(57)【要約】【課題】微量アミン関連受容体１（ＴＡＡＲ１）活性化作用を有し、かつ、食品素材由来で副作用が少なく生体への安全性が高い成分を含む、ＴＡＡＲ１活性化用組成物を提供すること。【解決手段】アマチャヅルの葉の抽出物を含む微量アミン関連受容体１活性化用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アマチャヅルの葉の抽出物を含む微量アミン関連受容体１活性化用組成物。
【請求項２】
抗うつ用飲食品として用いられる請求項１に記載の微量アミン関連受容体１活性化用組成物。
【請求項３】
緊張緩和用飲食品として用いられる請求項１又は２に記載の微量アミン関連受容体１活性化用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量アミン関連受容体１活性化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量アミン関連受容体１（ＴＡＡＲ１）は、β−フェネチルアミン等の微量アミン（ＴＡ）に応答するＧタンパク質共役型受容体である。ＴＡＡＲ１はドーパミンシステムを調節するといわれている。また、ＴＡの調節異常は、うつ病、精神病、注意欠陥多動性障害、薬物乱用、パーキンソン病、偏頭痛、摂食障害等の種々の疾患と関連付けられることから、ＴＡＡＲ１を活性化する物質は、上記の疾患の治療又は改善に有効であると考えられている。
【０００３】
例えば非特許文献１には、ＴＡＡＲ１アゴニストがマウスでコカインの活動亢進作用を抑制したこと、マウス及びサルで抑うつ状態を改善したことが記載されている。従ってＴＡＡＲ１を活性化すると、ドーパミンシステムを調節して、抑うつ状態の改善効果や緊張緩和効果が得られると考えられる。
【０００４】
アマチャヅル（学名：Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ  ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ）は、ウリ科のツル植物である。非特許文献２には、アマチャヅルに含まれるギペノシドがマウスで抗不安作用を示したことが記載されている。特許文献１には、アマチャヅルのサポニン成分を有効物質として含有する中枢神経作用系医薬組成物が記載されている。特許文献２には、アマチャヅルエキス等の植物性エキスを含有する精神安定用飲食物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６０−８４２２８号公報
【特許文献２】特開平１−２４２５３３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Revel et al., Molecular Psychiatry (2013) 18, 543-556
【非特許文献２】Zhao et al., BMC Complementary and Alternative Medicine (2015) 15:323
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら非特許文献１〜２及び特許文献１〜２には、アマチャヅルの葉の抽出物が微量アミン関連受容体１（以下、ＴＡＡＲ１ともいう）活性化作用を有することは記載されていない。
ＴＡＡＲ１活性化作用を有する物質は、抑うつ状態の改善や緊張緩和等に有用である。このため、日常的に摂取できる、副作用の少ないＴＡＡＲ１活性化作用を有する食品素材由来の成分が求められているが、ＴＡＡＲ１活性化作用を有する食品素材由来の成分は報告されていない。
【０００８】
本発明は、ＴＡＡＲ１活性化作用を有し、かつ、食品素材由来で副作用が少なく生体への安全性が高い成分を含む、ＴＡＡＲ１活性化用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、種々の食品素材由来の成分のＴＡＡＲ１活性化作用を調べた結果、アマチャヅルの葉の抽出物が、ＴＡＡＲ１活性化作用を有することを見出した。さらに、この抽出物が、ＴＡＡＲ１活性化作用を有することにより抑うつ状態の予防又は改善や緊張を緩和するために有用であることに想到した。本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明の微量アミン関連受容体１活性化用組成物は、アマチャヅルの葉の抽出物を含む。
アマチャヅルの葉の抽出物は、ＴＡＡＲ１活性化作用を有する。上述したように、ＴＡＡＲ１を活性化することにより、抑うつ状態の改善効果や緊張緩和効果等が得られる。
【００１１】
本発明の微量アミン関連受容体１活性化用組成物は、抗うつ用飲食品として好適に用いられる。本発明の微量アミン関連受容体１活性化用組成物は、緊張緩和用飲食品として好適に用いられる。
本発明の微量アミン関連受容体１活性化用組成物は、抑うつ状態の予防又は改善作用、活動意欲低下の予防又は改善作用、活動意欲の向上作用、気力向上作用、活力向上作用、認知機能向上作用、集中力持続又は向上作用、注意力持続又は向上作用、思考速度増進作用、リラックス作用、疲労感の軽減作用等の１又は２以上の作用を有する旨の表示、又は、上記作用を得るために用いられる旨の表示を付したものであってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＴＡＡＲ１活性化作用を有し、かつ、食品素材由来で副作用が少なく生体への安全性が高い成分を含む、ＴＡＡＲ１活性化用組成物を提供することができる。本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物に使用されるアマチャヅルの葉の抽出物は、ＴＡＡＲ１活性化作用を有し、かつ、食品素材としても使用される植物由来の成分であるため、日常的に摂取可能であり、長期間摂取しても安全である。本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物によりＴＡＡＲ１を活性化することにより、抑うつ状態を予防又は改善することができる。また、精神的な緊張状態を緩和することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、アマチャヅルの葉の抽出物を含む。
