(57)【要約】【課題】豚流行性下痢ウイルスに特異的な中和抗体の産生誘導活性、及び液性免疫応答の誘導活性に優れ、効率よく豚流行性下痢を予防又は治療することができる豚流行性下痢の予防又は治療方法、ワクチンキット、経口又は経鼻投与用ワクチン、及び筋肉内投与用ワクチンを提供すること。【解決手段】豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する第１の投与工程と、前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与で前記豚に投与する第２の投与工程と、を含む豚流行性下痢の予防又は治療方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する第１の投与工程と、
前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与で前記豚に投与する第２の投与工程と、を含むことを特徴とする豚流行性下痢の予防又は治療方法。
【請求項２】
アジュバントが、マイクロエマルジョンアジュバントである請求項１に記載の豚流行性下痢の予防又は治療方法。
【請求項３】
経口又は経鼻投与用の豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン、経口又は経鼻投与用アジュバント、筋肉内投与用の前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン、及び筋肉内投与用アジュバントを有することを特徴とするワクチンキット。
【請求項４】
経口又は経鼻投与用アジュバント及び筋肉内投与用アジュバントが、マイクロエマルジョンアジュバントである請求項３に記載のワクチンキット。
【請求項５】
豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与して後に追加免疫を付与される豚に対して用いられ、
前記豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン及びアジュバントを含むことを特徴とする経口又は経鼻投与用ワクチン。
【請求項６】
アジュバントが、マイクロエマルジョンアジュバントである請求項５に記載の経口又は経鼻投与用ワクチン。
【請求項７】
豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与又は経鼻投与して初回免疫を付与された豚に対して用いられ、
前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン及びアジュバントを含むことを特徴とする筋肉内投与用ワクチン。
【請求項８】
アジュバントが、マイクロエマルジョンアジュバントである請求項７に記載の筋肉内投与用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚流行性下痢の予防又は治療方法、経口又は経鼻投与用ワクチン、筋肉内投与用ワクチン、及びワクチンキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
豚流行性下痢（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｄｉａｒｒｈｅａ；ＰＥＤ）は、感染した豚の糞便中に含まれるＰＥＤウイルス（ＰＥＤＶ）の経口感染によって引き起こされ、水様性の下痢及び食欲不振を主徴とし、１週齢以下の哺乳豚において、非常に高い致死率を示すウイルス性感染症である（非特許文献１参照）。一度、養豚農場内にＰＥＤＶが侵入すると、清浄化が困難であり、甚大な経済的被害をもたらす点で問題となっている。実際に、近年アジア諸国及び米国を中心とする北米大陸で豚流行性下痢が流行し、甚大な経済的被害をもたらした（非特許文献２参照）。
【０００３】
ＰＥＤＶの標的細胞は、消化管、特に空腸及び回腸の上皮細胞である（非特許文献３参照）。一部のＰＥＤＶは、粘膜下のリンパ組織を通じて血流に入ると考えらてれおり、ＰＥＤＶ遺伝子が全身臓器で検出される時期もある。しかし、ＰＥＤＶは、他の臓器での二次的な増殖を示さず、消化管上皮細胞で増殖した後、糞便から排泄され、新たな感染源となる。離乳期以降の豚では、ＰＥＤＶに対する感受性が低下し、強制的にＰＥＤＶを経口投与しても無症状で経過することもある。しかし、他の病原体の感染、出産及び過密飼育などのストレス状況下にある豚がＰＥＤＶに暴露されると、食欲不振及び下痢等の症状を一過性に発現してしまう場合もある（非特許文献４参照）。
【０００４】
豚流行性下痢に対するワクチン（以下、「ＰＥＤワクチン」と称することがある）は、１９９０年代後半より日本、韓国、中国、フィリピン、及び米国で市販されている。これらの従来のＰＥＤワクチンは、母豚の妊娠期間中に接種され、分娩後の母豚の乳汁中にＰＥＤＶに対する中和抗体を分泌させ、哺乳豚がこの乳汁を摂取することにより該哺乳豚の消化管内に侵入したＰＥＤＶを中和させるという機序の元に設計されてきた（非特許文献５参照）。哺乳豚は、初乳に含まれる移行抗体だけではＰＥＤＶ感染から免れることはできず、哺乳期間を通じて、前記ＰＥＤワクチンによる高濃度のＰＥＤＶに対する中和抗体が含まれる乳汁を摂取し続けることでＰＥＤＶを中和することができ、これにより豚流行性下痢の発症を阻止することや、症状を軽減することができる。
【０００５】
しかし、何らかの原因で子豚が乳汁を摂取できない状況に陥ると、該子豚は、ＰＥＤＶに感染して重症化してしまうという問題があった。また、ＰＥＤＶ抗体陰性の母豚及び免疫レベルの低い母豚が大量のＰＥＤＶに暴露された場合は、泌乳量の減少を伴う全身症状を呈し、ＰＥＤワクチンの効果を十分に発揮できないという問題もあった。
【０００６】
更に、前記従来のＰＥＤワクチンの効果は、ＰＥＤＶによって引き起こされる症状の軽減及び子豚の死亡率の低下が限界であり、液性免疫応答の誘導が不十分でＩｇＡ抗体の応答を十分に誘導することができないという問題もあった（非特許文献６参照）。
【０００７】
したがって、乳汁中にＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生を誘導することができるだけでなく、母豚自身に感染防御可能な免疫応答を誘導することができる新たな豚流行性下痢に対するワクチンや、豚流行性下痢の予防又は治療方法の提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ，  １０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ２０１２
【非特許文献２】Ｌｅｅ  Ｃ．，  Ｖｉｒｏｌ  Ｊ,  ２０１５,  Ｖｏｌ．１２,  ｐ．１９３
【非特許文献３】Ｓｕｅｙｏｓｈｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｐａｔｈｏｌ，  １９９５，  Ｖｏｌ．１１３（１），  ｐｐ．５９−６７
【非特許文献４】宮▲崎▼綾子、「近年流行している豚流行性下痢（ＰＥＤ）について」、獣医疫学雑誌、２０１４年、１８（１），  ｐｐ．８５−８９
【非特許文献５】佐藤哲朗、「豚流行性下痢生ワクチンの特徴とその効果」、月刊ピッグジャーナル、２０１４年、２月号、ｐｐ．２２−２５
【非特許文献６】Ｓｏｎｇ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓ．，  ２０１５,  Ｖｏｌ．４（２），  ｐｐ．１６６−１７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、豚流行性下痢ウイルスに特異的な中和抗体の産生誘導活性、及び液性免疫応答の誘導活性に優れ、効率よく豚流行性下痢を予防又は治療することができる豚流行性下痢の予防又は治療方法、ワクチンキット、経口又は経鼻投与用ワクチン、及び筋肉内投与用ワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与した後、豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与により追加投与すると、従来の豚流行性下痢に対するワクチンと比較して、豚流行性下痢ウイルスに特異的な中和抗体の産生誘導が増強されるだけでなく、豚流行性下痢ウイルスに特異的なＩｇＡ抗体も誘導することができることを見出した。更に、これらの抗体は、乳汁中に分泌され、子豚における感染防御を可能にするのみならず、母豚自身の感染も防御可能であることを見出した。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する第１の投与工程と、
前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与で前記豚に投与する第２の投与工程と、を含むことを特徴とする豚流行性下痢の予防又は治療方法である。
＜２＞  経口又は経鼻投与用の豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン、経口又は経鼻投与用アジュバント、筋肉内投与用の前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン、及び筋肉内投与用アジュバントを有することを特徴とするワクチンキットである。
＜３＞  豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与して後に追加免疫を付与される豚に対して用いられ、
前記豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン及びアジュバントを含むことを特徴とする経口又は経鼻投与用ワクチンである。
＜４＞  豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与又は経鼻投与して初回免疫を付与された豚に対して用いられ、
前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン及びアジュバントを含むことを特徴とする筋肉内投与用ワクチンである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、豚流行性下痢ウイルスに特異的な中和抗体の産生誘導活性、及び液性免疫応答の誘導活性に優れ、効率よく豚流行性下痢を予防又は治療することができる豚流行性下痢の予防又は治療方法、ワクチンキット、経口又は経鼻投与用ワクチン、及び筋肉内投与用ワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＰＥＤＶスパイク遺伝子の系統樹解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（豚流行性下痢の予防又は治療方法）
本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法は、第１の投与工程と、第２の投与工程とを含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００１５】
＜第１の投与工程＞
前記第１の投与工程は、豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する工程である。
【００１６】
＜＜豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の生ワクチン＞＞
前記ＰＥＤＶの生ワクチンは、ＰＥＤＶの毒性を弱毒化したワクチンである。
ＰＥＤＶは、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、アルファコロナウイルス属（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）に属するウイルスであり、グループＩ及びグループＩＩの２つの遺伝学的グループに分類されている。
【００１７】
前記ＰＥＤＶの生ワクチンに用いられるＰＥＤＶの分類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記グループＩ及び前記グループＩＩのいずれであってもよい。これらのＰＥＤＶは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１８】
前記ＰＥＤＶの入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＥＤＶに感染した豚から分離して入手する方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
【００１９】
前記ＰＥＤＶに感染した豚から分離して入手する方法の具体例としては、以下の方法などが挙げられる。
