(57)【要約】【課題】生物学的試料からバイオマーカーを捕捉又は単離するためのデバイス及び方法を提供する。【解決手段】複数の実施形態で、デバイスは、投入領域、フィルター材料、及び受容領域を含む。特に、複数の実施形態で、生物学的流体を、投入領域からフィルター材料を経由して受容領域へと通過させることにより、バイオマーカーが捕捉又は単離される。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、
（ｉ）
（ａ）入口、出口、及び前記入口と前記出口との間の内部容積部を含む第１ボディー；
（ｂ）入口、出口、前記入口と前記出口との間の内部容積部、第２ボディーの前記内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー
を含み、
前記第１ボディー及び前記第２ボディーが、前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との相互作用により可逆的に接続される、
小胞捕捉デバイス；
（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、
前記受容容器の前記内部空洞部が、前記第１及び前記第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに前記第１ボディーの前記内部容積部から、前記フィルター材料を通り、前記第２ボディーの前記内部空洞部を通り、前記第２ボディーの前記出口から出るように通過させた後の前記生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器
を含むシステム。
【請求項２】
（ｉｉｉ）個々の第２ボディーの出口と可逆的に相互作用するように構成された１又は複数の分析ウェルを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記１又は複数の分析ウェルが、標準的な６、１２、４８、又は９６ウェルマイクロプレートを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記１又は複数の分析ウェルが、標準的な９６ウェルマイクロプレートを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記第１ボディーの前記内部容積部が約２〜約１０ｍＬである、請求項１に記載のシステム
【請求項６】
前記第２ボディーの前記内部容積部が約２〜約５ｍＬである、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との間の前記可逆的接続が摩擦接続を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との間の前記可逆的接続がルアーロック接続を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との間の前記可逆的接続が回転接続を含み、前記第２ボディーの前記出口のピンが、前記第２ボディーの前記入口の溝部と噛み合う、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との間の前記可逆的接続がねじ接続を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記第２ボディーの前記入口が、前記第１ボディーの前記出口の雄ねじ部と噛み合う前記第２ボディーの前記入口の雌ねじ部を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第２ボディーの前記入口が、前記第１ボディーの前記出口の雌ねじ部と噛み合う前記第２ボディーの前記入口の雄ねじ部を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記第２ボディー上の固有識別子が、患者特異的ＲＦＩＤタグを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第２ボディー上の固有識別子が、患者特異的二次元バーコードを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第２ボディー上の固有識別子が、患者特異的三次元バーコードを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第２ボディー上の固有識別子が、前記第２ボディーの前記出口が前記マイクロプレートのウェルと連通している時に前記第２ボディーの上の位置から可視及び／又は読取り可能である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記受容容器の前記内部空洞部の容積が約５０ｍＬである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記受容容器の前記内部空洞部の容積が約１００ｍＬである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記第１ボディーが、前記第１ボディーの前記入口の周辺部から延びるリップを含み、前記リップが、前記受容容器の前記入口の周辺部の上に留まり、前記リップが、前記受容容器から前記第１及び第２ボディーを取り外すことを可能にしながら前記第１及び第２ボディーを前記受容容器が囲むことを可能にする、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
前記第１ボディー上の前記リップが、前記受容容器の前記内部空洞部内の固定された位置に前記第１及び第２ボディーを保持する、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記固定された位置が、前記第１ボディーの前記内部容積部から前記フィルター材料を通って前記受容容器の前記内部空洞部へと通過した前記生物学的流体試料に前記第２ボディーの前記出口が接触しない位置である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
受容容器が、前記入口、前記入口の反対側の閉じた末端、及び前記内部空洞部から本質的になる、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記第１ボディーの内部から前記フィルター材料を通って前記第２ボディーの前記出口を出て前記受容容器の前記内部容積部中へと前記生物学的流体試料を通過させるために遠心が用いられる、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記フィルター材料が、直径が約０．６ミクロン〜約１．５ミクロンの小胞を保持するように構成された複数層の１又は複数のガラス様材料を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記システムが、前記第１ボディーの内部から前記フィルター材料を通って前記第２ボディーの前記出口を出て前記受容容器の前記内部容積部中へと前記生物学的流体試料を通過させるために陰又は陽圧を用いない、請求項１に記載のシステム。
【請求項２６】
対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、
（ｉ）
（ａ）入口、出口、及び前記入口と前記出口との間の内部容積部をを有する第１ボディー；
（ｂ）入口、出口、前記入口と前記出口との間の内部容積部、第２ボディーの前記内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、
を含み、
前記第１ボディー及び前記第２ボディーが、前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との相互作用により可逆的に接続され、
前記相互作用が、前記第２ボディーの前記入口への前記第１ボディーの前記出口の挿入を含み、
前記第２ボディーが、前記第２ボディーの前記入口から前記第１ボディーの前記出口を引き抜くことにより前記第１ボディーから引き離され、
前記第２ボディーの前記出口が、６、１２、４８、又は９６ウェルマイクロプレートのウェルの内径内に適合するような寸法であり、
前記第２ボディーが、前記対象のアイデンティティーに対応する固有識別子を含む、
小胞捕捉デバイス；及び
（ｉｉ）入口、前記入口の反対側の閉じた末端、及び内部空洞部を有する受容容器であって、
前記受容容器の前記内部空洞部が、前記第１及び前記第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに前記第１ボディーの前記内部容積部から、前記フィルター材料を通り、前記第２ボディーの前記内部空洞部を通り、前記第２ボディーの前記出口から出るように通過させた後の前記生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器
を含む、システム。
【請求項２７】
前記第１ボディーの前記内部容積部が約２〜約１０ｍＬである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記第２ボディーの前記内部容積部が約２〜約５ｍＬである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２９】
前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との間の可逆的接続が摩擦接続を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３０】
前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との間の前記可逆的接続が回転接続を含み、前記第２ボディーの前記出口のピンが、前記第２ボディーの前記入口の溝部と噛み合う、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３１】
前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーと前記出口との間の可逆的接続がねじ接続を含む、請求項２５に記載のシステム。
【請求項３２】
前記第２ボディーの前記入口が、前記第１ボディーの前記出口の雄ねじ部と噛み合う前記第２ボディーの前記入口の雌ねじ部を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記第２ボディーの前記入口が、前記第１ボディーの前記出口の雌ねじ部と噛み合う前記第２ボディーの前記入口の雄ねじ部を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３４】
前記第２ボディー上の前記固有識別子が、患者特異的ＲＦＩＤタグを含む、請求項２６
に記載のシステム。
【請求項３５】
前記第２ボディー上の前記固有識別子が、患者特異的二次元バーコードを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３６】
前記第２ボディー上の前記固有識別子が、患者特異的三次元バーコードを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３７】
前記第２ボディー上の前記固有識別子が、前記第２ボディーの前記出口が前記マイクロプレートのウェルと連通している時に前記第２ボディーの上の位置から可視及び／又は読取り可能である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記受容容器の前記内部空洞部の容積が約５０ｍＬである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３９】
前記受容容器の前記内部空洞部の容積が約１００ｍＬである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４０】
前記第１ボディーが、前記第１ボディーの前記入口の周辺部から延びるリップを含み、前記リップが、前記受容容器の前記入口の周辺部の上に留まり、前記リップが、前記受容容器から前記第１及び第２ボディーを取り外すことを可能にしながら前記第１及び第２ボディーを前記受容容器が囲むことを可能にする、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４１】
前記第１ボディー上の前記リップが、前記受容容器の前記内部空洞部内の固定された位置に前記第１及び第２ボディーを保持する、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記固定された位置が、前記第１ボディーの前記内部容積部から前記フィルター材料を通って前記受容容器の前記内部空洞部へと通過した前記生物学的流体試料に前記第２ボディーの前記出口が接触しない位置である、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
受容容器が、前記入口、前記入口の反対側の閉じた末端、及び前記内部空洞部から本質的になる、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４４】
前記第１ボディーの内部から前記フィルター材料を通って前記第２ボディーの前記出口を出て前記受容容器の前記内部容積部中へと前記生物学的流体試料を通過させるために遠心が用いられる、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
前記フィルター材料が、直径が約０．６ミクロン〜約１．５ミクロンの小胞を保持するように構成された複数層の１又は複数のガラス様材料を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４６】
生物学的流体試料から小胞を単離する方法であって、方法が、
請求項１に記載のシステムを得る工程；
前記第１ボディーの前記入口を介して前記第１ボディーの内部容積部に或る量の（ａ
ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ）生物学的流体試料を配置する工程であって、
前記第１ボディーが前記第２ボディーに可逆的に接続され、工程；
前記第１及び第２ボディーを前記受容容器の前記内部空洞部中に配置する工程；
