(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚状態改善活性を有するペプチドを提供する。【解決手段】ある特定のアミノ酸配列からなる皮膚状態改善活性を有するペプチド。前記ペプチドは、ＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）の活性を抑制することが出来る。前記ペプチドは、コラーゲン分解を抑制することが出来る。前記ペプチドは、メラノソーム移動（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を抑制することが出来る。前記皮膚状態改善は、しわの改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚老化の抑制、傷の再生、ニキビの改善、皮膚再生または皮膚美白であることが出来る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚状態改善活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、ＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）の活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、コラーゲン分解を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、メラノソーム移動（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記皮膚状態改善は、しわの改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚老化の抑制、傷の再生、ニキビの改善、皮膚再生または皮膚美白であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用組成物。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ＭＭＰ−活性関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物であって、前記ＭＭＰ−活性関連疾患は、関節炎、糖尿病性網膜症、肥厚性瘢痕、乾癬、粘膜及び上皮組織の潰瘍、自己免疫による炎症、基底膜の分解に係る疾病の狼瘡、自己免疫性神経障害、筋細胞破壊、緑内障、または過多血管新生であることを特徴とする組成物。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項９】
前記炎症疾患は、歯周炎、喘息、湿疹、乾癬、アレルギー、リウマチ関節炎、乾癬関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、アトピー性皮膚炎、ニキビ、アトピー性鼻炎（枯草熱）、アレルギー性皮膚炎（湿疹）、慢性副鼻腔炎または脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚状態改善活性を有するペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）は、コラーゲン、プロテオグリカン及びゼラチンのような巨大生分子を分解できるエンドペプチダーゼ類酵素であって、大きくコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン及び膜型ＭＭＰに分類される。ＭＭＰは、全部前駆酵素の形態で発現された後、一部分が切り離れることにより活性化される（非特許文献１〜３）。
【０００３】
コラゲナーゼは、三重螺旋型てんかん性コラーゲンとゼラチンなどに作用して、線維芽細胞コラゲナーゼ、好中球コラゲナーゼ及びコラゲナーゼ−３の３種類が知られており、第Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型のコラーゲン細線維（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌｓ）を切断すると報告されている（非特許文献４〜５）。また、これら３種のコラゲナーゼは、互いに約５０％以上の配列同一性を有すると知られている（非特許文献６〜７）。
【０００４】
ＭＭＰは、全ペプチド部位、触媒性部位及びＣ−末端部位の三つの部位に区分される。ＭＭＰは、全て活性のない潜伏型に生成分泌された後、Ｎ−末端の全ペプチド部位の８０個のアミノ酸が切られており、このＰＲＣＧＶＰＤ配列を有する部位のシステインが除去されて活性化される（非特許文献８）。活性化されたＭＭＰは、天然抑制剤のＭＭＰ組織阻害剤（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）と結合して活性が抑制されると知られているが、この結合は、触媒性部位により調節される（非特許文献９）。様々な形態のＭＭＰは、基質特異性を有しており、正常的な細胞にも細胞外マトリックス（ｅＸｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ）や他のコラーゲン構造を分解する必要性がある場合、代謝過程で発現される。
【０００５】
ＭＭＰにより媒介される疾患としては、動脈硬化症、中枢神経系の炎症疾患、アルツハイマー、皮膚老化、リウマチ関節炎、骨関節炎、角膜潰瘍、骨疾患、蛋白尿症、腹大動脈瘤疾患、外傷性関節損傷による退行性軟骨損失、神経系の脱髄疾患、肝硬変、腎糸球体疾患、胚胎膜の未成熟破裂、炎症性腸疾患、歯根膜疾患、老化に係る黄斑変性、糖尿性網膜病症、増殖性硝子体網膜病症、未成熟網膜病症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍、角膜移植拒否、血管新生、がんの浸潤と転移などがある。
【０００６】
リウマチ関節炎と骨関節炎は、自己免疫異常が原因であるが、病気が進行されつつ、関節軟骨の細胞外マトリックスが破壊される。このような関節炎及び関節外傷において、ストロメリシンが主要な酵素と認識され、プロコラゲナーゼを活性コラゲナーゼに転換させることにおいて重要な役割をすることが明かされている。したがって、ＭＭＰ活性を抑制することにより、関節炎進行を防ぐことができ、前記ＭＭＰは、浸透性白血球または線維芽細胞または外在的に微生物由来であることが報告されている。
【０００７】
また、炎症媒介体の刺激により分泌されたコラゲナーゼ及び細菌から分泌されたコラゲナーゼは、歯周組織の基質であるコラーゲンを分解し、歯茎退縮を発生させて、だんだん進行され、歯周疾患を引き起こす。炎症を起こした歯茎から分離された線維芽細胞コラゲナーゼ及びストロメリシンの活性が確認されて、酵素の水準は、観察された歯齦炎の程度と相互連関されることが確認された（非特許文献１０）。
【０００８】
ＭＭＰは、様々な中枢神経系（ＣＮＳ）の発病と関連がある。ＭＭＰは、炎症性の単核球細胞を中枢神経に流入させ、ミエリンを破壊するか、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ）を破壊して、アルツハイマー疾患では、アミロイドベータタンパク質の蓄積に関与すると推定されている（非特許文献１１）。また、ＭＭＰは、アルツハイマー疾患の脳において、正常の脳よりその濃度が高いと報告されており（非特許文献１２）、脳脊髄液におけるゼラチナーゼＢ水準は、多発性硬化症及びその他の神経性疾患と関連があって（非特許文献１３）、アミロイドベータタンパク質を分解して蓄積させることにも寄与すると報告されている（非特許文献１４）。
【０００９】
