(57)【要約】【課題】初発自己免疫性糖尿病を予防するため、および／または逆転させるためのマイクロスフェアに基づく組成物の提供。【解決手段】ｉｎ  ｖｉｖｏで自己免疫性糖尿病の状態を逆転および／または遅らせるためにアンチセンス法を用いることを含む方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、一次転写産物ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびそれらの組合せを標的とし、かつ結合する。本開示の一態様では、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６転写産物を標的とする３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドが合成され、このオリゴヌクレオチド混合物の水溶液が調製され、水性ポリマー溶液と混合される。このオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアが形成され、これらは、注射によってＮＯＤマウスに送達される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法またはプロセスまたは薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって付与された助成金第Ｒ２１  ＤＫ４９８３５−０１号の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
この出願は、２００８年４月１８日に出願された米国仮出願第６１／０４６，０３４号および２００８年４月２８日に出願された米国仮出願第６１／０４８，２４６号の利益を主張する。上記出願の各々の本文全体は、参考として本明細書に援用される。
【０００３】
背景
本開示は、全体として、ＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病の状態を予防するため、および／または逆転させるためのアンチセンス法に関する。このアンチセンス法は、特に非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおける負の調節活性を引き起こす治療効果を達成するための注射によるＡＳ−オリゴヌクレオチドのマイクロスフェア送達を含む。マイクロスフェアは、マイクロスフェアが１つまたは複数のアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドを取り込む完全に水性の条件を用いて形成される。
【背景技術】
【０００４】
微小粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルは、１ｍｍ未満、場合によっては１００μｍ未満としてもよい直径を有する固体または半固体粒子であり、これらは、合成ポリマー、タンパク質、および多糖を含む様々な材料から形成することができる。マイクロスフェアは、多くの異なる用途、主に分離、診断、および薬物送達に使用されている。
【０００５】
相分離、溶媒の蒸発、乳化、および噴霧乾燥を含む多数の異なる技術を用いて、合成ポリマー、天然ポリマー、タンパク質、および多糖からこれらの粒子を形成することができる。一般的には、ポリマーが、これらのマイクロスフェアの支持構造を形成し、目的の薬物が、ポリマー構造内に組み込まれる。マイクロスフェアの形成に使用される例示的なポリマーとして、Ｒｕｉｚの特許文献１、Ｒｅｉｄらの特許文献２、Ｔｉｃｅらの特許文献３、Ｔｉｃｅらの特許文献４、Ｔｉｃｅらの特許文献５、Ｓｉｎｇｈらの特許文献６、Ｂｏｙｅｓらの特許文献７、Ｔｉｃｅらの特許文献８、およびＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの欧州特許出願公開第２４８，５３１号に記載されている乳酸とグリコール酸とのホモポリマーおよびコポリマー（ＰＬＧＡ）；Ｉｌｌｕｍの特許文献９に記載されているＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０８およびポロキサマー４０７などのブロックコポリマー；ならびにＣｏｈｅｎらの特許文献１０に記載されているポリホスファゼンが挙げられる。これらのようなポリマーを用いて製造されるマイクロスフェアは、低い組み込み効率（ｌｏａｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を示し、しばしば、目的の薬物を僅かなパーセンテージでしかポリマー構造内に組み込むことができない。従って、治療効果を達成するためには、しばしば、相当な量のこれらのタイプのマイクロスフェアを投与しなければならない。加えて、これらのポリマーは、典型的には、疎水性であり、目的の薬物の溶解に負の影響を与える。この文脈で典型的に使用されるポリマーには、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，２１３，８１２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４１７，９８６号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５３０，８４０号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８９７，２６８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，０７５，１０９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１０２，８７２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３８４，１３３号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６０，６１０号明細書
【特許文献９】米国特許第４，９０４，４７９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，１４９，５４３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
医学界の目標は、糖尿病を含む様々な疾患の処置のために動物の細胞に核酸を送達することである。多くの方法では、トランスフェクション剤の添加で比較的効率的に核酸を培地の細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）に送達することができる。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、内因性ヌクレアーゼの存在により、核酸が動物に送達されると核酸が高い速度で分解されてしまう。
【０００８】
核酸をヌクレアーゼ消化から保護するのに加えて、核酸送達ビヒクルは、毒性が低くなければならず、細胞によって効率的に取り込まれなければならず、明確に規定された容易に製造できる処方を有さなければならない。臨床試験で示されているように、送達用のウイルスベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで重度に有害で、致命的でさえある免疫応答を引き起こし得る。加えて、この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで変異促進性効果を有する可能性がある。様々な処方の脂質複合体（リポソームまたは陽イオン性脂質複合体など）中に核酸を複合体化することによる送達は、有毒作用を有し得る。様々なポリマーまたはペプチドと核酸との複合体は、一貫していない結果を示し、これらの処方物の毒性は、未だに解決されていない。また、核酸は、送達のためにポリマーマトリックス内に被包化されてきたが、このような場合、粒子は、広いサイズ範囲を有し、治療用途としての有効性がまだ実証されていない。これらのこれまでの方法は、免疫系の刺激を含め、本明細書で望まれる目標とは反対の効果をもたらし得る。例えば、ＰＬＧＡが粒子内に組み込まれると、免疫系は、ＰＬＧＡの存在によって刺激される。
【０００９】
従って、核酸の送達の問題に取り組む必要があり、マイクロスフェアおよびマイクロスフェアを製造するための新たな方法を開発する必要が現在もある。マイクロスフェアについての詳細、特にマイクロスフェアの調製および特性についての詳細は、Ｓｃｏｔｔらの米国特許第６，４５８，３８７号、Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌｏらの同第６，２６８，０５３号、同第６，０９０，９２５号、同第５，９８１，７１９号、および同第５，５９９，７１９号、Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌｏの同第５，５７８，７０９号、ならびにＢｒｏｗｎらの米国特許出願公開第２００６／００２４２４０号に記載されている。これらおよび本明細書で言及するすべての参照文献は、本明細書での参考として本明細書に援用される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示によると、オリゴヌクレオチドが、マイクロスフェアとして送達される。このような送達方法は、マイクロスフェア内の核酸へのヌクレアーゼのアクセスを防止すると考えられる。アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドのマイクロスフェア送達は、特にＮＯＤマウスモデルにおいて樹状細胞寛容を誘導するために行われる。マイクロスフェアは、アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドが組み込まれるように水性条件を用いて形成される。これらのマイクロスフェアは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＯＤマウスにおける遺伝子発現を阻害して自己免疫性糖尿病の状態を予防するため、および／または逆転させるために用いられる。
【００１１】
本開示の一態様では、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６転写産物を標的とする３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドが合成され、このオリゴヌクレオチド混合物の水溶液が調製され、水性ポリマー溶液と混合される。このオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアが形成され、これらは、注射によってＮＯＤマウスに送達される。
【００１２】
本開示の一態様では、哺乳動物の１型糖尿病を逆転させるための方法が提供され、この方法は、マイクロスフェア組成物を投与するステップを含み、組成物中のマイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３、およびそれらの組合せ、またはＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を標的とする実にあらゆる他のオリゴヌクレオチドからなる群より選択することができる。
【００１３】
別の態様では、哺乳動物の１型糖尿病を処置する、または逆転させる方法が提供され、この方法は、１型糖尿病を処置するため、または逆転させるために有効な量のマイクロスフェアを含む組成物を投与するステップを含み、前記マイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物からなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
本開示の別の態様は、自己免疫破壊から哺乳動物の膵臓のβ細胞を保護する方法に関し、この方法は、マイクロスフェア組成物を哺乳動物に注射するステップを含み、組成物中のマイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含む。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、自己免疫破壊から哺乳動物の膵臓β細胞を保護するための方法であり、この方法は、膵臓β細胞を保護するために有効な量のマイクロスフェアを含む組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含み、前記マイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
別の態様は、哺乳動物におけるＴ細胞媒介性の膵臓の炎症および／または膵臓β細胞死を減少させる方法であり、この方法は、マイクロスフェア組成物を哺乳動物に投与するステップを含み、組成物中のマイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、組成物は、哺乳動物の１型糖尿病の症状を緩和するために有効な量で投与される。より明確な態様では、組成物は、１型糖尿病の臨床的発症の後に投与される。別の態様では、組成物は、１型糖尿病の臨床的発症の前に投与される。これらの治療の態様では、組成物の投与は、投与前の哺乳動物の血糖値と比較して、哺乳動物の血糖値を正常化する。
【００１７】
