孔３０２の内周面３０２ａに捕捉されている。即ち、エクソソーム１２１は、抗体１１１と微粒子１３１とによって貫通孔３０２の内周面３０２ａにサンドイッチ捕獲されている。
【００４１】
試料分析用ディスク２００を回転させた状態で、図４に示すように、レンズ２２０により集光されたレーザ光２２１を反応領域２１０に照射し、その反射光を検出して分析することにより、各反応領域２１０における微粒子１３１を計測することができる。各反応領域３２０における微粒子１３１の数は、対応する反応領域２１０における微粒子１３１の数に、反応領域２１０に対する反応領域３２０の面積比を乗算することにより算出することができる。従って、各ウェル１０１の反応領域２１０，３２０における微粒子１３１の総数を計測することができ、微粒子１３１と特異的に結合しているエクソソーム１２１の総数を間接的に計測することができる。
【００４２】
［抽出装置］
図７〜図９を用いて、検出対象物質であるエクソソーム１２１から内包物質１２５を抽出するための抽出装置を説明する。図７に示すように、抽出装置１は、基台２と、ターンテーブル３と、ターンテーブル保持部４と、ユニットホルダ５と、ケースホルダ３０と、押し当て板４０と、ターンテーブル傾斜回転軸部６と、ケースホルダスライド軸部７と、押し当て板スライド軸部８とを備える。
【００４３】
ターンテーブル傾斜回転軸部６は、水平方向に配置され、基台２に回転自在に保持されている。ターンテーブル保持部４はターンテーブル傾斜回転軸部６に固定されている。ターンテーブル３はターンテーブル保持部４にターンテーブル傾斜回転軸部６を回転軸として回転自在に保持されている。ユニットホルダ５はターンテーブル３に可倒自在に保持されている。
【００４４】
ケースホルダスライド軸部７は、ターンテーブル３に対して垂直方向に配置され、ターンテーブル３を貫通し、ターンテーブル保持部４にスライド自在に保持されている。ケースホルダ３０は、ケースホルダスライド軸部７に着脱自在に装着されている。ケースホルダスライド軸部７の外周面７ａには、ターンテーブル３に対して垂直方向に凹部７ｂが形成されている。
【００４５】
検出対象物質捕捉ユニット１００の中心孔３０５の内周面３０５ａに形成されている凸部３０５ｂとケースホルダスライド軸部７の外周面７ａに形成されている凹部７ｂとを位置合わせして、検出対象物質捕捉ユニット１００の中心孔３０５にケースホルダスライド軸部７を挿通させる。これにより、検出対象物質捕捉ユニット１００は、ターンテーブル３上に載置され、ケースホルダスライド軸部７を回転軸とした回転方向に位置決めされ、ユニットホルダ５により保持される。
【００４６】
押し当て板スライド軸部８は、ターンテーブル３に対して垂直方向に配置され、ケースホルダ３０を貫通し、ターンテーブル保持部４にスライド自在に保持されている。押し当て板スライド軸部８の外周面８ａには、ターンテーブル３に対して垂直方向に凹部８ｂが形成されている。押し当て板４０は、凹部８ｂにより押し当て板スライド軸部８を回転軸とした回転方向に位置決めされ、押し当て板スライド軸部８に着脱自在に装着されている。
【００４７】
また、抽出装置１は、ターンテーブル回転駆動部１１と、ユニットホルダ駆動部１２と、押し当て板駆動部１３と、ターンテーブル傾斜駆動部１４と、駆動制御部１５と、操作・表示部１６とを備える。ターンテーブル回転駆動部１１、ユニットホルダ駆動部１２、及び押し当て板駆動部１３は、ターンテーブル保持部４の内部に配置されている。ターンテーブル傾斜駆動部１４及び駆動制御部１５は基台２の内部に配置されている。操作・表示部１６は基台２の表面に配置されている。なお、抽出装置１は操作・表示部１６を備えていなくてもよく、外部の操作・表示部を用いてもよい。
【００４８】
