(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法の提供。【解決手段】下記群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含む方法。前記該試料由来のＤＮＡにおいて、特定の配列を持つ亜種アニマリスのゲノム、又は対応する領域に存在する特定のCas遺伝子群の３’側に存在するCRISPR領域。又は、亜種ポリモルファムのゲノム、又は対応する領域に存在する特定のCas遺伝子群の３’側に存在するCRISPR領域。亜種ヴィンセンティのゲノム、又は対応する領域に存在する特定のCas遺伝子群の３’側に存在するCRISPR領域。又は、亜種ポリモルファム又は、対応する領域に存在する特定のCas遺伝子群の３’側に存在するCRISPR領域。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）を菌株レベルで識別する方法であって、当該試料由来のＤＮＡにおいて、以下：
（１）国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）アクセッションナンバーCP012713であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリス（Fusobacterium nucleatum subsp. animalis） KCOM 1279株のゲノムの2,454,881 bp〜2,463,504 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域；
（２）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム（Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum） ChDC F306株のゲノムの1,070,083 bp〜1,078,752 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域；
（３）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティ（Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii）ChDC F8 KCOM 1231株のゲノムの1,100,111 bp〜1,106,109 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプII-A）の３’側に存在するCRISPR領域；および
（４）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム ChDC F306株のゲノムの279,908 bp〜289,159 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプIII-A）の３’側に存在するCRISPR領域；
からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含む、前記方法。
【請求項２】
CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出が、（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（２）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（３）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（４）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せである、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（１）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG -3’（配列番号９）を含むプライマーおよび
5’- TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA -3’（配列番号１０）を含むプライマーの組合せであり、
（２）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA -3’（配列番号１１）を含むプライマーおよび
5’- TTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA -3’（配列番号１２）を含むプライマーの組合せであり、
（３）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- CAAATGATTTATCATTAGTGAGA -3’（配列番号１３）を含むプライマーおよび
5’- ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC -3’（配列番号１４）を含むプライマーの組合せであり、ならびに
（４）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG -3’（配列番号１５）を含むプライマーおよび
5’- GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG -3’（配列番号１６）を含むプライマーの組合せである、
請求項２に記載の方法。
【請求項５】
識別対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンと、比較対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンとが一致する場合、識別対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムは、比較対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムと同一菌株であると識別する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
以下：
配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；ならびに
配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーの組合せ。
【請求項７】
以下：
配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーの組合せ；
配列番号３を含むプライマーおよび配列番号４を含むプライマーの組合せ；
配列番号５を含むプライマーおよび配列番号６を含むプライマーの組合せ；ならびに
配列番号７を含むプライマーおよび配列番号８を含むプライマーの組合せ；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーの組合せ。
【請求項８】