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、アマチャヅルの葉の抽出物を有効成分として含むものである。
本発明において、ＴＡＡＲ１は、好ましくはヒトＴＡＡＲ１（ｈＴＡＡＲ１）である。本発明の組成物は、ｈＴＡＡＲ１活性化用の組成物として特に好適である。
アマチャヅル（甘茶蔓、学名：Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ  ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ）は、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）アマチャヅル属（Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ）の植物である。アマチャヅルの産地は特に限定されず、日本、日本以外の国のいずれの産地のものでもよい。一例として、日本の九州地方、沖縄地方等で採取されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
抽出に供されるアマチャヅルの葉は、生葉でもよく、葉の乾燥物（乾燥させた葉）でもよい。抽出効率の点からは、葉の乾燥物が好ましい。乾燥方法は特に限定されず、例えば、アマチャヅルの葉を、天日乾燥、陰干乾燥、熱風乾燥等の方法により乾燥させればよい。乾燥の程度も特に限定されない。抽出の効率向上の観点から、例えば、アマチャヅルの葉を粉砕して抽出に供してもよい。
【００１４】
アマチャヅルの葉の抽出物は、アマチャヅルの葉の成分が抽出されたものであれば特に限定されず、例えば、アマチャヅルの葉と溶媒を接触させて抽出することによって得られる葉抽出液（葉の溶媒抽出液）等が挙げられる。また、アマチャヅルの葉の抽出物は、例えば、葉抽出液を濃縮又は希釈することによって得られる濃縮物（濃縮液）や希釈液であってもよく、葉抽出液中の溶媒を留去して得られる濃縮物、さらに乾燥処理を行って得られる乾燥物であってもよい。乾燥物は、粉末化して用いてもよい。
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、アマチャヅルの葉の抽出物を有効成分として含むが、該抽出物の成分はアマチャヅルの葉由来の成分である。本発明においては、アマチャヅルの葉の抽出物に代えて、又は、該抽出物とともに、アマチャヅルの葉（好ましくは葉の粉砕物）を使用することもできる。一態様において本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、アマチャヅルの葉の抽出物及び／又はアマチャヅルの葉を有効成分として含むＴＡＡＲ１活性化用組成物であってもよい。
【００１５】
アマチャヅルの葉の抽出物は、植物成分の抽出に用いられる通常の抽出方法により得ることができる。抽出方法は適宜設定することができ、抽出条件も特に限定されない。例えば、上記アマチャヅルの葉を常温又は加温下にて溶媒で抽出することにより得ることが好ましい。
【００１６】
アマチャヅルの葉の抽出物を抽出液の形態で得る場合には、例えば、溶媒中にアマチャヅルの葉を加えて、適宜加熱、攪拌等をして成分を抽出することにより、アマチャヅルの葉の抽出物が得られる。
【００１７】
抽出に用いる溶媒（抽出溶媒）としては、水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒を使用することが好ましい。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール（１−プロパノール、２−プロパノール）、ブタノール（ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール）等の低級１価アルコール；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、２，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル；ポリエチレングリコール等のポリエーテル等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせた混合溶媒を用いてもよい。中でも、抽出溶媒として、水、低級１価アルコール又はその水溶液、エステル又はその水溶液がより好ましく、水、低級１価アルコール又はその水溶液がさらに好ましい。低級１価アルコールは、炭素数１〜５のアルコールが好ましく、炭素数１〜４のアルコールがより好ましい。多価アルコールは、炭素数２〜５の多価アルコールが好ましく、炭素数２〜４の多価アルコールがより好ましい。低級１価アルコール又はその水溶液としては、エタノール、プロパノール、ブタノール又はその水溶液がより好ましく、エタノール又はエタノール水溶液がさらに好ましい。低級１価アルコール水溶液（好ましくはエタノール水溶液）は、低級１価アルコールの濃度が１０〜９８体積％が好ましく、５０〜９５体積％がより好ましい。エステルとしては、酢酸エチルがより好ましい。本発明におけるアマチャヅルの葉の抽出物として、上記溶媒の抽出物が好ましい。
抽出に際して酸又はアルカリを添加し、抽出溶媒のｐＨを調整してもよい。抽出溶媒の量は特に限定されないが、例えば、アマチャヅルの葉の乾燥重量１ｇに対して１〜１００ｍＬが好ましく、５〜５０ｍＬがより好ましい。
【００１８】
