(57)【要約】【課題】シミ等と相関性の高い遺伝子を見出し、高精度にシミ又はソバカスの発生リスクを鑑別する方法、及び前記鑑別結果に基づき化粧品を選択する方法を提供する。【解決手段】被験者について、下記遺伝子群のいずれかの遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを特徴とする、黄色人種の皮膚におけるシミ又はソバカスの発生確率を鑑別する方法。（遺伝子群）ＤＥＮＮＤ１Ａ、Ｓ１００ＰＢＰ、ＳＭＹＤ３、ＵＧＴ１Ａ８、ＫＩＡＡ０８２５、ＧＣＨ１、ＳＰＴＢＮ１、ＡＢＲ、ＳＢＦ２、ＳＦＳＷＡＰ、ＥＨＦ、ＳＷＡＰ７０【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者について、下記遺伝子群のいずれかの遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを特徴とする、黄色人種の皮膚におけるシミ又はソバカスの発生リスクを鑑別する方法。
（遺伝子群）
ＤＥＮＮＤ１Ａ、Ｓ１００ＰＢＰ、ＳＭＹＤ３、ＵＧＴ１Ａ８、ＫＩＡＡ０８２５、ＧＣＨ１、ＳＰＴＢＮ１、ＡＢＲ、ＳＢＦ２、ＳＦＳＷＡＰ、ＥＨＦ、ＳＷＡＰ７０
【請求項２】
被験者において、表１に記載の各遺伝子における一塩基多型のいずれかのマイナーアレルが検出された場合に、前記被験者は該一塩基多型のメジャーアレルを有する人に比べてシミ又はソバカスの発生リスクが低いと判定する、請求項１に記載の方法。
【表１】
2018078848.tif 000009
【請求項３】
被験者において、表２に記載の各遺伝子における一塩基多型のいずれかのマイナーアレルが検出された場合に、前記被験者は該一塩基多型のメジャーアレルを有する人に比べてシミ又はソバカスの発生リスクが高いと判定する、請求項１に記載の方法。
【表２】
2018078848.tif 000010
【請求項４】
黄色人種の複数人に対して行った、シミ又はソバカスに関する解析結果と前記一塩基多型のいずれかのマイナーアレルの存在確認結果とに基づいて算出された、前記一塩基多型の存否ごとのシミ又はソバカスの発生確率に、
被験者の前記一塩基多型のいずれかのマイナーアレルの存在確認結果を照らすことを含み、
前記被験者にマイナーアレルが存在する一塩基多型のシミ又はソバカスの発生確率を、前記被験者の発生確率であると判定する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記シミ又はソバカスの発生確率が、前記一塩基多型の存否ごとに算出されたシミ又はソバカスの発生確率に基づくオッズ比で示される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により鑑別された結果に基づいて、美白作用を有する化粧品を選択することを特徴とする、化粧品の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子変異に基づいてシミ発生リスクを鑑別する方法に関する。また、シミ発生リスクの鑑別結果に基づいて化粧品を選択する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
シミやソバカス等の皮膚の色素沈着症状は、顔の見た目に大きな影響を与えるため、その予防や改善に対する関心は高い。
従来、種々の作用機序による美白剤が開発されており、消費者は好みや所望の効果に応じて化粧料を選択することができる。その選択をより各人に適したものとし、適切な肌の手入れをサポートするものとして、シミやソバカス等の発生しやすさを予測することが提案されている。例えば、シミの原因となる過剰なメラニン量を細胞又は皮膚レベルで測定し、解析することにより、シミの程度や発生しやすさを評価する方法が知られている。また、遺伝的要因の解析による方法も提案されており、特許文献１にはヒトメラノサイト刺激ホルモン１受容体に係る特定のアミノ酸配列の変異がシミやソバカスの発生確率と相関していることに基づく、シミ等の発生確率を鑑別する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４８１７６６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に示されるように、シミ等の発生しやすさには先天的な要因が存すると推測されるところ、シミ等と相関性の高い遺伝子を指標とすれば、高い精度での鑑別が可能になると考えられる。