請求項６または７に記載のプライマーの組合せを含む、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）を菌株レベルで識別するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法に使用するプライマーの組合せ、および当該組合せを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）はヒト口腔や大腸に生息する細菌である。本菌には５つの亜種（フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリス（F. nucleatum subsp. animalis）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム（F. nucleatum subsp. polymorphum）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム（F. nucleatum subsp. nucleatum）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティ（F. nucleatum subsp. vincentii）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種フシフォルメ（F. nucleatum subsp. fusiforme）が存在するが、その病原性の強度は亜種よりもさらに細かい分類である菌株レベルで異なることが知られている（非特許文献１）。そのため、簡便に菌株レベルでの判別が行えることが望ましい。
【０００３】
菌株を判別するための既存の方法は、臨床検体より分離培養を行って複数の純粋培養株を取得し、さらにＤＮＡフィンガープリント法にて同じ菌株かどうかの判別を行うために最短でも１週間程度の日数を要する。
【０００４】
フソバクテリウム・ヌクレアタムの検出に関する他の方法としては、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（16S rRNA）の配列を同定する手法や、特定の菌株の16S rRNAに特異的なプローブを用いる手法など、16S rRNAが菌種によって異なることを利用した検出法が挙げられる（特許文献１、２）が、これらの手法は菌株レベルでの検出は困難である。
【０００５】
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）は、細菌ゲノム上に１箇所ないし複数箇所に限局して存在する反復配列領域であり、細菌の獲得免疫機構に関与することが知られている（非特許文献２）。具体的には、CRISPRは細菌や古細菌の細胞内でCRISPR関連タンパク質（Ｃａｓ：CRISPR-associated proteins）と共に働き、ファージやプラスミドの感染防御に関わる機能を有する領域である。この領域は一般的に、CRISPRとCRISPR関連たんぱく質（Ｃａｓ）とを合わせてCRISPR-Casシステムと呼ばれている。CRISPR-Casシステムは、そのシステムが有するＣａｓ遺伝子の種類によって大きく３つのタイプ、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩに分けられ、さらに、Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ、Ｉ−Ｃ、Ｉ−Ｄ、Ｉ−Ｅ、Ｉ−Ｆ、Ｉ−Ｕ、ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ａ、ＩＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ｕの１２種類のサブタイプに分類されている（非特許文献３、４）。CRISPRはその細菌が過去に感染したファージやプラスミドなどの履歴を記録している部位で、スペーサーと呼ばれるファージやプラスミド由来の21〜72ヌクレオチドの配列断片が、リピート配列と呼ばれる２３〜５５ヌクレオチドの配列に両側を挟まれた状態で並列（多くのケースで５０以下）している（非特許文献５）。菌株によってファージやプラスミドなどの感染歴が異なるため、CRISPRに含まれるスペーサー量は異なり、結果的にCRISPRの長さや配列の違いとして現れる。CRISPRの配列の検出を利用した菌株タイピングの手法が開発されてきている（特許文献３、４）が、フソバクテリウム・ヌクレアタムの菌株タイピングに利用した例は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−１８３６６３号公報
【特許文献２】特開２０１５−２３１３６２号公報
【特許文献３】特開２００７−５３５３２５号公報
【特許文献４】特開２０１５−５１９０７５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Strauss, J.ら、Inflamm. Bowel. Dis., 2011 Sep., Vol.17, No.9,pp.1971-1978, doi: 10.1002/ibd.21606
【非特許文献２】渡辺孝康ら、“原核生物の新規な獲得免疫機構CRISPR／Ｃａｓシステム”、化学と生物、公益社団法人日本農芸化学会、２０１３年、第５１巻、第７号、４４１〜４４４頁
【非特許文献３】Makarova, K. S.ら、Biol. Direct., 2011 Jul., 6:38, doi: 10.1186/1745-6150-6-38
【非特許文献４】Makarova, K. S.ら、Biochem Soc Trans, 2013. Vol.41, No.6, pp. 1392-1400, doi: 10.1042/BST20130038.
【非特許文献５】Barrangou, R. and L.A. Marraffini , Mol. Cell, 2014. Vol.54, No.2, pp. 234-244, doi: 10.1016/j.molcel.2014.03.011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法に使用するプライマーの組合せ、および当該組合せを含むキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以上に鑑み、本件の発明者は、CRISPRに注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、フソバクテリウム・ヌクレアタムのゲノム中にCRISPRを持つ可能性のある領域を特定し、この領域のＤＮＡについてＰＣＲによる増幅が可能なプライマーを設計するための領域のＤＮＡ配列を特定した。そして、当該プライマーを設計するための領域のＤＮＡ配列に基づきプライマーを作成したところ、フソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで効率よく識別できることを見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
【００１０】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
【００１１】
［１］試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）を菌株レベルで識別する方法であって、当該試料由来のＤＮＡにおいて、以下：
（１）国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）アクセッションナンバーCP012713であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリス（Fusobacterium nucleatum subsp. animalis） KCOM 1279株のゲノムの2,454,881 bp〜2,463,504 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域；
（２）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム（Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum） ChDC F306株のゲノムの1,070,083 bp〜1,078,752 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域；
