(57)【要約】【課題】破骨細胞分化抑制作用、骨芽細胞分化促進作用を有し、骨粗鬆症に有用な薬剤や飲食物の提供。【解決手段】カワラクトン誘導体化合物を有効成分として含有する、骨芽細胞分化促進剤または破骨細胞分化抑制剤、並びにそれらを含む骨粗鬆症または関節リウマチの予防または改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）、（３）、（４）、（６）、（７）、（８）、（１３）、（１４）または（１６）に示す構造式を有するカワラクトン誘導体化合物：
【化１】
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【化２】
2018123111.tif 000065
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
2018123111.tif 000072
【請求項２】
下記の式（１）〜（１４）のいずれかに示す構造式を有するカワラクトン誘導体化合物を有効成分として含有する、骨芽細胞分化促進剤：
【化１０】
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【化１１】
2018123111.tif 000074
【化１２】
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【化１３】
2018123111.tif 000076
【化１４】
2018123111.tif 000077
【化１５】
2018123111.tif 000078
【化１６】
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【化１７】
2018123111.tif 000080
【化１８】
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【化１９】
2018123111.tif 000082
【化２０】
2018123111.tif 000083
【化２１】
2018123111.tif 000084
【化２２】
2018123111.tif 000085
【化２３】
2018123111.tif 000086
【請求項３】
下記の式（１）〜（８）および（１０）〜（２０）のいずれかに示す構造式を有するカワラクトン誘導体を有効成分として含有する、破骨細胞分化抑制剤：
【化２４】
2018123111.tif 000087
【化２５】
2018123111.tif 000088
【化２６】
2018123111.tif 000089
【化２７】
2018123111.tif 000090
【化２８】
2018123111.tif 000091
【化２９】
2018123111.tif 000092
【化３０】
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【化３１】
2018123111.tif 000094
【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
2018123111.tif 000098
【化３６】
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【化３７】
2018123111.tif 000100
【化３８】
2018123111.tif 000101
【化３９】
2018123111.tif 000102
【化４０】
2018123111.tif 000103
【化４１】
2018123111.tif 000104
【化４２】
2018123111.tif 000105
【請求項４】
請求項２に記載の骨芽細胞分化促進剤、または請求項３に記載の破骨細胞分化抑制剤を含む、骨粗鬆症の予防または改善剤。
【請求項５】
請求項２に記載の骨芽細胞分化促進剤、または請求項３に記載の破骨細胞分化抑制剤を含む、関節リウマチの予防または改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カワラクトン誘導体化合物を有効成分とする、骨粗鬆症の予防または骨代謝を改善するための健康食品、医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本国内において骨粗鬆症患者は１０００万人を超えており、社会的に大きな問題となっている。また、急速な高齢化により６５才以上の人口が増加し、骨粗鬆症患者が増加の一途を辿ることが推測されている。骨粗鬆症は骨強度低下によって骨折の危険性が高まった病態であり、その治療および予防は健全な長寿社会を実現するために必要である。
【０００３】
人体において骨は絶えず骨吸収と骨形成を繰り返しており、骨吸収に関与する細胞が破骨細胞、骨形成に関与する細胞が骨芽細胞である。骨の形成、維持、修復には、これらの細胞の形成と吸収のバランスに依存しており、そのバランスが崩れることにより、骨吸収が骨形成を上回り、骨粗鬆症などの骨代謝疾患がもたらされることが知られている。よって骨形成が骨吸収を下回らないことが骨量の維持・増強に重要であると考えられている。
【０００４】
骨吸収は破骨細胞によって行なわれるため、破骨細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨吸収率は高くなる。一方、骨形成は骨芽細胞によって行なわれ、骨芽細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨形成率は高くなる。そのため、骨吸収率を減少させる骨吸収抑制作用を有し、骨形成率を高める骨形成促進作用を有する組成物が得られれば、骨粗鬆症に有効である。このような効果が報告されているものとして、例えば、生姜の辛味成分である６−ジンゲロールおよび６−ショウガオールを含むしょうがの抽出物を有効成分とする骨代謝改善組成物（特許文献１参照）やサルカケミカン（学名：Toddalia asiatica）由来のトダクリン（toddaculin）を有効成分とする骨代謝改善組成物（特許文献２参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2014-043416号公報
