(57)【要約】【課題】  天然のクモの牽引糸のクモ体内での産生機構及び高い靭性をもたらす原因を明らかにし、この機構を人工繊維の製造に応用することにより、高い靱性を有するクモ糸様ポリペプチド繊維を製造する方法、及び、該製造方法で製造されるポリペプチド繊維を提供する。【解決手段】  クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、(i)  クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを溶解したドープ液を調整するステップ、(ii)  高いアスペクト比を有する顆粒状構造体を有する小繊維を前記ドープ液中で形成させるステップ、(iii)  前記小繊維より、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してタンデム状に配向させてナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるステップ、及び  (iv)  前記マイクロ繊維を単離することにより前記ポリペプチド繊維を得るステップを含む製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
(i)  クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを溶解したドープ液を調整するステップ、
(ii)  高いアスペクト比を有する顆粒状構造体を有する小繊維を前記ドープ液中で形成させるステップ、
(iii)  前記小繊維より、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してタンデム状に配向させてナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるステップ、及び  
(iv)  前記マイクロ繊維を単離することにより前記ポリペプチド繊維を得るステップ
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項２】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記ステップ(ii)は、ドープ液の組成、pH及び／又はイオン強度を変化させる工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記ステップ(ii)において、
溶媒の組成の変化は、溶媒を水、極性有機溶媒若しくはそれらの混合溶媒とすること、及び／又は凝固剤を添加すること、
溶媒のpHの変化は、pH6〜10又はpH6〜8に調整すること、
イオン強度の変化は、高いイオン強度となるように調整すること、
を含むことを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
ポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記高いイオン強度は、300mMのNaCl水溶液に相当するイオン強度以上のイオン強度であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記ステップ(iii)において、溶媒の組成、pH、塩の種類及び／又は塩濃度塩濃度を変化させる工程、及び
剪断応力(shear stress)を繊維軸方向に負荷し、
前記ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させる工程を含むことを特徴とする、請求項１〜４に記載の製造方法。
【請求項６】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記ステップ(iii)において、
溶媒の組成の変化は、凝固剤をさらに添加すること、
pHの変化はpH3〜pH6に調整すること、
イオン強度の変化は、イオン強度低下させること、
を含むことを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記イオン強度の変化は、カオトロピック(chaotropic）剤及び／又はコスモティック(kosmotic)剤により調整されることを特徴とする、請求項２〜６に記載の製造方法。
【請求項８】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記ポリペプチド繊維は、アミノ酸配列中にグリシン残基及びアラニン残基の合計が40％以上、50％以上、60％以上、70％以上又は80％以上含まれることを特徴とする、請求項１〜７に記載の製造方法。
【請求項９】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記ポリペプチド繊維は、組み換えポリペプチドであることを特徴とする、請求項１〜８に記載の製造方法。
【請求項１０】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記ステップ(ii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体は、高さが110nm未満及び幅が30〜1900nmであり、
前記ステップ(iii)における高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体は、高さが9nm未満及び幅が50〜200nmである
ことを特徴とする、請求項１〜９に記載の製造方法。
【請求項１１】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
前記ポリペプチド繊維は、βシート構造を15〜30％含むことを特徴とする、請求項１〜１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
クモ糸由来のポリペプチド繊維であって、
高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してタンデム状に配向させてナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維であることを特徴とする、ポリペプチド繊維。
【請求項１３】
クモ糸由来のポリペプチド繊維であって、
前記ナノ顆粒状構造体は、高さが7nm未満及び幅が50〜200nmであることを特徴とする、請求項１２に記載の、ポリペプチド繊維。
【請求項１４】
クモ糸由来のポリペプチド繊維であって、
前記ポリペプチド繊維は、アミノ酸配列中にグリシン残基及びアラニン残基の合計が40％以上、50％以上、60％以上、70％以上又は80％以上含まれることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のポリペプチド繊維。
【請求項１５】
クモ糸由来のポリペプチド繊維であって、
