(57)【要約】【課題】ＡＦＭを用いた相互作用測定はカンチレバーを生体分子で修飾することが煩雑でありその測定は困難である。また一度に一つの相互作用（結合力）しか定量できない。生体分子に限らず、より簡便な分子間相互作用を計測する測定方法（分子計測法）が求められている。【解決手段】第１の分子と、前記第１の分子との相互作用により結合する第２の分子との結合力を測定する分子計測法であって、密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体を作成し、前記結合体と前記密度媒体とを充填したチャンバーを回転数を変化させながら回転させ、隣接する前記第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の回転数より前記結合力を計測する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の分子と、前記第１の分子との相互作用により結合する第２の分子との結合力を測定する分子計測法であって、
密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体を作成し、
前記結合体と前記密度媒体とを充填したチャンバーを回転数を変化させながら回転させ、
隣接する前記第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の回転数より前記結合力を計測することを特徴とする分子計測法。
【請求項２】
前記第１の微粒子および前記第２の微粒子のうち、前記第２の分子と結合する微粒子は、第３の分子を備え、
前記第２の分子は前記第３の分子との相互作用により前記微粒子と結合する
請求項１に記載の分子計測法。
【請求項３】
前記第１の分子はプローブ分子である請求項１または２の何れかに記載の分子計測法。
【請求項４】
前記第１の分子は抗体、アプタマー、ビオチンのいずれかである請求項１乃至３の何れか１項に記載の分子計測法。
【請求項５】
前記第１の分子は抗体であり、前記第２の分子は抗原である請求項１乃至３の何れか１項に記載の分子計測法。
【請求項６】
前記第２の微粒子に代えて、前記チャンバーの内壁面に前記第１の分子と前記第２の分子の他方を結合させることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の分子計測法。
【請求項７】
前記チャンバーはディスク上に形成され、前記ディスクを回転させることで前記チャンバーを回転させることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の分子計測法。
【請求項８】
前記結合力は、前記結合力をＦ［Ｎ］、前記回転数をＮ［ｒｐｍ］、前記第１の微粒子の体積をＶ［ｍ３］、前記第１の微粒子の密度をρs［ｋｇ／ｍ３］、密度媒体の密度をρf［ｋｇ／ｍ３］、前記チャンバーの回転半径ｒ［ｍ］、重力加速度［ｍ／ｓ２］とするとき、
Ｆ＝１１１８・ｒ・Ｎ２・１０−６×（ρf−ρs）・Ｖ  ×ｇ
により算出することを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の分子計測法。
【請求項９】
前記ディスクは前記チャンバーを複数備え、一連の計測シーケンスによって前記結合力の計測を複数行うことを特徴とする請求項７に記載の分子計測法。
【請求項１０】
前記一連の計測シーケンスよって得られた複数の前記結合力の計測結果により、前記結合力の測定値の度数分布であるスペクトル測定を行うことを特徴とする請求項９に記載の分子計測法。
【請求項１１】
計測制御装置と、
前記計測制御装置により所定シーケンスにより回転数を変化させながらチャンバーを搭載したディスクを回転させるディスク回転装置と、
前記ディスク回転装置のディスクの回転に同期して撮影対象の前記チャンバーをとらえて複数の画像を撮影するカメラとを備え、
前記チャンバーは、密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体と、さらに前記密度媒体とを充填され、
前記計測制御装置は、複数の前記画像の画像データから、隣接する前記第１の微粒子と前記第２の微粒子が互いに離れた時点の画像データを抽出し、
抽出された前記画像データが撮影された時の前記ディスク装置の回転数を、前記シーケンスの情報から算出し、
算出された前記回転数から前記結合力を算出する分子計測装置。
【請求項１２】
前記計測制御装置は、機械学習システムをさらに備え、前記機械学習システムが隣接する前記第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の前記画像データを抽出することを特徴とする請求項１１に記載の分子計測装置。
【請求項１３】
前記チャンバー内に前記結合体を複数入れて、一連の計測シーケンスによって前記結合力の計測を複数行うことを特徴とする請求項７に記載の分子計測法。
【請求項１４】
前記一連の計測シーケンスよって得られた複数の前記結合力の計測結果により、前記結合力の測定値の度数分布であるスペクトル測定を行うことを特徴とする請求項１３に記載の分子計測法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子計測法およびそれを用いた分子計測装置に関し、特に分子間相互作用（結合力）の測定方法およびその計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の優れた分子認識能力を利用したバイオセンサーの研究は世界中で行われている。バイオセンサーの高機能化には生体分子間の相互作用を解析することが必要不可欠である。これまでのところ、特許文献１や非特許文献１、２などのように原子間力顕微鏡(ＡＦＭ：Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ)を用いた生体分子間相互作用測定方法（分子計測法）が実現している。例えば、非特許文献２では、原子間力顕微鏡を用いた生体分子間の相互作用の測定を行う方法と、その測定により生体分子間の結合力が数十〜数百ピコニュートンであることが報告されている。
【０００３】
