(57)【要約】【課題】多数の酵素について酵素反応をそれぞれ測定する場合において、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御する技術を提供する。【解決手段】酵素反応の測定方法であって、前記酵素と、ケージド化合物である、前記酵素の基質又は補因子と、を含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は前記補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａと、前記酵素反応を測定する工程ｂと、工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃと、を備える、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応の測定方法であって、
前記酵素と、ケージド化合物である、前記酵素の基質又は補因子と、を含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は前記補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａと、
前記酵素反応を測定する工程ｂと、
工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃと、
を備える、方法。
【請求項２】
前記反応空間がウェルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応空間が液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記反応空間が細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
一度に１０，０００個以上の前記反応空間における前記酵素反応を測定する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質又は前記補因子が、脱保護波長が異なる複数のケージド化合物の混合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性エネルギー線が波長２００〜１５００ｎｍにピーク波長を有する電磁波である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記活性エネルギー線が周波数２００〜２０００ｋＨｚの超音波線である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により酵素反応を測定する工程を備える、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子のスクリーニング方法。
【請求項１０】
複数の反応空間でそれぞれ生じる酵素反応を測定する測定装置であって、
前記酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む前記反応空間に活性エネルギー線を照射して前記酵素反応を開始させる照射部と、
前記酵素反応を測定する測定部と、
前記照射部からの前記活性エネルギー線の照射と、前記測定部での前記酵素反応の測定と、の時間差を制御する制御部と、
を備える、測定装置。
【請求項１１】
前記測定部が、前記酵素反応に伴う光信号を検出する光検出器を有する、請求項１０に記載の測定装置。
【請求項１２】
前記測定部が、
複数の前記反応空間にそれぞれ接続された複数の電極と、
前記酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを前記電極において測定する回路部と、
を有する、請求項１０に記載の測定装置。
【請求項１３】
前記反応空間がウェルである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記反応空間が液滴である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１５】
前記反応空間が細胞である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１６】
１０，０００個以上の前記反応空間でそれぞれ生じる酵素反応の測定用である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応の測定方法、スクリーニング方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、バイオエネルギー、バイオセンサー等の様々な応用分野への貢献が期待されている。
【０００３】
従来、新規機能性タンパク質の取得は、タンパク質の構造をデザインするタンパク質工学的手法により行うことが主流であった。しかしながら、近年、より有用なタンパク質を取得するためには、多数のタンパク質を効率的にスクリーニングすることが重要であると考えられている。そこで、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。
【０００４】
進化分子工学的手法においては、スクリーニングの回数を増やすほど有用なタンパク質を得ることができる。このため、膨大な数の変異タンパク質を同時並列的に評価する必要がある。
【０００５】
例えば、特許文献１には、膨大な数の変異タンパク質のアレイを製造することができる、タンパク質アレイの製造方法が記載されている。また、例えば非特許文献１には、酵母細胞を封入した液滴を用いることにより、変異酵素をハイスループットにスクリーニングする方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０２９７１４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Agresti, J. J., et al., Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution, PNAS, 107 (9), 4004-4009, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載の方法によれば、例えば、数ｃｍ×数ｃｍの大きさのウェルアレイ上に数千万種類の変異酵素を積載したタンパク質アレイを製造することができる。このようなタンパク質アレイは、１ウェルあたりの容積がフェムトリットルオーダーである。
【０００９】
しかしながら、発明者らは、このようなタンパク質アレイを用いた場合、ウェルアレイを構成する全ウェルに同時に反応液を分配することや、ウェルアレイを構成する全ウェルを同時に観測し、酵素活性を測定することが困難な場合があることを見出した。
【００１０】
具体的には、まず、酵素反応の測定に必要な基質を含む反応液を上記のウェルアレイ上の各ウェルに添加するために、少なくとも数分間必要である。また、数ｃｍ×数ｃｍの大きさのチップ全体をスキャンし、酵素反応を測定するためにも少なくとも数分間必要である。一方、１ウェルあたりの容積がフェムトリットルオーダーであるウェル内では、数分程度で基質を消費してしまい、酵素反応が終了してしまう。このため、上記のタンパク質アレイでは、酵素活性の測定準備中又は測定中に酵素反応が終了してしまう場合がある。また、全ての変異酵素の酵素活性を測定することができたとしても、全てのウェルを同時に測定できないために、反応開始からの時間のずれが生じ、ウェル毎の反応条件を揃えて酵素活性を測定することが困難な場合がある。
【００１１】
また、非特許文献１に記載の方法は、酵素を細胞表面に発現した酵母細胞と、基質とを含む多数の液滴を調製し、酵素反応により生成された蛍光物質を含む液滴をソーティングして回収するものである。非特許文献１には、１０時間で１０８個の変異酵素をスクリーニングしたことが記載されている。しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、液滴の作製やソーティングにある程度の時間を必要とするため、全ての変異酵素について、反応条件を揃えて酵素活性を測定することが困難な場合がある。
【００１２】
このような背景のもと、本発明は、多数の酵素について酵素反応をそれぞれ測定する場合において、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は以下の態様を含む。
［１］酵素反応の測定方法であって、前記酵素と、ケージド化合物である、前記酵素の基質又は補因子と、を含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は前記補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａと、前記酵素反応を測定する工程ｂと、工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃと、を備える、方法。
［２］前記反応空間がウェルである、［１］に記載の方法。
［３］前記反応空間が液滴である、［１］に記載の方法。
［４］前記反応空間が細胞である、［１］に記載の方法。
［５］一度に１０，０００個以上の前記反応空間における前記酵素反応を測定する、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記基質又は前記補因子が、脱保護波長が異なる複数のケージド化合物の混合物である、［１］〜［５］のいずれか記載の方法。
［７］前記活性エネルギー線が波長２００〜１５００ｎｍにピーク波長を有する電磁波である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記活性エネルギー線が周波数２００〜２０００ｋＨｚの超音波線である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の方法により酵素反応を測定する工程を備える、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子のスクリーニング方法。
［１０］複数の反応空間でそれぞれ生じる酵素反応を測定する測定装置であって、前記酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む前記反応空間に活性エネルギー線を照射して前記酵素反応を開始させる照射部と、前記酵素反応を測定する測定部と、前記照射部からの前記活性エネルギー線の照射と、前記測定部での前記酵素反応の測定と、の時間差を制御する制御部と、を備える、測定装置。
［１１］前記測定部が、前記酵素反応に伴う光信号を検出する光検出器を有する、［１０］に記載の測定装置。