さらに別の態様は、哺乳動物におけるＴ細胞媒介性の膵臓の炎症または膵臓β細胞死を減少させる方法であり、この方法は、Ｔ細胞媒介性の膵臓の炎症または膵臓β細胞死を減少させるために有効な量のマイクロスフェアを含む組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含み、前記組成物中の前記マイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
本発明の別の態様では、初発自己免疫性糖尿病（ｎｅｗ−ｏｎｓｅｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）または前臨床自己免疫性糖尿病（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）を有する哺乳動物における残存β細胞集団（ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）を維持する方法が提供され、この方法は、残存β細胞集団を維持するために有効な量のマイクロスフェアを含む組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含み、前記組成物の投与は、哺乳動物のβ細胞集団を糖尿病発症前に存在した集団の少なくとも約１５％まで維持し、前記組成物中の前記マイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
組成物の投与は、哺乳動物のβ細胞集団を再生し得るか、またはβ細胞集団のさらなる劣化を食い止め得るか、またはこれらの両方をなし得る。
【００２０】
組成物は、任意の形態で投与され得、特定の例示的な態様では、注射可能な形態として投与される。特定の態様では、組成物は、インスリンと併用投与される。併用療法が用いられる場合、インスリンは、マイクロスフェア組成物の投与の前、投与と同時、または投与の後に投与され得る。
【００２１】
様々な実施形態では、組成物中のマイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、組成物中のマイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７のポリヌクレオチドからなる。更なる実施形態では、組成物中のマイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％以上のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する。
【００２２】
更なる態様は、初発自己免疫性糖尿病または前臨床自己免疫性糖尿病を有する対象における残存β細胞集団を維持する方法に関し、この方法は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアを含有する組成物を対象に投与するステップを含み、組成物の投与は、哺乳動物のβ細胞集団を糖尿病発症前に存在した集団の少なくとも約１５％まで維持する。この対象は、ヒト対象としてもよい。対象は、ヒトの子供としてもよい。この処置方法は、組成物の反復投与を伴ってもよく、反復投与は、哺乳動物のβ細胞集団を増加させる。
【００２３】
特定の規定された方法では、マイクロスフェアの３０％および７０％ｗ／ｗもがオリゴヌクレオチドである。このような組成物は、典型的には、１：１：１のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６のマイクロスフェア組成物中の比を含み得る。
【００２４】
さらなる実施形態では、マイクロスフェアを含む医薬組成物が提供され、前記マイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示されているポリヌクレオチド配列か、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも７５％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合するポリヌクレオチド配列か、またはＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型を有する。これらの実施形態の一部の態様では、マイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９５％超のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する。
本発明の特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
哺乳動物の１型糖尿病を処置する、または逆転させる方法であって、前記方法は、１型糖尿病を処置するため、または逆転させるために有効な量のマイクロスフェアを含む組成物を投与するステップを含み、前記マイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物からなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目２）
自己免疫破壊から哺乳動物の膵臓β細胞を保護するための方法であって、前記方法は、膵臓β細胞を保護するために有効な量のマイクロスフェアを含む組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含み、前記マイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３）
哺乳動物におけるＴ細胞媒介性の膵臓の炎症または膵臓β細胞死を減少させる方法であって、前記方法は、Ｔ細胞媒介性の膵臓の炎症または膵臓β細胞死を減少させるために有効な量のマイクロスフェアを含む組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含み、前記組成物中の前記マイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目４）
初発自己免疫性糖尿病または前臨床自己免疫性糖尿病を有する哺乳動物における残存β細胞集団を維持する方法であって、前記方法は、残存β細胞集団を維持するために有効な量のマイクロスフェアを含む組成物を前記哺乳動物に投与するステップを含み、前記組成物の投与は、前記哺乳動物の前記β細胞集団を糖尿病発症前に存在した集団の少なくとも約１５％まで維持し、前記組成物中の前記マイクロスフェアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、かつそれに結合するように標的化されるオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目５）
前記組成物中の前記マイクロスフェアが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目６）
前記組成物中の前記マイクロスフェアが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７のポリヌクレオチド配列からなる、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目７）
前記組成物中の前記マイクロスフェアが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも８０％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目８）
前記組成物中の前記マイクロスフェアが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目９）
前記組成物中の前記マイクロスフェアが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも９０％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１０）
前記組成物中の前記マイクロスフェアが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも９５％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１１）
前記組成物が、１型糖尿病の臨床的発症の後に投与される、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１２）
前記組成物が、１型糖尿病の臨床的発症の前に投与される、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１３）
前記組成物の投与が、投与前の前記哺乳動物の血糖値と比較して、前記哺乳動物の血糖値を正常化する、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１４）
前記組成物の投与が、前記哺乳動物のβ細胞集団を再生する、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１５）
前記組成物が、注射可能な形態として投与される、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１６）
前記組成物が、インスリンと併用投与される、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１７）
インスリンが、前記組成物の投与の前、投与と同時、または投与の後に投与される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記方法が、前記組成物の反復投与を含む、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目１９）
前記マイクロスフェアの少なくとも７０％ｗ／ｗがオリゴヌクレオチドである、項目１、２、３または４に記載の方法。
（項目２０）
前記組成物中の個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの比が、１：１：１のＣＤ４０アンチセンス：ＣＤ８０アンチセンス：ＣＤ８６アンチセンスである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
マイクロスフェアを含む医薬組成物であって、前記マイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示されているポリヌクレオチド配列か、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも７５％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合するポリヌクレオチド配列か、またはＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７の改変型を有する、医薬組成物。
（項目２２）
マイクロスフェアを含み、前記マイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも８０％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、項目２１に記載の医薬組成物。
（項目２３）
マイクロスフェアを含み、前記マイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、項目２１に記載の医薬組成物。
（項目２４）
マイクロスフェアを含み、前記マイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも９０％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、項目２１に記載の医薬組成物。
（項目２５）
マイクロスフェアを含み、前記マイクロスフェアは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは個々に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に対して少なくとも９５％のポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とし、かつ結合する、項目２１に記載の医薬組成物。
【００２５】
様々な組合せを含む本開示のこれらおよび他の態様、目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明の考察から明らかになり、これを通じて明確に理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
この説明の過程では、以下に説明する添付の図面を参照する。
【図１】図１ａおよび図１ｂは、ＡＳ−オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リジンポリカチオンのマイクロスフェアの走査電子顕微鏡写真である。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、本開示によるマイクロスフェア調製物の特性を示すグラフである。図２ａは、マイクロスフェア調製物のサイズ分布を示すグラフである。図２ｂは、マイクロスフェア調製物の表面電荷のグラフである。