前記受容容器に重力又は遠心力の１又は複数を印加することにより、前記第１ボディーの前記内部容積部から前記第２ボディーの前記フィルター材料を通って前記第２ボディーの前記出口から出て前記受容容器の前記内部空洞部中へと前記生物学的試料を通過させ
る工程；
を含み、前記フィルターが前記生物学的試料から小胞を捕捉することにより、前記生物学的流体試料から小胞が単離される、方法。
【請求項４７】
生物学的流体試料から目的遺伝子の発現を検出する方法であって、
請求項４６に記載の方法に従って前記生物学的流体試料から小胞を単離する工程；
前記受容容器から前記第１及び第２ボディーを引き抜く工程；
前記第１及び第２ボディーを互いから引き離す工程；
前記第２ボディーの前記出口を９６ウェルマイクロプレートのウェルと連通するように配置する工程；
溶出バッファーを前記第２ボディーの前記入口に導入する工程であって、前記溶出バッファーが、前記第２ボディーの前記フィルター上に捕捉された前記小胞を溶解するバッファーを含み、これにより前記小胞からＲＮＡを放出させる工程；
前記放出されたＲＮＡを前記フィルターから前記９６ウェルマイクロプレートの対応するウェルに移す工程；並びに
（ｉ）前記ＲＮＡを逆転写酵素と接触させて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する工程及び
（ｉｉ）前記ｃＤＮＡを、前記目的遺伝子に特異的なセンス及びアンチセンスプライマー並びにＤＮＡポリメラーゼと接触させて増幅ＤＮＡを生成することにより前記目的遺伝子の発現を検出する工程
を含む方法によって前記目的遺伝子の発現を検出する工程
を含む方法。
【請求項４８】
対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、
（ｉ）
（ａ）入口、出口、及び前記入口と前記出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；
（ｂ）入口、出口、前記入口と前記出口との間の内部容積部、第２ボディーの前記内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、患者特異的ＲＦＩＤタグを含む固有識別子を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、
を含み
前記第１ボディー及び前記第２ボディーが、前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との相互作用により可逆的に接続される、
小胞捕捉デバイス；及び
（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、
前記受容容器の前記内部空洞部が、前記第１及び前記第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに前記第１ボディーの前記内部容積部から、前記フィルター材料を通り、前記第２ボディーの前記内部空洞部を通り、前記第２ボディーの前記出口から出るように通過させた後の前記生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器、
を含むシステム。
【請求項４９】
対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、
（ｉ）
（ａ）入口、出口、及び前記入口と前記出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；
（ｂ）入口、出口、前記入口と前記出口との間の内部容積部、前記第２ボディーの前記内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、患者特異的二次元バーコードを含む固有識別子を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、
を含み
前記第１ボディー及び前記第２ボディーが、前記第２ボディーの前記入口と前記第
１ボディーの前記出口との相互作用によって可逆的に接続される、
小胞捕捉デバイス；
（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、
前記受容容器の前記内部空洞部が、前記第１及び前記第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに前記第１ボディーの前記内部容積部から、前記フィルター材料を通り、前記第２ボディーの前記内部空洞部を通り、前記第２ボディーの前記出口から出るように通過させた後の前記生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器
を含むシステム。
【請求項５０】
対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、
（ｉ）
（ａ）入口、出口、及び前記入口と前記出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；
（ｂ）入口、出口、前記入口と前記出口との間の内部容積部、前記第２ボディーの前記内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、患者特異的三次元バーコードを含む固有識別子を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、
を含み、
前記第１ボディー及び前記第２ボディーが、前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との相互作用によって可逆的に接続される、
小胞捕捉デバイス；
（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、
前記受容容器の前記内部空洞部が、前記第１及び前記第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに前記第１ボディーの前記内部容積部から、前記フィルター材料を通り、前記第２ボディーの前記内部空洞部を通り、前記第２ボディーの前記出口から出るように通過させた後の前記生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器
を含むシステム。
【請求項５１】
対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、
（ｉ）
（ａ）入口、出口、及び前記入口と前記出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；
（ｂ）入口、出口、前記入口と前記出口との間の内部容積部、第２ボディーの前記内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、
を含み、
前記第１ボディー及び前記第２ボディーが、前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との相互作用によって可逆的に接続され、前記相互作用が、前記第１ボディーの前記出口の雄ねじ部と噛み合う前記第２ボディーの前記入口の雌ねじ部の間の相互作用を含む、
小胞捕捉デバイス
（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、
前記受容容器の前記内部空洞部が、前記第１及び前記第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに前記第１ボディーの前記内部容積部から、前記フィルター材料を通り、前記第２ボディーの前記内部空洞部を通り、前記第２ボディーの前記出口から出るように通過させた後の前記生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器
を含むシステム。
【請求項５２】
対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、
（ｉ）
（ａ）入口、出口、及び前記入口と前記出口との間の内部容積部を含む第１ボディ
ー；
（ｂ）入口、出口、前記入口と前記出口との間の内部容積部、第２ボディーの前記内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、
を含み、
前記第１ボディー及び前記第２ボディーが、前記第２ボディーの前記入口と前記第１ボディーの前記出口との相互作用によって可逆的に接続されており、前記相互作用が、前記第１ボディーの前記出口の雌ねじ部と噛み合う前記第２ボディーの前記入口の雄ねじ部の間の相互作用を含む、
小胞捕捉デバイス；
（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、
前記受容容器の前記内部空洞部が、前記第１及び前記第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに前記第１ボディーの前記内部容積部から、前記フィルター材料を通り、前記第２ボディーの前記内部空洞部を通り、前記第２ボディーの前記出口から出るように通過させた後の前記生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器
を含むシステム。
【請求項５３】
前記第１及び第２ボディー間の前記可逆的接続が、前記第２ボディーに前記第１ボディーの前記内部容積部を通過させることなく前記第１ボディーから前記第２ボディーを引き離せるように構成されている、請求項５１〜５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記システムが、（ｉｉｉ）個々の第２ボディーの前記出口と可逆的に相互作用するように構成された１又は複数の分析ウェルを更に含む、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、それぞれの開示全体を参照により本明細書に援用する２０１３年５月６日付で提出された米国仮特許出願第６１／８２０，１１０号に基づく利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、流体試料から目的の物質（ａｇｅｎｔ）を捕捉する効率が上昇したシステム、デバイス、及び方法に関する。流体試料は、いくつかの実施形態では生物学的流体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅ）であり、別の実施形態では、非生物学的流体試料が用いられる。例えば、複数の実施形態で、例えばミネラル含有量、汚染レベル、化学物質又は毒素の含有量、病原体の存在等を評価するために、本明細書に開示されているデバイスに環境水試料を通過させる。
【背景技術】
【０００３】
しばしば、液体から特定の成分を抽出することが望ましい。例えば、多くの医学的試験は、患者から採取した流体試料（例えば、血液、尿等）中のバイオマーカーを分析する。健康な患者に存在しない又は以前に得られた患者試料から変化しているバイオマーカー又は生化学的パターンの同定から診断又は予後が得られ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しばしば、バイオマーカーを単離又は検出するために体液（ｂｏｄｉｌｙ  ｆｌｕｉｄ）を使用すると、バイオマーカーがかなり希釈される。更に、ほとんどのバイオマーカーは、組織及び体液中で低又は中程度の量で生産される。目的の化合物が低濃度で存在する場合、診断又は予後はさほど正確でないと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
複数の実施形態で、生物学的流体試料等の流体試料からバイオマーカーを効率的に回収するためのシステム及び方法が提供される。例えば、複数の実施形態で、対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、（ｉ）（ａ）入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部（ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を有する第１ボディー、（ｂ）入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、を含み、第１ボディー及び第２ボディーが、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用により可逆的に接続される、小胞捕捉デバイス、（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｖｅｓｓｅｌ）であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲む（ｅｎｃｌｏｓｅ）ような並びに第１ボディーの内部容積部から、フィルター材料を通り、第２ボディーの内部空洞部を通り、第２ボディーの出口から出た後の生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器、を含むシステムが提供される。
【０００６】
複数の実施形態で、システムは、（ｉｉｉ）個々の第２ボディーの出口と可逆的に相互作用するように構成された１又は複数の分析ウェルを更に含む。いくつかの実施形態では、分析ウェルは、例えば微量遠心チューブ等の単一チューブを含む。しかし、複数の実施形態で、１又は複数の分析ウェルは標準的な６、１２、４８、又は９６ウェルマイクロプレートを含む。一実施形態では、１又は複数の分析ウェルは標準的な９６ウェルマイクロプレートを含む。
【０００７】
更に、複数の実施形態で、対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、（ｉ）（ａ）入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部を有する第１ボディー、（ｂ）入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、を含み、第１ボディー及び第２ボディーが、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用によって可逆的に接続され、前記相互作用が、第２ボディーの入口への第１ボディーの出口の挿入を含み、第２ボディーが、第２ボディーの入口から第１ボディーの出口を引き抜くことにより第１ボディーから引き離され（ｄｉｓｃｏｎｎｅｃｔ）、第２ボディーの出口が、６、１２、４８、又は９６ウェルマイクロプレートのウェルの内径内に適合するような寸法であり、第２ボディーが、前記対象のアイデンティティーに対応する固有識別子を含む、小胞捕捉デバイス；並びに（ｉｉ）入口、入口の反対側の閉じた末端（ｃｌｏｓｅｄ  ｅｎｄ）、及び内部空洞部を有する受容容器であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに第１ボディーの内部容積部から、フィルター材料を通り、第２ボディの内部空洞部を通り、第２ボディーの出口から出た後の生物学的流体試料を受容するような寸法になっている、受容容器、を含むシステムが提供される。