ユニットホルダ駆動部１２は、ユニットホルダ５の先端がターンテーブル３の中心に接近するようにユニットホルダ５を駆動させる。検出対象物質捕捉ユニット１００がターンテーブル３上に載置されている状態で、ユニットホルダ駆動部１２がユニットホルダ５を駆動させることにより、ユニットホルダ５が検出対象物質捕捉ユニット１００の切欠き部３０６と接触して、検出対象物質捕捉ユニット１００はターンテーブル３上に装着される。
【００４９】
ターンテーブル回転駆動部１１は、ターンテーブル３を、ケースホルダスライド軸部７を回転軸として回転させる。検出対象物質捕捉ユニット１００がターンテーブル３上に装着されている場合、検出対象物質捕捉ユニット１００は、ターンテーブル３と共に回転する。
【００５０】
押し当て板駆動部１３は、押し当て板スライド軸部８をケースホルダスライド軸部７に沿って移動させる。押し当て板４０が押し当て板スライド軸部１０に装着されている状態で押し当て板スライド軸部１０を移動させることにより、押し当て板４０はターンテーブル３に対して垂直方向、具体的にはターンテーブル３に接近する方向及び離隔する方向に移動する。
【００５１】
押し当て板４０をターンテーブル３に接近する方向に移動させることにより、押し当て板４０はケースホルダ３０と接触する。押し当て板４０がケースホルダ３０と接触している状態で、さらに押し当て板４０をターンテーブル３に接近する方向に移動させることにより、ケースホルダ３０は押し当て板４０と共にターンテーブル３に接近する方向に移動する。
【００５２】
ターンテーブル傾斜駆動部１４は、ターンテーブル保持部４を、ターンテーブル傾斜回転軸部６を回転軸として所定の角度に傾斜させる。検出対象物質捕捉ユニット１００がターンテーブル３上に装着されている場合、検出対象物質捕捉ユニット１００は、ターンテーブル３と共に傾斜する。駆動制御部１５は、ターンテーブル回転駆動部１１、ユニットホルダ駆動部１２、押し当て板駆動部１３、及びターンテーブル傾斜駆動部１４を制御する。
【００５３】
図８及び図９を用いて、ケースホルダ３０と、ケースホルダ３０に装着される分析用ケースとの関係を説明する。図８に示すように、分析用ケース２０は、ケース本体２１と、周縁部２２と、キャップ２３と、ヒンジ２４とを有する。分析用ケース２０は、検出対象物質であるエクソソーム１２１の内包物質１２５を分析するためのポリプロピレン製の小型試験管である。周縁部２２はケース本体２１の開口部２５の周囲にリング状に形成されている。
【００５４】
キャップ２３は、ヒンジ２４を介して周縁部２２と接続されている。キャップ２３にはリング状の凸部２６が形成されている。凸部２６の外径と開口部２５の開口径とは同じ径Ｒ１である。ヒンジ２４を折り曲げて凸部２６を開口部２５に挿入することにより、ケース本体２１の内部をキャップ２３により密閉させることができる。なお、周縁部２２が形成されているケース本体２１と、キャップ２３とを別部品にして分析用ケース２０を構成してもよい。この場合、ヒンジ２４は不要となる。
【００５５】
図９に示す分析用ケース２０は、図８に示す分析用ケース２０が上下に反転された状態を示している。図９に示すように、ケースホルダ３０は、円板状のベース板３１と、ベース板３１の中心部に形成された中心孔３２と、ベース板３１の外周部に複数形成された円弧状の一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂとを有する。
【００５６】
中心孔３２の内周面３２ａには中心孔３２の中心軸に向かって凸部３２ｂが形成されている。一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂは、ベース板３１の中心孔３２の中心を中心点として同一円周上に位置するように、ベース板３１の外周部に等間隔に形成されている。一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂは、検出対象物質捕捉ユニット１００の複数のリム３１０に対応して複数形成されている。
