(57)【要約】      （修正有）【課題】単一分子レベルにおけるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法及び分析装置を提供する。【解決手段】第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板に第１タンパク質を供給し、第１標識子と生体分子体の結合を誘導し、第１標識子と生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を基板に供給し、細胞溶液が基板に供給された状態で、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を分析する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための方法において、
（ａ）前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１標識子と前記生体分子体の結合を誘導する段階と；
（ｂ）前記第１標識子と前記生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階と；
（ｃ）前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析する段階と；
を含むタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項２】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための方法において、
（ａ）前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導する段階と；
（ｂ）前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階と；
（ｃ）前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析する段階と；
を含むタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項３】
前記（ｃ）段階は、
前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号を、近接場を発生させる光学装置を利用して測定する段階を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項４】
前記（ｃ）段階は、
前記特定波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定することを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項５】
前記（ｃ）段階は、
前記基板に前記供給された細胞溶液が存在する状況で、前記特定波長の蛍光信号をリアルタイム測定することを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項６】
前記（ａ）段階は、
前記第１タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項７】
前記（ｂ）段階前に、
前記基板にバッファー溶液を供給する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項８】
前記第１標識子及び前記第２標識子は、異なる波長を有する蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項９】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための方法において、
（ａ）前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１標識子と前記生体分子体の結合を誘導する段階と；
（ｂ）前記第１標識子と前記生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階と；
（ｃ）前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析し、第１分析値を獲得する段階と；
（ｄ）前記（ａ）段階での前記第１標識子と前記生体分子体が結合された状態の基板と同一の基板に、前記（ｂ）段階での前記細胞溶液と分析対象細胞溶液とを混合した混合細胞溶液を供給する段階と；
（ｅ）前記混合細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析し、第２分析値を獲得する段階と；
（ｆ）前記第１分析値と前記第２分析値を比較分析する段階と；
を含むタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項１０】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための方法において、
（ａ）前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導する段階と；
（ｂ）前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階と；
（ｃ）前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析し、第１分析値を獲得する段階と；
（ｄ）前記（ａ）段階での前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された基板と同一の基板に、前記（ｂ）段階での前記細胞溶液と分析対象細胞溶液とを混合した混合細胞溶液を供給する段階と；
（ｅ）前記混合細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析し、第２分析値を獲得する段階と；
（ｆ）前記第１分析値と前記第２分析値を比較分析する段階と；
を含むタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項１１】
前記（ｃ）段階は、
前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号を、近接場を発生させる光学装置を利用して測定する段階を含むことを特徴とする、請求項９または１０に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項１２】
前記（ｃ）段階は、
前記特定波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定することを特徴とする、請求項１１に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項１３】
前記（ｃ）段階は、
前記基板に前記供給された細胞溶液が存在する状況で、前記特定波長の蛍光信号をリアルタイム測定することを特徴とする、請求項１１に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項１４】
前記（ａ）段階は、
前記第１タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階を含むことを特徴とする、請求項９または１０に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）段階前に、
前記基板にバッファー溶液を供給する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項１６】
