(57)【要約】      （修正有）【課題】コンジュゲーションの目的のために改善された抗体およびそのような改善された抗体を含むイムノコンジュゲートをもたらす、そのような特権的システイン置換部位を提供する。【解決手段】親抗体または抗体断片の定常領域における少なくとも１個の天然アミノ酸を、ペイロードまたはリンカー−ペイロードの組合せのための付着部位として使用され得るシステインで置換することによって、抗体または抗体断片を修飾するための特定部位を提供する。抗体は、ＥＵナンバリング形式によって定義した場合に重鎖定常領域の１５２および３７５位においてシステインで修飾される。抗体は、ＥＵナンバリング形式によって定義した場合に重鎖定常領域の３６０位で、かつカッパ軽鎖定常領域の１０７位においてシステインで修飾される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾抗体またはその抗体断片を含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体また
は抗体断片が、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステインでの置換の組合せを含
み、前記組合せが抗体重鎖の３６０位、および抗体カッパ軽鎖の１０７位から選択される
置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、イムノコンジ
ュゲート。
【請求項２】
修飾抗体またはその抗体断片を含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体また
は抗体断片が、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステインでの置換の組合せを含
み、前記組合せが抗体重鎖の１５２位および３７５位から選択される置換を含み、前記位
置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、イムノコンジュゲート。
【請求項３】
配列番号４８の重鎖定常領域および配列番号６１を含むカッパ軽鎖定常領域を含む修飾
抗体またはその抗体断片を含む、イムノコンジュゲート。
【請求項４】
配列番号１３１の重鎖定常領域を含む修飾抗体またはその抗体断片を含む、イムノコン
ジュゲート。
【請求項５】
薬物部分をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６】
薬物抗体比が約４である、請求項１から５のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７】
薬物部分が、前記システインの硫黄および任意選択のリンカーを介して前記修飾抗体ま
たは抗体断片に付着している、請求項１から６のいずれかに記載のイムノコンジュゲート
。
【請求項８】
前記薬物部分が、開裂性または非開裂性リンカーを介して前記システインの前記硫黄に
接続している、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９】
前記薬物部分が、非開裂性リンカーを介して前記システインの前記硫黄に接続している
、請求項８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０】
チオール−マレイミド連結を含む、請求項７から９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１】
−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−連結またはジスルフィド連結を含む、請求項１０に記載の
イムノコンジュゲート。
【請求項１２】
前記薬物部分が細胞毒性薬剤である、請求項１１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３】
前記薬物部分が、タキサン、ＤＮＡ−アルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）
、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチン
Ｅ、オーリスタチンＦ、マイタンシノイド、およびＥｇ５阻害剤からなる群から選択され
る、請求項１２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から１３のいずれかに記載のイムノコ
ンジュゲート。
【請求項１５】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１から１３のいずれかに記載のイムノコンジュゲ
ート。
【請求項１６】
前記抗体がヒト化または完全ヒト抗体である、請求項１から１３に記載のイムノコンジ
ュゲート。
【請求項１７】
前記抗体が、二重特異性または多重特異性抗体である、請求項１４から１６のいずれか
に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
前記抗体または抗体断片が、腫瘍上の細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項１
から１７のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項２０】
少なくとも１個のＰｃｌもしくは非天然アミノ酸置換または酵素媒介性コンジュゲーシ
ョン用のペプチドタグ、および／あるいはそれらの組合せをさらに含む、請求項１から１
９のいずれかに記載の修飾抗体または抗体断片。
【請求項２１】
請求項１から４のいずれかに記載の修飾抗体または抗体断片をコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２３】
修飾抗体または抗体断片を製造する方法であって、請求項２２に記載の宿主細胞を、前
記抗体または抗体断片を発現させるのに適した条件下でインキュベートすることと、前記
抗体または抗体断片を単離することとを含む、方法。
【請求項２４】
イムノコンジュゲートを製造する方法であって、リンカーユニット（ＬＵ）またはリン
カーユニット−ペイロードの組合せ（−ＬＵ−Ｘ）を、請求項１から４のいずれかに記載
の抗体または抗体断片中のシステイン残基に付着させることを含む、方法。
【請求項２５】
前記イムノコンジュゲートが、式（Ｉ）：
【化６４】
2018134080.tif 000127
［式中、Ａｂは、本明細書において記載の好ましいシステイン置換部位の１つに、少なく
とも１個のシステイン残基を含む抗体または抗体断片を表し；
ＬＵは、本明細書において記載のリンカーユニットであり；
Ｘは、ペイロードまたは薬物部分であり；
ｎは、１〜１６の整数である］のイムノコンジュゲートである、請求項２４に記載の方
法。
【請求項２６】
修飾抗体またはその抗体断片であって、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステ
インでの置換の組合せを含み、前記組合せが抗体重鎖の３６０位、および抗体カッパ軽鎖
の１０７位から選択される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリング
されている、修飾抗体またはその抗体断片。
【請求項２７】
修飾抗体またはその抗体断片であって、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステ
インでの置換の組合せを含み、前記組合せが抗体重鎖の１５２位および３７５位から選択
される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、修飾抗
体またはその抗体断片。
【請求項２８】
配列番号４８の重鎖定常領域および配列番号６１を含むカッパ軽鎖定常領域を含む、修
飾抗体またはその抗体断片。
【請求項２９】
配列番号１３１の重鎖定常領域を含む、修飾抗体またはその抗体断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
様々な治療用途のための抗体の重要性によって、抗体を選択的に修飾して、改善された
特性または追加の機能を導入するための確固たる方法が必要とされている。本出願は、抗
体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製において使用するためなど、修飾抗体を作製す
るために、抗体に部分を付着させる特定部位を開示する。選択的コンジュゲーション部位
は、抗体の定常領域に位置するので、様々な抗体で有用である。
【背景技術】
【０００２】
抗体を修飾するための方法の価値は周知であり、様々な「ペイロード」部分を付着させ
るために抗体をコンジュゲートするための多くの方法が開発されている。これらの方法の
多くは、ペイロードを付着させるために使用することができるリシンおよびシステインな
どの、抗体上の特異的反応性アミノ酸残基の天然発生に頼っている。しかしながら、天然
アミノ酸に頼ることは必ずしも望ましくなく、それというのも、付着するペイロードの位
置および量が、それらの反応性アミノ酸の数および位置に依存するためであり、そのよう
な残基が多すぎるか、または少なすぎることで、抗体上へのペイロードの負荷を効率的に
制御することが困難になる。加えて、反応性アミノ酸の配置によっては、完全なコンジュ
ゲーションを得ることが困難になり得て、コンジュゲーション中に不均一な生成物が生じ
る。例えば、医薬活性成分の不均一性は典型的には望ましくなく、それというのも、それ
は、不均一な対象集団に薬物を投与する予測不可能性を悪化させるためである。すなわち
、均一な生成物の投与がはるかに好ましく、不均一な生成物の挙動を完全に特徴づけて予
期することははるかに困難である。例えば、操作されたシステイン残基を介した細胞毒性
薬剤と抗体との部位特異的コンジュゲーションは、治療指数の改善を示す均一なイムノコ
ンジュゲートをもたらす（Junutula et al., (2008) Nat Biotechnol. 26(8):925-932）
。
【０００３】
システインなどの特定の残基を、これらの残基をコンジュケーションのために使用する
ことができる特定位置に付加するために、抗体は操作されているが（Lyons et al., (199
0) Protein Eng., 3:703-708）、操作されたシステインが、抗体の折り畳み、および適正
な分子内ジスルフィド結合の酸化に干渉し得るので、特異的置換の価値は、ある種の抗体
では変化し得る（Voynovら、(2010) Bioconjug. Chem. 21(2):385〜392）。
【０００４】
哺乳動物細胞において発現された抗体における操作されたシステインは、グルタチオン
（ＧＳＨ）および／またはシステインとのジスルフィド結合によって、それらの生合成中
に修飾されるので（Chen et al. (2009) mAbs 1:6, 563-571）、初めに発現されたままの
抗体薬物コンジュゲート生成物中の修飾されたシステインは、チオール反応性試薬に対し
て非反応性である。操作されたシステインの活性化は、ＧＳＨおよび／またはシステイン
付加物の還元（典型的には、抗体のすべての鎖内ジスルフィド結合の還元をもたらす）、
続いて、コンジュゲーションの前に、天然鎖内ジスルフィド結合の再酸化および再形成を
必要とする（Junutula et al., (2008) Nat. Biotechnol. 26(8):925-32）。システイン
が挿入されている部位の一部は、再酸化のプロセスに干渉し、結果として、望ましくない
不均一なコンジュゲーション生成物をもたらす。したがって、マレイミドまたはブロモ−
、クロロ−、またはヨード−アセトアミド基などのチオール反応性試薬とのコンジュゲー
ション前に、導入されたシステインが再酸化のプロセスに干渉しない抗体上の部位を同定
することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ブロモ−アセトアミド、ヨード−アセトアミド、またはクロロ−アセトアミドとのシス
テイン残基のコンジュゲーションは、安定したチオエーテル連結の形成をもたらす（Alle
y et al., (2008) Bioconjug Chem. 19(3):759〜65）。しかしながら、その化学は、マレ
イミドコンジュゲーション化学よりも効率性が低い。そのようなチオール−マレイミド連
結の形成は、ペイロードまたはリンカーをシステインに付着させる場合に使用するために
普及している、高効率的な方法であるので、マレイミド連結を使用することができる抗体
上のシステイン置換部位を同定することが必要とされている。より重要なことに、部位特
異的にコンジュゲートしたイムノコンジュゲートは、治療指数の改善を示し得るので、抗
体上へのペイロードのコンジュゲーションを効率的に形成することを可能にし、高い安定
性を有するコンジュゲートをもたらす、抗体中のシステイン置換用の特定の特権的部位を
同定することが依然として必要とされている。本出願は、コンジュゲーションの目的のた
めに改善された抗体およびそのような改善された抗体を含むイムノコンジュゲートをもた
らす、そのような特権的システイン置換部位を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願は、化学部分（例えば、ペイロード／薬物部分）の付着用のＣｙｓ残基を提供し
て良好な効率および安定性を有するイムノコンジュゲートを形成するために、親抗体また
は抗体断片上の天然アミノ酸のシステイン（「Ｃｙｓ」）置換が行われ得る抗体または抗
体断片の定常領域中の特定部位を提供する。本出願はさらに、これらの特定部位の１つま
たは複数において１個または複数のＣｙｓ残基を有する操作された抗体または抗体断片、
さらには、そのような操作された抗体または抗体断片から作製されたイムノコンジュゲー
トを提供する。
【０００７】
抗体の特定位置にＣｙｓを挿入するための方法は、当技術分野において公知であり、例
えば、国際公開第２０１１／００５４８１号パンフレットを参照されたい。しかしながら
、本出願は、親抗体または抗体断片の１個または複数の天然アミノ酸をＣｙｓで置換する
ことが、次の利点：効率的なイムノコンジュゲーションを促進する良好な反応性；Ｃｙｓ
−マレイミドコンジュゲーションリンカーが使用される場合のペイロード損失の性向の低
減；抗体間の架橋、または非天然分子内ジスルフィド結合の形成など、望ましくないジス
ルフィド連結が形成する傾向の低減；および得られるＡＤＣの低い疎水性の１つまたは複
数をもたらす、抗体または抗体断片の定常領域中の特定部位を開示する。
【０００８】
親抗体または抗体断片の定常領域中の天然アミノ酸のＣｙｓ置換用の特定の特権的部位
は、望ましくない作用を最小化しつつ効率的なコンジュゲーションが得られるように選択
される。まず、選択された場所の１つまたは複数における親抗体または抗体断片の天然ア
ミノ酸のＣｙｓでの置換が、新たなシステイン上で容易にコンジュゲートされる抗体また
は抗体断片をもたらすように、修飾用の特定部位は選択される。特定位置は、システイン
残基のスルフヒドリルを水性溶液中で求電子体に対して反応性にするために十分なだけ表
面アクセシブルであるように選択される。親抗体または抗体断片の天然アミノ酸のＣｙｓ
置換に適した部位の同定は、結晶構造データに基づき、天然アミノ酸の表面露出を分析す
ることを必要とした。本明細書において記載の部位は、十分にアクセシブルで、反応性で
あるので、それらを、天然に存在するシステイン残基を修飾するために当技術分野におい
て周知の化学によって、イムノコンジュゲートを形成するために使用することができる。
このため、置換Ｃｙｓ残基のコンジュゲーションは、従来の方法を使用する。
【０００９】
選択された修飾部位は、チオール−マレイミド部分がコンジュゲーションにおいて使用
される場合、コンジュゲーションのわずかな逆行の性向を示し得る。チオール−マレイミ
ドコンジュゲーション反応は、多くの場合に、高度に選択的で、極めて効率的であり、ペ
イロードをタンパク質のシステイン残基のチオールに付着させるために、またはタンパク
質とペイロードとの間の連結における他の場所のリンカーとしてのいずれかで使用するこ
とができる。例えば、マレイミドは、タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）に付着
することができ、付着したチオールを有するペイロードは、マレイミドに付加されて、コ
ンジュゲートを形成し得る：
【００１０】
【化１】
2018134080.tif 000002
したがって、このコンジュゲーションステップでは、タンパク質（例えば、抗体または抗
体断片）は、一重円または二重円のいずれかであり得、他方が、ペイロードを表す。ここ
で、イムノコンジュゲートの安定性情報は、特に、マレイミド基との反応による置換シス
テインのコンジュゲーションに関する。一部の実施形態では、チオールは、タンパク質（
例えば、抗体または抗体断片）上のシステインに由来し、この場合、二重円は、タンパク
質を表し、一重円は、ペイロードを表す。
【００１１】
多くの場合に、チオール−マレイミド反応を、コンジュゲートを作製するために使用す
るが、以下に示すとおりのコンジュゲーションステップの逆行が、ペイロードの損失また
はペイロードと他のチオール含有種との混合をもたらし得る。
【００１２】
【化２】
2018134080.tif 000003
【００１３】
システイン置換のためのいくつかの部位が、他のものより安定したマレイミドコンジュ
ゲートを提供することが報告されているが、これはおそらく、新たなシステイン周囲にお
ける抗体表面上の特定位置における局所化学環境が、スクシンイミド環の加水分解を促進
し得、これによって、イムノコンジュゲート中のチオール−マレイミド連結の逆行が防が
れるためである（Shen et al. (2012), Nat. Biotechnol. 30(2):184-9）。この基準を満
たす有利な部位の同定は、適切な表面露出を有する多数の天然アミノ酸に代えてＣｙｓを
挿入し、チオール−マレイミド連結を含むイムノコンジュゲートを作製し、コンジュゲー
トの安定性が不安定化した部位周囲の局所環境によって低下した部位を除去するために、
イムノコンジュゲートの安定性を評価することを必要とした。これによって、リンカーお
よびペイロードを置換Ｃｙｓ残基に付着させるために使用され得る化学は、上記で論述し
たチオール−マレイミドコンジュゲートの逆行性に関連する安定性の問題によって限定さ
れない。マレイミドコンジュゲーションを含む数多くの方法が、システインにおいてコン
ジュゲートを形成するために使用することができる。最も一般的なコンジュゲーション法
の１つを使用し、抗体操作に有利なこれらの部位を作製する際に、本明細書において記載
のシステイン置換用の部位は、抗体コンジュゲート生成物の安定性を向上させるが、これ
は、修飾抗体が周知の高度に効率的なマレイミドコンジュゲーション法と共に使用され得
るためである。
【００１４】
選択された部位は、均一なコンジュゲートの形成に干渉し得る、望ましくないジスルフ
ィド形成を最小化するように配置され得る。操作されたシステインを含む抗体または抗体
断片が哺乳動物細胞中で産生された場合、Ｃｙｓ残基は典型的には、遊離のＣｙｓアミノ
酸またはグルタチオンに対するジスルフィドとして存在する（Chen et al., (2009) mAbs
16, 353-571）。チオール反応性基とのコンジュゲーションのためのＣｙｓ残基を遊離さ
せるためには、すべてのジスルフィド結合を開裂させて、抗体または抗体断片を還元する
必要がある。次いで、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片を安定化する天然ジス
ルフィドの形成を容易にする条件下で再酸化される。再酸化の際に、抗体または抗体断片
表面上に顕著に露出し過ぎたシステイン残基は、別の抗体または抗体断片上のＣｙｓとの
反応によって（「抗体間ジスルフィド」）または望ましくない抗体内ジスルフィドを形成
することによってジスルフィドを形成し得る。本明細書において記載の特定部位に位置す
るシステイン残基は、効率的なコンジュゲーションに利用可能であるように適切にアクセ
シブルであるが、そうでない場合に、ｃｙｓ修飾抗体を発現時に典型的に必要とされる還
元／再酸化手順中に生じる抗体間および抗体内ジスルフィド結合の形成を低減または除去
するために十分なだけ遮断されるか、または適切に配置されることが見出されている。同
様に、再酸化後に、いくつかの部位が、操作された新たなＣｙｓ残基のタンパク質内への
位置のためと思われる不均一なコンジュゲーション生成物を生成することが見出され、本
明細書において同定した特定部位がこのような不均一性を最小化する部位である。
【００１５】
タンパク質治療剤の疎水性を低下させることは一般に、凝集および循環からのクリアラ
ンスを低下させる場合があるため一般的に有益であると考えられるため、ペイロード付着
が好ましい場合、薬物ペイロードを、それらが溶媒の相互作用および付着から隔離される
部位においてコンジュゲートさせることは、抗体の疎水性を向上させ得る。抗体１個当た
り４、６、または８個のペイロードが付着している場合、または特に、疎水性ペイロード
が使用される場合、疎水性の変化を最小にする付着部位を選択することが、特に有益であ
る場合がある。
【００１６】
本明細書の実施例において記載のこれらの方法および追加の方法を使用して、Ｃｙｓ組
み込み用の部位を評価し、これによって、抗体または抗体断片を操作してコンジュゲーシ
ョン、特にＡＤＣ作製のための部位としてＣｙｓを導入するためのＣｙｓ組み込み用の好
ましい部位を選択した。抗体の天然アミノ酸をＣｙｓで置換するための特定部位の選択に
関するさらなる詳細を、本明細書において提供する。
【００１７】
システイン置換部位は、抗体または抗体断片の定常領域中に位置し、標準的なナンバリ
ング規則を使用して本明細書において同定される。しかしながら、抗体の部分または断片
が、完全な全長抗体の代わりに、多くの目的で使用され得ることは周知であり、抗体が、
種々の方法において修飾されることができ、それらの方法が、それらが定常領域の機能性
に実質的に影響を及ぼさなくとも、定常領域中の部位のナンバリングに影響を及ぼすこと
も周知である。例えば、抗体のループ領域へのＳ６タグ（短いペプチド）の挿入は、抗体
の多くの部位のナンバリングを変化させるにも関わらず、抗体の活性を保持させ得ること
が示されている。したがって、本明細書において記載の好ましいシステイン置換部位は、
完全な抗体のナンバリングに基づく標準的なナンバリングシステムによって同定されるが
、本出願は、抗体断片中または他の修飾（例えば、ペプチドタグ挿入）を含む抗体中の対
応する部位を含む。したがって、それらの断片または修飾抗体中の対応する部位は、断片
または修飾抗体中のシステイン置換のために好ましい部位であり、番号によるシステイン
置換部位への言及は、全長抗体の関連部分の機能を保持する修飾抗体または抗体断片中の
対応する部位を含む。
【００１８】
抗体断片または修飾抗体中の対応する部位は、抗体断片または修飾抗体のセグメントを
全長抗体とアラインさせて、本発明の好ましいシステイン置換部位の１つにマッチする、
抗体断片または修飾抗体中の部位を同定することによって、容易に同定され得る。アライ
ンメントは、セグメントが全長抗体の正しい部分にマッチすることを保証するために十分
に長いセグメント、例えば、少なくとも２０個のアミノ酸残基または少なくとも５０個の
残基または少なくとも１００個の残基または少なくとも１５０個の残基のセグメントに基
づき得る。アラインメントは、抗体断片または修飾抗体内に操作されているため、アライ
ンメント、特に保存的置換に使用したセグメント中の操作された点変異による配列中の差
異が許容される場合がある他の修飾を考慮してもよい。したがって、例えば、Ｆｃドメイ
ンは、抗体から切除されることができ、ナンバリングの差異に関わらず、本明細書におい
て記載のシステイン置換部位に対応するアミノ酸残基を含む。本開示のシステイン置換部
位に対応するＦｃドメイン中の部位は、Ｆｃドメイン中のシステイン置換用の有利な部位
であることも期待され、本出願の範囲内に含まれる。
【００１９】
一実施形態では、本出願は、式（Ｉ）：
【００２０】
【化３】
2018134080.tif 000004
［式中、Ａｂは、本明細書において記載の好ましいシステイン置換部位の１つにおいて、
少なくとも１個のシステイン残基を含む抗体または抗体断片を表し；
ＬＵは、本明細書において記載するとおりのリンカーユニットであり；
Ｘは、ペイロードまたは薬物部分であり、
およびｎは、１〜１６の整数である］のイムノコンジュゲートを提供する。
【００２１】
典型的には、式（Ｉ）の化合物において、ＬＵは、本明細書において記載のシステイン
置換部位の１つにおいて、システインに付着しており、Ｘは、抗癌剤などの薬物部分であ
り、Ａｂが抗体である場合、ｎは、２〜８であるか、またはＡｂが抗体断片である場合、
ｎは、１〜８であり得る。
【００２２】
一実施形態では、本出願は、修飾抗体またはその抗体断片と、薬物部分とを含むイムノ
コンジュゲートであって、前記修飾抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片の重
鎖の、１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３６０、お
よび３７５位から選択されるその定常領域上の１個または複数のアミノ酸のシステインで
の置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、イムノコン
ジュゲートを提供する。
【００２３】
一実施形態において、本出願は、修飾抗体またはその抗体断片と、薬物部分とを含むイ
ムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片
の軽鎖の、１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１、および１６５位から選択
されるその定常領域上の１個または複数のアミノ酸のシステインでの置換を含み、前記位
置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖であ
る、イムノコンジュゲートを提供する。
【００２４】
一実施形態において、本出願は、修飾抗体またはその抗体断片と、薬物部分とを含むイ
ムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片
の軽鎖の１４３、１４７、１５９、１６３、および１６８位から選択されるその定常領域
上の１個または複数のアミノ酸のシステインでの置換を含み、前記位置が、Ｋａｂａｔシ
ステムに基づいてナンバリングされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、イムノ
コンジュゲートを提供する。
【００２５】
一実施形態において、本出願は、本明細書において記載の位置において、１個または複
数のアミノ酸のシステインでの置換を含む、修飾抗体またはその抗体断片を提供する。シ
ステイン置換用の部位は、抗体の定常領域中にあるため、様々な抗体に適用可能であり、
部位は、安定的で、均一なコンジュゲートを提供するために選択される。修飾抗体または
断片は、２つ以上のシステイン置換を有することができ、これらの置換は、本明細書にお
いて記載の他の抗体修飾およびコンジュゲーション方法と組み合わせて使用され得る。
【００２６】
一実施形態において、本出願は、上記で開示されたイムノコンジュゲートを含む医薬組
成物およびそのイムノコンジュゲートを使用する方法を提供する。
【００２７】
一実施形態において、本出願は、本明細書において記載の部位において、少なくとも１
つのシステイン置換を有する、本明細書において記載の修飾抗体または抗体断片をコード
する核酸を提供する。本出願は、さらに、これらの核酸を含む宿主細胞、およびその核酸
または宿主細胞を使用して、本明細書において記載の抗体または抗体断片を発現および産
生する方法を提供する。
【００２８】
一実施形態において、本出願は、システインでの置換に適した抗体のアミノ酸を選択し
て、コンジュゲート用に良好な部位を提供する方法であって、
（１）適切な表面露出を有する抗体の定常領域中のアミノ酸を同定して、初期候補部位の
セットを提供することと、
（２）各初期候補部位について、その部位における天然アミノ酸がシステインによって置
換されている抗体を発現させることと、
（３）発現した各抗体について、発現したタンパク質が、還元および再酸化後に実質的に
均一であるかどうかを決定して、初期候補部位に遊離システインを有する抗体を提供する
ことと、
（４）実質的に均一で、機能的な発現した各タンパク質について、初期候補部位における
システインをマレイミド部分とコンジュゲートさせて、チオール−マレイミド連結がその
部位において安定であるかどうかを決定することと、
（５）発現した抗体が実質的に均一でなく、機能的でない初期候補部位、およびチオール
−マレイミド連結が不安定化されている初期候補部位を、その初期候補部位のセットから
除去して、システイン置換に有利な部位のセットを提供すること
とを含む、方法。
【００２９】
場合により、該方法は、各有利なシステイン置換部位のコンジュゲートについての融解
温度を決定し、システイン置換およびコンジュゲーションによって、該融解温度が自然抗
体の融解温度と５℃以上異なっているあらゆる部位をそのセットから除去するステップを
さらに含む。
【００３０】
一実施形態において、本出願は、イムノコンジュゲートを製造する方法であって、リン
カーユニット（ＬＵ）またはリンカーユニット−ペイロードの組合せ（−ＬＵ−Ｘ）を、
抗体または抗体断片中のシステイン残基に付着させることを含み、そのシステインが、前
記抗体または抗体断片の重鎖の１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９
２、３３３、３６０、および３７５位、ならびに前記抗体または抗体断片の軽鎖の１０７
、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１、および１６５位から選択されるシステイン
置換部位に位置し、前位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、方法を提
供する。
【００３１】
本出願の他の態様および実施形態を、本明細書において、より詳細に記載する。
【００３２】
下記は、本出願の実施形態である。
１．修飾抗体またはその抗体断片を含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体ま
たは抗体断片が、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステインでの置換の組合せを
含み、その組合せが、抗体重鎖の３６０位、および抗体カッパ軽鎖の１０７位から選択さ
れる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、イムノコ
ンジュゲート。
２．修飾抗体またはその抗体断片を含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体ま
たは抗体断片が、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステインでの置換の組合せを
含み、その組合せが、抗体重鎖の１５２位および３７５位から選択される置換を含み、前
記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、イムノコンジュゲート。
３．配列番号４８の重鎖定常領域、および配列番号６１を含むカッパ軽鎖定常領域を含む
修飾抗体またはその抗体断片を含む、イムノコンジュゲート。
４．配列番号１３１の重鎖定常領域を含む修飾抗体またはその抗体断片を含む、イムノコ
ンジュゲート。
５．イムノコンジュゲートが、薬物部分をさらに含む、実施形態１から４のいずれかに記
載のイムノコンジュゲート。
６．薬物抗体比が約４である、実施形態１から５のいずれかに記載のイムノコンジュゲー
ト。
７．前記薬物部分が、前記システインの硫黄および任意選択のリンカーを介して、修飾抗
体または抗体断片に付着している、実施形態１から６のいずれかに記載のイムノコンジュ
ゲート。
８．前記薬物部分が、開裂性または非開裂性のリンカーを介して、前記システインの前記
硫黄に接続している、実施形態１から７に記載のイムノコンジュゲート。
９．前記薬物部分が、非開裂性のリンカーを介して、前記システインの前記硫黄に接続し
ている、実施形態８に記載のイムノコンジュゲート
１０．前記イムノコンジュゲートが、チオール−マレイミド連結を含む、実施形態７から
９に記載のイムノコンジュゲート
１１．前記イムノコンジュゲートが、−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−連結またはジスルフィ
ド連結を含む、実施形態１０に記載のイムノコンジュゲート。
１２．前記薬物部分が細胞毒性薬剤である、実施形態１１に記載のイムノコンジュゲート
。
１３．前記薬物部分が、タキサン、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体
）、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチ
ンＥ、オーリスタチンＦ、マイタンシノイド、およびＥｇ５阻害剤からなる群から選択さ
れる、実施形態１２に記載のイムノコンジュゲート。
１４．前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態１から１３のいずれかに記載の
イムノコンジュゲート。
１５．前記抗体が、キメラ抗体である、実施形態１から１３のいずれかに記載のイムノコ
ンジュゲート。
１６．前記抗体が、ヒト化抗体または完全ヒト抗体である、実施形態１から１３に記載の
いずれかのイムノコンジュゲート。
１７．前記抗体が、二重特異性抗体または多重特異性抗体である、実施形態１４から１６
のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
１８．前記抗体または抗体断片が、腫瘍上の細胞表面マーカーに特異的に結合する、実施
形態１から１７のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
１９．実施形態１から１８のいずれかに記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
２０．少なくとも１つのＰｃｌもしくは非天然アミノ酸置換または酵素媒介性コンジュゲ
ート用のペプチドタグおよび／あるいはそれらの組合せをさらに含む、実施形態１から１
９のいずれかに記載の修飾抗体または抗体断片。
２１．実施形態１から４に記載の修飾抗体または抗体断片をコードする核酸。
２２．実施形態２１に記載の核酸を含む宿主細胞。
２３．修飾抗体または抗体断片を製造する方法であって、 
実施形態２２に記載の宿主細胞を、抗体または抗体断片を発現させるために適した条件下
でインキュベートすることと、前記抗体または抗体断片を単離することとを含む、方法。
２４．イムノコンジュゲートを製造する方法であって、リンカーユニット（ＬＵ）または
リンカーユニット−ペイロードの組合せ（−ＬＵ−Ｘ）を、実施形態１から４のいずれか
に記載の抗体または抗体断片中のシステイン残基に付着させることを含む方法。
２５．イムノコンジュゲートが、式（Ｉ）：
【００３３】
【化４】
2018134080.tif 000005
［式中、Ａｂは、本明細書において記載の好ましいシステイン置換部位の１つにおいて少
なくとも１個のシステイン残基を含む抗体または抗体断片を表し；
ＬＵは、本明細書において記載のリンカーユニットであり；
Ｘは、ペイロードまたは薬物部分であり；
ｎは、１〜１６の整数である］
のイムノコンジュゲートである、実施形態２４に記載の方法。
２６．修飾抗体またはその抗体断片であって、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシ
ステインでの置換の組合せを含み、その組合せが、抗体重鎖の３６０位、および抗体カッ
パ軽鎖の１０７位から選択される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバ
リングされている、修飾抗体またはその抗体断片。
２７．修飾抗体またはその抗体断片であって、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシ
ステインでの置換の組合せを含み、その組合せが、抗体重鎖の１５２位および３７５位か
ら選択される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、
修飾抗体またはその抗体断片。
２８．配列番号４８の重鎖定常領域、および配列番号６１を含むカッパ軽鎖定常領域を含
む、修飾抗体またはその抗体断片。
２９．配列番号１３１の重鎖定常領域を含む、修飾抗体またはその抗体断片。
【００３４】
定義
「アミノ酸」という用語は、天然、合成、および非天然のアミノ酸、さらには天然アミ
ノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ
酸は、遺伝情報によってコードされるタンパク新生アミノ酸であり、アラニン、アルギニ
ン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン
、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロ
リン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、さらにはセレノシステ
イン、ピロリジンおよびその類似体のピロリン−カルボキシ−リシンを含む。アミノ酸類
似体は、天然アミノ酸と同じ基礎的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ
基、およびＲ基に結合したα−炭素を有する化合物、例えば、シトルリン、ホモセリン、
ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このよ
うな類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格
を有するが、天然アミノ酸と同じ基礎的化学構造を保持している。
【００３５】
アミノ酸模倣物は、アミノ酸の全体的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミ
ノ酸に類似する様式で機能する化合物を指す。本明細書において使用する場合、「非天然
アミノ酸」という用語は、同じか異なるかどうかに関わらず、任意の生物由来の非修飾ま
たは修飾遺伝子を使用しても、どのような生物においても生合成的に生成され得ないアミ
ノ酸構造を表すことを意図する。加えて、このような「非天然アミノ酸」は典型的には、
タンパク質内に取り込むための修飾されたｔＲＮＡおよび修飾されたｔＲＮＡ合成酵素（
ＲＳ）を必要とする。このｔＲＮＡ／ＲＳペアは、天然アミノ酸に対して非天然アミノ酸
を優先的に取り込む。このような直交性のｔＲＮＡ／ＲＳペアは、Schultz et al.によっ
て開発された選択プロセス（例えば、Liu et al., (2010) Annu. Rev. Biochem. 79:413-
444を参照されたい）または類似の手順によって生成される。「非天然アミノ酸」という
用語は、天然由来の２２番目のタンパク新生アミノ酸であるピロリジン（Ｐｙｌ）および
その脱メチル化類似体であるピロリン−カルボキシ−リシン（Ｐｃｌ）を含まない。これ
は、タンパク質内への両残基の取り込みが、非修飾の天然由来のピロリジル−ｔＲＮＡ／
ｔＲＮＡ合成酵素ペアによって媒介され、ＰｙｌおよびＰｃｌが、生合成的に生成される
ためである（例えば、Ou et al., (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:10437-1044
2；Cellitti et al., (2011) Nat. Chem. Biol. 27;7(8):528-30を参照されたい）。参照
によって組み込まれ、Ｐｃｌで置換され得る、抗体軽鎖および重鎖中の部位特異的アミノ
酸残基が記載されている米国仮出願第６１／７６２３６号も参照されたい。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は、対応する抗原と、非共有的、
可逆的および特異的な様式で結合可能な、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指
す。例えば、天然由来のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続している、
少なくとも２つの重（Ｈ）鎖（「抗体重鎖」とも言う）および２つの軽（Ｌ）鎖（「抗体
軽鎖」とも言う）を含む四量体である。各重鎖には、重鎖可変領域（本明細書において、
ＶＨと省略される）および重鎖定常領域が含まれる。重鎖定常領域には、３つのドメイン
、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３が含まれる。各軽鎖には、軽鎖可変領域（本明細書にお
いて、ＶＬと省略される）および軽鎖定常領域が含まれる。軽鎖定常領域には、１つのド
メイン、ＣＬが含まれる。ＶＨおよびＶＬの領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）
と呼ばれる超可変領域に細分され、その間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、よ
り保存されている領域が散在する。各ＶＨおよびＶＬには、３つのＣＤＲおよび４つのＦ