前記ポリペプチド繊維は、βシート構造を15〜30％含むことを特徴とする、請求項１２〜１４に記載のポリペプチド繊維。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クモ糸様構造を有するポリペプチド繊維の製造方法、及びその製造方法で製造されるポリペプチド繊維に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然のクモの糸は、引っ張り強度(tensile strength)、靱性（toughness)及び伸展性(extensibility)等の物理的な変化に対する特性に優れ、例えば、靱性は同一重量の鉄と比較して約５倍を有するポリペプチド繊維である。また、耐熱性にも優れ、さらに、ポリペプチドで形成されているところから、高い生体適合性(biocompatibility)及び生分解性(biodegradability)を有する。しかし、天然糸を産業上利用するカイコと相違し、クモは大量飼育が困難であるところから、クモの糸を模倣した人工合成繊維を製造し、前記物理的な変化に対する特性、並びに、生体適合性及び生分解性を有する糸、敷布等の素材や材料への応用が試みられている（特許文献１〜５）。しかし、上記の特性について天然のクモ糸に匹敵する人工繊維の製造は、成功していない。
【０００３】
天然のクモ糸は、その構造中にβシート構造を形成するポリアラニンとグリシンを多く含む極性領域とが繰り返されてコア部分となり、その両側に高度に保存された非反復型のアミノ末端とカルボキシル末端ドメインが配置されることにより、ランダムコイル状構造、βシート構造及びへリックス構造を有し、これらの構造の混在が天然のクモ糸の優れた特性の理由と考えられ、その構造的特性が検討されている（非特許文献１〜３）。また、クモの体内で紡糸される際、通常のタンパク質の場合と相違し、クモタンパク質は高濃度で貯蔵されている際には高い可溶性を示すが、必要に応じて極めて丈夫な繊維へと変化する（非特許文献２）。しかし、構造的特性やクモ糸の産生機構が必ずしも明らかにされていない。
【０００４】
天然のクモ糸は、その役割によって７種類に分類されるが、この中で、大瓶状腺で形成される牽引糸がもっとも上記の物理的特性が高いことが報告されている（非特許文献３）。しかし、クモ糸の上記の物理的な変化に対する高い特性の理由も明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報WO2007/078239
【特許文献２】国際公開公報WO2010/123450
【特許文献３】国際公開公報WO2011/112046
【特許文献４】国際公開公報WO2012/165476
【特許文献５】国際公開公報WO2013/065650
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Numata Kら、Soft Matter 2015年6月30日
【非特許文献２】Hagn Fら、Nature. 2010; 465(7295): 239-42
【非特許文献３】Teule Fら、Nature Protocols 2009; 4: 341-355
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
天然のクモの牽引糸のクモ体内での産生機構及び高い特性をもたらす原因を明らかにし、この機構を人工繊維の製造に応用することにより、高い強度、伸展性、靱性及び耐熱性等の特性を有するクモ糸様ポリペプチド繊維を製造する方法、及び、該製造方法で製造されるポリペプチド繊維を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
具体的には、本発明は、クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
(i)  クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを溶解したドープ液を調整するステップ、
(ii)  高いアスペクト比を有する顆粒状構造体を有する小繊維を前記ドープ液中で形成させるステップ、
(iii)  前記小繊維より、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してタンデム状に配向させてナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるステップ、及び  
(iv)  前記マイクロ繊維を単離することにより前記ポリペプチド繊維を得るステップ
を含む製造方法を提供する。
【０００９】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(ii)において、溶媒の組成、pH及び／又はイオン強度を変化させる工程を含む場合がある。
【００１０】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(ii)において、
溶媒の組成の変化は、ドープ液を水、極性有機溶媒若しくはそれらの混合溶媒とすること、及び／又は凝固剤を添加すること、
溶媒のpHの変化は、pH6〜10又はpH6〜8に調整すること、
イオン強度の変化は、高いイオン強度となるように調整すること、
を含む場合がある。
【００１１】
クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(ii)において、
前記高いイオン強度は、300mMのNaCl水溶液に相当するイオン強度以上のイオン強度である場合がある。
【００１２】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(iii)において、溶媒の組成、pH、塩の種類及び／又は塩濃度塩濃度を変化させる工程、及び
剪断応力(shear stress)を繊維軸方向に負荷し、
前記ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させる工程を含む場合がある。
【００１３】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(iii)において、
溶媒の組成の変化は、凝固剤をさらに添加すること、
pHの変化はpH3〜pH6に調整すること、
イオン強度の変化は、イオン強度を低下させること、
を含む場合がある。
【００１４】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法において、
前記イオン強度の変化は、カオトロピック(chaotropic）剤及び／又はコスモティック(kosmotic)剤により調整される場合がある。
【００１５】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法において、
