(57)【要約】【課題】天然物由来の成分の中から細胞接着因子の発現を抑制する作用を有するものを見出し、それを有効成分とする細胞接着因子発現抑制剤、および当該成分を配合した細胞接着因子発現抑制用飲食品を提供する。【解決手段】本発明に係る細胞接着因子発現抑制剤の有効成分として、ジガラクトシルジアシルグリセロールを含有させる。また、本発明に係る細胞接着因子発現抑制用飲食品に、ジガラクトシルジアシルグリセロールを配合する。【選択図】図２
2018100227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジガラクトシルジアシルグリセロールを有効成分として含有することを特徴とする細胞接着因子発現抑制剤。
【請求項２】
前記細胞接着因子は、ＩＣＡＭ−１および／またはＶＣＡＭ−１であることを特徴とする請求項１に記載の細胞接着因子発現抑制剤。
【請求項３】
ジガラクトシルジアシルグリセロールを配合したことを特徴とする細胞接着因子発現抑制用飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着因子発現抑制剤および細胞接着因子発現抑制用飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省の人口動態統計（２０１５年）によれば、日本人の死因は、悪性新生物、心疾患、肺炎、脳血管疾患の順となっており、動脈硬化が重要な原因となる心疾患および脳血管疾患が上位を占めている。また、心疾患および脳血管疾患は後遺症も強く、長期臥床を強いられる場合が多い。そのため、動脈硬化の予防、治療または改善は極めて重要である。
【０００３】
動脈硬化、特にその主要な割合を占めるアテローム性動脈硬化は、脂質異常症、糖尿病、高血圧、喫煙などの危険因子により生じると考えられており、最終的に動脈の血流が遮断され、心筋梗塞等の心疾患や脳梗塞等の脳血管疾患などの原因となる。
【０００４】
アテローム性動脈硬化の治療に対しては、一般的に、スタチンなどの抗高脂血症薬や、アンギオテンシン受容体遮断薬などの抗高血圧薬が用いられる。しかし、アテローム性動脈硬化の発生や進行には様々な要因が複雑に関与していることから、これらと作用機序の異なるアテローム動脈硬化抑制剤が求められている。
【０００５】
アテローム性動脈硬化は、血管内皮細胞が傷害を受けて活性化し、この内皮細胞に血液中の単球が接着する段階から進行すると考えられている。血管内皮細胞に接着した単球は、その内皮細胞の間から侵入し、マクロファージへと分化し、さらにコレステロール等の脂肪物質を取り込んで泡沫細胞へと変化する。この泡沫細胞が各種サイトカインや増殖因子等を分泌し動脈硬化病変の進行をもたらすと考えられている。
【０００６】
ここで、動脈硬化の初期段階である血管内皮細胞への単球の接着には、血管内皮細胞が活性化することでその細胞表面における細胞接着因子、例えばＩＣＡＭ−１（intercellular adhesion molecule-1）、ＶＣＡＭ−１（vascular cell adhesion molecule-1）などの発現が誘導され、これらの細胞接着因子が単球との接着に寄与することが知られている。そのため、細胞接着因子、例えばＩＣＡＭ−１やＶＣＡＭ−１の発現を抑制することができれば、動脈硬化の進行を抑制することができると考えられる。
【０００７】
細胞接着因子の発現を抑制する成分として、ジゴキシンに結合する抗体（特許文献１）、硫酸銅で安定化処理されたクマザサエキス（特許文献２）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００９−５４２６８２号公報
【特許文献２】特開２０１１−２１９４３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、天然物由来の成分の中から細胞接着因子の発現を抑制する作用を有するものを見出し、それを有効成分とする細胞接着因子発現抑制剤、ならびに当該成分を配合した細胞接着因子発現抑制用飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明に係る細胞接着因子発現抑制剤は、ジガラクトシルジアシルグリセロールを有効成分として含有することを特徴とする。また、本発明に係る細胞接着因子発現抑制用飲食品は、ジガラクトシルジアシルグリセロールを配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ジガラクトシルジアシルグリセロールを有効成分として含有させることにより、作用効果に優れた細胞接着因子発現抑制剤を提供することができる。さらに、ジガラクトシルジアシルグリセロールを配合することにより、上記作用に優れた細胞接着因子発現抑制用飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）に対するジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）の細胞毒性を評価した結果を表すグラフである。
【図２】ＨＵＶＥＣｓにおける細胞接着因子およびサイトカインの発現に対するＤＧＤＧの作用を評価した結果（ＲＴ−ＰＣＲ法）を表すグラフである。
【図３Ａ】ＨＵＶＥＣｓにおける細胞接着因子の発現に対するＤＧＤＧの作用を評価した結果（イムノブロット法）を表す写真である。
【図３Ｂ】図３Ａの結果を数値化したグラフである。
【図４Ａ】単球（ＴＨＰ−１）−血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）の接着に対するＤＧＤＧの作用を評価した結果を表す顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】図４Ａの顕微鏡写真から、接着した細胞数を計数した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤は、ジガラクトシルジアシルグリセロール（digalactosyl diacylglycerol，以下「ＤＧＤＧ」いうことがある。）を有効成分として含有するものである。また、本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制用飲食品は、ジガラクトシルジアシルグリセロールが配合されるものである。
【００１４】
