(57)【要約】【課題】高い感度および高い特異性での、個体における病原体、例えば結核菌の早期検出法が依然として必要とされている。【解決手段】  本発明は、対象における病原体由来の標的核酸を検出する方法に関する。この方法は、（ａ）対象由来の血液サンプルの無細胞画分から得られる標的核酸の核酸配列を増幅して二本鎖ＤＮＡを生成させるステップ、および（ｂ）二本鎖ＤＮＡを検出するステップを含む。二本鎖ＤＮＡの存在は対象における標的核酸の存在を示す。対象における病原体由来の標的核酸を検出するキットも提供する。【選択図】図３Ｂ
2018117645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ’）、（ａ）および（ｂ）の工程を含む、対象における結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ＴＢ）特異的無細胞核酸を検出する方法；
（ａ’）対象由来の血液サンプルの無細胞画分をプロテアーゼＫで処理する工程、
（ａ）前記プロテアーゼＫで処理した無細胞画分において、前記ＴＢ特異的無細胞核酸の核酸配列を増幅して二本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
（ｂ）前記二本鎖ＤＮＡを検出して、前記二本鎖ＤＮＡの存在により前記対象における前記ＴＢ特異的無細胞核酸の存在を検出する工程。
【請求項２】
工程（ａ’）の血液サンプルの無細胞画分が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ＴＢ）の細胞壁を破壊する処理の工程を経ていないものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＢ特異的無細胞核酸がＤＮＡである、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＢ特異的無細胞核酸がＲＮＡである、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記無細胞画分が血清である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記無細胞画分が血漿である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記核酸配列が、ＩＳ６１１０、ＩＳ１０８４、ＭＰＴ６４、ｒｒｓ、ｅｓａｔ６、ｅｓａｔ６−ｌｉｋｅ、ＭＤＲ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｉＢおよびこれらの断片からなる群から選択される結核菌（ＴＢ）Ｈ３７ＲｖのＤＮＡ配列に由来する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖ＤＮＡが４０〜１００ｂｐを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記血液サンプルの体積が０．２〜１０ｍＬである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記血液サンプルの体積が１〜１０ｍＬである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記血液サンプルの体積が２〜１０ｍＬである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記核酸配列を増幅する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
蛍光標識プローブ、インターカレーティング蛍光色素およびＬｉｇｈｔ Ｕｐｏｎ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＬＵＸ）のプライマーからなる群から選択される検出剤によって前記二本鎖ＤＮＡを検出する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記インターカレーティング蛍光色素がＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＣｙｔｏＧｒｅｅｎ、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ、ＢＯＸＴＯおよびＳＹＴＯ９からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）の前に、前記無細胞画分中で前記標的無細胞核酸を濃縮する工程をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ’）の前に、前記血液サンプルから前記無細胞画分を調製する工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
以下の（ａ’）、（ａ）および（ｂ）を含む、対象における結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ＴＢ）特異的無細胞核酸を検出するキット；
（ａ’）前記対象由来の血液サンプルの無細胞画分を処理するためのプロテアーゼＫ、
（ａ）前記プロテアーゼＫで処理した無細胞画分において前記ＴＢ特異的無細胞核酸の核酸配列を増幅して二本鎖ＤＮＡを生成させるための１または複数の試薬または材料、
（ｂ）前記二本鎖ＤＮＡを検出するための１または複数の試薬または材料。
【請求項１８】