【０００８】
複数の実施形態で、第１ボディーの内部容積部は約２〜約１０ｍＬである。複数の実施形態で、第２ボディーの内部容積部は約２〜約５ｍＬである。
【０００９】
複数の実施形態で、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との間の可逆的接続は摩擦接続（ｆｒｉｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を含む。複数の実施形態で、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との間の可逆的接続はルアーロック接続を含む。複数の実施形態で、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との間の可逆的接続は回転接続（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を含み、第２ボディーの出口のピンが第２ボディーの入口の溝部と噛み合う。複数の実施形態で、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との間の可逆的接続はねじ接続（ｔｈｒｅａｄｅｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を含む。いくつかの実施形態では、第２ボディーの入口は、第１ボディーの出口の雄ねじ部（ｍａｌｅ  ｔｈｒｅａｄ）と噛み合う第２ボディーの入口の雌ねじ部（ｆｅｍａｌｅ  ｔｈｒｅａｄ）を含む。更なる実施形態では、第２ボディーの入口は、第１ボディーの出口の雌ねじ部と噛み合う第２ボディーの入口の雄ねじ部を含む。複数の実施形態で、接続は、第２ボディーが第１ボディーの内部容積部を通らずとも、第２ボディーを連結（ｃｏｕｐｌｅ）して、その後、第１ボディーから分離（ｄｅ−ｃｏｕｐｌｅ）することが可能なように構成される。
【００１０】
複数の実施形態で、第２ボディー上の固有識別子は、患者特異的ＲＦＩＤタグを含む。複数の実施形態で、第２ボディー上の固有識別子は、患者特異的二次元バーコードを含む。複数の実施形態で、第２ボディー上の固有識別子は、患者特異的三次元バーコードを含む。複数の実施形態で、第２ボディー上の固有識別子は、前記第２ボディーの出口が分析ウェルと連通している時、第２ボディーの上の位置から可視及び／又は読取り可能である。複数の実施形態で、他の視覚的、電子的、又は磁気的固有患者識別子が使用される。
【００１１】
複数の実施形態で、受容容器の内部空洞部の容積は約５０ｍＬである。複数の実施形態で、受容容器の内部空洞部の容積は約１００ｍＬである。
【００１２】
複数の実施形態で、第１ボディーは、第１ボディーの入口の周辺部（ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）から延びるリップを含み、前記リップは、受容容器の入口の周辺部の上に留まり、受容容器からの第１及び第２ボディーの取り外しを可能にしながら、受容容器が第１及び第２ボディーを囲むことを可能にする。複数の実施形態で、第１ボディー上のリップは、受
容容器の内部空洞部内の固定された位置に第１及び第２ボディーを保持する。有利には、複数の実施形態で、固定された位置は、第１ボディーの内部容積部からフィルター材料を通って受容容器の内部空洞部中へと通過した生物学的流体試料と第２ボディーの出口が接触しない位置である。
【００１３】
複数の実施形態で、受容容器は、入口、入口の反対側の閉じた末端、及び内部空洞部から本質的になる（例えば、受容容器は更なる出入口又は開口部を有さない）。
【００１４】
複数の実施形態で、前記生物学的流体試料を第１ボディーの内部からフィルター材料を通って第２ボディーの出口を出て受容容器の内部容積部中へと通過させるために遠心を用いる。
【００１５】
複数の実施形態で、フィルター材料は、直径が約０．６ミクロン〜約１．５ミクロンの小胞を保持するように構成された１又は複数のガラス様材料の複数の層を含む。
【００１６】
複数の実施形態で、システムは、前記生物学的流体試料を第１ボディーの内部からフィルター材料を通って第２ボディーの出口を出て受容容器の内部容積部中へと通過させるために陰又は陽圧を用いない。
【００１７】
更に、生物学的流体試料から小胞を単離する方法であって、入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部を有する第１ボディー、入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー（第１ボディー及び第２ボディーは、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用により可逆的に接続される）、内部空洞部を有する受容容器、を含むシステムを得る工程であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに第１ボディーの内部容積部からフィルター材料を通って第２ボディーの内部空洞部を通って第２ボディーの出口を出た後の生物学的流体試料を受容するような寸法である、工程、或る量の（ａ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ）生物学的流体試料を第１ボディーの入口を介して第１ボディーの内部容積部中に配置する工程であって、第１ボディーが、第２ボディーに可逆的に接続される工程、第１及び第２ボディーを受容容器の内部空洞部中に配置する工程、重力又は遠心力の１又は複数を受容容器に印加することにより、生物学的試料を、第１ボディーの内部容積部から第２ボディーのフィルター材料を通って第２ボディーの出口を出て受容容器の内部空洞部中へと通過させる工程を含み、フィルターが生物学的流体試料から小胞を捕捉することにより前記生物学的流体試料から小胞が単離される、方法が提供される。
【００１８】
複数の実施形態で、方法は、生物学的流体試料から目的遺伝子の発現を検出する工程、受容容器から第１及び第２ボディーを引き抜く工程；第１及び第２ボディーを互いから引き離す工程；第２ボディーの出口を９６ウェルマイクロプレートのウェルと連通させて配置する工程；第２ボディーの入口に溶出バッファーを導入する工程であって、前記溶出バッファーが、第２ボディーのフィルターに捕捉された前記小胞を溶解させるバッファーを含み、これにより、前記小胞からＲＮＡを放出させる工程；前記放出ＲＮＡを前記フィルターから９６ウェルマイクロプレートの対応するウェルに移す工程；並びに（ｉ）前記ＲＮＡを逆転写酵素と接触させて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する工程及び（ｉｉ）前記ｃＤＮＡを、前記目的遺伝子に特異的なセンス及びアンチセンスプライマー並びにＤＮＡポリメラーゼと接触させて増幅ＤＮＡを生成することにより前記目的遺伝子の発現を検出する工程、を含む方法によって前記目的遺伝子の発現を検出する工程を更に含む。更なる実施形態では、他のマイクロプレートサイズ（又は個々のチューブ若しくはチューブのアレイ）が用いられてもよい。
【００１９】
更に、対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、（ｉ）（ａ）入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；（ｂ）入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、患者特異的ＲＦＩＤタグを含む固有識別子を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、を含み、第１ボディー及び第２ボディーが、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用によって可逆的に接続される、小胞捕捉デバイス；（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに第１ボディーの内部容積部から、フィルター材料を通って、第２ボディーの内部空洞部を通って、第２ボディーの出口を出るように通過させた後の生物学的流体試料を受容するような寸法になっている受容容器、を含む、システムが提供される。
【００２０】
更に、対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、（ｉ）（ａ）入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；（ｂ）入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、患者特異的二次元バーコードを含む固有識別子を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、を含み、第１ボディー及び第２ボディーが、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用により可逆的に接続されている、小胞捕捉デバイス；（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに第１ボディーの内部容積部から、フィルター材料を通って、第２ボディーの内部空洞部を通って、第２ボディーの出口から出るように通過させた後の生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器、を含むシステムが提供される。
【００２１】
更に、対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、（ｉ）（ａ）入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；（ｂ）入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、患者特異的三次元バーコードを含む固有識別子を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、を含み、第１ボディー及び第２ボディーが、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用によって可逆的に接続される、小胞捕捉デバイス；（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに第１ボディーの内部容積部から、フィルター材料を通って、第２ボディーの内部空洞部を通って、第２ボディーの出口から出るように通過させた後の生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器、を含むシステムが提供される。
【００２２】
更に、対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、（ｉ）（ａ）入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；（ｂ）入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、を含み、第１ボディー及び第２ボディーが、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用によって可逆的に接続され、前記相互作用が、第１ボディーの出口の雄ねじ部と噛み合う第２ボディーの入口の雌ねじ部の間の相互作用を含む、小胞捕捉デバイス；（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに第１ボディーの内部容積部から、フィルター材料を通って、第２ボディーの内部空洞部を通って、第２ボディーの出口から出るように通過させた後の生物学的流体試料を受容するような寸法である、受容容器、を含むシステムが提供される。
【００２３】
更に、対象から得た生物学的流体試料から小胞を捕捉するためのシステムであって、（
ｉ）（ａ）入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部を有する第１ボディー；（ｂ）入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー、を含み、第１ボディー及び第２ボディーが、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用によって可逆的に接続され、前記相互作用が、第１ボディーの出口の雌ねじ部と噛み合う第２ボディーの入口の雄ねじ部の間の相互作用を含む、小胞捕捉デバイス；（ｉｉ）内部空洞部を有する受容容器であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに第１ボディーの内部容積部から、フィルター材料を通って、第２ボディーの内部空洞部を通って、第２ボディーの出口から出るように通過させた後の生物学的流体試料を受容するような寸法である受容容器、を含むシステムが提供される。
【００２４】
複数の実施形態で、第１及び第２ボディー間の可逆的接続は、第２ボディーが第１ボディーの内部容積部を通過することなく第２ボディーを第１ボディーから引き離せるように構成されている。
【００２５】
複数の実施形態で、これらのシステムは更に、（ｉｉｉ）個々の第２ボディーの出口と可逆的に相互作用するように構成された１又は複数の分析ウェルを含む。
【００２６】
