(57)【要約】【課題】新たな外毛根鞘細胞増殖促進用組成物及び育毛用組成物を提供することを課題とする。【解決手段】ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物。
【請求項２】
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する組成物がシソ科タツナミソウ属タツナミソウ（Scutellaria indica L.）の抽出物である請求項１に記載の外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物を含有する育毛用組成物。
【請求項４】
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する毛乳頭細胞スフェロイド形成促進用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育毛用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
男性型脱毛症は、男性ホルモンと深くかかわり、遺伝と環境因子により誘発され、男性の半数以上に何らかの症状がみられるといわれている。特に近年のストレス社会や生活形態の乱れからこれらの症状が加速している。女性における美顔、美白、痩身を目的としたエステが流行しているのに対し、男性においては多くのヘアケアーを行う施設があり、育毛などを目的に営業を行っている。一般男性の頭髪に対する関心は増加しており、毛髪を確実に再生する薬剤や方法の出現が期待されている。
【０００３】
脱毛症に対する治療法は、有効成分を含む育毛剤・発毛剤による外用療法や、内服治療及び物理的な刺激等による残存毛包刺激によって毛の再生を促すものと、人工物若しくは本人の他部位の毛髪を毛包ごと移植する、所謂植毛術が主流であった。植毛の研究から、毛髪再生機構が徐々に明らかになってきている。
毛髪を作り出す組織である毛包は、真皮集塊と呼ばれる特殊な間充織と表皮との相互作用によって胎児期の一時期に形成される。真皮集塊を構成する細胞は毛包形成が完了すると毛乳頭となる。毛乳頭は毛髪の伸長・休止の周期である毛周期の進行にも深く関与している。細胞移植により毛包を形成誘導するには、この表皮−毛乳頭（間充織）相互作用を生体内で行わなければならないことが知られている。
そこで、皮膚内に表皮・毛乳頭混合細胞を移植することにより、ヒト毛乳頭細胞が表皮細胞を毛包に分化させ、この毛包から発毛させる方法が提案されている（特許文献１）。また特許文献２には、毛包真皮毛根鞘細胞を、機能を維持した状態で増殖させ、これを移植して発毛させる技術が記載されている。これらによれば、真皮毛根鞘細胞が発毛に大きく貢献することが、十分に理解される。
【０００４】
このような毛髪移植や毛根鞘細胞の研究から、毛根鞘細胞に働きかける成分を配合した発毛剤の研究が行われ、多くの発毛剤や育毛剤の提案がなされている。
特許文献３にはタウリンを有効成分とする、外毛根鞘細胞活性剤及び毛髪はり・こし改善剤が記載されている。特許文献４には、没食子酸誘導体を有効成分とする養育毛組成物が記載されている。この組成物は、外毛根鞘細胞を活性化するほか、発毛、育毛、脱毛防止、育毛促進、白髪改善、毛周期改善、毛髪成長期延長、毛包エネルギー代謝改善、矮小化毛包改善、細毛の太毛化、毛母細胞賦活、毛母細胞増殖促進、肝細胞増殖因子発現促進などの様々な作用効果を有している。特許文献５には、ミツイシコンブのエキスを有効成分とする外毛根鞘細胞増殖促進剤及び毛周期改善剤や育毛剤が記載されている。特許文献６には、杜仲、モウズイカ、霊芝胞子および黒酵母の抽出物を有効成分とする外毛根鞘細胞増殖促進剤並びにテストステロン−５α−レダクターゼ阻害剤が記載されている。特許文献７には、外毛根鞘細胞増殖促進作用を有している脱毛症に対して有効な育毛剤が記載されている。
このように外毛根鞘細胞増殖促進作用や外毛根鞘細胞活性化作用を有する物質は育毛剤としての有用性があると考えられている。
上記特許文献３〜７に記載の物質や組成物以外にも多数の物質に外毛根鞘細胞増殖促進作用や外毛根鞘細胞活性化作用があることが知られている。
また、毛包の毛球中にある毛母細胞は、毛成長の基本となる。そして近年毛母細胞を培養して、毛乳頭細胞にスフェロイドを形成させ、このスフェロイドを移植して、毛根を再生して発毛させる方法が提案されている（特許文献８、９）。また、本出願人は、プロシアニジンまたはプロシアニジンを含む植物抽出エキスに育毛効果を見いだして特許出願している（特許文献１０）。
【０００５】
本発明を得た天然化合物ライブラリーは、フランスGreenpharma社のGreenpharma Natural Compound Library（Greenpharma S.A.S）として販売されている。
本発明者は、上記の天然化合物ライブラリーから外毛根鞘細胞増殖促進作用や外毛根鞘細胞活性作用を有する物質の探索を行い、有用な物質を見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０５３７６３号
【特許文献２】国際公開第２００７／０３７４８６号
【特許文献３】特開２００２−９７１１６号公報
【特許文献４】特開２００３−３２１３３０号公報
【特許文献５】特開２００６−０２８１１８号公報
【特許文献６】特開２００７−００８８８５号公報
【特許文献７】特開２０１３−１６３６６１号公報
【特許文献８】特開平０９−１４０３７７号公報
【特許文献９】特開平１１−１８０８７８号公報
【特許文献１０】特開２００２−０３７７１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、上述のとおり、保有する天然化合物ライブラリーの中から、育毛剤として有用な化合物を探索する過程で、従来育毛剤や発毛剤として全く注目されていない化合物であるｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドに強い外毛根鞘細胞の増殖促進効果を見出し、本発明をなした。またｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは、培養した毛乳頭細胞スフェロイド形成促進作用も有していることを知見した。
すなわち本発明は、ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分とする毛乳頭細胞の外毛根鞘細胞の増殖促進剤及び育毛用組成物を提供することを課題とする。
また本発明はｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する毛乳頭細胞スフェロイド形成促進用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、次の構成からなる。
（１）ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物。
