(57)【要約】【課題】クロストリジウム類に属するヒト由来細菌種が、大腸で制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）集積を誘導し免疫機能を抑制することが明らかになった。【解決手段】これらの細菌を含有する医薬組成物を用いて、自己免疫疾患などの免疫介在性疾患を予防および治療することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する組成物であって、
（ａ）１種類以上のクロストリジウム類の細菌；
（ｂ）（ａ）の１種類以上の細菌の培養上清；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に由来する１種類以上の生理活性物質；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちのいずれか２つもしくは３つの組合せ
を含む組成物。
【請求項２】
前記（ａ）の１種類以上の細菌が、クロストリジウムクラスターＩＶおよびクロストリジウムクラスターＸＩＶａに属するヒト由来共生細菌（種）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記（ａ）の１種類以上の細菌が、クロストリジウムクラスターＸＩＶａに属する１種類以上のヒト由来共生細菌（種）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）が、クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
（ａ）が、クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、ブラウティア・ココイデス（Bliautia coccoides）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.)３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する組成物であって、
有効成分として、
（ａ）本明細書においてＯＴＵ１３６；ＯＴＵ４６；ＯＴＵ２２１；ＯＴＵ９；ＯＴＵ２９６；ＯＴＵ２１；ＯＴＵ１６６；ＯＴＵ７３；ＯＴＵ１７４；ＯＴＵ１４；ＯＴＵ５５；ＯＴＵ３３７；ＯＴＵ３１４；ＯＴＵ１９５；ＯＴＵ３０６；ＯＴＵ８７；ＯＴＵ８６；ＯＴＵ１５２；ＯＴＵ２５３；ＯＴＵ２５９；ＯＴＵ２８１；ＯＴＵ２８８；ＯＴＵ３３４；ＯＴＵ３５９；ＯＴＵ３６２；もしくはＯＴＵ３６７と命名されるＤＮＡ配列と少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡと、クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２のうちの１種類以上のＤＮＡと少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡとを含む細菌；
（ｂ）（ａ）の１種類以上の細菌の培養上清；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に由来する１種類以上の生理活性物質；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちのいずれか２つもしくは３つの組合せ
を含む組成物。
【請求項７】
前記相同性のパーセントが少なくとも９７％である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する組成物であって、
（ａ）クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２；
（ｂ）（ａ）の１種類以上の細菌の培養上清；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に由来する１種類以上の生理活性物質；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちのいずれか２つもしくは３つの組合せ
からなる群より選択される少なくとも２種類の生物体および／または物質を含む組成物。
【請求項９】
制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する組成物であって、配列番号１９〜４４のいずれかと少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む細菌に由来する少なくとも１種類の生理活性物質を有効成分として含む組成物。
【請求項１０】
前記制御性Ｔ細胞が、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞、ＩＬ−１０産生性の制御性Ｔ細胞、またはＨｅｌｉｏｓ陰性Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
免疫抑制作用を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物と薬学的に許容される成分とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
必要とする個体において制御性Ｔ細胞の増殖、集積または増殖と集積の両方を誘導する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物または請求項１２に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項１４】
必要とする個体において制御性Ｔ細胞の増殖、集積または増殖と集積の両方を誘導する方法であって、
（ａ）配列番号１９〜４４のいずれかと少なくとも９７％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む少なくとも１種類の細菌；
（ｂ）配列番号１９〜４４のいずれかと少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む細菌に由来する少なくとも１種類の生理活性物質；ならびに
（ｃ）クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２のいずれか１つの培養上清
からなる群より選択される少なくとも１種類の生物体または物質を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項１５】
前記個体にアーモンド皮、イヌリン、オリゴフルクトース、ラフィノース、ラクチュロース、ペクチン、ヘミセルロース、アミロペクチン、アセチル−ＣｏＡ、ビオチン、ビート糖蜜、酵母抽出物、難消化性デンプン、コルチコステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニゾン、メトトレキサート、抗ヒスタミン剤、グルココルチコイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、抗ロイコトリエン剤、抗コリン鼻炎薬、抗コリン充血除去剤、肥満細胞安定化剤、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体、ワクチン、抗ＴＮＦ阻害剤、およびその組合せからなる群より選択される物質を投与することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｇｒａｍ＋抗生物質による治療を受けている個体において制御性Ｔ細胞のレベルを増大させる方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物または請求項１２に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項１７】
Ｆｏｐ３Ｔｒｅｇの発現、ＩＬ−１０発現の促進、ＣＴＬＡ４発現の促進、ＩＤＯ発現の促進、およびＩＬ−４発現の抑制からなる群より選択される１つの測定結果を、前記個体において制御性Ｔ細胞の増殖または集積が誘導されたことの指標として用いる、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
必要とする個体において、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、および感染症から選択される少なくとも１つの疾患を治療する、その疾患の治療を補助する、その疾患の重症度を軽減する、またはその疾患を予防する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物また請求項１２に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物また請求項１２に記載の医薬組成物による治療の対象となる個体を選択する方法であって、
（ａ）個体から糞便試料または大腸生検などの（少なくとも１つの）試料を採取すること；
（ｂ）前記個体の試料におけるクロストリジウムクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属する細菌種の割合または絶対数を測定し、前記個体についての測定値を得ること；
（ｃ）（ｂ）の測定値と、健常個体の試料から得られた対応する測定値とを比較すること；および
（ｄ）（ｂ）で得られた測定値が健常個体の試料から得られた測定値よりも小さい場合、前記個体を請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物また請求項１２に記載の医薬組成物による治療の対象に選択すること
を含む方法。
【請求項２０】
制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する細菌を選択する方法であって、
（ａ）哺乳動物から採取した糞便または生検試料から細菌芽胞形成画分を単離すること；
（ｂ）単離した前記芽胞形成画分の段階希釈物をプレートに播くこと；および
（ｃ）培養プレートから単一のコロニーを選択すること
を含む方法。
【請求項２１】
例えば請求項１９に記載の方法に従って選択された対象において、治療または予防に使用する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１３〜１８のいずれか１項で定義される方法において使用する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１３〜１８のいずれか１項で定義される方法において使用する薬物の製造のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する細菌培養物を作製する工程であって、
（ａ）哺乳動物から採取した糞便または生検試料から細菌芽胞形成画分を単離すること；
（ｂ）単離した前記芽胞形成画分の段階希釈物をプレートに播くこと；
（ｃ）制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する能力の指標としてＦｏｐ３Ｔｒｅｇの発現、ＩＬ−１０発現の促進、ＣＴＬＡ４発現の促進、ＩＤＯ発現の促進、および／またはＩＬ−４発現の抑制のうちの１つ以上を測定することによって、制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する単一のコロニーを培養プレートから選択すること；および
（ｅ）前記選択したコロニーを培養すること
を含む工程。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法または請求項２４に記載の工程によって入手可能な、または入手した細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載する発明の内容は、制御性Ｔ細胞の増殖、集積または増殖と集積を誘導し、有効成分として（ａ）クロストリジウム類に属する１種類以上（１種類、少なくとも１種類）のヒト由来細菌、（ｂ）１種類以上（１種類、少なくとも１種類）の該細菌の培養上清、（ｃ）１種類以上の該細菌に由来する生理活性物質または（ｄ）上記のいずれか２つ以上の組合せを含む、ヒト由来細菌の組成物に関する。本明細書に記載する発明の内容はほかにも、制御性Ｔ細胞の増殖、集積または増殖と集積を誘導する方法に関する。上の（ａ）〜（ｄ）のいずれかを含む組成物を細菌組成物と呼ぶ。さらに、本発明の内容は、必要とする個体に細菌組成物を投与することによって、制御性Ｔ細胞誘導に応答性の少なくとも１つの疾患または病態、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患および感染症などを治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の消化管には何百種もの共生微生物が定着し、宿主免疫系と相互作用している。無菌（ＧＦ）動物を用いた研究から、共生微生物はパイエル板（ＰＰ）および孤立リンパ濾胞（ＩＬＦ）の組織形成、上皮からの抗菌性ペプチドの分泌、ならびに粘膜組織における免疫グロブリンＡ産生形質細胞、上皮間リンパ球、ＩＬ−１７産生ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ１７）およびＩＬ−２２産生ＮＫ様細胞を含む固有のリンパ球の集積など、粘膜免疫系の発達に影響を及ぼすことが示されている（非特許文献（ＮＰＬ）１〜７）。その結果、腸内細菌の存在が粘膜防御機能を増強し、宿主が体内に侵入してくる病原性微生物に対して強い免疫応答を備えることができる。一方、粘膜免疫系は、食物抗原および無害な微生物に対する無反応性を維持している（非特許文献３）。共生細菌と免疫系のクロストークの調節異常（腸内菌共生バランス失調）により、環境抗原に対する過度に強力な免疫応答が引き起こされ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が生じ得る（ＮＰＬ８〜１０）。
【０００３】
最近の研究成果から、個々の共生細菌が粘膜免疫系における特定の免疫細胞分化を制御していることが明らかになっている。例えば、ヒトの共生細菌、Bacteroides fragilisは、マウスにおいて特異的に全身性Ｔｈ１細胞応答および粘膜ＩＬ−１０産生Ｔ細胞応答を誘導し、病原体を原因とする大腸炎から宿主を保護する役割を果たしている（ＮＰＬ３）。マウスの腸内共生細菌である分節した糸状菌は粘膜Ｔｈ１７細胞応答を誘導し、宿主の消化管病原体感染に対する抵抗性を増強する（ＮＰＬ１１〜１３）。さらに、いくつかの共生細菌に由来する短鎖脂肪酸が腸炎を抑制することが知られている（ＮＰＬ１４）。また、腸内微生物叢の一部の種の存在が、免疫系の恒常性維持を助ける制御性Ｔ細胞（以下、「Ｔｒｅｇ細胞」と称する）の分化に多大な影響を及ぼすことが観察されている。Ｔｒｅｇを強力に刺激することができる特定種のマウス共生細菌が確認されているが（ＮＰＬ１５）、ヒト共生細菌種がヒト免疫系に同等の影響を及ぼすかどうかは未だ明らかにされていない。さらに、ヒト腸管には細菌が１，０００種を超えて常在し、その多くがこれまで培養されたことがない（ＮＰＬ１６）。Ｔｒｅｇに影響を及ぼす可能性がある細菌が存在するとしても、その種を経験的に推測するのは不可能である。
【０００４】
ヒトでの使用に有益な免疫機能を有する薬物、栄養補助食品、または食品を開発するためには、ヒトにおいて自然に定着し、免疫調節特性を有する共生微生物を同定するのが望ましい。さらに、ヒトミクロビオームの共生生物の多くが未だ培養されていないため、これを従来の工業的発酵工程で生産し、次いで医薬品または食品製剤に組み入れることができるよう、それらを培養する方法を開発する必要がある。
【０００５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫を抑制する細胞サブセットとして同定された制御性Ｔ細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は免疫学的恒常性を維持するのに重要な役割を果たしていることが知られており、この細胞には転写因子Ｆｏｘｐ３が発現する（ＮＰＬ８、９、１７および１８）。大腸にはＦｏｘｐ３発現細胞が多数存在し、大腸に局在するＴｒｅｇ細胞のみが免疫抑制サイトカインのＩＬ−１０を高レベルで恒常的に発現する（ＮＰＬ１９）。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞からＩＬ−１０が特異的に除去された動物には炎症性腸疾患が発症する（ＮＰＬ２０）。
したがって、Ｔｒｅｇ細胞の大腸における高レベルでのＩＬ−１０産生を強力に誘導する能力を有するヒト由来共生細菌種を同定し、このような細菌種を培養する方法を開発することが必要とされる。このような種を用いれば、免疫抑制を増強することが可能となり、ひいては、疾患および病態のなかでも炎症性腸疾患、炎症性疾患、アレルギーなどの自己免疫疾患の治療または臓器移植に応用することが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J.J.Cebra、"Am J Clin Nutr"、１９９９年５月、６９、１０４６Ｓ
【非特許文献２】A.J.Macpherson、N.L.Harris、"Nat Rev Immunol"、２００４年６月、４、４７８
【非特許文献３】J.L.Round、S.K.Mazmanian、"Nat Rev Immunol"、２００９年５月、９、３１３
【非特許文献４】D.Bouskraら、"Nature"、２００８年１１月２７日、４５６、５０７
【非特許文献５】K.Atarashiら、"Nature"、２００８年１０月９日、４５５、８０８
【非特許文献６】Ivanov,IIら、"Cell Host Microbe"、２００８年１０月１６日、４、３３７
【非特許文献７】S.L.Sanosら、"Nat Immunol"、２００９年１月、１０、８３
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【非特許文献１６】J.Quinら、"Nature"、２０１０年３月４日、４６４、５９
【非特許文献１７】L.F.Lu、A.Rudensky、"Genes Dev"、２００９年６月１日、２３、１２７０
【非特許文献１８】S.Sakaguchi、T.Yamaguchi、T.Nomura、M.Ono、"Cell"、２００８年５月３０日、１３３、７７５
【非特許文献１９】C.L.Maynardら、"Nat Immunol"、２００７年９月、８、９３１
【非特許文献２０】Y.P.Rubtsovら、"Immunity"、２００８年４月、２８、５４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の組成物および方法は、上に挙げた当該技術分野の諸課題に鑑みてなされたものである。本明細書には、ヒトから単離され、制御性Ｔ細胞の増殖、集積、または増殖と集積を誘導する、好ましくは強力に誘導する腸内共生細菌を同定および培養する方法が記載されている。（１）（ａ）１種類以上の同定された腸内共生（ヒト由来）細菌；（ｂ）１種類以上の該細菌の培養上清；（ｃ）１種類以上の該細菌もしくは１つ以上の該培養上清に由来する１種類以上の生理活性物質；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか２つもしくは３つの組合せを含み、かつ（２）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖および／または集積を誘導する、細菌組成物とも称する組成物が記載されている。あるいは、組成物は（ａ）１種類以上の同定された腸内共生（ヒト由来）細菌；（ｂ）１種類以上の該細菌の培養上清；または（ｃ）該細菌もしくは該培養上清に由来する１種類以上の生理活性物質を含み、制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する。いくつかの実施形態では、該組成物は１種類以上の同定された腸内共生（ヒト由来）細菌を含む。いくつかの実施形態では、該組成物は１種類以上の該細菌の培養上清を含む。いくつかの実施形態では、該組成物は、該細菌または該培養上清に由来する１種類以上の生理活性物質を含む。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は３種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は５種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は１７種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は２３種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は２３種類である。特定の実施形態では、細菌組成物は、大腸（例えば、ヒト大腸）でＩＬ−１０などの免疫抑制サイトカインを高レベルで産生する制御性Ｔ細胞の増殖、集積、または増殖と集積を誘導し、好ましくはこれを強力に誘導する。
【０００８】
このような細菌組成物は、例えば、免疫抑制を増強し、その結果、自己免疫疾患を治療するのに有用である。細菌組成物は有効成分として、以下のものからなる群より選択される少なくとも１種類の生物体および／または少なくとも１種類の物質を含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２；本明細書に記載／列挙されている少なくとも１種類（１種類、１種類以上）の細菌の培養上清；本明細書に記載／列挙されている（１種類、１種類以上の）細菌または上記のうちの２つもしくは３つの任意の組合せに由来する生理活性物質。あるいは、細菌組成物は有効成分として、以下のものからなる群より選択される少なくとも１種類の生物体または少なくとも１種類の物質を含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサ��（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２；本明細書に記載／または列挙されている少なくとも１種類（１種類、１種類以上）の細菌の培養上清；本明細書に記載／列挙されている（１種類、１種類以上の）細菌に由来する生理活性物質。
【０００９】
いくつかの実施形態では、細菌組成物は、以下のものからなる群より選択される少なくとも１種類の生物体を含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）A4、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２。いくつかの実施形態では、細菌組成物は、本明細書に記載／列挙されている少なくとも１種類（１種類、１種類以上）の細菌の培養上清を含む。いくつかの実施形態では、細菌組成物は、本明細書に記載／列挙されている（１種類、１種類以上の）細菌に由来する生理活性物質を含む。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は３種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は５種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活��物質は１７種類以上である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は２３種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は２３種類である。細菌組成物は、本明細書に提供される配列と十分な相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含み制御性Ｔ細胞に対して以下に挙げるいずれか１種類の細菌が発揮する効果と実質的に同じ効果を示す任意の細菌（クロストリジウムをはじめとする細菌）を含み得る：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、およびアナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２。
【００１１】
いくつかの実施形態では、細菌組成物中に存在する細菌は、本明細書に提供される配列、例えば特に限定されないが、本明細書でＯＴＵと命名され、例えば最後の実施例の後のページに列挙されるヌクレオチド配列などと少なくとも９０％（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の相同性を有する。特定の実施形態では、このような細菌は、本明細書で以下のように命名される１つ以上のＤＮＡ配列と少なくとも９０％（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む：ＯＴＵ１３６；ＯＴＵ４６；ＯＴＵ２２１；ＯＴＵ９；ＯＴＵ２９６；ＯＴＵ２１；ＯＴＵ１６６；ＯＴＵ７３；ＯＴＵ１７４；ＯＴＵ１４；ＯＴＵ５５；ＯＴＵ３３７；ＯＴＵ３１４；ＯＴＵ１９５；ＯＴＵ３０６；ＯＴＵ８７；ＯＴＵ８６；ＯＴＵ１５２；ＯＴＵ２５３；ＯＴＵ２５９；ＯＴＵ２８１；ＯＴＵ２８８；ＯＴＵ３３４；ＯＴＵ３５９；ＯＴＵ３６２；またはＯＴＵ３６７。あるいは、細菌は、以下に挙げる細菌のうちの１種類以上のＤＮＡと少なくとも９０％（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シン���オサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、およびアナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２。
【００１２】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本明細書に提供される配列、例えば特に限定されないが、本明細書でＯＴＵと命名され、例えば最後の実施例の後のページに列挙されるヌクレオチド配列などと少なくとも９７％、９８％または９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む細菌（ヒト由来細菌など）を含む。特定の実施形態では、細菌組成物中の細菌は、本明細書で以下のように命名される１つ以上のＤＮＡ配列と少なくとも９７％、９８％または９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む：ＯＴＵ１３６；ＯＴＵ４６；ＯＴＵ２２１；ＯＴＵ９；ＯＴＵ２９６；ＯＴＵ２１；ＯＴＵ１６６；ＯＴＵ７３；ＯＴＵ１７４；ＯＴＵ１４；ＯＴＵ５５；ＯＴＵ３３７；ＯＴＵ３１４；ＯＴＵ１９５；ＯＴＵ３０６；ＯＴＵ８７；ＯＴＵ８６；ＯＴＵ１５２；ＯＴＵ２５３；ＯＴＵ２５９；ＯＴＵ２８１；ＯＴＵ２８８；ＯＴＵ３３４；ＯＴＵ３５９；ＯＴＵ３６２；またはＯＴＵ３６７。あるいは、該細菌は、以下に挙げる細菌のうちの１種類以上のＤＮＡと少なくとも９７％、９８％または９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２。クロストリジウム類の細菌はいずれも、芽胞型または栄養型で存在し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書に記載する通り、ヒトミクロビオームにみられる１，０００種を超える細菌のなかには、大腸におけるＴｒｅｇの集積を強力に誘導する種がいくつか存在する。
【００１４】
同じく記載する通り、健常個体の糞便試料中に存在する細菌種のほとんどがＴｒｅｇを刺激する能力をもたないが、クロストリジウム類に属する種には、大腸でＴｒｅｇの強力な誘導を引き起こす能力がある。さらに本発明者らは、同定された各細菌種のインビトロ培養物を入手し、マウスにインビトロ培養した種を接種しても、大腸にＴｒｅｇが堅固に集積することを明らかにした。
本明細書に記載する通り、組成物は、有効成分として（ａ）芽胞型または栄養型のクロストリジウム類に属する細菌または本明細書に提供される配列と少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む細菌のうちの１つ以上の特定種；（ｂ）１種類以上のこのような細菌の培養上清；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に由来する１種類以上の生理活性物質；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか２つまたは３つの組合せを含み、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖および／または集積を誘導し免疫機能を抑制する。
【００１５】
さらに具体的に述べると：
１つの実施形態は、制御性Ｔ細胞の増殖、集積または増殖と集積の両方を誘導する組成物であり、該組成物は有効成分として、以下のものからなる群より選択される少なくとも１種類の生物体および／または少なくとも１種類の物質を含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２；本明細書に記載／列挙されている少なくとも１種類の細菌の培養上清、および本明細書に記載／列挙されている細菌に由来する生理活性物質。
【００１６】
いくつかの実施形態では、有効成分は、以下に挙げる１種類以上の細菌である：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２。
【００１７】
いくつかの実施形態では、有効成分は、本明細書に記載／列挙されている１種類以上の細菌の培養上清である。いくつかの実施形態では、有効成分は、本明細書に記載／列挙されている細菌に由来する１種類以上の生理活性物質である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は３種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は５種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は１７種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は２３種類以上である。いくつかの実施形態では、該１種類以上の細菌または該細菌に由来する１種類以上の生理活性物質は２３種類である。
【００１８】