［１２］前記測定部が、複数の前記反応空間にそれぞれ接続された複数の電極と、前記酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを前記電極において測定する回路部と、を有する、［１０］に記載の測定装置。
［１３］前記反応空間がウェルである、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の測定装置。
［１４］前記反応空間が液滴である、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の測定装置。
［１５］前記反応空間が細胞である、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の測定装置。
［１６］１０，０００個以上の前記反応空間でそれぞれ生じる酵素反応の測定用である、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の測定装置。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、多数の酵素について酵素反応をそれぞれ測定する場合において、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】（ａ）〜（ｅ）は、進化分子工学的手法により、有用な酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得する工程の一例を説明する図である。
【図２】ウェルアレイの具体例を示す写真である。
【図３】１つの液滴に１種類のタンパク質を封入する技術の一例を説明する模式図である。
【図４】（ａ）〜（ｄ）は、液滴の配置状態を例示した図である。
【図５】第１実施形態の測定装置の模式図である。
【図６】基板の平面図である。
【図７】図６の領域ＩＩＩの拡大図である。
【図８】ウェルアレイに活性エネルギー線を照射する工程の手順を示す図である。
【図９】ウェルアレイにおける酵素反応に伴う光信号を撮像する工程の手順を示す図である。
【図１０】ウェルアレイに活性エネルギー線を照射する工程及びウェルアレイにおける酵素反応に伴う光信号を撮像する工程の手順を示す図である。
【図１１】第２実施形態の測定装置の模式図である。
【図１２】第２実施形態の測定装置の変形例を示す模式図である。
【図１３】第３実施形態の測定装置の模式図である。
【図１４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１の結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２の結果を示すグラフである。
【図１６】実験例３の結果を示すグラフである。
【図１７】実験例４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。また、図には、場合によりＸ−Ｙ−Ｚ座標系を示した。以下の説明において、Ｘ−Ｙ平面に沿う方向を水平方向とし、＋Ｚ方向を上方向とする。以下、必要に応じて各座標系に基づいて各方向の説明を行う。
【００１７】
（従来のスクリーニング方法１）
まず、図１（ａ）〜（ｅ）を参照しながら、進化分子工学的手法により、有用な酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得する工程の一例を説明する。図１（ａ）は、ビーズ上に固定化された変異ＤＮＡライブラリー（ＤＮＡ結合ビーズ）を示す図である。１個のビーズ上に１種類の変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補をコードするＤＮＡが固定化されている。このようなビーズは、例えば特許文献１に記載された方法により作製することができる。
【００１８】
続いて、図１（ｂ）に示すように、図１（ａ）のＤＮＡ結合ビーズをウェルアレイ上に分配する。図１（ｂ）のウェルアレイでは、１ウェルあたり１個のビーズが分配されている。ビーズのウェルアレイ上への分配は、例えばビーズとして磁気ビーズを使用し、磁石を用いて磁気ビーズをウェルアレイに収容させることにより行うことができる（例えば、特許文献１を参照。）。図２は、図１（ｂ）のウェルアレイの具体例を示す写真である。図２に示すウェルアレイでは、例えば１０７〜１０８個の変異タンパク質が１枚のチップ上に積載されている。
【００１９】
続いて、図１（ｃ）に示すように、無細胞合成によりビーズに固定された変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補のＤＮＡを転写及び翻訳することで、ウェルアレイのウェル表面に変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補を結合させる。ウェル表面への変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補の結合は、例えば、変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグを導入しておき、ウェルアレイのウェルの表面をＮｉ−ＮＴＡ（ｎｉｃｋｅｌ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）で修飾しておくこと等により行うことができる。
【００２０】
続いて、図１（ｄ）に示すように、ウェルアレイ全体の酵素反応を測定し、活性の高い変異酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を特定する。続いて、図２（ｅ）に示すように、特定した変異酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子に対応するＤＮＡ結合ビーズを回収し、回収したＤＮＡを増幅するとともに変異を導入し、ビーズ上に再固定する。
【００２１】
以上の工程を繰り返すことにより、所望の活性を有する酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得することができる。
【００２２】
ＤＮＡへの変異の導入方法としては、例えば、エラープローンＰＣＲを利用する方法等が挙げられる。エラープローンＰＣＲとは、ＰＣＲ反応中に人為的にランダムなエラーを発生させる方法である。エラープローンＰＣＲにおいては、プルーフリーディング（校正）機能のないＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。更に、突然変異を有用な頻度で起こすために、反応液中にＭｎ２＋を添加することや、ｄＮＴＰ濃度を不均衡にすることも有効である。これらの処理により、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのエラー発生率が増加し、ＤＮＡに変異を導入することができる。
【００２３】
しかしながら、上述したように、図２に示すようなウェルアレイは、ウェルアレイ全体の酵素反応の測定に時間がかかるため、酵素活性の測定準備中又は測定中に酵素反応が終了してしまい、酵素反応の開始時から測定時までの時間を、ウェルアレイ上の全てのウェルで揃えて測定することが困難である。
【００２４】
（従来のスクリーニング方法２）
続いて、進化分子工学的手法により、有用な酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得する工程の別の例を説明する。以下に説明するスクリーニング方法は、上述したウェルアレイの代わりに液滴を用いる点が主に異なっている。
【００２５】
図３は、１つの液滴に１種類のタンパク質を封入する技術の一例を説明する模式図である。図３に示すように、例えば、互いに直交する流路３１０及び３２０を有する流体デバイス３００を用いて液滴を作製することができる。より具体的には、図３に示す流体デバイスの一方の流路３１０に水系液体３３０を導入して矢印の方向に送液し、他方の流路３２０にオイル３４０を導入して矢印の方向に送液することにより、液滴Ｄ（本例ではｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルション）を作製することができる。
【００２６】
ここで、例えば、水系液体３３０に変異ＤＮＡライブラリーを添加して液滴Ｄを形成することにより、１つの液滴Ｄに１分子のＤＮＡ３３１を封入することができる。ＤＮＡ３３１は、例えば、変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補をコードしていてもよい。
【００２７】
続いて、封入されたＤＮＡ３３１を無細胞翻訳させることにより、１つの液滴Ｄに１種類のタンパク質３３２を封入することができる。無細胞翻訳は、例えば、水系液体３３０として無細胞翻訳の反応液を使用することにより実現することができる。
【００２８】
ここで、水系液体３３０中に予め酵素の基質を添加しておけば、各液滴Ｄの内部で酵素反応を行うことができる。この酵素反応を測定することにより、活性の高い酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を含む液滴を特定することができる。
【００２９】
続いて、所望の活性を示した液滴Ｄをソーティング等により回収し、液滴Ｄの内部に存在するＤＮＡ３３１を回収する。続いて、回収したＤＮＡ３３１を増幅するとともに変異を導入する。ＤＮＡへの変異の導入方法としては、上述したものと同様の方法を用いることができる。以上の工程を繰り返すことにより、所望の活性を有する酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得することができる。
【００３０】
液滴を用いたスクリーニング方法において、液滴の作製方法は、上述したものに限られない。例えば、反応チューブ内に、水系液体とオイルを入れ、ボルテックス等により撹拌して乳化させることによっても、液滴（本例ではｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルション）を作製することができる。
【００３１】
しかしながら、上述したような方法により、液滴中で酵素反応を行い、酵素反応を測定する場合、液滴の作製やソーティングにある程度の時間を必要とするため、全ての液滴について、反応条件を揃えて酵素活性を測定することが困難である。
【００３２】
［酵素反応の測定方法］
１実施形態において、本発明は、酵素反応の測定方法であって、前記酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａと、前記酵素反応を測定する工程ｂと、工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃと、を備える方法を提供する。
