(57)【要約】【課題】新たなオートファジー阻害剤の提供。【解決手段】アルベンダゾール、カルバゾクロムスルホン酸、カルベジロール、シナカルセト、クレマスチン、クロミフェン、ロラタジン、ピモベンダン、テストステロンエナント酸エステル、ゾニサミド及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルベンダゾール、カルバゾクロムスルホン酸、カルベジロール、シナカルセト、クレマスチン、クロミフェン、ロラタジン、ピモベンダン、テストステロンエナント酸エステル、ゾニサミド及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー阻害剤。
【請求項２】
アルベンダゾール、カルバゾクロムスルホン酸、カルベジロール、シナカルセト、クレマスチン、クロミフェン、ロラタジン、ピモベンダン、テストステロンエナント酸エステル、ゾニサミド及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とする抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジー阻害剤及び抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーは、細胞が持っている、細胞内のタンパク質を分解するための仕組みの一つであり、自食作用ともよばれる。オートファジーではまず細胞質の一部が隔離膜によって取り囲まれてオートファゴソームが形成され、次にオートファゴソームの外膜がリソソーム膜と融合しオートリソソームとなり、内容物が分解される。オートファジーはタンパク質だけではなくミトコンドリアなどのオルガネラをも分解できる大規模なシステムで、酵母から高等動植物に至るまで非常によく保存されている。オートファジーでは約１μｍの領域がランダムに包み込まれるため、オートファジーは原則として非選択的な分解システムであると考えられてきたが、最近になって一部の基質は選択的に取り込まれることもわかってきた。
【０００３】
オートファジーは正常細胞の機能に重要であるが、一部のがん細胞はオートファジーにより依存していることが示唆されている（非特許文献１）。これは、がん細胞が栄養学的に不利な状況にあることや、急速な細胞内代謝回転を必要としていることなどが理由と考えられる。実際に、米国では難治性腫瘍に対するオートファジーを標的とした臨床試験が行われている（非特許文献２〜６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Amaravadi et al. (2007) Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma. J Clin Invest. 117:326-36.
【非特許文献２】Rosenfeld et al. (2014) A phase I/II trial of hydroxychloroquine in conjunction with radiation therapy and concurrent and adjuvant temozolomide in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme. Autophagy. 2014 10:1359-68.
【非特許文献３】Rangwala et al. (2014) Phase I trial of hydroxychloroquine with dose-intense temozolomide in patients with advanced solid tumors and melanoma. Autophagy. 10:1369-79.
【非特許文献４】Vogl et al. Combined autophagy and proteasome inhibition: a phase 1 trial of hydroxychloroquine and bortezomib in patients with relapsed/refractory myeloma. Autophagy. 2014 10:1380-90.
【非特許文献５】Mahalingam et al. (2014) Combined autophagy and HDAC inhibition: a phase I safety, tolerability, pharmacokinetic, and pharmacodynamic analysis of hydroxychloroquine in combination with the HDAC inhibitor vorinostat in patients with advanced solid tumors. Autophagy. 10:1403-14.
