(57)【要約】【課題】本発明は、概して、血管芽細胞から誘導された間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の新規な調製物、及びこのようなＭＳＣを使用して病態を治療する方法に関する。【解決手段】本発明の方法は、効力を保持している若々しい表現型を有する相当数のＭＳＣを産生し、これは病態の治療に有用である。例えば、哺乳動物患者における使用に好適な医薬調製物であって、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬調製物であり、前記間葉系間質細胞が、１０回目の倍加までに前記細胞の２５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞への分化を受けている状態で、細胞培養中で少なくとも１０回の集団倍加を受けるための複製能力を有する、医薬調製物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物患者における使用に好適な医薬調製物であって、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬調製物であり、前記間葉系間質細胞が、１０回目の倍加までに前記細胞の２５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞への分化を受けている状態で、細胞培養中で少なくとも１０回の集団倍加を受けるための複製能力を有する、医薬調製物。
【請求項２】
哺乳動物患者における使用に好適な医薬調製物であって、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬調製物であり、前記間葉系間質細胞が、５回目の継代までに前記細胞の２５％未満が細胞死、老化又は線維芽細胞への分化を受けている状態で、細胞培養中で少なくとも５回の前記継代を受けるための複製能力を有する、医薬調製物。
【請求項３】
少なくとも１０６個の間葉系間質細胞と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、血管芽細胞から分化する、医薬調製物。
【請求項４】
少なくとも１０８個の間葉系間質細胞を含む低温細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、１０回目の倍加までに前記細胞の２５％未満が細胞死、老化又は線維芽細胞への分化を受けている状態で、細胞培養中で少なくとも１０回の集団倍加を受けるための複製能力を有する、低温細胞バンク。
【請求項５】
少なくとも１０６個の間葉系間質細胞と１％未満の任意の他の細胞型とを含む精製細胞集団であって、前記間葉系間質細胞が、１０回目の倍加までに前記細胞の２５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞への分化を受けている状態で、細胞培養中で少なくとも１０回の前記集団倍加を受けるための複製能力を有する、精製細胞集団。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、胚性幹細胞系又は誘導多能性幹細胞系などの多能性幹細胞ソースから分化する、調製物又は細胞バンク。
【請求項７】
請求項６に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記調製物又はバンクの前記間葉系間質細胞の全てが、共通の多能性幹細胞ソースから分化する、調製物又は細胞バンク。
【請求項８】
請求項６に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、前記間葉系間質細胞の数に増殖するために培養中で継代され、２０回未満の集団倍加後に培養から単離された多能性幹細胞ソースから分化する、調製物又は細胞バンク。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、ＨＬＡに遺伝子型で同一である、調製物又は細胞バンク。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、ゲノム的に同一である、調製物又は細胞バンク。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞の少なくとも３０％が、ＣＤ１０が陽性である、調製物又は細胞バンク。
【請求項１２】
請求項１１に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞の少なくとも６０％が、マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−ＡＢＣが陽性である、調製物又は細胞バンク。
【請求項１３】
請求項１〜５又は１１のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞の３０％未満が、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４及びＴＬＲ３が陽性である、調製物又は細胞バンク。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、２５日未満の細胞培養中で少なくとも１０回の集団倍加を受けるための複製速度を有する、調製物又は細胞バンク。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、８ｋｂよりも長い平均末端制限酵素断片長さ（ＴＲＦ）を有する、調製物又は細胞バンク。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、（ｉ）細胞周期調節及び細胞老化、（ｉｉ）細胞エネルギー及び／又は脂質代謝、及び（ｉｉｉ）アポトーシスの１つ以上に関与するタンパク質の５回の集団倍加を受けている、前記間葉系間質細胞が、骨髄から誘導された間葉系間質細胞に対して、統計的に有意な減少した含量及び／又は酵素活性を有する、調製物又は細胞バンク。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、骨髄から誘導された間葉系間質細胞調製物に対して、細胞骨格及びそれに関連する細胞動態に関与するタンパク質の統計的に有意な増加した含量及び／又は酵素活性を有する、調製物又は細胞バンク。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、培養中において１０回の集団倍加にわたって５，０００，０００を超える、フローサイトメトリーによって測定される前方散乱光値を有する細胞において、７５％超の増加を受けない、調製物又は細胞バンク。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の調製物又は細胞バンクであって、前記間葉系間質細胞が、休止状態において、骨髄又は脂肪組織から誘導される間葉系間質細胞によって、休止状態で発現されるＩＬ−６ｍＲＮＡレベルの１０％未満である、インターロイキン−６をコード化するｍＲＮＡを発現する、調製物又は細胞バンク。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製物であって、ヒト患者への投与に好適である、調製物。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製物であって、非ヒト獣医動物への投与に好適である、調製物。
【請求項２２】
間葉系間質細胞を含む医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、少なくとも１０回の集団倍加を受けることが可能であり、前記１０回の集団倍加が、約２７日以内、より好ましくは、約２６日未満、好ましくは２５日未満、より好ましくは約２４日未満、更により好ましくは約２３日未満、更により好ましくは約２２日未満、又はそれ未満で生じる、医薬調製物。
【請求項２３】
間葉系間質細胞を含む医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、少なくとも１５回の集団倍加を受けることが可能である、医薬調製物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０回又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能である、医薬調製物。
【請求項２５】
間葉系間質細胞を含む医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、培養中で、少なくとも１５回の集団倍加、少なくとも２０回の集団倍加、又は少なくとも２５回の集団倍加を受けることが可能である、医薬調製物。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、血管芽細胞の生体外分化によって産生される、医薬調製物。
【請求項２７】
請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、霊長類細胞又はその他の哺乳動物細胞である、医薬調製物。
【請求項２８】
請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、ヒト細胞である、医薬調製物。
【請求項２９】
請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記１５回の集団倍加が、約３５日以内、より好ましくは、約３４日以内、好ましくは３３日以内、より好ましくは３２日以内、更により好ましくは３１日以内、又は更により好ましくは約３０以内で生じる、医薬調製物。
【請求項３０】
請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記調製物が、約１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、０．０１％未満、０．００９％未満、０．００８％未満、０．００７％未満、０．００６％未満、０．００５％未満、０．００４％未満、０．００３％未満、０．００２％未満、０．００１％未満、０．０００９％未満、０．０００８％未満、０．０００７％未満、０．０００６％未満、０．０００５％未満、０．０００４％未満、０．０００３％未満、０．０００２％未満、又は０．０００１％未満の多能性細胞を含む、医薬調製物。
【請求項３１】
請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記調製物が、多能性細胞を含まない、医薬調製物。
【請求項３２】
請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記調製物が、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の間葉系間質細胞を含む、医薬調製物。
【請求項３３】
請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％が、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも１つ；（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの少なくとも１つ；（ｉｉｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３及び／又はＣＤ９０若しくは（ｉｖ）これらの任意の組み合わせが陽性である、医薬調製物。
【請求項３４】
請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞の
少なくとも５０％が、（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３及び／又はＣＤ９０の少なくとも２つ、（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１；ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも２つ；若しくは（ｉｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性である、医薬調製物。
【請求項３５】
請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、（ｉ）前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の全てが陽性であり；（ｉｉ）前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり、及び／又は（ｉｉｉ）前記間葉系間質細胞の５％以下又は１０％以下が、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、又はＴＬＲ３が陽性である、医薬調製物。
【請求項３６】
請求項３２、３３又は３４に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％が、（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の１つ以上；（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１；ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の１つ以上；若しくは（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの１つ以上が陽性である、医薬調製物。
【請求項３７】
請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、これを必要とする対象において不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含む、医薬調製物。
【請求項３８】
請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、これを必要とする受容者への移植のための他の細胞、組織又は器官を更に含む、医薬調製物。
【請求項３９】
請求項３８に記載の医薬調製物であって、前記他の細胞又は組織が、ＲＰＥ細胞、皮膚細胞、角膜細胞、膵細胞、肝細胞、心細胞又は前記細胞のいずれかを含む組織である、医薬調製物。
【請求項４０】
請求項２２〜３９のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、骨髄から誘導されず、免疫調節アッセイにおける前記調製物の前記効力が、骨髄由来間葉系間質細胞の調製物の前記効力よりも大きい、医薬調製物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の医薬調製物であって、前記効力が、ＥＣ５０用量を決定する免疫調節アッセイによってアッセイされる、医薬調製物。
【請求項４２】
請求項２２〜４１のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記調製物が、１０回の集団倍加後に、その増殖能の約５０％〜１００％を保持する、医薬調製物。
【請求項４３】
請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、多能性細胞から直接的に誘導されず、前記間葉系間質細胞が、（ａ）凝集しないか、又は多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも少ない量で実質的に凝集し；（ｂ）多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞と比較して、分裂する場合、より容易に分散し；（ｃ）等しい数の多能性細胞から出発する場合、多能性細胞から直接的
に誘導された間葉系間質細胞よりも数が多く；及び／又は（ｄ）多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも早期に特徴的な間葉系細胞表面マーカーを獲得する、医薬調製物。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の調製物であって、前記間葉系間質細胞が哺乳動物細胞である、調製物。
【請求項４５】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の調製物であって、前記間葉系間質細胞が、ヒト、イヌ、ウシ、非ヒト霊長類、ネズミ、ネコ又はウマ細胞である、調製物。
【請求項４６】
間葉系間質細胞を生成するための方法であって、間葉系間質細胞を生じる条件下で血管芽細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、フィーダーフリー条件下で培養される、方法。
【請求項４８】
請求項４６又は４７に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、マトリックス上で平板培養される、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、前記マトリックスが、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１、ウシ線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、及び／又は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の１つ以上を含む、方法。
【請求項５０】
請求項４８又は４９に記載の方法であって、前記マトリックスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトイロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、硫酸ヘパラン、マトリゲル（エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウスの肉腫細胞から得た可溶性調製物）、ヒト基底膜抽出物、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項５１】
請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法であって、前記マトリックスが、エンゲルブレス−ホルム−スウォームマウスの肉腫細胞から得た可溶性調製物を含む、方法。
【請求項５２】
請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法であって、前記間葉系間質細胞が、哺乳動物細胞である、方法。
【請求項５３】
請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法であって、前記間葉系間質細胞が、ヒト、イヌ、ウシ、非ヒト霊長類、ネズミ、ネコ又はウマ細胞である、方法。
【請求項５４】
請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、αＭＥＭを含む培地中で培養される、方法。
【請求項５５】
請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、血清又は血清代替品を含む培地中で培養される、方法。
【請求項５６】
請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、０％、０．１〜０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％のウシ胎児血清で補充されたαＭＥＭを含む培地中で培養される、方法。
【請求項５７】
請求項４６〜５６のいずれか一項に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、少なくと
も約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間、前記マトリックス上で培養される、方法。
【請求項５８】
請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、多能性細胞から分化する、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、前記多能性細胞が、ｉＰＳ細胞又は割球から産生された多能性細胞である、方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の方法であって、前記多能性細胞が、ヒト胚を破壊することなく、１つ以上の割球から誘導される、方法。
【請求項６１】
請求項５８に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、（ａ）多能性細胞を培養し、細胞のクラスタを形成する工程を含む方法によって、前記多能性細胞から分化する、方法。
【請求項６２】
請求項４６〜６１のいずれか一項に記載の方法であって、前記多能性細胞が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び／又は骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）の存在下で培養される、方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法であって、工程（ａ）における前記多能性細胞が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び／又は骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）の存在下で培養される、方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法であって、前記ＶＥＧＦ及びＢＭＰ−４が、細胞培養の開始の０〜４８時間以内に前記多能性細胞培養に添加され、前記ＶＥＧＦが任意選択で２０〜１００ｎｍ／ｍＬの濃度で添加され、前記ＢＭＰ−４が、任意選択で１５〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される、方法。
【請求項６５】
請求項６３に記載の方法であって、前記ＶＥＧＦ及びＢＭＰ−４が、前記細胞培養の開始の０〜４８時間以内に前記工程（ａ）の細胞培養に添加され、前記ＶＥＧＦが任意選択で２０〜１００ｎｍ／ｍＬの濃度で添加され、前記ＢＭＰ−４が、任意選択で１５〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される、方法。
【請求項６６】
請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、（ｂ）前記細胞のクラスタの血管芽細胞への前記分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの増殖因子の存在下で、前記細胞のクラスタを培養する工程を更に含む方法によって、多能性細胞から分化する、方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法であって、工程（ｂ）において添加される前記少なくとも１つの増殖因子が、１つ以上の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ  ３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、及び／又はｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含む、方法。
【請求項６８】
請求項６６に記載の方法であって、工程（ｂ）において添加される前記少なくとも１つの増殖因子が、約２０〜２５ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、約２０〜１００ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、約１５〜１００ｎｇ／ｍｌの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ  ３Ｌ（ＦＬ）、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、及び／又は１．５〜５Ｕ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１
つ以上を含む、方法。
【請求項６９】
請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｂ）において任意選択で添加される前記少なくとも１つの増殖因子の１つ以上が、工程（ａ）の前記開始から３６〜６０時間以内又は４０〜４８時間以内に前記培養に添加される、方法。
【請求項７０】
請求項６９に記載の方法であって、工程（ｂ）において添加される前記少なくとも１つの増殖因子の１つ以上が、工程（ａ）の前記開始から４８〜７２時間以内に前記培養に添加される、方法。
【請求項７１】
請求項６６に記載の方法であって、工程（ｂ）において添加される前記少なくとも１つの因子が、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４、ＳＣＦ及び／又はＦＬの１つ以上を含む、方法。
【請求項７２】
請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の方法であって、（ｃ）前記細胞のクラスタを、任意選択で単一細胞に解離する工程を更に含む、方法。
【請求項７３】
請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の方法であって、（ｄ）前記血管芽細胞を少なくとも１つの追加の増殖因子を含む培地中で培養する工程を更に含み、前記少なくとも１つの追加の増殖因子が、前記血管芽細胞を活発に増殖させるのに十分な量で存在する、方法。
【請求項７４】
請求項７３に記載の方法であって、工程（ｄ）における前記少なくとも１つの追加の増殖因子が、インスリン、トランスフェリン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、及び／又はｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含む、方法。
【請求項７５】
請求項７３に記載の方法であって、工程（ｄ）における前記少なくとも１つの追加の増殖因子が、約１０〜１００μｇ／ｍｌのインスリン、約２００〜２，０００μｇ／ｍｌのトランスフェリン、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、約１０〜２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３（ＩＬ−３）、約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６（ＩＬ−６）、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、３〜５０Ｕ／ｍｌのエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、約２０〜２００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約２０〜２００ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、約１５〜１５０ｎｇ／ｍｌの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、及び／又は約１．５〜１５Ｕ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含む、方法。
【請求項７６】
請求項６１〜７５のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）における前記培地が、無血清培地である、方法。
【請求項７７】
請求項４６〜７６のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、９，５００万個、１億個、１億２，５００万個、又は１億５，０００万個の間葉系間質細胞が生成される、方法。
【請求項７８】
請求項４６〜７７のいずれか一項に記載の方法であって、前記血管芽細胞が、前記多能性細胞の分化を誘導し始めて少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８日後に採取される、方法。
【請求項７９】
請求項４６〜７８のいずれか一項に記載の方法であって、前記間葉系間質細胞が、前記多能性細胞の分化を誘導し始めて少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０日で生成される、方法。
【請求項８０】
請求項４６〜７９のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法が、培養の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５日以内に、約２００，０００個の血管芽細胞から生成される少なくとも８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、９，５００万個、１億個、１億２，５００万個、又は１億５，０００万個の間葉系間質細胞が生成されることをもたらす、方法。
【請求項８１】
請求項４６〜８０のいずれか一項に記載の方法であって、前記間葉系間質細胞が、血管芽細胞としての培養の約２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５日以内に、少なくとも１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４１５、１：４２５、１：４４０、１：４５０、１：３６５、１：４７５、１：４９０及び１：５００の間葉系間質細胞に対する血管芽細胞の比で、血管芽細胞から生成される、方法。
【請求項８２】
請求項８１に記載の方法であって、前記細胞がヒト細胞である、方法。
【請求項８３】
請求項４６〜８２のいずれか一項に記載の方法によって得られる血管芽細胞から誘導される、間葉系間質細胞。
【請求項８４】
血管芽細胞の生体外分化によって誘導される間葉系間質細胞。
【請求項８５】
請求項８３又は８４に記載の間葉系間質細胞であって、（ｉ）前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり、並びに（ｉｉ）前記間葉系間質細胞の１０％以下又は５％以下が、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４又はＴＬＲ３が陽性である、間葉系間質細胞。
【請求項８６】
請求項８３又は８４に記載の間葉系間質細胞であって、前記間葉系打間質細胞の少なくとも５０％が、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の全て；若しくは（ｉｉ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり、間葉系間質細胞。
【請求項８７】
請求項８３又は８４に記載の間葉系間質細胞であって、前記間葉系間質細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％が、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも１つ；若しくは（ｉｉ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４及びＨＬＡ−ＡＢＣの少なくとも１つが陽性である、間葉系間質細胞。
【請求項８８】
請求項８７に記載の間葉系間質細胞であって、前記間葉系間質細胞の１０％以下又は５％以下が、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔ
ｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、又はＴＬＲ３が陽性である、方法。
【請求項８９】
請求項８３〜８８のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞の調製物。
【請求項９０】
請求項８９に記載の調製物であって、前記調製物が、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、０．０１％未満、０．００９％未満、０．００８％未満、０．００７％未満、０．００６％未満、０．００５％未満、０．００４％未満、０．００３％未満、０．００２％未満、０．００１％未満、０．０００９％未満、０．０００８％未満、０．０００７％未満、０．０００６％未満、０．０００５％未満、０．０００４％未満、０．０００３％未満、０．０００２％未満、又は０．０００１％未満の多能性細胞を含む、調製物。
【請求項９１】
請求項８９に記載の調製物であって、多能性細胞を含まない、調製物。
【請求項９２】
請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の調製物であって、前記調製物が、実質的に精製され、任意選択で少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のヒト間葉系間質細胞を含む、調製物。
【請求項９３】
請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の調製物であって、前記調製物が、実質的に類似したレベルのｐ５３及びｐ２１タンパク質を含むか、又はｐ２１タンパク質と比較してｐ５３タンパク質の前記レベルが、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍大きい、調製物。
【請求項９４】
請求項８３〜９３のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞又は調製物であって、前記間葉系間質細胞が、培養中で少なくとも５回の集団倍加を受けることが可能である、間葉系間質細胞又は調製物。
【請求項９５】
請求項８３〜９３のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞又は調製物であって、前記間葉系間質細胞が、培養中で少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０回又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能である、間葉系間質細胞又は調製物。
【請求項９６】
請求項８３〜９５のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞又は調製物であって、前記間葉系間質細胞が、（ａ）凝集しないか、又は多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも少ない量で凝集し；（ｂ）多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞と比較して、分裂する場合、より容易に分散し；（ｃ）等しい数の多能性細胞で出発する場合、多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも多い数であり；及び／又は（ｄ）多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも早期に特徴的な間葉系細胞表面マーカーを獲得する、間葉系間質細胞又は調製物。
【請求項９７】
請求項８３〜９６のいずれか一項に記載の前記間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物を含む医薬調製物。
【請求項９８】
請求項９７に記載の医薬調製物であって、不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含む、医薬調製物。
【請求項９９】
請求項９７に記載の医薬調製物であって、不必要な免疫応答を治療するために有効な間
葉系間質細胞の量を含み、これを必要とする受容者への移植のための他の細胞又は組織を更に含む、医薬調製物。
【請求項１００】
請求項９９に記載の医薬調製物であって、前記他の細胞又は組織が、同種異系又は同系の膵臓、神経、肝臓、ＲＰＥ、角膜細胞又は前述のいずれかを含有する組織である、医薬調製物。
【請求項１０１】
請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、自己免疫障害又は同種異系細胞に対する免疫反応を治療することでの使用のためのものである、医薬調製物。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載の医薬調製物であって、多発性硬化症、全身性硬化症、血液癌、心筋梗塞、器官移植拒絶、慢性同種移植片腎炎、肝硬変、肝不全、心不全、ＧｖＨＤ、脛骨骨折、左室機能不全、白血病、骨髄異形成症候群、クローン病、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、骨形成不全、ホモ接合性家族性低コレステロール血症、半月板切除後の処置、成人性歯周炎、重篤な心筋虚血症を有する患者における脈管形成、脊髄損傷、骨異形性症、重度の虚血下肢、糖尿病性足部疾患、原発性シェーグレン症候群、骨関節炎、軟骨欠損、蹄葉炎、多系統委縮症、筋萎縮性側索硬化症、心臓手術、全身性エリテマトーデス、生体腎同種移植、非悪性赤血球障害、熱傷、放射線熱傷、パーキンソン病、微少骨折、水疱性表皮剥離症、重度の冠動脈虚血、突発性拡張心筋症、大腿骨骨頭壊死、ループス腎炎、骨空隙欠損、虚血性脳卒中、卒中後、急性放射線症候群、肺疾患、関節炎、骨再生、ブドウ膜炎又はこれらの組み合わせを治療することでの使用のためのものである、医薬調製物。
【請求項１０３】
請求項１〜３、２２〜４５又は８３〜１０２のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物を含む、キット。
【請求項１０４】
請求項１〜３、２２〜４５又は８３〜１０２のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物を含むキットであって、前記細胞又は細胞の調製物が、凍結又は低温保存される、キット。
【請求項１０５】
請求項１〜３、２２〜４５又は８３〜１０２のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物を含むキットであって、前記細胞又は細胞の調製物が、細胞送達用ビヒクル内に封入される、キット。
【請求項１０６】
疾患又は障害を治療するための方法であって、請求項１〜３、２２〜４５又は８３〜１０２のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物の有効量を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０７】
請求項１０６に記載の方法であって、他の細胞又は組織の前記移植を更に含む、方法。
【請求項１０８】
請求項１０７に記載の方法であって、前記細胞又は組織が、網膜、ＲＰＥ、角膜、神経、免疫、骨髄、肝臓又は膵臓の細胞を含む、方法。
【請求項１０９】
請求項１０６〜１０８のいずれか一項に記載の方法であって、前記疾患又は障害が、
多発性硬化症、全身性硬化症、血液癌、心筋梗塞、器官移植拒絶、慢性同種移植片腎炎、肝硬変、肝不全、心不全、ＧｖＨＤ、脛骨骨折、左室機能不全、白血病、骨髄異形成症候群、クローン病、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、骨形成不全、ホモ接合性家族性低コレステロール血症、半月板切除後の処置、成人性歯周炎、重篤な心筋虚血症を有する患者における脈管形成、脊髄損傷、骨異形性症、重度の虚血下肢、糖尿病性足部疾患、原発性シェーグレン症候群、骨関節炎、軟骨欠損、蹄葉炎、多系統委縮症、筋萎縮性側索硬化症、心臓手術、全身性エリテマトーデス、生体腎同種移植、非悪性赤血球障害、熱傷、パーキンソ
ン病、微少骨折、水疱性表皮剥離症、重度の冠動脈虚血、突発性拡張心筋症、大腿骨骨頭壊死、ループス腎炎、骨空隙欠損、虚血性脳卒中、卒中後、急性放射線症候群、肺疾患、関節炎、骨再生、又はこれらの組み合わせから選択される、方法。
【請求項１１０】
請求項１０６又は１０７に記載の方法であって、前記疾患又は障害がブドウ膜炎である、方法。
【請求項１１１】
請求項１０６又は１０７に記載の方法であって、前記疾患又は障害が、自己免疫障害又は同種異系細胞に対する免疫反応である、方法。
【請求項１１２】
請求項１１１に記載の方法であって、前記自己免疫性障害が、多発性硬化症である、方法。
【請求項１１３】
骨損失又は軟骨損傷を治療する方法であって、請求項１〜３、２２〜４５又は８３〜９７のいずれか一項に記載の間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物の有効量を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１４】
請求項１０６〜１１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記間葉系間質細胞が、同種移植又は同系移植細胞又は組織と組み合わせて投与される、方法。
【請求項１１５】
請求項１１４に記載の方法であって、前記同種移植細胞が、網膜色素上皮細胞、網膜細胞、角膜細胞、又は筋細胞を含む、方法
【請求項１１６】
有糸分裂不活性化間葉系間質細胞を含む、医薬調製物。
【請求項１１７】
請求項１１６に記載の医薬調製物であって、前記間葉系間質細胞が、血管芽細胞から分化する、医薬調製物。
【請求項１１８】
請求項１１６に記載の医薬調製物であって、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞及び薬学的に許容し得る担体を含む、医薬調製物。
【請求項１１９】
