(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３仲介疾患または障害（アレルギー性喘息およびアレルギー性皮膚炎を含む）を治療または予防するための抗体の提供。【解決手段】新規なＩＬ−４に特異的に結合するヒト化抗体及びＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化抗体及びそれらのフラグメント並びにＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する新規な二重特異性抗体及びそれらのフラグメント。抗体が抗体フラグメントであり、特定のアミノ酸配列からなる、可変軽鎖域及び、特定のアミノ酸配列からなる可変重鎖配列を含み、更に定常領域のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、ＩｇＧ抗体である抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−４に特異的に結合するヒト化抗体。
【請求項２】
配列番号３からなる可変軽鎖領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号４および配列番号５からなる群から選択される可変重鎖領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が抗体フラグメントである、代替法の請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
定常領域のＣH1、ＣH2およびＣH3領域を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１０】
ＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化抗体。
【請求項１１】
配列番号１からなる可変軽鎖領域を含む請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号２からなる可変重鎖領域を含む請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が抗体フラグメントである、代替法の請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
定常領域のＣH1、ＣH2およびＣH3領域を含む、代替法の請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１０に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９】
ＩＬ−１３およびＩＬ−４に特異的に結合する二重特異性抗体または二重特異性抗体フラグメント。
【請求項２０】
可変軽鎖および可変重鎖をさらに含む請求項１９に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント。
【請求項２１】
可変軽鎖がアミノ酸配列  配列番号１および配列番号３を含む、請求項２０に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント。
【請求項２２】
可変重鎖がアミノ酸配列  配列番号２および配列番号５を含む、請求項２０に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント。
【請求項２３】
可変重鎖がアミノ酸配列  配列番号２および配列番号４を含む、請求項２０に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント。
【請求項２４】
可変軽鎖がアミノ酸配列  配列番号１および配列番号３を含み、そして前記可変重鎖がアミノ酸（ａｎｉｍｏ  ａｃｉｄ）配列  配列番号２および配列番号４を含む、請求項２０に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント。
【請求項２５】
配列番号１および配列番号３がペプチドリンカーで一緒に連結され、そして前記配列番号２および配列番号４がペプチドリンカーで一緒に連結されている、請求項２４に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント。
【請求項２６】
ペプチドリンカーが配列番号６からなる、請求項２５に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント。
【請求項２７】
ＩＬ−１３およびＩＬ−４に特異的に結合する二重特異性抗体であり、ここで可変軽鎖は配列番号１および配列番号３を含み、そして可変重鎖は配列番号２および配列番号４を含み、そして定常領域をさらに含む、二重特異性抗体。
【請求項２８】
定常領域がＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬからなる、請求項２７に記載の二重特異性抗体。
【請求項２９】
請求項１または請求項１０に記載のヒト化抗体、および薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
代替法の請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント、および薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
さらにエフェクター分子に複合している、請求項１または１０に記載のヒト化抗体。
【請求項３２】
エフェクター分子が異種ポリペプチド、薬物、放射性ヌクレオチドおよび毒素からなる群から選択される、請求項３１に記載のヒト化抗体。
【請求項３３】
さらにエフェクター分子に複合している代替法の請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメント。
【請求項３４】
エフェクター分子が異種ポリペプチド、薬物、放射性ヌクレオチドおよび毒素からなる群から選択される、請求項３３に記載の二重特異性抗体またはフラグメント。
【請求項３５】
哺乳動物のアレルギー性疾患を治療する方法であって、該哺乳動物に治療有効量の代替法の請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、上記方法。
【請求項３６】
哺乳動物のアレルギー性疾患を治療する方法であって、該哺乳動物に治療有効量の請求項１または１０に記載のヒト化抗体を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項３７】
がんを治療する方法であって、哺乳動物に治療有効量の代替法の請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、上記
方法。
【請求項３８】
がんを治療する方法であって、哺乳動物に治療有効量の請求項１または１０に記載のヒト化抗体を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項３９】
哺乳動物の喘息を治療する方法であって、該哺乳動物に治療有効量の代替法の請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、上記方法。
【請求項４０】
哺乳動物の喘息を治療する方法であって、該哺乳動物に治療有効量の請求項１または１０に記載のヒト化抗体を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項４１】
哺乳動物のＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の異常生産に関連する疾患を治療する方法であって、該哺乳動物に治療有効量の代替法の請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、上記方法。
【請求項４２】
哺乳動物のＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の異常生産に関連する疾患を治療する方法であって、該哺乳動物に治療有効量の請求項１または１０に記載のヒト化抗体を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項４３】
哺乳動物のＴＨ−２仲介反応を抑制する方法であって、該哺乳動物に治療有効量の代替法の請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、上記方法。
【請求項４４】
哺乳動物のＴＨ−２仲介反応を抑制する方法であって、該哺乳動物に治療有効量の請求項１または１０に記載のヒト化抗体を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項４５】
請求項２７に記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４７】
請求項４５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項４８】
ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体である、請求項６に記載の抗体。
【請求項４９】
ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗−ＩＬ−４抗体、抗−ＩＬ−１３抗体および二重特異性抗−ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３抗体ならびに哺乳動物（ヒトを含む）における不適切なＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の活性化または代謝をもたらす疾患または障害の改善、治療または予防におけるそれらの使用に関する。目的の抗体は、リガンド、例えばＩＬ−４またはＩＬ−１３の連結および／またはシグナル伝達を受容体または受容体複合、例えばＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２で阻害し得る。目的の抗体を含む予防的、免疫治療的および診断的組成物ならびに哺乳動物（ヒトを含む）におけるリンパ細胞および非リンパ細胞（単球、線維芽細胞および内皮細胞を含む）の不適切な代謝および／または活性化によって引き起こされる疾患を予防または治療する方法におけるそれらの使用が開示される。このような疾患としては、炎症により引き起こされるか、または炎症を特徴とする自己免疫不全（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）および自己免疫疾患、例えば、アレルギー性喘息およびアレルギー性皮膚炎が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−４（ＩＬ−４）は、リンパ球Ｂ細胞およびＴ細胞、ならびに多くの非リンパ細胞（単球、内皮細胞および線維芽細胞を含む）に対する広範囲の生物学的効果を有する多面サイトカイン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）である。例えば、ＩＬ−４は、いくつかのＩＬ−２−およびＩＬ−３−依存性細胞株の増殖を刺激し、休止Ｂ細胞上のクラスＩＩの主要組織適合性複合体分子の発現を誘導し、そしてヒトＢ細胞によるＩｇＧ４およびＩｇＥの分泌を増加させる。ＩＬ−４はＴｈ２−型免疫応答に関連し、そしてＴｈ２細胞により生産され、そしてＴｈ２細胞の分化を促進する。ＩＬ−４は多数の障害、例えば、アレルギーおよび喘息に関与する。
【０００３】
ＩＬ−１３は、活性化Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および活性化後のマスト細胞により分泌される、最近になって同定された１１２アミノ酸のサイトカインである（非特許文献１、および非特許文献２）。
【０００４】
ＩＬ−４と共有したその多数の生物学的特性の理由により、ＩＬ−１３はＩＬ−４−様サイトカインとして記載されている。その活性は、Ｂ細胞（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）、単球（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）および他の非造血細胞（非特許文献１１、および非特許文献１２）に対するＩＬ−４の活性と実に類似している。ＩＬ−４に反して、他方では、休止または活性化Ｔ細胞に対する特異的効果を発揮しない（非特許文献１３）。
【０００５】
単球／マクロファージ、Ｂリンパ球および特定の造血前躯体に対するＩＬ−１３の種々の生物活性はＡ．Ｊ．Ｍｉｎｔｙにより、さらにＩＬ−１３に関する論文のレビューにおいて、詳細に記載されている。さらに、いくつかのデータは、このサイトカインが他の細胞型に対する多面効果を有することを示す。ＩＬ−１３の影響を直接受けるこれらの非造血細胞は、内皮細胞および小グリア細胞、ケラチノサイトならびに腎臓および結腸がんである。
【０００６】
細胞内の生体分子により伝達されるシグナルの分析における段階の１つは、その膜受容体を同定することにある。この目的を達成するために、ＩＬ−１３受容体上で実施した調査研究は、ＩＬ−１３およびＩＬ−４が一般的な受容体、またはどう少なく見積もっても、一般的な受容体複合体のいくつかの成分、さらに一般的なシグナル伝達要素を有することを示している（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）
。この受容体は、考えられる細胞型に従って変動し得る数で種々の細胞型の表面に存在する。ＩＬ−１３およびＩＬ−４受容体の比較分布は、Ａ．Ｊ．Ｍｉｎｔｙ（非特許文献１８）によって示されている。
【０００７】
細胞表面受容体および受容体複合体は、異なる親和性でＩＬ−４および／またはＩＬ−
１３に結合する。ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に結合する受容体および受容体複合体の主成分は、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３ＲαｌおよびＩＬ−１３Ｒα２である。これらの鎖は、単量体またはＩＬ−  ４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒαｌ（ＩＩ型  ＩＬ−４Ｒ）またはＩＬ−４Ｒα／ｃ（Ｉ型  ＩＬ−４Ｒ）のヘテロ二量体として細胞の表面上に発現される。ＩＬ−４Ｒα単量体およびＩＬ−４Ｒ／ｃヘテロ二量体はＩＬ−４に結合するが、ＩＬ−１３には結合しない。ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２単量体はＩＬ−１３に結合するが、ＩＬ−４には結合しない。ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１ヘテロ二量体はＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方に結合する（非特許文献１９）。
【０００８】
Ｔｈ２−型免疫応答は、抗体生産および液性免疫を促進し、そして細胞外病原体を撃退するために作られる。Ｔｈ２細胞はＩｇ生産（液性免疫）のメディエーターであり、そしてＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を生産する（非特許文献２０）。Ｔｈ２−型免疫応答は、特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）および特定のタイプの抗体（ＩｇＥ、ＩｇＧ４）の生成により特徴付けられ、そしてなみだ目および喘息症状（例えば、気道炎症および肺の気道筋細胞の収縮）をもたらし得るアレルギー反応に特有である。
【０００９】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方は、それらの生物学的機能に基づいて、治療的に重要なサイトカインであり、そして多くの疾患（喘息を含む）で重要な役割を果たす（非特許文献２１）。ＩＬ−４は自己免疫疾患を阻害し得ることが示されており、そしてＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方が抗−腫瘍免疫応答を増強する可能性を示している。両方のサイトカインはアレルギー性疾患の原因に関与するので、これらのサイトカインの阻害剤は治療的有用性を提供し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｉｎｔｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，２４８−２５０
【非特許文献２】ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ａ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９９３，９０，３７３５−３７３９
【非特許文献３】Ｄｅｆｒａｎｃｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４，１７９，１３５−１４３
【非特許文献４】Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９９３，９０，３７３０−３７３４
【非特許文献５】Ｆｉｏｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，１９９４，５，５９３−６００
【非特許文献６】Ｍｕｚｉｏ，Ｍ．Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９４，８３，１７３８−１７４３
【非特許文献７】Ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９３，１５１，６３７０−６３８１
【非特許文献８】Ｄｏｙｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４，１４４１−１４４５
【非特許文献９】Ｍｏｎｔａｎｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９３，１７８，７４３−７４７
【非特許文献１０】Ｓｏｚｚａｎｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，５０８４−５０８８
【非特許文献１１】Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．，１９９３，３２８，２６８−２７０
【非特許文献１２】Ｄｅｒｏｃｑ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．１９９４，３４３，３２−３６
【非特許文献１３】Ｚｕｒａｗｕｋｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９９４，１５，１９−２６
【非特許文献１４】Ｚｕｒａｗｓｋｉ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９３，１２，２６６３−２６７０
【非特許文献１５】Ａｖｅｒｓａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９３，１７８，２２１３−２２１８
【非特許文献１６】Ｖｉｔａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，３５１２−３５１７
【非特許文献１７】Ｌｅｆｏｒｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６６，１２２−１２６
【非特許文献１８】Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３  ｆｏｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｄｓ  Ｄ．Ｇ．Ｒｅｍｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｆｒｉｅ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９９６
【非特許文献１９】Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９９，６９，１３−２０
【非特許文献２０】Ｔａｎａｋａ，ｅｔ，ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２５１−  ２７２，Ｓｎａｐｐｅｒ，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）
【非特許文献２１】Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，Ｖｏ．５，１６１−１６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ＩＬ−４を阻害する改良された薬剤、ＩＬ−１３を阻害する改良された薬剤、およびＩＬ−４とＩＬ−１３の両方を阻害する単剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に特異的に結合する、新規なヒト化モノクローナル抗体および二重特異性抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体を提供する。抗−ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の単一特異性または二重特異性抗体、およびそれらのフラグメントのいくつかは、インビボでの製造および使用の間、安定な分子をもたらす鎖内のジスルフィド結合形成を防ぐように改変され得る。本発明の抗体は、本明細書中に記載される生物学的アッセイにおいて、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３活性を中和させる。
【００１３】
本発明は抗体の可変重鎖および軽鎖のアミノ酸配列ならびにそれらの対応する核酸配列を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体配列を宿す細胞株およびベクターを含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３機能および代謝に関連する疾患および障害を治療する医薬組成物を製造するための抗体の使用である。特に、本発明は、炎症により引き起こされる、または特徴付けられるがん、自己免疫不全および自己免疫疾患（例えば、アレルギー性喘息およびアレルギー性皮膚炎）の治療に関する。
【００１６】
さらなる特性および利点が本明細書中に記載され、そして以下の詳細な説明および図面から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】４つのポリペプチド鎖を含む二重特異性抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体分子の概略図である。２つの軽鎖はＮ−ＶＬhB-B13−リンカー−ＶＬh8D4-8−ＣＬ−Ｃ（ＣＬ、軽鎖定常領域）からなり、２つの重鎖はＮ−ＶＨhB-B13−リンカー−ＶＨh8D4-8−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｃからなる。リンカー配列（Ｇ４Ｓ）2はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６）である。
【図２】Ｂ−Ｂ１３抗−ＩＬ−１３抗体（配列番号１および２）のヒト化可変領域および８Ｄ４−８抗−ＩＬ−４抗体（配列番号３、４および５）のヒト化可変領域のアミノ酸配列を説明する。下線は、なされたアミノ酸変化を示す。太字はＣＤＲを示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく変更され得るので、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクター、または試薬に限定されない。さらに、本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を例示する目的のためだけであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。他に定義されない限り、全ての技術用語および科学用語ならびに本明細書中で使用される任意の頭字語は、本発明の分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の実施において使用され得、典型的な方法、デバイス、および材料のみが本明細書中に記載される。
【００１９】
本明細書中で言及される全ての特許および公報は、本発明と共に、そして本発明において使用され得るタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞およびそれらに参照される方法論を記載し、そして開示する目的のために、参照によりその全体が本明細書に加入される。しかし、本発明が先行発明によるこのような開示に先立って権利が与えられないと認めると解釈されるべきでない。
【００２０】
ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に関連する方法および目的の生成物の作製および使用を教示する前に、技術者をガイドするために以下のいくつかの用語および語句の非限定的定義を提供する。
【００２１】
「インターロイキン−４」（ＩＬ−４）とは、天然もしくは内因性哺乳動物ＩＬ−４タンパク質および天然もしくは対応する内因性哺乳動物ＩＬ−４タンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質｛例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学の方法を使用して生産される）｝をいう。従って、本明細書中で定義される場合、用語は、成熟ＩＬ−４タンパク質、多型変異体もしくは対立遺伝子多型、およびＩＬ−４の他のアイソフォームならびに前述の修飾もしくは未修飾形態（例えば、脂質化、グリコシル化）を含む。天然または内因性ＩＬ−４は、成熟ＩＬ−４のような野生型タンパク質、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）中に天然に存在する多型変異体もしくは対立遺伝子多型ならびに他のアイソフォームおよび突然変異型を含む。このようなタンパク質は、例えば、ＩＬ−４を自然に生産する供給源から回収または単離され得る。これらのタンパク質および天然または対応する内因性ＩＬ−４と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名称で呼ばれる。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合、タンパク質はヒトＩＬ−４と呼ばれる。ＷＯ０３／０３８０４１に開示されるもののようないくつかの突然変異ＩＬ−４タンパク質が、当該分野で公知である。
【００２２】
「インターロイキン−１３」（ＩＬ−１３）とは、天然もしくは内因性哺乳動物ＩＬ−
１３タンパク質および天然もしくは対応する内因性哺乳動物ＩＬ−１３タンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学の方法を使用して生産される））をいう。従って、本明細書中で定義される場合、用語は、成熟ＩＬ−１３タンパク質、多型変異体もしくは対立遺伝子多型、およびＩＬ−１３の他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞過程により生産される）、ならびに前述の修飾もしくは未修飾形態（例えば、脂質化（Ｈｐｉｄａｔｅｄ）、グリコシル化）を含む。天然または内因性ＩＬ−１３は、成熟ＩＬ−１３のような野生型タンパク質、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）中に天然に存在する多型変異体もしくは対立遺伝子多型ならびに他のアイソフォームおよび突然変異型を含む。例えば、本明細書中で使用される場合、ＩＬ−１３は成熟ヒトＩＬ−１３の位置１１０のＡｒｇが喘息（アトピー性および非アトピー性喘息）に関連するＧｉｎで置き換えられているヒトＩＬ−１３変異体（成熟ＩＬ−１３の位置１１０は前躯体タンパク質の位置１３０に対応する）および他のＩＬ−１３の変異体を含む。（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ  ｅｌ  ａｌ，Ｈｕｍ  ＭｏＩ  Ｇｅｎｅｔ．９：５４９−５５９（２０００））。このようなタンパク質は、例えば、ＩＬ−１３を自然に生産する供給源から回収または単離され得る。これらのタンパク質および天然または対応する内因性ＩＬ−１３と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名称で呼ばれる。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合、タンパク質はヒトＩＬ−１３と呼ばれる。ＷＯ０３／０３５８４７に開示されるもののようないくつかの突然変異ＩＬ−１３タンパク質が、当該分野で公知である。
【００２３】
抗体鎖ポリペプチド配列に関する語句「実質的に同一」は、基準ポリペプチド配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を示す抗体鎖と解釈され得る。核酸配列に関する用語は、基準核酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９７％またはそれ以上の配列同一性を示すヌクレオチド配列と解釈され得る。
【００２４】
用語「同一性」または「相同性」とは、全配列に対する最大同一性パーセントを達成する必要がある場合、配列を整列化し、そしてギャップを導入した後、比較される対応配列の残基と同一である候補配列中のヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基の百分率を意味しており、いかなる保存的置換も配列同一性の一部としては考慮されない。Ｎ末端またはＣ末端における伸長または挿入は、同一性または相同性を低下させると解釈されるべきでない。整列化のための方法およびコンピュータープログラムは入手可能であり、そして当該分野で周知である。配列同一性は、配列分析ソフトウェアを用いて測定され得る。
【００２５】
語句および用語、抗体または抗原の「機能的フラグメント、変異体、誘導体またはアナログ」など、さらにそれらの形態は、目的の完全長の抗体または抗原と共通する定性的な生物活性を有する化合物または分子である。例えば、抗−ＩＬ−４抗体の機能的フラグメントまたはアナログは、ＩＬ−４分子に結合し得るものまたはリガンド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト抗体がＩＬ−４に結合する能力を抑えるかまたは実質的に低下させ得るものである。
【００２６】
「置換」変異体は、天然配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして同じ位置に異なるアミノ酸が代わりに挿入され、置き換えられているものである。置換には、分子内の１つのアミノ酸のみが置換されている単一のものと、または同じ分子において２つまたはそれ以上のアミノ酸が置換されている多重のものがあり得る。複数の置換基が連続的な部位に存在し得る。また、変異体が置換および挿入の両方を含む場合、１つのアミノ酸が複数の残基に置き換えられ得る。「挿入」変異体は、天然配列の特定の位置でアミノ酸に直接隣接して１つまたはそれ以上のアミノ酸が挿入されているものである。アミノ酸に直接隣接してとは、アミノ酸のα−カルボキシルまたはα−アミノ官能基のいずれか
に連結していることを意味する。「欠失」変異体は、天然アミノ酸配列の１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失変異体は、分子の特定領域において１つまたは２つのアミノ酸が欠失している。
【００２７】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、そして特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメントまたはポリペプチドが所望の生物活性を示す限り、１つまたはそれ以上のＣＤＲまたはＣＤＲ誘導配列を有する合成ポリペプチドをカバーする。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同様の構造的特徴を有する糖タンパク質である。一般に、抗体は、定義されたまたは認識された特異性を有するＩｇとみなされる。従って、抗体は特定の標的に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体および標的特異性を欠いた他の抗体様分子の両方を含む。本発明の抗体は、あらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡなど）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ1、
ＩｇＧ2、ＩｇＧ2a、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2など）（「タイプ」および「
クラス」、ならびに「サブタイプ」および「サブクラス」は、本明細書中で交互に用いられる）のものであり得る。天然または野生型（すなわち、人工的に操作されていない集団のメンバーから得られる）の抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一軽（Ｌ）鎖および２つの同一重（Ｈ）鎖からなる。各重鎖は一方の末端に多数の定常領域が続く可変領域（ＶH）を有する。
各軽鎖は一方の末端に可変領域（ＶL）、そして他方の末端に定常領域を有する。「人工
的に操作されていない」とは、異質の抗原結合分子を含むか、または発現するように処理されていないことを意味する。野生型とは、集団において見られる最も一般的な対立遺伝子もしくは種、または対立遺伝子もしくは多型体、または抗原結合分子のアミノ酸を変化させるための突然変異生成のような操作の形態、組換え方法の使用などにより得られる変異体もしくは誘導体と比較して、操作されていない動物から得られる抗体をいうことができる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「抗−ＩＬ−４抗体」とは、本明細書中で定義されるＩＬ−４に特異的に結合する抗体またはそれらから誘導されるポリペプチド（誘導体）を意味し、これらとしては、その受容体へのＩＬ−４の結合を阻害するか、もしくは実質的に低下させる、またはＩＬ−４活性を阻害する分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「抗−ＩＬ−１３抗体」とは、本明細書中で定義されるＩＬ−１３に特異的に結合する抗体またはそれらから誘導されるポリペプチド（誘導体）を意味し、これらとしては、その受容体へのＩＬ−１３の結合を阻害するか、もしくは実質的に低下させる、またはＩＬ−１３活性を阻害する分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
