(57)【要約】      （修正有）【課題】濃度の異なる複数の測定試料のクロマトグラムに対して、ピーク検出感度を自動で決定する方法を提供する。【解決手段】クロマトグラム中でピークが存在しない任意の時間を安定点とした場合に、特定成分の濃度が既知である標準試料について、クロマトグラム中で前記特定成分に関するピークが検出可能な溶出時間の範囲を基準範囲、前記基準範囲内における最大出力値と安定点における出力値との差を標準最大ピーク値、測定の際のピーク検出感度を標準ピーク検出感度とし、前記特定成分を含んでなる試料を分析する際に、前記試料のクロマトグラム中における前記標準試料と同一の基準範囲内における最大出力値と、前記標準試料と同一の又は異なる安定点における出力値との差である最大ピーク値を算出し、前記標準最大ピーク値に対する前記最大ピーク値の割合を、前記標準ピーク検出感度に乗算した値をピーク検出感度として用いる分析方法。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィによる試料の分析方法であって、
クロマトグラム中でピークが存在しない任意の時間を安定点とした場合に、
特定成分の濃度が既知である標準試料について、
クロマトグラム中で前記特定成分に関するピークが検出可能な溶出時間の範囲を基準範囲、
前記基準範囲内における最大出力値と安定点における出力値との差を標準最大ピーク値、
測定の際のピーク検出感度を標準ピーク検出感度とし、
前記特定成分を含んでなる試料を分析する際に、
前記試料のクロマトグラム中における前記標準試料と同一の基準範囲内における最大出力値と、前記標準試料と同一の又は異なる安定点における出力値との差である最大ピーク値を算出し、
前記標準最大ピーク値に対する前記最大ピーク値の割合を、前記標準ピーク検出感度に乗算した値をピーク検出感度として用いることを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記安定点をクロマトグラムの最初又は最後の部分から自動的に決定することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記基準範囲をクロマトグラム全体とすることを特徴とする請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記特定成分を含んでなる試料が前記標準試料を希釈した試料であり、
前記試料のクロマトグラム中における前記標準試料と同一の基準範囲内における最大出力値と、前記標準試料と同一の安定点における出力値との差である最大ピーク値を算出して、
請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法を行うことを特徴とする検量線作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定試料のクロマトグラムに対して、適切なピーク検出感度を自動で決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィは複数成分を含む試料をカラムで分離定量する方法である。一般的には、各成分ピークの溶出時間から定性を行い、検出器の出力度合により定量を行う。未知試料の定量分析を行う際、希釈倍率の異なる複数の標準試料を用いて目的ピークの検量線を作成する必要がある。正確な定性・定量を実現するためには、標準試料、未知試料いずれにおいても、正確にピークを検出し、そのピークの面積または高さを算出することが重要となる。
【０００３】
ピークの検出は、時間当たりの検出器の出力の変化量、つまり、クロマトグラムの微分値の変化を基に行うのが一般的である。前記変化量が事前に定めたピーク検出感度を閾値としてピークスタート点およびピークエンド点を決定し、ピーク高さ、面積等を算出する。
【０００４】
ピーク検出感度は、濃度の異なる測定試料の全ピークが検出できるように、デフォルトの閾値として指定されたピーク検出感度から各クロマトグラムに最適なピーク検出感度へ手入力により変更し、クロマトグラム毎にピーク検出結果を確認し、正常にピーク検出ができなかった場合は再度、ピーク検出感度を手入力により変更する必要がある。
【０００５】
図１、２に濃度の異なる標準試料を単一のピーク検出感度を用いてピーク検出を試みた結果を示す。ピーク検出感度をピークスタートで２．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンドで−２．０００μＳ／ｍｉｎとしたところ、図１ａに示すクロマトグラムの一次微分値は図１ｂとなり、ピークスタート点とピークエンド点が一点ずつ検出され、正しくピーク検出ができていることがわかる。一方、図２ａに示すクロマトグラムの一次微分値は図２ｂとなり、ピークスタート点とピークエンド点いずれも検出されず、ピークが検出されていないことがわかる。
