(57)【要約】      （修正有）【課題】中性領域のｐＨでは水に溶解しないコラーゲンを温和な条件で化学修飾して標識物質で標識可能な方法を提供する。【解決手段】ｐＨが中性領域の水に溶解可能なクラゲに由来するコラーゲンを用いてｐＨが６．０以上８．５以下の条件で化学修飾すれば標識物質でコラーゲン表面を標識することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨが中性領域の水に溶解した状態のコラーゲンに対して標識物質で標識することを特徴とする標識方法。
【請求項２】
前記コラーゲンがクラゲに由来するものであることを特徴とする請求項１に記載の標識方法。
【請求項３】
ｐＨが６．０以上８．５以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の標識方法。
【請求項４】
前記標識物質が抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の標識方法。
【請求項５】
前記抗体がＢＮＰとの親和性を有することを特徴とする請求項４に記載の標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンを標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスの主要な構成分子として、コラーゲンがある。コラーゲンは多くの多細胞生物に共通してあるタンパク質であり、様々な結合組織に力学的強度を与える役割を持っている。コラーゲンは生体内で最も多く含まれるタンパク質の一種であるが、その多くは中性領域のｐＨでは水に溶解しない。ウシやブタなどに由来する一般的なコラーゲンを水に溶かすためには、溶液のｐＨを酸性にすることが必要である。しかし、酸性条件下では、コラーゲンを標識するための化学修飾を行うことが難しい。また中性領域のｐＨで水に溶けない状態では、その利用方法も限られる。そのため豊富な天然資源ではあるものの、コラーゲンの産業利用はあまり進んでいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、コラーゲンを標識物質で標識することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、中性領域のｐＨで水溶性であるクラゲに由来するコラーゲン等を用いれば、温和な条件下でこれを化学修飾することができ、標識も可能になると考え、本発明に到達した。
【０００５】
即ち本発明は以下のとおりである。
（１）ｐＨが中性領域の水に溶解した状態のコラーゲンに対して標識物質で標識することを特徴とする標識方法。
（２）前記コラーゲンがクラゲに由来するものであることを特徴とする（１）に記載の標識方法。
（３）ｐＨが６．０以上８．５以下であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の標識方法。
（４）前記標識物質が抗体であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の標識方法。
（５）前記抗体がＢＮＰとの親和性を有することを特徴とする（４）に記載の標識方法。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明はコラーゲンを標識する方法に関するものであり、ｐＨが中性領域であっても水溶性であるコラーゲンを利用することを特徴とする。使用するコラーゲンは、ｐＨが中性領域であっても水溶性であれば特にその種類が限定されるものではなく、クラゲに由来するコラーゲンなどを用いることができる。また中性領域で不溶性であるヒトやブタ、ウシなどの哺乳動物や、サメなどの魚類に由来するコラーゲンであっても、サクシニル化・ミリスチル化などの化学修飾やアルカリ処理によって水溶性となるものであれば特にその種類が限定されるものではない。更に、使用するコラーゲンは天然物に由来するものに限定されるわけではなく、遺伝的な改変により中性領域のｐＨで水溶性となる組み替え体コラーゲンなどを利用することもできる。
【０００８】
コラーゲンを溶解させる溶液のｐＨは中性領域であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５．０以上９．０以下、更に好ましくは６．０以上８．５以下である。
【０００９】
本発明で使用される標識物質は特に限定されるものではないが、抗体、ペプチド、核酸、蛋白質、糖鎖、脂質、ホルモン、薬剤、ウイルス、色素などを用いることができ、その中でも抗体が好ましく、特にＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）との親和性を有する抗体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、コラーゲンを標識物質で標識できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗体がコラーゲンへ標識されていることを示す結果である。
【実施例】
【００１２】
以下、抗ＢＮＰ抗体をコラーゲンへ標識する実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００１３】
なお、使用した薬品の組成及びｐＨは以下に示す通りである。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）
１２ｍＭ      炭酸ナトリウム