抽出の際には適宜加圧してもよい。抽出温度は特に限定されないが、例えば、０〜１００℃が好ましく、２０〜１００℃がより好ましく、一態様においては、５０〜１００℃が更に好ましく、７０〜９５℃がより更に好ましい。また、抽出温度は、溶媒の沸点以下とすることが好ましい。抽出時間は、抽出温度等の抽出条件に応じて適宜設定することができる。抽出時間は、例えば、５分〜３０日間が好ましく、１０分〜１５日間がより好ましい。例えば、抽出温度が５０〜１００℃（より好ましくは７０〜９５℃）の場合には、抽出時間は１０〜６０分が好ましい。
抽出後は、得られた抽出物から抽出残渣（抽出後のアマチャヅルの葉）を除去することが好ましい。除去方法は特に限定されず、濾過、遠心分離等の公知の方法を採用することができる。
【００１９】
アマチャヅルの葉の抽出方法の一例として、例えば以下の方法が使用できる。アマチャヅルの葉又はその乾燥物を砕細し、該粉砕物（乾燥物換算）１ｇに対して、抽出溶媒を５〜５０ｍＬ加え、常圧下、室温で好ましくは３〜１５日、より好ましくは５〜１０日間抽出するか、又は、抽出溶媒の沸点付近で１０〜６０分抽出してから、ろ過してろ液を得る。抽出の際には、適宜攪拌等の操作を行ってもよい。得られたろ液（抽出液）をそのままアマチャヅルの葉の抽出物としてもよく、必要に応じ濃縮又は乾燥してもよい。
【００２０】
本発明においては、抽出により得られた抽出液をそのままアマチャヅルの葉の抽出物として用いることができる。また、抽出液を適宜な溶媒で希釈してアマチャヅルの葉の抽出物としてもよく、該抽出液に濃縮又は乾燥工程を行って、濃縮物や乾燥物としてもよい。濃縮方法、乾燥方法も特に限定されず、凍結乾燥、噴霧乾燥等の公知の方法を使用できる。抽出物の形態も特に限定されず、液状、粉末状、ペースト状として用いることができる。また、本発明の効果を損なわない限り、抽出物を、さらに適当な精製方法又は分離方法（例えば、液液抽出（液液分配）、クロマトグラフィー）により、活性の高い画分を精製又は分画して用いることもできる。精製又は分離方法の一例を挙げると、上記溶媒で抽出して得た抽出液、その濃縮物又はその乾燥物を、水及び有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ブタノール等）を用いる液液抽出に付して、水相に抽出物成分を抽出し、該水相（水画分）を精製画分として回収する方法が挙げられる。このようにして得られた水画分は、本発明におけるアマチャヅルの葉の抽出物として使用することができる。さらに、この水画分に濃縮又は乾燥工程を行って、得られる濃縮物又は乾燥物を本発明におけるアマチャヅルの葉の抽出物として使用することもできる。本発明におけるアマチャヅルの葉の抽出物は、上記のような抽出方法で得られた各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮物、その乾燥物、これらの精製画分を含む。また、これらを、溶媒で希釈して用いることもできる。
アマチャヅルの葉の抽出物は市販されており、市販品を使用することもできる。市販品として、一丸ファルコス（株）製のアマチャヅル葉エキス等が挙げられる。
【００２１】
アマチャヅルの葉の抽出物は、ＴＡＡＲ１のアゴニストとして作用し、ＴＡＡＲ１を活性化する。このためアマチャヅルの葉の抽出物は、ＴＡＡＲ１活性化に有用であり、ＴＡＡＲ１活性化用組成物の有効成分として好適に使用される。ＴＡＡＲ１の活性化を介して、ドーパミンシステム（ドーパミンの機能）を調節（正常化）することができることが知られている（例えば、Revel FG et al. “TAAR1 activation modulates monoaminergic neurotransmission, preventing hyperdopaminergic and hypoglutamatergic activity.” Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 ;108(20):8485-8490）。ドーパミンシステムが低下した場合、例えば、ストレス等の原因で体内のドーパミンの濃度が減少したり、その働きが低下したりした場合には、気分が落ち込む、やる気喪失等の抑うつ状態が引き起こされる。このような場合にＴＡＡＲ１を活性化することにより、低下したドーパミンシステムを調節して、抑うつ状態を改善することができ、やる気や意欲を向上させることができる。一方、ドーパミンシステムが過活動の場合、例えば体内のドーパミン濃度が過度に上昇した場合、心が高揚するとともに落ち着くことができなくなり、脳内は緊張状態となる。このような場合にＴＡＡＲ１を活性化することにより、過活動のドーパミンシステムを調節して、この精神的な緊張状態を緩和することができる。
従って本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、ＴＡＡＲ１の活性化を介して、低下した又は過活動のドーパミンシステムを正常な状態に調節することができる。これにより、抗うつ効果や緊張緩和効果を発揮することができる。
【００２２】
上記のように、ＴＡＡＲ１を活性化することにより、抗うつ効果、緊張緩和効果が得られる。従って本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、例えば抗うつ用組成物として有用である。本発明において、抗うつとは、抑うつ状態の予防又は改善を意味し、活動意欲低下の予防又は改善、活動意欲の向上、気力又は活力の向上、認知機能向上（集中力持続又は向上、注意力持続又は向上、思考速度増進）等を包含する。予防は、発症の防止、遅延、又は、発症率の低下を包含する。改善は、症状の軽快、症状の進行抑制、及び治癒又は完快を包含する。
また、本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、緊張緩和用組成物としても有用である。緊張緩和は、精神的な緊張の緩和である。
【００２３】
