(57)【要約】      （修正有）【課題】核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）又はコンピューター断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視化される、骨生体特異的な薬剤の提供。【解決手段】核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）及びコンピューター断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視化される、造影剤のコアを含む骨生体特異的な薬剤であって、前記造影剤のコアが、骨−標的ペプチドで機能化された、ポリマーシェルによって囲まれ、前記ペプチドが、使用時、骨への前記生体特異的な薬剤を標的とする、骨生体特異的な薬剤。ＭＲＩ及びＣＴのような画像診断法、骨リモデリング活性の画像化、病理学的な骨の状態及び／もしくは骨修復プロセスの検出又は治療において用いられうる、骨生体特異的な薬剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）またはコンピューター断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視化
される、造影剤のコアを含む骨生体特異的な薬剤であって、前記造影剤のコアが、骨−標
的ペプチドで機能化された、ポリマーシェルによって囲まれ、前記ペプチドが、使用時、
骨への前記生体特異的な薬剤を標的とする、骨生体特異的な薬剤。
【請求項２】
前記造影剤のコアの平均直径が５ｎｍ〜３０ｎｍである、請求項１に記載の生体特異的
な薬剤。
【請求項３】
前記造影剤のコアが金属材料を含む、請求項１または２に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項４】
前記造影剤のコアが、磁性材料を含み、およびＭＲＩ造影剤である、請求項３に記載の
生体特異的な薬剤。
【請求項５】
前記造影剤のコアが、鉄、ニッケル、コバルトもしくはジスプロシウムまたは１以上の
これらの元素を含む、酸化物もしくは合金のような化合物である、請求項３または４に記
載の生体特異的な薬剤。
【請求項６】
前記造影剤が、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記
載の生体特異的な薬剤。
【請求項７】
前記造影剤のコアが、非磁性材料を含み、ならびにＭＲＩ造影剤およびＣＴ造影剤の両
方である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項８】
前記造影剤のコアが、ガドリニウム、金、ヨウ素またはボロサルフェート（ｂｏｒｏ−
ｓｕｌｐｈａｔｅ）を含む、請求項７に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項９】
前記造影剤が、ガドリニウムを含む、請求項８に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項１０】
前記骨生体特異的な薬剤のポリマーシェルが、ポリペプチド、荷電タンパク質、多糖ま
たは核酸を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項１１】
前記ポリマーシェルが、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリ（エチ
レングリコール）ポリ（乳酸）、ポリ（グルコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）お
よびポリ（アクリル酸）を含む生体適合性の天然または合成ポリマーを含む、請求項１〜
１０のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項１２】
前記ポリマーシェルがキトサンを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の生体特
異的な薬剤。
【請求項１３】
前記ポリマーシェルが無水コハク酸で誘導体化されている、請求項１〜１２のいずれか
１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項１４】
前記ポリマーシェルが、骨への生体特異的な薬剤を標的とする、１種または２種以上の
骨−標的ペプチドで機能化される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生体特異的な
薬剤。
【請求項１５】
前記骨−標的ペプチドが、例えば骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、破骨前駆
細胞または骨ライニング細胞のような、排他的に骨に存在する細胞への生体特異的な薬剤
を標的とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項１６】
前記骨−標的ペプチドが、骨芽細胞または破骨細胞への生体特異的な薬剤を標的とする
、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項１７】
前記骨−標的ペプチドが、例えばヒドロキシアパタイトのような、骨ミネラル相への生
体特異的な薬剤を標的とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤
。
【請求項１８】
前記骨−標的ペプチドが、ＲＡＮＫＬ−誘導破骨細胞分化および活性を減少または抑制
するために、ＲＡＮＫに結合することによりＯＰＧをミミックするアミノ酸配列を含む、
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項１９】
前記骨−標的ペプチドが配列番号１〜１５を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記
載の生体特異的な薬剤。
【請求項２０】
前記骨−標的ペプチドが環化している、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の生体特
異的な薬剤。
【請求項２１】
前記骨−標的ペプチドが、共有結合により前記骨生体特異的な薬剤の前記ポリマーシェ
ルに結合している、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項２２】
前記ペプチドがカルボジイミドの化学的性質を用いて前記ポリマーシェルに共有結合し
ている、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項２３】
前記生体特異的な薬剤が、前記骨−標的ペプチドの存在により骨へと運ばれる、生体活
性化合物を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項２４】
前記生体活性化合物が、色素、電気化学メディエータ、タンパク質、ペプチド、化学化
合物（例えば、薬）、遺伝物質（例えば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、小分
子、抗体、または酵素から構成される分子の群から選択される、請求項２４に記載の生体
特異的な薬剤。
【請求項２５】
前記生体特異的な薬剤の平均直径が１０００ｎｍ未満である、請求項１〜２４のいずれ
か１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項２６】
前記生体特異的な薬剤の平均直径が１００〜４５０ｎｍである、請求項１〜２５のいず
れか１項に記載の生体特異的な薬剤。
【請求項２７】
診断に用いられる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項２８】
ＭＲＩ生体標識としてのまたはＣＴ生体標識としての、請求項１〜２６のいずれか１項
に記載の骨生体特異的な薬剤の使用。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤を含む、生体標識。
【請求項３０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤の使用を含む、ＭＲＩまた
はＣＴ画像検査法。
【請求項３１】
治療に用いられる、好ましくは薬剤として用いられる、請求項１〜２６のいずれか１項
に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項３２】
骨疾患を治療する、予防するまたは改善することに用いられる、請求項１〜２６のいず
れか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項３３】
前記骨疾患が、骨吸収、骨腫瘍の治療、パジェット病、変形性関節症、骨粗しょう症、
骨肉腫、骨減少症ならびに溶骨性および造骨性の表現型などを含む骨転移を含む、請求項
３２に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項３４】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤、および薬学的に許容され
るベヒクルを含む、薬剤組成物。
【請求項３５】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の治療上有効な量の骨生体特異的な薬剤と、薬学
的に許容されるベヒクルとを接触させることを有する、請求項３４に記載の組成物の製造
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨のための生体特異的な薬剤、特に骨に対して特異的なペプチドで機能化さ
れた、ナノ粒子、サブミクロン粒子および原子または分子要素を含む、骨生体特異的な薬
剤に関する。本発明は、特に、核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）およびコンピューター断層撮
影法（ＣＴ）のような画像診断法におけるこれらの骨生体特異的な薬剤の使用、ならびに
骨リモデリング活性の画像化、病理学的な骨の状態および／もしくは骨修復プロセスの検
出または治療における前記剤の使用に関する。本発明は、生体特異的な薬剤を用いる骨の
疾患および骨病変の診断ならびに／または治療にまで及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）およびコンピューター断層撮影法（ＣＴ）は、組織の画像
化に最適な方法である。ＭＲＩは、大きな磁場の力に基づき、高含水組織のタンパク質の
アラインメントを一時的に変化させる正味の磁気ベクトルを生成する。ＭＲＩは主に、脳
腫瘍と同様に靭帯、腱および脊髄での損傷の画像化に適している。しかしながら、その技
術は、ＣＴによって得ることができる画像化と同じくらい詳細な骨組織の画像化ができな
い。
【０００３】
ＣＴは、検知器によって検知されたＸ線減衰に基づき、ピクセル値が計算され、次に画
像に変換される。定量的コンピューター断層撮影法（ＱＣＴ）は、二次元領域の骨密度と
は対照的に、骨密度を測定することができ、３次元での実際の体積（ｍｇ／ｃｍ３）を測
定することができる。これにより、オペレーターは、皮質骨と海綿質骨とを区別すること
ができ、また正確に骨格の経時変化を測定することができる。結果として、ＱＣＴは、主
に椎体海綿質骨密度検査のために用いられる。ＱＣＴは、代謝的に活発で構造的に重要な
骨梁を選択的に評価でき、脊椎骨折を区別でき、そして骨損失を測定できる。しかし、Ｑ
ＣＴは、非常に高額であり、二重エネルギーＥ線吸収測定法（ＤＸＡ）と比べた際、患者
により高用量のイオン化放射線を照射する。
【０００４】
造影剤は、画像鮮明度を向上させるため、両方の技術において画像化の改良に不可欠で
ある。組織に対する特異性のない造影剤は、現在、ＭＲＩで使用されており、酸化鉄ナノ
粒子またはガドリニウムのどちらかに基づいている。しかし、良好な画像化と患者への安
全性とを提供するとはいえ、これらの造影剤は、特定の組織および細胞型を認識すること
ができない。さらに、現在のＣＴ造影剤、例えばヨウ素系化合物は、素早い腎クリアラン
ス、腎臓毒性および血管透過による短い撮像時間を含む、いくつかの制限がある。
【０００５】
骨粗しょう症の発症機序は、明確ではないが、データは、破骨細胞の骨吸収活性と骨芽
細胞の骨形成活性との間の不均衡によって生じることを示している。この不均衡な細胞活
動は、臨床的に有意な骨折の起始部である微小破壊の形成の原因となる骨組織の進行性の
衰えを引き起こす。疫学研究は、これらの骨折が、椎体、転子下の大腿骨（ｓｕｂ−ｔｈ
ｒｏｃａｎｔｅｒｉｃ  ｆｅｍｏｕｒａｌ  ｂｏｎｅ）および手根骨を含む、特定の解剖
学的部位で発生しやすいことを示している。不均衡な細胞活動が、ほとんどの骨粗しょう
症の症例において重要な役割を果たしているが、骨損失（すなわち骨減少症）への相対的