このようなＡＦＭを用いた生体分子間相互作用の測定においては、カンチレバーを生体分子で修飾することが必要であり、一つ一つの相互作用を定量している。また、これによって、生体分子間の結合力の測定が可能となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２６３９０９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biophysical Journal Volume 79 December 2000 3267-3281
【非特許文献２】E.-L. Florin et al. ，Biosensors &Bioelectronics，10(1995)，895
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＡＦＭを用いた相互作用測定はカンチレバーを生体分子で修飾することが煩雑でありその測定は困難である。また一度に一つの相互作用（結合力）しか定量できない。生体分子に限らずより簡便な分子間相互作用を計測する測定方法（分子計測法）が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の分子計測法は、第１の分子と、前記第１の分子との相互作用により結合する第２の分子との結合力を測定する分子計測法であって、密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体を作成し、前記結合体と前記密度媒体とを充填したチャンバーを回転数を変化させながら回転させ、隣接する前記第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の回転数より前記結合力を計測することを特徴とする。
【０００８】
また本発明の分子計測装置は、計測制御装置と、前記計測制御装置により所定シーケンスにより回転数を変化させながらチャンバーを搭載したディスクを回転させるディスク回転装置と、前記ディスク回転装置のディスクの回転に同期して撮影対象の前記チャンバーをとらえて複数の画像を撮影するカメラとを備え、前記チャンバーは、密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体と、さらに前記密度媒体とを充填され、前記制御装置は、複数の前記画像の画像データから、隣接する前記第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の画像データを抽出し、抽出された前記画像データが撮影された時の前記ディスク装置の回転数を、前記シーケンスの情報から算出し、算出された前記回転数から前記結合力を算出する。
【発明の効果】
【０００９】
より簡便な分子間相互作用（結合力）の測定方法および測定装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の分子計測法を説明する図である。
【図２】本発明の分子計測法を用いる分子計測装置を示す図である。
【図３】マイクロ流路型チャンバーを備えたディスクを示す図である。
【図４】実験結果を示す図である
【図５】実験結果を示す図である。
【図６】第２の実施例における分子間結合力のスペクトル測定結果の一例を示す図である。
【図７】第３の実施例を示す図である。
【図８】第３の実施例の変形例を示す図である。
【図９】第４の実施例を示す図である。
【図１０】実施例４の被測定試料の作成方法を示す図である。
【図１１】抗原を加えた場合の結合力分布（結合力スペクトル）を示す図である。
【図１２】抗原を加えない場合の結合力分布（結合力スペクトル）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好適な実施の形態につき図面を用いて説明する。
【実施例１】
【００１２】
まず、本発明の分子計測法の原理を説明する。図１は、本発明の分子計測法を説明する図である。ここでは、測定対象として図１（１）に示す抗体１（第１の分子）と抗原５（第２の分子）の結合力の測定を一例に説明する。
【００１３】
（測定原理）
測定対象の一方の抗体１を微粒子(ビーズ）２と結合させた抗体固定化微粒子６、および抗体３を微粒子(ビーズ）４と結合させた抗体固定化微粒子７とをそれぞれ準備する。ここで抗体１および３は共に抗原５と結合できるもの（分子）とする。また、微粒子(ビーズ）２および微粒子(ビーズ）４とは互いに比重の異なっているものを選択する。そして抗体固定化微粒子６と抗体固定化微粒子７とを同じ抗原５に結合させる。つまり微粒子(ビーズ）２−抗体１−抗原５−抗体３−微粒子（ビーズ）４の順に結合させたサンプル（ここでは結合体と称す）１０１を作成する（図１（１））。
【００１４】
次にこのサンプル（結合体）１０１と、比重が微粒子(ビーズ）２と微粒子(ビーズ）４それぞれの比重の間の値である溶媒（パーコール）１０２とからなる懸濁液とする。そして、このサンプル（結合体）すなわち測定対象の抗体１と抗原５との結合部分に引っ張り力を加える。溶媒（パーコール）の中では、微粒子(ビーズ）２、微粒子(ビーズ）４と溶媒（パーコール）１０２の比重の大小関係から一方の微粒子(ビーズ）は浮き、他方の微粒子(ビーズ）が重りとして作用する。ここで、微粒子(ビーズ）２の比重が微粒子(ビーズ）４の比重よりも大きい場合、図１（２）に示すように微粒子(ビーズ）２、４には浮力Ｆ１と重力Ｆ２とが作用する。そして、この懸濁液をマイクロ流路構造のチャンバー９に入れ、チャンバー９全体を回転させて外力Ｆ３（後述するようにこれは例えば遠心力である）を徐々に加える。なお図１では回転軸８を中心にチャンバーをＲ０の向きに回転させる。
【００１５】
その結果、２つの微粒子（ビーズ）は比重の大きいビーズ（ここでは微粒子(ビーズ）４）によって沈降する。そしてチャンバー９の壁面（チャンバーの内側の壁面、内壁面）９ｗと接触することで比重の大きいビーズに作用していた遠心力が壁面９ｗとの反作用力によって打ち消され、引張力は比重が小さいビーズ（ここでは微粒子(ビーズ）２）に作用する浮力と遠心力のみとなる（図１（３））。なお、ここでは結合体にかかる浮力Ｆ１が、重力Ｆ２よりも小さくなるように、２つの微粒子（ビーズ）および溶媒（パーコール）１０２を選択した例で説明している（つまり結合体が沈降し、チャンバー壁面に接触する場合）。したがって結合体はチャンバーの下側（遠心力の働く方向）に接触する。しかしながら浮力Ｆ１が重力Ｆ２より大きい場合は（つまり結合体が浮上し、チャンバー壁面に接触する場合）、ちょうどこの関係を逆転させたようにとらえることができる。つまり結合体はチャンバーの上側（遠心力の起点側の方向）に接触する。