本明細書に記載の細菌組成物は、以下に挙げるもののうちの少なくとも１つを含む：本明細書に記載の１種類の細菌；１種類（もしくはそれ以上）の該細菌が存在していた（増殖した、もしくは維持されていた）培養物から得られる少なくとも１つの培養上清もしくはこのような上清の一部；１種類以上の細菌（本明細書で挙げられている細菌など）に由来する１種類以上の生理活性物質または上記のいずれか２つもしくは３つの組合せ。組成物／細菌組成物という用語はこのような組合せをすべて指す。
【００１９】
該組成物中の細菌は、例えば、クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２または本明細書に提供される配列、例えば特に限定されないが、本明細書でＯＴＵと命名され、例えば最後の実施例の後のページに列挙されるヌクレオチド配列などと少なくとも９０％の相同性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性）を有するＤＮＡを含む任意の細菌（ヒト由来細菌など）であり得る。
【００２０】
特定の実施形態では、該細菌は、本明細書で以下のように命名される１つ以上のＤＮＡ配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む：ＯＴＵ１３６；ＯＴＵ４６；ＯＴＵ２２１；ＯＴＵ９；ＯＴＵ２９６；ＯＴＵ２１；ＯＴＵ１６６；ＯＴＵ７３；ＯＴＵ１７４；ＯＴＵ１４；ＯＴＵ５５；ＯＴＵ３３７；ＯＴＵ３１４；ＯＴＵ１９５；ＯＴＵ３０６；ＯＴＵ８７；ＯＴＵ８６；ＯＴＵ１５２；ＯＴＵ２５３；ＯＴＵ２５９；ＯＴＵ２８１；ＯＴＵ２８８；ＯＴＵ３３４；ＯＴＵ３５９；ＯＴＵ３６２；またはＯＴＵ３６７。あるいは、該細菌は、以下に挙げる１種類以上の細菌のＤＮＡと少なくとも９７％（９７％、９８％、９９％、１００％）の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、およびアナ��ロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２。
【００２１】
一実施形態では、該組成物は、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞またはＩＬ−１０産生性の制御性Ｔ細胞である制御性Ｔ細胞を誘導する。別の実施形態では、該組成物は免疫抑制効果を有する。
【００２２】
１つの実施形態は、制御性Ｔ細胞の増殖、集積または増殖および／もしくは集積の両方を誘導し免疫機能を抑制する医薬組成物である。該医薬組成物は、本明細書に記載の細菌組成物と、担体、溶媒または希釈剤などの薬学的に許容される成分とを含む。特定の実施形態では、このような医薬組成物は、（ａ）（１）本明細書に記載のクロストリジウム類に属する芽胞型もしくは栄養型の１種類以上の細菌、（２）このような細菌の培養上清、（３）それらに由来する生理活性物質または（４）（１）、（２）および（３）のいずれか２つもしくは３つの組合せと（ｂ）担体、溶媒または希釈剤などの薬学的に許容される成分を含む。特定の実施形態では、上記（ａ）は、以下のものからなる群より選択される少なくとも１種類の生物体または物質である：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２、１種類以上の該細菌の培養上清、ならびに１種類以上の該細菌に由来する生理活性物質。いくつかの実施形態では、上記（ａ）は、以下のものからなる群より選択される少なくとも１種類の生物体である：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）A4、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２。
【００２３】
いくつかの実施形態では、上記（１）は１種類以上の該細菌の培養上清である。いくつかの実施形態では、上記（１）は１種類以上の該細菌に由来する生理活性物質である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１種類の生物体または物質は３種類以上である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１種類の生物体または物質は５種類以上である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１種類の生物体または物質は１７種類以上である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１種類の生物体または物質は２３種類以上である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１種類の生物体または物質は２３種類である。また別の実施形態では、上記（ａ）（１）は、本明細書に提供される配列、例えば特に限定されないが、本明細書でＯＴＵと命名され、例えば最後の実施例の後のページに列挙されるヌクレオチド配列などと少なくとも９０％の相同性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性）を有するＤＮＡを含む細菌（ヒト由来細菌など）である。該医薬組成物の特定の実施形態では、該細菌は、本明細書で以下のように命名される１つ以上のＤＮＡ配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む：ＯＴＵ１３６；ＯＴＵ４６；ＯＴＵ２２１；ＯＴＵ９；ＯＴＵ２９６；ＯＴＵ２１；ＯＴＵ１６６；ＯＴＵ７３；ＯＴＵ１７４；ＯＴＵ１４；ＯＴＵ５５；ＯＴＵ３３７；ＯＴＵ３１４；ＯＴＵ１９５；ＯＴＵ３０６；ＯＴＵ８７；ＯＴＵ８６；ＯＴＵ１５２；ＯＴＵ２５３；ＯＴＵ２５９；ＯＴＵ２８１；ＯＴＵ２８８；ＯＴＵ３３４；ＯＴＵ３５９；ＯＴＵ３６２；またはＯＴＵ３６７。あるいは、該医薬組成物中の細菌は、以下の１種類以上の細菌のＤＮＡと少なくとも９７％（９７％、９８％、９９％、１００％）の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.)３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２。
【００２４】
該医薬組成物は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖および／または集積を誘導し免疫機能を抑制する。
【００２５】
ほかにも、個体（例えば、制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積の誘導を必要とする個体など、それらを必要とする個体）において、制御性Ｔ細胞の増殖、集積または増殖と集積の両方を誘導する方法が提供される。該方法は、該個体に本明細書に記載の細菌組成物または本明細書に記載の細菌組成物を含む医薬組成物を投与することを含む。該方法では、健常個体または病態もしくは疾患の予防、軽減もしくは治療を必要とする個体であり得る個体（必要とする個体とも称する）に、クロストリジウム・サッカログミア(Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２；１種類以上の該細菌の培養上清もしくは該培養上清の１つ以上の成分；１種類以上の該細菌に由来する生理活性物質または上記のうちの２つもしくは３つの組合せからなる群より選択される少なくとも１種類の生物体または物質を投与する。例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患および感染症などの疾患または病態の治療、重症度の軽減または予防を必要とする個体に、記載の組成物を投与し得る。
【００２６】
任意選択で、該細菌組成物の投与は１種類以上の抗生物質による治療と組み合わせても、このような治療の後に実施してもよい。
【００２７】
任意選択で、該細菌組成物の投与は、該細菌組成物中の種の増殖に対して他のヒト共生細菌種の増殖よりも選択的に有利に働く少なくとも１種類のプレバイオティクス物質の投与と組み合わせてもよい。一実施形態では、該プレバイオティクス物質（１つまたは複数）は、例えば、難消化性オリゴ糖である。特定の実施形態では、該１種類以上のプレバイオティクス物質は、アーモンド皮、イヌリン、オリゴフルクトース、ラフィノース、ラクチュロース、ペクチン、ヘミセルロース、アミロペクチン、アセチル−ＣｏＡ、ビオチン、ビート糖蜜、酵母抽出物および難消化性デンプンからなる群より選択される。本明細書ではこのほか、該細菌組成物と少なくとも１種類のプレバイオティクス物質とを含む組成物が考慮される。
【００２８】
該細菌組成物は、コルチコステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニゾン、メトトレキサート、抗ヒスタミン剤、グルココルチコイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、抗ロイコトリエン剤、抗コリン鼻炎薬、抗コリン充血除去剤、肥満細胞安定化剤、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体、ワクチン、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブぺゴール、ゴリムマブまたはエタネルセプトなどの抗ＴＮＦ阻害剤、およびその組合せからなる群より選択される物質と組み合わせて投与してもよい。本明細書にはこのほか、該細菌組成物と、コルチコステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニゾン、メトトレキサート、抗ヒスタミン剤、グルココルチコイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、抗ロイコトリエン剤、抗コリン鼻炎薬、抗コリン充血除去剤、肥満細胞安定化剤、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体、ワクチン、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブぺゴール、ゴリムマブまたはエタネルセプトなどの抗ＴＮＦ阻害剤、およびその組合せからなる群より選択される少なくとも１種類の物質とを含む組成物が記載される。
【００２９】
また別の実施形態では、該細菌組成物はアジュバントとして使用しワクチン製剤の効果を向上させることができる。例えば、該細菌組成物はワクチンのアジュバントとして自己免疫疾患またはアレルギー疾患の予防または治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、予防または治療の方法が提供され、該方法は該細菌組成物の投与とワクチンの投与とを含む。
【００３０】
本明細書に記載の組成物の投与によって得られる制御性Ｔ細胞の増殖または集積誘導の程度の評価は、患者試料（生検または血液試料など）中のＦｏｘｐ３発現Ｔｒｅｇ数、ＩＬ−１０発現の促進、ＣＴＬＡ４発現の促進、ＩＤＯ発現の促進、ＩＬ−４発現の抑制、または個体における該細菌組成物の定着の測定などの様々な方法によって実施することができる。このような評価の結果を、該個体において制御性Ｔ細胞の増殖または集積が誘導されていることの指標として用いる。
【００３１】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与により、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞またはＩＬ−１０産生性の制御性Ｔ細胞である制御性Ｔ細胞の誘導が引き起こされる。
【００３２】
本明細書に記載の組成物は様々な経路によって投与することが可能であり、一実施形態では、必要とする患者などの必要とする個体に経口投与する。該組成物は、多数の経口形態で、例えば芽胞形態（乾燥粉末状態または液体製剤に溶解させたもの）、腸溶性カプセル、小袋、またはヨーグルトもしくは飲料などの食品マトリックスなどの形態で投与してよい。
【００３３】
ほかにも、本発明の組成物による治療に対する対象の応答を予測する（該対象が治療に応答するかどうかを予測する）方法が提供される。該方法は、（ａ）本明細書に記載の細菌組成物による治療前に患者から糞便試料または大腸生検などの試料を（少なくとも１つ、１つ以上）採取すること；（ｂ）クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、およびアナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌種の試料中の割合または絶対数を測定または決定することにより、割合または計数を求めること、ならびに（ｃ）得られた割合または計数（測定値）と、健常対象で実施した同じ測定のベースライン値とを比較することを含み、該患者から採取した試料の割合または計数が該ベースライン値より低いことは、該対象が該細菌組成物の投与に良好に応答し得ることを示す。
【００３４】
いくつかの実施形態では、該方法は、（ｄ）該患者から採取した試料の割合または計数がベースライン値より低い場合に該細菌組成物を該患者に投与することをさらに含む。任意選択で、該方法は、クロストリジウムクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属するが該細菌組成物中には存在しない他の共生種の割合または絶対数を患者試料（例えば、糞便試料または大腸生検）で測定することをさらに含んでよく、該割合または絶対数（測定値）がベースラインより低いことは、該対象が該細菌組成物の投与に良好に応答し得ることをさらに示す。いくつかの実施形態では、該方法は、該割合または絶対数（測定値）がベースラインより低い場合に該患者に該細菌組成物を投与することをさらに含む。一実施形態では、評価の対象となる患者は炎症性腸疾患またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に罹患している。
【００３５】
このほか、本発明の細菌組成物による治療に対する対象の応答をモニターする方法が提供され、この方法は、（ａ）本明細書に記載の細菌組成物による治療前に患者から糞便試料または大腸生検など試料を（少なくとも１つ）採取すること；（ｂ）本明細書に記載の細菌組成物による治療後に該患者から対応する試料を（少なくとも１つ）採取すること；ならびに（ｃ）（ａ）で採取した試料中のクロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌種の割合または絶対数と、（ｂ）で得られた試料中の同じ少なくとも１種類の細菌種の割合または絶対数とを比較することを含み、（ｂ）（該細菌組成物による治療後）で得られた試料中の値が（ａ）（治療前）で得られた試料中より大きいことは、該対象が治療に良好に応答したこと���指標となる（例えば、該対象において免疫抑制が増強されたことのプラスの指標となる）。
【００３６】
いくつかの実施形態では、該方法は、（ｄ）（ｃ）での比較に基づいて、該患者に該細菌組成物をさらに投与するか、該患者への該細菌組成物の投与を中止することをさらに含む。任意選択で、該方法は、クロストリジウムクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属するが、該細菌組成物中には存在しない他の共生種の割合または絶対数を該対象の試料で測定することを含んでよく、治療後の値が治療前の値より大きいことは、該対象が治療に良好に応答したことを示す。
【発明の効果】
【００３７】
本明細書に記載の組成物および方法の効果
本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載されているクロストリジウム類をはじめとする細菌に属する選択された細菌；このような細菌の培養上清；このような細菌に由来する生理活性物質；または上記のうちの２つもしくは３つの組合せを有効成分として含有するものであり、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖または集積の誘導に優れている。
【００３８】
例えば飲食品中でもしくは栄養補助食品として該細菌組成物を経口摂取する、または該細菌組成物を含む医薬組成物を投与するなどの本発明の組成物の投与によって、個体の免疫を抑制できる。本発明の組成物は、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症の予防または治療、ならびに臓器移植などにおける免疫拒絶の抑制に用いることが可能である。さらに、健康食品などの飲食品が本発明の組成物を含んでいれば、健常個体が該組成物を日常的に容易に摂取できる。その結果、制御性Ｔ細胞増殖および／または集積を誘導し、免疫機能を改善することが可能である。
【００３９】
本明細書に記載の組成物は、免疫仲介性の病態に対する、自然で持続性のある患者にやさしい穏和な代替療法となる。例えば、炎症性腸疾患は現在、重度の副作用を示し得る合成薬（コルチコステロイド、ＴＮＦ阻害剤など）、経口投与ができない合成薬（ＴＮＦ阻害剤など）、丸剤を１日に数回服用し投与が不便な合成薬（メサラジンまたはスルファサラジンなど）または効果が少なく一時的である合成薬（現在市販されているプロバイオティクス、例えば、ＬＧＧ乳酸菌（Lactobacillus GG）、アシドフィルス菌（Lactobacillus acidophilus）、ビフィズス菌（Bifidobacterium longum）など）で治療されている。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ＡＢ】図１Ａは、ＧＦマウスあるいは未処理のヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＵＴ、ｎ＝４、番号＃Ａ１〜＃Ａ４）またはクロロホルム処理したヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＣｈｌｏｒｏ、ｎ＝４、番号＃Ｂ１〜＃Ｂ４）の大腸粘膜固有層（Ｃ  ＬＰＬ、左パネル）および小腸粘膜固有層（ＳＩ  ＬＰＬ、右パネル）から採取しＦｏｘｐ３発現によってゲートをかけたＣＤ４細胞を示すヒストグラムである。図１Ｂは、ＧＦマウスあるいは未処理のヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＵＴ）またはクロロホルム処理したヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＣｈｌｏｒｏ）の大腸粘膜固有層（左パネル）および小腸粘膜固有層（右パネル）のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現を示すヒストグラムである。（Ａ）および（Ｂ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。
【図１ＣＤ】それぞれＧＦマウスあるいは未処理のヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＵＴ）またはクロロホルム処理したヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＣｈｌｏｒｏ）の大腸粘膜固有層（左パネル）および小腸粘膜固有層（右パネル）のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現と、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現に関する統合データを表すグラフである。（Ｃ）および（Ｄ）の丸はそれぞれ個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ−検定。
【図１Ｅ】ＧＦマウスあるいは未処理のヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＵＴ）またはクロロホルム処理したヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＣｈｌｏｒｏ）の大腸粘膜固有層（上パネル）および小腸粘膜固有層（下パネル）のＣＤ４＋細胞におけるＩＬ−１７およびＩＦＮ−の細胞内発現に関する代表的なフローサイトメトリーのドットプロットである。（Ｅ）の各象限の数値は個体群の百分率を表す。
【図１ＦＧ】それぞれＧＦマウスあるいは未処理のヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＵＴ）またはクロロホルム処理したヒト糞便で定着させたＧＦマウス（＋ｈｕＣｈｌｏｒｏ）の大腸粘膜固有層（左パネル）および小腸粘膜固有層（右パネル）のＣＤ４＋細胞におけるＩＬ−１７およびＩＦＮ−発現に関する全マウスの統合データを示す図である。（Ｆ、Ｇ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意差なし（Ｐ＞０．０５）、対応のないｔ−検定。
【図２】ＧＦマウスおよび予め高圧滅菌したクロロホルム処理ヒト糞便の懸濁物を経口接種（週１回を４週間）したＧＦマウスのＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現（Ａの上パネル、Ｂの左パネル）、またはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現（Ａの下パネル、Ｃの右パネル）に関する代表的なプロット（Ａ）および統合データ（Ｂ、Ｃ）を示す図である。（Ａ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。（Ｂ、Ｃ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。ｎｓ、有意差なし（Ｐ＞０．０５）、対応のないｔ−検定。
【図３】ＧＦマウスおよびクロロホルム処理したヒト糞便を経口接種したＧＦマウス（＋ｈｕＣｈｌｏｒｏ、ｎ＝７、番号＃Ｃ１〜＃Ｃ７）の大腸および小腸粘膜固有層リンパ球のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現に関する代表的なプロット（Ａ、ここではマウス＃Ｃ４のデータを示す）および統合データ（Ｂ）を示す図である。（Ａ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。（Ｂ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ−検定。
【図４】ＧＦマウスならびにクロロホルム処理したヒト糞便で定着させたｅｘ−ＧＦマウス＃Ｃ６および＃Ｃ７と同居させたＧＦマウス（番号＃Ｄ１〜＃Ｄ６）の大腸粘膜固有層（Ｃ  ＬＰＬ）および小腸粘膜固有層（ＳＩ  ＬＰＬ）のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現に関する代表的なプロット（Ａ）および統合データ（Ｂ）を示す図である。（Ａ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。（Ｂ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ−検定。
【図５】ＧＦマウス、２０００倍に希釈した＃Ｃ４マウス糞便懸濁物を接種したＧＦマウス（＋×２０００、ｎ＝４、番号＃Ｅ１〜＃Ｅ４）または２００００倍に希釈した＃Ｃ４マウス糞便懸濁物を接種したＧＦマウス（＋×２００００、ｎ＝８、番号＃Ｆ１〜＃Ｆ８）の大腸粘膜固有層（Ｃ  ＬＰＬ）および腸粘膜固有層（ＳＩ  ＬＰＬ）のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現（Ａ、Ｂ）、またはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現（Ｃ）に関する代表的なプロットおよび統合データを示す図である。（Ａ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。（Ｂ）および（Ｃ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ−検定。
【図６】ＧＦマウス、および＃Ｆ３（ｎ＝５）、＃Ｆ７（ｎ＝４）または＃Ｆ８（ｎ＝４）マウスの糞便懸濁物を接種したＧＦマウスの大腸粘膜固有層（Ｃ  ＬＰＬ）および小腸粘膜固有層（ＳＩ  ＬＰＬ）のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現（Ａ、Ｃ）、またはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現（Ｂ、Ｄ）に関する代表的なプロット（Ａ、Ｂ）および統合データ（Ｃ、Ｄ）を表す図である。（Ａ）および（Ｂ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。（Ｃ）および（Ｄ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ−検定。
【図７】ＧＦマウスおよび＃Ｆ８マウスの盲腸内容物から単離された３種類の細菌株を接種したＧＦマウス（ｎ＝４、番号＃Ｊ１〜＃Ｊ４）のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現（Ａ、Ｂ）またはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現に関する代表的なプロット（Ａ）および統合データ（Ｂ、Ｃ）を示す図である。（Ａ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。（Ｂ）および（Ｃ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。ｎｓ、有意差なし（Ｐ＞０．０５）、対応のないｔ−検定。
【図８】各盲腸試料中の同じ最近縁種を有するＯＴＵの相対存在量を示す図である（マウス＃Ａ１、＃Ｃ４、＃Ｆ８、＃Ｇ２、＃Ｈ３、＃Ｉ３、＃Ｊ３および＃Ｋ３の盲腸内容物から細菌ＤＮＡを抽出し、棒で示した）。各試料に検出された総ＯＴＵ数を棒の下に示す。試料＃Ｈ３、＃Ｉ３または＃Ｋ３に検出されたＯＴＵの名称、その最近縁種およびその最近縁種との類似性を右の表に示す。
【図９】ＧＦマウスおよび＃Ｇ２マウスの盲腸内容物の培養プレートから回収した細菌を接種したＧＦマウス（ｎ＝４、番号＃Ｋ１〜＃Ｋ４）の大腸粘膜固有層（Ｃ  ＬＰＬ）および小腸粘膜固有層（ＳＩ  ＬＰＬ）のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現（Ａ、Ｂ）、またはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現（Ａ、Ｃ）に関する代表的なプロット（Ａ）および統合データ（Ｂ、Ｃ）を示す図である。（Ａ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。（Ｂ）および（Ｃ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ−検定。
【図１０】ＧＦマウスおよび単離され表２に示した２３菌株の混合物（２３ｍｉｘ）を接種したＧＦマウスの大腸粘膜固有層（Ｃ  ＬＰＬ）および小腸粘膜固有層（ＳＩ  ＬＰＬ）のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現（Ａ，Ｂ）、またはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現（Ａ，Ｃ）に関する代表的なプロット（Ａ）および統合データ（Ｂ、Ｃ）を示す図である。（Ａ）の区切った線分の上側にある数値は個体群の百分率を表す。（Ｂ）および（Ｃ）の各丸は個々のマウスを表し、エラーバーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ−検定。
【図１１】２×１０４〜２×１０７倍に希釈した＋ｈｕＣｈｌｏマウスの盲腸試料を接種した成体ＧＦマウスにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞集積の代表的なプロットを示す図である。実験を３回以上実施した。エラーバーはＳＤを表す。スチューデントｔ検定による計算で＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図１２】単離され表２に示した２３菌株の混合物（２３−ｍｉｘ）を接種した成体ＧＦマウス、クロロホルム処理したヒト糞便を接種した成体ＧＦマウス（＋ｈｕＣｈｌｏ）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）を接種した成体ＧＦマウス（＋Ｆａｅｃａｌｉ）の大腸におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞集積の代表的なプロットを示す図である。エラーバーはＳＤを表す。スチューデントｔ検定による計算で＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１３】＋２×１０４マウスの盲腸内容物を二次接種した成体ＧＦマウス（＋２×１０４−ｒｅ）ならびに同盲腸内容物を三次接種した成体ＧＦマウス（＋２×１０４−ｒｅ−ｒｅ）、および２×１０４倍に希釈した＋２×１０４マウスの盲腸試料を接種した成体ＧＦマウス（＋（２×１０４）２）におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞集積の代表的なプロットを示す図である。
【図１４】４５４シーケンサーを用いて、定義されるマウス（＋ｈｕ、＋ｈｕＣｈｌｏ、＋２×１０４、＋２×１０４−ｒｅ、（＋２×１０４）２、＋２３−、ｍｉｘ）の盲腸内容物について１６ｓ  ｒＤＮＡパイロシーケンシングを実施した結果を示す図である。各マウスの盲腸細菌群におけるＯＴＵの相対存在量（％）ならびに示されるＯＴＵについてデータベースにおける最近縁株および対応する単離菌種番号が示されている。
【図１５】単離され表４に示した１７菌株の混合物（１７−ｍｉｘ）を接種した成体ＩＱＩ、ＢＡＬＢおよびＢ６  ＧＦマウスの大腸におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞集積の代表的なプロットを示す図である。スチューデントｔ検定による計算で＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１６】表４に記載した１７菌株（１７−ｍｉｘ）それぞれで単一定着させた成体ＩＱＩ  ＧＦマウスにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞集積の代表的なプロットを示す図である。
