(57)【要約】【課題】本発明は、安全に摂取することができ、免疫力増強作用を有する素材を提供することを課題とする。【解決手段】β−ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩、並びにそれらの溶媒和物を有効成分とすることを特徴とする、ナチュラルキラー細胞の活性化剤、前記ナチュラルキラー細胞の活性化剤を含有する、免疫増強剤、及び、ナチュラルキラー細胞の活性化剤を含有し、免疫力の増強のために摂取される、健康補助食品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩、並びにそれらの溶媒和物を有効成分とすることを特徴とする、ナチュラルキラー細胞の活性化剤。
【請求項２】
経口投与される、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の活性化剤を含有する、免疫力増強剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の活性化剤を含有し、免疫力の増強のために摂取される、健康補助食品。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の活性化剤を含有し、免疫力の増強のために摂取される、飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」という。）を活性化させる作用を有する素材、及び当該素材を有効成分とする免疫力の増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫ細胞は細胞傷害性リンパ球の１種であり、ウイルス感染や細胞のがん化等によって体内に異常な細胞が発生した時に防御機構として働く細胞である。しかしながら、ＮＫ細胞の細胞傷害活性は加齢と共に低下するため、高齢になるほどがんの発生率が高まること等に関連していると言われている。
【０００３】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、補酵素ＮＡＤ＋の生合成中間代謝産物である。近年、ＮＭＮは、老化マウスにおけるインスリン分泌能の改善効果、高脂肪食や老化によってひき起こされる２型糖尿病のマウスモデルにおいてインスリン感受性や分泌を劇的に改善する効果を有すること（例えば、特許文献１参照。）、サーカディアンリズムの制御に関与していること（例えば、特許文献２参照。）、老化した筋肉のミトコンドリア機能を顕著に高める効果を有することなどが報告されている。さらに、ＮＭＮの投与により、肥満、血中脂質濃度の上昇、インシュリン感受性の低下、記憶力低下、及び黄斑変性症等の眼機能劣化といった加齢に伴う各種疾患の症状の改善や予防に有用であることも報告されている（例えば、特許文献３参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７７３７１５８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／１２３５１０号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１４／１４６０４４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gomes，et al.，Cell，2013，vol.155，p.1624-1638．
【非特許文献２】Yoshino, et al., Cell Metabolism, 2011, vol.14, p.528-536.
【非特許文献３】Takeda，et al.，Nature Medicine，2001，vol.7(1)，p.94-100.
【非特許文献４】Takeda，et al.，Blood，2005，vol.105(5)，p.2082-2089.
【非特許文献５】Yuminamochi，et al.，Immunology，2007，vol.121(2)，p.197-206.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、安全に摂取することができ、免疫力増強作用を有する素材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、β−ＮＭＮがＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強させる作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のＮＫ細胞の活性化剤、免疫力増強剤、健康補助食品、及び飼料を提供するものである。
［１］  β−ＮＭＮ又はその薬理学的に許容される塩、並びにそれらの溶媒和物を有効成分とすることを特徴とする、ＮＫ細胞の活性化剤。
［２］  経口投与される、前記［１］の活性化剤。
［３］  前記［１］又は［２］の活性化剤を含有する、免疫力増強剤。
［４］  前記［１］又は［２］の活性化剤を含有し、免疫力の増強のために摂取される、健康補助食品。
［５］  前記［１］又は［２］の活性化剤を含有し、免疫力の増強のために摂取される、飼料。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るＮＫ細胞の活性化剤は、元々生体内に存在するβ−ＮＭＮを有効成分とし、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強させることができる。このため、本発明に係るＮＫ細胞の活性化剤は、副作用を起こすことなく安全に摂取することができ、免疫力の増強を補助することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、β−ＮＭＮ投与群（６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）とコントロール群の肝臓から回収された単核球のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を示した図である。
