(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬における、特に癌の処置に用いるための、腫瘍関連エピトープ、及び／又は前記エピトープをコードする核酸の提供。【解決手段】医薬に用いるための、腫瘍に対する免疫反応を刺激する腫瘍関連エピトープであって、前記エピトープが、アルギニンのシトルリンへの脱イミノ化、チロシンのニトロ化、トリプトファンの酸化、及び、グルタミン又はアスパラギンの脱アミノ化から選択される修飾を有する、エピトープ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬に用いるための、腫瘍に対する免疫反応を刺激する腫瘍関連エピトープであって、前記エピトープが、アルギニンのシトルリンへの脱イミノ化、チロシンのニトロ化、トリプトファンの酸化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化から選択される修飾を有する、エピトープ。
【請求項２】
癌を処置する方法に用いるための、腫瘍に対する免疫反応を刺激する腫瘍関連エピトープ、および／またはそのようなエピトープをコードする配列を含む核酸であって、前記エピトープが、アルギニンのシトルリンへの脱イミノ化、チロシンのニトロ化、トリプトファンの酸化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化から選択される修飾を有する、エピトープおよび／または核酸。
【請求項３】
前記エピトープが、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＭＰ７、サイトケラチン、ＩＮＧ４、ＭＵＣ１、ＣＥＡ．ＣＡＭ５、ＣＤ５９、ｂｃｌ２、β−カテニン、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、αエノラーゼ、ミエリン塩基性タンパク質、ヒストン、ヌクレオフォスミン、Ｂ２３、コアクチベーター複合体、抗トロンビン、アグリカン（aggregan）、伸長因子１α、アデニルシクラーゼ関連タンパク質（ＣＡＰ１）、グルコース制御タンパク質、ＡＬＤＨ２、軟骨中間層タンパク質（ＣＬＩＰ）、アルドラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、カルレチキュリン、ＨＳＰ６０、遠上流エレメント結合タンパク質１および２（ＦＵＳＥ−ＢＰ）、アスポリン、カテプシンＤ、ヘパリン結合タンパク質、β−アクチン、Ｆ−アクチン、キャッピングタンパク質α−１サブユニット（ＣａｐＺα−１）、アルブミン、ヒスタミン受容体、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥＲ６０前駆体、ミトコンドリアアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ２）、ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）、ＨＳＰ９０、またはＧＳＫ３βに由来する、請求項１に記載の使用のためのエピトープ、または請求項２に記載の使用のためのエピトープおよび／もしくは核酸。
【請求項４】
前記エピトープがビメンチンに由来する、請求項１に記載の使用のためのエピトープ、または請求項２に記載の使用のためのエピトープおよび／もしくは核酸。
【請求項５】
前記エピトープが脱イミノ化されている、請求項３または請求項４に記載の使用のためのエピトープおよび／または核酸。
【請求項６】
前記エピトープが、以下の配列：
ＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲ
ＶＲＬＲＳＳＶＰＧ
ＲＬＲＳＳＶＰＧＶ、および
ＦＳＳＬＮＬＲＥＴ、
の少なくとも１つを含み、Ｒ残基の１個以上はシトルリンに置換されている、請求項４または請求項５に記載の使用のためのエピトープおよび／または核酸。
【請求項７】
前記エピトープが以下の配列：
ＲＳＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲＰＳＴＳ（ｖｉｍ  ２８〜４９）
ＳＡＶＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲ（ｖｉｍ  ６５〜７７）
ＬＰＮＦＳＳＬＮＬＲＥＴＮＬＤＳＬＰＬ（ｖｉｍ  ４１５〜４３３）
の少なくとも１つを含む、請求項６に記載の使用のためのエピトープおよび／または核酸。
【請求項８】
前記エピトープが以下の配列：
ＲＳＳＶＰＧＶＲＬ、ＳＡＶＲＬＲＳＳＶ、ＡＴＲＳＳＡＶＲＬ、ＹＡＴＲＳＳＡＶＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲＬ（ｖｉｍ  ６１〜７９）、
ＲＳＳＶＰＧＶＲＬ、ＧＶＲＬＬＱＤＳＶ、ＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲＬＬＱＤＳＶＤＦＳ（ｖｉｍ  ６９〜８７）、
ＱＬＫＧＱＧＫＳＲ、ＫＳＲＬＧＤＬＹＥ、ＥＱＬＫＧＱＧＫＳＲＬＧＤＬＹＥＥＥＭ（ｖｉｍ１２５〜１５４）、
ＥＬＲＲＱＶＤＱＬ、ＥＭＲＥＬＲＲＱＶ、ＤＬＹＥＥＥＭＲＥＬＲＲＱＶＤＱＬＴＮ（ｖｉｍ  １４８〜１６６）、
ＱＬＴＮＤＫＡＲＶ、ＶＥＶＥＲＤＮＬＡ、ＬＴＮＤＫＡＲＶＥ、ＶＤＱＬＴＮＤＫＡＲＶＥＶＥＲＤＮＬＡ（ｖｉｍ  １６１〜１７９）、
ＥＶＥＲＤＮＬＡＥ、ＮＤＫＡＲＶＥＶＥＲＤＮＬＡＥＤＩＭＲ（ｖｉｍ  １６６〜１８４）、
ＩＭＲＬＲＥＫＬＱ、ＤＮＬＡＥＤＩＭＲＬＲＥＫＬＱＥＥＭＬ（ｖｉｍ  １７６〜１９４）、
ＱＲＥＥＡＥＮＴＬ、ＫＬＱＥＥＭＬＱＲ、ＥＫＬＱＥＥＭＬＱＲＥＥＡＥＮＴＬＱＳ（ｖｉｍ  １８７〜２０５）、および／または
ＦＲＱＤＶＤＮＡＳ、ＥＮＴＬＱＳＦＲＱ、ＥＡＥＮＴＬＱＳＦＲＱＤＶＤＮＡＳＬＡ（ｖｉｍ  １９８〜２１６）、
の少なくとも１つを含み、Ｒ残基の１個以上はシトルリンに置換されている、請求項４〜７のいずれか一項に記載の使用のためのエピトープおよび／または核酸。
【請求項９】
前記核酸が完全長ビメンチンをコードする、請求項４〜８のいずれか一項に記載のエピトープおよび／または核酸。
【請求項１０】
前記エピトープが、
ＩＱＫＬＹＧＫＲＳ、好ましくはＳＱＤＤＩＫＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳ（ＭＭＰ７−２４７）、
ＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡ、好ましくはＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（ＮＹＥＳＯ−１−１１９）、
ＩＬＴＩＲＬＴＡＡ、好ましくはＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（ＮＹＥＳＯ−１−１１９）、
ＥＩＲＥＬＱＳＱ、好ましくはＥＥＥＩＲＥＬＱＳＱＩＳＤＴＳＶＶＬＳ（サイトケラチン８  ２２９〜２４７）、
ＡＫＱＤＭＡＲＱＬＲＥＹＱＥＬ、好ましくはＡＫＱＤＭＡＲＱＬＲＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬ（サイトケラチン８：３６３〜３８２）、
ＡＫＱＤＭＡＲＱ、好ましくはＬＱＲＡＫＱＤＭＡＲＱＬＲＥＹＱＥＬＭ（サイトケラチン８：３６０〜３７８）、
ＩＳＳＳＳＦＳＲＶ、好ましくはＰＧＳＲＩＳＳＳＳＦＳＲＶＧＳＳ（サイトケラチン８：２９〜４４）、
ＰＲＡＦＳＳＲＳ、好ましくはＳＴＳＧＰＲＡＦＳＳＲＳＹＴＳＧＰＧ（サイトケラチン８：１３〜３０）、
ＥＡＡＬＱＲＡＫＱ、好ましくはＥＬＥＡＡＬＱＲＡＫＱＤＭＡＲＱＬ（サイトケラチン８：３５５〜３７１）、
ＬＥＶＤＰＮＩＱＡＶＲＴＱＥ、好ましくはＬＥＶＤＰＮＩＱＡＶＲＴＱＥＫＥＱＩ（サイトケラチン８：７８〜９５）、および
ＱＫＫＬＫＬＶＲＴ、好ましくはＡＱＫＫＬＫＬＶＲＴＳＰＥＹＧＭＰ（ＩＮＧ４  １５８〜１７４）
ＬＫＬＶＲＴＳＰＥ、好ましくはＡＱＫＫＬＫＬＶＲＴＳＰＥＹＧＭＰ（ＩＮＧ４  １５８〜１７４）
ＫＫＬＫＬＶＲＴＳ、好ましくはＡＱＫＫＬＫＬＶＲＴＳＰＥＹＧＭＰ（ＩＮＧ４  １５８〜１７４）
ＹＭＳＳＡＲＳＬＳ、ＭＳＳＡＲＳＬＳＳ、またはＴＥＹＭＳＳＡＲＳ、好ましくはＫＬＡＴＥＹＭＳＳＡＲＳＬＳＳＥＥＫ（ＩＮＧ４  ４４〜５８）
ＦＤＬＦＥＮＲＫＫ、好ましくはＲＡＰＦＤＬＦＥＮＲＫＫＫＮＮ（ＨＳＰ９０−３４６〜３６０）
ＹＬＮＦＩＲＧＶＶまたはＦＩＲＧＶＶＤＳＥ、好ましくはＩＰＥＹＬＮＦＩＲＧＶＶＤＳＥ（ＨＳＰ９０−３７８〜３９２）
ＬＲＹＹＴＳＡＳＧ、ＬＬＲＹＹＴＳＡＳ、またはＬＳＥＬＬＲＹＹＴ、好ましくはＲＫＫＬＳＥＬＬＲＹＹＴＳＡＳＧＤＥＭＶＳＬ（ＨＳＰ９０−４５６〜４７７）
ＲＲＲＬＳＥＬＬＲＹＨＴＳＱＳ（ＨＳＰ９０β  ４５６〜４６０）
ＶＧＶＦＫＮＧＲＶまたはＦＫＮＧＲＶＥＩＩ、好ましくはＹＳＣＶＧＶＦＫＮＧＲＶＥＩＩ（ＢｉＰ３９〜５３）
ＹＦＮＤＡＱＲＱＡ、好ましくはＶＰＡＹＦＮＤＡＱＲＱＡＴＫＤＡ（ＢｉＰ  １７２〜１８６）
ＦＥＩＤＶＮＧＩＬまたはＶＴＦＥＩＤＶＮＧ、好ましくはＥＶＴＦＥＩＤＶＮＧＩＬＲＶＴ（ＢｉＰ  ４９７〜５１１）
ＩＴＮＤＱＮＲＬＴ、好ましくはＫＩＴＩＴＮＤＱＮＲＬＴＰＥＥ（ＢｉＰ  ５２２〜５３６）
ＬＱＩＶＡＲＬＫＮまたはＶＡＲＬＫＮＮＮＲ、好ましくはＮＣＡＬＱＩＶＡＲＬＫＮＮＮＲ（ＣＸＣＬ１２−５４〜６８）
ＶＥＩＩＡＴＭＫＫまたはＲＶＥＩＩＡＴＭＫ、好ましくはＣＰＲＶＥＩＩＡＴＭＫＫＫＧＥ（ＣＸＣＬ１０  ５７〜７１）
を含み、Ｒ残基の１個以上はシトルリンに置換されている、請求項１に記載の使用のためのエピトープ、または請求項２に記載の使用のためのエピトープおよび／もしくは核酸。
【請求項１１】
癌を処置する方法に用いるための、配列ＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲを含み、配列ＲＳＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲＰＳＴＳ（ｖｉｍ  ２８〜４９）を任意に含むエピトープ、および／またはそのようなエピトープをコードする核酸。
【請求項１２】
前記癌が、メラノーマ、乳癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、または卵巣癌である、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の使用のためのエピトープおよび／または核酸。
【請求項１３】
自己免疫疾患を処置する方法に用いるための、配列ＦＳＳＬＮＬＲＥＴを含み、配列ＬＰＮＦＳＳＬＮＬＲＥＴＮＬＤＳＬＰＬ（ｖｉｍ  ４１５〜４３３）を任意に含むエピトープ、および／またはそのようなエピトープをコードする核酸。
【請求項１４】
前記使用がヒトまたは獣医学的使用である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのエピトープおよび／または核酸。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＹＶＴＴＳＴｃｉｔＴＹＳＬＧＳＡＬｃｉｔを含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、任意に、アミノ酸配列ｃｉｔＳＹＶＴＴＳＴｃｉｔＴＹＳＬＧＳＡＬｃｉｔＰＳＴＳ（ｖｉｍ  ２８〜４９）を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなるペプチドであって、ｃｉｔがシトルリンを表す、ペプチド。
【請求項１６】
医薬に用いるための、自己抗原に対するＩＬ−１０免疫反応を刺激する修飾型エピトープであって、前記エピトープが、アルギニンのシトルリンへの脱イミノ化、チロシンのニトロ化、トリプトファンの酸化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化から選択される修飾を有する、エピトープ。
【請求項１７】
結腸直腸癌細胞においてペプチジルアルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤ４）のレベルを決定することを含む、結腸直腸癌において生存を予測する方法。
【請求項１８】
卵巣癌細胞においてペプチジルアルギニンデイミナーゼ２（ＰＡＤ２）および／またはＨＭＧＢ１のレベルを決定することを含む、卵巣癌において生存を予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、一般的に、癌免疫治療のための標的として用いることができる修飾型ペプチドに関する。これらの修飾型ペプチドは、ワクチンとして、またはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療のための標的として用いることができる。そのようなワクチンまたはｍＡｂは、癌の処置に用いてもよい。
【０００２】
抗腫瘍免疫応答の焦点は、１つには、たいていの固形腫瘍ではＭＨＣクラスＩＩ発現が欠如しているため、腫瘍特異的ＣＤ８応答の発生に、大部分が向けられている。したがって、これらの腫瘍は、ＣＤ４  Ｔ細胞よりＣＤ８  Ｔ細胞についてのより良い標的を構成している。しかしながら、ＣＤ８  Ｔ細胞に関わる治療は、患者において中程度で、かつ短寿命の応答のみを誘発している。抗体が媒介されようとＣＤ８が媒介されようと、ＣＤ４ヘルパー細胞がエピトープ特異的免疫応答の誘導において中心的役割を果たすことは知られて久しい。ＣＤ４ヘルプの非存在下で誘導された場合には、メモリーＣＤ８応答が損なわれることが報告されている［１、２］。これは、最初、それらのＩＬ−２の分泌によると考えられたが［３］、最近になって、樹状細胞（ＤＣ）の修飾／活性化、それが次に、ＣＤ８細胞を活性化することにもよると考えられている［４〜７］。たいていの場合、このヘルプは、病原体から生じた、またはワクチンに挿入された外来ＣＤ４エピトープによって提供される。しかしながら、腫瘍特異的ＣＤ４応答はまた、炎症を増強するのに腫瘍部位に必要とされ、その結果として、ＣＤ８細胞、ＮＫ細胞、および抗腫瘍免疫の他の炎症性メディエーターの動員および保持の増強を生じる［８〜１１］。癌免疫におけるＣＤ４ヘルパーＴ細胞の関与は、腫瘍進行を保証するＣＤ４またはＭＨＣクラスＩＩ欠損マウスを用いる研究からさらに理解され、腫瘍の根絶におけるＣＤ４  Ｔ細胞の重要性を示している。文献におけるより最近の報告は、腫瘍根絶において直接的役割を果たす腫瘍反応性ＣＤ４  Ｔ細胞の重要性、加えて、インビボで腫瘍破壊を媒介することにおける腫瘍特異的Ｔｈ１７細胞の優れた作用を示唆している［１２〜１５］。腫瘍特異的エピトープに対するＣＤ４応答の高い頻度および結合活性は、そのレパートリーが寛容を受けにくい場合に、生じることができる［１６〜１８］。そのレパートリーが自己寛容を受け入れる場合、エピトープ特異的ＣＤ４応答の誘導は、より非常に強く制限され、生じた応答は、より低い頻度および結合活性をもつ。
【０００３】
腫瘍内でターゲットすることができるいくつかの型の腫瘍エピトープがある。これらには、腫瘍特異的エピトープおよび腫瘍関連エピトープが挙げられる。前者は、腫瘍の発生および病変形成中に獲得されるＤＮＡのより大きいセグメントの突然変異または重複または欠失により生じる。点突然変異は、それらが、ＭＨＣに結合することができる新しいアンカー残基か、またはＴもしくはＢ細胞受容体（ＴＣＲまたはＢＣＲ）とより強く相互作用する新しいアミノ酸のいずれかを生成するという理由から、それらが新しいエピトープを生成しなければならないため、免疫系によってターゲットすることは困難である。突然変異が新しいエピトープを生じたとしても、それらは、適切なＭＨＣハプロタイプを有する個体のほんの一部によって認識されるのみである場合が多い。遺伝子重複および欠失は、それらが通常、個々の癌に固有であるため、ターゲットすることが困難である。対照的に、腫瘍関連エピトープは、過剰発現した正常なエピトープである。そのような正常なエピトープは、通常、直接的か、またはＡＩＲＥ酵素を介してかのいずれかで胸腺内で発現し、高親和性でこれらのエピトープを認識するＴ細胞が、除去され、または内在性制御性Ｔ細胞へと分化する。腫瘍関連エピトープに対するＣＤ８応答が報告されているが、腫瘍関連エピトープに対するＣＤ４応答はほとんどなく、これらのエピトープに対するレパートリーが、ＣＤ８細胞よりＣＤ４細胞についてより強く制御されることを示唆している。唯一報告されたＣＤ４応答は、胚形成中に発現する癌精巣抗原に対してであるが、成体の配偶子において活性を維持するのみであり、胸腺寛容に曝されない可能性があるが、最新の証拠によれば、ＡＩＲＥもまた、胸腺においてこれらのエピトープを提示することができる。したがって、課題は、自己エピトープを認識し、かつ腫瘍を攻撃することができる、Ｔ細胞のレパートリーを見出すことである。
【０００４】
本発明者らは、予想外にも、ＴまたはＢ細胞エピトープへの特定の修飾が、非修飾型エピトープと比較して、より強い免疫応答を起こすエピトープを生じることを見出した。驚くべきことに、本発明者らは、特定の修飾型エピトープが、腫瘍に関連しており、それゆえに、そのような腫瘍に対する免疫応答を起こすために用いることができることを見出した。
【０００５】
本発明の第１の側面によれば、医薬に用いるための、腫瘍に対する免疫反応を刺激する腫瘍関連エピトープが提供され、そのエピトープは、アルギニンの脱イミノ化、チロシンのニトロ化、トリプトファンの酸化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化から選択される修飾を有する。
【０００６】
本発明はまた、癌を処置するための方法に用いるための、腫瘍に対する免疫反応を刺激する腫瘍関連エピトープ、および／またはそのようなエピトープをコードする配列を含む核酸であって、そのエピトープは、アルギニンの脱イミノ化、チロシンのニトロ化、トリプトファンの酸化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化から選択される修飾を有する、エピトープおよび／または核酸、加えて、癌の処置のための薬物の製造におけるそのようなエピトープおよび／または核酸の使用が提供される。本発明はまた、癌を処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象において本発明のエピトープまたは核酸を投与することを含む、方法が提供される。
【０００７】
エピトープは、ＴまたはＢ細胞エピトープであってもよい。本発明によるエピトープは、単独で、または組み合わせて用いてもよい。加えて、それらは、他の治療剤、例えば、それだけに限られないが、チェックポイント遮断薬、例えばイピリムマブを含む、抗癌剤と組み合わせて用いてもよい。
【０００８】
好ましい修飾は、シトルリンを形成する、アルギニンの脱イミノ化である。遊離アルギニンは、真核生物において一酸化窒素シンターゼにより、または細菌においてアルギニンデイミナーゼにより、遊離シトルリンへ変換され得る。シトルリンは、修飾型アミノ酸であるが、それはｔＲＮＡをもたないため、それは、直接、タンパク質へ組み込まれることができず、様々な組織に見出される酵素のファミリーである、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の作用によるアルギニンの翻訳後修飾から生じる。用語「シトルリン化」または「脱イミノ化」は、アルギニンのシトルリンへの修飾を指し、それは、ペプチド配列内での酵素ＰＡＤによる翻訳後修飾であってもよい。これは、添付の図面の図１においてより詳細に示されている。アルギニンからシトルリンへの反応において、アルギニン側鎖の末端窒素原子の１つが、酸素に置きかえられる。その反応は、１つのＨ2Ｏ分子を用い、副産物としてアンモニアを生じる。このアルギニンのシトルリンへの変換は、アルギニンが中性ｐＨで正電荷をもつが、シトルリンは非荷電であるため、タンパク質の構造および機能について重要な結果を生じる。タンパク質の疎水性の増加に伴い、タンパク質フォールディングにおいて変化があり得る。５つのＰＡＤ酵素、すなわち、ＰＡＤ１、２、３、４、および６がある。それらは、相同性が高く、アミノ酸レベルにおいて５０〜６０％配列同一性を有するが、それらは存在場所が異なる（ＰＡＤ１  −  表皮および子宮；ＰＡＤ２  −  脳、女性生殖管、骨格筋、および造血細胞；ＰＡＤ３  −  毛包および上皮；ＰＡＤ４  −  造血細胞、肺、食道、乳房、および卵巣の癌腫；ＰＡＤ６  −  卵母細胞および着床前胚［１９］）。標的タンパク質に関していくらかの重複があるが、各ファミリーメンバーはまた、固有のセットの細胞タンパク質をターゲットするように思われる。これは、良い標的にさせるアルギニンの表面露出およびクラスタリング、ならびに好ましいアミノ酸フランキング配列によって決定される。ＰＡＤ４について、位置−２および＋２において小さい非極性アミノ酸が好ましく、アルギニンと隣り合うプロリンがシトルリン化を阻止する［２０、２１］。したがって、タンパク質内の全てのアルギニンがシトルリン化されるとは限らず、全てがＴ細胞認識のためのＭＨＣ抗原上に提示されるとは限らない。
【０００９】
ＢｉＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＭＰ７、サイトケラチン、ＭＵＣ１、ＣＥＡ．ＣＡＭ５、ＣＤ５９、ｂｃｌ２、β−カテニン、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣｌ１２、αエノラーゼ、ミエリン塩基性タンパク質、ヒストン、ヌクレオフォスミン、Ｂ２３、コアクチベーター複合体、抗トロンビン、アグリカン（aggregan）、伸長因子１α、アデニルシクラーゼ関連タンパク質（ＣＡＰ１）、グルコース制御タンパク質、ＡＬＤＨ２、軟骨中間層タンパク質（ＣＬＩＰ）、アルドラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、カルレチキュリン、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０、遠上流エレメント結合タンパク質１および２（ＦＵＳＥ−ＢＰ）、アスポリン、カテプシンＤ、ヘパリン結合タンパク質、β−アクチン、Ｆ−アクチン、キャッピングタンパク質α−１サブユニット（ＣａｐＺα−１）、アルブミン、ヒスタミン受容体、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥＲ６０前駆体、ミトコンドリアアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ２）、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ３β）に由来するシトルリン化エピトープが、本発明に従って抗癌免疫を刺激するために用いることができる。これらのタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ参照番号は、添付図面の図３２に示されている。
【００１０】