【図１７】表４に記載した３−ｍｉｘ、５ｍｉｘ−Ａ、５−ｍｉｘ−Ｂ、５−ｍｉｘ−Ｃまたは１７−ｍｉｘで定着させた成体ＩＱＩ  ＧＦマウスにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞集積の代表的なプロットを示す図である。丸は個々のマウスを表す。実験を３回以上実施し、ほぼ同じ結果が得られた。エラーバーはＳＤを表す。スチューデントｔ検定による計算で＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ、有意差なし。
【図１８】１７−ｍｉｘを反復接種した成体ＳＰＦマウス（ＳＰＦ＋１７ｍｉｘ；ｎ＝５）または対照（ＳＰＦ＋ｃｏｎｔ；ｎ＝６）におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞集積の代表的なプロットを示す図である。スチューデントｔ検定による計算で＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１９】定性的下痢スコアにより測定した下痢ＯＶＡモデルに対する１７−ｍｉｘ接種の効果を示す図である。スチューデントｔ検定による計算で＊Ｐ＜０．０５。
【図２０】大腸炎の実験モデルに使用される薬剤のトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）に曝露した後、表４に記載した１７菌株の混合物（１７−ｍｉｘ）を接種した成体マウスの生存率を示す図である。
【図２１】潰瘍性大腸炎被験者および健常被験者のヒト糞便微生物叢における１７−ｍｉｘ菌株それぞれの相対存在量を示す図である。ＭｅｔａＨＩＴデータベースに公開されている健常被験者１５例および潰瘍性大腸炎被験者２０例のリードと１７菌株のゲノムの配列を比較した。１７菌株のゲノムそれぞれについて健常被験者群およびＵＣ群でマップされたリードの平均数が示されている。エラーバーはＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定による計算で＊Ｐ＜０．０５。
【００４１】
表の簡単な説明
表１は、マウス＃Ａ１、＃Ｃ４、＃Ｆ８、＃Ｇ２、＃Ｈ３、＃Ｉ３、＃Ｊ３および＃Ｋ３の盲腸内容物から抽出した細菌ＤＮＡの１６ｓｒＲＮＡコード遺伝子の増幅ならびにＰＣＲによるメタ配列決定による配列（各試料について３４００リード）の分類（ＢＬＡＳＴを用いた配列類似性に基づく分類、核酸データベースの配列と９７％超の同一性）から各ＯＴＵについて得られた検出リード数および最近縁種を示す。
【００４２】
表２は、ＢＬ寒天またはＥＧ寒天プレートを用いてマウス＃Ｆ８、＃Ｇ２、＃Ｉ１および＃Ｋ３の盲腸内容物から単離された１７菌株のそれぞれについて、既知種での最近縁種、最近縁種との類似性の最大値、クロストリジウム科クラスターにおける分類、由来するマウスのＩＤ、および単離に用いた培地を示す。
【００４３】
表３は、ＢＬ寒天またはＥＧ寒天プレートを用いてマウス＃Ｆ８、＃Ｇ２、＃Ｉ１および＃Ｋ３の盲腸内容物から単離された３１菌株のそれぞれについて、既知種での最近縁種、最近縁種との類似性の最大値、ＢＬＡＳＴ検索に用いたデータベース、および菌株間の類似性を示す。
【００４４】
表４は、単離された３１菌株それぞれの１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析の結果を示す。３１菌株の各株から細菌ＤＮＡを単離し、単離物の１６Ｓ  ｒＤＮＡをコロニーＰＣＲにより増幅した。増幅した各ＤＮＡを精製し、配列決定し、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアプログラムを用いて配列比較した。各菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列に基づいて、その最近縁種、最近縁種との％類似性、および他の菌株との類似性を示す。２３−ｍｉｘ、１７−ｍｉｘ、５−ｍｉｘＡ、５−ｍｉｘＢ、５−ｍｉｘＣおよび３−ｍｉｘに含まれていた菌株については右欄に印が付けてある。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
＜制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物＞
制御性Ｔ細胞の増殖、集積または制御性Ｔ細胞の増殖と集積の両方を誘導する組成物についてここに記載する。該組成物は、以下に挙げるもののうち１つ以上を有効成分として含む：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２からなる群より選択される（少なくとも１種類、１種類以上の）生物体、１種類以上の該細菌の培養上清、本明細書に記載の（少なくとも１種類、１種類以上の）細菌を増殖させた培地の成分、本明細書に記載の（少なくとも１種類；１種類以上の）細菌に由来する生理活性物質；ならびに上記細菌種など本明細書に記載されているいずれかの細菌種ＤＮＡのヌクレオチド配列と少なくとも９７％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む（少なくとも１種類；１種類以上の）細菌。本明細書に記載の細菌は、実施例１９〜２８で概説す���方法を用いてヒト糞便試料から単離されたものである。
【００４６】
「制御性Ｔ細胞」という用語は、異常なまたは過剰な免疫応答を抑制し、かつ免疫寛容に何らかの役割を果たしているＴ細胞を指す。制御性Ｔ細胞は通常、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞である。本発明の制御性Ｔ細胞にはこのほか、ＩＬ−１０を産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性の制御性Ｔ細胞が含まれる。
【００４７】
「制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する」という用語は、制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積に至る、未成熟Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化を誘導する作用を指す。さらに、「制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する」という用語の意味にはインビボにおける作用、インビトロにおける作用およびエクスビボにおける作用が含まれる。以下に挙げる作用がすべて含まれる：クロストリジウム類に属する上記細菌、該細菌の培養上清もしくは上清成分（１つまたは複数）、または該細菌に由来する生理活性物質の投与または摂取により、インビボで制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用；クロストリジウム類に属する上記細菌、該細菌の培養上清もしくは上清成分（１つまたは複数）、または該細菌に由来する生理活性物質を、培養制御性Ｔ細胞に作用させることにより、その増殖または集積を誘導する作用；ならびにクロストリジウム類に属する上記細菌、該細菌の培養上清もしくは上清成分（１つまたは複数）、または該細菌に由来する生理活性物質を、生体から採取したのちにそれを採取した生体または別の生体などの生体に導入する予定である制御性Ｔ細胞に作用させることにより、その増殖または集積を誘導する作用。制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用は、例えば、次のように評価することができる。具体的には、クロストリジウム類に属する上記細菌、該細菌の培養上清もしくは上清成分（１つまたは複数）、または該細菌に由来する生理活性物質を無菌マウスなどの実験動物に経口投与し、その後、大腸におけるＣＤ４陽性細胞を単離し、該細胞に含まれる制御性Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーにより測定する（実施例７を参照のこと）。
【００４８】
本発明の組成物により増殖または集積が誘導される制御性Ｔ細胞は、好ましくは、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞またはＩＬ−１０産生性の制御性Ｔ細胞である。
【００４９】
本発明では、「ヒト由来細菌」は、ヒト個体から採取した糞便試料もしくは消化管生検から単離された細菌種またはヒトから採取した糞便試料もしくは消化管生検から単離された細菌を祖先とする（例えば、糞便試料もしくは消化管生検から採取された細菌の子孫である）細菌種を意味する。例えば、該細菌種は、ヒトから採取した糞便試料または消化管生検から既に単離され、子孫が生じるのに十分な時間培養されたものであってよい。次いで、この子孫をさらに培養または凍結することができる。ヒト由来細菌は、ヒト個体、好ましくは健常なヒト個体の消化管に生息する天然の共生生物である。
【００５０】
本発明では、「クロストリジウム類」という用語（「クロストリジウム類に属する細菌を含有する組成物」における場合など）は、ファーミキューテス門に属し芽胞形成能を有するグラム陽性の偏性嫌気性菌の一種を指す。現在この種類の細菌のほとんどがクロストリジウム目に含まれているが、この分類は依然として一部旧来の方法に基づくものであり、将来、配列決定技術が新たに進歩し、この種類の細菌の全ゲノムの配列決定が可能になることで再定義される可能性があることに留意することが重要である。本発明者らがＴｒｅｇを強力に誘導するものであると同定しインビトロで培養した、クロストリジウム類に属する１７種の豊富にみられた種の分類を表２にまとめる。ここに挙げた種はいずれも、現在の分類規則に従ってクロストリジウム科に分類され、クラスターＩＶ、ＸＩＶａ、ＸＶＩおよびＸＶＩＩＩに属する。
【００５１】
本発明の組成物は、上記細菌株のいずれか１つの菌株を単独で（１つの菌株のみ）含み得るが、該細菌の２つ以上の菌株を一緒に用いることもできる。例えば、表２または表４に挙げた菌株のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の菌株を任意の組合せで一緒に用いて制御性Ｔ細胞に作用させることができる。いくつかの実施形態では、表４に挙げた２３種、１７種、５種または３種の混合物を一緒に用いて（および１種または複数種の組成物で投与して）制御性Ｔ細胞に作用させることができる。いくつかの実施形態では、以下の菌株を組み合わせることができる（該組成物が含む）：表４に記載されている菌株１（ＯＴＵ１３６、最近縁種：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８）、菌株３（ＯＴＵ２２１、最近縁種：フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＴＣ  ２９７９９）、菌株４（ＯＴＵ９、最近縁種：クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１）、菌株５（ＯＴＵ２９６、最近縁種：クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ）、菌株６（ＯＴＵ２１、最近縁種：ブラウティア・ココイデス（Blautia coccoides)、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ）、菌株７（ＯＵＴ１６６、最近縁種：クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３）、菌株８（ＯＴＵ７３、最近縁種：ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ）、菌株９（ＯＴＵ１７４、最近縁種：クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２）、菌株１０（ＯＴＵ１６６、最近縁種：クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３）、菌株１２（ＯＴＵ５５、最近縁種：ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１）、菌株１３（ＯＴＵ３３７、最近縁種：アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１）、菌株１４（ＯＴＵ３１４、最近縁種：ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ）、菌株１５（ＯＴＵ１９５、最近縁種：クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１）、菌株１６（ＯＴＵ３０６、最近縁種：クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３）、菌株１８（ＯＴＵ４６、最近縁種：クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum））、菌株２１（ＯＴＵ８７、最近縁種：ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５）、菌株２３（ＯＴＵ１５２、最近縁種：ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１）、菌株２４（ＯＴＵ２５３、最近縁種：オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes））、菌株２５（ＯＴＵ２５９、最近縁種：ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５）、菌株２６（ＯＴＵ２８１、最近縁種：クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ）、菌株２７（ＯＴＵ２８８、最近縁種：ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１）、菌株２８（ＯＴＵ３４４、最近縁種：クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、クロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ）、および菌株２９（ＯＴＵ３５９、最近縁種：ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１）。
【００５２】
いくつかの実施形態では、以下の菌株を組み合わせることができる（該組成物が含む）：表４に記載されている菌株１（ＯＴＵ１３６、最近縁種：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８）、菌株３（ＯＴＵ２２１、最近縁種：フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＴＣ  ２９７９９）、菌株４（ＯＴＵ９、最近縁種：クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１）、菌株６（ＯＴＵ２１、最近縁種：ブラウティア・ココイデス（Blautia coccoides）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ）、菌株７（ＯＵＴ１６６、最近縁種：クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３）、菌株８（ＯＴＵ７３、最近縁種：ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ）、菌株９（ＯＴＵ１７４、最近縁種：クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２）、菌株１３（ＯＴＵ３３７、最近縁種：アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１）、菌株１４（ＯＴＵ３１４、最近縁種：ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ）、菌株１５（ＯＴＵ１９５、最近縁種：クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１）、菌株１６（ＯＴＵ３０６、最近縁種：クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３）、菌株１８（ＯＴＵ４６、最近縁種：クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum））、菌株２１（ＯＴＵ８７、最近縁種：ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５）、菌株２６（ＯＴＵ２８１、最近縁種：クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ）、菌株２７（ＯＴＵ２８８、最近縁種：ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１）、菌株２８（ＯＴＵ３４４、最近縁種：クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、クロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ）、および菌株２９（ＯＴＵ３５９、最近縁種：ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１）。
【００５３】
いくつかの実施形態では、以下の菌株を組み合わせることができる（該組成物が含む）：表４に記載されている菌株１（ＯＴＵ１３６、最近縁種：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８）、菌株４（ＯＴＵ９、最近縁種：クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１）、菌株１６（ＯＴＵ３０６、最近縁種：クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３）、菌株２７（ＯＴＵ２８８、最近縁種：ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１）、および菌株２９（ＯＴＵ３５９、最近縁種：ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１）。いくつかの実施形態では、以下の菌株を組み合わせることができる：表４に記載されている菌株６（ＯＴＵ２１、最近縁種：ブラウティア・ココイデス（Blautia coccoides）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ）、菌株８（ＯＴＵ７３、最近縁種：ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ）、菌株１３（ＯＴＵ３３７、最近縁種：アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１）、菌株１４（ＯＴＵ３１４、最近縁種：ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ）、および菌株２６（ＯＴＵ２８１、最近縁種：クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ）。いくつかの実施形態では、以下の菌株を組み合わせることができる：表４に記載されている菌株３（ＯＴＵ２２１、最近縁種：フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＴＣ  ２９７９９）、菌株７（ＯＵＴ１６６、最近縁種：クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３）、菌株９（ＯＴＵ１７４、最近縁種：クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２）、菌株１５（ＯＴＵ１９５、最近縁種：クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１）、および菌株２８（ＯＴＵ３４４、最近縁種：クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、クロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ）。いくつかの実施形態では、以下の菌株を組み合わせることができる：表４に記載されている菌株１（ＯＴＵ１３６、最近縁種：クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８）、菌株２（ＯＴＵ４６、最近縁種：���ラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９）および菌株３（ＯＴＵ２２１、最近縁種：フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＴＣ  ２９７９９）。
【００５４】
上記細菌種、好ましくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａまたはクラスターＩＶに属する細菌種の菌株を複数組み合わせて用いることによって、制御性Ｔ細胞に対して優れた効果を発揮させることができる。クラスターＸＩＶａおよびクラスターＩＶに属する細菌のほかにも、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）（クラスターＸＶＩＩＩに属する）およびｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５（クラスターＸＶＩに属する）を用いることができる。細菌を１菌株以上（例えば、クラスターＸＩＶａに属する菌株を１つ以上、クラスターＩＶに属する菌株を１つ以上、クラスターＸＶＩＩＩもしくはＸＶＩに属する菌株を１つ以上または上記のいずれかの組合せ）を用いる場合、用いる菌株の数および比は様々なものであり得る。用いる数および比は、様々な因子（例えば、制御性Ｔ細胞の増殖または集積の誘導または阻害などの所望の効果；治療、予防または重症度軽減の対象となる疾患または病態；被投与者の年齢または性別；健常なヒトにおける菌株の典型的な量）に基づいて決定できる。
【００５５】
該菌株は単一の組成物中に存在していてよく、この場合、該菌株を同時に摂取または吸収することが可能であり（単一の組成物で）、あるいは、該菌株は２つ以上の組成物中に存在してもよく（例えば、それぞれ別々の組成物中に存在してもよい）、この場合、該菌株が別々に摂取され得るか、組成物を組み合わせて、得られる組合せ（併用組成物）が摂取または吸収され得る。効果を奏する任意の数または組合せの菌株（例えば、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２などの１〜２２の任意の数、およびその間の任意の数または例えば、１〜２３、３〜２３、５〜２３、１〜２０、１〜１７、３〜１７、５〜１７、１〜１５、１〜１０、１〜５、３〜５、１〜３、１〜２などの１〜２３、およびその間の任意の数）を投与することができる。
【００５６】
本発明の特定の実施形態では、本開示に記載されている２２または２３菌株（例えば、実施例３２および表４の２３菌株）の一部または全部の組合せを用いる。例えば、記載されている２２または２３菌株の少なくとも１、２以上、３、３以上、４、４以上、５、５以上、６、６以上または２２もしくは２３菌株を含めた任意の数の菌株を用いることができる。いくつかの実施形態では、表４に記載されている３、５、１７または２３菌株の特定の組合せを用いることができる（該組成物は、表４に記載されている３、５、１７または２３菌株の組合せを含む）。ここに挙げた菌株は互いに組み合わせても、引用文献に記載されていない菌株と組み合わせても使用することができる。
【００５７】
クロストリジウム類に属する細菌、特に本明細書に記載の細菌などの細胞は、芽胞型でも栄養型でも用いることができる。高温・高圧条件に対して安定である、有効期間が長い、取扱いが容易である、抗生物質に耐性を示す、ならびにコールドチェーンによる保存および流通を必要としないという観点から言うと、該細菌は芽胞型であることが好ましくてよい。設備が芽胞に汚染されることが許容されない特定の製造組織の指示の順守という観点からいうと、該細菌は逆に栄養型の細胞で生産（のちに投与）され得る。
【００５８】
「クロストリジウム類に属する細菌に由来する生理活性物質」という用語は、該細菌に含まれる物質、該細菌の分泌産物、および該細菌の代謝産物を包含する。このような生理活性物質は、既知の精製方法によって該細菌、その培養上清、またはクロストリジウム類に属する菌だけが定着したマウスの腸管内容物から活性成分を精製することにより同定が可能である。
【００５９】
ヒトから採取した糞便試料の「クロロホルム処理」とは、糞便試料中に存在し芽胞形成能を有する細菌を単離する方法のことであり、芽胞形成画分がヒトの糞便をクロロホルム（例えば、３％クロロホルム）で処理することによって得られ、かつマウス制御性Ｔ細胞およびヒト制御性Ｔ細胞などの哺乳動物制御性Ｔ細胞を含む制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する限り、特に限定されるものではない。
【００６０】
上記「クロストリジウム類に属する細菌」を培地で培養すると、該細菌からは、該細菌に含まれる物質、該細菌によって産生される分泌産物および代謝産物が放出される。本発明の組成物の有効成分である「細菌の培養上清」の意味には、このような物質、分泌産物、および代謝産物が包含される。培養上清は、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する限り特に限定されるものではない。培養上清の例としては、培養上清のタンパク質画分、培養上清のポリサッカライド画分、培養上清の脂質画分、および培養上清の低分子代謝産物画分が挙げられる。
【００６１】
細菌組成物は、医薬組成物、栄養補助食品、または飲食品（動物用飼料であってもよい）の形態で投与してもよく、あるいはモデル動物実験の試薬として用いてもよい。医薬組成物、栄養補助食品、飲食品、および試薬は制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する。本明細書に記載されている実施例では、クロストリジウム類に属する細菌等により誘導された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が、エフェクターＴ細胞の増殖を抑制することが明らかになった。本発明の組成物は、免疫抑制作用を有する組成物として好適に用いることができる。免疫抑制作用は、例えば、以下のように評価できる。本発明の組成物を経口投与したマウスなどの実験動物から単離した制御性Ｔ細胞を、脾臓から単離したエフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞）に作用させ、その増殖能を［３Ｈ］−チミジンの取り込み量を指標に測定する（実施例１４を参照のこと）。
【００６２】
本発明の細菌組成物は、例えば、慢性炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、もしくは橋本病などの自己免疫疾患；食物アレルギー、花粉症、もしくは喘息などのアレルギー疾患；クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）による感染症などの感染症；ＴＮＦ仲介性の炎症性疾患（例えば、回腸嚢炎などの消化管の炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症などの心血管系の炎症性病態、もしくは慢性閉塞性肺疾患などの炎症性肺疾患）などの炎症性疾患を予防または治療する（その有害作用を部分的にもしくは全面的に軽減する）ための医薬組成物として；組織拒絶が起こり得る臓器移植をはじめとする状況における拒絶反応を抑制するための医薬組成物として；免疫機能を改善するための栄養補助食品、飲食品として；またはエフェクターＴ細胞の増殖もしくは機能を抑制するための試薬として使用することができる。
【００６３】