【００１６】
さらに、この状態から回転速度を増加させていくと、サンプル（結合体）に作用する力は大きくなりある回転数に達した時点でサンプル（結合体）の結合が破断して２つのビーズが分離する（図１（４））。したがって分離したときのチャンバーの回転数がわかれば、このときの引張力を求めることができ、サンプル（結合体）の結合力を見積もることができる。
【００１７】
ここでサンプル（結合体）は微粒子(ビーズ）２−抗体１−抗原５−抗体３−微粒子（ビーズ）４の順に結合させたものであるから、測定対象が抗体１と抗原５の結合力である場合は、この結合力が一番弱くなるように抗体、抗原あるいは微粒子(ビーズ）の材料を選定すればよい。なお、抗体１，３は微粒子（ビーズ）２，４とくらべ後述するようにその大きさや質量が極めて小さく、抗体固定化微粒子６、７はそれぞれ実質的に微粒子（ビーズ）２，４の比重（あるいは密度）である。また測定対象に結合を図１（４）に示す結合が取れた部分、すなわち抗体１と抗原５の結合部分とすると、サンプル（結合体）は、微粒子(ビーズ）２（第１の微粒子）−抗体１（第１の分子）−抗原５（第２の分子）−抗体固定化微粒子７（第２の微粒子）のように構成しているとみなすことができる。
【００１８】
（測定の方法）
測定原理に示したように、第１の分子（例えば抗体１）と、この第１の分子との相互作用により結合する第２の分子（例えば抗原５）との結合力を測定する本発明の分子計測法は、次のような手順で分子間の相互作用（結合力）を測定する。
【００１９】
まず、図１（１）に示すように、パーコールよりも比重の小さい第１の微粒子（例えば微粒子２や実験例においてのポリスチレン微粒子）、第１の分子と第２の分子の一方、第１の分子と第２の分子の他方、パーコールよりも比重の大きい第２の微粒子（例えば、抗体固定化微粒子７や実験例においての抗体を結合したシリカ微粒子）の順にそれぞれ結合させた結合体（例えば１０１）を作成する。（ステップ１）
【００２０】
次に、図１（２）に示すように、結合体とパーコールとを充填したチャンバー９を回転数を変化させながら回転させる。（ステップ２）
【００２１】
そして、図１（３）に示すように、回転数を上昇させて、パーコールよりも比重の大きい第２の微粒子を遠心力が向かう方向のチャンバー９の壁面に押し付け、第２の微粒子にかかる遠心力をチャンバー９の壁面での反作用で打ち消すようにする。（ステップ３）
【００２２】
さらに、図１（４）に示すように、隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れるまで回転数を上げ、隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れる時点の回転数を計測、その回転数から結合力を算出する。（ステップ４）なお、後述するようにステップ１での結合体の構成形態により、ステップ３を取り除くことが可能である。
【００２３】
上記した測定原理や測定の方法では、サンプル（結合体）１０１と、比重が微粒子(ビーズ）２と微粒子(ビーズ）４それぞれの比重の間の値である溶媒（パーコール）１０２を用いるとして説明した。この溶媒（パーコール）１０２としては、溶媒やパーコールに限らずショ糖溶液、塩化シシウム、Ｆｉｃｏｌｌなどを２つの微粒子（２、４）あるいは結合体１０１に外力（遠心力）を与える媒体とすることができる。本発明では、２つの微粒子（２、４）の間の比重（あるいは密度）を有し２つの微粒子（２、４）あるいは結合体１０１に外力（遠心力）を与える媒体であればよい。本発明では、このような媒体を密度媒体（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｅｄｉａ）と称する。
【００２４】
なお、本発明の測定原理においては、測定対象として抗体１と抗原５の結合力の測定を例に説明したが、本発明の分子計測法は、結合体の構成を様々な材料に代えることで様々な分子間の結合力の測定が可能である。
【００２５】
（測定の対象）
本発明の分子計測法は、抗体１と抗原５の結合力の測定の他に、ある特定の分子と相互作用を備える（すなわち結合する）プローブ分子とその特定の分子との結合力の測定が代表的な測定対象となる。そうしたものの中では、例えば特定の分子と特異的に結合するアプタマー（核酸分子やペプチドなど）とその特定の分子との結合力の測定等がある。
【００２６】
（微粒子の形態）
上述した抗体の他に、アプタマー、ビオチンなどの分子相互作用能のある分子を微粒子２、４の表面に固定化するようにしてもよい。また微粒子の種類には樹脂粒子、無機材料粒子、ゲルビーズさらにはポリマーソームやリポソームなどの小胞体であってもよい。
【００２７】
さらに微粒子の結合に関与する分子数を制御する目的で微粒子表面に固定化する分子の密度を適当に調整することもできる。また、トポロジー効果による分子結合数制御を目的として粒子表面や固相表面にナノ・マイクロ構造を形成することもできる。
【００２８】
（結合体の形態）
上述した例では、抗体固定化微粒子６、７がともに抗原５を介して結合される例を示した。本発明は、抗体に限らず互いに分子相互作用能のある分子に使用可能である。つまり、相互作用（結合）する一方の分子（抗体１，３）をそれぞれ微粒子２、４に結合（固定化）させた分子固定化微粒子（抗体固定化微粒子６、７）を作成し、これらを相互作用（結合）する他方の分子（抗原５）を介して結合させるように結合体を構成した。しかしながら、他方の分子も直接微粒子に結合（固定化）させるように結合体を構成してもよい。
【００２９】
また、上述の例では２つの微粒子２、４を用いて説明したが、後述するように一方の微粒子を単に個体表面に置き換えてもよい。つまり、たとえば微粒子４に代えて壁面９ｗに抗体３を結合させたチャンバーをあらかじめ用意し、これに抗体１と微粒子２が結合した抗体固定化微粒子６を抗原５を介してチャンバー壁面９ｗと抗体固定化微粒子６とを結合するようにサンプル（結合体）を構成してもよい。この場合は、チャンバー壁面９ｗ−抗体３−抗原５−抗体１−微粒子２の順に結合された結合体となる。
【００３０】
次に本発明の分子計測法を用いる分子計測装置について説明する。図２は、本発明の分子計測法を用いる分子計測装置を示す図である。
【００３１】
