(57)【要約】【課題】乾燥した安定な止血組成物を作製するプロセスを提供すること。【解決手段】ａ）凝固誘導剤の乾燥調製物を含む第１の成分を提供するステップと、ｂ）止血に使用するのに適した生体適合性ポリマーの乾燥調製物を含む第２の成分を提供するステップと、ｃ）第１の成分によって第２の成分が分解するのを本質的に防止しながら、湿潤ペーストを形成するのに有効な条件下で、第１の成分と第２の成分を最終容器内で混合するか、または湿潤ペーストを最終容器に移すステップと、ｄ）容器内のペーストを冷凍し、凍結乾燥し、それによって第１の成分および第２の成分を含む、凍結乾燥形態の乾燥した安定な止血用組成物を得るステップと、ｅ）最終容器内で、乾燥した安定な止血用組成物を、乾燥した安定な止血用組成物として組み合わされた形態の第１の成分および第２の成分を含有する保存できる医薬デバイスに完成させるステップとを含むプロセスを記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥した保存安定性の止血用組成物を作製するための方法など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保存安定性形態の止血用組成物を作製するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体適合性、生分解性の乾燥した安定な粒状材料を含む、乾燥した保存安定性形態の止血用組成物は、例えば特許文献１または特許文献２から公知である。これらの生成物は、止血技術分野での適用に成功している。Ｆｌｏｓｅａｌ（登録商標）は、多用途の強力な止血剤の一例であり、これは、トロンビンを含有する溶液中で膨張して流動性ペーストを形成する粒状ゼラチンマトリックスからなる。
【０００３】
かかる生成物はヒトに適用されなければならないので、最終生成物およびその成分の品質、保存安定性および滅菌性に関して最高の安全標準を提供することが必要である。他方で、製造および取扱いは、可能な限り好都合かつ効率的に行われるべきである。止血用組成物が、使用にトロンビン成分を必要とする場合、このトロンビン成分を最終生成物に供給することは難問である。トロンビンおよびマトリックス材料は、通常、製造要件に関して異なる特性を有するので、別個に製造し、提供しなければならない。例えば、滅菌要件は、相対的に安定な粒状の（しばしば架橋もされている）マトリックス材料と、トロンビンなどのタンパク質性成分との間で著しく異なり得る。かかるマトリックス材料は、通常、強力な滅菌法（加圧蒸気殺菌法、ガンマ照射等）によって滅菌され得るのに対して、トロンビン（酵素として）は、より注意しながら処理しなければならない。それらの強力な滅菌法は、かかる過酷な処理によって酵素活性の喪失が引き起こされるため、通常はトロンビンに対して可能ではない。安定性の理由から、かかる生成物（ならびに本発明の生成物）は、通常、乾燥形態で提供され、使用直前に「すぐに使用できる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）」形態（通常は、（ヒドロ）ゲル、懸濁物または溶液の形態である）にされるが、これには、湿潤剤または溶媒和剤（懸濁剤）を添加し、マトリックス材料の成分を、トロンビン成分と混合することが必要である。トロンビンを再構成するか、またはトロンビン溶液を粒状マトリックス材料と混合するステップは、通常、ある程度の時間および取扱いを必要とし、特に集中的な健康ケアにおいて問題を引き起こすおそれがあるステップである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９８／００８５５０号
【特許文献２】国際公開第２００３／００７８４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一目的は、かかる問題を克服し、好都合に提供および使用できる乾燥した保存安定性の止血用組成物を作製するための適切な方法を提供することである。これらの方法は、特に取扱いステップの数が可能な限り少なく保たれるべき集中ケア用の医薬品において、「すぐに使用できる」止血用組成物を好都合に提供することができる生成フォーマットを提供するべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
乾燥した安定な止血用組成物を作製するためのプロセスであって、
ａ）凝固誘導剤の乾燥調製物を含む第１の成分を提供するステップと、
ｂ）止血に使用するのに適した生体適合性ポリマーの乾燥調製物を含む第２の成分を提供するステップと、
ｃ）該第１の成分によって該第２の成分が分解するのを本質的に防止しながら、湿潤ペーストを形成するのに有効な条件下で、該第１の成分と該第２の成分とを最終容器内で混合するか、または該湿潤ペーストを最終容器に移すステップと、
ｄ）該容器内の該ペーストを冷凍および凍結乾燥して、該第１の成分および該第２の成分を含む、凍結乾燥形態の乾燥した安定な止血用組成物を得るステップと、
ｅ）該最終容器内で、該乾燥した安定な止血用組成物を、乾燥した安定な止血用組成物として組み合わされた形態の該第１の成分および該第２の成分を含有する保存できる医薬デバイスへと完成させるステップと
を含む、プロセス。
（項目２）
ステップｃ）が、無菌条件下で実施される、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
ステップｃ）が、押出しによって実施される、項目１または２に記載のプロセス。
（項目４）
ステップｄ）が、エチレンオキシド滅菌ステップまたは電離放射線照射を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５）
前記第１の成分が、ＣａＣｌ２溶液中のトロンビンを含有する、項目１から４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６）
前記第１の成分が、トロンビンを１０〜１０，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、より好ましくは５０〜５，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、特に１００〜１，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌの濃度で含有する、項目１から５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７）
前記ペーストが、ステップｃ）の実施後に、前記最終容器内で冷凍される、項目１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目８）