【００３３】
本実施形態の方法によれば、酵素の基質又は補因子に、不活性型であるケージド化合物を利用することにより、所望のタイミングで酵素反応を開始して、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御することができる。以下、各工程について説明する。
【００３４】
（工程ａ）
本工程において、酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する。
【００３５】
《酵素》
本実施形態の方法において、酵素としては、特に制限されず、産業上有用な酵素の反応を測定することができる。酵素としては、タンパク質からなる酵素、リボザイム、デオキシリボザイム等の核酸からなる酵素等が挙げられる。具体的な酵素としては、例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ、キナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドラクターゼ、ラセマーゼ、エピメラーゼ、グルタミンシンテターゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ等が挙げられる。
【００３６】
《反応空間》
本実施形態の方法において、反応空間は、酵素が収容された反応空間であれば特に制限されない。反応空間としては、例えば、ウェル、液滴、細胞等が挙げられる。
【００３７】
・ウェル
ウェルとは、固相上に形成された凹部を意味する。反応空間がウェルである場合、ウェルとしては、ウェルアレイを構成しているウェルが挙げられる。ウェルアレイは、例えば、ウェルアレイ全体の酵素反応の測定に時間がかかるウェルアレイであってもよい。このようなウェルアレイとしては、例えば、図２に示すような、数ｃｍ×数ｃｍの大きさのウェルアレイ上に、例えば１０７〜１０８個の変異タンパク質が積載されたウェルアレイが挙げられる。
【００３８】
ウェルアレイのウェル密度は、例えば１０，０００〜１０，０００，０００ウェル／ｃｍ２であってもよく、例えば１００，０００〜１，０００，０００ウェル／ｃｍ２であってもよい。
【００３９】
また、ウェルアレイの面積は特に限定されず、数ｃｍ×数ｃｍ〜数ｍ×数ｍであってもよい。例えば、近年の液晶パネル製造技術等を用いることにより、数ｍ×数ｍのアレイを作製することが可能である。
【００４０】
また、ウェル１つあたりの容積は、例えば１ｆＬ／ウェル〜１０００ｐＬ／ウェルであってもよく、例えば５０ｆＬ／ウェル〜１００ｐＬ／ウェルであってもよい。
【００４１】
ウェルアレイの各ウェルには、それぞれ異なる変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補を収容してもよい。これにより、多数の変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補の活性を同時並列的に評価することが可能となる。
【００４２】
あるいは、ウェルアレイの各ウェルには同一の酵素を収容してもよい。そして、活性エネルギー線の照射量等の条件を領域ごとに変化させて酵素反応を測定してもよい。これにより、例えば、一度の測定で、様々な条件下における酵素反応を測定することができる。例えば、酵素反応のミカエリスメンテン式をプロットすることができる。
【００４３】
・液滴
反応空間が液滴である場合、液滴としては、水系液体等の液滴、ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルション、ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒエマルション等のエマルション、リポソーム、ゲル等が挙げられる。
【００４４】
ここで、水系液体としては、水、緩衝液、等張液等が挙げられる。また、ゲルとしては、例えば、アルギン酸ゲル、アガロースゲル等のハイドロゲル等が挙げられる。また、ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒエマルションは、例えば、疎水性環境下で機能する酵素の酵素反応を測定する場合等に用いることができる。
【００４５】
また、液滴を規則的に配置することもできる。図４（ａ）〜（ｄ）は、液滴の配置状態を例示した図である。図４（ａ）は、タンパク質３３２が封入された液滴Ｄを平面上に最密充填した状態を示す図である。図４（ｂ）は、液滴Ｄを規則的に２次元に配置した状態を示す図である。例えば、基板上に規則的に２次元に形成されたウェルに、それぞれ液滴を収容すること等により液滴Ｄを規則的に２次元に配置することができる。この場合、ウェルは、液滴Ｄの一部を収容可能な深さを有していてもよいし、液滴Ｄの全体を収容可能な深さを有していてもよい。また、ウェルの内部に吸引口を設け、吸引口から液滴を吸引することにより液滴を固定してもよい。
【００４６】
図４（ｃ）は、液滴Ｄを１次元に配置した状態を示す図である。例えば、直線状の流路内に液滴を封入すること等により液滴Ｄを１次元に配置することができる。図４（ｄ）は、蛇行した流路４００の内部に液滴Ｄを封入することにより、液滴Ｄを２次元に配置した状態を示す図である。
【００４７】
規則的に配置した液滴中の酵素反応を測定する場合、液滴を上述したウェルアレイと同様に取り扱うことが可能となる。
【００４８】
・細胞
反応空間としては、細胞そのものを用いることもできる。細胞としては、特に限定されず、例えば、大腸菌、酵母、動物細胞等が挙げられる。例えば、変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補をコードする遺伝子の発現ベクターからなるライブラリーを導入した細胞を反応空間として利用することができる。１つの細胞は、測定対象となる変異酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を１種類のみ含んでいることが好ましい。
【００４９】
細胞は、細胞内で行われた酵素反応を細胞１つずつについて個別に測定することができる限りどのような状態であってもよい。具体的には、細胞は、基板上に配置されていてもよいし、液滴に封入されていてもよいし、流体中に懸濁されていてもよい。
【００５０】
・反応空間の数
本実施形態の方法により、多数の反応空間における酵素反応を、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御して測定することができる。すなわち、本実施形態の方法の特徴の一つは、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御しながら、大規模な数の反応空間における酵素反応を測定することができることである。
【００５１】
本実施形態の方法により、例えば、一度に１０，０００個以上の反応空間における酵素反応を測定することができる。ここで、「一度に」とは、一度の測定で１０，０００個以上の反応空間における酵素反応を測定することができることを意味する。あるいは、測定装置を一度操作することにより、１０，０００個以上の反応空間における酵素反応を測定することができるといいかえることもできる。あるいは、連続的に１０，０００個以上の反応空間における酵素反応を測定することができるといいかえることもできる。
【００５２】
一度に測定することができる反応空間の数の上限は特に限定されないが、例えば１００億個程度を目安としてもよい。
【００５３】
《ケージド化合物》
ケージド化合物とは、活性エネルギー線の照射により脱保護することができる保護基で保護することにより、一時的に不活性化させた化合物である。ケージド化合物に活性エネルギー線を照射することにより、瞬時に活性型の化合物に変換することができる。ケージド化合物には、保護基で保護された酵素の基質又は補因子のほか、保護基で保護された分子と複合体を形成している補因子等も含まれる。
【００５４】
補因子とは、酵素の触媒活性に必要な化学物質であり、例えば補酵素、補欠分子族、金属イオン等が挙げられる。補因子と複合体を形成する分子としては、例えば、ケージド−エチレンジアミン四酢酸、ケージド−グリコールエーテルジアミン四酢酸等のように、活性エネルギー線の照射前は補因子をキレートし、活性エネルギー線の照射によって補因子を開放する分子が挙げられる。
【００５５】
ケージド化合物である基質又は補因子を使用することにより、活性エネルギー線の照射前は酵素反応を停止させておき、活性エネルギー線の照射により酵素反応を開始することができる。
【００５６】
ケージド化合物の保護基としては、例えば下記式（１）で表わされるα−カルボキシ−２−ニトロベンジル（ＣＮＢ）基、下記式（２）で表わされる１−（２−ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）基、下記式（３）で表わされる４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）基、下記式（４）で表わされる１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル（ＤＭＮＰＥ）基、下記式（５）で表わされる（４，５−ジメトキシ−２−ニトロ）フェニル（ＤＭＮＰ）基、下記式（６）で表わされる５−カルボキシメチルオキシ−２−ニトロベンジル（ＣＭＮＢ）基、下記式（７）で表わされる２−ニトロフェニル（ＮＰ）基、下記式（８）で表わされる１−（２−ニトロフェニル）エトキシカルボニル（ＮＰＥＣ）基、下記式（９）で表わされる３−ニトロベンゾフラン−２−イル（ＮＤＢＦ）基、下記式（１０）で表わされる４−メトキシ−７−ニトロインドリニル（ＭＮＩ）基、下記式（１１）で表わされる［１，３−ビス（ジヒドロキシホスホリルオキシ）プロパン−２−イルオキシ］−７−ニトロインドリン（ＤＰＮＩ）基、下記式（１２）で表わされるルテニウム−ビピリジン（ＲｕＢｉ）基、下記式（１３）で表わされる１−（ヒドロキシアセチル）ピレン基等が挙げられる。
【００５７】
【化１】
2018117536.tif 000002
［式（１２）中、Ｐｈはフェニル基を表す。］
【００５８】
