(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃｈｏｐ２（チャネルオプシン−２）遺伝子の有利な変異、及び／又はその組み合わせの発現による、光受容細胞の光感受性を回復及び／又は増大させる方法の提供。変異体ＣｈＲ２（チャネルロドプシン−２）を含む組成物を、被験体に投与して、光伝達を維持、改善、又は回復することを含む。好ましくは、組成物及び方法を、視覚障害を有する被験体に提供し、それによって視覚を正常レベルまで回復させる。【解決手段】Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＣｈｏｐ２由来である、特定の配列の１３２位のアミノ酸がロイシンではないように置換された、単離されたポリペプチド分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１２年３月５日に出願された米国仮出願第６１／６０６，６６３号に対する優先権およびその利益を主張する。この仮出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの助成金ＮＩＨ  ＥＹ  １７１３０の下、米国政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般的に、分子生物学の分野に関連する。チャネルオプシン（ｃｈａｎｎｅｌｏｐｓｉｎ）−２（Ｃｈｏｐ２）遺伝子の変異を同定する。変異体Ｃｈｏｐ２遺伝子を含む組成物を、視力喪失を改善および回復するための治療方法において使用する。
【背景技術】
【０００４】
網膜は、光受容体（または光受容細胞、桿体および錐体）から成る。光受容体は、光伝達、または視覚系において一連の事象を伝播し、最終的に我々の世界の表示を生成する（電磁放射の形態での）光の電気的および化学的シグナルへの変換を担う、高度に特殊化されたニューロンである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
光受容体の喪失または変性は、網膜内の視覚情報の光伝達を、完全に阻害はしないにしても、ひどく損なう。光受容細胞の喪失および／または光受容細胞機能の喪失は、視力の低下、光感受性の低下、および失明の主な原因である。当該分野において、視力喪失を経験している被験体の網膜の羞明を回復する組成物および方法に対する、長年のニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、チャネルオプシン−２（Ｃｈｏｐ２）遺伝子の有利な変異、および／またはその組み合わせの発現による、光受容細胞の光感受性を回復および／または増大させる方法に対する、長年のニーズに関する解決策を提供し、そして続いてチャネルオプシン−２（Ｃｈｏｐ２）に基づく遺伝子治療のための方法を提供する。
【０００７】
チャネルオプシン−２（Ｃｈｏｐ２）に基づく遺伝子治療は、光受容体の変性後に、網膜の光感受性を回復するためのすぐれた戦略を提供する。Ｃｈｏｐ２遺伝子のタンパク質産物は、光異性化可能な発色団、オールトランスレチナールに結合した場合、チャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）と呼ばれる、機能的な光ゲートチャネルを形成する。天然のＣｈＲ２は、低い光感受性を示す。最近、２つの変異体ＣｈＲ２、Ｌ１３２ＣおよびＴ１５９Ｃが、その光感受性を著しく増大させることが報告された（Ｋｌｅｉｎｌｏｇｅｌら（２０１１）Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：５１３−８；Ｂｅｒｎｄｔら（２０１１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０８：７５９５−６００；Ｐｒｉｇｇｅら（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８７（３８）３１０４：１２；そのそれぞれの内容は、それらの全体が本明細書に援用される）。これらの２つのＣｈＲ２変異体（すなわち、Ｌ１３２ＣおよびＴ１５９Ｃ）の特性を調査し、そしてこれらの２つの部位における多くの二重変異体と比較して、治療方法のために適当な候補を同定した。これらの変異のうち１つまたはそれより多くを含む組成物が、視覚を回復する目的のために、その必要のある被験体に提供される。具体的には、Ｃｈｏｐ２遺伝子の望ましい変異を、細胞に導入する、および／または細胞のゲノムＤＮＡに組み込んで、視覚を改善または回復する。視覚を改善または回復するために細胞に導入されるＣｈｏｐ２遺伝子の望ましい変異はまた、ゲノムＤＮＡに組み込まれずに、エピソーム性のままであり得る。
【０００８】
Ｃｈｏｐ２（および従って、できたＣｈＲ２）のＬ１３２またはＴ１５９アミノ酸位置の変異は、ＣｈＲ２媒介性の光電流を誘発するために必要な光強度閾値を、著しく低下させる。アミノ酸位置Ｌ１３２およびＴ１５９における二重変異体はさらに、低い光強度における光電流を増大させ、対応する単一の変異のいずれのものも超える。Ｌ１３２およびＴ１５９位置における二重変異体を発現する網膜神経節細胞は、通常の屋外の照明条件の範囲内に入る光強度に応答し得るが、依然として、有用な視覚を回復するために適当な、十分かつ高い時間分解能を維持しなければならない。従って、視覚を回復または改善するために、改善された光感受性を有する変異体ＣｈＲ２を形成する、本発明の変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質を、単独で、または組み合わせて使用する。
【０００９】
具体的には、本発明は、配列番号２６を含む、またはそれから成る、単離されたポリペプチド分子を提供し、ここで配列番号２６の位置１３２のアミノ酸はロイシン（Ｌ）ではない。単離されたポリペプチド分子のある実施態様において、位置１３２のアミノ酸はシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）である。位置１３２のアミノ酸がシステイン（Ｃ）である場合、そのポリペプチド分子は、配列番号１３を含み得る、またはそれから成り得る。位置１３２のアミノ酸がアラニン（Ａ）である場合、そのポリペプチド分子は、配列番号２０を含み得る、またはそれから成り得る。
【００１０】
本発明は、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子を提供し、ここで配列番号２６の位置１５９のアミノ酸は、トレオニン（Ｔ）ではない。単離されたポリペプチド分子のある実施態様において、位置１５９のアミノ酸は、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、またはアラニン（Ａ）である。位置１５９のアミノ酸がシステイン（Ｃ）である場合、そのポリペプチド分子は、配列番号１４を含み得る、またはそれから成り得る。位置１５９のアミノ酸がセリン（Ｓ）である場合、そのポリペプチド分子は、配列番号１７を含み得る、またはそれから成り得る。位置１５９のアミノ酸がアラニン（Ａ）である場合、そのポリペプチド分子は、配列番号２３を含み得る、またはそれから成り得る。
【００１１】
本発明は、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子を提供し、ここで配列番号２６の位置１３２のアミノ酸はロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸は、トレオニン（Ｔ）ではない。配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子のある実施態様において、位置１３２のアミノ酸はシステイン（Ｃ）であり、そして位置１５９のアミノ酸はシステイン（Ｃ）である。この単離されたポリペプチド分子の好ましい実施態様において、そのポリペプチド分子は、配列番号１６を含む、またはそれから成る。本発明は、配列番号１６を含む、またはそれから成る、単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、配列番号１６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子は、配列番号１５を含む、またはそれから成る核酸分子である。
【００１２】
配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子のある実施態様において、位置１３２のアミノ酸はシステイン（Ｃ）であり、そして位置１５９のアミノ酸はセリン（Ｓ）である。配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子は、配列番号１９を含み得る、またはそれから成り得る。あるいは、またはそれに加えて、配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子は、配列番号１９を含み得る、またはそれから成り得、ここで位置１３２のアミノ酸はシステインであり、そしてここで位置１５９のアミノ酸はセリンである。本発明は、配列番号１９を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、その核酸分子は、配列番号１８を含む、またはそれから成る。
【００１３】
配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子のある実施態様において、位置１３２のアミノ酸はアラニン（Ａ）であり、そして位置１５９のアミノ酸はシステイン（Ｃ）である。配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子は、配列番号２２を含み得る、またはそれから成り得る。あるいは、またはそれに加えて、配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子は、配列番号２２を含み得る、またはそれから成り得、ここで位置１３２のアミノ酸はアラニン（Ａ）であり、そしてここで位置１５９のアミノ酸はシステイン（Ｃ）である。本発明は、配列番号２２を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、その核酸分子は、配列番号２１を含む、またはそれから成る。
【００１４】
配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子のある実施態様において、位置１３２のアミノ酸はシステイン（Ｃ）であり、そして位置１５９のアミノ酸はアラニン（Ａ）である。配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子は、配列番号２５を含み得る、またはそれから成り得る。あるいは、またはそれに加えて、配列番号２６の位置１３２のアミノ酸がロイシン（Ｌ）ではなく、そして位置１５９のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、配列番号２６を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチド分子は、配列番号２５を含み得る、またはそれから成り得、ここで位置１３２のアミノ酸はシステイン（Ｃ）であり、そしてここで位置１５９のアミノ酸はアラニン（Ａ）である。本発明は、配列番号２５を含む、またはそれから成る単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、その核酸分子は、配列番号２４を含む、またはそれから成る。
【００１５】
本発明は、本明細書中で記載された、単離されたポリペプチド分子のいずれか１つを提供し、ここでそのポリペプチド分子は、変異体ＣｈＲ２を形成する変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質をコードし、それは野生型ＣｈＲ２タンパク質の閾値よりも低い光強度閾値に応答して電流を誘発する。さらに、その電流は陽イオンを伝導する。代表的な陽イオンは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣａ２＋イオンを含むがこれに限らない。ＣｈＲ２野生型および本明細書中で記載された変異体タンパク質は、非特異的に陽イオンを伝導する。従って、その電流は以下のものの１つまたはそれより多くを伝導する：Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣａ２＋イオン。
