(57)【要約】      （修正有）【課題】抗炎症活性を有するペプチド、及びそれを含む組成物の提供。特にアルツハイマー病を含む中枢又は末梢神経系関連炎症性疾患の治療又は予防のための医薬組成物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むペプチド、前記特定のアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はその断片であるペプチド、及びそれを有効成分として含む抗炎症組成物。前記ペプチドはヒトテロメラーゼに由来する抗炎症組成物。【選択図】図８
2018039806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のアミノ酸配列の断片
を含む、抗炎症活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記断片は少なくとも３個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
最大３０個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ヒトテロメラーゼに由来する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む、抗炎症組成物。
【請求項８】
炎症性疾患の治療または予防のための、請求項７に記載の抗炎症組成物。
【請求項９】
皮膚炎症を改善または予防するための化粧品組成物である、請求項７に記載の抗炎症組成物。
【請求項１０】
炎症性疾患の治療または予防のための医薬組成物である、請求項７に記載の抗炎症組成物。
【請求項１１】
炎症の治療または予防のための食品組成物である、請求項７に記載の抗炎症組成物。
【請求項１２】
前記炎症性疾患は、（１）全身または局所の炎症疾患（例えば、アレルギー；免疫複合体疾患；枯草熱；過敏性ショック；耐毒素ショック；悪液質（cachexia）、異常高熱；肉芽腫症；または類肉腫症）；（２）胃腸管系疾患（例えば、虫垂炎；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；腹膜炎；膵腸炎；潰瘍性、急性または虚血性の大腸炎；胆管炎；胆嚢炎、脂肪便症、肝炎、クローン病；またはウィップル病）；（３）皮膚関連疾患（例えば、乾癬；火傷；日焼け火傷；皮膚炎；蕁麻疹性のいぼまたは膨疹）；（４）心血管系疾患（例えば、血管炎；脈管炎；心内膜炎；動脈炎；粥状動脈硬化症；血栓静脈炎；心膜炎；鬱血性心不全；心筋炎；心筋虚血症；結節性動脈周囲炎；再発性狭窄症；バーガー氏病；またはリューマチ熱）；（５）呼吸器系疾患（例えば、喘息；喉頭蓋炎；気管支炎；肺気腫（emphysema）；鼻炎；嚢胞性纎維症；癲癇性肺炎；慢性閉鎖性疾患（ＣＯＰＤ）；成人呼吸障害症侯群；塵肺症；肺胞炎；細気管支炎；咽頭炎；肋膜炎；または副鼻腔炎）；（６）骨、関節、筋肉及び結合組織関連疾患（例えば、好酸性肉芽種；関節炎；関節痛；骨髄炎；皮膚筋炎；筋膜炎；パジェット病；通風；歯周疾患；リューマチ性関節炎；重症筋無力症；強直性脊椎炎；または潤滑膜炎）；（７）泌尿生殖系疾患（例えば、副睾丸炎；膣炎；前立腺炎；または尿道炎）；（８）中枢または末梢神経系関連疾患（例えば、アルツハイマー病；髄膜炎；脳炎；多発性硬化症；脳梗塞；脳塞栓症；キラン・バレー症侯群（Guillain-Barre syndrome）；神経炎；神経痛；骨髄外傷；麻痺；またはぶどう膜炎）；（９）ウイルス（例えば、インフルエンザ；呼吸器細胞融合ウイルス；ＨＩＶ；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルスまたはヘルペスウイルス）感染疾患（例えば、デング熱；または敗血症（septicemia））、真菌感染疾患（例えば、カンジダ症）；または細菌、寄生虫、および類似の微生物感染（例えば、散在性菌血症；マラリア；糸状虫症；またはアメーバ症）；（１０）自己免疫疾患（例えば、甲状腺炎；ループス；グッドパスチャー症侯群；同種移植拒否反応；移植片対宿主病；または糖尿病）；ならびに（１１）癌または腫瘍性疾患（例えば、ホジキン病）からなる群から選択される、請求項８または１０に記載の抗炎症組成物。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載の抗炎症組成物を投与することによって、炎症性疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド；及び
前記ペプチドまたは組成物の投与量、投与経路、投与回数及び適応症の少なくとも一つを含む指示書；
を含む、炎症性疾患の予防または治療のためのキット。
【請求項１５】
医薬としての使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法における使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症活性を有するペプチド、及びそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、外部の物理的刺激、各種アレルギー誘発物質の接触を例として挙げることができる化学的刺激、あるいは細菌、かびまたはウイルスのような微生物の侵入などによって、生体組織が損傷されることを防ぐための生体の防御反応のうち一つである。
【０００３】
炎症信号は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）経路またはリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）経路を介して作られ、プロスタグランジン、トロンボキサンなどを生成する。炎症信号が伝達されれば、生体内では、さまざまな変化が起こるが、そのうちの一つとして、炎症が、必要な部位の血管を拡張させ、血液供給を旺盛にし、好中球など炎症反応に必要な血液細胞が集中供給される現象を挙げることができる。しかし、そのような生体の防御反応が非正常的に過度に起これば、さまざまな炎症性疾患が発病することになるので、それを防止するために、炎症信号経路の酵素（例えば、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、５−ＬＯＸ、１２−ＬＯＸなど）を抑制して炎症信号経路を遮断することにより、過度の炎症反応を抑制することができる薬物が開発されている。
【０００４】
炎症は、反応期間により、急性炎症（acute inflammation；即刻反応、非特異的反応、数日〜数週間）、慢性炎症（chronic inflammation；遅延された反応、特異性反応、数週間以上）、亜急性炎症（subacute inflammation；急性炎症と慢性炎症との中間段階、多核球と単核球との混合型産出物の特徴）に分けられる。
【０００５】
また、炎症を誘発する因子には、ペプチド性因子以外に、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性因子のような脂質性因子、炎症因子合成酵素、ＮＯ（nitric oxide）のようなフリーラジカル、さまざまな種類の細胞接着分子、免疫系、凝固因子などが関与する。
【０００６】
現在まで知られた炎症のメカニズムは、外部の生物学的な原因（細菌、ウイルス、寄生虫）、物理学的な原因（機械的な刺激、熱、放射線、電気）、化学的原因などによる細胞損傷により、ヒスタミン及びキニンなどが放出され、血管拡張、毛細管透過性増大、及び炎症部位への大食細胞の集結が起こり、それによって、感染部位の血流量増加、浮腫、兔疫細胞及び抗体の移動、痛症、発熱などの現象が起こる。
【０００７】
現在使用されている炎症の治療剤には、イブプロフェンのような合成医薬品、抗ヒスタミン剤、ステロイド、コティソン、免疫抑制剤、免疫亢進制などが使用されているが、治療効果が一時的であったり、単純症状緩和であったり、あるいは過敏反応、免疫体系悪化などの副作用が多くあったりして、炎症の根本的な治療が困難である。従って、最近、効果的な炎症緩和のために、前記炎症関連タンパク質の発現を抑制することができる物質に係わる研究が進められている。しかし、そのような研究によって開発された抗炎物質の場合、いくつかの副作用が問題になっている。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とステロイド性抗炎症薬（ＳＡＩＤ）とを始めとした、多様なメカニズムの炎症抑制用薬物が開発されているが、それらは、少なくない副作用を示すだけではなく、炎症反応を根本的に抑制するものではないために、さらに効果的であって安全であり、経済性の高い薬物に対する要求が依然として存在する。一例として、急性関節炎またはリュウマチ性関節炎のような慢性炎症疾患の治療に使用される非ステロイド性消炎薬物は、ＣＯＸ−２酵素を抑制するだけではなく、ＣＯＸ−１酵素も抑制することにより、胃腸管障害のような副作用を示すと知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】KR2012-013996A
【特許文献２】KR2012-0133661A
【特許文献３】KR2011-0060940A
【特許文献４】US2011-0150873A1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bonaldi T et al., EMBOJ, (22)5551-60, 2003
【非特許文献２】Yankner BA et al., Science(New York, N. Y.)[1990, 250(4978): 279-282]
【非特許文献３】Dahlgren KN et al., J. Biol. Chem. 277: 32046-32053, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、テロメラーゼ由来のペプチドが抗炎活性を有するということを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
従って、本発明の目的は、新規ペプチドを提供するところにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、新規ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するところにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを提供するところにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを有効成分にする抗炎症組成物を提供するところにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを有効成分として含む化粧品組成物を提供するところにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを有効成分として含む医薬組成物を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一側面によれば、抗炎症活性を有するペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するペプチド、または前記ペプチドの断片であるペプチドが提供される。
【００１８】
本発明の他の側面によれば、前記断片は、３個以上のアミノ酸から構成された断片でもある。例えば、前記断片は、４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５または２６個のアミノ酸から構成された断片でもある。
【００１９】
本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されてもよい。
【００２０】
本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドでもある。例えば、前記ペプチドは、２９，２８，２７，２６，２５，２４，２３，２２，２１，２０，１９，１８，１７，１６，１５，１４，１３，１２，１１，１０，９または８個のアミノ酸から構成された断片でもある。
【００２１】
本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、ヒトテロメラーゼに由来したものでもある。
【００２２】
本発明の一側面によれば、抗炎症活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１の配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００２３】