前記最終容器として、シリンジが使用される、項目１から７のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目９）
前記シリンジが、前記乾燥した安定な止血用組成物を再構成するための薬学的に許容される希釈剤を有する希釈剤シリンジと共に完成させられたシリンジである、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
前記第１の成分が、ヒトトロンビンを含む、項目１から９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１１）
前記第１の成分が、組換えヒトトロンビンを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１２）
止血に使用するのに適した前記生体適合性ポリマーが、ゼラチン、可溶性コラーゲン、アルブミン、ヘモグロビン、フィブリノゲン、フィブリン、カゼイン、フィブロネクチン、エラスチン、ケラチンおよびラミニン、またはその誘導体もしくは組合せからなる群より選択されるタンパク質を含有する、項目１から１１のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１３）
止血に使用するのに適した前記生体適合性ポリマーが、グリコサミノグリカン、デンプン誘導体、セルロース誘導体、ヘミセルロース誘導体、キシラン、アガロース、アルギネートおよびキトサン、またはその誘導体もしくは組合せからなる群より選択される多糖を含有する、項目１から１２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１４）
止血に使用するのに適した前記生体適合性ポリマーが、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニル樹脂、ポリラクチド−グリコリド、ポリカプロラクトンおよびポリオキシエチレン、ならびにその誘導体および組合せからなる群より選択されるポリマーを含有する、項目１から１３のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１５）
止血に使用するのに適した前記生体適合性ポリマーが、架橋多糖、架橋タンパク質もしくは非生物学的架橋ポリマー、またはその混合物を含有する、項目１から１４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１６）
止血に使用するのに適した前記生体適合性ポリマーが、粒状材料である、項目１から１５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１７）
止血に使用するのに適した前記生体適合性ポリマーが、架橋ゼラチンである、項目１から１６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１８）
前記最終容器が、滅菌放射線に曝露されるときの前記ポリマーの修飾を阻害するのに有効な量の安定剤、好ましくはアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸の他の塩または抗酸化剤をさらに含有する、項目１から１７のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１９）
患者の身体の標的部位に止血用組成物を送達するための方法であって、項目１から１８のいずれか一項に記載のプロセスによって生成された止血用組成物を、該標的部位に送達するステップを含む、方法。
（項目２０）
前記止血用組成物を薬学的に許容される希釈剤と接触させて、ヒドロゲル形態の止血用組成物を得るステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
項目１から１８のいずれか一項に記載のプロセスによって得られる、完成した最終容器。
（項目２２）
すぐに使用できる止血用組成物を提供するための方法であって、項目１から１８のいずれか一項に記載のプロセスによって生成された止血用組成物を、薬学的に許容される希釈剤と接触させるステップを含む、方法。
（項目２３）
項目２１に記載の完成した容器と、薬学的に許容される希釈剤を含む容器とを含む、止血用組成物を投与するためのキット。
したがって、本発明は、乾燥した安定な止血用組成物を作製するプロセスであって、
ａ）乾燥トロンビン調製物などの凝固誘導剤の乾燥調製物を含む第１の成分を提供するステップと、
ｂ）止血に使用するのに適した生体適合性ポリマーの乾燥調製物を含む第２の成分を提供するステップと、
ｃ）前記第１の成分によって第２の成分が分解するのを本質的に防止しながら、湿潤ペーストを形成するのに有効な条件下で、前記第１の成分と前記第２の成分とを最終容器内で混合するか、または前記湿潤ペーストを最終容器に移すステップと、
ｄ）前記容器内の前記ペーストを冷凍し、凍結乾燥し、それによって前記第１の成分および前記第２の成分を含む、凍結乾燥形態の乾燥した安定な止血用組成物を得るステップと、
ｅ）前記最終容器内で、前記乾燥した安定な止血用組成物を、乾燥した安定な止血用組成物として組み合わされた形態の前記第１の成分および前記第２の成分を含有する保存できる医薬デバイスへと完成させるステップと
を含むプロセスを提供する。
【０００７】
本プロセスは、組成物が医学的使用のために容易に再構成されることを可能にするのに好都合な方式において、本発明の乾燥した安定な組成物を提供する。本発明はさらに、患者の身体の標的部位に止血用組成物を送達する方法であって、本発明のプロセスによって生成された止血用組成物を前記標的部位に送達するステップを含む方法に関する。もう１つの態様によれば、本発明は、本発明のプロセスによって得られる、完成した最終容器に関する。本発明はまた、すぐに使用できる止血用組成物を提供する方法であって、本発明のプロセスによって生成された止血用組成物を、薬学的に許容される希釈剤と接触させるステップを含む、方法、ならびに完成した最終容器と、該組成物を適用するための他の手段（例えば希釈剤容器）とを含むキットに関する。本発明の組成物は、外科手術による出血部位、外傷性出血部位等を含む出血部位において止血するのに特に有用である。組成物の例示的な使用は、血管カテーテル法のために作られた血管貫入部の上の組織路（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｃｔ）をふさぐことであり得る。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、主に、好都合な単一の組成物フォーマットで２成分の生成物を提供することによって、止血用組成物の送達および取扱いを改善することを提供する。