(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＣケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）介在障害を処置するための、ＣＣＲ２に結合する抗原結合タンパク質の提供。【解決手段】１０−６Ｍ以下の結合親和性でＣＣＲ２エピトープと結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＣＲ２エピトープと結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体。
【請求項２】
配列番号１／配列番号２(ここでＤ１と呼ぶ)、配列番号３／配列番号２(ここで１Ａ２と呼ぶ)、配列番号４／配列番号２(ここで１Ｂ１１と呼ぶ)、配列番号５／配列番号２(ここで１Ｇ１１と呼ぶ)、配列番号６／配列番号２(ここで１Ｈ５と呼ぶ)、配列番号７／配列番号２(ここで１Ｂ２と呼ぶ)、配列番号８／配列番号２(ここでＤ１−１と呼ぶ)、配列番号９／配列番号２(ここでＤ１−２と呼ぶ)、配列番号１０／配列番号２(ここでＤ１−３と呼ぶ)、配列番号１１／配列番号２(ここでＤ１−４と呼ぶ)、配列番号１２／配列番号２(ここでＤ１−５と呼ぶ)、配列番号１３／配列番号２(ここでＤ１−６と呼ぶ)、配列番号１４／配列番号２(ここでＤ１−７と呼ぶ)、配列番号１５／配列番号２(ここでＤ１−８と呼ぶ)、配列番号８／配列番号１６(ここでＤ１−１Ａと呼ぶ)、配列番号９／配列番号１６(ここでＤ１−２Ａと呼ぶ)、配列番号１０／配列番号１６(ここでＤ１−３Ａと呼ぶ)、配列番号１１／配列番号１６(ここでＤ１−４Ａと呼ぶ)、配列番号１２／配列番号１６(ここでＤ１−５Ａと呼ぶ)、配列番号１３／配列番号１６(ここでＤ１−６Ａと呼ぶ)、配列番号１４／配列番号１６(ここでＤ１−７Ａと呼ぶ)、配列番号１５／配列番号１６(ここでＤ１−８Ａと呼ぶ)、配列番号８／配列番号３２(ここでＤ１−１Ｂと呼ぶ)、配列番号９／配列番号３２(ここでＤ１−２Ｂと呼ぶ)、配列番号１０／配列番号３２(ここでＤ１−３Ｂと呼ぶ)、配列番号１１／配列番号３２(ここでＤ１−４Ｂと呼ぶ)、配列番号１２／配列番号３２(ここでＤ１−５Ｂと呼ぶ)、配列番号１３／配列番号３２(ここでＤ１−６Ｂと呼ぶ)、配列番号１４／配列番号３２(ここでＤ１−７Ａと呼ぶ)、配列番号１５／配列番号３２(ここでＤ１−８Ｂと呼ぶ)、配列番号１７／配列番号１８(ここで４２Ａ０と呼ぶ)、配列番号１９／配列番号２０(ここで４２Ｄ４と呼ぶ)、配列番号２１／配列番号２２(ここで４２Ｅ８と呼ぶ)、配列番号２３／配列番号２４(ここで４２Ｆ１と呼ぶ)、配列番号２５／配列番号２６(ここで４２Ｇ７と呼ぶ)、配列番号２７／配列番号２８(ここで４３Ｇ１２と呼ぶ)、配列番号２９／配列番号３０(ここで４３Ｆ１２と呼ぶ)、配列番号３１／配列番号３２(ここで４５Ｈ８と呼ぶ)、配列番号３３／配列番号３４(ここで４４Ａ４と呼ぶ)、配列番号３５／配列番号３６(ここで４５Ｄ７と呼ぶ)、配列番号３７／配列番号３８(ここで５４Ａ９と呼ぶ)、配列番号３９／配列番号４０(ここで５４Ｃ１と呼ぶ)、配列番号４１／配列番号４２(ここで４２５５Ｅ４０と呼ぶ)、配列番号４３／配列番号４４(ここで５５Ｆ５と呼ぶ)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項１に記載の完全ヒト抗体。
【請求項３】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体フラグメント。
【請求項４】
抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項３に記載の完全ヒト抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項５】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域ならびに重鎖と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体。
【請求項６】
配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項５に記載の完全ヒト一本鎖抗体。
【請求項７】
重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有する完全ヒト一本鎖抗体であって、該完全ヒト一本鎖抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項５に記載の完全ヒト一本鎖抗体。
【請求項８】
抗ＣＣＲ２ポリペプチドの有効量を投与することを含む、ＣＣＲ２介在障害の処置方法であって、ここで、該抗ＣＣＲ２ポリペプチドが少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＣＲ２エピトープと結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体フラグメント、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域ならびに重鎖と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体およびこれらの組み合わせからなる群から選択され；
ここで、該完全ヒト抗体が配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し；
ここで、該Ｆａｂ完全ヒト抗体フラグメントが配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％である軽鎖可変ドメイン配列を有し；
ここで、該一本鎖ヒト抗体が配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％である軽鎖可変ドメイン配列を有する、
方法。
【請求項９】
完全ヒト抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項８に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１０】
完全ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項８に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１１】
完全ヒト一本鎖抗体が重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該一本鎖完全ヒト抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項８に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１２】
ＣＣＲ２介在障害が炎症性、免疫障害；心血管障害；増殖性障害；移植片拒絶反応；線維性疾患；ウイルス感染症；神経障害；および代謝障害からなる群から選択される、請求項８に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１３】
炎症性または免疫障害が喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患および過敏性肺炎；アナフィラキシーまたは過敏反応；薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー；アレルギー性接触性皮膚炎；脈管炎、ヒスタミンおよびＩｇＥ介在アレルギー性反応性間質性肺炎、間質性肺疾患(ＩＬＤ)、特発性肺線維症、リウマチ性関節炎と関係するＩＬＤ、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎；脊椎関節症；強皮症；乾癬および炎症性皮膚疾患、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹；脈管炎、壊死性、皮膚性および過敏性脈管炎；炎症性糸球体症、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症；全身性エリテマトーデス；重症筋無力症；若年発症型糖尿病；腎炎、糸球体腎炎；自己免疫性甲状腺炎；後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)およびベーチェット病からなる群から選択される、請求項１２に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１４】
心血管障害がアテローム発生；アテローム性動脈硬化症；冠動脈疾患；心筋梗塞；卒中；急性冠血管症候群；血栓症；アテローム硬化が起源の末梢血管疾患；高血圧；および異脂肪血症からなる群から選択される、請求項１２に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１５】
増殖性障害が液性または固形腫瘍、骨髄腫、白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、腎癌、肝癌、カルシノーマ、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、未分化癌、気管支原性癌、黒色腫、腎細胞癌、肝細胞腫−肝細胞癌、胆管癌、胆道癌、乳頭癌、移行細胞癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、乳癌、消化器癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頚部の扁平上皮細胞癌；肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫および中皮肉腫；血液の癌、骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ性白血病、リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、細網肉腫、ホジキン病、神経系の腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、シュワン腫および上衣腫からなる群から選択される、請求項１２に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１６】
移植片拒絶反応が同種移植片拒絶反応または移植片対宿主病である、請求項１２に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１７】
線維性疾患が強皮症である、請求項１２に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１８】
神経障害がＡＩＤＳと関係する認知症および疼痛および神経障害性疼痛からなる群から選択される請求項１２に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項１９】
代謝疾患が糖尿病である、請求項１２に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【請求項２０】
他の疾患が再灌流傷害；ある種の血液系腫瘍；サイトカイン誘発毒性、敗血症性ショック、内毒素ショック、多発性筋炎；皮膚筋炎；およびサルコイドーシスからなる群から選択される、請求項１２に記載のＣＣＲ２介在障害の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗ＣＣＲ２抗体と関係するまたはこれに由来する組成物および方法を提供する。より具体的に、本発明は、ＣＣＲ２に結合するヒト抗体、このような抗体のＣＣＲ２結合フラグメントおよび誘導体ならびにこのようなフラグメントを含むＣＣＲ２結合ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、このような抗体、抗体フラグメントおよび誘導体をコードする核酸およびポリペプチド、このようなポリヌクレオチドを含む細胞、このような抗体、抗体フラグメントおよび誘導体ならびにポリペプチドの製造方法、ならびに自己免疫性障害、心血管障害、炎症性障害、免疫障害、増殖性障害、線維性障害、ウイルス感染症、神経障害および代謝障害からなる群から選択されるＣＣＲ２介在障害を含む、ＣＣＲ２が関係する障害または状態を有する対象の処置または診断方法を含む、このような抗体、抗体フラグメントおよび誘導体ならびにポリペプチドの使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ＣＣケモカイン受容体２(ＣＣＲ２)は、単球、樹状細胞および記憶Ｔ細胞のような白血球のいくつかのサブセットの表面に発現され、カルボキシ末端領域をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、２種のわずかに異なる形態(ＣＣＲ２αおよびＣＣＲ２β)で発現されるように思われる(Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2752-2756 (1994))。ＣＣＲ２は、ケモカインリガンドＣＣＬ２(単球走化性タンパク質１(ＭＣＰ−１))の主受容体であり、またＣＣＬ８(ＭＣＰ−２)、ＣＣＬ７(ＭＣＰ−３)、ＣＣＬ１３(ＭＣＰ−４)、ＣＣＬ１２(ＭＣＰ−５)およびＨＩＶと結合する。動物モデルおよびヒトの両者において、アテローム性動脈硬化症および他のＣＣＲ２介在障害の病因におけるＣＣＲ２およびＣＣＬ２の関与を支持する重要な証拠がある。ＣＣＬ２はヒト動脈の動脈硬化病変で発現され、マクロファージ富領域と関係する(Nelken et al. (1991) J. Clin. Invest. 88(4):1121-7; Yla-Hertuala et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 88(12):5252-6; and Seino et al. (1995) Cytokine 7(6):575-9)。動物において、ノックアウトモデルにおける遺伝子操作によるＣＣＲ−２発現消失は、アテローム性動脈硬化症のアポリポタンパク質Ｅ(ＡｐｏＥ)欠失マウスモデルにおいてアテローム産生を減少させる(Boring et al. (1998) Nature 394(6696):894-7; and Dawson et al. (1999) Atherosclerosis 143(1):205-11)。同様に、ＣＣＬ２をコードする遺伝子の遺伝子破壊、ＣＣＬ２の短縮化またはドミナントネガティブＣＣＬ２の発現は、複数のアテローム性動脈硬化症マウスモデルで動脈硬化病変形成を減少させた(Ni et al. (2001) Circulation 103(16):2096-2101; Gu L. et al. (1998) Mol. Cell 2(2):275-81; Gosling et al. (1999) J. Clin. Invest. 103(6):773-778; and Inoue et al. (2002) Circulation 106(21):2700-6)。あるいは、頸動脈(Namiki et al. (2002) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22(1):115-20)または同一遺伝子マウスからの移植したトランスジェニック過剰発現骨髄に由来する血液単球(Aiello et al. (1999) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(6):1518-25)のいずれかでの局所的なＣＣＬ２の過剰発現は、感受性動物モデルでアテローム形成を増加させる。
【０００３】
それゆえに、ＣＣＲ２アンタゴニスト、ＣＣＬ２アンタゴニストまたはＣＣＲ２のその天然リガンドへの結合を阻害する薬物は、重要な治療剤の一群となる。
【０００４】
哺乳動物ケモカイン受容体に加えて、哺乳動物サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスが、感染細胞において、ケモカイン受容体の結合特性を有するタンパク質を発現することが示されている(Wells et al., Curr. Opin. Biotech. 1997, 8, 741-748)。ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５およびＣＣＲ８のようなヒトケモカイン受容体は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)による、微生物による哺乳動物細胞の感染のための共受容体として作用し得る。
【０００５】
ケモカインおよびその同族受容体は、喘息およびアレルギー性疾患；ならびにリウマチ性関節炎および多発性硬化症のような自己免疫性病態；およびアテローム性動脈硬化症および糖尿病のような代謝疾患を含む、炎症性、感染性および免疫調節性障害および疾患の重要なメディエーターとして関係するとされている(Charo et al., New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Gao et al., Chem. Rev. 2003, 103, 3733; Carter, Curr. Opin. Chem. Biol. 2002, 6, 510; Trivedi et al., Ann. Reports Med. Chem. 2000, 35, 191; Saunders et al., Drug Disc. Today 1999, 4, 80; Premack et al., Nature Medicine 1996, 2, 1174にレビュー)。例えば、ケモカイン単球化学誘引物質−１(ＭＣＰ−１)およびその受容体ＣＣケモカイン受容体２(ＣＣＲ２)は、炎症部位への白血球誘引およびその後のこれらの細胞活性化に中心的役割を有する。ケモカインＭＣＰ−１がＣＣＲ２に結合したとき、細胞内カルシウム濃度の急激な上昇、細胞接着分子の発現増加および白血球遊走促進が誘発される。ＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の重要性が、遺伝子組換えマウスの実験で証明されている。
【０００６】
ＭＣＰ−１−／−マウスは、数種の免疫感作後、炎症部位に単球を動員できなかった(Lu et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601)。同様に、ＣＣＲ２−／−マウスは、種々の外因性薬剤で感作後、単球の動員またはインターフェロン−γ産生が不可能であり、さらに、ＣＣＲ２ヌルマウスの白血球は、ＭＣＰ−１に応答して遊走せず(Boring et al., J. Clin. Invest. 1997, 100, 2552)、それによりＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の特異性が証明された。別の２つのグループが、ＣＣＲ−２−／−マウスの別の系統での同等な結果を個々に報告している(Kuziel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 12053, and Kurihara et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 1757)。ＭＣＰ−１−／−およびＣＣＲ−２−／−動物の生存能および全体的に正常な健康状態は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の攪乱が生理的危機を誘発しないという点で注目に値する。まとめると、これらのデータは、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２の作用を遮断する分子が、多くの炎症性および自己免疫性障害の処置に有用であろうとの結論をもたらす(Feria et al., Exp. Opin. Ther. Patents 2006, 16, 49; and Dawson et al., Exp. Opin. Ther. Targets 2003, 7, 35)。この仮説は、下記のとおり、本発明により多くの種々の動物疾患モデルで検証された。
【０００７】
ＭＩＰ−１αがリウマチ性関節炎患者の滑液および血液で上昇することは知られている(Koch et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 921-928)。さらに、リウマチ性関節炎の処置においてＭＩＰ−１α／ＣＣＲ１相互作用の拮抗作用が治療価値がある可能性を証明するいくつかの研究がある(Pease et al., Expert Opin. Invest. Drugs 2005, 14, 785-796)。ＭＩＰ−１αに対する抗体は、マウスにおける多発性硬化症モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)を回復させることが示された(Karpus et al., J. Immun. 1995, 5003-5010)。同様に、炎症性疾患症状は、コラーゲン誘発関節炎を有するマウスへのＭＩＰ−１αに対する抗体の直接投与を介して制御できた(Lukacs et al., 1995, 95, 2868-2876)。
【０００８】
ＭＣＰ−１は、肺移植後閉塞性細気管支炎症候群を発症した患者で上方制御される(Reynaud-Gaubert et al., J. Heart Lung Transplant., 2002, 21, 721-730; Belperio et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556)。閉塞性細気管支炎症候群のマウスモデルにおいて、ＭＣＰ−１に対する抗体の投与は、気道閉塞を減弱させ、同様に、ＣＣＲ２−／−マウスは、この同じモデルで気道閉塞に抵抗性であった(Belperio et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556)。これらのデータは、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２の拮抗作用が、移植後の臓器拒絶反応の処置に有益である可能性を示唆する。さらに、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２軸の攪乱が、島移植片の生存を延長できたことを示す研究がある(Lee et al., J. Immunol. 2003, 171, 6929; Abdi et al., J. Immunol. 2004, 172, 767)。ラット移植片モデルにおいて、ＣＣＲ２およびＭＣＰ−１は、移植片脈管障害を発現している移植片で上方制御されていることが示された(Horiguchi et al., J. Heart Lung Transplant. 2002, 21, 1090)。他の研究において、抗ＭＣＰ−１遺伝子治療は移植片脈管障害を減弱した(Saiura et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 1886)。ＭＣＰ−１遮断による実験的静脈移植片新生内膜形成阻害を記載した研究がある(Tatewaki et al., J. Vasc. Surg. 2007, 45, 1236)。
【０００９】
他の研究において、喘息処置でのてＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用への拮抗が治療的価値を有する可能性を示している。オブアルブミン感作マウスにおける中和抗体でのＭＣＰ−１の隔離は、気管支応答性亢進および炎症の著しい減少をもたらした(Gonzalo et al., J. Exp. Med. 1998, 188, 157)。ＭＣＰ−１に対する抗体の投与によりマンソン住血吸虫卵チャレンジによるマウスにおけるアレルギー性気道炎症を低減することが可能であることが判明した(Lukacs et al., J. Immunol. 1997, 158, 4398)。同様に、ＭＣＰ−１−／−マウスは、マンソン住血吸虫卵チャレンジに対して低減された応答を示した(Lu et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601)。
【００１０】
他の研究は、腎疾患におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用への拮抗が治療的価値を有する可能性を示した。糸球体腎炎のマウスモデルにおけるＭＣＰ−１に対する抗体投与が、糸球体の半月体形成およびＩ型コラーゲン沈着を著しく減少させた(Lloyd et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 1371)。さらに、腎毒性血清腎炎を誘発させたＭＣＰ−１−／−マウスでは、ＭＣＰ−１＋／＋の対照マウスよりも尿細管損傷が顕著に少なかった(Tesch, G. H. et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 73)。
【００１１】
いくつかの研究が、全身性エリテマトーデスの処置におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用に対する拮抗が治療的価値を有する可能性を示している。ＣＣＲ２−／−マウスは、全身性エリテマトーデスのマウスモデルにおいて無処置の対照マウスより生存期間が長く、腎疾患が減少した(Perez de Lema et al. J. Am. Soc. Neph. 2005, 16, 3592)。これらのデータは、狼瘡の齧歯類モデルにおいて、ＭＣＰ−１の遺伝子欠失(Shimizu, S. et al. Rheumatology (Oxford) 2004, 43, 1121; Tesch et al., J. Exp. Med. 1999, 190, 1813)またはＣＣＲ２のペプチドアンタゴニストの投与(Hasegawa et al. Arthritis & Rheumatism 2003, 48, 2555)の最近の研究で発見された疾患改変活性と一致する。
【００１２】
クローン病患者の小腸で、非罹患回腸と比較して顕著なＣＣＲ２＋粘膜固有層リンパ球の３０倍の上昇が観察された(Connor et al., Gut 2004, 53, 1287)。同様に注目すべきことに、対照と比較して、活動性クローン病を有する患者で、循環ＣＣＲ２＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋単球のサブセットの拡大があった。数種の齧歯類研究で、クローン病／大腸炎の処置においてＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用への拮抗が治療的価値を有する可能性が示されている。ＣＣＲ−２−／−マウスは、デキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎の影響から保護された(Andres et al., J. Immunol. 2000, 164, 6303)。ＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３の小分子アンタゴニスト(マウス結合親和性＝それぞれ２４nM、２３６nMおよび３６９nM)の投与も、デキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎から保護した(Tokuyama et al., Int. Immunol. 2005, 17, 1023)。最後に、大腸炎のハプテン誘発モデルにおけるＭＣＰ−１−／−マウスの結腸損傷は実質的に低減された(肉眼および組織学的に)(Khan et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006, 291, G803)。
【００１３】