請求項７３に記載の方法であって、ｅ）前記間葉系間質細胞を有糸分裂的に不活性化する工程を更に含む、方法。
【請求項１２０】
請求項１１９に記載の方法によって生成された有糸分裂不活性化間葉系間質細胞を含む、医薬調製物。
【請求項１２１】
請求項１１６〜１１８又は１２０のいずれか一項に記載の調製物であって、ヒト患者への投与に好適である、調製物。
【請求項１２２】
請求項１１６〜１１８又は１２０のいずれか一項に記載の調製物であって、非ヒト獣医哺乳動物への投与に好適である、調製物。
【請求項１２３】
請求項１１６〜１１８又は１２０のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、前記調製物が、多能性細胞を含まない、医薬調製物。
【請求項１２４】
請求項１１６〜１１８又は１２０のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、これを必要とする対象において不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含む、医薬調製物。
【請求項１２５】
請求項１１６〜１１８又は１２０のいずれか一項に記載の医薬調製物であって、炎症呼吸状態、急性損傷に起因する呼吸状態、成人性呼吸困難症候群、外傷後成人性呼吸困難症候群、移植肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、気腫、慢性閉塞性気管支炎、気管支炎、アレルギー反応、細菌性肺炎に起因する損傷、ウイルス性肺炎に起因する損傷、喘息、刺激物質への曝露、喫煙、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、難聴、自己免疫性難聴、騒音性難聴、乾癬及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される疾患又は状態を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含む、医薬調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が、全体が参照として本明細書に組み込まれる、「ＭＥＴＨＯＤＳ
ＯＦ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＭＥＳＥＮＣＨＹＭＡＬ  ＳＴＲＯＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ
ＵＳＩＮＧ  ＨＥＭＡＮＧＩＯＢＬＡＳＴＳ」と題され、２０１１年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５６５，３５８号明細書（代理人整理番号第７５８２０．２１０００１号）に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、例えば、対象における不適切な免疫応答によって特徴付けられる病態の発現率を低減させるための、並びにその病態を規定している異常が正常な状態に戻されるように病態の根源に更に影響を与えるための細胞ベース療法の用途に関する。特に、本発明は、対象における病態の発現率の低下において高い効力を付与する「若々しい」細胞の表現型を保持する間葉系間質細胞（ＭＳＣ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの病態は、例えば移植拒絶反応、炎症及び自己免疫障害などの、宿主内部の不必要な又は過剰な免疫応答を通して臨床的に顕在化する。免疫抑制療法は、過剰な免疫応答によって特徴付けられる病態の根本原因を治療するのではなく、症状を治療するために開発された。これら療法は、免疫機能を下方制御する上で有効であり、然る故に、癌及び日和見感染、並びにプレドニゾン、シクロスポリン、及びタクロリムスなどの薬剤からの白内障、高血糖症、挫傷、及び腎毒性を含める重篤な有害事象への可能性をもたらす。
【０００４】
免疫系全体を抑制することがない療法が開発されているが、これらレジメンに関連する限界がなお存在する。これら免疫調節治療は、免疫系内の狭いポイントを標的にするために、異なる副作用、場合によっては重症度が軽減された副作用を有する。このような免疫調節療法の例としては、抗体、例えば抗ＣＤ３又は抗ＩＬ２Ｒの使用が挙げられる。これら免疫調節療法は、非応答性が高まる状態を誘導する上で有効であるが、これら免疫調節療法の中止は、望ましくない病態への逆転をもたらす。
【０００５】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、自己再生能、並びに間葉系細胞系列の中では、骨芽細胞、軟骨細胞、及び脂肪細胞に分化するための能力を有する多能性幹細胞である。近年、ヒトＭＳＣの複数系列分化能及び免疫調節特性に関する集中した研究は、これら細胞が、免疫学的障害並びに変性疾患を含める様々な臨床的状態を治療するために用いることが可能であることを示した。結果的に、ＭＳＣを使用する多くの臨床試験が、多種多様な症状：移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、心筋梗塞及び炎症並びに自己免疫疾患及び障害などに関して着実に増加を続けている。現在、ＭＳＣを用いる臨床プログラムは、成人のソース及び臍帯血からのこれら細胞の単離に依存している。ＭＳＣの臨床用途に必要とされる高細胞数（患者の体重１ｋｇ当たり最大で数百万個の細胞）は、ドナーソースから単離されたものから多数の細胞を産生することが可能な高信頼性の、再生可能かつ有効で活発な増殖のプロトコールを要求する。
【０００６】
しかしながら、細胞療法のための臨床的に意味のある細胞数及び組織工学的用途を達成するためには、ＭＳＣ生体外の活発な増殖が、必須となる。生体内での老化の間に、臍帯血、胎児及び成人のソース（例えば骨髄又は脂肪組織）から得たＭＳＣのその後の生体外細胞継代は、複製ストレス、染色体異常、又はその他の確率的細胞不全を引き起こす場合があり、増殖したＭＳＣの増殖能力、クローン原性能力及び分化能の進行的損失をもたらし、これが最終的にＭＳＣの臨床的安全性及び有効性を損なう可能性がある。治療におけ
る老化したＭＳＣの使用は、細胞がそれらの分化能の一部を喪失し、並びにそれらの分泌プロファイルもまた変更されているために、軽視されるべきではない。培養中のＭＳＣの老化が、テロメア短縮を伴う細胞増殖停止を誘導することが認められ、骨形成系統への分化の傾向性が増大するのに反して、脂肪細胞分化能における連続的減少が、継代が増加するにつれて骨髄（ＢＭ）ＭＳＣで報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＭＳＣの臨床的用途以前に、未だいくつかの解決すべき本質的な問題がある。ＥＳＣから誘導されたＭＳＣは、十分な量かつ高度に制御可能な方法で産生されることが可能であり、したがって、ドナー依存的ソースを伴う問題を軽減する。長期にわたるＭＳＣのグラフト化は不必要であり、主要組織適合性（ＭＨＣ）のミスマッチの基本的な懸念はない［７、８］。当該技術分野において、ＥＳＣから誘導されたＭＳＣは、ネズミＯＰ９細胞との共培養又はハンドピッキング手法を含める様々な方法を通して得られている［９〜１３］。しかしながら、これら方法は煩雑であり、低収率、精度のばらつき、効力の欠如を伴ってＭＳＣを産生する。更に、ＣＢ由来の、ＢＭ由来の又は脂肪由来のＭＳＣに対して、良好な治療指数、すなわち低減した投与量（細胞数）で使用されるための能力で細胞産物を提供可能であること、及び／又はＣＢ由来の、ＢＭ由来の又は脂肪由来のＭＳＣが十分に有効ではない炎症性疾患及び自己免疫疾患に扱いやすい療法を提供するためのＭＳＣについての能力の双方に関して、注入された細胞の効力を最大化することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）及びＭＳＣを産生するための方法に関する。本発明の方法は、高効力を付与する若々しい細胞の表現型によって特徴付けられる相当数の高品質間葉系間質細胞を産生する。本発明の一実施形態において、ＭＳＣは、血管芽細胞から誘導される。主題のＭＳＣの調製は、不必要な免疫応答、例えば自己免疫疾患及び障害、並びに炎症性疾患及び障害を含める病態の治療において有用である。
【０００９】
一態様において、本発明は、血管芽細胞を培養するための改善された方法を使用して、血管芽細胞から産生されたＭＳＣの改善された調製物を含む。例示的な実施形態において、本発明の間葉系間質細胞は、高レベルの効力を保持し、凝集しないか、又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも実質的に少量で凝集する。本発明のいずれか１つ以上のプロセスにより産生された間葉系間質細胞は、より高いレベルの効力を保持することが可能であり、凝集しないか、又はＥＳＣから誘導された間葉系間質細胞よりも実質的に少量で凝集することが可能である。
【００１０】
一態様において、本発明は、間葉系間質細胞を含む医薬調製物を提供し、前記間葉系間質細胞は、少なくとも１０回の集団倍加、例えば約２２〜２７日以内に少なくとも１０回の集団倍加を受けることが可能である。別の態様において、本発明は、間葉系間質細胞を含む医薬調製物を提供し、前記間葉系間質細胞は、少なくとも１５回の集団倍加、例えば約２２〜２７日以内に少なくとも１５回の集団倍加を受けることが可能である。本発明の医薬調製物は、血管芽細胞の生体外の分化によって産生され得る。本発明の間葉系間質細胞は、霊長類細胞、例えばヒト細胞であり得る。本発明の間葉系間質細胞は、少なくとも１５回の集団倍加を受けることが可能である。例えば、本発明の間葉系間質細胞は、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０回又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能であり得る。本発明の調製物は、約１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未
満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、０．０１％未満、０．００９％未満、０．００８％未満、０．００７％未満、０．００６％未満、０．００５％未満、０．００４％未満、０．００３％未満、０．００２％未満、０．００１％未満、０．０００９％未満、０．０００８％未満、０．０００７％未満、０．０００６％未満、０．０００５％未満、０．０００４％未満、０．０００３％未満、０．０００２％未満、又は０．０００１％未満の多能性細胞を含んでもよい。好ましくは、本発明の調製物は、多能性細胞を含まない。本発明の調製物は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の間葉系間質細胞を含んでもよい。
【００１１】
一態様において、前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも１つ、（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの少なくとも１つ、若しくは（ｉｉｉ）これらの任意の組み合わせが陽性である。別の態様において、前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも２つ、（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性である。更に別の実施形態において、前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり、並びに（ｉｉ）ＣＤ３１、３４、４５、１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、ＴＬＲ３の少なくとも１つを発現しないか又は低レベルで発現する。更に、前記間葉系間質細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、及びＣＤ９０の１つ以上、又は（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの１つ以上が陽性であってもよい。
【００１２】
一態様において、本発明の医薬調製物は、これを必要とする対象における不必要な免疫応答を治療又は予防するために有効な間葉系間質細胞の量を含む。本発明の医薬調製物は、これを必要とする受容者への移植のためのその他の細胞、組織又は器官を更に含んでもよい。例示的なその他の細胞又は組織としては、前記細胞のいずれかを含有しているＲＰＥ細胞、皮膚細胞、角膜細胞、膵細胞、肝細胞、又は心細胞又は組織が挙げられる。
【００１３】
別の態様において、本発明の間葉系間質細胞は、骨髄から誘導されず、免疫調節アッセイにおけるこの調製物の効力は、骨髄由来の間葉系間質細胞の調製物の効力を超える。効力は、ＥＣ５０用量を決定する免疫調節アッセイによって検定され得る。
【００１４】
一態様において、本発明の調製物は、１０回の集団倍加後にその増殖能の約５０％〜１００％を保持する。
【００１５】
別の態様において、本発明の医薬調製物の間葉系間質細胞は、多能性細胞から直接誘導されることはなく、前記間葉系間質細胞は、（ａ）凝集しないか、又はＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも実質的に少量で凝集し、（ｂ）ＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞と比較して、分裂する場合、より容易に分散し、（ｃ）等しい数
のＥＳＣから出発する場合、ＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも数が多く、及び／又は（ｄ）ＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも早期に特徴的な間葉系間質細胞表面マーカーを獲得する。
【００１６】
本発明は、間葉系間質細胞を生じる条件下で血管芽細胞を培養する工程を含む間葉系間質細胞を産生するための方法を更に包含する。血管芽細胞は、フィーダーフリー条件下で培養され得る。更に、血管芽細胞は、例えば形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１、ウシ線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、及び／又は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含むマトリックス上に配置されてもよい。このマトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から得た可溶性調製物）、ヒト基底膜抽出物、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。このマトリックスは、エンゲルブレス−ホルム−スウォームマウス肉腫細胞から得た可溶性調製物を含んでもよい。
【００１７】
一態様において、本発明の間葉系間質細胞は、哺乳動物細胞である。好ましくは、本発明の間葉系間質細胞は、ヒト、イヌ、又はウマの細胞である。
【００１８】
一態様において、この血管芽細胞は、αＭＥＭを含む培地中で培養され得る。別の態様において、この血管芽細胞は、血清又は血清代替品を含む培地中で培養されてもよい。例えば、血管芽細胞は、０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％のウシ胎児血清を補充したαＭＥＭを含む培地中で培養され得る。更なる例示的な実施形態において、この培地は、より高いパーセンテージのウシ胎児血清、例えば、２０％以上の、例えば少なくとも２５％の、少なくとも３０％の、少なくとも３５％の、少なくとも４０％の、更により高いパーセンテージのウシ胎児血清を含んでもよい。この血管芽細胞は、前記マトリックス上で少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０日間にわたって培養され得る。
【００１９】
一態様において、この血管芽細胞又は血管コロニー形成細胞は、多能性細胞、例えばｉＰＳ細胞、又は割球から分化する。この多能性細胞は、ヒトの胚を破壊することなく、１つ以上の割球から誘導され得る。更に、血管芽細胞は、（ａ）前記多能性細胞を培養し、細胞のクラスタを形成する工程を含む方法によって多能性細胞から分化することができる。一態様において、この多能性細胞は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び／又は骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）の存在下で培養される。ＶＥＧＦ及びＢＭＰ−４は、前記細胞培養の開始から０〜４８時間以内に多能性細胞培養に添加されることが可能であり、前記ＶＥＧＦは、２０〜１００ｎｍ／ｍＬの濃度で任意選択で添加され、前記ＢＭＰ−４は、１５〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で任意選択で添加される。
【００２０】
一態様において、血管芽細胞は、（ｂ）前記単一細胞を、血管芽細胞への前記細胞のクラスタの分化を誘導するために十分な量の少なくとも１つの増殖因子の存在下で培養する工程を更に含む方法によって、多能性細胞から分化する。工程（ｂ）で添加される少なくとも１つの増殖因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ  ３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ＥＰＯ、及び／又はｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含むことができる。工程（ｂ）で添加される前記少なくとも１つの増殖因子の１つ以上は、工程（ａ）の開始から３６〜６０時間以内で前記培養に添加され得る。好
ましくは、工程（ｂ）で添加される前記少なくとも１つの増殖因子の１つ以上は、工程（ａ）の開始から４０〜４８時間以内で前記培養に添加され得る。工程（ｂ）で添加される少なくとも１つの因子は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４、ＳＣＦ、ＦＬ及び／又はｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含んでもよい。工程（ｂ）で添加される場合、前記増殖因子の濃度は、およそ以下の範囲に及ぶことができる：ｂＦＧＦは約２０〜２５ｎｇ／ｍｌであり、ＶＥＧＦは約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ−４は約１５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦは約２０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＰＯは約２０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４は約１．５〜５Ｕ／ｍｌである。
【００２１】
別の態様において、本発明の方法は、（ｃ）前記細胞のクラスタを、任意選択で単一細胞に解離させる工程を更に含む。別の態様において、本発明の方法は、（ｄ）少なくとも１つの追加の増殖因子（前記少なくとも１つの追加の増殖因子は、血管芽細胞又は血管コロニー形成細胞を活発に増殖させるのに十分な量である）含む培地中の前記血管芽細胞を培養する工程を更に含む。（ｄ）の少なくとも１つの追加の増殖因子は、インスリン、トランスフェリン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激増殖因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、及び／又はｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含むことができる。工程（ｄ）における例示的な濃度は、約１０〜１００μｇ／ｍｌのインスリン、約２００〜２，０００μｇ／ｍｌのトランスフェリン、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、約１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、約３〜５０Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、約２０〜２００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約２０〜２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、約１５〜１５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４、及び／又は約１．５〜１５Ｕ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４を含む。工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）は、無血清培地であり得る。
【００２２】
一態様において、本発明の方法は、少なくとも８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、９，５００万個、１億個、１億２，５００万個、又は１億５，０００万個の間葉系間質細胞を産生する。血管芽細胞は、前記多能性細胞の分化を誘導し始めてから少なくとも１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日又は１８日後に採取することが可能である。本発明の間葉系間質細胞は、前記多能性細胞の分化を誘導し始めてから少なくとも２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、又は５０日以内で産生することが可能である。別の態様において、本発明の方法は、培養の約１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、又は３５日以内で約２００，０００個の血管芽細胞から産生される少なくとも８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、９，５００万個、１億個、１億２，５００万個、又は１億５，０００万個の間葉系間質細胞をもたらす。本発明の間葉系間質細胞は、少なくとも１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４１５、１：４２５、１：４４０、１：４５０、１：３６５、１：４７５、１：４９０及び１：５００の間葉系間質細胞に対する血管芽細胞の比で血管芽細胞及び／又は血管コロニー形成細胞から産生することが可能である。この細胞はヒト細胞であり得る。
【００２３】
本発明はまた、記載されている方法によって得られた血管芽細胞から誘導される間葉間質細胞を意図する。一態様において、本発明は、血管芽細胞の生体外分化によって誘導された間葉系間質細胞を含む。前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０
、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり、及び（ｉｉ）ＣＤ３１、３４、４５、１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、ＴＬＲ３の少なくとも１つを発現しないか又は低レベルで発現する。あるいは、前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の全てが陽性であり得るか、又は（ｉｉ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり得る。これら間葉系間質細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも１つについて陽性であり得るか、又は（ｉｉ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの少なくとも１つが陽性であり得る。好ましくは、本発明の間葉系間質細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、ＴＬＲ３の少なくとも１つを発現しないか又は低レベルで発現する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されている間葉系間質細胞の調製物を包含する。この調製物は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、０．０１％未満、０．００９％未満、０．００８％未満、０．００７％未満、０．００６％未満、０．００５％未満、０．００４％未満、０．００３％未満、０．００２％未満、０．００１％未満、０．０００９％未満、０．０００８％未満、０．０００７％未満、０．０００６％未満、０．０００５％未満、０．０００４％未満、０．０００３％未満、０．０００２％未満、又は０．０００１％未満の多能性細胞を含んでもよい。好ましくは、本発明の調製物は、多能性細胞を含まない。本発明の調製物は、実質的に精製されることが可能であり、任意選択で少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のヒト間葉系間質細胞を含む。本発明の調製物は、ｐ５３とｐ２１タンパク質の実質的に同一レベルを含むことが可能であり、又はｐ５３タンパク質のレベルをｐ２１タンパク質と比較する場合、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍大きい。本発明の間葉系間質細胞は、培養中で少なくとも５回の集団倍加を受けることが可能であり得る。好ましくは、本発明の間葉系間質細胞は、少なくとも１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、５５回、６０回又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能である。
【００２５】
一態様において、本発明の間葉系間質細胞は、（ａ）凝集しないか、又はＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも実質的に少量で凝集し、（ｂ）ＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞と比較して、分裂する場合、より容易に分散し、（ｃ）ＥＳＣの等しい数から出発する場合、ＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも数が多く、及び／又は（ｄ）ＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも早期に特徴的な間葉系間質細胞表面マーカーを獲得する。本発明は、このような間葉系間質細胞を含む医薬調製物を意図し、これは不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含む。この調製物は、不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含むことが可能であり、これを必要としている受容者への移植のためのその他の細胞又は組織を更に含むことが可能である。例示的なその他の細胞としては、前述されたもののいずれかを含有している同種又は同系の膵臓、神経、肝臓、ＲＰＥ、又は角膜の細胞又は組織が挙げられる。本発明の医薬調製物は、多発性硬化症、全身性硬化症、血液癌、
心筋梗塞、器官移植拒絶、慢性同種移植片腎炎、肝硬変、肝不全、心不全、ＧｖＨＤ、脛骨骨折、左室機能不全、白血病、骨髄異形成症候群、クローン病、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、骨形成不全、ホモ接合性家族性低コレステロール血症、半月板切除後の処置、成人性歯周炎、重篤な心筋虚血症を有する患者における脈管形成、脊髄損傷、骨異形性症、重度の虚血下肢、糖尿病性足部疾患、原発性シェーグレン症候群、骨関節炎、軟骨欠損、蹄葉炎、多系統委縮症、筋萎縮性側索硬化症、心臓手術、全身性エリテマトーデス、生体腎同種移植、非悪性赤血球障害、熱傷、放射線熱傷、パーキンソン病、微少骨折、水疱性表皮剥離症、重度の冠動脈虚血、突発性拡張心筋症、大腿骨骨頭壊死、ループス腎炎、骨空隙欠損、虚血性脳卒中、卒中後、急性放射線症候群、肺疾患、関節炎、骨再生、ブドウ膜炎又はこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない自己免疫疾患又は同種異系細胞に対する免疫反応を治療する上で有用であり得る。対象のＭＳＣ（これらの製剤又は調製物を含める）は、呼吸状態、特に、成人性呼吸困難症候群、外傷後成人性呼吸困難症候群、移植肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、気腫、慢性閉塞性気管支炎、気管支炎、アレルギー反応、細菌性又はウイルス性肺炎に起因する損傷、喘息、刺激物質への曝露、及び喫煙などの炎症成分又は急性損傷を含むものを治療するために使用することが可能である。更に、対象のＭＳＣ（これらの製剤又は調製物を含める）は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、聴覚障害（特に、自己免疫性聴覚障害又は騒音性聴力障害）、乾癬を治療するために使用することが可能である。
【００２６】
本発明は、本明細書に記載されている間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞調製物を含むキットを包含する。このキットは、凍結された又は低温保存された間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物を含むことができる。このキット中に含まれる間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物は、細胞送達ビヒクル内に封入され得る。
【００２７】
更に、本発明は、これを必要とする対象に、本明細書に記載されている間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物の有効量を投与する工程を含む、疾患又は障害を治療するための方法を意図する。この方法は、その他の細胞又は組織、例えば、網膜、ＲＰＥ、角膜、神経、免疫、骨髄、肝臓又は膵臓の細胞の移植を更に含む。治療される例示的な疾患又は障害としては、多発性硬化症、全身性硬化症、血液癌、心筋梗塞、器官移植拒絶、慢性同種移植片腎炎、肝硬変、肝不全、心不全、ＧｖＨＤ、脛骨骨折、左室機能不全、白血病、骨髄異形成症候群、クローン病、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、骨形成不全、ホモ接合性家族性低コレステロール血症、半月板切除後の処置、成人性歯周炎、重篤な心筋虚血症を有する患者における脈管形成、脊髄損傷、骨異形性症、重度の虚血下肢、糖尿病性足部疾患、原発性シェーグレン症候群、骨関節炎、軟骨欠損、蹄葉炎、多系統委縮症、筋萎縮性側索硬化症、心臓手術、全身性エリテマトーデス、生体腎同種移植、非悪性赤血球障害、熱傷、放射線熱傷、パーキンソン病、微少骨折、水疱性表皮剥離症、重度の冠動脈虚血、突発性拡張心筋症、大腿骨骨頭壊死、ループス腎炎、骨空隙欠損、虚血性脳卒中、卒中後、急性放射線症候群、肺疾患、関節炎、骨再生、ブドウ膜炎又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、疾患又は障害はブドウ膜炎である。別の態様において、疾患又は障害は、自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、又は同種異系細胞に対する免疫応答である。
【００２８】
本発明は、これを必要とする対象に、本明細書に記載されている間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物の有効量を投与する工程を含む、骨損失又は軟骨損傷を治療するための方法を更に包含する。本発明の間葉系間質細胞は、同種異系又は同系移植された細胞又は組織、例えば、網膜色素上皮細胞、網膜細胞、又は筋細胞と組み合わせて投与されてもよい。
【００２９】
本発明は、細胞分裂回数の数が増加しているにもかかわらず、効力を維持するＭＳＣの調節物を産生する血管芽細胞を培養する方法を含む。本発明の間葉系間質細胞の医薬調製
物は、このような投与を必要とする哺乳動物宿主に投与する場合、改善された治療特性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、多能性細胞からのＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの産生を示す。この図は、血管芽細胞を介してＥＳＣから間葉系間質細胞を産生する顕微鏡図を示す。
【図２】図２は、多能性細胞由来の血管芽細胞から得たＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの表現型を示す。この図は、初期血管芽細胞集団中のＭＳＣ表面マーカーが陽性の細胞のパーセンテージ（グラフの左側、７〜１１日の血管芽細胞）、及びマトリゲルでコーティングしたプレート上で血管芽細胞を培養した後にＭＳＣ表面マーカーが陽性の細胞のパーセンテージ（グラフの右側）、並びに血管芽細胞から誘導された間葉系間質細胞の顕微鏡図（右側パネル写真）を示す。
【図３】図３は、異なる培養法から誘導された間葉系間質細胞の表現型を示す。この図は、ゼラチンコーティングプレート上でヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）を培養した後（左パネル）、マトリゲルコーティングプレート上でＥＳＣを培養した後（中央パネル）、及びマトリゲルコーティングプレート上で血管芽細胞を培養した後（右パネル）のＭＳＣ表面マーカーが陽性の細胞のパーセンテージを示す。
【図４】図４は、多能性細胞からの間葉系間質細胞の収量を示す。この図は、ゼラチンコーティングプレート上でＥＳＣを培養したものから得た（第１番目の欄−産出無し）、マトリゲルコーティングプレート上でＥＳＣを培養したものから得た（第２番目の欄）、及びマトリゲルコーティングプレート上で血管芽細胞を培養したものから得た（第３番目の欄）、ＭＳＣ表面マーカーが陽性の細胞の収量を示す。
【図５】図５は、間葉系間質細胞マーカーの獲得を示す。この図は、ＭＳＣ表面マーカーが、血管芽細胞を使用して得られる時間（最上部の線）及びＥＳＣを使用して（下部の線）得られる時間を表す。
【図６】図６は、異なる培養法から誘導された間葉系間質細胞の表現型を示す。この図は、ＥＳＣをマトリゲルコーティングプレート上で培養した後（左パネル）に、及び血管芽細胞をマトリゲルコーティングプレート上で培養した後（右パネル）にＭＳＣマーカーが陽性であり、並びに造血及び内皮細胞マーカーが陰性である細胞のパーセンテージを示す。
【図７】図７は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの分化能を示す。この図は、ＭＡ０９  ＥＳＣから分化した血管芽細胞から誘導された間葉系間質細胞の脂肪細胞及び骨細胞を形成するための分化能を表す。
【図８】図８は、ＭＳＣの軟骨分化を示す。この図は、アグリカン（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン１）及びコラーゲンＩＩａのｍＲＮＡ発現による、ＭＡ０９  ＥＳＣ血管芽細胞由来間葉系間質細胞の軟骨分化を表す。
【図９】図９は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣによるＣＤ３０９の一過性発現を示す。この図は、細胞表面マーカーＣＤ３０９の一過性発現を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ミトーゲンに応答するＴ細胞増殖が、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣによって抑制されることを示す。この図は、化学刺激（ＰＭＡ／イオノマイシン）によって引き起こされたＴ細胞増殖の血管芽細胞由来の間葉系間質細胞の抑制を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、抗原提示細胞に応答するＴ細胞増殖が、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣによって抑制されることを示す。この図は、樹状細胞への暴露によって引き起こされたＴ細胞増殖の血管芽細胞由来の間葉系間質細胞の抑制を示す。
【図１１】図１１は、抗原提示細胞に応答するＴ細胞増殖が、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣによって抑制されることを示す。図１１Ａは、血管芽細胞由来の間葉系間質細胞が、ＩＬ２刺激に応答して誘導されるＣＤ４／ＣＤ２５に二重陽性のＴｒｅｇのパーセンテージを増加させることが可能であったことを示す。図１１Ｂは、血管芽細胞由来間葉系間質細胞が、ＩＦＮγのＴｈ１分泌を阻害することを示す。
【図１２】図１２は、炎症誘発性サイトカインＩＦＮｇがＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ表面マーカー発現における変化を刺激することを示す。この図は、インターフェロンガンマが、ＭＳＣ表面マーカー発現における変化を刺激し、ＭＳＣ免疫抑制効果を増強させ得ることを示す。
【図１３】図１３は、ＢＭ−ＭＳＣと比較する場合のＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの増大した効力及びより大きな阻害効果を示す。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣが及ぼすよりも大きなＴ細胞への阻害効果を及ぼす（Ａ）。ＰＢＭＣとの共培養中でＭＳＣの増加する量は、ＰＭＡ及びイオノマイシンに応答するＴ細胞増殖において用量依存的減少を引き起こす。若い（ｐ４）ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣは試験されたすべての細胞タイプのうち最も能力が高い（Ｂ）。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣは、ＰＨＡに応答してＢＭ−ＭＳＣが阻害するよりも大きな程度までＴ細胞増殖を阻害する。ＰＢＭＣ：ＭＳＣの５：１比を６日間共培養した（Ｃ）。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣは、増加する樹状細胞の量に応答して、Ｔ細胞増殖を、ＢＭ−ＭＳＣが阻害するよりも良好に阻害する。（Ａ〜Ｃ）において、Ｔ細胞増殖のパーセントは、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞集団中に組み込まれたＢｒｄＵによって評価された。
【図１４】図１４は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣがＴｒｅｇ誘発を増強させることを示す：初期継代培養のＭＳＣは、後期継代培養のＭＳＣが有するよりも大きな効果を有する。非接着ＰＢＭＣ（異なるドナー）を、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの存在下又は不在下、＋／−ＩＬ２で４日間培養した。ＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性Ｔｒｅｇのパーセンテージを、フローサイトメトリーによって評価した。若い（ｐ６）又は古い（ｐ１６〜１８）ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣを用いた。黒棒は、６つの実験の平均を示す。ＭＳＣは、全体として、Ｔｒｅｇの誘発に及ぼす統計的に有意な効果を有した。（ｐ＝０．０２）。
【図１５】図１５は、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣによる増大されたＴｒｅｇ増殖を示す。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣが誘発するよりも良好にＴｒｅｇ増殖を誘発する（Ａ）。ＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性Ｔｒｅｇにおける増加率を示す。−ＩＬ２条件を１に設定し、他の群は、このレベルを越える誘導率として表す。ＭＭはＭＡ０９−ＭＳＣであり、ＢＭは骨髄ＭＳＣであり、「ｐ」は継代数である（Ｂ）。ＦＭ  ＭＡ０９−ＭＳＣ（ＭＭ）は、ＢＭ−ＭＳＣが誘導するよりも良好にＣＤ４／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３三重陽性Ｔｒｅｇを誘発する（Ｃ）。ＣＤ４＋である応答するＰＢＭＣのパーセントは、異なる処置群の間で一致する（Ｄ）。ＣＤ２５＋である応答するＰＢＭＣのパーセントは、異なる処置群の間で異なる。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣが誘導するよりもＣＤ２５の大きな発現を誘導する。この差は、Ｔｒｅｇの誘導における差を説明することが可能である。
【図１６】図１６は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが、ＢＭ−ＭＳＣよりも大きな増殖能を有することを示す。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣが有するよりも大きな増殖能を有する。累積集団倍加回数を培養の日数に対してプロットする。ＥＳＣ由来血管芽細胞又は骨髄由来単核細胞の最初の平板培養後に、接着細胞をｐ０  ＭＳＣとみなした。連続ＭＳＣ継代培養を、７０００細胞／ｃｍ２の密度で再平板培養し、培養が約７０％の集密状態になった時に採取した（３〜５日毎）。