（２）ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する組成物がシソ科タツナミソウ属タツナミソウ（Scutellaria indica L.）の抽出物である（１）記載の外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物。
（３）（１）又は（２）記載の外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物を含有する育毛用組成物。
（４）ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する毛乳頭細胞スフェロイド形成促進用組成物。 
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新たな外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物が提供される。また外毛根鞘細胞が増加することによって、発毛が促進されるため育毛用組成物として使用が可能である。
さらにまた、ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは、毛乳頭細胞培養において、毛乳頭細胞からなるスフェロイドの形成を促進するため、細胞移植によって毛根を再生する場合、細胞培養の培養液に用いると効率よく、細胞移植のためや、試験研究のために毛乳頭細胞スフェロイドを形成させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドが外毛根鞘細胞の増殖促進効果を示すことを確認した試験のグラフである。
【図２】ミノキシジルが外毛根鞘細胞の増殖促進効果を示さないことを確認したグラフである。
【図３】Ｄ−パンテノールが外毛根鞘細胞の増殖促進効果を示さないことを確認した試験のグラフである。
【図４】アスチルビンの外毛根鞘細胞の増殖促進効果を確認した試験のグラフである。
【図５】ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドが培養毛乳頭細胞のスフェロイド形成を促進することを確認した試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本願は、ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物及びその利用に関する発明である。
発明の有効成分であるｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは、下記の化学式１で表されるフラボノイド化合物である。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは、シソ科タツナミソウ属タツナミソウから分離抽出されたフラボノイドである。したがってタツナミソウの乾燥物を原料として抽出、精製することができる。抽出精製する場合には、公知の溶媒抽出やクロマトグラフィーなどの方法で精製できる。また下記に示す試験例で明らかなように、ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは４μｇ／ｍｌという低濃度で外毛根鞘細胞の増殖を促進するため、植物の抽出物をそのまま、或いは濃縮物を外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物として使用することができる。なお組成物中のｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミド量は、高速液体クロマトグラフィー等を用いた公知の分析方法で測定することができる。
【００１４】
タツナミソウは、学名をScutellaria indica L.とする、シソ科タツナミソウ属の植物であり。主として日本など東アジアを原産とし、本州〜九州の丘陵の林縁や草地に広く分布する。
タツナミソウは、その全草から抽出した濾液を原料として用いてもよく、破砕物であってもよい。
抽出には、極性の溶媒を使用する。使用可能な極性溶媒として、水、Ｃ１−Ｃ４のアルコール、例えばエタノール、ブタノール、グリセロール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、が例示できる。好ましくは、１，３ブチレングリコールである。また、これらの溶媒の混合物であっても良い。特に好ましくは水と１，３ブチレングリコールの１：１の混合溶媒である。
溶媒の温度や、原料に対する溶媒の重量比率、抽出時間などの抽出方法については、原料及び使用する溶媒に応じてそれぞれを任意に設定することができる。溶媒の温度は−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、原料中に含まれる成分の安定性の点から、４〜４０℃付近が好ましい。
本発明に用いる各抽出物は、溶媒抽出後、さらに適宜精製操作を施すことも可能であり、精製操作としては、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等のクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示でき、これらを任意に選択し組み合わせた処理操作を行うことができる。
【００１５】
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは、化学合成によって調製することもできる。
【００１６】
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドあるいはタツナミソウ抽出物を、外毛根鞘細胞の増殖促進用組成物として使用するとき、水又は緩衝液で所望の濃度に希釈して用いることができる。また育毛用組成物とする場合は、０．１〜１質量％を含む組成物を直接頭部に外用剤として散布又は塗布すれば良い。
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを含有する組成物又はｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを含有する製剤は、製剤上の常套手段により調製することができる。医薬あるいは化粧料用無毒性担体としては、例えば、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等を配合して、所望の濃度に調整すれば良い。また、必要に応じて、安定化剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加し、外用剤として調製することができる。
投与回数は、１日当たり１〜３回投与することで、外用剤の投与部位で育毛効果を促進することができる。また投与部位で外毛根鞘細胞が増加し、毛髪の寿命（ライフサイクル）が延長する。
【００１７】
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは、その他公知の毛母細胞増殖促進物質と併用して育毛用組成物とすることが可能である。両者を併用することで、外毛根鞘細胞の増殖が相乗的に増加する。
