(57)【要約】【課題】  Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩を提供すること【解決手段】  本発明では、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩が提供されている。本発明では、この化合物の特定の多形体も提供されている。【選択図】図１
2018199740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤の塩形態。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年４月１３日出願の米国仮出願番号６１／６２４，２１５号に対し優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
２０１２年には、１６００万人以上が癌と診断されたと推定されている。例えば、女性の癌の最も一般的なタイプは乳癌であり、この疾患は女性を冒す全ての癌の最高死亡率の１つの原因である。現在の乳癌治療は全体的または部分的乳房切除術、放射線治療または化学療法に限られている。２０１２年の癌症例のほぼ２３０，０００人が乳癌であり、４０，０００人の死が生ずると推定されている。Ｓｉｅｇｅｌら，Ｃａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ
Ｃｌｉｎ，２０１２；６２：１０−２９を参照されたい。
【０００３】
多くの癌死は白血病、骨髄腫及びリンパ腫を含めた血液の癌に起因している。２０１２年には、癌症例のほぼ８０，０００人がリンパ腫であり、２０，０００人の死が生ずると推定されている。
【０００４】
放射線治療、化学療法及び手術が癌治療の主な方法である。しかしながら、これらの治療は癌が早期ステージで発見されたときのみ最も成功している。癌が侵襲／転移ステージに達したら、侵襲細胞／転移細胞の株は見逃される恐れがあり、よって毒性の強い治療を使用しなければならない再発が生ずる。この時点で、癌細胞及び患者の正常細胞の両方が毒性の治療に曝され、その結果他の合併症の中で免疫系の低下が生ずる。
【０００５】
それ故に、当業界では患者における癌、例えば乳癌またはリンパ腫を治療するための新規方法がなお要望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｅｇｅｌら，Ｃａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ，２０１２；６２：１０−２９
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明では、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩：
【０００８】
【化１】
2018199740.tif 000003
が提供される。
【０００９】
本発明では、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩の特定多形体（「多形Ａ」、または「Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩の多形Ａ」）も提供される。本明細書中に記載されているように、本発明で提供される臭化水素酸塩及び多形Ａは、新しい薬理学的特性を得るために利用され得、薬物及び医薬品の開発において使用され得る物性を示す。
【００１０】
１つの実施形態では、臭化水素酸塩は結晶性である。別の実施形態では、臭化水素酸塩は実質的に不純物を含んでいない。別の実施形態では、臭化水素酸塩は実質的に非晶質Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩を含んでいない結晶性固体である。
【００１１】
別の態様で、本発明では上記した臭化水素酸塩及び医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１２】
１つの態様で、上記した臭化水素酸塩は、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドを臭化水素酸と化合することを含む方法を用いて製造される。
【００１３】
Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドの多形ＡはそのＸ線粉末回折パターンに従って規定され得る。従って、１つの実施形態では、多形は、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１７．５±０．３°及び約２２．０±０．３°（２θ）に１個以上の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。別
の実施形態では、多形は、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１７．５±０．３°及び約２２．０±０．３°（２θ）に特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。更に別の実施形態では、多形は、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。更に別の実施形態では、多形は実質的に図１に従うＸ線粉末回折パターンを示す。別の実施形態では、多形は実質的に表１に従うＸ線粉末回折パターンを示す。
【００１４】
多形Ａは、その示差走査熱量測定サーモグラムに従っても規定され得る。１つの実施形態では、多形は、℃の単位で表示して、２５５±５℃の温度に特徴的ピークを有する示差走査熱量測定サーモグラムを示す。実施形態では、多形は実質的に図３に従う示差走査熱量測定サーモグラムを示す。
【００１５】
１つの態様では、多形Ａは、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドを臭化水素酸と化合することを含む方法を用いて製造される。
【００１６】
別の態様では、本発明では、（ａ）多形Ａを第１溶媒に溶解するステップ、及び（ｂ）第２溶媒を添加するステップを含み、それにより前記多形を再結晶化する、多形Ａの再結晶化方法が提供される。１つの実施形態では、第１溶媒はエタノールであり、第２溶媒はＭＴＢＥである。別の実施形態では、方法は、（ａ）多形Ａをエタノールに溶解するステップ、（ｂ）前記混合物を加熱するステップ、（ｃ）前記混合物にＭＴＢＥを添加し、前記多形を含む沈殿物を形成し、及び前記沈殿物を濾過するステップを含み、それにより前記多形を再結晶化する。
【００１７】
更に別の態様で、多形Ａ及び医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む、医薬組成物が提供される。
【００１８】
本発明では、治療有効量の上記した臭化水素酸塩化合物、多形Ａ、またはこれらの化合物のいずれかを含む医薬組成物を必要がある被験者に投与することを含む、癌の治療方法が提供される。非ホジキンリンパ腫または乳癌を含めた各種癌が治療され得る。
【００１９】
別の態様で、本発明では、有効量の上記した臭化水素酸塩化合物、多形Ａ、またはこれらの化合物のいずれかを含む医薬組成物を必要がある被験者に投与することを含む、前記被験者におけるＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の阻害方法が提供される。
【００２０】
更に別の態様で、本発明では、上記した臭化水素酸塩化合物または多形Ａを投与することを含む、インビトロでのＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の阻害方法が提供される。
【００２１】
本発明では、癌治療の医薬の必要がある被験者において癌を治療するための医薬を製造するための上記した臭化水素酸塩化合物、多形Ａ、またはこれらの化合物のいずれかを含む、医薬組成物の使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】多形Ａ（一臭化水素酸塩）のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図２】化合物Ｉの二臭化水素酸塩のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図３】多形Ａの示差走査熱量測定サーモグラムを示す。
【図４】多形Ａの動的水蒸気吸脱着を示し、この化合物の低吸湿性を立証している。
【図５】多形Ａの高温で３日間にわたるＨＰＬＣ分析を示す。多形Ａはこの間に最小の不純物しか生じなかった。
【図６】化合物Ｉのナトリウム塩の動的水蒸気吸脱着を示し、この化合物の高い吸湿性を立証している。
【図７】化合物Ｉの半硫酸塩の動的水蒸気吸脱着を示し、この化合物が中程度に高い吸湿性を有していることを立証している。
【図８】化合物Ｉの一塩酸塩の示差走査熱量測定データを示し、この化合物が低結晶性であることを示している。
【図９】合成中間体５のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１０】多形ＢのＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１１】化合物Ｉの一臭化水素酸塩のＸ線結晶構造を示す。
【図１２Ａ】ヒトリンパ腫細胞株における化合物Ｉの臭化水素酸塩のインビボ研究からの結果を示す。
【図１２Ｂ】ヒトリンパ腫細胞株における化合物Ｉの臭化水素酸塩のインビボ研究からの結果を示す。
【図１３】ヒトリンパ腫細胞株における化合物Ｉの臭化水素酸塩のインビボ研究からの結果を示す。
【図１４Ａ】ヒトリンパ腫細胞株における化合物Ｉの臭化水素酸塩のインビボ研究からの結果を示す。
【図１４Ｂ】ヒトリンパ腫細胞株における化合物Ｉの臭化水素酸塩のインビボ研究からの結果を示す。
【図１５】化合物Ｉの臭化水素酸塩のリンパ腫マウス異種移植片モデルに対する抗癌効果を示す。
【図１６】化合物Ｉの臭化水素酸塩のリンパ腫マウス異種移植片モデルに対する抗癌効果を示す。
【図１７】合成中間体２のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１８Ａ】(Ａ）化合物Ｉの三塩酸塩のＸ線粉末回折パターンを示し、この化合物の高い吸湿性を立証している。
【図１８Ｂ】（Ｂ）化合物Ｉの一塩酸塩の動的水蒸気吸脱着を示し、この化合物の高い吸湿性を立証している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ＨＢｒ塩形態及び多形体Ａ
本発明では、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩：
【００２４】
【化２】
2018199740.tif 000004
が提供される。
【００２５】
本明細書中で使用されている「化合物Ｉ」は、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドを指す。化合物Ｉの臭化水素酸塩は、被験者またはインビトロにおいてＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するために使用され得る。化合物Ｉの臭化水素酸塩は、必要がある被験者において癌を治療するためにも使用され得る。
【００２６】
化合物Ｉは、１個以上のその塩基サイト、例えばモルホリン、二置換アニリン及び／またはピリドン部分でプロトン化され得る。従って、ある実施形態で、化合物Ｉの一臭化水素酸塩、ニ臭化水素酸塩または三臭化水素酸塩が提供される。１つの実施形態では、本発明では化合物Ｉの一臭化水素酸塩が提供される。化合物が一臭化水素酸塩のとき、該化合物は任意の塩基サイトでプロトン化され得る。非限定的実施形態では、化合物Ｉはモルホリノ置換基の窒素でプロトン化され、以下の構造：
【００２７】
【化３】
2018199740.tif 000005
を有する化合物Ｉの一臭化水素酸塩が提供される。
【００２８】
この特定の一臭化水素酸塩は、「４−（（３’−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−５’−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４’−メチル−［１，１’−ビフェニ
ル］−４−イル）メチル）モルホリン−４−イウムブロミド」と称され得る。図１１はこの特定の塩形態のＸ線結晶構造を示している。
【００２９】
化合物Ｉの臭化水素酸塩は、その遊離塩基形態及び遊離塩基の他の塩に比して多数の有利な物性を有している。特に、化合物Ｉの臭化水素酸塩は化合物Ｉの他の塩形態に比して低吸湿性を有している。化合物が治療上有効であるためには、通常該化合物の吸湿性が最小であることが要求されている。高吸湿性の薬物形態は、湿度が異なる環境で保存すると薬物形態の溶解速度が変化する恐れがあるので不安定であり得る。また、吸湿性活性物質を含む医薬組成物を製造するときにこの活性物質の真の重量を測定することが困難となり得るので、吸湿性は化合物の大規模取り扱い及び製造に影響を与え得る。化合物Ｉの臭化水素酸塩は化合物Ｉの他の塩形態と比較して低吸湿性を有している。それ故、化合物Ｉの臭化水素酸塩は適切な期間保存することができ、例えば溶解性、密度、または化学組成の点でも有害な変化を受け得ない。
【００３０】
上記した作用効果に加えて、化合物Ｉの臭化水素酸塩は高結晶性の形態で製造され得、これは医薬の製造において有用であり、薬物化合物の一般的な取り扱い、操作及び保存を改善する。好ましい実施形態では、化合物Ｉの臭化水素酸塩の結晶形は「多形Ａ」と称される形態である。
【００３１】
物質が２つ以上の結晶形で存在する能力を多形と定義する；具体的物質の異なる結晶形を「多形」と称する。一般的に、多形は、物質の分子のそのコンフォメーションを変化させたり、異なる分子内または分子間相互作用、特に水素結合を形成する能力により影響され、これは各種多形の結晶格子内の異なる原子配置に反映される。対照的に、物質の全体的外形は、内部構造を指すことなく結晶の外形及び存在する面を指す「モルホロジー」として公知である。結晶は各種条件、例えば成長速度、撹拌及び不純物の存在に基づいて異なるモルホロジーを示し得る。
【００３２】
物質の異なる多形は結晶格子の異なるエネルギーを有し得、よって固体状態では多形は異なる物性、例えば形、密度、融点、色、安定性、溶解性、溶解速度等を示し得、これらは所与の多形の安定性、溶解速度及び／またはバイオアベイラビリティー、及び医薬として及び医薬組成物中に使用するためのその適合性に影響を与え得る。
【００３３】
多形Ａは非常に結晶性であり、低吸湿性を示す。また、この多形は再現性よく得ることができ、結晶化条件が僅かに変化しても異なる結晶形を生じない。
【００３４】
化合物Ｉの臭化水素酸塩の各種多形を入手することは多くの理由で望ましい。その１つの理由は、個々の多形が各種不純物、または結晶化時に化学残留物を含み得る。例えば、不純物は化合物Ｉを多形Ａに変換させるプロセス中で除去され得る。
【００３５】
理論に束縛されるつもりはないが、コンパクトな結晶形を示す多形体は濾過の容易さ及び流動の容易さの点で作用効果を有している。多形Ａはコンパクトな結晶形を示し、従ってこれらの作用効果を有している。
【００３６】
ある実施形態では、多形ＡはＸ線粉末回折分析の特徴的ピークに基づいて同定され得る。ＸＲＰＤとも称されるＸ線粉末回折は、材料の構造特性評価のために粉末、微結晶または他の固体材料に対してＸ線、中性子または電子回折を用いる科学技術である。１つの実施形態では、多形Ａは、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１７．５±０．３°及び約２２．０±０．３°（２θ）に１個以上の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。別の実施形態では、多形は、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１７．５±０．３°及び約２２．０±０．３°（２θ）に特徴的ピークを有するＸ
線粉末回折パターンを示す。
【００３７】
１つの実施形態では、多形Ａは、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも５個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。別の実施形態では、多形Ａは、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも６個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。更に別の実施形態では、多形Ａは、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも７個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。別の実施形態では、多形Ａは、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも８個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。更に別の実施形態では、多形Ａは、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも９個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。更に別の実施形態では、多形は、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも１０個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。
【００３８】
更に別の実施形態では、多形は、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１４．３±０．３°、約１８．７±０．３°、約２３．３±０．３°及び約２３．６±０．３°（２θ）に特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。
【００３９】
更に別の実施形態では、多形は、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１０．１±０．３°、約１４．３±０．３°、約１７．５±０．３°、約１８．７±０．３°、約２０．６±０．３°、約２０．９±０．３°、約２１．８±０．３°、約２２．０±０．３°、約２３．３±０．３°及び約２３．６±０．３°（２θ）に特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。更に別の実施形態では、多形は実質的に図１に従うＸ線粉末回折パターン示す。別の実施形態では、多形は実質的に表１にリストされている２θ値に従うＸ線粉末回折パターンを示す。
【００４０】
本明細書中で使用されている用語「約」は、°（２θ）値に対して使用されている場合には記載されている値±０．３°（２θ）を指す。
【００４１】
多形Ａを含む医薬組成物は、組成物のＸ線粉末回折パターンを多形ＡのＸ線粉末回折パターンと比較することにより同定され得る。多形Ａを含む医薬組成物は純粋な多形ＡのＸ線粉末回折パターンと比較して同一でないＸ線粉末回折パターンを示し得ることが認識されている。
【００４２】
ある実施形態では、多形Ａは、示差走査熱量測定サーモグラムで観察される特徴的ピー
クに基づいて同定され得る。示差走査熱量測定法、すなわちＤＳＣは、サンプル及び標準物質の温度を上昇させるのに必要な熱の量の差が温度の関数として測定される熱分析技術である。１つの実施形態では、多形Ａは、℃の単位で表示して、約２５５±５℃の温度に特徴的ピークを有する示差走査熱量測定サーモグラムを示す。別の実施形態では、多形Ａは、２５０〜２５５℃の温度範囲で観察される１つの吸熱ピークを有する示差走査熱量測定サーモグラムを示す。別の実施形態では、多形Ａは実質的に図３に従う示差走査熱量測定サーモグラムを示す。
【００４３】
ある実施形態では、多形Ａは不純物を含有していてもよい。不純物の非限定例には、望ましくない多形体、或いは残留する有機及び無機分子（例えば、溶媒、水または塩）が含まれる。１つの実施形態では、多形Ａは実質的に不純物を含んでいない。別の実施形態では、多形Ａは全不純物を１０重量％未満しか含有していない。別の実施形態では、多形Ａは全不純物を５重量％未満しか含有していない。別の実施形態では、多形Ａは全不純物を１重量％未満しか含有していない。更に別の実施形態では、多形Ａは全不純物を０．１重量％未満しか含有していない。
【００４４】
ある実施形態では、多形Ａは実質的に非晶質の化合物Ｉ臭化水素酸塩を含んでいない結晶性固体である。本明細書中で使用されている用語「実質的に非晶質の化合物Ｉ臭化水素酸塩を含んでいない」とは、化合物が有意な量の非晶質の化合物Ｉ臭化水素酸塩を含有していないことを意味する。ある実施形態では、少なくとも約９５重量％の結晶性多形Ａが存在している。本発明の更に他の実施形態では、少なくとも約９９重量％の結晶性多形Ａが存在している。
【００４５】
別の実施形態では、多形Ａは実質的に多形Ｂを含んでいない。