本発明の分子計測装置１０は、ＣＣＤカメラ１１、キセノンランプ１２、対物レンズ（Ｏｂｊｅｃｔ  Ｌｅｎｓ）１６、ハーフミラー１７、鏡筒１８、固定台２０、ディスク回転装置２１とを備えている。また、計測制御装置１９をさらに備える。計測制御装置１９は、信号ＣＳ１〜ＣＳ３によって、ＣＣＤカメラ１１、キセノンランプ１２、対物レンズ（Ｏｂｊｅｃｔ  Ｌｅｎｓ）１６、ディスク回転装置２１の動作制御を行う。また、ＣＣＤカメラ１１から撮影データを取り込み、撮影データやＣＣＤカメラ１１、キセノンランプ１２、対物レンズ（Ｏｂｊｅｃｔ  Ｌｅｎｓ）１６、ディスク回転装置２１の動作制御情報などのデータ整理を行う。
【００３２】
固定台２０は、鏡筒１８、キセノンランプ１２、ディスク回転装置２１が備え付けられ、鏡筒１８にはさらにＣＣＤカメラ１１がセットされる。
【００３３】
また鏡筒１８は、固定台２０に設置されたキセノンランプ１２からのランプ光が、ラインＬ１に沿って鏡筒１８内のハーフミラー１７で受けるように構成される。ハーフミラー１７は、ランプ光（キセノンランプ光）を鏡筒１８のラインＬ１に沿ってハーフミラー１７から対物レンズ１６の方向にこのランプ光を反射する。そしてランプ光は対物レンズ１６を介してターゲットに照射される。ターゲットからのラインＬ１に沿った反射光を対物レンズ１６、鏡筒１８を経てＣＣＤカメラ１１で受ける。ＣＣＤカメラ１１はターゲットからの反射光によりターゲット表面の画像を取り込む。
【００３４】
ディスク回転装置は、後述するマイクロ流路型チャンバーを備えたディスク１３がセットされる。上記したターゲットはこのディスク上に形成されたチャンバーであり、対物レンズ１６ならびにＣＣＤカメラ１１は、このチャンバーの位置に焦点が合うよう設定される。
【００３５】
次にディスク１３について説明する。図３はマイクロ流路型チャンバーを備えたディスクを示す図である。ディスク１３はＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｄｉｓｃ）とほぼ同じ形状である。したがって中心部にディスク回転装置２１の回転軸の軸受用の孔１５を備えている。ディスク１３を基板として、この基板上にジメチルポリシロキサン（ＰＭＤＳ）を材料としたマイクロ流路型デバイスチップ１４を備える。マイクロ流路型デバイスチップ１４には例えば、チャンバー（マイクロチャンバー）３１が複数パターニングされている。なお、図３においては、１つのマイクロ流路型デバイスチップ１４を基板のディスク１３に取り付ける構成を示しているが、ディスク１３に直接チャンバー３１を形成してもよいし、複数のマイクロ流路型デバイスチップ１４をディスク１３全面に張り付けるようにしてもよい。
【００３６】
このように構成されたディスク１３のチャンバー３１に上述したサンプル（結合体）を溶媒（パーコール）１０２とともにセットする。この時キセノンランプ光がディスク１３のチャンバー３１の表面にあたるようにディスク回転装置２１の回転軸を所望の位置にあわせ、ＣＣＤカメラの撮影画像の焦点がターゲットのチャンバー３１に合うようにセットする。
【００３７】
計測制御装置１９は、所定のシーケンスに従ってディスク回転装置２１に回転させ、サンプル（結合体）に外力Ｆ３（遠心力）を印加する。また、このシーケンスに従い、ディスク１３上にある観測対象のチャンバー３１をストロボ撮影するようＣＣＤカメラ１１、キセノンランプ１２のオンオフを制御する。すなわち、ディスク１３が１回転（あるいは整数回）するたびに計測が終了するまでディスクの回転に同期して、計測するチャンバーをとらえるようにＣＣＤカメラ１１、ディスク回転装置２１、キセノンランプ１２を制御する。また、ディスクの回転を徐々に上げていき印加する遠心力を強めるようシーケンス制御する。
【００３８】
また計測制御装置１９は、キセノンランプ１２のオンオフ制御の他、ランプ光の強度の制御、ならびに対物レンズ（Ｏｂｊｅｃｔ  Ｌｅｎｓ）１６を含めた焦点合わせ制御を行うようにしてもよい。
【００３９】
なお、計測制御装置１９は撮影データを取り込むデータを収集する。計測制御装置１９にＰＣなどのデータ処理装置（不図示）およびデータ処理ソフトを搭載して、データ処理装置が撮影データから結合体の切断時点を判断し、その時点のディスク１３の回転数や時間などを集計するようにしてもよい。画像のデータの判断は、データ処理装置やデータ処理ソフトにより機械学習可能なニューラルネットワークを組み込むことで、精度のよい実現が可能である。
【００４０】
（実験例）
上記した原理に基づいて、抗マウスＩｇＧ抗体とマウスＩｇＧとの抗原抗体反応による結合の結合力の測定の実証例に以下に示す。
【００４１】
まず、測定に用いるマイクロ流路型デバイスチップ１４は、５ｍｍ角のジメチルポリシロキサン(ＰＤＭＳ)製チップとした。このデバイスチップ１４には、直径２００μｍのマイクロチャンバー３１を複数パターニングした。
【００４２】
直径２０μｍのポリスチレンとシリカの２つの微粒子（ビーズ）を用意し、ともに抗マウスＩｇＧ抗体を共有結合によって固定化し抗体固定化微粒子を作成した。この固定化は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）をその表面に備え付けた微粒子に、抗体のアミン（-ＮＨ２）と脱水縮合反応によりエステル結合させ行った。
【００４３】
抗体を固定化した２種のビーズに抗原であるマウスＩｇＧを加えて抗原抗体反応によって結合させた（サンドイッチ反応）。このようにしてポリスチレン微粒子−抗マウスＩｇＧ抗体−マウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体−シリカ微粒子の順に結合された結合体を得た。なお、抗マウスＩｇＧ抗体はポリクローナル抗体であり、１つの抗原に対し複数の抗体が結合できる。ポリスチレン粒子、シリカ粒子の大きさは直径約２０ｕｍであり、分子量１０００００程度の抗マウスＩｇＧはこれらに比べると極めて小さいため、ほぼ粒子同士が結合しているように見える。また、２つの微粒子（ビーズ）と抗マウスＩｇＧ抗体とはどちらも極めて強力な結合である共有結合のため、引っ張り力を加えた場合、まずは、マウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体が切断される。
【００４４】