本発明の止血用組成物は、乾燥トロンビン調製物などの凝固誘導剤の乾燥調製物を含む第１の成分（「凝固誘導剤の成分」または「トロンビン成分」）と、止血に使用するのに適した生体適合性ポリマーの乾燥調製物を含む第２の成分（「止血用生体適合性ポリマー成分」）とを含有する。さらなる成分が存在することもできる。この種の生成物は、基本的に当技術分野では、今はまだ、異なるフォーマットにおけるものとして知られており、通常、その成分は、別々の実体として乾燥形態で提供される。患者に投与するために成分を混合する前に、乾燥した成分を、通常、適切な希釈剤と別個に接触させる。次に、別個に再構成された成分を混合することによって、成分の混合を実施する。例えば、薬学的に許容される（水性）希釈剤によって再構成される、例えばトロンビン成分などの凝固誘導剤の乾燥調製物を提供することができる。次に、再構成後に得られたトロンビン溶液などの凝固誘導剤の溶液は、通常は、後に患者に適用されるヒドロゲルの形成下で、ポリマーを湿潤または可溶化するために使用される。これは、生成物が「すぐに使用できる」状態になる前に少なくとも２つのステップがあるプロセスであることから、生成物がすぐに使用できる状態になる前に１ステップだけで済むならば、より好都合となる。しかし前述の通り、２つの成分の性質により、主に安定性および活性の喪失に起因して、生成方法の過程では、成分の単純な混合が妨げられる。
【０００９】
本発明では、２つの成分を、すぐに一緒に再構成される、組み合わされた乾燥形態においてあらかじめ提供することができる生成プロセスを提供する。本発明のプロセスは、科学的ベンチ実験に関して可能なだけでなく、産業用医薬品の大量生産にも適している。本発明により、酵素活性の望ましくない分解または喪失の危険を伴わずに、あらかじめ混合されたこの止血用組成物を提供することが可能になった。得られた組成物は、既に公知の生成物に匹敵する保存安定性を有するが、本発明によって得られる生成物では、医薬品を投与する前に別々に再構成し、混合する必要がないため、取扱いがより好都合である。適切な薬学的に許容される希釈剤を、最終容器内の組成物に単に添加することによって、１ステッププロセスで、止血用組成物のすぐに使用できるヒドロゲル、懸濁物または溶液を提供できる。最終容器は、好ましくは、希釈剤と接触させた後に、再構成した止血用組成物を直接投与するように設計されたシリンジである。
【００１０】
凝固誘導剤は、トロンビン、ヘビ毒、血小板活性化因子、トロンビン受容体活性化ペプチドおよびフィブリノゲン沈殿剤からなる群より選択される物質であり、好ましくはトロンビンである。
【００１１】
「トロンビン溶液」は、ヒトにおける使用に適した（すなわち薬学的に許容される）任意のトロンビン調製物から生成され得る。トロンビンの適切な供給源には、ヒトまたはウシの血液、血漿または血清（有害な免疫反応が予測されない場合には、他の動物供給源のトロンビンも適用され得る）および組換え起源のトロンビン（例えば、ヒト組換えトロンビン）が含まれ、いくつかの適用では自己ヒトトロンビンが好ましいことがある。第１の成分で提供されるトロンビン溶液の濃度は、通常、再構成された止血用組成物において計画されるトロンビン濃度に調整される。好ましくは、止血用組成物は、１０〜１００，０００国際単位（Ｉ．Ｕ．）、より好ましくは１００〜１０，０００Ｉ．Ｕ．、特に５００〜５，０００Ｉ．Ｕ．のトロンビンを含有する。「すぐに使用できる」組成物におけるトロンビン濃度は、好ましくは１０〜１０，０００Ｉ．Ｕ．、より好ましくは５０〜５，０００Ｉ．Ｕ．、特に１００〜１，０００Ｉ．Ｕ．の範囲である。希釈剤は、「すぐに使用できる」組成物において所望の最終濃度を達成する量で使用される。
【００１２】
本発明の「生体適合性ポリマーの乾燥調製物」は、例えばＷＯ９８／０８５５０Ａから公知である。好ましくは、ポリマーは、生体適合性、生分解性の乾燥した安定な粒状材料である。本発明の「乾燥」ポリマーは、通常、０．１〜５，０００μｍの粒径で提供される。通常、ポリマー粒子は、１０〜１０００μｍ、特に５０〜５００μｍの平均粒子直径（メジアンサイズ）を有する（「平均粒子直径」は、レーザー回折法によって測定されるメジアンサイズであり、「メジアンサイズ」（または質量メジアン粒子直径）は、度数分布を二等分する粒子直径であり、所与の調製物の粒子の５０パーセントは、より大きい直径を有し、粒子の５０パーセントは、より小さい直径を有する）。大きい粒子の適用は医学的な必要性に主に依存し、平均粒子直径が小さい粒子は、生成プロセスにおける取扱いがしばしばより困難である。したがって乾燥ポリマーは、粒状形態で提供される。粉末および粒状（または顆粒）という用語は、時に、別個のクラスの材料を区別するために使用されるが、粉末は、本明細書では粒状材料の特別な部分集合として定義される。特に、粉末は、より細かい粒度を有し、したがって流れるときに凝集塊を形成する傾向がより高い粒状材料を指す。粒状物には、湿潤化するとき以外は凝集塊を形成する傾向がない、より粗い粒状材料が含まれる。
【００１３】
本発明の「乾燥した」止血用組成物は、Ｆｌｏｓｅａｌ（登録商標）などの比較できる利用可能な生成物の水分含量にほぼ相当し得る残存水分含量だけを有する（Ｆｌｏｓｅａｌは、例えば乾燥生成物として約１２％の水分を有する）。通常、本発明の乾燥組成物は、これらの生成物を下回る残存水分含量、好ましくは１０％を下回る水分、より好ましくは５％を下回る水分、特に１％を下回る水分を有する。本発明の止血用組成物は、より低い、例えば０．１％またはそれをさらに下回る水分含量を有することもできる。本発明の乾燥した止血用組成物の好ましい水分含量は、０．１〜１０％、特に０．５〜５％である。
【００１４】
本発明によれば、止血用組成物は、乾燥形態で最終容器に入れて提供される。乾燥形態では、成分を分解または不活化するプロセスが著しくかつ適切に低減されて、保存安定性となる。適切な保存安定性は、トロンビン活性を基にして決定することができる。したがって、本発明の種類の乾燥した止血用組成物は、乾燥形態で室温（２５℃）において２４カ月間保存してから再構成した後、４００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ以上（５００Ｉ．Ｕ．／ｍｌの生成物に対して）がなおも存在する（すなわち、凍結乾燥する前の最初の活性と比較して、８０％以上のトロンビン活性が残っている）場合に、保存安定性がある。好ましくは、本発明の組成物は、この２４カ月の保存の後に、より高い保存安定性を有し、すなわち少なくとも９０％のトロンビン活性が残り、特に少なくとも９５％のトロンビン活性が残る。
【００１５】
