(57)【要約】【課題】本発明は、フコース類似体と糖を検出する方法を提供する。【解決手段】本発明によれば、以下一般式（Ｉ）に示される化合物またはその塩：【化１】2018002666.tif 000031｛ここで、  Ｌは、−（ＣＨ2）n−であり、かつ、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であるか、または、  Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−であり、かつ、ｍは、１〜４のいずれかの自然数である。｝が提供される【選択図】図１
2018002666.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下一般式（Ｉ）に示される化合物またはその塩：
【化１】
2018002666.tif 000028
｛ここで、
Ｌは、−（ＣＨ2）n−であり、かつ、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であるか、または、
Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−であり、かつ、ｍは、１〜４のいずれかの自然数である。｝
【請求項２】
一般式（Ｉ）が化学式（Ｉａ）である、
【化２】
2018002666.tif 000029
である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物またはその塩を含む、タンパク質の糖鎖または脂質の糖鎖を標識することに用いるための組成物。
【請求項４】
標識が細胞内において行われる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
フコースを含む糖鎖を有するタンパク質若しくは脂質を表出した細胞、細胞に表出した前記タンパク質若しくは脂質、または、前記タンパク質若しくは脂質を修飾する糖鎖を検出することに用いるための、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
以下一般式（ＩＩ）に示される化合物またはその塩：
【化３】
2018002666.tif 000030
｛ここで、
Ｌは、−（ＣＨ2）n−であり、かつ、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であるか、または、
Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−であり、かつ、ｍは、１〜４のいずれかの自然数である。｝
【請求項７】
グアノシン５’−ジホスホ−６−デオキシ−６−エチニル−β−Ｌ−ガラクトピラノース、およびその塩である、請求項６に記載の化合物またはその塩。
【請求項８】
請求項６または７に記載の化合物またはその塩を含む、フコース転移酵素のドナー基質として用いるための組成物。
【請求項９】
フコースを含む糖鎖を標識することに用いるための、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の化合物またはその塩を含む、タンパク質、脂質またはオリゴ糖へのフコース転移酵素活性を決定することに用いるための組成物。
【請求項１１】
７位の炭素がエチニル基により置換されたフコースを有する糖鎖により修飾された糖タンパク質または糖脂質を細胞膜上に表出した哺乳動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコース類似体と糖を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖修飾は、哺乳動物において最も一般的な翻訳後修飾の一つであり、発生、脳機能、免疫などの基本的生理機能に関与している他、がん、糖尿病および神経変性疾患などを含む様々な疾患の開始にも関与していることが知られている（非特許文献１）。しかしながら、糖鎖の分析は困難であり、糖鎖とこれらの生理機能や病気との関係の解析は困難である。
【０００３】
近年、糖鎖を検出する技術として、アジド基とエチニル基の反応性を利用したクリックケミストリーにより、糖鎖にアジド基またはエチニル基を導入して、エチニル基またはアジド基を有する標識でこれを検出する方法が開発されてきた（非特許文献２〜５）。この中で６−アジド−フコースは糖タンパク質への導入効率の良さの点では優れているが強い細胞毒性を生じる。また、６−アルキニル−フコースは、細胞毒性は低いものの、糖タンパク質への導入効率が非常に低く、糖鎖の標識として使うには十分ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Moremen, K.W., Tiemeyer, M., and Nairn, A.V., Nat Rev Mol Cell Biol 13, 448-462, 2012.
【非特許文献２】Baskin, J.M., Prescher, J.A., Laughlin, S.T., Agard, N.J., Chang, P.V., Miller, I.A., Lo, A., Codelli, J.A., and Bertozzi, C.R., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 16793-16797, 2007.
【非特許文献３】Hsu, T.L., Hanson, S.R., Kishikawa, K., Wang, S.K., Sawa, M., and Wong, C.H., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 2614-2619, 2007.
【非特許文献４】Rabuka, D., Hubbard, S.C., Laughlin, S.T., Argade, S.P., and Bertozzi, C.R., J Am Chem Soc 128, 12078-12079, 2006.
【非特許文献５】Sawa, M., Hsu, T.L., Itoh, T., Sugiyama, M., Hanson, S.R., Vogt, P.K., and Wong, C.H., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 12371-12376, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、フコース類似体と糖を検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）以下一般式（Ｉ）に示される化合物またはその塩：
【化１】
2018002666.tif 000003
｛ここで、
Ｌは、−（ＣＨ2）n−であり、かつ、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であるか、または、
Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−であり、かつ、ｍは、１〜４のいずれかの自然数である。｝
（２）一般式（Ｉ）が化学式（Ｉａ）である、
【化２】
2018002666.tif 000004
である、上記（１）に記載の化合物またはその塩。
（３）上記（１）に記載の化合物またはその塩を含む、タンパク質の糖鎖または脂質の糖鎖を標識することに用いるための組成物。
（４）標識が細胞内において行われる、上記（３）記載の組成物。
（５）フコースを含む糖鎖を有するタンパク質若しくは脂質を表出した細胞、細胞に表出した前記タンパク質若しくは脂質、または、前記タンパク質若しくは脂質を修飾する糖鎖を検出することに用いるための、上記（３）または（４）に記載の組成物。
（６）以下一般式（ＩＩ）に示される化合物またはその塩：
【化３】
2018002666.tif 000005
｛ここで、
Ｌは、−（ＣＨ2）n−であり、かつ、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であるか、または、
Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−であり、かつ、ｍは、１〜４のいずれかの自然数である。｝
（７）グアノシン５’−ジホスホ−６−デオキシ−６−エチニル−β−Ｌ−ガラクトピラノース、およびその塩である、上記（６）に記載の化合物またはその塩。
（８）上記（６）または（７）に記載の化合物またはその塩を含む、フコース転移酵素のドナー基質として用いるための組成物。
（９）フコースを含む糖鎖を標識することに用いるための、上記（８）に記載の組成物。
（１０）上記（６）または（７）に記載の化合物またはその塩を含む、タンパク質、脂質またはオリゴ糖へのフコース転移酵素活性を決定することに用いるための組成物。
（１１）７位の炭素がエチニル基により置換されたフコースを有する糖鎖により修飾された糖タンパク質または糖脂質を細胞膜上に表出した哺乳動物細胞。
【０００７】
本発明のフコース類似体またはＧＤＰ−フコース類似体は、糖タンパク質および糖脂質への導入効率が高く、低毒性であり、有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、細胞内でのフコースの合成経路およびフコース類似体の取込み経路と合成の経路を示す。（Ａ）は、フコース合成経路の概略図を示す。細胞内に取り込まれ、脱アセチル化され、ＧＤＰ結合形態に変換されたフコース類似体は、ゴルジ体に取り込まれ、ＦＵＴ８などのフコース転移酵素により糖タンパク質および糖脂質に転移する。グリカンに取り込まれたフコース類似体は、クリックケミストリーによって標識され得る。（Ｂ）は、実施例で合成し、検証されたフコース類似体を示す。（Ｂ）では過アセチル化形態（すなわち、分子中の全てのヒドロキシル基がアセチル化された形態）のフコース類似体を示している。
【０００９】
【図２】図２は、各フコース類似体を用いたインビトロでのフコース転移酵素アッセイの結果を示す。（Ａ）は、フコース転移酵素としてＦＵＴ８を用い、アクセプター基質としてＮ−（２−（２−ピリジルアミノ）エチル）スクシンアミド酸  ５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル（ＧｎＧｎ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＰＮＳＮＢ）を用いたフコース転移酵素アッセイの結果を示す。（Ｂ）は、フコース転移酵素としてＦｕｔ１、２、４または９を用いたフコース転移酵素アッセイの結果を示す。アクセプター基質としてラクト−Ｎ−ネオテトラオースを用いた結果を示す。
【００１０】
【図３】図３は、７−アルキニル−フコースから細胞内でＧＤＰ結合形態が生成されることを示す。（Ａ）アセチル化７−アルキニル−フコースで処理したＪｕｒｋａｔ細胞から抽出したヌクレオチド糖について、主なフラグメントイオンである［ＧＤＰ−Ｈ］-（ｍ／ｚ  ４４２）の抽出ＭＳ／ＭＳクロマトグラム（ＥＩＣ）を示す。（Ｂ）および（Ｃ）は、（Ａ）の液体クロマトグラフィー分析において３７．４〜３８分の保持時間で検出されたＧＤＰ−７−アルキニル−フコースに対応する擬分子イオン［Ｍ−Ｈ］-のＭＳ（Ｂ）およびＭＳ／ＭＳ（Ｃ）を示す。
【００１１】
【図４】図４は、細胞内における７−アルキニル−フコースの糖タンパク質への取込みを示す。（Ａ）は、様々な濃度の過アセチル化形態の６−アルキニル−フコースまたは７−アルキニル−フコース存在下で４８時間培養したマウス胎児線維芽細胞の細胞溶解物をクリックケミストリーによりビオチン化し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンにより検出した結果を示す。（Ｂ）は、２００μＭの過アセチル化形態の７−アルキニル−フコース存在下で８、２４または４８時間培養したマウス胎児線維芽細胞の細胞溶解物をクリックケミストリーによりビオチン化し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンにより検出した結果を示す。（Ｃ）は、マウス胎児線維芽細胞に代えてＨＥＫ２９３細胞で７−アルキニル−フコースが糖タンパク質に取り込まれることを示す。（Ｄ）は、過アセチル化形態の７−アルキニル−フコース存在下で培養したマウス胎児線維芽細胞をクリックケミストリーによりビオチン化し、ＤＡＰＩで核を染色し、Ａｌｅｘａ４８８標識ストレプトアビジンと反応させた細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。（Ｅ）は、過アセチル化形態の各種フコース類似体で処理したＪｕｒｋａｔ細胞の２４時間または４８時間培養後の生存細胞数を計数した結果を示す。（Ｆ）は、過アセチル化形態の６−アルキニル−フコースまたは７−アルキニル−フコース存在下で培養したマウス胎児線維芽細胞の細胞溶解物をAleuria aurantia lectin（ＡＡＬ）にてブロットした結果を示す。
【００１２】
