(57)【要約】【課題】充分な機械的強度を有するゲルを形成することが可能な変性多糖を提供する。【解決手段】式（１）で表される基を有する変性多糖。2018123241.tif 000008［式（１）中、ｎは、２以上の整数であり；Ｒ1は、エステル結合またはアミド結合であり；Ｒ2は、（ｎ＋１）価の有機基であり；Ｒ3〜Ｒ7は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、アルコキシ基、または置換基を有してもよいアルキル基であり、ただしＲ3〜Ｒ7のうち１つまたは２つのみが水酸基である。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表される基を有する変性多糖。
【化１】
2018123241.tif 000007
［式（１）中、ｎは、２以上の整数であり；Ｒ1は、エステル結合またはアミド結合であり；Ｒ2は、（ｎ＋１）価の有機基であり；Ｒ3〜Ｒ7は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、アルコキシ基、または置換基を有してもよいアルキル基であり、ただしＲ3〜Ｒ7のうち１つまたは２つのみが水酸基である。］
【請求項２】
Ｒ3〜Ｒ7のうち１つのみが水酸基である請求項１に記載の変性多糖。
【請求項３】
Ｒ2がペプチド結合を有する有機基である請求項１または２に記載の変性多糖。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変性多糖と、
酵素と、
水と
を含有する組成物。
【請求項５】
過酸化物をさらに含有する請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記変性多糖以外の多糖をさらに含有する請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変性多糖に含まれる式（１）中の前記-Ph(R3)(R4)(R5)(R6)(R7)で表される基（Phはベンゼン環を示す）の酸化カップリングによる架橋構造を有するゲル。
【請求項８】
水分を５０〜９９．９質量％含有するハイドロゲルである請求項７に記載のゲル。
【請求項９】
請求項７または８に記載のゲルを５０質量％以上含有する成形体。
【請求項１０】
請求項９に記載の成形体を有する医療用器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性多糖およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨および骨等の生体組織の一部が損なわれた場合、その損なわれた箇所にハイドロゲルを用いた人工の医療用器具への置き換えが行われている。このようなハイドロゲルとしては、以下の高分子ネットワーク（ゲル）が知られている。すなわち、西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素および過酸化水素を触媒として用い、多糖にヒドロキシフェニル基が導入された変性多糖をヒドロキシフェニル基において酸化カップリングさせることで形成される高分子ネットワーク（ゲル）である（特許文献１〜４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第８２８７９０６号公報
【特許文献２】米国特許第６９８２２９８号公報
【特許文献３】米国公開特許第２０１２／３０１４４１号公報
【特許文献４】米国特許第９１３２２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らの検討によれば、従来の変性多糖の酸化カップリングから得られるゲルは機械的強度が充分でない。本発明の課題は、充分な機械的強度を有するゲルを形成することが可能な変性多糖を提供することにあり、また、前記変性多糖を含有する組成物、前記変性多糖から得られるゲル、前記ゲルから形成される成形体、および前記成形体を有する医療用器具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ゲルの機械的強度を上げるには、例えば、モノフェノール化合物を用いた多糖への導入率（The degree of substitution（ＤＳ）、置換度）を大きくする方法が考えられるが、モノフェノール化合物を用いた多糖への導入では置換度を向上させることは困難であり、置換度を向上させることにも限界がある。
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、以下の構成を有する変性多糖が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、例えば以下の［１］〜［１０］に関する。
【０００７】
［１］式（１）で表される基を有する変性多糖。
【０００８】
【化１】
2018123241.tif 000002