【００１６】
本発明は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、本明細書中で記載された、単離されたポリペプチド分子のいずれか１つを提供する。本発明はまた、少なくとも１つの、本明細書中で記載された、単離されたポリヌクレオチド分子を含む組成物を提供する。その組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。
【００１７】
本発明は、本明細書中で記載された、単離されたポリペプチドのいずれかをコードする、単離された核酸分子を提供する。さらに、その単離された核酸分子はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。本発明はまた、少なくとも１つの、本明細書中で記載された、単離された核酸分子を含む組成物を提供する。その組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。
【００１８】
本発明は細胞を提供し、ここでその細胞は、本発明の単離されたポリペプチド分子と接触した、またはそれを含む。さらに、本発明は細胞を提供し、ここでその細胞は、本発明の単離されたポリペプチド分子をコードする、単離された核酸分子と接触した、またはそれを含む。本発明は、本発明の単離されたポリペプチド分子、または本発明の単離されたポリペプチド分子をコードする核酸分子を含む細胞を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る組成物を提供する。本発明の細胞を、単離されたポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする単離された核酸分子と、インビトロ、エキソビボ、インビボ、またはインサイチュで接触させ得る。本発明のある実施態様において、その細胞は、光受容体；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞、および特に、ＡＩＩアマクリン細胞；または光感受性網膜神経節細胞を含む網膜神経節細胞である。好ましくは、その細胞は、網膜神経節細胞、光感受性網膜神経節細胞、双極細胞、ＯＮ型双極細胞、桿体双極細胞、またはＡＩＩアマクリン細胞である。本発明のある局面において、その細胞は、光受容体、双極細胞、桿体双極細胞、ＯＮ型錐体双極細胞、網膜神経節細胞、光感受性網膜神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、またはＡＩＩアマクリン細胞である。
【００１９】
本発明は、被験体に、本明細書中で記載された組成物のいずれか１つを投与する事を含む、視覚を改善または回復する方法を提供する。本発明はさらに、被験体に、本明細書中で記載された組成物のいずれか１つを投与する事を含む、視覚を維持する予防的な方法を提供する。
【００２０】
本明細書中で記載される方法は、健康な、盲目の（部分的なまたは完全な）被験体、および／または網膜の変性（桿体および／または錐体光受容細胞の喪失によって特徴付けられる）を有する被験体にも適用され得るが、周囲の光レベルの決定に関して光感受性網膜神経節細胞の活性に依存し得る。例えば、本明細書中で記載される方法を、２４時間の明／暗サイクルに概日リズムを同調するための光情報の伝達、瞳孔の調節および反射、およびメラトニン放出の光による制御を媒介する、光感受性網膜神経節細胞の活性を維持、改善、または回復するために使用し得る。
【００２１】
本発明の方法のある実施態様において、その被験体は、正常な視覚または視覚障害を有し得る。あるいは、またはそれに加えて、その被験体は、視覚の障害を引き起こす眼科疾患を発症するリスクを有し得る。例えば、その被験体は、黄斑変性および網膜色素変性を含む、眼科疾患の家族歴を有し得る。その被験体は、網膜の光感受性細胞に損傷を引き起こす眼の損傷を負うリスクを有し得る。その被験体は、視覚障害、低視力、法的盲、部分的な盲目、または完全な盲目をもたらす、遺伝マーカーまたは遺伝性／先天性状態を有し得る。被験体は、近視（ｍｙｏｐｉａ）（近視（ｎｅａｒ−ｓｉｇｈｔｅｄｎｅｓｓ））または遠視（ｈｙｐｅｒｏｐｉａ）（遠視（ｆａｒ−ｓｉｇｈｔｅｄｎｅｓｓ））を引き起こす屈折の欠陥を有し得る。
【００２２】
本発明の方法の組成物を、全身的または局所的のいずれかで被験体に投与し得る。局所投与の好ましい経路は、硝子体内注射である。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになり、そしてそれに含まれる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
配列番号２６を含む、単離されたポリペプチド分子であって、ここで配列番号２６の１３２位のアミノ酸はロイシン（Ｌ）ではない、単離されたポリペプチド分子。
（項目２）
１３２位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）である、項目１に記載のポリペプチド分子。
（項目３）
１３２位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）であり、かつ前記ポリペプチド分子が配列番号１３を含む、項目２に記載のポリペプチド分子。
（項目４）
１３２位のアミノ酸がアラニン（Ａ）であり、かつ前記ポリペプチド分子が配列番号２０を含む、項目２に記載のポリペプチド分子。
（項目５）
配列番号２６を含む、単離されたポリペプチド分子であって、ここで配列番号２６の１５９位のアミノ酸はトレオニン（Ｔ）ではない、単離されたポリペプチド分子。
（項目６）
１５９位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）である、項目５に記載のポリペプチド分子。
（項目７）
１５９位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）であり、かつ前記ポリペプチド分子が配列番号１４を含む、項目６に記載のポリペプチド分子。
（項目８）
１５９位のアミノ酸がセリン（Ｓ）であり、かつ前記ポリペプチド分子が配列番号１７を含む、項目６に記載のポリペプチド分子。
（項目９）
１５９位のアミノ酸がアラニン（Ａ）であり、かつ前記ポリペプチド分子が配列番号２３を含む、項目６に記載のポリペプチド分子。
（項目１０）
配列番号２６を含む、単離されたポリペプチド分子であって、ここで配列番号２６の１３２位のアミノ酸はロイシン（Ｌ）ではなく、かつ１５９位のアミノ酸はトレオニン（Ｔ）ではない、単離されたポリペプチド分子。
（項目１１）
１３２位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）であり、１５９位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）である、項目１０に記載のポリペプチド分子。
（項目１２）
配列番号１６を含む、項目１０または１１に記載のポリペプチド分子。
（項目１３）
項目１２に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
（項目１４）
配列番号１５を含む、項目１３に記載の核酸分子。
（項目１５）
１３２位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）であり、１５９位のアミノ酸がセリン（Ｓ）である、項目１０に記載のポリペプチド分子。
（項目１６）
配列番号１９を含む、項目１０または１５に記載のポリペプチド分子。
（項目１７）
項目１６に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
（項目１８）
配列番号１８を含む、項目１７に記載の核酸分子。
（項目１９）
１３２位のアミノ酸がアラニン（Ａ）であり、１５９位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）である、項目１０に記載のポリペプチド分子。
（項目２０）
配列番号２２を含む、項目１０または１９に記載のポリペプチド分子。
（項目２１）
項目２２に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
（項目２２）
配列番号２１を含む、項目２１に記載の核酸分子。
（項目２３）
１３２位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）であり、１５９位のアミノ酸がアラニン（Ａ）である、項目１０に記載のポリペプチド分子。
（項目２４）
配列番号２５を含む、項目１０または２３に記載のポリペプチド分子。
（項目２５）
項目２４に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
（項目２６）
配列番号２４を含む、項目２５に記載の核酸分子。
（項目２７）
項目１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１５、１６、１９、２０、２３および２４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
（項目２８）
前記単離されたポリペプチドが、約３１５アミノ酸長、約３１０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２７５アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２２５アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１７５アミノ酸長または約１６０アミノ酸長である、項目２７に記載の単離された核酸分子。
（項目２９）
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目２７または２８に記載の単離された核酸分子。
（項目３０）
前記ポリペプチド分子が、野生型ＣｈＲ２タンパク質の光強度閾値よりも低い光強度閾値に応答して電流を誘発する変異体ＣｈＲ２タンパク質をコードする、項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１９、２０、２３および２４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド分子。
（項目３１）
前記ポリペプチド分子が、約３１５アミノ酸長、約３１０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２７５アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２２５アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１７５アミノ酸長または約１６０アミノ酸長である、項目３０に記載の単離されたポリペプチド分子。
（項目３２）
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目３０または３１に記載の単離されたポリペプチド分子。
（項目３３）
項目２７、２８および２９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む組成物。
（項目３４）
項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２９、３０および３１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド分子を含む組成物。
（項目３５）
項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２９、３０および３１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド分子を含む細胞。
（項目３６）
項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２９、３０および３１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド分子をコードする単離された核酸分子を含む細胞。