この結合体（結合した２つの微粒子（ビーズ））を、ポリスチレン微粒子とシリカ微粒子のそれぞれの比重（あるいは密度）の間となる比重（あるいは密度）に調整したパーコール（Percoll）液（溶媒）と共にマイクロ流路型デバイスチップ１４のマイクロチャンバー３１に封入した。ポリスチレン微粒子の密度は１０５２．６［ｋｇ／ｍ３］、シリカ微粒子の密度はおよそ２０００［ｋｇ／ｍ３］、したがって溶媒（パーコール）はその密度が１０９４．３［ｋｇ／ｍ３］のものを選択した。また、本実験ではディスク１３上のマイクロチャンバー３１は、ディスク１３の中心（回転軸の中心）から４．５ｃｍ（回転半径が４．５ｃｍ）となる位置に配置した。なお、本実験では、パーコールは、１０ｎｍ程度のシリカのナノ粒子をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングしたゾルを利用した。
【００４５】
この結合体とパーコール液とを封入したマイクロチャンバー３１を備えたディスク１３を図２に示す実験装置（分子計測装置１０）に取り付け、遠心力を印加し、結合体の挙動を観測した。実際は上述のように２つの微粒子（ビーズ）が結合しているように見えるため、微粒子（ビーズ）の挙動を観察した。測定は、ディスク１３の回転数を実験装置のシーケンス制御により、０ｒｐｍから１００ｒｐｍ／ｓの上昇スピードで徐々に上げていき、結合が切れたところまで観測を行った。
【００４６】
ディスク１３を取り付けた回転系が回転することで結合体に遠心力が印加される。回転している結合体の挙動は、系の回転周期と同期したキセノンランプから発するストロボ光によって顕微鏡画像を撮影し、観察を行った。
【００４７】
（結果）
ディスクの回転数が（１）略０ｒｐｍ、（２）５００ｒｐｍ、（３）９００ｒｐｍ、（４）１０００ｒｐｍにおけるチャンバー内のポリスチレン微粒子４１およびシリカ微粒子４２の様子を図４に示す。なお、図４はディスク１３の回転数を０ｒｐｍから１００ｒｐｍ／ｓの上昇スピードで徐々に上げて観測した結果であるので、図４（１）は測定開始時、図４（２）は５ｓ（ｓｅｃｏｎｄ）後、図４（３）は９ｓ後、図４（４）は１０ｓ後の状態である。ポリスチレン微粒子と隣接したシリカ微粒子は、１０００ｒｐｍに達した瞬間に分離した。また、図５に１０００ｒｐｍに達した時点でのより詳細な分離の瞬間のポリスチレン微粒子４１およびシリカ微粒子４２の様子を示す。図５（１）は１０００ｒｐｍに達した時点、図５（２）はその６０ｍｓ後、図５（３）はその１２０ｍｓ後、図５（４）はその１８０ｍｓ後、図５（５）はその２４０ｍｓ後の状態を示している。図４、図５とも図の上から下方向に遠心力が印加されている。
【００４８】
隣接したポリスチレンとシリカの両微粒子（ビーズ）を観察した場合、抗体抗原反応によって微粒子（ビーズ）同士が結合しているか、もしくは、結合していないポリスチレンビーズが遠心力を印加する前に天井方向に浮上し天井のカバーガラスと接触しており、顕微鏡で上から見た際に隣接しているように見えているかの２通りが考えられる。カバーガラスと接触しているシリカ微粒子（ビーズ）と隣接しているように見えるポリスチレン微粒子（ビーズ）は、回転系が回転し遠心力を印加し始めた直後、つまり１０００ｒｐｍに満たない回転数ですべて浮上しシリカ微粒子（ビーズ）と分離していたため１０００ｒｐｍで分離した微粒子（ビーズ）は，重なって結合しているように見える微粒子（ビーズ）ではなく，確かにシリカ微粒子（ビーズ）と抗原抗体反応によって結合していたと考えられる。
【００４９】
以上からポリスチレンとシリカ同士隣接した微粒子（ビーズ）が分離したことをもって、マウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体が切断されたと判断できる。したがってこの時の回転数１０００ｒｐｍからこの時点でマウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体結合に引っ張った力は次の通り求めることができる。
【００５０】
シリカ微粒子４２に比べポリスチレン微粒子４１の方が密度が小さいため、マウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体の結合を引っ張る力は溶媒（パーコール）でポリスチレン微粒子４１に作用する力を求めればよい。
【００５１】
流体密度（密度媒体）ρf［ｋｇ／ｍ３］のとき、体積Ｖ［ｍ３］の物体に作用する浮力Ｆb［Ｎ］は、重力加速度をｇ［ｍ／ｓ２］とすると、
【００５２】
Ｆｂ  ＝  ρf・Ｖ・ｇ  ［Ｎ］  ・・・式１
【００５３】
として求められる。物体の密度がρsの時、浮力と重力の合力Ｆは上向きを正として、
【００５４】
Ｆ  ＝  （ρf−ρs）・Ｖ・ｇ  ［Ｎ］  ・・・  式２
【００５５】
として求められる。ここで遠心力によってポリスチレン微粒子に作用する引っ張り力は式２のｇの代わりに相対遠心加速度ＲＣＦ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｏｒｃｅ）を持ちいればよい（実際ＲＣＦは重力加速度ｇに対する比なのでｇをＲＣＦ・ｇとみなす）。したがって
【００５６】
Ｆ  ＝  （ρf−ρs）・Ｖ・ＲＣＦ［×ｇ］  ［Ｎ］  ・・・  式３
【００５７】
となる。微粒子（ビーズ）にかかる相対遠心加速度ＲＣＦは、回転系の加速度をａ、重力加速度をｇとすると、
【００５８】
ＲＣＦ＝ａ／ｇ  ・・・  式４
【００５９】
で求められる。ここで、回転系の加速度ａならびに回転角速度ωは回転半径をｒ[ｍ］、回転数Ｎ［ｒｐｍ］とするとそれぞれ式５、６
【００６０】
回転系の加速度 ａ  ＝  ｒω２    ・・・式５
【００６１】
回転角速度     ω  ＝  ２πＮ／６０  ・・・式６
【００６２】
である。重力加速度（ｇ）≒９.８０６６５［ｍ／ｓ２］であるので、式４〜６により
【００６３】
ＲＣＦ≒ｒω２／ｇ＝４ｒ・π２・Ｎ２／（３６００・ｇ）［×ｇ］≒１１１８・ｒ・Ｎ２・１０−６［×ｇ］
【００６４】
となる。したがってポリスチレン微粒子に作用する力は、回転半径ｒ＝４．５×１０−２［ｍ］、切断時の回転数Ｎ＝１０００［ｒｐｍ］、溶媒の密度ρf＝１０９４．３［ｋｇ／ｍ３］、ポリスチレン微粒子の密度ρs＝１０５２．６  ［ｋｇ／ｍ３］、ポリスチレン微粒子の直径が２０［μｍ］であるから、式３より、
【００６５】
