(57)【要約】      （修正有）【課題】保管中のカラム性能の劣化を抑制できる液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法、および、保管方法を提供する。【解決手段】カチオン交換基導入型の充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムに、アンモニウム塩の濃度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウム塩水溶液を封入する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン交換基導入型の充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムに、
アンモニウム塩の濃度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウム塩水溶液を封入することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項２】
前記カチオン交換基導入型の充填剤が、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、スルホ基およびスルホアルキル基からなる群から選択される少なくとも１種のカチオン交換基が導入された親水性ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項３】
前記液体クロマトグラフィー用カラムが、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム、逆相クロマトグラフィー用カラムおよびイオン交換クロマトグラフィー用分析カラムからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項４】
前記アンモニウム塩が、ギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法で製造された液体クロマトグラフィー用カラムを０℃〜３０℃で保管することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの保管方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法および保管方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーは、天然物や発酵生産物、培養生産物、あるいは合成反応物中の目的物質を分離する手段として広く用いられている。
【０００３】
液体クロマトグラフィーの中でも、アミン類や塩基性アミノ酸、陽イオン等のカチオン性化合物を分離する場合、カチオン交換基導入型の充填剤が充填された親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム、逆相クロマトグラフィー用カラム、イオン交換クロマトグラフィー用カラム等を用いて分析する方法が広く知られている。
【０００４】
カチオン交換基導入型の充填剤としては、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、スルホ基、スルホアルキル基等が導入された親水性ポリマー等が知られている。この親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコール基材にカルボキシル基含有水溶性高分子を被覆した後、カルボキシル基含有水溶性高分子を架橋することにより、ポリビニルアルコール基材にカルボキシル基を導入したものが挙げられる（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
これらの液体クロマトグラフィー用カラムを用いてカチオン性化合物を分析する場合、例えば、リン酸、ギ酸、酢酸等を含有する酸性水溶液と、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフラン等の水と相溶する有機溶媒との混合溶液を移動相として用い、必要に応じて酸の添加量や有機溶媒の比率を変化させながら、カチオン性化合物の溶出力を調整する方法を用いることができる。
【０００６】
しかし、カチオン交換基導入型の充填剤が充填されたカラムは、酸性水溶液と有機溶媒との混合液をカラム内に封入したまま長期間保管すると、充填剤のカチオン交換基が加水分解の影響を受けて、カラム性能の劣化が促進され、カチオン性化合物の分析結果に再現性が得られなくなるという課題があった。特に、カラム性能の劣化に経時変化が生じる場合、徐々にカチオン性化合物の保持時間が減少する。そのため、分析精度が低下することに加えて、分析時に経時変化を認識していないことに起因して測定ミスを生じることや、高価なカラムを頻繁に交換しなければならないこと等の課題があった。この課題を解決する方法の１つとしては、カラム内を水や有機溶媒に置換してから保管する方法も用いられている。しかし、その方法では、水や有機溶媒による充填剤の加水分解を完全に抑制することが難しかった。
【０００７】