前記ポリペプチド繊維は、アミノ酸配列中にグリシン残基及びアラニン残基の合計が40％以上、50％以上、60％以上、70％以上又は80％以上含まれる場合がある。
【００１６】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法において、
前記ポリペプチド繊維は、組み換えポリペプチドである場合がある。
【００１７】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法において、
前記ステップ(ii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体は、高さが110nm未満及び幅が30〜1900nmであり、
前記ステップ(iii)における高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体は、高さが9nm未満及び幅が50〜200nmである場合がある。
【００１８】
また、本発明は前記製造方法で製造される、ポリペプチド繊維を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、クモ糸由来のポリペプチド繊維であって、
高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してタンデム状に配向させてナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維であるポリペプチド繊維を提供する。
【００２０】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維において、
前記ナノ顆粒状構造体は、高さが7nm未満及び幅が50〜200nmである場合がある。
【００２１】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維において、
前記ポリペプチド繊維は、アミノ酸配列中にグリシン残基及びアラニン残基の合計が40％以上、50％以上、60％以上、70％以上又は80％以上含まれる場合がある。
【００２２】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維において、
前記ポリペプチド繊維は、βシート構造を15〜30％含む場合がある。
【発明の効果】
【００２３】
高い靱性、伸展性、強度及び耐熱性等を有するクモ糸様ポリペプチド繊維を製造する方法、及び、該製造方法で製造されるポリペプチド繊維を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】N.clavata（ジョロウグモ）の大瓶状腺の模式図を表す。
【図２】貯蔵嚢シルク（上段）及びテーパリング管シルク（下段）の走査型電子顕微鏡写真の図を表す。
【図３】貯蔵嚢シルク（上段）及びテーパリング管シルク（下段）の原子間力微鏡写真の図を表す。
【図４】原子間力微鏡写真で計測した貯蔵嚢シルクの顆粒状構造体及びテーパリング管シルク顆粒状構造体の幅の分布図を表す。上段右図は0〜1900nmの範囲、下段図は0〜200nmの範囲での分布を表す。
【図５】原子間力微鏡写真で計測した貯蔵嚢シルクの顆粒状構造体及びテーパリング管シルクの顆粒状構造体の高さ、並びに繊維の幅及び高さの分布図を表す。上段中央図は貯蔵嚢シルクの顆粒状構造体及びテーパリングシルクの顆粒状構造体の0〜110nmの範囲の分布図、上段右図は貯蔵嚢シルクの顆粒状構造体及びテーパリングシルクの顆粒状構造体の0〜11nmの範囲の分布図、下段左図は繊維の0〜200nmの範囲での幅の分布図、下段右図は繊維の0〜11nmの範囲での高さ分布図を表す。
【図６】シンクロトロンでの広角Ｘ線散乱(WAXS、左図）及び小角Ｘ線散乱（SAXS、右図）の測定スペクトルを表す。
【図７】貯蔵嚢（上段）及びテーパリング管（下段）における複屈折像の図を表す。
【図８】N.clavata牽引糸の試料の調製及び解析方法の概略図を表す。
【図９】N.clavataのシルク繊維の内部構造の原子間力顕微鏡での観察像の図(180°) を表す。
【図１０】N. clavata シルク繊維の横断面の原子間力顕微鏡での観察像の図（拡大図）を表す。
【図１１Ａ】張力負荷による延伸で変化したナノ小繊維のトポロジーを検討した原子間力顕微鏡像の図を表す。
【図１１Ｂ】張力負荷による延伸に伴うナノ小繊維の直径を計測した結果を表す。
【図１２Ａ】外力により牽引糸を延伸した場合の一時的な複屈折の変化を表す。
【図１２Ｂ】外力により牽引糸を延伸後、弛緩し、その後再度延伸した場合の複屈折の変化を表す。
【図１２Ｃ】図１２Ｂの複屈折の値の変化を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の態様の一つは、クモ糸由来のポリペプチド繊維の製造方法である。該クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する方法は、
(i)  クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを溶解したドープ液を調整するステップ、
(ii)  高いアスペクト比を有する顆粒状構造体を有する小繊維を前記ドープ液中で形成させるステップ、
(iii)  前記小繊維より、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してタンデム状に配向させてナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるステップ、及び
(iv)  前記マイクロ繊維を単離することにより前記ポリペプチド繊維を得るステップ
を含む。
【００２６】
本明細書で記載される「クモの糸」又は「クモ糸」は、一般に、クモ絹糸ともいわれ、クモの体内の絹糸腺で産生され、腹部後部にある出糸突起（糸疣）の出糸管より吐糸される。クモの体内の絹糸腺はその形から梨状腺、ブドウ状腺、瓶状腺、管状腺、集合腺及び鞭状腺に分けられる。「クモ絹糸」は、一般に、その機能及び成分から、牽引糸（別名：しおり糸、ひき糸）、わく糸、縦糸、横糸及びけい留糸などに分けられるが、本明細書においては、代表的には大瓶状腺で形成される「牽引糸」をいう。
【００２７】
クモの体内の絹糸腺におけるクモ絹糸の産生機構においては、分泌腺でクモ絹糸を形成するタンパク質が溶解されたドープ液が産生され、分泌され、その後、貯蔵嚢でドープ液が貯蔵され、必要に応じて、テーパリング管を通過して、出糸管で紡糸されてクモ絹糸が形成される（図１参照）。しかし、詳細な産生機構は解明されていない。
【００２８】
本明細書において、「ドープ液」とは、ポリペプチド繊維を製造するための原料であるポリペプチドを溶解した溶液をいう。
【００２９】
本明細書において、「シルク」とは、アラニンが多く存在し、βシート構造を誘起する繰り返し配列が存在するポリペプチド又はタンパク質が連続した繊維をいう。