該組成物が治療（有害作用の軽減または予防）に有用な対象疾患のさらに具体的な例としては、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症、および臓器移植における拒絶反応、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、スプルー、自己免疫性関節炎、リウマチ性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、骨髄移植に付随する移植片対宿主拒絶反応、変形性関節症、若年性慢性関節炎、ライム病関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、ぜんそく、乾癬、強皮症皮膚炎（dermatitis scleroderma）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主拒絶反応、臓器移植に関連した急性又は慢性の免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病（パセドゥ病）、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェ−ライン紫斑病、腎臓における顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症候群、悪液質、エイズ（後天性免疫不全症候群）、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変症、溶血性貧血、多腺性機能不全症候群１型、多腺性機能不全症候群２型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、クラミジア感染症、エルシニア・サルモネラ感染による関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化、アレルギー性大腸炎、アトピー性アレルギー、食物アレルギー（例えば、ピーナッツアレルギー、ナッツアレルギー、卵アレルギー、乳アレルギー、大豆アレルギー、小麦アレルギー、魚介アレルギー、貝アレルギーまたはゴマアレルギー、など）、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス試験陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋肉脊髄炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺炎、間質性肺炎、結合組織病間質性肺疾患、混合性結合組織疾患肺疾患、全身性硬化症間質性肺疾患、関節リウマチ間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎肺疾患、シェーグレン病肺疾患、強直性脊椎炎肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症肺疾患、薬剤誘発性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺炎、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性又はルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎抗（抗ＬＫＭ１抗体肝炎）、自己免疫性低血糖、黒色表皮腫によるＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連した免疫疾患、臓器移植に関連した慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸��体腎炎、腎臓における顕微鏡的血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性男子不妊症またはＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（全てのサブタイプに関する）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、肺高血圧症による結合組織病、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、アレルギー性鼻炎（花粉アレルギー）、アナフィラキシー、ペットアレルギー、ラテックスアレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎結膜炎、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、皮膚エリスマトーデス、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、および下痢が挙げられる。
【００６４】
該組成物が治療に有用な対象疾患のほかの例としては、結腸癌、嚢胞性線維症、セリアック病、２型糖尿病、および自閉症に関連する免疫病理が挙げられる。ここに挙げた疾患は、消化管微生物叢におけるクロストリジウムクラスターＩＶおよびＸＩＶの減少を特徴とする。
【００６５】
本明細書に記載の組成物はほかにも、例えば、免疫による過度の炎症または患者のミクロビオームの変化によるダメージによって、感染症に対する耐性が損なわれている個体の感染症を予防または治療するための医薬組成物として使用することができる。宿主のホメオスタシスの維持または回復を損ない、結果としてこのような免疫病理学的な組織ダメージを与える感染性病原体の例としては、サルモネラ、赤痢菌、クロストリジウム．ディフィシル（C. difficile）、マイコバクテリウム（結核の原因となる）、原虫（マラリアの原因となる）、糸状線虫類（フィラリア症の原因となる）、住血吸虫（住血吸虫症の原因となる）、トキソプラズマ（トキソプラズマ症の原因となる）、リーシュマニア（リーシュマニア症の原因となる）、ＨＣＶおよびＨＢＣ（Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎の原因となる）、ならびに単純ヘルペスウィルス（ヘルペスの原因となる）が挙げられる。
【００６６】
当業者に公知の製剤方法によって、記載の細菌組成物から医薬品を製剤化できる。例えば、該組成物はカプセル剤、錠剤、丸剤、小袋剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などの形態で経口的または非経口的に使用することができる。
【００６７】
上に挙げた製剤を製剤化するために、該細菌組成物を、以下のものを１つ以上含む薬学的に許容されるまたは飲食品などでの摂取が許容される担体と適宜組み合わせて使用することができる：滅菌水、生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、溶媒、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、およびその他の添加剤。
【００６８】
医薬品また医薬製剤、特に経口投与のための医薬品は、大腸における制御性Ｔ細胞の増殖または集積をさらに効率的に誘導するために、本発明の組成物を大腸に効率的に送達することを可能にする追加の組成物を含む。該細菌組成物の大腸への送達を可能にする様々な組成物を用いることができる。その例としてはｐＨ感受性組成物が挙げられ、より具体的には、腸溶性ポリマーが胃を通過後ｐＨがアルカリ性になったときに内容物を放出する緩衝化小袋製剤または腸溶性ポリマーが挙げられる。医薬品の製剤化にｐＨ感受性組成物を使用する場合、ｐＨ感受性組成物は該組成物の分解されるｐＨの閾値が約６．８〜約７．５であるポリマーであることが好ましい。このような数値範囲は、胃の遠位部においてｐＨがアルカリ側へ移行する範囲であるため、大腸への送達に用いるのに好適な範囲である。
【００６９】
該細菌組成物を大腸に送達するのに有用な医薬品のまた別の実施形態は、内容物（例えば、該細菌組成物）の放出を小腸通過時間に相当する約３〜５時間だけ遅らせることによって大腸への送達を確保する組成物が挙げられる。放出を遅らせる医薬品の１つの実施形態では、ハイドロゲルを殻として用いる。ハイドロゲルは胃腸液と接触すると水和して膨張し、その結果、内容物が効率的に溶出される（主として大腸で放出される）。放出を遅らせる投与単位としては、投与する薬物または薬剤有効成分をコートするか、選択的にコートする材料を有する、薬物含有組成物が挙げられる。このような選択的コーティング材料としては例えば、生体内分解性ポリマー、徐々に加水分解されていくポリマー、徐々に水溶していくポリマー、および／または酵素分解性ポリマーが挙げられる。放出を効率的に遅らせるコーティング材料としては多数のものが利用可能であり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系ポリマー、メタクリル酸ポリマーおよびコポリマーなどのアクリル酸ポリマーおよびコポリマー、ならびにポリビニルピロリドンなどのビニルポリマーおよびコポリマーが挙げられる。
【００７０】
大腸への送達を可能とする組成物としてはさらに、大腸粘膜特異的に接着する生体接着性組成物（例えば、米国特許第６，３６８，５８６号明細書に記載のポリマー）および消化管において特に生物学的製剤をタンパク質分解酵素活性による分解から守るためにプロテアーゼ阻害剤を組み込んだ組成物が挙げられる。
【００７１】
大腸への送達を可能にするシステムとしては、例えば、細菌発酵によるガス産生の結果として生じる胃の遠位部における圧力変化を利用して内容物を放出するような、圧力変化によって引き起こされる大腸への送達システムが挙げられる。このようなシステムは特に限定されるものではなく、その具体例としては、坐薬の基剤中に内容物を分散させ疎水性ポリマー（例えばエチルセルロース）でコートしたカプセルが挙げられる。
【００７２】
大腸への送達を可能にするシステムのまた別の例には、大腸に存在する酵素（例えば、炭水化物加水分解酵素または炭水化物還元酵素）によって特異的に分解される大腸への組成物送達システムがある。このようなシステムは特に限定されるものではなく、その具体例としては、非デンプン多糖類、アミロース、キサンタンガム、およびアゾポリマーなどの食物成分を使用するシステムが挙げられる。
【００７３】
該細菌組成物を医薬品として用いる場合、免疫抑制に用いられる既知の医薬組成物と併用してもよい。いくつかの実施形態では、該医薬品は、該細菌組成物と既知の医薬組成物をともに含み得る。このような公知の医薬組成物は特に限定されるものではなく、コルチコステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニゾン、メトトレキサート、抗ヒスタミン、グルココルチコロイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、抗ロイコトリエン、抗コリン鼻炎薬、抗コリン充血除去剤、肥満細胞安定化剤、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体、ワクチン（好ましくは、アレルゲンの量を徐々に増加させるワクチン接種に用いるワクチン）、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、またはエタネルセプトなどの抗ＴＮＦ阻害剤、およびその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの治療用組成物であり得る。ここに挙げた治療用組成物を本明細書に記載の細菌組成物と併用することが好ましい。このほか、該細菌組成物は、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の予防または治療のためのワクチンなどワクチン製剤の効力を改善するアジュバントとして用いてもよい。
【００７４】
該細菌組成物は、飲食品、例えば健康飲食品、乳児用の飲食品、妊婦、運動選手、高齢者をはじめとする特定のグループの飲食品、機能性食品、飲料、特定保健用飲食品、栄養補助食品、病者用飲食品、または動物用飼料などとして用いることができる。飲食品の具体例としては、ジュース、清涼飲料水、茶飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の各種飲料；ビール等のアルコール飲料；飯類、麺類、パン類およびパスタ類等の炭水化物含有食品；魚肉ハム、ソーセージ、水産練り製品等の練製品；カレー、あんかけ食品、中華スープ等のレトルト製品；スープ類；牛乳、乳飲料、アイスクリーム、チーズ、ヨーグルト等の乳製品；みそ、ヨーグルト、発酵飲料、漬け物等の発酵物；豆製品；ビスケット、クッキーなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、ゼリー、プリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；インスタントスープ、インスタントみそ汁等のインスタント食品、電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状、またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象に使用できる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
理論に束縛されることを望むものではないが、ファーミキューテスの群（クロストリジウムクラスターＩＶおよびＸＩＶａが属する群）に属する細菌が相対的に豊富な個体の方が、バクテロイデスの群に属する細菌が相対的に豊富な個体よりも体重の増加量が多い。該細菌組成物は、栄養素の吸収を調節し飼料効率を向上させることができる。このような観点から、該細菌組成物は体重増加の促進、または効率の高い動物飼料に使用できる。体重増加が有益な疾患および病態としては、例えば、飢餓、癌、ＡＩＤＳ、胃腸障害（例えば、セリアック病、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、膵炎、胃炎、下痢）、甲状腺機能亢進症、感染症、腎疾患、心疾患、肺疾患、結合組織疾患、ならびに投薬、食欲不振、アジソン病、認知症、うつ病、高カルシウム血症、パーキンソン病および結核による体重減少が挙げられる。
【００７６】
該細菌組成物を無抗生物質の動物飼料に添加することにより、該動物飼料を摂取する動物の体重を、抗生物質含有動物飼料を摂取する動物が得る体重と同等かそれ以上のレベルに増加させることが可能になることに加えて、胃内の病原性細菌を、典型的な抗生物質含有動物飼料を摂取する動物のものと同じレベルまで減少させることが可能になる。該細菌組成物は抗生物質の添加が不要な動物飼料の成分として使用できる。
【００７７】
さらに、商業的に利用されており、家畜生産に容易に組み込むことができない従来の細菌（乳酸桿菌（Lactobacillus）およびビフィズス菌（Bifidobacteria））とは異なり、芽胞型の本発明の細菌組成物はペレット化でき、スプレーでき、または動物飼料と容易に混合でき、かつ飲料水に添加することもできる。
【００７８】
該細菌組成物を含む動物飼料は、多種多様なタイプの動物および様々な年齢の動物に与えることが可能であり、また定期的に与えることも特定の期間（例えば、出生時、離乳期、または動物を移動もしくは輸送するとき）与えることも可能である。
【００７９】
該細菌組成物は、ヒトおよび非ヒト（例えば、家畜をはじめとする食用動物）における体重増加の促進およびエネルギー吸収の増大に用いることができる。
【００８０】
該細菌組成物の細菌有効成分は、当該技術分野で周知の発酵技術を用いて製造できる。一実施形態では、クロストリジウム類に属する細菌種の急速な増殖を維持できる嫌気発酵槽を用いて、該有効成分を製造する。嫌気発酵槽は、例えば、攪拌槽型反応器または使い捨てのウェーブバイオリアクターであり得る。ＢＬ培地およびＥＧ培地、または動物性成分を含まないこれとほぼ同じタイプの培地などの培地を用いて、細菌種の増殖を維持できる。細菌産物は、遠心分離およびろ過などの従来の技術によって発酵ブロスから精製および濃縮が可能であり、また任意選択で、当該技術分野で周知の技術によって乾燥および凍結乾燥させることが可能である。
【００８１】
本明細書に記載の細菌組成物を含む飲食品は、当該技術分野で周知の製造技術によって製造できる。免疫抑制作用による免疫機能の改善に有効な１種類以上の成分（例えば、栄養素など）を該飲食品に添加してもよい。また、免疫機能の改善以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
【００８２】
また、該細菌組成物は、通常のプロバイオテック株であれば破壊されるような加工工程を要する食品に組み込むことができる。具体的には、商業利用が可能なプロバイオテック株のほとんどは、例えば熱処理、長期保管、凍結、機械的ストレス、または高圧処理（例えば、押し出し成形及びロール成形）によって加工する必要のある食品に組み込むことができない。これに対して、本明細書に記載の細菌組成物は、芽胞を形成するという有利な特性を有するため、そのような加工食品に容易に組み込むことができる。例えば、芽胞形態の該細菌組成物は乾燥食品の中でも生存可能であり、摂取された後も生存し続けることが可能である。該細菌組成物は低温殺菌加工、典型的には約７０℃以上〜約１００℃以下の温度で実施される加工に耐えることができる。該細菌組成物は殺菌段階を必要とする乳製品に組み込むことができる。さらに、該細菌組成物は何年もの長期保存、焼くおよび煮るなどの高温加工、凍結および冷蔵などの低温加工、および押し出し成形およびロール成形などの高圧処理に耐えることができる。
【００８３】
このような厳しい条件での加工を必要とする数多くの食品としては、食べるために電子レンジでの加工を要する食品（例えば、オートミール）、食べるために焼くことを要する食品（例えば、マフィン）、食べるために短時間殺菌・高温処理を要する食品（例えば、ミルク）、および飲むために加熱を要する食品（例えば、ホットティー）が挙げられる。
【００８４】
投与するまたは摂取させる該細菌組成物の量は、その対象となる個人の年齢、体重、性別、症状、健康状態などの因子、および投与または摂取させる細菌組成物の種類（医薬品、飲食品）を考慮に入れて経験的に決定され得る。例えば、１回当たりの投与量または摂取量は一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、特定の実施形態では、１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本明細書にはこのほか、対象の免疫を抑制する（免疫応答を軽減する）方法が記載され、該方法は、クロストリジウム類に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質を上記のように対象に投与するか摂取させることを特徴とする。
【００８５】
該細菌組成物は、個体に１回投与しても２回以上投与してもよい。該組成物を２回以上投与する場合、該組成物を定期的に（例えば、１日１回、２日に１回、週１回、２週間に１回、月１回、６か月に１回、または年１回）投与しても、必要に応じて投与しても、不定期に投与してもよい。しかるべき投与頻度は（様々な因子の中でも特に、対象の宿主遺伝学的因子、年齢、性別、および健康状態もしくは疾患の状態によって左右され得る）、経験的に決定され得る。例えば、患者に１回量の該組成物を投与し、様々な時間において（例えば、１日後、２日後、１週間後、２週間後、１か月後）、その患者から採取した糞便試料中の該組成物の各細菌株のレベルが測定され得る。細菌のレベルが、例えばその最大値の半分に低下したとき、２回目の投与を実施する、など。
【００８６】
該細菌組成物を含む製品（医薬品、飲食品または試薬）またはその説明書は、その製品が免疫を抑制するために用いられる旨を説明する書類または記載（製品が免疫抑制作用を有する旨の記載および製品がエフェクターＴ細胞の増殖や機能を抑制する作用を有する旨の記載を含む）を付したものであり得る。ここで「製品またはその説明書に注意書きを付す」は、製品の本体、容器、包装などに書類または記載を付すこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物をはじめとする印刷物などに注意書きを付すことを意味する。
【００８７】
＜制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する方法＞
前述の通り、および実施例に示す通り、該細菌組成物を個体に投与することにより、該個体において制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導することができる。これにより、個体において制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する方法が提供され、該方法は、以下のものからなる群より選択される少なくとも１種類の物質を該個体に投与することを含む：（ａ）クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２；（ｂ）本明細書に記載／列挙されている少なくとも１種類（１種類、１種類以上）の細菌の培養上清；（ｃ）本明細書に記載／列挙されている（１種類以上の、少なくとも１種類の）細菌に由来する生理活性物質；または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちのいずれか２つもしくは３つの組合せ。該個体には制御性Ｔ細胞の増殖、集積または増殖と集積の両方を誘導する所望の効果を得るのに十分な量で該細菌組成物を投与（提供）する。該細菌組成物は、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、および感染症から選択される少なくとも１つの疾患の治療、該疾患の重症度の軽減または該疾患の予防を必要とする個体に投与してよい。
【００８８】
「個体」または「対象」は健常状態であっても罹患状態であってもよいことに留意されたい。該方法は、少なくとも１種類（１種類、１種類以上）の抗生物質を、該細菌組成物の前にまたはこれと組み合わせて投与する段階をさらに含み得る。投与する抗生物質は、例えば、グラム陰性菌を減少させる抗生物質のような、クロストリジウム類のグラム陽性菌による消化管への再定着を促進する抗生物質であり得る。このような抗生物質の例としては、アミノグリコシド系抗生物質（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、トブラマイシンおよびパロモマイシン）、セファロスポリン系抗生物質（セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォキソチン）、スルホンアミド、アンピシリン、およびストレプトマイシンが挙げられる。
【００８９】
さらに、アーモンド皮、イヌリン、オリゴフルクトース、ラフィノース、ラクチュロース、ペクチン、へミセルロース（例えば、キシログルカン、αグルカン）、アミロペクチン、および難消化性デンプンなどの上部消化管では分解されず、腸管内で腸内細菌の生育を促すプレバイオティクス組成物、ならびにアセチル−ＣｏＡ、ビオチン、ビート糖蜜、および酵母抽出物などの増殖因子は、クロストリジウム類に属する組成物中の細菌種の増殖に選択的に寄与する。個体において制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する方法は、上記物質から選択される少なくとも１種類の物質を該細菌組成物と組み合わせて該個体に投与することを含み得る。このほか、本明細書では、該細菌組成物とプレバイオティクス組成物とを含む組成物を考慮する。
【００９０】
上記抗生物質、および上記プレバイオティクス組成物または増殖因子は組み合わせて用いてもよい。さらに、治療用組成物を、該細菌組成物、抗生物質、およびプレバイオティクス組成物または増殖因子からなる群より選択される少なくとも１種類の物質とともに個体に投与してもよい。
【００９１】
治療用組成物としては、例えば、コルチコステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニゾン、メトトレキサート、抗ヒスタミン、グルココルチコロイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、抗ロイコトリエン、抗コリン鼻炎薬、抗コリン充血除去剤、肥満細胞安定化剤、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体、ワクチン（好ましくは、アレルゲンの量を徐々に増加させるワクチン接種に用いられるワクチン）、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、またはエタネルセプトなどの抗ＴＮＦ阻害剤、およびその組み合わせからなる群から選択される１つの治療用組成物が挙げられる。ここに挙げた治療用組成物は、該細菌組成物の前に、該細菌組成物と組み合わせて、または該細菌組成物の後に投与でき、さらに任意選択で、抗生物質、プレバイオティクス組成物、増殖因子または抗生物質、プレバイオティクス組成物および増殖因子の任意の組合せと組み合わせて投与できる。
【００９２】
該細菌組成物、「抗生物質」、および「プレバイオティクス組成物または増殖因子」からなる群から選択される少なくとも１種類の物質と治療用組成物との併用については特に制限はない。例えば、「１種類の物質」と治療用組成物とを同時に、または適宜順次に／個々に個体へ経口投与または非経口投与する。
【００９３】
該細菌組成物の投与が制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導するかどうかは、制御性Ｔ細胞の数、大腸のＴ細胞群における制御性Ｔ細胞の割合、制御性Ｔ細胞の機能、または制御性Ｔ細胞のマーカーの発現のうち少なくとも１つが増加または増強していることを指標として判定できる。具体的な方法は、生検もしくは血液試料などの患者試料におけるＦｏｘｐ３発現Ｔｒｅｇの数もしくは割合、該細菌組成物を投与した個体のＩＬ−１０発現の促進（増強）、ＣＴＬＡ４発現の促進（増強）、ＩＤＯ発現の促進（増強）、ＩＬ−４発現の抑制、または定着を制御性Ｔ細胞の増加もしくは集積の誘導の指標として測定することである。
【００９４】
このような発現を検出する方法としては、転写レベルでの遺伝子発現の検出にはノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、およびドットブロット法；翻訳レベルでの遺伝子発現の検出にはＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、イムノブロッティング法、免疫沈降法、およびフローサイトメトリーが挙げられる。
【００９５】
このような指標を測定するのに用いられる試料としては、個体から採取した組織および体液、例えば生検で得られた血液、および糞便試料などが挙げられる。
【００９６】
＜組成物による治療に対する個体の応答をモニターすることにより個体の細菌組成物に対する応答を予測する方法＞
このほか、患者試料（例えば、大腸生検または糞便試料）中のクロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌種の量（例えば、計数）または割合を決定する方法を記載する。ある個体において、上記リストから選択される細菌の割合または計数が健常個体（例えば、自己免疫疾患、アレルギー病態、癌、臓器拒絶反応などの該細菌組成物で治療する可能性のある疾患または病態を有さない／有することが確認されていない個体）について同様の判定を実施して得られたベースライン値よりも低い場合、その個体は該細菌組成物に応答する可能性があると判定される。この判定を、例えば臨床医が用いて、個体または患者が該細菌組成物による治療から利益を得る可能性があるかどうかを判定したり、あるいは臨床試験に含める個体または患者を選択したりできる。次いで、臨床医は個体または患者が治療による利益を得る可能性があるという判定を踏まえて、その個体または患者に該細菌組成物を投与することができる。この判定はほかにも、記載の細菌組成物による治療に対する個体の応答をモニターする方法として用いることが可能であり、ここでは、該細菌組成物による治療後に測定値が（治療前の測定値と比べて）高くなっていれば、それはその個体が治療に良好に応答したことを示す（例えば、その個体における定着および免疫抑制増強に成功したことのプラスの指標となる）。任意選択で、ここに記載した予測およびモニタリングの方法は、個体試料中のクロストリジウムクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属し該細菌組成物中に存在しない他の共生種の割合または絶対数を測定する段階をさらに含んでよく、ここでは、治療前のベースライン値よりも低いことが治療に対する正の応答の可能性がより高いことを示し、また治療後の値の増加は、その個体が治療に良好に応答したことを示す。ここに記載した予測およびモニタリングの方法では、微生物叢の組成を決定するために様々な既知の方法を用いることができる。例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列決定を用いることができる。
【００９７】
＜ワクチンアジュバント組成物およびワクチン組成物の使用により感染症または自己免疫疾患を治療または予防する方法＞
前述の通り、また実施例に示すように、クロストリジウム類に属する細菌による大腸におけるＴｒｅｇ細胞の誘導は、局所および全身の免疫応答において重要な役割を果たしている。該細菌組成物は、アジュバントとして使用しワクチン製剤の効果を向上させることもできる。一実施形態では、該細菌組成物はワクチンのアジュバントとして（例えば、アレルゲンの量を徐々に増加させるワクチン接種プロトコルのアジュバントとして）自己免疫疾患またはアレルギー疾患の予防または治療に使用できる。
【００９８】
自己免疫疾患およびアレルギー疾患の例としては、＜制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物＞において「対象疾患の具体例」として記載したものが挙げられる。
【００９９】
その他の実施形態
このほか、該細菌組成物は抗生物質治療も受けている個体にも投与することができる。本発明者らは、バンコマイシンまたはメトロニダゾールなどのＧｒａｍ＋細菌に作用する抗生物質が、クロストリジウム類に属する細菌種を哺乳動物の消化管から効果的に排除するか大幅に減少させ、その結果、制御性Ｔ細胞のレベルを低下させることが可能であることを示した（実施例５、図３０）。理論に束縛されることを望むものではないが、クロストリジウム類に属する細菌の免疫寛容の維持における重要な役割は、それらの細菌の不在またはレベル低下が、免疫寛容の不全を特徴とする自己免疫疾患に重要な役割を果たし得ることを強く示すものである。したがって、Ｇｒａｍ＋細菌に対する抗生物質による治療を受けている個体（例えば、Ｃ．ディフィシル（C.difficile）およびジアルジア（Giardia）などの病原体による感染症の治療を受けている個体）では、クロストリジウム類に属する細菌が失われるリスクが高いため免疫寛容不全がみられるが、予防手段として該細菌組成物の使用により「再生息」させることが可能である。該細菌組成物は抗生物質治療前、抗生物質治療と同時、または抗生物質治療後のいずれにも用いることが可能であるが、抗生物質治療と同時または抗生物質治療後に用いるのが好ましい。該細菌組成物は、残留抗生物質に対するその耐性を向上させるため、芽胞型で投与するのが好ましい。グラム陽性菌に対する抗生物質としては、特に限定されないが、バンコマイシン、メトロニダゾール、リネゾリド、ラモプラニン、フィダキソマイシン、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキソチン、セフプロジル、セフトビプロール）；フルオロキノロン系抗生物質（シプロ、レバキン、フロキシン、テクイン、アベロックス、ノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、メチシリン）；およびカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム）が挙げられる。
【０１００】
＜Ｔｒｅｇ誘導生物を選択する方法＞