［式（１）中、ｎは、２以上の整数であり；Ｒ1は、エステル結合またはアミド結合であり；Ｒ2は、（ｎ＋１）価の有機基であり；Ｒ3〜Ｒ7は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、アルコキシ基、または置換基を有してもよいアルキル基であり、ただしＲ3〜Ｒ7のうち１つまたは２つのみが水酸基である。］
【０００９】
［２］Ｒ3〜Ｒ7のうち１つのみが水酸基である前記［１］に記載の変性多糖。
［３］Ｒ2がペプチド結合を有する有機基である前記［１］または［２］に記載の変性多糖。
［４］前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の変性多糖と、酵素と、水とを含有する組成物。
［５］過酸化物をさらに含有する前記［４］に記載の組成物。
［６］前記変性多糖以外の多糖をさらに含有する前記［４］または［５］に記載の組成物。
［７］前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の変性多糖に含まれる式（１）中の前記-Ph(R3)(R4)(R5)(R6)(R7)で表される基（Phはベンゼン環を示す）の酸化カップリングによる架橋構造を有するゲル。
［８］水分を５０〜９９．９質量％含有するハイドロゲルである前記［７］に記載のゲル。
［９］前記［７］または［８］に記載のゲルを５０質量％以上含有する成形体。
［１０］前記［９］に記載の成形体を有する医療用器具。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、充分な機械的強度を有するゲルを形成することが可能な変性多糖を提供することができ、また、前記変性多糖を含有する組成物、前記変性多糖から得られるゲル、前記ゲルから形成される成形体、および前記成形体を有する医療用器具を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
［変性多糖］
本発明の変性多糖は、式（１）で表される基を有する。
【００１２】
【化２】
2018123241.tif 000003
式（１）中の各記号について以下に説明する。
【００１３】
ｎは、２以上の整数であり、好ましくは２〜５、より好ましくは２〜３の整数である。
Ｒ1は、エステル結合またはアミド結合である。アミド結合は、例えば−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−で表され、Ｒは、例えば、水素原子、または炭素数１〜６のアルキル基等の炭化水素基である。
【００１４】
Ｒ2は、（ｎ＋１）価の有機基である。Ｒ2は、ペプチド結合を有する有機基であることが好ましい。ペプチド結合を有する有機基は、例えば、ジペプチド等のオリゴペプチドまたはそのエステル体において、-Ph(R3)(R4)(R5)(R6)(R7)で表される基（Phはベンゼン環を示す）と、−ＮＨ2、または−ＣＯＯＨもしくはそのエステルとを除外してなる基が挙げられる。
【００１５】
オリゴペプチドを構成するアミノ酸としては、-Ph(R3)(R4)(R5)(R6)(R7)で表される基を有するアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、ｏ−チロシン、ｍ−チロシン、チロシン、２−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン、および３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニン等のα−アミノ酸が挙げられる。オリゴペプチドを構成するアミノ酸数は、２以上であり、好ましくは２〜５、より好ましくは２〜３である。また、オリゴペプチドを構成するアミノ酸として、-Ph(R3)(R4)(R5)(R6)(R7)で表される基を有するアミノ酸が２以上あれば、-Ph(R3)(R4)(R5)(R6)(R7)で表される基を有さないアミノ酸が含まれていてもよい。
【００１６】
Ｒ3〜Ｒ7は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、アルコキシ基、または置換基を有してもよいアルキル基であり、ただしＲ3〜Ｒ7のうち１つまたは２つのみが水酸基であり、すなわち式（１）中に現れるベンゼン環に結合する水酸基数は１〜２である。Ｒ3〜Ｒ7のうち２つが水酸基である場合、２つの水酸基はオルト位の位置関係にあることが好ましい。Ｒ3〜Ｒ7のうち３つ以上が水酸基であると、後述するゲル化において酸化カップリングよりも酸化によるキノン化が優位に進み、機械的強度に優れたゲルが得られないと考えられる。このような観点から、Ｒ3〜Ｒ7のうち１つのみが水酸基であることが好ましく、Ｒ5が水酸基であることがより好ましい。水酸基に対して少なくとも１つのオルト位置の炭素原子には水素原子が結合していることが好ましい。
【００１７】
アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基が挙げられる。