【００４６】
本発明の塩及びその結晶形多形Ａは他の物質と一緒に存在し得、または単離され得る。幾つかの実施形態では、本発明の塩またはその結晶形は実質的に単離される。「実質的に単離される」とは、塩またはその結晶形が形成または検出された環境から少なくとも部分的にまたは実質的に分離されることを意味する。部分的分離には、例えば本発明の塩を多く含む組成物が含まれ得る。実質的分離には、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９重量７％、または少なくとも約９９重量％の化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａを含有している組成物を含み得る。化合物及びその塩の単離方法は当業界でルーチンである。
【００４７】
化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａはいずれも適当な互変異性体またはその混合物として存在し得る。本明細書中で使用されている「互変異性体」は、平衡で存在しており、１つの異性体から別の異性体に容易に変換される２つの以上の構造異性体の１つを指す。その例にはケト−エノール互変異性体、例えばアセトン／プロペン−２−オール等が含まれる。化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａは２つ以上の互変異性体を有し、従って各種異性体、すなわちピリジン−２（１Ｈ）−オン及び対応するピリジン−２−オールを含み得る。これらの化合物の全ての異性体が本発明において明らかに含まれる。
【００４８】
ＨＢｒ塩形態及び多形Ａの製造
化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａは公知技術を用いて製造され得る。従来、塩形態は溶液中で遊離塩基化合物を所望の塩形態のアニオンを含有している酸と化合した後、反応溶液から（結晶化、沈殿、蒸発等により）固体塩生成物を単離することにより製造されている。他の塩形成技術が使用され得る。
【００４９】
以下のスキーム１は、化合物Ｉの遊離塩基及び化合物Ｉの臭化水素酸塩を製造するため
の具体的実施形態を略述している。簡単に説明すると、ステップ１においてメチル３−アミノ−５−ブロモ−２−メチルベンゾエート（１）を還元アミノ化条件下でジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４（３Ｈ）−オンと反応させて、メチル５−ブロモ−２−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）ベンゾエート（２）を形成する。ステップ２において、再び還元アミノ化を使用して、５−ブロモ−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチルベンゾエート（３）を形成する。次いで、ステップ３においてこの化合物をスズキカップリング条件下で反応させて、メチル５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキシレート（４）を形成し、これをステップ４において対応する酸（５）に加水分解する。ステップ５において、酸（５）をアミドカップリング条件下で３−（アミノメチル）−４，６−ジメチル−ジヒドロ−ピリジン−２（１Ｈ）−オン塩酸塩と反応させて、化合物Ｉを形成する。
【００５０】
示されているように、次いで化合物Ｉを水性ＨＢｒと反応させると、化合物Ｉの臭化水素酸塩が形成される。
【００５１】
【化４】
2018199740.tif 000006
【００５２】
上記した合成は多数の利点を有している。例えば、この合成は単離できる結晶形で製造され得る多数の中間体を利用している。結晶性中間体を使用することにより、最小の精製技術（例えば、クロマトグラフィー）しか必要とせず、よって最終化合物Ｉの全収率が改善される。
【００５３】
従って、本発明では、結晶形の中間体化合物１が提供される。別の実施形態では、本発明では、結晶形の中間体化合物２が提供される。図１７は結晶性化合物２のＸ線粉末回折パターンを示している。更に別の実施形態では、中間体化合物５は結晶性である。図９は結晶性化合物５のＸ線粉末回折パターンを示している。他の実施形態では、化合物２及び／または５はクロマトグラフィーを使用することなく実質的に純粋な形態で製造される。当業者は、中間体の結晶化が必ずしも楽に、または効率的に進行しないことを認識している。
【００５４】
本発明では、５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボン酸（５）を３−（アミノメチル）−４，６−ジメチル−ジヒドロ−ピリジン−２（１Ｈ）−オンの塩と反応させることを含むＮ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドの製造方法も提供される。この方法の１つの実施形態では、（５）は結晶形である。
【００５５】
化合物Ｉを適切な溶媒の存在下で水性ＨＢｒと反応させると、多形Ａ、すなわち臭化水素酸塩の特定の結晶形が形成され得る。実施形態では、化合物Ｉをエタノール及び酢酸エチルの存在下で水性ＨＢｒと反応させて、多形Ａを形成する。
【００５６】
多形が製造されたら、この多形を該多形を製造するために使用したのと同じ溶媒（または、複数の溶媒）または異なる溶媒（または、複数の溶媒）を用いて再結晶化して、より高い結晶化度を有する組成物を製造し得る。一般的に、多形Ａは、多形を１つ以上の溶媒中に溶解させ、場合により加熱し、次いで任意の冷却ステップの後に、結晶構造を例えば濾過ステップにより単離することにより再結晶化され得る。多形をまず第１溶媒（または、溶媒の組合せ）中に溶解させ、追加の異なる溶媒をプロセスの任意の時点で（加熱の前またはその後、冷却の前またはその後等）に添加すると、所望の結晶構造が生じ得る。例えば、第１溶媒は多形化合物を溶解させるために使用され得、次いで多形を溶液から沈殿させるために第２溶媒（例えば、逆溶媒）を添加し得る。実施形態では、多形の溶解を助けるために水を第１溶媒に添加する。
【００５７】
多形Ａの再結晶化のために使用され得る溶媒の非限定例は次の通りである：メタノール、エタノール、酢酸エチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、水、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル及び２−メチルテトラヒドロフラン、並びにその組合せ。多形Ａの再結晶化のために有用な溶媒の組合せ（溶媒及び逆溶媒，多形の溶解を助けるために水を第１溶媒に添加し得る）の非限定例は、メタノール／水及び酢酸エチル、イソプロピルアルコール／水及び酢酸エチル、テトラヒドロフラン／水及び酢酸エチル、アセトン及び酢酸エチル、アセトニトリル／水及び酢酸エチル、エタノール／水及びメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、イソプロピルアルコール／水及びメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エタノール／水及びテトラヒドロフラン、イソプロピルアルコール／水及びアセトン、及びエタノール／水及び酢酸エチルである。具体的実施形態では、溶媒の組合せはメタノール／水及び酢酸エチル、イソプロピルアルコール／水及び酢酸エチル、エタノール／水及び２−メチルテトラヒドロフラン、及びメタノール／２−メチルテトラヒドロフランである。
【００５８】
１つの態様では、多形Ａは、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドを臭化水素酸と化合することを含む方法を用いて製造される。
【００５９】
別の態様で、本発明では、（ａ）多形Ａを第１溶媒中に溶解させるステップ、及び（ｂ）前記多形が再結晶化されるように第２溶媒を添加するステップを含む多形Ａの再結晶化方法が提供される。１つの実施形態では、第１溶媒はエタノールであり、第２溶媒はＭＴＢＥである。別の実施形態では、方法は、（ａ）多形Ａをエタノール中に溶解させるステップ、（ｂ）混合物を加熱するステップ、（ｃ）前記多形が再結晶化されるように前記混合物にＭＴＢＥを添加し、前記多形を含む沈殿を形成し、前記沈殿を濾過するステップを含む。
【００６０】
医薬組成物
別の態様で、本発明では、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。本発明では、多形Ａ及び医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。
【００６１】
用語「医薬組成物」には、哺乳動物（例えば、ヒト）に対して投与するのに適した製剤が含まれる。本発明の化合物を哺乳動物（例えば、ヒト）に対して医薬品として投与する場合、それ自体、または例えば０．１％〜９９．９％（より好ましくは、０．５〜９０％）の活性成分を医薬的に許容され得る担体と一緒に含む医薬組成物として投与され得る。
【００６２】
本明細書中に記載されている化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）は慣用の医薬コンパウンディング技術に従って医薬的に許容され得る担体と組み合わされ得る。本明細書中で使用されている「医薬的に許容され得る担体」には、所望する具体的投与形態に適した全ての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤等が含まれ得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）は、医薬組成物を処方する際に使用されている各種担体及びその製造のための公知技術を開示している。例えば望ましくない生物学的作用が生じたり、医薬組成物の他の成分と有害に相互作用することにより慣用の担体媒体が化合物と適合しない場合を除き、その使用は本発明の範囲内であると考えられる。医薬的に許容され得る担体として機能し得る材料の幾つかの例には、糖、例えばラクトース、グルコース及びスクロース；澱粉、例えばトウモロコシ澱粉及びジャガイモ澱粉；セルロース及びその誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロース；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオ脂及び座薬ワックス；油、例えば落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張性食塩液；リンガー液；エチルアルコール及びリン酸緩衝液、並びに他の非毒性の相容性滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムが含まれるが、これらに限定されない。また、製剤業者の判断に従って着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、着香及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤も組成物中に存在させ得る。
【００６３】
更に、担体は投与、例えば経口、鼻腔内、直腸内、膣内、非経口（静脈内注射及び注入を含む）のために望ましい製剤の形態に応じて各種形態を取り得る。経口投与形態用組成物を製造する際には、一般的な医薬媒体を使用し得る。一般的な医薬媒体には、例えば経口液体製剤（例えば、懸濁液剤、溶液剤、エマルジョン剤及びエリキシル剤）；エアゾール剤の場合には例えば水、グリコール、油、アルコール、着香剤、保存剤、着色剤等；経口固体製剤（例えば、散剤、カプセル剤及び錠剤）の場合には担体、例えば澱粉、糖、結晶セルロース、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等が含まれる。
【００６４】
湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、着香及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤を組成物中に存在させてもよい。
【００６５】
医薬的に許容され得る抗酸化剤の例には、水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、トコフェロール等；及び金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が含まれる。
【００６６】
化合物を含む医薬組成物は所望する濃度を有するように処方され得る。幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも治療有効量を含むように処方される。幾つかの実施形態では、組成物は１つ以上の望まない副作用を生じない量含むように処方される。
【００６７】
化合物Ｉの臭化水素酸塩の結晶形はその製造中より容易に維持されるので、固体投与形態が本発明の医薬組成物の好ましい形態である。経口投与用固体投与形態、例えばカプセル剤、錠剤、ピル剤、散剤及び顆粒剤が特に好ましい。所望ならば、錠剤に当業界で公知の技術によりコーティングを施してもよい。
【００６８】
医薬組成物には経口、舌下、鼻腔内、直腸内、膣内、局所、口腔内及び非経口（皮下、筋肉内及び静脈内を含む）投与のために適したものが含まれるが、最も適当なルートは治療しようとする状態の種類及び重症度に依存する。組成物を単位投与形態で提供することが好都合であり、製薬業界で公知の方法により製造され得る。ある実施形態では、医薬組成物はピル剤、カプセル剤、糖衣錠または錠剤の形態での経口投与用に処方される。他の実施形態では、医薬組成物は懸濁液剤の形態である。
【００６９】
本発明で提供される化合物は、ＥＺＨ２関連疾患、特に癌を治療するために特に有効である医薬組成物中の活性物質として適している。各種実施形態での医薬組成物は、医薬有効量の化合物Ｉの臭化水素酸塩または多形Ａを他の医薬的に許容され得る賦形剤、担体、増量剤、希釈剤等と一緒に有している。
【００７０】
治療または医薬「有効量」は、患者に対して投与したときに疾患または状態の症状を改善する、例えば癌の各種形態学的及び身体症状を抑える化合物（化合物Ｉの臭化水素酸塩または多形Ａ）の量である。例えば、化合物Ｉの臭化水素酸塩または多形Ａの有効量は被験者において癌を治療するのに十分な量である。量は、被験者の体型及び体重、病気のタイプ、または本発明の具体的化合物のような各種要因に応じて異なり得る。「有効量」を構成する化合物Ｉの臭化水素酸塩または多形Ａの量は化合物、病状及びその重症度、治療対象の患者の年齢等に応じて異なる。有効量は知識及び開示を考慮して当業者によりルーチンに決定され得る。
【００７１】
投与レジメンは医薬有効量を構成するものに影響を与え得る。化合物Ｉの臭化水素酸塩または多形Ａ、及びこれらの化合物のいずれかを含む組成物は被験者に対して疾患の発症前またはその後に投与され得る。更に、幾つかの分割投与量及び時間差投与量を毎日または逐次投与してもよく、または投与量を連続的に注入しても、またはボーラス注射でもよい。更に、投与量を治療または予防状況の切迫した要件により適応されるように比例的に増加または減少させてもよい。
【００７２】
治療方法
本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）はＥＺＨ２またはその変異体のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、従って本発明の１つの態様で、本明細書中に開示されているある化合物はある状態及び疾患を治療または予防するための候補者である。本発明は、その過程がヒストンまたは他のタンパク質のメチル化状態をモジュレートすることにより影響され得る状態及び疾患を治療するための方法を提供し、前記メチル化状態は少なくとも部分的にＥＺＨ２の活性により媒介される。また、ヒストンのメチル化状態のモジュレーションは、メチル化により活性化される標的遺伝子及び／またはメチル化により抑制される標的遺伝子の発現レベルに影響を及ぼし得る。この方法はその治療を必要とする被験者に対して治療有効量の本発明の化合物を投与することを含む。
【００７３】
ＥＺＨ２媒介タンパク質メチル化が役割を果たす疾患は癌または前癌状態であり得る。本発明は更に、その過程がＥＺＨ２媒介タンパク質メチル化をモジレートすることにより影響され得る癌または前癌の治療における、または前記癌または前癌の治療のために有用な医薬を製造するための本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）の使用を提供する。治療され得る癌の例には、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含めたリンパ腫；黒色腫；及びＣＭＬを含めた白血病が含まれる。前癌状態の例には、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ；以前は前白血病として公知）が含まれる。
【００７４】
更に別の実施形態では、本発明では、必要がある被験者に対して有効量の化合物Ｉの臭化水素酸塩を投与することを含むリンパ腫の治療方法が提供される。
【００７５】
更に別の実施形態では、本発明では、必要がある被験者に対して有効量の多形Ａを投与することを含むリンパ腫の治療方法が提供される。
【００７６】
本発明は、治療の必要がある被験者に対して治療有効量の本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）を投与することによる該被験者におけるＥＺＨ２媒介タンパク質メチル化が役割を果たす疾患に対する予防方法も提供する。この疾患は癌、例えばＥＺＨ２媒介タンパク質メチル化が役割を果たす癌であり得る。本発明は、少なくとも部分的にＥＺＨ２媒介タンパク質メチル化に関係する細胞増殖性疾患を予防するために有用な医薬を製造するための本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）の使用をも提供する。
【００７７】
本発明の化合物は、タンパク質（例えば、ヒストン）メチル化をモジュレートするために、例えばヒストンメチルトランスフェラーゼまたはヒストンデメチラーゼ酵素活性をモジュレートするために使用され得る。本発明の少なくとも幾つかの化合物はインビボまたはインビトロでタンパク質メチル化をモジュレートするために使用され得る。ヒストンメチル化は、癌中のある遺伝子の異常発現及び非神経性細胞中の神経細胞のサイレンシングに関与すると報告されている。本明細書中に記載されている少なくとも幾つかの化合物はこれらの疾患を治療するための、すなわちメチル化を減ずるかまたはメチル化を対応する正常細胞における大まかにそのレベルまで回復させるための適当な候補者である。
【００７８】
メチル化モジュレーターである化合物は細胞増殖をモジュレートするために使用され得る。例えば、幾つかの例では、過剰増殖はメチル化を減ずる物質を用いて抑えられ得、不十分な増殖はメチル化を高める物質を用いて刺激され得る。従って、本発明の化合物により治療され得る疾患には、過剰増殖性疾患、例えば良性細胞増殖及び悪性細胞増殖が含まれ得る。
【００７９】
本明細書中で使用されている「必要がある被験者」は、ＥＺＨ２媒介タンパク質メチル
化が役割を果たす疾患を有している被験者、または一般人と比べて前記疾患を発症するリスクが高い被験者である。必要がある被験者は前癌状態を有し得る。好ましくは、必要がある被験者は癌を有している。「被験者」には、哺乳動物が含まれる。哺乳動物は、例えばヒトまたは適当な非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジまたはブタであり得る。被験者は鳥類または家禽であり得る。１つの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００８０】
本明細書中で使用されている用語「細胞増殖性疾患」は、細胞の無秩序な及び／または異常な増殖が望ましくない状態または疾患の発症をもたらし得る状態を指し、これらの状態は癌性でも癌性でなくてもよい。本発明の化合物を用いて治療され得る細胞増殖性疾患の例は細胞分裂が調節解除されている各種状態を包含する。細胞増殖性疾患の例には、新生物、良性腫瘍、悪性腫瘍、前癌状態、上皮内癌、被包型腫瘍、転移性腫瘍、液性腫瘍、固体腫瘍、免疫学的腫瘍、血液癌、癌、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫及び急速に分裂する細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されている用語「急速に分裂する細胞」は、同一組織内の隣接または近位の細胞中で予測または観察されるものを超えるまたはそれよりも速い速度で分裂する細胞と定義される。細胞増殖性疾患には、前癌または前癌状態が含まれる。細胞増殖性疾患には、癌が含まれる。１つの態様で、本発明で提供される方法は癌の症状を治療または緩和するために、またはその目的のための適当な候補者を同定するために使用される。用語「癌」には、固体腫瘍、並びに血液腫瘍及び／または悪性疾患が含まれる。「前癌細胞」または「前癌性細胞」は、前癌または前癌状態である細胞増殖性疾患を呈している細胞である。「癌細胞」または「癌性細胞」は、癌である細胞増殖性疾患を呈している細胞である。再現性の測定手段が癌細胞または前癌細胞を同定するために使用され得る。癌細胞または前癌性細胞は、組織サンプル（例えば、生検サンプル）を組織学的に類別または格付けすることにより同定され得る。癌細胞または前癌細胞は適切な分子マーカーを使用して同定され得る。