ほかにも、Ｔｒｅｇを誘導することができる細菌を得る方法を記載し、この方法は、（１）哺乳動物、好ましくはヒトから得られた糞便または生検試料から細菌の芽胞形成画分を分離すること（例えば、クロロホルム処理または熱処理によって）；（２）任意選択で、非ヒト哺乳動物、好ましくは無菌非ヒト哺乳動物に芽胞形成画分を経口投与すること；（３）任意選択で、この非ヒト哺乳動物から糞便試料を採取し、この糞便試料の希釈（例えば、体積で１０倍、１００倍、１，０００倍または１０，０００倍に希釈する）によって希釈糞便試料を作製し、この希釈試料を第二の無菌非ヒト哺乳動物に経口投与することであり、この任意選択の段階（３）は２回以上繰り返されてもよい、（４）（１）で得られた芽胞形成画分または（３）の非ヒト哺乳動物の腸内容物試料の段階希釈物を、好気条件または偏性嫌気条件下でプレートに播くこと、および（５）この培養プレートから単一のコロニーを選択することを含む。このコロニーを、実施例に記載する方法などの既知の方法を用いて、細菌が制御性Ｔ細胞の増殖および／または制御性Ｔ細胞の集積を誘導する能力についてさらに評価してもよい。
【０１０１】
以下に記載するのは、特定の態様を説明するための例である。これらは決して限定することを意図したものではない。
【０１０２】
なお、実施例で用いたマウスは下記の通りに準備または作製した。以下の説明では、マウスを「ＳＰＦ」または「ＧＦ」と称することがある。この「ＳＰＦ」および「ＧＦ」は、特定の病原菌の非存在下（ＳＰＦ）、および無菌下（ＧＦ）でそれぞれ維持されたマウスであることを示す。
【０１０３】
＜マウス＞
ＳＰＦまたはＧＦ条件下で維持されたＣ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃおよびＩＱＩマウスを三協ラボサービス（日本）、ＳＬＣ（日本）、クレア（日本）、またはジャクソン研究所（ＵＳＡ）から購入した。ＧＦマウスおよびノトバイオートマウスを東京大学、ヤクルト中央研究所、または三協ラボサービスのノトバイオート施設内で繁殖させ維持した。Ｍｙｄ８８−／−、Ｒｉｐ２−／−およびＣａｒｄ９−／−マウスをＮＰＬ１〜３に記載されている通りに作製し、遺伝的背景がＣ５７ＢＬ／６になるよう戻し交配を８代以上行った。Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰマウスをジャクソン研究所から購入した。
【０１０４】
＜Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウス＞
Ｉｌ１０プロモーターの制御下にＩｌ１０およびＶｅｎｕｓがコードされるバイシストロニックな領域を作製するために、最初にターゲティングコンストラクトを作製した。具体的には、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）に続いて、配列内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、黄色蛍光蛋白質（Ｖｅｎｕｓ）、およびＳＶ４０ポリＡシグナル（ＳＶ４０ポリＡ）からなるカセット（ＩＲＥＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＳＶ４０ポリＡシグナルカセット、非特許文献４参照）をＩｌ１０遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル（エクソン５）との間に挿入した。次いで、得られたターゲティングコンストラクトを用いて、マウスゲノム内のＩｌ１０遺伝子領域との相同組み換えを生じさせた。このようにして、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓアレルを有するＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスを作製した（図１参照）。なお、図１中、「ｔｋ」はチミジンキナーゼをコードする遺伝子を表し、「ｎｅｏ」はネオマイシン耐性遺伝子を表し、「ＢａｍＨ１」は制限酵素ＢａｍＨ１による切断部位を表す。
【０１０５】
Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスからゲノムＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨ１で処理し、図１に示すプローブを用いてサザンブロッティングを行った。得られた結果は図２に示す。野生型およびＩｌ１０ｖｅｎｕｓのアレルがそれぞれ１９ｋｂおよび５．５ｋｂの大きさのバンドとして検出された。したがって、得られた結果から明らかなように、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスのゲノムに相同組み換えが生じた。
【０１０６】
さらに、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸粘膜固有層のＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ−細胞またはＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ＋細胞をソーティングした。次いで、後述の方法にてＡＢＩ７３００システムによるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現量を調べた。ＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ＋細胞でのみＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現が検出されたことから、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスでのＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現がＶｅｎｕｓの発現として正確に反映されていることが明らかになった。なお、上述Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの無菌状態は、実験動物中央研究所（川崎、日本）で確立された。この無菌状態のＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスを三協ラボサービス（東京、日本）のビニルアイソレーター内で維持し、のちの実施例で用いた。
【０１０７】
実施例の実験および解析を以下の通りに実施した。
【０１０８】
＜マウス細菌のマウスへの定着およびその解析の方法＞
ＮＰＬ５、６の記載に従って、ＳＦＢまたはクロストリジウムを定着させたマウスを作製した。得られたノトバイオートマウスの盲腸内容物または糞便を滅菌水または嫌気性希釈液に溶かした。溶かした盲腸内容物または糞便をそのままあるいはクロロホルム処理後にＧＦマウスに経口投与した。乳酸桿菌属細菌３株およびバクテロイデス属細菌１６株をＢＬおよびＥＧ寒天培地で嫌気的に別々に培養した。培養した細菌を回収して嫌気性ＴＳ培地に懸濁し、ＧＦマウスに強制経口投与した。マウスにおける細菌定着の状態を、糞便塊の塗沫標本を顕微鏡で観察することにより評価した。
【０１０９】
＜腸固有層リンパ球の単離およびフローサイトメトリー＞
小腸および大腸を採取し縦方向に切開した。盲腸も分離し、盲腸内容物をそのまま−８０℃で凍結するか、２ｍｌのＰＢＳに懸濁した後４０％グリセロールを加え（最終濃度２０％）、液体窒素で急速凍結し使用するまで−８０℃で保管した。大腸および小腸をＰＢＳで洗浄して管腔内容物をすべて除去し、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＨａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中、３７℃で２０分間振盪した。ピンセットを用いて上皮細胞、筋肉層および脂肪組織を除去した後、固有層を小片に細切し、振盪している水浴中、４％ウシ胎仔血清、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ、０．５ｍｇ／ｍｌディスパーゼおよび４０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（すべてRoche Diagnostics社製）を含有するＲＰＭＩ１６４０とともに３７℃で１時間インキュベートした。消化した組織を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＨＢＳＳで洗浄し、４０％パーコール（GE Healthcare）５ｍｌに再懸濁し、１５ｍｌのFalconチューブに入れた８０％パーコール２．５ｍｌに重層した。２５℃、８００ｇで２０分間の遠心分離によりパーコール勾配分離を実施した。固有層リンパ球をパーコール勾配の境界面から回収し、氷冷ＰＢＳに懸濁した。制御性Ｔ細胞の解析のため、単離リンパ球をLIVE/DEAD fixable violet死細胞染色キット（Invitrogen）で標識して解析での死細胞を除去した。細胞をＰＢＳ、２％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０９％ＮａＮ３を含有する染色緩衝液で洗浄し、ＰＥＣｙ７標識抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５、BD Biosciences）で表面ＣＤ４を染色した。Ｆｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの細胞内染色は、Ａｌｅｘａ７００標識抗Ｆｏｘｐ３抗体（ＦＪＫ−１６ｓ、eBioscience）、Ａｌｅｘａ６４７標識抗Ｈｅｌｉｏｓ（２２Ｆ６、eBioscience）およびFoxp3 Staining Buffer Set（eBioscience）を用いて実施した。Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞の解析のため、単離リンパ球を、５０ｎｇ／ｍｌホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ、Sigma）および１μｇ／ｍｌイオノマイシン（Sigma）でGolgiStop（BD Biosciences）存在下にて４時間刺激した。４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、LIVE/DEAD fixable violet死細胞染色キットで標識し、ＰＥＣｙ７標識抗ＣＤ４抗体で表面ＣＤ４を染色した。細胞を洗浄し、Cytofix/Cytopermで固定し、Perm/Wash緩衝液（BD Biosciences）で透過処理し、ＡＰＣ標識抗ＩＬ−１７抗体（ｅＢｉｏ１７Ｂ７、eBioscience）およびＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ−γ抗体（ＸＭＧ１．２、BD Biosciences）で染色した。抗体で染色された細胞をLSR Fortessa（BD Biosciences）で解析し、Flow Joソフトウェア（Treestar）を用いてデータを解析した。
【０１１０】
＜リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ＞
RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて調製したＲＮＡから、ＭＭＶ逆転写酵素（Promega）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをPower SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）およびABI 7300 real time PCR system（Applied Biosystems）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、またはSYBR Premix Ex Taq（TAKARA）およびLightCycler 480を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで解析した。各サンプルについて、得られた値をＧＡＰＤＨ量で正規化した。プライマーセットをPrimer Express Version 3.0（Applied Biosystems）を用いて設計し、初期評価で９０％以上の配列一致性を示したものを選択した。用いたプライマーセットは以下の通りである：
Ｆｏｘｐ３
５’−ＧＧＣＡＡＴＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号１）
５’−ＧＧＧＴＣＧＣＡＴＡＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴＴＧ−３’（配列番号２）
ＣＴＬＡ４
５’−ＣＣＴＴＴＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＴ−３’（配列番号３）
５’−ＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧ−３’（配列番号４）
ＧＩＴＲ
５’−ＴＣＡＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号５）
５’−ＡＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＡＣＡ−３’（配列番号６）
ＩＬ−１０
５’−ＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴ−３’（配列番号７）
５’−ＣＴＴＣＴＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡ−３’（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ
５’−ＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧＴＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号９）
５’−ＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＣＡＡ−３’（配列番号１０）
Ｍｍｐ２
５’−ＧＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１１）
５’−ＣＴＴＧＴＣＡＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号１２）
Ｍｍｐ９
５’−ＴＣＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＧＴＧＧ−３’（配列番号１３）
５’−ＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１４）
Ｍｍｐ１３
５’−ＡＧＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＣＴＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号１５）
５’−ＴＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１６）
Ｉｄｏ１
５’−ＡＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧ−３’（配列番号１７）
５’−ＡＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１８）。
【０１１１】
＜大腸腸上皮細胞（ＩＥＣ）の調製および培養＞
最初に大腸を採取し、縦方向に切開し、ＰＢＳですすいだ。次いで、大腸を振盪器上、３７℃で３０分間、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理した後、１分間ボルテックスすることにより、上皮の統合性を崩壊させた。解離した腸上皮細胞（ＩＥＣ）を回収し、２０％パーコール５ｍｌに懸濁し、１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに入れた８０％パーコール２．５ｍｌに重層した。次いで、チューブを２５℃、７８０ｇで２０分間遠心し、パーコール密度勾配遠心分離による細胞分離を行った。境界面の細胞を回収し、大腸ＩＥＣ（純度９０％以上、生存率９５％）として使用した。回収して得られたＩＥＣを１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩに懸濁し、１×１０５個のＩＥＣを２４ウェルプレートで２４時間培養した。その後、培養上清を回収し、活性型ＴＧＦ−β１のレベルをＥＬＩＳＡ（Promega）によって測定した。
【０１１２】
またインビトロＴ細胞培養のため、ＭＡＣＳ精製脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を９６ウェル丸底プレートで各ウェル１．５×１０５個ずつ、ＧＦマウスまたはクロストリジウム定着マウスから単離したＩＥＣを培養した５０％駲化培地、および２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−２(Peprotech）とともに、２５μｇ／ｍｌ  抗ＴＧＦ−β抗体（R&D）存在下または非存在下で培養した。丸底プレートには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（BD Bioscience）１０μｇ／ｍｌを結合させた。５日間の培養後、ＣＤ４＋Ｔ細胞を回収し、リアルタイムＰＣＲに供した。
【０１１３】
＜大腸炎実験モデル＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２週齢）にクロストリジウム定着マウスの糞便懸濁液を経口投与し、通常の環境で６週間飼育した。
【０１１４】
ＤＳＳ誘導大腸炎モデル作製のため、マウスに６日間、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＤＳＳ（試薬等級、ＤＳＳ塩、分子量＝３６〜５０ｋＤ、MP Biomedicals社製）を飲料水とともに与えた。
【０１１５】
またオキサゾロン誘導大腸炎モデル作製のため、マウスを、３％オキサゾロン（４−エトキシメチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／１００％エタノール溶液１５０μｌの経皮塗布により前感作した。その５日後、１％オキサゾロン／５０％エタノール溶液１５０μｌを前感作マウスの直腸内に浅麻酔下で再投与した。なお、直腸内投与は３．５Ｆカテーテルを用いて行った。
【０１１６】
各マウスの体重、潜血、肉眼で確認できる出血、および便の硬さを毎日分析した。さらに、"S.Wirtz, C.Neufert, B.Weigmann, M.F.Neurath, Nat Protoc 2,541(2007)"の記載に従って、体重減少率、腸内出血（出血なし、潜血（ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ＋）、または肉眼で確認できる出血）、および便の硬さ（正常便、軟便、または下痢）を数値で評価し、疾患活動性指数（ＤＡＩ）を算出した。
【０１１７】
＜ＯＶＡ特異的ＩｇＥ反応＞
クロストリジウム定着マウス（２週齢）の糞便懸濁液をＢＡＬＢ／ｃ  ＳＰＦマウスに接種し、コンベンショナルな環境で飼育した。次いで、ＯＶＡ（グレードＶ、Ｓｉｇｍａ）１μｇおよびミョウバン（Thermo Scientific）２ｍｇを全量０．２ｍｌでマウス（４週齢および６週齢時）の腹腔内に注射した。このマウスの尾の付け根から血清を毎週回収し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥをＥＬＩＳＡ（Chondrex）によって測定した。次いで、８週齢時に脾細胞を回収し、９６ウェルプレートに各ウェル１×１０６個ずつ播き、ＯＶＡ（１００μｇ／ｍｌ）で３日間刺激した。その後、培養上清を回収し、ＩＬ−４およびＩＬ−１０レベルをＥＬＩＳＡ（R&D）によって測定した。
【０１１８】
＜統計解析＞
対照群と実験群との間の差をスチューデントｔ検定によって評価した。
【０１１９】
＜クロロホルム処理およびＧＦマウスへの糞便試料の経口接種＞
健常被験者（日本人、男性、２９歳）のヒト糞便（２ｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２０ｍｌで懸濁し、７０μｍの細胞ストレーナーに通し、凝集物および残滓を除去した。次いで、クロロホルムを加えて、または加えずに糞便懸濁物を混合し（最終濃度３％）、振盪している水浴で６０分間インキュベートした。クロロホルム処理を行っていない糞便懸濁物を無菌（ＧＦ）マウスに経口接種した（２５０μｌ／マウス）。Ｎ２ガスを３０分間通気することによってクロロホルムを蒸発させた後、ヒト腸内細菌のクロロホルム耐性（芽胞形成）画分を含有するアリコートをＩＱＩ  ＧＦマウスに接種した。各ｅｘ−ＧＦマウス群をビニルアイソレーター内で３週間または４週間別々に飼育した。
【０１２０】
＜同居実験＞
Ｔｒｅｇ誘導ヒト細菌が水平に伝達し得るかどうかを評価するため、ＩＱＩ  ＧＦマウスをクロロホルム処理したヒト糞便で定着させたｅｘ−ＧＦマウス（実施例２１のマウス）と４週間、ビニルアイソレーターで同居させた（マウス＃Ｄ１〜＃Ｄ６と命名した６個体）。
【０１２１】
＜ＧＦマウスへの希釈盲腸内容物の接種＞
クロロホルム処理したヒト糞便を接種したｅｘ−ＧＦマウス（＃Ｃ４）の凍結盲腸内容物を１０倍体積（ｗ／ｖ）のＰＢＳに懸濁し、７０μｍの細胞ストレーナーに通し、３％クロロホルムで処理した。次いで、懸濁物をＰＢＳで２０００倍（マウス＃Ｅ１〜＃Ｅ４と命名した４個体）または２００００倍（マウス＃Ｆ１〜＃Ｆ８と命名した８個体）に希釈し、ＧＦ  ＩＱＩマウスに経口接種した（細胞２．５×１０５個または２．５×１０４個／２５０μｌ／マウス）。４週間後、大腸および小腸からリンパ球を回収し、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合およびそのＨｅｌｉｏｓ発現を解析した。盲腸内容物を凍結し、使用まで−８０℃で保管した。
【０１２２】
＜再定着実験＞
２００００倍希釈物を接種したｅｘ−ＧＦマウス（＃Ｆ３、７および８）の凍結盲腸内容物を１０倍体積（ｗ／ｖ）のＰＢＳに懸濁し、７０μｍ細胞ストレーナーに通し、３％クロロホルムで処理した。懸濁物をＧＦ  ＩＱＩマウス（マウス＃Ｇ１〜＃Ｇ５、＃Ｈ１〜＃Ｈ４または＃Ｉ１〜＃Ｉ４と命名したそれぞれ５個体、４個体または４個体のマウス）に経口接種した。４週間後、大腸および小腸を回収し、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合およびそのＨｅｌｉｏｓ発現を解析した。盲腸内容物を２０％グリセロール溶液に懸濁し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保管した。
【０１２３】
＜培養細菌の定着実験＞
＃Ｇ２マウスの盲腸内容物のグリセロールストックをＰＢＳで希釈し、ＢＬ寒天プレートに播いた。４８時間後、プレートスクレーパーでプレートをかき取って全細菌コロニーを回収し、ＧＦ  ＩＱＩマウス（マウス＃Ｋ１〜＃Ｋ４と命名した４個体）に接種した。ＢＬ寒天プレートを用いて、＃Ｆ８マウスの盲腸内容物の凍結ストックから６菌株が単離された。これらの単離された菌株をＧＦ  ＩＱＩマウス（マウス＃Ｊ１〜＃Ｊ４と命名した４個体）に接種した。（培養方法の詳細については後述する）。
【０１２４】
＜１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の定量ＰＣＲ解析＞
QIAamp DNA Stool mini kit（QIAGEN）を用いて、上記健常被験者のヒト糞便（ヒト糞便）、クロロホルム処理したヒト糞便を強制経口投与したＧＦマウスの盲腸内容物（Ｂ−４マウスの盲腸内容物）またはＳＰＦ  ＩＣＲマウスの糞便（ＳＰＦマウスの糞便）から細菌ゲノムＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡを定量ＰＣＲの鋳型として使用した。増幅プログラムは、９５℃で１分間を１サイクル、次いで９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間を５０サイクルで構成された。LightCycler480（Roche）を用いて定量ＰＣＲ解析を実施した。ΔＣｔ法により相対量を算出し、総細菌量に対し正規化した。以下のプライマーセットを用いた：総細菌、５’−ＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧ−３’（配列番号４５）および５’−ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号４６）；クロストリジウムクラスターＸＩＶａ（クロストリジウム・ココイデス（Clostridium coccoides）亜群）、５’−ＡＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＡＡ−３’（配列番号４７）および５’−ＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＧＡＡ−３’（配列番号４８）；クロストリジウムクラスターＩＶ（クロストリジウム・レプタム（Clostridium leptum））、５’−ＣＣＴＴＣＣＧＴＧＣＣＧＳＡＧＴＴＡ−３’（配列番号４９）および５’−ＧＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号５０）；バクテロイデス属、５’−ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣ−３’（配列番号５１）および５’−ＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号５２）；ビフィドバクテリウム属、５’−ＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号５３）および５’−ＴＧＡＴＡＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＣＡ−３’（配列番号５４）。クロロホルム処理したヒト糞便を強制経口投与したマウスでは、クロロホルム処理前のヒト糞便と比較して、クロストリジウムクラスターＸＩＶａおよびＩＶなどの芽胞形成細菌のレベルが高く、バクテロイデス属およびビフィドバクテリウム属などの非芽胞形成細菌が大幅に減少していたことに留意されたい。
【０１２５】
＜１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子メタ配列解析のための盲腸内容物からのＤＮＡの単離＞
Ａ１−１、Ａ２−４、Ｂ−４、Ｅ−３、Ｅ−７、Ｅ−８、Ｆ−２、Ｇ−３、Ｈ−３、Ｉ−３およびＪ−３の盲腸内容物を、４℃、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）とを含有するトリス−ＥＤＴＡ  １０ｍｌに懸濁した後、ＤＮＡ単離に使用した。細胞懸濁物にリゾチーム（ＳＩＧＭＡ、１５ｍｇ／ｍｌ）を加えた。穏やかにかき混ぜながら３７℃で１時間インキュベートした後、精製アクロモペプチダーゼ（Ｗａｋｏ）を加え（最終的に２０００単位／ｍｌ）、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞懸濁物にドデシル硫酸ナトリウム（最終的に１％）を加え、よくかき混ぜた。次いで、懸濁物にプロテイナーゼＫ（Merck）を加え（最終的に１ｍｇ／ｍｌ）、混合物を５５℃で１時間インキュベートした。高分子量ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール、および最後にポリエチレングリコール沈殿によって単離し精製した。
【０１２６】
＜１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のメタ配列＞
このＤＮＡのアリコートを細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定に用いた。（ｉ）４５４アダプター配列（下線部）と試料に特異的なエラー修正バーコード（１０塩基、太字）とユニバーサル細菌プライマー８Ｆとからなる修飾プライマー８Ｆ（５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ＋バーコード＋ａｇｒｇｔｔｔｇａｔｙｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号５５））ならびに
（ｉｉ）４５４アダプター配列（下線部）と細菌プライマー３３８Ｒとを含む修飾プライマー３３８Ｒ（５’−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧ＋ｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃｃｇｔａｇｇａｇｔ−３’（配列番号５６））を用いて、遺伝子の可変領域１〜２（Ｖ１〜２）にわたる約３３０ｂｐのアンプリコンを作製した。各糞便ＤＮＡ試料についてポリメラーゼ連鎖反応を実施した。各反応物５０μＬは、ＤＮＡ  ４０ｎｇ、１０×Ex Taq緩衝液（TAKARA）５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物５μｌ、Ex Taq  ０．２μｌおよび各プライマー０．２μＭを含んだ。ＰＣＲ条件は、９６℃で２分間実施する初期変性段階、次いで２０サイクルの変性（９６℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、４５秒）および増幅（７２℃、１分）、最後に７２℃で１０分間実施する増幅段階で構成された。次いで、各試料から作製したアンプリコンをAMPur XP（Beckman Coulter）を用いて精製した。ＤＮＡ量をQuant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen）およびTBS-380mini蛍光光度計（Turner Biosystems）を用いて定量した。増幅されたＤＮＡを454GS Junior（Roche）パイロシーケンシングの鋳型として用いた。配列決定は、GS Junior Titanium emPCR Kit-Lib-L、GS Junior Titanium Sequencing KitおよびGS Junior Titanium PicoTiterPlate Kit（すべてRoche社製）を製造業者の説明書（GS Junior Titanium Series、emPCR Amplification Method Manual-Lib-LおよびSequencing Method Manual）に従って用いて実施した。得られた配列（各試料について３４００のリードが得られた）を配列類似性（９７％超の同一性）に基づいてＯＴＵに分類した。各ＯＴＵの代表的な配列を、核酸データベース（Ribosomal Database Project）の配列とＢＬＡＳＴを用いて比較し、最近縁種を決定した。次いで、最近縁種に基づいてＯＴＵを種に分類した。近縁種の全データおよびリード数を表１に示す。