（３）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティ（Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii）ChDC F8 KCOM 1231株のゲノムの1,100,111 bp〜1,106,109 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプII-A）の３’側に存在するCRISPR領域；および
（４）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム ChDC F306株のゲノムの279,908 bp〜289,159 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプIII-A）の３’側に存在するCRISPR領域；
からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含む、前記方法。
【００１２】
［２］CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出が、（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行うことを含む、上記［１］に記載の方法。
【００１３】
［３］（１）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（２）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（３）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（４）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せである、
上記［２］に記載の方法。
【００１４】
［４］（１）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG -3’（配列番号９）を含むプライマーおよび
5’- TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA -3’（配列番号１０）を含むプライマーの組合せであり、
（２）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA -3’（配列番号１１）を含むプライマーおよび
5’- TTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA -3’（配列番号１２）を含むプライマーの組合せであり、
（３）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- CAAATGATTTATCATTAGTGAGA -3’（配列番号１３）を含むプライマーおよび
5’- ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC -3’（配列番号１４）を含むプライマーの組合せであり、ならびに
（４）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG -3’（配列番号１５）を含むプライマーおよび
5’- GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG -3’（配列番号１６）を含むプライマーの組合せである、
上記［２］に記載の方法。
【００１５】
［５］識別対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンと、比較対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンとが一致する場合、識別対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムは、比較対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムと同一菌株であると識別する、上記［２］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
【００１６】
［６］以下：
配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；ならびに
配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーの組合せ。
【００１７】
［７］以下：
配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーの組合せ；
配列番号３を含むプライマーおよび配列番号４を含むプライマーの組合せ；
配列番号５を含むプライマーおよび配列番号６を含むプライマーの組合せ；ならびに
配列番号７を含むプライマーおよび配列番号８を含むプライマーの組合せ；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーの組合せ。
【００１８】
［８］上記［６］は［７］に記載のプライマーの組合せを含む、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）を菌株レベルで識別するためのキット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルの識別に利用できる点で有用である。特に、唾液や糞便、組織などの臨床検体中に含まれるフソバクテリウム・ヌクレアタムを培養を経ずに菌株レベルで検出・識別できる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、フソバクテリウム・ヌクレアタムのタイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR-Cas領域を示す模式図である。
【図２】図２は、フソバクテリウム・ヌクレアタムのタイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR-Cas領域を示す模式図である。
【図３】図３は、フソバクテリウム・ヌクレアタムのタイプＩＩ−ＡのCRISPR-Cas領域を示す模式図である。
【図４】図４は、フソバクテリウム・ヌクレアタムのタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR-Cas領域を示す模式図である。
【図５】図５は、実施例２に示す分離株・標準菌株の各CRISPR領域のＰＣＲ増幅断片の電気泳動パターンを示す写真である。（ａ）タイプＩ−Ｂ（１）、（ｂ）タイプＩ−Ｂ（２）、（ｃ）タイプＩＩ−Ａ、（ｄ）タイプＩＩＩ−Ａ、のそれぞれ領域の増幅に特異的なプライマーセットごとに得られたＰＣＲ増幅断片について、各分離株・標準菌株を同じ順序で電気泳動したパターンを示す。ａ１〜ａ１０はF. nucleatum subsp. animalis、ｐ１〜ｐ９はF. nucleatum subsp. polymorphum、ｖ１はF. nucleatum subsp. vincentii、ｎ１はF. nucleatum subsp. nucleatumに同定された分離株を示す。星印の付いたａ３とａ４、ａ５とａ６、ｐ２とｐ３、ｐ７とｐ８は、同一被験者から分離された同じＡＰ−ＰＣＲバンドパターンを示す菌株であることを示す。ａ、ｐ、ｖ、ｎおよびｆで示される菌株は、それぞれ標準菌株であるF. nucleatum subsp. animalis JCM 11025T、F. nucleatum subsp. polymorphum JCM 12990T、F. nucleatum subsp. vincentii JCM 11023T、F. nucleatum subsp. nucleatum JCM 8532T、およびF. nucleatum subsp. fusiforme JCM 11024T、である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２３】