【００８１】
１つ以上の本発明の化合物を用いて治療され得る非癌性状態または疾患の例には、関節リウマチ；炎症；自己免疫疾患；リンパ増殖性状態；先端巨大症；リウマチ性脊椎炎；骨関節炎；痛風、他の関節炎状態；敗血症；敗血性ショック；エンドトキシンショック；グラム陰性敗血症；毒素性ショック症候群；喘息；成人呼吸窮迫症候群；慢性閉塞性肺疾患；慢性肺炎；炎症性腸疾患；クローン病；乾癬；湿疹；潰瘍性大腸炎；膵臓線維症；肝臓線維症；急性及び慢性腎疾患；過敏性腸症候群；発熱；再狭窄；大脳マラリア；卒中及び虚血性損傷；神経外傷；アルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；急性及び慢性疼痛；アレルギー性鼻炎；アレルギー性結膜炎；慢性心不全；急性冠状症候群；悪液質；マラリア；らい病；リーシュマニア病；ライム病；ライター症候群；急性滑膜炎；筋変性、滑液包炎；腱炎；腱滑膜炎；椎間板ヘルニア、破損または脱出した椎間板症候群；大理石骨病；血栓症；再狭窄；珪肺病；肺サルコーシス；骨吸収疾患、例えば骨粗鬆症；移植片対宿主症；多発性硬化症；狼瘡；線維筋痛症；ＡＩＤＳ及び他のウイルス疾患、例えば帯状疱疹、単純ヘルペスＩまたはＩＩ、インフルエンザウイルス及びサイトメガロウイルス；及び糖尿病が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
１つ以上の本発明の化合物を用いて治療され得る癌の例には、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、肛門直腸癌、肛門管の癌、虫垂癌、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非黒色腫）、胆管癌、肝臓外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、膀胱癌、骨関節癌、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視経路及び視床下部グリオーマ、乳癌、気管支腺種／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、胃腸神経系癌、神経系リンパ腫、中枢神経系癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、
セザリー症候群、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（胃）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、頭頸部癌、肝細胞（肝）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、眼癌、膵島細胞腫瘍（膵臓内分泌腺）、カポジ肉腫、腎臓癌、腎癌、腎臓癌、喉頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、口唇癌及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、髄芽腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞腫、悪性中皮腫、中皮腫、転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌、舌癌、多発性内分泌腺腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形性症候群、骨髄異形性／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口腔癌、口腔咽頭癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵島細胞膵臓癌、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜胚芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂及び尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮癌、子宮肉腫、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌（黒色腫）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃）癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂、尿管及び他の泌尿器の移行上皮癌、妊娠性トロホブラスト腫瘍、尿道癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、子宮体癌、膣癌、外陰癌及びウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
「血液系の細胞増殖性疾患」は血液系の細胞を冒す細胞増殖性疾患である。血液系の細胞増殖性疾患には、リンパ腫、白血病、骨髄性新生物、マスト細胞新生物、脊髄形成異常、良性モノクローナルγグロブリン血症、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ腫様丘疹症、真性多血症、慢性骨髄性白血病、特発性骨髄化生及び本態性血小板血症が含まれ得る。血液系の細胞増殖性疾患には、血液系の細胞の過形成、形成異常及び異形成が含まれ得る。１つの態様で、本発明の組成物は、本発明の血液癌または本発明の血液細胞増殖性疾患からなる群から選択される癌を治療するために使用され得、またはその目的のための適当な候補者を同定するために使用され得る。本発明の血液癌には、多発性骨髄腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小児リンパ腫、及びリンパ球及び皮膚起源のリンパ腫を含む）、白血病（小児白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病及びマスト細胞白血病を含む）、骨髄新生物及びマスト細胞新生物が含まれ得る。
【００８４】
「肺の細胞増殖性疾患」は肺細胞を冒す細胞増殖性疾患である。肺の細胞増殖性疾患には、肺細胞に影響を与える細胞増殖性疾患の全ての形態が含まれ得る。肺の細胞増殖性疾患には、肺癌、肺の前癌または前癌状態、肺の良性増殖または病変、肺の悪性増殖または病変、及び肺以外の身体中の組織及び臓器における転移性病変が含まれ得る。１つの態様で、本発明の組成物は、肺癌または肺の細胞増殖性疾患を治療するために使用され得、またはその目的のための適当な候補者を同定するために使用され得る。肺癌には、肺癌の全ての形態が含まれ得る。肺癌には、悪性肺新生物、上皮内癌、典型的カルチノイド腫瘍及び異型カルチノイド腫瘍が含まれ得る。肺癌には、小細胞肺癌（“ＳＣＬＣ”）、非小細胞肺癌（“ＮＳＣＬＣ”）、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌及び中皮腫が含まれ得る。肺癌には、「瘢痕癌」、気管支肺胞上皮癌、巨細胞癌、紡錘形細胞癌及び大細神経内分泌癌が含まれ得る。肺癌には、組織学的及び超微細構造的不均一性（例えば、混合細胞タイプ）を有する肺新生物が含まれ得る。
【００８５】
肺の細胞増殖性疾患には、肺細胞に影響を与える細胞増殖性疾患の全ての形態が含まれ
得る。肺の細胞増殖性疾患には、肺癌、肺の前癌状態が含まれ得る。肺の細胞増殖性疾患には、肺の過形成、異形成及び形成異常が含まれ得る。肺の細胞増殖性疾患には、アスベスト誘発性過形成、扁平上皮化生及び良性反応性中皮化生が含まれ得る。肺の細胞増殖性疾患には、円柱上皮の重層扁平上皮の置換、及び粘膜形成異常が含まれ得る。吸入した有害な環境物質、例えば喫煙及びアスベストに曝されている個人は肺の細胞増殖性疾患を発症するリスクが高いことがあり得る。個人が肺の細胞増殖性疾患を発症しやすくなり得る前肺疾患には、慢性間質性肺疾患、壊死性肺疾患、強皮症、リウマチ様疾患、サルコイドーシス、間質性肺炎、結核、反復性肺炎、特発性肺線維症、肉芽腫、石綿症、線維性肺胞炎及びホジキン病が含まれ得る。
【００８６】
「結腸の細胞増殖性疾患」は結腸の細胞を冒す細胞増殖性疾患である。好ましくは、結腸の細胞増殖性疾患は結腸癌である。１つの態様で、本発明の組成物は結腸癌または結腸の細胞増殖性疾患を治療するために使用され得、またはその目的のための適当な候補者を同定するために使用され得る。結腸癌には、結腸癌の全ての形態が含まれ得る。結腸癌には、散発性及び遺伝性結腸癌が含まれ得る。結腸癌には、悪性結腸新生物、上皮内癌、典型的カルチノイド腫瘍及び異形カルチノイド腫瘍が含まれ得る。結腸癌には、腺癌、扁平上皮癌及び腺扁平上皮癌が含まれ得る。結腸癌は、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、家族性腺腫性ポリポーシス、ガドナー症候群、ポイツ・ジェガーズ症候群、ターコット症候群及び若年性ポリポーシスからなる群から選択される遺伝性症候群に関係し得る。結腸癌は、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、家族性腺腫性ポリポーシス、ガードナー症候群、ポイツ・ジェガーズ症候群、ターコット症候群及び若年性ポリポーシスからなる群から選択される遺伝性症候群に起因し得る。
【００８７】
結腸の細胞増殖性疾患には、結腸細胞に影響を与える細胞増殖性疾患の全ての形態が含まれ得る。結腸の細胞増殖性疾患には、結腸癌、結腸の前癌状態、結腸の腺腫性ポリープ及び結腸の異時性病変が含まれ得る。結腸の細胞増殖性疾患には腺腫が含まれ得る。結腸の細胞増殖性疾患は、結腸の過形成、異形成及び形成異常により特徴づけられ得る。個人が結腸の細胞増殖性疾患を発症しやすくなり得る前結腸疾患には、前結腸癌が含まれ得る。個人が結腸の細胞増殖性疾患を発症しやすくなり得る現在の疾患には、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれ得る。結腸の細胞増殖性疾患は、ｐ５３、ｒａｓ、ＦＡＰ及びＤＣＣからなる群から選択される遺伝子の突然変異に関係し得る。個人は、ｐ５３、ｒａｓ、ＦＡＰ及びＤＣＣからなる群から選択される遺伝子に突然変異が存在するために結腸の細胞増殖性疾患を発症する高いリスクを有し得る。
【００８８】
「膵臓の細胞増殖性疾患」は膵臓の細胞を冒す細胞増殖性疾患である。膵臓の細胞増殖性疾患には、膵臓細胞に影響を与える細胞増殖性疾患の全ての形態が含まれ得る。膵臓の細胞増殖性疾患には、膵臓癌、膵臓の前癌または前癌状態、膵臓の過形成及び膵臓の形成異常、膵臓の良性増殖または病変、膵臓の悪性増殖または病変、及び膵臓以外の身体中の組織及び臓器における転移性病変が含まれ得る。膵臓癌には、膵臓癌の全ての形態が含まれる。膵臓癌には、膵管腺癌、腺扁平上皮癌、多形性巨細胞癌、粘液性腺癌、破骨細胞様巨細胞癌、粘液性嚢胞腺癌、腺房癌、分類不能大細胞癌、小細胞癌、膵芽細胞腫、乳頭腫瘍、漿液性胸腺腫、乳頭状嚢胞腫瘍及び漿液性嚢胞腺腫が含まれ得る。膵臓癌には、組織学的及び超微細構造的不均一性（例えば、混合細胞タイプ）を有する膵臓新生物も含まれ得る。
【００８９】
「前立腺の細胞増殖性疾患」は前立腺の細胞を冒す細胞増殖性疾患である。前立腺の細胞増殖性疾患には、前立腺細胞に影響を与える細胞増殖性疾患の全ての形態が含まれ得る。前立腺の細胞増殖性疾患には、前立腺癌、前立腺の前癌または前癌状態、前立腺の良性増殖または病変、前立腺の悪性増殖または病変、及び前立腺以外の身体中の組織及び臓器における転移性病変が含まれ得る。前立腺の細胞増殖性疾患には、前立腺の過形成、異形
成及び形成異常が含まれ得る。
【００９０】
「皮膚の細胞増殖性疾患」は皮膚の細胞を冒す細胞増殖性疾患である。皮膚の細胞増殖性疾患には、皮膚細胞に影響を与える細胞増殖性疾患の全ての形態が含まれ得る。皮膚の細胞増殖性疾患には、皮膚の前癌または前癌状態、皮膚の良性増殖または病変、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚の悪性増殖または病変、及び皮膚以外の身体中の組織及び臓器における転移性病変が含まれ得る。皮膚の細胞増殖性疾患には、皮膚の過形成、異形成及び形成異常が含まれ得る。
【００９１】
「卵巣の細胞増殖性疾患」は卵巣の細胞を冒す細胞増殖性疾患である。卵巣の細胞増殖性疾患には卵巣細胞に影響を与える細胞増殖性疾患の全ての形態が含まれ得る。卵巣の細胞増殖性疾患には、卵巣の前癌または前癌状態、卵巣の良性増殖または病変、卵巣癌、卵巣の悪性増殖または病変、及び卵巣以外の身体中の組織及び臓器における転移性病変が含まれ得る。皮膚の細胞増殖性疾患には、卵巣の細胞の過形成、異形成及び形成異常が含まれ得る。
【００９２】
「乳房の細胞増殖性疾患」は乳房の細胞を冒す細胞増殖性疾患である。乳房の細胞増殖性疾患には、乳房細胞に影響を与える細胞増殖性疾患の全ての形態が含まれ得る。乳房の細胞増殖性疾患には、乳癌、乳房の前癌または前癌状態、乳房の良性増殖または病変、乳房の悪性増殖または病変、及び乳房以外の身体中の組織及び臓器における転移性病変が含まれ得る。乳房の細胞増殖性疾患には、乳房の過形成、異形成及び形成異常が含まれ得る。
【００９３】
乳房の細胞増殖性疾患は乳房の前癌状態であり得る。本発明の組成物は乳房の前癌状態を治療するために使用され得る。乳房の前癌状態には、乳房の異形増殖症、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、管内癌、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、小葉癌、及び乳房のステージ０またはグレード０の増殖または病変（例えば、ステージ０またはグレード０の乳癌、すなわち上皮内癌）が含まれ得る。乳房の前癌状態は、原発性腫瘍（Ｔ）をＴ０またはＴｉｓのステージに割り当て、所属リンパ節（Ｎ）をＮ０のステージに割り当て、遠隔転移（Ｍ）をＭ０のステージに割り当てる対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）が承認しているＴＮＭ分類スキームに従って段階づけられ得る。
【００９４】
乳房の細胞増殖性疾患は乳癌であり得る。１つの態様で、本発明の組成物は乳癌を治療するために使用され得、またはその目的のための適当な候補者を同定するために使用され得る。乳癌には、乳癌の全ての形態が含まれ得る。乳癌には、原発性上皮性乳癌が含まれ得る。乳癌には、乳房が他の腫瘍、例えばリンパ腫、肉腫または黒色腫で冒されている癌が含まれ得る。乳癌には、乳房の癌、乳房の管癌、乳房の小葉癌、乳房の未分化癌、乳房の葉状膿肉腫、乳房の血管肉腫及び乳房の原発性リンパ腫が含まれ得る。乳癌には、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ及びＩＶ乳癌が含まれ得る。乳房の管癌には、浸潤性癌、管内成分優位の非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌、及びコメド、粘液性（コロイド）、髄様、リンパ球浸潤を有する髄様、乳頭状、硬性及び管状からなる群から選択される組織学的タイプを有する乳房の管癌が含まれ得る。乳房の小葉癌には、管内成分優位の浸潤性小葉癌、浸潤性小葉癌及び浸潤性小葉癌が含まれ得る。乳癌には、パジェット病、管内癌を有するパジェット病及び浸潤性管癌を有するパジェット病が含まれ得る。乳癌には、組織学的及び超微細構造的不均一性（例えば、混合細胞タイプ）を有する乳房新生物が含まれ得る。
【００９５】
本発明の化合物は、乳癌を治療するために使用され得、またはその目的のための適当な候補者を同定するために使用され得る。治療しようとする乳癌には、家族性乳癌が含まれ得る。治療しようとする乳癌には、散発性乳癌が含まれ得る。治療しようとする乳癌は男
性被験者で生じ得る。治療しようとする乳癌は女性被験者で生じ得る。治療しようとする乳癌は閉経前女性被験者または閉経後女性被験者で生じ得る。治療しようとする乳癌は３０才以上の被験者、または３０才より若い被験者で生じ得る。治療しようとする乳治療しようとする乳癌癌は５０才以上の被験者、または５０才より若い被験者で生じている。治療しようとする乳癌癌は７０才以上の被験者、または７０才より若い被験者で生じている。
【００９６】
治療しようとする乳癌は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２またはｐ５３における家族性または自然突然変異を同定するために類別され得る。治療しようとする乳癌は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子増幅を有している、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現している、または低、中間または高レベルのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を有していると類別され得る。治療しようとする乳癌はエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ヒト上皮成長因子受容体−２、Ｋｉ−６７、ＣＡ１５−３、ＣＡ  ２７−２９及びｃ−Ｍｅｔからなる群から選択されるマーカーに対して類別され得る。治療しようとする乳癌はＥＲ不明、ＥＲリッチまたはＥＲプアと類別され得る。治療しようとする乳癌はＥＲ陰性またはＥＲ陽性と類別され得る。乳癌のＥＲ類別は再現可能な手段により実施され得る。乳癌のＥＲ類別はＯｎｋｏｌｏｇｉｅ  ２７：１７５−１７９（２００４）に記載されているように実施され得る。治療しようとする乳癌はＰＲ不明、ＰＲリッチまたはＰＲプアと類別され得る。治療しようとする乳癌はＰＲ陰性またはＰＲ陽性と類別され得る。治療しようとする乳癌は受容体陽性または受容体陰性と類別され得る。治療しようとする乳癌はＣＡ  １５−３及び／またはＣＡ  ２７−２９の高い血液レベルに関連すると類別され得る。
【００９７】
治療しようとする乳癌には、乳房の限局性腫瘍が含まれ得る。治療しようとする乳癌には、陰性のセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）生検に関係する乳房の腫瘍が含まれ得る。治療しようとする乳癌には、陽性のセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）生検に関係する乳房の腫瘍が含まれ得る。治療しようとする乳癌には、適応可能な方法により段階づけた１つ以上の陽性の腋窩リンパ節に関係する乳房の腫瘍が含まれ得る。治療しようとする乳癌には、リンパ節陰性状態（例えば、リンパ節転移陰性）またはリンパ節陽性状態（例えば、リンパ節転移陽性）を有すると類別された乳房の腫瘍が含まれ得る。治療しようとする乳癌には、身体の他の場所に転移した乳房の腫瘍が含まれ得る。治療しようとする乳癌は、骨、肺、肝臓または脳からなる群から選択される場所に転移したと分類され得る。治療しようとする乳癌は、転移性、限局性、領域性、局所−領域性、局所進行性、遠隔、多中心性、両側性、同側性、対側性、新たに診断された、再発性及び手術不能からなる群から選択される特徴に従って分類され得る。
【００９８】
本発明の化合物は、乳房の細胞増殖性疾患を治療または予防するため、または一般人と比べて乳癌を発症するリスクの高い被験者において乳癌を治療または予防するために使用され得、またはその目的のための適当な候補者を同定するために使用され得る。一般人と比べて乳癌を発症するリスクの高い被験者は、乳癌の家族歴または個人的病歴を有している女性被験者である。一般人と比べて乳癌を発症するリスクの高い被験者は、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２において生殖細胞または自然突然変異を有している女性被験者である。一般人と比べて乳癌を発症するリスクの高い被験者は、乳癌の家族歴及びＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２において生殖細胞または自然突然変異を有している女性被験者である。一般人と比べて乳癌を発症するリスクの高い被験者は３０才以上、４０才以上、５０才以上、６０才以上、７０才以上、８０才以上、または９０才以上の女性である。一般人と比べて乳癌を発症するリスクの高い被験者は、乳房の異形増殖症、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、管内癌、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、小葉癌、または乳房のステージ０の増殖または病変（例えば、ステージ０またはグレード０の乳癌、すなわち上皮内癌）が含まれ得る。
【００９９】
