(57)【要約】      （修正有）【課題】浮遊細胞のライブイメージングの為の超薄膜及び前記膜の製造方法の提供。【解決手段】浮遊系細胞を保定するための、膜厚が２０〜２００ｎｍ、貫通孔の直径が０．１〜２μｍでピッチが１．５〜６μｍの、多孔質超薄膜。ＰＬＡ等の超薄膜及び超薄膜が溶解しない液状媒体に可溶で、且つ、膜厚が３００ｎｍ以下であるＰＶＡ等の犠牲層とを含む複合膜に、超薄膜側からモールドを接触させ、複合膜を加熱圧縮して該複合膜に貫通孔を形成する工程、複合膜の貫通孔の形成後、複合膜モールドを分離する工程、及び、複合膜とモールドの分離後、複合膜が含む犠牲層を溶解して多孔質超薄膜を分離する工程、貫通孔形成工程のモールドの温度が、（超薄膜のガラス転移温度（℃）−２０℃）〜（超薄膜のガラス転移温度（℃）＋２０℃）で、貫通孔形成工程の圧力が１０ＭＰａ以上である、浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜の製造方法。【選択図】図２
2018078866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜。
【請求項２】
膜厚が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、請求項１に記載の多孔質超薄膜。
【請求項３】
貫通孔の直径が０．１μｍ以上２μｍ以下である、請求項１又は２に記載の多孔質超薄膜。
【請求項４】
貫通孔のピッチが１．５μｍ以上６μｍ以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多孔質超薄膜。
【請求項５】
超薄膜、および該超薄膜が溶解しない液状媒体に可溶であり、かつ、膜厚が３００ｎｍ以下である犠牲層とを含む複合膜に、該超薄膜側からモールドを接触させ、該複合膜を加熱圧縮して該複合膜に貫通孔を形成する工程、
該複合膜に貫通孔を形成した後、該複合膜と該モールドを分離する工程、および、
該複合膜と該モールドを分離した後、該複合膜が含む該犠牲層を溶解して多孔質超薄膜を分離する工程を含み、
該貫通孔形成工程における該モールドの温度が、（該超薄膜のガラス転移温度（℃）−２０℃）以上、（該超薄膜のガラス転移温度（℃）＋２０℃）以下であり、
該貫通孔形成工程における圧力が１０ＭＰａ以上である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡を用いたライブイメージング技術は時々刻々と進化しており、細胞の生命現象をライブで可視化しありのままの情報を得る必要不可欠な観察技術である。特に、超解像度顕微鏡の開発を例に挙げるように、ハード面（顕微鏡本体）の開発は目を見張るものがある。
【０００３】
しかし、観察試料の作製法（ソフト面）に関しては、細胞を基板に展開し、緩衝液を満たしてイメージングする先代からの手法が現在も採用されている。接着系細胞ではその方法で十分であるが、浮遊系細胞ではブラウン運動して焦点が定まらない他、基板と接触すると瞬時に活性化するため未活性状態からのイメージングは困難である。さらに、液性刺激因子を含む水溶液を添加すると、浮遊系細胞は即座に拡散してしまい、可視化したい細胞をイメージングすることは難しい。このように、ブレずに未活性状態で保定でき、刺激反応を追跡できる浮遊系細胞の試料作製法の開発が焦眉の急である。
【０００４】
この点、最近、アシル鎖含有PEG誘導体（Biocompatible Anchor for Membrane）を介して浮遊系細胞を基板に固定する手法が開発されたが（非特許文献１）、アシル鎖はアルブミンとも相互作用するため、PBS等の血清非存在下でしか機能しない。また、近年、フォトリソグラフィー微細加工技術で構築したマイクロ流体デバイスが注目されており（非特許文献２）、細胞が通過しない溝やフィルターをデバイス内に配置して浮遊系細胞を捕捉しライブイメージングする試みもあるが、高度な微細加工技術が要求されたり、流路内の圧力変化で細胞が溶血する等、詳細な実験条件設定が必須となる。
【０００５】
さらに、膜厚をナノ寸法に制御した高分子超薄膜の開発もされている 。得られた超薄膜はナノ厚特有の高接着性が発現し、反応性官能基や接着剤を使用せず物理吸着のみで種々の界面（皮膚や生体組織等）に貼付（ラッピング）できる性質をもつことが特徴である（特許文献１、非特許文献３、４）。さらに、細胞培養支持体やナノ・マイクロフィルター、高光散乱膜、細胞分離フィルターとして利用できる多孔質超薄膜が、相分離を用いて製造されている（特許文献２）。
【０００６】
本発明者らは、上記高分子超薄膜をさらに発展させ、浮遊系細胞向けに、液性刺激因子が自由に透過できるように貫通孔を設けた超薄膜を開発し、浮遊系細胞を基板にラッピングして保定する手法を過去に提案している（非特許文献５）。しかし、多孔質超薄膜の膜厚や貫通孔の直径、貫通孔のピッチ等の多孔質性等について具体的な報告はなされておらず、さらに、該多孔質超薄膜を製造するに当たり、その製造方法の具体的な報告もなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５８３０３８１号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１３／１３７２６０号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nagamune, T. et al. Biotechniques, 35, 1014 (2003)