しかし、混合および凍結乾燥は、関連するポリマーおよび／または凝固誘導剤、例えばトロンビンの分解を防止するように実施されなければならないので、例えばトロンビン溶液などの凝固誘導剤の溶液と生体適合性ポリマーを混合して湿潤ペーストにすることによって生成される湿潤ペーストを提供し、それを凍結乾燥することは、ありふれたことではない。これは、分解を本質的に防止する条件下で混合ステップを実施し、最終容器内で、混合プロセスから得られる湿潤ペーストを冷凍することによって、本発明により保護される。次に、組成物を、さらなる分解プロセスの危険を伴わずに、適切に凍結乾燥することができる。本発明では、混合中の湿潤状態および凍結乾燥前のペースト状態での接触時間（凝固誘導剤の溶液、例えばトロンビン溶液とポリマーとの接触）も、可能な限り短く保持されることが重要である。本発明による、湿潤状態の間の最大接触時間は、様々なパラメータに依存して決まり、本方法に適した接触時間は、このパラメータに基づき、本明細書に開示の情報に基づいて当業者によって容易に調整され得る。適切な接触時間を規定するのに最も重要なパラメータは、温度、含水量およびトロンビン濃度である。例えば、トロンビン溶液４ｍｌおよびポリマー０．８ｇ（例えば、水と結びついたゼラチン顆粒であり、乾燥ゼラチン粉末０．７０４ｇに相当する）を含むペースト中、５００Ｉ．Ｅ．／ｍｌのトロンビン溶液では、湿潤状態（すなわち、ペースト形態）におけるポリマーとの最大接触時間は、約４℃、１５℃および室温（２５℃）では２５時間、６時間および２時間である。特に本発明で使用される温度は、約２℃〜約２５℃、好ましくは約２℃〜１５℃、特に好ましくは約４℃である。トロンビンなどの凝固誘導剤の濃度が高いか、または含水量が高いほど、湿潤状態の間の最大接触時間が短くなる。したがって、湿潤状態における好ましい接触時間は、５分〜６時間、さらにより好ましくは５分〜２時間、特に５分〜３０分の範囲である。好ましくは、混合ステップは、低温で、例えば１〜１０℃、特に２〜６℃で実施される。
【００１６】
本発明の混合ステップは、著しく多量の液相を含有しない湿潤ペーストをもたらし、すなわち、本発明のペーストは、自由液体をほとんど含まないことも重要である。本発明の湿潤ペーストは流動性がある（ある度合いの流動性を有する）が、ペーストとして取り扱うのに十分な粘性も有する（例えば、好ましい粘度は、約１０〜１００Ｐａ．ｓおよびそれ以上）。このことは、凍結乾燥前の混合中、分解プロセスを防止するために重要である。可溶性（懸濁）形態（本発明のペースト形態ではない）の成分を混合し、次に乾燥プロセスを開始すると、許容されない材料の分解が生じる。例えば、トロンビンおよびゼラチンを４℃に保っても、２４時間後には明らかな分解が見られる。
【００１７】
これに関して別の重要なパラメータは、混合ステップにおける凝固誘導剤、例えばトロンビン成分の量である。この量は、湿潤ペーストを作るのに十分多くなければならないが、著しく多量の液相を作るほど多量であってはならない。したがって、８５％ｗ／ｗを超える凝固誘導剤、例えばトロンビンの溶液を添加すると、湿潤ペースト中に、過剰でないとは言えない（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｅｘｃｅｓｓ）液体の凝固誘導剤、例えばトロンビンを生じることがあり、したがって、８５％ｗ／ｗを超える量は、好ましくは回避されるべきである。好ましい混合比は、約８０％ｗ／ｗで始まり、それ以下である（すなわちトロンビン溶液８０ｍｌ／乾燥ポリマー２０ｇ）。より少ない凝固誘導剤の含量、例えばトロンビンの含量は、得られる湿潤ペーストの取扱い性能を試験することによって、特定のポリマーに合わせて容易に調整することができる。通常、凝固誘導剤溶液、例えばトロンビン溶液の含量が６０〜８０％に近いペーストは、取扱いがより容易であり、さらに、押出し混合物について、凝固誘導剤の含量、例えばトロンビンの含量が低い方が、取扱いに重大な障害が生じない。５０％未満の凝固誘導剤溶液、例えばトロンビン溶液によって形成される湿潤ペーストは、取扱いにおいて（例えばシリンジ内で）問題となり得る流動性の喪失の可能性に起因して、問題を伴うことがある。
【００１８】
したがって、本発明は、この目的に到達するために、基本的に２つの実施形態を使用する。第１の原理は、最終容器内で２つの成分を混合し、次にその混合物を凍結乾燥することを含み、あるいは、成分を容器の外側で混合して湿潤ペーストを形成し、次に例えば押出しによって、最終容器に移すことができる。混合は、例えば、２つの連結容器（例えば、シリンジ）の間で「噴出（ｓｗｏｏｓｈｉｎｇ）」させることによって、または２つの成分を押出機に入れ、押出し生成物を押し出して最終容器に入れることによって達成され得る。好ましくは、得られた混合物（すなわち、湿潤スラリー）は、冷凍および凍結乾燥される。
【００１９】
好ましくは、本発明のプロセスは、無菌環境で実施され、特に混合ステップは、無菌で実施されるべきである。既に適切に滅菌された成分によってプロセスを開始し、次にすべてのさらなるステップを無菌で実施することも好ましい。
【００２０】
本方法の最終ステップは、完成ステップである。このステップの最中、最終容器は、適切に密封され、保存および／または販売に合わせて準備される。完成ステップは、最終容器にラベル付けし、パッケージングし、（さらなる）滅菌プロセスを実施する（例えば、最終容器で、または最終容器を含むパッケージされた生成物もしくはキットで実施される）ことを含み得る。
【００２１】
好ましくは、完成ステップは、ＥＯ（エチレンオキシド）滅菌ステップを含む。ＥＯ滅菌は、本発明の技術分野では一般的である。エチレンオキシドガスは、細菌（およびそれらの内生胞子）、カビおよび真菌を死滅させる。ＥＯ滅菌は、低温殺菌または加圧蒸気殺菌法などの高温技術によって損傷を受ける物質を滅菌するために使用される。
【００２２】
滅菌の他の好ましい実施形態は、βもしくはγ照射などの電離放射線照射を適用するか、または気化した過酸化水素を使用することである。
【００２３】
好ましい一実施形態によれば、最終容器は、滅菌放射線に曝露されるときのポリマーの修飾を阻害するのに有効な量の安定剤、好ましくはアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸の他の塩または抗酸化剤をさらに含有する。
【００２４】
