(57)【要約】【課題】  より簡易な装置で被検出物質を検出するための反応を自動で行うことができ、被検出物質検出用の処理液の量を可能な限り少なくすることができる自動反応装置を提供する。【解決手段】  本発明は、被検出物質が固相化されたメンブレンＭを用いて被検出物質を検出するための反応を自動で行うための自動反応装置１で、被検出物質検出用の処理液が収納される処理液用貯留槽１１と、メンブレンＭを横にした状態で収納することができ、処理液とメンブレンＭを反応させる反応槽２０と、反応槽２０を一の方向とその反対方向とに交互に傾動させることにより処理液を撹拌する撹拌機構４０と、撹拌機構４０による傾動によって最も大きく上下変位する反応槽２０の底面の部分に下端の排出口３２１が位置するように設けられる排出管３２と、を備える。排出管３２は、メンブレンＭと排出口３２１との間に介在する突出部３２２を備えている。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質が固相化されたメンブレンを用いて被検出物質を検出するための反応を自動で行うための自動反応装置であって、
被検出物質検出用の少なくとも１種の処理液が収納される処理液用貯留槽と、
洗浄液が収納される洗浄液用貯留槽と、
前記メンブレンを横にした状態で収納することが可能な広さの底面を有し、前記処理液用貯留槽から注入管を介して注入された処理液と前記メンブレンを反応させる反応槽と、
前記反応槽を一の方向とその反対方向とに交互に傾動させることにより前記処理液を撹拌する撹拌機構と、
前記撹拌機構による傾動によって最も大きく上下変位する前記反応槽の底面の部分に下端の排出口が位置するように設けられる排出管と、
前記排出管の下端の前記排出口に吸引力を作用させて処理液を排出する吸引装置と、
前記撹拌機構および前記吸引装置の各動作を制御する制御装置と、を備え、
前記排出管は、前記メンブレンと前記排出口との間に介在する突出部を備えており、
前記反応槽には、前記処理液用貯留槽からの処理液と前記洗浄液用貯留槽からの洗浄液とが前記注入管を介して設定した順序で注入されるとともに、前記反応槽に注入された処理液および洗浄液は、前記反応槽で所定の処理を行った後に前記排出管より前記反応槽の外部に排出され、
前記制御装置は、前記排出管が設けられている側が傾斜下端になったときに前記撹拌機構の動作を停止させて前記吸引装置の動作を開始させるものである自動反応装置。
【請求項２】
前記反応槽は、着脱式であり、
前記突出部は、前記排出管の下端の少なくとも一部を残してにより形成されている請求項１に記載の自動反応装置。
【請求項３】
前記注入管から注入される処理液および洗浄液の流速は、３．３ｍｌ／１０ｓｅｃ以上であり、
前記排出管から排出される処理液および洗浄液の流速は、３．３ｍｌ／１０ｓｅｃ以上である請求項１または２に記載の自動反応装置。
【請求項４】
前記注入管は、一または複数の注入口を有しており、
前記注入管から注入される処理液および洗浄液の流速は、方程式ｙ＝−０．４８０４×（ｌｎ（ｘ））２＋３２．７８９×ｌｎ（ｘ）−１３．８４９で導き出される値以下であり、前記ｘは前記注入管の下端の注入口の総面積を表し、前記ｙは処理液および洗浄液の流速を表す請求項１〜３のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【請求項５】
前記排出管は、内径が５ｍｍ未満であり、
前記排出管の下端は、前記突出部の最も接近した部分が前記反応槽の底面から１ｍｍ以内であり、最も離れた部分が前記反応槽の底面から６ｍｍ以内である請求項１〜４のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【請求項６】
前記撹拌機構は、１０秒間に５往復〜１１往復で傾動する請求項１〜５のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【請求項７】
前記制御機構は、処理液および洗浄液の注入、撹拌、および、排出のタイミングを制御するためのタイマーを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【請求項８】
前記反応槽を２５℃〜４５℃の間で加温可能な加温機構をさらに備える請求項１〜７のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【請求項９】
前記処理液用貯留槽のうち、少なくとも抗体溶液を貯留するための処理液用貯留槽を０℃〜１５℃の間で冷却可能な冷却機構をさらに備える請求項１〜８のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検出物質を検出するための反応を自動で行うための自動反応装置に関し、特に、被検出物質の検出するための各反応工程、および、各反応工程の前後に行われる洗浄を自動で行うことができる自動反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
被検出物質を検出する分析法として、例えば、イムノブロットと言われる分析法が知られている。イムノブロットは、被検出物質（通常はタンパク質）をメンブレンに固相化させ、被検出物質を特異的に認識する処理液（抗体）を用いた抗原抗体反応によって、被検出物質を検出する分析法である。その代表例であるウェスタンブロットでは、電気泳動により、サンプルである生体成分を、サンプルに含まれる被検出物質であるタンパク質の分子量で分離し、分離した電気泳動ゲルからタンパク質をメンブレンに転写する。タンパク質が転写されて固相化されたメンブレンは、非特異的な結合を防止するためにブロッキング溶液で処理され、その後、一次抗体との反応、二次抗体との反応が順次行われる。これらの各工程の後には余分なブロッキング溶液、一次抗体溶液または二次抗体溶液を取り除くために洗浄液を用いて洗浄が行われる。こうして反応が終わったメンブレンは、二次抗体に標識された酵素の活性を利用して、例えば化学発光基質による発光によって検出される。イムノブロットは、タンパク質の存在を確認する手法として、再生医療、創薬研究等のライフサイエンス領域では不可欠の分析法である。
【０００３】
イムノブロットにおいては、ブロッキング溶液でのメンブレンの処理から二次抗体との反応までの標準的工程における処理時間は約５時間であり、その間に、約１３回の処理液（ブロッキング溶液、一次抗体溶液、二次抗体溶液）の注入および排出の操作が必要となる。多くの実験者は、この作業を手動で行っており、メンブレンを入れた反応槽へ処理液を手動で注入し、反応槽を振盪機で一定時間振盪させながらメンブレンに固相化された被検出物質と処理液とを反応させた後、処理液を次の処理液と交換するという作業を繰り返している。また、被検出物質または処理液等が異なる場合には、ブロッキング溶液での処理時間、一次抗体との反応時間、二次抗体との反応時間、および、各工程の間に行われる洗浄時間が長くなる場合もあり、実験者は非常に多くの時間を本操作によって拘束されることになる。特に、処理液の交換が多いため、時にミスを犯すことも生じる。したがって、被検出物質を検出するための一連の作業を自動化することは大きな価値がある。
【０００４】
抗原抗体反応を利用する免疫学的アッセイにおいて、アッセイ手順を自動化する方法は、以前から種々知られている。例えば、特許文献１には、小型反応容器を用いた測定系へ、順次反応試薬を分注し、反応させるシステムが開示されている。また、特許文献２には、マイクロプレートを利用した免疫測定における撹拌機能を持つ自動化システムが開示されている。また、特許文献３には、サンプルを電気泳動した後、キャピラリー内にて、分離したタンパク質を固相化し、抗体と反応させて、検出する手法が開示されている。しかしながら、特許文献１〜３の装置は、被検出物質がメンブレンに固相化されておらず、メンブレンを用いるイムノブロット等とは反応系が異なるため、メンブレンに固相化された被検出物質を検出するために利用することはできない。
【０００５】
また、メンブレンを用いた測定を自動化する仕組みとして、特許文献４には、メンブレンを回転可能な円筒体に巻き付け、その一部が処理液と接触する形状の液槽からなる仕組みが開示されている。この機構は、液体を交換するシステムと併用することで自動化が可能であることが記載されているが、自動化に関する具体的な記載はなく、実現し難いものとなっている。
【０００６】
一方、特許文献５には、ウェスタンブロットにおける一連の反応の自動化装置が開示されている。この自動化装置は、メンブレン等の固体支持体を処理するためのバイオプロセシングチャンバー、バイオプロセシングチャンバーとポンプを介して流体連通するバイオプロセシングカートリッジ（以下単に「カートリッジ」ともいう）、カートリッジを収納するスロット、流体容器トレー、および、制御システムで構成されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−２８８７５３号公報
【特許文献２】特開平６−１６０３９３号公報
【特許文献３】特表２００８−５３６１２８号公報
【特許文献４】特開平７−０６３７６７号公報
【特許文献５】特表２０１２−５０６９９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、引用文献５の装置では、例えば、ウェスタンブロットにおける一連の反応という比較的単純な操作を行うには、装置が複雑で大型になるため、最適な装置とは言えない。また、カートリッジを用いるため、カートリッジの構造が複雑な場合、洗浄が難しくなり、カートリッジは使い捨てとせざるを得ないという問題も生じる。さらに、イムノブロットで用いる処理液は貴重な場合が多く、一連の反応で利用する処理液はできるだけ少ない量であることが求められる。しかしながら、上記したように、カートリッジの洗浄が難しくなると、各工程で使用される処理液が、前の工程で使用された処理液または各工程間で使用される洗浄液によって希釈される恐れがあり、精度の高い検出を行うためには処理液の濃度を高くする、または、処理液の量を多くすることが必要となり、処理液の使用量が多くなるという問題も生じる。
