(57)【要約】      （修正有）【課題】アレルゲン性が低下した加水分解されたアレルゲンの製造方法の提供。【解決手段】ａ）ピーナツ又はチリダニのアレルゲンタンパク質を含むアレルゲン源を抽出して、抽出物を形成する工程、ｂ）前記抽出物を精製して、非タンパク質成分を除去し、精製された抽出物を形成する工程、ｃ）前記精製された抽出物を第１の変性剤で変性させて、精製された変性抽出物を形成する工程、ｄ）前記精製された変性抽出物を純化して、不純物を除去し、純化した変性抽出物を形成する工程、ｅ）前記純化させた変性抽出物を第２の変性剤で変性させて、変性したアレルゲン混合物を形成する工程、およびｆ）前記変性したアレルゲン混合物を加水分解して、加水分解されたアレルゲンを形成する工程を含む、アレルゲンから加水分解されたアレルゲンを製造するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ピーナツまたはチリダニのアレルゲンタンパク質を含むアレルゲン源を抽出して、抽出物を形成する工程、
ｂ）前記抽出物を精製して、非タンパク質成分を除去し、精製された抽出物を形成する工程、
ｃ）前記精製された抽出物を第１の変性剤で変性させて、精製された変性抽出物を形成する工程、
ｄ）前記精製された変性抽出物を純化して、不純物を除去し、純化した変性抽出物を形成する工程、
ｅ）前記純化した変性抽出物を第２の変性剤で変性させて、変性したアレルゲン混合物を形成する工程、および
ｆ）前記変性したアレルゲン混合物を加水分解して、加水分解されたアレルゲンを形成する工程、
を含み、ａ）〜ｆ）の工程はａ）〜ｆ）の順序で行われる、アレルゲンから加水分解されたアレルゲンを製造するための方法。
【請求項２】
前記抽出が、塩を含まない溶液中、または炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳから選択される塩を含む溶液中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出が抽出媒体で実施され、前記抽出媒体の重量が前記アレルゲン源の重量の少なくとも２０倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記精製および／または純化が、イオン交換クロマトグラフィー工程、ゲル濾過もしくはサイズ排除クロマトグラフィー工程、沈殿工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、偽アフィニティーもしくはアフィニティークロマトグラフィー工程またはダイアフィルトレーション工程のうちの１つ以上を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記沈殿工程がトリクロロ酢酸を含む溶液で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の変性剤による変性および前記第２の変性剤による変性の少なくとも一方が、カオトロピック剤、還元剤およびそれらの混合物からなる群から選択される変性剤で実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記変性剤が、尿素、塩化グアニジニウム、ジチオトレイトール、チオグリセロール、β−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記尿素の濃度が４Ｍ超、および／または塩化グアニジニウムの濃度が３Ｍ超である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記尿素の濃度が６Ｍ超、および／または塩化グアニジニウムの濃度が４Ｍ超である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記加水分解が酵素で実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記加水分解が、ペプシン、トリプシン、およびキモトリプシンからなる群から選択される酵素で実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記加水分解が、カオトロピック剤および還元剤の存在下で実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記加水分解が、尿素および塩化グアニジニウムからなる群から選択されるカオトロピック剤、およびＴＣＥＰおよびＤＴＴからなる群から選択される還元剤の存在下で実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記加水分解されたアレルゲンを精製して、１０，０００Ｄａより高い分子量を有するペプチドおよび１，０００Ｄａより低い分子量を有するペプチドを除去する工程ｇ）をさらに含み、前記精製後の加水分解されたアレルゲンにおけるペプチドの７０％が１０，０００Ｄａ〜１，０００Ｄａの間である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドの除去がサイズ排除クロマトグラフィーおよび／または限外ろ過によって実施され、前記サイズ排除クロマトグラフィーが、カオトロピック剤の存在下で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドの除去がサイズ排除クロマトグラフィーおよび／または限外ろ過によって実施され、前記サイズ排除クロマトグラフィーが、尿素、塩化グアニジニウム、エチレングリコール、イソプロパノール、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカオトロピック剤の存在下で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記アレルゲン源が、ピーナツである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アレルゲン源が、少なくとも２つの種／亜種／変種／ハイブリッドおよび／または遺伝子組み換えピーナツの混合物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アレルゲン源が、少なくとも３つの種／亜種／変種／ハイブリッドおよび／または遺伝子組み換えピーナツの混合物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ピーナツが、アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ）属の中から選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ピーナツが、ハイポガエア（ｈｙｐｏｇａｅａ）種の中から選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項の方法によって得ることができる加水分解されたアレルゲン。
【請求項２３】
請求項２２に記載の加水分解されたアレルゲンを含む医薬組成物。
【請求項２４】
ヌクレオシド三リン酸；ヌクレオシド二リン酸；ヌクレオシド一リン酸；核酸；ペプチド核酸；ヌクレオシドまたはその類似体（ａｎａｌｏｇｓ）；免疫抑制性サイトカイン；免疫プロテアソームの発現を誘発する化合物；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３またはその類似体；リポ多糖類；エンドトキシン、熱ショックタンパク質；ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼのいずれかとチオレドキシン；還元剤；ジチオトレイトール；サルブタノール（ｓａｌｂｕｔａｎｏｌ）などのアドレナリン受容体アゴニスト；ブトキサミンなどのアドレナリン受容体アンタゴニスト；接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を調節する化合物；Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン；ｙ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン（還元Ｌ−グルタチオン）；アルファ−２−マクログロブリン；Ｆｏｘｐ３遺伝子発現のための誘導因子；フラボノイド；イソフラボノイド；プテロカルパノイド；レスベラトールなどのスチルベン；タキキニン受容体アンタゴニスト；キマーゼ阻害剤；ワクチンアジュバントまたはＣｐＧのような免疫調節薬；水酸化アルミニウム；リン酸カルシウム；ＴＬＲ−４アゴニスト（すなわち、ＭＰＬ）およびＴＬＲ−９アゴニストまたはザイモサンのような寛容原性アジュバント；ベータ−１，３−グルカン；調節性Ｔ細胞インデューサー；植物レクチンなどの粒子を腸粘膜内層へ付着させるための粘膜付着剤；亜鉛；亜鉛塩；多糖類；ビタミン；および表面結合抗体を提示する溶菌液または粒子、からなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