前記（ａ’）の血液サンプルの無細胞画分が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ＴＢ）の細胞壁を破壊する処理の工程を経ていないものである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記核酸配列を増幅するための１または複数の試薬または材料が、１のプライマー対を含み、かつ、前記二本鎖ＤＮＡが４０〜１００ヌクレオチドを有する、請求項１８または請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記核酸配列が、ＩＳ６１１０、ＩＳ１０８４、ＭＰＴ６４、ｒｒｓ、ｅｓａｔ６、ｅｓａｔ６様、ＭＤＲ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｉＢおよびこれらの断片からなる群から選択される結核菌（ＴＢ）Ｈ３７ＲｖのＤＮＡ配列に由来する、請求項１７〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
前記二本鎖ＤＮＡを検出するための１または複数の試薬または材料が、インターカレーティング蛍光色素を含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容があらゆる目的で完全に本明細書に組み込まれる、２０１１年４月１日に出願された米国仮出願第６１／４７０，７７４号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は一般に、対象における病原体特異的核酸を検出するのに有用な方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの病原体感染は重症の疾患を引き起こす。個体における病原体の早期検出は、このような病原体と関係があることが知られている疾患または障害の診断および治療において重要な役割を果たす。結核は、様々なマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）株、通常結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって引き起こされる一般的な感染症である。多くの場合、それは致死性である。結核は、臨床サンプル（例えば、痰または膿）を微生物培養し、当該臨床サンプル中の結核菌を同定することによって明確に診断される。放射線医学（例えば、胸部レントゲン検査）、ツベルクリン皮膚検査、およびインターフェロンガンマ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）などの他の試験を用いた場合には、不確定な診断がなされる場合がある。
【０００４】
ポリマー連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、サンプル、例えば痰や尿、胃内吸引物、脳脊髄液、胸膜液、血液、あるいは膿瘍や骨髄、生検サンプル、摘出組織、経気管支生検に由来する材料における結核菌を検出して、早期ＴＢ診断をもたらすために使用されている。末梢血の白血球画分においてＴＢのＤＮＡを検出することにより、ある試験では全８サンプルで肺ＴＢ患者を確認し、別の試験では４１サンプル中３９サンプルでＴＢ患者を確認したことが報告されている。Ｓｃｈｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ３４４：２３２−３（１９９４）；Ｃｏｒｄｏｓ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ３４７：１０８２−５（１９９６）（非特許文献１）。しかしながら、これらの結果は、血液ベースのＰＣＲによるＴＢ診断を調査していた他の研究者によって批判された。Ｋｏｌｋ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ．、３４４：６９４（１９９４）（非特許文献２）；Ｐａｌｅｎｑｕｅ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ．３４４：１０２１（１９９４）（非特許文献３）；Ａｇｕａｄｏ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ．３４７：１８３６−７（１９９６）（非特許文献４）。最近２０年間で、ＴＢ診断用の「血液ベースのＴＢのＰＣＲによる」アッセイを利用するために多大な努力がなされているが、成功は非常に限られている。
【０００５】
身体中の大部分の核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は細胞内に位置するが、少量の核酸が個体の血漿中で遊離循環しているのが見られる。これらのＤＮＡおよびＲＮＡ分子は、その分解時に血中にそれらの内容物を放出する死細胞に由来すると考えられる。
【０００６】
ＤＮＡ病原体由来の標的ＲＮＡの検出を使用して、活動性感染と潜在性感染を区別することができる。例えば、結核菌（ＴＢ）由来の標的ＲＮＡの検出を使用して活動性ＴＢ感染と潜在性ＴＢ感染を区別することができ、ＴＢ診断に有用である。循環核酸（ＣＮＡ）は血流中に見られるＤＮＡまたはＲＮＡである。宿主末梢血において、母体末梢血由来の胎児ＤＮＡ、腫瘍由来、異種移植片由来、移植組織由来あるいは寄生虫由来の無細胞ＤＮＡや無細胞ＲＮＡが検出されるので、ＣＮＡ検出は、様々な臨床状態の非侵襲的診断として探求されている。残念ながらそれは、高い感度および高い特異性での病原体特異的循環核酸の検出に関して、首尾よく取り入れられているわけではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｈｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ３４４：２３２−３（１９９４）；Ｃｏｒｄｏｓ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ３４７：１０８２−５（１９９６）