【図５】図５は、７−アルキニル−フコースがコアフコースを形成することを示す図である。（Ａ）は、０．５μｇ／ｍＬのツニカマイシン（Ｎ−グリコシル化の阻害剤）または２ｍＭのベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−グリコシル化の阻害剤）で処理したＨＥＫ２９３細胞を用いて、過アセチル化形態の７−アルキニル−フコースの糖タンパク質への導入効率を検証した結果を示す。（Ｂ）は、フコース転移酵素であるＦｕｔ８（−／−）の細胞における過アセチル化形態の７−アルキニル−フコースの糖タンパク質への導入効率を検証した結果を示す。（Ｃ）は、過アセチル化形態の７−アルキニル−フコース存在下で培養したマウス胎児線維芽細胞（Ｆｕｔ８＋／＋またはＦｕｔ８−／−）をクリックケミストリーによりビオチン化し、ＤＡＰＩで核を染色し、Ａｌｅｘａ４８８標識ストレプトアビジンと反応させた細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。
【００１３】
【図６】図６は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞においてＮ−グリカンがフコース修飾を欠如していること、およびＮ型糖鎖のコアに７−アルキニル−フコースが効率よく導入されること、並びに、ＭＳによる７−アルキニル−フコースの導入位置を示す図である。（Ａ）は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞およびその他の各種細胞の細胞溶解物に対して、ＡＡＬまたはＰｈｏＳＬによりブロットした結果、および抗ＧＭＤＳ抗体でウェスタンブロットした結果を示す。（Ｂ）は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞で、各種のヌクレオチド糖の存在量を検出した結果を示す。（Ｃ）は、Ｌ−フコース存在下で培養したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞の細胞溶解物のＡＡＬまたはＰｈｏＳＬによるブロットの結果を示す。（Ｄ）は、過アセチル化形態の７−アルキニル−フコース存在下で培養したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞の細胞溶解物をクリックケミストリーによりビオチン化し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンにより検出した結果を示す。（Ｅ）は、過アセチル化形態の７−アルキニル−フコース存在下で培養した可溶型ＢＡＣＥ１タンパク質発現Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞から精製した可溶型ＢＡＣＥ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色結果を示す。（Ｆ）は、過アセチル化形態の７−アルキニル−フコース存在下または非存在下（control）で培養した可溶型ＢＡＣＥ１タンパク質発現Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞から精製した可溶型ＢＡＣＥ１タンパク質のＮ型糖鎖をＭＳ分析した結果を示す。（Ｇ）は、コアフコースに７−アルキニル−フコースが導入されていることを示す。
【００１４】
【図７】図７は、ヒトＦＵＴ８とフコースとの複合体の結晶構造解析の結果を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１５】
本明細書では、「フコース」は、６−デオキシ−ガラクトースを意味する。ほ乳類や植物では、細胞表面の糖タンパク質のＮ型およびＯ型糖鎖中並びに糖脂質の糖鎖中に見出される。特にヒトでは、フコースを末端に持つ糖鎖の一つは、ＡＢＯ血液型におけるＨ抗原として知られる。
【００１６】
本明細書では、「フコース転移酵素」とは、フコースを糖鎖に連結させることができる酵素を意味する。フコース転移酵素は、ＧＤＰを連結したＧＤＰ−フコースをドナー基質とし、糖鎖をアクセプター基質としてフコースをアクセプター基質である糖鎖に連結させることができる。
【００１７】
（フコース）
【化４】
2018002666.tif 000006
【００１８】
（ＧＤＰ−フコース）
【化５】
2018002666.tif 000007
【００１９】
フコース転移酵素としては、例えば、ＦＵＴ１〜１１が知られ、それぞれアクセプター基質に対する特異性が異なる。ＦＵＴ８は、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.68）とも呼ばれ、５７５アミノ酸からなるタンパク質である。ＦＵＴ８は、Ｎ型糖鎖の根元のＧｌｃＮＡｃ（すなわち、アスパラギンのアミノ基に結合しているＧｌｃＮＡｃ）にフコースを転移し、コアフコースと呼ばれる糖鎖構造を形成させる。
【００２０】
本明細書では、「クリックケミストリー」とは、簡単ないくつかの手順で化学反応を達成する手法を意味する。例えば、エチニル基は、アジド基（Ｎ3基）と金属触媒下で反応し、１，２，３−トリアゾール環を形成して２つの化合物を連結させることができる。例えば、アルキニル基を有するフコース類似体は、ビオチン化したアジド基と反応させることにより、フコース類似体をビオチン化することができる。
【００２１】
本明細書では、「ＧＤＰ」とは、グアノシン  ５’−二リン酸であり、ヌクレオチドの一種として知られる。
【００２２】
本明細書では、「過アセチル化」とは、フコースに対して用いられ、フコースが有する４つのヒドロキシル基が全てアセチル化されていることを意味する。アセチル化することにより糖は細胞膜を通過しやすくなる。
【００２３】
本発明によれば、フコース類似体である、以下一般式（Ｉ）に示される化合物またはその塩：
【化６】
2018002666.tif 000008
｛ここで、
Ｌは、−（ＣＨ2）n−であり、かつ、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であるか、または、
Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−であり、かつ、ｍは、１〜４のいずれかの自然数であり、
Ｒ１〜Ｒ４は、ＯＨ基であり、但し、ＯＨ基のうちの１〜４つはアセチル化されていてもよい。｝
が提供される。
【００２４】
１以上の原子からなるリンカーは、直鎖状に複数の原子を連結していてもよく、直鎖上に連結した原子の数は１〜１０としてもよい。
【００２５】
Ｌが−（ＣＨ2）n−である場合、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であることが好ましく、１〜１０、１〜８、１〜６および１〜４から選択されるいずれかの自然数、または１、２、３若しくは４であることが好ましく、ｎは１とすることができる。
【００２６】
Ｌが−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−である場合、ｍは、１〜４のいずれかの自然数とすることができ、３とすることができ、２とすることができ、または１とすることができる。ある態様では、Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−であり、ｍは、１〜４のいずれかの自然数とすることができ、好ましくは３であり、より好ましくは２であり、さらに好ましくは１である。
【００２７】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ４は、ＯＨ基であり、そのうちの１〜４つはアセチル化されていてもよく、好ましくは、２つがアセチル化されていてもよく、より好ましくは３つがアセチル化されていてもよく、さらに好ましくは４つがアセチル化されていてもよい。当業者であれば、細胞膜の通過性から、いずれのアセチル化形態も細胞膜を通過すると理解するであろうが、より通過性の高いアセチル化形態は、細胞膜透過性を評価することにより容易に決定することができよう。従って、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、細胞外から細胞に提供されることにより、細胞は、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を細胞内に取込むことができる。細胞内に取り込まれた一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、細胞内のエステラーゼによりＲ１〜Ｒ４が加水分解されてＯＨ基となり、フコースキナーゼによりリン酸化され、さらにＧＤＰ−フコース  ピロホスホリラーゼ（ＦＰＧＴ）によりＧＤＰ−フコース類似体（下記一般式（ＩＩ）に示される構造を有する化合物）に変換される。
【００２８】
本発明のある形態では、式（Ｉ）で表される化合物は、以下化学式（Ｉａ）：
【化７】
2018002666.tif 000009
で示される化合物であり得る。化学式（Ｉａ）は、一般式（Ｉ）において、ＬがＣＨ２であり、Ｒ１〜Ｒ４が、−ＣＯ−ＣＨ3である化合物に対応する。
【００２９】
上記化学式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ４は、ＯＨ基であり、そのうちの１〜４つはアセチル化されていてもよく、好ましくは、２つがアセチル化されていてもよく、より好ましくは３つがアセチル化されていてもよく、さらに好ましくは４つがアセチル化されていてもよい。当業者であれば、細胞膜の通過性から、いずれのアセチル化形態も細胞膜を通過すると理解するであろうが、より通過性の高いアセチル化形態は、細胞膜透過性を評価することにより容易に決定することができよう。従って、化学式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、細胞外から細胞に提供されることにより、細胞は、化学式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を細胞内に取込むことができる。細胞内に取り込まれた化学式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、細胞内のエステラーゼによりＲ１〜Ｒ４が加水分解されてＯＨ基となり、フコースキナーゼによりリン酸化され、さらにＧＤＰ−フコース  ピロホスホリラーゼ（ＦＰＧＴ）によりＧＤＰ−フコース類似体（すなわち、グアノシン５’−ジホスホ−６−デオキシ−６−エチニル−β−Ｌ−ガラクトピラノース）に変換される。
【００３０】
ＧＤＰ−フコース類似体の形態に変換された上記化合物は、ゴルジ体にトランスポートされ、ゴルジ体内でフコース転移酵素（例えば、ＦＵＴ８）により糖タンパク質および糖脂質のフコース修飾位置に導入され得る。このようにして、一般式（Ｉ）に示される化合物またはその塩は、細胞外から供給することにより、細胞内に取り込まれ、細胞内の糖鎖合成経路に組込まれて当該細胞における糖鎖修飾中のフコースに置き換わる。このようにして、一般式（Ｉ）の化合物を用いると、細胞に内在する糖鎖合成経路において産生される糖タンパク質および糖脂質中のフコースに標識としてのエチニル基を導入することができる。
【００３１】
本発明のある態様では、７位の炭素がエチニル基により置換されたフコースを有する糖鎖により修飾された糖タンパク質または糖脂質を細胞膜上に表出した哺乳動物細胞が提供される。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト細胞であり得る。
【００３２】
エチニル基が導入されたフコースは、一般式（Ｉ）で示されていた化合物中のエチニル基で修飾されているから、エチニル基を介した化学により更なる標識を導入することができる。そのような標識としては、例えば、アジド基修飾を有する標識が挙げられ、例えば、アジド基修飾を有するビオチンが挙げられる。
【００３３】
また、糖タンパク質が膜タンパク質である場合には、細胞表面上にエチニル基修飾を受けたフコースを有する糖タンパク質が表出しうる。この場合も、エチニル基を介した化学により更なる標識を導入することができる。そのような標識としては、例えば、アジド基修飾を有する標識が挙げられ、例えば、アジド基修飾を有するビオチンが挙げられる。
【００３４】
このような標識は、常法を用いて検出することができる。標識をビオチンとすると、ストレプトアビジンなどのアビジンを用いて検出することができる点で簡便である。ストレプトアビジンは、さらに蛍光色素やペルオキシダーゼで標識して常法を用いてこれを検出することもできる。
【００３５】
当業者であれば、標識の際に細胞膜を維持させることで細胞膜上の糖タンパク質のみを検出することができるし、標識の際に界面活性剤等により細胞膜を破壊することで細胞内の糖タンパク質を検出することができよう。
【００３６】
このようにして、本発明によれば、一般式（Ｉ）の化合物を用いると、タンパク質および脂質の糖鎖を標識することができる。本発明によればまた、フコースを含む糖鎖を有するタンパク質および脂質を表出した細胞、細胞に表出した前記タンパク質および脂質、または、前記タンパク質および脂質を修飾する糖鎖を検出することができる。従って、本発明によれば、一般式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む、タンパク質若しくは脂質の糖鎖を標識することに用いるための組成物、標識（特にエチニル基による標識）が細胞内において行われる前記組成物、フコースを含む糖鎖を有するタンパク質若しくは脂質を表出した細胞、細胞に表出した前記タンパク質若しくは脂質、または、前記タンパク質若しくは脂質を修飾する糖鎖を検出することに用いるための組成物が提供される。
