(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養後に溶解して除去することができる性質を有したゲルファイバー複合体及びその効率的な製造方法の提供。【解決手段】アルギン酸成分とカゼイン成分とカルシウム成分とを有するゲルファイバー複合体１０。ゲルファイバー複合体１０は、２液を同時に通液する同軸型マイクロ流体装置１を用いて製造されるものであり、アルギン酸塩及びカゼインを有するプレゲル水溶液７と、カルシウム塩を有するゲル化剤８とを準備する工程と、プレゲル水溶液７をマイクロ流路２に注入する工程と、マイクロ流路２中にゲル化剤８を注入する工程とを有する方法によって製造する方法。このとき、プレゲル水溶液７にはさらにポリエチレングリコール及び塩化ナトリウムを含有するようにしてもよく、内部に空洞構造を有するゲルファイバー複合体１０を製造する方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を主成分とするゲルファイバーが束状となった複合体であって、アルギン酸成分とカゼイン成分とカルシウム成分とを有することを特徴とするゲルファイバー複合体。
【請求項２】
ゲルファイバー１本１本が、個々に分離して束状に集まっている、又は相互に付着している、請求項１に記載のゲルファイバー複合体。
【請求項３】
内部に空洞構造を有している、請求項１に記載のゲルファイバー複合体。
【請求項４】
２液を同時に通液する同軸型マイクロ流体装置を用いて製造されるゲルファイバー複合体の製造方法であって、
アルギン酸塩及びカゼインを有するプレゲル水溶液と、カルシウム塩を有するゲル化剤とを準備する工程と、前記プレゲル水溶液をマイクロ流路に注入する工程と、前記マイクロ流路中に前記ゲル化剤を注入する工程とを有することを特徴とするゲルファイバー複合体の製造方法。
【請求項５】
前記プレゲル水溶液は、ポリエチレングリコール及び塩化ナトリウムをさらに含有する、請求項４に記載のゲルファイバー複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲルファイバー複合体及びその製造方法に関し、さらに詳しくは、細胞培養基材等に好ましく適用可能なプロテインゲルからなるファイバーの複合体及びその複合体を一度に合成することができる効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、一定の方向に直線的に伸長した繊維状のゲルファイバーが束状構造になったゲルファイバー集合体が注目されている。繊維等の束状構造を得るためには１本１本の繊維を複数撚り合わせる手法が一般的であるが、ゲルファイバー等のように力学的強度が比較的弱い繊維の束を安定して撚り合わせる技術は容易には達成できない。
【０００３】
束状構造を有するゲルファイバー集合体の製造方法としては、２液を同時に通液する同軸型マイクロ流体デバイスを用いて、水溶液中で下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有するヒドロキシプロピルセルロースを用いた束状ゲルファイバーの製造方法が提案されている（特許文献１）。この技術は、ａ）第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液を調製する工程；ｂ）前記溶液をマイクロ流路に注入する工程；ｃ）前記マイクロ流路中に第１の架橋剤を注入することにより、前記第１のプレゲル剤をゲル化させて、糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成する工程；ｄ）前記鋳型ゲルファイバーを含む溶液に第２の架橋剤を添加することにより、前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持された状態で前記第２のプレゲル剤を架橋させ、前記第２のプレゲル剤が架橋してなるゲルが前記鋳型ゲルファイバーに被覆された構造のゲルファイバー複合体を形成する工程；及びｅ）前記ゲルファイバー複合体を含む溶液にゲル除去剤を添加することによって前記鋳型ゲルファイバーを除去して、束状構造を有するゲルファイバー集合体を得る工程を含む方法というものである。この製造方法において、ゲルファイバーの素材としては、水溶液中で相転移するヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）が適用されている。
【０００４】
ところで、近年、再生医療分野においては、生体内で細胞培養基材（いわゆる足場材料）とすることができる繊維状組織の開発が期待されている。これらの細胞培養基材は、細胞培養基材の表面で細胞を培養した後に溶解して除去できるものであることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１６７１７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ゲルファイバー集合体を細胞培養基材として利用するためには、生分解性素材からなるゲルファイバー集合体である必要がある。しかしながら、上記したヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）等のセルロース誘導体は、ヒトの体内で分解性がなく、細胞培養基材としての利用が制限される。また、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）は、ＬＣＳＴ（下限臨界溶液温度）を有する高分子であるが、現在まで、ＬＣＳＴ（下限臨界溶液温度）を有しない高分子で製造されたゲルファイバー集合体については報告されていない。