【００５７】
一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂの内周面３３ｃには、内周面３３ｃに沿って円弧状の凹部３３ｄが形成されている。ケースホルダ３０は、シリコーンゴム等の弾性変形部材により形成されている。凹部３３ｄの内径と分析用ケース２０の周縁部２２の外径とは同じ径Ｒ２である。
【００５８】
分析用ケース２０のケース本体２１の底部を上側にして周縁部２２を一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂの間隙に凹部３３ｄに沿って挿入させると、ホルダアーム３３ａ，３３ｂが変形するため、周縁部２２をベース板３１に向かってさらに挿入することができる。周縁部２２が凹部３３ｄにより位置決めされ、一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂにより保持される。これにより、複数の分析用ケース２０は、キャップ２３がケースホルダ３０の外側に向くように、一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂ毎にケースホルダ３０に装着される。
【００５９】
ケースホルダ３０の中心孔３２の内周面３２ａに形成されている凸部３２ｂとケースホルダスライド軸部７の外周面７ａに形成されている凹部７ｂとを位置合わせして、ケースホルダ３０の中心孔３２にケースホルダスライド軸部７を挿入させる。これにより、ケースホルダ３０は、ケースホルダスライド軸部７を回転軸とした回転方向に位置決めされ、着脱自在に装着される。
【００６０】
押し当て板４０は、分析用ケース２０のケース本体２１が挿通される複数の貫通孔４１が外周部に等間隔に形成されている。複数の貫通孔４１は、ケースホルダ３０の複数の一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂ、及び検出対象物質捕捉ユニット１００の複数のリム３１０に対応して形成されている。
【００６１】
［抽出方法］
図１０Ａ、図１０Ｂ、及び図１１〜図２１を用いて、検出対象物質であるエクソソーム１２１から内包物質１２５を抽出する抽出方法の一例を説明する。オペレータは、図１０Ａに示すフローチャートのステップＳ１にて、抽出装置１から押し当て板４０及びケースホルダ３０を取り外す。
【００６２】
オペレータは、ステップＳ２にて、検出対象物質捕捉ユニット１００の中心孔３０５にケースホルダスライド軸部７を挿通させ、検出対象物質捕捉ユニット１００をターンテーブル３上に載置する。検出対象物質捕捉ユニット１００はケースホルダスライド軸部７の凹部７ｂにより位置決めされる。
【００６３】
検出対象物質捕捉ユニット１００の各ウェル１０１の内周面１０１ａには高さＨ１の円筒状の反応領域３２０が形成され、底面１０１ｂには反応領域２１０が形成されている。反応領域２１０，３２０には、エクソソーム１２１が微粒子１３１と結合した状態で捕捉されている。
【００６４】
オペレータは、操作・表示部１６を操作して、ユニットホルダ駆動部１２を駆動制御部１５により制御し、ユニットホルダ５を駆動させる。検出対象物質捕捉ユニット１００は、ユニットホルダ５によりターンテーブル３上に装着される。
【００６５】
オペレータは、ステップＳ３にて、界面活性剤を主成分とする抽出液１４０を、検出対象物質捕捉ユニット１００の各ウェル１０１内に注入する。抽出液１４０は、エクソソーム１２１の表皮を構成する脂質二重膜１２３を溶解させ、内包物質１２５を抽出液１４０中に遊離させる溶解液である。
【００６６】
オペレータは、ステップＳ４にて、複数の分析用ケース２０を一対のホルダアーム３３ａ，３３ｂ毎にケースホルダ３０に装着する。オペレータは、図１１に示すように、分析用ケース２０のケース本体２１の底部を上側にして、ケースホルダ３０をケースホルダスライド軸部７に装着する。オペレータは、押し当て板４０を押し当て板スライド軸部８に装着する。