【００３７】
本発明によれば、ＧＤＰ−フコース類似体である、以下一般式（ＩＩ）に示される化合物またはその塩：
【化８】
2018002666.tif 000010
｛ここで、Ｌは、リンカーであり、１以上の原子からなり、好ましくは、
Ｌは、−（ＣＨ2）n−であり、かつ、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であるか、または、
Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−であり、かつ、ｍは、１〜４のいずれかの自然数である。｝
が提供される。
【００３８】
１以上の原子からなるリンカーは、直鎖状に複数の原子を連結していてもよく、直鎖上に連結した原子の数は１〜１０としてもよい。
【００３９】
Ｌが−（ＣＨ2）n−である場合、ｎは、１〜１２のいずれかの自然数であることが好ましく、１〜１０、１〜８、１〜６および１〜４から選択されるいずれかの自然数、または１、２、３若しくは４であることが好ましく、ｎは１とすることができる。
【００４０】
Ｌが−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−、−（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）m−若しくは、−（ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2）m−である場合、ｍは、１〜４のいずれかの自然数とすることができ、３とすることができ、２とすることができ、または１とすることができる。ある態様では、Ｌは、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−であり、ｍは、１〜４のいずれかの自然数とすることができ、好ましくは３であり、より好ましくは２であり、さらに好ましくは１である。
【００４１】
本発明のある態様では、式（ＩＩ）で表される化合物は、グアノシン５’−ジホスホ−６−デオキシ−６−エチニル−β−Ｌ−ガラクトピラノースであり得る。
【００４２】
上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、フコース転移酵素の良好なドナー基質となり得る。従って、本発明によれば、上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む、フコース転移酵素のドナー基質として用いるための組成物が提供される。本発明によればまた、上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む、糖鎖にアルキニル基を有するフコースを導入することに用いるための組成物が提供される。
【００４３】
アルキニル基を有するフコースは、例えば、アジド基と高い反応性を有する。従って、アルキニル基を有するフコースは、例えば、アジド基を有する標識と反応させれば、様々な標識をフコースに導入することができる。従って、本発明によれば、上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む、フコースを含む糖鎖を標識することに用いるための組成物が提供される。また、本発明によれば、上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む、フコースを含む糖鎖を有するタンパク質または脂質を標識することに用いるための、組成物が提供される。標識としては特に限定されないが例えば、ビオチンが挙げられる。
【００４４】
エチニル基とアジド基との反応は、以下のように行うことができる。
【化９】
2018002666.tif 000011
【００４５】
すなわち、アジド基とエチニル基とを金属触媒存在下で反応させると２つの基によってトリアゾール環が形成され、基同士が強固に連結する。この反応においては、金属触媒としては、例えば、銅（Ｉ）などの金属触媒が用いられ、配位子としてトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）を組み合わせて用いることができる。
【００４６】
従って、アジド基を有する化合物と７−アルキニル−フコースのエチニル基とは、上記反応により連結させることができ、結果としてフコースを化合物で修飾することができる。例えば、アジド基を有する標識と７−アルキニル−フコースのエチニル基とを反応させることにより、フコースを標識することができる。
【００４７】
標識としてビオチンを用いる場合、アジド基にビオチンを連結させることができる。ビオチン標識は、ストレプトアビジンなどのアビジンにより検出することができる。ビオチンはアビジンと高親和性を有し、特異的に結合するためである。ストレプトアビジンに発色試薬、蛍光試薬などを付加しておくことにより、ビオチン（すなわち、アルキニル基）を検出することができる。
【００４８】
本発明の別の側面では、フコースを含む糖鎖を有するタンパク質若しくは脂質を表出した細胞、細胞に表出した前記タンパク質若しくは脂質、または、前記タンパク質若しくは脂質を修飾する糖鎖を検出する方法であって、
（ｉ）一般式（Ｉ）に記載の化合物と細胞とを接触させ、これにより、細胞に前記化合物を取り込ませて、糖鎖にフコースとして前記化合物を取り込ませ、細胞膜上に糖タンパク質または脂質を表出させること
を含む方法が提供される。
【００４９】
本発明のある態様では、フコースを含む糖鎖を有するタンパク質若しくは脂質を表出した細胞、細胞に表出した前記タンパク質若しくは脂質、または、前記タンパク質若しくは脂質を修飾する糖鎖を検出する方法であって、上記（ｉ）と、（ｉｉ）標識と連結したアジド基を前記糖タンパク質若しくは糖脂質と接触させることとを含む方法が提供される。この方法は、上記（ｉｉ）に加えて（ｉｉｉ）前記標識を可視化することをさらに含んでいてもよい。この方法は、インビトロの方法またはインビボの方法であり得る。
【００５０】
本発明の別の側面では、タンパク質の糖鎖を標識することに用いるための組成物を製造するための、一般式（Ｉ）に記載の化合物の使用が提供される。本発明のある態様では、タンパク質または脂質の糖鎖を細胞内において標識することに用いるための組成物を製造するための、一般式（Ｉ）に記載の化合物の使用が提供される。本発明のある態様では、フコースを含む糖鎖を有するタンパク質若しくは脂質を表出した細胞、細胞に表出した前記タンパク質若しくは脂質、または、前記タンパク質若しくは脂質を修飾する糖鎖を検出することに用いるための組成物を製造するための、一般式（Ｉ）に記載の化合物の使用が提供される。
【００５１】
本発明の別の側面では、フコースを含む糖鎖を有するタンパク質若しくは脂質を表出した細胞、細胞に表出した前記タンパク質若しくは脂質、または、前記タンパク質若しくは脂質を修飾する糖鎖を検出するための、一般式（Ｉ）に記載の化合物の使用が提供される。
【００５２】
本発明の別の側面では、糖タンパク質または糖脂質の糖鎖にフコース類似体を転移させる方法であって、フコース転移酵素とアクセプター基質としての前記糖タンパク質または糖脂質とドナー基質としての一般式（ＩＩ）の化合物とを接触させることを含む、方法が提供される。また本発明によれば、タンパク質または脂質のフコース転移酵素活性を決定する方法であって、前記タンパク質または脂質とアクセプター基質としての糖タンパク質または糖脂質とドナー基質としての一般式（ＩＩ）の化合物とを接触させることを含む、方法が提供される。また、本発明によれば、フコースを含む糖鎖を標識する方法であって、フコース転移酵素とアクセプター基質としての糖タンパク質または糖脂質とドナー基質としての一般式（ＩＩ）の化合物とを接触させることを含む、方法が提供される。これらの方法において、特に限定されないが、糖タンパク質または糖脂質は低フコシル化（または非フコシル化）された糖タンパク質または糖脂質としてもよい。このような低フコシル化糖タンパク質または糖脂質は、例えば、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を用いて調製することができる。
【００５３】
本発明の別の側面では、フコース転移酵素のドナー基質として用いるための組成物の製造のための、一般式（ＩＩ）の化合物の使用が提供される。本発明ではまた、糖タンパク質または糖脂質の糖鎖にフコース類似体を転移させることに用いるための組成物の製造のための、一般式（ＩＩ）の化合物の使用が提供される。本発明ではまた、タンパク質、脂質またはオリゴ糖へのフコース転移酵素活性を決定することに用いるための組成物の製造のための、一般式（ＩＩ）の化合物の使用が提供される。本発明ではまた、フコース転移酵素のドナー基質として用いるための、一般式（ＩＩ）の化合物の使用が提供される。本発明ではまた、糖タンパク質または糖脂質の糖鎖にフコース類似体を転移させることに用いるため、一般式（ＩＩ）の化合物の使用が提供される。本発明ではまた、タンパク質、脂質またはオリゴ糖へのフコース転移酵素活性を決定することに用いるための、一般式（ＩＩ）の化合物の使用が提供される。
【実施例】
【００５４】
用語と略語
ＡｃＯＨ：  酢酸
ＭｅＯＨ：  メタノール
ＭｅＣＮ：  アセトニトリル
ＥｔＯＡｃ：  酢酸エチル
Ａｃ2Ｏ：  無水酢酸
ＤＭＡＰ：  Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン
ＴＨＦ：  テトラヒドロフラン
ＤＭＦ：  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＩＢＡＬ−Ｈ：  水素化ジイソブチルアルミニウム
ＴＢＡ：  テトラブチルアンモニウム塩
【００５５】
実施例１：フコース類似体の合成
本実施例では、様々なフコース類似体を合成した。
【００５６】
全ての試薬は、東京化成工業、和光純薬工業またはアルドリッチ・ケミカル社から購入した。トルエン−４−スルホン酸  ２−（２−プロプ−２−イニルオキシ−エトキシ）−エチルエステル（１２）およびトルエン４−スルホン酸  ２−［２−（２−プロプ−２−イニルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル（１３）は、Sirion, U. et al., Tetrahedron Letters, 48: 3953-3957, 2007およびLi, Z. B., Bioconjugate Chemistry, 18, 1987-1994, 2007の記載に従って合成した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０Ｆ２５４プレート（Ｅ．メルク社）により実施した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、ＦＬ６０ＢまたはＦＬ６０Ｄシリカゲル（富士シリシア化学）を用いて実施した。1H-NMR (400 MHz), 13C-NMR (100 MHz)および31P-NMR (162 MHz)のＮＭＲスペクトルは、ブルカーＮＭＲスペクトロメーターを用いて測定した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析は、ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ（Esquire HCT, Bruker）を用いて得た。ＨＰＬＣによる分離は、Alliance HPLC system（Waters社）と様々なＣ１８カラム（分析用: 4.6 mm I.D. × 25 cm, 0.5 ml/min, TSKgel ODS-80Tm、または4.6 mm I.D. × 15 cm, 0.5 ml/min, YMC-Pack ODS-A; および調製用: 20.5 mm I.D. × 30 cm, 3.0 ml/min, TSKgel ODS-80Tm）を用いて実施した。
【００５７】
合成スキームの概要は以下の通りである。合成スキームの概要を説明した後に、合成について詳述する。
【００５８】
７−アルキニル−フコースのアセチル化形態は、以下のスキームで合成した。以下、スキームの説明中の下線を付した数字は、スキーム中の数字と対応する。
【００５９】
スキーム１
【化１０】
2018002666.tif 000012
（ａ）ＣｕＳＯ4、Ｈ2ＳＯ4（Ｃａｔ．）、アセトン、室温、２４時間、ｑｕａｎｔ。（ｂ）、イミダゾール、Ｐｈ3Ｐ、Ｉ2、トルエン、ＭｅＣＮ、９０℃、２４時間、７７％。（ｃ）ＮａＣＮ、ＤＭＦ、９０℃、２４時間、６５％。（ｄ）ＤＩＢＡＬ−Ｈ、ＣＨ2Ｃｌ2、−７８℃、１時間、その後０℃、１時間、８９％。（ｅ）ジメチル（２−オキソプロピル）ホスホネート、トシルアジド、ＭｅＣＮ、室温、２時間。（ｆ）５、ＭｅＯＨ、室温、８時間、５から６３％、（ｇ）８０％ＡｃＯＨ水溶液、還流。（ｈ）Ａｃ2Ｏ、ピリジン、ＤＭＡＰ、６から９９％。
【００６０】
（上記スキーム１の説明）
