(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物胚の凍結において、汚染が生じにくく、凍結後も哺乳動物胚の品質を一定水準以上に保持でき、かつ比較的高効率に哺乳動物胚を凍結することが可能な手段の提供。【解決手段】冷却手段Ａ１と冷却処理部Ａ２とを有する哺乳動物胚凍結装置Aであって、冷却処理部Ａ２が、冷却媒体Mを収容する冷媒槽1と、哺乳動物胚が収納されたストロー管を中空内に挿嵌することができる細長の筒状部材２と、を備え、複数の筒状部材２が冷媒槽１の壁面１３を貫通して槽１内にそれぞれ突出形成されたことにより、各筒状部材２の外周側がそれぞれ冷却媒体Ｍに接し、中空内がそれぞれ冷却媒体Ｍと隔離された哺乳動物胚凍結装置Ａを提供する。冷却手段Ａ１の吸熱部を冷媒槽１の外面に当接させることで、筒状部材２の中空内に挿嵌されたストロー管が冷却される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
冷却手段と冷却処理部とを有する哺乳動物胚凍結装置であって、
前記冷却処理部が、冷却媒体を収容する冷媒槽と、哺乳動物胚が収納されたストロー管を中空内に挿嵌することができる細長の筒状部材と、を備え、
複数の前記筒状部材が前記冷媒槽の壁面を貫通して該槽内にそれぞれ突出形成されたことにより、各筒状部材の外周側がそれぞれ前記冷却媒体に接し、中空内がそれぞれ前記冷却媒体と隔離された哺乳動物胚凍結装置。
【請求項２】
前記冷却手段の吸熱部を前記冷媒槽の外面に当接させ、該冷却槽に収容された冷却媒体を冷却する請求項1記載の哺乳動物胚凍結装置。
【請求項３】
前記冷媒槽内の冷却媒体が前記筒状部材を外周側から冷却することにより、該筒状部材の中空内に挿嵌された前記ストロー管が冷却される請求項1又は請求項2記載の哺乳動物胚凍結装置。
【請求項４】
前記冷却手段がスターリング冷却機である請求項1〜3のいずれか一項記載の哺乳動物胚凍結装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷却処理部を有する哺乳動物胚凍結装置などに関する。より詳細には、冷却手段と冷却処理部を有し、その冷却処理部が、冷却媒体を収容する冷媒槽と、受精卵が収納されたストロー管を中空内に挿嵌することができる細長の筒状部材と、を備え、複数の筒状部材が冷媒槽の壁面を貫通して槽内にそれぞれ突出形成されたことにより、各筒状部材の外周側がそれぞれ冷却媒体に接し、中空内がそれぞれ冷却媒体と隔離された哺乳動物胚凍結装置などに関する。
【背景技術】
【０００２】
胚移植（又は受精卵移植、Embryo  Transfer；ET）は、雌から回収した受精卵（胚）、又は、体外受精などにより作製された胚を別個体の雌に移植する繁殖技術である。胚移植は、優良雌の卵の効率的な利用、特定品種・系統の増産などに有用であるため、人工授精とともに、人為的繁殖手段として広く普及している。
【０００３】
一般的に、胚移植は以下の手順で行われる。まず、ホルモン投与により供卵雌を過排卵処理する。次に、その雌に人工授精し、数日後にその雌の生殖器から受精卵を回収し、凍結保存する。次に、凍結胚を融解した後、別個体の雌（受卵雌）に胚を移植し、妊娠・出産させる。
【０００４】
また、雌から卵を採取し、体外受精し、その受精卵を体外培養した後、別個体の雌に移植し、妊娠・出産させる技術、顕微操作によりクローン胚を作出し、雌に移植し、妊娠・出産させる技術などに関する研究も進展しており、実用技術となっているものもある。その他、性別判定された胚の移植により、雌雄産み分けを行う技術も、既に実用化されている。
【０００５】
胚移植を広く利用可能にするために、胚を凍結保存する技術が必要となる。胚を凍結保存することにより、胚の長期保存が可能になり、輸送・取引にも有利となり、移植時期を調整できる。
【０００６】