したがって、本発明は、シミ等と相関性の高い遺伝子を見出し、高精度にシミ又はソバカスの発生リスクを鑑別する方法を提供することを目的とする。また、前記鑑別結果に基づき化粧品を選択する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、黄色人種においてシミ等と相関性の高い遺伝子群を見出し、該遺伝子群の各遺伝子における一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ）の存否を指標としてシミ等の発生リスクを鑑別することができることに想到し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]被験者について、下記遺伝子群のいずれかの遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを特徴とする、黄色人種の皮膚におけるシミ又はソバカスの発生リスクを鑑別する方法。
（遺伝子群）
ＤＥＮＮＤ１Ａ、Ｓ１００ＰＢＰ、ＳＭＹＤ３、ＵＧＴ１Ａ８、ＫＩＡＡ０８２５、ＧＣＨ１、ＳＰＴＢＮ１、ＡＢＲ、ＳＢＦ２、ＳＦＳＷＡＰ、ＥＨＦ、ＳＷＡＰ７０
[２]被験者において、表１に記載の各遺伝子における一塩基多型のいずれかのマイナーアレル（Minor Allele）が検出された場合に、前記被験者は該一塩基多型のメジャーアレル（Major Allele）を有する人に比べてシミ又はソバカスの発生リスクが低いと判定する、[１]に記載の方法。
【０００７】
【表１】
2018078848.tif 000002
【０００８】
[３]被験者において、表２に記載の各遺伝子における一塩基多型のいずれかのマイナーアレルが検出された場合に、前記被験者は該一塩基多型のメジャーアレルを有する人に比べてシミ又はソバカスの発生リスクが高いと判定する、[１]に記載の方法。
【０００９】
【表２】
2018078848.tif 000003
【００１０】
[４]黄色人種の複数人に対して行った、シミ又はソバカスに関する解析結果と前記一塩基多型のいずれかのマイナーアレルの存在確認結果とに基づいて算出された、前記一塩基多型の存否ごとのシミ又はソバカスの発生確率に、被験者の前記一塩基多型のいずれかのマイナーアレルの存在確認結果を照らすことを含み、前記被験者にマイナーアレルが存在する一塩基多型のシミ又はソバカスの発生確率を、前記被験者の発生確率であると判定する、[２]又は[３]に記載の方法。
[５]前記シミ又はソバカスの発生確率が、前記一塩基多型の存否ごとに算出されたシミ又はソバカスの発生確率に基づくオッズ比で示される、[４]に記載の方法。
[６][１]〜[５]のいずれかに記載の方法により鑑別された結果に基づいて、美白作用を有する化粧品を選択することを特徴とする、化粧品の選択方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、黄色人種においてシミ等と相関性の高い遺伝子群が示される。これらの遺伝子における各ＳＮＰの存否を指標とすることにより、高精度にシミ等の発生リスクを鑑別する方法が提供される。さらに、前記これにより、個人に適した化粧料を選択する際や、肌の手入れや化粧方法に関するカウンセリングの際に有用な情報を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｓ１００ＰＢＰの発現阻害による、細胞数あたりのメラニン量の変化を表すグラフ。
【図２】ＳＭＹＤ３の発現阻害による、細胞数あたりのメラニン量の変化を表すグラフ。
【図３】ＳＰＴＢＮ１の発現阻害による、細胞数あたりのメラニン量の変化を表すグラフ。
【図４】ＡＢＲの発現阻害による、細胞数あたりのメラニン量の変化を表すグラフ。
【図５】ＳＢＦ２の発現阻害による、細胞数あたりのメラニン量の変化を表すグラフ。
【図６】ＳＦＳＷＡＰの発現阻害による、細胞数あたりのメラニン量の変化を表すグラフ。
【図７】ＤＥＮＮＤ１Ａの発現阻害による、メラノサイト数の変化を表すグラフ。
【図８】ＥＨＦの発現阻害による、ＰＧＥ２量の変化を表すグラフ。
