(57)【要約】【課題】  補体依存性細胞傷害活性の異なる抗体を分離する方法を提供すること。【解決手段】  補体依存性細胞傷害活性が異なる抗体を含有する試料を、Ｆｃ結合性タンパク質（好ましくはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、より好ましくは糖鎖を有していないヒトＦｃγＲＩＩＩａ）を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤に接触させ、当該吸着剤に抗体を吸着させ、次いで、抗体とＦｃ結合性タンパク質との相互作用を弱めることにより、ＣＤＣ活性が異なる抗体を順次溶出させ、補体依存性細胞傷害活性の異なる抗体を分離する。【選択図】  図３
2018039735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体依存性細胞傷害活性が異なる抗体を含有する試料を、
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤に接触させ、
当該吸着剤に抗体を吸着させ、
次いで、抗体とＦｃ結合性タンパク質との相互作用を弱めることにより、補体依存性細胞傷害活性が異なる抗体を順次溶出させる、
ことを特徴とする、補体依存性細胞傷害活性の異なる抗体の分離方法。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基に一つ以上の他のアミノ酸残基が挿入されたポリペプチド、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換または欠失したポリペプチド
である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、配列番号２（ＦｃＲ２）、配列番号３（ＦｃＲ３）、配列番号４（ＦｃＲ４）、配列番号５（ＦｃＲ５ａ）、配列番号６（ＦｃＲ５ｂ）、配列番号７（ＦｃＲ６ａ）、配列番号８（ＦｃＲ６ｂ）、配列番号９（ＦｃＲ７）、配列番号１０（ＦｃＲ７ａ）、配列番号１１（ＦｃＲ８）、配列番号１２（ＦｃＲ９）、配列番号１３（ＦｃＲ１０）、配列番号１４（ＦｃＲ１１）のいずれかに記載のアミノ酸配列の少なくとも３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが糖鎖を有していないヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補体依存性細胞傷害活性が異なる抗体を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、モノクローナル抗体が有する特異性を利用した医薬（抗体医薬）の開発が進められている。抗体医薬で用いるヒトＩｇＧのうち、Ｆｃ領域の２９７番目のアスパラギン残基に付加するＮ型糖鎖の違いにより抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性や補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性が変化することが知られており、特にＣＤＣ活性に関しては、糖鎖の非還元末端部分のガラクトースの付加がＣＤＣ活性に影響することや（非特許文献１）、非還元末端部分のガラクトース数が多いほど補体第一成分（Ｃ１ｑ）への結合性が増加し、結果としてＣＤＣ活性が向上することが報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
抗体医薬においては、抗体が有するＣＤＣ活性の強さに重要な意味がある。しかしながら、抗体医薬は通常、動物細胞を宿主とした遺伝子組換え技術を用いて製造しており、宿主内での糖鎖付加を制御できないことから、一定のＣＤＣ活性を有した抗体を発現させるのは困難である。また発現した抗体の中から、ＣＤＣ活性の強さに基づき抗体を分離するには多くの時間と労力が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】八木  有紀等，ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，３４，８３−８８，２０１３
【非特許文献２】Ｊ．Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２１，１６４４−１６５２，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、ＣＤＣ活性が異なる抗体を分離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質および当該タンパク質におけるアミノ酸残基を置換した改良体を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤が、ＣＤＣ活性の異なる抗体を分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本願は以下の（Ａ）から（Ｆ）に記載の態様を包含する：
（Ａ）ＣＤＣ活性が異なる抗体を含有する試料を、
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤に接触させ、
当該吸着材に抗体を吸着させ、
次いで、抗体とＦｃ結合性タンパク質との相互作用を弱めることにより、ＣＤＣ活性の異なる抗体を順次溶出させる、
ことを特徴とする、ＣＤＣ活性が異なる抗体の分離方法。
（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、（Ａ）に記載の方法。
（Ｃ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基に一つ以上の他のアミノ酸残基が挿入されたポリペプチド、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換または欠失したポリペプチド
である、（Ｂ）に記載の方法。
（Ｄ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、配列番号２（ＦｃＲ２）、配列番号３（ＦｃＲ３）、配列番号４（ＦｃＲ４）、配列番号５（ＦｃＲ５ａ）、配列番号６（ＦｃＲ５ｂ）、配列番号７（ＦｃＲ６ａ）、配列番号８（ＦｃＲ６ｂ）、配列番号９（ＦｃＲ７）、配列番号１０（ＦｃＲ７ａ）、配列番号１１（ＦｃＲ８）、配列番号１２（ＦｃＲ９）、配列番号１３（ＦｃＲ１０）、配列番号１４（ＦｃＲ１１）のいずれかに記載のアミノ酸配列の少なくとも３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、（Ｃ）に記載の方法。
（Ｅ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、（Ｂ）に記載の方法。
（Ｆ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが糖鎖を有していないヒトＦｃγＲＩＩＩａである、（Ｂ）から（Ｅ）のいずれかに記載の方法。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明においてＦｃ結合性タンパク質とは、抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、一例として糖鎖修飾のないヒトＦｃγＲＩＩＩａが好ましい。ヒトＦｃγＲＩＩＩａの例として、