な寄与は、年齢、性別、骨粗しょう症への遺伝的な性質、運動不足、投薬、健康状態およ
び栄養を含む、多くの異なる要因により変化するであろう。一般的に、骨粗しょう症は、
原発性（すなわち老人性）または続発性（すなわち非加齢性）のどちらかに分類される。
【０００６】
原発性骨粗しょう症は、さらにＩ型（すなわち閉経後）またはＩＩ型（すなわち非加齢
性）のいずれかにカテゴライズされる。Ｉ型骨粗しょう症は、大部分が更年期でのエスト
ロゲン減少により、５０〜７０歳で主に発症し、柱骨に影響を及ぼす。ＩＩ型は、直接的
に老化と関連し、通常、７０歳以上で発症し、柱骨と皮質骨の両方に影響を及ぼす。しか
し、骨密度の変化が年齢に関係なくすべての人で起こることはよく知られている。通常の
成長の間、骨形成は、最大骨量（ＰＢＭ）に到達する３０〜３５歳までは、骨減少よりも
速い。ＰＢＭに到達すると、男女共に、かなりの個人差があり、１年あたり０．５〜２％
の割合で骨の減少が始まる。女性では、閉経がさらに約１０年の間、骨の減少の割合を加
速させる。
【０００７】
続発性骨粗しょう症は、健康状態を根底とする合併症またはライフスタイル（例えばア
ルコール摂取、薬物乱用または質の悪い食生活）のいずれかに起因し、あらゆる年齢の人
々に影響を与えうる。実際に、人生の初期に予測されるよりも低い骨密度の幼児は、骨粗
しょう症を発症すると報告されている。続発性骨粗しょう症を引き起こしうる健康状態は
、ホルモンの不均衡、関節リウマチ、肝不全、腎不全、正常に機能しない胃腸機能、多発
性硬化症、壊血病、神経性無食欲症およびアスリート三主徴症候群を含む。いくつかのケ
ースでは、骨粗しょう症を引き起こす状態ではないが、薬が使用される。健康状態を管理
するためのコルチコステロイド、いくつかのホルモン、およびリチウムのような薬剤は、
続発性骨粗しょう症の発症とつながっている。一般的に、骨粗しょう症は、男性よりも女
性において臨床的優位性がある。
【０００８】
骨肉腫は、十分に組織化されていない類骨につながる骨芽細胞分化または骨統合性に影
響を与える骨成長を特徴とする、最も一般的な原発性肉腫（発生率：０．２〜３／１００
０００／年）である。骨肉腫も悪性でありうるが、悪性腫瘍の中での絶対発生率は低い。
厳格な組織学的定義では、骨肉腫病変は、組織学的特徴および悪性度において、著しく異
なり、その予後は、それらのパラメータだけではなく、その解剖学的部位に依存する。骨
肉腫の他の特徴は、不定量の軟骨基質と時として実際の骨生産を支配する繊維組織を生み
出す傾向がある。結果として、３つのサブタイプの分類、すなわち造骨性、軟骨簿細胞性
および線維芽細胞の骨肉腫がある。骨格組織では、骨肉腫は、通常、長い四肢骨の骨幹端
、もっとも一般的には膝周辺で発症し、軸骨格または頭蓋顔面骨でのその存在は、成人で
広く観察される。骨に関し、骨肉腫は、骨の内部（髄内のまたは皮質内の部分）、骨の表
面、および骨外性部位で発症するであろう。
【０００９】
骨転移は、造骨性、溶骨性または造骨性および溶骨性両方の表現型により特徴づけられ
る。異なる悪性腫瘍は、骨向性および骨での最も一般的な転移性沈着である癌での骨に対
するより高い親和性を示す。最後に骨に至る一般的な癌は、乳癌、前立腺癌および肺癌を
含む。したがって、腫瘍学の分野における重要な課題として広く認められている。骨の時
点で、転移細胞は、可溶性媒体の放出を通じてまたは細胞間接触を介してＲＡＮＫＬの発
現および放出の増加を含む、造骨性の増殖および活性を増やす。次に、このことは、前破
骨細胞の分化とＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ相互作用による成熟破骨細胞の活性を盛んにする。
破骨細胞による骨吸収は、サイトカインおよび腫瘍細胞に必要であるＴＧＦ−βやインシ
ュリン様成長因子（ＩＧＦ）のような他の成長因子を放出し、よって腫瘍の成長を促進し
、そのプロセスを持続させる。増加した骨吸収は、Ｘ線、濃度測定法およびＭＲＩによっ
て測定可能な溶骨性病変を残す。造骨性転移は、異常な骨形成を増加させ、Ｘ線およびＭ
ＲＩで骨の高密度領域として見られる。
【００１０】
骨吸収活性化の頻度は、骨吸収段階と骨形成段階での差異よりも、健康な骨と病変した
骨との間で変化する。骨活性化の頻度は、骨の表面でのいわゆる骨多細胞ユニット（ＢＭ
Ｕ）の量により特徴づけられ、これは通常の骨よりも骨粗しょう症の骨で多く、増加した
破骨細胞および骨格での吸収窩と関連している。骨粗しょう症のような全身性疾患の骨生
検での組織学的染色は、診断として用いられるであろうし、染色は、診断や治療に用いら
れる固体微粒子物質を微視的に局所化できるであろう（すなわち鉄のプルシアンブルー染
色）。
【００１１】
上記観点から、骨関連疾患を診断および／または治療するための新たな方法を提供する
ことの必要性の増加は明らかであろう。
【発明の概要】
【００１２】
したがって、本発明の第１の態様によると、核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）またはコンピ
ューター断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視化される、造影剤のコアを含み、前記造影剤の
コアが、骨−標的ペプチドで機能化された、ポリマーシェルによって囲まれ、前記ペプチ
ドが、使用時、骨への生体特異的な薬剤を標的とする、骨生体特異的な薬剤が提供される
。
【００１３】
本発明の骨生体特異的な薬剤は、以下で詳述する、異なるナノ粒子、サブミクロン粒子
および原子または分子要素の範囲の設計、開発ならびに改良に、ならびにＭＲＩまたはＣ
Ｔ画像化技術のいずれかでのそれらの使用に基づいている。骨生体特異的な薬剤は、通常
の造影剤を含むコアを含み、コアは、骨の細胞（例えば、骨芽細胞または破骨細胞）また
は石灰化した骨細胞外マトリクスを特異的に認識できるペプチドで機能化されている。し
たがって、前記ペプチドは、薬剤を骨病理学での生体認識に対して特異的にする。実施例
１〜３に記載され、および図５Ｅに示されているように、本発明者らは、異なる範囲の骨
−標的ペプチドがポリマーシェルを機能化するために用いられる一連の異なる骨特異的な
薬剤を調製した。コア内の造影剤として用いられる材料、ポリマーシェルを形成するポリ
マー、および骨特異的機能化ペプチドの厳選により、骨生体特異的な薬剤がさまざまな骨
関連疾患の診断および／または治療のいずれかで使用されうる。よって、生体特異的な薬
剤は、骨リモデリング活動の画像化、病態の検出（例えば、骨吸収または骨腫瘍）および
／または骨折もしくは外科的介入後の組織修復過程で用いられるであろう。有利には、本
発明の生体特異的な薬剤は、骨リモデリングに必須である病変した骨の要素と特異的に接
触するために設計され、低侵襲性初期診断および／または骨疾患の治療のための注入材料
として注意深く調製されうる。
【００１４】
好ましくは、造影剤は、外側のポリマーシェルで覆われた本発明の骨生体特異的な薬剤
の内側のコアを形成または構成する。造影剤コアの平均直径は、５ｎｍ〜３０ｎｍ、また
は１０ｎｍ〜２０ｎｍであろう。
【００１５】
ＭＲＩまたはＣＴを用いて可視化される、造影剤コアは、金属または非金属材料を含む
ことができる。造影剤コアは、磁性または非磁性材料を含むことができる。造影剤が磁性
である形態では、ＭＲＩ造影剤を含みうる。造影剤は、常磁性または超常磁性材料を含む
ことができる。例えば、造影剤コアは、鉄、ニッケル、コバルトもしくはジスプロシウム
または１以上のこれらの元素を含む、酸化物もしくは合金のような化合物を含むことがで
きる。好ましくは、造影剤は、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）を含む。
【００１６】
造影剤材料は非磁性である形態では、ＭＲＩおよびＣＴ造影剤の両方を含むことができ
る。例えば、造影剤コアは、ガドリニウム、金、ヨウ素またはホウ硫酸塩（ｂｏｒｏ−ｓ
ｕｌｐｈａｔｅ）を含むことができる。これらの材料のそれぞれは、ＭＲＩ造影剤または
ＣＴ造影剤のいずれかとして用いることができる。好ましくは、造影剤は、ガドリニウム
を含む。
【００１７】
骨生体特異的な薬剤のポリマーシェルは、ポリマーを含むことができ、ポリマーは、ポ
リペプチド、帯電したタンパク質、多糖または核酸を含むであろう。適切なポリマーは、
制限されないが、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリ（エチレングリ
コール）ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）およびポリ
（アクリル酸）を含む、任意の生体適合性の天然または合成ポリマーを含むことができる
。ポリマーシェルのための好ましいポリマーは、キトサンを含むであろう。キトサンは、
ランダムに分布したβ−（１−４）−結合Ｄ−グルコサミン（脱アセチル化（ｄｅａｃｅ
ｔｙｌｅａｔｅｄ）ユニット）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化ユニ
ット）を含む鎖状多糖として知られている。
【００１８】
ポリマーシェルは、ポリマーおよび造影剤コア表面の化学的性質に応じて、物理吸着ま
たは共有結合によって造影剤に結合している。骨−標的ペプチドとの効率の良い機能化を
可能にするために、ポリマーシェルを誘導体化することが好ましいであろう。例えば、ポ
リマーシェルは、ポリマーを無水コハク酸と反応させることで誘導体化されうる。このこ
とは、立体障害を減少させるであろう、ポリマーと骨−標的ペプチドとの間のスペーサー
を提供するために行われうる。また、使用されるポリマー（例えば、キトサン）の溶解度
および生理的ｐＨを改善するであろう。無水コハク酸はまた、ジヒドロ−２，５−フラン
ジオンとして知られており、分子式Ｃ４Ｈ４Ｏ３である。ポリマー、例えば、キトサンを
無水コハク酸で誘導体化しうる方法は、当業者に知られているであろうし、実施例１にも
記載される。
【００１９】
ポリマーシェルに結合する骨−標的ペプチドの量は、官能基の量、使用するポリマーの
種類および結合の化学的性質に依存する。好ましくは、前記ペプチドは、ポリマーシェル
の外表面を覆うように相隔たる配列で並べられる。ポリマーシェルは、骨生体特異的な薬
剤を骨への標的とする、骨−標的ペプチドの１種類（すなわち、同じ配列）で機能化され
るであろう。しかし、前記シェルは、２種類以上（すなわち、異なる配列を有する）の骨
−標的ペプチドで機能化されうる。
【００２０】
例えば、骨−標的ペプチドは、骨生体特異的な薬剤を骨に排他的に存在する細胞、例え
ば、骨芽細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、破骨前駆細胞または骨ライニング細胞への標的と
するであろう。好ましくは、骨−標的ペプチドは、骨生体特異的な薬剤を骨芽細胞または
破骨細胞への標的とする。骨芽細胞および破骨細胞間ならびに骨芽細胞および破骨細胞内
細胞間情報伝達に対し特異的であるギャップ結合情報伝達（例えば、コネクシン４３、ｃ
ｘ４３）をミミックできる配列を有するペプチドはまた、骨−標的ペプチドとして用いら
れるであろう。さらに、骨−標的ペプチドは、骨生体特異的な薬剤を骨ミネラル相、すな
わちヒドロキシアパタイトへ導くことができる。したがって、ヒドロキシアパタイト−標
的ペプチドを含む骨生体特異的な薬剤は、衝撃的な出来事に続くまたは骨粗しょう症のよ
うな疾患の進行の間の形成する骨組織のミネラル化をモニターするための有益なツールで
ある。
【００２１】
パジェット病のような骨リモデリングサイクルおよび海綿骨転移癌に関連した多くのヒ
ト骨疾患は、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｔｅｒｉｎ）（ＯＰＧ）とＲ
ＡＮＫＬとの間の不均衡を示している。したがって、本発明者らは、ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫ
Ｌ−ＯＰＧ経路および関連経路が代謝性骨疾患の治療用や診断用である費用効率の高い、
生体特異性材料を開発するのに役立つであろうと考えている。
【００２２】
したがって、骨−標的ペプチドは、ギャップ結合細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）およびＲ
ＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ−ＯＰＧトライアド経路に関連しうる。本発明の骨生体特異的な薬剤
がＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬに特異的であるという事実は、検体内の細胞を同定し、標的とす
るであろうことを意味する。骨肉腫や骨疾患のような疾患では、腫瘍は、Ｘ線やＭＲＩに
より特定されるであろうし、骨生体特異的な薬剤は、シグナルを強めることができ、他で