本発明の他の側面によるポリヌクレオチドにおいて、前記断片は、３個以上のアミノ酸から構成された断片でもある。例えば、前記断片は、４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５または２６個のアミノ酸から構成された断片でもある。
【００２４】
本発明の他の側面によるポリヌクレオチドにおいて、前記ペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されたペプチドでもある。例えば、前記ペプチドは、２９，２８，２７，２６，２５，２４，２３，２２，２１，２０，１９，１８，１７，１６，１５，１４，１３，１２，１１，１０，９または８個のアミノ酸から構成された断片でもある。
【００２５】
本発明の他の側面によるポリヌクレオチドにおいて、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００２６】
本発明の他の側面によるポリヌクレオチドにおいて、前記ペプチドは、ヒトテロメラーゼに由来したものでもある。
【００２７】
本発明の一側面によれば、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１の配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む抗炎症組成物が提供される。
【００２８】
本発明の他の側面による組成物において、前記断片は、少なくとも３個のアミノ酸からなる（前記参照）。
【００２９】
本発明の他の側面による組成物において、前記ペプチドは、３０個以下のアミノ酸からなる（前記参照）。
【００３０】
本発明の他の側面による組成物において、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００３１】
本発明の他の側面による組成物において、前記ペプチドは、ヒトテロメラーゼに由来したものでもある。
【００３２】
本発明の他の側面による組成物において、前記組成物は、炎症性疾患の治療用または予防用である。
【００３３】
本発明の他の側面による組成物において、前記組成物は、皮膚炎症の改善または予防のための化粧品組成物である。
【００３４】
本発明の他の側面による組成物において、前記組成物は、炎症性疾患の治療または予防のための医薬組成物である。
【００３５】
本発明の他の側面による組成物において、前記組成物は、炎症の治療または予防のための食品組成物である。
【００３６】
本発明の他の側面による組成物で前記炎症性疾患は、（１）全身または局所の炎症疾患（例えば、アレルギー；免疫複合体疾患；枯草熱；過敏性ショック；耐毒素ショック；悪液質（cachexia）、異常高熱；肉芽腫症；または類肉腫症）；（２）胃腸管系疾患（例えば、虫垂炎；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；腹膜炎；膵腸炎；潰瘍性、急性または虚血性の大腸炎；胆管炎；胆嚢炎、脂肪便症、肝炎、クローン病；またはウィップル病）；（３）皮膚関連疾患（例えば、乾癬；火傷；日焼け火傷；皮膚炎；蕁麻疹性のいぼまたは膨疹）；（４）心血管系疾患（例えば、血管炎；脈管炎；心内膜炎；動脈炎；粥状動脈硬化症；血栓静脈炎；心膜炎；鬱血性心不全；心筋炎；心筋虚血症；結節性動脈周囲炎；再発性狭窄症；バーガー氏病；またはリューマチ熱）；（５）呼吸器系疾患（例えば、喘息；喉頭蓋炎；気管支炎；肺気腫（emphysema）；鼻炎；嚢胞性纎維症；癲癇性肺炎；慢性閉鎖性疾患（ＣＯＰＤ）；成人呼吸障害症侯群；塵肺症；肺胞炎；細気管支炎；咽頭炎；肋膜炎；または副鼻腔炎）；（６）骨、関節、筋肉及び結合組織関連疾患（例えば、読み上げ算性肉芽種；関節炎；関節痛；骨髄炎；皮膚筋炎；筋膜炎；パジェット病；通風；歯周疾患；リューマチ性関節炎；重症筋無力症；強直性脊椎炎；または潤滑膜炎）；（７）泌尿生殖系疾患（例えば、副睾丸炎；膣炎；前立腺炎；または尿道炎）；（８）中枢または末梢神経系関連疾患（例えば、アルツハイマー病；髄膜炎；脳炎；多発性硬化症；脳梗塞；脳塞栓症；キラン・バレー症侯群（Guillain-Barre syndrome）；神経炎；神経痛；骨髄外傷；麻痺；またはぶどう膜炎）；（９）ウイルス（例えば、インフルエンザ；呼吸器細胞融合ウイルス；ＨＩＶ；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルスまたはヘルペスウイルス）感染疾患（例えば、デング熱；または敗血症（septicemia））、真菌感染疾患（例えば、カンジダ症）、または細菌、寄生虫のようなその他微生物感染疾患（例えば、散在性菌血症；マラリア；糸状虫症；またはアメーバ症）；（１０）自己免疫疾患（例えば、甲状腺炎；ループス；グッドパスチャー症侯群；同種移植拒否反応；移植片対宿主病；または糖尿病）；及び（１１）癌または腫瘍性疾患（例えば、ホジキン病）からなる群から選択されるものでもある。
【００３７】
本発明の一側面によれば、前述の抗炎症組成物を投与することによって炎症性疾患を治療または予防するための方法が提供される。
【００３８】
本発明の一側面によれば、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１の配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、または前記ペプチド断片であるペプチドである、抗炎症活性を有するペプチド、または当該ペプチドを含む組成物；及び、当該ペプチド、または組成物の投与量、投与経路、投与回数及び適応症の少なくとも一つを含む指示書；を含む、炎症性疾患の予防または治療のためのキットが提供される。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、配列番号１の配列を有するペプチドは、炎症の抑制において、及び予防手段において優れた効果を有する。従って、本発明のペプチドを含む組成物は、抗炎症医薬組成物または化粧品組成物として使用され得、多様な異なる種類の炎症性疾患の治療及び予防に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＰＢＭＣ由来モノサイトを、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間刺激させた後、それぞれのペプチド、すなわち、ＦＩＴＣ，ＦＩＴＣ−ＴＡＴ，ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ペプチドで２時間処理し、その細胞培養液で、ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡを行った結果を示したグラフである（＊＊Ｐ＜０．０１；陰性対照群との比較（ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＴＡＴ）。
【図２】ＨＥＫ２９３／null及びＨＥＫ２９３／ＴＬＲ２細胞株に、ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼをトレンスフェクションし、リポプロテイン（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ１（４μＭ）で処理し、１８時間培養した後、ルシフェラーゼ分析を行った結果を示したグラフである。ルシフェラーゼ結果は、レニラ（renilla）で補正して得られたものである（＊＊Ｐ＜０．０１；陰性対照群（非治療群）及びリポプロテイン処理サンプルと比較）。
【図３】それぞれ何も処理していないもの；ＬＰＳ、ＰＥＰ１及びＬＰＳ＋ＰＥＰ１で処理したものの場合、ＴＨＰ１細胞株でのサイトカインの阻害レベルを示すグラフである。
【図４】それぞれ０，２．５，５．０，１０，４０μＭ濃度のベータアミロイドタンパク質で処理した神経幹細胞の生存力を示すグラフである。
【図５】それぞれ０，２．５，５．０，１０，４０μＭ濃度のベータアミロイドタンパク質で処理した神経幹細胞の増殖を示すグラフである。
【図６】それぞれ０，１，１０，５０，１００，２００μＭ ＰＥＰ１で処理した神経幹細胞の生存力を示すグラフである。
【図７】それぞれ０，１，１０，５０，１００，２００μＭ ＰＥＰ１で処理した神経幹細胞の増殖を示すグラフである。
【図８】２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）で処理された後で測定された神経幹細胞の生存力を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼ基盤ペプチドで処理していない集団である）。
【図９】２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）で処理された後で測定された神経幹細胞の毒性を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼ基盤ペプチドで処理していない集団である）。
【図１０】２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）で処理された後で測定された神経幹細胞の増殖を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼ基盤ペプチドで処理していない集団である）。
【図１１】２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）で処理された後で測定された神経幹細胞の移動を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼ基盤ペプチドで処理していない集団である）。
【図１２】２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）で処理された後で測定された神経幹細胞の細胞自殺（apoptosis）を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼ基盤ペプチドで処理していない集団である）。
【図１３】２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）で処理された後で測定された損傷された神経幹細胞内ＰＥＰ１の活性酸素阻害効果を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼ基盤ペプチドで処理していない集団である）。
【図１４】２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０μＭ）で処理された後で測定され、（Ａ）２Ｄ電気泳動、及び（Ｂ）抗体アレイによって分析されたタンパク質発現程度の結果を示す図面である（対照群は、ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼ基盤ペプチドで処理していない集団である）。
【図１５−１】炎症関連タンパク質の発現レベルを示すウェスタンブロットの結果を示す図面である（神経幹細胞は、２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０μＭ）で処理した）。
【図１５−２】炎症関連タンパク質の発現レベルを示すウェスタンブロットの結果を示す図面である（神経幹細胞は、２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０μＭ）で処理した）。
【図１６】ベータアミロイドタンパク質凝集に影響を及ぼすＰＥＰ１の阻害効果を示す図面であり、（Ａ）は、１μＭベータアミロイドタンパク質及びＰＥＰ １（０．１，１，１０μＭ）が共に処理されたとき、ベータアミロイドタンパク質の低下したオリゴマー化を示し、（Ｂ）は、すでに凝集が誘導されたベータアミロイドタンパク質をＰＥＰ １で処理した場合を示す。
【図１７】ＰＩ３Ｋ抑制剤である、ＬＹ２９４００２が、ＰＥＰ １で処理されたときに細胞の生存力に及ぼす効果を示し、細胞生存率は、ＰＥＰ １で処理された後で上昇し、ＬＹ２９４００２で処理した後に低下した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、多様な変換を加えることができ、さまざまな実施例を有するが、以下、本発明についてさらに具体的に説明する。しかし、それは、本発明を特定の実施形態について限定するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものであると理解されなければならない。本発明について説明するにあたり、関連公知技術に係わる具体的な説明が、本発明の要旨を不明確にすると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【００４２】