アマチャヅルの葉の抽出物は、ＴＡＡＲ１の活性化、抑うつ状態の予防又は改善、緊張緩和等のために使用することができる。アマチャヅルの葉の抽出物は、ＴＡＡＲ１の活性化、抑うつ状態の予防又は改善、緊張緩和等を目的とする医薬品、医薬部外品、飲食品など様々な用途に使用することができる。アマチャヅルの葉の抽出物は、ＴＡＡＲ１の活性化、抑うつ状態の予防又は改善、緊張緩和等のために使用される飲食品、医薬品、医薬部外品等の製造のために使用することができる。アマチャヅルの葉の抽出物は、飲食品、医薬品、医薬部外品等に配合され、ＴＡＡＲ１活性化、抑うつ状態の予防又は改善、緊張緩和等のための有効成分であり得る。本発明においては、アマチャヅルの葉の抽出物をそのままＴＡＡＲ１活性化用組成物（ＴＡＡＲ１活性化剤ということもできる）として用いてもよいし、本発明の効果を損なわない限り、アマチャヅルの葉の抽出物に加えてその他の成分を配合してＴＡＡＲ１活性化用組成物としてもよい。
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物の形態は特に限定されず、粉末状、顆粒状、ペースト状、固形状等であってもよく、液状であってもよい。
【００２４】
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、飲食品（飲食品組成物）、医薬品（医薬品組成物）、医薬部外品（医薬部外品組成物）等とすることができる。
一実施態様において、本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、例えば、アマチャヅルの葉の抽出物を、飲食品の製造に使用される物質（例えば飲食品原料、必要に応じて添加される飲食品に通常使用される添加剤等）と混合して、ＴＡＡＲ１活性化用飲食品とすることができる。また、一実施態様において、アマチャヅルの葉の抽出物を、医薬品又は医薬部外品に許容される担体、必要に応じて添加される添加剤等と混合して、ＴＡＡＲ１活性化用医薬品又は医薬部外品とすることができる。例えば担体、添加剤等は、飲食品、医薬品又は医薬部外品に許容されるものであればよく、特に限定されず、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤等の１又は２以上が挙げられる。また、アマチャヅルの葉の抽出物をそのまま、ＴＡＡＲ１活性化、抑うつ状態の予防又は改善、緊張緩和のために使用される飲食品、医薬品、医薬部外品等として用いることもできる。
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は経口摂取又は経口投与用であることが好ましく、飲食品としてより好適に用いられる。本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物を摂取又は投与することにより、ＴＡＡＲ１を活性化することができ、これにより抗うつ効果、緊張緩和効果が得られる。本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、抗うつ用飲食品又は緊張緩和用飲食品として好適である。
【００２５】
飲食品は特に限定されず、例えば、例えば、一般的な食品、健康食品、機能性表示食品等の食品；飲料が挙げられる。上記健康食品、機能性表示食品は、例えば、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、シロップ剤、液剤、流動食等の各種製剤形態として使用することができる。飲料として、ノンアルコール飲料、アルコール飲料が挙げられる。ノンアルコール飲料として、コーヒー飲料、炭酸飲料、フレーバーウォーター、茶飲料、果汁入り飲料、無果汁飲料、ノンアルコールビールテイスト飲料、麦芽飲料、豆乳、乳酸菌飲料、ココア、スポーツドリンク、栄養ドリンク等が挙げられる。アルコール飲料として、例えば、ビール、チューハイ、リキュール、カクテル等が挙げられる。
【００２６】
医薬品及び医薬部外品は、内服剤（内服組成物）が好ましい。内服剤の剤型は特に限定されないが、例えば、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、シロップ剤、液剤等が挙げられる。
【００２７】
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物を飲食品、医薬品、医薬部外品とする場合、これらの製造方法も特に限定されず、自体公知の方法により製造すればよい。例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品等の製造において、アマチャヅルの葉の抽出物を配合すればよい。
【００２８】
飲食品、医薬品、医薬部外品等のＴＡＡＲ１活性化用組成物におけるアマチャヅルの葉の抽出物の含量は特に限定されず、ＴＡＡＲ１活性化用組成物の形態等に応じて適宜設定すればよい。例えば、アマチャヅルの葉の抽出物（乾燥物換算）の含量が、ＴＡＡＲ１活性化用組成物中に０．００１〜１００重量％が好ましく、０．０１〜９９．９重量％がより好ましい。
【００２９】
ＴＡＡＲ１活性化用組成物の使用量は、例えば、ＴＡＡＲ１活性化作用が得られる量であればよく、特に限定されない。該組成物を経口摂取又は経口投与する場合であれば、例えば、アマチャヅルの葉の抽出物（乾燥物換算）として、１日当たり、体重１ｋｇあたり、好ましくは１０〜１０００ｍｇであり、より好ましくは３０〜３００ｍｇである。上記量を、１日１回〜数回に分けて、経口摂取又は経口投与することが好ましい。
【００３０】
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物には、ＴＡＡＲ１活性化作用、抗うつ作用、緊張緩和作用に基づく作用を有する旨の表示が付されていてもよい。例えば、本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物には、抑うつ状態の予防又は改善作用、活動意欲低下の予防又は改善作用、活動意欲の向上作用、気力向上作用、活力向上作用、認知機能向上作用、集中力持続又は向上作用、注意力持続又は向上作用、思考速度増進作用、リラックス作用、疲労感の軽減作用（活動意欲の向上による疲労感の軽減を含む）等の１又は２以上の作用を有する旨の表示を付すことができる。また上記表示は、上記作用を得るために用いられる旨の表示であってもよい。本発明の一実施態様において、ＴＡＡＲ１活性化用組成物は、上記の表示が付された飲食品であることが好ましい。
