(57)【要約】      （修正有）【課題】アグロバクテリウム法に比べて効率の高い、ソルガム属の植物の遺伝子導入方法および形質転換植物の作成方法の提供。【解決手段】ソルガム属の植物の植物組織材料を調製する工程、アグロバクテリウム菌を接種する工程及び／又は共存工程において、窒素源の濃度、ならびに／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよびナトリウムイオンから選択される無機イオンの濃度、を高めた培地を用いるソルガム属の植物の遺伝子導入方法。また、前記遺伝子導入方法を用いる形質転換植物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、マグネシウムイオンの濃度を高めた培地であって、マグネシウムイオン濃度が４．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源の濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭより多く２７０ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはマグネシウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、マグネシウムイオン濃度が２．６ｍＭ以上１００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項４】
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはカリウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、カリウムイオン濃度が２４ｍＭ以上６５ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項５】
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはカルシウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、カルシウムイオン濃度が５．２ｍＭ以上１０ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはナトリウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、ナトリウムイオン濃度が０．６ｍＭ以上２００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項７】
少なくとも（ｉｉｉ）の共存工程において、窒素源の濃度、ならびに／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよびナトリウムイオンから選択される無機イオンの濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ソルガム属（Sorghum）の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法にしたがって工程（ｉ）−（ｉｉｉ）を行い、次いで、
（ｉｖ）共存工程で培養した組織をレスティング培地で培養するレスティング工程；および
（ｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程；
を含む、前記方法。
【請求項９】
以下の形質転換向上処理：
ａ）加熱処理；
ｂ）遠心処理；
ｃ）加圧処理；
ｄ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理；および
ｅ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理；
のうちの少なくとも１つを行う、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記（ｉｖ）レスティング工程と、（ｖ）再分化工程の間に選抜工程を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
アグロバクテリウム菌が、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１、およびＣ５８Ｃ１からなる群より選択される菌である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ソルガム属の植物がソルガム（Sorghum bicolor）である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介してソルガム属の植物へ遺伝子導入を行う方法に関する。本発明はさらに、アグロバクテリウム属細菌を介して、ソルガム属の植物の形質転換植物を作成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ソルガムは、アフリカを原産とするイネ科の短日性単子葉植物である。ソルガムは、水利用効率が高く、耐乾性や耐高温性に富み、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギに次ぐ主要穀類であり、アフリカやアジアの国々において重要な食糧となっている。また、ソルガムは糖含有量が高く、バイオエタノールの原料にもなることから、ソルガムの農業形質を改良するための技術開発も盛んに行われている。ソルガムは全ゲノムが解読され、ソルガム特有の有用農業形質に関連する遺伝子や量的遺伝子座（QTL）の解析も進んでいる。ソルガムにおける遺伝子組換え技術の開発は、ソルガムの農業形質を改良する上で重要な役割を果たすと考えられる。
【０００３】
主要穀類であるオオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネなどの単子葉植物の形質転換方法には、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）とアグロバクテリウム属細菌が持つ機能を利用する生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）が知られている。アグロバクテリウム属細菌を介する遺伝子導入法は、Ｔｉプラスミドの病原性領域（ｖｉｒ領域）における遺伝子群の発現制御等により、目的遺伝子の導入コピー数は低く保たれ、断片化されて導入されることも少ない。そのため、得られた形質転換体において目的遺伝子が高発現する個体が多く得られ、直接導入法に比べると、発現量の個体間差も少ないという大きな利点がある。
【０００４】
アグロバクテリウム属細菌を介した遺伝子導入法は、双子葉植物の形質転換法として普遍的に用いられている。もともと、自然界におけるアグロバクテリウム属細菌の宿主は双子葉植物に限定されており、長い間、単子葉植物には寄生しないと考えられてきた。しかしながら、供試組織の検討、培地組成の改良、アグロバクテリウム菌株の選定などの詳細な研究の結果、主要穀物であるイネで初めてアグロバクテリウム属細菌を介した高効率形質転換方法が報告された（Hiei et al. 1994：非特許文献１）。その後、イネでの成功に続いて、トウモロコシ（Ishida et al. 1996：非特許文献２）、コムギ（Cheng et al. 1997：非特許文献３）、オオムギ（Tingay et al. 1997：非特許文献４）、ソルガム（Zhao et al. 2000：非特許文献５）でアグロバクテリウムを介した形質転換の成功が報告されている。
【０００５】
１．アグロバクテリウム属細菌を介したソルガムの形質転換方法に関連する従来技術
１）アグロバクテリウムを接種する植物組織
アグロバクテリウムを接種するために用いられるソルガムの組織としては、未熟胚が用いられている（非特許文献５）。
【０００６】
２）前処理
アグロバクテリウム法による形質転換効率を向上させる方法の１つとして、形質転換をする植物材料に熱処理または遠心処理を施すことがいくつかの単子葉植物への形質転換に使われている（Hiei et al. 2006：非特許文献６）。ソルガムにおいても、アグロバクテリウムを感染させる前の未熟胚に対して、４３℃で３分間処理することによって形質転換効率が未処理区に比べて約３倍向上するという報告がされている（Gurel et al. 2009：非特許文献７）。但し、遠心処理については、ソルガムの形質転換にネガティブな結果を生じたと記されている。
【０００７】
３）共存工程
アグロバクテリウムを植物組織に接種して共存させる工程である。アグロバクテリウムを介したソルガムの形質転換では、共存培地の組成としてＬＳ無機塩を１倍量含むＭＳ培地が使われている（非特許文献５）。