【図９】ＵＧＴ１Ａ８の発現阻害による、ＰＧＥ２量の変化を表すグラフ。
【図１０】ＳＷＡＰ７０の発現阻害による、ＰＧＥ２量の変化を表すグラフ。
【図１１】ＧＣＨ１の発現阻害による、ＰＧＥ２量の変化を表すグラフ。
【図１２】ＫＩＡＡ０８２５の発現阻害による、ケラチノサイト数の変化を表すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明するが、各項目の態様は以下の説明に限定されるものではなく、また、複数の態様を任意に組み合わせた場合も本発明に含まれるものとする。
【００１４】
本発明は、黄色人種の皮膚におけるシミ又はソバカスの発生リスクを鑑別する方法であり、被験者について、下記遺伝子群のいずれかの遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを特徴とする。
下記遺伝子群は、後述の実施例で得られた解析結果に基づいて、シミ又はソバカスの発生確率と有意な相関性を有する「シミ関連遺伝子」であると判断されたものである。
（遺伝子群）
ＤＥＮＮＤ１Ａ、Ｓ１００ＰＢＰ、ＳＭＹＤ３、ＵＧＴ１Ａ８、ＫＩＡＡ０８２５、ＧＣＨ１、ＳＰＴＢＮ１、ＡＢＲ、ＳＢＦ２、ＳＦＳＷＡＰ、ＥＨＦ、ＳＷＡＰ７０
【００１５】
さらに、前記シミ関連遺伝子は、後述の実施例での検証により、シミ又はソバカスの発生亢進に関与する「シミ亢進遺伝子」と、発生抑制に関与するもの「シミ抑制遺伝子」とに分類される。
（シミ亢進遺伝子）
ＤＥＮＮＤ１Ａ、ＡＢＲ、ＳＢＦ２
（シミ抑制遺伝子）
Ｓ１００ＰＢＰ、ＳＭＹＤ３、ＵＧＴ１Ａ８、ＫＩＡＡ０８２５、ＧＣＨ１、ＳＰＴＢＮ１、ＳＦＳＷＡＰ、ＥＨＦ、ＳＷＡＰ７０
【００１６】
前記遺伝子群に含まれる各遺伝子のヒトの塩基配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等から取得することができる。また、前記遺伝子群に含まれる各遺伝子には、それぞれ１個又は２個以上のＳＮＰが存在することが知られており、それぞれ固有の番号（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ ＩＤ ｎｕｍｂｅr：ＲＳ）でＮＣＢＩに登録されており、その多型部位のゲノム上の位置やその近郊の配列をｄｂＳＮＰデータベース等から取得することができる。
従来、これらのＳＮＰｓとシミ又はソバカスの発生リスクとの相関関係は知られてこなかった。
【００１７】
本発明の好ましい態様では、前記遺伝子群に含まれるいずれかの遺伝子のいずれかのＳＮＰを検出し、それがマイナーアレルである場合に、シミ又はソバカスの発生リスクが低い又は高いと判定する。
より具体的には、表１に記載の各遺伝子におけるＳＮＰのいずれかのマイナーアレルが検出された場合に、前記被験者は該一塩基多型のメジャーアレルを有する人に比べてシミ又はソバカスの発生リスクが低いと判定することが好ましい。
【００１８】
【表３】
2018078848.tif 000004
【００１９】
あるいは、表２に記載の各遺伝子におけるＳＮＰのいずれかのマイナーアレルが検出された場合に、前記被験者は該一塩基多型のメジャーアレルを有する人に比べてシミ又はソバカスの発生リスクが高いと判定することが好ましい。
【００２０】
【表４】
2018078848.tif 000005
【００２１】
本発明において検出するＳＮＰは、１個でもよいし、任意の２個以上でもよい。鑑別の精度を上げる観点から２個以上のＳＮＰの検出が好ましく、より好ましくは表１に記載のＳＮＰから２個以上、又は表２に記載のＳＮＰから２個以上を検出する。
【００２２】
本発明におけるＳＮＰの検出は、具体的には多型部位の塩基種の決定をいう。この際に、必ずしも当該部位についてＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのいずれの塩基であるかを判別しなくてもよく、既知のＳＮＰのマイナーアレルの塩基「ではない」こと又はメジャーアレルの塩基「ではない」ことが判別する程度であってもよい。
【００２３】
多型部位の塩基種を決定する方法は、種々の公知の方法を利用すればよく、とくに限定されない。
例えば、ＰＣＲ法を応用した解析方法として、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、Ａｃｙｃｌｏ