【００３１】
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物の摂取又は投与対象は、好ましくは脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト；サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の非ヒト哺乳動物が挙げられる。中でも、本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物の摂取又は投与対象は、ヒトが好ましい。
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、抑うつ状態の予防又は改善を希望する対象者、精神的な緊張状態の予防又は緩和を希望する対象者に好適に適用される。
【００３２】
アマチャヅルの葉の抽出物を哺乳動物に摂取させる又は投与することを含む、ＴＡＡＲ１活性化方法も本発明に包含される。アマチャヅルの葉の抽出物を哺乳動物に摂取させる又は投与することを含む、抑うつ状態の予防又は改善、緊張緩和方法も本発明に包含される。アマチャヅルの葉の抽出物及びその好ましい態様、好ましい投与量や投与対象等は上述した通りである。
【００３３】
本発明の一態様は、ＴＡＡＲ１を活性化するための、アマチャヅルの葉の抽出物の使用である。ＴＡＡＲ１を活性化することによる、抑うつ状態の予防又は改善のためのアマチャヅルの葉の抽出物の使用；ＴＡＡＲ１を活性化することによる、緊張緩和のためのアマチャヅルの葉の抽出物の使用も本発明に包含される。上記使用は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物における使用であり、治療的使用であってもよく、非治療的使用であってもよい。非治療的とは、医療行為、すなわち手術、治療又は診断を含まない概念である。
ＴＡＡＲ１活性化用組成物を製造するための、アマチャヅルの葉の抽出物の使用も、本発明に包含される。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明をより具体的に説明する実施例を示す。なお、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３５】
ＴＡＡＲ１活性化作用を有する物質のスクリーニングには、ＣＲＥ−ＳＥＡＰレポーターアッセイを用いた。ＣＲＥ−ＳＥＡＰレポーターアッセイ（以下、ＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイ）は、ヒトＴＡＡＲ１（ｈＴＡＡＲ１）の主要シグナル伝達分子ｃＡＭＰをヒト胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性による発光を測定することで間接的にモニターする手法である。細胞には、ヒト微量アミン関連受容体１（ｈＴＡＡＲ１）を発現している組み換えＨＥＫ−２９３細胞を用いた。ｈＴＡＡＲ１を発現している組み換えＨＥＫ−２９３細胞の調製方法及びＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイの手順を以下に示す。
【００３６】
＜ｈＴＡＡＲ１を発現している組み換えＨＥＫ−２９３細胞の調製方法＞
６０ｍｍディッシュで継代培養したＨＥＫ−２９３（Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  ２９３）細胞を血球計数盤又はセルカウンターで数え、３５ｍｍディッシュに６×１０５個／培地３ｍＬになるよう播き直した。その細胞にレポーターベクターｐＣＲＥ−ＳＥＡＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１μｇと受容体発現ベクターｐｃＤＮＡ３−β２−Ｎ９／ｈＴＡＡＲ１  １μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてコトランスフェクションした。その後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で一晩インキュベートした。これにより、ｈＴＡＡＲ１を発現している組み換えＨＥＫ−２９３細胞を得た。この細胞を、ＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイに使用した。
受容体発現ベクターｐｃＤＮＡ３−β２−Ｎ９／ｈＴＡＡＲ１は、Barak LS, Salahpour A, Zhang X, Masri B, Sotnikova TD, Ramsey AJ, Violin JD, Lefkowitz RJ, Caron MG, Gainetdinov RR., “Pharmacological characterization of membrane-expressed human trace amine-associated receptor 1 (TAAR1) by a bioluminescence resonance energy transfer cAMP biosensor.” Mol Pharmacol. 2008;74:585-94.に記載の方法に準じて作製した。
【００３７】
＜ＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイ＞