【非特許文献６】Barnard et al. (2014) Phase I clinical trial and pharmacodynamic evaluation of combination hydroxychloroquine and doxorubicin treatment in pet dogs treated for spontaneously occurring lymphoma. Autophagy. 10:1415-25.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、臨床試験で使用されている薬剤クロロキンおよびヒドロキシクロロキンは、オートファジー特異的ではなく、リソソームを含めた酸性コンパートメントの機能全般を抑制する。
従って、本発明の課題は、より特異性の高い新たなオートファジー阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、新たなオートファジー阻害剤を探索すべく既に医薬として用いられている成分を対象としてスクリーニングしてきたところ、特定の１０種の成分に強いオートファジー阻害作用があることから抗がん剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔２〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕アルベンダゾール、カルバゾクロムスルホン酸、カルベジロール、シナカルセト、クレマスチン、クロミフェン、ロラタジン、ピモベンダン、テストステロンエナント酸エステル、ゾニサミド及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー阻害剤。
〔２〕アルベンダゾール、カルバゾクロムスルホン酸、カルベジロール、シナカルセト、クレマスチン、クロミフェン、ロラタジン、ピモベンダン、テストステロンエナント酸エステル、ゾニサミド及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とする抗がん剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のオートファジー阻害剤及び抗がん剤の有効成分は、既に医薬として使用されている成分であるから、安全性は確認されており、かつ強いオートファジー阻害作用を有し、がん細胞の生存にオートファジーが重要な役割を果たしているがんの治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】薬剤処理による細胞増殖への影響を示す図である。
【図２】薬剤処理を行った細胞の顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のオートファジー阻害剤及び抗がん剤の有効成分は、アルベンダゾール、カルバゾクロムスルホン酸、カルベジロール、シナカルセト、クレマスチン、クロミフェン、ロラタジン、ピモベンダン、テストステロンエナント酸エステル、ゾニサミド及びこれらの塩から選ばれる成分である。  
【００１２】
アルベンダゾールは、種々の寄生虫の駆除薬として知られており、寄生虫病の治療薬として用いられている。
【００１３】
カルバゾクロムスルホン酸は、血管強化作用を有し、止血剤として用いられている。カルバゾクロムスルホン酸の塩としては、ナトリウム塩等が挙げられる。
【００１４】
カルベジロールは、αβ遮断薬の一つであり、血管拡張作用を有し、高血圧、心不全等の治療に用いられている。
【００１５】
シナカルセトは、カルシウム受容体作動薬であり、副甲状腺ホルモンの分泌を抑え、二次性副甲状腺機能亢進症又は副甲状腺がん等に伴う高カルシウム血症の治療に用いられている。シナカルセトの塩としては、塩酸塩等が挙げられる。
【００１６】
クレマスチンは、抗ヒスタミン薬の一つであり、アレルギー性疾患の治療に用いられている。クレマスチンの塩としては、フマル酸塩等が挙げられる。
【００１７】
クロミフェンは、選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）であり、排卵誘発薬として用いられている。クロミフェンの塩としては、クエン酸塩等が挙げられる。
【００１８】
ロラタジンは、抗ヒスタミン薬の一つであり、アレルギー性疾患の治療に用いられている。
【００１９】
ピモベンダンは、ホスホジエステラーゼ阻害作用及び心筋のＣａ２＋感受性増加作用を有し、心不全の治療に用いられている。
【００２０】
テストステロンエナント酸エステルは、男性ホルモン薬であり、男子性腺機能不全、造精機能障害による男子不妊症等の治療に用いられている。
【００２１】
ゾニサミドは、神経作用薬であり、てんかん治療薬又はパーキンソン病治療薬として用いられている。
【００２２】
前記本発明のオートファジー阻害剤の有効成分として用いられる成分は、既に種々の疾患の治療薬として用いられているが、オートファジー阻害作用を有すること、また抗がん剤として有用であることは全く知られていない。
【００２３】
後記実施例に示すように前記成分は、優れたオートファジー阻害作用を有するため、抗がん剤として有用である。対象となる癌は特に制限はされないが、例えば、頭頚部癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、胆道癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、血液癌、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍、中皮腫、血液癌等が挙げられる。中でも脳腫瘍、膵癌、多発性骨髄腫などの癌が好ましい。本発明のオートファジー阻害剤は、がん細胞の生存にオートファジーが重要な役割を果たしているがんにおいて、がん細胞の増殖を阻害することにより、がんを治療することができる。