本明細書においてCRISPRとは、細菌ゲノムにおいて、CRISPR関連たんぱく質（Ｃａｓ）をコードする遺伝子の下流側に存在する反復配列をいう。本明細書においてCRISPR領域とは、CRISPRを持つ可能性のある領域を意味する。CRISPR領域にはスペーサーと呼ばれる配列断片が通常複数存在するが、菌株によってはスペーサーを含まないものもあり得る。本明細書においては、このスペーサーを含まない菌株についても、スペーサーを含み得るＣａｓ遺伝子の下流側に存在する領域を、便宜上CRISPR領域と記載する。
【００２４】
本明細書においてCRISPR-Cas領域とは、CRISPR領域およびＣａｓ遺伝子の少なくとも一部を含む細菌ゲノム中の領域をいう。本明細書においてCRISPR-Cas配列とは、Ｃａｓ遺伝子の少なくとも一部およびCRISPR領域の配列を含む配列をいう。
【００２５】
本発明者らは、フソバクテリウム・ヌクレアタムのゲノム中に、４箇所のCRISPR領域が存在することを見出した。この４箇所のCRISPR領域を、非特許文献３、４の分類法に従い、それぞれタイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）、タイプＩＩ−Ａ、タイプＩＩＩ−Ａとして特定した。上記のCRISPR領域は、図１〜４の模式図に表され、それぞれ以下のように特定できる。
・タイプＩ−Ｂ（１）：国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）アクセッションナンバーCP012713であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリスKCOM 1279株のゲノムの2,454,881 bp〜2,463,504 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域。ここで、KCOM 1279株のゲノムにおけるタイプＩ−Ｂ（１）のCas遺伝子は、上記アクセッションナンバーで開示されている配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する。
・タイプＩ−Ｂ（２）：ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファムChDC F306株のゲノムの1,070,083 bp〜1,078,752 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域。ここで、ChDC F306株のゲノムにおけるタイプＩ−Ｂ（２）のCas遺伝子は、上記アクセッションナンバーで開示されている配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する。
・タイプＩＩ−Ａ：ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティChDC F8 KCOM 1231株のゲノムの1,100,111 bp〜1,106,109 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプII-A）の３’側に存在するCRISPR領域。ここで、ChDC F8 KCOM 1231株のゲノムにおけるタイプＩＩ−ＡのCas遺伝子は、上記アクセッションナンバーで開示されている配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する。
・タイプＩＩＩ−Ａ：ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム ChDC F306株のゲノムの279,908 bp〜289,159 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプIII-A）の３’側に存在するCRISPR領域。ここで、ChDC F306株のゲノムにおけるタイプＩＩＩ−ＡのCas遺伝子は、上記アクセッションナンバーで開示されている配列における５’→３’の向きで存在する。
【００２６】
したがって、本明細書において、タイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）、タイプＩＩ−ＡまたはタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域というときは、上記の特定に従ってその領域が特定される。
【００２７】
本明細書においてＤＮＡとはデオキシリボ核酸を意味する。
【００２８】
フソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法
一態様において本発明は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法であって、当該試料由来のＤＮＡにおいて、タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域、タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域、タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域、およびタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域、からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含む、前記方法に関する。
【００２９】
好ましい態様において本発明の方法は、タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域、タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域、タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域、およびタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域、からなる群より選択される少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべての領域について、当該領域をCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含んでもよい。
【００３０】
本発明の方法に使用する試料は、フソバクテリウム・ヌクレアタムのゲノムＤＮＡを含む試料であれば、いかなる試料であってもよい。試料の例としては、唾液、血液、糞便、組織、単離したフソバクテリウム・ヌクレアタムの細胞、が挙げられるが、これらに限定されない。試料は凍結試料であってもよい。
【００３１】
本発明の方法において、試料由来のＤＮＡとは、試料より単離または抽出された状態のＤＮＡであってもよく、試料を溶解液等で溶解しただけのクルードの状態のＤＮＡであってもよい。
【００３２】
したがって、本発明の方法は、CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出する工程の前に、試料を得る工程、または試料由来のＤＮＡを得る工程を含んでいてもよい。
【００３３】