【０００６】
目的のピークが自動で検出されないクロマトグラムに対しては、ピーク検出感度を操作者がクロマトグラム毎に手作業により指定する方法がとられている。しかし、操作者に依存したピーク検出手法は、操作者の主観的判断や作業習熟度により解析結果が変化するため、クロマトグラフィの定量性を損ない、計測手法としての信頼性を失う。また、濃度が異なる複数の標準試料のクロマトグラムに含まれるすべての目的ピークを単一の検出感度にて自動検出しようとした場合、もっとも微分値が小さいピーク以下になるようにピーク検出感度を指定しなければならない。この場合、クロマトグラムに含まれるノイズや夾雑物による不要ピークを検出してしまうといった問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、試料を測定する際に、ピーク検出感度を自動で調整し、適切なピーク検出が可能となる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、試料のクロマトグラムのピークの一次微分値が、クロマトグラムの高さによって変化することに着目し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
クロマトグラフィによる試料の分析方法であって、
クロマトグラム中でピークが存在しない任意の時間を安定点とした場合に、
特定成分の濃度が既知である標準試料について、
クロマトグラム中で前記特定成分に関するピークが検出可能な溶出時間の範囲を基準範囲、
前記基準範囲内における最大出力値と安定点における出力値との差を標準最大ピーク値、
測定の際のピーク検出感度を標準ピーク検出感度とし、
前記特定成分を含んでなる試料を分析する際に、
前記試料のクロマトグラム中における前記標準試料と同一の基準範囲内における最大出力値と、前記標準試料と同一の又は異なる安定点における出力値との差である最大ピーク値を算出し、
前記標準最大ピーク値に対する前記最大ピーク値の割合を、前記標準ピーク検出感度に乗算した値をピーク検出感度として用いることを特徴とする。
【００１０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明における安定点とは、クロマトグラム中でピークが存在しない任意の時間をいう。クロマトグラムのうち測定試料や夾雑物に由来したピークに干渉されないベースライン上となるような時間であればどこを選択してもよいが、クロマトグラムの最初又は最後の部分を選択することが好ましく、操作者の主観的判断を排除するために装置によって自動的に決定されることが好ましい。
【００１２】
本発明における基準範囲とは、クロマトグラム中で特定成分に関するピークが検出可能な溶出時間の範囲をいう。特定成分とは、内部標準成分や検量線作成時の既知成分等の必ず含まれる成分を選択する必要がある。検量線作成時であれば、試料中に少量しか含まれていない成分を選択することが好ましい。また、主成分が１種類であるような試料、あるいは分子量分布測定であれば、基準範囲についてクロマトグラムすべてを包含するような時間にしても問題はない。
【００１３】
本発明はまず、前述した特定成分の濃度が既知である標準試料について、クロマトグラフィ測定を行い、得られたクロマトグラムについて基準範囲内における最大出力値と安定点における出力値との差を標準最大ピーク値として算出する。標準試料のクロマトグラフィ測定の際に設定されているピーク検出感度が標準ピーク検出感度となる。デフォルト値などであらかじめ指定された値がノイズや夾雑物による不要ピークを検出してしまうような値で設定されている場合は、ピーク検出感度を下げて標準試料を測定する方が好ましく、また、デフォルト値などであらかじめ指定された値が目的とするピークを正しく検出できないような値で設定されている場合は、ピーク検出感度を上げて測定する方が好ましい。ただし、実際に標準試料を測定する際に使用したピーク検出感度を標準ピーク検出感度とすれば問題ない。
【００１４】