また、市販のカラムでは、保管中のカラム性能の劣化を抑制するために、カラム内を高濃度のナトリウム塩含有水溶液からなるカラム封入液に置換してから保管することが広く推奨されている。例えば、ポリヒドロキシメタクリレート樹脂にカルボキシメチル基が導入された充填剤が充填されたイオン交換クロマトグラフィー用カラム（商品名：Ｓｈｏｄｅｘ  ＩＥＣ  ＣＭ−８２５、昭和電工株式会社製）では、カラム封入液として、５０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム水溶液が用いられている。また、ポリヒドロキシメタクリレート樹脂にスルホ基が導入された充填剤が充填された逆相クロマトグラフィー用カラム（商品名：Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＳｐａｋ  ＮＮ−８１４、昭和電工株式会社製）では、カラム封入液として、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ３．０に調整したもの）が用いられている。
【０００８】
しかし、これらの高濃度のナトリウム塩含有水溶液をカラム封入液として用いた場合、カラム内に、移動相として水と相溶する有機溶媒（水と任意の割合で混合した混合液を含む）を通液すると、ナトリウム塩は有機溶媒に難溶であるため、カラム内に析出する。カラム内にナトリウム塩が析出することは、カラムの圧力上昇やカラムの劣化の原因となる。そのため、高濃度のナトリウム塩含有水溶液をカラム封入液として用いた場合には、移動相を通液する前に、予めカラム内を水で十分に置換する必要がある。また、ナトリウム塩はカラム内から溶出され難いことから、カラム内を水で置換する際、通液が安定化するには長時間を要する。また、カラム内をカラム封入液や移動相で置換することを繰り返すと、充填剤の加水分解の度合いや、充填剤の充填状態が変化して、カラム性能の劣化が促進されるという課題があった。さらに、検出器として質量分析計（ＭＳ）を用いる場合、カラム内に不揮発性であるナトリウム塩が残存していると、検出感度の低下やゴーストピークの出現等の悪影響を及ぼす可能性もある。
【０００９】
カラム性能の劣化の抑制方法としては、例えば、Ｓ−カルボキシアルキルシスティンを含む溶液をカラム封入液として用いることにより、保存安定性を向上させる方法も知られている（例えば、特許文献２参照）。この方法によれば、カルボキシル基またはカルボキシアルキル基が導入されたカチオン交換基導入型の充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムの保管において、カラム性能の劣化の経時変化を抑制することができる。
【００１０】
しかしながら、この方法は、カラム封入液として特殊な試薬を用いる上に、カラムの用途もグリコヘモグロミン分析用に限定されるため、必ずしも一般的なカラムの保管方法として用いることはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−１９１５８１号公報
【特許文献２】特開平６−９４６９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、カチオン交換基導入型の充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法および保管方法であって、保管中のカラム性能の劣化を抑制できる液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法および保管方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、カチオン交換基導入型の充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムに、３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウム塩水溶液を封入することにより、保管中のカラム性能の劣化を抑制し、カラム内に移動相として水と相溶する有機溶媒を通液しても、分析性能に影響がないことを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法におけるカラムは、移動相として水と相溶する有機溶媒（水と任意の割合で混合した混合液を含む）を含む液体を用いる液体クロマトグラフィーに好適である。
【００１４】
すなわち、本発明は次の事項に関する。
［１］カチオン交換基導入型の充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムに、アンモニウム塩の濃度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウム塩水溶液を封入することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【００１５】
［２］前記カチオン交換基導入型の充填剤が、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、スルホ基およびスルホアルキル基からなる群から選択される少なくとも１種のカチオン交換基が導入された親水性ポリマーである［１］に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【００１６】
［３］前記液体クロマトグラフィー用カラムが、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム、逆相クロマトグラフィー用カラムおよびイオン交換クロマトグラフィー用分析カラムからなる群から選択される少なくとも１種である［１］または［２］に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【００１７】
［４］前記アンモニウム塩が、ギ酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも１種である［１］〜［３］のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【００１８】