Ｌ−ガラクトース（１）のヒドロキシル基をＣ１およびＣ２の間で、並びにＣ３およびＣ４の間でイソプロピリデン化した（２）。Ｃ６のヒドロキシル基をヨウ化した（３）。ヨード基をＣＮ基で置換する（４）。ニトリル基をＤＩＢＡＬ−Ｈで還元した（５）。５をセイファース・ギルバート増炭反応により６に変換した。６を脱保護し、アセチル化した。
【００６１】
ＧＤＰ−７−アルキニル−フコースは、以下のスキームにより合成できる。
【００６２】
スキーム２
【化１１】
2018002666.tif 000013
（ａ）ＡｃＯＨ中３０％ＨＢｒ、Ａｃ2Ｏ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、４時間。（ｂ）ｎＢｕ4Ｎ−ＧＤＰ、ＭｅＣＮ、トルエン、０℃、３０分、その後、室温、５時間、７から１１％。（ｃ）２８％ＮＨ4ＯＨ水溶液、室温、３時間、５７％。
【００６３】
（スキーム２の説明）
７のアノマー位の炭素に結合したＯを臭化し、その後、ＧＤＰ−ＴＢＡ塩と反応させた（８）。８は脱アセチル化された（９）。
【００６４】
アルキニル−（Ｏ）ｎ−フコースは以下のスキームで合成できる。
【００６５】
スキーム３
【化１２】
2018002666.tif 000014
（ａ）ＣｕＳＯ4、Ｈ2ＳＯ4（ｃａｔ．）、アセトン、室温、２４時間、ｑｕａｎｔ．（ｂ）ＮａＨ、ＴＨＦ、プロパルギルブロミド、または１２若しくは１３。（ｃ）８０％ＡｃＯＨ水溶液、還流。（ｄ）Ａｃ2Ｏ、ピリジン、ＤＭＡＰ。
【００６６】
（スキーム３の説明）
Ｌ−ガラクトース（１）のヒドロキシル基を、Ｃ１およびＣ２の間で並びにＣ３およびＣ４の間でイソプロピリデン化した（２）。Ｃ６のヒドロキシル基をナトリウムヒドリドで活性化し、その後、プロパルギルブロミドまたはトシル化化合物である１２若しくは１３と反応させた（１０ａ〜１０ｃ）。１０ａ〜１０ｃを脱保護し、アセチル化した（１１ａ〜１１ｃ）。
【００６７】
ＧＤＰ−アルキニル−（Ｏ）ｎ−フコースは以下のスキームで合成できる。
【００６８】
スキーム４
【化１３】
2018002666.tif 000015
（ａ）ＡｃＯＨ中３０％ＨＢｒ、Ａｃ2Ｏ、ＣＨ2Ｃｌ2。（ｂ）４Ａ−ＭＳ、ＭｅＣＮ、トルエン、ｎＢｕ4−ＧＤＰ。（ｃ）２８％ＮＨ4ＯＨ水溶液、Ｄｏｗｅｘ（５０ｗ×８）［Ｅｔ3ＮＨ+］。
【００６９】
（スキーム２の説明）
１１ａ〜１１ｃのアノマー位の炭素に結合したＯを臭化し、その後、ＧＤＰ−ＴＢＡ塩と反応させた（１４ａ〜１４ｃ）。１４ａ〜１４ｃは脱アセチル化された（１５ａ〜１５ｃ）。
【００７０】
具体的には、以下の通りである。
【００７１】
１，２：３，４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−デオキシ−６−エチニル−α−Ｌ−ガラクトピラノシド（化合物６）
【化１４】
2018002666.tif 000016
【００７２】
ジメチル−２−オキソプロピルホスホネート（４６０ｍｇ，２．７７ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（３５．０ｍＬ）中のＫ2ＣＯ3（９５４ｍｇ，６．９０ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホニルアジド（５４６ｍｇ，２．７７ｍｍｏｌ）に加え、２時間攪拌した。反応物を次に、７ｍＬのＭｅＯＨ中、１，２：３，４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−デオキシ−６−ホルミル−α−Ｌ−ガラクトピラノシド（５）（６２７ｍｇ，２．３０ｍｍｏｌ）の溶液で処理し、８時間攪拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をＣＨＣｌ3（１００ｍＬ）および食塩水５０ｍＬで溶解した。有機層を分離し、食塩水（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で逐次的に洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させた。混合物は、ろ過して、真空下でエバポレートして乾燥させ、シリカゲル（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）を充填したフラッシュクロマトグラフィーを用いて残渣を精製し、表題の化合物６を得た（３９１ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ，６３％，無色シロップ）。1H NMR (CDCl3, δ in ppm); 1.34 (s, 3 H, Me), 1.37 (s, 3 H, Me), 1.45 (s, 3 H, Me), 1.55(s, 3 H, Me), 2.02 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, C≡C-H), 2.55 (ddd, J = 2.4, 8.4 and 16.1 Hz, 2 H, H-6ab) 3.92 (t, J = 7.6 Hz, 1 H, H-5), 4.32 (2 H, H-2, H-4), 4.63 (dd, J = 2.4 and 8.0 Hz, 1 H, H-3), 5.52 (d, J = 4.8 Hz, 1 H, H-1).
【００７３】
ＧＤＰ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−エチニル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩（化合物８）［グアノシン５’−ジホスホ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−デオキシ−６−エチニル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩］
【化１５】
2018002666.tif 000017
化合物６（３３０ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）を８０％ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）溶液に添加し、得られた溶液を還流条件下で２時間加熱した。その後、室温に冷却し、真空下でエバポレートして乾燥させ、残渣を得た。ピリジン（６．００ｍＬ）をこれに添加し、Ａｃ2Ｏ（１２．０ｍＬ，１２３ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＡＰを添加して、室温で１４時間攪拌した。反応物を真空下で濃縮して残渣を得てトルエン（３×２０ｍＬ）からの共エバポレートにより残存したピリジンを除去した。これにより得られた残渣をさらにＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、次いで飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、さらに次いで食塩水（５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過してエバポレートして残渣を得た。次いで、シリカゲル（２０〜３５％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ）を用いたラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物７を得た（４３３ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ，９９％，無色シロップ）。化合物７（１００ｍｇ，２８０μｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2溶液（２．５ｍＬ）をＡｃ2Ｏ（２５０μＬ，２．６４ｍｍｏｌ）および３０％ＨＢｒを含むＡｃＯＨ（１ｍＬ）で０〜５℃で処理した。得られた混合物を室温で４時間攪拌した。反応は、冷却飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（３０ｍＬ）で停止させ、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機化合物を無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過してエバポレートして残渣を得て、乾燥トルエン（１．５０ｍＬ）に懸濁した。トルエン懸濁液は、０〜５℃のＭｅＣＮ（１．５０ｍＬ）中のグアノシン−５’−ジホスフェート（ＧＤＰ）ジテトラブチルアンモニウム塩（２０３ｍｇ，２９６μｍｏｌ）に加え、０〜５℃で１５分攪拌し、その後室温で６時間攪拌した。得られた混合物をＣＨＣｌ3（３×１５．０ｍＬ）で洗浄し、水層を回収して凍結乾燥した。得られた残渣をＨＰＬＣにより精製した（ODS-80Tm (20.5×300 mm) (Eluent (A), 50 mM Et3N-H2CO3 buffer (pH 7.1); eluent (B), MeCN; flowrate, 3.0 mL/min; gradient (120 min), [A:B] = [96.5:3.5 to 60:40, v/v]; detection, 254 nm）。化合物８を含有するフラクションを合わせ、凍結乾燥して化合物８を得た（２９．６ｍｇ，２４．２μｍｏｌ，化合物７から１１％，白色固体）。
1H NMR (D2O, δ in ppm): 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 18 H, CH3 of TEA), 2.01 (s, 3 H, Me), 2.15 (s, 3 H, Me), 2.21 (s, 3 H, Me), 2.45 (dd, J = 8.8 and 16.8 Hz, 1 H, H-6a"), 2.56 (dd, J = 9.6 and 16.8 Hz, 1 H, H-6b"), 3.17-3.22 (q, J = 7.2 Hz, 12 H, CH2 of TEA), 4.08 (dd, J = 6.4 and 8.0 Hz, 1 H, H-5"), 4.21 (t, J = 4.4 Hz, 2 H, H-5ab'), 4.35 (s, 1 H, H-4'), 4.52 (m, 1 H, H-3'), 4.82 (m, 1 H, H-2'), 5.11 (m, 1 H, H-3"), 5.17 (dd, J = 3.2 and 10.4 Hz, 1 H, H-2"), 5.31 (t, J = 8.4 Hz, 1 H, H-4"), 5.51 (d, J = 2.8 Hz, 1 H, H-1"), 5.92 (d, J = 6.4 Hz, 1 H, H-1'), 8.10 (s, 1 H, H-8). 13C NMR (D2O contained 1,4-dioxiane, δ in ppm): 8.85, 13.44, 19.77, 20.05, 20.58, 20.99, 23.90, 47.27, 65.90, 69.14, 70.32, 71.18, 71.83, 72.17, 74.01, 78.68, 78.86, 84.42, 87.42, 96.08, 117.18, 152.46, 173.24, 173.76, 174.05, 182.05. 31P NMR (D2O, δ in ppm): -14.54 (d, J = 19.2 Hz), -14.88 (dd, J = 8.0 and 19.2 Hz). ESI-MS: m/z 738.0 for [M-H]-, calculated for C24H31N5O18P2 = 738.1.
【００７４】
ＧＤＰ−６−デオキシ−６−エチニル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩（化合物９）［グアノシン５’−ジホスホ−６−デオキシ−６−エチニル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩］
【化１６】
2018002666.tif 000018
【００７５】
化合物８（１５．９ｍｇ，１３．０μｍｏｌ）を含む２８％アンモニア水（１０．０ｍＬ）を室温で３時間攪拌した。混合物をエバポレートして乾燥させ、残渣を得、水に溶解させた。得られた溶液をＤｏｗｅｘ（商標）５０Ｗ×８−２００レジン（Ｅｔ3ＮＨ+形態）を通し、溶出物を凍結乾燥して残渣を得た。残渣をＨＰＬＣにより精製した（ODS-80Tm (20.5 × 300 mm) (Eluent (A), 50 mM Et3N-H2CO3 buffer (pH 7.1); eluent (B), MeCN; flowrate, 3.0 mL/min; gradient (120 min), [A:B] = [96.5:3.5 to 60:40, v/v]; detector, 254 nm）。化合物９を含むフラクションを合わせ、凍結乾燥して化合物９を得た（７．９ｍｇ，９．６８μｍｏｌ，５７％，白色固体）。
ESI-MS: m/z 612.0 for [M-H]-, calculated for C18H25N5O15P2 = 612.1.