テロメア（telomere）は、染色体の末端に反復して存在する遺伝物質であり、当該染色体の損傷や、他の染色体との結合を防止すると知られている。細胞が分裂するたびに、テロメアの長さは少しずつ短くなるが、一定回数以上の細胞分裂後、テロメアの長さは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死滅する。一方、テロメアを長くすれば、細胞の寿命が延長すると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（telomerase）という酵素が分泌し、テロメアが短くなることを防ぐために、癌細胞が死滅せず、続けて増殖可能であると知られている。本発明は、抗炎症効果を有するテロメラーゼ由来のペプチドの発見に基づいてなされた。
【００４３】
本発明の一側面によれば、抗炎症活性を有するペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを提供する。
【００４４】
本発明において抗炎症活性を有するペプチドは、下記配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドである。下記配列番号１のペプチドは、テロメラーゼでの［６１１−６２６］の位置にある１６個アミノ酸から構成されたペプチドである。
【００４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１  ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ
【００４６】
本発明の一側面は、抗炎症活性を有するペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドを利用して、ペプチドを量産することができる。例えば、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主細胞に入れて培養することにより、ペプチドを量産することができる。
【００４７】
本明細書に開示されたペプチドは、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超の配列相同性を有するペプチドを含んでもよい。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチドまたはその断片、及び１個超のアミノ酸、２個超のアミノ酸、３個超のアミノ酸、４個超のアミノ酸、５個超のアミノ酸、６個超のアミノ酸または７個超のアミノ酸が変化されたペプチドを含んでもよい。
【００４８】
本明細書において、「相同性（homology）」及び「配列同一性（sequence identity）」というのは、相互変換可能に使用され、それは、２個のアミノ酸（または、関連したものとして核酸）間での配列のオーバーラップ程度を示す。
【００４９】
本明細書において、ペプチドや核酸に対して「配列同一性」の用語使用にあたって特に使用していないとしても、配列の同一性は、（ｎref−ｎdif）＊１００／ｎrefを使用して計算され、前記計算式で、２つの配列を整列し、最多の一致数が出てくるとき、ｎdifは、２つの配列間で非一致残基の総個数を、ｎrefは、２つの配列のうち短い配列の残基の総個数を意味する。例えば、ＤＮＡ配列ａｇｔｃａｇｔｃは、ａａｔｃａａｔｃの配列との配列同一性を前記式で求めれば、７５％である（ｎref＝８、ｎdif＝２）。
【００５０】
本明細書の一側面で、配列の同一性は、従来公知の下記の方法で決定された：Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, by the search for similarity method of Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, using the CLUSTAL W algorithm of Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res 22:467380, by computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group). The BLAST algorithm (Altschul et al., 1990, Mol. Biol. 215:403-10) for which software may be obtained through the National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/) may also be used. When using any of the aforementioned algorithms, the default parameters for "Window" length, gap penaltyなど。
【００５１】
本発明の一側面で、アミノ酸変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるようなアミノ酸変化が行われる。
【００５２】
本発明の一側面で、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されてもよい。
【００５３】
本発明の一側面で、配列番号１の配列を有するペプチド、前記ペプチド配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドは、テロメラーゼ、具体的には、ヒトテロメラーゼに由来したペプチドを含む。
【００５４】
本明細書において「アミノ酸」とは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸だけではなく、Ｄ−アイソマー及び変形されたアミノ酸を含む。それによって、本発明の一側面においてペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドでもある。一方、本発明の他の側面においてペプチドは、翻訳後変形（post-translational modification）された非標準アミノ酸などを含んでもよい。翻訳後変形の例は、リン酸化（phosphorylation）、糖化（glycosylation）、アシル化（acylation）（例えば、アセチル化（acetylation）、ミリストイル化（myristoylation）及びパルミトイル化（palmitoylation）を含む）、アルキル化（alkylation）、カルボキシル化（carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）、糖化反応（glycation）、ビオチニル化（biotinylation）、ユビキチニル化（ubiquitinylation）、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去脱イミド化、脱アミド化）及び構造的変化（例えば、二硫化物ブリッジの形成）を含む。また、ペプチドコンジュゲートを形成するための架橋剤（cross linker）との結合過程で起こる化学反応によって生ずるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボン酸基または側鎖での変化のようなアミノ酸の変化を含む。
【００５５】
本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から同定及び分離された野生型ペプチドでもある。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１の断片であるペプチドと比較し、一つ以上のアミノ酸が置換、欠失及び／または挿入されたアミノ酸配列を含む、人工変異体でもある。人工変異体でだけではなく、野生型ポリペプチドでのアミノ酸変化は、タンパク質のフォールディング（folding）及び／または活性に、有意の影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換を含む。保存性置換の例としては、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般的に、特異的活性を変更させないアミノ酸置換が本分野に公知されている。最も一般的に発生する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにそれらと反対であるものである。保存的置換の他の例は、下記表１の通りである。
【００５６】
【表１】
2018039806.tif 000003
【００５７】
ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたは螺旋立体構造の維持におけるそれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷または疎水性の維持におけるそれらの効果、または（ｃ）側鎖のバルク維持におけるそれらの効果が、相当に異なる置換部を選択することによって行われる。天然残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに区分される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００５８】
非保存的置換は、それら部類のうち１つの構成員を、他の部類で交換することによって行われる。ペプチドの適当な立体構造の維持と関連がないいかなるシステイン残基も、一般的にセリンで置換され、前記分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋結合を防止することができる。逆に言えば、システイン結合を、前記ペプチドに加え、その安定性を向上させることができる。
【００５９】
ペプチドの他の類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化したものである。変化という意味は、ペプチドで発見された一つ以上の炭水化物残基の欠失、及び（または）ペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を示す。
【００６０】
ペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−連結されたり、あるいはＯ−連結されたものである。Ｎ−連結されたということは、炭水化物残基がアスパラギン残基の側鎖に付着したということをいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）は、炭水化物残基をアスパラギン側鎖に酵素的付着を行わせるための認識配列である。従って、それらトリペプチド配列のうち一つがポリペプチドに存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ−連結されたグリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンに付着させることを意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。
【００６１】
ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、一つ以上の前述のトリペプチド配列を含むように、アミノ酸配列を変化させることによって便利に行われる（Ｎ−連結されたグリコシル化部位の場合）。そのような変化は、一つ以上のセリン残基またはトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、あるいはそれら残基で置換することによってもなされる（Ｏ−連結されたグリコシル化部位の場合）。
【００６２】
本発明の一側面で、ポリヌクレオチドは、核酸分子であり、自然発生的または人工的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり、一本鎖または二本鎖でもある。核酸分子は、一つ以上でもあるが、同一類型の（例えば、同一ヌクレオシド配列を有する）核酸分子でもあり、他の類型としての核酸分子でもある。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、decoy ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＰＮＡ、アンチセンスオリゴマー（antisense oligomer）、プラスミド（plasmid）、及びそれ以外の変形された核酸のうち一つ以上を含むが、それらに制限されるものではない。