経口、皮下、経鼻、経皮またはリンパ内投与のための、舌下薬物送達のための、腸薬物送達のための、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
寛容および脱感作を誘発させるための、請求項２２に記載の加水分解されたアレルゲンを含む医薬組成物または食品組成物。
【請求項２７】
アレルギー反応の治療または予防において使用するための、請求項２６に記載の医薬組成物または食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加水分解されたアレルゲン、さらに詳細には、アレルゲン性が低下した加水分解されたアレルゲン、を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加水分解されたアレルゲンの製造のための一般的方法は、国際公開２００８／０００７８３Ａｌから公知である。この文献で開示されている方法は、乳、毒、卵、雑草、イネ科草本（ｇｒａｓｓ）、樹木、灌木、花、野菜、穀物、菌類などのような様々な天然材料の抽出、精製、変性および加水分解の工程を含む。
【０００３】
しかしながら、公知の方法を使用することによる高度な実験研究で、アレルゲンタンパク質の加水分解は複雑であり、アレルゲンタンパク質を完全に加水分解するためにはさらなる処置の工程を必要とすることが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の１つの目的は、先行技術の欠点の少なくともいくつかを解決すること、特に粗アレルゲン抽出物（ｃｒｕｄｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｅｘｔｒａｃｔ）と比較してアレルギー反応を引き起こす能力が有意に減少しているが、Ｂ細胞およびＴ細胞を刺激することができる天然のアレルゲン由来の抗原を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、ａ）アレルゲンタンパク質を含むアレルゲン源を抽出して、抽出物を形成する工程、
ｂ）前記抽出物を精製して、非タンパク質成分を除去し、精製された抽出物を形成する工程、
ｃ）前記精製された抽出物を第１の変性剤で変性させて、精製された変性抽出物を形成する工程、
ｄ）前記精製された変性抽出物を純化して（ｒｅｆｉｎｉｎｇ）、不純物を除去し、純化した変性抽出物を形成する工程、
ｅ）前記純化した変性抽出物を第２の変性剤で変性させて、変性したアレルゲン混合物を形成する工程、および
ｆ）前記変性したアレルゲン混合物を加水分解して、加水分解されたアレルゲンを形成する工程
を含む、アレルゲンから加水分解されたアレルゲンを製造するための方法によって解決される。
【０００６】
驚くべきことに、２つの変性工程を適用することによって、アレルゲンタンパク質は完全に加水分解され得ることを示すことができた。
【０００７】
本明細書中で使用される「抽出する」とは、可溶性成分を不溶性残留物から除去するための、水、緩衝液または有機溶媒を含む、抽出媒体でのアレルゲン源の処理である。水溶液系（少なくとも５０％のＨ２Ｏを含む）の使用が好ましい。
【０００８】
本明細書中で使用される「変性」とは、タンパク質がそれらの四次、三次および二次構造を失うプロセスであり、特にこの用語は１つまたは複数の変性剤での処理を指す。
【０００９】
工程ａ）は抽出工程である。
【００１０】
抽出は、好ましくは水溶液で実施される。好適な塩は、これらに限定されないが、リン酸水素２ナトリウム、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳのような塩である。
【００１１】
また、多くの他の抽出方法と比較すると、抽出媒体の量は比較的大きい、すなわち、アレルゲン源の重量の少なくとも２０倍、好ましくは重量の１００倍またはそれ以上である、ことが好ましい。
【００１２】
抽出物は図面および実施例で粗タンパク質抽出物と指定される。
【００１３】
工程ｂ）は精製工程である。
【００１４】
アレルゲン源の抽出後、すなわち工程ａ）後、抽出物を精製（工程ｂ）して、糖、脂質、核酸などの非タンパク性成分を除去する。
【００１５】
抽出物の精製は、以下の１つ以上によって実施されてもよい：
・イオン交換クロマトグラフィー工程（アニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーを含む）、
・サイズ排除クロマトグラフィー工程（ゲル濾過とも呼ばれる）、
・沈殿工程、
・疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、
・偽アフィニティー（ｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）およびアフィニティークロマトグラフィーならびに／または
・ダイアフィルトレーション。
【００１６】
一つの好ましい実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーを使用し、ここで、カチオン交換体の場合、ローディング溶液は、カチオン交換体の酸性官能基のｐＫａと抽出物中のタンパク質の最低ｐＫａを有するタンパク質のｐＫａとの間のｐＨを有する。アニオン交換体の場合、ｐＨは、アニオン交換体の塩基性官能基のｐＫａと抽出物を構成するタンパク質の最高ｐＫａを有するタンパク質のｐＫａとの間である。
【００１７】
この方法によって、すべてのタンパク質がイオン交換体に結合しながら、中性不純物およびイオン交換樹脂と同じ電荷を有する不純物は除去される。
【００１８】
または、アレルゲンタンパク質を、少なくとも５０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウム、更に好ましくは少なくとも９０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウム、の添加によって沈殿させることが可能である。一つの好ましい実施形態において、沈殿は、少なくとも２％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、好ましくは５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは少なくとも１０％（ｗ／ｖ）のＴＣＡ、の添加により実施することも可能である。
【００１９】
典型的には、複数の異なるタンパク質は、精製された抽出物のタンパク質画分中に存在する。精製された抽出物中のタンパク質の相対量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのような方法とそれに続くデンシメトリーを用いて容易に測定することができる。
【００２０】
工程ｃ）は第１の変性工程である。
【００２１】
次の工程（工程ｃ））として、変性を実施する。変性剤は、好ましくは、カオトロピック剤、還元剤またはそれらの混合物である。好適なカオトロピック剤は、例えば尿素および塩化グアニジニウムである。典型的な還元剤は、例えば、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、チオ−グリセロール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびそれらの混合物である。
【００２２】