【００６７】
ケースホルダ３０はケースホルダスライド軸部７の凹部７ｂにより位置決めされる。押し当て板４０は押し当て板スライド軸部８の凹部８ｂにより位置決めされる。これにより、検出対象物質捕捉ユニット１００のウェル１０１及びリム３１０と、分析用ケース２０のケース本体２１と、押し当て板４０の貫通孔４１とは、同一の垂直軸上に配置される。
【００６８】
オペレータは、操作・表示部１６を操作して、抽出装置１による抽出動作を実行させる。抽出装置１は、予め設定されているプログラムに基づいて抽出動作を実行する。具体的には、抽出装置１の駆動制御部１５は、ステップＳ５にて、押し当て板駆動部１３を制御して、押し当て板４０を検出対象物質捕捉ユニット１００と接近する方向（図１１における下方向）へ移動させる。
【００６９】
押し当て板４０は、貫通孔４１にケース本体２１が挿通され、ケースホルダ３０と接触する。駆動制御部１５は、押し当て板駆動部１３を制御して、押し当て板４０をさらに移動させることにより、ケースホルダ３０及び分析用ケース２０を押し当て板４０と共に検出対象物質捕捉ユニット１００と接近する方向へ移動させる。図１１においては、ケースホルダ３０及び分析用ケース２０が押し当て板４０と共に検出対象物質捕捉ユニット１００と接近する方向は、図面の下方向となる。
【００７０】
図１２または図１３に示すように、駆動制御部１５は、押し当て板駆動部１３を制御して、ケースホルダ３０及び分析用ケース２０を押し当て板４０と共に、ケースホルダ３０の下面３０ａと検出対象物質捕捉ユニット１００のカートリッジ本体３０１の上面３０１ａとが接触しない位置まで移動させる。具体的には、駆動制御部１５は、分析用ケース２０のケース本体２１と検出対象物質捕捉ユニット１００のリム３１０との間隙ＧＰが形成されるように押し当て板駆動部１３を制御して、ケースホルダ３０及び分析用ケース２０を押し当て板４０と共に移動させる。
【００７１】
図１３に示すように、リム３１０は、カートリッジ本体３０１の上面３０１ａに対して、カートリッジ本体３０１の中心部側が高く、外周部側が低くなるように斜めに切断されたような円筒形状を有する。そのため、間隙ＧＰは検出対象物質捕捉ユニット１００の外周部側に形成される。検出対象物質捕捉ユニット１００の中心部側では、ケース本体２１の内周面２１ａとリム３１０の外周面３１０ｂとは接触している。
【００７２】
抽出液１４０は、ウェル１０１内に高さＨ２（Ｈ２＜Ｈ１）まで注入されている。従って、ウェル１０１内には試料液１２２よりも少量の抽出液１４０が注入されている。間隙ＧＰは、抽出液１４０がエクソソーム１２１の脂質二重膜１２３を溶解させることにより発生するガス成分を、ウェル１０１内から検出対象物質捕捉ユニット１００の外側に向かって排出するための排気口としての機能を有する。ガス成分は検出対象物質捕捉ユニット１００の外側に向かって排出されるため、他のウェル１０１内へのガス成分の侵入を抑制できる。
【００７３】
駆動制御部１５は、ステップＳ６にて、ターンテーブル回転駆動部１１を制御して、検出対象物質捕捉ユニット１００をターンテーブル３と共に回転させる。ケースホルダ３０、分析用ケース２０、及び押し当て板４０は、検出対象物質捕捉ユニット１００と共に回転する。
【００７４】
図１４に示すように、駆動制御部１５は、ターンテーブル傾斜駆動部１４を制御して、検出対象物質捕捉ユニット１００をターンテーブル３と共に傾斜させる。具体的には、駆動制御部１５は、ターンテーブル傾斜回転軸部６を回転軸として、図１５に示すように、検出対象物質捕捉ユニット１００が所定の角度θ１に傾斜する状態となるようにターンテーブル傾斜駆動部１４を制御する。ケースホルダ３０、分析用ケース２０、及び押し当て板４０は、検出対象物質捕捉ユニット１００と共に傾斜する。
【００７５】