Ｐｒｉｍｅ法、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法等が実用化されている。また、ＰＣＲに依らない方法として、Ｉｎｖａｄｅｒ法やＲＣＡ法等が知られている。さらにＤＮＡアレイを用いる方法も適用できる。これらの方法に用いるプライマーやプローブとなるオリゴヌクレオチドは、検出対象となるＳＮＰを含む遺伝子の既知の塩基配列等から適宜設計することができる。
【００２４】
本発明におけるＳＮＰの検出に用いる試料としては、ＳＮＰ検出が可能なＤＮＡを調製できる限りにおいて特に限定されず、例えば、血液、口腔粘膜、唾液、毛髪、眉毛等が挙げられる。試料からのＤＮＡの調製は、試料に適した手法を適用でき、それぞれ市販のキットを用いれば簡便である。
【００２５】
本発明により判定されるシミ発生リスクは、シミに限らずシミやソバカスを含む皮膚の局所的な色素沈着症状の発生しやすさのことであり、通常は確率として数値で表される。
なお、色素沈着症状が発生する皮膚の部位は、顔面、四肢、頸部、胴部等、特に限定されないが、通常は顔面のシミ発生リスクについて鑑別を行う。
【００２６】
本発明の方法では、黄色人種の複数人のパネルに対して行った、シミ又はソバカスに関する解析結果と前記一塩基多型のいずれかのマイナーアレルの存在確認結果とに基づいて算出された、前記一塩基多型の存否ごとのシミ又はソバカスの発生確率を予め用意しておき、この発生確率に、被験者の前記一塩基多型のいずれかのマイナーアレルの存在確認結果を照らすことによって行われることが好ましい。このとき、前記被験者にマイナーアレルが存在する一塩基多型のシミ又はソバカスの発生確率を、前記被験者の発生確率であると判定する。
【００２７】
前述の複数人のパネルに対するシミ又はソバカスに関する解析は、例えば、シミの程度を複数段階の数値で表したシミスコアで判定して、シミの多少／大小グループに分ける手法が挙げられる。また、例えば、若年（例えば４０歳未満）でシミが発生しているグループと、高年（例えば５０歳以上）でシミが発生していないグループとで分ける手法も挙げられる。
前述の複数人のパネルに含まれるパネラーは、特に限定されないが、好ましくは３０名以上、より好ましくは５０名以上、さらに好ましくは１００名以上であることが、解析の正確性を確保するため好ましい。また、性別は男女混合でもよいが、男性のみ女性のみとしてもよい。
【００２８】
前述の発生確率を予め用意する際の解析には、ＳＰＳＳ社やＳＡＳ社等の市販されているソフトウェアやフリーソフト等の解析ソフトを適宜用いることができる。
前記発生確率は、前記一塩基多型の存否ごとに算出されたシミ又はソバカスの発生確率
に基づくオッズ比で示されることが好ましい。
【００２９】
本発明により判定されたシミ発生リスク（発生確率）は、化粧品を選択する際の指標として利用することができる。ここで選択される化粧品は、通常は美白作用を有する化粧品であり、より具体的には、メラニン産生抑制作用、メラニン蓄積抑制作用、メラニン排出促進作用、メラニン分解促進作用、肌代謝促進作用など、種々の美白用化粧品を含む。通常は、鑑別結果においてシミ発生リスクが高い場合に、より作用・効果が強い美白用化粧品を選択する。
また、本発明により判定されたシミ発生リスク（発生確率）の結果は、肌の手入れ（スキンケア）や化粧方法に関するカウンセリングにおいても有用な指標となり得る。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
＜試験例１＞
シミの発生しやすさと関連する遺伝子を抽出すべく、以下の手順によってＧｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ（ＧＷＡＳ）を行った。
日本人女性ボランティアを対象として、「４０歳未満でシミを有すること」をシミが発生しやすい人の条件として設定し、「５０歳以上でシミを有さない人」をシミが発生しにくい人の条件として設定した。皮膚科専門医の診断のもと、各条件に該当する、シミが発生しやすい群１５６名及びシミが発生しにくい群１３３名を、それぞれ選定した。選定した２８９名から採取した血液から定法によりＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡ及び遺伝型解析用チップＨｕｍａｎ Ｏｍｉｎｉ Ｅｘｐｒｅｓｓ−２４（イルミナ社製）を用いて、各対象者の遺伝型を判定した。判定結果を群間比較し、シミが発生しやすい人とシミが発生しにくい人との間で遺伝型が異なる箇所（ＳＮＰ）を抽出した。それらについてＰＬＩＮＫ（Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira MAR, Bender D, et al.PLINK:
a tool set for whole-genome association and population-basedlinkage analyses. Am J Hum Genet. 2007;81:559-75.）を使用して相関解析を行った。χ２乗検定によるＰ値が１０−４以下となるＳＮＰを含む遺伝子を、シミの発生しやすさと統計学的に有意に関連する「シミ関連遺伝子」と判断した。なお、Ｐ値が小さいほど、当該ＳＮＰはシミ発生リスクとの統計学的に有意に高い関連度を有することを示す。また、各シミ関連遺伝子に含まれるＳＮＰにおけるマイナーアレルのオッズ比を算出した。
【００３２】
オッズ比が１より小さいＳＮＰ、すなわち当該ＳＮＰにおいてマイナーアレルを有すると、シミ発生リスクが低いと有意に判定されるＳＮＰを、これを含むシミ関連遺伝子とともに表３に示す。例えば、Ｓ１００ＰＢＰ遺伝子のｒｓ１０９１４６２５のＳＮＰにおいて、Ａを有する場合は、Ｃを有する場合に比べてシミ発生リスクが０．４７８４倍高いと判定される。
【００３３】
【表５】
2018078848.tif 000006
【００３４】
オッズ比が１より大きいＳＮＰ、すなわち当該ＳＮＰにおいてマイナーアレルを有すると、シミ発生リスクが高いと有意に判定されるＳＮＰを、これを含むシミ関連遺伝子とともに表４に示す。例えば、ＡＢＲ遺伝子のｒｓ８９４６３３のＳＮＰにおいて、Ａを有する場合は、Ｃを有する場合に比べてシミ発生リスクが３．５５６倍高いと判定される。
【００３５】
【表６】
2018078848.tif 000007
【００３６】
＜試験例２＞
試験例１でＧＷＡＳによってシミ等の発生リスクと相関するＳＮＰが存在することが判明した各遺伝子について、その発現とシミとの関連性を検証した。
【００３７】
（１）メラニン産生量に与える影響
メラノサイトにおけるＳ１００ＰＢＰ、ＳＭＹＤ３、ＳＰＴＢＮ１、ＡＢＲ、ＳＢＦ２、又はＳＦＳＷＡＰの発現を、ｓｉＲＮＡを用いて抑制したときの、細胞数あたりのメラニン産生量を測定した。
メラニン量の測定は、１４Ｃチオウラシルの取り込みを指標として行った。チオウラシルは、メラニン産生過程においてメラニン中間体に結合する性質を有し、特異的にメラニンに取り込まれることが知られている（Whittaker JR., J Biol Chem. 1971 Oct 25;246(20):6217-26.、Dencker L., et al., Acta Pharmacol Toxicol (Copenh). 1981 Aug;49(2):141-9.、Palumbo A. et al., Biochim Biophys Acta. 1990 Dec 6;1036(3):221-7.、及びPalumbo A. et al., Biochim Biophys Acta. 1994 Aug 18;1200(3):271-6.参照）。そ
のため、メラニンに取り込まれたチオウラシル量は、生成されたメラニン量に比例すると考えられる。これを利用して、Broxtermanらの方法（Broxterman HJ et al., Cancer Res. 1983 Mar;43(3):1316-20.）を参考に、正常ヒトメラノサイトに２−［２−１４Ｃ］チ
オウラシルを添加して、培養し、生成メラニンに結合した２−［２−１４Ｃ］チオウラシルの放射活性を測定することにより、メラニン産生量を測定した。
【００３８】
具体的な手順は、以下の通りである。
１日目：ヒト正常メラノサイト（Lot. 1223150（新生児由来メラノサイト、Male、Dark/African American））に、ネッパジーン社製NEPA 21を使用してエレクトロポレーション法にてｓｉＲＮＡを導入した。コントロールとしてはNon-coding siRNAを用いた。該メラノサイトを１２ウェルプレートに播種し（８．０×１０４ cells/ウェル）、Ｏ／Ｎ培養