【図１７】図１７は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ産生のプロセス；マトリゲル効果を示す。初期継代培養において（すなわち、ｐ２で）細胞をマトリゲルから取り出すことは、マトリゲル上でｐ６まで維持したものと比べて、ＭＳＣ増殖を一時的に遅くする可能性がある。
【図１８】図１８は、ＢＭ−ＭＳＣ及びＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが軟骨形成を行うことを示す。サフラニンＯ染色（軟骨基質沈着の指標）を、２１日後にパラフィン埋包ペレット集団培養で行った。画像は４０倍の倍率である。
【図１９】図１９は、基底状態において、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが、ＢＭ−ＭＳＣが分泌するよりも少量のＰＧＥ２を分泌し、なおＩＦＮγ又はＴＮＦα刺激時の増加率がより大きいことを示す（Ａ）。プロスタグランジンＥ２分泌の量（ｐｇ／ｍｌ）は、基底条件又は様々な刺激条件下のＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣに対比するＢＭ−ＭＳＣについて示されている。ＰＧＥ２の量は細胞数に標準化されている（Ｂ）。基底ＰＧＥ２値が１に設定され（黒線）、様々な刺激下のＰＧＥ２分泌は、基底レベルを越える増加率として表されている。
【図２０】図２０は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが経時的に表現型を維持することを示す。異なるＭＳＣ集団のフローサイトメトリー分析を示す（Ａ）。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの細胞表面マーカー発現は、３つの異なる基材上で維持され、ＢＭ−ＭＳＣと比較される（Ｂ）。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの細胞表面マーカー発現は、経時的に評価される（示すように、連続継代培養を使用する）。
【図２１】図２１は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、より少量のＳｔｒｏ−１及びより多量のＣＤ１０を発現することを示す。異なるＭＳＣ集団のフローサイトメトリー分析を示す。Ｓｔｒｏ−１発現は、示した継代数において、ＢＭ−ＭＳＣ中よりもＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ中で低い。ＣＤ１０発現は、ＢＭ−ＭＳＣ中よりもＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ中で高い。その他のマーカーは、両ＭＳＣ集団で同様である。
【図２２】図２２は、初期継代培養ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの１０個の異なるロット中のＳｔｒｏ−１及びＣＤ１０発現は、低いＳｔｒｏ−１発現及び中間の範囲のＣＤ１０発現を一貫して示すことを表示する。異なるＭＳＣ集団のフローサイトメトリー分析を示す。ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの１０個の異なるロットを、Ｓｔｒｏ−１及びＣＤ１０の発現に関して、示した継代数で評価した。Ｓｔｒｏ−１の発現は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの異なるロットにおいて一貫して低い（平均で５〜１０％）。ＣＤ１０の発現は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの異なるロットにおいて一貫して中間の範囲である（平均で約４０％）。
【図２３】図２３は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが、それらが培養中で老化するとともにそれらのサイズを維持し、一方ＢＭ−ＭＳＣは老化と共にそのサイズを増加させることを示す。フローサイトメトリー上の前方散乱／側方散乱ドットプロット（左側に示す）を使用して、ＭＳＣのサイズを取得した。上右四分の一の「大きな」細胞における細胞のパーセンテージを監視し、棒グラフで表わす。
【図２４】図２４は、ＣＤ１０及びＣＤ２４が、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ中でアップレギュレートされることを示す。遺伝子発現分析を、基底状態におけるＢＭ−ＭＳＣ及びＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣについて示す。Ｔａｑｍａｎプローブを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、示した遺伝子の発現を評価し、２つのハウスキーピング遺伝子に標準化する。４通りの読み取りの平均を＋／−標準偏差で示している。
【図２５】図２５は、Ａｉｒｅ−１及びＩＬ−１１が、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ中でアップレギュレートされることを示す。遺伝子発現分析を、基底状態におけるＢＭ−ＭＳＣ及びＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣについて示す。Ｔａｑｍａｎプローブを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、示した遺伝子の発現を評価し、２つのハウスキーピング遺伝子に標準化する。４通りの読み取りの平均を＋／−標準偏差で示している。
【図２６】図２６は、Ａｎｇ−１及びＣＸＣＬ１が、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ中でアップレギュレートされることを示す。遺伝子発現分析を、基底状態におけるＢＭ−ＭＳＣ及びＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣについて示す。Ｔａｑｍａｎプローブを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、示した遺伝子の発現を評価し、２つのハウスキーピング遺伝子に標準化する。４通りの読み取りの平均を＋／−標準偏差で示している。
【図２７】図２７は、ＩＬ６及びＶＥＧＦが、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ中でダウンレギュレートされることを示す。遺伝子発現分析を、基底状態におけるＢＭ−ＭＳＣ及びＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣについて示す。Ｔａｑｍａｎプローブを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、示した遺伝子の発現を評価し、２つのハウスキーピング遺伝子に標準化する。４通りの読み取りの平均を＋／−標準偏差で示している。
【図２８】図２８は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣが、３日間のＩＦＮγ刺激に応答して、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性の増加を示すことを表示する。トリプトファンをキヌレニンに変換させるそれらの能力（ＩＤＯ活性の指標）について、５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮｇで３日間刺激されたＭＳＣの比較を示す。各ＭＳＣ集団について、１００万個の細胞を溶解し、アッセイで用いた。
【図２９】図２９は、Ａｉｒｅ−１及びプリオンタンパク質（ＰｒＰ）のＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ中の発現における老化関連変化を示す：２つのタンパク質は、それぞれ免疫抑制及び増殖に関与した。異なる継代数（ｐ）におけるＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの全細胞溶解物中のＡｉｒｅ−１及びＰｒＰの発現のウェスタンブロット分析を示す。アクチン発現を負荷コントロールとして示す。Ａｉｒｅ−１とＰｒＰの発現との間の差を、アクチン負荷コントロールを参照して表記している。
【図３０】図３０は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが、基底状態においてＢＭ−ＭＳＣが分泌するよりも少ないＩＬ６を分泌することを示す。標準化のための陽性コントロール（左の４つの点）及びＭＳＣ培養上清中のＩＬ６（囲み線内）を示しているサイトカインアレイを表示する。２つの異なるドナーから得たＢＭ−ＭＳＣを、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの４つの異なるロットと比較する。
【図３１】図３１は、基底状態及びＩＦＮγ刺激状態において、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣよりも少ないＩＬ６を分泌することを示す。標準化のための陽性コントロール（左の４つの点）及びＭＳＣ培養上清中のＩＬ６（囲み線内）を示しているサイトカインアレイを表示する。４８時間の＋／−ＩＦＮγ処置後の７継代のＢＭ−ＭＳＣを、ｐ７のＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣと比較する。
【図３２】図３２は、基底状態及びＩＦＮγ刺激状態において、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣよりも少ないＶＥＧＦを分泌することを示す。標準化のための陽性コントロール（左の４つの点）及びＭＳＣ培養上清中のＶＥＧＦ（囲み線内）を示しているサイトカインアレイを表示する。４８時間の＋／−ＩＦＮγ処置後の７継代のＢＭ−ＭＳＣを、ｐ７のＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣと比較する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、間葉系間質細胞を産生する方法、血管芽細胞を培養することから得た間葉系間質細胞の調製物、血管芽細胞を培養する方法、及び間葉系間質細胞を用いて病態を治療する方法に関する。
【００３２】
先行プロセスと比較して、血管芽細胞が増大した収量の間葉系間質細胞を産生する、本発明の方法は、実質的に無ＥＳＣの間葉系間質細胞を産生する点で、以前のプロセスよりも効率的である。本発明の血管芽細胞由来の間葉系間質細胞は、特異的マーカーの発現又はその欠如によって定義される新規な若々しい表現型を保持する。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明のＭＳＣ調製物（少なくとも１０３、１０４、１０５又は更に１０６個のＭＳＣを有する培養物など）は、平均として、ＥＳＣ及び／又はヒトｉＰＳ細胞の（又はＥＳＣ及び／又はヒトｉＰＳ細胞の集団の平均の）少なくとも３０％であるテロメアの長さ、好ましくはＥＳＣ及び／又はヒトｉＰＳ細胞の（又はＥＳＣ及び／又はヒトｉＰＳ細胞の集団の平均の）少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は更に９０％であるテロメアの長さを有することが可能である。例えば前記ＥＳＣ及び／又はヒトｉＰＳ細胞（又はＥＳＣ及び／又はヒトｉＰＳ細胞の集団）は、そこから前記ＭＳＣ細胞が分化した細胞又は細胞集団であり得る。
【００３４】
本発明のＭＳＣ調製物は、集団として、４ｋｂを超える、好ましくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は更に１３ｋｂを超える平均末端制限酵素断片長（ＴＲＦ）を有することが可能である。例示的な実施形態において、本発明のＭＳＣは、１０ｋｂ以上である平均ＴＲＦを有することが可能である。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明のＭＳＣ調製物（少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７又は更に１０８個のＭＳＣを有する培養物など）は、その他の供給源（
例えば、胎児、乳幼児、小児、青年又は成人の組織などの移植用ヒト組織から誘導された培養物）から得たＭＳＣ調製物の複製寿命を超える複製寿命を有する。複製寿命は、複製老化前の培養中の集団倍加数又は継代数を決定することにより評価することが可能であり、すなわち、培養中の細胞の１０、２０、３０、４０又は更に５０％以上が、次の倍加又は継代の前に老化する。例えば、主題のＭＳＣ調製物は、提供されたヒト組織から誘導された（特に成人骨髄又は成人脂肪組織から誘導された）ＭＳＣ調製物のものを超える少なくとも１０回の倍加である複製寿命を有することが可能であり、好ましくは少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は更に１００回の集団倍加を有することが可能である。特定の実施形態において、本発明のＭＳＣ調製物は、細胞の５０％以上が老化する前に、及び／又は非ＭＳＣ細胞型（例えば線維芽細胞）に分化する前に少なくとも８継代を可能にする、より好ましくは、このポイントに到達する前に少なくとも１０、１２、１４、１６、１８又は更に２０継代を可能にする複製寿命を有することが可能である。特定の実施形態において、本発明のＭＳＣ調製物は、細胞の５０％以上が老化する前に、及び／又は非ＭＳＣ細胞型（例えば線維芽細胞）に分化する前に、成人の骨髄由来のＭＳＣ調製物及び／又は脂肪細胞由来のＭＳＣ調製物（例えば、細胞の等しい出発数）と比較して少なくとも２倍多い倍加又は継代を可能にし、より好ましくは少なくとも４、６、８倍又は更に１０倍多い倍加又は継代を可能にする複製寿命を有することが可能である。
【００３６】
特定の実施形態において、本発明のＭＳＣ調製物（少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７又は更に１０８個のＭＳＣを有する培養物など）は、他の供給源（例えば、胎児、乳幼児、小児、青年又は成人の組織などの移植用ヒト組織から誘導された培養物）から誘導された継代数１（Ｐ１）、継代数２（Ｐ２）、継代数３（Ｐ３）、継代数４（Ｐ４）及び／又は継代数５（Ｐ５）のＭＳＣ調製物、特に骨髄由来ＭＳＣ及び脂肪細胞由来ＭＳＣと比較して、細胞周期の調節及び老化に関与するタンパク質の統計的に有意な増加した含量及び／又は酵素活性を有する。例えば、主題のＭＳＣ調製物は、移植用ヒト組織から得たＭＳＣ（特に成人骨髄又は成人脂肪組織から誘導されたＭＳＣ）中の含量の７５％未満であり、なおより好ましくは、６０、５０、４０、３０、２０又は更に１０％未満であるプロテアーゼ２６Ｓサブユニット、非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１１（ＰＳＭＤ１１）タンパク質の含量を有する。
【００３７】
特定の実施形態において、本発明のＭＳＣ調製物（少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７又は更に１０８個のＭＳＣを有する培養物など）は、他の供給源（例えば、胎児、乳幼児、小児、青年又は成人の組織などの移植用ヒト組織から誘導された培養物）から誘導された継代数１（Ｐ１）、継代数２（Ｐ２）、継代数３（Ｐ３）、継代数４（Ｐ４）及び／又は継代数５（Ｐ５）のＭＳＣ調製物、特に骨髄由来ＭＳＣ及び脂肪細胞由来ＭＳＣと比較して、細胞のエネルギー及び／又は脂質代謝に関与するタンパク質の統計的に有意な増加した含量及び／又は酵素活性を有する。例示すると、主題のＭＳＣ調製物は、解糖（フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ、ＡＬＤＯＡ；アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＡ１、ＡＫＲ１Ａ１）；グリセルアルデヒド三リン酸、ＧＡＰＤＨなど）、トリカルボン酸サイクル（ＴＣＡサイクル）（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１、ＩＤＨ１など）、ペントースリン酸回路（グルコース六リン酸デヒドロゲナーゼ、Ｇ６ＰＤなど）、及びグルクロン酸生合成経路におけるＵＤＰ−グルコースの生合成（ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ、ＵＧＤＨ）などのＡＴＰ又はＮＡＤＨＰ合成に関する代謝経路に関与する１つ以上のタンパク質について、移植用ヒト組織から得たＭＳＣ（特に成人骨髄又は成人脂肪組織から誘導されたＭＳＣ）中の含量の９０％未満であり、なおより好ましくは、６０、５０、４０、３０、２０又は更に１０％未満であるタンパク質の含量を有する。更に例示すると、主題のＭＳＣ調製物は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、短鎖、１（ＥＣＨＳ１）及び／又はアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ２）などの脂質代謝に関与する１つ以上のタンパク質について、移植用ヒ
ト組織から得たＭＳＣ（特に成人骨髄又は成人脂肪組織から誘導されたＭＳＣ）中の含量の９０％未満であり、なおより好ましくは、６０、５０、４０、３０、２０又は更に１０％未満であるタンパク質の含量を有する。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明のＭＳＣ調製物（少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７又は更に１０８個のＭＳＣを有する培養物など）は、他の供給源（例えば、胎児、乳幼児、小児、青年又は成人の組織などの移植用ヒト組織から誘導された培養物）から誘導された継代数１（Ｐ１）、継代数２（Ｐ２）、継代数３（Ｐ３）、継代数４（Ｐ４）及び／又は継代数５（Ｐ５）のＭＳＣ調製物、特に骨髄由来ＭＳＣ及び脂肪細胞由来ＭＳＣと比較して、細胞のアポトーシスに関与するタンパク質の統計的に有意な増加した含量及び／又は酵素活性を有する。例示すると、主題のＭＳＣ調製物は、１つ以上のタンパク質アネキシンＡ１（ＡＮＸＡ１）、Ａ２（ＡＮＸＡ２）、Ａ５（ＡＮＸＡ５）、電位依存性アニオン選択性チャンネルタンパク質１（ＶＤＡＣ１）、及び／又はグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）について、移植用ヒト組織から得たＭＳＣ（特に成人骨髄又は成人脂肪組織から誘導されたＭＳＣ）中の含量の９０％未満であり、なおより好ましくは、６０、５０、４０、３０、２０又は更に１０％未満であるタンパク質の含量を有する。
【００３９】
理論に束縛されるものではないが、本発明の血管芽細胞由来のＭＳＣによって示される細胞のエネルギー及び／又は脂質代謝、及び／又はアポトーシスに関与するタンパク質の含量及び／又は酵素活性における統計的に有意な差は、調製物の均一な性質に少なくとも一部は起因している。例えば、本発明の血管芽細胞由来のＭＳＣは、均一なＭＨＣ遺伝子発現を有し、すなわち、完全にＭＨＣマッチであり、細胞が複数の異なるドナーから誘導されている、すなわちＭＨＣミスマッチである成人由来のＭＳＣバンクとは異なる。ＭＳＣの治療用量は、約２００万〜８００万個の細胞／ｋｇ（又は約１億３，０００万〜５億個の細胞／用量）である。
【００４０】
用語の定義
本明細書で使用するとき、「多能性細胞」及び「多能性幹細胞」とは、適切な条件下で、それらの非分化状態を維持し、安定した（好ましくは正常な）核型を呈し、並びに全ての３つの胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉）に分化する能力を有すると同時に、生体外で長期の又は実質的に無期限の増殖が可能である細胞を広義に指す。典型的には、多能性細胞は、（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植される場合、奇形腫を誘発することが可能であり、（ｂ）全ての３つの胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉）に分化することが可能であり、並びに（ｃ）少なくとも１つのｈＥＳ細胞マーカー（Ｏｃｔ−４、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＳＥＡ  ３表面抗原、ＳＳＥＡ  ４表面抗原、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ  １  ６０、ＴＲＡ  １  ８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１など）を発現する。例示的な多能性細胞は、Ｏｃｔ−４、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＳＥＡ  ３表面抗原、ＳＳＥＡ  ４表面抗原、ＴＲＡ  １  ６０、及び／又はＴＲＡ  １  ８１を発現することが可能である。更なる例示的な多能性細胞としては、胚性幹細胞、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞、胚由来細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞から産生された多能性細胞（例えば、ＦＧＦ−２、ＬＩＦ及びＳＣＦの存在下で培養することによって）、単為生殖ＥＳ細胞、培養された内部細胞塊細胞から産生されたＥＳ細胞、割球から産生されたＥＳ細胞、及び核移植によって産生されたＥＳ細胞（例えば、受容者の卵母細胞に移植された体細胞核）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な多能性細胞は、胚の破壊なく産生され得る。例えば、誘導多能性細胞は、胚破壊なく得られた細胞から産生され得る。更なる例として、多能性細胞は、生検割球から産生することが可能であり（これは、残りの胚を傷つけることなく達成され得る）、任意選択で、残りの胚を低温保存し、培養し、及び／又は好適な宿主に移植することも可能である。多能性細胞（どんなソースから得たものでも）は、このような多能性細胞（例えばＭＳＣ、及び血管芽細胞）から分化した細胞において、
寿命、効力、ホーミングを増加させるために、又は所望の因子を供給するために、遺伝子レベルで修正を加え、又は他の方法で修正を加えることが可能である。これらの非限定的な例として、多能性細胞は、Ｓｉｒｔ  １を発現するように（これによって寿命を増加させる）、任意選択で誘導可能な又は抑制プロモータの制御下で、１つ以上のテロメラーゼを発現するように、蛍光標識を組み込むように、酸化鉄粒子又はその他のこのような試薬（これは、生体内撮像、ＭＲＩなどを介して細胞の追跡に使用される、Ｔｈｕら著、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１２年２月２６日；１８（３）：４６３−７を参照）を組み込むように、寿命を促進することが可能であるｂＦＧＦを発現するように（Ｇｏら著、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２、７４１−７４８（２００７年）を参照）、ホーミングのためにＣＸＣＲ４を発現するように（Ｓｈｉら著、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００７年７月；９２（７）：８９７−９０４を参照）、神経膠細胞腫のような癌細胞中でカスパーゼ媒介ｘアポトーシスを誘発するために組換えＴＲＡＩＬを発現するように（Ｓａｓｐｏｒｔａｓら著、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９年３月２４日；１０６（１２）：４８２２−７を参照）など、遺伝的に修飾することが可能である。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「胚」又は「胚性」とは、母性宿主の子宮内膜に移植されていない細胞集団を発達させるものを広義に指す。「胎性細胞」とは、胚から単離された、又は胚内に包含される細胞である。これはまた、二細胞分裂期の早い時期に得られた割球、及び凝集した割球も含む。
【００４２】
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞又はＥＳＣ）は、胚性細胞から産生された多能性細胞（培養された内部細胞塊細胞又は培養された割球から得た細胞など）並びに誘導多能性細胞（以下に更に記載）を包含する。多くの場合、このような細胞は、細胞系として連続継代培養されるもの又は連続継代培養されたものである。胚性幹細胞は、本明細書に記載されている血管芽細胞を産生するプロセスにおいて多能性幹細胞として使用することが可能である。例えば、ＥＳ細胞は、精子又は精子ＤＮＡによる卵細胞の受精、核移植（体細胞核移植を含める）、又は単為生殖などの任意の方法（有性又は無性手段を含める）によって産生された胚からの誘導などの当該技術分野で既知の方法によって産生することが可能である。更なる例としては、胚性幹細胞はまた、非胚性細胞がそのプロセスで使用される場合であっても、体細胞核移植によって産生された細胞も含む。例えば、ＥＳ細胞は、胚盤胞期胚のＩＣＭ、並びに１つ以上の割球から誘導された胚性幹細胞から誘導されてもよい。このような胚性幹細胞は、生殖によって、又は体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、無為生殖、及び雄性生殖を含める無性手段によって産生された胚性物質から生成することが可能である。更に上述したように（「多能性細胞」を参照）、ＥＳ細胞は、このような多能性細胞（例えば、ＭＳＣ、及び血管芽細胞）から分化する細胞において、寿命、効力、ホーミングを増加させ、又は所望の因子を供給するために、遺伝子レベルで修正が加えられてもよい。
【００４３】
ＥＳ細胞は、例えば、遺伝子操作、ヘテロ接合性の自然消失についてのスクリーニングなどを通して、１つ以上のＨＬＡ遺伝子におけるホモ接合又は半接合を用いて生成することが可能である。ＥＳ細胞は、このような多能性細胞（例えば、ＭＳＣ、及び血管芽細胞）から分化する細胞において、寿命、効力、ホーミングを増加させ、又は所望の因子を供給するために、遺伝子レベルで修正が加えられてもよい。胚性幹細胞は、それらのソース又はそれらを産生するために使用される特定の方法に無関係に、典型的には以下の属性の１つ以上を有する：（ｉ）全ての３つの胚葉の細胞に分化するための能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ−４及びアルカリ性ホスファターゼを発現、並びに（ｉｉｉ）免疫不全状態の動物に移植される場合、奇形腫をもたらすための能力。本発明の実施形態において使用され得る胚性幹細胞としては、ＭＡ０１、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４及びＡＣＴ３０胚性幹細胞などのヒトＥＳ細胞（「ＥＳＣ」又は「ｈＥＳ細胞」）が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的な細胞系としては、ＮＥＤ１、ＮＥＤ２、ＮＥＤ３、ＮＥＤ４、ＮＥＤ５、及びＮＥＤ７が挙げられる。ＮＩＨ胚
性幹細胞登録も参照されたい。使用され得る例示的なヒト胚性幹細胞系は、ＭＡ０９細胞である。ＭＡ０９細胞の単離及び調製は、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら著（２００６年）、「Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：４８１−４８５に以前に記載されている。本発明の例示的実施形態により使用されるヒトＥＳ細胞は、ＧＭＰ標準に従って誘導され維持され得る。
【００４４】
例示的ｈＥＳ細胞マーカーとしては、アルカリ性ホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、段階特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、段階特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚性細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、表面抗原３０（ＣＤ３０）、クリプト（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）などが挙げられるが、これらに限定されない。追加の例としては、Ｏｃｔ−４、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＳＥＡ３表面抗原、ＳＳＥＡ４表面抗原、ＴＲＡ  １  ６０、及び／又はＴＲＡ  １  ８１を発現し得る胚性幹細胞が挙げられる。
【００４５】
このＥＳＣは、最初はネズミ胚性フィーダー細胞（ＭＥＦ）と共培養され得る。このＭＥＦ細胞は、ＥＳＣを共培養中に播種する前に、ミトマイシンＣへの暴露によって有糸分裂的に不活性化することが可能であり、これによってＭＥＦは、培養中で増殖することができない。更に、ＥＳＣ細胞培養は、顕微鏡検査を行うことが可能であり、非ＥＳＣ細胞形態を含有するコロニーは、例えば、レーザーアブレーション、又はその他の手段によって、幹細胞切断工具を使用して、採取されかつ廃棄することが可能である。典型的には、胚様体形成の播種のためのＥＳＣの採取の時点で、追加のＭＥＦ細胞は使用されない。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「胚由来細胞」（ＥＤＣ）とは、広くは、内部細胞塊、胚盾、又は胚体杯盤上層などのものを含める多能性桑実胚由来細胞、胚盤胞由来細胞、若しくは原始的外胚葉、中胚葉、及び内胚葉並びにそれらの誘導体を含める初期胚のその他の多能性幹細胞を指す。「ＥＤＣ」はまた、割球及び凝集した単一の割球から得た細胞塊並びに発生の異なる段階から得た胚も含めるが、細胞系として継代したヒト胚性幹細胞は除外する。
【００４７】
例示的なＥＳＣ細胞マーカーとしては、アルカリ性ホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、段階特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、段階特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚性細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、表面抗原３０（ＣＤ３０）、クリプト（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書で使用するとき「効力」とは、広くは、濃度、例えば、定義された効果をもたらす試薬（血管芽細胞由来のＭＳＣなど）のモルを指す。効力は、有効濃度（ＥＣ５０）に関して定義されることが可能であり、有効濃度は、最大効果の測定値を含まないが、この代わりに用量反応曲線の濃度軸に沿った様々な場所における効果を含む。効力はまた、段階的（ＥＣ５０）又は計数的用量反応曲線（ＥＤ５０、ＴＤ５０及びＬＤ５０）のいずれかから決定することも可能であるが、効力は、ＥＣ５０によって測定されることが好ま
しい。用語「ＥＣ５０」とは、いくつかの指定した暴露時間後のベースラインの効果と最大効果との間の中間部分の応答を誘発する薬剤、抗体又は毒物の濃度を指す。したがって、段階的用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される場合の化合物の濃度を表す。計数的用量反応曲線のＥＣ５０は、指定した暴露持続時間後に、集団の５０％が応答を示す場合の化合物の濃度を表す。このＥＣ５０は、定義された動物モデルが、薬剤の適用に応答して、測定可能な生理学的変化を示す動物試験；薬剤の添加時に、測定可能な生物学的応答を示す、特定の細胞系を使用する細胞ベースアッセイ；及び／又は薬剤の生物学的活性が、薬剤によって促進された化学反応後に、生成物の蓄積によって測定され得る酵素反応を使用して決定することが可能である。好ましくは、免疫調節アッセイがＥＣ５０を決定するために使用される。このような免疫調節アッセイの非限定的な例としては、細胞内サイトカイン、細胞障害性、調節能力、細胞シグナル伝達能力、増殖能力、アポトーシス評価、及びその他のアッセイが挙げられる。
【００４９】
本明細書で使用するとき、「間葉系幹細胞」（ＭＳＣ）とは、自己再生能力並びに特にその他の間葉系細胞系統の中で骨芽細胞、軟骨細胞、及び脂肪細胞に分化する能力を備えた多能性幹細胞を指す。これら特性に加えて、ＭＳＣは、本明細書に更に記載されている１つ以上のマーカーの発現によって特定され得る。このような細胞は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、心筋梗塞及び炎症並びに自己免疫疾患及び障害などの免疫学的障害並びに変性疾患を含める様々な臨床状態を治療するために使用することが可能である。文脈が別途指示する場合を除き、ＭＳＣは、成人のソース及び臍帯血から得た細胞を含むことが可能である。ＭＳＣ（又は多能性細胞などのこれらが生成される細胞）は、寿命、効力、ホーミングを増加させるために、又はＭＳＣ又はこのようなＭＳＣから分化した細胞中に所望の因子を供給するために、遺伝的に修正を加えるか又はその他の方法で修正を加えることが可能である。これらの非限定的な例として、このＭＳＣ細胞は、Ｓｉｒｔ  １を発現するように（これによって寿命を増加させる）、任意選択で誘導可能な又は抑制プロモータの制御下で、１つ以上のテロメラーゼを発現するように、蛍光標識を組み込むように、酸化鉄粒子又はその他のこのような試薬（これは、生体内撮像、ＭＲＩなどを介して細胞の追跡に使用される、Ｔｈｕら著、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１２年２月２６日；１８（３）：４６３−７を参照）を組み込むように、寿命を促進することが可能であるｂＦＧＦを発現するように（Ｇｏら著、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２、７４１−７４８（２００７年）を参照）、ホーミングのためにＣＸＣＲ４を発現するように（Ｓｈｉら著、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００７年７月；９２（７）：８９７−９０４を参照）、神経膠細胞腫のような癌細胞中でカスパーゼ媒介ｘアポトーシスを誘発するために組換えＴＲＡＩＬを発現するように（Ｓａｓｐｏｒｔａｓら著、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９年３月２４日；１０６（１２）：４８２２−７を参照）など、遺伝的に修飾することが可能である。
【００５０】
本明細書で使用するとき「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」、「治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」。「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療法（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、広くは、疾患を治療し、疾患又はその臨床的症状の発生を停止し又は低減し、及び／又は疾患を軽減し、疾患又はその臨床的症状の消退を生じることを指す。療法は、疾患、疾患の徴候、及び／又は疾患の症状の予防、阻止、治療、治癒、改善、低減、緩和、及び／又は軽減の提供を包含する。療法は、進行中の疾患の徴候及び／又は症状（例えば、筋衰弱、多発性硬化症）を有する患者における徴候及び／又は症状の緩和を包含する。療法はまた、「予防」及び「阻止」も包含する。予防は、患者の疾患の治療後に疾患の発生を阻止すること、又は患者の疾患の発症又は重症度を低減することを含む。療法の目的のための用語「低減した」とは、広くは、徴候及び／又は症状における臨床的に有意な減少を指す。療法は、徴候及び／又は症状（例えば、網膜変性、失明）の再燃又は再発を治療することを含める。療法は、限定されないが、徴候及び／又は症状の発現を防止すること、並びに既発の徴候及び／又は症状を低減すること、更に既発の徴
候及び／又は症状を排除することを包含する。療法は、慢性疾患（「維持」）及び急性疾患を治療することを含める。例えば、治療は、徴候及び／又は症状（例えば、筋衰弱、多発性硬化症）の再燃又は再発を治療する又は阻止することを含める。
【００５１】
規制の遵守を維持するために、ＭＳＣバンクは、例えば、少なくとも数百人から１０，０００人の患者を治療するために十分な数の細胞を提供するように、細胞の十分な供給を維持せねばならず、ＭＳＣバンクは、少なくとも５００億個のＭＳＣを有さねばならない。本発明は、ＧＭＰコンプレイン品及び／又は低温保存されたＭＳＣバンクを包含する。一実施形態において、本発明のＭＳＣ調製物は、少なくとも１０１０個の血管芽細胞由来のＭＳＣを含む。別の態様において、本発明のＭＳＣ調製物は、少なくとも１０１１、１０１２、１０１３、又は１０１４個の血管芽細胞由来のＭＳＣを含むＭＳＣ調製物を提供する。
【００５２】
本明細書で使用するとき「病態を正常化する」とは、疾患から生じた異常構造及び／又は機能をより正常な状態に回復させることを指す。正常化とは、疾患から生じた組織、器官、細胞型などの構造及び／又は機能における異常を修正することによって、病態の進行が制御されかつ改善され得ることを示唆する。例えば、本発明のＥＳＣ−ＭＳＣによる治療後に、自己免疫疾患、例えばＭＳの結果としての免疫系の異常が、改善され、修正され、及び／又は回復されることが可能である。
【００５３】
誘導多能性幹細胞
更なる例示的な多能性幹細胞としては、因子（「再プログラミング因子」）の組み合わせを発現することによって、又は因子の組み合わせの発現を誘導することによって、体細胞を再プログラミングすることで生成される誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、胎児、出生後、新生児、未成年者、又は成人の体細胞を使用して生成され得る。ｉＰＳ細胞は、細胞バンクから得ることも可能である。あるいは、ｉＰＳ細胞は、ＲＰＥ細胞又は別の細胞型に分化し始める前に、新たに生成されてもよい（当該技術分野で既知のプロセスによって）。ｉＰＳ細胞の製造は、分化した細胞の産生における最初の工程であり得る。ｉＰＳ細胞は、組織適合ＲＰＥ細胞を生成することを目的として、特定の患者又は適合したドナーから得た材料を用いて特異的に生成することが可能である。ｉＰＳ細胞は、意図されている受容者において実質的に免疫原性ではない細胞から生成され得、例えば、自己由来細胞又は意図されている受容者に対して組織適合性の細胞から産生され得る。更に上述したように（「多能性細胞」を参照）、ｉＰＳ細胞を含める多能性細胞は、このような多能性細胞（例えば、ＭＳＣ及び血管芽細胞）から分化する細胞中で、寿命、効力、ホーミングを増加させるために、又は所望の因子を供給するために、遺伝的に修正を加えるか、又は他の方法で修正を加えてもよい。
【００５４】
他の例として、誘導多能性幹細胞は、細胞を１つ以上の再プログラミング因子に接触させることによって、体細胞又はその他の細胞を再プログラミングすることで生成されてもよい。例えば、再プログラミング因子は、例えば、細胞に加えられた外因性核酸から、又はその遺伝子の発現を促進又は誘導する小分子、マイクロＲＮＡ等、などの因子に応答して内因性遺伝子から、細胞によって発現されてもよい（Ｓｕｈ及びＢｌｅｌｌｏｃｈ著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８、１６５３−１６６１（２０１１年）；Ｍｉｙｏｓｈら著、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２０１１年）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１１．０５．００１；Ｓａｎｃｈｏ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら著、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１年）、１−３；Ａｎｏｋｙｅ−Ｄａｎｓｏら著、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ８、３７６−３８８、２０１１年４月８日；Ｏｒｋｉｎ及びＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ著、Ｃｅｌｌ  １４５、８３５−８５０、２０１１年６月１０日を参照（これらのそれぞれは、その全体が参考として本明細書に援用される）。再プログラミング因子は、例えば、培養基に加えられることで
、外因性ソースから提供されることが可能であり、細胞に侵入するペプチド、タンパク質、又は核酸トランスフェクション剤へのカップリング、リポフェクション、電子穿孔、バイオリスティック粒子送達系（遺伝子ガン）、マイクロインジェクションなどを通して等、当該技術分野で既知の方法によって、細胞中に導入され得る。ｉＰＳ細胞は、胎児、出生後、新生児、未成年者、又は成人の体細胞を使用して生成され得る。特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用され得る因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と呼ばれることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４の組み合わせが挙げられる。他の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用され得る因子としては、例えば、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の組み合わせが挙げられる。他の実施形態において、体細胞は、少なくとも２つの再プログラミング因子、少なくとも３つの再プログラミング因子、又は４つの再プログラミング因子を発現することによって再プログラミングされる。他の実施形態において、更なる再プログラミング因子が特定され、体細胞を多能性細胞に再プログラミングするために、単独で又は１つ以上の既知の再プログラミング因子と組み合されて使用される。ｉＰＳ細胞は、典型的には、胚性幹細胞と同一のマーカーの発現によって特定され得るが、特定のｉＰＳ細胞系は、その発現プロファイルで異なる場合がある。