前記第１標識子及び前記第２標識子は、異なる波長を有する蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項１７】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための装置において、
前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板がローディングされる試料ローディング部であって、前記基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１標識子と前記生体分子体の結合が誘導されて、前記第１標識子と前記生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液が前記基板に供給される、試料ローディング部と；
前記試料ローディング部にローディングされた前記基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる光学励起部と；
前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知する光学測定部と；
を含むタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項１８】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための装置において、
前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板がローディングされる試料ローディング部であって、前記基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液が前記基板に供給される、試料ローディング部と；
前記試料ローディング部にローディングされた前記基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる光学励起部と；
前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知する光学測定部と；
を含むタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項１９】
前記光学測定部は、前記第２波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定することを特徴とする、請求項１７または１８に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２０】
前記光学測定部は、前記基板に前記供給された細胞溶液が存在する状況で、前記第２波長の蛍光信号をリアルタイム測定することを特徴とする、請求項１７または１８に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２１】
前記第１標識子及び前記第２標識子は、異なる波長を有する蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項１７に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２２】
前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析する信号分析部をさらに含むことを特徴とする、請求項１７または１８に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２３】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための装置において、
前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板がローディングされる試料ローディング部であって、前記基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１標識子と前記生体分子体の結合を誘導し、前記第１標識子と前記生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液が前記基板に供給される、試料ローディング部と；
前記試料ローディング部にローディングされた前記基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる光学励起部と；
前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知する光学測定部と；
前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、第１分析値を獲得する信号分析部と；
を含み、
前記試料ローディング部には、前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した新しい基板がローディングされ、
前記新しい基板に前記細胞溶液と分析対象細胞溶液とを混合した混合細胞溶液が供給され、前記混合細胞溶液が前記新しい基板に供給された状態で、前記光学測定部は、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知し、
前記信号分析部は、前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、第２分析値を獲得することを特徴とするタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２４】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための装置において、
前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板がローディングされる試料ローディング部であって、前記基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導して、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液が前記基板に供給される、試料ローディング部と；
前記試料ローディング部にローディングされた前記基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる光学励起部と；
前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知する光学測定部と；
前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、第１分析値を獲得する信号分析部と；
を含み、
前記試料ローディング部には、前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した新しい基板がローディングされ、
前記新しい基板に前記細胞溶液と分析対象細胞溶液とを混合した混合細胞溶液が供給され、前記混合細胞溶液が前記新しい基板に供給された状態で、前記光学測定部は、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知し、
前記信号分析部は、前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、第２分析値を獲得することを特徴とするタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２５】
前記第１分析値と前記第２分析値を比較分析する信号診断部をさらに含むことを特徴とする、請求項２３または２４に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２６】