【０００７】
また、セルロース誘導体からなるゲルファイバー集合体は、特定の装置で作製した後に、架橋反応、洗浄、アルギン酸の溶出等の多段階の工程を必要としており、より効率的に製造可能な方法が要請されている。
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的は、細胞培養後に溶解して除去することができる性質を有したゲルファイバー複合体を提供するとともに、そのゲルファイバー複合体を効率的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、水溶液で相転移しないタンパク質ミセルを素材として研究している過程で、タンパク質及びアルギン酸（多糖）からなる束状のゲルファイバー複合体を作製する新手法を見出し、本発明を完成させた。なお、本願の「ゲルファイバー複合体」の用語は、ゲルファイバー１本１本が個々に分離して束状に集まっている集合体を含むとともに、ゲルファイバー１本１本が相互に付着した状態の複合体も含み、さらに、ゲルファイバー１本１本は明確には区別できないが内部に空洞構造を有するような複合体も含む意味で用いている。
【００１０】
（１）本発明に係るゲルファイバー複合体は、タンパク質を主成分とするゲルファイバーが束状となった複合体であって、アルギン酸成分とカゼイン成分とカルシウム成分とを有することを特徴とする。
【００１１】
この発明によれば、生分解性素材からなるゲルファイバーの複合体であるので、例えば細胞培養基材として用いた場合に、細胞を培養した後に溶解して除去することができる。また、カルシウム成分は、アルギン酸成分をゲル化して骨格となるゲルを形成するとともに、ミセル状のカゼイン同士を結合させて一体化させる。一体化したミセル状のカゼインは、カゼイン成分としてゲルファイバー複合体中に存在する。こうしたゲルファイバー複合体は、ＬＣＳＴ（下限臨界溶液温度）を有する高分子を用いておらず、その製造が容易である。
【００１２】
本発明に係るゲルファイバー複合体において、ゲルファイバー１本１本が、個々に分離して束状に集まっている、又は相互に付着している、ように構成できる。
【００１３】
本発明に係るゲルファイバー複合体において、内部に空洞構造を有しているように構成できる。
【００１４】
（２）本発明に係るゲルファイバー複合体の製造方法は、２液を同時に通液する同軸型マイクロ流体装置を用いて製造されるゲルファイバー複合体の製造方法であって、アルギン酸塩及びカゼインを有するプレゲル水溶液と、カルシウム塩を有するゲル化剤とを準備する工程と、前記プレゲル水溶液をマイクロ流路に注入する工程と、前記マイクロ流路中に前記ゲル化剤を注入する工程とを有することを特徴とする。
【００１５】
この発明によれば、アルギン酸塩及びカゼインを有するプレゲル水溶液が流れるマイクロ流路中にカルシウム塩を有するゲル化剤を注入するので、カルシウム塩がアルギン酸成分をゲル化して骨格となるゲルを形成するとともに、プレゲル水溶液中にミセルとして存在するカゼインを集積する。こうして束状のゲルファイバー複合体を製造することができる。
【００１６】
本発明に係るゲルファイバー複合体の製造方法において、前記プレゲル水溶液は、ポリエチレングリコール及び塩化ナトリウムをさらに含有するものであってもよい。
【００１７】
この発明によれば、ポリエチレングリコール及び塩化ナトリウムをさらに含有するプレゲル水溶液を適用することにより、ゲルファイバー１本１本は明確には区別できないが内部に空洞構造を有するゲルファイバー複合体を製造することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るゲルファイバー複合体によれば、例えば細胞培養基材として用いる場合に、細胞を培養した後に溶解して除去することができる。こうしたゲルファイバー複合体は、ＬＣＳＴ（下限臨界溶液温度）を有する高分子を用いておらず、その製造が容易である。また、本発明に係るゲルファイバー複合体の製造方法によれば、ゲルファイバー複合体を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係るゲルファイバー複合体の例を示す写真であり、（Ａ）は束状のミクロゲルファイバーを有するゲルファイバー複合体であり、（Ｂ）は束状のミクロゲルファイバーが判別できないゲルファイバー複合体である。
【図２】本発明に係るゲルファイバー複合体の他の例を示す写真であり、（Ａ）はストロー状で束状のゲルファイバー複合体であり、（Ｂ）はストロー状であるが束状ではないゲルファイバー複合体である。
【図３】他のゲルファイバー複合体の一例を示す写真である。
【図４】本発明に係るゲルファイバー複合体の製造に使用する同軸型マイクロ流体装置の模式図である。
【図５】実施例１〜４で得られたゲルファイバー複合体を示す写真である。