【非特許文献２】Ｋｏｌｋ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ．、３４４：６９４（１９９４）
【非特許文献３】Ｐａｌｅｎｑｕｅ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ．３４４：１０２１（１９９４）
【非特許文献４】Ａｇｕａｄｏ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ．３４７：１８３６−７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、高い感度および高い特異性での、個体における病原体、例えば結核菌の早期検出法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る一態様によれば、対象における病原体由来の標的核酸を検出する方法を提供する。この方法は、対象由来の血液サンプルの無細胞画分から得られる標的核酸の核酸配列を増幅する工程を含む。それによって二本鎖ＤＮＡが生成する。この方法は、二本鎖ＤＮＡを検出する工程をさらに含む。二本鎖ＤＮＡの存在は対象における標的核酸の存在を示す。無細胞画分は、好ましくは血清、血漿、胸水またはＣＳＦ、より好ましくは血清または血漿である。
【００１０】
病原体は細菌、真菌および寄生虫からなる群から選択することができる。病原体は結核菌（ＴＢ）であることが好ましい。
【００１１】
標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。標的核酸の核酸配列は、例えばＩＳ６１１０、ＩＳ１０８４、ＭＰＴ６４、ｒｒｓ、ｅｓａｔ６、ｅｓａｔ６−ｌｉｋｅ、ＭＤＲ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｉＢおよびこれらの断片からなる群から選択される結核菌（ＴＢ）Ｈ３７ＲｖのＤＮＡ配列に由来してよい。
【００１２】
二本鎖ＤＮＡは１００ｂｐ未満、好ましくは４０〜６０ｂｐを有し得る。
【００１３】
対象由来の血液サンプルは、０．２〜１０ｍＬ、好ましくは２〜５ｍＬの量であってよい。
【００１４】
標的核酸の核酸配列は、ポリマー連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって増幅することができる。核酸配列はＰＣＲによって増幅することが好ましい。
【００１５】
二本鎖ＤＮＡは検出剤によって検出することができる。検出剤は、蛍光標識プローブ（例えば、タックマンプローブ（Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ）、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）、またはスコルピン（Ｓｃｏｒｐｉｎ）、インターカレーティング蛍光色素またはＬｉｇｈｔ Ｕｐｏｎ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＬＵＸ）のプライマーであってよい。検出剤はインターカレーティング蛍光色素であることが好ましい。インターカレーティング蛍光色素は、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＣｙｔｏＧｒｅｅｎ、Ｅｖａ  Ｇｒｅｅｎ、ＢＯＸＴＯおよびＳＹＴＯ９からなる群から選択することができる。
【００１６】
方法は、標的核酸を無細胞画分中で濃縮する工程をさらに含むことができる。
【００１７】
方法は、血液サンプルから無細胞画分を調製する工程をさらに含むことができる。
【００１８】
方法は、対象におけるＴＢ感染を診断する工程をさらに含むことができる。ＴＢ感染は活動性または潜在性であってよい。
【００１９】
本発明に係る別の態様によれば、対象における病原体由来の標的核酸を検出するキットを提供する。このキットは、対象由来の血液サンプルの無細胞画分から得られるＤＮＡまたはＲＮＡであってよい標的核酸の核酸配列を増幅して、二本鎖ＤＮＡを生成させるための、１または複数の試薬または材料を含む。このキットは、二本鎖ＤＮＡを検出するための１または複数の試薬または材料をさらに含む。病原体は細菌、真菌および寄生虫、好ましくは結核菌（ＴＢ）からなる群から選択することができる。核酸配列は、ＩＳ６１１０、ＩＳ１０８４、ＭＰＴ６４、ｒｒｓ、ｅｓａｔ６、ｅｓａｔ６−ｌｉｋｅ、ＭＤＲ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｉＢおよびこれらの断片からなる群から選択される結核菌（ＴＢ）Ｈ３７ＲｖのＤＮＡ配列に由来してよい。
【００２０】
標的核酸配列を増幅するための１または複数の試薬または材料は１のプライマー対を含むことができ、二本鎖ＤＮＡは４０〜６０ヌクレオチドを有することができる。プライマー対は、ＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＧＡＧ（配列番号１）およびＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＧＡＣＧＧ（配列番号２）の配列を有することができる。
【００２１】