例えば、現在、最も広く普及している胚の凍結保存法である緩慢凍結法の場合、ストロー管内に胚を収納し、そのストロー管を-30℃前後まで0.3〜0.5℃/分の極めて緩慢な速度で冷却した後、液体窒素に入れて凍結保存する。
【０００７】
その際、例えば、手作業で、アルコール槽内にドライアイスの小片を投入しながら冷却速度を調節することも可能であるが、通常、コンピュータ制御のプログラムフリーザーが使用される。
【０００８】
胚凍結に用いられているプログラムフリーザーの冷却方式として、冷媒槽による方法、ペルチェ素子による方法、スターリング方式の冷却機による方法などが提案又は実用化されている。
【０００９】
例えば、特許文献1には、液体窒素を霧状に噴射してチャンバー（冷媒槽）内の温度を低下させるプログラムフリーザーが、特許文献2には、アルコール液を冷媒に用いた1液2槽タイプの受精卵凍結装置が、特許文献3にはペルチェ素子を用いた冷却手段で冷却するストロー管の凍結装置が、特許文献4には、スターリング式の冷却機とペルチェ素子による局部冷却手段とを備えた細胞類の凍結装置が、それぞれ記載されている。
【特許文献１】特開昭58-47975号公報
【特許文献２】特開2003-621号公報
【特許文献３】特開2007-97872号公報
【特許文献４】特開2012-34667号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プログラムフリーザーなどを用いて哺乳動物胚を凍結する場合において、例えば、冷媒槽で冷却を行う場合、冷却のために冷媒内にストロー管を浸漬させる際に、ストロー管内に収容された哺乳動物胚が汚染する可能性がある。一方、例えば、ペルチェ素子を用いた冷却手段で冷却する場合、処理本数（一回の操作で同時に冷却できるストロー管の数）を多くすることが難しい。また、スターリング方式の冷却機で冷却を行う場合、ストロー管ごとに、若しくはストロー管内の部位ごとに、冷却の度合が異なる場合があり、温度ムラを生じやすい。哺乳動物胚の凍結時に温度ムラが生じると、胚の品質不良化・劣化が生じやすい。
【００１１】
そこで、本発明は、汚染が生じにくく、凍結後も哺乳動物胚の品質を一定水準以上に保持でき、かつ比較的高効率に哺乳動物胚を凍結することが可能な新規手段を提供することなどを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では、冷却手段と冷却処理部とを有する哺乳動物胚凍結装置であって、前記冷却処理部が、冷却媒体を収容する冷媒槽と、哺乳動物胚が収納されたストロー管を中空内に挿嵌することができる細長の筒状部材と、を備え、複数の前記筒状部材が前記冷媒槽の壁面を貫通して該槽内にそれぞれ突出形成されたことにより、各筒状部材の外周側がそれぞれ前記冷却媒体に接し、中空内がそれぞれ前記冷却媒体と隔離された哺乳動物胚凍結装置などを提供する。
【００１３】
前記冷却手段の吸熱部を前記冷媒槽の外面に当接させ、該冷却槽に収容された冷却媒体を冷却する。そして、前記冷媒槽内の冷却媒体が前記筒状部材を外周側から冷却することにより、該筒状部材の中空内に挿嵌された前記ストロー管が冷却される。
【００１４】
この装置では、筒状部材が冷媒槽の壁面を貫通して槽内にそれぞれ突出形成されており、筒状部材の中空内は冷媒槽内の冷却媒体からは完全に隔離されている。そのため、冷媒槽内の冷却媒体は、筒状部材の外周側には接するが、中空内に侵入できない。従って、筒状部材の中空内に挿嵌されたストロー管は、冷却媒体と一切接触しないため、冷却媒体がストロー管内に侵入することによる汚染の発生を防止でき、それによる哺乳動物胚の品質不良化・劣化を抑止できる。
【００１５】
また、複数の筒状部材を冷媒槽内に突出形成させることにより、筒状部材の数の分だけ、ストロー管を一回の操作で同時に冷却できるため、同時処理本数を増大でき、哺乳動物胚の凍結処理を高効率化することができる。
【００１６】