また、ＭＭＰは、皮膚老化を誘導するため、これを抑制すると、しわの治療及び予防作用が期待でき、さらに、ＭＭＰは、基底膜分解作用によって、血管新生、がんの浸潤と転移を促進させる。したがって、ＭＭＰは、基底膜の分解を通じて、がんの浸潤と転移に非常に重要な役割をするだけではなく、これにより媒介される疾患が非常に多様であるため、これを抑制できる薬剤の開発が要求されている。しかし、このような抑制剤は、長期間使用時安全でなければ、理想的な治療剤として使用することができないため、ＭＭＰ活性抑制剤として、毒性の低い製剤の開発が要求されている。ＭＭＰにより媒介される多様な疾患の効果的な治療のために、ＭＭＰ抑制剤に対する研究が活発に進行されており、ＭＭＰ抑制剤の開発は、多様な疾患の治療に効果的に使用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｏｎｄ，  Ｊ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７５，  ５６５−５７４（１９８５）
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｗ．Ｔ．，  Ｃｅｌｌ，  ４８，  １９３−２０３（１９８７）
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓ，  Ｅ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｌ  Ｒｅｌ  Ｒｅｓ，  ４，  ４９３−５１２（１９８４）
【非特許文献４】Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  Ｇ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６１，  ６６００−６６０５（１９８６）
【非特許文献５】Ｆｉｎｉ，  Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２６，  ６１５５−６１６５（１９８７）
【非特許文献６】Ｂｏｒｋａｋｏｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  １，  １０６−１１０（１９９４）
【非特許文献７】ＥＭＢＯ，  Ｊ．，  １３，  １２６３−１２６９（１９９４）
【非特許文献８】Ｖａｎ  Ｗａｒｔ，  Ｈ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７，  ５５７８−５５８２（１９９０）
【非特許文献９】Ｍｕｒｐｈｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７，  ９６１２−９６１８（１９９２）
【非特許文献１０】Ｏｖｅｒａｌｌ，  Ｃ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．  ２２，  ８１−８８（１９８７）
【非特許文献１１】Ｙｏｎｇ，  ＶＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１（２），７５−８０（１９９８）
【非特許文献１２】Ｌｅａｋｅ  Ａ，  Ｍｏｒｒｉｓ  ＣＭ，  ＆  Ｗｈａｔｅｌｅｙ  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２９１（３），２０１−３（２０００）
【非特許文献１３】Ｍｉｙａｚａｋｉ，  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８３９〜８４１（１９９３）
【非特許文献１４】Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ＪＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６（２４），７９１０−９（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドがＭＭＰ２抑制活性及びコラーゲン分解抑制活性などを示して、皮膚状態改善に有用に利用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、皮膚状態改善活性を有するペプチドを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、皮膚状態改善用組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、ＭＭＰ−活性関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明のまた他の目的は、炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明のまた他の目的は、皮膚状態改善方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のまた他の目的は、炎症疾患の予防または治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一様態によると、本発明は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚状態改善活性を有するペプチドを提供する。
【００１９】
本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドがＭＭＰ２抑制活性及びコラーゲン分解抑制活性などを示して、皮膚状態改善に有用に利用できることを究明した。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
（ａ）本発明は、皮膚状態改善活性を有するペプチドを提供する。
（ｂ）本発明のペプチドは、ＭＭＰ２活性を抑制し、皮膚状態の改善に非常に優れた効能を奏し、本発明のペプチドを含む組成物は、コラーゲン分解を抑制して、メラノソーム移動を抑制するなどの優れた生理活性を示し、しわの改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚老化の抑制、傷の再生、ニキビの改善、皮膚再生または皮膚美白に利用可能である。
（ｃ）本発明のペプチドを含む組成物は、ＭＭＰ−活性関連疾患及び炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１ａ】本発明のペプチドに対するＨＰＬＣ分析結果である（（ａ）ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ）。
【図１ｂ】本発明のペプチドに対するＨＰＬＣ分析結果である（（ｂ）ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ）。
【図２ａ】本発明のペプチドによるヒト１次真皮線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ）の増殖促進効能を評価した結果である（（ａ）ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ）。
【図２ｂ】本発明のペプチドによるヒト１次真皮線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ）の増殖促進効能を評価した結果である（（ｂ）ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ）。
【図３ａ】ヒト１次真皮線維芽細胞において、本発明のペプチドによる信号伝達変化を確認した結果である（（ａ）ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ）。
【図３ｂ】ヒト１次真皮線維芽細胞において、本発明のペプチドによる信号伝達変化を確認した結果である（（ｂ）ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ）。
【図４ａ】本発明のペプチドによるＭＭＰ２活性抑制効果を評価した結果である（（ａ）ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ）。
【図４ｂ】本発明のペプチドによるＭＭＰ２活性抑制効果を評価した結果である（（ｂ）ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ）。