した。
２日目：培養したメラノサイトに、１４Ｃチオウラシルを添加し（０．５μＣｉ／ウェル）、７２時間培養した。
５日目：プレートから培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後、ウェル中に培地を用いて２０倍希釈したテトラゾリウム塩ＷＳＴ−８試薬（Cell Counting Kit-8; 同仁化学研究
所）を１０００μＬ/ウェル添加し、ＣＯ２インキュベーターにて２時間反応させた。プ
レートリーダーで４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度を測定し、該測定値の差（Abs.450
−Abs.650）を細胞数として％／コントロールを算出した。
その後、プレートからＷＳＴ−８入り培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後、ウェル中に１００％ ＴＣＡを１２０μＬ添加した。細胞が剥がれたことを確認した後、水を５０
０μＬ添加し、エッペンチューブに回収した。細胞回収後のウェルに水を６００μＬ添加し、前記エッペンチューブに追加回収して混合した後、４℃で３０分静置した。１．５万ｒｐｍで５分遠心後、上清を除去し、１０％ＴＣＡを添加し、４℃で３０分静置した。次いで、１．５万ｒｐｍで５分遠心後、上清を除去し、液体シンチレーションカクテルを１ｍＬ添加して混合した後、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定し、メラニン産生量として％／コントロールを算出した。
結果を図１〜６に示す。
【００３９】
（２）細胞増殖に与える影響
メラノサイトにおけるＤＥＮＮＤ１Ａの発現を、ｓｉＲＮＡを用いて抑制したときの、メラノサイト数を測定した。
メラノサイト数の測定には、前述の（１）と同様に、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８試薬（Cell Counting Kit-8; 同仁化学研究所）を用いた。ＷＳＴ−８試薬は、細胞内の脱水
素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成する。生細胞数と生成するホルマザンの量は直線的な比例関係にあるため、このホルマザンの極大吸収波長である４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、生細胞数を測定することができる（Cell Counting Kit-8 - 細胞増殖／細胞毒性測定用試薬 - Technical Manual, 同仁化学研究所, 2007.参照）。
【００４０】
具体的な手順は、以下の通りである。
１日目：ヒト正常メラノサイト（Lot. 1223150（新生児由来メラノサイト、Male、Dark/African American））に、ネッパジーン社製NEPA 21を使用してエレクトロポレーション法にてｓｉＲＮＡを導入した。コントロールとしてはNon-coding siRNAを用いた。該メラノサイトを１２ウェルプレートに播種し（８．０×１０４ cells/ウェル）、９６時間培
養した。
５日目：プレートから培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後、ウェル中に培地を用いて２０倍希釈したＷＳＴ−８試薬を１０００μＬ/ウェル添加し、ＣＯ２インキュベーター
にて２時間反応させた。プレートリーダーで４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度を測定し、該測定値の差（Abs.450−Abs.650）を細胞数として％／コントロールを算出した。
結果を図７に示す。
【００４１】
（３）ＰＧＥ２に与える影響
ケラチノサイトにおけるＥＨＦ、ＵＧＴ１Ａ８、ＳＷＡＰ７０、又はＧＣＨ１の発現を、ｓｉＲＮＡを用いて抑制したときの、ＰＧＥ２量を測定した。
紫外線に暴露されたケラチノサイトは、その培養上清にＰＧＥ２を産生・放出することが知られている（Gilchrest BA. et al., Photochem Photobiol. 1996 Jan;63(1):1-10.