抗体の可変領域の文脈において、用語「可変」とは、抗体間および抗体の中で大きく配列が異なっており、そしてその特定の標的に対する特定の抗体の特異的認識および結合において使用される関連分子の特定の部分をいう。しかし、可変性は抗体の可変領域にわたって均一分布されていない。可変性は、軽鎖および重鎖可変領域の両方において、超可変領域としても公知である相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変領域のより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域または配列と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、ＦＲは主としてβ−シート立体配置をとり、３つのＣＤＲにより連結され、β−シート構造を連結し、場合によってβ−シート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖中のＣＤＲは、しばしばＦＲ領域に近接して、他の鎖由来のＣＤＲと結び付き、抗体の標的（エピトープまたは決定基）結合部
位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７）を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、他に示されない限りＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．の免疫グロブリンアミノ酸残基番号付けシステムに従って行なわれる。１つのＣＤＲは、同種エピトープに特異的に結合する能力を有し得る。
【００３１】
本発明で使用される場合、用語「ヒンジ」または「ヒンジ領域」とは、抗体の第一と第二の定常領域間のアミノ酸を含む柔軟性ポリペプチドをいう。
【００３２】
用語「抗体フラグメント」とは、インタクトなもしくは完全長鎖の（ｏｒ）抗体の一部、一般に、標的結合領域または可変領域をいう。抗体フラグメントの例としては、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2およびＦvフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。「機能的フラグメント」または「抗−ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３抗体のアナログ」は、受容体がリガンドに結合するか、またはシグナル伝達を開始する能力を抑えるか、または実質的に低下させ得るものである。本明細書中で使用される場合、機能的フラグメントは、一般に「抗体フラグメント」と同じ意味であり、そして抗体に関して、受容体がリガンドに結合するか、またはシグナル伝達を開始する能力を抑えるか、または実質的に低下させ得るフラグメント（例えば、Ｆv、ＦabおよびＦ(ab')2など）をいうことができる。「
Ｆv」フラグメントは、非共有結合（ＶH−ＶL二量体）中の１つの重鎖可変領域と１つの
軽鎖可変領域の二量体からなる。この立体配置において、インタクトな抗体においてみられるように、各可変領域の３つのＣＤＲがＶH−ＶL二量体の表面上の標的結合部位を定義するために相互作用する。集合的に、６つのＣＤＲが、インタクトな抗体に標的結合特異性を与える。しかし、単一の可変領域（または標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、標的を認識し、そして結合する能力を有し得る。
【００３３】
「単鎖Ｆv」、「ｓＦv」または「ｓｃＡｂ」抗体フラグメントは、抗体のＶH領域およ
びＶL領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆvポリペプチドは、さらにＶH領域とＶL領域との間に、ｓＦｖが標的結合のための所望の構造を形成し得るポリペプチドリンカー、多くの場合、柔軟性分子を含む。
【００３４】
用語「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」とは、２つの抗原結合性部位を有する抗体フラグメントをいい、このフラグメントが同一のポリペプチド鎖中に軽鎖可変領域（ＶL
）に連結した重鎖可変領域（ＶH）を含み得る。同一鎖上にある２つの可変領域間で対合
するには短過ぎるリンカーを用いることにより、ディアボディー領域は、別の鎖の結合領域と強制的に対合させられ、２つの抗原結合部位を生成する。
【００３５】
Ｆabフラグメントは、軽鎖の可変領域および定常領域ならびに重鎖の可変領域および第一定常領域（ＣH1）を含む。Ｆab'フラグメントは、ＣH1領域のカルボキシ末端に抗体ヒ
ンジ領域由来の１つまたはそれ以上のシステインを含むようにいくつかの残基が付加されている点でＦabフラグメントと異なる。Ｆab'フラグメントは、Ｆ(ab')2ペプシン消化産
物のヒンジシステインでのジスルフィド結合の切断により生産され得る。抗体のさらなる酵素処理および化学的処理により、目的の他の機能的フラグメントを得ることができる。
【００３６】
用語「線形（ｌｉｎｅａｒ）Ｆａｂ」とは、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：４８５４−４８６１により記載されているような四価抗体をいう。「線形Ｆａｂ」は、各ＣＨ１−ＶＨ位置で同一の軽鎖と対合した同じＣＨ１−ＶＨ領域のタンデムからなる。抗体の結合価を増加させ、アビディティー効果によるその機能的親和性を向上させるために、これらの分子は開発されているが、これらは単一特異
性である。
【００３７】
用語「二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）」とは、単一分子内に２つの抗体の抗原結合部位を兼ね備える分子をいう。従って、二重特異性抗体は、同時に２つの異なる抗原に結合し得る。診断目的での適用に加えて、罹患部に有効なエフェクター系をリダイレクトすることよるか、または抗体の活性を増強するか、中和するか、もしくは刺激することにより、ＢｓＡｂは新しい治療適用への道を開く。
【００３８】
治療目的のために異なる標的抗原に対する２つの全抗体の結合特異性を合わせようとする最初の試みは、化学的に融合したヘテロ複合体分子を利用した（Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：６２８−６３１）。
【００３９】
二重特異性抗体は、ヘテロハイブリドーマ技術によりハイブリッドハイブリドーマから生産され、そしてヘテロ複合体に観察されるものに類似するインビトロ特性を実証している（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ＆  Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５４０）。
【００４０】
上記のように、細胞融合から生産されたヘテロ複合体または二重特異性抗体を使用して、期待できる結果が得られたにもかかわらず、いくつかの因子がそれらを大規模治療適用に実用的でないようにする。このような因子としては、大きなヘテロ複合体のインビボでの迅速なクリアランス、どちらか一方のタイプの分子を生成するのに必要とされる手間のかかる技術、ヘテロ複合体または単一特異性抗体からのヘテロ複合体の大規模な精製の必要性および一般に低い回収率。
【００４１】
遺伝子工学がますます頻繁に使用され、結合特性およびエフェクター機能の所望のセットを有する、抗体または抗体誘導体を設計し、修飾し、そして生産する。
【００４２】
抗体フラグメント（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６３−４７０；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ  ３：８３−１０５；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６）としても、完全長ＩｇＧ形式（Ｃａｒｔｅｒ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：７−１５）としても、ＢｓＡｂの効率的生産のための様々な組換え法が開発されている。
【００４３】
２つの異なるｓｃＦｖの組み合わせが、ｓｃ−ＢｓＡｂまたはＴａ−ｓｃＦｖと呼ばれる最小分子量のＢｓＡｂ形式をもたらす（Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：７０２１−７０２５；Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ｅｔ
ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６）。ＢｓＡｂは、ロイシンジッパーのような二量化官能性を介する２つのｓｃＦｖを遺伝学的に融合することによって構築される（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−４）。
【００４４】
上記のように、ディアボディーは、小さな二価の二重特異性抗体フラグメントである。フラグメントは、同一鎖上の２つの領域間で対合するには短過ぎる（１２アミノ酸未満の）リンカーを用いることにより、同一ポリペプチド鎖上でＶＬに連結したＶＨを含む。領域は別の鎖の相補的な領域と分子間で強制的に対合させられ、そして２つの抗原結合部位を生成する。これらの二量体抗体フラグメント、または「ディアボディー」は、二価で、かつ二重特異性である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：６４４４−６４４８）。ディアボディーは、Ｆａｂフラグメントと同じくらいの大きさである。３〜１２のアミノ酸のリンカーと結合したＶＨ領域およびＶＬ領域のポリペプチド鎖は、主に二量体（ディアボディー）を形成するが、０〜２アミノ酸残基のリンカーでは三量体（トリアボディー）および四量体（テトラボディー）が支持される。リンカーの長さに加えて、オリゴマー化の正確なパターンは、組成さらにＶ領域の方向に依存しているようである（Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１７７−１８９）。ディアボディー分子の最終構造の予測可能性は非常に低い。
【００４５】
ｓｃ−ＢｓＡｂおよびディアボディーベースの構築物は興味深い臨床的可能性を示すが、このような非共有結合分子は生理的条件下で十分に安定性でないことが示された。ｓｃＦｖフラグメントの総合的な安定性は、ＶＬおよびＶＨ領域の  固有の安定性さらにドメイン界面の安定性に依存する。ペプチドリンカーにより可能となる界面の一時的な開口が凝集、それによる不安定性および乏しい収率を助長する疎水性パッチを剥き出しにするので、ｓｃＦｖフラグメントのＶＨ−ＶＬ界面の不十分な安定性がしばしば不可逆的ｓｃＦｖ失活の主な原因と考えられている（Ｗoｒｎ  ａｎｄ  Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５：９８９−１０１０）。
【００４６】
ＶＨおよびＶＬ領域から二重特異性二価抗原結合タンパク質を製造する代替法は、米国特許第５，９８９，８３０号に開示されている。このようなダブルヘッド（ｄｏｕｂｌｅ
ｈｅａｄ）抗体フラグメントは、２つのポリペプチド鎖をコードする二シストロン性ベクターを発現させることによって得られ、一方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカー（ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２）による連続する二倍のＶＨを有し、そして他方のポリペプチド鎖はペプチドリンカー（ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２）による連続して連結した相補的ＶＬ領域からなる。各リンカーは、少なくとも１０のアミノ酸残基を含むべきであると米国特許第５，９８９，８３０号に記載されていた。
【００４７】
増加した価数を有する多価タンパク質複合体（ＰＰＣ）が、ＵＳ２００５／０００３４０３  Ａ１に記載されている。ＰＰＣは、一般に他方に沿って配列した２つのポリペプチド鎖を含む。各ポリペプチド鎖は、典型的に３または４つの「ｖ−領域」を含み、反対のポリペプチド鎖上の対応するｖ−領域と一致する場合、抗原結合部位を形成し得るアミノ酸配列を含む。約６つまでの「ｖ−領域」が各ポリペプチド鎖上で使用され得る。各ポリペプチド鎖のｖ−領域は他方に対して直線的に連結し、そして散在連結領域により連結され得る。ＰＰＣの形態で配列される場合、各ポリペプチド鎖上のｖ−領域は個々に抗原結合部位を形成する。複合体は１つまたはいくつかの結合特異性を含み得る。
【００４８】
しかし、このような分子の使用は、凝集、不安定性および乏しい発現収率を示した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１４：１０２５−１０３３）。これらは、抗体ベースの発現単鎖を生じ得る典型的な安定問題である（Ｗoｒｎ  ａｎｄ  Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５：９８９−１０１０）。
【００４９】
従って、本発明の目的は、凝集の形成を避け得る手段により二重特異性多価抗体を提供することである。さらに、これは治療用途に使い易くする安定性を有するべきである。
【００５０】
本明細書中で使用される、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、集団を含む個々の抗体は少量存在し得る自然発生突然変異を除き同一である。
【００５１】
本明細書中のモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体のクラスまたはサブクラス（タイプまたはサ
ブタイプ）に属する抗体における対応する配列と同一かまたは相同であり、鎖の残りが、別の種に由来する抗体、または別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かまたは相同である「キメラ」抗体、さらにＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に結合するか、またはＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の活性または代謝に影響を与える所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））。従って、あるクラスの抗体由来のＣＤＲは、異なるクラスまたはサブクラスの抗体のＦＲに埋め込まれ得る。
【００５２】
モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の標的部位、エピトープまたは決定基に指向される。さらに、典型的に抗原の異なる決定基（エピトープ）に指向される異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は標的上の単一決定基に指向される。それらの特異性に加えて、他の免疫グロブリンが混入していないモノクローナル抗体は、宿主細胞によりに合成される点で有利であり、そして関連遺伝子およびそれらの鎖の抗体をコードするｍＲＮＡのクローニングを提供する。修飾語句「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られるような抗体の性質を示し、そして任意の特定の方法によって抗体を生産する必要があると解釈されるべきではない。例えば、本発明と共に使用するためのモノクローナル抗体は、周知技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得るか、またはポリクローナル調製物から精製され得る。本発明に従って使用される親モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）により記載されるハイブリドーマ法により作製され得るか、または当該分野で周知の組換え法により作製され得る。
【００５３】
本発明において使用される場合、用語「多価抗体」とは、２つまたはそれ以上の抗原結合部位を含み、従って２つまたはそれ以上の抗原に結合し得る抗体をいい、同時に同一かまたは異なる構造を有し得る。用語「二価」とは、２つの抗原結合部位を含む抗体を意味する。用語「四価」とは、４つの抗原結合部位を含む抗体を意味する。
【００５４】
本発明において使用される場合、用語「抗原結合部位」とは、抗原の部分または全体に特異的に結合し、そしてこれらと相補的である領域を含む抗体の部分をいう。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合し得、この部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合領域は、１つまたはそれ以上の抗体可変領域により提供され得る。好ましくは、抗原結合領域は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）に関連付けられる。
【００５５】
本発明において使用される場合、用語「抗原」とは、本発明の抗体により結合され得る分子または分子の一部をいう。抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有し得る。本発明の抗体により認識される抗原の例としては、血清タンパク質、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ５、ＩＬ９およびＩＬ−１３）、生物活性ペプチド、細胞表面分子、例えば、受容体、輸送体、イオンチャネル、ウイルスタンパク質および細菌タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明において使用される場合、用語「単一特異性」とは、本発明の多価抗体が１つの抗原のみを認識し、全ての抗原結合部位が同一であることを意味する。
【００５７】
本発明において使用される場合、用語「二重特異性」とは、本発明の多価抗体が同一または２つの異なる抗原上の２つの異なるエピトープを認識することを意味する。
【００５８】
本発明において使用される場合、用語「多重特異性」とは、本発明の多価抗体が同一または多数の異なる抗原上の多数の異なるエピトープを認識することを意味する。
【００５９】
本発明において使用される場合、用語「リンカー」とは、本発明の抗体構築物の可変領域を連結するように適応されるペプチドをいう。ペプチドリンカーは、あらゆるアミノ酸を含み得、アミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）が好ましい。リンカーは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの間で、そしてその中で同一であるか、または互いに異なり得る。さらに、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸長を有し得る。軽鎖領域と同様に、重鎖領域の好ましいペプチドリンカー単位はＧＧＧＧＳである。重鎖および軽鎖のリンカー単位の数は、等しいか（対称的なオーダー）または互いに異なり得る（非対称的なオーダー）。
【００６０】
ペプチドリンカーは、互いの活性の妨害（例えば、立体障害）から抗体部分を妨げ、適正なタンパク質折り畳みを可能にし、そして必要な場合、抗体分子が２つまたはそれ以上の、場合により広い間隔で、同一細胞上の受容体と相互作用することを可能にするように適度な程度の柔軟性を提供するように十分に長いことが好ましい；さらに、抗体部分が細胞中で安定なままであるように十分に短いことが好ましい。
【００６１】
従って、ペプチドリンカーの長さ、組成および／または構造は、多価抗体の所望の特性を最適化するために、当業者により容易に選択され得る。
【００６２】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト抗体と比較して、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆv、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2または抗体の他の標的結合サブ配列）である。一般に、ヒト化抗体は、１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含み、ここで全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン鋳型配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、典型的に、選択されたヒト免疫グロブリン鋳型のものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。一般に、ヒトにおいて最小限の免疫原性である抗体分子を有することが目的である。従って、１つまたはそれ以上のＣＤＲ中の１つまたはそれ以上のアミノ酸をまた、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対する１つまたはそれ以上のＣＤＲの特異的結合機能を実質的に最小化することなく、ヒト宿主に対する免疫原性をより小さいものに変化させ得ることが可能である。あるいは、ＦＲは非ヒトであるが、これらのアミノ酸のほとんどの免疫原性をより小さい免疫原性のものに置き換える。そうはいうものの、上で議論されるようなＣＤＲグラフティングは、ヒト化抗体を得るための唯一の方法ではない。例えば、フレームワーク領域がＣＤＲループの三次元構造およびそのリガンドについての抗体の全体的な親和性の決定に関与することは珍しくないので、ＣＤＲ領域を単に修飾することは不十分であり得る。従って、あらゆる手段が実施され得、非ヒト親抗体分子は、ヒトに対してより小さい免疫原性であるものとなるように修飾され、そしてヒト抗体との広範囲の配列同一性が必ずしも必要とは限らない。だから、例えば、ごくわずかな残基、特に、抗体分子上に露出しており、そして分子内に埋め込まれておらず、従って、宿主免疫系に利用しにくいものの単なる置換により、ヒト化はまた達成され得る。抗体分子上の「可動性」または「柔軟性」残基の置換に関するこのような方法が本明細書中に教示され、そのエピトープまたは決定基に対する抗体の特異性を含むことなく、得られた分子の免疫原性を減少または抑えることを目的とする。例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ７（６）８０５−８１４，１９９４；Ｍｏｌ  Ｉｍｍ  ４４：１９８６−１９８８，２００７；Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２６２３（１
９９３）、ＷＯ２００６／０４２３３３および米国特許第５，８６９，６１９号を参照のこと。
【００６３】
目的のヒト化法は、免疫認識の間および免疫認識時の抗体の分子柔軟性の影響に基づく。タンパク質柔軟性は、タンパク質分子の分子運動に関連する。タンパク質柔軟性は、総タンパク質、タンパク質の一部または単一アミノ酸残基が互いに著しく異なる立体配座の集団を導入する能力である。タンパク質柔軟性に関する情報は、タンパク質Ｘ線結晶学実験（例えば、Ｋｕｎｄｕ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ８３：７２３？７３２を参照のこと）、核磁気共鳴実験（例えば、Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９８，１２０（３１）：７９１６−７９２３を参照のこと）を実施することにより、または分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを実行することにより得ることができる。タンパク質のＭＤシミュレーションは、コンピュータ上でなされ、そして互いの原子の物理的相互作用を計算することにより、ある期間にわたる全てのタンパク質原子の運動を決定することを可能にする。ＭＤシミュレーションの出力は、シミュレーションの期間にわたって調査されるタンパク質の軌道である。軌道は、タンパク質立体構造（スナップショットともいう）の集団であり、これはシミュレーションの期間にわたって周期的にサンプリングされる（例えば、１ピコ秒（ｐｓ）毎）。スナップショットの集団を分析することにより、これはタンパク質アミノ酸残基の柔軟性を定量化し得る。従って、柔軟性残基は、この残基が存在するポリペプチドにおいて、異なる立体配座の集団を導入するものである。ＭＤ法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ」（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）を参照のこと。いくつかのソフトウェア、例えば、Ａｍｂｅｒ（Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｃｈｅｍ  ２６：１６６８１６８８を参照のとこ）、Ｃｈａｒｍｍ（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔａｌ．（１９８３）Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｃｈｅｍ  ４：１８７−２１７を参照のとこ；およびＭａｃＫｅｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）「Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ｖｏｌ．１：２７１−１７７，Ｓｃｈｌｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）またはＩｍｐａｃｔ（Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ
Ｓｏｃ；２０００；１２２（５１）：１２８９８−１２９００を参照のとこ）がＭＤシミュレーションを可能にする。
【００６４】
ほとんどのタンパク質複合体が、比較的大きくかつ平面的に埋没した表面を共有し、そして結合パートナーの柔軟性がそれらの可塑性の起点を提供し、それらを互いに配座的に適応することを可能にすることが示されている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２０００）８，Ｒ１３７−Ｒ１４２）。このようにして、「誘導適合」の例は、タンパク質−タンパク質相互作用で主要な役割を果たすことを示している。さらに、タンパク質が種々の形状、大きさおよび組成のリガンドを実際に結合し（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）１１：１８４１８７）、そして立体構造多様性が異なるパートナーを認識する能力の不可欠な要素であると考えられることを示す着実に増加している多数データが存在する（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）２９９，１３６２−１３６７）。柔軟性残基は、タンパク質−タンパク質パートナーの結合に関与する（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００６）１４，６８３−６９３）。
【００６５】
柔軟性残基は、記憶Ｂ細胞により認識され、そして免疫応答を引き起こす可能性のある相互作用領域の集団を提供する種々の立体配座に導入され得る。従って、修飾された抗体により提示される立体配座および認識領域の集団がヒト抗体により導入されるものとできるだけ類似するように、抗体はフレームワーク由来の多数の残基を修飾することによりヒト化され得る。
【００６６】
これは以下により、限定数の残基を修飾することにより達成され得る：（１）親ｍＡｂの相同性モデルを構築し、そしてＭＤシミュレーションを実行すること；（２）非ヒト抗体分子の柔軟性残基および最も柔軟な残基の同一性を分析し、さらに不均一なまたは分解反応の供給源となる可能性のある残基またはモチーフを同定すること；（３）親抗体のような認識領域の最も類似する集団を提示するヒト抗体を同定すること；（４）突然変異されている柔軟性残基を決定する、不均一なまたは分解の供給源となる可能性のある残基またはモチーフがまた、突然変異されている；そして（５）既知のＴ細胞またはＢ細胞エピトープの存在をチェックすること。陰溶媒モデルを使用して、本明細書中に教示されるようにＭＤ計算を使用して、柔軟性残基が見出され得、シミュレーションの期間にわたる水溶媒とタンパク質原子との相互作用を明らかにする。一旦、柔軟性残基のセットが可変軽鎖および重鎖内で同定されると、目的の抗体のものと酷似するヒト重鎖および軽鎖可変領域フレームワークのセットが同定される。例えば、これは、抗体ヒト生殖細胞系列配列のデータベースに対する柔軟性残基のセットのブラストサーチを使用して行うことができる。これはまた、親ｍＡｂのダイナミック（ｄｙｎａｍｉｃ）と生殖細胞系列標準構造のライブラリーのダイナミックとを比較することにより行うことができる。抗原の高親和性が維持されるのを確保するために、ＣＤＲ残基および隣接残基は検索から排除される。
【００６７】
次いで、柔軟性残基は置き換えられる。いくつかのヒト残基が類似の相同性を示す場合、ヒト化抗体の溶液挙動に影響を与える可能性のある残基の性質により、選択がまた後押しされる。例えば、極性残基は、疎水性残基よりも露出した柔軟性ループを好む。ＣＤＲ中で見出される場合でさえ、不安定性および不均一性の潜在源である残基はまた、突然変異される。スルホキシド形成が、酸素ラジカル、酸に不安定な結合（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドのもの）のタンパク質分解的切断、（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｒｅｓ（２００４）６１：１３７−１５４）、露出したアスパラギン残基、続く小アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＣｙｓ内で見出される脱アミド部位（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ（２００６）８３７：３５−４３）およびＮ−グリコシルカ化部位、例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ部位から得ることができる場合、これは露出したメチオンを含む。典型的に、露出したメチオニンは、Ｌｅｕで置換されるか、露出したアスパラギンは、グルタミンまたはアスパラギン酸塩で置換されるか、または続く残基が変化させられる。グリコシル化部位について（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈ残基のいずれかが変化させられる。
【００６８】
得られた合成列を既知のＢ細胞または線状（ｌｉｎｅａｒ）Ｔ細胞エピトープの存在についてチェックする。例えば、公表されているＩＥＤＢを用いて、検索を実施する。既知のエピトープが合成列内で見出される場合、別のヒト配列のセットを検索し、そして置換する。
【００６９】
米国特許第５，６３９，６４１号の再表面形成法（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）と違い、Ｂ細胞仲介性およびＴ細胞仲介性免疫応答（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の両方が本方法により対処される。本方法はまた、ＣＤＲグラフティングで時折観察される活性の減少の問題を回避する（米国特許第５，５３０，１０１号）。さらに、安定性および溶解性の問題もまた、工学過程および選定過程において考慮され、低免疫原性、抗原の高親和性および改善された生物物理学的特性のために最適化されている抗体を得る。
【００７０】
再表面形成抗体のためのストラテジーおよび方法、ならびに異なる宿主内で抗体の免疫原性を低下させる他の方法が、例えば、米国特許第５，６３９，６４１号に開示される。簡潔に、好ましい方法において、（１）抗体重鎖および軽鎖可変領域のプールの位置配列（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を生成し、全ての可変領域の配列位置が少な
くとも約９８％同一である重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出位置を得る；（２）重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットを非ヒト（例えば、齧歯動物）抗体（またはそれらのフラグメント）について定義する；（３）齧歯動物表面露出アミノ酸残基のセットに最も厳密に一致する重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットを同定する；そして（４）齧歯動物抗体のＣＤＲのあらゆる残基のあらゆる原子の５Å以内にあるアミノ酸残基を除いて、工程（２）で定義した重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットを工程（３）で同定した重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットで置換し、結合特異性を保持したヒト化、例えば、齧歯動物抗体を得る。
【００７１】
ＣＤＲグラフティング（欧州特許第０  ２３９  ４００号；ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面形成（欧州特許第０５９２  １０６；欧州特許第０
５１９  ５９６号；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍ  ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３）および鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む他の様々な技術により、抗体はヒト化され得る。ヒト抗体は、当該分野で公知の様々な方法によりなされ得、この方法としては、トランスジェニック動物（例えば、齧歯動物）を使用し、キメラ細胞などを使用するファージディスプレイ法が挙げられるが、これらに限定されない、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号および同第５，８１４，３１８；ならびにＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１を参照のこと。
【００７２】
「抗体ホモログ」または「ホモログ」とは、本明細書中で教示されるようなＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に特異的に結合するあらゆる分子をいう。従って、抗体ホモログは、修飾されているかどうか問わず、ネイティブなまたは組換え抗体、目的の生物学的特性（例えば  ＩＬ−４またはＩＬ−１３を結合する）を保持する抗体の一部、例えば、ＦabまたはＦv分子、単鎖抗体、１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域を保有するポリペプチド
などを含む。ホモログのアミノ酸配列は、天然の抗体のものに対する同一性を必要としないが、改善された特性または他の有益な特性を有するポリペプチドを得るために、置換アミノ酸、挿入アミノ酸、欠失アミノ酸、タンパク質中に通常見出される２０以外のアミノ酸などを保有するように改変または修飾され得る。
【００７３】
ホモログ配列を有する抗体は、本発明のＩＬ−４、ＩＬ−１３または二重特異性ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体のアミノ酸配列と配列相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体である。好ましくは、相同性は本発明の抗体の可変領域のアミノ酸とのものである。本明細書中でアミノ酸配列に適用される場合、「配列相同性」は、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５，２４４４−２４４８（１９８８）に従うＦＡＳＴＡ検索方法によって決定されるように、別のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％またはそれ以上の配列相同性、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する配列として定義される。