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するためになされた発明であり、より簡易な装置で被検出物質を検出するための反応を自動で行うことができ、被検出物質検出用の処理液の量を可能な限り少なくすることができる自動反応装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、処理液の注入機構、処理液とメンブレンを均一に接触させる機構、処理液の排出機構等について新知見を加えることによって完成させるに至った。
【００１１】
項１．  被検出物質が固相化されたメンブレンを用いて被検出物質を検出するための反応を自動で行うための自動反応装置であって、
被検出物質検出用の少なくとも１種の処理液が収納される処理液用貯留槽と、
洗浄液が収納される洗浄液用貯留槽と、
前記メンブレンを横にした状態で収納することが可能な広さの底面を有し、前記処理液用貯留槽から注入管を介して注入された処理液と前記メンブレンを反応させる反応槽と、
前記反応槽を一の方向とその反対方向とに交互に傾動させることにより前記処理液を撹拌する撹拌機構と、
前記撹拌機構による傾動によって最も大きく上下変位する前記反応槽の底面の部分に下端の排出口が位置するように設けられる排出管と、
前記排出管の下端の前記排出口に吸引力を作用させて処理液を排出する吸引装置と、
前記撹拌機構および前記吸引装置の各動作を制御する制御装置と、を備え、
前記排出管は、前記メンブレンと前記排出口との間に介在する突出部を備えており、
前記反応槽には、前記処理液用貯留槽からの処理液と前記洗浄液用貯留槽からの洗浄液とが前記注入管を介して設定した順序で注入されるとともに、前記反応槽に注入された処理液および洗浄液は、前記反応槽で所定の処理を行った後に前記排出管より前記反応槽の外部に排出され、
前記制御装置は、前記排出管が設けられている側が傾斜下端になったときに前記撹拌機構の動作を停止させて前記吸引装置の動作を開始させるものである自動反応装置。
【００１２】
項２．  前記反応槽は、着脱式であり、
前記突出部は、前記排出管の下端の少なくとも一部を残して切断することにより形成されている前記項１に記載の自動反応装置。
【００１３】
項３．  前記注入管から注入される処理液および洗浄液の流速は、３．３ｍｌ／１０ｓｅｃ以上であり、
前記排出管から排出される処理液および洗浄液の流速は、３．３ｍｌ／１０ｓｅｃ以上である前記項１または２に記載の自動反応装置。
【００１４】
項４．  前記注入管は、一または複数の注入口を有しており、
前記注入管から注入される処理液および洗浄液の流速は、方程式ｙ＝−０．４８０４×（ｌｎ（ｘ））２＋３２．７８９×ｌｎ（ｘ）−１３．８４９で導き出される値以下であり、前記ｘは前記注入管の下端の注入口の総面積を表し、前記ｙは処理液および洗浄液の流速を表す前記項１〜３のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【００１５】
項５．  前記排出管は、内径が５ｍｍ未満であり、
前記排出管の下端は、前記突出部の最も接近した部分が前記反応槽の底面から１ｍｍ以内であり、最も離れた部分が前記反応槽の底面から６ｍｍ以内である前記項１〜４のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【００１６】
項６．  前記撹拌機構は、１０秒間に５往復〜１１往復で傾動する前記項１〜５のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【００１７】
項７．  前記制御機構は、処理液および洗浄液の注入、撹拌、および、排出のタイミングを制御するためのタイマーを含む前記項１〜６のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【００１８】
項８．  前記反応槽を２５℃〜４５℃の間で加温可能な加温機構をさらに備える前記項１〜７のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【００１９】
項９．  前記処理液用貯留槽のうち、少なくとも抗体溶液を貯留するための処理液用貯留槽を０℃〜１５℃の間で冷却可能な冷却機構をさらに備える前記項１〜８のいずれか一項に記載の自動反応装置。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、より簡易な装置で被検出物質を検出でき、被検出物質の検出に用いる処理液の量を可能な限り少なくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の自動反応装置の概念図である。
【図２】本発明の自動反応装置の第１実施形態を示す斜視図である。
【図３】図２の自動反応装置の縦断面図である。
【図４】図２の自動反応装置のブロック図である。
【図５】本発明の自動反応装置の第１実施形態の変形例を示す斜視図である。
【図６】本発明の自動反応装置の第１実施形態の排出管の変形例を示す縦断面図である。
【図７】本発明の自動反応装置の第１実施形態の排出管の変形例を示す縦断面図である。
【図８】本発明の自動反応装置の第２実施形態を示すブロック図である。
【図９】実施例１における処理液の流速と注入口の総面積との関係を示すグラフである。
【図１０】実施例３における本発明の自動反応装置の試作装置の構造を示す概略図である。
【図１１】実施例３における排出管の開口部が底面から一番離れている部分の底面からの距離ｄと溶液の残量との関係を示すグラフである。
【図１２】実施例６における振盪数と均一に振盪するまでの時間との関係を示すグラフであり、（ａ）は溶液量が５ｍｌの場合、（ｂ）は溶液量が１０ｍｌの場合、（ｃ）は溶液量が１５ｍｌの場合を示す。
【図１３】実施例７における流速と均一に振盪するまでの時間との関係を示すグラフであり、（ａ）はｂｏｘが小の場合、（ｂ）はｂｏｘが中の場合、（ｃ）はｂｏｘが大の場合を示す。
【図１４】実施例８における実験の結果を示す図である。
【図１５】実施例９における実験の結果を示す図である。
【図１６】実施例１０における反応時間とシグナル強度との関係を示すグラフである。
【図１７】実施例１１における実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、被検出物質が固相化されたメンブレンＭを用いて被検出物質を検出するための反応を自動で行うための自動反応装置１である。以下では、ウェスタンブロットおよびドットブロット等のイムノブロットによって被検出物質を検出するための反応を行うことを例示して説明する。しかしながら、本発明の自動反応装置１は、イムノブロットのみでなく、２つの物質が特異的に結合または反応する性質を有した反応系において、一方の物質が容易に回収可能な支持体（例えば、メンブレン、組織切片、プラスチック片、金属片等）に固相化され、他方の物質が溶液であるような場合に、その反応操作を自動化するものとしても利可能である。例えば、抗体を利用した組織切片の免疫染色、ＤＮＡまたはＲＮＡの結合反応を利用したサザンブロット（ＤＮＡを検出する手法）またはノーザンブロット（ＲＮＡを検出する手法）、もしくは、in situ hybridization等が挙げられる。また、本発明に係る自動反応装置１は、酵素反応を利用した反応（例えば、メンブレンに基質を固相化し、酵素反応で基質が発色するような場合）等でも利用可能である。
【００２３】
本発明に係る自動反応装置１は、図１の概念図に示すような装置となる。具体的には、自動反応装置１は、ブロッキング溶液および抗体溶液等の処理液を個別に貯留する処理液用貯留槽１１、洗浄液を個別に貯留する洗浄液用貯留槽１２、メンブレンＭ等を収納し、処理液との反応を行う反応槽２０、処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２から反応槽２０へ設定した順序で適切に処理液および洗浄液を注入する注入管３１、反応槽２０内で処理液とメンブレンＭとを均一に接触させるための撹拌機構４０、処理が終わった処理液を反応槽２０から排出する排出管３２、処理液の加温機構５１、および、これらを制御する制御装置６０を備えている。
【００２４】
自動反応装置１では、処理液であるブロッキング溶液、一次抗体溶液、ならびに、二次抗体溶液、および、洗浄液が別々に収納された処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２から、予め設定した回数と間隔で注入管３１を介して、被検出物質を固相化したメンブレンＭが収納された反応槽２０へ注入される。注入された処理液は、撹拌または液の循環等によりメンブレンＭと絶えず均一に接触し、処理液とメンブレンＭとの均一な反応が進行する。反応終了後、反応槽２０の処理液は、排出管３２により排液槽１３に排出される。反応を行っている間は、加温機構５１により、反応槽２０内の処理液は一定に加温されており、これにより、処理液とメンブレンＭとの反応が促進されている。処理液によるメンブレンＭとの反応後は、必要に応じて洗浄液を反応槽２０に注入し、反応槽２０内に残った処理液を取り除くために洗浄する。これらの一連の動作は、制御装置６０により、処理液および洗浄液を注入する順序、量、およびタイミング、反応槽２０を撹拌するタイミングおよび時間、処理液および洗浄液を排出するタイミング等を制御する。