【図５ａ】線維芽細胞において、本発明のペプチドによるＭＭＰ２活性抑制効果を評価した結果である（（ａ）ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ）。
【図５ｂ】線維芽細胞において、本発明のペプチドによるＭＭＰ２活性抑制効果を評価した結果である（（ｂ）ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ）。
【図６ａ】本発明のペプチドによるコラーゲン分解抑制効果を評価した結果である（（ａ）ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ）。
【図６ｂ】本発明のペプチドによるコラーゲン分解抑制効果を評価した結果である（（ｂ）ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ）。
【図７ａ】本発明のペプチドによるコラーゲン分解抑制効果を評価した結果である（（ａ）ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ）。
【図７ｂ】本発明のペプチドによるコラーゲン分解抑制効果を評価した結果である（（ｂ）ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ）。
【図８ａ】ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎによるメラノソーム移動（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）抑制効果を評価した結果である。
【図８ｂ】ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎによるメラノソーム移動（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）抑制効果を評価した結果である。
【図９】歯髄幹細胞（ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）において、ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎによる抗炎症効果を評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明によると、本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む。具体的に、本発明のペプチドは、必須的に配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列から構成されている。
【００２３】
本明細書で使用される用語‘ペプチド’は、ペプチド結合により、アミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−５４（１９６３）；  Ｓｔｅｗａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ．  ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．：  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１（１９８４））または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造できる。
【００２４】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列の一部部位を選定して、その活性を増加させるために、Ｎ−末端またはＣ−末端に変形を誘導することができる。このような変形を通じて、本発明のペプチドは、生体内投与時の半減期を増加させた、高い半減期を有することができる。
【００２５】
また、本発明のペプチドのＣ−末端は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、アジド（−ＮＨＮＨ２）などに変形されており、ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される保護基が結合される。
【００２６】
上述のアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において用語‘安定性’は、インビボ安定性だけではなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。上述の保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００２７】
本発明の一具現例によると、本発明のペプチドは、ＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）の活性を直接的に抑制する機能を有するだけではなく、ＭＭＰ２によるコラーゲン分解を抑制する機能を有する。また、本発明のペプチドは、皮膚美白に関与するメラノソーム移動（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）に対する抑制効果に優れている。このような結果は、本発明のペプチドが皮膚状態の改善に非常に優れた効能を有するということを意味する。
【００２８】
本発明の他の様態によると、本発明のペプチドを有効成分として含む皮膚状態（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用化粧量組成物を提供する。
【００２９】
本発明の組成物は、上述の本発明のペプチドを有効成分として含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００３０】
本発明の一具現例によると、本発明において皮膚状態の改善は、しわの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷の除去、ニキビの改善、皮膚再生または美白である。
【００３１】
本発明のペプチドは、他のタンパク質より分子量が遥かに小さいため、皮膚浸透率に非常に優れている。したがって、本発明の組成物を局所的に皮膚に塗布する場合、皮膚状態を効果的に改善することができる。
【００３２】
本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、（ａ）上述の本発明のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）、及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。
【００３３】
本明細書において用語‘化粧品学的有効量’は、上述の本発明の組成物の皮膚改善効能を達成するに十分な量を意味する。
【００３４】
本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるあらゆる剤形に製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造することができる。
【００３５】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが利用できる。
【００３６】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが利用でき、特にスプレーの場合は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体をさらに含むことができる。
【００３７】
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用されて、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００３８】