（ｉ）配列番号１に記載の野生型Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含むポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載の野生型Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸酸基に一つ以上の他のアミノ酸残基が挿入されたポリペプチド、又は、配列番号１に記載の野生型Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換または欠失したポリペプチドがあげられる。
【００１０】
前記（ｉｉ）の一態様としては、特開２０１５−０８６２１６号公報、特開２０１６−０２３１５２号公報、およびＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載のポリペプチドがあげられる。前記（ｉｉ）の好ましい態様としては、配列番号２（ＦｃＲ２）、配列番号３（ＦｃＲ３）、配列番号４（ＦｃＲ４）、配列番号５（ＦｃＲ５ａ）、配列番号６（ＦｃＲ５ｂ）、配列番号７（ＦｃＲ６ａ）、配列番号８（ＦｃＲ６ｂ）、配列番号９（ＦｃＲ７）、配列番号１０（ＦｃＲ７ａ）、配列番号１１（ＦｃＲ８）、配列番号１２（ＦｃＲ９）、配列番号１３（ＦｃＲ１０）、配列番号１４（ＦｃＲ１１）のいずれかに記載のアミノ酸配列の少なくとも３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を含むポリペプチドがあげられる。中でも配列番号５（ＦｃＲ５ａ）または配列番号１２（ＦｃＲ９）に記載のアミノ酸配列の少なくとも３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、本発明におけるＦｃ結合性タンパク質として、より好ましい。
【００１１】
なお本発明におけるＦｃ結合性タンパク質中、特定位置のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよい。その一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
【００１２】
本発明におけるＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。
【００１３】
前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ（特開２０１５−１１６１８５号公報）、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００１４】
本発明におけるＦｃ結合性タンパク質は、当該Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主を形質転換して得られる組換え体から製造することができる。前記宿主に特に限定はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。
【００１５】
なお本発明におけるＦｃ結合性タンパク質は、一例として糖鎖を有していないものが好ましい。糖鎖を有していないＦｃ結合性タンパク質を得るためには、大腸菌等糖鎖付加が起こらない宿主として用いればよい。または、Ｆｃ結合性タンパク質を動物細胞、昆虫細胞等を宿主として発現し、糖鎖を有したＦｃ結合性タンパク質から糖鎖を除去する操作を行なうことで、糖鎖を有していないＦｃ結合性タンパク質を得ることもできる。
【００１６】
本発明における、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化させるための不溶性担体としては特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００１７】
本発明の分離方法は、例えば、Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を充填したカラムに、ＣＤＣ活性が異なる抗体を含む試料をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、抗体を前記吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、前記吸着した抗体をＣＤＣ活性の強さに基づき抗体を分離することができる。なお、ＣＤＣ活性が異なる抗体を含む試料をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。
【００１８】
前記吸着剤に吸着したＣＤＣ活性が異なる抗体を順次溶出させるには、抗体とリガンド（Ｆｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、溶出液における緩衝液等によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度の上昇、塩濃度の上昇が例示できる。前記吸着剤に吸着したＣＤＣ活性が異なる抗体を、順次溶出させるための溶出液の具体例として、前記吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。この緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、ＣＤＣ活性の異なる抗体の分離を、Ｆｃ結合性タンパク質（例えば糖鎖が付加されていないヒトＦｃγＲＩＩＩａ）を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いて行なうことを特徴としており、本発明によりＣＤＣ活性の異なる抗体の分離が簡便かつ精度良く行なえる。したがって本発明は、抗体医薬製造の効率化や製造した抗体医薬の品質管理などに有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル（ＦｃＲ９ゲル）を用いた抗体の溶出パターン（クロマトグラム）を示した図である。実線が溶出パターン、破線がグラジエントパターンである。
【図２】図１の溶出パターンのうち、溶出量１８ｍＬから２４ｍＬまでの領域を拡大した図である。溶出時間の早いものからピーク１、ピーク２、およびピーク３としている。
【図３】ＦｃＲ９ゲルで分離した各ピーク画分に含まれる抗体のＣＤＣ活性を測定した結果を示した図である。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル（ＦｃＲ９ゲル）の作製と抗体分離