マイクロプレートが用いられる複数の実施形態では、第２中空ボディーとマイクロプレートとの間の相互作用の安定性を向上させるために小胞捕捉デバイス第２ボディー間にフレームが配置される。複数の実施形態で、第２中空ボディーをマイクロプレート中に（例えば、フレームを介して）配置した後、溶解バッファーを加え、３７℃で１〜２０（例えば１０）分間インキュベートして、捕捉されたエキソソームからｍＲＮＡを放出させる。複数の実施形態で、その後、フレームをオリゴ（ｄＴ）固定化プレート上に置き、２０００×ｇ、約４℃で１〜１０（例えば、５）分間遠心した。得られたオリゴ（ｄＴ）固定化プレートを、以前に報告されているように、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）＋テイルと固定化オリゴ（ｄＴ）との間のハイブリダイゼーションのために約４℃で一晩（例えば、１４〜２４時間）保存した。複数の実施形態で、非ｍＲＮＡ材料を洗浄により除去し、ｃＤＮＡを生成し、これをリアルタイムＰＣＲ（又は他の分析方法）に用いることができる。このプロセスは、非マイクロプレートフォーマット（例えば、チューブ又はチューブのアレイ）を用いる場合及びマイクロプレートフレームを用いない場合にも用いることができる。更に、更なる実施形態は、異なる反応条件及び／又は時間を用いる。
【００２７】
目的の標的化合物が低濃度で生物学的試料中に存在する場合に正確な診断が妨害され得る（不可能なこともある）ことを考慮すると、標的バイオマーカーの濃度を過度に低下させずに患者の流体試料から目的のバイオマーカー及び他の成分を抽出するためのデバイス及び方法に対するニーズがある。流体成分の抽出は多くの状況で有益であり、そのような状況としては、ろ過、精製、単離、及び濃縮が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
したがって、デバイス及び方法の複数の実施形態は液体からの標的成分の抽出を可能にする。特に、本明細書に開示されているデバイス及び方法は、生物学的流体から核酸、エキソソーム、小胞、並びに他の循環膜結合核酸及び／又はタンパク質含有構造を捕捉するのに有用である。しかし、本明細書に開示されているデバイス及び方法は、有機及び非有機化合物の抽出を可能にするので、本明細書に開示されているデバイス及び方法は、生物学的又は非生物学的起源の流体試料に適用可能である。
【００２９】
従来の小胞及びエキソソームの抽出方法は小胞を生物学的試料中の他の物質（ｍａｔｔｅｒ）から分離するために超遠心を用いることが多い。超遠心は、高価で危険性のある設備を用いて達成される。更に、超遠心ではしばしば、試料が複数のチューブに回収される
。その結果、超遠心は多くの実験室にとって非実用的又は不可能な技術であることがある。
【００３０】
そこで、本発明は、細胞から生物学的流体中に放出される核酸、エキソソーム、小胞、並びに他の循環膜結合核酸及び／又はタンパク質含有構造を捕捉するためのデバイス及び方法を提供する。複数の実施形態で、本明細書に開示されているデバイス及び方法は、超遠心等の小胞単離のための従来の技術に対する複数の利点を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているデバイス及び方法は、試料から小胞、エキソソーム、及び／又はバイオマーカーを捕捉し、有利には、同じフィルターを介した試料の多重ろ過（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を可能にする。結果的に、単にデバイスに複数の試料アリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を加えることで、より多量の小胞材料を回収することができる。いくつかの実施形態では、デバイスに試料アリコートのろ液を再度通過させることにより小胞収率が上がる。
【００３１】
複数の実施形態で、生物学的流体から小胞を単離する方法であって、（ａ）前記小胞を含む生物学的流体試料を得る工程；（ｂ）流体試料の塩濃度を約１０ｍＭ〜８００ｍＭに調整する工程；（ｃ）流体試料のｐＨを約ｐＨ６〜ｐＨ９に調整する工程；及び（ｄ）前記生物学的流体試料を小胞捕捉材料に通す工程であって、前記小胞捕捉材料が、ガラス様材料を含み、前記生物学的流体試料由来の小胞が、前記小胞捕捉材料上又は中に捕捉される工程、を含む方法が提供される。
【００３２】
複数の実施形態で、試料アリコートを小胞捕捉材料に通す前に試料アリコートを遠心にかける。いくつかの実施形態では、前記遠心により生じた上清を捨て、別の実施形態では、これを前記捕捉材料に更に１又は複数回通して小胞の収率を上昇させる。複数の実施形態で、流体試料は尿である。複数の実施形態で、塩濃度は約２０ｍＭ〜６００ｍＭに調整される。複数の実施形態で、塩濃度は試料中の１価陽イオンの濃度に基づく。
【００３３】
複数の実施形態で、小胞捕捉材料は、小胞の捕捉を阻害する材料を除去するために前処理される。複数の実施形態で、前処理によってアルブミンが除去される。複数の実施形態で、材料は、加熱、酸浴、塩基性浴、及び超音波洗浄からなる群から選択される方法によって前処理される。
【００３４】
複数の実施形態で、調整は、濃縮された塩及びバッファー溶液で前記流体試料を滴定して約１０ｍＭ〜８００ｍＭの前記塩濃度及び約ｐＨ６〜約ｐＨ９の前記ｐＨに到達させることを含む。
【００３５】
複数の実施形態で、小胞捕捉材料はガラス様材料を含む。複数の実施形態で、小胞捕捉材料は複数の層の材料を含む。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材料の保持率は、直径が約０．６ミクロン〜約１．５ミクロンの小胞で、５０％、７５％、９０％、又は９９％超である。一実施形態では、小胞捕捉材料は、直径が約０．７ミクロン〜約１．６ミクロンのサイズの小胞を捕捉する。一実施形態では、小胞捕捉材料は、サイズ約０．０２０〜約１．０ミクロンのエキソソーム又は他の小胞を捕捉する。
【００３６】
複数の実施形態で、小胞捕捉材料は複数の層の材料を含む。複数の実施形態で、小胞捕捉材料の組合せが用いられる。いくつかの実施形態では、複数のガラス様材料が用いられる。複数の実施形態で、小胞捕捉材料の複数の層は、ガラス繊維の少なくとも第１の層及び第２の層を含む。いくつかの実施形態では、生物学的流体をガラス繊維の第１の層に通して生物学的試料から直径が約１．６ミクロン以上の材料を捕捉する。いくつかの実施形態では、生物学的流体をガラス繊維の第２の層に通して、最小サイズが直径約０．６ミクロン〜約０．８ミクロン、最大サイズが１．６ミクロン未満である小胞を捕捉する。複数
の実施形態で、ガラス様及び非ガラス様材料の組み合わせが使用される。一実施形態では、ニトロセルロースを含む非ガラス様材料をガラス様材料と組み合わせて用いる。
【００３７】
複数の実施形態で、小胞捕捉材料は、捕捉される小胞のプロファイルに合わせるために修飾される。一実施形態では、材料の修飾（例えば、静電気の荷電）の基礎として材料のゼータ電位を用いる。複数の実施形態で、材料は、（そのゼータ電位に基づき）修飾を必要としない。
【００３８】
複数の実施形態で、本命明細書に開示されている方法は、小胞捕捉材料から小胞を溶出することを更に含む。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材料は、小胞捕捉材料の引き寄せる（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）性質と小胞捕捉材料が捕捉小胞を放出する能力とのバランスがとられるように最適化される。いくつかの実施形態では、小胞は、小胞小胞捕捉材料にカオトロピック試薬を通すことにより小胞捕捉材料から溶出される。いくつかの実施形態では、小胞は、小胞捕捉材料に溶解バッファーを通すことにより小胞捕捉材料から溶出される。
【００３９】
複数の実施形態で、小胞捕捉デバイスは、生物学的流体を試料投入領域（ｓａｍｐｌｅ
ｌｏａｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）から小胞捕捉材料を通じて試料受容領域中へと通過させるために、真空源に接続されている。一実施形態では、通過は、デバイスに真空圧を印加することにより達成される。複数の実施形態で、小胞捕捉デバイスは、生物学的流体を試料投入領域から小胞捕捉材料を通じて試料受容領域中へと通すために、陽圧を受け得る。一実施形態では、通過はデバイスに陽圧を印加することにより達成される。複数の実施形態で、デバイスは、生物学的流体を試料投入領域から小胞捕捉材料を通じて試料受容領域中へと通すために、遠心機中に置かれ得る。一実施形態では、通過はデバイスの低速遠心により達成される。いくつかの実施形態では、試料受容領域への生物学的流体の通過は吸上げ型（ｗｉｃｋｉｎｇ−ｔｙｐｅ）材料により達成される。複数の実施形態で、小胞捕捉デバイスはマルチウェルプレートフォーマットで構成される。
【００４０】
本明細書は更に、バイオマーカーを単離するための方法であって、生物学的流体を小胞捕捉材料に通すことにより生物学的流体から少なくとも１つのバイオマーカーを含む小胞を単離すること、小胞捕捉材料から非小胞材料を除去すること、及び溶解バッファーで小胞捕捉材料中又は上の小胞を溶解することにより小胞からバイオマーカーを単離することを含む方法を提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、エキソソーム、小胞、他の循環膜結合核酸及び／又はタンパク質含有構造、並びに炭水化物からなる群から選択される。複数の実施形態で、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｖＲＮＡからなる群から選択される種類のものである。
【００４２】
いくつかの実施形態は、生物学的流体から小胞を回収するためのデバイスであって、デバイスが、（１）少なくとも１つの試料投入領域；（２）少なくとも１つの対応する小胞捕捉材料、及び（３）少なくとも１つの対応する試料受容領域を含み、生物学的流体を試料投入領域から小胞捕捉材料を通して試料受容領域へと通すことにより小胞捕捉材料上又は中の生物学的流体内の小胞が捕捉される、デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材料は、プラスチック又はガラスのような、原子規模で秩序のない又は「アモルファス」な構造を有するガラス様材料を含む。ガラス様材料としては、限定されるものではないが、ガラスのビーズ又は繊維、シリカビーズ（又は他の立体構造）、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）又は他の同様なポリマー、金属又はナノ金属繊維、ポリスチレン、エチレン酢酸ビニル又は他のコポリマー、天然繊維（例えば、絹）、アルギン酸繊維、又はこれらの組み合わせが含まれる。特定の実施形態で
は、小胞捕捉材料は、所望に応じて、複数層の小胞捕捉材料を含んでよい。別の実施形態では、小胞捕捉材料は更にニトロセルロースを含む。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材料は約５０〜約１００ナノメートルのサイズのエキソソームを捕捉する。
【００４３】
いくつかの実施形態は、生物学的流体から小胞を単離する方法であって、（１）小胞を含む生物学的試料を得る工程；（２）小胞捕捉デバイスの試料投入領域に生物学的試料の少なくとも一部を投入する工程；（３）生物学的試料を試料投入領域から小胞捕捉デバイス中の小胞捕捉材料に通す工程；及び（４）生物学的試料を小胞捕捉材料から試料受容領域へと通す工程であって、生物学的試料の通過により、小胞捕捉材料上又は中の生物学的流体内の小胞が捕捉される工程、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、小胞捕捉材料から小胞を溶出する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡを含む小胞を捕捉、濃縮、及び／又は凝縮する工程；デバイスから非小胞材料を除去する工程；及び溶解バッファーで小胞捕捉材料中又は上の小胞を溶解することにより小胞関連ＲＮＡを小胞から単離する工程、を更に含む。
【００４４】
上記に要約し、以下に更に詳細に記載する方法は、実施者によってとられる特定の行為を説明しているが、これらは別の団体によるそれらの行為の指示も含むと理解されるべきである。したがって、「血液検査を行う」等の行為は「血液検査の実施を指示する」を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、本明細書に開示されている捕捉デバイスの一実施形態の断面図である。
【図２】本明細書に開示されている第１中空ボディーの一実施形態の断面図である。
【図３】本明細書に開示されている第２中空ボディーの一実施形態の断面図である。
【図４】本明細書に開示されている第２中空ボディーの更なる実施形態の断面図である。
【図５】本明細書に開示されている微小胞捕捉システムの断面図である。
【図６】尿試料の塩及びｐＨを調整した後のエキソソーム捕捉効率に関するデータを示す図である。
【図７】超遠心に基づく単離と比較した、本明細書に開示されているデバイスを用いたエキソソーム捕捉の有効性に関するデータを示す図である。
【図８】超遠心に基づく単離と比較した、本明細書に開示されているデバイスがエキソソームの捕捉に用いられた場合のアッセイ内変動に関するデータを示す図である。
【図９】超遠心に基づく単離と比較した、本明細書に開示されているデバイスを用いたエキソソーム捕捉後に検出されたＲＮＡプロファイルの比較を示す図である。
【図１０】（Ａ）超遠心に基づく単離と比較した、本明細書に開示されているデバイスを用いたエキソソームの捕捉後に分析した場合の、１２時間尿試料から検出された同様なＲＮＡプロファイルに関するデータを示す図である。（Ｂ）本明細書に開示されているデバイスを用いてエキソソームを再捕捉した場合の２週間にわたるＲＮＡ検出の一貫性に関するデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
概要
細胞外環境中では核酸分解の速度が速いため、従来の理解では、検出のための鋳型として使用できる前に核酸が分解されるので、多くの組織は診断標的として好適な核酸を提供できないことが示唆される。しかし、細胞外ＲＮＡ（及び本明細書に開示されている他のバイオマーカー）はしばしば、１又は複数の異なる種類の膜粒子（サイズ５０〜８０ｎｍ）、エキソソーム（サイズ５０〜１００ｎｍ）、エキソソーム様小胞（サイズ２０〜５０ｎｍ）、及び微小胞（サイズ１００〜１０００ｎｍ）に結合している。他の小胞タイプ、