【図６】実施例７で得られたゲルファイバー複合体を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に係るゲルファイバー複合体及びその製造方法について、図面を参照して説明する。なお、本発明はその要旨を含む範囲で以下の実施形態のみに限定されず、種々の変形例も含まれる。
【００２１】
本発明に係るゲルファイバー複合体１０は、タンパク質を主成分とするゲルファイバーが束状となった複合体であって、アルギン酸成分とカゼイン成分とカルシウム成分とを有し、例えば図１及び図２に示す構造形態からなるものである。こうしたゲルファイバー複合体１０は、生分解性素材からなるゲルファイバー複合体であり、細胞培養基材として用いた場合に、細胞を培養した後に溶解して除去することができるという利点があるとともに、ＬＣＳＴ（下限臨界溶液温度）を有する高分子を用いておらず、その製造も容易である。
【００２２】
［ゲルファイバー複合体の製造方法］
ゲルファイバー複合体１０は、図４に示すような２液を同時に通液する同軸型マイクロ流体装置（以下「マイクロ流体装置１」という。）を用いて製造されるものであり、アルギン酸塩及びカゼインを有するプレゲル水溶液とカルシウム塩を有するゲル化剤とを準備する工程と、前記プレゲル水溶液をマイクロ流路に注入する工程と、前記マイクロ流路中に前記ゲル化剤を注入する工程とを有する方法により、束状のゲルファイバー複合体を製造することができる。
【００２３】
（マイクロ流体装置）
マイクロ流体装置１は、図４に示すように、本発明に係るゲルファイバー複合体１０を製造するために好ましく用いられる装置である。このマイクロ流体装置１は、二重管の構造により２層の流体流れを形成する装置であり、キャピラリー２と、キャピラリー２の外側の流路に設けられた注入口５とを有する。キャピラリー２は、入口３と出口４があり、出口４の内径は入口３の内径よりも小さく、且つ入口３の内径が例えば０．５ｍｍ〜１０ｍｍの範囲であり、出口４の内径が例えば０．１ｍｍ〜３ｍｍの範囲である。出口４からマイクロ流体装置出口９まではゲルファイバー形成部６となっており、その長さは特に限定されないが、例えば５ｍｍ〜５ｃｍとすることができる。
【００２４】
マイクロ流体装置１は、例えば、Ｋｉｒｉｙａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１２，５１，１５５３−１５５７や、上記特許文献１で具体的に説明されており、図４に示すように、成分の異なる２つの流体を同軸となるように内流及び外流に分けて流し、出口４から射出された内流は、ゲルファイバー形成部６において外流と接触することができる装置である。このようなマイクロ流体装置１により、例えば、内流にプレゲル水溶液を用い、外流にゲル化剤を用いて、ゲルファイバー複合体を製造することができる。その製造に際しては、内流と外流の流量比や流速を適宜調製して混合することにより、流路中で形成されるゲルファイバーの本数や外径を制御することができる。
【００２５】
各種の形態のゲルファイバー複合体は、以下の方法で製造することができる。
【００２６】
（束状のゲルファイバー複合体の製造）
図１（Ａ）に示すゲルファイバー複合体１０Ａの製造は、カゼインとアルギン酸塩とを含有したプレゲル水溶液を、図４に示すマイクロ流体装置１の入口３から注入して内流とし、キャピラリー２の外側の流路に設けられた注入口５からゲル化剤であるカルシウムイオン水溶液を注入して外流として、出口４から射出することにより合成することができる。出口４から射出したゲルファイバー複合体は、複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着した束状のゲルファイバーの複合体になっている。
【００２７】
図１（Ｂ）は、複数本のミクロゲルファイバーを判別できないゲルファイバー複合体１０Ｂであるが、このゲルファイバー複合体１０Ｂは、後述の実施例３，４で説明するように、カゼインの含有量を少なくすることにより製造することができる。
【００２８】
（ストロー状で束状のゲルファイバー複合体の製造）
図２（Ａ）に示すゲルファイバー複合体１０Ｃの製造は、プレゲル水溶液を調製する前に、あらかじめアルギン酸塩とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを混合して混合水溶液とし、その混合水溶液をオートクレーブ処理等で加熱溶解する。この加熱溶解により、アルギン酸分子間の水素結合等が消失し、会合体がほぐれ、ポリエチレングリコール分子と相互作用したアルギン酸の粒子径は小さく変化する。粒子径が小さくなったアルギン酸塩を有した混合水溶液に、カゼインと塩化ナトリウムとを添加してプレゲル水溶液とした。このプレゲル水溶液を、図４に示すマイクロ流体装置１の入口３から注入して内流とし、キャピラリー２の外側の流路に設けられた注入口５からゲル化剤であるカルシウムイオン水溶液を注入して外流として、出口４から射出することによりゲルファイバー複合体１０Ｃを合成することができる。出口４から射出したゲルファイバー複合体は、複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着したストロー状で束状のゲルファイバーの複合体になっている。なお、本願において、「ストロー状」とは、空洞構造と同じ意味内容として用いている。
【００２９】