【図３】図３は、マイクロスフェアの脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）後のオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】図４は、スクランブルオリゴヌクレオチドマイクロスフェアまたはＰＢＳビヒクルのみで処置した動物と比較した、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフェア（ＡＳ−ＭＳＰ）で複数回処置したＮＯＤマウスにおける糖尿病の予防を示すプロットである。
【図５】図５は、スクランブルオリゴヌクレオチドマイクロスフェアまたはＰＢＳビヒクルのみで処置した動物と比較した、本開示のＡＳ−ＭＳＰで１回処置したＮＯＤマウスにおける糖尿病の予防を示すプロットである。
【図６】図６ａ〜図６ｄは、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（図６および図６ｃ；Ｈ＋Ｅ）またはインスリンに対して染色した（図６ｂおよび図６ｄ）コントロールＮＯＤマウス由来の膵臓組織の切片の光学顕微鏡写真である。
【図７】図７ａ〜図７ｄは、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（図７ａおよび図７ｃ；Ｈ＋Ｅ）またはインスリンに対して染色した（図７ｂおよび図７ｄ）ＡＳ−ＭＳＰ処置ＮＯＤマウス由来の膵臓組織の切片の光学顕微鏡写真である。
【図８】図８は、本開示のＡＳ−ＭＳＰで処置したマウスまたはコントロール動物から得たＴ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【図９】図９は、本開示に従ってＡＳ−ＭＳＰで処置した動物に由来する、脾細胞と共に培養したＴ細胞の増殖を実証する相対蛍光強度（ＲＦＩ）のプロットを示す。
【図１０】図１０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける照射した同系脾細胞および卵白アルブミンの存在下でのＡＳ−ＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の増殖を実証するＲＦＩのプロットを示す。
【図１１】図１１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける同系膵島溶解物の存在下でのＡＳ−ＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の増殖の抑制を実証するＲＦＩのプロットを示す。
【図１２】図１２は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアまたはスクランブルオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアのいずれか一方で処置した初発糖尿病マウスの血糖値のプロットである。
【図１３】図１３Ａは、初発糖尿病のマウスを用いた実験の予定表を示し、図１３Ｂおよび図１３Ｃは、ＡＳ−ＭＳＰまたはコントロールのいずれかで処置した初発糖尿病マウスの平均血糖値のプロットである。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図面は、ＡＳ−ＭＳＰを投与すると、哺乳動物の血糖値が１５日以内に正常に戻り（正常値は、約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示されている）、ＡＳ−ＭＳＰ投与を停止（３０日目）した後でも正常に維持されることを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図面は、ＡＳ−ＭＳＰを投与すると、哺乳動物の血糖値が１５日以内に正常に戻り（正常値は、約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示されている）、ＡＳ−ＭＳＰ投与を停止（３０日目）した後でも正常に維持されることを示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図面は、ＡＳ−ＭＳＰを投与すると、哺乳動物の血糖値が１５日以内に正常に戻り（正常値は、約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示されている）、ＡＳ−ＭＳＰ投与を停止（３０日目）した後でも正常に維持されることを示す。
【図１５】図１５は、自己免疫性糖尿病の治療的逆転を説明するモデルである。
【図１６−１】図１６は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）によるオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の取り込みを示す。図１６Ａは、ｈＤＣによるＦＩＴＣ標識ＣＤ８６  ＡＳ−オリゴヌクレオチドの取り込みを示し；図１６Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮ処理ｈＤＣによるＤＱ−Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの取り込み／プロセシングを示し；図１６Ｃは、ＬＰＳ処理後のＤＣの実施形態のＦＡＣＳによる表現型を示す。
【図１６−２】図１６は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）によるオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の取り込みを示す。図１６Ａは、ｈＤＣによるＦＩＴＣ標識ＣＤ８６  ＡＳ−オリゴヌクレオチドの取り込みを示し；図１６Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮ処理ｈＤＣによるＤＱ−Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの取り込み／プロセシングを示し；図１６Ｃは、ＬＰＳ処理後のＤＣの実施形態のＦＡＣＳによる表現型を示す。
【図１６−３】図１６は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）によるオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の取り込みを示す。図１６Ａは、ｈＤＣによるＦＩＴＣ標識ＣＤ８６  ＡＳ−オリゴヌクレオチドの取り込みを示し；図１６Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮ処理ｈＤＣによるＤＱ−Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの取り込み／プロセシングを示し；図１６Ｃは、ＬＰＳ処理後のＤＣの実施形態のＦＡＣＳによる表現型を示す。
【図１６−４】図１６は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）によるオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の取り込みを示す。図１６Ａは、ｈＤＣによるＦＩＴＣ標識ＣＤ８６  ＡＳ−オリゴヌクレオチドの取り込みを示し；図１６Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮ処理ｈＤＣによるＤＱ−Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの取り込み／プロセシングを示し；図１６Ｃは、ＬＰＳ処理後のＤＣの実施形態のＦＡＣＳによる表現型を示す。
【図１６−５】図１６は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）によるオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の取り込みを示す。図１６Ａは、ｈＤＣによるＦＩＴＣ標識ＣＤ８６  ＡＳ−オリゴヌクレオチドの取り込みを示し；図１６Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮ処理ｈＤＣによるＤＱ−Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの取り込み／プロセシングを示し；図１６Ｃは、ＬＰＳ処理後のＤＣの実施形態のＦＡＣＳによる表現型を示す。
【図１６−６】図１６は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）によるオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の取り込みを示す。図１６Ａは、ｈＤＣによるＦＩＴＣ標識ＣＤ８６  ＡＳ−オリゴヌクレオチドの取り込みを示し；図１６Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮ処理ｈＤＣによるＤＱ−Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの取り込み／プロセシングを示し；図１６Ｃは、ＬＰＳ処理後のＤＣの実施形態のＦＡＣＳによる表現型を示す。
【図１６−７】図１６は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）によるオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の取り込みを示す。図１６Ａは、ｈＤＣによるＦＩＴＣ標識ＣＤ８６  ＡＳ−オリゴヌクレオチドの取り込みを示し；図１６Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮ処理ｈＤＣによるＤＱ−Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの取り込み／プロセシングを示し；図１６Ｃは、ＬＰＳ処理後のＤＣの実施形態のＦＡＣＳによる表現型を示す。
【図１７】図１７は、破傷風トキソイドの存在下で自己ＡＳ−ＯＤＮ処置末梢血由来ＤＣと共培養した、最近、破傷風追加ワクチン投与を受けた健常なヒトボランティア由来のＴ細胞の増殖を示す。エラーバーは、同じ個体の細胞の３つの別個の共培養からの応答の平均の標準誤差を示す。
【図１８】図１８は、名目上の抗原としてのインタクトな卵白アルブミンの存在下または非存在下で自己ＡＳ−ＯＤＮ処置末梢血由来ＤＣと共培養した、健常なヒトボランティア由来のＴ細胞の増殖を示す。エラーバーは、３人の別個のボランティアからの応答の平均の標準誤差を示す。
【図１９】図１９は、同種異系ＡＳ−ＯＤＮ処置末梢血由来ＤＣまたは未処置同種異系ＤＣと共培養した、健常なヒトボランティア由来のＴ細胞の増殖を示す。エラーバーは、ＤＣドナーが同じままである３人の別個のボランティアからの応答の平均の標準誤差を示す。
【図２０】図２０は、ヒト単球由来樹状細胞のＡＳＯ−ＭＳとのインキュベーション後のタンパク質の発現を示す。
【図２１】図２１は、ヒトＡＳＯ−ＭＳとの培養後のタンパク質の発現の減少率（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
必要に応じて、本開示の詳細な実施形態が本明細書に開示されるが、開示される実施形態が、様々な形態で具現できる本開示の単なる例示であることを理解されたい。従って、本明細書に開示される特定の詳細は、限定としてではなく、単に特許請求の範囲の根拠として、および実質的にあらゆる適切な要領で本開示を当業者が様々に利用できるようにする教示の代表的な根拠として解釈されるべきものである。
【００２８】
１型糖尿病は、膵臓、特に内分泌インスリン産生β細胞の進行性の炎症が存在する自己免疫疾患である。発症前に、炎症が、まず内分泌β細胞を機能不全にする。マイクロスフェア処方物の単回注射により、ヒト自己免疫（１型）糖尿病の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおける疾患の発症がかなり遅れる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、マイクロスフェアは、注射部位の常在および移動樹状細胞によって取り込まれ、そして疾患の発症前に近位リンパ節に移動すると考えられている。また、処置を受けたレシピエントにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定β細胞抗原を標的とするＴ細胞の増殖の低下が起こると考えられている。同系Ｔ細胞と樹状細胞で再構築されてからマイクロスフェアが投与された免疫不全ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスでは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋推定Ｔ調節細胞の普及の増加が起こり得る。従って、マイクロスフェアに基づく治療用組成物は、樹状細胞の活性を調節し、予防のための調節ネットワークを動員することができる。
【００２９】
糖尿病の発症を予防し得る処置を有することが望ましいであろう。また、相当数のβ細胞が破壊された臨床的発症後に疾患を抑制する、または逆転させ得る治療用組成物を有することが望ましいであろう。初発糖尿病マウスへの反復投与は、高血糖を正常化し、疾患を逆転させる。逆転は、典型的には、ヒトまたは他の哺乳動物などの個体が正常値に近い血糖値を有するようにすることを指す。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、「逆転」の間は、疾患誘発性のＴ細胞炎症および細胞死が抑制されると考えられる。
