(57)【要約】      （修正有）【課題】タバコ（ニコチアナ・タバカム）における、栄養繁殖できる、遺伝子組み換え植物の封じ込めを確保するために開花しない植物を操作する方法の提供。【解決手段】タンパク質をコードする核酸配列であり、（１）各プロモーターの下で、植物の開花を抑制又は抑圧又は遅延させることができ、（２）モチーフ「ＮＡＰＤＩＩＤＳ」又は好ましい場合では「ＶＮＡＰＤＩＩＤＳ」を含むが、ジャガイモ遺伝子ＳｔＳＰ５Ｇ又はその一部の核酸を除く、核酸配列。好ましくは、核酸配列が、系統発生学的にＰＥＢＰ遺伝子ファミリーのＦＴクレードに属しており、ここで、モチーフ「（Ｖ）ＮＡＰＤＩＩＤＳ」が、開花促進タンパク質ＡｔＦＴ及びＢｖＦＴ２の「（Ｖ）ＹＡＰＧＷ」モチーフの代わりにある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードする核酸配列であり、（１）各プロモーターの下で、植物の開花を抑制又は抑圧又は遅延させることができ、（２）モチーフ「ＮＡＰＤＩＩＤＳ」を含むが、ジャガイモ遺伝子ＳｔＳＰ５Ｇ又はその一部の核酸を除く、核酸配列。
【請求項２】
前記モチーフが「ＶＮＡＰＤＩＩＤＳ」である、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】
系統発生学的にはＰＥＢＰ遺伝子ファミリーのＦＴクレードに属しており、前記モチーフ「（Ｖ）ＮＡＰＤＩＩＤＳ」が、開花促進タンパク質ＡｔＦＴ及びＢｖＦＴ２の「（Ｖ）ＹＡＰＧＷ」モチーフの代わりにある、請求項１又は２に記載の核酸配列。
【請求項４】
４つのエクソンを含み、前記モチーフ「（Ｖ）ＮＡＰＤＩＩＤＳ」が、４番目のエクソンの一部である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
前記モチーフ「（Ｖ）ＮＡＰＤＩＩＤＳ」が、前記タンパク質の外部ループの一部である、先行する請求項のいずれかに記載の核酸。
【請求項６】
ＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２のそれぞれにおいて等しく保存されるアミノ酸の少なくとも５０％、好ましくは８０％、最も好ましくは１００％を共有するか、及び／又は、タンパク質ＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２のいずれかの中にあるアミノ酸配列鎖の少なくとも５０％、好ましくは７０％、最も好ましくは８０％を共有するタンパク質をコードする、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。
【請求項７】
配列番号５の第6, 7, 12, 14, 16, 18, 20, 28, 30, 36, 38, 42, 44, 51-53, 57, 61, 65, 68, 70-72, 74, 76, 77, 79, 83, 85-87, 89, 90, 92, 93, 96, 100, 101, 103, 107, 108, 110, 112, 115-118, 123, 126, 129, 134-141, 好ましくは131-141, 144-147, 155, 158-161, 165, 168, 169, 175番に位置するアミノ酸を、必ずしも配列番号５のペプチド又はタンパク質と同じ位置番号ではないが、この順番で少なくとも含むペプチド又はタンパク質をコードする、先行する請求項のいずれかに記載の核酸。
【請求項８】
更に、配列番号５の第8-11, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 26, 29, 31, 32, 35, 37, 39-41, 43, 45-48, 50, 54, 55, 58, 59, 62, 64, 67, 69, 73, 75, 78, 80, 82, 84, 88, 94, 95, 102, 104, 113, 114, 119-122, 124, 127, 131-133, 148-152, 156, 163, 164, 167, 171-174, 176-167番に位置するアミノ酸を、必ずしも配列番号５のペプチド又はタンパク質と同じ位置番号ではないが、この順番で含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
先行する請求項のいずれかに記載の核酸であって、前記核酸が、配列番号５、６及び７に示される配列のいずれかからなるか若しくはいずれかを含むタンパク質、又は配列番号１、２及び３に示される配列のいずれかからなるか若しくはいずれかを含むタンパク質をコードする、核酸。
【請求項１０】
更に、プロモーターとして機能することができる成分を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸。
【請求項１１】
前記プロモーターが、細胞特異的プロモーター、時間誘導性プロモーター、タバコ植物に本来含まれるプロモーター、好ましくは遺伝子ＮｔＦＴ１からＮｔＦＴ４を自然に制御するプロモーター、タバコ由来の組織特異的及び／又は細胞特異的プロモーター、経時的構成的活性化プロモーター、他の植物に由来するプロモーター、好ましくはシロイヌナズナＦＴ又はスクロース輸送体ＡｔＳＵＣの細胞特異的な時間誘導性プロモーター、組織特異的及び／又は細胞特異的及び／又は経時的構成的活性化プロモーター、市販のプロモーター、他の源から入手できるプロモーター、合成プロモーター、或いは、上で列挙した機能の組み合わせを有するプロモーターから選択される、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
プロモーターとして機能できる前記核酸配列が、核酸の発現を上方制御する、請求項１０及び１１のいずれかに記載の核酸。
【請求項１３】
前記核酸が、１つ以上の別々の調節成分と組み合わせて、好ましくは増強成分と組み合わせて使用される、請求項１０〜１２のいずれかに記載の核酸。
【請求項１４】
先行する請求項のいずれかに記載の核酸によってコードされたペプチド又はタンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１６】
前記ベクターが、バイナリーベクター、好ましくは抗生物質抵抗性、代謝抵抗性又は除草剤抵抗性遺伝子を保有するものから選択される、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記抗生物質抵抗性、代謝抵抗性又は除草剤抵抗性遺伝子が、時間的及び空間的構成的活性化プロモーター又は時間誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
前記抗生物質抵抗性遺伝子がカナマイシン及びハイグロマイシン遺伝子から選択されるか、又は、前記除草剤抵抗性遺伝子がＢＡＳＴＡ抵抗性遺伝子であるか、及び／又は、前記抗生物質抵抗性、代謝抵抗性又は除草剤抵抗性遺伝子がｎｏｓ若しくは３５ＳＣａＭＶプロモーター又はエタノール誘導性３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下にある、請求項１６又は１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸、請求項１４に記載のペプチド若しくはタンパク質、及び／又は請求項１５〜１８のいずれかに記載のベクターを含む、植物、植物の一部又は植物の種子。
【請求項２０】
ナス科植物ファミリーのメンバーであり、好ましくは作物であり、更に好ましくはタバコ、ジャガイモ及びトマトから選択される、請求項１９に記載の植物、植物の一部又は植物の種子。
【請求項２１】
アブラナ科植物ファミリーのメンバーである、請求項１９に記載の植物、植物の一部又は植物の種子。
【請求項２２】
植物の開花の発生を抑制、抑圧又は遅延させる遺伝子組み換え植物の生産のための、タンパク質をコードする核酸配列の使用であり、該核酸配列が、（１）各プロモーターの下で、植物の開花を抑制又は抑圧又は遅延させることができ、（２）モチーフ「ＡＰＤＩＩＤＳ」を含む、使用。
【請求項２３】
前記核酸配列が系統発生学的にＰＥＢＰ遺伝子ファミリーのＦＴクレードに属しており、前記モチーフ「ＡＰＤＩＩＤＳ」が、開花促進タンパク質ＡｔＦＴ及びＢｖＦＴ２の「ＹＡＰＧＷ」モチーフの代わりにある、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記遺伝子組み換え植物が、ナス科植物ファミリーのメンバーである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記核酸が、ＳｔＳＰ５Ｇ若しくはその一部、ＳＩＳＰ５Ｇ若しくはその一部、又はＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２、ＮｔＦＴ３若しくはそれらの一部である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
前記核酸が、構成的プロモーターの制御下にある、請求項２２〜２５のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な核酸配列、それから得られるアミノ酸、ペプチド及びタンパク質配列、並びにそれらで形質転換された植物及びその子孫に関する。その核酸配列は、開花の遅延又は抑制をもたらす。更に、本発明は、特には栄養繁殖できる、遺伝子組み換え植物の封じ込めを確保するために開花しない植物を操作する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
栄養生長から生殖生長への移行は、植物の生活環の重要な特徴である。開花開始の正確なタイミングは、植物が生殖的成功を確実なものにするために不可欠である。農業及び林業でも、この移行は非常に重要である。なぜなら、産生量及びバイオマスに大きな影響を及ぼすためである。一例として、植物における花の発生が栄養生長の終了及び老化を伴うことが多いため、豊富な量のバイオマスを生産する目的では花の発生が障害となる。それ故に、開花時期の調節、特にその遅延は、バイオマスの増大をもたらすはずである。なぜなら、その植物がその全エネルギーを栄養生長に変えることを可能にし、その植物物質の老化を抑制するか又は少なくとも引き延ばすからである。
【０００３】
光周期及び春化のような外因性シグナルを伴う織り合わさったシグナル経路の網は、植物の生活環における開花の発生段階を、多くの遺伝子の発現を調節することで、しっかりと制御する。進化の中で、新しい機能が相同遺伝子によって確立されたという事実を考慮すると、開花を制御する主要遺伝子の重複が、重要な役割を果たしているように見えた。顕著な例では、細菌及び動物にも見られるファミリーであるが、植物のホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーである。それらは、様々な生物学的過程にかかわっており、例えばプロテアーゼ阻害剤及びキナーゼ阻害剤である。しかしながら、植物におけるＰＥＢＰファミリーのメンバーは、茎分裂組織決定の重要な役割を果たし、開花時期の制御に作用する。最も顕著なメンバーは、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｔ（ＦＴ）である。ＦＴは、葉で花成誘導状態を感知し、茎頂分裂組織（ＳＡＭ）で花の発生を誘発するため、移動性花成シグナル分子であり、１９３７年にＣｈａｉｌａｋｈｙａｎによって既に定義された用語である「フロリゲン」と呼ばれている。幾つかの種における同族体の研究によると、ＦＴは、開花を促進する上での数種にまたがる普遍的役割を、例えば、シロイヌナズナ、トマト、ポプラ、リンゴ、ウリ科植物、サトウダイコン（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）及びその他多くの種のような双子葉植物種などの場合において、持つことが明らかになった。