【００２４】
本発明のオートファジー阻害剤及び抗がん剤の投与形態としては、注射剤、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤）、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、坐剤等が挙げられる。このうち、経口剤が特に好ましい。これらの医薬組成物の形態とするには、薬学的に許容される担体とともに製剤化することができる。そのような担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸−水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００２５】
さらに、本発明の医薬組成物製剤中における本発明の有効成分の含有量は、製剤の形によって大きく変動し、特に限定されるものではないが、通常は、組成物全量に対して０．０１〜１００質量％、好ましくは１〜１００質量％である。
【００２６】
本発明のオートファジー阻害剤及び抗がん剤の投与量は、投与する患者の症状、年齢、投与方法等によって異なるが、前記有効成分量として、成人に対して１日あたり１〜１０００ｍｇであるのが好ましい。またこの投与量は１日に１〜４回、好ましくは２〜４回に分けて投与することもできる。
【００２７】
さらに、本発明のオートファジー阻害剤及び抗がん剤は、単独での使用に限らず、少なくとも１つの他の抗がん剤と、同時又は異なるときに、同一又は異なる頻度で、及び同一又は異なる投与方法で、併用投与することが可能である。本発明のオートファジー阻害剤及び抗がん剤並びに併用される他の抗がん剤の投与量は、併用する薬剤、投与する患者の症状、年齢、投与方法等に応じて薬剤ごとに適宜決定される。多剤併用療法における本発明のオートファジー阻害剤及び抗がん剤の投与量は前記と同様である。
ここで、本発明のオートファジー阻害剤及び抗がん剤と併用できる抗がん剤としては、通常がん治療に使用される抗がん剤が挙げられる。これらのオートファジー阻害剤及び抗がん剤並びに他の抗がん剤は、同時に投与してもよいし、別個に投与してもよい。また、投与ルートが相違してもよい。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２９】
実施例１
ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧプローブを用いたオートファジー阻害活性の評価
【００３０】
〔方法〕
ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧを安定発現するＨｅＬａ細胞を用いた。この細胞が発現するＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧは先頭（アミノ末端）より、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ３（ＬＣ３）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＬＣ３のカルボキシ末端グリシンの欠損体（ＬＣ３ΔＧ）が連結したものである。ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧは細胞内で合成された後に直ちにＧＦＰ−ＬＣ３とＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧに切断分離される。ＧＦＰ−ＬＣ３はオートファジーによって分解されるが、ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧは分解されずに細胞内にとどまる。従って、オートファジーが阻害されるとＧＦＰ／ＲＦＰ比が上昇する。この細胞を９６穴プレートに３０，０００個ずつ播種し、翌日薬剤（１０  μＭ）または溶媒のみを含む飢餓培地（１％ウシ胎仔血清と０．１Xアミノ酸を含むＤＭＥＭ培地）に交換した（１薬剤につき３ｗｅｌｌずつ使用）。２４時間後、各ｗｅｌｌの細胞を１０分間４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定した。マイクロプレートリーダー（ＥｎＳｐｉｒｅ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｊａｐａｎ）で各ウェルのＧＦＰとＲＦＰの蛍光量を測定しＧＦＰ／ＲＦＰ比を算出した。コントロール（溶媒で処理した細胞）のＧＦＰ／ＲＦＰ比との比率を表１に記す。
【００３１】
【表１】
2018002619.tif 000002
【００３２】
〔結果〕
上記の薬剤で２４時間処理した細胞ではＧＦＰ／ＲＦＰ比が１．５倍以上上昇したため、これらの薬剤にオートファジー阻害効果があることが示された。
【００３３】
実施例２
薬効評価
〔方法〕
上記の１０種類の薬剤がヒト子宮頚がん由来のＨｅＬａ細胞の増殖に及ぼす影響を検証した。ＨｅＬａ細胞を４０万個ずつ播種し、各薬剤（終濃度１０ μＭ）または溶媒（ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）を添加して ２４時間および４８時間培養後、生細胞（トリパンブルー陰性の細胞）の数をカウントした。また、４８時間培養後の位相差顕微鏡画像を取得した。結果を図１及び図２に示す。
【００３４】
〔結果〕
いずれの薬剤においても、溶媒のみの処理と比較して顕著な細胞増殖抑制が認められた（図１）。また、薬剤処理による細胞死（培養ディッシュからの剥離）が認められた（図２）。よって、これらの薬剤は抗がん作用を有していることが示唆された。
【図１】
2018002619.tif 000003
【図２】
2018002619.tif 000004