治療しようとする乳癌は、乳房腫瘍を１、２または３の分裂像数；１、２または３の核多形性；１、２または３の腺腔形成度；及び３〜９の全スカーフ−ブルーム−リチャードソンスコアに割り当てるスカーフ−ブルーム−リチャードソンシステムに従って組織学的に格付けされ得る。治療しようとする乳癌には、グレード１、グレード１〜２、グレード２、グレード２〜３またはグレード３からなる群から選択される乳癌の治療に関する国際コンセンサス委員会に従って腫瘍グレードが割り当てられ得る。
【０１００】
１つの実施形態では、本発明では、必要がある被験者に対して有効量の化合物Ｉの臭化水素酸塩を投与することを含む乳癌の治療方法が提供される。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明では、必要がある被験者に対して有効量の多形Ａを投与することを含む乳癌の治療方法が提供される。
【０１０２】
治療しようとする癌は、腫瘍（Ｔ）をＴＸ、Ｔ１、Ｔ１ｍｉｃ、Ｔ１ａ、Ｔ１ｂ、Ｔ１ｃ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ４ａ、Ｔ４ｂ、Ｔ４ｃまたはＴ４ｄのステージに割り当てる；所属リンパ節（Ｎ）をＮＸ、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ２ａ、Ｎ２ｂ、Ｎ３、Ｎ３ａ、Ｎ３ｂまたはＮ３ｃのステージに割り当てる；及び遠隔転移（Ｍ）をＭＸ、Ｍ０またはＭ１のステージを割り当てる対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）ＴＮＭ分類システムに従って段階づけられ得る。治療しようとする癌は、対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）分類に従ってステージＩ、ステージＩＩＡ、ステージＩＩＢ、ステージＩＩＩＡ、ステージＩＩＩＢ、ステージＩＩＩＣまたはステージＩＶと段階づけられ得る。治療しようとする癌は、ＡＪＣＣ分類に従ってグレードＧＸ（例えば、グレードを評価できない）、グレード１、グレード２、グレード３、またはグレード４と割り当てられ得る。治療しようとする癌は、ｐＮＸ、ｐＮ０、ＰＮ０（Ｉ−）、ＰＮ０（Ｉ＋）、ＰＮ０（ｍｏｌ−）、ＰＮ０（ｍｏｌ＋）、ＰＮ１、ＰＮ１（ｍｉ）、ＰＮ１ａ、ＰＮ１ｂ、ＰＮ１ｃ、ｐＮ２、ｐＮ２ａ、ｐＮ２ｂ、ｐＮ３、ｐＮ３ａ、ｐＮ３ｂまたはｐＮ３ｃのＡＪＣＣ病態分類（ｐＮ）に従って段階づけられ得る。
【０１０３】
治療しようとする癌には、直径が約２ｃｍ以下であると判定された腫瘍が含まれ得る。治療しようとする癌には、直径が約２〜約５ｃｍと判定された腫瘍が含まれ得る。治療しようとする癌には、直径が約３ｃｍ以上と判定された腫瘍が含まれ得る。治療しようとする癌には、直径が５ｃｍより大きいと判定された腫瘍が含まれ得る。治療しようとする癌は、顕微鏡像により十分分化している、中程度に分化している、余り分化していない、または全く分化していないと分類され得る。治療しようとする癌は、分裂像数（例えば、細胞分裂の量）または核多形性（例えば、細胞の変化）に関して顕微鏡像により分類され得る。治療しようとする癌は、壊死のエリア（例えば、死んでいるまたは変性している細胞のエリア）に関連して顕微鏡像により分類され得る。治療しようとする癌は、異常な核型を有する、異常な染色体数を有する、または１つ以上の外観が異常な染色体を有すると分類され得る。治療しようとする癌は異数体、三倍体、四倍体である、または変化した倍数性を有すると分類され得る。治療しようとする癌は、染色体転移位、全染色体の欠失または複製、或いは染色体の一部の欠失、複製または増幅の領域を有すると分類され得る。
【０１０４】
治療しようとする癌は、ＤＮＡサイトメトリー、フローサイトメトリー、またはイメージサイトメトリーにより評価され得る。治療しようとする癌は、細胞の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が細胞分裂の合成ステージ（例えば、細胞分裂のＳ期）にあると類別され得る。治療しようとする癌は低Ｓ期分画または高Ｓ期分画を有していると類別される。
【０１０５】
本明細書中で使用されている「正常細胞」は、「細胞増殖性疾患」の一部と分類され得ない細胞である。正常細胞は、望ましくない状態または疾患の発症につながり得る無秩序
な及び／または異常な増殖を欠く。好ましくは、正常細胞は正常に機能する細胞周期チェックポイントコントロールメカニズムを有している。
【０１０６】
本明細書中で使用されている「細胞と接触させる」は、化合物または他の物質が細胞と直接接触しているか、または細胞中で望ましい生物学的効果を誘発させるのに十分近くにある状態を指す。
【０１０７】
本明細書中で使用されている「候補化合物」は、本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）が細胞、組織、系、動物またはヒトにおいて研究者または臨床医が求めている所望の生物学的または医学的応答を引き出す可能性があるかを調べるために１つ以上のインビトロまたはインビボ生物学的アッセイにおいて試験したかまたは試験される前記化合物を指す。候補化合物は本発明の化合物である。生物学的または医学的応答は癌の治療であり得る。生物学的または医学的応答は細胞増殖性疾患の治療または予防であり得る。生物学的応答または効果には、インビトロまたは動物モデルで生ずる細胞増殖または成長の変化、及びインビトロで観察され得る他の生物学的変化も含まれ得る。インビトロまたはインビボでの生物学的アッセイには、酵素活性アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、インビトロ細胞生存性アッセイ及び本明細書中に記載されているアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本明細書中で使用されている「単独治療」は、単一の活性または治療用化合物の必要がある被験者への投与を指す。好ましくは、単独治療は治療有効量の活性化合物の投与を伴う。例えば、癌単独治療は１つの本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）を癌治療を要する被験者への投与を伴う。単独治療は複数の活性化合物の組合せを投与する併用治療と対比され得、前記組合せの各成分が治療有効量で存在していることが好ましい。１つの態様では、本発明の化合物を用いる単独治療は、所望の生理学的効果を誘導する点で併用治療よりもより有効である。
【０１０９】
本明細書中で使用されている「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療する（ｔｒｅａｔ）」は、疾患、状態または障害を治す目的での患者の管理及びケアを表し、本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）の疾患、状態または障害の症状または合併症を緩和するための、または疾患、状態または障害を消失させるための投与を含む。用語「治療する」はインビトロまたは動物モデルでの細胞の治療をも含み得る。
【０１１０】
本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）は、疾患、状態または障害を予防するためにも使用され、またはその目的のための適当な候補者を同定するためにも使用され得る。本明細書中で使用されている「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」は、疾患、状態または障害の症状または合併症の開始を遅らすまたは消失させることを表す。
【０１１１】
本明細書中で使用されている用語「緩和する」は、障害の兆候または症状の重症度を低下させるプロセスを表すことを意味する。重要なことは、兆候または症状が消失されるのではなく緩和され得る。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物を投与すると、兆候または症状は消失するが、消失は必要でない。有効投与量は兆候または症状の重症度を低下させると予想される。例えば、複数の場所で起こり得る障害（例えば、癌）の兆候または症状は、癌の重症度が複数の場所の少なくとも１カ所で低下しているならば緩和される。
【０１１２】
本明細書中で使用されている用語「重症度」は、前癌または良性状態から悪性状態へ変換する癌の潜在性を表すことを意味する。或いはまたは加えて、重症度は、癌ステージを
例えばＴＮＭシステム（国際対癌連合（ＵＩＣＣ）及び対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）により承認されている）に従って、または他の当業界で認められている方法により表すことを意味する。癌ステージは、原発性腫瘍の場所、腫瘍の大きさ、腫瘍の数。及びリンパ節転移（癌のリンパ節への転移）のような要因に基づく癌の程度または重症度を指す。或いはまたは加えて、重症度は腫瘍グレードを当業界で認められている方法（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）により表すことを意味する。腫瘍グレードは、顕微鏡下で観察して癌細胞がどの位異常か及びどの位の速さで腫瘍が増殖及び転移する可能性があるかの点で癌細胞を分類するために使用されているシステムである。腫瘍グレードを判定するときに、細胞の構造及び増殖パターンを含めた多くの要因が考慮される。腫瘍グレードを判定するために使用される特定要因は癌の各タイプによって異なる。重症度は、どの位多くの腫瘍細胞が同一組織タイプの正常細胞に似ているかを指す分化とも称される組織学的グレードをも表す（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）。更に、重症度は、腫瘍細胞中の核の大きさ及び形、及び分裂している腫瘍細胞のパーセントを指す核グレードを表す（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）。
【０１１３】
本発明の別の態様では、重症度は、腫瘍が分泌増殖因子を有する、細胞外マトリックスを分解する、新生血管を形成するようになる、近位組織への粘着を失う、または転移する程度を表す。更に、重症度は、原発性腫瘍が転移した位置の数を表す。最後に、重症度はタイプ及び場所の異なる腫瘍の治療の困難さを含む。例えば、手術不能な腫瘍、複数の身体系（血液学的及び免疫学的腫瘍）により近づきやすい癌、及び従来の治療に対してかなり耐性である癌が最も重症であると考えられる。これらの状況で、被験者の平均余命の延長、及び／または疼痛の軽減、癌性細胞の比率の低下、または細胞の１つの系への限定、及び癌ステージ／腫瘍グレード／組織学的グレード／核グレードの改善は癌の兆候または症状の緩和と考えられる。
【０１１４】
本明細書中で使用されている用語「症状」は、疾患、病気、損傷、または身体の違和感の兆しと定義される。症状は、その症状を経験している個人は感じたり気づくが、他人には容易に気づかれない。他人は非ヘルスケア専門家と定義される。
【０１１５】
癌は、ほとんどの兆候または症状を生じ得る疾患の群である。兆候及び症状は癌のある場所、癌の大きさ、どのくらい多く近位臓器または構造に影響を与えているかに依存している。癌が広まると（転移）、症状は身体の別の部分に現れ得る。
【０１１６】
癌が増殖すると、癌が近くの臓器、血管及び神経を圧迫し始める。この圧力により癌の兆候及び症状の幾つかが生じる。癌が重大なエリア（例えば、脳のある部分）にあるならば、最小の腫瘍でも初期の症状が生じ得る。
【０１１７】
しかしながら、時々、癌は癌がかなりの大きさに増殖するまで症状が生じていない場所で始まる。例えば、膵臓癌は通常体外から感知するのに十分な大きさに増殖しない。幾つかの膵臓癌は、近くの神経の周りで増殖し始める（この場合、頭痛が生ずる）まで症状を生じない。他は胆管の周りで増殖し、これにより胆汁の流れが塞がれ、黄疸として公知の皮膚の黄化がもたらされる。膵臓癌がこれらの兆候または症状を生ずるころには、通常進行ステージに達している。
【０１１８】
癌は複数の症状、例えば発熱、疲労または体重減少をも生じ得る。これは、癌細胞が身体のエネルギー供給の大部分を消費したり、身体の代謝を変化させる物質を放出するためであり得る。また癌はこれらの症状を生ずるように免疫系を反応させ得る。
【０１１９】
時々、癌細胞は、通常癌から生ずると考えられていない症状を引き起こす物質を血流に放出する。例えば、幾つかの膵臓癌は血餅を脚の静脈に発生させる物質を放出し得る。幾つかの肺癌は、血液カルシウムレベルに影響を与えて、神経及び筋肉を冒し、虚弱及び眩暈を生じさせるホルモン様物質を生成する。
【０１２０】
癌は、癌細胞の各種サブタイプが存在するときに生ずる幾つかの一般的兆候または症状を呈する。癌を有している多くの人々はその疾患のためにそのうちに体重減少を示す。１０ポンド以上の説明のつかない（意図的でない）体重減少は癌、特に膵臓臓、胃癌、食道癌または肺癌の最初の兆候であり得る。
【０１２１】
発熱は癌の場合非常に一般的であるが、進行した疾患ではよりしばしば見られる。癌を有している殆ど全ての患者は、特に癌またはその治療が免疫系に影響を与え、身体が感染と戦いにくくなるならばそのうちに発熱するであろう。それほど頻繁ではないが、発熱は癌、例えば白血病またはリンパ腫の初期兆候であり得る。
【０１２２】
疲労は、癌が進行するにつれて重要な症状であり得る。しかし、癌、例えば白血病では、または幾つかの結腸癌または胃癌の場合のように癌が進行している血液の損失を引き起こしているならば、早期に起こり得る。
【０１２３】
疼痛は幾つかの癌、例えば骨癌または精巣癌の場合初期の症状であり得る。しかしながら、最も多くの場合、疼痛は進行疾患の症状である。
【０１２４】
皮膚癌（次欄を参照されたい）に加えて、幾つかの内臓癌は観察され得る皮膚兆候を生じ得る。これらの変化には、皮膚が暗く（色素沈着過度）、黄色く（黄疸）、または赤く（紅斑）見えること；かゆみ；または多毛が含まれる。
【０１２５】
或いはまたは加えて、癌サブタイプは特定の兆候または症状を呈する。排便習慣または膀胱機能の変化は癌の徴候となり得る。長時間の便秘、下痢、または便の大きさの変化は結腸癌の兆候であり得る。排尿痛、尿中血液、または膀胱機能の変化（例えば、頻尿または乏尿）を伴う疼痛は膀胱癌または前立腺癌に関連し得る。
【０１２６】
皮膚状態の変化または新しい皮膚状態の出現は癌の徴候となり得る。皮膚癌は出血したり、治っていない傷のように見え得る。口腔内の長く続く傷は、特に煙草やかみたばこを吸ったり、しばしば飲酒している患者では口腔癌であり得る。陰茎または膣の傷は感染または早期癌の兆候であり得る。
【０１２７】
異常出血または排泄物は癌の徴候であり得る。異常出血は早期癌または進行癌で起こり得る。痰（喀痰）中の血液は肺癌の兆候であり得る。便中の血液（すなわち、黒っぽいまたは黒い便）は結腸癌または直腸癌の兆候であり得る。子宮頸部または子宮内膜（子宮の内壁）の癌は膣出血を生じ得る。尿中の血液は膀胱癌または腎臓癌の兆候であり得る。乳首からの血性分泌物は乳癌の兆候であり得る。
【０１２８】
乳房または身体の他の部分での肥厚またはしこりは癌の存在を示し得る。多くの癌は皮膚を介して、大部分は身体の乳房、精巣、リンパ節（腺）及び軟部組織中の皮膚を介して触れることができる。しこりまたは肥厚は癌の早期または後期兆候であり得る。しこりまたは肥厚は、特に新たに形成されたり、大きくなったならば癌を示し得る。
【０１２９】
消化不良またはつかえ感は癌の徴候であり得る。これらの症状は通常他の原因を有しているが、消化不良または嚥下困難は食道癌、胃癌または咽頭（喉）癌の兆候であり得る。
【０１３０】
疣またはほくろの最近の変化は癌を示し得る。色、大きさまたは形が変化したり、或いは境界が曖昧となった疣、ほくろまたはそばかすは癌の発症の可能性を示す。例えば、皮膚病変は黒色腫であり得る。
【０１３１】
持続する咳または嗄声は癌の存在を示し得る。消えない咳は肺癌の兆候であり得る。嗄声は喉頭（喉頭）癌または甲状腺癌の兆候であり得る。
【０１３２】
上にリストした兆候及び症状は癌の場合により一般的なものであるが、余り一般的でなく、ここにリストされていない他の兆候及び症状も多くある。しかしながら、癌の当業界で認識されている兆候及び症状が考えられ、本発明に含まれる。
【０１３３】
癌を治療すると、腫瘍の大きさを縮小させ得る。腫瘍の大きさの縮小は「腫瘍退縮」とも称され得る。好ましくは、治療後、腫瘍の大きさは治療前の大きさに比して５％以上縮小している；より好ましくは、腫瘍の大きさは１０％以上縮小している；より好ましくは、２０％以上縮小している；より好ましくは、３０％以上縮小している；より好ましくは、４０％以上縮小している；更により好ましくは、５０％以上縮小している；最も好ましくは、７５％以上縮小している。腫瘍の大きさは再現可能な測定手段により測定され得る。腫瘍の大きさは腫瘍の直径として測定され得る。
【０１３４】
癌を治療すると、腫瘍容積を減少させ得る。好ましくは、治療後、腫瘍容積は治療前の大きさに比して５％以上減少し得る；より好ましくは、腫瘍容積は１０％以上減少し得る；より好ましくは、２０％以上減少し得る；より好ましくは、３０％以上減少し得る；より好ましくは、４０％以上減少し得る；更により好ましくは、５０％以上減少し得る；最も好ましくは、７５％以上減少し得る。腫瘍容積は再現可能な測定手段により測定され得る。
【０１３５】
癌を治療すると、腫瘍の数を減少させる。好ましくは、治療後、腫瘍の数は治療前の数に比して５％以上減少している；より好ましくは、腫瘍の数は１０％以上減少している；より好ましくは、２０％以上減少している；より好ましくは、３０％以上減少している；より好ましくは、４０％以上減少している；更により好ましくは、５０％以上減少している；最も好ましくは、７５％以上減少している。腫瘍の数は再現可能な測定手段により測定され得る。腫瘍の数は、肉眼でまたは特定倍率で見える腫瘍をカウントすることにより測定され得る。好ましくは、特定倍率は２×、３×、４×、５×、１０×、または５０×である。
【０１３６】
癌を治療すると、原発腫瘍部位から遠隔の他の組織または臓器中の転移性病変の数を減少させ得る。好ましくは、治療後、転移性病変の数は治療前の数に比して５％以上減少している；より好ましくは、転移性病変の数は１０％以上減少している；より好ましくは、２０％以上減少している；より好ましくは、３０％以上減少している；より好ましくは、４０％以上減少している；更により好ましくは、５０％以上減少している；最も好ましくは、７５％減少している。転移性病変の数は再現可能な測定手段により測定され得る。転移性病変の数は、肉眼でまたは特定倍率で見える転移性病変をカウントすることにより調べられ得る。好ましくは、特定倍率は２×、３×、４×、５×、１０×、または５０×である。
【０１３７】
癌を治療すると、治療を受けた被験者の集団の平均生存期間を担体のみを投与された集団と比較して延長し得る。好ましくは、平均生存期間は３０日以上、より好ましくは６０日以上、より好ましくは９０日以上、最も好ましくは１２０日以上延長する。集団の平均生存期間の延長は再現可能な手段により調べられ得る。集団の平均生存期間の延長は、例えば集団について活性化合物を用いる治療を開始後の生存の平均長さを計算することによ
り調べられ得る。集団の平均生存期間の延長は、例えば集団について活性化合物での治療の第１ラウンドの完了後の生存の平均長さを計算することによっても調べられ得る。
【０１３８】
癌を治療すると、治療を受けた被験者の集団の平均生存期間を治療を受けていない被験者の集団と比較して延長し得る。好ましくは、平均生存期間は３０日以上、より好ましくは６０日以上、より好ましくは９０日以上、最も好ましくは１２０日以上延長する。集団の平均生存期間は再現可能な手段により調べられ得る。集団の平均生存期間の延長は、例えば集団について活性化合物を用いる治療を開始後の生存の平均長さを計算することにより調べられ得る。集団の平均生存期間の延長は、例えば集団について活性化合物での治療の第１ラウンドの完了後の生存の平均長さを計算することによっても調べられ得る。
【０１３９】
癌を治療すると、治療を受けた被験者の集団の平均生存期間を本発明の化合物でない薬物を用いる単独治療を受けた集団と比較して延長し得る。好ましくは、平均生存期間は３０日以上、より好ましくは６０日以上、より好ましくは９０日以上、最も好ましくは１２０日以上延長する。集団の平均生存期間の延長は再現可能な手段により調べられ得る。集団の平均生存期間の延長は、例えば集団について活性化合物を用いる治療を開始後の生存の平均長さを計算することにより調べられ得る。集団の平均生存期間の延長は、例えば集団について活性化合物での治療の第１ラウンドの完了後の生存の平均長さを計算することによっても調べられ得る。
【０１４０】
癌を治療すると、治療を受けた被験者の集団の死亡率を担体のみを投与された集団と比較して低下させ得る。癌を治療すると、治療を受けた被験者の集団の死亡率を治療を受けていない集団と比較して低下させ得る。癌を治療すると、治療を受けた被験者の集団の死亡率を本発明の化合物でない薬物を用いる単独治療を受けた集団と比較して低下させ得る。好ましくは、死亡率は２％以上、より好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、最も好ましくは２５％以上低下している。治療を受けた被験者の集団の死亡率の低下は再現可能な手段により調べられ得る。集団の死亡率の低下は、例えば集団について活性化合物を用いる治療を開始後の単位時間あたりの疾患関連死の平均数を計算することにより調べられ得る。集団の死亡率の低下は、例えば集団について活性化合物での治療の第１ラウンドの完了後の単位時間あたりの疾患関連死の平均数を計算することによっても調べられ得る。