ＤＧＤＧは、例えば、ＤＧＤＧを含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することができる。この場合、このようなＤＧＤＧを含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって得ることができる。ＤＧＤＧを含有する植物としては、例えば、ホウレンソウ、パイナップル、米、小麦、ジャガイモ、コマツナ、シュンギク等が挙げられる。
【００１５】
上記植物からＤＧＤＧを抽出・単離・精製する方法は特に限定されず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出処理は、抽出原料としての上記植物を乾燥した後、そのまままたは粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供すればよい。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
【００１６】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用することが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独でまたは２種以上を組み合わせて、室温または溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１７】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００１９】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を抽出溶媒として使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比が９：１〜１：９（容量比）であることが好ましく、７：３〜２：８（容量比）であることがさらに好ましい。また、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族ケトンとの混合比が９：１〜２：８（容量比）であることが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水と多価アルコールとの混合比が５：５〜１：９（容量比）であることが好ましい。
【００２０】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温または還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から、必要に応じて活性炭等を用いてクロロフィルを除去した後、溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２１】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物または当該抽出液の乾燥物からＤＧＤＧを単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、抽出物を展開溶媒に溶解し、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、ＤＧＤＧを含む画分を回収する方法等が挙げられる。この場合、展開溶媒は使用する固定相に応じて適宜選択すればよいが、例えば固定相としてシリカゲルを用いた順相クロマトグラフィーにより抽出物を分離する場合、展開溶媒としてはクロロホルム：メタノール：水＝４０：１０：０．１等が挙げられる。さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたＤＧＤＧを含む画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００２２】
〔細胞接着因子発現抑制剤〕
以上のようにして得られるＤＧＤＧは、優れた細胞接着因子発現抑制作用を有しているため、細胞接着因子発現抑制剤の有効成分として用いることができる。本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等の幅広い用途に使用することができる。
【００２３】
本実施形態において、ＤＧＤＧにより発現が抑制される細胞接着因子は、例えば、ＩＣＡＭ−１（intercellular adhesion molecule-1）、ＶＣＡＭ−１（vascular cell adhesion molecule-1）、ＰＥＣＡＭ−１（platelet endothelial cellular adhesion molecule-1）等の免疫グロブリンスーパーファミリー；ＬＦＡ−１やＶＬＡ４等のインテグリンファミリー；Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等のセレクチンファミリー；などが挙げられる。本実施形態において発現が抑制される細胞接着因子は、これらの中でも免疫グロブリンスーパーファミリーであることが好ましく、ＩＣＡＭ−１および／またはＶＣＡＭ−１であることが特に好ましい。ただし、ＤＧＤＧによって発現が抑制される細胞接着因子は、上記細胞接着因子に限定されるものではない。
【００２４】
また、ＤＧＤＧは、そのＩＣＡＭ−１発現抑制作用またはＶＣＡＭ−１発現抑制作用を利用して、ＩＣＡＭ−１発現抑制剤またはＶＣＡＭ−１発現抑制剤の有効成分として使用してもよい。
【００２５】
本実施形態において発現抑制の対象となる細胞接着因子は、血管内皮細胞の細胞接着因子であることが好ましい。
【００２６】
なお、本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤の有効成分として、単離したＤＧＤＧに替えて、ＤＧＤＧを含有する組成物を用いてもよい。ここで、本実施形態における「ＤＧＤＧを含有する組成物」には、ＤＧＤＧを含有する植物を抽出原料として得られる抽出物等が含まれる。また、「抽出物」には、抽出処理により得られる抽出液、当該抽出液の希釈液もしくは濃縮液、または当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物が含まれる。
【００２７】
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤の有効成分として、ＤＧＤＧを含有する組成物を用いる場合は、精製してＤＧＤＧの純度を高めたものを使用することが好ましい。ＤＧＤＧの純度を高めたものを有効成分として使用することによって、より一層作用効果に優れた細胞接着因子発現抑制剤を得ることができる。
【００２８】