は検出できないであろうより小さな病変を可視化しうる分解能を改善できる。
【００２３】
骨−標的ペプチドは、ＲＡＮＫＬ−誘導破骨細胞分化および活性を減少または抑制する
ために、ＲＡＮＫに結合することによりＯＰＧをミミックするアミノ酸配列を含むであろ
う。あるいは、骨標的ペプチドは、破骨細胞−破骨細胞相互作用およびまたは破骨細胞−
骨芽細胞相互作用の阻害に関与するＣｏｎｎｅｘｉｎ４３のようなタンパク質をミミック
することができるであろう。骨−標的ペプチドはまた、移動する骨芽細胞または骨のミネ
ラル相（例えば、ヒドロキシアパタイト）を認識するのに用いられうる。したがって、骨
−標的ペプチドは、下記のアミノ酸配列の一つを含むであろう。
【００２４】
（ａ）ＳＲＰＴＥＫＴＩＦＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）。このペプチドは、Ｃｏｎ
ｎｅｘｉｎ４３ミミックペプチド（Ｃｘ４３）Ｇａｐ２７に由来し、破骨細胞−破骨細胞
相互作用および／または破骨細胞−骨芽細胞相互作用を阻害するために用いられうる。こ
のペプチドは、本明細書で言及する際、ＧＡＰ２７ｐとする。既知の配列であり、骨芽細
胞−破骨細胞接触依存性細胞情報伝達を阻害する。
【００２５】
（ｂ）ＹＣＬＥＩＥＦＣＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）。このペプチドは、ＯＰＧ残存
１１３−１２２（これは、ＯＰＧのアミノ酸配列を表し、アミノ酸１１３〜１２２により
同定されたタンパク質の部位に由来する）に基づき、特異的にＲＡＮＫに結合し、ＲＡＮ
ＫＬ−誘導破骨細胞分化および活性を阻害する。このペプチドは、本明細書で言及する際
、ＯＰ３−１とする。
【００２６】
（ｃ）ＹＣＥＩＥＦＣＹＬＩＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）。このペプチドは、ＯＰＧ
残存１１３〜１２２に基づき、特異的にＲＡＮＫに結合し、ＲＡＮＫＬ−誘導破骨細胞分
化および活性を阻害する。このペプチドは、本明細書で言及する際、ＯＰ３−４とする。
【００２７】
（ｄ）ＦＨＲＲＩＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）。このペプチドは、特異的に骨芽細
胞に結合し、移動を促進する。
【００２８】
（ｅ）ＰＳＨＲＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）。ことペプチドもまた、特異的に骨芽細
胞に結合する。
【００２９】
（ｆ）ＹＩＧＳＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）。このペプチドは、特異的に骨内皮細
胞に結合する。
【００３０】
（ｇ）ＳＴＬＰＩＰＨＥＦＳＲＥ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）。このペプチドは、ヒ
ドロキシアパタイトに高い親和性を有する。
【００３１】
（ｈ）ＶＴＫＨＬＮＱＩＳＱＳＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）。このペプチドもまた
、ヒドロキシアパタイトに高い親和性を有する。
【００３２】
本発明者らは、いくつかの形態において、ポリマーシェルへ骨−標的ペプチドを結合す
るためにＣペプチドまたはスペーサーペプチド、好ましくはそれらの誘導体化した形態（
例えば、コハク酸との）を用いることが好ましいことを見出した。かかるＣペプチドは、
溶液中での改善した溶解性を示し、したがって、ペプチドの薬剤へのグラフト工程を促進
し、その後バイオリガンドの細胞への提示を改善する。
【００３３】
一つの実施形態では、用いられるであろう適切なＣペプチドは、アミノ酸配列Ｋ−（Ｋ
Ｋ）を含むであろう。このペプチドは、本明細書で言及する際、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９
またはＧ１ＰＬとする。このペプチドは、極性分子であり、よって溶解性と到達性を改善
する。
【００３４】
他の実施形態では、Ｃペプチドは、アミノ酸配列Ｋ−（ＫＫ）−（ＫＫＫＫ）を含むで
あろう。このペプチドは、本明細書で言及する際、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０またはＧ２
ＰＬとする。
【００３５】
さらに他の実施形態では、Ｃペプチドは、アミノ酸配列Ｋ−（ＫＫ）−（ＫＫＫＫ）−
（ＫＫＫＫＫＫＫＫ）を含むであろう。このペプチドは、本明細書で言及する際、ＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ．１１またはＧ３ＰＬとする。
【００３６】
したがって、骨−標的ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１１、もしくは機能的変
異体またはそのフラグメントのいずれかを含むであろう。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．
１〜８としたペプチドのいずれかは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１１と結合されるであろ
う。したがって、他の実施形態では、骨−標的ペプチドは、下記のアミノ酸配列、もしく
は機能的フラグメントまたはそれらの変異体を含むであろう：
（ｉ）（ＫＫＫＫ）−（ＫＫ）−Ｋ−ＹＣＬＥＩＥＦＣＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２
）。このペプチドは、ＣペプチドＧ２ＰＬ（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）に係
留したＯＰ３−１ペプチド（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）を含むであろう。この
ペプチドは、本明細書で言及する際、Ｇ２ＰＬ−ＯＰ３−１とする。
【００３７】
本発明者らはまた、骨−標的ペプチドは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカ
ン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（すなわち、ＤＯＴＡ）を含みうることを示している
。それは、ガドテル酸を含み、キレート剤として有機酸「ＤＯＴＡ」からなる、大環状構
造のＧｄ系ＭＲＩ造影剤である。したがって、他の実施形態では、骨−標的ペプチドは、
下記のアミノ酸配列、もしくは機能的フラグメントまたはそれらの変異体を含むであろう
：
（ｊ）ＤＯＴＡ−ＫＧＧ−ＹＣＬＥＩＥＦＣＹＬＩＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）。
ＭＲＩ可視化Ｇｄ3＋のキレート化のための新規のＤＯＴＡ−係留ＯＰ３−４ペプチドで
ある。このペプチドは、本明細書で言及する際、ＤＯＴＡ−ＯＰ３−４とする。
【００３８】
（ｋ）ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＫＧＧ−ＹＣＬＥＩＥＦＣＹＬＩＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１
４）。このペプチドは、Ｇｄ3＋キレートを有する新規のＭＲＩ−検出ＯＰ３−４誘導体
である。このペプチドは、本明細書で言及する際、ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４とする。
【００３９】
（ｌ）ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＦＨＲＲＩＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）。このペプチド
は、Ｇｄ3＋キレートを有する新規のＭＲＩ−検出骨芽細胞移動誘導体である。このペプ
チドは、本明細書で言及する際、ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＦＨＲＲＩＫＡとする。
【００４０】
ＤＯＴＡ分子は、かなり大きく、非常に酸性で反応性が高く、そしてこの分子は、骨−
標的ペプチドの効力を損なうことを避けるためにスペーサーペプチドまたはＣペプチドの
ユーザーを必要とするであろう。
【００４１】
実施例で記載するように、骨−標的ペプチドは、既知の方法で合成され得、例えば、通
常の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護／脱保護戦略を用いる固
相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）である。
【００４２】
骨−標的ペプチドは、環化されるであろう。環化形態は、より化学的に安定であり、改
善された活性を報告するものがあり（Ｓｈｉｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  ２００８参照）、例え
ばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）酸化によりシステイン−システインジスルフィド結
合を形成する。
【００４３】
骨−標的ペプチドは、共有結合により骨生体特異的な薬剤のポリマーシェルに結合して
いるであろう。好ましくは、ポリマーシェルは、例えば無水コハク酸を用いて、誘導化さ
れうる、キトサンを含む。一つの形態において、前記ペプチドは、本発明のナノ粒子を作
製するためにカルボキシジイミドの化学作用を用いてポリマーシェルと共有結合している
であろう。
【００４４】
骨生体特異的な薬剤は、骨−標的ペプチドの存在により骨へと運ばれうる、生物活性化
合物を含む。例えば、生物活性化合物は、色素、電気化学メディエータ、タンパク質、ペ
プチド、化学化合物（例えば、薬）、遺伝物質（例えば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、
ＲＮＡ）、小分子、抗体、または酵素からなる分子の群から選択されうる。生物活性化合
物は、骨生体特異的な薬剤に結合され、例えば架橋時のカプセル化、吸収、イオンチャネ
ル型相互作用または直接にポリマーコーティングの共有結合によるであろう。
【００４５】
一つの形態では、骨生体特異的な薬剤は、ナノ粒子を含むであろう。他の形態では、骨
生体特異的な薬剤は、サブミクロン粒子を含むであろう。ナノ粒子は、実質的に球状であ
りうる。
【００４６】
生体特異的な薬剤の平均直径は、サブミクロン、すなわち１０００ｎｍ未満でありうる
。生体特異的な薬剤の平均直径は、１００〜４５０ｎｍでありうる。
【００４７】
骨生体特異的な薬剤は、まずイオンチャネル型の架橋工程を行い、次に所定の濃度のポ
リマーおよび架橋剤を溶解することにより生産されるであろう。内部造影剤コアは、混合
物に添加されるであろう。ポリマーは、造影剤を含む溶液に溶解されるであろう（例えば
、連続攪拌中の液滴）。混合物は、反応させることができるであろう（例えば、少なくと
も３０分）。混合物は、その後、遠心分離され、得られた粒子（つまり、生体特異的な薬
剤）は、適切な溶媒（例えば、エタノールまたは水）にて回収されるであろう。粒子は、
保存のために凍結乾燥するおよび／または特性を明らかにされるであろう。Ｃペプチド（
またはスペーサー）は、例えば開環反応を行うため、例えば無水コハク酸の場合に、加え
られるであろう。最後に、骨−標的ペプチドは、例えばカルボキシジイミドの化学作用を
用いて、加えられるであろう。
【００４８】
実施例４に記載されているように、本発明者らは、本発明の骨生体特異的な薬剤が、用
いられる造影剤の材料によって、ＭＲＩまたはＣＴ画像化技術にて効果的に使用されうる
ことを明らかにしている。
【００４９】
したがって、第２の態様では、診断に用いるための、第１の態様の骨生体特異的な薬剤
を提供する。
【００５０】
骨生体特異的な薬剤が、さまざまな異なる生物学的な画像処理アプリケーションでバイ
オセンサーとして用いられうることは明らかであるだろう。例えば、生体特異的な薬剤は
、好ましくは、生体標識として、ＭＲＩまたはＣＴ画像化技術にて用いられる。
【００５１】
したがって、第３の態様では、ＭＲＩ生体標識として、またはＣＴ生体標識として、第
１の態様の骨生体特異的な薬剤の使用を提供する。
【００５２】
第４の態様では、第１の態様の骨生体特異的な薬剤を含む生体標識を提供する。
【００５３】
生体標識は、ＭＲＩまたはＣＴ画像検査で使用されうる。
【００５４】
第５の態様では、第１の態様の骨生体特異的な薬剤の使用を含むＭＲＩまたはＣＴ画像
検査法を提供する。
【００５５】
本発明者らは、骨生体特異的な薬剤が骨リモデリング活性の画像化、病態の検出（例え
ば骨吸収、骨腫瘍、骨粗しょう症など）および／または骨折後の骨組織修復過程で用いら