【００３０】
一実施形態は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の転写産物を標的とする、本明細書に開示されるアンチセンス（ＡＳ）−オリゴヌクレオチドマイクロスフェアを処方して注射することによって自己免疫インスリン依存性糖尿病を逆転させる。これらの転写産物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの具体例が、本明細書の実施例に記載されている。他のアンチセンスオリゴヌクレオチドも、本明細書に開示される効果を達成するために、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の転写産物への結合に有効であるように設計できることを理解されたい。また、このようなオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、チオエート化（ｔｈｉｏａｔｉｏｎ）、メチル化、およびメトキシエチル化を含む当分野で公知の修飾を含み得ること、および最適な効果を達成するためにこのような修飾の位置および数を変更できることも理解されたい。これらのオリゴヌクレオチドは、ＮＯＤマウスモデルにおけるインスリン産生β細胞の破壊の逆転をもたらす免疫寛容を誘導するように設計されている。
【００３１】
オリゴヌクレオチドの修飾型も企図され、これには、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を有する修飾型が含まれる。オリゴヌクレオチドの「修飾型」として、限定されるものではないが、修飾ヌクレオシド間結合および／または修飾塩基が挙げられる。
【００３２】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、すべてまたは一部がペプチド核酸である。他の修飾ヌクレオシド間の結合には、少なくとも１つのホスホロチオエート結合が含まれる。さらに他の修飾オリゴヌクレオチドには、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含むものが含まれる。「ユニバーサル塩基」は、構造を有意に不安定化させることなく水素結合を形成することによって、核酸におけるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵのいずれか１つに結合するために置換可能な分子を指す。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾主鎖または非天然ヌクレオシド間の結合を含むものが含まれる。修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、主鎖にリン原子を保持したものおよび主鎖にリン原子を有していないものが含まれる。ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であると見なされる。
【００３４】
リン原子を含む修飾オリゴヌクレオチド主鎖として、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホン酸塩（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホン酸塩を含む）、ホスフィン酸塩、ホスホラミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）（３’−アミノホスホラミダート（３’‐ａｍｉｎｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）およびアミノアルキルホスホラミダート（ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）を含む）、チオノホスホラミダート（ｔｈｉｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、チオノアルキルホスホン酸（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、または２’から２’の結合である、反転した極性を有するものが含まれる。また、最も３’側のヌクレオチド間結合における１つの３’から３’の結合、すなわち脱塩基（ヌクレオチドが、欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）とすることができる１つの反転ヌクレオシド残基を含む、反転した極性を有するオリゴヌクレオチドも企図される。塩、混合塩、および遊離酸の形態も企図される。上記のリンを含む結合の調製を教示する代表的な米国特許の例として、参考としてその開示が本明細書に援用される米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号、および同第５，６２５，０５０号が挙げられる。
【００３５】
主鎖の中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチドの主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間の結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケンを含む主鎖；スルファミン酸主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホン酸およびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分部分を有する他の主鎖が含まれる。例えば、参考としてその開示のすべてが本明細書に援用される米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号、および同第５，６７７，４３９号を参照されたい。
【００３６】
さらに他の実施形態では、ヌクレオチド単位の１つまたは複数の糖の結合および／または１つまたは複数のヌクレオチド間結合の両方が、「天然に存在しない」基に置き換えられたオリゴヌクレオチド模倣物。オリゴヌクレオチドの塩基は、標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために維持される。一態様では、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミドを含む主鎖で置き換えられている。例えば、参考としてその開示が本明細書に援用される米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００を参照されたい。
【００３７】
さらに他の実施形態では、ホスホロチオエート主鎖を備えたオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖を備えたオリゴヌクレオシド、ならびに米国特許第５，４８９，６７７号および同第５，６０２，２４０号に記載されている−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含むオリゴヌクレオチドが提供される。また、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されているモルホリノ主鎖構造を備えたオリゴヌクレオチドも企図される。
【００３８】
様々な形態では、オリゴにおける２つの連続したモノマー間の結合は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ’’）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ’’）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される２から４、望ましくは３の基／原子からなり、ここで、ＲＨは、水素およびＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ’’は、Ｃ１−６アルキルおよびフェニルから選択される。このような結合の例示的な例として、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（続くモノマーへの結合として使用される場合はＲ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（続くモノマーへの結合として使用される場合はＲ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（続くモノマーへの結合として使用される場合はＲ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−；−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ’’）２−Ｏ−であり、特に、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨＰ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−が企図され、ここで、ＲＨは、水素およびＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ’’は、Ｃ１−６アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる例示的な例が、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、５、３４３〜３５５、ならびにＳｕｓａｎ  Ｍ．ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、２５巻、頁４４２９〜４４４３に記載されている。
【００３９】
オリゴヌクレオチドのさらに他の修飾型は、参考としてその開示のすべてが本明細書に援用される米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されている。
【００４０】
修飾オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換糖部分を含み得る。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを２’位に含み、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでもよい。他の実施形態は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含み、ｎおよびｍは、１から約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および類似の特性を有するほかの置換基の１つを２’位に含む。一態様では、修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。他の修飾には、以下に示す例にも記載されている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および同様に以下に示す例に記載されている２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。
【００４１】
さらに他の修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置に位置し得る。一態様では、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位にも行うことができる。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物も有し得る。例えば、参考としてその開示のすべてが本明細書に援用される米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、および同第５，７００，９２０号を参照されたい。
【００４２】