【００２５】
本発明に係る自動反応装置１の第１実施形態を示す図２〜図４を参照して、自動反応装置１の各構成を具体的に説明する。なお、本発明が以下に示す実施形態に限定されないのは言うまでもない。
【００２６】
処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２
処理液用貯留槽１１は、被検出物質検出用の少なくとも１種の処理液が収納される容器である。本実施形態では、処理液としてブロッキング溶液、一次抗体溶液、および二次抗体溶液が用いられるため、処理液用貯留槽１１は、ブロッキング溶液、一次抗体溶液、および二次抗体溶液をそれぞれ個別に収納する３個の容器として構成される。また、洗浄液用貯留槽１２は、洗浄液が収納される容器である。
【００２７】
イムノブロットの場合、通常、１枚のメンブレンＭを処理するのに、ブロッキング溶液、一次抗体溶液および二次抗体溶液は、１０ｍｌ〜４０ｍｌ程度を使用し、洗浄液は、３００ｍｌ〜６００ｍｌ程度を使用する。したがって、処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２は、これらの量を収めることができる大きさとなっている。また、処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２は、処理液および洗浄液を貯留することに加え、貯留している処理液および洗浄液を反応槽２０へ送液する際に支障のない構造となっている。すなわち、処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２は、上記要件を満たせば任意の構造とすることができる。さらに、処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２は、洗浄し易いもの、または、使い捨て可能なものであることが好ましい。
【００２８】
反応槽２０
反応槽２０は、メンブレンＭを横にした状態で収納することが可能な広さの底面を有し、かつ、処理液および洗浄液とメンブレンＭとの均一な接触が達成できるために、メンブレンＭよりやや大きいサイズの内寸を有している。具体的に説明すると、通常イムノブロットで利用されるメンブレンＭのサイズは、７ｃｍ×９ｃｍ程度のものが多く、大きいもので１３ｃｍ×１３ｃｍ程度である。このメンブレンＭは、９ｃｍ×１ｃｍ、９ｃｍ×０．５ｃｍのような短冊型、または、４．５ｃｍ×４．５ｃｍのような小さい矩形型にカットして利用される場合もある。したがって、反応槽２０は、これらのサイズのメンブレンＭが平らに収納できる面積を持つものとなる。
【００２９】
一方で、反応槽２０のサイズをメンブレンＭのサイズより著しく大きくすると、メンブレンＭを浸すのに使用する処理液および洗浄液の量が多くなり、必然的に、処理液の一つである抗体溶液に含まれる抗体の量が多くなる。抗体は貴重であり、使用する抗体の量を節約することが望まれることから、反応槽２０のサイズをメンブレンＭのサイズに対して著しく大きくすることは好ましくない。これらの観点から、反応槽２０は、最大で１３ｃｍ×１３ｃｍ、最小で５ｃｍ×５ｃｍまでの各種のサイズのものを準備し、メンブレンＭの大きさに応じて反応槽２０を選択できるようにすることが好ましい。
【００３０】
また、被検出物質用の処理液として低濃度でも反応する抗体溶液を使うため、反応槽２０を再利用する場合には、反応槽２０を十分に洗浄してから再利用することが要求される。このように、反応槽２０は、各種のサイズを利用する可能性が高いこと、および、洗浄を容易にすることから、自動反応装置１から容易に着脱可能であり、なるべく単純な容器構造であることが好ましい。また、反応槽２０の深さは、後述するように、処理液とメンブレンＭとの均一な接触を達成するために処理液を撹拌することから、処理液の撹拌によって処理液がこぼれない深さを有している。
【００３１】
注入管３１
注入管３１は、処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２から反応槽２０へ、処理液および洗浄液を送液し、反応槽２０へ注入するものである。注入管３１の先端には注入口３１１が設けられており、注入口３１１が反応槽２０内で、反応槽２０の底面付近に位置している。なお、図３には、注入口３１１は、１個として図示されているが、注入管３１が途中で分岐して、注入口３１１が複数個設けられてもよい。
【００３２】
この注入管３１は、例えば、ブロッキング処理から二次抗体反応までのイムノブロットの標準工程で示した反応順序および反応時間にしたがって、処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２に貯留されている各処理液および洗浄液を、反応槽２０へ数秒から１分程度の間に自動で送液する仕組みを持つものであることが好ましい。この仕組みは、例えば、送液ポンプ３１２および電磁弁３１３を制御装置６０で制御することによって達成することができる。具体的には、制御装置６０が備えるタッチパネルで、処理液および洗浄液を注入する順序、量、およびタイミングを設定する。その設定したプログラムに基づき、制御装置６０が、送液ポンプ３１２の稼働を制御し、二方向性の電磁弁３１３のオン・オフを切り替えることにより、注入管３１を介して適切な処理液または洗浄液が反応槽２０に注入される。イムノブロットの場合、ブロッキング溶液、洗浄液、一次抗体溶液、洗浄液、二次抗体溶液の順で、電磁弁３１３が開き、送液ポンプ３１２によって反応槽２０へ注入される。
【００３３】
なお、本実施形態では、送液ポンプ３１２が１台で、各処理液および洗浄液の流路毎に電磁弁３１３が設けられた構造であるが、各処理液および洗浄液の流路毎に送液ポンプを設置し、各送液ポンプの稼働を制御装置６０で制御し、反応槽２０に注入する液を切り替える仕組みであってもよい。また、本実施形態では、二方向性の電磁弁３１３を４個使用して各処理液および洗浄液の切り替えを行っているが、例えば、五方向性の電磁弁を１個利用して各処理液および洗浄液を切り替えてもよい。また、送液は、送液ポンプに限らず、重力落下を利用してもよい。以上のように、処理液および洗浄液がそれぞれ設定した順序に従って反応槽２０へ注入されれば、特にその機構は問わない。
【００３４】
イムノブロットで利用する各処理液、すなわち、ブロッキング溶液、一次抗体溶液、および二次抗体溶液、ならびに洗浄液は、界面活性剤やタンパク質が入っているため非常に気泡が発生し易く、一旦発生すると消えにくい。また、一次抗体溶液および二次抗体溶液は、抗体が貴重なためなるべく少ない液量（例えば、５ｍｌ〜２０ｍｌ）でメンブレンＭの処理を行うことが強く望まれている。ブロッキング溶液も種類によっては貴重なため、少ない液量が好まれる場合が多い。こうしたことから、注入管３１は、デッドボリュームを少なくすることは当然として、少ない液量でも気泡を発生させないで反応槽２０へ送液する必要がある。
【００３５】
例えば、反応槽２０に処理液および洗浄液を注入する場合、流速が大きいと気泡が発生し易くなる。メンブレンＭは、処理液および洗浄液より僅かに比重が大きい程度であるため、静置した処理液および洗浄液中では底に沈む。しかしながら、処理液とメンブレンＭとを反応させるために、処理液を撹拌させると、処理液とともにメンブレンＭが動く。したがって、処理液を注入したときに気泡が発生してしまうと、発生した気泡は水平に設置されたメンブレンＭの下部に侵入し易くなる。気泡がメンブレンＭの下部に侵入すると、気泡がメンブレンＭを浮かし、処理液によるメンブレンＭ全体の均一な反応を妨げる原因となる。したがって、処理液および洗浄液を注入する場合には、気泡の発生をできるだけ抑えるとともに、メンブレンの下方への気泡の侵入を抑制することが大きな課題となる。この観点から、注入管３１から注入される処理液および洗浄液の流速は、３．３ｍｌ／１０ｓｅｃ以上であり、かつ、次の方程式で導き出される値以下であることが好ましい。方程式は、ｙ＝−０．４８０４×（ｌｎ（ｘ））２＋３２．７８９×ｌｎ（ｘ）−１３．８４９である。ここで、ｘは注入管３１の下端の注入口３１１の総面積を表し、ｙは処理液および洗浄液の流速を表す。また、発生した気泡の影響を減らすために、メンブレンＭを反応槽２０とともに斜めに設置し、そこへ処理液を流すようにしてもよい。
【００３６】
撹拌機構４０
上記で述べたように、イムノブロットでは、被検出物質と抗体との結合反応を利用するが、抗体が貴重なため、処理液（特に、抗体溶液）は可能な限り少ない量とすることが必要である。例えば、反応槽２０の内寸を９．５ｃｍ×９．５ｃｍとし、利用する処理液を１０ｍｌ〜２０ｍｌとする場合、反応槽２０に１０ｍｌの処理液を入れると処理液の深さは１．１ｍｍ、反応槽２０に２０ｍｌの処理液を入れると処理液の深さは２．２ｍｍと非常に浅くなる。そのため、メンブレンＭが多少湾曲している場合があること考慮すると、静置した場合、絶えずメンブレンＭ全体が完全に処理液に浸る環境を作るのは難しくなる。しかしながら、メンブレンＭが処理液に均一に浸っていないと、反応にムラが生じる。この観点から、自動反応装置１に、処理液を適切に撹拌するための撹拌機構４０を設ける。撹拌機構４０によって処理液を適切に撹拌すると、反応時間全体を通して見た場合、メンブレンＭ全体が均一に処理液に浸った状態を作り出すことができる。
【００３７】
本実施形態では、撹拌機構４０は、反応槽２０を、一の方向とその反対方向とに交互に傾動させることにより、処理液を撹拌する構成となっている。この撹拌機構４０の傾動動作は、制御装置６０によって制御される。撹拌機構４０は、任意の速度で傾動動作を行うことができるが、１０秒間に５往復〜１１往復で傾動することが好ましい。このように、メンブレンＭを反応槽２０に水平に設置して、撹拌機構４０によって反応槽２０全体を定められた方向に沿って交互に傾動させることで、反応槽２０中の処理液が左右に移動し、メンブレンＭ全体を処理液に均一に接触させることができる。