（ストロー状のゲルファイバー複合体の製造）
図２（Ｂ）に示すゲルファイバー複合体１０Ｄの製造は、図２（Ａ）に示すゲルファイバー複合体１０Ｃと同様であり、異なる点は塩化ナトリウムを添加しないだけである。ゲルファイバー複合体１０Ｃの合成と同様、粒子径が小さくなったアルギン酸塩を有した混合水溶液に、カゼインだけを添加してプレゲル水溶液とした。このプレゲル水溶液を、図４に示すマイクロ流体装置１の入口３から注入して内流とし、キャピラリー２の外側の流路に設けられた注入口５からゲル化剤であるカルシウムイオン水溶液を注入して外流として、出口４から射出することによりゲルファイバー複合体１０Ｄを合成することができる。出口４から射出したゲルファイバー複合体は、複数本のミクロゲルファイバーは見られず、ストロー状のゲルファイバーの複合体になっている。
【００３０】
（プレゲル水溶液）
プレゲル水溶液は、図４に示すマイクロ流路の内流として射出される溶液であり、カゼインとアルギン酸塩とを含む水溶液である。
【００３１】
カゼインは、タンパク質を構成するアミノ酸のうちセリンに由来する部分（セリン残基）の多くにリン酸が結合したリンタンパク質（リン酸化タンパク質）であり、カルシウムイオンと結びつきやすい性質を持っている。カゼインは、カルシウムイオンと混合することにより、カゼイン−カルシウム複合体となる。この複合体は、直径１０ｎｍ〜１０００ｎｍ程度のミセルを形成して、プレゲル水溶液中にコロイド状に分散してなるものである。プレゲル水溶液中のカゼインの含有量としては、５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲とすることができる。
【００３２】
なお、カゼインの含有量により、束状のミクロゲルファイバーで構成されたゲルファイバー複合体とするか、束状のミクロゲルファイバーを有さないか判別できないゲルファイバー複合体とするかを制御できる。例えば後述の実施例１，２では、図５（Ａ）、図５（Ｂ）に示すように、束状のミクロゲルファイバーで構成されたゲルファイバー複合体とすることができ、後述の実施例３，４では、図５（Ｃ）及び図５（Ｄ）に示すように、束状のミクロゲルファイバーを判別できないゲルファイバー複合体とすることができる。そうした含有量は、実施例では区分けできるが、他の製造条件や他の成分の含有量にも影響するものと考えられ、一概にはいえないが、少なくとも後述の各実施例の範囲内では区分けすることができる。
【００３３】
アルギン酸塩は、ゲル化剤によってゲル化して骨格となるゲルの主要部を構成する材料であり、キャピラリー２中での流れで発生するシェアストレスによって、流路の流れ方向に糸状に伸長したゲルを形成するように作用する。このアルギン酸塩は、ゲル化剤であるカルシウムイオン（２価のカルシウムイオン）によってイオン架橋してゲル化する性質を有する。アルギン酸塩としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムが好ましく用いられ、なかでもアルギン酸ナトリウムが好ましく用いられる。プレゲル水溶液中のアルギン酸塩の含有量としては、５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌの範囲とすることができる。
【００３４】
なお、図２（Ａ）（Ｂ）に示すストロー状のゲルファイバー複合体においては、プレゲル水溶液に、さらにポリエチレングリコールを加えている。ポリエチレングリコールは、アルギン酸塩と混合した後の加熱溶解により、アルギン酸分子間の水素結合等を消失させ、会合体をほぐし、ポリエチレングリコール分子と相互作用したアルギン酸の粒子径を小さく変化させるように作用する。プレゲル水溶液中のポリエチレングリコールの含有量としては、アルギン酸塩に対して０．１質量％以上であればよく、例えば、プレゲル水溶液中に０．０１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの範囲で含有させることができる。
【００３５】
プレゲル水溶液にポリエチレングリコールを加えたときには必要に応じて塩化ナトリウムが配合され、配合された場合には、図２（Ａ）に示すストロー状の束状ゲルファイバー複合体となり、配合されない場合には、図２（Ｂ）に示すストロー状のゲルファイバー複合体（束状にはならない）となる。この塩化ナトリウムは、アルギン酸を含有するドロップレットを生成する。その結果、そのドロップレットが流路の流れ方向に糸状に伸長し、ゲル化剤であるカルシウムイオン（２価のカルシウムイオン）によってイオン架橋してゲルを形成すると考えられる。したがって、塩化ナトリウムが添加されない場合は、アルギン酸のドロップレットが形成されないので、糸状に伸張したゲルが生成せず、束状にならないものと考えられる。プレゲル水溶液中の塩化ナトリウムの含有量としては、アルギン酸塩に対して５質量％程度であればよく、例えば、プレゲル水溶液中に１ｇ／Ｌ〜２６０ｇ／Ｌの範囲とすることができる。なお、プレゲル水溶液中の塩化ナトリウムの含有量は飽和食塩水と同程度でも可能であり、その溶解度は温度にも依存するが約２６質量％である。
【００３６】