【００７６】
１，２：３，４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−プロパルギル−α−Ｌ−ガラクトピラノシド（化合物１０ａ）
【化１７】
2018002666.tif 000019
【００７７】
ＮａＨ（油中６０％）（４８．４ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）の懸濁液と乾燥ＴＨＦ（１．５０ｍＬ）中のプロパルギルブロマイド（１００μＬ，１．１６ｍｍｏｌ）を化合物２（３００ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ）を含む乾燥氷冷ＴＨＦ（１．５ｍＬ）に加えた。得られた混合物を室温で２５時間攪拌した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）と水（１００ｍＬ）との間で分離した。有機層を回収し、無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過し、エバポレートとして残渣を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ヘキサン中１１〜１４％ＥｔＯＡｃ）を通して精製し、化合物１０ａを得た（２８３ｍｇ，９４７μｍｏｌ，８２％，白色固体）。
1H NMR (CDCl3, δ in ppm): 1.34 (s, 3 H, Me), 1.35 (s, 3 H, Me), 1.46 (s, 3 H, Me), 1.55 (s, 3 H, Me), 2.42 (bs, 1 H, C≡C-H), 3.51 (dd, J = 9.2 and 14.4 Hz, 1 H, H-6a), 3.66 (dd, J = 6.4 and 14.4 Hz, 1 H, H-6b), 4.00 (t, J = 6.2 Hz, 1 H, H-5), 4.17-4.28 (3 H, H-4, C≡C-CH2-) 4.32 (dd, J = 2.0 and 5.2 Hz, 1 H, H-2), 4.61 (dd, J = 2.0 and 8.0 Hz, 1 H, H-3), 5.54 (d, J = 5.2 Hz, 1 H, H-1).
【００７８】
ＧＤＰ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−プロパルギル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩（化合物１４ａ）［グアノシン５’−ジホスホ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−プロパルギル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩］
【化１８】
2018002666.tif 000020
【００７９】
化合物１０ａ（２４０ｍｇ，０．８０４ｍｍｏｌ）を８０％ＡｃＯＨ水溶液（１５ｍＬ９に溶解させ、還流条件下で２時間加熱した。混合物を室温まで冷却し、エバポレートして乾燥させ、残渣を得、ピリジン（４ｍＬ）に溶解させた。得られたピリジン溶液をＡｃ2Ｏ溶液（８．００ｍＬ，８４．９ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰで処理し、得られた混合物を室温で１７時間攪拌した。得られた混合物をさらに真空下で濃縮して残渣を得て、トルエンからの共エバポレート（３×２０ｍＬ）により残存したピリジンを除去した。得られた残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解させ、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、次いで飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）、さらに食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過し、エバポレートとして残渣を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ）を通して精製し、化合物１１ａを得た（２４２ｍｇ，０．６２６ｍｍｏｌ，７８％，無色シロップ）。
【００８０】
Ａｃ2Ｏ（２５０μＬ，２．６４ｍｍｏｌ）および３０％ＨＢｒを含むＡｃＯＨ（１．０７ｍＬ）を化合物１１ａ（１２４ｍｇ，３２１μｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（２．５０ｍＬ）に０〜５℃で加えて、得られた混合物を室温で４時間攪拌した。反応は、冷却飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（３０ｍＬ）で停止させ、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機化合物を無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過してエバポレートして残渣を得て、乾燥トルエン（１．００ｍＬ）に懸濁した。トルエン懸濁液は、０〜５℃のＭｅＣＮ（１．５０ｍＬ）中のグアノシン−５’−ジホスフェート（ＧＤＰ）ジテトラブチルアンモニウム塩（２３０ｍｇ，３３６μｍｏｌ）およびＡＷ−３００分子シーブ（２５０ｍｇ）に加え、０〜５℃で１５分攪拌し、その後室温で５時間攪拌した。得られた混合物を真空下でエバポレートして残渣を得て、水（５．０ｍＬ）に溶解した。得られた水溶液をろ過して不溶成分を除去し、ろ液をＣＨ3Ｃｌ（２×１５．０ｍＬ）で洗浄した。水層を回収し、凍結乾燥して、残渣を得て、得られた残渣をＨＰＬＣにより精製した（ODS-80Tm (20.5 × 300 mm) (Eluent (A), 50 mM Et3N-H2CO3 buffer (pH 7.1); eluent (B), MeCN; flowrate, 3.0 mL/min; gradient (120 min), [A:B] = [96.5:3.5 to 60:40, v/v]; detection, 254 nm）。化合物８を含有するフラクションを合わせ、凍結乾燥して化合物８を得た（２９．６ｍｇ，２４．２μｍｏｌ，化合物７から１１％，白色固体）。目的化合物を含むフラクションを合わせて凍結乾燥し、化合物１４ａを得た（４０．６ｍｇ，３２．４μｍｏｌ，化合物１１ａから１３％，白色固体）。
1H NMR (D2O, δ in ppm): 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 18 H, CH3 of TEA), 2.01 (s, 3 H, Me), 2.16 (s, 3 H, Me), 2.23 (s, 3 H, Me), 3.20 (q, J = 7.2 Hz, 12 H, CH2 of TEA), 3.61-3.77 (m, 2 H, H-6′′ab), 4.09-4.22 (5 H, H-5′′, H-5′ab, C≡C-CH2-), 4.36 (brs, 1 H, H-4′), 4.52-4.53 (m, 1H, H-3′), 5.11-5.21 (2 H, H-2′′, H-3′′), 5.33 (t, J = 7.2 Hz, 1 H, H-4′′), 5.45 (brs, 1 H, H-1′′), 5.93 (d, J = 6.0 Hz, 1 H, H-1′), 8.11 (s, 1 H, H-8). 13C NMR (D2O containing 1,4-dioxiane, δ in ppm): 8.86, 13.50, 19.72, 20.58, 21.06, 23.81, 47.26, 58.67, 65.75, 67.33, 68.27, 68.51, 71.02, 71.57, 72.05, 74.01, 74.80, 84.09, 87.16, 95.89, 117.06, 138.07, 152.47, 173.00, 173.71, 173.75, 181.90. 31P NMR (D2O, δ in ppm): -14.52 (d, J = 19.4 Hz), -16.73 (t, J = 9.72 Hz). ESI-MS: m/z 768.1 for [M-H]-, calculated for C25H33N5O19P2 = 768.1.
【００８１】
ＧＤＰ−６−Ｏ−プロパルギル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩（化合物１５ａ）［グアノシン５’−ジホスホ−６−Ｏ−プロパルギル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩］
【化１９】
2018002666.tif 000021
【００８２】
化合物１４ａ（１７．９ｍｇ，１４．３ｍｍｏｌ）を２８％アンモニア水溶液（３．０ｍＬ）に溶解させ、得られた溶液を室温で３．５時間攪拌した。反応混合物を真空下でエバポレートして残渣を得て水に溶解した。Ｄｏｗｅｘ（商標）５０Ｗ×８−２００レジン（Ｅｔ3ＮＨ+形態）を通過させた。溶出物を回収し、凍結乾燥して残渣を得て、ＨＰＬＣで精製した（ODS-80Tm (20.5 × 300 mm) (Eluent (A), 50 mM Et3N-H2CO3 buffer (pH 7.1); eluent (B), MeCN; Flowrate, 3.0 mL/min; gradient (120 min), [A:B] = [96.5:3.5 to 60:40, v/v]; detection, 254 nm）。目的化合物を含むフラクションを合わせて凍結乾燥し、化合物１５ａを得た（９．９ｍｇ，１１．７μｍｏｌ，６４％，白色固体）。
ESI-MS: m/z 642.0 for [M-H]-, calculated for C19H27N5O16P2 = 642.1.
【００８３】
１，２：３，４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−（２−プロパルギルオキシ）エチル−α−Ｌ−ガラクトピラノシド（化合物１０ｂ）
【化２０】
2018002666.tif 000022
【００８４】
ＮａＨ（油中６０％）（１２７ｍｇ，３．１７ｍｍｏｌ）とトルエン−４−スルホン酸２−（２−プロプ−２−イニルオキシ−エトキシ）−エチルエステル（１２）（７６９ｍｇ，３．０３ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＴＨＦ（７．５０ｍＬ）を化合物２（７５０ｍｇ，２．８８ｍｍｏｌ）を含む乾燥氷冷ＴＨＦ（１５．０ｍＬ）に加えた。得られた溶液を還流条件下で１３時間加熱した。混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈して、水（１００ｍＬ）、次いで食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過し、エバポレートとして残渣を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ＥｔＯＡｃ：トルエン：ヘキサン＝１：１：８〜１：１：６，ｖ／ｖ／ｖ）を通して精製し、化合物１０ｂを得た（４８６ｍｇ，１．４２ｍｍｏｌ，４９％，無色シロップ）。
1H NMR (CDCl3, δ in ppm): 1.33 (s, 3 H, Me), 1.34 (s, 3 H, Me), 1.45 (s, 3 H, Me), 1.54 (s, 3 H, Me), 2.43 (d, J = 2.4 Hz, 1 H, C≡C-H), 3.70-3.80 (6 H, H-6ab, CH2 × 2), 4.00 (t, J = 6.4 Hz, 1 H, H-5), 4.20-4.21 (m, 2 H, C≡C-CH2-), 4.27 (d, J = 8.4 Hz, 1 H, H-4), 4.30 (dd, J = 2.4 and 5.2 Hz, 1 H, H-2), 4.59 (dd, J = 2.4 and 8.4 Hz, 1 H, H-3), 5.53 (d, J = 5.2 Hz, 1 H, H-1).