限定されるものではないが、例えばナノ小胞、小胞、デキソソーム（ｄｅｘｏｓｏｍｅ）、ブレブ（ｂｌｅｂ）、プロスタソーム（ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅ）、微粒子、腔内小胞（ｉｎｔｒａｌｕｍｅｎａｌ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、エンドソーム様小胞、又はエキソサイトーシスにより放出される媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）も捕捉され得る。本発明において、「エキソソーム」及び「小胞」という用語は、この分野でのそれぞれの通常の意味に従って使用され、原形質膜又は内膜のいずれかに由来する任意の脱落した膜結合粒子を含むとも解釈されなければならない。疑義がないように、様々な種類の小胞を記述する用語は、特に断りのない限り、小胞又はエキソソームとして一般的に言及される。エキソソームは更に、エキソソーム内腔に含まれる分子（例えば、限定されるものではないが、腫瘍由来マイクロＲＮＡ又は細胞内タンパク質）と共に腫瘍由来タンパク質に選択的に結合する宿主循環に由来する表面結合分子等の腫瘍起源の種々の膜結合タンパク質を含む任意の細胞内膜に囲まれた小胞構造の搬出により生じる又は原形質膜の一部の脱出性膨出（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ  ｅｖａｇｉｎａｔｉｏｎ）（例えば、ブレブ形成）分離及び封止（ｓｅａｌｉｎｇ）により生じる、脂質二重層膜によって囲まれた細胞由来構造を含み得る。エキソソームは膜フラグメントも含み得る。本明細書中、循環腫瘍由来エキソソーム（ＣＴＥ）とは、腫瘍細胞から循環又は体液中に脱落したエキソソームである。ＣＴＥは通常、起始細胞（ｃｅｌｌ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ）特異的エキソソーム同様、高度に特異的に体液からのそれらの単離を可能にする固有のバイオマーカーを有する。本明細書に開示されている複数の実施形態により達成されるように、そのような種類の小胞のいずれかの選択的単離は、多くの疾患の診断又は予後に有用であり得るそれらのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ）の単離及び分析を可能にする。したがって、エキソソーム及び微小胞（ＥＭＶ）は、疾患のバイオマーカーを提供することができる（例えば、限定されるものではないが、腎疾患を評価するための尿由来小胞の単離）。本明細書に開示のデバイス及び方法を用いて抽出できる標的化合物としては、タンパク質、脂質、抗体、ビタミン、ミネラル、ステロイド、ホルモン、コレステロール、アミノ酸、小胞、エキソソーム、及び核酸が含まれる。
【００４７】
複数の実施形態で、生物学的流体試料が処理される。本発明において、「体液」とは、その通常の意味を有するものとし、対象の体から採取された流体の試料、例えば、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、尿、痰、髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、気道、腸管、及び泌尿生殖路の流体、涙液、唾液、母乳、リンパ系に由来する流体、精液、脳脊髄液、器官系内液（ｉｎｔｒａ−ｏｒｇａｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｌｕｉｄ）、腹水、腫瘍嚢胞液（ｔｕｍｏｒ  ｃｙｓｔ  ｆｌｕｉｄ）、羊水、及びこれらの組み合わせも指すものとする。
【００４８】
複数の実施形態で、流体から目的の標的を捕捉するように構成されたシステムを用いて生物学的流体試料が処理される。一般的に、システムの複数の実施形態は、第１容積部を有する第１流体区画を含み、第１区画は、物質（ａｇｅｎｔ）捕捉材料を含む第２流体区画と可逆的に相互接続するように構成され、第１及び第２区画はどちらも、外部筐体内に適合するような寸法である。複数の実施形態で、外部筐体が溶出物（例えば、目的の標的を枯渇させた生物学的試料）を受容するように機能する。
【００４９】
複数の実施形態で、システムは、流体試料中に低濃度で存在する目的の物質（ａｇｅｎｔ）の高度な濃縮を可能にする点で特に利点がある。
【００５０】
本開示の一態様は、生物学的流体からエキソソーム、小胞、並びに他の循環膜結合核酸及び／又はタンパク質含有構造を捕捉する効率が増大したデバイス及び方法に関する。これらのデバイス及び方法は、個々の試料が種々の特性を有する場合にも有利に用いることができる。捕捉されたエキソソーム、小胞、並びに他の循環膜結合核酸及び／又はタンパク質含有構造は、種々の診断、予後、並びに治療的及び他の医学的に関連する方法及び使
用に用いることができる種々の異なる特異的バイオマーカーを含み得る。
【００５１】
図１は、捕捉デバイス１００の一実施形態を示す図である。図１に示されている捕捉デバイス１００の実施形態は、第２中空ボディー２と機能的に連通する第１中空ボディー１を含む。「機能的連通（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ」とは、その通常の意味を有するものとし、デバイスの意図される使用を行うことが可能なように連結されている２個の中空ボディーも指すものとする。直接的及び間接的な接続が「機能的コミュニケーション」の意味の範囲に含まれる。
【００５２】
複数の実施形態で、流体試料３を第１中空ボディー１に投入し、第２中空ボディー２へと通過させる。複数の実施形態で、流体試料３を捕捉材料４に通す。流体試料３は標的成分を含み得る。いくつかの実施形態では、流体試料３が捕捉材料４を通過する際、捕捉材料４は流体試料３に含まれる標的成分の少なくとも一部を保持する。いくつかの実施形態では、標的成分は少なくとも１つのエキソソームを含むが、単離又は精製が望ましい他の成分も標的成分と見なされ得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、捕捉材料４は第２中空ボディー２内に位置する。複数の実施形態で、流体試料３が捕捉材料４を通過した後、第２中空ボディー２を第１中空ボディー１から取り外し、その後、第２中空ボディー２を処理して捕捉材料４中に保持されている標的成分を回収する。少なくとも１つ実施形態で、捕捉材料４に保持されたエキソソームは、その後、少量の液体（例えば、溶解バッファー）を捕捉材料４に通すことにより捕捉材料４から回収される。いくつかの実施形態では、別の溶液（例えば、洗浄バッファー）を、所望に応じて、保持されたエキソソームの回収に使用される液体を加える前及び／又は後に捕捉材料４に通す。
【００５４】
いくつかの実施形態では、重力により、流体試料３を捕捉材料４に通す。いくつかの実施形態では、陽圧により、流体試料３を捕捉材料４に通す。いくつかの実施形態では、陰圧により、流体試料３を捕捉材料４に通す。複数の実施形態では、陰又は陽圧を用いない。いくつかの実施形態では、遠心力により、流体試料３を捕捉材料４に通す。いくつかの実施形態では、吸上げ型材料により、流体試料３を捕捉材料４に通す。いくつかの実施形態では、毛管作用により、流体試料３を捕捉材料４に通す。
【００５５】
流体試料３は体液を初めとする任意の液体であり得る。「体液」とは、その通常の意味を有するものとし、対象の体のどこかから単離された流体の試料、例えば、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、尿、痰、髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液；気道、腸管、及び泌尿生殖路の流体；涙液、唾液、母乳、リンパ系に由来する流体、精液、脳脊髄液、器官系内液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、及びこれらの組み合わせも指すものとする。
【００５６】
図２は、第１中空ボディー１の一実施形態を示す図である。複数の実施形態で、第１中空ボディー１は、入口開口部１０１、出口開口部１０２、外側表面１３０、及び内側表面１４０を有する。いくつかの実施形態では、入口開口部１０１は、入口直径１１１を有する円形開口部である。いくつかの実施形態では、出口開口部１０２は、出口直径１１２を有する円形開口部である。複数の実施形態で、入口開口部１０１及び出口開口部１０２は、軸方向に揃った（ａｘｉａｌｌｙ−ａｌｉｇｎｅｄ）円形開口部であり、出口直径１１２が入口直径１１１より小さい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１は、上部領域１３２、中間領域１３４、及び末端領域１３６を含む。いくつかの実施形態では、上部領域１３２及び末端領域１３６は、円柱状又は略円柱状であり、中間領域１３４はテーパーがつけられている（例えば
、円錐形）。いくつかの実施形態では、中間領域１３４のテーパーは、流体試料３による出口開口部１０２の通過を容易化するように構成されている。いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１は、第１中空ボディー１の隣接部分の外側表面１３０を超えて延びるつば１０５を含む。いくつかの実施形態では、つば１０５は、第１中空ボディー１が保存ラック又は受容容器（図示せず）に挿入された時に第１中空ボディー１を支持するように構成されている。
【００５８】
図３は、第２中空ボディー２の一実施形態を示す図である。複数の実施形態で、第２中空ボディー２は入口開口部２０１、出口開口部２０２、外側表面２３０、及び内側表面２４０を有する。いくつかの実施形態では、入口開口部２０１は、入口直径２１１を有する円形開口部である。いくつかの実施形態では、出口開口部２０２は、出口直径２１２を有する円形開口部である。複数の実施形態で、入口開口部２０１及び出口開口部２０２は、軸方向に揃った円形開口部であり、出口直径２１２が入口直径２１１より小さい。
【００５９】
複数の実施形態で、第１中空ボディー１及び第２中空ボディー２は、核酸に対する結合親和性が低い材料でできている。好適な材料としては、限定されるものではないが、とりわけ、ポリプロピレン、ポリスチレン、及びポリエチレン等のプラスチックが含まれる。いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１及び第２中空ボディー２は、金属又は複合材料でできている。いくつかの実施形態では、内側表面１４０、２４０は、核酸に対する表面の結合親和性を低下させる１又は複数の物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）でコーティングされている。
【００６０】
いくつかの実施形態では、第２中空ボディー２は、上部領域２３２、中間領域２３４、及び末端領域２３６を含む。いくつかの実施形態では、末端領域２３６はテーパーがつけられている。少なくとも１つの実施形態で、末端領域２３６のテーパーは、第２中空ボディー２から出る流体試料３の通過を容易化するように構成されている。
【００６１】
複数の実施形態で、第２中空ボディー２は、外側表面２３０から延びるタブ２６０を有する。いくつかの実施形態では、タブ２６０は上部領域２３２に位置する。タブ２６０は上側表面２６２を有する。いくつかの実施形態では、上側表面２６２は、入口開口部２０１とほぼ同一平面上にある。複数の実施形態で、上側表面２６２は、第２中空ボディー２をラベリングするためのプラットフォームとして機能するのに充分な寸法である。少なくとも１つの実施形態で、上側表面２６２は、幅が約１ｍｍ〜約５ｍｍ、長さが約１ｍｍ〜約５ｍｍである。いくつかの実施形態では、ラベル２６４が上側表面２６２に固定されている。複数の実施形態で、上側表面２６２は、エッチング又はインクを含む任意の好適な手段により印がつけられる。少なくとも１つ実施形態で、ラベル２６４又は上側表面２６２の印は、第２中空ボディー２を通過させた流体試料３のアイデンティティー（例えば、供給源患者）を表示する。いくつかの実施形態では、ラベル２６４又は上側表面２６２の印はバーコード（例えば、２Ｄ又は３Ｄバーコード）をコードする。複数の実施形態では、試料が得られた患者のアイデンティティーを表示するためにＲＦＩＤタグ又は他の識別子（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）が用いられ得る。
【００６２】
複数の実施形態で、第２中空ボディー２の上部領域２３２は、第１中空ボディー１の末端領域１３６と機能的に連通するように構成されている。第１中空ボディー１及び第２ボディー２は、任意の数の方法、例えば、限定されるものではないが、噛み合うねじ山、締まりばめ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｉｔ）、及び圧入（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｉｔｔｉｎｇ）により機能的に連通し得る。いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１の末端領域１３６は、第２中空ボディー２の上部領域２３２の内側に適合するように構成されている。いくつかの実施形態では、第２中空ボディー２の上部領域２３２は、第１中空ボディー１の末端領域１３６の内側に適合するように構成されている。いくつかの
