(57)【要約】【課題】細胞同士の結合状態を保ち、かつ、健全な細胞をシート状の形態のまま基板上から剥離させることのできる、細胞シート作製装置を提供する。【解決手段】表面にて細胞Ｃを培養できる基板２と、前記基板２の裏面に対し、紫外線Ｌ１を含む光Ｌを照射可能な光照射部３と、前記光照射部３における光Ｌの照射を制御する照射制御部４と、を備え、前記基板２は、前記光照射部３から照射される光Ｌのうち少なくとも紫外線Ｌ１を該基板２の表面まで透過させず、かつ、照射された紫外線Ｌ１により光化学反応を起こすように構成され、前記照射制御部４は、細胞Ｃの培養完了後の所定時間に光Ｌを照射させるように前記光照射部３を制御する、細胞シート作製装置１である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にて細胞を培養できる基板と、
前記基板の裏面に対し、紫外線を含む光を照射可能な光照射部と、
前記光照射部における光の照射を制御する照射制御部と、を備え、
前記基板は、前記光照射部から照射される光のうち少なくとも紫外線を該基板の表面まで透過させず、かつ、照射された紫外線により光化学反応を起こすように構成され、
前記照射制御部は、細胞の培養完了後の所定時間に光を照射させるように前記光照射部を制御する、細胞シート作製装置。
【請求項２】
前記照射制御部は、前記基板の表面に細胞を播種する前の所定時間、細胞を播種した後の所定時間、のうち少なくともいずれかの時間に光を照射させるように前記光照射部を制御する、請求項１に記載の細胞シート作製装置。
【請求項３】
前記照射制御部は、前記基板の表面に細胞を播種した後から細胞の培養が完了するまでの間で、前記基板において細胞の培養が不要な領域に対して光を照射させるように前記光照射部を制御する、請求項１または２に記載の細胞シート作製装置。
【請求項４】
前記基板のうち表面に、少なくともチタンを含む層が形成されている、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞シート作製装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養した細胞をシート状の形態で取り出せる細胞シート作製装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
培養した細胞をシート状の形態とした細胞シートは、再生医療等で用いることができるため非常に有用である。このため、細胞シートを効率良く作製する方法について研究されている。
【０００３】
細胞シートを作製するには、平らな基板上で細胞を膜状に培養した上で、培養された細胞を基板からシート状に剥離させる。細胞を剥離させる方法としては、酵素（トリプシン等）を用いる方法や、細胞が載った基板の表面に対して紫外線等の光を照射する方法が考えられる。例えば特許文献１には、培養終了後の培養面（基板の表面）に紫外線を照射することによって、細胞を培養面から剥離することが記載されている。
【０００４】
しかし、酵素を用いる方法では、細胞同士の結合が無くなったり弱まったりすることで、細胞同士の結合状態が保たれなくなり、シート状の形態のまま剥離できない場合がある。そして、細胞が載った基板の表面に対して紫外線を照射する方法では、細胞が直接紫外線に暴露されることから、細胞が死滅したり損傷したりすることがある。このように従来の方法は、細胞シートの作製に当たって改良の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、細胞同士の結合状態を保ち、かつ、健全な細胞をシート状の形態のまま基板上から剥離させることのできる、細胞シート作製装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は一例として、表面にて細胞を培養できる基板と、前記基板の裏面に対し、紫外線を含む光を照射可能な光照射部と、前記光照射部における光の照射を制御する照射制御部と、を備え、前記基板は、前記光照射部から照射される光のうち少なくとも紫外線を該基板の表面まで透過させず、かつ、照射された紫外線により光化学反応を起こすように構成され、前記照射制御部は、細胞の培養完了後の所定時間に光を照射させるように前記光照射部を制御する、細胞シート作製装置である。
【０００８】
この構成によれば、細胞の培養完了後の所定時間に、光照射部から紫外線を含む光を基板に対して照射する。このため、基板に光化学反応を起こさせ、基板からシート状の形態のまま細胞を剥離できる。そして、基板において細胞を培養する表面とは反対の裏面に紫外線を含む光が照射される。このため、細胞が直接紫外線に暴露されない。よって、培養した細胞が死滅したり損傷したりすることを抑制できる。
【０００９】