最終容器は、薬学的に投与できる化合物を収容（および保存）するのに適した任意の容器であり得る。シリンジ、バイアル、管等を使用することができるが、本発明の止血用組成物をシリンジに入れて提供することが特に好ましい。医療の実施ではシリンジの取扱いが有利であることから、シリンジは、従来技術に開示されている止血用組成物についても、好ましい投与手段となっている。次に組成物は、好ましくはシリンジの特定の針または適切なカテーテルを介して適用することができる（再構成した後）。再構成した止血用組成物（好ましくは、ヒドロゲルを形成するために再構成される）は、様々な他の手段によって、例えばヘラ、ブラシ、スプレーによって、圧力によって手動で、または任意の他の従来技術によって適用することもできる。通常、再構成された本発明の止血用組成物は、開口部、孔、針、管または他の通路を介して、再構成された組成物を押し出して、ビーズ、層または類似の材料部分を形成することができる、シリンジまたは類似のアプリケーターを使用して適用される。組成物の機械的な崩壊は、一般に０．０１ｍｍ〜５．０ｍｍ、好ましくは０．５ｍｍ〜２．５ｍｍの範囲のサイズを有する、シリンジまたは他のアプリケーターの開口部を介して押し出すことによって実施され得る。しかし好ましくは、止血用組成物は、最初に所望の粒径を有する乾燥形態（特に水和によって再構成されると、必須のサイズのサブユニット（例えばヒドロゲルサブユニット）をもたらす）から調製されるか、または最終的な押出しもしくは他の適用ステップの前に、必須のサイズに部分的もしくは完全に機械的に崩壊させられる。当然のことながら、これらの機械部品は、ヒトに使用するための安全性の要件を満たすために、滅菌形態（内側も外側も）で提供されなければならない。
【００２５】
最終容器の設計は、好ましくは最終容器内における凍結乾燥プロセスに適合され得る。
【００２６】
本発明の乾燥した止血用組成物は、通常、乾燥組成物を適切な希釈剤に接触させることによって、使用前に再構成（再水和）される。本発明の希釈剤は、乾燥組成物を適切に湿潤化することができる、乾燥した止血用組成物用の任意の適切な再構成媒体であり得る。好ましくは、乾燥した止血用組成物は、「すぐに使用できる」フォーマットとしてヒドロゲルに再構成される。
【００２７】
適切な希釈剤は、薬学的に許容される水性流体、例えば医薬等級の脱イオン水（すべてのイオン成分または緩衝剤成分が、乾燥組成物中に既に提供されている場合；「注射用水」）または特定のイオンおよび／もしくは緩衝剤を含有する医薬等級の水性溶液である。これらの水性溶液は、賦形剤などの他の構成成分をさらに含有することができる。「賦形剤」は、例えばトロンビンが保存（または滅菌（例えば、照射による））に際し、例えばその化学的安定性および生物学的活性を確実に保持するようにするため、または審美的理由、例えば色のために、溶液に添加される不活性物質である。好ましい賦形剤には、ヒトアルブミン、マンニトールおよび酢酸ナトリウムが含まれる。再構成された生成物中のヒトアルブミンの好ましい濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍである。好ましいマンニトール濃度は、０．５〜５００ｍｇ／ｍｌ、特に１０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲であり得る。好ましい酢酸ナトリウム濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、特に２〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２８】
例えば、適切な希釈剤は、注射用水、ならびに互いに独立にＮａＣｌ（好ましくは５０〜１５０ｍＭ、特に１１０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（好ましくは１０〜８０ｍＭ、特に４０ｍＭ）、ヒトアルブミン（好ましくは最大２％ｗ／ｗ、特に０．５％ｗ／ｗ）、酢酸ナトリウム（好ましくは０〜５０ｍＭ、特に２０ｍＭ）およびマンニトール（好ましくは最大１０％ｗ／ｗ、特に２％ｗ／ｗ）を含む。好ましくは、希釈剤は、再構成された乾燥組成物のｐＨを、好ましくはｐＨ６．４〜７．５、特にｐＨ６．９〜７．１に緩衝化するための緩衝剤または緩衝系を含むこともできる。
【００２９】
好ましい一実施形態では、希釈剤は、別個の容器で提供される。この容器は、好ましくはシリンジであり得る。シリンジ内の希釈剤は、次に、本発明の乾燥した止血用組成物を再構成するための最終容器に、容易に適用することができる。最終容器もシリンジである場合、両方のシリンジを、パック内に一緒に入れて完成させることができる。したがって、本発明の乾燥した止血用組成物をシリンジに入れて提供し、それを、前記乾燥した安定な止血用組成物を再構成するための薬学的に許容される希釈剤を含む希釈剤シリンジと共に完成させることが好ましい。
【００３０】
止血に使用するのに適した本発明の生体適合性ポリマーの乾燥調製物（「乾燥した止血用ポリマー」）は、生物学的ポリマーおよび非生物学的ポリマーから形成することができる。適切な生物学的ポリマーには、ゼラチン、可溶性コラーゲン、アルブミン、ヘモグロビン、カゼイン、フィブリノゲン、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチン、ケラチンおよびラミニンなどのタンパク質、またはその誘導体もしくは組合せが含まれる。特に好ましいのは、ゼラチンまたは可溶性の非線維性コラーゲン、より好ましくはゼラチンを使用することであり、例示的なゼラチン処方物を、以下に記載する。他の適切な生物学的ポリマーには、グリコサミノグリカン、デンプン誘導体、キシラン、セルロース誘導体、ヘミセルロース誘導体、アガロース、アルギネートおよびキトサンなどの多糖、またはその誘導体もしくは組合せが含まれる。適切な非生物学的ポリマーは、２つの機構、すなわち（１）ポリマー主鎖の破壊、または（２）水溶性をもたらす側鎖の分解のいずれかによって分解可能であるように選択される。例示的な非生物学的ヒドロゲル形成ポリマーには、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニル樹脂、ポリラクチド−グリコリド、ポリカプロラクトンおよびポリオキシエチレンなどの合成物質、またはその誘導体もしくは組合せが含まれる。異なる種類のポリマーの組合せも可能である（例えば、タンパク質と多糖、タンパク質と非生物学的ヒドロゲル形成ポリマー等）。
【００３１】
適切な再水和助剤を伴った非架橋ポリマーを、再構成するのに適した、例えば適切なヒドロゲルベースを形成するのに適した任意の方式で架橋することができる。例えば、ポリマー分子を、２つ以上のポリマー分子鎖に共有結合によって結合する二官能性または多官能性架橋剤を使用して架橋することができる。例示的な二官能性架橋剤には、アルデヒド、エポキシド、スクシンイミド、カルボジイミド、マレイミド、アジド、カーボネート、イソシアネート、ジビニルスルホン、アルコール、アミン、イミデート、無水物、ハロゲン化物、シラン、ジアゾアセテート、アジリジン等が含まれる。あるいは、架橋は、ポリマーの側鎖または一部が他の側鎖または一部と反応して架橋結合を形成することができるように、ポリマーの側鎖または一部を活性化する、過ヨウ素酸塩などの酸化剤および他の薬剤を使用して達成することができる。さらなる架橋法は、ポリマーを、ガンマ放射線などの放射線に曝露して、ポリマー鎖を活性化して架橋反応を可能にすることを含む。熱脱水（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ）架橋法が適切であることもある。ゼラチン分子を架橋するための好ましい方法を、以下に記載する。