ケージド化合物は塩であってもよく、フリー体であってもよい。より具体的なケージド化合物としては、例えば、アデノシン５’−トリフォスフェート，Ｐ３−（１−（２−ニトロフェニル）エチル）エステル，二ナトリウム塩（ＮＰＥ−ケージドＡＴＰ）、アデノシン５’−トリフォスフェート，Ｐ３−（１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル）エステル，二ナトリウム塩（ＭＮＰＥ−ケージドＡＴＰ）、アデノシン５’−ジフォスフェート，Ｐ２−（１−（２−ニトロフェニル）エチル）エステル，カリウム塩（ＮＰＥ−ケージドＡＤＰ）、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルアデノシン３’，５’−サイクリックモノフォスフェート（ＤＭＮＢ−ケージドｃＡＭＰ）、Ｄ−ミオイノシトール１，４，５−トリフォスフェート，Ｐ４（５）−（１−（２−ニトロフェニル）エチル）エステル，トリス（トリエチルアンモニウム）塩（ＮＰＥ−ケージドイノシトール１，４，５−トリフォスフェート）、サイクリックアデノシン５’−ジフォスフェートリボース，１−（１−（２−ニトロフェニル）エチル）エステル（ＮＰＥ−ケージドｃＡＤＰ−リボース）、γ−アミノ酪酸，α−カルボキシ−２−ニトロベンジルエステル，トリフルオロ酢酸塩（Ｏ−（ＣＮＢケージド）ＧＡＢＡ）、Ｄ−ルシフェリン，１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチルエステル（ＤＭＮＰＥ−ケージドルシフェリン）、下記式（１４）で表される、Ｃａ２＋イオンと錯体を形成したＮＰ−ＥＧＴＡ、下記式（１５）で表される、Ｃａ２＋イオンと錯体を形成したＤＭＮＰ−ＥＧＴＡ、下記式（１６）で表される、ジアゾ−２，四カリウム塩、下記式（１７）で表される、ＣＮＢケージドＬ−グルタミン酸、下記式（１８）で表される、Ｎ−（ＣＮＢケージド）カルバコール（Ｎ−（α−カルボキシ−２−ニトロベンジル）カルバミルコリン，トリフルオロ酢酸塩等が挙げられるがこれに限定されない。
【００５９】
【化２】
2018117536.tif 000003
【００６０】
【化３】
2018117536.tif 000004
【００６１】
【化４】
2018117536.tif 000005
【００６２】
【化５】
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【００６３】
【化６】
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【００６４】
また、ケージド化合物として、保護基を脱保護させる活性エネルギー線が異なる複数種類の化合物を用いることもできる。これにより、複数の基質を用いた酵素反応や、多段階の酵素反応を測定することが可能になる。ケージド化合物の保護基は次の工程での効果との関連で適宜選択することができる。
【００６５】
《活性エネルギー線》
活性エネルギー線としては、上述した保護基を脱保護し、上述したケージド化合物を活性型に変換できるものであれば特に限定されず、例えば、紫外線、可視光線、赤外線等の電磁波、α線、β線、γ線、電子線、中性子線、Ｘ線等の放射線、集束された超音波線等が挙げられる。
【００６６】
好適な活性エネルギー線として、例えば波長２００〜１５００ｎｍ、例えば波長２５０〜８５０ｎｍ、例えば波長３４０〜３８０ｎｍにピーク波長を有する電磁波を用いることができる。電磁波の照射量は、使用するケージド化合物を脱保護できる量であれば特に制限されず、例えば１〜１００００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１〜１０００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１〜１００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１〜１０ｍＪ／ｃｍ２であってもよい。
【００６７】
また、例えば電磁波の波長が３４０〜３８０ｎｍの範囲であれば、核酸に損傷を与えにくい。また、例えば電磁波の波長が１０００〜１５００ｎｍの範囲であれば、民生用の部品を流用して、電磁波を照射する装置を安価に製造することができる。
【００６８】
あるいは、好適な活性エネルギー線として、周波数２００〜２０００ｋＨｚの超音波線を用いることができる。超音波線の照射量は、使用するケージド化合物を脱保護できる量であれば特に制限されず、例えば１〜１００００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１〜１０００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１〜１００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１〜１０ｍＪ／ｃｍ２であってもよい。
【００６９】
また、実施例において後述するように、活性エネルギー線の照射量を変化させることにより、活性型に変化させるケージド化合物の量を制御することも可能である。
【００７０】
あるいは、活性エネルギー線の照射量等の条件を変化させながら、活性エネルギー線の照射及び酵素反応の測定を複数回繰り返してもよい。これにより、例えば、同一のウェルにおいて、様々な条件下における酵素反応を測定することができる。例えば、１つのウェルに収容されている１種の変異酵素のミカエリスメンテン式をプロットすることができる。
【００７１】
（工程ｂ）
工程ａの後、本工程において、酵素反応を測定する。酵素反応は、光信号、電気信号等として測定することができる。光信号としては、発色、発光、蛍光等が挙げられる。また、電気信号は、例えば酵素による酸化還元反応を電気化学計測により計測することにより得ることができる。
【００７２】
例えば、キナーゼの酵素反応を発光の検出により測定する場合、下記式（Ｆ１）に示すような反応系を利用することができる。この場合、キナーゼの基質はＡＤＰであり、ＡＤＰとして、ＮＰＥ−ケージドＡＤＰ等のケージド化合物を使用するとよい。
【００７３】
下記式（Ｆ１）における反応では、工程ａにおいて活性エネルギー線を照射するとケージド化合物が脱保護され、ＡＤＰが生成される。生成されたＡＤＰはキナーゼの基質として反応することができる。続いて、キナーゼがＡＤＰをＡＴＰに変換する。続いて、生成されたＡＴＰを、ルシフェラーゼによる発光反応と組み合わせることにより、キナーゼの活性に対応した発光が観察される。この発光を測定することによりキナーゼの反応を測定することができる。
【００７４】
下記式（Ｆ１）における反応において、補因子であるマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）と複合体を形成したケージド−エチレンジアミン四酢酸をケージド化合物として使用することもできる。この場合、活性エネルギー線を照射するとケージド化合物が脱保護され、遊離Ｍｇ２＋が生成される。生成されたＭｇ２＋はキナーゼ及びルシフェラーゼの補因子として作用することができる。その結果、キナーゼがＡＤＰをＡＴＰに変換し、精製されたＡＴＰをルシフェラーゼによる発光反応と組み合わせることにより、キナーゼの活性に対応した発光が観察される。この発光を測定することによりキナーゼの反応を測定することができる。
【００７５】
【化７】
2018117536.tif 000008
【００７６】
（工程ｃ）
本工程において、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する。時間差を制御するとは、工程ａを実施した時間、すなわち、対象の反応空間に活性エネルギー線を照射した時間と、工程ｂを実施した時間、すなわち、当該反応空間における酵素反応を測定した時間との時間差（間隔）を制御することを意味する。
【００７７】
例えば、複数の反応空間において、工程ａと工程ｂとの時間差を一定にしてもよいし、工程ａと工程ｂとの時間差を意図的に変化させてもよい。
【００７８】
上述した従来のスクリーニング方法においては、酵素反応の開始時を制御することが困難である。このため、反応空間中の酵素反応が無制御に開始してしまい、酵素反応の開始時と測定時との時間差を一定にすること、あるいは時間差を意図的に変化させることが困難であった。このため、酵素の活性を正確に測定することが困難であった。
【００７９】
これに対し、本実施形態の測定方法によれば、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御することができる。時間差の制御方法は、測定装置の構造と密接に関連するため、詳細については後述する。
【００８０】
［スクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、上述した方法により酵素反応を測定する工程を備える、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子のスクリーニング方法を提供する。
【００８１】
上述したように、上述した酵素反応の測定方法により、多数の酵素について、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御して、酵素反応を正確に測定することができる。本実施形態のスクリーニング方法において、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子は、進化分子工学的手法により作製されたライブラリーにコードされるものであってもよい。
【００８２】
したがって、本実施形態のスクリーニング方法で酵素反応を測定することにより、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子の大規模なスクリーニングをハイスループットに行うことができる。
【００８３】
［測定装置］
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間でそれぞれ生じる酵素反応を測定する測定装置を提供する。本実施形態の測定装置は、照射部と、測定部と、制御部とを備える。照射部は、前記酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む前記反応空間に活性エネルギー線を照射して前記酵素反応を開始させる。測定部は、酵素反応を測定する。また、制御部は、照射部からの活性エネルギー線の照射と、測定部での酵素反応の測定との時間差を制御する。本実施形態の測定装置は、１０，０００個以上の反応空間でそれぞれ生じる酵素反応の測定用であってもよい。
【００８４】
本実施形態の測定装置により、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御しながら、上述した酵素反応の測定方法を実施することができる。
【００８５】
（第１実施形態）
ここで、測定装置の第１実施形態について説明する。第１実施形態の測定装置は、ウェルアレイ内での酵素反応を測定する装置である。
【００８６】
第１実施形態の測定装置は、ウェルアレイ内での酵素反応を測定する測定装置であって、前記ウェルアレイが形成された基板の前記ウェルアレイが形成された領域よりも面積が小さい照射領域に活性エネルギー線を照射してウェルアレイ内で前記酵素反応を開始させる照射部と、前記照射領域において前記酵素反応に伴う光信号を検出する測定部と、前記照射部及び前記測定部に対する前記基板の相対的な位置を前記基板の面に沿う方向に移動させる駆動部と、前記照射部からの活性エネルギー線の照射と前記測定部での前記酵素反応の測定との時間差を制御する制御部とを備える。