【００７４】
キメラ抗体は、異なる供給源、例えば、異なる抗体、異なるクラスの抗体、異なる動物種由来の抗体の異なる部分を有するもの、例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域などと対合したマウスモノクローナル抗体由来の可変領域を有する抗体である。従って、ヒト化抗体は、特定のキメラ抗体である。キメラ抗体の生産方法は当該分野で公知であり、例えば
、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号および同第４，８１６，３９７号を参照のこと。
【００７５】
人工抗体としては、ｓｃＦｖフラグメント、キメラ抗体、ディアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびｍｒｕ（Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；およびＨｕｄｓｏｎ，１９９９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍ  １１：５４８−５５７を参照のこと）が挙げられ、それぞれ、抗原結合またはエピトープ結合能力を有する。単鎖Ｆvフラグメント（ｓｃＦv）において、抗体のＶHおよびＶL領域は、柔軟性ペプチドにより連結されている。典型的に、リンカーは、約１５のアミノ酸のペプチドである。リンカーがかなり小さい（例えば、５アミノ酸）である場合、ディアボディーが形成される。抗体の最も小さい結合単位はＣＤＲ、典型的に、十分な特異的な認識および結合能力を有する重鎖のＣＤＲ２である。このようなフラグメントは、分子認識単位またはｍｒｕと呼ばれる。いくつかのこのようなｍｒｕが短いリンカーペプチドで連結され、従って単一ｍｒｕよりも高いアビディティーを有する人工結合タンパク質を形成する。
【００７６】
目的の抗体の機能的等価物がまた、本発明の範囲内に包含される。用語「機能的等価物」は、相同配列を有する抗体、抗体ホモログ、キメラ抗体、人工抗体および修飾抗体を含み、例えば、各機能的等価物は、ＩＬ−４および／またはＬ−１３に結合する能力、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のシグナル伝達能力または機能を阻害すること、またはＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のその受容体への結合を阻害することにより定義される。当業者は、「抗体フラグメント」と呼ばれる分子の群および「機能的等価物」と呼ばれる群中にオーバーラップが存在することを理解する。ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３結合能力を保持する機能的等価物の生産方法は、当業者に公知であり、そして例えば、ＷＯ９３／２１３１９、欧州特許第Ｓｅｒ．Ｎｏ．２３９，４００、ＷＯ８９／０９６２２、欧州特許第Ｓｅｒ．Ｎｏ．３３８，７４５および欧州特許第Ｓｅｒ．Ｎｏ．３３２，４２４に開示される。
【００７７】
本出願の機能的等価物はまた、修飾抗体、例えば、抗体にあらゆるタイプの分子を共有結合させることにより修飾された抗体を含む。例えば、修飾抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、脱アミド化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドへの連結、毒素もしくは細胞毒性部分または他のタンパク質への連結などにより修飾された抗体を含む。共有結合は抗−イディオタイプ応答を生成するのを妨げる抗体を回収する必要がない。公知の技術により修飾が達成され得、この技術としては、特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、修飾抗体は、１つまたはそれ以上の非古典的なアミノ酸を含み得る。
【００７８】
結合親和性の最適化を可能にする多くの技術が、当業者に利用可能である。典型的に、技術は、目的の部位での様々なアミノ酸の置換、続く同種抗原またはエピトープについての突然変異ポリペプチドの結合親和性のスクリーニング分析を含む。
【００７９】
一旦、抗体を同定し、そして単離すると、しばしば、変異抗体または突然変異体、または突然変異タンパク質を生成するのに有用であり、ここで、例えば、抗体の１つまたはそれ以上の超可変領域において、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変される。あるいは、またはそれに加えて、フレームワーク残基の１つまたはそれ以上の改変（例えば、置
換）が抗体中に導入され得、それによりＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対する抗体突然変異体の結合親和性が改善される。修飾され得るフレームワーク領域残基の例としては、抗原に直接的に非共有結合するもの（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：７４７−７５３（１９８６））；ＣＤＲの立体配座に相互作用／影響するもの（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；および／またはＶL−ＶH界面に関与するもの（欧州特許第２３９  ４００号）が挙げられる。特定の実施形態において、１つまたはそれ以上のこのようなフレームワーク領域残基の修飾により、同種抗原に対する抗体の結合親和性が増大する。本発明の実施形態において、例えば、約１〜約５のフレームワーク残基が改変され得る。時折、超可変領域残基が全く改変されていない場合でさえ、これは前臨床試験に使用するのに適切な抗体突然変異体を得るのに十分であり得る。しかし、通常、抗体突然変異体は、１つまたはそれ以上の超可変領域改変を含み得る。定常領域はまた、所望の、またはより所望のエフェクター特性を得るために改変され得る。
【００８０】
改変された超可変領域残基はランダムに変更され得、特に、親抗体の最初の結合親和性は、ランダムに生産された抗体突然変異体が、本明細書中に教示されるアッセイにおいて、改変された結合について容易にスクリーニングできるようなものである。
【００８１】
抗体突然変異体、例えば、ＣＤＲ突然変異体を得る手段の１つは、「アラニンスキャンイング突然変異誘発」（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１１０８５（１９８９）；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：６４３４−６４３７（１９９１））である。１つまたはそれ以上の超可変領域残基が、アラニンまたはポリアラニン残基で置換される。次いで、置換基に対して機能感受性を示すこれらの超可変領域残基を、置換部位にまたは置換部位に対してさらなる突然変異または他の突然変異を導入することによりリファイニングする。従って、アミノ酸配列変異が導入される部位を予め決定しておくと、突然変異自体の性質を予め決定する必要がない。スキャンされる残基の所望の特性に依存して、同様の置換が他のアミノ酸を用いて試みられ得る。
【００８２】
修飾するためのアミノ酸残基を同定するより系統的方法は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３結合に関与する超可変領域残基およびＩＬ−４および／またはＩＬ−１３結合にほとんど関与しないこれらの超可変領域残基を同定することを含む。非結合超可変領域残基のアラニンスキャンが実施され、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３への増強した結合について、各ａｌａ突然変異体は試験される。別の実施形態において、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３結合に有意に関与するこれらの残基を選択して、修飾する。修飾は、目的の残基に隣接する残基の欠失または１つもしくはそれ以上の残基の挿入を含み得る。しかし、通常、修飾は、別のアミノ酸による残基の置換を含む。保存的置換が第一の置換であり得る。このような置換が生物活性（例えば、結合親和性）の変化をもたらす場合、次いで別の保存的置換がなされ、より実質的な変化が得られるかどうかを確認し得る。
【００８３】
抗体範囲におけるさらにより実質的な修飾および生物学的特性の提示が、通常、部位で固有のものと特性がより実質的に異なるアミノ酸を選択することによって達成され得る。従って、このような置換は、以下を維持しながらなされ得る：（ａ）例えば、シートもしくはらせん構造のような置換領域におけるポリペプチド骨格の構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク。
【００８４】
例えば、天然のアミノ酸は、一般的な側鎖特性に基づいて群に分類され得る：
（１）疎水性：メチオニン（Ｍまたはｍｅｔ）、アラニン（Ａまたはａｌａ）、バリン（Ｖまたはｖａｌ）、ロイシン（Ｌまたはｌｅｕ）およびイソロイソン（Ｉまたはｉｌｅ）；
（２）中性、親水性：システイン（Ｃまたはｃｙｓ）、セリン（Ｓまたはｓｅｒ）、スレオニン（Ｔまたはｔｈｒ）、アスパラギン（Ｎまたはａｓｎ）およびグルタミン（Ｑまたはｇｌｎ）；
（３）酸性：アスパラギン酸（Ｄまたはａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｅまたはｇｌｕ）（４）塩基性：ヒスチジン（Ｈまたはｈｉｓ）、リシン（Ｋまたはｌｙｓ）およびアルギニン（Ｒまたはａｒｇ）；
（５）鎖の方向に影響を与える残基：グリシン（Ｇまたはｇｌｙ）およびプロリン（Ｐまたはｐｒｏ）、および
（６）芳香族：トリプトファン（Ｗまたはｔｒｐ）、チロシン（Ｙまたはｔｙｒ）およびフェニルアラニン（Ｆまたはｐｈｅ）。
【００８５】
非保存的置換は、別の基由来のアミノ酸とアミノ酸を交換することを伴い得る。保存的置換は、基内のあるアミノ酸と別のものを交換することを伴い得る。
【００８６】
好ましいアミノ酸置換としては、以下ものが挙げられる：（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する感受性を低下させるもの、（３）結合親和性を改変するものおよび（４）このようなアナログの他の物理化学的特性または機能特性を与えるか、または修飾するもの。アナログは、天然のペプチド配列以外の配列の様々な突然変異を含み得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）は、天然の配列（好ましくは、分子間接触を形成する領域外のポリペプチド部分）中でなされ得る。Ｒ基または側鎖のバルクまたは立体配座の変化がない限り、保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変化させるべきでない（例えば、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）アミノ酸は、親配列中に存在するらせんを壊す傾向にあるべきでなく、また親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を崩壊させるべきでない）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ＆  Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）。
【００８７】
通常、改善された生物学的特性を有する抗体突然変異体は、親抗−ヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−１３抗体の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性または類似性、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびしばしば少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を有する。親抗体配列に関する同一性または類似性は、必要な場合、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、そしてギャップを導入した後、親抗体残基と同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、一般的な側鎖特性に基づく同じ基由来のアミノ酸残基、上記）である候補配列におけるアミノ酸残基の割合として本明細書中で定義される。
【００８８】
あるいは、抗−ＩＬ−４、抗−ＩＬ−１３もしくは二重特異性ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体の重鎖および軽鎖のＦＲおよびＣＤＲ領域、またはＦc領域の系統的突然変異により、
抗体突然変異体は生成され得る。抗体突然変異体を生成するための別の手順は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟の使用を含む（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５４：８８９−８９６（１９９２）およびＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０（４５）：１０８３２−１０８３８（１９９１））。バクテリオファージコートタンパク質融合（Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５（１９８５）；Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８：３０９（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：
４０４（１９９０）；Ｗｅｌｌｓ  ＆  Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２：５９７（１９９２）；および米国特許第５，２２３，４０９号）は、それらをコードするバクテリオファージ粒子の遺伝子型に提示されたタンパク質またはペプチドの表現型を関連付けるのに有用であることが公知である。抗体のＦab領域もまた、ファージ上に提示される（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２（１９９０）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：７９７８（１９９１）；およびＧａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：１３７３（１９９１））。
【００８９】
一価のファージディスプレイは、ファージ粒子上のバクテリオファージコートタンパク質の融合としてタンパク質変異体のセットを提示することからなる（Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８：３０９（１９９０）。親和性成熟、または種々のタンパク質の平衡結合親和性の改善は、突然変異誘発、一価ファージディスプレイおよび機能分析の連続的な適用により（Ｌｏｗｍａｎ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３４：５６４  ５７８（１９９３）；および米国特許第５，５３４，６１７号）、例えば、抗体のＣＤＲ領域に焦点を合わせることにより（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：３８０９（１９９４）；およびＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５４：３９２（１９９５））以前に達成されている。
【００９０】
配列中の定義された位置で異なる、多くの（例えば、１０6またはそれ以上の）タンパ
ク質変異体のライブラリーは、各々が特定のタンパク質変異体をコードするＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子上で構築され得る。親和性精製のサイクル後、固定化抗原を使用して個々のバクテリオファージクローンを単離し、そして提示されたタンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡから推定する。
【００９１】
抗体突然変異体の生産に続いて、親抗体と比較して、この分子の生物活性を本明細書中に教示されるように決定し得る。上で述べたように、これは、結合親和性および／または抗体の他の生物活性もしくは物理的特性を決定することを含む。本発明の好ましい実施形態において、抗体突然変異体のパネルを用意し、そして抗原に対する結合親和性をスクリーニングする。スクリーニングから選択される１つまたはそれ以上の抗体突然変異体は、場合により、抗体突然変異体が新規なまたは改善された特性を有することを確認するために、１つまたはそれ以上のさらなる生物活性アッセイに供される。好ましい実施形態において、抗体突然変異体は、親抗体のものと類似するか、またはよりよい／より高い結合親和性でＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を結合する能力を保持する。
【００９２】
そのように選択される抗体突然変異体は、しばしば抗体の使用目的に依存して、さらなる修飾に供され得る。このような修飾は、さらにアミノ酸配列の改変、異種ポリペプチドへの融合および／または共有結合修飾を含み得る。例えば、抗体突然変異体の適正な立体配座の維持に関連していないシステイン残基を、分子の酸化安定性を改善し、そして異常な交差結合を防止するために、一般に、セリンで置換し得る。反対に、（特に、抗体がＦvフラグメントのような抗体フラグメントである場合）システインは安定性を改善するた
めに抗体に付加され得る。
【００９３】
別のタイプの抗体突然変異体は、改変されたグリコシル化パターンを有する。抗体において見出される１つまたはそれ以上の炭水化物部分を欠失させ、そして／または抗体中に存在しない１つまたはそれ以上のグリコシル化部位を付加することにより、これを達成し得る。抗体のグリコシル化は、典型的に、ＡｓｎへのＮ−結合またはＳｅｒもしくはＴｈｒへのＯ−結合のいずれかである。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は
、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）のための一般的な認識配列である。例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、またはキシロースは、ヒドロキシアミノ酸に結合され、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた使用され得る。元の抗体の配列への１つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換は、Ｏ結合グリコシル化の可能性を増し得る。
【００９４】
抗体の有効性を高めるために、エフェィター機能に関連する本発明の抗体を修飾するのが望ましくあり得る。例えば、システイン残基は、Ｆc領域中に導入され、それによりこ
の領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。このように生成されたホモ二量体抗体は、内在性機能（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）が改善され、そして／または補体仲介性細胞死滅および抗体依存性細胞毒性  （ＡＤＣＣ）が向上され得る、Ｃａｒｏｎ  ｅｔａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：２９１８２９２２（１９９３）を参照のこと。あるいは、二重のＦc領域を有する抗体が設計され得、それに
より、補体溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｌｙｓｉｓ）およびＡＤＣＣ機能が向上され得る、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９  ２３０（１９８９）を参照のこと。
【００９５】
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。該当する場合、このような修飾は抗体の化学合成により、または酵素的切断もしくは化学分解によりなされ得る。他のタイプの抗体の共有結合修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択される側鎖またはＮ−末端もしくはＣ−末端残基と反応し得る有機誘導化剤と反応させることにより、分子に導入される。
【００９６】
システイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させ、カルボキシルメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、例えば、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクラ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化され得る。
【００９７】
ヒスチジル残基は、ｐＨ  ５．５〜７．０でジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化され得る。ｐ−ブロモフェナシルブロミドもまたは使用され得、その反応は好ましくは、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中ｐＨ  ６．０で実施される。
【００９８】
リシニルおよびα末端残基を、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応させ、残基の電荷を逆にし得る。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬としては、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレアおよび２，４−ペンタンジオンが挙げられ、そしてアミノ酸はグリオキシラートを用いてトランスアミナーゼ触媒化され得る。
【００９９】
アルギニル残基は、１またはいくつかの従来の試薬、例えば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応により修飾され得る。アルギニン残基の誘導体化は、しばしばアルカリ性反応条件を必要とする。さらに、これらの試薬は、リシンさらにアルギニンε−アミノ基と反応させ得る。
【０１００】
チロシル残基の特定の修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンを用いてなされ得る。例えば、Ｎ−アセチルイミダゾール（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）およびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基は、125Ｉまたは131Ｉを使用してヨウ素化され、ラジオイムノアッセイに使用するための標識タンパク質を調製し得る。
【０１０１】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｃ−Ｒ’）（ここでＲおよびＲ’は異なるアルキル基であり得る）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により修飾され得る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換され得る。
【０１０２】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に、中性または塩基性条件下、それぞれ、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。これらの残基の脱アミド形態は、本発明の範囲内にある。
【０１０３】
他の修飾としては、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリニルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化およびＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１０４】
別のタイプの共有結合修飾は、抗体にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、Ｎ−結合またはＯ−結合グリコシル化のためにグリコシル化機能を有する宿主細胞中で抗体を生産する必要がない。使用されるカップリング様式に依存して、糖が（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのもの；（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのもの；（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのもの；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合し得る。このような方法は、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ
＆  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載される。
【０１０５】
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。例えば、化学的脱グリコシル化は、抗体を化合物、トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物への暴露を必要とし得、連結糖（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｓｕｇａｒ）（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖の開裂をもたらす一方、抗体を完全に残す。化学的脱グリコシル化は、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅ  ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１８：１３１（１９８１）に記載される。抗体上の炭水化物部分の酵素的開裂は、例えば、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １３８：３５０（１９８７）に記載されるようなあらゆる種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼにより達成され得る。
【０１０６】
抗体の別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７に示される様式で、抗体を種々の非タンパク質
ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシルアルキレンに連結することを含む。
【０１０７】
突然変異体または突然変異タンパク質を得るための好ましい別の技術は、ファージディスプレイによる親和性成熟である（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５４：８８９−８９６（１９９２）；およびＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０（４５）：１０８３２１０８３８（１９９１））。簡潔に、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）は、各部位で全ての可能なアミノ酸置換を生成するために突然変異される。このように生成された抗体突然変異体は、粒子状に見出されるタンパク質に融合するので、ファージ粒子上に一価様式で提示される。種々の突然変異体を発現するファージは、結合セレクション（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の周りを通って循環させられ、続いて単離され、そして高い親和性を示すこれらの突然変異体を配列決定し得る。
【０１０８】
新規な結合ポリペプチドを選択する方法は、構造的に関連があるポリペプチドのライブラリーを利用し得る。例えば、ファージコートタンパク質に融合された構造的に関連があるポリペプチドのライブラリーは、突然変異誘発により生産され、そして粒子の表面に提示される。次いで、粒子は標的分子に接触させられ、そして標的に対して最も高い親和性を有するこれらの粒子をより低い親和性のものから分離する。次いで、高親和性バインダーは、適切な細菌性宿主の感染により増幅され、そして競合的結合工程が繰り返される。所望の親和性のポリペプチドが得られるまで、工程は繰り返される。
【０１０９】
あるいは、多価ファージ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；およびＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８）をまた使用して、ランダム点突然変異を発現させ（例えば、エラープローンＤＮＡポリメラーゼの使用により生成される）、ファージ抗体フラグメントのライブラリーを生成し、次いで、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対する親和性についてスクリーニングされ得る、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５４：８８９−８９６。
【０１１０】
好ましくは、親和性成熟工程の間、複製可能な発現ベクターは、転写調節要素の厳しい管理下にあり、そして融合タンパク質の１より多いコピーを提示する粒子の量または数が約１％未満となるように、培養条件を調節する。融合タンパク質の１より多いコピーを提示する粒子の量が、融合タンパク質の単一コピーを提示する粒子の量の１０％未満であることもまた好ましい。量が２０％未満であることが好ましい。
【０１１１】
フレームワーク内で異なる抗体鎖の異なるＣＤＲまたは複数の抗体由来の合成ＦＲを交換することにより、機能的等価物が生産され得る。従って、例えば、異なるクラスの抗体が異なる重鎖の置換による既定のＣＤＲセットに対して可能であり（例えば、ＩｇＧ1〜4、ＩｇＭ、ＩｇＡ1〜2またはＩｇＤ）、異なるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３抗体のタイプおよびアイソタイプを得る。同様に、完全な合成フレームワーク内に、既定のＣＤＲセットを包埋することにより、本発明の範囲内の人工抗体を生産し得る。
【０１１２】
本発明の抗体フラグメントおよび機能的等価物は、検出可能な程度でＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に特異的結合するこれらの分子を含む。検出可能な程度の結合は、目的の抗体への結合能力の少なくとも１０〜１００％、好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、より、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の範囲の全ての値を含む。目的に抗体の１００％のものよりも大きい親和性を有する等価物もまた含まれる。
【０１１３】
一般に、ＣＤＲは、エピトープ認識および抗体結合に重要である。しかし、抗体が同種エピトープを認識し、そして結合する能力を妨害することなく、ＣＤＲを含む残基に変化がなされ得る。例えば、エピトープ認識に影響を与えず、エピトープに対する抗体の結合親和性をなお高める変化がなされ得る。いくつかの研究により、一次抗体配列の知識に基づいて、それらの特性（例えば、結合および発現レベル）に対する抗体配列の種々の位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸変化を導入する効果が調査されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５４：３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５；およびＶａｕｇｈａｎ  ｅｔａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６，５３５−５３９）。
【０１１４】
従って、オリゴヌクレオチド媒介部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリングまたは大腸菌のミューテーター株のような方法を使用して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３、またはフレームワーク領域において、重鎖および軽鎖の遺伝子配列を変化させることにより、目的の抗体の等価物を生成し得る（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔａｌ．，１９９８，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：５３５−５３９；およびＡｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｈａｐ．１６，ｐｐ．２７７−２９１，ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｅｄｓ．Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。一次抗体の核酸配列を変化させる方法により、改善された親和性を有する抗体を得ることができる（Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ  ＆  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ２：１６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５６：７７−８８；Ｓｈｏｒｔ  ｅｔａｌ．，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１６３６５−１６３７０；およびＦｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２７６２２−２７６２８）。
【０１１５】
「ポリペプチドセレクション」の繰り返しサイクルを使用して、例えば、サイクルの複数のセレクションにより選択される複数のアミノ酸変化のセレクションによって次々と高い親和性結合を選択し得る。リガンドまたは抗体ポリペプチド中のアミノ酸のセレクションの第一の領域を含む第一回目のセレクションに続き、リガンドの他の領域またはアミノ酸におけるさらなる回のセレクションが実施される。所望の親和特性が達成されるまで、セレクションのサイクルは繰り返される。
【０１１６】
改善された抗体はまた、動物免疫（ａｎｉｍａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、ハイブリドーマ形成および特性を有する抗体のセレクションの標準的技術により調製される改善された特性を有する抗体を含む。
【０１１７】