（項目３７）
項目２７または２８に記載の単離された核酸分子を含む細胞。
（項目３８）
項目３５、３６および３７のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
（項目３９）
前記細胞が、前記単離されたポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする単離された核酸分子とインビトロ、エキソビボ、インビボ、またはインサイチュで接触させられる、項目３５、３６および３７に記載の細胞。
（項目４０）
前記細胞が、光受容体、双極細胞、桿体双極細胞、ＯＮ型錐体双極細胞、網膜神経節細胞、光感受性網膜神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、またはＡＩＩアマクリン細胞である、項目３５、３６および３７に記載の細胞。
（項目４１）
前記細胞が、網膜神経節細胞または光感受性網膜神経節細胞である、項目４０に記載の細胞。
（項目４２）
被験体に項目３３に記載の組成物を投与するステップを含む、視覚を改善または回復する方法。
（項目４３）
被験体に項目３４に記載の組成物を投与するステップを含む、視覚を改善または回復する方法。
（項目４４）
被験体に項目３８に記載の組成物を投与するステップを含む、視覚を改善または回復する方法。
（項目４５）
前記被験体が、正常な視覚を有する、項目４２、４３および４４に記載の方法。
（項目４６）
前記被験体が、視覚障害を有する、項目４２、４３および４４に記載の方法。
（項目４７）
前記被験体が、眼科疾患に罹患している、項目４２、４３および４４に記載の方法。
（項目４８）
前記眼科疾患が、黄斑変性または網膜色素変性である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記組成物が、硝子体内注射または網膜下注射によって投与される、項目４２、４３および４４に記載の方法。
（項目５０）
前記視覚を改善または回復することが、以下：光感受性を増大させること；光電流を誘発するのに必要とされる光強度閾値を低下させること；および視覚皮質において視覚誘発電位を増大させること、のうちのいずれかを含む、項目４２、４３および４４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、その光感受性の比較のための、ＨＥＫ細胞における、野生型（ＷＴ）ＣｈＲ２、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／１５９Ｓ変異体からの、光誘発電流の代表的な記録を示す（Ａ）。光刺激（４６０ｎｍにおける光子／ｃｍ２．ｓ）を、キセノンアークランプによって産生し、そして濃度フィルターによって減弱した：ＮＤ４．０（２．８×１０１４）、ＮＤ３．０（１．４×１０１５）、ＮＤ２．５（４．８×１０１５）；ＮＤ２．０（１．６×１０１６）、ＮＤ１．０（１．３×１０１７）、ＮＤ０（１．２×１０１８）。（Ｂ）同じ電流トレースを、異なる電流スケールで示す。矢印によって示されるトレースは、同じ光強度（ＮＤ２．５）によって誘発される。
【図２】図２は、その非活性化時間の過程（消灯後の減衰時間の過程）の比較のための、ＨＥＫ細胞における、１０ｍｓの光パルス（４６０ｎｍにおける１．２×１０１８光子／ｃｍ２／ｓ）に対する、野生型（ＷＴ）ＣｈＲ２、Ｔ１５９Ｃ、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓ変異体からの、光誘発電流の代表的な記録を示す。
【図３】図３は、その光感受性の比較のための、網膜全組織標本における、網膜神経節細胞からの、ＷＴ  ＣｈＲ２、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓに媒介されるスパイク活性の代表的な多チャンネルアレイの記録を示す。光刺激（光子／ｃｍ２／ｓ）を、４７３ｎｍの青色レーザーによって産生し、そして濃度フィルターによって減弱した：ＮＤ０（６．３×１０１６）、ＮＤ１．０（７．４×１０１５）、ＮＤ１．５（２．７×１０１５）、ＮＤ２．０（７．３×１０１４）、ＮＤ２．５（３．２×１０１４）、ＮＤ３．０（８．５×１０１３）、ＮＤ３．５（３．８×１０１３）、およびＮＤ４．０（９．５×１０１２）。
【図４Ａ】図４は、その時間的動態の比較のための、網膜全組織標本における、網膜神経節細胞からの、ＷＴ  ＣｈＲ２、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓに媒介されるスパイク活性の代表的な多チャンネルアレイの記録を示す。各パネルにおいて、単一のニューロンから由来する１０個の連続する光誘発スパイクのラスタープロット（上）および平均スパイク率のヒストグラム（下）を示す。異なる頻度の光パルスを、各変異体の閾値強度よりも約１  ｌｏｇ単位高い強度で、４７３ｎｍの青色レーザーによって産生した。ＷＴ  ＣｈＲ２およびＬ１３２Ｃの記録を（Ａ）に示し、そしてＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９ＣおよびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓの記録を（Ｂ）に示す。
【図４Ｂ】図４は、その時間的動態の比較のための、網膜全組織標本における、網膜神経節細胞からの、ＷＴ  ＣｈＲ２、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓに媒介されるスパイク活性の代表的な多チャンネルアレイの記録を示す。各パネルにおいて、単一のニューロンから由来する１０個の連続する光誘発スパイクのラスタープロット（上）および平均スパイク率のヒストグラム（下）を示す。異なる頻度の光パルスを、各変異体の閾値強度よりも約１  ｌｏｇ単位高い強度で、４７３ｎｍの青色レーザーによって産生した。ＷＴ  ＣｈＲ２およびＬ１３２Ｃの記録を（Ａ）に示し、そしてＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９ＣおよびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓの記録を（Ｂ）に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
視覚系
中枢神経系は、視覚系に存在する特殊化した細胞および独特のシグナル伝達方法によって、視覚（本明細書中で視力（ｓｉｇｈｔ）とも呼ばれる）を媒介する。視覚系の主な責務は、電磁放射の形態である光を、周囲の世界の表示または画像に変換することである。この系の「視覚」機能に加えて、視覚系はまた、瞳孔対光反射（ＰＬＲ）、周期的な明／暗サイクルに対する概日性光同調、およびホルモンであるメラトニンの放出を制御する。
【００２６】
網膜の細胞は、光（様々な波長および強度の電磁放射）に遭遇する視覚または神経系の最初の細胞である。光子は、角膜、瞳孔、および水晶体を通り、その後網膜に達する。直接光子を吸収する光受容細胞が、網膜の外側層に位置するので、網膜は、独特の構造を有する。水晶体を横切った光子は、まず網膜神経節細胞の内側層（そのうちの少数がオプシン、メラノプシンの発現によって光感受性である）および双極細胞の中間層に遭遇し、その後、光受容細胞（桿体および錐体としても公知である）の外側層に達する。桿体光受容体は、薄暗い照明条件で作用し（暗所視）、一方錐体光受容体は、色覚を担い、明るい照明条件で作用する（明所視）。錐体光受容体は、ＯＮおよびＯＦＦ型錐体双極細胞に直接シナプス伝達（ｓｙｎａｐｓｅ）し、それは次にＯＮおよびＯＦＦ型網膜神経節細胞にシナプス伝達する。桿体光受容体は、桿体双極細胞（独特の型の双極細胞、ＯＮ型）にシナプス伝達し、それはＡＩＩアマクリン細胞にシナプス伝達する。ＡＩＩアマクリン細胞は次いで、視覚シグナルを、ギャップ結合によってＯＮ型の錐体双極細胞に、および抑制性グリシン作動性シナプスによってＯＦＦ型錐体双極細胞およびＯＦＦ神経節細胞に伝える。網膜神経節細胞は、視覚情報を脳のニューロンに関係付けることを担う。
【００２７】
光伝達
網膜内で、光受容細胞は光子粒子を吸収し、そして光の周波数および波長の生データを、化学的、および続いて電気シグナルに変換し、それがこの最初の情報を視覚および神経系を通して伝える。具体的には、光受容体（桿体、錐体、および／または光感受性網膜神経節細胞）の表面に位置するオプシンタンパク質が光子を吸収し、そして細胞内シグナル伝達カスケードが開始し、それが光受容体の過分極をもたらす。暗所において、そのオプシンタンパク質は光子を吸収せず、光受容体は脱分極する。光受容体の視覚シグナルは次いで、双極細胞、アマクリン細胞、および神経節細胞によって、脳の高次視覚中枢へ伝わる。具体的には、桿体および錐体光受容体が脱分極した場合（暗所において）、それらは桿体双極細胞およびＯＮ型錐体双極細胞の脱分極を引き起こすが、ＯＦＦ型錐体双極細胞の過分極を引き起こし、それは次にＡＩＩアマクリン細胞の脱分極、およびＯＮ型網膜神経節細胞のスパイクの増大、およびＯＦＦ型網膜神経節細胞のスパイクの減少を引き起こす。桿体および錐体光受容体が過分極した場合（光に応答して）、反対のことが起こる（桿体、ＯＮおよびＯＦＦ型双極細胞、ＡＩＩアマクリンおよびＯＮおよびＯＦＦ型神経節細胞に対して）。
【００２８】
光情報は、光受容体、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、および網膜神経節細胞の作用によって、処理および有意に精密化される。この系の複雑性に加えるために、光受容体は、桿体、錐体（そのうち３つの型が、区別できる波長の光に最も強く応答する）、および光感受性網膜神経節細胞を含む、３つの主な種類で見出される。従って、情報処理の最初の層は、光の特定の波長および強度に異なって応答する、光受容体のレベルで起こる。網膜の双極細胞は、光受容細胞および水平細胞の両方から情報を受け取る。網膜の水平細胞は、複数の光受容細胞から情報を受け取り、そして従って、細胞型間および網膜内の距離をわたり情報を統合する。双極細胞はさらに、網膜神経節細胞に主に段階電位（ｇｒａｄｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を産生することによって、光受容細胞および水平細胞からの情報を直接統合するが、いくつかの最近の研究は、いくつかの双極細胞は活動電位を産生し得ることを示す。錐体双極細胞は、網膜神経節細胞およびアマクリン細胞にシナプス伝達し、一方桿体双極細胞は、ＡＩＩアマクリン細胞のみにシナプス伝達する。水平細胞と同様、ほとんどのアマクリン細胞は、網膜内で情報を側方に統合する。水平細胞と異なり、ほとんどのアマクリン細胞は、抑制性（ＧＡＢＡ作動性）介在ニューロンである。それぞれのアマクリン細胞は、特定の型の双極細胞（１０種類の双極細胞のうち１つ）に特異的にシナプス伝達するので、アマクリン細胞はまた、水平細胞より特殊化されている。特に、ＡＩＩアマクリン細胞は、桿体経路において重要な中継ニューロンである（錐体光受容体が応答しない暗所視において）。ＡＩＩアマクリン細胞は、桿体双極細胞からシナプスの入力を受け、そして次いでＯＮおよびＯＦＦ型錐体双極細胞を介して、上記で記載したようなＯＮおよびＯＦＦ型神経節細胞へ、シグナルを錐体経路へ伝達する（ｐｉｇｇｙ−ｂａｃｋ）。従って、桿体双極細胞またはＡＩＩアマクリン細胞における、Ｃｈｏｐ２の発現、およびその結果としてのＣｈＲ２の形成は、網膜神経節細胞においてＯＮおよびＯＦＦの応答の両方を生じ得る。さらに、網膜神経節細胞は、双極細胞由来の情報およびアマクリン細胞由来の情報を統合する。網膜神経節細胞は、サイズ、接続性、および視覚刺激（例えば視野）に対する応答に関して有意に異なるが、全ての網膜神経節細胞は、長い軸索を脳に伸ばす。瞳孔対光反射および概日同調に関する非視覚情報を伝達する網膜神経節細胞のわずかな部分を除いて、網膜神経節細胞から伸びる軸索の全体は、視神経、視神経交差、および中枢神経系の視索を形成する。結果として、かなりの量の情報処理が、網膜自体で起こる。
【００２９】
光受容細胞は、ロドプシンのような内因性オプシンタンパク質を発現する。本発明の変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質は、あらゆる細胞型で発現され得、そして機能的なＣｈＲ２チャネルを形成し得る。好ましくは、その細胞は網膜の細胞である。代表的な細胞は、光受容細胞（例えば桿体、錐体、および光感受性網膜神経節細胞）、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、および網膜神経節細胞を含むがこれに限らない。