炎症性腸疾患を有する患者の腸上皮細胞および腸粘膜におけるＭＣＰ−１の過剰発現ついて二つの報告がある(Reinecker et al., Gastroenterology 1995, 108, 40およびGrimm et al., J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 804)。一つの研究は、ＭＣＰ−１遺伝子のプロモーター多型と強皮症(全身性硬化症)の関係に関する(Karrer et al., J. Invest. Dermatol. 2005, 124, 92)。組織線維症関係のモデルにおいて、ＣＣＲ２／ＭＣＰ−１軸の阻害が、皮膚(Yamamoto et al., J. Invest. Dermatol. 2003, 121, 510; Ferreira et al., J. Invest. Dermatol. 2006, 126, 1900)、肺(Okuma et al., J. Pathol. 2004, 204, 594; Gharaee-Kermani et al., Cytokine 2003, 24, 266)、腎臓(Kitagawa et al., Am. J. Pathol. 2004, 165, 237; Wada et al., J. Am. Soc. Nephrol. 2004, 15, 940)、心臓(Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134)および肝臓(Tsuruta et al., Int. J. Mol. Med. 2004, 14, 837)における線維症を低減させた。
【００１４】
一つの研究は、肺胞炎の処置にＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用への拮抗が治療的価値を有する可能性を示している。ＩｇＡ免疫複合肺傷害を有するラットを、ラットＭＣＰ−１に対して惹起させた抗体(ＪＥ)で静脈内処置したとき、肺胞炎の症状は一部軽減した(Jones et al., J. Immunol. 1992, 149, 2147)。癌の処置においてＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用への拮抗が治療的価値を有する可能性を示すいくつかの研究がある(Craig et al., Cancer Metastasis Rev. 2006, 25, 611; Conti, Seminars in Cancer Biology 2004, 14, 149; Giles, Curr. Cancer Drug Targets 2006, 6, 659にレビュー)。ヒト乳癌細胞を持つ免疫欠損マウスを抗ＭＣＰ−１抗体で処置したとき、肺微小転移の阻害および生存の延長が観察された(Salcedo et al., Blood 2000, 96, 34-40)。ヒト腫瘍臨床検体を使用して、ＣＣＲ２発現が、前立腺癌進行と関係付けられた(Lu et al., J. Cell. Biochem. 2007, 101, 676)。インビトロで、ＭＣＰ−１発現は、前立腺癌細胞増殖および侵襲に介在することが示されており(Lu et al., Prostate 2006, 66, 1311)、さらに、前立腺癌細胞により発現されたＭＣＰ−１は、骨吸収のためのヒト骨髄前駆細胞を誘導した(Lu et al., Cancer Res. 2007, 67, 3646)。
【００１５】
再狭窄の処置にＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用への拮抗が治療的価値を有する可能性が複数の報告で述べられている。ヒトにおいて、ＭＣＰ−１レベルは、再狭窄のリスクと直接相関する(Cipollone et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 327)。ＣＣＲ２またはＭＣＰ−１を欠損するマウスは、動脈傷害後、内膜表面および内膜／中膜比の減少を示した(野生型同腹仔と比較して)(Roque et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 554; Schober et al., Circ. Res. 2004, 95, 1125; Kim et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 2003, 310, 936)。マウスにおいて、骨格筋へのＭＣＰ−１のドミナントネガティブ阻害剤の遺伝子導入(Egashira et al., Circ. Res. 2002, 90, 1167)も、動脈傷害後の内膜過形成を減少させた。中和抗体を使用したＣＣＲ２の遮断は、霊長類でステント留置後の新生内膜過形成を減少させた(Horvath et al., Circ. Res. 2002, 90, 488)。
【００１６】
脳損傷を誘発したラットのＭＣＰ−１過剰発現に関する二つの報告がある(King et al., J. Neuroimmunol. 1994, 56, 127, and Berman et al., J. Immunol. 1996, 156, 3017)。さらに、ＣＣＲ２−／−マウス(Dimitrijevic et al., Stroke 2007, 38, 1345)およびＭＣＰ−１−／−マウス(Hughes et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002, 22, 308)が虚血／再潅流傷害からある程度保護されることが研究で示されている。
【００１７】
単球／マクロファージは、神経障害性疼痛の発症に重要な役割を有する(Liu et al., Pain 2000, 86, 25)。これに符合して、近年、炎症性および神経障害性の疼痛の処置においてＣＣＲ２が役割を有する可能性が報告されている。ＣＣＲ２−／−マウスは、これを欠く対照と比較して、足底内ホルマリン注射後の疼痛行動減少および足底内ＣＦＡ注射後の機械的異痛(allodynia)のわずかな減少を含む、炎症性疼痛応答の変化を示した(Abbadie et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 2003, 100, 7947)。さらに、ＣＣＲ２−／−マウスは、坐骨神経傷害後に顕著な機械的異痛を示さなかった。同様に、小分子ＣＣＲ２アンタゴニストは、経口投与後機械的異痛を損傷前レベルの８０％まで減少させた(ＷＯ２００４／１１０３７６)。
【００１８】
一つの研究が、虚血性心筋症におけるＭＣＰ−１の重要な役割を発表した(Frangogiannis et al., Circulation 2007, 115, 584)。他の研究で、ＭＣＰ−１阻害後の実験的心不全の減少が報告された(Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134)。他の研究は、上記以外の種々の疾病状態でＭＣＰ−１が過剰発現される証拠を提示している。これらの報告は、ＭＣＰ−１アンタゴニストがこのような疾患の有用な治療剤であり得るという相関的証拠を提供する。他の研究で、齧歯類心臓同種移植片におけるＭＣＰ−１の過剰発現が示されており、移植片動脈硬化症の病因におけるＭＣＰ−１の役割を示唆する(Russell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6086)。ＭＣＰ−１の過剰発現は、特発性肺線維症の患者の肺内皮細胞で示されている(Antoniades et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5371)。同様に、ＭＣＰ−１の過剰発現は、乾癬患者の皮膚で示されており(Deleuran et al., J. Dermatol. Sci. 1996, 13, 228, and Gillitzer et al., J. Invest. Dermatol. 1993, 101, 127)、ＣＣＲ２＋細胞の優性に係る相関的知見も報告されている(Vestergaard et al., Acta Derm. Venerol. 2004, 84, 353)。最後に、最近の報告で、ＭＣＰ−１がＨＩＶ−１に関係する認知症患者の脳および脳脊髄液で過剰発現されることが示されている(ＷＯ９９／４６９９１)。
【００１９】
さらに、ＣＣＲ２多型は、少なくとも一つの患者集団であるサルコイドーシスと関係することが示されている(Spagnolo et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003, 168, 1162)。
【００２０】
ＣＣＲ２が、ＨＩＶのある株の共受容体として関係しているとされていることも注意すべきである(Doranz et al., Cell 1996, 85, 1149)。ＨＩＶ共受容体としてのＣＣＲ２の使用が、疾患進行と相関し得ることも見出されている(Connor et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 621)。この知見は、ＣＣＲ２変異体であるＣＣＲ２−６４Ｉの存在が、ヒト集団におけるＨＩＶの発症遅延と正に相関するとの最近の知見と一致する(Smith et al., Science 1997, 277, 959)。ＭＣＰ−１はこれらの過程と関係付けられていないが、ＣＣＲ２への結合を介して作用するＭＣＰ−１アンタゴニストが、ＨＩＶ感染患者のＡＩＤＳへの疾病進行の遅延に有利な治療効果を有する可能性がある。
【発明の概要】
【００２１】
概要
本発明は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＣＲ２エピトープと結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体を開示し、これは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト抗体は重鎖および軽鎖の両者を有し、ここで、該抗体は、配列番号１／配列番号２(ここでＤ１と呼ぶ)、配列番号３／配列番号２(ここで１Ａ２と呼ぶ)、配列番号４／配列番号２(ここで１Ｂ１１と呼ぶ)、配列番号５／配列番号２(ここで１Ｇ１１と呼ぶ)、配列番号６／配列番号２(ここで１Ｈ５と呼ぶ)、配列番号７／配列番号２(ここで１Ｂ２と呼ぶ)、配列番号８／配列番号２(ここでＤ１−１と呼ぶ)、配列番号９／配列番号２(ここでＤ１−２と呼ぶ)、配列番号１０／配列番号２(ここでＤ１−３と呼ぶ)、配列番号１１／配列番号２(ここでＤ１−４と呼ぶ)、配列番号１２／配列番号２(ここでＤ１−５と呼ぶ)、配列番号１３／配列番号２(ここでＤ１−６と呼ぶ)、配列番号１４／配列番号２(ここでＤ１−７と呼ぶ)、配列番号１５／配列番号２(ここでＤ１−８と呼ぶ)、配列番号８／配列番号１６(ここでＤ１−１Ａと呼ぶ)、配列番号９／配列番号１６(ここでＤ１−２Ａと呼ぶ)、配列番号１０／配列番号１６(ここでＤ１−３Ａと呼ぶ)、配列番号１１／配列番号１６(ここでＤ１−４Ａと呼ぶ)、配列番号１２／配列番号１６(ここでＤ１−５Ａと呼ぶ)、配列番号１３／配列番号１６(ここでＤ１−６Ａと呼ぶ)、配列番号１４／配列番号１６(ここでＤ１−７Ａと呼ぶ)、配列番号１５／配列番号１６(ここでＤ１−８Ａと呼ぶ)、配列番号８／配列番号３２(ここでＤ１−１Ｂと呼ぶ)、配列番号９／配列番号３２(ここでＤ１−２Ｂと呼ぶ)、配列番号１０／配列番号３２(ここでＤ１−３Ｂと呼ぶ)、配列番号１１／配列番号３２(ここでＤ１−４Ｂと呼ぶ)、配列番号１２／配列番号３２(ここでＤ１−５Ｂと呼ぶ)、配列番号１３／配列番号３２(ここでＤ１−６Ｂと呼ぶ)、配列番号１４／配列番号３２(ここでＤ１−７Ａと呼ぶ)、配列番号１５／配列番号３２(ここでＤ１−８Ｂと呼ぶ)、配列番号１７／配列番号１８(ここで４２Ａ０と呼ぶ)、配列番号１９／配列番号２０(ここで４２Ｄ４と呼ぶ)、配列番号２１／配列番号２２(ここで４２Ｅ８と呼ぶ)、配列番号２３／配列番号２４(ここで４２Ｆ１と呼ぶ)、配列番号２５／配列番号２６(ここで４２Ｇ７と呼ぶ)、配列番号２７／��列番号２８(ここで４３Ｇ１２と呼ぶ)、配列番号２９／配列番号３０(ここで４３Ｆ１２と呼ぶ)、配列番号３１／配列番号３２(ここで４５Ｈ８と呼ぶ)、配列番号３３／配列番号３４(ここで４４Ａ４と呼ぶ)、配列番号３５／配列番号３６(ここで４５Ｄ７と呼ぶ)、配列番号３７／配列番号３８(ここで５４Ａ９と呼ぶ)、配列番号３９／配列番号４０(ここで５４Ｃ１と呼ぶ)、配列番号４１／配列番号４２(ここで４２５５Ｅ４０と呼ぶ)、配列番号４３／配列番号４４(ここで５５Ｆ５と呼ぶ)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００２２】
本発明は、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体フラグメントを提供し、ここで、これは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト抗体Ｆａｂフラグメントは重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００２３】
本発明は、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域ならびに重鎖と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体を提供し、ここで、これは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト一本鎖抗体は重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該一本鎖完全ヒト抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００２４】
本発明は、さらに、抗ＣＣＲ２ポリペプチドの有効量を投与することを含む広範な哺乳動物の癌または広範な炎症性疾患および自己免疫性疾患の処置方法を提供し、ここで、該抗ＣＣＲ２ポリペプチドは、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＣＲ２エピトープと結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体フラグメント、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域ならびに重鎖と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体およびこれらの組み合わせからなる群から選択され；
ここで、該完全ヒト抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群のアミノ酸配列と少なくとも９５％である軽鎖可変ドメイン配列を有し；
ここで、該Ｆａｂ完全ヒト抗体フラグメントは配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％である軽鎖可変ドメイン配列を有し；そして
ここで、該一本鎖ヒト抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％である軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００２５】
好ましくは、本完全ヒト抗体は重鎖および軽鎖の両者を有し、ここで、該抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト抗体Ｆａｂフラグメントは重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト一本鎖抗体は重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該一本鎖完全ヒト抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００２６】
好ましくは、哺乳動物の処置される広範な癌は、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽腫、あらゆる小児癌、腎癌、白血病、腎臓の移行上皮癌、ヴェルナー・モリソン症候群、先端巨大症、膀胱癌、ウィルムス癌、卵巣癌、膵癌、良性前立腺肥大、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頚癌、滑膜肉腫、転移性カルチノイドと関係する下痢、血管作用性小腸ペプチド分泌性腫瘍、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄および不適切な微小血管増殖、頭頸部癌、扁平上皮細胞癌、多発性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、血液系腫瘍、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、肥満細胞白血病、肥満細胞新生物、濾胞性リンパ腫、汎発性大細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、慢性骨髄増殖性障害、中枢神経系腫瘍、脳の癌、神経膠芽腫、神経膠芽腫ではない脳の癌、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭シュワン腫、神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫および脈絡叢乳頭腫、骨髄増殖性障害、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症、軟組織肉腫、甲状腺癌、子宮内膜癌、カルチノイド癌、胚細胞腫瘍、肝癌、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、先端巨大症、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄または不適切な微小血管増殖、グレーブス病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫甲状腺炎およびベーチェット病からなる群から選択される。
【００２７】
好ましくは、ＣＣＲ２介在障害の処置方法は、炎症性、免疫障害；心血管障害；増殖性障害；移植片拒絶反応；線維性疾患；ウイルス感染症；神経障害；および代謝障害から選択される。より好ましくは、ＣＣＲ２介在障害の処置方法は、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患および過敏性肺炎；アナフィラキシーまたは過敏反応；薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー；アレルギー性接触性皮膚炎；脈管炎、ヒスタミンおよびＩｇＥ介在アレルギー性反応性間質性肺炎、間質性肺疾患(ＩＬＤ)、特発性肺線維症、リウマチ性関節炎と関係するＩＬＤ、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎；脊椎関節症；強皮症；乾癬および炎症性皮膚疾患、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹；脈管炎、壊死性、皮膚性および過敏性脈管炎；炎症性糸球体症、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症；全身性エリテマトーデス；重症筋無力症；若年発症型糖尿病；腎炎、糸球体腎炎；自己免疫性甲状腺炎；後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)およびベーチェット病からなる群から選択される炎症性または免疫障害である。
【００２８】
より好ましくは、ＣＣＲ２介在障害の処置方法は、アテローム発生；アテローム性動脈硬化症；冠動脈疾患；心筋梗塞；卒中；急性冠血管症候群；血栓症；アテローム硬化が起源の末梢血管疾患；高血圧；および異脂肪血症からなる群から選択される心血管障害である。
【００２９】
より好ましくは、ＣＣＲ２介在障害の処置方法は、液性または固形腫瘍、骨髄腫、白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、腎癌、肝癌、カルシノーマ、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、未分化癌、気管支原性癌、黒色腫、腎細胞癌、肝細胞腫−肝細胞癌、胆管癌、胆道癌、乳頭癌、移行細胞癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、乳癌、消化器癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頚部の扁平上皮細胞癌；肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫および中皮肉腫；血液の癌、骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ性白血病、リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、細網肉腫、ホジキン病、神経系の腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、シュワン腫および上衣腫からなる群から選択される増殖性障害である。
【００３０】
好ましくは、ＣＣＲ２介在障害の処置方法は、同種移植片拒絶反応または移植片対宿主病のような移植片拒絶反応または強皮症のような線維性疾患である。好ましくは、ＣＣＲ２介在障害の処置方法は、ＡＩＤＳと関係する認知症および疼痛および神経障害性疼痛からなる群から選択される神経障害である。好ましくは、ＣＣＲ２介在障害の処置方法は、糖尿病のような代謝疾患である。好ましくは、ＣＣＲ２介在障害の処置方法は再灌流傷害；ある種の血液系腫瘍；サイトカイン誘発毒性、敗血症性ショック、内毒素ショック、多発性筋炎；皮膚筋炎；およびサルコイドーシスからなる群から選択される他の疾患である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】抗ＣＣＲ２Ｄ１抗体に対する細胞結合ＥＣ５０を示す。抗ＣＣＲ２Ｄ１抗体に対する細胞結合ＥＣ５０は、図１に示すとおり１６８pMと決定された。
【００３２】
【図２】マウスＣＣＲ２発現細胞に対するＤ１の細胞結合ＥＣ５０を示す。マウスＣＣＲ２に結合した唯一の抗ＣＣＲ２抗体はＤ１であり、他の全ての抗体は、細胞染色を示さなかった。マウスＣＣＲ２発現細胞に対するＤ１の細胞結合ＥＣ５０は約１７nMである(図２)。
【００３３】
【図３】ＴＨＰ−１細胞を用いるカルシウムアッセイを示す。(Ａ)  ＭＣＰ−１のＥＣ５０決定：ＴＨＰ−１細胞(アッセイ緩衝液２５μl中０.３×１０５細胞)を、２５μlのプロベネシドを含むカルシウム４アッセイキットと、ポリ−Ｄ−リシン３８４ウェルプレートで１時間、３７℃、５％ＣＯ２、続いて１５分、室温でインキュベートし、遠心分離した。最終指示濃度を達成するためにＭＣＰ−１の５倍用量応答を添加した(１２.５μl／ウェル)。図３Ａは平均±Ｓ.Ｄ.(ｎ＝３)を示す。(Ｂ)  Ｄ１のＩＣ５０決定：ＴＨＰ−１細胞(アッセイ緩衝液２５μl中０.３×１０５細胞)を、連続希釈用量のＤ１と２０分、室温でプレインキュベートした。２５μlのプレインキュベート細胞を、２５μlのプロベネシドを含むカルシウム４アッセイキットに添加して、Ｄ１の最終指示濃度を達成した。ポリ−Ｄ−リシン３８４ウェルプレートで３７℃、５％ＣＯ２で１時間、続いて１５分、室温でインキュベートし、遠心分離後、１０nM  ＭＣＰ−１(３８４ウェルプレート中最終濃度)を、FlexStation3で検出中チャレンジアゴニスト(challenge agonist)として添加した。図３Ｂは平均±Ｓ.Ｄ.(ｎ＝３)および類似の結果となった２個の独立した実験の１個を示す。
【００３４】
【図４】初代ヒト単球を用いるカルシウムアッセイを示す。(Ａ)  ＭＣＰ−１のＥＣ５０決定：初代ヒト単球(アッセイ緩衝液２５μl中０.３×１０５細胞)を、２５μlのプロベネシドを含むカルシウム４アッセイキットと、ポリ−Ｄ−リシン３８４ウェルプレートで１時間、３７℃、５％ＣＯ２、続いて１５分、室温でインキュベートし、遠心分離した。最終指示濃度を達成するためにＭＣＰ−１の５倍用量応答を添加した(１２.５μl／ウェル)。図４Ａは類似の結果となった２個の独立した実験の１個を示す。(Ｂ)  Ｄ１のＩＣ５０決定：ＴＨＰ−１細胞(２５μlアッセイ緩衝液中８,０００細胞)を、連続希釈用量のＤ１と２０分、室温でプレインキュベートした。２５μlのプレインキュベート細胞をプロベネシドを含む２５μlのカルシウム４アッセイに添加して、Ｄ１の最終指示濃度を達成した。ポリ−Ｄ−リシン３８４ウェルプレートで３７℃、５％ＣＯ２で１時間、続いて１５分、室温でインキュベートし、遠心分離後、１０nM  ＭＣＰ−１(３８４ウェルプレート中最終濃度)を、FlexStation3で検出中チャレンジアゴニストとして添加した。図４Ｂは類似の結果となった２個の独立した実験の１個を示す。
【００３５】
【図５】ＴＨＰ−１細胞を用いる走化性アッセイを示す。図５Ａは、ＭＣＰ−１のＥＣ５０決定である：２９μlのＨＢＳＳ＋０.１％ＢＳＡ中の連続希釈濃度のＭＣＰ−１(図５Ａに示す)を、下部チャンバーのプレートのウェルに入れ、一方ＴＨＰ−１細胞(２５μlのＨＢＳＳ＋０.１％ＢＳＡ中０.１×１０６細胞)を、５μm孔膜の上端の各側に載せた。３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベーション後、膜の上端の非遊走細胞をブロットし、膜を除いた。プレートのウェルの遊走細胞をCedexで計数し、ＭＣＰ−１のＥＣ５０をPrism 5で計算した。図５Ａは２個の独立した実験の１個を示す(平均±ＳＥ、ｎ＝３)。図５ＢはＤ１のＩＣ５０決定である：連続希釈濃度のＤ１(図５Ｂに示す)を、ＴＨＰ−１細胞(２５μl中０.１×１０６細胞)と室温で２０分プレインキュベートした。３nMのＭＣＰ−１を下部チャンバーのプレートのウェルに入れ、一方Ｄ１とプレインキュベートした細胞を膜の上端に載せた。２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーション後、Ａの方法のとおり遊走細胞を回収し、計数し、計算した。図５Ｂは平均±Ｓ.Ｄ.(ｎ＝３)および各々類似の結果の３個の独立した実験の１個を示す。
【００３６】
【図６】初代ヒト単球細胞を用いる走化性アッセイを示す。図６Ａは、ＭＣＰ−１のＥＣ５０決定である：２９μlのＨＢＳＳ＋０.１％ＢＳＡ中の種々の濃度のＭＣＰ−１(図に示す)を、下部チャンバーのプレートのウェルに入れ、一方初代ヒト単球細胞(２５μlのＨＢＳＳ＋０.１％ＢＳＡ中０.１×１０６細胞)を、５μm孔膜の上端の各側に載せた。３７℃、５％ＣＯ２で１時間４５分インキュベーション後、膜の上端の非遊走細胞をブロットし、膜を除いた。プレートのウェルの遊走細胞をCedexで計数し、ＭＣＰ−１のＥＣ５０をPrism 5で計算した。図６ＢはＤ１のＩＣ５０決定である：種々の濃度のＤ１(０.０３〜６.７nM)を、初代ヒト単球細胞(部位あたり２５μl中０.１×１０６細胞)と室温で２０分プレインキュベートした。１nMのＭＣＰ−１を下部チャンバーのプレートのウェルに入れ、一方Ｄ１とプレインキュベートした細胞を膜の上端に載せた。３７℃、５％ＣＯ２で１時間４５分インキュベーション後、Ａの方法のとおり遊走細胞を回収し、計数し、計算した。図６Ｂおよび６Ｃは、２名の別のドナーから単離した初代ヒト単球を使用する２個の独立した実験の平均±Ｓ.Ｄ.(ｎ＝２)を表す。
【００３７】
【図７】ＷＥＨＩ  ２７４.１細胞を用いる走化性アッセイを示す。図７Ａにおいて、ＥＣ５０をｍＭＣＰ−１について決定した。簡単にいうと、２９μlのＨＢＳＳ＋０.１％ＢＳＡ中の種々の濃度のｍＭＣＰ−１(０.０２〜６０nM)を、下部チャンバーのプレートのウェルに入れ、一方ＷＥＨＩ  ２７４.１細胞(２５μlのＨＢＳＳ＋０.１％ＢＳＡ中０.１×１０６細胞)を、８μm孔膜の上端の各側に載せた。３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベーション後、膜の上端に残っている非遊走細胞をブロットし、膜の上端をＰＢＳで洗浄した。膜をプレートから外し、ウェルの蛍光を、励起蛍光プレートリーダー(FlexStation3, Molecular Device)で、励起４８５nmおよび発光５３０nmで膜の底から測定した。ＭＣＰ−１のＥＣ５０値をPrism 5で計算した。図７Ｂにおいて、Ｄ１のＩＣ５０決定を提供する。種々の濃度のＤ１(４.０〜５３４nM)を、ＷＥＨＩ細胞(部位あたり２５μl中０.１×１０６細胞)と室温で２０分プレインキュベートした。２.５nMのｍＭＣＰ−１を下部チャンバーのプレートのウェルに入れ、一方Ｄ１とプレインキュベートした細胞を膜の上端に載せた。２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーション後、Ａの方法のとおり遊走細胞を回収し、計数し、計算した。