【００８７】
図５は、第１実施形態の測定装置１の要部の模式図である。測定装置１は、支持部３０と、駆動部３５と、照射部４０と、測定部５０と、制御部３６と、を有する。測定装置１は、酵素反応に伴う光信号を測定する。測定部５０は、光の強度を検出する光検出器であってもよいし、画像を取得する撮像部であってもよい。光信号は、着色であってもよいし、発光であってもよいし、蛍光であってもよい。光信号が蛍光である場合、測定部５０は、蛍光物質を励起するための励起光を照射する励起光照射部を更に備えることが好ましい。
【００８８】
支持部３０は、基板２０を着脱可能に固定して支持する。基板２０は、ガラス又はポリジメチルシロキサン等のエラストマー材料からなる。基板２０は、第１の面２０ａ及び第２の面２０ｂを有する。
【００８９】
図６は、基板２０の平面図である。図７は、図６の領域ＩＩＩの拡大図である。基板２０の第１の面２０ａには、複数のウェル２１が形成されている。複数のウェル２１は、第１の面２０ａの面内でＸ軸方向及びＹ軸方向に沿って配列されている。それぞれのウェル２１の直径及び深さは、例えば、共に数μｍである。複数のウェル２１は、ウェルアレイ２５を構成する。すなわち、基板２０には、複数のウェル２１が配列されて構成されたウェルアレイ２５が形成されている。ウェルアレイ２５の各ウェル２１には、酵素と、当該酵素の基質と、必要に応じて、酵素阻害分子、酵素活性化分子又は補因子とが収容される。本実施形態の測定装置１は、ウェルアレイ２５内での酵素反応を測定する。
【００９０】
支持部３０は、基板２０の第１の面２０ａを上側に向けた状態で、基板２０を支持する。支持部３０は、駆動部３５により水平方向（Ｘ軸方向及びＹ軸方向）に沿って移動させられる、いわゆるＸＹテーブルである。
【００９１】
駆動部３５は、支持部３０を基板２０の面に沿う方向（水平方向）に移動させる。駆動部３５は、支持部３０をＸ軸方向及びＹ軸方向に沿ってそれぞれ移動させるサーボモータを有する。なお、駆動部３５は、照射部４０及び撮像部５０に対して基板２０の相対的な位置を基板２０の面に沿う方向に移動させるものであればよい。したがって、駆動部３５は、必ずしも支持部３０を駆動するものでなくてもよく、例えば照射部４０及び測定部５０を一体的に駆動するものであってもよい。
【００９２】
制御部３６は、駆動部３５に接続されている。制御部３６は、駆動部３５の移動速度を制御する。結果として、制御部３６は、照射部４０における活性エネルギー線の照射と、測定部５０における酵素反応の検出と、の時間差を制御することができる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、駆動部３５の移動速度を制御することにより実施されてもよい。
【００９３】
照射部４０は、基板２０の第１の面２０ａに対向して配置されている。照射部４０は、ウェルアレイ２５内に照射領域Ａを形成し、照射領域Ａに活性エネルギー線を照射する。照射部４０の光軸Ｌ４０は、基板２０の第１の面２０ａと直交する。上述したように、ウェルアレイ２５内に収容されたケージド化合物である基質又は補因子は、活性エネルギー線が照射されることで、活性型に変換される。これにより、ウェルアレイ２５内で酵素反応を開始させる。
【００９４】
照射部４０は、光源４１と、光源４１から出射された光をウェルアレイ２５に向けて出射する光学系（出射レンズ）４２と、光学系４２から出射された光の一部を遮光し照射領域Ａを測定領域Ｂと同一の形状及び同一の大きさとするマスク４３と、を有していてもよい。
【００９５】
光源４１としては、例えばＬＥＤ光源を採用することができる。また、出射レンズ４２は、光源４１から出射された光をウェルアレイ２５に向けて集光して出射する。マスク４３は、中央に矩形状の孔４３ａが設けられた遮光板４３ｂを有する。遮光板４３ｂは、出射レンズ４２から出射された光の一部を遮光する。また、遮光板４３ｂは、出射レンズ４２から出射された光を孔４３ａの形状に沿って通過させる。出射レンズ４２から出射された光は、孔４３ａの形状に対応する矩形状の外形でウェルアレイ２５上に投影される。すなわち、照射部４０の照射領域Ａは、マスク４３に対応する矩形状となる。照射領域Ａは、ウェルアレイ２５が形成された領域よりも面積が小さい。照射領域Ａは、測定部５０により測定される測定領域Ｂと同一の形状及び同一の大きさとなるように形成されていてもよい。
【００９６】
測定部５０は、基板２０の第１の面２０ａに対向して配置されている。測定部５０は、ウェルアレイ２５内の所定の領域（測定領域Ｂ）において、酵素反応に伴う光信号を撮像することでウェルアレイ２５内の酵素反応を測定する。すなわち、測定部５０は、酵素反応を検出する検出部として機能する。測定部５０の光軸Ｌ５０は、基板２０の第１の面２０ａと直交する。照射部４０及び測定部５０は、基板２０の面に沿う方向に並んで配置されていてもよい。
【００９７】
測定部５０の光軸Ｌ５０と照射部４０の光軸Ｌ４０は、互いに平行である。本実施形態において、測定部５０の光軸Ｌ５０と照射部４０の光軸Ｌ４０とは、Ｘ軸方向に沿って距離Ｗだけ離して配置されている。
【００９８】
例えば、距離Ｗは可変であってもよい。距離Ｗを制御することにより、酵素反応の開始時と酵素反応の測定時の時間差を制御することもできる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、距離Ｗを制御することにより実施されてもよい。
【００９９】
測定部５０は、撮像素子５１と、対物レンズ（対物光学系）５２と、を有していてもよい。撮像素子５１としては、例えばＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサが採用される。測定部５０は、撮像素子５１の性能（画素数及び解像度）に依存した形状及び大きさの測定領域Ｂを形成する。
【０１００】
以下に、図８及び図９を参照しながら、測定装置１を用いた酵素反応の測定方法について説明する。
【０１０１】
測定装置１を用いた酵素反応の測定方法において、上述した工程ａは、前記ウェルアレイ上に設定された、前記ウェルアレイが形成された領域よりも面積が小さい照射領域に、前記活性エネルギー線を照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａ１であり、上述した工程ｂは、前記照射領域における前記酵素反応を測定する工程ｂ１であってもよい。また、上述した工程ｃは、照射部４０及び測定部５０を前記ウェルアレイ上で移動させる速度を制御することにより実施されてもよい。
【０１０２】
（工程ａ１）
図８は、本実施形態の測定方法においてウェルアレイ２５に対して活性エネルギー線を照射する工程の手順を示す図である。ウェルアレイ２５上には、照射部４０によって活性エネルギー線が照射された矩形の照射領域Ａが形成される。
【０１０３】
照射領域Ａは、ウェルアレイ２５において一方向（図８の例では、Ｘ軸方向）に一定速度で移動する。照射領域Ａの移動は、駆動部３５（図５参照）により支持部３０をＸ軸方向及びＹ方向に駆動させることで容易に実現できる。
【０１０４】
照射領域Ａで活性エネルギー線が照射されたウェル２１に含まれる基質又は補因子は活性型に変換される。これにより、酵素反応が開始する。なお、活性型へ変換される基質又は補因子の量は、活性エネルギー線の照射エネルギー量に依存する。活性エネルギー線の照射エネルギー量は、光源４１から照射される活性エネルギー線の強度、照射領域Ａの移動時間等により調整することができる。
【０１０５】
図８に示すように、照射領域Ａは、まず、ウェルアレイ２５内において、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動する。続いて、照射部４０による活性エネルギー線の照射を停止する。続いて、照射領域Ａは、ウェルアレイ２５のＸ軸方向に沿う一端側の、Ｙ軸方向に照射領域Ａのスポットサイズだけオフセットした位置に移動する。
【０１０６】
続いて、照射部４０による活性エネルギー線の照射を再開する。具体的には、照射領域Ａを、上述したものと同様に、ウェルアレイ２５内において、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動させる。以上の工程を繰り返すことで、照射領域Ａは、ウェルアレイ２５に含まれる全てのウェルを走査することができる。
【０１０７】
（工程ｂ１）
図９は、本実施形態の測定方法において、ウェルアレイ２５における酵素反応に伴う光信号を検出する工程の手順を示す図である。測定部５０は、ウェルアレイ２５上に、酵素反応に伴う光信号を検出できる範囲としての測定領域Ｂを形成する。
【０１０８】
測定領域Ｂは、ウェルアレイ２５において一方向（図９の例では、Ｘ軸方向）に一定速度で移動する。測定領域Ｂの移動は、照射領域Ａの移動と同様に、駆動部３５（図５参照）により支持部３０をＸ軸方向及びＹ方向に駆動させることで容易に実現できる。測定領域Ｂの移動速度は、照射領域Ａの移動速度と同一に制御してもよい。また、測定領域Ｂの移動経路は、照射領域Ａの移動経路と同一に制御してもよい。これにより、工程ａ１と工程ｂ１との時間差を一定に制御することができる。
【０１０９】
すなわち、本実施形態の測定方法では、工程ａ１及び工程ｂ１を同時に実施し、工程ｃにおいて、照射領域Ａを一定の速度で移動させ、測定領域Ｂの移動を照射領域Ａの移動に追従させてもよい。
【０１１０】
まず、測定領域Ｂは、ウェルアレイ２５内において、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動する。続いて、測定部５０による測定を停止する。続いて、ウェルアレイ２５のＸ軸方向に沿う一端側の、Ｙ軸方向に測定領域Ｂのスポットサイズだけオフセットした位置に移動する。
【０１１１】
続いて、測定部５０による測定を再開する。具体的には、測定領域Ｂを、上述したものと同様に、ウェルアレイ２５内において、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動させる。以上の工程を繰り返すことで、測定領域Ｂは、ウェルアレイ２５に含まれる全てのウェルを走査することができる。
【０１１２】
このようにして、測定領域Ｂの移動速度と照射領域Ａの移動速度及び移動経路を同一に制御することにより、活性エネルギー線が照射されて酵素反応が開始してから測定されるまでの時間を複数のウェルにおいて一定にすることができる。これにより、各ウェル２１における測定条件を揃えて、各ウェル２１での測定結果の比較の正確性を高めることができる。
【０１１３】