【００３０】
チャネルオプシン−２（Ｃｈｏｐ２）
チャネルオプシン−２（Ｃｈｏｐ２）は、緑藻類、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉから最初に単離された。チャネルオプシン−２は、７回膜貫通型ドメインタンパク質であり、発色団オールトランスレチナールと結合した場合、光スイッチ可能（光感受性）になる。Ｃｈｏｐ２は、シッフ塩基結合によってレチナール分子と結合した場合、チャネルロドプシン−２（Ｃｈｏｐ２  レチニリデン（ｒｅｔｉｎａｌｉｄｅｎｅ）、ＣｈＲ２と省略される）と呼ばれる、光ゲート、非特異的、内向き整流性、陽イオンチャネルを形成する。
【００３１】
本明細書中で言及する場合、「チャネルオプシン−２」または「Ｃｈｏｐ２」は、チャネルオプシン−２をコードする遺伝子を指し、それは次いで一旦レチナールに結合すればチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）を形成する。本発明の遺伝子構築物は、主にチャネルオプシン−２（すなわちレチナールを含まない）を指し、そして本明細書中で開示される全てのＣｈｏｐ２変異体は、機能的なチャネルロドプシン−２改変体を形成する。本明細書中で開示される方法は、外来性のレチナール無しに、Ｃｈｏｐ２を細胞へ送達することを含み得る。細胞（すなわち網膜ニューロン）においてＣｈｏｐ２が発現した時に、内因性の利用可能なレチナールが、野生型Ｃｈｏｐ２または本発明のＣｈｏｐ２変異体に結合して、機能的な光ゲートチャネル、ＷＴ  ＣｈＲ２または変異体ＣｈＲ２を形成することが理解される。従って、本明細書中で言及されるＣｈｏｐ２タンパク質はまた、ＣｈＲ２と同義であり得る。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「チャネルロドプシン−２」または「ＣｈＲ２」は、レチナールに結合した機能的光感受性チャネルを指す。１つの実施態様において、その結合したレチナールは、外来性に提供され得る。好ましい実施態様において、その結合したレチナールは、細胞において利用可能な内因性レベルから提供される。本発明はまた、本明細書中で記載されたＣｈｏｐ２変異体をコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチドによって形成された、機能的チャネルロドプシン−２チャネルを含む。
【００３３】
好ましい線量の光放射によって照射された場合に、ＣｈＲ２はチャネルの孔を開き、それを通って細胞外スペースから細胞内にＨ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、および／またはＣａ２＋イオンが流入する。ＣｈＲ２チャネルの活性化は、典型的にはそのチャネルを発現する細胞の脱分極を引き起こす。脱分極した細胞は、段階電位および／または活動電位を生じ、Ｃｈｏｐ２／ＣｈＲ２発現細胞から、網膜または脳の他の細胞へ情報を運ぶ。
【００３４】
ＣｈＲ２の野生型形態または高い時間分解能を有する変異体ＣｈＲ２が、神経科学研究の中心的な焦点となった。哺乳動物ニューロンにおいて発現された場合、ＣｈＲ２は、インビトロまたはエキソビボの培養の、光で制御された脱分極を媒介する。野生型ＣｈＲ２または高い時間分解能を有する変異体ＣｈＲ２（後者は通常低い光感受性を示す）は、視覚回復の目的のためにそれらを使用することを可能にするために取り組まなければならない、いくつかの困難を提示した。視覚回復の目的のためには、高い時間分解能よりも高い光感受性を有するＣｈＲ２が望ましい。
【００３５】
野生型ＣｈＲ２タンパク質は、完全な活性化のために、強い青色光強度の照明を必要とする（すなわち、４８０ｎｍの波長で、１０１８〜１０１９光子ｓ−１ｃｍ−２）。この型の連続的な照明は、細胞を損傷し得る。
【００３６】
野生型ＣｈＲ２タンパク質の動態は、チャネル有効性を最大化するために最適ではない。野生型ＣｈＲ２タンパク質の１つまたはそれより多くのアミノ酸を修飾することによって、有効性を上昇させ得、チャネルの開口状態を延長し得る、またはチャネルの単位コンダクタンスを増大させ得る、またはその両方である。野生型ＣｈＲ２の単一チャネルのコンダクタンスは小さい。従って、インビボにおけるニューロンの活性化は、野生型チャネルの高い発現か、または好ましい波長の青色光による非常に強力な活性化のいずれかを必要とする。チャネルコンダクタンスを変化させること、またはチャネル開口時間を延長することによって、より単純な解決策を見出し得る。これらのメカニズムのいずれか１つ、および特にこれらのメカニズムの組み合わせが、より低い、およびより安全な光強度を使用して、同じレベルの細胞脱分極を達成することを可能にする。
【００３７】
例えば、本発明の変異体ＣｈＲ２タンパク質は、チャネル開口状態の延長によって、より高い光感受性を達成する。結果として、各変異体ＣｈＲ２チャネルは、同じ光強度によって活性化された場合、野生型ＣｈＲ２チャネルよりも大きい光電流を伝導する。従って、その変異体チャネルは、野生型ＣｈＲ２チャネルの活性化に必要なものよりも低い光強度によって活性化される。定量的に、変異体ＣｈＲ２タンパク質を発現する網膜神経節細胞の検出可能なスパイク活性を、野生型ＣｈＲ２を発現する網膜神経節細胞からスパイク活性を誘発するために必要な光強度より、１．５〜２  ｌｏｇ単位低い光強度によって誘発し得る。従って、変異体ＣｈＲ２タンパク質を活性化するために必要な光強度は、通常の屋外照明条件に近いか、またはその範囲内に入る。
【００３８】
以下の配列は、野生型および変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質、および本発明の当該ＷＴおよび変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質をコードし、そして本発明のＷＴおよび変異体ＣｈＲ２を形成するポリヌクレオチドの制限しない例を提供する。
【００３９】
本発明の野生型（ＷＴ）Ｃｈｏｐ２は、以下のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉクラミオプシン（ｃｈｌａｍｙｏｐｓｉｎ）４光ゲートイオンチャネル（ＣＯＰ４）ｍＲＮＡ配列によってコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１７０１６７３、および配列番号１）：
【００４０】
【化１】
2018134098.tif 000002
【００４１】
【化２】
2018134098.tif 000003
本発明の野生型（ＷＴ）ＣｈＲ２は、以下のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉクラミオプシン４光ゲートイオンチャネル（ＣＯＰ４）アミノ酸配列によってコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１７０１７２５、および配列番号２）：
【００４２】
【化３】
2018134098.tif 000004
本発明の野生型（ＷＴ）Ｃｈｏｐ２は、以下のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉレチナール結合タンパク質（ｃｏｐ４）遺伝子配列によってコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４６１３９７、および配列番号３）：
【００４３】
【化４】
2018134098.tif 000005
【００４４】
【化５】
2018134098.tif 000006
本発明の野生型（ＷＴ）Ｃｈｏｐ２は、以下のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉレチナール結合タンパク質（ｃｏｐ４）アミノ酸配列によってコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ１５７７７、および配列番号４）：
【００４５】
【化６】
2018134098.tif 000007
本発明の野生型（ＷＴ）Ｃｈｏｐ２は、以下のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ感覚性オプシンＢ（ＣＳＯＢ）ｍＲＮＡ配列によってコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０８９６６、および配列番号５）：
【００４６】
【化７】
2018134098.tif 000008
【００４７】
【化８】
2018134098.tif 000009
本発明の野生型（ＷＴ）Ｃｈｏｐ２は、以下のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ感覚性オプシンＢ（ＣＳＯＢ）アミノ酸配列によってコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ４４０４０、および配列番号６）：
【００４８】
【化９】
2018134098.tif 000010
【００４９】
【化１０】
2018134098.tif 000011
本発明の野生型（ＷＴ）Ｃｈｏｐ２は、以下のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの、古細菌型オプシン２核酸配列のａｃｏｐ２  ｍＲＮＡによってコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０５８８９１、および配列番号７）：
【００５０】
【化１１】
2018134098.tif 000012
本発明の野生型（ＷＴ）Ｃｈｏｐ２は、以下のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの、古細菌型オプシン２アミノ酸配列のａｃｏｐ２  ｍＲＮＡによってコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ６８５６７、および配列番号８）：
【００５１】
【化１２】
2018134098.tif 000013
ＣｈＲ２変異体
本発明は、１つまたはそれより多くのアミノ酸が変異したＣｈｏｐ２変異体を提供する。いくつかの実施態様において、そのＣｈｏｐ２は、少なくとも１つのアミノ酸変異を有する、配列番号２、４、６、および８のような、全長ポリペプチドである。いくつかの実施態様において、その変異はアミノ酸１３２および／またはアミノ酸１５９においてである。いくつかの好ましい実施態様において、位置１３２のアミノ酸は、ロイシンからシステインまたはアラニンに変異している。いくつかの好ましい実施態様において、位置１５９のアミノ酸は、トレオニンからアラニン、システイン、またはセリンに変異している。全ての実施態様において、そのＣｈｏｐ２変異体は、機能的なＣｈＲ２チャネルを形成する。
【００５２】
本発明はまた、Ｃｈｏｐ２タンパク質およびＣｈｏｐ２の生物学的に活性な断片、または保存的アミノ酸置換または他の変異改変体をコードする核酸を含む。有用な断片の制限しない例は、野生型Ｃｈｏｐ２のアミノ酸１−３１５をコードするポリペプチド、すなわち配列番号２６を含み、ここで、例えばアミノ酸位置１３２および／または１５９において、少なくとも１つのアミノ酸が変異されているかまたは保存的に置換されている。野生型Ｃｈｏｐ２のより小さい断片も、本発明において有用であり得、ここで少なくとも１つのアミノ酸が変異されているかまたは保存的に置換されている（すなわちアミノ酸位置１３２および／または１５９において）。よって、本発明のＣｈｏｐ２ポリペプチドおよび核酸はさらに、野生型Ｃｈｏｐ２のアミノ酸１−３１５、１−３１０、１−３００、１−２７５、１−２５０、１−２２５、１−２００、１−１７５、または１−１６０をコードする、生物学的に活性な断片を含むがこれに限らず、ここで例えばアミノ酸位置１３２および／または１５９において、少なくとも１つのアミノ酸が変異されているかまたは保存的に置換されている。他の実施態様において、本発明のＣｈｏｐ２ポリペプチドおよび核酸は、３１５アミノ酸長、３１０アミノ酸長、３００アミノ酸長、２７５アミノ酸長、２５０アミノ酸長、２２５アミノ酸長、２００アミノ酸長、１７５アミノ酸長、または１６０アミノ酸長までであるか、または約３１５アミノ酸長、約３１０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２７５アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２２５アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１７５アミノ酸長、または約１６０アミノ酸長であり得る。