【特許文献２】特開2016-069355号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来では、エストロゲン、ビスフォスフォネート、ビタミンＤ、カルシトニンなどの薬剤が臨床応用されてきたが、これらによる治療法は充分とはいえず、より優れた新たな治療薬が求められている。
【０００７】
本発明の目的は、破骨細胞分化抑制作用および骨形成促進作用を有し、骨粗鬆症の予防および改善に有用な有効成分を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、破骨細胞分化抑制作用および骨形成促進作用を有する有効成分について、種々の素材から探索を重ねた結果、月桃（ゲットウ）（Alpinia zerumbet)に含まれるカワラクトンである5,6-dehydrokawainが、骨芽細胞の骨形成を促進することを見出した。そこで，5,6-dehydrokawainの構造を種々変換し，さらに高活性なカワラクトンの誘導体を合成し本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、カワラクトン誘導体化合物を含有する破骨細胞分化抑制剤および骨形成促進剤、骨粗鬆症の予防および骨代謝改善剤である。
【００１０】
また、本発明は、カワラクトン誘導体化合物を含有する飲食品である。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  下記の式（１）、（３）、（４）、（６）、（７）、（８）、（１３）、（１４）または（１６）に示す構造式を有するカワラクトン誘導体化合物：
【化１】
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【化２】
2018123111.tif 000003
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
2018123111.tif 000009
【化９】
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[２]  下記の式（１）〜（１４）のいずれかに示す構造式を有するカワラクトン誘導体化合物を有効成分として含有する、骨芽細胞分化促進剤：
【化１０】
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【化１１】
2018123111.tif 000012
【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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[３]  下記の式（１）〜（８）および（１０）〜（２０）のいずれかに示す構造式を有するカワラクトン誘導体を有効成分として含有する、破骨細胞分化抑制剤：
【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
2018123111.tif 000043
[４]  [２]の骨芽細胞分化促進剤、または[３]の破骨細胞分化抑制剤を含む、骨粗鬆症の予防または改善剤。
[５]  [２]の骨芽細胞分化促進剤、または[３]の破骨細胞分化抑制剤を含む、関節リウマチの予防または改善剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の骨代謝改善剤は、カワラクトン誘導体化合物を含有し、破骨細胞への分化抑制作用により骨吸収を抑制し、さらに骨芽細胞の分化促進作用により、骨形成を促し、骨粗鬆症を予防および改善できる。
【００１３】
本発明の飲食品は、カワラクトン誘導体化合物を含有し、経口摂取することにより破骨細胞への分化抑制、骨芽細胞の分化を促進し、骨粗鬆症を予防および改善できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のカワラクトン誘導体化合物1〜20の構造式を示す図である。
【図２】カワラクトン誘導体によるALP活性の促進効果を示す図である。
【図３】カワラクトン誘導体によるMC3T3-E1細胞の石灰化促進効果を示す図である。
【図４】カワラクトン誘導体によるMC3T3-E1細胞の石灰化定量結果を示す図である。
【図５】RANKL誘導によるRAW264細胞のTRAP活性上昇にカワラクトン誘導体化合物１〜10が与える影響を示す図である。
【図６】RANKL誘導によるRAW264細胞のTRAP活性上昇にカワラクトン誘導体化合物11〜20が与える影響を示す図である。
【図７】化合物18のTRAP活性抑制作用を示す図である。
【図８】化合物18が細胞増殖に与える影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明の骨形成促進剤、破骨細胞分化抑制剤、骨粗鬆症もしくは関節リウマチ等の予防または改善剤は、カワラクトン誘導体化合物を有効成分として含有する。本発明のカワラクトン誘導体化合物は、5,6-dehydrokawain誘導体化合物ともいい、下記の式（１）〜（２０）に示す構造式を有するカワラクトン誘導体化合物1〜20である。化合物1〜20の構造式をまとめて図１に示す。
【００１７】
【化４３】
2018123111.tif 000044