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法で製造された液体クロマトグラフィー用カラムを０℃〜３０℃で保管することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの保管方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、保管中のカラム性能の劣化を抑制できる液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法および保管方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１において、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムである。
【図２】実施例２において、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムである。
【図３】実施例３において、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムである。
【図４】比較例１において、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムである。
【図５】比較例２において、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムである。
【図６】比較例３において、加速試験前と加速試験開始から３日後におけるアドレナリンのクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法および保管方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００２２】
［液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法］
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法は、カチオン交換基導入型の充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムに、アンモニウム塩の濃度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウム塩水溶液を封入する。
【００２３】
本発明における液体クロマトグラフィー用カラムとしては、例えば、円筒形状等をなすハウジングと、そのハウジングの内部に充填された充填剤とを備えるカラムが挙げられる。
【００２４】
ハウジングの材質および大きさは、特に限定されない。ハウジングとしては、ステンレス管またはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）管を用いることが好ましい。また、ハウジングが円筒形状である場合、その内径は、１．０ｍｍ〜８．０ｍｍであることが好ましく、１．０ｍｍ〜４．６ｍｍであることがより好ましい。さらに、ハウジングの長さは、１０ｍｍ〜３００ｍｍであることが好ましく、５０ｍｍ〜２５０ｍｍであることがより好ましい。
【００２５】
本発明における充填剤としては、一般的に液体クロマトグラフィー用カラムに用いられる材料であって、水に分散させても化学的および物理的に安定で、分解・変質を起こさないものであれば特に限定されない。
【００２６】
充填剤としては、ベースとなる基材と、その基材に導入されたカチオン交換基と、を有するカチオン交換基導入型の充填剤が用いられる。
【００２７】
ベースとなる基材としては、例えば、樹脂、シリカゲル、アルミナ（酸化アルミニウム）、チタニア（酸化チタン）、セリア（酸化セリウム）、カーボン等が挙げられる。また、基材の組成は、単体に限定されず、例えば、シリカゲルからなる核と、その周囲を被覆する樹脂とを有する構造（コアシェル構造）をなす複合体であってもよい。このような基材の中でも、強酸あるいは強アルカリに対しても化学的に安定であり、かつ表面を種々の官能基で化学的に修飾可能な架橋ポリマーまたは非架橋ポリマーが好適に用いられる。
【００２８】
カチオン交換基導入型の充填剤としては、親水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーに用いられ、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、スルホ基およびスルホアルキル基からなる群から選択される少なくとも１種のカチオン交換基が導入された親水性ポリマーが好適に用いられ、最も好ましくはカルボキシル基が導入された親水性ポリマーを用いることができる。
【００２９】
カチオン交換基が導入された親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシメタクリレート等の親水性ポリマーに、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、スルホ基およびスルホアルキル基からなる群から選択される少なくとも１種のカチオン交換基が化学修飾または被覆により導入されたものが挙げられる。カルボキシアルキル基としては、カルボキシメチル基やカルボキシエチル基等が挙げられる。スルホアルキル基としては、スルホメチル基やスルホエチル基等が挙げられる。カチオン交換基は、親水性ポリマーに対して、１種のみを導入してもよいし、２種以上を組み合わせて導入してもよい。
【００３０】