細胞（ｈＴＡＡＲ１を発現している組み換えＨＥＫ−２９３細胞）を１×１０４個／培地１５０μＬとなるように、ＣＯＲＮＩＮＧ製９６ｗｅｌｌ細胞培養プレートに播き直し、さらに一晩インキュベートした。９６ｗｅｌｌ細胞培養プレートから上清を除去し、スクリーニングサンプル混合無血清培地溶液（１００μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、及び、１ｖ／ｖ％又は０．５ｖ／ｖ％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む）を１５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し３７℃、５％ＣＯ２環境下で一晩インキュベートした。スクリーニングサンプル混合無血清培地溶液は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）に、１００μＭ  ＩＢＭＸ及び後述する評価用サンプル（コントロールの場合は溶媒）を添加したものである。
培養後の上清をすべてＰＣＲプレートに一旦回収した。以降はＰｈｏｓｐｈａ−ｌｉｇｈｔ（登録商標）  ｓｙｓｔｅｍキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、そのプロトコルに従って操作を行った。白色９６ｗｅｌｌプレートに１×Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μＬ／ｗｅｌｌを加え、ＰＣＲプレートに回収した培養上清液のうち２５μＬ／ｗｅｌｌを加えた。その後、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬ／ｗｅｌｌを加え、５分間室温でインキュベートした。Ｂｕｆｆｅｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔで２０倍希釈したＣＳＰＤ溶液５０μＬ／ｗｅｌｌを加え、１０分間室温でインキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘ  マルチラベルカウンタ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて１秒／ｗｅｌｌごとの発光量を測定した。同じサンプルについて、２連の実験をＮ＝２回実施し、平均値を算出して各サンプルの発光量とした。
上記の評価方法では、サンプルがＴＡＡＲ１アゴニスト活性を有すると、培養上澄液中のｃＡＭＰ濃度が上昇し、発光量が大きくなる。
【００３８】
＜試験例１＞
上記のＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイの操作に従って、スクリーニングを行った。ポジティブコントロールとしてｈＴＡＡＲ１の既知アゴニストのβ−フェネチルアミン（ＰＥＡ）も一緒に評価した。スクリーニングサンプル９種類（ＮＯ．１〜９）の名称を以下の表１に示す。
【００３９】
【表１】
2018123098.tif 000002
【００４０】
表１のＮＯ．１〜９の植物については、表１に示す部位の乾燥物を植物材料として用いて、以下の方法により調製した抽出物を使用した。ＮＯ．２、４〜９の植物材料は、新和物産（株）から購入した。
【００４１】
植物抽出物の調製方法
植物材料の粉砕物（３ｇ）に７０ｖ／ｖ％エタノール（３０ｍＬ）を加え、室温で１週間静置して抽出した。遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０℃、２０分）によって抽出残差を除去して得られた上清を０．４５μｍのフィルターでろ過して抽出液を得た。抽出液を５ｍＬずつに分け、各々エタノールを除去後、凍結乾燥して抽出物を得た。
抽出物を水（１ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル（３ｍＬ）及びｎ−ブタノール（１ｍＬ）で順次抽出し、残った水相を凍結乾燥して水画分（サンプル）を得た。
水画分に、該水画分が５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ又は２００ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＤＭＳＯを加えて溶解し、評価用サンプルとした。表１中の「濃度（ｍｇ／ｍＬ）」は、評価用サンプルの水画分濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。
【００４２】
ＮＯ．１〜９は、上記水画分の最終濃度（スクリーニングサンプル混合無血清培地溶液中の水画分濃度）が、表１に記載された濃度の２００倍希釈で試験した。スクリーニングは、表１のＮＯ．１〜９を２つに分けて実施した（試験１：ＮＯ．１〜６、試験２：ＮＯ．７〜９）。上述したように、試験では、同じサンプルについて、２連の実験をＮ＝２回実施し、その平均値を発光量とした。ポジティブコントロール（ＰＥＡ）の最終濃度は、１０−５Ｍであった。コントロール（Ｃｏ）には、最終濃度１％のＤＭＳＯ及び最終濃度１００μＭのＩＢＭＸを含む、ＤＭＥＭ無血清培地を使用した。スクリーニングのアッセイ結果を表２に示す。表２中、Ｃｏはコントロール、ＰＥＡはフェネチルアミンである。相対発光値は、各試験系のコントロール（Ｃｏ）の発光量を１とした場合の、各サンプルの相対発光量である。表２中の「＊」は、発光量がコントロールの２倍以上であることを示す。
【００４３】
この結果から、発光値の上昇、すなわちアゴニスト活性がみられたものは、ＮＯ．７（アマチャヅル）、ＮＯ．９（キッピ）であった。
【００４４】
【表２】
2018123098.tif 000003
【００４５】
＜試験例２＞
ｈＴＡＡＲ１を発現させていないＨＥＫ−２９３細胞でのＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイ
試験例１のスクリーニングの結果で、発光値の上昇を示したものが本当にｈＴＡＡＲ１を介したアゴニスト応答であるかを確認するための試験を行った。