「アンタゴニスト」とは、標的分子の１つまたはそれ以上の生物活性（例えば、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３によるシグナル伝達）を阻害し得る分子をいう。リガンドにより活性化される細胞を無能化または死滅させることにより、および／または受容体もしくはリガンド活性化（例えば、チロシンキナーゼ活性化）または受容体へのリガンド結合後のシグナル変換を妨害することにより、アンタゴニストは、リガンドへの受容体の結合を妨害し得る（逆の場合もまた同じ）。アンタゴニストは、受容体−リガンド相互作用を完全に阻害し得るか、またはこのような相互作用を実質的に減少させ得る。
【０１１８】
「アゴニスト」とは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の１つまたはそれ以上の生物活性を活性化する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、複
合体、巨大分子、小分子を含む化合物をいう。リガンドにより活性化される細胞のマイトジェンとして作用することにより、および／または細胞不活性化または受容体へのリガンド結合後のシグナル変換阻害を妨害することにより、アゴニストはリガンドへの受容体の結合と相互作用し得る（逆の場合もまた同じ）。アゴニストによる介入のこのような全ての点が、本発明の目的の等価物とみなされるべきである。
【０１１９】
用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」とは、それらの後代を含む。意図的なまたは偶発的な突然変異のために、全ての後代は、例えば、ＤＮＡの内容が正確に同一ではなくなり得るということもまた理解される。起源細胞においてスクリーニングされる場合、同様の機能または目的の生物学的特性を有する変異後代を含む。
【０１２０】
用語「ベクター」とは、適切な宿主中でトランス遺伝子の発現に適当な制御配列に操作可能に連結され得る核酸、トランス遺伝子、外来遺伝子または目的の遺伝子を含む核酸構築物、担体を意味する。このような制御配列としては、例えば、転写をもたらすプロモーター、このような転写を調節する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単なる潜在的ゲノム挿入であり得る。一旦、適切な宿主中に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは独立して複製および機能し得るか、または場合によっては、宿主細胞ゲノムに組み入れられ得る。本明細書において、プラスミドはベクターの一般的に用いられる形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交互に用いられる。しかし、本発明は、例えば、核酸、リポソームなどを保有するウイルス性合成分子として同等の担体機能を果たし、そしてこのようなウイルス性合成分子として当該分野で公知のまたは公知となるこのような他の形態のベクターを含むことが意図される。
【０１２１】
治療目的の「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類されるあらゆる動物をいい、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、非ヒト霊長類、ならびに動物園、スポーツまたはペット用の動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ）などを含む。
【０１２２】
目的の抗体は、本明細書中に記載されるか、または当該分野で公知のアッセイにおいてスクリーニングされ得るか、または使用され得る。しばしば、このようなアッセイは、検出可能な試薬、すなわち、例えば、標識化を必要とする。本明細書中で使用される場合、語「標識」とは、分子またはタンパク質、例えば、抗体に直接または間接的に複合され得る検出可能な化合物または組成物をいう。標識はそれ自体が検出可能であり得るか（例えば、放射性同位元素標識、粒子または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変質を触媒し得る。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、「固相」とは、実体または分子、例えば、本発明の抗体が付着し得る非水性マトリックスを意味する。本明細書中に含まれる固相の例としては、ガラス（例えば、制御されたポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ））、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンで部分的にまたは全体的に形成されるものが挙げられる。特定の実施形態において、状況次第で、固相はアッセイプレートのウェルを含み得；他においては、精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）に使用され得る。従って、固相は、紙、ビーズ、プラスチック、チップなどであり得、種々の材料、例えば、ニトロセルロース、アガロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、シリコーンなどから作製され得、そして種々の形状であり得る。
【０１２４】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３をコードする遺伝子またはｃＤＮＡは当該分野で公知であり
、当業者に周知の方法に従って、そして、例えば以下を参照して、プラスミドまたは他の発現ベクター中でクローニングされ、そしてかなり多数の発現系中で発現され得る。
【０１２５】
アミノ酸配列突然変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法により調製され得る。これらの方法としては、オリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発および初期に調製した目的の分子の変異体または非変異体バージョンのカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８５）を参照のこと）。
【０１２６】
本発明の抗体、それらのフラグメント、誘導体、またはアナログ（例えば、本発明の抗体、本発明の単鎖抗体または本発明の抗体突然変異体の重鎖または軽鎖）の組換え発現は、本明細書中に記載されるような抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築物を含む。一旦、抗体分子をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体生産のためのベクターが当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって生産され得る。抗体コード配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターが構築される。この方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。
【０１２７】
発現ベクターは従来技術により宿主細胞に移入され、次いで、トランスフェクト細胞は従来技術により培養され、本発明の抗体またはフラグメントを生産する。本発明の１つの局面において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、本明細書中に詳述されるように、完全な免疫グロブリン分子を発現するために宿主細胞で共発現され得る。
【０１２８】
種々の宿主／発現ベクター系が、本発明の抗体分子を発現するために利用され得る。このような発現系は、目的のコード配列を生産し、続いて精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞も表す。細菌性細胞、例えば、大腸菌、および真核細胞が、一般に、組換え抗体分子の発現、特に完全な組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウィルスからの主要中間体初期遺伝子プロモーター要素を保有するもののようなベクターと併用される、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞が、抗体の効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；およびＣｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。植物および植物細胞培養物、昆虫細胞などをまた使用して、当該分野で公知の目的のタンパク質を作製し得る。
【０１２９】
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または所望の特定の形態に遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞が選択される。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系を選択し、目的の発現された抗体の正しい修飾およびプロセシングを確実にし得る。従って、遺伝子産物の一次転写物、グリコシル化およびリン酸化の適正なプロセシングのための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、３Ｔ３または骨髄腫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
組換えタンパク質の長期的な高収率生産のためには、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株が操作され得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するよりはむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）および選択可能マーカー
により制御されたＤＮＡを用いて形質転換される。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は富化培地で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に移される。組換えプラスミド中のの選択可能マーカーにより、選択に耐性が与えられ、そして細胞がプラスミドを染色体に安定して組み込むことを可能にし、そして細胞株に拡大される。このように操作された細胞株は、抗体生産に有用なだけでなく、抗体分子と直接または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価に有用である。
【０１３１】
多数の選択系が、それぞれ、ｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞中で使用され得、これらとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、メチオニンスルホキシミン（ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｄｅ）の存在下グルタミン酸シンターゼ選択（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ  ５８，６７１，２００６およびＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．のウェブサイトまたは文献を参照のこと）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性が、以下の遺伝子についての選択基準として使用され得る：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシド、Ｇ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７（１９９１））；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の当該分野で公知の方法が、所望の組換えクローンを選択するのに通常適用され得、そしてこのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＣｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：１（１９８１）に記載されている。
【０１３２】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により高められ得る（例えばＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能な場合、培養物中に存在するインヒビターレベルの上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅された領域は抗体遺伝子と関連するので、抗体の生産もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２５７（１９８３））。
【０１３３】
宿主細胞は、本発明の２つまたはそれ以上の発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二のベクターで共トランスフェクトされ得る。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの均一発現（ｅｑｕａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を可能にする同一の選択可能マーカーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、そしてこれらを発現し得る単一のベクターを使用してもよい。このような状況下、軽鎖は、過剰な有毒な遊離重鎖を避けるために重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒ
ｅ  ３２２：５２（１９８６）；およびＫｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０１３４】
一旦、本発明の抗体分子は、動物により生産されるか、化学合成されるか、または組換えで発現されると、免疫グロブリン分子を精製するための当該分野で公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィー後のＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対する親和性による、など）、遠心分離、示差溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）により、またはタンパク質精製のための任意の他の標準技術により精製され得る。さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、精製を促進するために、本明細書中に記載されるか、または当該分野で他に公知の異種のポリペプチド配列に融合され得る。
【０１３５】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法により生成され得る。ヒトにおける使用を最適化し、さらに抗体自体の使用を最適化する抗体の修飾のために、本発明の抗体はポリクローナル抗体を含み得るが、特定のタンパク質の生産および操作の容易さのために、モノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に公知である（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２編（１９８８））。
【０１３６】
本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２編（１９８８）およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８１）により記載されるようなハイブリドーマ技術、例えば、トランスフェクトーマを作製し、そして使用する組換えＤＮＡ法、または当業者に公知の他の方法を使用して調製され得る。モノクローナル抗体の生産に利用され得る他の方法の例としては、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；およびＣｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６（１９８３））、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラス、および任意のそれらのサブクラスのものであり得る。本発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。
【０１３７】
ハイブリドーマモデルにおいて、宿主、例えば、マウス、ヒト化マウス、ヒト免疫系遺伝子を有するトランスジェニックマウス、ハムスター、ウサギ、ラット、ラクダまたは任意の他の適切な宿主動物は免疫化され、ＩＬ−４またはＩＬ−１３に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球はポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。
【０１３８】
一般に、抗体生産ハイブリドーマの作製において、ヒト由来の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、齧歯動物、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。典型的に、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が利用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは未融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つまたはそれ以上の物質を含む適切な培地中で培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的に、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐ物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。
【０１３９】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による安定した高レベルの抗体生産をサポートし、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性であるものである。これらの骨髄腫細胞株には、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能なＳＰ２／０、ＦＯまたはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものがある。
【０１４０】
ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ｐｐ．５１−６３（１９８７））。マウス骨髄腫細胞株ＮＳＯもまた使用され得る（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｓｈｉｒｅ，ＵＫ）。
【０１４１】
代替法は、化学融合よりもむしろ電気融合を使用して、ハイブリドーマを形成することである。融合の代わりに、例えば、エプスタインバーウイルスまたは別の形質転換遺伝子を使用して、Ｂ細胞を不死化し得る、例えば、Ｚｕｒａｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｅｄ．，Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１９−３３．（１９８０）を参照のこと。免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスおよびヒトＢリンパ球を移植された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスをまた使用し得る。
【０１４２】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培地が、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に指向されるモノクローナル抗体の生産についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、またはインビトロ結合アッセイ、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フルオロサイトメトリー分析（ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＡＣＳ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定され得る。このような技術は、当該分野および当業者に公知である。ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析により決定され得る（Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０７：２２０（１９８０））。
【０１４３】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンは、限界希釈法によりサブクローニングされ、標準的な方法により増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。適切な培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ
−ＭＥＭ）またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０１４４】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、プロテインＧ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水または血清から適切に分離または単離される。
【０１４５】
モノクローナル抗体を生産するための種々の方法が当該分野に存在し、従って、本発明はハイブリドーマでの生産のみに限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるもののように組換えＤＮＡ法より作製され得る。これに関連して、用語「モノクローナル抗体」は、単一の真核生物、ファージまたは原核生物クローン由来の抗体をいう。
【０１４６】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖、またはヒト、ヒト化または他の供給源からのこのような鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって））、容易に単離され、そして配列決定される（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９９０），およびＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７４：５４６３（１９７７））。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に配置され、次いで、これは宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または別法で免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常領域のコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより、ＤＮＡはまた修飾され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域と置換されるか、または本発明の抗体の１つのＩＬ−４またはＬ−１３結合部位の可変ドメインと置換され、キメラ二価抗体を作製し得る。
【０１４７】
抗体は一価抗体であり得る。一価抗体の調製方法は当該分野で周知である。例えば、ある方法は、免疫グロブリンの軽鎖および修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、一般に、重鎖の架橋を防ぐためにＦc領域の任意の点で切断される。あるいは、架橋を防ぐために
、関連するシステイン残基が別のアミノ酸残基と置換されるか、または欠失される。
【０１４８】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により生成され得る。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解により誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。例えば、本発明のＦabおよびＦ(ab')2フラグメントは、酵素、例えば、（Ｆabフラグメントを生産するための）パパインまたは（Ｆ(ab')2フラグメントを生産するための）ペプシンを使用して、免疫グロブリン分子のタンパク分解的切断により生産され得る。Ｆ(ab')2フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣH1領域を含む。しかし、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞により直接生産され得る。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリー
から単離され得る。あるいは、Ｆ(ab')2−ＳＨフラグメントが、大腸菌から直接回収され、そして化学的に結合され、Ｆ(ab')2フラグメントを形成し得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３  （１９９２））。別法に従って、Ｆ(ab')2フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントを生産するための他の技術は、当業者に明らかである。他の実施形態において、最適な抗体は、単鎖Ｆvフラグメント（Ｆv）である（ＷＯ９３／１６１８５）。
【０１４９】
ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの使用については、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましくあり得る。キメラ抗体の生産方法は、当該分野で公知である、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号を参照のこと。
【０１５０】
ヒト化抗体は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を結合する非ヒト種で生成される抗体分子由来であり、これら由来の１つまたはそれ以上のＣＤＲがヒト免疫グロブリン分子由来のＦＲ領域に挿入される。抗体は、当該分野で公知の種々の技術を使用してヒト化され得、これらの技術としては、例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；ＷＯ９１／０９９６７；ならびに米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたは再表面形成法（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：４８９（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５（１９９４）；およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：９６９（１９９４））、および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）が挙げられる。
【０１５１】
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、これは典型的には「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に非ヒトＣＤＲまたはＣＤＲ配列の一部を置換することによるＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って基本的に実施され得る（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））。従って、このような「ヒト化」抗体は、実質的に１未満のインタクトなヒト可変領域が非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基および可能性のあるいくつのＦＲ残基が、齧歯動物抗体の類似部位から置換されているヒト抗体である。重鎖定常領域およびヒンジ領域は、任意のクラスまたはサブクラスに由来し、特定のエフェクター機能のような所望の効果を得ることができる。
【０１５２】
しばしば、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を改変、好ましくは改善するためにＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換され得る。フレームワーク置換は、当該分野で公知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較により同定される、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと。
【０１５３】
ヒト化抗体は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対する高親和性を保持し、そして他の好ましい生物学的特性を保持または確保することがさらに望ましい。従って、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析工程により、ヒト化抗体を生産する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、そして当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、そして表示するコンピュータープログラムが入手可能である。表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における特定の残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グログリンがＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このように、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３結合に直接的かつ最も実質的に影響を与えるのはＣＤＲ残基であるが、所望の抗体特性（例えば、標的抗原に対する向上した親和性）が最大化されるように、ＦＲ残基はレシピエントおよび移入配列から選択され、そして組み合わせられ得る。ＣＤＲ領域はまた、ＣＤＲが得られた親抗体から得られるものと異なる１つまたはそれ以上のアミノ酸を含むように修飾され、目的の向上したまたは異なる特性、例えば、より高い親和性またはより高いアビディティーの結合を提供し得る。
【０１５４】
抗体の定常領域の特定部分を操作し、そして変化させ、親抗体において観察されるものとは異なるか、またはより良い特性を有する抗体ホモログ、誘導体、フラグメントなどを得ることができる。従って、例えば、多くのＩｇＧ４抗体はヒンジ領域と近接して鎖内ジスルフィド結合を形成する。鎖内結合は、軽鎖に関連する重鎖を含む一価分子を形成する親二価分子を不安定にし得る。ランダムベースであるが、このような分子は再関連し得る。
【０１５５】
ＩｇＧ４分子のヒンジ領域中のアミノ酸を修飾することは、鎖内結合形成の可能性を低くし得、それによりＩｇＧ４分子を安定化することが観察され、これにより二重特異性分子を形成する可能性を最小化する。向上した安定性により生産および製造の間、さらにインビボで、分子の解離を有する可能性を最小化するので、治療的抗体がＩｇＧ４分子である場合、この修飾は有益であり得る。一価抗体は、二価親分子と同じ効果を有し得ない。例えば、二価ＩｇＧ４が患者に投与される場合、二価ＩｇＧ４の割合は、２週間にわたって約３０％まで減少する。位置２２８でのアミノ酸置換により、ＩｇＧ４安定性は高まる。２２８に存在するセリンが別のアミノ酸、例えば、残りの１９アミノ酸のうちの１つで置き換えられ得る。このような変化は、特に、組換え抗体を用いてなされ得、ここで配列をコードする核酸が突然変異され、位置２２８でのアミノ酸置換をもたらし得る。例えば、Ｓはプロリンで置き換えられ得る。
【０１５６】
修飾に適切なアミノ酸の別のセットは、Ｆc受容体への結合および結合抗体の内在化で
重鎖を含む分子の結合に影響を与えるヒンジ領域中のアミノ酸を含む。ＩｇＧ１分子中のこのようなアミノ酸としては、約２３３〜約２３７（ＧｌｕＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）；（配列番号４９）、約２５２〜約２５６（Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ）（配列番号５０）および約３１８（Ｇｌｕ）〜約３３１（Ｐｒｏ）（例えば、Ｌｙｓ320、Ｌｙｓ322およびＰｒｏ329が挙げられる）の残基が挙げられる。
【０１５７】
ヒト患者の治療には、完全なヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、当該分野で公知の種々の方法により作製され得、この方法としては、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法が挙げられる、例えば、米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１を参照のこと。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｏｅｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ  １４７：８６（１９９１））。
【０１５８】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現できないが、特定のヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用して生産され得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体が、ランダムにまたは相同的組換えにより、マウス胚幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域が、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚幹細胞に導入され得る。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別個にまたは同時に非機能性の状態になり得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合体欠失は内因性抗体生産を防止する。改変胚幹細胞は、キメラマウスを生産するために伸長され、そして胚盤胞に顕微注入される。次いで、キメラマウスを交配して、ヒト抗体を発現するホモ接合型の子孫を生産する、例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２））を参照のこと。