【０００４】
モデル植物シロイヌナズナにおいて、ＦＴの発現は、葉の師部伴細胞において、Ｂボックスジンクフィンガー転写因子ＣＯＮＳＴＡＮＳ（ＣＯ）により、誘導的な長日条件（ＬＤ）下で、上記ＣＯタンパク質が光でのみ安定化されるという理由から、活性化される。続いて、ＦＴタンパク質は、篩管の篩要素に入り、ＳＡＭへの質量流を通じて運ばれ、ここで、それはｂＺＩＰ転写因子ＦＤと相互作用する；双方が一緒に花の発生の下流標的、第二花成インテグレーターＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ  ＯＦ  ＯＶＥＲＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＣＯＮＳＴＡＮＳ  １（ＳＯＣ１）及び花芽分裂組織決定遺伝子ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）等を活性化する。シロイヌナズナにおいてＦＴに最も近い同族体は、遺伝子重複によって進化したＴＷＩＮ  ＳＩＳＴＥＲ  ＯＦ  ＦＴ（ＴＳＦ）である。ＴＳＦは、ＣＯの直接的な制御標的であり、花成プロモーターとして作用し、それ故にＦＴに重複して作動する。非誘導的な短日条件（ＳＤ）下では、通性ＬＤ植物シロイヌナズナの開花が、ＦＴ非依存性ジベレリン経路によって制御される。その経路は、ＳＯＣ１の発現を直接活性化する。
【０００５】
シロイヌナズナにおいて重要である他の主要な開花調節因子は、ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ  １（ＴＦＬ１）である；そのキンギョソウからの同族体ＣＥＮＴＲＯＲＡＤＩＡＬＥＳは、植物ＰＥＢＰ遺伝子ファミリーの創設メンバーである。ＦＴと高い配列類似性を共有するが、ＴＦＬ１は、花成抑制因子であり、花序構築に関与しており、それ故に、それと関係のあるＦＴに対して機能的に拮抗する。しかしながら、少しの明確なアミノ酸の置換により、ＴＦＬ１を開花誘導因子に、ＦＴを開花抑制因子にそれぞれ転換できる（非特許文献１及び２）。ＦＴ及びＴＦＬの特異的限界決定は転写レベルで行われる。ＦＴは、ただ単に葉で発現されるにすぎないが、その後にＳＡＭに輸送され、一方、ＴＦＬ１の発現及び翻訳は、ＳＡＭでのみ起こる。両タンパク質ＴＦＬ及びＦＴは、茎頂における同一の補助因子ＦＤと相互作用すると報告されており、このようにして、標的遺伝子の転写抑制又は活性化を調節する：ＴＦＬ／ＦＤ複合体は、花芽分裂組織決定遺伝子の転写を抑制するが、該遺伝子は、ＦＴ／ＦＤ複合体によって活性化される。それ故に、一方が、花の発生の調節において、２つのＰＥＢＰタンパク質の一般的な配位をとる必要がある。ここで、２つのＰＥＢＰタンパク質は、拮抗作用を有し、それぞれがＰＥＢＰファミリーのサブファミリーを示す。開花抑制の点で類似の機能を持つＴＦＬ１の同族体は、他の種で広く知られており、ＰＥＢＰファミリーの主要な３つのクレードの１つを構成する。ＦＴ、ＴＳＦ及びＴＦＬに加えて、更に３つのＰＥＢＰファミリーメンバーがシロイヌナズナで特徴付けられ、即ち、ＦＴに重複して作用するように見えるＭＯＴＨＥＲ  ＯＦ  ＦＴ  ＡＮＤ  ＴＦＬ１（ＭＦＴ）、及びＢＲＯＴＨＥＲ  ＯＦ  ＦＴ  ＡＮＤ  ＴＦＬ１  （ＢＦＴ）、並びにＴＦＬ１に対して重複的な活性を示すＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ  ＴＨＡＬＩＡＮＡ  ＣＥＮＴＲＯＲＡＤＩＡＬＥＳ  （ＡＴＣ）である。
【０００６】
ＦＴ及びＴＬＦ１は同一のファミリーに属すると見なされ、それらのアミノ酸配列において５７％の同一性を有するが、それらは、開花の発生においてアンタゴニストとして機能し、その上、それぞれがＰＥＢＰファミリーの系統発生学的に異なるサブファミリーを示す。
【０００７】
従来技術は、開花時期の調節を提案する。これは、花の発生の抑制因子の過剰発現によって達成でき、又は花の発生の活性化因子の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって下方制御する。しかしながら、これらすべての場合で、植物の開花が遅れるだけであり、決して抑制されない。一つの例は、シロイヌナズナのタンパク質ＦＬＣであるが、それは、開花の時期を延期するために、花の発生の抑制因子として使用できる（特許文献１参照）。
【０００８】
近年、サトウダイコンにおいて、開花抑制の代替的方法が確認された。この植物種では、一対の拮抗するＦＴ同族体（ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２）が進化し、花成を制御したが、ここで、ＢｖＦＴ１は−ＦＴ同族体であるものの−開花を抑制し、一方、ＢｖＦＴ２はそれを進展させる（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，１３９７（２０１０））。サトウダイコン植物の生長において春化応答の遅延を得るため、又はサトウダイコン植物に薹立ちしない表現型を発生させるため、これらタンパク質の遺伝子の発現を、具体的にはＢｖＦＴ２遺伝子の下方制御若しくは抑制又はＢｖＦＴ１遺伝子の上方制御によって、調節することが提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、薹立ち抵抗性サトウダイコンは開花しないと思われるので、薹立ちの欠如により、種子が生産されないと思われる。薹立ち抵抗性サトウダイコン植物を維持、繁殖及び商業化できるためには、サトウダイコンが栄養繁殖できないので、前述の調節が条件付きか又は潜在的であることが必要である。その結果、遺伝子導入のためのハイブリッド構築物として誘導性プロモーターの使用が提案されている。その例では、ＢｖＦＴ２が、それからＲＮＡｉカセットを引き出すことで発現停止された。観察された開花の遅延は、ゼロ日から−２９ケースのうちの１つであるが−８７日に亘っていた。更に、ＢｖＦＴ１は、一年生と二年生の遺伝子組み換え植物の両方においてシロイヌナズナからの構成的Ｕｂｉ３プロモーターの制御を受けて発現された。それらは、数週間から３ヶ月を超える範囲に及ぶ薹立ちの遅延を示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ  ２０００／０５０６１５
【特許文献２】ＷＯ  ２０１０／０２５８８８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hanzawa Y., Money T., and Bradley D. (2005). A single amino acid converts a repressor to an activator of flowering. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 7748
【非特許文献２】Ahn J.H., Miller D., Winter V.J., Banfield M.J., Lee J.H., Yoo S.Y., Henz S.R., Brady R.L., and Weigel D. (2006). A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1. EMBO J. 25, 605-614
【発明の概要】
【００１１】
開花の時期はバイオマス生産に非常に大きな影響を与えるため、農学的に興味のある種の開花時期をどのように制御するのか理解することが必要である。タバコ（ニコチアナ・タバカム）は、ナス科植物ファミリーの他の多くのメンバーのように、主として経済的に作物として重要であるが、タバコの花成調節について知られていることは比較的少なく、解析されている遺伝子もほんのわずかである。花の発生の徹底的な調査として、この種が四倍体化現象の結果であり且つ通性ＳＤ栽培品種ニコチアナ・トメントシホルミスの近縁種のゲノムと組み合わされたＬＤ栽培品種ニコチアナ・シルベストリスのゲノムを持つ可能性が最も高いため、タバコはとても興味深い。しかしながら、モデル植物シロイヌナズナと対照的に、確認されている遺伝子がほんのわずかであり、これまで特徴付けされていないため、タバコにおける花の発生の分子基盤はほとんど理解されていない。
【００１２】
条件付きの又は潜在的なプロモーターの制御下にある開花の阻害因子を発現する遺伝子組み換え植物は、花を早く又は後で発生することになる−望まれていなかったり、子孫を得るためであるが。それ故に、遅かれ早かれ、かかる植物は、必然的に花粉粒の生産源になる。かかる花粉の制御が困難であることは明らかであるが、その植物が商業的に興味のある作物に属する場合には、温室から外で栽培される。それ故に、近縁種や対応する作物との外交配が、未だに考えられており、トランス遺伝子が自然に拡散されることを回避できない。
【００１３】
本発明の目的又は課題は、この不利な点を少なくともある程度克服し、花の発生を抑制又は遅延可能なアミノ酸配列をコードする核酸であって、好ましくはそのアミノ酸の大部分とモチーフによってＦＴクレードに属するが、どんな場合でも当該技術で知られるＦＴタンパク質の全配列及びモチーフから外れる部分的配列を示す核酸を提供することにあり、前述の核酸を含む構造物で形質転換された植物に新規で且つ独創的な特徴を与える。特に、前述の核酸は、遺伝子組み換え植物、好ましくは作物の産生に使用でき、開花を遅らせたり、更に好ましくは、開花せず、一植物期間より長い期間に亘って開花しないままでいる。本発明は、従って、植物の利用に焦点を合わせており、例えばタバコ又はジャガイモを栄養繁殖できる。
【００１４】
本発明の発明者は、タバコにおいて４つのＦＴ同族体を同定することができ、系統発生的にはＦＴサブファミリーに属するが花の発生において拮抗作用を有するＮｔＦＴ１−４として指定した。これらタンパク質の機能は過剰発現によって調べられた。驚いたことには、ＮｔＦＴを過剰発現する植物が全く異なる表現型を見せることが示され、組織培養において非常に早く開花する苗条（ＮｔＦＴ４）から、開花せず、９ヶ月で、高さ５ｍを超える巨大なもの（ＮｔＦＴ１−３）にまで及んだ。通常、変種ＳＲ１のタバコ植物は、発芽後およそ６〜８週で開花し、その時点で約１〜１．５ｍの高さに達することになる。開花の抑制を引き起こすＦＴのうちの１種の過剰発現によって、少なくとも９ヶ月は純粋に栄養生長し、前述の期間中に５ｍを超える高さに達するタバコ植物を発生させることができた。本発明者は、この効果をタバコ以外の種、少なくともナス科ファミリー内のものに移すことができることを示した。これらの結果は、前述のＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２及びＮｔＦＴ３又はそれらの一部を、タバコだけでなく、ジャガイモのような他のナス科植物種をも形質転換するのに使用できる構築物に使用することを可能にする。更に、花成の抑制のため、アブラナ科又はキク科植物ファミリーの植物、例えばゴム料作物タラクサクム・コクサギス（キク科）のような、他の植物ファミリーの植物を形質転換することもできる。好ましくは、選ばれた植物種を栄養繁殖すべきである。
【００１５】