実施形態では、外側表面１３０の少なくとも一部は、内側表面２４０の少なくとも一部に包囲されている。いくつかの実施形態では、外側表面２３０の少なくとも一部は、内側表面１４０の少なくとも一部に包囲されている。いくつかの実施形態では、出口直径１１２は入口直径２１１より小さい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１は、末端領域１３６の外側表面１３０から突出する少なくとも１つのピン１５０を有し、第２中空ボディー２は、第２中空ボディー２の上部領域２３２中に少なくとも１つのチャンネル２５０を有する（例えば、図３参照）。少なくとも１つの実施形態で、ピン１５０は、チャンネル２５０と可逆的に協同するように構成されている。チャンネル２５０は、長手部分２５２、横断（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ）部分２５４、及び逆行部分２５６を有する。いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１は、ピン１５０をチャンネル２５０の長手部分２５２にスライドさせることにより第２中空ボディー２に連結される。第１中空ボディー１及び第２中空ボディー２は、ピン１５０がチャンネル２５０の横断部分２５４に到達できるように配置される。その後、第２中空ボディー２を回転させて、ピン１５０がチャンネル２５０の逆行部分２５６と並ぶまで、ピン１５０を横断部分２５４中に持ってくる。その後、第１中空ボディー１と第２中空ボディー２の間の圧縮力を減らして、ピン１５０が逆行部分２５６中にスライドできるようにすることにより、第１中空ボディー１及び第２中空ボディー２の連結を確実にする。いくつかの実施形態では、第２中空ボディー２は、２つの中空ボディー同士を締め付けて（ｓｑｕｅｅｚｅ）、ピン１５０がチャンネル２５０を戻ることができるようにすることで、第１中空ボディー１から取り外される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、第２中空ボディー２の上部領域２３２中の少なくとも１つのチャンネル２５０は長手部分２５２及び横断部分２５４を含む。いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１は、ピン１５０をチャンネル２５０の長手部分２５２中にスライドさせることにより第２中空ボディー２に連結される。第１中空ボディー１及び第２中空ボディー２は、ピン１５０がチャンネル２５０の横断部分２５４に達することができるように配置される。その後、第２中空ボディー２を回転させてピン１５０を横断部分２５４中に持ってくることにより、第１中空ボディー１と第２中空ボディー２との間の連結を確実にする。処理後、２つの中空ボディーを反対方向に回転させて、ピン１５０がチャンネル２５０を戻ることができるようにすることにより第１及び第２中空ボディーを係合解除（ｄｉｓｅｎｇａｇｅ）できるようにすることで、第２中空ボディー２を第１中空ボディー１から取り外す。複数の実施形態で、第１及び第２中空ボディーは、第２中空ボディーが第１中空ボディーの内部を再度通過することを必要とせずにそれらの分離が可能なように、可逆的に相互作用するように構成される。すなわち、特定のデバイスは、第２中空ボディーが第１中空ボディー中に（及び部分的に通過して）挿入されている（例えば、第２ボディーが第１ボディーの内側に重なっている）おかげで第１及び第２ボディーの相互作用が可能になっていてよい。これにはいくつかの利点がある（例えば、遠心及び他の取り扱い中の相互作用の確実性）が、第２中空ボディーが第１中空ボディー中のその経路（例えば、上向きの経路）を戻ることがそれら２つの係合解除に必要となる。これは相互汚染に関する潜在的問題を提示する。有利には、複数の実施形態で、本明細書に開示されているデバイスの第２中空ボディーは、第２中空ボディーに第１中空ボディーを通過させる必要なく、第１中空ボディーから分離させることができる。複数の実施形態で、これは第２中空ボディーの汚染のリスクを大幅に低減するが、２つのボディー間の可逆的相互作用は遠心（又は他の取り扱い）中の確実な相互作用を維持するのに充分である。
【００６５】
複数の実施形態で、捕捉材料４は、流体試料３から抽出されている標的成分を保持できる任意の好適な材料でできている。複数の実施形態で、捕捉材料４に用いられる材料は、標的成分に対する材料の引きつける性質と適切な条件下で材料が標的成分を放出する能力とのバランスがとられるように最適化される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、捕捉材料４は、所望に応じて、捕捉材料４に保持される標的成分のプロファイルに合わせるために修飾される。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は荷電（例えば、静電気的に荷電）されるか、親水性又は疎水性材料でコーティングされるか、化学的に修飾されるか、及び／又は生物学的に修飾される。複数の実施形態で、捕捉材料４のゼータ電位が材料の修飾（例えば、静電気的荷電）の基礎として用いられる。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は（そのゼータ電位に基づき）修飾を必要としない。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は、捕捉材料４の表面にヌクレオチド配列を付着させることにより修飾される。いくつかの実施形態では、タンパク質を捕捉材料４の表面に付着させる。いくつかの実施形態では、ビオチン又はストレプトアビジンを捕捉材料４の表面に付着させる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片を捕捉材料４に付着させる。そのような実施形態はいずれも、標的の捕捉効率を有利に増大させるために用いることができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、タンパク質マーカーの表面発現及びそのマーカーを同定する捕捉材料４上の相補的物質（ａｇｅｎｔ）（例えば、特定の小胞上の抗原を認識する抗体）に基づいて、小胞の差別捕捉（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃａｐｔｕｒｅ）が達成される。いくつかの実施形態では、マーカーは固有の小胞タンパク質又はペプチドである。いくつかの疾患状態では、マーカーは更に、特定の小胞修飾を含み得、それらは、いくつかの実施形態では、特定の小胞の単離に用いられる。そのような実施形態では、捕捉材料４は、小胞修飾の特異的認識ができるように構成され得る。小胞の修飾は、限定されるものではないが、脂質、炭水化物、及び他の分子の付加、例えばアシル化、ホルミル化、リポイル化、ミリストリル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌｙｌａｔｅｄ）、パルミトイル化、アルキル化、メチル化、イソプレニル化、プレニル化、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、アデニル化、ホスホリル化、硫化、及びセレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｅｄ）、ユビキチン化を含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は、脂質、炭水化物、核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ等の非タンパク質を含む小胞マーカーを認識するように構成されている。
【００６８】
いくつかの実施形態では、小胞と捕捉材料４との間の相互作用は、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、又はこれらの相互作用の組み合わせに基づく。したがって、小胞を含む試料の生化学的構成は、おそらくは捕捉効率を有意に妨害する程度に、これらの力を変化させ得る。
【００６９】
複数の実施形態で、捕捉材料を通過する時に小胞が曝される捕捉条件の標的範囲は、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの１価陽イオン（例えば、ナトリウム及び／又はカリウム）、例えば下側の濃度が約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、又は約１００ｍｍ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ（及びその間の任意の濃度）であり、上側の濃度が約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、及び約９００ｍＭ（及びその間の任意の濃度）である範囲を含む。したがって、複数の実施形態で、濃度範囲は、約２０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７００ｍＭ、及び約４０ｍＭ〜約６００ｍＭ、及びその重複する範囲である。それらの条件と組み合わせて、ｐＨは複数の実施形態で約４、約５、又は約６〜約９又は約１０（又は記載されているｐＨ値間のｐＨ値）に調整される。したがって、実施形態に応じて、ｐＨ範囲は約４〜約１０、約５〜約９、及び約６〜約９を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、捕捉材料４に用いられる材料は、小胞の捕捉を阻害する材料を含む。したがって、複数の実施形態で、捕捉材料４は、小胞の捕捉に捕捉材料を用いる
前にそのような阻害性材料が除去されるように前処理される。例えば、高濃度のアルブミン等のタンパク質は、小胞捕捉の捕捉効率を低下させ得る。そのような場合、例えば、アルブミンへの親和性が捕捉材料４へのアルブミンの親和性より大きな化合物（例えば、Ｂｌｕｅ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ樹脂）を含む材料又は溶液を捕捉材料４に通過させる等の種々の技術によってアルブミンが除去され得る。混入物を除去するために用いられる技術としては、加熱、酸浴、塩基性浴、超音波洗浄等も含まれ得る。
【００７１】
複数の実施形態で、小胞の捕捉を試みる前に、流体試料３の生化学的特性を好ましい範囲（例えば、塩濃度、ｐＨ等）に調整することが有利である。複数の実施形態で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はＨＥＰＥＳバッファー等のバッファー溶液が用いられる。複数の実施形態で、そのようなバッファーのｐＨは約６〜約９である。複数の実施形態で、ナトリウム及びカリウム等の１価陽イオンの濃度は、約５０ｍＭ超、約６０ｍＭ超、約７０ｍＭ超、約８０ｍＭ超、約９０ｍＭ超、約１００ｍＭ超、約２００ｍＭ超であり、場合によっては、実施形態に応じて、更に高い濃度が必要となり得る。複数の実施形態で、尿及びバッファー溶液の混合物の最終結果は、約２０ｍＭ〜約６００ｍＭのナトリウム及びカリウム等の１価陽イオン及び約ｐＨ６〜約ｐＨ９である。その後、以下により詳細に説明されるように小胞の捕捉を行うことができ、以下に記載されているように分析を行うことができる。
【００７２】
複数の実施形態で、捕捉材料４はガラス様材料でできている。いくつかの実施形態では、捕捉デバイス１００は、流体試料３が捕捉材料４を通過する前に流体試料３をろ過するように構成されたフィルター材料５（図２に図示）を含む。いくつかの実施形態では、フィルター材料５は、第２中空ボディー２中の捕捉材料４と入口開口部２０１との間に配置される。いくつかの実施形態では、フィルター材料５は、第１中空ボディー１中の中間領域１３６と出口開口部１０２との間に配置される。しかし、複数の実施形態では、フィルター材料を用いない。
【００７３】
複数の実施形態で、フィルター材料５及び捕捉材料４の組合せが用いられる。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は複数層の材料を含む。複数の実施形態で、捕捉材料４はガラス繊維の少なくとも第１の層及び第２の層を含む。いくつかの実施形態では、直径約１．６ミクロン以上の成分を捕捉するために流体試料３をフィルター材料５に通す。いくつかの実施形態では、直径約０．６ミクロン〜約０．８ミクロンの最小サイズ及び約１．６ミクロン未満の最大サイズを有する小胞が捕捉されるように流体試料３を捕捉材料４に通す。複数の実施形態で、捕捉材料４の保持率は、直径が約０．６ミクロン〜約１．５ミクロンの小胞で約５０％、約７５％、約９０％、又は約９９％超である。少なくとも１つの実施形態で、捕捉材料４は、直径約０．７ミクロン〜約１．６ミクロンのサイズの小胞を捕捉する。少なくとも１つの実施形態で、捕捉材料４は、サイズが約０．０２０ミクロン〜約１．０ミクロンのエキソソーム又は他の小胞を捕捉する。
【００７４】
複数の実施形態で、捕捉材料４は、ガラス様及び非ガラス様材料の組み合わせを含む。例えば、一実施形態では、ニトロセルロースを含む非ガラス様材料が用いられる。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は、プラスチック又はガラス等の、原子規模で秩序のない又は「アモルファス」な構造を有するガラス様材料を含む。ガラス様材料としては、限定されるものではないが、ガラスのビーズ又は線維、シリカビーズ（又は他の立体構造）、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）又は他の同様なポリマー、金属又はナノ金属繊維、ポリスチレン、エチレン酢酸ビニル又は他のコポリマー、天然繊維（例えば、絹）、アルギン酸繊維、又はこれらの組合せが含まれる。捕捉材料４に好適なその他の材料としては、ゼオライト、金属酸化物又は混合金属酸化物、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム、酸化ジルコニウム、又はこれらの組合せが含まれる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、捕捉材料４のスペースを小胞が通過できない物理的寸法を小胞が有するため、小胞が捕捉材料４中に保持される（例えば、サイズに基づく物理的保持）。いくつかの実施形態では、小胞と捕捉材料４との間の結合力により小胞が捕捉材料４中に保持される。いくつかの実施形態では、小胞が捕捉材料４と抗原−抗体結合を形成する。複数の実施形態で、小胞が捕捉材料４と水素結合を形成する。いくつかの実施形態では、ファンデルワールス力が小胞と捕捉材料４との間で形成される。いくつかの実施形態では、小胞のヌクレオチド配列が捕捉材料４に付着しているヌクレオチド配列に結合する。
【００７６】