【０１５９】
トランスジェニックマウスは、ＩＬ−４またはＩＬ−１３サイトカイン（例えば、ＩＬ−４またはＩＬ−１３の全てまたは一部）を使用して通常の手順で免疫化される。ＩＬ−４またはＩＬ−１３に指向されたモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を使用して免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスに宿ったヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、続いてクラススイッチおよび体細胞変異を受ける。従って、このような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生産することが可能である。概説について、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産する議論およびこのような抗体を生産するためのプロトコルについて、例えば、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；およびＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０  ５９８  ８７７号；ならびに米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８を参照のこと。さらに、Ａｍｇｅｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、Ｇｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）のような企業が、上記のものと類似の技術を使用して、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に指向されるヒト抗体を提供することに取り組み得る。
【０１６０】
また、ヒトｍＡｂは、ヒト末梢血白血球、脾細胞または骨髄を移植されたマウスを免疫化することにより作製され得る（例えば、ＸＴＬ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｓｒａｅｌのトリオーマ技術（ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ））。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技術を使用して生成され得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体のセレクションをガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９（１９８８））。
【０１６１】
組換え技術を使用する場合、抗体変異体は、ペリプラズム空間で細胞内に生産されるか
、または培地中に直接分泌され得る。抗体変異体が細胞内で生産される場合、第一段階として、宿主細胞または溶解したフラグメントいずれかの微粒子状破片を、例えば、遠心分離または限外ろ過により除去し得る。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３（１９９２）は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌された抗体を単離する手順を記載する。簡潔に、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）およびＥＤＴＡに暴露する。細胞片を遠心により除去し得る。抗体変異体が培地中に分泌される場合は、このような発現系由来の上清を、一般に、始めに、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過装置を使用して濃縮する。タンパク分解を防止するために、ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を含んでもよく、そして外因性汚染物質の増殖を防止するために抗生物質を含んでもよい。
【０１６２】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡまたはプロテインＧの適合性は、抗体変異体に存在する任意の免疫グロブリンＦc領域の種およびアイソタイプに依存する。プロ
テインＡを使用して、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製し得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．６２：１（１９８３））。プロテインＧは、マウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に使用され得る（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７（１９８６））。アフィニティーリガンドを結合させているマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御されたポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて達成され得るよりも流速を速め、そして処理時間を短縮することが可能となる。抗体変異体がＣH3領域を含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収される抗体または変異体に依存して、タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンアガロースでのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿も利用可能である。
【０１６３】
任意の予備精製工程に続いて、目的の抗体または変異体および汚染物質を含む混合物は、ｐＨ約２．５〜４．５の溶出緩衝液を使用して、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行なわれる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
【０１６４】
本発明の抗体は二重特異性抗体であり得る。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化抗体であり得る。好ましい実施形態おいて、二重特異性抗体、それらのフラグメントなどは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に指向された結合特異性を有する。
【０１６５】
二重特異性抗体の作製方法は周知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の共発現に基づき、ここで２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せのために、ハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生産し、これらの分子の一つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により達成される。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５（１９９１）に開示
されている。他の二重特異性抗体の作製方法が、例えば、Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２：２３８−２４４，２００４に提供される。
【０１６６】
所望の結合特異性を有する抗体可変領域は、免疫グロブリン定常領域配列に融合され得る。ヒンジ、ＣH2、およびＣH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域との融合が好ましい。それは、融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第一重鎖定常領域（ＣH1）を有し得る。免疫グロブリン重鎖融合、および所望である場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同時形質転換される。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍ  １２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１６７】
ヘテロ複合体抗体もまた本発明により意図される。ヘテロ複合体抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、不必要な細胞に対して免疫系細胞を標的化することが提案されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。抗体は、架橋剤に関するものを含む、合成タンパク質化学において公知である方法を使用して、インビトロで調製され得ることが意図される。例えば、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエスエル結合を形成することにより、免疫毒素が構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダート（ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）、ならびに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。
【０１６８】
さらに、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対する単一領域抗体を生成し得る。この技術の例は、ラクダ重鎖Ｉｇ由来の抗体に関するＷＯ９４２５５９１、さらにファージライブラリーからの単一領域完全ヒト抗体の単離を記載しているＵＳ２００３０１３０４９６に記載されている。
【０１６９】
あるいは、単鎖抗体の生産について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９（１９８８）；およびＷａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４（１９８９））は、単鎖抗体の生産に適応され得る。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦv領域の重鎖および軽鎖
フラグメントを連結することにより形成され、単鎖ポリペプチドがもたらされる。大腸菌における機能的Ｆvフラグメントのアセンブリ技術もまた使用され得る（Ｓｋｅｒｒａ  
ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８（１９８８））。
【０１７０】
本発明は、ポリペプチドに組換え技術により融合されたか、または化学的に複合された（共有および非共有複合の両方を含む）抗体を含む。本発明の融合または複合抗体は、精製を容易にするために使用され得る、例えば、ＷＯ９３／２１２３２；欧州特許第４３９，０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３９：９１（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１４２８（１９９２）；およびＦｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：２４４６（１９９１）を参照のこと。マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、これらの多くが市販されており、特にｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）で供給されるタグ）であり得る、Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８２１（１９８９）。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
重鎖および軽鎖Ｆv領域が連結されているペプチド単鎖結合分子を生成し得る。単鎖抗
体（「ｓｃＦv」）およびそれらの構築方法は、例えば、米国特許第４，９４６，７７８
号に記載されている。あるいは、同様の手段によりＦabを構築し、そして発現し得る。全ての完全および部分的ヒト抗体が、完全マウスモノクローナル抗体よりも免疫原性を低くし得、そしてフラグメントおよび単鎖抗体もまた免疫原性を低くし得る。
【０１７２】
抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３４８：５５２（１９９０）に記載の技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１（１９９１）は、ファージライブラリーを使用して、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載する。続く公報は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９（１９９２））、さらに非常に大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしての組合せ感染（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：２２６５（１９９３））を記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替法である。
【０１７３】
候補抗−ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３抗体を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＦＡＣＳ、ウエスタン免疫ブロット法または当該分野で公知の他の免疫化学的技術により試験する。
【０１７４】
特定の抗体ホモログがヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に結合するかどうかを決定するために、任意の従来の結合アッセイが使用され得る。有用なＩＬ−４およびＩＬ−１３結合アッセイとしては、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ分析、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）、放射免疫測定法などが挙げられ、これらは、ヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−１３への抗体の結合およびそれらから得られた機能を検出する。本明細書中に教示されるヒトＩＬ−４およびＩＬ−１３の完全長および可溶形態が、このようなアッセイにおいて有用である。ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３への、またはそれらの可溶フラグメントへの抗体またはホモログの結合は、抗体またはホモログ由来の種の免疫グロブリンに対する第二の抗体特異性の使用により、都合良く検出され得る。
【０１７５】
特定の抗体またはホモログがＩＬ−４および／またはＩＬ−１３への結合を著しく阻害するかどうかを決定するために、任意の適切な競合アッセイが使用され得る。有用なアッセイとしては、例えば、抗体またはホモログがＩＬ−４および／またはＩＬ−１３と競合する能力を定量化する、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、放射免疫測定法などが挙げられる。好ましくは、リガンドが固定化された抗体またはホモログへの標識化ヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の結合を阻害する能力を測定する。
【０１７６】
本発明の抗体は、抗体が認識するか、または特異的に結合するＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のエピトープまたは部分に関して記載または特定され得る。本明細書中に記載されるように、エピトープまたはポリペプチド部分が、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置により、隣接アミノ酸残基の大きさ、立体配座エピトープなどにより特定され得る。
【０１７７】
本発明の抗体はまた、交差反応に関して記載または特定され得る。（当該分野で公知および本明細書中に記載される方法を使用して見積もられるように）ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なく
とも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性を有する、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３  ポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に包含される。
【０１７８】
本発明の抗体はまた、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に対する結合親和性に関して記載または特定され得る。抗−ＩＬ−４および／または抗−ＩＬ−１３抗体は、約１０-7Ｍ未満、約１０-6Ｍ未満、または約１０-5ＭのＫDで結合し得る。約１０-8〜約１０-15Ｍ、約１０-8〜約１０-12Ｍ、約１０-9〜約１０-11Ｍ、もしくは約１０-8〜約１０-10Ｍの
平衡解離定数またはＫDを有するものような、目的の抗体におけるより高い結合親和性が
有益であり得る。本発明はまた、競合的結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法、例えば、本明細書中に記載される免疫測定法により決定されるような、本発明のエピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態おいにて、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％でエピトープへの結合を競合的に阻害する。
【０１７９】
本発明はまた、目的の抗体を含む複合体を含む。複合体は、２つの主成分、目的の抗体および第二の成分（これは、細胞結合剤、細胞毒性薬などであり得る）を含む。
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞結合剤」とは、細胞表面上の分子を特異的に認識し、そして結合する薬剤をいう。従って、細胞結合剤は、ＣＤ抗原、病原体抗原、例えば、ウイルス抗原、分化抗原、がん抗原、細胞特異的抗原、組織特異的抗原、ＩｇまたはＩｇ−様分子などであり得る。
【０１８１】
細胞結合剤は、現在公知であるか、または公知となる、任意のタイプものであり得、そしてこれらとしては、ペプチド、非ペプチド、単糖、核酸、リガンド、受容体など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。細胞結合剤は、特異的または非特異的な様式で細胞に結合し得る任意の化合物であり得る。一般に、これらの薬剤は、抗体（特に、モノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、ビタミン、栄養素輸送分子（例えば、トランスフェリン）、または任意の他の細胞結合分子もしくは物質であり得る。
【０１８２】
使用され得る細胞結合剤の他の例としては、ポリクローナル抗体；モノクローナル抗体；および抗体フラグメント（例えば、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2およびＦv）が挙げられる（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４７０−４７８（１９７４）；およびＮｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０−２４４（１９６０））。
【０１８３】
第二の成分はまた、細胞毒性薬であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「細胞毒性薬」とは、細胞の機能または増殖を低下させるか、または阻害し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。従って、細胞毒性薬は、タキソール、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）、ＣＣ−１０６５もしくはＣＣ−１０６５アナログ、リシン、マイトマイシンＣなどであり得る。いくつかの実施形態において、本発明の抱合体の任意の結合剤と同様に、細胞毒性薬は、目的の抗体に直接的または開裂性もしくは非開裂性リンカーを介して細胞毒性薬に共有結合される。
【０１８４】
適切なメイタンシノイドの例としては、メイタンシノールおよびメイタンシノールアナログが挙げられる。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、そして哺乳動物細胞に極めて有毒である。
【０１８５】
適切なメイタンシノールアナログの例としては、修飾された芳香環を有するものおよび他の位置に修飾を有するものが挙げられる。このような適切なメイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６２，６６３号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３７１，５３３号；同第６，３３３，４１０号；同第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；および同第５，８４６，５４５号に開示される。
【０１８６】
修飾された芳香環を有する適切なメイタンシノールアナログの例としては、（１）Ｃ−１９デクロロ（ｄｅｃｈｌｏｒｏ）（米国特許第４，２５６，７４６号）（例えば、アンサマイトシン（ａｎｓａｍｙｔｏｃｉｎ）Ｐ２のＬＡＨ還元によリ調製される）；（２）Ｃ−２０ヒドロキシ（またはＣ−２０デメチル）＋／−Ｃ−１９デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および同第４，３０７，０１６号）（例えば、ストレプトマイセスもしくはアクチノミセスを使用する脱メチル反応または水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）を使用する脱塩素により調製される）；および（３）Ｃ−２０デメトキシ、Ｃ−２０アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを使用するアシル化により調製される）が挙げられる。
【０１８７】
他の位置での修飾を有する適切なメイタンシノールアナログの例としては、（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ2ＳまたはＰ2Ｓ5
の反応により調製される）；（２）Ｃ−１４アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ2ＯＲ
）（米国特許第４，３３１，５９８号）；（３）Ｃ−１４ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ2ＯＨまたはＣＨ2ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジアから調製される）；（４）Ｃ−１５ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの変換により調製される）；（５）Ｃ−１５メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および同第４，３１５，９２９号）（トレビア  ヌーディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離される）；（６）Ｃ−１８−Ｎデメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および同第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの脱メチル反応により調製される）；および（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）が挙げられる。
【０１８８】
細胞毒性複合体は、インビトロ法により調製され得る。細胞毒性薬、薬物またはプロドラッグを抗体に連結させるために、一般に連結基が使用される。適切な連結基が当該分野で公知であり、そしてこれらとしは、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光解離性基、ペプチダーゼに不安定な基およびエステラーゼに不安定な基が挙げられる。例えば、複合体は、ジスルフィド交換反応を使用して、または目的の抗体と薬物またはプロドラッグとの間にチオエーテル結合を形成することにより構築され得る。
【０１８９】
上で議論されるように、本発明は、本明細書中に開示される抗体またはそれらの機能的フラグメントもしくは変異体をコードする単離された核酸配列、本発明の抗体またはそれらの機能的フラグメントのＩＬ−４および／またはＩＬ−１３−結合部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物、このようなベクターを含む宿主細胞、およびポリペプチドを生産するための組換え技術を提供する。
【０１９０】
ベクターは、通常、当該分野で公知の成分を含み、そして、一般に、１つまたはそれ以上の以下を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子もしくは選択遺伝子、翻訳を促進および／または増強する配列、エンハンサー要素など。従って、発現ベクターは、このような適切な転写または翻訳制御ヌク
レオチド配列（例えば哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来のもの）に操作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。さらなる制御配列の例としては、オペレーター、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および／または転写および翻訳（例えば、これらの開始および終止）を制御する他の適切な配列が挙げられる。ヌクレオチド配列は、制御配列が適切なポリペプチドのヌクレオチド配列と機能的に関連する場合「操作可能に連結」される。従って、プロモーターヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の転写を制御する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、例えば、抗体重鎖配列に操作可能に連結される。
【０１９１】
さらに、抗体重鎖および／軽鎖配列と天然には関連しない適切なシグナルペプチドをコードする配列を、発現ベクターに組込むことができる。例えば、抗体がペリプラズム空間または培地に分泌されるように、シグナルペプチドのヌクレオチド配列（分泌リーダー）をインフレームでポリペプチド配列に融合し得る。意図される宿主細胞において機能的なシグナルペプチドが、適切な抗体またはそれの部分の細胞外分泌を増加させる。シグナルペプチドは、細胞から抗体を分泌する際、ポリペプチドから切断され得る。このような分泌シグナルの例は周知であり、そしてこれらとしては、例えば、米国特許第５，６９８，４３５号；同第５，６９８，４１７号；および同第６，２０４，０２３号に記載されるものが挙げられる。
【０１９２】
ベクターは、プラスミド、一本鎖もしくは二本鎖ウイルスベクター、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡファージベクター、ファージミド、コスミドまたは目的のトランス遺伝子の任意の他の担体であり得る。このようなベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入する周知の技術により、ポリヌクレオチドとして細胞に導入され得る。ファージおよびウイルスベクターの場合、ベクターはまた、感染および形質導入のための周知の技術により、パッケージ化またはカプセル化されたウイルスとして細胞に導入され得る。ウイルスベクターは、複製可能または複製欠損であり得る。後者の場合において、ウイルス増殖は、一般に、相補宿主細胞でのみ起こり、そして粒子を生産するのに必要な種々のウイルス成分を有する複数のベクターを使用する。無細胞翻訳系をまた利用して、本発明ＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して、タンパク質を生産し得る（例えば、ＷＯ８６／０５８０７およびＷＯ８９／０１０３６；ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）。
【０１９３】
本発明の抗体は、任意の適切な宿主細胞から発現され得る。本発明に有用な宿主細胞の例としては、原核生物、酵母または高等真核細胞が挙げられ、そして目的の抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌、エンテロバクター菌、エルビニア菌、クレブシエラ菌、プロテウス菌、サルモネラ菌、セラチア菌、および赤痢菌、さらにバチルス菌、シュードモナス菌および放線菌）のような微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス、ピチア、放線菌、クリベロマイセス、シゾサッカロミセス、カンジダ、トリコデルマ、アカパンカビ、および糸状菌（例えば、アカパンカビ、ペニシリウム、トリポクラジウムおよびアスペルギルス））；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）で感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；またはタバコモザイクウィルス、ＴＭＶ）で感染させた、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウィルス遅発性プロモーター；またはワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を宿す哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３または３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
原核宿主細胞に使用する発現ベクターは、一般に、１つまたはそれ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞のための有用な発現ベクターの例としては、市販のプラスミド由来のもの、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）シリーズのベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｊ  Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ  ２１９：３７（１９９１）；およびＳｃｈｏｅｐｆｅｒ，Ｇｅｎｅ  １２４：８３（１９９３））が挙げられる。組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般的に使用されるプロモーター配列としては、Ｔ７（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６：１２５（１９８７））、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ８：４０５７（１９８０））、およびｔａｃプロモーター（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９０））が挙げられる。
【０１９５】
酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミドに由来するような複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終止配列および選択可能マーカー遺伝子を含む。酵母ベクターに適切なプロモーター配列としては、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：２０７３（１９８０））または他の糖分解酵素（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７：４９００（１９７８））、例えば、エノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。酵母発現での使用に適切な他のベクターおよびプロモーターは、さらに、Ｆｌｅｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０７：２８５（１９９１）に記載される。酵母および酵母形質転換プロトコルに適切な他のプロモーターおよびベクターが当該分野で周知である。酵母形質転換プロトコルは周知である。このようなプロトコルの１つは、Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７５：１９２９（１９７８）に記載され、これは、選択培地におけるＴｒｐ+形質転換体を選択する。
【０１９６】
脊椎動物培養でもまたは無脊椎動物培養でも、いかなる真核細胞培養も有効である。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−９，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８６）；およびＭａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２（１９８５））。例えば、バキュロウィルス系が、異種タンパク質を生産するために使用され得る。昆虫系において、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。このウイルスは、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞で増殖する。抗体コード配列は、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下でクローニングされ得る。同定されている他の宿主としては、ネッタイシマカ、キイロショウジョウバエおよびカイコが挙げられる。
トランスフェクションのための種々のウイルス株（例えば、ＡｃＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株）が公的に入手可能である。さらに、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養もまた、当該分野で公知の宿主として利用される。
【０１９７】