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等の炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。アルキル基における１以上の水素原子は置換されていてもよく、置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子、フェニル基、アセトキシ基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基が挙げられる。
【００１８】
Ｒ3〜Ｒ7のうち水酸基以外の残りの基は、水素原子または炭素数１〜６のアルコキシ基であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。
＊は、Ｒ1がエステル結合である場合は、多糖に含まれうる水酸基またはカルボキシル基が結合していた炭素原子との結合手であることが好ましく、Ｒ1がアミド結合である場合は、多糖に含まれうるカルボキシル基が結合していた炭素原子との結合手であることが好ましい。前記カルボキシル基は、ナトリウムイオン等のアルカリ金属イオンなどの任意の陽イオンによる塩であってもよい。
【００１９】
本発明の変性多糖を構成する多糖としては、例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、セルロース、グアーガム、プルラン、デキストラン、フルクタン、マンナン、カラギーナン、キチン、キトサン、ペクチン、デンプン、グリコーゲン、デキストリン、ゲランガム、およびこれらの誘導体が挙げられる。誘導体としては、各種変性物が挙げられ、変性される箇所および変性基は本発明の作用効果を大きく損なうものでなければ特に制限はない。例えば、前記例示の多糖のアルカリ金属塩や、前記例示の多糖がメチル基、エチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシエチルメチル基、ヒドロキシプロピルメチル基、アセチル基、ステアロキシ基、グリセロール、プロピレングリコールなどの置換基を有する誘導体が挙げられる。誘導体は、前記置換基を単独で又は複数の組合せで有してもよい。
【００２０】
置換基を有する多糖としては、具体的には、アセチル化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアロキシヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルグアーガム、エチルグアーガム、ヒドロキシエチルグアーガム、ヒドロキシプロピルグアーガム、ヒドロキシエチルメチルグアーガム、ヒドロキシプロピルメチルグアーガムが挙げられる。
【００２１】
多糖は、カルボキシル基またはその任意の陽イオン（例：ナトリウムイオン等のアルカリ金属イオン）による塩を有する多糖であることが好ましく、例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、ペクチン、ゲランガム、およびこれらに含まれるカルボキシル基において任意の陽イオンによる塩を有する多糖、例えばヒアルロン酸ナトリウムが挙げられる。
【００２２】
本発明の変性多糖は、多糖中の水酸基および／またはカルボキシル基（多糖がカルボキシル基を有する場合）が式（１）で表される基に変性されている。本発明の変性多糖では、式（１）で表される基が、Ｒ1がエステル結合である場合は、多糖に含まれうる水酸基またはカルボキシル基が結合していた炭素原子と結合していることが好ましく、Ｒ1がアミド結合である場合は、多糖に含まれうるカルボキシル基が結合していた炭素原子と結合していることが好ましい。前記カルボキシル基は、ナトリウムイオン等のアルカリ金属イオンなどの任意の陽イオンによる塩であってもよい。
【００２３】
式（１）で表される基には、モノ又はジヒドロキシフェニル基が複数含まれることから、モノフェノール化合物による多糖の変性に比べて、実質的に多糖のフェノール性水酸基の導入量が向上しており、したがって、得られるゲルの機械的強度も向上する。
【００２４】
変性多糖の絶対分子量測定による数平均分子量は、通常は１，０００〜１０，０００，０００、好ましくは３，０００〜１，０００，０００、より好ましくは５，０００〜５００，０００である。また、変性多糖の分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、通常は１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５である。
【００２５】
変性多糖の置換度（ＤＳ）は、通常、０．１〜１０である。なお、変性多糖のＤＳは、1Ｈ ＮＭＲより求めることができ、変性多糖のＤＳとは、変性多糖の構成単糖１００単位あたりに式（１）で表される基により置換された基の平均数、すなわち導入された式（１）で表される基の平均数を示す。
【００２６】
［変性多糖の製造方法］