前記光学測定部は、前記第２波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定することを特徴とする、請求項２３または２４に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２７】
前記光学測定部は、前記基板に前記供給された細胞溶液が存在する状況で、前記第２波長の蛍光信号をリアルタイム測定することを特徴とする、請求項２３または２４に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項２８】
前記第１標識子及び前記第２標識子は、異なる波長を有する蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項２３に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用分析方法に関し、より詳細には、実際の細胞環境内でのタンパク質−タンパク質相互作用を単一分子レベルにて分析することができると共に、実際の細胞環境内で他のタンパク質が関与した場合に特定のタンパク質−タンパク質相互作用に対する影響度を分析することができる、タンパク質−タンパク質相互作用分析方法及び分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、多様で且つ複雑なタンパク質−タンパク質相互作用を通じて遺伝子発現、細胞成長、細胞周期、代謝、シグナル伝逹などの様々な生物学的機能を行うことによって、生命現象を維持している。したがって、細胞内でのタンパク質−タンパク質相互作用及び相互作用の機能を理解することは、生命現象を理解する礎石となり、新薬開発及び疾病治療の重要な基盤になる。
【０００３】
試験管内でタンパク質−タンパク質相互作用を調査するための方法としては、代表的な方法として親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍｏａｔｏｇｒａｐｈｙ）方法がある。
【０００４】
タンパク質親和性クロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）の場合、精製されたタンパク質を用意しなければならないという不都合がある。また、タンパク質間の相互作用確認が試験管内で起きるので、細胞内では相互作用しないタンパク質がカラムを通過する間に、静電気的相互作用によって結合するもののように見られる偽陽性（Ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）結果を導き出すことができる。
【０００５】
すなわち、定量的測定のためには、従来技術によるタンパク質−タンパク質相互作用を調査するための方法は、タンパク質−タンパク質相互作用を分析するために、細胞内に存在するそれぞれのタンパク質を精製し、これらを細胞内の他の物質と分離した状態で相互作用を分析するので、他のタンパク質などが混在している実際の細胞環境内でのタンパク質−タンパク質相互作用を単一分子レベルで分析することはできないという限界がある。
【０００６】
しかも、従来技術によるタンパク質−タンパク質相互作用を調査するための方法は、実際の細胞環境内で他のタンパク質が関与した場合に、特定タンパク質−タンパク質相互作用に対する影響度を分析することができないという限界がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、実際の細胞環境内でのタンパク質−タンパク質相互作用を単一分子レベルまで分析することができると共に、実際の細胞環境内で他のタンパク質が関与した場合に、特定タンパク質−タンパク質相互作用に対する影響度を分析することができる、タンパク質−タンパク質相互作用分析方法及び分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための方法において、（ａ）前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１標識子と前記生体分子体の結合を誘導する段階と；（ｂ）前記第１標識子と前記生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階と；（ｃ）前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析する段階と；を含む。
【０００９】
一方、本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための方法において、（ａ）前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導する段階と；（ｂ）前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階と；（ｃ）前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析する段階と；を含む。
【００１０】
また、前記（ｃ）段階は、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号を、近接場を発生させる光学装置を利用して測定する段階を含む。
【００１１】
また、前記（ｃ）段階は、前記特定波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定することを特徴とする。
【００１２】
また、前記（ｃ）段階は、前記基板に前記供給された細胞溶液が存在する状況で、前記特定波長の蛍光信号をリアルタイム測定することを特徴とする。
【００１３】
また、前記（ａ）段階は、前記第１タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階を含むことを特徴とする。
【００１４】
また、前記（ｂ）段階前に、前記基板にバッファー溶液を供給する段階をさらに含む。
【００１５】
また、前記第１標識子及び前記第２標識子は、異なる波長を有する蛍光タンパク質であることを特徴とする。
【００１６】
一方、本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための方法において、（ａ）前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１標識子と前記生体分子体の結合を誘導する段階と；（ｂ）前記第１標識子と前記生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階と；（ｃ）前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析し、第１分析値を獲得する段階と；（ｄ）前記（ａ）段階での前記第１標識子と前記生体分子体が結合された状態の基板と同一の基板に前記（ｂ）段階での前記細胞溶液と分析対象細胞溶液とを混合した混合細胞溶液を供給する段階と；（ｅ）前記混合細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析し、第２分析値を獲得する段階と；（ｆ）前記第１分析値と前記第２分析値を比較分析する段階と；を含む。
【００１７】
一方、本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための方法において、（ａ）前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導する段階と；（ｂ）前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階と；（ｃ）前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析し、第１分析値を獲得する段階と；（ｄ）前記（ａ）段階での前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された基板と同一の基板に前記（ｂ）段階での前記細胞溶液と分析対象細胞溶液とを混合した混合細胞溶液を供給する段階と；（ｅ）前記混合細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用を分析し、第２分析値を獲得する段階と；（ｆ）前記第１分析値と前記第２分析値を比較分析する段階と；を含む。