れうることを明らかにしている。さらに、骨特異的な薬剤の強力な骨−標的タンパク質を
利用できるさまざまな画像化技術に加えて、実施例５はまた、どのように本発明の骨生体
特異的な薬剤を破骨細胞形成および破骨細胞の活性化を抑制するために効果的に使用でき
るかについて明らかにしている。したがって、本発明者らは、骨生体特異的な薬剤が骨疾
患の治療のためのさまざまな治療用途に用いられうると考えている。
【００５６】
したがって、第６の態様では、治療に用いられ、好ましくは薬剤としての第１の態様の
骨生体特異的な薬剤を提供する。
【００５７】
本発明の骨生体特異的な薬剤は、骨疾患を予防するまたは治療するために特に有益であ
る。
【００５８】
したがって、第７の態様では、骨疾患を治療する、予防するまたは改善することに用い
られる、第１の態様の骨生体特異的な薬剤を提供する。
【００５９】
第８の態様では、骨疾患を治療する、予防するまたは改善する方法が提供され、前記方
法は、かかる治療を必要とする患者に対し、治療上有効な量の第１の態様の骨生体特異的
な薬剤を投与することを含む。
【００６０】
治療されうる骨疾患の例は、骨吸収、骨腫瘍の治療、パジェット病、変形性関節症、骨
粗しょう症、骨肉腫、骨減少症ならびに溶骨性および造骨性の表現型などを含む骨転移を
含む
本発明の骨生体特異的な薬剤が、単剤治療で用いられうる、薬剤として使用されうるこ
とは明らかであるだろう。また、本発明の薬剤は、添加物として、もしくはそれらの組み
合わせとしてまたは骨疾患を治療するための既知の治療との組み合わせとして用いられる
であろう。
【００６１】
本発明の生体特異的な薬剤は、特に、組成物が使用される方法に応じて、多くの異なる
形態を有する組成物と組み合わされるであろう。したがって、例えば、組成物は、粉、粉
懸濁液、タブレット、カプセル、液体、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセ
ル溶液の形態、または治療を必要とするヒトもしくは動物に投与されうるその他の適切な
形態であろう。本発明の薬剤のベヒクルが、投与される被験者に良好な耐容性を示すもの
であるべきことは明らかであろう。
【００６２】
本発明の生体特異的な薬剤を含む薬剤はまた、持続放出性または遅延放出性デバイスに
含有されるであろう。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して設置されるであろう。
かかるデバイスは、本発明の生体特異的な薬剤での長期治療が必要とされるときに、通常
頻繁な投与（例えば、少なくとも連日投与）を必要とするときに、特に有効であろう。
【００６３】
好ましい形態として、本発明の生体特異的な薬剤および本発明の組成物は、被験者に対
し、血流に注入または治療を必要とする部位、すなわち骨へと直接注入することで投与さ
れるであろう。注入は、静脈に（ボーラス投与もしくは点滴）もしくは皮下に（ボーラス
投与もしくは点滴）、または皮内に（ボーラス投与もしくは点滴）もしくは骨内にされう
る。
【００６４】
必要とされる本発明の生体特異的な薬剤の量は、その生物活性およびバイオアベイラビ
リティにより決定され、それぞれ投与方法、薬剤の物理化学的性質および単剤療法でまた
は併用療法のいずれかで用いられるかに依存することは明らかであろう。投与頻度はまた
、治療される被験者での薬剤の半減期に影響されるであろう。投与される最適用量は、当
業者によって決定されるであろうし、使用する特定の薬剤、薬剤組成物の強さ、投与方法
および診断もしくは治療される疾患の進行で変わるであろう。治療される特定の被験者に
よって決まる追加の要素は、被験者の年齢、体重、性別、食習慣、および投与時期を含む
、投与量の調整を必要とするであろう。
【００６５】
一般的に、生体特異的な薬剤の体重あたり０．０１μｇ／ｋｇから体重あたり０．５ｇ
／ｋｇの１日用量が、骨疾患の治療、改善、または予防のために用いられるであろう。
【００６６】
本発明の薬剤は、疾患の発症前、発症中または発症後に投与されうる。１日用量は、単
回投与（例えば、１日１回の注入）で与えられるであろう。また、薬剤は、１日あたり２
回以上の投与を必要とするであろう。例として、薬剤は、２５ｍｇから７０００ｍｇ（す
なわち、体重７０ｋｇと仮定して）の１日２回（または治療される骨疾患の重症度により
それ以上）投与されるであろう。治療を受ける患者は、目が覚めたときに１回目、その後
夜に２回目の投与またはその後３〜４時間おきに投与されるであろう。または、持続放出
性デバイスは、反復投与をする必要なしに患者へ薬剤の適量を与えるために用いられうる
。
【００６７】
製薬産業で通常用いられているような、既知の手段（例えば、インビボ実験、臨床試験
など）は、生体特異的な薬剤を含む特定の製剤を製造および正確な治療計画（例えば、薬
剤の１日投与量や投与頻度）を作成するために用いられるであろう。
【００６８】
したがって、本発明の第９の態様では、第１の態様の骨生体特異的な薬剤、および薬学
的に許容されるベヒクルを含む、薬剤組成物を提供する。
【００６９】
本発明はまた、第１０の態様として、第１の態様の治療上有効な量の骨生体特異的な薬
剤と、薬学的に許容されるベヒクルとを接触させることを含む、第９の態様の組成物の製
造方法を提供する。
【００７０】
「被験者」は、脊椎動物、哺乳類、または家畜でありうる。したがって、本発明の組成
物および薬剤は、いかなる哺乳類、例えば、家畜（例えば、馬）、ペットを治療するため
に用いられるであろうし、または他の獣医用外用薬で用いられるであろう。しかし、もっ
とも好ましくは、被験者はヒトである。
【００７１】
生体特異的な薬剤の「治療上有効な量」は、被験者に投与される際、骨疾患を治療する
、または所望の効果をもたらすために必要とされる薬剤または薬物の量であるいかなる量
をいう。例えば、用いられる薬剤の治療上有効な量は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇで
ありうる。
【００７２】
本明細書において「薬学的に許容されるベヒクル」とは、薬剤組成物を製剤化するのに
有用であると当業者に知られているいかなる既知の化合物または既知の化合物の組み合わ
せをいう。
【００７３】
一つの実施形態では、薬学的に許容されるベヒクルは、固体であり、組成物は、粉また
はタブレットの形態でありうる。固体の薬学的に許容されるベヒクルは、香味剤、潤滑剤
、可溶化剤、懸濁化剤、染料、賦形剤、流動促進剤、圧縮補助剤、不活性バインダ、甘味
料、防腐剤、染料、コーティング、またはタブレット−崩壊剤となりうる１以上の物質を
含むであろう。ベヒクルはまた、封入材料でありうる。粉において、ベヒクルは、本発明
の微粉化した活性薬剤と混合する微細化した固体である。タブレットにおいて、活性薬剤
（例えば、生体特異的な薬剤）は、適切な割合で必要な圧縮特性を有するベヒクルと混合
され、所望の形やサイズに圧縮されるであろう。粉およびタブレットは、好ましくは、カ
プセルまたはセルの９９％まで含む。適切な固体のベヒクルは、例えば、リン酸カルシウ
ム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、スターチ、ゼ
ラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含
む。他の実施形態では、薬剤ベヒクルは、ゲルであり、組成物はクリームなどの形態であ
りうる。
【００７４】
しかし、薬剤ベヒクルは、液体であり得、薬剤組成物は、溶液の形態である。液体ベヒ
クルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤および加圧組成物を調製
するのに用いられる。本発明の薬剤は、水、有機溶媒、薬学的に許容される油もしくは脂
またはそれらの両方のような薬学的に許容されるベヒクルに溶解または懸濁されうる。液
体ベヒクルは、可溶化剤、乳化剤、バッファー、防腐剤、甘味料、香味剤、懸濁化剤、増
粘剤、染料、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤のような他の適切な医薬品添加物を
含むことができる。経口および非経口投与のための液体ベヒクルの適切な例は、水（部分
的に上記の添加物、例えばセルロース誘導体、好ましくは、カルボキシメチルセルロース
ナトリウム液）、アルコ―ル（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコール
を含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分別されたココナッツ油およびラ
ッカセイ油）を含む。
【００７５】
非経口投与のために、ベヒクルはまた、オレイン酸エチルやミリスチン酸イソプロピル
のような油性エステルでありうる。滅菌液体ベヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形
態組成物において有用である。
【００７６】
滅菌溶液または懸濁液である、液体薬剤組成物は、例えば、筋肉、くも膜下、硬膜外、
腹腔内、静脈内および特に皮下注入に利用されうる。薬剤は、滅菌水、生理食塩水、また
は他の適切な滅菌の注入可能媒体を用いて投与時に溶解または懸濁されるであろう滅菌固
体組成物として調製されうる。
【００７７】
本発明の生体特異的な薬剤および薬剤組成物は、他の溶質または懸濁化剤（例えば、溶
液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁塩、アカシア、ゼラチン
、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（エチレンオキシドと共重合したソル
ビトールおよびその無水物のオレイン酸エステル）などを含む滅菌溶液または懸濁液の形
態で経口投与されうる。本発明の生体特異的な薬剤はまた、液体または固体組成物形態の
いずれかで経口投与されうる。経口投与に適した組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、タブ
レット、および粉などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル剤、および懸濁
液のような液体形態を含む。非経口投与に有用な形態は、滅菌溶液、エマルジョン、およ
び懸濁液を含む。
【００７８】
本明細書に記載されたすべての特徴、および／または開示されたいかなる方法もしくは
プロセスのすべての工程は、少なくともいくつかのかかる特徴および／または工程が互い
に排他的である組み合わせを除き、いかなる組み合わせにおける上記のいかなる態様と組
み合わせられうる。
【００７９】
本発明のよりよい理解のため、およびその実施形態がどのような効果を奏するのかを示
すために、例として、添付の図面が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、コハク酸誘導体化キトサン（Ｓｕｃ−Ｃｈｉ）を生成するための無水コハク酸によるキトサン（ＣＳ）誘導体化反応のスキームを示す。
【図２】図２は、非誘導体化キトサン（ＣＳ、Ａ）および誘導体化キトサン（Ｓｕｃ−Ｃｈｉ、Ｂ）のＮＭＲデータを示す。（Ｂ）の垂直矢印は、非修飾ＣＳに存在するピークの消失を示す。
【図３】図３は、非誘導体化ＣＳと比較した、ｓｕｃ−ｃｈｉにおける無水コハク酸でのＣＳの誘導体化の度合いを示す。
【図４】図４は、Ｓｕｃ−ＣｈｉでのＣＳ誘導体化および次のアミノ酸配列ＹＣＥＩＥＦＣＹＬＩＲを有するＯＰ３−４ペプチドでのその機能化のＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図５】図５Ａは、動的光散乱法（ＤＬＳ）分析（ＡおよびＢ）およびＣＳビーズ（ＡおよびＣ）の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＣおよびＤ）ならびに本発明の生体特異的造影剤ナノ粒子の一形態を示す。図５Ｅは、本発明のナノ粒子の一形態の略図である。
【図６−１】図６は、ろ過工程ありおよびなしにおけるナノ粒子サイズでのキトサン濃度の影響を示す。（Ａ）１５０分子量、（Ｂ）４００分子量。
【図６−２】図６は、ろ過工程ありおよびなしにおけるナノ粒子サイズでのキトサン濃度の影響を示す。（Ｃ）６００分子量、（Ｄ）異なる分子量のＣｈ（ｎ＝４）での濃度依存性。
【図７】図７は、ＤＯＴＡ−ＯＰ３−４の代表的な構造を示し、すなわち骨細胞で発現したサイトカインを特異的に標的とする、ＯＰＧミミックペプチド（ＯＰ３−４）と、造影剤としてガドリニウム（Ｇｄ３＋）のような複数の金属イオンをキレートするために用いられうる、ＤＯＴＡとの結合の結果を示す。
【図８】図８は、ＤＯＴＡ−ＯＰ３−４の集合の略図である。数字の矢印は、集合の順番を示す。
【図９】図９は、ＤＯＴＡ−ＯＰ３−４のイオントラップＭＳスペクトルを示す。