【図２】実施例２において、β−ＮＭＮ投与群（６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）とコントロール群から回収された単核球のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を示した図である。左図が肝臓から回収された単核球の結果であり、右図が脾臓から回収された単核球の結果である。
【図３】実施例３において、β−ＮＭＮ投与群（６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）とコントロール群から回収された単核球のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を示した図である。左図が肝臓から回収された単核球の結果であり、右図が脾臓から回収された単核球の結果である。
【図４】実施例４において、β−ＮＭＮ投与群（６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）とコントロール群から回収された単核球のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を示した図である。左列がＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスから回収された単核球の結果であり、右列がＢＡＬＢ／ｃマウスから回収された単核球の結果である。また、上段が肝臓から回収された単核球の結果であり、下段が脾臓から回収された単核球の結果である。
【図５】実施例５において、β−ＮＭＮ投与群（１２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、３１３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）とコントロール群から回収された単核球のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を示した図である。左図が肝臓から回収された単核球の結果であり、右図が脾臓から回収された単核球の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るＮＫ細胞の活性化剤（以下、「本発明に係る活性化剤」ということがある。）は、ＮＭＮ（化学式：Ｃ１１Ｈ１５Ｎ２Ｏ８Ｐ）を有効成分とし、ＮＫ細胞の細胞障害活性を増強させるという効果を有する。ＮＫ細胞は、自然免疫の主要因子であり、免疫力（疾病等に対する抵抗力）の指標とされている。免疫力が低下している動物では、ＮＫ細胞の細胞障害活性が低く、ＮＫ細胞の細胞障害活性を増強させることにより、動物の免疫力を増強させることができる。すなわち、本発明に係る活性化剤は、免疫力増強剤の有効成分として好適である。例えば、本発明に係る活性化剤を摂取させることにより、加齢、疲労、ストレス、睡眠不足等により低下した免疫力を改善することが可能になる。
【００１２】
ＮＭＮには、光学異性体としてα、βの２種類が存在するが、本発明に係る活性化剤の有効成分となるＮＭＮは、β−ＮＭＮ（ＣＡＳ番号：１０９４−６１−７）である。β−ＮＭＮの構造を下記に示す。
【００１３】
【化１】
2018002604.tif 000002
【００１４】
有効成分とするβ−ＮＭＮとしては、いずれの方法で調製されたものであってもよい。例えば、化学合成法、酵素法、発酵法等により、人工的に合成したβ−ＮＭＮを精製したものを、有効成分として用いることができる。また、β−ＮＭＮは広く生体に存在する成分であるため、動物、植物、微生物などの天然原料から抽出・精製することによって得られたβ−ＮＭＮを有効成分として用いることもできる。また、市販されている精製されたβ−ＮＭＮを使用してもよい。
【００１５】
β−ＮＭＮを合成する化学合成法としては、例えば、ニコチンアミドとＬ−リボーステトラアセテートとを反応させ、得られたニコチンアミドモノヌクレオシドをリン酸化することによりβ−ＮＭＮを製造できる。また、酵素法としては、例えば、ニコチンアミドと５’−ホスホリボシル−１’−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）から、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）によりβ−ＮＭＮを製造できる。発酵法としては、例えば、ＮＡＭＰＴを発現している微生物の代謝系を利用して、ニコチンアミドからβ−ＮＭＮを製造できる。
【００１６】
本発明に係る活性化剤の有効成分としては、β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩であってもよい。β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、無機酸塩であってもよく、アミンのような塩基性部位を有する有機酸塩であってもよい。このような酸塩を構成する酸としては、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、アルカリ塩であってもよく、カルボン酸のような酸性部位を有する有機塩であってもよい。このような酸塩を構成する塩基としては、例えば、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であって、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア、トリメチルアンモニア、トリエチルアンモニア、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム等の塩基から誘導されるものが挙げられる。