【０１４１】
癌を治療すると、腫瘍増殖率を低下させ得る。好ましくは、治療後、腫瘍増殖率は治療前の数に比して少なくとも５％減少している。より好ましくは、腫瘍増殖率は、少なくとも１０％減少し；より好ましくは少なくとも２０％減少し；より好ましくは少なくとも３０％減少し；より好ましくは少なくとも４０％減少し；より好ましくは少なくとも５０％減少し；更により好ましくは少なくとも５０％減少し；最も好ましくは少なくとも７５％減少している。腫瘍増殖率は再現可能な測定手段により調べられ得る。腫瘍増殖率は単位時間あたりの腫瘍直径の変化に従って調べられ得る。
【０１４２】
癌を治療すると、腫瘍再増殖を低下させ得る。好ましくは、治療後、腫瘍再増殖は５％未満である；より好ましくは、腫瘍再増殖は１０％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは５０％未満、更により好ましくは５０％未満、最も好ましくは７５％未満である。腫瘍再増殖は再現可能な測定手段により調べられ得る。腫瘍再増殖は、例えば治療に続いて以前腫瘍が縮小した後の腫瘍の直径の増加を測定することにより調べられ得る。腫瘍再増殖の減少は治療を中止した後の腫瘍の再発の失敗により示される。
【０１４３】
細胞増殖性疾患を治療または予防すると、細胞増殖率を低下させ得る。好ましくは、治療後、細胞増殖率は少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは
少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％減少し得る。細胞増殖率は再現可能な測定手段により調べられ得る。細胞増殖率は、例えば単位時間あたりの組織サンプル中の分裂細胞の数を測定することにより調べられる。
【０１４４】
細胞増殖性疾患を治療または予防すると、増殖細胞の比率を減少させ得る。好ましくは、治療後、増殖細胞の比率は少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％減少している。増殖細胞の比率は再現可能な測定手段により調べられ得る。好ましくは、増殖細胞の比率は、例えば組織サンプル中の非分裂細胞の数に対する分裂細胞の数を量化することにより調べられる。増殖細胞の比率は分裂像数と同等であり得る。
【０１４５】
細胞増殖性疾患を治療または予防すると、細胞増殖のエリアまたはゾーンの大きさを減少させ得る。好ましくは、治療後、細胞増殖のエリアまたはゾーンの大きさは治療前のその大きさに比して少なくとも５％減少している；より好ましくは、少なくとも１０％減少している；より好ましくは、少なくとも２０％減少している；より好ましくは、少なくとも３０％減少している；より好ましくは、少なくとも４０％減少している；より好ましくは、少なくとも５０％減少している；更により好ましくは、少なくとも５０％減少している；最も好ましくは、少なくとも７５％減少している。細胞増殖のエリアまたはゾーンの大きさは再現可能な測定手段により調べられ得る。細胞増殖のエリアまたはゾーンの大きさは細胞増殖のエリアまたはゾーンの直径または幅として測定され得る。
【０１４６】
細胞増殖性疾患を治療または予防すると、異常な外観またはモルホロジーを有する細胞の数または比率を減少させ得る。好ましくは、治療後、異常なモルホロジーを有する細胞の数は治療前のその数に比して少なくとも５％減少している；より好ましくは、少なくとも１０％減少している；より好ましくは、少なくとも２０％減少している；より好ましくは、少なくとも３０％減少している；より好ましくは、少なくとも４０％減少している；より好ましくは、少なくとも５０％減少している；更により好ましくは、少なくとも５０％減少している；最も好ましくは、少なくとも７５％減少している。異常な細胞の外観またはモルホロジーは再現可能な測定手段により調べられ得る。異常な細胞モルホロジーは、例えば倒立組織培養顕微鏡を用いる顕微鏡検査により調べられ得る。異常な細胞モルホロジーは核多形性の形態をとり得る。
【０１４７】
本明細書中で使用されている用語「選択的に」は、別の集団よりも１つの集団において高い頻度で起こる傾向を意味する。比較される集団は細胞集団であり得る。好ましくは、本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）は癌または前癌細胞に対して選択的に作用するが、正常細胞に対してはそうではない。好ましくは、本発明の化合物は、１つの分子標的（例えば、標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）をモジュレートするように選択的に作用するが、別の分子標的（例えば、非標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）を余りモジュレートしない。本発明は、酵素（例えば、タンパク質メチルトランスフェラーゼ）の活性を選択的に阻害する方法をも提供する。好ましくは、事象が集団Ａにおいて集団Ｂと比較して２倍以上の高頻度で生じるならば、事象は集団Ａにおいて集団Ｂに対して選択的に生ずる。事象が集団Ａにおいて５倍以上の高頻度で生じるならば、事象は選択的に生ずる。事象が集団Ａにおいて集団Ｂと比較して１０倍以上、より好ましくは５０倍以上、更により好ましくは１００倍以上、最も好ましくは１０００倍以上の高頻度で生じるならば、事象は選択的に生ずる。例えば、細胞死が癌細胞において正常細胞と比較して２倍以上の高頻度で生じたならば、細胞死は癌細胞において選択的
に生ずると言える。
【０１４８】
本発明の化合物は分子標的（例えば、標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）の活性をモジューレートし得る。モジュレートするとは、分子標的の活性を刺激または抑制することを指す。好ましくは、本発明の化合物を存在させないだけで同一の条件下での分子標的の活性に比して分子標的の活性を少なくとも２倍刺激または抑制するならば、本発明の化合物は分子標的の活性をモジュレートする。より好ましくは、本発明の化合物が本発明の化合物を存在させないだけで同一の条件下での分子標的の活性に比して分子標的の活性を少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍刺激または抑制するならば、本発明の化合物は分子標的の活性をモジュレートする。分子標的の活性は再現可能な手段により測定され得る。分子標的の活性はインビトロまたはインビボで測定され得る。例えば、分子標的の活性はインビトロで酵素活性アッセイまたはＤＮＡ結合アッセイにより測定され得、または分子標的の活性はインビボでレポーター遺伝子の発現をアッセイすることにより測定され得る。
【０１４９】
本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）は、化合物の添加が化合物を存在させないだけで同一の条件下での分子標的の活性に比して分子標的の活性を１０％以上刺激または抑制しないならば、分子標的の活性を余りモジュレートしない。
【０１５０】
本明細書中で使用されている用語「イソ酵素選択的」は、酵素の第２のイソ型と比較して酵素の第１のイソ型が優先的に抑制または刺激されること（例えば、タンパク質メチルトランスフェラーゼイソ酵素βと比較してタンパク質メチルトランスフェラーゼイソ酵素αが優先的に抑制または刺激されること）を意味する。好ましくは、本発明の化合物は生物学的効果を達成するために必要な用量の点で最低４倍の差、好ましくは１０倍の差、より好ましくは５０倍の差を示す。好ましくは、本発明の化合物は抑制の範囲にわたりこの差を示し、差は当該分子標的についてのＩＣ５０、すなわち５０％抑制で例示される。
【０１５１】
本発明の化合物を細胞または前記化合物の必要がある被験者に投与すると、当該タンパク質メチルトランスフェラーゼの活性をモジュレート（すなわち、刺激または抑制）し得る。
【０１５２】
癌または細胞増殖性疾患を治療すると、細胞死が生じ得る。好ましくは、細胞死は集団中の細胞の数を少なくとも１０％減少させる。より好ましくは、細胞死は少なくとも２０％の減少、より好ましくは少なくとも３０％の減少、より好ましくは少なくとも４０％の減少、より好ましくは少なくとも５０％の減少、最も好ましくは少なくとも７５％の減少を意味する。集団中の細胞の数は再現可能な手段により調べられ得る。集団中の細胞の数は蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光顕微鏡検査及び光学顕微鏡検査により調べられ得る。細胞死の測定方法は、Ｌｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１００（５）：２６７４−８，２００３に記載されている。１つの態様で、細胞死はアポトーシスにより生ずる。
【０１５３】
好ましくは、有効量の本発明の化合物は正常細胞に対して余り細胞毒性でない。化合物を治療有効量で投与しても正常細胞の１０％以上で細胞死が誘発されないならば、治療有効量の化合物は正常細胞に対して余り細胞毒性でない。化合物を治療有効量で投与しても正常細胞の１０％以上で細胞死が誘発されないならば、治療有効量の化合物は正常細胞の生存性に余り影響を与えない。１つの態様で、細胞死はアポトーシスにより生ずる。
【０１５４】
細胞を本発明の化合物と接触させると、癌細胞において細胞死を選択的に誘発または活性化し得る。本発明の化合物を必要がある被験者に対して投与すると、癌細胞において細胞死が選択的に誘発または活性化され得る。細胞を本発明の化合物と接触させると、細胞
増殖性疾患に冒されている１つ以上の細胞において細胞死が選択的に誘発され得る。好ましくは、本発明の化合物を必要がある被験者に対して投与すると、細胞増殖性疾患に冒されている１つ以上の細胞において細胞死が選択的に誘発される。
【０１５５】
本発明は、本発明の化合物（すなわち、化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａ）を必要がある被験者に対して投与することによる癌（例えば、その経過はＥＺＨ２媒介タンパク質メチル化をモジュレートすることにより影響され得る）の治療または予防方法に関し、本発明の化合物を投与すると、細胞周期の１つ以上の相（例えば、Ｇ１、Ｇ１／Ｓ、Ｇ２／Ｍ）における細胞の蓄積、細胞老化の誘発、または腫瘍細胞分化の促進による癌細胞増殖の予防；正常細胞において大量の細胞死を生ずることなく細胞毒性、壊死またはアポトーシスによる癌細胞における細胞死の促進、少なくとも２の治療指数での動物の抗腫瘍活性の１つ以上が生ずる。本明細書中で使用されている「治療指数」は、有効用量で割った最大耐量である。本発明は、癌を治療または予防するための適当な候補者を同定するために使用される方法にも関する。
【０１５６】
当業者は、本明細書中に記載されている公知技術または均等技術を詳細説明するために一般的参考文献を参照し得る。これらの文献には、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｅｎｎａら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｆｉｎｇｌら，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９７５），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１８版（１９９０）が含まれる。勿論、これらの文献は本発明の態様を製造または使用する際にも参照され得る。
【実施例】
【０１５７】
材料及び方法
粉末Ｘ線回折
全てのサンプルについてのＰＸＲＤをＲｉｇａｋｕ  ＭｕｌｔｉＦｌｅｘ（標的：Ｃｕ；管電圧：４０ｋＶ；管電流：３０ｍＡ）で取った。
【０１５８】
示差走査熱量測定
全てのサンプルについてのＤＳＣをＭｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣ  １／７００（ラン条件：初期温度３５℃，最終温度３２５℃，加熱速度３０℃／分）で取った。
【０１５９】
Ｘ線結晶学
０．２８×０．２２×０．０６ｍｍの寸法を有する無色板状結晶を非常に少量のパラトン油を用いてナイロンループに載せた。１７３Ｋで操作するＯｘｆｏｒｄ  Ｃｒｙｏｓｔｒｅａｍ低温装置を備えたブルカーＣＣＤ（電荷結合素子）に基づく回折計を用いてデータを集めた。データは０．５°／フレームのω及びφスキャンを用いて４５秒間測定した。イメージの全数は、冗長度が４．０であると予測され、１００％までの完全性が０．８３ÅであるプログラムＣＯＳＭＯからの結果に基づいていた。細胞パラメーターをＡＰＥＸ  ＩＩソフトウェアを用いて検索し、全ての観察された反射についてＳＡＩＮＴを用いて精密化した。データ整理をＬｐについて補正するＳＡＩＮＴソフトウェアを用いて実施した。スケーリング及び吸収補正はＧｅｏｒｇｅ  Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋから供給されるＳ
ＡＤＡＢＳマルチスキャン技術を用いて適用した。構造をＳＨＥＬＸＳ−９７プログラムを用いる直接方法により解析し、ＳＨＥＬＸＴＬ−ＰＣ  Ｖ  ６．１０に取り込まれるＦ２，ＳＨＥＬＸＬ−９７を用いて最小二乗法により精密化した。
【０１６０】
図１１に示す構造は空間群Ｐ２１／ｃ（＃１４）で解析した。全ての非水素原子を異方性の方法で精密化する。水素を幾何学的方法により計算し、ライディングモデルとして精密化した。回折研究のために使用した結晶はデータ収集中に分解を示さなかった。全ての図は５０％楕円体で描いた。
【０１６１】
動的水蒸気吸脱着
ＤＶＳはＶＴＩモデルＳＧＡ−１００システムを用いて測定した。測定方法：相対湿度（ＲＨ）を管理された方法で５．０％から９５．０％まで５％ずつ変化させた後、重量測定水蒸気吸脱着システムを用いて５．０％に戻し、各段階でのサンプルの重量変化％（ｗｔ％）を測定した。
【０１６２】
ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣは、インライン脱ガス装置を有するＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣクォータナリポンプ，低圧混合を用いて実施した。分析方法条件：８μＬのサンプル（約０．４ｍｇ／ｍＬの溶液を与えるように５０ｍＬのメタノールで希釈した２０ｍｇのＥＲ−５８１９８２−０６）をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ，３．５ｕｍ）に注入した。クロマトグラフィー条件：移動相Ａ  水＋５ｍＭ  ギ酸アンモニウム；移動相Ｂ  ５０／４５／５  アセトニトリル／メタノール／水中の５ｍＭ  ギ酸アンモニウム；流速  １．５ｍｌ／分；勾配：０分から３分までは１０％  Ｂで無勾配；３分から７分までは７０％  Ｂに線形増加；７分から１２分までは７０％  Ｂで無勾配；１２分から１５分までは１００％  Ｂに線形増加；１５分から２０分までは１００％  Ｂで無勾配；カラム温度３５℃；検出  ＵＶ  ２３０ｎｍ。化合物Ｉのおおよその保持時間＝１０．７分。
【０１６３】
多形Ａの合成
【０１６４】
【化５】
2018199740.tif 000007
【０１６５】
５−ブロモ−２−メチル−３−ニトロ安息香酸：２−メチル−３−ニトロ安息香酸（１００ｇ，５５２ｍｍｏｌ）を濃Ｈ２ＳＯ４（４００ｍＬ）中に含む撹拌溶液に１，３−ジブロモ−５，５−ジメチル−２，４−イミダゾリジンジオン（８８ｇ，３０８ｍｍｏｌ）を室温で少しずつ添加し、次いで反応混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ、沈殿した固体を濾別し、水で洗浄し、真空下で乾燥して、所望の化合物を固体（１４０ｇ，９８％）として得た。単離した化合物を直接次ステップに使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ  ８．３１（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ）。
【０１６６】
【化６】
2018199740.tif 000008
【０１６７】
メチル５−ブロモ−２−メチル−３−ニトロベンゾエート：５−ブロモ−２−メチル−３−ニトロ安息香酸（２８５ｇ，１１０５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．８Ｌ）中に含む撹拌溶液に室温で炭酸ナトリウム（４６８ｇ，４４１５ｍｍｏｌ）を添加した後、ヨウ化メチル（６２６．６ｇ，４４１５ｍｍｏｌ）を添加した。生じた反応混合物を６０℃で８時間加熱した。完了後（ＴＬＣでモニターした）、（炭酸ナトリウムを除去するために）反応混合物を濾過し、酢酸エチル（１Ｌ×３）で洗浄した。合わせた濾液を水（３Ｌ×５）で洗浄し、水性相を酢酸エチル（１Ｌ×３）で逆抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、標記化合物を固体（２９０ｇ，収率９７％）として得た。単離した化合物を直接次ステップに使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ８．１７（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ）。
【０１６８】
【化７】
2018199740.tif 000009
【０１６９】
メチル３−アミノ−５−ブロモ−２−メチルベンゾエート（１）：メチル５−ブロモ−２−メチル−３−ニトロベンゾエート（２９０ｇ，１０５８ｍｍｏｌ）をエタノール（１．５Ｌ）中に含む撹拌溶液に水性塩化アンモニウム（１．５Ｌの水に溶解した２８３ｇ，５２９０ｍｍｏｌ）を添加した。生じた混合物を８０℃で撹拌し、ここに鉄粉（４７２ｇ，８４５１ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。生じた反応混合物を８０℃で１２時間加熱した。ＴＬＣにより調べて完了したら、反応混合物をセライト（登録商標）を用いて熱濾過し、セライト床をメタノール（５Ｌ）、ＤＣＭ（５Ｌ）中３０％  ＭｅＯＨで順次洗浄した。合わせた濾液を真空中で濃縮し、得られた残渣を水性炭酸水素ナトリウム溶液（２Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（５Ｌ×３）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、標記化合物を固体（２２０ｇ，８５％）として得た。この化合物を直接次ステップに使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ７．３７（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｂｓ，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ）。
【０１７０】
【化８】
2018199740.tif 000010
【０１７１】
メチル５−ブロモ−２−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ア
ミノ）ベンゾエート（２）：反応器にメチル３−アミノ−５−ブロモ−２−メチルベンゾエート（４５５．８ｇ，１．８７ｍｏｌ）、１，２−ジクロロエタン（４．５６Ｌ）及び酢酸（５３５ｍｌ，９．３４ｍｏｌ）を充填した。内部温度を４０℃以下に維持しながら、混合物にジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４（３Ｈ）−オン（２８０ｇ，２．８０ｍｏｌ）及びトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（５９４ｇ，２．８０ｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で２．５時間撹拌した後、反応物を水酸化ナトリウム（４４８ｇ，１１．２０ｍｏｌ）を水（５．６１Ｌ）中に含む溶液でクエンチした。周囲温度で２０分間撹拌した後、有機層を分離し、水性槽を酢酸エチル（３．６５Ｌ）で抽出した。有機層を合わせ、ブライン（１．５Ｌ）で洗浄し、真空下で濃縮した。
【０１７２】
残渣を酢酸エチル（１．８Ｌ）で処理し、６５〜７０℃に加熱した。混合物を６５〜７０℃で１５分間撹拌して透明溶液を得た後、温度を６０〜７０℃に維持しながらｎ−ヘプタン（７．３Ｌ）で処理した。溶液にヘプタンを完全に添加したら、混合物を６５〜７０℃で１５分間保持した後、３時間かけて１８〜２２℃に冷却した。生じた懸濁液を１８〜２２℃で４時間撹拌し、１時間かけて０〜５℃に冷却し、０〜５℃で２時間保持した。沈殿を濾過し、ｎ−ヘプタン（１．４Ｌ）で２回洗浄し、真空下で乾燥して、標記化合物（５４０ｇ，８８％）を得た。この化合物のＸＲＰＤパターンを図１７に示す。