【図１０】図１０は、Ｇ２ＰＬ−ＯＰ３−１の集合の略図である。数字の矢印は、集合の順番を示す。
【図１１】図１１は、Ｇ２ＰＬ−ＯＰ３−１のイオントラップＭＳスペクトルを示す。
【図１２】図１２は、ナノ粒子でのおよびナノ粒子−ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４複合体でのＯＰ３−４ペプチドのアミノ酸分析を示す。
【図１３】図１３は、ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４複合体、ならびにネガティブコントロールのＤＯＴＡ−ＯＰ３−４複合体およびＰＢＳのＭＲＩ分析を示す。
【図１４】図１４は、０．４μｇ／ｍｌでの磁性ナノ粒子−ＯＰ３−４複合体（ｍＳＣＢ）、ナノ粒子−ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４複合体のＭＲＩ分析を示す。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をネガティブコントロールとして用いた。ガドリニウム系および磁性ビーズ系造影剤は、それぞれ典型的な明暗画像を提供する。
【図１５】図１５は、ｒｈ  ＲＮＡＫＬ誘導破骨細胞形成へのペプチドの影響を示す。モノサイトは、濃度が１００μＭのペプチドを加えたαＭＥＭ培地で６日間培養した。ｒｈ  ＲＮＡＫＬ濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであり、ｒｈ  Ｍ−ＣＳＦ濃度は、２５ｎｇ／ｍｌであり、ｒｈ  ＯＰＧは、５０ｎｇ／ｍｌであった。それぞれの用量の培地は、３日後に交換された。
【図１６】図１６は、ｒｈ  ＲＮＡＫＬ誘導破骨細胞形成へのペプチド係留ナノ粒子の影響を示す。モノサイトは、ペプチド（１００μＭ）およびビーズ（２５μｇ／ｍｌ）を加えたαＭＥＭ培地で６日間培養した。ｒｈ  ＲＮＡＫＬ濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであり、ｒｈ  Ｍ−ＣＳＦ濃度は、２５ｎｇ／ｍｌであり、ｒｈ  ＯＰＧは、５０ｎｇ／ｍｌであった。それぞれの用量の培地は、３日後に交換された。
【図１７】図１７は、ローダミン−ファロイジンおよびＨｏｅｓｃｈｔ  ３３２５８二重染色を用いたＦ−アクチン環形成の分析により決定されたモノサイトモノカルチャーでのｒｈ  ＲＮＡＫＬ誘導破骨細胞活性の阻害を示す。
【図１８】図１８は、骨スライスでの培養された細胞の代表的なＳＥＭ顕微鏡写真である。（Ａ）未処理細胞（Ｂ）Ｍ−ＣＳＦのみ（Ｃ〜Ｄ）Ｍ−ＣＳＦ＋ｒｈ  ＲＡＮＫ（Ｅ〜Ｆ）代表的な吸収窩（Ｇ〜Ｈ）ＯＰ３−４ペプチドおよび係留造影剤で処理した細胞。
【実施例】
【００８１】
実施例
本発明者らは、改善した装置および診断（例えば、ＭＲＩまたはＣＴ画像化のいずれか
による）または骨関連疾患の治療のための方法を提供することに関心を有していた。した
がって、本発明者らは、図５Ｅで示す、骨の細胞（例えば、骨細胞、骨芽細胞）もしくは
骨にのみ存在するペプチド（例えばヒドロキシアパタイト特異的ペプチド）を認識する、
１以上のペプチドで誘導体化または機能化された、ポリマー６（例えば、キトサン）で覆
われた、造影剤コア４（例えば、鉄酸化またはゴールドメタリックコア）を含む、新規の
骨特異的な薬剤２（例えば、微粒子、サブミクロン粒子、および原子または分子要素）を
設計し、発展させている。コア４、アウターシェル６を形成するポリマーコーティング、
ポリマーアウターシェル６に結合する骨−特異的な機能化ペプチド８における材料の厳選
により、ナノ粒子２などは、診断または治療で用いられうる。例えば、前記粒子２は、骨
リモデリング活性の画像化、病態の検出および／または組織修復プロセスの検出で用いら
れうる。下記実施例は、これらの研究の結果を記載する。
【００８２】
実施例１−キトサンへの無水コハク酸の結合
本発明者らは、キトサン（ＣＳ）、造影剤または薬剤の他の活性成分をコートするため
に用いられうる多糖は、無水コハク酸に結合しうることを明らかにしている。キトサンコ
ハク酸エステル複合体は、タブレットで用いられうる生体適合性および生分解性ドラッグ
デリバリー薬剤であるとして、当技術分野で公知である。
【００８３】
１．材料および方法
（ｉ）キトサン（ＣＳ）誘導体化
ＣＳは、既知の開環反応（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａ
ｓｓｈｉ，１２６，７８９−７９３）を用いて無水コハク酸により誘導体化された（Ｓｕ
ｃ−Ｃｈｉ）。１％（Ｗ／Ｖ）ＣＳ溶液（１％ｖ／ｖ酢酸中）は、０．８μｍ細孔膜（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過され、メタノールで希釈された（１：４）。無水コハク
酸（≧９９％ＧＣ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）は、４％（ｗ／ｖ）の５ｍｌアセトン
に溶解され、磁気攪拌下、液滴で加えられ、室温で攪拌しながら一晩置かれた。形成され
たゲルは、過剰な溶液が除かれ、メタノールで２倍希釈され、３日間超純水で透析された
。水は１日２回交換され、その後、得られた沈殿物は、遠心分離により回収し、凍結乾燥
された。
【００８４】
（ｉｉ）Ｓｕｃ−Ｃｈｉサブミクロンビーズ（すなわち、ナノ粒子）の製造
Ｓｕｃ−Ｃｈｉビーズは、確立したイオンゲル法（Ａｇｎｉｈｏｔｒｉ，ｅｔ  ａｌ．
，２００４）を用いて製造された。簡潔には、トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）溶液
（１ｍｇ／ｍｌ）は、１ｍｇ／ｍｌのＳｕｃ−ＣＳ溶液（上記）に体積比１：５、磁気攪
拌下液滴で加えられ、室温で４５分、反応させた。核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）またはＣ
Ｔ画像化生体特異的造影剤（すなわち、本発明のナノ粒子２）を製造するために、酸化鉄
コア４粒子（Ｆｅ３Ｏ４、１０ｎｍ平均直径）または金コア４粒子（＜２０ｎｍ平均直径
）はまず、Ｓｕｃ−ＣＳ溶液に添加する前、超音波処理を用いてＴＰＰ溶液に分散された
。加えられたコア粒子４の重量は、溶解ポリマー６の半分であった。その後、コア４粒子
は、（滅菌するために）エタノールを用いて遠心分離により洗浄され、その後超純水で洗
浄され、滅菌ＰＢＳに戻された。
【００８５】
（ｉｉｉ）ペプチド合成
表１に記載されたペプチド８およびそれらに対応するアミノ酸配列は、合成され、その
後コア粒子４を機能化するために用いられた。
【００８６】
【表１】
2018199693.tif 000002
【００８７】
ペプチド２は、テンタゲルＳ  ＮＨ２樹脂（０．１ｍｍｏｌ）および反応溶媒としてジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）による従来の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（
Ｆｍｏｃ）保護／脱保護ストラテジーを用いて固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）により合
成された。酸依存Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅリンカー（リンカー）は、最初に、ペ
プチド８の後の開裂のために樹脂に結合された。その後、ペプチド８は、Ｃ末端から最初
のアミノ酸を加え、次に、表１に示される、ペプチド配列のように、その後のアミノ酸の
配列カップリング／脱保護工程により合成された。カップリング反応（３０分×２）は、
アミノ基活性化のためのＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾールＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
メチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスファート）、および三級塩基としてＮ，Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いて行われた。保護されたアミノ基の曝
露は、ＤＭＦの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンでＦｍｏｃ保護基を開裂することで得られた
（２分、×３）。すべての調製物において、樹脂、リンカーおよびアミノ酸は、それぞれ
１：４：４の分子比で加えられた。ＨＢＴＵおよびＤＩＰＡ（ジイソプロピルエチルアミ
ン）は、それぞれアミノ酸のモル濃度の１〜２倍であった。各カップリングおよび／また
は脱保護工程に続いて、洗浄工程（ＤＭＦで×３）が行われた。
【００８８】
表１に示される、オステオプロゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｔｅｒｉｎ）様ペプチド
、ＯＰ３−１およびＯＰ３−４は、（Ｇｏｎｇｏｒａ−Ｂｅｎｉｔｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，
２０１１）に記載された、システイン−システインジスルフィド結合を形成するためにジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）酸化により環化された。ＯＰ３は、ＯＰＧタンパクのセ
グメントである。骨芽細胞表面のＲＡＮＫ（しばしば、可溶型で放出）は、破骨細胞上の
ＲＡＮＫと相互作用し、よって破骨細胞分化および増大された活性を誘導する反応カスケ
ードを開始する。ＯＰＧ（骨芽細胞により放出された）は、ＲＡＮＫＬのためのデコイで
あり、そのＲＡＮＫＬへの結合は、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫＬ相互作用を阻害し、よってカ
スケードを停止する。したがって、ＯＰＧ模倣体は、骨関連標的細胞のレセプターのため
のリガンドとなるであろう。合成後、環化されたペプチドは、３時間、窒素雰囲気下で樹
脂から切断された。切断後、ペプチドは、冷たいジメチルエーテルで回収され、遠心分離
により分離され、窒素流で乾燥された。その後、ペプチドは、６０ｍｌの酸化バッファー
（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および２ｍＭ  Ｇｄｎ．ＨＣｌ、５％ＤＭＳＯ、ｐＨ７）に
溶解され、１２時間振とうされた。その後、溶液は、１Ｍ  ＨＣＯ２Ｈ（２５０μｌ）で
酸性にされ、ＬＣ−ＭＳにより精製された。純粋フラクションは、混合され、凍結乾燥さ
れた。環化の程度（ジスルフィド架橋の形成）は、エルマン試薬を用いて自由チオール基
の定量のための一般的な方法により決定された。ペプチドは、最終的に、ＨＰＬＣおよび
ＭＳにより明らかにされた。
【００８９】
（ｉｖ）ペプチド−係留生体特異的な造影剤の製造（すなわち、ナノ粒子）
上記ペプチド２は、本発明のナノ粒子２を作製するためにカルボジイミドの化学的性質
によりコア４粒子に共有結合された。非誘導化粒子は、まず、２ｍｌの２−（Ｎ−モルフ
ォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー（０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．３Ｍ  ＮａＣ
ｌ、ｐＨ６．５）に分散され、１ｍｇ／ｍｌのビーズ濃度が得られた。その後、コア４粒
子のカルボキシル基は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（ＥＤＣ、４ｍＭ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１０ｍＭ）の添加
により活性化された。活性化反応は、室温で３０分間、進められた。過剰なＥＤＣは、β
−メルカプトエタノール（２．８μｌ）の添加により不活化され、コア４粒子は、脱塩メ
ンブレンにより洗浄された。その後、表１から選択されたペプチド（例えば、ＹＣＥＩＥ
ＦＣＹＬＩＲ配列を有するＯＰ３−４ペプチド）が１ｍｇ／ｍｌであるＭＥＳバッファー
溶液は、体積比１：１でコア４粒子の溶液に加えられた。抱合反応は、室温で３時間、磁
気攪拌下で進められた。当該反応は、その後、５〜１０ｍＭの最終濃度を得るためにヒド
ロキシアミンの添加によりクエンチされた。
【００９０】
図５Ｅを参照すると、本発明のナノ粒子２の一実施形態の略図が示されている。前記図
は、ポリマーアウターシェル６（例えば、キトサン）でコートされたインナーコア４（例
えば、イオン酸化または金）を有するナノ粒子２を示す。シェル６は、骨の細胞、または
骨のみに存在する他のペプチド、例えば、ヒドロキシアパタイトを認識する、ペプチド８
のコーティングで機能化されている。その後、結果として得られるナノ粒子２は、限外ろ