また、前記照射制御部は、前記基板の表面に細胞を播種する前の所定時間、細胞を播種した後の所定時間、のうち少なくともいずれかの時間に光を照射させるように前記光照射部を制御することもできる。
【００１０】
この構成によれば、播種の前後の時間に基板に対して光が照射される。これにより、細胞が基板に付着しやすくなる。よって、基板の表面において膜状に細胞を付着させることが容易である。
【００１１】
また、前記照射制御部は、前記基板の表面に細胞を播種した後から細胞の培養が完了するまでの間で、前記基板において細胞の培養が不要な領域に対して光を照射させるように前記光照射部を制御することもできる。
【００１２】
この構成によれば、細胞を播種した後から細胞の培養が完了するまでの間に、光照射部から紫外線を含む光が照射されることで、細胞の培養が不要な領域については細胞を死滅させられる。このため、所望の形状の細胞シートを作製できる。
【００１３】
また、前記基板のうち表面に、少なくともチタンを含む層が形成されていることもできる。
【００１４】
この構成によれば、基板の裏面に照射された紫外線を、チタンを含む層にて遮断でき、しかも、照射された紫外線によりチタンを含む層で光化学反応を起こすことができる。このため、基板の表面に位置する細胞が直接紫外線に暴露されない構成を容易に構成できる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、培養した細胞が死滅したり損傷したりすることを抑制できる。このため、細胞同士の結合状態を保ち、かつ、健全な細胞をシート状の形態のまま基板上から剥離させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞シート作製装置を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る基板の特性に関し、（ａ）は光吸収性を示し、（ｂ）は光応答性を示すグラフである。
【図３】（ａ）（ｂ）とも、発明者らが光の照射と基板表面にある細胞との関係とに関して行った実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
次に、本発明につき一実施形態を取り上げて説明を行う。本実施形態の細胞シート作製装置１の概略的な構成を図１に示す。本実施形態の細胞シート作製装置１は、主に、基板２、光照射部３、照射制御部４を備える。また具体的には説明しないが、この細胞シート作製装置１は、細胞Ｃを培養したり、剥離した細胞シートＣＳを回収したりする際に必要な種々の機構（例えば、培養液供給機構、温度調整機構、ロボットアーム等）を備える。
【００１８】
基板２は平板状であり、表面にて細胞Ｃを培養できるよう構成されている。なお、本説明においては、図１に示す上側を表面側とし、図１に示す下側を裏面側とする。基板２は、基材層２１の表面にセラミックス、より詳しくは光応答セラミックスからなる光反応層２２が形成された、少なくとも二層からなる構造である。
【００１９】
基材層２１は、厚み方向の光Ｌ（特に紫外線Ｌ１）の透過が妨げられにくい材質から形成されることが望ましい。本実施形態の基材層２１は石英（二酸化ケイ素（SiO2））から形成されている。
【００２０】
光反応層２２は、基板２の裏面に対して照射される光Ｌのうち、少なくとも紫外線Ｌ１を透過させない材質及び厚みで形成された層である。図１に波線矢印で示したように、光Ｌのうち紫外線Ｌ１は基材層２１を透過するものの、光反応層２２で表面側への透過が遮断される。一方、光Ｌのうち可視光線Ｌ２の一部は光反応層２２を透過して基板２の表面側まで到達することがある（可視光線Ｌ２についても表面側への透過が遮断されることもできる）。
【００２１】
本実施形態の光反応層２２は、ｎ型半導体としての挙動を示し、結晶構造がアナターゼ型である二酸化チタン（TiO2）から形成されている。本実施形態の光反応層２２の厚みは約１００nmであるが、特にこれに限定されるものではない。図２（ａ）は、２０mm四方で厚さ１mmの石英板の表面に厚み約１００nmの二酸化チタン（TiO2）からなる光反応層２２を形成した試験体につき、裏面側に波長２００nm〜８００nmの光Ｌを照射した場合に、基材層２１（SiO2）と光反応層２２（TiO2）における光Ｌの吸収率を％表示したものである。光反応層２２が紫外線の波長域において光Ｌの大部分を吸収できていることが図示内容から明らかである。
【００２２】
基板２は、例えば二酸化ケイ素からなる板状体にSol-gel法により二酸化チタンの膜を合成することで形成できる。このSol-gel法による膜の合成は、一例として、Ti(OC3H7i)4、H2O、HNO3、C3H7OHのそれぞれをモル比1 : 1 : 0.2 : 20 で混合したものを二酸化ケイ素からなる板状体に対してスピンコーティングにより成膜させ、その後、乾燥及び焼成を行うことにより光反応層２２を完成させることで行うことができるが、これに限定されず、種々の方法で合成が可能である。