検出対象物質捕捉ユニット１００を所定の角度θ１に傾斜させると、ウェル１０１内の抽出液１４０は、液面を水平に保つように流動する。角度θ１及び検出対象物質捕捉ユニット１００の傾斜前における抽出液１４０の高さＨ２は、反応領域２１０が形成されているウェル１０１の底面１０１ｂの中心Ｃ１０１ｂから、反応領域３２０が形成されているウェル１０１の内周面１０１ａにおける高さＨ１までの範囲が抽出液１４０で満たされるように、設定されている。
【００７６】
検出対象物質捕捉ユニット１００を回転させた状態で傾斜させることにより、抽出液１４０は、ウェル１０１の底面１０１ｂの中心Ｃ１０１ｂから内周面１０１ａにおける底面１０１ｂから高さＨ１までの範囲が抽出液１４０で満たされた状態を維持しながら、ウェル１０１内を回転流動する。なお、ステップＳ６では、検出対象物質捕捉ユニット１００を回転させてから傾斜させてもよいし、傾斜させてから回転させてもよいし、回転と傾斜とを同時に行ってもよい。
【００７７】
抽出液１４０は、反応領域２１０，３２０に捕捉されているエクソソーム１２１の表皮を構成する脂質二重膜１２３を溶解させる。具体的には、抽出液１４０は、脂質二重膜１２３の組織または細胞を破砕する。検出対象物質捕捉ユニット１００を傾斜させた状態で抽出液１４０を回転流動させることにより、試料液１２２よりも少ない量の抽出液１４０で脂質二重膜１２３を効率的に溶解させることができる。
【００７８】
図１６に示すように、エクソソーム１２１の表皮が溶解することにより、内包物質１２５が抽出液１４０中に遊離する。図１６は図４に対応する。図１６に示す内包物質１２５は、図５に示す内包物質１２５を簡略化して模式的に示している。
【００７９】
駆動制御部１５は、検出対象物質捕捉ユニット１００を傾斜させた状態で所定の時間だけ回転させた後、ステップＳ７にて、ターンテーブル回転駆動部１１を制御して、ターンテーブル３の回転を停止させる。
【００８０】
駆動制御部１５は、図１０Ｂに示すフローチャートのステップＳ８にて、押し当て板駆動部１３を制御して、図１７に示すように、ケースホルダ３０及び分析用ケース２０を押し当て板４０と共に、ケースホルダ３０の下面３０ａと検出対象物質捕捉ユニット１００のカートリッジ本体３０１の上面３０１ａとが接触する位置まで移動させる。これにより、分析用ケース２０のケース本体２１はリム３１０に装着される。
【００８１】
ケース本体２１の内周面２１ａとリム３１０の外周面３１０ｂとが全周に亘って接触するため、間隙ＧＰは閉鎖される。即ち、抽出液１４０が溜められているウェル１０１の内部は、ケース本体２１とリム３１０とにより密閉された状態となる。
【００８２】
駆動制御部１５は、ステップＳ９にて、ターンテーブル傾斜回転軸部６を回転軸として、所定の角度θ１に傾斜している検出対象物質捕捉ユニット１００がさらに角度θ２だけ回転した状態となるようにターンテーブル傾斜駆動部１４を制御する。角度θ１と角度θ２とは、θ２＝１８０°−θ１の関係を有する。
【００８３】
図１８に示すように、検出対象物質捕捉ユニット１００と分析用ケース２０は、駆動制御部１５によりリム３１０とケース本体２１の底部とが下側に位置するように回転する。ケースホルダ３０及び押し当て板４０は、検出対象物質捕捉ユニット１００と共に回転する。即ち、図１８に示す状態は、図１２に示す状態を上下に反転させた状態に相当する。これにより、検出対象物質捕捉ユニット１００のウェル１０１及びリム３１０と、分析用ケース２０のケース本体２１と、押し当て板４０の貫通孔４１とは、同一の垂直軸上に配置される。
【００８４】
検出対象物質捕捉ユニット１００を分析用ケース２０と共にリム３１０及びケース本体２１の底部が下側に位置するように回転させることにより、図１９Ａに示すように、複数のウェル１０１内の抽出液１４０は、各ウェル１０１の内周面１０１ａを伝って、対応する複数の分析用ケース２０のケース本体２１へ一度に移し替えられる。