【００３２】
したがって、好ましい一実施形態によれば、止血に使用するのに適した生体適合性ポリマーは、架橋多糖、架橋タンパク質もしくは非生物学的架橋ポリマー、またはその混合物を含有する。
【００３３】
好ましくは、止血に使用するのに適した生体適合性ポリマーは、粒状材料である。この粒状材料は、流体（すなわち希釈剤）に曝露すると迅速に膨潤することができ、この膨潤形態において、出血部位に適用され得る流動性ペーストをもたらす。生体適合性ポリマー、例えばゼラチンを、フィルムとして提供することができ、次に、このフィルムを加工して（ｍｉｌｌ）、粒状材料を形成することができる。この粒状材料に含有されている粒子のほとんどは、好ましくは１００〜１，０００μｍ、特に３００〜５００μｍの粒径を有する。
【００３４】
好ましい一実施形態によれば、止血に使用するのに適した生体適合性ポリマーは、架橋ゼラチンである。乾燥した架橋ゼラチン粉末は、適切な希釈剤と接触する場合に、迅速に再水和するように調製することができる。ゼラチン粉末は、好ましくは、ＷＯ９８／０８５５０ＡおよびＷＯ２００３／００７８４５Ａに記載の通り、フラグメントまたはサブユニットとも呼ばれる相対的に大型の粒子を含む。好ましい（メジアン）粒径は、２０〜１，０００μｍ、好ましくは１００〜７５０μｍ、特に１５０〜５００μｍの範囲であるが、この好ましい範囲の外側の粒径も、多くの環境で使用することができる。乾燥組成物はまた、水性の再水和媒体（＝希釈剤）に曝露されると、著しい「平衡膨潤」を示す。好ましくは、膨潤は、４００％〜１０００％の範囲である。「平衡膨潤」は、ゼラチンヒドロゲル粉末の乾燥重量を、それが完全に水和し、したがって完全に膨潤したときの重量から引くことによって決定することができる。次に、その差異を、乾燥重量で割り、１００をかけて、膨潤の測定値を得る。乾燥重量は、実質的にすべての残りの水分を除去するのに十分な時間にわたって高温に材料を曝露した後（例えば１２０℃で２時間）、測定されるべきである。材料の平衡水和は、乾燥材料を、水性の生理食塩水などの適切な希釈剤に、含水量が一定になるのに十分な時間にわたって、一般に室温で１８〜２４時間にわたって浸漬することによって達成され得る。
【００３５】
再水和助剤を伴った非架橋ゼラチンを、適切なヒドロゲルベースを形成するのに適した任意の方式で架橋することができる。この好ましい実施形態の乾燥した架橋ゼラチン粉末は、好ましくは、特定の再水和助剤の存在下で粉末を調製することによって得られる。かかる再水和助剤は、粉末の調製中には存在するが、通常は最終生成物から除去されることになる。例えば、約２０％の全固体含量で存在する再水和助剤は、一般に最終生成物において１重量％未満、しばしば０．５重量％未満まで低減されることになる。例示的な再水和助剤には、好ましくは約１０００の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、好ましくは約５０，０００の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、および一般に約４０，０００の平均分子量を有するデキストランが含まれる。本発明の組成物を調製するときに、これらの再水和助剤の少なくとも２種類を用いることが好ましく、より具体的には、３種類すべてを用いることが好ましい。
【００３６】
架橋ゼラチンを生成するための例示的な方法を、以下に記載する。ゼラチンを得て、水性溶液に懸濁して、一般に１重量％〜７０重量％、通常３重量％〜１０重量％の固体含量を有する非架橋ヒドロゲルを形成する。ゼラチンは、一般に、グルタルアルデヒド（例えば、水性緩衝液中０．０１％〜０．０５％ｗ／ｗ、終夜０℃〜１５℃）、過ヨウ素酸ナトリウム（例えば、０．０５Ｍ、０℃〜１５℃で４８時間保持する）もしくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（「ＥＤＣ」）（例えば、０．５％〜１．５％ｗ／ｗ、終夜室温）のいずれかに曝露することによって、または約０．３〜３メガラド（ｍｅｇａｒａｄ）のガンマもしくは電子ビーム放射線に曝露することによって架橋される。あるいはゼラチン粒子を、アルコール、好ましくはメチルアルコールまたはエチルアルコールに、１重量％〜７０重量％、通常３重量％〜１０重量％の固体含量で懸濁し、架橋剤、一般にグルタルアルデヒド（例えば、０．０１％〜０．１％ｗ／ｗ、終夜室温）に曝露することによって架橋することができる。アルデヒドの場合、ｐＨは、約６〜１１、好ましくは７〜１０に保持されるべきである。グルタルアルデヒドを用いて架橋する場合、架橋は、シッフ塩基を介して形成され、これは、例えば水素化ホウ素ナトリウムによる処理によって、その後還元することにより安定化することができる。架橋した後、得られた顆粒を水で洗浄し、任意選択によりアルコールですすぎ、乾燥することができる。次に、得られた乾燥粉末を、本明細書に記載の最終容器に入れて提供することができる。
【００３７】
架橋した後、再水和助剤の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）が、得られたヒドロゲルから除去される。通常、再水和助剤は、ヒドロゲルを濾過し、その後、得られた濾過ケーキを洗浄することによって除去される。かかる濾過／洗浄ステップを、生成物を所望のレベルまで清浄にし、再水和助剤の少なくとも５０％を除去するために、好ましくは元々存在する再水和助剤の少なくとも９０％（ｗ／ｗ）を除去するために、１回またはさらに複数回反復することができる。濾過後、一般に、生成された最終的な濾過ケーキを乾燥することによって、ゼラチンを乾燥する。次に、乾燥した濾過ケーキを、破壊または粉砕して、前述の所望の範囲の粒径を有する架橋された粉末を生成することができる。
【００３８】
もう１つの態様によれば、本発明はまた、患者の身体の標的部位に止血用組成物を送達する方法であって、本発明のプロセスによって生成される止血用組成物を前記標的部位に送達するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、乾燥組成物を標的部位に直接適用する（任意選択により、必要に応じて標的部位で希釈剤と接触させる）こともできるが、乾燥した止血用組成物を、標的部位に投与する前に薬学的に許容される希釈剤と接触させて湿潤形態、特にヒドロゲル形態の止血用組成物を得ることが好ましい。
【００３９】
本発明はまた、本発明のプロセスによって得られる、完成した最終容器に言及する。この完成した容器は、組み合わされた成分を、保存安定性および市場性のある滅菌された形態で含有する。
【００４０】
本発明の別の態様は、すぐに使用できる止血用組成物を提供する方法であって、本発明のプロセスによって生成された止血用組成物を、薬学的に許容される希釈剤と接触させるステップを含む方法に関する。