本発明におけるカチオン交換基導入型の充填剤は、材質、大きさ、形状等が特に限定されない。ただし、十分な分離性能および高い検出感度を得るためには、カチオン交換基導入型の充填剤は、体積平均粒子径が１μｍ〜３０μｍの球状であることが好ましく、体積平均粒子径が３μｍ〜１０μｍの球状であることがより好ましい。
【００３１】
ここで、本明細書において充填剤の体積平均粒子径とは、２０００個以上の充填剤を粒度分布測定装置で撮像して得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得て、その円相当径から各粒子の体積を算出して、体積を基準に平均化した粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径の球体とみなす。
【００３２】
本発明における液体クロマトグラフィー用カラムは、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム、逆相クロマトグラフィー用カラム、イオン交換クロマトグラフィー用分析カラムおよびイオンクロマトグラフィー用カラムからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム、逆相クロマトグラフィー用カラムおよびイオン交換クロマトグラフィー用分析カラムからなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムおよび逆相クロマトグラフィー用カラムからなる群から選択される少なくとも１種であることがさらに好ましい。本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法では、これらのカラムの１種を単独で製造してもよく、２種以上を同時に製造してもよい。
【００３３】
本発明における親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムおよび逆相クロマトグラフィー用カラムでは、移動相として、水と相溶する有機溶媒と、水との混合溶液を用いることが好ましい。液体クロマトグラフィーによる分析時に、カラム内を移動相からカラム封入液に置換する際、または、カラム内をカラム封入液から移動相に置換する際に用いられる移動相における有機溶媒と水の混合割合において、水の割合が５質量％以上であることが好ましく、１０質量％以上であることがより好ましく、１５質量％以上であることがさらに好ましい。また、当該水の割合は９０質量％以下であることが好ましい。有機溶媒と水の混合溶液からなる移動相が水を５質量％以上含むことにより、カラム内を移動相からカラム封入液に置換する際、または、カラム内をカラム封入液から移動相に置換する際に、カラム内にアンモニウム塩が析出することがなく、カラムの圧力上昇やカラム性能の劣化を抑制できる。
【００３４】
有機溶媒としては、水と相溶するものであれば特に限定されないが、アセトニトリルが好適に用いられる。
【００３５】
また、液体クロマトグラフィーによる分析時に、カラム内を移動相からカラム封入液に置換する際、または、カラム内をカラム封入液から移動相に置換する際には、分析時の流量以下でカラム内に通液することが好ましく、分析時の１／３〜１／２の流量で通液することがより好ましい。カラム内を置換する際の移動相またはカラム封入液の流量が、分析時の流量以下であれば、この置換によって、カラム性能が劣化することを防止できる。
【００３６】
液体クロマトグラフィーによる分析時に、カラム内を移動相からカラム封入液に置換する際、または、カラム内をカラム封入液から移動相に置換する際には、カラム内に通液する時間（通液時間）は１０分〜３０分であることが好ましく、１５分〜３０分であることがより好ましい。通液時間が１０分以上であれば、カラム内が移動相またはカラム封入液によって十分に置換されるため、保管中のカラム性能の劣化を抑制する効果が十分に得られる。また、液体クロマトグラフィーによる分析時に、カラム内に、封入液に含まれるアンモニウム塩が残存することがなく、精度良く分析を行うことができる。
【００３７】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法では、液体クロマトグラフィー用カラムのカラム封入液として、アンモニウム塩を含むアンモニウム塩水溶液が用いられる。
【００３８】
アンモニウム塩の種類は特に限定されないが、ギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウム等の有機酸アンモニウム塩を用いることが好ましい。これらのアンモニウム塩は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
アンモニウム塩としては、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機酸アンモニウムを用いることもできるが、カラムを長期に保管した場合に、アンモニウム塩の分解により無機酸が生じて、カラムのハウジングを構成するステンレスを腐食する可能性があるため注意を要する。
【００４０】
カラム封入液におけるアンモニウム塩の濃度は、３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであり、４０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。アンモニウム塩の濃度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であれば、保管中のカラム性能の劣化を抑制する効果が十分に得られる。一方、アンモニウム塩の濃度が２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であれば、液体クロマトグラフィーによる分析時に、移動相として、水と相溶する有機溶媒を通液しても、アンモニウム塩が析出することがなく、液体クロマトグラフィーの分析性能が劣化しない。