Ｆ＝（ρf−ρs）・Ｖ・ＲＣＦ［×ｇ］＝（ρf−ρs）・Ｖ  ×  ４ｒ・π２・Ｎ２／（３６００・ｇ）・［×ｇ］＝１１１８・ｒ・Ｎ２・１０−６×（ρf−ρs）・Ｖ  ［×ｇ］＝１１１８・４．５×１０−２・１０００２・１０−６×（１０９４．３−１０５２．６）×４／３×π×（１０×１０−６）３  ・９．８０６６５＝５０．３１×（１０９４．３−１０５２．６）×４．１９×１０−１５×９．８０６６５＝８．６・１０−１１  ［Ｎ］＝８６[ｐＮ]
【００６６】
となる。
【００６７】
実験を繰り返した結果、微粒子（ビーズ）が分離したときに微粒子（ビーズ）に作用していた力は８０−９０［ｐＮ］となった。このことは上記測定原理の実証であり、遠心マイクロ流体デバイスを用いた生体分子間相互作用測定が可能であることを示している。なお、上記は結合体にかかる浮力が重力より小さい場合（結合体が沈降するし、チャンバー内壁に引っ付く場合）を例に求めた。したがって浮き側の微粒子（ρｓ）と密度媒体（ρｆ）との関係で結合力を算出した。結合体にかかる重力が浮力より小さい場合（結合体が浮いてチャンバーの内壁に引っ付く場合）は、重り側の微粒子（ρａ）と密度媒体（ρｆ）との関係で結合力を算出すればよい。つまりρｓに代えて重り側の微粒子の密度（ρａ）を使って計算すればよい。
【００６８】
今回の実験によって得られた微粒子（ビーズ）の結合力は先述の生体分子間の相互作用に匹敵するほどの結合力であり、生体分子間の相互作用としては非常に高い値となっている。これは、今回使用したビーズが抗体のサイズに対して大きかったためと考えられる。ビーズの曲率が抗体に対して大きいため複数の抗体が複数の抗原分子と反応して結合したために結合力が大きくなったと考えられる。
【００６９】
一方、抗体分子１分子について結合力を測定するには一分子抗原１分子抗体とが反応するように反応系を最適化して１分子結合を形成させる必要がある。
【実施例２】
【００７０】
実施例１では、１つのチャンバーにおける分子間の結合力の測定を示した。しかしながら、顕微鏡の視野内に存在する微粒子（ビーズ）を複数観察することが可能であるため、１度の測定で複数の微粒子（ビーズ）に関して結合力を測定することが可能である。
【００７１】
つまり、複数のサンプルを同時並行的に測定ができるため、これらの測定結果を統計的に生体分子間相互作用の解析が可能である。
【００７２】
１つの方法としては、顕微鏡の視野内に存在する微粒子（ビーズ）を複数観察することが可能であるため、撮影データ1枚分に複数のチャンバーでの観測結果を撮影して、これらを計測制御装置１９に搭載したＰＣなどのデータ処理装置で処理する方法である。
【００７３】
また別の方法としては、計測制御装置１９のシーケンスを改良して、ディスク１３が１回転する間に複数のチャンバーの撮影を行うようにし、得られた画像データを計測制御装置１９のデータ処理装置でチャンバーごとに分けて処理するようにしてもよい。あるいは、上記２つを組み合わせてもよい。
【００７４】
さらには、計測制御装置１９がディスク回転装置と対物レンズとの位置関係をコントロールしてより広範囲の撮影を行うようにしてもよい。
【００７５】
このように、同一構造の結合体の結合力の複数の同時計測を行うことによって、統計的に生体分子間相互作用（結合力）の測定を行うことが可能となる。その結果を、例えば図６に示すように測定された結合力とそのサンプル頻度との関係（ここではこれを分子間結合力のスペクトル測定と称す）として、容易に出すことができる。また、そもそも生体分子の結合力はばらつきが大きいため、このような統計的解析が非常に有効である。さらに、上記した抗マウスＩｇＧ抗体とマウスＩｇＧとの抗原抗体反応で用いる抗マウスＩｇＧ抗体のようなポリクローナル抗体はモノクローナル抗体と比べて選択反応性が低いため、複数の抗原と相互作用を持ち結合してしまう傾向が強い。したがってポリクローナル抗体のような選択反応性の低いものの結合状態を解析するには、このスペクトル測定が有効である。複数のサンプルによる結合力分布を統計的に解析すると分布のピークがそれぞれ結合した抗原の種類や結合位置に応じた結合力を示すことになり、分子結合の解析が可能となる。
【００７６】
以上説明したように本発明の分子計測法および分子計測装置は、遠心力を用いることにより複数の結合を一括測定可能となり、統計解析を一括で実施可能なスループットが得られる。これにより生体分子間に生じる相互作用の質を評価する新たな分析が可能となる。
【００７７】
例えば抗原抗体反応によるバイオ分析で得られたシグナルには抗体が間違って補足した分子に由来するシグナルが含まれるが、これを真正なシグナルと切り分ける術はない。しかし、一旦形成した結合が分離する閾値を再評価すれば、生体分子間の微妙な相互作用の違いから誤認識に由来する結合を識別することが可能となる。
【００７８】
この応用として前立腺癌特異的バイオマーカーであるＰＳＡの解析が考えられる。ＰＳＡは末梢血液中においてＴｏｔａｌ＿ＰＳＡとＦｒｅｅ＿ＰＳＡの２種の形態を取っているが、これらはもともと同一の物質であったことから抗体が誤認識する可能性が高い。
【００７９】
このような場合、上記した分子間結合力のスペクトル測定を行うことにより本発明の適用によりＴｏｔａｌ＿ＰＳＡとＦｒｅｅ＿ＰＳＡの識別が可能になる。
【実施例３】
【００８０】
図７は、実施例１の結合体１０１を結合体５１０１に代えて本発明の分子計測法を行う例を示す図である。本実施例では、結合体１０１の一方の微粒子をチャンバー９の壁面の一部に塗布された薄膜状のシリカ５４に置き換えたものである。こうしておけば、実施例１と同じ要領で、薄膜状のシリカ５４に抗体３を結合させ、抗体固定化壁面５７が構成できる。したがってチャンバー壁面の薄膜状のシリカ５４−抗体３−抗原５−抗体１−微粒子２の順に結合された結合体を構成できる。なお、すべての実施例に当てはまるが、材料としてのシリカ５４は必須ではなく測定対象に応じて適宜選択可能である。また、図７では、チャンバー９の一部を覆うように薄膜状のシリカ５４を形成しているが、チャンバー９の壁面（内壁）の全てを覆うようにしてもよい。
【００８１】
（実施例３の変形例）
図８は、図７で示した実施例３の変形例である。実験においてチャンバー９はＰＤＭＳを材料として作成する例を示したが、チャンバーそのものの材料を抗体３が結合できる素材に置き換えてしまうことも可能である。すなわち本変形例ではチャンバー６４そのものがシリカで構成されている。したがってシリカで出来たチャンバー６４−抗体３−抗原５−抗体１−微粒子２の順に結合された結合体を構成できる。こうすれば、薄膜状のシリカ５４をチャンバー９の壁面に覆うようにする手間が省けることになる。