Ｒが含まれ、下記順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およ
びＦＲ４で、アミノ−末端からカルボキシ−末端に配置されている。重鎖および軽鎖の可
変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な
細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）を含
む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することがある。
【００３７】
「抗体」という用語は、これらだけに限定されないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体
、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例え
ば、本開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含む。抗体は、任意のアイソタイプ／ク
ラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）またはサブク
ラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）
のものであり得る。
【００３８】
軽鎖および重鎖は両方とも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。「定常」
および「可変」という用語は、機能的に使用される。この認識において、軽鎖部分の可変
ドメイン（ＶＬ）および重鎖部分の可変ドメイン（ＶＨ）は両方とも、抗原認識および特
異性を決定することが理解される。逆に、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメ
イン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤
性移動性、Ｆｃ受容体結合性、相補結合性などを付与する。慣例的に、定常領域ドメイン
のナンバリングは、それらが、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位側にな
る場合に大きくなる。Ｎ末端は、可変領域であり、Ｃ末端は、定常領域である。ＣＨ３お
よびＣＬドメインは、実際には、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインをそれぞれ含
む。
【００３９】
本明細書において使用する場合、「抗体断片」という用語は、抗体の抗原結合断片また
は抗体の非抗原結合断片（例えば、Ｆｃ）のいずれかを指す。本明細書において使用する
場合、「抗原結合断片」という用語は、（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、
空間的分布によって）抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の
１つまたは複数の部分を指す。結合断片の例には、これらだけに限定されないが、一本鎖
Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片
（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片）；Ｆ（ａｂ）２断片（ヒン
ジ領域においてジスルフィドブリッジによって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片
）；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の１本の腕のＶＬおよびＶＨドメ
インからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:54
4-546, 1989）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または抗体の他のエピト
ープ結合断片が含まれる。
【００４０】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコ
ードされるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価の分子を形
成する１本のタンパク質鎖を構成することを可能にする、合成リンカーによって結合され
得る（一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）として公知；例えば、Bird et al., Science 242:423
-426, 1988；およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988を参照
されたい）。このような一本鎖抗体も、「抗原結合断片」という用語に包含されることを
意図する。これらの抗原結合断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られる。断片
は、完全な抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
【００４１】
抗原結合断片は、単一のドメイン抗体、マキシボディ（maxibody）、ミニボディ（mini
body）、ナノボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、
ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖにも包含され得る（例えば、Hollinger and Hudson, 
Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005を参照されたい）。抗原結合断片は、ポリペ
プチド、例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）に基づく足場に移植され得る（例
えば、フィブロネクチンポリペプチドのモノボディ（monobody）が記載されている米国特
許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。
【００４２】
抗原結合断片は、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含
む一本鎖分子に包含され得、これは、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領
域を形成する（Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995；および米国特許第５
，６４１，８７０号明細書）。
【００４３】
本明細書において使用する場合、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体
組成物」という用語は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝的ソー
スから得られる、抗体および抗体断片を含むポリペプチドを指す。この用語は、単一の分
子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープにつ
いて単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４４】
本明細書において使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣ
ＤＲ領域の両方がヒト由来の配列から得られる可変領域を有する抗体を含む。さらに、該
抗体が定常領域を含む場合、定常領域も、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系配列
もしくはヒト生殖系配列の変異型、または例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:
57-86, 2000に記載されているように、ヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセ
ンサスフレームワーク配列を含む抗体から得られる。
【００４５】
本出願のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  
ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、もしくはｉｎ  ｖｉ
ｖｏにおける体細胞変異によって導かれる変異、または安定性もしくは製造を促進する保
存的置換）を含んでもよい。
【００４６】
本明細書において使用する場合、「ヒト化」抗体という用語は、非ヒト抗体の反応性を
保持しているが、ヒトにおける免疫原性がほとんどない抗体を指す。これは、例えば、非
ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残り部分をそれらのヒトカウンターパートで置き換える
ことによって達成され得る。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
1:6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)；Verhoeyen e
t al., Science, 239:1534-1536 (1988)；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991)；
Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照されたい。
【００４７】
本明細書において使用する場合、「認識する」という用語は、そのエピトープが直線状
であるかまたは立体構造であるかに関わらず、そのエピトープを発見し、同エピトープと
相互作用する（例えば、結合する）抗体またはその抗原結合断片を指す。「エピトープ」
という用語は、本開示の抗体または抗原結合断片が特異的に結合する抗原上の部位を指す
。エピトープは、連続的なアミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並
んだ非連続的なアミノ酸の両方から形成され得る。連続的なアミノ酸から形成されたエピ
トープは典型的には、変性溶媒に対する暴露において保持される一方で、三次フォールデ
ィングによって形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒での処理において失われる
。エピトープは典型的には、固有の空間的構造において、少なくとも３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を含む。エピトープ
の空間的構造を決定する方法は、当技術分野における技術、例えば、ｘ線結晶構造解析お
よび二次元核磁気共鳴法（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular
Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい）を含む。
【００４８】
本明細書において使用する場合、「親和性」という用語は、１つの抗原部位における抗
体と抗原との間における相互作用の強度を指す。各抗原部位において、抗体「腕」の可変
領域は、弱い非共有力を介して、多くの部位において抗原と相互作用し、相互作用が強い
ほど親和性が高い。
【００４９】
「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含ま
ない抗体を指す。ただし、１つの抗原に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原に
対する交差反応性を有することがある。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および
／または化学物質を実質的に含まないことがある。
【００５０】
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適
用する。特定の核酸配列について、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同
一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない
場合は、本質的に同じ配列を指す。遺伝情報の退縮のために、多数の機能的に同一の核酸
が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、お
よびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。このため、アラニンがコドンに
よって特定されるすべての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変更す
ることなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸変異
は、保存的に修飾された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコ
ードする本明細書におけるすべての核酸配列は、核酸のすべての可能性のあるサイレント
変異も記載する。当業者は、核酸における各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコ
ドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除
く）が修飾されて、機能的に同一の分子を生じ得ることを認識する。したがって、ポリペ
プチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された配列それぞれに黙示的に含ま
れる。
【００５１】
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」は、化学的に類似するアミ
ノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失、また
は付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野におい
て周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本開示の多形変異体、種間ホモ
ログ、および対立遺伝子を除外するものではなく、これらに追加されるものである。下記
８つのグループ：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グ
ルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）
、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン
（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セ
リン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互
いに保存的置換であるアミノ酸を含む（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照され
たい）。一部の実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗
体の結合特性に有意に影響を及ぼさない、または同特性を有意に変更しない、アミノ酸修
飾を指すために使用される。
【００５２】
本明細書において使用する場合、「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列が
、産生細胞または生物、一般的には、真核生物の細胞、例えば、酵母細胞、ピキア（Pich
ia）細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、チャイニーズハムスター卵
巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用して、アミノ酸配列を
コードするように変更されていることを指す。最適化されたヌクレオチド配列は、本来、
「親」配列としても公知の出発ヌクレオチド配列によって本来コードされるアミノ酸配列
を完全に、または可能な限り高く維持するように操作される。
【００５３】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチドの配列についての、「パーセント同一」または
「パーセント同一性」という用語は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じであることを
指す。比較ウインドウにわたって最大の一致を比較およびアラインさせるか、または下記
配列比較アルゴリズムの１つを使用して、もしくは手動のアラインメントおよび目視検査
によって測定されたものとして領域を指定した場合に、２つの配列が、特定の割合の、同
じ（すなわち、特定の領域にわたって、または特定しない場合には配列全体にわたって、
６０％同一性、場合により、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％
、または９９％同一性の）アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合、２つの配列は
「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも約３０個のヌクレオ
チド（または１０個のアミノ酸）の領域にわたって、またはより好ましくは、長さが１０
０から５００個または１０００個以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００個以上
のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００５４】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として
機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピュ
ータに入力され、必要に応じて、配列座標が指定され、配列アルゴリズムのプログラムパ
ラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを使用することができ、ま
たは別のパラメーターが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパ
ラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００５５】
本明細書において使用する場合、「比較ウインドウ」は、２０〜６００、一般的には、
約５０〜約２００、より一般的には、約１００〜約１５０からなる群から選択される数の
連続的な位置のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここで、２つの配列が最
適にアラインされた後に、ある配列が、同じ数の連続的な位置の参照配列に対して比較さ
れてもよい。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野において周知である
。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman Adv. Appl
. Math. 2:482c (1970)の局所的ホモロジーアルゴリズムによって、Needleman and Wunsc
h, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Pe
arson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法によっ
て、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（the Wisconsin Genetics Software Pack
age, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおける、ＧＡＰ、ＢＥ
ＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アラインメントお
よび目視検査（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003
を参照されたい）によって行われ得る。
【００５６】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの２つの
例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０のアルゴリズムであり、これらのアルゴリズ
ムはそれぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschu
l et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行う
ためのソフトウェアは、米国バイオテクノロジー情報センター（National Center for Bi
otechnology Information）から公開されている。このアルゴリズムは、まず、データベ
ース配列における同じ長さのワードとアラインさせた場合、何らかの正の値を有する閾値
スコアＴにマッチするか、または同スコアＴを満たすかのいずれかである照会配列におい
て長さＷのショートワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定
することを含む。Ｔは、近接ワードスコア閾値（Altschul et al、上記）と呼ばれる。こ
れらの最初の近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開
始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大
し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列につ
いて、パラメーターＭ（一対のマッチする残基についての報酬スコア；通常＞０）および
Ｎ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；通常＜０）を使用して算出される。ア
ミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを算出するために使用
される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大
達成値からの量Ｘによって減少する；累積スコアが、１つまたは複数の負のスコアリング
残基アラインメントの蓄積によってゼロ以下になる；またはいずれかの配列の端部に達し
た時点で停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、およびＸは
、アラインメントの感受性および速度を決定する。（ヌクレオチド配列についての）ＢＬ
ＡＳＴＮプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、
および両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰ
プログラムは、３のワード長および１０の予測（Ｅ）ならびに５０のＢＬＯＳＵＭ６２ス
コアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:10915を参照されたい）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、
Ｎ＝−４、および両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。
【００５７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間における類似性の統計学的分析も行う（例え
ば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照され
たい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最小合計確
率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間のマッチ
が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比
較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好
ましくは、約０．００１未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。
【００５８】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅ
ｒのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）を使用しても決定され得、
これは、ＰＡＭ１２０重量残基表（PAM120 weight residue table）、１２のギャップ長
ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョ
ン２．０）に組み込まれている。さらに、上記２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性
は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）のアル
ゴリズムを使用して決定され得、これは、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ
２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４の
ギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフト
ウェアパッケージ（www.gcg.comにおいて利用可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込
まれている。
【００５９】
上記配列同一性の割合以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であ
ることの別の指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載され
るように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して生じる抗体と、免疫学
的に交差反応性であることである。このため、ポリペプチドは典型的には、例えば、２つ
のペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合に、第２のポリペプチドに対して実質
的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子またはそ
の相補体が、以下に記載されるように、ストリンジェントな条件下において互いにハイブ
リダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じ
プライマーが配列を増幅するために使用され得ることである。
【００６０】
本明細書において、「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的
に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本
鎖のいずれかの形態におけるそれらのポリマーを指す。該用語は、公知のヌクレオチド類
似体または修飾された骨格残基もしくは連結を含む核酸を包含し、これは、合成、天然由
来および非天然由来であり、参照核酸と類似する結合特性を有し、参照ヌクレオチドに類
似する様式で代謝される。このような類似体の例には、これらだけに限定されないが、ホ
スホロチオアート、ホスホラミダート、メチルホスホナート、キラル−メチルホスホナー
ト、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。
【００６１】
特に示さない限り、特定の核酸配列は、黙示的に、そのサイレント変異体（例えば、変
性コドン置換）および相補配列、さらには明確に示された配列も包含する。具体的には、
以下に詳述されるように、変性コドン置換は、１つまたはそれ以上の選択された（または
すべての）コドンの第３位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置
換されている配列を生成することによって達成されてもよい（Batzer et al., (1991) Nu
cleic Acid Res. 19:5081；Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608；お
よびRossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
【００６２】
核酸についての「動作可能に連結する」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（
例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、これは、転写される配
列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列またはエンハン
サー配列は、それが、適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激
または調節する場合、コード配列に動作可能に連結する。一般的には、転写される配列に
動作可能に連結するプロモーター転写調節配列は、転写される配列に対して物理的に連続
している。すなわち、それらは、シス作用性である。ただし、一部の転写調節配列、例え
ば、エンハンサーは、物理的に連続している必要がないか、またはそれらによって転写が
増大するコード配列に近接して配置される必要がない。
【００６３】
本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使
用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然アミノ酸ポリマー、さらには
非天然アミノ酸ポリマーに適用する。特に示さない限り、特定のポリペプチド配列は、黙
示的に、その保存的に修飾された変異体も包含する。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「イムノコンジュゲート」または「抗体コンジュゲー
ト」という用語は、抗体またはその抗体断片と別の作用因子、例えば、化学療法剤、毒素
、免疫療法剤、画像化プローブ、分光プローブとの連結を指す。連結は、１つもしくは複
数の共有結合または非共有的相互作用によることができ、キレート化を含み得る。様々な
リンカーは、その多くが当技術分野において公知であり、該イムノコンジュゲートを形成
するために用いられ得る。さらに、イムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートをコ
ードするポリヌクレオチドから発現されてもよい融合タンパク質の形態で提供され得る。
本明細書において使用する場合、「融合タンパク質」は、本来別々のタンパク質について
コードされる、２つ以上の遺伝子または遺伝子断片（ペプチドおよびポリペプチドを含む
）の結合によって創成されたタンパク質を指す。融合タンパク質は、遺伝子もしくは遺伝
子断片のＮ−もしくはＣ−末端における結合によって、または１つのパートナータンパク
質の許容される領域内への遺伝子もしくは遺伝子断片の挿入によって形成されてもよい。
融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質それぞれに由来する機能的特性を有する１つのタン
パク質をもたらす。
【００６５】
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、すべての脊椎動
物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、
ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。言及した場合を除いて、「患者」または「対象
」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「細胞毒」または「細胞毒性薬剤」という用語は、細
胞の成長および増殖に有害であり、細胞または悪性腫瘍を減少、阻害、または崩壊するた
めに作用し得る、任意の作用因子を指す。
【００６７】
本明細書において使用する場合、「抗癌剤」という用語は、細胞増殖性障害、例えば、
癌を処置するために使用され得る任意の作用因子を指し、これらだけに限定されないが、
細胞毒性薬剤、化学療法剤、放射線治療および放射線治療剤、標的化抗癌剤、および免疫
療法剤が含まれる。
【００６８】
「薬物部分」または「ペイロード」という用語は、互換的に使用され、本開示の抗体ま
たは抗体断片にコンジュゲートする化学部分を指し、抗体または抗体断片に付着するため
に有用な任意の部分を含み得る。例えば、薬物部分またはペイロードは、抗癌剤、抗炎症
剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、麻酔剤であり得る。特定の実施形態
では、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏ
ｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタ
ンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、プロテインＣＲＭ１の核外
移行の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤
、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、プロテア
ソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、Ｅｇ５阻害剤、ＤＮＡ傷害剤、ＤＮＡ
アルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤、およびＤＨＦＲ阻害剤か
ら選択される。適切な例には、オーリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ；カリチア
マイシン、例えば、ガンマ−カリチアマイシン；およびメイタンシノイド、例えば、ＤＭ
１およびＤＭ４が含まれる。これらのそれぞれを、本開示の抗体および方法と適合するリ
ンカーに付着させるための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Singh et a
l., (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457を参
照されたい。さらに、ペイロードは、コンジュゲートを別の部分、表面等に接続させ得る
、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外プローブ、親和性プローブ
、キレート剤、分光プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポ
リマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体断片、
ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、糖類もしくは多糖類、反応性官能基
、または結合剤であり得る。
【００６９】
「薬物抗体比」（「ＤＡＲ」とも言う）という用語は、イムノコンジュゲートの抗体に
連結しているペイロードまたは薬物部分の数を指す。例えば、薬物抗体比が２であること
は、イムノコンジュゲートの試料中の各抗体に、平均２個の薬物部分が結合していること
を意味する。薬物抗体比が２の試料中には、薬物部分と全く連結していないか、または１
つの薬物部分とのみ連結している個々のイムノコンジュゲートもあれば、個々の抗体上に
、２、３、４個、またはそれ以上の部分を有する同試料中の他のイムノコンジュゲートも
ある。しかし、試料中の平均は、２である。イムノコンジュゲートの薬物抗体比を測定す
るために、当技術分野において公知の異なる方法が存在する。
【００７０】
本出願の実施形態において、イムノコンジュゲートの試料中のＤＡＲは、「均一」であ
り得る。「均一なコンジュゲート試料」は、狭い分布のＤＡＲを有する試料である。例示
的な実施形態として、均一なコンジュゲート試料において、２のＤＡＲを有することは、
その試料中に、コンジュゲートしていない抗体、および約２のＤＡＲでコンジュゲートし
ている、３つ以上の部分を有する一部の抗体を含み得る。「ほとんどの試料」は、２つの
部分にコンジュゲートしている試料中の抗体を、少なくとも７０％を超え、または少なく
とも８０％を超え、または少なくとも９０％を超えて有することを意味する。
【００７１】
例示的な実施形態として、４のＤＡＲを有する均一なコンジュゲート試料は、その試料
中に、約４のＤＡＲにおいて各抗体にコンジュゲートしている４つ前後の部分を有する抗
体を含み得る。「ほとんどの試料」は、４つの部分にコンジュゲートしている試料中の抗
体を、少なくとも７０％を超え、または少なくとも８０％を超え、または少なくとも９０
％を超えて有することを意味する。
【００７２】
例示的な実施形態として、６のＤＡＲを有する均一なコンジュゲート試料は、その試料
中に、約６のＤＡＲにおいて各抗体にコンジュゲートしている６つ前後の部分を有する抗
体を含み得る。「ほとんどの試料」は、６つの部分にコンジュゲートしている試料中の抗
体を、少なくとも７０％を超え、または少なくとも８０％を超え、または少なくとも９０
％を超えて有することを意味する。
【００７３】
例示的な実施形態として、８のＤＡＲを有する均一なコンジュゲート試料は、その試料
中に、約８のＤＡＲにおいて各抗体にコンジュゲートしている８つ前後の部分を有するい
くつかの抗体を有する抗体を含み得る。「ほとんどの試料」は、８つの部分にコンジュゲ
ートしている試料中の抗体を、少なくとも７０％を超え、または少なくとも８０％を超え
、または少なくとも９０％を超えて有することを意味する。
【００７４】
「約２の薬物抗体比」を有するイムノコンジュゲートは、薬物抗体比が約１．６〜２．
４部分／抗体、１．８〜２．３部分／抗体、または１．９〜２．１部分／抗体の範囲であ
り得るイムノコンジュゲートの試料を指す。
【００７５】
「約４の薬物抗体比」を有するイムノコンジュゲートは、薬物抗体比が約３．４〜４．
４部分／抗体、３．８〜４．３部分／抗体、または３．９〜４．１部分／抗体の範囲であ
り得るイムノコンジュゲートの試料を指す。
【００７６】
「約６の薬物抗体比」を有するイムノコンジュゲートは、薬物抗体比が約５．１〜６．
４部分／抗体、５．８〜６．３部分／抗体、または５．９〜６．１部分／抗体の範囲であ
り得るイムノコンジュゲートの試料を指す。
【００７７】
「約８の薬物抗体比」を有するイムノコンジュゲートは、薬物抗体比が約７．６〜８．
４部分／抗体、７．８〜８．３部分／抗体、または７．９〜８．１部分／抗体の範囲であ
り得るイムノコンジュゲートの試料を指す。
【００７８】
「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず新生細胞の成長および増殖、ならびにすべての
前癌性および癌性の細胞および組織を指す。
【００７９】
「抗腫瘍活性」という用語は、腫瘍細胞増殖の速度、生存率、または転移活性の低下を
意味する。抗腫瘍活性を示すことが可能な方法は、治療中に生じる異常な細胞の成長速度
の低下または腫瘍サイズの安定性もしくは低下を示すことである。このような活性は、こ
れらだけに限定されないが、異種移植片モデル、同種移植片モデル、ＭＭＴＶモデル、お
よび抗腫瘍活性を研究するために当技術分野において公知の他の公知のモデルを含む、承
認されたｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルを使用して評価され得る。
【００８０】
「悪性腫瘍」という用語は、非良性腫瘍または癌を指す。本明細書において使用する場
合、「癌」という用語は、調節解除されているか、または無制御な細胞増殖によって特徴
付けられる悪性腫瘍を含む。例示的な癌には、癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が含
まれる。
【００８１】
「癌」という用語は、原発性悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位以外の対象の身体中の部
位に、その細胞が移動していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位とは
異なる二次部位に腫瘍細胞の転移、移動を生じているもの）が含まれる。
【００８２】
本明細書において使用する場合、「光学異性体」または「立体異性体」という用語は、
本出願の所与の化合物について存在することがあり、幾何異性体を含む、様々なステレオ