典型的なｐＨ値は、第１の変性工程については、７．０〜１１．０の間、好ましくは７．０〜１０．０の間、更に好ましくは７．０〜９．０の間である。
【００２３】
変性は、少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも３０分間、更に好ましくは少なくとも６０分間、１５〜４０℃の間、好ましくは２０〜３７℃の間、の温度で好ましくは実施される。
【００２４】
一つの好ましい実施形態において、変性のために使用される還元剤はＤＴＴ（ジチオトレイトール）である。
【００２５】
尿素の好適な濃度は３Ｍ以上、好ましくは４Ｍ以上である。グアニジニウムの好適な濃度は、好ましくは２Ｍ、好ましくは３Ｍ以上である。
【００２６】
工程ｄ）は精製工程である。
【００２７】
工程ｄ）として、さらなる精製を実施する。一つの好ましい実施形態では、ゲル濾過またはダイアフィルトレーション手順が適用される。クロマトグラフィー、特にサイズ排除クロマトグラフィー、の使用が好ましい。工程ｄ）によって、アレルゲンのタンパク質成分と共有結合せず、工程ｃ）によってタンパク質から分離された、さらなる精製不純物を調製物から今度は除去することができると考えられる。
【００２８】
工程ｅ）は第２の変性工程である。
【００２９】
工程ｄ）後に、第２の変性工程（工程ｅ））を実施する。この変性工程のために、工程ｃ）と同じまたは異なる組成であり得る第２の変性剤を使用する。一つの好ましい実施形態では、第２の変性工程のために使用される還元剤はＴＣＥＰである。
【００３０】
第２の変性工程のためにｐＨを１．５〜９．０の間に設定することが好ましい。好ましくは、ｐＨは、工程ｆ）において使用される選択された酵素の最適ｐＨ活性に近い。一つの好ましい実施形態において、ｐＨは、７．０より低いか、または５．０より低いか、または３．０より低いが、好ましくは１．０より高い。変性は、少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも３０分間、さらに好ましくは少なくとも６０分間、１５〜４０℃の間、好ましくは２０〜３７℃の温度で好ましくは実施される。
【００３１】
次の工程（工程ｆ））は加水分解工程である。
【００３２】
加水分解工程は典型的には酵素を用いて実施される。好適な酵素は、たとえばペプシン、トリプシン、および／またはキモトリプシンである。加水分解工程は、カオトロピック剤、好ましくは尿素または塩化グアニジニウムの存在下でも実施することができる。加水分解中、尿素および塩化グアニジニウムの濃度は、４Ｍ未満、好ましくは３Ｍ未満であるべきである。加水分解工程はまた、還元剤、好ましくはＴＣＥＰの存在下で実施され得る。加水分解中、ＴＣＥＰの濃度は、好ましくは１０ｍＭ未満である。好ましくは、ペプシンが使用される。さらに好ましくは、１．０〜３．０のｐＨ範囲でペプシンが使用される。
【００３３】
工程ｇ）は、加水分解されたアレルゲンの精製および選択である。
【００３４】
さらなる工程（工程ｇ）において、加水分解されたアレルゲンを精製して、精製された加水分解物を形成することができ、ここで、特にペプチドのフラグメント、すなわち典型的には１，０００Ｄａ未満の分子量を有するフラグメントおよび例えば１０，０００Ｄａを超える分子量を有するタンパク質および／またはペプチドの非加水分解フラグメント、が除去される。したがって、精製された加水分解物のペプチドは、１，０００〜１０，０００Ｄａの間の分子量を有するペプチドを含む。好ましくは、ペプチドの１０％未満は１０，０００Ｄａを超える分子量を有し、ペプチドの２０％未満が１，０００Ｄａ未満の分子量を有するので、ペプチドの７０％またはさらに好ましくは８０％、が１０，０００Ｄａ〜１，０００Ｄａの間である。
【００３５】
大または小ペプチドを除去するための好適な方法は、限外ろ過およびサイズ排除クロマトグラフィーである。さらに、このサイズ排除クロマトグラフィーも、カオトロピック剤、例えば尿素、塩化グアニジニウム、エチレングリコール、イソプロパノールおよびそれらの混合物、の存在下で実施されてもよい。
【００３６】
好ましくは、加水分解されたペプチドの精製は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または限外ろ過によって実施され、ここで、サイズ排除クロマトグラフィー工程は、好ましくは尿素、塩化グアニジニウム、エチレングリコール、イソプロパノールおよびそれらの混合物から選択される、カオトロピック剤の存在下で好ましくは実施される。
【００３７】
加水分解物の１つの利点は、ペプチドが精製された変性タンパク質の消化の結果であるということである。それらは、即時型アレルギー反応および共炎症（ｃｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）反応も同様に誘発する可能性が減少している。
【００３８】
本発明の一つの好ましい実施形態において、アレルゲン源は、乳、毒、卵、雑草、イネ科草本、樹木、灌木、花、野菜、穀物、菌類、果物、ベリー、ナッツ、種子、豆、魚、甲殻類、シーフード、肉、香辛料、昆虫、ダニ、カビ、動物、ハトダニ（ｐｅｇｉｏｎ  ｔｉｃｋ）、毛虫、ソフトサンゴ、動物の鱗屑、線虫、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）およびそれらの混合物を含む天然源である。
【００３９】
本発明で使用される好ましいアレルゲンは、特にイネ科草本花粉、チリダニ（ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）、カバノキ花粉およびピーナツである。
【００４０】
あるいは、出発材料としてのアレルゲンの合成源を使用することができる。アレルゲンの合成源とは、組換えタンパク質のようなバイオテクノロジー的に製造されたタンパク質および／または遺伝子組換え生物を意味する。
【００４１】
本発明の一つの更に好ましい実施形態において、ピーナツおよびチリダニ（精製されたダニ）がアレルゲン源である。
【００４２】
好ましくは、源はアレルゲンの混合物を含む。
【００４３】
好ましくは、ピーナツは、アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ）属から、好ましくはハイポガエア（ｈｙｐｏｇａｅａ）種から、更に好ましくはハイポガエアおよびファスティギアタ（ｆａｓｔｉｇｉａｔａ）から、選択される。亜種は、バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、スパニッシュ（Ｓｐａｎｉｓｈ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）変種および／またはハイブリッド（ｈｙｄｒｉｄｓ）、例えばランナー（Ｒｕｎｎｅｒ）またはさらには遺伝子工学によって得られる更なる遺伝子組み換えピーナツを含む。
【００４４】
好ましくは、少なくとも２つ、好ましくは３つの種／亜種／変種／ハイブリッドおよび／または遺伝子組み換えピーナツの混合物が使用される。一つの好ましい実施形態において、ピーナツの赤色の種皮（外皮）は除去されている。
【００４５】
本発明の加水分解されたアレルゲンは、寛容および脱感作を誘発するための医薬組成物および／または食品組成物の製造のために使用することができる。寛容の誘発は、アレルギー反応を治療または予防に用いられ得る。
【００４６】
治療または予防されるアレルギー反応はアレルゲン源に依存する。すなわち、ピーナツに対するアレルギーは、ピーナツ由来のアレルゲンを使用することによって予防または治療することができ、一方、イネ科草本花粉に対するアレルギーは、イネ科草本花粉由来のアレルゲンで治療される。
【００４７】