豚流行性下痢（ＰＥＤ）を発症した豚から小腸を採取して組織乳剤を調製した後、該組織乳剤をＰＥＤに感染していない豚に経口投与し、数日間後に該豚の小腸を採取し、これを用いて組織乳剤を調製する。このような継代を適宜選択した回数行った後、最後の代から得られた組織乳剤に、終濃度が５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬとなるようにトリプシンを添加し、コンフルエントにしたＶｅｒｏ細胞に接種し、５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬトリプシン加培養液中で培養する。光学顕微鏡で細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日確認し、ＣＰＥが確認された時点で培養を停止する。前記ＣＰＥが確認されたＶｅｒｏ細胞の培養上清から、常法によりＲＮＡを抽出し、配列番号１〜１６で表されるプライマー配列を用いてＲＴ−ＰＣＲを行う。次いで、常法により、増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物を任意のベクターへクローニングし、プラスミドを得る。このプラスミド中のＰＥＤＶスパイク遺伝子（以下、「ＰＥＤＶ  Ｓ遺伝子」と称することがある）の塩基配列を常法により解析し、解析した各配列断片をアセンブリし、例えば、ＭＥＧＡ４．０ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ．ｎｅｔ）を用いて、近隣接合法による系統樹解析を行うことにより、前記グループＩ及び前記グループＩＩのいずれの遺伝的グループに属するＰＥＤＶであるかを判別することができる。
【００２０】
前記市販品を用いる方法の具体例としては、市販されている生ワクチンを、Ｖｅｒｏ細胞に接種し、培養する方法などが挙げられる。この場合、トリプシン非添加の培養液を用いることが好ましい。
【００２１】
前記グループＩに属するＰＥＤＶとしては、例えば、Ｐ−５Ｖ株（Ｓａｔｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，  ２０１１，  Ｖｏｌ．４３（１），  ｐｐ．７２−７８）、ＣＶ７７７株（Ｐｅｎｓａｅｒｔ  Ｍ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １９７８，  Ｖｏｌ．５８（３），  ｐｐ．２４３−２４７）、ＤＲ１３株（Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，  ２００７，  Ｖｏｌ  ３５（１），  ｐｐ．５５−６４）、９６−Ｐ４Ｃ６株（一般財団法人化学及血清療法研究所スイムジェン登録商標ＴＧＥ／ＰＥＤワクチン株）、ＪＳ−２００４−２株（Ｚｈａｏ  Ｐ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，２０１５，  Ｖｏｌ．７９（１），８−１５）、ＯＨ８５１株（Ｗａｎｇ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  ２０１４，  Ｖｏｌ．２０（５），ｐｐ．９１７−９１９）、ＣＨ／ＦＪＮＤ−１／２０１１株（Ｔｉａｎ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓｅｓ，  ２０１３，  Ｖｏｌ．５（８），  ｐｐ．１９９１−２００４）、ＤＸ株（Ｚｈａｏ  Ｐ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，２０１５，  Ｖｏｌ．７９（１），８−１５）などが挙げられる。
また、前記Ｐ−５Ｖ株は、日生研ＰＥＤ生ワクチン（日生研株式会社製）から前記方法により容易に培養することもできる。
【００２２】
前記グループＩＩに属するＰＥＤＶとしては、例えば、ＭＺ０１１６−２／２０１３株（後述の「試験例２」参照）、ＯＫＮ−１／ＪＰＮ／２０１３株（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｖｏｌ．２０１５，  Ｖｏｌ．３６，  ｐｐ．３６３−３６８）、ＵＳＡ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／２０１３株（Ｍａｒｔｈａｌｅｒ  Ｄ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃｅ．，  ２０１３，  Ｖｏｌ．１（４），  ｐｐ．ｅ００５５５−１３）、ＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ１８８／２０１４株（Ｍａｒｔｈａｌｅｒ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  ２０１４，  Ｖｏｌ．２０（１２），  ｐｐ．２１６２−２１６３）などが挙げられる。
【００２３】
前記ＰＥＤＶの毒性を弱毒化する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＰＥＤＶを異種宿主で継代培養する方法などが挙げられる。
前記異種宿主としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養細胞、発育鶏卵などが挙げられる。
【００２４】
前記第１の投与工程における前記ＰＥＤＶの生ワクチンの投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができるが、１回の投与当たりのウイルス含有量が１０７．０  ＴＣＩＤ５０以上となる投与量（１０７．０  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上）であることが好ましい。前記投与量が、１０７．０  ＴＣＩＤ５０／ドーズ未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがある。
【００２５】
＜＜アジュバント＞＞
前記アジュバントの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルミニウム塩、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、モノホスホリルリピッドＡ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ：ＭＰＬ）、マイクロエマルジョンアジュバント、コレラトキシン、大腸菌易熱性毒素、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリイノシンポリシチジン酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、ポリマーアジュバント、スクアレン、デキストリン誘導体、流動パラフィン、トコフェロール酢酸エステル、ポリソルベートなどが挙げられる。前記アジュバントは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、マイクロエマルジョンアジュバント、コレラトキシン、大腸菌易熱性毒素、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリイノシンポリシチジン酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、ポリマーアジュバント、スクアレンなどが好ましく、マイクロエマルジョンアジュバントが特に好ましい。
【００２６】
前記マイクロエマルジョンアジュバントは、水中に分散された微小油性粒子からなるものである。前記微小油性粒子とは、軽鉱物油と界面活性剤とを混合し、水中で乳化することにより５ｎｍ〜５００ｎｍの粒子を形成させたものである。
【００２７】
前記軽鉱物油としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、流動パラフィン、エーテル化流動パラフィン、軽質流動パラフィン（日本薬局方）などが挙げられる。これらの軽鉱物油は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２８】
前記流動パラフィンとしては、例えば、商品名で、ＭＡＲＣＯＬ（商標）５２（商品名、Ｅｘｘｏｎ  Ｍｏｂｉｌ社製）、Ｐｅｎｒｅｃｏ（登録商標）Ｄｒａｋｅｏｌ（登録商標）６ＶＲ（商品名、Ｐｅｎｒｅｃｏ社製）などが挙げられる。
【００２９】
前記マイクロエマルジョンアジュバントにおける前記軽鉱物油の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００１質量％〜１０．０質量％が好ましく、０．０１質量％〜０．１質量％がより好ましい。前記軽鉱物油の含有量が、０．００１質量％未満であると、粒子が不安定になることがあり、１０．０質量％を超えると、接種対象の動物に対して接種物の遺残をもたらすことがある。
【００３０】
前記界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マンナイドモノオレイン酸、オレイン酸マンニタンエステルのエトキシル化誘導体、モノステアリン酸グリセリル、モノラウリン酸デカグリセリル、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテートなどが挙げられる。これらの界面活性剤は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３１】
前記マイクロエマルジョンアジュバントにおける前記界面活性剤の含有量としては、前記軽鉱物油を乳化してマイクロエマルジョンとすることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
前記マイクロエマルジョンアジュバントは、更にキレート化剤を含んでいてもよい。前記マイクロエマルジョンアジュバントがキレート化剤を含むと、前記微小油性微粒子に結合した抗原（ＰＥＤＶ）を安定化することや、微小油性粒子の免疫担当細胞への結合を介助する作用を奏する点で有利である。
【００３３】
前記キレート化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マンガン、サリチル酸アルミニウム、可溶性酢酸アルミニウム等の多イオン性酸複合体などが挙げられる。これらのキレート化剤は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３４】
前記マイクロエマルジョンアジュバントにおける前記キレート化剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００２質量％〜３０質量％が好ましく、０．０１質量％〜１５質量％がより好ましい。前記キレート化剤の含有量が、０．００２質量％未満であると、免疫応答活性を増強することができないことがあり、３０質量％を超えると、接種動物に対して副作用がもたらされることがある。
【００３５】
前記キレート化剤を含有するマイクロエマルジョンアジュバントを調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水に、前記軽鉱物油、前記界面活性剤、及び前記キレート化剤を添加し、公知の乳化手段により乳化して、マイクロエマルジョンアジュバントとする方法などが挙げられ、具体的には、特開２０００４−１３１４１７号公報、特開２００５−７５７５２号公報に記載の方法などを用いることができる。また、前記マイクロエマルジョンアジュバントは、市販品を用いてもよく、市販品の具体例としては、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＭＳシリーズのＩＭＳ  １３１２  ＶＧ、ＩＭＳ  １３１３  ＶＧ、ＩＭＳ  ２５１Ｃ、ＩＭＳ  ２２１５  ＶＧ、ＩＭＳ  ３０１２  ＶＧ  ＳＴ（いずれも、ＳＥＰＰＩＣ社製）などが挙げられる。
【００３６】
前記第１の投与工程における前記アジュバントの投与量としては、前記ＰＥＤＶの生ワクチンの効果を損なわない限り、特に制限はなく、アジュバントの種類、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状などの様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【００３７】
前記アジュバントが、前記マイクロエマルジョンアジュバントである場合の投与量としても、特に制限はないが、前記マイクロエマルジョンアジュバントと前記ＰＥＤＶの生ワクチンを含むウイルス液との体積比が、２０／８０〜８０／２０となる投与量が好ましく、５０／５０となる投与量が特に好ましい。前記体積比（マイクロエマルジョンアジュバント／ＰＥＤＶの生ワクチンを含むウイルス液）が、２０／８０未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがあり、８０／２０を超えると、投与部位の腫脹、硬結、発赤、発熱、アナフィラキシーショックなどが起こることや、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことなどがある。