【００３０】
本明細書において、「貯蔵嚢シルク」とは、貯蔵嚢に貯蔵されているシルクをいい、「テーパリング管シルク」はテーパリング管を通過中のシルクをいう。また、本明細書において、「ポリペプチド繊維」は、ポリペプチドからなる繊維をいい、特に、ナノ小繊維が繊維軸に沿って束状に集合し結合したマイクロ繊維をいう。
【００３１】
また、本明細書において、「紡糸」とは、原則として、クモが体内でクモ絹糸を産生後、出糸突起より吐糸する生物学的なプロセスをいう。
【００３２】
一方、本明細書において、「湿式紡糸法」、「乾式紡糸法」及び「溶融紡糸法」等の用語における「紡糸法」は、原則として、一般に合成繊維を製造する際に用いられる「高分子より繊維を形成させる方法における工程」の意味で使用される。
【００３３】
本明細書において、「ナノ小繊維」とは、クモ糸由来のポリペプチドが集合し結合して生成する高さ及び幅が数百nm以下で、幅が100nm程度の小繊維をいい、「マイクロ繊維」とは、ナノ小繊維が繊維軸方向に束状に集合し結合して生成する幅が１μm以上の繊維をいう。「ナノ小繊維」は、幅が数百nm以下のナノ顆粒状構造体が密接にタンデム状に集合し結合している。
【００３４】
本明細書において、顆粒状構造体とは、クモ由来のシルクを構成する構造体の一つであり、特に、ナノ小繊維を構成する小型の顆粒状構造体をナノ顆粒状構造体と記載する。「顆粒状(granular)構造体」は、高いアスペクト比を有する顆粒状の形態を有し、シルクに特徴的なグリシン及びアラニンを多く含み、βシート構造を含むペプチド又はポリペプチドを主成分とする構造体をいう。Nephila edulis のクモ絹糸の場合、17％±4％のβシート構造を有すると報告されている(Ling Sら、Biomaclomolecules, 2011, 12, 3344-3349)。
【００３５】
これらの繊維の形成におけるポリペプチド、小繊維及びナノ小繊維の結合は、水素結合、イオン結合、疏水結合及びファンデルワールス力等による非共有結合、並びに、共有結合が挙げられるが、好ましくは、主に非共有結合である。また、本発明の製造方法において、共有結合により各繊維の分子間に化学的に架橋形成させる工程を含む場合がある。
【００３６】
ポリペプチドの架橋に使用可能な官能基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基等が挙げられる。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸の側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合を形成し架橋できる。
【００３７】
また、本発明のポリペプチド繊維は、その繊維が絡み合うことにより引っ張り強度等の特性に影響する場合がある。
【００３８】
また、マイクロ繊維の形成におけるナノ小繊維の集合と結合は、凝集剤を用い溶媒の組成を変化させることにより、及び／又は、ナノ小繊維の環境を形成する溶媒中の無機塩やpHを変化させることにより、ナノ小繊維の集合によって形成させることができる。
【００３９】
本発明の製造方法の態様は、クモ体内における絹糸腺における牽引糸の特性に近似するポリペプチド繊維を製造するために、本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維の原料であるポリペプチドが溶媒に溶解した状態から、ナノ小繊維を形成し、そのナノ小繊維が集合し結合したマイクロ繊維を形成する工程を含む。特に、これらの工程の中でも、ナノ小繊維からマイクロ繊維を形成するまでの工程における、高いアスペクト比を有する顆粒状構造体の幅及び高さを減少させると共に、密接にタンデム状に配列させる工程を含む。
【００４０】
本明細書において、前記クモ糸タンパク質由来のポリペプチドは、天然のクモ糸タンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくは、それと85%以上、90%以上、又は95%以上のアミノ酸配列の相同性を有するポリペプチド、若しくは、これらのポリペプチドの部分配列を有するポリペプチド断片、又は、これらのポリペプチド若しくはポリペプチド断片と他のポリペプチド若しくはペプチドとの融合タンパク質等を含む。
【００４１】
クモの天然の牽引糸のアミノ酸組成は、グリシン及びアラニンを多く含み、両者を合計すると全配列中の90%以上である。したがって、本発明における前記クモ糸タンパク質由来のポリペプチドは、アラニン残基及びグリシン残基が全アミノ酸残基に対して40%、50%、60%、70％又は80%以上である。
【００４２】
クモ糸タンパク質の例として、代表的には、スピドロインタンパク質が挙げられる。スピドロインタンパク質は、フィブロインともいわれ、天然のクモの大瓶状腺等で紡糸され、主にスピドロインＩ（MaSp1）とスピドロインII（MaSp2）とが知られる。分子量は250〜350kDaであり、30〜40アミノ酸単位の100回繰り返し構造で全長の90％を占め、そのアミノ酸組成は、グリシン及びアラニンを多く含むコンセンサス配列の繰り返し構造からなる特徴的な構造を有する。アラニンは短いポリアラニン構造を形成し、スピドロインタンパク質中で繰り返し構造を有し、クモ糸繊維中で結晶状構造としてβシート構造の形成に関与する。グリシンは、GGX, GPGXX (X=A, L, Q, Y)の配列を基本単位として、スピドロインタンパク質中で繰り返し構造を有し、クモ糸繊維中で非晶質のランダムコイル構造の形成に関与する。
【００４３】
スピドロイン関連タンパク質及びポリペプチド等のアミノ酸配列は、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI: National Centor for Biotechnology Infomration)に下記表１−１及び表１−２にアクセッション番号で記載のペプチド又はポリペプチドが収録されている。そこで、例えば、これらのアミノン酸配列を利用して、本発明のクモ糸由来ポリペプチド繊維を製造するためのポリペプチドを作製することができる。
【００４４】
【表１−１】
2018159137.tif 000002
【００４５】
【表１−２】
2018159137.tif 000003
【００４６】
前記クモ糸由来ポリペプチドは、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列を製造し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを公知の方法で作製し、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、昆虫細胞等の適当な宿主に導入して形質転換体を作製することができる。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えペプチド又はポリペプチドが産生されるので、培養物から産生された遺伝子組み換えペプチド鎖を回収することにより、本発明で用いる遺伝子組み換えペプチド鎖を調製することができる。また、昆虫、鳥類又は哺乳動物に組み換え遺伝子を導入し、これらの体内で製造された組み換えポリペプチドを精製し単離することによりクモ糸由来のペプチド又はポリペプチドを得ることができる。