さらに、本発明では、冷却手段をストロー管に直接的に接触させるのではなく、冷却媒体で筒状部材を外周側から冷却してその中空内のストロー管を冷却する構成であるため、筒状部材を、その全長に亘ってかつ全周から略均一に冷却させることができる。そのため、哺乳動物胚が収納されたストロー管を筒状部材の中空内に挿嵌することにより、哺乳動物胚の凍結処理にあたって、温度ムラを生じにくい。これにより、胚移植に際し、哺乳動物胚の凍結・融解による胚の品質不良化・劣化の発生頻度を低減でき、胚の品質を一定水準以上のまま保持できる。従って、より確実かつ安定的に胚移植を成功させることが可能となる。
【００１７】
加えて、筒状部材を、その全長に亘ってかつ全周から略均一に冷却させることができるため、哺乳動物胚が収納されたストロー管に略均一にその熱を伝達させることができる。これにより、ストロー管内の哺乳動物胚の周りの溶液が先に冷却されることで、氷核が植え付けられ、氷晶形成が誘起されるため、別途の操作を加えなくても、植氷されやすく、それによって、哺乳動物胚の細胞内凍結（細胞傷害）の発生を抑止できる。
【００１８】
その他、本発明では、ストロー管を冷却媒体に出し入れしないため、また、それにより、冷媒槽を略閉鎖的に形成してその中に冷却媒体を貯留しておくことが可能であるため、冷却媒体が減量しにくい。そのため、本発明には、冷却媒体の使用量を大幅に低減でき、冷却媒体を補充する頻度・労力も大幅に軽減できるという有利性がある。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、汚染を生じにくくすることができ、哺乳動物胚の品質を一定水準以上に保持でき、かつ比較的高効率に哺乳動物胚を凍結することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、冷却手段と冷却処理部とを有する哺乳動物胚凍結装置であって、前記冷却処理部が、冷却媒体を収容する冷媒槽と、哺乳動物胚が収納されたストロー管を中空内に挿嵌することができる細長の筒状部材と、を備え、複数の前記筒状部材が前記冷媒槽の壁面を貫通して該槽内にそれぞれ突出形成されたことにより、各筒状部材の外周側がそれぞれ前記冷却媒体に接し、中空内がそれぞれ前記冷却媒体と隔離された哺乳動物胚凍結装置をすべて包含する。
【００２１】
以下、図1〜図3を用いて本発明の実施形態の例を説明する。なお、本発明は、以下に例示した実施形態のみに狭く限定されない。
【００２２】
図1は本発明に係る哺乳動物胚凍結装置の例を示す部分外観斜視模式図、図2は同部分縦断面模式図である。なお、両図面は個別の模式図であって、各構成・長さなどが必ずしも対応しているわけではない。
【００２３】
図1又は図2に例示された哺乳動物胚凍結装置Aは、冷却手段A1と冷却処理部A2を有し、両図中の冷却処理部A2は、冷却媒体Mを収容する冷媒槽1と、哺乳動物胚が収納されたストロー管を中空21内に挿嵌することができる細長の筒状部材2と、冷媒槽1の外面を取り囲む断熱部材3と、を備えている。図2では、前記冷媒槽1と前記冷却手段A1の吸熱部A11との間に、緩衝部材4を介在させた構成となっており、また、冷媒槽1内に撹拌手段5が配置されている。
【００２４】
冷却手段A1は、冷却するための熱源設備である。例えば、冷却手段A1の吸熱部A11を、直接又は緩衝部材4を介して冷媒槽1の外面11に当接させ、その熱を冷却槽1内に移動させることで、冷却槽1内に収容された冷却媒体Mを冷却する。
【００２５】
冷却手段A1には、吸熱量を調節することができ、それによって、少なくとも0℃から-30℃程度まで、冷媒槽1内の冷却媒体Mを冷却していくことが可能な公知のものを広く採用できる。例えば、前記冷却手段A1がスターリング冷却機である場合、哺乳動物胚凍結装置A全体を軽量化・小型化することが可能であり、それにより、装置の運搬・移動を簡易に行うことができるようになるとともに、様々な場所に設置して利用することが可能となるため、利便性を高めることができる。