【０００８】
４）カルス形成工程
カルス形成工程は、植物組織を脱分化させる工程である。
【０００９】
ソルガムの組織培養工程ではフェノール化合物が過剰に産生し、カルス形成が阻害される傾向がある（Cai et al. 1987：非特許文献８）。これに対し、ＭＳ培地にＬ−プロリン、Ｌ−アスパラギンを添加することによって、エンブリオジェニックカルスの増殖を促進すること、およびソルガム培養の阻害要因となるフェノール産生を抑制することが示された（Elkonin et al. 1995：非特許文献９)。また、カルス形成培地の硝酸イオン濃度とリン酸イオン濃度を増加することによって、エンブリオジェニックカルスの誘導を促し、さらに得られたカルスからの再分化効率も向上することが報告されている（Elkonin et al. 2000：非特許文献１０）。ポリビニルポリピロリドン（PVPP）のカルス形成培地への添加が、アグロバクテリウム接種時のダメージによる細胞の褐変を軽減するという報告がある（Gao et.al. 2005：非特許文献１１）。
【００１０】
また、実際にソルガムを形質転換した事例としては、カルス形成培地に添加する植物成長調節物質に６−ベンジルアミノプロリン（BAP）を使用することによって、形質転換効率が改善したという報告もある（Wu et al. 2014：非特許文献１２）。
【００１１】
５）再分化工程
再分化培地に添加する植物成長調節物質の種類と濃度を最適化する試みも行われ、1 mg/L ナフタレン酢酸（NAA）、1 mg/L インドール−３−酢酸（IAA）、1 mg/L インドール−３−酪酸（IBA）、1 μmol/L 硫酸銅を含むＭＳ培地を用いることによって、発根培地に移植後の再分化植物からの発根が促進されることが報告されている（Guoquan et al. 2013：非特許文献１３）。
【００１２】
以上のように、アグロバクテリウムを介したソルガムの形質転換方法は、改良が行われ、最初の報告で２．１％（非特許文献５）であった形質転換効率が、３３％（非特許文献１２）まで上昇してきた。しかしながら、その形質転換効率は、イネやトウモロコシと比較しても、未だ十分に高いとはいえない。
【００１３】
２．アグロバクテリウム属細菌を介した植物の形質転換方法における共存培地の改良
アグロバクテリウムを介した形質転換方法において、トウモロコシでは、Ｎ６培地を希釈した共存培地を用いることによって形質転換効率が向上したという報告が複数なされている。例えば、Duらは、アグロバクテリウムを接種したトウモロコシ（A188）未熟胚のうち、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現が確認された未熟胚の割合が、Ｎ６無機塩を１倍量含むＮ６培地では７２％であったのに対し、主要無機塩を５０％、３０％、１０％に希釈したＮ６培地ではいずれも９０％以上に増加することを示した（Du et al. 2010：非特許文献１４）。
【００１４】
また、別の報告では、主要無機塩を１０％、５０％に希釈したＮ６培地からなるアグロバクテリウム懸濁培地、および共存培地を使用することによって、Ｎ６無機塩を１倍量含むＮ６培地を用いた時のトウモロコシ（Hi-II）における供試カルス当たりの形質転換効率が０％であったのに対し、それぞれ４．０％、１７．５％に向上することが確認された（Vega et al. 2008：非特許文献１５）。
【００１５】
コムギにおいては、無機塩を１０％に希釈したＭＳ培地からなるアグロバクテリウム懸濁培地、および共存培地を用いた場合、ＭＳ無機塩を１倍量含むＭＳ培地からなる上記培地を用いるよりも著しくＧＵＳ遺伝子の一過性発現を示した未熟胚の割合が高かったことが報告されている（Cheng et al. 1997：非特許文献１６）。このように「低無機塩培地は、数種の主要作物へのアグロバクテリウムによる導入遺伝子の一過性発現や形質転換効率向上のために一般的に用いられている。」（Vega et al. 2008：非特許文献１５）と考えられている。
【００１６】
反対に、共存培地ではないが、タバコにおいて、アグロバクテリウムを接種する前の植物材料を前培養する培地に、硝酸アンモニウム濃度を増加させた培地を用いることによって、導入遺伝子の一過性発現や形質転換効率が向上したことが報告されている（Boyko et al. 2009：非特許文献１７）。また、アグロバクテリウムを接種する前の植物組織を前培養する培地に、塩化カリウムや希土類元素の塩化物を添加することにより、シロイヌナズナやタバコの形質転換効率が向上したという報告がある（Boyko et al. 2011：非特許文献１８）。
【００１７】
共存培地に、抗酸化物質や銅を添加することによって、導入遺伝子の一過性発現を促進させる方法も報告されている。トウモロコシでは、抗酸化物質であるＬ−システインとジチオトレイトール（DTT）をＭＳ培地、Ｎ６培地、ＬＳ培地、Ｄ培地それぞれに添加した結果、非添加区に比べて０．４ｇ／Ｌ  Ｌ−システインと０．１５ｇ／Ｌ  ＤＴＴを添加した試験区において導入遺伝子の一過性発現および形質転換効率が著しく向上した（非特許文献１４）。
【００１８】
３．植物組織の培養に用いられる培地
上記のＭＳ培地（ＬＳ培地）以外にも、植物組織の培養にさまざまな組成の培地が開発され、利用されている。
【００１９】
Ｎ６培地は、主にイネの葯培養培地として用いられている。Ｂ５培地は、液体培養用として開発されたが、固体培地としても多くの植物組織培養に用いられている。Ｒ２培地は、Ｂ５培地を基本としてイネの懸濁培養細胞用に開発された培地である。ＣＣ培地は、トウモロコシのプロトプラストからのカルス形成培地として考案された培地である。
【００２０】
下記の表は、公知の基本培地であるＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ６培地、Ｂ５培地、Ｒ２培地、ＣＣ培地について、窒素源としてのＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度、および各種無機イオン（マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、およびナトリウムイオン）の濃度をまとめたものである。
【００２１】
【表１】
2018027020.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Hiei et al. (1994)  The Plant Journal 6:271-282.
【非特許文献２】Ishida et al. (1996)  Nature Biotechnology 14:745-750.
【非特許文献３】Cheng et al. (1997)Plant Physiol. 115: 971-980.
【非特許文献４】Tingay et al.(1997) Plant J. 11: 1369-1376.
【非特許文献５】Zhao et. al. (2000) Plant Molecular Biology 44:789-798.
【非特許文献６】Hiei et al. (2006) Plant Cell Tissue Organ Cult 87: 233-243.
【非特許文献７】Gurel et.la (2009) Plant Cell Rep 28(3): 429-444.
【非特許文献８】Cai et al. (1987) Plant Cell Tissue Organ Cult. 9:245-252.
【非特許文献９】Elkonin et al. (1995) Maydica 40(2):153-157.
【非特許文献１０】Elkonin et al. (2000) Plant Cell Tissue Organ Cult 61(2):115-123.
【非特許文献１１】Gao et.al. (2005)Genome 48:321-333.
【非特許文献１２】Wu et al. (2014) In Vitro Cell Dev Biol-Plant 50: 9-18.
【非特許文献１３】Guoquan et al. (2013) In Vitro Cell.Dev.Biol-Plant (2013) 49(2):191-197.
【非特許文献１４】Du et al. (2010) African Journal of Biotechnology 9(8): 1135-1143
【非特許文献１５】Vega et al.(2008)Plant Cell Reports 27(2): 297-305.
【非特許文献１６】Cheng et al.(1997)Plant Physiol Physiol 115: 971-980.
【非特許文献１７】Boyko et al. (2009)Plant Cell Reports 28: 737-757.