【０１２７】
＜細菌株の単離＞
＃Ｆ８、＃Ｇ２、＃Ｉ１および＃Ｋ３の盲腸内容物からの細菌株の単離を、好気性条件または偏性嫌気性条件（８０％Ｎ２、１０％Ｈ２、１０％ＣＯ２）下でＢＬ寒天プレート（Eiken Chemical）またはＥＧ寒天プレート上に盲腸試料の段階希釈物を播くことにより実施した。ＥＧ寒天プレートは以下の成分（１リットル当たりの量で表す）：肉エキス５００ｍｌ；プロテオースペプトンＮｏ．３（１０．０ｇ、Difco）；酵母抽出物（５．０ｇ、Ｄｉｆｃｏ）；Ｎａ２ＨＰＯ４（４．０ｇ）；Ｄ（＋）−グルコース（１．５ｇ）；可溶性デンプン（０．５ｇ）；Ｌ−シスチン（０．２ｇ）、Ｌ−システイン−ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ（０．５ｇ）；Ｔｗｅｅｎ８０（０．５ｇ）；Bacto Agar（１６．０ｇ、Difco）；ウマ脱線維素血液（５０ｍｌ）を含む培地を含有した。３７℃で２日または４日間培養した後、それぞれ単一のコロニーを取り出し、ＡＢＣＭブロスまたはＥＧ寒天プレートにより３７℃でさらに２日または４日間培養した。単離した菌株をＥＧストック培地（１０％ＤＭＳＯ）に回収し、−８０℃で保管した。単離した菌株の懸濁物をマウスに再接種するため、ＴＳ培地（トリプチカーゼダイズブロスｗ／ｏデキストロース２７．５ｇ、Ｎａ２ＣＯ３  ０．８４ｇ、Ｌ−システイン−ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、蒸留水１０００ｍｌ、ＮａＯＨでｐＨを７．２±０．２に調整、次いで、１１５℃で１５分間高圧滅菌した）。単離した菌株を同定するため、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列決定を実施した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、KOD FX（TOYOBO）を用いたコロニーＰＣＲによって増幅した。使用した１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子特異的プライマーペアは：８Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号５７））およびＣ．インドリス（C.indolis）、Ｃ．ボルテアエ（C.bolteae）、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、Ｌ．菌ＤＪＦ＿ＶＰ３０、Ａ．コリホミニス（A.colihominis）、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、Ｃ．ラバレンス（C.lavalense）、Ｃ．シンビオサム（C.symbiosum）およびＥ．コントルタム（E.contortum）に対して５１９Ｒ（５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ−３’（配列番号５８））またはＣ．サッカログミア（C.saccharogumia）、Ｃ．ラモーサム（C.ramosum）、Ｆ．プラウティ（F.plautii）、Ｃ．ハセワイ（C.hathewayi）、Ｃ．シンデンス（C.scindens）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）２３３５、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６およびｃｆ  クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５に対して１５１３Ｒ（５’−ＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号５９））であり、GeneAmp PCR System9700（Applied Biosystems）を用いて増幅した。増幅プログラムは、９８℃で２分間を１サイクル、次いで９８℃で１０秒、５７℃で３０秒および６８℃で４０秒を４０サイクルで構成された。Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE Healthcare）を用いて、反応混合物から各増幅ＤＮＡを精製した。配列解析は、BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）およびApplied Biosystems 3730xl  ＤＮＡ解析器（Applied Biosystems）を用いて実施した。得られた配列をＢＬＡＳＴを用いて核酸データベースの配列と比較し、最近縁種を決定した。全単離株の最近縁種お���び％同一性、最近縁種の属−種に関する情報、クロストリジウムクラスター、由来するマウスのＩＤ、類似性の最大値および単離株の培地を表２にまとめた。
【０１２８】
実施例１
まず、大腸粘膜固有層における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の集積が共生細菌に依存するものであるかどうかを検討した。具体的には、特定の病原菌の非存在下（ＳＰＦ）で飼育されたＢａｌｂ／ｃマウスの末梢リンパ節（ｐＬＮ）または該マウスの大腸もしくは小腸（ＳＩ）の粘膜固有層からリンパ球を単離した。ＣＤ４およびＦｏｘｐ３を抗体で染色した。次いで、ＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率をフローサイトメトリーを用いて解析した。結果から、特定の病原性微生物の非存在（ＳＰＦ）環境下で維持したマウスの消化管の粘膜固有層、特に大腸の粘膜固有層に、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が高頻度に存在することが明らかになった。さらに、大腸の粘膜固有層のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の数は生後３か月まで徐々に増加していくが、末梢リンパ節のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の数は生後２週から基本的に一定であることがわかった。
【０１２９】
実施例２
次に、実施例１で明らかになった大腸における経時的なＴｒｅｇ細胞の集積が腸内共生細菌の定着と関係するかどうかを検討した。具体的には、無菌（ＧＦ）またはＳＰＦ環境下で飼育したマウス（８週齢：Ｂａｌｂ／ｃマウス、ＩＱＩマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス）の小腸、大腸および末梢リンパ節から単離したリンパ球のＣＤ４およびＦｏｘｐ３の発現を解析した。３回以上の独立した実験でほぼ同じ結果が得られた。
【０１３０】
また、ＳＰＦマウスおよびＧＦマウス（Ｂａｌｂ／ＣマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウス）から粘膜固有層リンパ球を回収した。ＣＤ４およびＦｏｘｐ３を抗体で染色した。次いで、粘膜固有層リンパ球をＦＡＣＳにより解析した。
【０１３１】
さらに、抗生物質を水とともに８週間経口投与したマウス（ＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の大腸の粘膜固有層、小腸（ＳＩ）の粘膜固有層、パイエル板（ＰＰ）、および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からリンパ球を単離した。ＣＤ４およびＦｏｘｐ３を抗体で染色した。次いで、リンパ球をＦＡＣＳにより解析した。２回以上の独立した実験でほぼ同じ結果（個々のマウスのＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合）が得られた。なお、下記文献の記載に従って、以下の抗生物質を組み合わせて使用した：
アンピシリン（Ａ；５００ｍｇ／Ｌ、Sigma）
バンコマイシン（Ｖ；５００ｍｇ／Ｌ、NACALAI TESQUE,INC）
メトロニダゾール（Ｍ；１ｇ／Ｌ、NACALAI TESQUE,INC）
ネオマイシン（Ｎ；１ｇ／Ｌ、NACALAI TESQUE,INC）
Rakoff-Nahoum, J.Paglino, F.Eslami-Varzaneh, S.Edberg, R.Medzhitov, Cell 118,229（Jul 23, 2004）
Fagarasanら, Science 298, 1424（Nov 15, 2002）。
【０１３２】
結果から明らかなように、ＧＦマウスの小腸または末梢リンパ節におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞の頻度および絶対数は、ＳＰＦマウスと同等かそれ以上であった。また、抗生物質を８週間経口投与したＳＰＦマウスの小腸粘膜固有層、パイエル板、および腸間膜リンパ節のＴｒｅｇ細胞数は、抗体を投与しなかったＳＰＦマウスと同等かそれ以上であった。一方、ＧＦマウスの大腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞数は、ＳＰＦマウスよりも有意に減少していた。この減少は、異なる遺伝的背景のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、ＩＱＩ、Ｃ５７ＢＬ／６）でも、異なる動物施設で飼育したマウスでも共通して観察された。また、抗生物質を投与したＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞数が有意に減少することも明らかになった。
【０１３３】
実施例３
次に、実施例２で示されたＧＦマウスの大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞数の減少が、微生物叢が存在しないことに起因するかどうかを直接確認した。具体的には、ジャクソン研究所から購入したＢ６  ＳＰＦマウスの糞便懸濁物をＧＦ−ＩＱＩマウスに経口投与した（コンベンショナル化）。投与の３週間後、大腸粘膜固有層からリンパ球を単離し、ＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３の発現を解析した。結果は、小腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞数が変化しないことを示した。しかし、大腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞数は有意に増加した。したがって、大腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の集積には宿主と微生物との相互作用が重要な役割を果たしているのに対して、小腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞の集積には異なる機序があることが明らかになった。
【０１３４】
実施例４
次に、M.N.Kweonら, J Immunol 174, 4365（Apr 1, 2005）に記載されている方法に従って、マウス消化管関連リンパ組織と、大腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３＋細胞数との間の関係を検討した。具体的には、妊娠第１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスに、細胞外ドメイン組換えタンパク質（リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）とヒトＩｇＧ１のＦｃ部位との融合タンパク質（ＬＴβＲ−Ｉｇ）、Hondaら, J Exp Med 193, 621（Mar 5, 2001）参照）１００μｇを腹腔内注射した。このマウスから得られた胎児にも同じくＬＴβＲ−Ｉｇを腹腔内注射し、孤立リンパ小節（ＩＬＦ）、パイエル板（ＰＰ）、および大腸板（colonic-patch）（ＣＰ）が完全に除去されたマウスを作製した。次いで、ＬＴβＲ−Ｉｇで処置したマウス、およびラットＩｇＧで処置したマウス（対照）の大腸粘膜固有層のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合をＦＡＣＳにより分析した。結果は、孤立リンパ小節、パイエル板、および大腸板（colonic-patch）が欠損したマウス（ＬＴβＲ−Ｉｇで処置したマウス）の大腸粘膜固有層ではＦｏｘｐ３＋細胞の割合がむしろ増加していることを示す。したがって、ＧＦマウスおよび抗生物質で処置したマウスの大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞数の減少は、単に消化管関連リンパ組織の形成不全の二次的影響によるというより、大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞集積を促進し腸内細菌によって引き起こされる特定のシグナルの伝達が生じなかったためであることが示唆された。
【０１３５】
実施例５
特定の腸内細菌叢が大腸Ｔｒｅｇ細胞の集積を誘導するのかどうかを検討するため、ＳＰＦマウス（４週齢〜）にグラム陽性菌に対する抗生物質としてバンコマイシン、またはグラム陰性菌に対する抗生物質としてポリミキシンＢを４週間投与し、ＣＤ４＋細胞群におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合（ＣＤ４における［％］Ｆｏｘｐ３＋）を分析した。結果は、バンコマイシンを投与したマウスの大腸のＴｒｅｇ細胞数が対照よりも著明に減少していることを示す。これに対して、ポリミキシンＢを投与したマウスのＴｒｅｇ細胞数には何ら影響はみられなかった。以上の事実は、Ｔｒｅｇ細胞の集積にグラム陽性の共生細菌が主要な役割を果たしていることを示唆した。
【０１３６】
実施例６
最近の報告から、腸のＴ細胞応答に芽胞形成性細菌が重要な役割を果たしていることが示唆されている（V. Gaboriau-Routhiauら，Immunity 31, 677（Oct 16, 2009）参照）。そこで、３％クロロホルムに耐性を示す糞便微生物（芽胞形成細菌画分）をＧＦマウスに経口投与し、次いで、ＣＤ４＋細胞群におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合（ＣＤ４における［％］Ｆｏｘｐ３＋）について分析した。
【０１３７】
クロロホルム処理した糞便投与の３週間後、投与したマウスのＴｒｅｇ細胞の数はＳＰＦマウスおよび無処理の糞便を強制投与したＧＦマウスと同レベルまで著明に増加していた。
【０１３８】
したがって、実施例５に示した結果と考え合わせると、常在微生物叢の特定の構成細菌がグラム陽性群に属している可能性が高く、芽胞形成画分がＴｒｅｇ細胞の誘導に重要な役割を果たしていること明らかになった。
【０１３９】
実施例７
次に、実施例４〜６で示唆された大腸Ｔｒｅｇ細胞の集積を誘導する腸内細菌の種を同定した。具体的には、ＧＦ−Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはＧＦ−ＩＱＩマウスに、分節した糸状菌（ＳＦＢ）、バクテロイデス属細菌１６株（Ｂａｃｔｅｒｏ．（Ｂ．ブルガタス（B. vulgatus）６株、Ｂ．アシディファシエンス（B. acidifaciens）群１  ７株、およびＢ．アシディファシエンス（B. acidifaciens）群２  ３株））、乳酸桿菌属細菌３株（Ｌａｃｔｏ．（Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）、およびＬ．マリナム（L. murinum））、およびクロストリジウム属細菌４６株（Ｃｌｏｓｔ．"Itoh, K.およびMitsuoka,T. Characterization of clostridia isolated from faeces of limited flora mice and their effect on caecal size when associated with germ-free mice.Lab.Animals 19:111-118 (1985)）"参照）、またはコンベンショナルな環境で飼育したマウス（ＳＰＦ）から採取した微生物叢を経口投与した。マウスをビニルアイソレーター内で３週間維持した。次いで、このマウスから大腸および小腸のＣＤ４細胞を単離した。大腸および小腸のＴｒｅｇ細胞数をフローサイトメトリーにより分析した。
【０１４０】
クロストリジウム属に属する細菌を、以下に示す通り、１６ＳｒＲＮＡの配列を決定することにより分類した。具体的には、細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子特異的プライマーペア：
５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号：６０）および５’ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ−３’（配列番号：６１）（T.Aebischerら, Vaccination prevents Helicobacter pylori-induced alterations of the gastric flora in mice. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 46, 221-229 (2006)参照）を用いたＰＣＲにより増幅した。次いで、１．５ｋｂのＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターに挿入した。ClustalWソフトウェアプログラムを用いて、挿入物の配列を決定し配列比較した。これにより得られた、クロストリジウム属細菌４６株のうちの菌株１〜４１に由来する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を配列番号２１〜６１に示す。クロストリジウム４１株の配列とＧｅｎｂａｎｋデータベースから得られた既知の細菌の配列をもとにＭｅｇａソフトウェアを用いた近隣結合法により系統樹を構築した。
【０１４１】
結果は、分節した糸状菌（ＳＦＢ）を定着させたＧＦマウスでは大腸のＴｒｅｇ細胞数に何ら影響が認められないことを示した。また、乳酸桿菌属細菌３株のカクテルを定着させたマウスでもほぼ同じ結果が得られた。一方、クロストリジウム属細菌４６株を定着させたマウスでは、大腸粘膜固有層のＦｏｘｐ３＋細胞の集積が強力に誘導されたことが明らかになった。重要なことに、このような集積はマウスの遺伝的背景とは関係なく促進され、ただ一つの細菌属の腸内細菌の定着にも関わらず、ＳＰＦマウスとほぼ同数まで増加された。また、クロストリジウムの定着は小腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞数を変化させないことも明らかになった。バクテロイデス属細菌１６株を定着させた場合にも大腸のＴｒｅｇ細胞数が有意に増加したことに注目されたい。しかし、その増加の程度は定着させたマウスの遺伝的背景によって異なっていた。
【０１４２】
実施例８
次に、ＳＰＦマウス、ＧＦマウス、乳酸桿菌定着マウス、およびクロストリジウム定着マウスの胸腺および大腸のＬＰリンパ球におけるＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、およびＨｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリーにより解析した。結果は、ＳＰＦマウスまたはクロストリジウム定着マウスに認められたＦｏｘｐ３＋細胞のほとんどがＨｅｌｉｏｓを発現しなかったことを示す。Ｈｅｌｉｏｓは胸腺由来ナチュラルＴｒｅｇ細胞に発現することが知られている転写因子である（A.M.Thorntonら, J Immunol 184, 3433（Apr 1, 2010）参照）ことに注目されたい。したがって、ＳＰＦマウスおよびクロストリジウム定着マウスに認められたＴｒｅｇ細胞のほとんどが末梢部で誘導されたＴｒｅｇ細胞（いわゆるｉＴｒｅｇ細胞）であることが示唆された。
【０１４３】
実施例９
次に、クロストリジウムなどの定着が他のＴ細胞に影響を及ぼすかどうかを検討した。具体的には、ＧＦ  ＩＱＩマウスにＳＦＢ、バクテロイデス属細菌（Ｂａｃｔｅｒｏ．）１６株、クロストリジウム属細菌（Ｃｌｏｓｔ．）４６株、またはコンベンショナルな環境（ＳＰＦ）下で飼育したマウスから採取した微生物叢を定着させた。３週間後、これらのマウスから大腸粘膜固有層のリンパ球を単離し、Golgistop（BD Bioscience）の存在下、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間刺激した。刺激を与えた後、cytofix/cytopermキット（BD Bioscience）の説明書に従い、抗ＩＬ−１７  ＰＥ抗体（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）および抗ＩＦＮ−ｇ  ＦＩＴＣ抗体（BD Bioscience）を用いて細胞内サイトカインを染色した。次いで、ＣＤ４＋白血球におけるＩＦＮ−γ＋細胞またはＩＬ−１７＋細胞の割合をフローサイトメトリーにより分析した。結果は、クロストリジウムの定着は大腸のＴｈ１細胞（ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋細胞）には何ら影響を及ぼさず、Ｔｈ１７細胞（ＣＤ４＋ＩＬ−１７＋細胞）をわずかに増加させるにとどまったことを示す。したがって、クロストリジウム属はＴｒｅｇ細胞を特異的に誘導する細菌属であることが示唆された。
【０１４４】
実施例１０
クロストリジウムの４６株が大腸におけるＣＤ８＋腸管上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の集積に影響を及ぼすことが報告されている。したがって、クロストリジウムは様々な側面で免疫系を調節し、前述の通り、特に大腸におけるＴｒｅｇ細胞の誘導および維持に著明な能力を発揮すると考えられる。ほかにも、サイトカインの一種であるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）がＴｒｅｇ細胞発生の調節に重要な役割を果たしていることが知られている。
【０１４５】
そこで、クロストリジウムの定着がＴＧＦ−βの豊富な大腸環境をもたすのかどうかを検討した。具体的には、まずＧＦマウス、クロストリジウム定着マウス、および乳酸桿菌定着マウスの全大腸を２４時間培養し、その培養上清の活性型ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１）濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（分析個体数は各群４匹ずつ）。
【０１４６】
結果は、ＧＦマウスおよび乳酸桿菌定着マウスの大腸よりもクロストリジウム定着マウスの大腸の方がＴＧＦ−βの産生量が有意に多かったことを示す。
【０１４７】
次に、ＧＦマウスおよびクロストリジウム定着マウスの腸上皮細胞（ＩＥＣ）を２４時間培養し、その培養上清の活性型ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１）濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（分析個体数は各群４匹ずつ）。
【０１４８】
結果は、クロストリジウム定着マウスから単離されたＩＥＣの培養上清にＴＧＦ−βが検出されたが、ＧＦマウスから単離されたＩＥＣの培養上清にはＴＧＦ−βが検出されなかったことを示す。
【０１４９】
次に、前述の通り、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＴＧＦ−β抗体の存在下または非存在下で、ＧＦマウスまたはクロストリジウム定着マウスから単離したＩＥＣを培養した５０％駲化培地および抗ＣＤ３抗体とともに５日間培養した。次いで、Ｔ細胞を回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＦｏｘｐ３の発現を解析した。
【０１５０】
結果は、クロストリジウム定着マウス由来のＩＥＣの培養上清を脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞に添加すると、Ｆｏｘｐ３発現細胞への分化が促進されたことを示す。一方、Ｔｒｅｇ細胞への分化は抗ＴＧＦ−β抗体によって阻害された。
【０１５１】
潜在型ＴＧＦ−βの活性化に寄与すると考えられているＭＭＰ２、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１３の発現を調べた。Ｔｒｅｇ細胞の誘導に関与すると考えられているインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現も調べた。具体的には、無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにクロストリジウム属の細菌株（Ｃｌｏｓｔ．）４６株、または乳酸桿菌属の細菌株（Ｌａｃｔｏ．）３株を経口投与した。投与の３週間後、ＩＥＣを採取し、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、およびＩＤＯ遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって解析した（解析個体数は各群３匹ずつ）。
【０１５２】
潜在型ＴＧＦ−βの活性化と上記ＭＭＰとの関係については、D’Angeloら, J. Biol. Chem. 276, 11347-11353, 2001；Heidingerら, Biol. Chem. 387, 69-78, 2006；Yuら, Genes Dev. i4, 163-176, 2000  を参照されたい。ＩＤＯとＴｒｅｇ細胞誘導との関係については、G. Matteoliら, Gut 59, 595（May, 2010）を参照されたい。
【０１５３】
結果は、前述のＴＧＦ−β産生と一致して、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１３をコードする遺伝子の転写産物は、ＧＦマウスおよび乳酸桿菌定着マウスのＩＥＣと比較してクロストリジウム定着マウス由来のＩＥＣで高レベルに発現したことを示す。
【０１５４】
さらに、ＩＤＯはクロストリジウム定着マウスにのみ発現した。
【０１５５】
したがって、クロストリジウムがＩＥＣを活性化し、これにより大腸内でＴＧＦ−βおよび他のＴｒｅｇ細胞誘導分子が産生されることが明らかになった。
【０１５６】
実施例１１
次に、クロストリジウムの定着によって誘導されるＴｒｅｇ細胞の集積が、病原体関連分子パターン認識受容体によるシグナル伝達に依存しているかどうかを検討した。具体的には、Ｍｙｄ８８−／−（Ｍｙｄ８８（Ｔｏｌｌ様受容体のシグナル伝達アダプター）が欠損）、Ｒｉｐ２−／−（Ｒｉｐ２（ＮＯＤ受容体アダプター）が欠損）、およびＣａｒｄ９−／−（Ｃａｒｄ９（デクチン−１シグナル伝達に不可欠なシグナル伝達因子）が欠損）の各ＳＰＦマウスの大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞数を調べた。さらに、Ｍｙｄ８８−／−ＧＦマウスにクロストリジウム属細菌を定着させ、Ｔｒｅｇ細胞数の変化を調べた。結果は、病原体関連分子パターン認識受容体の関連因子が欠損した各種ＳＰＦマウスのＴｒｅｇ細胞の数は、対照とした野生型同腹子と比較して変化しなかったことを示す。また、Ｍｙｄ８８欠損ＧＦマウスにクロストリジウム属細菌を定着させると、大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞の集積が誘導されることがわかった。したがって、大腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞集積を誘導する機序は、ほとんどの細菌によって引き起こされる主要な病原体関連分子パターン認識経路の活性化ではなく、特定の共生細菌種に依存することが示唆された。
【０１５７】
実施例１２
腸管Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞はＩＬ−１０産生を介して一部の免疫抑制機能を発揮することが知られている（ＮＰＬ９参照）。また、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞からＩＬ−１０が特異的に除去されている動物は炎症性腸疾患を発症することが知られている（ＮＰＬ１８参照）。そこで、まず各種組織のリンパ球におけるＩＬ−１０の発現を調べた。具体的には、ＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの各種組織からリンパ球を単離し、フローサイトメトリーによりＣＤ４およびＶｅｎｕｓの発現を解析した。
【０１５８】
Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスから大腸粘膜固有層のリンパ球を単離し、ＦＡＣＳにより細胞表面でのＴ細胞受容体β鎖（ＴＣＲβ）発現を検出した。
【０１５９】
Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスから大腸粘膜固有層のリンパ球を単離した。リンパ球をGolgistop（BD Bioscience）の存在下、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間刺激した。刺激を与えた後、cytofix/cytopermキット（BD Bioscience）の説明書に従い、抗ＩＬ−１７  ＰＥ抗体、抗ＩＬ−４  ＡＰＣ抗体（１１Ｂ１１）および抗ＩＦＮ−ｇ  ＦＩＴＣ抗体（BD Bioscience）を用いて細胞内サイトカインを染色した。