二本鎖ＤＮＡを検出するための１または複数の試薬または材料は、蛍光標識プローブ（例えば、タックマンプローブ、モレキュラービーコンまたはスコルピン）、インターカレーティング蛍光色素またはＬｉｇｈｔ Ｕｐｏｎ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＬＵＸ）のプライマー、好ましくはインターカレーティング蛍光色素を含む。インターカレーティング蛍光色素は、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＣｙｔｏＧｒｅｅｎ、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ、ＢＯＸＴＯおよびＳＹＴＯ９からなる群から選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】鋳型としてＴＢゲノムＤＮＡを使用した短鎖増幅ｑＰＣＲ産物の増幅曲線（Ａ）および融解曲線（Ｂ）を示す図である。
【図２】サルの血漿におけるＴＢ検出用の短鎖増幅ｑＰＣＲ産物の増幅曲線（Ａ）および融解曲線（Ｂ）を示す図である。
【図３】ＴＢと臨床診断された６個体（ＴＢ、矢印Ａ）およびＴＢと臨床診断されなかった２個体（非ＴＢ、矢印Ｂ）由来の血漿画分を使用した、ヒト個体におけるＴＢ検出用の短鎖増幅ｑＰＣＲ産物の増幅曲線（Ａ）および融解曲線（Ｂ）を示す図である。
【図４】個体由来の胸水サンプルの無細胞画分（矢印Ａ）および同じ胸水サンプルの沈殿画分（矢印Ｂ）を使用した、ＴＢと臨床診断されたヒト個体におけるＴＢ検出用の短鎖増幅ｑＰＣＲ産物の増幅曲線（Ａ）および融解曲線（Ｂ）を示す図である。
【図５】各個体由来の血漿（ＰＳ）およびＣＦＳサンプルの無細胞画分を使用した、ＴＢと臨床診断された２人のヒト個体であるＡおよびＢにおけるＴＢ検出用の短鎖増幅ｑＰＣＲ産物の増幅曲線（Ａ）および融解曲線（Ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、結核菌などの病原体由来の対象における標的核酸を検出するための、新規な核酸増幅試験（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）（ＮＡＡＴ）の発見に基づく。
【００２４】
本発明は、対象における病原体由来の標的核酸を検出するための方法を提供する。この方法は、対象由来の生物サンプルの無細胞画分から得られる標的核酸の核酸配列を増幅する工程を含む。それによって二本鎖ＤＮＡが生成する。この方法は、二本鎖ＤＮＡを検出する工程をさらに含む。二本鎖ＤＮＡの存在は対象における標的核酸の存在を示す。
【００２５】
対象は、哺乳動物を含めた動物、例えばヒト、マウス、ウシ、ウマ、ニワトリ、イヌ、ネコおよびウサギであってよい。動物は農耕動物（例えば、ウマ、ウシおよびニワトリ）またはペット（例えば、イヌおよびネコ）であってよい。対象は、好ましくはヒトまたはマウス、より好ましくはヒトである。対象は雄または雌であってよい。対象は、新生児、子供または成人であってもよい。対象は、疾患もしくは内科的疾患に罹患しているか、または罹患しやすくなっている場合があり得る。
【００２６】
病原体は細菌、寄生虫および真菌からなる群から選択することができる。細菌は、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびより好ましくは梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・レプラ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、および炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、最も好ましくは結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であってよい。寄生虫はトリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、体内寄生性アメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、フィラリア属（Ｆｉｌａｒｉａｅ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉａ）、またはファシオラ属（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、およびより好ましくはトリコモナス原虫（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ジアルジア・インテスティナリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、クリプトスポリジウム・パルバ（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖａ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、フィラリア属（Ｆｉｌａｒｉａｅ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉａ）、およびファシオラ・ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｅｐａｔｉｃａ）であってよい。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「核酸」は、２つ以上のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。それはＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。変異体の核酸は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば欠失、挿入または置換されたヌクレオチドを有すること以外、元の核酸の配列と同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。変異体は、元の核酸のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列を有する可能性がある。