本実施形態の測定方法において、照射領域Ａ及び測定領域Ｂの移動経路は、図８、図９に示したものに限られない。例えば、ウェルアレイ２５の外周から中心部に向かって渦巻き状に移動する経路を採用してもよいし、中心部から外周に向かって渦巻き状に移動する経路を採用してもよい。また、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動した後、Ｘ軸方向の他端側において、Ｙ軸方向に測定領域Ｂのスポットサイズだけオフセットした位置に移動し、Ｘ軸方向の他端側から一端側に沿って移動する経路を採用してもよい。
【０１１４】
本実施形態において、照射領域Ａ及び測定領域Ｂは、基板２０の第１の面２０ａにおいて、ウェルアレイ２５が形成された領域よりも面積が小さい。測定部５０により測定される測定領域Ｂの大きさは、例えば、撮像素子５１の画素数及び解像度に依存する。したがって、ウェルアレイ２５全体を同時に撮像しようとする場合、高価な撮像素子５１を用意する必要が生じる。本実施形態によれば、ウェルアレイ２５より小さい照射領域Ａ及び測定領域Ｂにより、活性エネルギー線の照射及び測定を順次行うことで、活性エネルギー線の照射から測定までの時間を一定に保ちつつ大面積のウェルアレイの測定を安価な測定装置１により行うことができる。
【０１１５】
本実施形態の測定装置１では、照射部４０及び測定部５０が基板２０の面に沿う方向に並んで配置されている。したがって、駆動部３５を用いて支持部３０を移動させ、基板２０を照射部４０及び測定部５０が並ぶ方向に移動させることで、工程ａ１と工程ｂ１とを同時並行的に行うことができる。これにより、活性エネルギー線が照射されて酵素反応が開始してから測定されるまでの時間を複数のウェルにおいて一定にすることができる。
【０１１６】
測定領域Ｂを照射領域Ａに追従させて照射と測定を同時並行的に行う場合、活性エネルギー線の照射から測定までの時間は、支持部３０の移動速度、並びに照射部４０の光軸Ｌ４０と撮像部５０の光軸Ｌ５０の距離Ｗを調整することにより制御することができる。
【０１１７】
本実施形態の測定装置１は、複数の測定部５０を備えていてもよい。また、複数の測定部５０は、基板の面に沿う方向に並んでいてもよい。すなわち、図５に、二点鎖線で示すように、本実施形態の測定装置１は、第２の測定部５０Ａを有していてもよい。すなわち、測定装置１は、複数の撮像部５０、５０Ａを有していてもよい。この構成によれば、駆動部３５を用いて支持部３０を移動させ、基板２０を複数の測定部５０、５０Ａが並ぶ方向に移動させることで、同一のウェル２１での酵素反応に対し反応時間を異ならせた測定を、１回の工程ａ１及び工程ｂ１において行うことができる。これにより、同一のウェル２１における酵素反応の経時的な変化を測定でき、例えば酵素反応速度を算出することが可能となる。測定部５０は３個以上存在していてもよい。
【０１１８】
図５の例では、照射部４０及び測定部５０は、光軸Ｌ４０、Ｌ５０が基板２０の面に沿う方向に並ぶように配置されている。しかしながら、照射部４０と測定部５０は、活性エネルギー線照射時及び測定時に同軸上で切り替えて使用する構成としてもよい。この場合、工程ａ１がウェルアレイ２５全体に亘って完了した後に、工程ｂ１を開始する手順を採用してもよい。
【０１１９】
また、本実施形態において、照射部４０及び測定部５０は、基板２０の上側の面（第１の面２０ａ）側に配置されている。しかしながら、照射部４０及び測定部５０は、基板２０の下側の面（第２の面２０ｂ）側に配置されていてもよく、基板２０に対してそれぞれ上下の面側に別々に配置されていてもよい。
【０１２０】
（第１実施形態の測定装置の変形例）
以下に、図１０を参照しながら、測定装置１を用いた酵素反応の測定方法の変形例について説明する。図１０は、ウェルアレイに活性エネルギー線を照射する工程及びウェルアレイにおける酵素反応に伴う光信号を撮像する工程の手順を示す図である。
【０１２１】
測定装置１を用いた酵素反応の測定方法においては、ウェルアレイ上の同一の領域において、工程ａ１と工程ｂ１とを交互に行ってもよい。
【０１２２】
この場合、まず、工程ａ１において、ウェルアレイ２５に対して活性エネルギー線を照射する。この結果、図１０に示すように、ウェルアレイ２５上の領域ａに、照射部４０によって活性エネルギー線が照射された矩形の照射領域Ａが形成される。
【０１２３】
続いて、工程ｂ１において、ウェルアレイ２５における酵素反応に伴う光信号を測定する。本実施形態の測定方法では、図１０に示すウェルアレイ２５上の領域ａに、酵素反応に伴う光信号を測定できる範囲としての測定領域Ｂを形成し、酵素反応を測定する。すなわち、同一の領域ａにおいて、工程ａ１を実施した後、工程ｂ１を実施する。この場合、工程ａ１と工程ｂ１との時間差を制御する工程ｃは、工程ａ１を実施した後、工程ｂ１を実施するまでの時間を制御することにより実施することができる。
【０１２４】
続いて、照射部４０を、照射領域Ａのスポットサイズだけオフセットした位置である領域ｂに移動し、以上の工程ａ１及び工程ｂ１を繰り返す。続いて、照射部４０を、照射領域Ａのスポットサイズだけオフセットした位置である領域ｃに移動し、以上の工程ａ１及び工程ｂ１を更に繰り返す。
【０１２５】
以上の工程を繰り返すことで、照射領域Ａ及び測定領域Ｂは、ウェルアレイ２５に含まれる全てのウェルを走査することができる。
【０１２６】
本実施形態の測定方法によっても、活性エネルギー線の照射から測定までの時間を各ウェル２１で同一とすることができる。これにより、各ウェル２１における測定条件を揃えて、各ウェル２１での測定結果の比較の正確性を高めることができる。
【０１２７】
第１実施形態の測定装置の変形例において、照射部４０は、ウェルアレイ２５の全体に同時に活性エネルギー線を照射可能に構成されていてもよい。また、測定部５０の対物レンズ５２及び撮像素子５１は、ウェルアレイ２５の全体における光信号を同時に撮像可能に構成されていてもよい。
【０１２８】
このような構成の測定装置によっても、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御することができる。例えば、ウェルアレイを構成する全ウェルに同時に反応液を分配することが困難な場合であっても、ウェルアレイを構成する全ウェルに反応液を分配した後に、任意のタイミングで酵素反応を開始させることができ、全てのウェルで酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を揃えて酵素反応を測定することができる。
【０１２９】
第１実施形態の測定装置において、ウェルアレイ２５の代わりに基板２０上に配置された細胞を用いることもできる。あるいは、ウェルアレイ２５の代わりに基板２０上に配置された液滴を用いることもできる。
【０１３０】
（第２実施形態）
続いて、測定装置の第２実施形態について説明する。第２実施形態の測定装置は、ウェルアレイ内での酵素反応を測定する装置である。
【０１３１】
第２実施形態の測定装置は、内面の少なくとも一部に電極が形成された複数のウェルからなるウェルアレイが形成された基板の前記ウェルアレイに活性エネルギー線を照射してウェルアレイ内で前記酵素反応を開始させる照射部と、複数の前記電極に接続され酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを測定する測定部と、前記照射部からの活性エネルギー線の照射と、前記測定部での前記酵素反応の測定との時間差を制御する制御部とを備える。
【０１３２】
すなわち、第２実施形態の測定装置において、測定部は、内面の少なくとも一部に電極が形成された複数のウェルからなるウェルアレイの前記電極と、酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを前記電極において測定する回路部と、を有する。
【０１３３】
図１１は、第２実施形態の測定装置１０１の要部の模式図である。本実施形態の測定装置１０１は、第１実施形態の測定装置と比較して、酵素反応の検出方法が主に異なる。なお、上述した実施形態と同一態様の構成要素については、同一又は対応する符号を付し、その説明を省略する。
【０１３４】
図１１に示すように、測定装置１０１は、照射部１４０と、測定部（回路部）１６０と、制御部１３６と、を有する。測定装置１０１は、酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを測定する。
【０１３５】
基板１２０は、第１の面１２０ａ及び第２の面１２０ｂを有する。基板１２０の第１の面１２０ａには、複数のウェル１２１が形成されている。複数のウェル１２１は、第１の面１２０ａの面内でＸ軸方向及びＹ軸方向に沿って配列されている。ウェルアレイ１２５の各ウェル１２１には、酵素と、当該酵素の基質と、必要に応じて、酵素阻害分子、酵素活性化分子又は補因子とが収容される。
【０１３６】
各ウェル１２１の底面には、電極１２９が設けられている。なお、電極１２９は、ウェル１２１の内面の少なくとも一部に形成されていればよい。
【０１３７】
照射部１４０は、基板１２０の第１の面１２０ａに対向して配置されている。照射部１４０は、ウェルアレイ１２５全体に対して、同時に活性エネルギー線を照射することができる。各ウェル１２１内に収容された基質又は補因子は、活性エネルギー線が照射されることで、活性型に変換される。これにより、各ウェル１２１内で酵素反応を開始させる。また、酵素反応に伴い、電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスが変化する。
【０１３８】
測定部１６０は、基板１２０の第２の面１２０ｂ側に配置されている。測定部１６０は、酵素反応に伴い電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを測定する。すなわち、測定部１６０は、酵素反応を検出する検出部として機能する。
【０１３９】
制御部１３６は、照射部１４０及び測定部１６０に接続されている。制御部１３６は、照射部１４０における活性エネルギー線の照射及び測定部１６０における電流、電圧又はインピーダンスの測定を制御する。制御部１３６は、照射部１４０における活性エネルギー線の照射と、測定部１６０における酵素反応の検出と、の時間差を制御できる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、制御部１３６により実施されてもよい。
【０１４０】
また、測定装置１０１は、測定部１６０における酵素反応の検出結果の経時的な変化を記録するメモリを備えていてもよい。これにより、ウェル１２１内の酵素反応を経時的に記録することが可能となる。
【０１４１】