【００３８】
【図８】抗体Ｄ１およびＭＬＮ１２０２の走化性の比較を示す。図８Ａは、ＭＣＰ−１誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＤ１対ＭＬＮ１２０２のＩＣ５０決定である。図８Ｂは、ＭＣＰ−２誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＤ１対ＭＬＮ１２０２のＩＣ５０決定である。図８Ｃは、ＭＣＰ−３誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＤ１対ＭＬＮ１２０２のＩＣ５０決定である。図８Ｄは、ＭＣＰ−４誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＤ１対ＭＬＮ１２０２のＩＣ５０決定である。図８Ｅは、マウスＭＣＰ−５誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＤ１対ＭＬＮ１２０２のＩＣ５０決定である。
【００３９】
【図９】多発性硬化症のマウスＥＡＥモデルにおけるインビボでの抗ＣＣＲ２抗体Ｄ１の有益な効果を示す。
【００４０】
【図１０】抗体１Ｇ１１についてのＩＣ５０結果を示す。具体的に、ＭＣＰ−１(３nM)に対する１Ｇ１１のＩＣ５０は７９pM(図１０Ａ)であり、ＭＣＰ−５(６ng／ml)に対しては２６１pM(図１０Ｂ)であった。
【００４１】
【図１１】抗体１Ｂ２についてのＩＣ５０結果を示す。具体的に、ＭＣＰ−１(３nM)に対する１Ｂ２のＩＣ５０は８７pM(図１１Ａ)であり、ＭＣＰ−５(３nM)に対しては１９７pM(図１１Ｂ)であった。これらのＩＣ５０値は、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−５誘発ＴＨＰ−１遊走に対して１Ｇ１１および１Ｂ１１がＤ１より強力であることを示す。しかしながら、１Ｇ１１および１Ｂ２はＭＣＰ−２、３および４誘発ＴＨＰ−１遊走に対する阻害活性を有しない(データは示していない)。
【００４２】
【図１２】抗体１Ｈ５についてのＩＣ５０結果を示す。具体的に、ＭＣＰ−１(３nM)に対する１Ｈ５のＩＣ５０は１０９pM(図１２Ａ)であり、ＭＣＰ−５(６ng／ml)に対しては３４９pM(図１２Ｂ)であった。これらのＩＣ５０値はＤ１と同等である。１Ｈ５はまた３０ng／mlのＭＣＰ−２に対して１.９nMのＩＣ５０値(図１２Ｃ)、６ng／mlのＭＣＰ−３に対して２.６nMのＩＣ５０値(図１２Ｄ)および２００ng／mlのＭＣＰ−４に対して１.４nMのＩＣ５０(図１２Ｅ)を示した。
【００４３】
【図１３】種々のＣＣＲ２ＩｇＧ１クローンのＣＨＯ−ｈｕＣＣＲ２細胞に対する分離速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な記載
本発明は、１０−６Ｍ以下の結合親和性でＣＣＲ２エピトープと結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体を提供し、これは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト抗体は重鎖および軽鎖の両者を有し、ここで、該抗体は、配列番号１／配列番号２(ここでＤ１と呼ぶ)、配列番号３／配列番号２(ここで１Ａ２と呼ぶ)、配列番号４／配列番号２(ここで１Ｂ１１と呼ぶ)、配列番号５／配列番号２(ここで１Ｇ１１と呼ぶ)、配列番号６／配列番号２(ここで１Ｈ５と呼ぶ)、配列番号７／配列番号２(ここで１Ｂ２と呼ぶ)、配列番号８／配列番号２(ここでＤ１−１と呼ぶ)、配列番号９／配列番号２(ここでＤ１−２と呼ぶ)、配列番号１０／配列番号２(ここでＤ１−３と呼ぶ)、配列番号１１／配列番号２(ここでＤ１−４と呼ぶ)、配列番号１２／配列番号２(ここでＤ１−５と呼ぶ)、配列番号１３／配列番号２(ここでＤ１−６と呼ぶ)、配列番号１４／配列番号２(ここでＤ１−７と呼ぶ)、配列番号１５／配列番号２(ここでＤ１−８と呼ぶ)、配列番号８／配列番号１６(ここでＤ１−１Ａと呼ぶ)、配列番号９／配列番号１６(ここでＤ１−２Ａと呼ぶ)、配列番号１０／配列番号１６(ここでＤ１−３Ａと呼ぶ)、配列番号１１／配列番号１６(ここでＤ１−４Ａと呼ぶ)、配列番号１２／配列番号１６(ここでＤ１−５Ａと呼ぶ)、配列番号１３／配列番号１６(ここでＤ１−６Ａと呼ぶ)、配列番号１４／配列番号１６(ここでＤ１−７Ａと呼ぶ)、配列番号１５／配列番号１６(ここでＤ１−８Ａと呼ぶ)、配列番号８／配列番号３２(ここでＤ１−１Ｂと呼ぶ)、配列番号９／配列番号３２(ここでＤ１−２Ｂと呼ぶ)、配列番号１０／配列番号３２(ここでＤ１−３Ｂと呼ぶ)、配列番号１１／配列番号３２(ここでＤ１−４Ｂと呼ぶ)、配列番号１２／配列番号３２(ここでＤ１−５Ｂと呼ぶ)、配列番号１３／配列番号３２(ここでＤ１−６Ｂと呼ぶ)、配列番号１４／配列番号３２(ここでＤ１−７Ａと呼ぶ)、配列番号１５／配列番号３２(ここでＤ１−８Ｂと呼ぶ)、配列番号１７／配列番号１８(ここで４２Ａ０と呼ぶ)、配列番号１９／配列番号２０(ここで４２Ｄ４と呼ぶ)、配列番号２１／配列番号２２(ここで４２Ｅ８と呼ぶ)、配列番号２３／配列番号２４(ここで４２Ｆ１と呼ぶ)、配列番号２５／配列番号２６(ここで４２Ｇ７と呼ぶ)、配列番号２７／配列番号��８(ここで４３Ｇ１２と呼ぶ)、配列番号２９／配列番号３０(ここで４３Ｆ１２と呼ぶ)、配列番号３１／配列番号３２(ここで４５Ｈ８と呼ぶ)、配列番号３３／配列番号３４(ここで４４Ａ４と呼ぶ)、配列番号３５／配列番号３６(ここで４５Ｄ７と呼ぶ)、配列番号３７／配列番号３８(ここで５４Ａ９と呼ぶ)、配列番号３９／配列番号４０(ここで５４Ｃ１と呼ぶ)、配列番号４１／配列番号４２(ここで４２５５Ｅ４０と呼ぶ)、配列番号４３／配列番号４４(ここで５５Ｆ５と呼ぶ)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００４５】
本発明は、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体フラグメントを提供し、ここで、これは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト抗体Ｆａｂフラグメントは重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００４６】
本発明は、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域ならびに重鎖と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体を提供し、ここで、これは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト一本鎖抗体は重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該一本鎖完全ヒト抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００４７】
本発明は、さらに抗ＣＣＲ２ポリペプチドの有効量を投与することを含む広範な哺乳動物の癌または炎症性疾患または自己免疫性疾患の処置方法を提供し、ここで、該抗ＣＣＲ２ポリペプチドは少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＣＲ２エピトープと結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有するＦａｂ完全ヒト抗体フラグメント、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域ならびに重鎖と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体およびこれらの組み合わせからなる群から選択され；
ここで、該完全ヒト抗体およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し；
ここで、該Ｆａｂ完全ヒト抗体フラグメントは配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％である軽鎖可変ドメイン配列を有し；そして
ここで、該一本鎖ヒト抗体は配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％である軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００４８】
好ましくは、本完全ヒト抗体は重鎖および軽鎖の両者を有し、ここで、該抗体は配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト抗体Ｆａｂフラグメントは重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該抗体は配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、本完全ヒト一本鎖抗体は重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両者を有し、ここで、該一本鎖完全ヒト抗体は配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００４９】
好ましくは、哺乳動物の処置される広範な癌は、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨髄腫、神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病、Ｔ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、肥満細胞由来腫瘍およびこれらの組み合わせから選択される。好ましくは、自己免疫性疾患または炎症性疾患は腸粘膜炎症、大腸炎と関係する消耗性疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ウイルス感染症、リウマチ性関節炎、骨関節症、乾癬、クローン病および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【００５０】
“抗原結合タンパク質”は、抗原に結合する部分と、所望により、抗原結合部分が抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する配座を取ることを可能にするスキャフォールドまたはフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗原結合タンパク質の例は、抗体、抗体フラグメント(例えば、抗体の抗原結合部分)、抗体誘導体および抗体アナログを含む。抗原結合タンパク質は、例えば、別のタンパク質スキャフォールドまたは結合させたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する人工的スキャフォールドを含み得る。このようなスキャフォールドは、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された変異を含む抗体由来スキャフォールドならびに例えば、生体適合性ポリマーを含む完全合成スキャフォールドを含むが、これらに限定されない。例えば、Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654参照。さらに、ペプチド抗体模倣物(“ＰＡＭ”)ならびにスキャフォールドとしてフィブロネクチン成分を利用する抗体模倣物に基づくスキャフォールドを使用できる。
【００５１】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有し得る。“免疫グロブリン”は四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一対からなり、各対は１個の“軽”鎖(約２５kDa)および１個の“重”鎖(約５０〜７０kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖はカッパまたはラムダ軽鎖に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は約１２個またはそれ以上のアミノ酸の“Ｊ”領域により連結され、重鎖または約１０個またはそれ以上のアミノ酸の“Ｄ”領域も含む。一般に、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))参照(全ての目的のためにその全体を引用により本明細書に包含させる)。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、完全免疫グロブリンが２個の結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【００５２】
天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３個の超可変領域で連結された比較的保存されたフレームワーク領域(ＦＲ)の同じ一般構造を示す。Ｎ末端からＣ末端方向で、軽鎖および重鎖の両者は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991の定義に従う。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸の他のナンバリングシステムは、IMGT.RTM.(international ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005)およびAHo(Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001)を含む。
【００５３】
抗体は、多様な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含む血清または血漿のような源から得ることができる。このような抗体を親和性精製すれば、特定の抗原特異性について富化できる。このような抗体の富化調製物は、通常特定の抗原に対する特異的結合活性を有する抗体が約１０％未満である。これらの調製物を数回親和性精製して、抗原に対する特異的結合活性を有する抗体の比率を増加できる。この方法で製造した抗体はしばしば“単一特異性”と呼ばれる。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する抗体が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または９９.９％に高められ得る。
【００５４】
“抗体”は、特に断らない限り、無傷免疫グロブリンまたは特異的結合について無傷抗体に対抗するその抗原結合部分をいう。抗原結合部分は組み換えＤＮＡ技術または無傷抗体の酵素開裂もしくは化学開裂により製造し得る。抗原結合部分は、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ドメイン抗体(ｄＡｂｓ)および相補性決定領域(ＣＤＲ)フラグメント、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、キメラ抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体およびポリペプチドが特異的抗原結合できるのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
【００５５】
ＦａｂフラグメントはＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであり、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントはヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２個のＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであり、ＦｄフラグメントはＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し、Ｆｖフラグメントは抗体の一つのアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインを有し、そしてｄＡｂフラグメントはＶＨドメイン、ＶＬドメインまたはＶＨドメインもしくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する(米国特許６,８４６,６３４；６,６９６,２４５、米国出願公開２０／０２０２５１２；２００４／０２０２９９５；２００４／００３８２９１；２００４／０００９５０７；２００３／００３９９５８およびWard et al., Nature 341:544-546, 1989)。
【００５６】
一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)は、ＶＬ領域およびＶＨ領域がリンカー(例えば、アミノ酸残基の合成配列)で連結されて連続タンパク質鎖を形成する抗体であり、ここで、該リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体折り返され、一価抗原結合部位を形成するのに十分な長さである(例えば、Bird et al., 1988, Science 242:423-26およびHuston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83参照)。二特異性抗体は、２個のポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ここで、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２個のドメインの間で対形成させるには短すぎ、それゆえに、各ドメインが他のポリペプチド鎖上の相補性ドメインと対形成することが可能になる、リンカーにより連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む(例えば、Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48およびPoljak et al., 1994, Structure 2:1121-23参照)。二特異性抗体の２個のポリペプチド鎖が同一ならば、対形成により得られた二特異性抗体は２個の同一抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２個の異なる抗原結合部位を有する二特異性抗体を製造できる。同様に、三特異性抗体および四特異性抗体は、それぞれ３個および４個のポリペプチド鎖を有し、それぞれ同一でも異なってもよい３個および４個の抗原結合部位を形成する抗体である。
【００５７】
ある抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)およびフレームワーク領域(ＦＲ)は、Kabat et al. supra；Lefranc et al., supraおよび／またはHonegger and Pluckthun, supraのシステムを使用して同定できる。１個以上のＣＤＲを、共有結合的または非共有結合的に分子に取り込み、それを抗原結合タンパク質とすることができる。抗原結合タンパク質は、大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ(複数も可)を取り込んでよく、ＣＤＲ(複数も可)を他のポリペプチド鎖と共有結合的に結合させてよくまたはＣＤＲ(複数も可)を非共有結合的に取り込んでよい。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的の特定の抗原と特異的に結合することを可能とする。
【００５８】
抗原結合タンパク質は１個以上の結合部位を有し得る。１個を超える結合部位があるとき、結合部位は互いに同一でも異なってもよい。例えば、天然に存在するヒト免疫グロブリンは、典型的に２個の同一結合部位を有するが、“二特異性”または“二機能性”抗体は２個の異なる結合部位を有する。
【００５９】
用語“ヒト抗体”は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１個以上の可変領域および定常領域を有する全ての抗体を含む。一つの態様において、可変ドメインおよび定常ドメインの全てがヒト免疫グロブリン配列由来である(完全ヒト抗体)。これらの抗体は多様な方法で製造でき、その例を下に記載し、ヒト重鎖および／または軽鎖コード化遺伝子由来の抗体を発現するように遺伝子組換えしたマウスの目的抗原による免疫化を含む。
【００６０】
ヒト化抗体は、非ヒト種抗体と比較して、ヒト対象に投与したとき、ヒト化抗体が免疫応答を誘発する可能性が低いおよび／または誘発する免疫応答の重篤度が低いように、１個以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加により非ヒト種由来の抗体の配列と異なる配列を有する。一つの態様において、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメインにおけるあるアミノ酸を変異させて、ヒト化抗体を製造する。他の態様において、ヒト抗体由来の定常ドメインを、非ヒト種の可変ドメインと融合させる。他の態様において、非ヒト抗体の１個以上のＣＤＲ配列における１個以上のアミノ酸残基を、ヒト対象に投与したとき非ヒト抗体の免疫原性の可能性を減らすように変更し、ここで、該変更したアミノ酸残基は抗体の抗原への免疫特異的結合に重要ではないか、行ったアミノ酸配列変更は、ヒト化抗体の抗原への結合が、非ヒト抗体の抗原への結合より顕著に悪化しないような保存的変更である。ヒト化抗体をどのようにつくるかの例は、米国特許６,０５４,２９７、５,８８６,１５２および５,８７７,２９３に見ることができる。
【００６１】
用語“キメラ抗体”は、ある抗体由来の１個以上の領域と１種以上の他の抗体由来の１個以上の領域を含む抗体をいう。一つの態様において、ＣＤＲの１個以上はヒト抗ＣＣＲ２抗体由来である。他の態様において、ＣＤＲの全てはヒト抗ＣＣＲ２抗体由来である。他の態様において、１個を超えるヒト抗ＣＣＲ２抗体由来のＣＤＲを混合し、キメラ抗体に適合させる。例えば、キメラ抗体は第一ヒト抗ＰＡＲ−２抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第二ヒト抗ＣＣＲ２抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３および第三抗ＣＣＲ２抗体の重鎖由来のＣＤＲを含み得る。他の組み合わせが可能である。
【００６２】
さらに、フレームワーク領域は、同じ抗ＣＣＲ２抗体の１個、１個以上の異なる抗体、例えばヒト抗体またはヒト化抗体由来であり得る。キメラ抗体の一例として、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種由来のまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体と同一であるか、それと相同であるかまたはそれに由来し、一方鎖の残りは他の種由来のまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体と同一であるか、それと相同であるかまたはそれに由来する。また包含されるのは、所望の生物活性(すなわち、ＣＣＲ２と特異的に結合する能力)を示すような抗体のフラグメントである。
【００６３】
“中和抗体”または“阻害抗体”は、過剰の抗ＣＣＲ２抗体が活性化の程度を、本明細書の実施例に記載するもののようなアッセイを使用して少なくとも約２０％減少させるときの、ＣＣＲ２のタンパク分解性活性化を阻害する抗体である。種々の態様において、抗原結合タンパク質は、ＣＣＲ２のタンパク分解性活性化の程度を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％および９９.９％減少させる。
【００６４】
抗体のフラグメントまたはアナログは、本明細書の教示に従い、当分野で知られる技術を使用して、当業者が容易に製造できる。フラグメントまたはアナログの好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近辺に生じる。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データと公共のまたは私有の配列データの比較により決定できる。コンピューター化された比較方法を使用して、既知構造および／または機能の他のタンパク質で生じる配列モチーフまたは予測タンパク質配座ドメインを同定できる。既知三次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法が知られている。Bowie et al., 1991, Science 253:164参照。
【００６５】
“ＣＤＲ接合抗体”は、特定の種またはアイソタイプの抗体由来の１個以上のＣＤＲと同一または異なる種またはアイソタイプの他の抗体のフレームワークを含む抗体である。
【００６６】
“多特異性抗体”は、１個以上の抗原上で１個を超えるエピトープを認識する抗体である。このタイプの抗体の下位群は、同一または異なる抗原上の２個の異なるエピトープを認識する“二特異性抗体”である。
【００６７】
抗原結合タンパク質は、抗原(例えば、ヒトＣＣＲ２)に解離定数１ナノモル濃度以下で結合するならば、該抗原と“特異的に結合”する。
【００６８】
“抗原結合ドメイン”、“抗原結合領域”または“抗原結合部位”は、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質の抗原に対する特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基(または他の部分)を含む抗原結合タンパク質の一部である。抗原と特異的に結合する抗体について、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１個の少なくとも一部を含む。
【００６９】
“エピトープ”は、抗原結合タンパク質(例えば、抗体)により結合される分子の一部である。エピトープは、分子の非近接部分を含み得る(例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列では近接していないが、ポリペプチドの三次または四次構造の状況において、抗原結合タンパク質により結合されるのに十分互いに近いアミノ酸残基)。
【００７０】
２個のポリヌクレオチドまたは２個のポリペプチド配列の“同一性パーセント”は、ＧＡＰコンピュータプログラム(GCG Wisconsin Package, version 10.3 (Accelrys, San Diego, Calif.)の一部)を使用して、そのデフォルトパラメータを使用して配列を比較することにより決定する。
【００７１】
用語“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”および“核酸”は全体に交換可能に使用し、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチドアナログを使用して産生されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ(例えば、ペプチド核酸および非天然に存在するヌクレオチドアナログ)およびそのハイブリッドを含む。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよい。一つの態様において、本発明の核酸分子は、抗体またはそのフラグメント、誘導体、変異タンパク質または変異体をコードする近接オープンリーディングフレームを含む。