一態様では、糖の修飾には、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合されて、二環糖部分を形成しているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）が含まれる。結合は、特定の態様では、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製は、国際公開第９８／３９３５２号および同第９９／１４２２６号に記載されている。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書で用いられる「非修飾」または「天然」塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾塩基には、他の合成および天然塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれる。別の修飾塩基には、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が含まれる。また、修飾塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置換された塩基（例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドン）も含まれ得る。別の塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に記載されている塩基、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、頁８５８〜８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０に記載されている塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３に記載されている塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、頁２８９〜３０２、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３に記載されている塩基が含まれる。一部のこれらの塩基には、結合親和性を高めるのに有用であり、２−アミ���プロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含め、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示され、特定の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられる。参考としてその開示が本明細書に援用される米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号、および同第５，６８１，９４１号を参照されたい。
【００４４】
「修飾塩基」または他の類似の用語は、天然塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、および／またはチミン）と対を形成でき、かつ／または天然に存在しない塩基と対を形成できる組成物を指す。特定の態様では、修飾塩基は、１５℃、１２℃、１０℃、８℃、６℃、４℃、または２℃以下のＴｍ差をもたらす。例示的な修飾塩基は、欧州特許第１０７２６７９号および国際出願第９７／１２８９６号に記載されている。
【００４５】
「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびに天然に存在しない核酸塩基、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびにＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ  Ｍ．ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、２５巻、頁４４２９〜４４４３に記載されている「天然に存在しない」核酸塩基を意味する。従って、用語「核酸塩基」には、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけではなく、複素環類似体およびその互変異性体が含まれる。さらなる天然に存在する核酸塩基および天然に存在しない核酸塩基には、それぞれが参考としてその開示のすべてが本明細書に援用される米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）に記載されている核酸塩基、Ｓａｎｇｈｖｉによる１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３に記載されている核酸塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３〜７２２（特に頁６２２および６２３を参照）に記載されている核酸塩基、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ
Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、頁８５８〜８５９に記載されている核酸塩基、およびＣｏｏｋ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１、６、５８５〜６０７に記載されている核酸塩基が含まれる。用語「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」は、最も伝統的な意味ではヌクレオシド塩基ではないがヌクレオシド塩基として機能する特定の「ユニバーサル塩基」を含め、核酸塩基のように機能できる複素環化合物などの化合物を含むことをさらに意図とする。特にユニバーサル塩基と呼ばれるものは、３−ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意選択で置換されたヒポキサンチンである。他の望ましいユニバーサル塩基には、当技術分野で公知のユニバーサル塩基を含め、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体が含まれる。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つの塩基位置で修飾されている。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以上の塩基位置で修飾されている。いかなる修飾も、得られるオリゴヌクレオチドがその標的転写産物に結合する能力を保持する限り、本発明によって企図される。
【００４７】
本発明によって企図される別の配列には、限定されるものではないが、表１に示されている配列が含まれる。
【００４８】
【表１】
2018197274.tif 000002
１型糖尿病は、ＮＯＤマウスおよびヒトにおける膵臓インスリン産生β細胞の自己免疫破壊によって明らかになる。臨床的発症の時点で、ヒトは、典型的には、１０〜２０％以下の残存β細胞集団を有する。この残存集団のいくらかの維持により、グルコースレベルを調節するのに十分なインスリンレベルを維持することができる。加えて、β細胞の破壊の逆転により、β細胞集団の部分的な再生をもたらすことができる。β細胞の自己免疫破壊を妨害するために、本開示のオリゴヌクレオチド含有微粒子が提供される。
【００４９】
樹状細胞（ＤＣ）を活性化させて、すべての組織に見られる皮膚下に存在する強力な抗原提示細胞にすることができることを理解されたい。これらの抗原提示樹状細胞は、特にリンパ節におけるＴ細胞の活性化によって、自己免疫応答を含む免疫応答の引き金として機能する。理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６は、自己免疫応答にとって重要であると考えられ、これらの分子のダウンレギュレーションは、自己免疫の反応性低下を促すと思われる。加えて、特定のサイトカイン、例えば、インターフェロンやインターロイキンが、反応性低下の結果として減少する。
【００５０】
マウスの自己免疫性糖尿病の処置に用いられるマイクロスフェアの形成では、１つ、２つ、または３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを水溶液に溶解して、水溶性ポリマー（複数可）およびポリカチオンと混合することができる。この溶液を、典型的には、約６０〜７０℃でインキュベートし、約２３℃に冷却し、次いで過剰なポリマーを除去する。
【００５１】
核酸は、典型的には、マイクロスフェアの約３０〜１００重量％を構成し、約５０μｍ以下、典型的には約２０μｍ以下の平均粒度を有し、約１０μｍ以下とすることもできる。典型的には、マイクロスフェアは、以下の通り調製される。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの水溶液を調製する。３つのオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアを調製したい場合は、３つのオリゴヌクレオチド溶液のアリコートを混合する。各溶液は、これら３つのオリゴヌクレオチドのタイプの１つを含む。オリゴヌクレオチドを含む最終溶液は、典型的には、約１０ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを含む。
【００５２】
特定の例では、マイクロスフェア処方物は、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％ｗ／ｗ、またはそれよりも多い量のオリゴヌクレオチドを含む。このような実施形態では、組成物は、６〜１０％ｗ／ｗのポリ−Ｌ−リジン含量を有し、加えて、マイクロスフェアの水分含量は、様々であるが、約４％とすることができる。オリゴヌクレオチドは、一態様では、１：１：１のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比で存在する。本発明によって企図される更なる処方物は、推定自己抗原を含む。これらには、限定されるものではないが、インタクトなヒトインスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、およびインスリノーマ関連タンパク質−２（ＩＡ−２）が含まれ得る。
【００５３】
これらを、１０ｍｇ／ｍｌポリカチオンストック溶液のアリコートと混合する。ポリカチオンの例には、ポリ−リジンおよびポリ−オルニチンが含まれる。他のポリカチオンには、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロラミン、プロタミン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアルギニン、ビニルアミン、および正に荷電したキトサンなどの正に荷電した多糖の誘導体、およびそれらの組合せが含まれる。ポリカチオン溶液は、ポリカチオン：オリゴヌクレオチドの容積比を約１：１〜約４：１とすることができる。一般的に使用されるポリカチオンには、ポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒ（最大７０，０００ダルトン、Ｂａｃｈｅｍから入手可能）およびポリ−Ｌ−オルニチン・ＨＢｒ（例えば、１１，９００ダルトン、Ｓｉｇｍａから入手可能）が含まれる。
【００５４】
ポリマー溶液も調製する。これらは、相分離促進剤として機能することができる。適切なポリマーの例には、直鎖または分岐ポリマー、コポリマー、およびブロックコポリマーが含まれる。これらのポリマーは、水溶性、半水溶性、水混和性、または水混和性溶媒に可溶性とすることができる。ポリマーの例として、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００などの様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびにポロキサマー１８８およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  ＦＩ２７またはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８などの様々な分子量のポロキサマーなどの薬学的に許容される添加剤が挙げられる。一般的に使用されるポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。別のポリマーは、ヒドロキシエチルスターチである。他の両親媒性ポリマーも、単独または混合して用いることができる。また、相分離促進剤は、プロピレングリコールとエタノールとの混合物などの非ポリマーとすることができる。
【００５５】
典型的な実施形態では、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリエチレングリコールのポリマー溶液を調製し、他の溶液と混合することができる。加熱、冷却、遠心分離、および複数回の洗浄により、水性懸濁液が得られ、この懸濁液は、オリゴヌクレオチドおよびポリカチオンを含むマイクロスフェアの乾燥粉末を形成するために、典型的には凍結させられ、凍結乾燥される。
【００５６】
マイクロスフェアは、静脈内、筋肉内、皮下、腹膜内、髄腔内、硬膜外、動脈内、および関節内などを含む注射経路によるｉｎ  ｖｉｖｏ送達に適している。実施できる他の送達経路には、例えば、局所、口腔、直腸、鼻、肺、膣、頬、舌下、経皮、経粘膜、眼、または眼内などが含まれる。本開示の目的に好都合なものは、注射可能な送達経路である。従って、一態様では、微粒子またはマイクロスフェアをシリンジ内に吸引して、細い針から注射することができる。皮下および眼などを含む適切な送達経路は、微細針（ｆｉｎｅ
ｂｏｒｅ  ｎｅｅｄｌｅ）を用いた注射である。用語「微細針」は、少なくとも２０ゲージのサイズ、典型的には約２２〜約３０ゲージ、およびこれよりも大きい針を意味する。一態様では、微細針は、少なくとも２４ゲージの細さ、少なくとも２６ゲージの細さ、および少なくとも２８ゲージの細さである。
【００５７】
一態様では、微粒子またはマイクロスフェアは、限定されるものではないが、注射される組成物１ｍｌ当たり少なくとも約１０μｇのオリゴヌクレオチドの濃度で注射することができる。例えば、約１５０〜約５００ｍｇのオリゴヌクレオチドを、多くの適用例について約１ｍｌ以下、一般的には約２ｍｌ未満の送達量で注入可能である。投与量は、１日に２回または３回以上の用量に分けることもできるし、単一の１日用量として投与することもできる。