【００５５】
誘導多能性幹細胞は、体細胞中で１つ以上の再プログラミング因子を発現することによって、又は再プログラミング因子の発現を誘導することによって産生することが可能である。この体細胞は、皮膚線維芽細胞、滑膜線維芽細胞、又は肺線維芽細胞などの線維芽細胞、若しくは非線維芽細胞体細胞である。この体細胞は、少なくとも１、２、３、４、５個の再プログラミング因子を発現することによって再プログラミングされる。この再プログラミング因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、Ｌｉｎ２８、ｃＭｙｃ、及びＫｌｆ４から選択され得る。再プログラミング因子の発現は、体細胞を、再プログラミング因子の発現を誘導する小有機分子作用物質などの少なくとも１つの作用物質に接触させることによって誘発され得る。
【００５６】
この体細胞はまた、再プログラミング因子が発現され（例えば、ウイルスベクター、プラスミド等を使用して）、再プログラミング因子の発現が誘発される（例えば、小有機分子を使用して）組み合わせアプローチを使用しても再プログラミングすることが可能である。例えば、この再プログラミング因子は、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用する感染によって体細胞中で発現されてもよい。更に、再プログラミング因子は、エピソームプラスミドなどの非組込みベクターを使用して、体細胞中で発現されてもよい。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９年５月８日；３２４（５９２８）：７９７−８０１を参照されたい。再プログラミング因子が、非組込みベクターを使用して発現される場合、この因子は、電気穿孔、トランスフェクション、又はこのベクターによる体細胞の形質転換を使用して、発現され得る。例えば、マウス細胞において、組込みウイルスベクターを使用しての４つの因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃｍｙｃ、及びＫｌｆ４）の発現は、体細胞を再プログラミングするのに十分である。ヒト細胞において、組込みベクターを使用しての４つの因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬｉｎ２８）の発現は、体細胞を再プログラミングするのに十分である。
【００５７】
再プログラミング因子が細胞中で一旦発現されると、この細胞は培養され得る。経時的に、ＥＳ特性を有する細胞は、培養皿中で出現する。例えばＥＳ形態に基づいて、又は選択可能又は検出可能なマーカーの発現に基づいて、この細胞を選択し、サブ培養することが可能である。この細胞を培養し、ＥＳ細胞に類似する細胞（これらは推定上のｉＰＳ細胞である）の培養物を産生することが可能である。ｉＰＳ細胞は、典型的には、他の胚性幹細胞と同一のマーカーの発現によって特定され得るが、特定のｉＰＳ細胞系は、その発
現プロファイルにおいて異なる場合がある。例示的なｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ−４、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＳＥＡ  ３表面抗原、ＳＳＥＡ  ４表面抗原、ＴＲＡ  １  ６０、及び／又はＴＲＡ  １  ８１を発現することができる。
【００５８】
ｉＰＳ細胞の多能性を確認するために、この細胞を多能性の１つ以上のアッセイで試験することが可能である。例えば、この細胞は、ＥＳ細胞マーカーについて試験されてもよく；この細胞はＳＣＩＤマウス中に移植される場合、奇形腫を産生するための能力が試験されてもよく；細胞が、全ての３つの胚葉の細胞型を産生するよう分化するための能力について評価されてもよい。一旦多能性ｉＰＳ細胞が得られると、この多能性ｉＰＳ細胞は、血管芽細胞及びＭＳＣ細胞を産生するために使用することが可能である。
【００５９】
血管芽細胞
血管芽細胞は多能性であり、造血細胞及び内皮細胞系統の双方に対する共通の前駆体として働く。胚発生時に、これらは、初期中胚葉発生時に出現し、原始的血島をコロニー形成する移行性細胞型として発生すると考えられている（Ｃｈｏｉら著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５（４）：７２５−７３２（１９９８年））。一旦そうなると、血管芽細胞は原始的及び最終的な造血細胞、ＨＳＣ、及び内皮細胞の双方をもたらすことが可能である（Ｍｉｋｋｏｌａら著、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １１（１）：９−１７（２００２年））。
【００６０】
血管芽細胞は、マウスＥＳＣ（Ｋｅｎｎｅｄｙら著、Ｎａｔｕｒｅ（３８６）：４８８−４９３（１９９７年）；Ｐｅｒｌｉｎｇｅｉｒｏら著、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２１）：２７２−２８０（２００３年））及びヒトＥＳＣ（参考文献１４、１５、Ｙｕら著、Ｂｌｏｏｄ  ２０１０  １１６：４７８６−４７９４）の双方から生体外で誘導されることが可能である。その他の研究は、臍帯血から（Ｂｏｒｄｏｎｉら著、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４５（５）１２１８−１２２８）、末梢血液から得た循環するＣＤ３４−ｌｉｎ−ＣＤ４５−ＣＤ１３３細胞から（Ｃｉｒａｃｉら著、Ｂｌｏｏｄ  １１８：２１０５−２１１５）、及びマウスの子宮から（Ｓｕｎら著、Ｂｌｏｏｄ  １１６（１６）：２９３２−２９４１（２０１０年））から血管芽細胞が単離されたことを主張している。マウス及びヒトＥＳＣ由来血管芽細胞の双方は、様々なサイトカイン及び増殖因子を含有する半固体培地中の細胞の増殖後に、液体培地中で増殖した細胞の培養及びクラスタの分化を通して得られ（Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｐｅｒｌｉｎｇｅｉｒｏ著、参考文献１４、１５）、更にその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０１７，３９３号明細書を参照されたい。この適用の目的で、用語血管芽細胞はまた、米国特許第８，０１７，３９３号明細書に記載されている血管コロニー形成細胞を包含し、これは、造血細胞及び内皮細胞系統への分化に加えて、平滑筋細胞になることも可能であり、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＫＤＲ、及びＣＤ１３３が陽性ではない。本明細書に記載されている方法において有用な血管芽細胞は、これら既知の方法のいずれかから誘導又は取得され得る。例えば、胚様体は、非付着条件下、例えば、低接着性基材上又は「懸滴」で多能性細胞を培養することによって形成することが可能である。これら培養において、ＥＳ細胞は、胚様体と呼ばれる細胞の集塊又はクラスタを形成することができる。Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒら著、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０００年２月；６（２）：８８−９５を参照されたい（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。典型的には、胚様体は、最初は多能性細胞の固体集塊又はクラスタとして形成し、経時的に、胚様体のいくつかが流体で満たされた空洞を含有するようになり、後者前者は、この文献では「単純性」ＥＢと呼ばれ、後者は「嚢胞性」胚様体と呼ばれる。これらＥＢ（固体型及び嚢胞性型双方の）中の細胞は、分化することができ、経時的に徐々に増加する細胞を産生する。任意選択で、その後ＥＢは、接着培養として培養され、突起物を形成させることも可能である。同様に、過増殖させ、多層細胞集団を形成させる多能性細も経時的に分化することが可能である。
【００６１】
一実施形態において、血管芽細胞は、（ａ）ＥＳＣ細胞系を２、３、４、５、６又は７日間培養し、細胞のクラスタを形成させる工程と、（ｂ）前記細胞のクラスタを血管芽細胞に分化するように誘導する工程とを含む工程によって生成される。他の実施形態において、工程（ｂ）における細胞のクラスタは、サイトカインに富む無血清のメチルセルロース系培地中で培養される（１４、１５）。
【００６２】
一実施形態において、血管芽細胞は、（ａ）ＭＡ０９、Ｈ７、Ｈ９、ＭＡ０１、ＨｕＥＳ３、及びＨ１ｇｆｐからなる群から選択されるＥＳＣ細胞系を、２、３、４、５、６又は７日間培養し、細胞のクラスタを形成させる工程と、（ｂ）サイトカインに富む無血清のメチルセルロース系培地中で培養することによって、血管芽細胞に分化するよう誘導する工程とを含む工程によって生成される。
【００６３】
別の実施形態において、血管芽細胞は、本明細書に記載されているいずれかの多能性細胞を誘導することによって生成される。他の実施形態において、血管芽細胞は、胚盤胞、平板培養されたＩＣＭ、１つ以上の割球、又は着床前段階の胚又は胚葉構造のその他の部分（生殖、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、雄性生殖、若しくは有性手段又は無性手段によって産生されるかどうかに無関係に）、若しくは再プログラミングを通して誘導されたＥＳＣ（例えばｉＰＳ細胞）を含む群から選択される多能性細胞の分化を誘導することによって生成される。更に他の実施形態において、血管芽細胞は、ｉＰＳ細胞から生成され、ここではこのｉＰＳ細胞は、外因的に付加された因子若しくはタンパク質又はマイクロＲＮＡなどの当該技術分野で既知のその他の方法を使用して生成される（Ｚｈｏｕら著、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（４）：１−４、２００９年；Ｍｉｙｏｓｈｉら著、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（８）：１−６、２０１１年；Ｄａｎｓｏら著、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（８）：３７６−３８８、２０１１年を参照）。
【００６４】
別の態様において、本開示は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の調製物及び血管芽細胞を使用するＭＳＣを生成する方法を提供する。このＭＳＣは、本明細書で更に説明されるように、１つ以上の態様における既存のＭＳＣとは異なる場合がある。一実施形態において、血管芽細胞は、胚盤胞、平板培養されたＩＣＭ、１つ以上の割球、又は着床前段階の胚又は胚葉構造のその他の部分（生殖、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、雄性生殖、若しくは有性手段又は無性手段によって産生されるかどうかに無関係に）、若しくは再プログラミングを通して誘導された細胞（例えばｉＰＳ細胞）を含む群から選択される多能性細胞を誘導することによって、無血清のメチルセルロース培地に、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｐ）、ＥＸ−ＣＹＴＥ（登録商標）増殖補給物（９．０〜１１．０ｇ／Ｌのコレステロール及び１３．０〜１８．０ｇ／Ｌのリポタンパク質並びに脂肪酸を含む水溶性濃縮物（ｐＨ７〜８．４））、Ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、幹細胞由来因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、及びインターロイキン６（ＩＬ６）からなる群から選択された１つ以上の材料を加えたものを使用する培養において、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日後に採取される。本発明の好ましい実施形態において、血管芽細胞は、例えば、無血清のメチルセルロースに前の実施形態の成分を加えた培地中で、６〜１４日間培養されて採取される。好ましい実施形態において、この成分は、前記培地中に以下の濃度で存在する：Ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬ）は５０ｎｇ／ｍｌで、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は５０ｎｇ／ｍｌで、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）は、５０ｎｇ／ｍｌで、及び塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は２０ｎｇ／ｍｌで存在し、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞由来因子（ＳＣＦ）、２０ｎｇ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン３（ＩＬ３）、２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン６（ＩＬ６）、５０ｎｇ／ｍｌのＦＬ、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、５０ｎｇ
／ｍｌのＴＰＯ、及び３０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦである。
【００６５】
別の実施形態において、実質的に血管芽細胞から構成される細胞のクラスタは、再再度プレーティングし、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６日間培養して、間葉系幹細胞の調製物を形成する。一実施形態において、間葉系幹細胞は、（ａ）ＥＳＣを８〜１２日間培養する工程と、（ｂ）細胞のクラスタを形成する血管芽細胞を採取する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の血管芽細胞を再度プレーティングする工程と、（ｄ）工程（ｃ）の血管芽細胞を１４〜３０日間培養する工程とを含む工程によって生成される。
【００６６】
一実施形態において、マウス胚性繊維芽細胞、ＯＰ９細胞、又は当業者に既知であるその他の細胞型などの細胞のフィーダー層が培養中に含まれる無フィーダー条件下で、血管芽細胞を採取し、再度プレーティングし、液体培地中で培養する。好ましい実施形態において、血管芽細胞は細胞外マトリックス上で培養される。更に好ましい実施形態において、血管芽細胞は細胞外マトリックス上で培養され、前記マトリックスは、室温でゲル化し、再構成基底膜（マトリゲル）を形成する、エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウスの肉腫細胞から得た可溶性調製物を含む。更に他の実施形態において、血管芽細胞は、（ａ）前記血管芽細胞を、マトリゲル上で少なくとも７日間培養する工程と、（ｂ）工程（ａ）の血管芽細胞を、非コーティング組織培養プレートに移し、工程（ｂ）の前記血管芽細胞を約７〜１４日の間、更に培養する工程と、を含む工程によって生成される。血管芽細胞は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１、ウシ線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、及び／又は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヒト基底膜抽出物（ＢＭＥ）（例えば、Ｃｕｌｔｒｅｘ  ＢＭＥ、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）又はＥＨＳマトリックス、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ）、及び硫酸ヘパランからなる群から選択される因子の１つ以上を含む基材上で培養されてもよい。前記マトリックス又はマトリックス構成成分は、哺乳動物のものであり、又はより具体的にはヒト起源であり得る。一実施形態において、血管芽細胞は、マトリゲルコーティングプレート上で血清を含む液体培地中で培養され、この培養基は、１０〜２０％のウシ胎児血清を補充したαＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（αＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ）、１０〜２０％の熱不活性化ヒトＡＢ血清を補充したαＭＥＭ、及び１０〜２０％の熱不活性化ＡＢヒト血清を補充したＩＭＤＭから選択される成分を含むことが可能である。
【００６７】
血管芽細胞を培養することにより生成される間葉系間質細胞
本発明の一実施形態は、改善された間葉系間質細胞を含む。本発明の間葉系間質細胞は、血管芽細胞を培養する改善されたプロセスを使用して、血管芽細胞から生成することが可能である。
【００６８】
本発明の間葉系間質細胞は、より高いレベルの効力を維持することが可能であり、凝集しないか、ＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも実質的に少なく凝集することが可能である。本発明の一実施形態において、本発明のプロセスのいずれか１つ以上により生成された間葉系間質細胞の調製物は、より高いレベルの効力を維持し、凝集しないか、ＥＳＣから直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも実質的に少なく凝集する。
【００６９】
本発明の一実施形態は、間葉系間質細胞の調製物を生成する血管芽細胞を培養するプロセスを提供し、前記間葉系間質細胞は、若々しい表現型を維持する。本発明の間葉系間質細胞の医薬調製物は、治療を必要とする哺乳動物宿主に投与される場合、改善された治療特性を示す。
【００７０】
本発明の一実施形態は、ヒト血管芽細胞を培養することによって生成される間葉系間質細胞の調製物を提供する。本発明の他の実施形態は、ヒト血管芽細胞を培養することによる間葉系間質細胞の調製物を生成するためのプロセスを提供する。本発明のプロセスの実施形態において、前記ヒト血管芽細胞は、フィーダーフリー条件で培養され、次いでマトリックス上で平板培養される。本発明の更に他の実施形態において、前記マトリックスは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１、ウシ線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、硫酸ヘパラン、エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウスの肉腫細胞から得た可溶性調製物、マトリゲル、及びヒト基底膜抽出物を含む群から選択される。更に他の実施形態において、前記マトリックスは、哺乳動物又はヒト起源から誘導され得る。
【００７１】
別の実施形態において、血管芽細胞は、血清又は２０％ウシ胎児血清を補充したαＭＥＭなどの血清代替え品を含む培地中で培養される。他の実施形態において、血管芽細胞は、マトリックス上で約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間培養される。本発明の更に他の実施形態において、間葉系間質細胞の調製物は、（ａ）血管芽細胞をマトリゲル上で約７日間培養する工程と、（ｂ）工程（ａ）の血管芽細胞をマトリゲルから移し、この血管芽細胞を非コーティングの組織培養皿上で更に９〜１００日間、すなわち約９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００日間増殖させる工程と、を含む工程によって生成される。
【００７２】
本発明の一実施形態において、間葉系間質細胞の調製物は、血清又は２０％ウシ胎児血清を補充したαＭＥＭなどの血清代替え品を含む培地中で培養される。本発明の他の実施形態において、前記血管芽細胞は、マトリックス上で、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間培養される。
【００７３】
本発明の一実施形態において、血管芽細胞は、ＥＳＣから分化する。本発明の他の実施形態において、前の実施形態の血管芽細胞は、ＥＳＣから分化し、前記ＥＳＣは、ｉＰＳ、ＭＡ０９、Ｈ７、Ｈ９、ＭＡ０１、ＨｕＥＳ３、Ｈ１ｇｆｐ、内部細胞塊細胞及び割球を含む群から選択される。
【００７４】
本発明の一実施形態は、血管芽細胞がＥＳＣから分化するプロセスによって生成された間葉系間質細胞の調製物を含む。本発明の他の実施形態において、前の実施形態の血管芽細胞は、ＥＳＣから分化し、前記ＥＳＣは、ｉＰＳ、ＭＡ０９、Ｈ７、Ｈ９、ＭＡ０１、ＨｕＥＳ３、Ｈ１ｇｆｐ、内部細胞塊細胞及び割球を含む群から選択される。
【００７５】
本発明の一実施形態において、血管芽細胞は、以下の工程によってＥＳＣから分化し、工程は、（ａ）ＥＳＣを、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び／又は骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）の存在下で培養し、細胞のクラスタを形成する工程と、（ｂ）前記細胞のクラスタを、前記細胞のクラスタの血管芽細胞への分化を誘導するのに十分な量で提供される、少なくとも１つの増殖因子（例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ  ３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、及び／又はｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４）の存在下で培養する工程と、（ｃ）前記血管芽細胞を、少なくとも１つの追加の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、及びｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４）を含む培地中で培養する工程（前記少なくとも１つの追加の増殖因子は、前記培養中の前記細胞のクラスタを増殖させるのに十分な量で提供される）と、を含み、任意選択で、工程（ａ）〜（ｃ）のいずれかに銅が付加される。
【００７６】
本発明の一実施形態において、間葉系間質細胞の調製物は、血管芽細胞を培養することで生成され、前記血管芽細胞は、以下の工程によりＥＳＣから分化し、工程は、（ａ）ＥＳＣを、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）の存在下で培養し、前記培養の開始から０〜４８時間以内に細胞のクラスタを形成させる工程と、（ｂ）前記細胞のクラスタを、前記細胞のクラスタの血管芽細胞への分化を誘導するのに十分な量で提供される、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ  ３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、及びｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４を含む群から選択される少なくとも１つの増殖因子の存在下で培養する工程と、（ｃ）前記血管芽細胞を、インスリン、トランスフェリン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、及びｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４を含む群から選択される１つ以上の追加の増殖因子を含む培地中で培養する工程（前記少なくとも１つの追加の増殖因子は、前記培養中でヒトの細胞のクラスタを増殖させるのに十分な量で提供される）と、を含む。
【００７７】
別の実施形態において、間葉系間質細胞の調製物は、（ａ）前記血管芽細胞に分化させるようにＥＳＣを誘導する少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日後に、血管芽細胞を採取する工程と、（ｂ）工程（ａ）から得た前記血管芽細胞を前記間葉系間質細胞に分化させる誘導の約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０日以内に生成された前記間葉系間質細胞を採取する工程と、を含む工程によって生成される。
【００７８】
更に別の実施形態において、少なくとも８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、１億個、１億２，５００万個又は１億２，５００万個の間葉系間質細胞の調製物は、約２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５日以内の約２００，０００個の血管芽細胞の培養から生成され、前記間葉系間質細胞の調製物は、約１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、０．０１％未満、０．００９％未満、０．００８％未満、０．００７％未満、０．００６％未満、０．００５％未満、０．００４％未満、０．００３％未満、０．００２％未満、０．００１％未満、０．０００９％未満、０．０００８％未満、０．０００７％未満、０．０００６％未満、０．０００５％未満、０．０００４％未満、０．０００３％未満、０．０００２％未満、又は０．０００１％未満のヒト胚性幹細胞を含む。更に別の実施形態において、少なくとも８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、１億個、１億２，５００万個又は１億５，０００万個の間葉系間質細胞が、血管芽細胞の培養の約２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５日以内の約２００，０００個の血管芽細胞から生成される。
【００７９】
本発明のプロセスの一実施形態において、間葉系間質細胞の調製物は、ヒト胚性幹細胞について実質的に精製される。本発明のプロセスの他の実施形態において、間葉系間質細胞の調製物は、前記調製物が少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の間葉系間質細胞を含むように、ヒト胚性幹細胞について実質的に精製される。
【００８０】
本発明の別の実施形態において、本発明のプロセスの任意の１つ以上により生成される間葉系間質細胞の調製物は、宿主に導入される場合、奇形腫を形成しない。
【００８１】
本発明の別の実施形態において、間葉系間質細胞の調製物の少なくとも５０％は、培養の約７〜２０（例えば１５）日以内でＣＤ１０５又はＣＤ７３が陽性である。本発明の好ましい実施形態において、本発明の任意の１つ以上のプロセスにより生成される間葉系間質細胞の調製物の少なくとも５０％は、培養の約７〜１５日後に、ＣＤ１０５又はＣＤ７３が陽性である。本発明の他の実施形態において、間葉系間質細胞の少なくとも８０％は、培養の約２０日以内でＣＤ１０５及びＣＤ７３が陽性である。本発明の更に他の実施形態において、本発明の任意の１つ以上のプロセスにより生成される間葉系間質細胞の調製物の少なくとも８０％は、培養の約２０日以内でＣＤ１０５及びＣＤ７３が陽性である。
【００８２】
例示的な態様において、本開示は、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞及び薬学的に許容し得る担体を含む、哺乳動物患者における使用に好適な医薬調製物を提供し、この間葉系間質細胞は、１０回目の倍加までに、細胞の２５％未満が細胞死を受け、非ＭＳＣに老化するか分化する状態で、少なくとも１０回の集団倍加を受けるための複製能力を有する。
【００８３】
例示的な態様において、本開示は、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞及び薬学的に許容し得る担体を含む、哺乳動物患者における使用に好適な医薬調製物を提供し、この間葉系間質細胞は、第５継代までに、細胞の２５％未満が細胞死を受け、線維芽細胞に老化又は分化する状態で、細胞培養中で少なくとも５継代を受けるための複製能力を有する。
【００８４】
例示的な態様において、本開示は、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬調製物を提供し、この間葉系間質細胞は、血管芽細胞から分化する。
【００８５】
例示的な態様において、本開示は、少なくとも１０８個の間葉系間質細胞を含む低温細胞バンクを提供し、この間葉系間質細胞は、１０回目の集団倍加までに細胞の２５％未満が細胞死、老化又は線維芽細胞への分化を受ける状態で、細胞培養中で少なくとも１０回の集団倍加複製能力を受けるための複製能力を有する。
【００８６】
例示的な態様において、本開示は、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞及び１％未満の任意のその他の細胞型を含む精製された細胞調製物を提供し、この間葉系間質細胞は、１０回目の集団倍加までに細胞の２５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞への分化を受ける状態で、細胞培養中で少なくとも１０回の集団倍加複製能力を受けるための複製能力を有する。
【００８７】
本発明の間葉系間質細胞は、胚性幹細胞系又は誘導多能性幹細胞系などの多能性幹細胞源から分化することが可能である。例えば、調製物又はバンクの間葉系間質細胞の全ては、共通の多能性幹細胞源から分化することが可能である。更に、この間葉系間質細胞は、多能性幹細胞ソースから分化し、培養中で継代し、間葉系間質細胞の数を増大させ、２０回未満の集団倍加後に培養から単離することが可能である。
【００８８】
この間葉系間質細胞は、ＨＬＡ遺伝子型的に同一であり得る。この間葉間質細胞は、ゲノム的に同一であり得る。
【００８９】
この間葉系間質細胞の少なくとも３０％は、ＣＤ１０が陽性であり得る。更にこの間葉系間質細胞の少なくとも６０％は、マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、及びＣＤ１６６並びにＨＬＡ−ＡＢＣが陽性であり得る。例示的な実施形態において、この間葉系間質細胞の少なくとも３０％が、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４及びＴＬＲ３が陽性であり得る。
【００９０】
本発明の間葉系間質細胞は、２５日未満に細胞培養中で少なくとも１０回の集団倍加を受けるための複製率を有することが可能である。この間葉系間質細胞は、８ｋｂよりも長いことが可能である平均末端制限酵素断片長さ（ＴＲＦ）を有する。この間葉系間質細胞は、５回の集団倍加を受けた骨髄から誘導された間葉系間質細胞調製物と比較して、（ｉ）細胞周期調節及び細胞老化、（ｉｉ）細胞エネルギー及び／又は脂質代謝、及び（ｉｉｉ）アポトーシスに関与するタンパク質の含量及び／又は酵素活性の統計的に有意な減少を有することが可能である。この間葉系間質細胞は、骨髄から誘導された間葉系間質細胞と比較して、細胞骨格構造及びこれに関連する細胞動態に関与するタンパク質の含量及び／又は酵素活性の統計的に有意な増加を有することが可能である。この間葉系間質細胞は、培養中の１０回の集団倍加にわたって、５，０００，０００を超えるフローサイトメトリーで測定される前方散乱光値を有する細胞において７５％以上の増加を受けることができない。この間葉系間質細胞は、休止状態で、骨髄又は脂肪組織から誘導された間葉系間質細胞によって、その休止状態で発現されるＩＬ−６  ｍＲＮＡのレベルの１０％未満であり得るレベルで、インターロイキン６をコード化するｍＲＮＡを発現することが可能である。
【００９１】
本発明の調製物は、ヒト患者への投与に好適であり得る。この調製物は、非ヒト獣医哺乳動物への投与に好適であり得る。
【００９２】
例示的な態様において、本開示は、間葉系間質細胞を含む医薬調製物を提供し、前記間葉系間質細胞は、少なくとも１０回の集団倍加を受けることが可能であり、１０回の集団倍加は約２７日以内、より好ましくは約２６日未満、好ましくは２５日未満、より好ましくは約２４日未満、更により好ましくは約２３日未満、更により好ましくは約２２日未満、若しくはそれ以下で起こる。
【００９３】
例示的な態様において、本開示は、間葉系間質細胞を含む医薬調製物を提供し、前記間葉系間質細胞は、少なくとも１５回の集団倍加を受けることが可能である。
【００９４】
前記間葉系間質細胞は、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０回又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能であり得る。
【００９５】
例示的な態様において、本開示は、間葉系間質細胞を含む医薬調製物を提供することが可能であり、前記間葉系間質細胞は、培養中で少なくとも１５回の集団倍加、少なくとも２０回の集団倍加、又は少なくとも２５回の集団倍加を受けることが可能である。
【００９６】
本発明の間葉系間質細胞は、血管芽細胞の生体外分化によって産生され得る。この間葉系間質細胞は、霊長類細胞又はその他の哺乳動物細胞であり得る。この間葉系間質細胞はヒト細胞であり得る。
【００９７】
前記集団倍加は、約３５日以内、より好ましくは約３４日以内、好ましくは３３日以内、より好ましくは３２日以内、更により好ましくは３１日以内、又は更により好ましくは約３０日以内で生じる。
【００９８】
本発明の調製物は、約１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、０．０１％未満、０．００９％未満、０．００８％未満、０．００７％未満、０．００６％未満、０．００５％未満、０．００４％未満、０．００３％未満、０．００２％未満、０．００１％未満、０．０００９％未満、０．０００８％未満、０．０００７％未満、０．０００６％未満、０．０００５％未満、０．０００４％未満、０．０００３％未満、０．０００２％未満、又は０．０００１％未満の多能性細胞を含むことが可能である。
【００９９】
本発明の調製物は、多能性細胞を含まなくともよい。
【０１００】
本発明の調製物は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の間葉系間質細胞を含むことが可能である。
【０１０１】
前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも１つ；（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４及びＨＬＡ−ＡＢＣの少なくとも１つ；（ｉｉｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３及び／又はＣＤ９０；若しくは（ｉｖ）これらの任意の組み合わせが陽性であり得る。前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３及び／又はＣＤ９０の少なくとも２つ；（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも２つ；若しくは（ｉｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり得る。前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の全てが陽性であり得；（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり得、及び／又は（ｉｉ）ＣＤ３１、３４、４５、１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、及び／又はＴＬＲ３が陰性であり得るか、若しくは細胞の５％未満又は１０％未満がＣＤ３１、３４、４５、１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、及び／又はＴＬＲ３を発現することが可能である。前記間葉系間質細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％が、（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の１つ以上；（ｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の１つ以上；若しくは（ｉｉｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４及びＨＬＡ−ＡＢＣの１つ以上が陽性であり得る。
【０１０２】
本発明の医薬調製物は、これを必要とする対象における不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含むことが可能である。
【０１０３】
本発明の医薬調製物は、これを必要とする受容者への移植のためのその他の細胞、組織又は器官を含むことが可能である。その他の細胞又は組織は、ＲＰＥ細胞、皮膚細胞、角膜細胞、膵細胞、肝細胞、心細胞又は前記細胞のいずれかを含有する組織であり得る。前記間葉系間質細胞は、骨髄から誘導されることはなく、免疫調節アッセイにおけるこの調製物の効力は、骨髄由来の間葉系間質細胞の調製物の効力を超えることが可能である。効力は、ＥＣ５０用量を決定する免疫調節アッセイによってアッセイされ得る。この調製物は、１０回の集団倍加後に、その分化能の約５０％〜１００％を保持することができる。
【０１０４】
前記間葉系間質細胞は、多能性細胞から直接的に誘導されることができず、前記間葉系間質細胞は、（ａ）凝集しないか又は多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも少ない量で凝集し；（ｂ）多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞と比較して、分裂する場合より容易に分散し；（ｃ）等しい数の多能性細胞で出発する場合、多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも数で多い場合があり；及び／又は（ｄ）多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりもより早期に特徴的な間葉系間質細胞表面マーカーを獲得する。
【０１０５】
前記間葉系間質細胞は、哺乳動物細胞であり得る。前記間葉系間質細胞は、ヒト、イヌ、ウシ、非ヒト霊長類、ネズミ、ネコ、又はウマの細胞であり得る。
【０１０６】
例示的な態様において、本開示は、間葉系間質細胞を生成するための方法を提供し、方法は、間葉系幹細胞をもたらす条件下で血管芽細胞を培養する工程を含む。前記血管芽細胞は、フィーダーフリー条件下で培養することが可能である。前記血管芽細胞は、マトリックス上で平板培養することが可能である。前記マトリックスは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１、ウシ線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、及び／又は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の１つ以上を含むことが可能である。前記マトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、硫酸ヘパラン、マトリゲル（エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウスの肉腫細胞から得た可溶性調製物）、ヒト基底膜抽出物、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することが可能である。前記マトリックスは、エンゲルブレス−ホルム−スウォームマウスの肉腫細胞から得た可溶性調製物を含むことができる。
【０１０７】
前記間葉系間質細胞は、哺乳動物細胞であり得る。前記間葉系間質細胞は、ヒト、イヌ、ウシ、非ヒト霊長類、ネズミ、ネコ、又はウマの細胞であり得る。
【０１０８】
前記血管芽細胞は、αＭＥＭを含む培地中で培養され得る。前記血管芽細胞は、血清又は血清代替品を含む培地中で培養され得る。前記血管芽細胞は、０％、０．１〜０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％のウシ胎児血清が補充されたαＭＥＭを含む培地中で培養され得る。前記血管芽細胞は、前記マトリックス上で少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間培養され得る。
【０１０９】
前記血管芽細胞は、多能性細胞から分化することが可能である。
【０１１０】
前記多能性細胞は、ｉＰＳ細胞又は割球から産生された多能性細胞であり得る。前記多能性細胞は、ヒトの胚を破壊することなく１つ以上の割球から誘導することが可能である。
【０１１１】