【００７２】
２個の一本鎖ポリヌクレオチドは、一方ポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチドにおけるその相補性ヌクレオチドと逆であり、ギャップの挿入がなく、かついずれかの配列の５’または３’末端に不対ヌクレオチドがないように、逆平行配向でそれらの配列を整列できるならば、互いに“相補体”である。２個のポリヌクレオチドが中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズできるならば、一方のポリヌクレオチドは、他方のポリヌクレオチドに“相補性”である。それゆえに、一方のポリヌクレオチドは、その相補体でなく、他方のポリヌクレオチドに相補性であり得る。
【００７３】
“ベクター”は、それに結合した他の核酸を細胞に挿入するために使用できる核酸である。あるタイプのベクターは、付加的核酸セグメントをライゲートできる直線状または環状二本鎖ＤＮＡ分子をいう、“プラスミド”である。他のタイプのベクターは、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに挿入できる、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)である。ある種のベクターは、それらが導入されている宿主細胞内で自律増殖可能である(例えば、細菌複製開始点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムと共に複製する。“発現ベクター”は、選択したポリヌクレオチドの発現を指示できるタイプのベクターである。
【００７４】
ヌクレオチド配列は、制御配列がヌクレオチド配列の発現(例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置)に影響を及ぼすならば、制御配列に“操作可能に結合”している。“制御配列”は、それが操作可能に結合している核酸の発現(例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置)に影響を及ぼす核酸である。制御配列は、例えば、その作用を、直接または１個以上の他の分子(例えば、制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド)の作用を介して制御される核酸に発揮する。制御配列の例は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御配列(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含む。制御配列のさらなる例は、例えば、Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06に記載されている。
【００７５】
“宿主細胞”は、核酸、例えば、本発明の核酸の発現に使用できる細胞である。宿主細胞は原核生物、例えば、大腸菌であってよく、または真核生物、例えば、単細胞真核生物(例えば、酵母または他の真菌)、植物細胞(例えば、タバコまたはトマトの植物細胞)、動物細胞(例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞)またはハイブリドーマであってよい。宿主細胞の例は、サル腎細胞のＣＯＳ−７系統(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., 1981, Cell 23:175参照)、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞(ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞またはVeggie CHOのようなその派生物および無血清培地で増殖する関連細胞株(Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31参照)またはＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１(Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20参照)、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ(ATCC CRL 10)細胞株、アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株(ATCC CCL 70)(McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821参照)、２９３,２９３  ＥＢＮＡまたはＭＳＲ  ２９３のようなヒト胚性腎細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常２倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物に由来する細胞株、初代移植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット細胞を含む。典型的に、宿主細胞は、ポリペプチドコード化核酸で形質転換または遺伝子導入できる培養細胞であり、これをその後宿主細胞で発現できる。用語“組み換え宿主細胞”は、発現すべき核酸で形質転換または遺伝子導入されている宿主細胞を意味するように使用し得る。宿主細胞はまた該核酸を含むが、制御配列が該核酸と操作可能に結合されるように宿主細胞に導入されない限り、望むレベルでそれを発現しない核酸でもあり得る。用語宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫もいうと解釈すべきである。後代に、例えば、変異または環境の影響によりある種の修飾が起こり得るために、このような子孫は実際に親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなおここで使用する本用語の範囲内に含まれる。
【００７６】
好ましくは、処置する哺乳動物の癌は、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽腫、あらゆる小児癌、腎癌、白血病、腎臓の移行上皮癌、ヴェルナー・モリソン症候群、先端巨大症、膀胱癌、ウィルムス癌、卵巣癌、膵癌、良性前立腺肥大、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頚癌、滑膜肉腫、転移性カルチノイドと関連する下痢、血管作用性小腸ペプチド分泌性腫瘍、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄および不適切な微小血管増殖、頭頸部癌、扁平上皮細胞癌、多発性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、血液系腫瘍、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、肥満細胞白血病、肥満細胞新生物、濾胞性リンパ腫、汎発性大細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、慢性骨髄増殖性障害、中枢神経系腫瘍、脳の癌、神経膠芽腫、神経膠芽腫ではない脳の癌、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭シュワン腫、神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫および脈絡叢乳頭腫、骨髄増殖性障害、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症、軟組織肉腫、甲状腺癌、子宮内膜癌、カルチノイド癌、胚細胞腫瘍、肝癌、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、先端巨大症、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄または不適切な微小血管増殖、グレーブス病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫甲状腺炎およびベーチェット病からなる群から選択される。
【００７７】
ここで使用する“ＣＣＲ２介在障害”は、ＣＣＲ２を発現する細胞の移動、例えば、一つの部位から他の部位への動員、一つの部位から他の部位への浸潤、増殖、分化および／または機能が関与する障害をいう。ＣＣＲ２を発現する細胞は、例えば、単球、樹状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、リンパ球、好塩基球、肥満細胞、内皮細胞および線維芽細胞を含む。ＣＣＲ２介在障害の例は、ｉ)炎症性または免疫障害；ii)心血管障害；iii)増殖性障害；iv)移植片拒絶反応；ｖ)線維性疾患；vi)ウイルス感染症；vii)神経障害；およびviii)代謝障害を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
炎症性障害および状態は慢性または急性であり得る。炎症性または免疫障害の例は、喘息、鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、間質性肺疾患(ＩＬＤ)(例えば、特発性肺線維症またはリウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎もしくは皮膚筋炎と関連するＩＬＤ)のような呼吸器疾患；クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患；脊椎関節症；強皮症；乾癬および皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹のような炎症性皮膚疾患；脈管炎(例えば、壊死性、皮膚性および過敏性脈管炎)；および炎症性糸球体症を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
炎症性または免疫障害の他の例は、関節炎(例えば、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎)；多発性硬化症；全身性エリテマトーデス；重症筋無力症；若年発症型糖尿病；糸球体腎炎のような腎炎；自己免疫性甲状腺炎；後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)およびベーチェット病のような自己免疫性障害を含む。
【００８０】
炎症性または免疫障害のさらに別の例は、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患および過敏性肺炎のような呼吸器アレルギー性疾患；アナフィラキシーまたは過敏反応；薬物アレルギー(例えば、ペニシリン、セファロスポリン類に対する)；昆虫咬傷アレルギー；アレルギー性接触性皮膚炎；脈管炎(例えば、過敏性脈管炎)；およびヒスタミンおよびＩｇＥ介在アレルギー性反応のようなアレルギー性疾患および状態を含む。
【００８１】
心血管障害は、アテローム発生；アテローム性動脈硬化症；冠動脈疾患；心筋梗塞；卒中；急性冠血管症候群；血栓症；アテローム硬化が起源の末梢血管疾患；高血圧；および異脂肪血症を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
増殖性障害は、癌または腫瘍を含むが、これらに限定されない。“癌”または“腫瘍”は、初発性腫瘍およびあらゆる転移を含む、患者における何らかの新生物増殖を含むことを意図する。癌は、皮膚または臓器の白血球浸潤を伴う癌であり得る。癌は液性または固形腫瘍であり得る。液体腫瘍は、例えば、骨髄腫(多発性骨髄腫)、白血病(例えば、ワルデンストレーム症候群、慢性リンパ性白血病、他の白血病)およびリンパ腫(例えば、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫)を含む、血液起源の腫瘍を含む。固形腫瘍は臓器において生じ得るものであり、肺、乳房、前立腺、卵巣、結腸、腎臓および肝臓のような癌を含む。ここで使用する腫瘍細胞を含む癌細胞は、異常な(増加した)速度で分裂する細胞をいう。癌細胞は、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、未分化癌、気管支原性癌、黒色腫、腎細胞癌、肝細胞腫−肝細胞癌、胆管癌、胆道癌、乳頭癌、移行細胞癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、乳癌、消化器癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌および頭頚部の扁平上皮細胞癌のような癌腫；線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫および中皮肉腫のような肉腫；骨髄腫、白血病(例えば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ性白血病)およびリンパ腫(例えば、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、細網肉腫またはホジキン病)のような血液の癌；および神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、シュワン腫または上衣腫を含む神経系の腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
移植片拒絶反応(例えば、移植における)は、同種移植片拒絶反応または移植片対宿主病を含むが、これらに限定されないを含むが、これらに限定されない。
線維性疾患は、強皮症を含むが、これに限定されない。
【００８４】
神経障害は、ＡＩＤＳと関係する認知症および疼痛(例えば神経障害性疼痛)を含むが、これらに限定されない。
代謝障害は、糖尿病を含むが、これに限定されない。
【００８５】
望ましくない炎症性応答が阻止されるべき他の疾患または状態(ＣＣＲ２介在疾患または状態を含む)は、再灌流傷害；ある種の血液系腫瘍；サイトカイン誘発毒性(例えば、敗血症性ショック、内毒素ショック)；多発性筋炎；皮膚筋炎；およびサルコイドーシスを含む肉芽腫性疾患を含むが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明のポリペプチドは、当分野で知られる標準的方法のいずれかを使用して製造できる。一例として、ポリペプチドを、該ポリペプチドをコードする核酸配列(例えば、ｃＤＮＡ)を組み換え発現ベクターに挿入し、該ＤＮＡ配列を発現を促進する条件下で発現させることによる、組み換えＤＮＡ方法で製造する。
【００８７】
ここに開示する種々のポリペプチドのいずれかをコードする核酸は化学合成し得る。コドン使用頻度を、細胞における発現を改善するように選択し得る。このようなコドン使用頻度は選択する細胞型による。特殊化したコドン使用頻度パターンが大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞について開発されている。例えばMayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 100(2):438-42; Sinclair et al. Protein Expr. Purif. 2002 (1):96-105; Connell N D. Curr. Opin. Biotechnol. 2001 12(5):446-9; Makrides et al. Microbiol. Rev. 1996 60(3):512-38; およびSharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78参照。
【００８８】
核酸操作の一般的技術は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989, またはF. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)および定期的改訂版に記載され、引用により本明細書に包含させる。該ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳制御要素に操作可能に結合させる。このような制御要素は、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の停止を制御する配列を含む。宿主で複製する能力は、通常複製開始点により付与され、形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子がさらに取り込まれる。
【００８９】
組み換えＤＮＡはまた、タンパク質の精製に有用であり得るあらゆるタイプのタンパク質タグ配列も含み得る。タンパク質タグの例は、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグを含むが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主で使用するための適当なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, N.Y., 1985)に見ることができる。
【００９０】
発現構築物を、宿主細胞に適する方法を使用して宿主細胞に挿入する。宿主細胞に核酸を導入するための多くの方法が当分野で知られ、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いる遺伝子導入；微粒子銃；リポフェクション；および感染(ベクターが感染病原体であるとき)を含むが、これらに限定されない。適切な宿主細胞は原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞を含む。
【００９１】
適切な細菌はグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌またはバチルス属を含む。好ましくはサッカロミセス・セレビシエのようなサッカロミセス属種由来の酵母もポリペプチドの産生に使用し得る。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系も組み換えタンパク質の発現に使用できる。昆虫細胞で異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系はLuckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)によりレビューされている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)、ヒト胚性腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株を含む。精製ポリペプチドを、組み換えタンパク質を発現させるための適切な宿主／ベクター系の培養により製造する。多くの応用のために、ここに開示するポリペプチドの多くのものの少量を、好ましい発現方法として、大腸菌で発現する。その後、タンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製する。
【００９２】
ここに開示するタンパク質を細胞翻訳系を使用しても製造できる。このような目的のために、該ポリペプチドをコードする核酸を、ｍＲＮＡを産生するためのインビトロ転写を可能にするために、そして使用する特定の無細胞系におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように修飾しなければならない(例えば、無哺乳動物細胞または無酵母細胞のような無真核細胞系翻訳あるいは無細菌細胞のような無原核細胞系翻訳)。
【００９３】
ＣＣＲ２結合ポリペプチドは化学合成によっても製造できる(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Illに記載の方法による)。タンパク質の修飾も化学合成により実施できる。
【００９４】
本発明のポリペプチドを、タンパク質化学の分野で一般に知られるタンパク質の単離／精製方法により精製できる。非限定的例は抽出、再結晶、塩析(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム)、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組み合わせを含む。精製後、ポリペプチド緩衝液交換および／または濾過および透析を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多くの方法のいずれかにより、濃縮してよい。
【００９５】
精製ポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋および最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは医薬品として使用するのに十分純粋である。
【００９６】
ポリペプチドの翻訳後修飾
ある態様において、本発明の結合ポリペプチドは、さらに翻訳後修飾を含み得る。タンパク質の翻訳後修飾の例は、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、SUMO化、ビオチニル化またはポリペプチド側鎖または疎水性基の付加を含む。結果として、修飾可溶性ポリペプチドは、脂質、多糖類または単糖類およびホスフェートのような非アミノ酸要素を含み得る。グリコシル化の好ましい形態はシアリル化であり、これは１個以上のシアル酸部分をポリペプチドに結合させる。シアル酸部分は溶解度および血清半減期を改善し、同時にまたタンパク質の免疫原性の可能性も減少させる。Raju et al. Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76参照。ポリペプチドの機能性に対するこのような非アミノ酸要素の影響を、ＣＣＲ２機能における拮抗性の役割について試験し得る。
【００９７】
一つの具体的態様において、対象可溶性ポリペプチドの修飾は、対象可溶性ポリペプチドの非タンパク質性ポリマーへの結合を含む。一つの具体的態様において、ポリマーは、米国特許４,６４０,８３５；４,４９６,６８９；４,３０１,１４４；４,６７０,４１７；４,７９１,１９２または４,１７９,３３７に示す方法での、ポリエチレングリコール(“ＰＥＧ”)、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである。修飾ポリペプチドの例は、ペグ化ＶＫ−Ｂ８を含む。
【００９８】
ＰＥＧは、市販されており、また当分野で周知の方法に従いエチレングリコールの開環重合により製造できる水可溶性ポリマーである(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161)。用語“ＰＥＧ”は、サイズおよびＰＥＧ末端への修飾にかかわらず、あらゆるポリエチレングリコール分子を含み、式：Ｘ−Ｏ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ    (１)〔式中、ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えば、Ｃ１−４アルキルである〕により表され得る。一つの態様において、本発明のＰＥＧは、一端がヒドロキシまたはメトキシで終わり、すなわち、ＸがＨまたはＣＨ３である(“メトキシＰＥＧ”)。ＰＥＧは、結合反応に必要なさらなる化学基を含んでよく、これは本分子の化学合成に由来するか、該分子の部分の最適距離のためのスペーサーである。さらに、このようなＰＥＧは、互いに結合した１個以上のＰＥＧ側鎖からなり得る。１個を超えるＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多腕または分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールを含む種々のポリオール類へのポリエチレンオキシドの結合により製造できる。例えば、四腕分岐ＰＥＧは、ペンタエリスリトールおよびエチレンオキシドから製造できる。分岐ＰＥＧは、例えば、ＥＰ−Ａ０４７３０８４および米国特許５,９３２,４６２により製造できる。ＰＥＧの１形態は、リシンの１級アミノ基を介して結合した２個のＰＥＧ側鎖(ＰＥＧ２)を含む(Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。
【００９９】
ＰＥＧは良く知られているが、我々の知る限り、これは、ペグ化１０Ｆｎ３ポリペプチドがペグ化でき、リガンド結合活性を維持することを示した最初である。好ましい態様において、ペグ化１０Ｆｎ３ポリペプチドは、部位特異的ペグ化、特にＰＥＧのシステイン部分のＮ末端またはＣ末端への結合により製造される。従って、本発明は、薬物動態特性が改善した標的結合１０Ｆｎ３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、約８０〜約１５０アミノ酸を有する１０Ｆｎ３ドメイン(ここで、該１０Ｆｎ３ドメインのループの少なくとも１個は標的結合に参加している)および共有結合により結合したＰＥＧ部分(ここで、該１０Ｆｎ３ポリペプチドは、１００nM未満のＫＤで標的と結合し、哺乳動物で３０mL／時間／kg未満のクリアランス速度を有する)を含む。ＰＥＧ部分は、Ｃｙｓ残基が０Ｆｎ３ポリペプチドのＮ末端もしくはＮ末端と最もＮ末端のベータまたはベータ様鎖の間または１０Ｆｎ３ポリペプチドのＣ末端もしくはＣ末端と最もＣ末端のベータまたはベータ様鎖の間に位置するとき、Ｃｙｓ残基への結合のような、部位定方向ペグ化により１０Ｆｎ３ポリペプチドに結合し得る。Ｃｙｓ残基は、同様に他の位置、特に標的結合に参加しないループのいずれかに位置してよい。ＰＥＧ部分はまた、アミンへの結合を含む、他の化学により結合してよい。
【０１００】
ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧの結合は、一般にＰＥＧの活性化および活性化ＰＥＧ中間体の直接標的タンパク質／ペプチドへの結合またはリンカーへの結合を含み、当該リンカーは続いて活性化され、標的タンパク質／ペプチドに結合される(Abuchowski et al., J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977) and J. Biol. Chem., 252, 3582 (1977), Zalipsky, et al., and Harris et. al., in: Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications; (J. M. Harris ed.) Plenum Press: New York, 1992; Chap.21 and 22参照)。ＰＥＧ分子を含む結合ポリペプチドは複合タンパク質としても知られ、一方ＰＥＧ分子が結合していないタンパク質は非複合型ということができる。
【０１０１】
ＣＣＲ２結合ポリペプチドへの結合のために、幅広い分子量のＰＥＧ、例えば、約１,０００ダルトン(Da)〜１００,０００Da(ｎは２０〜２３００)を選択できる。ＰＥＧ中の反復単位“ｎ”の数は、ダルトンで表す分子量に対して近似する。活性化リンカー上のＰＥＧの複合分子量が医薬使用に適していることが好ましい。それゆえに、一つの態様において、ＰＥＧ分子の分子量は１００,０００Daを超えない。例えば、３ＰＥＧ分子がリンカーに結合しているとき、各ＰＥＧ分子が１２,０００Daの同一分子量(各ｎは約２７０)を有するならば、リンカー上のＰＥＧの総分子量は約３６,０００Da(総ｎは約８２０)である。リンカーに結合したＰＥＧの分子量はまた異なってもよく、例えば、リンカー上の３分子のうち、２個のＰＥＧ分子がそれぞれ５,０００Da(各ｎは約１１０)であり、１個のＰＥＧ分子が１２,０００Da(ｎは約２７０)であってもよい。
【０１０２】