プレゲル水溶液は、含有する化学物質の種類や含有量にもよるが、おおむねｐＨ５〜１０程度の水溶液であることが好ましい。このプレゲル水溶液には、水と混じりあう性質を有する水性有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルホルムアミド、又はジメチルスルホキシド等がその作用を阻害しない範囲で含まれていてもよい。
【００３７】
（ゲル化剤）
ゲル化剤は、プレゲル水溶液に含まれるアルギン酸塩をゲル化するように作用する。その作用により、ゲル化剤は、アルギン酸成分とともにゲル化した骨格部分を構成する。ゲル化剤としては、カルシウムイオンを含む塩やマグネシウムイオンを含む塩が好ましいが、カルシウムイオンを含む塩がより好ましい。カルシウムイオンを含む塩としては、塩化カルシウムや硝酸カルシウムを挙げることができる。
【００３８】
カルシウムイオンを含有するゲル化剤は、カゼインと結合して、カゼイン−カルシウム複合体を形成させる。ゲル化剤中のカルシウムイオンの含有量としては、例えば、１ｇ／Ｌ〜２４０ｇ／Ｌの範囲とすることができる。
【００３９】
ゲル化剤は、ｐＨ５〜１３程度の水溶液であることが好ましい。このゲル化剤には、プレゲル水溶液と同様、水と混じりあう性質を有する水性有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルホルムアミド、又はジメチルスルホキシド等がその作用を阻害しない範囲で含まれていてもよい。
【００４０】
（他のゲルファイバー複合体の製造）
ここで、アルギン酸塩を含まないプレゲル水溶液を用いて製造した、図３に示す他の形態のゲルファイバー複合体の製造方法について説明する。図３に示すゲルファイバー複合体１０Ｅも、図１に示すゲルファイバー複合体１０Ａとほぼ同じ方法で製造される。すなわち、カルボキシメチルセルロース及びカゼインを有するプレゲル水溶液と、カルシウム塩を有するゲル化剤とを準備する工程と、そのプレゲル水溶液をマイクロ流路に注入する工程と、そのマイクロ流路中に前記ゲル化剤を注入する工程とを有する方法であり、２液を同時に通液する同軸型マイクロ流体装置を用いて製造される。
【００４１】
この製造方法では、アルギン酸塩の代わりにカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いている。すなわち、このゲルファイバー複合体１０Ｅの製造は、カゼインとカルボキシメチルセルロースとを含有したプレゲル水溶液を、図４に示すマイクロ流体装置１の入口３から注入して内流とし、キャピラリー２の外側の流路に設けられた注入口５からゲル化剤であるカルシウムイオン水溶液を注入して外流として、出口４から射出することにより合成することができる。カゼインは、カルシウムイオンと混合することにより、カゼイン−カルシウム複合体となっている。出口４から射出したゲルファイバー複合体は、複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着しない束状のゲルファイバーの複合体になっている。
【００４２】
このゲルファイバー複合体１０Ｅにおいて、複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着しない理由は、カルボキシメチルセルロースがカルシウムイオンによるゲル形成能を有しないからである。こうした構造からなるゲルファイバー複合体１０Ｅは、複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着しないゲルファイバーであって、カルボキシメチルセルロース成分とカゼイン成分とカルシウム成分とを有している。得られたゲルファイバー複合体１０Ｅは、ゲルファイバーが互いに接着していないので、ファイバー間に隙間があり、その隙間に細胞が入り込む細胞培養基材として好ましく応用することができる。
【００４３】
この製造方法において、プレゲル水溶液中のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の含有量としては、例えば、５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌの範囲とすることができ、カゼインの含有量としては、５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲とすることができる。また、ゲル化剤中のカルシウムイオンの含有量としては、例えば、１ｇ／Ｌ〜２４０ｇ／Ｌの範囲とすることができる。
【００４４】
なお、上記したカゼイン、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等はサイズ排除クロマトグラフィー分析で定量でき、カルシウム塩、ナトリウム塩等は原子吸光分析で定量でき、それぞれが上記した含有量で含まれていることを測定することができる。
【００４５】
［ゲルファイバー複合体］
ゲルファイバー複合体１０は、図１及び図２に示すように、１次元的に伸長したゲルファイバーであって、タンパク質を主成分とし、水を分散系とするハイドロゲルのファイバー複合体である。なお、「タンパク質を主成分とする」は、ゲルファイバーは、カゼイン成分のほかに、アルギン酸成分とカルシウム成分等とを有しているためである。
【００４６】