図１０は、植物ＰＥＢＰファミリーの見本となるように選ばれたメンバーのタンパク質アラインメントを示す。該アラインメントの全配列において完全同一のアミノ酸の例を＊で指定し；保存置換を：で指定し；半保存置換を．で指定する。アスタリスクは、ＡｔＦＴ対ＡｔＴＦＬ１機能に必須のアミノ酸を示し（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、上記参照）、イタリック文字はＢｖＦＴ１対ＢｖＦＴ２機能を媒介するアミノ酸を示す（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、上記参照）。一つの非保存領域があり、ここで、ＡｔＦＴ、ＮｔＦＴ４は、サトウダイコンからの開花促進タンパク質ＢｖＦＴ２と同様に、同一の「ＹＡＰＧＷ」モチーフを示す。
【００１６】
本発明は、新しい種類のタンパク質及び前述のタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、上記タンパク質は、（１）抑制特性を有し、（２）全ての開花促進タンパク質の「ＹＡＰＧＷ」モチーフの代わりにモチーフ「ＮＡＰＤＩＩＤＳ」を含む。その上、このモチーフは、その同一タンパク質領域において開花抑制ＢｖＦＴ１の既に特徴付けられた「ＮＡＰＱＱ」モチーフとも異なる。好ましくは、（３）上記タンパク質はＦＴクレードに属する。好ましくは、「ＦＴクレードに属する」という語は、上記タンパク質が、系統発生的にＦＴクレードに分類でき、及び／又はＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２のぞれぞれに同様に保存されているアミノ酸の少なくとも５０％、好ましくは８０％、最も好ましくは１００％を共有し（図１０中、＊の印が付けられたアミノ酸列を参照）、及び／又はタンパク質ＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２のいずれかの中にあるアミノ酸配列鎖の少なくとも７０％、好ましくは８０％、更に好ましくは９０％を共有することを意味するものとする。
【００１７】
更に、本発明者は、モチーフ「ＡＰＤＩＩＤＳ」を見出し、更には前述の及び関連したペプチド及びタンパク質の開花抑制特性に寄与するモチーフ「ＮＡＰＤＩＩＤＳ」を見出し、それ故に、ジャガイモにおける塊茎肥大の潜在的阻害因子であるとこれまでに報告されているジャガイモ遺伝子ＳｔＳＰ５Ｇ（ソラナム・ツベロサム由来）及びトマト遺伝子ＳＩＳＰ５Ｇ（ソラナム・リコペルシカム由来）並びにそれらから得られるタンパク質が、ジャガイモ及びトマト並びにそれらで形質転換された遺伝子組み換え植物の開花抑制に重要な役割を果たすことを初めて見出した。
【００１８】
更に、本発明者は、核酸及び前述の核酸によって発現できるタンパク質又はペプチドであって、上記核酸の配列の一部又は全部が配列番号１、２、３及び４のうち一つの配列であり（図１〜４）或いはタンパク質又はペプチドの配列の一部又は全部が配列番号５、６、７及び８のうち一つの配列であり（図５〜８）、好ましくは従属請求項に示されるものである核酸及びタンパク質又はペプチドを提供する。
【００１９】
更に、本発明の核酸配列のいずれかはプロモーターの制御を受けることができる。上記プロモーターは、タバコに本来存在する、細胞特異的で、時間誘導性プロモーターとすることができ、好ましくは遺伝子ＦＴ１〜ＦＴ４を自然に制御するプロモーターであり、それにより師部伴細胞においてＦＴの発現を誘導する。更に、上記プロモーターは、タバコ由来の組織特異的又は細胞特異的で、花成誘導組織であるＳＡＭにおいて優先的に発現されるＦＤプロモーター（ここで、ＦＤはＦＴの補助因子である）のような経時的構成的活性化プロモーターとすることができる。
【００２０】
代わりに、上記プロモーターは、他の植物から得ることができ、例えば細胞特異的で、時間誘導性の、シロイヌナズナＦＴのプロモーター又はスクロース輸送体ＡｔＳＵＣのプロモーターであり、両者は、ソース葉の師部伴細胞において活性がある。更に、上記プロモーターが、組織特異的又は細胞特異的で、シロイヌナズナＦＴのプロモーターのような経時的構成的活性化プロモーターであることもあり得、ＳＡＭにおいて発現を駆り立てる。
【００２１】
市販される他のプロモーター又は他の源から入手できるプロモーター、並びに合成プロモーターも同様に使用でき、両者は任意に他の調節成分と、特に増強成分と併用でき、例えば、空間的及び時間的で、構成的活性が強い、ウイルス、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターである。どんな場合でも、上記プロモーターは、構成的であってもよいが、この特徴は必須のものではない。
【００２２】
本発明の核酸及びペプチド／タンパク質は、開花の時期の調節（延期）又はその完全な抑制を通じて、植物／時間単位当たりのバイオマスの増強に使用されることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】配列番号１を示す。
【図２】配列番号２を示す。
【図３】配列番号３を示す。
【図４】配列番号４を示す。
【図５】配列番号５を示す。
【図６】配列番号６を示す。
【図７】配列番号７を示す。
【図８】配列番号８を示す。
【図９】タバコＦＴ同族体ＮｔＦＴ１−４の分類を示す。
【図１０】植物ＰＥＢＰファミリーの見本となるように選ばれたメンバーのタンパク質アラインメントを示す。
【図１１】タバコ組織培養を示す。
【図１２】ＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２又はＮｔＦＴ３−遺伝子組み換え植物のＬＤ／ＳＤ培養実験を示す。
【図１３】ＮｔＦＴ１−３を過剰発現する重度表現型の遺伝子組み換えタバコ系統のＬＤ条件下での生長挙動を示す。
【図１４】ＮｔＦＴ１−３を過剰発現する重度発現型の遺伝子組み換えタバコ系統のＳＤ条件下での生長挙動を示す。
【図１５】個別のＮｔＦＴの発現レベルをＮｔＥＦ１αとの関連で示す。
【図１６】シロイヌナズナに関するＮｔＦＴの開花抑制機能を示す。
【図１７】ジャガイモに関するＮｔＦＴの開花抑制機能を示す。
【図１８】部位特異的変異誘発による置換を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
続いて、好適な実施態様及び実施例の観点から本発明を更に説明する。
【００２５】
（ニコチアナ・タバカムからのＦＴ同族体の同定及び系統発生的分類）
タバコにおけるＦＴの潜在的同族体を同定するため、ｃＤＮＡクローン（ＤＶ９９９４５５．１）の同定に至るＢＬＡＳＴクエリーとしてシロイヌナズナＦＴ（ＡｔＦＴ）のコード領域を用いて、公共の配列データベース（ＮＣＢＩ）をスクリーニングした。それは、全オープンリーディングフレームを含有し、ＡｔＦＴでのアラインメントによって示される。このｃＤＮＡクローンに基づき、プライマーをデザインし、その後に、タバコ葉ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを用いる幾つかのＰＣＲアプローチに用いた。その際に、４つの潜在的ＦＴ同族体のオープンリーディングフレーム及びゲノム配列を同定でき、ＮｔＦＴ１−４として指定した；その核酸配列を配列番号１〜４に示す（図１〜４参照）。ゲノム及びＤＮＡ配列のアラインメントは、図９Ａに示されるように、ＮｔＦＴ１−４のエクソン・イントロン構造を明らかにした。この図は、タバコＦＴ同族体ＮｔＦＴ１−４の分類を示す。（Ａ）パートから明らかなように、タバコＮｔＦＴ１−４のエクソン・イントロン構造はＡｔＦＴの構造と似ている。エクソンはボックスとして示され、線がイントロンを表す。点線は、未知の大きさのイントロンを示す。（Ｂ）パートは、同定したタバコＦＴ同族体ＮｔＦＴ１−４を含めたＫａｒｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）によって定義された植物ＰＥＢＰファミリーの系統樹を表現する。略称の意味は次の通りである：ＡＴＣ：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｅｎｔｒｏｒａｄｉａｌｉｓ；ＢＦＴ：ＦＴ及びＴＦＬ１のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｂｒｏｔｈｅｒ；ＦＴ：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｌｏｃｕｓ  Ｔ；ＭＦＴ：ＦＴ及びＴＦＬ１のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｍｏｔｈｅｒ；Ｎｔ  ＣＥＴ１，２，４：タバコからのＮ．ｔａｂａｃｕｍ  Ｃｅｎｔｒｏｒａｄｉａｌｉｓ様遺伝子；Ｎｔ  ＦＴ１−４：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｌｏｃｕｓ  Ｔ；ＴＦＬ１：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｆｌｏｗｅｒ  １；ＴＳＦ：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｔｗｉｎ  Ｓｉｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｌｏｃｕｓ  Ｔ。
【００２６】
これらの配列から明らかなように、全ての潜在的ＮｔＦＴは、それら自身の中で、また、３つのイントロンで遮断された４つのエクソンを持つ他の種からのＦＴ遺伝子に対して（見本となるようにＡｔＦＴと比較すると）、類似のゲノム構造を有する。エクソンの長さは高度に保存されているが、イントロンの長さはＮｔＦＴの中で異なる。
【００２７】
推定タバコＦＴの配列解析は、全タンパク質が特徴的なＰＥＢＰドメインを保有するため、それらがＰＥＢＰ遺伝子ファミリーに属することを明らかにした。タバコからの同定ＦＴ同族体の系統発生関係を解明するため、４つの推定タバコＦＴのアラインメントから最尤系統樹を作り、３つのＰＥＢＰファミリークレードに対するタバコＦＴ同族体のアラインメントを容易にした（図９Ｂ及び例１参照）。シロイヌナズナタンパク質ＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１及びＡｔＭＦＴは、予期したように、３つの主要クレードを標的にする一方で、タバコＦＴ同族体は、ＦＴ様クレードにはっきりと密集しており、それらの開花における促進機能を示す。
【００２８】
ＮｔＦＴ１−４の系統発生分類を確認するため、これら推定タバコＦＴのアミノ酸配列アラインメントを開花促進シロイヌナズナＦＴ並びに開花抑制シロイヌナズナＴＦＬ１及びそのタバコ同族体ＣＥＴ１、ＣＥＴ２及びＣＥＴ４と共に作成した（図１０）。潜在的タバコＦＴは、相対的に高い全体配列同一性を示し、互いには約７０％（ＮｔＦＴ３とＮｔＦＴ４）から約８９％（ＮｔＦＴ１とＮｔＦＴ３）であり、ＡｔＦＴとは約６２％（ＮｔＦＴ２）から約７３％（ＮｔＦＴ４）である。対照的に、それらは、タバコＣＥＴ（約５２％）及びシロイヌナズナＴＦＬ１（約５２％）に対して低い配列同一性を示す。ＥＭＢＯＳＳニードル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）で得られた全配列同一性の詳細なリストを以下の表１に与える。系統樹及び配列類似性を考慮すると、推定タバコＦＴ、即ちＮｔＦＴ１−４はＴＦＬ１クレードよりもＦＴクレードに属することが明らかになる。
【００２９】
【表１】
2018078909.tif 000002
【００３０】
（開花におけるタバコＦＴ遺伝子の拮抗作用の検出）
開花時期の調節におけるＮｔＦＴ１−４の機能を評価するため、タバコにおける強力な構成的カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ：ＮｔＦＴ）の制御下で、対応する遺伝子を異所的に過剰発現させた。アグロバクテリウムが形質転換を媒介した後、各構築物について最大７つの独立した遺伝子組み換え系統を再生させた。