前記血管芽細胞は、（ａ）前記多能性細胞を培養し細胞のクラスタを形成する工程を含む方法によって、多能性細胞から分化することが可能である。この多能性細胞は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び／又は骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）の存在下で培養され得る。工程（ａ）において、この多能性細胞は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び／又は骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）の存在下で培養され得る。前記ＶＥＧＦ及びＢＭＰ−４は、前記細胞培養の開始から０〜４８時間以内に多能性細胞培養に添加することが可能であり、前記ＶＥＧＦは、２０〜１００ｎｍ／ｍＬの濃度で任意選択で添加することが可能であり、前記ＢＭＰ−４は、１５〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で任意選択で添加することが可能である。前記ＶＥＧＦ及びＢＭＰ−４は、前記細胞培養の開始から０〜４８時間以内に工程（ａ）の細胞培養に添加することが可能であり、前記ＶＥＧＦは、２０〜１００ｎｍ／ｍＬの濃度で任意選択で添加することが可能であり、前記ＢＭＰ−４は、１５〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で任意選択で添加することが可能である。前記血管芽細胞は、（ｂ）前記細胞のクラスタの血管芽細胞への分化を誘導するのに十分な量で、少なくとも１つの増殖因子の存在下で、前記細胞のクラスタを培養する工程を更に含む方法によって、多能性細胞から分化することが可能である。工程（ｂ）で添加される前記少なくとも１つの増殖因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ  ３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ＥＰＯ、及び／又はｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上の増殖因子を含むことができる。
【０１１２】
工程（ｂ）で添加される前記少なくとも１つの増殖因子は、約２０〜２５ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、約２０〜１００ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、約１５〜１００ｎｇ／ｍｌの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ  ３Ｌ（ＦＬ）、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ＥＰＯ、及び／又は１．５〜５Ｕ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含むことが可能である。
【０１１３】
工程（ｂ）で添加される前記少なくとも１つの増殖因子の１つ以上は、工程（ａ）の開始から３６〜６０時間以内、又は４０〜４８時間以内に前記培養に添加することが可能である。
【０１１４】
工程（ｂ）で添加される前記少なくとも１つの増殖因子１つ以上は、工程（ａ）の開始から４８〜７２時間以内に前記培養に添加することが可能である。
【０１１５】
工程（ｂ）で添加される前記少なくとも１つの増殖因子は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４、ＳＣＦ及び／又はＦＬの１つ以上を含むことが可能である。
【０１１６】
本発明の方法は、（ｃ）前記細胞のクラスタを任意選択で単一細胞に解離する工程を更に含んでもよい。
【０１１７】
本発明の方法は、（ｄ）前記血管芽細胞を、少なくとも１つの追加の増殖因子を含む培地中で培養する工程を更に含んでもよく、前記少なくとも１つの追加の増殖因子は、血管芽細胞を増殖させるために十分な量であり得る。
【０１１８】
工程（ｄ）において、前記少なくとも１つの追加の増殖因子は、インスリン、トランスフェリン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、及び／又はｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含むことが可能である。
【０１１９】
工程（ｄ）において、前記少なくとも１つの追加の増殖因子は、約１０〜１００μｇ／ｍｌのインスリン、約２００〜２，０００μｇ／ｍｌのトランスフェリン、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、約１０〜２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３（ＩＬ−３）、約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６（ＩＬ−６）、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、３〜５０Ｕ／ｍｌのエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、約２０〜２００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約２０〜２００ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、約１５〜１５０ｎｇ／ｍｌの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、及び／又は約１．５〜１５Ｕ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４の１つ以上を含むことが可能である。
【０１２０】
工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）における前記培地は、無血清培地であり得る。
【０１２１】
上述の方法は、（ｅ）間葉系間質細胞を有糸分裂で不活性化する工程を更に含んでもよい。
【０１２２】
少なくとも８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、９，５００万個、１億個、１億２，５００万個、又は１億５，０００万個の間葉系間質細胞を生成することが可能である。
【０１２３】
前記血管芽細胞は、前記多能性細胞の分化を誘導し始めてから少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８日後に採取されることが可能である。
【０１２４】
前記間葉系間質細胞は、前記多能性細胞の分化を誘導し始めてから少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０日以内で生成することが可能である。
【０１２５】
本発明は、培養の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５日以内に、約２００，０００個の血管芽細胞から生成される少なくとも８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、９，５００万個、１億個、１億２，５００万個、又は１億５，０００万個の間葉系間質細胞をもたらすことが可能である。
【０１２６】
本発明の間葉系間質細胞は、血管芽細胞としての培養の約２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５日以内に、少なくとも１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４１５、１：４２５、１：４４０、１：４５０、１：３６５、１：４７５、１：４９０及び１：５００の間葉系間質細胞に対する血管芽細胞の比で、血管芽細胞から生成することが可能である。
【０１２７】
前記細胞は、ヒトの細胞であり得る。
【０１２８】
別の態様において、本開示は、上記記載の方法のいずれかにより得られた血管芽細胞から誘導される間葉系間質細胞を提供する。
【０１２９】
別の態様において、本開示は、血管芽細胞の生体外分化において誘導された間葉系間質細胞を提供する。
【０１３０】
前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、
ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４、及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり得、並びに（ｉｉ）ＣＤ３１、３４、４５、１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４及び／又はＴＬＲ３が陰性であるか、又はこの細胞の５％未満又は１０％未満がＣＤ３１、３４、４５、１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４及び／又はＴＬＲ３を発現することが可能である。
【０１３１】
前記間葉系間質細胞の少なくとも５０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の全て；又は（ｉｉ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４及びＨＬＡ−ＡＢＣの全てが陽性であり得る。
【０１３２】
前記間葉系間質細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％は、（ｉ）ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＩＬ−１１、ＡＩＲＥ−１、ＡＮＧ−１、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも１つ；又は（ｉｉ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２７４及びＨＬＡ−ＡＢＣの少なくとも１つが陽性であり得る。
【０１３３】
この間葉系間質細胞は、ＣＤ３１、３４、４５、１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、又はＴＬＲ３の少なくとも１つを発現することができないか、若しくはこの細胞の５％未満又は１０％未満が、ＣＤ３１、３４、４５、１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４、又はＴＬＲ３の少なくとも１つを発現することができる。
【０１３４】
別の態様において、本開示は、上記記載の間葉間質細胞の調製物を提供する。
【０１３５】
前記調製物は、約１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、０．０１％未満、０．００９％未満、０．００８％未満、０．００７％未満、０．００６％未満、０．００５％未満、０．００４％未満、０．００３％未満、０．００２％未満、０．００１％未満、０．０００９％未満、０．０００８％未満、０．０００７％未満、０．０００６％未満、０．０００５％未満、０．０００４％未満、０．０００３％未満、０．０００２％未満、又は０．０００１％未満の多能性細胞を含むことが可能である。
【０１３６】
この調製物は、多能性細胞を含まなくともよい。
【０１３７】
前記調製物は、実質的に精製されることが可能であり、任意選択で少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のヒト間葉系間質細胞を含むことが可能である。
【０１３８】
この調製物は、実質的に類似したレベルのｐ５３及びｐ２１タンパク質を含むことが可能であり、又はｐ２１タンパク質と比較してｐ５３タンパク質のレベルが１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍大きいことも可能である。
【０１３９】
この調製物中の間葉系間質細胞又はＭＳＣは、培養中で少なくとも５回の集団倍加を受けることが可能であり、若しくは培養中で少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０回又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可
能である。
【０１４０】
前記間葉系間質細胞は（ａ）凝集することができないか、又は多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも少ない量で凝集することが可能であり；（ｂ）多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞と比較して、分裂する場合より容易に分散することが可能であり；（ｃ）等しい数の多能性細胞で出発する場合、多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりも多い数であることが可能であり；及び／又は（ｄ）多能性細胞から直接的に誘導された間葉系間質細胞よりもより早期に特徴的な間葉系細胞表面マーカーを獲得する。
【０１４１】
別の態様において、本開示は、上記記載のいずれかの間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物を含む医薬調製物を提供する。
【０１４２】
この医薬調製物は、不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含むことが可能である。
【０１４３】
この医薬調製物は、不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含むことが可能であり、それを必要とする受容者への移植のためのその他の細胞又は組織を更に含んでもよい。
【０１４４】
前記その他の細胞又は組織は、同種異系又は同系の膵臓、神経、肝臓、ＲＰＥ、角膜細胞又は前述のいずれかを含有する組織であり得る。
【０１４５】
本発明の医薬調製物は、自己免疫障害又は同種異系細胞に対する免疫反応を治療することで使用され得るか、若しくは多発性硬化症、全身性硬化症、血液癌、心筋梗塞、器官移植拒絶、慢性同種移植片腎炎、肝硬変、肝不全、心不全、ＧｖＨＤ、脛骨骨折、左室機能不全、白血病、骨髄異形成症候群、クローン病、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、骨形成不全、ホモ接合性家族性低コレステロール血症、半月板切除後の処置、成人性歯周炎、重篤な心筋虚血症を有する患者における脈管形成、脊髄損傷、骨異形性症、重度の虚血下肢、糖尿病性足部疾患、原発性シェーグレン症候群、骨関節炎、軟骨欠損、蹄葉炎、多系統委縮症、筋萎縮性側索硬化症、心臓手術、全身性エリテマトーデス、生体腎同種移植、非悪性赤血球障害、熱傷、放射線熱傷、パーキンソン病、微少骨折、水疱性表皮剥離症、重度の冠動脈虚血、突発性拡張心筋症、大腿骨骨頭壊死、ループス腎炎、骨空隙欠損、虚血性脳卒中、卒中後、急性放射線症候群、肺疾患、関節炎、骨再生、ブドウ膜炎又はこれらの組み合わせを治療することで使用され得る。
【０１４６】
別の態様において、本開示は、上記記載の間葉系間質細胞のいずれか、又は間葉系間質細胞の調製物のいずれかを含むキットを提供する。
【０１４７】
別の態様において、本開示は、上記記載の間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物含むキットを提供し、前記細胞又は細胞の調製物は、凍結又は低温保存されることが可能である。
【０１４８】
別の態様において、本開示は、上記記載の間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物含むキットを提供し、前記細胞又は細胞の調製物は、細胞送達用ビヒクル内に封入されることが可能である。
【０１４９】
別の態様において、本開示は、疾患又は障害を治療するための方法を提供し、方法は、上記記載の間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物の有効量を、これを必要とする対象に投与する工程を含む。
【０１５０】
本発明の方法は、その他の細胞又は組織の違勅を更に含むことが可能である。この細胞又は組織は、網膜、ＲＰＥ、角膜、神経、免疫、骨髄、肝臓又は膵臓の細胞を含むことが可能である。この疾患又は障害は、多発性硬化症、全身性硬化症、血液癌、心筋梗塞、器官移植拒絶、慢性同種移植片腎炎、肝硬変、肝不全、心不全、ＧｖＨＤ、脛骨骨折、左室機能不全、白血病、骨髄異形成症候群、クローン病、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、骨形成不全、ホモ接合性家族性低コレステロール血症、半月板切除後の処置、成人性歯周炎、重篤な心筋虚血症を有する患者における脈管形成、脊髄損傷、骨異形性症、重度の虚血下肢、糖尿病性足部疾患、原発性シェーグレン症候群、骨関節炎、軟骨欠損、蹄葉炎、多系統委縮症、筋萎縮性側索硬化症、心臓手術、全身性エリテマトーデス、生体腎同種移植、非悪性赤血球障害、熱傷、パーキンソン病、微少骨折、水疱性表皮剥離症、重度の冠動脈虚血、突発性拡張心筋症、大腿骨骨頭壊死、ループス腎炎、骨空隙欠損、虚血性脳卒中、卒中後、急性放射線症候群、肺疾患、関節炎、骨再生、又はこれらの組み合わせから選択され得る。
【０１５１】
この疾患又は障害は、ブドウ膜炎であってもよい。前記疾患又は障害は、自己免疫障害又は同種異系細胞に対する免疫反応であってもよい。この自己免疫障害は、多発性硬化症であり得る。
【０１５２】
別の態様において、本開示は、骨損失又は軟骨損傷を治療する方法を提供し、方法は、間葉系間質細胞又は間葉系間質細胞の調製物の有効量を、これを必要とする対象に投与する工程を含む。
【０１５３】
本発明の間葉系間質細胞は、同種移植又は同系移植細胞又は組織と組み合わせて投与されてもよい。この同種移植細胞は、網膜色素上皮細胞、網膜細胞、角膜細胞、又は筋細胞を含むことが可能である。
【０１５４】
別の態様において、本開示は、有糸分裂不活性化間葉系間質細胞を含む医薬調製物を提供する。この間葉系間質細胞は、血管芽細胞から分化することが可能である。
【０１５５】
この医薬品は、少なくとも１０６個の間葉系間質細胞及び薬学的に許容し得る担体を含むことが可能である。
【０１５６】
別の態様において、本開示は、上記方法によって産生された有糸分裂不活性化間葉系間質細胞を含む医薬調製物を提供する。
【０１５７】
この調製物は、ヒト対象への投与に好適であり得る。この調製物は、非ヒト獣医哺乳動物への投与に好適であり得る。
【０１５８】
この医薬調製物は、多能性細胞を含まなくともよい。
【０１５９】
この医薬調製物は、これを必要とする対象において不必要な免疫応答を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含むことが可能である。
【０１６０】
この医薬調製物は、炎症呼吸状態、急性損傷に起因する呼吸状態、成人性呼吸困難症候群、外傷後成人性呼吸困難症候群、移植肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、気腫、慢性閉塞性気管支炎、気管支炎、アレルギー反応、細菌性肺炎に起因する損傷、ウイルス性肺炎に起因する損傷、喘息、刺激物質への曝露、喫煙、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、難聴、自己免疫性難聴、騒音性難聴、乾癬及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される疾患又は状態を治療するために有効な間葉系間質細胞の量を含むことが可能である
。
【０１６１】
間葉系間質細胞の調製物
本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物が提供され、この中で、前記間葉系間質細胞の所望の表現型は、ＥＳＣ培養による間葉系間質細胞と比較して、より早期に存在する（図５を参照）。本発明の他の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の調製物が提供され、この中で、前記間葉系間質細胞の所望の表現型は、ＥＳＣ培養による間葉系間質細胞と比較して、より早期に存在し、前記所望の表現型は、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、及びＨＬＡ−ａｂｃを含む群から選択される少なくとも２つのマーカーの発現によって規定される。
【０１６２】
本発明の他の実施形態は、間葉系間質細胞の調製物を含み、この中で、前記間葉系間質細胞の表現型は、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、及びＨＬＡ−ＡＢＣを含む群から選択される少なくとも２つのマーカーの発現によって規定される。本発明の更に他の実施形態は、間葉系間質細胞の調製物を含み、この中で、前記間葉系間質細胞の表現型は、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を含む群から選択される少なくとも２つのマーカーの発現によって規定され、前記間葉系間質細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ及びＣＤ１３３を発現しない。
【０１６３】
本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成された）の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％が、培養中で約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０日後に、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、及びＨＬＡ−ａｂｃの発現によって規定される表現型を提示する。本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成された）の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％が、培養中で約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０日後に、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、及びＨＬＡ−ａｂｃを含む群から選択される少なくとも２つのマーカーの発現並びにＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ１３３及びＳｔｒｏ−１の発現の欠如によって規定される表現型を提示する。前述の実施形態において、前記表現型は、ＡＩＲＥ−１、ＩＬ−１１、ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＡＮＧ−１、及びＣＸＣＬ１を含む群から選択されるマーカーによって更に規定される。
【０１６４】
本発明の好ましいプロセスが提供され、この中で、血管芽細胞から誘導された間葉系間質細胞の数は、間葉系間質細胞の培養の約３０日以内に、約２×１０５個の血管芽細胞から誘導された約８×１０７、８．５×１０７、９×１０７、９．５×１０７、１×１０８、１．２５×１０８、又は１．５×１０８個の間葉系間質細胞である。本発明の代替実施形態において、間葉系間質細胞は、間葉系間質細胞の培養の約３０日以内に、約１：２００、１：４００、１：４１５、１：４２５、１：４４０、１：４５０、１：４６５、１：４７５、１：４９０、及び１：５００の間葉系間質細胞に対する血管芽細胞の比で、血管芽細胞から生成されることが可能である。
【０１６５】
本発明の好ましい実施形態において、血管芽細胞を培養することで得られる間葉系間質細胞の数は、ＥＳＣから直接的に得られる間葉系間質細胞の数よりも多い。本発明の他の好ましい実施形態において、血管芽細胞の培養によって得られる間葉系間質細胞の数は、ＥＳＣから直接的に得られる間葉系間質細胞の数よりもＥＳＣから直接的に得られる間葉系間質細胞の数よりも少なくとも５倍、１０倍、２０倍、２２倍多い（図４を参照）。
【０１６６】
本発明の別の実施形態において、主題の間葉系間質細胞の調製物は、哺乳動物宿主に導入される場合、奇形腫を形成することはない。
【０１６７】
本発明の一実施形態は、本発明のプロセス実施形態のいずれかを使用して、血管芽細胞を培養することによって生成される間葉系間質細胞の調製物を提供する。本発明の一実施形態は、本発明のプロセス実施形態のいずれかを使用して、血管芽細胞を培養することによって生成される間葉系間質細胞の調製物を含み、ここでは、前記調製物の表現型は、ＡＩＲＥ−１、ＩＬ−１１、ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＡＮＧ−１、及びＣＸＣＬ１を含む群から選択されるマーカーのいずれか又は全ての存在によって規定される。本発明の他の実施形態は、本発明のプロセス実施形態のいずれかを使用して、血管芽細胞を培養することにより生成された間葉系間質細胞の調製物を含み、前記調製物の表現型は、ＡＩＲＥ−１、ＩＬ−１１、ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＡＮＧ−１、及びＣＸＣＬ１を含む群から選択されるマーカーのいずれか又は全ての存在によって規定され、前記調製物は、ＩＬ−６、Ｓｔｒｏ−１及びＶＥＧＦの低減した発現を提示する。
【０１６８】
本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の調製物が提供され、前記調製物は、実質的に同程度のレベルのｐ５３及びｐ２１タンパク質を含むか、又はｐ２１と比較したｐ５３のレベルは、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍大きい。本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の調製物が提供され、前記調製物は、実質的に同程度のレベルのｐ５３及びｐ２１タンパク質を含むか、又はｐ２１と比較したｐ５３のレベルは、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍大きい。本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の医薬調製物が提供され、前記医薬調製物は、実質的に同程度のレベルのｐ５３及びｐ２１タンパク質を含むか、又はｐ２１と比較したｐ５３のレベルは、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍大きい。
【０１６９】
本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の調製物が提供され、前記調製物は、実質的に同程度のパーセンテージのｐ５３及びｐ２１タンパク質が陽性の細胞を含むか、又はｐ２１と比較したｐ５３が陽性の細胞のパーセンテージは、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍大きい。本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の調製物が提供され、前記調製物は、実質的に同程度のパーセンテージのｐ５３及びｐ２１タンパク質が陽性の細胞を含むか、又はｐ２１と比較したｐ５３が陽性の細胞のパーセンテージは、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍大きい。本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の医薬調製物が提供され、前記医薬調製物は、実質的に同程度のパーセンテージのｐ５３及びｐ２１タンパク質が陽性の細胞を含むか、又はｐ２１と比較したｐ５３が陽性の細胞のパーセンテージは、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍大きい。
【０１７０】
本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養する
ことによって生成される）の調製物が提供され、前記調製物は、Ｓ１００Ａ１、ＶＩＭ、ＭＹＡＤＭ、ＰＩＭ１、ＡＮＸＡ２、ＲＡＭＰ、ＭＥＧ３、ＩＬ１３Ｒ２、Ｓ１００Ａ４、ＴＲＥＭ１、ＤＧＫＡ、ＴＰＢＧ、ＭＧＬＬ、ＥＭＬ１、ＭＹＯ１Ｂ、ＬＡＳＳ６、ＲＯＢＯ１、ＤＫＦＺＰ５８６Ｈ２１２３、ＬＯＣ８５４３４２、ＤＯＫ５、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＳＰ５３、ＶＥＰＨ１、ＳＬＣ３５Ｅ１、ＡＮＸＡ２、ＨＬＡ−Ｅ、ＣＤ５９、ＢＨＬＨＢ２、ＵＣＨＬ１、ＳＵＳＰ３、ＣＲＥＤＢＬ２、ＯＣＲＬ、ＯＳＧＩＮ２、ＳＬＥＣ３Ｂ、ＩＤＳ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＳＰＡＮ６、ＴＭ４ＳＦ１、ＭＡＰ４、ＣＡＳＴ、ＬＨＦＰＬ２、ＰＬＥＫＨＭ１、ＳＡＭＤ４Ａ、ＶＡＭＰ１、ＡＤＤ１、ＦＡＭ１２９Ａ、ＨＰＤＣ１、ＫＬＦ１１、ＤＲＡＭ、ＴＲＥＭ１４０、ＢＨＬＨＢ３、ＭＧＣ１７３３０、ＴＢＣ１Ｄ２、ＫＩＡＡ１１９１、Ｃ５ＯＲＦ３２、Ｃ１５ＯＲＦ１７、ＦＡＭ７９１、ＣＣＤＣ１０４、ＰＱＬＣ３、ＥＩＦ４Ｅ３、Ｃ７ＯＲＦ４１、ＤＵＳＰ１８、ＳＨ３ＰＸ３、ＭＹＯ５Ａ、ＰＲＭＴ２、Ｃ８ＯＲＦ６１、ＳＡＭＤ９Ｌ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１０３、ＥＰＯＲ及びＴＭＥＭ１１２からなる群から、又はＳ１００Ａ１、ＶＩＭ、ＭＹＡＤＭ、ＰＩＭ１、ＡＮＸＡ２、ＲＡＭＰ、ＭＥＧ３、ＩＬ１３Ｒ２、Ｓ１００Ａ４、ＴＲＥＭ１、ＤＧＫＡ、ＴＰＢＧ、ＭＧＬＬ、ＥＭＬＩ、ＭＹＯ１Ｂ、ＬＡＳＳ６、ＲＯＢＯ１、ＤＫＦＺＰ５８６Ｈ２１２３、ＬＯＣ８５４３４２、ＤＯＫ５、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＳＰ５３、ＶＥＰＨ１及びＳＬＣ３５Ｅ１を含む群から選択された老化マーカーのバックグラウンドレベルを有する細胞の実質的に同程度のパーセンテージを含み、若しくはＳ１００Ａ１、ＶＩＭ、ＭＹＡＤＭ、ＰＩＭ１、ＡＮＸＡ２、ＲＡＭＰ、ＭＥＧ３、ＩＬ１３Ｒ２、Ｓ１００Ａ４、ＴＲＥＭ１、ＤＧＫＡ、ＴＰＢＧ、ＭＧＬＬ、ＥＭＬ１、ＭＹＯ１Ｂ、ＬＡＳＳ６、ＲＯＢＯ１、ＤＫＦＺＰ５８６Ｈ２１２３、ＬＯＣ８５４３４２、ＤＯＫ５、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＳＰ５３、ＶＥＰＨ１、ＳＬＣ３５Ｅ１、ＡＮＸＡ２、ＨＬＡ−Ｅ、ＣＤ５９、ＢＨＬＨＢ２、ＵＣＨＬ１、ＳＵＳＰ３、ＣＲＥＤＢＬ２、ＯＣＲＬ、ＯＳＧＩＮ２、ＳＬＥＣ３Ｂ、ＩＤＳ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＳＰＡＮ６、ＴＭ４ＳＦ１、ＭＡＰ４、ＣＡＳＴ、ＬＨＦＰＬ２、ＰＬＥＫＨＭ１、ＳＡＭＤ４Ａ、ＶＡＭＰ１、ＡＤＤ１、ＦＡＭ１２９Ａ、ＨＰＤＣ１、ＫＬＦ１１、ＤＲＡＭ、ＴＲＥＭ１４０、ＢＨＬＨＢ３、ＭＧＣ１７３３０、ＴＢＣ１Ｄ２、ＫＩＡＡ１１９１、Ｃ５ＯＲＦ３２、Ｃ１５ＯＲＦ１７、ＦＡＭ７９１、ＣＣＤＣ１０４、ＰＱＬＣ３、ＥＩＦ４Ｅ３、Ｃ７ＯＲＦ４１、ＤＵＳＰ１８、ＳＨ３ＰＸ３、ＭＹＯ５Ａ、ＰＲＭＴ２、Ｃ８ＯＲＦ６１、ＳＡＭＤ９Ｌ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１０３、ＥＰＯＲ、ＴＭＥＭ１１２を含む群から、又はＳ１００Ａ１、ＶＩＭ、ＭＹＡＤＭ、ＰＩＭ１、ＡＮＸＡ２、ＲＡＭＰ、ＭＥＧ３、ＩＬ１３Ｒ２、Ｓ１００Ａ４、ＴＲＥＭ１、ＤＧＫＡ、ＴＰＢＧ、ＭＧＬＬ、ＥＭＬ１、ＭＹＯ１Ｂ、ＬＡＳＳ６、ＲＯＢＯ１、ＤＫＦＺＰ５８６Ｈ２１２３、ＬＯＣ８５４３４２、ＤＯＫ５、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＳＰ５３、ＶＥＰＨ１及びＳＬＣ３５Ｅ１を含む群から選択される老化マーカーが陽性の細胞のパーセンテージは、バックグラウンドよりも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍大きい。本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の調製物が提供され、前記調製物はＨｏｘＢ３、ＨｏｘＢ７、ＭＩＤ１、ＳＮＡＰＣ５、ＰＰＡＲＧ、ＡＮＸＡ２、ＴＩＰＩＮ、ＭＹＬＩＰ、ＬＡＸ１、ＥＧＲ１、ＣＲＩＰ１、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＳＴＭＮ１、ＣＣＴ８、ＳＦＲＳ１０、ＣＢＸ３、ＣＢＸ１、ＦＬＪ１１０２１、ＤＤＸ４６、ＡＣＡＤＭ、ＫＩＡＡ０１０１、ＴＹＭＳ、ＢＣＡＳ２、ＣＥＰ５７、ＴＤＧ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＣＳＲＰ２、ＧＬＭＮ、ＨＭＧＮ２、ＨＮＲＰＲ、ＥＩＦ３Ｓ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＳＦＲＳ１０、ＴＣＦ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＬＯＣ７３０７４０、ＬＹＰＬＡ１、ＵＢＥ３Ａ、ＳＵＭ０２、ＳＨＭＴ２、ＡＣＰ１、ＦＫＢＰ３、ＡＲＬ５Ａ、ＧＭＮＮ、ＥＮＹ２、ＦＡＭ８２Ｂ、ＲＮＦ１３８、ＲＰＬ２６Ｌ１、ＣＣＤＣ５９、ＰＸＭＰ２、ＰＯＬＲ３Ｂ、ＴＲＭＴ５、ＺＮＦ６３９、ＭＲＰＬ４７、ＧＴＰＢＰ８、ＳＵＢ１、ＳＮＨＧ１、ＡＴＰＡＦ１、ＭＲＰＳ２４、Ｃ１６ＯＲＦ６３、ＦＡＭ３３Ａ、ＥＰＳＴＬ１、ＣＴＲ９、ＧＡＳ５、ＺＮＦ７１１、ＭＴＯ１及びＣＤＰ２を含む群から選択されるマーカーのバックグラウンドレベルを有する細胞の実質的に同程度のパーセンテージを含み、若しくはＨｏｘＢ３、ＨｏｘＢ７、ＭＩＤ１、ＳＮＡＰＣ５、ＰＰＡ
ＲＧ、ＡＮＸＡ２、ＴＩＰＩＮ、ＭＹＬＩＰ、ＬＡＸ１、ＥＧＲ１、ＣＲＩＰ１、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＳＴＭＮ１、ＣＣＴ８、ＳＦＲＳ１０、ＣＢＸ３、ＣＢＸ１、ＦＬＪ１１０２１、ＤＤＸ４６、ＡＣＡＤＭ、ＫＩＡＡ０１０１、ＴＹＭＳ、ＢＣＡＳ２、ＣＥＰ５７、ＴＤＧ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＣＳＲＰ２、ＧＬＭＮ、ＨＭＧＮ２、ＨＮＲＰＲ、ＥＩＦ３Ｓ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＳＦＲＳ１０、ＴＣＦ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＬＯＣ７３０７４０、ＬＹＰＬＡ１、ＵＢＥ３Ａ、ＳＵＭ０２、ＳＨＭＴ２、ＡＣＰ１、ＦＫＢＰ３、ＡＲＬ５Ａ、ＧＭＮＮ、ＥＮＹ２、ＦＡＭ８２Ｂ、ＲＮＦ１３８、ＲＰＬ２６Ｌ１、ＣＣＤＣ５９、ＰＸＭＰ２、ＰＯＬＲ３Ｂ、ＴＲＭＴ５、ＺＮＦ６３９、ＭＲＰＬ４７、ＧＴＰＢＰ８、ＳＵＢ１、ＳＮＨＧ１、ＡＴＰＡＦ１、ＭＲＰＳ２４、Ｃ１６ＯＲＦ６３、ＦＡＭ３３Ａ、ＥＰＳＴＬ１、ＣＴＲ９、ＧＡＳ５、ＺＮＦ７１１、ＭＴＯ１及びＣＤＰ２を含む群から選択されるマーカーが陽性である細胞のパーセンテージは、バックグランドの１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍未満である。
【０１７１】
本発明の一実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成される）の調製物が提供され、前記調製物は、ＨｏｘＢ３、ＨｏｘＢ７、ＭＩＤ１、ＳＮＡＰＣ５、ＰＰＡＲＧ、ＡＮＸＡ２、ＴＩＰＩＮ、ＭＹＬＩＰ、ＬＡＸ１、ＥＧＲ１、ＣＲＩＰ１、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＳＴＭＮ１、ＣＣＴ８、ＳＦＲＳ１０、ＣＢＸ３、ＣＢＸ１、ＦＬＪ１１０２１、ＤＤＸ４６、ＡＣＡＤＭ、ＫＩＡＡ０１０１、ＴＹＭＳ、ＢＣＡＳ２、ＣＥＰ５７、ＴＤＧ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＣＳＲＰ２、ＧＬＭＮ、ＨＭＧＮ２、ＨＮＲＰＲ、ＥＩＦ３Ｓ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＳＦＲＳ１０、ＴＣＦ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＬＯＣ７３０７４０、ＬＹＰＬＡ１、ＵＢＥ３Ａ、ＳＵＭ０２、ＳＨＭＴ２、ＡＣＰ１、ＦＫＢＰ３、ＡＲＬ５Ａ、ＧＭＮＮ、ＥＮＹ２、ＦＡＭ８２Ｂ、ＲＮＦ１３８、ＲＰＬ２６Ｌ１、ＣＣＤＣ５９、ＰＸＭＰ２、ＰＯＬＲ３Ｂ、ＴＲＭＴ５、ＺＮＦ６３９、ＭＲＰＬ４７、ＧＴＰＢＰ８、ＳＵＢ１、ＳＮＨＧ１、ＡＴＰＡＦ１、ＭＲＰＳ２４、Ｃ１６ＯＲＦ６３、ＦＡＭ３３Ａ、ＥＰＳＴＬ１、ＣＴＲ９、ＧＡＳ５、ＺＮＦ７１１、ＭＴＯ１及びＣＤＰ２を含む群から、又はＨｏｘＢ３、ＨｏｘＢ７、ＭＩＤ１、ＳＮＡＰＣ５、ＰＰＡＲＧ、ＡＮＸＡ２、ＴＩＰＩＮ、ＭＹＬＩＰ、ＬＡＸ１、ＥＧＲ１、ＣＲＩＰ１及びＳＵＬＴ１Ａ３を含む群から選択される老化マーカーのバックグラウンドレベルを有する細胞の実質的に同程度のパーセンテージを含み、若しくはＨｏｘＢ３、ＨｏｘＢ７、ＭＩＤ１、ＳＮＡＰＣ５、ＰＰＡＲＧ、ＡＮＸＡ２、ＴＩＰＩＮ、ＭＹＬＩＰ、ＬＡＸ１、ＥＧＲ１、ＣＲＩＰ１、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＳＴＭＮ１、ＣＣＴ８、ＳＦＲＳ１０、ＣＢＸ３、ＣＢＸ１、ＦＬＪ１１０２１、ＤＤＸ４６、ＡＣＡＤＭ、ＫＩＡＡ０１０１、ＴＹＭＳ、ＢＣＡＳ２、ＣＥＰ５７、ＴＤＧ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＣＳＲＰ２、ＧＬＭＮ、ＨＭＧＮ２、ＨＮＲＰＲ、ＥＩＦ３Ｓ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＳＦＲＳ１０、ＴＣＦ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＬＯＣ７３０７４０、ＬＹＰＬＡ１、ＵＢＥ３Ａ、ＳＵＭ０２、ＳＨＭＴ２、ＡＣＰ１、ＦＫＢＰ３、ＡＲＬ５Ａ、ＧＭＮＮ、ＥＮＹ２、ＦＡＭ８２Ｂ、ＲＮＦ１３８、ＲＰＬ２６Ｌ１、ＣＣＤＣ５９、ＰＸＭＰ２、ＰＯＬＲ３Ｂ、ＴＲＭＴ５、ＺＮＦ６３９、ＭＲＰＬ４７、ＧＴＰＢＰ８、ＳＵＢ１、ＳＮＨＧ１、ＡＴＰＡＦ１、ＭＲＰＳ２４、Ｃ１６ＯＲＦ６３、ＦＡＭ３３Ａ、ＥＰＳＴＬ１、ＣＴＲ９、ＧＡＳ５、ＺＮＦ７１１、ＭＴＯ１及びＣＤＰ２を含む群から選択される、又はＨｏｘＢ３、ＨｏｘＢ７、ＭＩＤ１、ＳＮＡＰＣ５、ＰＰＡＲＧ、ＡＮＸＡ２、ＴＩＰＩＮ、ＭＹＬＩＰ、ＬＡＸ１、ＥＧＲ１、ＣＲＩＰ１及びＳＵＬＴ１Ａ３を含む群から選択される老化マーカーが陽性の細胞のパーセンテージは、バックグランドの１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍未満である。
【０１７２】
別の実施形態において、血管芽細胞由来のＭＳＣは、成人由来のＭＳＣと比較して、より若々しい表現型を有する。一実施形態において、主題のＭＳＣは、培養中で少なくとも５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０回、又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能である。これとは対照的に、成人由来の間葉系間質細胞は、典型的には、培養中で２〜３回の倍加を受ける。別の実施形態において、血管芽細胞由来のＭＳＣは、成人由来のＭＳＣと比較して、より長いテロメア長さ、より大きな
免疫抑制効果、より少ない液胞、より迅速な分裂、培養中のより容易な分裂、より高いＣＤ９０発現を有すること、より少ない分化系列に決定されること、又はこれらの組み合わせを有する。別の実施形態において、血管芽細胞由来のＭＳＣは、成人由来ＭＳＣと比較して、細胞増殖を促進する転写物の増加した発現を有し（すなわち、より高い増殖能を有し）、最終細胞分化に関与する転写物の低減した発現を有する。
【０１７３】
本発明の別の実施形態において、間葉系間質細胞の調製物は、本発明の任意の１つ以上のプロセスによって生成され、前記間葉系間質細胞は、培養中で少なくとも又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０回、又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能である。
【０１７４】
本発明の別の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物は、培養中で少なくとも又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０回、又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能である。本発明の別の実施形態において、主題の間葉系間質細胞の調製物は、培養中で少なくとも又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０回、又はそれを超える回数の集団倍加を受けることが可能であり、前記集第倍加後に、間葉系間質細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、又は１％未満は、複製老化を受けている。他の実施形態において、前記調製物は、医薬調製物である。
【０１７５】
本発明の別の実施形態において、間葉系間質細胞の調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、培養中で少なくとも又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０回の集団倍加を受けている。
【０１７６】
本発明の別の実施形態において、間葉系間質細胞の調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、培養中で少なくとも又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０回の集団倍加を受けていて、前記間葉系間質細胞の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満は、複製老化を受けていて、前記間葉系間質細胞は、若々しい表現型及び効力を有し、並びに前記調製物は医薬調製物である。前記調製物は、免疫学的障害、変性疾患、又はＭＳＣを使用して治療し易いその他の疾患などの疾患の治療に有効な数の間葉系間質細胞を含むことが可能である。