【００３８】
前記ＰＥＤＶの生ワクチンと前記アジュバントとを経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する時期としては、前記アジュバントのアジュバント効果が得られ、かつ、前記第２の投与工程の前であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ＰＥＤＶの生ワクチンと前記アジュバントとを、同時に投与してもよく、別々に投与してもよいが、同時に投与することが簡便である点で好ましい。
【００３９】
前記ＰＥＤＶの生ワクチンと前記アジュバントとを同時に経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＰＥＤＶの生ワクチンと前記アジュバントとを混合した組成物を投与する方法などが挙げられる。
前記ＰＥＤＶの生ワクチンと前記アジュバントとを混合した組成物としては、後述する本発明の経口又は経鼻投与用ワクチンが好適に用いられる。
【００４０】
前記ＰＥＤＶの生ワクチンと前記アジュバントとを別々に経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する場合、前記ＰＥＤＶの生ワクチンと前記アジュバントとの投与順序としては、前記アジュバントのアジュバント効果が得られる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ＰＥＤＶの生ワクチンと前記アジュバントとの投与間隔としては、前記アジュバントのアジュバント効果が得られる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
前記第１の投与工程を行う回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。本発明は、前記第１の投与工程を１回行うだけでも十分な効果を得ることができる点で有利である。
【００４２】
＜第２の投与工程＞
前記筋肉内投与工程は、前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与で前記第１の投与工程後の豚に投与する工程である。
【００４３】
＜＜豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の不活化ワクチン＞＞
ＰＥＤＶの不活化ワクチンは、ＰＥＤＶの病原性を消失又は毒素を無毒化したワクチンである。
前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンに用いられるＰＥＤＶの分類、入手方法などとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記第１の投与工程の中のＰＥＤＶの生ワクチンの項目で記載した態様などが挙げられる。
【００４４】
前記ＰＥＤＶの感染能を不活化する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＰＥＤＶをホルマリン等の薬剤で処理する方法、加熱する方法、ｐＨを変化させる方法、ガンマ線を照射する方法、紫外線を照射する方法などが挙げられる。
前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンに使用するＰＥＤＶは、分離したウイルスをそのまま不活化してもよく、前記弱毒化したＰＥＤＶを不活化してもよい。
【００４５】
前記第２の投与工程における前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンの投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができるが、１回の投与当たりのウイルス含有量が１０６．５  ＴＣＩＤ５０以上となる投与量（１０６．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上）が好ましく、１０７．５  ＴＣＩＤ５０以上となる投与量（１０７．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上）がより好ましい。前記投与量が、１０６．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがある。
【００４６】
＜＜アジュバント＞＞
前記アジュバントの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記第１の投与工程の中のアジュバントの項目で記載したものなどが挙げられる。
これらの中でも、アルミニウム塩、マイクロエマルジョンアジュバント、ポリマーアジュバント、デキストリン誘導体、流動パラフィン、スクアレン、トコフェロール酢酸エステル、ポリソルベートなどが好ましく、マイクロエマルジョンアジュバントが特に好ましい。
【００４７】
前記マイクロエマルジョンアジュバントの態様は、前記第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものと同様である。
【００４８】
前記第２の投与工程における前記アジュバントの投与量としては、前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンの効果を損なわない限り、特に制限はなく、アジュバントの種類、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状などの様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【００４９】
前記アジュバントが、前記マイクロエマルジョンアジュバントである場合の投与量としても、特に制限はないが、前記マイクロエマルジョンアジュバントと前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンを含むウイルス液との体積比が、２０／８０〜８０／２０となる投与量が好ましく、５０／５０となる投与量が特に好ましい。前記体積比（マイクロエマルジョンアジュバント／ＰＥＤＶの不活化ワクチンを含むウイルス液）が、２０／８０未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがあり、８０／２０を超えると、投与部位の腫脹、硬結、発赤、発熱、アナフィラキシーショックなどが起こることや、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことなどがある。
【００５０】
前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記アジュバントとを筋肉内投与で前記豚に投与する時期としては、前記アジュバントのアジュバント効果が得られ、かつ、前記第１の投与工程の後あれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記アジュバントとを、同時に投与してもよく、別々に投与してもよいが、同時に投与することが簡便である点で好ましい。
【００５１】
前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記アジュバントとを同時に筋肉内投与で前記豚に投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記アジュバントとを混合した組成物を投与する方法などが挙げられる。
前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記アジュバントとを混合した組成物としては、後述する本発明の筋肉内投与用ワクチンが好適に用いられる。
【００５２】
前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記アジュバントとを別々に筋肉内与で前記豚に投与する場合、前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記アジュバントとの投与順序としては、前記アジュバントのアジュバント効果が得られる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記アジュバントとの投与間隔としては、前記アジュバントのアジュバント効果が得られる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
前記第２の投与工程を行う回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。本発明は、前記第２の投与工程を１回行うだけでも十分な効果を得ることができる点で有利である。
【００５４】
前記第１の投与工程と、前記第２の投与工程との投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１週間〜２０週間が好ましく、２週間〜１０週間がより好ましく、４週間〜１０週間が特に好ましい。前記投与間隔が、１週間未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがあり、２０週間を超えても、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがある。
【００５５】
（ワクチンキット）
本発明のワクチンキットは、経口又は経鼻投与用の豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン、経口又は経鼻投与用アジュバント、筋肉内投与用の前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン、及び筋肉内投与用アジュバントを有し、必要に応じて、更にその他の構成を有する。
【００５６】
＜経口又は経鼻投与用の豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の生ワクチン＞
前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶ生ワクチンに用いられるＰＥＤＶの分類、入手方法、ＰＥＤＶの毒性を弱毒化する方法などとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のＰＥＤＶの生ワクチンの項目で記載したものなどが挙げられる。
【００５７】
前記ワクチンキットにおける前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶ生ワクチンのウイルス含有量としては、特に制限はなく、使用回数などに応じて適宜選択することができる。前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶ生ワクチンの１回の投与当たりのウイルス含有量は、１０７．０  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上であることが好ましい。また、前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶ生ワクチンは、前記ワクチンキットの使用時に、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択希釈等により調整することができる。
【００５８】
＜経口又は経鼻投与用アジュバント＞
前記経口又は経鼻投与用アジュバントの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものなどが挙げられる。
これらの中でも、マイクロエマルジョンアジュバント、コレラトキシン、大腸菌易熱性毒素、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリイノシンポリシチジン酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、ポリマーアジュバント、スクアレンなどが好ましく、マイクロエマルジョンアジュバントが特に好ましい。
【００５９】
前記マイクロエマルジョンアジュバントの態様は、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものと同様である。
【００６０】
前記ワクチンキットにおける前記経口又は経鼻投与用アジュバントの量としては、特に制限はなく、使用回数、前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶ生ワクチンを含むウイルス液の量などに応じて、適宜選択することができる。
【００６１】