【００８５】
ＧＤＰ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（２−プロパルギル）エチル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩（化合物１４ｂ）［グアノシン５’−ジホスホ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（２−プロパルギル）エチル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩］
【化２１】
2018002666.tif 000023
【００８６】
化合物１０ｂ（４００ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）を８０％ＡｃＯＨ（２０ｍＬ）の水溶液に加えて、還流条件下で１．５時間加熱した。反応物を室温まで冷却し、エバポレートして乾燥させて残渣を得た。残渣をピリジン（５．５０ｍＬ）に溶解させた。ピリジン溶液をＡｃ2Ｏ（１１．０ｍＬ，１１７ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰで処理して、室温で２５時間攪拌した。溶液を真空下で濃縮して残渣を得て、トルエン（３×２０ｍＬ）を用いて共エバポレートして残存したピリジンを除去した。得られた残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解させて、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、次いで飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（５０ｍＬ）、さらに食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過し、エバポレートとして残渣を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ヘキサン中２５〜３３％ＥｔＯＡｃ）を通して精製し、化合物１１ｂを得た（４２１ｍｇ，０．９７９ｍｍｏｌ，８４％，無色シロップ）。
【００８７】
Ａｃ2Ｏ（２５０μＬ，２．６４ｍｍｏｌ）および３０％ＨＢｒを含むＡｃＯＨ（１．００ｍＬ）を化合物１１ｂ（１００ｍｇ，２３２μｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（２．５０ｍＬ）に０〜５℃で加え、室温で４時間攪拌した。得られた反応物を冷却した飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（３０ｍＬ）と混合し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機化合物を回収し、無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過し、エバポレートとして残渣を得た。残渣を乾燥トルエン（１．００ｍＬ）に懸濁した。このトルエン懸濁液を、０〜５℃のＭｅＣＮ（１．５０ｍＬ）中のグアノシン５’−ジホスフェート（ＧＤＰ）ジテトラブチルアンモニウム塩（１６７ｍｇ，２４３μｍｏｌ）およびＡＷ−３００分子シーブ（２５０ｍｇ）の懸濁液に加え、０〜５℃で１５分攪拌し、その後室温で６時間攪拌した。混合物をエバポレートして残渣を得て水（５．０ｍＬ）に溶解させた。得られた水溶液をろ過して不溶成分を除去し、ろ液をＣＨＣｌ3（３×１５．０ｍＬ）で洗浄した。水層を凍結乾燥して残渣を得て、ＨＰＬＣにより精製した（ODS-80Tm (20.5 × 300 mm) (Eluent (A), 50 mM Et3N-H2CO3 buffer (pH 7.1); eluent (B), MeCN; flowrate, 3.0 mL/min; gradient (120 min), [A:B] = [96.5:3.5 to 60:40, v/v]; detection, 254 nm)。目的化合物を含むフラクションを合わせ、凍結乾燥して化合物１４ｂを得た（２９．５ｍｇ，２２．８μｍｏｌ，化合物１１ｂから１３％，白色固体）。
1H NMR (D2O, δ in ppm): 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 18 H, CH3 of TEA), 2.00 (s, 3 H, Me), 2.13 (s, 3 H, Me), 2.20 (s, 3 H, Me), 3.17 (q, J = 7.2 Hz, 12 H, CH2 of TEA), 3.55-3.61 (6 H, H-6′′ab, O-CH2CH2-O), 4.16-4.21 (5 H, H-5′′, H-5′ab, C≡C-CH2-), 4.34 (brs, 1 H, H-4′), 4.49-4.51 (m, 1H, H-3′), 4.75-4.77 (m, 1 H, H-2′), 5.11-5.20 (2 H, H-2′′, H-3′′), 5.33 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4′′), 5.46 (brs, 1 H, H-1′′), 5.92 (d, J = 6.0 Hz, 1 H, H-1′), 8.09 (s, 1 H, H-8). 13C NMR (D2O containing 1,4-dioxiane, δ in ppm): 8.88, 13.45, 19.77, 20.59, 21.01, 23.91, 47.24, 58.44, 65.92, 68.62, 68.72, 69.12, 70.59, 71.14, 71.75, 72.38, 74.17, 84.42, 87.18, 96.06, 117.48, 137.92, 152.63, 173.46, 173.85, 173.90, 182.04. 31P NMR (D2O, δ in ppm): -14.56 (d, J = 19.4 Hz), -16.74 (t, J = 9.72 Hz). ESI-MS: m/z 821.1 for [M-H]-, calculated for C27H37N5O20P2 = 812.1.
【００８８】
ＧＤＰ−６−Ｏ−（２−プロパルギルオキシ）エチル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩（化合物１５ｂ）［グアノシン５’−ジホスホ−６−Ｏ−（２−プロパルギルオキシ）エチル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩
【化２２】
2018002666.tif 000024
【００８９】
化合物１４（１５．２ｍｇ，１１．７ｍｍｏｌ）を含む２８％アンモニア水溶液（３．００ｍＬ）を室温で３．５時間攪拌した。溶媒を真空下で除去して残渣を得て、水で溶解し、Ｄｏｗｅｘ（商標）５０Ｗ×８−２００レジン（Ｅｔ3ＮＨ+形態）を通過させた。溶出物を凍結乾燥して残渣を得て、ＨＰＬＣにより精製した（ODS-80Tm (20.5 × 300 mm) (Eluent (A), 50 mM Et3N-H2CO3 buffer (pH 7.1); eluent (B), MeCN; flowrate, 3.0 mL/min; gradient (120 min), [A:B] = [96.5:3.5 to 60:40, v/v]; detection, 254 nm)。
ESI-MS: m/z 686.0 for [M-H]-, calculated for C21H31N5O17P2 = 686.1.
【００９０】
１，２：３，４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−（２−（２−プロパルギルオキシ）エトキシ）エチル−α−Ｌ−ガラクトピラノシド（化合物１０ｃ）
【化２３】
2018002666.tif 000025
【００９１】
ＮａＨ（油中６０％）（１７３ｍｇ，４．３２ｍｍｏｌ）とトルエン−４−スルホン酸２−［２−（２−プロプ−２−イニルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル（１３）（９０３ｍｇ，３．０３ｍｍｏｌ）を化合物２（７５０ｍｇ，２．８８ｍｍｏｌ）を含む氷冷乾燥ＴＨＦ（１５．０ｍＬ）に加えた。得られた溶液を還流条件下で２０時間加熱した。混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）と水（１５０ｍＬ）の間で分離した。有機層を回収して、食塩水（７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過し、エバポレートとして残渣を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ヘキサン中１１〜１６％ＥｔＯＡｃ）を通して精製し、化合物１０ｃを得た（４３２ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ，３９％，無色シロップ）。
1H NMR (CDCl3, δ in ppm): 1.33 (s, 3 H, Me), 1.34 (s, 3 H, Me), 1.44 (s, 3 H, Me), 1.54 (s, 3 H, Me), 2.43 (brs, 1 H, C≡C-H), 3.62-3.74 (10 H, H-6ab, O-CH2CH2-O-CH2CH2-O), 3.99 (t, J = 6.2 Hz, 1 H, H-5), 4.21 (d, J = 2.0 Hz, 2 H, C≡C-CH2-), 4.26 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 4.30 (dd, J = 2.0 and 5.2 Hz, 1 H, H-2), 4.59 (dd, J = 2.0 and 8.0 Hz, 1 H, H-3), 5.53 (d, J = 5.2 Hz, 1 H, H-1). 13C NMR (CDCl3, δ in ppm): 24.45, 24.94, 26.00, 26.09 (Me × 4), 58.40 (C≡C-CH2-), 66.78 (C-5), 69.14 (C-6), 69.89, 70.41, 70.52, 70.69 (O-CH2- × 4), 70.65 (C-3), 70.77 (C-2), 71.14 (C-4), 74.47 (H-C≡C-), 79.71 (H-C≡C-), 96.36 (C-1), 108.53, 109.19 (C-Me2 × 2).
【００９２】
ＧＤＰ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（２−（２−プロパルギルオキシ）エトキシ）エチル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩（化合物１４ｃ）
【化２４】
2018002666.tif 000026
【００９３】
化合物１０ｃ（３８０ｍｇ，０．９８３ｍｍｏｌ）を８０％ＡｃＯＨ水溶液（１０ｍＬ）に添加し、還流条件下で１．５時間加熱した。混合物を室温まで冷却し、エバポレートして残渣を得て、ピリジン（５．０ｍＬ）に溶解させた。このピリジン溶液をＡｃ2Ｏ（１０．０ｍＬ）および触媒ＤＭＡＰで処理して室温で８．５時間攪拌した。反応混合物をエバポレートして乾燥させて残渣を得て、トルエン（３×２０ｍＬ）からの共エバポレートにより残存したピリジンを除去した。ピリジンを除いた残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解させ、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、次いで飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、さらに食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過し、エバポレートとして残渣を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ヘキサン中２５〜５０％ＥｔＯＡｃ）を通して精製し、化合物１１ｃを得た（４６７ｍｇ，０．９８３ｍｍｏｌ，quant，無色シロップ）。
【００９４】
Ａｃ2Ｏ（２５０μＬ，２．６４ｍｍｏｌ）および３０％ＨＢｒを含むＡｃＯＨ（１．００ｍＬ）を化合物１１ｃ（１００ｍｇ，２１１μｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（２．５０ｍＬ）に０〜５℃で加え、室温で４時間攪拌した。得られた反応物を冷却した飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（３０ｍＬ）と混合し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機化合物を回収し、無水Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、ろ過し、エバポレートとして残渣を得た。残渣を乾燥トルエン（１．００ｍＬ）に懸濁した。このトルエン懸濁液を、０〜５℃のＭｅＣＮ（１．５０ｍＬ）中のグアノシン５’−ジホスフェート（ＧＤＰ）ジテトラブチルアンモニウム塩（１７８ｍｇ，２６０μｍｏｌ）およびＡＷ−３００分子シーブ（２５０ｍｇ）の懸濁液に加え、０〜５℃で１５分攪拌し、その後室温で６時間攪拌した。混合物をエバポレートして残渣を得て水（５．０ｍＬ）に溶解させた。得られた水溶液をろ過して不溶成分を除去し、ろ液をＣＨＣｌ3（２×１５．０ｍＬ）で洗浄した。水層を凍結乾燥して残渣を得て、ＨＰＬＣにより精製した（ODS-80Tm (20.5 × 300 mm) (Eluent (A), 50 mM Et3N-H2CO3 buffer (pH 7.1); eluent (B), MeCN; flowrate, 3.0 mL/min; gradient (120 min), [A:B] = [96.5:3.5 to 60:40, v/v], detection, 254 nm)。目的化合物を含むフラクションを合わせ、凍結乾燥して化合物１４ｃを得た（２７．６ｍｇ，２０．６μｍｏｌ，化合物１１ｃから１２％，白色固体）。
1H NMR (D2O, δ in ppm): 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 18 H, CH3 of TEA), 2.00 (s, 3 H, Me), 2.16 (s, 3 H, Me), 2.20 (s, 3 H, Me), 3.19 (q, J = 7.2 Hz, 12 H, CH2 of TEA), 3.56-3.69 (10 H, H-6′′ab, O-CH2CH2-O-CH2CH2-O), 4.17-4.23 (5 H, H-5′′, H-5′ab, C≡C-CH2-), 4.35 (brs, 1 H, H-4′), 4.52 (t, J = 4.0 Hz, 1H, H-3′), 5.16-5.19 (2 H, H-2′′, H-3′′), 5.33 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4′′), 5.45 (d, J = 2.4 Hz, 1 H, H-1′′), 5.93 (d, J = 6.4 Hz, 1 H, H-1′), 8.11 (s, 1 H, H-8). 13C NMR (D2O containing 1,4-dioxiane, δ in ppm): 8.86, 13.45, 19.97, 20.58, 21.00, 23.90, 47.26, 58.47, 65.92, 68.61, 68.78, 69.26, 70.01, 70.78, 71.16, 71.79, 74.17, 83.22, 87.29, 95.92, 117.38, 137.93, 152.46, 173.21, 173.77, 173.84, 182.05. 31P NMR (D2O, δ in ppm): -14.54 (d, J = 19.4 Hz), -16.72 (q, J = 9.72 Hz). ESI-MS: m/z 856.1 for [M-H]-, calculated for C29H41N5O21P2 = 856.1.