【００２８】
本明細書中で使用する用語「由来」は原型または供給源を指し、天然のもの、組換えにより生じたもの、精製していないものもしくは精製したものを挙げることができる。原型核酸由来の核酸は、原型核酸を一部または全部含むことができ、それは原型核酸の断片または変異体であってよい。
【００２９】
本発明に係る方法中の「標的核酸」は、検出される核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡである。生物に由来する標的核酸は、その生物の配列に由来しその生物に特異的な配列を有するポリヌクレオチドである。病原体由来の標的核酸は、その特異的病原体由来のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを指す。例えば、標的核酸は結核菌（ＴＢ）Ｈ３７Ｒｖ株に由来してよく、Ｈ３７Ｒｖ株に特異的な配列を含む。適切なＴＢ Ｈ３７Ｒｖ株特異的配列の例としては、ＩＳ６１１０、ＩＳ１０８４、ＭＰＴ６４、ｒｒｓ、ｅｓａｔ６、ｅｓａｔ６−ｌｉｋｅ、ＭＤＲ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｉＢの配列およびこれらの断片を挙げることができる。標的核酸は任意の長さであってよく、好ましくは約３０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは約４０〜１００ヌクレオチドを有し得る。
【００３０】
生物サンプルは、対象から得られる任意のサンプルであってよい。生物サンプルの例としては、体液、細胞および組織を挙げることができる。体液は、血清または血漿、粘膜（鼻漏液および粘液含む）、腹膜液、胸水、胸部排液、唾液、尿、滑液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腹腔穿刺液、腹腔液、腹水、または心膜液であってよい。生物サンプルは血液サンプルであることが好ましい。対象由来の生物サンプルは、任意の体積、例えば約０．２〜１０ｍＬ、好ましくは約０．５〜１０ｍＬ、より好ましくは約２〜１０ｍＬ、最も好ましくは約２〜５ｍＬであってよい。無細胞画分は、好ましくは血清、血漿、胸水、またはＣＳＦ、より好ましくは血清または血漿である。
【００３１】
本明細書中で使用する用語生物サンプルの「無細胞画分」は、実質的に無細胞である生物サンプルの画分を指す。本明細書中で使用する用語「実質的に無細胞」は、１ｍＬ当たり約２０，０００個未満の細胞、好ましくは１ｍＬ当たり約２，０００個未満の細胞、より好ましくは１ｍＬ当たり約２００個未満の細胞、最も好ましくは１ｍＬ当たり約２０個未満の細胞を含む生物サンプルからの調製物を指す。無細胞画分は、宿主のゲノムＤＮＡを実質的に含まない可能性がある。宿主のゲノムＤＮＡは、対象に由来する（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００ｋｂより長い）大きなＤＮＡ片である。例えば、対象由来の生物サンプルの無細胞画分は、１ｍＬ当たり約１，０００ｎｇ未満、好ましくは１ｍＬ当たり約１００ｎｇ未満、より好ましくは１ｍＬ当たり約１０ｎｇ未満、最も好ましくは１ｍＬ当たり約１ｎｇ未満の宿主のゲノムＤＮＡを含むことができる。
【００３２】
本発明に係る方法は、生物サンプルから無細胞画分を調製する工程をさらに含むことができる。無細胞画分は、当技術分野で知られている従来技法を使用して調製することができる。例えば、血液サンプルの無細胞画分は、約３〜３０分、好ましくは約３〜１５分、より好ましくは約３〜１０分、最も好ましくは約３〜５分、約２００〜２０，０００×ｇ、好ましくは約２００〜１０，０００×ｇ、より好ましくは約２００〜５，０００×ｇ、最も好ましくは約３５０〜４，５００×ｇの低速で、血液サンプルを遠心分離することによって得ることができる。生物サンプルを限外濾過によって得て、細胞およびそれらの断片と可溶性ＤＮＡまたはＲＮＡを含む無細胞画分を分離することができる。従来、限外濾過は０．２２μｍの膜フィルターを使用して行われる。
【００３３】
本発明に係る方法は、標的核酸を生物サンプルの無細胞画分中で濃縮（または富化）する工程をさらに含むことができる。標的核酸は、高塩濃度の存在下での固相吸着法、フェノール−クロロホルムによる有機抽出法、次にエタノールもしくはイソプロピルアルコールを用いた沈殿法、または高塩濃度または７０〜８０％エタノールもしくはイソプロピルアルコールの存在下での直接的沈殿法などの、当技術分野で知られている従来技法を使用して濃縮することができる。濃縮標的核酸は、無細胞画分中のそれより少なくとも約２、５、１０、２０または１００倍を超えて濃縮することができる。標的核酸は、濃縮されていようといまいと、本発明に係る方法に従う増幅に使用することができる。
【００３４】
当技術分野で知られている様々な方法を使用して、標的核酸の配列を増幅し二本鎖ＤＮＡを生成することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって配列を増幅することができる。標的核酸の配列は、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって増幅することが好ましい。プライマー対は、標的核酸の望ましい配列を増幅して望ましい長さの二本鎖ＤＮＡを生成するように設計することができる。例えば、プライマー対はＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＧＡＧ（配列番号１）およびＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＧＡＣＧＧ（配列番号２）の配列を有することができる。二本鎖ＤＮＡは、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０または３０未満のヌクレオチドを有することができる。例えば二本鎖ＤＮＡは、約３０〜７０ｂｐ、好ましくは約４０〜６０ｂｐを有することができる。