【００１８】
好ましくは、前記（ｃ）段階は、前記第１タンパク質と結合された前記第２タンパク質に備えられた標識子によって発生する特定波長の蛍光信号を、近接場を発生させる光学装置を利用して測定する段階を含むことを特徴とする。
【００１９】
また、前記（ｃ）段階は、前記特定波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定することを特徴とする。
【００２０】
また、前記（ｃ）段階は、前記基板に前記供給された細胞溶液が存在する状況で、前記特定波長の蛍光信号をリアルタイム測定することを特徴とする。
【００２１】
また、前記（ａ）段階は、前記第１タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液を前記基板に供給する段階を含むことを特徴とする。
【００２２】
また、前記（ｂ）段階前に、前記基板にバッファー溶液を供給する段階をさらに含む。
【００２３】
また、前記第１標識子及び前記第２標識子は、異なる波長を有する蛍光タンパク質であることを特徴とする。
【００２４】
上記目的を達成するための本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析装置は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための装置において、前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板がローディングされる試料ローディング部と−前記基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１標識子と前記生体分子体の結合が誘導され、前記第１標識子と前記生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液が前記基板に供給される−；前記試料ローディング部にローディングされた前記基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる光学励起部と；前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知する光学測定部と；を含む。
【００２５】
一方、本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析装置は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための装置において、前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板がローディングされる試料ローディング部と−前記基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液が前記基板に供給される−；前記試料ローディング部にローディングされた前記基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる光学励起部と；前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知する光学測定部と；を含む。
【００２６】
好ましくは、前記光学測定部は、前記第２波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定することを特徴とする。
【００２７】
また、前記光学測定部は、前記基板に前記供給された細胞溶液が存在する状況で、前記第２波長の蛍光信号をリアルタイム測定することを特徴とする。
【００２８】
また、前記第１標識子及び前記第２標識子は、異なる波長を有する蛍光タンパク質であることを特徴とする。
【００２９】
また、前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析する信号分析部をさらに含むことを特徴とする。
【００３０】
一方、本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析装置は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための装置において、前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した基板がローディングされる試料ローディング部と−前記基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１標識子と前記生体分子体の結合を誘導し、前記第１標識子と前記生体分子体が結合された場合に、第２標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液が前記基板に供給される−；前記試料ローディング部にローディングされた前記基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる光学励起部と；前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知する光学測定部と；前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、第１分析値を獲得する信号分析部と；を含み、前記試料ローディング部には、前記第１タンパク質に備えられた第１標識子と結合される生体分子体が付着した新しい基板がローディングされ、前記新しい基板に前記細胞溶液と分析対象細胞溶液とを混合した混合細胞溶液が供給され、前記混合細胞溶液が前記新しい基板に供給された状態で、前記光学測定部は、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知し、前記信号分析部は、前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、第２分析値を獲得することを特徴とする。
【００３１】
一方、本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析装置は、第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルにおいて分析するための装置において、前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した基板がローディングされる試料ローディング部と−前記基板に前記第１タンパク質を供給し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体の結合を誘導し、前記第１タンパク質と前記第１タンパク質結合分子体が結合された場合に、標識子が備えられた第２タンパク質が含まれた細胞の細胞溶液が前記基板に供給される−；前記試料ローディング部にローディングされた前記基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる光学励起部と；前記細胞溶液が前記基板に供給された状態で、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知する光学測定部と；前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、第１分析値を獲得する信号分析部と；を含み、前記試料ローディング部には、前記第１タンパク質が結合される生体分子体である第１タンパク質結合分子体が付着した新しい基板がローディングされ、前記新しい基板に前記細胞溶液と分析対象細胞溶液とを混合した混合細胞溶液が供給され、前記混合細胞溶液が前記新しい基板に供給された状態で、前記光学測定部は、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の相互作用による前記基板表面での前記第１波長から第２波長への変化を感知し、前記信号分析部は、前記光学測定部が測定した前記第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、第２分析値を獲得することを特徴とする。