【０１７７】
本発明の別の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、培養中で少なくとも又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０回の集団倍加を受けていて、このような倍加後に、前記間葉系間質細胞の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満は、複製老化を受けていて、前記間葉系間質細胞は、若々しい表現型及び効力を有し、並びに前記調製物は医薬調製物である。前記調製物は、免疫学的障害、変性疾患、又はＭＳＣを使用して治療し易いその他の疾患などの疾患の治療に有効な数の間葉系間質細胞を含むことが可能である。
【０１７８】
本発明の別の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、培養中で少なくとも又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０回の集団倍加を受けている。前の実施形態において、前記間葉系間質細胞の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％、又は１％未満は、複製老化を受けていて、前記間葉系間質細胞は、若々しい表現型及び効力を有し、前記調製
物は医薬調製物であり、前記医薬調製物は、間葉系間質細胞の有効な数を含み、並びに前記医薬調製物は保存されている。
【０１７９】
別の実施形態において、本発明は、間葉系間質細胞の医薬調製物を含むキットを提供する。別の実施形態において、本発明は、間葉系間質細胞の医薬調製物を含むキットを提供し、前記調製物は保存されている。別の実施形態において、本発明は、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の医薬調製物を含むキットを提供する。別の実施形態において、本発明は、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の医薬調製物を含むキットを提供し、前記調製物は保存されている。
【０１８０】
別の実施形態において、本発明は、血管芽細胞から誘導された間葉系間質細胞の有効量を、これを必要とする対象に投与することによって、病態を治療する方法を提供する。前記病態としては、自己免疫障害、ブドウ膜炎、骨損失又は軟骨損傷が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
血管芽細胞を培養することで得られる本発明の間葉系間質細胞は、ＥＳＣから直接誘導されたＭＳＣと比較して、改善された特性を有する。例えば、ＥＳＣ誘導ＭＳＣは、血管芽細胞由来ＭＳＣと比較すると、大量に凝集し、分裂する場合分散することがより難しく、等しい数のＥＳＣから出発する場合、同じ数のＭＳＣを生成することは殆どなく、特徴的なＭＳＣ細胞表面マーカーを獲得するために長い時間を要する。実施例２及び図３〜６を参照されたい。
【０１８２】
一実施形態において、本発明は、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物を提供し、前記調製物は、病態の正常化において有効である。本発明の他の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物が提供され、前記調製物は、過剰な又は不必要な免疫応答を低減することにおいて有効である。本発明の他の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物が提供され、前記調製物は、自己免疫障害を軽減することにおいて有効である。本発明の他の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の有効量を宿主に投与することによる病態の正常化が提供される。本発明の他の実施形態は、病態の正常化を提供し、このような病態の正常化は、前記ＭＳＣによるサイトカイン放出、調節性Ｔ細胞の数の増加を刺激すること、Ｔｈ１細胞から放出するＩＦＮγの特定量を阻害すること、及びＴｈ２細胞からの特定量のＩＬ４分泌を刺激することを含む群から選択される効果で特徴付けられる。他の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物の投与は、形質転換増殖因子β、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ、プロスタグランジンＥ２、肝細胞増殖因子、一酸化窒素、インターロイキン１０、インターロイキン６、マクロファージコロニー刺激因子、及び可溶性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ｇ５を含む群から選択されるサイトカインの前記間葉系間質細胞からの放出をもたらす。
【０１８３】
本発明の他の実施形態において、主題の間葉系間質細胞（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物の投与は、形質転換増殖因子β、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ、プロスタグランジンＥ２、肝細胞増殖因子、一酸化窒素、インターロイキン１０、インターロイキン６、マクロファージコロニー刺激因子、及び可溶性人白血球抗原（ＨＬＡ）Ｇ５、インターロイキン４、８、１１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血管内皮細胞増殖因子、インスリン様増殖因子１、ホスファチジルイノシトール−グリカン生合成クラスＦタンパク質、単球化学誘因タンパク質１、間質細胞由来因子１、腫瘍壊死因子１、形質転換増殖因子β、塩基性線維芽細胞増速因子、アンジオポイエ
チン１及び２、インターフェロンγによって誘導されるモノカイン、インターフェロン誘導タンパク質１０、脳由来神経親和性因子、インターロイキン１受容体α、ケモカインリガンド１及び２を含む群から選択されるサイトカインの前記間葉系間質細胞からの放出をもたらす。
【０１８４】
ＭＳＣの医薬調製物
本発明のＭＳＣは、薬学的に許容し得る担体で製剤化することが可能である。例えば、本発明のＭＳＣは、単独又は医薬品製剤の構成成分として投与されることができ、前記ＭＳＣは、医薬品での使用のための任意の便利な方法で投与されるために製剤化され得る。一実施形態は、分散液、懸濁液、エマルジョン、使用の直前に無菌の注射可能な溶液又は分散液に任意選択で再構成される無菌粉末、抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤、溶質又は懸濁化剤及び増粘剤からなる群から選択される１つ以上の薬学的に許容し得る無菌等張の水性又は非水性溶液と結合した間葉系間質細胞の医薬調製物を提供する。
【０１８５】
本発明の一実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約５回〜約１００回の集団倍加を受けている。本発明の他の実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約１０回〜約８０回の集団倍加を受けている。本発明の他の実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約２５回〜約６０回の集団倍加を受けている。本発明の他の実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約１０回未満の集団倍加を受けている。本発明の更に他の実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約２０回未満の集団倍加を受けている。本発明の他の実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約３０回未満の集団倍加を受けており、前記間葉系間質細胞は、複製老化を受けていない。本発明の他の実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約３０回未満の集団倍加を受けており、前記間葉系間質細胞の約２５％未満が複製老化を受けている。本発明の他の実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約３０回未満の集団倍加を受けており、前記間葉系間質細胞の約１０％未満が複製老化を受けている。本発明の他の実施形態において、間葉系間質細胞の医薬調製物が提供され、前記間葉系間質細胞は、約３０回未満の集団倍加を受けており、前記間葉系間質細胞の約１０％未満が複製老化を受けており、前記間葉系間質細胞は、ＡＩＲＥ−１、ＩＬ−１１、ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＡＮＧ−１、及びＣＸＣＬ１を含む群から選択されるマーカーを発現する。
【０１８６】
ＭＳＣの医薬調製物の注射のための濃度は、有効である任意の量であり、例えば実質的にＥＳＣを含まない量であり得る。例えば、この医薬調製物は、本明細書に記載されているＭＳＣの数及びタイプを含むことが可能である。特定の実施形態において、ＭＳＣの医薬調製物は、これを必要とする宿主への全身投与用に、約１×１０６個の主題のＭＳＣ（例えば、血管芽細胞を培養することにより生成された）を含み、又はこれを必要とする宿主への局所投与用に、約１×１０４個の血管芽細胞の培養による前記ＭＳＣを含む。
【０１８７】
本開示の例示的な組成物は、パイロジェンフリー又は本質的にパイロジェンフリー、及び病原体フリーなどの、ヒト患者を治療する上での使用に好適な製剤であり得る。投与される場合、本開示における使用のための医薬調製物は、パイロジェンフリー、病原体フリーの生理学的に許容し得る形態であり得る。
【０１８８】
本明細書に記載されている方法で使用されるＭＳＣを含む調製物は、懸濁液、ゲル、コロイド、スラリー、又は混合物で移植されてもよい。また、注射時に、冷凍保存したＭＳＣが市販の平衡塩類溶液で再懸濁され、注射（すなわち、ボーラス注射又は静脈内注射）による投与に望ましい浸透圧及び濃度を達成することが可能である。
【０１８９】
本発明の一態様は、哺乳動物患者における使用に好適な医薬調製物に関し、医薬調製物は、少なくとも１０６、１０７、１０８又は更に１０９個もの間葉系間質細胞と、薬学的に許容し得る担体を含む。本発明の別の態様は、少なくとも１０６、１０７、１０８又は更に１０９個もの間葉系間質細胞と、薬学的に許容し得る担体を含む医薬調製物に関し、この間葉系間質細胞は、血管芽細胞から分化する。本発明の更に別の態様は、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、又は１０１３個もの間葉系間質細胞を含む低温細胞バンクを提供する。本発明の更に別の態様は、非ヒト細胞及び／又は非ヒト動物の産物を含まない又は実質的に含まない、精製された細胞調製物を提供し、この調製物は、少なくとも１０６、１０７、１０８又は更に１０９個もの間葉系間質細胞と、１％未満の任意のその他の細胞型、より好ましくは０．１％未満、０．０１％未満又は更に０．００１％未満の任意のその他の細胞型を含む。上記の調製物、組成物及びバンクの特定の好ましい実施形態としては、限定されないが、以下のパラグラフに列挙されているものが挙げられる。
【０１９０】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、１０回目の倍加までに細胞の２５、２０、１５、１０又は更に５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞（線維芽細胞、脂肪細胞及び／又は骨細胞）への分化を受けている状態で、培養中で少なくとも１０回の集団倍加を受けるための複製能力を有する。
【０１９１】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、１５回目の倍加までに細胞の２５、２０、１５、１０又は更に５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞（線維芽細胞、脂肪細胞及び／又は骨細胞）への分化を受けている状態で、培養中で少なくとも１５回の集団倍加を受けるための複製能力を有する。
【０１９２】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、２０回目の倍加までに細胞の２５、２０、１５、１０又は更に５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞（線維芽細胞、脂肪細胞及び／又は骨細胞）への分化を受けている状態で、培養中で少なくとも２０回の集団倍加を受けるための複製能力を有する。
【０１９３】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、第５継代までに細胞の２５、２０、１５、１０又は更に５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞（線維芽細胞、脂肪細胞及び／又は骨細胞）への分化を受けている状態で、培養中で少なくとも５回の継代を受けるための複製能力を有する。
【０１９４】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、第１０継代までに細胞の２５、２０、１５、１０又は更に５％未満が細胞死、老化又は非ＭＳＣ細胞（線維芽細胞、脂肪細胞及び／又は骨細胞）への分化を受けている状態で、培養中で少なくとも１０回の継代を受けるための複製能力を有する。
【０１９５】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、ＯＣＴ−４、アルカリ性ホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８０を発現する多能性幹細胞などの多能性幹細胞源（及び、胚性幹細胞系又は誘導多能性幹細胞系など）から分化し、、より好ましくは一般的な多能性幹細胞ソースからも分化する。
【０１９６】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、ＨＬＡと遺伝子型で同一である。
【０１９７】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、ゲノム的に同一である。
【０１９８】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％又は更に５０％は、ＣＤ１０が陽性である。
【０１９９】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は更に９０％は、マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６及びＣＤ２７４及びＨＬＡ−ＡＢＣが陽性である。
【０２００】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞の３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満又は更に１０％未満は、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＸＣＲ４及びＴＬＲ３が陽性である。
【０２０１】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、２５日未満、２４日未満、２３日未満、２２日未満、２１日未満又は更に２０日未満で、細胞培養中で少なくとも１０回の集団倍加を受ける複製速度を有する。
【０２０２】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、１０ｋｂ、１０．５ｋｂ、１１ｋｂ、１１．５ｋｂ又は更に１２ｋｂよりも長い平均末端制限酵素断片長さ（ＴＲＦ）を有する。
【０２０３】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、培養中で１０、１５又は更に２０回の集団倍加にわたる５，０００，０００を超える、フローサイトメトリーにより測定される前方散乱光値を有する細胞において、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、又は更に４５％以上のパーセント増加を受けることはない。
【０２０４】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、休止状態において、臍帯血、骨髄又は脂肪組織から誘導された間葉系間質細胞によって発現されるＩＬ−６  ｍＲＮＡレベルの１０％未満、８％未満、６％未満、４％未満又は更に２％未満であるレベルで、インターロイキン−６をコード化するｍＲＮＡを発現する。
【０２０５】
特定の実施形態において、この間葉系間質細胞は、臍帯血、骨髄又は脂肪組織から誘導されたＭＳＣよりも少なくとも２、４、６、８、１０、２０、５０又は更に１００倍の効力がある。
【０２０６】
特定の実施形態において、ＭＯＧ３５−５５  ＥＡＥマウスモデル（ＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスなど）に注射される場合、１００万個の間葉系間質細胞は、平均で、３．５の臨床スコアを２．５未満に低減し、更により好ましくは、この臨床スコアを２、１．５未満に、又は１未満までにも低減するであろう。
【０２０７】
特定の実施形態において、この調製物は、ヒト患者への投与に好適であり、より好ましくは、パイロジェンフリーであり、及び／又は非ヒト動物産物を含まない。
【０２０８】
他の実施形態において、この調製物は、イヌ、ネコ又はウマなどの非ヒト獣医動物への投与に好適である。
【０２０９】
血管芽細胞の培養から誘導されたＭＳＣを使用して治療可能な疾患及び状態
ＭＳＣは、多様な疾患及び状態に対する治療的効果があることが示されている。特に、ＭＳＣは、損傷部位に移動し、免疫抑制効果を及ぼし、損傷した組織の修復を促進する。本発明の一実施形態が提供され、その中で間葉系間質細胞の医薬調製物が病態の発現を低減する。本発明の一実施形態が提供され、その中で間葉系間質細胞の医薬調製物は、病態
を患う宿主に投与される。本発明の他の実施形態において、主題のＭＳＣ（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成される）の医薬調製物は、創傷治癒、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、疾患、慢性眼疾患、網膜変性、緑内障、ブドウ膜炎、急性心筋梗塞、慢性疼痛、肝炎、及び腎炎から選択される病態の発現を低減する。本発明の他の実施形態において、血管芽細胞を培養することによる間葉系間質細胞の医薬調製物は、ウマ蹄葉炎の症状発現を低減する。他の例として、ＭＳＣは、同種移植細胞又は組織（例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、乏突起膠細胞前駆体、網膜、角膜、骨格筋、平滑筋、又は心筋若しくはこれらの任意の組み合わせなどの筋肉、又はその他などのＥＳ細胞から分化した細胞を含む）と組み合わせて投与することが可能であり、これによって、移植された細胞又は組織に対する免疫反応の可能性を減少させ、その他の免疫抑制の必要性を潜在的に排除する。本明細書に記載されている主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成された）は、同様な用途で使用することが可能である。本発明のプロセスの一実施形態が提供され、ここでは主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成される）の医薬調製物の宿主への投与は、将来的な治療の必要性を低減する。本発明のプロセスの一実施形態が提供され、ここでは、主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成される）の医薬調製物の宿主への投与は、将来的な治療の必要性を低減し、前記治療が免疫機能を抑制する。
【０２１０】
本発明の一実施形態において、主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成される）の医薬調製物は、病態の治療のために宿主に投与される。本発明の一実施形態において、主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成される）の医薬調製物は、病態の治療のために宿主に投与され、この病態は、創傷治癒、多発性硬化症、全身性硬化症、血液癌、心筋梗塞、組織及び器官移植、組織及び器官移植拒絶、慢性同種移植片腎炎、肝硬変、肝不全、心不全、ＧｖＨＤ、脛骨骨折、左室機能不全、白血病、骨髄異形成症候群、クローン病、Ｉ型又はＩＩ型真性糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、肺高血圧賞、慢性疼痛、骨形成不全、ホモ接合性家族性低コレステロール血症、半月板切除後の処置、成人性歯周炎、重篤な心筋虚血症を有する患者における脈管形成、脊髄損傷、骨異形性症、真正糖尿病に関連する重度の虚血下肢、糖尿病性足部疾患、原発性シェーグレン症候群、骨関節炎、軟骨欠損（例えば、関節軟骨の欠損）、蹄葉炎、多系統委縮症、筋萎縮性側索硬化症、心臓手術、治療抵抗性全身性エリテマトーデス、生体腎同種移植、非悪性赤血球障害、熱傷、放射線熱傷、パーキンソン病、微少骨折（例えば、膝関節軟骨の欠損損傷を有する患者における）、水疱性表皮剥離症、重度の冠動脈虚血、突発性拡張心筋症、大腿骨骨頭壊死、ループス腎炎、骨空隙欠損、虚血性脳卒中、卒中後、急性放射線症候群、肺疾患、関節炎、骨再生を含むリストから選択される。
【０２１１】
本発明の他の実施形態において、主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成される）の医薬調製物は、自己免疫性病態の治療のために宿主に投与され、この自己免疫性病態は、急性壊死性出血性脳脊髄炎、アディソン病、無γグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイド症、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ抗体／抗ＴＢＭ抗体腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経失調、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵臓炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及びニューロン神経障害、同心円硬化症（Ｂａｌｏ病）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト病、本能性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、ヘルペス状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ルーパス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、
結節性紅斑、実験的アレルギー脳髄膜炎、エヴァンズ症候群、線維筋痛症、線維化肺胞炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（ウェゲナー肉芽腫症を参照）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低γグロブリン血症、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質疾患、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎病、ランバート−イートン症候群、白血球は規制血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、睡眠発作、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性精神障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群（進行性顔面片側萎縮）、パーソネージ・ターナー症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲストロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、突発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤血球糸無形成症、レーノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、不穏脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、多臓器肉芽腫性疾患、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、自己免疫性無精子性睾丸炎、全身硬直性症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、測頭動脈炎／巨細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、脈管炎、水疱性皮膚炎、白斑症、及びウェゲナー肉芽腫症（現在、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）を含むリストから選択される。
【０２１２】
血管芽細胞の培養から誘導されたＭＳＣを使用する治療レジメン
本明細書に記載されているＭＳＣ及びＭＳＣを含む医薬調製物は、細胞ベースの治療に使用することが可能である。特に、本発明は、本明細書に記載されている疾患及び状態を治療又は予防するための方法を提供し、方法は、ＭＳＣを含む医薬調製物の有効量を投与する工程を含み、このＭＳＣは、血管芽細胞を培養することから誘導される。
【０２１３】
本発明のＭＳＣは、治療される特定の病態に応じて、静脈内、心筋内、経心内膜、硝子体内、又は筋肉内経路を介する注射若しくは局所移植を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の治療手段を使用して投与することが可能である。
【０２１４】
本発明の間葉系間質細胞は、局所移植を介して投与することが可能であり、ここでは送達装置が利用される。本発明の送達装置は、生体適合性かつ生体分解性である。本発明の送達装置は、生体適合性繊維、生体適合性糸、生体適合性発泡材、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、ポリアルキレン、シュウ酸塩、ポリアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミノ基を含有するポリオキサエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、バイオポリマー；ラクチド、グリコシド、ε−カプロラクトン、パラ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネートのホモポリマー及びコポリマー；ラクチド、グリコシド、ε−カプロラクトン、パラ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネートのホモポリマー及びコポリマー；線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン、ペプシンで処理されていないコラーゲン、他のポリマーと組み合されたコラーゲン、増殖因子、細胞外マトリックスタンパク質、生物学的関連ペプチド断片、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板強化血漿、インスリン増殖因子、増殖分化因子、血管内皮
細胞由来増殖因子、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド、テネイシン−Ｃ、ラミニン、抗拒絶剤、鎮痛剤、抗酸化剤、抗アポトーシス剤、抗炎症剤及び細胞増殖抑制剤を含む群から選択される材料を使用して製造することが可能である。
【０２１５】
特定の治療レジメン、投与の経路、及び補助療法は、特定の病態、業態の重度、及び患者の健康状態に基づいて調整され得る。ＭＳＣを含む医薬調製物の投与は、病態の症状の重症度を低減するために、及び／又は病態の症状の更なる編成を予防するために有効であり得る。
【０２１６】
本発明の治療手段は、ＭＳＣの単一用量の投与を含むことが可能である。あるいは、本明細書に記載されている治療手段は、ＭＳＣがある期間にわたって複数回投与される治療のコースを含んでもよい。治療の例示的コースは、毎週、隔週、毎月、年４回、半年ごと、又は年１回の治療を含むことができる。あるいは、治療は、複数回投与が初期に必要とされ（例えば、初めの１週間は１日１回投与）、その後、より少なく低頻度の投与回数が要求される。
【０２１７】
一実施形態において、血管芽細胞を培養することにより得られた間葉系間質細胞の調製物は、患者の一生を通じて、１回以上周期的に患者に投与される。本発明の他の実施形態において、主題のＭＳＣ（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成された）の医薬調製物は、１年に１回、６〜１２ヶ月毎に１回、３〜６ヶ月毎に１回、１〜３ヶ月毎に１回、又は１〜４週間毎に１回投与される。あるいは、特定の状態又は障害には、より頻繁な投与が望ましい場合がある。本発明の一実施形態において、主題のＭＳＣ（例えば、血管芽細胞を培養することによって生成された）の医薬調製物は、１回、複数回、患者の一生を通して周期的に、又は特定の患者及び治療される患者の病態の任意選択で、装置を介して投与される。同様に、時間とともに変化する治療レジメンも考えられる。例えば、治療開始時にはより頻繁な治療が必要とされ得る（例えば、毎日又は毎週治療）。時間と共に、患者の状態が改善するにつれて、より少ない回数の治療が必要とされ、又は更なる治療さえ必要でない場合もある。
【０２１８】
本発明によると、本明細書に記載されている間葉系幹細胞の静脈内投与によって、疾患又は状態が治療又は予防されることが可能である。いくつかの実施形態において、約２，０００万個、約４，０００万個、約６，０００万個、約８，０００万個、約１億個、約１億２，０００万個、約１億４，０００万個、約１億６，０００万個、約１億８，０００万個、約２億個、約２億２，０００万個、約２億４，０００万個、約２億６，０００万個、約２億８，０００万個、約３億個、約３億２，０００万個、約３億４，０００万個、約３億６，０００万個、約３億８，０００万個、約４億個、約４億２，０００万個、約４億４，０００万個、約４億６，０００万個、約４億８，０００万個、約５億個、約５億２，０００万個、約５億４，０００万個、約５億６，０００万個、約５億８，０００万個、約６億個、約６億２，０００万個、約６億４，０００万個、約６億６，０００万個、約６億８，０００万個、約７億個、約７億２，０００万個、約７億４，０００万個、約７億６，０００万個、約７億８，０００万個、約８億個、約８億２，０００万個、約８億４，０００万個、約８億６，０００万個、約８億８，０００万個、約９億個、約９億２，０００万個、約９億４，０００万個、約９億６，０００万個、約９億８，０００万個の細胞が静脈内注射される。いくつかの実施形態では、約１０億個、約２０億個、約３０億個、約４０億個又は約５０億個の細胞又はそれ以上が静脈内注射される。いくつかの実施形態において、細胞の数は、約２，０００万個〜約４０億個の細胞の間、約４，０００万個〜約１０億個の細胞の間、約６，０００万個〜約７億５，０００万個の細胞の間、約８，０００万個〜約４億個の細胞の間、約１億個〜約３億５，０００万個の細胞の間、及び約１億７，５００万個〜約２億５，０００万個の間に及ぶ。
【０２１９】
本明細書に記載されている方法は、当該技術分野において既知の方法を使用して、治療又は予防の有効性をモニタリングする工程を更に含んでもよい。
【０２２０】
キット
本発明は、本明細書に記載されている組成物のいずれかを含むキットを提供する。間葉系間質細胞の調製物が、当業者に既知である方法によって、並びに米国特許出願公開第２００２／０１０３５４２号明細書、欧州特許出願第ＥＰ１４５４６４１号明細書に記載されている方法を含める方法によって製造された送達装置内に封入され得るか、又は当業者に既知の方法、並びに米国特許第８，１９８，０８５号明細書、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００４／０９８２８５号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２／００７７１８１号明細書に記載されている方法を含める方法に従って保存される。本発明の一実施形態において、キットは、少なくとも約８×１０７個、８．５×１０７個、９×１０７個、９．５×１０７個、１×１０８個、１．２５×１０８個、又は１．２５×１０８個の血管芽細胞の培養から誘導された主題のＭＳＣの調製物を含む。別の実施形態において、約８×１０７個、８．５×１０７個、９×１０７個、９．５×１０７個、１×１０８個、１．２５×１０８個、又は１．２５×１０８個の主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成された）の調製物を含むキットが提供され、前記調製物は、医薬調製物である。本発明の更に他の実施形態において、約８×１０７個、８．５×１０７個、９×１０７個、９．５×１０７個、１×１０８個、１．２５×１０８個、又は１．２５×１０８個の主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成された）の医薬調製物を含むキットが提供され、前記医薬調製物は保存されている。本発明の更に他の実施形態において、約８×１０７個、８．５×１０７個、９×１０７個、９．５×１０７個、１×１０８個、１．２５×１０８個、又は１．２５×１０８個の主題のＭＳＣ（血管芽細胞を培養することによって生成された）の医薬調製物を含むキットが提供され、前記医薬調製物は、細胞送達ビヒクル内に収容されている。
【０２２１】
更に、このキットは、低温保存されたＭＳＣ又は低温保存されたＭＳＣの調製物、凍結ＭＳＣ又は凍結ＭＳＣの調製物、解凍された凍結ＭＳＣ又は解凍された凍結ＭＳＣの調製物を含んでもよい。
【０２２２】
様々な実施形態及び概念の組み合わせ
本明細書に記載されている実施形態及び概念は、組み合わせて使用することが可能であることを理解されたい。例えば、本発明は、ＭＳＣを生成する方法を提供し、この方法は、ＥＳＣから血管芽細胞を生成する工程、この血管芽細胞を少なくとも４日間培養する工程、この血管芽細胞を採取する工程、マトリゲルコーティングプレート上で血管芽細胞を再平板培養する工程、並びに本明細書に記載されている血管芽細胞を少なくとも１４日間培養する工程を含み、この方法は、ＥＳＣを実質的に含まない、少なくとも８，５００万個のＭＳＣを生成する。
【実施例】
【０２２３】
以下の実施例は、決して本発明を限定するよう意図するものではない。
【０２２４】
実施例１−ＭＳＣの血管芽細胞からの生成
血管芽細胞を、以下のように、ＥＳＣ系、ＭＡ０９［１６］に由来する、臨床段階の単一割球から生成した。
【０２２５】
まず初めに、モルフォゲン及び初期造血サイトカインの組み合わせ（具体的には、骨形態形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポイエチン（Ｔｐｏ）及びｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ））で補充された無血清培地中で培養さ
れたＭＡ０９  ＥＳＣから初期段階の細胞のクラスタを生成した。より具体的には、６−ウェルの組織培養処置プレートの１つのウェルから得たＥＳＣを、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ）で補充した３ｍＬのＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中、６ウェル超低接着表面プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１つのウェルに播種し、５％のＣＯ２で３７℃にてインキュベートした。細胞のクラスタが初めの２４時間で形成した。４０〜４８時間後に、培地の半分（１．５ｍｌ）を、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４、及び２０〜２２．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補充した新鮮なＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地で置き換え、更に４０〜４８時間インキュベーションを続けた（すなわち、合計で３．５〜４日）。
【０２２６】
細胞のクラスタを解離し、単一細胞を無血清半固体の芽球コロニー増殖培地（ＢＧＭ）中で平板培養した。具体的には、細胞のクラスタを０．０５％のトリプシン−０．５３ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、２〜５分間解離した。細胞懸濁液を上下にピペッティングし、次いでＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳを加え、トリプシンを不活性化させた。次いで４０μｍの濾過器に細胞を通過させて、単一細胞懸濁液を得た。次いで細胞を計数し、１〜１．５×１０６個細胞／ｍｌでＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中に再懸濁させた。
【０２２７】
単一細胞懸濁液（０．３ｍｌ、３〜４．５×１０５個の細胞）を、短時間ボルテックスしながら、２．７ｍｌの血管芽細胞増殖培地（上記記載のＨ４５３６ベースの培地配合）と混合し、５分間静置させた。次いで、１８Ｇの針を取り付けたシリンジ（３ｍｌ）を使用して、この細胞混合物を６ウェル超低接着プレートの１つのウェルに移し、５％ＣＯ２で３７℃にてインキュベートした。
【０２２８】
細胞のいくつかは、ブドウ様芽球コロニー（ＢＣ）に発達した。具体的には、ＢＣは３日目に見ることができ（典型的には、３日目の始めに１０個未満の細胞に含まれた）、４〜６日後には、ブドウ様ｈＥＳ−ＢＣは、顕微鏡下で容易に特定された（ＢＣ当たり１００個を超える細胞に含まれた）。培養中に存在するＢＣの数は、数日間を経て徐々に増加した。６〜７日後には、ＢＣは、開口ガラスキャピラリーを使用して採取することができた。
【０２２９】
血管芽細胞は、７〜１２日の間の培養物から採取することが可能であり、α  ＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ中、マトリゲルコーティング組織培養プレート上に再平板培養した。フローサイトメトリー分析は、典型的にＭＳＣ上で見出される５つの細胞表面マーカーの発現レベルが、開始時の血管芽細胞集団において比較的低いことを示している（図２、左側パネル、４つの実験の平均＋／−標準偏差）。しかしながら、ＭＳＣ増殖条件における３週間の培養後に、これら５つの特徴的なＭＳＣマーカーについて＞９０％の陽性に染色する均一な接着細胞集団が発生する（図２、右側パネル−２２〜２３日、４つの実験の平均＋／−標準偏差）。ＭＳＣ培養条件時に、ＭＳＣ表面マーカーを獲得するために細胞を分化させるのに要する時間の量は、使用される特定のＥＳＣ系、血管芽細胞を採取する日にち、及びマトリゲル上で平面培養される血管芽細胞の数に応じて異なる可能性がある。いくつかの実験において、マーカーは細胞の９０％で７〜１４日までに生じ、一方他の実験においては、この多くの細胞がこれらＭＳＣマーカーを獲得するために２２〜２４日を要する場合がある。
【０２３０】
上記実験に関連して、図１は、多能性細胞からのＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの生成、及び血管芽細胞を介してのＥＣＳからの間葉系間質細胞の生成の顕微鏡写真を示している。加えて、図２は、上記記載のように産生された多能性細胞由来血管芽細胞から得たＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの表現型を含む。この図は、最初の血管芽細胞集団中のＭＳＣ表面マーカーが陽性の細胞のパーセンテージ（グラフの左側、７〜１１日の血管芽細胞）及びマトリ
ゲルコーティングプレート上で血管芽細胞を培養後のＭＳＣ表面マーカーが陽性の細胞のパーセンテージ（グラフの右側）並びに血管芽細胞から誘導された間葉系間質細胞の顕微鏡写真（右側パネルの写真）を示している。更に、上記実験に関連して、図１７は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ生成のプロセス；及びマトリゲルの効果、すなわち、初期継代（すなわち、ｐ２）においてマトリゲルから細胞を取り出すことが、ｐ６までマトリゲル上で維持されたものと比較して、一時的にＭＳＣ増殖を遅くする可能性があるという効果を示している。
【０２３１】
図１８は、得られたＢＭ−ＭＳＣ及びＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが軟骨形成を受けることを示している。
【０２３２】
実施例２−ＥＳＣ及び血管芽細胞由来ＭＳＣの分化の比較