本発明の変性多糖は、例えば、多糖と、式（２）で表される化合物（以下「化合物（２）」ともいう）とを、必要に応じて縮合剤の存在下で、縮合させることで製造することができる。
【００２７】
【化３】
2018123241.tif 000004
式（２）中、Ｒ2〜Ｒ7およびｎは式（１）中における同一記号と同義であり、Ａはカルボキシル基、−ＣＯＸ（Ｘは塩素原子等のハロゲン原子）で表される基、アルコール性水酸基またはアミノ基である。アミノ基は、例えば−ＮＨＲで表され、Ｒは、例えば、水素原子、または炭素数１〜６のアルキル基等の炭化水素基である。
【００２８】
化合物（２）は、多糖が有する水酸基と反応可能なカルボキシル基またはその酸ハロゲン化物を有するか、または多糖がカルボキシル基もしくはその任意の陽イオンによる塩を有する場合、カルボキシル基もしくはその塩と反応可能なアルコール性水酸基またはアミノ基を有している。
【００２９】
化合物（２）としては、例えば、アミノ基とフェノール性水酸基とを有する化合物、カルボキシル基またはその酸ハロゲン化物とフェノール性水酸基とを有する化合物、アルコール性水酸基とフェノール性水酸基とを有する化合物が挙げられる。
【００３０】
アミノ基とフェノール性水酸基とを有する化合物としては、例えば、フェノール性水酸基を有するアミノ酸の脱水縮合物およびその酸アルコキシ化物が挙げられ、好ましくはジペプチド等のオリゴペプチドであり、オリゴペプチドにおいて、カルボキシル基はエステル化していてもよい。フェノール性水酸基を有するアミノ酸としては、例えば、ｏ−チロシン、ｍ−チロシン、チロシン、２−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン、および３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニン等のα−アミノ酸が挙げられる。
【００３１】
カルボキシル基またはその酸ハロゲン化物とフェノール性水酸基とを有する化合物としては、例えば、フェノールフタリン、およびジフェノール酸が挙げられる。
アルコール性水酸基とフェノール性水酸基とを有する化合物としては、例えば、特開２００４−３５９６００号公報、および特開２０１１−０３２２１１号公報に記載の化合物が挙げられる。
【００３２】
前記製造において、化合物（２）は、多糖１００質量部に対して、通常は１〜５００質量部、好ましくは５〜３００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部の量で用いることができる。このような範囲であれば、得られる変性多糖において架橋反応が進行しやすく、また、ゲルが硬くなり過ぎることもない。化合物（２）は単独で又は２種以上用いることができる。
【００３３】
前記製造において、縮合剤を用いてもよい。縮合剤としては、例えば、１，１’−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩が挙げられる。縮合剤と共に、触媒を用いてもよい。触媒としては、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールが挙げられる。縮合剤および触媒は、それぞれ単独で又は２種以上用いることができる。
【００３４】
また、ｐＨ緩衝剤を用いてもよい。ｐＨ緩衝剤としては、例えば、生化学用途で一般的に用いられる、両性イオン構造を持つ緩衝剤として市販されているグッド緩衝剤、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸１水和物（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）等のモルホリノアルカンスルホン酸が挙げられる。ｐＨ緩衝剤は単独で又は２種以上用いることができる。
【００３５】
前記製造は、溶媒中で行ってもよい。溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが挙げられる。また、前記反応において加温および溶媒の留去を行ってもよく、また溶媒留去後の残渣を加温して反応をさらに進めてもよい。
【００３６】
前記製造は、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。前記縮合反応の反応温度は、通常は０〜９０℃、好ましくは５〜４０℃であり、反応時間は、通常は１〜１５０時間、好ましくは２０〜１００時間である。
【００３７】
［ゲル］
本発明のゲルは、上述した変性多糖に含まれる式（１）中の前記-Ph(R3)(R4)(R5)(R6)(R7)で表される基（Phはベンゼン環を示す）の酸化カップリングによる架橋構造を有し、すなわち前記変性多糖の架橋体を含有する。酸化カップリングの詳細は、後述する。
【００３８】
一実施態様において、前記ゲルは、水分を通常は５０〜９９．９質量％、好ましくは７０〜９５質量％含有するハイドロゲルである。前記ハイドロゲルは、前記変性多糖の架橋体を通常は５０〜０．１質量％、好ましくは３０〜５質量％含有する。前記ハイドロゲルは、機械的強度および柔軟性に優れる。