【００３２】
好ましくは、前記第１分析値と前記第２分析値を比較分析する信号診断部をさらに含むことを特徴とする。
【００３３】
また、前記光学測定部は、前記第２波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定することを特徴とする。
【００３４】
また、前記光学測定部は、前記基板に前記供給された細胞溶液が存在する状況で、前記第２波長の蛍光信号をリアルタイム測定することを特徴とする。
【００３５】
また、前記第１標識子及び前記第２標識子は、異なる波長を有する蛍光タンパク質であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、実際の細胞環境内でのタンパク質−タンパク質相互作用を単一分子レベルまで分析することができる。
【００３７】
また、本発明によれば、実際の細胞環境内で他のタンパク質が関与した場合に、特定タンパク質−タンパク質相互作用に対する影響度を分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明する手続流れ図である。
【図２】本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法の各段階を説明する図である。
【図３】本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法の各段階を説明する図である。
【図４】本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法の各段階を説明する図である。
【図５】本発明の他の実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明する手続流れ図である。
【図６】図１〜図５でのタンパク質−タンパク質相互作用分析方法が実行される分析装置の構造を示す機能ブロック図である。
【図７】本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析装置の光学測定部が測定した信号を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下では、図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。図面において、同一の構成要素は、できるだけ同一の参照符号で示していることに留意しなければならない。また、本発明の要旨を不明にし得る公知の機能及び構成に対する詳細な説明は省略する。
【００４０】
図１は、本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明する手続流れ図である。図１を参照して、本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明すれば、まず、分析者は、特定の２つのタンパク質である第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルまで分析するために、細胞状態で遺伝子組換え過程を経て当該細胞内に存在する第１タンパク質上に標識子として第１蛍光タンパク質が発現されるようにする（Ｓ１１０）。一方、本発明を実施するに際して、第１蛍光タンパク質を物理化学的な方法によって第１タンパク質に付着または連結させることもできる。
【００４１】
本発明による実験において、第１タンパク質は、ｈ−Ｒａｓタンパク質であり、第２タンパク質は、Ｃ−ＲａｆのＲａｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（ＲＢＤ）タンパク質であり、第１蛍光タンパク質は、ｍ−Ｃｈｅｒｒｙタンパク質である。
【００４２】
次に、分析者は、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）コーティング処理されたクオーツスライド（Ｑｕａｒｔｚ  Ｓｌｉｄｅ）である基板に、前述したＳ１１０段階で第１タンパク質上に標識子として発現された第１蛍光タンパク質と結合される抗体である第１蛍光タンパク質結合抗体を図２のように付着する（Ｓ１２０）。
【００４３】
一方、本発明を実施するに際して、第１蛍光タンパク質と結合する抗体には、抗体以外にもＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質と結合する特定成分を有するリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの第１蛍光タンパク質と結合する生体分子体が使用されることができる。
【００４４】
次に、分析者は、前述したＳ１１０段階で用意した、内部の第１タンパク質上に第１蛍光タンパク質が発現されている細胞の細胞質原液を基板に供給することによって（Ｓ１３０）、第１タンパク質上に発現された第１蛍光タンパク質と第１蛍光タンパク質結合抗体の結合を誘導する（Ｓ１４０）。
【００４５】
一方、前述したＳ１３０段階を実施するに際して、細胞質原液だけではなく、細胞原液、希釈された細胞質原液、または希釈された細胞原液などの細胞溶解液が使用されることができる。
【００４６】
図３のように、基板上に付着した第１蛍光タンパク質結合抗体と第１蛍光タンパク質が結合された場合に、分析者が全反射顕微鏡を利用した基板の表面観察を行う場合、分析者は、第１蛍光タンパク質による波長変化から（すなわち、第１蛍光タンパク質から発生する個々の単分子信号を測定し）基板上に付着した複数の第１蛍光タンパク質結合抗体に第１蛍光タンパク質が結合されたか否かを確認することができる。
【００４７】
一方、本発明を実施するに際して、基板に付着した抗体との結合のために第１タンパク質上に発現された所定のタンパク質は、必ずしも蛍光タンパク質である必要はないが、蛍光タンパク質ではない場合には、抗体との結合可否を全反射顕微鏡を用いて把握することができないため、第１タンパク質上に発現されたタンパク質は蛍光タンパク質になるようにすることが好ましい。
【００４８】
すなわち、本発明での第１タンパク質上に発現された所定のタンパク質は、基板に付着した抗体との結合をする抗原の機能を担うものであって、このように第１タンパク質に付着した所定の抗原は、必ずしもタンパク質である必要はなく、抗体との結合が可能な化合物であってもよい。
【００４９】
すなわち、第１タンパク質上に発現されたタンパク質が蛍光タンパク質である場合には、抗体との結合可否を全反射顕微鏡を用いて把握することができるので、基板に付着した抗体と結合された蛍光タンパク質の個数及びそれによる結合密度を正確に測定することができる。
【００５０】
基板上に付着した複数の第１蛍光タンパク質結合抗体にそれぞれ第１蛍光タンパク質が結合されたものと確認されれば、分析者は、基板にバッファー溶液を供給することによって、第１蛍光タンパク質が発現された第１タンパク質を除いた、細胞質原液に含まれている残りの物質を基板上から除去する（Ｓ１５０）。
【００５１】
次に、分析者は、前述したＳ１１０段階での細胞と同一の他の細胞で、当該細胞に存在する第２タンパク質上に遺伝子組換えを通じて標識子として第２蛍光タンパク質が発現されるようにする（Ｓ１６０）。一方、本発明を実施するに際して、第２蛍光タンパク質を物理化学的な方法によって第２タンパク質に付着または連結させることもできる。