【非特許文献２】Okubo, A. et al. Anal. Chem. 77, 3309 (2005)
【非特許文献３】Okamura, Y. et al. Adv. Mater. 21, 4388 (2009)
【非特許文献４】Okamura, Y. et al. Adv. Mater. 25, 545 (2013)
【非特許文献５】高分子超薄膜を用いた見活性浮遊細胞固定技術  “ナノラッピング”の確立と機能解明，ナノメディシン分子化学 平成27年度研究成果報告書，文部科学省科学研究費補助金  新学術領域研究（研究領域提案型），領域番号：２３０６，領域略称名：ナノメディシン，２０１６年３月発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、浮遊系細胞を保定するための多孔質超薄膜およびその製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、所定の構造を有する多孔質超薄膜により上記課題が解決できることに想到し、本発明に到達した。
本発明は、以下の通りである。
【００１１】
〔１〕
浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜。
〔２〕
膜厚が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、〔１〕に記載の多孔質超薄膜。
〔３〕
貫通孔の直径が０．１μｍ以上２μｍ以下である、〔１〕又は〔２〕に記載の多孔質超薄膜。
〔４〕
貫通孔のピッチが１．５μｍ以上６μｍ以下である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の多孔質超薄膜。
〔５〕
超薄膜、および該超薄膜が溶解しない液状媒体に可溶であり、かつ、膜厚が３００ｎｍ以下である犠牲層とを含む複合膜に、該超薄膜側からモールドを接触させ、該複合膜を加熱圧縮して該複合膜に貫通孔を形成する工程、
該複合膜に貫通孔を形成した後、該複合膜と該モールドを分離する工程、および、
該複合膜と該モールドを分離した後、該複合膜が含む該犠牲層を溶解して多孔質超薄膜を分離する工程を含み、
該貫通孔形成工程における該モールドの温度が、（該超薄膜のガラス転移温度（℃）−２０℃）以上、（該超薄膜のガラス転移温度（℃）＋２０℃）以下であり、
該貫通孔形成工程における圧力が１０ＭＰａ以上である、
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞のライブイメージングに影響を与えない構造を有する浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施態様に係る多孔質超薄膜の超薄膜部分と貫通孔部分とを示す画像である（図面代用写真）。
【図２】実施例１における、犠牲層と超薄膜とを含む複合膜の調製工程を含む、多孔質超薄膜の製造工程を示す模式図である。
【図３】実施例２の結果を示す画像である（図面代用写真）。
【図４】実施例３の結果を示す画像である（図面代用写真）。
【図５】実施例４の結果を示す画像である（図面代用写真）。
【図６】実施例５の結果を示す画像である（図面代用写真）。
【図７】実施例６の結果を示す画像である（図面代用写真）。
【図８】実施例７のディスク状粒子のラッピング効果を示す結果である。
【図９】実施例８の血小板細胞の保定効果を示す結果である（図面代用写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜に係る発明（第一の発明）と、該浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜の製造方法に係る発明（第二の発明）を含む。
【００１５】
＜１．第一の発明＞
本発明の第一の発明は、浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜である。
【００１６】
［浮遊系細胞］
浮遊系細胞とは、培養液中で浮遊状態で生存できる細胞のことであり、基材等に接着しなければ生存や増殖ができない接着系細胞とは区別されるものである。本発明の第一の発明における浮遊系細胞としては、一般的には血球細胞が挙げられるが、これに制限されるわけではない。血球細胞の例としては、血小板が挙げられる。血小板は血漿などに分散していてもよい。
【００１７】
［保定］
本明細書における保定とは、浮遊系細胞に生物学的な刺激を与えず、かつ、該浮遊系細胞を観察等するのに際して該浮遊系細胞を基材等に固定することなく観察等に支障がない程度にまで該浮遊系細胞の移動を抑制し、さらに、保定に用いる多孔質超薄膜を通して生理活性分子の交換が可能である状態をいう。
【００１８】
［多孔質超薄膜］
（素材）
多孔質超薄膜の素材は、浮遊系細胞の培養時や観察時に用いられる培養液や緩衝液に不溶であり、製造時に用いる液状媒体に不溶であることが必要である。液状媒体としては、後述するように、例えば、水性媒体が挙げられる。また、多孔質超薄膜の素材は、浮遊系細胞に影響を与えるものではなく、例えば、細胞に対して生物学的な刺激を与える素材や、細胞に対して毒性を有する素材でなければ、特に制限されない。