３８ｍＭ      炭酸水素ナトリウム
洗浄緩衝液（ｐＨ  ７．４）
１ｍＭ        トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
７．５ｍＭ    塩化ナトリウム
０．０５％    ｔｗｅｅｎ２０
ブロッキング緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
１％          スキムミルク
インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
０．１％      スキムミルク
ＡＬＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
１Ｍ          ジエタノールアミン
０．５ｍＭ    塩化マグネシウム
１０ｍＭ      ４−メチルウンベリフェリルリン酸
【００１４】
（実施例１）
（１）クラゲ由来コラーゲンへのマレイミド基の導入
クラゲ由来コラーゲンの濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう６００μｌのＰＢＳ溶液に溶解させた。次に、サクシニミジル―［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ドデカエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）１２）を２５０ｍＭとなるようジメチルスルホキシドに溶かし、濃度を調整したコラーゲン溶液へ２４μｌ加えた。その後この溶液を室温で１時間反応させた後に１Ｍ  ＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を７６μｌ加え、反応を止めた。反応後はこのコラーゲン溶液をＰＢＳ溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）へ通し、未反応のＳＭ（ＰＥＧ）１２を除いた。以上により、クラゲ由来コラーゲンにマレイミド基を導入した。
【００１５】
（２）抗体が有するアミノ基のチオール基への変換
ＢＮＰとの親和性を有するマウス由来抗体（ＢＣ２３−１１、特許第５８１０５１４号公報に記載の抗体）を２ｍｇ用意し、この抗体がＰＢＳ溶液中で１ｍｇ／ｍｌとなるよう濃度を調整した。次に、２−イミノチオラン塩酸塩（トラウト試薬）を２ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳ溶液に溶かし、濃度を調整した抗体溶液へ４４μｌ加えた。その後この溶液を室温で１時間反応させた後に１Ｍ  ＴｒｉｓＣｌ、１００ｍＭ  ＧｌｙＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を４５６μｌ加え、反応を止めた。反応後はこの抗体溶液をＰＢＳ溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）へ通し、未反応のトラウト試薬を除いた。以上により、抗体が有するアミノ基をチオール基へ変換した。
【００１６】
（３）クラゲ由来コラーゲンへの抗体標識
マレイミド基を導入したコラーゲンと、アミノ基をチオール基へ変換した抗体とを混ぜ、４℃で一昼夜反応させた。その後この溶液を１０００ｋ  ｃｕｔの透析膜（ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）の中へ入れてＰＢＳ溶液で透析し、コラーゲンに標識されなかった抗体を除いた。以上により、抗体標識されたコラーゲンを調製した。
【００１７】
（４）抗体がコラーゲンへ標識されていることの確認
抗体がコラーゲンへ標識されていることを下記のＥＬＩＳＡ法で調べた。
（Ａ）抗マウス抗体を０．５μｇ／ｍｌとなるように炭酸緩衝液へ溶かし、この溶液をウェルごとに１００μｌずつＥＬＩＳＡ用プレート（９６ウェル）に分注した。このプレートを室温で１時間静置した後、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｂ）次に、ブロッキング緩衝液をウェルごとに２００μｌずつ加えて、室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを１回洗浄した。
（Ｃ）次に、インキュベーション緩衝液をウェルごとに７０μｌずつ加えた。
（Ｄ）次に、抗体量を調べたいサンプル溶液をウェルごとに３０μｌずつ加えて、室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｅ）次に、Ｇｏａｔ−α  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＡＬＰを含むインキュベーション緩衝液をウェルごとに１００μｌずつ加えて、室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｆ）最後に、ウェルごとに１００μｌずつＡＬＰ緩衝液を加えて、３０分静置した。
（Ｇ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ４６５ｎｍ）、コラーゲンに標識された抗体量を調べた。
【００１８】
以上の実験により、抗体がコラーゲンに標識されていることを確認できた（図１）。
【図１】
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