フィラグリン、コラーゲン、α−エノラーゼ、フィブリノーゲン、およびビメンチンを含む、様々なシトルリン化タンパク質に対する抗体が、関節リウマチ（ＲＡ）患者において見出され、その疾患を診断する特異的マーカーとして用いられる［２２〜２４］。最近になって、ヒストン、ヌクレオフォスミン、Ｂ２３、コアクチベーター複合体、抗トロンビン、アグリカン、伸長因子１α、アデニルシクラーゼ関連タンパク質（ＣＡＰ１）、グルコース制御タンパク質、ＡＬＤＨ２、軟骨中間層タンパク質（ＣＬＩＰ）、アルドラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、カルレチキュリン、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０、ＢｉＰ、遠上流エレメント結合タンパク質１および２（ＦＵＳＥ−ＢＰ）、アスポリン、カテプシンＤ、ヘパリン結合タンパク質、β−アクチン、Ｆ−アクチン、キャッピングタンパク質α−１サブユニット（ＣａｐＺα−１）、アルブミン、ヒスタミン受容体、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥＲ６０前駆体、ミトコンドリアアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ２）を含む、いくつかの他のシトルリン化タンパク質がＲＡ患者における抗体についての標的として記載されている［４９］。さらに、シトルリンそれだけで、免疫応答の発生に十分ではなく、むしろ、シトルリンを囲むアミノ酸が、そのエピトープの抗原性を決定するのに必須であると仮定されている［２５〜２７］。
【００１１】
シトルリン化に加えて、いくつかの他の翻訳後修飾は、本発明に従い、ＭＨＣ結合ペプチド内に観察されている。これらには、チロシン残基のニトロ化［２８］およびトリプトファン残基の酸化［２９］が挙げられる。マクロファージおよび樹状細胞の活性化は、一酸化窒素および他の活性酸素種の産生を含む。タンパク質の曝露は、チロシンのニトロ化、およびより少ない程度で、トリプトファンのニトロ化をもたらし得る。ＣＤ４細胞は、鶏卵リゾチーム由来エピトープにおけるこれらの修飾を特異的に認識することが示されている［２９］。しかしながら、いかなる疾患におけるニトロ化エピトープの役割もいまだ確立されていない。前立腺腫瘍浸潤性リンパ球における高レベルのニトロチロシンの存在は、ペルオキシナイトライトの局所的産生を示唆する。悪性前立腺において高度に発現するが、正常な前立腺においては発現しない、アルギニン代謝における重要な酵素である、アルギナーゼおよび一酸化窒素シンターゼの活性を阻害することは、チロシンニトロ化および腫瘍浸潤性リンパ球の回復を低下させた［３０］。グルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化は、加齢に起因し得るが、この修飾のかなりの割合は、酵素機構によって生成される。脱アミノ化は、主に、負荷電側鎖（グルタメートまたはアスパルテート）を生じ、グルタミンおよびアスパラギンの水素結合を形成する能力を変化させる。アスパラギンは、Ｎ−グリカナーゼによってアスパルテートへ変換され得、それゆえに、この修飾は、本質的に、Ｎ−グリコシル化に結びつけられる。グルタミン残基は、組織トランスグルタメートにより脱アミノ化され得る。食物性コムギグルテン由来のグリアジンにおけるグルタミンの脱アミノ化は、遺伝的に罹りやすい個体においてグルテン不耐性に関連づけられる自己免疫障害であるセリアック病の要となる。ＨＬＡハプロタイプ、ＤＱ２およびＤＱ８は、脱アミノ化グリアジンペプチドに対して強い親和性をもち、胃腸管内膜に対するＴ細胞応答を刺激する［３１］。
【００１２】
本発明のエピトープは、
ＩＱＫＬＹＧＫＲＳ、好ましくはＳＱＤＤＩＫＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳ（ＭＭＰ７−２４７）、
ＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡ、好ましくはＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（ＮＹＥＳＯ−１−１１９）、
ＩＬＴＩＲＬＴＡＡ、好ましくはＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（ＮＹＥＳＯ−１−１１９）、
ＥＩＲＥＬＱＳＱ、好ましくはＥＥＥＩＲＥＬＱＳＱＩＳＤＴＳＶＶＬＳ（サイトケラチン８  ２２９〜２４７）、
ＡＫＱＤＭＡＲＱＬＲＥＹＱＥＬ、好ましくはＡＫＱＤＭＡＲＱＬＲＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬ（サイトケラチン８：３６３〜３８２）、
ＡＫＱＤＭＡＲＱ、好ましくはＬＱＲＡＫＱＤＭＡＲＱＬＲＥＹＱＥＬＭ（サイトケラチン８：３６０〜３７８）、
ＩＳＳＳＳＦＳＲＶ、好ましくはＰＧＳＲＩＳＳＳＳＦＳＲＶＧＳＳ（サイトケラチン８：２９〜４４）、
ＰＲＡＦＳＳＲＳ、好ましくはＳＴＳＧＰＲＡＦＳＳＲＳＹＴＳＧＰＧ（サイトケラチン８：１３〜３０）、
ＥＡＡＬＱＲＡＫＱ、好ましくはＥＬＥＡＡＬＱＲＡＫＱＤＭＡＲＱＬ（サイトケラチン８：３５５〜３７１）、
ＬＥＶＤＰＮＩＱＡＶＲＴＱＥ、好ましくはＬＥＶＤＰＮＩＱＡＶＲＴＱＥＫＥＱＩ（サイトケラチン８：７８〜９５）、および
ＱＫＫＬＫＬＶＲＴ、好ましくはＡＱＫＫＬＫＬＶＲＴＳＰＥＹＧＭＰ（ＩＮＧ４  １５８〜１７４）
ＬＫＬＶＲＴＳＰＥ、好ましくはＡＱＫＫＬＫＬＶＲＴＳＰＥＹＧＭＰ（ＩＮＧ４  １５８〜１７４）
ＫＫＬＫＬＶＲＴＳ、好ましくはＡＱＫＫＬＫＬＶＲＴＳＰＥＹＧＭＰ（ＩＮＧ４  １５８〜１７４）
ＹＭＳＳＡＲＳＬＳ、ＭＳＳＡＲＳＬＳＳ、またはＴＥＹＭＳＳＡＲＳ、好ましくはＫＬＡＴＥＹＭＳＳＡＲＳＬＳＳＥＥＫ（ＩＮＧ４  ４４〜５８）
ＦＤＬＦＥＮＲＫＫ、好ましくはＲＡＰＦＤＬＦＥＮＲＫＫＫＮＮ（ＨＳＰ９０−３４６〜３６０）
ＹＬＮＦＩＲＧＶＶまたはＦＩＲＧＶＶＤＳＥ、好ましくはＩＰＥＹＬＮＦＩＲＧＶＶＤＳＥ（ＨＳＰ９０−３７８〜３９２）
ＬＲＹＹＴＳＡＳＧ、ＬＬＲＹＹＴＳＡＳ、またはＬＳＥＬＬＲＹＹＴ、好ましくはＲＫＫＬＳＥＬＬＲＹＹＴＳＡＳＧＤＥＭＶＳＬ（ＨＳＰ９０−４５６〜４７７）
ＲＲＲＬＳＥＬＬＲＹＨＴＳＱＳ（ＨＳＰ９０β  ４５６〜４６０）
ＶＧＶＦＫＮＧＲＶまたはＦＫＮＧＲＶＥＩＩ、好ましくはＹＳＣＶＧＶＦＫＮＧＲＶＥＩＩ（ＢｉＰ３９〜５３）
ＹＦＮＤＡＱＲＱＡ、好ましくはＶＰＡＹＦＮＤＡＱＲＱＡＴＫＤＡ（ＢｉＰ  １７２〜１８６）
ＶＴＦＥＩＤＶＮＧ、好ましくはＥＶＴＦＥＩＤＶＮＧＩＬＲＶＴ（ＢｉＰ  ４９７〜５１１）
ＩＴＮＤＱＮＲＬＴ、好ましくはＫＩＴＩＴＮＤＱＮＲＬＴＰＥＥ（ＢｉＰ  ５２２〜５３６）
ＬＱＩＶＡＲＬＫＮまたはＶＡＲＬＫＮＮＮＲ、好ましくはＮＣＡＬＱＩＶＡＲＬＫＮＮＮＲ（ＣＸＣＬ１２−５４〜６８）
ＶＥＩＩＡＴＭＫＫまたはＲＶＥＩＩＡＴＭＫ、好ましくはＣＰＲＶＥＩＩＡＴＭＫＫＫＧＥ（ＣＸＣＬ１０  ５７〜７１）
から選択される配列を含んでもよく、本質的にそれからなってもよく、またはそれからなってもよく、Ｒ残基の１個以上はシトルリンに置換されている。ＮＹＥＳＯ−１−１１９において、（位置１３６における）最初のＲ残基がシトルリンに置換されている場合が好ましい。サイトケラチン８：３６０〜３７８において、（位置３６９における）２番目のＲ残基がシトルリンに置換されている場合が好ましい。サイトケラチン８：２９〜４４において、（位置４０における）２番目のＲ残基がシトルリンに置換されている場合が好ましい。ＨＳＰ９０、ＢｉＰ、ＩＮＧ４、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１２において、その配列内の全部のＲ残基がシトルリンに置換されている場合が好ましい。本発明はまた、さらなる側面としてこれらのエピトープを提供する。特に、本発明は、アミノ酸配列ＹＶＴＴＳＴｃｉｔＴＹＳＬＧＳＡＬｃｉｔを含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、任意に、アミノ酸配列ｃｉｔＳＹＶＴＴＳＴｃｉｔＴＹＳＬＧＳＡＬｃｉｔＰＳＴＳ（ｖｉｍ  ２８〜４９）を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなるペプチドを提供し、ｃｉｔはシトルリンを表す。
【００１３】
本発明の好ましいエピトープは、ビメンチン由来であり、シトルリン化されている。本発明者らは、予想外にも、ビメンチン由来のシトルリン化エピトープが、制限されないが、メラノーマ、乳房腫瘍、子宮内膜腫瘍、結腸直腸腫瘍、および卵巣腫瘍を含む腫瘍に対して免疫応答を起こすために用い得ることを見出した。
【００１４】
ビメンチン由来の好ましいエピトープは、ＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲ（ビメンチン３０〜４５）を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、これは、任意にシトルリン化することができる。一方または両方のアルギニンをシトルリン化してもよい。エピトープは、ＲＳＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲＰＳＴＳ（ビメンチン２８〜４９）を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、これは、任意にシトルリン化することができる。存在するこれらのアルギニンの任意の１個もしくは２個、または全部をシトルリン化してもよい。全ての３個のＲ残基をシトルリン化することが好ましい。（位置３６における）２番目のＲ残基をシトルリンに置換してもよい。
【００１５】
ビメンチン由来の代替のエピトープは、以下の配列：
ＶＲＬＲＳＳＶＰＧまたはＲＬＲＳＳＶＰＧＶ、好ましくはＳＡＶＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲ（ｖｉｍ  ６５〜７７）および
ＦＳＳＬＮＬＲＥＴ、好ましくはＬＰＮＦＳＳＬＮＬＲＥＴＮＬＤＳＬＰＬ（ｖｉｍ  ４１５〜４３３）
の少なくとも１つを含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、Ｒ残基の１個以上はシトルリンに置換されている。ｖｉｍ６５〜７７において、（位置７０における）２番目のＲ残基がシトルリンに置換されている場合が好ましい。
【００１６】
ビメンチン由来のさらなる代替のエピトープは、以下の配列：
ＲＳＳＶＰＧＶＲＬ、ＳＡＶＲＬＲＳＳＶ、ＡＴＲＳＳＡＶＲＬ、ＹＡＴＲＳＳＡＶＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲＬ（ｖｉｍ  ６１〜７９）、
ＲＳＳＶＰＧＶＲＬ、ＧＶＲＬＬＱＤＳＶ、ＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲＬＬＱＤＳＶＤＦＳ（ｖｉｍ  ６９〜８７）、
ＱＬＫＧＱＧＫＳＲ、ＫＳＲＬＧＤＬＹＥ、ＥＱＬＫＧＱＧＫＳＲＬＧＤＬＹＥＥＥＭ（ｖｉｍ１２５〜１５４）、
ＥＬＲＲＱＶＤＱＬ、ＥＭＲＥＬＲＲＱＶ、ＤＬＹＥＥＥＭＲＥＬＲＲＱＶＤＱＬＴＮ（ｖｉｍ  １４８〜１６６）、
ＱＬＴＮＤＫＡＲＶ、ＶＥＶＥＲＤＮＬＡ、ＬＴＮＤＫＡＲＶＥ、ＶＤＱＬＴＮＤＫＡＲＶＥＶＥＲＤＮＬＡ（ｖｉｍ  １６１〜１７９）、
ＥＶＥＲＤＮＬＡＥ、ＮＤＫＡＲＶＥＶＥＲＤＮＬＡＥＤＩＭＲ（ｖｉｍ  １６６〜１８４）、
ＩＭＲＬＲＥＫＬＱ、ＤＮＬＡＥＤＩＭＲＬＲＥＫＬＱＥＥＭＬ（ｖｉｍ  １７６〜１９４）、
ＱＲＥＥＡＥＮＴＬ、ＫＬＱＥＥＭＬＱＲ、ＥＫＬＱＥＥＭＬＱＲＥＥＡＥＮＴＬＱＳ（ｖｉｍ  １８７〜２０５）、および／または
ＦＲＱＤＶＤＮＡＳ、ＥＮＴＬＱＳＦＲＱ、ＥＡＥＮＴＬＱＳＦＲＱＤＶＤＮＡＳＬＡ（ｖｉｍ  １９８〜２１６）、
の少なくとも１つを含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、Ｒ残基の１個以上はシトルリンに置換されていてもよい。上記において、シトルリンへの置換について好ましいＲ残基は、下線が引かれている。コア配列はエピトープの前に示されている。
【００１７】
１つの側面において、本発明は、癌を処置する方法に用いるための、配列ＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲを含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、配列ＲＳＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲＰＳＴＳ（ｖｉｍ  ２８〜４９）を任意に含むエピトープ、および／またはそのようなエピトープをコードする核酸を提供する。
【００１８】
別の側面において、本発明は、自己免疫疾患を処置する方法に用いるための、配列ＦＳＳＬＮＬＲＥＴ、好ましくはＬＰＮＦＳＳＬＮＬＲＥＴＮＬＤＳＬＰＬ（ｖｉｍ  ４１５〜４３３）を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなるエピトープ、および／またはそのようなエピトープをコードする核酸を提供する。本発明者らは、このエピトープが、全体的な免疫応答を抑制するＩＬ１０応答を刺激することを見出している。
【００１９】
他に指示がない限り、上記配列における下線が引かれた残基は、コア配列を示す。これらのコア配列の外側のアミノ酸は、他のアミノ酸、好ましくは、置きかえられる本来のアミノ酸と類似したサイズおよび／もしくは電荷を有するアミノ酸に保存的に置換してもよく、または除去してもよい。追加として、または代替として、１個、２個、３個、４個、５個、または全部の非コアアミノ酸を置換または除去してもよい。本発明において有用なエピトープは、ＨＬＡクラスＩＩ分子の関連において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞による認識に最適である長さ、疎水性、および／または電荷を有してもよい。本発明のエピトープは、少なくとも１３個、１４個、１５個、１６個、またはそれ以上のアミノ酸を含んでもよい。本発明において有用な追加のエピトープが、ここでの例１０に示された様々な技術を用いて同定し得ることは、当業者は理解しているだろう。
【００２０】
本発明者らはまた、完全長ビメンチン（ヒトビメンチンの配列について図２を参照。Ｎ末端メチオニン残基は含まれ得、または排除され得る。）をコードする核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの投与が、強い免疫応答を生じることを見出している。これは、本発明のさらなる態様を形成する。
【００２１】
ビメンチン（ｖｉｍ）は、その遺伝子がクローニングされている種（ニワトリ、マウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、およびヒト）の間で高度に保存されている。したがって、ビメンチン、およびビメンチン由来のエピトープ、例えば、上記で論じられたもの、加えて、これらをコードする核酸は、非ヒト哺乳動物において癌を処置するために用いることができる。
【００２２】
抗体ＤＮＡ構築物内のＴ細胞エピトープの組み入れが、Ｔ細胞応答の頻度と結合活性の両方を増強することを出願人は以前に示している［３２、３３］。下記の例においてより詳細に論じられているように、本発明者らは、様々な外来および自己エピトープを抗体−ＤＮＡ構築物へクローニングし、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいてＴ細胞応答についてスクリーニングした。全ての外来エピトープが、強いＴ細胞応答を刺激したが、有意な応答を刺激した唯一の自己エピトープは、ビメンチン２８〜４９であった。天然のマウスエピトープと１つの保存的アミノ酸変化だけ異なるヒトｇｐ１００エピトープでさえも、マウスにおいて強い応答を刺激したが、完全に保存されたマウスエピトープは、マウスにおいて応答を刺激することができなかった。これは、マウスエピトープを認識するＴ細胞の完全寛容／除去があるが、非常に類似したヒトエピトープについてはそうではないことを示唆している。その意味は、ヒトエピトープはヒトにおいてＴ細胞応答を刺激しないだろうし、マウスエピトープがＴ細胞応答を刺激したとしても、そのＴ細胞は、腫瘍内において天然でプロセシングされたヒトエピトープを認識することができないだろうということである。対照的に、自己ビメンチン２８〜４９エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいてＩＦＮγ応答を刺激した。以前の研究により、ｖｉｍ  ２８〜４９エピトープが、正常なドナー、または関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者において免疫応答を刺激できなかったことが示されている［３４］。対照的に、本発明者らは、癌患者がｖｉｍ  ２８〜４９に対して免疫応答を起こすことを示している。これは、予想外にも、このエピトープが、自己寛容を受けにくく、このエピトープを認識して応答することができるＴ細胞のレパートリーがマウスとヒトの両方にあることを示唆している。
【００２３】
ビメンチン（ｇｉ／４５０７８９５）は、間葉系細胞および他の非上皮細胞において、中間径フィラメント（ＩＦ）、具体的にはクラスＩＩＩ  ＩＦに見出されるホモ二量体細胞内タンパク質である。ＩＦは、高等真核細胞の細胞骨格の主要な構成成分であり、いくつかの異なる構造的に関連したタンパク質で構成される。異なるＩＦタンパク質遺伝子は、異なる組織に発現している。ヒトとマウスのどちらのビメンチン遺伝子も特徴づけられている（例えば、［３５、３６］参照）。
【００２４】
他のＩＦタンパク質と共にビメンチンは、ヒト腫瘍の組織学的分類において（概説として、［３７、３８］を参照）、およびいくつかの型の腫瘍における脱分化についてのマーカーとして、用いられている。多剤耐性腫瘍性疾患についての診断学および治療学に向けられたビメンチンが記載されており（米国特許出願第２０１００２６０６６７号）、ビメンチンおよび他のＩＦと共存する腫瘍マーカーも同様であり、例えば、ＷＯ０１２７２６９を参照されたい。後者は、ＶＩＰ５４と呼ばれる、神経芽細胞腫についての新規のマーカー、ならびに腫瘍発生および進行のマーカーとしてのＩＦの検出および細胞画像化におけるそれの使用を記載する。異なる型のヒト固形腫瘍および固形腫瘍細胞系においてビメンチンの発現レベルおよび細胞内分布の変化を示すいくつかの他の例が知られている［３９、４０］。しかしながら、これまでに、非修飾型ビメンチンに対するＴ細胞応答の実証はない。
【００２５】
ヒトビメンチンは、４６６個のアミノ酸を含む５７ｋＤａタンパク質であり（添付の図面の図２参照）、ＩＩＩ型ＩＦタンパク質ファミリーの最も広く発現し、かつ高度に保存されたタンパク質の１つである。それは、サイトゾル内に存在しないが、核内に、および細胞外タンパク質として、発現している。それは、細胞骨格の動的組織化に関与し、細胞小器官輸送、細胞遊走、および増殖において重要な機能をもつ。
【００２６】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）；ビメンチンはまた、前立腺癌、消化器癌、乳癌、肺癌、悪性メラノーマ、および中枢神経系の腫瘍を含む様々な上皮癌において過剰発現している。それはまた、子宮頚癌［４１］、腎明細胞癌腫［４２］、特定の型のリンパ腫［４３］、甲状腺乳頭癌腫［４４］、および子宮内膜癌腫［４５］にも見出される。癌におけるそれの過剰発現は、加速化腫瘍成長、浸潤、および予後不良と相関している。胃癌において、ビメンチン発現は、浸潤性表現型の胃癌腫と関連づけられる場合が最も多く、胃癌腫の転移において重要な役割を果たし、加えて、予後マーカーとして機能することが示唆される［４６、４７］。上皮間葉転換（ＥＭＴ）表現型を示す軟部肉腫およびいくつかの上皮癌はビメンチンを発現する。ＥＭＴによる上皮表現型から間葉様表現型への癌腫細胞の切り換えは、固形腫瘍の転移における関連ステップとして認識されている（添付図面の図３参照）。追加として、この癌腫細胞の表現型切り換えは、放射線照射、化学療法、およびいくつかの小分子標的治療の抗腫瘍効果を低下させる腫瘍抵抗性機構の獲得と関連づけられる。ビメンチンは、ＥＭＴについてのマーカーとして認識されているが、腫瘍形成におけるそれの役割はまだ明らかにされていない。ＥＭＴの最も研究された誘導因子の１つはＴＧＦβであり、それは、複数の腫瘍型において、ＲＴＫシグナル伝達経路または他の経路と協力して、腫瘍細胞をより間葉系で、転移性の表現型にさせることが示されている。Ｉｖａｓｋａ［４８］は、ビメンチンが、いくつかのＥＭＴ関連遺伝子の遺伝子発現、特に遊走促進性受容体チロシンキナーゼＡｘｌの発現を上方制御することによりＥＭＴに寄与することを実証している。いくつかの研究が、ＥＭＴの正の制御因子としてのビメンチン機能およびそれの上方制御がＥＭＴ誘導の必要条件であるという意見を支持している［４８、４９］。上記で挙げられた癌の全て、加えて卵巣癌および消化器癌が、そのエピトープに関わらず、本発明に従って処置される可能性がある。本発明はまた、それだけに限られないが、前立腺癌、乳癌、肺癌、悪性メラノーマ、中枢神経系の腫瘍、子宮頚癌、腎明細胞癌腫、リンパ腫、甲状腺乳頭癌腫、および子宮内膜癌腫の処置に関係し得る。
【００２７】
本発明によるビメンチン２８〜４９および他のエピトープは、ペプチドとして、任意に、ＷＯ０２／０５８７２８に開示されているペプチドの形をとって、インビボで送達してもよい。本発明者らは、驚くべきことに、本発明において有用なエピトープが、ペプチドとして投与された場合、強い免疫応答を生じることを見出している。そのようなエピトープは、ちょうどそのエピトープの配列として、またはそのエピトープを含有するポリペプチドとして、またはさらに完全長タンパク質として投与してもよい。あるいは、本発明によるエピトープは、そのエピトープをコードする核酸、そのエピトープを含有するポリペプチドをコードする核酸、またはさらに完全長タンパク質をコードする核酸としてインビボで投与してもよい。そのような核酸は、ミニ遺伝子の形、すなわち、リーダー配列およびエピトープをコードしてもよいし、またはリーダー配列および完全長タンパク質をコードしてもよい。あるいは、それらは、ＷＯ２００８／１１６９３７に開示されている核酸の形をとってもよい。さらなる側面において、本発明は、免疫グロブリン分子の組換え重鎖をコードする少なくとも１つの配列を含む核酸を提供し、その重鎖が、その中に少なくとも１つの異種性Ｔ細胞エピトープを有し、そのＴ細胞エピトープが、本発明の第１の側面のエピトープ、好ましくはビメンチン２８〜４９である。好ましくは、核酸はさらに、非特異的プロモーターを含み、ＤＮＡであってもよい。免疫グロブリンは抗体であってもよい。エピトープは、重鎖のＣＤＲ、好ましくは重鎖のＣＤＲ３へ挿入してもよい。本発明において有用なエピトープをコードする核酸は、抗原提示細胞、およびＰＡＤ酵素、好ましくはＰＡＤ４酵素を発現する他の細胞へターゲットしてもよい。本発明の核酸は、ターゲティング剤、例えば、Ｆｃ、もしくはＡＰＣ上の異なる抗原をターゲットするモノクローナル抗体、例えば、抗ＤＥＣ２０５  ｍＡｂをコードする核酸を含むことにより、または皮膚は多数のＡＰＣを有するので、皮内注射によって、ターゲットしてもよい。
【００２８】