【００３８】
なお、撹拌機構４０は、上記構成に限られず、例えば、バイブレーター型の振盪機構としてもよい。この場合は、撹拌機構４０を稼働することで、反応槽２０中の処理液に微細振動が生じ、その微細振動によって処理液が反応槽２０内で撹拌される。また、撹拌機構４０は、反応槽２０内に設けられた小型プロペラによって構成することもできる。この場合は、撹拌機構４０（小型プロペラ）を稼働する（回す）ことで、処理液に流れを発生させて撹拌する。
【００３９】
排出管３２
排出管３２は、反応槽２０から処理液および洗浄液を排出し、排液槽１３へ処理液および洗浄液を送液するものである。反応槽２０から処理液を排出する際に重要な点の一つは、できるだけ処理液の残液量を少なくすることである。イムノブロットでは、ブロッキング処理、一次抗体反応、二次抗体反応による工程の前に、洗浄工程が入る。したがって、洗浄液の残液があった場合、ブロッキング溶液、一次抗体溶液および二次抗体溶液が希釈されることになる。一方、排液が不完全で、反応槽２０にブロッキング溶液、一次抗体溶液および二次抗体溶液が残ると、その後の洗浄工程中にも弱いながら余分にブロッキング処理、一次抗体反応および二次抗体反応が行われることとなり、これも問題である。通常、ブロッキング溶液および抗体溶液（一次抗体溶液および二次抗体溶液）は、１０ｍｌ〜２０ｍｌ、少ない場合でも５ｍｌが利用される。例えば、抗体溶液が１０ｍｌで、洗浄液の残液量が１．０ｍｌとした場合、一次抗体反応および二次抗体反応がともに１．１倍に希釈されるため、一連の反応工程の全体で約１．２１倍に希釈されることとなり、２０％を超える影響を受けることとなる。これは、無視できない影響である。こうしたことから、排液時の処理液および洗浄液の残液量はできるだけ少ない方がよい。しかしながら、メンブレンＭの周囲、および、反応槽２０の底面とメンブレンＭとの間隙に滞留する処理液および洗浄液は、完全に排除することができないため、一定量の許容範囲はある。
【００４０】
もう一つの課題は、反応槽２０中に存在するメンブレンＭが排出管３２に接触し、メンブレンＭが傷ついてしまう、または、排出管３２の排出口３２１をメンブレンＭが塞いでしまうという可能性である。これを防ぐには、排出管３２にメンブレンＭが接触しない、または、接触しても障害を起こさない、および、排出口３２１にはメンブレンＭが接触しないような構造にすることで対応できる。すでに述べたように、反応槽２０は交換可能で洗浄が容易な単純な構造の方がより良いことから、反応槽２０自体には、排出口３２１やメンブレンＭの動きを制限する構造体などを取り付けることは避けた方がよい。したがって、排出口３２１は、反応槽２０に挿入する構造で、排出管３２と吸引装置３２３によりに反応槽２０中の処理液および洗浄液が排液される仕組みが望ましい。また、排液する際には反応槽２０を傾かせて処理液および洗浄液を一方に集め、そこへ排出口３２１を設置し、排液させると反応槽２０中の残液を少なくすることに有効である。
【００４１】
これらの観点から、本実施形態では、排出管３２は、反応槽２０に対しては、撹拌機構４０による傾動によって最も大きく上下変位する位置に設けられている。排出管３２の先端（図３における下端）には排出口３２１が設けられており、排出口３２１は、反応槽２０の底面の部分に位置している。排出管３２は、メンブレンＭと排出口３２１との間に介在する突出部３２２を備えている。本実施形態では、突出部３２２は、排出管３２の先端を斜めに切断することにより形成されている。このとき、メンブレンＭと排出口３２１との間に突出部３２２が介在するように、斜めに切断してなる開口部（排出口３２１）は、反応槽２０の側壁に対向するように排出管３２は設けられる。このような構成とすることで、排出口３２１は、排液するために反応槽２０の一方へ集合させた処理液および洗浄液の直上に設置でき、より反応槽中の残液を少なくすることができる。
【００４２】
排出管３２は、内径が５ｍｍ未満であり、排出管３２の下端は、突出部３２１の最も接近した部分が反応槽２０の底面から１ｍｍ以内であり、最も離れた部分が反応槽２０の底面から６ｍｍ以内であることが好ましい。また、排出口３２１は、図３では、１個として図示されているが、複数個有していてもよく、排出口３２１が複数である方がより広い領域から排液できるため、排液スピードや残量を少なくするためにより有用である。
【００４３】
排出管３２には、排出口３２１に吸引力を作用させて処理液および洗浄液を排出する吸引装置３２３が取り付けられている。本実施形態では、吸引装置３２３は、排液ポンプとして構成されており、制御装置６０によって動作が制御される。吸引装置３２３の吸引により排出口３２１から排出された処理液および洗浄液は、排液槽１３に排出される。なお、排出管３２を途中で分岐することで、抗体溶液（一次抗体溶液および二次抗体溶液）等を再利用のために別の容器に保存させることも可能である。
【００４４】
この排出管３２は、処理時間を一定にするため、処理終了後には数秒から１分程度の間に排液する仕組みを持つものであることが好ましい。この仕組みは、例えば、制御装置６０を利用した、排液ポンプ３２３と電磁弁（図示せず）の制御によって達成することが可能である。また、排液ポンプ３２３の代わりに重力落下を利用してもよい。
【００４５】
加温機構５１
一般的に生物学的な反応、例えば、抗原抗体反応、酵素反応などは温度依存性があり、温度が上がれば反応が促進される。しかしながら、多くのタンパク質は温度の上昇によってその機能が損なわれることがあるため、タンパク質が障害を受けず反応が向上する温度として生物の体温付近である３７℃の温度が好んで使われる。抗体と抗原との反応も同様に温度依存性があり、反応温度を上げることで、反応時間の短縮やシグナル強度の上昇を起こすことが可能である。この観点から、処理液を加温するために、反応槽２０の下部にラバーヒーター等の加温機構５１を設置している。加えて、温度センサー５３および測定温度に対するフィードバック機構５４を備え、反応槽２０を一定温度に加温している。加温機構５１は、反応槽２０を２５℃〜４５℃の間で加温可能となっている。
【００４６】
自動反応装置１は、さらに、制御機構６０に含まれ、処理液および洗浄液の注入、撹拌、および、排出のタイミングを制御するためのタイマー６１と、処理液用貯留槽１１のうち、少なくとも抗体溶液を貯留するための処理液用貯留槽を冷却するための冷却機構５２とを備えている。冷却機構５２は、抗体溶液を貯留するための処理液用貯留槽１１の周囲に設けられ、処理液用貯留槽１１を０℃〜１０℃の間で冷却可能となっている。
【００４７】
タイマー
自動反応装置１は、イムノブロットで必要とされるブロッキング反応と抗体反応を自動で行う装置である。この操作には５時間程度必要となるため、その操作を任意の時間に終わらせるために、任意の時間に開始したいという欲求がある。タイマーはそれを実現するものである。制御装置６０でタイマー６１を制御することで、自動反応装置１の反応処理の開始時間等を調整することができる。
【００４８】
次に、自動反応装置１の動作について説明する。制御装置６０が備えるタッチパネルで、処理液および洗浄液を注入する順序、量、およびタイミングを設定する。その設定したプログラムに基づき、制御装置６０が、送液ポンプ３１２の稼働を制御し、二方向性の電磁弁３１３のオン・オフを切り替えることにより、注入管３１を介して適切な処理液または洗浄液が反応槽２０に注入される。イムノブロットの場合、ブロッキング溶液、洗浄液、一次抗体溶液、洗浄液、二次抗体溶液の順で、電磁弁３１３が開き、送液ポンプ３１２によって反応槽２０へ注入される。反応槽２０は、制御装置６０で制御された撹拌機構４０により、一定時間撹拌され、処理液とメンブレンＭとの反応または洗浄液による洗浄が行われる。それが終了すると、制御装置６０で制御された吸引装置３２３により、処理液および洗浄液が、排出管３２を介して排液槽１３へ排液される。このとき、制御装置４０は、排出管３２が設けられている側が傾斜下端になったときに撹拌機構４０の動作を停止させて吸引装置３２３の動作を開始させる。また、排出管３２から排出される処理液および洗浄液の流速は、３．３ｍｌ／１０ｓｅｃ以上であることが好ましい。排液が終わった後は、次の処理液または洗浄液が送液ポンプ３１２によって反応槽２０へ送液される。
【００４９】
以上、本発明の第１実施形態について説明したが、本発明はこの実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて、種々の変更が可能である。
【００５０】
例えば、上記実施形態では、処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２と、排液槽１３とを、反応槽２０を挟んで両側に配置したが、図５に示すように、処理液用貯留槽１１、洗浄液用貯留槽１２および排液槽１３を反応槽２０の一方側にまとめて配置してもよい。また、反応槽２０のサイズが変更された場合でも、反応槽２０の側壁に沿わせて注入管３１および排出管３２を配置できるよう、注入管３１および排出管３２を支持する支柱３３を、回転可能に設けてもよい。
【００５１】
また、上記実施形態では、排出口３２１は、排出管３２の先端を斜めに切断することにより形成しているが、図６のように、排出管３２の先端を、正面視において複数の山形を形成するように切断して排出口３２１を形成してもよい。また、図７のように、排出管３２の先端を、一部分のみ長く残し、他の部分を平坦に切断するようにして排出口３２１を形成してもよい。いずれの場合も、排出口３２１とメンブレンＭとの間に位置する凸部が突出部３２２となる。