本発明のさらなる一つの実施形態は、本発明の加水分解されたアレルゲンを含む医薬組成物である。さらに、前記医薬組成物は、以下の物質の１つ以上を含み得る：ヌクレオシド三リン酸；ヌクレオシド二リン酸；ヌクレオシド一リン酸；核酸；ペプチド核酸；ヌクレオシドまたはその類似体；免疫抑制性サイトカイン；免疫プロテアソームの発現を誘発する化合物；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３またはその類似体；リポ多糖類；エンドトキシン；熱ショックタンパク質；ＮＡＤＰＨチオレドキシンレダクターゼまたはＮＡＤＰチオレドキシンレダクターゼのいずれかとチオレドキシン；還元剤；ジチオトレイトール；サルブタノール（ｓａｌｂｕｔａｎｏｌ）などのアドレナリン受容体アゴニスト；ブトキサミン（ｂｕｔｏｘａｍｉｎｅ）などのアドレナリン受容体アンタゴニスト；接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を調節する化合物；Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン；ｙ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン（還元Ｌ−グルタチオン）；アルファ−２−マクログロブリン；Ｆｏｘｐ３遺伝子発現のための誘導因子；フラボノイド；イソフラボノイド；プテロカルパノイド；レスベラトールなどのスチルベン；タキキニン受容体アンタゴニスト；キマーゼ阻害剤；ＣｐＧのようなワクチンアジュバントまたは免疫調節薬；水酸化アルミニウム；リン酸カルシウム；ＴＬＲ−４アゴニスト（すなわち、ＭＰＬ）およびＴＬＲ−９アゴニストまたはザイモサンのような寛容原性アジュバント；ベータ−１，３−グルカン；調節性Ｔ細胞誘導因子；植物レクチンのような粒子を腸粘膜内層に付着させるための粘膜付着剤；亜鉛；亜鉛塩；多糖類；ビタミン；および表面結合抗体を提示する溶菌液または粒子。
【００４８】
一つの好ましい実施形態において、医薬組成物は、皮下投与、経鼻投与、経皮投与、リンパ内投与、経口投与のため、舌下薬物送達のため、または腸薬物送達のため、に調製される。
【００４９】
本発明のさらなる一つの実施形態は、本発明の方法によって得ることができる精製された加水分解アレルゲンである。
【００５０】
本発明のさらなる一つの実施形態は、アレルゲンタンパク質の沈殿および／または精製のための沈殿手段としてのトリクロロ酢酸の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるピーナツ粗抽出物のタンパク質プロフィール。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１〜５：分子量マーカー、レーン２：ランナー型の粗タンパク質抽出物（１３μｇ）、レーン３：バージニア型の粗タンパク質抽出物（１３μｇ）、レーン４：スパニッシュ型の粗タンパク質抽出物（１３μｇ）、レーン６：ピーナツミックスの粗タンパク質抽出物（１３μｇ）。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色を実施。アレルゲン：アレルゲン１：±６０ｋＤａ；アレルゲン２：±１７ｋＤａ；アレルゲン３：２つのサブユニット、±２０ｋＤａおよび±４０ｋＤａ；アレルゲン４：±３７ｋＤａ。
【図２】ＳＥＣ  Ｇ２５溶出プロフィール。カラム容積／試料容積比は７であった。樹脂を２Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で１０ｍｌ／分の流速にて平衡化した。溶出を２８０ｎｍでの吸光度によって追跡した。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製されたアレルゲン抽出物のタンパク質プロフィール。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製された変性抽出物（１３μｇ）。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色を実施した。アレルゲン１：±６０ｋＤａ；アレルゲン２：±１７ｋＤａ；アレルゲン３：２つのサブユニット±２０ｋＤａおよび±４０ｋＤａ；アレルゲン４：±３７ｋＤａ。
【図４】ＩｇＥウェスタンブロットによる免疫反応性。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製された変性抽出物（１３μｇ）。ＢＳＡ２％（ｗ／ｖ）によってブロッキングされた膜。１／５００に希釈した６つの患者血清のプール。１／１，０００に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＥペルオキシダーゼ複合体によって検出され、ＴＭＢ基質によって明らかにされたＩｇＥ結合。アレルゲン１：±６０ｋＤａ；アレルゲン２：±１７ｋＤａ；アレルゲン３：２つのサブユニット±２０ｋＤａおよび±４０ｋＤａ；アレルゲン４：±３７ｋＤａ。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる２回変性されたタンパク質の加水分解プロフィール。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１：分子量マーカー、レーン２：粗タンパク質抽出物（１３μｇ）、レーン３：変性アレルゲン混合物（１３μｇ）、レーン４：加水分解されたアレルゲン（２６μｇ）。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で実施された染色。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１回変性されたタンパク質の加水分解プロフィール。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１：分子量マーカー、レーン２：粗タンパク質抽出物（１３μｇ）、レーン３：１回変性されたタンパク質の加水分解物（２６μｇ）、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で実施した染色。
【図７】Ｇ５０ＳＥＣ溶出プロフィール。カラムを２Ｍ尿素、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５で１０ｍｌ／分の流速にて平衡化した。カラム容積／試料容積比は１０であった。溶出を２８０ｎｍでの吸光度によって追跡した。
【図８】精製前後のペプチドプロフィールの比較。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析を実施した。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１：分子量マーカー、レーン２：粗タンパク質抽出物（１３μｇ）、レーン３：変性アレルゲン混合物（１３μｇ）、レーン４：加水分解されたアレルゲン（２６μｇ）、レーン５：精製された加水分解物（２６μｇ）。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で実施された染色。
【図９】ＨＰＬＣ分析の校正曲線。１０μｌの、以下に示す標準（１ｍｇ／ｍｌ）をＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラムに注入した：シトクロムｃ（ＣｙｔｏＣｈｒｏｍ  ｃ）（１２ｋＤａ）、グルカゴン（３．５ｋＤａ）、１ｋＤａ合成ペプチド。
【図１０】サイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。カラム：ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００。溶出緩衝液：５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ｐＨ６．８。流速１ｍｌ／分。２１５ｎｍでの検出。１０μｌの試料を注入した。
【図１１】異なる精製工程での４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅにおけるチリダニタンパク質のプロフィール。レーン１：分子量マーカー；レーン２：デルマトファゴイデス  プテロニッシナス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）からの粗タンパク質抽出物；レーン３：ＴＣＡ沈殿後に得られるタンパク質プロフィール；レーン４：ＴＣＥＰでの第２の変性後に得られる精製された変性抽出物；レーン５：０．４Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシン／１００ｍｇで加水分解された変性タンパク質のプロフィール；レーン６：４Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシン／１００ｍｇで加水分解された変性タンパク質のプロフィール。レーン７：１６Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシン／１００ｍｇで加水分解された変性タンパク質のプロフィール。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で実施した染色。