【００１７】
本発明に係る活性化剤の有効成分としては、遊離のβ−ＮＭＮ又はβ−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。当該溶媒和物を形成する溶媒としては、水、エタノール等が挙げられる。
【００１８】
本発明に係る活性化剤は、有効成分のみからなるものであってもよく、その他の成分を含むものであってもよい。例えば、本発明に係る活性化剤は、有効成分を医薬用無毒担体と組み合わせて、製剤上の常套手段により様々な剤型に製剤化することができる。本発明に係る活性化剤の剤型のうち、経口投与剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤等の固形剤；溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤；凍結乾燥製剤等が挙げられる。非経口投与剤としては、注射剤のほか、坐剤、噴霧剤、経皮吸収剤等が挙げられる。
【００１９】
製剤化に使用する医薬用無毒担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、果糖、還元麦芽糖等の糖類；デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、デキストリン、β−シクロデキストリン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の炭水化物；マンニトール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール；脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等のエステル類；ポリエチレングリコール、エチレングリコール、アミノ酸、アルブミン、カゼイン、二酸化珪素、水、生理食塩水等が挙げられる。また、本発明に係る活性化剤の製剤化においては、製剤上の必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、矯味矯臭剤、着色剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。
【００２０】
本発明に係る免疫力増強剤は、本発明に係る活性化剤を、そのＮＫ細胞の細胞障害性活性化効果が発揮されるために十分な量含有させたものである。本発明に係る免疫力増強剤は、本発明に係る活性化剤のみを有効成分として含有するものであってもよく、その他の有効成分を含有するものであってもよい。当該他の有効成分としては、穀物由来のアルキルレゾルシノール、酵母由来のβ−グルカン、アガリスク、フコイダン、プロポリス、アラビノキシラン、ラクトフェリン、ムチン、ルチン、イソフラボン、スピルナ、ポリフェノール、セサミン、アリシン、アスタキサンチン、クルクミン、カテキン、キトサン、キトサンオリゴ糖、キチンオリゴ糖、Ｌ−アスコルビン酸、コエンザイムＱ１０等の免疫力の増強作用を有することが知られている各種成分が挙げられる。
【００２１】
本発明に係る免疫力増強剤は、本発明に係る活性化剤と同様に、有効成分を医薬用無毒担体と組み合わせて、製剤上の常套手段により様々な剤型に製剤化することができる。本発明に係る免疫力増強剤の製剤化は、前記と同様にして行うことができる。
【００２２】
本発明に係る活性化剤及び免疫力増強剤は、ヒトやヒト以外の動物に投与されることが好ましい。ヒト以外の動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物が挙げられる。本発明に係る活性化剤及び免疫力増強剤としては、ヒト、家畜、実験動物、ペットに投与・摂取されるものであることが好ましく、ヒトに投与・摂取されるものであることがさらに好ましい。
【００２３】
本発明に係る活性化剤及び免疫力増強剤の投与・摂取量は、投与される動物の生物種、年齢、体重、症状、疾患の程度、投与スケジュール、製剤形態等により、適宜選択・決定される。例えば、成人１人あたりの１日量を、β−ＮＭＮ量として、０．１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜７ｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは１００ｍｇ〜２ｇを、１回又は数回に分けて投与することができる。
【００２４】
β−ＮＭＮは、生体構成成分であり、かつ食品中にも含まれている成分であることから、安全性が高いと考えられる。そこで、本発明に係る活性化剤は、免疫力の増強のために摂取される健康補助食品の有効成分として用いることができる。健康補助食品は、健康状態の維持又は改善を目的として栄養を補助するための飲食品であり、特定保健用食品、栄養機能食品、及び健康食品も含む。
【００２５】
また、本発明に係る活性化剤は、免疫力の増強のために動物に摂取させる飼料の有効成分として用いることができる。当該飼料を家畜、ペット、実験動物等に与えることにより、摂取させた動物のＮＫ細胞の細胞障害性を高める結果、当該動物の免疫力が維持され、健康の維持に貢献できる。
【００２６】