【００５２】
次に、図８を参照して、本発明の第２実施形態について説明する。第１実施形態と同様の構成については同じ符号を付けることにより、詳細な説明は省略する。具体的には、本実施形態の自動反応装置１は、撹拌機構４０の構成が第１実施形態と異なっている。
【００５３】
本実施形態では、ブロッキング溶液、一次抗体溶液、および、二次抗体溶液が別々に処理液用貯留槽１１に収納されており、洗浄液が洗浄液用貯留槽１２に収納されている。処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２の中の処理液および洗浄液は、送液ポンプ３１２によって反応槽２０に設置した循環ユニット３４へ送られる。処理液および洗浄液は、タッチパネル経由で設定したプログラムに基づき、制御装置６０によって制御される電磁弁３１３の切り替えにより、設定した処理液または洗浄液のみが順次送液されるようになっている。ウェスタンブロットの場合、上記したように、ブロッキング溶液、洗浄液、一次抗体溶液、洗浄液、二次抗体溶液と切り替えられる。
【００５４】
循環ユニット３４には上部に穴３４１が開いており、溶液は穴を通して上部へ噴出する。ブロッキング溶液による処理によってブロットされたメンブレンＭは、反応槽２０中の循環ユニット３４の上部に設置されるため、噴出した処理液および洗浄液と絶えず接触する。反応槽２０へ噴出した処理液および洗浄液は、送液ポンプ３１２および電磁弁３５１によって循環路３５へ流出し、再度循環ユニット３４に注入されるようになっている。本実施形態では、撹拌機構４０は、循環ユニット３４、送液ポンプ３１２および電磁弁３５１により構成され、反応槽２０の処理液および洗浄液を循環ユニット３４、送液ポンプ３１２および電磁弁３５１によって、メンブレンＭの下部または上部から流しながら循環させることで処理液および洗浄液を撹拌している。
【００５５】
一定時間、処理液および洗浄液が循環ユニット３４へ送液された後、制御装置６０で制御された電磁弁３１３の切換と吸引装置３２３の稼働により排液槽１３へ排液される。循環ユニット３４にはヒーター等の加温機構５１と温度センサー５３とが設置されており、制御装置６０の制御により加温機構５１および循環ユニット３４を介して処理液は一定の温度に保温することが可能になっている。
【００５６】
図８では、送液ポンプ３１２が１台で、各処理液および洗浄液の流路毎に電磁弁３１３が付いた構造であるが、各処理液用貯留槽１１および洗浄液用貯留槽１２毎に送液ポンプを設置し、各送液ポンプの稼働を制御装置６０で制御して、反応槽２０に注入する処理液および洗浄液を切り替える仕組みであってもよい。また、送液ポンプ３１２の代わりに重力落下を利用してもよい。また、図８では、二方向性の電磁弁３１３を４個使用して各処理液および洗浄液の切り替えを行っているが、例えば、五方向性の電磁弁を１個利用して各処理液および洗浄液を切り替えてもよい。以上のように、処理液および洗浄液がそれぞれ設定した順序に従って反応槽２０へ送液され、反応終了後に反応槽２０から排液されることが達成されれば特にその機構は問わない。
【００５７】
また、図８では、反応槽２０の処理液および洗浄液を反応槽２０外の送液ポンプ３１２により循環ユニット３４を介して循環させる機構であるが、循環ユニット３４の使用の有無、あるいは循環ユニット３４の形態は問わない。また、図８では、循環ユニット３４に加温機構５１および温度センサーを設置し、一定に加温する方式を採用しているが、処理液が反応槽２０の外部を循環する経路（循環路３５）の途中で温度を調節する機構であっても良く、処理液が安定に加温される仕組みであれば機構は問わない。
【００５８】
以上に示した第１実施形態および第２実施形態では、自動反応装置１は、反応槽２０を１個備える構成であるが、自動反応装置１は、反応槽２０を複数個備える構成としてもよい。自動反応装置１を利用した反応において、複数のメンブレンＭに異なる抗体を使用して一度に操作を行う場合がしばしばある。このような場合に、反応槽２０を複数個設け、個々の反応槽２０に対して処理液および洗浄液の制御装置６０を設けておくと、同時に複数のメンブレンＭに対してマルチで反応を行うことができる。
【００５９】
以上、本発明の自動反応装置１における重要な点は、（ｉ）処理液および洗浄液がそれぞれ設定した順序に従って反応槽２０へ送液され、反応または洗浄終了後に反応槽２０から排液される機構を持つこと、（ｉｉ）メンブレンＭに接触する処理液は滞留しないで、絶えず動くことで反応を促進する機構を持つことである。したがって、上記第１実施形態および上記第２実施形態は、本発明の自動反応装置１の一実施形態を示したものであり、以上の２つの重要ポイントを満たせば他の機構によって自動反応装置１が構成されてもよい。また、付加的な機能として処理液を安定に加温できる機構（加温機構５１）、処理液や洗浄液を冷却できる機構（冷却機構５２）、ならびに、タイマーを備えるとさらによい。
【００６０】
以上のように、本発明は、イムノブロットと言うライフサイエンスで多用される分析法において、ブロッキング溶液による処理によってブロットされたメンブレンＭを抗体と反応させる時に必要な、ブロッキング処理、抗体反応、洗浄操作等を自動化し、かつ、全体の反応に必要な時間を大幅に短縮するものである。
【００６１】
本発明の主要な用途の一つである、ウェスタンブロットについて詳細を記載する。ウェスタンブロットは、例えば細胞に特定のタンパク質（被検出物質）が存在するか否かを確認する方法であり、再生医療における細胞の分化の確認の目的や薬物の効果をタンパク質レベルで観察する場合によく利用される。（ｉ）細胞の場合、細胞の破砕液をサンプルとした電気泳動により細胞中のタンパク質を分子量で分離する。（ｉｉ）次いで、電気泳動ゲル中で分離したタンパク質をそのままメンブレンＭへ転写する。
【００６２】
（ｉｉｉ）転写したメンブレンＭは非特異的な結合を防ぐため、ブロッキング溶液（例えば、スキムミルク、ウシ血清アルブミン水溶液、カゼイン水溶液等）にてタンパク質のブロッキングを行う。（ｉｖ）ブロッキングしたメンブレンＭは、TBS-T（Tris-Buffered Saline, 0.05% Tween含有）で洗浄後、TBS-Tで希釈した一次抗体溶液（目的タンパク質に特異的に結合する抗体を含んだ溶液）と反応させ、その後、TBS-Tで数回洗浄して、非結合の余分な一次抗体溶液を除去する。（ｖ）次いで、TBS-Tで希釈した二次抗体溶液（一次抗体に結合する抗体、通常はペルオキシダーゼ酵素で標識された抗体を利用、を含んだ溶液）と反応させ、反応終了後、余分な二次抗体溶液を完全に除くため、TBS-Tで数回洗浄する。
【００６３】
（ｖｉ）洗浄が終わったメンブレンＭを、基質溶液（ペルオキシダーゼ酵素によって発光する基質を含んだ溶液が良く利用される）と反応させてシグナルを発生させることで、目的とするタンパク質を検出する。もし目的とするタンパク質が存在する場合は、目的とするタンパク質に一次抗体が結合し、その一次抗体にさらに酵素標識した二次抗体が結合するため、電気泳動で分離した目的分子量の位置に、バンド状にシグナルが発生することになる。ウェスタンブロットの場合、上記（ｉ）〜（ｉｉ）のステップで約２時間、上記（ｉｉｉ）〜（ｖ）のステップで約５時間、上記（ｖｉ）のステップで約３０分間が必要であり、約８時間を費やす作業である。
【００６４】
本発明の自動反応装置１は、最も時間のかかる上記（ｉｉｉ）〜（ｖ）のステップを自動化するものである。特に、この工程を手動で行った場合、４種類の処理液および洗浄液の交換を１３回程度行う必要があるため、処理液および洗浄液の交換のため実験者は長時間拘束されることになる。また、この交換時に人的なミスが発生しやすく、場合によっては一日の作業を無駄にしてしまうこともある。しかしながら、本発明の自動反応装置１では、上記（ｉｉｉ）〜（ｖ）のステップを自動化できるため、実験者の長時間拘束を減らすことができる。また、本発明の自動反応装置１は、人為的な単純ミスの回避、および、タイマー６１をセットすることで実験者が不在の深夜の操作を行うことができるという効果もある。
【実施例】
【００６５】
以下に、本発明をさらに詳細に説明するための実施例を示す。
【００６６】
実施例１：反応槽へ処理液および洗浄液を注入する時の気泡発生と、送液ポンプの流量および注入口の内径との検討
イムノブロットで利用されるブロッキング溶液、抗体溶液、洗浄液等（以下総称して「溶液」という）は、界面活性剤やタンパク質を含有するため気泡が発生し易い。この発生した気泡が、反応槽中のメンブレンの下部へ侵入すると、メンブレンを浮かせることになり、メンブレンと処理液との接触が不均一となる。これにより、メンブレンから得られるシグナルのムラ等が発生するとことになり、大きな問題となる。そこで、反応槽へ溶液を注入する注入管の内径、送液ポンプの流量と、気泡の発生、および、その気泡がメンブレンの下部へ侵入するかについて検討した。
【００６７】
プラスチック製の反応槽（９６ｍｍ×９６ｍｍ×５０ｍｍ（高さ））に、９０ｍｍ×９０ｍｍのPVDFメンブレンを入れた。反応槽の一方側の端部の中央の位置において、端から５ｍｍの位置に３５ｍｍの高さから落下するように注入管の先端部分（ノズル）を設け、送液ポンプにより注入管を介してTBS-T（Tris-Buffered Saline, 0.05% Tween含有）を５０ｍｌ注入した。そのとき、注入口の数、内径、送液ポンプの流量を種々に変化させ、気泡の発生とメンブレンの下部への気泡の侵入を観察した。なお、送液ポンプの流量は設定した流量が正しく流れていることを測定して確認した。気泡発生の有無については、継続的に気泡が発生した場合を陽性判定とし、メンブレンの下部への気泡の侵入については目視確認可能な泡が入った場合を陽性判定とした。実験は３回繰返し、一度も陽性判定がない場合を“−”、一度でも陽性判定があった場合を“±”、３回とも陽性判定の場合を“＋”とした。