【００６３】
ＨＭＧＢ１タンパク質は、外部刺激によって核内に存在するＨＭＧＢ１タンパク質がアセチル化されて細胞質に移動していて、その後細胞外部に分泌されることによって、炎症誘発サイトカイン（cytokine）の役割を行うと知られている。そのように炎症がある場合、ＨＭＧＢ１タンパク質が細胞外部に分泌されるので、炎症性疾患であるチャーグ・ストラウス症侯群、リューマチ関節炎及びシェーグレン症候群の患者の血清は、正常人よりはるかく多くの量のＨＭＧＢ１タンパク質を有する。従って、炎症が誘発されるいかなる刺激が与えられても、細胞核内のＨＭＧＢ１タンパク質量が多ければ、それは、ＨＭＧＢ１タンパク質が細胞外部に分泌されていないということを意味するので、炎症が抑制されていると見られる。
【００６４】
本発明の一側面において、配列番号１の配列を含むペプチド、前記ペプチド配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、又は上記ペプチドの断片で細胞が処理されるとき、細胞核内ＨＭＧＢ１タンパク質の量は増加する。それは、上記ペプチドが優れた炎症の予防効果または抑制効果を有するということを意味する。
【００６５】
また、本発明の一側面による配列番号１の配列を含むペプチド、前記ペプチド配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、又は上記ペプチドの断片は、細胞内毒性が低いために高い実施可能性を有するという長所を有する。
【００６６】
本明細書において「炎症性疾患」は、炎症を主な原因にする疾患、または疾患によって炎症が発生する疾患など炎症と係わる疾患をいずれも含む広範囲な概念である。具体的には、炎症性疾患は、（１）全身または局所の炎症疾患（例えば、アレルギー；免疫複合体疾患；枯草熱；過敏性ショック；耐毒素ショック；悪液質（cachexia）、異常高熱；肉芽腫症；または類肉腫症）；（２）胃腸管系疾患（例えば、虫垂炎；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；腹膜炎；膵腸炎；潰瘍性、急性または虚血性の大腸炎；胆管炎；胆嚢炎、脂肪便症、肝炎、クローン病；またはウィップル病）；（３）皮膚関連疾患（例えば、乾癬；火傷；日焼け火傷；皮膚炎；蕁麻疹性のいぼまたは膨疹）；（４）心血管系疾患（例えば、血管炎；脈管炎；心内膜炎；動脈炎；粥状動脈硬化症；血栓静脈炎；心膜炎；鬱血性心不全；心筋炎；心筋虚血症；結節性動脈周囲炎；再発性狭窄症；バーガー氏病；またはリューマチ熱）；（５）呼吸器系疾患（例えば、喘息；喉頭蓋炎；気管支炎；肺気腫（emphysema）；鼻炎；嚢胞性纎維症；癲癇性肺炎；慢性閉鎖性疾患（ＣＯＰＤ）；成人呼吸障害症侯群；塵肺症；肺胞炎；細気管支炎；咽頭炎；肋膜炎；または副鼻腔炎）；（６）骨、関節、筋肉及び結合組織関連疾患（例えば、好酸性肉芽種；関節炎；関節痛；骨髄炎；皮膚筋炎；筋膜炎；パジェット病；通風；歯周疾患；リューマチ性関節炎；重症筋無力症；強直性脊椎炎；または潤滑膜炎）；（７）泌尿生殖系疾患（例えば、副睾丸炎；膣炎；前立腺炎；または尿道炎）；（８）中枢または末梢神経系関連疾患（例えば、アルツハイマー病；髄膜炎；脳炎；多発性硬化症；脳梗塞；脳塞栓症；キラン・バレー症侯群（Guillain-Barre syndrome）；神経炎；神経痛；骨髄外傷；麻痺；またはぶどう膜炎）；（９）ウイルス（例えば、インフルエンザ；呼吸器細胞融合ウイルス；ＨＩＶ；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルスまたはヘルペスウイルス）感染疾患（例えば、デング熱；または敗血症（septicemia））、真菌感染疾患（例えば、カンジダ症）、または細菌、寄生虫及び類似の微生物感染（例えば、散在性菌血症；マラリア；糸状虫症；またはアメーバ症）；（１０）自己免疫疾患（例えば、甲状腺炎；ループス；グッドパスチャー症侯群；同種移植拒否反応；移植片対宿主病；または糖尿病）；または（１１）癌または腫瘍性疾患（例えば、ホジキン病）を含むが、それらに制限されるものではない。
【００６７】
そのような疾病の炎症性要素の治療は、数十年間、全世界製薬業界の最も重要な目標であり、数多くの有用な治療法が開発されてきた。その例としては、コルチコステロイド（プレドニソロン、メチルプレドニソロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾンなどを含み、コルチゾールの効果を模倣するように考案された多様な範囲の天然、半合成及び合成の製剤）、シクロオキシゲナーゼ抑制剤（インドメタシン、スルファサラジン及びアスピリンのように、非選択性またはｃｏｘ−１選択性、及びさらに最近のセレコキシブのように、ｃｏｘ−２選択性）、（モンテルカストのような）ロイコトリエン遮断製、及び（サリドマイドのような低分子ＴＮＦ−α合成抑制剤だけではなく、インフリキシマブ（RemicadeTM）及びアダリムマブ（HumiraTm）を含む改良モノクローナル中和抗体、エタネルセプト（EnbrelTM）のようなＴＮＦ受容体融合タンパク質のような）抗ＴＮＦを含む。
【００６８】
本発明の一側面では、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む抗炎症組成物を提供する。
【００６９】
本発明の一側面による抗炎症組成物は、一側面では、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを０．１μｇ／ｍｇないし１ｍｇ／ｍｇ、具体的には１μｇ／ｍｇないし０．５ｍｇ／ｍｇ、さらに具体的には１０μｇ／ｍｇないし０．１ｍｇ／ｍｇの含量で含んでもよい。前記範囲で含む場合、本発明の意図した効果を示すのに適切なだけではなく、組成物の安定性及び安全性をいずれも満足することができ、コスト対比効果の側面で、も前記範囲で含むことが適切である。
【００７０】
本発明の一側面による組成物は、ヒト、犬、ニワトリ、豚、牛、羊、ギニアピッグまたは猿を含む全ての動物に適用されてもよい。
【００７１】
本発明の一側面において、該組成物は、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列の断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％超の配列相同性を有するペプチドを有効成分として含む炎症性疾患の治療用または予防用の医薬組成物を提供する。本発明の一側面において、医薬組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内または皮下手段を通じて投与されてもよい。
【００７２】
経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質または硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤または乳濁剤でもあるが、それらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁液剤、乳剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤でもあるが、それらに制限されるものではない。
【００７３】
本発明の一側面による医薬組成物は、必要によっては、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料または甘味剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の一側面による医薬組成物は、当業界の一般的な方法によって製造されてもよい。
【００７４】
本発明の一側面による医薬組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路、または処方者の判断によって異なる。そのような因子に基づいた適用量の決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、０．１μｇ／ｋｇ／日ないし１ｇ／ｋｇ／日、具体的には１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には１０μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には５０μｇ／ｋｇ／日ないし１００μｇ／ｋｇ／日になるが、それらに制限されるものではない。本発明の一側面による医薬組成物は、１日１回ないし３回投与されるが、それに制限されるものではない。
【００７５】
本発明の一側面では、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む皮膚炎症の改善用または予防用の皮膚外用剤組成物を提供する。
【００７６】
本発明の他の一側面では、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む皮膚炎症の改善用または予防用の化粧品組成物を提供する。
【００７７】
本発明の一側面による皮膚外用剤組成物または化粧品組成物は、局所適用に適する全ての剤形に提供されてもよい。例えば、溶液、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、泡沫（foam）またはエアロゾールの剤形で提供されてもよい。そのような剤形は、当該分野の一般的な方法によって製造されてもよい。
【００７８】
本発明の一側面による化粧品組成物は、主効果を損傷させない範囲内で、望ましくは、主効果に相乗効果を与えることができる他の成分を含んでもよい。また、本発明の一側面による化粧品組成物は、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機または無機の顔料、香料、冷感剤または制汗剤をさらに含んでもよい。前記成分の配合量は、本発明の目的及び効果を損傷させない範囲内で、当業者が容易に選定可能であり、その配合量は、化粧品組成物全体重量を基準に、０．０１ないし５重量％、具体的には０．０１ないし３重量％でもある。
【００７９】
本発明の一側面において該組成物は、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列の断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％超の配列相同性を有するペプチドを有効成分として含む炎症予防用または抑制用の食品組成物を提供する。
【００８０】
本発明の一側面による食品組成物の剤形は、特別に限定されるものではないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などで剤形化にもなる。各剤形は、有効成分以外に、当該分野で一般的に使用される成分を剤形または使用目的によって、当業者が困難なしに、適宜選定して配合することができ、他の原料と同時に適用する場合、相乗効果が起こるのである。
【００８１】
前記有効成分の投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、具体的には１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には１０μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には５０μｇ／ｋｇ／日ないし１００μｇ／ｋｇ／日にもなるが、それらに制限されるものではなく、投与する対象の年齢、健康状態、合併症など多様な要因によって異なる。
【００８２】
本発明の一側面においては、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドの炎症性疾患の予防用途または治療用途を提供する。
【００８３】
本発明の一側面によれば、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドの炎症性疾患を予防または治療する方法が提供される。
【００８４】
本発明の一側面において、炎症性疾患の予防用または治療用のキットが提供される。当該キットは、抗炎症活性を有するペプチド又は当該ペプチドを含む組成物と、ペプチドまたは組成物の投与量、投与経路、投与回数及び適応症のうち一つ以上を含む指示書とを含み得る。ここで、当該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列と８０％超の配列相同性を有するか、または前記ペプチドの断片である。
【００８５】