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤は、ＤＧＤＧまたはＤＧＤＧを含有する組成物のみからなるものでもよいし、ＤＧＤＧまたはＤＧＤＧを含有する組成物を製剤化したものでもよい。
【００２９】
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。細胞接着因子発現抑制剤は、他の組成物（例えば、後述する細胞接着因子発現抑制用飲食品等）に配合して使用することができるほか、錠剤、カプセル剤等として使用することができる。
【００３０】
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤を製剤化した場合、ＤＧＤＧまたはＤＧＤＧを含有する組成物の含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。
【００３１】
なお、本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤は、必要に応じて、細胞接着因子発現抑制作用を有する他の天然抽出物等を、ＤＧＤＧまたはＤＧＤＧを含有する組成物とともに配合して有効成分として用いることができる。
【００３２】
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤の患者に対する投与方法としては、経口投与、静脈内投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防または治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３３】
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤は、有効成分であるＤＧＤＧが有する細胞接着因子発現抑制作用、特にＩＣＡＭ−１発現抑制作用またはＶＣＡＭ−１発現抑制作用を通じて、血管内皮細胞への単球の接着を抑制し、動脈硬化；動脈硬化に起因した虚血性心疾患；脳出血や脳梗塞等の動脈硬化に起因した脳血管疾患；などを予防、治療または改善することができる。ただし、本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤は、これらの用途以外にも、細胞接着因子発現抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３４】
また、本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤は、優れた細胞接着因子発現抑制作用を有するので、これらの作用機構に関する研究のための試薬としても好適に利用することができる。
【００３５】
〔細胞接着因子発現抑制用飲食品〕
ＤＧＤＧは、優れた細胞接着因子発現抑制作用を有しているため、細胞接着因子発現抑制用の飲食品に配合するのに好適である。この場合、ＤＧＤＧをそのまま配合してもよいし、ＤＧＤＧから製剤化した細胞接着因子発現抑制剤を配合してもよい。
【００３６】
ここで、飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口または消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品等の区分に制限されるものではない。したがって、本実施形態における「飲食品」は、経口的に摂取される一般食品、健康食品（機能性飲食品）、保健機能食品（特定保健用食品，栄養機能食品）、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。
【００３７】
ＤＧＤＧまたは上記細胞接着因子発現抑制剤を飲食品に配合することにより、細胞接着因子発現抑制作用、特にＩＣＡＭ−１発現抑制作用またはＶＣＡＭ−１発現抑制作用を飲食品に付与することができる。
【００３８】
ＤＧＤＧ、またはＤＧＤＧから製剤化した細胞接着因子発現抑制剤を飲食品に配合して細胞接着因子発現抑制用飲食品とする場合、それらにおける有効成分の配合量は、使用目的、症状、性別等を考慮して適宜変更することができるが、添加対象となる飲食品の一般的な摂取量を考慮して、成人１日あたりの抽出物摂取量が約１〜１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。なお、添加対象飲食品が顆粒状、錠剤状またはカプセル状の飲食品の場合、ＤＧＤＧ、またはＤＧＤＧから製剤化した細胞接着因子発現抑制剤の添加量は、添加対象飲食品に対して通常０．１〜１００質量％であり、好ましくは５〜１００質量％である。
【００３９】
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制用飲食品は、ＤＧＤＧをその活性を妨げないような任意の飲食品に配合したものであってもよいし、ＤＧＤＧを主成分とする栄養補助食品であってもよい。
【００４０】
本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制用飲食品を製造する際には、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類などの任意の助剤を添加して任意の形状の飲食品にすることができる。
【００４１】
ＤＧＤＧを配合し得る飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液および調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などが挙げられ、これらの飲食品にＤＧＤＧを配合するときに、通常用いられる補助的な原料や添加物を併用することができる。
【００４２】
なお、本実施形態に係る細胞接着因子発現抑制剤および細胞接着因子発現抑制用飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ，ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、製造例、試験例および配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４４】
なお、後述する試験例において、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）およびPKH26 Red Fluorescent Cell Linker KitはSigma Aldrich社より購入したものを用いた。抗ＩＣＡＭ−１、抗ＶＣＡＭ−１、および抗β−アクチンの各抗体は、Cell Signaling Technology社製のものを用いた。ＨＲＰ標識した抗ウサギＩｇＧ抗体およびenhanced chemiluminescence（ＥＣＬ）systemはＧＥヘルスケア社より購入した。