【００５８】
様々な態様では、微粒子またはマイクロスフェアは、限定されるものではないが、注射される組成物１ｍｌ当たり少なくとも約０．０１〜１０００ｍｇの濃度で注射することができる。さらなる態様では、微粒子またはマイクロスフェアは、注射される組成物１ｍｌ当たり少なくとも約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、．０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ以上の濃度で注射することができる。関連する態様では、微粒子またはマイクロスフェアは、注射される組成物１ｍｌ当たり少なくとも約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００ｍｇの濃度で注射することができる。
【００５９】
注射送達は、通常の注射時間中に行われる。典型的には、このような時間は、限定されるものではないが、約２０秒以下である。
【００６０】
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本明細書に例示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアが、細胞表面分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６をダウンレギュレートすると考えられる。マイクロスフェアが注射されると、樹状細胞が、オリゴヌクレオチドマイクロスフェアを積極的に取り込むと考えられる。これらのオリゴヌクレオチドは、樹状細胞における細胞表面細胞分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現を抑制する。ＮＯＤマウスでの発病後のこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフェアの投与は、糖尿病を効果的に逆転させる。
【００６１】
以下の実施例は、本開示をさらに例示するために本開示の特定の特徴および利点を例示する。実施例は、本開示の制限または限定と見なされるべきものではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１
ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物を標的とする３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを合成した。この実施例に使用するＡＳ−オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであり、＊は、主鎖におけるチオエート化の部位を示している：
【００６３】
【化１】
2018197274.tif 000003
オリゴヌクレオチド混合物の水溶液を、それぞれが１つの型のオリゴヌクレオチドを含む３つのオリゴヌクレオチド溶液のアリコートを混合して調製し、３つの型のオリゴヌクレオチドの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製した。脱イオン水中の１０ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒの溶液（Ｂａｃｈｅｍ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡによる最大７０，０００ダルトンのポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒ）を調製した。ポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒを、１：１の容積比で、このオリゴヌクレオチド溶液に添加した。この混合物を、穏やかにボルテックスした。ｐＨ５．５の１Ｍ酢酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）中に、１２．５％のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、４０，０００ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）および１２．５％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、３，３５０ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）を含む２５％ポリマー溶液を、ＡＳ−オリゴヌクレオチド０．７５ｍｌ、ポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒ  ０．７５ｍｌ、およびＰＥＧ／ＰＶＰ  ３．０ｍｌの全容量４．５０ｍｌに２：１の容積比で添加した。
【００６４】
このバッチを７０℃で３０分間インキュベートし、次いで２３℃に冷却した。冷却時に、溶液が濁り、マイクロスフェアが形成された。次いで、この懸濁液を遠心分離し、過剰なＰＥＧ／ＰＶＰを除去した。得られたペレットを、脱イオン水中にペレットを再懸濁することによって洗浄し、次いで遠心分離し、上清を除去した。この洗浄過程を３回繰り返した。この水性懸濁液を凍結させ、凍結乾燥させて、オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リジンを含むマイクロスフェアの乾燥粉末を形成した。
【００６５】
図１ａおよび図１ｂは、２つの異なる倍率での１：１のポリ−Ｌ−リジン：オリゴヌクレオチドの比のマイクロスフェアの代表的な走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示している。平均粒度が約２．５μｍの０．５〜４μｍのサイズのマイクロスフェアを形成した。図２ａは、レーザー光散乱によって明らかにされた本開示に従って形成されたマイクロスフェアの１つの調製物のサイズ分布を示している。図２ｂは、光散乱によるマイクロスフェア調製物（ゼータ電位）の表面電荷の決定を示している。図３は、取り込み量（ｌｏａｄｉｎｇ）を定量化し、脱処方化後のマイクロスフェアのアンチセンスオリゴヌクレオチド成分の完全性を評価するために使用される逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ法を示している。マイクロスフェアは、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８０オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ；ＭＷ  ３０〜７０ｋＤ）を用いて処方した。次いで、マイクロスフェアを、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＡ）によってＰＬＬからのＤＮＡオリゴヌクレオチドの競合置換を用いて脱処方化した。ＰＡＡは、２６０ｎｍで吸収されず、２６０ｎｍでオリゴヌクレオチドの定量を妨げないポリアミノ酸試薬として選択した。図３などのＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールでは、各ピークの下側の面積は、マイクロスフェアに取り込まれた各オリゴヌクレオチドの量に比例している。図３に示されているように、ピークの高さは、各オリゴヌクレオチドのマイクロスフェア内への取り込み量にほぼ等しい値を示している。オリゴヌクレオチドのマイクロスフェア内への取り込み量は、約６５重量％〜約８０重量％となるように計算した。また、図３は、脱処方化後のピークの狭い分布によって示されているように、オリゴヌクレオチドの完全性が、マイクロスフェアの処方過程によって影響されなかったことも示している。
【００６６】
実施例２
この実施例では、本開示の予防の態様を包含する試験の結果を示す。図４に示されているように、５〜８週齢のＮＯＤマウスへのＡＳ−ＭＳＰの単回投与が、糖尿病の発症を遅らせる。ＮＯＤ雌マウス（５〜８週齢）の２つの群に、本開示のマイクロスフェアに処方されたアンチセンス−オリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＭＳＰ）の単回皮下注射を行った。各アンチセンスオリゴヌクレオチド（抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ８０、および抗−ＣＤ８６）の１：１：１の混合物５０μｇを含むと考えられる量で、処方物を注射した。マウスの他の群には、スクランブル配列マイクロスフェア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）またはＰＢＳビヒクルを注射した（コントロールＮＯＤ）。血中グルコースを、尾部静脈穿刺によって毎週測定した。読み取り値が２回続けて２８０〜３００ｍｇ／ｄＬを超えたら、糖尿病と認めた。図４は、２つの別個に処置したコホートの累積生存を示している。
【００６７】
図５は、５〜８週齢のＮＯＤマウスへのＡＳ−ＭＳＰの複数回投与が、糖尿病の発症を予防することを示している。ＮＯＤ雌マウス（５〜８週齢）に、本開示に従ったマイクロスフェアに処方されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの単回皮下注射（週１回）を８回続けて行った。注射（１：１：１の各アンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物またはスクランブルオリゴヌクレオチド５０μｇ）を、週１回、８週間にわたって行い、１３週で停止した。マウスの他の群には、スクランブル配列マイクロスフェア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）またはＰＢＳビヒクルを注射した（コントロールＮＯＤ）。図５は、処置した動物の累積生存を示している。
【００６８】
図６ａおよび図６ｂはヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（Ｈ＋Ｅ；図６ａ）またはインスリンに対して染色した（図６ｂ）、処置を受けなかったため自己免疫に自然に進行したマウス（糖尿病ＮＯＤマウス）の膵臓組織の切片を示している。図６ｃおよび図６ｄは、ＳＣＲ−ＭＳＰ処方物で処置した（特定のＡＳ−ＭＳＰで処置した群と並行して注射を開始した）マウス由来の膵臓組織の切片を示している。これらの切片も、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色（Ｈ＋Ｅ；図６ｃ）またはインスリンに対して染色した（図６ｄ）。ＳＣＲ−ＭＳＰマウスはすべて、糖尿病を発症した。
【００６９】
図７ａおよび図７ｂは、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色（Ｈ＋Ｅ；図７ａ）またはインスリンに対して染色（図７ｂ）した、８週齢未満のときに処置し（予防モデル）、そして本開示のアンチセンスマイクロスフェアで処置したマウス由来の膵臓組織の切片を示している。
【００７０】
図８に示されているように、ＡＳ−ＭＳＰで処置したＮＯＤマウス由来のＴ細胞は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋推定Ｔｒｅｇ細胞の普及の増加を示している。図８Ａは、ＦＡＣＳ分析に使用されるゲーティングを示している。図８Ｂは、脾臓から濃縮されたＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージを示し、図８Ｃは、ＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスのプールされたリンパ節由来、またはスクランブル配列マイクロスフェア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）で処置した、もしくはＰＢＳビヒクルで処置した動物由来のパーセンテージを示している。
【００７１】
図９は、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞が、同種異系脾細胞と共培養した場合に増殖することを示している。ＡＳＭＳＰで処置した非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞は、濃縮カラムから得て、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ６、または同系非糖尿病ＮＯＤマウス（１０週齢）由来のγ線照射脾細胞と共培養した。Ｃｙｑｕａｎｔ試薬を用いて４日後に増殖を測定した。Ｓｐｌは、同種異系照射脾細胞を指す。
【００７２】
図１０に示されているように、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同系照射脾細胞および卵白アルブミンの存在下で増殖する。Ｔ細胞は、ＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスの脾臓またはプールされたリンパ節から濃縮した。
【００７３】