【００５２】
一方、前述したＳ１６０段階は、円滑な分析の進行のために前述したＳ１１０段階とともにあらかじめ行うこともでき、本発明を実施するに際して、第２蛍光タンパク質は、第１蛍光タンパク質と異なる波長領域を有することが好ましいので、第１蛍光タンパク質がｍ−Ｃｈｅｒｒｙタンパク質である場合に、第２蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質であるｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とすることができる。
【００５３】
次に、分析者は、前述したＳ１６０段階での内部の第２タンパク質上に第２蛍光タンパク質が発現されている細胞の細胞質原液全体を基板に供給する（Ｓ１７０）。
【００５４】
一方、前述したＳ１７０段階を実施するに際して、細胞質原液だけではなく、細胞原液、希釈された細胞質原液、または希釈された細胞原液などの細胞溶解液が使用されることができる。
【００５５】
基板の表面に付着している複数の第１蛍光タンパク質結合抗体には、それぞれ第１蛍光タンパク質を通じて第１タンパク質が結合されており、このような基板の表面に、第２タンパク質が含まれている細胞質原液全体が供給されれば、基板表面の第１タンパク質は、細胞質原液に含まれている第２タンパク質及び細胞内の他のタンパク質（Ｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が共存する細胞内環境と同一の状態で第２タンパク質と相互作用をする。
【００５６】
さらに具体的に、図４のように、基板表面上に付着したそれぞれの抗体に第１蛍光タンパク質を通じて結合されているそれぞれの第１タンパク質は、第２タンパク質と細胞内環境と同一の状態で単一分子レベルで結合と分離を繰り返す相互作用をする。
【００５７】
図４のように、第１タンパク質と第２タンパク質間の単一分子レベルでの結合がある場合に、分析者が４７３ｎｍの波長を有する全反射顕微鏡などの近接場を発生させる光学装置を通じて基板の表面を観察すれば、第２タンパク質上に発現されている第２蛍光タンパク質であるｅＧＦＰによって、基板表面での波長が４７３ｎｍから５２０ｎｍに変化したことを確認することができる。
【００５８】
すなわち、第１タンパク質と第２タンパク質間の結合を通じて基板表面に位置する第２蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から発生する特定波長帯域（５２０ｎｍ）の蛍光信号の検出を通じて、第１タンパク質と第２タンパク質の結合状態を確認することができ、分析者は、基板表面上に付着したそれぞれの抗体での波長の変化を持続的に観察することによって、第１タンパク質と第２タンパク質の結合と分離の頻度などの相互作用を単分子レベルで分析することができる（Ｓ１８０）。
【００５９】
なお、本発明では、前述したＳ１７０段階で基板に供給された細胞質原液が存在する状況で、特定波長の蛍光信号をリアルタイム測定することによって、第１タンパク質と第２タンパク質の結合と分離の頻度などの相互作用を、細胞環境と同一の環境で分析することができる。
【００６０】
一方、第１タンパク質と結合しない第２タンパク質は、基板に供給された細胞質原液内で浮遊移動する過程で、基板表面の近くに移動することができ、このような場合にも、全反射顕微鏡を用いた表面観察時に、第２タンパク質上に発現されている第２蛍光タンパク質であるｅＧＦＰによって、基板表面での波長が４７３ｎｍから５２０ｎｍに変化するので、相互作用分析のエラーをもたらし得るという問題点が提起され得る。
【００６１】
したがって、本発明を実施するに際して、全反射顕微鏡を用いて基板表面での波長変化を測定する場合に、波長変化を所定の時間の間に積分（累積）測定することが好ましい。
【００６２】
第１タンパク質と結合されずに、細胞質原液内を浮遊する第２タンパク質は、細胞質原液内での移動速度が非常に速いので、第２タンパク質が浮遊移動中に一時的に基板表面に接近しても、積分測定の時間区間内でさらに基板表面から離脱するからである。
【００６３】
これを検証するために、第２タンパク質を第１タンパク質と結合されないように処理することによって、第１タンパク質と結合される第２タンパク質が無くすべての第２タンパク質が細胞質原液内を浮遊移動する状態で基板表面での波長変化を５０ｍｓｅｃの積分区間で積分測定した結果、波長変化が全く観測されないことを実験的に確認した。
【００６４】
一方、本発明を実施するに際して、前述したＳ１８０段階でのタンパク質−タンパク質相互作用分析値を第１分析値として確保し、後述する他の環境でのタンパク質−タンパク質相互作用分析値を第２分析値として確保し、両者の比較分析を行うこともできる。
【００６５】
すなわち、試験者は、前述したＳ１８０段階での相互作用分析値を第１分析値として確保した後に、前述したＳ１１０段階乃至Ｓ１６０段階までを同様に繰り返して実施する。
【００６６】
一方、試験者は、前述したＳ１７０段階を行うに際して、前述したＳ１６０段階で内部の第２タンパク質上に第２蛍光タンパク質が発現されている細胞の細胞質原液のみを基板に供給するものではなく、当該細胞の細胞質原液と癌細胞などの別途の分析対象細胞質原液とを混合した混合細胞質原液を基板に供給する（Ｓ１９０）。
【００６７】
一方、前述したＳ１９０段階を実施するに際して、混合細胞質原液だけではなく、混合細胞原液、希釈された混合細胞質原液、または希釈された混合細胞原液などの混合細胞溶解液が使用され得る。
【００６８】
すなわち、基板の表面に付着している複数の第１蛍光タンパク質結合抗体には、それぞれ第１蛍光タンパク質を通じて第１タンパク質が結合されており、第２タンパク質が含まれている細胞質原液と分析対象細胞質原液を混合した混合細胞質原液が基板の表面に供給されれば、基板表面の第１タンパク質は、混合細胞質原液に含まれている第２蛍光タンパク質が発現されている第２タンパク質だけでなく、分析対象細胞内の第２蛍光タンパク質が発現されていない第２タンパク質及び他のタンパク質（Ｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が共存する環境で第２タンパク質と相互作用をする。
【００６９】
すなわち、前述したＳ１８０段階とは異なって、第２蛍光タンパク質が発現されている第２タンパク質は、分析対象細胞内の第２蛍光タンパク質が発現されていない第２タンパク質と共存する状態で基板表面の第１タンパク質と競合的に相互作用をする。しかも、分析対象細胞内の他のタンパク質によって、第２蛍光タンパク質が発現されている第２タンパク質は、第１タンパク質との相互作用において影響を受ける。
【００７０】
このような分析対象細胞内の他のタンパク質または分析対象細胞内の第２タンパク質による影響の程度は、試験者が前述したＳ１８０段階のように全反射顕微鏡などの近接場を発生させる光学装置を用いて基板の表面を観察し、基板表面の第１タンパク質と、第２蛍光タンパク質が発現されている第２タンパク質との結合及び分離の頻度などの相互作用を単分子レベルで分析することによって確認することができる（Ｓ１９５）。
【００７１】
より具体的に、試験者は、前述した第１分析値と前述したＳ１９５段階での分析値である第２分析値を比較分析することによって、第２タンパク質と第１タンパク質との相互作用における、他の細胞内の第２タンパク質及び他の細胞内のその他のタンパク質による相互作用の促進または妨害などの影響程度を分析することができる。
【００７２】