前記ワクチンキットは、前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと、前記経口又は経鼻投与用アジュバントとを、個別の構成として有していてもよく、これらを混合した組成物の状態で有していてもよい。
前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと前記経口又は経鼻投与用アジュバントとを混合した組成物としては、後述する本発明の経口又は経鼻投与用ワクチンが好適に用いられる。
【００６２】
＜筋肉内投与用の豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の不活化ワクチン＞
前記筋肉内投与用のＰＥＤＶ不活化ワクチンに用いられるＰＥＤＶの分類、入手方法、ＰＥＤＶの感染能を不活化する方法などしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第２の投与工程の中のＰＥＤＶの不活化ワクチンの項目で記載した態様などが挙げられる。
【００６３】
前記ワクチンキットにおける前記筋肉内投与用のＰＥＤＶ不活化ワクチンのウイルス含有量としては、特に制限はなく、使用回数などに応じて適宜選択することができる。前記筋肉内投与用のＰＥＤＶ不活化ワクチンの１回の投与当たりのウイルス含有量は、１０６．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上が好ましく、１０７．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上がより好ましい。また、前記筋肉内投与用のＰＥＤＶ不活化ワクチンは、前記ワクチンキットの使用時に、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択希釈等により調整することができる。
【００６４】
＜筋肉内投与用アジュバント＞
前記筋肉内投与用アジュバントの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものなどが挙げられる。
これらの中でも、アルミニウム塩、マイクロエマルジョンアジュバント、ポリマーアジュバント、デキストリン誘導体、流動パラフィン、スクアレン、トコフェロール酢酸エステル、ポリソルベートなどが好ましく、マイクロエマルジョンアジュバントが特に好ましい。
【００６５】
前記マイクロエマルジョンアジュバントの態様は、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものと同様である。
【００６６】
前記ワクチンキットにおける前記筋肉内投与用アジュバントの量としては、特に制限はなく、使用回数、前記筋肉内投与用のＰＥＤＶ不活化ワクチンを含むウイルス液の量などに応じて適宜選択することができる。
【００６７】
前記ワクチンキットは、前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと、前記筋肉内投与用アジュバントとを、個別の構成として有していてもよく、これらを混合した組成物の状態で有していてもよい。
前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記筋肉内投与用アジュバントとを混合した組成物としては、後述する本発明の筋肉内投与用ワクチンが好適に用いられる。
【００６８】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶解液、希釈用生理食塩水、用事調製用の容器、シリンジ、注射針、添付文書などが挙げられる。
【００６９】
前記溶解液の組成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する本発明の経口又は経鼻投与用ワクチンの中のその他の成分の項目に記載のものなどが挙げられる。
【００７０】
＜使用方法＞
前記ワクチンキットは、前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと前記経口又は経鼻投与用アジュバントとを経口投与又は経鼻投与した後、前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記筋肉内投与用アジュバントとを筋肉内投与して用いる。
【００７１】
前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと前記経口又は経鼻投与用アジュバントとは、同時に投与してもよく、別々に投与してもよいが、同時に投与することが簡便である点で好ましい。
【００７２】
前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと前記経口又は経鼻投与用アジュバントとを同時に経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する場合は、前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと前記経口又は経鼻投与用アジュバントとを混合した前記組成物を用いることが好ましい。
【００７３】
前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと前記経口又は経鼻投与用アジュバントとを別々に経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する場合、前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと前記経口又は経鼻投与用アジュバントとの投与順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記経口又は経鼻投与用のＰＥＤＶの生ワクチンと前記経口又は経鼻投与用アジュバントとの投与間隔としては、前記経口又は経鼻投与用アジュバントのアジュバント効果が得られる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７４】
前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記筋肉内投与用アジュバントとは、同時に投与してもよく、別々に投与してもよいが、同時に投与することが簡便である点で好ましい。
【００７５】
前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記筋肉内投与用アジュバントとを同時に筋肉内投与で前記豚に投与する場合は、前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記筋肉内投与用アジュバントとを混合した前記組成物を用いることが好ましい。
【００７６】
前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記筋肉内投与用アジュバントとを別々に筋肉内与で前記豚に投与する場合、前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記筋肉内投与用アジュバントとの投与順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記筋肉内投与用のＰＥＤＶの不活化ワクチンと前記筋肉内投与用アジュバントとの投与間隔としては、前記筋肉内投与用アジュバントのアジュバント効果が得られる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７７】
前記ワクチンキットは、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法に好適に使用することができる。
【００７８】
（経口又は経鼻投与用ワクチン）
本発明の経口又は経鼻投与用ワクチンは、豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン及びアジュバントを含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
前記経口又は経鼻投与用ワクチンは、豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与して後に追加免疫を付与される豚に対して用いられる。
【００７９】
＜豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の生ワクチン＞
ＰＥＤＶの生ワクチンに用いられるＰＥＤＶの分類、入手方法、ＰＥＤＶの毒性を弱毒化する方法などしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のＰＥＤＶの生ワクチンの項目で記載した態様などが挙げられる。
【００８０】
前記経口又は経鼻投与用ワクチンにおける前記ＰＥＤＶの生ワクチンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０７．０  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上であることが好ましい。前記含有量が、１０７．０  ＴＣＩＤ５０／ドーズ未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがある。
【００８１】
＜アジュバント＞
前記アジュバントの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものなどが挙げられる。
これらの中でも、マイクロエマルジョンアジュバント、コレラトキシン、大腸菌易熱性毒素、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリイノシンポリシチジン酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、ポリマーアジュバント、スクアレンなどが好ましく、マイクロエマルジョンアジュバントが特に好ましい。
【００８２】
前記マイクロエマルジョンアジュバントの態様は、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものと同様である。
【００８３】
前記経口又は経鼻投与用ワクチンにおける前記アジュバントの含有量としては、前記ＰＥＤＶの生ワクチンの効果を損なわず、アジュバント効果が得られる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８４】
前記アジュバントが、前記マイクロエマルジョンアジュバントである場合、前記経口又は経鼻投与用ワクチンにおける前記マイクロエマルジョンアジュバントの含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０体積％〜８０体積％が好ましく、５０体積％が特に好ましい。前記マイクロエマルジョンの含有量が、２０体積％未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがあり、８０体積％を超えると、投与部位の腫脹、硬結、発赤、発熱、アナフィラキシーショックなどが起こることや、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことなどがある。
【００８５】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００８６】
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。
【００８７】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００８８】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾール、チメロサール、フェノキシエタノールなどが挙げられる。
【００８９】
前記粘結剤、前記増粘剤、又は前記固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００９０】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００９１】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００９２】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００９３】
前記ｐＨ調整剤又は前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００９４】
前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００９５】
前記経口又は経鼻投与用ワクチンにおける前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００９６】