【００９５】
ＧＤＰ−６−Ｏ−（２−（２−プロパルギルオキシ）エトキシ）エチル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩（化合物１５ｃ）［グアノシン５’−ジホスホ−６−Ｏ−（２−（２−プロパルギルオキシ）エトキシ）エチル−β−Ｌ−ガラクトピラノース  ジトリエチルアンモニウム塩］
【化２５】
2018002666.tif 000027
【００９６】
化合物１４ｃ（１７．８ｍｇ，１３．３ｍｍｏｌ）を含む２８％アンモニア水溶液（１．５ｍＬ）を室温で３．５時間攪拌した。溶媒を真空下でエバポレートして残渣を得、水に溶解させてＤｏｗｅｘ（商標）５０Ｗ×８−２００レジン（Ｅｔ3ＮＨ+形態）を通過させた。溶出物を回収し、凍結乾燥して残渣を得て、ＨＰＬＣにより精製した（ODS-80Tm (20.5 × 300 mm) (Eluent (A), 50 mM Et3N-H2CO3 buffer (pH 7.1); eluent (B), MeCN; flowrate, 3.0 mL/min; gradient (120 min), [A:B] = [96.5:3.5 to 60:40, v/v], detection, 254 nm)。目的化合物を含むフラクションを合わせて、凍結乾燥して化合物う１５ｃを得た（７．３ｍｇ，７．８１ｍｍｏｌ，４７％，白色固体）。
ESI-MS: m/z 730.1 for [M-H]-, calculated for C23H35N5O18P2 = 730.1.
【００９７】
実施例２：各種フコース類似体の変換活性
本実施例では、フコース転移酵素であるＦＵＴ８の転移活性におけるフコース類似体依存性を確認した。併せて、他のフコース転移酵素であるＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ４およびＦＵＴ９についても同様の実験を行った。
【００９８】
Ｆｕｔ１、２、４および９についての全長ｃＤＮＡは、マウス脳全ＲＮＡから逆転写およびＰＣＲ法を用いて増幅して、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。これらのｃＤＮＡを鋳型として用いて、Ｆｕｔ１および４はストップコドンを含まないようにＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ６／ｍｙｃ−ＨｉｓＡベクターにライゲーションし、ｍｙｃ−ＨｉｓタグＦｕｔ酵素をコードするプラスミドを構築した。Ｆｕｔ２および９は膜貫通領域以降の触媒領域をＰＣＲ増幅し、Ｎ末端にシグナル配列とＨｉｓタグを融合して発現するように、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）に組み込んだ。
【００９９】
Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有する組換えヒトＨＵＴ８は、Ihara, H. et al., Glycobiology16, 333-342, 2006に記載の通り、バキュロウイルスシステムを用いて可溶型形態で発現させ、Ｎｉ2+カラムを用いて精製した。マウス組換えＦｕｔ２および９は、ＣＯＳ７細胞に上記発現プラスミドをPolyethyleneimine MAX (Polyscience)を用いてトランスフェクションし、発現したタンパク質をＮｉ2+カラムを用いて精製した。Ｆｕｔ１および４は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞に発現させ、抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、Enzo Lifesciences）とDynabeads Protein Gを用いて精製した。
【０１００】
フコース転移酵素活性
蛍光標識したＮ−（２−（２−ピリジルアミノ）エチル）スクシンアミド酸  ５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル（ＧｎＧｎ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＰＮＳＮＢ）を基質（受容体）として用いてＦＵＴ８のフコース転移酵素活性を測定した（Ihara, H. et al., Glycobiology16, 333-342, 2006参照）。具体的には、１０μＭの基質（受容体）と０．５ｍＭのＧＤＰ結合型フコース類似体とを含む２０μＬの５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行い、反応を１００℃１０分間の加熱により停止させて、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０分）した後に上清をＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ｇｅｌ、ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ））で分析した。Ｆｕｔ１，２，  ４および９に関しては、ピリジルアミンで蛍光標識したラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ，Ｇａｌ  １−４ＧｌｃＮＡｃ  １−３Ｇａｌ  １−４Ｇｌｃ）を用いてKorekane, H. et al., J. Biochem. 148, 359-370, 2010の記載に従って行った。反応をボイル２分間により停止させて遠心上清を逆相ＨＰＬＣで分析した。変換率は、フコシル化生成物を用いた全基質量で除して算出した。結果は、図２に示される通りであった。
【０１０１】
図２Ａに示されるように、様々なＧＤＰ結合型フコース類似体の中で、７−アルキニル−フコースが最も高い転移活性を有していることが明らかとなった。また、図２Ｂに示されるように、Ｆｕｔ１，２，４および９についても、７−アルキニル−フコースは、他のフコース類似体と比較して高い転移活性を示すことが明らかとなった。このことから、ＧＤＰ−７−アルキニル−フコースは、フコース転移酵素の良好な基質（ドナー）たり得ることが明らかとなった。なお、Ｆｕｔ１，２，４および９は、血液のＨ抗原および(Sialyl) Lewisグリカンを合成することができる。
【０１０２】
また、図２Ａに示されるように、ＧＤＰ−アルキニル−Ｏ−フコース（化合物１５ａ）、ＧＤＰ−アルキニル−（Ｏ）2−フコース（化合物１５ｂ）、またはＧＤＰ−アルキニル−（Ｏ）3−フコース（化合物１５ｃ）も、ＧＤＰ−６−アルキニル−フコースよりも高い転移活性を有していた。
【０１０３】
実施例３：フコース類似体のＧＤＰ結合形態への変換
細胞内で糖鎖に組込まれるためには、フコース類似体は、細胞内でＧＤＰ結合形態に変換される必要がある（例えば、図１Ａ参照）。本実施例では、フコース類似体が細胞内でＧＤＰ結合形態に変換されうるかについて調べた。
【０１０４】
この目的のためにフコース類似体として化合物７の過アセチル化７−アルキニル−フコース（２００μＭ）存在下でＪｕｒｋａｔ細胞を標準的な培養条件下で７２時間培養し、細胞内で形成したヌクレチド−糖化合物をイオンペアー逆相ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。
【０１０５】
結果は、図３に示される通りであった。図３Ａに示されるように、ＧＤＰ−７−アルキル−フコースに由来する主なフラグメントイオンである［ＧＤＰ−Ｈ+］（ｍ／ｚ：４４２）を調べたところ、３８分付近に単一のピークを有していた。この保持時間は、図３Ｂに示される［Ｍ−Ｈ］-６１２の保持時間と対応する。そしてまた、図３Ｃに示されるように、この［Ｍ−Ｈ］-のＭＳ／ＭＳクロマトグラムは、以前報告されていたＧＤＰ−フコースから得られる同フラグメントイオンのＭＳパターンと類似していた（Turnock and Ferguson, 2007）。これらの結果から、化合物７の過アセチル化７−アルキニル−フコースは、ＧＤＰ結合型に変換されていることが明らかとなった。この結果は、化合物７の過アセチル化７−アルキニル−フコースが細胞膜透過性を有していることも示すものである。
【０１０６】
実施例４：細胞内での７−アルキニル−フコースの糖タンパク質への取込みアッセイ
本実施例では、７−アルキニル−フコースが細胞内で糖タンパク質に取り込まれうるかを調べた。
【０１０７】
マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を６−アルキニル−フコースまたは７−アルキニル−フコースのフコース類似体の糖タンパク質への取込み効率を比較した。マウス胎児線維芽細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから不死化させて樹立した（Kizuka, et al., EMBO Mol Med 7, 175-189, 2015）。培養は１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で培養した。マウス胎児線維芽細胞を、過アセチル化６−アルキニル−フコースまたは過アセチル化７−アルキニル−フコースの存在下で４８時間培養し、細胞溶解物中のアルキニル基をビオチン化アジド（３−アジドプロピルビオチンアミド）とClick-iT（商標） Protein Reaction Buffer Kit(ThermoFisher Scientific社)を用い、製造者マニュアルに従ってビオチン化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、メンブレンに対して西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）連結−ストレプトアビジン（VECTASTAIN ABC Standard Kit）を反応させて、Western lightning ECL Pro (PerkinElmer)を用いて発光させ、ImageQuant LAS-4000mini (GE Healthcare)で検出した。結果は図４Ａに示される通りであった。
【０１０８】
図４Ａに示されるように、７−アルキニル−フコースは、低分子量から高分子領域にわたって広く糖タンパク質に取り込まれたことが明らかとなった。また、図４Ｂに示されるように、糖タンパク質への７−アルキニル−フコースの取り込みが経時的に増加していることが分かった。さらに、マウス胎児線維芽細胞に代えてＨＥＫ２９３細胞を用いて同じ実験を行ったところ、図４Ｃに示されるように、７−アルキニル−フコースの方が６−アルキニル−フコースよりも効率よく糖タンパク質に取り込まれた。このように、７−アルキニル−フコースは細胞の種類を問わず効率よく糖タンパク質に取り込まれた。
【０１０９】
次に、７−アルキニル−フコースの細胞内局在を確認した。マウス胎児線維芽細胞を過アセチル化７−アルキニル−フコース（２００μＭ）またはＤＭＳＯで処理して４８時間培養した。細胞に含まれるアルキニル−フコースを、ビオチン化アジド（３−アジドプロピルビオチンアミド）とClick-iT Cell Reaction Buffer Kit (Thermo Fisher Scientific)を用いて製造者マニュアルに従ってビオチン化した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ａｌｅｘａ４８８標識−ストレプトアビジンおよびＤＡＰＩ存在下で室温で３０分間インキュベートし、蛍光をOlympus FV-1000 confocal microscope (Olympus)を用いて観察した。結果は、図４Ｄに示される通りであった。図４Ｄに示されるように、７−アルキニル−フコースは、細胞質に広く局在することが明らかとなった。
【０１１０】
さらに、７−アルキニル−フコースの毒性を調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、過アセチル化された６−アルキニル−フコース、７−アルキニル−フコースまたは６−アジド−フコース（いずれも２００μＭ）でそれぞれ２４時間または４８時間処理し、細胞数を計数した（ｎ＝３）。結果は図４Ｅに示される通りであった。図４Ｅに示されるように、６−アジド−フコースが強い毒性を発揮したのに対して、７−アルキニル−フコースは、ほとんど毒性を示さなかった。
【０１１１】
なお、フコースを認識するビオチン化レクチン（Aleuria aurantia lectin (AAL)）を用いて糖タンパク質をレクチンブロット染色した。すると、７−アルキニル−フコースにおいては、ＡＡＬレクチンと反応する糖タンパク質量がＤＭＳＯ処理と変わらなかったのに対して、６−アルキニル−フコースを導入した場合には糖タンパク質の検出量が激減した（図４Ｆ参照）。細胞内のフコースの存在量を考慮すると、この結果は、６−アルキニル−フコースが細胞内の内在性のフコース転移のシステムを阻害している可能性を示唆するものである。一方で、７−アルキニル−フコースは、内在性のフコース転移のシステムに対しては影響が少ないことが示唆された。
【０１１２】
実施例５：修飾部位
本実施例では、７−アルキニル−フコースの修飾部位について調べた。