過スピンカラム（ＭＷＣＯ  １００，０００）を用いて生成され、凍結乾燥され、−２０
℃で保存された。図１は、Ｓｕｃ−ＣｈｉへのＣＳの誘導体化およびそれに続くＯＰ３−
４ペプチドでの機能化のスキームを示す。
【００９１】
２．結果
ＣＳおよびＳｕｃ−Ｃｈｉの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図２に示す。簡潔に、シグナル
は、下記のように割り当てられる：２．５０〜２．７０ｐｐｍ（Ｈ−Ａｃ）は、ＧｌｃＮ
Ａｃモノマーのアセチルタンパク質に割り当てられた；２．５０−２．７５ｐｐｍ（Ｈ２
Ｄ）は、ＧｌｃＮモノマーのプロトン２に割り当てられた；３．９５〜４．６５ｐｐｍ（
Ｈ２−２）は、ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮモノマー両方のプロトン２〜６に割り当てら
れた；４．６５〜４．９０ｐｐｍ（ＨＯＤ）は、溶媒（ＨＯＤ）に対応する；５．１０〜
５．３０ｐｐｍ（Ｈ１−Ａ）は、ＧｌｃＮＡｃモノマーのプロトン１に対応する；５．３
０〜５．６５ｐｐｍ（Ｈ１−Ｄ）は、ＧｌｃＮモノマーのプロトン１に対応する。ＣＳの
スペクトルと対比すると、Ｓｕｃ−Ｃｈｉのスペクトルは、無水コハク酸のＣＳへの結合
が成功していることを裏付けている。ここでは、５．００〜５．７０ｐｐｍ（図２Ｂ、矢
印、最初の２つを参照）およびＨ２Ｄの３．６〜３．９ｐｐｍの範囲でのＨ１（Ｄ）、Ｈ
１−ＡおよびＨ２Ｄの分解能の悪いまたは消失したシグナルが見られる。ＣＳのスペクト
ルでは見られないがＳｕｃ−Ｃｈｉのスペクトルで見られる、２．３４〜２．５７ｐｐｍ
の範囲での新たなシグナルは、スクシニル基の２つのメタン水素基（−ＣＯＣＨ２ＣＨ２
ＣＯＯＨ）に帰し、他の報告（Ｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｘｉａｎｇｙａｎ
ｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００７）と一致する。
【００９２】
滴定により決定された置換度は、１Ｈ  ＮＭＲにより２５．５％および３０．６％であ
った。精度は低いが、電位差滴定分析は、ＣＳおよびＳｕｃ−Ｃｈｉの両方でフリー−Ｎ
Ｈ２の分子量を決定することができた。図３に示すように、ＣＳで算出された誘導体化の
度合い（ＤＤ）の値は、７９．９２％（±５．８５）であり、Ｓｕｃ−Ｃｈｉでは、５４
．４％（±３．７）であった。前記滴定は、両方のポリマーに対し５回繰り返された。こ
れらのデータは、無水コハク酸でのＣＳの誘導体化後、−ＮＨ２基の量の減少を示唆して
いる。非誘導体化−ＮＨ２基の存在は、ナノ粒子２製造の間に、ＴＰＰによるＣＳ架橋を
するために重要であった。
【００９３】
図４に示すように、ＦＴＩＲの結果はまた、キトサンからＳｕｃ−Ｃｈｉへの誘導体化
の成功およびそれに続くＯＰ３−４の結合を示した。１級および２級アミンのＮ−Ｈ伸縮
およびＯ−Ｈ伸縮は、バンド１（３５００〜３２００ｃｍ−１）に含まれる。ＯＰ３−４
のスペクトルでのバンド１の主な寄与は、アミド結合に含まれるアミンからである。バン
ド２（１６４０〜１５８０ｃｍ−１）は、４つの種に存在する、第１アミンでのＮ−Ｈ変
角（ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；アミドのＮ−Ｈ変角ならびにＯＰ３−４，Ｓｕｃ−Ｃｈ
ｉおよびＳｕｃ−Ｃｈｉ−ＯＰ３−４の場合での２級アミドでのカルボニル伸縮にも対応
するであろう。Ｓｕｃ−Ｃｈｉに存在し、Ｓｕｃ−Ｃｈｉ−ＯＰ３−４では見られない、
バンド３（１７２２ｃｍ−１）は、前述のアミド結合を介する結合に加え（バンド３）、
エステル結合を通じてスクシニル基の多糖への結合の結果としてのカルボニル伸縮に帰さ
れるであろう。チロシンおよびフェニルアラニンに存在する芳香族構造は、不飽和種での
Ｃ−Ｈ伸縮から生じる、バンド４を持つＳｕｃ−Ｃｈｉ−ＯＰ３−４にて確認しうる。Ｏ
Ｐ３−４サンプルにて弱く存在し、Ｓｕｃ−ＣｈｉおよびＣＳでは存在しない、Ｓｕｃ−
Ｃｈｉ−ＯＰ３−４のスペクトルでのバンド５（５００〜５４０ｃｍ−１）にある大きな
ピークは、ジスルフィド結合の存在に帰せられる。１Ｈ  ＮＭＲおよび滴定により得られ
た結果から、スクシニル基は、ＣＳのアミノ基への結合に成功していたと判断された。Ｆ
ＴＩＲの結果は、さらにＯＰ３−４ペプチドのＳｕｃ−Ｃｈｉへの結合の成功を示唆して
いる。
【００９４】
動的光散乱法の解析（ＤＬＳ）および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、ナノ粒子が、Ｍ
ＲＩ検出可能ナノ粒子２を製造するためにＦｅ３Ｏ４コア４粒子の取込後、４０８．３ｎ
ｍ（０．４のＰＤＩ）に増加した、３６６．４ｎｍの平均流体力学直径（Ｚａｖｅｒａｇ
ｅ）を有したことを示した（図５参照）。ろ過工程の有無によるキトサン分子量の変化、
および濃度は、ナノ粒子２サイズと多分散性指数（ＰＤＩ）とでチューニングされた（図
６Ａ〜Ｄ参照）。
【００９５】
実施例２−ＯＰ３とＤＯＴＡとの結合
本発明者らは、次に、タンパク質、破骨細胞や骨芽細胞のような、骨の細胞で特異的に
発現した、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｔｒｉｎ）３（ＯＰ３）が、ガ
ドリニウムを含む、さまざまな造影剤をコートするために用いられうるキレート剤である
、ドタレム（Ｄｏｔａｒｅｍ）（ＤＯＴＡ）に結合しうるかどうかを決定することに着手
した。ドタレムは、ガドテル酸、既知の巨大環状構造のＧＤ系ＭＲＩ造影剤である。それ
は、キレート剤として有機酸ＤＯＴＡからなる。
【００９６】
１．材料および方法
新規ＤＯＴＡ−ＯＰ３−４複合タンパク質は、ＯＰ３−１およびＯＰ３−２の合成で記
載したＦｍｏｃを用いて固相ペプチド合成法により合成された。しかし、この場合、最初
にリジンコアアミノ酸を加え、次に、ＤＯＴＡとＭｔｔで保護されたＮＨ２基とをカップ
リングした。その後、２つのグリシンアミノ酸は、ＯＰ３−４ペプチドのその後の集合に
続くスペーサーを形成するためにカップリングされた。ＤＯＴＡ分子とＯＰ３−４配列間
のリジン−グリシン−グリシンスペーサーの導入は、合成中の潜在的な立体障害およびペ
プチドのポテンシーへの影響を避けるために重要であると考えられる。ＤＯＴＡ−ＯＰ３
−４の構造は、図７に示される。
【００９７】
同様の固相ペプチド合成法は、ペプチドの造影剤への安定した結合を有利にできる直鎖
状末端（図８参照）または分岐末端（図１０参照）を有する新規誘導体化生体特異的なペ
プチドを合成するのに用いられた。
【００９８】
２．結果
図９および１１は、直鎖状（図９）および分岐（図１１）ＯＰ３−４ペプチドの代表的
な質量分析スペクトルを示す。これらは、コア４粒子への安定した結合と当該粒子の機能
化の形成に必要なそれらのペプチドの合成に成功したことを示す。９５％を超える純度が
精製後に得られた。
【００９９】
実施例３−生体特異的な造影剤の生成−ＯＰ３に結合する、ＤＯＴＡ被覆ガドリニウム
本発明者らは、次に、ガドリニウム（Ｇｄ）系造影剤がＤＯＴＡ被覆と骨特異的なタン
パク質オステオプロゲトリン３（ＯＰ３）との結合により本発明のナノ粒子２を形成する
ために生成されうるかどうかを決定することに着手した。期待は、それらがまたＭＲＩお
よび／またはＣＴ画像化技術で使用されうることであった。
【０１００】
１．材料および方法
新規ペプチドは、ＭＲＩおよびＣＴのための生体特異的な造影剤（すなわち、機能化ナ
ノ粒子２）を製造するために用いられた（表１参照）。コア４粒子、Ｇｄ３＋のキレート
化は、１５時間、バッファーシステムにおいて、ＧｄＣｌ３とＤＯＴＡ−ＯＰ３−４とを
インキュベートすることによりなされた。ＤＯＴＡ部分は、多座配位子として働き、Ｇｄ
３＋を複合体にする場合、ＭＲＩ−可視化ペプチドとするために金属カチオンをエンベロ
ープした。複合体でのＤＯＴＡリガンドと金属イオンとの配位は、リガンドの配座および
金属カチオンの幾何学的傾向に依存する。ＤＯＴＡは、それ自体で、８配位のリガンドと
して働き、４つのアミノ基および４つのカルボキシレート基と金属とを結合する。本研究
では、カルボキシレート基の一つがペプチドとの共有結合に用いられるため、ＤＯＴＡ分
子は、７配位として働く。しかし、アミノ酸結合ＤＯＴＡのカルボキシレート基およびペ
プチドは、８配位子をもたらし、そして８配位の状態に戻り、安定性の高い配位複合体を
形成する（Ｖｉｏｌａ−Ｖｉｌｌｅｇａｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１０１】
結果として得られたナノ粒子２は、線状または分岐ルート（ｒｏｏｔ）を有するペプチ
ド８とポリマー６の薄膜またはセラミック（すなわち、ＭＲＩ造影剤）もしくは金コア４
粒子（すなわち、ＣＴ造影剤）で被覆された磁性コア４粒子とを直接結合して得られた。
この場合、ポリマーのカルボン酸基もしくはヒドロキシル基およびセラミックの表面機能
化は、表１から選択された生体特異的なペプチドが共有結合によりグラフトされたアミノ
酸で活性化および誘導体化された。
【０１０２】
２．結果
Ｇｄ３＋のキレート化の成功は、ＬＣ−ＭＳにより確認され、ＤＯＴＡ−ＯＰ３−４の
ｍ／ｚの６９４．１のピークがＧｄ３＋のキレート化後の［Ｍ＋３Ｈ］３＋に対応するｍ
／ｚの７１４．８のピークに置き換わっていた。アミノ酸分析は、ＯＰ３−４のガドリニ
ウム（Ｇｄ）系ナノ粒子２への結合の成功を裏付けた（図１２）。加水分解後、ポリマー
中に存在するグルコサミンユニットの量およびアミノ酸の量が決定された。ナノ粒子２に
結合したペプチド８の量は、ピークエリアの積分により算出した。ＯＰ３−４ペプチド８
で機能化されたＧｄナノ粒子２の加水分解生成物の代表的なＬＣプロファイルは、図１２
に示される。材料のマイクログラムあたりのグルコサミンユニットは、キトサン系ナノ粒
子（ＣＮＢ）で１．９２ナノモル、Ｇｄコア４粒子（そのまま）で１．４０ナノモルなら
びにＯＰ３−４ペプチド８で機能化されたＧｄナノ粒子２およびＧｄナノ粒子−ＤＯＴＡ
−Ｇｄ−ＯＰ３−４で１．４０ナノモルと算出された。
【０１０３】
重要なことには、ナノ粒子−ＯＰ３−４およびナノ粒子−ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４
において、結合したペプチド８の量は、ナノ粒子２のグラムあたり４．２ミリモルと算出
された。個々のアミノ酸は、ＯＰ３−４配列での量を反映したモル比で検出された。
【０１０４】
実施例４−ＭＲＩでのナノ粒子の使用試験
本発明者らは、次に、Ｔ１およびＴ２モードでのポジティブＭＲＩシグナリングのため
の生体特異的なペプチド−機能化ナノ粒子２を試験した。生体特異的なナノ粒子２は、Ｇ
ｄコア４を誘導化ペプチド８で覆い、あらかじめ生物活性ペプチドで機能化したナノ粒子
にグラフトすることで得られた。
【０１０５】
１．材料および方法
ペプチド（ＤＯＴＡ−ＯＰ３−４およびＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４）のＰＢＳバッフ
ァー溶液は、まず最少量のＤＭＳＯにペプチドを溶解して調製され、次に希釈して２０μ
ｇ／ｍｌペプチドのＰＢＳ（１％ＤＭＳＯ）原液とし、０．１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．２
に調整した。さまざまなナノ粒子２（すなわち、コア４粒子のみ、ナノ粒子−ＯＰ３−４
複合体、ナノ粒子−ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４複合体）は、同じＰＢＳバッファー溶液
に懸濁された。ＤＯＴＡ−Ｇｄ３＋（２０μｇ／ｍｌ）およびＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（１０
ｎｍ、２０μｇ／ｍｌ）の原液は、調製され、ガドリニウム系およびＦｅ３Ｏ４系造影剤
それぞれのポジティブコントロールとして用いられた。
【０１０６】
ナノ粒子−ＯＰ３−４複合体とナノ粒子−ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４複合体との比較
が最初に行われた。このため、ワットマンろ紙（円形、１５ｍｍ直径、ｃａｔ：１４４１
１５０，ＵＳＡ）を原液に浸した。
【０１０７】
ナノ粒子２およびペプチド８の濃度の影響に関する本研究では、異なる濃度のペプチド
８およびナノ粒子２が、原液の２倍希釈系列により調製された。ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３
−４の濃度は、（１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．０７８、
０．０３９、０．０２０、０．０１０および０．００５μｇ／ｍｌ）であり、コア４パー
ティクルのみでは、（２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０