【００４５】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）はCambrex Bio Science Walkersville社より購入した。ＨＵＶＥＣｓは、内皮細胞基礎培地（ＥＢＭ−２；Lonza社製）に、増殖因子であるＥＧＭ−２ＭＶ添加因子（ＥＢＭ−２に付属）を添加した培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト急性単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）はＪＣＲＢ細胞バンクより購入し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Life technologies社製）に１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質（いずれもLife technologies社製）を添加した培地で培養した。
【００４６】
〔製造例〕ＤＧＤＧの製造
乾燥ホウレンソウ（２００ｇ）を７０％エタノール（２Ｌ）で２時間、還流抽出した。ろ過後、抽出液に活性炭を加え、還流下で１時間撹拌した後、濾過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、糖脂質混合物（４８．７ｇ）を得た。糖脂質混合物（４７．５ｇ）をカラムクロマトグラフィー（担体：ダイヤイオンＨＰ−２０，三菱化学社製）に付し、７０％エタノール、９５％エタノール、クロロホルムの順で溶出させ、クロロホルム溶出部（２．７ｇ）を得た。クロロホルム溶出部（２．６ｇ）を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（担体：Silica gel 60，メルク社製）に付し、クロロホルム−メタノール−水（４０：１０：０．１）で分画し、糖脂質画分（４２５ｍｇ）を得た。糖脂質画分（４２５ｍｇ）を、リサイクルＨＰＬＣ（溶媒：メタノール，カラム：JAIGEL GS310を２本連結（500×20 mm i.d.）（日本分析工業社製），使用機器：YMC LC-forte/R（ワイエムシィ社製））で精製し、精製物（３０３ｍｇ，０．１５％）を得た。得られた精製物について１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＤＥＰＴにより解析し、ＤＧＤＧ（試料１）であることが確認された。
【００４７】
〔試験例１〕ＨＵＶＥＣｓに対する細胞毒性の評価
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）に対する細胞毒性の検討は、Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System（タカラバイオ社製）を用い、製品添付の試験方法に従って行った。具体的には、ＨＵＶＥＣｓを前述した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２で前培養し、９６ウェルプレートの各ウェルに１×１０３cellsずつ播種し、４時間培養した後に被験試料（試料１，最終濃度は図１を参照）を添加し、さらに２４時間培養した。培養後、Premix WST-1溶液（タカラバイオ社製）を添加して３０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダー（Multiscan FC，ThermoFisher Scientific社製）を用いて４４０ｎｍの波長の吸光度を測定した。得られた各データを平均値±標準偏差で示した。
【００４８】
結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＤＧＤＧ（試料１）は、試験した濃度においては血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）に対する細胞毒性を示さなかった。
【００４９】
〔試験例２〕細胞接着因子およびサイトカインの発現抑制作用の評価（ＲＴ−ＰＣＲ法）
ＨＵＶＥＣｓを前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．４×１０４cells/mLの細胞密度になるように前培養と同じ培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に２ｍＬずつ播種し、３７℃・５％ＣＯ２で４８時間培養した。
【００５０】
培養後に培地を除去し、被験試料（試料１，５μg/mL）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ，１μg/mL）が添加された培地を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃・５％ＣＯ２にて２時間培養した。なお、コントロールの細胞は試料およびＬＰＳ無添加の培地にて、また発現誘導細胞は試料無添加・ＬＰＳ添加の培地にて、それぞれ同様に培養した。培養後、培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）にて総ＲＮＡを抽出した。
【００５１】
この総ＲＮＡ１μgを鋳型とし、ランダムプライマーおよびＭＭＬＶ逆転写酵素（ReverTra Ace，東洋紡社製）を用いて逆転写反応を行った。その後、ＰＣＲ装置（LightCycler480システム，Roche Diagnostics社製）およびQuantiTect SYBR Green PCR kit（QIAGEN社製）を用い、定量リアルタイムＰＣＲを行い、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。
【００５２】
結果を図２に示す。ＬＰＳによるＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の各ｍＲＮＡに対する発現誘導は、ＤＧＤＧ（試料１）によりいずれも抑制された。
【００５３】
〔試験例３〕細胞接着因子の発現抑制作用の評価（イムノブロット法）
ＨＵＶＥＣｓを前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．４×１０４cells/mLの細胞密度になるように前培養と同じ培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に２ｍＬずつ播種し、３７℃・５％ＣＯ２で４８時間培養した。