具体的には、上述したｈＴＡＡＲ１を発現している組み換えＨＥＫ−２９３細胞の調製において、ｐｃＤＮＡ３−β２−Ｎ９／ｈＴＡＡＲ１ベクターの代わりに空のｐｃＤＮＡ３ベクターを１．０μｇトランスフェクションして組み換えＨＥＫ−２９３細胞（ｈＴＡＡＲ１を発現させていないＨＥＫ−２９３細胞）を調製した。この細胞を用いた以外は上記のＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイと同様のアッセイを行った。ここでアッセイを行ったサンプルは、試験例１でアゴニスト活性が見られたサンプル（ＮＯ．７、ＮＯ．９）である。ポジティブコントロールとしてＦＯ（フォルスコリン）を、ネガティブコントロールとしてＰＥＡ（β−フェネチルアミン）を最終濃度１０−５Ｍで合わせて評価した。コントロール（Ｃｏ）には、最終濃度１％のＤＭＳＯ及び最終濃度１００μＭのＩＢＭＸを含む、ＤＭＥＭ無血清培地を使用した。試験では、同じサンプルについて、２連の実験をＮ＝２回実施し、平均値を算出して各サンプルの発光量とした。表３に結果を示す。
相対発光値は、コントロール（Ｃｏ）の発光量を１とした場合の、各サンプルの相対発光量である。「＊」は、コントロールよりも発光量が２倍以上であることを示す。
【００４６】
【表３】
2018123098.tif 000004
【００４７】
表３より、柑橘系抽出サンプルのＮＯ．９は発光値がコントロールよりも高くなっていた。これは試験例１のスクリーニングで見られたアゴニスト活性がｈＴＡＡＲ１を介したものではないことを示唆している。ホストのＨＥＫ−２９３細胞に発現していた何らかの受容体（例：アドレナリン受容体など）に作用した結果であると考えられる。しかしながら、ＮＯ．７のアマチャヅルにおいては今回の実験では発光値の上昇は見られず、ｈＴＡＡＲ１が発現している細胞でのみアゴニスト作用を示すサンプルであることが分かった。
【００４８】
表１に示したＮＯ．１〜９に加えて、別の３６種類の植物の葉等の部位を用いて、試験例１と同じ方法で抽出物（追加サンプルＮＯ．１〜３６）を調製し、該抽出物を用いて試験例１と同じ方法で評価を行った。試験例１では、発光量がコントロールの１．５倍以上の追加サンプルは３つであり、残りの３３の追加サンプルの発光量はコントロールの１．５倍未満であった。試験例１の方法による評価で発光量がコントロールの１．５倍以上であった追加サンプル３つを用いて試験例２と同じ方法で評価を行った。その結果、これらの追加サンプル３つはいずれも、その相対発光値がコントロールの発光量の３倍以上であった。
【００４９】
以上、４５種類のサンプルをスクリーニングした結果、唯一表１のＮＯ．７のアマチャヅルの葉の抽出物がｈＴＡＡＲ１に応答する食品成分抽出サンプルとして選抜された。
ＮＯ．７のアマチャヅル（学名：Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ  ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ）は、ウリ科アマチャヅル属のツル植物であり、葉や茎は生薬として用いられる。含有成分としてはサポニンというサポゲニンと糖の配糖体が約７０種類含まれている。一般にｈＴＡＡＲ１を含むＧＰＣＲのリガンド結合ポケットには、分子量があまり大きくない分子が作用することが一般的であるため、サポニン、サポゲニン以外の成分がｈＴＡＡＲ１にアゴニストとして作用した可能性が高いと推察された。
【００５０】
＜実施例１＞
アマチャヅルの葉の抽出物のアゴニスト活性の再現性を調べた。実験は、試験例１と同様に、上記のＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにより行った。アマチャヅルの葉の抽出物は、試験例１で調製した評価用サンプル（表１のＮＯ．７、水画分濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を使用した。同じサンプルについて、２連で測定を行い、その平均値を発光量とした。
また、ＴＡＡＲ１アンタゴニストＥＰＰＴＢ（Ｎ−（３−Ｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−４−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ−３−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ；Ｂｒａｄａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００９，１０６，２００８１−２００８６）によって、そのアゴニスト活性を阻害できるかどうかの試験も実施した。ＥＰＰＴＢによって阻害することができれば、アマチャヅルの葉の抽出物のアゴニスト活性は、ｈＴＡＡＲ１に間違いなく作用して引き起こされた活性であることを薬理学的に証明することができる。
【００５１】
（１）ＥＰＰＴＢのｈＴＡＡＲ１アンタゴニスト作用の検証
まず、ＥＰＰＴＢがヒトのＴＡＡＲ１にもアンタゴニスト活性を示すかを確認するための実験を行った。
β−フェネチルアミン（ＰＥＡ）（ｈＴＡＡＲ１の代表的アゴニスト）による濃度依存的なアゴニスト活性を確認した上で、１０−５Ｍ  ＰＥＡで処理したときに得られるアゴニスト活性について、各濃度のＥＰＰＴＢ（１０−９〜１０−４Ｍ）の同時投与によって、該ＰＥＡのアゴニスト活性が阻害されるかどうかを試験した。結果（ＰＥＡ＋ＥＰＰＴＢ）を表４に示す。その結果、１０−４ＭのＥＰＰＴＢでは、ＰＥＡのアゴニスト活性をほぼ１００％阻害した。ＥＰＰＴＢによる濃度依存的なアンタゴニスト活性が観察された。以上の結果から、ＥＰＰＴＢは、ｈＴＡＡＲ１に対しても有効なアンタゴニストとして利用できることが分かった。
【００５２】
（２）アマチャヅルの葉の抽出物のアゴニスト活性の再現性とＥＰＰＴＢによる阻害実験