【００８２】
以上説明したように、本発明の分子計測方法は、第１の分子（例えば抗体１）と、この第１の分子との相互作用により結合する第２の分子（例えば抗原５）との結合力を測定する分子計測法であって、パーコールよりも比重の小さい第１の微粒子（例えば微粒子２や実験例においてのポリスチレン微粒子）、第１の分子と第２の分子の一方、第１の分子と第２の分子の他方、パーコールよりも比重の大きい第２の微粒子（例えば、抗体固定化微粒子７や実験例においての抗体を結合したシリカ微粒子）の順にそれぞれ結合させた結合体（例えば１０１）を作成し、結合体とパーコールとを充填したチャンバー（例えば後述する３１など）を回転数を変化させながら回転させ、隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の回転数により結合力を計測する。
【００８３】
特定の分子と特異的に結合するアプタマー（核酸分子やペプチドなど）のアプタマーと特定分子との結合力を測定する場合は、アプタマー（第１の分子）にパーコールよりも比重の小さい微粒子を結合させ、特定の分子（第２の分子）にパーコールよりも比重の大きい微粒子を結合させ（この逆でもよい）、アプタマーと特定の分子とさらに結合させ、引っ張り力を与えるようにすればよい。
【００８４】
言い換えると、第１の分子（例えば抗体１）と第２の分子（例えば抗原５）との結合を、第１の分子、第２の分子の一方につけた浮きと他方につけた重りにより引っ張り力を与え、その結合が切れる時に加えた引っ張り力を、チャンバーの回転数から求める測定方法である。
【００８５】
なお、上記の例では抗体固定化微粒子７は微粒子４に抗体３（第３の分子）が結合されている。したがって、第１の微粒子および第２の微粒子のうち、第２の分子と結合する微粒子は、第３の分子を備え、第２の分子は第３の分子との相互作用により微粒子と結合するようにしてもよい。
【００８６】
浮きは、パーコールに対して比重（あるいは密度）の小さい微粒子が用いられ、重りはパーコールに対して比重（あるいは密度）の大きい微粒子であればいい。また、第１の分子と第２の分子とが結合した結合分子の一方に浮き、他方に重りがつけばよいので、測定対象の分子の種類によって浮きと重りのつけ方を選択すればよい。
【００８７】
また、第１の分子と第２の分子とが結合した結合分子が重りに結合している部分を、重りに代えてチャンバーの壁面に結合させてもよい。
【００８８】
第１の分子をプローブ分子を、第２の分子をそのプローブ分子が相互作用を備える特定の分子とすることも可能である。プローブ分子としては、抗体の他、アプタマー、ビオチンとすることもできる。
【００８９】
一方、ディスク１３はチャンバー３１を複数備え、一連の計測シーケンスによって結合力の計測を複数同時に行うことが可能である、またさらに、一連の計測シーケンスよって得られた複数の結合力の計測結果により、結合力の測定値の度数分布であるスペクトル測定を行うこと可能である。
【００９０】
この分子計測法を取り入れた分子計測装置は、例えば、計測制御装置と、計測制御装置により所定シーケンスにより回転数を変化させながらチャンバーを搭載したディスクを回転させるディスク回転装置と、ディスク回転装置のディスクの回転に同期して撮影対象のチャンバーをとらえて複数の画像を撮影するカメラとを備え、チャンバーは、パーコールよりも比重の小さい第１の微粒子、第１の分子と第２の分子の一方、第１の分子と第２の分子の他方、パーコールよりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体と、さらにパーコールとを充填され、計測制御装置は、複数の画像の画像データから、隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の画像データを抽出し、抽出された画像データが撮影された時のディスク装置の回転数を、シーケンスの情報から算出し、算出された回転数から前記結合力を算出するように構成される。
【００９１】
さらに計測制御装置は、機械学習システムを備え、機械学習システムが隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の前記画像データを抽出するようにすることもできる。このようにすればほぼすべての測定を精度よく自動に行うことが可能となる。
【実施例４】
【００９２】
本実施例は、ポリスチレンビーズを複数個結合させ、同時に結合力測定を行う場合における本発明の一例である。図９は第４の実施例を示す図であり、抗体固定化基板（６４０１）を用いた生体分子間相互作用の測定方法を示す図である。図９では、実施例３におけるチャンバー６４に代えて抗体固定化基板（６４０１）を用いている。抗体固定化基板（６４０１）は、あらかじめ抗体３をその基板表面に複数固定化したものである。また抗体１を微粒子(ビーズ）２と結合させた抗体固定化微粒子６を用いた例を示している。抗体３および抗体固定化微粒子６の抗体１はともに抗原５と抗原抗体反応で複数結合させたものを示している。
【００９３】
図９に示すように、本実施例では、基板（６４０１）の抗体３と抗体固定化微粒子６の抗原１と、抗原５とをそれぞれ抗原抗体反応で複数結合させ（図９（ａ））、微粒子２（例えばポリスチレンビーズ）よりも比重の大きい溶媒（パーコール）でチャンバー内を満たし微粒子２、抗体固定化微粒子６には浮力Ｆ１が加わるようにしたうえで、遠心力Ｆ３を印加する（図９（ｂ））。こうすることによって上述の例と同じように、まず、結合力の小さい抗体固定化微粒子６は低回転数で結合が破断する（図９（ｃ）、特に同図の左端の抗体固定化微粒子６’）。さらに回転数を変化させることで抗体固定化微粒子６にかかる遠心力を上げていくことにより順次結合を破断させていく（図９（ｄ））。ここで複数の抗体固定化微粒子６に加えた遠心力の大きさと結合が破断した抗体固定化微粒子６の数との関係をプロットすることによりスペクトル解析が行える。
【００９４】
（試料の作成）