【００３５】
二本鎖ＤＮＡは、当技術分野で知られている様々な技法によって検出することができる。例えば、二本鎖ＤＮＡは検出剤によって検出することができる。検出剤は、蛍光標識プローブ（例えば、タックマンプローブ、モレキュラービーコンまたはスコルピン）、インターカレーティング蛍光色素またはＬｉｇｈｔ Ｕｐｏｎ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＬＵＸ）のプライマーからなる群から選択することができる。検出剤はインターカレーティング蛍光色素であることが好ましい。インターカレーティング蛍光色素は、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＣｙｔｏＧｒｅｅｎ、ＬＣＧｒｅｅｎ、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ、ＢＯＸＴＯまたはＳＹＴＯ９であってよい。
【００３６】
本発明に係る方法は、対象における標的核酸のコピー数を定量化する工程をさらに含むことができる。例えば、標的核酸の配列はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって増幅することができる。知られているコピー数および検出蛍光で、標準核酸について検量線を確定することができる。検量線を基にして、標的核酸のコピー数をｑＰＣＲ後の蛍光レベルに基づき決定することができる。
【００３７】
本発明に係る方法は、対象における病原体による感染の診断をさらに含むことができる。例えば、病原体感染（例えば、ＴＢ感染）は活動性または潜在性であり得る。病原体（例えば、細菌、寄生虫または真菌）由来のＲＮＡの検出を使用して、活動性感染と潜在性感染を区別することができる。例えば、結核菌（ＴＢ）由来の標的ＲＮＡの検出を使用して活動性ＴＢ感染と潜在性ＴＢ感染とを区別することができ、したがって活動性または潜在性ＴＢ感染の診断に貢献することができる。その方法は、例えば少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の高い感度をもたらすことができる。その方法は、例えば少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の高い特異性をもたらすことができる。
【００３８】
本発明に係る検出法用に、様々な検出キットを提供する。対象における病原体由来の標的核酸を検出するためのキットを提供する。このキットは、（ａ）対象由来の生物サンプルの無細胞画分から得られる標的核酸の核酸配列を増幅して二本鎖ＤＮＡを生成させるための１または複数の試薬または材料、および（ｂ）二本鎖ＤＮＡを検出するための１または複数の試薬または材料を含む。生物サンプルは血液サンプルであることが好ましい。
【００３９】
本発明に係るキットでは、１または複数の増幅試薬または材料は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０または３０未満のヌクレオチドを有する二本鎖核酸を生成するのに適したプライマー対を含むことができる。二本鎖ＤＮＡは、約３０〜７０塩基対（ｂｐ）、好ましくは約４０〜６０ｂｐを有することができる。プライマーは、病原体に特異的な標的配列を増幅するように設計することができる。標的配列は、例えばＩＳ６１１０、ＩＳ１０８４、ＭＰＴ６４、ｒｒｓ、ｅｓａｔ６、ｅｓａｔ６−ｌｉｋｅ、ＭＤＲ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｉＢおよびこれらの断片からなる群から選択される結核菌（ＴＢ）Ｈ３７Ｒｖに特異的な配列であってよい。例えば、プライマー対はＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＧＡＧ（配列番号１）およびＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＧＡＣＧＧ（配列番号２）の配列を有することができる。
【００４０】
本発明に係るキットでは、１または複数の検出試薬または材料は、蛍光標識プローブ（例えば、タックマンプローブ、モレキュラービーコンまたはスコルピン）、インターカレーティング蛍光色素およびＬＵＸのプライマーからなる群から選択される検出剤を含むことができる。検出剤はインターカレーティング蛍光色素であることが好ましい。インターカレーティング蛍光色素は、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＣｙｔｏＧｒｅｅｎ、ＬＣＧｒｅｅｎ、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ、ＢＯＸＴＯまたはＳＹＴＯ９であってよい。
【００４１】