【００５３】
本発明の単一変異体Ｃｈｏｐ２は、以下の合成構築物ｈＶＣｈＲ１−ｍＫａｔｅ−ｂｅｔａｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＮ８３６７４６、および配列番号９）によってコードされ得、注釈は以下の通りである、ＧＦＰ配列は太字であり、Ｌ１３２Ｃ  Ｃｈｏｐ２配列には下線が引かれている：
【００５４】
【化１３】
2018134098.tif 000014
【００５５】
【化１４】
2018134098.tif 000015
本発明の単一変異体ＣｈＲ２は、以下の合成構築物ｈＶＣｈＲ１−ｍＫａｔｅ−ｂｅｔａｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＲ２９８３９、および配列番号１０）によってコードされ得、注釈は以下の通りである、ＧＦＰ配列は太字であり、Ｌ１３２Ｃ  Ｃｈｏｐ２配列には下線が引かれている：
【００５６】
【化１５】
2018134098.tif 000016
本発明の単一変異体Ｃｈｏｐ２は、以下の合成構築物ｈＶＣｈＲ１−ｍＫａｔｅ−ｂｅｔａｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＮ８３６７４５、および配列番号１１）によってコードされ得、注釈は以下の通りである、ＧＦＰ配列は太字であり、Ｌ１３２Ｃ  Ｃｈｏｐ２配列には下線が引かれている：
【００５７】
【化１６】
2018134098.tif 000017
【００５８】
【化１７】
2018134098.tif 000018
本発明の単一変異体Ｃｈｏｐ２は、以下の合成構築物ｈＶＣｈＲ１−ｍＫａｔｅ−ｂｅｔａｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＲ２９８３８、および配列番号１２）によってコードされ得、注釈は以下の通りである、ＧＦＰ配列は太字であり、Ｌ１３２Ｃ  Ｃｈｏｐ２配列には下線が引かれている：
【００５９】
【化１８】
2018134098.tif 000019
本発明のＬ１３２Ｃ単一変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１３２は下線および太字、配列番号１３）：
【００６０】
【化１９】
2018134098.tif 000020
本発明のＴ１５９Ｃ単一変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１５９は下線および太字、配列番号１４）：
【００６１】
【化２０】
2018134098.tif 000021
本発明のＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ二重変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る（配列番号１５）：
【００６２】
【化２１】
2018134098.tif 000022
本発明のＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ二重変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１３２および１５９は下線および太字、配列番号１６）：
【００６３】
【化２２】
2018134098.tif 000023
【００６４】
【化２３】
2018134098.tif 000024
本発明のＴ１５９Ｓ単一変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１５９は下線および太字、配列番号１７）：
【００６５】
【化２４】
2018134098.tif 000025
本発明のＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓ二重変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る（配列番号１８）：
【００６６】
【化２５】
2018134098.tif 000026
本発明のＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓ二重変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１３２および１５９は下線および太字、配列番号１９）：
【００６７】
【化２６】
2018134098.tif 000027
本発明のＬ１３２Ａ単一変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１３２は下線および太字、配列番号２０）：
【００６８】
【化２７】
2018134098.tif 000028
本発明のＬ１３２Ａ／Ｔ１５９Ｃ二重変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る（配列番号２１）：
【００６９】
【化２８】
2018134098.tif 000029
本発明のＬ１３２Ａ／Ｔ１５９Ｃ二重変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１３２および１５９は下線および太字、配列番号２２）：
【００７０】
【化２９】
2018134098.tif 000030
本発明のＴ１５９Ａ単一変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１５９は下線および太字、配列番号２３）：
【００７１】
【化３０】
2018134098.tif 000031
本発明のＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ａ二重変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る（配列番号２４）：
【００７２】
【化３１】
2018134098.tif 000032
本発明のＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ａ二重変異体Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（位置１３２および１５９は下線および太字、配列番号２５）：
【００７３】
【化３２】
2018134098.tif 000033
本発明の野生型（ＷＴ）Ｃｈｏｐ２は、以下のアミノ酸配列によってコードされ得る（配列番号２６）：
【００７４】
【化３３】
2018134098.tif 000034
本発明の変異体ＣｈＲ２タンパク質はまた、より遅いチャネル動態を示す。より高い光感受性は、より遅いチャネル動態と関連することが見出され、光感受性とチャネル動態との間の二律背反を示した。本発明のＣｈＲ２タンパク質を形成するＣｈｏｐ２タンパク質はまた、ＣｈＲ２のチャネル動態を改善し得る、または非活性化速度を増大させ得る、さらなる変異または修飾を含み得る。特に好ましいＣｈＲ２変異体は、光感受性の閾値とチャネル動態の釣り合いを保つ。
【００７５】
組成物およびキット
本発明の組成物およびキットは、本発明の変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質、および結果として生じるＣｈＲ２をコードする、少なくとも１つの核酸分子またはポリペプチド分子を含む。本発明の変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質をコードする、少なくとも１つの核酸分子またはポリペプチド分子はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。本発明のキットはさらに、本発明の組成物を被験体に投与するための説明書を含む。
【００７６】
治療的使用
Ｌ１３２（ロイシン１３２）およびＴ１５９（トレオニン１５９）部位において単一および二重変異を生じるために、コドン最適化Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ融合タンパク質に変異を作製した。各変異体ＣｈＲ２、またはその組み合わせの機能的特性を、まずＨＥＫ細胞において調査した。ＣＡＧプロモーターによって駆動される変異体Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ構築物を保持するＡＡＶ２ウイルスベクターを作成し、そして成体マウスの眼に硝子体内注射した。変異体Ｃｈｏｐ２により媒介される光応答を、網膜全組織標本（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｒｅｔｉｎａ）からの多電極アレイ記録を用いて調査した。
【００７７】
単一変異体ＣｈＲ２、すなわちＬ１３２ＣおよびＴ１５９Ｃは、ＣｈＲ２により媒介される光電流を誘発するために必要な光強度の閾値を、著しく下げる。さらに、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、Ｌ１３２Ａ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓを含む、いくつかの二重変異体ＣｈＲ２改変体は、低い光強度で、どの単一変異体ＣｈＲ２の結果よりも上回って、光電流をさらに増大させることが見出された。その二重変異体は、より遅いｏｆｆ速度を示し、それはおそらく低い光強度における光電流の増大に寄与する。Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ二重変異体によって媒介される網膜神経節細胞のスパイク活性が、１０１３光子／ｃｍ２／ｓの光強度および４７３ｎｍの波長で観察された。この光レベルは、野生型ＣｈＲ２でスパイク活性を誘発するために必要な光レベルより、約１．５から２  ｌｏｇ単位低い。Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃを発現する網膜神経節細胞のスパイク発火は、１５Ｈｚまでの光明滅頻度に追従し得る。進行中の研究は、網膜ニューロンにおける、本発明の変異体ＣｈＲ２の長期の発現および安全性を評価している。
【００７８】
さらに、本発明の変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質、および結果として生じるＣｈＲ２タンパク質の発現は、マウスにおいてウイルス注射の２ヶ月後まで、神経毒性を引き起こさないことが見出され、治療的使用のための本発明の安全性を示した。
【００７９】
本発明において使用するためのベクターは、プラスミドおよび組換えウイルス、すなわち組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、および当該分野で公知の他のウイルスのような、様々なウイルスベクターを含み得る。
【００８０】
いくつかの実施態様において、本発明のＣｈｏｐ２タンパク質の発現は、構成的プロモーター、すなわちＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲによって駆動される。他の実施態様において、そのプロモーターは、誘導性または細胞特異的プロモーターである。特定の細胞の亜集団、すなわち網膜ニューロン細胞、または変性細胞において、Ｃｈｏｐ２タンパク質の発現を可能にする、細胞型特異的プロモーターが好ましくあり得る。これらの細胞は、網膜神経節細胞、光受容細胞、双極細胞、桿体双極細胞、ＯＮ型錐体双極細胞、網膜神経節細胞、光感受性網膜神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、またはＡＩＩアマクリン細胞を含み得るがこれに限らない。細胞型特異的プロモーターは、当該分野で周知である。特に好ましい細胞型特異的プロモーターは、ｍＧｌｕＲ６、ＮＫ−３、およびＰｃｐ２（Ｌ７）を含むがこれに限らない。