＜剤型＞
前記経口又は経鼻投与用ワクチンの剤型としては、経口投与又は経鼻投与することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、液剤などが挙げられる。これらの中でも、前記経口投与用ワクチンとしては、前記固形剤、前記液剤などが好ましく、前記経鼻投与用ワクチンとしては、前記液剤が好ましい。
【００９７】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硬カプセル剤、軟カプセル剤などが挙げられる。
【００９８】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、経口投与用ワクチンとして用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤、混餌剤などが挙げられる。
前記液剤が、経鼻投与用ワクチンとして用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【００９９】
＜製造方法＞
前記経口又は経鼻投与用ワクチンを製造する方法としては、前記ＰＥＤＶの生ワクチンと、前記アジュバントとを混合することができれば、特に制限はなく、剤型などに応じて公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
【０１００】
＜使用＞
前記経口又は経鼻投与用ワクチンは、ＰＥＤＶの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与して後に追加免疫を付与される豚に対して用いられる。
前記豚に追加免疫を付与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記豚流行性下痢の予防又は治療方法の前記第２の工程に記載の方法が好適に用いられる。
【０１０１】
前記経口又は経鼻投与用ワクチンは、１種単独で使用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記経口又は経鼻投与用ワクチンは、他の成分を有効成分とする医薬、飼料、飲水などに配合された状態で使用してもよい。
【０１０２】
前記経口又は経鼻投与用ワクチンは、後にＰＥＤＶの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与して追加免疫を付与されることにより、ＰＥＤＶに特異的な中和抗体の産生を誘導することができ、更に液性免疫応答によりＰＥＤＶに特異的なＩｇＡの産生も誘導することができるため、効率よく豚流行性下痢を予防又は治療することができる。
【０１０３】
前記経口又は経鼻投与用ワクチンは、母豚だけでなく、子豚にも直接投与することができるため、何らかの原因で乳汁を摂取することができない子豚や、母豚の乳汁中のＰＥＤＶに対する中和抗体の濃度が低い場合であっても、子豚のＰＥＤＶへの感染を予防又は治療することができる点で有利である。
【０１０４】
（筋肉内投与用ワクチン）
本発明の筋肉内投与用ワクチンは、豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン及びアジュバントを含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
前記筋肉内投与用ワクチンは、豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口又は経鼻投与して初回免疫を付与された豚に対して用いられる。
【０１０５】
＜豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の不活化ワクチン＞
ＰＥＤＶの不活化ワクチンに用いられるＰＥＤＶの分類、入手方法、ＰＥＤＶの感染能を不活化する方法などしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第２の投与工程の中のＰＥＤＶの不活化ワクチンの項目で記載した態様などが挙げられる。
【０１０６】
前記筋肉内投与用ワクチンにおける前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０６．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上が好ましく、１０７．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ以上がより好ましい。前記含有量が１０６．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがある。
【０１０７】
＜アジュバント＞
前記アジュバントの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものなどが挙げられる。
これらの中でも、アルミニウム塩、マイクロエマルジョンアジュバント、ポリマーアジュバント、デキストリン誘導体、流動パラフィン、スクアレン、トコフェロール酢酸エステル、ポリソルベートなどが好ましく、マイクロエマルジョンアジュバントが特に好ましい。
【０１０８】
前記マイクロエマルジョンアジュバントの態様は、上記した本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法の第１の投与工程の中のアジュバント項目で記載したものと同様である。
【０１０９】
前記筋肉内投与用ワクチンにおける前記アジュバントの含有量としては、前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンの効果を損なわず、アジュバント効果が得られる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０１１０】
前記アジュバントが、前記マイクロエマルジョンアジュバントである場合、前記筋肉内投与用ワクチンにおける前記マイクロエマルジョンアジュバントの含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０体積％〜８０体積％が好ましく、５０体積％が特に好ましい。前記マイクロエマルジョンの含有量が、２０体積％未満であると、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことがあり、８０体積％を超えると、投与部位の腫脹、硬結、発赤、発熱、アナフィラキシーショックなどが起こることや、ＰＥＤＶ特異的な中和抗体の産生や液性免疫応答を誘導することができず、豚流行性下痢を予防又は治療することができないことなどがある。
【０１１１】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記経口又は経鼻投与用ワクチンのその他の成分の項目において記載したものなどが挙げられる。
【０１１２】
前記筋肉内投与用ワクチンにおける前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０１１３】
＜剤型＞
前記筋肉内投与用ワクチンの剤型としては、筋肉内投与することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤などが挙げられる。
【０１１４】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
【０１１５】
＜製造方法＞
前記筋肉内投与用ワクチンを製造する方法としては、前記ＰＥＤＶの不活化ワクチンと、前記アジュバントとを混合することができれば、特に制限はなく、剤型などに応じて公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
【０１１６】
＜使用＞
前記筋肉内投与用ワクチンは、ＰＥＤＶの生ワクチンとアジュバントと経口又は経鼻投与して初回免疫を付与された豚に対して用いられる。
前記豚に初回免疫を付与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記豚流行性下痢の予防又は治療方法の前記第１の工程に記載の方法が好適に用いられる。
【０１１７】
前記筋肉内投与用ワクチンは、１種単独で使用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記筋肉内投与用ワクチンは、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【０１１８】
前記筋肉内与用ワクチンは、ＰＥＤＶの生ワクチンとアジュバントとを経口投与又は経鼻投与して初回免疫を付与された豚に対して用いられることにより、ＰＥＤＶに特異的な中和抗体の産生を誘導することができ、更に液性免疫応答によりＰＥＤＶに特異的なＩｇＡの産生も誘導することができるため、効率よく豚流行性下痢を予防又は治療することができる。
【０１１９】
前記筋肉内投与用ワクチンは、母豚だけでなく、子豚にも直接投与することができるため、何らかの原因で乳汁を摂取することができない子豚や、母豚の乳汁中のＰＥＤＶに対する中和抗体の濃度が低い場合であっても、子豚のＰＥＤＶへの感染を予防又は治療することができる点で有利である。
【実施例】
【０１２０】
以下に実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に何ら限定されるものではない。
【０１２１】
（製造例１）
＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン１の製造＞
＜＜ＰＥＤＶのＰ−５Ｖ株の分離及び作出＞＞
野外で豚流行性下痢（ＰＥＤ）を発症した子豚から小腸を採取し、１０質量％組織乳剤とした。この１０％組織乳剤を、ＰＥＤに感染していない子豚に経口投与し、２日間後、小腸を採取し、１０質量％組織乳剤を作製した。同様の方法で、ＰＥＤに感染していない子豚で３代まで継代した。継代３代目の子豚から得られた組織乳剤に、終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにトリプシンを添加し、予め２５ｃｍ２培養フラスコでコンフルエントにしたＶｅｒｏ細胞に接種し、３７℃で６０分間培養した。その後、以下に記載の方法で調製した培養液（以下、「１０μｇ／ｍＬトリプシン加培養液」と称することがある）５ｍＬを加え、３７℃で培養した。光学顕微鏡で細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日確認し、ＣＰＥが確認された時点で培養を停止し、継代した。分離したウイルスの継代は、継代が進むにつれてトリプシン添加量を徐々に減少させ、最終的にトリプシン非添加とし、総継代数１００代まで継代した。
−１０μｇ／ｍＬトリプシン加培養液−
５００ｍＬのＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）となるように酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及び終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）となるようにトリプトースホスフェートブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を溶解し、更にペニシリン５０，０００ユニット、ストレプトマイシン５０ｍｇ、及び終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようトリプシンを溶解した。
【０１２２】
＜＜Ｐ−５Ｖ株の同定＞＞
Ｐ−５Ｖ株の培養上清からＴＲＩＺｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ウイルスＲＮＡを抽出した。ＰＥＤＶ  ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及び下記表１に示す８種類のＰＥＤＶ  Ｓ遺伝子特異的プライマーセット（プライマーセット１〜８）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、サーマルサイクラー（Ｖｅｒｉｔｉ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて増幅した。増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物は、ｐＣＲ（商標登録）２．１−ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にヒートショック法を用いて大腸菌ＴＯＰ１０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に形質転換し、クローニングした。大腸菌をＬＢ培地（組成：塩化ナトリウム１０ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ  １０ｇ、酵母エキス５ｇを１Ｌの蒸留水に溶解）を用いて、３７℃にて一晩培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用してプラスミドを精製した。精製したプラスミドから、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１試薬及び３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって、ＰＥＤＶ  Ｓ遺伝子塩基配列を解読した。解読した各配列断片をアセンブリし、ＭＥＧＡ４．０ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ．ｎｅｔ）を用いて、近隣接合法による系統樹解析を行った。
