(57)【要約】【課題】酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株を提供する。【解決手段】本発明によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株は、優れた酵素生成能を有し、優れた胆汁抵抗性、腸粘膜付着性及びヘリコバクターピロリに対する優れた抗菌能を有するので、腸機能改善用健康食品などの高機能性食品に適用可能である。また、本発明によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株は優れた血栓溶解能を有するので、血栓症予防又は改善用健康食品に適用可能であり、ひいてはこのような健康食品は血栓によって発生し得る生活習慣病に対する予防効果を期待することができる。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有する、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株（受託番号ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ）。
【請求項２】
前記酵素生成能はアミラーゼ又はプロテアーゼを生成する能力である、請求項１に記載のバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株（受託番号ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ）。
【請求項３】
酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株（受託番号ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ）又は前記菌株の培養液のいずれか一方又は両方を有効成分として含む、血栓症予防又は改善用健康食品。
【請求項４】
酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株（受託番号ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ）又は前記菌株の培養液のいずれか一方又は両方を有効成分として含む、腸機能改善用健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株に関するもので、より詳しくは酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）はいわゆる枯草菌とも呼ばれ、主に土壌に棲息するＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する菌で、グラム陽性の胞子を形成する菌である。このようなバチルスサブチリスは好気性であり、周毛性鞭毛を持って運動し、耐熱性の菌であり、ブドウ糖など多様な糖類又は澱粉などをエネルギー源として代謝し、みそだま麹又はチョングクチャンのような発酵食品の製造時に発酵菌株として用いられることもある、有機物を分解することができる微生物である。
【０００３】
一方、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は植物組織のペクチンと多糖類を分解する微生物として知られており、その他にもタンパク質及び澱粉のような多様な物質を分解することができる酵素を生産することができる微生物である。また、病原性細菌を抑制することができる抗菌物質を生成するバチルスサブチリスも研究によって知られ、多様な生化学、物理的な特性を有するとともに菌に対する安全性も立証されているため、生物学的製剤としても広く使われているのが実情である。また、韓国人にはチョングクチャンの発酵微生物として関係が深いだけでなく多くの微生物製剤としても用いられている。
【０００４】
一方、Ｋｏｒｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０１２，Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．３，ｐｐ．２２０−２２４．には伝統醤油類から分離された生体アミン（Ｂｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｍｉｎｅｓ）分解能を有するバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株が開示されている。
【０００５】
また、バチルスサブチリスは血栓溶解能を保有するものとして知られているので、血栓に起因する成人病に対する予防効果を期待することができ、各種の有用な生理活性機能が報告されることによって機能性健康食品として注目が増している。
【０００６】
血栓はフィブリノゲン（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）がトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）によってフィブリン（Ｆｉｂｒｉｎ）に転換されて形成される重合体であり、脳血管又は心臓血管に血栓が形成される疾患である血栓症は致命的である。よって、血栓を溶解させるために、ウロキナーゼ（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔＰＡ）などが使われていた。しかし、このような製剤は血中半減期が短く、出血などの副作用があり、価格が高いという問題点があった。それで、このような問題点を解決することができる血栓溶解物質を捜そうとする研究が活発に進められていた。
【０００７】
しかし、整腸機能（酵素分泌能、胆汁抵抗性、腸粘膜付着性）と血栓溶解能が高く、病原性微生物であるヘリコバクターピロリに対する抗菌作用を同時に有している菌株は見つかっていないのが実情であり、これらを同時に有している高付加価値食品の製造に使用可能な新規微生物に対する研究が必要とされていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】キムヨンサン他、Ｋｏｒｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０１２，Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．３，ｐｐ．２２０−２２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一側面によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株（受託番号：ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ）は、優れた酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能を有するとともに優れた血栓溶解能を有する。
そして、前記酵素はアミラーゼ又はプロテアーゼである。
本発明の他の側面による血栓症の予防又は改善用健康食品は、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株（受託番号：ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ）又は前記菌株の培養液のいずれか一方又は両方を有効成分として含むことができる。