本明細書の具体的態様において、ＣＣＲ２結合ポリペプチドは式−ＣＯ−(ＣＨ２)ｘ−(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｍ−ＯＲの１個のポリ(エチレングリコール)基に共有結合により結合し、式中、ポリ(エチレングリコール)基の−ＣＯ(すなわちカルボニル)は、結合ポリペプチドのアミノ基の１個とアミド結合を形成し、Ｒは低級アルキルであり、ｘは２または３であり、ｍは約４５０〜約９５０であり、ｎおよびｍは、複合体から結合ポリペプチドを減算した分子量が約１０〜４０kDaであるように選択する。一つの態様において、結合ポリペプチドのリシンの６−アミノ基は利用可能(遊離)アミノ基である。
【０１０３】
上記複合体は、式(II)Ｐ−ＮＨＣＯ−(ＣＨ２)ｘ−(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｍ−ＯＲ    (II)によりさらに具体的に表され、式中、Ｐはここに記載する結合ペプチドの基であり(すなわち式(II)に示すカルボニルとアミド結合を形成する１個または複数個のアミノ基がなくなっており)、Ｒは低級アルキルであり、ｘは２または３であり、ｍは約４５０〜約９５０であり、複合体から結合ポリペプチドを減算した分子量が約１０〜約４０kDaとなるように選択する。ここで使用する“ｍ”の範囲は参考のために示す。“ｍ”の範囲は、常にＰＥＧ基の分子量により特定される。
【０１０４】
当業者は、例えば、ペグ化結合ポリペプチドをどのように治療的に使用するか、所要の投与量、血中維持時間、代謝抵抗性、免疫原性およびその他の考慮事項に基づき、ＰＥＧの適切な分子量を選択できる。タンパク質の特性を増強するためのＰＥＧおよびその使用についての考察は、Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10:91-114 (1993)を参照のこと。
【０１０５】
一つの態様において、ＰＥＧ分子を活性化して、リシンのような結合ポリペプチド上のアミノ基と反応させ得る(Bencham et al., Anal. Biochem., 131, 25 (1983); Veronese et al., Appl. Biochem., 11, 141 (1985).; Zalipsky et al., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 ACS Symposium Series 469 (1999); Zalipsky et al., Europ. Polym. J., 19, 1177-1183 (1983); Delgado et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128 (1990))。
【０１０６】
一つの具体的態様において、ＰＥＧの炭酸エステル類を使用してＰＥＧ結合ポリペプチド複合体が形成される。Ｎ,Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート(ＤＳＣ)をＰＥＧとの反応に使用して、活性混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートを形成し、これをその後リンカーの求核性基または結合ポリペプチドのアミノ基と反応させ得る(米国特許５,２８１,６９８および５,９３２,４６２参照)。同様のタイプの反応において、１,１’−(ジベンゾトリアゾリル)カーボネートおよびジ−(２−ピリジル)カーボネートをＰＥＧと反応させて、それぞれＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カーボネートを形成し得る(米国特許５,３８２,６５７)。
【０１０７】
１０Ｆｎ３ポリペプチドのペグ化を、最先端の方法により、例えば結合ポリペプチドと求電子的に活性なＰＥＧの反応により実施できる(供給業者：Shearwater Corp., USA, www.shearwatercorp.com)。好ましい本発明のＰＥＧ試薬は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート類(ＰＥＧ−ＳＰＡ)、ブタノエート類(ＰＥＧ−ＳＢＡ)、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートまたは分枝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド類、例えばｍＰＥＧ２−ＮＨＳである(Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。このような方法を使用して、結合ポリペプチドリシンのｆ−アミノ基または結合ポリペプチドのＮ末端アミノ基をペグ化し得る。
【０１０８】
他の態様において、ＰＥＧ分子を結合ポリペプチド上のスルフヒドリル基と結合させ得る(Sartore et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991); Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996); Goodson et al., Bio/Technology (1990) 8, 343；米国特許５,７６６,８９７)。米国特許６,６１０,２８１および５,７６６,８９７はスルフヒドリル基と結合し得る、反応性ＰＥＧ種の例を記載する。
【０１０９】
ＰＥＧ分子が結合ポリペプチド上のシステイン残基と結合しているときのある態様において、システイン残基は結合ポリペプチドに元々あり、一方他の態様において、１個以上のシステイン残基は結合ポリペプチドに設計導入されている。変異を結合ポリペプチドコード化配列に導入し、システイン残基を作製し得る。これは、例えば、１個以上のアミノ酸残基のシステインへの変異により達成される。システイン残基に変異させるのに好ましいアミノ酸はセリン、スレオニン、アラニンおよび他の親水性残基を含む。好ましくは、システインに変異させる残基は、表面露出残基である。一次配列またはタンパク質に基づき残基の表面可触性(accessibility)を予測するアルゴリズムは当分野で周知である。あるいは、結合ポリペプチドの設計および展開に利用されるフレームワークの結晶構造が解決していると仮定して、表面残基は結合ポリペプチドのアミノ酸配列の比較により予測でき(Himanen et al., Nature. (2001) 20-27;414(6866):933-8参照)、それゆえに、表面露出残基が同定される。一つの態様において、システイン残基を、Ｎ末端および／またはＣ末端またはその付近またはループ領域で結合ポリペプチドに導入する。
【０１１０】
ある態様において、ペグ化結合ポリペプチドは、Ｎ末端アミノ酸のアルファアミノ基に共有結合により結合したＰＥＧ分子を有する。部位特異的Ｎ末端還元的アミノ化はPepinsky et al., (2001) JPET, 297, 1059および米国特許５,８２４,７８４に記載される。他の利用可能な求核性アミノ基を利用するタンパク質の還元的アミノ化のためのＰＥＧ−アルデヒドの使用は、米国特許４,００２,５３１、Wieder et al., (1979) J. Biol. Chem. 254,12579およびChamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133に記載されている。
【０１１１】
他の態様において、ペグ化結合ポリペプチドは、リンカーに共有結合により結合した１個以上のＰＥＧ分子を有し、該リンカーは、次に結合ポリペプチドのＮ末端でアミノ酸残基のアルファアミノ基に結合する。このような取り組みは、米国特許公開２００２／００４４９２１およびＷＯ０９４／０１４５１に開示されている。
【０１１２】
一つの態様において、結合ポリペプチドはＣ末端でペグ化されている。具体的態様において、タンパク質は、Ｃ末端アジド−メチオニンの導入と、続くシュタウディンガー反応を介するメチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物の結合によりＣ末端でペグ化される。このＣ末端結合法はCazalis et al., Bioconjug. Chem. 2004;15(5):1005-1009に記載されている。
【０１１３】
結合ポリペプチドのモノペグ化はまたＷＯ９４／０１４５１に記載された一般的方法に従いなし得る。ＷＯ９４／０１４５１は、修飾末端アミノ酸アルファ炭素反応基を有する組み換えポリペプチドの製造方法を記載する。本方法の工程は組み換えポリペプチドの形成およびＮ末端アルファ−アミンおよびＣ末端アルファ−カルボキシルの１個以上の生物学的に付加した保護基での保護を含む。次いで、ポリペプチドを化学保護剤で処理して、反応性側鎖基を選択的に保護し、それにより側鎖基を修飾から守る。次いで、ポリペプチドを生物学的保護基に特異的に作用する開裂剤で開裂して、非保護末端アミノ酸アルファ炭素反応基を形成する。非保護末端アミノ酸アルファ炭素反応基を、化学修飾剤で修飾する。次いで、側鎖保護末端修飾単鎖配列ポリペプチドを側鎖基において脱保護して、末端修飾組み換え単鎖配列ポリペプチドを形成する。本方法における工程の数および順番は、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸での選択的修飾を達成するために多様であり得る。
【０１１４】
結合反応における結合ポリペプチド対活性化ＰＥＧの比は約１：０.５〜１：５０、約１：１〜１：３０または約１：５〜１：１５であり得る。種々の水性緩衝液を本方法で使用して、結合ポリペプチドへのＰＥＧの共有結合的付加を触媒できる。一つの態様において、使用する緩衝液のｐＨは約７.０〜９.０である。他の態様において、ｐＨはわずかに塩基性範囲、例えば、約７.５〜８.５である。中性ｐＨ範囲に近いｐＫａを有する緩衝液、例えば、リン酸緩衝液を使用し得る。
【０１１５】
分子ふるい(例えばゲル濾過)およびイオン交換クロマトグラフィーのような当分野で知られる慣用の分離および精製技術を使用して、ペグ化結合ポリペプチドを精製できる。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離してもよい。分離され得る生成物は、単、二、三、多および非ペグ化結合ポリペプチド、ならびに遊離ＰＥＧを含み得る。モノ−ＰＥＧ複合体のパーセンテージを、組成物中のモノ−ＰＥＧのパーセンテージを上げるために溶出ピーク周辺の広いフラクションの貯留により制御できる。約９０％モノ−ＰＥＧ複合体が収率と活性の良好なバランスを表す。複合体の例えば、少なくとも９２％または少なくとも９６％がモノ−ＰＥＧ種である組成物がおそらく望ましい。本発明の態様において、モノ−ＰＥＧ複合体のパーセンテージは９０％〜９６％である。
【０１１６】
一つの態様において、ペグ化結合本発明のポリペプチドは、１個、２個またはそれ以上のＰＥＧ部分を含む。一つの態様において、ＰＥＧ部分は、タンパク質表面上のおよび／または標的リガンドと接触する表面から離れた、アミノ酸残基に結合する。一つの態様において、ＰＥＧ結合ポリペプチドにおけるＰＥＧの複合または総分子量は約３,０００Da〜６０,０００Da、所望により約１０,０００Da〜３６,０００Daである。一つの態様において、ペグ化結合ポリペプチドにおけるＰＥＧは実質的に直線状の直鎖ＰＥＧである。
【０１１７】
本発明の一つの態様において、ペグ化結合ポリペプチドにおけるＰＥＧは、ヒドロキシルアミンアッセイ、例えば、４５０mM  ヒドロキシルアミン(ｐＨ６.５)を使用して８〜１６時間、室温でペグ化アミノ酸残基から加水分解されず、それゆえに安定である。一つの態様において、組成物の８０％を超えるものが、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が安定なモノ−ＰＥＧ結合ポリペプチドである。
【０１１８】
他の態様において、ペグ化結合本発明のポリペプチドは、非修飾タンパク質に関する生物活性を好ましくは少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％維持する。一つの態様において、生物活性は、ＫＤ、ｋｏｎまたはｋｏｆｆで評価したそのＣＣＲ２への結合能をいう。一つの具体的態様において、ペグ化結合ポリペプチドタンパク質は、非ペグ化結合ポリペプチドと比較してＣＣＲ２への結合が増強されている。
【０１１９】
ＰＥＧ修飾ポリペプチドの血清クリアランス速度は、非修飾結合ポリペプチドのクリアランス速度の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％までも低下する。ＰＥＧ修飾ポリペプチドは、非修飾タンパク質の半減期(ｔ１／２)と比較して、延長された半減期を有する。ＰＥＧ結合ポリペプチドの半減期は、非修飾結合ポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％または１０００％までも延長される。ある態様において、タンパク質半減期は、インビトロで、例えば緩衝化食塩水溶液中または血清中で測定される。他の態様において、タンパク質半減期は、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減のようなインビボ半減期である。
【０１２０】
治療的製剤および投与方法
本発明は、ＣＣＲ２生物活性の阻害に応答する状態を処置するまたは前駆状態を予防する方法に関する。好ましい例は炎症または細胞過増殖により特徴付けられる状態である。投与のための手法および投与量は、具体的なポリペプチドのタイプおよび処置する具体的な状態により変わるが、当業者が容易に決定できる。一般に、監督当局は、治療に使用するタンパク質剤の発熱物質レベルが許容可能に低いことを要求する。従って、治療的製剤は、実質的に無発熱物質であるかまたは少なくとも適当な監督当局(例えば、ＦＤＡ)により決定される許容レベルを超える発熱物質を含まない点で一般に他の製剤と区別される。
【０１２１】
本発明の治療的組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体または添加物と共に、単位投与量形態で投与され得る。投与は、非限定的例として非経腸(例えば、静脈内、皮下)でも、経口でも局所的でもよい。さらに、ネイキッドＤＮＡ送達、組み換え遺伝子およびベクター、患者細胞のエクスビボ操作を含む細胞送達などのような、本発明のポリペプチドをコードする核酸を使用する遺伝子治療技法のいずれかを用いてよい。
【０１２２】
本組成物は、経口投与用丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤または徐放性錠剤；または静脈内、皮下または非経腸投与用液剤；局所投与用ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤またはポリマー剤または他の徐放性媒体の形であり得る。
【０１２３】
製剤を製造するための当分野で周知の方法を、例えば、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”(20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に見ることができる。非経腸投与用製剤は、例えば、添加物、無菌水、食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール類、植物起源の油類または水素化ナフタレン類を含み得る。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを、化合物の放出制御のために使用できる。ナノ粒子製剤(例えば、生分解性ナノ粒子、固形脂質ナノ粒子、リポソーム)を化合物の体内分布制御のために使用できる。他の有用な可能性のある非経腸送達系は、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入系およびリポソームを含む。製剤中の化合物の濃度は、投与すべき薬物の量および投与経路を含む多くの因子により変わる。
【０１２４】
ポリペプチドは、所望により、製薬業界で一般に使用される薬学的に許容される塩、例えば非毒性酸付加塩または金属錯体として投与してよい。酸付加塩の例は、有機酸、例えば酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸など；重合酸、例えばタンニン酸、カルボキシメチルセルロースなど；および無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などを含む。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。一例として、ポリペプチドを、熱安定性を高めるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤する。
【０１２５】
経口使用のための製剤は、非毒性の薬学的に許容される添加物と混合して活性成分を含む錠剤を含む。これらの添加物は、例えば、不活性希釈剤または充填剤(例えば、スクロースおよびソルビトール)、滑沢剤、流動促進剤および抗接着剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ類、水素化植物油類またはタルク)であり得る。
【０１２６】
経口使用のための製剤はまた、咀嚼錠剤または活性成分が不活性固形希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル剤もしくは活性成分が水または油媒体と混合されている軟ゼラチンカプセル剤としても提供し得る。
【０１２７】
治療有効投与量は、投与目的の治療効果を生じる投与量をいう。正確な投与量は処置する障害により、既知技術を使用して当業者により確認され得る。一般に、ポリペプチドは１日あたり約０.０１μg／kg〜約５０mg／kg、好ましくは１日あたり０.０１mg／kg〜約３０mg／kg日、最も好ましくは１日あたり０.１mg／kg〜約２０mg／kgで投与する。ポリペプチドは毎日(例えば、１日１回、２回、３回または４回)または好ましくは低頻度で(例えば、毎週、２週毎、３週毎、毎月または年四回)投与し得る。さらに、当分野で知られるとおり、年齢ならびに体重、一般的健康状態、性別、食習慣、投与の時期、薬物相互作用および疾患の重症度に対する調整が必要であることがあり、当業者が慣用の実験で確認できる。
【０１２８】
使用例
ここに記載するＣＣＲ２結合タンパク質およびその関係変異体は多くの治療的および診断的適用に有用である。これらは、ＣＣＲ２への結合と競合または遮断することによるＣＣＲ２の生物活性の阻害ならびに細胞、好ましくはＣＣＲ２を発現する細胞への細胞毒性部分または造影部分の送達を含む。これらの分子のサイズの小ささおよび安定な構造が、薬物の製造、急速なクリアランスが望まれるある種の適用について体内からの急速なクリアランスまたはこのような特徴を有する分子の使用に適するまたは改善される新規送達系に製剤に関して特に価値ある。
【０１２９】
ＣＣＲ２生物活性の阻害剤としてのその効果に基づき、本明細書のポリペプチドは、多くの癌状態ならびに胸水および腹水のような癌に起因する合併症に対して有効である。好ましくは、本明細書のＣＣＲ２結合ポリペプチドは、過増殖性疾患または癌および癌の転移性拡散の処置または予防に使用できる。開示する抗ＣＣＲ２抗体の好ましい適応症は、結腸直腸癌、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)および膵癌を含む。癌の非限定的例は、膀胱、血液、骨、脳、乳房、軟骨、結腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、泌尿生殖器管、輸尿管、尿道、子宮または膣の癌を含む。
【０１３０】
さらに、種々の炎症性障害を、ここに開示する抗ＣＣＲ２結合ポリペプチドで処置できる。このような炎症性障害は、例えば、腸粘膜炎症、大腸炎と関係する消耗性疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ウイルス感染症、リウマチ性関節炎、骨関節症、乾癬およびクローン病を含む。
【０１３１】
ＣＣＲ２結合ポリペプチドは単独でまたは１種以上の付加的治療剤、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的処置またはこれらの任意の組み合わせと組み合わせて投与できる。長期治療は、下記のとおり、他の処置戦略の状況におけるアジュバント治療である限り、同様に可能である。
【０１３２】
このような方法のある態様において、１種以上のポリペプチド治療剤を、共に(同時に)または異なる時間に(逐次的に)投与できる。さらに、ポリペプチド治療剤を、癌を処置するまたは血管形成を阻止するための他のタイプの化合物と投与できる。
【０１３３】
ある態様において、本発明の抗ＣＣＲ２抗体薬剤を単独で使用できる。あるいは、本発明の薬剤を、増殖性障害(例えば、腫瘍)の処置または予防に向けた他の慣用の抗癌治療的手法と組み合わせて使用し得る。例えば、このような方法を、予防的癌阻止、術後の癌再発および転移予防におよび他の慣用の癌治療のアジュバントとして使用できる。本発明では、慣用の癌治療(例えば、化学療法、放射線治療、光線療法、免疫療法および手術)の有効性が、本発明ポリペプチド治療剤の使用を介して増強されることが認められる。
【０１３４】
広範な慣用の化合物が抗新生物活性を有することが示されている。これらの化合物は、固形腫瘍の退縮、転移およびさらなる増殖の予防または白血病性または骨髄悪性腫瘍における悪性細胞の数の減少のために化学療法における薬剤として使用されている。化学療法は種々のタイプの悪性腫瘍の処置に有効であるが、多くの抗新生物化合物が望ましくない副作用を誘発する。２種以上の異なる処置剤を組み合わせたとき、これらの処置剤は相乗的に働き、各処置剤の量の減少と、それによる高投与量で各化合物により発現される有害副作用の減少を可能にし得ることが示されている。他の状況において、ある処置剤に難治性の悪性腫瘍は、２種以上の異なる処置剤の組み合わせ治療に応答し得る。
【０１３５】
本発明のポリペプチド治療剤を他の慣用の抗新生物剤と、同時にまたは逐次的に、組み合わせて投与したとき、このような治療剤は、抗新生物剤の治療効果を増強するまたはこのような抗新生物剤に対する細胞耐性を打ち負かすことがある。これは抗新生物剤の投与量の減少と、それにより望ましくない副作用の減少または耐性細胞における抗新生物剤の有効性の回復を可能にする。
【０１３６】
組み合わせ抗腫瘍治療に使用し得る医薬化合物は、単なる例示として、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン(ironotecan)、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含む。
【０１３７】
ある種の他の化学療法抗腫瘍化合物はその作用機序により、例えば、下記群に分類し得る：代謝拮抗剤／抗癌剤、例えばピリミジンアナログ(５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン)およびプリンアナログ、葉酸アンタゴニストおよび関連阻害剤(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン(クラドリビン))；天然生成物、例えばビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン)、微小管撹乱物質、例えばタキサン(パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン類およびナベルビンを含む抗増殖性／有糸分裂阻害剤、エピジポドフィロトキシン(エトポシド、テニポシド)、ＤＮＡ傷害剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン類、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホロアミドおよびエトポシド(ＶＰ１６))；抗生物質、例えばダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン類、ミトキサントロン、ブレオマイシン類、プリカマイシン(ミトラマイシン)およびマイトマイシン；酵素(Ｌ−アスパラギンを全身性に代謝し、自身のアスパラギンを合成する能力を有しない細胞を欠乏させるＬ−アスパラギナーゼ)；抗血小板剤；抗増殖性／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば窒素マスタード類(メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミン類およびメチルメラミン類(ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ)、アルキルスルホネート類−ブスルファン、ニトロソウレア類(カルムスチン(ＢＣＮＵ)およびアナログ、ストレプトゾシン)、トラゼン類−ダカルバジン(ＤＴＩＣ)；抗増殖性／抗有糸分裂代謝拮抗剤、例えば葉酸アナログ(メトトレキサート)；白金配位錯体(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)およびアロマターゼ阻害剤(レトロゾール、アナストロゾール)；抗凝血剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤)；血栓溶解剤(例えば組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤(ブレフェルジン)；免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス(ＦＫ−５０６)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル)；抗血管形成化合物(ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン)および増殖因子阻害剤(例えば、ＶＥＧＦ阻害剤、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)阻���剤)；アンギオテンシン受容体ブロッカー；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体(トラスツマブ)；細胞周期阻害剤および分化誘発剤(トレチノイン)；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤(ドキソルビシン(アドリアマイシン)、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、テニポシド(eniposide)、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コルチゾン、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンおよびプレドニゾロン)；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘発剤およびカスパーゼアクティベーター；およびクロマチン撹乱物質。
【０１３８】
組み合わせ治療の性質によって、他の治療剤を投与する間および／またはその後にポリペプチド治療剤の投与を継続してよい。ポリペプチド治療剤の投与は一回投与でも複数回投与でもよい。ある場合、ポリペプチド治療剤の投与を、慣用の治療の少なくとも数日前に開始し、他方で他の状況において、投与を慣用の治療剤の投与直前または同時に開始する。
【０１３９】
診断的適用の一例として、不適切な血管形成により特徴付けられる状態を有することが疑われる患者からの生物サンプル、例えば血清または生検組織を、検出可能に標識した本明細書のポリペプチドと接触させ、ＣＣＲ２のレベルを検出する。検出したＣＣＲ２のレベルを、次いで、同様に標識ポリペプチドと接触させた正常サンプルで検出されたＣＣＲ２のレベルと比較する。ＣＣＲ２のレベルの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％上昇は、診断的指標と見なし得る。
【０１４０】