【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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【化５４】
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【化５５】
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【化５６】
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【化５７】
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【化５８】
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【化５９】
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【化６０】
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【化６１】
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【化６２】
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【００１８】
なお、5,6-dehydrokawainは、ショウガ科アルピニア属の多年草である月桃（ゲットウ）（Alpinia zerumbet)に含まれる化合物である。
【００１９】
本発明のカワラクトン誘導体化合物は、α-ピロンを出発原料として合成することができる。
【００２０】
本発明のカワラクトン誘導体化合物が骨芽細胞の分化を促進し、骨形成の促進活性を有することは、以下の方法により確認することができる。すなわち、MC3T3-E1細胞と本発明のカワラクトン誘導体化合物を接触させ、MC3T3-E1細胞の分化程度を分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ（ALP）活性を確認すればよい。ALP活性が上昇する場合、骨芽細胞への分化が促進されていると評価することができる。また骨芽細胞への分化は、例えば、アリザリンレッド染色法で蓄積したカルシウムの増加量により評価してもよい。
【００２１】
また、破骨細胞の分化抑制作用を、破骨細胞への分化のマーカーである、酸性フォスファターゼ（Acp5）、カテプシンK（Ctsk）、Oscarなどの遺伝子発現上昇を確認してもよい。一方、骨芽細胞の分化促進作用を、骨芽細胞への分化のマーカーである、アルカリフォスファターゼ（Alpl）、オステオカルシン（Bglap）などの遺伝子発現上昇を確認してもよい。
【００２２】
本発明のカワラクトン誘導体化合物のうち、式（１）〜（１４）に示す構造式を有する化合物1〜14は、MC3T3-E1細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性を上昇させる。特に式（８）を有する化合物８はアルカリフォスファターゼ活性を強く上昇させる。また、本発明のカワラクトン誘導体化合物のうち、式（１）〜（１４）に示す構造式を有する化合物1〜14は、MC3T3-E1細胞における石灰化を促進する。これらのことは、本発明のカワラクトン誘導体化合物のうち、式（１）〜（１４）に示す構造式を有する化合物1〜14は、骨芽細胞の分化を促進させる作用を有することを示す。
【００２３】
本発明のカワラクトン誘導体化合物が破骨細胞の分化抑制作用を有することは、以下の方法により確認することができる。すなわち、RAW264細胞等の哺乳動物の単球由来細胞はRANKL刺激を与えることにより、多核細胞を形成しながら、破骨細胞へと分化する。従って、単球由来細胞と分化促進因子であるRANKLおよび本発明のカワラクトン誘導体化合物を接触させ培養し、単球由来細胞が破骨細胞へ分化するか確認すればよい。破骨細胞への分化は、破骨細胞の分化マーカーである酸性フォスファターゼ（TRAP）活性を確認すればよい。破骨細胞の分化抑制作用を有する場合、単球由来細胞は破骨細胞へ分化しないので、TRAP活性は上昇しない。従って、TRAP活性が上昇しない場合、破骨細胞への分化を抑制していると評価することができる。また、RAW264細胞等の哺乳動物の単球由来細胞が破骨細胞に分化が進むと、NF-κBの転写活性が上昇することが知られている。従って、細胞のNF-κB転写活性を調べることにより破骨細胞への分化促進作用を評価してもよい。
【００２４】
本発明のカワラクトン誘導体化合物のうち、式（１）〜（８）および（１０）〜（２０）に示す構造式を有する化合物1〜8および10〜20、特に式（１８）に示す構造式を有する化合物8は、TRAP活性抑制効果を示す。このことは、本発明のカワラクトン誘導体化合物のうち、式（１）〜（８）および（１０）〜（２０）に示す構造式を有する化合物1〜8および10〜20、特に式（１８）に示す構造式を有する化合物18は、破骨細胞の分化を抑制させる作用を有することを示す。
【００２５】
上記のように、本発明のカワラクトン誘導体化合物は、破骨細胞分化抑制剤として用いることができる。破骨細胞分化抑制剤は、研究用試薬としても用いることができる。また、本発明のカワラクトン誘導体化合物は、骨形成促進剤として用いることができる。骨形成促進剤は、研究用試薬としても用いることができる。
【００２６】
また、本発明のカワラクトン誘導体化合物は、骨粗鬆症や関節リウマチに起因する疾患を予防または改善するための医薬として用いることができる。本発明は、カワラクトン誘導体化合物を有効成分として含む、骨粗鬆症をはじめ、関節リウマチ炎、ページェット病、悪性腫瘍の骨転移、甲状腺機能後進症などを予防または改善や卵巣摘出手術後の治療をするための医薬組成物を包含する。
【００２７】