次に、アマチャヅルの葉の抽出物のアゴニスト活性の再現性を見るとともに、該抽出物のアゴニスト活性がＥＰＰＴＢによって阻害されるかどうかの実験を行った。アマチャヅルの葉の抽出物（水画分濃度）の最終濃度（スクリーニングサンプル混合無血清培地溶液中の水画分濃度）は、０．５ｍｇ／ｍＬとした（評価用サンプルを２００倍希釈）。このアマチャヅルの葉の抽出物と各濃度のＥＰＰＴＢ（１０−９〜１０−４Ｍ）の同時投与によって、アマチャヅルの葉抽出物のアゴニスト活性が阻害されるかを調べた。その結果（アマチャヅル＋ＥＰＰＴＢ）を表４に示す。アマチャヅルの葉の抽出物単独での施用で、２−３倍程度の発光量の上昇が認められた。つまり、ｈＴＡＡＲ１に対するアゴニスト活性が認められ、データの再現性が確認できた。また、高濃度のＥＰＰＴＢ（１０−４Ｍ又は１０−５Ｍ）では、アマチャヅルの葉の抽出物のアゴニスト活性をほぼ１００％阻害した。以上の結果から、アマチャヅルの葉の抽出物のｈＴＡＡＲ１に対するアゴニスト活性には充分な再現性が認められ、そのアゴニスト活性は、ｈＴＡＡＲ１を介して引き起こされていることが薬理学的に証明された。
【００５３】
【表４】
2018123098.tif 000005
【００５４】
表４中、Ｃｏはコントロール（最終濃度１％のＤＭＳＯ及び最終濃度１００μＭのＩＢＭＸを含む、ＤＭＥＭ無血清培地）である。Ｐ．Ｃ．は、１０−５ＭのＰＥＡ単独施用のときのデータである。表４中のｌｏｇ［濃度（Ｍ）］は、ＥＰＰＴＢ濃度（Ｍ）のｌｏｇ［濃度（Ｍ）］を示す。相対発光値は、コントロール（Ｃｏ）の発光量を１とした場合の、各サンプルの相対発光量である。
【００５５】
＜実施例２＞
アマチャヅルの葉の水抽出物の調製方法
アマチャヅルの葉（乾燥物、新和物産（株）より購入）の粉砕物３ｇに３０ｍＬの蒸留水を加え、加熱して３０分間沸騰させて抽出し、抽出液を濾過した。ろ液を凍結乾燥したものを葉の水抽出物とした。
【００５６】
＜比較例１＞
アマチャヅルの茎抽出物の調製方法
葉の代わりに、アマチャヅルの茎（乾燥物）を使用した以外は、実施例２と同じ方法でアマチャヅルの茎を抽出し、抽出液を濾過した。ろ液を凍結乾燥したものを茎抽出物とした。
【００５７】
実施例２で調製したアマチャヅルの葉の水抽出物及び比較例１で調製した茎抽出物をそれぞれ使用して、試験例１と同様に、上記のＣＲＥ−ＳＥＡＰアッセイを行った。試験例１と同様に、各抽出物の濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように評価用サンプルを調製し（溶媒は、ＩＢＭＸを含むＤＭＳＯ、ＩＢＭＸの最終濃度は１００μＭ）、この評価用サンプルを用いて、各抽出物の最終濃度（スクリーニングサンプル混合無血清培地溶液中の抽出物濃度）が１０〜１０−５ｍｇ／ｍＬになるように希釈して評価を行った。コントロール（Ｃｏ）には、最終濃度１％のＤＭＳＯ及び最終濃度１００μＭのＩＢＭＸを含む、ＤＭＥＭ無血清培地を使用した。実験では、同じサンプルを２連で測定し、その平均値を発光量とした。結果を表５に示す。実施例２で調製したアマチャヅルの葉の水抽出物は、ｈＴＡＡＲ１のアゴニスト活性を有していた。
【００５８】
【表５】
2018123098.tif 000006
【００５９】
表５中、Ｃｏはコントロールである。ｌｏｇ［濃度（ｍｇ／ｍＬ）］は、アマチャヅルの葉の水抽出物又は茎抽出物の最終濃度（ｍｇ／ｍＬ）のｌｏｇ［濃度（ｍｇ／ｍＬ）］を示す。相対発光値は、コントロール（Ｃｏ）の発光量を１とした場合の、各サンプルの相対発光量である。
【００６０】
アマチャヅルの葉の抽出物を配合したＴＡＡＲ１活性化用組成物の製造例の一例を以下に示す。下記の製造例では、アマチャヅルの葉の抽出物として、実施例２と同じ方法で得たアマチャヅルの葉の水抽出物（凍結乾燥物）を粉砕したもの（乾燥粉砕物）を使用した。アマチャヅルの葉の抽出物には、例えば、試験例１で得た水画分を使用することもできる。
【００６１】
＜製造例１＞
下記の組成の茶飲料を調製した。
茶飲料
（組成）
緑茶抽出物  ２．０重量％
水  ９７．４重量％
アマチャヅルの葉の抽出物（乾燥粉砕物）  ０．０５重量％
ビタミンＣ  ０．０１重量％
全量  １００．０重量％
【００６２】
＜製造例２＞
カプセル剤
＜用時溶解用粉末＞
アマチャヅルの葉の抽出物（乾燥粉砕物）  ７０重量％
デキストリン  ３０重量％
下記成分からなるソフトカプセル剤皮の中に、上記の用時溶解用粉末を常法により充填し、ソフトカプセル（１錠あたりの重さ：３６０ｍｇ）を得た。
ゼラチン  ６０．０重量％
グリセリン  ３０．０重量％
パラオキシ安息香酸メチル  ０．１５重量％
パラオキシ安息香酸プロピル  ０．５１重量％
水  適量
【００６３】
＜製造例３＞
錠剤
下記に示す配合の混合物を、常法により造粒ならびに成型し、錠剤を得た（１錠あたりの重さ：２００ｍｇ）。
アマチャヅルの葉の抽出物（乾燥粉砕物）  ５０重量％
結晶セルロース  ２９．５重量％
部分α化デンプン  ２０重量％
ステアリン酸マグネシウム  ０．５重量％
【００６４】
＜製造例４＞
ビールテイスト飲料
麦芽を適当な粒度に粉砕したものを仕込槽に入れ、これに１２０Ｌの温水を加え、約５０℃のマッシュを作った。５０℃で３０分保持後、徐々に昇温して６５℃〜７２℃で６０分間、糖化を行った。糖化が完了したマッシュを７７℃まで昇温後、麦汁濾過槽に移し濾過を行い、濾液を得た。得られた濾液の一部をとり、温水を加え、その際、濾液と温水の混合割合は、煮沸完了時のエキス分の量が目標とする値になるよう調節した。製造スケールを１００Ｌとし、ホップを約１００ｇ添加し、１００℃で８０分間煮沸をした。煮沸後の液からオリを分離し、約２℃に冷却後、麦汁を希釈し、アマチャヅルの葉の抽出物（乾燥粉砕物）（０．０５重量％）を加えた。酸化剤、香料、酸味料、甘味料、苦味料、カラメル色素を各々適量加えた後、２４時間貯蔵した。炭酸ガスを適量添加し、その後、ろ過、瓶詰、殺菌（６５℃以上１０分間加熱）の工程を経て、ビールテイスト炭酸飲料を得た。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のＴＡＡＲ１活性化用組成物は、抗うつ作用や緊張緩和作用を有する飲食品等として有用である。