その結果、上記で得られた株は、ＰＥＤＶの遺伝学的グループＩのＰ−５Ｖ株と同定した（図１参照）。
【０１２３】
【表１】
2018027903.tif 000002
【０１２４】
＜＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液１の調製＞＞
前記Ｐ−５Ｖ株をＶｅｒｏ細胞に接種し、３７℃で３日間培養後、Ｖｅｒｏ細胞を回収して凍結融解した。次いで、前記凍結融解物を遠心分離し、得られた上清を「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）ウイルス抗原液１」として回収した。前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）ウイルス抗原液１に対して、７．５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール６０００、及び１Ｍの塩化ナトリウムをそれぞれ添加し、４℃で一晩撹拌した後、遠心分離して沈殿を回収した。前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）ウイルス抗原液１の１／２０量（ｖ／ｖ）の生理食塩水で前記沈殿を溶解後、再度遠心分離を行い、得られた上清を「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液１」として回収した。
【０１２５】
−ウイルス力価の測定−
前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液１のウイルス力価（ウイルス感染価）を５０％組織培養感染値量（５０％  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ｄｏｓｅ：ＴＣＩＤ５０）法により測定した。
具体的には、Ｖｅｒｏ細胞を０．７５×１０６細胞／０．５ｍｌ／ウェルで２４ウェル細胞培養プレートへ播種し、３７℃で３日間培養した。測定対象の抗原液（ここでは、前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液１）を培養液（５００ｍＬのＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）となるように酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及び終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）となるようにトリプトースホスフェートブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を溶解し、更にペニシリン５０，０００ユニット、ストレプトマイシン５０ｍｇを溶解した）で１０倍階段希釈し、Ｖｅｒｏ細胞へ接種後、３７℃で９０分間培養した。培養液を交換後、３７℃で７日間培養した。細胞変性効果（ＣＰＥ）を光学顕微鏡で観察し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法に従いウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）を算出した。
その結果、前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液１のウイルス力価は、１０７．７５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。
【０１２６】
＜＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン１の調製＞＞
前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液１と、マイクロエマルジョン（商品名：ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＭＳ１３１３  ＶＧ、ＳＥＰＰＩＣ社製）とを等量（ｖ／ｖ）で混合し、室温（２５±５℃）で５分間以上撹拌して、「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン１」とした。
【０１２７】
（製造例２）
＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン２の製造＞
＜＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液２の調製＞＞
製造例１で分離及び作出したＰＥＤＶのＰ−５Ｖ株をＶｅｒｏ細胞に接種し、３７℃で３日間培養後、Ｖｅｒｏ細胞を回収して凍結融解した。次いで、前記凍結融解物を遠心分離し、得られた上清を「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）ウイルス抗原液２」として回収した。前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）ウイルス抗原液２に対して、７．５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール６０００、及び１Ｍの塩化ナトリウムをそれぞれ添加し、４℃で一晩撹拌した後、遠心分離して沈殿を回収した。前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）ウイルス抗原液２の１／２０量（ｖ／ｖ）の生理食塩水で前記沈殿を溶解後、再度遠心分離を行い、得られた上清を「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液２」として回収した。
【０１２８】
前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液２のウイルス力価を、前記製造例１の「ウイルス力価の測定」の欄に記載のＴＣＩＤ５０法により測定した。その結果、前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液２のウイルス力価は、１０７．７５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。
【０１２９】
＜＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン２の調製＞＞
前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液２と、製造例１で調製したマイクロエマルジョンとを等量（ｖ／ｖ）で混合し、室温（２５±５℃）で５分間以上撹拌して、「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン２」とした。
【０１３０】
（製造例３）
＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン１の製造＞
＜＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ウイルス抗原液１の調製＞＞
製造例１で得られたＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液１に対して、終濃度０．２％（ｖ／ｖ）となるように中性緩衝ホルマリン（関東化学株式会社製）を添加し、４℃で４８時間攪拌して前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）ウイルス抗原を不活化することにより、「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ウイルス抗原液１」を得た。
【０１３１】
＜＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン１の調製＞＞
前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ウイルス抗原液１と、製造例１で調製したマイクロエマルジョンとを等量（ｖ／ｖ）で混合し、室温（２５±５℃）で５分間以上撹拌して、「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン１」とした。
【０１３２】
（製造例４）
＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン２の製造＞
＜＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ウイルス抗原液２の調製＞＞
製造例２で得られたＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液２に対して、終濃度０．２％（ｖ／ｖ）となるように中性緩衝ホルマリン（関東化学株式会社製）を添加し、４℃で４８時間攪拌して前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）ウイルス抗原を不活化することにより、「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ウイルス抗原液２」を得た。
【０１３３】
＜＜ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン２の調製＞＞
前記ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ウイルス抗原液２と、製造例１で調製したマイクロエマルジョンとを等量（ｖ／ｖ）で混合し、室温（２５±５℃）で５分間以上撹拌して、「ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン２」とした。
【０１３４】
（実施例１）
＜初回免疫＞
ＰＥＤ抗体陰性の８週齢の豚に、製造例１で製造したＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン１（１０ｍＬ、１０８．０  ＴＣＩＤ５０／ドーズ）を１回経口投与した。
【０１３５】
＜追加免疫＞
前記初回免疫から４週間後に、製造例３で製造したＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン１（２ｍＬ、１０７．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ）を１回筋肉内投与（注射）した。
【０１３６】
（比較例１）
＜初回免疫＞
ＰＥＤ抗体陰性の８週齢の豚に、製造例１で得たＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）濃縮ウイルス抗原液（１０ｍＬ、１０８．０  ＴＣＩＤ５０／ドーズ）を１回経口投与した。
【０１３７】
＜追加免疫＞
前記初回免疫から４週間後に、製造例３で製造したＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン１（２ｍＬ、１０７．５  ＴＣＩＤ５０／ドーズ）を１回筋肉内投与（注射）した。
【０１３８】
（比較例２）
＜初回免疫＞
ＰＥＤ抗体陰性の８週齢の豚に、日生研ＰＥＤ生ワクチン（日生研株式会社製）（２ｍＬ）を１回筋肉内投与（注射）した。
【０１３９】
＜追加免疫＞
前記初回免疫から４週間後に、日生研ＰＥＤ生ワクチン（日生研株式会社製）（２ｍＬ）を１回筋肉内投与（注射）した。
【０１４０】
【表２】
2018027903.tif 000003
【０１４１】
（試験例１）
実施例１、比較例１、及び比較例２の豚について、初回免疫直前及び追加免疫から１週間後に、それぞれ血液を採取した。また、対照として、初回免疫及び追加免疫を行っていないＰＥＤ抗体陰性の８週齢の豚についても、８週齢、１２週齢、及び１３週齢の時点で血液を採取した。次いで、以下に示す方法で、採取した血液中のＰＥＤＶ中和抗体価の測定、及びＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導を調べた。