ゲルファイバー複合体１０を構成する成分としては、アルギン酸成分とカゼイン成分とカルシウム成分とを有している。具体的には、図１（Ａ）の例では、個々のミクロゲルファイバーが相互に接着した束状になっている構造形態からなるものであり、図１（Ｂ）の例では、個々のミクロゲルファイバーは見られない構造形態からなるのであり、図２（Ａ）の例では、複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着したストロー状で束状になっている構造形態からなるものであり、図２（Ｂ）の例では、複数本のミクロゲルファイバーは見られず、ストロー状の構造形態からなるものである。このゲルファイバー複合体１０は、生分解性素材からなるゲルファイバー複合体であり、細胞培養基材として用いた場合に、細胞を培養した後に溶解して除去することができる。
【００４７】
こうしたゲルファイバー複合体は、ミクロファイバーが集合又は一体化した構造形態からなるものであり、例えば、ゲルファイバー１本１本が個々に分離して束状に集まっている集合体、明確に区別できるゲルファイバー１本１本が相互に付着している複合体、又は、ゲルファイバー１本１本は明確には区別できない複合体、等を含む意味で用いている。こうした複合体を構成するゲルファイバーの他の例としては、粉体を含むものであってもよく、例えば、粉体が分散固定された複合ミクロファイバーが集合して束状構造を形成したもの、ミクロファイバー間に粉体が挟まれる形態でゲル状に形成されているもの、等を含む。なお、このときの粉体としては、例えば、酸化チタン等の金属酸化物微粒子、シリカ微粒子、活性炭微粒子、高分子ミクロスフェア等の有機物微粒子、微結晶粒子等を挙げることができる。
【００４８】
なお、ゲルファイバーは、生成後の含水率が７０質量％〜９９．５質量％の範囲内になっている。こうしたゲルファイバーは、高分子が溶媒で膨潤したものと言うことができ、水と水溶性溶媒の混合溶液で膨潤したものや、製造後に乾燥したものも含む。前記した混合溶液としては、例えば、水とエタノール、水とメタノール、水とジメチルスルホキシド、水とアセトニトリル等を挙げることができる。
【００４９】
（含有成分）
カゼインは、主にミクロゲルファイバーの構成成分として含まれている。カゼインは、タンパク質を構成するアミノ酸のうちセリンに由来するセリン残基の多くにリン酸が結合したリンタンパク質（リン酸化タンパク質）と、カルシウムイオンとが結びついたカゼイン−カルシウム複合体として存在し、ミクロゲルファイバーの主要成分である。カゼインは、ゲルファイバー複合体中に、０質量％〜１０質量％の範囲内で含まれている。
【００５０】
アルギン酸成分は、ゲル化して骨格となるゲルの主要部を構成し、ミクロゲルファイバー同士を束ねる成分として含まれている。アルギン酸成分は、好ましくはアルギン酸ナトリウムとして加えられているので、ナトリウム成分も同時に含まれていることになる。アルギン酸成分は、ゲルファイバー複合体中に、０.０１質量％〜５質量％の範囲内で含まれている。
【００５１】
カルシウム成分は、カゼイン−カルシウム複合体を構成している。さらに、アルギン酸成分とともにゲル化した骨格部分を構成している。こうしたカルシウム成分は、好ましくは塩化カルシウムや硝酸カルシウムとして加えられているので、塩素成分も同時に含まれていてもよい。したがって、カルシウム成分は、アルギン酸成分をゲル化して骨格となるゲルを形成するとともに、ミセル状のカゼイン同士を結合させて一体化させる。一体化したミセル状のカゼインは、カゼイン成分としてゲルファイバー複合体中に存在する。
【００５２】
図２（Ａ）（Ｂ）に示すゲルファイバー複合体１０Ｃ，１０Ｄでは、上記カゼイン、アルギン酸成分及びカルシウム成分の他に、ポリエチレングリコールが含まれている。このポリエチレングリコールは、アルギン酸及びカゼインと水素結合等により複合化してゲルファイバー複合体に取り込まれている。ポリエチレングリコールは、ゲルファイバー複合体中には、０．００１質量％〜５質量％の範囲内で含まれている。
【００５３】
図２（Ａ）に示すゲルファイバー複合体１０Ｃでは、上記したポリエチレングリコールの他にも、ナトリウム成分が含まれている。このナトリウム成分は、アルギン酸及びカゼイン分子と、主に静電的相互作用によりゲルファイバー複合体に取り込まれる他に、ゲルファイバーが膨潤した水溶液に含まれている。なお、ナトリウム成分は、アルギン酸ナトリウム及び塩化ナトリウムの電離により存在するが、プレゲル水溶液中への配合量を考慮すれば、形成されるゲルファイバー複合体中には、０．０１質量％〜２６質量％の範囲内で含まれている。
【００５４】
なお、他のゲルファイバー複合体として図３に示した形態のゲルファイバー複合体では、アルギン酸成分は含まれておらず、カルボキシメチルセルロースが含まれている。カルボキシメチルセルロースは、カルシウムイオンによるゲル形成能を有しないので、ゲル化して骨格部分を構成することがなく、したがって、カゼイン成分で主に形成された複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着しない形態になっている。このときのカルボキシメチルセルロースは、ゲルファイバー複合体中に、０．０１質量％〜２質量％の範囲内で含まれている。
【００５５】
各成分の測定方法として、上記したカゼイン成分、アルギン酸成分、カルボキシメチルセルロース等はサイズ排除クロマトグラフィー分析で定量でき、カルシウム塩、ナトリウム塩等は原子吸光分析で定量でき、それぞれが上記した含有量でゲルファイバー複合体１０に含まれていることを測定することができる。