．０７８、０．０３９、０．０２０および０．０１０μｇ／ｍｌ）であった。次に、検体
は、ウェルあたり５００μｌの量で２４ウェル培養皿にセットされた。すべてのＭＲＩは
、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｂｒｉｇｈｔｏ
ｎ  ａｎｄ  Ｓｕｓｓｅｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，ＵＫのＳｉｅｍｅｎｓ  Ａ
ＶＡＮＴＯ  １．５Ｔ  ＭＲＩ  ｓｃａｎｎｅｒを用いて行われた。
【０１０８】
２．結果
図１３は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸したネガティブコントロールフィルタ
ー、造影剤コア４を含まないＤＯＴＡ−ＯＰ３−４ペプチド８からなるネガティブコント
ロールおよびガドリニウム−キレートＤＯＴＡ−ＯＰ３−４ナノ粒子２の代表的なＭＲＩ
スキャンを示す。前記スキャンは、ネガティブコントロールがノイズシグナルのみを示す
一方、ガドリニウムコア４をキレートしたペプチド８が明らかなポジティブシグナルを示
すことを明確に表している。ガドリニウム−キレートＤＯＴＡ−ＯＰ３−４およびペプチ
ド−機能化磁性ナノ粒子２のいずれかに浸したフィルターの比較分析では、検出の選択モ
ードでの２つの造影剤から期待される典型的な明暗画像を示した。
【０１０９】
実施例５−ＯＰ３およびＯＰ４−結合ナノ粒子のインビトロでの阻害効果試験
本発明者は、次に、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｔｒｉｎ）３または
４（ＯＰ３またはＯＰ４）ペプチドと結合したＤＯＴＡ−被覆ガドリニウムコア４を含む
ナノ粒子が、インビトロでの破骨細胞形成および破骨細胞活性を阻害するかどうかを決定
した。
【０１１０】
１．材料および方法
破骨細胞は、ＲＮＡＫおよびＭ−ＣＳＦを有する細胞の添加（ｓｐｉｋｉｎｇ）または
Ｍ−ＣＳＦを添加した骨芽細胞の単核細胞共培養システムに基づく一般的な方法により、
健康なヒトドナーからの末梢血から単離した新鮮な単核細胞から得られた。ペプチドおよ
びペプチド−係留ナノ粒子２（すなわち、ナノ粒子−ＯＰ３−４、磁性ナノ粒子−ＯＰ３
−４、ナノ粒子−ＯＰ３−ＤＯＴＡおよびナノ粒子−ＯＰ３−４−Ｇｄ−ＤＯＴＡ）は、
アミノ酸分析により決定された５０μＭのペプチド当量濃度で細胞に添加された。ネガテ
ィブコントロールは、試験材料を添加されず、ポジティブコントロールは、ｒｈ  ＯＰＧ
（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加された。添加（ｓｐｉｋｉｎｇ）は、単核細胞の破骨細胞への
分化の前後のいずれかに行われた。
【０１１１】
破骨細胞形成および破骨細胞活性の阻害は、光学顕微鏡検査を用いたＴＲＡＰポジティ
ブ多核細胞（ＭＮＣ）の数および落射蛍光顕微鏡検査を用いたＦ−アクチン環をもつＭＮ
Ｃ細胞の数を計測することで定量的に評価された。破骨細胞活性はまた、ＳＥＭによる骨
スライスで形成された吸収窩の数の分析により定量的に評価された。培地は、すべての成
長因子および試験材料を添加した新たな培地に３日ごとに交換された。
【０１１２】
３つの異なるアプローチが、破骨細胞形成および破骨細胞活性の阻害を決定するために
用いられた。これらの方法は：（１）ＴＲＡＰポジティブ多核細胞の数の計測；（２）ヘ
キスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８およびローダミン・ファロイジン二重染色を用いて
アクチン環（ＭＮＣ−ＡＲ＋）を有する多核細胞の数の計測；（３）骨スライスでの細胞
培養後に形成された吸収窩の評価により骨吸収の度合いの決定、であった。細胞が顕微鏡
で計測するには多すぎた場合、画像編集ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｖ１．４４ｐ）が細胞
を区別および計測するために用いられた。前記ソフトは、破骨細胞および非破骨細胞の両
方の色および形により細胞を計測することができ、発現した破骨細胞形成の度合いは、フ
ィールドあたりのＴＲＡＰポジティブ細胞の割合であった（Ｌａｂｎｏ）。
【０１１３】
２．結果
破骨細胞形成でのＯＰ３−４およびそのＧｄ３＋キレート化誘導体により機能化された
ナノ粒子２の影響に関する研究の結果は、図１５に示される。すべての薬剤において、ナ
ノ粒子２およびガドリニウムに結合しないならびに結合した修飾ペプチド８は、コントロ
ールとは著しく異なるレベルで破骨細胞の形成を減少したが、有効性の度合いは異なって
いた（図１５）。
【０１１４】
さらに、ペプチド−機能化磁性ナノ粒子は、非機能化ナノ粒子と比較した際、破骨細胞
形成を著しく減少するように思われる（図１６参照）。ナノ粒子−ＯＰ３−４，ナノ粒子
−ＤＯＴＡ−ＯＰ３−４およびナノ粒子−ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４で処理した培地で
のＴＲＡＰポジティブＭＮＣの数は、有意に異なるものではなかった。このことは、さま
ざまに修飾されたペプチドとそのナノ粒子２へのグラフトは、破骨細胞形成を阻害する能
力を変化させなかったことを示している。Ｇｄ３＋は、そのものを用いた場合、インビト
ロおよびインビボの両方で有毒である。しかし、Ｇｄ３＋をしっかりとトラップするＤＯ
ＴＡのような大環状キレートは、イオン溶解度を改善し、よって細胞毒性を回避する。実
際、多くの自由カルボキシル基および改善した溶解度を有するＳｕｃ−Ｃｈｉは、さらに
Ｇｄ３＋を含み、ＤＯＴＡ−Ｇｄ−ＯＰ３−４の生体適合性を改善するであろう。
【０１１５】
すでに分化した破骨細胞の活性への明らかな阻害効果は、図１７に示される。
【０１１６】
最後に、分化した破骨細胞の活性の阻害は、ＳＥＭにより明確に観察され、図１８に示
すように、コントロール細胞によりもたらされた窩がないことを示している。
【０１１７】
サマリー
薬剤の局所注入による骨病理学の診断および治療は、広く支持されている。本発明者ら
は現在、ＭＲＩおよびＣＴ画像化で用いる新規の造影剤を発展させ、薬剤は、石灰化した
骨細胞外マトリクスと同様に、骨の細胞、骨芽細胞および破骨細胞を認識できる。これら
の生物学的認識特性は、さまざまな骨の細胞および骨のミネラル相に特異的な新規誘導化
ペプチドの合成により得られた。誘導化は、画像化特性に影響を与えることなくナノ粒子
またはイオン組成物の造影剤と安定した結合を有利にするために設計された。磁化ポリマ
ービーズ、主にキトサンナノビーズの形態での造影剤の特定のタイプは、磁性コアを被覆
するもしくはガドリニウム−修飾ペプチドをグラフトする方法、またはペプチドの架橋マ
トリクスでのイオン散在のいずれかにより得られた。骨の細胞および構造成分を認識する
能力は、細胞の挙動を制御する能力と結び付けられた。分化した破骨細胞の活性を認識お
よび阻害するだけではなく、破骨細胞への分化プロセスの間に単核細胞をも認識できる生
体特異的な造影剤は、骨芽細胞移動を有利にできる薬剤とともに得ることができた。
【０１１８】
要約すると：−
１．ヒドロキシアパタイト−特異的ペプチドを有し、骨芽細胞−および破骨細胞−特異
的ペプチドも有する、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（すなわち、ＭＲＩ造影剤）および金ナノ粒子
（すなわち、ＣＴ造影剤）のようなサブミクロン粒子の表面機能化が好ましい。
【０１１９】
２．ヒドロキシアパタイト−特異的ペプチドを有し、骨芽細胞−および破骨細胞−特異
的ペプチドにより機能化されたポリマービーズにも覆われたガドリニウム（すなわち、Ｍ
ＲＩ造影剤）およびヨウ素またはボロサルフェート（ｂｏｒｏ−ｓｕｌｐｈａｔｅ）（す
なわち、ＭＲＩ造影剤）。
【０１２０】
３．ヒドロキシアパタイト−特異的ペプチドを有し、骨芽細胞−および破骨細胞−特異
的ペプチドをも有するガドリニウム（すなわち、ＭＲＩ造影剤）およびヨウ素（すなわち
、ＭＲＩ造影剤）複合体。
【０１２１】
４．形態およびサイズがポリマーの調整された物理化学的性質により決定され、ならび
に生物学的認識および生体活性が組織細胞を認識できる特異的ペプチドを有する誘導体に
より得られる、合成または天然ポリマーの被覆により形成されたナノ粒子。
【０１２２】
５．架橋および生体機能化がナノ粒子の安定性および生体特異的／生体活性分子の存在
を最適化するように調整されている、あらかじめ組織−特異的ペプチドで機能化された合
成および天然ポリマー（例えば、キトサン）の架橋（主にイオン架橋）により形成された
ナノ粒子。これらのナノ粒子は、ＭＲＩ用およびＣＴ用の造影剤を分散させた薬剤に含ま
れる。
【０１２３】
すべての場合において、これらの生体特異的な薬剤は、造影剤の特性と、組織画像化お
よび再生を誘導可能な、組み合わされ、組み込まれた生物学的認識および生物活性とを組
み合わせる。
【０１２４】
インビトロでの骨芽細胞および破骨細胞の単培養および共培養の研究は、骨特異的ペプ
チドの細胞への能力を示した。細胞プロセスを促進する骨芽細胞−特異的ペプチド（例え
ば、ＦＨＲＲＩＫＡ）の能力および破骨細胞形成を阻害するＯＰＧ−ミミックペプチドの
能力を考えると、これらの新規材料はまた、骨欠損の治療での融合（すなわち、治療と診
断の組み合わせ）剤として用いられうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１２５】
【非特許文献１】Ａｇｎｉｈｏｔｒｉ  Ｓ，  Ａ，  Ｍａｌｌｉｋａｒｊｕｎａ  Ｎ，  Ｎ  ＆  Ａｍｉｎａｂｈａｖｉ  Ｔ，  Ｍ  （２００４）．  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｏｎ  ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １００，  ５  −２８
【非特許文献２】Ｃｈａｙｔｏｒ  Ａ  Ｔ，  Ｅｖａｎｓ  Ｗ  Ｈ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｔ  Ｍ  （１９９７）．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｏｐ  ｍｏｔｉｆｓ  ｏｆ  ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ４３  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ａｂｏｌｉｓｈ  ｒｈｙｔｈｍｉｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ａｒｔｅｒｉｅｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ５０３，  ９９−１１０
【非特許文献３】Ｃｈｅｎｇ  Ｘ，  Ｋｉｎｏｓａｋｉ  Ｍ，  Ｔａｋａｍｉ  Ｍ，  Ｃｈｏｉ  Ｙ，  Ｚｈａｎｇ  Ｈ  ＆  Ｍｕｒａｌｉ  Ｒ  （２００４）．  Ｄｉｓａｂｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−  ＫａｐｐａＢ  （ＲＡＮＫ）  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｙ  Ｎｏｖｅｌ  Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｂｏｎｅ  Ｌｏｓｓ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７９，  ８２６９−８２７７
【非特許文献４】Ｇｏｎｇｏｒａ−Ｂｅｎiｔｅｚ  Ｍ，  Ｔｕｌｌａ−Ｐｕｃｈｅ  Ｊ，  Ｐａｒａｄｉｓ−Ｂａｓ  Ｍ，  Ｗｅｒｂｉｔｚｋｙ  Ｏ，  Ｇｉｒａｕｄ  Ｍ  ＆  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  Ｆ  （２０１１）．  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｆｍｏｃ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄｅ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ９６，  ６９−８０
【非特許文献５】Ｉｌｖｅｓａｒｏ  Ｊ，  Ｔａｖｉ  Ｐ  ＆  Ｔｕｕｋｋａｎｅｎ  Ｊ  （２００１）．  Ｃｏｎｎｅｘｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇａｐ  ２７  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ２