【０１７３】
【化９】
2018199740.tif 000011
【０１７４】
メチル５−ブロモ−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチルベンゾエート（３）：メチル５−ブロモ−２−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）ベンゾエート（１４ｇ，４２．７ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１５０ｍＬ）中に含む撹拌溶液にアセトアルデヒド（３．７５ｇ，８５．２ｍｍｏｌ）及び酢酸（１５．３ｇ，２５６ｍｍｏｌ）を添加した。生じた反応混合物を室温で１５分間撹拌した。混合物を０℃に冷却し、トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（２７ｇ，１２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＴＬＣにより調べて反応が完了したら、ｐＨ７〜８が得られるまで反応混合物に水性炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、有機相を分離し、水性相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗な化合物を酢酸エチル：ヘキサンで溶離させるカラムクロマトグラフィー（１００〜２００メッシュ  シリカゲル）により精製して、所望化合物を粘性液体（１４ｇ，９３％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ  ７．６２（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），３．８０（ｂｓ，５Ｈ），３．３１（ｔ，２Ｈ），２．９７−３．０５（ｍ，２Ｈ），２．８７−２．９６（ｍ，１Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），１．５２−１．６１（ｍ，２Ｈ），１．３７−１．５０（ｍ，２Ｈ），０．８７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
【０１７５】
【化１０】
2018199740.tif 000012
【０１７６】
メチル５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキシレート（４）：
メチル５−ブロモ−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチルベンゾエート（５８０ｇ，１．６３ｍｏｌ）、４−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）モルホリン（５９２ｇ，１．９５ｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（３．８６Ｌ）、炭酸ナトリウム（６１８ｇ，５．８３ｍｏｌ）及び水（７７１ｍｌ）の混合物に２０℃で窒素を２０分間通気することによりこの混合物を脱気し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１４．１１ｇ，１２．２１ｍｍｏｌ）で処理した。生じた混合物を更に２０分間脱気した後、８７〜８９℃に１７時間加熱した。２０℃に冷却した後、混合物を酢酸エチル（５．８０Ｌ）及び（Ｒ）−２−アミノ−３−メルカプトプロピオン酸（２３２ｇ）を水（２．３２０Ｌ）中に含む溶液で希釈した。２０℃で１時間撹拌した後、有機層を分離し、（Ｒ）−２−アミノ−３−メルカプトプロピオン酸（２３２ｇ）を水（２．３２０Ｌ）中に含む溶液で再び洗浄した。水性層を合わせ、酢酸エチル（５．８０Ｌ）で抽出した。有機層を合わせ、水（２．３２Ｌ）中に水酸化ナトリウム（９３ｇ）を含む溶液で洗浄し、真空下３５℃で濃縮して、標記化合物をオレンジ色油状物（１．２１ｋｇ，収率１６４％）として得た。
【０１７７】
【化１１】
2018199740.tif 000013
【０１７８】
５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボン酸（５）：メチル５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキシレート（６９．０ｇ，１５２．５ｍｍｏｌ）（前ステップからの理論収率に基づいて）をエタノール（３８０ｍＬ）中に懸濁し、水酸化ナトリウム（２４．８４ｇ，６２１．０ｍｍｏｌ）を水（２０７ｍＬ）中に含む溶液で処理した。混合物を４０℃で１８時間撹拌した。０〜５℃に冷却した後、温度を２５℃以下に維持しながら混合物を１Ｎ  塩酸（５８０ｍＬ）を用いてｐＨ６．５に中和した。次いで、混合物をジクロロメタン（６９０ｍＬ）とメタノール（６９．０ｍＬ）の混合物で２回抽出した。有機層を合わせ、真空下で濃縮して、粗な生成物を
黄色固体（１２７ｇ）として得た。
【０１７９】
粗な生成物を７０℃で２−メチルテトラヒドロフラン（６５６ｍＬ）中に溶解した後、ＩＰＡ（８２８ｍＬ）で処理した。混合物を３〜４時間かけて室温まで放冷した後、室温で一晩撹拌した。沈殿を濾過し、ＩＰＡ（２０７ｍＬ）で２回洗浄し、真空下で乾燥して、標記化合物をオフホワイト色固体（５３．５４ｇ，８０％）として得た。この化合物のＸＲＰＤパターンを図９に示す。
【０１８０】
【化１２】
2018199740.tif 000014
【０１８１】
Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド（化合物Ｉ）：５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボン酸（５４０ｇ，１．２３ｍｏｌ）及び３−（アミノメチル）−４，６−ジメチル−ジヒドロ−ピリジン−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（２７９ｇ，１．４８ｍｏｌ）の混合物をＤＭＳＯ（２．７０Ｌ）中に懸濁し、トリエチルアミン（２２３ｍｌ，１．６０ｍｏｌ）で処理した。混合物を２５℃で３０分間撹拌し、ＥＤＣ−ＨＣｌ（３５４ｇ，１．８５ｍｏｌ）及びＨＯＢＴ水和物（２８３ｇ，１．８５ｍｏｌ）で処理した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。トリエチルアミン（２９２ｍｌ，２．０９ｍｏｌ）を添加した後、混合物を１５℃まで冷却し、温度を３０℃以下に維持しながら水（１０．１Ｌ）で希釈し、１９〜２５℃で４時間撹拌した。生じた沈殿を濾過し、水（２．７０Ｌ）で２回洗浄し、真空下で乾燥して、粗な生成物（６９５ｇ，ｗｔ−ｗｔ分析＝７８％）を得た。
【０１８２】
生成物を更に精製するために、再結晶化を実施した。粗な生成物（２０．００ｇ，３４．９２ｍｍｏｌ）をエタノール（１９０ｍｌ）と水（１０．００ｍｌ）の混合物中に懸濁し、透明な溶液が得られるまで７５℃に加熱した。溶液を一晩で室温まで放冷した。沈殿を濾過し、エタノール（３０．０ｍｌ）と水（３０．０ｍｌ）の混合物で２回洗浄し、真空下３５℃で乾燥して、標記化合物をオフホワイト色固体（１４．０ｇ，粗な生成物から７０％の回収率及びｗｔ−ｗｔアッセイに基づいて９０％の収率）として得た。
【０１８３】
【化１３】
2018199740.tif 000015
【０１８４】
４−（（３’−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−５’−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４’−メチル−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）メチル）モルホリン−４−イウムブロミド（多形Ａ）：粗なＮ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド（５９５ｇ，ｗｔ−ｗｔアッセイに基づいて４６４ｇ，８１０．３ｍｍｏｌ）をエタノール（３．３３Ｌ）中に懸濁した。７０℃に加熱した後、混合物を４８％  水性ＨＢｒ（９７ｍｌ，８５０．８ｍｍｏｌ）で処理し、７０℃で３０分間撹拌した。温度を６０℃以上に維持しながら生じた橙赤色溶液を酢酸エチル（３．３３Ｌ）で処理した。混合物を１８時間かけて室温までゆっくり冷却した。混合物を１時間かけて０℃まで冷却し、この温度で５．５時間撹拌した。生じた沈殿を濾過し、酢酸エチル（１．３９Ｌ）で２回洗浄し、真空下で乾燥して、標記化合物をオフホワイト色固体（５１５ｇ，収率９７％）として得た。
【０１８５】
多形Ａの再結晶化：４−（（３’−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−５’−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４’−メチル−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）メチル）モルホリン−４−イウムブロミド（０．５０ｇ，０．７７ｍｍｏｌ；ＨＰＬＣにより純度９５．６％）をエタノール（３．０ｍＬ）中に懸濁し、透明な溶液が得られるまで８０℃に加熱した。溶液にＭＴＢＥ（５．０ｍｌ）をゆっくり添加した。生じた溶液を３時間かけて１８〜２２℃まで放冷し、１８〜２２℃で１５時間撹拌した。沈殿を濾過し、ＭＴＢＥ（２ｍＬ）で２回洗浄し、真空下で乾燥して、０．４５ｇの標記化合物（回収率８９％，ＨＰＬＣにより純度９６．６％）を得た。多形Ａ（一臭化水素酸塩）のＸ線粉末回折パターンを図１に示す。下表１は最も重要なピークをリストしている。
【０１８６】
【表１】
2018199740.tif 000016
【０１８７】
化合物Ｉの臭化水素酸塩及び多形Ａの評価
塩酸塩、臭化水素酸塩、半硫酸塩、ナトリウム塩、リン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩及びＬ−酒石酸塩を含めた化合物Ｉの多数の各種塩形態を製造し、スクリーニングした。これらの中で、臭化水素酸塩（ＨＢｒ）塩が製造の容易さ及び吸湿性の点で最も有利な物理化学的特性を有していた。
【０１８８】
化合物Ｉの遊離塩基及びこの化合物のＨＣｌ塩の詳細な研究を実施した。ＸＲＤ及びＤＳＣを用いた予備多形スクリーニング中、化合物Ｉの遊離形態から少なくとも５つの異なる結晶形が検出された。遊離形態の結晶化中に高度の変動が観察されたために、他の塩の結晶形は購入した。スクリーニングした塩の中で、一塩酸塩、一臭化水素酸塩、半硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、Ｌ−酒石酸塩及びナトリウム塩形態は結晶性であった。リン酸塩及びマレイン酸塩は非常に吸湿性であり、Ｌ−酒石酸塩は低い結晶化度を有していた。
【０１８９】
化合物ＩのＨＣｌ塩から高い結晶化度を得ることは困難であった。結晶化条件に関係なく結晶性及び非晶質物質の混合物が得られた。図８に示すように、化合物Ｉの一塩酸塩のＤＳＣデータは１９０．５℃で吸熱する若干の非結晶化度を示している。また、化合物Ｉの一塩酸塩についての動的水蒸気吸脱着（ＤＶＳ）データを得、若干の吸湿性を示すことが判明した。７５％の相対湿度（ＲＨ）及び２５℃で４〜６％の重量増加が観察された（図１８Ｂ）。これは、一塩酸塩のある量の非結晶性に起因し得る。例えば、化合物Ｉの非晶質三塩酸塩を示している図１８Ａを参照されたい。結晶化度レベルはコントロール不能であったので、ＨＣｌ塩は更なる開発のために考慮されなかった。
【０１９０】
図６に示すように、化合物Ｉのナトリウム塩のＤＶＳ分析は高い吸湿性を示した：７５％の相対湿度（ＲＨ）及び２５℃で約１５％の重量増加が観察された。図７に示すように、化合物Ｉの半硫酸塩は中程度に高い吸湿性を示した：７５％の相対湿度（ＲＨ）及び２５℃で９〜１１％の重量増加が観察された。これは、半硫酸塩のＤＳＣデータが明らかな吸熱なしで非常高い非結晶化度を示しているように化合物の高い非晶性に起因し得る。
【０１９１】
これらの結晶性化合物の中で、一臭化水素酸塩が最も結晶性であり、最低の吸湿性であ
った（図１、３及び４を参照されたい）。更に、一臭化水素酸塩は非常に安定であり、不純物の生成に抵抗している（図５は多形Ａの高温で３日間にわたるＨＰＬＣ分析を示している。多形Ａは１００℃で３日間でも最小の不純物しか生じなかった）。興味深いことに、化合物Ｉの二ＨＢｒ塩は主に非晶質であることが判明した（図２）。
【０１９２】
化合物Ｉの一臭化水素酸塩の２つの異なる結晶形（多形Ａ及びＢ）は異なる溶媒系から入手し、ＸＲＤ、ＤＳＣ及びＴＧＡ−ＤＳＣ分析を用いて特性評価した。化合物Ｉのそれぞれのバッチからのこれら２つの異なる結晶形についてのＸＲＤ及びＤＳＣデータを図１、図３及び図１０に示す。多形Ｂは８．５、１０．９、１６．７、１７．４、２０．９、２２．１及び２５．７±０．２°（２θ）にピークを有する粉末ＸＲＤパターンにより特性評価される（図１０を参照されたい）。これら２つの中で、多形Ａはより結晶性であると判明した。動的水蒸気吸脱着（ＤＶＳ）研究は多形Ａが非吸湿性であることを示した（図４）。熱分析で、１つの吸熱ピークが約２５１℃の開始温度で観察された。加えて、ＤＳＣ分析から多形Ａを再結晶化すると材料の結晶化度が大きく向上することが明らかとなった（図３を参照されたい）。
【０１９３】
複数の実験室規模ランで、多形Ａが再現性よく得られ、結晶化条件を僅かに変化させても異なる結晶形を生じなかった。
【０１９４】
野生型及び変異体ＰＲＣ２酵素アッセイ
一般的材料
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ビシン、ＫＣｌ、トゥイーン２０、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び牛皮ゼラチン（ＢＳＧ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからできるだけ最高純度のものを購入した。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）はＥＭＤから購入した。３Ｈ−ＳＡＭはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから８０Ｃｉ／ｍｍｏｌの比放射能のものを購入した。３８４ウェルのストレプトアビジンフラッシュプレートはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから購入した。
【０１９５】
基質
無修飾リシン２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０）またはジメチル化リシン２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２）のいずれかを含有しているヒトヒストンＨ３残基２１−４４を代表するペプチドを２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓによりＣ末端Ｇ（Ｋ−ビオチン）リンカー親和性タグモチーフ及びＣ末端アミドキャップを用いて合成した。これらのペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて純度９５％以上に精製し、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）により確認した。配列を以下にリストする：Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０：ＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＧＫ（ビオチン）−アミド（配列番号１）
Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２：ＡＴＫＡＡＲＫ（ｍｅ２）ＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＧＫ（ビオチン）−アミド（配列番号２）
ニワトリ赤血球オリゴヌクレオゾームは定型手順に従ってニワトリ血液から精製した。
【０１９６】
組換えＰＲＣ２複合体
ヒトＰＲＣ２複合体をスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ｓｆ９）細胞においてバキュロウイルス発現系を用いて共発現させた四成分酵素複合体として精製した。発現させたサブユニットは、野生型ＥＺＨ２（ＮＭ＿００４４５６）、または野生型ＥＺＨ２構築物から作成したＥＺＨ２  Ｙ６４１Ｆ、Ｎ、Ｈ、ＳまたはＣ変異体、ＥＥＤ（ＮＭ＿００３７９７）、Ｓｕｚ１２（ＮＭ＿０１５３５５）及びＲｂＡｐ４８（ＮＭ＿００５６１０）であった。ＥＥＤサブユニットは、ｓｆ９細胞ライゼート由来の全四成分複合体を精製するために使用したＮ末端ＦＬＡＧタグを含ん
でいた。複合体の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びアジレントバイオアナライザー分析により調べて９５％以上であった。酵素ストック濃厚物の濃度（通常０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬ）はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準に対してブラッドフォードアッセイを用いて測定した。
【０１９７】
ペプチド基質に対するＰＲＣ２酵素アッセイの一般的手順
アッセイはすべて、使用当日に調製した２０ｍＭ  ビシン（ｐＨ＝７．６）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．００５％  ＢＳＧ及び０．００２％  トゥイーン２０から構成した緩衝液中で実施した。１００％  ＤＭＳＯ（１μＬ）中の化合物を３８４チャネルピペットヘッド（Ｔｈｅｒｍｏ）を取り付けたＰｌａｔｅｍａｔｅ  ２×３を用いてポリプロピレン３８４ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にスポッティングした。最大シグナルコントロールのためにＤＭＳＯ（１μＬ）を列１１、１２、２３、２４の行Ａ〜Ｈに添加し、最小シグナルコントロールのために公知化合物でありＰＲＣ２の阻害剤のＳＡＨ（１μＬ）を列１１、１２、２３、２４の行Ｉ〜Ｐに添加した。野生型ＰＲＣ２酵素及びＨ３Ｋ２７ｍｅ０ペプチド、またはＹ６４１変異体酵素及びＨ３Ｋ２７ｍｅ２ペプチドを含有しているカクテル（４０μＬ）をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）により添加した。化合物をＰＲＣ２と２５℃で３０分間インキュベートした後、反応を開始させるために非放射性及び３Ｈ−ＳＡＭの混合物を含有しているカクテル（１０μＬ）を添加した（最終容量＝５１μＬ）。いずれの場合も、最終濃度は以下の通りであった：野生型または変異体ＰＲＣ２酵素は４ｎＭであり、最小シグナルコントロールウェル中のＳＡＨは１ｍＭであり、ＤＭＳＯ濃度は１％であった。残りの成分の最終濃度を下表２に示す。３Ｈ−ＳＡＭをペプチド基質への取り込みがもはや検出されなくなるレベルに希釈する６００μＭの最終濃度まで非放射性ＳＡＭ（１０μＬ）を添加することによりアッセイを停止した。次いで、３８４ウェルポリプロピレンプレート中の反応物５０μＬを３８４ウェルフラッシュプレートに移し、ビオチニル化ペプチドをストレプトアビジン表面に少なくとも１時間結合させた後、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄装置を用いて０．１％
トゥイーン２０で３回洗浄した。次いで、プレートを毎分壊変数（ｄｐｍ）として測定される、または毎分カウント数（ｃｐｍ）と称されるフラッシュプレート表面に結合した３Ｈ標識ペプチドの量を測定するためにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒトップコートプレートリーダーを用いて調べた。
【０１９８】
【表２】
2018199740.tif 000017
【０１９９】
オリゴヌクレオゾーム基質に対する野生型ＰＲＣ２酵素アッセイの一般的手順