異性体型のいずれかを指す。置換基が炭素原子のキラル中心に付着することがあることが
理解される。「キラル」という用語は、その鏡像パートナーと重ね合わせることができな
い特性を有する分子を指す一方で、「アキラル」という用語は、その鏡像パートナーとの
重ね合わせができる分子を指す。したがって、本開示は、化合物のエナンチオマー、ジア
ステレオマー、またはラセミ体を含む。「エナンチオマー」は、互いの鏡像を重ね合わせ
ることができない一対の立体異性体である。一対のエナンチオマーの１：１の混合物は、
「ラセミ」混合物である。この用語は、必要に応じて、ラセミ混合物を指定するために使
用される。「ジアステレオマー」は、少なくとも２つの不斉原子を有するが、互いに鏡像
関係にない立体異性体である。絶対立体化学は、Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ
Ｒ−Ｓシステムに従って特定される。化合物が純粋なエナンチオマーである場合、各キ
ラル炭素における立体化学は、ＲまたはＳのいずれかによって特定されてもよい。絶対配
置が未知である分離された化合物は、それらがナトリウムＤ線の波長における面偏光を回
転させる方向（右旋または左旋）に応じて、（＋）または（−）で指定され得る。本明細
書において記載の特定の化合物は、１つまたは複数の不斉中心または軸を含むので、エナ
ンチオマー、ジアステレオマー、および絶対立体化学に関して（Ｒ）−または（Ｓ）−と
して定義されることがある他の立体異性体を生じることがある。
【００８３】
出発材料および手順の選択に応じて、化合物は、可能性のある異性体またはそれらの混
合物の１つの形態において、例えば、純粋な光学異性体または異性体混合物、例えば、不
斉炭素原子の数に応じて、ラセミ体およびジアステレオ異性体混合物として存在し得る。
本出願は、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物、および光学的に純粋な形態を含む、
すべてのこのような可能性のある異性体を含むことを意味する。光学的に活性な（Ｒ）−
および（Ｓ）−異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を使用して調製されてもよ
いし、または従来技術を使用して分離されてもよい。上記化合物が二重結合を含む場合、
置換基は、ＥまたはＺ配置でもよい。化合物が二置換のシクロアルキルを含む場合、シク
ロアルキル置換基は、ｃｉｓ−またはｔｒａｎｓ−配置を有してもよい。すべての互変異
体も含まれると意図する。
【００８４】
本明細書において使用する場合、「塩（単数）」または「塩（複数）」という用語は、
本出願の化合物の酸付加塩または塩基付加塩を指す。「塩」は特に、「薬学的に許容され
る塩」を含む。「薬学的に許容される塩」という用語は、本出願の化合物の生物学的有効
性および特性を保持する塩を指し、典型的には、生物学的に、またはその他の方法で望ま
しくないことはないものである。多くの場合に、本出願の化合物は、アミノおよび／もし
くはカルボキシル基またはそれに類似する基の存在によって、酸および／または塩基塩を
形成可能である。
【００８５】
薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸と共に形成され得、例えば、酢酸
塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、重炭酸塩／炭
酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩化水素塩、クロロテオフ
ィリン酸塩、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコ
ン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸
塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マン
デル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ニコチ
ン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ
酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸
塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、および
トリフルオロ酢酸塩である。
【００８６】
塩が得られる無機酸には、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など
が含まれる。
【００８７】
塩が得られる有機酸には、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マ
レイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、
メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸などが含
まれる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機の塩基と共に形成され得る。
【００８８】
塩が得られる無機塩基には、例えば、アンモニウム塩および周期表のＩ〜ＸＩＩ族の金
属が含まれる。特定の実施形態では、塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル
シウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅から得られ、特に適した塩には、アンモ
ニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウムの塩を含む。
【００８９】
塩が得られる有機塩基には、例えば、第一級、第二級、および第三級アミン、置換アミ
ン（天然由来の置換アミンを含む）、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂などが含まれる
。特定の有機アミンには、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート（cholinate）
、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジン、およびトロ
メタミンが含まれる。
【００９０】
本出願の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分から、従来の化学法によって
合成され得る。一般的には、このような塩は、遊離酸の形態のこれらの化合物と化学量論
的量の適切な塩基（例えば、Ｎａ、Ｃａ、ＭｇまたはＫの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩な
ど）とを反応させることによって、または遊離塩基の形態のこれらの化合物と化学量論的
量の適切な酸とを反応させることによって調製され得る。このような反応は典型的には、
水中もしくは有機溶媒中、またはその２つの混合物中で行われる。一般的には、実施可能
な場合、非水性媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、
またはアセトニトリルを使用することが望ましい。さらなる適切な塩の列記は、例えば、
「Remington's PharmaceuticalSciences」, 20th ed., Mack Publishing Company, Easto
n, Pa., (1985)；および「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection,
and Use」by Stahl and Wermuth（Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002）において見出
すことができる。
【００９１】
本明細書において示される任意の式は、無標識の形態、さらには同位体標識された形態
の化合物を表すことも意図する。同位体標識された化合物は、１個または複数の原子が選
択した原子量または質量数を有する原子によって置き換えられていることを除いて、本明
細書において示された式によって表した構造を有する。本出願の化合物内に組み込まれ得
る同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素および塩素の同位体、例えば
、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３
５Ｓ、３６Ｃｌ、１２５Ｉが含まれる。本開示は、本明細書において定義した様々な同位
体標識された化合物、例えば、化合物内に放射性同位体、例えば、３Ｈおよび１４Ｃ、ま
たは化合物内に非放射性同位体、例えば、２Ｈおよび１３Ｃが存在するものを含む。この
ような同位体標識された化合物は、代謝試験（１４Ｃで）、反応速度論試験（例えば、２
Ｈまたは３Ｈで）、薬物もしくは基質の組織分布アッセイを含む検出もしくは画像化技術
、例えば、陽電子放出型コンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ）もしくは単一光子放出型コン
ピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または患者の放射線治療に有用である。特に、１８
Ｆまたは標識化合物は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ試験に特に望ましいことがある。式（Ｉ
）の同位体標識された化合物は通常、当業者に公知の従来技術によって、または添付の実
施例および調製に記載されたものに類似するプロセスによって、先に用いた非標識試薬の
代わりに、適切な同位体標識された試薬を使用して調製され得る。
【００９２】
さらに、より重い同位体、特に重水素（すなわち、２ＨまたはＤ）での置換によって、
より高い代謝安定性、例えば、増大したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、または減少した用量要求
または治療指数の改善による特定の治療的利益が達成され得る。この文脈における重水素
は、式（Ｉ）の化合物の置換基と見なされると理解される。このようなより重い同位体（
特に重水素）の濃度は、同位体濃縮因子によって定義されてもよい。本明細書において使
用する場合、「同位体濃縮因子」という用語は、特定の同位体の同位体存在度と天然存在
度との間の比を意味する。本出願の化合物における置換基が言及される重水素である場合
、そのような化合物は、少なくとも３５００（各指定の重水素原子における５２．５％の
重水素包含）、少なくとも４０００（６０％の重水素包含）、少なくとも４５００（６７
．５％の重水素包含）、少なくとも５０００（７５％の重水素包含）、少なくとも５５０
０（８２．５％の重水素包含）、少なくとも６０００（９０％の重水素包含）、少なくと
も６３３３．３（９５％の重水素包含）、少なくとも６４６６．７（９７％の重水素包含
）、少なくとも６６００（９９％の重水素包含）、または少なくとも６６３３．３（９９
．５％の重水素包含）の各指定の重水素原子についての同位体濃縮因子を有する。
【００９３】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に
公知であるとおり（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Pri
nting Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）、任意およびすべての溶媒、分散
媒体、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、
等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物安定化剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、
甘味剤、香味剤、染料などおよびこれらの組合せを含む。任意の従来のキャリアが活性成
分と不適合である場合を除いて、治療的組成物または医薬組成物におけるその使用が考え
られる。
【００９４】
本出願の化合物の「治療有効量」という用語は、対象の生物学的または医学的応答、例
えば、酵素またはタンパク質の活性の低減もしくは阻害を引き出す、または症状を寛解し
、状態を緩和し、疾患の進行を遅くするもしくは遅延させる、または疾患を予防するよう
な量の本出願の化合物を指す。非限定的な一実施形態では、「治療有効量」という用語は
、対象に投与した場合、状態もしくは障害もしくは疾患を少なくとも部分的に緩和、阻害
、予防、および／または寛解し、または標的の酵素または受容体の活性を少なくとも部分
的に阻害するために有効な量の本出願の化合物を指す。
【００９５】
本明細書において使用する場合、「阻害する」、「阻害」、または「阻害すること」と
いう用語は、所与の状態、症状、または障害、または疾患の低減もしくは抑制、または生
物学的活性もしくはプロセスのベースライン活性の顕著な低下を指す。
【００９６】
本明細書において使用する場合、任意の疾患または障害を「処置する」、「処置するこ
と」、または「処置」という用語は、一実施形態において、疾患または障害を寛解するこ
と（すなわち、該疾患または少なくとも１つのその臨床的症状の発症を遅くし、停止させ
、または低下させること）を指す。別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」
、または「処置」は、患者によって認識できないことがあるものを含む、少なくとも１つ
の肉体的パラメーターを緩和または寛解することを指す。さらに別の実施形態では、「処
置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害を、肉体的（例えば、認
識できる症状の安定化）、生理学的（例えば、肉体的パラメーターの安定化）のいずれか
、または両方で調節することを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置す
ること」、または「処置」は、疾患または障害の発現または発症もしくは進行を予防また
は遅延させることを指す。
【００９７】
本明細書において使用する場合、このような対象がこのような処置によって、生物学的
に、医学的にまたは生活の質において利益を得る場合、対象は、処置を「必要とする」。
【００９８】
本明細書において使用する場合、本出願について（特に特許請求の範囲において）使用
する「１つの（a）」、「１つの（an）」、「その（the）」という用語および類似する用
語は、本明細書において別段示すか、または文脈と明確に矛盾しない限り、単数または複
数の両方を含むものと解釈すべきである。
【００９９】
本明細書において使用する場合、「チオール−マレイミド」という用語は、この一般式
【０１００】
【化５】
2018134080.tif 000006
［式中、ＹおよびＺは、チオール−マレイミド連結を介して接続している基であり、リン
カーユニットであり得、抗体またはペイロードに付着してよい］を有する、チオールとマ
レイミドとの反応によって形成された基を説明する。一部の例では、Ｙは、本出願による
操作された抗体であり、該式において示した硫黄原子は、本明細書において記載の置換部
位の１つにおけるシステインに由来し；一方、Ｚは、ペイロードに接続しているリンカー
ユニットを表す。
【０１０１】
本明細書において使用する場合、「リンカーユニット」（ＬＵ）は、２つの部分、例え
ば、抗体とペイロードとの間の共有的化学接続を指す。各ＬＵには、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、
Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６として本明細書において記載の１つまたは複数の構成成分が含ま
れ得る。リンカーユニットは、接続している部分間の適切な間隔を提供し、または特定の
物理化学的特性を提供するために選択され、または特定の条件下においてリンカーユニッ
トの開裂を可能にするように選択され得る。
【０１０２】
本明細書において使用する場合、「開裂性」は、共有結合的接続によって２つの部分を
接続させるが、生理学的条件下において壊れて、その部分間の共有結合的接続を切断する
、リンカーまたはリンカーユニット（ＬＵ）を指す。開裂は、酵素的でも、非酵素的でも
よいが、一般的には、抗体を分解することなく、抗体からペイロードを脱離させる。
【０１０３】
本明細書において使用する場合、「非開裂性」は、生理学的条件下における破壊に感受
性でないリンカーまたはリンカーユニット（ＬＵ）を指す。リンカーは、生理学的に修飾
されることがあるが、抗体が実質的に分解する、すなわち、抗体の分解がｉｎ  ｖｉｖｏ
における該リンカーの開裂に先行するまで、抗体に接続しているペイロードを維持する。
【０１０４】
本明細書において使用する場合、「シクロオクチン」は、炭素−炭素三重結合（アセチ
レン）を含む８員環を指す。その環は、場合により、１個または２個のフェニル環と縮合
しており、これは、１〜４個のＣ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ハロ、ヒドロキ
シル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＬ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ１、Ｏ−Ｌ１、または類似する基で置
換されていてもよく、環員としてＮ、Ｏ、またはＳを含んでよい。好ましい実施形態では
、シクロオクチンは、Ｃ８炭化水素環、特に、三重結合を除いて飽和しており、Ｆまたは
ヒドロキシで置換されていてもよく、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、またはＣ（Ｏ
）Ｏを介して、リンカーまたはＬＵに連結していてもよい、孤立環（isolated ring）で
あり得る。
【０１０５】
本明細書において使用する場合、「シクロオクテン」は、少なくとも１つの二重結合、
特にｔｒａｎｓ−二重結合を含む８員環を指す。その環は、場合により、１個または２個
のフェニル環と縮合しており、これは、１〜４個のＣ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキ
シ、ハロ、ヒドロキシル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＬ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ１、Ｏ−Ｌ１、ま
たは類似する基によって置換されていてもよく、環員としてＮ、Ｏ、またはＳを含んでよ
い。好ましい実施形態では、シクロオクテンは、ｔｒａｎｓ二重結合を除いて飽和してお
り、場合により、Ｆまたはヒドロキシで置換されており、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）
ＮＨ、またはＣ（Ｏ）Ｏを介して、リンカーまたはＬＵに連結していてもよい、孤立した
Ｃ８炭化水素環であり得る。
【０１０６】
本明細書において記載のすべての方法は、本明細書において別段に示すか、そうでなけ
れば文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書において提
供されるあらゆる一切の例または例示的言語（例えば、「など」）の使用は、単に本出願
をより良好に明らかにすることを意図し、特に主張しない限り本出願の範囲を限定するも
のではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】トラスツズマブ（配列番号１５５）、ヒトＩｇＧ１（配列番号１５１）、ＩｇＧ２（配列番号１５２）、ＩｇＧ３（配列番号１５３）、およびＩｇＧ４（配列番号１５４）の定常領域のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図２】ｃＫＩＴを発現する細胞に対する、その定常領域中に２つのｃｙｓ変異を有するｃＫＩＴ抗体を含む抗体薬物コンジュゲートの細胞殺滅活性を示すグラフである。該抗体は、Ｅｇ５を阻害するリンカー−ペイロード複合体にコンジュゲートしている。表５において、四角形のデータポイントは、化合物Ａを含むイムノコンジュゲートのデータポイントであり；表５において、三角形のデータポイントは、化合物Ｂを含むイムノコンジュゲートのデータポイントであり；表５において、四角形のデータポイントは、化合物Ｃを含むイムノコンジュゲートのデータポイントである。
【図３−１】Ｈ５２６腫瘍マウス異種移植片モデルにおける、５ｍｇ／ｋｇ（図３Ａ）および１０ｍｇ／ｋｇ（図３Ｂ）の投薬量でのシステイン操作されたｃＫＩＴ抗体を含むイムノコンジュゲート、および５．９ｍｇ／ｋｇ（図３Ａ）および１１．８ｍｇ／ｋｇ（図３Ｂ）の投薬量で投与された野生型ｃＫＩＴ抗体を含むイムノコンジュゲートの活性を示すグラフである。
【図３−２】Ｈ５２６腫瘍マウス異種移植片モデルにおける、５ｍｇ／ｋｇ（図３Ａ）および１０ｍｇ／ｋｇ（図３Ｂ）の投薬量でのシステイン操作されたｃＫＩＴ抗体を含むイムノコンジュゲート、および５．９ｍｇ／ｋｇ（図３Ａ）および１１．８ｍｇ／ｋｇ（図３Ｂ）の投薬量で投与された野生型ｃＫＩＴ抗体を含むイムノコンジュゲートの活性を示すグラフである。
【図４】マウスでのＨｅｒ２陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１クローン１６乳癌異種移植片モデルにおける、Ｅｇ５阻害剤とコンジュゲートした抗Ｈｅｒ２イムノコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示すグラフである。
【図５】マウスでのＨｅｒ２陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌異種移植片における、Ｅｇ５阻害剤とコンジュゲートした抗Ｈｅｒ２イムノコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示すグラフである。
【図６】マウスでのＨｅｒ２陽性ＨＣＣ１９５４乳癌異種移植片モデルにおける、Ｅｇ５阻害剤とコンジュゲートした抗Ｈｅｒ２イムノコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示すグラフである。
【図７】マウスでのＨ５２６腫瘍異種移植片モデルにおける、化合物Ｆとコンジュゲートした抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究からの結果を示すグラフである。化合物Ｆは、システイン操作されたｃＫＩＴ抗体または野生型ｃＫＩＴ抗体にコンジュゲートされた。抗Ｈｅｒ２イムノコンジュゲートは、非結合対照として含まれた。
【図８−１】ナイーブマウスにおける、１ｍｇ／ｋｇの用量での抗体  抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ｆ（図８Ａ）および抗体  抗ｃＫＩＴ−化合物Ｆ（図８Ｂ）ＡＤＣの薬物動態研究からの結果を示すグラフである。
【図８−２】ナイーブマウスにおける、１ｍｇ／ｋｇの用量での抗体  抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ｆ（図８Ａ）および抗体  抗ｃＫＩＴ−化合物Ｆ（図８Ｂ）ＡＤＣの薬物動態研究からの結果を示すグラフである。
【図９】マウスでのＨ５２６腫瘍異種移植片モデルにおける、２種の異なるシステイン操作された抗体に対する２種の異なる化合物にコンジュゲートした抗ｃＫＩＴイムノコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
本出願は、親抗体または抗体断片の特定位置における１個または複数のアミノ酸を、シ
ステインアミノ酸（「Ｃｙｓ」）で置き換えることによって、抗体または抗体断片を部位
特異的に標識して、操作された抗体または抗体断片が、様々な作用因子（例えば、細胞毒
性薬剤）にコンジュゲート可能であるようにする方法を提供する。本出願は、本明細書に
おいて記載の方法を使用することによって製造されたイムノコンジュゲートも提供する。
【０１０９】
システインが親抗体または抗体断片内に操作された場合、修飾抗体または抗体断片を、
まず、ジスルフィド連結を介して操作されたシステイン部位に付着しているシステインま
たはグルタチオン（ＧＳＨ）と共に発現培地から回収する（Chen et al., (2009) mAbs 1
6, 353-571）。次いで、該付着しているシステインまたはＧＳＨを、親抗体または抗体断
片のすべての天然鎖内ジスルフィド結合も還元する還元ステップにおいて除去する。第２
のステップにおいて、これらのジスルフィド結合を、コンジュゲーションが生じる前に再
酸化する。本開示は、システインが特定部位において操作された場合、不正確なジスルフ
ィド結合が形成される可能性があるために、再酸化ステップは十分進行しないことを示す
。したがって、本出願は、抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域のそれぞれに固有の
部位セットを提供し、この場合、本明細書において記載のＣｙｓ置換によって、再酸化手
順において良好に作用し、また、安定した良好な挙動を示すイムノコンジュゲートも産生
する、修飾抗体または抗体断片が生じる。
【０１１０】
本出願による部位特異的抗体標識は、様々な化学的にアクセシブルな標識試薬、例えば
、抗癌剤、フルオロフォア、ペプチド、糖、界面活性剤、ポリエチレングリコール、免疫
賦活物質、放射性画像化プローブ、プロドラッグ、および他の分子で達成され得る。
【０１１１】
したがって、本出願は、癌治療および他の適用、さらには画像化試薬に使用するための
、定義した薬物抗体比を有する均一なイムノコンジュゲートを調製する方法を提供する。
本出願は、それによって調製したイムノコンジュゲート、さらには、これらのイムノコン
ジュゲートを含む医薬組成物も提供する。本出願の方法は、当技術分野において公知の他
のコンジュゲーション方法と組み合わせて使用され得る。
【０１１２】
以下に列記した実施形態は、本出願の特定の態様および変形例を表す：
【０１１３】
【化６】
2018134080.tif 000007
［式中、Ａｂは、本明細書において記載の好ましいシステイン置換部位の１つにおいて、
少なくとも１つのシステイン残基を含む抗体または抗体断片を表し；
ＬＵは、本明細書において記載のリンカーユニットであり；
Ｘは、ペイロードまたは薬物部分であり；
およびｎは、１〜１６の整数である］。これらの実施形態では、ｎは、好ましくは、約
２、約４、約６、または約８である。ＬＵは典型的には、式−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
Ｌ５−Ｌ６−の基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、−Ａ１−、−
Ａ１Ｘ２−、および−Ｘ２−から独立に選択され；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−
（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（
＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）
−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨ
Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ
Ｈ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）
ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−
Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）
（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−
（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）
（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ
（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）
ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（Ｃ
Ｈ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ
−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）
２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【０１１４】
【化７−１】
2018134080.tif 000008
【０１１５】
【化７−２】
2018134080.tif 000009
【０１１６】
【化７−３】
2018134080.tif 000010
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０１１７】
【化８】
2018134080.tif 000011
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０１１８】
【化９】
2018134080.tif 000012
から独立に選択され、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択される。
【０１１９】
これらの実施形態の一部では、イムノコンジュゲートは、下式：
【０１２０】
【化１０】
2018134080.tif 000013
［式中、硫黄原子は、修飾抗体または抗体断片中のシステイン残基の硫黄であり、本明細
書において同定した置換部位の１つに位置している］の基を含む。
【０１２１】
上述の実施形態のいずれかにおいて、配列中の部位の位置が全長抗体の修飾または短縮
化によって変更されている場合であっても、システイン置換部位は、位置番号によって同
定された部位の１つに対応する位置であってよい。対応する部位は、抗体または断片と全
長抗体とのアラインメントによって容易に同定され得る。
【０１２２】
１．部位特異的システイン操作抗体
部位特異的標識
本出願の抗体（例えば、親抗体、場合により、１個または複数の非天然アミノ酸を含む
）は、ラムダ軽鎖が、Kabat et al., (1991) Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3
242において説明されたＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされてい
る場合を除いて、Edelman et al., (1969) Proc. Natl. Acad. USA 63:78-85において説
明された、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされている。ヒトＩｇＧ１定
常領域が、本出願を通して代表例として使用される。しかしながら、本出願は、ヒトＩｇ
Ｇ１に限定されず、対応するアミノ酸位置は、配列アラインメントによって容易に推定さ
れ得る。例えば、図１は、抗体トラスツズマブ野生型重鎖定常領域（その配列は、ＳＴＫ
ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧ
ＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮ
ＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦ
ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧ
ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ
ＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ
ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤ
ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬ
ＳＬＳＰＧ（配列番号１５５）である）、ヒトＩｇＧ１（その配列は、ＳＴＫＧＰＳＶＦ
ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ
ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ
ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫ
ＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮ
ＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫ
ＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴ
ＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬ
ＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
（配列番号１５１）である）、ＩｇＧ２（その配列は、ＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ
ＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶ
ＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫ
ＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ
ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮ
ＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ
ＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ
ＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１５２）であ
る）、ＩｇＧ３（その配列は、ＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣ
ＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳ
ＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴ
ＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰ
ＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ
ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ
ＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ
ＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１５２）であ
る）、およびＩｇＧ４（その配列は、ＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡ
ＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳ
ＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰ
ＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶ
ＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳ
ＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲ
ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮ
ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳ
ＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１５３）である）重鎖定常領
域の配列アラインメントを示し、これによって、ＩｇＧ１定常領域中で同定したＣｙｓ操
作部位は、図１において示したとおり、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４について容
易に同定され得る。軽鎖定常領域についても、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩ
ｇＧ４は同様である（ヒト抗体トラスツズマブの全長野生型軽鎖配列は、ＤＩＱＭＴＱＳ
ＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬ
ＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹ
ＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ
ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ
ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ
ＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号９０）である）。
【０１２３】
以下の表１に、システインによって置き換えられ得る、抗体重鎖の定常領域中のアミノ
酸位置を列記する。表２Ａに、システインによって置き換えられ得る、抗体カッパ軽鎖の
定常領域中のアミノ酸位置を列記する。表２Ｂに、システインによって置き換えられ得る
、抗体ラムダ軽鎖の定常領域中のアミノ酸位置を列記する。
【０１２４】
【表１−１】
2018134080.tif 000014
【０１２５】
【表１−２】
2018134080.tif 000015
【０１２６】
【表１−３】
2018134080.tif 000016
【０１２７】
【表１−４】
2018134080.tif 000017
【０１２８】
【表１−５】
2018134080.tif 000018
【０１２９】
【表１−６】
2018134080.tif 000019
【０１３０】
【表１−７】
2018134080.tif 000020
【０１３１】
【表１−８】
2018134080.tif 000021
【０１３２】
【表１−９】
2018134080.tif 000022
【０１３３】
【表１−１０】
2018134080.tif 000023
【０１３４】
【表２−１】
2018134080.tif 000024
【０１３５】
【表２−２】
2018134080.tif 000025
【０１３６】
【表２−３】
2018134080.tif 000026
【０１３７】
【表３】
2018134080.tif 000027
【０１３８】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体の定常領域の高い配列相同性のた
めに、本出願の知見は、任意の特定の抗体または抗体断片に限定されない。
【０１３９】
一実施形態では、本出願は、修飾抗体またはその抗体断片と薬物部分とを含み、前記修
飾抗体またはその抗体断片が、その重鎖定常領域上の１個または複数（例えば、１、２、
３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸の置換を含む、イムノコンジュ
ゲートを提供する。
【０１４０】
本出願の一実施形態では、本明細書において記載のアミノ酸置換は、チオール基を含む
システインである。本出願の一部の態様では、チオール基は、化学的コンジュゲーション
のために利用され、リンカーユニット（ＬＵ）および／または薬物部分に付着される。一
部の実施形態では、本出願のイムノコンジュゲートは、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害剤、ＨＳＰ
９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オー
リスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダ
ーゼ）、プロテインＣＲＭ１の核外移行の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻
害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キ
ナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、Ｅ