【００３１】
タバコ組織培養において、本発明者は、３５Ｓ：ＮｔＦＴ４構築物が開花を強く加速し、過剰発現が植物発育の非常に早い段階において花及び花様構造物をもたらすことが分かった。これは、図１１Ａ及び１１Ｂから導き出すことができる：写真（Ａ）及び（Ｂ）は、植物の苗条を示し、ここで、ＮｔＦＴ４のコード領域は、カリフラワー・モザイク・ウイルス（３５Ｓ）の構成的プロモーターの下流でクローン化され、アグロバクテリウム媒介形質転換によってタバコ中に導入された。花様構造物を持つ苗条だけが再生でき、苗条は発育を停止し、根を形成せず、それにより成熟植物の再生を終わらせた。それ故に、それらは成熟植物に再生できなかった。表現型は、この実験では対照としての役割を果たすシロイヌナズナＦＴの過剰発現によって生じるもの（３５Ｓ：ＡｔＦＴ）とほぼ同一であった（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
【００３２】
対照的に、構築物３５Ｓ：ＮｔＦＴ１、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２及び３５Ｓ：ＮｔＦＴ３の形質転換体は、組織培養においてほぼ正常の苗条を発生させた。これらすべての構築物の小植物は、異なる発現レベルであるが、（各系統の２つのクローンを同一発現レベルで得るために）挿し木により繁殖され、小植物が根を発生するまで組織培養において培養された。その後、各系統の遺伝子組み換えクローンをファイトトロンに移したが、一方のクローンはＬＤ（長日）条件下で培養され、他方はＳＤ（短日）条件下で培養され、開花時間を測定した。これらの条件下で、共培養された野生型対照植物は、４週（ＬＤ）及び５週（ＳＤ）後に花をつけ始め、開花がＳＤ下で遅れたことを示した。同じＬＤ／ＳＤ培養実験において、ＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２又はＮｔＦＴ３−遺伝子組み換え植物は異なって発育し、両方の培養条件下での開花時間及び生長に対して、軽度、中程度及び重度の表現型を示した。これは図１２Ａから１２Ｆに示されるように観察できた：ＮｔＦＴ１（Ａ、Ｄ）、ＮｔＦＴ２（Ｂ、Ｅ）又はＮｔＦＴ３（Ｃ、Ｆ）を過剰発現させる代表的な遺伝子組み換えタバコ系統を長日（ＡからＣ）又は短日（ＤからＦ）条件下で生長させた。野生型（ＷＴ）植物が開花を始めた時点で、遺伝子組み換え系統は、その生長挙動及び開花時間によって、３つの表現型グループに分類された：軽度表現型の遺伝子組み換え系統は、ＷＴ植物よりわずか数日だけ遅れて開花し始め、中程度の表現型系統では、約１週間開花が遅れた。ただ３５Ｓ：ＮｔＦＴ３構築物では、中程度の表現型が観察できなかった。ＷＴの開花時に、軽度に影響を受けたすべての植物は、ＷＴ植物と同程度の表現型を見せ、開花時間はわずかに遅れただけであったが（約３ｄ）、中程度に影響を受けた植物は、１〜１．５週間遅れて最初の花を発生し、わずかに減少した節間長を示した。対照的に、重度に影響を受けた植物は同じ時間枠で少しも花をつけず、節間の著しい短縮が原因で起きた生長の長さの大きな減少が明らかになった。この生長期間中、葉の枚数は、植物が軽度、中程度又は重度表現型であるかどうかにかからわず、ＷＴと同程度であった。葉のＲＮＡ全体を用いた包括的定量的（ｑ）ＲＴ−ＰＣＴ実験によれば、表現型とトランス遺伝子発現レベルの間に直接的相関関係があることが示され、最も重度に影響を受けた植物で見られた所定のＮｔＦＴ遺伝子が最も高い転写レベルであった。これは、図１２Ｇ〜１２Ｉから分かる。ここで、生長挙動及び開花時間について重度の表現型は、対応するトランス遺伝子の発現レベルとの間に正の相関が認められることを示す。図１２Ｊ〜Ｌのグラフは、ｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、ここで、ＷＴ発現レベルを１として、３つの表現型クラスのそれぞれを表す全系統の平均値を示す。棒は平均の標準偏差を表す；ｎ＝１の場合、棒は、対応するｑＲＴ−ＰＣＲの三重反復試験の標準偏差を表す。図（Ｊ）から（Ｌ）は、長日（ＬＤ）及び短日（ＳＤ）条件下でのＷＴとＮｔＦＴ１（Ｊ）、ＮｔＦＴ２（Ｋ）又はＮｔＦＴ３（Ｌ）を過剰発現する遺伝子組み換え植物の開花までの週数（ファイトトロンへの移行後）を示す。符号「＞」は、示された週数以後も植物が依然として開花していないことを示す。
【００３３】
次に、重度に影響を受けた植物における花の発生が本当に抑制されたのか又はまだ遅れているのかを決定しようと試みた。それ故に、重度に影響を受けたすべての３５Ｓ：ＮｔＦＴ１−３植物をＬＤ条件下で温室において更に栽培した。図１３は、ＮｔＦＴ１−３を過剰発現する重度表現型の遺伝子組み換えタバコ系統の生長挙動を示す。写真（Ａ）から（Ｊ）は、模範となるように選ばれたＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２又はＮｔＦＴ３を過剰発現する系統を長日条件下で生長させたものの時系列を示す。ファイトトロンに移してから８、１１．５及び２９週後（ｗａｔ）に写真を撮った。Ｉ及びＪの野生型（ＷＴ）植物は８週である。重度表現型系統の薹立ち時点は過剰発現レベルと相関する（表３）。なぜなら、８．５ｗａｔにて既に薹立ちしている植物（３５Ｓ：ＮｔＦＴ１Ｌ１及び３５Ｓ：ＮｔＦＴ２Ｌ１）は、重度表現型植物の中で最も低い発現レベルを見せるからである。８．５ｗａｔで圧縮した表現型の植物はおよそ１１．５ｗａｔで薹が立ち始めたが、それらはまさに栄養生長を続けており、ＬＤ条件下で花をつけ始めようとする試みが全くない。左側の棒は５０ｃｍを示し、右側の棒は１ｍを示す。図１３（Ｋ）は、開花ＷＴ植物と重度の過剰発現タバコ系統の間で２８ｗａｔでの葉数、高さ、茎直径及び葉サイズの比較を示す。明らかに、重度の過剰発現系統においては全パラメータが著しく増大している。図１３（Ｌ）は、２８週の３５Ｓ：ＮｔＦＴ２Ｌ２、３５Ｓ：ＮｔＦＴ３Ｌ１と８週の開花ＷＴ植物の間における尖端（トップ）、中間（ミドル）及び基底（ボトム）の葉の比較を示す。棒＝１０ｃｍである。
【００３４】
３５Ｓ：ＮｔＦＴ１遺伝子組み換え系統のすべてと、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２遺伝子組み換え系統の１つは、６〜８週後に薹が立ち始め、その結果、１１週後に高さ約２ｍで花を発生させたが（図１３Ａ及びＢ、Ｅ及びＦには一個体の系統が模範となるように示される）、残りの３５Ｓ：ＮｔＦＴ２遺伝子組み換え系統と、すべての３５Ｓ：ＮｔＦＴ３遺伝子組み換え系統は、花のない圧縮された表現型を取り続けた（図１３Ｃ及び１３Ｄ、１３Ｇ及び１３Ｈ）。定量的ｑＲＴ−ＰＣＲ実験によれば、圧縮表現型を保つ植物においてはＮｔＦＴ転写レベルが概して高いことが示された（表３）。花のない圧縮された３５Ｓ：ＮｔＦＴ２遺伝子組み換え系統とすべての３５Ｓ：ＮｔＦＴ３遺伝子組み換え系統は、生殖相へ移行せずに９ヶ月以上に亘って生長を続けた（図１３Ｉ及びＪ）。それは観察の最長期間であった。上記遺伝子組み換え系統は最大５ｍの大きさに達し、それによりバイオマスの大幅な増加を示した：実験の終わりで、それらは、約１２０枚の葉を保有し、成熟葉の長さの最大サイズが６５ｃｍであり、８週のＷＴ植物と比較してサイズが約１．５倍増加した（図１３Ｋ及びＬ）。茎についても約３．５倍というバイオマスの同じような増加が認められる（図１３Ｋ）。注目すべきことには、重度に過剰発現する植物のＳＤ条件下での培養は、６月後に終了せざるを得なかったことである。その時、植物は、高さが２ｍあり、ファイトトロンの天井に達していたからである。その時まで、植物は、ＬＤ条件下で育てられたそれらの対応物と同じように発達した。このことは、図１４から導くことができる。図１４は、ＮｔＦＴ１−３を過剰発現する重度発現型の遺伝子組み換えタバコ系統のＳＤ条件下での生長挙動を示す。写真（Ａ）から（Ｊ）は、模範となるように選ばれたＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２又はＮｔＦＴ３を過剰発現する系統をＳＤ条件下で生長させたものの時系列を示す。写真は、各画像について以下に示されるように撮影された（ｗａｔ：ファイトトロンに移してからの週数）。Ｉ及びＪの野生型植物は８週である。重度表現型系統の薹立ち時点は過剰発現レベルと相関する（表３）。なぜなら、４〜６ｗａｔにて既に薹立ちしている植物（３５Ｓ：ＮｔＦＴ１Ｌ１及び３５Ｓ：ＮｔＦＴ２Ｌ１）は、重度表現型植物の中で最も低い発現レベルを見せるからである。４〜６ｗａｔで圧縮表現型の植物はおよそ１４〜１６ｗａｔで薹が立ち始めたが、それらはまさに栄養生長を続けており、ＳＤ条件下で花をつけ始めようとする試みが全くない。ファイトトロン内の高さ制限のため、ファイトトロンの上端レベルにまで植物が達したという理由で、ＳＤ条件下での培養を停止せざるを得なかった。
【００３５】
（葉における全ＮｔＦＴの基底発現パターンの検出）
開花抑制ＮｔＦＴ１−３及び開花促進ＮｔＦＴ４の空間的及び時間的発現プロファイルを解析した。このため、ＬＤ及びＳＤ条件下で培養された４週のタバコ植物の葉、尖部、茎及び根の組織から全ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを受けた。図１５には、個別のＮｔＦＴの発現レベルが、参照遺伝子としたＮｔＥＦ１αとの関連で示される。ＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２及びＮｔＦＴ４は、両方の光条件下で、葉組織においてのみ発現したが、すべての遺伝子の転写レベルは低く、ＬＤ条件下での検出限界に近いものであった。このことは、図１５Ａ及びＢから分かる。図１５Ａ及びＢにおいて、ＮｔＦＴ１、２及び４は、ＬＤ下での発現レベルが検出限界に近いものの、ＳＤ（Ａ）条件下とＬＤ（Ｂ）条件下で葉においてのみ発現されることが示される。値は、参照遺伝子ＥＦ１ａの転写レベルに正規化された。ＮｔＦＴ３ではｃＤＮＡが得られるが、発現レベルが低すぎ、そのｑＲＴ−ＰＣＲによる時空的発現を確実に解析できなかった。
【００３６】
抑制ＮｔＦＴ遺伝子の発現部位に関する追加の洞察を得るため、ＮｔＦＴ３の１−ｋｂプロモーターフラグメント（ＰＮｔＦＴ３）の制御下で、ＥＲ標識付きバージョンの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰＥＲ）を模範となるように発現させることによって、空間的発現を研究した。独立した５つの遺伝子組み換えタバコ系統を、アグロバクテリウムで媒介した植物の形質転換によって得、ＰＮｔＦＴ３：ＧＦＰＥＲと指定した。ＧＦＰ発現細胞を正確に同定するため、師部によるＧＦＰの拡散が防げるようにＥＲ標識付きバージョンのＧＦＰを選んだ。図１５（Ｃ）及び（Ｄ）は、共焦点レーザー走査顕微鏡法ＣＬＳＭによるＮｔＦＴ３発現の局在を示す。１ｋｂのＮｔＦＴ３プロモーターをレポーター遺伝子ＧＦＰ−ＥＲの上流でクローン化し、アグロバクテリウム媒介形質転換によってタバコ植物に安定に転換させた。ＣＬＳＭによれば、図１５（Ｃ）の葉柄の断面図によって示されるように、ＧＦＰ発現が葉の維管束に限定されていることを示した。最も強い信号を根出葉の葉脈で観察できたが、それにもかかわらず、発現ひいては蛍光が弱く、検出に要する高レーザー強度による木質部の強い自己蛍光によって示された。それ故に、ＮｔＦＴ３の発現は、維管束に、より正確には伴細胞に局在できる（Ｄ、葉柄の縦断面図）。木質部の自己蛍光（Ｘ）は、ＮｔＦＴ３の低い発現レベルを反映する。（Ｃ）の矢印は、維管束を示す。（Ｄ）の矢じりは、アニリンブルーで染色した篩板を指し示す。ＣＣ：伴細胞；ＳＥ：篩要素；棒＝５０μｍである。葉柄の縦断面図から明らかなように、ＰＮｔＦＴ３は、師部伴細胞（ＣＣ）で活性がある細胞レベルで示され、典型的には篩要素（ＳＥ）に隣接して局在しており、その篩板をカロース染色染料アニリンブルーで染色した（図１５Ｄ）。それ故に、ＰＮｔＦＴ３活性は、ＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２及びＮｔＦＴ４の葉特異的発現を映し、それによって、活性化機能と抑制機能を持つ両ＦＴの共通する空間的発現パターンが示される。