以前の研究により、位置２８および３６でシトルリン化されたｖｉｍ  ２６〜４４、位置３６および４５でシトルリン化されたｖｉｍ  ３６〜５４、ならびに位置４２４でシトルリン化されたｖｉｍ  ４１５〜４３３は、ＨＬＡ−ＤＲ４マウスおよび／またはＲＡ患者においてＴ細胞応答を刺激することができることが示されている［３４］。実施例において詳細に記載されているように、ＤＮＡ構築物内のｖｉｍエピトープが、シトルリン化ビメンチンに対する免疫応答を刺激しているかどうかを試験するために、ビメンチンエピトープをコードするＤＮＡでマウスを免疫化し、非修飾型およびシトルリン化エピトープに対する応答についてスクリーニングした。ｖｉｍ  ２８〜４９  ＤＮＡまたはビメンチン全配列をコードするＤＮＡで免疫化したマウスは、野生型エピトープよりシトルリン化２８〜４９エピトープに対してより強く応答した。これは、ＤＮＡが翻訳された時、ｖｉｍエピトープがシトルリン化され、シトルリン化エピトープがＭＨＣへより高い親和性で結合すること、または非修飾型ｖｉｍエピトープで刺激されたＴ細胞がシトルリン化エピトープをより貪欲に認識することを示唆している。
【００２９】
ｖｉｍ  ２８〜４９とは対照的に、ｖｉｍ  ４１５〜４３３  ＤＮＡまたはビメンチン全配列をコードするＤＮＡは、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３を認識するが、野生型ｖｉｍ  ４１５〜４３３を認識しない応答を刺激するのみであり、エピトープ提示細胞（ＡＰＣ）内のＤＮＡが、シトルリン化されるだろうペプチドへ翻訳されるだろうことを確認した。この関連において、樹状細胞がシトルリン化酵素ＰＡＤ２およびＰＡＤ４を発現することが最近、示されている［５１］。さらに興味深いことには、ｖｉｍ  ４１５〜４３３コード化ＤＮＡが、強いＴｈ１７応答を与えることであった。ＭＭＰ７およびＮＹＥＳＯ−１由来のエピトープをコードするＤＮＡワクチンもまた、シトルリン化および非修飾型エピトープを認識することができるＴ細胞を刺激した。ＭＭＰ−７応答は、主にＴｈ１７であったが、ＮＹＥＳＯ−１応答は、主にＴｈ１であった。同様に、癌患者は、これらのＭＭＰ７およびＮＹＥＳＯ−１修飾型および非修飾型ペプチドに対する応答を示した。
【００３０】
単球がＰＡＤ酵素を発現することを示すいくつかの報告がある［２７、５２、５３］。最近になって、骨髄由来樹状細胞と腹腔マクロファージの両方が、ＰＡＤ２およびＰＡＤ４を発現することが示されている［５１］。炎症過程の一部としてのシトルリン化は、探求され始めたばかりである。末梢血単核細胞のＩＦＮγおよび二本鎖ＲＮＡでの刺激は、サイトカインＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ１０のシトルリン化を引き起こし、それらの受容体の利用、タンパク質分解性プロセシング、および生物活性へ根本的な効果を生じる［５４〜５６］。これは、ＴＯＬＬ受容体、ＤＡＭＰ受容体、または熱ショックタンパク質を介する細胞ストレスのメディエーターが、ＡＰＣ内と、標的細胞、例えば、感染細胞または腫瘍細胞内の両方において、ＰＡＤ酵素の生理学的活性化を可能にして、修飾型自己エピトープへの寛容の破壊、および免疫応答の誘導を可能にすることを意味する可能性がある。樹状細胞内のシトルリン化は、オートファジーに関連しているように思われるが［５７］、これは鶏卵リゾチームに関してだけ実証されている。ここで開示されているように、非修飾型エピトープをコードするＤＮＡは、シトルリン化エピトープに特異的であるＴ細胞応答を刺激することができる。これは、そのＤＮＡが翻訳され、ＡＰＣ内で翻訳後シトルリン化されて、シトルリン化エピトープに特異的であるＴ細胞を刺激することを意味する。核酸ワクチンがシトルリン化を刺激することが示されたのはこれが最初である。腫瘍が、ＭＨＣ分子上に提示されるいかなるエピトープについてもシトルリン化するという報告はない。
【００３１】
抗体−ＤＮＡ内のエピトープをコードするものがより高い頻度およびより高い結合活性の応答を与えることを示したことに加えて、本発明者らはまた、シトルリン化ペプチドが、Ｔ細胞応答を刺激することをここで示している。シトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４９ペプチドは、野生型ペプチドに対するいくらかの交差反応があるにしても、修飾型エピトープを認識するＴｈ１応答を主に刺激した。野生型ｖｉｍ  ２８〜４９ペプチドは、野生型と修飾型の両方のエピトープに対するＴｈ１応答を刺激した。癌患者がいずれかのペプチドで刺激された場合、２人／１１人が非修飾型エピトープに応答し、５人／１１人がシトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４９に応答した。Ｈｉｌｌら［５０］は、位置３３においてＬの代わりにＡを用いる、改変されたシトルリン化ｖｉｍ  ６５〜７７エピトープが、非修飾型エピトープより強くＨＬＡ−ＤＲ４に結合することを以前に示している。しかしながら、これは合成抗原であり、天然ｖｉｍ  ６５〜７７エピトープは、たとえそれがシトルリン化されているとしても、免疫応答を誘導しないことは、ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて示されている［３４］。対照的に、本発明者らは、シトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４９およびｖｉｍ  ６５〜７７ペプチドが、その修飾型エピトープを主に認識するＴｈ１応答を刺激するが、野生型エピトープが弱い免疫原であったことをＨＬＡ−ＤＲ４マウスにおいて示している。さらなる分析により、これらの応答が、ＣＤ４  Ｔ細胞により媒介されることが確認された。シトルリン化ｖｉｍ  ６５〜７７もまた、ＨＬＡ−Ａ２．ＤＲ１トランスジェニックマウスにおいて応答を刺激した。しかしながら、さらなる分析により、これはＣＤ８応答であり、その特異的エピトープはＲＬｃｉｔＳＳＶＰＧＶであることが明らかにされた。シトルリン化ＣＤ８エピトープが記載されたのはこれが最初である。
【００３２】
予想外にも、本発明者らは、癌患者において、４人／９人の患者が、ｖｉｍ  ６５〜７７に応答し、４人／９人がシトルリン化ｖｉｍ  ６５〜７７に応答したが、これらの患者のうちの２人だけが、両方のペプチドに応答したことを示している。ＤＮＡ免疫化と同様に、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドで免疫化したマウスは、その修飾型エピトープに特異的である応答を刺激したが、野生型エピトープは、応答を刺激することができなかった。さらに、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドは、非常に強いＩＬ−１７応答を刺激した。対照的に、癌患者において、８人／１１人が野生型エピトープに応答したが、５人／１１人のみが、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３に応答した。これは、非修飾型エピトープと修飾型エピトープの両方が、患者においてＴ細胞応答を刺激することができること、およびこれらのＴ細胞が常に交差反応するとは限らないことを示唆している。これもまた、以前にＲＡ患者に限定されると考えられていたシトルリン化エピトープに癌患者が応答することができることの最初の実証である。
【００３３】
修飾型ペプチドおよびそのようなペプチドをコードするＤＮＡは、修飾型エピトープに対する免疫応答を刺激することができ、これらの修飾型エピトープは、標的腫瘍細胞により発現している。シトルリン化ビメンチンは炎症性マクロファージ内に存在し［５８、５９］、ヒトおよびマウスマクロファージのカルシウムイオノフォア誘導性アポトーシス中に観察される。マクロファージは、ＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方においてＰＡＤを発現し［６０］、シトルリン化ビメンチンは、インビトロで、イオノフォア誘導性Ｃａ2+流入後、マクロファージ様細胞において発現する［２７、５８］。しかしながら、正常には、サイトゾルＣａ2+濃度（約１０-7Ｍ）はＰＡＤ酵素の活性にとって低すぎる。ＰＡＤ活性に必要とされる最小Ｃａ2+濃度は、正常なサイトゾルＣａ2+濃度より約１００倍高い。これらのイオノフォアおよび同時的Ｃａ2+流入はアポトーシスを引き起こすので、ビメンチンのシトルリン化はアポトーシスと関連づけられることが示唆された。実際、シトルリンは、アポトーシス中、分解のために細胞内タンパク質を調製するのに重要な役割を果たしている。ビメンチンは、アポトーシスを起こすマクロファージにおいてシトルリン化されていることが示されており、シトルリン化ビメンチンに対する抗体は、アポトーシス材料の不適当な廃棄の事象において、生成されることが示されている［２７］。そのような研究により、特に修飾が細胞および組織特異的に見えることを考慮すれば、ビメンチンの機能を制御することにおける翻訳後修飾についての重要な役割が示唆される。しかしながら、ＰＡＤがアポトーシス性腫瘍細胞において活性化されるだけの場合には、シトルリン化タンパク質は、これらの細胞がすでに瀕死であるため、良くない標的であろう。しかしながら、本発明者らは、修飾型エピトープを認識するＴ細胞が、強力な抗腫瘍応答を生じることを示しており、ＡＰＣのような生存腫瘍細胞が局所的に高い細胞内カルシウムレベルを放出することができ、結果として、標的タンパク質のシトルリン化を生じることを示唆している。さらに、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３およびｖｉｍ  ２８〜４９により誘導されるＴ細胞が、ＭＨＣクラスＩＩおよびエピトープ発現という状況において、腫瘍細胞を認識し、殺すことができるが、正常細胞を認識し、殺すことができない、ＣＤ４  Ｔ細胞を誘導する。
【００３４】
シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３は、Ｔ細胞応答を刺激することが示されたが、非修飾型エピトープは刺激せず、これは、ヒトｖｉｍ  ４１５〜４３３とマウスｖｉｍ  ４１５〜４３３の間での２個のアミノ酸の違いに関連した可能性がある。したがって、マウスを、マウスエピトープに対する応答についてスクリーニングした。シトルリン化ヒトビメンチンで免疫化したマウスは、マウスビメンチンを認識した。さらに、ヒトエピトープのように、これはＴｈ１／Ｔｈ１７応答であった。以前に、Ｔｈ１またはＴｈ１７応答の誘導は、適切な応答のために正しいサイトカイン環境を生じる免疫アジュバントによって強く影響されることが示されている。ＩＦＮγおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞の分化を引き起こす。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、およびＧＭ−ＣＳＦを産生し、例えば、ＣＤ8+  Ｔ細胞の活性化を刺激する。対照的に、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４によって分化する。それらは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を分泌し、抗体産生においてＢ細胞を補助し、Ｔｈ１細胞によって誘導される炎症促進性応答を下方制御する。ＴＧＦβ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３は、Ｔｈ１７細胞の分化を引き起こす。それらはＩＬ−１７およびＩＬ−６を産生する。ＣＤ４+  Ｔ細胞は、炎症促進性サイトカインの非存在下であるが、高濃度のＴＧＦβにおいて、ｉＴｒｅｇへ分化する（添付の図面の図４参照）。これらの細胞は、ＴＧＦβおよびＩＬ−１０を分泌し、転写因子フォークヘッドボックスｐ３（Ｆｏｘｐ３）によって特徴づけられる。それらは、他のエフェクターＴ細胞による免疫応答をコントロールおよび対抗し、自己免疫の防止に関与している［６１］。
【００３５】
したがって、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドは様々なアジュバントと共に、または実際にはアジュバントなしで免疫化した。免疫刺激性アジュバント、例えば、ＣｐＧ／ＭＰＬＡとＧＭＣＳＦのどちらも、Ｔｈ１／Ｔｈ１７応答を刺激し、アジュバントの非存在下で応答がないため、必要とされた。不活性アジュバント、例えば、アラムおよび不完全フロイントアジュバントは、ＩＬ−１０応答をまた誘導した野生型ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドでの免疫化と同様に、主にＩＬ−１０応答の誘導を引き起こし、ｉＴｒｅｇ応答の誘導を示唆した。対照的に、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドの最適なアジュバントとの組み合わせは、ＩＦＮγ／ＩＬ−１７応答を誘導し、Ｔｈ１７応答を示唆した。Ｔ細胞エピトープがＴヘルパー細胞分化を決定し得ることを例示したのはこれが最初である。
【００３６】
マウスは、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドでの単一免疫化に対する強いＴｈ１／Ｔｈ１７応答で応答したため、これは、内在性Ｔｒｅｇ応答へのブーストを反映した可能性がある。しかしながら、内在性Ｔｒｅｇの枯渇は、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３免疫応答の頻度または結合活性に影響を及ぼすことはできず、これはありそうにないことを示唆した。それは、インサイチュで提示された野生型ｖｉｍ  ４１５〜４３３エピトープが、ＩＬ−１０の産生によって特徴づけられるｉＴｒｅｇ応答を刺激していたということであった可能性がある。実際、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドで免疫化したマウスはＩＦＮγ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１０応答を起こしたが、非修飾型エピトープで免疫化したマウスはＩＬ−１０応答を刺激するのみであった。非修飾型ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドはまた、癌患者においてＩＬ−１０応答を刺激した。抗ＣＴＬＡ−４  ｍａｂは、ＣＴＬＡ−４のそれの同族受容体ＣＤ８０／８６との相互作用を遮断し、したがって、このリガンドにより誘導されるＴ細胞の阻害を阻止することができる。抗ＣＴＬＡ−４  ｍａｂの存在下でのシトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドでのマウスの免疫化は、Ｔ細胞応答の結合活性を１０-6Ｍから１０-8Ｍへ有意に増加させた。
【００３７】
本発明のさらなる側面によれば、医薬に用いるための、自己抗原に対するＩＬ−１０免疫反応を刺激する修飾型エピトープ、および／またはそのようなエピトープをコードする核酸が提供され、そのエピトープが、アルギニンからシトルリンへの脱イミノ化、チロシンのニトロ化、トリプトファンの酸化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化から選択される修飾を有する。本発明のさらなる側面によれば、Ｔヘルパー細胞を、ここで定義されているエピトープおよび／または核酸、ならびに任意にアジュバントと接触させることを含む、Ｔヘルパー細胞分化を調節するための方法が提供される。本発明のなおさらなる側面は、Ｔヘルパー細胞分化を調節する方法に用いるための、ここで定義されているエピトープおよび／または核酸、ならびに任意にアジュバントを提供する。本発明のなおさらなる側面は、Ｔヘルパー細胞分化を調節するための薬物の製造における、ここで定義されているエピトープおよび／または核酸、ならびに任意にアジュバントの使用を提供する。本発明のこれらの側面において有用なエピトープは、本発明の第１の側面に定義されているエピトープであってもよく、および／または自己抗原に対するＩＬ−１０免疫反応を刺激する修飾型エピトープであって、そのエピトープが、アルギニンからシトルリンへの脱イミノ化、チロシンのニトロ化、トリプトファンの酸化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化から選択される修飾を有する、修飾型エピトープであってもよい。アジュバントは、不完全フロイントアジュバント、ＣｐＧ、ＭＰＬＡ、ＧＭＣＳＦ、および完全フロイントアジュバントであってもよい。
【００３８】
本発明において有用なエピトープおよび／または核酸は、免疫応答を刺激するようにＴヘルパー細胞分化を方向づけるために用いることができる。それとして、それらは、そのようなワクチンの効力を増加させるためにワクチンと共に用いることができる。本発明者らによって実証されているように、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドは、ＩＦＮγ／ＩＬ−１７応答を誘導し、Ｔｈ１７応答を示唆した。これは、Ｔヘルパー細胞のｉＴｒｅｇ細胞への分化を引き起こす、ｖｉｍ  ４１５〜４３３および他の自己エピトープに対する正常な応答と対照的である。
【００３９】
あるいは、本発明において有用なエピトープおよび／または核酸は、免疫応答を抑制するようにＴヘルパー細胞分化を方向づけるために用いることができる。シトルリン化ＩＮＧ４は、ＩＬ−１０応答を生じ、ｉＴｒｅｇ応答および免疫応答の抑制を示唆している。そのようなエピトープは、免疫抑制が望ましい疾患、例えば、自己免疫疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置において用いることができる。自己免疫疾患の例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー−皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、デゴス病、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年型、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、ループス、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎・皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑症、およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【００４０】
本発明のさらなる側面によれば、結腸直腸癌細胞においてペプチジルアルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤ４）のレベルを決定することを含む、結腸直腸癌において生存を予測する方法が提供される。腫瘍の９４％がＰＡＤ４を発現する。ＰＡＤ４の発現を喪失する腫瘍細胞は、予後不良を示し、生存の低下を示唆する。したがって、結腸直腸癌がＰＡＤ４の有りか無しかの発現を示す場合には、その患者の予後は不良である。理論によって縛られることを望むものではないが、これは、Ｔ細胞によって認識され、かつ殺害され得るシトルリン化エピトープの欠損と関連している可能性がある。したがって、腫瘍は、免疫監視を逃れる。逆に、腫瘍がＰＡＤ４を発現する場合には、標的は脱イミノ化され、腫瘍成長は、免疫応答によりコントロールされ、患者の予後はより良い。
【００４１】
ＰＡＤ４のレベルは、細胞におけるＰＡＤ４タンパク質の量を測定する抗体または他のイムノアッセイを用いることにより決定することができる。あるいは、ＰＡＤ４  ｍＲＮＡのレベルを、インサイチュハイブリダイゼーションによって測定することができる。当業者は、ｍＲＮＡのレベルを決定するための適切な代替技術、加えて、タンパク質のレベルを決定するための代替技術を知っている。
【００４２】
結腸直腸腫瘍の９０％はビメンチンを発現し、それは、主に、間質性および浸潤性細胞において見出された。細胞の１５％において、いくつかの上皮細胞もまた、染色され、腫瘍の１２％において、全ての細胞の７５％より多くが染色された。結腸直腸腫瘍の６％だけが、ＰＡＤ４特異的ｍＡｂで染色することができなかった。カプラン・マイヤー生存分析により、ＰＡＤ４強度と生存の相関があることが示された。多変量モデルにおいて、ＴＮＭステージ（ｐ＝＜０．０００１）、血管侵入（ｐ＝＜０．０００１）、およびＰＡＤ４発現（ｐ＝０．００４）が、患者生存の独立予測因子であり、ＰＡＤ４が、結腸直腸癌における有用な予後マーカーであり得ることが示唆された。ＰＡＤ４の発現と、ＢＣＬ２（ｐ＝０．０１）、β−カテニン（ｐ＝０．００１）、いくつかのＣＤ８  Ｔ細胞（ｐ＝０．００６）、ＭＵＣ１（ｐ＝０．０００）、ＣＥＡ（ｐ＝０．０００）、ＣＤ５９（ｐ＝０．０３８）、およびビメンチン（ｐ＝０．０００）との相関があり、これらの全てが、修飾型タンパク質についての標的であり得ることが示唆された。
【００４３】
本発明者らによって実行された実験において、卵巣腫瘍の８９％がビメンチンについて強く染色され、４％だけが、抗ＰＡＤ４抗体で染色することができなかった。さらに、８２％はまた、シトルリンを発現し、その酵素が活性であることが示唆された。ＰＡＤ４の発現は、ストレス関連タンパク質ＲＡＥＴ１ＥおよびＵＬＢＰ１と相関し、細胞がストレスを加えられる時のこの酵素の活性化が示唆された。ビメンチンとの強い相関があり、シトルリン化ビメンチンが卵巣癌において良い標的であることが示唆された。ＨＭＧＢ１は、腫瘍の８７％によって発現され、また、ビメンチンの発現と相関した。
【００４４】
本発明のさらなる側面によれば、卵巣癌細胞においてペプチジルアルギニンデイミナーゼ２（ＰＡＤ２）および／または高移動度タンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１）のレベルを決定することを含む、卵巣癌において生存を予測する方法が提供される。腫瘍の９１％がＰＡＤ２を発現する。ＰＡＤ２の発現を喪失する腫瘍細胞は、予後不良を示し、生存の低下を示唆する。したがって、卵巣癌がＰＡＤ２の有りか無しかの発現を示す場合には、その患者の予後は不良である。理論によって縛られることを望むものではないが、これは、Ｔ細胞によって認識され、かつ殺害され得るシトルリン化エピトープの欠損と関連している可能性がある。したがって、腫瘍は、免疫監視を逃れる。逆に、腫瘍がＰＡＤ２を発現する場合には、標的は脱イミノ化され、腫瘍成長は、免疫応答によりコントロールされ、患者の予後はより良い。
【００４５】
本発明者らによって実行された実験において、卵巣腫瘍の１６％がＰＡＤ２について強く染色された。さらに９１％はまた、シトルリンを発現する。ＰＡＤ２の発現は、オートファジーとの関連を示唆するＨＭＧＢ１発現、および免疫応答とのリンクを示唆するＭＨＣ発現と相関した。
【００４６】
腫瘍の８７％は、ＨＭＧＢ１を発現する。ＨＭＧＢ１の発現を喪失する腫瘍細胞は、より良い予後を示し、生存の増加を示唆する。高レベルのＨＭＧＢ１を有する腫瘍は、強力な生存機構である強いオートファジーを有し、予後不良と相関した。したがって、卵巣癌が、ＨＭＧＢ１の有りか無しかの発現を示す場合には、その患者の予後は良く、低レベルはより良い予後であり、高発現は悪い予後である。
【００４７】
ＨＭＧＢ１のレベルは、細胞におけるＨＭＧＢ１タンパク質の量を測定するための抗体または他のイムノアッセイを用いることにより決定することができる。あるいは、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのレベルを、インサイチュハイブリダイゼーションによって測定することができる。当業者は、ｍＲＮＡのレベルを決定するための適切な代替技術、加えて、タンパク質のレベルを決定するための代替技術を知っている。