この実施例は、直接的分化（ここではＥＳＣがゼラチン又はマトリゲル上に直接的に平板培養された）又は血管芽細胞法（ここでは、実施例１に記載されているように、ＥＳＣが血管芽細胞にまず分化し、次いでマトリゲル上で平板培養された）のいずれかの２つの方法によるＥＳＣのＭＳＣへの分化の比較を記述する。ゼラチン上の直接的分化は、ＭＳＣ様細胞を発生するが、この細胞はＣＤ１０５の発現を欠如し、このことは、ＭＳＣの運命の不完全な選択を示唆している（図３、左側パネル）。ＥＳＣがマトリゲル上で直接的に平板培養された場合、得られた細胞はＭＳＣについて予想したようにＣＤ１０５を発現しなかった（図３の中央パネル）。しかしながら血管芽細胞法によって産生されたＭＳＣと比較すると、直接的に分化したＭＳＣ細胞は、集塊で増殖し、分裂する場合、分散することが難しく、等しい数のＥＳＣから出発する場合、同じ数のＭＳＣを生成することは殆どなかった（図４）。
【０２３３】
ＥＳＣから直接的に分化したＭＳＣもまた、特徴的なＭＳＣ細胞表面マーカーを獲得するためにより長い時間を要した（図５）。一旦ＭＳＣが得られると、拡大された免疫表現型検査は、両方法から得られたＭＳＣが、ＨＬＡ−ＡＢＣなどのＭＳＣ上で典型的に見出されるその他のマーカーについては陽性であるが、ＣＤ３４及びＣＤ４５などの血管芽細胞関連マーカーについては陰性であることを示している（図６）。これらの結果は、血管芽細胞の中間段階が、ＥＳＣからの均質のＭＳＣの堅調な産生を可能にすることを示唆している。これらの所見から、ＭＳＣに関する追加の試験が、血管芽細胞由来ＭＳＣを使用して行われるであろう。
【０２３４】
加えて、その結果が図３〜６、１３、１５、１６、１９、及び２１〜２７に含まれる実験（上記記載の）が、血管芽細胞由来ＭＳＣの特性に対比してＥＳＣ−ＭＳＣ又はＢＭ−ＭＳＣの特性を比較し、これら細胞が、これらの細胞及びそれらから誘導された組成物の治療有効性に影響を与える可能性がある有意差を示すことを明らかにしている。特に、図３は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）をゼラチンコーティングプレート上で培養後の（左側パネル）、ＥＳＣをマトリゲルコーティングプレート上で培養後の（中央パネル）、及び血管芽細胞をマトリゲルコーティングプレート上で培養後の（右側パネル）ＭＳＣ表面マーカーが陽性の細胞のパーセンテージを示している。更に、図４は、多能性細胞から産出されたＭＳＣを示し、図５は、間葉系間質細胞マーカーの獲得を図示し、並びに図６は、ＭＳＣマーカーの発現及び造血及び内皮細胞マーカーの発現の欠如を含める、異なる培養方法から誘導された間葉系間質細胞の表現型を示す。更に、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣを、効力及び阻害効果における（図１３）、Ｔｒｅｇ増殖の刺激における（図１５）、増殖能における（図１６）、ＰＧＥ２分泌における（図１９）、Ｓｔｒｏ−１及びＣＤ１０発現（図２１〜２２）、継代中のサイズの維持における（図２３）、ＣＤ１０及びＣＤ２４発現における（図２４）、Ａｉｒｅ−１及びＩＬ−１１発現における（図２５）、Ａｎｇ−１及びＣＸＣＬ１発現における（図２６）、並びにＩＬ６及びＶＥＧＦ発現における（図２７）顕著な差異を検出するためにアッセイした。
【０２３５】
実施例３−その他の細胞型へ分化する血管芽細胞から誘導されたＭＳＣ
ＭＳＣは、定義によって、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞を生じることが可能でなければならない。標準法を使用して、図７は、血管芽細胞由来ＭＳＣの脂肪細胞及び骨細胞に分化するための能力を示し、一方図８は、軟骨細胞特異的遺伝子の発現を介しての、軟骨細胞に向かうそれらの分化の能力を示し、並びに図１８は、ペレット集団培養のサフラニンＯ染色を介しての、軟骨細胞に向かうそれらの分化の能力を示している。
【０２３６】
血管芽細胞から誘導されたＭＳＣは、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化することが予想される。これら分化の経路は、当該技術分野において以前報告された方法を使用して検討することが可能である。Ｋａｒｌｓｓｏｎら著、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：３９−５０（２００９年）（血管芽細胞由来及び直接ＥＳＣ由来のＭＳＣの脂肪細胞及び骨細胞への分化に関する）を参照されたい。特に、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣは、脂肪細胞及び骨細胞に分化するための能力を含める分化能を示す（図７）。軟骨細胞への分化については、このプロセスを研究し、軟骨細胞特異的遺伝子（例えば、アグリカン及びコラーゲンＩＩａ）の獲得並びにサフラニンＯ、アルシアンブルー、及び／又はトルエンブルー染色を通してのグリコサミノグリカン沈着を引き続き検討するために、Ｇｏｎｇら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２４：６６４−６７１（２０１０年）からの方法が適合された。特に、ＭＡ０９  ＥＳＣ血管芽細胞由来間葉系間質細胞の軟骨形成分化は、アグリカン（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン１）及びコラーゲンＩＩａのｍＲＮＡ発現により検出した（図８）。文献では、これら３つの細胞型（ＭＳＣから誘導された脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞）は、免疫刺激性ＨＬＡ  ＤＲ分子を発現することが報告されている（Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ２００３年、Ｇｏｔｈｅｒｓｔｒｏｍ  ２００４年、Ｌｉｕ  ２００６年）。これらの報告された観察を確認するためには、これらの完全に分化したＭＳＣ細胞型で免疫染色法及び／又はフリーサイトメトリーを実施することが考えられる。このことは、生体内環境におけるＭＳＣの分化が宿主受容者から免疫応答を誘発しないことを確認するために重要である。これら３つの細胞型の中では、スポーツ損傷、老化による関節痛、骨関節炎に対する軟骨置換療法で使用されるその能力のために、軟骨形成分化が特に重要であり得る。このような療法については、ＭＳＣは、治療的に使用されるために、ＭＳＣは軟骨細胞に完全に分化することは必ずしも必要ではない。
【０２３７】
実施例４−血管芽細胞から誘導されたＭＳＣが実質的にＥＳＣを含まないことの確認
ＭＳＣはまた、ＥＳＣの奇形腫を形成する性向を欠如せねばならない。ＭＳＣは、１２継代までに（培養中で約５０日まで）正常な核型を含有することが確認された（データ図示せず）。芽球由来ＭＳＣが微量のＥＳＣも含有しないことを確認するために、奇形腫形成アッセイをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて実行した。５×１０６個のＭＳＣを、３匹のマウスの左大腿筋に皮下注射した。ＣＴ２  ＥＣを陽性対照として使用し、ＥＳＣＣ注入マウスに対比してＭＳＣ注入マウスにおける奇形腫形成を比較するために、マウスを６週間にわたってモニタリングした。ＭＳＣを注射されたマウスにおいて、奇形腫は形成されなかった。
【０２３８】
実施例５−血管芽細胞から誘導されたＭＳＣによるＥＡＥスコアの減少
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスで実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を血管芽細胞由来ＥＳＣ−ＭＳＣを使用して治療するためのパイロット試験を行った。ＥＡＥは、マウスの側腹部に、アジュバント油（ＣＦＡ）中、５０ｐｇのＭＯＧ（３５−５５）ペプチド及び２５０ｐｇの結核マイコバクテリア（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の１００ｐＬのエマルジョンで０日目に注射し、このマウスは、５００ｎｇの百日咳毒素で腹腔内注射した。６日後に、マウスに、ＰＢＳ中１００万個のＥＳＣ−ＭＳＣ（ｎ＝３）又は対照としてビヒクル（ｎ＝４）のいずれかを腹腔内注射した。免疫化後２９日間にわたって、この動物の臨床スコアを記録した。疾患スコアの大幅な減少が観察された（データ図示せ
ず）。
【０２３９】
実施例６−ＥＡＥ治療における血管芽細胞由来ＥＳＣ−ＭＳＣの有効性の確認及び疾患の追加の動物モデルの使用
Ａ．マウスのＥＡＥモデルにおけるＥＳＣ−ＭＳＣ試験がそれらの抗ＥＡＥ効果を確認する。
実施例５で得られた結果を確認するために、追加の試験を、動物の数を増やし、細胞用量を種々変えて、異なる投与プロトコールで、並びにより多くの対照で実行する。臨床スコア及び死亡率を記録する。マウスの脳及び脊髄中のリンパ球の浸潤の程度もまた評価される。ＭＳＣの抗ＥＡＥ効果は、Ｔｈ１７細胞の抑制などの免疫抑制活性に関与すると一般的に考えられ、ＣＮＳ中のリンパ球浸潤の程度を低減することが予想される。
【０２４０】
Ｂ．マウス骨髄（ＢＭ）−ＭＳＣ、ヒトＢＭ−ＭＳＣ及びヒトＵＣＢ−ＭＳＣとＥＳＣ−ＭＳＣを比較する。
マウスＢＭ−ＭＳＣは、最初にＥＡＥ治療に使用され、徹底的に研究がなされた［１］。（それらの異種間の性質があるとすれば）ＥＳＣ−ＭＳＣは、抗ＥＡＥ有効性についてネズミＢＭ−ＭＳＣと直接的に比較することが可能である。ヒトＵＣＢ−ＭＳＣもまた、免疫抑制活性を有することが示されている［１９］。ヒトＵＣＢ−ＭＳＣ及びヒトＢＭ−ＭＳＣの抗ＥＡＥ活性もまた、ＥＡＥマウスモデルにおいてＥＳＣ−ＭＳＣの抗ＥＡＥ活性と比較することが可能である。これら多様な細胞型の年齢及び継代は、これらの抗ＥＡＥ挙動に影響を及ぼす可能性があり、したがって、本出願人らは、ＥＡＥマウスモデル系におけるＭＳＣの有効性に及ぼす年齢の因果関係も評価するつもりである。
【０２４１】
Ｃ．ＥＳＣ−ＭＳＣの投与用量、経路、及びタイミングを最適化する。
ＥＳＣ−ＭＳＣの注射は、免疫化後２９日以内で記録されたように、ＥＡＥのスコアを低減することができる。疾患の長期にわたる予防及び治癒を試験するためには、ＥＳＣ−ＭＳＣが種々の容量、経路、及び時間で投与されることが可能である。
【０２４２】
ＭＳＣは、Ｈ１ｇｆｐ  ＥＳＣから生成され、これらがＭＳＣ段階でなおＧＦＰを発現することが確認されている。ＥＡＥマウスはこれらＧＦＰ＋ＥＳＣ−ＭＳＣで注射することができ、これらの分布をＸｅｎｏｇｅｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、生体内で追跡することができる。これらのアプローチを通して、ＥＳＣ−ＭＳＣの種々の投与用量、経路、及びタイミングが分析され、ＭＳＣの抗ＥＡＥ活性についての作用のメカニズム（すなわち、膵臓又は内分泌効果）、マウス体内のＭＳＣの寿命並びにＭＳＣ生体分布、及び排泄／排除の経路に関する情報を提供されるであろう。
【０２４３】
抗ＥＡＥ効果は、臨床スコアの低減、生存率の増加、及び／又はリンパ球浸潤の退行並びにＣＮＳの脱髄の１つ以上によっては反映され得る。異なるＥＳＣ系は、ＭＳＣを生成するための異なる固有の能力を有する場合がある。したがって、複数のＥＳＣ系をこの試験において使用することが可能であり、ＭＳＣマーカーの獲得は、経時的にモニタリングされ、各ＥＳＣ系について比較されることができる。ＥＳＣ−ＭＳＣを使用する実験間のばらつきを更に低減するために、凍結ＥＳＣ−ＭＳＣの多量の在庫がアリコートで製造されることが可能であり、アリコートの各在庫が、複数の実験で使用することが可能である。
【０２４４】
Ｄ．その他の疾患モデルにおいて血管芽細胞由来ＭＳＣの有効性を確認する。
上述したように、ＭＳＣはまた、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び眼障害（ブドウ膜炎）などの他の型の自己免疫性疾患に対して治療的活性を有することが可能である。これらの疾患についての動物モデルは現存し、当該技術分野において周知である（例えば、Ｐｉｚａｒｒｏら著、２００３年、Ｄｕｉｊｖｅｓｔｅｉｎら著、２０１１年、Ｌｉａｎｇら
著、２０１１年、Ｃｏｐｌａｎｄら著、２００８年を参照）。生体内試験は、これら動物モデル系の１つ以上でＭＳＣの治療的有用性の評価を含むように拡大されることが可能である。このようなモデルは、注射された動物の血清を単離しかつヒトサイトカインについてスクリーニングすることによって、本出願人らがヒトＭＳＣのサイトカイン分泌プロファイルを検討することを可能にすることができる。特に、ブドウ膜炎のモデルは、局所的硝子体内注射が、本出願人らが非全身的な環境でＭＳＣの効果を研究することを可能にすることができるために、有用であり得る。
【０２４５】
ＭＳＣはまた、関節軟骨の損失及び冒された関節の炎症を含める、骨関節炎状態を治療する上で大きな治療的有用性を有することが可能である（Ｎｏｔｈら著、２００８年）。骨関節炎、軟骨損失及び関節炎症を検討するためのモデルも当該技術分野において周知である（例えば、Ｍｏｂａｓｈｅｒｉら著、２００９年を参照）。これらの試験のいくつかにおいて、ＭＳＣが炎症の低減及び／又は軟骨の修復に関して局所的、非全身的な治療的効果を有するかどうかを決定するために、ヒトＢＭ−ＭＳＣは、半固体骨格又はミクロスフィア内にカプセル化され、ヒト対象の冒された関節に移植される（Ｗａｋｉｔａｎｉら著、２００２年）。このような方法は、本出願人らのＥＳＣ血管芽細胞由来ＭＳＣの変性関節状態を治療するための治療的有用性を決定する上で補助するであろう。
【０２４６】
注射されたＭＳＣの予想寿命は、非常に短く［８］、このことは、移植細胞の長期生存は必要とされないことを示唆している。したがって、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣ−ＭＳＣ（例えば、照射された又はミトマイシンＣで処置された）もまた、上述された動物モデルにおいて、抗ＥＡＥ効果又はその他の抗疾患効果について試験され得る。そうである場合、生ＥＳＣ−ＭＳＣは必要とされ得ず、したがって、移植されたＥＳＣ−ＭＳＣ中の潜在的に残留するＥＳＣ混在物からの生物学的安全性の懸念を更に低減する。
【０２４７】
Ｅ．結果
異なるドナー由来ソースから得たＭＳＣ（マウスＢＭ−ＭＳＣ、ヒトＢＭ−ＭＳＣ、及びヒトＵＣＢ−ＭＳＣ）は、抗ＥＡＥ効果を保持することが予想される。しかしながら、これらの効果は、ＭＳＣがドナー限定ソースから得られるために、実験間で変動する可能性がある。これとは対照的に、本開示のＥＳＣ−ＭＳＣは、より一貫した効果を有することが可能である。多くの細胞表面マーカーがＭＳＣを特性評価するために使用され、全てのＭＳＣが全てのマーカーを発現するわけではないので、ＭＳＣの有効性を異なるソースから比較するために、ＣＤ７３＋及びＣＤ４５−などのマーカーのサブセットを使用することが可能である。
【０２４８】
ＥＳＣ−ＭＳＣは、クローン病、潰瘍性大腸炎、及びブドウ膜炎（これらが自己免疫性成分及び炎症反応を含有するために）の動物モデルにおける治療的有用性を有することが予想される。
【０２４９】
有糸分裂不活性化ＭＳＣ（例えば、照射された若しくはミトマイシンＣ不活性化ＭＳＣ又はＥＳＣ−ＭＳＣ）は、これらがサイトカインをなお分泌し、免疫抑制機能に関連する細胞表面マーカーを発現するために、免疫抑制機能を少なくとも部分的に保持することができる［２９］。しかしながら、これらの効果は、これらの生体内の短くなった寿命のために低減する可能性がある。もしそうであるならば、照射された、又は別の方法で有糸分裂不活性化された細胞の用量及び投与頻度は、免疫抑制機能を増強するために、増加させることが可能である。有糸分裂不活性化ＭＳＣ及びＥＳＣ−ＭＳＣは、これらがサイトカインをなお分泌し、免疫抑制機能に関連する細胞表面マーカーを発現するために、免疫抑制機能を少なくとも部分的に保持することができる［２９］。しかしながら、これらの効果は、生体内でのこれらの短くなった寿命のために低減する可能性がある。もしそうであるならば、有糸分裂不活性化細胞の用量及び投与頻度は、免疫抑制機能を増強するために
、増加させることが可能である。
【０２５０】
ＥＡＥを治療するための第２のパイロット試験を行った。８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、皮下注射を介して、完全フロイントアジュバント中のＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫化した。これは、百日咳毒素の腹腔内注射と併用して行われた。６日後に、マウス１匹当たり１００万個の生（又は２００万個の照射された）血管芽細胞由来多能性細胞兼用系間質細胞を腹腔内注射した。疾患重症度を、以前に公開されたように、マウスの足／胴体の運動を監視することによって、０〜５のスケールで採点した。結果は、４継代の血管芽細胞由来多能性細胞間葉系間質細胞及び照射された血管芽細胞由来多能性細胞兼用系間質細胞によって、ビヒクル対照と比較して、臨床スコアの著しい減少を示している（データ図示せず）。両パイロット試験についての採点は、以下のプロトコールに従って実行された：１のスコアは尾部の引きずりを示し、２は後ろ足の部分的麻痺を示し、３は後ろ足の完全な麻痺であり、４は後ろ足の完全麻痺及び前足の部分的麻痺であり、５は瀕死の状態である。
【０２５１】
加えて、本発明によるＭＳＣ及びこれらから誘導された生成物の異なる療法において使用されるための有効性は、企図された治療適応症に応じて、その他の動物モデル、例えば、その他の移植又は自己免疫性モデルで確認することが可能である。
【０２５２】
実施例７−ＥＳＣ−ＭＳＣの機能的構成成分の検討
ＭＳＣは、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ１３及びＨＬＡ−クラスＩ（ＡＢＣ）を発現するプラスチック接着細胞として定義することが可能であるが、一方、これと同時に、非誘導状態で培養される場合（例えば、サイトカインを含まない定型的なαＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ中で培養される場合）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａ及びＣＤ３１が陰性である。これらの条件下では、ＭＳＣは細胞内ＨＬＡ−Ｇを発現し、ＣＤ４０及びＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲ）が陰性でなければならない。機能的には、このような細胞はまた、標準生体内培養アッセイで評価されるように、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化することが可能でなければならない。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）による刺激から７日後に、ＭＳＣは、それらの細胞表面上にＨＬＡ−Ｇを、並びにそれらの細胞表面上にＣＤ４０及びＨＬＡ−クラスＩＩ（ＤＲ）を発現せねばならない。これらの必要条件にもかかわらず、ＥＳＣの多能性のために、いかなるソースから誘導されたＭＳＣもいくらかの不均質性を含有する場合があり、ＥＳＣから誘導されたＭＳＣ培養物は、３種の胚葉からの任意の系統の細胞を含有することができる。本明細書に記載されている培養系は、細胞の＞９０％が上述の免疫表現型及び機能的特性を日常的に示すことを示唆しているが、ＭＳＣ培養内の細胞の一部のサブ集団はＭＳＣ細胞表面マーカーの１つ以上の発現を欠如して存在し又は不在であるべきマーカーの１つ以上を発現することもある。混在する不均質性の程度を決定するために、本発明のＭＳＣ培養中のこのようなサブ集団の存在範囲が検討される。上述のマーカー間の重複を決定するために、多色フローサイトメトリー（同時に８色以上）を、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターで実行することが可能である。これはまた、最も大きな免疫抑制活性に必要とされる正確な細胞表面マーカープロファイルを正確に示すためにも役立つことができる。
【０２５３】
Ａ．免疫抑制効果と関連付けてＥＳＣ−ＭＳＣの分化段階、サブ集団、及び活性状態を特性化する。
ＥＳＣ−ＭＳＣを採取するために大きな時間窓（例えば、ＭＳＣ分化培地中で少なくとも１４日〜２８日）が存在する（例えば、図１を参照）。いくつかの試験は、ＭＳＣがそれらの免疫抑制機能を喪失する傾向性があり、これらが連続的に継代するにつれて古くなり、長期の培養の間に老化することを示している。このように、この細胞は、ＭＳＣ培地中の所定日数が、より大きな免疫抑制活性を与えるかどうかを決定するために、異なる時
点の活性で採取することが可能である。事実、初期の時点（例えばＭＳＣ培養条件において１４日目）で回収されたＭＳＣは、特徴的なＭＳＣ細胞表面マーカーの全てをまだ完全に獲得していないが、非常に強力な免疫抑制効果を保持する前駆体細胞を含有することが可能である。潜在的に有用なＭＳＣ前駆体集団を画定するために、広範囲の細胞表面マーカーの発現が、ＭＳＣ分化プロセス全体を通して、７日〜２８日にわたって追跡される。培養物の少なくとも５０％が、ＭＳＣ培養条件の１４日以内で細胞表面マーカーＣＤ３０９（別名として、ＶＥＧＦＲ２、ＫＤＲを含む）を獲得するであろう。ＣＤ３０９は、出発血管芽細胞集団で大部分は不在である（図９、第１の時点、ｄ７及び８で採取されたＭＡ０９血管芽細胞）が、ＭＳＣ培養条件の最初の２週間以内に発生し、２８日までに細胞の５％未満まで再度低下する（図９、第２、第３、及び第４）。このパターンは、ＭＡ０９血管芽細胞由来ＭＳＣのみならず、ＭＡ０１、Ｈ１ｇｆｐ、及びＨ７  ＥＳＣから得たものでも生じることが認められている。これら実験において、血管芽細胞は、それらの採取日数に無関係に（６日〜１４日）、ＣＤ３０９について常に陰性である。しかしながら、ＣＤ３０９発現を獲得するＭＳＣに発達するパーセンテージは、より古い血管芽細胞（例えば、ｄ１０又はｄ１２の割球）から発達する場合、低減する可能性がある。同様な様式で、血管芽細胞由来ＭＳＣの増殖特性は、血管芽細胞の採取日数に応じて異なる可能性があることが観察されている。より若い血管芽細胞（６日又は７日）から発達するＭＳＣは、より古い（ｄ８〜１２）血管芽細胞から発達するＭＳＣと同じように力強く増殖し続けることはない。血管芽細胞採取の最適日数は、これらが２８日及びそれ以降を通して増殖するための力強い能力をなお維持しつつ、ＭＳＣ発達の代理マーカーとしてＣＤ３０９の適切な獲得を可能にすることができるために、中間の日数（８日〜１０日）であり得る。ＭＳＣ前駆体発達のこれら態様を最適化するための試験が進行中である。
【０２５４】
ＭＳＣに対して最も典型的なマーカーであることが証明されているＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３（ＭＳＣの最小分類としてのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら著、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ８（４）：３１５−３１７（２００６年）に記載されているような）を除いて、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７１、ＶＣＡＭ、及びＩＣＡＭなどの上述されていない多くの他の細胞表面分子もまたＭＳＣマーカーとして提案され又は使用されてきた［２２］。したがって、ＥＳＣ−ＭＳＣは、血管芽細胞からの分化の間にその他のマーカーの様々な組み合わせを発現するサブ集団を含有できることが可能であり、これらは多様な免疫抑制活性を有することが可能である。サブ集団は、生体外又は生体内の方法を使用して、それらの免疫抑制活性を比較するための分析に、１つ以上のマーカー（単独で又は組み合わせて）に基づいて分類され得る（例えば、ＦＡＣＳを使用して）。
【０２５５】
Ｂ．大量の機能的ＥＳＣ−ＭＳＣを得るために分化及び増殖条件を最適化する。
予備実験が、ＭＳＣはＩＭＤＭ＋１０％熱不活性化ヒト血清中で維持され得ることを示してはいるが、本出願人らは、この培地中のこれらの派生物をまだ試験していない。異なる培養条件が、代替培養成分（例えば、基礎培地、血清源、血清代替製品、ヒト血清血小板溶融物）が本明細書に記載されている有効なサブ集団を富化させることができるかどうかを決定するために試験することが可能である。ＥＳＣを培養しかつＭＳＣを調製するための動物を含まない異なる基本培地及び定義された培養システム（ＦＢＳなしの）が評価されるであろう。具体的には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＭＳＣ  ＳＦＭ、及びＬｏｎｚａから入手可能なＭＳＣＭビュレットキットを使用して、無血清の定義された培養系がＥＳＣ−ＭＳＣを所望の品質及び量で生成するかどうかを決定するであろう。更に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、及びＴＧＦＩ３などの様々な増殖因子、並びにシグナル伝達経路又は細胞構造を調節する小化学物質を使用して、ＥＳＣ−ＭＳＣの品質及び量を増強することが可能である。
【０２５６】
Ｃ．結果
ＥＳＣ−ＭＳＣは、典型的なマーカーＣＤ７３（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ［２６］）、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現する。更に、図２０は、本発明により産生されたＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣが、それらの表現型を経時的に維持する（経時的及び連続的継代にわたって異なるＭＳＣ集団のフローサイトメトリー分析中に検出されるマーカー発現に基づいて）ことを示している。
【０２５７】
実施例８−ＥＳＣ−ＭＳＣによる免疫抑制のメカニズム
Ａ．ＥＳＣ−ＭＳＣが、Ｔ細胞によって仲介される適応免疫応答をどのように抑制し得るかを試験する。
ＰＢＭＣ内のＴ細胞の一般的な応答は、これらがフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）又はホルボールミリスチン酸酢酸（ＰＭＡ）／イオノマイシンなどの有糸分裂刺激物質によって誘導される場合、又はこれらが樹状細胞などの抗原提示細胞に遭遇する場合、増殖することである。このことは、混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の全般的な増殖によって最適に例示される。以前の試験は、ＭＬＲアッセイにおいて、ＭＳＣがＴ細胞増殖を抑制できることを示唆している。
【０２５８】
化学的刺激（ＰＭＡ／イオノマイシン、図１０ａ及び１３ａ）（ＰＨＡ、図１３ｂ）又はＡＰＣ（樹状細胞、図１０ｂ及び１３ｃ）への暴露のいずれかによって引き起こされる本発明のＥＳＣ−血管芽細胞由来ＭＳＣのＴ細胞増殖を阻害する能力を検討した。ＭＳＣは、化学的刺激又はＡＰＣとの共培養のいずれかに起因して、Ｔ細胞の増殖応答を減衰すること、並びにこの抑制が、用量依存的様式で生じることを観察した（図１０ｂ、右側のグラフ）。更に、有糸分裂不活性化ＭＳＣ（図１０ｂ）が、Ｔ細胞増殖を生ＭＳＣと同程度まで抑制することが可能であることを見出し、このことは、有糸分裂不活性化ＭＳＣが免疫抑制のために生体内で十分に有用であり得ることを示唆している。
【０２５９】
Ｔ細胞の様々な機能的サブセットが現存し、これらは炎症誘発性応答、抗炎症応答、又はＴ細胞アネルギーの誘導に関与する特異的役割を実行する。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、天然発生型の免疫抑制Ｔ細胞であり、通常の設定において、過敏性の自己反応性Ｔ細胞応答を減衰させる役割を果たしていると考えることができる。これらは、通常、身体のＴ細胞の極一部ではあるが、それらの分布状況は、様々な環境因子によって影響され得る。ＭＳＣは、Ｔｒｅｇ細胞の誘導を通して、末梢免疫寛容を誘導することが示されている［３３〜３５］。
【０２６０】
短期間の５日間の共培養アッセイにおいて、以前の試験と同様に、血管芽細胞由来ＭＳＣは、ＩＬ２刺激に応答して誘発されるＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性Ｔｒｅｇのパーセンテージを増加させることが可能であることが認められた（図１１ａ、１４、１５ａ）。非接着末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得た混合Ｔ細胞集団とＭＳＣとの共培養（１０ＰＢＭＣ：１  ＭＳＣの比で）は、ＭＳＣがＩＬ２誘導培養中に含まれる場合、Ｔｒｅｇ誘導はほぼ倍加されたことを示す。このＴｒｅｇ誘導の程度は、Ｂｌｏｏｄ、２００５で公開された、非常によく引用されたＡｇｇａｒｗａｌらの試験で観察されたものと同様である。ＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性集団内で誘導されたＦｏｘＰ３の量は、これらが実際の真のＴｒｅｇであることを確認するために検討された（図１５ｂ）。細胞内フローサイトメトリーを、ＩＬ２誘導Ｔ細胞培養中のＭＳＣの不在下及び存在下のＦｏｘＰ３誘導を試験するために使用した。非接着ＰＢＭＣ及び精製ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の双方は、これらのアッセイにおいてＴｒｅｇ誘導を試験するために使用することができる。理論によって束縛されようとするものではないが、ＥＳ−ＭＳＣは、これらがＢＭ−ＭＳＣよりも効果的にＣＤ２５の発現を増加させるために、Ｔｒｅｇを誘導する上でより効果的である（図１５ｂ）。
【０２６１】
Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞は、ＭＳ及び他の自己免疫性疾患において重要な役割を果たすと考えられている。Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化及び機能が、インビトロアッセイを使用して、最初に分析され；これらはまた、ＥＡＥモデル又は本発明で使用することが可能であるその他の動物モデルにおいて検討することが可能である。生体外でのＴｈ１に及ぼすＭＳＣの効果は、検討が開始されている。無感作ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴｈ１特定を促進する培養条件は、当該技術分野において既知である（Ａｇｇａｒｗａｌら）。これら培養条件（ヒトＩＬ３及びＩＬ１２と共に抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ４抗体を含有する）を、ＭＳＣの不在下又は存在下で、無感作の非接着ＰＢＭＣからＴｈ１細胞を誘導するために使用した（１０ＰＢＭＣ：１  ＭＳＣ）。共培養の４８時間後に、非接着細胞を単離し、濯ぎ、新しいウェル中でＰＭＡ／イオノマイシンで１６時間にわたって刺激した。１６時間の誘導の後に、上清を回収し、Ｔｈ１サイトカインのＩＦＮγを分泌について分析した。予測されたように、４８時間のＴｈ１誘導条件においてＭＳＣと共に培養されたＰＢＭＣは、ＭＳＣなしに培養されたものほど多くのＩＦＮγを産生しないことが認められた。このことは、ＭＳＣが主要なＴｈ１細胞機能、すなわち、ＩＦＮγ分泌を抑制することが可能であることを示唆している（図１１ｂ）。同様な試験が、生体外でＴｈ１７細胞を分化させ、培養上清に関するＥＬＩＳＡアッセイを使用して、炎症誘発性ＩＬ１７の分泌に及ぼすＭＳＣの効果を決定することにより実行されるであろう。
【０２６２】
Ｔｈ２細胞は、ＩＬ４などの抗炎症効果を有するサイトカインを分泌することが知られている。ＭＳＣは、Ｔｈ２の分化及びＩＬ４の分泌を増強することが可能であり得る。Ｔｈ１細胞についての上記記載の試験と同様に、Ｔ細胞を含有する無感作ＰＢＭＣからＴｈ２の分化を刺激するために、Ｔｈ２誘導条件を４８時間の培養系で使用するであろう。ＩＬ４分泌に及ぼすＭＳＣ共培養の効果は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して検討されるであろう。
【０２６３】
最近、ＣＤ８  Ｔ細胞が、ＥＡＥモデル及びＭＳの根本的なメカニズムにおいて中心的役割を果たすことも示唆されている［３０］。本発明者は、生体外でのＥＳＣ−ＭＳＣとの共培養がＣＤ８  Ｔ細胞の機能に影響を及ぼすことができるかどうかを検討する。これを行うためには、非接着ＰＢＭＣ又は精製ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＡＰＣの使用を介して、ＥＡＥ関連ＭＢＰ１１０−１１８ペプチドに暴露されると考えられる。これが、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を出現させ、このような集団は、ＣＤ３／ＣＤ２８エクスパンダビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、活発に増殖させることが可能であろう。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は、フローサイトメトリーにおいて、ＭＢＰ−ペプチドに特異的なペンタマー試薬（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）を使用して確認することが可能である。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活発な増殖及びＩＦＮγの分泌の双方を含む、抗原特異的免疫応答を誘導するためにＭＢＰ１１０−１１８装填ＡＰＣによる再刺激が実行されるであろう。ＭＳＣの不在下又は存在下で培養されたＴ細胞からの応答を比較し、ＭＳＣがこれら細胞障害性ＥＡＥ関連抗原特異的Ｔ細胞の誘導を抑制することが可能であるかどうかを決定する。ペンタマー特異的フローサイトメトリー（ＢｒｄＵ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＥＬＩＳＡアッセイが、この目的で使用される。
【０２６４】
Ｂ．炎症因子及び細胞間接着分子がＥＳＣ−ＭＳＣの免疫抑制効果に寄与するかどうかを決定する。
ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、ＩＤＯ、一酸化窒素（ＮＯ）、及びＩＣＡＭが、ＭＳＣの免疫抑制機能に重要であることが示されている［７］。ＥＳＣ−ＭＳＣによるこれら分子の分泌及びＩＣＡＭの発現が、ＥＬＩＳＡアッセイ及びフローサイトメトリーを使用して検討されるであろう。
【０２６５】
炎症誘発性サイトカイン、ＩＦＮγがＭＳＣの活性化には必要とされ［２３］、ＬＰＳ及びポリ（Ｉ：Ｃ）などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）についての様々な作動薬が、ＭＳ
Ｃの異なるサブセットを誘導することができること［２４］が示されている。例えば、ＩＦＮγ活性化ＭＳＣは、未処理のＭＳＣよりも大腸炎のマウスモデルにおいて大きな治療的有効性を有することが最近示されている（Ｄｕｉｊｖｅｓｔｅｉｎら、２０１１年）。ＭＳＣ特性に及ぼすＩＦＮγのこの効果は、検討が始められている。ＥＳＣ−ＭＳＣが生体外にてＩＦＮγで７日まで処理され、細胞表面マーカーの発現における著しい変化がもたらされている。これら試験結果は、以前の試験（Ｇｏｔｈｅｒｓｔｒｏｍら著、２００４年、Ｒａｓｍｕｓｓｏｎら著、２００６年、Ｎｅｗｍａｎら著、２００９年）で行われた観察と一致し、血管芽細胞由来ＥＳＣ−ＭＳＣが体部から単離されたＭＳＣと同様に機能することを立証している。例えば、休止状態において、ＭＳＣは、それらの細胞表面上で多量のＨＬＡ  Ｇを発現しないが（＜１０％）、免疫耐性ＨＬＡマーカーのこの特殊な部類の細胞内貯蔵所を保有する。７日間のＩＦＮγ処理の際に、ＨＬＡ  Ｇは細胞表面で容易に検出され（図１２）、分泌されるよう誘導することも可能である（まだ試験されていない）。更に、ＩＦＮγ処理は、細胞表面においてＣＤ４０発現及びＨＬＡ  ＤＲ発現のアップレギュレーションを引き起こす（図１２）。これら変化は、これらの免疫抑制効果を増強させることを提唱する。例えば、本出願人らは、上記記載のインビトロ共培養アッセイを使用して、ＩＦＮγでのＭＳＣの前処理がＴｒｅｇ集団を誘導し、ＩＦＮγのＴｈ１分泌を抑制し、又はＴｈ２細胞からのＩＬ分泌を増強させるこれらの能力を強化することができるかを検討するつもりである。ＩＦＮγはまた、ＭＬＲアッセイにおいて、一般的なＴ細胞増殖を阻害するＭＳＣの能力に影響を与える可能性がある。ＴＮＦα、ＬＰＳ、及び／又はポリＩ：Ｃが、これらのタイプのＭＳＣ免疫抑制特性に及ぼす影響もまた試験することも可能である。
【０２６６】
Ｃ．結果
機能的Ｔｒｅｇが誘導刺激に応答して、転写因子の発現をアップレギュレートすることが報告されているように、ＭＳＣから誘導されたＴｒｅｇのＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性集団もまた、転写因子ＦｏｘＰ３を発現することを示した（図１５ｂ）。
【０２６７】
ＭＳＣは、Ｔｈ１７細胞によるＩＬ１７の炎症誘発性分泌をある程度まで阻害すること、並びにＭＳＣが、抗炎症性Ｔｈ２細胞によるＩＬ４分泌を著しく増強させることが可能であることが予想される。このような観察は、以前の試験で行われており、血管芽細胞由来ＭＳＣの真の機能性を確認する上で補助すると考えられる。
【０２６８】
このＥＳＣ−ＭＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原誘導活性化を少なくとも部分的に阻害するべきである。ＥＳＣ−ＭＳＣ共培養後のＮＫ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞の機能もまた検討することが可能である。これらその他のタイプの免疫細胞による成熟、細胞障害性、及び／又は特異的サイトカイン産生に及ぼすＥＳＣ−ＭＳＣの効果も検討されるであろう。
【０２６９】
例えば、図１１Ａの実験は、血管芽細胞由来間葉系間質細胞が、ＩＬ２刺激に応答して誘導されるＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性Ｔｒｅｇのパーセンテージを増加させることを示している。更に、図１２の実験は、炎症誘発性サイトカインＩＦＮｇが、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣ表面マーカーにおける変化を刺激すること、並びにインターフェロンγが、ＭＳＣ表面マーカー発現における変化を刺激し、ＭＳＣ免疫抑制効果を増強し得ることを示している。
【０２７０】
更に、図１４の実験は、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣがＴｒｅｇ誘導を増強すること、特に、初期継代ＭＳＣが後期継代ＭＳＣよりも大きな影響を有したことを示している。非接着ＰＢＭＣ（異なるドナー）を、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの不在下又は存在下で、ＩＬ２の有無で培養した。ＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性Ｔｒｅｇのパーセンテージを、フローサイトメトリーにより評価した。若い（ｐ６）又は古い（ｐ１６〜１８）ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳ
Ｃを使用した。黒棒は、６つの実験の平均値を示している。ＭＳＣは、全体として、Ｔｒｅｇの誘導に関して統計的に有意な効果を有した（ｐ＝０．０２）。
【０２７１】
実施例９−ＥＳＣ−ＭＳＣはＢＭ−ＭＳＣよりも増加した効力及び大きな阻害効果を有する
異なるＭＳＣ集団がＴ細胞増殖を阻害する異なる能力を有するかどうかを決定するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを実行した。結果は、ＥＳＣ−ＭＳＣは、マイトジェン刺激（「一方向」ＭＬＲ）（図１３ａ及び１３ｂ参照）又は抗原提示細胞（樹状細胞、ＤＣ、「二方向」ＭＬＲ）（図１３ｃ参照）のいずれかに応答してＴ細胞増殖を阻害するこれらの能力において、ＢＭ−ＭＳＣよりも強力であることを示唆している。
【０２７２】
この「一方向」ＭＬＲアッセイは、以下のように行った：ヒトＰＢＭＣをＡｌｌＣｅｌｌから購入した。凍結バイアルを解凍する際に、ＰＢＭＣを、ＩＭＤＭ＋１０％熱不活性化ヒト血清中で少なくとも１時間又は一晩平板培養し、単核細胞を選択的に接着させた。非接着細胞（Ｔ細胞を含有する）をＴ細胞レスポンダーの粗供給源として使用した。ＥＳＣ由来ＭＳＣ又はＢＭ由来ＭＳＣを阻害剤として使用した。これらＭＳＣは、生きた状態又はミトマイシンＣで有糸分裂を停止されたもののいずれかであった。非接着ＰＢＭＣ及びＭＳＣを種々の割合で一緒に混合し、５日間共培養させた。３日目に、ミトーゲン、ホルボール−１２ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシン又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）をこの培養に加え、Ｔ細胞増殖を誘導した。４日目に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を加えた。５日目に、Ｔ細胞増殖を、ＢｒｄＵ組込みキット（Ｂ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＣＤ４、ＣＤ８、及びＢｒｄＵ指向性の抗体で染色するフローサイトメトリーを通して評価した。Ｔ細胞増殖は、それらのＤＮＡに組み込まれたＢｒｄＵ（すなわち、ＢｒｄＵ＋）を有するＣＤ４＋及び／又はＣＤ＋８細胞の％として評価した（図１３ａ及び１３ｂに図示）。
【０２７３】
「二方向」ＭＬＲにおいては、ＥＳＣ由来ＭＳＣ又はＢＭ由来ＭＳＣを阻害剤として使用し、非接着末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴ細胞レスポンダーの粗供給源として使用し、並びに単核細胞由来樹状細胞（ＤＣ）を刺激剤として使用した。ＤＣを誘導するために、プラスチック接着単核細胞をＰＢＭＣから単離した。ＰＢＭＣを、ＩＭＤＭ＋１０％熱不活性化ヒト血清中（１０％ＨｕＳｅｒ）で少なくとも１時間又は一晩平板培養し、単核細胞を選択的に接着させた。非接着細胞を除去し、接着細胞を、ＩＭＤＭ＋１０％ＨｕＳｅｒ中で、ＳＣＦ、ＦＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３、及びＩＬ４と共に４日間培養した。アッセイのこの変型においては、３日目にミトーゲンを添加しない。ＢｒｄＵだけを、上記のようにフローサイトメトリー用に細胞を採取する１６〜２４時間前に、加える。このアッセイでは、ＭＳＣ及びＤＣの双方は、ミトマイシンＣで有糸分裂不活性化された（図１３ｃに図示）。