【０１４２】
＜ＰＥＤＶ中和抗体価の測定＞
Ｖｅｒｏ細胞を０．７５×１０６細胞／０．５ｍｌ／ウェルで２４ウェル細胞培養プレートへ播種し、３７℃で３日間培養した。培養液（５００ｍＬのＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）となるように酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及び終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）となるようにトリプトースホスフェートブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を溶解し、更にペニシリン５０，０００ユニット、ストレプトマイシン５０ｍｇを溶解した）で２倍階段希釈した豚血清に、等量のＰ−５Ｖ株（２００  ＴＣＩＤ５０）を含有するウイルス液を混合し、３７℃で９０分間反応させた。血清とＰ−５Ｖ株との混合液を、前記Ｖｅｒｏ細胞に接種し、３７℃で９０分間培養した。培養液を交換後、３７℃で７日間培養した。細胞変性効果（ＣＰＥ）を光学顕微鏡で観察してＰＥＤＶ中和抗体価を測定した。結果を下記表３に示す。なお、中和抗体価の単位は、血清の希釈倍率（倍）で示す。
【０１４３】
＜ＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導＞
＜＜ウェスタンブロット法によるＰＥＤＶに対するＩｇＡの検出＞＞
実施例１、比較例１、及び比較例２の追加免疫から１週間後に採取した血液をそれぞれ遠心分離し、血清を分離した。Ｐ−５Ｖ株（１０７．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を含有するウイルス液２００μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて泳動した後、ポリフッ化ビリニデン（ＰＶＤＦ）フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へブロッティングした。１次抗体として、３％（ｗ／ｖ）スキムミルク及び０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ（組成：ＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４／１２Ｈ２Ｏ  ２．９ｇ、及びＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇを、蒸留水１Ｌに溶解。以下の試験例においても同様の組成とする）で１００倍希釈した豚血清を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗豚ＩｇＡポリクローナル抗体（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）を用い、検出試薬（商品名：ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により、ＰＥＤＶに対するＩｇＡを検出した。
【０１４４】
ウェスタンブロットの結果より、以下の評価基準に基づきＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導の有無を評価した。結果を下記表３に示す。
−評価基準−
「−」：ＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導活性なし（ウェスタンブロットのバンドが検出されなかった）
「＋」：ＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導活性あり（ウェスタンブロットのバンドが検出された）
【０１４５】
【表３】
2018027903.tif 000004
【０１４６】
初回免疫でアジュバントを含むＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン経口投与した場合（実施例１）は、アジュバントを含まないＰＥＤＶを経口投与した場合（比較例１）や、従来の筋肉内投与用ワクチンを２回投与した場合（比較例２）と比較して、顕著なＰＥＤＶ特異的中和抗体の産生増強活性、及びＰＥＤＶ特異的ＩｇＡの産生誘導活性が認められた。
【０１４７】
（試験例２）
実施例１及び比較例１の豚に、追加免疫から２週間後に、それぞれ以下の方法で分離及び作出した野外株であるＭＺ０１１６−２／２０１３株（以下、「野外株ＭＺ」と称することがある）（１０５．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）５ｍＬを経口投与して攻撃した。また、対照として、初回免疫及び追加免疫を行っていないＰＥＤ抗体陰性の１４週齢の豚も、同様にして野外株ＭＺ（１０５．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）５ｍＬを経口投与して攻撃した。次いで、以下に示す方法で、臨床症状の観察、糞便中のＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出、及び臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出を行った。
【０１４８】
＜＜ＰＥＤＶ（ＭＺ０１１６−２／２０１３株（野外株ＭＺ））の分離及び作出＞＞
豚流行性下痢（ＰＥＤ）で死亡した子豚から小腸を採取し、この小腸０．５ｇをビーズ入り破砕チューブ（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に入れ、高速細胞破砕機（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ、Ｂｅｒｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で破砕後、培養液（ＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５ｍＬに懸濁し、遠心分離した。遠心分離後の上清をポアサイズ（孔径）０．２２μｍのシリンジフィルター（ＧＥヘルスケア社製）に通し、１０質量％組織乳剤とした。次いで、前記１０質量％組織乳剤３００μＬと、１０μｇ／ｍＬトリプシン加培養液１００μＬとを混合した混合液を調製した。予め６ウェルの細胞培養プレートでコンフルエントにしたＶｅｒｏ細胞に、前記混合液を全量接種し、３７℃で９０分間培養した。次いで、前記混合液を除去し、１０μｇ／ｍＬトリプシン加培養液４ｍＬを加え、３７℃で培養した。光学顕微鏡で細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日確認し、ＣＰＥが確認された時点で培養を停止した。上清及び細胞を回収し、凍結融解した後に遠心分離した上清を継代した。
【０１４９】
＜＜ＭＺ０１１６−２／２０１３株の同定＞＞
製造例１の「Ｐ−５Ｖ株の同定」において、Ｐ−５Ｖ株の培養上清に代えて、野外株ＭＺの培養上清を用いたこと以外は、前記「Ｐ−５Ｖ株の同定」と同様の方法で系統樹解析を行った。
その結果、上記で得られた株は、ＰＥＤＶの遺伝学的グループＩＩの野外株ＭＺと同定した（図１参照）。
【０１５０】
＜臨床症状の観察＞
実施例１、比較例１、及び対照を野外株ＭＺで攻撃後０日目〜１４日目に、毎日、糞便の状態及び食欲を観察し、以下の評価基準に基づき評価した。糞便の状態の結果を下記表４に、食欲の結果を下記表５に示す。
−糞便の状態の評価基準−
「０」：正常便
「１」：軟便
「２」：下痢便
「３」：水様性下痢便
−食欲の評価基準−
「０」：正常
「１」：軽度の不振
「２」：中程度の不振
「３」：重度の不振
【０１５１】
【表４】
2018027903.tif 000005
【０１５２】
【表５】
2018027903.tif 000006
【０１５３】
糞便の状態については、実施例１、比較例１、及び対照の全てにおいて０点であり、差が認められなかった（表４）。一方、食欲については、実施例１では正常であったのに対し、比較例１及び対照では食欲の不振が認められた（表５）。
【０１５４】
＜直腸スワブ中のＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出＞
実施例１、比較例１、及び対照を野外株ＭＺで攻撃後０日目〜１４日目の間、毎日、滅菌綿棒（オオサキメディカル株式会社製）を用いて直腸スワブを採取し、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、ＴＲＩＺｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ウイルスＲＮＡを抽出した。ＰＥＤＶ  ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＰＥＤＶ特異的プライマー（配列番号１７で表されるプライマー９−Ｆ［５’−ＧＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＣＴＣ−３’］及び配列番号１８で表されるプライマー９−Ｒ［５’−ＡＧＣＡＴＡＧＣＴＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣ−３’］）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、サーマルサイクラー（Ｖｅｒｉｔｉ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて増幅した。増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドを用いて染色した後、紫外線照射によって検出した。各群の母数に対するＰＥＤＶ  ＲＮＡが検出された陽性個体の出現率（％）を算出した結果を下記表６に示す。
【０１５５】
【表６】
2018027903.tif 000007
【０１５６】
＜臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出＞
実施例１、比較例１、及び対照を野外株ＭＺで攻撃後１４日目に、各個体の脾臓、空回腸、盲腸、結腸、及び腸管膜リンパ節を摘出し、それぞれ１０質量％組織乳剤を作製した。各１０質量％組織乳剤から、ＴＲＩＺｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、各臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡを抽出した。次いで、ＧｏＴａｑ（登録商標）  １−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）及びＰＥＤＶ特異的プライマー（配列番号１９で表されるプライマー１０−Ｆ［５’−ＣＧＣＡＡＡＧＡＣＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣ−３’］及び配列番号２０で表されるプライマー１０−Ｒ［５’−ＴＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＴ−３’］）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にてＲＮＡ量（ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ相当）を定量した。結果を下記表７に示す。
【０１５７】
【表７】
2018027903.tif 000008
【０１５８】
表６の結果より、比較例１及び対照では、ＰＥＤＶ  ＲＮＡが検出された陽性個体の出現率が高かったのに対し、実施例１では、観察期間中にＰＥＤＶ  ＲＮＡが検出された陽性個体は出現しなかった。また、表７の結果より、臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡも同様に、実施例１では検出されなかった。
これらの結果より、実施例１では、腸管粘膜から分泌された分泌型ＩｇＡによってＰＥＤＶが中和され、感染防御免疫が成立しているものと考えられる。
なお、表６の比較例１及び対照で認められるように、ＰＥＤＶは、一度検出されなくなっても、再び出現し、これが感染後１ヶ月〜２ヶ月程度持続することが知られている。
【０１５９】
（実施例２）
＜初回免疫＞
ＰＥＤ抗体陰性の８週齢の豚に、製造例２で製造したＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン２（１ｍＬ、１０７．４５ＴＣＩＤ５０／ドーズ）を１回経鼻投与した。
【０１６０】
＜追加免疫＞