該液状媒体が水性媒体であれば、多孔質超薄膜の素材としては、例えば、Ｄ，Ｌ‐ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸‐グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）；汎用性高分子に代表されるポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート；ゴム系高分子に代表されるポリ酢酸ビニル、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン、ポリシロキサンなどが挙げられる。好ましくは、生体適合性がありガラス転移温度も比較的低く超薄膜に多孔質を形成しやすい観点から、Ｄ，Ｌ‐ポリ乳酸（ＰＬＡ）である。いずれも市販の製品を用いることができる。
尚、多孔質超薄膜は、１層であっても複数層であってもよい。複数層の場合、層間で素材が同種でもよいし、異種の素材でもよい。
【００１９】
また、多孔質超薄膜の素材のガラス転移温度は、通常２０℃以上、好ましくは２５℃以上であり、通常２００℃以下、好ましくは１００℃以下である。
多孔質超薄膜の素材のガラス転移温度が２０℃以上であることにより室温で良好な強度をもつ多孔質超薄膜が調製することができ、一方で、ガラス転移温度が２００℃を超える素材は、貫通孔の形成以前に超薄膜そのものへの成膜加工が極めて困難である。
尚、Ｄ，Ｌ‐ポリ乳酸（ＰＬＡ）のガラス転移温度は５５℃である。
【００２０】
（膜厚）
多孔質超薄膜は、その膜厚が、通常２０ｎｍ以上、好ましくは３０ｎｍ以上、より好ましくは４０ｎｍ以上であり、一方、通常２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下である。本発明の「超薄膜」とは、該膜厚範囲にある薄膜を指す。
膜厚が２０ｎｍ以上であることにより超薄膜のハンドリングがしやすく、一方で、２００ｎｍ以下であることにより超薄膜の接着性が向上して浮遊系細胞の保定に有利であるとともに、多孔質超薄膜としての良好な貫通孔が得やすい。
【００２１】
多孔質超薄膜の膜厚は、公知の方法で測定することができ、特に制限されない。例えば、実施例に記載されるように、シリコンウェーハ上に展開した多孔質超薄膜の表面の一部をピンセットで削り、シリコンウェーハを露出させ、触針式段差計を用いて測定する方法が挙げられる。
【００２２】
（貫通孔の形状）
多孔質超薄膜の貫通孔の形状は、特に制限されないが、通常、円柱形である。また、例えば、後述する第二の発明のようにモールドにより貫通孔を形成する場合には、そのモールドの形状が貫通孔の形状として反映される。よって、所望の形状を有するモールドを選択すればよい。
【００２３】
（貫通孔の直径）
多孔質超薄膜の貫通孔が円柱形である場合、その貫通孔の直径は、通常０．１μｍ以上、好ましくは０．１５μｍ以上、より好ましくは０．２μｍ以上であり、一方、通常２μｍ以下、好ましくは１．５μｍ以下、より好ましくは１μｍ以下である。
貫通孔の直径が０．１μｍ以上であることにより保定された細胞に対して生理活性分子を素早く反応させることができ、一方で、２μｍ以下であることにより、例えば、血小板のように直径が小さい細胞でもラッピング内に留まり、外部へ拡散することがない。
【００２４】
貫通孔の直径は、公知の方法で測定することができ、特に制限されない。例えば、実施例に記載されるように、多孔質超薄膜を酸化アルミニウムメンブレンフィルターに掬い取り、デシケータ内で乾燥させた後、多孔質超薄膜の表面を走査型電子顕微鏡を用いて観察し、多孔質超薄膜の下に配置したメンブレンフィルターが目視できる箇所を貫通孔の箇所とし、画像解析ソフトを用いて測定する方法が挙げられる。
また、例えば、後述する第二の発明のようにモールドにより貫通孔を形成する場合には、そのモールドにおける凸部の直径が貫通孔の直径として反映される。よって、所望の直径を有するモールドを選択すればよい。
【００２５】
（貫通孔のピッチ）
多孔質超薄膜の貫通孔のピッチは、隣接する貫通孔の中心点間距離を指す。そのピッチは、多孔質超薄膜に存在する各貫通孔において、最も距離の小さいふたつの貫通孔の中心点間距離を測定し、その距離は、通常１．５μｍ以上、好ましくは２μｍ以上であり、一方、通常６μｍ以下、好ましくは５μｍ以下である。
貫通孔のピッチが１．５μｍ以上であることにより、例えば、後述するように、複合膜を基材上に形成してから貫通孔を形成する場合であっても、基材から剥離する際に破断しない適度な強度をもつ多孔質超薄膜を製造することができ、一方で、６μｍ以下であることにより、多孔質超薄膜の製造時に、複合膜とモールドとを分離することが容易となって、良好な多孔質超薄膜を製造することができる。
【００２６】
貫通孔のピッチは、公知の方法で測定することができ、特に制限されない。例えば、既
に説明した「貫通孔の直径」の測定方法と同様の観察をして測定することができる。また、例えば、後述する第二の発明のようにモールドにより貫通孔を形成する場合には、そのモールドにおける凸部のピッチが貫通孔のピッチとして反映される。よって、所望のピッチを有するモールドを選択すればよい。
【００２７】
（貫通孔のパターン）
また、多孔質超薄膜における貫通孔のパターンは、特に制限されないが、生理活性分子を保定された細胞に対して均等に刺激させるとの観点から、規則的なパターンであることが好ましく、各貫通孔間が等間隔であることがより好ましい。
【００２８】
（細胞の保定）