一方、図５は、本発明の他の実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明する手続流れ図である。図５での本発明の他の実施例においては、図１での本発明の一実施例とは異なって、第１タンパク質上に第１蛍光タンパク質を発現させず、基板に第１蛍光タンパク質結合抗体ではなく、第１タンパク質結合抗体を付着することによって、基板に付着した抗体に第１タンパク質が直接結合された状態での第１タンパク質と第２タンパク質との相互作用を分析する。
【００７３】
図５を参照して、本発明の他の実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を説明すれば、まず、分析者は、特定の２つのタンパク質である第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を単一分子レベルで分析するために、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）コーティング処理されたクオーツスライド（Ｑｕａｒｔｚ  Ｓｌｉｄｅ）である基板に、第１タンパク質と結合される抗体である第１タンパク質結合抗体を一緒に付着する（Ｓ２１０）。
【００７４】
一方、本発明を実施するに際して、第１タンパク質と結合する抗体に関しては、抗体以外にも、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質と結合する特定成分を有するリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの、第１タンパク質と結合する生体分子体が使用されることができる。
【００７５】
次に、分析者は、第１タンパク質が含まれている細胞の細胞質原液を基板に供給することによって（Ｓ２２０）、第１タンパク質と第１タンパク質結合抗体との結合を誘導する（Ｓ２３０）。
【００７６】
一方、前述したＳ２２０段階を実施するに際して、細胞質原液だけではなく、細胞原液、希釈された細胞質原液、または希釈された細胞原液などの細胞溶解液が使用されることができる。
【００７７】
一方、本発明の他の実施例においても、分析者は、第１タンパク質上にｍ−Ｃｈｅｒｒｙなどの所定の蛍光タンパク質が発現されるように事前処理することができ、この場合、第１タンパク質結合抗体と第１タンパク質が結合された場合に、分析者が全反射顕微鏡を利用した基板の表面観察を行うと、分析者は、第１タンパク質上に発現されている第１蛍光タンパク質による波長変化から、基板上に付着した複数の第１タンパク質結合抗体に第１タンパク質が結合されたか否かを確認することができる。
【００７８】
基板上に付着した複数の第１タンパク質結合抗体にそれぞれ第１タンパク質が結合されたものと確認されれば、分析者は、基板にバッファー溶液を供給することによって、第１タンパク質を除いた細胞質原液に含まれている残りの物質を基板上から除去する（Ｓ２４０）。
【００７９】
次に、分析者は、前述した細胞と同一の他の細胞で当該細胞に存在する第２タンパク質上に遺伝子組換えを通じて蛍光タンパク質が発現されるように操作する（Ｓ２５０）。
【００８０】
一方、前述したＳ２５０段階は、円滑な分析の進行のために前述したＳ２１０段階前にあらかじめ実行することもでき、本発明を実施するに際して、第２タンパク質上に発現される蛍光タンパク質もｅＧＦＰとすることが好ましい。
【００８１】
次に、分析者は、前述したＳ２５０段階での、内部の第２タンパク質上に蛍光タンパク質が発現されている細胞の細胞質原液全体を基板に供給する（Ｓ２６０）。
【００８２】
一方、前述したＳ２６０段階を実施するに際して、細胞質原液だけではなく、細胞原液、希釈された細胞質原液、または希釈された細胞原液などの細胞溶解液が使用されることができる。
【００８３】
基板の表面に付着している複数の第１タンパク質結合抗体には、それぞれ第１タンパク質が結合されており、このような基板の表面に第２タンパク質が含まれている細胞質原液全体が供給されれば、基板表面の第１タンパク質は、細胞質原液に含まれている第２タンパク質と細胞内環境と同一の状態で相互作用をする。
【００８４】
すなわち、基板表面上に付着したそれぞれの抗体に結合されているそれぞれの第１タンパク質は、第２タンパク質と細胞内環境と同一の状態で単一分子レベルで結合と分離を繰り返す相互作用をする。
【００８５】
第１タンパク質と第２タンパク質間の単一分子レベルでの結合がある場合に、分析者が４７３ｎｍの波長を有する全反射顕微鏡を用いて基板の表面を観察すれば、第２タンパク質上に発現されている蛍光タンパク質であるｅＧＦＰによって、基板表面での波長が４７３ｎｍから５２０ｎｍに変化し、このような波長の変化を通じて第１タンパク質と第２タンパク質の結合状態を確認することができるため、分析者は、基板表面上に付着したそれぞれの抗体での波長の変化を持続的に観察することによって、第１タンパク質と第２タンパク質の結合と分離の頻度などの相互作用を単分子レベルで分析することができる（Ｓ２７０）。
【００８６】
なお、図５での本発明の他の実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法を実施するに際して、前述したＳ２７０段階でのタンパク質−タンパク質相互作用分析値を第１分析値として確保し、後述する他の環境でのタンパク質−タンパク質相互作用分析値を第２分析値として確保し、両方の比較分析を行うこともできる。
【００８７】
すなわち、試験者は、前述したＳ２７０段階での相互作用分析値を第１分析値として確保した後に、前述したＳ２１０段階〜Ｓ２５０段階までを同様に繰り返して実施する。
【００８８】
一方、試験者は、前述したＳ２６０段階を実行するに際して、前述したＳ２５０段階で内部の第２タンパク質上に第２蛍光タンパク質が発現されている細胞の細胞質原液のみを基板に供給するものではなく、当該細胞の細胞質原液と癌細胞などの別途の分析対象細胞質原液とを混合した混合細胞質原液を基板に供給する（Ｓ２８０）。
【００８９】
一方、前述したＳ２８０段階を実施するに際して、混合細胞質原液だけではなく、混合細胞原液、希釈された混合細胞質原液、または希釈された混合細胞原液などの混合細胞溶解液が使用されることができる。
【００９０】
すなわち、基板の表面に付着している複数の第１タンパク質結合抗体には、それぞれ第１タンパク質が結合されており、第２タンパク質が含まれている細胞質原液と分析対象細胞質原液とを混合した混合細胞質原液が基板の表面に供給されれば、基板表面の第１タンパク質は、混合細胞質原液に含まれている第２蛍光タンパク質が発現されている第２タンパク質だけでなく、分析対象細胞内の第２蛍光タンパク質が発現されていない第２タンパク質及び他のタンパク質（Ｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が共存する環境で第２タンパク質と相互作用をする。
【００９１】
すなわち、前述したＳ２７０段階とは異なって、第２蛍光タンパク質が発現されている第２タンパク質は、分析対象細胞内の第２蛍光タンパク質が発現されていない第２タンパク質と共存する状態で、基板表面の第１タンパク質と競合的に相互作用をする。しかも、分析対象細胞内の他のタンパク質によって、第２蛍光タンパク質が発現されている第２タンパク質は、第１タンパク質との相互作用において影響を受ける。
【００９２】
このような分析対象細胞内の他のタンパク質または分析対象細胞内の第２タンパク質による影響の程度は、前述したＳ２７０段階のように、全反射顕微鏡などの近接場を発生させる光学装置を用いて試験者が基板の表面を観察し、基板表面の第１タンパク質と第２蛍光タンパク質が発現されている第２タンパク質との結合及び分離の頻度などの相互作用を単分子レベルで分析することで確認することができる（Ｓ２９０）。
【００９３】
より具体的に、試験者は、前述した第１分析値と前述したＳ２９０段階での分析値である第２分析値を比較分析することによって、第２タンパク質と第１タンパク質との相互作用における、他の細胞内の第２タンパク質及び他の細胞内のその他のタンパク質による相互作用の促進または妨害などの影響程度を分析することができる。