本発明に係るキットは、生物サンプル（例えば、血液サンプル）から無細胞画分を調製するための１または複数の試薬または材料を、例えば約０．２〜１０ｍＬ、好ましくは約０．５〜１０ｍＬ、より好ましくは約２〜１０ｍＬ、最も好ましくは約２〜５ｍＬの量、さらに含むことができる。無細胞画分は、例えば１ｍＬ当たり約２０，０００個未満の細胞、好ましくは１ｍＬ当たり約２，０００個未満の細胞、より好ましくは１ｍＬ当たり約２００個未満の細胞、最も好ましくは１ｍＬ当たり約２０個未満の細胞を含み、実質的に無細胞であってもよい。無細胞画分は、宿主のゲノムＤＮＡを実質的に含まなくてもよい。宿主のゲノムＤＮＡは、対象に由来する（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００ｋｂより長い）大きなＤＮＡ片である。例えば、対象由来の生物サンプルの無細胞画分は、１ｍＬ当たり約１，０００ｎｇ未満、好ましくは１ｍＬ当たり約１００ｎｇ未満、より好ましくは１ｍＬ当たり約１０ｎｇ未満、最も好ましくは１ｍＬ当たり約１．０ｎｇ未満の宿主のゲノムＤＮＡを含むことができる。
【００４２】
本発明に係るキットは、無細胞画分から標的核酸を単離または精製するための、１または複数の試薬または材料をさらに含むことができる。標的核酸は、無細胞画分中のそれより少なくとも約２、５、１０、２０または１００倍を超えて濃縮することができる。標的核酸は、濃縮されていようといまいと、本発明に係る方法に従う増幅に使用することができる。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「約」は、例えば量、割合などの測定可能な値を指すとき、指定値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％およびさらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、このような変動は適切である。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１＞  プライマー設計
プライマー設計プログラムＰｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）を、ＴＢ検出用の全プライマーの設計に使用した。ＴＢゲノムＤＮＡ配列と特異的に相補的であるプライマーを設計するため、結核菌Ｈ３７Ｒｖ株の完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９６２）を参照として使用した。ヒトゲノムＤＮＡと特異的に相補的であるプライマーに関しては、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからの参照配列としてヒトゲノムを使用した。
【００４５】
ＴＢ  Ｈ３７ｒｖ株に特異的な核酸を増幅するために設計した様々なアンプリコンサイズのプライマーを、ＳＹＢＲｑＰＣＲ反応と融解曲線解析を使用して最適化した。それらは、アガロースゲル（３％）電気泳動において非特異的ＤＮＡ産物やプライマーダイマーを含まない正確なサイズのＤＮＡバンドを確認することにより、さらに立証することができる。例示的なＴＢプライマーを表１中に示す。
【００４６】
例示的なＴＢプライマー
【表１】
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【００４７】
＜実施例２＞  リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＴＢ  Ｈ３７ＲｖゲノムＤＮＡの一連の１０倍希釈物を、リアルタイムｑＰＣＲ反応における鋳型として使用した。ＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＧＡＧ（配列番号１）およびＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＧＡＣＧＧ（配列番号２）の配列を有するプライマー対を使用して、ＴＢ  Ｈ３７ＲｖゲノムＤＮＡにおける標的配列であるＩＳ６１１０挿入配列を増幅した。使用したＰＣＲ反応プログラムは、９５℃３分、次に「蛍光検出しながら９４℃１０秒、６０℃１０秒、７２℃３０秒」の４０サイクル、ならびに６０℃〜９５℃の融解期を含んでいた。１，０００，０００、１，０００および１０コピーの標的核酸に関して作製した増幅曲線（図１Ａ）は、サイクル数が増大するほど蛍光が大きくなり、増幅配列のコピー数が低減するほど閾値サイクル数（Ｃｔ値）が小さくなることを示した。Ｃｔ値対コピー数の検量線を増幅曲線に基づいて作製することができ、ｑＰＣＲ条件下で適切なプライマー対を使用して生成したｑＰＣＲ産物の蛍光に基づいて、サンプル中の任意の特異的核酸のコピー数を定量化するのに有用であった。融解曲線（図１Ｂ）は、１，０００，０００、１，０００または１０コピーの標的核酸についての特異的ピークを示し（矢印Ａ）、鋳型が存在しなかったとき（すなわち、０コピーのとき）には特異的ピークは示さなかった。非特異的ノイズピークやプライマーダイマーのノイズピークは示さなかった。
【００４８】
＜実施例３＞  サル血液試料におけるＴＢ検出
予備実験では、６匹のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）に、５０ＣＦＵおよび５００ＣＦＵ／対象でＴＢ（結核菌Ｈ３７Ｒｖ株）を接種した（各感染群２匹ずつおよびコントロール群２匹）。実験中、ツベルクリン検査（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ ＯＴ、Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ Ｃｒｏｐ．ＣＡ）、ＴＢ抗体、サイトカイン放出、刺激性ＩＦＮ−γについての免疫検査を定期的に実施した。実験の終了時に、病理検査およびＴＢ培養用にサルからサンプルを回収した。全血サンプルも２週間に１回回収した。
【００４９】