次に、前述した特定成分を含んでなる試料を分析するが、この際に測定試料のクロマトグラム中における前記標準試料と同一の基準範囲内における最大出力値と、前記標準試料と同一の又は異なる安定点における出力値との差である最大ピーク値を算出し、前記標準最大ピーク値に対する前記最大ピーク値の割合を、前記標準ピーク検出感度に乗算した値をピーク検出感度として用いる。例えば、標準最大ピーク値が２μＳ、標準ピーク検出感度がピークスタートで２．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンドで−２．０００μＳ／ｍｉｎの場合、測定試料の最大ピーク値が１μＳであれば、標準最大ピーク値（２μＳ）に対する最大ピーク値（１μＳ）の割合は０．５（１μＳ／２μＳ）となるため、標準ピーク検出感度（２．０００μＳ／ｍｉｎ）を０．５で乗算し、ピークスタートで１．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンドで−１．０００μＳ／ｍｉｎというピーク検出感度を用いればよい。
【００１５】
標準試料中の特定成分と同一成分での比較を行う必要があるため、基準範囲は標準試料と同一である必要があるが、安定点については前記標準試料と同一の時間が必ずしも測定試料にとっての安定点となるとは限らないため、標準試料と同一の場合もあれば、異なる場合もある。なお、基準範囲をクロマトグラムすべてを包含するような時間に設定している場合は、測定試料中に特定成分より多量に含まれている成分があってはならない。この場合、基準範囲を再設定する必要がある。
【００１６】
本発明は、検量線の作成にも好適に用いることが可能である。測定試料に標準試料を希釈した試料を選択し、標準試料と同一の基準範囲及び安定点で最大ピーク値を算出して、前述した通り、標準最大ピーク値に対する最大ピーク値の割合を、標準ピーク検出感度に乗算した値をピーク検出感度として用いればよい。
【００１７】
本発明の方法は、測定者自身が自動的に算出されるピーク検出感度を手入力で変更することで実施してもよく、装置がプログラムでピーク検出感度を自動的に変更しても問題ない。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、クロマトグラムを取得した後、適切なピーク検出感度により、定量計算まで適切かつ自動に行うことが可能になり、操作者の負担低減および定量計算の信頼性を高めることが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】一般的な希釈倍率が低い測定試料に対するピーク検出結果を示した図である。
【図２】一般的な希釈倍率が高い測定試料に対するピーク検出結果を示した図である。
【図３】実施例１で使用したシステム構成を示した図である。
【図４】一般的なピーク検出結果を用いて作成した検量線を示した図である。
【図５】本発明での希釈倍率が高い測定試料に対するピーク検出結果を示した図である。
【図６】本発明のピーク検出結果を用いて作成した検量線を示した図である。
【図７】実施例２で使用したシステム構成を示した図である。
【図８】実施例２で得られたクロマトグラムを示した図である。
【図９】従来法でのピーク検出結果と、本発明でのピーク検出結果（＃７〜＃４）を示したものである。
【図１０】従来法でのピーク検出結果と、本発明でのピーク検出結果（＃３〜＃１）を示したものである。
【図１１】従来法で検出したピークの面積と、本発明法で検出した面積を比較したものである。
【図１２】従来法で検出したピークの積分分子量分布曲線と、本発明法で検出したピークの積分分子量分布曲線を比較したものである。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明について実施例を用いて説明するが、これらは本発明の一実施形態であり、本発明を限定するものではない。
【００２１】
（実施例１）
本発明の方法を、図３に示すイオンクロマトグラフィシステムを使用し、複数の標準物質を測定することで検量線を作成する検証した。なお、検量線の作成対象は塩化物イオン（基準溶出時間  １．８〜２．０５分）とした。
【００２２】
システムは、溶媒脱気装置（２）、送液ポンプ（３）、試料注入バルブ（４）、カラムオーブン（６）、サプレッサ（７）、電気伝導度検出計（８）にて構成される。データ処理装置（１０）は東ソー（株）製データ処理プログラム  ＩＣ−２０１０ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用した。
分析カラム（５）としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＩＣ−Ａｎｉｏｎ ＨＳを使用した。
【００２３】