【図１２】ピーナツペプチドの減少したアレルゲン性。ピーナツアレルゲンペプチドによるよりも、ピーナツインタクトアレルゲンの量を増加させてプレインキュベーションすることによって、ピーナツアレルゲンに対するピーナツアレルギードナーのプールされた血清からのＩｇＥの結合がより阻害された。
【図１３】ａ〜ｄ：不完全フロイントアジュバント（ｖ／ｖ）で乳化させたピーナツペプチド（Ｄ０、Ｄ３、Ｄ７で１ｍｇ／注射）で皮下免疫されたＬｅｗｉｓラットのＩｇＧ抗体応答のアイソタイププロフィール。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表す。
【図１４】ピーナツペプチドの投与量の増加（６．２５〜１００μｇ／ｍｌ）に応じた、ピーナツタンパク質（１００μｇ／注射）またはピーナツペプチド（４００μｇまたは１ｍｇ／注射）であらかじめ皮下免疫されたＬｅｗｉｓラットについての脾細胞増殖アッセイ。
【図１５】ピーナツタンパク質の投与量の増加（６．２５〜１００μｇ／ｍｌ）に応じた、ピーナツタンパク質（１００μｇ／注射）またはピーナツペプチド（４００μｇまたは１ｍｇ／注射）であらかじめ皮下免疫されたＬｅｗｉｓラットについての脾細胞増殖アッセイ。
【図１６】ブロッキング抗体活性の評価のための競合ＥＬＩＳＡ。ピーナツタンパク質をマイクロタイタープレート上にコーティングした。ピーナツアレルギーの患者のプールした血清を、ピーナツのペプチドまたはタンパク質のいずれかに対して生じたウサギ抗体の段階希釈物と混合した。インキュベーション後、プレートにコーティングしたピーナツタンパク質に結合するＩｇＥを、ペルオキシダーゼ抗体標識抗ヒトＩｇＥを使用して検出した。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。
実施例１：ピーナツアレルゲン
ピーナツアレルゲンの抽出
３つのピーナツ型のミックス（アラキス  ハイポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）種ランナー、バージニアおよびスパニッシュの皮を剥き、粉砕し、混合した。２％（ｗ／ｖ）のピーナツミックスをリン酸ナトリウム（１２．５ｍＭ）に添加し、撹拌下で室温にて１時間インキュベートした。次いで、セライトを２％（ｗ／ｖ）で添加し、０．４５μｍフィルターを通過させることによって、溶液を清澄化および濾過した。この試料は粗タンパク質抽出物を構成する。
【００５３】
ピーナツアレルギーの患者血清を使用して、粗タンパク質抽出物中のアレルゲンの存在をウェスタンブロットによって分析した。
【００５４】
図１で示されるように、粗タンパク質抽出物中には４つの主なアレルゲン（アレルゲン１、アレルゲン２、アレルゲン３およびアレルゲン４）がある。
【００５５】
ピーナツアレルゲンタンパク質の精製
アレルゲン抽出物を以下によって精製した。
・トリクロロ酢酸沈殿
この工程は室温（２０〜２５℃）で実施した。
１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を生成物に撹拌下で添加した。次いで、沈殿した抽出物を１５分間１０，０００ｇで遠心分離した。上清を慎重に捨てた。
・第１の変性
ペレットを２５ｍｇ／ｍｌで８Ｍの尿素中に再懸濁させ、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および８０ｍＭのＤＴＴを添加した。溶液を３７℃で１時間インキュベートした。
・Ｇ２５樹脂カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからのｆｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ）におけるサイズ排除クロマトグラフィー
精製された変性抽出物を直ちにカラムにロードし、タンパク質を２Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で溶出させた。
【００５６】
タンパク質の存在を２８０ｎｍでの吸光度によって追跡した。関心対象の画分をプールして、純化した変性抽出物を構成した。
【００５７】
図２は、２８０ｎｍでの吸光度によって追跡したＳＥＣ  Ｇ２５溶出プロフィールを示す。
【００５８】
純化した変性抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、およびピーナツアレルギーの患者血清を使用するウェスタンブロッティングによって、さらに分析した。
【００５９】
図３で示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抽出物中で視覚化された４つの主なアレルゲン（図１を参照のこと）は、精製された変性抽出物中に存在する。
【００６０】
図４は、全てのタンパク質、特に４つの主なアレルゲンがピーナツアレルギーの患者血清により認められ、また抗ヒトＩｇＥ抗体で視覚化されたことを示す。
【００６１】
第２の変性：
８Ｍの尿素および４０ｍＭのＴＣＥＰを純化した変性抽出物に添加した。次いで、ｐＨを２．５に調節した。溶液を３７℃で１時間インキュベートした。
【００６２】
変性ピーナツアレルゲンの加水分解
以下のプロトコルを使用して変性アレルゲンを加水分解した。
変性アレルゲン混合物を１０ｍＭのＨＣｌで４倍に希釈し、６ＮのＨＣｌでｐＨ２．０に酸性化した。タンパク質加水分解を１００ｍｇのタンパク質について１６Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシンで３７℃にて２時間実施した。次いでＮａＯＨ溶液でｐＨを１０．０まで上昇させることによって加水分解を停止させた。
【００６３】
図５は、粗タンパク質抽出物（レーン２）、変性アレルゲン混合物（レーン３）および加水分解されたアレルゲン（レーン４）間の比較を示す。１０ｋＤａの上に、唯一の残留ペプチドバンドがプロフィールで可視化されるため、２回変性されたタンパク質はほぼ完全に加水分解されることが理解できる。
【００６４】
それと比較して、図６、特にレーン３は、１回変性されたタンパク質の場合を示す。３つの残存するタンパク質は、対応する加水分解物のプロフィールにおいて可視化される。タンパク質が１回だけ変性される場合、加水分解は効率的ではないため、これはダブル変性の利点を示している。
【００６５】
加水分解されたピーナツアレルゲンの精製
ＭＷ≧１０，０００ＤａおよびＭＷ≦１，０００Ｄａを有するペプチドを除去するために、加水分解されたアレルゲンを以下によって精製した：
・Ｇ５０樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからのｆｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ）によるサイズ排除クロマトグラフィー。ｐＨを上昇させた後、加水分解されたアレルゲンを迅速にＧ５０カラムにロードした。ペプチドを２Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５で溶出させた。溶出は２８０ｎｍでの吸光度で追跡した。ペプチド（ＭＷ≦１０ｋＤａ）を含む画分を、図７に示すようにプールした。
・１ｋＤａ膜（ＰＡＬＬからの限外ろ過カセットＯｍｅｇａ  ＰＥＳ）によるダイアフィルトレーション。ペプチドを２５倍に濃縮し、１０容積の５０ｍＭのリン酸ナトリウムに対してｐＨ７．６でダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅｄ）し、最終的に２倍濃縮した。この試料は精製された加水分解物を構成する。