【００４７】
また、βシート構造の形成は、張力を負荷しない非延伸状態で、材料全体の電子の量のうち、結晶に存在する電子の量として表した場合に、クモ糸由来のポリペプチドの全体中の15〜30％を含むポリペプチドが好ましいが、本発明の製造方法で製造されるクモ糸由来のポリペプチド繊維は、10〜50％又は5〜80％のβシート構造を有する場合がある。
【００４８】
前記ステップ(ii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体は、その少なくとも50％以上、60％以上、70％以上又は80％以上の顆粒状構造体が、例えば、高さが100nm未満、110nm未満又は120nm未満であり、好ましくは110nm未満であり、幅が20〜2500nm、30〜1900nm又は50〜1500nmであり、好ましくは30〜1900nmである。また、前記ステップ(iii)における高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体は、その少なくとも50％以上、60％以上、70％以上又は80％以上の顆粒状構造体が、高さが5nm未満、9nm未満又は15nm未満であり、好ましくは9nm未満であり、幅が20〜300nm、50〜200nm又は70〜300nmであり、好ましくは50〜200nmである。
【００４９】
また、前記ステップ(ii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体のアスペクト比は、その少なくとも50％以上、60％以上、70％以上又は80％以上の顆粒状構造体が、幅/高さの比が5以上、10以上又は20以上であり、好ましくは10以上であり、上限は、特に限定されない。一方、前記ステップ(iii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体のアスペクト比は、その少なくとも50％以上、60％以上、70％以上又は80％以上の顆粒状構造体が、幅/高さの比が3以上、5以上又は10以上であり、好ましくは5以上であり、上限は特に限定されない。
【００５０】
本発明の製造方法のステップ(i)における、スピドロンタンパク質等のクモ糸由来タンパク質を溶解したドープ液の製造は、前記の天然又は組み換えクモ糸由来ポリペプチドを用い、公知の方法（特許文献１〜５）で製造することができる。これらのドープ液の溶媒は、例えば、水溶液若しくは極性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を使用することができる。
【００５１】
ドープ液に使用する極性有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド若しくは1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFIP)、又は、これらの混合液から選択することができるが、これらに限定されない。
【００５２】
クモ糸由来のタンパク質の三次元構造は、例えば、水溶媒の場合に、その環境中のpH、イオン強度（塩の種類及び濃度）、湿度又は水分濃度等の影響を受けることが知られている（非特許文献２)。
【００５３】
したがって、剪断応力を負荷しながら、このドープ液のpH、塩の種類及び濃度、湿度又は水分濃度等のクモ糸由来のポリペプチドの環境に関連する要素を変化させることにより、クモ糸由来ポリペプチドを製造することができる。これらの要素の１種以上を変化させることにより、又は、複数の要素を組み合わせて変化させることにより、クモ糸由来のポリペプチドを製造することができる。本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維の製造方法として、具体的には、湿式紡糸法、乾式紡糸法及び溶融紡糸法を挙げることができる。
【００５４】
ポリペプチドの環境に関連する要素の変化は、これらの要素の選択に応じて、急速に変化させる場合があり、又は、緩徐に変化させる場合がある。
【００５５】
このドープ液の溶媒の組成、pH及び／又はイオン強度を変化させる、及び／又は、凝集剤を添加することにより、マイクロ繊維を形成させることができる。
【００５６】
本発明の態様において、湿式紡糸法を用いる場合、繊維軸方向に剪断応力を負荷しながら、ドープ液に凝固剤を添加する、又は、凝固剤を含む溶媒中に前記ドープ液を射出、押し出す又は浸漬することにより、クモ糸由来のポリペプチド繊維を製造することができる。
【００５７】
湿式防止法の凝固剤としては、無機塩を含む水溶液が好ましい。なお、メタノール、エタノール、2-プロパノールなどの炭素数1〜5の低級アルコール又はアセトンを適宜加えてもよいが、これらに限定されない。前記無機塩を含む水溶液は、弱酸性〜酸性の溶媒が好ましい。
【００５８】
また、本発明のクモ糸由来ポリペプチドを製造する方法の前記ステップ(ii)及び(iii)において、それぞれ、溶媒中の塩を調整する場合がある。この塩の変化は、ステップ(ii)からステップ(iii)への変化により、前記高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してタンデム状に配向させてナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるように調製される。
【００５９】
例えば、ステップ(ii)では、高いイオン強度の溶媒に調製され、ステップ(iii)では、そのイオン強度を低下させるように塩が調製される。
【００６０】
より具体的には、例えば、ステップ(ii)では、150mM以上、200mM以上、250mM以上、300mM以上、350mM以上又は400mM以上の塩化ナトリウム(NaCl)水溶液のイオン強度以上のイオン強度を与えるように調製され、ステップ(iii)では、ステップ(ii)での塩化ナトリウム(NaCl)水溶液のイオン強度よりも低いイオン強度を与えるように溶媒中の塩が調製されるが、これに限定されない。
【００６１】
イオン強度Ｉとは、溶液中のイオンの影響度を表す物理量であり、本明細書において、当業者により一般に理解される定義で使用される。すなわち、イオン強度は、溶液中の全てのイオンに対しモル濃度と電荷の２乗を掛けあわせたものの和の半分であり、下記式１で表すことができる。
［数１］                  
2018159137.tif 000004
式１
miは、i番目のイオン濃度、Ziはその電荷数を表す。 
【００６２】