本明細書で使用された用語は、特定具体例について説明するための目的のみに意図されたものであり、本発明を限定する意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞物品が一つ以上存在するということを示すものである。用語「含む」、「有する」及び「なる」は、開かれた用語と解釈される（すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」という意味）。
【００８６】
数値の範囲を言及したのは、ただその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を個別的に言及することの代わりとする容易な方法だからであり、そうではないということが明示されていない限り、各別個の数値は、まさに個別的に明細書に言及されているように本明細書に統合される。全ての範囲の終値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。
【００８７】
本明細書に言及された全ての方法は、異なって明示されているか、あるいは文脈によって明白に矛盾しない限り、適切な手順で遂行されてもよい。ある一実施例及び全ての実施例、または例示的言語（例えば、「〜のような」）を使用するのは、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明をさらに良好に記述するためであり、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる言語も、いかなる非請求の構成要素を、本発明の実施に必須なものであると解釈されてはならない。取り立てての定義がない限り、本明細書に使用される技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野で当業者によって、通常理解されるような意味を有する。
【００８８】
本発明の望ましい具体例は、本発明を遂行するために、発明者に知られた最適のモードを含む。望ましい具体例の変動は、先行記載を読めば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がかような変動を適切に利用することを期待し、本明細書に記載されたところと異なる方式で本発明が実施されることを期待する。従って、本発明は、特許法によって許容されるように、添付された特許請求の範囲で言及された発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変動内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせでも、ここで反対に明示するか、あるいは文脈上明白に矛盾しない限り、本発明に含まれるものである。本発明は、例示的な具体例を参照し、具体的に示されて記述されたが、当業者であるならば、特許請求の範囲によって定義される発明の精神及び範囲を外れずとも、形態及びディテールにおいて、多様な変化が行われるということを十分に理解するであろう。
【００８９】
腫瘍懐死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦ−αは、炎症性細胞から放出され、多彩な細胞毒性反応、免疫反応及び炎症反応を起こすと知られている。ＴＮＦ−αは、多くの炎症疾患及び自己免疫疾患の発症や遷延化に関与し、また血液中に放出されて全身に作用すれば、重症の敗血症及び敗血症性ショックを起こということが知られている。そのようにＴＮＦ−αは、生体の免疫系に広範囲に関連する因子であるために、ＴＮＦ−αを抑制する薬剤の開発が活発に実施されている。ＴＮＦ−αは、不活性型に生合成され、プロテアーゼによって切断されて活性型になるが、その活性化に関与する酵素は、腫瘍懐死因子変換酵素（ＴＡＣＥ）と呼ばれている。従って、そのＴＡＣＥを阻害する物質は、ＴＮＦ−αから起因する疾患、病態、異常状態、状態が不良、不良な自覚症状などを治療、改善、予防することができる。
【００９０】
ＨＭＧＢ１（high-mobility group box １）タンパク質は、胸腺、リンパ節、睾丸、胎児の肝臓などで高い濃度で存在し、肝細胞と脳細胞とを除けば、ほとんどの細胞では、主に核内に存在する。そのような前記ＨＭＧＢ１タンパク質は、Ａ−box、Ｂ−box、Ｃ−terminalから構成された３個のドメイン（domain）を有している。
【００９１】
ＨＭＧＢ１タンパク質が炎症を誘発するサイトカインの役割を行うということは、１９９９年、Traceyらによって報告され、前記ＨＭＧＢ１の炎症誘発メカニズムは、外部刺激によって、核内に存在するＨＭＧＢ１がアセチル化された後に細胞質に移動する。その後、細胞外に分泌されるか、あるいは懐死に陥った細胞から外部に分泌されると知られている（Bonaldi T et al., EMBO J, (22)5551-60, 2003）。
【００９２】
以下、実施例及び実験例を挙げ、本発明の構成及び効果についてさらに具体的に説明する。しかし、下記実施例及び実験例は、本発明の理解の一助とするために、例示の目的にのみ提供されたものであり、本発明の範疇及び範囲がそれらによって制限されるものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１：ＰＥＰ １（配列番号１）の合成及び抗炎活性測定
実験例１：ＰＥＰ １（配列番号１）の合成
ヒトテロメラーゼから選別された下記配列ＳＥＱ ＩＤ：１（ＰＥＰ １）を有する下記化学構造１を有する１６個のアミノ酸から構成されたペプチドを合成した。
【００９４】
【化１】
2018039806.tif 000004
【００９５】
配列番号１のペプチドＰＥＰ １は、従来公知の固相ペプチド合成法によって製造することができた。具体的には、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron、Ｉｎｃ．，大韓民国大田所在）を利用して、Ｆｍｏｃ固相合成法（ＳＰＰＳ：solid phase peptide synthesis）を介して、Ｃ−末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることによって合成した。次のように、ペプチドのＣ−末端の最初のアミノ酸が樹脂に付着したものを使用した。例えば、次の通りである：
【００９６】
ＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ2−Ａｌａ−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ2−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−chloro−Trityl Resin
【００９７】
ペプチド合成に使用した全てのアミノ酸原料は、Ｎ−termがＦｍｏｃによって保護され、残基は、いずれも酸で除去されるＴｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（ｔ−butylester）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−pentamethyl dihydro−benzofuran−５−sulfonyl）などによって保護されたものを使用した。例えば、次の通りである：
【００９８】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−Mercaptoaceticacid
【００９９】
カップリング試薬（coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−Benzotriazole−１−yl）−１，１，３，３−tetamethylaminium hexafluorophosphate］／ＨＯＢｔ［Ｎ−Hydroxxybenzotriazole］／ＮＭＭ［４−Methylmorpholine］を使用した。Ｆｍｏｃ除去は、２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を利用した。合成されたペプチドをResinから分離し、残基の保護基を除去するためには、切断カクテル（cleavage cocktail）［ＴＦＡ（trifluoroacetic acid）／ＴＩＳ（triisopropylsilane）／ＥＤＴ（ethanedithiol）／Ｈ2Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を使用した。
【０１００】
アミノ酸保護基が結合された出発アミノ酸が固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸をそれぞれ反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護する過程を反復することにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを樹脂から切り取った後、ＨＰＬで精製し、合成をＭＳで確認して、その後凍結乾燥した。
【０１０１】
ＰＥＰ １の具体的な合成過程について説明すれば、次の通りである。
１）カップリング
ＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resinに保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解させて添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を加え、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
３）１及び２の反応を反復して行い、ペプチド基本骨格ＮＨ2−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin）を作った。
４）切断（cleavage）：合成が完了したペプチドResinに、切断カクテル（cleavage cocktail）を加え、ペプチドをレジンから分離した。
５）得られた混合物（mixture）に、cooling diethyl etherを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させる。
６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認して凍結させ、パウダーに製造した。
【０１０２】
実験例２：ＰＥＰ １の抗炎症活性測定
細胞株培養
韓国細胞株銀行から分譲されたRaw ２６４．７macrophage cell（ＫＣＢＬ、４００７１）は、１０％ fetal bovine serum（ＦＢＳ；Gibco Laboratories）と、１００unit／ｍＬのstreptomycin及びpenicillin（Gibco Laboratories）が添加されたDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ；ＰＡＡ，Austria）培地を使用して、１×１０6細胞／ｍｌに調節した後、９６ウェルプレートに接種し、３７゜Ｃ、５％ ＣＯ2の条件で前培養した。
【０１０３】
翌日、培地を除去し、新たな培地に代替し、実験例１を介して得られたペプチド試料を５μｇ／ｍＬ細胞に加えた。３０分間ＣＯ2インキュベータで培養した後、５０μｌのＬＰＳ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を含んだ培地を処理し、インキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）で２４時間培養した。炎症反応モデルは、各ウェル当たり１μｇ／ｍＬリポ多糖（ＬＰＳ：lipopolysaccharide；Sigma，ＵＳＡ）を処理し、対照群は、フォスフェリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）処理を行った。ＬＰＳ処理モデル及び対照群から得たそれぞれの細胞培養液は、追加分析のために、エッペンドルフチューブ（eppendorf tube）に入れて保管した。
【０１０４】
実験例２−１．酸化窒素（ＮＯ）分析
酸化窒素の定量は、Raw ２６４．７細胞（１×１０6細胞／ｍｌ）を利用して、グリース反応液システム（Griess reagent system；Promega，ＵＳＡ）を使用して測定する方法を使用した。９６−ウェルプレートに培養液５０μｌを入れ、グリース反応液Ｉ（ナフチルエチレンジアミド（ＮＥＤ）溶液）及びグリース反応液ＩＩ（スルファニルアミド溶液）を同量で混合して入れ、１０分間の反応後、３０分以内に、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices，ＵＳＡ）を利用して、光学密度５４０ｎｍで測定した。酸化窒素（ＮＯ）の濃度は、亜硝酸ナトリウムの標準曲線（０〜１００μＭ）を利用して計算した