【００４８】
卵巣腫瘍の８７％はＨＭＧＢ１を発現し、それは主に、核および細胞質内に見出された。カプラン・マイヤー生存分析により、ＨＭＢＧ１レベルと生存の相関（ｐ＝０．００１）があることが示された。多変量モデルにおいて、ＴＮＭステージ（ｐ＝＜０．０００１）、腫瘍型（ｐ＝０．０３１）、化学療法に対する応答（ｐ＝＜０．００１）、およびＨＭＧＢ１の欠損（ｐ＝０．００２）は、患者生存の独立予測因子であり、ＨＭＧＢ１が卵巣癌における有用な予後マーカーであり得ることが示唆された。
【００４９】
高いＨＭＧＢ１発現および低いＰＡＤ２発現を示した患者において、３１０人のうちの２１９人の患者（７０％）は、５０カ月の最も悪い生存期間中央値を有し、低ＨＭＧＢ１および低ＰＡＤ２を有する患者は、より良い生存を示し、３１０人のうちの４１人の患者（１３％）は、１０１カ月間の生存期間中央値を有した。理論によって縛られることを望むものではないが、これは、シトルリン化エピトープの欠損およびオートファジーの欠損に関連づけられる可能性があり、腫瘍は免疫監視を逃れ、生存能力は弱い。
【００５０】
哺乳動物において、それぞれが別個の遺伝子によってコードされる５つのＰＡＤアイソタイプが同定されている［６０］。これらの酵素の全ては、活性のためにＣａ2+の存在に強く依存している。ＰＡＤの全てのアイソタイプは、広範な相互の配列相同性を示す。アイソタイプ間での最も注目すべき違いは、それらの組織特異的発現である。全てのアイソタイプは、インビトロで、アクセス可能なアルギニンを有するたいていのタンパク質をシトルリン化することができる［６２］が、特定のタンパク質は、個々のＰＡＤによって、他のものより迅速にシトルリン化される［６３］。ペプチド研究により、アルギニン残基に隣接する特定のアミノ酸は、シトルリン化に対する感受性に影響することが示されている［２０］。
【００５１】
これらの酵素の全ては、活性のためにＣａ2+の存在に強く依存する。ＰＡＤの全てのアイソタイプは、広範な相互の配列相同性を示す。アイソタイプ間での最も注目すべき違いは、それらの組織特異的発現である。全てのアイソタイプは、インビトロで、アクセス可能なアルギニンを有するたいていのタンパク質をシトルリン化することができる［６２］が、特定のタンパク質は、個々のＰＡＤによって、他のものより迅速にシトルリン化される［６３］。ペプチド研究により、アルギニン残基に隣接する特定のアミノ酸は、シトルリン化に対する感受性に影響することが示されている［２０］。
【００５２】
最も広く発現するＰＡＤアイソタイプである、ＰＡＤ２は、多くの異なる組織、例えば、骨格筋、脳、脾臓、分泌腺、およびマクロファージ内に存在する。この広範な発現パターンにも関わらず、生理学的シトルリン化が、ミエリン鞘の電気絶縁性を保証するのに重要である、中枢神経系におけるミエリン結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびビメンチンだけが、天然基質として同定されている。ＣＮＳの慢性炎症障害である、多発性硬化症（ＭＳ）において、ミエリン鞘が破壊され、患者は、シトルリン化ＭＢＰに対して自己免疫応答を起こす。健康な成人において、ＭＢＰの１８％がシトルリン化され、一方、ＭＳにおいて、４５％より多くがシトルリン化され、アンフォールディングおよび分解の増加をもたらす。
【００５３】
ＰＡＤ１は、主に、表皮および子宮において発現し、ケラチノサイトの最終分化中に、ケラチン（Ｋ１およびＫ１０）およびケラチン関連タンパク質フィラグリンがシトルリン化される。一般的に、シトルリン化は、タンパク質上の電荷を減少させ、心房アンフォールディング、表皮の柔軟性の低下および角化をもたらす。乾癬は、ＰＡＤ１により乾癬表皮における異常なシトルリン化によって引き起こされる。ＰＡＤ３は、毛包／羊毛包に限定され、その天然基質が、毛包の内毛根鞘細胞の主要な構造タンパク質であるトリコヒアリンである。ＰＡＤ６は、卵細胞および胚によって発現される。
【００５４】
滑膜ＴおよびＢ細胞、マクロファージ、好中球、加えて、線維芽細胞様滑膜細胞を含む炎症性白血球は、２つのＰＡＤアイソフォーム、２および４を発現する［２７、６４］。すべて、主に、細胞の細胞質内に局在する他のＰＡＤと違って、ＰＡＤ４は核内に局在する。ＰＡＤ４の核局在シグナルは、そのタンパク質のＮ末端領域に見出された。ＰＡＤ４は、主に、末梢血顆粒球および単球に発現している。ＰＡＤ４はまた、腺癌腫を含む多くの腫瘍組織によって発現される［６５］。免疫組織化学法によっても、ＰＡＤ４のサイトケラチンとの共存が検出され、ウェスタンブロッティングにより、腫瘍から抽出されたサイトケラチンにおいてシトルリンシグナルが検出された。加えて、インビトロのシトルリン化後のサイトケラチン８、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９は、カスパーゼによる消化に抵抗した。これは、腫瘍に成長優位性を与えることができた。シトルリン含有タンパク質は、末梢白血球において、これらの細胞がＰＡＤ４の強い発現を示したとしても、検出できなかった。カルシウムの濃度が、ＰＡＤ４の活性化および結果としてのシトルリン化において重要な因子であることが示唆されている。加えて、関節リウマチ（ＲＡ）滑膜のシトルリン化は、主に、それの細胞外沈着物内で起こるが、シトルリン化タンパク質は、腫瘍細胞の内側に位置している。ヒストンのシトルリン化は、腫瘍内の遺伝子発現を変化させることができ、ＩＮＧ４のシトルリン化は、それのｐ５３との会合を阻害し、この強力な腫瘍抑制遺伝子の不活性化をもたらす［６６］。
【００５５】
本発明はまたそれの範囲内に、上記および／または表３、８、９、もしくは１０に示されているアミノ酸配列、ならびにそれと実質的な同一性、例えば、それと７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を有するポリペプチド、加えて、医薬における、特に、癌を処置するための方法におけるそれらの使用を含む。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性は、一般的に、最適な比較を行うために配列を整列させ（例えば、第１の配列において、第２の配列との最良のアラインメントのためにギャップを導入することができる）、対応する位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較することにより決定される。「最良のアラインメント」は、結果として最高のパーセント同一性を生じる２つの配列のアラインメントである。パーセント同一性は、それらの配列内の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を比較することにより決定される（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。
【００５６】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に知られた数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較するための数学アルゴリズムの例は、［６７］にあるような改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムである。ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムは、そのようなアルゴリズムを組み入れている［６８］。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行して、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップドアラインメントを得るために、［６９］に記載されているように、ギャップドＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行することができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用した場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列の比較のために利用された数学アルゴリズムの別の例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムである［７０］。ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、そのようなアルゴリズムを組み入れている。当技術分野において知られた配列解析のための他のアルゴリズムには、［７１］に記載されているＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびに［７２］に記載されたＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡ内において、ｋｔｕｐは、検索の感度および速度を設定するコントロールオプションである。
【００５７】
ここで用いられる場合、用語「処置」は、ヒトまたは非ヒト動物の利益になることができる任意の療法を含む。ポリペプチドまたは核酸は、薬学的に許容される担体と組み合わせて用いてもよい。そのような担体には、それだけに限られないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられ得る。
【００５８】
本発明において有用なペプチドは、当業者に知られたＦｍｏｃ化学法または他の標準技術を用いて合成してもよい。
【００５９】
注射は、本発明の組成物の治療的投与のための主要な経路であるが、カテーテルまたは他の外科的管類を通しての送達もまた用いてもよいことは想定される。いくつかの適切な投与経路には、静脈内、皮下、皮内、腹腔内、および筋肉内の投与が挙げられる。液体製剤は、粉末製剤からの再構成後に利用してもよい。
【００６０】
静脈内注射または苦痛の部位における注射について、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨを有し、等張性であり、かつ安定性を維持する非経口的に許容される水溶液の形をとる。当業者は、例えば、等張性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液または乳酸リンゲル注射液を用いて適切な溶液を調製することは十分できる。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／または他の添加物は、必要に応じて含まれてもよい。
【００６１】
経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末、または液体の形をとってもよい。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、またはアジュバントを含んでもよい。液体薬学的組成物は、一般的に、液体担体、例えば、水、石油、動物もしくは植物油、ミネラルオイル、または合成油を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他のサッカライド溶液、またはグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールが含まれてもよい。製剤が液体である場合、それは、例えば、ｐＨ６．８〜７．６における非リン酸緩衝液を含有する生理食塩水、または凍結乾燥した粉末であってもよい。
【００６２】
組成物は、腫瘍部位もしくは他の望まれる部位への限局化様式で投与してもよく、またはそれが腫瘍もしくは他の細胞をターゲットする様式で送達してもよい。
【００６３】
組成物は、好ましくは、「治療的有効量」で個体に投与され、この治療的有効量とは、個体に利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および経時変化は、処置されることになっているものの性質および重症度に依存する。処置の処方、例えば、投薬量に関する決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与方法、および開業医に知られた他の因子を考慮に入れる。本発明の組成物は、特に、癌の処置、および最初の処置または手術後のそのような状態の再発の予防に関連している。上記で言及された技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる［７３］。組成物は、処置されるべき状態に依存して、単独で、または他の処置と併用して同時もしくは逐次的に投与してもよい。他の癌処置には、当技術分野で知られた、他のモノクローナル抗体、他の化学療法剤、他の放射線治療、または他の免疫治療が挙げられる。本発明の組成物の１つの特定の適用は、手術の補助として、すなわち、腫瘍が除去された後の癌再発のリスクを低下させるように助けることである。本発明の組成物は、全体的に、または部分的に化学合成によって作製してもよい。組成物は、十分確立された標準的な液相、または好ましくは、固相ペプチド合成方法に従って容易に調製することができ、その一般的説明は広く入手でき（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ［７４］、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［７５］、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ、ＡＢＩ  Ｉｎｃ．を参照）、またはそれらは、液相方法により、もしくは固相、液相、および溶液化学法の任意の組み合わせにより、例えば、まずそれぞれのペプチド部分を完成することにより、その後、望ましくかつ適切ならば、存在するいかなる保護基も除去した後、それぞれの炭酸もしくはスルホン酸もしくはその誘導体の反応による残基Ｘの導入により、溶液中で調製してもよい。
【００６４】
本発明による組成物の別の便利な方法は、発現系における核酸の使用により、それをコードする核酸を発現させることである。
【００６５】
本発明はさらに、本発明の組成物をコードする単離された核酸を提供する。好ましい側面において、本発明は、上記で定義されている本発明の組成物をコードする核酸を提供する。当業者は、本発明の組成物をなお提供するだろう、そのような核酸への置換、欠失、および／または付加を決定することができるだろう。核酸は、クローニングにより得られ、または化学合成により産生される、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであってもよい。治療的使用について、核酸は、好ましくは、処置されることになっている対象において発現する能力がある形をとる。本発明において有用なポリペプチドまたは本発明の核酸は、単離物として、単離された、および／もしくは精製された形で、またはそれが天然で付随している物質を含まずに、もしくは実質的に含まずに、提供してもよい。核酸の場合、それは、発現のためのおそらく１つ以上の制御配列を除いて、ヒトゲノムにおいてその遺伝子に隣接する核酸を含まず、または実質的に含まなくてもよい。核酸は、全体的に、または部分的に合成であってもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡを含んでもよい。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合、示された配列への言及は、ＵがＴに代わって置換されている、ＲＮＡ等価物への言及として解釈されるべきである。
【００６６】
本発明において有用なポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、核酸配列およびクローンが入手可能ならば、ここで含有される情報および参考文献、ならびに当技術分野において知られた技術（例えば、［７６、７７］参照）を用いて、当業者により容易に調製することができる。これらの技術には、（ｉ）例えばゲノム源由来の、そのような核酸の試料を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列を調製することが挙げられる。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、コードするＤＮＡを取得し、発現されるべき部分の両側に適切な制限酵素認識部位を同定し、そのＤＮＡから前記部分を切り取ることによることを含む、当業者に知られた任意の適切な方法で作製し、用いてもよい。その後、その部分は、標準的な市販の発現系において適切なプロモーターに作動可能に連結してもよい。別の組換えアプローチは、ＤＮＡの関連部分を適切なＰＣＲプライマーを用いて増幅することである。配列への改変は、改変されたペプチドの発現をもたらすために、またはその核酸を発現するために用いられる宿主細胞におけるコドン選択を考慮するために、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、行うことができる。
【００６７】
本発明はまた、上記に記載の少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形をとる構築物を提供する。本発明はまた、上記のような１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。言及されているように、本発明の組成物をコードする核酸は、本発明の側面を形成し、方法がコードする核酸からの発現を含む、組成物の産生の方法も同様である。発現は、便利には、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより達成してもよい。発現による産生の後、組成物は、任意の適切な技術を用いて単離および／または精製してもよく、その後、必要に応じて用いてもよい。
【００６８】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系はよく知られている。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種性ポリペプチドの発現のための当技術分野において入手可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、および他多数が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。原核細胞、例えば、大腸菌における抗体および抗体断片の発現は、当技術分野において十分確立されている。概説として、例えば、［７８］を参照されたい。
【００６９】
培養中の真核細胞における発現もまた、特異的な結合メンバーの産生のための選択肢として当業者に利用可能であり、最近の概説として、例えば、［７９、８０］を参照されたい。
【００７０】
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含む、適切な制御配列を含有する適切なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス性、例えば、ファージ、またはファージミドでもよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照［７６］。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析についての多くの公知の技術およびプロトコールは、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙにおいて詳細に記載されている［７７］。
【００７１】
したがって、本発明のさらなる側面により、ここで開示されている核酸を含有する宿主細胞が提供され、その宿主細胞は単離されていてもよい。なおさらなる側面により、そのような核酸を宿主細胞へ導入することを含む方法が提供される。導入は、任意の利用可能な技術を用いてもよい。真核細胞について、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニア、もしくは、昆虫細胞について、バキュロウイルスを用いる形質導入が挙げられ得る。細菌細胞について、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられ得る。導入に続いて、例えば、その遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こし、または可能にしてもよい。
【００７２】
１つの態様において、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）へ組み込まれる。組込みは、標準技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の包含により促進してもよい。
【００７３】
本発明はまた、上記に記載のポリペプチドを発現するために、発現系において上記で述べられた構築物を用いることを含む方法を提供する。
【００７４】
本発明の各側面の好ましい特徴は、その他の側面のそれぞれに関して、変更すべきところは変更する。ここで言及された先行技術文書は、法律で認められた最も完全な程度で、組み込まれている。
【００７５】
［実施例］
本発明は、今、以下の例および添付の図面を参照してさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】タンパク質内のアルギニンのシトルリンへの酵素的変換がＰＡＤによって触媒される。
【図２】ヒトビメンチンのアミノ酸配列。
【図３】上皮間葉転換（ＥＭＴ）およびそれの逆過程、間葉上皮転換（ＭＥＴ）を定義する関連表現型変化。図は［８１］から取られた。
【図４】ＣＤ4+  Ｔ細胞の亜集団。ＣＤ4+  Ｔ細胞の主要な集団はＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７、加えてｉＴｒｅｇである。Ｔｒｅｇは、免疫エフェクター細胞の応答をコントロールする。図は、Ｋａｕｆｍａｎｎ［６１］から取られた。
【図５】抗体ＤＮＡ内にコードされるヘルパーエピトープに対するＣＤ４  Ｔ細胞応答。ＨＬＡ−ＤＲ４またはＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウスを、ＣＤＲＬ１またはＣＤＲＨ３内にヘルパーエピトープを含有する抗体ＤＮＡ構築物で遺伝子銃を用いて免疫化した。全てのマウスを、０日目、７日目、および１４日目に３回、免疫化した。ヘルパーエピトープに特異的な応答を、関連ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対するＩＦＮγ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより２０日目にエクスビボで分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図６】ｈｕＩｇＧ１抗体ＤＮＡ二重発現ベクターのＣＤＲＨ３部位へ挿入されたビメンチン２８〜４９ヘルパーエピトープは、インビボで、プロセシングされ、シトルリン化され、提示される。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、抗体ＤＮＡ構築物で、遺伝子銃を用いて、週１回、３週間連続で、免疫化した。１９日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのビメンチン２８〜４９野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７および（ｉｉｉ）ＩＬ−２  ｅｌｉｓｐｏｔにより分析した。