【００４１】
カラムの保管は、室温または冷蔵庫内にて行うことができる。
保管温度は０℃〜３０℃であることが好ましく、０℃〜２５℃であることがより好ましく、０℃〜１０℃であることがさらに好ましい。
保管温度が０℃以上であれば、カラム内部が凍結することがなく、カラム性能の劣化を防止することができる。一方、保管温度が３０℃以下であれば、カラム性能の劣化を抑制することができる。
【００４２】
本発明における液体クロマトグラフィー用カラムを保管している時のカラム性能の保存安定性を調べる方法としては、次のような方法が挙げられる。
保存安定性を調べる方法としては、例えば、実際に１０℃〜３０℃の室温にて、カラムを長期に保管した場合に、保管前後のカラム性能の変化により保存安定性を調べる方法、４０℃以上に設定されたオーブン内にてカラムを保管し、カラム性能の劣化を促進させる加速試験法等が挙げられる。
【００４３】
加速試験法は、高温であるほどカラム性能の劣化を促進させることができるため、短時間でカラムの保存安定性を評価できるが、安全上の観点から４０℃〜７０℃で試験することが好ましく、５０℃〜６０℃で試験することがより好ましく、６０℃で試験することがさらに好ましい。
【００４４】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法において、保管前後におけるカラム性能の変化は、例えば、移動相として、水と相溶する有機溶媒と、水との混合溶液を用いてカチオン性化合物を分析する方法により、カチオン性化合物の保持時間の保持率（％）およびカラムの理論段数の保持率（％）から求めることができる。
カチオン性化合物の保持時間の保持率（％）は、（保管後のカチオン性化合物の保持時間）／（保管前のカチオン性化合物の保持時間）×１００の計算式にて算出することができる。
カラムの理論段数の保持率（％）は、（保管後のカラムの理論段数）／（保管前のカラムの理論段数）×１００の計算式にて算出することができる。ここで、保管前後の理論段数はそれぞれ、５．５４×（（ピークの溶出時間）／（ピーク高さの５０％におけるピーク幅（半値幅）））２の計算式にて算出することができる（２００６年４月改正の日本薬局方）。
【００４５】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法において、例えば、上述の６０℃のオーブン中にてカラムを保管する加速試験法において、６日間の保管を行うことにより、２０℃にて９６日間保管した場合に相当するカラム性能の保持率（カチオン性化合物の保持時間の保持率、カラムの理論段数の保持率）を調べることができる。
カラム性能の保持率は、分析誤差（日間誤差）も考慮して６０℃、６日間の加速試験後で９０％以上であることが好ましく、９２％以上であることがより好ましく、９４％以上であることがさらに好ましい。
【００４６】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法によれば、カチオン交換基導入型の充填剤が充填され、移動相として水と相溶する有機溶媒を用いる液体クロマトグラフィー用カラムのカラム封入液として、３０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウム塩水溶液を用いることにより、保管中のカラム性能の劣化を抑制できる。従って、本発明の方法によって製造されたカラムは、長期間保管された後に、カラム内に移動相として水と相溶する有機溶媒を通液しても、分析性能に影響がない。よって、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等において、アミン類やアミノ酸、陽イオン等のカチオン性化合物をカラムの長期保管の後に分析する場合に、有効な液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
（カラムの作製）
充填剤としては、特開２００７−１９１５８１号公報に記載されている方法に準じてカルボキシル基が導入されたポリビニルアルコール樹脂（体積平均粒子径５．０μｍ）を用いた。
０．５ｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液１．２ｍＬに、上記充填剤０．３５ｇを加えた後、超音波バスにて分散処理を施し、充填剤が均一に分散した充填剤スラリーを調製した。
得られた充填剤スラリーを用いて、円筒形状であり、内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＰＥＥＫ製ハウジング（株式会社巴製作所製）に、上記のカルボキシル基が導入されたポリビニルアルコール樹脂を充填した。
すなわち、ハウジング内に、上記の充填剤スラリーを注入し、ハウジングの入口側から出口側に向かって、水を通液することにより、充填剤スラリーを２９ＭＰａ（定圧）にて２０分加圧し、ハウジング内にカルボキシル基が導入されたポリビニルアルコール樹脂からなる充填層を形成し、実施例１〜実施例３および比較例１〜比較例３のそれぞれで用いる液体クロマトグラフィー用カラムを５本ずつ作製した。
【００４９】
（カラムの評価）
高速液体クロマトグラフ分析装置として高速液体クロマトグラフィーＮｅｘｅｒａ−ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）を用い、検出器として紫外検出器（波長：２８０ｎｍ）を用いてカラムを評価した。