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガカントなどが利用できる。
【００３９】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イソチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できる。
【００４０】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチドと担体成分の他に、化粧料組成物に通常的に利用される成分を含むが、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常的な補助剤を含むことができる。
【００４１】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含むＭＭＰ−活性関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物であって、前記ＭＭＰ−活性関連疾患は、関節炎、糖尿病性網膜症、肥厚性瘢痕、乾癬、粘膜及び上皮組織の潰瘍、自己免疫による炎症、基底膜の分解に係る疾病の狼瘡、自己免疫性神経障害、筋細胞破壊、緑内障、または過多血管新生であることを特徴とする組成物を提供する。
【００４２】
本発明のペプチドは、ＭＭＰ２の活性抑制、コラーゲン分解抑制及びメラノソーム移動抑制などの多様な生理活性を示すことにより、これに係る疾病の治療に有用に利用できる。
【００４３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、（ａ）上述の本発明のペプチドの薬剤学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物である。
【００４４】
本明細書において用語‘薬剤学的有効量’は、上述のペプチドの効能または活性を達成するに十分な量を意味する。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００４６】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与の場合は、筋肉注入、静脈内注入、皮下注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与できる。
【００４７】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方できる。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、１日当たり０．０００１〜１０００μｇである。
【００４８】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造するか、または多用量容器内に入れて製造できる。ここで剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００４９】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００５０】
本発明の一具現例によると、本発明の組成物が適用できる炎症疾患は、歯周炎、喘息、湿疹、乾癬、アレルギー、リウマチ関節炎、乾癬関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、アトピー性皮膚炎、ニキビ、アトピー性鼻炎（枯草熱）、アレルギー性皮膚炎（湿疹）、慢性副鼻腔炎または脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）である。
【００５１】
本発明のペプチドは、炎症反応に関与する親−炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインＰＡＲ２（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）及びＩＬ−１βの発現を抑制させて炎症反応を減少させることにより、これに係る炎症疾患の予防または治療に有用に利用できる。
【００５２】
本発明の他の一様態によると、本発明は、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む皮膚状態改善方法を提供する。
【００５３】
本発明の他の一様態によると、本発明は、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む炎症疾患の予防または治療方法を提供する。
【００５４】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００５５】
合成例１：ペプチド合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；  ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ，  Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．  ０１−６４−００２１）  ７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド（ＭＣ）  １０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去してジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）  １０ｍｌを入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｓｗｉｓｓ）  ２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）  ４００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かし、１時間攪拌しながら反応した。反応後、洗浄して、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭに溶かして１０分間反応して、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去して、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて、３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピぺリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）  １０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、それぞれ３分間ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄し、Ｇｌｙ−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｓｗｉｓｓ）  ２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌して、よく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅ  ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を分画で２回にかけて入れた後、全ての固体が溶けるまで少なくとも５分間攪拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンの入った反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応した。反応液を除去して、ＤＭＦ溶液で３回５分間ずつ攪拌した後、除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  ｔｅｓｔ）を利用して反応程度を点検した。