本発明に係る健康補助食品及び飼料は、β−ＮＭＮ等に適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、粉末状、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、ペースト状等に形成することによって製造できる。本発明に係る健康補助食品は、そのまま食用に供してもよく、種々の食品や飲料に混合させた状態で食用に供してもよい。例えば、粉末状の健康補助食品を、水、酒類、果汁、牛乳、清涼飲料水等の飲料に溶解又は分散させた状態で摂取させることができる。本発明に係る飼料も、そのまま動物に摂取させてもよく、他の固形飼料や飲料水に混合させた状態で動物に摂取させてもよい。
【００２７】
本発明に係る健康補助食品及び飼料は、その他の食品素材や種々の添加剤を含有することができる。食品素材としては、ビタミン類、糖質、蛋白質、脂質、食物繊維、果汁等が挙げられる。具体的には、例えば、ビタミンＢ１誘導体、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビオチン、パントテン酸、ニコチン酸、葉酸等のビタミンＢ群；ビタミンＥ、ビタミンＤ又はその誘導体、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、βカロチン等の脂溶性ビタミン；カルシウム、カリウム、鉄、亜鉛等のミネラル；酵母、Ｌ−カルニチン、クレアチン、α−リポ酸、グルタチオン、グルクロン酸、タウリン、コラーゲン、大豆イソフラボン、レシチン、ペプチド、アミノ酸、γ−アミノ酪酸、ジアシルグリセロール、ＤＨＡ、ＥＰＡ、カプサイシン、コンドロイチン硫酸、アガリクス茸エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、青汁、レシチン、ローヤルゼリー、プロポリス、オクタコサノール、フラバンジェノール、ピクノジェノール、マカ、キトサン、ガルシニアエキス、コンドロイチン、グルコサミン等が挙げられる。添加剤としては、甘味料、有機酸等の酸味料、安定剤、香料、着色料等が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２９】
［マウス及び腹腔内投与］
以降の実験に用いたＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、及びＢＡＬＢ／ｃマウスは、全実験期間中を通して、ＳＰＦ環境下で飼育した。
【００３０】
マウスへの腹腔内投与は、β−ＮＭＮ（オリエンタル酵母工業社製）をＰＢＳ（リン酸生理食塩水）に溶解させた溶液を、Dr. Sinclair 等の方法（非特許文献１）及びDr. Imai等の方法（非特許文献２）などに従って腹腔内投与した。具体的には、β−ＮＭＮの投与量が１２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、３１３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、及び１２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの場合には、それぞれ、１２．５ｍｇ／ｍＬ、３１．３ｍｇ／ｍＬ、６２．５ｍｇ／ｍＬ、及び１２５ｍｇ／ｍＬにＰＢＳで調整したβ−ＮＭＮ溶液を、１日に、マウスに対して体重２０ｇ当たり２００μＬずつ腹腔内投与した。コントロールのマウスに対しては、１日に、ＰＢＳを２００μＬずつ腹腔内投与した。
【００３１】
［単核球の分離］
以降の実験において、マウスの肝臓及び脾臓からの単核球の分離は、以下のようにして行った。
【００３２】
肝臓からの単核球の分離は、まず、マウスから摘出した肝臓を、１０ｃｍシャーレ上で金属メッシュ（０．１２×８０、目開き０．２ｍｍ）上で、１０ｍＬの３％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ（３％のウシ胎児血清を含有させたＲＰＭＩ培地）中ですりつぶし、組織抽出液を得た。得られた組織抽出液を５０ｍＬ容チューブに移し、１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離処理した。得られた細胞のペレットを、３３％Ｐｅｒｃｏｌｌ液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を１８００ｒｐｍにて１５分間遠心分離処理した。得られたペレットに１ｍＬのｌｙｓｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ｛３．７３ｇのＮＨ４Ｃｌと０．４５ｇのＫＨＣＯ３と０．１６５ｇのＥＤＴＡ−Ｎａを４５０ｍＬの蒸留水に溶かした溶液と、５０ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０．６ｇのＴｒｉｓをＨＣｌでｐＨ７．６５に調整して１Ｌに調整した溶液)の混合物｝を添加し、赤血球を溶解させた。次いで、処理後の溶液を１５ｍＬ容チューブへ移し、１０ｍＬの３％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを加え、１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離処理することにより肝臓の単核球を得た。
【００３３】
脾臓からの単核球の分離は、まず、マウスから摘出した脾臓を、肝臓と同様にして、金属メッシュ上ですりつぶし、得られた組織抽出液を遠心分離処理して細胞のペレットを得た。得られたペレットに１ｍＬのｌｙｓｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、赤血球を溶解させた。次いで、処理後の溶液を１５ｍＬ容チューブへ移し、１０ｍＬの３％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを加え、１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離処理することにより脾臓の単核球を得た。