【００４１】
本発明はまた、完成した形態の本発明の乾燥した安定な止血用組成物と、適切な希釈剤を含む容器とを含むキットに関する。キットのさらなる成分は、使用のための指示書、シリンジ、カテーテル、ブラシなどの投与手段（組成物が、投与手段中にあらかじめ提供されていない場合）であってよく、または代替の針もしくはカテーテル、余分のバイアルもしくはさらなる創傷被覆手段などの医療（外科）の実施における使用に必要な他の成分であってもよい。好ましくは、本発明のキットは、乾燥した安定な止血用組成物を収容するシリンジと、希釈剤を含有する（または別の希釈剤の容器から希釈剤を取るために提供される）シリンジとを含む。好ましくは、これらの２つのシリンジは、希釈剤が、再構成された組成物を投与するための出口ではない別の入口から、乾燥した止血用組成物に送達され得るように、互いに適合された形態で提供される。
【００４２】
本発明を、以下の実施例にさらに記載するが、それに限定されない。
【実施例】
【００４３】
１．本発明の乾燥した止血用組成物の調製
材料および方法
すべての変形形態で、安定な形態のＦｌｏｓｅａｌゼラチンマトリックスおよびトロンビンの両方を含有する１つのシリンジと、適切な液体再構成媒体（例えば、０．９％ＮａＣｌまたは４０ｍＭ  ＣａＣｌ２）を含有する１つのシリンジとを含むキットを提示する、同じスキームを使用する。両方のシリンジの内側および外側を滅菌し、そのようにして、すべての再構成を、手術室の手術室看護師側で実施することができる。再構成は、普段通りに２つのシリンジをつなぎ、「噴出」（すなわち、２つのシリンジの間で内容物を繰り返し往復させる）によって２つのシリンジの内容物を混合することによって達成する。
【００４４】
「シリンジ内凍結乾燥（Ｉｎ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｌｙｏ）」
本発明の組成物を、ゼラチンおよびトロンビン溶液を混合して湿潤ペーストにし、そのペーストを単一のシリンジ内で凍結乾燥することによって生成する。ゼラチンマトリックスを、照射により、先立ってバルク滅菌することができる。ゼラチンの滅菌には、ガンマまたはベータ照射が適している。滅菌したゼラチンを、滅菌したトロンビン溶液を含むバルク内で水和する。これにより、湿潤ペースト、すなわち自由液相を含まないペーストが生成される。好ましくはこのステップは、バルクにおいて、一定に撹拌されるトロンビン溶液にゼラチン顆粒を徐々に落とし、均質なペーストが形成されるまでブレンドすることによって、または顆粒とトロンビン溶液とを適切に構成された押出機に同時に供給し、そこで２つの成分を密接にブレンドして流動性ペーストにすることによって、実施される（この流動性ペーストは、後に、さらなる加工のためにシリンジに直接分注することができる）。
【００４５】
次に、ペーストをシリンジに充填して、シリンジ内で凍結乾燥することができる。
【００４６】
充填したシリンジを冷凍した後、適切な凍結乾燥プログラムを使用してスラリーを凍結乾燥する。シリンジ内に最初にセットしておいたプランジャーを押すことによって、凍結乾燥器内でシリンジを閉鎖する。同じステップで、凍結乾燥したマトリックスを、ゼラチン顆粒だけで占められる体積近くまで圧縮して、再構成時に生成物に混合される空気の量を最小限にする。ここで生成物は、希釈剤シリンジと共にパッケージングし、ＥＯによって小袋を滅菌し、保存するための準備が整う。
【００４７】
希釈剤シリンジ
希釈剤シリンジは、生成物を水和するのに適した再構成媒体を含有する。このシリンジは、Ｆｌｏｓｅａｌシリンジと直接、またはコネクタを用いてつなぐことができる。希釈剤をＦｌｏｓｅａｌシリンジに移し、水和した生成物を、つないだシリンジ間を繰り返し往復させて、流動性ペーストを生成する。希釈剤シリンジは、例えば、媒体を滅菌濾過し、適切なシリンジ（Ｔｏｐｐａｃシリンジ、Ｃｌｅａｒｓｈｏｔ・・・等）に充填し、必要に応じて照射によって最終的に滅菌するなどのプロセスによって調製することができる。
【００４８】
ゼラチン顆粒
ゼラチン顆粒のバルクの製造を、確立された方法（ＷＯ９８／０８５５０Ａ、ＷＯ２００３／００７８５Ａ等）に従って実施する。顆粒（「Ｆｌｏｓｅａｌ」顆粒、「Ｆｌｏｓｅａｌ」マトリックス）を、ガンマ照射によって滅菌する。前臨床滅菌のために、Ｆｌｏｓｅａｌマトリックスを、適切なサイズのＳｃｈｏｔｔガラス瓶に充填する。
【００４９】
最終容器内の生成物に必要な、現在の最大バイオバーデンレベル（１０００ｃｆｕ／試料）における照射線量は、２５〜４０ｋＧｙである。次に、バルク材料を、さらなる製造のために−２０℃で保存する。
【００５０】
Ｆｌｏｓｅａｌの「シリンジ内凍結乾燥」
Ｆｌｏｓｅａｌゼラチン０．８１ｇ（水と会合しており、乾燥ゼラチン粉末０．７０４ｇに相当する）を秤量して、凍結乾燥シリンジに入れる。次に、シリンジプランジャーを、ゼラチン顆粒の真上に後方からセットする。他方では、Ｆｌｏｓｅａｌトロンビンシリンジに、４．０ｍｌのトロンビン５００ＩＥ／ｍｌを充填する。次に、これらのシリンジを連結し、少なくとも２１回通過させるように噴出する。最後の通過の後、生成物は、凍結乾燥シリンジ内に入っていなければならない。このシリンジのルアーを、Ｆｌｏｓｅａｌルアーキャップを使用して閉鎖する。生成物を、このシリンジ内で凍結乾燥する。凍結乾燥のために、トロンビンＳＴＩＭ５  ５００ＩＵ／ｍｌに対して凍結乾燥プログラムを使用する。シリンジを、ステンレス鋼製の特注のラックに入れる。このラックは、ラックの下方の床にシリンジのルアーキャップが置かれ、上方の床にシリンジのフィンガーレストが置かれるように構築されている。これにより、凍結乾燥ケーキを圧縮するステップ中の、シリンジの最大の安定性を確保する。
【００５１】
凍結乾燥器の水圧式「ストッパー」プレートを下げ、それによってプランジャーを凍結乾燥用ホールを越えて、シリンジに押し込むことによって、乾燥した生成物を減圧下で圧縮する。これによってシリンジを閉鎖し、凍結乾燥ステップ後に、凍結乾燥ケーキが可能な限り小さい体積を占めるように、凍結乾燥ケーキを圧縮する。ストッパープレートが押し下げられるレベルは、金属スペーサーによって制限され、このスペーサーにより、生成物／デバイスに過度に圧力がかかることなく、正しいレベルまでシリンジが圧縮される。
【００５２】
２．ブタ肝臓の擦過傷モデルにおける有効性