【非特許文献１８】Boyko et al. (2011)Plant Cell Reports 30: 505-518.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、従来公知のアグロバクテリウム法と比較して効率の高い、ソルガム属の植物へ遺伝子導入を行う方法、および、ソルガム属の形質転換植物を作成する方法を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、ソルガム属の植物の植物材料を調製する工程、当該植物材料の組織へアグロバクテリウム菌を接種する工程および／または共存工程において、窒素源の濃度、ならびに／またはマグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよびナトリウムイオンから選択される無機イオンの濃度を、ＬＳ無機塩を１倍量含む培地よりも高めた培地を用いることにより、ソルガム属の植物において遺伝子導入効率が向上することを見いだした。
【００２５】
本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これらに限定されるものではない。
［態様１］
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、マグネシウムイオンの濃度を高めた培地であって、マグネシウムイオン濃度が４．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様２］
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源の濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭより多く２７０ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様３］
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはマグネシウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、マグネシウムイオン濃度が２．６ｍＭ以上１００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様４］
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはカリウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、カリウムイオン濃度が２４ｍＭ以上６５ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様５］
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはカルシウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、カルシウムイオン濃度が５．２ｍＭ以上１０ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様６］
ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはナトリウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、ナトリウムイオン濃度が０．６ｍＭ以上２００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様７］
少なくとも（ｉｉｉ）の共存工程において、窒素源の濃度、ならびに／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよびナトリウムイオンから選択される無機イオンの濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、態様１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
ソルガム属（Sorghum）の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
態様１ないし７のいずれか１項に記載の方法にしたがって工程（ｉ）−（ｉｉｉ）を行い、次いで、
（ｉｖ）共存工程で培養した組織をレスティング培地で培養するレスティング工程；および
（ｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程；
を含む、前記方法。
［態様９］
以下の形質転換向上処理：
ａ）加熱処理；
ｂ）遠心処理；
ｃ）加圧処理；
ｄ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理；および
ｅ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理；
のうちの少なくとも１つを行う、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
上記（ｉｖ）レスティング工程と、（ｖ）再分化工程の間に選抜工程を含む、態様８または９に記載の方法。
［態様１１］
アグロバクテリウム菌が、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１、およびＣ５８Ｃ１からなる群より選択される菌である、態様１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
ソルガム属の植物がソルガム（Sorghum bicolor）である、態様１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、高い効率でソルガム属の植物の遺伝子導入を行うことが可能となった。また、それにより高い効率でソルガム属の形質転換植物を作成することができる。本発明の方法により、ソルガムの形質転換した植物体を得るためのコストを削減することも可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に本発明の構成を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２８】
本発明は、ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法を提供する。
【００２９】
さらに本発明は、ソルガム属の植物の、形質転換植物の作成方法であって、（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程； 
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
（ｉｖ）共存工程で培養した組織をレスティング培地で培養するレスティング工程；および
（ｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法を提供する。
【００３０】
本発明において使用可能な植物材料が由来する植物はソルガム属の植物である。なお、ソルガム属はモロコシ属と呼ばれることもあるが、本明細書では「ソルガム属」の呼称に統一して記載する。本明細書における「ソルガム属」の植物の例として、限定されるものではないが、ソルガム（Sorghum bicolor）を挙げることができる。
【００３１】
本発明においてソルガム（S. bicolor）はとりわけ好適である。なお、本明細書において「ソルガム（S. bicolor）」と記載した場合には、「ソルガム属」の中で「ソルガム」という特定の植物種を示すものとする。またソルガム（S. bicolor）は、モロコシ、タカキビ、高粱（コウリャン）とも呼ばれることがあるがいずれも同じ植物種であり、本発明において使用可能である。
【００３２】
本発明において使用可能な「植物材料」は、非限定的に、アグロバクテリウム法による植物の遺伝子導入または形質転換に供するためのソルガム属の植物の細胞、葉、根、茎、実、その他いずれかの部位の植物組織、未熟胚、完熟種子、カルスもしくは不定胚様組織（以下、本明細書においてカルス等、または単にカルスという）、または完全な植物体など植物のあらゆる態様を包含する。本発明の方法に用いる植物材料の形態として好ましいのは、未熟胚、完熟種子、およびそれらから誘導されるカルスであり、最も好ましいのは未熟胚である。
【００３３】
本明細書において「未熟胚」とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。また、本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定される物ではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよいが、受粉後２日以降、好ましくは受粉後７から２４日後のものが好ましい。未熟胚は取り出した当日使用することができるが、前培養した未熟胚であってもよい。
【００３４】
本明細書において「完熟種子」とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。
【００３５】
本明細書において「カルス」とは、無秩序に増殖する未分化状態の細胞塊をいう。カルスを得るためには、植物組織の分化した細胞をオーキシン（例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ））、サイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地（脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得るための処理を脱分化処理といい、またこの過程を脱分化過程という。
【００３６】
本発明の方法において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地とは、当業者によく知られているＭＳ（ＬＳ）基本培地に含まれる窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度と比較して、高濃度の窒素源および／または無機イオンを含む培地をいう。高濃度とは、当該ＭＳ（ＬＳ）基本培地（Zhao, et al., 2000：非特許文献５）に含まれる窒素源および／または無機イオンの濃度よりも高いことをいう。具体的には、ＭＳ（ＬＳ）基本培地は窒素源としてＮＨ４＋とＮＯ３−を含んでおり、それらの合計濃度は６０．０ｍＭである。また、ＭＳ（ＬＳ）基本培地は、１．５ｍＭのマグネシウムイオン、２０．０ｍＭのカリウムイオン、３．０ｍＭのカルシウムイオンを含む。ＭＳ（ＬＳ）基本培地はナトリウムイオンを含まない。これらＭＳ（ＬＳ）基本培地に含まれる窒素源および／または無機イオンの濃度よりも高濃度の窒素源および／または無機イオンを含む場合には、その培地は窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地である。
【００３７】
本発明の方法において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地は、上記（ｉ）の植物材料の調製工程、（ｉｉ）のアグロバクテリウム菌の接種工程および（ｉｉｉ）の共存工程の少なくとも１の工程において用いられる。好ましくは、当該培地は少なくとも（ｉｉｉ）の共存工程において用いられる。