【００３４】
［ＮＫ細胞活性の測定］
以降の実験において、ＮＫ細胞の細胞傷害活性の測定は、ＮＫ感受性細胞株ＹＡＣ−１細胞を標的細胞として、５１Ｃｒを用いた４時間のＣｒリリースアッセイにより行った（非特許文献３〜５参照。）。
【００３５】
具体的には、まず、ＹＡＣ−１細胞をＮａ５１ＣｒＯ４存在下で１時間培養して５１Ｃｒにてラベルした後、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ（１０％のＦＣＳを含有させたＲＰＭＩ培地）に１×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁させた。
【００３６】
このラベル済ＹＡＣ−１細胞懸濁液を、１ウェル当たり１００μＬ（１×１０４細胞）ずつ分注した。次いで、９６ウェルプレート「96-well round-bottomed microtitre plate」(NUNC, Roskilde, Denmark)の各ウェルに、マウスの脾臓又は肝臓から分離した単核球の１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ懸濁液を、所定のEffector(単核球)／Target(ＹＡＣ−１細胞)比となるように添加し、さらに１ウェル当たりの溶液量が２００μＬとなるように必要に応じて１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを添加した。コントロールとして、単核球を添加せず、１００μＬのラベル済ＹＡＣ−１細胞懸濁液と１００μＬの１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩの混合したウェルも調製した。このプレートを、５％ＣＯ２の加湿空気中、３７℃で４時間培養した。培養後、各ウェルから上清を回収し、そのγ線量（ｃｐｍ）を測定した。
【００３７】
特異的溶解率（特異的に溶解した細胞の比率、％）を、以下の計算式に基づき算出した。式中、「測定された放出量」は、単核球とＹＡＣ−１細胞の混合物の培養上清のγ線量の実測値であり、「自然放出量」は、ＹＡＣ−１細胞のみの培養上清（コントロールの培養上清）のγ線量の実測値であり、「最大放出量」は、１ウェルに分注したラベル済ＹＡＣ−１細胞の全細胞を溶解させた場合のγ線量の実測値である。各処置群のＮＫ細胞の細胞傷害活性（cytotoxicity、％）は、各処置群のマウスから得られた特異的溶解率（％）の平均値±ＳＤで表記した。
【００３８】
［特異的溶解率（％）］＝１００×（［測定された放出量（ｃｐｍ）］−［自然放出量（ｃｐｍ）］）／（［最大放出量（ｃｐｍ）］−［自然放出量（ｃｐｍ）］）
【００３９】
［ＮＫ細胞の比率の測定］
以降の実験において、各マウスから回収された単核球に占めるＮＫ細胞の比率（％）の測定は、免疫染色法により行った（非特許文献３〜５参照。）。
具体的には、まず、抗体の非特異的なＦｃレセプターへの結合を抑制するために、単核球に抗マウスＦｃγレセプター抗体（２．４Ｇ２）を加えてインキュベートした後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１）とＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体（ＰＫ１３６）を用いて単核球を染色した。染色後の細胞を、フローサイトメーター「ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ」（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて分析した後、分析結果をソフトウェア「Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏ」（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて解析した。
【００４０】
［実施例１］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２２週齢、メス）を用いて、β−ＮＭＮを６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで８日間腹腔内投与した（β−ＮＭＮ（６２５ｍｇ）投与群、ｎ＝３）。コントロール群（ｎ＝３）のマウスには、ＰＢＳを２００μＬ／ｄａｙで腔内投与した。投与開始から８日後に、各マウスから肝臓を採取してＮＫ細胞活性を測定した。ＮＫ細胞活性の測定は、Effector／Target比を３０、１５、７．５、又は３．８とした条件で行った。
【００４１】
各処置群のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を図１に示す。β−ＮＭＮ（６２５ｍｇ）投与群では、コントロール群と比べて有意にＮＫ細胞活性の増加が見られ、β−ＮＭＮにＮＫ細胞活性を増強させる効果があることが示された。
【００４２】
［実施例２］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２５週齢、メス）を用いて、β−ＮＭＮを６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（β−ＮＭＮ（６２５ｍｇ）投与群、ｎ＝３）又は１２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（β−ＮＭＮ（１２５０ｍｇ）投与群、ｎ＝３）で４日間腹腔内投与した。コントロール群（ｎ＝３）のマウスには、ＰＢＳを２００μＬ／ｄａｙで腹腔内投与した。投与開始から４日後に、各マウスから肝臓及び脾臓を採取してＮＫ細胞活性を測定した。ＮＫ細胞活性の測定は、肝臓から採取した単核球ではEffector／Target比を２０、１０、又は５とした条件で、脾臓から採取した単核球ではEffector／Target比を１００とした条件で、それぞれ行った。