【００３９】
本発明のハイドロゲルは、１，０００ＧＰａ以上の貯蔵弾性率を有することが好ましく、前記貯蔵弾性率は、より好ましくは１，０００〜３，０００ＧＰａ、さらに好ましくは１，２００〜２，５００ＧＰａである。
【００４０】
本発明のハイドロゲルは、後述するように変性多糖と酵素とを水中で混合して、変性多糖を架橋することにより得ることができる。また、前記ハイドロゲルを適宜乾燥するなどして水分を除去することにより、キセロゲルを得ることができる。あるいは、本発明のゲルは、例えば、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１５）２６２４−２６３０に記載のように、変性多糖とともにエオシンＹ、メチレンブルー、ローズベンガル等の光増感剤を用い、光照射を行うことでゲル化させて得ることもできる。
【００４１】
ゲルおよびハイドロゲルの製造方法の詳細は後述する。
本発明のゲルおよびハイドロゲルは、例えば、軟骨および骨等の生体組織の一部が損なわれた場合の、人工軟骨および人口骨等として好適に用いることができる。
【００４２】
［変性多糖を含有する組成物］
本発明の組成物は、上述した変性多糖と、酵素と、水とを含有し、好ましくはさらに過酸化物を含有する。前記組成物の一実施態様は、変性多糖を含み、過酸化物および酵素のいずれかを含むが両方は含まない第１の溶液と、前述の過酸化物および酵素のうち第１の溶液中で含まれない方を含む第２の溶液とを有する。
【００４３】
本発明の組成物は、変性多糖を含有する。前記組成物において、変性多糖の含有量は、通常は０．０１〜５０質量％、好ましくは０．１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％である。変性多糖は単独で又は２種以上用いることができる。
【００４４】
本発明の組成物は、好ましくは過酸化物を含有する。過酸化物としては、例えば、過酸化水素が挙げられる。前記組成物において、過酸化物の量は、変性多糖中のフェノール性水酸基１モルに対して、通常は０．０１〜１０００モル、好ましくは０．１〜５００モル、より好ましくは０．５〜２００モルである。
【００４５】
本発明の組成物は、酵素を含有する。酵素としては、例えば、ラッカーゼ、チロシナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼが挙げられる。ラッカーゼおよびチロシナーゼは、ゲルの構成要素とならない他の薬品を一切加える必要がないので、ゲル化の際に機能発現物質が変性するおそれが全くない点で優れる。ペルオキシダーゼは、過酸化水素等の過酸化物と併用することで瞬時にゲル化させることができる。ラッカーゼ、チロシナーゼ（フェノールオキシダーゼ）等の銅酵素類の起源は、例えばウルシ、キノコ（ツチカブリ、マッシュルーム）、カビ（Polyporus vericolor）が挙げられる。カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等のヒドロペルオキシダーゼ類の起源は、例えば、ウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、M. lysodeikticus、西洋ワサビ（ホースラディッシュ）、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Caldariomyces fumago、Steptococcus faecalisが挙げられる。これらの中でも、チロシナーゼとしてはマッシュルーム由来、ペルオキシダーゼとしては西洋ワサビ由来のものが好ましい。酵素としては、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼが好ましく、ペルオキシダーゼがより好ましい。
酵素は単独で又は２種以上用いることができる。
【００４６】
本発明の組成物において、酵素の量は、変性多糖中のフェノール性水酸基１モルに対して、通常は０．０１〜１００００ユニット、好ましくは０．１〜２０００ユニット、より好ましくは１〜１０００ユニットである。なお、ユニットとは酵素活性の単位を示し、毎分１マイクロモルの基質を変化させることができる酵素量を示す。
【００４７】
本発明の組成物は、水を含有する。また、本発明の組成物は、さらに塩化ナトリウムを含有してもよい。このように本発明の組成物は、生理食塩水のような塩化ナトリウム水溶液を含有してもよい。
【００４８】
本発明の組成物は、前記変性多糖以外の多糖をさらに含有してもよい。この多糖としては、例えば、［変性多糖］の欄に記載した多糖が挙げられる。多糖は単独で又は２種以上用いることができる。
【００４９】
本発明の組成物は、例えば、変形性関節症の治療に用いられる関節腔内の潤滑剤として用いることができる。