【００２６】
冷却処理部A2は、哺乳動物胚を凍結処理する部位である。哺乳動物胚が収納されたストロー管を、冷却処理部A2の筒状部材2の中空21内に挿嵌し、冷媒槽1内の冷却媒体Mによって、筒状部材2を外周22側から冷却することにより、ストロー管内の哺乳動物胚を凍結処理する。
【００２７】
冷媒槽1は、冷却媒体Mを収容する部位であり、槽1内に冷却媒体Mを貯留させて用いる。
【００２８】
冷媒槽1の形状は、冷却媒体Mを収容・貯留できるように形成されていればよく、特に限定されない。例えば、外観形状が略箱状・略筒状などになるように形成されていてもよい。また、例えば、冷却媒体Mを冷媒槽1内に注入する注入口が形成されていれば、天面を設け、冷媒槽1が略閉鎖された状態に形成してもよい。
【００２９】
冷媒槽1の材質には、極低温に対する耐性を有し、かつ熱伝導性の高い公知のものを広く採用できる。冷媒槽1の材質として、例えば、アルミニウム、アルミニウム合金、銅、ニッケル、マグネシウム、ステンレスなどを採用できる。それらは、材質などに応じ、適宜、公知の表面処理などが施されたものであってもよい。
【００３０】
冷媒槽1の外面11、例えば、冷媒槽1の外面の底面12又は側面13の一部領域に、冷却手段A1の吸熱部A11を直接又は緩衝部材4を介して当接させる。これにより、その熱を冷却槽1内に移動させ、冷却槽1内に収容された冷却媒体Mを冷却する。
【００３１】
冷却媒体Mは、冷却時に、冷却手段A1からの冷熱を筒状部材2に移動させるために用いられる熱媒体である。冷却媒体Mには、公知のものを広く採用でき、特に限定されないが、凝固点が少なくとも-30℃以下の液体、例えば、メタノール、エタノールなどのアルコールなどを好適に用いることができる。
【００３２】
筒状部材2は、その中空21内に、哺乳動物胚が収納されたストロー管を挿嵌する部位である。
【００３３】
筒状部材2は、例えば、(1)管状で細長な中空の棒状部材で、(2)その中空21内に、哺乳動物胚が収納されたストロー管を挿嵌できるように、(3)筒状部材2の中空21側が冷媒槽1内とは流通せずに遮断されているように、(4)その外周22側が、少なくとも一方又は両方の先端部分（符号211、又は212及び212）を除く全面に亘って冷媒槽1内に開放され、冷媒槽1内に貯留する冷却媒体Mと接するように、かつ(5)中空21の少なくとも一方の先端部分211が封鎖されずに冷媒槽1外に開口しているように、形成される。
【００３４】
そのために、筒状部材2は、冷媒槽1の壁面（例えば、符号13）を貫通して槽1内にそれぞれ突出形成される。筒状部材2を冷媒槽1内に突出形成させる方法は、公知のものを広く採用でき、特に限定されない。例えば、図1及び図2のように、筒状部材2が冷媒槽1内を貫通して配設されていてもよい。このように、筒状部材2に、冷媒槽1の一方の側面13から対向する位置の側面14まで冷媒槽1内を貫通させ、両先端部分211、212が冷媒槽1外の位置に、それ以外の部分が冷媒槽1内の位置に配置されるようにするとともに、その貫通部分から冷却媒体Mが漏れ出ないように、該部分（冷媒槽1の壁面13の貫通孔形成部分と筒状部材2の外周22との隙間部分）を略密封することによっても、筒状部材1の外周22側が冷却媒体Mに接し、中空21内が冷却媒体Mと隔離されるように、筒状部材2を配設できる。
【００３５】
筒状部材2の両先端部分211、212のうち、少なくとも一方は、ストロー管を挿嵌したり抜き出したりできるようにするため、冷媒槽1外に開口した状態に形成される。もう一方は、封鎖されていてもよいし、同様に冷媒槽1外に開口した状態に形成されていてもよい。
【００３６】
筒状部材2を突出させる方向は、適宜定めることができ、特に限定されない。例えば、図1及び図2のように、冷媒槽1の底面に対して略平行に、即ち略水平方向に、筒状部材2を配設してもよい。