【００２３】
光反応層２２は、光照射部３によって照射された光Ｌ（特に紫外線Ｌ１）により光化学反応を起こす。ここで言う「光化学反応」とは、被照射物質に紫外線Ｌ１が照射されたことによる、表面の帯電、電流（光電流）の発生（電子と正孔との分離）、表面水酸基濃度の上昇、ヒドロキシラジカルの発生等の反応である。図２（ｂ）は、前記試験体に紫外線Ｌ１（波長３６５nm、照度５W/m2）を照射した場合に電流（光電流）が生じることを示している。
【００２４】
詳細な作用機序は明らかではないものの、光化学反応により、光反応層２２の表面と細胞Ｃとの間に位置するたんぱく質（図１に小さな長方形で示した部分）を変性させて切断することができる。一方、細胞Ｃ、Ｃ間にも同様のたんぱく質が存在するが、光反応層２２の表面から離れているため、前記光化学反応の影響を受けない。前記たんぱく質は、光反応層２２の表面に対して細胞Ｃが接着される「糊」のような働きをするものであるから、光化学反応により「糊」が無くなって、細胞Ｃを基板２から剥離させることができる。このように、細胞Ｃ、Ｃ同士の結合状態が保たれ、かつ、細胞Ｃをシート状の形態のまま基板２から剥離させることができる。また、紫外線Ｌ１が光反応層２２で吸収されることにより遮断され、基板２の表面側には到達しないので、細胞Ｃが直接紫外線Ｌ１に暴露されない。よって、紫外線Ｌ１により細胞Ｃが死滅したり損傷したりすることを抑制できる。このため、健全な細胞Ｃを細胞シートＣＳの状態で基板２上から剥離させることができる。
【００２５】
光照射部３は、基板２の裏面に対して光Ｌを照射可能に設けられている。光照射部３から照射される光Ｌは紫外線Ｌ１を含む。本実施形態の光照射部３としては、キセノンランプが用いられているが、ＬＥＤ等、種々の発光手段を用いることができる。
【００２６】
照射制御部４は、光照射部３における光Ｌの照射、具体的には、基板２に対する光Ｌの照射領域、照射タイミング及び継続時間を制御する。照射制御部４は、その他、照度や基板２に対する照射角度を制御することもできる。
【００２７】
照射制御部４は、細胞Ｃの培養完了後の所定時間に光Ｌを照射させるように光照射部３を制御することができる。この制御により、細胞Ｃの培養完了までは光化学反応が起きないから、基板２の表面上で確実に細胞Ｃを培養できる。そして、細胞Ｃの培養完了後における所定時間に、光照射部３から紫外線Ｌ１を含む光Ｌを基板２に対して照射することにより、基板２における光反応層２２に光化学反応を起こさせ、基板２からシート状の形態のまま細胞Ｃを剥離できる。なお、前述のように細胞Ｃの培養完了を待たず、培養完了の直前における所定時間から光Ｌの照射を開始しても同様の作用を奏することができる。
【００２８】
また、照射制御部４は、基板２の表面に細胞Ｃを播種する前の所定時間、細胞Ｃを播種した後の所定時間のうち少なくともいずれかの時間に光Ｌを照射させるように光照射部３を制御することもできる。この制御により、播種の前後の時間に、基板２に対して光Ｌが照射される。これにより、基板２の表面を酸化させて水酸基を生じさせることができる。この水酸基にたんぱく質が付着することにより、細胞Ｃが基板２に付着しやすくなる。よってこの照射により、基板２の表面において膜状に細胞Ｃを付着させることが容易になる。
【００２９】
更に、照射制御部４は、基板２の表面に細胞Ｃを播種した後から細胞Ｃの培養が完了するまでの間で、基板２において細胞Ｃの培養が不要な領域に対して光Ｌを照射させるように光照射部３を制御することもできる。この制御により、細胞Ｃの培養が不要な領域については光化学反応により細胞Ｃを死滅、もしくは，細胞の接着（付着）を抑制できる。このため、得られる細胞シートＣＳの形状を、細胞Ｃの死滅しなかった部分、もしくは，細胞の接着（付着）が抑制されなかった部分だけが残存した形状とできる。よって、所望の形状の細胞シートＣＳを作製できる。このため、このように所望の形状とした細胞シートＣＳを複数積み重ねることで、所望の立体形状を有する細胞集合体を形成することも可能となる。また、異種細胞を共培養する際の各細胞の培養制御も可能となる。
【００３０】
ここで、発明者らが光Ｌの照射と基板２表面にある細胞との関係とに関して行った実験について説明する。本実験で用いた試験片は、６mm四方で厚さが２mmであって、石英（二酸化ケイ素（SiO2））製の基材層２１の表面に二酸化チタン（TiO2）からなる光反応層２２を設けたものである。対照のための比較片としては、基材層２１だけ（光反応層２２無し）の板状体を用いた。試験片及び比較片では、基板２の表面にマウスの骨芽細胞（Primary osteoblasts）が播種され、３７℃、二酸化炭素濃度５％の環境に置かれた。試験片及び比較片の裏面側には、光照射部３として出力１５０Ｗのキセノンランプが配置されており、ここから光を照射した。