ｇ５阻害剤、ＤＮＡ傷害剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副
溝結合剤、およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される薬物部分を含む。一部の実施
形態では、本出願のイムノコンジュゲートは、抗癌剤である薬物部分を含む。本出願の修
飾抗体または抗体断片は、モノクローナル、キメラ化、ヒト化、完全ヒト、二重特異性、
もしくは多重特異性抗体、またはその抗体断片などの当技術分野で公知のいずれの形式で
あってもよい。
【０１４１】
本出願では、修飾抗体の重鎖および／もしくは軽鎖（またはその抗体断片）は、１、２
、３、４、５、６、７、８個以上のシステイン置換を、その定常領域中に含んでもよい。
一実施形態では、修飾抗体または抗体断片は、２、４、６、８個以上のシステイン置換を
、その定常領域中に含む。一部の実施形態では、修飾抗体、抗体断片、またはそのイムノ
コンジュゲートは、４個以上のＣｙｓ置換を含む。
【０１４２】
一実施形態では、親抗体（システイン置換を含まない抗体）は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ｅ、またはＩｇＡの抗体である。具体的な実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ１の抗体であ
る。別の具体的な実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の抗体
である。
【０１４３】
本出願は、表１で同定した位置から選択されるその重鎖定常領域上の１個または複数の
アミノ酸の置換を含む、修飾抗体またはその抗体断片も提供する。一部の実施形態では、
本出願は、表２Ａまたは表２Ｂで同定した位置から選択されるその軽鎖定常領域上の１個
または複数のアミノ酸の置換を含む、修飾抗体またはその抗体断片を提供する。他の実施
形態では、修飾抗体またはその抗体断片は、表１で同定した位置から選択されるその重鎖
定常領域上の１個または複数のアミノ酸、および表２Ａで同定した位置から選択されるそ
の軽鎖定常領域上の１個または複数のアミノ酸を含む。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供する修飾抗体または抗体断片は、本出
願の方法を、これらだけに限定されないが、リシン、ヒスチジン、チロシン、ホルミル−
グリシン、ピロリジン、ピロリン−カルボキシ−リシン、非天然アミノ酸、および酵素媒
介性コンジュゲーション用のタンパク質タグ（例えば、Ｓ６タグ）による化学選択コンジ
ュゲートを含む、当技術分野において公知の他のコンジュゲーション方法と組み合わせて
使用して標識される。
【０１４５】
２．コンジュゲーション化学
本明細書において提供するコンジュゲート化抗体またはその抗体断片は、上述したとお
り、部位特異的標識法によって、抗体またはその抗体断片内に組み込まれた、少なくとも
１個のシステイン残基の翻訳後修飾によって製造される。コンジュゲート化抗体または抗
体断片は、タンパク質中に天然に存在するシステイン残基に対して該当するペイロードを
コンジュゲートさせるための、当技術分野において公知の方法によって、および天然タン
パク質配列の別のアミノ酸に対して置換された追加のシステイン残基を含むように操作さ
れたタンパク質に対するコンジュゲーションのために記載された方法によって調製され得
る。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供する修飾抗体またはその抗体断片は、
組み込まれたシステイン（ｃｙｓ）が、以下のスキームＩａのように、マレイミド誘導体
にコンジュゲートされる、公知の方法を使用してコンジュゲートされる。この種のコンジ
ュゲーションを経る本出願の修飾抗体は、チオール−マレイミド連結を含む。
【０１４７】
【化１１】
2018134080.tif 000028
［式中、
ＬＵは、リンカーユニット（ＬＵ）であり、
Ｘは、ペイロードまたは薬物部分である］。
【０１４８】
他の実施形態では、修飾抗体または抗体断片内に組み込まれたＣｙｓは、以下のスキー
ムＩｂに示すとおり、アルファ−ハロカルボニル化合物、例えば、クロロ−、ブロモ−、
またはヨード−アセトアミドとの反応によってコンジュゲートされる。ハロゲン以外の他
の脱離基、例えば、トシラート、トリフラート、および他のアルキルまたはアリールスル
ホナートが、脱離基Ｙとして使用され得ることは理解されるであろう。スキームＩｂは、
Ｃｙｓのチオールとアルファ−ハロアセトアミドとの反応を示すが、その方法は、式Ｙ−
ＣＨＲ−Ｃ（＝Ｏ）−の基［式中、Ｒは、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、Ｙは、脱離
基（典型的には、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、および場合により、アルキルスルホナートまた
はアリールスルホナート）であり、アミドに限定されない］での、組み込まれたＣｙｓの
硫黄の任意のアルキル化を含む。
【０１４９】
【化１２】
2018134080.tif 000029
【０１５０】
別法では、修飾抗体または抗体断片内に組み込まれたＣｙｓは、以下のスキームＩｃに
示すとおり、外部チオールと組み込まれたシステイン残基の硫黄原子との間のジスルフィ
ド結合の形成を誘導する条件下での外部チオールとの反応によってコンジュゲートされ得
る。これらの例では、Ｒは、Ｈであり得るが、Ｒ基の一方または両方がアルキル基、例え
ば、メチルを表す化合物が、ジスルフィドの安定性を向上させることが見出されている。
【０１５１】
【化１３】
2018134080.tif 000030
【０１５２】
例に過ぎないが、このような翻訳後修飾は、上記スキーム（Ｉａ）〜（Ｉｃ）に図示さ
れ、これらにおいて、出発構造は、本明細書において同定した特定部位の１つにおいて、
抗体の軽鎖または重鎖内に組み込まれたシステインを表す。これらのコンジュゲーション
方法の各々を行うための方法は、当技術分野において周知である。抗体は、その軽鎖もし
くはその重鎖、または軽鎖および重鎖の両方において、これらの方法によって修飾され得
る。各軽鎖または各重鎖が修飾されて１つの組み込まれたシステインを含む抗体は一般に
、２つのコンジュゲーション部位を含む。これは、抗体が典型的に、２つの軽鎖および２
つの重鎖を含むためである。
【０１５３】
コンジュゲーションすると、本出願の修飾抗体は典型的に、１〜１２個、多くの場合２
〜８個、および好ましくは２、４、または６個の−ＬＵ−Ｘ（リンカーユニット−ペイロ
ード）部分を含む。一部の実施形態では、抗体の軽鎖または重鎖は修飾されて、Ｃｙｓ置
換について本明細書において同定した特定部位の２つにおいて、２つの新たなＣｙｓ残基
を組み込むので（または別法では、１個のＣｙｓが軽鎖に組み込まれ、１個のＣｙｓが重
鎖に組み込まれる）、四量体抗体は最終的に、４つのコンジュゲーション部位を含む。同
様に、抗体は、軽鎖もしくは重鎖またはその組み合わせにおける本明細書において同定し
た特定部位において、３個または４個のその天然アミノ酸のＣｙｓでの置換によって修飾
されて、四量体抗体中に６つまたは８つのコンジュゲーション部位をもたらし得る。
【０１５４】
これらのコンジュゲートにおけるＸは、抗体に付着するために有用な任意の化学部分で
あり得るペイロードを表す。一部の実施形態では、Ｘは、細胞毒、抗癌剤、抗炎症剤、抗
真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、免疫増強剤、および麻酔剤、または任意の
他の治療剤から選択される薬物部分、または生物学的に活性な部分もしくは薬物部分であ
る。他の実施形態では、Ｘは、標識、例えば、生物物理的プローブ、フルオロフォア、親
和性プローブ、分光プローブ、放射性プローブ、スピン標識、または量子ドットである。
他の実施形態では、Ｘは、抗体の物理化学的性質を修飾する化学部分、例えば、脂質分子
、ポリエチレングリコール、ポリマー、多糖類、リポソーム、またはキレート剤である。
他の実施形態では、Ｘは、機能性または検出可能な生体分子、例えば、核酸、リボ核酸、
タンパク質、ぺプチド（例えば、酵素または受容体）、糖または多糖類、抗体または抗体
断片である。他の実施形態では、Ｘは、アンカー部分、例えば、ナノ粒子、ＰＬＧＡ粒子
、もしくは表面、または別の部分にコンジュゲートを特異的に結合させるための任意の結
合部分、例えば、ヒスチジンタグ、ポリ−Ｇ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン
などである。他の実施形態では、Ｘは、抗体コンジュゲートを別の化学部分、例えば、薬
物部分、標識、別の抗体、別の化学部分、または表面に付着させるために使用され得る反
応性官能基である。
【０１５５】
リンカーユニット（ＬＵ）は、チオール反応性基（例えば、マレイミド、アルファ−ハ
ロカルボニル、ビニルカルボニル（例えば、アクリラートもしくはアクリルアミド）、ビ
ニルスルホン、ビニルピリジン、またはチオール）をペイロードに共有結合で付着させる
、任意の適切な化学部分であり得る。多くの適切なＬＵが、当技術分野において公知であ
る。例えば、ＬＵは、１、２、３、４、５、６個、または６個より多くのリンカーからな
り得、本明細書において、リンカーは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６と呼
ばれる。ある特定の実施形態では、ＬＵは、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、
酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカーまたはそれらの任意の組合せ
から選択されるリンカーを含み、ＬＵは、場合により、自壊型スペーサー（self-immolat
ive spacer）を含む。
【０１５６】
一部の実施形態では、ＬＵは、式−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−または−Ｌ１−Ｌ−Ｌ３
−Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６−の基である。ＬＵにおいて使用するための連結基Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３
、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、アルキレン基−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは、１〜２０、典型的
には１〜１０または１〜６である。）、エチレングリコールユニット（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ
−）ｎ（ｎは、１〜２０、典型的には１〜１０または１〜６である）、アミド−Ｃ（＝Ｏ
）−ＮＨ−もしくは−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、エステル−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−もしくは−Ｏ−
Ｃ（＝Ｏ）−、２つの利用可能な付着点を有する環、例えば、二価のフェニル、Ｃ３〜８
シクロアルキルもしくはＣ４〜８ヘテロシクリル基、アミノ酸−ＮＨ−ＣＨＲ＊−Ｃ＝Ｏ
−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ＊−ＮＨ−（Ｒ＊は、公知のアミノ酸（多くの場合、天
然アミノ酸の１つであるが、例えば、ノルバリン、ノルロイシン、ホモセリン、ホモシス
テイン、フェニルグリシン、シトルリンおよび他の名称のアルファ−アミノ酸も含む）の
側鎖）、公知のアミノ酸のポリペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペ
プチドなど）、チオール−マレイミド連結（マレイミドへの−ＳＨの付加に由来）、−Ｓ
−ＣＲ２−および他のチオールエーテル、例えば、−Ｓ−ＣＲ２−Ｃ（＝Ｏ）−もしくは
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＲ２−Ｓ−（Ｒは、スキームＩｃについて上記で定義した通りである）
、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、およびジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、さらには、これらのい
ずれかと以下に記載される他のリンカー、例えば、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂
性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカー、または自壊型
スペーサーを含むリンカーとの組合せを含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、ＬＵが−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６−である場合、Ｌ
１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は：
−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、および−Ｘ２−
から選択されることができ：
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−
（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（
＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）
−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨ
Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ
Ｈ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）
ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−
Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）
（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−
（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）
（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ
（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）
ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（Ｃ
Ｈ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ
−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）
２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【０１５８】
【化１４−１】
2018134080.tif 000031
【０１５９】
【化１４−２】
2018134080.tif 000032
【０１６０】
【化１４−３】
2018134080.tif 000033
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０１６１】
【化１５】
2018134080.tif 000034
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０１６２】
【化１６】
2018134080.tif 000035
から独立に選択され、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択される］。
【０１６３】
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６の少なくとも１個は
、安定した、または非開裂性リンカーである。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、
Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６の少なくとも１個は、開裂性リンカーであり、この開裂性リンカ
ーは、化学開裂性（ヒドラゾン、ジスルフィド）でも、酵素開裂性でもよい。一部の実施
形態では、酵素開裂性リンカーは、ペプチダーゼによって容易に開裂するものである。２
つの公知のアミノ酸のジペプチドであるＶａｌ−Ｃｉｔリンカー（バリン−シトルリン）
は、このようなリンカーの１つである。他の実施形態では、酵素開裂性リンカーは、グル
クロニダーゼの活性によってトリガーされるものである。
【０１６４】
【化１７】
2018134080.tif 000036
は、このようなリンカーの例であり、このリンカーは、生理学的条件下において、グルク
ロニダーゼがグリコシド連結を開裂させると自発的に分解する自壊型スペーサーも含む。
【０１６５】
一部の実施形態では、本出願のイムノコンジュゲートは、式ＩＩＡまたはＩＩＢの修飾
システイン残基を含む：
【０１６６】
【化１８】
2018134080.tif 000037
［式中、−ＣＨ２−Ｓ−は、本明細書において記載の、選択されたＣｙｓ置換部位の１つ
に組み込まれたＣｙｓの側鎖を表し、Ｌ２〜Ｌ６およびＸは、本明細書においてさらに記
載される、連結基およびペイロードをそれぞれ表す］。ＩＩＡの一部の実施形態では、Ｌ
２は、結合である。ＩＩＢの一部の実施形態では、Ｌ２は、ＮＨまたはＯである。ＩＩＡ
およびＩＩＢ両方の一部の実施形態では、Ｌ３は、（ＣＨ２）１〜１０および（ＣＨ２Ｃ
Ｈ２Ｏ）１〜６から選択される。Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、本明細書において記載のも
のから選択される、追加の任意選択のリンカーである。ある特定の実施形態では、Ｌ６は
、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）または自壊型スペーサーを含むリンカーであり得る。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり、および
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、光開裂性リンカー、または自壊型スペーサーを含むリンカーである。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リ
ンカー、または光開裂性リンカーであり；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり、および
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、光開裂性リンカー、または自壊型スペーサーを含むリンカーである。
【０１６９】
ＬＵの一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６の少なくとも
１個は、開裂性リンカーであり、ＬＵは、開裂性であると考えられる。同様に、ＬＵの一
部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６の少なくとも１個は、非
開裂性リンカーである。これらのある特定の実施形態では、ＬＵの各リンカーは非開裂性
であり、ＬＵは、非開裂性であると考えられる。
【０１７０】
ＬＵが−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−である上述の実施形態の一部では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ
３、およびＬ４の少なくとも１個は、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、および−Ｘ２−から選択
されるリンカーであり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−
（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ
（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ
）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｎ
ＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）
ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２
）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ
）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、
−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ
）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２
）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）
ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４
）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【０１７１】
【化１９−１】
2018134080.tif 000038
【０１７２】
【化１９−２】
2018134080.tif 000039
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０１７３】
【化２０】
2018134080.tif 000040
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０１７４】
【化２１】
2018134080.tif 000041
から独立に選択され；
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択される。
【０１７５】
これらの実施形態では、ＬＵの他のリンカーは、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、−Ｘ
２−、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカ
ー、光開裂性リンカー、および自壊型スペーサーを含むリンカーから独立に選択される。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、または−Ｘ２−であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−
（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ
（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ
）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｎ
ＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）
ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２
）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ
）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、
−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ
）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２
）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）
ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４
）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８
【０１７７】
【化２２−１】
2018134080.tif 000042
【０１７８】
【化２２−２】
2018134080.tif 000043
【０１７９】
【化２２−３】
2018134080.tif 000044
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０１８０】
【化２３】
2018134080.tif 000045
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０１８１】
【化２４】
2018134080.tif 000046
から独立に選択され；
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり； 
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり；ならびに
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、光開裂性リンカー、または自壊型スペーサーを含むリンカーである。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ
Ｈ２ＣＨ２−Ｓ−であるので、ＬＵは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）
−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−である。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、または−Ｘ２−であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ
）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ
２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２
）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ
（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−
、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（
ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（
ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ
２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８
【０１８４】
【化２５−１】
2018134080.tif 000047
【０１８５】
【化２５−２】
2018134080.tif 000048
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０１８６】
【化２６】
2018134080.tif 000049
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０１８７】
【化２７】
2018134080.tif 000050
から独立に選択され；
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり；
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、光開裂性リンカー、または自壊型スペーサーを含むリンカーである。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、または−Ｘ２−であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ
２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ
Ｈ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８
【０１８９】
【化２８−１】
2018134080.tif 000051
【０１９０】
【化２８−２】
2018134080.tif 000052
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０１９１】
【化２９】
2018134080.tif 000053
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０１９２】
【化３０】
2018134080.tif 000054
から独立に選択され；
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、または光開裂性リンカーであり、ならびに
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安
定性リンカー、光開裂性リンカー、または自壊型スペーサーを含むリンカーである。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、または−Ｘ２−であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ
２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ
Ｈ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８
【０１９４】
【化３１−１】
2018134080.tif 000055
【０１９５】
【化３１−２】
2018134080.tif 000056
【０１９６】
【化３１−３】
2018134080.tif 000057
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０１９７】
【化３２】
2018134080.tif 000058
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０１９８】
【化３３】
2018134080.tif 000059
から独立に選択され；
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、または非開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、または非開裂性リンカーであり；
Ｌ４は、結合、酵素開裂性リンカー、または自壊型スペーサーを含むリンカーである。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、または−Ｘ２−であり；
Ｌ２は、結合、−Ａ２−、または−Ａ２Ｘ２−であり；
Ｌ３は、結合、−Ａ３−、または−Ａ３Ｘ２−であり；
Ｌ４は、結合、−Ａ４−、−Ａ４Ｘ２−、
【０２００】
【化３４】
2018134080.tif 000060
であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ
４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（
（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ
−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ
Ｈ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）
（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）
ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝
Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）
２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ
２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２
）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ
）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ
−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（
（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ
）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、ま
たは−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
Ａ２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−
（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（
＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＲ４−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ
）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｎ
ＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）
ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２
）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２
）ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ
−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、
−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）
ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、
−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−
、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４
）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ
２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４
）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）
２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ
ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ
４）２）ｎ−、
【０２０１】
【化３５】
2018134080.tif 000061
であり；
Ａ３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−
（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ
（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ
）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｎ
ＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）
ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２
）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２
）ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ
Ｈ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−
、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ
（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ
ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨ
Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）Ｎ
Ｈ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ
（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（
Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２
）ｎ）ｍＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＣ（＝Ｏ）−
、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）
（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ
（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、
【０２０２】
【化３６】
2018134080.tif 000062
であり；
Ａ４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−
（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ
（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ
）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｎ
ＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）
ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２
）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ
）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、
−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ
）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（
Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２
）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（
ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）
ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４
）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８
【０２０３】
【化３７−１】
2018134080.tif 000063
【０２０４】
【化３７−２】
2018134080.tif 000064
【０２０５】
【化３７−３】
2018134080.tif 000065
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０２０６】
【化３８】
2018134080.tif 000066
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０２０７】
【化３９】
2018134080.tif 000067
から独立に選択され；