【０１１３】
ＨＥＫ２９３細胞を０．５μｇ／ｍＬのツニカマイシン若しくは２ｍＭベンジル−α−ＧａｌＮＡｃまたはＤＭＳＯで１６時間処理し、その後、過アセチル化７−アルキニル−フコースまたはＤＭＳＯで細胞を８時間処理して、細胞溶解物をクリックケミストリーによりビオチン化し、ウェスタンブロット解析を行った。結果は図５Ａに示される通りであった。図５Ａに示されるように、７−アルキニル−フコースの取り込みは、ツニカマイシン存在下では強く阻害されたのに対して、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃでは取り込みについては大きな影響は認められなかった。ツニカマイシンは、Ｎ−グリコシル化の阻害剤として知られ、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃは、Ｏ−グリコシル化の阻害剤として知られることから、上記の結果は、７−アルキニル−フコースがＮ−グリカンに主に取り込まれたことを示唆する。
【０１１４】
哺乳動物におけるＮ−グリカン中に存在する最も豊富かつ一般的なフコースはコアフコースである（Wang, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15791-15796, 2005）。そこで、Ｎ−グリコシル化におけるフコース取込み部位を検証した。コア−フコースを導入するフコース転移酵素であるＦｕｔ８のノックアウト細胞を用いて、７−アルキニル−フコースの導入部位を検証した。Ｆｕｔ８ノックアウトマウス胎児線維芽細胞は、上記Wang, et al., 2005に記載された通りに作製した。Ｆｕｔ８＋／＋マウス胎児線維芽細胞とＦｕｔ８−／−マウス胎児線維芽細胞を過アセチル化された６−アルキニル−フコース、７−アルキニル−フコースまたはＤＭＳＯで処理して、糖タンパク質に導入されたフコース類似体の量を上記と同様にウェスタンブロットで解析した。結果は図５Ｂに示される通りであった。図５Ｂに示されるように、Ｆｕｔ８−／−マウス胎児線維芽細胞では、７−アルキニル−フコースの糖タンパク質への取込み効率が大きく低下した。また、Ｆｕｔ８＋／＋マウス胎児線維芽細胞とＦｕｔ８−／−マウス胎児線維芽細胞を過アセチル化過アセチル化で処理して、実施例４と同様に細胞内のアルキニル基をビオチン化し、Ａｌｅｘａ４８８標識−ストレプトアビジンで可視化した。結果は図５Ｃに示されるように、Ｆｕｔ８−／−マウス胎児線維芽細胞では、可視化される７−アルキニル−フコースが低下した。このことから、７−アルキニル−フコースの導入部位は主にはコアフコースであることが示唆された。
【０１１５】
実施例６：ＢＡＣＥ１へのフコース導入
本実施例では、糖タンパク質の一例としてＢＡＣＥ１タンパク質に対する糖鎖にフコース類似体を導入して、これを検出することができることを検証した。
【０１１６】
ところで、内在性のＧＤＰ−フコース合成経路が弱い細胞株としてＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を見出した。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞は、ＧＤＰ−マンノース  ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤＳ）の発現をほとんどしていない（図６Ａの抗ＧＭＤＳ抗体によるブロットを参照；実験方法は後述する通り）。ＧＭＤＳは、ＧＤＰ−フコース合成の重要酵素であることから、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞では、内在性のＧＤＰ−フコース合成経路が弱いと考えられる。マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に転写して、ＡＡＬ、ＰｈｏＳＬ、または抗ＧＭＤＳ抗体を用いてそれぞれの結合タンパク質を染色した。
【０１１７】
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるヌクレオチド糖の存在量を分析した。分析は、過去の論文(Nakajima, et al., Mol Cell Proteomics 12, 2468-2480, 2013)に記載された方法に従って行った。すると、図６Ｂに示されるようにＧＤＰ−フコース（ＧＤＰ−ｆｕｃ）は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞では検出限界以下であった。
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、様々な濃度のＬ−フコース存在下で２４時間培養し、細胞の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に転写後、フコースに結合するレクチンであるＡＡＬまたはコアフコースに結合するレクチンであるＰｈｏＳＬで染色した結果を図６Ｃに示す。
【０１１８】
図６Ａに示されるように、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞では、フコースに結合するレクチンであるＡＡＬに対して反応する糖タンパク質がほとんど存在しないことが明らかとなった。さらに、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞に対してフコースを供給すると、図６Ｃに示されるように、ＡＡＬやＰｈｏＳＬによってフコース修飾を有する糖タンパク質が広く検出された。このことから、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞は、フコースを糖に転移する能力を維持していることが明らかとなり、また、図６Ａでフコースを有する糖タンパク質がほとんど検出できなかった理由は、ＧＤＰ−フコースを合成できないためであると示唆された。従って、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞であれば、外部からフコース類似体を供給することにより、糖鎖に効率よくフコース類似体が導入でき、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞は、実験の目的のためには好ましいものと考えられた。
【０１１９】
そこで、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞に対して過アセチル化７−アルキニル−フコースを供給して、７−アルキニル−フコースが導入された糖タンパク質を上述の実施例の通りビオチン化し、ＨＲＰ連結−ストレプトアビジンを用いて検出した。結果は図６Ｄに示されるように、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞で、７−アルキニル−フコース導入を効率よく検出することができた。
【０１２０】
Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有する可溶型ＢＡＣＥ１タンパク質を安定的に発現するＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を樹立した（Kizuka, et al., Biochem J 473, 21-30, 2016）。通常の培養条件下で培養し、１００％コンフルエントに達したら培地を、過アセチル化７−アルキニル−フコース（最終濃度２００μＭ）またはＤＭＳＯを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉに変えて４８時間培養した。ＢＡＣＥ１タンパク質を上記Kizuka, et al., 2016に記載された通りに精製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、CBB染色した結果を図６Ｅに示す。精製したＢＡＣＥ１からＮ型糖鎖を遊離させ、ＭＳにより糖鎖の構造解析を行った結果を図６ＦとＧに示す（方法は後述）。図６Ｅに示される通り、７５ｋＤａより少し下にＢＡＣＥ−Ｈｉｓのバンドが検出された。
【０１２１】
また、発明者らは、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞が発現するＢＡＣＥ１タンパク質には、フコースが存在しないことを明らかにしている（上記Kizuka, et al., 2016）。上述のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞から精製したＢＡＣＥ１糖タンパク質の糖鎖をＬC−ＭＳにより構造解析した。具体的には、精製したＢＡＣＥ１糖タンパク質からＰＮＧａｓｅＦを用いてＮ型糖鎖（Ｎ−グリカン）を遊離し、遊離したＮ型糖鎖をアミノキシ  タンデム  マス  タグ  ゼロ（ＴＭＴ０）で標識した後、ＬＣ−ＭＳ（装置名：サーモフィッシャーサイエンティフィック製のAccela- LTQ Orbitrap XL、ＬＣの分析条件：サーモフィッシャーサイエンティフィック製のHyperCarbカラムで分離、溶媒は１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水／アセトニトリル、ＭＳの分析条件：Positive ion mode、mass range; m/z 800 to m/z 2000, capillary temperature; 300℃, source voltage; 4.5 kV, capillary voltage; 18 V, tube lens voltage; 110 V、MS/MSはHCDでフラグメント化）により分析した。結果は、図６Ｆに示される通りであった。図６Ｆでは、各ピークに対応する糖鎖の概略構造をマスクロマトグラム上に記した。図６Ｆに示されるように、コントロール（上段）では、フコースが導入された糖鎖は検出されないが、７−アルキニル−フコースが供給されるとコアフコースの位置への７−アルキニル−フコースの導入が確認された（下段）。
【０１２２】
さらに、上記分析サンプルのＭＳ／ＭＳのクロマトグラムのデータを用いて、７−アルキニル−フコースが、ルイス型フコースの位置ではなく、コアフコースの位置に結合しているかどうかを調べた。１段目は全てのフラグメントイオンの保持時間のクロマトグラムを、２段目はコアフコースに、３段目は７−アルキニルーフコースを取り込んだコアフコースに、４段目はルイス型のフコースに、５段目は７−アルキニルーフコースを取り込んだルイス型のフコースに、それぞれ由来するフラグメントイオンのクロマトグラムを示す。図６Ｇに示されるように、コアフコースの位置に７−アルキニル−フコースが導入されていることが示された（３段目）。一方で、ルイス型フコースには７−アルキニル−フコースの導入は観察されなかった。
【０１２３】
実施例７：立体構造モデル
本実施例では、フコースとヒトＦＵＴ８酵素との複合体の立体構造モデルを検討した。
【０１２４】
ＦＵＴ８とＧＤＰ−フコースとの構造モデルは、アポヒトＦＵＴ８の結晶構造（ＰＤＢコード２ＤＥＯ）を基に構築された。このタンパク質のＡｓｎ３６８〜Ｔｈｒ３７２の領域は、Modeller ver 9.15を用いてモデル化した。このモデルにＧＤＰ−フコースをあてはめるために、線虫のＰＯＦＵＴ１とＧＤＰ−フコースとの構造（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＺＹ５）を考慮した。ＦＵＴ８とＧＤＰ−フコースの構造との重ね合わせは、それぞれのリガンド結合領域をアラインメントすることにより行った（アミノ酸番号においてＦＵＴ８：３６０〜３６５、ＰＯＦＵＴ１：２４５〜２５０）。ＦＵＴ８のＡｒｇ３６５は、ＧＤＰ−フコースと立体的にぶつかるのでＡｒｇ３６５の側鎖は、回転して、ＰＯＦＵＴ１のＡｒｇ２４０と同様のコンフォメーションを取ると考えられた。ＦＵＴ８とＧＤＰ−フコースとの構造モデルは、Pymol softwareを用いて可視化した。得られた結果は、図７に示される通りであった。
【０１２５】
図７を考慮すると、Ｃ６の位置に長いリンカーが存在した場合、リンカーやアルキンがＦＵＴ８と構造的にぶつかり、ＦＵＴ８の基質として適さなくなる可能性が高い。アルキニル−（Ｏ）ｎ−フコースが、図２Ａに示すように、ｎの数が大きくなるほどＦＵＴ８の基質としての適性が低くなったのは、リンカーが長くなるほどＦＵＴ８と構造的にぶつかりやすくなったためと考えられる。また６−アルキニル−フコースは、アルキンが直接ＦＵＴ８の構造とぶつかるとは考えにくいが、Ｃ６の位置に比較的硬直した構造を有するアルキンが直接結合しているため、糖の六員環構造が不安定化している可能性が考えられる。一方で、７−アルキニル−フコースは、メチレンがアルキンとフコースとの間に介在することにより構造が柔軟化して糖の六員環構造が安定化することに加え、リンカーが長すぎないためにＦＵＴ８との構造的な障害も回避できたと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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