本発明の組成物は、ゲルの用途に応じた機能発現物質を含有してもよい。これにより、得られるゲル中に機能発現物質を含ませることができる。機能発現物質としては、例えば、薬剤、細胞が挙げられる。機能発現物質を含有するゲルは、医学用器具等の幅広い分野で用いることができる。
【００５０】
本発明の組成物を用いることにより、ゲルおよびハイドロゲルを形成することができる。例えば、一実施態様において、変性多糖と過酸化水素等の過酸化物と酵素とを水中で混合して、変性多糖を架橋して、ハイドロゲルを形成する。ここでは、変性多糖中のヒドロキシフェニル基が酸化され、前記基同士の架橋またはカップリングが起こり、ゲル化が進行すると考えられる。例えば、変性多糖のヒドロキシフェニル基を酵素の存在下で過酸化物と反応させると、フェノール性水酸基において水素原子が引き抜かれてフリーラジカル種となり、これが異性化してオルト位置の炭素上に不対電子が存在するフリーラジカル種となり、次に２つのフリーラジカル種が結合して、続いてエノール化することにより、架橋構造が形成されるものと考えられる。
【００５１】
本発明のハイドロゲルの製造方法の一態様は、例えば、変性多糖と、酵素と、必要な場合は過酸化物とを水中で混合して、変性多糖を架橋させて、ハイドロゲルを製造する。変性多糖、酵素および過酸化物は、それぞれの水溶液として用いてもよい。
【００５２】
本発明のハイドロゲルの製造方法の別の一態様は、例えば、（１）変性多糖を含み、過酸化物および酵素のいずれかを含むが両方は含まない第１の溶液を用意し、（２）前述の過酸化物および酵素のうち第１の溶液に含まれない方を含む第２の溶液を用意し、（３）第１の溶液と第２の溶液とを混合して変性多糖を架橋させて、ハイドロゲルを製造する。具体的には、変性多糖、酵素および水を含む第１の溶液と、過酸化物および水を含む第２の溶液とを混合して、変性多糖を架橋させる。ここで、例えば、所望の形状のキャビティーを有する金型を用意し、第１の溶液と第２の溶液とを前記キャビティー中で混合して反応させることにより、前記形状を有するハイドロゲルを形成することができる。
ハイドロゲル形成時の水溶液温度は、通常は０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間は、通常は０．１〜３６００秒、好ましくは１〜６００秒である。
【００５３】
［成形体および医療用器具］
本発明の成形体は、上述した変性多糖のゲルを含有する。例えば、本発明のゲルが、所望の形状に成形された成形体である。前記成形体において、ゲルの量は、通常は５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、さらに好ましくは７０質量％以上である。
【００５４】
本発明の医療用器具は、前記成形体を有する。前記医療用器具は、機械的強度および柔軟性に優れる前記成形体を有することから、医療用器具の中でも特にインプラント材料に好適に用いることができる。インプラント材料としては、例えば、軟骨および骨等の生体組織の一部が損なわれた場合に用いられるインプラント材料が挙げられる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。以下の実施例等の記載において、特に言及しない限り、「部」は「質量部」を示す。
【００５６】
［合成例１］ジペプチド（ａ）の合成
下記式に示す合成経路に従い、ジペプチド（ａ）を合成した。
【００５７】
【化４】
2018123241.tif 000005
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシン１０ｇ、Ｌ−チロシンメチルエステル６．９ｇ、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）５．８ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１８０ｍｌに溶解し、氷冷下１時間撹拌中に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）８．２ｇを加えた。その後、室温で２４時間撹拌し、１Ｍの塩酸水溶液を加えて中和した。中和後の溶液を、酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で酢酸エチル溶液を洗浄した。その後、１２Ｍの塩酸を加え、濃縮し、ジペプチド（ａ）を合成した。
【００５８】
［実施例１］変性多糖（Ａ）の合成
ヒアルロン酸ナトリウム（キューピー株式会社製、製品名「ＨＡ−ＬＦ−５Ａ」）６．５５ｇを０．１ＭのＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸１水和物）水溶液１７０ｍｌに加え、さらに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１．５５ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．９４ｇを加え、均一な溶液（溶液１）を調製した。