（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー社製：ＮＰＲゲル）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、特開２０１６−０２３１５２号に記載の方法で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９Ｃｙｓ（配列番号１５）を４ｍｇ反応させることにより、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル（以下、ＦｃＲ９ゲル）を得た。なおＦｃＲ９Ｃｙｓ（配列番号１５）は、配列番号１２（ＦｃＲ９）に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列（配列番号１５では２４番目から１９９番目までのアミノ酸配列に相当）からなるポリペプチドのＮ末端側にＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号１５の１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでの領域）およびメチオニン（配列番号１５の２３番目のメチオニン）を、Ｃ末端側にシステインタグ（配列番号１５の２００番目のグリシンから２０７番目のグリシンまでの領域）を、それぞれ付加したポリペプチドである。
【００２３】
（２）（１）で調製したＦｃＲ９ゲル１．２ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填してＦｃＲ９ゲル充填カラム（以下、ＦｃＲ９カラム）を作製した。
（３）（２）で作製したＦｃＲ９カラムを高速液体クロマトグラフィー装置に接続し、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した。
（４）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）で４．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業社製）を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎにて０．１５ｍＬアプライした。
（５）流速０．５ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で４分洗浄後、１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（１８分で１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
【００２４】
溶出パターン（クロマトグラム）を図１に示した。モノクローナル抗体はＦｃＲ９ゲルと相互作用するため、ゲルろ過クロマトグラフィーのような単一のピークではなく、複数のピークに分離された。溶出パターンのうち、溶出量１８ｍＬから２４ｍＬまでの領域を拡大したものを図２に示した。図２のうち、溶出時間の早いピークから、ピーク１、ピーク２、およびピーク３とした。
【００２５】
実施例２  分離抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性測定
（１）実施例１に記載の方法でモノクローナル抗体を分離し、図２に示す溶出パターン（クロマトグラム）中のピーク１、ピーク２、およびピーク３の画分を分取した。これら３つのピークに含まれるモノクローナル抗体および分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した。
【００２６】
（２）ＣＤＣ活性測定
（２−１）ピーク１、ピーク２およびピーク３に含まれるモノクローナル抗体および分離前のモノクローナル抗体を、ＰＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬから１／２希釈で７段階の希釈系列を調製した。
（２−２）モノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業社製）の抗原であるＣＤ２０を発現しているＤａｕｄｉ細胞をＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＬのＯｐｔｉＭｅｍ培地と５ｍＬの１６％Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍとを混合して調製したＢｕｆｆｅｒ）を用いて約１．１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ウェルプレート（３９１７：コーニング社製）に９０μＬ／ｗｅｌｌで加えた。
【００２７】
（２−３）Ｄａｕｄｉ細胞を加えたｗｅｌｌに（２−１）で調製したピーク１、ピーク２、ピーク３、分離前のモノクローナル抗体、又はブランクとしてのＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒのみを、それぞれ１０μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
（２−４）測定抗体サンプルを添加した９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）に２時間静置した。
（２−５）Ｃｙｔｏｔｏｘ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ（プロメガ社製）の手順に従って、基質を溶解したＡｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを５０μＬ／ｗｅｌｌで加えた。
（２−６）Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを添加した９６ウェルプレートをプレート振とう機で数十秒撹拌し、室温で１５分反応させた後、プレートリーダーＥｎｓｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）で発光を測定した。
【００２８】
測定した発光強度からブランクの発光強度を引き、実施例１で分離したピーク１、ピーク２、ピーク３、ならびに分離前のモノクローナル抗体の各抗体濃度での発光強度を比較した結果を図３に示した。図３の結果において、発光強度が高い程ＣＤＣ活性が高いことを示している。
【００２９】
また抗体濃度と発光強度から市販ソフトウェアＰＬＡ３．０（Ｓｔｅｇｍａｎｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ社製）を用いて半数効果濃度ＥＣ５０を基に相対力価を計算、比較した結果を表１に示した。ピーク１のＣＤＣ活性は分離前の約４５％に低下している一方、ピーク３のＣＤＣ活性は分離前の約１２０％に向上していた。この結果から、実施例１で分離する前のモノクローナル抗体、ならびに実施例１で分離した後のピーク１およびピーク２に含まれるモノクローナル抗体と比べて、実施例１で分離した後のピーク３に含まれるモノクローナル抗体はＣＤＣ活性が高いことが分かる。つまり実施例１で作製したＦｃＲ９カラムからの溶出が遅い（カラムに保持される時間が長い）方がよりＣＤＣ活性の高い抗体であるといえる。このことから、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルにより、ＣＤＣ活性が異なるモノクローナル抗体を分離できることが確認できた。
【００３０】
【表１】
2018039735.tif 000003
【図１】
2018039735.tif 000004
【図２】
2018039735.tif 000005
【図３】
2018039735.tif 000006
【配列表】
2018039735000001.app