本発明のさらに他の側面による腸機能改善用健康食品は、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株（受託番号：ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ）又は前記菌株の培養液のいずれか一方又は両方を有効成分として含むことができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株は、優れた酵素生成能を有し、優れた胆汁抵抗性、腸粘膜付着性及びヘリコバクターピロリに対する優れた抗菌能を有するので、腸機能改善用健康食品などの高機能性食品に適用可能である。
【００１２】
また、本発明によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株は優れた血栓溶解能を有するので、血栓症の予防又は改善用健康食品に適用可能であり、さらにこのような健康食品は血栓が原因となり得る生活習慣病に対する予防効果を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ１００２菌株の酵素分泌能確認結果を示す図である。
【図２】本発明によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ１００２菌株の腸内付着性確認結果を示す図である。
【図３】本発明によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ１００２菌株の抗菌力測定結果を示す図である。
【図４】本発明によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ１００２菌株の血栓溶解能測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は多様に変更させることができ、様々な実施例を含み得るが、特定の実施例を図面に例示し、以降、詳細に説明を行う。しかし、これは本発明を特定の実施形態に限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物乃至代替物を含むものとして理解されなければならない。本発明の説明において関連の公知技術についての具体的な説明が本発明の要旨をあいまいにするおそれがあると判断された場合には、その詳細な説明を省略する。
【００１５】
本発明の一側面によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株（受託番号：ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ、以下ＬＲＣＣ１００２菌株の受託番号ＫＣＣＭ１１８８０Ｐの記載は省略する）は、酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有する。
【００１６】
従来技術によれば、整腸機能（酵素分泌能、胆汁抵抗性、腸粘膜付着性）と血栓溶解能が高く、病原性微生物であるヘリコバクターピロリに対する抗菌作用を併せ持っている菌株が存在しないという問題点があった。
【００１７】
そこで、本発明者らは優れた酵素生成能を有し、優れた胆汁抵抗性、腸粘膜付着性及びヘリコバクターピロリに対する優れた抗菌能を有する菌株について研究を行い、同定して本発明を完成させた。
【００１８】
以下、発明の具体例であるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株についてより詳細に説明する。
【００１９】
前記バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株を韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に２０１６年８月１２日付けで寄託した（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ１００２菌株）。
【００２０】
前記菌株は、酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を同時に有することができる。
【００２１】
前記酵素は消化酵素であって、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）が挙げられるが、好ましくはアミラーゼ又はプロテアーゼである。
【００２２】
本発明の一側面によれば、本発明によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株又は前記菌株の培養液を有効成分として含む腸機能改善用健康食品を提供することができる。
【００２３】
一方、本発明によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株又は前記菌株の培養液を有効成分として含む血栓症予防又は改善用健康食品を提供することができる。
【００２４】
具体的に、腸機能改善又は血栓症の予防又は改善の効果を目的として本発明の前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液を食品又は飲料に添加することができる。この時、食品又は飲料中の前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液の量は食品総重量の０．０１〜１．０重量％で加えることができ、健康飲料組成物は１０００ｍｌを基準として０．１〜１０．０ｇの割合で加えることができる。
【００２５】
本発明の健康機能性飲料組成物は、必須成分として前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液を含む限り、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように多様な甘味料又は天然炭水化物などを追加成分として配合することができる。上述した天然炭水化物の例は、単糖類、例えばブドウ糖、果糖など；二糖類、例えばマルトース、スクロースなど；及び多糖類、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどの一般的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したものの他に、甘味料として天然甘味料（タウマチン、ステビア抽出物、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど）及び合成甘味料（サッカリン、アスパルテームなど）を使うことができる。
【００２６】
その他に、本発明の前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液は多様な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成香料及び天然香料などの香料、着色料及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを配合することができる。その他に、本発明の前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液は天然果汁及び果汁飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を配合することができる。このような成分は単独又は組合せで使うことができる。