全血を６週後および８週後に回収し、すぐに２画分、血漿と血液細胞に遠心分離した。末梢血白血球細胞（ＰＷＢＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離機（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｍｏ．）によってさらに分離した。分離した画分はすぐに−８０℃に凍結した。これらの血液画分は、ｑＰＣＲ定量化によるＴＢ ＤＮＡの単離に使用した。シリカ膜遠心分離カラム、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｍｉｄｉキット（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−ｔｅｋ、Ｉｎｃ．、ＧＡ）を用いて試料からＴＢ ＤＮＡを抽出した。全血、ＰＷＢＣおよび血漿画分から抽出したＤＮＡは、実施例２に記載したｑＰＣＲプロトコールに従いｑＰＣＲ定量化ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、ＣＡ）用の鋳型として使用した。血漿（Ａ）、ＰＷＢＣ（Ｂ）および全血（Ｃ）に関する増幅曲線（図２Ａ）は、ＰＷＢＣ（Ｂ）または全血（Ｃ）のそれより血漿（Ａ）について、はるかに低いＣｔ値を示した。融解曲線（図２Ｂ）は、血漿（Ａ）について特異的単一ピーク、ならびにＰＷＢＣ（Ｂ）および全血（Ｃ）について幾つかの非特異的ピークを示した。
【００５０】
＜実施例４＞  ヒト血液試料におけるＴＢ検出
臨床サンプルを９２個体から得た（研究室での通常の臨床試験後に廃棄するよう準備した）。それらの中で、７４個体がＴＢであると臨床的に診断され、１８個体がＴＢではないと臨床的に診断された。これらの１８個体の中で、１５個体に他の疾患があると診断された。
【００５１】
臨床サンプルには、血液サンプル、胸水および脳脊髄液（ＣＳＦ）が含まれていた。約５ｍＬの末梢血サンプルを、抗凝固剤ＥＤＴＡＫ２を含む血清回収チューブまたは血漿回収チューブ中に回収した。１，６００×ｇ、１０分間の遠心分離によって血清と血漿とを分離した。血清と血漿の画分はすぐに−２０℃に凍結した。胸水とＣＳＦは、抗凝固剤ＥＤＴＡＫ２有りまたは無しのチューブ中に回収し、５，０００×ｇ、１０分間での遠心分離によって無細胞画分と沈殿とに分離した。血漿（ＰＳ）、胸水およびＣＳＦの無細胞画分、ならびに胸水およびＣＳＦの細胞成分画分（沈殿）は、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を用いて溶解、変性およびプロテナーゼＫによる消化を行った後に、核酸抽出に使用した。実施例２に記載したプロトコールに従いＴＢ検出を実施した。ＴＢであると臨床的に診断された６個体由来の血漿（ＰＳ）画分（ＴＢ血漿画分、矢印Ａ）、およびＴＢではないと臨床的に診断された２個体由来の血漿（ＰＳ）画分（非ＴＢ血漿画分、矢印Ｂ）についての増幅曲線（図３Ａ）と融解曲線（図３Ｂ）とを、典型的な定量比較として示す。血液サンプルの無細胞画分におけるＩＳ６１１０のＴＢ特異的短鎖核酸断片（図３Ｂ）を実施例２に記載した検量線を用いて定量化したところ、ＴＢ血漿画分では１ｍＬ当たり約２０〜４０コピーであり、非ＴＢ血漿画分では１ｍＬ当たり０コピーであった。
【００５２】
ＴＢ特異的核酸を、ＴＢであると臨床的に診断された個体の胸水の無細胞画分において検出したが（図４Ａ、矢印Ａ）、同じ胸水サンプルの沈殿画分においては検出しなかった（図４Ａ、矢印Ｂ）。さらに、沈殿画分は十分な非特異的ＰＣＲ産物を示す（図４Ｂ、矢印Ｂ）。
【００５３】
ＴＢであると臨床的に診断された２個体であるＡおよびＢ由来の、ＰＳおよびＣＳＦサンプルの無細胞画分を分析した。図５Ａは、個体ＡおよびＢ由来の無細胞画分（ＰＳ対ＣＳＦ）において検出した、比較可能なレベルのＴＢ由来ＤＮＡ断片を示す。図５Ｂは、ＴＢ ＤＮＡ断片のＩＳ６１１０アンプリコンの特異的融解ピークを示し、非特異的ＰＣＲ産物は認められなかった。
【００５４】
無細胞画分ＴＢ特異的核酸の検出のためのｑＰＣＲを使用した検出結果をＴＢ臨床診断と比較したところ（表２）、約９１％の感度（６７／７４）および約８３％の特異性（１５／１８）を示した。
【００５５】
無細胞ＮＡのｑＰＣＲ対臨床診断
【表２】
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【００５６】
標的ＴＢ特異的核酸を定量化した。Ｃｔ値が４０を超えるサンプルは、標的ＴＢ特異的核酸を有しない（０コピー有する）とし、Ｃｔ値が３６〜４０であるサンプルは、標的ＴＢ特異的核酸を１コピー有するとした。
【００５７】
Ｃｔ値が３６未満のサンプルについては、実施例１に記載した検量線を用いて標的ＴＢ特異的核酸のコピー数を決定した。ＴＢであると臨床的に診断し標的ＴＢ特異的核酸に陽性反応を示した６７個体の中で、標的ＴＢ特異的核酸の平均コピー数は画分１ｍＬ当たり２４２．６±５３１．８であった。ＴＢではないと臨床的に診断されたが標的ＴＢ特異的核酸に陽性反応を示した３個体の中では、標的ＴＢ特異的核酸の平均コピー数は画分１ｍＬ当たり１６．２±１６．２であった。
【００５８】
本明細書に引用した全ての文書、書籍、マニュアル、論文、特許、公開特許出願、ガイド、要約、および／または他の参照文献は、その全容が参照によって組み込まれる。本発明に係る他の実施形態は、本明細書に開示する本明細書の考慮事項および本発明に係る実践から当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は単なる例示的なものと考え、本発明に係る真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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