下記表３に示されているように、ＬＰＳは、ＮＯの生成を増加させたが、ＬＰＳとペプチドＰＥＰ １とを同時に処理した場合、ＮＯ生成量が減少するということを確認することができた。特に、ＰＥＰ １を処理した場合には、炎症の誘発時に生成されるＮＯの生成量が６５％減少したと推し量るとき、炎症誘発が抑制されたということが分かった。
【０１０５】
【表２】
2018039806.tif 000005
【０１０６】
実験例２−２．サイトカイン生成抑制効果の分析
ＰＥＰ １の炎症性サイトカイン生成抑制効果を調査するために、RAW ２６４．７cellを、ヒトテロメラーゼ由来ＰＥＰ １５μｇ／ｍＬ濃度でまず処理した後、ＬＰＳ １μｇ／ｍＬ濃度で処理し、２４時間さらに培養した。細胞培養液（culture medium）を含む上澄み液サンプルを採集し、ＥＬＩＳＡキット（ｅBioscience，San Diego）を使用して、サイトカインレベルを分析した。
【０１０７】
９６−ウェルプレートは、１００μｌのキャプチャ抗体（capture antibodies；製造社のプロトコルによる推薦濃度によってなるコーティングバッファに溶解されたもの）でコーティングされ、４℃で一晩反応させた。そして、プレートを５回洗浄した後、２００μｌのアッセイ希釈液（diluents）を各ウェルに添加し、ブロッキングの間、室温で１時間反応させた。各ウェルをウォッシュバッファで５回洗浄した後、細胞培養液サンプル、または各サイトカイン標準タンパク質サンプルは希釈され、１００μｌずつ各ウェルに添加された。サンプルを含んだプレートは、４℃で一晩反応させた。その後、プレートをウォッシュバッファで５回洗浄した後、１００μｌの二次抗体と、アビジン（avidin）の接合体（conjugate）とを添加し、室温で１時間反応させた。
【０１０８】
二次抗体と共に反応させた後、プレートを５回洗浄し、１００μｌのアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ Bioscience）と共に、３０分間室温で反応させた。プレートを７回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ溶液（Pierce）を添加し、１５分間室温で反応させた。反応は、各ウェルに、５０μｌの２Ｎ硫酸（Ｈ2ＳＯ4）を添加することによって終了した。４５０ｎｍで、光学密度が、マイクロプレートリーダー（reader）を使用して測定された。統計学的分析は、ＳＰＳＳプログラムのＡＮＯＶＡプロシージャを使用して、変量分析で実施され、分析間の有意点は、Duncan’s multiple range testを使用して検証された。
【０１０９】
実験例２−３：ＩＬ−６分泌測定
下記表４に示されているように、ＬＰＳは、サイトカインＩＬ−６（interleukin−６）の分泌を増加させたが、ＬＰＳ及びＰＥＰ １を同時に処理した場合、炎症関連サイトカインＩＬ−６の分泌量が減少するということを確認するということができた。特に、ＰＥＰ １を処理した場合には、炎症誘発関連サイトカインの分泌量を７０％超減少させ、すぐれた抗炎活性を示した。
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
実験例２−４：ＨＭＧＢ１、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２の発現抑制能測定
タンパク質発現の分析は、ウェスタンブロット分析（Western blot analysis）によって行ったが、ヒトテロメラーゼ由来ペプチドが処理された培地で育った細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理した後、遠心分離を行って細胞を集めた。そのように集められた細胞に、適量のリシスバッファで溶解させた後、細胞内残渣物を分離させ、同量のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離されたタンパク質を、ニトロセルロース膜（nitrocellulose membrane；Schleicherand Schuell，Keene，ＮＨ，ＵＳＡ）に転移させた後、特定タンパク質に対する抗体と、それに対する二次抗体との反応を実施した後、ＥＣＬ（enhanced chemiluminoesence）溶液（Amersham Life Science Ｃｏｒｐ．，Arlington Heights，ＩＬ，ＵＳＡ）を適用させた後、Ｘ線フィルムに感光させ、タンパク質の発現程度を分析した。
【０１１２】
ＮＯ生成抑制メカニズムであるＴＮＦ−αと、ＣＯＸ−２タンパク質との関連性を確認するために、ウェスタンブロットを介して、発現量を測定した結果、下記表５に示されているように、ＬＰＳは、サイトカインＨＭＧＢ１、ＴＮＦ−α、ＣＯＸの発現を増加させたが、ＬＰＳ及びＰＥＰ １を同時に処理した場合、炎症関連タンパク質の発現量が減少するということを確認することができた。特に、本発明のＰＥＰ １を処理した場合には、炎症誘発関連サイトカインタンパク質の発現量を７０％超減少させ、すぐれた抗炎症活性を示した。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
実験例３：ＰＥＰ １の肝臓癌細胞株でのＴＮＦα阻害活性検証
実験例３−１：細胞株培養
健常者から血液を採血（５０ｍｌ）した後、Ficoll−PaqueTM ＰＬＵＳ（ＧＥ Healthcare Life Sciences，Piscataway，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して、ＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cell）層を回収した。回収されたＰＢＭＣは、ヒト血清（２０％）が添加されたＲＰＭＩ １６４０培地（Invitrogen／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）で富化させ、３０分ほどヒト血清をコーティングした１００−ｍｍポリスチレン細胞培養プレートに移し、２時間３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで培養した。その後、細胞培養プレートの底に付着したモノサイトを、冷たいＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）（Gibco／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）で引き離した後、９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０5セルになるように、ＲＰＭＩ １６４０培地（supplemented with penicillin-streptomycin；１００ｍｇ／ｍｌ、human serum；２０％）で実験前日に培養した。
【０１１５】
また、ＴＬＲ ２（toll-like receptor ２）が安定して発現されるＨＥＫ２９３（human embryonic kidney ２９３）細胞株（ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ ２）と、一般的なＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３／null）細胞株とをソウル大学校歯科大学院から分譲してもらい、ルシフェラーゼ（luciferase）分析に使用した。ＨＥＫ２９３／nullとＨＥＫ２９３／ＴＬＲ ２細胞株は、ルシフェラーゼ分析実験前日に、１２ウェルプレートに、ウェル当たり２．５×１０5セルになるように、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培地（supplemented with blasticidin；１０μｇ／ｍｌ、fetal bovine serum；１０％）（Invitrogen／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）で富化させて実験前日培養した。
【０１１６】
実験例３−２：サイトカインアッセイ（Cytokine assay）
ＰＥＰ １がＴＮＦ−αのタンパク質発現程度に、いかなる影響を及ぼすかということを調べるために、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）実験を行った。ＰＢＭＣに由来したモノサイトを、９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０5セルになるように実験前日に培養させた。その後、ＬＰＳ（lipopolysaccharide；１０ｎｇ／ｍｌ、Sigma）を２時間処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Invitrogen／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）を入れ、１時間飢餓状態処理（starvation）した後、ＦＩＴＣ（Fluorescein Isothiocyanate）、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ、ＰＥＰ １−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ １の４μＭで処理し、ＴＮＦ−αレベル測定前に２時間培養した。培養が終了した後、細胞培養液を集め、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ，Minneapolis，ＭＮ，ＵＳＡ）キットマニュアルによってＴＮＦ−αを定量した。具体的な定量方法は、次の通りである。
【０１１７】
ＴＮＦ測定は、サンドイッチ（sandwich）ＥＬＩＳＡ法を利用する。あらかじめコーティングされている９６ウェルプレートに、ＴＮＦα一次抗体（primary antibody）を１００μｌずつ入れ、４℃で前日に培養する。翌日、０．５％tween ２０ウォッシュ溶液で、５分ずつ３回洗浄した後、測定するサンプルと標準溶液とを１００μｌずつ入れ、２時間常温で反応させる。前述のようにプレート洗浄した後、ＨＲＰ結合された検出用二次抗体を、各１００μｌずつ入れ、２時間常温で反応させる。その後、さらにプレート洗浄し、avidin／biotinを添加して発色させ、吸光度を測定する。標準溶液の吸光度を利用して標準曲線を求め、それを利用して、各サンプルのＴＮＦ−αを定量する。
【０１１８】
ＰＢＭＣ由来モノサイトを、エンドトキシン（endotoxin）であるＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間刺激させ、１時間ＯＰＴＩ−ＭＥＭで飢餓状態処理（starvation）した後、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ、ＰＥＰ １−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ １で、４μＭの濃度で２時間処理した。反応後、細胞培養液のＴＮＦ−αレベルを、ＥＬＩＳＡで測定した結果、ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＴＡＴの場合、ＬＰＳによって、ＴＮＦ−αレベルが高く測定されたが（６．２及び６．７ｎｇ／ｍｌ）、ＰＥＰ １−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ １の場合、ＴＮＦ−αレベルが大きく低下した傾向を示し（０．１７及び０．２５ｎｇ／ｍｌ）、その差は、統計学的に有意な結果であると確認された（Ｐ＜０．０１）（図１）。
【０１１９】
実験例３−３：ルシフェラーゼ分析（Luciferase Assay）