【０１６０】
また、Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスの脾臓（Ｓｐｌ）からＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞およびＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋細胞を単離し、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸粘膜固有層および小腸（ＳＩ）粘膜固有層からＶｅｎｕｓ＋細胞を単離した。得られた各細胞を所定の遺伝子発現について解析した。遺伝子発現はPower SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）およびABI 7300リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ここで、各細胞の値をＧＡＰＤＨ量で正規化した。
【０１６１】
結果は、Ｖｅｎｕｓ＋細胞（ＩＬ−１０産生細胞）が、ＳＰＦ条件下で維持されたマウスの頸部リンパ節（末梢リンパ節）、胸腺、末梢血、肺、および肝臓ではほとんど検出されなかったことを示す。一方、Ｖｅｎｕｓ＋細胞は同マウスの脾臓、パイエル板および腸間膜リンパ節でわずかに検出された。これに対して、小腸および大腸の粘膜固有層リンパ球にはＶｅｎｕｓ＋細胞が多数認められた。また、腸のＶｅｎｕｓ＋細胞のほとんどがＣＤ４陽性であり、Ｔ細胞受容体β鎖（ＴＣＲβ）陽性でもあった。Ｖｅｎｕｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ２型（ＩＬ−４産生）、Ｔｈ１７型（ＩＬ−１７産生）のいずれの表現型も示さなかったが、Ｆｏｘｐ３ならびに細胞障害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ−４）およびグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）などのその他のＴｒｅｇ細胞関連因子を発現することがわかった。腸内Ｖｅｎｕｓ＋細胞でのＣＴＬＡ−４の発現レベルは、Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスから単離された脾臓のＧＦＰ＋Ｔｒｅｇ細胞でのレベルよりも高いことが明らかになった。
【０１６２】
実施例１３
Ｖｅｎｕｓ＋細胞は細胞内のＦｏｘｐ３発現に基づいて、少なくとも２つのサブセット、すなわちＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋二重陽性（ＤＰ）Ｔｒｅｇ細胞とＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−Ｔｒｅｇ細胞に分類することができる。後者のサブセットの細胞は１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１）に相当する（ＮＰＬ８および９参照）。そこで、実施例８で観察されたＶｅｎｕｓ＋細胞（ＩＬ−１０産生細胞）についてＦｏｘｐ３の発現を調べた。具体的には、ＧＦまたはＳＰＦ条件下で飼育したＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸および小腸の粘膜固有層におけるＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、およびＶｅｎｕｓの発現をＦＡＣＳにより解析し、腸管粘膜固有層のＶｅｎｕｓ＋細胞数をＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスとＧＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスとの間で比較した。
【０１６３】
また、ＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの各種組織のＣＤ４細胞における細胞内ＶｅｎｕｓおよびＦｏｘｐ３の発現をフローサイトメトリーにより解析した。
【０１６４】
共生細菌の存在が消化管の制御性細胞におけるＩＬ−１０発現に何らかの影響を及ぼすかどうかを検討するため、無菌（ＧＦ）Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスを作製した。次いで、得られたＧＦＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスに所定の細菌種を定着させた。細菌を定着させてから３週間後、大腸および小腸でＦｏｘｐ３および／またはＶｅｎｕｓが発現しているＣＤ４＋細胞群（Ｖ＋Ｆ−、Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−細胞；Ｖ＋Ｆ＋、Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋細胞；Ｖ−Ｆ＋、Ｖｅｎｕｓ−Ｆｏｘｐ３＋細胞）をフローサイトメトリーにより解析した。
【０１６５】
共生細菌の存在が消化管の制御性細胞におけるＩＬ−１０発現に何らかの影響を及ぼすかどうかを確認するため、抗生物質を１群当たり５匹または６匹のＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスに水とともに１０週間投与した。以下の抗生物質を組み合わせて使用した。
アンピシリン（Ａ；５００ｍｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）
バンコマイシン（Ｖ；５００ｍｇ／Ｌ、ＮＡＣＡＬＡＩ  ＴＥＳＱＵＥ，ＩＮＣ．）
メトロニダゾール（Ｍ；１ｇ／Ｌ、ＮＡＣＡＬＡＩ  ＴＥＳＱＵＥ，ＩＮＣ．）
ネオマイシン（Ｎ；１ｇ／Ｌ、ＮＡＣＡＬＡＩ  ＴＥＳＱＵＥ，ＩＮＣ．）
【０１６６】
次いで、大腸の粘膜固有層、小腸（ＳＩ）の粘膜固有層、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、およびパイエル板（ＰＰ）のリンパ球のＣＤ４およびＦｏｘｐ３を抗体で染色し、ＦＡＣＳにより解析した。結果は、ほぼ同じ結果を与える２回以上の独立した実験から得た。
【０１６７】
結果は、ＳＰＦマウスの小腸粘膜固有層にはＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−細胞、すなわちＴｒ１様細胞が多数存在し、大腸にはＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋ＤＰ  Ｔｒｅｇ細胞が高頻度で存在していたことを示す。これに対して、他の組織にも十分な数のＦｏｘｐ３＋細胞が観察されたが、その細胞のほとんどでＶｅｎｕｓの発現は認められなかった。
【０１６８】
また、大腸のＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−、Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋、およびＶｅｎｕｓ−Ｆｏｘｐ３＋のすべての制御性Ｔ細胞分画は、ＧＦ条件下で有意に減少していることが明らかになった。さらに、抗生物質で処理したＳＰＦＩＩ１０Ｖｅｎｕｓマウスでも同様にＶｅｎｕｓ＋細胞の減少が認められた。
【０１６９】
クロストリジウム属細菌の定着は、大腸のＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−、Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋、およびＶｅｎｕｓ−Ｆｏｘｐ３＋すべての制御性Ｔ細胞分画を強力に誘導し、その誘導の程度はＳＰＦマウスのものと同程度であった。また、乳酸桿菌属細菌３株の定着およびＳＦＢの定着が大腸のＶｅｎｕｓ＋および／またはＦｏｘｐ３＋細胞数に及ぼす影響はごくわずかであることがわかった。さらに、バクテロイデス属細菌１６株の定着もＶｅｎｕｓ＋細胞を誘導したが、定着の影響はＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−Ｔｒ１様細胞に特異的であった。これに対して、試験したいずれの細菌種も、小腸粘膜固有層のＩＬ−１０産生細胞数に何ら有意な影響を及ぼさないことがわかった（図２６参照）。
【０１７０】
したがって、大腸に定着したクロストリジウム属の細菌または該細菌に由来する生理活性物質が、ＩＬ−１０＋制御性Ｔ細胞の大腸粘膜固有層への集積またはＴ細胞のＩＬ−１０発現を誘導するシグナルをもたらすことが明らかになった。小腸のＶｅｎｕｓ＋細胞数は、共生細菌が存在しないか減少している状況による影響をあまり受けず、ＩＬ−１０＋制御性細胞（Ｔｒ１様細胞）は共生細菌とは関係なく小腸粘膜固有層に集積することが明らかになった。
【０１７１】
実施例１４
クロストリジウム属細菌によって誘導されたＶｅｎｕｓ＋細胞が、ＳＰＦマウス大腸のＶｅｎｕｓ＋細胞と同様の免疫抑制機能を有するかどうかを検討した。具体的には、脾臓から単離したＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞（エフェクターＴ細胞、Ｔｅｆｆ細胞）を平底９６ウェルプレートに２×１０４個／ウェルで播種し、３０Ｇｙ放射線照射で処理した２×１０４個の脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞（抗原提示細胞）、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および多数のＴｒｅｇ細胞とともに３日間培養した。さらに、最後の６時間は［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加してＣＤ４＋ＣＤ２５−を培養した。なお、実施例１４で用いたＴｒｅｇ細胞は、Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスの脾臓から単離されたＣＤ４＋ＧＦＰ＋Ｔ細胞、またはクロストリジウム細菌を定着させたＧＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスもしくはＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸粘膜固有層のＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ＋Ｔ細胞であった。次いで、［３Ｈ］−チミジンの取込み量によって細胞の増殖を測定し、毎分のカウント（ｃｐｍ）値で示した。
【０１７２】
結果は、クロストリジウム属細菌を定着させたマウスのＶｅｎｕｓ＋ＣＤ４＋細胞がインビトロでのＣＤ２５−ＣＤ４＋活性型Ｔ細胞の増殖を抑制したことを示す。この抑制活性は、Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスから単離されたＧＦＰ＋細胞にわずかに劣るものの、ＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスから単離されたＶｅｎｕｓ＋細胞と同程度であった。したがって、クロストリジウム属の細菌は、十分な免疫抑制活性を有するＩＬ−１０発現Ｔ細胞を誘導することによって、大腸における免疫恒常性の維持に重要な役割を果たしていることが明らかになった。
【０１７３】
実施例１５
次に、大量のクロストリジウムの定着が局所性免疫応答およびその結果生じるＴｒｅｇ細胞の増殖に及ぼす影響を検討した。
【０１７４】
＜デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導大腸炎モデル＞
まず、前述の通りにＤＳＳ誘導大腸炎モデルを作製し、クロストリジウムの接種およびＴｒｅｇ細胞の増殖がモデルマウスに及ぼす影響を検討した。具体的には、対照マウスおよびクロストリジウム接種マウスを２％ＤＳＳで処理した後、６日間、体重の減少、便の硬さおよび出血を観察および測定し、数値により評価した。また、６日目に大腸を回収し、解剖し、ＨＥ染色により組織学的に分析した。
【０１７５】
結果は、体重減少および直腸出血などの大腸炎の症状が、大量のクロストリジウムを有するマウス（以下、「クロストリジウム豊富マウス」とも称する）で、対照マウス（コンベンショナルな環境で６週間飼育し、糞便懸濁物を接種しなかったＣ５７ＢＬ／６マウス）と比較して有意に抑制されたことを示す。大腸の短縮、浮腫および出血などの大腸炎症に典型的なすべての特徴は、クロストリジウム豊富マウスに比して対照マウスで著明に認められた。さらに、粘膜びらん、浮腫、細胞浸潤、および陰窩欠損などの組織学的特徴については、ＤＳＳ処置したクロストリジウム豊富マウスの方が対照マウスよりも重症度が低かった。
【０１７６】
＜オキサゾロン（ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）誘導大腸炎モデル＞
次に、前述の通りにオキサゾロン誘導大腸炎モデルを作製し、クロストリジウムの接種およびＴｒｅｇ細胞の増殖がモデルマウスに及ぼす影響を検討した。具体的には、対照マウスおよびクロストリジウム接種マウスをオキサゾロンで感作した後、直腸の内側を１％オキサゾロン／５０％エタノール溶液で処理した。次いで、体重減少を観察し測定した。さらに、大腸を解剖し、ＨＥ染色により組織学的に分析した。
【０１７７】
結果は、対照マウスでは持続的な体重減少を伴って大腸炎が進行したことを示す。一方、クロストリジウム豊富マウスでは体重減少が軽減されていた。また、クロストリジウム豊富マウスの大腸では、粘膜びらん、浮腫、細胞浸潤、および出血などの組織学的疾患を有する部位が減少していることも明らかになった。
【０１７８】
実施例１６
次に、大量のクロストリジウムの定着およびその結果生じるＴｒｅｇ細胞の増殖が全身性免疫応答（全身性ＩｇＥ産生）に及ぼす影響を検討した。具体的には、前述の通り、対照マウスおよびクロストリジウム接種マウスを、ミョウバンに吸着させた卵白アルブミン（ＯＶＡ）を２週間間隔で２回投与することにより免疫した。次いで、これらのマウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＯＶＡ特異的ＩｇＥのレベルを調べた。また、各群のマウスから脾細胞を採取し、インビトロでのＯＶＡ再刺激によるＩＬ−４およびＩＬ−１０の産生を調べた。
【０１７９】
結果は、ＩｇＥレベルがクロストリジウム豊富マウスで対照マウスよりも有意に低かったことを示す。さらに、ＯＶＡおよびミョウバンで感作したクロストリジウム豊富マウスの脾細胞では、対照マウスに比してＯＶＡの再刺激によるＩＬ−４産生量が減少しＩＬ−１０産生量が増加した。
【０１８０】
したがって、実施例１５に示した結果と考え合わせると、クロストリジウムによる大腸でのＴｒｅｇ細胞の誘導は局所性および全身性の免疫応答に重要な役割を果たしている。
【０１８１】
実施例１７
次に、クラスターＩＶに属するクロストリジウム３菌株（図４９に記載した菌株２２、２３および３２）をＧＦ  Ｂａｌｂ／ｃマウスに定着させた。３週間後、大腸のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞をＦＡＣＳにより解析した。結果は、クロストリジウム３菌株を定着させたノトバイオートマウスにおけるＴｒｅｇ細胞の誘導パターンが、ＧＦマウスと全４６株を接種したマウスの中間のパターンを示したことを示す。
【０１８２】
実施例１８
次に、マウスから採取した糞便試料の芽胞形成画分と同様に、ヒトから採取した糞便試料の芽胞形成（例えば、クロロホルム耐性）画分が制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する効果を有するかどうかを検討した。
【０１８３】
健常被験者（日本人、男性、２９歳）のヒト糞便をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で懸濁し、クロロホルム（最終濃度：３％）と混合した後、振盪している水浴中で６０分間インキュベートした。Ｎ２ガスを通気することによってクロロホルムを蒸発させた後、ヒト腸内細菌のクロロホルム耐性（例えば、芽胞形成）画分を含有するアリコートを無菌（ＧＦ）マウス（ＩＱＩ、８週齢）に経口接種した。処置したマウスをビニルアイソレーター内で３週間飼育した。大腸を採取し、縦方向に切開し、洗浄して糞便内容物を除去し、３７℃で２０分間、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で振盪した。上皮細胞および脂肪組織を除去した後、大腸を細片化し、４％ウシ胎児血清、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ、０．５ｍｇ／ｍｌディスパーゼおよび４０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（いずれもRoche Diagnostics社製）を含有するＲＰＭＩ１６４０とともに３７℃で１時間、浸透している水浴中でインキュベートした。消化した組織を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＨＢＳＳで洗浄し、４０％パーコール（GE Healthcare社製）５ｍｌに再懸濁し、１５ｍｌ  Falconチューブに入れた８０％パーコール２．５ｍｌに重層した。２５℃、７８０ｇで２０分間遠心分離することにより、パーコール勾配分離を実施した。境界面の細胞を回収し、ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０９％ＮａＮ３を含有する染色緩衝液に懸濁し、フィコエリシン標識抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５、BD Biosciences社製）で細胞表面のＣＤ４を染色した。Ｆｏｘｐ３の細胞内染色は、Ａｌｅｘａ６４７標識抗Ｆｏｘｐ３抗体（ＦＪＫ−１６ｓ、eBioscience社製）およびFoxp3 Staining Buffer Set（eBioscience社製）を用いて実施した。ＣＤ４陽性リンパ球の集団におけるＦｏｘｐ３陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより解析した。
【０１８４】
結果は、ヒト腸内細菌の芽胞形成（例えば、クロロホルム耐性）画分をＧＦマウスに定着させると、マウスの大腸粘膜固有層でＦｏｘ３＋制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の集積が誘導されたことを示す。
【０１８５】
次に、クロロホルム処理したヒト糞便の強制経口投与により、どのような細菌種が増殖するかを調べた。
【０１８６】
具体的には、QIAamp DNA Stoolミニキット（QIAGEN社製）を用いて、前述の健常被験者のヒト糞便（ヒト糞便）またはクロロホルム処理したヒト糞便を投与したＧＦマウスの糞塊（ＧＦ＋Ｃｈｌｏｒｏ．）から細菌のゲノムＤＮＡを単離した。LightCycler480（Roche社製）を用いて定量的ＰＣＲ分析を実施した。デルタＣｔ法により相対量を算出し、総細菌量、希釈度、および試料重量に対し正規化した。以下のプライマーセットを用いた：
総細菌
５’−ＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧ−３’（配列番号：６２）および
５’−ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号：６３）
クロストリジウムクラスターＸＩＶａ（クロストリジウム・ココイデス（Clostridium coccoides）亜群）
５’−ＡＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＡＡ−３’（配列番号：６４）および
５’−ＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＧＡＡ−３’（配列番号：６５）
クロストリジウムクラスターＩＶ（クロストリジウム・レプタム（Clostridium leptum））
５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴ−３’（配列番号：６６）および
５’−ＣＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＴＴＧＴＣＡＡ−３’（配列番号：６９）
バクテロイデス属
５’−ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣ−３’（配列番号：６７）および
５’−ＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号：６８）。
【０１８７】
結果は、クロロホルム処理したヒト糞便を強制経口投与したものでは、クロロホルム処理前のヒト糞便に比して、クロストリジウムクラスターＸＩＶａおよびＩＶなどの芽胞形成細菌が大量に存在し、またバクテロイデス属などの非芽胞形成細菌が大幅に減少していたことを示す。
【０１８８】
実施例１９
健常被験者（日本人、男性、２９歳）のヒト糞便（２ｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２０ｍｌで懸濁し、クロロホルムを加えて、または加えずに混合し（最終濃度３％）、振盪している水浴で６０分間インキュベートした。次いで、Ｎ２ガスを３０分間通気することによってクロロホルムを蒸発させた。未処理のヒト糞便（「ｈｕＵＴ」と命名）およびクロロホルム処理したヒト糞便（「ｈｕＣｈｌｏｒｏ」と命名）の懸濁物を無菌（ＧＦ）マウス（ＩＱＩ、８週齢）に経口接種した（２５０μｌ／マウス）。ｈｕＵＴ懸濁物は＃Ａ１〜＃Ａ４の番号を付したＧＦマウス４個体に接種し、ｈｕＣｈｌｏｒｏ懸濁物は＃Ｂ１〜＃Ｂ４の番号を付したＧＦマウス４個体に接種した。このよう糞便の懸濁物などを接種したＧＦマウスを以後、「ｅｘ−ＧＦマウス」とも呼ぶ。マウスがさらに微生物で汚染されるのを避けるため、ｅｘ−ＧＦマウスの各群をビニルアイソレーターで別々に飼育した。３週間後、各マウスから小腸および大腸粘膜固有層のリンパ球を別々に採取し、フローサイトメトリーにより表面のＣＤ４および細胞内のＦｏｘｐ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの発現を調べた。細胞内ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの染色には、単離リンパ球をインビトロでＰＭＡおよびイオノマイシンにより４時間刺激した。Ｆｏｘｐ３はＴｒｅｇ細胞の分化および機能に不可欠な転写因子である。ＨｅｌｉｏｓはＩｋａｒｏｓ転写因子ファミリーのメンバーであり、Ｈｅｌｉｏｓ−Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は末梢で誘導されるＴｒｅｇ細胞［いわゆる誘導されたＴｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞］であることが示唆されている。図１Ａ〜１Ｄに示されるように、小腸および大腸粘膜固有層のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合は、両群のｅｘ−ＧＦマウスでＧＦマウスよりも増加していた。両群のｅｘ−ＧＦマウスで、小腸および大腸のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞におけるＨｅｌｉｏｓ−細胞の割合の著明な増加も観察された。注目すべきことに、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞以外にも、ｅｘＧＦ＋ｈｕＵＴマウスではＩＬ−１７発現ＣＤ４＋細胞（すなわち、Ｔｈ１７細胞）の有意な集積が観察されたのに対して、ｅｘＧＦ＋ｈｕＣｈｌｏｒｏマウスではそれがわずかに観察されるにとどまった（図１Ｅ、１Ｆ）。両群マウスともに、ＣＤ４＋細胞におけるＩＦＮ−γ＋細胞の割合に変化は認められなかった（図１Ｅ、１Ｇ）。
【０１８９】
実施例２０
死菌もまたＴｒｅｇ細胞の誘導に影響を及ぼすかどうかを検討するため、クロロホルム処理したヒト糞便の懸濁物を高圧滅菌し（１２１℃で２０分間）、ＧＦマウスに経口接種した（週１回を４週間）。４週間後、マウスを屠殺し、各マウスの大腸粘膜固有層のリンパ球をフローサイトメトリーによりＣＤ４、Ｆｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの発現について調べた。図２に示されるように、死菌の接種は、Ｆｏｘｐ３＋細胞数にもＨｅｌｉｏｓ−Ｆｏｘｐ３＋細胞数にも何ら影響を及ぼさなかった。これらの結果は接種した死菌の量が不十分であった可能性を否定するものではないが、Ｔｒｅｇ細胞の誘導には生菌が必要であることを示唆している。
【０１９０】
実施例２１
クロロホルム耐性細菌によるＴｒｅｇ細胞の誘導を裏付けるため、同じ被験者から別の日に糞便を新たに採取し、クロロホルムで処理し、ＩＱＩ  ＧＦマウス（＃Ｃ１〜Ｃ７の番号を付した７個体）に接種した。３〜４週間後、＃Ｃ１〜＃Ｃ５のマウスを屠殺し、各マウスから小腸および大腸粘膜固有層のリンパ球を別々に採取し、フローサイトメトリーによりＣＤ４およびＦｏｘｐ３の発現について調べた。実施例１９の結果と一致して、クロロホルム処理したヒト糞便を用いた定着により、大腸および小腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の集積が有意に誘導された（図３）。これらの結果は、クロロホルム耐性の芽胞形成細菌が腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞の分化、増殖および／または動員を誘導し得ることをさらに裏付けるものである。
【０１９１】
実施例２２
ヒト腸内細菌のクロロホルム耐性の芽胞形成画分によるＴｒｅｇ細胞の誘導が水平に伝達可能かどうかを試験するため、ＩＱＩ  ＧＦマウス（＃Ｄ１〜＃Ｄ６の番号を付した６個体）を４週間、マウス＃Ｃ６および＃Ｃ７とビニルアイソレーター内の同じケージで同居させた。大腸および小腸の粘膜固有層リンパ球を単離し、ＣＤ４およびＦｏｘｐ３について調べた。同居させたマウスでＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合の有意な増加がみられた（図４）。したがって、ヒト腸内細菌によるＴｒｅｇ細胞誘導は水平に伝達可能である。これらの結果から、Ｔｒｅｇ細胞の誘導には腸内微生物叢のわずかな構成細菌よりもむしろ大量の構成細菌が役割を果たしていると考えられる。
【０１９２】
実施例２３
マウス＃Ｃ４の盲腸内容物の凍結ストックを解凍し、１０倍体積（ｗ／ｖ）のＰＢＳに懸濁し、７０μｍの細胞ストレーナーに通した。次いで懸濁物を３％クロロホルムで処理し、ＰＢＳで２０００倍または２００００倍に希釈し、ＧＦ  ＩＱＩマウスに経口接種した（それぞれ、細菌細胞２．５×１０５個または２．５×１０４個／２５０μｌ／個体）。２０００倍希釈試料は４個体（ｅｘＧＦ＋２０００と命名し、＃Ｅ１〜＃Ｅ４の番号を付した）に経口接種し、２００００倍希釈試料は８個体（ｅｘＧＦ＋２００００と命名し、＃Ｆ１〜＃Ｆ８の番号を付した）に接種した。３週間後、腸粘膜固有層のリンパ球を単離し、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓについて調べた。２０００倍希釈試料、２００００倍希釈試料ともに、腸粘膜固有層において同程度にＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞の著明な集積を誘導した（図５）。したがって、経口接種する細菌の量は、２．５×１０４細菌細胞未満に最小化できる。
【０１９３】
実施例２４
マウス＃Ｆ３、＃Ｆ７または＃Ｆ８の盲腸内容物の凍結ストックを、１０倍体積（ｗ／ｖ）のＰＢＳに懸濁し、７０μｍの細胞ストレーナーに通し、３％クロロホルムで処理した。次いで、マウス＃Ｆ３の糞便懸濁物をＧＦマウス５個体（＃Ｇ１〜＃Ｇ５の番号を付した）に、マウス＃Ｆ７の糞便懸濁物をＧＦマウス４個体（＃Ｈ１〜＃Ｈ４の番号を付した）に、マウス＃Ｆ８の糞便懸濁物をＧＦマウス４個体（＃Ｉ１〜＃Ｉ４の番号を付した）に経口接種した。４週間後、大腸および小腸粘膜固有層のリンパ球を単離し、フローサイトメトリーによりＣＤ４、Ｆｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの発現を調べた。＃Ｆ、＃Ｇおよび＃Ｈのいずれのマウスでも、腸粘膜固有層のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合が未処置ＧＦマウスに比して有意に増加した（図６）。したがって、ｅｘＧＦ＋２００００マウスでのヒト腸内細菌定着によるＴｒｅｇ細胞誘導も伝達可能である。さらに、のちのメタ１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定のデータ（図８）に示されるように、これらのマウスには、２０種の既知の細菌（Ｃ．アミノフィラム（C.aminophilum）、Ｈ．サックガロボランス（H.saccgarovorans）、Ｅ．フィシカテナ（E.fissicatena）、Ｈ．フィリホルミス（H.filiformis）、Ｃ．クロストリディイフォルメ（C.clostridioforme）、Ｃ．インドリス（C.indolis）、Ｃ．ボルテアエ（C.bolteae）、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、Ｌ．菌ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、Ｃ．ラバレンス（C.lavalense）、Ｃ．シンビオサム（C.symbiosum）、Ｅ．コントルタム（E.contortum）、Ｃ．サッカログミア（C.saccharogumia）、Ｃ．ラモーサム（C.ramosum）、Ｆ．プラウティ（F.plautii）、Ｃ．シンデンス（C.scindens）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）２３３５、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６およびｃｆ  クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５）と１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列類似性を有する細菌が共通してみられた。