【００３１】
まず、５．０×１０４個の細胞を播種した試験片及び比較片に対して４時間の連続照射を行った。図３（ａ）に結果を示す。試験片における接着斑（「desmosomes」、細胞の接着構造）の数は、４時間暗所下で保持したものに比べると、有意な差（ｐ＜０．０５）をもって減少していることがわかった。一方、比較片では、暗所保持のものと連続照射のもので有意な差は現れなかった。連続照射により接着斑数が減少することから、連続照射では基板２に対して細胞の接着が抑制されることが確認できた。
【００３２】
また、４．４×１０４個の細胞を播種した試験片及び比較片に対して培養完了の直前に照射を行った。照射の第１パターンとして、２３．５時間非照射（暗所下で保持）の後、０．５時間の照射を行った。また照射の第２パターンとして、２２時間非照射（暗所下で保持）の後、２時間の照射を行った。図３（ｂ）に結果を示す。試験片における細胞密度は、２４時間暗所下で保持したものに比べ、第１パターンは小さく、第２パターンは更に小さくなっており、細胞密度が有意な差（暗所保持と第１パターンとではｐ＜０．０５、暗所保持と第２パターンとではｐ＜０．０１、第１パターンと第２パターンとではｐ＜０．０１）をもって減少していることがわかった。一方、比較片では、暗所保持のものと連続照射のもので有意な差は現れなかった。このように細胞密度が減少することから、本実験の結果は、培養完了の直前に照射を行うことにより細胞をシート状の形態のまま基板上から剥離させることができることを示唆していると言える。
【００３３】
以上のように、播種前後に予備照射として短時間だけ光Ｌを照射すると、細胞Ｃの基板２に対する接着、及び、基板２上での細胞Ｃの増殖が促進される。また、播種直後から連続的に光Ｌを照射すると、照射領域では細胞Ｃの接着が抑制される。また、細胞Ｃを剥離させたい領域に基材の裏面から光Ｌを照射することで、その領域の細胞Ｃを剥離することも可能である。
【００３４】
このように、基板２に対する光Ｌの照射タイミング等の照射態様を制御することにより、基板２上における細胞Ｃの状態を変化させることができるので、これを利用して種々の形状の細胞シートＣＳを作製することが可能である。このため、本発明を応用して従来にない新しい生体デバイスの設計が可能になる。また、既存の高分子技術やパターニング技術（３Ｄプリンティングに関する技術等）と併せて本発明を応用することで、精緻な細胞マニピレーションの実現が期待できる。
【００３５】
以上、本発明につき前記実施形態を取り上げて説明したが、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【００３６】
例えば、前記実施形態の基板２は平板状であったが、例えば細胞シートを立体的に形成する場合等には、湾曲した形状等、立体的な形状とすることもできる。
【００３７】
また、光反応層２２は、前記実施形態では二酸化チタンからなっていたが、少なくともチタンを含む層（セラミックス層）であればよい。例えば光反応層２２を、CaTiO3、SrTiO3等のチタネート系の材料で構成することもできる。チタンを含む層で光反応層２２を構成することにより、紫外線Ｌ１を遮断し、かつ、光化学反応を起こすことのできる基板２を構成することが容易にできる。ただし、光反応層２２は、培養中の細胞Ｃに直接触れる層であるから、生体為害性のない物質で形成しておくことが必要である。また、光反応層２２は、半導体（ｎ型、ｐ型）としての性質を持つ物質から形成されることもできる。
【００３８】
また、光反応層２２の表面に更に別の層を形成し、この別の層の表面で細胞Ｃを培養させることもできる。また、基材層２１と光反応層２２との間に別の層を挟んだり、液体（ハンクス液等）を封入したりすることもできる。
【００３９】
また、前記実施形態における光反応層２２は、Sol-gel法により成膜していたが、例えばスパッタリング等、他の方法による成膜であってもよい。
【符号の説明】
【００４０】
１          細胞シート作製装置
２          基板
２１        基材層
２２        光反応層、少なくともチタンを含む層
３          光照射部
４          照射制御部
Ｌ          光
Ｌ１        紫外線
Ｌ２        可視光線
Ｃ          細胞
ＣＳ        細胞シート
【図１】
2018027029.tif 000003
【図２】
2018027029.tif 000004
【図３】
2018027029.tif 000005