ある態様において、ＣＣＲ２結合ポリペプチドを、さらに検出できる標識と結合させる(例えば、標識は放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共因子であり得る)。活性部分は、放射性医薬品、例えば、放射性重金属、例えば鉄キレート類、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート類、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子放出体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉまたは９９Ｔｃであり得る。このような部分に結合した結合剤を、造影剤として使用でき、哺乳動物、例えばヒトに診断的使用の有効量で投与し、次いで造影剤の局在化および蓄積を検出する。造影剤の局在化および蓄積は、放射シンチグラフィー、核磁気共鳴造影、コンピュータ断層撮影または陽電子放出断層撮影により検出できる。ＣＣＲ２を指向したＣＣＲ２結合ポリペプチドを使用する免疫シンチグラフィーを、癌および脈管構造の検出および／または診断に使用し得る。例えば、９９テクネチウム、１１１インジウムまたは１２５ヨウ素で標識したＣＣＲ２マーカーに対する何らかの結合ポリペプチドを、このような造影に有効に使用できる。当業者には明らかなとおり、投与する放射性同位体の量は放射性同位体による。当業者は、活性部分として使用するある放射性核種の特異的活性およびエネルギーに基づき、投与すべき造影剤の量を容易に製剤できる。典型的に造影剤１投与量あたり０.１〜１００ミリキュリー、好ましくは１〜１０ミリキュリー、最もしばしば２〜５ミリキュリーを投与する。それゆえに、放射性部分に結合したターゲティング部分を含む造影剤として有用な本発明の組成物は、０.１〜１００ミリキュリー、ある態様において好ましくは１〜１０ミリキュリー、ある態様において好ましくは２〜５ミリキュリー、ある態様においてより好ましくは１〜５ミリキュリーを含む。
【０１４１】
ＣＣＲ２結合ポリペプチドを、ＣＣＲ２を発現する細胞または組織に治療剤(薬物化合物、化学療法化合物および放射線療法化合物を含むが、これらに限定されない)を送達するためにも使用できる。一例として、ＣＣＲ２結合ポリペプチドを、ＣＣＲ２を発現する腫瘍細胞または組織に化学療法剤を標的送達ために化学療法剤と融合する。
【０１４２】
ＣＣＲ２結合ポリペプチドは、研究、診断および治療適用を含む、多様な適用に有用である。例えば、それらは、受容体またはその一部の単離および／または精製ならびに受容体構造(例えば、配座)および機能の試験に使用できる。
【０１４３】
ある面において、種々の結合ポリペプチドを、例えば、内皮細胞(例えば、静脈内皮細胞)またはＣＣＲ２遺伝子を遺伝子導入した細胞での、ＣＣＲ２の発現の検出または測定に使用できる。それゆえに、診断または研究目的での細胞選別および造影(例えば、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別)のような適用にも有用性がある。
【０１４４】
ある態様において、結合ポリペプチドまたはそのフラグメントは、診断目的で標識されていても、標識されていなくてもよい。典型的に、診断アッセイは、結合ポリペプチドのＣＣＲ２への結合に起因する複合体の形成の検出を伴う。結合ポリペプチドまたはフラグメントを、抗体と同様、直接標識できる。放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素共因子、酵素阻害剤およびリガンド(例えば、ビオチン、ハプテン類)を含むが、これらに限定されない多様な標識を用いることができる。多くの適当な免疫アッセが当業者に知られる(例えば、米国特許３,８１７,８２７；３,８５０,７５２；３,９０１,６５４；および４,０９８,８７６参照)。標識しないとき、結合ポリペプチドを、アッセイ、例えば凝集アッセイに使用できる。非標識結合ポリペプチドは、結合ポリペプチドの検出に使用できる他の(１種以上の)適切な試薬、例えば結合ポリペプチドと反応の標識抗体性または他の適切な試薬(例えば、標識プロテインＡ)と組み合わせても使用できる。
【０１４５】
一つの態様において、本発明の結合ポリペプチドを、対象ポリペプチドが酵素に結合する酵素免疫アッセイで使用できる。ＣＣＲ２タンパク質を含む生物サンプルを対象結合ポリペプチドと組み合わせたとき、結合ポリペプチドとＣＣＲ２タンパク質の間で結合が起こる。一つの態様において、ＣＣＲ２タンパク質を発現する細胞(例えば、内皮細胞)を含むサンプルを対象抗体と合わせ、結合ポリペプチドと結合ポリペプチドにより認識されるＣＣＲ２タンパク質を有する細胞の間で結合が起こる。これらの結合細胞を非結合試薬から分離でき、細胞に特異的に結合した結合ポリペプチド−酵素複合体の存在を、例えば、該サンプルと、酵素が作用したとき発色するまたは他の検出可能な変化を生じる酵素の基質と接触させることにより決定できる。他の態様において、対象結合ポリペプチドは非標識であってよく、対象結合ポリペプチドを認識する第二の標識ポリペプチド(例えば、抗体)を添加してよい。
【０１４６】
ある面において、生物サンプル中のＣＣＲ２タンパク質の存在の検出に使用するためのキットも製造できる。このようなキットは、ＣＣＲ２タンパク質または該受容体の一部に結合するＣＣＲ２結合ポリペプチド、ならびに結合ポリペプチドと受容体タンパク質またはその一部の間の複合体の存在の検出に適する１種以上の補助的試薬を含む。本発明のポリペプチド組成物は、単独でまたは他のエピトープに特異的な付加的抗体と組み合わせて凍結乾燥形態で提供できる。標識または非標識であり得る結合ポリペプチドおよび／または抗体を、補助剤成分(例えば、緩衝液、例えばＴｒｉｓ、ホスフェートおよびカーボネート、安定化剤、添加物、殺生物剤および／または不活性タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン)と共にキットに入れてよい。例えば、結合ポリペプチドおよび／または抗体は、補助剤成分との凍結乾燥混合物として提供できまたは補助剤成分を使用者が組み合わせるために別に提供できる。一般にこれらの補助剤物質は、活性結合ポリペプチドまたは抗体の量に基づき約５重量％未満で存在し、通常ポリペプチドまたは抗体濃度に基づき総量少なくとも約０.００１重量％で存在する。結合ポリペプチドに結合できる第二抗体を用いるとき、このような抗体をキットに、例えば別のバイアルまたは容器に入れてよい。第二抗体は、存在するならば、典型的に標識され、上記抗体製剤と同様の方法で製剤できる。
【０１４７】
同様に、本発明はまたＣＣＲ２の発現を検出および／または定量する方法も提供し、ここで、細胞またはそのフラクション(例えば、膜フラクション)を含む組成物を、ＣＣＲ２または受容体の一部に結合に適する条件下で結合する結合ポリペプチドと接触させ、結合をモニターする。結合ポリペプチドとＣＣＲ２またはその一部の間の複合体形成の指標である結合ポリペプチドの検出は、受容体の存在を示す。ポリペプチドの細胞への欠尾久は、標準法、例えば作業実施例に記戴するものにより決定できる。本方法は、個体からの細胞上のＣＣＲ２の発現に使用できる。所望により、内皮細胞の表面上のＣＣＲ２発現を定量的に、例えば、フローサイトメトリーにより評価でき、染色強度を疾患感受性、進行または危険性と相関させ得る。
【０１４８】
本発明はまた哺乳動物のある種の疾患に対する感受性の検出方法も提供する。説明として、本方法は、哺乳動物における細胞に存在するＣＣＲ２の量および／またはＣＣＲ２陽性細胞数に基づき、進行する疾患について哺乳動物の感受性を検出するために使用できる。
【０１４９】
ポリペプチド配列は標準的な１文字または３文字略号を使用して示す。特に断らない限り、各ポリペプチド配列は、左側がアミノ末端であり、右側がカルボキシ末端であり、各一本鎖核酸配列および各二本鎖核酸配列のトップ鎖は左側が５’末端であり、右側が３’末端である。特定のポリペプチド配列は、それがどのように対照配列と異なるかの説明によっても表すことができる。
【０１５０】
次の用語は、特に断らない限り、次の意味を有すると理解すべきである。
用語“ＣＣＲ２阻害剤”および“ＣＣＲ２アンタゴニスト”は交換可能に使用する。各々は、ＣＣＲ２の少なくとも１個の機能を検出可能に阻害する分子である。逆に、“ＣＣＲ２アゴニスト”はＣＣＲ２の少なくとも１個の機能を検出可能に増加させる分子である。ＣＣＲ２阻害剤による阻害は、アッセイを使用して検出可能である限り、完全である必要はない。ＣＣＲ２の機能の任意のアッセイを使用でき、その例をここに提供する。ＣＣＲ２阻害剤により阻害できるまたはＣＣＲ２アゴニストにより増加できるＣＣＲ２の機能の例は、癌細胞増殖またはアポトーシス(プログラム細胞死)などを含む。ＣＣＲ２阻害剤およびＣＣＲ２アゴニストのタイプの例は、ＣＣＲ２結合ポリペプチド例えば抗原結合タンパク質(例えば、ＣＣＲ２阻害性抗原結合タンパク質)、抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１５１】
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は、各々２個以上の互いにペプチドにより結合したアミノ酸残基を含む分子をいう。これらの用語は、例えば、天然および人工的タンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質配列のポリペプチドアナログ(例えば変異タンパク質、変異体および融合タンパク質)ならびに翻訳後または他に共有結合性または非共有結合性に修飾されたタンパク質を含む。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は単量体でも重合体でもよい。
【０１５２】
ポリペプチド(例えば、抗体)の“変異体”は、１個以上のアミノ酸残基が他のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列に挿入された、欠失されたおよび／または置換されたアミノ酸配列を含む。開示された変異体は、例えば、融合タンパク質を含む。
【０１５３】
ポリペプチドの“誘導体”は、例えば、他の化学部分(例えば、ポリエチレングリコールまたはアルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン)への結合、リン酸化およびグリコシル化を介して化学修飾されているポリペプチド(例えば、抗体)である。特に断らない限り、用語“抗体”は、２個の完全長重鎖および２個の完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、フラグメントおよび変異タンパク質を含み、その例を下に記載する。
【０１５４】
“抗原結合タンパク質”は、抗原に結合する部分と、所望により、抗原結合部分が抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する配座を採用することを可能にするスキャフォールドまたはフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗原結合タンパク質の例は、抗体、抗体フラグメント(例えば、抗体の抗原結合部分)、抗体誘導体および抗体アナログを含む。抗原結合タンパク質は、例えば、別のタンパク質スキャフォールドまたは結合させたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する人工的スキャフォールドを含み得る。このようなスキャフォールドは、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された変異を含む抗体由来スキャフォールドならびに例えば、生体適合性ポリマーを含む完全合成スキャフォールドを含むが、これらに限定されない。例えば、Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654参照。さらに、ペプチド抗体模倣物(“ＰＡＭ”)ならびにスキャフォールドとしてフィブロネクチン成分を利用する抗体模倣物に基づくスキャフォールドを使用できる。
【０１５５】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有し得る。“免疫グロブリン”は四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一対からなり、各対は１個の“軽”鎖(約２５kDa)および１個の“重”鎖(約５０〜７０kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖はカッパまたはラムダ軽鎖に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを規定する。好ましくは、ここに開示する抗ＣＣＲ２抗体は、重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬアミノ酸配列における可変ドメイン領域配列により特徴付けられる。好ましい抗体は、カッパＩｇＧ抗体であるＡ６である。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は約１２個またはそれ以上のアミノ酸の“Ｊ”領域により連結され、重鎖または約１０個またはそれ以上のアミノ酸の“Ｄ”領域も含む。一般に、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))参照。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、完全免疫グロブリンが２個の結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【０１５６】
“多特異性抗体”は、１個以上の抗原上で１個を超えるエピトープを認識する抗体である。このタイプの抗体の下位群は、同一または異なる抗原上の２個の異なるエピトープを認識する“二特異性抗体”である。
【０１５７】
抗原結合タンパク質は、抗原(例えば、ヒトＣＣＲ２)に解離定数１ナノモル濃度以下で結合するならば、該抗原と“特異的に結合”する。
【０１５８】
“抗原結合ドメイン”、“抗原結合領域”または“抗原結合部位”は、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質の抗原に対する特異性および親和性に貢献するアミノ酸残基(または他の部分)を含む抗原結合タンパク質の一部である。抗原と特異的に結合する抗体について、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１個の少なくとも一部を含む。
【０１５９】
“エピトープ”は、抗原結合タンパク質(例えば、抗体)により結合される分子の一部である。エピトープは、分子の非近接部分を含み得る(例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列では近接していないが、ポリペプチドの三次または四次構造の状況において、抗原結合タンパク質により結合されるのに十分互いに近いアミノ酸残基)。
【０１６０】
２個のポリヌクレオチドまたは２個のポリペプチド配列の“相同性パーセント”は、ＧＡＰコンピュータプログラム(GCG Wisconsin Package, version 10.3 (Accelrys, San Diego, Calif.)の一部)を使用して、そのデフォルトパラメータを使用して配列を比較することにより決定する。
【０１６１】
“宿主細胞”は、核酸、例えば、本発明の核酸の発現に使用できる細胞である。宿主細胞は原核生物、例えば、大腸菌であってよくまたは真核生物、例えば、単細胞真核生物(例えば、酵母または他の真菌)、植物細胞(例えば、タバコまたはトマトの植物細胞)、動物細胞(例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞)またはハイブリドーマであってよい。宿主細胞の例はサル腎細胞のＣＯＳ−７系統(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., 1981, Cell 23:175)、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞(ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞またはVeggie CHOのようなその派生物および無血清培地で増殖する関連細胞株(Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31)またはＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１(Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20)、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ(ATCC CRL 10)細胞株、アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株(ATCC CCL 70)(McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821)、２９３,２９３  ＥＢＮＡまたはＭＳＲ  ２９３のようなヒト胚性腎細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常２倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物に由来する細胞株、初代移植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット細胞を含む。典型的に、宿主細胞はポリペプチドコード化核酸で形質転換または遺伝子導入できる培養細胞であり、これをその後宿主細胞で発現できる。用語“組み換え宿主細胞”は、発現すべき核酸で形質転換または遺伝子導入されている宿主細胞を意味するように使用し得る。宿主細胞はまた該核酸を含むが、制御配列が該核酸と操作可能に結合されるように宿主細胞に導入されない限り、望むレベルでそれを発現しない核酸でもあり得る。用語宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫もいうと解釈すべきである。後代に、例えば、変異または環境の影響によりある種の修飾が起こり得るために、このような子孫は実際に親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなおここで使用する本用語の範囲内に含まれる。
【０１６２】
抗原結合タンパク質
抗原結合タンパク質(例えば、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体変異タンパク質および抗体変異体)は、ＣＣＲ２(好ましくは、ヒトＣＣＲ２)に結合するポリペプチドである。抗原結合タンパク質は、ＣＣＲ２の生物活性を阻害する抗原結合タンパク質を含む。
【０１６３】
１個以上の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーをＣＣＲ２アンタゴニストとして使用し得る。オリゴマーは、共有結合により結合したまたは非共有結合により結合した二量体、三量体またはより高度のオリゴマーの形であり得る。２個以上の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーの使用が意図され、その一例はホモ二量体である。他のオリゴマーはヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などを含む。
【０１６４】
一つの態様は、抗原結合タンパク質に融合したペプチド部分間で共有結合または非共有結合相互作用により結合した複数抗原結合タンパク質を含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー(スペーサー)またはオリゴマー形成を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパーおよびある種の抗体由来ポリペプチドは、とりわけ、下に詳述するとおり、結合した抗原結合タンパク質のオリゴマー形成を促進できるペプチドである。
【０１６５】
具体的態様において、オリゴマーは２〜４個の抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質はあらゆる形態、例えば上記の形態のいずれか、例えば、変異体またはフラグメントであり得る。好ましくは、オリゴマーは、ＣＣＲ２結合活性を有する抗原結合タンパク質を含む。
【０１６６】
一つの態様において、オリゴマーを、免疫グロブリン類由来のポリペプチドを使用して製造する。抗体由来ポリペプチドの種々の部分(Ｆｃドメインを含む)に融合したある種の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の製造は、例えば、Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; and Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11により記載されている。
【０１６７】
一つの態様は、抗ＣＣＲ２抗体のＣＣＲ２結合フラグメントの抗体のＦｃ領域への融合により製造した２個の融合タンパク質を含む二量体に関する。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合物の適当な発現ベクターへの挿入、組み換え発現ベクターで形質転換宿主細胞中での遺伝子融合物の発現および発現融合タンパク質を抗体分子に酷似するように凝集させることにより製造でき、そうすると鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分の間で形成され、二量体を産生する。
【０１６８】
用語“Ｆｃポリペプチド”は、抗体のＦｃ領域由来の天然および変異タンパク質形態のポリペプチドを含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含むこのようなポリペプチドの切断型も含まれる。Ｆｃ部分(およびそこから形成されるオリゴマー)を含む融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでの親和性クロマトグラフィーによる精製を容易にする利益をもたらす。
【０１６９】
オリゴマー抗原結合タンパク質を製造する他の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それが見られるタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは元々数種のＤＮＡ結合タンパク質で同定され(Landschulz et al., 1988, Science 240:1759)、それ以来多様な種々のタンパク質で発見された。とりわけ知られているロイシンジッパーは、天然に存在するペプチドおよび二量体化または三量体化されたその誘導体である。可溶性オリゴマータンパク質の製造に適するロイシンジッパーの例は、ＷＯ９４／１０３０８に記載されているものおよびHoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191に記載された肺サーファクタントタンパク質Ｄ(ＳＰＤ)由来ロイシンジッパーである。融合した異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78に記載されている。一つの方法では、ロイシンジッパーペプチドに融合した抗ＣＣＲ２抗体フラグメントまたは誘導体を含む組み換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現させ、形成した可溶性オリゴマー抗ＣＣＲ２抗体フラグメントまたは誘導体を培養上清から回収する。
【０１７０】
本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合フラグメントは慣用の技術により製造できる。このようなフラグメントの例は、ＦａｂおよびＦ(ａｂ’)２フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１７１】
本発明は、ＣＣＲ２に結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、当分野で知られる何らかの技法を使用して、例えば、免疫化スケジュール終了後、トランスジェニック動物から回収した脾細胞を不死化して製造できる。脾細胞は、当分野で知られる何らかの技法を使用して、例えば、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを製造することにより不死化できる。ハイブリドーマ産生融合方法で使用する骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体産生であり、高融合効率であり、望む融合細胞(ハイブリドーマ)のみの増殖を支持するある種の選択的培地での増殖を不可能とする酵素欠乏を有する。マウス融合物で使用するための適切な細胞株はＳｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８.６５３、ＮＳ１／１.Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１.７およびＳ１９４／５ＸＸ０Ｂｕｌを含み、ラット融合物で使用する細胞株の例は、Ｒ２１０.ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１.２.３、ＩＲ９８３Ｆおよび４８２１０を含む。細胞融合物で有用な他の細胞株はＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【０１７２】
ＣＣＲ２に対する抗原結合タンパク質を、例えば、インビトロまたはインビボのいずれかでＣＣＲ２ポリペプチドの存在を検出するためのアッセイで使用できる。抗原結合タンパク質はまた免疫親和性クロマトグラフィーによるＣＣＲ２タンパク質精製にも使用できる。遮断抗原結合タンパク質をここに開示する方法で使用できる。ＣＣＲ２アンタゴニストとして機能するこのような抗原結合タンパク質は、種々の癌を含むが、これらに限定されない何らかのＣＣＲ２誘発状態の処置に使用できる。
【０１７３】
抗原結合タンパク質は、ＣＣＲ２誘発生物活性を阻害するためにインビトロ方法で用いても、インビボで投与してもよい。例をここに提供するＣＣＲ２のタンパク分解性活性化が原因のまたは増悪する(直接的または間接的)障害は、それゆえに、処置され得る。一つの態様において、本発明は、ＣＣＲ２誘発生物活性の減少に有効な量でＣＣＲ２遮断抗原結合タンパク質を処置を必要とする哺乳動物にインビボで投与することを含む、治療法を提供する。
【０１７４】
抗原結合タンパク質は、ＣＣＲ２の生物活性を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体を含む。
【０１７５】
抗原結合タンパク質は、多くの慣用の技術のいずれかにより製造できる。例えば、それを自然に発現する細胞からの精製により(例えば、抗体を、それを産生するハイブリドーマから精製できる)または組み換え発現系において、当分野で知られる技法のいずれかを使用して産生できる。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)参照。
【０１７６】
当分野で知られるあらゆる発現系を、本発明の組み換えポリペプチドの製造に使用できる。一般に、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターで形質転換される。用いることができる宿主細胞は、とりわけ、原核生物、酵母または高級真核細胞である。原核生物はグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌または桿菌を含む。高級真核細胞は、昆虫細胞および哺乳動物起源の確立された細胞株を含む。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、サル腎細胞のＣＯＳ−７系統(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., 1981, Cell 23:175、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞(ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ(ATCC CRL 10)細胞株およびMcMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821に記載のアフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株(ATCC CCL 70)を含む。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主で使用する適当なクローニングおよび発現ベクターは、Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)により記載される。