医薬組成物は、経口で投与しても、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよい。好ましくは経口で投与する。該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤等を含んでいてもよい。また、着色料、香料、防腐剤などを含んでいてもよい。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、それぞれあげられる。使用する際の形態は特に限定されず、カプセル状、粉末、粒状、タブレット状、液状などの形態とでき、また、外用剤としてクリーム、ペースト状、ジェルなどの形態で用いることもできる。
【００２８】
本発明の本発明のカワラクトン誘導体化合物は、サプリメントとして用いることができ、あるいは、飲食物に混合してまたは飲食用組成物として用いることもできる。
【００２９】
サプリメントとして用いる場合、錠剤や顆粒の形態で用いることができ、他の有用成分と混合してもよい。
【００３０】
飲食用組成物として用いる場合、機能性食品、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等として供することが可能である。これらの飲食品は、骨代謝を改善する機能性食品として供することができ、特定保健用飲食品やその他のサプリメント、健康飲食品等には、骨吸収を抑制する、骨形成を促進する、骨粗鬆症を予防または改善する等の機能を表示することができる。
【００３１】
飲食用組成物は、固形物、液状、粉末、顆粒状、ペースト状等の種々の形態であり、具体的には、例えば、清涼飲料、乳酸飲料、嗜好飲料、コーヒー、緑茶、紅茶、ウーロン茶などの飲料品；キャンディー、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類などの菓子類；果実飲料、野菜飲料、ジャム類、ペースト類などの野菜・果実加工品；日本酒、焼酎、ワイン、中国酒、ウイスキー、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム、酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなどのアルコ−ル飲料；ヨーグルト、アイスクリーム、バター、チーズ、練乳、粉乳のなどの乳製品；ドレッシング、マヨネーズ、てんぷら油、サラダ油などの油脂加工品；しょうゆ、ソース、酢、みりん、ドレッシングタイプ調味料などの調味料；粉末ジュース、粉末スープ、インスタントコーヒー、即席麺類、即席カレー、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなどの乾燥飲食品、小麦粉加工品、でんぷん類加工品などの穀物加工品等が挙げられる。例えば飴、クッキー、チューインガム、ビスケットのような固形物として用いても、あるいは清涼飲料水、牛乳、ヨーグルト、シロップのような液状でもよい。飲食物とする場合、クエン酸、乳酸、カゼインなど、通常飲食物に使用される添加剤を配合することができる。
【００３２】
本発明のカワラクトン誘導体化合物を含有する医薬組成物薬剤、サプリメントまたは飲食物等の飲食用組成物におけるカワラクトン誘導体化合物含有量は、その剤型に応じて異なるが、通常カワラクトン誘導体化合物が、全組成物中の0.01〜50重量％、好ましくは0.01〜20重量％程度含まれていればよい。カワラクトン誘導体化合物の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重、症状の種類、症状の程度などを考慮して適宜増減できるが、一日当たりの摂取量が0.01〜300mg/kgになるように、飲食品の形態に合わせて設定するのが好ましい。１日１回または数回に分けて投与、摂食等により摂取すればよい。
【００３３】
本発明のカワラクトン誘導体化合物を含有する医薬組成物、サプリメントまたは飲食物等の飲食用組成物は、ヒトを含む哺乳動物を対象とする。ヒト以外の哺乳動物としては、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ等が挙げられる。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
[実施例１]  カワラクトン誘導体の合成方法およびスペクトルデータ
化合物1：6-[(E)-2-Cyclohexylvinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（１））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.30 g)とcyclohexanecarbaldehyde  (0.27 ml, 2.2 mmol)  を加え、60℃で4時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Mp 86-87 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ:6.70 (dd, J = 8.4, 15.6 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.74 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 2.58 (m, 1H), 1.36-1.84 (m, 8H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.3, 164.3, 158.9, 144.6, 119.4, 99.4, 88.2, 55.8, 43.5, 32.8, 25.3; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C13H17O3, 221.1178; found, 221.1171.