【０１９４】
実施例２５
＃Ｆ８マウスの盲腸内容物の凍結ストックを好気性条件下、０．８５％ＮａＣｌで段階希釈し、ＢＬ寒天上に播いた。３７℃で２日または４日間培養した後、単一コロニーが５０個観察された。５０コロニーのうち、２９コロニーを取り出し、ＡＢＣＭブロスにより３７℃でさらに２日または４日間培養し、ＥＧストック培地（１０％ＤＭＳＯ）中で−８０℃にて保管した。各コロニーのゲノムＤＮＡを単離し、１６Ｓ  ｒＲＮＡコード遺伝子配列を解析した。各コロニーの１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列から、調べたこの２９コロニーが３つの菌株によって表され、それぞれがクロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）と１００％の類似性、クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）と９９．７５％の類似性、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）と１００％の類似性、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）と９９．１７％の類似性、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）と９９．２３％の類似性、またはクロストリジウム菌種（Clostridium sp.）２３３５と９９．６６％の類似性を有することが明らかになった。元の５０コロニーから選択した２９コロニーには、クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、およびフラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）のみが存在していた（それぞれ２５コロニー、３コロニーおよび１コロニー）。これらの３つの単離株を増殖させ、混合し、ＧＦ  ＩＱＩマウス（＃Ｊ１〜Ｊ４の番号を付した４個体）に接種した。３〜４週間後、大腸粘膜固有層のリンパ球を採取し、フローサイトメトリーによりＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、およびＨｅｌｉｏｓの発現について調べた。Ｆｏｘｐ３＋細胞またはＨｅｌｉｏｓ−細胞は、３つの細菌株の大腸への定着により誘導されず、または誘導されてもごくわずかであった（図７）。これらの結果は、クロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）とクロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）（ともにクラスターＸＶＩＩＩに含まれる）の組み合わせは、マウスの大腸でのＴｒｅｇ細胞の誘導に十分ではないことを示唆する。フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）は選択した２９コロニーのうち１コロニーのみを代表する菌株であったため、その効果は明らかでなかった。
【０１９５】
実施例２６
実施例１９で実施した方法と同様に、＃Ｇ２マウスの盲腸内容物の凍結グリセロールストックをＰＢＳで懸濁し、ＢＬ寒天プレート上に播き、４８時間インキュベートした。実施例１９とは異なり、プレート上の全細菌をプレートスクレーパーでかき取って回収し、ＴＳブロスに懸濁し、ＧＦ  ＩＱＩマウス（＃Ｋ１〜＃Ｋ４の番号を付した４個体）に接種した。この実験に使用した細菌懸濁物には、プレート上で増殖はしなかったが生き延びた細菌が含まれていたことに留意する必要がある。４週間後、Ｋ１〜Ｋ４マウスの大腸および小腸から粘膜固有層のリンパ球を単離し、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの発現について調べた。全４個体において、腸粘膜固有層のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合（図９Ａ、９Ｂ）およびＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞におけるＨｅｌｉｏｓ−細胞の割合（図９Ａ、９Ｃ）が未処置ＧＦマウスに比して有意に増加した。ＢＬ寒天プレート上で増殖した細菌６株を接種したマウスでＴｒｅｇ細胞が誘導されなかったことを考えると、プレート上で増殖はしなかったが生き延びた細菌がＴｒｅｇ細胞の誘導に関与している可能性もある。
【０１９６】
実施例２７
マウス＃Ａ１、＃Ｃ４、＃Ｆ８、＃Ｇ２、＃Ｈ３、＃Ｉ３、＃Ｊ３および＃Ｋ３の盲腸内容物から細菌ＤＮＡを抽出した。細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の可変領域１〜２（Ｖ１〜２）をＰＣＲによって増幅し、メタ配列決定の鋳型として使用した。得られた配列（各試料について３４００リード）を配列類似性（９７％超の同一性）に基づいて操作的分類単位（ＯＴＵ）に分類した。各ＯＴＵの代表的な配列をＢＬＡＳＴを用いて核酸データベースの配列と比較し、既知の種の最近縁種を決定した。各ＯＴＵについて検出されたリード数および最近縁種を表１に示す。各盲腸試料について同じ最近縁種を有するＯＴＵの相対存在量を図８に示す。マウス＃Ａ１では１５３のＯＴＵ（最近縁種は９３種であった）が同定され、その半数がバクテロイデス属の種に近縁であった。これに対して、マウス＃Ｃ４では１１３のＯＴＵが同定され、そのほとんどがクロストリジウム科に属する種に近縁であった。マウス＃Ｆ８、＃Ｇ２、＃Ｈ３、＃Ｉ３、＃Ｊ３および＃Ｋ３では９７〜６８のＯＴＵが同定された。これらのマウスでは、腸にＴｒｅｇ細胞の集積が観察され、細菌の大部分がＣ．アミノフィラム（C.aminophilum）、Ｈ．サックガロボランス（H.saccgarovorans）、Ｅ．フィシカテナ（E.fissicatena）、Ｈ．フィリホルミス（H.filiformis）、Ｃ．クロストリディイフォルメ（C.clostridioforme）、Ｃ．インドリス（C.indolis）、Ｃ．ボルテアエ（C.bolteae）、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、Ｌ．菌ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、Ｃ．ラバレンス（C.lavalense），Ｃ．シンビオサム（C.symbiosum）、Ｅ．コントルタム（E.contortum）、Ｃ．サッカログミア（C.saccharogumia）、Ｃ．ラモーサム（C.ramosum）、Ｆ．プラウティ（F.plautii）、Ｃ．シンデンス（C.scindens）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）２３３５、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６およびｃｆ  クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５と１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列類似性を有する細菌で構成されていた。
【０１９７】
マウス＃Ｊ３では、Ｔｒｅｇ集積は観察されず、３つのＯＴＵが検出された。それぞれＣ．サッカログミア（C.saccharogumia）、Ｃ．ラモーサム（C.ramosum）またはＦ．プラウティ（F.plautii）と１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列類似性を有していた。これらの結果は、これらの３種の組合せは腸でのＴｒｅｇ細胞集積の誘導に不十分であることを示唆する。
【０１９８】
実施例２８
ＢＬ寒天またはＥＧ寒天プレートを用いて、マウス＃Ｆ８、＃Ｇ２、＃Ｉ１および＃Ｋ３の盲腸内容物から細菌株を単離した。ＥＧ寒天プレートから１４４コロニー、およびＢＬ寒天プレートから１１６コロニーを選択した。これらのクローンの１６Ｓ  ｒＲＮＡコード配列のＢＬＡＳＴ検索から、これらが１７種に属し、それぞれがＣ．インドリス（C.indolis）、Ｃ．ボルテアエ（C.bolteae）、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、Ｌ．菌ＤＪＦ＿ＶＰ３０、Ａ．コリホミニス（A.colihominis）、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、Ｃ．ラバレンス（C.lavalense）、Ｃ．シンビオサム（C.symbiosum）、Ｅ．コントルタム（E.contortum）、Ｃ．サッカログミア（C.saccharogumia）、Ｃ．ラモーサム（C.ramosum）、Ｆ．プラウティ（F.plautii）、Ｃ．ハセワイ（C.hathewayi）、Ｃ．シンデンス（C.scindens）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）２３３５、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６およびｃｆクロストリジウム菌種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＭＬＧ０５５と９３〜１００％の相同性を有することが明らかになった（表２）。ここに挙げた細菌はいずれもクロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａまたはＸＶＩＩＩに属するものであった（クラスターＩＶが２種、クラスターＸＩＶａが１２種、クラスターＸＶＩが１種、クラスターＸＶＩＩＩが２種）。
【０１９９】
実施例２９
実施例２８で選択したコロニーの中から追加のコロニーを選択して単離し、ＥＧおよびＢＬ培地を用いてこれらの株を培養した。これらのクローンの１６Ｓ  ｒＲＮＡコード配列のＢＬＡＳＴ検索から、これらの菌株が計３１種（実施例２８で挙げた種を含む）に属し、それぞれがクロストリジウム・サッカログミア（Clostridium saccharogumia）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plautii）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Clostridium hathewayi）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Bacteroides sp.）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム（Clostridium saccharolyticum）、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（cf.Clostridium sp.）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス菌（Erysipelotrichaceae bacterium）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）ＤＳＭ１７２４１、ルミノコッカス菌種（Ruminococcus sp.）ＩＤ８、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Clostridium lavalense）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）ＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Eubacterium contortum）、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）Ｄ５、オシロスピラ菌（Oscillospiraceae bacterium）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes）、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）Ａ４、クロストリジウム菌種（Clostridium sp.）３１６００２／０８、およびクロストリジウム菌（Clostridiales bacterium）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Blautia cocoides）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）ＤＳＭ１４６６２と９３〜１００％の相同性を有することが明らかになった（表３）。細菌株のストックは、培養物の増殖に使用する培地を加えた１０％グリセロール中に保管し、チューブは−８０℃の冷凍庫で保管した。
【０２００】
実施例３０
実施例２９の菌株がＧＦマウスにおいてＴｒｅｇｓを誘導する能力を有するかどうかを検討するため、表３の３１株をＴＳ培地を用いて等体積の培地で混合し、ＧＦマウスに接種した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の詳細な解析から、３１株のうち８株が他の菌株と重複していることが明らかになり（表３を参照、アスタリスクで示されている）、結果として異なる細菌株は２３株となった。図１０に示されるように、２３株の混合物（２３ｍｉｘ）をＧＦマウスに経口投与したところ、きわめて強いレベルのＴｒｅｇが誘導された（大腸粘膜固有層では３５〜４０％、小腸では１０％超；図１０）。２３ｍｉｘによる定着で観察されたこれらのＴｒｅｇは、ほとんどがＨｅｌｉｏｓ−であった。
【０２０１】
実施例３１
ヒト腸内細菌のクロロホルム耐性画分の腸内微生物叢に少数ではなく多数存在するメンバーがＴｒｅｇ細胞の誘導を引き起こしているのかどうかを検討するため、実施例１９に記載した通りに、ヒト腸内細菌のクロロホルム耐性画分を接種したマウス（＋ｈｕＣｈｌｏマウス）の希釈盲腸試料を成体ＧＦマウスに接種した。図１１に示されるように、ぞれぞれ＋２×１０４マウスおよび２×１０５マウスを作製するためにｈｕＣｈｌｏマウス盲腸試料を希釈（２×１０４および２×１０５に希釈）しても、これらの成体ＧＦマウスでＴｒｅｇが誘導された。
【０２０２】
実施例３２
実施例３０の２３株の混合物が、制御性細胞の機能を増強することを特徴とする周知のヒトクロストリジウム株フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）よりも効果的に成体ＧＦ  ＩＱＩマウスのＴｒｅｇを誘導する能力を有するかどうかを検討するため、表４の２３株を培地と等量で混合してカクテルを作製し、これを成体ＩＱＩ  ＧＦマウスに投与した。比較のため、別の群のＩＱＩ  ＧＦマウスにフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）を投与した。図１２に示されるように、２３株の混合物（２３−ｍｉｘ）を成体ＩＱＩ  ＧＦマウスに経口投与したところ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）よりも高レベルのＴｒｅｇが誘導された。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）（＋Ｆａｅｃａｌｉ．）はごくわずかなレベルのＴｒｅｇ誘導を示した。
【０２０３】
実施例３３
実施例３１に記載した＋２×１０４マウスの微生物叢群が安定であるかどうかを検討するため、成体ＧＦマウスに連続経口接種を実施して＋２×１０４−ｒｅマウス（二次接種）および＋２×１０４−ｒｅ−ｒｅマウス（三次接種）を作製した。図１３に示されるように、＋２×１０４−ｒｅマウス、＋２×１０４−ｒｅ−ｒｅマウスのいずれにおいてもＴｒｅｇの有意な誘導がみられた。Ｔｒｅｇ細胞を誘導するために不必要な微生物叢の成分をさらに排除するため、実施例３１に記載した＋２×１０４マウスの盲腸内容物を再び２×１０４倍に希釈し、別の成体ＧＦマウス群（＋（２ｘ１０４）２マウス）に経口接種した。図１３に示されるように、＋（２×１０４）２マウスでは大腸でＴｒｅｇ細胞の著明な集積が認められた。
【０２０４】
実施例３４
実施例１９、実施例３１、および実施例３３に記載した＋ｈｕＵＴ（＋ｈｕ）、＋ｈｕＣｈｌｏ、＋２×１０４、＋２×１０４−ｒｅおよび＋（２ｘ１０４）２の消化管微生物叢の組成を評価するため、これらの成体マウスの盲腸内容物から細菌ＤＮＡを抽出した。細菌１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の可変領域（Ｖ１〜Ｖ２）を増幅し、４５４シーケンサーを用いたメタ配列決定を実施した。得られた配列（各試料について３４００リード）を配列類似性（９６％超の同一性）に基づいて操作的分類単位（ＯＴＵ）に分類した。各ＯＴＵの代表的な配列を、ＢＬＡＳＴを用いて、公開されている１６Ｓおよびゲノムデータベースに寄託されている配列と比較し、最近縁種を決定した。図１４に示されるように、＋ｈｕマウスでは、バクテロイデス門に属するＯＴＵが盲腸微生物群の約５０％を占めていた。これに対して、＋ｈｕＣｈｌｏマウスのほとんどのＯＴＵがクロストリジウムに属する種に近縁であった。＋２×１０４、＋２×１０４−ｒｅおよび＋（２ｘ１０４）２マウスでは、細菌の大部分が、図１４に挙げたクラスターＸＩＶａ（Ｃ．レプタム（C.leptum）群とも呼ばれる）、ＩＶ、ＸＶＩ、およびＸＶＩＩＩに属する約２０種のクロストリジウムと１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列類似性を有する細菌で構成されていた。
【０２０５】
実施例３５
実施例３０で単離された２３株を接種したマウス（＋２３−ｍｉｘマウス）の盲腸内容物について１６Ｓ  ｒＤＮＡのメタ解析を実施したところ、図１４および表４に挙げた２３株のうち１７株の存在が確認された。この１７株がＴｒｅｇ細胞を誘導できるかどうかを判定するため、これらの１７株の混合物を成体ＧＦマウスに接種した（＋１７−ｍｉｘマウス）。各細菌株を２ｍＬのＥＧ液体培地で培養しコンフルエンスまで増殖させた後、これらの発端培養物を５０ｍＬチューブに入れて混合した（２ｍＬ×１７株＝３４ｍＬ）。細菌を遠沈してペレット状にし、ＰＢＳ  １０ｍＬに再懸濁した。各菌株を約１×１０６〜１×１０７個含む２００μＬのアリコートを、成体ＧＦマウスの接種に用いた。図１５に示されるように、ＩＱＩ、ＢＡＬＢおよびＢ６成体マウスに１７株の混合物を経口投与したところ、この３種のマウスモデルでＴｒｅｇを誘導することができた。
【０２０６】
実施例３６
実施例３５で明らかになった１７株がそれぞれ個々にＴｒｅｇを誘導できるかどうかを検討するため、１７株をそれぞれ１株ずつ成体ＧＦマウスに単一定着させた。図１６に示されるように、単一の菌株を単一定着させた成体ＧＦマウスで低レベルないし中レベルのＴｒｅｇが認められた。重要なことに、１７株の混合物と同程度にＴｒｅｇを誘導する単一菌株はなかった。
【０２０７】
実施例３７
実施例３５に記載した１７株のサブセットがＴｒｅｇを誘導できるかどうかを検討するため、表４に示すように、無作為に選択した３〜５株の組合せ３−ｍｉｘ、５ｍｉｘＡ、５−ｍｉｘＢ、および５−ｍｉｘＣを作製し、成体ＧＦマウスの接種に用いた。図１７に示されるように、５種混合物のみがＴｒｅｇ細胞の頻度の有意な増加を引き起こし、その増加の程度は＋１７−ｍｉｘマウスで観察されたものと比べると中程度であった。
【０２０８】
実施例３８
実施例３５に記載した１７株混合物（１７−ｍｉｘ）の投与の有益性を検討するため、成体ＳＰＦマウスに１７−ｍｉｘまたは対照培地のいずれかを経口接種し、３週間後にＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の誘導を評価した。図１８に示されるように、処置の３週間後、大腸のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（ＣＤ４）細胞の頻度に有意な増加が認められた。
【０２０９】
実施例３９
アレルギー性下痢の動物モデルにおける１７−ｍｉｘ投与の有益性を検討するため、成体ＳＰＦマウスに１７−ｍｉｘまたは対照培地を経口接種し、この間アレルギー性下痢の誘発物質である卵白アルブミン（ＯＶＡ）で処置した。図１９に示されるように、１７−ｍｉｘを投与したマウスでは、下痢の頻度および重症度（下痢スコア）が対照マウスに比して有意に減少した。
【０２１０】
実施例４０
大腸炎の動物モデルにおける１７−ｍｉｘ投与の有益性を検討するため、成体ＳＰＦマウスに１７−ｍｉｘまたは対照培地のいずれかを経口接種し、この間大腸炎を実験的に誘発する物質としてよく用いられるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で処置した。図２０に示されるように、ＳＰＦ  １７−ｍｉｘマウスの方はＴＮＢＳへの曝露時に対照マウスよりも低い死亡率を示した。
【０２１１】
実施例４１
１７−ｍｉｘに示した菌株の、潰瘍性大腸炎の診断およびモニタリングツールとしての有用性を評価するため、この１７菌株および欧州ＭｅｔａＨＩＴプロジェクトで作製され公開されているヒト糞便ミクロビオームゲノムのドラフトゲノム配列を用いて、健常なヒト被験者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のヒト被験者における１７菌株の相対存在量を調べた。図２１に示されるように、ＵＣ被験者（Ｎ＝２０）では健常被験者（Ｎ＝１５）に比してこの１７菌株が減少していることがわかった。
【０２１２】
配列番号：ＯＴＵ１３６；ＯＴＵ４６；ＯＴＵ２２１；ＯＴＵ９；ＯＴＵ２９６；ＯＴＵ２１；ＯＴＵ１６６；ＯＴＵ７３；ＯＴＵ１７４；ＯＴＵ１４；ＯＴＵ５５；ＯＴＵ３３７；ＯＴＵ３１４；ＯＴＵ１９５；ＯＴＵ３０６；ＯＴＵ８７；ＯＴＵ８６；ＯＴＵ１５２；ＯＴＵ２５３；ＯＴＵ２５９；ＯＴＵ２８１；ＯＴＵ２８８；ＯＴＵ３３４；ＯＴＵ３５９；ＯＴＵ３６２；またはＯＴＵ３６７はそれぞれ、配列番号１９〜４４である。
【産業上の利用可能性】
【０２１３】
ここまで説明した通り、本明細書に記載の組成物および方法は、クロストリジウム類に属する特定のヒト由来細菌または該細菌に由来する生理活性物質などを利用して制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖または集積を誘導するための十分に特徴付けられた優れた組成物を提供することを可能にするものである。該細菌組成物は免疫抑制作用を有するため、例えば、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の予防または治療、および臓器移植などにおける免疫拒絶の抑制に用いることが可能である。さらに、健常者が該細菌組成物を飲食品（例えば、健康食品）などの形で容易に日常的に摂取し、免疫機能を改善することが可能である。
【０２１４】
【表１Ａ−１】
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【表１Ａ−２】
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【０２１５】
【表１Ｂ−１】
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【表１Ｂ−２】
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【０２１６】
【表２】
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【０２１７】
【表３−１】
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【表３−２】
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【０２１８】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【０２１９】
【表５−１】
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【０２２０】
【表５−２】
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【０２２１】
【表５−３】
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【０２２２】
【表５−４】
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【０２２３】
【表５−５】
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【０２２４】
【表５−６】
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【０２２５】
【表５−７】
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【０２２６】
【表５−８】
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【０２２７】
【表５−９】
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【０２２８】
【表５−１０】
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【０２２９】
【表５−１１】
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【０２３０】
【表５−１２】
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【０２３１】
【表５−１３】
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【０２３２】
【表５−１４】
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【０２３３】
【表５−１５】
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【０２３４】
【表５−１６】
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【０２３５】
【表５−１７】
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【０２３６】
【表５−１８】
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【０２３７】
【表５−１９】
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【０２３８】
【表５−２０】
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【０２３９】
【表５−２１】
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【０２４０】
【表５−２２】
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【０２４１】
【表５−２３】
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【０２４２】
【表５−２４】
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【０２４３】
【表５−２５】
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【０２４４】
【表５−２６】
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【０２４５】
【表５−２７】
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【０２４６】
【表５−２８】
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【図１ＡＢ】
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【図１ＣＤ】
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【図１Ｅ】
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【図１ＦＧ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５ＢＣ】
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【図６ＡＢ】
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【図６ＣＤ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０ＢＣ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月6日(2017.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御性Ｔ細胞の増殖および／または集積を誘導する組成物であって、
（ａ）１種類以上のクロストリジウム類の細菌；
（ｂ）（ａ）の１種類以上の細菌の培養上清；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に由来する１種類以上の生理活性物質；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちのいずれか２つもしくは３つの組合せ
を含む組成物。
【外国語明細書】
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