すなわち、300mMのNaCl水溶液と100mMのNa3PO4水溶液とは、同一のイオン強度を与える。そこで、例えば、ステップ(ii)では、300mM以上のNaCl水溶液とし、ステップ(iii)では、100mM未満のNa3PO4水溶液に調整される場合がある。
【００６３】
また、クモ糸由来のポリペプチドをカオトロピック(chaotropic)イオンを多く含む環境に曝露し、続いて、繊維軸方向に剪断応力を負荷しながら、コスモトロピック（kosmotropic）イオンを多く含む環境に曝露することにより、ステップ(ii)と(iii)の塩の種類及び／又は濃度を調整することにより、本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造することができる。
【００６４】
カオトロピックイオンは、水分子間の相互作用を減少させ、それによる構造を不安定化させるイオンのことであり、水のエントロピーを増大させるような溶質が存在する環境に、クモ糸由来のポリペプチドを曝露し、ポリペプチド間の、水素結合、ファン・デル・ワールス力や疎水結合などに影響を与えることにより、その分子構造を不安定化するものもある。コスモトロピックイオンは、このカオトロピックイオンと反対の効果を有する。カオトロピックイオンに曝露した後に、コスモトロピックイオンを多く含む環境への曝露、及び／又はカオトロピックイオンを除く又は減少させることにより、本発明のポリペプチド繊維を製造することができる。
【００６５】
前記カオトロピックイオンを含む環境を調製するためのカオトロピック剤は、尿素、イソチオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム(NaSCN)、グアニジンHCl、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、トリフルオロ酢酸セシウム、アルギニン、シトルリン、塩化ナトリウム、これらの誘導体又はカウンターカチオンが相違する塩が含まれるが、これらに限定されない。前記コスモトロピック環境を調製するためのコスモトロピック剤は、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム及びクエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、タウリン、Ｄ−トレハロース、イノシトール、ベタイン、これらの誘導体又はカウンターカチオンが相違する塩が含まれるが、これらに限定されない。また、カオトロピック塩からコスモトロピック塩への調製は、塩のホフマスター系列にしたがってもよい。例えば、前記ステップ(iii)において、溶媒が水溶液の場合には、塩のイオンがナトリウムイオンおよび塩化物イオンよりも顕著なコスモトロピック特性を有する塩類（例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム）をコスモトロピック塩として用いることができる。
【００６６】
また、前記カオトロピック塩及びコスモティック塩に加えて、又は、これらの塩の添加を伴わずに、適宜、アルカリ金属ハロゲン化物（例えばLiCl,LiBrなど）、アルカリ土類金属ハロゲン化物(例えばCaCl2)、アルカリ土類金属硝酸塩(例えばCa(NO3)2など)、チオシアン酸塩(例えばNaSCNなど)から選ばれる少なくとも一種の塩を使用できる。
【００６７】
本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を製造する工程において、pHを変化させる場合は、例えば、弱アルカリ性のドープ液を中性付近にすることにより、顆粒状の構造体を形成させた後、さらに、弱酸性に変化させることにより、前記ポリペプチド小繊維に剪断応力を負荷しながら、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してタンデム状に配向したナノ小繊維が軸方向に集合し結合して構成されるマイクロ繊維を形成させることができる。
【００６８】
前記弱アルカリ性のドープ液はpH6.0〜10.0であり、pH6.5〜8.0が好ましく、顆粒状構造体を形成させるための中性付近のpHとしては、pH6〜7.5が挙げられる。また、ナノ顆粒状構造体を形成させるための弱酸性のpHとしては、pH4〜6が挙げられる。また、前記ステップ(iii)におけるpHはpH6.7よりpH5.7に順次低下させることにより、本発明のクモ糸由来ポリペプチド繊維を製造することができる。また、前記ステップ(ii)とステップ(iii)の各々pHは、pH6.4を境界として、ステップ(ii)はpH6.4以上、ステップ(iii)はpH6.4未満に調整される場合がある。
【００６９】
pH調整剤としては、一般に使用されるpH調整剤を使用できる。具体的には、塩酸、希塩酸、硫酸、希硫酸、硝酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム及びアンモニア水溶液等から選択されるが、これらに限定されない。また、これらに限定されない、酢酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩等の有機塩を使用することができる。
【００７０】
前記クモ糸由来のポリペプチドを製造する方法の前記工程において剪断応力(shear stress)を負荷する方法として、例えば、製造されるマイクロ繊維に張力を負荷することにより、又は、製造中のマイクロ繊維を高速で巻き取ることにより行うこと、又は製造工程でマイクロ繊維が直径500nm〜数μmの狭い管を管壁と接触しながら通過させることにより、剪断応力を負荷できるが、これらに限定されない。
【００７１】
前記クモ糸由来のポリペプチドを製造する方法の前記工程において、温度は、特に限定されないが、適宜、特定の温度を選択して本発明のクモ糸由来ポリペプチド繊維を製造することができる。
【００７２】
前記ステップ(i)〜(iii)の工程によって製造されるマイクロ繊維を単離することにより、本発明のクモ糸由来ポリペプチド繊維を製造することができる。本明細書において、「単離する」とは、湿式紡糸法においては、マイクロ線維を溶媒中で形成後に、該溶媒より該マイクロ繊維を分離し本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を取得すること等をいい、乾式紡糸法においては、マイクロ線維を溶媒中で形成後に該溶媒を気化させることにより本発明のクモ糸由来のポリペプチド繊維を取得すること等をいう。
【００７３】
また、前記クモ糸由来のポリペプチドを製造する方法で製造されるポリペプチド繊維を束ねることにより、人工シルクを製造することができる。
【００７４】