前記初回免疫から６週間後に、製造例４で製造したＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン２（２ｍＬ、１０７．７５ＴＣＩＤ５０／ドーズ）を１回筋肉内投与（注射）した。
【０１６１】
【表８】
2018027903.tif 000009
【０１６２】
（試験例３）
実施例２の豚について、初回免疫直前及び追加免疫から１週間後の血液を採取した。また、対照として、初回免疫及び追加免疫を行っていないＰＥＤ抗体陰性の８週齢の豚についても、８週齢及び１５週齢の時点で血液を採取した。次いで、試験例１の「ＰＥＤＶ中和抗体価の測定」及び「ＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導」の欄に記載の方法と同様の方法で、採取した血液中のＰＥＤＶ中和抗体価、及びＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導を調べた。結果を下記表９に示す。
【０１６３】
【表９】
2018027903.tif 000010
【０１６４】
初回免疫でＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン経鼻投与した場合も、経口投与した場合と同様に、顕著なＰＥＤＶ特異的中和抗体の産生増強活性、及びＰＥＤＶ特異的ＩｇＡの産生誘導活性が認められた。
従来、ＰＥＤＶが呼吸器系器官に感染するという報告はなく、ＰＥＤＶの感染は消化器官に限局されているため、経鼻投与により、ＰＥＤＶ特異的中和抗体やＰＥＤＶ特異的ＩｇＡの産生を誘導することができることは、本発明者らによる予想外の知見である。
【０１６５】
（試験例４）
実施例２の豚に、追加免疫から２週間後に、野外株ＭＺ（１０５．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）５ｍＬを経口投与して攻撃した。また、対照として、初回免疫及び追加免疫を行っていないＰＥＤ抗体陰性の１６週齢の豚も、同様にして野外株ＭＺ（１０５．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）５ｍＬを経口投与して攻撃した。次いで、試験例２の「直腸スワブ中のＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出」の欄に記載の方法と同様の方法で、直腸スワブ中のＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出、及び臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出を行った。
【０１６６】
＜直腸スワブ中のＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出＞
各群の母数に対するＰＥＤＶ  ＲＮＡが検出された陽性個体の出現率（％）を算出した結果を下記表１０に示す。
【０１６７】
【表１０】
2018027903.tif 000011
【０１６８】
＜臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出＞
実施例２及び対照を野外株ＭＺで攻撃後１４日目に、各個体の空回腸、盲腸、結腸、及び腸間膜リンパ節を摘出し、各臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡを試験例２の「臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出」の欄に記載の方法と同様の方法で検出し、ＲＮＡ量（ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ相当）を定量した。結果を下記表１１に示す。
【０１６９】
【表１１】
2018027903.tif 000012
【０１７０】
（実施例３）
＜初回免疫＞
ＰＥＤ抗体陰性の妊娠豚に、製造例２で製造したＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）生ワクチン２（１ｍＬ、１０７．４５ＴＣＩＤ５０／ドーズ）を１回経鼻投与した。
【０１７１】
＜追加免疫＞
前記初回免疫から８週間後に、製造例４で製造したＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ株）不活化ワクチン２（２ｍＬ、１０７．７５ＴＣＩＤ５０／ドーズ）を１回筋肉内投与（注射）した。
【０１７２】
（比較例３）
＜初回免疫＞
ＰＥＤ抗体陰性の妊娠豚に、日生研ＰＥＤ生ワクチン（日生研株式会社製）  ２ｍＬを１回筋肉内投与（注射）した。
【０１７３】
＜追加免疫＞
前記初回免疫から４週間後に、日生研ＰＥＤ生ワクチン（日生研株式会社製）  ２ｍＬを１回筋肉内投与（注射）した。
【０１７４】
【表１２】
2018027903.tif 000013
【０１７５】
（試験例５）
実施例３及び比較例３の妊娠豚から生まれた子豚（生後２日目）に、それぞれ野外株ＭＺ（１０５．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）５ｍＬを経口投与して攻撃した。また、対照として、初回免疫及び追加免疫を行っていないＰＥＤ抗体陰性の妊娠豚から生まれた子豚（生後２日目）に対しても野外株ＭＺ（１０５．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）５ｍＬを経口投与して攻撃した。なお、子豚の攻撃後も、実施例３及び比較例３の母豚と、これらの子豚とは同居させた。
【０１７６】
＜母豚におけるＰＥＤＶ中和抗体価＞
実施例３、比較例３、及び対照の妊娠豚（母豚）ついて、初回投与直前、追加投与から１週後、及び子豚への攻撃から１週間後の血液を採取した。次いで、試験例１の「ＰＥＤＶ中和抗体価の測定」の欄に記載の方法と同様の方法で、採取した血液中のＰＥＤＶ中和抗体価を調べた。結果を下記表１３に示す。
【０１７７】
＜母豚の乳汁におけるＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導＞
子豚への攻撃直前に、実施例３、比較例３、及び対照の母豚の乳汁を採取し、試験例１の「ウェスタンブロット法によるＰＥＤＶに対するＩｇＡの検出」の欄に記載の方法において、血液を前記乳汁に変えたこと以外は、試験例１と同様の方法で、乳汁中のＰＥＤＶに対するＩｇＡを検出し、試験例１と同様の方法でＰＥＤＶに対するＩｇＡの産生誘導の有無を評価した。結果を下記表１３に示す。
【０１７８】
【表１３】
2018027903.tif 000014
【０１７９】
＜子豚の生存率＞
実施例３、比較例３、及び対照の妊娠豚から生まれた子豚を野外株ＭＺで攻撃後０日目〜７日目に、毎日、生存率の確認を行った。結果を下記表１４に示す。
【０１８０】
【表１４】
2018027903.tif 000015
【０１８１】
＜子豚の小腸の病理組織学的観察＞
前記「子豚の臓器におけるＰＥＤＶ  ＲＮＡの検出」の際に摘出した各子豚の小腸をホルマリン固定後、常法によりパラフィン切片を作製した。次いで、キシレンを用いて前記パラフィン切片からパラフィンを除去した。次いで、切片の再水和のため、濃度勾配をもたせたエタノール水溶液に切片を浸漬し、切片の再水和を行った後、蒸留水を用いてエタノールを除去した。エタノールを除去した切片標本を、ヘマトキシリン液に２０分間浸漬した後、蒸留水で洗浄し、エオジン液に２分間浸漬して染色した。次いで、濃度勾配をもたせたエタノール水溶液に浸漬して脱水した後、キシレンに浸漬して透徹し、組織標本とした。作製した組織標本を光学顕微鏡で観察し、絨毛の萎縮、絨毛細胞の空砲化、絨毛の平坦化、及び絨毛基底膜の炎症に関する総合的な評価を以下の評価基準に基づき行った。なお、１頭の母豚から数頭の子豚が生まれたため、評価基準のスコアは、実施例３、比較例３、及び対照の各群の子豚の平均値を算出し、スチューデントのＴ検定により有意差の確認を行った。結果を下記表１５に示す。
−評価基準−
「０」：正常
「１」：軽度
「２」：中等度
「３」：重度
【０１８２】
【表１５】
2018027903.tif 000016
【０１８３】
本発明の態様としては、例えば、以下の態様などが挙げられる。
＜１＞  豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する第１の投与工程と、
前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与で前記豚に投与する第２の投与工程と、を含むことを特徴とする豚流行性下痢の予防又は治療方法である。
＜２＞  アジュバントが、マイクロエマルジョンアジュバントである前記＜１＞に記載の豚流行性下痢の予防又は治療方法である。
＜３＞  経口又は経鼻投与用の豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン、経口又は経鼻投与用アジュバント、筋肉内投与用の前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン、及び筋肉内投与用アジュバントを有することを特徴とするワクチンキットである。
＜４＞  経口又は経鼻投与用アジュバント及び筋肉内投与用アジュバントが、マイクロエマルジョンアジュバントである前記＜３＞に記載のワクチンキットである。
＜５＞  豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとアジュバントとを筋肉内投与して後に追加免疫を付与される豚に対して用いられ、
前記豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン及びアジュバントを含むことを特徴とする経口又は経鼻投与用ワクチンである。  
＜６＞  アジュバントが、マイクロエマルジョンアジュバントである前記＜５＞に記載の経口又は経鼻投与用ワクチンである。
＜７＞  豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとアジュバントとを経口投与又は経鼻投与して初回免疫を付与された豚に対して用いられ、
前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン及びアジュバントを含むことを特徴とする筋肉内投与用ワクチンである。
＜８＞  アジュバントが、マイクロエマルジョンアジュバントである前記＜７＞に記載の筋肉内投与用ワクチンである。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明の豚流行性下痢の予防又は治療方法、ワクチンキット、経口又は経鼻投与用ワクチン、及び筋肉内投与用ワクチンは、豚流行性下痢ウイルスに特異的な中和抗体の産生誘導活性、及び液性免疫応答の誘導活性に優れるため、豚流行性下痢の予防又は治療に好適に利用可能である。
【図１】
2018027903.tif 000017
【配列表】
2018027903000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月25日(2017.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとマイクロエマルジョンアジュバントとを経口投与及び経鼻投与のいずれかで豚に投与する第１の投与工程と、
前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとマイクロエマルジョンアジュバントとを筋肉内投与で前記豚に投与する第２の投与工程と、を含むことを特徴とする豚を対象とする豚流行性下痢の予防又は治療方法。
【請求項２】
経口又は経鼻投与用の豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン、経口又は経鼻投与用マイクロエマルジョンアジュバント、筋肉内投与用の前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン、及び筋肉内投与用マイクロエマルジョンアジュバントを有することを特徴とするワクチンキット。
【請求項３】
豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチンとマイクロエマルジョンアジュバントとを筋肉内投与して後に追加免疫を付与される豚に対して用いられ、
前記豚流行性下痢ウイルスの生ワクチン及びマイクロエマルジョンアジュバントを含むことを特徴とする経口又は経鼻投与用ワクチン。
【請求項４】
豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンとマイクロエマルジョンアジュバントとを経口投与又は経鼻投与して初回免疫を付与された豚に対して用いられ、
前記豚流行性下痢ウイルスの不活化ワクチン及びマイクロエマルジョンアジュバントを含むことを特徴とする筋肉内投与用ワクチン。