【００３７】
次に、様々な発達段階での発現レベルを比較することによって、ＮｔＦＴの時間的発現パターンをより詳細に解析した。このため、タバコの実生と、ＬＤ及びＳＤ条件下で培養されたタバコ植物から開花まで毎週収集された根出葉の全ＲＮＡを用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＮｔＦＴ１−４の発現が推定された。図１５（Ｅ）〜１５（Ｇ）から分かるように、ＮｔＦＴ１（Ｅ）、ＮｔＦＴ２（Ｆ）及びＮｔＦＴ４（Ｇ）の発現レベルは、ＳＤ条件下での発達の間徐々に増加し、実生において最も低い発現レベルを示し（時点１）、開花植物の葉において最も高い発現レベルを示す（時点６）。実生（時点１）と、最初の花が開くまで毎週収集された根出葉（時点２〜６）において、転写レベルを決定した。値は、参照遺伝子ＥＦ１ａの転写レベルに正規化された。
【００３８】
空間的発現パターンの解析により既に言及されたように、ＮｔＦＴ３のＳＤ及びＬＤ下での発現レベル並びに残りのＮｔＦＴのＬＤ下での発現レベルは、検出限界に近いものであった。ＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２及びＮｔＦＴ４では、ＳＤ条件下で同じような発現パターンが観察された：すべての遺伝子は、かなり低い発現を実生で見せたが、発達段階中での連続増加が明らかになり、すべてのＮｔＦＴの発現レベルは、開花時点で最大に達した。この事実はＮｔＦＴ３についても認められるように見える。ＮｔＦＴ４は、一般にＮｔＦＴ１及びＮｔＦＴ２より低い発現レベルを示すように見えるが、ＮｔＦＴ４発現の増加（４４００倍）は、開花の時点で、ＮｔＦＴ１発現の増加（１６４倍）とＮｔＦＴ２発現の増加（９３６倍）を大きく超えるものであった。図１５（Ｈ）は、発現レベルの増加を視覚化する。各遺伝子の時点２〜６の値を時点１（各遺伝子で１と設定した）に当てはめた。一見したところ、ＮｔＦＴ４（花成活性化因子をコードする）の発現レベルは、ＮｔＦＴ１又はＮｔＦＴ４（花成抑制因子をコードする）の発現レベルよりもずっと高い倍率まで増加する。シロイヌナズナ又はイネのような幾つかの種では既に説明したように、ＦＴ発現が、光周期に依存して調節される。タバコＦＴの発現がＬＤ条件下ではほとんど検出できなかったがＳＤ条件下では徐々に増加したという事実によって、タバコのＦＴ発現も光周期に依存しており、ＳＤ条件下での開花はＦＴ依存的に調節されると結論を出すことができる。しかしながら、ＬＤ条件下での花成誘導の分子基盤は依然として分かりにくい。欠損した配列データのため、ＬＤ条件下での花成誘導がＦＴ非依存的に起こるのか又は更なるＦＴオルソログが関わっているのか最終的に明らかにすることは未だできていない。
【００３９】
（他の植物種に関するＮｔＦＴ１−３の開花抑制機能の移動可能性）
ＮｔＦＴの開花抑制機能が原則として他の種に対しても適用できるかどうか解明するため、模範となるように、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２が、モデル植物シロイヌナズナ、アブラナ科のメンバー、及び花成抑制機能を持つＦＴを保有しない植物において過剰発現された。３５Ｓ：ＮｔＦＴ２遺伝子組み換えシロイヌナズナ植物が、アグロバクテリウム媒介形質転換によって得られ、表現型が解析された。異なる形質転換体の開花時間の分析により、タバコの３５Ｓ：ＮｔＦＴ１−３の過剰発現から得られるものと似た結果であることが明らかになった。３５Ｓ：ＮｔＦＴ２の発現レベルが高い植物は、誘導的ＬＤ条件下で開花の遅い表現型を示す。これは、図１６Ａから１６Ｃに示される。ＷＴシロイヌナズナ植物は、発芽して約８週間後に正常に開花したが（図１６Ａ）、重度表現型を示す形質転換体は、約１〜２週間遅れて開花した（図１６ＢにはＮｔＦＴ２Ｌ２が模範となるように示される）。それ故に、シロイヌナズナにおけるＮｔＦＴ２の過剰発現もまた開花を遅らせる。更に、それは、バイオマスの増加をもたらす（Ｃ）：誘導的長日条件下で植物を生長させ、野生型対照植物が開花し始めた時点（Ａ及びＢ）及び一週間後（Ｂ）に写真を撮った。タバコほど目覚ましいものではないが、ＮｔＦＴ２を強く過剰発現するシロイヌナズナ植物もまたバイオマスの増加を示すことが認められ、葉の大きさ、葉の枚数及び茎直径の増加を特徴とする（図１６Ｂ及び１６Ｃ）。
【００４０】
更に、ジャガイモ種ソラナム・ツベロサムにおいて３５Ｓ：ＮｔＦＴ１１−３を過剰発現させた。その遺伝子組み換えジャガイモ植物は、アグロバクテリウム媒介形質転換によって得られ、表現型が解析された。異なる形質転換体の開花時間の分析により、タバコの３５Ｓ：ＮｔＦＴ１−３の過剰発現から得られるものと似た結果であることが明らかになった。３５Ｓ：ＮｔＦＴ１、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２又は３５Ｓ：ＮｔＦＴ３の発現レベルが高い植物は、ＬＤ条件下で開花の遅い表現型を示す（図１７）。ＷＴジャガイモ植物は、温室に移して約８週間後に正常に開花したが（図１７Ａ）、形質転換体は、５ヶ月以上に亘って温室で生長し続けたが、生殖相への移行を経験しなかった（図１７Ｂ、３５Ｓ：ＮｔＦＴ１が模範となるように示される）。それは観察の最長期間であった。遺伝子組み換え系統は、最大で約３ｍの大きさに達し、それによって、バイオマスの増加が示された。
【００４１】
それ故に、抑制ＮｔＦＴによって媒介された花成抑制は、種にまたがって機能することが明らかになり、本発明は、同様に、タバコ以外の植物、例えばソラナム属（一例としてはジャガイモがある）のような、ナス科ファミリーの他の属の植物、又はアブラナ科ファミリーのような他の植物ファミリーの植物の形質転換に使用できる。
【００４２】
最も注目されるＮｔＦＴ１−３の特徴は、系統発生学的に明らかにＦＴ様クレードに関係するにもかかわらず、３つすべてのタンパク質が開花抑制機能を有することであり、それ故、機能的にＴＦＬ１に匹敵する。シロイヌナズナからのＴＦＬ１及びＦＴのＸ線解析によれば、これらＰＥＢＰファミリータンパク質の典型的な構造的特徴が２つ明らかになった：一つは推定リガンド結合ポケットであり、他方では外部ループである（Ｂｅｎｆｉｅｌｄ及びＢｒａｄｙ，２０００；Ｈａｎｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これら構造的特徴の主要アミノ酸が、シロイヌナズナにおけるＦＴ機能対ＴＦＬ１機能にとって重要であると示唆されている（Ｈａｎｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ここで、Ｔｙｒ８５は、結合ポケットの入り口に位置し、ＦＴ機能にとって不可欠であり、一方、Ｈｉｓ８８（ＴＦＬ１の対応位置）はＴＦＬ１機能を媒介する。２番目の重要なアミノ酸は、４番目のエクソンによってコードされる外部ループを構成する１４のアミノ酸の一部である（セグメントＢ）。それは、ＴＦＬ１オルソログにおいてかなり急速に進化したが、ＦＴオルソログのほぼ不変異体である（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＴＦＬ１では、Ａｓｐ１４４がＨｉｓ８８と共に水素結合を形成し、一方、ＦＴはグルタミンを対応する位置（Ｇｌｎ１４０）に保有し、Ｔｙｒ８５と相互作用しない。表２は、部分的な配列アラインメントを示し、ここに記載される抑制及び活性化タバコＦＴ双方の重要アミノ酸は、シロイヌナズナからのＦＴ／ＴＦＬ１、開花促進ＢｖＦＴ２及び開花抑制因子ＢｖＦＴ１、並びに開花抑制因子であるソラナム・リコペルシカムからのＳＩＳＰ５Ｇ及びソラナム・ツベロサムからのＳｔＳＰ５Ｇと比較して示される。上部の星印は、ＡｔＦＴ（Ｔｙｒ８５／Ｇｌｎ１４０）対ＡｔＴＦＬ１（Ｈｉｓ８８／Ａｓｐ１４４）機能に不可欠なアミノ酸を示す（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。セグメントＢは、エクソン４の一部であり、ＴＦＬ１同族体においてかなり急速に進化したがＦＴ同族体のほぼ不変異体である外部ループをコードする。イタリック体の文字は、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の拮抗作用に重要なアミノ酸を示す（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。アミノ酸配列に関し、ＮｔＦＴ１−３及びＢｖＦＴ１は２つの重要なアミノ酸残基（又はそれらの保存された置換）を含有し、対応する位置でそれらはシロイヌナズナのＦＴ機能にとって不可欠である（Ｔｙｒ８５及びＧｌｎ１４０）ことが明らかになる。従って、これらのアミノ酸は、サトウダイコンＦＴについて既に説明された事実であるが、タバコにおけるＦＴ機能の決定に必須ではない（Ｐｉｎ  ｅｔ．２０１０）。
【００４３】
【表２】
2018078909.tif 000003
【００４４】
記載されている別の重要な配列三連構造（ＬＹＮ、セグメントＣに位置する）は、ＦＴ同族体において保存され、それ故にＦＴ機能にとって潜在的に不可欠であり、ＮｔＦＴ１−３において明らかに変化するが、花成抑制因子ＢｖＦＴ１に存在する（表２）。後者は、セグメントＢの３つのアミノ酸残基がその開花誘導オルソログＢｖＦＴ２と異なり（表２のイタリック体）、これら残基の置換が活性化因子を抑制因子に変え、その逆もまたしかりである（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。既に知られているナス科特異的活性化ＦＴ（ＮｔＦＴ４）は、この位置に、開花誘導ＡｔＦＴ及びＢｖＦＴ２と同一のアミノ酸を保有しており、一方、抑制ＮｔＦＴ１−３、抑制ＳｔＳＰ５Ｇ及び抑制因子ＳＩＳＰ５Ｇのアミノ酸配列は、抑制ＢｖＦＴ１と大きく異なるが、代わりに３つのアミノ酸ＩＩＤの保存された挿入を示す。それ故に、発明者は、ＦＴの抑制対促進機能についての種特異的アミノ酸パターンを想定した。
【００４５】
この仮説を検証するため、ドメイン交換試験を行った。抑制機能を持つタバコＦＴのモチーフＮＡＰＤＩＩＤＳ（ＮｔＦＴ１）は、部位特異的変異誘発によって、活性化機能を持つタバコＦＴのＹＡＰＧＷ（ＮｔＦＴ４）に置換された（図１８）。それ故に、３５Ｓ：ＮｔＦＴ１ｓｗａｐをタバコにおいて過剰発現し、アグロバクテリウム媒介形質転換によって遺伝子組み換えタバコ植物を得、表現型を解析した。遺伝子組み換え植物が温室に移して４週間後に開花したため、花成抑制機能はＮＡＰＤＩＩＤＳモチーフの置換によって除去されたことが明らかになった。
【実施例】
【００４６】
（例１：タバコＦＴ同族体のクローニング及びその進化的関係の分析）