脊椎動物細胞および培養物（組織培養物）における脊椎動物細胞の増殖は通常の手順であるが、例えば、特有の因子、支持細胞などを含む特殊な培地を必要とする難しい（ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ）細胞株が存在する、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７３）を参照のこと。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、サル腎臓；ヒト胚腎臓株；ベビーハムスター腎細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞；ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ）；イヌ腎細胞；ヒト肺細胞；ヒト肝細胞；マウス乳房腫瘍；およびＮＳ０細胞が挙げられる。
【０１９８】
宿主細胞は、抗体生産のためのベクターで形質転換され、そして成長因子、ビタミン、ミネラルなど、さらに使用される細胞およびベクターに適切な誘導因子を含む従来の栄養培地中で培養される。通常、使用されるプロモーター配列およびハンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０由来の早期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位）を使用して、哺乳動物宿主細胞において構造遺伝子配列を発現するための他の遺伝要素を提供し得る。ウイルス早期および後期プロモーターは、両方ともがウイルス複製起点を含み得るフラグメントとしてウイルスゲノムから容易に得られるので、特に有用である。哺乳動物宿主細胞に使用するための例示的な発現ベクターは、市販されている。
【０１９９】
市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が宿主細胞を培養するのに適切である。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ５８：４４（１９７９）およびＢａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０２：２５５（１９８０）、ならびに米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，５６０，６５５号；同第５，１２２，４６９号；５，７１２，１６３号；または同第６，０４８，７２８号に記載された任意の培地を宿主細胞のための培地として使用し得る。これらの任意の培地は、必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インシュリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化物、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウム；およびリン酸塩）、緩衝化剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質、微量元素（通常、最終濃度がマイクロモル範囲で存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは等価なエネルギー源で補充され得る。任意の他の必要な補充物質を、設計上の選択として適切な濃度で含み得る。細胞に適切で、そしてトランス遺伝子の所望の発現を可能にするような培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは当該分野で公知の通りである。
【０２００】
当該分野で公知の任意の方法により、目的のポリヌクレオチドを得ることができ、そしてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定し得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載のように）、次いで、例えば、ＰＣＲによりライゲートされたオリゴヌクレオチドを増幅し得る。
【０２０１】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、同じものを発現する細胞の核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手不可能であるが、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸を、ライブラリーのような適切な供給源から得ることができ、これは、本発明の抗体を発現するために選択されるハイブリドーマ細胞のような抗体生産細胞に特異的なものであり得る。適切なプライマリーは、ＰＣＲ増幅のために構成され得る。次いで、ＰＣＲにより生成された増幅核酸は、当該分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能クローニングベクターにクローニングされ得る。
【０２０２】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成するため、例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を生成するために、ヌクレオチド配列の操作に関する当該分野で公知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを使用して、本明細書中に記載される目的の等価物を得るために操作され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９０）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９８）を参照のこと）。
【０２０３】
周知の方法により、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較して、配列超可変領域を決定することにより、重鎖および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列を調査し、ＣＤＲの配列を同定し得る。通常の組換えＤＮＡ技術を使用して、上記のように、１つまたはそれ以上のＣＤＲを、フレームワーク領域内で、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入し、非ヒト抗体をヒト化し得る。フレームワーク領域と１つまたはそれ以上のＣＤＲの組合せにより生成された目的のポリヌクレオチドは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３、または少なくともそれらのＥＤ領域に特異的に結合する抗体をコードする。例えば、このような方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つまたはそれ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行い、１つまたはそれ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を生成し得る。
【０２０４】
本発明の抗体または抗体フラグメントを使用して、インビトロまたはインビボで生体サンプル中のＩＬ−４および／またはＩＬ−１３、従って、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を発現する細胞を検出し得る。１つの実施形態において、本発明の抗−ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３抗体を使用して、組織または組織由来の細胞中のＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の存在およびレベルを決定する。組織または生検中のＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のレベルを、例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントを用いる免疫測定法において決定し得る。組織またはそれらの生検は凍結または固定され得る。同様のまたは他の方法を使用して、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の他の特性、例えば、それらのレベル、細胞局在、ｍＲＮＡレベル、それらの突然変異体などを決定し得る。
【０２０５】
上記の方法を使用して、例えば、がんを有することが既知であるか、またはその疑いのある被験体におけるがんを診断し得、ここで前記患者において測定されるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のレベルは、正常な参照被験体または標準のものと比較される。目的のアッセイをまた使用して、関節炎または分化したリンパ系組織の発達と共にＢ細胞浸潤および濃度により特徴付けられる他の自己免疫疾患を診断し得る。
【０２０６】
本発明は、研究用途または診断的適用に使用するために、さらに標識されたモノクローナル抗体、ヒト化抗体およびそれらのエピトープ結合フラグメントをさらに提供する。い
くつかの実施形態において、標識は放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤または金属イオンである。
【０２０７】
前記標識された抗体またはそれらのエピトープ結合フラグメントをがん、関節炎、自己免疫疾患または他のＩＬ−４および／またはＩＬ−１３仲介性疾患を有する疑いのある被験体に投与し、そして被験体の体内での標識の分布を測定またはモニターする診断方法がまた提供される。
【０２０８】
本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、アフィニティー精製の薬剤として使用され得る。この工程において、抗体は当該分野で公知の方法を使用して、固相、例えば、デキストランもしくはアガロース樹脂または濾紙上に固定化される。固定化された抗体は、精製されるＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を含むサンプルまたは同様のものを保有する細胞と接触させられ、その後、固定化された目的の抗体に結合した、精製されたＩＬ−４および／またはＩＬ−１３または細胞を除いて、サンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、目的の抗体からＩＬ−４および／またはＩＬ−１３または細胞を放出する別の適切な溶媒（例えば、グリシン緩衝剤）（ｐＨ５．０）で支持体を洗浄する。
【０２０９】
診断的適用について、目的の抗体は、典型的に、検出可能な部分で標識される。一般に、以下のカテゴリーに分類され得る多数の標識が利用可能である：（ａ）放射性同位体、例えば、35Ｓ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈおよび131Ｉ（抗体は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１２，Ｃｏｌｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載される技術を使用して、放射性同位体で標識され得、そしてシンチレーションカウンターを使用して放射性活性を測定し得る）；（ｂ）蛍光標識、例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッド、蛍光光度計を使用して蛍光を定量化し得る場合、蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出に開示される技術を使用して抗体に抱合され得る；および（ｃ）種々の酵素基質標識が利用可能であり（米国特許第４，２７５，１４９号はレビューを提供する）、一般に、酵素は、種々の技術を使用して測定され得る発色性基質の化学的変化を触媒し、例えば、酵素は、分光光度法で測定され得る基質における色素変化を触媒し得るか、または酵素は基質の蛍光または化学発光を改変し得る。例えば、照度計を使用する蛍光の変化を定量化するための技術が公知であるか、または標識は蛍光アクセプターにエネルギーを放出する。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば蛍ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ））、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素を抱合する技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚ，ｅｄ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３（１９８１）に記載される。
【０２１０】
このような標識が使用される場合、以下のような適切な基質が利用可能である：（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を用いる西洋ワサビペルオキシダーゼ、ここで、水素ペルオキシダーゼは色素前駆体を酸化する（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチル
ベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））；（ｉｉ）発色基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩を用いるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；および（ｉｉｉ）発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
【０２１１】
他の酵素−基質の組み合わせが当業者に利用可能である。一般的なレビューについて、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０号を参照のこと。
【０２１２】
時折、標識は抗体と間接的に複合される。例えば、抗体をビオチンと複合させ得、そして、上記の任意の受容体がアビジンと複合し得、逆もまた同様である。ビオチンはアビジンと選択的に結合し、従って標識が間接的な様式で抗体と複合され得る。あるいは、標識の間接的な複合を達成するために、抗体は小さいハプテン（例えば、ジゴキシン）と複合され、そして上記と異なるタイプの標識または受容体の１つが抗ジゴキシン抗体と複合される。従って、抗体または突然変異タンパク質との標識の間接的複合は、第二の抗体を使用して達成され得る。
【０２１３】
本発明の別の実施形態において、抗体を標識する必要はなく、そしてその存在を抗体に結合する標識化抗体、第二の抗体の別の形態を使用して検出し得る。
【０２１４】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドウィッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような、任意の公知のアッセイに利用され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。
【０２１５】
競合結合アッセイは、限定された量の抗体との結合に関して標識化標準物質が試験サンプルと競合する能力に依存する。試験サンプル中の抗原の量は、抗体に結合することとなる標準物質の量に反比例する。結合することとなる標準物質の量の決定を容易にするために、抗体は、一般に、競合の前または後に不溶化される。その結果、抗体に結合される標準物質および試験サンプルを、未結合のままの標準物質および試験サンプルから都合良く分離し得る。
【０２１６】
サンドイッチアッセイは、検出される標的の異なる免疫原性部分、決定基またはエピトープにそれぞれ結合し得る２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、分析される試験サンプルを、固体支持体上に直接的または間接的に固定化される第一の抗体に結合させ、その後、直接的または間接的に標識された第二の抗体を結合試験サンプルに結合させ、それにより不溶性の３部からなる複合体を形成させる、例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第二の抗体は、それ自体を検出可能な部分で標識してもよく（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体または他の適切な結合対メンバー（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、酵素／基質）を使用して測定してもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合検出可能な部分は酵素である。
【０２１７】
本発明はまた、抗体、それらのフラグメント、ホモログ、それらの誘導体など、例えば、標識化複合体または細胞毒性複合体、ならびに抗体、特定の細胞型を死滅させる複合体などの使用についての取扱説明書を含むキットを含む。取扱説明書は、インビトロ、インビボまたはエキソビボでの抗体、複合体などを使用するための指示を含み得る。抗体は、液体形態または一般に凍結乾燥された固体として存在し得る。キットは、適切な他の試薬、例えば、緩衝剤、再構成溶液および使用目的に必要な他の成分を含み得る。それらの使
用のための、例えば、診断アッセイを実施する治療上の使用のための指示書と共に所定量の試薬の包装された組み合わせが検討される。抗体が、例えば、酵素で標識される場合、キットは、酵素が必要とする基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含み得る。さらに、他の添加物、例えば、安定剤、緩衝剤（例えば、ブロック緩衝剤または溶解緩衝剤）などを含み得る。種々の試薬の相対量は、試薬溶液濃度を提供するように変化し得、これは使用者の柔軟性、空間の節約、試薬の節約などを提供する。溶解の際に、適切な濃度を有する試薬溶液を提供する添加剤を含み、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として、試薬は提供され得る。
【０２１８】
本発明の抗体を使用して、哺乳動物を治療し得る。１つの実施形態において、目的の抗体または等価物は、例えば、前臨床データを得る目的のために非ヒト哺乳動物に投与される。処置される例示的な非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物および前臨床試験が実施される他の哺乳動物が挙げられる。このような哺乳動物は、抗体で治療する疾患の動物モデルとして確立され得るか、または目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、用量漸増試験が哺乳動物において実施され得る。
【０２１９】
第二の成分、例えば、抗体に複合された治療的部分を含むか含まない、単独または細胞毒性因子と組み合わせて投与される抗体が、治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）として使用され得る。本発明は、抗体ベースの治療に関し、この方法としては、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３仲介性疾患、障害または状態を治療するために、本発明の抗体を動物、哺乳動物、またはヒトに投与することを含む。
【０２２０】
本発明において使用される場合、用語「治療」とは、治療および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）対策の両方をいう。これは、病状、疾患の進行、疾患の原因物質（例えば、細菌またはウイルス）または他の異常状態の有害効果を予防、治癒、逆転、軽減、緩和、最小化、抑制または食い止めることをいう。
【０２２１】
従って、本発明はまた、二重特異性抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体を含む多価抗体を含み、この抗体はこれらに結合した診断または治療に機能的なエフェクター分子、原子または他の種を有する。例えば、抗体は、がんをインビボで診断または治療するためにこれらに結合した放射性診断標識または放射性細胞毒性原子もしくは金属または細胞毒性種（例えば、リシン鎖）を有し得る。
【０２２２】
さらに、本発明に従う抗体は、免疫測定法、精製方法および免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントが使用される他の方法において使用され得る。このような使用は当該分野で周知である。
【０２２３】
従って、本発明はまた、当該分野で慣行の薬学的に受容可能な担体、賦形剤または添加剤と都合良く組み合わされた、本発明に従う抗−ＩＬ−１３および／または抗−ＩＬ−４抗体またはそれらのフラグメントを含む組成物を提供する。
【０２２４】
本発明において使用される場合、用語「医薬組成物」とは、種々の調合の製剤をいう。治療有効量の多価抗体を含む製剤は、滅菌溶液、液体懸濁液または凍結乾燥バージョンであり、そして場合により、安定剤または添加剤を含む。
【０２２５】
本発明において使用される場合、用語「障害」とは、本発明の抗体を用いる治療で効果が得られる任意の状態をいう。これらとしては、慢性および急性の障害または疾患（哺乳動物、特にヒトを問題となっている障害にかかりやすくするこれらの病的状態を含む）が挙げられる。本明細書中で治療される障害の非限定的な例としては、がん、炎症、自己免
疫疾患、感染、心疾患、呼吸器疾患、神経疾患および代謝性疾患が挙げられる。
【０２２６】
本発明の抗体を使用して、疾患、例えば、アレルギー性疾患、Ｔｈ２−仲介性疾患、ＩＬ−１３−仲介性疾患、ＩＬ−４−仲介性疾患、および／またはＩＬ−４／ＩＬ−１３−仲介性疾患を治療、抑制または予防し得る。このような疾患の例としては、ホジキン病、喘息、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アトピー性アレルギー、潰瘍性大腸炎、強皮症、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ３、特発性肺線維症、慢性移植片拒絶、ブレオマイシン誘発性肺線維症、放射線誘発性肺線維症、肺肉芽腫、全身性進行性硬化症、住血吸虫症、肝線維症、腎臓がん、バーキットリンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、セザリー症候群、喘息、敗血症性関節炎、疱疹状皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、潰瘍性大腸炎、強皮症、肥厚性瘢痕、ウィップル病、良性前立腺肥大、ＩＬ−４受容体が関与する肺障害、ＩＬ−４受容体仲介性上皮バリアの破壊が関与する状態、ＩＬ−４受容体が関与する消化器官の障害、薬物によるアレルギー反応、川崎病、鎌状赤血球病、チャーグ・ストラウス症候群、バセドウ病、子癇前症、シェーグレン症候群、自己免疫リンパ球増殖性症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核症、嚢胞性線維症、アレルギー性気管支配真菌症、慢性閉塞性肺疾患、ブレオマイシン誘発性肺臓炎（ｂｌｅｏｒｎｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｎｅｕｍｏｐａｔｈｙ）およびブレオマイシン誘発性線維症、肺胞タンパク症、成人呼吸窮迫症候群（ａｄｕｌｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、サルコイドーシス、高ＩｇＥ症候群、特発性好酸球増加症候群（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈｙｐｅｒｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫水疱形成疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、重症筋無力症、慢性疲労症候群、ネフローゼが挙げられる。
【０２２７】
用語「アレルギー性疾患」とは、患者が通常非免疫原性である物質に対して過感作されるか、またはこの物質に対する免疫応答が増大する病的状態をいう。アレルギー性疾患は、一般に、炎症反応（例えば、局所反応、全身性反応）を引き起こすＩｇＥによるマスト細胞の活性により特徴付けられ、この炎症は、鼻水のような軽い症状から生命を脅かすアナフィラキシーショックおよび死をもたらし得る。アレルギー性疾患の例としては、アレルギー性鼻炎（例えば、花粉症）、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、アレルギー性皮膚炎（例えば、湿疹）、接触性皮膚炎、食物アレルギーおよび皮膚の掻痒（蕁麻疹）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２８】
本明細書中で使用される場合、「Ｔｈ２−仲介性疾患」とは、病状が免疫応答（Ｔｈ２−型免疫応答）により（全体または一部において）生じる疾患をいい、この免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を特徴的に生産するＣＤ４+  Ｔｈ２  
Ｔリンパ球により調節される。Ｔｈ２−型免疫応答は、特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）および特定のクラスの抗体（例えば、ＩｇＥ）の生産に関連し、そして液性免疫に関連する。Ｔｈ２−仲介性疾患は、高レベルのＴｈ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）および／または特定のクラスの抗体（例えば、ＩｇＥ）の存在により特徴付けられ、そしてこれらとしては、例えば、アレルギー性疾患（例えば、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、喘息（例えば、アトピー性喘息）、アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）、アナフィラキシーショック、結膜炎）、高レベルのＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に関連する自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎、移植片対宿主病、腎疾患（例えば、腎炎症候群、ループス腎炎）、および高レベルのＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に関連する感染（例えば、ウイルス感染、寄生虫感染、真菌（例えば、カンジダアルビカンス）感染）が挙げられる。特定のがん（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部がん、乳がんおよび卵巣がん）が、高レベルのＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に関連するか、またはＩＬ−４−誘発性および／またはＩＬ−１３−誘発性がん細胞増殖に関連する。これらのがんは本発明のリガンド（Ｉｉｇａｕｄ）を使用して、治療、抑制または予防され得る。
【０２２９】
本発明において使用される場合、用語「がん」とは、哺乳動物、特に、ヒトにおける、典型的に、調節されない細胞増殖により特徴付けられる生理的状態をいうか、または記載する。がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３０】
本発明において使用される場合、用語「自己免疫疾患」とは、非悪性疾患または個々の自分自身の組織から生じ、そして自分自身の組織に向けられた障害をいう。自己免疫疾患または自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の例としては、炎症反応、例えば、乾癬および皮膚炎を含む炎症性皮膚疾患；アレルギー状態、例えば、湿疹および喘息；Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症反応を含む他の状態；アテローム性動脈硬化症；糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症および中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３１】
本発明の抗体は、別個に投与される組成物として、または他の薬剤と併用して使用され得る。抗体は、従来のＩＬ−１３治療薬（例えば、従来のＩＬ−１３薬剤、例えば、抗−ＩＬ−１３Ｒαｌ、ＩＬ−４／１３  Ｔｒａｐ、抗−ＩＬ−１３）＋抗−ＩＬ−４抗体ならびに従来のＩＬ−４薬剤（例えば、抗−ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−４  Ｍｕｔｅｉｎ、ＩＬ−４／１３  Ｔｒａｐ）＋抗−ＩＬ−１３抗体およびＩＬ−４  抗体との併用療法に使用され得る（例えば、ＷＯ０５／００７６９９０（ＣＡＴ）、ＷＯ０３／０９２６１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＷＯ００／６４９４４（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｓｔ．）およびＷＯ２００５／０６２９６７（Ｔａｎｏｘ））。
【０２３２】
本発明の抗体は、１つまたはそれ以上のさらなる治療薬または活性薬剤と一緒に投与され、そして／または製剤化され得る。リガンドがさらなる治療薬と投与される場合、リガンドは、さらなる薬剤投与の前、同時に、または後に投与され得る。一般に、リガンドおよびさらなる薬剤は、治療効果の重複を提供する様式で投与される。本発明のリガンドと投与されるか、または製剤され得るさらなる薬剤としては、例えば、種々の免疫治療薬（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｉｎｇｓ？）、例えば、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｍｕｎ）、抗生物質、真菌薬、抗ウイルス薬および抗毒素が挙げられる。例えば、アンタゴニストは、肺炎症または呼吸器疾患（例えば、喘息）を予防、抑制または治療するために投与される場合、これは、以下と併用して（ｉｎ  ｃｏｎｊｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）投与され得る：ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ホスホジエステラーゼ４の阻害剤）、気管支拡張剤（例えば、β２−アゴニスト、抗コリン剤（ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｒｇｅｒｉｃｓ）、テオフィリン）、短時間作用型β−アゴニスト（例えば、アルブテロール、サルブタモール（ｓａｌｂｕｉａｍｏｌ）、バンブテロール、フェノテロール（ｆｅｎｏｔｅｒ［ｓｉｇｍａ］ｌ）、イソエタリン（ｉｓｏｅｔｈｅｒｉｎｅ）、イソプロテレノール、レバルブテロール（ｌｅｖａ［ｉｏｔａ］ｂｕｔｅｒｏｌ）、メタプロテレノール、ピルブテロール、テルブタリンおよびトルンレート（ｔｏｒｎｌａｔｅ））；長時間作用型β−アゴニスト（例えば、ホルモテロールおよびサルメテロール）、短時間作用型抗コリン剤（例えば、臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム）、長時間作用型抗コリン剤（例えば、チオトロピウム）、テオフィリン（例えば、短時間作用剤、長時間作用剤）、吸入ステロイド（例えば、ベクロメタゾン（ｂｅｃｌｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ベクロメタゾン（ｂｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）、ブデソニド、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾンおよびトリアムシノロン）、経口ステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎ）およびプレドニゾン）、短時間作用型β−アゴニストと抗コリン剤との組み合わせ（例えば、アルブテロール／サルブタモール／イプラトロピウム、およびフェノテロール／イプラトロピウム）、長時間作用型β−アゴニストと吸入ステロイドとの組み合わせ（例
えば、サルメテロール／フルチカゾン、およびホルモテロール（ｆｏｒｍｏｌｅｒｏｌ）／ブデソニド）および粘液溶解剤（例えば、エルドステイン、アセチルシステイン、ブロムヘキシン（ｂｒｏｍｈｅｋｓｉｎ）、カルボシステイン（ｃａｒｂｏｃｙｓｌｃｉｎｅ）、グアイフェネシン（ｇｕｉａｆｅｎｃｓｉｎ）およびヨウ素化グリセリン）。
【０２３３】
喘息（例えば、アレルギー性喘息）を予防、抑止または治療するために、本発明の抗体と投与され得る他の適切な共治療薬としては、副腎皮質ステロイド（例えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルチカゾン）、クロモグリケイト、ネドクロミル、β−アゴニスト（例えば、サルブタモール、テルブタリン、バンブテロール、フェノテロール、レプロテロール、ツロブテロール（ｔｏｌｕｂｕｔｅｒｏｌ）、サルメテロール、フォムテロ（ｆｏｍｔｅｒｏ））、ザフィルルカスト、サルメテロール、プレドニゾン、プレドニゾロン、テオフィリン、ジレウトン（ｚｉｌｅｕｔｒｏｎ）、モンテルカスト、およびロイコトリエン修飾物質（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）が挙げられる。本発明のリガンドは、疾患（例えば、Ｔｈ−２仲介性疾患、ＹＬ−Ａ−仲介性疾患、ＩＬ−１３仲介性疾患、ＩＬ−４仲介性疾患およびがん）を治療するのに適切な種々の共治療薬（サイトカイン、鎮痛剤／解熱剤、制吐薬、および化学療法薬が挙げられる）と共投与され得る。
【０２３４】
本発明の抗体は、当該分野で公知の、または本明細書中に記載される薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。用語「生理的に受容可能な」、「薬学的に受容可能な」などとは、動物、より特にヒトにおける使用について、連邦または州政府の規制機関によって承認されるか、米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方に掲載されることを意味する。
【０２３５】
抗−ＩＬ−４、抗−ＩＬ−１３および二重特異性抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体は、任意の受容可能な様式で哺乳動物、特にヒトに投与され得る。導入の方法としては、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、硬膜外、吸入および経口の経路が挙げられるが、これに限定されず、そして免疫抑制療法が望ましい場合、病巣内投与が挙げられる。非経口注入としては、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内または腹膜内投与が挙げられる。抗体または組成物は、任意の従来の経路、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮層または皮膚粘膜ライニング（ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）からの吸収により投与され得、そして他の生物活性薬剤と共に投与され得る。投与は、全身または局所的であり得る。さらに、脳室内および髄膜注射を含む任意の適切な経路により、本発明の治療的抗体または組成物を中枢神経系に導入することが望ましくあり得；脳室内注射は、例えば、オマヤ漕のような漕に取り付けられた脳室内カテーテルにより促進され得る。さらに、抗体は、特に抗体の用量減少を伴うパルス注入により適切に投与される。投薬は、投与が短期的かまたは常習的かどうかにある程度依存して、注射、好ましくは静脈内または皮下注射により与えられるのが好ましい。