上記と同様に脱保護溶液で２回脱保護反応し、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，  Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ，  Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），  Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），  Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），  Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）及びＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）順に連鎖反応を行った。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分間ずつ２回反応した後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔ（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、五酸化リン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｐｅｎｔｏｘｉｄｅ，  Ｐ２Ｏ５）下で真空で減圧し、完全に乾燥した後、脱漏溶液［ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ８１．５％、蒸留水５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）  ５％、フェノール��％、ＥＤＴ  ２．５％及びＴＩＳ  １％］  ３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ  配列番号１のペプチドを０．５ｇ（収率：  ９５％）、ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ  配列番号２のペプチドを０．７ｇ合成（収率：９５％）した。分子量測定器を利用して測定時、配列番号１のペプチド分子量は、１０４１．２（理論値：  １０４１．２５）、配列番号２のペプチド分子量は、１０７２．２（理論値：  １０７２．２７）である。
【００５６】
【表１】
2018197251.tif 000002
【００５７】
実施例１：ヒト真皮線維芽細胞の増殖促進
ヒト１次真皮線維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌｓ）にＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ（配列番号１のペプチド）またはＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ（配列番号２のペプチド）を濃度別（１ｎｇ／ｍｌ−１μｇ／ｍｌ）に処理して、細胞培養器で７２時間培養した後、ペプチド処理による細胞増殖変化をＳＲＢアッセイ（ＯＤ  ５９０ｎｍ）を通じて分析した。ＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ処理量に依存的にヒト１次真皮線維芽細胞の増殖が増加された（図２ａ−２ｂ）。
【００５８】
実施例２：ヒト線維芽細胞においてＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎの信号伝達
２×１０５細胞／ウェルの細胞密度で６−ウェルプレートにＮＩＨ３Ｔ３（表皮細胞株）をシーディングして、一晩中培養した後、ＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎペプチドを濃度別（１−１０μｇ／ｍｌ）に処理して、３０分間３７℃培養器で培養後、ＵＶＡ（８Ｊ）を照射して２４時間培養した。細胞溶解バッファーを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量した。細胞活性因子の発現確認のために、ａｎｔｉ−ｐＥＲＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＵＳＡ）、ｐ３８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＵＳＡ）抗体を使用してウェスタンブロットを行った。
【００５９】
ＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎを処理する場合、細胞の増殖、移動及び生存に関与するＥＲＫ及びＰ３８のリン酸化増加が確認された（図３ａ〜３ｂ）。
【００６０】
実施例３：ＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−ＮｏｖｅｒｉｎによるｒｈＭＭＰ２の抑制
ｒｈＭＭＰ２とペプチドを濃度別（０．１μｇ／ｍｌ，  １μｇ／ｍｌ）に混合して常温で１時間培養後、ゼラチンザイモグラフィー（ｇｅｌａｔｉｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）を行ってその発現を調べるために、まず、ゼラチン（２ｍｇ／ｍｌ）を基質としてタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。電気泳動後、ゲルを２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に３０分間浸しておいてから、再び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を組成とする緩衝剤で２４時間３７℃で培養した。培養後、ゲルはＣｏｏ−ｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ２５０（Ｓｉｇｍａ）で染色して、５％メタノールと７．５％アセト酸、蒸留水で組成された溶液で脱染色した。それからゼラチン加水分解により表れるバンドを観察したが、活性（ａｃｔｉｖｅ）ＭＭＰ−２は、６６ｋＤａ、ｐｒｏ−ＭＭＰ−２は、７２ｋＤａバンドを探して観察した。
【００６１】
ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ及びＣＧ−ＮｏｖｅｒｉｎによりＭＭＰ２の活性が直接的に抑制されることを、ゼラチンザイモグラフィーを通じて確認した（図４ａ〜４ｂ）。
【００６２】
実施例４：線維芽細胞においてＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−ＮｏｖｅｒｉｎによるｒｈＭＭＰ２の抑制
３×１０４細胞／ウェルの細胞密度で２４−ウェルプレートに（ＮＩＨ３Ｔ３）をシーディングした。翌日、無血清培地で２４時間培養して、ＴＮＦ−αでＭＭＰ２の発現及び活性化を誘導した後、ＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎをそれぞれ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ，  １００ｎｇ／ｍｌ，  １０００ｎｇ／ｍｌ）別に処理した後、２４時間培養した。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離して得た上澄み液を培養後、ゼラチンザイモグラフィーを行って、その発現を調べるために、ゼラチン（２ｍｇ／ｍｌ）を基質としてタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。電気泳動後、ゲルを２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に３０分間浸しておいてから、再び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を組成とする緩衝剤で２４時間３７℃で培養した。培養後、ゲルは、Ｃｏｏ−ｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ２５０（Ｓｉｇｍａ）で染色して、５％メタノールと７．５％アセト酸、蒸留水で組成された溶液で脱染色した。それからゼラチン加水分解により表れるバンドを観察したが、活性ＭＭＰ−２は、６６ｋＤａ、ｐｒｏ−ＭＭＰ−２は、７２ｋＤａバンドを探して観察した。