【００５６】
（形状等）
ゲルファイバー複合体１０において、「ゲルファイバー複合体」の用語は、ゲルファイバー１本１本が個々に分離して束状に集まっている集合体を含むとともに、ゲルファイバー１本１本が相互に付着した状態の複合体も含み、さらに、ゲルファイバー１本１本は明確には区別できないが内部に空洞構造を有するような複合体も含む意味で用いている。
【００５７】
複合体を構成するゲルファイバーの本数は特に限定されないが、整列した２以上のゲルファイバーを含んでいればよい。通常は、５本以上、好ましくは１０本以上、さらに好ましくは２０本以上である。上限も特に限定されず、後述するファイバー径によっては１００万本から１億本のようにとても数えられない多本数となりうる。なお、「整列した」とは、複数のゲルファイバーが全体として概ね平行関係を維持していることが好ましいが、２本以上のゲルファイバーにおいて部分的に平行関係が失われている場合や、複数のゲルファイバーの一部又は全体がねじれて重なり合う場合なども含まれる。
【００５８】
ゲルファイバー複合体１０を形成する各ゲルファイバーの外径は特に限定されないが、一般的には１０ｎｍ〜１０μｍ程度であり、概ね同一の外径を有するが、それぞれ異なった外径を有していてもよい。各ゲルファイバーの断面は概ね円形であるが、用いるプレゲル剤の種類などに応じて円形以外の断面を与える場合もある。複数のゲルファイバーは一般的には概ね同一の外径を有するが、それぞれ異なった外径を有していてもよい。
【００５９】
ゲルファイバー複合体１０の断面形状としては、円形、楕円系、又は四角形や五角形等の多角形など多様な形状であってもよいが、断面形状としては円形が好ましい。ゲルファイバー複合体１０の外径も特に限定されず、ファイバーの本数に応じて適宜選択することができ、例えば１００ｎｍ〜１ｃｍであることができるが、外径は用途によって適宜選択可能である。その外径は、出口４の内径及びマイクロ流路の流速によって制御することによって、選択することができる。ゲルファイバー複合体の長さは特に限定されないが、数百μｍ以上、好ましくは数ｃｍ以上であり、数ｍ程度の長さを有するものとすることができる。
【００６０】
なお、このゲルファイバー複合体１０の製造方法は上記した方法で好ましく製造することができ、図４に示すような２液を同時に通液するマイクロ流体装置１を用いて製造することができる。同様の構成であれば、他の方法や装置を適用してもよい。
【００６１】
以上説明したゲルファイバー複合体１０は、例えば細胞培養基材として用いる場合に、細胞を培養した後に溶解して除去することができる。また、ゲルファイバー複合体１０はＬＣＳＴ（下限臨界溶液温度）を有する高分子を用いておらず、その製造が容易である。特にその利用としては、再生医療等に用いる細胞培養基材として利用することができる。また、空洞構造を持つストロー状のゲルファイバー複合体は、足場となるゲルの外側と内側に異種細胞を播種することで二重構造の細胞ファイバーの製造に利用可能であり、その応用が期待できるとともに、例えば人工血管の構築等への利用が期待される。また、このゲルファイバー複合体は、生分解性素材で構成されているので、例えば薬物輸送担体としての利用も期待できる。
【実施例】
【００６２】
以下の実験によって、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００６３】
［実施例１］
プレゲル水溶液として、７．５質量％のカゼインナトリウム（ミルク由来、東京化成工業株式会社製）と１．０質量％のアルギン酸ナトリウムとを含有する水溶液を準備した。ゲル化剤として、２００ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸カルシウム水溶液を準備した。これらの水溶液（２３℃）を、図４に示すマイクロ流体装置１に適用してゲルファイバー複合体を製造した。マイクロ流体装置１では、プレゲル水溶液を流速１８ｍＬ／ｈｒで入口３から注入し、ゲル化剤を流速１５０ｍＬ／ｈｒで注入口５から注入した。こうして実施例１のゲルファイバー複合体を製造した。
【００６４】
図５（Ａ）は、得られたゲルファイバー複合体の光学顕微鏡写真である。アルギン酸ゲルの骨格内部に繊維状のミクロゲルファイバーが保持された状態でゲル化されていることが分かる。ゲルファイバー複合体の直径は５２０μｍ程度であった。
【００６５】
［実施例２］
実施例１において、カゼインナトリウムの含有量を６．０質量％とした。それ以外は実施例１と同様にして、実施例２のゲルファイバー複合体を製造した。
【００６６】
図５（Ｂ）は、得られたゲルファイバー複合体の光学顕微鏡写真である。アルギン酸ゲルの骨格内部に繊維状のミクロゲルファイバーが保持された状態でゲル化されていることが分かる。ゲルファイバー複合体の直径は３９０μｍ程度であった。
【００６７】
［実施例３］
実施例１において、カゼインナトリウムの含有量を３．８質量％とした。それ以外は実施例１と同様にして、実施例３のゲルファイバー複合体を製造した。
【００６８】