【００６６】
精製された加水分解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図８を参照のこと）。プロフィール（レーン５）は、１０ｋＤａを超える分子量を有する残留タンパク質が無いことを示している。
【００６７】
精製の効率はサイズ排除ＨＰＬＣによって制御した。ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラムを５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、ｐＨ６．８で１ｍｌ／分の流速にて平衡化した。ペプチドは２１５ｎｍで検出された。
【００６８】
１０ｋＤａおよび１ｋＤａの極限（ｌｉｍｉｔｓ）を図９に例示される較正曲線から算出した。
【００６９】
図１０に示されるように、１，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの間の分子量を有するペプチドは精製された加水分解物中の全ペプチドの約８０％を示す。
【００７０】
実施例２：チリダニ、デルマトファゴイデス  プテロニッシナスからのアレルゲン
チリダニのタンパク質抽出
チリダニからのタンパク質を、撹拌下、リン酸塩緩衝生理食塩水ｐＨ７．４中で１時間室温にてインキュベーションすることによって抽出した。セライトを２％（ｗ／ｖ）で添加し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターを通過させることによって、溶液を清澄化し、ろ過した。この試料は粗タンパク質抽出物を構成する。
【００７１】
粗タンパク質抽出物は、それらの分子量（それぞれ２５ｋＤａおよび１４ｋＤａ）に従って局在化可能である、主要なアレルゲン（Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｐ２）を示すようである。
【００７２】
チリダニからのアレルゲンタンパク質の精製
精製は以下によって実施した：
・トリクロロ酢酸沈殿
１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を、室温にて５分間撹拌下粗タンパク質抽出物に添加した。タンパク質を２０分間１０，０００ｇでの遠心分離によって集めた。
・第１の変性
上清を除去した後、ペレットを８Ｍ尿素、０．１ＭＴｒｉｓｐＨ７〜８中に再懸濁させた。ｐＨを７．５に調節し、８０ｍＭのＤＴＴを添加した後、溶液を３７℃にて１時間インキュベートした。
・Ｇ２５樹脂カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィー
変性抽出物由来のタンパク質をカラムにロードし、２Ｍの尿素、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．０で溶出させた。
２８０ｎｍでの吸光度の測定によって、タンパク質の存在をモニターした。
・第２の変性
３７℃で１時間、４Ｍの尿素、０．１ＭのＮａＣｌおよびｐＨを２．５に調節した４０ｍＭのＴＣＥＰ中でのインキュベーションによって変性が起こった。
【００７３】
チリダニについての変性アレルゲンの加水分解
変性タンパク質混合物をあらかじめ１０ｍＭのＨＣｌで２倍に希釈し、６ＮのＨＣｌでｐＨ２．０に酸性化した。タンパク質の加水分解を１００ｍｇあたり１６Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシンで１時間、３７℃にて実施した。
【００７４】
図１１は、精製の異なる工程での４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅにおけるチリダニタンパク質のプロフィールを示す。
レーン１：分子量マーカー；
レーン２：デルマトファゴイデス  プテロニッシナスからの粗タンパク質抽出物；
レーン３：ＴＣＡ沈殿後に得られたタンパク質プロフィール；
レーン４：ＴＣＥＰでの第２の変性後に得られた精製された変性抽出物；
レーン５：０．４Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシン／１００ｍｇで加水分解された変性タンパク質のプロフィール；
レーン６：４Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシン／１００ｍｇで加水分解された変性タンパク質のプロフィール。
レーン７：１６Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシン／１００ｍｇで加水分解された変性タンパク質のプロフィール。染色はクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で実施。
【００７５】
実施例３：
実施例２と同様の方法で、イネ科草本およびカバノキ花粉の加水分解されたアレルゲンを製造した。
【００７６】
実施例４：ピーナツペプチド：特異抗体のアレルゲン性、免疫原性およびブロッキングの可能性
・ピーナツペプチドのアレルゲン性を、ＥＬＩＳＡ阻害アッセイによる、インビトロＩｇＥ−結合特性の分析によって調査した。
・ラット免疫後に、Ｔ細胞増殖、特異的ＩｇＧ力価を使用して、免疫原性を扱った（ａｄｄｒｅｓｓ）。
・ピーナツペプチドに対して生じた抗体のブロッキング活性を競合ＥＬＩＳＡによって評価した。
【００７７】
ピーナツペプチドのアレルゲン性：アレルギー患者の血清からのＩｇＥの結合の減少
ピーナツペプチドは、ＥＬＩＳＡ阻害アッセイによって示されるように、インビトロで減少したアレルゲン性を示す。
【００７８】
ＥＬＩＳＡ阻害アッセイの原理は、ピーナツ由来のペプチドまたはタンパク質の量を増加させて、あらかじめインキュベートしたアレルギー患者の血清由来のＩｇＥのピーナツタンパク質への結合の減少を測定することであった。
【００７９】
Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中０．８μｇ／ｍｌのピーナツタンパク質で、４℃にて一晩コーティングした。３７℃で１時間ブロッキングした後、ピーナツタンパク質（範囲：１．２５μｇ／ｍｌ〜６３．５ｐｇ／ｍｌ）またはピーナツペプチド（範囲：５０μｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ）の段階希釈物であらかじめ処理（３７℃で１時間）されたピーナツアレルギーの患者の血清プール（１／５０希釈）の１００μｌ混合物とともにウェルを４℃にて一晩インキュベートした。洗浄後、ウェルをペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体とともにインキュベートし、１００μｌのＴＭＢＳ基質とともにインキュベートすることによって展開させた。１００μｌの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で反応を停止させ、光学密度値を４５０〜６５０ｎｍで測定した。
【００８０】
ピーナツペプチドまたはピーナツタンパク質の存在下でのプレインキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害のパーセントを以下のようにして算出した：
％阻害＝１００−［［阻害された試料のＯＤ／ポジティブコントロールの平均ＯＤ］×１００］
【００８１】
ポジティブコントロールは、５０μｌのウサギ免疫前血清と混合された、５０μｌの１／２５希釈されたプールされたヒト血清であった（ｎ＝１０）。
【００８２】
図１２は、ピーナツペプチドのアレルゲン性の減少を示す。ピーナツアレルゲンに対するピーナツアレルギードナーのプールされた血清からのＩｇＥの結合は、ピーナツペプチドによるよりも、ピーナツタンパク質の量を増加させてプレインキュベーションすることによって、より阻害された。
【００８３】
ピーナツペプチドの免疫原性：ラットにおける特異抗体の誘導
ピーナツペプチドは液性免疫応答を引き起こすことが可能である。
【００８４】
不完全フロイントアジュバント中で乳化させたピーナツペプチドで３回皮下免疫したラットは、顕著なレベルのＩｇＧを産生する。ピーナツペプチドの混合物はＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂを誘導した。