【００３８】
一態様において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地は、マグネシウムイオンの濃度を高めた培地である。マグネシウムイオンの濃度を高めた培地におけるマグネシウムイオン濃度は、４．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下、好ましくは４．８ｍＭ以上９０．４ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてマグネシウムイオン濃度の下限は４．０ｍＭ以上、４．８ｍＭ以上、および７．５ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は１００ｍＭ以下、９０．４ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５．３ｍＭ以下、４０．０ｍＭ以下から選択してもよい。マグネシウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
【００３９】
別の態様において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地は、窒素源の濃度を高めた培地である。窒素源の濃度を高めた培地におけるＮＨ４＋およびＮＯ３−の合計濃度は６０ｍＭより多く２７０ｍＭ以下、好ましくは６２ｍＭ以上２７０ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてＮＨ４＋およびＮＯ３−の合計濃度の下限は、６０ｍＭより多い、６２ｍＭ以上、６５ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、７５ｍＭ以上、および８０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は２７０ｍＭ以下、２６３ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２２５ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１７５ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１２５ｍＭ以下、１１５ｍＭ以下および１１２ｍＭ以下から選択してもよい。ＮＨ４＋およびＮＯ３−の合計濃度の下限および上限は、上記の数値からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
【００４０】
さらなる態様において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地は、窒素源の濃度、および／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンもしくはナトリウムイオンの濃度を高めた培地である。
【００４１】
窒素源の濃度、および／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンもしくはナトリウムイオンの濃度を高めた培地におけるＮＨ４＋およびＮＯ３−の合計濃度は６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下、好ましくは６２ｍＭ以上１１２ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてＮＨ４＋およびＮＯ３−の合計濃度の下限は、６０ｍＭ以上、６２ｍＭ以上、６５ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、７５ｍＭ以上、および８０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は２７０ｍＭ以下、２６３ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２２５ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１７５ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１２５ｍＭ以下、１１５ｍＭ以下および１１２ｍＭ以下から選択してもよい。上記のＮＨ４＋およびＮＯ３−の合計濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
【００４２】
窒素源の濃度および／またはマグネシウムイオンの濃度を高めた培地におけるマグネシウムイオン濃度は、２．６ｍＭ以上１００ｍＭ以下、好ましくは４．８ｍＭ以上９０．４ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてマグネシウムイオン濃度の下限は２．６ｍＭ以上、４．０ｍＭ以上、４．８ｍＭ以上、および１０．０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は１００ｍＭ以下、９０．４ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５．３ｍＭ以下から選択してもよい。上記のマグネシウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
【００４３】
窒素源の濃度および／またはカリウムイオンの濃度を高めた培地におけるカリウムイオン濃度は２４ｍＭ以上６５ｍＭ以下、好ましくは２４ｍＭ以上６０ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてカリウムイオン濃度の下限は、２４．０ｍＭ以上、２７．０ｍＭ以上、および３０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は７０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、６４．１ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５５ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、および４５ｍＭ以下から選択してもよい。上記のカリウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
【００４４】
窒素源の濃度および／またはカルシウムイオンの濃度を高めた培地におけるカルシウムイオン濃度は、５．２ｍＭ以上１０ｍＭ以下、好ましくは５．２ｍＭ以上９．６ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてカルシウムイオン濃度の下限は、５．２ｍＭ以上、５．５ｍＭ以上、および６．０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は１０ｍＭ以下、９．６ｍＭ以下、９．０ｍＭ以下、８．０ｍＭ以下、７．５ｍＭ以下、７．０ｍＭ以下、および６．９ｍＭ以下から選択してもよい。上記のカルシウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
【００４５】
窒素源の濃度および／またはナトリウムイオンの濃度を高めた培地におけるナトリウムイオン濃度は、０．６ｍＭ以上２００ｍＭ以下、好ましくは０．６ｍＭ以上１５０ｍＭ以下、さらに好ましくは４０．０ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてナトリウムイオン濃度の下限は０．６ｍＭ以上、１．０ｍＭ以上、４．０ｍＭ以上、１０．０ｍＭ以上、２０．０ｍＭ以上、３０．０ｍＭ以上および４０．０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は２００ｍＭ以下、１７５ｍＭ以下、１５０．１ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１２５ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、９０．１ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、および５０ｍＭ以下から選択してもよい。上記のナトリウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
【００４６】
以下、上記の本発明の方法の各工程についてさらに詳しく説明する。
【００４７】
１．本発明の各工程について
本発明の遺伝子導入方法および形質転換植物の作成方法は、アグロバクテリウム属細菌を利用する。特に明記する工程以外は、公知のアグロバクテリウム属細菌を利用した遺伝子導入方法、形質転換方法の各工程に従って行うことが可能である。
【００４８】
（ｉ）植物材料を調製する工程
工程（ｉ）においては、未熟胚、完熟種子などの植物材料を植物体または種子等から取り出す、または必要に応じてそれらから誘導されるカルスを得ることにより、遺伝子導入または形質転換に好適な植物材料を調製する。「植物材料」の定義については上述のとおりである。植物材料の調製は、ソルガム属植物の植物体から組織（これには未熟胚、完熟種子等が含まれる）を単離・採取することにより行う。また、単離・採取した組織からカルスを誘導して植物材料を調製してもよい。所望によりさらに、植物材料をアグロバクテリウムに感染させる前に培養してもよい。
【００４９】
本発明において使用するソルガム属の植物の植物材料の大きさは特に限定される訳ではないが、例えば、未熟胚の場合、１．０−３．０ｍｍの大きさの物を用いることができる。
【００５０】
工程（ｉ）においては、上述の通り、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を用いることができる。
【００５１】
また、工程（ｉ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば熱処理、遠心処理、熱処理および遠心処理、ならびに加圧処理などがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
【００５２】
（ｉｉ）植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程
工程（ｉｉ）においては、工程（ｉ）で調製したソルガム属植物の植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する。
【００５３】
本明細書で使用する「接種」とは、アグロバクテリウム菌を植物の組織に接触させることをいい、当該技術分野においては種々のアグロバクテリウム菌接種方法が公知である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム菌を懸濁した液体培地に植物組織を加える方法、共存培地上の植物組織にアグロバクテリウム菌の懸濁液を直接滴下する方法、植物組織中にアグロバクテリウム菌の懸濁液を注入する方法、およびアグロバクテリウム菌の懸濁液中に植物組織を浸漬し減圧する方法があげられる。しかしながら、本発明の方法におけるアグロバクテリウム菌の接種方法は、これらの方法に限定されない。
【００５４】
当該アグロバクテリウム菌を接種するにあたり、アグロバクテリウム菌による形質転換効率を改善するために、例えば、アセトシリンゴン、界面活性剤、多孔性セラミックス糖の種々の添加剤をアグロバクテリウム菌の懸濁液中に含ませることが可能である。