移動相として、２５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液とアセトニトリルを質量比で５０：５０の割合で混合した混合溶液を用いた。
カラムの温度を４０℃として、カラム内に、上記の移動相を、流量０．１ｍＬ／ｍｉｎで２０分間通液し、カラム内を移動相で置換した。
次に、カラムの温度を４０℃、カラム内における移動相の流量を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、１０００ｍｇ／Ｌのアドレナリン２μＬを注入して、アドレナリンの保持時間とカラムの理論段数を調べた。
カラムの理論段数は、５．５４×（（ピークの溶出時間）／（ピーク高さの５０％におけるピーク幅（半値幅）））２の計算式にて算出することができる（２００６年４月改正の日本薬局方）。
【００５０】
（加速試験方法）
カラムの評価が終了したカラム内に、実施例１〜実施例３および比較例１〜比較例３で用いるカラム封入液を、流量０．１ｍＬ／ｍｉｎで２０分間通液し、カラム内をカラム封入液で置換した。
カラム封入液で置換した後のカラムの両端に栓をして封止し、その封止したカラムを、液体クロマトグラフ分析装置用カラムオーブンＣＴＯ−２０Ａ（商品名、株式会社島津製作所製）内に配置して、６０℃で保管した。
保管開始から３日後と保管開始から６日後に、オーブンからカラムを取り出し、カラムの温度を４０℃として、カラム内に、２５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液とアセトニトリルを質量比で５０：５０の割合で混合した混合溶液を、流量０．１ｍＬ／ｍｉｎで２０分間通液し、カラム内を移動相で置換した。
その後、カラムの温度を４０℃、カラム内における移動相の流量を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、１０００ｍｇ／Ｌのアドレナリン２μＬを注入して、アドレナリンの保持時間とカラムの理論段数を調べた。
この加速試験により、カラム性能の保存安定性を評価した。
【００５１】
（実施例１）
カラムを保管する時のカラム封入液として、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム水溶液を用いて、加速試験を行った。
加速試験前、加速試験開始から３日後および加速試験開始から６日後において、アドレナリンの保持時間（ｍｉｎ）、カラムの理論段数、アドレナリンの保持時間の保持率（％）およびカラムの理論段数の保持率（％）を調べた。
アドレナリンの保持時間の保持率（％）は、（加速試験開始から３日後または６日後のアドレナリンの保持時間）／（加速試験前のアドレナリンの保持時間）×１００の計算式にて算出した。
カラムの理論段数の保持率（％）は、（加速試験開始から３日後または６日後のカラムの理論段数）／（加速試験前のカラムの理論段数）×１００の計算式にて算出した。
加速試験では、５本のカラムについて、アドレナリンの保持時間（ｍｉｎ）、カラムの理論段数、保持時間の保持率（％）およびカラムの理論段数の保持率（％）を調べ、それぞれの平均値を算出した。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
2018009947.tif 000002
【００５３】
表１の結果から、加速試験開始から３日後では、アドレナリンの保持時間およびカラムの理論段数はほとんど変化しなかった。また、加速試験開始から６日後でも、アドレナリンの保持時間の保持率およびカラムの理論段数の保持率は９４％以上であり、カラム性能の劣化の経時変化を抑制できていることが確認された。
図１に、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムを示す。
【００５４】
（実施例２）
カラムを保管する時のカラム封入液として、１００ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液を用いて、加速試験を行った。
実施例１と同様にして、加速試験前、加速試験開始から３日後および加速試験開始から６日後において、アドレナリンの保持時間（ｍｉｎ）、カラムの理論段数、アドレナリンの保持時間の保持率（％）およびカラムの理論段数の保持率（％）を調べた。結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
2018009947.tif 000003
【００５６】
表２の結果から、加速試験開始から３日後では、アドレナリンの保持時間およびカラムの理論段数はほとんど変化しなかった。また、加速試験開始から６日後でも、アドレナリンの保持時間の保持率およびカラムの理論段数の保持率は９４％以上であり、カラム性能の劣化を抑制できていることが確認された。
図２に、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムを示す。
【００５７】
（実施例３）
カラムを保管する時のカラム封入液として、５０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液を用いて、加速試験を行った。
実施例１と同様にして、加速試験前、加速試験開始から３日後および加速試験開始から６日後において、アドレナリンの保持時間（ｍｉｎ）、カラムの理論段数、アドレナリンの保持時間の保持率（％）およびカラムの理論段数の保持率（％）を調べた。結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