【図７】ｈｕＩｇＧ１抗体ＤＮＡ二重発現ベクターのＣＤＲＨ３部位へ挿入されたビメンチン４１５〜４３３ヘルパーエピトープは、インビボで、プロセシングされ、シトルリン化され、提示される。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、抗体ＤＮＡ構築物で、遺伝子銃を用いて、週１回、３週間連続で、免疫化した。１９日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのビメンチンヒト４１５〜４３３野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７および（ｉｉｉ）ＩＬ−２  ｅｌｉｓｐｏｔにより分析した。
【図８】ＭＭＰ−７ヘルパーエピトープをコードする抗体ＤＮＡ構築物での免疫化により誘発されたＤＲ１マウスにおいてＣＤ４応答。ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウスを、ＣＤＲＬ１内にＭＭＰ−７  ２４７ヘルパーエピトープを含有する抗体ＤＮＡｈｕＩｇＧ１構築物で遺伝子銃を用いて免疫化した。全てのマウスを、０日目、７日目、および１４日目に３回、免疫化した。ヘルパーエピトープに特異的な応答を、ＭＭＰ７ヒト２４７野生型とシトルリン化の両方のペプチドに対して（ｉ）ＩＦＮγ（ｎ＝１４）（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｎ＝１４）  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより２０日目にエクスビボで分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図９】抗体ＤＮＡ内にコードされるＮＹＥＳＯ１  １１９〜１４３  ＣＤ４エピトープは、抗腫瘍応答を伴うＣＤ４応答を刺激する。ＨＨＤＩＩ／ＤＲ１トランスジェニックマウスに、０日目に、２．５×１０4個のＢ１６  ＨＨＤＩＩ  ＮＹＥＳＯ−１細胞を注射した。マウスを、ＣＤＲＬ１部位内にヘルパーエピトープＮＹＥＳＯ−１  １１９〜１４３を含有する抗体ＤＮＡ  ｈｕＩｇＧ１  ＤＮＡで遺伝子銃を用いて、３日目、１０日目、および１７日目に免疫化した。（ｉ）ヘルパーエピトープに特異的な応答を、野生型、シトルリン化ＮＹＥＳＯ−１  １１９〜１４３ヘルパーエピトープ、および無関係の対照に対して、ＩＦＮγ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより２０日目にエクスビボで分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。（ｉｉ）ＮＹＥＳＯ−１抗体ＤＮＡ単独もしくはｈｏｍｓｐｅｒａアジュバントと共に、またはｈｏｍｓｐｅｒａ単独で、免疫化した動物の生存。
【図１０】ビメンチン２８〜４９および４１５〜４３３エピトープは、全抗原ＤＮＡ構築物からインビボで、プロセシングされ、シトルリン化され、提示される。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、マウスビメンチンをコードするＤＮＡ構築物で遺伝子銃により、またはＣｐＧ／ＭＰＬＡ中のｖｉｍ  ２８〜４９および４１５〜４３３シトルリン化ペプチドで皮下に、週１回、３週間連続で、免疫化した。１９日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのビメンチン２８〜４９および４１５〜４３３の野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【図１１ａ−１】ヒト野生型とシトルリン化のビメンチン２８〜４９ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答の比較。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン２８〜４９ヒト野生型またはシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、（ａ）５μＭ濃度でのビメンチンヒト２８〜４９野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−２（ｉｖ）ＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、（ｂ）ｃｉｔエピトープ特異的応答の結合活性を、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて増加性ペプチド濃度に対する応答を測定することにより、（ｃ）５μＭ濃度でのビメンチン２８〜４９三重、二重、および単一シトルリン化ペプチドをＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１１ａ−２】ヒト野生型とシトルリン化のビメンチン２８〜４９ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答の比較。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン２８〜４９ヒト野生型またはシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、（ａ）５μＭ濃度でのビメンチンヒト２８〜４９野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−２（ｉｖ）ＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、（ｂ）ｃｉｔエピトープ特異的応答の結合活性を、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて増加性ペプチド濃度に対する応答を測定することにより、（ｃ）５μＭ濃度でのビメンチン２８〜４９三重、二重、および単一シトルリン化ペプチドをＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１１ｂ】ヒト野生型とシトルリン化のビメンチン２８〜４９ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答の比較。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン２８〜４９ヒト野生型またはシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、（ａ）５μＭ濃度でのビメンチンヒト２８〜４９野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−２（ｉｖ）ＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、（ｂ）ｃｉｔエピトープ特異的応答の結合活性を、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて増加性ペプチド濃度に対する応答を測定することにより、（ｃ）５μＭ濃度でのビメンチン２８〜４９三重、二重、および単一シトルリン化ペプチドをＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１１ｃ】ヒト野生型とシトルリン化のビメンチン２８〜４９ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答の比較。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン２８〜４９ヒト野生型またはシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、（ａ）５μＭ濃度でのビメンチンヒト２８〜４９野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−２（ｉｖ）ＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、（ｂ）ｃｉｔエピトープ特異的応答の結合活性を、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて増加性ペプチド濃度に対する応答を測定することにより、（ｃ）５μＭ濃度でのビメンチン２８〜４９三重、二重、および単一シトルリン化ペプチドをＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１２】競合結合アッセイにおけるＨＬＡ−ＤＲ０４０１へのｖｉｍ  ２８〜４９、４１５〜４３３、ｖｉｍ  ４１５〜４３３  ｃｉｔ、およびｖｉｍ  ２８〜４９  ｃｉｔペプチドの結合。ペプチドを、所定濃度の、インフルエンザ由来のビオチン化ペプチド（ＨＡ306〜318）と混合し、その後、精製ＨＬＡ−ＤＲ０４０１への結合についてアッセイした。非標識ＨＡ306〜318ペプチドを陽性対照として用いた。
【図１３ａ】ヒト野生型とシトルリン化のビメンチン４１５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答の比較。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン４１５ヒト野生型またはシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、（ａ）５μＭ濃度でのビメンチンヒト４１５野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−２（ｉｖ）ＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。（ｂ）ＩＦＮγおよびＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて増加性ペプチド濃度に対する応答を測定することによる、エピトープ特異的応答の結合活性。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１３ｂ】ヒト野生型とシトルリン化のビメンチン４１５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答の比較。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン４１５ヒト野生型またはシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、（ａ）５μＭ濃度でのビメンチンヒト４１５野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−２（ｉｖ）ＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。（ｂ）ＩＦＮγおよびＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて増加性ペプチド濃度に対する応答を測定することによる、エピトープ特異的応答の結合活性。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１３ｃ】ヒト野生型とシトルリン化のビメンチン４１５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答の比較。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン４１５ヒト野生型またはシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、（ａ）５μＭ濃度でのビメンチンヒト４１５野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−２（ｉｖ）ＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。（ｂ）ＩＦＮγおよびＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて増加性ペプチド濃度に対する応答を測定することによる、エピトープ特異的応答の結合活性。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１４】ヒトシトルリン化ビメンチン４１５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答、およびマウスシトルリン化ペプチド等価物との交差反応性。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン４１５〜４３３ヒトシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのヒトおよびマウスのビメンチンシトルリン化４１５ペプチドに対して、（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１５】ヒトシトルリン化ビメンチン４１５ペプチド（ａ）およびシトルリン化ビメンチン２８ペプチド（ｂ）での免疫化からＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて誘発されたＴ細胞応答がＣＤ４応答であることの確認。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン４１５〜４３３ヒトシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、全脾細胞またはＣＤ４が枯渇した脾細胞のいずれかをインビトロで、Ｌ２４３  ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体の存在下または非存在下において５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化４１５または２８ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１６ａｂ】シトルリン化ビメンチン６５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４およびＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答。ＨＬＡ−ＤＲ４（ａ）またはＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１（ｂ）トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン６５ヒトシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化のペプチドに対して、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、またはＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｃ）１４日目において、全脾細胞を、インビトロで、Ｌ２４３  ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体の存在下または非存在下において５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化６５ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。ｄ）ＣＤ８、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαについて共染色された、脾細胞の免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析。ｅ）１４日目において、脾細胞を、インビトロで、ヒトシトルリン化ビメンチン６５ペプチドパルス化ＬＰＳ芽細胞で刺激した。刺激から６日後、シトルリン化ヒトビメンチン６５ペプチドでパルスされたＴ２またはＢ１６ＨＨＤ腫瘍細胞、およびＴ２細胞またはＢ１６ＨＨＤ単独を溶解する能力についてクロム放出アッセイにより、ＣＴＬ株を評価した。応答は、％細胞傷害性として測定される。グラフ上に示されたｐ値は、標的対エフェクターの比１００：１についてである。ｆ）免疫化マウス由来の脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度での、最小の推定の野生型およびシトルリン化ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド  ビメンチン６８および６５短鎖、加えて、ビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｇ）免疫化マウス由来の脾細胞を、Ｖｉｍ  ６５およびＶｉｍ  ６８のｃｉｔおよび野生型ペプチド、ならびにＥＬ４  ＨＨＤおよびＢ１６腫瘍標的細胞に対する応答についてＩＦＮｇ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによりアッセイした。
【図１６ｃ】シトルリン化ビメンチン６５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４およびＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答。ＨＬＡ−ＤＲ４（ａ）またはＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１（ｂ）トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン６５ヒトシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化のペプチドに対して、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、またはＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｃ）１４日目において、全脾細胞を、インビトロで、Ｌ２４３  ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体の存在下または非存在下において５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化６５ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。ｄ）ＣＤ８、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαについて共染色された、脾細胞の免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析。ｅ）１４日目において、脾細胞を、インビトロで、ヒトシトルリン化ビメンチン６５ペプチドパルス化ＬＰＳ芽細胞で刺激した。刺激から６日後、シトルリン化ヒトビメンチン６５ペプチドでパルスされたＴ２またはＢ１６ＨＨＤ腫瘍細胞、およびＴ２細胞またはＢ１６ＨＨＤ単独を溶解する能力についてクロム放出アッセイにより、ＣＴＬ株を評価した。応答は、％細胞傷害性として測定される。グラフ上に示されたｐ値は、標的対エフェクターの比１００：１についてである。ｆ）免疫化マウス由来の脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度での、最小の推定の野生型およびシトルリン化ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド  ビメンチン６８および６５短鎖、加えて、ビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｇ）免疫化マウス由来の脾細胞を、Ｖｉｍ  ６５およびＶｉｍ  ６８のｃｉｔおよび野生型ペプチド、ならびにＥＬ４  ＨＨＤおよびＢ１６腫瘍標的細胞に対する応答についてＩＦＮｇ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによりアッセイした。
【図１６ｄ】シトルリン化ビメンチン６５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４およびＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答。ＨＬＡ−ＤＲ４（ａ）またはＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１（ｂ）トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン６５ヒトシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化のペプチドに対して、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、またはＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｃ）１４日目において、全脾細胞を、インビトロで、Ｌ２４３  ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体の存在下または非存在下において５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化６５ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。ｄ）ＣＤ８、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαについて共染色された、脾細胞の免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析。ｅ）１４日目において、脾細胞を、インビトロで、ヒトシトルリン化ビメンチン６５ペプチドパルス化ＬＰＳ芽細胞で刺激した。刺激から６日後、シトルリン化ヒトビメンチン６５ペプチドでパルスされたＴ２またはＢ１６ＨＨＤ腫瘍細胞、およびＴ２細胞またはＢ１６ＨＨＤ単独を溶解する能力についてクロム放出アッセイにより、ＣＴＬ株を評価した。応答は、％細胞傷害性として測定される。グラフ上に示されたｐ値は、標的対エフェクターの比１００：１についてである。ｆ）免疫化マウス由来の脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度での、最小の推定の野生型およびシトルリン化ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド  ビメンチン６８および６５短鎖、加えて、ビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｇ）免疫化マウス由来の脾細胞を、Ｖｉｍ  ６５およびＶｉｍ  ６８のｃｉｔおよび野生型ペプチド、ならびにＥＬ４  ＨＨＤおよびＢ１６腫瘍標的細胞に対する応答についてＩＦＮｇ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによりアッセイした。