多孔質超薄膜は、細胞の保定に用いる前に、ガラス基板などの基材上に貼付し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を溶解させたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などでブロッキングしてもよい。ブロッキング条件は常法に従えばよく、例えば、４℃で２時間などの条件が挙げられる。
細胞の保定の方法は特に制限されず、例えば、実施例に記載されるように、その上に細胞が添加されたガラス基板などに、金属枠に掬い取った多孔質超薄膜を通過させて保定する方法などが挙げられる。
【００２９】
（細胞の観察）
保定された細胞の観察は、通常の細胞観察と同様に行うことができる。実施例に記載されるように、必要に応じて、その上に細胞が添加されたガラス基板をフローチャンバーにセットし、シリンジポンプを用いて培養液や緩衝液を還流させてもよい。
【００３０】
（細胞への刺激）
保定された細胞への生理活性分子による刺激は、常法と同様に行うことができる。生理活性分子の種類や濃度も特に制限されないが、例えば、浮遊系細胞が血小板があれば、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にトロンビンレセプターアゴニストペプチド（ＴＲＡＰ）、トロンビン、アデノシン‐５’‐二リン酸などが挙げられる。ＴＲＡＰにより血小板が刺激されると、該血小板は、活性化して偽足を現す反応（凝集反応）を示すことが知られている。
【００３１】
＜２．第二の発明＞
本発明の第二の発明は、超薄膜、および該超薄膜が溶解しない液状媒体に可溶であり、かつ、膜厚が３００ｎｍ以下である犠牲層とを含む複合膜に、該超薄膜側からモールドを接触させ、該複合膜を加熱圧縮して該複合膜に貫通孔を形成する工程（貫通孔形成工程）、該複合膜に貫通孔を形成した後、該複合膜と該モールドとを分離する工程（モールド分離工程）、および、複合膜と該モールドを分離した後、該複合膜が含む該犠牲層を溶解して多孔質超薄膜を分離する工程（多孔質超薄膜分離工程）を含み、該貫通孔形成工程における該モールドの温度が、（該超薄膜のガラス転移温度（℃）−２０℃）以上、（該超薄膜のガラス転移温度（℃）＋２０℃）以下であり、該貫通孔形成工程における圧力が１０ＭＰａ以上である、本発明の第一の発明に係る浮遊系細胞保定用多孔質超薄膜の製造方法である。
【００３２】
本発明の第二の発明は、貫通孔形成工程、モールド分離工程、および多孔質超薄膜分離工程を含むが、その他の工程を含んでもよい。尚、本発明の第二の発明について以下に記載するが、本発明の第二の発明には、上記した本発明の第一の発明の記載も適用される。
【００３３】
［貫通孔形成工程］
本工程は、超薄膜、および該超薄膜が溶解しない液状媒体に可溶であり、かつ、膜厚が
３００ｎｍ以下である犠牲層とを含む複合膜に、該超薄膜側からモールドを接触させ、該複合膜を加熱圧縮して該複合膜に貫通孔を形成する工程である。
【００３４】
本工程では、前記複合膜に超薄膜側からモールドを接触させ、該複合膜を加熱圧縮して該複合膜に貫通孔を形成することができれば、その方法は特に制限されない。このとき、当業者であれば、超薄膜にのみ貫通孔が形成される限り、犠牲層にまで孔が形成される必要はないと考えるだろうが、超薄膜だけでなく犠牲層にまで孔が形成されることが好ましく、犠牲層のより深くにまで孔が形成されることがより好ましく、犠牲層を完全に貫通する孔が形成されることがさらに好ましく、犠牲層を完全に貫通する孔ができるだけ多く形成されることがよりさらに好ましい。例えば、後述するように、複合膜を基材上に形成してから貫通孔を形成する場合には、これにより、基材と複合膜とが分離しやすくなる。
【００３５】
（犠牲層の素材）
犠牲層の素材については次の通りである、後述する［多孔質超薄膜分離工程］欄の記載の通り、最終的に犠牲層が溶解されて多孔質超薄膜の単体が得られる。そのため、犠牲層の素材は、その際に多孔質超薄膜が溶解しない液状媒体に可溶であれば特に制限されない。例えば、該液状媒体が水性媒体の場合、ポリアクリル酸及びポリメタクリル酸等の高分子電解質；ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；デンプン、セルロースアセテート等の多糖類等の非イオン性の水溶性高分子が挙げられる。中でも、例えば、後述するように、複合膜を基材上に形成してから貫通孔を形成する場合における基材への成膜性と溶解性の観点から、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が好ましい。いずれも市販の製品を用いることができる。
【００３６】
（犠牲層の膜厚）
犠牲層は、その膜厚が、通常５ｎｍ以上、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは１５ｎｍ以上であり、一方、通常３００ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下である。
膜厚が５ｎｍ以上であることにより、例えば、後述するように、複合膜を基材上に形成してから貫通孔を形成する場合でも、複合膜を基材から分離させやすく、一方で、３００ｎｍ以下であることにより超薄膜に貫通孔が形成されやすくなる。膜厚が３００ｎｍを超える場合、後述する加熱圧縮時に犠牲層がクッションの役割を果たして孔が形成されなくなるものと推測される。この場合、実施例に記載されるように、残膜が確認されるなどする。
【００３７】
（犠牲層のガラス転移温度）