【００６８】
【表１】
2018059754.tif 000003
【００６９】
実験結果を表１に示す。送液ポンプの流量と気泡の発生およびメンブレンの下部への気泡侵入は正の相関を示し、送液ポンプの流量が大きいほど気泡の発生およびメンブレンの下部への気泡侵入は発生し易かった。一方、ノズルの内径およびノズルの本数は、内径が大きいほど、また、本数が多いほど、気泡の発生およびメンブレンの下部への侵入は少なかった。これらの結果は、ノズルの先端部分（注入口）の面積と送液ポンプの流量との関係が重要であることを示している。すなわち、注入口から溶液が出る速度が速いほど気泡の発生およびメンブレンの下部への気泡の侵入が起き易いことを示している。表１で得られたデータから、気泡がメンブレンの下部へ侵入したときの溶液の最低流速（ｙ，ｍｌ／１０ｓｅｃ）と注入口の総面積（ｘ）との関係をプロットした結果、図９に示すように、両者はｙ＝３０．６１１ｌｎ（ｘ）＋１．８１３８（Ｒ２＝０．９６３５）で表される対数関数に従うことが分かった。このことは注入口の総面積がｘの時、この関数で示されるyの値より流速が小さければ気泡がメンブレンの下方へ侵入しないことを示している。しかし、実際の観測値はこの関数で表される直線の上下に分散しているため、より正しい流速下限は推定値における９５％信頼区間の下限で表される。そこで、このデータから推定値における９５％信頼区間の下限を求めた結果、図９に示すようにｙ＝−０．４８０４×（ｌｎ（ｘ））２＋３２．７８９×ｌｎ（ｘ）−１３．８４９（Ｒ２＝１．０００）の式で表された。すなわち、気泡が発生しないためには、xの注入口の総面積を持つ場合、本式で求められる流速ｙより小さければよいことになる。
【００７０】
なお、送液ポンプの流量が極端に少ない場合、気泡発生の懸念はないものの、反応槽を満たすために要する時間がかかりすぎるという別の課題が発生する。特に、洗浄は、通常、５分で行われるため、注入時間は短いほどよく、遅くとも１分以内に洗浄液を注入することが必要となる。使用する洗浄液の量は用いる反応槽の大きさによって異なるが、比較的小さいサイズ（７ｃｍ×７ｃｍの底面積）の反応槽の場合でも、洗浄液の量は最低２０ｍｌ程度が必要となる。最も少ない２０ｍｌの洗浄液を１分以内に注入するには、送液ポンプの流量つまり注入口から注入される溶液の流速が３．３ｍｌ／１０ｓｅｃ以上であることが必要となる。
【００７１】
実施例２：反応槽内の溶液の残量の検討
反応槽から溶液を排液する際に、反応槽から排液不可能な最低の容液の残量を知るために検討を行った。プラスチック製の反応槽にメンブレンを入れ、手動で排液した場合の溶液の残量を測定した。５種の箱型のプラスチック製の反応槽、Ａ：７０ｍｍ×７０ｍｍ×４５ｍｍ（高さ）、Ｂ：１００ｍｍ×９０ｍｍ×５０ｍｍ（高さ）、Ｃ：１４５ｍｍ×１４５ｍｍ×６０ｍｍ（高さ）、Ｄ：９０ｍｍ×９０ｍｍ×５０ｍｍ（高さ）、Ｅ：９６ｍｍ×９６ｍｍ×５０ｍｍ（高さ）を利用した。反応槽Ｄ（ポリスチレン製）と反応槽Ｅ（アクリル製）は、四隅が直角に成形された容器であるが、反応槽Ａ、反応槽Ｂおよび反応槽Ｃ（いずれもポリエチレン製）は、底面の四隅が丸く成形された同一メーカの容器である。
【００７２】
まず、これらの反応槽に、２０ｍｌ、４０ｍｌおよび８０ｍｌのTBS-Tを入れ、反応槽から溶液をデカンテーションで排液し、その後、３０秒間、反応槽を傾け、底部に集積したTBS-Tの量を測定した。なお、デカンテーションによる排液の仕方は、ウェスタンブロットを手動で行う場合に洗浄液を排液する仕方に倣って残液量を減らすため２回反応槽を振って液切を行った。表２に、残液量（μｌ）を、３回測定したときの平均値を取って示す。
【００７３】
メンブレンが入っていない場合には、反応槽に入れるTBS-Tの量とは無関係に一定の残量が確認された。また、形状や素材が同じ反応槽Ａ、反応槽Ｂおよび反応槽Ｃを比較すると、溶液の残量は反応槽の底面の面積に比例することが分かった。反応槽Ｄおよび反応槽Ｅは、相同形であり、ほぼ同等の大きさであったため、溶液の残量はほぼ同じであった。
【００７４】
次いで、これらの反応槽にメンブレンを入れた後、４０ｍｌのTBS-Tを入れ、反応槽中のメンブレンを抑えながらデカンテーションにて溶液を排液し、次いで上記と同様に２回液切を行って排液した。その後、メンブレンを容器底面から外し、３０秒間、反応槽を傾け、底部に集積した溶液の残量を測定した。なお、メンブレンは３種のサイズ、大：７０ｍｍ×８０ｍｍ、中：７０ｍｍ×４０ｍｍ、小：４０ｍｍ×３５ｍｍを利用したが、反応槽Ａについては、大：７０ｍｍ×８０ｍｍサイズのメンブレンは水平に入らないので検討しなかった。
【００７５】
表２に、溶液の残量（μｌ）を３回測定したときの平均値を示す。表２に示したように、溶液の残量は、メンブレンの面積に比例して増加しており、メンブレンと反応槽の底面との間隙、メンブレン自体に溶液が残存することが分かる。
【００７６】
通常、イムノブロットでは、標準的には７０ｍｍ×８０ｍｍ前後、または、それより小さいサイズのメンブレンが利用される。反応槽Ｃは特殊な場合に利用されるサイズ用の反応槽であり通常は利用されないが、他の反応槽はよく利用されるサイズである。これら通常サイズの反応槽の溶液の残量を見ると、最大でも４００μｌ以下である。したがって、４００μｌという残液量は、手動による排液操作でも残液として許容される量であると考える事ができる。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
実施例３：排出口の形状および大きさが溶液の排液に及ぼす影響の検討
反応槽から溶液を排液する際には、溶液の残量が課題となる。例えば、反応槽中にブロッキング溶液が残ると、その後の洗浄工程中にも弱いながら余分にブロッキング処理が行われることとなるし、抗体においても同様の問題が発生する。これに影響する要因として、排出口の形状、設置角度、内径等があると想定されるため、それらの影響について検討した。
【００７９】
実施形態１で示した自動反応装置１の試作品を用いて検討した。本試作装置は、撹拌機構４０として、反応槽２０を、一の方向とその反対方向とに交互に傾動できるシーソー型振盪台４０を用い、制御装置６０によりシーソー型振盪台４０、ならびに、溶液の注入および排出を制御できるものである。本施策装置は、シーソー型振盪台４０上に置いた反応槽２０を一定時間振盪し、終了後、溶液を排液ポンプ（吸引装置）に接続した排出管３２から排液する仕組みである。図１０に示すように、本試作装置では、排液するときの状態は、シーソー型振盪台４０が７．５度傾き、一方の端に溶液が集まる仕組みになっている。本試作装置のシーソー型振盪台４０に、９６ｍｍ×９６ｍｍ×５０ｍｍ（高さ）のプラスチック製の反応槽２０を設置した。シーソー型振盪台４０の下方になる反応槽２０の一端側の中央に、反応槽２０の壁面に沿って反応槽２０の底面に先端が着くように斜めの開口部を持つ排出口３２１を設置した。排出管３２は、排液ポンプ（吸入流速、４４ｍｌ／１０ｓｅｃ）に繋がっており、排液ポンプを稼働することで反応槽２０から溶液を排液できる仕組みである。図１０に示すように、排出管３２は、斜めに切った開口部が反応槽２０の壁側と底面の合する方向を向くようにして配置した。こうすることで、排出口３２１を、排液するため反応槽２０の一方へ集合させた溶液の直上に位置させることができる。
【００８０】
２０ｍｌのTBS-Tを入れた反応槽２０から、２０秒間排液ポンプを稼働させることにより、TBS-Tを排液させ、そのときの反応槽２０中のTBS-Tの残量を測定した。本セットアップではTBS-Tの排液は数秒で完了し、その後は排出口３２１からは殆どエアーのみを吸引する形となる。ただし、このエアーを吸引している間に反応槽２０の底面や壁面等に残ったTBS-Tは少しずつ最低部へ集合し、エアーとともに排出口３２１から排液されることになる。
【００８１】
以上の実験条件のもと、内径が、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ（肉厚は何れも１ｍｍ）の５種の排出管３２を用いて、斜めに切った開口部の先端角度を５種に変えて検討した。その結果を表３に示す。なお、表３では、排出管３２の開口部（排出口３２１）と反応槽２０の底面とが成す角度とともに、排出管３２の開口部が底面から一番離れている部分の底面からの距離（図１０中のｄ）も示した。
【００８２】
【表３】
2018059754.tif 000005
【００８３】
反応槽２０内のTBS-Tの残量は、排出管３２の内径と排出管３２の開口部が反応槽２０の底面と成す角度に影響を受けた。排出管３２の内径が５ｍｍ以上の場合には、一旦排出管３２内へ吸引された溶液が、排液ポンプの停止時に重力により逆流する現象が見られたため、４ｍｍ以下とは異なり、残量が著しく多かった。排出管３２の内径が４ｍｍ以下の場合、排出管３２の開口部が反応槽２０の底面と成す角度が小さくなるほど溶液の残量は減少し、最小では溶液の残量を５０μｌまで減らすことができた。
【００８４】
この溶液の残量はさらに良好な排液条件でもこれ以上少なくすることはできなかった。このことは、２０秒間という排液時間では、反応槽２０の壁面に吸着している溶液が全部最低部へ集合できないことを示している。なお、表３には示していないが、排出管３２の内径が２ｍｍの場合、排出管３２の開口部と反応槽２０の底面とが成す角度が８．５°のとき、排出管３２の先端を反応槽２０の底面から１ｍｍ離しても排液はスムーズに行われ、残量は５０μｌという最低値を示した。