【００５５】
本発明に使用可能なアグロバクテリウム菌は特に限定されず、アグロバクテリウムによる形質転換法に使用可能な、公知のいずれのアグロバクテリウム菌であってよい。本発明の好ましい態様において、アグロバクテリウム菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、例えばＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１およびＣ５８Ｃ１等であるが、これらに限定されない。
【００５６】
アグロバクテリウム菌は、アグロバクテリウム菌内のプラスミドのＴ−ＤＮＡの中に挿入された遺伝子を植物のゲノム中に導入する性質を有することが公知である。そのため、本発明で使用可能なアグロバクテリウム菌は、植物内で発現させることを意図する遺伝子をＴ−ＤＮＡ中に挿入したプラスミドを有する。そして、当該プラスミドを有するアグロバクテリウム菌を植物組織に接種することにより植物を形質転換することが可能である。これにより、組織中の植物細胞に好ましい形質が付与される。本発明において使用可能なアグロバクテリウム菌用のプラスミドは、例えば、ｐＬＣ４１、ｐＳＢ１３１、Ｕ０００９Ｂ、Ｕ００１７Ｓ、ｐＳＢ１３４、ｐＮＢ１３１、およびｐＩＧ１２１Ｈｍ等があげられるが、これらに限定されるわけではない。
【００５７】
工程（ｉｉ）においては、上述の通り、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を用いることができる。
【００５８】
また、工程（ｉｉ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば熱処理、遠心処理、熱処理および遠心処理、加圧処理、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理、ならびに硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理、などがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
【００５９】
（ｉｉｉ）共存工程
工程（ｉｉｉ）においては、工程（ｉｉ）においてアグロバクテリウム菌を接種した植物材料の組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行う。本工程は、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、アグロバクテリウム菌の共存下にて培養することにより、アグロバクテリウム菌から植物細胞へのＤＮＡの導入を確実にする工程である。
【００６０】
工程（ｉｉｉ）で使用される培地は、本明細書では「共存培地」という。共存培地は、植物細胞を通常培養するために通常使用されるものでもよく、例えばＬＳ無機塩類（Linsmaier, E., and Skoog, F., (1965) Physiol. Plant, 18:100-127）を基本とする培地等が挙げられる。好ましくは、工程（ｉｉｉ）においては、上述の通り、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を、共存培地として用いることができる。
【００６１】
また、本発明で用いる共存培地中に、オーキシン類として２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ピクローラム、ダイカンバまたは他のオーキシン類を添加することができる。あるいは、カイネチンや４ＰＵのようなサイトカイニンなど、他の植物成長調節物質を添加することもできる。
【００６２】
工程（ｉｉｉ）における「培養」とは固化した共存培地の上または液体状の共存培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。本発明において、培地の形態は、培養成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。共存培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロースが知られている。本発明においては、このような固化した共存培地を好適に使用することができる。
【００６３】
工程（ｉｉｉ）における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは１８℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、工程（ｉｉｉ）の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。工程（ｉｉｉ）の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日ないし７日、より好ましくは２日ないし３日である。
【００６４】
植物材料として未熟胚が用いられる場合、本発明の工程（ｉｉｉ）の共存培養において未熟胚は胚盤側を上向きに、胚軸側を培地に接するように置床して培養してもよく、または未熟胚は胚軸側を上向きに、胚盤側を下向きに培地に接するように置床して培養してもよい。好ましくは、未熟胚は胚盤側を上向きに、胚軸側を培地に接するように置床して共存培養する。
【００６５】
また、工程（ｉｉｉ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば、遠心処理、加圧処理、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理、および硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理、などがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
【００６６】
（ｉｖ）レスティング工程
本発明の形質転換植物の作成方法においては、上記共存工程の後にさらにレスティング工程、再分化工程を経て、形質転換植物を作成する。
【００６７】
工程（ｉｖ）のレスティング工程においては、共存工程後に植物組織をレスティング培地で培養する。本工程は、共存工程の後に植物細胞からアグロバクテリウム菌を除くとともに植物細胞の増殖を行う工程である。
【００６８】
工程（ｉｖ）で使用される培地は、本明細書中では「レスティング培地」という。レスティング培地は、植物細胞を培養するために通常使用されるものでよく、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類（Chu, C.-C., (1978) Proc. Symp. Plant Tissue Culture., Peking: Science Press, pp. 43-50）を基本とする培地等があげられる。なお本工程におけるレスティング培地は、好ましくは抗生物質を含む。レスティング培地中に含まれる抗生物質は、下記の選抜工程で用いる選抜用の抗生物質とは異なり、アグロバクテリウムの除菌を目的とする。限定される訳ではないが、抗生物質として、好ましくはセフォタキシムおよび／またはカルベニシリン、チメンチン等を使用することができる。
【００６９】
工程（ｉｖ）におけるレスティング培地中には、好ましくは、植物成長調節物質を含む。植物成長調節物質としては好ましくは、オーキシン類に属するピクローラムおよび／または２，４−Ｄ、ダイカンバが含まれる。オーキシン類は一般に植物組織を脱分化させる作用を有するために、工程（ｉｖ）および所望により続いて行われる選抜工程において、ほとんどの植物組織は一部または全部が脱分化組織（カルス）となる。本明細書で使用する、「脱分化組織」または「カルス」の用語は、分化した植物組織の一部（外植片）をオーキシンおよびサイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地で培養することにより得られる組織で、元来の植物組織としての形態を有さない無定形で未分化状態の細胞塊をいう。したがって、脱分化組織の状態でレスティング工程を開始する場合、および分化している植物組織がレスティング工程中または続く選抜工程中にすべてが脱分化および一部が脱分化する場合等の、脱分化組織が関係するいかなる態様も本発明の範囲内である。
【００７０】
また、レスティング培地は、好ましくは糖質を含む。糖質源としては、シュークロース、グルコース、マルトースなどの糖や、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコールを用いることができる。ソルガム属ではないが、イネではシュークロース濃度やマンニトール、ソルビトール濃度を変えることによってカルス形成、および再分化効率が改善したとの報告がある（Kavi Kishor（1987）Plant Science 48:189-194）。ソルガムにおいても適宜、糖質源の種類と濃度を変えることができる。
【００７１】
工程（ｉｖ）における「培養」とは、固化したレスティング培地の上または液体状のレスティング培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。本発明において、培地の形態は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。レスティング培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース等が知られている。工程（ｉｖ）における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日−２８日、より好ましくは７日−２１日である。
【００７２】
また、工程（ｉｖ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば、遠心処理、加圧処理、Ｌ−プロリン、および／またはＬ−アスパラギンを添加した培地（Elkonin, et al., 1995：非特許文献９）、硝酸イオン濃度とリン酸イオン濃度を増加させた培地（Elkonin, et al., 2000：非特許文献１０）；ポリビニルポリピロリドン（PVPP）を添加した培地（Gao, et al., 2005：非特許文献１１）；ならびに、６−ベンジルアミノプロリン（BAP）を添加した培地（Wu, et al., 2014：非特許文献１２）；をレスティング培地として用いること、などがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
【００７３】
さらに、レスティング工程（ｉｖ）と再分化工程（ｖ）の間に選抜工程が含まれていてもよい。選抜工程は、アグロバクテリウム菌による植物の形質転換方法において一般的に行われている工程である。本発明の形質転換植物の作製方法において選抜工程は必須ではない。例えば、後に述べる形質転換向上処理をした場合には、選抜工程を経なくても目的とする形質転換体を得ることができるからである。なお、選抜工程を行う場合、以下の記載は例示のためのものであり、本発明は以下の記載により限定されるものではない。
【００７４】
選抜工程は、上記工程により得られた組織から、形質転換体を導入遺伝子の有無により選抜する工程である。選抜工程で使用される培地は、本明細書中では「選抜培地」という。選抜培地として使用可能な培地は、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＭＳ培地等があげられる。
【００７５】