【００３７】
筒状部材2の内径は、ストロー管を筒状部材2の中空21内に挿嵌でき、かつ挿嵌時に筒状部材2の中空21側の壁面（内壁面）とストロー管の外周面とが略接する状態になるように、即ち、例えば、（挿嵌するストロー管の外径よりもほんの少しだけ大きいが）略同一になるように設計する。
【００３８】
筒状部材2の材質には、略筒状に形成することができ、極低温に対する耐性を有し、かつ熱伝導性の高い公知のものを広く採用できる。筒状部材2の材質として、例えば、アルミニウム、アルミニウム合金、銅、ニッケル、マグネシウム、ステンレスなどを採用できる。それらは、材質などに応じ、適宜、公知の表面処理などが施されたものであってもよい。
【００３９】
本発明では、筒状部材2を複数配設する。例えば、図1又は図2のように、複数の筒状部材2を冷媒槽1の一方の側面13から略同一方向に突出形成し、縦方向及び/又は横方向に略平行に並べ、複数の筒状部材2を配設してもよい。これにより、筒状部材2の配設数の分だけ、ストロー管を一回の操作で同時に冷却できるため、同時処理本数を増大でき、哺乳動物胚の凍結処理を高効率化することができる。冷媒槽1の寸法にもよるが、例えば、図1のような配置で、一つの冷媒槽1に50〜250本の筒状部材2を配設してもよい。
【００４０】
断熱材3は、熱移動を防止するための部材である。断熱材3で冷媒槽1の外面11を取り囲み、外気と冷媒槽1とをできるだけ遮断することで、冷媒槽1内の冷却媒体Mの温度を安定化でき、冷却手段A1で発生させた冷熱の損失を極力抑制でき、冷却手段A1による吸熱を高効率化できる。
【００４１】
断熱材3の材質については、公知のものを広く適用でき、限定されない。断熱材3の配置場所についても、特に限定されないが、例えば、図1又は図2のように、冷媒槽1の底面12及び側面13に配置してもよいし、さらに天面にも配置してもよい。その他、例えば、筒状部材2の開口部分（ストロー管を挿嵌する部位、例えば符号211）、冷却媒体Mを冷媒槽1内に注入する注入口の配置部分などでは、断熱材3を開閉可能又は着脱可能に形成してもよい。
【００４２】
図2に示された緩衝部材4は、冷却手段A1を駆動している際に生じる振動を緩和させるための部材で、任意の構成要素である。冷却手段A1の吸熱部A11と冷媒槽1との間に緩衝部材4を挟み込むことにより、冷却手段A1を駆動している際に生じる振動が冷媒槽1へ伝わることを抑止できる。これにより、ストロー管内に収納された哺乳動物胚が損傷・劣化する可能性をより少なくできる。緩衝部材4には、振動を吸収でき、かつ熱伝導性の高い公知の部材を広く採用できる。
【００４３】
図2に示された冷媒槽1内の撹拌手段5は、冷却媒体Mを撹拌する部材である。撹拌手段5によって冷却媒体Mを撹拌することにより、冷却手段A1の吸熱部A11から冷却槽1内への熱の移動を円滑かつ効率的に行うことができ、冷却媒体M内の温度ムラの発生を抑制できる。そのため、冷却手段A1からの冷熱を、冷却媒体Mを介して筒状部材2にムラなく均一に移動させることができる。撹拌手段5には、公知のものを広く採用できる。
【００４４】
図3は、本発明に係る哺乳動物胚凍結装置A内のシステム構成の例を示す図である。なお、本発明は、この構成例のみに狭く限定されない。
【００４５】
図3では、制御手段Bが、温度制御部B1、CPU（符号B2）、メモリB3、入力手段B4などを備えるとともに、冷却手段A1、加熱手段C、温度検出手段Dなどと接続している。
【００４６】
制御手段Bは、予め設定された冷却処理手順に則って、冷却処理部A2内（冷却媒体M又は筒状部材2の中空21内）を冷却する動作を制御する。制御手段Bを、例えば、電子基板で形成し、哺乳動物胚凍結装置A内に実装してもよい。
【００４７】
その際、例えば、冷却処理部A2内（冷却媒体M又は筒状部材2の中空21内）に温度検出手段Dを設置し、その温度情報に基づいて、制御手段Bが冷却又は加熱処理を調節するように設定してもよい。