この研究の目的は、本発明の乾燥した止血用組成物の有効性を、ブタ肝臓の擦過傷モデルにおいて、確立された標準生成物（Ｆｌｏｓｅａｌ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ；Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と比較することである。Ｆｌｏｓｅａｌ  ＶＨ  Ｓ／Ｄは、適用の２分以内に活動性出血を止める、トロンビンを送達するゼラチンマトリックスである。この生成物は、（１）トロンビンを再構成するステップと、（２）ゼラチン粒子を、再構成したトロンビンを用いて水和するステップの２ステップによる調製を必要とする。本発明の生成物は、乾燥した止血用組成物を１ステップで再構成するように設計されており、生成物が迅速または多量に必要とされる場合に望ましくない、２ステップによる調製を大きく改善するものである。
【００５３】
ブタ肝臓の擦過傷モデル
平均体重５５．０ｋｇ（５２．４〜５８．４ｋｇの範囲）の６匹の家畜の雌性ブタを、Ｏａｋ  Ｈｉｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（イリノイ州ユーイング）から得て、外科手術時に量る。動物が到着したら、６日間検疫する。外科手術時、６匹すべてのブタは、臨床疾患の徴候を示していない。耳のタグを使用して動物を識別し、割り当てた識別番号と相互参照する。動物をグループ分けして、囲いに収容する。ブタは、水を自由に摂取し、標準のブタ用の食餌を１日１回摂取する。
【００５４】
ブタは、広く受け入れられている心血管モデルであり、このタイプの研究に適している。複数の大型の肝葉は、異なる試験項目について直接比較するための複数の病変を可能にした。
【００５５】
麻酔剤および輸液療法
ブタに、ミダゾラム（０．３ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）を投薬し、窒素と酸素２：１のキャリア中、イソフルランでマスクにより誘導する。ブタに挿管し、１分あたり１０〜１５回の速度の呼吸を人工的にさせる（ｖｅｎｔｉｌａｔｅ）。酸素キャリア中イソフルランで、麻酔を維持する。ブタに、温めた乳酸加リンゲル液を連続的な速度により注入する。
【００５６】
肝臓擦過傷の手順
ブタ肝臓の擦過傷モデルを、この研究で使用する。１２０カ所の病変（処置群１つあたり４０カ所）を評価し、比率８０パーセント対４０パーセントの差異を検出するのに十分となる（α＝０．０５および検出力＝９０％）ことを目標にして、６匹のブタを準備する。各系列を、中葉、外側左葉または外側右葉のいずれかにもたらす。
【００５７】
各病変の系列は、紙やすりを固定したハンドドリルを使用して作った、直径１ｃｍ、深さ３〜４ｍｍの３カ所の肝臓擦過傷を含有している。出血を評価し、病変を、参照または試験物質を用いて無作為に盲検的に処置する。参照および試験物質を、乱数発生器を使用して無作為化する。各物質を病変上に置き、湿らせたガーゼを用いて適所に２分間保持し、処置の２、５および１０分後に、止血について盲検的に評価する。過剰の参照または試験物質を、評価の５分後に洗浄する。
【００５８】
ヘパリン化プロトコル
ベースラインとなる活性凝固時間（ＡＣＴ）を記録し、各ブタに負荷量２００ＩＵ／ｋｇのヘパリンを投与する。ＡＣＴがベースラインの少なくとも２倍になるまで、ＡＣＴを１０分毎に評価する。ＡＣＴがベースラインの２倍未満またはおよそ２倍と測定されたら、ブタを用量７５ＩＵ／ｋｇのボーラスヘパリンで処置した。
【００５９】
ＡＣＴがベースラインの２倍を超えると、ＡＣＴを２０分毎に測定する。ＡＣＴが標的の、ベースラインの２倍未満またはおよそ２倍と測定されたら、ブタに用量４０ＩＵ／ｋｇのボーラスヘパリンを与える。ＡＣＴが標的の、ベースラインの２倍を超えると測定されたら、ブタを処置しないか、または２，０００ＩＵ／時間以下に制限して、維持（ｍａｉｎｔｅｎｃｅ）用量のヘパリンをボーラス投与する。
【００６０】
すべてのヘパリンを、末梢静脈カテーテルを介して与える。すべての血液試料を、頸静脈カテーテルから採取する。血圧および心拍の参照値を、ＡＣＴ測定時に記録する。
【００６１】
止血評価
病変系列が生じ、処置されてから０、２、５および１０分後に止血を評価する（０分は、処置前を指す）。点数０、１、２、３、４および５を、それぞれ出血なし、漏出、非常に軽度、軽度、中程度および重度に割り当てる。３つのすべての病変を、ほぼ同時に処置して、それぞれ独立の処置から生じ得る位置および凝固の差異を回避する。病変からの血液を、必要に応じて各評価の後に拭き取る。
【００６２】
測定および記録
ＡＣＴ、止血、血圧および心拍を、標準の方法に従って評価する。
【００６３】
統計的分析
この研究のためのサンプリング単位は、処置群１つあたり４０カ所の病変で合計１２０カ所の病変を有する肝臓病変部位である。
【００６４】
多重ロジスティック回帰を使用して、処置の２、５および１０分後の出血点数（０＝なし、１＝漏出、２＝非常にわずか、３＝わずか、４＝中程度および５＝重度）に対する処置効果を評価する。独立変数には、処置群、ブタ、肝葉（中央、右または左）および初期の出血点数が含まれる。ＦＢ／ＦＳ、Ｌｙｏ／ＦＳ、ＦＢ／Ｌｙｏの効果のオッズ比およびそれらの信頼区間を、処置後の各時点においてコンピュータ処理する。
【００６５】
病変の位置は、３つの葉（ｌｏｂｅ）およびブタの間で均一には分布していない。葉による影響は、有意ではないことが見出されており、したがって分析は、この影響を伴わずに再度実施される。結論は、モデルの葉による影響を伴わない分析に基づく。
【００６６】
結果
本発明の乾燥した止血用組成物の性能は、すべての時点でＦｌｏｓｅａｌ  ＶＨ  Ｓ／Ｄと著しく異ならない。このことは、本発明の生成方法および１ステップによる再構成様式が、組成物の性能に対して負の影響を与えず、実用的な取扱いにおいて所望の利点を提供し、それによって本発明の目的が解決されることを示している。
【００６７】
さらなる動物実験
前臨床評価を実施して、非常にストリンジェントな（抗凝固性が高い）モデルにおいてＦｌｏｓｅａｌの「シリンジ内凍結乾燥」とＦｌｏｓｅａｌ  ＶＨのインビボ効能を比較する。このモデルは、５ｍｍの全層肝臓穿刺と、十字様式における穿刺による欠損から放射状に広がる４つのさらなる切開からなる。試験群１つあたり６匹の動物を使用し、これらの動物を４，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇまでヘパリン化する。病変が生じた後、再構成したＦｌｏｓｅａｌを適用し、湿潤ガーゼを用いて２分間軽く圧力をかける。この時間の後、一次止血を評価する。一次止血が達成されない場合、止血が達成されるまで生成物を再度適用するか、または生成物（５ｍｌ）／時間（１５分）を使用する。主要エンドポイントは、一次止血の達成（はい／いいえ）および止血までの時間（分）である。
【００６８】
一次止血が達成されたら、動物を外科手術により縫合し、２４後、動物を再出血について評価する。
【００６９】
本発明の組成物により、この特定の前臨床実験セッションにおいて、標準のＦｌｏｓｅａｌと等しいか、またはそれより良好な、止血までの時間に関する結果が得られる。
【外国語明細書】
2018016656000001.pdf