【００２７】
本発明の一側面による腸機能改善又は血栓症予防又は改善用健康食品において、前記食品は乳製品、発酵乳、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料、アルコール飲料及びビタミン複合剤からなる群から選択されるものであるが、これに制限されない。
【００２８】
以下、本発明の好適な実施例を添付図面に基づいて詳細に説明する。ただ、これら実施例は専ら本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものとして解釈されてはいけない。
【００２９】
試験例１：分離菌株の同定及び酵素分泌能に優れた菌株の分離
伝統発酵食品から菌株を分離した後、生育がよくコロニー形状が鮮やかな９種の菌株を選抜した。選抜した菌株は食品原料として使用可能な微生物であるかを確認するために（株）バイオファクト（ＢＩＯＦＡＣＴ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，大韓民国）に依頼して１６ｓリボソームＤＮＡ塩基配列に基づいて菌株を同定した分析結果を得た。同定を実施した結果、いずれもＢａｃｉｌｌｕｓ属の微生物であり、このうち食用可能な微生物は４種で、いずれもＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであり、その細胞外酵素分泌能を確認した結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ１００２菌株においてアミラーゼ（Ａｍｙｌａｓｅ）及びプロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）酵素活性が一番優秀であった（図１）。実験の対照群は韓国細胞株銀行から分譲されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＣＣＭ１２５１２を用いた。
【００３０】
試験例２：人工胃液及び胆汁酸に対する抵抗性評価
分離菌株の人工胃液に対する抵抗性評価のために菌株はトリプシンソイ培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＵＳＡ）にて前培養した後、遠心分離して菌体のみ回収した。回収した菌体は滅菌した０．５％ＮａＣｌで洗浄し、洗浄の最終段階で０．５％ＮａＣｌに分散させて菌株懸濁液を準備した。人工胃液の抵抗性測定は、０．５％ＮａＣｌ（ｐＨ２．５）に０．０４％（ｗ／ｖ）ペプシンを添加して製造した人工胃液に菌株懸濁液を接種し、３時間反応させたのち寒天（Ａｇａｒ）培地に平板塗抹して生菌数を測定した。対照群の生菌数は、人工胃液に接種した後、直ちに寒天（Ａｇａｒ）培地に平板塗抹して測定した。分離菌株の人工胃液に対する抵抗性は初期生菌数と３時間反応後の生菌数の割合で計算してＬｏｇ％で示した。
【００３１】
胆汁酸に対する抵抗性評価のために、分離菌株は液体培地にて前培養した後、遠心分離して菌体を回収した後、滅菌水で洗浄し、洗浄の最終段階で滅菌水に分散させて菌株懸濁液を準備した。胆汁酸の抵抗性測定は０．５％ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）に０．３％胆汁塩（Ｂｉｌｅ  Ｏｘ  ｇａｌｌ  ｓａｌｔ）が添加された液体培地に菌株懸濁液を接種し、３時間反応させ、寒天（Ａｇａｒ）培地に平板塗抹して生菌数を測定した。対照群の生菌数は、胆汁酸液に接種した後、直ちに寒天培地に平板塗抹して測定した。分離菌株の胆汁酸に対する抵抗性は初期生菌数と３時間反応後の生菌数の割合で計算してＬｏｇ％で示した。
【００３２】
プロバイオティック微生物を製品に適用するためには胃腸管の低いｐＨ条件及び消化酵素が多い胆汁が存在する環境で生存させなければならない。よって、選抜されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのうち人工胃液と胆汁酸に対する抵抗性が高い菌株の探索実験を行い、下記の表１にその結果を示した。実験の対照群として、前記と同様に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＣＣＭ１２５１２及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＣＣＭ１２０２７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＣＣＭ１２５１１を用いた。人工胃液に対する抵抗性を評価した結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ１００２がＬｏｇ６７．６％と一番高い生存率を示し、０．３％胆汁塩を用いて製造した胆汁酸に対する耐性は４種の菌株のいずれもＬｏｇ９９％以上であり、有意差はなかった。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
試験例３：腸内付着性評価
本実験に使用されたＣａｃｏ２  Ｃｅｌｌは人の大腸癌に由来する腸管上皮細胞であって、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から分譲されたものを用いた。Ｃａｃｏ２  Ｃｅｌｌ（ＨＴＢ−３７、ＡＴＣＣ）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（Ｗｅｌｇｅｎｅ  ｃｏ．，デグ，大韓民国）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ、ＵＳＡ）を添加したＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ、Ｗｅｌｇｅｎｅ  ｃｏ．，デグ，大韓民国）培地を用いて３７℃で５％ＣＯ2が供給される培養器で培養した。細胞が単一層（Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成したものについて、継代培養し、隔日で培地を交換しながら実験に使った。腸内付着性実験のために、Ｃａｃｏ２  Ｃｅｌｌは２４Ｗｅｌｌ  ＰｌａｔｅにＷｅｌｌ当たり１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で分取し、３７℃で５％ＣＯ2培養器で２４時間培養した。分離菌株はトリプシンソイ培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）に接種し、２４時間の間３７℃で前培養した後、菌株を回収し、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄し、ＦＢＳとペニシリン／ストレプトマイシンが無添加のＥＭＥＭ培地に分散した。Ｃａｃｏ２Ｃｅｌｌを培養した２４Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅに分離された菌株培養液を５００μｌずつ接種し、３７℃で５％ＣＯ2条件の下で２時間培養した後、付着しなかった菌株を除去するために０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。これを回収して希釈した後、トリプシンソイ寒天（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ）培地に平板塗抹し、３７℃で２４時間培養して生菌数を確認した。腸内付着性（Ｌｏｇ％）は接種した初期菌数に対するＣａｃｏ２  Ｃｅｌｌに処理されて付着した菌数の割合で計算した。