測定試料には標準陰イオン試料（フッ化物イオン１ｍｇ／Ｌ、塩化物イオン１ｍｇ／Ｌ、亜硝酸イオン５ｍｇ／Ｌ、臭化物イオン５ｍｇ／Ｌ、硝酸イオン５ｍｇ／Ｌ、燐酸イオン１０ｍｇ／Ｌ、硫酸イオン５ｍｇ／Ｌ）を２０倍希釈（濃度１）、４０倍希釈（濃度２）、８０倍希釈（濃度３）、１６０倍希釈（濃度４）、３２０倍希釈（濃度５）、６４０倍希釈（濃度６）したものを使用した。
その他の条件は下記の通りである。
注入量：３０μＬ、カラムオーブン温度：４０℃、溶離液流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：３．８ｍＭ炭酸水素ナトリウム＋３．０ｍＭ炭酸ナトリウム、サプレッサゲル：ＴＳＫｇｅｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ＩＣ−Ａ。
【００２４】
まず、従来法に従い、単一の検出感度であるピークスタート検出感度を２．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンド検出感度を−２．０００μＳ／ｍｉｎに設定して試料の測定を行った。その結果、６４０倍希釈した試料（濃度６）では、ピークが検出できず検量線としてプロットできなかった（図４参照）。
【００２５】
次に、本発明の方法で検量線作成を行った。塩化物イオンの出現する溶出時間１．８〜２．０５分を基準範囲、ベースライン上から安定点（クロマトグラムの最後の部分である７．０分）を選択し、濃度１の試料を標準試料として標準最大ピーク値、濃度２〜６の試料の最大ピーク値をそれぞれ算出した。ピークスタート検出感度２．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンド検出感度−２．０００μＳ／ｍｉｎを標準ピーク検出感度とし、表１に本手法を用いて算出した各試料のピーク検出感度を示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
濃度６の試料の測定の際は、標準ピーク検出感度を標準最大ピーク値に対する濃度６の試料の最大ピーク値の割合（０．０２３）で乗算し、ピークスタート検出感度０．０４６μＳ／ｍｉｎ、ピークエンド検出感度−０．０４６μＳ／ｍｉｎに設定して、測定を行った。その結果、従来法では検出ができなかった濃度６の試料でもピークを検出することができ（図５参照）、全ての測定試料の点をプロットした検量線が作成できた（図６参照）。
【００２８】
（実施例２）
本実施例においては、図７に示すクロマトグラフィシステムを使用し、分子排除クロマトグラフィー（ＧＰＣ）での高分子成分の分子量測定の系で検証した。
【００２９】
システムは、溶媒脱気装置（２）、サンプル側送液ポンプ（１１）、リファレンス側送液ポンプ（１２）、試料注入バルブ（４）、カラムオーブン（６）、示差屈折率検出器（１３）、データ処理装置（１０）にて構成される。データ処理装置（１０）は東ソー（株）製マルチステーション ＧＰＣ-８０２０ＩＩを使用した。
分析カラム（５）としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ−Ｏｌｉｇｏ−ＰＷ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０  ｃｍ）を２本直列に接続して使用した。
【００３０】
測定試料にはポリエチレングリコール：平均分子量１０００（和光純薬工業(株)製）２５０ｍｇ／ｍＬ（＃７）と、それを２倍希釈（＃６）、４倍希釈（＃５）、８倍希釈（＃４）、１６倍希釈（＃３）、３２倍希釈（＃２）、６４倍希釈（＃１）したものを使用した（表２参照）。
その他の条件は下記の通りである。
注入量：５０μＬ、カラムオーブン温度：４０℃、溶離液流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ（サンプル側）、０．５ｍＬ／ｍｉｎ（リファレンス側）、溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
【００３１】
【表２】
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【００３２】
図８は得られたクロマトグラムを示した図である。図中の凡例は測定＃を示している。
【００３３】
まず、＃７の試料を標準とし、ピーク検出感度を含むピーク検出条件を設定した。
本実施例で使用したデータ処理装置のピーク検出条件は以下の通りである。
[検出感度]：２．０００ｍＶ／分
（ピーク検出用のクロマトグラム一次微分閾値）