タバコの潜在的なＦＴの同族体を同定するため、シロイヌナズナＦＴ（ＡｔＦＴ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０２７５０４．１）のコード領域をＢＬＡＳＴクエリーとして用いて、公共の配列データベース（ＮＣＢＩ）をスクリーニングした。タバコＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＶ９９９４５５．１）が同定され、それを用いて、エクソン１（アミノ酸１〜８）及びエクソン４（アミノ酸１７３〜１７７）に位置する初期プライマー対を設計した。潜在的タバコＦＴをｃＤＮＡレベルで単離するため、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡプラントキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてタバコ葉から全ＲＮＡを抽出し、製造業者の指示を受けてＳｕｐｅｒＳｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに転換した。ｃＤＮＡ端の急速増幅等のｃＤＮＡ又はＰＣＲ技術でＰＣＲを行い（ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、対応するゲノム配列を同定するためにゲノムウォーキングを行い（ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌキット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、幾つかのＰＣＲ産物を得ることができた。当業者に知られる常法を適用して、これらＰＣＲ産物を切断、精製、クローン化及び配列決定した。配列解析によって、ＡｔＦＴとの高い配列類似性を共有する異なる配列を持つ４つの同族体（ＮｔＦＴ１−４）が明らかになった。ゲノム及びｃＤＮＡ配列のアラインメントは、ＮｔＦＴ１−４のエクソン・イントロン構造を明らかにした。図９Ａにおいて図式的に示す。この図から明らかなように、すべての潜在的ＮｔＦＴは、それら自身の中で類似のゲノム構造を有し、また、３つのイントロンで遮断された４つのエクソンを持つ他の種からのＦＴ遺伝子に対して（模範となるようにＡｔＦＴと比較して）類似のゲノム構造を有する。エクソンの長さは高度に保存されているが、イントロンの長さはＮｔＦＴの中で異なる。
【００４７】
推定タバコＦＴタンパク質のＩｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｆａ／ｉｐｒｓｃａｎ）を用いた配列解析は、すべてのタンパク質が特徴的なＰＥＢＰドメインを保有するため、それらがＰＥＢＰ遺伝子ファミリーに属することを明らかにした。植物ＰＥＢＰ遺伝子の最近の系統発生解析は、３つの主要クレードの存在を明かした：ＦＴ様、ＴＦＬ１様及びＭＦＴ様（Ｃｈａｒｄｏｎ及びＤａｍｅｒｖａｌ，２００５）。ＰＥＢＰ遺伝子ファミリーの全メンバーは、栄養相から生殖相への移行に関与する重要な調節因子をコードしており、ＦＴ／ＭＦＴクレードの遺伝子が開花を促進し、ＴＦＬクレードの遺伝子がそれを抑制する。同定されたタバコからのＦＴ同族体の系統発生関係を解明するため、４つの潜在的タバコＦＴ、シロイヌナズナからの主要制御因子ＦＴ、ＴＦＬ１及びＭＦＴ、並びに既に記載されているタバコからのＴＦＬ１同族体ＣＥＴ１、ＣＥＴ２及びＣＥＴ４（Ａｍａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）のアラインメントから、最尤系統樹を作った。加えて、我々は、３つのＰＥＢＰファミリークレードへのタバコＦＴ同族体のアラインメントを容易にするため、Ｋａｒｇｒｅｎ及び共同研究者（Ｋａｒｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）によって特徴付けられたＰＥＢＰタンパク質と、ジャガイモＰＥＢＰ  ＳｔＳＰ３Ｄ、ＳｔＳＰ６Ａ、ＳｔＳＰ５Ｇ、ＳｔＳＰ５Ｇ様、ＳｔＳＰ９Ｄ、ＳｔＭＦＴ、ＳｔＣＥＮ１ａ及びＳｔＣＥＮ１ｂを系統樹に含めた（図９Ｂ）。シロイヌナズナタンパク質ＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１及びＡｔＭＦＴは、期待したように、３つの主要クレードを対象とするが（系統樹において赤で示した）、タバコＦＴ同族体（系統樹において緑で示した）は明らかにＦＴ様クレードに集まっており、それらの開花促進機能を示す。
【００４８】
ＮｔＦＴ１−４の系統発生的分類を確認するため、これら潜在的タバコＦＴのアミノ酸配列アラインメントを、開花促進シロイヌナズナＦＴ並びに開花抑制シロイヌナズナＴＦＬ１及びタバコ同族体ＣＥＴ１、ＣＥＴ２及びＣＥＴ４と共に、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）を用いて、作った（図１０）。潜在的タバコＦＴは、お互いに約７０％（ＮｔＦＴ３とＮｔＦＴ４）から約８９％（ＮｔＦＴ１とＮｔＦＴ３）までの比較的高い全配列同一性を示し、ＡｔＦＴとは約６２％（ＮｔＦＴ２）から約７３％（ＮｔＦＴ４）である。対照的に、それらは、タバコＣＥＴ（約５２％）及びシロイヌナズナＴＦＬ１（約５２％）に対して低い配列同一性を示す。ＥＭＢＯＳＳニードル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）で得られたすべての配列同一性の詳細なリストを表１に与える。系統樹及び配列類似性を考慮すると、推定タバコＦＴ、即ちＮｔＦＴ１−４はＴＦＬ１クレードよりむしろＦＴクレードに属することが明らかになる。
【００４９】
（例２：タバコにおける過剰発現研究によるＮｔＦＴ１−４の分子機能の特徴付け）
開花時期の調節におけるＮｔＦＴ１−４の機能を評価するため、我々は、次に、強力な構成的カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ：ＮｔＦＴ）の制御下で、タバコにおいて対応する遺伝子を異所的に過剰発現させることを試みた。それ故に、以下に示すクローニング戦略を行った。
【００５０】
ｎｏｓプロモーターの制御下でハイグロマイシン耐性遺伝子を保有するバイナリーベクターを得るため、ＮｈｅＩ及びＡｆｌＩＩでｐＣａｍｂｉａ１３００を消化し、ハイグロマイシンのコード領域を、ＮｈｅＩ及びＡｆｌＩＩで消化したｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ，１９８４）に挿入し、バイナリーベクターｐＢｉｎ１９Ｈｙｇを生じさせた。
【００５１】
ＮｔＦＴ１−４の過剰発現構築物のクローニングのため、それらのコード領域を、表４に示されるような制限部位を含有するプライマーを用いたベクターｐＣＲＩＩ（登録商標）Ｔｏｐｏ（登録商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でｃＤＮＡからのＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物を対応する制限部位に消化させ、構成的カリフラワー・モザイク・ウイルスプロモーター（３５Ｓ）の下流でｐＲＴ１０４ベクターにクローニングした（Ｔｏｅｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。次いで、３５Ｓ：ＮｔＦＴ１−４構築物を切断し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したバイナリーベクターｐＣａｍｂｉａ１３００又はｐＢｉｎ１９Ｈｙｇに挿入し、ｐＣａｍｂｉａ１３００  ３５Ｓ：ＮｔＦＴ１及びｐＢｉｎ１９Ｈｙｇ  ３５Ｓ：ＮｔＦＴ２−４を生じさせた。正の対照として、シロイヌナズナ葉ｃＤＮＡからＡｔＦＴのコード領域を増幅し、ｐＣＲＩＩ（登録商標）Ｔｏｐｏ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。次いで、以下の表４に示されるような制限部位を含有するプライマーを用いたベクターｐＣＲＩＩ（登録商標）Ｔｏｐｏ（登録商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でｃＤＮＡからのＰＣＲにより、ＡｔＦＴのコード領域を増幅させた。ＰＣＲ産物を対応する制限部位に消化させ、構成的３５Ｓプロモーターの下流でｐＲＴ１０４ベクターにクローニングした。次いで、３５Ｓ：ＡｔＦＴ構築物を切断し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したバイナリーベクターｐＣａｍｂｉａ１３００に挿入した。すべてのバイナリーベクターを配列決定により確認し、その後、電気穿孔法によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に導入した（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。形質転換実験では、滅菌条件下（ＬＤ；２３℃、１００μｍｏｌｍ−２ｓｅｃ−１）、ＭＳ培地で（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ，１９６２）、ニコチアナ・タバカムｃｖ．ＳＲ１植物を生長させ、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）に記載されるようにアグロバクテリウム媒介形質転換を行った。
【００５２】
組織培養において、３５Ｓ：ＮｔＦＴ４構築物は開花を強く加速し、過剰発現は、植物の発達の非常に早い段階で花及び花様構造物を生じさせることが分かった（図１１Ａ及びＢ）；苗条は発達を停止し、根を形成せず、それによって成熟植物の再生を消失する。表現型は、この実験の対照であるシロイヌナズナＦＴの過剰発現によって生じるもの（３５Ｓ：ＡｔＦＴ）とほとんど同じであった（図１１Ｃ及びＤ）。
【００５３】
対照的に、構築物３５Ｓ：ＮｔＦＴ１、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２及び３５Ｓ：ＮｔＦＴ３の形質転換体は、組織培養においてほぼ正常の苗条を発達させた。各構築物について独立した遺伝子組み換え系統を再生し（３５Ｓ：ＮｔＦＴ１では７つ、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２では５つ、３５Ｓ：ＮｔＦＴ３では３つ）、すべての遺伝子組み換えタバコ植物とＷＴタバコ植物の同一クローンを滅菌条件下での挿し木により作り、発根後に土壌中に移し、長日（ＬＤ；１６ｈ／明及び８ｈ／暗）又は短日（ＳＤ；８ｈ／明及び１６ｈ／暗）条件（明るいとき２５℃、暗いとき２２℃、２２０μｍｏｌｍ−２ｓｅｃ−１）下、ファイトトロン中で生長させた。開花時間及び生長挙動に関する表現型（軽度、中程度、重度）をＷＴ植物が開花した時に分類した。ファイトトロンの制限された高さのため、ＬＤ条件下で培養した植物を温室に移し（明るいとき２２〜２５℃、暗いとき２０〜２５℃、自然光の状態が７００μｍｏｌｍ−２ｓｅｃ−１以下になったら人工照明のスイッチを入れた）、一方、ＳＤ条件下での培養は、ファイトトロンの上部レベルに植物が達した時に停止させた。
【００５４】