第２実施形態の測定装置１０１において、測定部１６０としては、集積回路（ＩＣ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）を採用することができる。測定部１６０は、多数の電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを同時に処理することができる。
【０１４２】
以下に、測定装置１０１を用いた酵素反応の測定方法について説明する。測定装置１０１を用いた酵素反応の測定方法において、上述した工程ａは、前記ウェルアレイの全ウェルに、前記活性エネルギー線を同時に照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａ２であり、上述した工程ｂは、前記ウェルアレイの全ウェルにおける前記酵素反応を、電気化学計測により同時に計測する工程ｂ２であってもよい。
【０１４３】
本実施形態の測定装置及び測定方法によれば、酵素反応の検出を電気化学計測により計測するという構成を採用することにより、数ｃｍ×数ｃｍの大きさのウェルアレイ上に、例えば１０７〜１０８個の変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補が積載されたウェルアレイを用いた場合においても、全てのウェルにおける酵素反応を同時に測定することができる。
【０１４４】
（工程ａ２）
まず、本工程において、ウェルアレイ１２５の全てのウェル１２１に、活性エネルギー線を同時に照射して基質Ｓ又は補因子を活性型に変換し、酵素による酵素反応を開始する。より具体的には、図１１に示すように、ウェル１２１のそれぞれには、それぞれ異なる変異酵素（例えば図１１におけるｅ１、ｅ２）、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補が収容されている。基質Ｓ又は補因子が活性型に変換された結果、酵素ｅ１、ｅ２等による酵素反応が進行し、生成物Ｐが生成される。生成物Ｐが生成される過程において、酸化体Ｏｘと還元体Ｒｅｄとの間で電子ｅ−の授受が行われる。
【０１４５】
（工程ｂ２）
続いて、本工程において、ウェルアレイ１２５の全てのウェル１２１における酵素反応を、電気化学計測により同時に計測する。具体的には、各ウェル１２１における酵素反応の過程で生じる電子の移動により発生する電流、電圧又はインピーダンスを、電極１２９を通じて測定部１６０で測定する。
【０１４６】
（第２実施形態の測定装置の変形例）
図１２は、第２実施形態の測定装置の変形例である測定装置２０１の要部の模式図である。測定装置２０１の照射部２４０は、測定装置１０１の照射部１４０と異なり、ウェルアレイが形成された領域よりも面積が小さい照射領域に活性エネルギー線を照射する構成である点が主に異なる。なお、上述の実施形態と同一態様の構成要素については、同一又は対応する符号を付し、その説明を省略する。
【０１４７】
照射部２４０によれば、照射部１４０と比較して、光源の総光量が同じであっても、レンズを介して小面積に集光し、光照射領域を小面積に限定することにより、単位面積当たりの活性エネルギー線の照射量を増加させることができる。これにより、活性エネルギー線の照射時間を短縮することが可能となる。
【０１４８】
図１２に示すように、測定装置２０１は、照射部２４０と、測定部（回路部）１６０と、制御部１３６と、を有する。測定装置２０１は、酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを測定する。
【０１４９】
照射部２４０は、基板１２０の第１の面１２０ａに対向して配置されている。照射部２４０は、ウェルアレイ１２５内に照射領域Ａを形成し、照射領域Ａに活性エネルギー線を照射する。照射部２４０の照射領域Ａは、ウェルアレイ１２５が形成された領域よりも面積が小さい。
【０１５０】
続いて、測定装置２０１を用いた酵素反応の測定方法を説明する。測定装置２０１を用いた酵素反応の測定方法において、上述した工程ａは、前記ウェルアレイ上に設定された、前記ウェルアレイが形成された領域よりも面積が小さい照射領域に、前記活性エネルギー線を照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａ１であり、上述した工程ｂは、前記照射領域における前記酵素反応を測定する工程ｂ１であってもよい。
【０１５１】
測定装置２０１において、制御部１３６は、照射部２４０における活性エネルギー線の照射と、測定部１６０における酵素反応の検出と、の時間差を制御できる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、制御部１３６により実施されてもよい。
【０１５２】
各ウェル１２１内に収容された基質又は補因子は、活性エネルギー線が照射されることで、活性型に変換される。これにより、各ウェル１２１内で酵素反応を開始させる。また、酵素反応に伴い、電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスが変化する。
【０１５３】
測定部１６０は、基板１２０の第２の面１２０ｂ側に配置されている。測定部１６０は、酵素反応に伴い電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを測定する。すなわち、測定部１６０は、酵素反応を検出する検出部として機能する。
【０１５４】
制御部１３６は、照射部２４０及び測定部１６０に接続されている。制御部１３６は、照射部２４０における活性エネルギー線の照射及び測定部１６０における電流、電圧又はインピーダンスの測定を制御する。制御部１３６は、照射部２４０における活性エネルギー線の照射と、測定部１６０における酵素反応の検出と、の時間差を制御できる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、制御部１３６により実施されてもよい。
【０１５５】
測定部１６０は、照射領域Ａへの活性エネルギー線の照射後、制御部１３６によって制御された時間に、照射領域Ａの各ウェル１２１に設けられた電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを測定する。
【０１５６】
ここで、測定部１６０は、ウェルアレイ１２５の全てのウェル１２１に設けられた電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを同時に測定してもよい。この場合、照射領域Ａ以外のウェル１２１では酵素反応が生じていないため、照射領域Ａ以外のウェル１２１で測定されたデータは不要なデータとして破棄してもよい。
【０１５７】
あるいは、測定部１６０は、ウェルアレイ１２５の全てのウェル１２１のうち、照射領域Ａに位置するウェル１２１を含む、限定された領域（測定領域Ｂ）のみにおいて、電流、電圧又はインピーダンスを測定する構成としてもよい。
【０１５８】
大規模なアレイを構成する多数の電極１２９の全てについて、電流、電圧又はインピーダンスを同時に測定することは困難な場合があり、時間的な遅延が問題となる場合がある。このような場合において、測定領域Ｂに限定して、電流、電圧又はインピーダンスを測定する構成とすることにより、時間的な遅延を無視できるレベルに抑えることが可能となる。
【０１５９】
また、測定装置２０１は、測定部１６０における酵素反応の検出結果の経時的な変化を記録するメモリを備えていてもよい。これにより、ウェル１２１内の酵素反応を経時的に記録することが可能となる。
【０１６０】
測定装置２０１を用いた酵素反応の測定においては、照射領域Ａ及び測定領域Ｂの移動は、図８、図９、図１０を参照しながら上述したものと同様に行うことができる。すなわち、測定装置２０１を用いた測定は、図８、図９を参照しながら上述したものと同様に、工程ａ１及び工程ｂ１を同時に実施し、工程ｃにおいて、照射領域Ａを一定の速度で移動させ、測定領域Ｂの移動を照射領域Ａの移動に追従させるものであってもよい。
【０１６１】
あるいは、測定装置２０１を用いた測定は、図１０を参照しながら上述したものと同様に、照射領域Ａ及び測定領域Ｂが同一の領域であり、工程ａ１及び工程ｂ１をこの順で繰り返し実施するものであってもよい。この場合、工程ａ１と工程ｂ１との時間差を制御する工程ｃは、工程ａ１を実施した後、工程ｂ１を実施するまでの時間を制御することにより実施することができる。
【０１６２】
（第３実施形態）
続いて、測定装置の第３実施形態について説明する。第３実施形態の測定装置は、液滴内での酵素反応を測定する装置である。第３実施形態の測定装置によっても、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御することができる。
【０１６３】
図１３は、第３実施形態の測定装置５０１の要部の模式図である。測定装置５０１は、酵素反応に伴う光信号を測定する。第３実施形態の測定装置５０１は、第１実施形態の測定装置と比較して、反応空間が液滴である点が主に異なる。なお、上述した実施形態と同一態様の構成要素については、同一又は対応する符号を付し、その説明を省略する。
【０１６４】
図１３に示すように、第３実施形態の測定装置５０１は、液滴Ｄ中での酵素反応を測定する測定装置であって、酵素３３２とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む液滴Ｄが流れる流路５１０と、液滴Ｄに活性エネルギー線を照射して液滴Ｄ内で酵素反応を開始させる照射部５４０と、酵素反応に伴う光信号を検出する測定部５５０と、照射部５４０からの活性エネルギー線の照射と、測定部５５０での酵素反応の測定との時間差を制御する制御部５３６とを備える。
【０１６５】
制御部５３６は、照射部５４０と測定部５５０との間の距離Ｗを制御することにより、活性エネルギー線の照射と、酵素反応の測定との時間差を制御してもよい。あるいは、制御部５３６は、測定装置５０１における液滴Ｄの送液速度を制御することにより、活性エネルギー線の照射と、酵素反応の測定との時間差を制御してもよい。
【０１６６】
制御部５３６は、例えば照射部５４０と測定部５５０とを固定して保持する部材であってもよい。あるいは、制御部５３６は、例えば測定装置５０１における液滴Ｄの送液速度を制御するものであってもよい。
【０１６７】
すなわち、測定装置５０１において、上述した工程ｃは、照射部５４０と測定部５５０との間の距離Ｗを制御することによって実施することができる。距離Ｗは、例えば一定に保たれていてもよい。あるいは、上述した工程ｃは、測定装置５０１における液滴Ｄの送液速度を制御することによって実施することができる。
【０１６８】
測定装置５０１は、液滴を形成する液滴形成部５１５を備えていてもよい。液滴形成部５１５は、例えば図３に示す流体デバイス３００と同様の構造を有していてもよい。液滴形成部５１５で形成された液滴は、図１３中の矢印の方向に一定の速度で送液される。そして、照射部５４０により活性エネルギー線が照射された照射領域Ａを通過した時点で酵素反応が開始される。