犠牲層の素材のガラス転移温度は、通常３０℃以上、好ましくは３５℃以上であり、通常２００℃以下、好ましくは１００℃以下である。
犠牲層の素材のガラス転移温度が３０℃以上であることにより室温で犠牲層を成膜することができ、一方で、ガラス転移温度が２００℃を超える素材は、３００ｎｍ以下の犠牲層の形成が極めて困難である。
【００３８】
（超薄膜のガラス転移温度と犠牲層のガラス転移温度の関係）
犠牲層の素材のガラス転移温度は、超薄膜の素材のガラス転移温度より１０℃以上、好ましくは２０℃以上高いのがよい。１０℃未満あるいは前者が後者より低いと、貫通孔形成工程で犠牲層が軟化して超薄膜に貫通孔が形成されにくいことや、超薄膜に犠牲層が付着することがある。
【００３９】
（複合膜の構成）
複合膜は、最終的に所望の多孔質超薄膜が得られる限り、犠牲層、超薄膜ともに複数層ずつ含まれていてもよく、例えば、１又は複数の犠牲層、１又は複数の超薄膜をこの順に
含んでいてもよい。
【００４０】
（基材）
本工程では、複合膜に超薄膜側からモールドを接触させ、該複合膜を加熱圧縮して該複合膜に貫通孔を形成するため、該複合膜は、例えば基材上に形成されている方が貫通孔を形成する上で好ましい。この場合、複合膜は、基材上に、基材から、犠牲層、超薄膜の順に２層が積層されていることが好ましい。また、最終的に所望の多孔質超薄膜が得られる限り、犠牲層、超薄膜ともに複数層ずつ積層されていてもよく、例えば、基材上に、基材から、１又は複数の犠牲層、１又は複数の超薄膜がこの順に積層されていてもよい。
【００４１】
基材の素材は、表面が平滑であれば特に制限されないが、例えば、シリコン、シリコンゴム、シリカ、ガラス、マイカ、グラファイトなどのカーボン材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、セロハン、エラストマーなどの高分子材料、アパタイトなどのカルシウム化合物からなるものが挙げられる。得られる多孔質超薄膜表面の平滑性の観点から、好ましい素材はシリコンであり、好ましい基材としてはシリコンウェーハである。いずれも市販の製品を用いることができる。
【００４２】
（モールド）
本工程におけるモールドは、超薄膜に所望の貫通孔が形成されれば特に制限されない。例えば、ピラーパターン、モスアイパターン、レンズアレイパターン等を有するモールドが挙げられる。パターンのサイズ、ピッチ、形状を制御しやすいため、ピラーパターンをもつモールドが好ましく、中でも、超薄膜に残膜なく貫通孔を形成できる観点から、ドーム状ピラーパターンをもつモールドがより好ましい。
【００４３】
（複合膜の加熱圧縮）
複合膜の加熱圧縮の方法は特に制限されず、公知の方法に従えばよい。例えば、実施例に記載されるように、小型熱プレス機を用いることができる。
【００４４】
（加熱圧縮時のモールドの温度）
加熱圧縮時のモールドの温度は、通常、（超薄膜のガラス転移温度（℃）−２０℃）以上であり、好ましくは（超薄膜のガラス転移温度（℃）−１５℃）以上であり、より好ましくは（超薄膜のガラス転移温度（℃）−１０℃）以上であり、一方、（超薄膜のガラス転移温度（℃）＋２０℃）以下であり、好ましくは（超薄膜のガラス転移温度（℃）＋１５℃）以下であり、より好ましくは（超薄膜のガラス転移温度（℃）＋１０℃）以下である。
（超薄膜のガラス転移温度（℃）−２０℃）以上であることにより、超薄膜全体に貫通孔が良好に形成される。一方で、（超薄膜のガラス転移温度（℃）＋２０℃）以下であることにより、形成される貫通孔の周辺が熱変性することなく貫通孔が形成される。
【００４５】
（加熱圧縮時の圧力）
加熱圧縮時の圧力は、通常１０ＭＰａ以上、好ましくは２０ＭＰａ以上、より好ましくは３０ＭＰａ以上であり、一方で、通常１００ＭＰａ以下、好ましくは６０ＭＰａ以下、より好ましくは５０ＭＰａ以下である。
１０ＭＰａ以上であることにより、超薄膜に貫通孔が形成され超薄膜全体に貫通孔が良好に形成されるようになる。一方で、１００ＭＰａ以下であることにより、複合膜とモールドが分離しやすくなる。
【００４６】
（加熱圧縮時の時間）
加熱圧縮時の時間は、通常３０秒以上、好ましくは４５秒以上、より好ましくは６０秒以上であり、一方で、通常３００秒以下、好ましくは２００秒以下、より好ましくは１０
０秒以下である。
３０秒以上であることにより、超薄膜に貫通孔を良好に形成でき、一方で、３００秒以下であることにより、複合膜とモールドの分離がしやすくなる。
【００４７】
＜塗工工程＞
既述の基材を用いる場合には、貫通孔形成工程は、基材に犠牲層を塗工し、その上に超薄膜を塗工する工程を含んでもよい。具体的には以下である。
【００４８】
既述の通り、複合膜は、基材上に、犠牲層、超薄膜の順に２層が積層されていることが好ましい。また、最終的に所望の多孔質超薄膜が得られる限り、犠牲層、超薄膜ともに複数層ずつ積層されていてもよく、例えば、基材上に、１又は複数の犠牲層、１又は複数の超薄膜が積層されていてもよい。いずれの複合膜も、当業者であれば、本塗工工程の記載に従って得ることができる。
【００４９】
（犠牲層の塗工）
犠牲層の塗工としては、例えば、基材上に適当な濃度に調製した犠牲層を成す溶液を滴下後、公知の塗工方法で塗工すればよい。その塗工方法は特に制限されないが、例えば、スピンコーティング法、キャスト法、マイクログラビア法などが挙げられる。スピンコーティング法を用いた場合は、例えば、基材上に、適当な濃度に調製した犠牲層を成す溶液を、スピンコーターにより１０００〜８０００ｒｐｍで１０〜１００秒回転させた後、乾燥させればよい。加熱により乾燥させてもよい。犠牲層を成す溶液の濃度、スピンコーターの回転速度及び回転時間によって基材上の犠牲層の膜厚を制御することができる。加熱温度及び加熱時間は、塗工後の犠牲層を成す液状媒体の溶媒が蒸発する条件であればよく、特に限定はされない。