【００６３】
ＭＭＰ２の活性を観察した結果、ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ及びＣＧ−ＮｏｖｅｒｉｎによりＭＭＰ２の活性が抑制されることを確認した（図５ａ〜５ｂ）。
【００６４】
実施例５：ＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎによるコラーゲン分解抑制
ＨＤＦ（Ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞（３×１０４細胞）を２４ウェルプレートにシーディングした。翌日、５％血清培地で４２時間培養した後、ＭＭＰ２（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＳＩＧＭＡ／ＵＳＡ）とＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ、ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎをそれぞれ処理した後、６時間培養した。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離して得た上澄み液をｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｋｉｔ（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍ／ＵＳＡ）を利用して分析した。
【００６５】
ＨＤＦ（Ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞（３×１０４細胞）を２４ウェルプレートにシーディングして、翌日５％血清培地に入れ替えた後、ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ／ＵＳＡ）を処理して、４４時間培養した後、ＭＭＰ２（２０ｎｇ／ｍｌ）とＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ、ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎを処理した後、４時間培養した。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離して得た上澄み液をｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｋｉｔを利用して分析した。
【００６６】
ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ及びＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎが、ＭＭＰ２により誘導されるコラーゲン分解を抑制する機能を有するかどうかについて実験を行った結果、ＭＭＰ２を処理した時、細胞内コラーゲン分解が、対照群に比べて増加し、ＣＧ−ＲｅｎｕｉｎまたはＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎと同時に処理した時、コラーゲン分解誘導が抑制されることを確認した（図６ａ−６ｂ及び図７ａ−７ｂ）。
【００６７】
実施例６：ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎ，  ＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎによるメラノソーム移動（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）
メラノソーム移動を観察するために、ＨａＣａＴ角質細胞を利用してファゴサイトーシス試験（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｓｓａｙ）を進行した。ファゴサイトーシスのための物質としては、蛍光（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｎｃｅ）物質の付いた生粒子（ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を利用した。９６−ウェル組織培養用平板に各ウェル当たり３×１０３細胞になるようにして、２４時間培養後、無血清培地で６時間培養した。以後、ファゴサイトーシスを誘導するために、１μｇ／ｍｌのトリプシンを処理して、１μｇ／ｍｌのペプチドを４８時間処理した。その結果、蛍光顕微鏡を通じて生粒子が角質細胞内にファゴサイトーシスされることを確認した。ファゴサイトーシス誘導群、即ち、トリプシン処理群を１００％にしてデータ観察した時、ＣＧ−ＮｏｖｅｒｉｎとＣＧ−Ｒｅｎｕｉｎ処理群でファゴサイトーシスが抑制されることを確認した。
【００６８】
実施例７：  ＣＧ−Ｎｏｖｅｒｉｎの抗−歯周疾患（ａｎｔｉ−ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ）機能
合成ペプチドによる歯周炎細胞における抗炎症効果
前記合成例で合成されたペプチドに歯周炎細胞における抗炎症効果を観察するために、ヒト歯根膜線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）（ＡＴＣＣ，  ＵＳＡ）を利用して実験を進行した。ヒト歯根膜線維芽細胞を６−ウェル組織培養用平板に各ウェル当たり５×１０１細胞になるようにして、２４時間培養した。歯周細胞に炎症を誘導するために、１０μｇ／ｍｌの濃度でトリプシン（シグマ、ＵＳＡ）を処理した後、本発明のペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で共に処理して４時間培養した後、対照群と、誘発物質、誘発物質とペプチドを処理した培養細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＰＡＲ−２、ＩＬ−１βのプライマーを利用して逆転写重合酵素連鎖反応を行った。使用した各プライマーのヌクレオチド配列は、表２に示した。
【００６９】
【表２】
2018197251.tif 000003
【００７０】
図９から分かるように、ヒト歯根膜線維芽細胞にトリプシンを処理して炎症を誘導した時、炎症性サイトカインであるＰＡＲ−２、ＩＬ−１βの発現が増加することを観察することができて、本発明のペプチドを同時に処理した時には、上記２種の炎症性サイトカインの発現が著しく抑制されることを確認した（図９）。
【図１ａ】
2018197251.tif 000004
【図１ｂ】
2018197251.tif 000005
【図２ａ】
2018197251.tif 000006
【図２ｂ】
2018197251.tif 000007
【図３ａ】
2018197251.tif 000008
【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
2018197251.tif 000011
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
2018197251.tif 000019
【図９】
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【配列表】
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