【図１６ｅｆ】シトルリン化ビメンチン６５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４およびＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答。ＨＬＡ−ＤＲ４（ａ）またはＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１（ｂ）トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン６５ヒトシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化のペプチドに対して、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、またはＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｃ）１４日目において、全脾細胞を、インビトロで、Ｌ２４３  ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体の存在下または非存在下において５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化６５ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。ｄ）ＣＤ８、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαについて共染色された、脾細胞の免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析。ｅ）１４日目において、脾細胞を、インビトロで、ヒトシトルリン化ビメンチン６５ペプチドパルス化ＬＰＳ芽細胞で刺激した。刺激から６日後、シトルリン化ヒトビメンチン６５ペプチドでパルスされたＴ２またはＢ１６ＨＨＤ腫瘍細胞、およびＴ２細胞またはＢ１６ＨＨＤ単独を溶解する能力についてクロム放出アッセイにより、ＣＴＬ株を評価した。応答は、％細胞傷害性として測定される。グラフ上に示されたｐ値は、標的対エフェクターの比１００：１についてである。ｆ）免疫化マウス由来の脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度での、最小の推定の野生型およびシトルリン化ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド  ビメンチン６８および６５短鎖、加えて、ビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｇ）免疫化マウス由来の脾細胞を、Ｖｉｍ  ６５およびＶｉｍ  ６８のｃｉｔおよび野生型ペプチド、ならびにＥＬ４  ＨＨＤおよびＢ１６腫瘍標的細胞に対する応答についてＩＦＮｇ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによりアッセイした。
【図１６ｇ】シトルリン化ビメンチン６５ペプチドでの免疫化から誘発されたＨＬＡ−ＤＲ４およびＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４応答。ＨＬＡ−ＤＲ４（ａ）またはＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１（ｂ）トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのビメンチン６５ヒトシトルリン化ペプチドで免疫化した。１４日目において、脾細胞をインビトロで、５μＭ濃度でのビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化のペプチドに対して、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、またはＩＬ−１０のｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｃ）１４日目において、全脾細胞を、インビトロで、Ｌ２４３  ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体の存在下または非存在下において５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化６５ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。ｄ）ＣＤ８、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαについて共染色された、脾細胞の免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析。ｅ）１４日目において、脾細胞を、インビトロで、ヒトシトルリン化ビメンチン６５ペプチドパルス化ＬＰＳ芽細胞で刺激した。刺激から６日後、シトルリン化ヒトビメンチン６５ペプチドでパルスされたＴ２またはＢ１６ＨＨＤ腫瘍細胞、およびＴ２細胞またはＢ１６ＨＨＤ単独を溶解する能力についてクロム放出アッセイにより、ＣＴＬ株を評価した。応答は、％細胞傷害性として測定される。グラフ上に示されたｐ値は、標的対エフェクターの比１００：１についてである。ｆ）免疫化マウス由来の脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度での、最小の推定の野生型およびシトルリン化ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド  ビメンチン６８および６５短鎖、加えて、ビメンチンヒト６５野生型およびシトルリン化ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。ｇ）免疫化マウス由来の脾細胞を、Ｖｉｍ  ６５およびＶｉｍ  ６８のｃｉｔおよび野生型ペプチド、ならびにＥＬ４  ＨＨＤおよびＢ１６腫瘍標的細胞に対する応答についてＩＦＮｇ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによりアッセイした。
【図１７】内在性制御性Ｔ細胞の存在下または非存在下におけるマウスビメンチン４１５〜４３３シトルリン化ペプチドに対して生じたヘルパー応答。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目に、２５μｇのマウスビメンチン４１５〜４３３シトルリン化ペプチドで免疫化した。制御性Ｔ細胞の枯渇を、免疫化の３日前に、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ＰＣ６１）を用いて行った。１４日目において、脾細胞を、滴定濃度のシトルリン化マウスビメンチン４１５ペプチドに対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【図１８−１】アジュバントはシトルリン化ビメンチン４１５および２８エピトープに応答したＴｈ１／Ｔｈ１７バランスに影響する。アラム、ＩＦＡ、ＧＭＣＳＦ、ＭＰＬＡ、およびＣｐＧまたはＴＭＸ２０１アジュバント中のヒトシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３および２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を、皮下に投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について、野生型およびシトルリン化ペプチドならびに無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−１０  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１８−２】アジュバントはシトルリン化ビメンチン４１５および２８エピトープに応答したＴｈ１／Ｔｈ１７バランスに影響する。アラム、ＩＦＡ、ＧＭＣＳＦ、ＭＰＬＡ、およびＣｐＧまたはＴＭＸ２０１アジュバント中のヒトシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３および２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を、皮下に投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について、野生型およびシトルリン化ペプチドならびに無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−１０  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１８−３】アジュバントはシトルリン化ビメンチン４１５および２８エピトープに応答したＴｈ１／Ｔｈ１７バランスに影響する。アラム、ＩＦＡ、ＧＭＣＳＦ、ＭＰＬＡ、およびＣｐＧまたはＴＭＸ２０１アジュバント中のヒトシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３および２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を、皮下に投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について、野生型およびシトルリン化ペプチドならびに無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγ（ｉｉ）ＩＬ−１７（ｉｉｉ）ＩＬ−１０  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図１９】抗ＣＴＬＡ−４  ｍａｂは、シトルリン化ビメンチン４１５ペプチドに対する応答の結合活性を増加させる。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目、７日目、および１４日目に、２５μｇのヒトシトルリン化ビメンチン４１５ペプチドで免疫化した。マウスの半数はまた、７日目および１４日目に抗ＣＴＬＡ−４  ｍａｂを受けた。２１日目において、脾細胞を、インビトロで、（ｉ）５μＭ濃度でのシトルリン化ビメンチン４１５に対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｏｔアッセイにより、分析した。（ｉｉ）エピトープ特異的応答の結合活性を、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、増加性ペプチド濃度に対して測定した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図２０−１】癌を有する患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の、野生型およびシトルリン化ペプチドに対する増殖性応答。患者のＰＢＭＣを、４日間、７日間、および１１日間、培養された、１０μｇ／ｍｌの、（ｉ）野生型およびシトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチド（ｉｉ）野生型およびシトルリン化ヒトビメンチン２８〜４９（ｉｉｉ）野生型およびシトルリン化ヒトビメンチン６５〜７７（ｉｖ）野生型およびシトルリン化ＮＹＥＳＯ−１  １１９〜１４３のペプチドで刺激した。リンパ球増殖を、3［Ｈ］−チミジン取り込みにより評価した。増殖応答は、刺激指数（ＳＩ）として表現される。ＳＩは、ペプチド刺激化培養物の平均ｃｐｍ対非刺激化培養物の平均ｃｐｍの比として計算された。
【図２０−２】癌を有する患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の、野生型およびシトルリン化ペプチドに対する増殖性応答。患者のＰＢＭＣを、４日間、７日間、および１１日間、培養された、１０μｇ／ｍｌの、（ｉ）野生型およびシトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチド（ｉｉ）野生型およびシトルリン化ヒトビメンチン２８〜４９（ｉｉｉ）野生型およびシトルリン化ヒトビメンチン６５〜７７（ｉｖ）野生型およびシトルリン化ＮＹＥＳＯ−１  １１９〜１４３のペプチドで刺激した。リンパ球増殖を、3［Ｈ］−チミジン取り込みにより評価した。増殖応答は、刺激指数（ＳＩ）として表現される。ＳＩは、ペプチド刺激化培養物の平均ｃｐｍ対非刺激化培養物の平均ｃｐｍの比として計算された。
【図２１ａ】ａ）腫瘍がＰＡＤ２を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｂ）腫瘍がＨＭＧＢ１を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｃ）腫瘍がＰＡＤ２およびＨＭＧＢ１を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｄ）腫瘍がＰＡＤ４を発現する結腸直腸患者のカプラン・マイヤー生存率。
【図２１ｂ】ａ）腫瘍がＰＡＤ２を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｂ）腫瘍がＨＭＧＢ１を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｃ）腫瘍がＰＡＤ２およびＨＭＧＢ１を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｄ）腫瘍がＰＡＤ４を発現する結腸直腸患者のカプラン・マイヤー生存率。
【図２１ｃ】ａ）腫瘍がＰＡＤ２を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｂ）腫瘍がＨＭＧＢ１を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｃ）腫瘍がＰＡＤ２およびＨＭＧＢ１を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｄ）腫瘍がＰＡＤ４を発現する結腸直腸患者のカプラン・マイヤー生存率。
【図２１ｄ】ａ）腫瘍がＰＡＤ２を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｂ）腫瘍がＨＭＧＢ１を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｃ）腫瘍がＰＡＤ２およびＨＭＧＢ１を発現する卵巣患者のカプラン・マイヤー生存率。ｄ）腫瘍がＰＡＤ４を発現する結腸直腸患者のカプラン・マイヤー生存率。
【図２２ａ】ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目、７日目、および１４日目に、ＣＰＧおよびＭＰＬＡ中、シトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチド（ｂ）、またはシトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４８ペプチド（ｃ）、または両方（ａ、ｄ、およびｅ）で免疫化した。Ａ、１４日目において、脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化および非シトルリン化の４１５および２８ペプチド、ならびに３−ＭＡまたはＣＩ−アミジンの存在下または非存在下における、血清欠乏状態によりオートファジーへ誘導されたＢ１６ＤＲ４腫瘍標的細胞に対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。Ｂ〜Ｅ、エクスビボＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイからの上清を、グランザイムＢの存在についてｅｌｉｓａにより分析した。
【図２２ｂ】ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目、７日目、および１４日目に、ＣＰＧおよびＭＰＬＡ中、シトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチド（ｂ）、またはシトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４８ペプチド（ｃ）、または両方（ａ、ｄ、およびｅ）で免疫化した。Ａ、１４日目において、脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化および非シトルリン化の４１５および２８ペプチド、ならびに３−ＭＡまたはＣＩ−アミジンの存在下または非存在下における、血清欠乏状態によりオートファジーへ誘導されたＢ１６ＤＲ４腫瘍標的細胞に対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。Ｂ〜Ｅ、エクスビボＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイからの上清を、グランザイムＢの存在についてｅｌｉｓａにより分析した。
【図２２ｃｄ】ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目、７日目、および１４日目に、ＣＰＧおよびＭＰＬＡ中、シトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチド（ｂ）、またはシトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４８ペプチド（ｃ）、または両方（ａ、ｄ、およびｅ）で免疫化した。Ａ、１４日目において、脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化および非シトルリン化の４１５および２８ペプチド、ならびに３−ＭＡまたはＣＩ−アミジンの存在下または非存在下における、血清欠乏状態によりオートファジーへ誘導されたＢ１６ＤＲ４腫瘍標的細胞に対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。Ｂ〜Ｅ、エクスビボＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイからの上清を、グランザイムＢの存在についてｅｌｉｓａにより分析した。
【図２２ｅ】ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目、７日目、および１４日目に、ＣＰＧおよびＭＰＬＡ中、シトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチド（ｂ）、またはシトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４８ペプチド（ｃ）、または両方（ａ、ｄ、およびｅ）で免疫化した。Ａ、１４日目において、脾細胞を、インビトロで、５μＭ濃度でのヒトビメンチンシトルリン化および非シトルリン化の４１５および２８ペプチド、ならびに３−ＭＡまたはＣＩ−アミジンの存在下または非存在下における、血清欠乏状態によりオートファジーへ誘導されたＢ１６ＤＲ４腫瘍標的細胞に対して、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した。Ｂ〜Ｅ、エクスビボＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイからの上清を、グランザイムＢの存在についてｅｌｉｓａにより分析した。
【図２３】腫瘍細胞のインビトロでの殺害。（ａｉ）ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、０日目、７日目、および１４日目に、ＣＰＧおよびＭＰＬＡ中のシトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチドで免疫化した。１９日目において、脾細胞を、インビトロで、ヒトシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチドパルス化芽細胞で刺激した。刺激から６日後、ＣＴＬ株を、シトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチドでパルスされたＤＲ４脾細胞、シトルリン化ヒトビメンチン４１５〜４３３ペプチドでパルスされたＴ２  ＤＲ４腫瘍細胞、およびＴ２  ＤＲ４細胞単独を溶解させる能力についてクロム放出アッセイにより評価した。応答は、％細胞傷害性として測定される。グラフ上に示されたＰ値は、標的対エフェクター比１０：１についてである。２０：１および４０：１についてのＰ値は全て、非常に有意である（Ｐ＜０．０００１）。（ａｉｉ）ＨＨＤ／ＤＲ１トランスジェニックマウスを、０日目、７日目、および１４日目に、ＣＰＧおよびＭＰＬＡ中のシトルリン化ヒトビメンチン２８〜４９ペプチドで免疫化した。１９日目において、脾細胞を、インビトロで、ヒトシトルリン化ビメンチン２８〜４９ペプチドパルス化芽細胞で刺激した。刺激から６日後、ＣＴＬ株を、シトルリン化ヒトビメンチン２８〜４９ペプチドでパルスされたＴ２  ＤＲ１腫瘍細胞、Ｔ２  ＤＲ１細胞単独、およびＴ２細胞単独を溶解させる能力についてクロム放出アッセイにより評価した。応答は、％細胞傷害性として測定される。グラフ上に示されたＰ値は、有意であり、標的対エフェクター比１２．５：１についてである。２５：１（Ｔ２ＤＲ１  Ｐ＝０．００１７、Ｔ２  ＤＲ１＋ｖｉｍ  ２８  ｃｉｔ  Ｐ＜０．０００１）および５０：１（Ｔ２ＤＲ１  Ｐ＝０．０００８、Ｔ２  ＤＲ１＋ｖｉｍ  ２８  ｃｉｔ  Ｐ＝０．０００５）についてのＰ値は全て、非常に有意である。