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択される。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、または−Ｘ２−であり；
Ｌ２は、結合、−Ａ２−、または−Ａ２Ｘ２−であり；
Ｌ３は、結合、−Ａ３−、または−Ａ３Ｘ２−であり；
Ｌ４は、結合、−Ａ４−、−Ａ４Ｘ２−、
【０２０９】
【化４０】
2018134080.tif 000068
であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ
）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ
２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝
Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ
（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−
、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（
ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（
ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２
）ｎ−であり；
Ａ２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ
）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ
２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝
Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ
（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−
、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（
ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（
ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ
−または
【０２１０】
【化４１】
2018134080.tif 000069
であり；
Ａ３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ
）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ
２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝
Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ
（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−
、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（
ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（
ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ
−または
【０２１１】
【化４２】
2018134080.tif 000070
であり；
Ａ４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ
）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ
２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝
Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ
（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−
、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（
ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（
ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２
）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、
【０２１２】
【化４３】
2018134080.tif 000071
、−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０２１３】
【化４４】
2018134080.tif 000072
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択される。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−
であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、または−Ｘ２−であり；
Ｌ２は、結合、−Ａ２−、または−Ａ２Ｘ２−であり；
Ｌ３は、結合、−Ａ３−、または−Ａ３Ｘ２−であり；
Ｌ４は、結合、−Ａ４−、−Ａ４Ｘ２−、
【０２１５】
【化４５】
2018134080.tif 000073
であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ
（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ
（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ａ２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ
（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ
（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、または
【０２１６】
【化４６】
2018134080.tif 000074
であり；
Ａ３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ
（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ
（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、または
【０２１７】
【化４７】
2018134080.tif 000075
であり；
Ａ４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（
ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ
（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ
（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８
【０２１８】
【化４８−１】
2018134080.tif 000076
【０２１９】
【化４８−２】
2018134080.tif 000077
【０２２０】
【化４８−３】
2018134080.tif 000078
−Ｓ−、−Ｓｉ（ＯＨ）２Ｏ−、
【０２２１】
【化４９】
2018134080.tif 000079
、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−
、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立に選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および
−ＯＨから独立に選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されて
いるＣ１〜４アルキルから独立に選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アル
コキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ１〜４アルキルから独立に選択され
；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ピリミジン、およびピリジンから独立に選
択され；
Ｒ８は、
【０２２２】
【化５０】
2018134080.tif 000080
から独立に選択され、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜６ハロアルキルから独立に選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択され、ならびに
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から独立に選択される。
【０２２３】
一実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）１〜１０−Ｃ（＝Ｏ）−、例えば、−（ＣＨ２
）５−Ｃ（＝Ｏ）−であり；Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４はそれぞれ、結合を表す。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、ＬＵは、この式のｖａｌ−ｃｉｔリンカーを含み、Ｘは、ペ
イロード、典型的には、抗癌活性を有するものなどの薬物部分を表す。
【０２２５】
【化５１】
2018134080.tif 000081
Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６が、上記で示したとおりのｖａｌ−ｃｉｔリンカーである場合、Ｌ３は
好ましくは、−（ＣＨ２）２〜６−Ｃ（＝Ｏ）−である。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、Ｘ基は、ＤＭ１もしくはＤＭ４などのマイタンシノイド、ま
たはドラスタチン１０または１５などのドラスタチン類似体もしくは誘導体、およびオー
リスタチンＭＭＡＦもしくはＭＭＡＥ、またはＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンなど
のカリケアマイシン、またはローダミンもしくはテトラメチルローダミンなどの標識また
は染料である。
【０２２７】
本明細書において使用する場合、「リンカー」は、抗体またはその断片をＸ基（ペイロ
ード）に接続してイムノコンジュゲートを形成し得る任意の化学的部分である。リンカー
は、化合物または抗体が活性なままである条件下で、酸誘発性開裂、光誘発性開裂、ぺプ
チダーゼ誘発性開裂、エステラーゼ誘発性開裂、およびジスルフィド結合開裂などの開裂
を受け得る。別法では、リンカーは、開裂に対して実質的に耐性であり得る。リンカーは
、自壊型スペーサーを含んでも含まなくてもよい。
【０２２８】
本明細書において提供される修飾抗体またはその抗体断片にＸ１基をコンジュゲートさ
せるために本明細書において使用される非酵素開裂性リンカーの非限定的例には、酸不安
定性リンカー、ジスルフィド部分を含むリンカー、トリアゾール部分を含むリンカー、ヒ
ドラゾン部分を含むリンカー、チオエーテル部分を含むリンカー、ジアゾ部分を含むリン
カー、オキシム部分を含むリンカー、アミド部分を含むリンカー、およびアセトアミド部
分を含むリンカーが含まれる。
【０２２９】
本明細書において提供される修飾抗体またはその抗体断片にＸ基をコンジュゲートさせ
るために本明細書において使用される酵素開裂性リンカーの非限定的例には、これらだけ
に限定されないが、プロテアーゼによって開裂されるリンカー、アミダーゼによって開裂
されるリンカー、およびβ−グルクロニダーゼまたは別のグリコシダーゼによって切断さ
れるリンカーが含まれる。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、このような酵素開裂性リンカーは、カテプシンＺ、カテプシ
ンＢ、カテプシンＨ、およびカテプシンＣを含むカテプシンによって開裂されるリンカー
である。ある特定の実施形態では、酵素開裂性リンカーは、カテプシンＺ、カテプシンＢ
、カテプシンＨ、またはカテプシンＣによって開裂されるジペプチドを含む、カテプシン
によって開裂されるジペプチドである。ある特定の実施形態では、酵素開裂性リンカーは
、カテプシンＢ開裂性ペプチドリンカーである。ある特定の実施形態では、酵素開裂性リ
ンカーは、カテプシンＢ開裂性ジペプチドリンカーである。ある特定の実施形態では、酵
素開裂性ジペプチドリンカーは、バリン−シトルリンまたはフェニルアラニン−リシンで
ある。本明細書において提供される修飾抗体またはその抗体断片にＸ基をコンジュゲート
させるために本明細書において使用される酵素開裂性リンカーの他の非限定的例には、こ
れらだけに限定されないが、β−グルクロニダーゼによって開裂されるリンカー、例えば
、
【０２３１】
【化５２】
2018134080.tif 000082
が含まれる。Ducry et al, Bioconjugate Chem,(2010) vol. 21(1), 5-13を参照されたい
。
【０２３２】
「自壊型スペーサー」は、一方の末端において第１の化学部分に共有結合的に連結して
おり、他方の末端において第２の化学部分に共有結合的に連結していることによって、安
定した３つの部分に分かれた分子を形成する二官能性の化学部分である。リンカーは、ス
ペーサーから化学的にまたは酵素的にのいずれかで開裂可能である、第３の化学部分に結
合している自壊型スペーサーを含み得る。自壊型スペーサーと第１の化学部分または第３
の化学部分との間の結合が開裂されると、自壊型スペーサーは、急速かつ自発的な分子内
反応を経ることによって、第２の化学部分から分離する。これらの分子内反応は一般的に
は、電子転位、例えば、１，４もしくは１，６もしくは１，８脱離反応または環化を含み
、非常に好ましい５または６員環を形成する。本出願のある特定の実施形態では、第１ま
たは第３の部分は、酵素開裂性基であり、この開裂は、酵素反応に起因する一方で、他の
実施形態では、第１または第３の部分は、酸不安定性基であり、この開裂は、ｐＨの変化
によって生じる。本出願に適用した場合、第２の部分は、本明細書において定義するとお
りの「ペイロード」基である。ある特定の実施形態では、自壊型スペーサーからの第１ま
たは第３の部分の開裂は、タンパク質分解酵素による開裂に起因する一方で、他の実施形
態では、これは、加水分解酵素による開裂に起因する。ある特定の実施形態では、自壊型
スペーサーからの第１または第３の部分の開裂は、カテプシン酵素またはグルクロニダー
ゼによる開裂に起因する。
【０２３３】
ある特定の実施形態では、酵素開裂性リンカーはペプチドリンカーであり、自壊型スペ
ーサーがその一方の末端においてペプチドリンカーに共有結合的に連結しており、その他
方の末端において薬物部分に共有結合的に連結している。この３つの部分に分かれた分子
は、酵素が存在しない状態で、安定しており、薬理学的に不活性であるが、スペーサー部
分およびペプチド部分を共有結合的に連結している結合において、酵素によって酵素開裂
可能である。ペプチド部分は、３つの部分に分かれた分子から開裂され、これが、スペー
サー部分の自壊特性を開始して、スペーサー部分を薬物部分に共有結合的に連結させてい
る結合の自然開裂をもたらし、それによって、薬理学的に活性な形態での薬物の放出をも
たらす。
【０２３４】
他の実施形態では、リンカーは、一方の末端において直接または間接のいずれかでペプ
チドに接続し、他方の末端においてペイロードに結合する自壊型スペーサーを含む。スペ
ーサーは、グルクロニダーゼなどによってスペーサーから酵素的に開裂され得る第３の部
分に付着している。第３の部分が開裂されると、スペーサーは、ペイロードの放出を引き
起こすように、分解または転位する。この種の自壊型スペーサーを有するリンカーの例は
、このグルクロニダーゼ開裂性リンカーであり、この場合、グルクロニダーゼによって触
媒されるアセタールの加水分解によって、生理学的条件下で自発的に分解するフェノール
性化合物が放出される。
【０２３５】
【化５３】
2018134080.tif 000083
【０２３６】
本明細書において提供される修飾抗体またはその抗体断片にＸ１基をコンジュゲートさ
せる際に場合により使用される自壊型スペーサーの非限定的例には、これらだけに限定さ
れないが、ベンジルカルボニル部分、ベンジルエーテル部分、４−アミノブチラート部分
、ヘミチオアミナール部分、またはＮ−アシルヘミチオアミナール部分を含む部分が含ま
れる。
【０２３７】
自壊型スペーサーの他の例には、これらだけに限定されないが、ｐ−アミノベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル基と電子的に類似する芳香族化
合物、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体およびオルトまたはパラ
−アミノベンジルアセタールが含まれる。ある特定の実施形態では、アミド結合の加水分
解の際に環化される、本明細書において使用される自壊型スペーサーには、置換および非
置換４−アミノ酪酸アミドおよび２−アミノフェニルプロピオン酸アミドが含まれる。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、自壊型スペーサーは、
【０２３９】
【化５４】
2018134080.tif 000084
であり、他の実施形態では、自壊型スペーサーは、
【０２４０】
【化５５】
2018134080.tif 000085
である［式中、ｎは、１または２である］。他の実施形態では、自壊型スペーサーは、
【０２４１】
【化５６】
2018134080.tif 000086
である［式中、ｎは、１または２である］。他の実施形態では、自壊型スペーサーは、
【０２４２】
【化５７】
2018134080.tif 000087
である［式中、ｎは、１または２である］。他の実施形態では、自壊型スペーサーは、
【０２４３】
【化５８】
2018134080.tif 000088
である［式中、ｎは、１または２である］。他の実施形態では、自壊型スペーサーは、
【０２４４】
【化５９】
2018134080.tif 000089
である［式中、ｎは、１または２である］。
【０２４５】
スキーム（２ａ〜２ｃ）は、本明細書において提供される修飾抗体またはその抗体断片
の翻訳後修飾を図示しており、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４
−であり、Ｌ１は、各場合において、新たなＣｙｓと反応する基である。
【０２４６】
【化６０】
2018134080.tif 000090
【０２４７】
【化６１】
2018134080.tif 000091
【０２４８】
【化６２】
2018134080.tif 000092
【０２４９】
スキーム２ａ〜２ｃの各々において、出発物質は、本明細書において記載したとおりに
修飾された抗体または抗体断片中の置換Ｃｙｓ残基であり、その際、破線による結合は、
抗体または抗体断片の隣の残基への接続を示し；各Ｒは、ＨまたはＣ１〜４アルキル、典
型的には、Ｈまたはメチルであり；Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、連結ユニットＬＵの構成
成分、例えば、上記のものであり；Ｘは、ペイロードであり；本出願の置換基Ｃｙｓの硫
黄にＬ２を接続させる基は、Ｌ１である。
【０２５０】
本出願の一部の実施形態では、Ｘは、適切な相補的官能基と相互作用することによって
、コンジュゲート化抗体を別の化学部分に接続させるために使用され得る反応性官能基で
ある。表３は、Ｘを含むコンジュゲートを別の化合物に接続させるために使用され得る相
補的官能基と共に、Ｘによって表され得る反応性官能基の一部の例を示す。対応する相補
的官能基に接続させるためにＸを使用するための方法は、当技術分野で周知である。アジ
ドを使用する接続は典型的には、「クリック」または無銅クリック化学を使用して行われ
る。ヒドラジン、アルコキシアミン、またはアシルヒドラジンに関与する反応は典型的に
は、カルボニル官能基の１個とのシッフ塩基の形成を介して進行する。
【０２５１】
【表４】
2018134080.tif 000093
【０２５２】
これらの構成成分を使用して作製される接続の例示的な生成物を表４に示し、その際、
Ｙ１は、本出願の抗体を表し、Ａ１は、抗体をペイロードＸａに接続させる連結ユニット
（ＬＵ）を表し、式ＩＩ−ａ中の−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−は、Ｘａを介してコンジュゲート
した抗体に接続することになる分子中に存在し得るリンカーユニットを表し、Ｘ１は、ペ
イロードを表す。ペイロードＸａは、反応性官能基であり、式ＩＩ−ａ上のＸｂは、対応
する相補的官能基であり、式ＩＩ−ａ自体は、コンジュゲート化抗体に接続することにな
る分子を表す。表４中の第３列は、ＸａとＸｂとの反応からの生成物を示す。
【０２５３】
【表５−１】
2018134080.tif 000094
【０２５４】
【表５−２】
2018134080.tif 000095
【０２５５】
【表５−３】
2018134080.tif 000096
【０２５６】
【表５−４】
2018134080.tif 000097
【０２５７】
【表５−５】
2018134080.tif 000098
【０２５８】
【表５−６】
2018134080.tif 000099
【０２５９】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される修飾抗体またはその抗体断片は
、約１〜１６の間、例えば、１〜１２、または１、２、３、４、５、６、７、もしくは８
の「Ｘ基抗体」（ペイロード抗体）比でコンジュゲートし、その際、その修飾抗体または
その抗体断片は、本明細書において開示する特定部位に組み込まれた１、２、３、４、５
、６、７、または８個のシステイン残基を含む。例えば、４の「Ｘ基抗体」比は、２個の
Ｃｙｓ残基を抗体の重鎖に組み込むことによって達成され得、抗体は、各重鎖から２つで
、４つのコンジュゲーション部位を含むこととなる。このような抗体のイムノコンジュゲ
ートは、同じでも異なってもよく、好ましくは、すべて同じである最高４個のペイロード
基を含むこととなる。別の例では、４の「Ｘ基抗体」比は、１個のＣｙｓ残基を抗体の重
鎖に、第２のＣｙｓ残基を抗体の軽鎖に組み込むことによって達成され得て、２つの重鎖
中に２つ、および２つの軽鎖に２つで、４つのコンジュゲーション部位が得られる。６、
８またはそれ以上の比は、抗体の重鎖および軽鎖中の本出願の３、４以上のシステイン置
換の組合せによって達成され得る。抗体内に複数のシステイン基を置換することは、不適
切なジスルフィド形成および他の問題をもたらし得る。したがって、４個より多いペイロ
ード基を１つの抗体分子上に負荷するために、本出願の方法は、別法では、システインの
硫黄の反応に頼らない方法、例えば、リシンのアシル化またはＳ６タグを介したコンジュ
ゲーションまたはＰｃｌ法と組み合わせられ得る。
【０２６０】
ペイロード抗体比は、特定のコンジュゲート分子について正確な値を有するが、その値
は多くの場合に、典型的にはコンジュゲーションステップにおけるある程度の不均一性に
よって、多くの分子を含む試料を記載する際に使用される平均値であることは理解される
であろう。本明細書において、イムノコンジュゲートの試料についての平均負荷は、薬物
抗体比またはＤＡＲと呼ばれる。一部の実施形態では、ＤＡＲは、約４〜約１６の間であ
り、典型的には、約４、５、６、７、８である。一部の実施形態では、試料の少なくとも
５０重量％が、平均比±２を有する化合物であり、好ましくは試料の少なくとも５０％が
、平均比±１を含むコンジュゲートである。好ましい実施形態は、ＤＡＲが約２または約
８、例えば、約２、約４、約６、または約８であるイムノコンジュゲートを含む。一部の
実施形態では、「約ｎ」のＤＡＲは、ＤＡＲの測定値がｎ（式（Ｉ）において）の１０％
以内であることを意味する。
【０２６１】
３．Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる変異
本出願は、部位特異的標識化イムノコンジュゲートを提供する。本出願のイムノコンジ
ュゲートは、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対する修飾を、例えば、
抗体の特性を改善するためにさらに含む修飾抗体またはその抗体断片を含んでもよい。典
型的には、このようなフレームワークの修飾は、抗体の免疫原性を低減させるために行わ
れる。例えば、手法の１つは、１個または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細
胞系配列に「復帰変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗
体は、その抗体が得られる生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含むことがあ
る。このような残基は、その抗体フレームワーク配列を、その抗体が得られる生殖細胞系
配列と比較することによって同定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞
系構成に戻すために、体細胞変異は、例えば、特定部位の突然変異誘発によって、生殖細
胞系配列に「復帰変異」され得る。このような「復帰変異した」抗体も、本出願に包含さ
れると意図される。
【０２６２】
別の種類のフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、またはさらに１つまたは複
数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去するこ
とによって、その抗体の潜在的な免疫原性を低減させることを含む。この手法は、「非免
疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書（Carr et al.
）においてさらに詳細に記載されている。
【０２６３】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、またはそれに代えて、本
出願の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含むために、典型的には、抗体の１つまたは複数の機
能特性、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性、および／または抗原依存性
細胞毒性を変更するために操作されてもよい。さらに、本出願の抗体は、化学的に修飾さ
れてもよく（例えば、１個または複数の化学部分を抗体に付着させることができる）、ま
たは抗体の１つまたは複数の機能特性を再び変更するために、そのグリコシル化を変更す
るように修飾されていてもよい。これらの実施形態の各々を以下にさらに詳細に記載する
。
【０２６４】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基数が変更、例え
ば、増加または減少するように修飾される。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５
号明細書（Bodmer et al.）においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシ
ステイン残基数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするか、または抗体の
安定性を向上もしくは低減させるために変更される。
【０２６５】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるため
に変異される。より具体的には、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して
損われたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌプロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有することになる
ように、１つまたは複数のアミノ酸変異が、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン
界面領域に導入される。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号明細書（Ward et 
al.）においてさらに詳細に記載されている。
【０２６６】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ
酸残基で置き換えることによって変更されて、抗体のエフェクター機能を変更する。例え
ば、１個または複数のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する変更された親和
性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えら
れ得る。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体の
Ｃ１構成成分であり得る。この手法は、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書
および同第５，６４８，２６０号明細書（両方ともWinter et al.）において記載されて
いる。
【０２６７】
別の実施形態では、抗体が、変化したＣ１ｑ結合性および／または低下もしくは無効化
された補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を有することになるように、アミノ酸残基から選択
された１個または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。この手法
は、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書（Idusogie et al.）において記載
されている。
【０２６８】
別の実施形態では、１個または複数のアミノ酸残基が変更されることによって、補体を
固定する抗体の能力が変化する。この手法は、例えば、国際公開第９４／２９３５１号パ
ンフレット（Bodmer et al.）において記載されている。具体的な実施形態では、本出願
の抗体またはその抗体断片の１個または複数のアミノ酸は、１個または複数のアロタイプ
のアミノ酸残基によって置き換えられる。アロタイプのアミノ酸残基にはまた、これらだ
けに限定されないが、Jefferis et al., Mabs. 1:332-338(2009)によって記載された、Ｉ
ｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３サブクラスにおける重鎖の定常領域、さらには、カッ
パアイソタイプにおける軽鎖の定常領域が含まれる。
【０２６９】
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介
する抗体の能力を向上させ、かつ／または１個または複数のアミノ酸を修飾することによ
ってＦｃγ受容体についての抗体の親和性を増大させるために修飾される。この手法は、
例えば、国際公開第００／４２０７２号パンフレット（Presta）において記載されている
。さらに、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎについてのヒト
ＩｇＧ１上の結合部位は、マッピングされており、改善した結合性を有する変異体が記載
されている（Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001を参照されたい）。
【０２７０】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、グリコシル化し
ていない抗体が作製され得る（すなわち、その抗体は、グリコシル化を欠いている）。グ
リコシル化は、例えば、抗原についての抗体の親和性を増大させるために変更され得る。
このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位
を変更することによって達成され得る。例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換は、１つ
または複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらすことによって、
その部位におけるグリコシル化を除去するように成され得る。このような非グリコシル化
は、抗原についての抗体の親和性を増大させ得る。このような手法は、例えば、米国特許
第５，７１４，３５０号明細書および同第６，３５０，８６１号明細書（Co et al.）に
おいて記載されている。
【０２７１】
加えて、または別法では、変化した種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、減少し
た量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体、または増加した２つに分かれたＧｌｃＮ
ａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような変更したグリコシル化パターンは、抗
体のＡＤＣＣ能を増大することが実証されている。このような炭水化物の修飾は、例えば
、変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成さ
れ得る。変化したグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野において記載されており
、本出願の組換え抗体を発現することによって、変化したグリコシル化を有する抗体を産
生する宿主細胞として使用され得る。例えば、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書（
Hang et al.）には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系が記載されてい
て、その遺伝子は、フコシルトランスフェラーゼをコードするので、このような細胞系中
で発現された抗体は、低フコシル化を示す。国際公開第０３／０３５８３５号パンフレッ
ト（Presta）には、フコースをＡｓｎ（２９７）−連結炭水化物に付着させる能力が低下
し、その宿主細胞中で発現された抗体の低フコシル化をもたらす、ＣＨＯ細胞系の変異体
、Ｌｅｃ１３細胞が記載されている（Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:2673
3-26740も参照されたい）。国際公開第９９／５４３４２号パンフレット（Umana et al.
）には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−
ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するよう
に操作された細胞系が記載されており、操作された細胞系中で発現した抗体が増加した２
つに分かれるＧｌｃＮａｃ構造を示し、その構造が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたら
すようになる（Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999も参照されたい）。
【０２７２】
別の実施形態では、抗体は、生物学的半減期を増大するために修飾される。様々な手法
が可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号明細書（Ward）において記載さ
れているとおり、１つまたは複数の次の変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、またはＴ２５６
Ｆが導入され得る。別法では、生物学的半減期を増大させるために、米国特許第５，８６
９，０４６号明細書および同第６，１２１，０２２号明細書（Presta et al.）において
記載されているとおり、抗体を、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから
得られるサルベージ受容体結合エピトープを含むよう、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更し
得る。
【０２７３】
４．抗体コンジュゲート
本出願は、部位特異的標識方法、修飾抗体およびその抗体断片、ならびにそれによって
調製されたイムノコンジュゲートを提供する。本出願の方法を使用して、修飾抗体または
その抗体断片は、標識、例えば、薬物部分、例えば、抗癌剤、自己免疫処置剤、抗炎症剤
、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、もしくは麻酔剤、または画像化試薬、
例えば、ＰＥＴ画像化用のキレート剤、または蛍光標識、またはＭＲＩ造影試薬にコンジ
ュゲートし得る。抗体または抗体断片は、本出願の方法と他のコンジュゲーション方法と
を組み合わせて、複数の同一または異なる標識部分を使用してコンジュゲートし得る。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、本出願のイムノコンジュゲートは、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害剤
、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化
剤、オーリスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノ
ぺプチダーゼ）、プロテインＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテア
ソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻
害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ傷害
剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤、トポイソメラ
ーゼ阻害剤、ＲＮＡ合成阻害剤、キネシン阻害剤、タンパク質間相互作用の阻害剤、Ｅｇ
５阻害剤、およびＤＨＦＲ阻害剤から選択される薬物部分を含む。
【０２７５】
さらに、本出願の修飾抗体または抗体断片は、所与の生物学的応答を修飾する薬物部分
にコンジュゲートしてもよい。薬物部分は、古典的な化学治療剤に限定されると解釈され
るべきではない。例えば、薬物部分は、免疫モジュレーター、例えば、免疫賦活物質、小
分子免疫賦活物質、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧオリゴマー、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ
４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞
エピトープペプチドなどであってよい。薬物部分はまた、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮ
Ａ、ｓｈＲＮＡ、ｃＤＮＡなどであってよい。別法では、薬物部分は、所望の生物学的活
性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってよい。このようなタンパ
ク質は、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒
素、またはジフテリア毒素、タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン
、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活
性化剤、サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生剤、または生物学的応答調整剤、例
えば、リンホカインなどを含んでよい。
【０２７６】
一実施形態では、本出願の修飾抗体または抗体断片は、薬物部分、例えば、細胞毒、薬
物（例えば、免疫抑制剤）、または放射性毒素にコンジュゲートする。細胞毒の例には、
これらだけに限定されないが、タキサン（例えば、国際公開第０１／３８３１８号パンフ
レットおよびＰＣＴ／ＵＳ０３／０２６７５号明細書を参照されたい）、ＤＮＡ−アルキ
ル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デ
ュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、マイタンシノイド、お
よび反応性ポリエチレングリコール部分を含む細胞毒性薬剤（例えば、Sasse et al., J.
Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000), Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 217
5-84 (2000), Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44, 1045-53 (1991), Francisc
o et al., Blood (2003)（印刷出版前に電子出版）、米国特許第５，４７５，０９２号明
細書、同第６，３４０，７０１号明細書、同第６，３７２，７３８号明細書、および同第
６，４３６，９３１号明細書、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３号明細書、
係属中の米国特許出願第１０／０２４，２９０号明細書、および同第１０／１１６，０５
３号明細書、ならびに国際公開第０１／４９６９８号パンフレットを参照されたい）、タ
キソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイ
シン、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒド
ロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、
１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ならびにピューロマイシンおよび類
似体、またはその同族体が含まれる。治療剤にはまた、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メ
トトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロ
ウラシルデカルバジン）、除去剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、
メイファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロフォス
ファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシン
Ｃ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アント
ラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン
）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン
、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば
、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる（例えば、Seattle Geneticsの米国
特許出願公開第２００９０３０４７２１号明細書を参照されたい）。
【０２７７】
本出願の修飾抗体または抗体断片にコンジュゲートし得る治療的細胞毒の他の例には、
デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシン、およびオーリスタチン、ならび
にそれらの誘導体が含まれる。カリケアマイシン抗体コンジュゲートの例は、市販されて
いる（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。
【０２７８】
細胞毒の種類、治療剤を抗体にコンジュゲートさせるためのリンカーおよび方法のさら
なる検討については、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail
et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cel
l 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (200
2) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Dru
g Deliv. Rev. 53:247-264も参照されたい。
【０２７９】
本出願によると、修飾抗体またはその抗体断片は、放射性同位体にコンジュゲートして
、放射性イムノコンジュゲートと呼ばれる細胞毒性放射性医薬品を生成することもできる
。診断的または治療的に使用するために抗体にコンジュゲートし得る放射性同位体の例に
は、これらだけに限定されないが、ヨウ素ｌ３１、インジウム１１１、イットリウム９０
、およびルテチウム１７７が含まれる。放射性イムノコンジュゲートを調製するための方
法は、当技術分野で確立されている。Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌｓ）を含む放射性イムノコンジュゲートの例は市販されており、同様の方法が、
本出願の抗体を使用して、放射性イムノコンジュゲートを調製するために使用され得る。
ある特定の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に付着し得る
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸（Ｄ
ＯＴＡ）である。このようなリンカー分子は一般的に、当技術分野で公知であり、それぞ
れ、それらの全体が参照によって組み込まれるDenardo et al., (1998) Clin. Cancer Re
s. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; and Zimm
erman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50において記載されている。
【０２８０】
本出願はさらに、抗原に特異的に結合する修飾抗体またはその断片を提供する。その修
飾抗体または断片は、異種タンパク質またはポリペプチド（またはその断片、好ましくは
、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なく
とも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０
個、もしくは少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）にコンジュゲートまたは融
合して、融合タンパク質を生成してもよい。特に、本出願は、本明細書において記載の抗
体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、
ＶＨＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬＣＤＲ）と、異種タンパク質、ポリペプチド、ま
たはペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
【０２８１】
一部の実施形態では、抗原結合特異性を有さない修飾抗体断片、例えば、これらだけに
限定されないが、本出願によって操作されたシステイン残基を有する修飾Ｆｃドメインが
、このような抗体断片（例えば、操作されたＦｃ）と、異種タンパク質、ポリペプチド、
またはペプチドとを含む融合タンパク質を生成させるために使用される。
【０２８２】
追加の融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソン
シャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（正確には、「ＤＮＡシャッフリ
ング」と呼ばれる）の技術によって生成されてもよい。ＤＮＡシャッフリングは、本出願
の抗体またはその断片（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体ま
たはその断片）の活性を変化させるために用いられてもよい。一般的には、米国特許第５
，６０５，７９３号明細書，同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１
号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書；
Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trend
s Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; and 
Lorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308-313を参照されたい（これらの特
許および刊行物はそれぞれ、その全体が参照によって組み込まれる）。抗体もしくはその
断片、またはコードされた抗体もしくはその断片は、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌ
クレオチド挿入、または組換え前の他の方法による、ランダム変異導入法にかけられるこ
とによって変更されてもよい。抗原に特異的に結合する抗体またはその断片をコードする
ポリヌクレオチドは、１種または複数の異種分子の１個または複数の構成成分、モチーフ
、セクション、部分、ドメイン、断片などで組み換えられてもよい。
【０２８３】
さらに、本出願の修飾抗体またはその抗体断片は、精製を容易にするためにマーカー配
列、例えば、ペプチドにコンジュゲートし得る。好ましい実施形態では、マーカーアミノ
酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ,Ｉｎ
ｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）
において提供されるタブであり、特に、それらの多くは市販されている。Gentz et al., 
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されているとおり、例えば
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペ
プチドタグには、これらだけに限定されないが、血球凝集素（「ＨＡ」）タグ（インフル
エンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson et al., (1984) Cell
37:767））および「ＦＬＡＧ」タグ（A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Meth
ods 49: 455-465, 2001）が含まれる。本出願によって、抗体または抗体断片は、それら
の有効性を向上させるために、腫瘍透過性ペプチドにもコンジュゲートし得る。
【０２８４】
他の実施形態では、本出願の修飾抗体または抗体断片は、診断剤または検出剤にコンジ
ュゲートする。このようなイムノコンジュゲートは、臨床試験手順、例えば、特定の療法
の有効性を判定することの一部として、疾患または障害の発現、発症、進行、および／ま
たは重症度をモニターまたは予後判断するために有用であり得る。このような診断および
検出は、抗体を、検出物質にカップリングさせることによって達成され得、その検出物質
には、これらだけに限定されないが、様々な酵素、例えば、これらだけに限定されないが
、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシ
ダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらだけに限定さ
れないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光物質、例えば
、これらだけに限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕ
ｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａ
ｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕ
ｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａ
ｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕ
ｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａ
ｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕ
ｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ウンベリフェロン、フルオレセイン、
フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレ
セイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリン；発光物質、例えば、これらだけに
限定されないが、ルミノール；生物発光物質、例えば、これらだけに限定されないが、ル
シフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン；放射性物質、例えば、これらだけに限
定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４
Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１
１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、
ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）
、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、
１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１
８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓ
ｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、６４Ｃｕ、１１
３Ｓｎ、および１１７Ｓｎ；ならびに様々な陽電子放射型断層撮影に使用する陽電子放射
性金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。
【０２８５】
本出願の修飾抗体または抗体断片は、ターゲット抗原のイムノアッセイまたは精製に特
に有用である固体支持体にも付着し得る。このような固体支持体には、これらだけに限定
されないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ
塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれる。
【０２８６】
５．医薬組成物
イムノコンジュゲートを含む医薬組成物または無菌の組成物を調製するために、本出願
のイムノコンジュゲートは、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。該組成
物は、癌（乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、急
性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌腫、末梢神経鞘腫瘍（例え
ば、神経鞘腫）、頭頚部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽細胞腫、軟部組
織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥
大症（ＢＰＨ）、女性化乳房、および子宮内膜症）を処置または予防するために適した１
種または複数の他の治療剤を追加で含み得る。
【０２８７】
治療剤および診断剤の製剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混
合することによって、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、または懸
濁液の形態に調製され得る（例えば、Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharm
acological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001；Gennaro, Re
mington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins
, New York, N.Y., 2000；Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parent
eral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993；Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceuti
cal Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990；Lieberman, et al. (eds.) Pha
rmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990；Weiner and 
Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2
000を参照されたい)。
【０２８８】
治療用の投与レジメンの選択は、実体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、
実体の免疫原性、および生物学的マトリックス中でのターゲット細胞のアクセシビリティ
ーを含む複数の因子に左右される。ある特定の実施形態では、投与レジメンは、副作用の
許容レベルと一致して、患者に送達される治療剤の量を最大化する。したがって、送達さ
れるバイオロジックの量は、特定の実体、および処置される状態の重症度に部分的に左右
される。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量を選択する指針が利用可能であ
る（例えば、Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire
, UK, 1996；Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marce
l Dekker, New York, N.Y., 1991；Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Th
erapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993；Baert et al.,
New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003；Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966
-1973, 1999；Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001；Beniaminovitz e
t al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000；Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:
24-32, 2003；Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000を参照されたい
）。
【０２８９】
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響を及ぼすことが当技術分野において公知であ
るかもしくは疑われる、または処置に影響を及ぼすことが予測されるパラメーターまたは
因子を使用して、医師によってなされる。一般には、用量は、最適用量よりもいくぶん少
ない量で開始し、その後、任意の負の副作用と比較して所望または最適な効果が達成され
るまで少しずつ増加させる。重要な診断尺度には、例えば、炎症の症状または産生された
炎症性サイトカインのレベルが含まれる。
【０２９０】
本出願の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、およ
び投与様式について、患者に対する毒性を伴うことなく、所望の治療応答を達成するため
に有効な活性成分の量が得られるように変化させてもよい。選択された投薬量レベルは、
用いる本出願の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投
与経路、投与時間、用いた特定の化合物の排泄速度、処置の持続期間、用いた特定の組成
物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢
、性別、体重、状態、全身健康、および既往歴、ならびに医学分野において公知の同様の
因子を含む様々な薬物動態因子に左右される。
【０２９１】
本出願の抗体またはその断片を含む組成物は、連続的な注入によって、または例えば、
１日、１週間、もしくは１週間当たり１〜７回の間隔での投与によって提供され得る。投
与は、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内で、または吸入によって提
供されてもよい。具体的な投与プロトコールは、著しく望ましくない副作用を回避する最
大用量また投与頻度を含むものである。
【０２９２】
本出願のイムノコンジュゲートでは、患者に投与される投薬量は、０．０００１ｍｇ／
ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重であってよい。投薬量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２
０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／
ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１〜１ｍｇ／ｋ
ｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜
０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜
０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋ
ｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重であ
ってよい。本出願の抗体またはその断片の投薬量は、患者の体重（キログラム（ｋｇ））
に投与される用量（ｍｇ／ｋｇ）を掛けて算出され得る。
【０２９３】
本出願のイムノコンジュゲートの用量は、繰り返されてもよく、投与間に、少なくとも
１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、
または少なくとも６カ月の間隔をおいてもよい。具体的な実施形態では、本出願のイムノ
コンジュゲートの用量は、３週間ごとに繰り返される。
【０２９４】
特定の患者での有効量は、処置される状態、患者の全体的な健康、投与の方法経路およ
び用量、ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る（例えば、Maynard et a
l., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton,
Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londo
n, UK, 2001を参照されたい）。
【０２９５】
投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚での塗布、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼
内、動脈内、脳脊髄内、病変内での注射もしくは注入、または持続放出システムもしくは
インプラントによるものでもよい（例えば、Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1
983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech.
12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985;
Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980；米国特許第６，３５
０，４６６号明細書、および同第６，３１６，０２４号明細書を参照されたい）。必要に
応じて、組成物は、可溶化剤、および注射部位における疼痛を緩和するためのリドカイン
などの局所麻酔剤を含んでもよい。加えて、肺投与も、例えば吸入器またはネブライザー
の使用、およびエアゾール化剤との配合によって用いられ得る。例えば、それぞれのそれ
らの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，０１９，９６８号明細書
、同第５，９８５，３２０号明細書、同第５，９８５，３０９号明細書、同第５，９３４
，２７２号明細書、同第５，８７４，０６４号明細書、同第５，８５５，９１３号明細書
、同第５，２９０，５４０号明細書、および同第４，８８０，０７８号明細書；ならびに
国際公開第９２／１９２４４号パンフレット、同第９７／３２５７２号パンフレット、同
第９７／４４０１３号パンフレット、同第９８／３１３４６号パンフレット、同第９９／
６６９０３号パンフレットを参照されたい。
【０２９６】
本出願の組成物はまた、当技術分野で公知の様々な方法の１つまたは複数を使用して、
１種または複数の投与経路を介して投与されてもよい。当業者には分かるであろうとおり
、投与の経路および／または形態は、所望の結果に応じて変化する。本出願のイムノコン
ジュゲート用に選択される投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、
または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入が含まれる。非経口投与は、通常注
射による腸内および局所投与以外の投与形態を表すことがあり、それには、限定ではない
が、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経皮気管
内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外、および胸骨内注射およ
び注入が含まれる。別法では、本出願の組成物は、非経口でない経路、例えば、局所、表
皮または粘膜経路の投与、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下、または局所を介し
て投与され得る。一実施形態では、本出願のイムノコンジュゲートは、注入によって投与
される。別の実施形態では、本出願のイムノコンジュゲートは、皮下に投与される。
【０２９７】
本出願のイムノコンジュゲートが制御放出または持続放出システムにおいて投与される
場合、ポンプが、制御または持続放出を達成するために使用されてもよい（Langer、前出
; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:50
7, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989を参照されたい）。ポリマー
材料が、本出願の治療剤の制御または持続放出を達成するために使用され得る（例えば、
Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., B
oca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and 
Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J
. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983を参照; Levy et al., Science 22
8:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosu
rg. 7 1:105, 1989；米国特許第５，６７９，３７７号明細書；米国特許第５，９１６，
５９７号明細書；米国特許第５，９１２，０１５号明細書；米国特許第５，９８９，４６
３号明細書；米国特許第５，１２８，３２６号明細書；国際公開第９９／１５１５４号パ
ンフレット；および国際公開第９９／２０２５３号パンフレットも参照されたい）。持続
放出製剤において使用されるポリマーの例には、これらだけに限定されないが、ポリ（２
−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸
）、ポリ（エチレン−コ−ビニル酢酸塩）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（Ｐ
ＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ
アクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチ
ド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが含まれる。一実施形態
では、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性で、溶出性不純物を含まず、
貯蔵安定で、無菌で、かつ生分解性である。制御または持続放出システムは、予防または
治療ターゲットに近接して置くことができるので、全身用量の一部しか必要としない（例
えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 前出、vol. 2, pp. 
115-138, 1984を参照されたい）。
【０２９８】
制御放出システムは、Langerによるレビューにおいて検討されている（Science 249:15
27-1533, 1990）。当業者に公知の任意の技術が、１種または複数の本出願のイムノコン
ジュゲートを含む持続放出製剤を製造するために使用され得る。例えば、それぞれ、それ
らの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，５２６，９３８号明細書
、国際公開第９１／０５５４８号パンフレット、国際公開第９６／２０６９８号パンフレ
ット、Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996; Song et al., PDA Jo
urnal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995; Cleek et al., Pro
. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997; and Lam et al., Pr
oc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997を参照されたい。
【０２９９】
本出願のイムノコンジュゲートが局所に投与される場合、それらは、軟膏剤、クリーム
剤、経皮貼付剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー剤、スプレー剤、エアゾール剤、液
剤、乳剤の形態、または当業者に周知の他の形態で製剤化され得る。例えば、Remington'
s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th 
ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。非噴霧性局所剤形では、局所
用途に適合する担体または１種または複数の賦形剤を含み、一部の例では、水より高い動
的粘度を有する半固体または固体状の粘着性の形態が、典型的には用いられる。適切な製
剤には、限定ではないが、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント
剤、膏薬などが含まれ、これらは、所望の場合には、滅菌されるか、または例えば、浸透
圧などの様々な特性に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩
衝剤、または塩）と混合される。他の適切な局所剤形には、噴霧性エアゾール調製物が含
まれ、ここで、一部の例では、固体または液体の不活性な担体と組み合わせた活性成分は
、加圧した揮発性物質（例えば、ガス状噴射剤、例えば、Ｆｒｅｏｎ（商標））との混合
物で、またはスクイズボトルに封入される。所望の場合には、保湿剤または湿潤剤も、医
薬組成物および剤形に添加され得る。そのような追加の成分の例は、当技術分野で周知で
ある。
【０３００】
イムノコンジュゲートを含む組成物が鼻腔内に投与される場合、それは、エアゾール状
、スプレー、ミスト、またはドロップ状に製剤化され得る。特に、本出願によって使用す
るための予防または治療剤は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリ
クロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な
ガス）を含む加圧したパックまたはネブライザーからのエアゾールスプレー提示の形態で
好都合に送達され得る。加圧したエアゾールの場合、投薬量単位は、計測した量を送達す
るための弁を提供することによって決定されてもよい。吸入器または注入器において使用
するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成）は、化合物と、適
切な散剤基材、例えば、ラクトースまたはデンプンとの粉末混合物を含んで製剤化されて
いてもよい。
【０３０１】
第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放
射線と共に同時投与または処置するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ha
rdman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Th
erapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (20
01) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott
, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemot
herapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい
）。有効量の治療剤は、症状を少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０
％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％低下させ得る。
【０３０２】
本出願のイムノコンジュゲートと組み合わせて投与され得る追加の治療剤（例えば、予
防または治療剤）は、本出願のイムノコンジュゲートとは５分未満空けて、３０分未満空
けて、１時間空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空け
て、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて
、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、
約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間
空けて、約１２時間〜１８時間空けて、１８時間〜２４時間空けて、２４時間〜３６時間
空けて、３６時間〜４８時間空けて、４８時間〜５２時間空けて、５２時間〜６０時間空
けて、６０時間〜７２時間空けて、７２時間〜８４時間空けて、８４時間〜９６時間空け
て、または９６時間〜１２０時間空けて投与されてもよい。２つ以上の治療剤が、患者の
同一外来時内に投与されてもよい。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、本出願のイムノコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける
適正な分布を保証するように製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの
高度に親水性の化合物を排除する。本出願の治療用化合物が（所望の場合には）ＢＢＢを
通過することを保証するために、それらは、例えば、リポソームに製剤化され得る。リポ
ソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書；同
第５，３７４，５４８号明細書；および同第５，３９９，３３１号明細書を参照されたい
。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送されて、ターゲティング化薬物送
達を向上させる１つまたは複数の部分を含んでよい（例えば、Ranade, (1989) J. Clin. 
Pharmacol. 29:685を参照されたい）。例示的なターゲティング部分には、葉酸塩または
ビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号明細書（Low et al.）を参照された
い）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038