アッセイは、使用当日に調製した２０ｍＭ  ビシン（ｐＨ＝７．６）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．００５％  ＢＳＧ、１００ｍＭ  ＫＣｌ及び０．００２％  トゥイーン２０から構成される緩衝液中で実施した。１００％  ＤＭＳＯ（１μＬ）中の化合物を３８４チャネルピペットヘッド（Ｔｈｅｒｍｏ）を取り付けたＰｌａｔｅｍａｔｅ  ２×３を用いてポリプロピレン３８４ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にスポッティングした。最大シグナルコントロールのためにＤＭＳＯ（１μＬ）を列１１、１２、２３、２４の行Ａ〜Ｈに添加し、最小シグナルコントロールのために公知化合物でありＰＲＣ２の阻害剤のＳＡＨ（１μＬ）を列１１、１２、２３、２４の行Ｉ〜Ｐに添加した。野生型ＰＲＣ２酵素及びニワトリ赤血球オリゴヌクレオゾームを含有しているカクテル（４０μＬ）をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）により添加した。化合物をＰＲＣ２と２５℃で３０分間インキュベートした後、反応を開始させるために非放射性及び３Ｈ−ＳＡＭの混合物を含有しているカクテル（１０μＬ）を添加した（最終容量＝５１μＬ）。最終濃度は以下の通りであった：野生型ＰＲＣ２酵素は４ｎＭであり、非放射性ＳＡＭは４３０ｍＭであり、３Ｈ−ＳＡＭは１２０ｎＭであり、ニワトリ赤血球オリゴヌクレオゾームは１２０ｎＭであり、最小シグナルコントロールウェル中のＳＡＨは１ｍＭであり、ＤＭＳＯ濃度は１％であった。３Ｈ−ＳＡＭをニワトリ赤血球オリゴヌクレオゾームへの取り込みがもはや検出されなくなるレベルに希釈する６００μＭの最終濃度まで非放射性ＳＡＭ（１０μＬ）を添加することによりアッセイを停止した。次いで、３８４ウェルポリプロピレンプレート中の反応物５０μＬを３８４ウェルフラッシュプレートに移し、ニワトリ赤血球オリゴヌクレオゾームをプレートの表面に固定化し、次いでＢｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄装置を用いて０．１％  トゥイーン２０で３回洗浄した。次いで、プレートを毎分壊変数（ｄｐｍ）として測定される、または毎分カウント数（ｃｐｍ）と称されるフラッシュプレート表面に結合した３Ｈ標識ニワトリ赤血球オリゴヌクレオゾームの量を測定するためにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒトップコートプレートリーダーを用いて調べた。
【０２００】
【数１】
2018199740.tif 000018
ここで、ｄｐｍ＝毎分壊変数、ｃｍｐｄ＝アッセイウェル中のシグナル、ｍｉｎ及びｍａｘはそれぞれ最小及び最大シグナルコントロール。
【０２０１】
４パラメーターＩＣ５０フィット
【０２０２】
【数２】
2018199740.tif 000019
ここで、トップ及びボトムは通常変動し得るが、３パラメーターフィットではそれぞれ１００または０に固定され得る。ヒル係数は通常変動し得るが、３パラメーターフィットでは１に固定され得る。Ｙは抑制％であり、Ｘは化合物濃度である。
【０２０３】
ペプチド基質（例えば、ＥＺＨ２野生型及びＹ６４１Ｆ）に対するＰＲＣ２酵素アッセイのＩＣ５０値を下表３に示す。
【０２０４】
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２メチル化アッセイ
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２懸濁細胞はＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，独国ブラウンシュヴァイク）から購入した。ＲＰＭＩ／Ｇｌｕｔａｍａｘ培地、ペリシリン−ストレプトマイシン、熱失活したウシ胎児血清及びＤ−ＰＢＳはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。抽出緩衝液及び中和緩衝液（５×）はＡｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ（米国カリフォルニア州カールスバッド）から購入した。家兔抗ヒストンＨ３抗体はＡｂｃａｍ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。家兔抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３及びＨＲＰコンジュゲートした抗家兔ＩｇＧはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国マサチューセッツ州ダンバース）から購入した。ＴＭＢ「スーパーセンシティブ」基質はＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メリーランド州オーウィング・ミルズ）から提供された。ＩｇＧ非含有ウシ血清アルブミンはＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（米国ペンシルベニア州ウェスト・グローブ）から購入した。トゥイーンを含むＰＢＳはＫＰＬ（米国マサチューセッツ州ゲイザースバーグ）（１０×ＰＢＳＴ）から購入した。硫酸はＲｉｃｃａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ（米国テキサス州アーリントン）から購入した。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＥＬＩＳＡプレートはＴｈｅｒｍｏ（米国ニューヨーク州ロチェスター）から購入した。Ｖ底細胞培養プレートはＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（米国ニューヨーク州コーニング）から購入した。Ｖ底ポリプロピレンプレートはＧｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（米国ノースカロライナ州モンロー）から購入した。
【０２０５】
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２懸濁細胞は増殖培地（１０％ｖ／ｖ  熱失活したウシ胎児血清及び１００単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０）において維持し、５％  ＣＯ２下３７℃で培養した。アッセイ条件下で、細胞をプレートシェーカーを用いてアッセイ培地（２０％ｖ／ｖ  熱失活したウシ胎児血清及び１００単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０）において５％
ＣＯ２下３７℃でインキュベートした。
【０２０６】
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を９６ウェルＶ底細胞培養プレートに対して２００μＬ／ウェルでアッセイ培地に５０，０００細胞／ｍＬの濃度で接種した。９６ウェルソースプレートからの化合物（１μＬ）をＶ底細胞プレートに直接添加した。プレートをタイタープレートシェーカーを用いて３７℃、５％  ＣＯ２で９６時間インキュベートした。４日間インキュベートした後、プレートを２４１×ｇで５分間回転し、細胞ペレットを乱すことなく培地を細胞プレートの各ウェルからやさしく吸引した。ペレットを２００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁し、プレートを再び２４１×ｇで５分間回転した。上清を吸引し、冷（４℃）抽出緩衝液（１００μＬ／ウェル）を添加した。プレートをオービタルシェーカーを用いて４℃で２時間インキュベートした。プレートを３４２７×ｇで１０分間回転した。上清（８０μＬ／ウェル）を９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート中のそれぞれのウェルに移した。上清を含有しているＶ底ポリプロピレンプレートに中和緩衝液５×（２０μＬ／ウェル）を添加した。粗なヒストン調製物（ＣＨＰ）を含有しているＶ底ポリプロピレンプレートをオービタルシェーカーを用いて５分間インキュベートした。粗なヒストン調製物（２μＬ／ウェル）を２組の１００μＬのコーティング緩衝液（１×ＰＢＳ＋ＢＳＡ
０．０５％ｗ／ｖ）を含有している９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェルに添加した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを３００μＬ／ウェルの１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルを３００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ希釈剤（（ＰＢＳ（１×）ＢＳＡ（２％ｗ／ｖ）及びトゥイーン２０（０．０５％ｖ／
ｖ））で２時間ブロックした。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。ヒストンＨ３検出プレートに対して、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ希釈剤で１：１０，０００希釈した抗ヒストン−Ｈ３抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１７９１）を添加した。Ｈ３Ｋ２７トリメチル化検出プレートに対して、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ希釈剤で１：２０００希釈した抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を添加した。プレートを室温で９０分間インキュベートした。プレートを３００μＬ／ウェルの１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。ヒストンＨ３検出のために、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ希釈剤で１：６０００希釈したＨＲＰコンジュゲートした抗家兔ＩｇＧ抗体を添加した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３検出のために、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ希釈剤で１：４０００希釈したＨＲＰコンジュゲートした抗家兔ＩｇＧ抗体を添加した。プレートを室温で９０分間インキュベートした。プレートを３００μＬ／ウェルの１×ＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加した。ヒストンＨ３プレートを室温で５分間インキュベートした。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３プレートを室温で１０分間インキュベートした。反応を１Ｎ  硫酸（１００μＬ／ウェル）で停止させた。各プレートの吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０２０７】
まず、各ウェルの比を
【０２０８】
【数３】
2018199740.tif 000020
により求めた。
【０２０９】
各プレートに、ＤＭＳＯのみの治療（最小抑制）の８つの対照ウェル及び最大抑制のための８つの対照ウェル（バックグラウンドウェル）を含めた。
【０２１０】
各対照タイプについての比値の平均を計算し、プレート中の各試験ウェルについての抑制％を決定するために使用した。試験化合物を２５μＭから始めて全部で１０個の試験濃度に対してＤＭＳＯで３倍連続希釈した。抑制％を決定し、ＩＣ５０曲線を化合物の濃度につき２組のウェルを用いて作成した。このアッセイのＩＣ５０値を下表３に示す。
【０２１１】
【数４】
2018199740.tif 000021
【０２１２】
細胞増殖分析
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２懸濁細胞はＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，独国ブラウンシュヴァイク）から購入した。ＲＰＭＩ／Ｇｌｕｔａｍａｘ培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、熱失活したウシ胎児血清はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。Ｖ底ポリプロピレン３８４ウェルプレートはＧｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（米国ノースカロライナ州モンロー）から購入した。細胞培養３８４ウェル乳白色プレートはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（米国マサチューセッツ州ウォーザン）から購入した。Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）はＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ウィスコンシン州マディソン）から購入した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬ（米国カリフォルニア州サニーベール）から購入した。
【０２１３】
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２懸濁細胞は増殖培地（１０％ｖ／ｖ  熱失活したウシ胎児血清アルブミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０）において維持し、５％  ＣＯ２下３７℃で培養した。アッセイ条件下で、細胞をアッセイ培地（２０％ｖ／ｖ  熱失活したウシ胎児血清アルブミン及び１００単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０）において５％  ＣＯ２下３７℃でインキュベートした。
【０２１４】
化合物のＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株の増殖に対する効果を評価するために、指数増殖している細胞を３８４ウェル乳白色プレートにおいて最終容量５０μＬのアッセイ培地で１２５０細胞／ｍｌの密度で平板培養した。化合物ソースプレートは、１０ｍＭから始めて３組の９ポイントのＤＭＳＯでの３倍連続希釈を実施することにより作成した（アッセイ中の化合物の最終トップ濃度は２０μＭであり、ＤＭＳＯは０．２％であった）。化合物ストックプレートからの１００ｎＬアリコートを細胞プレート中のそれぞれのウェルに添加した。１００％抑制対照は２００ｎＭの最終濃度のスタウロスポリンで治療した細胞から構成し、０％抑制対照はＤＭＳＯ治療細胞から構成した。化合物を添加した後、アッセイプレートを３７℃、５％  ＣＯ２、相対湿度＞９０％で６日間インキュベートした。細胞培養物中に存在するＡＴＰを定量し、３５μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬を細胞プレートに添加することにより細胞生存性を調べた。ルミネセンスをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５を用いて測定した。細胞生存性を５０％抑制する濃度を正規化した用量応答曲線の４パラメーターフィットを用いて求めた。このアッセイのＩＣ５０値を下表３に示す。
【０２１５】
【表３】
2018199740.tif 000022
【０２１６】
インビボ研究−ＳＵＤＨＬ１０ヒトリンパ腫細胞株
マウス
雌Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（登録商標）マウス（ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＩｃｒＩｃｏＣｒｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）は６〜８週齢であり、研究の１日目には１６．０〜２１．１ｇの体重（ＢＷ）を有していた。動物は自由に水（滅菌）及び放射線滅菌したドライ顆粒状餌を摂取した。マウスをスタティックマイクロアイソレーター中のトウモロコシ穂軸わらに２０〜２２℃（６８〜７２°Ｆ）及び４０〜６０％  湿度で１２時間光サイクルで入れた。全ての手順は拘束、畜産、外科手順、飼料及び流体規制並びに獣医ケアに関して実験動物の管理及び使用に関するガイドの推奨に従っている。
【０２１７】
腫瘍細胞培養
ヒトリンパ腫細胞株ＳＵＤＨＬ１０はＤＳＭＺから入手し、１００単位／ｍＬのペニシリンＧナトリウム塩、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１０％  ウシ胎児血清を含有しているＲＰＭＩ−１６４０培地中の懸濁培養物としてＣＲＯで維持した。細胞を加湿インキュベーター内の組織培養フラスコにおいて３７℃、５％  ＣＯ２及び９５％  空気の雰囲気中で培養した。移植のためには経代１２以下の培養物のみを使用した。
【０２１８】
インビボ腫瘍移植
ＳＵＤＨＬ１０ヒトリンパ腫細胞株を対数増殖中期中に採取し、５０％  マトリゲル（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳ中に再懸濁した。各マウスの右脇腹に１×１０７細胞（０．２ｍＬ細胞懸濁液）を皮下投与した。所望の８０〜１２０ｍｍ３範囲に近づいた平均容積として増殖をモニターするために腫瘍を２寸法でカリパスを用いて計った。腫瘍大きさ（単位ｍｍ３）は
【０２１９】
【数５】
2018199740.tif 000023
（ここで、ｗ＝腫瘍の幅、ｌ＝腫瘍の長さ，単位ｍｍ）
から計算した。腫瘍重量は、１ｍｇは１ｍｍ３の腫瘍容積に等しいと仮定して推定され得る。１０日後、７２〜２５６ｍｍ３の腫瘍を有するマウスを１７３〜１７９ｍｍ３の平均腫瘍容積を有する４つの群（ｎ＝１６匹／群）に分けた。
【０２２０】
試験物
化合物Ｉの臭化水素酸塩を室温で保存し、遮光した。各治療日に、粉末を脱イオン水中０．５％  ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＮａＣＭＣ）及び０．１％  トゥイーン（登録商標）８０中に懸濁することにより新鮮な化合物処方物を調製した。同一スケジュールで対照群を治療するためにビヒクル、脱イオン水中０．５％  ＮａＣＭＣ及び０．１％  トゥイーン（登録商標）８０を使用した。処方物は投与前４℃で遮光して保存した。
【０２２１】
治療プラン
マウスに１２５〜５００ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ｉの臭化水素酸塩を用いてＢＩＤ（１２時間毎に１日２回）スケジュールで２８日間強制経口投与した。各用量を０．２ｍＬ／２０ｇ  マウス（１０ｍＬ／ｋｇ）の容量でデリバリーし、各動物の最後に記録された体重に対して調節した。２５日目に、８匹／群の最小の腫瘍を有するマウスを腫瘍増殖遅延エンドポイント（６０日まで観察）のために選択した。残りの動物は腫瘍採取のために２８日目に最後の投与から３時間後に安楽死させた。
【０２２２】
メディァン腫瘍容積（ＭＴＶ）及び腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）分析
治療効率を治療最終日に調べた。最終日に評価可能な動物数ｎに対するＭＴＶ（ｎ）メディアン腫瘍容積を群毎に調べた。腫瘍増殖抑制パーセント（％ＴＧＩ）は幾つかの方法で規定され得る。第１に、指定された対象群のＭＴＶ（ｎ）と薬物治療群のＭＴＶ（ｎ）間の差は対象群のＭＴＶ（ｎ）のパーセントとして表示される。
【０２２３】
【数６】
2018199740.tif 000024
【０２２４】
％ＴＧＩを計算する別の方法は、ｎは治療最終日として、１日目からｎ日までの腫瘍大きさの変化を考慮している。
【０２２５】
【数７】
2018199740.tif 000025
【０２２６】
腫瘍増殖遅延分析
腫瘍増殖遅延分析のために、８匹／群のマウスを最終治療日後も生存させた。腫瘍を１週間に２回カリパスを用いて計り、新生物が２０００ｍｍ３のエンドポイント容積に達したかまたは研究の予め特定した最終日のいずれか早い日に各試験動物を安楽死させた。カプランマイヤー生存分析を実施した。
【０２２７】
毒性
動物の体重を１〜５日目に毎日測定した後、研究が完了するまで１週間に２回測定した。治療に関連する副作用の明らかな兆候についてマウスをしばしば観察し、文書に残した。最大耐量（ＭＴＤ）に対する許容され得る毒性は、試験中群平均ＢＷ減少２０％未満及びＴＲ死に起因する死亡率１０％以下と定義された。死亡が臨床兆候及び／または検死により立証される治療副作用に起因したかまたは投与期間中の原因不明のためであったならば、死亡はＴＲと分類することとした。死亡が治療副作用に関連していなかったならば、死亡はＮＴＲと分類することとした。投与間隔中のＮＴＲ死は典型的にはＮＴＲａ（事故またはヒューマンエラーに起因する）またはＮＴＲｍ（侵襲及び／または転移による検死で確認された腫瘍播種に起因する）と分類される。投与期間中原因不明で死亡した経口治療を受けた動物は、投与エラーを除外するために群パフォーマンスがＴＲ分類及び検死を裏付けず、利用不可能のときにはＮＴＲｕと分類され得る。
【０２２８】
サンプリング
２８日目に、腫瘍の標的抑制を評価するために最大の腫瘍を有する８匹のマウスを予め規定した方法でサンプリングした。腫瘍を特定したマウスからＲＮＡｓｅのない条件下で採取し、二分した。全腫瘍重量を測定した。各動物からの凍結腫瘍組織を液体Ｎ２中で瞬間凍結し、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した。
【０２２９】
統計及びグラフィカル分析