【０２３６】
種々の他の送達系が公知であり、そして本発明の抗体を投与するのに使用され得、これらとしては、例えば、リポソーム、微小粒子、マククロカプセル内へのカプセル化（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ．３５３−３６５（１９８９）；およびＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐ．３１７−３２７を参照のこと）および化合物を発現し得る組換え細胞；受容体仲介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９（１９８７）を参照のこと）；レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築物などが挙げられる。
【０２３７】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション（ｃｏａｓｃｅｒｖａｔｉｏｎ）技術により、または界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、それぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中に封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６編，Ａ．Ｏｓａｌ，Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２３８】
肺投与はまた、例えば、吸入器またはネブライザーの使用により、そしてエアロゾル化剤との製剤を利用し得る。抗体はまた、乾燥粉末組成物の形態で、患者の肺に投与され得る、例えば、米国特許第６，５１４，４９６号を参照のこと。
【０２３９】
特定の実施形態において、治療を必要とする範囲に局所的に本発明の治療的抗体または組成物を投与することが望ましくあり得る；これは、例えば、限定的ではないが、局所注入、局所適用、注射により、カテーテルにより、坐薬によりまたはインプラントにより達成され得、前記インプラントは、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜または繊維のような膜を含む多孔性、非多孔性、ゼリー状の物質である。好ましくは、本発明の抗体を投与する場合、タンパク質を吸収しないか、または吸収する物質の使用に注意する。
【０２４０】
さらに別の実施形態でにおいて、抗体は、制御放出系で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｆ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  １４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；およびＳａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｓｃｉ  Ｒｅｖ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２５：３５１（１９８９）；およびＨｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御放出系は、治療標的に近接して配置され得る。
【０２４１】
ポリペプチドまたは抗体の治療製剤は、望ましい程度の純度を有するポリペプチドを、当該分野で典型的に利用される任意の「薬学的に受容可能な」担体、賦形剤、添加物または安定剤、すなわち、緩衝剤、安定剤、保存料、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒ）、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤および他の多方面の添加物と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液として貯蔵するために調製され得る、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６編，Ｏｓｏｌ，ｅｄ．（１９８０）を参照のこと。このような添加物は、一般に、利用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、従って、添加物、賦形剤、担体などは薬学的に受容可能である。
【０２４２】
「単離された」または「精製された」抗体は、タンパク質由来の細胞もしくは組織供給源または培地由来の細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化
学合成した場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。専門用語「細胞物質を実質的に含まない」は、ポリペプチド／タンパク質が、それが単離されたか組換えにより生産された細胞の細胞成分から分離される抗体の調製物を含む。従って、細胞物質を実質的に含まない抗体は、約３０％、２０％、１０％、５％、２．５％または１％（乾燥重量で）未満の夾雑タンパク質を有する抗体の調製物を含む。抗体を組換え的に生産する場合、培地もまた実質的に含まない、すなわち、培地がタンパク質調製物の約２０％、１０％、５％、２．５％または１％未満の量を示すことが好ましい。抗体を化学合成により生産する場合、化学前駆体または他の化学物質および試薬を実質的に含まない、すなわち、目的の抗体がタンパク質合成に関する化学前駆体または他の化学物質から分離されていることが好ましい。従って、抗体のこのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量で）未満の化学前駆体または目的の抗体以外の化合物を有する。本発明の好ましい実施形態において、抗体は単離または精製される。
【０２４３】
本明細書中で使用される場合、語句「低レベルから検出不可能なレベルの凝集」とは、例えば、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により測定されるように、タンパク質質量でわずか５％、わずか４％、わずか３％、わずか２％、わずか１％およびしばしばわずか０．５％の凝集を含むサンプルをいう。
【０２４４】
本明細書中で使用される場合、用語「低レベルから検出不可能なレベルの断片化」とは、例えば、ＨＰＳＥＣにより決定される場合に単一ピーク中に、または例えば、還元キャピラリーゲル電気泳動（ｒＣＧＥ）により２つのピーク（重鎖および軽鎖）中に、全タンパク質の８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％以上を含むサンプルおよび各々全タンパク質の５％より多い、４％より多い、３％より多い、２％より多い、１％より多いまたは０．５％より多くを有する他の単一ピークを含まないサンプルをいう。本明細書中で使用される場合、ｒＣＧＥとは、抗体または抗体型または誘導される分子中のジスルフィド結合を還元するのに十分な還元条件下でのキャピラリーゲル電気泳動をいう。
【０２４５】
本明細書中で使用される場合、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３抗体またはそれらの結合フラグメントを含む液体製剤に関連する用語「安定性」および「安定した」とは、一定の製造、調製、輸送および貯蔵条件下で、熱および化学変性、凝集、分解または断片化に対する、製剤中の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントの耐性をいう。本発明の「安定した」製剤は、一定の製造、調製、輸送および貯蔵条件下で、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％以上の生物活性を保持する。前記抗体調製物の安定性は、当業者に公知の方法による凝集、分解または断片化の程度により評価され得、この方法としては、参照と比較されるｒＣＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびＨＰＳＥＣが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４６】
用語「担体」とは、それと共に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、添加剤またはビヒクルをいう。このような生理学的担体は、滅菌液、例えば、水および油（石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む）であり得る。医薬組成物が静脈に投与される場合、水が適切な担体である。生理食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセリン溶液はまた、液体担体、特に注射可能な溶液として利用され得る。適切な医薬添加剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望の場合、組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、ピル剤、カプセル剤、粉末、徐放製剤、デポー剤などの形態をと
り得る。組成物は、伝統的なバインダーおよび担体、例えば、トリグリセリドを用いて坐薬として製剤され得る。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。適切な担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｒｔｉｎに記載されている。このような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように適切な量の担体と共に、好ましくは精製形態の有効量の抗体を含む。当該分野で公知なように、製剤は、投与様式に適合するように構成される。
【０２４７】
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲にｐＨを維持するのを助ける。緩衝剤は、約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度で存在するのが好ましい。本発明と共に使用するのに適切な緩衝剤としては、有機酸および無機酸の両方、およびそれらの塩、例えば、クエン酸緩衝剤（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝剤（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝剤（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）が挙げられる。リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、トリメチルアミン塩、例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳおよび他のこのように公知の緩衝剤が使用され得る。
【０２４８】
保存料は、微生物増殖を抑制するために添加され得、そして０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加され得る。本発明と共に使用するのに適切な保存料としては、フェノール、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚｙａｃｏｎｉｕｍ  ｈａｌｉｄｅ）（例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物）、ヘキサメトニウムクロリド、アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。
【０２４９】
等張化剤は、本発明の液体組成物の生理的等張性を確保するために存在し、そしてこれらとしては、多価（ｐｏｌｈｙｄｒｉｃ）糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが挙げられる。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮に入れて、約０．１質量％〜約２５質量％、好ましくは１質量％〜５質量％の量で存在し得る。
【０２５０】
安定剤は、機能が充填剤から、治療薬を可溶化するかまたは変性または容器壁面への付着の防止を助ける添加物にまで及び得る、広義のカテゴリーの添加剤をいう。典型的な安定剤は、多価糖アルコール；アミノ酸、例えば、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、アラビトール、エリトリトール、マンニトール、ソ
ルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセリンなど、イノシトールのようなシクリトールを含む；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；イオウ含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセリン、α−モノチオグリセリンおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（すなわち＜約１０残基）；タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、サッカリド、単糖、例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖、例えば、ラクトース、マルトースおよびスクロース；三糖、例えば、ラフィノース；多糖、例えば、デキストランなどであり得る。安定剤は、１活性タンパク質あたり０．１〜１０，０００ｗ／ｗの範囲で存在する。
【０２５１】
さらなる種々の添加剤としては、増量剤（例えば、デンプン）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニンまたはビタミンＥ）および共溶媒が挙げられる。
【０２５２】
本明細書中の製剤はまた、治療する特定の適応症の必要に応じて１つより多い活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましくあり得る。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて適切に存在させられる。
【０２５３】
本明細書中で使用される場合、用語「界面活性剤」とは、両親媒性構造を有する有機物質をいい、すなわち、溶解度傾向（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｎｄｅｎｃｙ）が相対する基、典型的に油溶性炭化水素鎖および水溶性イオン基からなる。界面活性剤は、界面活性部分の変化に依存して、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤に分類され得る。界面活性剤は、しばしば、種々の医薬組成物および生体物質の調製物についての湿潤剤、乳化剤、可溶化剤および分散剤として使用される。
【０２５４】
非イオン性界面活性剤または清浄剤（「湿潤剤」としてもまた公知）は、治療薬の可溶化を助けるため、さらに撹拌誘発凝集から治療用タンパク質を保護するために添加され得、これはまた、製剤がタンパク質の変性を引き起こすことなく剪断表面ストレスへの暴露を可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(R)ポリオールおよびポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ−２０(R)、ＴＷＥＥＮ−８０(R)など）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ
／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【０２５５】
本明細書中で使用される場合、用語「無機塩」とは、金属または金属のように作用する基での酸性水素または酸の一部または全ての置き換えをもたらす炭素を含まない任意の化合物をいい、そしてしばしば、医薬組成物および生体物質の調製物における等張調節化合物（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として使用される。最も一般的な無機塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ2ＰＯ4などである。
【０２５６】
本発明は、診療所または実験室にある市販の冷蔵庫および冷凍庫において見られる温度、例えば、約−２０℃〜約５℃で安定性を有する液体製剤を含み、前記安定性は、貯蔵目的について、例えば、約６０日間、約１２０日間、約１８０日間、約１年間、約２年間またはそれ以上について、例えば、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）で評価される。本発明の液体製剤はまた、使用の前に室温で、少なくとも数時間、例えば、１時間、２時間または約３時間、例えば、ＨＰＳＥＣで評価されるような安定性を示す。
【０２５７】
用語「小分子」および類似の用語としては、ペプチド、ペプチド模倣薬、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、１モルあたり約１０，０００未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物（すわなち、ヘテロオーガニック（ｈｅｔｅｒｏｒｇａｎｉｃ）化合物および／または有機金属（ｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ）化合物を含む）、１モルあたり約５，０００ｇ未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、１モルあたり約１，０００ｇ未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、１モルあたり約５００ｇ未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に受容可能な形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
従って、がんの場合において、本発明の抗体は、単独または他のタイプのがん治療薬と組み合わせて投与され、これらのがん治療薬としては、従来の化学療法剤（パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチンおよびドキソルビシン）、抗−ＥＧＦＲ剤（ゲフィチニブ、エルロチニブおよびセツキシマブ）、抗血管形成剤（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｇｅｎｔ）（ベバシズマブおよびスニチニブ）、さらに免疫調節薬、例えば、インターフェロン−αおよびサリドマイドが挙げられる。
【０２５９】
本明細書中で使用される場合、用語「治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」および「治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）」とは、異常なＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の代謝および活性に関連する疾患、障害、病気などの治療、管理または改善に使用され得る任意の薬剤をいう。
【０２６０】
さらに、本発明の抗体は、種々のエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性ヌクレオチドまたは毒素に複合され得る、例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。抗体またはそれらのフラグメントは、治療的部分、例えば、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤（ｃｙｔｏｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ））、治療薬または放射性金属イオン（例えば、213Ｂｉのようなα放射体）に
複合され得る。細胞毒または細胞毒性薬は、細胞に有毒な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療薬としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルおよびダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ダウノマイシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６１】
抗体にこのような治療的部分を複合させる技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐ．２４３−５６  Ａ
ｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，第２編，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ．６２３−５３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ．４７５−５０６（１９８５）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ．３０３−１６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）；およびＴｈｏｒｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ６２：１１９（１９８２）を参照のこと。あるいは、抗体は、抗体ヘテロ複合体、例えば、二重特異性抗体を形成するために、第二の抗体に複合され得る、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと。
【０２６２】
本発明の複合体は、所定の生物学的応答を修飾するために使用され得、治療薬または薬物部分は、古典的な化学治療薬に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ
ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：１５６７（１９９４））、ＶＥＧＦ（ＷＯ９９／２３１０５）；抗血栓剤；抗血管新生薬、例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチン））；または生物学的応答修飾因子、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）または他の成長因子が挙げられ得る。
【０２６３】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば、除菌膜に通す濾過により達成され得る。例えば、本発明の液体製剤は、０．２μｍまたは０．２２μｍのフィルターを使用する濾過により滅菌され得る。
【０２６４】
徐放製剤を調製し得る。徐放製剤の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは造形品、例えば、フィルムまたはマトリクスの形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、非分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、乳酸−グリコール酸コポリマーからなる注入可能なミクロスフィア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー（例えば、エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸）は、１００日以上、分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。関連する機構に依存して、安定化のために合理的なストラテジーが考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による細胞間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見出された場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を制御し、適当な添加物、アミノ酸置換を使用し、そして特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより安定化が達成され得る。
【０２６５】
抗体または変異体組成物を、良質の医療のための原則（Good Medical Practice）に合
致する様式で、製剤し、投薬し、そして投与する。これに関連し、考慮される因子として
は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物またはヒト、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与の計画、および医師に公知の他の因子が挙げられる。投与される抗体または変異体の「治療有効量」は、このような考慮により調節され、そしてＩＬ−４および／またはＩＬ−１３仲介性疾患、状態または障害を予防、改善または治療するのに必要な最小量であり得る。
【０２６６】
場合により、抗体または変異体は、問題の障害を予防または治療するのに現在使用されている、１つまたはそれ以上の薬剤と共に製剤される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体に量、障害または治療の種類および上で議論される他の因子に依存する。これらは、一般に、上記で使用されるのと同じ投薬量および投薬経路またはこれまでに利用される投薬量の約１〜９９％で使用される。
【０２６７】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」とは、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３仲介性疾患の重症度および／もしくは継続を軽減するか、１つもしくはそれ以上のそれらの症状を改善するか、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３仲介性疾患の進行を阻止するか、または疾患の退行を引き起こすのに十分であるか、またはＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３仲介性疾患または１つもしくそれ以上のそれらの症状の発症、再発、発病もしくは進行の予防をもたらすか、またはＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３仲介性疾患を治療するのに有用な別の治療（例えば、別の治療薬）の予防および／または治療効果を向上または改善するのに十分である、治療（例えば、予防薬または治療薬）の量をいう。
【０２６８】
特定の障害または状態の使用または治療において有効な治療用抗体またはそれらのフラグメントの量は、障害または状態の性質に依存し、そして標準的な臨床技術により決定され得る。可能ならば、本発明の医薬組成物についての（ａｎｄ）用量−反応曲線を始めにインビトロで導き得る。適切な動物モデル系が利用可能である場合、用量−反応曲線を再び得、そして当該分野で公知の方法を実施して、適切なヒト用量を推定するために使用し得る。しかし、当該分野の常識に基づいて、炎症効果の縮小を促進するのに有効な医薬組成物は、例えば、約５〜２０ｎｇ／ｍｌ、および好ましくは、約１０〜２０ｎｇ／ｍｌの局所治療薬濃度で提供され得る。
【０２６９】
好ましい実施形態において、治療用ポリペプチド、抗体またはそれらのフラグメントの水溶液が、皮下注射によって投与され得る。各用量は、体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇ、またはより好ましくは、体重１ｋｇあたり約３ｍｇ〜約３０ｍｇの範囲であり得る。投薬量は、当該分野で公知の薬学的方法を実施して特定の疾患、患者集団、投与様式などで経験的に確定され得る。
【０２７０】
皮下投与の投薬スケジュールは、疾患の種類、疾患の重症度および治療薬に対する対象（subject）の感受性を含む多数の臨床学的因子に依存して、週に１回から毎日の間で変
更され得る。
【０２７１】
本発明は、抗体またはそれらのＩＬ−４および／またはＩＬ−１３結合フラグメントの液体製剤を調製する方法を提供し、前記方法は、例えば、適切な分子量（ｍｗ）カットオフを有する半透膜（例えば、Ｆ(ab')2フラグメントについて３０  ｋＤカットオフ；およびＦabフラグメントについて１０  ｋＤカットオフ）を使用して、精製抗体の画分を約１５ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ、約３００ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の最終濃度まで濃縮することを含む。
【０２７２】
さらに、本発明はまた、インビボにおいて改善された半減期を有する目的の生成物の安定な液体製剤を含む。従って、目的の抗体は、対象、好ましくはヒトにおいて３日を超える、７日を超える、１０日を超える、１５日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２ヵ月を超える、３ヵ月を超える、４ヵ月を超える、５ヵ月を超える半減期有する。
【０２７３】
インビボでの抗体の血清循環（ｓｅｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）を延長するために、種々の技術を使用し得る。例えば、不活性ポリマー分子、例えば、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、多機能リンカーを用いて、または用いずに、抗体のＮ末端もしくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的複合により、またはリジン残基上に存在するεアミノ基を介して抗体に結合させ得る。生物活性の損失が最小限となる線状または分枝のポリマー誘導体化が使用され得る。複合の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により厳密に監視し、抗体へのＰＥＧ分子の適正な複合を確保し得る。未反応のＰＥＧは、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧ複合体から分離され得る。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に公知の方法を使用して、例えば、本明細書中に記載の免疫測定法により結合活性について、さらにインビボ有効性について試験され得る。
【０２７４】
増加したインビボ半減期を有する抗体はまた、１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入または欠失）をＩｇＧ定常領域、またはそれらのＦcＲ結合フラグメ
ント（例えば、ＦeまたはヒンジＦe領域フラグメント）に導入することにより生成され得る、例えば、ＷＯ９８／２３２８９；ＷＯ９７／３４６３１；および米国特許第６，２７７，３７５号を参照のこと。
【０２７５】
さらに、インビボでより安定な抗体にするか、またはより長いインビボ半減期を有するために抗体をアルブミンに複合し得る。この技術は当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷＯ０１／７７１３７；ならびに欧州特許第４１３，６２２号を参照のこと。抗体はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）／保護基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などにより修飾され得る。
【０２７６】
１つの実施形態において、組成物は、通常の手段に従って、ヒトへの静脈内投与に適している医薬組成物として製剤される。典型的に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるための局部麻酔薬、例えば、リドカインまたは他の「カイン」麻酔薬を含み得る。一般に、成分は、活性剤の量を表示する密閉容器、例えば、アンプルまたはサシェ中の、別個にまたは一緒に混合された単一投薬形態、例えば、凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物のいずれかで提供される。組成物が  注入により投与される場合、これは医薬グレードの滅菌水または生理食塩水を含む点滴ボトルに調剤され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルが、例えば、キットに提供され得る。
【０２７７】
本発明の液体製剤が目的の生成物の量を表示する密閉容器、例えば、アンプルまたはサシェにパッケージされている、本発明をまた提供する。本発明の液体製剤は、抗体または抗体フラグメントの量または濃度を表示する密閉容器に存在し得る。本発明の液体製剤は、例えば、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌまたは２０ｍｌの量で、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍ
ｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、または３００ｍｇ／ｍｌのＩＬ−４および／またはＩＬ−１３抗体を有する密閉容器で供給され得る。
【０２７８】
上記の障害の治療に有用な物質を含む製品が提供される。製品は容器およびラベルを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、種々の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックから形成され得る。容器は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３仲介性障害または疾患を診断、予防または治療するのに有効な組成物を収容しており、そして滅菌アクセスポート（ａｃｃｅｓｓ  ｐｏｒｔ）を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液バックまたはバイアルであり得る）。容器上のまたは容器に付随するラベルには、組成物が選択された状態の治療に使用されることが示されている。製品は、薬学的に受容可能な緩衝剤、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第二の容器をさらに含み得る。緩衝剤、賦形剤、フィルター、針、シリンジおよび添付文書（使用指示書を含む）を含む、市販および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０２７９】
ここで、以下の非限定的な実施例により、技術者を手助けするために本発明が例示され、本発明が実施され得るいくつかの実施形態を描写する。
【実施例】
【０２８０】
実施例１：マウス抗−ヒトＩＬ−１３モノクローナル抗体クローンＢ−Ｂ１３のＦｖ領域の配列決定
以下の方法に使用した試薬は、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入したマウス抗−ＩＬ−１３モノクローナル抗体クローンＢ−Ｂ１３であった。Ｃｅｌｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓはＤｉａｃｌｏｎｅ（Ｂｅｓａｎcｏｎ，Ｆ