【００５０】
犠牲層を成す溶液の濃度としては、例えば、通常１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上であり、一方で、通常１００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは８０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは６０ｍｇ／ｍＬ以下である。
１ｍｇ／ｍＬ以上であることにより、超薄膜を基材から剥離するための犠牲層として機能し、一方で、１００ｍｇ／ｍＬ以下であることにより、適度な溶液粘度になるため基材に均一に成膜できる。
【００５１】
（超薄膜の塗工）
超薄膜の塗工としては、例えば、基材上に塗工された犠牲層の上に、適当な濃度に調製した超薄膜を成す溶液を滴下後、公知の塗工方法で塗工すればよく、上記「犠牲層の塗工」欄で記載した方法が援用される。
尚、超薄膜を成す溶液の濃度としては、例えば、通常１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上であり、一方で、通常６０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以下である。
【００５２】
［モールド分離工程］
本工程は、貫通孔形成工程で複合膜に貫通孔を形成した後、該複合膜とモールドとを分離する工程である。
貫通孔形成工程で複合膜に形成された貫通孔の形状が崩れなければ、その方法に特に制限はない。例えば、ピンセット状の器具を用いて複合膜とモールドとを分離することが挙げられる。
【００５３】
［多孔質超薄膜分離工程］
本工程は、モールド分離工程で複合膜とモールドとを分離した後、該複合膜が含む該犠牲層を溶解して多孔質超薄膜を分離する工程である。
多孔質超薄膜と犠牲層とを分離するためには、複合膜が含む多孔質超薄膜は溶解せず、犠牲層だけが溶解する液状媒体に該複合膜を浸漬すればよい。このとき、例えば、上述したように、複合膜を基板上に形成してから貫通孔を形成した場合には、基材上に形成した複合膜を一旦基材から分離させた後に浸漬してもよいし、基材から複合膜を分離せずに基材ごと浸漬してもよい。
【００５４】
液状媒体としては、例えば、水性媒体が好ましく、水、蒸留水、塩を溶解させた水、界面活性剤を溶解させた水、緩衝液等が好ましい。多孔質超薄膜がＤ，Ｌ‐ポリ乳酸（ＰＬＡ）、犠牲層がポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である場合には、例えば、水、蒸留水が挙げられる。
【００５５】
［その他の工程］
＜多孔質超薄膜保存工程＞
上記多孔質超薄膜分離工程で取得された多孔質超薄膜は、上記液性媒体中で保存可能であり、また、乾燥させて保存することも可能である。乾燥方法は特に制限されないが、例えば、自然乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、気流乾燥、回転乾燥、攪拌乾燥、噴霧乾燥等が挙げられ、好ましくは凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥である。これら乾燥方法は常法により行うことができる。さらなる具体例としては、シリコンウェーハに貼付し、デシケータ内で乾燥するなどして保存することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５７】
（材料）
[基板]
Ｐ型シリコンウェーハ（ケイ・エス・ティ・ワールド社製、直径：１００±０．５ｍｍ、  厚さ：５２５±２５μｍ、酸化膜：２００ｎｍ、結晶面：１００）を３０ｍｍ×３０ｍｍのサイズにカットして使用した。
【００５８】
[犠牲層]
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、関東化学社製、鹸化度：８６．５〜８９％、重合度：５００）を使用した。スターラーを用いて、ＰＶＡを蒸留水に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬあるいは１００ｍｇ／ｍＬの水溶液とした。
【００５９】
[超薄膜]
ポリＤ，Ｌ−乳酸（ＰＬＡ、ネイチャーワークスＬＬＣ社製、重量平均分子量：２５０，０００）を使用した。スターラーを用いて、ＰＬＡをトルエンに溶解させた。ＰＬＡ超薄膜の膜厚はスピンコートする際のＰＬＡ濃度に比例するため、それに従って１０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲で濃度を適宜調整した。
【００６０】
［ピラーパターンモールド］
突起高さ０．７５μｍ〜０．８９μｍのドーム状ピラーパターンを有するモールド（ＪＶＣケンウッド・クリエイティブメディア社製）であって、ピラーピッチがそれぞれ１．５μｍ、３．０μｍ、６．０μｍ、１２．０μｍの４種類を使用した。
【００６１】
[特性の評価方法]
（１）犠牲層、多孔質超薄膜の膜厚
シリコンウェーハにスピンコートしたＰＶＡ犠牲層、あるいはシリコンウェーハに貼付したＰＬＡ多孔質超薄膜の表面の一部をピンセットで削り、シリコンウェーハをむき出し