上述したこれらの条件下で、共培養した野生型対照植物は、４週間後（ＬＤ）及び５週間後（ＳＤ）に花をつけ始め、ＳＤ下で開花が遅れたことを示す。同じＬＤ（図１２ＡからＣ）／ＳＤ（図１２ＤからＦ）培養実験では、ＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２又はＮｔＦＴ３遺伝子組み換え植物が違った形で発達し、両方の培養条件下での開花時間及び生長に対して軽度、中程度及び重度の表現型を見せた。ただ３５Ｓ：ＮｔＦＴ３構築物では、中程度の表現型を観察できなかった。ＷＴ開花時に、軽度に影響を受けたすべての植物は、ＷＴ植物と同程度の表現型を見せ、開花時期はほんのわずかに遅れただけであったが（約３ｄ）、中程度に影響を受けた植物は、最初の花の発生が１〜１．５週間遅れ、わずかに減少した節間長さを示した。対照的に、重度に影響を受けた植物は、同じ時間枠で全く花をつけず、節間の著しい短縮によって引き起こされる生長長さの大きな減少が明らかになった。この生長期間中、植物が軽度、中程度又は重度の表現型を見せるかどうかにかかわらず、葉の数は、ＷＴと同程度であった。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡプラントキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出された葉の全ＲＮＡを用いて、包括的定量的（ｑ）ＲＴ−ＰＣＲ実験を行い、ＤＮＡｓｅＩ（ＮＥＢ）の使用とその後のフェノール・クロロホルム抽出によりゲノムＤＮＡの除去を行った。製造業者の指示を受けてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により全ＲＮＡ１μｇを逆転写し、それぞれの定量的リアルタイムＰＣＲ反応（ｑＲＴ）において１μｌのｃＤＮＡを用いた。ｉＱ  ＳＹＢＲグリーン・スーパーミックス（Ｂｉｏｒａｄ）を用いるＣＦＸ９６サイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）において４５サイクル実施し、次いで融点曲線を実施した。ＮｔＦＴ１−４の各ＲＴサンプルを三重反復試験でアッセイし、一方、参照遺伝子、ＮＲＴ対照（逆転写しなかった）及びＮＴＣ対照（非鋳型対照）を二重反復試験でアッセイした。２つの潜在的参照遺伝子ＥＦ１α及びＬ２５（Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＤｅｌａｎｅｙ，２０１０）の転写レベルを各ＲＴサンプルで調べた。これら遺伝子の中で、ＥＦ１αが最も安定に発現していることが分かり、それ故に、この遺伝子を用いてＮｔＦＴ１−４の転写レベルを正規化した。ＲＥＳＴ−ＭＣＳソフトウェア（Ｐｆａｆｆｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて相対的発現レベルを算出した。ｑＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを表４に示す。
【００５５】
ｑＲＴ−ＰＣＲは、表現型とトランス遺伝子発現レベルの間に直接相関関係があることを示し、最も重度に影響を受けた植物においては所定のＮｔＦＴ遺伝子の転写レベルが最も高いことが分かった（図１２ＧからＩ）。
【００５６】
次に、我々は、重度に影響を受けた植物における花の発生が本当に抑制されたのか又はまだ遅れているのかを決定しようと試みた。それ故に、重度に影響を受けた全ての３５Ｓ：ＮｔＦＴ１−３植物をＬＤ条件下で温室にて更に培養した（図１３）。３５Ｓ：ＮｔＦＴ１遺伝子組み換え系統のすべてと、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２遺伝子組み換え系統の一つは、６〜８週間後に薹が立ち始め、その結果、１１週間後には高さ約２メートルにて花を発生させた（図５Ａ及びＢ、Ｅ及びＦには個別の系統が模範となるように示される）。一方、残りの３５Ｓ：ＮｔＦＴ２遺伝子組み換え系統とすべての３５Ｓ：ＮｔＦＴ３遺伝子組み換え系統は、花のない圧縮された表現型を取り続けた（図１３Ｃ及びＤ、Ｇ及びＨ）。定量的ｑＲＴ−ＰＣＲ実験は、圧縮表現型を保つ植物においてＮｔＦＴ転写レベルが概して高かったことを示した（表３）。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
圧縮された開花のない３５Ｓ：ＮｔＦＴ２遺伝子組み換え系統とすべての３５Ｓ：ＮｔＦＴ３遺伝子組み換え系統は、生殖相への移行を通過せず、温室にて少なくとも９ヵ月間（実験終了）生長し続けた（図５Ｉ及びＪ）。遺伝子組み換え系統は最大で５ｍの大きさに達し、それによって、バイオマスの著しい増加を見せた：実験の終わりで、それらは、約１２０枚の葉を保有し、成熟葉の長さは最大サイズが６５ｃｍであり、８週のＷＴ植物と比較して約１．５倍のサイズ増加であった（図１３Ｋ及びＬ）。茎でも、約３．５倍という同様なバイオマスの増加が認められる（図１３Ｋ）。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
（例３：ＮｔＦＴ１−４の遺伝子発現解析）
次に、我々は、開花抑制ＮｔＦＴ１−３及び開花促進ＮｔＦＴ４の空間的及び時間的発現プロファイルを解析した。それ故に、タバコ種子を土壌に蒔き、ファイトトロン中、ＬＤ又はＳＤ条件下で生長させた。空間的発現パターンについては、約４週の３体の植物の葉、尖部、茎及び根をプールし、全ＲＮＡ抽出に用いた。ＮｔＦＴ１−４の時間的発現レベルを調べるため、実生を収集して時点１を決定し、次いで、３体の植物の根出葉を最初の花が開くまで毎週収集し、ＬＤ及びＳＤ条件でそれぞれ合計５回及び６回の回収時期があった。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡプラントキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡｓｅＩ（ＮＥＢ）の使用とその後のフェノール・クロロホルム抽出によりゲノムＤＮＡの除去を行った。製造業者の指示を受けてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により全ＲＮＡ１μｇを逆転写し、１μｌのｃＤＮＡがｑＲＴ−ＰＣＲを受けた。ｉＱ  ＳＹＢＲグリーン・スーパーミックス（Ｂｉｏｒａｄ）を用いるＣＦＸ９６サイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）において４５サイクル実施し、次いで融点曲線を実施した。ＮｔＦＴ１−４の各ＲＴサンプルを三重反復試験でアッセイし、一方、参照遺伝子、ＮＲＴ対照（逆転写しなかった）及びＮＴＣ対照（非鋳型対照）を二重反復試験でアッセイした。２つの潜在的参照遺伝子ＥＦ１α及びＬ２５（Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＤｅｌａｎｅｙ，２０１０）の転写レベルを各ＲＴサンプルで調べた。これら遺伝子の中で、ＥＦ１αが最も安定に発現していることが分かり、それ故に、この遺伝子を用いてＮｔＦＴ１−４の転写レベルを正規化した。ＲＥＳＴ−ＭＣＳソフトウェア（Ｐｆａｆｆｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて相対的発現レベルを算出した。ｑＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを表４に示す。
【００６１】
図１５では、個別のＮｔＦＴの発現レベルを参照遺伝子であるＮｔＥＦ１αとの関連で示す。ＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２及びＮｔＦＴ４は、両方の光条件下、葉組織のみで発現したが、すべての遺伝子の転写レベルは弱く、ＬＤ条件下で検出限界に近かった（図１５Ａ及びＢ）。ＮｔＦＴ３についてはｃＤＮＡを得ることができたが、その発現レベルは低すぎて、そのｑＲＴ−ＰＣＲによる時空的発現を確実に分析することができなかった。
【００６２】
抑制ＮｔＦＴ遺伝子の発現部位に関する追加の洞察を得るため、我々は、ＮｔＦＴ３の１−ｋｂプロモーターフラグメント（ＰＮｔＦＴ３）の制御下で、ＥＲ標識付きバージョンの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰＥＲ）を模範となるように発現させることによって、空間的発現をも研究した。この構築物のクローニングのため、表４に示されるような制限部位を含有するプライマーを用いて、１ｋｂのＰＮｔＦＴ３を増幅させた。ＰＣＲ産物を対応する制限部位に消化し、ＧＦＰＥＲレポーター遺伝子の上流でｐＢｓＧＦＰＥＲにクローニングした（Ｎｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＧＦＰ発現細胞を正確に同定するため、師部によるＧＦＰの拡散が防げるようにＥＲ標識付きバージョンのＧＦＰを選んだ。配列決定による確認後、ＰＮｔＦＴ３：ＧＦＰＥＲからなるカセットと、カリフラワー・モザイク・ウイルスのターミネーターとを、ＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーを用いて、増幅させた。ＰＣＲ産物をＳａｌＩで消化し、ＳａｌＩで消化されたバイナリーベクターｐＢｉｎ１９Ｈｙｇに挿入し、配列決定によって検証され、その後、電気穿孔法によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に導入した（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。
【００６３】
独立した５つの遺伝子組み換えタバコ系統をアグロバクテリウム媒介植物形質転換によって得、ＰＮｔＦＴ３：ＧＦＰＥＲと指定した。発根後にその遺伝子組み換え植物を土壌中に移し、温室で生長させ、励起／放射波長が４８８／５００〜６００ｎｍでＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５Ｘ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ドイツ）を用いた共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）によって４〜６週の植物を解析した。
【００６４】
ＣＬＳＭ解析は、図１５Ｃの葉柄の断面図によって示されるように、ＧＦＰ発現が葉の維管束に制限されたことを示した。最も強い信号を根出葉の葉脈において観察することができたが、それにもかからわず、発現ひいては蛍光が弱く、検出に要する高レーザー強度による木質部の強い自己蛍光によって示された。葉柄の縦断面図から明らかなように、ＰＮｔＦＴ３は、師部伴細胞（ＣＣ）で活性がある細胞レベルで示され、典型的には篩要素（ＳＥ）に隣接して局在しており、その篩板をカロース染色染料アニリンブルーで染色した（図１５Ｄ）。それ故に、ＰＮｔＦＴ３活性は、ＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２及びＮｔＦＴ４の葉特異的発現を映し、それによって、活性化機能と抑制機能を持つ両ＦＴの共通する空間的発現パターンが示される。
【００６５】
次に、我々は、様々な発達段階での発現レベルを比較することによって、ＮｔＦＴの時間的発現パターンをより詳細に解析しようと試みた。このため、タバコの実生と、ＬＤ及びＳＤ条件下で培養されたタバコ植物から開花まで毎週収集された根出葉の全ＲＮＡを用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＮｔＦＴ１−４の発現を推定した（図１５ＥからＧ）。ＮｔＦＴ４は概してＮｔＦＴ１及びＮｔＦＴ２よりも低い発現レベルを見せるように見えたが、ＮｔＦＴ４発現の増加（４４００倍）は、開花時点でのＮｔＦＴ１（１６４倍）及びＮｔＦＴ２（９３６倍）の発現の増加（図１５Ｈ）を大きく超えた。
【００６６】
（例４：ＮｔＦＴ２はシロイヌナズナにおいても開花を抑制する）