一般的なアグロバクテリウム菌を用いた形質転換法によれば、選抜培地中には、オーキシン類、好ましくは２，４−Ｄおよび／またはピクローラム、ダイカンバが添加される。本発明においても、選抜培地が植物成長調節物質を含むのは、好ましい態様である。本選抜工程で使用されるオーキシン類は特に限定されず、好ましくは２，４−Ｄである。さらに、必要に応じて、種々の添加物を加えることが可能である。
【００７６】
形質転換植物の選抜は、例えば、適当な選抜薬剤を含む選抜培地で、上記共存工程および／またはレスティング工程を経た植物を培養し、選抜薬剤に対する耐性の有無により行うことができる。選抜工程に使用可能な選抜薬剤は、当該技術分野で通常使用されるものを用いることが可能である。例えば、選抜薬剤としては、抗生物質または除草剤を使用可能である。抗生物質としては、例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、またはブラストサイジンＳ等が使用可能である。さらに、除草剤としては、例えば、フォスフィノスライシン、ビアラフォスまたはグリホセート等が使用可能である。
【００７７】
本選抜工程を行うためには、アグロバクテリウム菌中のＴ−ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、例えば、選抜薬剤に対する耐性遺伝子等を含むことが必要である。このような選抜薬剤に対する耐性遺伝子は当該技術分野においては公知である。選抜工程において、例えばハイグロマイシンを含む選抜培地において選抜を行う場合、植物には、植物内で発現させることを意図する遺伝子に加え、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていることが必要である。
【００７８】
あるいは、形質転換植物の選抜は、植物細胞の糖要求性に基づいて行うことが可能である。植物細胞が利用できる糖にはシュークロース、グルコースなどがあるが、マンノースは利用できないことが知られている。したがって、マンノースのみを炭素源とする培地で植物組織を培養すると、利用できる糖がないために植物組織は枯死する。糖要求性に基づく選抜はこの原理を利用するものである。即ち、この選抜方法を利用するためには、アグロバクテリウム菌中のＴ−ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、リン酸化マンノースイソメラーゼ（phosphomannose isomerase：ＰＭＩ）遺伝子を含むことが必要となる。ここで、ＰＭＩ遺伝子を導入された植物細胞は、マンノースを炭素源として利用できるようになる。したがって、上記のようなアグロバクテリウム菌により形質転換された植物組織のみが、マンノースのみを炭素源とする培地で生育することが可能となり、これにより形質転換植物組織のみを選抜することが可能となる（Negrotto, D., et al., (2000) Plant Cell Reports, 19:798-803）。このような方法は、他の糖についても行うことができる。例えば、キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入された植物細胞は炭素源としてキシロースを利用することが可能となるため、このような方法に適用可能である。
【００７９】
また、容易に検出可能な遺伝子をスクリーニングの指標として導入し、当該遺伝子の発現の有無により選抜することも可能である。このようなスクリーニングの指標となる遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子等があげられる。これらの遺伝子を発現する細胞・組織を検出する方法は当該技術分野において公知である。
【００８０】
選抜工程は、培地の成分組成を変更して、複数回繰り返して行うことも可能である。例えば、複数回の選抜工程では、選抜薬剤の濃度を各選抜工程で上昇させることにより、薬剤選抜の確実性が増し、形質転換植物体を得られる可能性を上昇させることが可能となる。本選抜工程は、好ましくは少なくとも１回、より好ましくは２回行われる。また、複数回選抜工程を行う場合には、選抜薬剤を含む培地で培養した組織のうち増殖した部分を切り取り、当該増殖部分のみを次の選抜工程に供することにより、効率よく形質転換組織を獲得することも可能である。
【００８１】
選抜工程における「培養」とは、固化した選抜培地の上または液体状の選抜培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。本発明において、培地の形態は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。選抜培地の固化は、上記のように例えばアガロース等により行うことが可能である。選抜工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、例えば、２回選抜工程が行われる場合には、１次選抜は１週間、そして２次選抜は２週間の計３週間行われる。また、複数回の選抜工程全体では好ましくは２−６週間、より好ましくは３−５週間行われる。また、複数回の選抜を行う場合には、各回毎に培養期間、温度および明暗条件を変更することも可能である。
【００８２】
（ｖ）再分化工程
工程（ｖ）においては、レスティング培地で培養した組織を、必要ならば選抜した後に、再分化培地で再分化させる工程を行う。工程（ｖ）で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」という。再分化培地には、オーキシンやサイトカイニンを適宜添加してもよい。
【００８３】
再分化培地としては、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＭＳ培地等があげられる。
【００８４】
再分化培地は選抜薬剤を含んでもよい。再分化工程（ｖ）において使用可能な選抜薬剤は、選抜工程において定義したものと同様である。しかしながら、再分化工程において必ずしも選抜工程で用いた選抜薬剤と同じ選抜薬剤を用いなくともよい。その場合には、植物にはアグロバクテリウム菌から、２種類以上の選抜薬剤に対する耐性遺伝子が導入されている必要がある。
【００８５】
本発明における「再分化」とは、全部または一部が脱分化していた植物組織が、再び元の植物組織または植物体の性質を獲得することをいう。共存工程および／または選抜工程中にオーキシン類を使用すると、植物組織の全部または一部が脱分化する。したがって、再分化工程に供することにより、脱分化組織が再分化し、完全な形質転換植物体を得ることが可能となる。
【００８６】
再分化工程における「培養」とは、固化した再分化培地の上または液体状の再分化培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。本発明において、培地の形態は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。再分化培地の固化は、上記のように例えばアガロース等により行うことが可能である。再分化工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、再分化工程の培養は好ましくは１６−２４時間／日の照明下で行われるが、これに限定されない。再分化工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは７日−５６日、より好ましくは１４日−３５日である。
【００８７】
また、再分化工程（ｖ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば、１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ、１ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ、１μｍｏｌ／Ｌ  硫酸銅を含むＭＳ培地（非特許文献１３）や０．５ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、  １ｍｇ／Ｌ  インドール−３−酢酸（IAA）、０．１ｍｇ／Ｌ  チジアズロンを含む改良ＭＳ培地(非特許文献１２)を再分化培地として用いることなどがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
【００８８】
２．形質転換向上処理
また本発明の遺伝子導入方法と形質転換植物の作成方法において、以下に述べる形質転換向上処理を行ってもよい。本明細書において、「形質転換向上処理」とは、形質転換効率の向上を達成するための処理をいう。また、本明細書において「形質転換向上処理」とは、遺伝子導入効率を向上させる処理、カルス形成率を向上させる処理、および／または、再分化効率を向上させる処理を包含する概念である。
【００８９】
このような形質転換向上処理としては、限定されるものではないが、例えば以下のａ）ないしｋ）のいずれか１つの処理、あるいはこれらの組み合わせが含まれる。
【００９０】
ａ）熱処理；
ｂ）遠心処理；
ｃ）加圧処理；
ｄ）熱処理及び遠心処理；
ｅ）アグロバクテリウム菌の接種時および／または共存工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理；
ｆ）アグロバクテリウム菌の接種時および／または共存工程において硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理；
ｇ）レスティング工程において、Ｌ−プロリンおよび／またはＬ−アスパラギンを添加した培地を用いる処理；
ｈ）レスティング工程において、硝酸イオン濃度とリン酸イオン濃度を増加させた培地を用いる処理；
ｉ）レスティング工程において、ポリビニルポリピロリドン（PVPP）を添加した培地を用いる処理；
ｊ）レスティング工程において、６−ベンジルアミノプロリン（BAP）を添加した培地を用いる処理；ならびに
ｋ）再分化工程において、１ｍｇ／Ｌ  ナフタレン酢酸（NAA）、１ｍｇ／Ｌ  インドール−３−酢酸（IAA）、１ｍｇ／Ｌ  インドール−３−酪酸（IBA）、１μｍｏｌ／Ｌ  硫酸銅を含むＭＳ培地を用いる処理。
【００９１】
ｌ）再分化工程において、０．５ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、  １ｍｇ／Ｌ  インドール−３−酢酸（IAA）、０．１ｍｇ／Ｌ  チジアズロンを含む改良ＭＳ培地を用いる処理。
【００９２】
上記ａ）ないしｋ）の処理のうち、ａ）ないしｅ）はいずれも遺伝子導入効率を向上させる効果があり、ｂ）、ｅ）ないしｉ）はカルス形成率を向上させる効果があり、ｅ）、ｈ）およびｋ）は再分化効率を向上させる効果がある。ｊ）は、遺伝子導入効率、カルス形成率、または再分化効率のいずれの段階に効果があるのかについてまだ確認されていないが、結果として形質転換効率を向上させる効果がある。
【００９３】
熱処理は、例えばWO 1998/054961に記載の方法を用いて行うことができる。熱処理は本発明の工程（ｉ）または（ｉｉ）において行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に熱処理を行う場合、３３℃ないし６０℃、好ましくは３７℃ないし５２℃で、５秒間ないし２４時間、好ましくは１分間ないし２４時間、処理する。
【００９４】