にした。触針式段差計（Ｂｒｕｋｅｒ社製、Ｄｅｋｔａｋ（登録商標）ＤＸＴ−Ｅ）を用いて、シリコンウェーハとＰＶＡ犠牲層あるいはＰＬＡ多孔質超薄膜の段差を測定し、膜厚とした。
【００６２】
（２）貫通孔の判定と直径、貫通孔内の残膜率
図１に示すように、水中で分離した多孔質超薄膜を酸化アルミニウムメンブレンフィルター（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製、Ａｎｏｄｉｓｋ（登録商標）２５、孔径：０．１μｍ、直径：２５ｍｍ）に掬い取り、デシケータ内で乾燥させた。多孔質超薄膜の表面を走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ社製、ＦＥ−ＳＥＭ  Ｓ−４８００）を用いて観察し、多孔質超薄膜の下に配置したメンブレンフィルターが目視できるか否かで、貫通孔の付与を判定した。貫通孔の直径は画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）で実測した。また、多孔質超薄膜上に転写されたパターン内に残る膜成分を残膜と定義した。パターンと残膜の面積を画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）にて計測し、パターンの面積に対する残膜の面積の割合を残膜率として算出した。
【００６３】
（３）ディスク状粒子、浮遊細胞のラッピングによる保定効果
ＰＬＡ超薄膜（膜厚：５５ｎｍ、貫通孔なし）をガラス基板（アズワン社製、直径：２５ｍｍ、厚み：０．１６〜０．１８ｍｍ）に貼付し、乾燥（５０℃、終夜）させた。得られたガラス基板をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、３０ｍｇ／ｍＬ）を溶解させたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸漬し、ブロッキングした（４℃、２時間）。ＰＢＳでガラス基板を洗浄後、蛍光標識ディスク状粒子（直径１．７μｍ、励起波長：４４１ｎｍ、発光波長：４８６ｎｍ）、あるいはヒト多血小板血漿（ＰＲＰ、血小板数：３．５×１０５／μＬ）を５０μＬ添加した。金属枠（直径：３０ｍｍ）に掬い取った多孔質超薄膜を基板に通過させ、粒子あるいは血小板細胞を基板間にラッピングした。次いで、得られた基板をフローチャンバー（自作装置）にセットし、シリンジポンプ（アズワン社製、ＳＰＳ−１）を用いてＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで還流させた。このとき、粒子あるいは血小板細胞の分散挙動を蛍光顕微鏡（ニコン社製、ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ）にて動画撮影した。このとき、粒子の移動速度を画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ
Ｊ）にて解析し、保定効果を判定した。
【００６４】
［実施例１］
＜犠牲層と超薄膜とを含む複合膜の調製＞
（工程１：犠牲層の塗工）
図２の工程１に従い、シリコンウェーハ上に１０ｍｇ／ｍＬあるいは１００ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したＰＶＡ水溶液を滴下後スピンコート（ミカサ社製、ＭＳ−Ａ１００、回転数：４０００ｒｐｍ、回転時間：６０秒）し、犠牲層とした。乾燥後の膜厚は、それぞれ１５±１ｎｍ、３８５±１５ｎｍであった。
【００６５】
（工程２：超薄膜の塗工）
図２の工程２に従い、工程１で得た犠牲層上に２０、３０、又は６０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したＰＬＡトルエン溶液を滴下後スピンコート（回転数：４，０００ｒｐｍ、回転時間：６０秒）した。続いて、後述する方法で貫通孔を形成し、または形成せずに、蒸留水で満たしたシャーレの中にシリコンウェーハを浸漬させて超薄膜を回収後、別のシリコンウェーハに貼付し、デシケータ内で乾燥させた。乾燥後のＰＬＡ超薄膜の膜厚は、それぞれ５５±０．２ｎｍ、１５０±３ｎｍ、４９８±４ｎｍであった。
【００６６】
［実施例２］
＜多孔質超薄膜の調製１〜加熱圧縮操作時の圧力〜＞
実施例１に従って、シリコンウェーハ上に、膜厚１５ｎｍのＰＶＡ犠牲層、膜厚５５ｎｍのＰＬＡ超薄膜を塗工した。ピラーパターンモールド（ピラーピッチ：３．０μｍ）を
超薄膜に接触させた状態で小型熱プレス機（アズワン社製、ＡＨ−２００３）に挿入し、加熱（到達温度：７０℃、到達温度後の時間：６０秒、無加圧）した。続いて、温度を維持したまま、加熱圧縮操作として、圧力を０ＭＰａ、１０ＭＰａ、２０ＭＰａ、３０ＭＰａ、又は４０ＭＰａとしてプレス（いずれも、時間：６０秒）した後、シリコンウェーハが３０℃になるまで冷却し、ＰＶＡ犠牲層とＰＬＡ超薄膜の複合膜からモールドを分離した。蒸留水で満たしたシャーレの中にシリコンウェーハを浸漬させて多孔質超薄膜を回収後、酸化アルミニウムメンブレンフィルターに貼付し、デシケータ内で乾燥、走査型電子顕微鏡にて観察した。
【００６７】
結果を図３に示す。ピラーパターンモールドを超薄膜に接触させた状態のみでは（０ＭＰａ）、超薄膜に貫通孔は形成されないことを確認した。１０ＭＰａ、２０ＭＰａの圧縮により貫通孔が形成されることを確認した。３０ＭＰａ以上で超薄膜全体に貫通孔が付与された多孔質超薄膜が調製可能であった。このとき、貫通孔の平均直径は０．９５μｍであった。尚、各画像の右上に示された画像は、超薄膜をデジタルカメラ（キヤノン製、IXY DIGITAL 25 IS）で撮影して得られたものであり、白色に見える部分が貫通孔が形成された領域である。