複数の実施形態で、捕捉デバイス１００は、流体試料３が捕捉デバイス１００を通過した後に流体試料３を受容区画６００中に受容する受容容器５００（図５参照）と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、受容容器は、処理中に捕捉デバイス１００を受容容器５００内に固定するために、キャップ７００を更に含む。複数の実施形態で、キャップは圧入キャップ（ｐｒｅｓｓ−ｆｉｔ  ｃａｐ）であり、別の実施形態では、キャップはねじ込みキャップ（ｓｃｒｅｗ−ｆｉｔ  ｃａｐ）を含む。複数の実施形態で、受容容器は遠心チューブを含み、したがって、いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１及び第２中空ボディー２は、受容容器／遠心チューブ内に適合するようなサイズである。いくつかの実施形態では、つば１０５が、受容容器に対して固定された位置に捕捉デバイス１００を保持する手段として機能する。複数の実施形態で、捕捉デバイス１００及びつば１０５は、１０ｍＬ、１２ｍＬ、１５ｍＬ、３０ｍＬ、５０ｍＬ、１７５ｍＬ、又は２２５ｍＬ遠心チューブ等の受容容器との捕捉デバイス１００の使用を可能にするようなサイズであるが、他のサイズ及び容量の遠心チューブも想定される。いくつかのそのような実施形態では、つば１０５は、遠心チューブのねじ蓋（ｔｈｒｅａｄｅｄ  ｃａｐ）の機能を妨害せずに遠心チューブの口の上に適合するようなサイズである。複数の実施形態で、捕捉デバイス１００は遠心チューブ内に配置され、流体試料３を第１中空ボディーから捕捉材料４を通って第２中空ボディーへと動かすために遠心力が印加される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、捕捉デバイス１００は、流体試料３が捕捉デバイス１００を通過して受容容器中に蓄積された後に第２中空ボディー２の出口開口部２０２が流体試料３に接触しないようなサイズである。いくつかの実施形態では、受容容器の容積容量（ｖｏｌｕｍｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ）は、捕捉デバイス１００の容積容量より約２倍、約３倍、約４倍、又は約５倍大きい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、捕捉デバイス１００は、流体試料３及び捕捉材料４への核酸の結合を容易化するための他の試薬の全体を受容するのに充分な容積である。いくつかの実施形態では、捕捉デバイス１００は、約１ｍＬ〜１０００ｍＬの容積、例えば約１ｍＬ〜１００ｍＬ、約５ｍＬ〜５０ｍＬ、約１０ｍＬ〜２０ｍＬ、及びそれらの範囲間の任意の容積を収容するサイズである。いくつかの実施形態では、捕捉デバイス１００は約１５ｍＬの容積を収容する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１の容量は第２ボディー２の容量より、約１００倍、又は約５０倍、又は約２０倍、又は約１０倍、又は約５倍大きい。いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１の容量は第２中空ボディー２の容量とほぼ同じである。
【００８０】
多くの実施形態で、捕捉材料４の寸法は、試料３から標的を適切に捕捉するのに充分な捕捉材料４を有することと少量の液体（例えば、マイクロリットル規模）を用いて結合した標的成分を溶出できることとのバランスがとられるように最適化されている。回収液の容積を小さくすることにより、特定の有利な実施形態では、標的成分を高濃度で抽出することが可能になる。いくつかの実施形態では、捕捉デバイス１００の容積は、捕捉材料４
の容積より約１０００倍、約５００倍、約３００倍、又は約１００倍大きい。捕捉材料４の材料が隙間空間（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｓｐａｃｅ）を含む実施形態では、「捕捉材料４の容積」という語句の意味は、これらの隙間空間の容積を含むと解釈されるべきである。複数の実施形態で、溶出容積は、約５〜約５００マイクロリットル、例えば約５マイクロリットル〜約１０マイクロリットル、約１０マイクロリットル〜約２０マイクロリットル、約２０マイクロリットル〜約５０マイクロリットル、約５０マイクロリットル〜約１００マイクロリットル、約１００マイクロリットル〜約１５０マイクロリットル、約１５０マイクロリットル〜約２００マイクロリットル、約２００マイクロリットル〜約３００マイクロリットル、約３００マイクロリットル〜約４００マイクロリットル、約４００マイクロリットル〜約５００マイクロリットル、及びこれらの間の重複する範囲である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、捕捉材料４は立方状である。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は、ウェーハ（ｗａｆｅｒ）状、球状、又はその何らかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、捕捉材料４の表面積と厚さの比は約５０：１、約２５：１、約１０：１、約５：１、又は約３：１である。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は、直径と長さの割当てが約２０：１、約１０：１、約５：１、又は約２：１の円柱状ウェーハである。少なくとも１つの実施形態では、捕捉材料４は円柱状であり、直径約９ｍｍ、厚さ約１ｍｍである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、陽圧の印加により、流体試料をデバイスに通す。例えば、いくつかの実施形態では、第１中空ボディー１は、第２中空ボディーに向かって押し下げられた時に流体試料３を捕捉デバイス１００に通す陽圧を与えるピストン（ｓｙｒｉｎｇｅ
ｐｌｕｎｇｅｒ）を受容するように構成されている。いくつかの実施形態では、陰圧の印加により流体試料をデバイスに通す。例えば、いくつかの実施形態では、第２中空ボディーは、バキュームマニホールド等の真空源に可逆的に接続されるようになっており、これにより、流体試料３を捕捉デバイス１００に通す陰圧を印加することができる。受容容器を用いるいくつかの実施形態では、受容容器は、捕捉デバイスに陰（又は実施形態に応じて陽）圧が印加されるように構成されており、これにより、流体試料を捕捉デバイスに通すことができる。しかし、複数の実施形態では、特別な陽又は陰圧が印加されない。例えば、複数の実施形態で、流体試料３を捕捉デバイス１００に通すために遠心力が印加される。複数の実施形態では、重力流（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ  ｆｌｏｗ）も用いられ得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、第２中空ボディー２の末端領域２３６は、標準的マルチウェルプレートのウェル内に適合するようなサイズである。複数の実施形態で、末端領域２３６は、標準的な６ウェルプレート、又は標準的な１２ウェルプレート、又は標準的な２４ウェルプレート、又は標準的な９６ウェルプレート、又は標準的な３８４ウェルプレート、又は標準的な１５３６ウェルプレートのウェル内に適合するようなサイズである。そのようなプレートは様々な製造業者、例えば、限定されるものではないがコーニング社、Ｎｕｎｃ社、フィッシャー社、ＢＤバイオサイエンス社等から市販されている。複数の実施形態で、プレートは表１に示すウェル寸法を有する。
【００８４】
【表１】
2018082715.tif 000003
【００８５】
いくつかの実施形態では、第２中空ボディー２のタブ２６０は、第２中空ボディー２がマルチウェルプレートの第１ウェルと相互作用する時、マルチウェルプレートの隣接するウェルの少なくとも一部の上に延びている。少なくとも１つの実施形態で、タブ２６０は、タブ２６０が互いに重なることなく第２中空ボディー２により一度にマルチウェルプレートのウェルの半分が占められるように構成されている。いくつかの実施形態では、第２中空ボディー２は、マルチウェルプレートのウェルの壁と相互作用して第２中空ボディー２をマルチウェルプレートのウェルに固定する突出部２７０を有する。複数の実施形態で、タブ２６０は、マルチウェルプレートの各ウェルを試料の受容に用いることができるような寸法である。
【００８６】
複数の実施形態で、バイオマーカーを単離する方法は、患者から流体試料３を採取する工程、流体試料３を捕捉材料４に通す工程；捕捉材料４から非小胞材料を除去する工程、及び捕捉材料４中又は上の小胞を溶解バッファーで溶解することにより小胞からバイオマーカーを単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、及び炭水化物からなる群から選択される。複数の実施形態で、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｖＲＮＡからなる群から選択される種類のものである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、捕捉デバイス１００は遠心チューブ内に配置され、つば１０５が、遠心チューブを基準として固定された位置に捕捉デバイス１００を保持する。捕捉デバイス１００を遠心チューブ内に配置する前又は後に捕捉デバイス１００に流体試料３を投入する。捕捉デバイス１００を遠心にかける。遠心チューブは、受容容器として機能し、流体試料３が捕捉デバイス１００を通過した後にこれを受容する。いくつかの実施形態では、低速遠心を用いて流体試料３を捕捉デバイス１００に通す。
【００８８】
いくつかの実施形態では、流体試料３から標的成分を抽出するためのキットが提供される。キットは多くの場合、より良い品質管理及びより一貫性のある結果を可能にする。いくつかの実施形態では、キットは、捕捉デバイス１００及び本明細書に開示されている方法の実施に有用な付加的物品を含む。いくつかの実施形態では、キットは、溶解バッファー、カオトロピック試薬、洗浄バッファー、アルコール、界面活性剤、又はその組合せからなる群から選択される試薬を含む。いくつかの実施形態では、キットの試薬は、個々に又は保存容器に入れて提供される。複数の実施形態で、キットの試薬は使用準備済みで提供される。いくつかの実施形態では、キットの試薬は、使用前に希釈される貯蔵液の形態で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示されている方法の実施に有用なプラスチック製部品を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ラック、遠
心チューブ、バキュームマニホールド、及びマルチウェルプレートからなる群から選択されるプラスチック製部品を含む。複数の実施形態では、使用説明書も提供される。
【実施例】
【００８９】
実施例１−エキソソーム捕捉へのｐＨ／塩濃度の影響
エキソソーム捕捉の有効性に関して、生物学的試料の種々の特性の影響を評価した。４名の健康ドナーから採取した尿試料を８００×ｇで１５分間遠心し、上清を回収した。処理前に、各対象から得た４．５ｍＬの尿上清を種々の容積の濃縮バッファー溶液と混合した。本明細書に開示されている回収デバイスで試料を処理した。簡潔に述べると、第２ボディーに接続した第１ボディーに試料を添加した。第１及び第２ボディーを５０ｍＬの円錐形遠心チューブ（受容容器）の内側に配置し、２，０００×ｇで１０分間遠心して、第２ボディー内の捕捉フィルター上にエキソソーム及び微小胞（ＥＭＶ）を捕捉した。その後、第１及び第２ボディーを受容容器から取り外し、第２ボディーを第１ボディーから係合解除した。第２ボディーを、その出口部分がマルチウェルマイクロプレートのウェル中にあるように配置した。溶解バッファーで捕捉ＥＭＶを溶解（３７℃、１０分）した後、ｍＲＮＡ単離のために、ライセートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｎｃ．）に移した。ハウスキーピングｍＲＮＡを含む複数の腎臓関連遺伝子をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量した。プロトコールを比較するために、標準的な超遠心プロトコールを用いてエキソソームを単離した。８００×ｇ上清を１００，０００×ｇで１時間遠心し、ＥＭＶペレットを回収した。溶解バッファーでＥＭＶを溶解した後、ライセートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに移してｍＲＮＡ単離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用に処理した。
【００９０】
図６に示されているように、尿試料のｐＨ及び塩濃度を調整するためのバッファー溶液の添加は、本明細書に開示のデバイスを用いたエキソソーム捕捉の効率を向上させる。図６は、矢印で示されているように、対象＃１から採取した尿試料のアッセイ感度を増大させている（ＧＡＰＤＨ及びＲＰＬＰＯハウスキーピング遺伝子の発現に基づく）が、他の対象由来の試料の感度に悪影響を与えていない。
【００９１】
実施例２−標準的な超遠心と比較したフィルターに基づくエキソソーム捕捉
多くの一般的に用いられているプロトコール及び生物学的流体からエキソソームを単離するための超遠心を用いる。しかし、前述したように、超遠心はコストが高く（ｃｏｓｔ
ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）なり得る。本明細書に開示されているようにエキソソーム捕捉デバイスを用いて０．１〜１０ｍＬの尿試料を処理した。尿試料を確立されている超遠心法でも処理してエキソソームを捕捉した。その後、同じｍＲＮＡ単離及びＰＣＲプロトコールを用いた。
【００９２】
図７は、開示のエキソソーム捕捉デバイス（○）又は超遠心（□）を用いた単離に基づく、３つのハウスキーピング遺伝子（ベータアクチン、ＧＡＰＤＨ、及びＲＰＬＰＯ）へのＰＣＲ適用結果を示す図である。両方の方法に高度な相関が見られ、これにより、本明細書に開示のエキソソーム捕捉デバイスがエキソソームの捕捉及びそれらのエキソソーム内のｍＲＮＡの維持に有効であることが示された。
【００９３】
図８は、本明細書に開示されているデバイスを用いたエキソソーム捕捉を超遠心に基づく方法と比較した場合の、アッセイ内変動に関連する付加的データを示す図である。図８及び表２に示されるように、いずれの方法を用いても非常に似たｍＲＮＡ発現プロファイルが見られ、したがって、本明細書に開示されているデバイスを用いたエキソソーム捕捉が再現可能で正確なｍＲＮＡ結果を提供することが示された。更に、これらのデータは、本明細書に開示されているエキソソーム捕捉デバイスを用いた場合のアッセイ内変動の有