【００８１】
いくつかの実施態様において、本発明の変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質および標的化遺伝子発現に加えて、異なるオプシン遺伝子の使用はさらに、光感受性を増大させ得る、または視覚を改善し得る。視覚情報は、２つの経路：光のＯＮをシグナル伝達するＯＮ経路、および光のＯＦＦをシグナル伝達するＯＦＦ経路によって、網膜を通して処理される。対比感度の増強のために、ＯＮおよびＯＦＦ経路の存在が重要である。ＯＮ経路の視覚シグナルは、ＯＮ錐体双極細胞から、ＯＮ神経節細胞へ伝わる。ＯＮ錐体双極細胞およびＯＮ神経節細胞はどちらも、光に応答して脱分極する。他方、ＯＦＦ経路の視覚シグナルは、ＯＦＦ錐体双極細胞から、ＯＦＦ神経節細胞へ伝わる。ＯＦＦ錐体双極細胞およびＯＦＦ神経節細胞はどちらも、光に応答して過分極（ｈｙｐｏｐｏｌａｒｉｚｅｄ）する。薄明かりで見る能力（暗所視）を担う桿体双極細胞は、ＯＮ双極細胞である（光に応答して脱分極する）。桿体双極細胞は、視覚シグナルを、ＡＩＩアマクリン細胞（ＯＮ型網膜細胞）を通して、ＯＮおよびＯＦＦ錐体双極細胞に伝える。
【００８２】
よって、視覚処理および視力に不可欠な、ＯＮおよびＯＦＦ経路を再現するために、二重ロドプシンシステムを使用し得る。簡単には、本発明のＣｈｏｐ２タンパク質を、ＯＮ型網膜ニューロン（すなわち、ＯＮ型神経節細胞および／またはＯＮ型双極細胞）に特異的に標的化し得、一方、過分極（ｈｙｐｏｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ）する光センサー（すなわち、ハロロドプシンまたは当該分野で公知の他のクロライドポンプ）を、ＯＦＦ型網膜ニューロン（すなわち、ＯＦＦ型神経節細胞および／またはＯＦＦ型双極細胞）に標的化して、ＯＮおよびＯＦＦ経路を生じ得る。好ましい細胞亜集団への特異的標的化を、異なる細胞型特異的プロモーターを用いることによって達成し得る。例えば、Ｃｈｏｐ２の発現を、ＯＮ型網膜ニューロン（すなわち、ＯＮ型神経節細胞および／またはＯＮ型双極細胞）における標的化発現のために、ｍＧｌｕＲ６プロモーターによって駆動し得、一方、ハロロドプシンのような過分極（ｈｙｐｏｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ）するチャネルの発現を、ＯＦＦ型網膜ニューロン（すなわち、ＯＦＦ型神経節細胞および／またはＯＦＦ型双極細胞）における標的化発現のために、ＮＫ−３プロモーターによって駆動する。
【００８３】
網膜においてＯＮおよびＯＦＦ経路を回復するための代替のアプローチを、ＣｈＲ２のような脱分極する光センサーを、桿体双極細胞またはＡＩＩアマクリンに発現することによって達成する。このアプローチにおいて、桿体双極細胞またはＡＩＩアマクリン細胞の脱分極は、錐体双極細胞および下流の網膜神経節細胞のレベルにおけるＯＮおよびＯＦＦ応答を引き起こし得る。従って、網膜において固有のＯＮおよびＯＦＦ経路が維持される。
【００８４】
本発明を、被験体または患者に投与するために適当な、薬学的組成物または医薬に処方し得る。適当な投与経路は、例えば硝子体内注射、眼内注射、または網膜下注射を含む。
【００８５】
そのような処方物は、生理学的ｐＨを維持するための、緩衝化食塩水または他の緩衝液、例えばＨＥＰＥＳのような、薬学的および／または生理学的に受容可能なビヒクル、希釈剤、キャリア、または賦形剤を含む。そのような成分およびその処方物の議論のために、一般的に、Ｇｅｎｎａｒｏ，ＡＥ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；２００３または最新版を参照のこと。ＷＯ００／１５８２２も参照のこと。もしその調製物を長期間保存するなら、例えばグリセロールの存在下で、それを凍結し得る。
【００８６】
上記で記載した薬学的組成物を、標的化される網膜層に依存して、あらゆる適当な経路によって、好ましくは硝子体内注射または網膜下注射によって、視覚疾患または失明疾患（ｂｌｉｎｄｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）を有する被験体に投与する。
【００８７】
Ｂｅｎｎｅｔｔおよび同僚らの開示（本明細書中で引用される）は、網膜色素上皮−硝子体空間から最も遠位の層の標的化を懸念する。本発明によって、Ｃｈｏｐ２構築物またはポリペプチドを、網膜細胞、すなわち網膜神経節細胞または双極細胞に標的化する。そのような細胞は、本明細書中で開示されるような硝子体内注射に適度に良好に接近可能であることが公知である。硝子体内および／または網膜下注射は、特に変性のために光受容細胞層が存在しない状況においては、双極細胞に対して必要な接近を提供し得、それは本発明が克服することを意図するある形態の変性において当てはまる。
【００８８】
ＡＡＶ媒介性の送達によって、特に哺乳動物網膜ニューロンにおいて、本発明のＣｈｏｐ２変異体を発現するベクターの能力を試験するために、ＳＶ４０ポリＡ配列に結合した、ＬａｃＺまたはＧＦＰのようなリポーター遺伝子に結合した好ましいプロモーター配列の組み合わせを、プラスミドに挿入し、そしてｒＡＡＶウイルス粒子にパッケージングし、濃縮し、混入アデノウイルスに関して試験し、そして感染中心アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｅｎｔｅｒ  ａｓｓａｙ）を用いてｒＡＡＶに関して力価測定（ｔｉｔｅｒ）し得る。多くの試験被験体、好ましくは近交系マウスの右目に、約１μｌのｒＡＡＶ調製物（例えば約１０１０感染単位（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｕｎｉｔ）ｍｌより多い）を網膜下注射し得る。２週間後、半分の動物の右眼（試験）および左眼（コントロール）を除去し、固定し、そして適当な基質または抗体または他の物質で染色して、リポーター遺伝子の存在を明らかにし得る。注射した眼の試験網膜の大部分は、局在化した網膜の剥離を生じる、注射したウイルスの網膜下のブレブと一致して、限局性の染色領域、例えばＬａｃＺ／Ｘｇａｌについては青、またはＧＦＰについては緑を示す。全てのコントロール眼は、リポーター遺伝子産物に関して陰性であり得る。より後の時期に屠殺したマウスにおいて調査したリポーター遺伝子発現を、注射の少なくとも１０週間後に検出し、それはリポーター導入遺伝子の持続する発現を示唆する。
【００８９】
１つの実施態様において、導入遺伝子送達のために、Ｃｈｏｐ２構築物を、アデノウイルスベクターにパッケージングする。選択したプロモーター、好ましくは構成的ＣＭＶプロモーターまたはｍＧｌｕＲ６のような細胞特異的プロモーターの制御下で、Ｃｈｏｐ２ＤＮＡをコードする核酸配列を保持するｒＡＡＶビリオンの有効量は、注射あたり約１５０および約８００μｌの間の容積で、好ましくは約１０１０から約１０１３ｒＡＡＶ感染単位の間の範囲である。ｒＡＡＶ感染単位を、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ＳＫら、１９８８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６２：１９６３によって測定し得る。より好ましくは、その有効量は、約１０１０および約１０１２ｒＡＡＶ感染単位の間であり、そして注射容積は、好ましくは約２５０および約５００μｌの間である。好ましくはこれらの範囲内であるが、あるいはその外側である可能性もある、他の投与量および容積を、年齢、体重、一般的な健康、およびその特定の眼の障害の性質および重症度を含む、処置されている被験体（好ましくはヒト）の身体的状態を考慮して、処置する専門家が選択し得る。
【００９０】
本核酸またはｒＡＡＶ組成物のさらなる用量（「追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）」）を投与することも望ましくあり得る。例えば、眼の標的細胞内の導入遺伝子の発現期間に依存して、第２の処置を、６ヶ月後または毎年投与し得、そして同様に反復し得る。使用する経路および用量の観点から、ＡＡＶに対する中和抗体は産生されないことが予測され、従って反復回の処置を可能にする。
【００９１】
そのようなさらなる用量の必要性を、例えば周知の電気生理学的および他の網膜および視覚機能試験および視覚行動試験を用いて、処置する専門家がモニターし得る。処置する専門家は、当該分野における日常的な技術を適用して、適切な試験を選択し得る。関連する結果パラメーターをさらに改善するために、単回用量または複数回用量のいずれかで、より多い量の組成物を注射することが望ましくあり得る。
【００９２】
眼の障害
本Ｃｈｏｐ２タンパク質、および結果として生じるＣｈＲ２タンパク質が意図され、そして視覚の１つまたはそれより多くのパラメーターを改善するために使用し得る眼の障害は、眼の前方および後方部分の両方に影響する発生異常を含むがこれに限らない。前方部分の障害は、緑内障、白内障、角膜ジストロフィー、円錐角膜を含む。後方部分の障害は、網膜ジストロフィーおよび変性によって引き起こされる、光受容体の機能不全および／または死によって引き起こされる、失明障害を含む。網膜の障害は、先天性停止性夜盲、加齢性黄斑変性、先天性錐体ジストロフィー、および網膜色素変性（ＲＰ）関連障害の大きなグループを含む。これらの障害は、様々な年齢で起こる、網膜の光受容細胞、桿体、および錐体の、遺伝的に素因のある死を含む。年齢とともに進行し、そして小児期および成人期初期に失明を引き起こす、ＲＰ自体のサブタイプのような重度の網膜症、およびしばしば０歳時のように早く、小児期の間に視覚の喪失をもたらす、ＬＣＡの遺伝的サブタイプのようなＲＰ関連疾患が含まれる。後者の障害は一般的に、光受容細胞、桿体および錐体の、重度の減少、および多くの場合完全な喪失によって特徴付けられる（Ｔｒａｂｕｌｓｉ，ＥＩ編、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｙｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９８）。
【００９３】
特に、本発明のＣｈｏｐ２およびＣｈＲ２タンパク質は、機能喪失にも関わらず眼の組織構造の長期保存によって、および機能喪失と被験体の眼の細胞における正常遺伝子の欠損または欠如との間の関連によって特徴付けられる、ＲＰＥ関連網膜症のような、眼の障害に起因して視覚を失った被験体に対して処置および／または少なくとも部分的な視覚の回復に有用である。小児期に発症する失明疾患、網膜色素変性、黄斑変性、および糖尿病性網膜症、および当該分野で公知の眼の失明疾患のような、様々なそのような眼の障害が公知である。これらの他の障害、および現在原因が未知であり、後に上記と同じ説明によって特徴付けられる失明障害も、本発明のＣｈｏｐ２およびＣｈＲ２タンパク質によってうまく処置され得ることが予測される。従って、本発明によって処置される特定の眼の障害は、上記で述べた障害、およびまだ特徴付けられていない多くの疾患を含み得る。
【００９４】
オプトジェネティクス（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）
出現しつつあるオプトジェネティクスの分野は、生きた組織の標的化細胞において、特定のイベントを制御する遺伝的および光学的方法の組み合わせを含む。オプトジェネティクスを、自由に動く哺乳動物および他の動物において使用し得る。さらに、オプトジェネティクス法の時間的精度（ミリ秒のタイムスケール）は、インタクトな生物学的システムにおいて機能するために十分である。
【００９５】
本発明は、網膜細胞に、少なくとも１つのＣｈｏｐ２の変異体形態をコードする核酸またはポリペプチドを導入することによって、眼の網膜組織に対してＣｈｏｐ２遺伝子治療を提供する。本発明の変異体Ｃｈｏｐ２／ＣｈＲ２タンパク質は、その野生型の対応物より低い光強度の閾値で光活性化されるように特異的に適合されている。よって、本発明の変異体Ｃｈｏｐ２／ＣｈＲ２タンパク質を、より損傷の少ない照射源を用いて網膜および視覚系の細胞を活性化するために使用し得る。その変異体Ｃｈｏｐ２／ＣｈＲ２タンパク質はまた、活性化時により大きい光電流を伝導し、変異体Ｃｈｏｐ２／ＣｈＲ２発現細胞からより確固とした、または有効な応答をもたらす。
【００９６】