【非特許文献６】Ｌａｂｎｏ  Ｃ．  （２０１１）．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｃｏｒｅ：  Ｔｗｏ  Ｗａｙｓ  ｔｏ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ＩｍａｇｅＪ  ［Ｏｎｌｉｎｅ］．  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ．  Ａｖａｉｌａｂｌｅ：  ｈｔｔｐ：／／ｄｉｇｉｔａｌ．ｂｓｄ．ｕｃｈｉｃａｇｏ．ｅｄｕ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ＿ｆｉｌｅｓ／ｃｅｌｌ％２０ｃｏｕｎｔｉｎｇ％２０ａｕｔｏｍａｔｅｄ％２０ａｎｄ％２０ｍａｎｕａｌ．ｐｄｆ  ［Ａｃｃｅｓｓｅｄ  ０１／１２／２０１１  ２０１１］
【非特許文献７】Ｌｉａｎｇ  Ｎ，  Ｓｕｎ  Ｓ，  Ｌｉ  Ｘ，  Ｐｉａｏ  Ｈ，  Ｐｉａｏ  Ｈ，  Ｃｕｉ  Ｆ  ＆  Ｆａｎｇ  Ｌ  （２０１２）．  α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｓ  ａ  ｍｉｃｅｌｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ４２３，  ４８０−４８８
【非特許文献８】Ｌｌｏｙｄ  Ａ，  Ｗｉｌｌｉａｍ，  Ｊｏｈｎ  Ｇ，  Ｗｉｌｌｉａｍ，  Ｈｅａｔｈ  Ｈ，  Ｓｔａｎｄｅｎ  Ｇ，  Ｍａｔｔｅｏ  Ｓ  ＆  Ｍｅｉｋｌｅ  Ｓ，  Ｔｈｏｍａｓ．  ２００７．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ．  ＵＳＡ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １２／５１７，７０５
【非特許文献９】Ｍｅｉｋｌｅ  Ｓ  Ｔ，  Ｐｅｒｕｇｉｎｉ  Ｖ，  Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ  Ａ  Ｌ  ＆  Ｓａｎｔｉｎ  Ｍ  （２０１１）．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｎｔｉ−Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｏｎ  ＶＥＧＦ  Ｂｌｏｃｋｅｒｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １１，  １７６１−１７６５
【非特許文献１０】Ｓｈｉｎ  Ｊ，  Ｋｉｍ  Ｙ−Ｍ，  Ｌｉ  Ｓ−Ｚ，  Ｌｉｍ  Ｓ−Ｋ  ＆  Ｌｅｅ  Ｗ  （２００８）．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ，  ２５，  ３５２−３５７
【非特許文献１１】Ｔａ  Ｈ  Ｍ，  Ｎｇｕｙｅｎ  Ｇ，  Ｔｈｉ，  Ｔｕｙｅｔ，  Ｊｉｎ  Ｈ，  Ｍｉ，  Ｃｈｏｉ  Ｊ，  Ｐａｒｋ  Ｈ，  Ｋｉｍ  Ｎ，  Ｈｗａｎｇ  Ｈ−Ｙ  ＆  Ｋｉｍ  Ｋ，  Ｋｙｕ  （２０１０）．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−ｋＢ  Ｌｉｇａｎｄ  （ＲＡＮＫＬ）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  １０７，  ２０２８１-２０２８６
【非特許文献１２】Ｖｉｏｌａ−Ｖｉｌｌｅｇａｓ  Ｎ  ＆  Ｄｏｙｌｅ  Ｒ  Ｐ  （２００９）．  Ｔｈｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  １，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  （Ｈ４ＤＯＴＡ）：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ-ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２５３，  １９０６−１９２５
【非特許文献１３】Ｘｉａｎｇｙａｎｇ  Ｘ，  Ｌｉｎｇ  Ｌ，  Ｊｉａｎｐｉｎｇ  Ｚ，  Ｓｈｉｙｕｅ  Ｌ，  Ｊｉｅ  Ｙ，  Ｘｉａｏｊｉｎ  Ｙ  ＆  Ｊｉｎｓｈｅｎｇ  Ｒ  （２００７）．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｎ′−ｏｃｔｙｌ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ａｓ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，  ５５，  ２２２−２２８
【非特許文献１４】Ｙａｎ  Ｃ，  Ｃｈｅｎ  Ｄ，  Ｇｕ  Ｊ，  Ｈｕ  Ｈ，  Ｚｈａｏ  Ｘ  ＆  Ｑｉａｏ  Ｍ  （２００６）．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｈｙｓｉｃａｌ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ．  Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，  １２６，  ７８９−７９３
【図１】
2018199693.tif 000003
【図２】
2018199693.tif 000004
【図３】
2018199693.tif 000005
【図４】
2018199693.tif 000006
【図５】
2018199693.tif 000007
【図６−１】
2018199693.tif 000008
【図６−２】
2018199693.tif 000009
【図７】
2018199693.tif 000010
【図８】
2018199693.tif 000011
【図９】
2018199693.tif 000012
【図１０】
2018199693.tif 000013
【図１１】
2018199693.tif 000014
【図１２】
2018199693.tif 000015
【図１３】
2018199693.tif 000016
【図１４】
2018199693.tif 000017
【図１５】
2018199693.tif 000018
【図１６】
2018199693.tif 000019
【図１７】
2018199693.tif 000020
【図１８】
2018199693.tif 000021
【配列表】
2018199693000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月14日(2018.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）またはコンピューター断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視化するための、造影剤のコアを含む骨生体特異的な薬剤であって、
前記造影剤のコアは、ポリマーシェルによって囲まれていてもよく、
骨−標的ペプチドは、前記造影剤のコアまたは前記ポリマーシェルに共有結合しており、
前記骨−標的ペプチドは、使用時、骨を標的とし、
前記骨−標的ペプチドは、破骨細胞−破骨細胞相互作用および／または破骨細胞−骨芽細胞相互作用を阻害し、
前記骨−標的ペプチドは、配列番号１〜１５から選択されたペプチドを含む、骨生体特異的な薬剤。
【請求項２】
前記造影剤のコアの平均直径が５ｎｍ〜３０ｎｍである、請求項１に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項３】
前記造影剤のコアが
金属材料を含む；
磁性材料を含み、およびＭＲＩ造影剤である；または
鉄、ニッケル、コバルトもしくはジスプロシウムまたは１以上のこれらの元素を含む、酸化物もしくは合金のような化合物であり、この際前記造影剤のコアがマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）を含んでもよい、
請求項１または２に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項４】
前記造影剤のコアが、非磁性材料を含み、ならびにＭＲＩ造影剤およびＣＴ造影剤の両方であり、この際前記造影剤のコアが、ガドリニウム、金、ヨウ素またはボロサルフェート（ｂｏｒｏｓｕｌｐｈａｔｅ）を含んでもよい、請求項１または２に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項５】
前記ポリマーシェルが、
ポリペプチド、荷電タンパク質、多糖または核酸を含む；
キトサン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリ（エチレングリコール）ポリ（乳酸）、ポリ（グルコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）およびポリ（アクリル酸）を含む生体適合性の天然または合成ポリマーを含む；
無水コハク酸で誘導体化されている；または
骨を標的とする、１種または２種以上の骨−標的ペプチドに共有結合している、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項６】
前記骨−標的ペプチドが、
例えば骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、破骨前駆細胞または骨ライニング細胞のような、排他的に骨に存在する細胞を標的とする；
例えばヒドロキシアパタイトのような、骨ミネラル相を標的とする；または
ＲＡＮＫＬ−誘導破骨細胞分化および活性を減少または抑制するために、ＲＡＮＫに結合することによりＯＰＧをミミックするアミノ酸配列を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項７】
前記骨−標的ペプチドが、カルボジイミドの化学的性質を用いて前記ポリマーシェルに共有結合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項８】
前記骨生体特異的な薬剤が、前記骨−標的ペプチドの存在により骨へと運ばれる、生体活性化合物を含み、この際前記生体活性化合物が、色素、電気化学メディエータ、タンパク質、ペプチド、化学化合物（例えば、薬）、遺伝物質（例えば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、小分子、抗体、または酵素から構成される分子の群から選択されてもよい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項９】
前記骨生体特異的な薬剤の平均直径が１０００ｎｍ未満である、または１００〜４５０ｎｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項１０】
診断に用いられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項１１】
ＭＲＩ生体標識物としてまたはＣＴ生体標識物として使用される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤を含む、生体標識物。
【請求項１３】
ＭＲＩまたはＣＴ画像検査法で使用される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項１４】
治療に用いられる、好ましくは薬剤として用いられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項１５】
骨疾患を治療する、予防するまたは改善することに用いられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項１６】
前記骨疾患が、骨吸収、骨腫瘍の治療、パジェット病、変形性関節症、骨粗しょう症、骨肉腫、骨減少症ならびに溶骨性および造骨性の表現型などを含む骨転移を含む、請求項１５に記載の骨生体特異的な薬剤。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の骨生体特異的な薬剤、および薬学的に許容されるベヒクルを含む、薬剤組成物。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の治療上有効な量の骨生体特異的な薬剤と、薬学的に許容されるベヒクルとを接触させることを有する、請求項１７に記載の組成物の製造方法。
【外国語明細書】
2018199693000001.pdf
2018199693000002.pdf
2018199693000003.pdf
2018199693000004.pdf