全ての統計及びグラフィカル分析をＰｒｉｓｍ  ３．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ）ｆｏｒ
Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を用いて実施した。全治療期間にわたり対照群と治療群間の統計上有意を調べるために、反復測定ＡＮＯＶＡテストの後に、ダネット多重比較ポストテストを使用した。Ｐｒｉｓｍは、結果をＰ＞０．０５で有意でない（ｎｓ）、０．０１＜Ｐ＜０．０５で有意である（“＊”の記号で表す）、０．００１＜Ｐ＜０．０１で非常に有意である（“＊＊”）、Ｐ＜０．００１で特に有意である（“＊＊＊”）と報告している。研究の腫瘍増殖遅延アームの場合、研究で残っている各群中の動物のパーセント対時間をカプラン・マイヤー生存プロットで表す。
【０２３０】
ヒストン抽出
ヒストンを単離するために、６０〜９０ｍｇの腫瘍組織を１．５ｍｌの核抽出緩衝液（１０ｍＭ  トリスＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２５ｍＭ  ＫＣｌ，１％  トリトンＸ−１００，８．６％  スクロース＋Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤錠剤１８３６１４５）中でホモジナイズし、氷上で５分間インキュベートした。核を４℃で６００ｇで５分間遠
心することにより収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。上清を取り除き、１５分毎に渦流撹拌しながらヒストンを０．４Ｎ  冷硫酸で１時間抽出した。抽出物を４℃で１００００ｇで１０分間遠心することにより清澄化し、１０×容量の氷冷アセトンを収容している新しい微量遠心管に移した。ヒストンを−２０℃で２時間〜一晩沈殿させ、１００００ｇで１０分間遠心することによりペレット化し、水中に再懸濁した。
【０２３１】
ＥＬＩＳＡ
ヒストンを０．５ｎｇ／ｕｌ−サンプルを生ずるようにコーティグ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％  ＢＳＡ）中に当量濃度で作成し、１００ｕｌのサンプルまたは標準物質を２つの９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ  ＃３８８５）に対して２通りで添加した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＢｉｏＴｅｋプレート洗浄装置を用いて３００ｕｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％  トゥイーン２０；１０×ＰＢＳＴ，ＫＰＬ
＃５１−１４−０２）で３回洗浄した。プレートを３００ｕｌ／ウェルの希釈剤（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．０５％  トゥイーン２０）でブロックし、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。全ての抗体を希釈剤で希釈した。１００ｕｌ／ウェルの抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（ＣＳＴ  ＃９７３３，５０％  グリセロールストック  １：１，０００）または抗全Ｈ３（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７９１，５０％  グリセロール  １：１０，０００）を各プレートに添加した。プレートを室温で９０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。１００ｕｌ／ウェルの抗Ｒｂ−ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７０７４）をＨ３Ｋ２７Ｍｅ３プレートに対して１：２，０００で添加し、Ｈ３プレートに対しては１：６，０００で添加し、室温で９０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。検出のために、１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ＢｉｏＦｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＴＭＢＳ）を添加し、プレートを暗所、室温で５分間インキュベートした。反応を１００ｕｌ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。４５０ｎｍの吸光度をＳｐｅｃｔａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【０２３２】
結果
ＳＵＤＨＬ１０腫瘍異種移植片を有しているマウスを化合物Ｉの臭化水素酸塩を用いて５００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤの最大耐量及びＭＴＤの分量（１／２及び１／４  ＭＴＤ）で治療した。全ての用量は明白な体重減少を示すことなく２８日間十分耐性を示した。５００ｍｇ／ｋｇの群では、投与エラーのために１５日目に１例の治療関連死が見られた。全ての用量で、２８日目でビヒクルと比較して腫瘍増殖抑制が生じ（表４）、２５０ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ群は退縮を誘発した（ＴＧＩ＞１００％）。
【０２３３】
【表４】
2018199740.tif 000026
【０２３４】
図１２Ａは各種治療群についてのＳＵＤＨＬ１０異種移植片腫瘍の増殖を経時的に示し
ている。１２５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ群は反復測定ＡＮＯＶＡ及びダネットポストテストによりビヒクル群と有意な差はなかったが、２８日目の平均最終腫瘍大きさはビヒクル群のものに比して有意に小さかった（ボンフェローニポストテストを用いて２元ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０００１）。２５０ｍｇ／ｋｇのＢＩＤ及び５００ｍｇ／ｋｇのＢＩＤの化合物Ｉの臭化水素酸塩を２８日間投与すると、これら２群に対する２８日目の最終腫瘍重量が類似であるように匹敵する退縮応答を誘発した（図１２Ｂ）。
【０２３５】
２８日目に（最後の投与から３時間後）投与してから腫瘍から単離したヒストンをグローバルＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルのためにＥＬＩＳＡ分析にかけた。図１３は、化合物Ｉの臭化水素酸塩の治療でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチルマークの明らかな用量依存性ダウンレギュレーションを示している。この図は、化合物Ｉの臭化水素酸塩を用いて２８日間治療したマウスからのＳＵＤＨＬ１０腫瘍中のグローバルＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示している。
【０２３６】
２５日目に、８匹／群の最小大きさの腫瘍を有するマウスを２８日目に投与中止した後の腫瘍の再増殖を評価するための腫瘍増殖遅延研究のために選択した。腫瘍が２０００ｍｍ３の大きさに達するかまたは６０日目に（いずれか早い方）マウスを安楽死させた。これらのデータを使用してカプラン・マイヤー生存分析を実施した。図１４Ａは、腫瘍再増殖は明らかに用量依存性であり、５００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤの最高用量で２８日間の治療を受けた全てのマウスが６０日目まで生存したことを示している。２５０ｍｇ／ｋｇ群の２匹のマウスだけは６０日目前に安楽死させねばならなかった。１２５ｍｇ／ｋｇ群のマウスはヒビクル治療されたマウスに比して明らかな生存効果を有しており、１５．５日のメディアン生存日数の上昇を示した（図１４Ｂ）。
【０２３７】
化合物Ｉの臭化水素酸塩のファイファーヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫マウス異種移植片モデルに対する抗癌効果
化合物Ｉの一臭化水素酸塩の抗癌活性をヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫異種移植片モデルであるファイファーマウス異種移植片モデルで調べた。雌５週令のＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，メイン州バー・ハーバー）に２０〜２５ｍｇの腫瘍断片を皮下移植した。平均腫瘍が約３６５ｍｍ３に達した腫瘍移植から約３１日目に治療を開始した。治療スキームを表５に示す。
【０２３８】
【表５】
2018199740.tif 000027
【０２３９】
腫瘍容積を実験を通して追跡した。腫瘍容積を治療開始後１週間に２回測定した。腫瘍量（ｍｇ＝ｍｍ３）をカリパス測定値から長球面の体積に関する式（ＬｘＷ２）／２（ここで、Ｌ及びＷはそれぞれ直交長さ及び幅の測定値（ｍｍ）である）により計算した。
【０２４０】
１日目は治療初日であり、２８日目は治療最終日であった。この研究は最終投与から３６日目に終了した。すなわち、６４日目が研究最終日であった。この研究で効果を評価するために使用した主要エンドポイントは研究終了時の完全腫瘍退縮（ＣＲ）、群の間の腫瘍の大きさ及び腫瘍抑制％であった。完全応答は、研究終了時の腫瘍大きさの検出不能大きさ（＜２０ｍｍ３）までの減少として規定した。腫瘍抑制％の値は、式［１−（ΔＴ／ΔＣ）］×１００（ここで、ΔＴ及びΔＣは治療（Ｔ）及びビヒクル対照群（Ｃ）のそれぞれについての平均腫瘍容積の変化（Δ増殖）である）から計算した。開始時の腫瘍容積に対してＴ０及びＣ０（投与初日の前日）を使用した。更に、ΔＴ及びΔＣを計算するために最終投与日の翌日に調べた腫瘍容積（Ｔ２９及びＣ２９）を使用した。値が１００％を超えるときには１００％と結論づけた。腫瘍抑制％を計算するために使用した式を以下に示す。
【０２４１】
【数８】
2018199740.tif 000028
【０２４２】
治療期間中、動物は１１４２ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉの臭化水素酸塩の毎日の治療に耐えることができず、この群（群Ｅ）中の３匹の動物は基準体重の２０％以上の減少のために治療の第１週後に安楽死させなければならなかったことが判明した。よって、この群に対する薬物投与は１２回の投与後中止した。他の３つの投与群の動物は、群Ｄ（３４２ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉの臭化水素酸塩）の１匹を除いて全ての動物が最小の体重減少で２８日
の治療に耐えた。相対的マウス体重を図１５にグラフ化した。０日目に測定した動物体重をグラフ中の基準体重として使用した。
【０２４３】
化合物Ｉの臭化水素酸塩は、４つの投与群のうちの３群で１００％のＣＲ率でファイファーモデルにおいて強力で持続的な抗癌活性を示した（表６）。更に、治療を中止してから３６日経っても腫瘍再増殖は観察されなかった。このことは、すべての腫瘍細胞が治療中死滅したことを示唆している。腫瘍再増殖は最低用量の群（群Ｂ，３４．２ｍｇ／ｋｇ）で観察されたが、明らかな腫瘍静止活性が治療期間中観察された（図１６）。治療を中止すると腫瘍は増殖し始めた（図１６）。この結果は、群Ｂで観察された腫瘍静止活性が実際試験物質により誘発される活性であることも示唆している。
【０２４４】
【表６】
2018199740.tif 000029
【０２４５】
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
（項１）
Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩。
（項２）
一臭化水素酸塩である、上記項１に記載の化合物。
（項３）
結晶性である、上記項１〜２のいずれか１項に記載の化合物。
（項４）
上記項１〜３のいずれか１項に記載の化合物であって、実質的に不純物を含まない、化合物。
（項５）
上記項１〜４のいずれか１項に記載の化合物であって、非晶質Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩を実質的に含まない結晶性固体である、化合物。
（項６）
上記項１〜５のいずれか１項に記載の化合物及び医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
（項７）
上記項１に記載の化合物の製造方法であって、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドを臭化水素酸と化合することを含む、方法。
（項８）
Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド臭化水素酸塩の多形Ａ。
（項９）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１７．５±０．３°及び約２２．０±０．３°（２θ）に１個以上の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１０）
上記項８〜９のいずれか１項に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１７．５±０．３°及び約２２．０±０．３°（２θ）に特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１１）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、約１４．３±０．３°、約１８．７±０．３°、約２３．３±０．３°及び約２３．６±０．３°（２θ）に１個以上の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１２）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも５個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１３）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも６個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１４）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．
１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも７個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１５）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも８個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１６）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも９個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１７）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に少なくとも１０個の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１８）
上記項８に記載の多形であって、°（２θ）で表示して、約３．９±０．３°、１０．１±０．３°、１４．３±０．３°、１７．５±０．３°、１８．７±０．３°、２０．６±０．３°、２０．９±０．３°、２１．８±０．３°、２２．０±０．３°、２３．３±０．３°及び２３．６±０．３°（２θ）に特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項１９）
上記項８〜１８のいずれか１項に記載の多形であって、実質的に図１に従うＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項２０）
上記項８〜１９のいずれか１項に記載の多形であって、実質的に表１に従うＸ線粉末回折パターンを示す、多形。
（項２１）
上記項８〜２０のいずれか１項に記載の多形であって、℃の単位で表示して、２５５±５℃の温度に特徴的ピークを有する示差走査熱量測定サーモグラムを示す、多形。
（項２２）
上記項８〜２１のいずれか１項に記載の多形であって、実質的に図３に従う示差走査熱量測定サーモグラムを示す、多形。
（項２３）
上記項８〜２２のいずれか１項に記載の多形の製造方法であって、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドを臭化水素酸と化合することを含む、方法。
（項２４）
上記項８〜２２のいずれか１項に記載の多形の再結晶化方法であって、(ａ）多形Ａを
第１溶媒に溶解するステップ、及び（ｂ）第２溶媒を添加するステップを含み、それにより前記多形を再結晶化する、方法。
（項２５）
上記項２４に記載の方法であって、前記第１溶媒はエタノールであり、前記第２溶媒はＭＴＢＥである、方法。
（項２６）
上記項１６に記載の方法であって、(ａ）多形Ａをエタノールに溶解し、（ｂ）前記混
合物を加熱し、（ｃ）前記混合物にＭＴＢＥを添加し、前記多形を含む沈殿物を形成し、及び前記沈殿物を濾過することを含み、それにより前記多形を再結晶化する、方法。
（項２７）
上記項８〜２２のいずれか１項に記載の多形及び医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
（項２８）
癌の治療方法であって、癌治療の必要がある被験者に治療有効量の上記項１〜５のいずれかに記載の化合物、上記項８〜２２のいずれかに記載の多形、または上記項６または２７のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項２９）
前記癌が、非ホジキンリンパ腫または乳癌である、上記項２８に記載の方法。
（項３０）
被験者におけるＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の阻害方法であって、前記阻害の必要がある被験者に有効量の上記項１〜５のいずれかに記載の化合物または上記項８〜２２のいずれかに記載の多形を投与することを含む、方法。
（項３１）
インビトロでのＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の阻害方法であって、上記項１〜５のいずれかに記載の化合物または上記項８〜２２のいずれかに記載の多形を投与することを含む、方法。
（項３２）
上記項１〜５のいずれかに記載の化合物または上記項８〜２２のいずれかに記載の多形の使用であって、癌治療医薬の必要がある被験者において癌を治療するための医薬を製造するための、使用。
（項３３）
５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボン酸（５）を、３−（アミノメチル）−４，６−ジメチル−ジヒドロ−ピリジン−２（１Ｈ）−オンの塩と反応させることを含む、Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチル−４’−（モルホリノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドの製造方法。
（項３４）
(５）は結晶形である、上記項３３に記載の方法。
【図１】
2018199740.tif 000030
【図２】
2018199740.tif 000031
【図３】
2018199740.tif 000032
【図４】
2018199740.tif 000033
【図５】
2018199740.tif 000034
【図６】
2018199740.tif 000035
【図７】
2018199740.tif 000036
【図８】
2018199740.tif 000037
【図９】
2018199740.tif 000038
【図１０】
2018199740.tif 000039
【図１１】
2018199740.tif 000040
【図１２Ａ】
2018199740.tif 000041
【図１２Ｂ】
2018199740.tif 000042
【図１３】
2018199740.tif 000043
【図１４Ａ】
2018199740.tif 000044
【図１４Ｂ】
2018199740.tif 000045
【図１５】
2018199740.tif 000046
【図１６】
2018199740.tif 000047
【図１７】
2018199740.tif 000048
【図１８Ａ】
2018199740.tif 000049
【図１８Ｂ】
2018199740.tif 000050
【外国語明細書】
2018199740000001.pdf