ＮｔＦＴの開花抑制機能が原則として他の種に対しても適用できるかどうか解明するため、我々は、模範となるように、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２を、モデル植物シロイヌナズナ、アブラナ科のメンバー、及び花成抑制機能を持つＦＴを保有しない植物において過剰発現させた。シロイヌナズナにおけるＮｔＦＴ２の過剰発現では、３５Ｓ：ＮｔＦＴ２構築物を、マンノピンシンターゼプロモーターの制御下で、ＢＡＳＴＡ耐性遺伝子を保有するＨｉｎｄＩＩＩで消化したバイナリーベクター中に挿入した（Ｐｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。すべてのバイナリーベクターを配列決定により検証し、その後、電気穿孔法によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に導入した（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。シロイヌナズナにおける過剰発現の研究では、Ａ．タリアナＣｏｌの種を土壌に蒔き、ＬＤ条件下ファイトトロン中で培養した（明るいとき２３℃、夜は１７℃、１００μｍｏｌｍ−２ｓｅｃ−１）。遺伝子組み換えシロイヌナズナ植物をｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法によって産生した（Ｃｌｏｕｇｈ及びＢｅｎｔ，１９９８）。遺伝子組み換えシロイヌナズナ植物の種を土壌に蒔き、正の遺伝子組み換え植物を選択するため、発芽後にＢＡＳＴＡによって噴霧した。
【００６７】
異なる形質転換体の開花時間の分析により、タバコの３５Ｓ：ＮｔＦＴ１−３の過剰発現から得られるものと似た結果であることが明らかになった。３５Ｓ：ＮｔＦＴ２の発現レベルが高い植物は、誘導的ＬＤ条件下で開花の遅い表現型を示す（図１６ＡからＣ）。ＷＴシロイヌナズナ植物は、発芽して約８週間後に正常に開花したが（図１６Ａ）、重度表現型を示す形質転換体は、約１〜２週間遅れて開花した（図１６ＢにはＮｔＦＴ２Ｌ２が模範となるように示される）。タバコほど目覚ましいものではないが、ＮｔＦＴ２を強く過剰発現するシロイヌナズナもまたバイオマスの増加を示し、葉の大きさ、葉の枚数及び茎直径の増加を特徴とした（図１６Ｂ及びＣ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月22日(2018.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
系統発生的にホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）遺伝子ファミリーのＦＴクレードに属するタンパク質をコードする核酸の使用であって、
前記タンパク質が、植物の開花を抑制又は抑圧又は遅延させることができ、
前記タンパク質が、図１０において、それぞれ、ＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２と称されるアミノ酸配列を有するタンパク質各々において同一に保存されているアミノ酸の１００％を共有し、かつモチーフ「ＡＰＤＩＩＤＳ」を含むか、又は、
前記タンパク質が、タンパク質ＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２のいずれかの中にあるアミノ酸配列鎖の少なくとも５０％を共有し、かつモチーフ「ＡＰＤＩＩＤＳ」を含む、
開花の発生を抑制、抑圧又は遅延させる遺伝子組み換え植物の生産のための使用。
【請求項２】
前記モチーフが「ＮＡＰＤＩＩＤＳ」又は「ＶＮＡＰＤＩＩＤＳ」である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記核酸が、４つのエクソンを含み、前記モチーフ「（Ｖ）ＮＡＰＤＩＩＤＳ」が、４番目のエクソンの一部である、請求項１及び２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
前記モチーフ「（Ｖ）ＮＡＰＤＩＩＤＳ」が、前記タンパク質の外部ループの一部である、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記核酸が、タンパク質ＡｔＦＴ、ＡｔＴＦＬ１、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２のいずれかの中にあるアミノ酸配列鎖の少なくとも７０％、好ましくは８０％を共有するタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号５の第６，７，１２，１４，１６，１８，２０，２８，３０，３６，３８，４２，４４，５１−５３，５７，６１，６５，６８，７０−７２，７４，７６，７７，７９，８３，８５−８７，８９，９０，９２，９３，９６，１００，１０１，１０３，１０７，１０８，１１０，１１２，１１５−１１８，１２３，１２６，１２９，１３４−１４１，好ましくは１３１−１４１，１４４−１４７，１５５，１５８−１６１，１６５，１６８，１６９，１７５番に位置するアミノ酸を、必ずしも配列番号５のペプチド又はタンパク質と同じ位置番号ではないが、この順番で少なくとも含むペプチド又はタンパク質をコードする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記核酸が、更に、配列番号５の第８−１１，１３，１５，１７，２１，２３，２５，２６，２９，３１，３２，３５，３７，３９−４１，４３，４５−４８，５０，５４，５５，５８，５９，６２，６４，６７，６９，７３，７５，７８，８０，８２，８４，８８，９４，９５，１０２，１０４，１１３，１１４，１１９−１２２，１２４，１２７，１３１−１３３，１４８−１５２，１５６，１６３，１６４，１６７，１７１−１７４，  １７６−１６７番に位置するアミノ酸を、必ずしも配列番号５のペプチド又はタンパク質と同じ位置番号ではないが、この順番で含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号５、６及び７に示される配列のいずれかからなるか若しくはいずれかを含むタンパク質、又は配列番号１、２及び３に示される配列のいずれかからなるか若しくはいずれかを含むタンパク質をコードする、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記核酸が、更に、プロモーターとして機能することができる成分を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記プロモーターが、細胞特異的プロモーター、時間誘導性プロモーター、タバコ植物に本来含まれるプロモーター、好ましくは遺伝子ＮｔＦＴ１からＮｔＦＴ４を自然に制御するプロモーター、タバコ由来の組織特異的及び／又は細胞特異的プロモーター、経時的構成的活性化プロモーター、他の植物に由来するプロモーター、好ましくはシロイヌナズナＦＴ又はスクロース輸送体ＡｔＳＵＣの細胞特異的な時間誘導性プロモーター、組織特異的及び／又は細胞特異的及び／又は経時的構成的活性化プロモーター、市販のプロモーター、他の源から入手できるプロモーター、合成プロモーター、或いは、上で列挙した機能の組み合わせを有するプロモーターから選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記核酸の配列が、プロモーターとして機能でき、核酸の発現を上方制御する、請求項９及び１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記核酸が、１つ以上の別々の調節成分と組み合わせて、好ましくは増強成分と組み合わせて使用される、請求項９〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
開花の発生を抑制、抑圧又は遅延させる遺伝子組み換え植物の生産のための、請求項１〜１２のいずれかに規定される核酸によってコードされたペプチド又はタンパク質の使用。
【請求項１４】
開花の発生を抑制、抑圧又は遅延させる遺伝子組み換え植物の生産のための、請求項１〜１２のいずれかに規定される核酸の配列を含むベクターの使用。
【請求項１５】
前記ベクターが、バイナリーベクター、好ましくは抗生物質抵抗性、代謝抵抗性又は除
草剤抵抗性遺伝子を保有するものから選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記抗生物質抵抗性、前記代謝抵抗性又は前記除草剤抵抗性遺伝子が、時間的及び空間的構成的活性化プロモーター又は時間誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗生物質抵抗性遺伝子がカナマイシン及びハイグロマイシン遺伝子から選択されるか、又は、前記除草剤抵抗性遺伝子がＢＡＳＴＡ抵抗性遺伝子であるか、及び／又は、前記抗生物質抵抗性、代謝抵抗性又は除草剤抵抗性遺伝子がｎｏｓ若しくは３５ＳＣａＭＶプロモーター又はエタノール誘導性３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下にある、請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかに規定される核酸、請求項１３に規定されるペプチド若しくはタンパク質、及び／又は請求項１４〜１７のいずれかに規定されるベクターを含む、遺伝子組み換え植物、遺伝子組み換え植物の一部又は遺伝子組み換え植物の種子であって、前記核酸、ペプチド、タンパク質又はベクターが、前記植物、その一部又はその種子に対して異なる種の核酸、ペプチド、タンパク質又はベクターである、遺伝子組み換え植物、遺伝子組み換え植物の一部又は遺伝子組み換え植物の種子。
【請求項１９】
ナス科植物ファミリーのメンバーであり、好ましくは作物であり、更に好ましくはタバコ、ジャガイモ及びトマトから選択される、請求項１８に記載の遺伝子組み換え植物、遺伝子組み換え植物の一部又は遺伝子組み換え植物の種子。
【請求項２０】
アブラナ科植物ファミリーのメンバーである、請求項１８に記載の遺伝子組み換え植物、遺伝子組み換え植物の一部又は遺伝子組み換え植物の種子。
【請求項２１】
前記モチーフ「ＡＰＤＩＩＤＳ」、「ＮＡＰＤＩＩＤＳ」又は「ＶＮＡＰＤＩＩＤＳ」はそれぞれが開花促進タンパク質ＡｔＦＴ及びＢｖＦＴ２の「（Ｖ）ＹＡＰＧＷ」モチーフの代わりにある、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
前記遺伝子組み換え植物が、ナス科植物ファミリーのメンバーである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記核酸が、ＳｔＳＰ５Ｇ若しくはその一部、ＳＩＳＰ５Ｇ若しくはその一部、又はＮｔＦＴ１、ＮｔＦＴ２、ＮｔＦＴ３若しくはそれらの一部である、請求項１〜１２、２１及び２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
前記核酸が、構成的プロモーターの制御下にある、請求項１〜１２及び２１〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１３及び２１〜２４のいずれかに記載の核酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載のベクターを含み、ナス科植物ファミリーのメンバーである、植物、植物の一部又は植物の種子であって、前記核酸が、時間誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター又は構成的プロモーターをさらに含む、植物、植物の一部又は植物の種子。
【請求項２６】
タバコ、ジャガイモ又はトマトである、請求項２５に記載の植物、植物の一部又は植物の種子。
【外国語明細書】
2018078909000001.pdf