【０１７７】
形質転換細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、ポリペプチドを慣用のタンパク質精製方法により回収する。このような精製方法の一つは、例えば、それに結合したＣＣＲ２の全てまたは一部(例えば、細胞外ドメイン)を含むマトリクス上での、親和性クロマトグラフィーの使用を含む。ここでの使用が意図されるポリペプチドは、実質的に内在物質の汚染がない、実質的に均一な組み換え哺乳動物抗ＣＣＲ２抗体ポリペプチドを含む。
【０１７８】
抗原結合タンパク質を、多くの既知技術のいずれかにより製造し、所望の特性についてスクリーニングし得る。この技術のいくつかは、目的の抗原結合タンパク質(例えば、抗ＣＣＲ２抗体)のポリペプチド鎖をコードする核酸(またはその一部)の単離および組み換えＤＮＡテクノロジーを介する核酸操作を含む。核酸を、他の目的の核酸と融合しても、、例えば１個以上のアミノ酸残基を付加、欠失または置換するように改変してもよい(例えば、変異誘発または他の慣用の技術)。
【０１７９】
一本鎖抗体は、単ポリペプチド鎖を得るように、アミノ酸架橋(短ペプチドリンカー)を介する重鎖および軽鎖可変ドメイン(Ｆｖ領域)フラグメントの結合により形成できる。このような一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)は、２個の可変ドメインポリペプチド(ＶＬおよびＶＨ)をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードするＤＮＡの融合により製造できる。得られたポリペプチドを、２個の可変ドメインの間の可動性リンカーの長さによって、折り畳んで抗原結合単量体を形成できまたは多量体(例えば、二量体、三量体または四量体)を形成できる(Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423;Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108)。異なるＶＬおよびＶＨ含有ポリペプチドを合わせることにより、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成できる(Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40)。一本鎖抗体の製造のために開発された手法は、米国特許４,９４６,７７８；Bird, 1988, Science 242:423；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879；Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:379-87に記載のものを含む。
【０１８０】
目的の抗体から異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を導く技術、すなわち、サブクラススイッチングが知られている。それゆえに、例えば、ＩｇＧ抗体をＩｇＭ抗体から製造でき、逆も可能である。このような手法は、ある抗体(親抗体)の抗原結合特性を有するが、親抗体と異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関係する生物学的特性も発揮する新規抗体の製造を可能にする。組み換えＤＮＡ技術を用い得る。クローン化した特定の抗体をコードするポリペプチドＤＮＡ、例えば、望む抗体アイソタイプの定常ドメインをコードするＤＮＡをこのような方法に用い得る(Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16)。さらに、ＩｇＧ４が所望ならば、ＩｇＧ４抗体を不均一にし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を減らすために、ヒンジ領域(Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407)に点変異(ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ)を導入することが望ましいことがある。
【０１８１】
具体的態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＣＲ２に対して少なくとも１０６の結合親和性(Ｋａ)を有する。他の態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または少なくとも１０１０のＫａを示す。他の態様において、抗原結合タンパク質は、ここで実施例に記載する抗体と実質的に同じＫａを示す。
【０１８２】
他の態様において、本発明は、ＣＣＲ２からの低解離速度を有する抗原結合タンパク質を提供する。一つの態様において、抗原結合タンパク質は、１×１０−４〜−１以下のＫｏｆｆを有する。他の態様において、Ｋｏｆｆは５×１０−５〜−１以下である。他の態様において、Ｋｏｆｆは、ここに記載する抗体と実質的に同一である。他の態様において、抗原結合タンパク質は、ＣＣＲ２に、ここに記載する抗体と実質的に同じＫｏｆｆで結合する。
【０１８３】
他の面において、本発明は、ＣＣＲ２の活性を阻害する抗原結合タンパク質を提供する。一つの態様において、抗原結合タンパク質は、１０００nM以下のＩＣ５０を有する。他の態様において、ＩＣ５０は１００nM以下であり、他の態様において、ＩＣ５０は１０nM以下である。他の態様において、ＩＣ５０はここで実施例に記載する抗体と実質的に同一である。他の態様において、抗原結合タンパク質は、ここに記載する抗体と実質的に同じＩＣ５０でＣＣＲ２の活性を阻害する。
【０１８４】
他の面において、本発明は、細胞表面上に発現されるヒトＣＣＲ２と結合し、このように結合したとき、細胞表面上のＣＣＲ２の量を顕著に減少させることなく細胞におけるＣＣＲ２シグナル伝達活性を阻害する抗原結合タンパク質を提供する。細胞表面面および／または内部のＣＣＲ２の量を決定するまたは概算する何らかの方法を使用できる。他の態様において、抗原結合タンパク質のＣＣＲ２発現細胞への結合は、細胞表面ＣＣＲ２の内在化を約７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、１％または０.１％未満とする。
【０１８５】
他の面において、本発明は、インビトロまたはインビボで(例えば、ヒト対象に投与したとき)少なくとも１日の半減期を有する抗原結合タンパク質を提供する。一つの態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。他の態様において、抗原結合タンパク質は４日以上の半減期を有する。他の態様において、抗原結合タンパク質は８日以上の半減期を有する。他の態様において、抗原結合タンパク質は、非誘導体化または非修飾抗原結合タンパク質と比較して半減期が長くなるように、誘導体化または修飾されている。他の態様において、抗原結合タンパク質は、例えば、本明細書に引用により包含させるＷＯ００／０９５６０に記載の血清半減期を延長させる、１個以上の点変異を含む。
【０１８６】
本発明は、さらに多特異性抗原結合タンパク質、例えば、二特異的抗原結合タンパク質、例えば、２個の異なる抗原結合部位または領域を介して、２個の異なるＣＣＲ２のエピトープまたは１個のＣＣＲ２のエピトープと１個の他の分子のエピトープに結合する抗原結合タンパク質を提供する。さらに、ここに開示する二特異的抗原結合タンパク質は、ここに開示する抗体の一つ由来のＣＣＲ２結合部位と、ここに他の文献の引用により記載しているものを含む他のここに記載する抗体由来の第二ＣＣＲ２結合領域を含む。あるいは、二特異的抗原結合タンパク質は、ここに記載する抗体の一つ由来の抗原結合部位と、当分野で知られる他のＣＣＲ２抗体または既知方法もしくはここに記載する法オフにより製造した抗体由来の第二抗原結合部位を含み得る。
【０１８７】
二特異的抗体を製造する多数の方法が当分野で知られる。このような方法は、Milstein et al., 1983, Nature 305:537に記載のハイブリッド−ハイブリドーマおよび抗体フラグメントの化学カップリングを含む(Brennan et al., 1985, Science 229:81; Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139:2367；米国特許６,０１０,９０２)。さらに、二特異的抗体は、組み換え手段により、例えばロイシンジッパー部分(すなわち、優勢にヘテロ二量体を形成するＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来；Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547)または米国特許５,５８２,９９６に記載の他の鍵孔と鍵相互作用的ドメイン構造の使用により製造できる。さらに有用な技術は米国特許５,９５９,０８３；および５,８０７,７０６に記載のものを含む。
【０１８８】
他の面において、抗原結合タンパク質は、抗体の誘導体を含む。誘導体化抗体は、所望の特性、例えば特定の使用における半減期延長を抗体に与えるあらゆる分子または物質を含む。誘導体化抗体は、例えば、検出可能(または標識)部分(例えば、放射性、比色、抗原性または酵素分子、検出可能ビーズ(例えば磁気または電極(例えば、金)ビーズ)または他の分子と結合する分子(例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン)、治療的または診断部分(例えば、放射性、細胞毒性または薬学的に活性部分)または特定の使用(例えば、対象、例えばヒト対象への投与または他のインビボまたはインビトロ使用)のための抗体の適性を高める分子を含み得る。抗体の誘導体化に使用できる分子の例は、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)およびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。抗体のアルブミン結合およびペグ化誘導体は、当分野で周知の技術を使用して行い得る。一つの態様において、抗体を、トランスサイレチン(ＴＴＲ)またはＴＴＲ変異体と複合化するかまたは他の方法で結合させる。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体を、例えば、デキストラン、ポリ(ｎ−ビニルピロリドン)、ポリエチレングリコール類、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共ポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類から成る群から選択される化学物質で化学修飾できる。
【０１８９】
次の用語は、特に断らない限り、次の意味を有すると解釈すべきである。
適応症
一つの面において、本発明は、対象の処置方法を提供する。該方法は、例えば、一般に対象に健康に良い影響を有し、例えば、対象の余命を延長できる。あるいは、方法は、疾患、障害、状態または病気(“状態”)を、例えば、処置、予防、治癒、軽減または回復(“処置”)できる。処置する状態は、とりわけ、ＣＣＲ２の不適切な発現または活性により特徴付けられる状態である。このような状態のいくつかにおいて、発現または活性レベルが高過ぎ、処置は、ここに記載するＣＣＲ２アンタゴニストの投与を含む。障害または状態は、癌に関係する。特に、このような癌は、肺、卵巣および結腸の癌ならびに種々の骨髄腫を含むが、これらに限定されない。
【０１９０】
本発明の抗原結合タンパク質で処置可能または予防可能な具体的病状および疾患は種々の癌を含む。
【０１９１】
治療法および抗原結合タンパク質の投与
ここに提供するある方法は、対象へのＣＣＲ２結合抗原結合タンパク質の投与を含み、それにより特定の状態において役割を有するＣＣＲ２誘発生物学的応答を軽減する。具体的態様において、本発明の方法は、内在ＣＣＲ２とＣＣＲ２結合抗原結合タンパク質を、例えば、対象への投与を介してまたはエクスビボ方法で接触させることを含む。
【０１９２】
用語“処置”は、少なくとも１個の症状または障害の他の側面の軽減または予防または疾患重症度の軽減などを含む。抗原結合タンパク質は、実行可能な治療剤を構成するために、完全な治癒をもたらすまたは全ての疾患の症状または顕在化を根絶する必要はない。関連分野で認識されているとおり、治療剤として使用する薬物は、ある疾患状態の重症度を軽減し得るが、有用な治療剤とみなされるために、疾患の全ての顕在化を根絶する必要はない。同様に、予防的投与処置は、実行可能な予防を構成するために、状態の発症の予防に完全に有効である必要はない。疾患の影響の単なる減少(例えば、症状の数または重症度の減少によるまたは他の処置の有効性を高めることによるまたは他の有益な効果を生じる)または対象における疾患が起こるまたは悪化する可能性の減少で十分である。本発明の一つの態様は、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超える持続した改善を誘発するのに十分な量および時間でＣＣＲ２アンタゴニストを患者に投与することを含む、方法に関する。
【０１９３】
関連分野では理解されるとおり、ここに開示した抗体およびそのフラグメントを含む医薬組成物を、適応症に適する方法で対象に投与する。医薬組成物は、非経腸、局所または吸入を含むが、これらに限定されない任意の適切な手法で投与してよい。注射するならば、医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注射または連続点滴により投与できる。例えば疾患または傷害部位での局所投与も、経皮送達および徐放性製剤インプラントとして考慮される。吸入による送達は、例えば、経鼻または経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル製剤のアンタゴニスト吸入などを含む。他の選択肢は点眼剤；丸剤、シロップ剤、ロゼンジ剤またはチューインガム剤を含む経口調製物；および局所調製物、例えばローション剤、ゲル剤、スプレー剤および軟膏剤を含む。
【０１９４】
エクスビボ方法での抗原結合タンパク質の使用も考慮される。例えば、患者の血液または他の体液を、エクスビボでＣＣＲ２と結合する抗原結合タンパク質と接触させ得る。抗原結合タンパク質は、適切な不溶性マトリクスまたは固体支持物質に結合させ得る。
【０１９５】
有利には、抗原結合タンパク質を、１個以上の付加的成分、例えば生理学的に許容される担体、添加物または希釈剤を含む組成物の形で投与する。所望により、組成物は、さらに１個以上の生理学的活性剤、例えば、第二の炎症または免疫阻害物質、抗血管形成物質、鎮痛剤物質などを含んでよく、その非排他的例をここに提供する。種々の特定の態様において、組成物は、ＣＣＲ２結合抗原結合タンパク質に加えて、１種、２種、３種、４種、５種または６種の生理学的活性剤を含む。
【０１９６】
組み合わせ治療
他の面において、本発明は、ＣＣＲ２阻害性抗原結合タンパク質および１種以上の他の処置を用いる対象の処置方法を提供する。一つの態様において、このような組み合わせ治療は、例えば、腫瘍の複数部位または分子標的を攻撃することにより、相乗的または相加的効果を達成する。本発明に関係して使用できる組み合わせ治療のタイプは、単一疾患に関係する経路における複数接点、標的細胞における複数経路および標的組織における複数細胞タイプの阻害または活性化(適切ならば)を含む。
【０１９７】
他の態様において、組み合わせ治療方法は、ここに記載するＣＣＲ２アゴニストまたはアンタゴニストの２種、３種、４種、５種、６種またはそれ以上を対象に投与することを含む。他の態様において、本方法は、一体となってＣＣＲ２介在シグナル伝達を阻害または活性化(直接的または間接的)する２種以上の処置剤を対象に投与することを含む。このような方法の例は、２種以上のＣＣＲ２阻害性抗原結合タンパク質の組み合わせ、１種のＣＣＲ２阻害性抗原結合タンパク質と１個以上の抗癌特性を有する他の治療的構造的部分(例えば、細胞毒性剤および／または免疫調節剤)の組み合わせまたは１種のＣＣＲ２阻害性抗原結合タンパク質と１種以上の他の処置(例えば、手術または放射線)の組み合わせを含む。さらに、１種以上の抗ＣＣＲ２抗体または抗体誘導体を、１種以上の分子または他の処置と組み合わせて使用でき、ここで、該他の分子および／または処置はＣＣＲ２と直接結合または作用しないが、この組み合わせは処置する状態の処置または予防に有効である。一つの態様において、分子および／または処置の１種以上は、治療中に他の分子または処置の１種以上が原因である状態、例えば、悪心、疲労、脱毛症、カヘキシー、不眠症などを処置または予防する。分子および／または他の処置の組み合わせを使用する全ての場合、個々の分子および／または処置を、任意の順番で、有効である任意の長さの期間にわたり、例えば、同時に、連続的にまたは交互に適用できる。一つの態様において、処置方法は、１個の分子または他の処置での処置の第一コースの終了後の処置の第二のコースの開始を含む。処置の第一のコースの終了から処置の第二のコースの開始までの期間の長さは、治療の全過程を有効とする任意の長さであってよく、例えば、秒単位、分単位、時間単位、日単位、週単位、月単位または年単位であってさえよい。
【０１９８】
他の態様において、本方法は、ｌここに記載するＣＣＲ２アンタゴニストの１種以上および１種以上の他の処置(例えば、治療的または予防的処置)の投与を含む。方法が対象への１種を超える処置の投与を含むとき、投与の順番、タイミング、数、濃度および体積は、医学的要求および処置の制限によってのみ制限され、すなわち、２種の処置を対象に、例えば、同時に、連続的に、交互にまたは他の何らかのレジメンに従って投与できる。
【実施例】
【０１９９】
実施例１
本実施例は、抗ＣＣＲ２抗体に対するＥＣ５０を決定するための細胞結合アッセイを示す。図１のデータは、細胞結合ＥＣ５０測定のインビトロデータを示す。本実施例は、最大細胞結合および５０％結合飽和(ＥＣ５０)に達する濃度の点でこれらの抗体の特徴的結合を示す。本実施例において、ＣＨＯ−ＣＣＲ２細胞を、ＰＢＳベースの非酵素細胞解離緩衝液(Life Technologies #13151-014)を使用して培養フラスコから上げた。細胞を１×１０６細胞／mlでＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ中２％ウシ胎児血清)に懸濁し、１００μl(１×１０５細胞)を９６ウェルプレートのウェルに等分した。播種細胞を遠沈させ、上清を廃棄した。細胞を、３個ずつ示す濃度のＣＣＲ２Ｄ１  ＩｇＧを含む５０μlＦＡＣＳ緩衝液に最懸濁させた(図１)。プレートを１時間、４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１：５００希釈した５０μlヤギ抗ヒトＩｇＧ(γ鎖特異的)−ＰＥ結合二次抗体(Southern Biotech # 2040-09)に再懸濁した。細胞をさらに３０分、４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を最終体積２５μlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Intellicyt Flow Cytometerを使用して分析した。ＦＬ−２Ｈチャネルの中央蛍光をFlowJoソフトウェアを使用して決定し、ＥＣ５０値をデータをGraphPad Prismにプロットすることにより決定し、可変勾配非線形回帰を使用して分析した。
【０２００】
結果：抗ＣＣＲ２抗体の細胞結合ＥＣ５０を表１に示す。
【表１】
2018199681.tif 000002
【０２０１】
実施例２
実施例２は、マウスＣＣＲ２に対する抗ＣＣＲ２抗体の細胞結合ＥＣ５０測定のインビトロデータを示す。本実施例は、ヒトＣＣＲ２に対するこれらの抗体がマウスＣＣＲ２と交差反応できるかを示し、同時に最大細胞結合および５０％結合飽和(ＥＣ５０)に達する濃度の点でこれらの抗体の特徴的結合を明らかにする。本実施例において、ＷＥＨＩ  ２７４.１細胞を、１×１０６細胞でＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ中２％ウシ胎児血清)に再懸濁し、５０μl(１×１０５細胞)の細胞懸濁液を９６ウェルプレートのウェルに等分した。播種細胞を遠沈させ、上清を廃棄した。細胞を、３個ずつ連続希釈した抗ＣＣＲ２ＩｇＧを含む３０μlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。プレートを１時間、４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１：５００希釈した５０μlヤギ抗ヒトＩｇＧ(γ鎖特異的)−ＰＥ結合二次抗体(Southern Biotech # 2040-09)に再懸濁し、３０分、４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を最終体積３０μlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Intellicyt Flow Cytometerを使用して分析した。ＦＬ−２Ｈチャネルの中央蛍光をFlowJoソフトウェアを使用して決定し、ＥＣ５０値をデータをGraphPad Prismにプロットすることにより決定し、可変勾配非線形回帰を使用して分析した。結果を表２に示す。
【表２】
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【０２０２】
実施例３
本実施例は、ＴＨＰ−１細胞(ヒト単球細胞株)上のカルシウム流入アッセイを示す。ＭＣＰ−１誘発ＴＨＰ−１カルシウム流動に対するＤ１のＩＣ５０を測定するために、我々は、最初にＭＣＰ−１のＥＣ５０を決定するために、ＭＣＰ−１誘発ＴＨＰ−１カルシウム流動アッセイを設定した。方法(カルシウム流入アッセイ)に記載するＭＣＰ−１のＥＣ５０の測定に使用したアッセイ条件下、ＭＣＰ−１誘発カルシウム流動に対するＥＣ５０値３.３nMを得た。その後、我々は、１０nMのヒトＭＣＰ−１(PROSPEC # CHM-271)(約ＥＣ８０)を使用して、ＭＣＰ−１誘発ＴＨＰ−１カルシウム流動に対するＤ１  ＩＣ５０を決定するためのカルシウム流動アッセイを行った。
【０２０３】
結果：方法(カルシウム流入アッセイ)に記載するＤ１のＩＣ５０に使用したアッセイ条件下、ＭＣＰ−１誘発カルシウム流動に対するＩＣ５０値４.７nMのＤ１を２個の独立した実験で得た。３回のアッセイの平均±Ｓ.Ｄ.を図２に示す。
【０２０４】
実施例４
本実施例は、ＭＣＰ−１誘発初代ヒト単球カルシウム流動に対するＤ１のＩＣ５０を測定するための初代ヒト単球を提供する。我々は、最初にＭＣＰ−１のＥＣ５０を決定するためにＭＣＰ−１誘発初代ヒト単球カルシウム流動アッセイを設定した。カルシウム流入アッセイを、FLIPR calcium 4 assay kitを使用して設定し、細胞内Ｃａ２＋の変化を、FlexStation3走査型蛍光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で測定した。ケモカインＭＣＰ−１のＥＣ５０を決定するために、２５μlのアッセイ緩衝液(ＨＢＳＳ＋２０mM  ＨＥＰＥＳ)中のＴＨＰ−１細胞または初代ヒト単球を、ポリ−Ｄ−リシン被覆３８４ウェル黒壁、透明底アッセイプレート(Greiner)にプロベネシド  ３mM(ウェル作業最終濃度)を含む２５μlのFLIPR calcium 4 assay kit(Ｒ８１４２、Molecular Devices)と入れ、１時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、アッセイプレートを４分、１,０００rpmで遠心分離し、室温で１０分インキュベートした。種々の用量のＭＣＰ−１を含む別のプレートを設定した。両者のプレートをＭＣＰ−１の蛍光標識細胞への自動添加のためにFlexStationに入れた。ベースライン蛍光を、ＭＣＰ−１を細胞添加前に１７秒で添加した。経時的カルシウム放出の定量化を、FlexStation3に動力を供給するSoftMax Proソフトウェアにより決定した。応答倍率を、各ＭＣＰ−１濃度の最大−最小蛍光値を緩衝液媒体の最大−最小蛍光で割ることにより計算した。ＭＣＰ−１のＥＣ５０値を、GraphPad Prism 5でＭＣＰ−１濃度の濃度を増加させたときの応答倍率をプロットし、シグモイド用量−応答解析を使用して計算した。
【０２０５】
Ｄ１のＩＣ５０を決定するために、細胞を種々の用量のＤ１と、ＨＢＳＳ＋２０mM  ＨＥＰＥＳ緩衝液中２０分、室温でインキュベートし、２５μl細胞を、３８４ウェルプレートに２５μlのFLIPR calcium 4 assay kitと共に添加した。他の方法は、ケモカインＭＣＰ−１のＥＣ５０決定についての上記と同じであった。
【０２０６】
細胞数、ＭＣＰ−１およびＤ１の濃度、アッセイパラメータなどのようなアッセイ条件の詳細な情報を図の脚註に示す。
方法(カルシウム流入アッセイ)に記載したＭＣＰ−１のＥＣ５０の測定に使用したアッセイ条件下、ＭＣＰ−１誘発カルシウム流動に対するＥＣ５０値３.７９nMを得た。その後、我々は、１０nMのＭＣＰ−１(約ＥＣ８０)を使用して、ＭＣＰ−１誘発初代ヒト単球カルシウム流動に対するＤ１  ＩＣ５０決定のためのカルシウム流動アッセイを行った。
【０２０７】
結果：方法(カルシウム流入アッセイ)に記載するＤ１のＩＣ５０に使用したアッセイ条件下、ＭＣＰ−１誘発カルシウム流動に対するＩＣ５０値２.８nMのＤ１を得た。３回のアッセイの平均±Ｓ.Ｄ.を図３に示す。
【０２０８】
実施例５
本実施例は、ＭＣＰ−１誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＤ１のＩＣ５０を測定するためのＴＨＰ−１(ヒト単球細胞株)を使用した走化性アッセイを示す。我々は、最初にＭＣＰ−１のＥＣ５０を決定するためにＭＣＰ−１誘発ＴＨＰ−１細胞遊走アッセイを設定した。ここに記載するＭＣＰ−１のＥＣ５０(走化性アッセイ)の測定に使用したアッセイ条件下、ＥＣ５０値０.８nMがＭＣＰ−１誘発走化性で達成された。その後、我々は、３nMのＭＣＰ−１(約ＥＣ８０)を使用して、ＭＣＰ−１誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＤ１のＩＣ５０を決定するために走化性アッセイを設定した。
【０２０９】
走化性アッセイを、５μmポリカーボネート膜で２区画に分かれた９６ウェル走化性チャンバー(ChemoTX; NeuroProbe, Gaithersburg, MD)を使用して設定した。ケモカインＭＣＰ−１のＥＣ５０を決定するために、２９μlの種々の用量のＭＣＰ−１を含むアッセイ緩衝液(図に示す)を下部区画に添加した。膜をウェルと位置合わせし、定位置に留めた。２５μlのアッセイ緩衝液に再懸濁したＴＨＰ−１または初代ヒト単球細胞を、上部チャンバーウェルに添加した。蓋を閉め、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。インキュベーション後、膜の最上部に残っている非遊走細胞を濾紙によりブロットし、膜をマイクロプレートから離し、下部チャンバーの各ウェルの細胞数をCedexで計数した。ＭＣＰ−１誘発用量依存性曲線およびＭＣＰ−１のＥＣ５０値をPrism5により計算した。
【０２１０】
結果：使用したアッセイ条件下、Ｄ１はＭＣＰ−１誘発走化性に対するＩＣ５０値１９４pMを有した。図４は、Ｄ１  ＩＣ５０を決定するための３個の別の実験の一つを示す。Ｄ１のＩＣ５０値は３個の別々の実験の各々で類似した。