【図２４ａｂ】シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３およびｖｉｍ  ２８〜４９  ＣＤ４応答は抗腫瘍応答に影響する。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスに、０日目、２．５×１０4個のＢ１６Ｆ１−ＤＲ４細胞を注射した。（ａ）マウスを、４日目、１１日目、および１８日目において、対照抗体ＤＮＡ、もしくはＣＤＲＨ３においてＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ｖｉｍ  ４１５ヘルパーエピトープをコードする抗体ＤＮＡワクチンで遺伝子銃を用いて、またはＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のマウスシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｉ）（ｂ）マウスを、４日目、１１日目、および１８日目において、対照抗体ＤＮＡ、もしくはＣＤＲＨ３においてＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ｖｉｍ  ２８ヘルパーエピトープをコードする抗体ＤＮＡワクチンで遺伝子銃を用いて、またはＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化もしくは野生型のビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｃ）マウスを、ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中の、シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）またはビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）または両方を皮下投与して、免疫化した。（ｄ）マウスを、抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５）と組み合わせてＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｅ）マウスを、抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５）と組み合わせてＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化ビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。
【図２４ｃｄ】シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３およびｖｉｍ  ２８〜４９  ＣＤ４応答は抗腫瘍応答に影響する。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスに、０日目、２．５×１０4個のＢ１６Ｆ１−ＤＲ４細胞を注射した。（ａ）マウスを、４日目、１１日目、および１８日目において、対照抗体ＤＮＡ、もしくはＣＤＲＨ３においてＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ｖｉｍ  ４１５ヘルパーエピトープをコードする抗体ＤＮＡワクチンで遺伝子銃を用いて、またはＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のマウスシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｉ）（ｂ）マウスを、４日目、１１日目、および１８日目において、対照抗体ＤＮＡ、もしくはＣＤＲＨ３においてＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ｖｉｍ  ２８ヘルパーエピトープをコードする抗体ＤＮＡワクチンで遺伝子銃を用いて、またはＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化もしくは野生型のビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｃ）マウスを、ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中の、シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）またはビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）または両方を皮下投与して、免疫化した。（ｄ）マウスを、抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５）と組み合わせてＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｅ）マウスを、抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５）と組み合わせてＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化ビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。
【図２４ｅ】シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３およびｖｉｍ  ２８〜４９  ＣＤ４応答は抗腫瘍応答に影響する。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスに、０日目、２．５×１０4個のＢ１６Ｆ１−ＤＲ４細胞を注射した。（ａ）マウスを、４日目、１１日目、および１８日目において、対照抗体ＤＮＡ、もしくはＣＤＲＨ３においてＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ｖｉｍ  ４１５ヘルパーエピトープをコードする抗体ＤＮＡワクチンで遺伝子銃を用いて、またはＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のマウスシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｉ）（ｂ）マウスを、４日目、１１日目、および１８日目において、対照抗体ＤＮＡ、もしくはＣＤＲＨ３においてＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ｖｉｍ  ２８ヘルパーエピトープをコードする抗体ＤＮＡワクチンで遺伝子銃を用いて、またはＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化もしくは野生型のビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｃ）マウスを、ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中の、シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）またはビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）または両方を皮下投与して、免疫化した。（ｄ）マウスを、抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５）と組み合わせてＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。（ｅ）マウスを、抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５）と組み合わせてＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化ビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）を皮下投与して、免疫化した。
【図２５ａｂ】シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチドおよびビメンチン２８〜４９抗腫瘍免疫応答は、一部、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７によって媒介される。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスに、０日目、２．５×１０4個のＢ１６Ｆ１−ＤＲ４細胞を注射した。マウスを、ＩＦＮγ中和モノクローナル抗体（ａおよびｂ）またはＩＬ−１７中和抗体（ｃおよびｄ）の存在下または非存在下において、ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中の、（ａおよびｃ）シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）または（ｂおよびｄ）シトルリン化ビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）で皮下に免疫化した。
【図２５ｃｄ】シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチドおよびビメンチン２８〜４９抗腫瘍免疫応答は、一部、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７によって媒介される。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスに、０日目、２．５×１０4個のＢ１６Ｆ１−ＤＲ４細胞を注射した。マウスを、ＩＦＮγ中和モノクローナル抗体（ａおよびｂ）またはＩＬ−１７中和抗体（ｃおよびｄ）の存在下または非存在下において、ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中の、（ａおよびｃ）シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）または（ｂおよびｄ）シトルリン化ビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）で皮下に免疫化した。
【図２６】シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３抗腫瘍免疫応答は、一部、腫瘍細胞上でのＨＬＡ−ＤＲ０４０１の直接的認識により媒介されるが、ビメンチン２８〜４９抗腫瘍免疫応答は、それにより媒介されない。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスに、０日目、２．５×１０4個のＢ１６Ｆ１細胞（ａ）またはＢ１６Ｆ１−ＤＲ４細胞（ｂ）を注射した。マウスを、（ａ）ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）もしくはシトルリン化ビメンチン２８〜４９ペプチド（２５μｇ）もしくは両方を、または（ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ０４０１中和モノクローナル抗体の存在下もしくは非存在下でＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中のシトルリン化ビメンチン４１５〜４３３ペプチド（２５μｇ）を皮下で免疫化した。
【図２７−１】異なる種内でのビメンチンの相同性。
【図２７−２】異なる種内でのビメンチンの相同性。
【図２８ａ−１】Ｔ細胞応答を刺激する新規なエピトープについてのビメンチンのスクリーニング。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒトシトルリン化ビメンチンペプチド（３×１０μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１およびｂ）Ｃ５７／Ｂｌマウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγおよび（ｉｉ）ＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。ｃ）ＭＰＬＡおよびＣｐＧアジュバント中のヒトシトルリン化ｖｉｍ  １４ペプチドを皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔによりヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図２８ａ−２】Ｔ細胞応答を刺激する新規なエピトープについてのビメンチンのスクリーニング。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒトシトルリン化ビメンチンペプチド（３×１０μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１およびｂ）Ｃ５７／Ｂｌマウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγおよび（ｉｉ）ＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。ｃ）ＭＰＬＡおよびＣｐＧアジュバント中のヒトシトルリン化ｖｉｍ  １４ペプチドを皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔによりヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図２８ｂ−１】Ｔ細胞応答を刺激する新規なエピトープについてのビメンチンのスクリーニング。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒトシトルリン化ビメンチンペプチド（３×１０μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１およびｂ）Ｃ５７／Ｂｌマウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγおよび（ｉｉ）ＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。ｃ）ＭＰＬＡおよびＣｐＧアジュバント中のヒトシトルリン化ｖｉｍ  １４ペプチドを皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔによりヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図２８ｂ−２】Ｔ細胞応答を刺激する新規なエピトープについてのビメンチンのスクリーニング。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒトシトルリン化ビメンチンペプチド（３×１０μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１およびｂ）Ｃ５７／Ｂｌマウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγおよび（ｉｉ）ＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。ｃ）ＭＰＬＡおよびＣｐＧアジュバント中のヒトシトルリン化ｖｉｍ  １４ペプチドを皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔによりヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図２８ｃ】Ｔ細胞応答を刺激する新規なエピトープについてのビメンチンのスクリーニング。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒトシトルリン化ビメンチンペプチド（３×１０μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１およびｂ）Ｃ５７／Ｂｌマウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγおよび（ｉｉ）ＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。ｃ）ＭＰＬＡおよびＣｐＧアジュバント中のヒトシトルリン化ｖｉｍ  １４ペプチドを皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔによりヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図２９ａ】Ｔ細胞応答を刺激する新規なエピトープについてのサイトケラチン８のスクリーニング。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒトシトルリン化サイトケラチンペプチド（３×１０μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１およびｂ）Ｃ５７／Ｂｌマウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγおよび（ｉｉ）ＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図２９ｂ】Ｔ細胞応答を刺激する新規なエピトープについてのサイトケラチン８のスクリーニング。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒトシトルリン化サイトケラチンペプチド（３×１０μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ａ）ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１およびｂ）Ｃ５７／Ｂｌマウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγおよび（ｉｉ）ＩＬ−１７  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図３０−１】野生型ビメンチンは、ＩＬ−１０を分泌するｉＴｒｅｇ細胞を刺激する。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒト４１５ビメンチンペプチド（２５μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ４マウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγ、（ｉｉ）ＩＬ−１７、および（ｉｉｉ）ＩＬ−１０  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図３０−２】野生型ビメンチンは、ＩＬ−１０を分泌するｉＴｒｅｇ細胞を刺激する。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のヒト４１５ビメンチンペプチド（２５μｇ）を皮下投与した。免疫化から１４日後、脾細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ４マウスにおいて、ヘルパーペプチドおよび無関係の対照に対する（ｉ）ＩＦＮγ、（ｉｉ）ＩＬ−１７、および（ｉｉｉ）ＩＬ−１０  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図３１】シトルリン化ＩＮＧ４はＣＤ４応答を刺激する。ＭＰＬＡおよびＣＰＧアジュバント中のシトルリン化ＩＮＧ４ペプチド１５８〜１７４ペプチド（２５μｇ）を、０日目、７日目、および１４日目に皮下投与した。最後の免疫化から７日後、脾細胞を、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１マウスにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ遮断モノクローナル抗体の存在下または非存在下において、ヘルパーペプチドに対するＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、ヘルパーエピトープに対する特異的応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図３２−１】本発明において有用なエピトープが由来し得るタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ参照番号。
【図３２−２】本発明において有用なエピトープが由来し得るタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ参照番号。
【図３２−３】本発明において有用なエピトープが由来し得るタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ参照番号。
【図３３ａ】抗原ビメンチンＤＮＡ全体はシトルリン化ビメンチン特異的Ｔ細胞応答を誘導する。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウス（ａ）またはＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウス（ｂ）を、０日目、７日目、および１４日目において、マウスビメンチン全配列をコードする１μｇのＤＮＡで免疫化した。２０日目において、脾細胞を、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、タンパク質全体に及ぶシトルリン化ビメンチンペプチドのパネルに対するＩＦＮγ応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図３３ｂ】抗原ビメンチンＤＮＡ全体はシトルリン化ビメンチン特異的Ｔ細胞応答を誘導する。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウス（ａ）またはＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウス（ｂ）を、０日目、７日目、および１４日目において、マウスビメンチン全配列をコードする１μｇのＤＮＡで免疫化した。２０日目において、脾細胞を、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、タンパク質全体に及ぶシトルリン化ビメンチンペプチドのパネルに対するＩＦＮγ応答について分析した。応答は、スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【図３４】シトルリン特異的免疫応答についての予測されるペプチドのスクリーニング。ＢｉＰ、ＨＳＰ９０、およびＩＮＧ４由来の予測されるシトルリン化ペプチド（２５ｕｇ）を、ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバント中、０日目、７日目、および１４日目においてＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスへ皮下投与した。脾細胞を、関連シトルリン化および非修飾型ペプチド（５ｕＭ）ならびにバックグラウンド対照に対するＩＦＮｇ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより１４日目または２０日目において免疫応答について分析した。応答は、平均スポット数／脾細胞１００万個として測定される。
【００７７】
方法
２．１．市販のｍＡｂ