本発明の方法におけるCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出は、タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域、タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域、タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域、およびタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域、からなる群より選択される少なくとも１つの領域、好ましくは少なくとも２つの領域、少なくとも３つの領域、または４つすべての領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出が可能な公知の手法を用いて行うことができる。好ましくは、そのような手法は、当該領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことが含まれる。
【００３４】
ＰＣＲの条件は、使用するプライマーのＴｍ等に基づいて当業者が適宜決定することができる。例えば、後述する実施例４（２）に示した反応液および反応条件を採用することができる。
【００３５】
本発明の方法に使用するプライマーの組合せは、次の「プライマー」の項目に記載するプライマーを含む組合せであってよい。
【００３６】
CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出は、例えば、ＰＣＲ産物の電気泳動により行うことができる。電気泳動は、当業者に公知の方法により行えばよく、例えばアガロースゲル電気泳動により行ってもよい。別の態様において、CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出は、例えば、ＰＣＲ産物についての塩基配列決定により行うこともできる。
【００３７】
本発明の方法において、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムの識別は、識別対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンと、比較対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンとが一致する場合、識別対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムは、比較対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムと同一菌株であると識別することを含んでもよい。電気泳動パターンが一致するとは、当該ＰＣＲ産物について電気泳動で現れるバンドの位置（すなわちＰＣＲ産物の長さ）が、識別対象の試料由来のＤＮＡについて得られるＰＣＲ産物と比較対象の試料由来のＤＮＡについて得られるＰＣＲ産物とで一致することをいう。
【００３８】
本明細書において、「識別対象の試料」とは、フソバクテリウム・ヌクレアタムの有無、または当該試料中に含まれるフソバクテリウム・ヌクレアタムの菌株の識別について検査または分析の対象となる試料をいう。
【００３９】
本明細書において「比較対象の試料」とは、比較対象のフソバクテリウム・ヌクレアタムを含む試料であれば特に限定されない。比較対象のフソバクテリウム・ヌクレアタムは、菌株レベルで分離・同定されたもの（すなわち、F. nucleatumの分離株または公知の標準菌株）であってもよく、菌株の分離・同定がされていないものであってもよい。
【００４０】
比較対象のフソバクテリウム・ヌクレアタムが、菌株レベルで分離・同定されたものである場合、本発明の方法は識別対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムが、既に同定された菌株と同一か否かを判定するのに用いることができる。
【００４１】
比較対象のフソバクテリウム・ヌクレアタムが、菌株レベルで分離・同定されたものではない場合としては、例えば、本発明の方法を以下の目的に適用する場合が想定される。
・識別対象の試料中に含まれるフソバクテリウム・ヌクレアタムが、比較対象の別検体中に含まれる菌株未知のフソバクテリウム・ヌクレアタムと同一株であるか否かを識別する。
・ある集団の検体について、個体の違いを超えて同一菌株が存在するか否かを識別する。・ある個体の検体またはある集団の検体について、何種類の菌株が存在するかを判定する。
【００４２】
プライマー
一態様において本発明は、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域、タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域、タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域、およびタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域、からなる群より選択される少なくとも１つの領域、好ましくは少なくとも２つの領域、少なくとも３つの領域、または４つすべての領域について、当該領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーに関する。
【００４３】
上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および／または配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。上記プライマーの位置についての概略図を図１に示す。配列番号１は、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域の上流側（５’側）に存在するＣａｓ遺伝子の一部の配列である。配列番号２は、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域の下流側（３’側）に存在する保存遺伝子の一部の配列である。ここで、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCas遺伝子はＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012713で開示されているゲノム配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する点に留意すべきである。CRISPR領域の上流側、下流側は、近接して存在しているＣａｓ遺伝子コード鎖の方向に従う。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを上記の観点で設計することにより、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域を挟むプライマーの組合せを得ることができる。
【００４４】
上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および／または配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。上記プライマーの位置についての概略図を図２に示す。配列番号３は、上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域の上流側（５’側）に存在するＣａｓ遺伝子の一部の配列である。配列番号４は、上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域の下流側（３’側）に存在する保存遺伝子の一部の配列である。ここで、上記タイプＩ−Ｂ（２）のCas遺伝子はＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121で開示されているゲノム配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する点に留意すべきである。CRISPR領域の上流側、下流側は、近接して存在しているＣａｓ遺伝子コード鎖の方向に従う。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを上記の観点で設計することにより、上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域を挟むプライマーの組合せを得ることができる。