このポリペプチド繊維から製造されるシルクを用いることにより、例えば、これを使用する糸、敷布、不敷布、メッシュ及びネット等を製造することができる。本ポリペプチド繊維の、耐熱性、高い引っ張り強度(tensile strength)、靱性(toughness)、伸展性(extensibility)の特性を活かし、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造に利用できる。また、高強度、高伸展性及び高靱性並びに生分解性及び生互換性を利用した創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料として使用できる。
【００７５】
なお、本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例】
【００７６】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００７７】
１．実験材料及び方法
(1)  Nephila clavataの大瓶状腺シルクの採取
体長20mm以上のメスのNephila clavata（和名：ジョロウグモ）より大瓶状腺を摘出した。ピンセットで大瓶状腺のシルクを採取し、以後の実験に使用した。
【００７８】
(2)  牽引糸の回収と保存
N. clavataより2m/分の巻き取り速度で牽引しを回収した。繊維束は暗所、室温、40%湿度下の条件でボックス内に保存した。
【００７９】
(3)  走査電子顕微鏡による観察
紡糸前後の糸の形態を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。試料を金でスパッタリングコーティングしたアルミニウムスタブ上にマウントし、走査型電子顕微鏡（JSM6330F, 日本電子株式会社、東京)を用い、加速電圧5kVで試験した。
【００８０】
(4)  シンクロトロン小角Ｘ線散乱（SAXS）及び広角Ｘ線散乱(WAXS）
SPring-8のBL45XUビームライン（播磨、兵庫）でシンクロトロン小角Ｘ線散乱（SAXS）及び広角Ｘ線散乱(WAXS）の測定を、Ｘ線エネルギー：12.4keV（波長0.1nm)、ビーム直径：45μmで実施した。フラットパネルディテクター(FPD, C9728DK-10型、浜松ホトニクス株式会社、静岡）で全てのWAXSパターンが記録された。カメラ距離は、WAXS及びSAXS測定の間、各々50.2及び2036 mmであった。各散乱パターンの曝露時間は10秒であった。取得された二次元散乱パターンは、Fit2Dソフトウェア―を使用して、１次元プロフィールに変換された。バックグランド散乱及び検出器の配置に対する校正が行われた。
【００８１】
(5)  複屈折
複屈折が目的とする厚さによって分割される位相差として表された。クモの繊維は、シリンダー状であるため、厚さは繊維直径である。位相差は、光偏光顕微鏡(BX53型、オリンパス株式会社、東京)を使用し、50倍の対物レンズで取得された。画像は、WPA-viewソフトウェア (ver. 2.4.2.5, Photonic Lattice,Inc.)で解析された。
【００８２】
ステイン−複屈折測定のために、１本の糸繊維が1.5cmの長さに切断され、166μm/sの速度でLinkamの使用によって延伸された。緩んだ長さ、引っ張り強度（strain)の５％増加又は減少で屈折率が測定された。情報が１試料の３画像より収集された（図８参照）。
【００８３】
(6)  原子間力顕微鏡(AFM)観察
１本の繊維が、試料ステージに直接載置されるか、又はスーパーグル―（Loctite 460, Henkel, ドイツ）中にマウントされ、試料の横断面切片がミクロトーム（RM2265型, Leica Mikryosysteme GmbH、オーストリア）によって調製された。繊維試料の長軸方向の横断面切片がＡＦＭ観察された。画像が40％湿度条件下、タッピングモードで、走査型プローブ顕微鏡（5300E型、株式会社日立製作所、東京）を使用して取得された。試料表面の観察には、カンチレバーは3 N/mのスプリング定数及びスキャン波長：0.8Hzが適用され、横断面切片試料に対して、20 N/mのスプリング定数及びスキャン波長0.5 Hzが使用された。画像が取得され、AFM5000II（株式会社日立製作所、東京）で解析された。ナノ小繊維の幅（各ナノ小繊維間の距離）が、データが全結果において典型的であることを確認するために、１試料当たり５画像、１画像当たり少なくとも20〜30領域で収集された。ナノ小繊維の幅（各ナノ小繊維間距離）及び顆粒状構造体の長さ（同一ナノ小繊維上の隣接する顆粒状構造体間距離）が、データが全結果において典型的であることを確認するために、１試料当たり５画像、１画像当たり20〜30領域で収集された。
【００８４】
(7)  張力負荷試験
個別の牽引糸繊維の延伸試験が小型卓上試験機（EZ -LX型、株式会社島津製作所、京都）で実施された。初期の試料長さは、10.0mmであり、一定の速度10mm/mmで延伸した。結果が記録され、TRAPEZIUM （ver 1.3.0, 株式会社島津製作所、京都）で解析された。測定は40%湿度、室温下で実施された。さらに、隣接する繊維断片が回収され、直径を求めるために電子顕微鏡で観察された。シリンダー形状のため、繊維の横断面切片領域が直径より計算された。
【実施例１】
【００８５】
N.clavataの大瓶状腺より採取した繊維の観察
(1) 走査型電子顕微鏡による観察
N.clavataの大瓶状腺を摘出し、貯蔵嚢及びテーパリング管の内部の特徴を走査型顕微鏡(SEM)及び原子間力顕微鏡(AFM)で解析し、比較した（図１参照）。
【００８６】
両シルクの走査型電子顕微鏡での観察結果を図２に示す。多数のナノ小繊維で形成される束が貯蔵嚢シルクで認められた。この束は、約50μmの長さであり、貯蔵嚢シルクに沿った方向に並んでいた。テーパリング管においても、より少ない凝集のナノ小繊維の束が観察された。より高い拡大率では、らせん状構造のナノ小繊維を示す所見が認められた。
【００８７】
(2)  原子間力顕微鏡による観察
より詳細なナノスケールでの解析が原子間力顕微鏡で行われた。この貯蔵嚢シルクとテーパリング管シルクを原子間力顕微鏡で観察した結果を図３に示す。貯蔵嚢シルクでは数μmの高いアスペクト比を有する顆粒状構造体が主に観察された。一方、テーパリング管では、より幅及び高さが減少したナノ小繊維が主に観察された。ナノ小繊維は、テーパリング管の軸方向に配列した。すなわち、このナノ小繊維は、この軸方向に沿った高いアスペクト比を有するナノ顆粒構造体が密接してタンデム状に配向することを示した。
【００８８】
そこで、この顆粒状構造体について顆粒状構造体の幅と高さを測定した。貯蔵嚢では、500nm〜1900nmの範囲に80％の顆粒構造体が分布した一方、100nm未満は、15％であった。反対にテーパリング管シルクの顆粒構造体の幅は減少し、200nm未満であり、ピークは100nmであった。高さについての解析も、減少傾向を示し、10nm〜110nmの貯蔵嚢シルクに対して、テーパリング管シルクでは1nm〜9nmであった（図４、５）。