【００８５】
排出管３２の開口部が底面から一番離れている部分の底面からの距離（ｄ）は、排出管３２の内径（ｃ）に肉厚を足したものと、排出管３２の開口部が反応槽２０の底面と成す角度（θ）とで決定される。すなわち、ｄ＝（ｃ＋２）×ｔａｎθである。そこで、ｄと溶液の残量の相関を調べたところ、ｄが１．５ｍｍ以下の場合は、排出管３２の内径に関わらず、最低残量であるほぼ５０μｌになったが、それ以上のｄの場合、距離ｄの値と残量は良好な正の相関を示し（図１１参照）、溶液の残量を決定しているのはｄの値であると判断された。このことは、反応槽２０から溶液を排液する最終段階では、残量が少ないため、排出管３２の開口部ではエアーを吸いながら、残液を吸引することになるが、このとき、距離ｄの値が小さいほど、残液の吸引力が高くなり、残液が減少すると解釈できる。
【００８６】
以上の結果は、吸引した溶液が排出管３２から落下するという現象は、内径が５ｍｍ以上の排出管３２で排液ポンプが停止したときに見られること、排出管３２の内径が４ｍｍ以下の場合には、反応槽２０の底面から一番離れている排出管３２の開口部の底面からの距離（ｄ）と溶液の残量とはよく相関し、ｄが１．５ｍｍ以下であれば、溶液の残量をほぼ最低まで減らすことが可能であることを示している。
【００８７】
なお、本実施例で使用した反応槽２０は、実施例２で使用した反応槽Ｅと同じものであり、実施例２で示したように手動では約１４０μｌが最低残液であったため、本試作装置における排液管３２の方がより効率的に排液したと考えられる。
【００８８】
実施例４：排出口の形状および排液ポンプの流量が溶液の残量に与える影響の検討
実施例３の結果から、排出口と反応槽の底面とが成す間隙であるｄが反応槽からの排液に重要であることが分かった。そこで、実施例３と同様のセッティングを利用して、メンブレンを入れた反応槽から排液するときの、排出管の内径、排液ポンプの流速が反応槽内の溶液の残量に及ぼす影響について検討した。なお、排出管の内径が５ｍｍ以上のものについてはポンプ停止時に吸引した溶液が排出管から反応槽へ落下するため不適格と判断し使用しなかった。
【００８９】
実施例３の試作装置のシーソー型振盪台に、９６ｍｍ×９６ｍｍ×５０ｍｍ（高さ）のプラスチック製の反応槽を設置した。反応槽に、７０×８０ｍｍのPVDFメンブレンを入れた以外は、実施例３と同じ試作装置およびセッティングを用いて検討した。反応槽に、２０ｍｌのTBS-Tを注入し、排液ポンプを２０秒間稼働させ、排出管を介して排液し、排出管の開口部（排出口）の最大間隙（実施例３のｄの値）、排出管の太さ、および排液ポンプの流速を変化させ検討した。なお、排出管の設置方法は実施例３と同様である。反応槽の残液量は５０μｌ単位で計測した。なお、本セットアップでは、規定の２０秒間で、排液ポンプで完全に吸引したと判断された状態でも、メンブレンの下部にTBS-Tが存在するため、最低の残液量は２５０μｌであった。
【００９０】
【表４】
2018059754.tif 000006
【００９１】
結果を表４に示す。得られた結果から、溶液の残量を最小にするは、反応槽の底面から一番離れている排出管の開口部の底面からの距離（ｄ）が小さい方がよいことが分かった。また、完全排液には、排液時の排液ポンプの流速が大きいほどよりよいことが分かった。また、距離ｄの値が小さい場合には、排液ポンプの流速が５ｍｌという小さい流量でも完全排液が可能であることが分かった。
【００９２】
実施例２に示したように、手動で行う場合、通常サイズの反応槽やメンブレンを用いると、発生する残液量は最大でも４００μｌであると判断された。これを本発明の自動反応装置でも許容される最大残液とした場合、これを実現するためのｄの最大値は排液ポンプの流速が最大の１２０ｍｌ／１０ｓｅｃのときで、６．０ｍｍであった。ちなみに、排液ポンプの流速が８４ｍｌ／１０ｓｅｃのときでは、４．８ｍｍ、排液ポンプの流速が４０ｍｌ／１０ｓｅｃのときでは、３．５ｍｍであった。以上のことは少なくとも、ｄの値が６．０ｍｍ以下であれば、排液ポンプの流速を上げれば手動による操作と同等の処理液の排液ができることを示している。
【００９３】
なお、本実施例４では円筒形の１本の排出管の片側のみに斜めに開口部を設けたが、排出管は複数本を利用した方が、より広い部分から吸入できるため、排液スピードや残量を少なくするためにより有用と考えられる。また、排出管の開口部の数も溶液の集合部位に向かって設置されておれば複数であってもよいと考えられる。
【００９４】
実施例５：排出口の形状が反応槽中のメンブレンの動きに与える影響の検討
反応槽内にメンブレンを入れて、排出口の形状、排出口の設置角度、排出口の大きさ、および排液ポンプの流速が、メンブレンの動きに及ぼす影響について検討した。実施例３と同じ試作装置とセッティングを用いて検討した。反応槽に２０ｍｌのTBS-Tを注入し、シーソー型振盪台を２０往復振盪させた後、排液ポンプを２０秒間稼働させて排出管を介して排液した。この間にメンブレンの動きについて、排出口の形状、排出管の太さ、および排液ポンプの流速を種々変化させて検討した。メンブレンが排出管にわずかでも引っかかる動きがあった場合を×、引っかかる動きが見えない場合を○とした。
【００９５】
【表５】
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【００９６】
結果を表５に示す。排出管の先端へのメンブレンの引っ掛かりは、排出管の開口面が反応槽の壁面を向いている場合、全く見られなかった。排出管の開口部が中央へ向いている場合（−５度）の場合、メンブレンが排出管の開口部に侵入し、振盪時、排液時とも引っ掛る結果となった。なお、表５には示していないが、排出管の先端を反応槽の底面から１ｍｍ浮かせると何れの場合もメンブレンが排出管の先端部に引っ掛る動きが見えた。
【００９７】
以上の結果は、メンブレンは、排出管の先端に入り込む、または、排液時の吸入によって排出口へ接触することで引っ掛ることを示している。これを防ぐために、構造が最も単純である排出口が一本の場合は、排出口は、反応槽の中央ではなく、図１０に示すように反応槽の壁面と底面とが合する方向に向いており、かつ、排出口の反応槽の中央部側は、反応槽の底面と接触する構造を有することが重要である。こうすることにより、メンブレンは排出口に接近できないため、メンブレンが排出口に引っ掛ることはなくなる。なお、この排出口が反応槽の壁面と底面とが合する方向に向いている構造は、反応槽を傾けて溶液を排液する際には、溶液が集合した直上部に排出口を位置させることができるため都合がよい。
【００９８】
構造が複雑化する問題を除けば、排出管は、１個よりも複数個を設置した方が、排液速度の上昇と残液量の減少には効果的と考えられる。さらに、排出管に複数の排出口を持つようなものも効果があると考えられる。しかしながら、これらの場合でも、排出口にメンブレンが接近できないように、排出口を形成する構造体の一部が反応槽の底面と接触、または、別の構造体を排出口の周りに設置することが重要である。
【００９９】
以上、排液に関する検討である実施例２から実施例５までの結果を併せて考えると、排出管の内径は５ｍｍ未満であることが必須であり、排液速度は３．３ｍｌ／１０ｓｅｃ以上で、かつ、反応槽の底面に一番近接した部分（突出部の先端）は反応槽の底面から１ｍｍ以内、一番離れている排出管の開口部（排出口）の底面からの距離（ｄ）は反応槽の底面から６ｍｍ以下であれば、実質的に問題ない程度まで、残液を減らして排液できることが分かった。また、排出口にメンブレンが接近できないように、排出口を形成する構造体の一部が反応槽の底面と接触、または、別の構造体を排出口の周りに設置することが重要であると結論できた。
【０１００】
実施例６：シーソー型振盪台における振盪速度の検討
実施例３で示したシーソー型振盪台での溶液の撹拌において、撹拌が最もよく行われる振盪速度を検討した。シーソー型振盪台へ、プラスチック製の反応槽を載せ、種々の振盪速度で反応槽内の溶液を撹拌した。撹拌の状態は、反応槽に入れた水溶液に青色素（sumifix）標識したブタIgG抗体を反応槽の中央部に１０μｌを加え、色素が反応槽全体に均一になるまでの時間を測定することで検討した。なお、溶液の均一性は目視で確認した。３種のサイズの反応槽、ｂｏｘ小（７ｃｍ×７ｃｍ）、ｂｏｘ中（１０ｃｍ×９ｃｍ）、およびｂｏｘ大（１４ｃｍ×１２ｃｍ）に５ｍｌ、１０ｍｌ、または１５ｍｌのTBS-Tを入れ、１０秒の往復の振盪数として、１０秒間に２．２往復、５．０往復、７．１往復、１１．１往復、２０．０往復の振盪速度を用いた。
【０１０１】
図１２（ａ）に示すように、溶液量が５ｍｌと少ない場合、どの大きさの反応槽でも振盪数１１．１往復／１０ｓｅｃ以下の場合は１２０秒以内に均一になった。振盪数が上昇するにつれて、ｂｏｘ小では均一になる時間が短縮したが、ｂｏｘ中ではほとんど変化はなく、ｂｏｘ大では逆に均一になるのに非常に時間がかかり最大振盪数では１０分以内に均一にならなかった。
【０１０２】
また、図１２（ｂ）に示すように、溶液量を１０ｍｌにした場合、ｂｏｘ小では振盪数が一番少ない時にやや均一になる時間が長かったが、それ以上の振盪数では何れの大きさの反応槽であっても速やかに溶液は均一になった。
【０１０３】
また、図１２（ｃ）に示すように、溶液量を１５ｍｌにした場合、ｂｏｘ小では振盪数が少ない時に均一になる時間が長くなり、最少振盪数のときには４分以上かった。振盪数が５．９往復／１０ｓｅｃ以上のときでは何れの大きさの反応槽でも速やかに溶液は均一になった。以上の結果は、シーソー型振盪台を利用した場合、回転数と溶液量を最適に設定しないと反応および洗浄が効率よく行われないことを示している。