【００３６】
化合物2：6-[(E)-2-(4-Chlorophenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（２））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-chlorobenzaldehyde (0.23 g, 1.6 mmol)を加え、60℃で4時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
化合物のスペクトルデータは文献１と一致した。
文献１）Soldi, C.; Moro, A. V.; Pizzolatti, M. G.; Correia, C. R. D. Eur. J. Org. Chem. 2012, 19, 3607.
【００３７】
化合物3：6-[(E)-2-(4-Ethoxyphenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（３））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-ethoxybenzaldehyde (0.22 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で4時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Mp 161-162 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.47-7.42 (m, 3H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.44 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.88 (s, 1H), 5.47 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 1.43 (t, J = 6.9 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.2, 164.2, 160.1, 159.1, 135.5, 129.0, 127.8, 116.2, 114.8, 100.4, 88.3, 63.6, 55.9, 14.8; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C16H17O4, 273.1127; found, 273.1120.
【００３８】
化合物4：6-[(E)-2-(4-Ethynylphenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（４））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-ethinylbenzaldehyde (0.21 g, 1.6 mmol)を加え、60℃で5時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 39%. Mp 164-166 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.50-7.43 (m, 5H), 6.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.18 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 170.9, 163.9, 158.2, 135.5, 134.7, 132.6, 127.2, 122.9, 119.6, 101.9, 89.1, 83.3, 78.9, 56.0; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C16H13O3, 253.0865; found, 253.0858.
【００３９】
化合物5：4-Methoxy-6-[(E)-2-p-tolylvinyl]-2H-pyran-2-one（式（５））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-methylbenzaldehyde (0.18 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で6時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Mp 174-176 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.47 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.53 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.37 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.1, 164.0, 158.9, 139.7, 135.8, 132.4, 129.6, 127.4, 117.6, 100.9, 88.6, 55.9, 21.4; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C15H15O3, 243.1021; found, 243.1016.
【００４０】
化合物6：6-[(E)-2-(4-Ethylphenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（６））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-ethylbenzaldehyde (0.21 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で5時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Mp 94-96 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.49 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.25 (t, J = 7.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 152.3, 146.7, 142.5, 132.3, 124.1, 121.6, 118.2, 117.4, 109.5, 96.1, 86.3, 60.1, 38.4, 27.7; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C16H17O3, 257.1178; found, 257.1172.
【００４１】
化合物7：4-Methoxy-6-[(E)-2-(4-propylphenyl)vinyl]-2H-pyran-2-one（式（７））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.30 g)と4-propylbenzaldehyde (0.32 ml, 2.2 mmol)を加え、60℃で5時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Mp 111-113 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.50-7.41 (m, 3H), 7.19-7.17 (m, 2H), 6.54 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.59 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 0.97-0.93 (m, 3H) ; 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.1, 164.1, 158.9, 144.6, 135.8, 132.7, 129.0, 127.4, 117.6, 100.9, 88.6, 55.9, 37.9, 24.4, 13.8; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C17H19O3, 271.1334; found, 271.1328.
【００４２】
化合物8：6-[(E)-2-(4-Butylphenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（８））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-butylbenzaldehyde (0.41 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で4時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Mp 104-106 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.48 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.62 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.1, 164.1, 158.9, 144.8, 135.9, 132.7, 129.0, 127.4, 117.6, 100.9, 88.6, 55.9, 35.5, 33.4, 22.3, 14.0; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C18H21O3, 285.1491; found, 285.1484.
【００４３】
化合物9：4-Methoxy-6-[(E)-2-m-tolylvinyl]-2H-pyran-2-one（式（９））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と3-methylbenzaldehyde (0.18 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で6時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Mp 129-131 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.47 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.31-7.24 (m, 3H), 7.15 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.93 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.37 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.0, 164.0, 158.7, 138.5, 135.9, 135.1, 130.3, 128.8, 128.0, 124.7, 118.4, 101.2, 88.8, 55.9, 21.4; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C15H15O3, 243.1021; found, 243.1015.