【００４８】
例えば、温度制御部B1において、予め設定された冷却処理手順中における特定のタイミングの想定温度と、温度検出手段Dによって検知された実際の温度とを比較し、実際の温度が、そのタイミングにおける想定温度よりも閾値以上に高いと判定した場合、温度制御部B1は、冷却手段A1に、駆動を促進して吸熱量を増大させるように、若しくは駆動の度合いを命令する。温度制御部B1からの命令を受けた冷却手段A1は、吸熱量を増大させるように駆動を促進し、それによって、冷却処理部A2内（冷却媒体M又は筒状部材2の中空21内）が冷却される。
【００４９】
また、例えば、温度制御部B1において、予め設定された冷却処理手順中における特定のタイミングの想定温度と、温度検出手段Dによって検知された実際の温度とを比較し、両者の温度が閾値の範囲内になったと判定した場合、温度制御部B1は、冷却手段A1にその駆動を停止するように命令する。
【００５０】
反対に、例えば、温度制御部B1において、予め設定された冷却処理手順中における特定のタイミングの想定温度と、温度検出手段Dによって検知された実際の温度とを比較し、実際の温度が、そのタイミングにおける想定温度よりも閾値以上に低いと判定した場合、温度制御部B1は、冷却手段A1にその駆動を停止するように命令するか、若しくは加熱手段Cを駆動するように、又はその度合いを命令する。
【００５１】
例えば、以上のステップをプログラムで記述し、メモリB3などに格納しておくことにより、哺乳動物胚凍結装置A内での自動処理が可能である。なお、加熱手段C及び温度検出手段Dは、公知のものを広く採用できる。
【００５２】
本発明において、凍結する対象となる哺乳動物胚として、例えば、人工授精後採卵された体内受精卵、体外受精により得られた体外受精卵（胚）、雌雄判別胚、クローン胚などが挙げられる。哺乳動物胚のステージについては、特に限定されないが、一般的には、胚移植を行うために凍結する場合、胚盤胞期〜拡張胚盤胞期のものを凍結することが多い。動物種は特に限定されず、本発明は、ヒトを含む哺乳動物の胚の凍結に適用可能であるが、非ヒト哺乳動物（ヒト以外の哺乳動物）の胚の凍結に適用することがより好適であり、産業動物（牛、豚、馬、羊、山羊など）の胚の凍結に適用することがさらに好適であり、牛の胚の凍結に適用することが最も好適である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明に係る哺乳動物胚凍結装置の例を示す部分外観斜視模式図。
【図２】本発明に係る哺乳動物胚凍結装置の例を示す部分縦断面模式図。
【図３】本発明に係る哺乳動物胚凍結装置内のシステム構成の例を示す図。
【符号の説明】
【００５４】
1          冷媒槽
11          冷媒槽の外面
12          同底面
13          同側面
14          側面13と対向する位置の側面
2          筒状部材
21          筒状部材の中空
211、212          筒状部材2の（中空21の）先端部分
22          筒状部材の外周
3          断熱部材
4          緩衝部材
5          撹拌手段
A          哺乳動物胚凍結装置
A1          冷却手段
A11          冷却手段の吸熱部
A2          冷却処理部
B          制御手段
B1          温度制御部
B2          CPU
B3          メモリ
B4          入力手段
C          加熱手段
D          温度検出手段
M          冷却媒体
【図１】
2018071843.tif 000003
【図２】
2018071843.tif 000004
【図３】
2018071843.tif 000005