表３の結果から、加速試験開始から３日後にアドレナリンの保持時間が僅かに低下し、加速試験開始から６日後にアドレナリンの保持時間の保持率が９３．３％であり、９０％以上を維持していた。すなわち、実施例３は、実施例１よりもカラム性能の劣化が僅かに大きいことが確認された。また、加速試験開始から６日後では、カラムの理論段数の保持率は９４％以上であった。
図３に、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムを示す。
【００６０】
（比較例１）
カラムを保管する時のカラム封入液として、２５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液を用いて、加速試験を行った。
実施例１と同様にして、加速試験前、加速試験開始から３日後および加速試験開始から６日後において、アドレナリンの保持時間（ｍｉｎ）、カラムの理論段数、アドレナリンの保持時間の保持率（％）およびカラムの理論段数の保持率（％）を調べた。結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
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【００６２】
表４の結果から、加速試験開始から３日後にアドレナリンの保持時間が低下し、加速試験開始から６日後にアドレナリンの保持時間の保持率は９０％以下に低下していた。すなわち、比較例１は、実施例１〜実施例３と比べて、カラム性能の劣化の経時変化が大きいことが確認された。
図４に、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムを示す。
【００６３】
（比較例２）
カラムを保管する時のカラム封入液として水を用いて、加速試験を行った。
実施例１と同様にして、加速試験前、加速試験開始から３日後および加速試験開始から６日後において、アドレナリンの保持時間（ｍｉｎ）、カラムの理論段数、アドレナリンの保持時間の保持率（％）およびカラムの理論段数の保持率（％）を調べた。結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】
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【００６５】
表５の結果から、加速試験開始から３日後にアドレナリンの保持時間が低下し、加速試験開始から６日後に保持時間の保持率は９０％以下に低下していた。すなわち、比較例１は、実施例１〜実施例３と比べて、カラム性能の劣化の経時変化が大きいことが確認された。
図５に、加速試験前と加速試験開始から６日後におけるアドレナリンのクロマトグラムを示す。
【００６６】
（比較例３）
カラムを保管する時のカラム封入液として、５０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム水溶液を用いて、加速試験を行った。
比較例３では、カラム内をカラム封入液で置換する前に、カラム内に純水を流量０．１ｍｌ／ｍｉｎで２０分間通液し、カラム内を純水で置換した。その後、カラム内にカラム封入液を流量０．１ｍｌ／ｍｉｎで２０分間通液し、カラム内をカラム封入液で置換した。
また、保管開始から３日後に、オーブンからカラムを取り出した時も、カラム内を移動相で置換する前に、カラム内に純水を流量０．１ｍｌ／ｍｉｎで２０分間通液し、カラム内を純水で置換した。その後、２５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液とアセトニトリルを質量比で５０：５０の割合で混合した混合溶液を、流量０．１ｍＬ／ｍｉｎでベースラインが安定化するまで通液し、カラム内を移動相で置換した。
実施例１と同様にして、加速試験前および加速試験開始から３日後において、アドレナリンの保持時間（ｍｉｎ）、カラムの理論段数、アドレナリンの保持時間の保持率（％）およびカラムの理論段数の保持率（％）を調べた。結果を表６に示す。
また、図６に、加速試験前と加速試験開始から３日後におけるアドレナリンのクロマトグラムを示す。
【００６７】
【表６】
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【００６８】
表６の結果から、加速試験開始から３日後にアドレナリンの保持時間の保持率が９２％であった。また、２５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液とアセトニトリルの混合溶液の通液開始からベースラインが安定化するまでに２時間を要した。また、加速試験開始から３日後のカラムの評価では、クロマトグラムにおけるアドレナリンのピーク形状が異常であった上に、５．１分にもゴーストピークが観測された。これらのクロマトグラムにおける異常はいずれも、カラム内にナトリウム塩が残存していることが影響していると考えられる。すなわち、カラム封入液として、硫酸ナトリウム水溶液を用いることは、有機溶媒を含む移動相を用いる分析には不適であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、カチオン交換基導入型の充填剤が充填され、移動相として水と相溶する有機溶媒を含む液体を用いる液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法であり、長期間保管しても、保管中にカラム性能が劣化することを抑制することに寄与するものである。カラム性能の低下の抑制は、液体クロマトグラフィーの分析性能の低下の抑制に寄与する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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