【００４４】
化合物10：4-Methoxy-6-[(E)-2-o-tolylvinyl]-2H-pyran-2-one（式（１０））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と2-methylbenzaldehyde (0.18 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で6時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Mp 110-111 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.71 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.53-7.51 (m, 1H), 7.24-7.19 (m, 3H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.44 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.0, 164.0, 158.7, 137.3, 134.2, 133.3, 130.8, 129.2, 126.2, 125.6, 119.9, 101.4, 88.8, 55.9, 20.0; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C15H15O3, 243.1021; found, 243.1016
【００４５】
化合物11：6-[(E)-2-(3-Ethylphenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（１１））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と3-ethylbenzaldehyde (0.21 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で6時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 32%. Mp 93-94 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.49 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.33-7.27 (m, 3H), 7.18 (m, 1H), 6.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 2.4 Hz, 1H),2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.258 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.0, 164.0, 158.7, 144.9, 136.0, 135.2, 129.2, 128.9, 126.9, 124.9, 118.3, 101.2, 88.8, 55.9, 28.8, 15.5; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C16H17O3, 257.1178; found, 257.1171.
【００４６】
化合物12：6-[(E)-2-(2-Ethylphenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（１２））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と2-ethylbenzaldehyde (0.21 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で5時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 35%. Mp 101-103 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.75 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.28-7.21 (m, 3H), 6.50 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.22 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.0, 164.0, 158.8, 143.4, 133.6, 133.1, 129.4, 129.2, 126.2, 125.8, 120.1, 101.4, 88.9, 55.9, 26.3, 15.7; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C16H17O3, 257.1178; found, 257.1172.
【００４７】
化合物13：4-Methoxy-6-[(E)-2-(4-trifluoromethylphenyl)vinyl]-2H-pyran-2-one（式（１３））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-trifluoromethylbenzaldehyde (0.22 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で  時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 25%. Mp 159-161 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.64-7.58 (m, 4H), 7.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.00 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.53 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 170.8, 163.6, 157.7, 138.6, 133.9, 130.9 (d, J = 32.4 Hz), 127.5, 125.8 (q, J = 3.7 Hz), 123.9 (q, J = 270.4 Hz), 120.9, 102.5, 89.4, 56.0 ; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C15H12F3O3, 297.0739; found, 297.0735.
【００４８】
化合物14：6-[(E)-2-(4-tert-Butylphenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（１４））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-tert-butylbenzaldehyde (0.41 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で6時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 26%. Mp 155-156 °HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C18H21O3, 285.1491; found, 285.1489.
化合物のスペクトルデータは文献2と一致した。
文献2）McCracken, S. T.; Kaiser, M.; Boshoff, H. I.; Boyed, P. D. W.; Copp, B. R. Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 1482.
【００４９】
化合物15：6-[(E)-2-Cyclopentylvinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（１５））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)とcyclopentanecarboxaldehyde (0.24 ml, 2.2 mmol)を加え、60℃で5時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 17%. Mp 86-87 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ:6.70 (dd, J = 8.4, 15.6 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.74 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 2.58 (m, 1H), 1.36-1.84 (m, 8H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.3, 164.3, 158.9, 144.6, 119.4, 99.4, 88.2, 55.8, 43.5, 32.8, 25.3; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C13H17O3, 221.1178; found, 221.1171.
【００５０】
化合物16：4-Methoxy-6-[(E)-2-thiophen-3-ylvinyl]-2H-pyran-2-one（式（１６））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と3-thiophencarboxaldehyde (0.15 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で5時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 40%. Mp 168-170 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.50 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.41 (m, 1H), 7.34-7.32 (m, 1H), 7.28 (dd, J = 1.4 Hz, 5.1, 1H), 6.41 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.1, 164.0, 158.7, 138.2, 129.7, 126.9, 126.4, 124.7, 118.4, 100.9, 88.6, 55.9; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C12H11O3S, 235.0429; found, 235.0424.
【００５１】
化合物17：6-[(E)-2-(4-Fluorophenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（１７））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.30 g)と4-fluorobenzaldehyde (0.24 ml, 2.2 mmol)を加え、60℃で5時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 20%. Mp 143-145 °C; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C14H12FO3, 247.0771; found, 247.0765.
【００５２】
化合物のスペクトルデータは以下の文献と一致した。
Soldi, C.; Moro, A. V.; Pizzolatti, M. G.; Correia, C. R. D. Eur. J. Org. Chem. 2012, 19, 3607.