【００６８】
［実施例３］
＜多孔質超薄膜の調製２〜加熱圧縮操作時のモールドの温度〜＞
実施例２と同様にして、ピラーパターンモールドを超薄膜に接触させた状態で小型熱プレス機に挿入し、加熱（到達温度：３０℃、５０℃、７０℃、又は９０℃、到達温度後の時間：６０秒、無加圧）した。続いて、それぞれ温度を維持したまま、加熱圧縮操作としてプレス（いずれも、圧力：３０ＭＰａ、時間：６０秒）した後、実施例２と同様に多孔質超薄膜を調製した。結果を図４に示す。３０℃で圧縮した場合、ピラー形状に相当するパターンは転写されていたものの貫通孔には至らなかった。５０℃では、残膜のない貫通孔をもつ多孔質超薄膜が得られた（貫通孔の平均直径：０．４３μｍ）。７０℃では、貫通孔の直径が増大した多孔質超薄膜が得られた（貫通孔の平均直径：０．９５μｍ）。９０℃でも同様に多孔質超薄膜は得られたが、貫通孔周辺に変性が見られた。
【００６９】
［実施例４］
＜多孔質超薄膜の調製３〜犠牲層の膜厚〜＞
ＰＶＡ犠牲層の膜厚を３８５ｎｍにすること以外、実施例３と同条件（ただし、到達温度：５０℃又は７０℃）で多孔質超薄膜を調製した。結果を図５に示す。ＰＶＡ犠牲層が厚くなると、ピラー形状に相当するパターンは転写されて貫通領域は形成されるものの、残膜が確認された。
【００７０】
［実施例５］
＜多孔質超薄膜の調製４〜超薄膜の膜厚〜＞
ＰＬＡ超薄膜の膜厚を１５０ｎｍ又は４９８ｎｍにすること以外、実施例３と同条件（ただし、到達温度：７０℃）で多孔質超薄膜を調製した。結果を図６に示す。１５０ｎｍの超薄膜では、残膜のない多孔質超薄膜が得られた。しかし、４９８ｎｍの超薄膜ではピラー形状に相当するパターンは転写されていたものの貫通孔には至らなかった。
【００７１】
［実施例６］
＜多孔質超薄膜の調製５〜貫通孔のピッチ〜＞
ピラーピッチが１．５μｍ、６μｍ、１２μｍのドーム状ピラーパターンモールドを使用すること以外、実施例３と同条件（ただし、到達温度：７０℃）で多孔質超薄膜を調製した。結果を図７に示す。ピラーピッチが１．５μｍ、６μｍの場合、多孔質超薄膜が得られた。ピラーピッチが１２μｍの場合、加熱圧縮後、シリコンウェーハからモールドを離型することが困難であり多孔質超薄膜が得られなかった。
【００７２】
［実施例７］
＜多孔質超薄膜によるディスク状粒子、浮遊細胞のラッピングと保定効果＞
ドーム状ピラーパターンモールド（ピラーピッチ：３．０μｍ）を使用し、実施例３と同条件（ただし、到達温度：７０℃）で多孔質超薄膜（多孔質超薄膜の直径：３０ｍｍ）を調製した。このとき、貫通孔のない超薄膜を比較対照とした。
浮遊細胞のモデルであるディスク状粒子（直径：１．７μｍ）のラッピング効果を図８に示す。ラッピングしない系では、粒子は還流方向に沿って移動した（移動速度：１５．１±１．７μｍ／ｓ、ｎ＝１７）。多孔質超薄膜でラッピングした場合、移動せずにその場に留まることが明らかになった（移動速度：２．１±０．２μｍ／ｓ、ｎ＝２３）。これは貫通孔のない超薄膜と同等であった（移動速度：２．１±０．６μｍ／ｓ、ｎ＝２４）。従って、超薄膜の貫通孔の有無に関わらず、超薄膜で粒子分散体をラッピングすれば、観察等に支障がない程度にまでディスク状粒子の移動を抑制できることが実証された。
【００７３】
［実施例８］
ドーム状ピラーパターンモールド（ピラーピッチ：３．０μｍ）を使用し、実施例７と同条件で多孔質超薄膜（多孔質超薄膜の直径：３０ｍｍ）を調製した。また、貫通孔のない超薄膜を比較対照とした。
浮遊細胞の１例として用いた血小板細胞の保定効果を図９に示す。このとき、血小板細胞の生理活性分子であるトロンビンレセプターアゴニストペプチド、ＴＲＡＰ（シグマ・アルドリッチ社製）を５０μＭ溶解させたＨＥＰＥＳ緩衝液を還流させた。粒子と同様、超薄膜の貫通孔の有無に関わらず、超薄膜で血小板細胞をラッピングすれば、観察等に支障がない程度にまで血小板細胞の移動を抑制できることが実証された。
【００７４】
続いて、血小板細胞の刺激反応を経時的に観察した。貫通孔のない超薄膜でラッピングした場合、還流開始１８０秒後でも血小板細胞の形態は変化せず、未活性状態を維持した。これは、貫通孔がないためにＴＲＡＰが拡散せず、刺激が入らなかったためと考えられる。
しかし、多孔質超薄膜ではＴＲＡＰが拡散可能なため、血小板細胞が偽足を現し（活性化）、凝集する挙動がライブでイメージングできた。従って、多孔質超薄膜は浮遊細胞を保定し、追跡できるイメージングツールへの応用の可能性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、浮遊系細胞の保定および該浮遊系細胞のライブイメージングツールとして有用である。
【図１】
2018078866.tif 000003
【図２】
2018078866.tif 000004
【図３】
2018078866.tif 000005
【図４】
2018078866.tif 000006
【図５】
2018078866.tif 000007
【図６】
2018078866.tif 000008
【図７】
2018078866.tif 000009
【図８】
2018078866.tif 000010
【図９】
2018078866.tif 000011