【００５４】
培養後に培地を除去し、被験試料（試料１，５μg/mL）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ，１μg/mL）が添加された培地を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃・５％ＣＯ２にて４時間培養した。なお、比較対象としてＬＰＳ無添加の培地（被験試料濃度は図３Ａおよび図３Ｂを参照）についても同様に培養した。培養後、培地を除去し、ＲＩＰＡ溶解液（ThermoFisher Scientific社製）にて溶解し、得られたサンプルをイムノブロットに供した。抗ＩＣＡＭ−１、抗ＶＣＡＭ−１、および抗β−アクチンの各一次抗体（いずれもCell Signaling Technology社製）、ならびに二次抗体としてＨＲＰ標識した抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、enhanced chemiluminescence（ＥＣＬ）systemにて検出した。得られた結果に基づき、画像解析ソフトであるImage-Jを用いてシグナル強度を数値化した。
【００５５】
結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。ＤＧＤＧ（試料１）は、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の発現誘導を抑制した。
【００５６】
〔試験例４〕ＨＵＶＥＣｓに対する単球接着抑制作用の評価
ＨＵＶＥＣｓを前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに５×１０４cellsずつ播種し２４時間培養した後、リポポリサッカライド（ＬＰＳ，１μg/mL）が添加または無添加のＰＢＳ緩衝液にて２４時間処理した。このように処理したＨＵＶＥＣｓに対し、PKH26 Redにて標識したヒト急性単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）２×１０５cellsを添加し、さらに被験試料（試料１，５μg/mL）または対照（ＤＭＳＯ）にて１時間インキュベートした。その後、接着しなかった細胞をＰＢＳ緩衝液にて洗浄した後、培養細胞を４％パラホルムアルデヒドにて１０分間固定し、ＰＢＳ緩衝液にて洗浄した。接着した赤色蛍光を有するＴＨＰ−１細胞を、蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬセルイメージングシステム，ThermoFisher Scientific社製)を用いて計数した。接着した細胞は、２連のウェルからランダムに選択した５視野から計数し、各試験は４回繰り返した。
【００５７】
結果を図４Ａ（顕微鏡写真）および図４Ｂ（計数結果のグラフ）に示す。ＬＰＳによって誘導された単球（ＴＨＰ−１）の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）への接着は、ＤＧＤＧ（試料１）により抑制された。
【００５８】
〔配合例１〕
常法により、以下の組成を有する細胞接着因子発現抑制用錠剤を製造した。
ＤＧＤＧ                                                ５．０ｍｇ
ドロマイト（カルシウム20％、マグネシウム10％含有）    ８３．４ｍｇ
カゼインホスホペプチド                                １６．７ｍｇ
ビタミンＣ                                            ３３．４ｍｇ
マルチトール                                        １３６．８ｍｇ
コラーゲン                                            １２．７ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル                                  １２．０ｍｇ
【００５９】
〔配合例２〕
常法により、以下の組成を有する細胞接着因子発現抑制用経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
ＤＧＤＧ                                                ０．３質量％
ソルビット                                            １２．０質量％
安息香酸ナトリウム                                      ０．１質量％
香料                                                    １．０質量％
硫酸カルシウム                                          ０．５質量％
精製水                                        残部（１００質量％）
【００６０】
〔配合例３〕
常法により、下記の組成を有するコーヒー飲料を製造した。
ＤＧＤＧ                                                ０．１質量部
コーヒー抽出液（Ｌ（明度）＝２０、Ｂｒｉｘ＝３）      ４０質量部
マルチトール                                            ２質量部
香料                                                  適量
水                                            残部（１００質量部）
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明に係る細胞接着因子発現抑制剤および細胞接着因子発現抑制用飲食品は、動脈硬化；動脈硬化に起因した虚血性心疾患；脳出血や脳梗塞等の動脈硬化に起因した脳血管疾患；などに大きく貢献できる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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