意な低減を示している。このように、これらのデバイスを用いた遺伝子発現分析は、より高い精度を達成でき、データ変動に基づく偽陽性結果のリスクを低減することができる。
【００９４】
【表２】
2018082715.tif 000004
【００９５】
本明細書に開示のデバイスを用いて又は超遠心に基づくプロトコールを用いてエキソソームを捕捉した場合のｍＲＮＡプロファイルの類似性を決定するために更なる実験を行った。本明細書に開示のデバイス又は超遠心により処理した尿試料（１０ｍＬ）から特定の腎臓関連遺伝子及び種々のハウスキーピング遺伝子を増幅した。図９に示されているように、使用した方法に関係なく、非常に似た発現プロファイルが得られた。これらのデータは、アッセイ内変動の低減に関連する上記データと組み合わせて、本明細書に開示されているデバイスから非常に正確なｍＲＮＡ発現データが得られることを示している。
【００９６】
実施例３−尿エキソソームモニタリング
本明細書に開示のエキソソーム捕捉デバイスを用いて、２週間にわたり４回対象から採取した尿試料（１２時間採取）中の遺伝子発現を評価する。図１０Ａはこの遺伝子発現データを示しており、特に、遺伝子発現レベル（各試験遺伝子内）が２週間の実験期間全体にわたり非常に類似している。図１０Ｂは、３つのハウスキーピング遺伝子の経時的データを示している。これらの各遺伝子の非常に安定な遺伝子発現プロファイルが確認され、このことから、本明細書に開示のデバイスを用いてエキソソームを捕捉した場合のｍＲＮＡ発現プロファイリングの精度が確認される。
【００９７】
上記に開示した実施形態の特別な構成及び態様の様々な組合せ又はサブコンビネーションがなされ得、それらは依然として本発明の１又は複数の範囲内であると考えられる。更に、実施形態と組み合わせた任意の特定の構成、態様、方法、性質、特性、質、属性、要素等の本明細書中の開示が、本明細書に記載の全ての別の実施形態中で用いられてよい。したがって、本開示の発明の様々な様式を形成するために、開示されている実施形態の種々の構成及び態様を互いに組み合わせる又は互いに置換することができると理解されるべきである。したがって、本明細書に開示されている発明の範囲は、上記の特定の開示されている実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。更に、本発明には種々の改変及び代替的形態が可能であるが、その具体例を図面中に示し、本明細書中に具体的に説明した。しかし、本発明は開示されている特定の形態又は方法に限定されず、むしろ、本発明は記載されている種々の実施形態及び添付の特許請求の範囲の精神及び範囲に含まれる全ての改変例、均等物、及び代替物を網羅すると理解されるべきである。本明細
書に開示されている方法は、必ずしも記載されている順番で行われなくてもよい。本明細書に開示の方法は、実施者によりとられる特定の行為を含むが、明示的であれ暗示的であれ、任意の第３者によるそれらの行為の指示も含み得る。例えば、「血液検査を行う」等の行為は、「血液検査の実施を指示する」を含む。本明細書に開示されている範囲は更に、重複、サブ範囲、及びその組合せの全てを包含する。「最大」、「少なくとも」、「超」、「より大きい」、「未満」、「間」等の言葉は、記載されている数字を含む。「約」又は「およそ」等の用語に先行される数字は記載の数字を含む。例えば、「約３ｍｍ」は「３ｍｍ」を含む。
【図１】
2018082715.tif 000005
【図２】
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【図３】
2018082715.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月2日(2018.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的流体試料から小胞を単離するための方法であって、
（ａ）小胞を含む生物学的流体試料を得る工程；
（ｂ）生物学的流体試料の塩濃度を１０ｍＭ〜９００ｍＭに調整する工程；
（ｃ）前記流体試料のｐＨをｐＨ６〜ｐＨ９に調整する工程；及び、
（ｄ）前記流体試料を小胞捕捉材料に通して上清を得る工程であって、前記小胞捕捉材料が、ガラス様材料を含み、前記流体試料由来の小胞が、前記小胞捕捉材料上又は中に捕捉される工程、を含む方法。
【請求項２】
さらに、前記上清を前記小胞捕捉材料に通過させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体試料が尿である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記塩濃度が２００ｍＭ〜９００ｍＭに調整された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記塩濃度は前記試料中の１価陽イオンの濃度に基づく、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記塩濃度は１価陽イオンによって調整される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び／又はＨＥＰＥＳによって前記流体試料の前記塩濃度と前記ｐＨが調整される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ガラス様材料はガラス繊維の少なくとも第１の層及び第２の層を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ガラス様材料は直径０．６ミクロン〜１．５ミクロンの粒子に対して５０％超の保持率を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記小胞は、細胞外ＲＮＡが結合した脂質二重膜構造体を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記小胞はｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｖＲＮＡからなる群から選択されるバイオマーカーを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生物学的流体試料から小胞を単離するための方法であって、
（ａ）小胞を含む生物学的流体試料を得る工程；
（ｂ）前記流体試料の塩濃度を１０ｍＭ〜９００ｍＭに調整する工程；
（ｃ）前記流体試料のｐＨをｐＨ６〜ｐＨ９に調整する工程；及び、
（ｄ）ファンデルワールス力によって前記小胞を捕捉する小胞捕捉材料に前記流体試料を通過させる工程、を含む方法。
【請求項１３】
前記小胞捕捉材料は直径０．６ミクロン〜１．５ミクロンの粒子に対して５０％超の保持率を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記小胞捕捉材料はガラス繊維の少なくとも第１の層及び第２の層を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の層は直径１．６ミクロン以上の粒子を捕捉する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の層は最小サイズの直径が０．６ミクロン〜０．８ミクロンの粒子を捕捉する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、前記小胞捕捉材料から前記捕捉した小胞を溶出する工程を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶出は前記小胞捕捉材料にカオトロピック試薬を通過させることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出は前記小胞捕捉材料に溶解バッファーを通過させることを含む、請求項１７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
複数の実施形態で、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との間の可逆的接続は摩擦接続（ｆｒｉｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を含む。複数の実施形態で、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との間の可逆的接続はルアーロック接続を含む。複数の実施形態で、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との間の可逆的接続は回転接続（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を含み、第１ボディーの出口のピンが第２ボディーの入口の溝部と噛み合う。複数の実施形態で、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との間の可逆的接続はねじ接続（ｔｈｒｅａｄｅｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を含む。いくつかの実施形態では、第２ボディーの入口は、第１ボディーの出口の雄ね
じ部（ｍａｌｅ  ｔｈｒｅａｄ）と噛み合う第２ボディーの入口の雌ねじ部（ｆｅｍａｌｅ  ｔｈｒｅａｄ）を含む。更なる実施形態では、第２ボディーの入口は、第１ボディーの出口の雌ねじ部と噛み合う第２ボディーの入口の雄ねじ部を含む。複数の実施形態で、接続は、第２ボディーが第１ボディーの内部容積部を通らずとも、第２ボディーを連結（ｃｏｕｐｌｅ）して、その後、第１ボディーから分離（ｄｅ−ｃｏｕｐｌｅ）することが可能なように構成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
更に、生物学的流体試料から小胞を単離する方法であって、入口、出口、及び入口と出口との間の内部容積部を有する第１ボディー、入口、出口、入口と出口との間の内部容積部、第２ボディーの内部容積部内に配置されたフィルター材料を有し、前記第１ボディーと流体連通する、第２ボディー（第１ボディー及び第２ボディーは、第２ボディーの入口と第１ボディーの出口との相互作用により可逆的に接続される）、内部空洞部を有する受容容器、を含む小胞捕捉デバイスを含むシステムを得る工程であって、受容容器の内部空洞部が、第１及び第２ボディーの両方を可逆的に囲むような並びに第１ボディーの内部容積部からフィルター材料を通って第２ボディーの内部空洞部を通って第２ボディーの出口を出た後の生物学的流体試料を受容するような寸法である、工程、或る量の（ａ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ）生物学的流体試料を第１ボディーの入口を介して第１ボディーの内部容積部中に配置する工程であって、第１ボディーが、第２ボディーに可逆的に接続される工程、第１及び第２ボディーを受容容器の内部空洞部中に配置する工程、重力又は遠心力の１又は複数を受容容器に印加することにより、生物学的試料を、第１ボディーの内部容積部から第２ボディーのフィルター材料を通って第２ボディーの出口を出て受容容器の内部空洞部中へと通過させる工程を含み、フィルターが生物学的流体試料から小胞を捕捉することにより前記生物学的流体試料から小胞が単離される、方法が提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
複数の実施形態で、捕捉材料を通過する時に小胞が曝される捕捉条件の標的範囲は、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの１価陽イオン（例えば、ナトリウム及び／又はカリウム）、例えば下側の濃度が約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、又は約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ（及びその間の任意の濃度）であり、上側の濃度が約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、及び約９００ｍＭ（及びその間の任意の濃度）である範囲を含む。したがって、複数の実施形態で、濃度範囲は、約２０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７００ｍＭ、及び約４０ｍＭ〜約６００ｍＭ、及びその重複する範囲である。それらの条件と組み合わせて、ｐＨは複数の実施形態で約４、約５、又は約６〜約９又は約１０（又は記載されているｐＨ値間のｐＨ値）に調整される。したがって、実施形態に応じて、ｐＨ範囲は約４〜約１０、約５〜約９、及び約６〜約９を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
いくつかの実施形態では、捕捉材料４は立方状である。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は、ウェーハ（ｗａｆｅｒ）状、球状、又はその何らかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、捕捉材料４の表面積と厚さの比は約５０：１、約２５：１、約１０：１、約５：１、又は約３：１である。いくつかの実施形態では、捕捉材料４は、直径と長さの比が約２０：１、約１０：１、約５：１、又は約２：１の円柱状ウェーハである。少なくとも１つの実施形態では、捕捉材料４は円柱状であり、直径約９ｍｍ、厚さ約１ｍｍである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
実施例２−標準的な超遠心と比較したフィルターに基づくエキソソーム捕捉
多くの一般的に用いられているプロトコールは、生物学的流体からエキソソームを単離するために超遠心を用いる。しかし、前述したように、超遠心はコストが高く（ｃｏｓｔ
ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）なり得る。本明細書に開示されているようにエキソソーム捕捉デバイスを用いて０．１〜１０ｍＬの尿試料を処理した。尿試料を確立されている超遠心法でも処理してエキソソームを捕捉した。その後、同じｍＲＮＡ単離及びＰＣＲプロトコールを用いた。