遠心処理は、例えばWO 2002/012520に記載の方法を用いて行うことができる。遠心処理は本発明の工程（ｉ）ないし（ｉｖ）のいずれかの工程において行うことができる。植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に遠心処理を行う場合の条件は、例えば、１００Ｇないし２５万Ｇ、好ましくは、５００Ｇないし２０万Ｇ、更に好ましくは１０００Ｇないし１５万Ｇの遠心加速度で、１秒間ないし４時間、更に好ましくは１秒間ないし２時間処理することであってもよい。また、遠心処理を共存工程の後に行う場合の条件は、例えば、１００Ｇ−２５万Ｇ、５００Ｇ−２０万Ｇ、好ましくは１０００Ｇ−１５万Ｇ、最も好ましくは１１００Ｇ−１１万Ｇ程度の遠心加速度範囲で、１秒以上、好ましくは１秒間ないし４時間、より好ましくは１秒間ないし２時間、さらに好ましくは１秒間ないし１０分間、処理することであってもよい。遠心処理の時間は、遠心加速度に応じて適宜選択される。遠心処理時間は、遠心加速度が大きい場合には極く短い時間、例えば１秒以下でも遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。一方、遠心加速度が小さい場合には、遠心処理を長く行うことにより遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。なお、適切な遠心処理条件は、ルーチンな実験により容易に設定することができる。
【００９５】
加圧処理は、例えばWO 2005/017169に記載の方法を用いて行うことができる。加圧処理は本発明の工程（ｉ）ないし（ｉｖ）のいずれかの工程において行うことができる。加圧処理は、限定されるわけではないが、好ましくは１．７気圧ないし１０気圧の範囲、より好ましくは２．４気圧ないし８気圧の範囲で行われる。
【００９６】
熱処理および遠心処理は、例えばWO 2002/012521に記載の方法を用いて行う事ができる。熱処理および遠心処理の条件は、上述の熱処理および遠心処理についてそれぞれ記載した条件を採用しうる。
【００９７】
アグロバクテリウム菌の接種時および／または共存工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理は、例えばWO 2005/017152に記載の方法を用いて行うことができる。当該処理は本発明の工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）において行うことができる。当該処理は、例えば、銅イオンを含む金属塩を１μＭないし５０μＭ、好ましくは１μＭないし１０μＭの濃度で含む培地を用いて行い得る。金属塩は、例えば硫酸銅またはグルコン酸銅であってもよい。
【００９８】
アグロバクテリウム菌の接種時および／または共存工程において硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理は、例えば、Zhao, Z.-Y., et al., (2001) Mol. Breed., 8:323-333; 非特許文献２；および／またはIshida, Y., et al., (2003) Plant Biotechnology, 20:57-66に記載の方法を用いて行う事ができる。当該処理は、本発明の工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）において行う事ができる。当該処理は、例えば硝酸銀を１μＭないし５０μＭ、好ましくは１μＭないし１０μＭの濃度で含む培地を用いて行い得る。
【００９９】
レスティング工程において、以下：Ｌ−プロリンおよび／またはＬ−アスパラギンを添加した培地を用いる処理；硝酸イオン濃度とリン酸イオン濃度を増加させた培地を用いる処理；ポリビニルポリピロリドン（PVPP）を添加した培地を用いる処理；および、６−ベンジルアミノプロリン（BAP）を添加した培地を用いる処理；は、それぞれ例えば非特許文献９、１０、１１及び１２に記載の方法を用いて行うことができる。当該処理は本発明の工程（ｉｖ）において行うことができる。それぞれの物質の添加量は上述の非特許文献を参照して、当業者が適宜決定することができる。
【０１００】
再分化工程において、１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ、１ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ、１μｍｏｌ／Ｌ  硫酸銅を含むＭＳ培地を用いる処理は、例えば非特許文献１３に記載の方法を用いて行うことができる。また、０．５ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、  １ｍｇ／Ｌ  インドール−３−酢酸（IAA）、０．１ｍｇ／Ｌ  チジアズロンを含む改良ＭＳ培地を用いる処理は、例えば非特許文献１２に記載の方法を用いて行うことができる。当該処理は本発明の工程（ｖ）において行うことができる。
【０１０１】
当業者は、これらの形質転換向上処理を適切なタイミング・条件で行う事ができる。また、これらを適宜組み合わせることは、形質転換効率向上のために一層好ましい。
【０１０２】
３．本発明の方法による効果とその確認方法
本明細書において形質転換とは、導入した目的遺伝子が核ゲノムに組み込まれ安定的に発現している植物を得る工程をいう。本発明の形質転換植物の作成方法により、高い効率でソルガム属植物の形質転換を行うことができる。よって植物の形質転換効率の向上が達成される。
【０１０３】
形質転換工程は、具体的には、対象植物の細胞内への目的遺伝子の導入、遺伝子が導入された細胞を含む組織からのカルス形成、遺伝子が核ゲノムに組み込まれたカルスの再分化、といった工程を経る。
【０１０４】
本明細書において遺伝子導入とは、対象植物の細胞内に目的遺伝子を導入することをいう。本発明の遺伝子導入方法により、高い効率でソルガム属植物に遺伝子導入を行うことが可能となる。また、それにより高い効率でソルガム属の形質転換植物を作成することができる。
【０１０５】
さらには、カルス形成率や再分化効率の向上によっても、植物の形質転換効率の向上が可能となる。
【０１０６】
すなわち本明細書において「形質転換効率が高い」とは、高い効率で目的遺伝子が植物細胞へ導入されること（遺伝子導入効率が高い）、目的遺伝子が導入された植物組織からから高い効率でカルスが形成されること（カルス形成率が高い）、目的遺伝子が組み込まれたカルスから高い効率で再分化が起こること（再分化効率が高い）、を包含する概念である。また本明細書において「形質転換効率が向上する」とは、目的遺伝子の植物細胞への導入効率が向上すること、目的遺伝子が導入された植物組織からのカルス形成率が向上すること、目的遺伝子が組み込まれたカルスからの再分化効率が向上すること、を包含する概念である。
【０１０７】
本発明の形質転換植物の作成方法により、植物の形質転換効率の再現性が高い、形質転換の実験毎のバラツキが少ない、安定して形質転換植物を獲得できる、などの有利な効果も得ることができる。これらの効果も広義においては、上記の「形質転換効率が高い」、および「形質転換効率が向上する」、という概念に包含される。
【０１０８】
対象植物が形質転換されたか否かを決定するためのより確実な方法は、例えば、サザンハイブリダイゼーション法による植物染色体への導入遺伝子の組み込み、および後代植物での導入遺伝子の発現確認（後代への遺伝）などである。サザンハイブリダイゼーション法は広く知られた方法により行うことができ、例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) に記載される方法により行われる。また、後代植物における発現の確認はＧＵＳ遺伝子などのレポーター遺伝子の発現や除草剤抵抗性遺伝子などの選抜マーカー遺伝子の発現を調査する方法により実行可能である。具体的には非特許文献２に記載されているが、これに限定されるものではない。
【０１０９】
植物細胞に遺伝子導入がされたか否かは、遺伝子導入組織の一過性発現を観察することにより決定することができる。一過性発現とは、植物細胞の核内へ移行した目的遺伝子が、植物細胞のタンパク発現機構を利用して、ある一定期間発現する現象である。一過性発現の後、核内に移行した目的遺伝子のうちの一部が核ゲノムに組み込まれ、目的遺伝子が組み込まれた細胞は形質転換細胞として、目的遺伝子を安定的に発現し始める。
【０１１０】
一過性発現は公知の種々の方法により確認することができる。例えば、導入する遺伝子にＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子あるいはＧＦＰ遺伝子などのレポーター遺伝子を利用し、簡便な公知の方法でこれらのレポーター遺伝子の発現部位を目視することにより確認することが可能である。
【０１１１】
遺伝子導入効率は、例えば、目視により一過性発現を段階的にスコアリングすることにより評価することができる。例えば、後述の実施例のように、レスティング工程における未熟胚の胚盤組織のＧＵＳ遺伝子の発現を、青色を呈するスポットが０個の未熟胚はスコア０、１−１０個の未熟胚はスコア１、１１−４０個の未熟胚はスコア２、４１個から胚盤の１／３未満が青色を呈した未熟胚はスコア３、胚盤の１／３以上１／２未満が青色を呈した未熟胚はスコア４、胚盤の１／２以上が青色を呈した未熟胚はスコア５とした６段階で評価してもよい。
【０１１２】
また遺伝子導入効率は、当業者に一般に使用されている計算方法によっても決定することができる。例えば、遺伝子導入された植物組織数を、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織数で除することにより算出することが可能である。
【０１１３】
カルス形成率については、例えば、目視によりカルスが形成されたか否かを段階的に評価して平均値をとってもよい。例えば、後述の実施例のように未熟胚からのカルス形成を１（胚盤の半分以上がカルス化）、０．５（胚盤の一部がカルス化）、０（カルス形成なし）の３段階で評価してもよい（後述の実施例におけるカルス形成指数）。あるいは、カルスが形成された数を、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織数で除することにより算出してもよい。
【実施例】
【０１１４】
以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
【０１１５】
実施例１：高窒素共存培地の遺伝子導入に対する効果
材料および方法