【００３５】
消化器官を通過して最終目的部位である腸に到逹したときに腸管上皮細胞に正常に付着して生存することができるかを評価するために、分離した菌株と比較群としてＫＣＣＭ１２５１２、ＫＣＣＭ１２０２７、ＫＣＣＭ１２５１１の腸内付着性を評価した結果を図２に示した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ１００２とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＣＣＭ１２５１１がそれぞれＬｏｇ８０．３％、Ｌｏｇ７８．２％と腸内付着性が高い結果を示した。
【００３６】
試験例４：ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）菌に対する抗菌能評価
ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ＡＴＣＣ  ４０４４９）は韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ；Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）から分譲された。ヘリコバクターピロリは１０％羊血液（Ｓｈｅｅｐ  Ｂｌｏｏｄ）を含む血液寒天培地（ＢＡＰ；Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅ）（ハンイルコメド、大韓民国）に接種し、１０％ＣＯ2培養器で増菌した。３日乃至４日間培養されたヘリコバクターピロリを０．８５％生理食塩水に懸濁して準備した。実験用培地はＢｏｔｔｏｍ  Ａｇａｒ（Ａｇａｒ  １．２％含有）及びＴｏｐ  Ａｇａｒ（Ａｇａｒ  ０．３％含有）に区分して作成した。ＢＢＬTM  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を滅菌し、４０℃まで冷やし、全体の１０％の体積でウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を追加した。Ｂｏｔｔｏｍ  Ａｇａｒ１０ｍＬをペトリ皿（Ｐｅｔｒｉ  Ｄｉｓｈ）に先に分取し、常温で２時間程度固化させた。滅菌したＴｏｐ  Ａｇａｒは４０℃まで冷やし、全体の１０％の体積でウシ胎児血清（ＦＢＳ）と用意したヘリコバクターピロリ菌を接種し、固化させたＢｏｔｔｏｍ  Ａｇａｒ上に３ｍＬ分株し、３０分間固化させた後、１０ｍｍペーパーディスク（Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ  Ｋａｉｓｈａ、Ｌｔｄ、Ｊａｐａｎ）を前記プレート上に載せた。ＬＲＣＣ  １００２菌株の培養液を遠心分離して（８，０００ｒｐｍ、１０分）上澄液と菌体液を分離した後、それぞれの試料を３０μＬずつペーパーディスクに分取し、３７℃１０％ＣＯ2培養器で３日乃至４日間培養して、阻止円形成の有無を観察した（図３）。伝統発酵食品から分離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬＲＣＣ  １００２菌株はプロバイオティックスとして適用可能な有害菌の抑制力に対する特性を持っていると判断される。
【００３７】
試験例５：血栓溶解能活性評価
Ａｓｔｒｕｐ，Ｔ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒｔｚ方法［Ｔｈｅ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｐｌａｔｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ、  Ａｒｃｈｉｖｅｓｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９５２］を変形してフィブリノゲン（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）溶液（０．１７Ｍ ほう酸緩衝溶液、０．３％フィブリノゲン１０ｍＬ）をペトリ皿に分取し、これにトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）溶液（０．１７Ｍほう酸緩衝溶液、５００Ｕ／ｍＬトロンビン）を０．５ｍＬ添加した後、１分間撹拌し、１時間以上固化させた。固化したフィブリンプレートにペーパーディスクを載せ、測定試料２０μＬを分株した後、室温で３時間放置し、ペーパーディスクの周りに生成された透明な部位の直径を測定した。対照群は、精製された血栓溶解酵素であるプラスミン（Ｐｌａｓｍｉｎ、１．０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を用い、次の式で血栓溶解能を計算した。分離した菌株ＬＲＣＣ１００２と比較群としてのＫＣＣＭ１２５１２、ＫＣＣＭ１２０２７、ＫＣＣＭ１２５１１の血栓溶解酵素活性度の測定結果は図４に示す通りである。
【００３８】
＊血栓溶解能（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）（％）＝（Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｚｏｎｅ／Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｚｏｎｅ）×１００
前記のように、本発明によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株は、優れた酵素生成能を有し、優れた胆汁抵抗性、腸粘膜付着性及びヘリコバクターピロリに対する優れた抗菌能を有するので、腸機能改善用健康食品などの高機能性食品に適用可能であることが分かった。さらに、本発明によるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＲＣＣ１００２菌株は優れた血栓溶解能を有するので、血栓症の予防又は改善用健康食品に適用可能であり、ひいてはこのような健康食品は血栓によって発生し得る生活習慣病に対する予防効果を期待することができる。
【００３９】
以上で本発明の特定部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述はただ好適な実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とその等価物によって定義されると言える。
【受託番号】
【００４０】
寄託機関：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１１８８０Ｐ
寄託日：２０１６．０８．１２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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