）；抗体（Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimi
crob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性プロテインＡ受容体（Briscoe et al., (1
995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem.
269:9090）が含まれ；K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. 
J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
【０３０４】
本出願は、本出願のイムノコンジュゲートを単独で、または他の治療薬と組み合わせて
含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するためのプロトコールを提供する。本
出願の組合せ療法における治療薬（例えば、予防または治療剤）は、同時に、または逐次
的に対象に投与され得る。本出願の組合せ療法の治療薬（例えば、予防または治療剤）は
、サイクル的にも投与され得る。治療薬（例えば、薬剤）の１種に対する抵抗性の出現を
低下させ、かつ治療薬（例えば、薬剤）の１種の副作用を回避または低下させ、かつ／ま
たは治療薬の有効性を改善するために、サイクリング療法は、第１の治療薬（例えば、第
１の予防または治療剤）の一定期間にわたる投与、それに続く第２の治療薬（例えば、第
２の予防または治療剤）の一定期間にわたる投与、およびこの逐次的投与の繰り返し、す
なわち、サイクルを含む。
【０３０５】
本出願の組合せ療法の治療薬（例えば、予防または治療剤）は、対象に同時に投与され
得る。
【０３０６】
「同時に」という用語は、正確に同時に治療薬（例えば、予防または治療剤）を投与す
ることに限定されず、むしろ、本出願の抗体が他の１種または複数の治療薬と共に作用し
て、それらが他の方法で投与された場合よりも増大した利点を提供するように、本出願の
抗体またはその断片を含む医薬組成物が連続で、かつ一定の時間間隔内で対象に投与され
ることを意味する。例えば、各治療薬は、同時、または異なる時点で任意の順序で逐次的
に対象に投与され得るが；しかしながら、同時に投与されない場合、それらは、所望の治
療的または予防的効果を提供するように、十分に近い時間で投与されるべきである。各治
療薬は、任意の適切な形態で、任意の適切な経路によって別々に対象に投与され得る。様
々な実施形態において、治療薬（例えば、予防または治療剤）は、１５分未満、３０分未
満、１時間未満空けて、約１時間空けて、約１時間〜約２時間空けて、約２時間〜約３時
間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間
空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空
けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１
２時間空けて、２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて、または１週間空けて
、対象に投与される。他の実施形態では、２種以上の治療薬（例えば、予防または治療剤
）が、患者の同一外来時内に投与される。
【０３０７】
組合せ療法の予防または治療剤は、同じ医薬組成物において対象に投与され得る。別法
では、組合せ療法の予防または治療剤は、別々の医薬組成物において対象に同時に投与さ
れ得る。予防または治療剤は、同じか、または異なる投与経路によって、対象に投与され
てもよい。
【０３０８】
本出願を十分に記載してきて、下記実施例および特許請求の範囲によってさらに説明す
るが、それらは、例示であって、本出願をさらに限定することを意味しない。
［実施例］
【実施例１】
【０３０９】
ペイロード化合物。
下記の表５において、本出願の実施例において記載するとおりの抗体薬物コンジュゲー
トの作製において使用される様々なペイロード化合物の構造を列挙する。化合物Ａ〜Ｅお
よび化合物を合成する方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２４７９５号明細書に
開示されており、化合物Ｆは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０８００号明細書に
おいて開示されており、それらは両方とも、それらの全体が参照によって本明細書に組み
込まれる。化合物Ｇのための合成方法を下記に開示する。
【０３１０】
化合物Ｇ：合成手順
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（
Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロー
ル−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジ
メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル
）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（ＭＣ−ＭＭ
ＡＦ、化合物Ｇ）の合成
【０３１１】
【化６３】
2018134080.tif 000100
ＭＭＡＦ−ＯＭｅ（１３５ｍｇ、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＣＨ
３ＣＮ（１０ｍＬ）に溶解した。得られた透明な溶液に、水５ｍＬ、続いて、１Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液０．３７５ｍＬ（認証済み、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を
添加した。反応混合物を磁気によって２１℃で１８時間撹拌し、その時点で、ＬＣＭＳ分
析によって、反応の完了が示された。反応混合物を凍結し、凍結乾燥して、ＭＭＡＦナト
リウム塩を得た。ＬＣＭＳ保持時間０．９１１分。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ７３２．
５（Ｍ＋１）。こうして先行反応で得られたＭＭＡＦナトリウム塩の全体を、ＤＭＳＯ１
０ｍＬに溶解した。別の反応容器内で、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１
Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（９５ｍｇ）をＤＭＳＯ３．０ｍＬ中のＨＡＴＵ（
１６５ｍｇ）およびＤＩＥＡ（０．１２６ｍＬ）で２１℃で２５分間処理した。活性化エ
ステルの反応混合物の全体を、ＭＭＡＦナトリウム塩の溶液に添加し、反応混合物を同じ
温度で３時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ４０ｍＬと５％クエン酸水溶液２０ｍＬ
とに分配した。有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ２０ｍＬで抽出した。合わせた有機層
を飽和ＮａＣｌ水溶液１０ｍＬで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃
縮した。残渣を、ＩＳＣＯ  Ｃ１８ｇｏｌｄ  １５．５ｇカラムを使用してＩＳＣＯコン
ビフラッシュ装置で精製した。所望の物質をＨ２Ｏ中の５０％ＣＨ３ＣＮで溶離した。所
望の生成物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥し、化合物を白色の固体として得た。ＬＣ
ＭＳ保持時間１．３９２分。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ９２５．６（Ｍ＋１）。
【０３１２】
【表６−１】
2018134080.tif 000101
【０３１３】
【表６−２】
2018134080.tif 000102
【０３１４】
【表６−３】
2018134080.tif 000103
【実施例２】
【０３１５】
トラスツズマブＣｙｓ変異抗体の調製。
トラスツズマブ、抗ＨＥＲ２抗体（「トラスツズマブ」、「抗ＨＥＲ２抗体」、および
「ＴＢＳ」という用語は本明細書において互換的に使用される）の重鎖および軽鎖のＤＮ
Ａコード可変領域を化学的に合成し、ヒトＩｇＧ１の定常領域およびヒトカッパ軽鎖を含
む２種の哺乳動物発現ベクター、ｐＯＧ−ＨＣおよびｐＯＧ−ＬＣにクローニングして、
２種の野生型コンストラクト、それぞれ、ｐＯＧ−トラスツズマブＨＣおよびｐＯＧ−ト
ラスツズマブＬＣを生じさせた。該ベクターにおいて、哺乳動物細胞での抗体重鎖および
軽鎖コンストラクトの発現をＣＭＶプロモーターによって駆動する。該ベクターは、重鎖
または軽鎖のＮ末端に、哺乳動物細胞からのそれらの分泌をガイドする合成２４アミノ酸
シグナル配列：ＭＫＴＦＩＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＩＦＬＬＰＧＡＴＡ（配列番号９９）を
含む。該シグナル配列は、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞において、数百種の哺
乳動物タンパク質のタンパク質分泌の指示において効率的であることが確認されている。
【０３１６】
オリゴヌクレオチド指示変異誘発を用いて、トラスツズマブにおけるＣｙｓ変異コンス
トラクトを調製した。各Ｃｙｓ変異部位のために、変異プライマー対を化学的に合成した
（表６）。ＰＣＲ増幅の前に、センス変異プライマーおよびアンチセンス変異プライマー
対を混合した。ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、鋳型としてｐＯＧ−トラスツズマブＨＣおよびｐＯＧ
−トラスツズマブＬＣを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の後に、ＰＣＲ産物を
アガロースゲルで確認し、Ｄｐｎ  Ｉで処理し、続いて、ＤＨ１０ｂ細胞に形質転換した
（Klock et al., (2009) Methods Mol Biol. 498:91-103）。
【０３１７】
【表７】
2018134080.tif 000104
【０３１８】
一部の場合には、トラスツズマブの同じ鎖中に２つ以上の変異を作製した。複数Ｃｙｓ
変異コンストラクトを調製するために、上記と同じ方法を使用したが、ただし、複数ラウ
ンドの変異誘発のために、鋳型としてｐＯＧ−トラスツズマブ−Ｃｙｓ変異プラスミドを
使用して、オリゴヌクレオチド指定変異誘発を用いた。
【０３１９】
すべてのＣｙｓ変異コンストラクトの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ＨＣ
およびＬＣ  Ｃｙｓ変異ＩｇＧ１コンストラクトの定常領域のコード化タンパク質配列を
それぞれ表７および表８に示す。ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトカッパ軽鎖のアミノ酸残基
は、ＥＵナンバリングシステムによってナンバリングされる（Edelman et al, (1969) Pr
oc Natl Acad Sci U S A, 63:78-85）。
【０３２０】
【表８−１】
2018134080.tif 000105
【０３２１】
【表８−２】
2018134080.tif 000106
【０３２２】
【表８−３】
2018134080.tif 000107
【０３２３】
【表８−４】
2018134080.tif 000108
【０３２４】
【表８−５】
2018134080.tif 000109
【０３２５】
【表９】
2018134080.tif 000110
【実施例３】
【０３２６】
異なる抗体へのトラスツズマブ重鎖および軽鎖Ｃｙｓ変異の移行。
トラスツズマブでは、そのヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトカッパ軽鎖の定常領域中にある
ように、薬物ペイロードの付着用のすべてのＣｙｓ変異を選択した。抗体の定常領域は、
一次配列および構造において高度保存されているので、トラスツズマブについて良好なペ
イロード付着部位として同定されているＣｙｓ変異残基は、他の抗体においても好ましい
付着残基として役立つであろう。他の抗体へのこれらのジェネリックなコンジュゲーショ
ン部位の移行性を実証するために、本発明者らは、Ｃｙｓ変異のセットを抗ｃＫＩＴ抗体
へとクローニングした。抗ｃＫＩＴ抗体は、ｃＫＩＴタンパク質に結合するヒトＩｇＧ１
重鎖およびヒトカッパ軽鎖を含む抗体である。抗体、抗ｃＫＩＴのＤＮＡコード化可変領
域を、３種の選択されたｐＯＧトラスツズマブＨＣ  Ｃｙｓ変異プラスミドコンストラク
ト、および２種の選択されたｐＯＧトラスツズマブＬＣ  Ｃｙｓ変異プラスミドコンスト
ラクト（表９に列挙されている配列番号）にクローニングして、トラスツズマブコンスト
ラクトの可変領域を、実施例２に記載のとおりのプラスミドにおいて置き換えた。結果と
して、抗ｃＫＩＴ抗体およびトラスツズマブの対応する５種のＣｙｓコンストラクト中の
重鎖および軽鎖定常領域のアミノ酸配列は同一である。後続の例は、これらの部位が容易
にコンジュゲートし得ることを示している。逆に、異なるヒトＩｇＧアイソタイプでの一
次配列および三次構造の高い相同度によって、トラスツズマブのカッパ軽鎖上のＣｙｓ変
異は、異なるアイソタイプ重鎖を含むヒト抗体上の同等の軽鎖に容易に移行し得る。同様
に、ＩｇＧ１の定常領域において同定された部位は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ
４に移行され得る。
【０３２７】
【表１０】
2018134080.tif 000111
【実施例４】
【０３２８】
２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞におけるＣｙｓ変異抗体の発現および精製。
リシン残基へのコンジュゲーション、または部分的に還元された天然ジスルフィド結合
を介して製造された抗体コンジュゲートは多くの場合、３〜４の間の薬物抗体比（ＤＡＲ
）を特徴とする。Ｃｙｓ操作された抗体はより典型的には、２のＤＡＲを特徴とする。あ
る種の適応では、原則として、複数のＣｙｓ変異を抗体に導入することによって達成され
得る、より高いＤＡＲを有するＡＤＣを製造することが望ましいことがある。Ｃｙｓ変異
の数が増大するにつれて、そのような変異がＡＤＣ調製の間に必要な再酸化プロセスに干
渉して、不均一な生成物が生じる可能性も増大する。この研究では、良好な再酸化挙動を
示す多数の単一部位重鎖および軽鎖Ｃｙｓ変異を同定した。２を超えるＤＡＲを有するＡ
ＤＣを製造するために、複数のコンジュゲーション部位を組み合わせることができること
を実証するために、トラスツズマブおよび抗ｃＫＩＴ抗体の軽鎖および重鎖の複数の単一
部位Ｃｙｓコンストラクト（表１０）を、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞にお
いて同時発現させた。
【０３２９】
【表１１】
2018134080.tif 000112
【０３３０】
Ｃｙｓ変異抗体を、以前に記載（Meissner, et al., Biotechnol Bioeng. 75:197-203 
(2001)）されたとおりの一過性トランスフェクション方法を使用して、重鎖および軽鎖プ
ラスミドを同時トランスフェクトすることによって、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標
）細胞において発現させた。同時トランスフェクションにおいて使用したＤＮＡプラスミ
ドは、製造者プロトコールに従ってＱｉａｇｅｎプラスミド調製キットを使用して調製し
た。２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞を、５％ＣＯ２下、３７℃で、Ｆｒｅｅｓ
ｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、懸濁液で培養した。トランスフ
ェクションの３日前に、細胞を０．２５×１０６細胞／ｍｌで新鮮な培地に分割した。ト
ランスフェクションの日に、細胞密度は典型的には、１．５〜２×１０６細胞／ｍｌに達
した。ＰＥＩ方法（Meissner, et al., Biotechnol Bioeng. 75:197-203 (2001)）を使用
して、細胞を、１：１の比の重鎖および軽鎖プラスミドの混合物でトランスフェクトした
。トランスフェクトされた細胞をさらに５日間培養した。２０００ｇで２０分間の培養物
の遠心分離によって、培養物から培地を採取し、０．２マイクロメートルフィルターを通
して濾過した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ
ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、発現した抗体を濾過培地から精製
した。抗体ＩｇＧを、溶離緩衝液（ｐＨ３．０）によってＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ（商標）カラムから溶離し、１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で直ちに中
和し、続いて、ＰＢＳに緩衝液を交換した。
【０３３１】
一過性トランスフェクトされた２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）におけるトラスツ
ズマブおよび抗ｃＫＩＴ  Ｃｙｓ変異抗体の発現レベルは、野生型抗体の発現レベルと同
様であり、収率は１２〜２５ｍｇ／Ｌの範囲であり、これは、選択された部位における単
一から三重の点変異が、細胞の分泌機構によって発現される抗体の保持を著しく変更しな
かったことを示唆している。非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用しての精製Ｃｙｓ変異抗体の
分析は、Ｃｙｓ変異抗体が、操作システインによってジスルフィド連結されたオリゴマー
を形成しなかったことを示す。
【実施例５】
【０３３２】
様々なペイロードを含むＣｙｓ変異抗体の還元、再酸化、およびコンジュゲーション。
哺乳動物細胞において発現された抗体における操作されたＣｙｓは典型的には、グルタ
チオン（ＧＳＨ）および／またはシステインなどの付加（ジスルフィド）によって、それ
らの生合成中に修飾されるので（Chen et al., 2009）、初めに発現されたままの生成物
中の修飾されたＣｙｓは、マレイミドまたはブロモ−もしくはヨード−アセトアミド基な
どのチオール反応性試薬に対して非反応性である。発現後の操作システインをコンジュゲ
ートするために、グルタチオンまたはシステイン付加は、これらのジスルフィドの還元に
よって除去される必要があり、これは一般に、発現されたタンパク質中のジスルフィドの
すべてを還元することを伴う。これは、抗体をジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元
剤に初めに曝露した後に、抗体のすべての天然ジスルフィド結合を再酸化して、機能性抗
体構造を再生および／または安定化することを可能にする手順によって達成され得る。し
たがって、すべての天然ジスルフィド結合および操作システイン残基のシステインまたは
ＧＳＨ付加物の間のジスルフィド結合を還元するために、新たに調製されたＤＴＴを、ト
ラスツズマブおよび抗ｃＫＩＴ抗体の精製Ｃｙｓ変異体に、１０または２０ｍＭ  ＤＴＴ
の最終濃度まで添加した。３７℃で１時間のＤＴＴとの抗体のインキュベーションの後に
、混合物を、３日間、ＰＢＳに対して透析したが、その際、ＤＴＴを除去し、天然ジスル
フィド結合を再酸化するために、緩衝液を毎日交換した。再酸化プロセスを、個々の重鎖
および軽鎖分子から全ＩｇＧを分離することができる逆相ＨＰＬＣによってモニターした
。コンジュゲーション反応混合物を、８０℃に加熱されたＰＲＬＰ−Ｓ  ４０００Ａカラ
ム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析し、カラムの溶離を１．５ｍｌ／分
の流速で、ＴＦＡ０．１％を含有する水中の３０〜６０％アセトニトリルの直線勾配によ
って実施した。カラムからのタンパク質の溶離を２８０ｎｍでモニターした。再酸化が完
了するまで、透析を継続した。再酸化は、鎖内ジスルフィドを再生する一方で、透析は、
新たに導入されたシステインに接続したシステインおよびグルタチオンを透析によって除
去することを可能にする。
【０３３３】
再酸化の後に、抗体は、コンジュゲーションの用意が整う。マレイミド含有化合物をＰ
ＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中の再酸化抗体に、典型的には１．５：１、２：１、または１
０：１の比で添加した。インキュベーションを１時間〜２４時間実施した。多くの場合に
、コンジュゲートされた抗体を、コンジュゲートされなかった抗体から分離することを可
能にする逆相ＨＰＬＣによって、コンジュゲーションプロセスをモニターした。カラムか
らのタンパク質の溶離を、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ、および２１５ｎｍの波長でのＵＶ吸
光度によってモニターした。
【０３３４】
コンジュゲーション混合物を逆相ＨＰＬＣによって分析すると、均一で単一ピークの溶
離プロファイルによって示唆されるとおり、多くのＣｙｓ部位は、均一なコンジュゲーシ
ョン生成物を生成したが、一部のＣｙｓ部位は、不均一なコンジュゲーション生成物を生
成したか、または非コンジュゲート抗体にマッチするピークのみを示した。
【０３３５】
上記の手順は、天然ジスルフィド結合の還元および再酸化、さらには、操作システイン
残基のシステインとＧＳＨ付加物との間の結合の還元を伴う。再酸化プロセスの間、操作
システイン残基が、ジスルフィドシャッフリングのプロセスを介して、適正な天然ジスル
フィド結合の再形成に干渉することがある。これは、操作システインと天然システイン残
基との間、または不正にマッチした天然ジスルフィド結合間のいずれかでのミスマッチし
たジスルフィド結合の形成をもたらし得る。そのようなミスマッチしたジスルフィド結合
は、逆相ＨＰＬＣカラム上での抗体の保持に影響を及ぼし得る。そのミスマッチプロセス
は、所望の操作システイン以外の非対合システイン残基ももたらし得る。抗体上の異なる
位置へのマレイミド化合物の付着は、保持時間に異なる影響を及ぼす（下記の均一にコン
ジュゲートされたＡＤＣについての考察を参照されたい）。加えて、不完全な再酸化は、
操作システイン残基との所望のコンジュゲーションに加えて、マレイミド化合物と反応す
るであろう天然システイン残基を含む抗体を残すはずである。天然ジスルフィド結合の適
正かつ完全な形成を妨害する任意のプロセスは、Ｃｙｓ反応性化合物とのコンジュゲーシ
ョンの際に、複雑なＨＰＬＣプロファイルをもたらす。表面露出しているように部位は選
択されたが、導入された遊離システインが抗体の一部またはすべての構造においてマレイ
ミド−薬物にアクセシブルではないか、そうでなければそれと生産的に相互作用し得ない
場合には、最終生成物に不均一性も存在し得る。遊離システインが非反応性であると、最
終ＤＡＲは低下し、生成物はおそらく、完全に修飾されたＣｙｓ変異抗体、部分的に修飾
されたＣｙｓ変異抗体、および未修飾のＣｙｓ変異抗体の不均一な混合物である。２個以
上の導入遊離システインを有する抗体の場合には、１つの部位での薬物付着が（すなわち
、立体密集状態によって）、第２の部位における第２の薬物の結合を干渉すると、追加的
な複雑性が導入され得る。このような競合は、より低い最終ＤＡＲおよび不均一な生成物
をもたらす。２個の導入システインが非常に近く、適正に配向されていれば、それらはま
た、２個の遊離システインを形成せず、非天然ジスルフィド結合を形成し得る。この場合
、抗体は、マレイミド−薬物化合物に対して反応性ではなく、その結果は、より低い最終
ＤＡＲまたはさらに、均一な非コンジュゲート生成物であろう。未精製反応混合物におい
てＲＰ−ＨＰＬＣによるＵＶ吸収によって測定される均一なＡＤＣの収率は、Ｃｙｓ変異
、さらには、使用されたリンカー−ペイロード化合物に応じて変化した。上記の還元／再
酸化プロトコールおよびコンジュゲーション手順を使用すると、本明細書において記載の
４５種の多重Ｃｙｓ変異トラスツズマブまたは抗ｃＫＩＴ抗体のうちの２６種は、そのよ
うな小さな試験コンジュゲーションで、許容される最終ＤＡＲ（二重Ｃｙｓ変異体ではＤ
ＡＲ  ３．４〜４．４、三重Ｃｙｓ変異体では５．１〜６．０、表１１）の均一なコンジ
ュゲーション生成物をもたらした。これらのＣｙｓ部位および薬物の組合せは、ＡＤＣを
作製するときに有利である。
【０３３６】
【表１２】
2018134080.tif 000113
【０３３７】
表１１中の４５種のＡＤＣ試料のサブセットを、様々なアッセイにおいて詳細に分析し
た：熱安定性を測定するために、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）を使用した。分析用サイ
ズ排除クロマトグラフ（ＡｎＳＥＣ）および多角光散乱（ＭＡＬＳ）を使用して、凝集率
を測定した。細胞生存性アッセイによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原依存性細胞殺滅効力を
測定し、薬物動態挙動をマウスにおいて測定した。一般に、多重Ｃｙｓ変異ＡＤＣは、単
一Ｃｙｓ変異ＡＤＣと同様の熱安定性を示した。ＡＤＣは主に、分析用サイズ排除クロマ
トグラフィーによって決定されるとおり、モノマーであった。
【実施例６】
【０３３８】
様々な化合物とコンジュゲートした抗ｃＫＩＴおよびトラスツズマブＣｙｓ変異ＡＤＣの
調製。
上記のとおり、複数のペイロードを使用して、トラスツズマブおよび抗ｃＫＩＴ  ｃｙ
ｓ変異抗体ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５ＣおよびＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｋ１０７Ｃの
抗体薬物コンジュゲートを調製した。これらのＡＤＣの特性の一部を表１２において示す
。これらのＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺滅効力を、実施例７において記載するとおり
に試験し、その結果を、表１３および表１４にまとめる。化合物を、実施例８において記
載するとおり、ナイーブなマウスにおいて薬物動態（ＰＫ）研究にさらにかけた。ＰＫ特
性を、表１５および表１６においてまとめる。
【０３３９】
【表１３】
2018134080.tif 000114
【実施例７】
【０３４０】
Ｃｙｓ変異ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺滅効力を測定するための細胞増殖アッセイ。
ＡＤＣの活性および効力をアッセイするために、ターゲット抗原を自然に発現する細胞
またはターゲット抗原を発現するように操作された細胞系が多くの場合に使用される。ｉ
ｎ  ｖｉｔｒｏでトラスツズマブＡＤＣの細胞殺滅効力を評価するために、２種の操作細
胞系、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６およびクローン４０、ならびにＨＣＣ１９５４細
胞を用いた（Gazdar A, Rabinovsky R, Yefenof E, Gordon B, Vitetta ES.  Breast Can
cer Res Treat. (2000) 61:217-228）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６細胞は、高いコ
ピー数（約５×１０５コピー／細胞）の組換えヒトＨｅｒ２を安定発現し、クローン４０
は、低いコピー数（約５×１０３コピー／細胞）のヒトＨｅｒ２を発現する。ＨＣＣ１９
５４細胞は、高レベル（約５×１０５コピー／細胞）のヒトＨｅｒ２を表面に内因性発現
する。抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣの細胞殺滅効力を決定するために、Ｈ５２６、ＫＵ８１２、Ｃ
ＭＫ１１−５、およびＪｕｒｋａｔ細胞を使用した。ＣＭＫ１１−５、Ｈ５２６、および
ＫＵ８１２細胞は、抗ｃＫＩＴ抗体の抗原を高レベルで細胞表面に発現するが、Ｊｕｒｋ
ａｔ細胞においては、検出可能な抗原発現は存在しない。抗原依存性細胞毒性作用は、細
胞表面に十分な抗原を発現する細胞のみを殺滅すべきであって、抗原を欠失した細胞は殺
滅すべきではない。細胞が様々な濃度のＡＤＣと共にインキュベートされてから５日後に
、細胞増殖アッセイはＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）で行わ
れた（Riss et al., (2004) Assay Drug Dev Technol. 2:51-62）。一部の研究では、細
胞ベースのアッセイはハイスループットであり、自動システムにおいて行われる（Melnic
k et al., (2006) Proc Natl Acad Sci U S A. 103:3153-3158）。
【０３４１】
トラスツズマブＣｙｓ変異ＡＤＣは、Ｈｅｒ２発現性ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６
およびＨＣＣ１９５４は特異的に殺滅したが、非常に低いレベルでＨｅｒ２を発現するＭ
ＤＡ−ＭＢ２３１クローン４０細胞は殺滅しなかった（表１３）。化合物Ｆと共に調製さ
れたトラスツズマブＡＤＣは、ＪｉｍＴ１細胞も殺滅した。トラスツズマブＣｙｓ変異Ａ
ＤＣのＩＣ５０は、細胞種によって、かつ使用した化合物に応じて変化した（表１３）。
同様に、抗ｃＫＩＴ  Ｃｙｓ変異ＡＤＣは、細胞増殖アッセイにおいて、抗原依存性細胞
殺滅を示した。抗ｃＫＩＴ  Ｃｙｓ−薬物ＡＤＣは、抗原発現性ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＫＵ
８１２、およびＣＭＫ１１５細胞を殺滅したが、抗原陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞は殺滅しなか
った。抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣのＩＣ５０は、使用した細胞種類および化合物で変化した（表
１４）。
【０３４２】
【表１４】
2018134080.tif 000115
【０３４３】
【表１５】
2018134080.tif 000116
【実施例８】
【０３４４】
Ｃｙｓ変異ＡＤＣの薬物動態研究。
長い血清半減期は、ＡＤＣの高いｉｎ  ｖｉｖｏ有効性について重要であることが実証
されている（Hamblett, et al., “Effects of drug loading on the antitumor activit
y of a monoclonal antibody drug conjugate,” Clin Cancer Res., 10:7063-7070 (200
4); Alley et al., Bioconjug Chem. 19:759-765 (2008)）。抗体への通常疎水性の薬物
ペイロードの付着は、抗体の特性にかなりの影響を及ぼし得、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで
のＡＤＣの急速なクリアランス（Hamblett et al., 2004）および不十分なｉｎ  ｖｉｖ
ｏ有効性をもたらし得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでの多重Ｃｙｓ−薬物ＡＤＣのクリアランスに
対する異なるコンジュゲーション部位の効果を評価するために、非腫瘍担持マウスにおけ
る薬物動態を実施した。マウス血漿中で薬物含有ＡＤＣを検出するために、抗ＭＭＡＦ抗
体を生成した。Ｇｙｒｏｓ（商標）プラットホーム上で、血漿からヒトＩｇＧ分子を捕捉
するための抗ヒトＩｇＧ（抗ｈＩｇＧ）、ならびに２つの別のアッセイにおいてシグナル
を発生させるための抗ヒトＩｇＧ（抗ｈＩｇＧ）抗体および抗ＭＭＡＦ抗体を使用して、
ＡＤＣを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイは開発された。下記でさらに詳細に論述する
とおり、その２つのＥＬＩＳＡアッセイは、抗体および「インタクト」なＡＤＣの血清濃
度をそれぞれ測定する。１群当たり３匹のマウスに、Ｃｙｓ  ＡＤＣの単回用量を１ｍｇ
／ｋｇで投与した。８つの血漿試料を３週間の経過中に収集し、上記のとおり、ＥＬＩＳ
Ａによってアッセイした。マウスに注射された材料と同じ材料を別々に使用して、各ＡＤ
Ｃについて、標準曲線を生成した。抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって測定すると、Ｃｙｓ
変異ＡＤＣ（表１５および１６）は、コンジュゲートしていない野生型抗体と同様の薬物
動態プロファイルを示し、これは、これらの部位における変異およびペイロードコンジュ
ゲーションが、抗体のクリアランスに著しい影響を及ぼさなかったことを示している。マ
ウス中において循環している間の、様々なＣｙｓ部位におけるマレイミドペイロードと抗
体との間の連結の化学的安定性を決定するために、抗ＭＭＡＦ  ＥＬＩＳＡアッセイによ
って測定されるＡＤＣ濃度および抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるＡ
ＤＣ濃度を、抗ＭＭＡＦ  ＥＬＩＳＡで容易に検出される化合物Ｆと共に調製されたＡＤ
Ｃについて相互に比較した（表１５および１６）。これらのＡＤＣでは、抗ＭＭＡＦ（Ａ
ＵＣ−ＭＭＡＦ）および抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（ＡＵＣ−ＩｇＧ）での測定から、血漿
中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）の値を算出した。同様の分析での先行する結果は、＞
２５％の不確実性を示唆している。薬物損失が生じなければ、その比は、１近くのままで
あるはずなので、比＞０．７は、測定の精度の範囲内で、マウスへの投与後に、化合物Ｆ
と共に調製されたトラスツズマブおよび抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣについて、僅かな薬物損失が
観察されたことを示している（表１５および１６）。
【０３４５】
ＡＤＣ薬物ペイロード、特に、抗ＭＭＡＦ  ＥＬＩＳＡによって検出不可能なペイロー
ド（化合物Ａ〜Ｅなど）の保持をさらに理解するために、試料を免疫沈降質量分析法（Ｉ
Ｐ−ＭＳ）によって分析した。特に、ＡＤＣを、排尿終末時血尿によって収集されたマウ
ス血清から親和性精製し、ＡＤＣに付着した薬物ペイロードをＭＳ分析によって分析した
。典型的なプロセスでは、血漿２００μｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する等量のＰＢ
Ｓで希釈した。希釈液に、親和性樹脂１０μｌ（ＩｇＧ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０９６９−０１；
５０％スラリー）を添加した。樹脂の沈降を回避するために穏やかな撹拌を適用すること
によって、希釈した血漿試料とのその樹脂のインキュベーションを室温で１時間行った。
次いで、樹脂を濾別し、ＰＢＳ２００μｌで２回洗浄した。抗体を脱グリコシル化するた
めに、ＰＢＳ  １０μｌで希釈したＰＮＧアーゼ  Ｆ１０μｌ（１ｍｇ／ｍＬ、１／２倍
ＴＢＳ  ｐＨ７．４、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０％グリセロール）を樹脂に添加し、混
合物を３７℃で２〜３時間インキュベートした。親和性樹脂をＰＢＳ  ２００μｌで２回
洗浄することによってＰＮＧアーゼ  Ｆを除去した後に、１％ギ酸２０μｌを添加し、樹
脂を濾別することによって、試料を親和性樹脂から２回溶離した。合わせた溶出液を、６
Ｍ塩酸グアニジン２０μｌおよび還元緩衝液５μｌ（０．６６Ｍ  ＴＣＥＰ、３．３Ｍ酢
酸アンモニウム、ｐＨ５）で希釈した。抗体を有効に還元するために、分析前に、試料を
室温で少なくとも３０分間インキュベートした。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ  ６５５０−ｉＦｕｎｎｅｌ  ＱＴＯＦ  ＭＳ／Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬ
Ｃシステムで、ＬＣＭＳを行った。試料を脱塩するために、標準的な逆相クロマトグラフ
ィーを０．５ｍｌ／分の流速、８０℃で、ＰＬＲＳカラム（８μｍ、２．１×５０ｍｍ、
１０００Å、Ａｇｉｌｅｎｔ）で使用した。ギ酸０．１％を含有する２０％〜６０％アセ
トニトリルの直線勾配（６分）を使用して、溶離を実施した。スペクトル記録の加工およ
びスペクトル逆重畳のために、Ａｇｉｌｅｎｔ定性分析を使用した。解析のために、すべ
ての関連種の溶離をカバーする時間間隔にわたって、スペクトル記録を合計した。合計し
たスペクトルを電荷状態において逆重畳し、逆重畳スペクトルの画像を記録した。ピーク
強度の値を、帰属可能な種について抽出した。解析される抗体の配列から算出された質量
の値、および薬物分子を含むコンジュゲートの予測された質量シフトに基づき、ＤＡＲ状
態および断片種の帰属を行った。分布全体で、すべてのＤＡＲ状態の相対ピーク高さを使
用して、平均ＤＡＲを算出した。２つの平均軽鎖および２つの平均重鎖からのＤＡＲの合
計として、平均抗体ＤＡＲを算出した。
【０３４６】
ＭＳによって測定される、３週間のマウス内循環後の血漿から精製されたＡＤＣの平均
ＤＡＲを、元のＡＤＣ製剤におけるＤＡＲと比較した。「ペイロード保持」（表１５およ
び１６）は、２つのＤＡＲの比から算出され（マウス血漿から単離されたＡＤＣのＤＡＲ
を元のＡＤＣ製剤のＤＡＲで割る）、３週間のマウス内循環後のＡＤＣに保持されている
ペイロードのパーセンテージを表す。ＭＳによって測定されるＡＤＣのペイロード保持は
主に、化合物Ｆと共に調製されたＡＤＣでの上述のＥＬＩＳＡアッセイによって得られる
結果と一致する（表１５および表１６）。データは、本明細書において記載のＣｙｓ  Ａ
ＤＣについて、３週間にわたるマウス内循環中の薬物−抗体連結の高い安定度を示す。
【０３４７】
【表１６】