例えば、本発明のＣｈｏｐ２タンパク質を、変異体Ｃｈｏｐ２をコードする核酸分子、変異体Ｃｈｏｐ２ポリペプチド分子、または変異体Ｃｈｏｐ２／ＣｈＲ２を発現する細胞の局所、硝子体内、または網膜下注射を介して、被験体に投与する。被験体の網膜細胞は、細胞膜内に変異体Ｃｈｏｐ２タンパク質を発現する。トランスフェクトした、または形質転換した網膜細胞が、光放射と遭遇した場合、そのトランスフェクトした、または形質転換した網膜細胞は、改善または回復したシグナルを伝達する。
【００９７】
これらの方法を、正常な視覚および／または視覚障害を有する被験体において使用し得る。本発明のＣｈｏｐ２／ＣｈＲ２変異体は、視覚を維持、改善、または回復し得る。さらに、本発明のＣｈｏｐ２／ＣｈＲ２変異体を、光感受性網膜神経節細胞から脳への、非視覚情報の伝達を維持、改善、または回復するために使用する。
【００９８】
本明細書中で使用される「視覚」という用語は、識別または行動のために刺激として光を有用に検出する生物の能力として定義される。視覚は、以下のものを含むことが意図される：
１．光の検出または知覚−光が存在するかどうかを見分ける能力；
２．光投影能−光刺激が来る方向を見分ける能力；
３．分解能−格子または文字標的において、異なる明るさレベル（すなわちコントラスト）を検出する能力；
４．認識−標的内の異なるコントラストレベルを参照することによって、視覚標的の形状を認識する能力。
【００９９】
従って、「視覚」は、単に光の存在を検出する能力を含む。本発明の変異体Ｃｈｏｐ２をコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用して、視覚を改善または回復し得、ここでその視覚の改善または回復は、例えば、光の検出または知覚の増大、光刺激に応答した光感受性または羞明の増大、光刺激が来る方向を見分ける能力の増大、異なる明るさレベルを検出する能力の増大、視覚的標的の形状を認識する能力の増大、および視覚誘発電位または網膜から皮質への伝達の増大を含む。従って、視覚の改善または回復は、視力の完全な回復、すなわち、本発明で処置された患者の視覚が、罹患していない個体の視覚の程度まで回復されることを含み得る、または含まないかもしれない。下記で記載する動物実験において記載される視覚の回復は、ヒトの関係において、完全な視力を回復することなく、視覚の１つの局面（すなわち、光感受性、または視覚誘発電位）を増大させることによって、そのヒトを視覚機能の下端に置き得る。それにも関わらず、そのようなレベルにすることは、有意に有益である。なぜなら、これらの個体は、運動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）において、および潜在的に低分解能のタスクにおいて訓練し得、それは完全な盲目と比較して、非常に改善したレベルの視覚的な独立を彼らに提供するからである。基本的な光の知覚さえ、視覚に障害のある個体によって使用され得、その視覚は本組成物および方法を用いて改善されて、特定の毎日のタスクを達成し、そして一般的な運動性、能力、および生活の質を改善する。
【０１００】
視覚の回復の程度を、例えばＣｈｏｐ２をコードするＤＮＡを含むベクターを投与する前、および好ましくはその後に視覚を測定することによって決定し得る。当該分野において周知の多くの方法、またはまだ確立されていない方法のいずれかを用いて、視覚を測定し得る。本発明によって改善または回復した視覚を、以下の視覚応答のいずれかによって測定し得る：
１．光刺激に曝露した後の被験体による光検出応答、ここで明かりを点灯した場合に、その対象の個体による、光のおおよその方向の指示または動作の信頼性の高い応答に関して証拠を探す；
２．光刺激への曝露後の被験体による光投影応答、ここで明かりを点灯した場合に、その個体による、光の特定の方向の指示または動作の信頼性の高い応答に関して証拠を探す；３．光対暗パターン化視覚刺激の被験体による光分解能、それは以下のものによって証明される、光対暗パターン化視覚刺激を解像する被験体の能力を測定する：
ａ．明白な、信頼性の高い、視動性に生じた眼振様の眼の動き、および／もしくは標的（上記を参照のこと）の追跡を示す関連する頭部または体の運動の存在、ならびに／または
ｂ．パターン化視覚刺激を識別する、およびそのような識別を、言語、もしくは例えば指差し、またはバーまたはボタンを押すことを含む非言語的手段によって示す、信頼性の高い能力の存在；あるいは
４．閃光刺激またはパターン視覚刺激に対する視覚皮質応答の電気的記録、それは回復した網膜から視覚皮質への電気的伝達のエンドポイントであり、視覚誘発電位（ＶＥＰ）とも呼ばれる。測定は、皮質表面における、視覚皮質領域の頭皮表面における電気的記録、および／または視覚皮質の細胞内の記録により得る。
【０１０１】
従って、本発明による視覚の改善または回復は、網膜細胞の光刺激に応答した、光電流の振幅または動態、または電気的応答の増大、網膜細胞の光感受性の増大（すなわち、光刺激に応答した光電流または電気的応答の開始に必要な光強度閾値の低下、それによる光電流を誘発するために必要な光の減少または低下）、光誘発性スパイクまたはスパイク発火の数または振幅の増大、網膜または網膜細胞から、視覚皮質または脳に伝達される視覚誘発電位の増大を含む、視覚皮質に対する光応答の増大を含み得るがこれに限らない。
【０１０２】
本発明の様々なパラメーターを評価するために、ヒトの眼の失明障害の、認識された動物モデルを含む、インビトロおよびインビボ研究の両方を使用し得る。ヒト網膜症、例えば小児期の失明の大型動物モデルは有用である。本明細書中で提供される実施例は、当業者が、この方法を一連の網膜疾患を処置するために同様に使用し得ることを、容易に予測することを可能にする。
【０１０３】
他の人々による初期の研究は、網膜の変性を遺伝子治療技術によって遅らせ得ることを示したが、本発明は、機能の明確な生理学的回復を示し、それは行動パラメーターを含む、視覚の様々なパラメーターを産生または改善することが期待される。
【０１０４】
公知の動物モデルおよび試験、例えば、視覚が維持されている、または様々な程度に回復した被験体が、光に向かって泳ぐ水迷路における成績を用いて、行動の測定値を得ることができる（Ｈａｙｅｓ，ＪＭら、１９９３、Ｂｅｈａｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２３：３９５〜４０３）。
【０１０５】
成体の間に盲目が誘導されるか、または個体が視覚を失う前にその個体が視覚を経験するのに十分ゆっくりと先天性の盲目が進行するモデルにおいて、様々な試験でその被験体の訓練を行い得る。この方法において、その視覚回復効果に関して本組成物および方法の有効性を試験するために、これらの試験を視覚喪失後に再び施す場合、動物は盲目状態で新規にタスクを学習する必要がない。他の行動試験は、学習を必要とせず、そしてある行動の本能的であること（ｉｎｓｔｉｎｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）に依存する。例は、視動性眼振試験である（Ｂａｌｋｅｍａ  ＧＷら、１９８４、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２５：７９５−８００；Ｍｉｔｃｈｉｎｅｒ  ＪＣら、１９７６、Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．１６：１１６９−７１）。
【０１０６】
本発明をまた、視覚を改善または回復することが当該分野で公知である他の形態の視覚治療と組み合わせて使用し得る。例えば、網膜インプラント、角膜インプラント、外側膝状体核インプラント、または視神経インプラントを含む、視覚プロテーゼ（ｖｉｓｕａｌ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）の使用。従って、本方法を用いた生存網膜ニューロンの遺伝的修飾に加えて、処置されている被験体に、分子的方法を採用する前に、それと同時に、またはその後に視覚プロテーゼ（ｖｉｓｕａｌ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）を提供し得る。視覚プロテーゼ（ｖｉｓｕａｌ  ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃｓ）の有効性を、その個体の訓練によって改善し、従って本明細書中で企図される、患者細胞のＣｈｏｐ２形質転換の潜在的な影響を増強し得る。（ｉ）様々なレベルの光および／またはパターン刺激、および／または（ｉｉ）当業者によって理解されるような、一般的な光源または物体からの環境刺激を認識するように被験体を訓練することによって特徴付けられる習慣訓練；および局所的な物体を視覚的に検出し、そして訓練無しよりも効率的に当該物体の間を移動するように被験体を訓練することによって特徴付けられる、見当識および運動性訓練のような訓練法。実際、低視覚のリハビリテーションの分野で典型的に使用される、あらゆる視覚刺激技術を、ここに適用可能である。
【実施例】
【０１０７】
実施例１：標識変異体Ｃｈｏｐ２構築物の生成
コドン最適化Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ融合タンパク質に対して変異を作製し、Ｌ１３２（ロイシン１３２）およびＴ１５９（トレオニン１５９）部位において単一および二重変異を産生した。いくつかの変異体、例えば、Ｌ１３２Ａ、Ｌ１３２Ｃ、Ｔ１５９Ａ、Ｔ１５９Ｃ、およびＴ１５９Ｓのような単一変異体、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓ、Ｌ１３２Ａ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ａのような二重変異体を産生した。Ｃｈｏｐ２‐ＧＦＰ導入遺伝子を、当該分野で公知の方法を用いて、ＣＡＧプロモーターの制御下でｒＡＡＶベクターにクローニングした。
【０１０８】
実施例２：変異体Ｃｈｏｐ２構築物のインビトロ分析
各変異体Ｃｈｏｐ２、またはその組み合わせの機能的特性を、最初にＨＥＫ細胞において調査した。Ｃｈｏｐ２構築物を、例えばアデノウイルスの感染によって、ＨＥＫ細胞に送達した。ＷＴまたは変異体Ｃｈｏｐ２の発現時に、機能的ＷＴおよび変異体ＣｈＲ２チャネルが形成された。ＣｈＲ２チャネルの光感受性および他の特性の測定値を、本明細書中で記載したように評価した。光刺激（４６０ｎｍにおいて光子／ｃｍ２．ｓ）を、キセノンアークランプによって産生し、そして濃度フィルターによって減弱した：ＮＤ４．０（２．８×１０１４）、ＮＤ３．０（１．４×１０１５）、ＮＤ２．５（４．８×１０１５）；ＮＤ２．０（１．６×１０１６）、ＮＤ１．０（１．３×１０１７）、ＮＤ０（１．２×１０１８）。光誘発電流を、野生型ＣｈＲ２、Ｔ１５９Ｃ、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓから測定した。当該分野で公知の方法を用いて、パッチクランプ記録を行った。
【０１０９】
Ｃｈｏｐ２構築物の間で光感受性を比較したこの実験からの代表的な記録は、Ｌ１３２における変異は単独で、またはＴ１５９における変異と組み合わせて、ＷＴと比較して光電流の増大を示すことを実証した（図１Ａおよび１Ｂ）。図１Ｂは、ＷＴ  ＣｈＲ２およびＣｈＲ２変異体の間の、光電流の振幅の差異をより明らかに示すために、同じ電流トレースを異なるスケールで示す。図１Ｂは、４．８×１０１５光子／ｃｍ２／ｓと同等の、濃度フィルター（ＮＤ２．５）を用いた光刺激から生じる電流トレースを具体的に比較する；そのトレースを矢印によって示す。Ｌ１３２Ｃ変異体の光電流の振幅は、ＷＴのものより大きい；二重変異体Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃの光電流の振幅は、Ｌ１３２Ｃのものより大きい；およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓ変異体の光電流の振幅は、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃのものより大きい。ＣｈＲ２変異体、特に二重変異体Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９ＣおよびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓの電流トレースはまた、ＷＴおよびＬ１３２Ｃと比較した場合に、より遅い非活性化動態を示す。