【００５３】
化合物18：6-[(E)-2-(2-Fluorophenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（１８））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と2-fluorobenzaldehyde (0.17 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で6時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 71%. Mp 129-131°C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.56 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.51-7.47 (m, 1H), 7.33-7.26 (m, 1H), 7.17-7.06 (m, 2H), 6.72 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.97 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 170.9, 163.8, 161.1 (d, J = 249.8 Hz), 158.4, 130.6 (d, J = 8.5 Hz), 129.0 (d, J = 3.4 Hz), 128.8, 124.4 (d, J = 3.5 Hz), 123.3 (d, J = 11.4 Hz), 121.4 (d, J = 8.4 Hz), 116.2 (d, J = 21.9 Hz), 101.9, 89.1, 56.0; HRESIMS (m/z): [M+H]+ calcd for C14H12FO3, 247.0771; found, 247.0763. 
【００５４】
化合物19：6-[(E)-2-(3-Fluorophenyl)vinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one（式（１９））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と3- fluorobenzaldehyde (0.17 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で6時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 41%. Mp 178-179 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.45 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.34-7.31 (m, 1H), 7.26-7.18 (m, 2H), 7.05-7.00 (m, 1H), 6.57 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 170.9, 164.3, 163.0 (d, J = 245.0 Hz), 158.0, 137.5 (d, J = 7.6 Hz), 134.4, 130.4 (d, J = 8.1 Hz), 123.6, 119.9, 116.2 (d, J = 21.2 Hz), 113.4 (d, J = 21.6 Hz), 102.0, 89.2, 56.0; HRESIMS (m/z): [M+H]+ calcd for C14H12FO3, 247.0771; found,247.0764.
【００５５】
化合物20：4-Methoxy-6-[(E)-2-(4-methoxyphenyl)vinyl]-2H-pyran-2-one（式（２０））
金属Mgをメタノール中で加熱（60℃)し、懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl -2-pyrone(0.20 g)と4-methoxybenzaldehyde (0.20 ml, 1.6 mmol)を加え、60℃で5時間加熱した。冷却後、酢酸で酸性としたのち、酢酸エチルで抽出した。抽出エキスを減圧濃縮後、逆相の分取HPLC(移動相：水−アセトニトリル＝3：7）で精製した。
Yield: 23%. Mp 153-154 °C; 1H and 13C NMR data were agreed with literature values.27 HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C15H15O4, 259.0970; found, 259.0966.
化合物のスペクトルデータは以下の文献と一致した。
Dharmaratne, H. R. W.; Nanayakkara, N. P. D.; Khan, I. A. Phytochemistry, 2002, 59, 429.
【００５６】
[実施例２]  骨芽細胞分化促進試験（ALP活性促進）
マウス頭蓋骨由来繊維芽細胞MC3T3-E1細胞(MC3T3-E1細胞）(理研より入手）は、通常培養条件下においては繊維芽細胞様の形態を示す。MC3T3-E1細胞は、アスコルビン酸およびβグリセロフォスフェート含有の分化培地処理により骨芽細胞へと分化が誘導されるので、化合物による骨芽細胞への分化活性を分化マーカーであるALP（アルカリフォスファターゼ）活性を評価することで、骨芽細胞への分化誘導促進作用の評価が可能である。本活性試験を以下の方法で行った。