【００８５】
０、３および７日（Ｄ０、Ｄ３、Ｄ７）で、不完全フロイントアジュバントを含むエマルジョン（ｖ／ｖ）として皮下投与された１ｍｇのピーナツペプチドで４匹の７週齢のメスラット群を免疫した。
【００８６】
Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中２μｇ／ｍｌのピーナツタンパク質で、４℃にて一晩コーティングした。３７℃で１時間ブロッキングした後、１００μｌの処理されたラットの血清の段階希釈物（１／２００〜１／４３７，４００希釈）とともに、ウェルを３７℃で１時間インキュベートした。結合ラットＩｇＧは、１／２０，０００希釈ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧで検出された。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂは、それぞれ１／１，５００、１／５００および１／５００希釈のビオチン標識抗体で検出された。ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン（１／２００）とともにインキュベーションした後、１００μｌのＴＭＢＳ基質を添加することによって呈色反応を開始させた。１００μｌの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で反応を停止させ、光学密度値を４５０〜６５０ｎｍで測定した。
【００８７】
結果を力価として表した。力価は、０．３の吸光度をもたらすラット抗血清の最大希釈として定義された。
【００８８】
図１３ａ〜ｄは、不完全フロイントアジュバント（ｖ／ｖ）で乳化させたピーナツペプチド（Ｄ０、Ｄ３、Ｄ７で１ｍｇ／注射）で皮下免疫したＬｅｗｉｓラットのＩｇＧ抗体応答のアイソタイププロフィールを示す。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表す。
【００８９】
ピーナツペプチドの免疫原性：細胞免疫応答の刺激
ピーナツペプチドは、ピーナツペプチドまたはピーナツタンパク質であらかじめ免疫されたラットの脾臓から単離されたＴ細胞の増殖を引き起こすことが可能である。
【００９０】
チミジン取り込みに基づいた細胞増殖アッセイを用いることによって、ピーナツペプチドを、精製ピーナツタンパク質と、Ｔリンパ球を刺激する能力について比較した。
【００９１】
７週齢のメスＬｅｗｉｓラットに関して調査を実施した。
【００９２】
Ｄ０、Ｄ３およびＤ７で、４匹のラットをミョウバン（ｖ／ｖ）と混合した１００μｇのピーナツタンパク質で腹腔内免疫した。４匹のラットに、４００μｇまたは１ｍｇのピーナツペプチドを、不完全フロイントアジュバントを含むエマルジョン（ｖ／ｖ）として皮下投与して処理した。
【００９３】
Ｄ２１に、動物を屠殺し、脾細胞を抜き取った。１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清、１％の非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸塩、５０μΜのβ−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１ｍＭのＨＥＰＥＳを補ったＲＰＭＩ１６４０（完全培地）中で細胞を培養した。
【００９４】
細胞を完全培地中２×１０６／ｍｌの密度で播種した。また、抗原も完全培地中で、次の濃度にて使用した：１００、５０、２５、１２．５、６．２５μｇ／ｍｌ。全ての培養は、加湿インキュベーターにおいて、５％ＣＯ２中で３７℃にて実施された。増殖アッセイは、９６ウェル丸底プレートにおいて、３連で（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）、４日間実施された。ここで、細胞は、７２時間の時点で０．５μＣｉの［３Ｈ］−チミジン／ウェルでパルスがかけられ、１２〜１６時間後に回収し、β−放射活性についてカウントした。
【００９５】
結果を次のようにして計算される増殖指数として表した：
・培地単独（非刺激細胞）中で培養した細胞を０％の増殖とみなした。
・増殖指数＝Ｃｐｍ試験ウェル（３連の平均）／培地で処理された細胞のｃｐｍ（３連の平均）。
【００９６】
図１４は、ピーナツペプチドの投与量の増加（６．２５〜１００μｇ／ｍｌ）に応じた、ピーナツタンパク質（１００μｇ／注射）またはピーナツペプチド（４００μｇまたは１ｍｇ／注射）であらかじめ免疫されたＬｅｗｉｓラットについての脾細胞増殖アッセイを示す。
【００９７】
結果を３連の刺激指数の平均±ＳＤとして表す。
【００９８】
図１４に示されるように、ピーナツペプチドは、ピーナツタンパク質であらかじめ免疫されたラットからのＴ細胞の増殖を誘導することが可能であった。さらに、培養培地中どのようなピーナツペプチド濃度であっても、不完全フロイントアジュバントの存在下、ピーナツペプチドでラットをあらかじめ皮下免疫した場合、Ｔ細胞増殖は高かった。
【００９９】
ピーナツペプチドの各投与量について、未処理ラットでは関連する増殖を何ら示さなかった。
【０１００】
図１５は、ピーナツタンパク質の投与量の増加（６．２５〜１００μｇ／ｍｌ）に応じた、ピーナツタンパク質（１００μｇ／注射）またはピーナツペプチド（４００μｇまたは１ｍｇ／注射）であらかじめ免疫したＬｅｗｉｓラットについての脾細胞増殖アッセイを示す。
【０１０１】
図１５は、精製されたピーナツタンパク質の投与量を増加させることによるＴ細胞の増殖を示す。ピーナツタンパク質免疫化ラットからのＴ細胞と比較して低いレベルにも関わらず、精製されたピーナツタンパク質は、皮下投与されたピーナツペプチドで免疫されたラットからのＴ細胞に対する特異的免疫応答も引き起こす。
【０１０２】
未処理ラットは、培養培地中のいかなるピーナツタンパク質濃度にも、関連する増殖を何ら示さなかった。
【０１０３】
結果は、３連の刺激指数の平均±ＳＤとして表す。
【０１０４】
これらの結果は、ピーナツペプチドが、免疫動物において特異的免疫応答を刺激することが可能な、Ｔ細胞エピトープの存在と関連する生物学的活性を保つことを示した。
【０１０５】
ピーナツペプチドに対して生成した抗体のブロッキングの可能性
ピーナツペプチドでウサギを免疫することによって誘導される免疫グロブリンは、タンパク質アレルゲンに対する患者のＩｇＥ結合を阻害する。
【０１０６】
ウサギ抗ピーナツペプチドおよび抗ピーナツタンパク質がピーナツアレルギーの患者のＩｇＥ抗体のアレルゲンとの結合を阻害する能力を、ＥＬＩＳＡ競合実験によって調査した。
【０１０７】
０．８μｇ／ｍｌのピーナツタンパク質で３７℃にて２時間コーティングされたＥＬＩＳＡ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、ピーナツペプチドまたはピーナツタンパク質に対するウサギ抗血清の段階２倍希釈物（１／２から１／１０２４最終希釈まで）とともに１／５０希釈（最終希釈）のプールしたヒト血清の存在下でインキュベートした（ｖ／ｖ）。４℃で一晩インキュベーションした後、結合ＩｇＥ抗体を１／８，０００希釈ペルオキシダーゼ−結合ポリクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体で検出した。結合ＩｇＥに相当する光学密度値を４５０〜６５０ｎｍで測定した。ウサギ由来の血清（抗ピーナツペプチドまたは抗ピーナツタンパク質）の存在下でのプレインキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害パーセントを次のようにして計算した：
％阻害＝１００−［［阻害された試料のＯＤ／ポジティブコントロールの平均ＯＤ］×１００］
【０１０８】
ポジティブコントロールは、５０μｌのウサギ免疫前血清と混合された、１／２５希釈の５０μｌのプールしたヒト血清であった（ｎ＝１０）。
【０１０９】