【００８９】
また、牽引糸繊維では、幅は、50〜200nmの範囲であり、高さは7nm以下の範囲であった（図５）。
【００９０】
これらの結果は、剪断応力による紡糸過程で、遷移的な特徴が惹起されることを示している。したがって、遷移的な結果として、出糸管から押し出される前にテーパリング管シルクでナノ小繊維が形成されたことを示す。
【００９１】
これらの結果は、N.clavataの大瓶状腺において、貯蔵嚢では約500nm〜数μmの幅、高さ50nmと高いアスペクト比を有する顆粒を含む繊維が、テーパリング管での移動に伴い小型化し、幅は約60〜130nm、高さが10nm以下の高いアスペクト比を有する小顆粒がタンデム状に密接して配向し、N.clavataの出糸突起より排出された牽引糸は、テーパリング管シルクよりも、より大きな幅及び高さを有すること、及び、貯蔵嚢では高いアスペクト比を有する顆粒を有し、テーパリング管、出糸突起より吐糸されたシルクのいずれもが、高いアスペクト比を有する顆粒がタンデム状に配列して形成されていることが観察された。
【００９２】
(3)  広角Ｘ線散乱(WAXS）及び小角Ｘ線散乱（SAXS）の測定
貯蔵嚢シルク(n=2)、テーパリング管シルク(n=5)、大瓶状腺皮(n=1)及び牽引糸(n=1)の広角Ｘ線散乱(WAXS）及び小角Ｘ線散乱（SAXS）を測定した。広角Ｘ線散乱では、結晶性構造を示す特徴的な散乱が認められた。また、小角Ｘ線散乱では、貯蔵嚢シルクに4.18nmの、テーパリング管シルクで7.85nm及び5.28nmの特徴的なピークを認めた（図６）。
【００９３】
(4)  複屈折の測定
貯蔵嚢シルク及びテーパリング管シルクの複屈折を測定した。貯蔵嚢シルクでは、複屈折率は、貯蔵嚢シルクでは8ｘ10-6±1ｘ10-6、テーパリング管シルクでは3.8ｘ10-4±0.3ｘ10-4であった。このテーパリング管シルクにおける高い複屈折は、上記の配向構造の存在を示すＸ線の散乱結果と一致した。一方、牽引糸繊維においても、ラスク状態で、0.003の複屈折率を示した。したがって、分子構造の配向において、テーパリング管シルクと牽引糸とが、全体に均一な同一形を示した（図７）。
【００９４】
牽引糸に張力が負荷された状態で、さらに複屈折が測定された。複屈折は引っ張り高度が高くなるにつれて、増加した。これは、応力によって分子鎖又は構造が配向していることを示す。複屈折は、ランダムに惹起される代わりに、シルク全体に均一な増加が観察された。
【００９５】
(5)  小括
以上の結果より、紡糸される前のシルク繊維は、高アスペクト比が紡糸前から存在し、紡糸により配向すること、繊維を構成するマイクロ繊維は、100nm程度の顆粒状構造体が集合することで形成されていること、紡糸前から、顆粒状構造体は密接に配向することで、マイクロ繊維を形成していることが示された。
【実施例２】
【００９６】
N.clavata繊維の解析
紡糸工程の製造物としての牽引糸及びその内部構造が分析された（図８）。
(1)  N.clavata牽引糸繊維の原子間力顕微鏡による観察
原子間力顕微鏡を使用して、N.clavata牽引糸繊維のナノメーター範囲の構造が検討された（図８〜１０）。牽引糸、すなわち、出糸管から吐糸された後のシルクにおいても、ナノ小繊維を示す像が観察された。全てのナノ小繊維の牽引糸軸方向での配列が観察された。また、２つのナノ小繊維の隣接部位でらせん構造の所見が観察された。しかし、大半のナノ小繊維は、相互に平行に配列するように観察された。テーパリング管シルクのナノ小繊維と比較して、牽引糸のナノ小繊維は、その特性を共有し、113±21nm幅で繊維に沿った高いアスペクト比を有する顆粒状像を示した。顆粒状構造体の高さは、約7nmであった。
【００９７】
【表２】
2018159137.tif 000005
【００９８】
(2)  張力負荷時における原子間力顕微鏡による観察
ナノ小繊維に張力を負荷した場合の変化を観察した。インタクトな牽引糸に対して、最初に全長に対して20％引き伸ばし、瞬間接着剤で固定し、内部構造を分析した。主に、２つの特徴が観察された。ナノ小繊維は繊維軸に沿っており、より圧縮されたパターンを示した一方、ナノ小繊維の幅は54±32nmに減少した。ナノ小繊維は、顆粒状構造体の特徴を示したが、高さは同様に減少した(〜1nm）。繊維のいくつかの箇所でスキャンされ、全ての像は、同一の、良好に配列したナノ小繊維のパターンを示した。繊維を引き延ばした場合、らせん構造は観察されなかった（図１１Ａ、図１１Ｂ）。
【００９９】
これらの結果は、ナノ小繊維が牽引糸での主要な内部構造であることを示した。さらに、機械的な引っ張りに応答して変化するナノ小繊維構造の変化は、牽引糸の引張強度と伸展特性に関与することが示された。
【０１００】
(3)  N.clavata牽引糸繊維の外部張力による一時的な複屈折の変化
複屈折は、分子の配列の指標であり、対象物の厚さによって分割される位相差として表される。クモ糸繊維は、シリンダー形状であるため、厚さとしてその各繊維の直径を用いた。直径は、走査型電子顕微鏡の画像より求め、平均の厚さは4.8±0.4μmであった。N.clavata牽引糸の複屈折率は約0.03を示した。この値は、繊維の全長さに対して5％及び10％引き伸ばした場合に、増加した。この複屈折値は、10%の延伸から5%の延伸に緩めた場合に、減少した。この値は、5％延伸の際の値に相当する。繊維を再び10％及び15％に引き伸ばした場合、複屈折値は、それに応じて増加した。これらの結果は、複屈折の変化は、外部張力に相関し、分子配列が可逆的な変化であることを示すものである（図１２Ａ〜Ｃ）。
【０１０１】
(4)  小括
以上の結果より、牽引糸内部においても、同様の顆粒が観察され、紡糸直前の顆粒から構成されるマイクロ繊維が束状に紡糸されることで、牽引糸が形成されることが示された。これらの結果は、引き伸ばし過程において、顆粒が変形し、マイクロ繊維が再配向することで高い靱性を実現することを示すものである。
【図１】
2018159137.tif 000006
【図２】
2018159137.tif 000007
【図３】
2018159137.tif 000008
【図４】
2018159137.tif 000009
【図５】
2018159137.tif 000010
【図６】
2018159137.tif 000011
【図７】
2018159137.tif 000012
【図８】
2018159137.tif 000013
【図９】
2018159137.tif 000014
【図１０】
2018159137.tif 000015
【図１１Ａ】
2018159137.tif 000016
【図１１Ｂ】
2018159137.tif 000017
【図１２Ａ】
2018159137.tif 000018
【図１２Ｂ】
2018159137.tif 000019
【図１２Ｃ】
2018159137.tif 000020