【００５７】
方法
MC3T3-E1細胞を培地（10%FBS胎児血清）を含むα-MEM培地）を用いて10×104細胞/mLとなるように調製し、これを96ウェルプレートに0.1mL/wellにて分注した。培養プレートを3日間37℃、5％CO2存在下にて培養後、各ウェルに50μg/mLアスコルビン酸と10ｍM βグリセロフォスフェートを含有する分化誘導培地に、カワラクトン誘導体の各化合物の終濃度が30または60μＭとなるように調製した試験溶液を添加した。添加後4日後に培地を抜き取り、冷却メタノールで細胞をプレートに固定したのちにアルカリフォスファターゼ基質を添加し、プレートリーダーにてALP活性を測定した。値は平均値±標準偏差(n=3)で示した。
【００５８】
結果
調製したカワラクトン誘導体について、ALP活性上昇作用が認められたものを図２に示す。
【００５９】
化合物1〜14について骨芽細胞への分化の指標であるALP活性を上昇させる効果が認められた。中でも、8がその効果が最も強かった。以上の結果は、化合物1〜14が骨芽細胞の分化を促進させる作用を有することを示す。
【００６０】
[実施例３]  骨芽細胞分化促進試験（アリザリンレッド染色）
MC3T3-E1細胞の石灰化を、アリザリンレッド染色法によって目視で評価することが可能である。アリザリンレッドは、キレート作用によってカルシウムに吸着するため、石灰化が進んでいるほど、細胞は濃く染色される。以下の方法によりMC3T3-E1細胞の染色を行った。
【００６１】
方法
MC3T3-E1細胞を培地（10%FBS胎児血清）を含むα-MEM培地を用いて10×104細胞/mLとなるように調製し、これを96ウェルプレートに0.1mL/wellにて分注した。培養プレートを3日間37℃、5％CO2存在下にて培養後、各ウェルに50μg/mLアスコルビン酸および10mM βグロセロフォスフェートからなる分化誘導剤とカワラクトン誘導体の各化合物を添加し、10日間培養した。培養後、冷却メタノールで細胞をプレートに固定した後に、20mMアリザリンレッド染色液で石灰化マトリックスを染色し、イオン交換水で余分な色素を洗浄した。プレート内のアリザリンレッド色素を10％セチルピリジウムクロライドで溶解し、550nmの吸光を測定した。
【００６２】
結果
化合物1〜14のアリザリン染色試験結果を図３および４に示す。アリザリンレッドによるカルシウムの染色が、コントロールに対して化合物1〜14を添加した細胞では濃くなっている事が分かる（図３）。また、化合物6〜8の効果は10、30μMにおいて濃度依存的であった（図３）。アリザリンレッドの色素量を定量したところ、化合物1〜14は骨芽細胞分化に伴うカルシウム沈着量を増加させることが明らかとなった（図４）。以上の結果は、化合物1〜14が骨芽細胞の分化を促進させる作用を有することを示す。
【００６３】
[実施例４]  破骨細胞分化抑制試験（TRAP活性抑制）
マウスマクロファージ様RAW264細胞（RAW264細胞）(理研より入手）は、通常培養条件下においては単球細胞様の形態を示す。RAW264細胞は、RANKL刺激を与えることにより、多核化した巨大細胞を形成しながら効率的に破骨細胞へと分化するため、化合物による破骨細胞への分化活性を、分化マーカーであるTRAP活性を評価することで破骨細胞への分化誘導抑制作用の評価が可能である。RAW264細胞の破骨細胞への分化誘導は以下の方法で行った。
【００６４】
方法
RAW264細胞を培地（10%FBS（胎児血清）を含むα-MEM培地）を用いて1.5×104 細胞/mLとなるよう調製し、これを96ウェルプレートに0.1mL/wellにて分注した。
培養プレートを37℃、5％CO2存在下にて24時間培養後、各ウェルに10 ng/mL RANKLおよび各サンプルを終濃度1〜20μＭとなるように添加し、3〜4日間培養した。培養後、培地を抜き取り、冷却メタノールで細胞を固定化したのちに酒石酸耐性フォスファターゼ基質を添加することにより、TRAP活性を測定した。測定はマイクロプレートリーダーにて行い、値は平均値±標準偏差(n=3)で示した。
【００６５】
結果
化合物1〜10(図５）および11〜20(図６）のTRAP活性抑制効果を示す。化合物1〜8および10〜20は10、20μＭにおいて濃度依存的なTRAP活性の抑制効果を示し、破骨細胞の分化抑制作用を有することが示された。特に活性の強かった化合物18についてTRAP活性抑制作用のEC50を算出したところ、3.4μMと強力な破骨細胞分化抑制効果を有することが明らかとなった（図７）。また、化合物18は、0.01〜5μMの濃度において細胞増殖に影響を及ぼさなかった（図８）。
【００６６】
以上の結果より、カワラクトン誘導体化合物1〜8および10〜20は破骨細胞の分化を抑制する作用を有し、特に化合物18が強力な作用を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のカワラクトン誘導体化合物は、骨粗鬆症または関節リウマチの予防または改善剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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