【００５９】
合成例１で合成したジペプチド（ａ）６．４５ｇを０．１ＭのＭＥＳ水溶液１７０ｍｌに加え、この溶液を、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和した後、前記溶液１に加え、２３℃で３日間攪拌した。
【００６０】
攪拌後の溶液を濾過し、三日間、透析を行った（一日目は硫酸アンモニウム塩水溶液にて、二日目および三日目は純水にて実施）。透析後の溶液を１１質量％まで濃縮し、ヒアルロン酸をジペプチド（ａ）で変性した変性多糖（Ａ）の水溶液を得た。
【００６１】
得られた変性多糖（Ａ）を1Ｈ ＮＭＲにて分析した。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）： σ１．８８(s、 methyl protons)、２．４−２．８(ｍ、 polysaccharide ring protons)、３．２−４．１ (ｍ、 polysaccharidering protons)、４．２−４．６ (ｄ、１Ｈ、 polysaccharide ring protons)、６．７１  ａｎｄ  ６．９７ (ｄ、aromatic protons)．
また、得られた変性多糖（Ａ）のＤＳは２．６であった。
【００６２】
［実施例２］ハイドロゲル（Ａ）の合成およびその性能評価
実施例１で合成した変性多糖（Ａ）の水溶液（１１．２質量％の水溶液）２０００μｌ、過酸化水素水（２００ｍＭの水溶液）３２０μｌ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ水溶液（０．４質量％の水溶液）８０μｌを２３℃で６０秒間攪拌して、ハイドロゲル（Ａ）を得た。ハイドロゲル（Ａ）中に含まれる水分の含有割合は９０．９質量％であった。
【００６３】
得られたハイドロゲル（Ａ）の貯蔵弾性率を、直径２５ｍｍおよびパレルプレートジオメトリーを使用して、レオメーター（装置名「ＭＣＲ３０２」、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ社製）にて測定した。測定は１％の一定変形および１Ｈｚの周波数で、動的振動モードにおいて、２９６Ｋで行った。貯蔵弾性率はプラトーに達した時点で測定を終了し、最大値を貯蔵弾性率として算出した。結果を下記表１に示す。
【００６４】
［比較例１］変性多糖（Ｂ）の合成
ヒアルロン酸ナトリウム（キューピー株式会社製、製品名「ＨＡ−ＬＦ−５Ａ」）６．５５ｇを０．１ＭのＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸１水和物）水溶液１７０ｍｌに加え、さらに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１．５５ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．９４ｇを加え、均一な溶液（溶液２）を調製した。
【００６５】
Ｌ−チロシンメチルエステル６．９ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１７０ｍｌに加え、この溶液を、前記溶液２に加え、２３℃で３日間攪拌した。
攪拌後の溶液を濾過し、三日間、透析を行った（一日目は硫酸アンモニウム塩水溶液にて、二日目および三日目は純水にて実施）。透析後の溶液を１１質量％まで濃縮し、ヒアルロン酸をＬ−チロシンメチルエステルで変性した変性多糖（Ｂ）の水溶液を得た。
【００６６】
得られた変性多糖（１Ｂ）を1Ｈ ＮＭＲにて分析した。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：σ１．８８(s、 methyl protons)、２．４−２．８(ｍ、 polysaccharide ring protons)、３．２−４．１ (ｍ、 polysaccharidering protons)、４．２−４．６ (ｄ、１Ｈ、 polysaccharide ring protons)、６．７６  ａｎｄ  ７．０５ (ｄ、aromatic protons)．
また、得られた変性多糖（Ａ）のＤＳは３．２であった。
【００６７】
［比較例２］ハイドロゲル（Ｂ）の合成およびその性能評価
比較例１で合成した変性多糖（Ｂ）の水溶液（１１．２質量％の水溶液）２０００μｌ、過酸化水素水（２００ｍＭの水溶液）３２０μｌ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ水溶液（０．４質量％の水溶液）５０μｌを２３℃で６０秒間攪拌して、ハイドロゲル（Ｂ）を得た。ハイドロゲル（Ｂ）中に含まれる水分の含有割合は９０．９質量％であった。
【００６８】
得られたハイドロゲル（Ｂ）の貯蔵弾性率を、実施例２と同様にレオメーターにて測定した。結果を下記表１に示す。
【００６９】
【表１】
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