【０１６９】
続いて、液滴Ｄは流路５１０の内部を所定の距離Ｗ流れ、測定領域Ｂにおいて測定部５５０により液滴Ｄにおける酵素反応が測定される。
【０１７０】
測定装置５０１は、複数の測定部を有していてもよい。例えば、図１３に示すように、測定装置５０１は、第２の測定部５５０Ａ及び第３の測定部５５０Ｂを有していてもよい。この構成によれば、同一の液滴Ｄでの酵素反応に対し反応時間を異ならせた測定を、１回の送液において行うことができる。これにより、同一の液滴Ｄにおける酵素反応の経時的な変化を測定でき、例えば酵素反応速度を算出することが可能となる。
【０１７１】
測定装置５０１の下流には、所望の液滴をソーティングして回収する回収部が存在していてもよい。液滴Ｄに酵素３３２をコードするＤＮＡが含まれている場合、当該ＤＮＡを回収することにより、所望の活性を有する酵素をコードするＤＮＡを得ることができる。すなわち、酵素のスクリーニングを行うことができる。
【実施例】
【０１７２】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１７３】
［実験例１］
（紫外線照射量の検討）
ケージド化合物を基質とした酵素反応を行い、ケージド化合物の活性化に必要な紫外線照射量を検討した。ケージド化合物として、ＮＰＥ−ケージドＡＤＰを使用した。また、ＡＤＰを代謝する酵素として、ポリリン酸キナーゼを使用した。
【０１７４】
具体的には、１ｍＭ  ＮＰＥ−ケージドＡＤＰ  ３μＬに、波長３４０〜３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射した後、下記表１に示す組成の反応液を調製した。
【０１７５】
紫外線照射には、水銀ランプを光源とし、ＤＡＰＩ蛍光フィルター（Ｅｘ：３４０−３８０、ＤＭ：４００、ＢＡ４３５−４８５）を搭載した正立蛍光顕微鏡を用いた。紫外線照射時間は、０秒、１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、６０秒、１２０秒、３００秒の９通りとした。
【０１７６】
【表１】
2018117536.tif 000009
【０１７７】
上記反応液を９６ウェルプレートに２７μＬ／ウェルずつ移し、ミネラルオイルを３０μＬ／ウェル重層した。続いて、ポリリン酸キナーゼ（１６．８Ｕｎｉｔ／Ｌ）を３μＬ／ウェルずつ添加し、ルミノメーターを用いて発光量を測定した。
【０１７８】
図１４（ａ）及び（ｂ）は、発光量の測定結果を示すグラフである。その結果、ケージド化合物を活性化するためには、波長３４０〜３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）の場合、照射時間３０〜６０秒程度（４５０〜９００ｍＪ／ｃｍ２）の照射量が必要であることが明らかとなった。
【０１７９】
［実験例２］
（紫外線照射による酵素反応の開始１）
ケージド化合物を基質とした酵素反応を行い、紫外線照射により酵素反応の開始を制御できることを確認した。ケージド化合物として、ＮＰＥ−ケージドＡＤＰを使用した。また、ＡＤＰを代謝する酵素として、ポリリン酸キナーゼを使用した。具体的には、まず、下記表２に示す反応液を調製した。
【０１８０】
【表２】
2018117536.tif 000010
【０１８１】
続いて、上記反応液を９６ウェルプレートに２７μＬ／ウェルずつ移し、ミネラルオイルを３０μＬ／ウェル重層した。続いて、ポリリン酸キナーゼ（１６．８Ｕｎｉｔ／Ｌ）を３μＬ／ウェルずつ添加し、ルミノメーターを用いて発光量を測定した。
【０１８２】
発光量を３０分間測定した後、９６ウェルプレートをルミノメーターから取り出し、ウェル中の反応液に波長３４０〜３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外線照射には、水銀ランプを光源とし、ＤＡＰＩ蛍光フィルター（Ｅｘ：３４０−３８０、ＤＭ：４００、ＢＡ４３５−４８５）を搭載した正立蛍光顕微鏡を用いた。紫外線照射時間は、０秒、１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、６０秒の７通りとした。続いて、ルミノメーターを用いて再度発光量を測定した。
【０１８３】
図１５（ａ）及び（ｂ）は、発光量の測定結果を示すグラフである。図１５（ａ）は紫外線照射前の発光量の測定結果を示すグラフであり、図１５（ｂ）は紫外線照射後の発光量の測定結果を示すグラフである。その結果、紫外線照射前は酵素反応が抑制されていることが明らかとなった。また、紫外線照射により酵素反応を開始できることが確認された。また、酵素活性の高さは、紫外線の照射量に依存することが明らかとなった。
【０１８４】
［実験例３］
（紫外線照射装置の検討）
酵素に紫外線を照射した後に酵素反応を行い、紫外線照射装置の種類が酵素活性に与える影響を検討した。紫外線照射装置として、ＵＶランプ又は正立蛍光顕微鏡を使用した。具体的には、まず、下記表３に示す反応液を調製した。
【０１８５】
【表３】
2018117536.tif 000011
【０１８６】
続いて、上記反応液を９６ウェルプレートに２７μＬ／ウェルずつ移し、ミネラルオイルを３０μＬ／ウェル重層した。続いて、ウェル中の反応液に波長３４０〜３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外線照射時間は、０秒、１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、６０秒、１２０秒、３００秒の９通りとした。
【０１８７】
紫外線照射装置としては、水銀ランプを光源とし、ＤＡＰＩ蛍光フィルター（Ｅｘ：３４０−３８０、ＤＭ：４００、ＢＡ４３５−４８５）を搭載した正立蛍光顕微鏡、又は波長３６５ｎｍのＵＶランプ（型式「Ｂ−１００ＡＰ」、ＵＶＰ社）を使用した。
【０１８８】
続いて、ポリリン酸キナーゼ（１６．８Ｕｎｉｔ／Ｌ）を３μＬ／ウェルずつ添加し、ルミノメーターを用いて発光量を測定した。
【０１８９】
図１６は、発光量の測定結果を示すグラフである。図中、発光量は、紫外線照射時間０秒のサンプルの最大発光量を１００％とした割合（％）で示した。
【０１９０】
その結果、ＵＶランプによる紫外線照射では、照射時間が長くなると酵素活性が低下することが明らかとなった。この結果から、ＵＶランプによる紫外線照射では、熱により酵素が失活している可能性が考えられた。一方、蛍光顕微鏡による紫外線照射では、ＵＶランプよりも長時間の紫外線照射を行っても酵素活性が維持される傾向にあった。
【０１９１】
［実験例４］
（紫外線照射による酵素反応の開始２）
ケージド化合物を補因子とした酵素反応を行い、紫外線照射により酵素反応の開始を制御できることを確認した。ケージド化合物として、Ｍｇ２＋をキレートしたＤＭＮＰ−ＥＤＴＡを使用した。また、ＡＤＰを代謝する酵素として、ポリリン酸キナーゼを使用した。
【０１９２】
まず、ＤＭＮＰ−ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）に波長３４０〜３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射したものと照射しなかったものを準備した。紫外線照射には、水銀ランプを光源とし、ＤＡＰＩ蛍光フィルター（Ｅｘ：３４０−３８０、ＤＭ：４００、ＢＡ４３５−４８５）を搭載した正立蛍光顕微鏡を用いた。紫外線照射時間は３０秒とした。続いて、下記表４に示す反応液を調製した。なお、下記表４中のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは、ＤＭＮＰ−ＥＤＴＡにキレートされるＭｇ２＋イオンを供給するものである。
【０１９３】
【表４】
2018117536.tif 000012
【０１９４】
続いて、上記反応液を９６ウェルプレートに２７μＬ／ウェルずつ移し、ミネラルオイルを３０μＬ／ウェル重層した。続いて、ポリリン酸キナーゼ（１６．８Ｕｎｉｔ／Ｌ）を３μＬ／ウェルずつ添加し、ルミノメーターを用いて発光量を測定した。
【０１９５】
図１７は、発光量の測定結果を示すグラフである。その結果、紫外線照射前は酵素反応が抑制されていることが明らかとなった。また、紫外線照射により酵素反応を開始できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本発明によれば、多数の酵素について酵素反応をそれぞれ測定する場合において、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御する技術を提供することができる。
【符号の説明】
【０１９７】
１，１０１，２０１，５０１…測定装置、２０，１２０…基板、２０ａ，１２０ａ…第１の面、２０ｂ，１２０ｂ…第２の面、２１，１２１…ウェル、２５，１２５…ウェルアレイ、３０…支持部、３５…駆動部、３６，１３６，５３６…制御部、４０，１４０，２４０，５４０…照射部、４１…光源、４２…出射レンズ、４３…マスク、４３ａ…孔、４３ｂ…遮光版、５０，５５０…測定部、５０Ａ，５５０Ａ…第２の測定部、５５０Ｂ…第３の測定部、５１…撮像素子、５２…対物レンズ（対物光学系）、１２９…電極、１６０，２６０…測定部（回路部）、３００…流体デバイス、３１０，３２０，４００，５１０…流路、３３０…水系液体、３３１…ＤＮＡ、３３２…タンパク質（酵素）、５１５…液滴形成部、Ａ…照射領域、Ｂ…測定領域、ＩＩＩ，ａ，ｂ，ｃ…領域、Ｌ４０，Ｌ５０…光軸、Ｗ…距離、ｅ１，ｅ２…酵素、Ｓ…基質、Ｐ…生成物、Ｏｘ…酸化体、Ｒｅｄ…還元体、ｅ−…電子、Ｄ…液滴。
【図１】
2018117536.tif 000013
【図２】
2018117536.tif 000014
【図３】
2018117536.tif 000015
【図４】
2018117536.tif 000016
【図５】
2018117536.tif 000017
【図６】
2018117536.tif 000018
【図７】
2018117536.tif 000019
【図８】
2018117536.tif 000020
【図９】
2018117536.tif 000021
【図１０】
2018117536.tif 000022
【図１１】
2018117536.tif 000023
【図１２】
2018117536.tif 000024
【図１３】
2018117536.tif 000025
【図１４】
2018117536.tif 000026
【図１５】
2018117536.tif 000027
【図１６】
2018117536.tif 000028
【図１７】
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