【００８５】
リム３１０は、リム３１０の端面３１０ａと貫通孔３０２の内周面３０２ａとの角度θａがカートリッジ本体３０１の中心部側で鋭角になるように、内周部から外周部に向かって傾斜した鋭利な先端形状を有する。リム３１０の鋭利な先端形状により、ウェル１０１の内周面１０１ａを伝ってきた抽出液１４０の液切れを速やかに行うことができる。
【００８６】
図１８及び図１９Ａに示す状態において、検出対象物質捕捉ユニット１００が傾斜方向または回転方向に小刻みに往復回転駆動するように、駆動制御部１５はターンテーブル傾斜駆動部１４またはターンテーブル回転駆動部１１を制御してもよい。
【００８７】
駆動制御部１５は、ステップＳ１０にて、押し当て板駆動部１３を制御して、押し当て板４０を検出対象物質捕捉ユニット１００から離隔する方向（図１８及び図１９Ａにおける下方向）に移動させる。押し当て板４０は、貫通孔４１からケース本体２１が離脱する位置まで移動する。
【００８８】
駆動制御部１５は、押し当て板駆動部１３を制御して、押し当て板４０をさらに移動させる。これにより、図１９Ｂ及び図２０に示すように、ケースホルダ３０及び分析用ケース２０は押し当て板４０と共に検出対象物質捕捉ユニット１００から離隔する方向へ移動する。抽出装置１は抽出動作を終了する。
【００８９】
オペレータは、ステップＳ１１にて、ケースホルダ３０に分析用ケース２０が装着されている状態で、分析用ケース２０のヒンジ２４を折り曲げてキャップ２３の凸部２６をケース本体２１の開口部２５に挿入する。これにより、ケース本体２１の内部に移し替えられた抽出液１４０はキャップ２３により密閉される。オペレータは、抽出液１４０が密閉された分析用ケース２０をケースホルダ３０から取り外し、回収する。
【００９０】
分析用ケース２０を抽出液１４０が密閉された状態でケースホルダ３０から取り外すことにより、取り外すときの衝撃で抽出液１４０が分析用ケース２０から外部へ飛び出すことを防止できる。
【００９１】
オペレータは、ケースホルダ３０に装着されている全ての分析用ケース２０を回収した後、ステップＳ１２にて、操作・表示部１６を操作して、ターンテーブル保持部４を初期位置へ移動させる。具体的には、図２１に示すように、抽出装置１の駆動制御部１５は、ターンテーブル傾斜回転軸部６を回転軸として、検出対象物質捕捉ユニット１００が傾斜する前の状態に戻るようにターンテーブル傾斜駆動部１４を制御し、ターンテーブル保持部４を初期位置へ移動させる。
【００９２】
オペレータは、ステップＳ１３にて、抽出装置１から押し当て板４０及びケースホルダ３０を取り外す。オペレータは、操作・表示部１６を操作して、検出対象物質捕捉ユニット１００の装着が解除されるようにユニットホルダ駆動部１２を駆動制御部１５により制御し、ユニットホルダ５を駆動させる。オペレータは、抽出装置１から検出対象物質捕捉ユニット１００を取り外す。以上により、抽出工程は終了となる。
【００９３】
分析用ケース２０に回収された抽出液１４０は、試料液１２２よりも少量である。また、鋭利な先端形状を有するリム３１０により、抽出液１４０の液切れを速やかに行うことができるため、ウェル１０１内の抽出液１４０のほぼ全量を分析用ケース２０に移し替えることができる。
【００９４】
回収された抽出液１４０中の内包物質１２５は、例えばリアルタイムＰＣＲ（Real-Time Polymerase Chain Reaction）法を用いて分析することができる。リアルタイムＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素反応を利用してＤＮＡを増幅させ、増幅産物の増加量をリアルタイムでモニタリングして解析する方法である。
【００９５】