【０１１０】
図２は、消灯後の非活性化時間の過程、または減衰時間の過程を比較するために、１０ｍｓの光パルス（４６０ｎｍの波長で１．２×１０１８光子／ｃｍ２／ｓ）による刺激後の、ＷＴ  ＣｈＲ２、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓからの光誘発電流の代表的な記録を示す。変異体ＣｈＲ２は、より長い非活性化時間の過程を示し、二重変異体Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓが最も長かった。Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９ＣおよびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓによって示されるような、より高い光感受性は、より遅いチャネル動態と関連し得る。
【０１１１】
実施例３：変異体Ｃｈｏｐ２構築物のインビボにおける眼への投与および分析
ＣＡＧプロモーターによって駆動される変異体Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ構築物を保持するＡＡＶ２ウイルスベクターを作製し、そしてＣ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウスの眼に硝子体内注射した。成体マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射によって麻酔した。解剖顕微鏡下で、眼瞼をハサミで切開し、強膜を露出した。針で水晶体の後方の強膜領域に小さい穿孔をあけ、そして約１０１１ゲノム粒子／ｍｌの濃度の０．８〜１．５μｌのウイルスベクター懸濁液を、３２ゲージの平滑末端針を有するハミルトンシリンジで、その孔から硝子体内スペースに注射した。各動物に関して、通常一方の眼のみに、Ｃｈｏｐ２構築物を有するウイルスベクターを注射し、そして他方の眼には注射しないか、またはＧＦＰのみを有するコントロールウイルスベクターを注射した。ＷＴまたは本発明の変異体Ｃｈｏｐ２の発現時に、内因性レチナールを用いて機能的ＷＴまたは変異体ＣｈＲ２チャネルが形成され、そしてこれらのＣｈＲ２タンパク質の特性を、本明細書中で記載したように評価した。
【０１１２】
ＣｈＲ２に媒介される光応答を、全組織標本網膜由来の多電極アレイ記録によって調査した。光刺激（光子／ｃｍ２／ｓ）を、４７３ｎｍの青色レーザーで産生し、そして濃度フィルターによって減弱した：ＮＤ０（６．３×１０１６）、ＮＤ１．０（７．４×１０１５）、ＮＤ１．５（２．７×１０１５）、ＮＤ２．０（７．３×１０１４）、ＮＤ２．５（３．２×１０１４）、ＮＤ３．０（８．５×１０１３）、ＮＤ３．５（３．８×１０１３）、およびＮＤ４．０（９．５×１０１２）。
【０１１３】
多電極アレイ記録は、ＴｉａｎおよびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（２００３）によって報告された手順に基づいていた。簡単には、網膜を切開し、そして光受容体側を下にしてニトロセルロースフィルターペーパー片（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に置いた。標本にした（ｍｏｕｎｔｅｄ）網膜を、神経節細胞層を記録電極に面して、２００μｍ離しておいた直径３０μｍの電極の、ＭＥＡ−６０多電極アレイ記録チャンバーに置いた（Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＣＳ  ＧｍｂＨ、Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。その網膜を、全ての実験の間、３４℃の酸素添加細胞外溶液で持続的に灌流した。その細胞外溶液は、以下のものを含んでいた（ｍＭ）：ＮａＣｌ、１２４；ＫＣｌ、２．５；ＣａＣｌ２、２；ＭｇＣｌ２、２；ＮａＨ２ＰＯ４、１．２５；ＮａＨＣＯ３、２６；およびグルコース、２２（ｐＨ７．３５、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２）。通常、網膜を記録チャンバーに置いてから６０分後に記録を開始した。各光刺激の開始の間の間隔は、１０〜１５ｓであった。シグナルを、２００Ｈｚ（低カットオフ）および２０ｋＨｚ（高カットオフ）の間でフィルタリングした。個々のニューロンからの応答を、Ｏｆｆｌｉｎｅ  Ｓｏｒｔｅｒソフトウェア（Ｐｌｅｘｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）を用いて分析した。
【０１１４】
単一変異体Ｃｈｏｐ２／ＣｈＲ２変異体、すなわちＬ１３２およびＴ１５９Ｃは、ＣｈＲ２に媒介される光電流を誘発するために必要な光強度閾値を著しく低下させる。さらに、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、Ｌ１３２Ａ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓを含む、いくつかの二重変異体は、低い光強度で、光電流をさらに増大させることが見出された。異なる濃度フィルターを使用して、光刺激を減弱して、低い光におけるＣｈｏｐ２構築物の光誘発応答を区別した。本発明の変異体によって媒介される、網膜神経節細胞のスパイク活性を、野生型ＣｈＲ２でスパイク活性を誘発するために必要な光レベルより、約１．５から２  ｌｏｇ単位低い光強度で観察した（図３）。具体的には、ＷＴ  ＣｈＲ２は、濃度フィルター２．５による光刺激（３．２×１０１４光子／ｃｍ２／ｓ）に応答していかなるスパイク活性も示さない一方、ＣｈＲ２変異体（Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｃ、およびＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓ）は、スパイク活性を示した。実際、ＣｈＲ２変異体は、濃度フィルター３．０および３．５による光に応答して、依然としてスパイク活性を示した。従って、本発明のＣｈＲ２変異体は、より高い光感受性を有し、そして従って、ＣｈＲ２に媒介される光電流を誘発するために必要な光強度閾値が著しく低い。さらに、ＣｈＲ２二重変異体は、単一変異体、すなわちＬ１３２Ｃよりも高い光感受性を有する。それに加えて、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９ＣおよびＬ１３２／Ｔ１５９Ｓを発現する網膜神経節細胞のスパイク発火は、それぞれ１５Ｈｚおよび５Ｈｚまでの光明滅頻度に追従し得る（図４）。
【０１１５】
Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ａ変異体は、高い光感受性を示し、おそらくこれらの変異体のうちで最も高い光感受性を示すが、それはまた極めて遅いオフ速度を示す（チャネルは、消灯後、長い秒数にわたって開口し続ける）。興味深いことに、黄色光のような長い波長の光を用いて、それをより迅速にオフにすることができる。Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ａ変異体（配列番号２４および２５番によってコードされる）は、有意な可能性を示す。
【０１１６】
光感受性およびチャネル動態の間の二律背反を考慮して、Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９ＣまたはＬ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓのような、光感受性およびチャネル動態の間のバランスを示すＣｈｏｐ２／ＣｈＲ２変異体が、視覚回復の適用のために適当であり得る。
【０１１７】
実施例４：疾患のマウスモデルにおける、変異体Ｃｈｏｐ２構築物の分析
変性眼科疾患のマウスモデルが、当該分野で公知である。例えば、ホモ接合ｒｄ１（ｒｄ１／ｒｄ１）マウスは、一般的に使用される光受容体変性モデルである。Ｒｄ１マウスは、サイクリックＧＭＰホスホジエステラーゼ、ＰＤＥ６にヌル変異を有し、ヒトにおける一部の形態の網膜色素変性に類似する。ＣｈＲ２変異体の安全性および有効性を示すために特に関心のあり得る、他のよく確立された眼科疾患のマウスモデルは、ｒｄｓ（ＰｒｐｈＲｄ２としても公知である）、ｒｄ３、ｒｄ４、ｒｄ５、ｒｄ６、ｒｄ７、ｒｄ８、ｒｄ９、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０、またはｃｐｆｌ１マウスを含む。
【０１１８】
本発明のＣｈｏｐ２−ＧＦＰ構築物を、新生仔（Ｐ１）または２〜１２ヶ月齢の成体マウスの眼に硝子体内注射し得る。ＧＦＰシグナルを、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰを注射した網膜において観察し得、ＣｈＲ２発現のレベル、または網膜神経節細胞のような、特定の細胞集団における発現を決定し得る。変異体Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰの発現を、ウイルス注射後、所定の時間量、すなわち３〜６ヶ月、または１年間、モニターし得る。当該分野で公知の、および本明細書中で記載された方法を用いて、パッチクランプおよび多チャンネルアレイ記録を行って、インビボで変異体Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰを発現する細胞の光誘発応答を測定し得る。
【０１１９】
光感受性または視覚の回復に関して試験するために、さらなる技術および試験が、当該分野でよく確立されている。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ発現細胞または視覚皮質からの視覚誘発電位を、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３１１８０において記載されたように調査し得る。他の試験は、マウスにおける視力の行動評価、すなわち擬似視覚運動試験（ｖｅｒｔｕａｌ  ｏｐｔｏｍｏｔｏｒ  ｔｅｓｔ）および視覚水迷路を含む。
【０１２０】
実施例５：変異体Ｃｈｏｐ２構築物の網膜ニューロンへの投与の、長期発現および安全性の分析
本発明のＣｈｏｐ２構築物を注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウスにおいて、神経毒性を評価した。網膜におけるＣｈｏｐ２変異体発現の安全性を、強力な青色光に２週間曝露した後に、免疫染色および細胞計数によって評価した。どのマウスも、注射後２ヶ月までの間、神経毒性の症状を示さなかったことが見出された。
【０１２１】
さらなる進行中の試験は、網膜ニューロンにおける、本発明のＣｈｏｐ２／ＣｈＲ２変異体の長期発現および安全性を評価している。
【０１２２】
他の実施態様
本発明を、その詳細な説明とあわせて記載したが、前述の説明は、例証することを意図し、そして添付の特許請求の範囲によって規定される、本発明の範囲を制限しない。他の局面、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲内である。
【０１２３】
本明細書中で参照される特許および科学論文は、当業者が入手可能な知識を確立する。本明細書中で引用される、全ての米国特許および公開または非公開米国特許出願は、参考文献に組み込まれる。本明細書中で引用される、全ての公開された外国特許および特許出願は、本明細書中で参考文献に組み込まれる。本明細書中で引用された、全ての他の出版された参考文献、文書、原稿、および科学論文は、本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【０１２４】
本発明を、具体的に示し、そしてその好ましい実施態様に関して記載したが、添付の請求によって含まれる本発明の範囲から離れることなく、そこで形態および詳細における様々な変更をし得ることが、当業者によって理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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