ｒａｎｃｅ）の米国販売業者であり、抗体Ｂ−Ｂ１３を製造する。
【０２８１】
エドマンＮ末端配列決定および質量分光分析の組み合わせにより、抗−ＩＬ−１３モノクローナル抗体クローンＢ−Ｂ１３のアミノ酸配列を決定した。ポリペプチドまたはペプチドフラグメントを作成するために、抗体を以下の異なるアプローチにかけ、そして続いて、タンパク質配列データベースペプチドマッチングに関連するエドマンＮ末端配列決定および液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にかけるサンプルを調製するために、これらを異なるアプローチにより分別した。
【０２８２】
未処理であるか、または重鎖および軽鎖を分離するためにｐｙｒｏｇｌｕアミノペプチダーゼで処理した抗体のＳＤＳ−Ｐａｇｅに続き、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜へのブロッティングおよびバンドのエドマンＮ末端配列決定。
【０２８３】
抗体の特異的プロテアーゼを用いる制限された部分的タンパク質分解に続き、ＳＤＳ−ＰａｇｅおよびＰＶＤＦ膜へのブロッティングおよびバンドのエドマンＮ末端配列決定。
【０２８４】
全抗体、または重鎖および軽鎖のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルバンドの制限された部分的化学分解に続き、ＳＤＳ−ＰａｇｅおよびＰＶＤＦ膜へのブロッティングおよびバンドのエドマンＮ末端配列決定。
【０２８５】
特異的プロテアーゼを用いる全抗体または重鎖および軽鎖のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルバンドのタンパク質分解およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析。
【０２８６】
特異的プロテアーゼを用いる重鎖および軽鎖のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルバンドのタンパク質分解に続き、逆相高速液体クロマトグラフィーの分別（ｒｐ−ｈｐｌｃ）、その後のエ
ドマンＮ末端配列決定および画分のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析。
【０２８７】
プロテアーゼパパインを用いる抗体の制限タンパク質分解、ＳＤＳ−ＰａｇｅによるＦｄ（抗体重鎖のＶＨ−ＣＨ１フラグメント）ゲルバンドの分別、特異的プロテアーゼを用いるタンパク質分解、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐ−ｈｐｌｃ）、その後のエドマンＮ末端配列決定および画分のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析。
【０２８８】
実施例２：マウス抗−ヒトＩＬ−４モノクローナル抗体クローン８Ｄ４−８のＦｖ領域の配列決定
試薬のマウス抗−ＩＬ−４モノクローナル抗体クローン８Ｄ４−８を、Ｂｉｏｚｏｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｖｅｒｔｒｉｅｂ  ＧｍｂＨ（Ｅｃｈｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＢｉｏｚｏｌはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のドイツ販売業社であり、抗体８Ｄ４−８を製造する。
【０２８９】
エドマン配列決定および質量分析の組み合わせにより、マウスモノクローナル抗−ＩＬ−４抗体（クローン８Ｄ４−８）のアミノ酸配列を決定した（Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５２：７７−８６；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：３６１３−２５）。簡潔に、まず抗体を軽鎖および重鎖に分離し、次いで各鎖を配列特異的プロテアーゼにより、または化学的に切断した。得られたペプチドを逆相クロマトグラフィーにより分離し、そしてマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）および／またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。次いで、固有のペプチドさらにインタクトな重鎖および軽鎖を、タンパク質配列の一義的決定のためにエドマン配列決定に供した。
【０２９０】
実施例３：マウス抗−ヒトＩＬ−１３モノクローナル抗体クローンＢ−Ｂ１３のＦｖ領域のヒト化
本明細書で上述したヒト化プロトコルを使用して、Ｂ−Ｂ１３クローンをヒト化した。問題のある残基（脱アミド部位、溶媒露出メチオニン、酸に不安定な（ａｃｉｄｅ  ｌａｂｉｌｅ）部位）に対処するために、ＣＤＲ中に突然変異を含む６つのヒト化バージョンを提案した。
【０２９１】
Ｂ−Ｂ１３のＶＬおよびＶＨ配列を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の２００７、７月バージョンに対してブラストした。最も類似する軽鎖および重鎖アミノ酸配列が読み出された。可変軽鎖に対してそっくりなホモログが１ＥＧＪに見出された。重鎖にそっくりなホモログが１ＦＮＳに見出された。構造１ＥＧＪおよび１ＦＮＳを使用して可変領域のホモロジーモデルを構築し、これは後にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）において実行される標準手順を使用して、エネルギーを最小化された。ＭＯＥは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐにより配布されたコンピュータを使用した薬物設計のための総合的なソフトウェア一式である。続いて、Ｂ−Ｂ１３の３Ｄホモロジーモデルの分子力学（ＭＤ）計算を、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｒｎ陰溶媒中、１．７ナノ秒間実施した。次いで、ＭＤ軌道から得られた１，７００のスナップショットを使用して、参照メドイド位置（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅｄｏｉｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と比較して、各Ｂ−Ｂ１３アミノ酸について、その標準偏差（ｒｍｓｄ）の分布を計算した。最終的に、各アミノ酸のｒｍｓｄ分布と全体的なｒｍｓｄ分布を比較する統計的検定を使用して、ＭＤの間に見られるように、アミノ酸が十分に柔軟である場合、Ｂ−細胞受容体と相互作用し、そして免疫応答の活性化の原因となる可能性があると決定される。マウスＢ−Ｂ１３可変領域の柔軟な位置を、局所的にダウンロードしたＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅの２００７年１月バージョンのヒト抗体配列の対応する位置と比較した。これらの柔軟性残基の３Ｄ構造を保存する平均残基および数個の隣接残基よりも３倍大きい柔軟性を示す残基のみが、
検索のために保持された。マウスＢ−Ｂ１３抗体可変領域柔軟性残基を置き換えるために、ＣＤＲが５．０Å以内である位置を特に考慮して、最も一致する柔軟性残基を有するヒト抗体可変領域を選択した。問題のある残基を避けるために、ＣＤＲ中の多数の突然変異がまた、提案されたバージョンに含まれた。以下の配列モチーフを考察した：Ａｓｐ−Ｐｒｏ（酸に不安定な（ａｃｉｄｅ  ｌａｂｉｌｅ）結合）、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（グリコシル化）、Ａｓｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（露出範囲における脱アミド部位）、Ｍｅｔ（露出範囲における酸化）。得られたヒト化配列を、配列類似性について合理的仮定がなされていると確信を得るＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに対してブラストした。全ての配列が多数のヒト抗体に対して高い程度で類似性を示すことが見出された。さらに、配列はＩｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＩＥＤＢデータベース）に列挙される既知のＢ−またはＴ−細胞エピトープを全く含んでいなかった。
【０２９２】
重鎖の３つのバージョン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）および軽鎖の３つのバージョン（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を提案した。軽鎖の３つのバージョンはＣＡＡ８３２７１．１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号  ＣＡＡ８３２７１）由来である。Ｌ１バージョンは４つの突然変異を有する。Ｌ２バージョンは、ＣＤＲ３中のＤＰ部位（Ｐｒｏ９９）を除去するために、さらなる突然変異を含む。２つの推定される脱アミド部位（Ｎ３４Ｑ、Ｎ９６Ａ）であるＬ２と比較した場合、Ｌ３はＣＤＲ中に位置する２つのさらなる突然変異を組み込む。重鎖のＨ１、Ｈ２およびＨ３バージョンはＣＡＣ３９３６４．１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号  ＣＡＣ３９３６４）由来である。この鋳型は、トップスコアリング鋳型（ｔｏｐ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）ではないが、既知の免疫原性配列との高い相同性（＞７０％）を示す配列を含まない最も高いスコアリング鋳型であった。Ｈ１バージョンは６つの突然変異を含み、そしてＨ２配列は、３つの脱アミド部位（Ｎ６０Ａ、Ｎ７３Ｔ、およびＮ８３Ｔ）を避けるために、２つのさらなる突然変異を組み込む。アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｙ）の順次番号付けは、タンパク質内でそれらの自然順序を示す（Ｎ−末端からＣ−末端）。Ｈ３は、有効性を改善すると考えられる２つのさらなる突然変異（Ｙ１００ＲおよびＤ１０６Ｋ）を含む。ＶＬおよびＶＨ変異体の６つの組み合わせを、ヒト化抗体の作成に推奨した：ＶＬ１×ＶＨ１、ＶＬ２×ＶＨ２、ＶＬ１×ＶＨ３、ＶＬ３×ＶＨ１、ＶＬ３×ＶＨ２およびＶＬ３×ＶＨ３。表１に示したように、本願の詳細な説明の節に示される再表面形成技術を使用して、アミノ酸変化をヒト化Ｂ−Ｂ１３  ＶＬおよびＶＨ変異体になした。左欄は、マウスＢ−Ｂ１３  ｍＡｂ中の元のアミノ酸およびそれらの位置を示す。
【０２９３】
【表１】
2018078907.tif 000002
【０２９４】
実施例４：マウス抗−ヒトＩＬ−４モノクローナル抗体クローン８Ｄ４−８のＦｖ領域のヒト化
本明細書中に上記されるヒト化（再表面形成）技術を使用して、８Ｄ４−８クローンをヒト化した。２つのヒト化バージョンを提案した。１つバージョンは、問題のある残基（露出した酸に不安定な（ａｃｉｄｅ  ｌａｂｉｌｅ）位置）に対処すると考えられた重鎖のＣＤＲ中に１つの突然変異を含む。
【０２９５】
８Ｄ４−８のＶＬおよびＶＨ配列を、ＰＤＢの２００７、７月バージョンに対してブラストした。最も類似する軽鎖および重鎖アミノ酸配列が読み出された。可変軽鎖に対してそっくりなホモログが１ＹＤＪである。重鎖にそっくりなホモログが１ＩＱＷに見出された。構造１ＹＤＪおよび１ＩＱＷを使用して可変領域のホモロジーモデルを構築し、これは後にＭＯＥにおいて実行される標準手順を使用して、エネルギーを最小化された。続いて、８Ｄ４−８の３Ｄホモロジーモデルの分子力学（ＭＤ）計算を、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚ
ｅｄ  Ｂｏｒｎ陰溶媒中、１．７ナノ秒間実施した。次いで、ＭＤ軌道から得られた１，７００のスナップショットを使用して、参照メドイド位置と比較して、各８Ｄ４アミノ酸について、その標準偏差（ｒｍｓｄ）の分布を計算した。最終的に、各アミノ酸のｒｍｓｄ分布と全体的なｒｍｓｄ分布を比較する統計的検定を使用して、ＭＤの間に見られるように、アミノ酸が十分に柔軟である場合、Ｂ−細胞受容体と相互作用し、そして免疫応答の活性化の原因となる可能性があると決定される。マウス８Ｄ４−８可変領域の柔軟な位置を、局所的にダウンロードしたＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅの２００７年１月バージョンのヒト抗体配列の対応する位置と比較した。これらの柔軟性残基の３Ｄ構造を保存する平均残基および数個の隣接残基よりも３倍大きい柔軟性を示す残基のみが、検索のために保持された。マウス８Ｄ４−８抗体可変領域柔軟性残基を置き換えるために、ＣＤＲが５．０Å以内である位置を特に考慮して、最も同一な柔軟性残基を有するヒト抗体可変領域を選択した。最終的に、問題のある残基を避けるために、いくつかのさらなる突然変異がまたなされた。以下の配列モチーフを考察した：Ａｓｐ−Ｐｒｏ（酸に不安定な（ａｃｉｄｅ  ｌａｂｉｌｅ）結合）、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（グリコシル化）、Ａｓｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（露出範囲における脱アミド）、Ｍｅｔ（露出範囲における酸化）。唯一見出された問題のある残基は、重鎖のＣＤＲ２中のＤＰ部位であった。得られたヒト化配列を、配列類似性について合理的仮定がなされていると確信を得るＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに対してブラストした。全ての配列が多数のヒト抗体に対して高い程度で類似性を示した。さらに、配列はＩＥＤＢデータベースに列挙される既知のＢ−またはＴ−細胞エピトープを全く含んでいなかった。
【０２９６】
重鎖の２つのバージョン（Ｈ１、Ｈ２）および軽鎖の１つのバージョン（Ｌ１）を提案した。軽鎖のＬ１バージョンはＢＡＣ０１６７６．１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号  ＢＡＣ０１６７６）由来である。Ｌ１バージョンは３つの突然変異を有する。重鎖のＨ１およびＨ２バージョンはＢＡＣ０２４１８．１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号  ＢＡＣ０２４１８）由来である。Ｈ１バージョンは９つの突然変異を含み、そしてＨ２バージョンは、ＣＤＲ２中のＤＰ部位（Ｐｒｏ５３）を除去するためにさらなる１つの突然変異を含む。２つの組み合わせ、ＶＬ１×ＶＨ１およびＶＬ１×ＶＨ２が調製された。
【０２９７】
表２は、ヒト化（再表面形成）技術を使用する、ヒト化８Ｄ４−８  ＶＬおよびＶＨ変異体中でなされるアミノ酸変化を示す。左欄は、マウス８Ｄ４−８  ｍＡｂ中の元のアミノ酸およびそれらの位置を示す。
【０２９８】
【表２】
2018078907.tif 000003
【０２９９】
実施例５：キメラ抗−ＩＬ−１３クローンＢ−Ｂ１３モノクローナル抗体、キメラ抗−ＩＬ−４クローン８Ｄ４−８モノクローナル抗体およびヒト化変異体のクローニングおよび生成
抗−ＩＬ−１３クローンＢ−Ｂ１３および抗−ＩＬ−４クローン８Ｄ４−８の可変重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ、Ｙｏｕｎｇ  Ｌ．ａｎｄ  Ｄｏｎｇ  Ｑ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００４），３２（７），ｅ５９）により記載されるオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）の改良プロトコルを使用してヌクレオチド配列に逆翻訳し、そして生成した。ＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ  ＃  ４５−０６４１）を使用して、ｐＣＲ(R)４−ＴＯＰＯ中で
クローニングし、そしてＭ１３順方向およびＭ１３逆方向プライマーを使用して配列決定した。可変領域をそれぞれ、定常重鎖（ＩＧＨＧ１、Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号  Ｑ５６９Ｆ４）または軽鎖（ＩＧＫＣ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号  Ｑ５０２Ｗ４）と共に融合し、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてキメラＢ−Ｂ１３−重鎖および軽鎖ならびにキメラ８Ｄ４−８重鎖および軽鎖の哺乳動物発現のためのプラスミドを作製するエピソーム発現ベクターｐＸＬ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２），Ｅ９により記載されるｐＴＴベクターのアナログ）のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に各々ライゲーションした。
【０３００】
抗−ＩＬ−１３クローンＢ−Ｂ１３および抗−ＩＬ−４クローン８Ｄ４−８のヒト化変異体をコードする発現クローンをまた、元の配列の提案されたアミノ酸交換に基づいて、
オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）により合成的に生成した。
【０３０１】
抗体の重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５ａで増殖させた。トランスフェクションに使用したプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａキットを使用して、大腸菌から調製した。
【０３０２】
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、５００ｍＬ振とうフラスコ中の無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１００ｍＬ容量）に３×１０5細胞／ｍＬで播種した。細胞を８％  Ｃ
Ｏ2の湿気のある環境で、１１０ｒｐｍのオービタルシェーカープラットホーム回転（ｏ
ｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｒｏｔａｔｉｎｇ）上、３７℃のインキュベーター中で培養した。
【０３０３】
播種の３日後の生存細胞および全細胞を、ＣＡＳＹ電子細胞カウンター（Ｓｃｈaｒｆ
ｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ）で決定した。トランスフェクションのために、９０％以上の生存率を有する細胞を１〜１．５×１０6 細胞／ｍＬの細胞密度で使用した。製造業者により記載された条件で、ＤＮＡ：ＦｕｇｅｎｅＨＤ  ２：７の比率でＦｕｇｅｎｅＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、重鎖および軽鎖の発現プラスミドの混合物（５×１０-7μｇＤＮＡ／細胞）を含む５００ｍＬ振とうフラスコ中で、細胞（１００ｍＬ）をトランスフェクトした。トラスフェクト細胞を、１１０ｒｐｍのオービタルシェーカープラットホーム回転上３７℃のインキュベーター（８％  ＣＯ2）中で７日間培養した。
【０３０４】
Ｎｕｎｃ  Ｆ９６−ＭａｘｉＳｏｒｐ−Ｉｍｍｕｎｏプレートをヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）［ＮａｔｕＴｅｃ  Ａ８０−１０４Ａ］でコーティングした。抗体を炭酸塩コーティング緩衝液（ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ
炭酸ナトリウム  ｐＨ  ９．６）中１０μｇ／ｍｌまで希釈し、そして１ウェルあたり５０μＬで分注した。プレートを粘着テープで密閉し、そして４℃で一晩保存した。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ．４  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。ブロッキング溶液（１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ）（１５０μＬ）を各ウェルに分注し、プレートをカバーした。ＲＴで１時間後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。サンプルまたは標準物質（１５００ｎｇ／ｍｌ〜１２０ｎｇ／ｍｌの範囲）（１００μＬ）を添加し、そしてＲＴで１時間そのままにしておいた。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。インキュベート溶液（０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を使用して１：１０．０００に希釈したヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＦＣ−ＨＲＰ複合体［ＮａｔｕＴｅｃ  Ａ８０−１０４Ｐ−６０］（１００μＬ）を添加した。ＲＴで１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＡＢＴＳ基質（０．１Ｍ  Ｎａ2
ＨＰＯ4、０．０５Ｍ  クエン酸溶液、ｐＨ５．０中１０ｍｇ  ＡＢＴＳ  タブレット（
Ｐｉｅｒｃｅ  ３４０２６）、使用前に３０％  Ｈ2Ｏ2（１０μＬ）／基質溶液（１０ｍｌ）を添加）（１００μＬ）を各ウェルに分注し、発色させた。発色した後（約１０〜１５分）、１％  ＳＤＳ溶液（５０μＬ）を添加し、反応を停止した。プレートをＡ４０５で読んだ。
【０３０５】
タンパク質をプロテインＡ（ＨｉＴｒａｐTM  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を用いてカラムから溶出した後、モノクローナル抗体をＰＢＳ中で形成させ（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）、そして０．２２μｍで濾過した。２８０ｎｍで吸光度を測定することにより、タンパク質濃度を決定した。還元性条件下および非還元性条件下、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー上のＰｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ｐｌｕｓ  ＬａｂＣｈｉｐキットを使用して、各バッチを分析し、各サブユニットおよび単量体の純度および分子量を決定した
。
【０３０６】
実施例６：ヒト化抗−ＩＬ−１３クローンＢ−Ｂ１３変異体およびヒト化抗−ＩＬ−４クローン８Ｄ４−８変異体の特徴付け
試薬の組換えヒトＩＬ−１３およびＩＬ−４をＣｈｅｍｉｃｏｎ（ＵＳＡ）から購入した。Ｂｉａｃｏｒｅ動力学的分析を以下のように実施した。
【０３０７】
精製された抗体の詳細な動力学的特性化のために、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面プラズモン共鳴技術を使用した。調査される抗体の捕捉および方向のために、特定の特異的抗体（例えば、ヒト−Ｆｃ特異的ＭＡＢ  １３０２、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用する捕捉アッセイ（ｃａｐｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ）を使用した。標準的な手順を使用して、調査グレード（ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒａｄｅ）ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の第一級アミン基（１００００ＲＵ）を介して、捕捉抗体を固定化した。分析される抗体を、１０μｌ／分の流速で、３０ＲＵの最大検体結合をもたらす調整されたＲＵ値で捕捉した。ＨＢＳ  ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  界面活性剤Ｐ２０）中、３０μｌ／分の流速で、０〜５０ｎＭの濃度範囲にわたって組換えヒトＩＬ−４およびＩＬ−１３についての結合反応速度を測定した。チップ表面を１０  ｍＭ  グリシンｐＨ２．５で再生した。参照として捕捉抗体を用いずに、フローセルを使用して、ＢＩＡ評価プログラムパッケージ中で速度パラメータを分析し、そして計算した。両方の抗原の付加結合を調査するために、１つの抗原を注入し、即座に次のＩＬ−１３／ＩＬ−４の抗原混合物を注入するウィザード駆動型共注入（ｗｉｚａｒｄ−ｄｒｉｖｅｎ  ｃｏ−ｉｎｊｅｃｔ）法を適用した。
【０３０８】
ＴＦ−１細胞中のＩＬ−４またはＩＬ−１３仲介性細胞増殖の阻害を測定することにより、生物活性について本発明の抗体を測定した。簡潔には、本発明者は、ＴＦ−１細胞の増殖を刺激するためにＩＬ−４またはＩＬ−１３を使用した。ＴＦ−１は、サイトカインに増殖を依存し、そしてＩＬ−４およびＩＬ−１３を含む多くのサイトカインに応答する細胞株である。（サイトカインの不在下の基準状態と比較して）誘導された増殖が、ＩＬ−４またはＩＬ−１３の生物活性を示す。抗−ＩＬ−４、抗−ＩＬ−１３および二重特異性抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体が、ＩＬ−４またはＩＬ−１３誘発性ＴＦ−１細胞増殖を阻害することを示した。さらに、二重特異性抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体が、複合ＩＬ−４およびＩＬ−１３刺激により誘導されるＴＦ−１細胞増殖を阻害することを示した。その標的、すなわち、ＩＬ−４またはＩＬ−１３に対する中和抗体有効性（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｃｙ）としてのＩＣ５０（５０％阻害の抗体濃度）を生成（ｇｅｎｅｒａｔ）させるために、阻害効果を用量依存的に測定した。利用される方法の詳細を以下により詳細に記載する。
【０３０９】
４ｎｇ／ｍｌの最終濃度で、新たに添加したｈＧＭ−ＣＳＦを含む完全培地（高グルコース、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  緩衝剤およびグルタミン、１０％  ＦＢＳ、１×Ｐ／Ｓ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）中でＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２００３）を維持した。２４時間前に、ＩＬ−１３（１５ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−４（１ｎｇ／ｍｌ）処理。０．０５×１０6／ｍｌで細胞を９６−ウェルプレート中のｈＧＭ
−ＣＳＦを含まない完全培地中に播種した。細胞を添加する前に、対応するサイトカインを含む抗体の連続希釈を、３７℃で３０分間プレインキュベートした。細胞を７２時間培養した（３７℃、５％  ＣＯ2）。ｃｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡｑｕｅｏｕｓのＭＴＳ／
ＰＭＳ溶液を添加した。次いで、細胞を３時間インキュベートした。その期間後、プレートリーダーを使用して、４９０  ｎｍでの吸光度を読み取った。Ｓｐｅｅｄソフトウェアを使用してＩＣ５０値を計算した。
【０３１０】
ヒト化Ｂ−Ｂ１３変異体の結合反応速度および中和活性を表３に示す（ｎｔ、試験されず）。
【表３】
2018078907.tif 000004
【０３１１】
ヒト化Ｂ−Ｂ１３変異体の１つ、ｈｕＢ−Ｂ１３  ＶＬ３×ＶＨ２は、元のマウスＢ−Ｂ１３（１３倍）およびキメラＢ−Ｂ１３（６倍）と比較して有意に高い親和性を有する。これらのヒト化抗−ＩＬ−１３抗体を使用して、喘息患者を治療する場合、改善された親和性は有効性および効果の増強をもたらし得る。さらに、ヒトにおいて使用される場合、マウス抗体またはキメラ抗体と比較して、ヒト化抗体は、免疫原性を減少させ得る。
【０３１２】
ヒト化８Ｄ４−８変異体の結合反応速度および中和活性を表４に示す。
【表４】
2018078907.tif 000005
【０３１３】
ヒト化８Ｄ４−８変異体の１つ、ｈｕ８Ｄ４−８  ＶＬ１×ＶＨ１は、元のマウス８Ｄ４−８（１１倍）およびキメラ８Ｄ４−８（２倍）と比較して有意に高い親和性を有する。このヒト化抗−ＩＬ−４抗体を使用して、喘息患者を治療する場合、改善された親和性は有効性および効果の増強をもたらし得る。さらに、ヒトにおいて使用される場合、マウス抗体またはキメラ抗体と比較して、ヒト化抗体は、免疫原性を減少させ得る。
【０３１４】
実施例７：ヒト化抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体のクローニングおよび生成
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の発現に使用される形式は、米国特許第５，９８９，８３０号に記載される二重領域ダブルヘッド形式（ｄｕａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅａｄ  ｆｏｒｍａｔ）のＩｇＧ変異体である。この形式において、第二の抗体のさらなる可変領域により、対応する重鎖および軽鎖上のそのＮ末端で、ＩｇＧ分子を伸張する。従って、得られたＩｇＧ分子は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなるヘテロ四量体である。重鎖は、１０のアミノ酸（Ｇ４Ｓ）2からなるリンカーにより結合され、そしてＩ
ｇＧ４定常領域に融合した２つの異なる抗体に由来する２つの可変重鎖領域（ＶＨ１−ＶＨ２）からなる。軽鎖は、１０のアミノ酸（Ｇ４Ｓ）2からなるリンカーにより結合され
、そして定常κ領域に融合した２つの異なる抗体に由来する２つの可変軽鎖領域（ＶＬ１−ＶＬ２）からなる。
【０３１５】
８Ｄ４−８変異体の可変重鎖および軽鎖領域の配列を、（Ｇ４Ｓ）2−（ＧＧＡ  ＴＣ
Ｃ）−８Ｄ４−８の一部をコードするそれぞれの５’末端にＢａｍＨＩ  制限酵素認識部位（ＧＧＡ  ＴＣＣ）を導入するＰＣＲにより生成した。８Ｄ４−８ヒト化変異体のＶＨの３’配列は、ＩＧＨＧ４配列（Ｑ５６９Ｆ４、末端のＬｙｓの欠失ならびに２つの突然変異Ｓ２４１ＰおよびＬ２４８Ｅを有する）に後で融合するために、ＡｐａＩ制限酵素認識部位（ＣＨ１領域の始めのアミノ酸をコードする）を用いて終結した。ＶＬ８Ｄ４−８の３’末端は、ＩＧＫＣ（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  受託番号  Ｑ５０２Ｗ４）に後で融合するために、定常κ鎖の始めの２つのアミノ酸をコードするＢｓｉＷＩ制限酵素認識部位を用いて終結した。
【０３１６】
Ｂ−Ｂ１３変異体の可変重鎖および軽鎖領域の配列を、（Ｇ４Ｓ）2−（Ｂ−Ｂ１３）
−（ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ（配列番号７））の一部をコードするそれぞれの３’末端にＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を導入するＰＣＲにより生成させた。Ｂ−Ｂ１３変異体のＶＨおよびＶＬの両方の配列を、それぞれの５’末端にＮｈｅＩ制限酵素認識部位、次いで、ＡＴＧ開始コドンおよびリーダーペプチドコード配列を用いて生成させた。
【０３１７】
Ｂ−Ｂ１３および８Ｄ４−８のＶＨを、（Ｇ４Ｓ）2リンカー内でそれらのＢａｍＨＩ
部位を介して融合した。Ｂ−Ｂ１３および８Ｄ４−８のＶＬを、（Ｇ４Ｓ）2リンカー内
でそれらのＢａｍＨＩ部位を介して互いに融合した。従って、生成された重鎖および軽鎖のタンデムは、以下の組成を有した。
【０３１８】
二重特異性抗体重鎖：ＮｈｅＩ−リーダーペプチド−ＶＨ−Ｂ−Ｂ１３−（Ｇ４Ｓ）2
−ＶＨ８Ｄ４−８−ＡｐａＩ。
【０３１９】
二重特異性抗体軽鎖：ＮｈｅＩ−リーダーペプチド−ＶＬ−Ｂ−Ｂ１３−（Ｇ４Ｓ）2
−ＶＬ８Ｄ４−８−ＢｓｉＷＩ。
【０３２０】
中間ＰＣＲフラグメントの全てを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ  ＃：４５−０６４１）を使用してｐＣＲR４−ＴＯＰＯにクローニン
グし、そしてＭ１３順方向およびＭ１３逆方向プライマーを使用して配列決定した。
【０３２１】
配列確認後、重鎖タンデムをＩＧＨＧ４配列にそれらのＡｐａＩ部位を介して融合し、そして可変軽鎖タンデムをＩＧＫＣにそれらのＢｓｉＷＩ部位を介して融合した。作製された二重領域重鎖および軽鎖をＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてそれぞれ、ＴＢＴＩ−重鎖および軽鎖の哺乳動物発現のためのプラスミドを作製するエピソーム発現ベクターｐＸＬのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に各々ライゲーションした。
【０３２２】
表５に示されるように、Ｂ−Ｂ１３および８Ｄ４−８のヒト化ＶＨおよびＶＬバージョンの以下の組み合わせに基づいて、４つのヒト化二重特異性抗−ＩＬ−４／抗−ＩＬ−１３構築物を生成させた。
【表５】
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【０３２３】
実施例８：ヒト化二重特異性抗体の特徴付け
結合および中和活性アッセイを、前の実施例に記載されるように実施した。
【０３２４】
表６は、４つのヒト化抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体変異体の結合反応速度を描く。二重特異性抗体の４つ全ての構築物は、高い親和性でＩＬ−４およびＩＬ−１３に結合する。
【表６】
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【０３２５】
ヒト化抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体変異体の中和活性を表７に要約する。ｈｕＴＢＴＩ３−１＿１およびｈｕＴＢＴＩ３−２＿１の両方が、以下に示されるＩＣ５０でＩＬ−１３またはＩＬ−４誘発性ＴＦ−１細胞増殖を完全に中和した。
【表７】
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【０３２６】
突然変異ＩＬ−１３対立遺伝子は、高頻度で喘息と関連付けられることが周知である（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９，４，ｐ５４９−５５９）。従って、突然変異ＩＬ−１３タンパク質  （ヒトＩＬ−１３  Ｒ１１２Ｑ変異体、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）に対する二重特異性抗体の結合反応速度を研究した。ｈｕＴＢＴＩ３−１＿１およびｈｕＴＢＴＩ３−２＿１は野生型ＩＬ−１３に類似するＩＬ−１３変異体に結合することが、結果により示された。
【０３２７】
表８は、突然変異ＩＬ−１３タンパク質に対するヒト化抗−ＩＬ−４／ＩＬ−１３分子の結合反応速度を示す。
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月15日(2018.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−４に特異的に結合するヒト化抗体。
【外国語明細書】
2018078907000001.pdf