例えば、段階的に希釈した基準サンプルに対してリアルタイムＰＣＲ法を適用することにより増幅産物の増幅曲線を得る。増幅曲線と設定された閾値との交わる点であるＣｔ（Threshold Cycle）値を算出し、検量線を作成する。回収された抽出液１４０についても基準サンプルと同様にＣｔ値を算出し、算出したＣｔ値と作成した検量線とからエクソソーム１２１の内包物質１２５を定性及び定量することができる。
【００９６】
従って、上記の抽出装置１及び抽出方法によれば、試料液１２２よりも少量の抽出液１４０でエクソソーム１２１の内包物質１２５を抽出することができる。また、上記の抽出装置１及び抽出方法によれば、検出対象物質捕捉ユニット１００の複数のウェル１０１を用いて内包物質１２５を抽出し、ケースホルダ３０に装着された複数の分析用ケース２０に外気に触れることなく一度に移し替えることができる。そのため、抽出液１４０の移し替えを効率的に行うことができ、ピペッティングによる反応領域２１０，３２０の損傷を防止することができる。
【００９７】
よって、上記の抽出装置１及び抽出方法によれば、抽出液１４０中の内包物質１２５の濃度が低くなることを抑制し、反応領域２１０，３２０の損傷を防止してウェル１０１内の抽出液１４０を分析用ケース２０に効率的に移し替えることができる。
【００９８】
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。
【００９９】
例えば、図２２及び図２３に示すように、検出対象物質捕捉ユニット４００を構成するカートリッジ５００の貫通孔５０２が、リム３１０側の内径Ｒ１１が試料分析用ディスク２００側の内径Ｒ１２よりも小さい形状を有する。図２３は図１５に対応する。図２２及び図２３に示す検出対象物質捕捉ユニット４００は、前述の検出対象物質捕捉ユニット１００と比較して、貫通孔５０２の形状が異なる点で相違し、それ以外の構成は同じである。検出対象物質捕捉ユニット４００は、前述の抽出装置１に装着される。
【０１００】
検出対象物質捕捉ユニット４００を用いて抽出液１４０中に内包物質１２５を抽出する抽出方法は、図１０Ａ及び図１０Ｂのフローチャートに示す抽出方法と同じである。図１０ＡのステップＳ６にて、検出対象物質捕捉ユニット４００を傾斜させて回転させた場合、ウェル４０１を構成する貫通孔５０２のリム３１０側の内径Ｒ１１が小さくなっているため、抽出液１４０がウェル４０１から外部へ飛び出すことを抑制できる。
【０１０１】
また、図１０Ａに示すステップＳ２では、駆動制御部１５がユニットホルダ駆動部１２を制御してユニットホルダ５を駆動させることにより、検出対象物質捕捉ユニット１００はターンテーブル３上に装着されるが、オペレータがユニットホルダ５を手動で操作することにより、検出対象物質捕捉ユニット１００をターンテーブル３上に装着してもよい。この場合、ユニットホルダ駆動部１２は不要となる。
【０１０２】
また、図１０ＡのステップＳ５から図１０ＢのステップＳ１０までの抽出工程は抽出装置１により自動で実行されるが、オペレータがステップ毎に操作・表示部１６を操作して、抽出装置１による抽出動作をステップ毎に実行させてもよい。
【符号の説明】
【０１０３】
１  抽出装置
３  ターンテーブル
１１  ターンテーブル回転駆動部
１４  ターンテーブル傾斜駆動部
１００  検出対象物質捕捉ユニット
２００  試料分析用ディスク
３００  カートリッジ
３０１  カートリッジ本体
３０１ａ  上面（第１の面）
３０２  貫通孔
３１０  リム
【図１】
2018159684.tif 000003
【図２Ａ】
2018159684.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
2018159684.tif 000007
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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