図１６は、ブロッキング抗体活性の評価のための競合ＥＬＩＳＡを示す。ピーナツタンパク質をマイクロタイタープレートにコーティングした。ピーナツアレルギーの患者のプールした血清をピーナツのペプチドまたはタンパク質のいずれかに対して生じたウサギ抗体の段階希釈物と混合した。インキュベーション後、プレートにコーティングされたピーナツタンパク質と結合するＩｇＥを、ペルオキシダーゼ抗体標識抗ヒトＩｇＥを使用して検出した。
【０１１０】
結論として、本発明によって得られたピーナツペプチドは、アレルギー免疫療法での使用に有益な特性を示す。実際に、それらはアレルゲン性が減少したが、Ｔ細胞反応性は保存されることを特徴とする。さらに、アレルゲン由来ペプチドは、動物において免疫応答を誘導することが可能であり、アレルゲンへのヒトＩｇＥ結合において、ブロッキングの可能性を有するＩｇＧ抗体を生成させることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月6日(2017.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アレルゲンタンパク質を含むアレルゲン源を抽出して、抽出物を形成する工程、
ｂ）前記抽出物を精製して、非タンパク質成分を除去し、精製された抽出物を形成する工程であって、前記精製は沈殿工程を含み、前記沈殿工程がトリクロロ酢酸を含有する溶液によって行われる工程、
ｃ）前記精製された抽出物を第１の変性剤で変性させて、精製された変性抽出物を形成する工程であって、前記変性がカオトロピック剤および還元剤の混合物を用いて行われる工程、
ｄ）前記精製された変性抽出物を純化して、不純物を除去し、純化した変性抽出物を形成する工程であって、前記純化がサイズ排除クロマトグラフィー工程を含む工程、
ｅ）前記純化した変性抽出物を第２の変性剤で変性させて、変性したアレルゲン混合物を形成する工程であって、前記第２の変性剤がカオトロピック剤および還元剤の混合物を含み、前記還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である工程、
ｆ）前記変性したアレルゲン混合物を加水分解して、加水分解されたアレルゲンを形成する工程であって、前記加水分解が酵素を用いてカオトロピック試薬および還元剤の存在下で行われる工程、および、
ｇ）前記加水分解したアレルゲンを精製して、１０，０００Ｄａを超える分子量を有するペプチドおよび１，０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドを除去する工程であって、前記精製後の加水分解されたアレルゲンにおけるペプチドの７０％以上が１，０００Ｄａから１０，０００Ｄａの間であり、ペプチドの除去がサイズ排除クロマトグラフィーおよび／または限外ろ過によって行われる工程、
を含む、ａ）〜ｇ）の工程はａ）〜ｇ）の順序で行われる、アレルゲンから加水分解されたアレルゲンを製造するための方法。
【請求項２】
前記抽出が、塩を含まない溶液中、または炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳから選択される塩を含む溶液中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記精製および／または純化が、イオン交換クロマトグラフィー工程、ゲル濾過もしくはサイズ排除クロマトグラフィー工程、沈殿工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、偽アフィニティーもしくはアフィニティークロマトグラフィー工程またはダイアフィルトレーション工程のうちの１つ以上を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
変性が、尿素、塩化グアニジニウム、ジチオトレイトール、チオグリセロール、β−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）から選択される変性剤の混合物を用いて、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記尿素の濃度が４Ｍ超、および／または塩化グアニジニウムの濃度が３Ｍ超である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記加水分解が、ペプシン、トリプシン、またはキモトリプシンを用いて実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記加水分解が、尿素および塩化グアニジンから選択されるカオトロピック剤と、還元剤であるＴＣＥＰと、の存在下で実施される、請求項１〜６のうちの１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サイズ排除クロマトグラフィーがカオトロピック剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記カオトロピック剤が、尿素、塩化グアニジニウム、エチレングリコール、イソプロパノール、およびそれらの混合物のうちから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アレルゲン源が、ピーナツおよび／または遺伝子組み換えピーナツである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ピーナツが、アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ）属の中から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項の方法によって得ることができる加水分解されたアレルゲン。
【請求項１３】
請求項１２に記載の加水分解されたアレルゲンを含む、寛容および脱感作を誘発させるための、医薬組成物および／または食品組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の加水分解されたアレルゲンを含む、アレルギー反応の治療または予防のための、医薬組成物および／または食品組成物。
【請求項１５】
請求項１２に記載の加水分解されたアレルゲンを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
ヌクレオシド三リン酸；ヌクレオシド二リン酸；ヌクレオシド一リン酸；核酸；ペプチド核酸；ヌクレオシドまたはその類似体（ａｎａｌｏｇｓ）；免疫抑制性サイトカイン；免疫プロテアソームの発現を誘発する化合物；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３またはその類似体；リポ多糖類；エンドトキシン、熱ショックタンパク質；ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼのいずれかとチオレドキシン；還元剤；ジチオトレイトール；アドレナリン受容体アゴニスト；アドレナリン受容体アンタゴニスト；接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を調節する化合物；Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン；ｙ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン（還元Ｌ−グルタチオン）；アルファ−２−マクログロブリン；Ｆｏｘｐ３遺伝子発現のための誘導因子；フラボノイド；イソフラボノイド；プテロカルパノイド；スチルベン；タキキニン受容体アンタゴニスト；キマーゼ阻害剤；ワクチンアジュバントまたは免疫調節薬；水酸化アルミニウム；リン酸カルシウム；ＴＬＲ−４アゴニスト（すなわち、ＭＰＬ）およびＴＬＲ−９アゴニストまたは寛容原性アジュバント；ベータ−１，３−グルカン；調節性Ｔ細胞インデューサー；粒子を腸粘膜内層へ付着させるための粘膜付着剤；亜鉛；亜鉛塩；多糖類；ビタミン；および表面結合抗体を提示する溶菌液または粒子、からなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
経口、皮下、経鼻、経皮またはリンパ内投与のための、舌下薬物送達のための、腸薬物送達のための、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。