[ベース判定値]：０．０００ｍＶ／分
（検出されたピークを「ベースピーク」または「谷ピーク」とするかの判定値）
[排除面積値]：０．０００ｍＶ×秒
（ピークと判断しないピーク面積閾値）
[排除高さ]：０．０２０ｍＶ
（ピークと判断しないピーク高さ閾値）
[排除半値幅]：０．０００秒
（ピークと判断しないピーク半値幅閾値）
基準範囲をクロマトグラム０．０〜２５．０ｍｉｎ、＃７の最大ピーク値を標準最大ピーク値とし、ピークスタート検出感度２．０００ｍＶ／ｍｉｎ、ピークエンド検出感度−２．０００ｍＶ／ｍｉｎを標準ピーク検出感度とした。表３に本手法を用いて算出した各試料のピーク検出感度を示す。
【００３４】
たとえば、＃４のクロマトグラムでは、時間ゼロを安定点とした最大出力は１１．８３４ｍＶであり、標準最大ピーク値（５８．３３４ｍＶ）に対する試料の最大ピーク値（１１．８３４ｍＶ）の割合は０．２０３（１１．８３４／５８．３３４）となり、ピーク検出感度は０．４０６ｍＶ／ｍｉｎ（２．０００ｍＶ／ｍｉｎ×０．２０３）と算出される。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
以上のように算出されたピーク検出感度を各々のクロマトグラムに適用し、ピーク検出を実施して得られた結果を図９ｂ、図１０ｂに示す。
【００３７】
なお、従来法との比較のため、ピーク検出感度を２．０００ｍＶ／ｍｉｎと設定し、全てのクロマトグラムに適用し、ピーク検出を実施した場合の結果を図９ａ、図１０ａに示す。なお、ピークスタート点、およびピークエンド点は図中に黒丸で示す。
【００３８】
図９、図１０から明らかなように、ピーク検出感度を一定の値に設定した場合、ピーク強度（濃度）が小さくなるにつれて、ピークスタート点が正常時間から遅れたり、ピークエンド点が正常時間から早まる現象が顕著となる。本発明の方法によりピーク強度に則したピーク検出感度を用いた場合は、ピーク強度（濃度）が小さくなっても、ピークスタート点およびピークエンド点が正常に検出される。
【００３９】
本実施例で示したＧＰＣでは、未知試料の分子量分布を得ることが目的である。ピークのスタート側とエンド側は、それぞれ未知試料の分子量分布における最大値付近と最小値付近をあらわすため、ブロードな高分子成分ピークのスタート位置およびエンド位置を正確に特定する必要がある。そのため、自動でピーク検出を実行した後、ピークスタート位置およびエンド位置が不適切な場合、再度、ピーク検出条件を変えて正確なピーク検出ができるように試行錯誤することとなる。如何なる試行錯誤を行っても適切なピーク検出ができない場合は、最終的に、操作者の判断でピークスタート位置およびエンド位置を手動で特定する作業等を行う必要がある。特に、ピーク高さが変化したり、溶出位置が変化した場合などは、正確なピーク検出が行われないケースが多い。
【００４０】
図１１は前記操作で得られたピークスタート点、およびピークエンド点から得られた面積値の違いを示した図である。本発明の検出法（ピーク検出感度可変）で得られた面積を１００として、従来法（ピーク検出感度固定）で得られた面積％を計算し、プロットした。なお、横軸は濃度の対数値であり、黒三角は従来法（ピーク検出感度固定）白丸は本法（ピーク検出感度可変）を示している。この図からも明らかなように、全ての濃度の試料に対しても、従来法（ピーク検出感度固定）でピーク検出法を行った場合は、最大で２５％も小さくなっていることが分かる。
【００４１】
図１２は、図９、図１０で得られた結果を元に作成した積分分子量分布曲線である。横軸が分子量、縦軸が積分分布の割合である。凡例破線は従来法によりピーク検出感度を固定でピークを検出した場合の積分分子量分布曲線であり、凡例実線は本発明によりピーク検出感度を可変にしてピークを検出した場合の積分分子量分布曲線である。ここからわかるように、本発明は従来法と比べてピークの分子量分布における最大値付近と最小値付近をより正確に取得できていることがわかる。
【符号の説明】
【００４２】
１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．サプレッサ
８．電気伝導度検出器
９．廃液
１０．システム制御およびデータ処理装置
１１．送液ポンプ（サンプル側）
１２．送液ポンプ（リファレンス側）
１３．示差屈折率検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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