【００４５】
上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および／または配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。上記プライマーの位置についての概略図を図３に示す。配列番号５は、上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域の上流側（５’側）に存在するＣａｓ遺伝子の一部の配列である。配列番号６は、上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域の下流側（３’側）に存在する保存遺伝子の一部の配列である。ここで、上記タイプＩＩ−ＡのCas遺伝子はＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714で開示されているゲノム配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する点に留意すべきである。CRISPR領域の上流側、下流側は、近接して存在しているＣａｓ遺伝子コード鎖の方向に従う。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを上記の観点で設計することにより、上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を挟むプライマーの組合せを得ることができる。
【００４６】
上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および／または配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。上記プライマーの位置についての概略図を図４に示す。配列番号７は、上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域の上流側（５’側）に存在するＣａｓ遺伝子の一部の配列である。配列番号８は、上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域の下流側（３’側）に存在する保存遺伝子の一部の配列である。ここで、上記タイプＩＩＩ−ＡのCas遺伝子はＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121で開示されているゲノム配列の５’→３’の向きで存在し、CRISPR領域の上流側、下流側は、近接して存在しているＣａｓ遺伝子コード鎖の方向に従う。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを上記の観点で設計することにより、上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域を挟むプライマーの組合せを得ることができる。
【００４７】
本明細書において、特定の塩基配列に対して「少なくとも８５％以上の同一性」は、好ましくは、特定の塩基配列に対して少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも９８％以上、少なくとも９９％以上、または１００％の同一性であってもよい。
【００４８】
本明細書において、ＤＮＡ配列についての同一性は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定してもよい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、MUSCLE（Edgar, R. C., Nucleic acids research, Vol.32, No.5, 1792-1797, 2004）やClustalW（Higgins D.ら、Nucleic Acids Res. Vol.22, pp.4673-4680, 1994）等があげられる。配列の整列に使用する標準的なデフォルトパラメーターの設定は、MUSCLEではgap penaltiesパラメーターのgap openは-400、gap extendは0である。その他のパラメーターとして、max memoryは849MB、max iterationsについては8回、オプションのclustering methodはすべてUPGMB、min diag lengthは24である。ClustalWでは、pairwise alignmentパラメーターならびにmultiple alignmentパラメーターのgap opening penaltyは15、gap extension penaltyは6.66であり、DNA weight matrixはIUB、transition weightは0.5、negative matrixの仕様はOFF、delay divergent cutoffは30%である。
【００４９】
別の態様において、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーに、配列番号９を含むフォワードプライマー、および／または配列番号１０を含むリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。
【００５０】
上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号１１を含むフォワードプライマー、および／または配列番号１２を含むリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。
【００５１】
上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号１３を含むフォワードプライマー、および／または配列番号１４を含むリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。
【００５２】
上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号１５を含むフォワードプライマー、および／または配列番号１６を含むリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。
【００５３】
キット
一態様において、本発明は、上記「プライマー」の項目において記載するプライマーを含む、フソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別するためのキットに関する。
【００５４】
本発明のキットは、本発明のプライマーを溶液または凍結乾燥品として含むものであってもよい。当該溶液または凍結乾燥品は適切に包装されていてよい。本発明のキットはまた、本発明の方法を実施するための指示が記載された説明書を含むものであってもよい。
【００５５】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。しかし、これらは例示目的とするものであって、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
実施例１：フソバクテリウム・ヌクレアタムのCRISPR−Ｃａｓ領域の探索