【００９４】
一方、前述した図１〜図５での本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析方法は、図６に示す構造を有する分析装置で実行されうる。
【００９５】
図６を参照すれば、本発明によるタンパク質−タンパク質相互作用分析装置３００は、光学励起部３２０、試料ローディング部３１０、光学測定部３３０、信号分析部３４０、信号診断部３６０、及び格納部３５０を含む。
【００９６】
まず、試料ローディング部３１０では、前述した本発明でのタンパク質−タンパク質相互作用分析方法に使用される基板がローディングされる。光学励起部３２０は、試料ローディング部にローディングされた基板の表面に第１波長を有する近接場を発生させる。
【００９７】
光学測定部３３０は、細胞質原液または混合細胞質原液が基板に供給された状態において、基板表面に付着した第１タンパク質と蛍光タンパク質が備えられた第２タンパク質との相互作用による基板表面での前記第１波長から第２波長への波長変化を感知する。
【００９８】
本発明を実施するに際して、第２タンパク質に備えられた蛍光タンパク質がｅＧＦＰである場合に、第１波長は、４７３ｎｍ、第２波長は５２０ｎｍになる。
【００９９】
なお、光学測定部３３０は、第２波長の蛍光信号を所定の時間の間に積分測定すると共に、基板に細胞質原液または混合細胞質原液が存在する状況で第２波長の蛍光信号をリアルタイムで測定し、その測定において単分子感度を有することが好ましい。
【０１００】
一方、信号分析部３４０は、光学測定部３３０が測定した第２波長の蛍光信号をイメージプロセッシングを用いて分析し、分析値を算出し、算出された分析値を格納部３５０に格納する。
【０１０１】
また、信号分析部３４０は、細胞質原液または混合細胞質原液などの多様な細胞質原液が基板に供給されたそれぞれの状況で光学測定部３３０がそれぞれ測定した第２波長の蛍光信号に基づいて個別的に算出した分析値を格納部３５０に格納する。
【０１０２】
具体的には、光学測定部３３０が図７のように蛍光信号を測定した場合に、信号分析部３４０は、測定された蛍光信号のうち図７での赤い線で表示された信号底点（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を捜し出す。
【０１０３】
信号底点は、略１０秒〜２０秒の間に上昇し、これは、第２タンパク質を含んでいる細胞質原液または混合細胞質原液が光学測定部３３０のイメージング領域に到着することを意味する。
【０１０４】
一方、信号分析部３４０は、上昇した信号底点（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を中心に発生する変動（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ、すなわち、ノイズ（Ｎｏｉｓｅ））を測定した後、これを基準にして有意なタンパク質−タンパク質相互作用を定義する基準点（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定する。
【０１０５】
信号底点を中心に発生するノイズは、タンパク質間の相互作用なしに単純に速く連続的に移動している第２タンパク質の挙動によって形成されるものであり、信号分析部３４０は、このように相互作用と関係ないノイズによっては超過することができない値に基準点を設定する。
【０１０６】
基準点を超過する信号がある場合には、信号分析部３４０は、当該時点に第１タンパク質と第２タンパク質との有意な相互作用があるものと判断し、相互作用が持続する時間τｏｆｆと、第１タンパク質と第２タンパク質の次の結合までの時間τｏｎを測定し、これを分析値として格納部３５０に格納する。
【０１０７】
信号分析部３４０が獲得した、相互作用が持続する時間τｏｆｆ、及び第１タンパク質と第２タンパク質の次の結合までの時間τｏｎの分析を通じてタンパク質−タンパク質相互作用に対する一連の情報を得ることができ、信号診断部３６０は、多様な細胞質原液が基板に供給されたそれぞれの状況で算出された分析値を相互比較分析し、比較分析結果によってそれぞれの細胞質状態に対する生物学的、医学的診断を所定の診断アルゴリズムによって導出する機能を行う。
【０１０８】
以上では、本発明の好ましい実施例及び応用例について図示し説明したが、本発明は、前述した特定の実施例及び応用例に限定されず、特許請求の範囲で請求する本発明の趣旨を逸脱することなく、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって多様な変形実施が可能であることは勿論であり、このような変形実施は、本発明の技術的思想や見込みから別個に理解されるべきものではない。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、医療産業分野での産業上利用可能性が認められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月5日(2018.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を分析する方法において、
前記第１タンパク質と結合された第２タンパク質の標識子によって発生する波長を全反射で測定して設定された基準点を超過する信号を分析し、 
前記測定は第１タンパク質と第２タンパク質の繰り返される結合及び／又は分離を含む相互作用をリアルタイム測定または所定の時間の間に積分測定する、
タンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項２】
前記信号が基準点を超過する時間及び／又は次の超過までの時間を分析することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項３】
前記基準点未満で測定される信号は第１タンパク質と結合していない第２タンパク質の標識子によって発生するノイズ信号であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析方法。
【請求項４】
第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用を分析する装置において、
前記第１タンパク質と標識子が結合された第２タンパク質とが供給される基板を含む試料ローディング部と；
前記試料ローディング部に全反射を発生させる光学励起部と；
前記第１タンパク質と結合される第２タンパク質の標識子によって発生する波長を感知する光学測定部と；
前記光学測定部が感知した信号中の設定された基準点を超過する信号を測定して分析した分析値を算出する信号分析部と； 
前記信号分析部から算出された分析値を保存する保存部と
を含むことを特徴とする、タンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項５】
前記光学測定部は、繰り返される結合・分離の第１タンパク質と第２タンパク質の相互作用をリアルタイム測定または所定の時間の間に積分測定することを特徴とする、請求項４に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項６】
前記信号分析部は基準点を超過する信号の基準点超過時間及び／又は次の超過までの時間を測定して分析した分析値を算出することを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。
【請求項７】
前記基準点未満で測定される信号は第１タンパク質と結合していない第２タンパク質の標識子から発生するノイズ信号であることを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質−タンパク質相互作用分析装置。