実施例４の被測定試料の作成方法について説明する。図１０は、実施例４の被測定試料の作成方法を示す図である。図１０に示すように、まず抗体固定化基板（６４０１）のベースとなるガラス基板に対し抗体を固定化する（図１０（ａ））。ここでは、ＥＤＡＣを架橋剤として用いることでペプチド結合によってガラス基板に抗体を固定化した。抗体分子中に存在するカルボキシル基をＥＤＡＣによって活性化させた後に，ガラス基板にコーティングされているアミノ基と反応させることでガラス基板に抗体を固定化した。抗体を固定化するガラス基板には，ＡＰＳ（アミノシラン）コートスライドグラス（松浪硝子）を使用した。また、カップリング剤としてＰｏｌｙＬｉｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＣＯＯＨ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  （ＰｏｌｙＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ，  ＰｏｌｙＬｉｎｋ  Ｗａｓｈ／Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｎｆｆｅｒ，  ＰｏｌｙＬｉｎｋ  ＥＤＡＣ）を、基板の洗浄を行う際にはシカクリーン（関東化学）を０．３％加えた純水を洗剤として使用した。
【００９５】
次に、抗体固定化微粒子６の一例である抗体固定化済ポリスチレンビーズを抗原抗体反応で結合する。まず、図１０（ａ）で抗体３を固定化した基板（６４０１）に抗原５を加えて反応させ（図１０（ｂ））、未反応の抗原（抗原分子）５を洗浄し（図１０（ｃ））、抗体固定化済ポリスチレンビーズ６を加えて反応させて（図１０（ｄ））、
密度調整した溶媒（パーコール１０２）を加えカバーガラス６４０２をかぶせることにより所望の被測定試料を作成した(図１０（ｅ））。図９および図１０（ｅ）においては、遠心力が働く方向側に抗体固定化基板（６４０１）を配置する例を示しているが、これに代えて抗体固定化基板（６４０１）の上下を逆さ（すなわち遠心力が働く方向とは逆の位置に配置）にして遠心することも可能である。この場合は、例えば溶媒の比重が微粒子６の比重よりも小さいものを選択することができる。これに限らず微粒子が溶媒に沈むような関係を確保するよう適宜材料を選択するとよい。
【００９６】
実験においては、抗体分子５を固定化したガラス基板にφ３ｍｍの穴を開けたＰＤＭＳを貼り付けることでチャンバー(不図示）を作成した（図１０（ａ））。チャンバー内に１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳで１００倍に希釈した抗原分子５を加えて３０分間室温静置下で反応させ（図１０（ｂ））、溶液を取り除き０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＤＰＢＳを加えることで未反応分子を洗浄した（図１０（ｃ））。洗浄は同様の手順で３回を行った。１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳで１０００個／μｌ（マイクロリットル）になるように希釈した抗体固定化済ポリスチレンビーズ（６）を加えて室温静置下で３０分反応させビーズと基板を結合させ（図１０（ｄ））、密度調整したパーコール(Ｐｅｒｃｏｌｌ）１０２を加えてチャンバーを満たし，溶媒の漏れを防ぐためカバーガラス６４０２をかぶせ被測定試料を作成した（図１０（ｅ））。
【００９７】
（実験）
このようにして作成した試料に対し、遠心力は、０〜１００Ｇ（Ｇ：重力加速度）まで１０Ｇ刻みで加わるように回転数を調整し，１分間回転させることで遠心力を印加した。遠心力印加後に基板を取り出し，顕微鏡にて結合が破断せずに残っていたビーズを数えた。ここから試料に加えた遠心力と結合が破断せずに残っていたビーズの数の結果から結合力分布（すなわち結合力スペクトル）を求めた。なお、比較対象試料として抗原５を全く加えない試料についても同様の実験を行った。
【００９８】
（結果）
以上により求められた抗原を加えた場合／抗原を加えない場合についての結合力分布（結合力スペクトル）の結果を図１１、図１２にそれぞれ示す。図１１と図１２を見ると抗原を加えた場合の結合力は，２２．５〜３３．８ｐＮの区間でピークを持っており，抗原を加えない場合では，０〜１１．３ｐＮの区間で殆どの結合が破断していることがわかる。このように結合力のピーク値が異なることから，抗原分子を加えた場合では，殆どのポリスチレンビーズが抗原抗体反応によって結合していると考えることができる。また，結合力の違いによって特異的結合と非特異的結合の区別が可能であると考えられる。また，図１１を見ると９０〜１０１．３ｐＮの区間で第２のピークを持っているように見える。これは，１つのビーズについて結合に関与する抗体分子が複数個存在するため，結合力が大きくなってしまったものと見られる．この傾向は，ＡＦＭを用いた単分子間相互作用のスペクトル解析にも見られ，先行研究の結果と近い波形を取っていることから，整合性のある実験結果を得ることができたと考えられる。以上より，印加する遠心力の区間をより細かく設定し，結合力の分布を作成することで生体分子間相互作用のスペクトル解析が可能であることがこの結果からも確認できた。
【００９９】
本実施例からも明らかなように、１つのチャンバーで複数の試料を測定することも本結果から実証された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
たとえば、生体検査・化学分析に利用が可能である。
【符号の説明】
【０１０１】
１、３  抗体
２、４  微粒子（ビーズ）
５  抗原
６、７  抗体固定化微粒子
８  ディスク回転軸
９  チャンバー
９ｗ  チャンバー壁面
１０  分子計測装置
１１  カメラ
１２  キセノンランプ
１３  ディスク
１４  マイクロ流路型チップ
１５  ディスク回転軸用孔
１６  対物レンズ
１７  ハーフミラー
１８  鏡筒
１９  計測制御装置
２０  固定台
２１  ディスク回転装置
４１  ポリスチレン微粒子
４３  シリカ微粒子
５４  薄膜状のシリカ
５７  抗体固定化壁面
６４  シリカ製チャンバー
６７  抗体固定化チャンバー
１０１、５１０１、６１０１  結合体
１０２  溶媒（パーコール）
６４０１  抗体固定化基板
６４０２  カバーガラス
Ｒ０  回転方向
ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３  制御信号
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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