【００４３】
各処置群のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を図２に示す。肝臓由来の単核球では、β−ＮＭＮを４日間投与した群は、実施例１の場合と同様に、コントロール群に比べて有意にＮＫ細胞活性の増加が見られた。また、脾臓由来の単核球でも、β−ＮＭＮ投与群では、コントロール群に比べてＮＫ細胞活性の増加が観察された。これらの結果から、４日間という短期間の投与であっても、β−ＮＭＮにＮＫ細胞活性を増強させる効果があることが示された。また、肝臓由来の単核球と脾臓由来の単核球のいずれにおいても、β−ＮＭＮ（６２５ｍｇ）投与群とβ−ＮＭＮ（１２５０ｍｇ）投与群の比較では有意な差は見られず、β−ＮＭＮによるＮＫ細胞活性増強効果は、６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで充分に得られることが示された。
【００４４】
［実施例３］
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、メス）を用いて、β−ＮＭＮを６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（β−ＮＭＮ（６２５ｍｇ）投与群、ｎ＝３）で４日間腹腔内投与した。コントロール群（ｎ＝３）のマウスには、ＰＢＳを２００μＬ／ｄａｙで腹腔内投与した。投与開始から４日後に、各マウスから肝臓及び脾臓を採取してＮＫ細胞活性を測定した。ＮＫ細胞活性の測定は、肝臓から採取した単核球ではEffector／Target比を２０、１０、又は５とした条件で、脾臓から採取した単核球ではEffector／Target比を１００又は５０とした条件で、それぞれ行った。
【００４５】
各処置群のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を図３に示す。肝臓由来の単核球では、β−ＮＭＮを４日間投与した群は、実施例２の場合と同様に、コントロール群に比べて有意にＮＫ細胞活性の増加が見られた。また、脾臓由来の単核球でも、β−ＮＭＮ投与群では、コントロール群に比べてＮＫ細胞活性の増加が観察された。これらの結果から、別系統で、若齢のマウスであってもβ−ＮＭＮによってＮＫ細胞活性を増強させる効果が得られることが示された。
【００４６】
［実施例４］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（８ヶ月齢、メス）及びＢＡＬＢ／ｃマウス（８ヶ月齢、メス）を用いて、β−ＮＭＮを６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（β−ＮＭＮ（６２５ｍｇ）投与群、ｎ＝３）で４日間経口投与した。コントロール群（ｎ＝３）のマウスには、ＰＢＳを２００μＬ／ｄａｙで経口投与した。投与開始から４日後に、各マウスから肝臓及び脾臓を採取してＮＫ細胞活性を測定した。ＮＫ細胞活性の測定は、肝臓から採取した単核球ではEffector／Target比を２０、１０、又は５とした条件で、脾臓から採取した単核球ではEffector／Target比を２００、１００、又は５０とした条件で、それぞれ行った。
【００４７】
各処置群のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を図４に示す。いずれのマウスにおいても、肝臓由来の単核球と脾臓由来の単核球の両方において、β−ＮＭＮを４日間投与した群は、コントロール群に比べて有意にＮＫ細胞活性の増加が見られた。これらの結果から、マウスの系統にかかわらず、β−ＮＭＮを経口投与した場合であっても、ＮＫ細胞活性を増強させる効果が得られることが示された。
【００４８】
［実施例５］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（９ヶ月齢、メス）を用いて、β−ＮＭＮを１２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（β−ＮＭＮ（１２５ｍｇ）投与群、ｎ＝３）、３１３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（β−ＮＭＮ（３１３ｍｇ）投与群、ｎ＝３）、６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（β−ＮＭＮ（６２５ｍｇ）投与群、ｎ＝３）、又は１２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（β−ＮＭＮ（１２５０ｍｇ）投与群、ｎ＝３）で４日間腹腔内投与した。コントロール群（ｎ＝３）のマウスには、ＰＢＳを２００μＬ／ｄａｙで腹腔内投与した。投与開始から４日後に、各マウスから肝臓及び脾臓を採取してＮＫ細胞活性を測定した。ＮＫ細胞活性の測定は、肝臓から採取した単核球ではEffector／Target比を２０、１０、又は５とした条件で、脾臓から採取した単核球ではEffector／Target比を１００とした条件で、それぞれ行った。
【００４９】
各処置群のＮＫ細胞活性（％）の測定結果を図５に示す。この結果、肝臓由来の単核球と脾臓由来の単核球の両方において、β−ＮＭＮの容量依存的にＮＫ細胞活性の増加が観察された。
【図１】
2018002604.tif 000003
【図２】
2018002604.tif 000004
【図３】
2018002604.tif 000005
【図４】
2018002604.tif 000006
【図５】
2018002604.tif 000007