【０２１１】
実施例６
本実施例は、ＭＣＰ−１誘発初代ヒト単球遊走に対するＤ１のＩＣ５０アッセイを提供する。我々は、最初にＭＣＰ−１のＥＣ５０を決定するためにＭＣＰ−１誘発初代ヒト単球遊走アッセイを設定した。方法(走化性アッセイ)に記載したＭＣＰ−１のＥＣ５０の粗測定のために使用したアッセイ条件下、我々は、ＭＣＰ−１誘発走化性に対するＥＣ５０値０.３８９nMを得た。その後、我々は、１nMのＭＣＰ−１(約ＥＣ８０)を使用して、ＭＣＰ−１誘発初代ヒト単球細胞遊走に対するＤ１  ＩＣ５０を決定するための走化性アッセイを行った。
【０２１２】
結果：ここに記載したＤ１のＩＣ５０のために使用したアッセイ条件下(走化性アッセイ)、ＭＣＰ−１誘発走化性に対するＤ１のＩＣ５０値１.０２nMを、あるドナーから単離した単球(図５)で得て、ＭＣＰ−１誘発走化性に対するＤ１のＩＣ５０値３.４８nMを他のドナーから単離した単球(図６)で得た。
【０２１３】
実施例７
本実施例は、ｍＭＣＰ−１(マウスＭＣＰ−１)誘発ＷＥＨＩ  ２７４.１(マウス単球細胞株)細胞遊走アッセイに対するＤ１のＩＣ５０決定を提供する。我々は、最初にｍＭＣＰ−１のＥＣ５０を決定するためにｍＭＣＰ−１誘発ＷＥＨＩ  ２７４.１細胞遊走アッセイを設定した。
【０２１４】
ＭＣＰ−１に対するＷＥＨＩ  ２７４.１の走化性を蛍光方法を用いて行った。細胞(５×１０６／ml)を２μM  カルセイン−ＡＭで３０分、３７℃、５％ＣＯ２で遮光して標識した。続いて、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、２５μlのアッセイ緩衝液に再懸濁した細胞を、上部チャンバーウェルに添加した。ＴＨＰ−１および初代ヒト単球について上に記載したアッセイ方法に従った。遊走のために３７℃、５％でインキュベーション後、膜の最上部に残っている非遊走細胞を濾紙にブロットし、膜の上端をＰＢＳで洗浄した。膜をプレートから外し、ウェルの蛍光を、励起蛍光プレートリーダー(FlexStation3, Molecular Device)で、励起４８５nmおよび発光５３０nmで膜の底から測定した。
【０２１５】
ＭＭＣＰ−１のＥＣ５０を測定するために使用したアッセイ条件下(上記)、ｍＭＣＰ−１誘発走化性に対する０.１２nMのＥＣ５０値を得た。その後、我々は、０.２５nM(〜ＥＣ８０)のＭＣＰ−１を使用して、ｍＭＣＰ−１誘発ＷＥＨＩ  ２７４.１細胞遊走アッセイを使用してＤ１のＩＣ５０を決定するための走化性アッセイを行った。
【０２１６】
結果：方法(走化性アッセイ)に記載したＤ１のＩＣ５０のために使用したアッセイ条件下、６６nMのＩＣ５０値をＤ１について得た(図７)。
【０２１７】
実施例８
本実施例は、走化性を用いたＤ１とＭＬＮ１２０２の機能的活性の比較を提供する。ＭＬＮ１２０２(Millennium)は、ＣＣＲ２に高特異性を有するヒト化モノクローナル抗体であり、これはＣＣＲ２へのＭＣＰ−１結合を妨害する。ＭＬＮ１２０２は臨床試験で評価中である。Ｄ１およびＭＬＮ１２０２の機能的活性を比較するために、我々は、誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＣＣＲ２ケモカイン(ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびＭＣＰ−５)を用いる走化性アッセイを行った。
【０２１８】
走化性アッセイを、５μmポリカーボネート膜で２区画に分かれた９６ウェル走化性チャンバー(ChemoTX; NeuroProbe, Gaithersburg, MD)を使用して設定した。ケモカインＭＣＰ−１のＥＣ５０を決定するために、２９μlの種々の用量のＭＣＰ−１を含むアッセイ緩衝液(図に示す)を下部区画に添加した。膜をウェルと位置合わせし、定位置に留めた。２５μlのアッセイ緩衝液に再懸濁したＴＨＰ−１または初代ヒト単球細胞を、上部チャンバーウェルに添加した。蓋を閉め、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、膜の最上部に残っている非遊走細胞を濾紙によりブロットし、膜をマイクロプレートから離し、下部チャンバーの各ウェルの細胞数をCedexで計数した。ＭＣＰ−１誘発用量依存性曲線およびＭＣＰ−１のＥＣ５０値をPrism5により計算した。
【０２１９】
Ｄ１のＩＣ５０を決定するために、細胞をアッセイ緩衝液中種々の用量のＤ１と２０分、室温でインキュベートし、２５μlのアッセイ緩衝液中の細胞を上部チャンバーウェルに添加し、１濃度のＭＣＰ−１(約ＥＣ８０)を下部区画に添加した。他の方法は、ケモカインＭＣＰ−１の上記ＥＣ５０決定と同じであった。
Ｄ１およびＭＬＮ１２０２のＩＣ５０値を図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄおよび８Ｅに示す。ＩＣ５０値の比較を下の表３に示す。
【０２２０】
結果：図８Ａ〜Ｅならびに表３のデータは、Ｄ１がこれら５種のＣＣＲ２ケモカイン誘発ＴＨＰ−１細胞遊走の阻害においてＭＬＮ１２０２よりも強力であったことを示す。
【表３】
2018199681.tif 000004
【０２２１】
実施例９
本実施例は、Ｄ１抗体のインビボＥＡＥモデルを示す。ＣＣＲ２に対する抗体が疾患発症に影響を与える能力を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)を誘発することにより試験した。これは、Hooke laboratories(Lawrence, MA)のキットを使用して達成され、そこで、マウスは神経症状を促進するためにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(ＭＯＧ)および百日咳毒素を注射された。ＥＡＥは多発性硬化症(ＭＳ)のマウスモデルであり、ヒト疾患の多くの重要な病原学的要素を再現する。マウスを、二通りのうち一方でＤ１抗体で処置した。一つの処置プロトコルにおいて、マウスを疾患誘発１日後(予防)、２日毎に腹腔内投与するＤ１抗体(０.１mg)で処置した。第二処置プロトコル(治療的)において、抗体(０.１mg)を、マウスが疾患の証拠(尾の弛緩)を示したときに腹腔内に与えた。この処置を２日毎に行った。実験の間、マウスを毎日評価し、疾患スコアを記録した。図９から、Ｄ１処置は、予防的であれ治療的であれ、疾患重症度を軽減することが明らかである。
【０２２２】
実施例１０
本実施例は、抗体１Ｇ１１、１Ｂ２および１Ｈ５に対する細胞結合ＩＣ５０を提供する。これらの抗体で使用した走化性アッセイ方法は、Ｄ１で使用したものと同一であった。ＭＣＰ誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対する抗体のＩＣ５０を測定するために、我々は、最初にＭＣＰリガンドのＥＣ５０を決定するためのＴＨＰ−１細胞遊走アッセイを設定した。上記ＭＣＰ−１のＥＣ５０の測定のために使用したアッセイ条件下(走化性アッセイ)、ＥＣ５０値を決定した(データは示していない)。
【０２２３】
その後、我々は、ＥＣ８０濃度の各ＭＣＰを使用して、ＭＣＰ誘発ＴＨＰ−１細胞遊走に対するＣＣＲ２抗体１Ｇ１１、１Ｂ２および１Ｈ５のＩＣ５０を決定するための走化性アッセイを行った。
【０２２４】
結果：ＭＣＰ−５(３nM)に対する１Ｇ１１のＩＣ５０は７９pM(図１０Ａ)であり、ＭＣＰ−５(６ng／ml)に対して２６１pM(図１０Ｂ)であった。ＭＣＰ−５(３nM)に対する１Ｂ２のＩＣ５０は８７pM(図１１Ａ)であり、ＭＣＰ−５(３nM)に対して１９７pM(図１１Ｂ)であった。ＭＣＰ−５(３nM)に対する１Ｈ５のＩＣ５０は１０９pM(図１２Ａ)であり、ＭＣＰ−５(６ng／ml)に対して３４９pM(図１２Ｂ)であった。１Ｈ５はまた３０ng／mlのＭＣＰ−２に対する１.９nM  ＩＣ５０値(図２Ｃ)、６ng／mlのＭＣＰ−３に対する２.６nM  ＩＣ５０値(図１２Ｄ)および２００ng／mlのＭＣＰ−４に対する１.４nM  ＩＣ５０(図１２Ｅ)を示した。
【０２２５】
実施例１１
本実施例は、ヒト単球細胞株であるＴＨＰ−１(ATCC #TIB-202)細胞を使用する走化性アッセイを提供する。走化性アッセイ５をμmポリカーボネート膜で２区画に分かれた９６ウェル走化性チャンバー(ChemoTX; NeuroProbe, Gaithersburg, MD)を使用して設定した。連続希釈濃度のｍＡｂをＴＨＰ−１細胞(０.１％ＢＳＡ添加２５μlのＨＢＳＳ中０.１×１０６細胞)と、室温で２０分プレインキュベートした。０.１％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ中のリガンドを、下部チャンバーのプレートのウェルに入れ、一方プレインキュベートした細胞とｍＡｂを膜の上端に載せた。リガンドの最終濃度は３nM  ＭＣＰ−１(PROSPEC # CHM-271)、６.７nMのＭＣＰ−２(PeproTech #300-15)、１.１nMのＭＣＰ−３(PeproTech #300-17)、３５nMのＭＣＰ−４(PeproTech #300-24)および０.６５nMのＭＣＰ−５(PeproTech #250-04)であった。２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーション後、膜の最上側に残る非遊走細胞を濾紙によりブロットし、膜を下部チャンバーのプレートから離した。下部チャンバーのプレートの各ウェルの遊走細胞をCedex XS細胞カウンター(Innovatis, Roche)で計数するかまたは不透明白色９６ウェルプレートに移し、CellTiter Glo(Cat#G7571, Promega)で１０分、室温で処理した。CellTiter Gloにより生じた発光シグナルを蛍光プレートリーダー(FlexStation3、Molecular Device)で検出した。表に示す各ｍＡｂのＩＣ５０値をPrism5により計算した。
【０２２６】
対応するリガンドに対する各ｍＡのＩＣ５０の結果を表４に示す。各ＩＣ５０値は平均±Ｓ.Ｄ.(ｎ＝２またはｎ＝３)および同等の結果となった２個または３個の独立した実験の１個を示す。ＭＬＮ１２０２(武田)を対照として使用した；これはＣＣＲ２に高特異性を有するヒト化モノクローナル抗体であり、ＣＣＲ２へのＭＣＰ−１結合を妨害する。開示されたｍＡｂ(Ｄ１、１Ｂ２、１Ｇ１１、Ｄ１−１およびＤ１Ｈ１／４５Ｈ８Ｌ１)はヒトＩｇＧ１である。
【表４】
2018199681.tif 000005
【０２２７】
実施例１２
本実施例は、ヒトＴＨＰ−１細胞を用いるカルシウムアッセイを説明する。ＴＨＰ−１細胞(２５μlの２０mM  ＨＥＰＥＳ添加アッセイ緩衝液ＨＢＳＳ中０.３×１０５細胞)を、連続希釈用量のｍＡｂと２０分、室温でプレインキュベートした。２５μlのプレインキュベート細胞を、ポリ−Ｄ−リシン３８４ウェルプレート(Greiner #781946)中の５mM  プロベネシド(Sigma #P8761-25G)を含む２５μlのCalcium 4 Assay kit(Molecular Device #R8142)に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で１時間、続いて１５分、室温インキュベーションし、プレートを短く遠心分離した後、FlexStation3での検出中、１２.５μlの５倍濃縮リガンドをプレートの各ウェルに、感作アゴニストとして添加した。アッセイに使用したリガンドの最終濃度は２.５nMのＭＣＰ−１(PROSPEC # CHM-271)、２２nMのＭＣＰ−３(PeproTech #300-17)および０.４３nMのＭＣＰ−５(PeproTech #250-04)であった。表５に示す各ｍＡｂのＩＣ５０値をPrism5により計算した。
【０２２８】
表５の結果は、対応するリガンドに対する各ｍＡｂのＩＣ５０を示す。各ＩＣ５０値は平均±Ｓ.Ｄ.を示す(ｎ＝２)および類似の結果となった２個の独立した実験の１個。
【表５】
2018199681.tif 000006
【０２２９】
実施例１３
本実施例は、マウスＷＥＨＩ細胞を用いる走化性アッセイを説明する。マウス単球細胞株であるＷＥＨＩ−２７４.１(ATCC, CRL-1679)を本走化性アッセイで使用した。走化性アッセイを、８μmポリカーボネート膜で２区画に分かれた９６ウェル走化性チャンバー(ChemoTX; NeuroProbe, Gaithersburg, MD)を使用して設定した。走化性に使用したアッセイ緩衝液は、０.１％ＢＳＡを添加した１：１体積比のＲＰＭＩおよびＨＢＳＳであった。連続希釈したｍＡｂを０.１×１０６細胞のＷＥＨＩと、２５μlのアッセイ緩衝液中で２０分、室温でプレインキュベートした。０.７nMのマウスＭＣＰ−１(R&D, 479-JE)を下部チャンバーのプレートのウェルに入れ、一方プレインキュベートした細胞とｍＡｂを膜の最上部に充填した。２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーション後、下部チャンバーの遊走細胞を不透明白色９６ウェルプレートに移し、CellTiter Glo(Cat#G7571, Promega)と１０分、室温でインキュベートした。各ウェルの細胞から生じた発光シグナルを蛍光プレートリーダー(FlexStation3、Molecular Device)で検出した。表６に示す各ｍＡｂのＩＣ５０値をPrism5により計算した。
【０２３０】
表６の結果は、ＭＣＰ−１に対する各ｍＡｂのＩＣ５０を示す。各ＩＣ５０値は平均±Ｓ.Ｄ.を示す(ｎ＝２)および類似の結果となった２個の独立した実験の１個。Ｄ１、Ｄ１−１およびＤ１Ｈ１／４５Ｈ８Ｌ１は、それぞれＩＣ５０値６２pM、３５pMおよび１２pMを示した。
【表６】
2018199681.tif 000007
【０２３１】
実施例１４
本実施例において、ＣＨＯ−ＣＣＲ２細胞を、ＰＢＳベースの非酵素細胞解離緩衝液(Life Technologies #13151-014)を使用して培養フラスコから上げた。細胞をナトリウムアジド添加ＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ中２％ウシ胎児血清)中、１×１０６細胞／mlで再懸濁し、８００μlずつを各抗体のためにチューブに入れた。抗体を最終濃度５μg／mlで添加し、室温で１時間インキュベートした。次いでサンプルを氷に乗せ、種々の時点で１０５μlずつを９６ウェルプレート中の１９０μlＦＡＣＳ緩衝液に添加し、３分遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を１０５μlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、１５０μlＦＡＣＳ緩衝液を含む他の９６ウェルプレートに２個ずつ等分し(５０μl)、室温でインキュベートした。全時点の採取後、プレートを３分遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１：５００希釈した５０μlヤギ抗ヒトＩｇＧ(γ鎖特異的)−ＰＥ結合二次抗体(Southern Biotech # 2040-09)に再懸濁した。細胞をさらに３０分、４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を最終体積３０μlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Intellicyt Flow Cytometerを使用して分析した。種々のＩｇＧ１クローンの分離速度を図１３に示す。
【０２３２】
実施例１５
本実施例において、ＣＨＯ−ＣＣＲ２細胞を、ＰＢＳベースの非酵素細胞解離緩衝液(Life Technologies #13151-014)を使用して培養フラスコから上げた。細胞を１×１０６細胞／mlでＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ中２％ウシ胎児血清)に懸濁し、５０μl(１×１０５細胞)を９６ウェルプレートのウェルに等分した。抗体を１種以上の濃度(典型的に５、１０および／または２０μg／ml)で添加した。プレートを１時間、４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１：５００希釈した５０μlヤギ抗ヒトＩｇＧ(γ鎖特異的)−ＰＥ結合二次抗体(Southern Biotech # 2040-09)に再懸濁した。細胞をさらに３０分、４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を最終体積３０μlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Intellicyt Flow Cytometerを使用して分析した。細胞への抗体結合の結果を表７に示す。
【表７】
2018199681.tif 000008
【０２３３】
【表８】
2018199681.tif 000009
【表９】
2018199681.tif 000010
【０２３４】
【表１０】
2018199681.tif 000011
【表１１】
2018199681.tif 000012
【表１２】
2018199681.tif 000013
【図１】
2018199681.tif 000014
【図２】
2018199681.tif 000015
【図３】
2018199681.tif 000016
【図４】
2018199681.tif 000017
【図５】
2018199681.tif 000018
【図６】
2018199681.tif 000019
【図７】
2018199681.tif 000020
【図８Ａ】
2018199681.tif 000021
【図８Ｂ】
2018199681.tif 000022
【図８Ｃ】
2018199681.tif 000023
【図８Ｄ】
2018199681.tif 000024
【図８Ｅ】
2018199681.tif 000025
【図９】
2018199681.tif 000026
【図１０Ａ】
2018199681.tif 000027
【図１０Ｂ】
2018199681.tif 000028
【図１１Ａ】
2018199681.tif 000029
【図１１Ｂ】
2018199681.tif 000030
【図１２Ａ】
2018199681.tif 000031
【図１２Ｂ】
2018199681.tif 000032
【図１２Ｃ】
2018199681.tif 000033
【図１２Ｄ】
2018199681.tif 000034
【図１２Ｅ】
2018199681.tif 000035
【図１３】
2018199681.tif 000036
【配列表】
2018199681000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月27日(2018.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書および図面に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
【表１０】
2018199681.tif 000037
【表１１】
2018199681.tif 000038
【表１２】
2018199681.tif 000039
さらに、本願発明は次の態様を含む。
１. 配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび
配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＣケモカイン受容体２(ＣＣＲ２)エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体。
２. 抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２および配列番号４３／配列番号４４からなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、項１に記載の完全ヒト抗体。
３. 配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび
配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗ＣＣＲ２完全ヒト抗体Ｆａｂフラグメント。
４. 抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２および配列番号４３／配列番号４４からなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、項３に記載の完全ヒト抗体Ｆａｂフラグメント。
５. ペプチドリンカーにより連結された重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗ＣＣＲ２一本鎖ヒト抗体であって、重鎖可変ドメインが配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、一本鎖ヒト抗体。
６. 一本鎖抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号２、配列番号４／配列番号２、配列番号５／配列番号２、配列番号６／配列番号２、配列番号７／配列番号２、配列番号８／配列番号２、配列番号９／配列番号２、配列番号１０／配列番号２、配列番号１１／配列番号２、配列番号１２／配列番号２、配列番号１３／配列番号２、配列番号１４／配列番号２、配列番号１５／配列番号２、配列番号８／配列番号１６、配列番号９／配列番号１６、配列番号１０／配列番号１６、配列番号１１／配列番号１６、配列番号１２／配列番号１６、配列番号１３／配列番号１６、配列番号１４／配列番号１６、配列番号１５／配列番号１６、配列番号８／配列番号３２、配列番号９／配列番号３２、配列番号１０／配列番号３２、配列番号１１／配列番号３２、配列番号１２／配列番号３２、配列番号１３／配列番号３２、配列番号１４／配列番号３２、配列番号１５／配列番号３２、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２および配列番号４３／配列番号４４からなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、項５に記載の一本鎖抗体。
７. 項１〜６のいずれかに記載の抗体、抗体Ｆａｂフラグメントまたは一本鎖抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
８. 配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１および配列番号４３からなる群から選択される重鎖可変ドメインアミノ酸配列に示す相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む重鎖可変ドメインおよび
配列番号２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２および配列番号４４からなる群から選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列に示す相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、単離抗ＣＣＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント。
９. 抗体またはその抗原結合フラグメントが少なくとも１×１０−６Ｍの結合親和性を有する、項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１０. 項８または項９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
１１. 項１〜６のいずれかに記載の抗体、抗体Ｆａｂフラグメントまたは一本鎖抗体を含む、ＣＣＲ２介在障害の処置用医薬。
１２. 項８または９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ＣＣＲ２介在障害の処置用医薬。
１３. ＣＣＲ２介在障害が炎症性または免疫障害、心血管障害、増殖性障害、移植片拒絶反応、線維性疾患、ウイルス感染症、神経障害、代謝障害、再灌流傷害、血液系腫瘍、サイトカイン誘発毒性、敗血症性ショック、内毒素ショック、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスから選択される、項１２に記載の医薬。
１４. ＣＣＲ２介在障害が炎症性または免疫障害、心血管障害、増殖性障害、移植片拒絶反応、線維性疾患、ウイルス感染症、神経障害および代謝障害から選択される、項１１または項１３に記載の医薬。
１５. 炎症性または免疫障害が喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、アナフィラキシー、過敏反応、薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー、アレルギー性接触性皮膚炎、脈管炎、ヒスタミン介在アレルギー性反応、ＩｇＥ介在アレルギー性反応、過敏性肺炎、間質性肺疾患(ＩＬＤ)、特発性肺線維症、リウマチ性関節炎と関係するＩＬＤ、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、脊椎関節症、強皮症、乾癬、炎症性皮膚疾患、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、脈管炎、炎症性糸球体症、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、若年発症型糖尿病、腎炎、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)およびベーチェット病からなる群から選択される、項１３または項１４に記載の医薬。
１６. 心血管障害がアテローム発生、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、心筋梗塞、卒中、急性冠血管症候群、血栓症、アテローム硬化が起源の末梢血管疾患、高血圧および異脂肪血症からなる群から選択される、項１３または項１４に記載の医薬。
１７. 増殖性障害が骨髄腫、白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、腎癌、肝癌、カルシノーマ、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、未分化癌、気管支原性癌、黒色腫、腎細胞癌、肝細胞腫−肝細胞癌、胆管癌、胆道癌、乳頭癌、移行細胞癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、乳癌、消化器癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頚部の扁平上皮細胞癌、肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、中皮肉腫、血液の癌、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、細網肉腫、ホジキン病、神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、シュワン腫および上衣腫からなる群から選択される、項１３または項１４に記載の医薬。
１８. 移植片拒絶反応が同種移植片拒絶反応または移植片対宿主病である、項１３または項１４に記載の医薬。
１９. 線維性疾患が強皮症である、項１３または項１４に記載の医薬。
２０. 神経障害がＡＩＤＳと関係する認知症および疼痛および神経障害性疼痛からなる群から選択される、項１３または項１４に記載の医薬。
２１. 代謝疾患が糖尿病である、項１３または項１４に記載の医薬。
２２. ＣＣＲ２介在疾患が再灌流傷害、血液系腫瘍、サイトカイン誘発毒性、敗血症性ショック、内毒素ショック、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなる群から選択される、項１１に記載の医薬。
【外国語明細書】
2018199681000001.pdf