炎症反応（inflammatory response）でのＰＥＰ １の役割を調査するため、ルシフェラーゼ分析（Luciferase assay）を介して、ＮＦ−ｋＢ発現パターン（expression patterns）を評価した。第一に、１２ウェルプレートに、ウェル当たり２．５ｘ１０5セルになるように、ＨＥＫ２９３／nullと、ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ ２（Graduate School of Dentistry，Seoul National University）を２４時間培養した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、培地は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Invitrogen／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）に交換して４時間培養した後、３μｌ lipofectamine（Invitrogen／Life Technologies）、１μｌ ＮＦ−ｋＢ ルシフェラーゼ、１０ｎｇ renilla luciferase（Promega，Madison，ＷＩ，ＵＳＡ）混合物を各ウェルに加えた後、４時間さらに培養した。陰性対照群を除外した全てのウェルに、Lipoprotein ｐａｍ３ｃｙｓ（１０ｎｇ／ｍｌ、Sigma−Aldrich，Ｓｔ．Louis，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え、ＰＢＳで３回洗浄する前に、１８時間ＦＩＴＣ（４μＭ）とＦＩＴＣ−ＰＥＰ １（４μＭ）とで処理した。dual-luciferase reporter assayシステム（Promega）によって提供されることにより、それぞれのウェルに、５０μｌ passive溶解緩衝剤（lysis buffer）を加えて細胞を溶解させた後、ＴＤ−２０／２０ luminometer（Turner designs，Sunnyvale，ＣＡ，ＵＳＡ）を介して、ＮＦ−ｋＢ活性化を確認した。Ｐｃｍｖ−renilla luciferase（Promega）のコトランスフェクションで、トレンスフェクション効能を確認し、ルシフェラーゼ値をcalibrateして結果を分析した。
【０１２０】
ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼを、ＨＥＫ２９３／nullとＨＥＫ２９３／ＴＬＲ ２細胞株とにトランスフェクションした後、合成リポプロテイン、ＦＩＴＣ（４μＭ）、陰性対照群を共に処理し、ｐａｍ３ｃｙｓは、１８時間培養するために、ＦＩＴＣ−ＰＥＰ １（４μＭ）でさらに処理した。Passive溶解緩衝剤を加えた細胞溶解を介して、ルシフェラーゼ強度を利用したＮＦ−ｋＢ発現パターン測定は、dual-luciferase reporter assayシステムによって提供され、リポプロテイン及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ １処理、またはＨＥＫ２９３／null非処理に差を示していない。しかし、ＴＬＲ ２の亢進剤であるリポプロテインを、ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ ２細胞株で処理した場合（Ｐ＜０．０１）、処理していない場合よりＮＦ−ｋＢ発現が増大し、それを介して、抗炎反応を確認することができた。また、ＮＦ−ｋＢ発現は、ＦＩＴＣ−ＰＥＰ １で共に処理した場合、処理していない場合より増大し、リポプロテインとＦＩＴＣとが共に処理された陰性対照群の場合（Ｐ＜０．０１）より低下した（図２）。結局、ＴＬＲ ２によって発生する抗炎反応は、ＰＥＰ １が共に処理されたときに低減するということを確認することができた。
【０１２１】
実験例３−４：ＴＨＰ１細胞株でのサイトカインレベルに影響を及ぼすペプチド再分析
ヒト急性単核球性白血病（Human acute monocytic leukemia）細胞株であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＳＳ：American Type Culture Collection，Manassas，ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＰＥＰ １の効能を再確認した。細胞は、密度０．５−０．７ｘ１０5cells／ｍＬのＲＰＭＩ １６４０において、このときＲＰＭＩ １６４０は、１０％ ＦＢＳ、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含み、３７℃の５％ＣＯ2で維持された。ＴＨＰ−１細胞は、ＰＭＡ（phorbol myristate acetate）１００ｎｇ／ｍＬを２４時間３７℃で処理し、大食細胞に分化させた。
【０１２２】
全ての試験薬及び培養液は、Gibco ＢＲＬ．から購入した。ＰＭＡ及びＬＰＳ、２−メルカプトエタノールは、Sigma（Ｓｔ．Louis，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ペプチドＲＩＡは、ペプトロン（大田、大韓民国）で合成された。逆転写ＰＣＲキットは、Promega（Madison，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入した。ＲＴ2 ＳＹＢＲ（登録商標） Green ｑＰＣＲマスターミックス試験薬及びＱＩＡｚｏｌｄは、ＱＩＡＧＥＮ（Valencia，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【０１２３】
大食細胞への分化後、ＴＨＰ−１細胞は、ＲＰＭＩ １６４０（洗浄１回当たり５分）を使用して、２回洗浄された。その後、細胞は、４時間１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び／または４μＭのペプチドＲＩＡで、ＦＢＳがないＲＰＭＩ １６４０で処理された。
【０１２４】
トータルＲＮＡサンプルは、ペプチド処理されたＴＨＰ−１細胞からTrizol（ＱＩＡｚｏｌ）試験薬を使用して分離され、ｃＤＮＡは、Promegaの逆転写ＰＣＲキットを、製造社プロトコルによって利用した逆転写ＰＣＲから合成された。
【０１２５】
そして、リアルタイム（ＲＴ：real-time）ｑＰＣＲは、ＣＦＸ９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）装置を、ＳＹＢＲ Greenシステムと共に使用して行われた。実験に使用されたプライマーは、表５に示した。ＰＣＲサイクル条件は、９５℃、１０分間のHotStart ＤＮＡ Ｔａｑ polymeraseの活動時間に設定され、９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒からなるサイクルの４５回が続けて遂行された。全てのサンプルは、３回反復して測定され、遺伝子発現の差は、２サイクル限界点（threshold）方式を使用して計算された。全てのデータは、β−アクチン（ハウスキーピング遺伝子）に対して正規化され、３回の独立した実験を、＋／−標準エラー（Ｓ．Ｅ．：standard error）の手段として使用した。
【０１２６】
【表５】
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【０１２７】
図３を介して確認することができるように、炎症反応に関与するサイトカインは、ＬＰＳによって、ＰＥＰ １の処理によって目立って減少した。
【０１２８】
実験例４：ベータアミロイドによって誘導された炎症反応の分析
ＨＭＧＢ１タンパク質は、外部刺激によって、核内に存在するＨＭＧＢ１タンパク質がアセチル化されて細胞質に移動していて、その後、細胞外部に分泌されることにより、炎症誘発サイトカインの役割を行うと知られている。このように、炎症がある場合、ＨＭＧＢ１タンパク質が細胞外部に分泌されるので、炎症性疾患であるチャーグ・ストラウス症侯群、リューマチ関節炎及びシェーグレン症候群の患者の血清は、正常人よりはるかに多量のＨＭＧＢ１タンパク質を有する。従って、炎症が誘発されるいかなる刺激が与えられても、細胞核内のＨＭＧＢ１タンパク質量が多ければ、それは、ＨＭＧＢ１タンパク質が細胞外部に分泌していないということを意味するので、炎症が抑制されていると見られる。
【０１２９】
実験例４−１：ＰＥＰ １の抗炎症効果による神経幹細胞の生存効果及び増殖効果の分析
まず、ＰＥＰ １を、実施例１に記載されたペプチドの製造方法によって準備した。
【０１３０】
実験例４−２：神経幹細胞の培養及びベータアミロイド毒性評価
妊娠１３日目の胎児ラットの頭から大脳皮質を分離した後、次のような培養条件で１週間、ｂＦＧＦ（Basic Fibroblast Growth Factor）で処理し、神経幹細胞を確保した。ベータアミロイドタンパク質が、前記培養された神経幹細胞に及ぼす影響を分析するために、あらかじめオリゴマー化させたベータアミロイドタンパク質を、０μＭで、４０μＭ濃度で神経幹細胞を４８時間処理した後、ＣＣＫ−８アッセイ、ＢｒｄＵ及びTUNELアッセイ利用して、細胞毒性評価を実施した。２０μＭのベータアミロイドタンパク質の処理後、６０％ほどに細胞生存率が低下するということを確認し、前述のところと同一の濃度（０μＭ〜４０μＭ）を、その後の実験に利用した（図４７及び図４８参照）。
【０１３１】
実験例４−３：ＰＥＰ １の処理による細胞毒性評価
ＰＥＰ １が、前記培養された神経幹細胞に及ぼす影響を分析するために、既存に周知の方法によって、あらかじめ０，１，１０，５０，１００，２００μＭまで多様な濃度で処理した後、ＭＴＴアッセイ、ＢｒｄＵ及びＴＵＮＥＬアッセイを利用して、細胞生存率と細胞増殖程度との評価を実施した。ＰＥＰ １の０ないし２００μＭの濃度では、細胞の生存及び増殖を阻害しないということが分かり、神経細胞系で安定しているということが確認された（図４９及び図５０参照）。
【０１３２】
実験例４−４：ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼペプチド（ＧＶ１００１）の同時処理後の細胞毒性評価
ＰＥＰ １がベータアミロイドタンパク質の神経毒性を抑制する効果があるか否かということを確認するために、２０μＭベータアミロイドタンパク質と、多様な濃度のＰＥＰ １とで４８時間処理後、細胞生存率及び死滅程度を、ＭＴＴアッセイ、ＣＣＫ−８アッセイ、ＬＤＨアッセイ及びＴＵＮＥＬアッセイを利用して評価し、ＢｒｄＵアッセイを利用して、神経幹細胞の増殖程度を分析した。
【０１３３】
ＭＴＴアッセイ、ＣＣＫ−８アッセイの分析結果、１０μＭ ＰＥＰ １が、ベータアミロイドタンパク質による神経毒性から神経幹細胞を保護し始め、１００μＭで、最良の保護効果が確認された（図８参照）。他の方法として、細胞の死滅程度を評価するＬＤＨアッセイを実施し、ベータアミロイドタンパク質によって増大した細胞死滅が、ＰＥＰ １によって効果的に低減するということを確認することができ、この場合には、１μＭ濃度から効果を見せ始めた（図９参照）。
【０１３４】
ＢｒｄＵアッセイを介しては、ベータアミロイドタンパク質によって低下した細胞の増殖（proliferation）が、ＰＥＰ １を処理した場合、増殖が回復するということを確認した（図１０参照）。
【０１３５】
神経幹細胞の特性上、細胞移動性は、非常に重要な部分である。細胞移動性に係わる実験結果、ベータアミロイドタンパク質によって低下した細胞移動が、ＰＥＰ １処理によって回復し、１０μＭ濃度の場合、対照群対比で、さらに増大しているということを確認し、その後、臨床実験で幹細胞移植前に前処理される場合、さらに効果的な結果が出てくるであろうということを示している（図１１参照）。
【０１３６】
神経幹細胞損傷程度を直接的に確認するために、TUNELアッセイを実施した。２０μＭベータアミロイドタンパク質処理群において、神経幹細胞死滅が著しく増加することを観察し、１から１００μＭ ＰＥＰ １処理によって、神経幹細胞死滅が低減するということを確認した（図１２参照）。
【０１３７】
ベータアミロイドタンパク質による細胞死滅において、ＰＥＰ １保護効果の作用メカニズムを調べる。まず、ベータアミロイドタンパク質による酸化性損傷を、ＰＥＰ １が低減させるか否かということを調べる。ＤＣＦ−ＤＡ染色試料（Molecular Probes，Eugene，ＯＲ）を利用して、ベータアミロイドタンパク質及びＰＥＰ １の処理後、活性酸素の発生変化を観察した。２０μＭのベータアミロイドタンパク質によって、活性酸素が増加し、ＰＥＰ １と共に処理した群（１μＭ、１０μＭ、５０μＭ）では、増えた活性酸素が減少するということを確認した（図１３参照）。
【０１３８】
実験例４−５：ＰＥＰ １を処理した群と、処理していない比較群とのタンパク質発現量比較分析
ＰＥＰ １処理された群と、処理されていない群とのタンパク質発現量を、２Ｄ−電気泳動技法（２−Ｄ gel electrophoresis）及び抗体マイクロアレイ（antibody microarray）技法で分析して定量した。前記実施例３の実験例１−１で培養された神経幹細胞から、プロテオームを抽出して２００μｇを準備し、ＰＥＰ １が処理されていない群を比較群として使用して、同一条件で比較分析した。
【０１３９】