【００１８】
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを毛乳頭細胞の培養系に添加すると、増殖した細胞が細胞塊を形成し、スフェロイドとなる。このスフェロイドは、毛髪再生を望む患者の皮膚に移植して発毛させることが可能である。
スフェロイド形成を促進するために、ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは、４μｇ／ｍｌ以上の濃度になるように培養系に添加する必要がある。
【実施例】
【００１９】
以下に、試験例を示して本発明を具体的に説明する。
１．試験例１（外毛根鞘細胞の増殖促進試験）
＜試験方法＞
出願人が保有する天然化合物ライブラリーで陽性と判断された化合物の、ヒト外毛根鞘細胞の増殖効果をＷＳＴ−８アッセイにより評価を行った。このアッセイ系で細胞の増加効果を確認した。
ヒト外毛根鞘細胞（ＯＲＳｃ，ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手）の増殖能を、ＷＳＴ−８アッセイ｛Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８），同仁化学研究所｝で評価した。
すなわち、１０％ＦＢＳを含むＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＭ，ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに懸濁したヒト外毛根鞘細胞（ＯＲＳｃ）を、９６穴平底型カルチャープレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）９６  Ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１００μｌ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
培養２４時間後、適切な濃度に希釈した試験化合物、ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミド（ＧｒｅｅｎＰｈａｒｍａ  Ｓ．Ａ．Ｓ）、比較対照として育毛効果が確認されているミノキシジル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｄ−パンテノール（東京化成工業）、アスチルビン（Ａｓｔｉｌｂｉｎ：ナカライテスク）それぞれを含有するＭＳＣＭに置換し、７２時間培養を行った。
その後、ＷＳＴ−８溶液１０μｌを添加してインキュベーター内で３時間発色させた後、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長６５０ｎｍ）を測定した。
ＷＳＴ−８は、細胞内脱水素酵素により還元され水溶性のホルマザンを生成するため、この吸光度の測定値は細胞数と相関する。データは平均値±標準偏差で示し、ｔ検定にて統計学的検討を行った（ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００２０】
＜試験結果＞
外毛根鞘細胞への、ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドの増殖効果を図１に示した（結果はコントロールを１００とする相対値で示した）。
また毛母細胞に増殖効果を示すミノキシジル、育毛製品の有効成分で知られるＤ−パンテノールおよびアスチルビンの効果を図２、図３、図４に示した（結果はコントロールを１００とする相対値で示した）。
図から明らかなように、ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは強い外毛根鞘細胞増殖効果を示したが、育毛効果の確認されているミノキシジル、Ｄ−パンテノールには、外毛根鞘細胞増殖促進効果が認められなかった。またアスチルビンは低濃度では、わずかな増殖促進効果が確認できたが、高濃度で抑制的に作用することがわかった。
本試験から、本発明のｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドを有効成分として含有する組成物は、外毛根鞘細胞を増加させ、育毛作用を示すことがわかった。
また公知の育毛作用を有する成分は、外毛根鞘細胞を増加させる作用を有しないことから、ミノキシジルやＤ−パンテノールと併用することで育毛の相乗効果が期待できる。
【００２１】
２．試験例２（培養毛乳頭細胞のスフェロイド形成促進試験）
＜試験方法＞
ヒト毛乳頭細胞（ＤＰＣｓ，ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手）を用いてスフェロイドを作製した。
すなわち、１０％ＦＢＳ−ＭＳＣＭで１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＤＰＣｓ懸濁液に試験化合物を添加し、９６穴３次元培養プレート（ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ（登録商標）Ｐｌａｔｅ  ＭＨパターン，ＯＲＧＡＮＯＧＥＮＩＸ）に１００μｌ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
培養約１〜３週後、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ）を用いて透過光撮影を行った。撮影は４×レンズを用いて行い、各ウェル４視野ずつ画像を取り込むことでウェルの全体像を網羅した。その後、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ）により４視野の画像をスティッチングで一枚のホールウェル画像とし、そこからスフェロイドの数とサイズの計測を行った。
データは、ウェルごとのスフェロイドサイズの平均値から、化合物ごとの平均値±標準偏差を算出し、ｔ検定にて統計学的検討を行った（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。なお予備実験の結果より、デブリ・ゴミ由来の３０００ｃｍ２以下の測定値は解析から除外した。
【００２２】
＜結果＞
ｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは、図５に示すように培養細胞のスフェロイド形成を有意に促進した。
したがってｎ−（２−（２，３，４´，５´−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エトキシル）−アセタミドは培養細胞のスフェロイド形成を目的とした培養液などの促進剤として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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