図１１は、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同系膵島溶解物の存在下で増殖の抑制を示すことを示している。図４に示されているように、Ｔ細胞は、ＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスの脾臓またはプールされたリンパ節から濃縮した。照射ＮＯＤ脾細胞（１０週齢の非糖尿病ＮＯＤマウス由来）を、抗原提示細胞として使用し、並行培養物をＮＩＴ−１溶解物（１μｇ／ウェル）（またはＰＢＳビヒクル）を用いてパルス化した。
【００７４】
糖尿病抑制治療のヒト試験への最終的な移行に関する主な懸念は、この処置方法の抗原特異性（従って細胞特異性）、ならびにこの処置が全体的および非特異的な抑制をもたらすか否かである。これらの問題に取り組むために、図４に示されているコホートからランダムに選択した非糖尿病マウスを安楽死させて、同種抗原、名目上の抗原（インタクトな卵白アルブミンの形態である）、およびＮＯＤ由来インスリノーマ細胞系ＮＩＴ−１由来の細胞溶解物の形態の同系β細胞由来抗原に対する脾臓およびリンパ節のＴ細胞の増殖を確認した。インスリンおよびグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）は、機構的および目的論的に関与する有望な候補の自己抗原であるが、自己抗原を惹起する性質は不明確なままである。これにも関わらず、β細胞に存在するはずであると見なすのが妥当である。従って、ＮＯＤインスリノーマに由来するＮＩＴ−１細胞系を、ＡＳ−ＭＳＰで処置した非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の共培養物中のβ細胞抗原の供給源として使用して、抗原特異的反応性低下の可能性を決定した。これらの研究から、名目上の抗原および同種抗原に対するＴ細胞の増殖は維持されるが、ＮＩＴ−１細胞溶解物との共培養物中でＴ細胞の増殖低下が起こることが観察された。
【００７５】
さらに、共培養物の上清中のサイトカインのプロフィールを確認して、本発明者らは、ＮＩＴ−１溶解物の存在下でさえ、ＡＳ−ＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞によるＴＮＦαの産生の有意な低下を観察した。ＩＦＮγの産生は、ＡＳ−ＭＳＰ処置マウス由来のＴ細胞の共培養物中で僅かに低下したが、ＮＩＴ−１溶解物の存在下では、ＰＢＳ処置マウス由来のＴ細胞との共培養物と統計学的に区別できなかった。最後に、このアッセイは、上清中のＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＴＧＦβの存在を検出できなかった。
【００７６】
実施例３
早期発症ＮＯＤマウスにおける糖尿病の症状を逆転させるアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフェアの能力も試験した。これらの実験の予定表が図１３Ａに示されている。早期発症したＮＯＤマウスは、血糖値を試験し、血糖値が４００ｍｇ／ｄＬを超える動物を特定することによって選択した。選択した動物に、インスリンペレットを与えて、３００ｍｇ／ｄＬよりも低い血糖値に正常化した。インスリンを中止し、マイクロスフェアの一連の非経口注射を開始した。６匹の動物に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアを週２回注射した。さらに１０匹の動物に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６に向けられたものではないスクランブル配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を含むマイクロスフェアを注射した。両方の群の動物の各注射は、１００μｌの注射溶液中のマイクロスフェア中にオリゴヌクレオチド５０μｇを含んでいた。スクランブル群の動物のうちの２匹を、健康状態が悪いため、実験終了前に安楽死させた。注射プロトコルの開始後、血糖値を週２回サンプリングした。動物は、実験中、空腹状態でなかった。結果が図１２にプロットされており、標識（１）は、インスリンペレットの設置を示し、標識（２）は、インスリンペレットの除去および週２回のＭＳＰ注射の開始を示している。図１２で報告された最高血糖値は、７００ｍｇ／ｄＬであり、この値は、使用した測定器の最大の読みであることに留意し、７００ｍｇ／ｄＬのデータポイントは、７００ｍｇ／ｄＬ以上の血中グルコースを示唆することを理解されたい。ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物を含むマイクロスフェア（ＡＳＭＳＰ１〜ＡＳＭＳＰ６）が投与された群の全ての動物は、スクランブルオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェア（ＳＣＲＭＳＰ１〜ＳＣＲＭＳＰ１０）が投与された動物よりも有意に低いグルコースレベルを示した。さらに、このＡＳＭＳＰ群の６匹の動物のうちの４匹は、典型的には糖尿病発症の閾値指標と見なされる４００ｍｇ／ｄＬよりも低い血糖値を示した。
【００７７】
図１３Ａに、実験の予定表が示されている。各群の平均非空腹時血糖値（図１３Ｂ）および平均空腹時血糖値をプロットした（図１３Ｃ）（＋／−ＳＥＭ）。一部マウスでは、図１３Ａに示されているように、ＡＳＭＳＰ投与を中止した。図１３Ｂおよび１３Ｃに示されているように、初発糖尿病ＮＯＤ雌マウスへのＡＳ−ＭＳＰの複数回投与により、血糖値が改善され、未処置の動物（コントロール）、ＰＢＳで処置した動物、またはスクランブルオリゴヌクレオチド（ＳＣＲ−ＭＳＰ）マイクロスフェアで処置した動物と比較して、ＡＳ−ＭＳＰ中止後でさえ安定した空腹時正常血糖をもたらした。
【００７８】
図７ｃおよび７ｄは、糖尿病の発症後にアンチセンス処方物で処置し、疾患の逆転を示したＮＯＤマウス由来の膵臓組織の切片を示している。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色（Ｈ＋Ｅ；図７ｃ）またはインスリンに対して染色（図７ｄ）した。
【００７９】
３つの異なるＡＳ−オリゴヌクレオチドを、本明細書に開示される方法に従ってマイクロスフェア内に組み込むことができ、このようなマイクロスフェアを、免疫調節性樹状細胞の誘導による初発自己免疫性糖尿病を予防するため、および／または逆転させるための組成物として使用することができる。実際、この組成物の単回注射は、疾患の発症を遅らせ、初発糖尿病マウスへの反復投与は、高血糖を正常化し、疾患の逆転を示唆した。これらの研究において、血中グルコースが３００ｍｇ／ｄＬよりも低くなるまでインスリンを毎日投与した。次いで、インスリンを中止し、その際にＡＳ−ＭＳＰを皮下投与した。例示的な投与計画では、体重１ｋｇ当たり２ｍｇのＡＳ−ＭＰを３〜４週間、週２回、動物に投与した。非糖尿病ＮＯＤマウスをモニタリングした。
【００８０】
図１４Ａ〜図１４Ｃでは、ＮＯＤマウスへのＡＳ−ＭＳＰの投与が、前記マウスの血糖値を正常レベルに戻し、前記血糖値の正常化が、長期間維持されることを実証している。図１４Ｂおよび図１４Ｃに示されているように、インスリン投与を中止してから０〜３０日の間、ＡＳ−ＭＳＰを投与した。血糖値は、インスリン中止後１５日目までに正常に戻り、モニタリング期間の終了（５５日目）まで正常レベルに維持された。
【００８１】
自己免疫性糖尿病の治療上の逆転の効果を示す線図が図１５に示されている。マイクロスフェア治療薬が、図１５に示されている初発「ハネムーン期間」に投与されると、機能を維持した１０〜２０％のβ細胞が維持されると推定され、これにより糖尿病が制御され、患者のインスリンに対する依存が減少する。
【００８２】
記載された本開示の実施形態は、本開示の原理の適用例の一部の例示であることを理解されたい。本開示の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって様々な変更がなされ得る。本明細書中に記載された様々な特徴は、任意の組合せで使用することができ、本明細書で具体的に要点を述べた厳密な組合せに限定されるものではない。
【００８３】
実施例４
以下のヒトアンチセンス配列を、以下に記載される研究に使用した。
【００８４】
【化２】
2018197274.tif 000004
血液のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離、プレート上での接着細胞の非接着細胞からの分離、続くＡＩＭ  Ｖ培地中のＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４における接着細胞の増殖（Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、２０００、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：１８３〜１９０；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、１９９８、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８：２８７〜２９６；Ｍｅｄａｒｏｖａら、２００５、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：１７８０〜１７８８；Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：１９３６〜１９４２；Ｇｍｙｒら、２００１、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １０：１０９〜１２１）によって末梢血からヒトＤＣを得て、以下に概要を述べるすべての実験に使用した。ＣＤ３カラム上での選択の後のＤＣ増殖中に収集した非接着細胞からＴ細胞を濃縮した。すべての細胞は、健康なボランティアから得た。
【００８５】
ヒトＤＣによるＯＤＮの取り込み：ヒトＤＣは、ＰＩ／アネキシンＶ染色、細胞表面ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびクラスＩＩ  ＭＨＣ発現、およびＤＱＯｖａｌｂｕｍｉｎ（商標）の取り込み／プロセシングによって評価される細胞の生存能力および機能を変更することなく、蛍光ＮＦ−κＢおよびＡＳ−ＯＤＮを迅速（５時間までに）に取り込む。図１６Ａは、培地（最終濃度３．３μＭ）に添加してから２４時間後までのヒトＤＣによるＦＩＴＣ標識ＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを示している。ＤＣの未成熟は、外部から供給された粒子の食作用およびエンドソーム／リソソームプロセシングのこれらの能力に関連している。図１６Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮ  ＤＣが、外部から供給されたタンパク質（ＤＱ−Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を取り込むことができ、より重要なことに、これらの蛍光が、抗原がエンドサイトーシスの区画（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）内でプロセシングされたこと（インタクトなＤＱ−ｏｖａｌｂｕｍｉｎは蛍光を発しないが、プロセシングされると蛍光を発する）を示唆することを実証している。同時に、ＡＳ−ＯＤＮ処理ＤＣ（３つすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物）は、リポ多糖（ＬＰＳ）刺激；ＣＤ８０およびＣＤ８６の細胞表面レベルを大幅に増大させる処理が行われても、抗原提示に重要なＩＣＡＭ−１またはクラス１およびクラスＩＩ  ＨＬＡが一切変化することなく、劇的に抑制されたＣＤ８６およびＣＤ８０の細胞表面レベルを示した。１×１０５のヒトＤＣをまず、ＡＳ−ＯＤＮ混合物（各オリゴヌクレオチドは最終濃度が３．３μＭ）で２４時間処理し、次いでＬＰＳ（１０μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳビヒクルでさらに２４時間処理した。次いで、細胞を、指示された蛍光抗体またはアイソタイプコントロールで染色した。次いで、ＦＡＣＳ分析を行った（図１６Ｃ）。
【００８６】
ワクチン投与および名目上の抗原に対する応答：ＡＳ−ＯＤＮ（配列番号４、６、および７）で処理したヒトＰＢＭＣ由来樹状細胞は、破傷風トキソイドとの共培養で同系Ｔ細胞の正常な活性化を示した（Ｔ細胞は、最近ワクチン投与された個体から得た）；図１７。加えて、ＡＳ−ＯＤＮ  ＤＣ刺激正常Ｔ細胞は、ＤＣが卵白アルブミン、名目上の抗原でパルス化されたときに応答した；図１８。両方のアッセイで、刺激物質としての未処理ＤＣとの共培養物に対して比較した。１：１の比のＤＣ：Ｔ細胞が１×１０４の細胞からなる共培養物を確立した。共培養の５日目にＣｙＱｕａｎｔ試薬によって増殖を測定した。外部抗原（破傷風トキソイドまたはインタクトな卵白アルブミン）を、共培養期間の間、５μｇ／ｍＬの最終濃度で調製した。
【００８７】
同種抗原に対する応答：図１９に、ＡＳ−ＯＤＮ  ＤＣが、培養下の同種異系Ｔ細胞に対して弱い増殖刺激を与えることが示されている。ＡＳ−ＯＤＮ  ＤＣとの共培養物中のＴ細胞の増殖は、刺激物質としてのコントロールＤＣとの共培養物と比較して少なかった。１：１の比のＤＣ：Ｔ細胞が１×１０４の細胞からなる共培養物を確立した。共培養の５日目にＣｙＱｕａｎｔ試薬によって増殖を測定した。
【００８８】