２Ｄ電気泳動技法は、８．５ｘ７サイズの１２％アクリルアミドゲルを使用して、ＰＩ ４〜１０Ｎで、一次電気泳動を実施した。電気泳動後、クマシーブルー（Colloidal Coomassie Blue）染色試薬で発色させ、ＰＤQuestソフトウェアを利用して、それぞれのスポットを分析して発現量を比較した。
【０１４０】
発現量の差が１．５倍超であるものは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Matrix Desoprtion／lionization Time of Flight Mass Spectromestry）を利用して、タンパク質を同定した。そのうち、ｉ−ＮＯＳ及びＨＭＧＢ−１のような炎症関連信号伝逹と相関関係があると知られたタンパク質を同定した（表６参照）。ベータアミロイドタンパク質によって、発現量の変化が１．５倍増加又は減少したが、ＰＥＰ １を加えたとき、発現量が陰性対照群の発現量に近く調節されているということを確認した（図１４参照）。
【０１４１】
抗体マイクロアレイ技法は、細胞信号伝逹キット（ＣＳＡＡ１、PanoramaTM Ａｂ Microarray Cell Signaling kit）を利用して実施し、ＧｅｎｅＰｉｘ Personal ４１００Ａスキャナを使用して、アレイスライドをスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０（Molecular Devices）を利用してデータを分析した。
【０１４２】
下記表６は、２Ｄ電気泳動技法を介して獲得された炎症関連タンパク質の発現分析結果である。対照群は、ベータアミロイドタンパク質またはＰＥＰ １を処理していない正常細胞から抽出したタンパク質の発現量を示し、対照群の発現量を基準に増減した発現量の倍数を整理して示したものである。
【０１４３】
下記表６に提示されている分析結果を介して、ＰＥＰ １によって、炎症関連タンパク質の過剰発現（over-expression）及び過小発現（under-expression）が統制され、対照群のタンパク質発現量が陰性対照群に近い発現量を示すということを確認した。
【０１４４】
【表６】
2018039806.tif 000009
【０１４５】
ＰＩ３Ｋ（phosphatidylinositol−３−kinase）／ＡＫＴ信号伝達経路は、神経幹細胞の成長及び生存において決定的な役割を行う。ＰＩ３Ｋ経路は、多様な成長因子及び調節因子によって活性化され、神経幹細胞の成長及び生存の正常調節に関与する。ＡＫＴ信号伝達経路は、多くのプロ細胞死滅因子（pro-apoptotic factor）を非活性化させ、すでに公知の代表的細胞死滅信号であるＧＳＫ３βを抑制させる。
【０１４６】
ＰＥＰ １の抗炎症効果について、さらに詳細に確認するために、タンパク質分析で明らかな変化を示したＨＭＧＢ１に対するウェスタンブロットを行った。その結果、ＰＥＰ １の処理は、細胞生存信号であるＫｉ６７，ｐＡＫＴ，ＰＩ３Ｋ，ＨＳＴＦ−１及びＢｃｌ−２タンパク質の発現量を増加させ、細胞死滅信号であるＢａｘ，ＧＳＫ３β，Cytochrom−ｃ、caspase−３タンパク質の発現量を減少させた（図５８参照）。
【０１４７】
非ヒストン（non-histone）構造を有し、ＤＮＡに結合するタンパク質であるＨＭＧＢ１は、ヌクレオソーム（nucleosome）構造を安定化させて遺伝子発現調節を行うというような、細胞内で多様な役割を行う。炎症反応の後期段階で排出される炎症誘発物質のうち一つでもって、炎症反応が生ずるたびに刺激が加えられれば、初期に、大食細胞とモノサイドとによって排出されるが、神経細胞が著しく損傷されて懐死が生じれば、細胞外に排出され、非常に強烈な炎症反応を誘発させる。神経細胞の細胞質内で、ベータアミロイドタンパク質の処理後に減少したＨＭＧＢ１が、テロメラーゼペプチド（ＧＶ１００１）が、神経細胞死滅によるＨＭＧＢ１の細胞外排出を阻害し、細胞内での重要な役割を増大させるということを反映することにより、ＧＶ１００１が強力な抗炎症効果があり得ることを示す（図１５参照）。
【０１４８】
ベータアミロイド凝集に対するＰＥＰ １が、いかなる効果を示すかということを確認した。ベータアミロイドタンパク質の凝集誘導過程で、ＰＥＰ １で共に処理するとき、タンパク質凝集が阻害され（図１６（Ａ）参照）、すでに凝集が誘導されたベータアミロイドタンパク質にＰＥＰ １処理を行うとき、タンパク質が分解されるということが確認された（図１６（Ｂ）参照）。
【０１４９】
ＰＥＰ １の作用メカニズムにおいて、ＰＩ３Ｋ経路の細胞生存信号増加や細胞死滅信号減少などを確認したが、そのような現象が直接的なものであるか、あるいは間接的なものであるかということを確認するために、ＰＩ３Ｋ抑制剤であるＬＹ２９４００２（Promega）を前処理した結果、テロメラーゼペプチド（ＧＶ１００１）の処理後に上昇した細胞生存率が、ＬＹ２９４００２の前処理によって低下したものと見られ、ＧＶ１００１の神経保護効果において、ＰＩ３Ｋ経路に対する直接的な影響が関与するものであると確認された（図１７参照）。
【０１５０】
ＰＥＰ １は、ベータアミロイドタンパク質による神経幹細胞の死滅を抑制する効果は、神経幹細胞でさらに明らかに確認された。また、神経幹細胞の移動能向上にも寄与するということを確認し、臨床適用時に多様な可能性を提示した。ＰＥＰ １の作用メカニズムにより、抗炎症効果、神経幹細胞生存因子増加及び死滅因子減少、特に、ＰＩ３Ｋ信号伝達体系の活性化や抗酸化の効果などが確認され、非常に多様な作用メカニズムを介して、ベータアミロイドタンパク質による神経毒性抑制を確認した。
【０１５１】
実験例５：ｑＰＣＲアレイ
実験方法
ＴＨＰ−１細胞培養
ヒト急性単核球性白血病（Human acute monocytic leukemia）細胞株であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ），Manassas，ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して実験を進めた。ＴＨＰ−１を９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０5セルになるように、ＲＰＭＩ １６４０培地で富化させ、２４時間培養させた。懸濁液で正常に成長するＴＨＰ−１細胞は、付着大食細胞類似表現型（adherent macrophage-lik ephenotype）に分化され、それは、分化培地で２４時間行われた（１００ｎｇ／ｍＬのphorbol １２−myristate １３−actate（ＰＭＡ；Sigma−Aldrich）を含む完全成長培地条件）。分化の間、ＴＨＰ−１細胞（３ｘ１０6cells／plate、〜９５％コンフルエンシー（増殖尺度））は、１０／ｃｍの組織培養プレートにシードされ、分化培地で培養された。
【０１５２】
抗炎症ペプチドＰＥＰ−１のＴＨＰ−１細胞に対する処理
分化後に、大食細胞類似ＴＨＰ−１細胞は、完全成長培地で２回洗浄された。その後、細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（Sigma−Aldrich）及び／または４μＭのＰＥＰ−１で４時間３７℃で処理された。
【０１５３】
ＴＨＰ−１細胞でのＲＮＡの分離及びｃＤＮＡの合成
トータルＲＮＡは、ＲＮeasyminikit（Qiagen，Valencia，ＣＡ，ＵＳＡから購入）を使用して抽出及び精製され、製造社のプロトコルに従った。ｃＤＮＡは、逆転写を介して合成され、Reverse Transcription System（Madison，ＷＩ，ＵＳＡで購入）を使用して、製造社のプロトコルに従った。
【０１５４】
ＰＣＲアレイ
その後、ＴＨＰ−１細胞から得たｃＤＮＡサンプルは、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ：real−time quantitative PCR）分析のテンプレートとして使用された。ｑＰＣＲ分析のために、ＲＴ２ Profilier ＰＣＲアレイキットを、ＳＡBiosciences／Qiagen（Valencia，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。分離された信号伝達を分析する４個の異なるＰＣＲアレイキットが実験に使用され、詳細な内容は、次の通りである：ヒト信号変換メカニズムファインダ、ヒト炎症サイトカイン及び受容体、ヒト転写因子、ヒトＮＦ−κＢ信号メカニズム。ＰＣＲは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Mercules，ＣＡ，ＵＳＡ）のＣＦＸ ９６リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、ＳＹＢＲ Green感知システム（Qiagen）を介して行われた。
【０１５５】
熱的サイクリング条件は、次の通りである：９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、９５℃で１０分間、９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で３０秒間を５０回増幅サイクルにした。データは、３個の独立した実験で得た平均値を示し、％低下は、対象遺伝子発現を、ＬＰＳ処理されたサンプルと、ＬＰＳ＋ＰＥＰ−１処理されたサンプルとを比較して決定された。３３６個の遺伝子が分析される間、下記のものにおいてのみ、統計的に有意（ｐ＜０．０５、student’s t-test）の％低下が示され、下記表７に示した。
【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
表７に表示されたＰＥＰ−１によって転写が抑制された遺伝子が％阻害度でもって示され、それは、ＬＰＳ処理されたものと、ＬＰＳ＋ＰＥＰ−１処理されたサンプル（ＴＨＰ−１細胞）との転写レベルの変化率と計算された。３３６個の遺伝子を分析する間、表７に示された１３個の遺伝子のみがＰＥＰ−１処理後、統計的に有意の低下を示した。それら遺伝子は、それぞれ異なる機能カテゴリー別にグループ化され、前記機能は、ケモカイン（chemokyne）及びサイトカイン、ＴＮＦα受容体信号伝逹（signaling）、脂質代謝、細胞自殺及びＮＦ−κＢ信号伝逹を含む。さらに重要な点は、ケモカイン及びサイトカインのカテゴリーの遺伝子がＮＦ−κＢの対象遺伝子として知られており、ＮＦ−κＢ一致ＤＮＡ結合サイトを、それらのプローモーター領域に有するということである。それと共に、ＰＣＲアレイで得たデータは、ＰＥＰ−１の抗炎効果が、ＮＦ−κＢによる炎症に対する主要調節子（regulator）操作を利用して遂行されるということも裏付け、それにより、ＰＥＰ−１が広い範囲の炎症疾患において、抗炎症治療剤として使用されるということも裏付ける。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月11日(2017.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢または末梢神経系関連炎症性疾患の治療または予防のための医薬組成物であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記疾患がアルツハイマー病である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
０．１μｇ／ｍｇ〜１ｍｇ／ｍｇの前記ペプチドを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが０．１μｇ／ｋｇ〜１．０ｇ／ｋｇの単回投与用量で投与される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの単回投与用量で投与される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが０．１μｇ／ｋｇ〜１．０ｇ／ｋｇの１日投与用量で投与される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
１日に１〜３回投与される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項８】
経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜外または皮下手段を通じて投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【外国語明細書】
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