NCBIデータベースに登録されているフソバクテリウム・ヌクレアタム（F. nucleatum）の５亜種２８株（表１）のゲノム配列中のCRISPR関連タンパク質（Ｃａｓ）遺伝子の検索、ならびにCRISPRfinderプログラム (http://CRISPR.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)を用いてCRISPRの探索を行い、CRISPR-Cas領域を探索した。
【００５７】
【表１】
2018078823.tif 000002
【００５８】
上記の探索の結果、F. nucleatumは亜種に限らず、CRISPR-Casを保存する可能性のある領域をゲノム中に４か所有し、その前後の遺伝子は保存されていることが分かった（図１〜４）。CRISPRはＣａｓ遺伝子の種類などによってタイプ分けされているが（非特許文献３、４）、F. nucleatumで見つかった４つのCRISPRタイプは、タイプＩ−Ｂが２種類（タイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）と記載する）、タイプＩＩ−Ａ、タイプＩＩＩ−Ａが各一種類ずつであった（表１）。タイプＩ−Ｂ（１）は亜種アニマリス（F. nucleatum subsp. animalis）、タイプＩ−Ｂ（２）は亜種ポリモルファム（F. nucleatum subsp. polymorphum）と亜種ヌクレアタム（F. nucleatum subsp. nucleatum）、タイプＩＩ−Ａは亜種ヴィンセンティ（F. nucleatum subsp. vincentii）、タイプＩＩＩ−Ａは亜種ポリモルファムが保有する傾向が見られた。
【００５９】
ここで、上記F. nucleatumで見つかったCRISPRは、それぞれ次のように特定することもできる。
・タイプＩ−Ｂ（１）は、ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012713であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリスKCOM 1279株のゲノムの2,454,881 bp〜2,463,504 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域である。
・タイプＩ−Ｂ（２）は、ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファムChDC F306株のゲノムの1,070,083 bp〜1,078,752 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域である。
・タイプＩＩ−Ａは、ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティChDC F8 KCOM 1231株のゲノムの1,100,111 bp〜1,106,109 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプII-A）の３’側に存在するCRISPR領域である。
・タイプＩＩＩ−Ａは、ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム ChDC F306株のゲノムの279,908 bp〜289,159 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプIII-A）の３’側に存在するCRISPR領域である。
【００６０】
実施例２：試験に使用するフソバクテリウム・ヌクレアタム菌株の調製
（１）試験に使用したF. nucleatum株
標準菌株としてはF. nucleatum subsp. animalis JCM 11025T、F. nucleatum subsp. fusiforme JCM 11024T、F. nucleatum subsp. nucleatum JCM 8532T、F. nucleatum subsp. polymorphum JCM 12990T、F. nucleatum subsp. vincentii JCM 11023Tの５株（国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターに登録されている標準菌株）と、協同乳業（株）研究所で保存していた臨床検体から分離した分離株２１株を使用した。各菌株は、純粋培養し、16S rRNA遺伝子の全長を27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号１７））（Young, B. K.ら、Prostaglandins and medicine, Vol.6, No.3, pp.257-265 (1981)）と1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’（配列番号１８））（Lane, D.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, pp.6955-6959 (1985)）プライマーを使用して増幅し、増幅断片をサンガーシークエンスした。得られた配列より分離株の亜種を決定し、実験に供した。分離株の亜種の内訳は、アニマリスが１０株、ポリモルファムが９株、ヴィンセンティが１株、ヌクレアタムが１株であった。
【００６１】
アービトラリリーポリメラーゼ連鎖反応（Arbitrarily primed polymerase chain reaction／ＡＰ−ＰＣＲ)
単離した複数のコロニーが同じ株由来か否かの確認はＡＰ−ＰＣＲ法を用いて確認した（Haraldsson, G., et al., J. Med. Microbiol., Vol.53, pp.161-165, doi:10.1099/jmm.0.5441-0 (2004)）。プライマーはC1 (5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3’（配列番号１９）)、D8635 (5’-GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC-3’（配列番号２０）)、もしくはD11344 (5’-AGTGAATTCGCGGTGAGATGCCA-3’（配列番号２１）)を使用した。クルードサンプルをテンプレートとし、１× Ex Taq Buffer、２００μＭの各ｄＮＴＰ、８００ｎＭのプライマー、０．３８Ｕ  Ex Taq Hot Start Version （TaKaRa）を含む全溶液量１５μｌのＰＣＲ反応液を使用した。温度条件はHaraldssonら（同上）と同じ条件（９４℃５分の変性と３５℃５分間のアニーリング後、９４℃３分、３７℃３分、７２℃３分の３ステップを５回、さらに９４℃１分、５５℃１分、７２℃３分の３ステップを３０回繰り返し、最後に７２℃１０分間の伸長を行った）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は１×ＴＢＥに溶解した１．５％アガロースにローディングし、１×ＴＢＥ中で５０Ｖ、６０分間電気泳動した。ゲルはエチジウムブロマイドで染色し、ＤＮＡ断片のバンドパターンは紫外線のイメージャーを用いて可視化した。３種類のプライマーによる増幅産物のすべてで同じバンドパターンを示すものを、同じ株由来の菌体とした。
【００６２】
実施例３：CRISPR検出用プライマーの設計
表１のF. nucleatumの２８株のゲノム配列と、実施例２の分離株のシークエンスによって得られた配列を基に、実施例１で特定した４箇所のCRISPR領域のそれぞれに特異的なＰＣＲプライマーを設計した。フォワードプライマーはCRISPR上流に必ず存在するＣａｓ１もしくはＣａｓ２遺伝子配列の中で設計し、リバースプライマーはデータベースに登録されているF. nucleatum ２８株がすべて有しているCRISPR下流に存在する保存遺伝子を標的としてプライマーを設計し、調製した。調製したプライマーは以下のとおりである。
・タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域を増幅するプライマーセット
Type I-B No. 1 F：5’- TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG -3’（配列番号９）
Type I-B No. 1 R：5’- TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA -3’（配列番号１０）
・タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域を増幅するプライマーセット
Type I-B No.2 F：5’- AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA -3’（配列番号１１）
Type I-B No.2 R：5’- TTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA -3’（配列番号１２）
・タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を増幅するプライマーセット
Type II-A F：5’- CAAATGATTTATCATTAGTGAGA -3’（配列番号１３）
Type II-A R：5’- ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC -3’（配列番号１４）
・タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を増幅するプライマーセット
Type III-A F：5’- TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG -3’（配列番号１５）
Type III-A R：5’- GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG -3’（配列番号１６）
実施例４：分離株と標準菌株を対象にしたＰＣＲプライマーによるフソバクテリウム・ヌクレアタムのCRISPR検出
（１）細菌細胞からのＤＮＡ抽出
F. nucleatumの標準菌株および分離株（実施例２）はＥＧ培地上で嫌気条件下にて３７℃、４８時間培養し、生育したコロニーを回収してＰＢＳで２回洗浄した後、２００μｌのＰＢＳに懸濁した。
【００６３】
ＤＮＡの抽出はMatsukiらの方法（Matsuki, T.ら、Appl. Environ. Microbiol., Vol.70, No.1, pp.167-173 (2004)）の一部を改変して行った。２００μｌのＰＢＳに懸濁した菌体は、直径０．１ｍｍビーズ（３００ｍｇ）と溶菌バッファー（100 mM Tris-HCl・50mM EDTA pH8 (３５０μｌ)、１０％ＳＤＳ（５０μｌ））およびＴＥ飽和フェノール（５００μｌ）を加え、熱処理後（７０℃、１０分間）、Micro Smash MS-100（(TOMY社）にて菌体を物理的に破砕する（4000 rpm、１分間）と同時に菌体タンパクの変性処理を行った。遠心（４℃、20000 ×ｇ、5分間）の後、上清５００μｌにフェノール-クロロフォルム-イソアミルアルコール(２５：２４：１）（５００μｌ）を加え、遠心後の上清３５０μｌをエタ沈メイト（Takara）によりＤＮＡを抽出した。冷７０％エタノール（１ｍｌ）を用いて２回の遠心洗浄後、風乾して１００μｌのヌクレアーゼ不含水（nuclease free water）に溶解した。
（２）ＰＣＲ
タイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）、タイプＩＩ−Ａ、タイプＩＩＩ−Ａの４箇所のCRISPR領域の増幅にそれぞれ特異的なプライマーセット（実施例３）を用い、上記（１）で抽出した分離株と標準菌株のＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応はテンプレートとなるＤＮＡ溶液１．０μｌ、１× Ex Taq Buffer、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、０．３８Ｕ  Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa)を含む全溶液量１５μｌの反応液中で行った。タイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）、およびタイプＩＩＩ−ＡのプライマーセットのＰＣＲ条件は、９４℃２分の変性の後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１０分の３ステップを４０回繰り返し、その後７２℃１０分の伸長を行った。タイプＩＩ−ＡのＰＣＲ条件は、９４℃２分の変性の後、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃７分の３ステップを３０回繰り返した。各菌株に対して４回のＰＣＲを行った。
【００６４】
ＰＣＲ結果を図５に示す。プライマーセットごとに、各分離株・標準菌株を同じ順序で電気泳動した（すなわち、図５の４枚のゲル電気泳動写真において、縦に同じ菌株が並んでいる）。ａ１〜ａ１０はF. nucleatum subsp. animalis、ｐ１〜ｐ９はF. nucleatum subsp. polymorphum、ｖ１はF. nucleatum subsp. vincentii、ｎ１はF. nucleatum subsp. nucleatumに同定された分離株を示す。星印の付いたａ３とａ４、ａ５とａ６、ｐ２とｐ３、ｐ７とｐ８の菌株は、同一被験者から分離され、かつ同じＡＰ−ＰＣＲバンドパターンを示す菌株である。図５において、ａ（亜種アニマリス）、ｐ（亜種ポリモルファム）、ｖ（亜種ヴィンセンティ）、ｎ（亜種ヌクレアタム）、ｆ（亜種フシフォルメ）は国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターに登録されている標準菌株である。また、これら標準菌株は国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）にゲノム配列の全部または一部がすでに登録されており、４か所のCRISPRを持つ可能性のある領域についてはすべての株で配列情報が存在するため、ポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールとして用いた。
【００６５】
分離株・標準菌株ごとに異なる位置に０〜３個のCRISPRの増幅断片が検出された。標準菌株では、ゲノム配列情報によるCRISPRの有無と、ＰＣＲ増幅断片の有無が一致していた。同じ被験者の異なる部位から分離され、かつ同じＡＰ−ＰＣＲバンドパターンを持つ菌株（星印）については、２つの株で同じ長さの増幅断片が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の方法は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別することが可能である。フソバクテリウム・ヌクレアタムは、疾患への関与が菌株レベルで議論されているため、臨床検体中に含まれるフソバクテリウム・ヌクレアタムの培養を必要としない簡便な菌株識別検査への応用が期待される点でも有用である。
【図１】
2018078823.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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