図５（Ｃ）は、得られたゲルファイバー複合体の光学顕微鏡写真である。アルギン酸ゲルの骨格内部には、繊維状のミクロゲルファイバーを十分に判別することができなかった。したがって、このゲルファイバー複合体は、ミクロゲルファイバーが束状になっていないゲルファイバー複合体ということができる。ゲルファイバー複合体の直径は５００μｍ程度であった。
【００６９】
［実施例４］
実施例１において、カゼインナトリウムの含有量を２．３質量％とした。それ以外は実施例１と同様にして、実施例４のゲルファイバー複合体を製造した。
【００７０】
図５（Ｄ）は、得られたゲルファイバー複合体の光学顕微鏡写真である。アルギン酸ゲルの骨格内部には、繊維状のミクロゲルファイバーを十分に判別することができなかった。したがって、このゲルファイバー複合体は、ミクロゲルファイバーが束状になっていないゲルファイバー複合体ということができる。ゲルファイバー複合体の直径は２９０μｍ程度であった。
【００７１】
［実施例５］
２．９８質量％のアルギン酸ナトリウムと、０．７５質量％のポリエチレングリコール（重量平均分子量２０００）と、０．４５質量％の塩化ナトリウムとを含有する水溶液をオートクレーブ（株式会社トミー精工製、ＬＳＸ−５００）で加熱（１２１℃）及び加圧（２気圧）した。その水溶液を２３℃まで放冷した後に、この水溶液０．８０ｇと、７．０質量％のカゼインナトリウム（ミルク由来、東京化成工業株式会社製）水溶液２．５０ｇとを混合してプレゲル水溶液とした。したがって、プレゲル水溶液は、５．３質量％のカゼインナトリウム、０．７２質量％のアルギン酸ナトリウム、０．１８質量％のポリエチレングリコール、及び０．１１質量％の塩化ナトリウムを含有する。ゲル化剤として、２００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を準備した。これらの水溶液（２３℃）を用いた他は、実施例１と同様にして、実施例５のゲルファイバー複合体を製造した。
【００７２】
図２（Ａ）は、得られたゲルファイバー複合体の光学顕微鏡写真である。複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着したストロー状で束状のゲルファイバーの複合体になっていることが分かる。ゲルファイバー複合体の直径は３５０μｍ程度であり、ストロー状の空洞の内径はおよそ１００μｍ程度であった。
【００７３】
［実施例６］
プレゲル水溶液として、０．１１質量％の塩化ナトリウムを含有させなかった。それ以外は、実施例１と同様にして、実施例６のゲルファイバー複合体を製造した。
【００７４】
図２（Ｂ）は、得られたゲルファイバー複合体の光学顕微鏡写真である。複数本のミクロゲルファイバーは見られず、ストロー状のゲルファイバーの複合体になっていることが分かる。ゲルファイバー複合体の直径は５４０μｍ程度であり、ストロー状の空洞の内径はおよそ１２０μｍ程度であった。
【００７５】
［実施例７］
３．０８質量％のアルギン酸ナトリウムと０．７７質量％のポリエチレングリコール（重量平均分子量２０００）とを含有する水溶液をオートクレーブ（株式会社トミー精工製、ＬＳＸ−５００）で加熱（１２１℃）及び加圧（２気圧）した。その水溶液を２３℃まで放冷してプレゲル水溶液とした。ゲル化剤として、２００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を準備した。これらの水溶液（２３℃）を用いた他は、実施例１と同様にして、実施例７のゲルファイバー複合体を製造した。
【００７６】
図６は、得られたゲルファイバー複合体の光学顕微鏡写真である。複数本のミクロゲルファイバーは見られず、１本１本が明確には区別できないストロー状（空洞構造）のゲルファイバーの複合体になっていることが分かる。ゲルファイバー複合体の直径は２７０μｍ程度であり、ストロー状の空洞の内径はおよそ８０μｍ程度であった。
【００７７】
［参考例１］
プレゲル水溶液として、７．５質量％のカゼインナトリウム（ミルク由来、東京化成工業株式会社製）と１．０質量％のカルボキシメチルセルロースとを含有する水溶液を準備した。ゲル化剤として、２００ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸カルシウム水溶液を準備した。これらの水溶液（２３℃）を、図４に示すマイクロ流体装置１に適用してゲルファイバー複合体を製造した。マイクロ流体装置１では、プレゲル水溶液を流速１８ｍＬ／ｈｒで入口３から注入し、ゲル化剤を流速１５０ｍＬ／ｈｒで注入口５から注入した。こうして参考例１のゲルファイバー複合体を製造した。
【００７８】
図３は、得られたゲルファイバー複合体の光学顕微鏡写真である。このゲルファイバー複合体は、複数本のミクロゲルファイバーが互いに接着しない束状のゲルファイバーの複合体になっていた。ゲルファイバー複合体の直径は４２０μｍ程度であった。
【符号の説明】
【００７９】
１  同軸型マイクロ流体装置
２  キャピラリー
３  入口
４  出口
５  注入口
６  ゲルファイバー形成部
７  プレゲル水溶液
８  ゲル化剤
９  マイクロ流体装置出口
１０  ゲルファイバー複合体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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