、Nordlund JJ. et al., J. Invest Dermatol. 1989 Apr;92(4 Suppl):53S-60S.、及びTomita Y. et al., Dermatologica. 1989;179 Suppl 1:49-53.参照）。放出されたＰＧＥ２はメラノサイトを活性化し、メラニンを産生させるため、ＰＧＥ２量はシミ等発生の指標となる。
【００４２】
具体的な手順は、以下の通りである。
１日目：ヒト正常ケラチノサイト（Lot. 00702（成人由来ケラチノサイト、Female、Hispanic、45才））を２４ウェルプレートに播種し（６．０×１０４ cells/ウェル）、２
４時間Ｏ／Ｎ培養した。
２日目：抗生物質不含のＨｕＭｅｄｉａ ＫＧ２培地に交換し（４５０μＬ/ウェル）、
ｓｉＲＮＡ mixを５０μＬ/ウェル添加して、２４時間培養した。なお、ｓｉＲＮＡ ｍｉｘは、Opti-mem ２５μＬに対してLipofectamine3000 １μＬとなるように、必要量を混
合したものと、Opti-mem ２５μＬに対してsiRNA（２０μＭ）１．５μＬとなるように、必要量を混合したものとを等量ずつ混合し、さらに室温にて５分間静置することにより調製した。
３日目：培地をＰＢＳに置換し、ＳＷＡＰ７０ ｓｉＲＮＡ又はＧＣＨ１ ｓｉＲＮＡ導入のウェルにはＵＶＢ ０／５０ｍＪ／ｃｍ２を照射した。一方、ＥＨＦ ｓｉＲＮＡ又はＵＧＴ１Ａ８ ｓｉＲＮＡ導入のウェルには紫外線を照射しなかった。次いで、抗生物質
不含のＨｕＭｅｄｉａ ＫＧ２培地に交換した（５００μＬ/ウェル）。
４日目：紫外線照射から２４時間後、上清を回収して、Prostaglandin E2 EIA Kit -monoclonal（Cayman Chemical Company, Cat. No. 514010）を用いてＰＧＥ２量を測定した。
結果を図８〜１１に示す。
【００４３】
（４）細胞増殖に与える影響
ケラチノサイトにおけるＫＩＡＡ０８２５の発現を、ｓｉＲＮＡを用いて抑制したときの、ケラチノサイト数を測定した。
ケラチノサイト数の測定には、前述の（１）（２）と同様に、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８試薬（Cell Counting Kit-8; 同仁化学研究所）を用いた。
【００４４】
具体的な手順は、以下の通りである。
１日目：ヒト正常ケラチノサイト（Lot. 00702（成人由来ケラチノサイト、Female、Hispanic、45才））を２４ウェルプレートに播種し（４．０×１０４ cells/ウェル）、２
４時間Ｏ／Ｎ培養した。
２日目：抗生物質不含のＨｕＭｅｄｉａ ＫＧ２培地に交換し（４５０μＬ/ウェル）、ｓｉＲＮＡ mixを５０μＬ/ウェル添加して、７２時間培養した。なお、ｓｉＲＮＡ ｍｉｘは、Opti-mem ２５μＬに対してLipofectamine3000 １μＬとなるように、必要量を混
合したものと、Opti-mem ２５μＬに対してsiRNA（２０μＭ)１．５μLとなるように、必要量を混合したものとを等量ずつ混合し、さらに室温にて５分間静置することにより調製した。
５日目：プレートから培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後、ウェル中にＨｕＭｅｄｉａ ＫＧ２培地を用いて２０倍希釈したＷＳＴ−８試薬を５００μＬ/ウェル添加し、ＣＯ２インキュベーターにて２時間反応させた。プレートリーダーで４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度を測定し、該測定値の差（Abs.450−Abs.650）を細胞数として％／コントロールを算出した。
結果を図１２に示す。
【００４５】
（１）〜（４）の結果から、試験例１で見出された各遺伝子の発現が、シミ発生に関与することが分かる。特に、ＤＥＮＮＤ１Ａ、ＡＢＲ、及びＳＢＦ２については、その発現が抑制されるとシミ発生が抑制されると推測されることから、シミ等の発生亢進に関与する遺伝子（シミ亢進遺伝子）であると考えられる。また、Ｓ１００ＰＢＰ、ＳＭＹＤ３、ＵＧＴ１Ａ８、ＫＩＡＡ０８２５、ＧＣＨ１、ＳＰＴＢＮ１、ＳＦＳＷＡＰ、ＥＨＦ、及びＳＷＡＰ７０については、その発現が抑制されるとシミ発生が亢進すると推測されることから、シミ等の発生抑制に関与する遺伝子（シミ抑制遺伝子）であると考えられる。表５に、これらの遺伝子及びそのＳＮＰとシミ発生リスクとの分類についてまとめた。
【００４６】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明により、高精度にシミ等の発生リスクを鑑別する方法が提供される。これにより、個人に適した化粧料を選択する際や、肌の手入れや化粧方法に関するカウンセリングの際に有用な情報を得ることができるので産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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