【０１０４】
イムノブロットにおける最短の工程は洗浄の５分間である。したがって、２分以内に均一に混合することが最低でも必要である。２分以内の混合を考えた場合、ｂｏｘ大のサイズに５ｍｌの溶液を入れた場合には、振盪速度は１０秒間に１１．１往復以下、ｂｏｘ小のサイズに１５ｍｌの溶液を入れた場合には、振盪速度は１０秒間に５往復以下が必要となる。本実施例の結果から判断すると、シーソー型振盪台によって撹拌する場合、振盪速度は１０秒間に５往復〜１１往復の範囲であれば問題ないと考えられる。
【０１０５】
実施例７：溶液の撹拌を循環で行う際の送液ポンプの流量の検討
上記実施形態２の撹拌機構４０によって行われる循環方式の撹拌において、溶液の撹拌が最もよい送液ポンプの流量（循環流速）を検討した。プラスチック製の反応槽に入れた溶液が、流速コントロールペリスタポンプ、以下本実施例では単に「ポンプ」という）を利用して、反応槽内を循環できるようにセットアップした。反応槽にTBS-Tを一定量入れ、ポンプによる循環を開始後、実施例６と同じ色素標識したブタIgG抗体、１０μｌを反応槽の中央に入れた時点で測定を開始し、目視で観測しながら色素標識抗体が均一になるまでの時間を測定した。反応槽として、３種のサイズの反応槽、ｂｏｘ小（７ｃｍ×７ｃｍ）、ｂｏｘ中（１０ｃｍ×９ｃｍ）、およびｂｏｘ大（１４ｃｍ×１２ｃｍ）を利用した。ｂｏｘ小とｂｏｘ中では、５ｍｌ、１０ｍｌおよび１５ｍｌ、ｂｏｘ大では１０ｍｌ、１５ｍｌおよび２０ｍｌの溶液量で観察した。また、循環の流速は、６．５ｍｌ／１０ｓｅｃ、１３．０ｍｌ／１０ｓｅｃ、２０．０ｍｌ／１０ｓｅｃ、３１．５ｍｌ／１０ｓｅｃに設定した。
【０１０６】
その結果、同じ大きさの反応槽の中では溶液量が少ないほど、また流速が速いほど均一になるまでの時間が短いことが分かった。また、反応槽のサイズで比較すると、小さい反応槽の方が速く均一になることが分かった。実際にイムノブロットで利用する場合、最も短い工程は洗浄工程の５分間であるので、遅くとも２分以内に均一になることが望ましい。これを満たす流速としては、ｂｏｘ小では流速６．５ｍｌ／１０ｓｅｃ以上、最も時間のかかるｂｏｘ大では流速３１．５ｍｌ／１０ｓｅｃのみが満足した。
【０１０７】
以上のことから、安全係数を考慮し、循環方式の場合、流速が５ｍｌ／１０ｓｅｃ〜３５ｍｌ／１０ｓｅｃの範囲であれば迅速に均一になると判断した。
【０１０８】
実施例８：実施形態１の自動反応装置によるウェスタンブロットの例
実施形態１と同等のセッティングにおいて自動運転時のウェスタンブロットおよびドットブロットによる評価を行った。HuH7細胞の破砕液を１０μｌ、５μｌ、２．５μｌ、マーカーと共に電気泳動し、泳動ゲル中のタンパク質をPVDFメンブレンに転写した。転写したメンブレンを反応槽に入れ、処理工程を、ブロッキング処理  １時間、洗浄１分×３回、一次抗体反応  １時間、洗浄５分×３回、二次抗体反応  １時間、洗浄５分×４回、にセットした。各工程用の処理液は、ブロッキング溶液として２０ｍｌの５％スキムミルク、一次抗体溶液として２０ｍｌの１／１００００希釈の抗ビメンチン抗体、二次抗体液として２０ｍｌの１／２００００希釈の抗マウスIgG（HRP標識）を利用して、自動運転をスタートした。なお、温度は室温で行った。対照として同じ操作を手動で行った。自動、または手動で処理が終わったメンブレンをHRPの発光用基質と反応させ、発光検出装置を利用して測定した。
【０１０９】
結果を図１４に示す。図１４から分かるように自動装置でウェスタンを行ってもシグナル強度は手動と変化はなかった。また、バックグラウンドもほぼ同じであった。
【０１１０】
実施例９：メンブレンを水平にセットした時のドットブロットの例
実施形態１と同等のセッティングにおいて自動運転時のウェスタンブロットおよびドットブロットによる評価を行った。BNC-ST(ビークル社製)を１０００ｐｇから２倍希釈系列で７つの濃度で各濃度３点ずつスポットしたPVDFメンブレンを反応槽に入れ、処理工程を、ブロッキング処理  ３０分間、洗浄１分×３回、一次抗体反応  ３０分間、洗浄５分×３回、二次抗体反応  ３０分間、洗浄５分×４回、にセットした。各工程用の処理液は、ブロッキング溶液として２０ｍｌの５％スキムミルク、一次抗体溶液として２０ｍｌの０．５μｇ／ｍｌの抗Pre-Slポリクローナル抗体、二次抗体溶液として２０ｍｌの１／１００００希釈の抗ウサギIgG（HRP標識）を利用して、自動運転をスタートした。なお、温度は室温で行った。対照として同じ操作を手動で行った。自動、または手動で処理が終わったメンブレンをHRPの発光用基質と反応させ、発光検出装置を利用して測定した。
【０１１１】
結果を図１５に示す。図１５から分かるように自動装置で行ってもシグナル強度は手動と変化はなかった。また、バックグラウンドもほぼ同じであった。
【０１１２】
実施例１０：反応温度が抗体反応時間に及ぼす影響の検討
加温がイムノブロットの抗体反応時間に対する影響を検討した。タンパク質（HBsAg ST型、ビークル社製）の２ｎｇをスポットしたPVDFメンブレン（メルクミリポア社製）を作成し、５％スキムミルクでブロッキング処理後、５０ｍｌのプラスチックチューブへ１０ｍｌの一次抗体溶液（抗Pre-S1抗体、ビークル社製、２００００倍希釈）と一緒に収納した。５０ｍｌチューブを加温が可能なロータリー型撹拌装置（日伸理化サーモブロックローテーター、SN-06BN）へ入れてチューブを回転させることで抗体溶液を撹拌しつつ反応させた。反応終了後、メンブレンを洗浄し、次いで１０ｍｌの二次抗体溶液（HRP標識抗マウス抗体、(Rockland社製、２００００倍希釈）をチューブに入れてさらに反応させた。反応終了後、メンブレンをECL試薬（ECL-Prime、GE社製）により発光させ、測定装置（ChemiDocTM XRS  Bio-Rad社製）を用いてスポットしたタンパク質のシグナル強度を観測した。得られた画像データはimage-Jによる解析で数値化した。
【０１１３】
結果を図１６に示す。図１６から分かるように抗体反応温度を３７℃に上昇させると、室温と比べ、シグナル強度は格段に向上し、３７℃の場合、室温のほぼ２倍まで向上した。このとき、室温６０分の反応と同等の反応を得るために、３７℃では２３分の時間で達成することが出来ることが分かった。
【０１１４】
実施例１１：処理液用貯留槽の温度の検討
処理液用貯留槽および洗浄液用貯留槽（以下単に「貯留槽」という）には、ブロッキング溶液、一次抗体溶液、二次抗体溶液、および、洗浄液が入れられる。このうち、一次抗体溶液および二次抗体溶液は長時間室温にさらすと反応性が下がる可能性があり、二次抗体溶液は酵素標識されているため、酵素活性が低下する可能性も考えられる。一方、上記したように、自動反応装置にタイマーを取り付けることは、反応開始時間を任意に設定することで、反応終了時間を希望の時間に設定することが可能となる。しかしながら、貯留槽に抗体溶液を含む必要な溶液をセットした後、反応開始させるまでに長時間の間隔がある場合、抗体溶液が劣化し、反応が低下する可能性がある。そこで貯留槽に各溶液をセットした後の貯留槽の温度と反応開始までの時間がイムノブロットの結果に及ぼす影響を検討した。
【０１１５】
実施形態１に示した原理に基づく自動反応装置を用いて以下の条件で検討を行った。タンパク質としてHBsAg ST型（ビークル社製）の２ｎｇをスポットしたPVDFメンブレン（メルクミリポア社製）を作製した。このメンブレンを自動反応装置の反応槽にセットし、貯留槽には、ブロッキング溶液として２０ｍｌの５％スキムミルク、２０ｍｌの一次抗体溶液（抗Pre-S1抗体、ビークル社製、１００００倍希釈）、二次抗体溶液（HRP標識抗マウス抗体、Rockland社製、１００００倍希釈）、洗浄液としてTBS-Tをセットし、反応時間はすべて１時間に設定し、装置を用いて一連の反応を行った。反応終了後メンブレンをECL試薬（ケミルミワン、ナカライテスク社製）により発光させ、測定装置（ChemiDocTM XRS  Bio-Rad社製）を用いて観測した。
【０１１６】
まず、タイマーを利用しないで反応を行い、反応の終わったメンブレンを４℃にてTBS-T中で１６時間保存し、これを反応が終わった直後のメンブレンと同時にECL試薬と反応させ比較した。その結果、両者に違いはなく、反応後のメンブレンは４℃のTBS-T中で保存すれば１６時間までは安定であることが分かったので、これをコントロールとした。次いで、２種の抗体を入れた貯留容器を４℃または２５℃で１２時間放置した後、反応を開始して得られた結果をコントロールと比較した。結果を図１７に示す。
【０１１７】
図１７に示すように、２５℃で貯留容器を放置した場合、コントロールと比べ、明らかに低いシグナルが得られた。一方、４℃で放置した場合には、コントロールとほぼ同じ強さのシグナルが得られた。以上のことから、タイマーを利用して反応を遅れて開始させる場合には、一次抗体溶液および二次抗体溶液を４℃で保存すれは少なくとも１２時間程度は活性の低下を起こすことなく反応を行うことが出来ることが分かった。
【符号の説明】
【０１１８】
１      自動反応装置
１１    処理液用貯留槽
１２    洗浄液用貯留槽
２０    反応槽
３１    注入管
３１１  注入口
３２    排出管
３２１  排出口
３２２  突出部
３２３  吸引装置
４０    撹拌機構
５１    加温機構
５２    冷却機構
６０    制御装置
６１    タイマー
Ｍ      メンブレン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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