開花後１４−２３日目のソルガム（品種：Tx430）の未熟胚を無菌的に採取し、アグロバクテリウム懸濁培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ  ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ  ピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ／Ｌ  チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／Ｌ  ミオ−イノシトール、１ｇ／Ｌ  カザミノ酸、１．５ｍｇ／Ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、６８．５ｇ／Ｌ  シュークロース、３６ｇ／Ｌ  グルコース、ｐＨ５．２；非特許文献５を参照）で１回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理（１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理および４３℃、３分間の熱処理）を行った。１００μＭ  アセトシリンゴンを含むアグロバクテリウム懸濁培地に約１．０×１０９  ｃｆｕ／ｍＬでアグロバクテリウムを懸濁し接種源とした。アグロバクテリウム菌株には、WO 2014/157541 A1のpLC41GWHのＴ−ＤＮＡ領域を、トウモロコシユビキチンプロモーターおよびイントロンで制御されヒマのカタラーゼイントロンが介在したＧＵＳ遺伝子（Ｐｕｂｉ−Ｉｕｂｉ−ＩＧＵＳ−Ｔｎｏｓ）、およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターで制御されたＢａｒ遺伝子（Ｐ３５Ｓ−bar-T35S）を有するＴ−ＤＮＡに改変したバイナリーベクター、およびWO 2014/157541 A1のブースターベクターを有するＥＨＡ１０５（pLC41 GUS-Bar::pVGW7）を使用した。前処理した未熟胚に接種源を加え、５分間室温で静置した。ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ  ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ  ピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ／Ｌ  チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／Ｌ  ミオ−イノシトール、７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン、１．５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、２０ｇ／Ｌ  シュークロース、１０ｇ／Ｌ  グルコース、５００ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１００μＭ  アセトシリンゴン、５μＭ  ＡｇＮＯ３、５μＭ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、８ｇ／Ｌ  寒天、ｐＨ５．８；非特許文献５を参照、ただしアスコルビン酸は除いた）、またはＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が２２−３６２ｍＭでありＬＳ無機塩を１／５倍量含む上記共存培地に、アグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤側が上になるように置床した。ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が２２−３６２ｍＭである培地は、ＮＨ４ＮＯ３を添加することによって調整した。２５℃、暗黒下で２日間培養した後、未熟胚をレスティング培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ  ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ  ピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ／Ｌ  チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／Ｌ  ミオ−イノシトール、１ｇ／Ｌ  カザミノ酸、３ｍｇ／Ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、３０ｇ／Ｌ  マルトース、７．５ｇ／Ｌ  ソルビトール、７．８μＭ  硫酸銅、１５０ｍｇ／Ｌ  チメンチン、３．５ｇ／Ｌ  ゲランガム、ｐＨ５．８）に置床し、２５℃、暗黒下で培養した。
【０１１６】
レスティング培地に置床後３日間培養した後、未熟胚を０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で１度洗浄し、１．０ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（X-gluc）を含むリン酸緩衝液に浸潤した。２８℃で２４時間反応させた後、顕微鏡下で観察し、青色を呈する胚盤組織の範囲を調査した。青色を呈するスポットが０個の未熟胚はスコア０、１−１０個の未熟胚はスコア１、１１−４０個の未熟胚はスコア２、４１個から胚盤の１／３未満が青色を呈した未熟胚はスコア３、胚盤の１／３以上１／２未満が青色を呈した未熟胚はスコア４、胚盤の１／２以上が青色を呈した未熟胚はスコア５とした。１試験区６−８未熟胚を使用し、試験は２回行った。
【０１１７】
結果
対照培地であるＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地を用いた時より、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６２ｍＭ−２６２．１ｍＭであり、ＬＳ無機塩を１／５倍量含む共存培地を用いた時の方がＧＵＳ遺伝子の一過性発現の平均スコアは高かった。よって、低無機塩培地であっても、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６２ｍＭ以上２６２．１ｍＭ以下の培地を用いることによって、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率が向上することが確認された。
【０１１８】
【表２】
2018027020.tif 000003
【０１１９】
実施例２：高Ｍｇ２＋共存培地の遺伝子導入に対する効果
材料および方法
ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＭｇ２＋濃度が０．６−１５０．４  ｍＭ  でありＬＳ無機塩を１／５倍量含む共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｍｇ２＋濃度が０．６−１５０．４ｍＭである培地は、ＭｇＳＯ４を添加することによって、調整した。１試験区６−７未熟胚を使用し、試験は２回行った。
【０１２０】
結果
Ｍｇ２＋のみを高濃度にした培地ではＭｇ２＋濃度が４．８ｍＭ−９０．４ｍＭである時、対照培地よりもＧＵＳ一過性発現の平均スコアは高くなった。高Ｍｇ２＋共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を向上させることが明らかになった。
【０１２１】
【表３】
2018027020.tif 000004
【０１２２】
実施例３：高Ｍｇ２＋および高Ｎ共存培地の遺伝子導入に対する効果
材料および方法
ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＭｇ２＋濃度が０．６−１５０．４ｍＭかつＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６２．０ｍＭであるＬＳ無機塩を１／５倍量含む共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｍｇ２＋濃度が０．６−１５０．４ｍＭである培地は、ＭｇＳＯ４を添加することによって、ＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６２．０ｍＭである培地は、ＮＨ４ＮＯ３を添加することによって調整し、作成した。１試験区８未熟胚を使用し、試験は２回行った。
【０１２３】
結果
高窒素条件では、Ｍｇ２＋濃度が２．６ｍＭ−９０．４ｍＭである時、対照培地と比較してＧＵＳ一過性発現の平均スコアは著しく高くなった。高Ｍｇ２＋高Ｎ共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の遺伝子導入効率を顕著に向上させることが明らかになった。
【０１２４】
【表４】
2018027020.tif 000005
【０１２５】
実施例４：高Ｋ＋および／または高Ｎ共存培地の遺伝子導入に対する効果
材料および方法
ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＫ＋濃度が８．０−２０４．４ｍＭでありＬＳ無機塩を１／５倍量含む上記共存培地、または上記Ｋ＋を様々な濃度含む培地にさらにＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６２．０ｍＭとなるように調整した共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｋ＋濃度が８．０−２０４．４ｍＭである培地は、Ｋ２ＳＯ４を添加することによって調整し、作成した。１試験区６−７未熟胚を使用し、試験は４回行った。
【０１２６】
結果
高窒素条件においてＫ＋濃度が２４．０ｍＭ−６４．１ｍＭである時、対照培地よりＧＵＳ一過性発現の平均スコアは著しく高くなった。高Ｋ＋高Ｎ共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の遺伝子導入効率を向上させることが明らかになった。
【０１２７】
【表５】
2018027020.tif 000006
【０１２８】
実施例５：高Ｃａ２＋および／または高Ｎ共存培地の遺伝子導入に対する効果
材料および方法
ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＣａ２＋濃度が１．２−９．６ｍＭでありＬＳ無機塩を１／５倍量含む上記共存培地、または上記Ｃａ２＋を様々な濃度含む培地にさらにＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６２．０ｍＭとなるように調整した共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｃａ２＋濃度が１．２−９．６  ｍＭである培地は、ＣａＳＯ４を添加することによって調整した。１試験区６−７未熟胚を使用し、試験は２回行った。
【０１２９】
結果
高窒素条件でＣａ２＋濃度が５．２ｍＭ−９．６ｍＭである時、対照培地よりＧＵＳ一過性発現の平均スコアは顕著に高くなった。よって、高Ｃａ２＋高Ｎ共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の遺伝子導入効率を著しく向上させることが明らかになった。
【０１３０】
【表６】
2018027020.tif 000007
【０１３１】
実施例６：高Ｎａ＋および／または高Ｎ共存培地の遺伝子導入に対する効果
材料および方法
ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＮａ＋濃度が０．６−２５０．０ｍＭでありＬＳ無機塩を１／５倍量含む上記共存培地、または上記Ｎａ＋を様々な濃度含む培地にさらにＮＨ４＋とＮＯ３−の合計濃度が６２．０ｍＭとなるように調整した共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｎａ＋濃度が０．６−２５０．０ｍＭである培地は、Ｎａ２ＳＯ４を添加することによって調整し、作成した。１試験区６−７未熟胚を使用し、試験は２回行った。
【０１３２】
結果
高窒素条件では、Ｎａ＋濃度が０．６ｍＭ−１５０．１ｍＭである時、ＧＵＳ一過性発現の平均スコアは高くなった。高Ｎａ＋共存培地、および高Ｎａ＋高Ｎ共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の遺伝子導入効率を向上させることが明らかになった。
【０１３３】
【表７】
2018027020.tif 000008