Ａｓ−ＯＤＮ処理ＤＣにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの詳細なＤＣ表現型の評価：表２および表３（下記）は、ＦＡＣＳによって測定された２人の健常なボランティア由来の試料中のＬＰＳ刺激ＤＣ成熟（同時刺激タンパク質のアップレギュレーション）の予防に対するＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６アンチセンスＯＤＮ調製ＤＣの効果を実証している。
【００８９】
２人の健常なボランティアから白血球を得て、これを用いてコントロールＤＣまたはＡＳ−ＯＤＮ  ＤＣを作製した（２人の各ボランティア由来）。次いで、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６のアップレギュレーションが存在するか否かを確認するためにＤＣをＬＰＳ（リポ多糖）で活性化させて成熟させた。コントロールＤＣでは、ＬＰＳは、表面でＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６のアップレギュレーションを刺激したが、ＡＳ−ＯＤＮ  ＤＣでは刺激することができなかった。これは、通常はＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の表面での発現をアップレギュレートする強力な成熟信号（ＬＰＳ）の存在下でさえも、ＡＳ−ＯＤＮがＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現を抑制することを裏付けている。データは、表２および表３に示されている。
【００９０】
【表２】
2018197274.tif 000005
【００９１】
【表３】
2018197274.tif 000006
実施例５
ヒトＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６共刺激分子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（実施例４に記載）を含むマイクロスフェアを以下に示す通り形成した：
水溶液中のポリ−Ｌ−リジン約６．０ｍｇを水浴中で７０℃に加熱し、１５ｍｌ円錐管に入れた。水溶液中のＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例４に記載した配列番号４、６、および７）の混合物６．９ｍｇを水浴中で７０℃に加熱し、１５ｍｌの円錐管に入れた。１２．５％−ＰＥＧ／１２．５％ＰＶＰ溶液も、水浴中で７０℃に加熱した。アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液にポリ−Ｌ−リジンをピペットで添加した。得られた懸濁液を、ピペット先端部で簡単に撹拌して混合した。次いで、この管を７０℃の水浴に迅速に戻して、５分間インキュベートした。次いで、ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液をＡＳＯ／ＰＬＬ溶液に添加した。これを、ピペット先端部で撹拌して簡単に混合した。
【００９２】
次いで、この管を７０℃の水浴に迅速に戻して、５〜１０分間インキュベートした。次いで、処方物を、１℃／分の冷却速度で４℃まで冷却した。次いで、試料を氷上で水洗した。
【００９３】
次いで、試料を、４℃で１０〜３０分間、４７５０ｒｐｍで遠心分離した。次いで、上清を除去し、マイクロスフェアを４℃の等量のＨ２Ｏで再懸濁した。次いで、マイクロスフェアを、４℃で５〜１０分間、４７５０ｒｐｍでの遠心分離、洗浄、および再懸濁によってさらに３回洗浄した。上清の除去、マイクロスフェアの再懸濁、および４℃の等量のＨ２Ｏでの再懸濁によって。
【００９４】
４回目の遠心分離ステップの後、マイクロスフェアを１ｍｌ当たり約１０ｍｇの濃度に再懸濁した。次いで、試料を、ドライアイス上または−８０℃の冷凍庫内で３０分間凍結させた。最後に、試料を約２４時間、凍結乾燥して乾燥させた。
【００９５】
実施例６
以下に示す通り動物毒性研究のために生産したグラムスケールのバッチ：
マイクロスフェア（ＭＳ）処方物：アンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフェア（ＡＳＯ  ＭＳ）の典型的な生産工程を、実施例４に記載されたアンチセンス（配列番号４、６、および７）を用いて以下に説明する。１０ｇの量のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）生産バッチを、２．３ｍｇ／ｍｌの開始ＡＳＯ（１３．８ｇ）で、３つの２Ｌの生産アリコートを用いて生産した。
【００９６】
【表５】
2018197274.tif 000007
２Ｌバッチに、３Ｌの開口したステンレス鋼（ＳＳ）容器を使用した。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）溶液およびヌクレアーゼを含まない水を滅菌１０００ｍｌボトルに加えて、７０℃に加熱した。ＡＳＯカクテルを滅菌２５０ｍｌボトルに加えて、７０℃に加熱した。ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液を３Ｌ容器に加えて、７０℃に加熱した。ＡＳＯカクテルを高温のＰＬＬ／水混合物に加えて、ＡＳＯ／ＰＬＬ複合体を形成した。この複合体を７０℃で５分間維持し、次いで、滅菌した平羽根リフターで撹拌しながら、ＰＥＧ／ＰＶＰを含む３Ｌ容器内に加えた。この溶液を、７０℃で１０分間維持した。全処方物を、約０．９℃／分の速度で７０℃から２℃に冷却した。懸濁液を、ポリマーの除去および洗浄のために移した。
【００９７】
ポリマーの除去／洗浄：すべての開放性の作業は、層流フード内で行った。ＡＳＯ−ＭＳ懸濁液を、４つの予め滅菌した５００ｍＬポリプロピレン円錐ボトルに移した。このボトルを、４℃で３０分間、３７００ｒｐｍ（３２００ｇの力）で遠心分離した。上清を捨て、予め冷却した（４℃）０．２μｍろ過済みＵＳＰ水を、ボトルに加えた（除去した上清と同量）。ボトルを手で振盪し、冷水超音波処理を用いて、ペレットを再懸濁した。この過程を、６０分ではなく１０分の遠心分離時間でさらに３回繰り返した。最後の再懸濁をろ過済みＵＳＰ水約５００ｍＬ中で行い、全容量を凍結乾燥皿に加えた。
【００９８】
凍結乾燥：乾燥粉末にするための最後の乾燥は、凍結乾燥によって達成した。ＡＳＯ−ＭＳを、滅菌した１０インチ×１６インチのステンレス鋼皿（１バッチ当たり１つ）でバルク凍結乾燥させた。３つすべてのバッチを、ＳＰ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（ＦＴＳ）Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ  ＦＤ−１６５の棚の上で−４０℃で凍結させた。次いで、バッチを凍結乾燥機に戻し、３日間凍結乾燥させた。用いたサイクルは、−４０℃で４時間の凍結ステップ、−１０℃で４８．５時間の第１の乾燥ステップ、徐々に温度を上げて２０℃で２時間の第２の乾燥ステップ、徐々に温度を下げて−５℃での保持ステップ、徐々に温度を上げて２０℃での最終保持ステップを含んだ。この時点で、０．２μｍろ過クリーンルーム空気を凍結乾燥機に充填し、収集のためにトレーを層流フードに移した。
【００９９】
収集／パッケージング：ＡＳＯ−ＭＳを、１００ｍＬの蓋付き加圧滅菌ガラスボトルの中に収集した。合計２４のアリコートを、用量範囲研究のために１０ｍＬまたは２０ｍＬ（投与量に基づく）の蓋付き加圧滅菌ガラスバイアルにサンプリングした。分析試験、生物汚染度、内毒素、および他の用途のために別の材料をサンプリングした。すべての収集およびサンプリングは、予め滅菌したまたは衛生化した構成要素を用いて層流フード内で行った。
【０１００】
再懸濁ビヒクルの調製：グリシン粉末をＵＳＰ水に溶解した。ＡＳＯ−ＭＳを、投与時にビヒクル内で再懸濁されるように設計した。
【０１０１】
材料：可能な限りＵＳＰグレードの原材料を使用した。活性ＡＳＯ混合物および洗浄用のろ過済みＵＳＰ水の２つの溶液を生産の前に調製した。２つの溶液を、（１）１２．５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１２．５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６、および（２）１５ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジンに処方した。両方の溶液を、０．２μｍフィルターに通してろ過し、層流フード内の加圧滅菌ボトルに入れた。活性ＡＳＯカクテルを、個々のＡＳＯ粉末（ＨｕＣＤ４０、ＨｕＣＤ８０、およびＨｕＣＤ８６）をヌクレアーゼを含まない水で再懸濁して調製し、濃度を決定した。個々のＡＳＯ溶液を等モル比で混合し、２．７ｍＭ（２７．４５ｍｇ／ｍｌ）の濃度に希釈した。
【０１０２】
環境／工程のクリーニング：ＡＳＯ  ＭＳ生産物は、ＩＳＯ８（Ｃｌａｓｓ  １００，０００）クリーンルームで生産した。最大の工程の密閉は、許容される限り維持した。環境への曝露を必要とするすべての工程作業は、クリーンルームの層流フード内で行った。ＨＶＡＣシステムおよび設備機器の較正および証明書は、現状のままとした。クリーンルームおよび関連設備の予防保全プログラムは、決められた手順で行った。クリーンルームの慣例的なクリーニングおよび衛生化を実施し、活動中は完全予防衣とした。
【０１０３】
生産物が接触する機器および構成要素は、滅菌済みを購入するか、または１２１℃で３０分以上、研究室の加圧滅菌器で衛生化するか、または水酸化ナトリウムとＵＳＰ純水で衛生化した。可能な場合は、使い捨て滅菌済み構成要素を使用した。生産物が接触しない表面は、７０％イソプロパノールおよびＳｐｏｒ−Ｋｌｅｎｚ  Ｃｏｌｄ−Ｓｔｅｒｉｌａｎｔを用いて衛生化した。
【０１０４】
試料（試験および／またはコントロール）の明細：材料を特徴付けるために以下に示す試験（以下の表４）を行った。
【０１０５】
【表４】
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実施例７
マイクロスフェア−ＡＳ−ＯＤＮ（実施例４に記載されているアンチセンス配列、配列番号４、６、および７を含む）が、非ヒト霊長類で非毒性であることを実証するため、ならびにマイクロスフェア中の放射標識された、または蛍光タグの付いたオリゴヌクレオチドの膵臓リンパ節輸送および蓄積を確認するために、別の臨床前研究を行った。
【０１０６】
初期実験は、本明細書に開示されるマイクロスフェア（ＭＳＰ）と同一に振る舞うように企図されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎが販売するＦｌｕｏｓｐｈｅｒｅｓを利用した。ＭＳＰを取り込んだ細胞型およびその機能的能力を同定するために、脾臓およびリンパ節を、ＭＳＰの蓄積を示した研究対象から単離した。
【０１０７】
これらの実験結果は、マイクロスフェア−ＡＳ−ＯＤＮが非毒性であり、ＭＳＰの蓄積がリンパ節、膵臓、腎臓、および肝臓で観察されたことを示した。このＭＳＰの蓄積は、驚くべきことに、マウスを用いた同様の実験で観察されたものと少なくとも部分的に酷似していた。
【０１０８】
実施例８
ＡＳＯ−ＭＳ標的のタンパク質ノックダウン：Ｆｉｃｏｌｌ勾配による遠心分離、単球のプラスチックへの接着、およびＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下での７日間の細胞の分化によって単球由来樹状細胞を得た。７日後、ヒトＡＳＯ−ＭＳ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ、実施例４に記載されている配列番号４、６、および７に示されている配列）または培地のみを細胞に添加した。細胞を７〜１４日間培養し、次いでフローサイトメトリーによる分析のために収集した。ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ８６、およびヒトＣＤ４０に対する抗体または対応するアイソタイプコントロールと共に細胞を４℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／ＦＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞をＰＢＳ／ＦＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒは、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＣａｌｉｂｒｉｔｅビーズで毎日較正した。データを、各タンパク質に対して陽性の細胞のパーセンテージについてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアで分析した。データは、Ｅｘｃｅｌ  ２００７で計算した、各群における陽性細胞の平均パーセント（図２０）またはコントロール／未処理細胞からの減少パーセント（図２１）±標準偏差として示されている。２人の異なるドナーからの細胞を、７〜１４日間、培養の２つの異なる日に分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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