【０２７４】
実施例１０−ＢＭ−ＭＳＣ及び後期ＥＳＣ−ＭＳＣと比較しての初期ＥＳＣ−ＭＳＣによるＴｒｅｇ発現の改善された誘導
ＭＳＣの存在が、ＰＢＭＣ集団内の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活発な増殖を誘導し得るかどうかを決定するために、ＰＢＭＣ及びＭＳＣを使用して共培養実験を実施した。結果は、初期ＥＳＣ−ＭＳＣが、ＢＭ−ＭＳＣ及び後期ＥＳＣ−ＭＳＣの双方よりも良好にＴｒｅｇの活発な増殖を誘導したことを示唆している（図１４及び図１５参照）。
【０２７５】
共培養を、非接着ＰＢＭＣ及び異なるタイプのＭＳＣ（「初期」ＥＳＣ由来（約ｐ５〜６）、「後期」ＥＳＣ由来（約ｐ１２又はそれを超える継代）、ＢＭ−由来のもの）を１０：１比（ＰＢＭＣ：ＭＳＣ）で使用して確立した。共培養を、ＩＭＤＭ＋１０％熱不活性化ヒト血清＋３００単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ２中で４日間にわたってインキュベートした。Ｔｒｅｇの存在を、ＦｏｘＰ３細胞内フローサイトメトリー染色キット（Ｂｉｏ
ｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＦｏｘＰ３が陽性で染色されたＰＢＭＣのパーセンテージにより決定した。
【０２７６】
実施例１１−ＥＳＣ−ＭＳＣは大きな増殖能力を有する。
ＭＳＣの供給源がそれらの増殖能力に影響を与えるかどうかを決定するために、異なるＭＳＣ集団の増殖速度を経時的に監視した。結果は、ＥＳＣ由来ＭＳＣが、ＢＭ由来ＭＳＣよりも大きな増殖能力を有することを示している。結果はまた、基材（マトリゲルなど）上でＥＳＣ−ＭＳＣを長期にわたって（最大６継代）培養することが、ｐ２などのより初期の継代で細胞を基材から除去する場合よりも高い増殖速度を維持することに役立つことも示唆している（図１６及び図１７）。
【０２７７】
ＥＳＣ由来血管芽細胞を、ｐ０として、αＭＥＭ＋２０％  Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＦＢＳ＋１−グルタミン＋非必須アミノ酸（＝ＭＳＣ増殖培地）中、マトリゲルコーティング組織培養プラスチックに５０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。骨髄単核細胞を、ｐ０として、ＭＳＣ増殖培地中、規定の組織培養プラスチックに５０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。細胞がｐ０で約５０〜６０％の集密状態に到達したときに、又はｐ１以降で７０〜８０％の集密状態に到達したときに（通常、３〜５日毎）、細胞を０．０５％トリプシン−ｅｄｔａ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して採取した。採取の際に、細胞を遠心して、計数し、７０００細胞／ｃｍ２で再平板培養した。ＥＳＣ−ＭＳＣをマトリゲルから取り外し、特に断らない限り、引き続いてｐ３で開始する規定組織培養プラスチック上で増殖させた。ＭＳＣなどの細胞の増殖の速度が培養中で維持されていることを示すために、経時的な累積集団倍加をプロットする。
【０２７８】
実施例１２−ＥＳＣ−ＭＳＣは軟骨形成分化を受ける
異なるＭＳＣ集団の軟骨形成能を決定するために、ＥＳＣ−ＭＳＣ又はＢＭ−ＭＳＣをペレット集団培養として播種し、分化培地を使用して軟骨細胞への分化を誘導した（又は陰性対照として、規定ＭＳＣ増殖培地中で保持した）。結果は、ＥＳＣ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣのものと同様な様式で軟骨形成を受けることを示唆している。ＥＳＣ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣペレットの双方は、サフラニンＯ染色を介して、軟骨基質（プロテオグリカン）沈着を明らかにしている（図１８参照）。
【０２７９】
軟骨形成ペレット培養を形成するために、２．５×１０５細胞のＥＳＣ−ＭＳＣを、１５ｍＬの円錐形管中、５００×ｇで５分間遠心分離した。培養基を吸引し、０．５ｍＬの軟骨形成培養基（１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭのアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｎａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％のＩＴＳ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）で補充されたＤＭＥＭ−ＨＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）からなる）又は培養基（対照）をこのペレットに加えた。培地を２〜３日毎に交換して、ペレット培養を２１日間維持した。２１日の終わりに、ペレットを４％パラホルムアルデヒドで固定し、標準的手法を使用するパラフィン包埋、薄片化、及びサフラニンＯ染色のために、ＭａｓｓＨｉｓｔｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）に送った。
【０２８０】
実施例１３−ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α刺激下のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の増強された分泌
ＥＳＣ−ＭＳＣは、一部ではＰＧＥ２の分泌を通して免疫調節性効果を及ぼす。ＦＭ  ＥＳＣ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣから回収した培養上清は、ＢＭ−ＭＳＣが、基底状態においてＦＭ  ＥＳＣ−ＭＳＣよりも高レベルのＰＧＥ２を分泌することを示している。刺
激条件下（ＩＦＮ−γ及び／又はＴＮＦ−αの様々な濃度での）ＰＧＥ２分泌を決定するための実験は、ＦＭ−ＥＳＣ―ＭＳＣが刺激に応答して、それらのＰＧＥ２の分泌を大幅に増加することを示している（図１９）。事実、基底状態から刺激状態までのＰＧＥ２分泌の誘導率は、ＢＭ−ＭＳＣよりもＦＭ  ＥＳＣ−ＭＳＣについて大幅に大きい。しかしながら、刺激条件下でのＰＧＥ２分泌の実際の未精製量は、ＦＭ  ＥＳＣ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣで同様である。
【０２８１】
ＥＳＣ−ＭＳＣを、６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において７．５×１０６細胞／ｃｍ２で平板培養した。培養物を培地中で２４時間にわたって維持し、次いで１０、５０、１００、又は２００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ及び／又は１０、２５、５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で刺激した。誘導の３日後に上清を回収し、−２０℃で保存した。ＥＳＣ−ＭＳＣを採取し、計数してＰＧＥ２レベルを細胞数に標準化した。ＰＧＥ２濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ
ＰＧＥ２  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＥＩＡキット、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で測定し、製造業者のプロトコールに従って使用した。
【０２８２】
実施例１４−ＥＳＣ−ＭＳＣ表現型評価
様々な細胞表面マーカーの発現を、異なるＭＳＣ集団で評価し、それらの個々の免疫表現型を決定した。ＥＳＣ由来ＭＳＣは、多様な基材上で分化することが可能である。細胞表面マーカーのパネルを検討し、ＢＭ−ＭＳＣ上のこれらの発現と対比して、３つの異なるマトリックス（マトリゲル、フィブロネクチン、又はコラーゲンＩ）上で誘導されたＭＳＣ上でのこれらの発現プロファイルを決定した。結果は、これらの最初の分化で使用した基材に無関係に、これらマーカーについての発現の類似のパターンを示している。これらは９５％を超えてＣＤ１３、２９、４４、７３、９０、１０５、１６６、及びＨＬＡ−ＡＢＣが陽性であり、一方ＣＤ３１、３４、４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１が陰性であった（図２０Ａを参照）。Ｓｔｒｏ−１発現は、ＥＳＣ−ＭＳＣでは約５％からＢＭ−ＭＳＣでは約３０％までの間で異なった。
【０２８３】
ＭＳＣは、継代数の増加と共に、増殖及び集団倍加で遅くなる。この実験の狙いは、ＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣにおける継代３〜１７からの多数の異なるＭＳＣマーカーについての表面マーカー発現を検査することである。ＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣの全ての継代における細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１６６、ＣＤ１３、及びＣＤ４４を陽性で染色した。細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＴＬＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１０６、ＣＤ１３３、及びＣＤ２７１が陰性であった（図２０Ｂを参照）。
【０２８４】
各系統／継代数については、同一のプロトコールに従った。細胞を、ＭＳＣ培地中、Ｔ７５又はＴ１７５フラスコにて増殖した。細胞を３〜４日毎に継代させた。細胞の継代は、フラスコをＰＢＳで洗浄し、細胞分離培地ＴｒｙＰＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して細胞を回収し、ＭＳＣ培地で洗浄することからなる。トリパンブルーを使用して細胞を生存率について計数し、条件ごとに５０〜１００，０００個の生存可能な細胞をアリコートした。以下の抗体を使用した：ＣＤ３４−Ｆｉｔｃ、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ４４−Ｆｉｔｃ、ＣＤ７３−ＰＥ、ＣＤ１０６−ＰＥ、ＣＤ４５−ＡＰＣ（ＢＤ）；ＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣ、ＣＤ９０−Ｆｉｔｃ、ＨＬＡ−ＡＢＣ−Ｆｉｔｃ、ＣＤ１３３−ＡＰＣ、ＣＤ２９（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ＣＤ１６６−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＡＰＣ、ＣＤ１３−ＰＥ、ＣＤ１３−ＡＰＣ、ＣＤ２７１−Ｆｉｔｃ、ＣＤ−Ｆｉｔｃ、Ｓｔｒｏ−１−ＡＦ６４７、ＣＤ１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；ＴＬＲ３−Ｆｉｔｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。ヨウ化プロピジウムもまた、生存率マーカーとして加えた。細胞を室温で３０分間インキュベートし、遠心分離し、４０μｍの細胞濾過器を通過させ、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターで分析した。それぞれの細胞型については、細胞をＭＳＣ
集団（ＦＳＣ対ＳＳＣ）上でＰＩ陰性でゲートコントロールした。陽性パーセントを、ヒストグラムプロットでゲートコントロールし、染色されていない細胞集団を陰性対照として使用することにより決定した。Ｗａｇｎｅｒ  Ｗら著、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２００８年））．３（５）：ｅ２２１３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００２２１３；及びＭｕｓｉｎａら著、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００５年）４月、１（２）、５０４−５０９を参照されたい。
【０２８５】
更に、ＦＭ  ＥＳＣ−ＭＳＣは、ＦＭ  ＥＳＣ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣよりも高いレベルのＣＤ発現及び低いレベルのＳｔｒｏ−１発現を有する（図２１参照）。低レベルのＳｔｒｏ−１（細胞の５〜１０％）及び中間レベルのＣＤ１０（細胞の約４０％）のこの発現パターンを、ＦＭ−ＭＡ０９−ＭＳＣの１０個の異なるロットで確認した（図２２参照）。細胞サイズを評価するために、フローサイトメトリーも異なる集団で使用した（図２３参照）。結果は、この細胞が長期にわたり培養中で維持されているために、ＢＭ−ＭＳＣの細胞サイズは増加するが、一方ＦＭ  ＥＳ−由来ＭＳＣは細胞サイズを維持することを示している。細胞サイズは、フローサイトメトリードットプロット上の前方散乱対側方散乱によって決定した。４分の１ゲートを使用して、プロットを４つの領域に分けた。右上４分の１は、大きな細胞を有する、すなわち、この領域内の細胞は、大きな前方散乱（細胞体積）及び高い側方散乱（粒状性）も有する。
【０２８６】
ＥＳＣ−ＭＳＣを前述のように採取し、１Ｘ  ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で洗浄した。７５〜１００×１０５個の細胞をフローバッファー（３％のＦＢＳ；Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）で洗浄し、続いて、氷上で、一次抗体又はイソタイプ対照抗体を含有するフローバッファー１００μＬで４５分間インキュベートした。細胞を２ｍＬのフローバッファーで洗浄し、氷上、二次抗体を含有する１００μＬのフローバッファー中でインキュベートした。細胞を最終的に洗浄し、ヨウ化プロピジウムを含有するフローバッファー中に再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）で分析した。
【０２８７】
実施例１５−ＥＳＣ−ＭＳＣにおける遺伝子発現分析
これらの試験の目的は、ＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの間のｍＲＮＡ発現の類似性又は相違性を決定することであった。実験の第１のセット（基礎実験）において、ＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣから得た細胞のｍＲＮＡ発現の相対的差を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）によって比較した。ΔΔＣｔ法を使用して、内因性対照、ＧＡＰＤＨに対する相対的発現を決定するために、様々な遺伝子に対するＴａｑｍａｎプローブ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。２８個の遺伝子のリストから、以下の遺伝子がＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣ対ＢＭ−ＭＳＣの基礎実験においてアップレギュレートされた：ＡＩＲＥ、ＡＮＧＰＴ１（ＡＮＧ−１）、ＣＸＣＬ１、ＣＤ１０、ＣＤ２４、及びＩＬ１１（図２４〜２６を参照）。ＩＬ６及びＶＥＧＦは、ＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣ対ＢＭ−ＭＳＣにおいてダウンレギュレートされた（図２７参照）。以下の遺伝子はＭＳＣのソース間で顕著な差はなかった：ＡＬＣＡＭ、ＦＧＦ７、ＨＧＦ、ＬＧＡＬＳ１、ＮＴ５Ｅ、及びＴＮＦＳＦ１Ｂ（データ図示せず）。以下の遺伝子は、いずれのＭＳＣソースでも検出されなかった：ＡＮＧＰＴ２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ３、ＩＬ１２Ｂ（データ図示せず）。陰性対照として、全てのＭＳＣを、造血前駆細胞マーカーＣＤ３４、ＣＤ４１、及びＣＤ４５の発現について試験し
た。これらの実験から、本出願人らは、ＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣが等価のＢＭ−ＭＳＣよりも高いレベルで又は低いレベルでいくつかの遺伝子を発現することを決定した。
【０２８８】
更に、本出願人らは、ＭＳＣをＴ細胞で処理し、次いで刺激剤フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を加えることによる免疫応答を模倣する環境に対してＭＳＣをチャレンジさせた。ＲＮＡを回収する前の更に２日間にわたって２．５μｇ／ｍｌのＰＨＡを添加する以前に、ＥＳＣ−ＭＳＣを、Ｔ細胞の存在下（非刺激）又はＴ細胞に加えてＰＨＡの存在下（刺激を受けた）で２日間培養した。非刺激又は刺激されたＥＳＣ−ＭＳＣの遺伝子発現は、現在、非刺激及び刺激を受けたＢＭ−ＭＳＣのｍＲＮＡレベルと比較されている。
【０２８９】
基礎実験ついては、ＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣを、前述された条件下で、１０ｃｍの皿において、約５００，０００細胞の出発密度にて４日間培養した。更に、基礎実験についての陰性対照は、ＭＡ０９  ＥＳＣ由来造血前駆細胞であった。
【０２９０】
刺激実験については、ＦＭ−ＥＳＣ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣを、前述された条件下で、１０ｃｍの皿において、約５００，０００細胞の出発密度にて３〜４日間培養した。次いで、ＭＳＣをＴ細胞に２日間にわたって暴露し、その後２．５μｇ／ｍｌのＰＨＡに＋／−暴露させた。対照として、ＭＳＣをＰＨＡなしでＴ細胞の存在下で増殖し、別個にＴ細胞＋ＰＨＡ（ＭＳＣなし）も増殖させた。培地を吸引し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、吸引乾燥した。ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示通りに使用して、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの濃度及び純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析した。ｃＤＮＡ合成を、出発物質として１マイクログラムのＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ｆｏｒｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。ｃＤＮＡは５マイクロリットル／ウェルで約３０倍に希釈された。希釈ｃＤＮＡ、１マイクロリットルのＱＰＣＲ  Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１５マイクロリットルのＳＳＯ  Ｆａｓｔ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を各ウェルで混合した。ＱＰＣＲをＢｉｏｒａｄ  ＣＦＸ  ９６で実施した。データをＣＦＸマネージャー２．１（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して分析した。ｍＲＮＡ発現の相対量を、内因性対照、ＧＡＰＤＨ、及びΔΔＣｔ法を使用して決定した。
【０２９１】
実施例１６−ＥＳＣ−ＭＳＣ中のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）酵素活性
インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、トリプトファンのキヌレニンへの変換に関与する酵素である。ＩＦＮγ活性化ＭＳＣは、ＩＤＯを産生し、ＩＤＯがＴ細胞代謝を妨害するために、このことがＴ細胞増殖を抑制するこれらの能力を部分的に担当することが可能である。この試験において、本出願人らは、ＥＳＣ−ＭＳＣと比較してＢＭ−ＭＳＣのＩＤＯ活性を試験している。ＩＤＯ発現は、ＩＦＮγによる刺激後に、又はＴ細胞との共培養することによって測定されている。実験は、ＩＦＮγによる刺激時に、全てのＭＳＣ集団がＩＤＯを大幅に増加させることを示している（図２８）。
【０２９２】
細胞を、ＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加することで、又はＴ細胞と３日間共培養することのいずれかで刺激し、ＩＤＯ発現は、分光学的アッセイを使用して実施する。刺激後に、細胞を回収し、１〜２×１０６個の細胞を溶解した。溶解物を回収し、２Ｘ
ＩＤＯ緩衝液（４０ｍＭのアスコルビン酸塩、２０μＭのメチレンブルー、２００μｇ／ｍｌのカタラーゼ、及び８００μＭのＬ−トリプトファンを含むＰＢＳ）と１：１で混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。３０％のトリクロロ酢酸の添加によって、反応を停止させ、５２℃で３０分間インキュベートした。溶解物を遠心分離し、上清をエールリッヒ試薬（新しく調製された、酢酸中０．８％のｐ−ジメチルアミノベンズアルデ
ヒド）と１：１で混合した。発色後に、吸光度を４９２ｎｍにて分光光度計で読み取った。キヌレニンへのトリプトファンの変換を評価するために、ＯＤ値を、０〜１０００μＭのキヌレニンの標準物と比較した。
【０２９３】
Ｍｅｉｓｅｌら著、Ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ―ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．（２００４年）６月１５日；１０３（１２）：４６１９−２１を参照されたい。
【０２９４】
Ｂｒａｕｎ，Ｄら著、Ａ  ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＩＤＯ）  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．（２００５年）１０月１日；１０６（７）：２３７５−８１を参照されたい。
【０２９５】
実施例１７−ＥＳＣ−ＭＳＣ中のＡｉｒｅ−１及びプリオンタンパク質の発現レベル
Ａｉｒｅ−１及びプリオンタンパク質（Ｐｒｐ）の発現レベルを、ウェスタンブロット分析を使用して監視し、異なるＭＳＣ集団（細胞供給源、誘導法、又はＭＳＣの継代数に基づく）の間に差があるかどうかを決定した。Ａｉｒｅ−１は、後にＭＨＣ上で提示され、隣接するＴ細胞の応答を緩和する稀な末梢組織拘束性抗原（ＰＴＡ）の転写を誘導することを助ける。Ａｉｒｅ−１はまた、初期Ｔ細胞活性化因子―１（ＥＴＡ−１）の発現を抑制し、Ｔ細胞炎症応答を阻害する。プリオンタンパク質（ＰｒＰ）は、様々な幹細胞集団（造血幹細胞、神経幹細胞等）の増殖及び自己再生を増強することが示されていて、その発現は、培養中の異なるＭＳＣ集団の増殖特性と相互に関連することが可能である。結果は、両タンパク質において、老化関連減退を示している（各試料についての負荷コントロールのアクチンの検討後に）。ＦＭ  ＭＡ０９−ＭＳＣは、経時的にＡｉｒｅ−１及びＰｒＰの双方の発現を維持すると思われる（図２９）。
【０２９６】
ＭＳＣの全細胞溶解物を、標準プロトコールに従って、１２％のアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動させた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＰＢＳ中５％の乳汁＋０．０５％のツイーン−２０でブロックした。膜をＡｉｒｅ−１指向性の抗原（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）又はプリオンタンパク質（Ａｂｃａｍ）で、続いてＨＲＰ接合二次抗原で探査した。Ｂｉｏｒａｄ  ＧｅｌＤｏｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍでの分析の前に、強化化学発光試薬を使用して、信号を発生させた。
【０２９７】
Ｐａｒｅｋｋａｄａｎら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０（１）：１７８−１８６（２０１１年）を参照されたい。
【０２９８】
Ｍｏｈａｎｔｙら著、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３０：１１３４−１１４３（２０１２年）を参照されたい。
【０２９９】
実施例１８−サイトカインのＥＳＣ−ＭＳＣ分泌
ＭＳＣは、種々のサイトカイン及び増殖因子を基底状態及び様々な刺激に対する応答の双方において分泌することが知られている。２０を超える異なる分泌された因子を、サイトカインアレイを使用して分析した。結果は、ＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの間に基底状態及び刺激状態の双方において分泌された因子に関して、数個の重要な相違が存在することを示している。ＢＭ−ＭＳＣは、基底状態及びＩＦＮγ刺激状態の双方において、ＥＳＣ−ＭＳＣが発現するよりも高いレベルのＶＥＧＦを発現する（図３０〜３２参照）。
【０３００】
ＭＳＣの同数を最初に平板培養し、平板培養後３〜４日目にＭＳＣから上清を回収した。ＣＭを短時間で遠心分離し、細胞残骸を除去し、−２０℃で凍結させた。ＣＭを解凍し、製造業者のプロトコールに従って、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）特注膜アレイ又は様々なＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の既製品サイトカインアレイで分析した。
【０３０１】
実施例１９−ＭＳＣの分化のためのヒトＥＳ細胞培養
この実験の目的は、ＭＳＣへの分化の前のｈＥＳＣ培養に使用される異なる増殖培地を評価することであった。
【０３０２】
ヒトＥＳ細胞を、概ね、ヒト細胞増殖培地（ノックアウトＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）基礎培地、２０％の血清代替品、１−グルタミン、非必須アミノ酸、及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ）中で、照射された又はミトマイシンＣ処理のマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で培養した。０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡを使用して、継代を行った。あるいは、ｈＥＳＣを、Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ中、ＭＥＦフィーダー上で培養し、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ溶液を使用して継代させた（両者共にＲｅｐｒｏＣＥＬＬから購入した）。結果は、Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍは、ノックアウトＤＭＥＭを含有するヒトＥＳ細胞増殖培地上で増殖した細胞と比較して、「見かけのよい」ｈＥＳＣコロニー（自発的分化があまりない、円形に近い、より引き締まったコロニー）を一貫して提供した。
【０３０３】
引用文献
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２３．Ｒｙａｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｂｒｅａｋ，ｂｕｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１４９（２）：ｐ．３５３−６３．
２４．ＤｅｌａＲｏｓａ，０．ａｎｄ  Ｅ．Ｌｏｍｂａｒｄｏ，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｂｙ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ，２０１０．２０１０：ｐ．８６５６０１．
２５．Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ，２００７．１１０（２）：ｐ．９１−１００．
２６．Ｂａｒｒｙ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＳＨ−３  ａｎｄ  ＳＨ−４  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ＣＤ７３  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００１．２８９（２）：ｐ．５１９−２４．
２７．Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｍａｏ，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｓｔｅｒｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ，２００４．１３（４）：ｐ．４３６−４８．
２８．Ｍｉｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，ＣＤ２７１／ｐ７５ＮＴＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｓ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ，ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ，ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ，ａｎｄ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｓｔｅｒｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ，２０１０．
２９．Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ
ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏ
ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒ  ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｓｔｉｍｕｌｉ．Ｂｌｏｏｄ，２００２．９９（１０）：ｐ．３８３８−４３．
３０．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ａ．，Ｆ．Ｒ．Ｊｉｒｉｋ，ａｎｄ  Ｓ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，２０１０．３２（２）：ｐ．１９７−２０９．
３１．Ｈｕｓｅｂｙ，Ｅ．Ｓ．，Ｃ．Ｏｈｌｅｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｇｏｖｅｒｍａｎ，Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  Ｈ−２ｋ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．１６３（３）：ｐ．１１１５−８．
３２．Ｔａｎｇ，Ｑ．ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ，２００６．２１２：ｐ．２１７−３７．
３３．Ｂｏｕｍａｚａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒａｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ＰＤＸ−１  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔｓ，ａｌｔｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐａｔｔｅｒｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｒｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉａ．Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ，２００９．３２（１）：ｐ．３３−４   
３４．Ｍａｃｃａｒｉｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｖｏｒｓ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ／ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００５．９０（４）：ｐ．５１６−２５．
３５．Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ，Ｆ．，Ｒ．Ｍａｃｃａｒｉｏ，ａｎｄ  Ｆ．Ｆｒａｓｓｏｎｉ，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，ｆｒｏｍ  ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｐｅｃｔａｔｏｒｓ  ｔｏ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ａｃｔｏｒｓ．Ａｒｅ  ｗｅ  ｇｏｉｎｇ  ｔｏ  ｗｉｔｎｅｓｓ  ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｃｅｎａｒｉｏ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ？Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００７．９２（７）：  ｐ．８７２−７．
３６．Ｗａｎ，Ｙ．Ｙ．ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｆｏｘｐ３−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２００５．１０２（１４）：ｐ．５１２６−３１．
３７．Ｄｕｉｊｖｅｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２９（１０）：１５４９−１５５８（２０１１）
３８．Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０  （９）：１３９５−１４０８（２０１１）
３９．Ｐｉｚａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ９  （５）：２１８−２２２（２００３）
４０．Ｃｏｐｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＯＶＳ  ４９  （１２）：５４５８−５４６５
（２００８）
４１．Ｗａｋｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １０：１９９−２０６（２００２）
４２．Ｍｏｂａｓｈｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２４  （３）：３４７−３６６（２００９）
４３．Ｎｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｏ  ４（７）：３７１−３８０  （２００８）
４４．Ｇｏｔｈｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９０（１）：２３９−４５（２００４）
４５．Ｒａｓｍｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１２（１２）：２１６９−７９（２００６）
４６．Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ８（２）：１１０−１２３（２００９）
４７．Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３１：８９０−８９６（２００３）
４８．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：２８６４−２８７１（２００６）
【０３０４】
本明細書で引用された各文献（米国特許、米国特許出願公開、非特許文献等）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
2018027954.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月4日(2017.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０６個の間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を含む、哺乳動物患者における免疫または炎症の疾患または障害の治療における使用に好適な医薬調製物であって、ＣＤ２４発現が、骨髄のＭＳＣと比較して、前記調製物のＭＳＣにおいてアップレギュレートされ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）をコードするｍＲＮＡが、骨髄のＭＳＣにより発現されるＩＬ−６ｍＲＮＡレベルの１０％未満であるレベルにおいて調製物のＭＳＣにおいて発現される、前記医薬調製物。
【請求項２】
少なくとも１０６個の間葉系間質細胞（ＭＳＣ）と１％未満の任意の他の細胞型とを含む、免疫または炎症の疾患または障害の治療における使用のための精製細胞調製物であって、調製物のＭＳＣが、ＣＤ２４発現について陽性である、前記精製細胞調製物。
【請求項３】
調製物のＭＳＣが、共通の多能性幹細胞ソースから生体外で分化する、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項４】
ＭＳＣがＨＬＡ遺伝子型的に同一である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項５】
ＭＳＣがゲノム的に同一である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項６】
ＭＳＣが、５回の集団倍加を受けている骨髄から誘導されたＭＳＣ調製物と比較して、（ｉ）細胞周期調節及び細胞老化、（ｉｉ）細胞エネルギー及び／又は脂質代謝、及び（ｉｉｉ）アポトーシスの１つ以上に関与するタンパク質の統計的に有意に減少した含量及び／又は酵素活性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項７】
ＭＳＣが、培養中において１０回の集団倍加にわたって５，０００，０００を超える、フローサイトメトリーによって測定される前方散乱光値を有する細胞において、７５％超の増加を受けない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項８】
ＭＳＣがヒト細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項９】
本質的にパイロジェンフリーかつ病原体フリーである、請求項８に記載の調製物。
【請求項１０】
ＭＳＣが、同じ数の骨髄由来ＭＳＣの免疫調節アッセイにおける免疫調節効力よりも大きい、前記効力を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１１】
免疫または炎症の疾患または障害が、多発性硬化症、全身性硬化症、血液癌、心筋梗塞、器官移植拒絶、慢性同種移植片腎炎、肝硬変、肝不全、心不全、ＧｖＨＤ、脛骨骨折、左室機能不全、白血病、骨髄異形成症候群、クローン病、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、骨形成不全、ホモ接合性家族性低コレステロール血症、半月板切除後の処置、成人性歯周炎、重篤な心筋虚血症を有する患者における脈管形成、脊髄損傷、骨異形性症、重度の虚血下肢、糖尿病性足部疾患、原発性シェーグレン症候群、骨関節炎、軟骨欠損、蹄葉炎、多系統委縮症、筋萎縮性側索硬化症、心臓手術、全身性エリテマトーデス、生体腎同種移植、非悪性赤血球障害、熱傷、放射線熱傷、パーキンソン病、微少骨折、水疱性表皮剥離症、重度の冠動脈虚血、突発性拡張心筋症、大腿骨骨頭壊死、ループス腎炎、骨空隙欠損、虚血性脳卒中、卒中後、急性放射線症候群、肺疾患、関節炎、骨再生、ブドウ膜炎又はこれらの組み合わせである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬調製物。
【請求項１２】
免疫または炎症の疾患または障害が、多発性硬化症である、請求項１１に記載の医薬調製物。
【請求項１３】
免疫または炎症の疾患または障害が、ブドウ膜炎である、請求項１１に記載の医薬調製物。
【請求項１４】
免疫または炎症の疾患または障害が、全身性エリテマトーデスである、請求項１１に記載の医薬調製物。
【請求項１５】
免疫または炎症の疾患または障害が、ループス腎炎である、請求項１１に記載の医薬調製物。
【外国語明細書】
2018027954000001.pdf