2018134080.tif 000117
【０３４８】
【表１７】
2018134080.tif 000118
【実施例９】
【０３４９】
Ｅｇ５阻害剤とコンジュゲートしたトラスツズマブおよび抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣの調製。
部分的に還元された天然ジスルフィドとのコンジュゲーションによって、または天然リ
シン残基を介して作製されたＡＤＣよりも、操作Ｃｙｓ  ＡＤＣはマウスおよびラット動
物モデルにおいて良好に認容されると報告されている（Junutula et al.,(2008) Nat Bio
technol. 26(8):925-932）。操作Ｃｙｓ抗体を介してコンジュゲートされたＡＤＣと、部
分的に還元された天然ジスルフィド結合にコンジュゲートされたＡＤＣとの間の、ｉｎ  
ｖｉｖｏ有効性における差異を評価するために（Doronina et al.,(2003) Nat. Biotechn
ol. 21, 778-784）、トラスツズマブおよび抗ｃＫＩＴ抗体のＣｙｓ変異体を、２９３  
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞において発現させ、実施例４に記載のとおりに精製し、
実施例５において記載したとおりにＡＤＣを調製した。
【０３５０】
表５中のＥｇ５リンカー−ペイロード化合物Ａを、抗体の抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２
Ｃ−Ｓ３７５Ｃ二重変異体（ｃＫＩＴＢとも呼ばれ、そのイムノコンジュゲートは、ｃＫ
ｉｔ−Ｂ化合物ＡまたはｃＫｉｔＢ−５Ｂと呼ばれる）および抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｋ３６
０Ｃ−ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ二重変異体（ｃＫｉｔＣとも呼ばれ、イムノコンジュゲートは、
ｃＫｉｔＣ−化合物ＡまたはｃＫｉｔＣ−５Ｂと呼ばれる）、さらには、野生型抗ｃＫＩ
Ｔ  抗体（イムノコンジュゲートはｃＫｉｔＡ−化合物ＡまたはｃＫｉｔＡ−５Ｂとも呼
ばれる）にコンジュゲートした。（残基番号は、ＥＵ番号である）。抗体の定常領域の配
列を表１７に記載する。
【０３５１】
【表１８】
2018134080.tif 000119
【０３５２】
具体的には、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で抗体５ｍｇ／ｍｌを
０．３５ｍＭ化合物Ａと共に１時間インキュベートすることによって、再酸化抗体を化合
物Ａとコンジュゲートさせた。反応の完了をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、３．９
および４．０のＤＡＲをそれぞれｃＫｉｔＢおよびｃＫｉｔＣコンジュゲートについて得
た。ＤＡＲ測定をＭＳによってさらに検証した。ＡＤＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺滅ア
ッセイにおいて効力があることを示し、非腫瘍担持マウスにおいて、非コンジュゲート化
抗体と同様の薬物動態特性を有した。
【０３５３】
ｃＫｉｔＡの天然ジスルフィド結合にコンジュゲートした化合物Ａを有するＡＤＣを、
次のとおり、２ステッププロセスで調製した。２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中に５
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体を初めに、５０ｍＭ  メルカプトエチルアミン（固体とし
て添加）で３７℃で１時間、部分的に還元した。脱塩および１％ｗ／ｖ  ＰＳ−２０界面
活性剤の添加の後に、部分的に還元された抗体（１〜２ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＭＳＯ中に１
０ｍｇ／ｍｌで溶かした、抗体１０ｍｇ当たり０．５〜１ｍｇの量の化合物Ａと４℃で終
夜反応させた。ＡＤＣを、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。ＰＢＳで
のベースライン洗浄の後に、コンジュゲートを５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ２．７、１４０
ｍＭ  ＮａＣｌで溶離し、中和し、滅菌濾過した。平均ＤＡＲは３．２であった。
【０３５４】
【表１９】
2018134080.tif 000120
【０３５５】
同様に、ペイロードと、システイン置換を有する抗ｃＫＩＴおよびトラスツズマブ変異
抗体との次の組合せを含むイムノコンジュゲートを調製し、同じ方法によって特徴づけた
。操作された抗体は一貫して、抗体複合体１個当たり４個の付加システイン残基がすべて
ペイロードにコンジュゲートする場合に予測される負荷である、約４のＤＡＲを示したこ
とに注意されたい（表１８および１９）：
【０３５６】
【表２０】
2018134080.tif 000121
【実施例１０】
【０３５７】
Ｅｇ５阻害ペイロードで調製されたＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力およびｉｎ  ｖｉｖｏ
有効性。
イムノコンジュゲートを、抗ｃＫＩＴ抗体（ｃＫｉｔＡとも呼ばれる）および抗ｃＫＩ
Ｔ抗体のＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ  Ｃｙｓ−変異バージョン（ｃＫｉｔＢ）とコン
ジュゲートした、表５において示されているＥｇ５阻害リンカー−ペイロード化合物の各
々から調製した。抗ｃＫＩＴ（ｃＫｉｔＡ）野生型およびＣｙｓ置換変異体の定常領域は
、上記の表１７に記載されている。３．５〜４．０の薬物抗体比（ＤＡＲ）を有するコン
ジュゲートを、上記の方法によって各ペイロードについて調製した。イムノコンジュゲー
トを、ｃＫｉｔに対する抗体によって認識されると予測される細胞系における活性につい
て試験した。
【０３５８】
図２は、化合物Ａ、Ｂ、およびＣを含むＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ  Ｃｙｓ置換ｃ
ＫＩＴイムノコンジュゲートを含むイムノコンジュゲートによる、細胞増殖の阻害を示し
ている。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ｃＫＩＴ陰性細胞系であり、それら３種の抗ｃＫＩＴ（ｃ
ＫｉｔＡ）イムノコンジュゲートに対する感受性がなかった。しかしながら、ｃＫＩＴ陽
性細胞系であるＨ５２６細胞の増殖は、３種すべての抗ｃＫＩＴ（ｃＫｉｔＡ）コンジュ
ゲートによって、１００〜５００ｐＭの範囲のＩＣ５０で阻害された。Ｈ５２６細胞系が
、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究のための異種移植片モデルとして選択された。
【０３５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植片腫瘍モデルは、ヒトにおいて観察される生物学的活性を刺激
し、該当する十分に特徴づけられたヒト一次腫瘍または腫瘍細胞系を免疫不全ヌードマウ
スに移植することからなる。抗癌試薬での腫瘍異種移植片マウスの処置での研究は、試験
試薬のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に関して価値のある情報を提供している（Sausville and Bu
rger, (2006) Cancer Res. 66:3351-3354）。
【０３６０】
すべての動物研究を、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publ
ication; National Academy Press, 8thedition, 2001)に従って行った。Ｈ５２６細胞を
ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植した（Morton and Houghton, Nat Protoc. 2007;2:247-250
）。腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に達した後に、ＡＤＣを、単回用量で静脈内注射によっ
て、マウスに投与した。ＡＤＣ注射後に、腫瘍成長を定期的に測定した。そのようなｉｎ
ｖｉｖｏ有効性研究の例を図３において示す。
【０３６１】
図３には、システイン操作抗ｃＫＩＴ抗体、すなわち、抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ
−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ（ｃＫｉｔＢ−５Ｂ）および抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−Ｌ
Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−化合物Ａ（ｃＫｉｔＣ−５Ｂ）で作製された２種のＡＤＣの活性をまと
めているが、これらは、５ｍｇ／ｋｇ（図３Ａ）および１０ｍｇ／ｋｇ（図３Ｂ）の用量
でマウスにおいてＨ５２６腫瘍異種移植片の増殖を阻害した。部分的還元によって野生型
抗体で調製された抗ｃＫＩＴ−化合物Ａ（ｃＫｉｔＡ−５Ｂ）は、より低いＤＡＲのため
、モルペイロード用量にマッチさせるためにより高用量で投与された。各試験ＡＤＣにつ
いて、１群当たり６匹のマウスに注射した。いずれの群においても、ＡＤＣ処置と関連し
て、有意な体重減少は観察されず、これは、低い全身毒性を示唆した。
【０３６２】
化合物Ａのシステイン操作抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣは、野生型抗体の抗ｃＫＩＴ−化合物Ａ
（ｃＫｉｔＡ−５Ｂ）の部分的還元によって調製されたＡＤＣよりも活性であった。した
がって、Ｅｇ５阻害剤のイムノコンジュゲートは、非修飾抗体を含む様々なｃＫｉｔ抗体
と共に活性であったが、これは、新たなシステイン残基を定常領域に導入するタンパク質
操作およびペイロード／リンカー基のための付着点としての新たなシステイン残基の使用
によって、改善されたイムノコンジュゲートが得られ得ることを実証している。
【０３６３】
Ｃｙｓ置換ｃＫｉｔＡイムノコンジュゲートも、マウス異種移植片モデルにおいて試験
した。インプラント後の腫瘍体積によって測定した場合、両方のＣｙｓ置換イムノコンジ
ュゲートが、非置換イムノコンジュゲートよりも高い活性を示した。
【実施例１１】
【０３６４】
マウスでのＨｅｒ２陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１クローン１６乳癌モデルにおける、Ｅｇ５
阻害剤とコンジュゲートした抗Ｈｅｒ２  ＡＤＣの用量依存性ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
トラスツズマブＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ  Ｃｙｓ変異抗体をＥｇ５阻害剤化合物
Ａとコンジュゲートさせることによって調製された抗Ｈｅｒ２  ＡＤＣトラスツズマブ−
ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａの抗腫瘍有効性を、Ｈｅｒ２陽性ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１  ＨＥＲ２クローン１６乳癌異種移植片モデルにおいて評価した。雌の無胸腺ヌ
ードＦｏｘｎ１マウスに、５×１０６細胞を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中
の５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を皮下移植した。
懸濁液中に細胞を含有する注射の全体積は、２００μｌであった。マウスを、腫瘍細胞の
移植から１３日後に、約２２０ｍｍ３の平均腫瘍体積で研究に登録した。８群（ｎ＝５／
群）の１つに無作為に割り当てた後に、マウスに、単回静脈内用量のＰＢＳ、非特異的ア
イソタイプ対照−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）、または
トラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ（２．５、５、または１０ｍ
ｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積（図４）および体重を週に少なくとも２回測定した。
【０３６５】
腫瘍細胞の移植後４０日目に、トラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合
物Ａ  ２．５ｍｇ／ｋｇの単回投与で処置されたマウスは、ビヒクル対照（Ｔ／Ｃ）と比
較して、８．２２％の腫瘍体積のパーセント平均変化を示す腫瘍を有した。トラスツズマ
ブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ  ５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの単
回投与で処置されたマウスは、それぞれ７４．１４％および７６．３５％の体積の退縮を
示した腫瘍を有し、それらは両方とも、ビヒクル単独および非特異的アイソタイプＡＤＣ
対照とは統計的に異なった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ事後検定）。その処
置は、すべての用量レベルにおいて忍容性が良好であった。
【０３６６】
【表２１】
2018134080.tif 000122
【実施例１２】
【０３６７】
Ｈｅｒ２陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌異種移植片マウスモデルにおける、Ｅｇ５阻
害剤とコンジュゲートした抗Ｈｅｒ２  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。
抗Ｈｅｒ２トラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ  ＡＤＣの抗腫
瘍有効性をＨｅｒ２陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌異種移植片モデルにおいても評価
した。雌のＳＣＩＤベージュマウスに、５×１０６細胞を含有するリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）中の５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を皮
下移植した。懸濁液中に細胞を含有する注射の全体積は、２００μｌであった。マウスを
、腫瘍細胞の移植から７日後に、約１６８ｍｍ３〜２１６ｍｍ３の腫瘍体積で研究に登録
した。４群（ｎ＝６／群）の１つに無作為に割り当てた後に、マウスに、単回静脈内用量
のＰＢＳ、非特異的アイソタイプ対照−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ（１０
ｍｇ／ｋｇ）、またはトラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ（１０
ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積（図５）および体重を週に少なくとも２回測定した。
【０３６８】
移植後４５日目に、トラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ（１０
ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスは、７１．２％の体積の退縮を示す腫瘍を有し、これは
、ビヒクル単独および非特異的アイソタイプＡＤＣ対照とは統計的に異なった（ｐ＜０．
０５、ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ事後検定）。その処置は、すべての用量レベルにおいて忍
容性が良好であった。
【０３６９】
【表２２】
2018134080.tif 000123
【実施例１３】
【０３７０】
Ｈｅｒ２陽性ＨＣＣ１９５４ヒト乳癌異種移植片マウスモデルにおける、Ｅｇ５阻害剤と
コンジュゲートした抗Ｈｅｒ２  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。
抗Ｈｅｒ２  トラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ  ＡＤＣの抗
腫瘍有効性をＨｅｒ２陽性ＨＣＣ１９５４乳癌異種移植片モデルにおいても評価した。雌
の無胸腺ヌードＦｏｘｎ１マウスに、５×１０６細胞を含有するリン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ）中の５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を皮下
移植した。懸濁液中に細胞を含有する注射の全体積は、２００μｌであった。マウスを、
移植から１１日後に、約１４８ｍｍ３〜２１６ｍｍ３の腫瘍体積で研究に登録した。４群
（ｎ＝６／群）の１つに無作為に割り当てた後に、マウスに、単回静脈内用量のＰＢＳ、
非特異的アイソタイプ対照−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ
）、またはトラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ
）を投与した。腫瘍体積（図６）および体重を週に少なくとも２回測定した。
【０３７１】
移植後４５日目に、トラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７２Ｃ−化合物Ａ（１０
ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスは、６３．０％の体積の退縮を示す腫瘍を有し、これは
、ビヒクル単独および非特異的アイソタイプＡＤＣ対照とは統計的に異なった（ｐ＜０．
０５、ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ事後検定）。その処置は、すべての用量レベルにおいて忍
容性が良好であった。
【０３７２】
【表２３】
2018134080.tif 000124
【実施例１４】
【０３７３】
抗ｃＫＩＴ  Ｃｙｓ変異ＡＤＣと、非操作抗体の部分的還元によって調製されたＡＤＣと
を比較するｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究。
２種の抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣ：抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ｆお
よび抗ｃＫＩＴ−化合物Ｆのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を、Ｈ５２６異種移植片マウスモデル
において比較した（図７）。２種のＡＤＣを同じペイロードで調製し、化合物Ｆ（表５）
は、２つの異なる方法を使用して異なるＣｙｓ部位にコンジュゲートされた。コンジュゲ
ートの抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ｆを、実施例５において記載
したとおり、Ｃｙｓ変異抗体で調製し、その場合、化合物Ｆは、操作Ｃｙｓ残基、ＨＣ−
Ｅ１５２ＣおよびＨＣ−Ｓ３７５Ｃにコンジュゲートした。実施例９に記載の部分的還元
方法を、野生型抗ｃＫＩＴ抗体に適用することによって、コンジュゲート抗ｃＫＩＴ−化
合物Ｆを調製し、その場合、化合物Ｆは、天然Ｃｙｓ残基にコンジュゲートした。抗ｃＫ
ＩＴ−化合物Ｆは、抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ｆ（ＤＡＲ３．
９、０．６％凝集率）よりもやや高いＤＡＲ（ＤＡＲ４．６）および凝集（２．９％率）
を有した。非腫瘍担持マウスにおける薬物動態研究は、２種のＡＤＣが、３週間のマウス
内循環の間に、同じペイロードを非常に異なる程度で保持することを示し、ＥＬＩＳＡに
よって示されるとおり（図８Ａ、図８Ｂ）、かつＩＰ−ＭＳによって決定されるとおり（
実施例８を参照されたい）、抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ｆは、
抗ｃＫＩＴ−化合物Ｆ（２０％）よりもかなり良好なペイロード保持（５６％）を示した
。
【０３７４】
Ｈ５２６異種移植片モデルでは、同じ投薬量の抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７
５Ｃ−化合物Ｆが、抗ｃＫＩＴ−化合物Ｆよりも腫瘍の阻害において有効である（図７）
。その抗原がＨ５２６細胞において発現されない抗Ｈｅｒ２−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７
５Ｃ−化合物Ｆ（特性については表１２を参照されたい）は、対照として含まれ、どのよ
うな腫瘍阻害活性も示さなかった。
【実施例１５】
【０３７５】
異なる部位において化合物Ｆおよび化合物Ａとコンジュゲートしている抗ｃＫＩＴ  Ｃｙ
ｓ変異ＡＤＣを比較するｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究。
別の実施例では、抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−化合物Ｆ、抗ｃＫＩＴ
−ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−化合物Ｆ、抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ
３７５Ｃ−化合物Ａ、および抗ｃＫＩＴ−ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−化合物
ＡのＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を、Ｈ５２６異種移植片モデルにおいて比較した（図
９）。実施例７において記載したとおりの２種の異なる抗体を使用して、２種のペイロー
ド、化合物Ｆおよび化合物Ａを異なるＣｙｓ部位にコンジュゲートさせた。ＡＤＣの特性
を表１２にまとめる。ＤＡＲ測定値は、４種のコンジュゲートすべてについて、４の理論
ＤＡＲに近似し、僅かな凝集が、得られたＡＤＣで観察された（表１２）。単回用量のＡ
ＤＣ  ３．５ｍｇ／ｋｇを、Ｈ５２６腫瘍を担持する動物に静脈内注射した。Ｈ５２６異
種移植片モデルにおける腫瘍体積の測定結果を図９において示す。このモデルにおいて、
同じ投薬量の抗ｃＫＩＴ−化合物Ｆ  ＡＤＣは、化合物Ａで調製されたＡＤＣよりも腫瘍
の阻害において有効であった。Ｃｙｓ変異体の２つの異なるセットにコンジュゲートした
ＡＤＣの間で、腫瘍阻害活性に統計的に有意な差はなかった。
【実施例１６】
【０３７６】
化合物ＧとコンジュゲートしたトラスツズマブＡＤＣの疎水性。
２、４、６以上のＤＡＲを有するＡＤＣの調製についてＣｙｓ変異および変異の組合せ
の選択をさらに最適化するために、トラスツズマブＣｙｓ変異ＡＤＣの特性を、疎水性に
関して分析した。化合物Ｇ（ＭＣ−ＭＭＡＦ）とコンジュゲートしたＣｙｓ変異ＡＤＣを
上記のとおり調製した。記載のとおりに実験的に決定した最終ＤＡＲは概して目標に近く
、下記の表２３に列記する。これらのＡＤＣの疎水性を、下記のとおり、疎水性相互作用
クロマトグラフィーによって測定した。
【０３７７】
Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＬＣシステム（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）
に取り付けられたＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ
、ＰＡ、ＵＳＡ）ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ、
２．５μｍ）を使用して、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣでの分析ＨＩＣデー
タを収集した。方法は、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１．５Ｍ  硫酸アンモニ
ウム、ｐＨ６．０）および緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１５％イソプロパノー
ル、ｐＨ６．０）の二成分勾配からなった。抗体約２０μｇ（ＰＢＳ）を０．５体積の３
Ｍ  硫酸アンモニウムで希釈することによって、試料を調製した。勾配は、１００％Ａで
の５分保持、続いて、３０分かけての０〜１００％Ｂの直線勾配、５分かけての１００％
Ａへの戻し、最後に、次の注入前に１０分間の当初条件での再平衡化からなった。分離を
、２８０ｎｍでのＵＶ吸収によってモニターし、Ｃｈｒｏｍｅｌｉｏｎソフトウェア（Ｄ
ｉｏｎｅｘ）を使用して分析した。
【０３７８】
意外にも、唯一の差違は化合物Ｇ付着の部位であるが、ＤＡＲ  ４  ＡＤＣの保持時間
が大きく変化したことが観察された。加えて、保持時間の範囲は、比較のために含まれた
ＤＡＲ  ２  ＡＤＣで観察された範囲と実質的に重なった（表２３）。ＨＩＣは、疎水性
に基づき分子を分離する。すべてのＤＡＲ  ２  ＡＤＣは、化合物Ｇなどの疎水性薬物分
子が抗体に付着した場合に予測される非コンジュゲート化抗体（保持時間＝４５分）のＨ
ＩＣ保持時間よりも長いＨＩＣ保持時間を有する。しかしながら、異なる部位におけるペ
イロードの付着は、ＡＤＣの疎水性を様々な程度に上昇させる。
【０３７９】
【表２４】
2018134080.tif 000125
【０３８０】
意外にも大きな保持時間の差は、抗体の構造上の付着部位の場所を検査することで、合
理化され得、薬物ペイロードが、抗体の外側の露出部位において、例えばＨＣ−Ｐ２４７
Ｃにおいて付着していると、保持時間は比較的長く、その場合、ほぼ１９分の保持時間が
測定された。逆に、ペイロードが、内部部位、例えば、可変ドメインとＣＨ１ドメインと
の間に形成されるキャビティ（例えば、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）または抗体のＣＨ２ドメイン
とＣＨ３ドメインとの間の大きな開口部（例えば、ＨＣ−Ｐ３９６Ｃ）において付着して
いると、ペイロードが、溶媒およびＨＩＣカラムとの相互作用から部分的に隔離されてい
るので、ＨＩＣ保持時間は、１６分未満である。同様に、２個の相対的に内部の部位（例
えば、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｐ３９６ＣおよびＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）を含むＤＡ
Ｒ  ４  ＡＤＣでは、保持時間は１５．５〜１６．５分程度で、短いままである一方で、
非常に露出している部位を含むＤＡＲ  ４  ＡＤＣ（例えば、ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−ＨＣ−
Ｋ３６０Ｃ）は、２１分超の保持時間を示し得る。
【０３８１】
ＡＤＣを含むタンパク質薬物の疎水性を低下させることは一般に、凝集および循環から
のクリアランスを低下させ得るので、有利であると考えられる。溶媒相互作用から隔離さ
れていて、付着が、薬物付着の際に抗体の疎水性を最小限上昇させる部位で薬物ペイロー
ドをコンジュゲートさせることは、コンジュゲーション化学およびペイロード群とは独立
に有利であるはずである。疎水性の最小限の変化をもたらす付着部位を慎重に選択するこ
とは、１個の抗体当たり４、６以上の薬物を付着させる場合か、または特に疎水性のペイ
ロードを使用する場合に特に有利であり得る。
【実施例１７】
【０３８２】
様々な化合物とコンジュゲートした抗Ｈｅｒ２  Ｃｙｓ変異ＡＤＣの疎水性。
実施例７において調製したトラスツズマブ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃおよびトラ
スツズマブ−ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ  ＡＤＣのサブセット（特性について
は表１２を参照されたい）を、下記で詳細に記載するとおりの疎水性相互作用クロマトグ
ラフィーによっても特徴づけた（表２４）。露出したＣｙｓ残基の組合せにコンジュゲー
トしたＡＤＣ（ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ位）は、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７
５Ｃ抗体に付着した薬物を含むＡＤＣよりも疎水性である。その作用は、細胞毒性ペプチ
ドの化合物Ｆと比較して、Ｅｇ５阻害剤ペイロードの化合物Ａおよび化合物Ｃについて、
より顕著である。
【０３８３】
実施例１６において論述したとおり、溶媒相互作用から隔離された部位、例えば、ＨＣ
−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃにおける薬物の付着は、より溶媒に露出した位置、例えば、Ｈ
Ｃ−Ｋ３６０ＣおよびＬＣ−Ｋ１０７Ｃにおいて付着している場合よりも、僅かな程度で
、抗体の疎水性を上昇させるようである。多くの用途について、特に、疎水性ペイロード
の付着では有利であるが、より溶媒露出した位置におけるペイロードのコンジュゲーショ
ンが、他の用途において有利な有用性を有するはずである。
【０３８４】
【表２５】
2018134080.tif 000126
【０３８５】
本明細書において記載の例および実施形態が、例示を目的としたものに過ぎず、それら
を考慮した様々な変更または変化が当業者に示唆され、それらが本出願の意図および趣旨
の範囲内、ならびに添付の請求項の範囲内に含まれることは理解されるであろう。
【図１】
2018134080.tif 000128
【図２】
2018134080.tif 000129
【図３−１】
2018134080.tif 000130
【図３−２】
2018134080.tif 000131
【図４】
2018134080.tif 000132
【図５】
2018134080.tif 000133
【図６】
2018134080.tif 000134
【図７】
2018134080.tif 000135
【図８−１】
2018134080.tif 000136
【図８−２】
2018134080.tif 000137
【図９】
2018134080.tif 000138
【配列表】
2018134080000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月4日(2018.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記述された発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８５】
本明細書において記載の例および実施形態が、例示を目的としたものに過ぎず、それら
を考慮した様々な変更または変化が当業者に示唆され、それらが本出願の意図および趣旨
の範囲内、ならびに添付の請求項の範囲内に含まれることは理解されるであろう。
本願発明は以下の態様を含み得る。
［１］
修飾抗体またはその抗体断片を含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体また
は抗体断片が、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステインでの置換の組合せを含
み、前記組合せが抗体重鎖の３６０位、および抗体カッパ軽鎖の１０７位から選択される
置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、イムノコンジ
ュゲート。
［２］
修飾抗体またはその抗体断片を含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体また
は抗体断片が、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステインでの置換の組合せを含
み、前記組合せが抗体重鎖の１５２位および３７５位から選択される置換を含み、前記位
置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、イムノコンジュゲート。
［３］
配列番号４８の重鎖定常領域および配列番号６１を含むカッパ軽鎖定常領域を含む修飾
抗体またはその抗体断片を含む、イムノコンジュゲート。
［４］
配列番号１３１の重鎖定常領域を含む修飾抗体またはその抗体断片を含む、イムノコン
ジュゲート。
［５］
薬物部分をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
［６］
薬物抗体比が約４である、請求項１から５のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
［７］
薬物部分が、前記システインの硫黄および任意選択のリンカーを介して前記修飾抗体ま
たは抗体断片に付着している、請求項１から６のいずれかに記載のイムノコンジュゲート
。
［８］
前記薬物部分が、開裂性または非開裂性リンカーを介して前記システインの前記硫黄に
接続している、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
［９］
前記薬物部分が、非開裂性リンカーを介して前記システインの前記硫黄に接続している
、請求項８に記載のイムノコンジュゲート。
［１０］
チオール−マレイミド連結を含む、請求項７から９に記載のイムノコンジュゲート。
［１１］
−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−連結またはジスルフィド連結を含む、請求項１０に記載の
イムノコンジュゲート。
［１２］
前記薬物部分が細胞毒性薬剤である、請求項１１に記載のイムノコンジュゲート。
［１３］
前記薬物部分が、タキサン、ＤＮＡ−アルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）
、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチン
Ｅ、オーリスタチンＦ、マイタンシノイド、およびＥｇ５阻害剤からなる群から選択され
る、請求項１２に記載のイムノコンジュゲート。
［１４］
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から１３のいずれかに記載のイムノコ
ンジュゲート。
［１５］
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１から１３のいずれかに記載のイムノコンジュゲ
ート。
［１６］
前記抗体がヒト化または完全ヒト抗体である、請求項１から１３に記載のイムノコンジ
ュゲート。
［１７］
前記抗体が、二重特異性または多重特異性抗体である、請求項１４から１６のいずれか
に記載のイムノコンジュゲート。
［１８］
前記抗体または抗体断片が、腫瘍上の細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項１
から１７のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
［１９］
請求項１から１８のいずれかに記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
［２０］
少なくとも１個のＰｃｌもしくは非天然アミノ酸置換または酵素媒介性コンジュゲーシ
ョン用のペプチドタグ、および／あるいはそれらの組合せをさらに含む、請求項１から１
９のいずれかに記載の修飾抗体または抗体断片。
［２１］
請求項１から４のいずれかに記載の修飾抗体または抗体断片をコードする核酸。
［２２］
請求項２１に記載の核酸を含む宿主細胞。
［２３］
修飾抗体または抗体断片を製造する方法であって、請求項２２に記載の宿主細胞を、前
記抗体または抗体断片を発現させるのに適した条件下でインキュベートすることと、前記
抗体または抗体断片を単離することとを含む、方法。
［２４］
イムノコンジュゲートを製造する方法であって、リンカーユニット（ＬＵ）またはリン
カーユニット−ペイロードの組合せ（−ＬＵ−Ｘ）を、請求項１から４のいずれかに記載
の抗体または抗体断片中のシステイン残基に付着させることを含む、方法。
［２５］
前記イムノコンジュゲートが、式（Ｉ）：
【化６４】
2018134080.tif 000139
［式中、Ａｂは、本明細書において記載の好ましいシステイン置換部位の１つに、少なく
とも１個のシステイン残基を含む抗体または抗体断片を表し；
ＬＵは、本明細書において記載のリンカーユニットであり；
Ｘは、ペイロードまたは薬物部分であり；
ｎは、１〜１６の整数である］のイムノコンジュゲートである、請求項２４に記載の方
法。
［２６］
修飾抗体またはその抗体断片であって、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステ
インでの置換の組合せを含み、前記組合せが抗体重鎖の３６０位、および抗体カッパ軽鎖
の１０７位から選択される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリング
されている、修飾抗体またはその抗体断片。
［２７］
修飾抗体またはその抗体断片であって、その定常領域上の２個以上のアミノ酸のシステ
インでの置換の組合せを含み、前記組合せが抗体重鎖の１５２位および３７５位から選択
される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに従ってナンバリングされている、修飾抗
体またはその抗体断片。
［２８］
配列番号４８の重鎖定常領域および配列番号６１を含むカッパ軽鎖定常領域を含む、修
飾抗体またはその抗体断片。
［２９］
配列番号１３１の重鎖定常領域を含む、修飾抗体またはその抗体断片。
【外国語明細書】
2018134080000001.pdf