一次ウサギ抗ヒトビメンチン（クローンＥＰＲ３７７６）、ウサギ抗ヒトＰＡＤ２（クローンｐａｂ０１９７）、ウサギ抗ヒトシトルリン（クローンａｂ６４６４）を全て、Ａｂｃａｍから購入した。一次ウサギ抗ヒトＰＡＤ−４（クローンｐａｂ０１９９）をＣｏｖａｌａｂから入手し、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ  ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート化抗体（クローンＬ２４３）をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。抗ＣＤ２５抗体（クローンＰＣ６１）、抗ＩＦＮγ抗体（クローンＸＭＧ１．２）、抗ＩＬ−１７（クローン１７Ｆ３）抗体、および抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）抗体をＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。抗ＣＴＬＡ４抗体を、ＨＢ３０４ハイブリドーマ細胞培養上清（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）からセファロースプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（クローンＬ２４３）を、ＨＢ−５５ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）培養上清からセファロースプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ウサギｍＡｂ抗ＨＭＧＢ１（クローンＤ３Ｅ５）をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【００７８】
２．２細胞株
機能的クラスＩＩ  ＤＲ４（ＤＲＢ１*０４０１；Ｔ２  ＤＲ４）またはＤＲ１（ＤＲＢ１*０１０１；Ｔ２ＤＲ１）を安定的にトランスフェクションされたＴ細胞／Ｂ細胞ハイブリッド細胞株Ｔ２［８０］は、記載されており［８２、８３］、親切にも、Ｊａｎｉｃｅ  Ｂｌｕｍ博士およびＬａｗｒｅｎｃｅ  Ｓｔｅｒｎ教授によって提供された。マウスメラノーマＢ１６Ｆ１およびＢ１６Ｆ１０細胞株を、ＡＴＣＣから入手した。全ての細胞株を、他に記述がない限り、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を補充し、かつ重炭酸ナトリウム緩衝のＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）中で培養した。ＨＢ３０４ハイブリドーマ細胞を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）において培養した。インビトロアッセイのために、シトルリン化エピトープを提示する腫瘍標的を作製するために、１％ＢＳＡを含有する０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）で、４℃、２分間、細胞を処理した。続いて、細胞を、培地で洗浄し、血清の非存在下、３７℃で２０時間、培養した。オートファジー阻害剤およびＰＡＤ阻害剤である、３−メチルアデニン（Ｓｉｇｍａ）およびＣＩ−アミジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、無血清培地中、２０時間の培養の間、それぞれ、１０ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。
【００７９】
２．３．免疫原
２．３．１．ペプチド
９０％より高い純度のペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ（Ｆａｒｅｈａｍ、ＵＫ）により合成された。０．２ｍｇアリコートとして、−８０℃で、凍結乾燥した状態で貯蔵した。使用する当日、それらを、１０％ジメチルホルムアミド中、適切な濃度に再構成した。
【００８０】
２．４．プラスミド
抗体ＤＮＡ構築物の作製は、他の所で詳細に記載されている［８４］。簡単に述べれば、抗体ＤＮＡ構築物を作製するために、標準分子生物学的技術を用いて、抗体の重鎖および軽鎖可変領域の相補性決定領域へエピトープを組み入れた。エピトープチロシナーゼ４４８〜４６２（ＤＹＳＹＬＱＤＳＤＰＤＳＦＱＤ）、マウスおよびヒトｇｐ１００  ４４〜５９エピトープ（ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＶＱＧＳＮ／ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ）由来のＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ヘルパーＣＤ４エピトープ、ならびにＨｅｐＢ核タンパク質１２８〜１４０（ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ）由来のＩ−Ａｂ拘束性エピトープを、κ鎖のＣＤＲＬ１と置きかえて挿入した。同様に、エピトープ  ＭＭＰ７  ２４７〜２６２（ＳＱＤＤＩＫＧＱＫＬＹＧＫＲＳ）、ＳＳＸ２  ３３〜４８（ＫＥＥＷＥＫＭＫＡＳＥＫＩＦＹ）、ＮＹＥＳＯ−１  ８７〜１１１（ＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ）、および１１９〜１４３（ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ）由来のＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＣＤ４エピトープを、ＣＤＲＬ１へ組み入れ、同時に、エピトープトリオースリン酸イソメラーゼ２３〜３７（ＧＥＬＩＧＩＬＮＡＡＫＶＰＡＤ）由来の修飾型エピトープをκ鎖のＣＤＲＬ３と置きかえて挿入した。ＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ＣＤ４ビメンチン４１５〜４３３（ＬＰＮＦＳＳＬＮＬＲＥＴＮＬＤＳＬＰＬ）およびＨＬＡ−ＤＲ１拘束性エピトープ２８〜４９（ＲＳＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲＰＳＴＳ）をどちらもＣＤＲＨ３へ組み入れた。ＤＲ１  ＣＤ４  ＮＹＥＳＯ−１  ８７〜１１１（ＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ）はまた、抗体ＤＮＡ二重発現ベクターのＣＤＲＨ３部位へクローニングされた、拡張された配列８３〜１１１内にコードされた。３つ全部のビメンチンエピトープを含有するヒトＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ２ａ  ＩｍｍｕｎｏＢｏｄｙベクターも作製した。ＨＬＡ−ＤＲ１  ２８〜４９（ＲＳＹＶＴＴＳＴＲＴＹＳＬＧＳＡＬＲＰＳＴＳ）、６５〜７７（ＳＡＶＲＬＲＳＳＶＰＧＶＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ヒトＣＤ４ビメンチン４１５〜４３３（ＬＰＮＦＳＳＬＮＬＲＥＴＮＬＤＳＬＰＬ）エピトープをそれぞれ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３部位へ組み入れた。
【００８１】
プラスミドｐＶａｘ１マウスビメンチン完全長を、Ｂ１６Ｆ１細胞株から単離されているｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを鋳型として用いる完全長配列の増幅により作製した。利用されるフォワードおよびリバースプライマーを、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位を組み入れるように設計した。野生型配列の増幅および確認において、完全長マウスビメンチンを、哺乳動物発現ベクターｐＶａｘＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内のマルチプルクローニング部位のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位へ組み入れた。
【００８２】
プラスミドｐＶｉｔｒｏ  ２キメラＨＬＡ−ＤＲ４０１を作製するために、ｃＤＮＡを、トランスジェニックＨＬＡ−ＤＲ４マウスの脾細胞から単離されたｍＲＮＡから作製した。それぞれ、ｆｓｐＩ／ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位を組み入れたフォワードおよびリバースプライマーを用いてキメラαおよびβ鎖を別々に増幅するために、これを鋳型として用いた。配列確認において、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡα１ドメインと共にマウスＨ２−Ｅａで構成する完全長キメラα鎖を、ベクターｐＶＩＴＲＯ２−ｈｙｇｒｏ−ｍｃｓ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）のｆｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ  ｍｃｓ２へライゲーションした。その後、ヒトＤＲＢ１*０４０１β１と共にマウスＨ２−Ｅｂで構成するβ鎖を、キメラα鎖と並んで、そのベクターのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ  ｍｃｓ１へ挿入した。
【００８３】
ＨＨＤプラスミドを作製するために、ＥＬ４−ＨＨＤ細胞から単離された全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。フォワードおよびリバースプライマーを用いてＨＨＤを増幅するためにこれを鋳型として用い、ｐＣＲ２．１へサブクローニングした。その後、ヒトＨＬＡ−Ａ２リーダー、グリシンセリンリンカーを介してヒトＨＬＡ−０２０１  ＭＨＣクラス１分子のα１および２ドメインに共有結合されたヒトＢ２ミクログロブリン分子、ならびにマウスＨ−２Ｄｂクラス１分子の膜貫通および細胞質ドメインである、α３で構成されるＨＨＤ鎖を、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手された哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１のＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位へ挿入した。
【００８４】
マウスＴａｐ２およびＮＹＥＳＯ−１完全長鎖をコードする哺乳動物二重発現プラスミドを構築するために、それぞれＢａｍＨ１／ＸｈｏＩ部位を組み入れたフォワードおよびリバースプライマーを用いて、ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅから入手されたＩＭＡＧＥクローン４０１４６３９３からＮＹＥＳＯ−１を増幅した。配列確認において、抗体ＤＮＡ二重発現ベクターのＢａｍＨ１／ＸｈｏＩマルチプルクローニング部位へ、軽鎖と置きかえて、完全長ＮＹＥＳＯ−１をライゲーションした。マウスＴａｐ２を、イメージクローン６５３０４８８から、コード配列からのＨｉｎｄＩＩＩ部位の除去およびこの部位の開始コドンの前の組み入れ後、増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶを用いて発現ベクターｐＯｒｉｇＨＩＢへクローニングした。その後、マウスＴａｐ２を、二重発現ベクターへ完全長ＮＹＥＳＯ−１と並んで、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩを用いて重鎖と置きかえて、移入した。
【００８５】
細胞株Ｂ１６Ｆ１０においてマウスＢ２ミクログロブリンおよびマウスＭＨＣクラスＩＩの発現をノックダウンするために、ＲＮＡ干渉を利用した。マウスＢ２ミクログロブリンの配列２６６およびマウスＭＨＣクラスＩＩの１５９をターゲットする相補性オリゴをアニールし、ｐＣＤＮＡ６．２  ＧＷ  ｍｉＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ別々に挿入した。その２つのｍｉＲＮＡをつないで、その同じベクター内で１つの一次転写物においてそれらを発現させるために、ｍｉＲＮＡ２６６を含有するプレｍｉＲＮＡ発現カセットを、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを用いて切り出し、ｐＣＤＮＡ６．２  ＧＷ  ｍｉＲ  １５９のＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩ部位へライゲーションした。
【００８６】
ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｑｉａｇｅｎ  ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ）を用いて内毒素を含まないプラスミドＤＮＡを作製した。
【００８７】
２．５．トランスフェクション
完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１およびマウスＴａｐ２、ＨＨＤＩＩ、ならびにマウスＭＨＣクラスＩＩおよびマウスβ２ミクログロブリンの発現をノックダウンするためのｓｉＲＮＡをコードする発現ベクターを、リポフェクタミントランスフェクション試薬を用いて、Ｂ１６Ｆ１０細胞に連続してトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、それぞれ、Ｚｅｏｃｉｎ（３００μｇ／ｍｌ）、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）、およびブラストサイジン（４μｇ／ｍｌ）の存在下における成長により選択した。株を限界希釈によりクローニングし、発現をフローサイトメトリーにより確認した。
【００８８】
完全長キメラα鎖とβ鎖の両方をコードする４μｇのプラスミドｐＶｉｔｒｏ  ２キメラＨＬＡ−ＤＲ４０１を、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、Ｂ１６Ｆ１細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、ハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍｌ）の存在下における成長により選択した。株を限界希釈によりクローニングし、発現を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ  ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート化抗体（クローンＬ２４３）を用いるフローサイトメトリーにより確認した。
【００８９】
２．６．ＨＬＡＤＲ０４０１結合研究
簡単に述べれば、関心対象となるペプチドを、増加性濃度における既定濃度のビオチン化ＨＡ306-318参照ペプチドと混合し、プレート結合化ＨＬＡ  ＤＲ０４０１に加えた。ＨＬＡ  ＤＲ０４０１に結合するビオチン化参照ペプチドの量を、ストレプトアビジン連結型酵素を用いて定量化し、続いて、発色基質で検出した。最大結合を、ビオチン化ＨＡ306-318ペプチド単独により達成された値として採用する。陽性対照として、非標識ＨＡ306-318ペプチドを用いて、ビオチン化バージョンと競合させた。
【００９０】
２．７．免疫化
２．７．１．免疫化プロトコール
週齢８〜１２週間の、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＵＫ）、ＨＬＡ−ＤＲ４マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＵＳＡ）、ＨＨＤＩＩマウス（Ｐａｓｔｅｕｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、およびＨＨＤＩＩ／ＤＲ１マウス（Ｐａｓｔｅｕｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）が用いられ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｔｒｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのスタッフにより世話された。全ての作業は、Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅプロジェクトライセンスの下、実行された。ペプチドを、１０％ジメチルホルムアミド中に１ｍｇ／ｍｌまで溶解し、その後、異なるアジュバント：ＣｐＧおよびＭＰＬＡ、各６μｇ／マウス（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＵＫ）、不完全フロイント５０μｌ／マウス（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）、およびＧＭＣＳＦ  １０μｇ／マウス（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＵＫ）で乳化した（一連の希釈物）。ペプチド（２５μｇ／マウス）を尾の付け根に皮下注射した。ＤＮＡ（１μｇ／マウス）を、製造会社の使用説明書を用いて１．０μｍ金粒子（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、ＵＫ）上にコーティングし、遺伝子銃（ＢｉｏＲａｄ）により皮内に投与した。Ｈｏｍｓｐｅｒａ（１０ｎＭ／マウス）（ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｔｉｃｓ、ＵＫ）を、遺伝子銃免疫化と共に皮内注射した。マウスを、ペプチド免疫化について０日目か、またはペプチドおよび遺伝子銃免疫化について０日目、７日目、および１４日目のいずれかにおいて免疫化した。脾臓を分析のために、他に記述がない限り、ペプチドについては１４日目、ペプチドまたは遺伝子銃免疫化については２０日目に取り出した。４００μｇの抗ＣＤ２５抗体（ＰＣ６１）を、免疫化の３日前に、食塩水において、腹腔内に投与した。２００μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体（ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１）を、遺伝子銃免疫化またはペプチド免疫化のいずれかで、食塩水において、７日目および１４日目に腹腔内に投与した。
【００９１】
腫瘍負荷実験について、マウスに、２．５×１０4個のＢ１６  ＨＨＤＩＩ  ＮＹＥＳＯ／ＴＡＰ２  ｓｉβ２ｍ  １Ｆ１０細胞またはＢ１６  ＤＲ４  ２Ｅ７細胞を、一次免疫化の３日前に右側腹部上の皮下に負荷し、その後、上記のように免疫化した。抗ＩＦＮγ抗体（３００μｇ／用量）、抗ＩＬ−１７抗体（２００μｇ／用量）、および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（３００μｇ／用量）を、腫瘍移植後２日目、７日目、１１日目、および１４日目に食塩水において腹腔内投与した。抗ＣＤ４抗体（５００μｇ／用量）を、腫瘍移植後２日目および８日目に腹腔内投与した。腫瘍成長を、３〜４日間間隔で監視し、腫瘍が直径１０ｍｍ以上に達した時点で、マウスを人道的に安楽死させた。
【００９２】
２．８．免疫応答の分析
２．８．１．エクスビボＥｌｉｓｐｏｔアッセイ
Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを、マウスＩＦＮγ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１０捕獲および検出試薬を製造会社の使用説明書（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）により用いて、実施した。簡単に述べれば、抗ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１０抗体で、９６ウェルＩｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐプレートのウェル上をコーティングした。（様々な濃度での）合成ペプチドおよびウェルあたり５×１０5個の脾細胞を、プレートのウェルに３連で加えた。腫瘍標的細胞を、関連した所に、５×１０4個／ウェルで、３連で加え、プレートを３７℃で４０時間、インキュベートした。インキュベーション後、捕獲されたＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１０を、ビオチン化抗ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１０抗体によって検出し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよび発色基質で発色させた。スポットを分析し、自動プレートリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ）を用いてカウントした。機能的結合活性を、ペプチド濃度に対するエフェクター機能のグラフを用いて、５０％最大エフェクター機能を媒介する濃度として計算した。
【００９３】
２．８．２．脾細胞培養物からのＣＤ８およびＣＤ４細胞のエクスビボでの枯渇
脾細胞を、抗体コーティング化磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を製造会社の使用説明書に従って用いて、ＣＤ４またはＣＤ８細胞のポジティブ単離に供した。ＭＨＣクラスＩＩ遮断研究について、２０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−ＤＲ（クローンＬ２４３）抗体をｅｌｉｓｐｏｔアッセイに加えた。
【００９４】
２．８．３．グランザイムＢ  ｅｌｉｓａ
脾細胞におけるエクスビボのＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔアッセイからの上清を、４０時間後、取り出し、ｅｌｉｓａアッセイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により製造会社の使用説明書に従って、グランザイムＢについて評価した。
【００９５】
２．８．４．Ｌｕｍｉｎｅｘ多重アッセイ
ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮу、ＴＮＦα、ＩＬ−２、およびＩＬ−４に対するＩｇＧ抗体についての多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のために３工程間接手順を用いた。標準、対照、および未知の血清を、５０％アッセイ希釈緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５０％無血清ＲＰＭＩ中に１：２に希釈した。標準の段階希釈物は各アッセイに含まれた。標準、対照、および未知の血清の各希釈物を、９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）内で１セットの結合したＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェアと混合し、振盪させながら室温で２時間、インキュベートした。ミクロスフェアを減圧濾過により収集し、ＰＢＳＴで洗浄した。ビオチン化検出抗体を、振盪させながら室温で１時間、各ウェルへ加えた。ミクロスフェアを減圧濾過により収集し、ＰＢＳＴで洗浄した。ストレプトアビジンコンジュゲート化Ｒ−フィコエリトリンを各ウェルに加えた。３０分間のインキュベーションおよび洗浄工程後、ミクロスフェアをＰＢＳＴ中に再懸濁させ、ＸＹプラットフォームを備えたＢｉｏｒａｄ  ＢｉｏＰｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘアナライザーにおいて読み取った。データ獲得および解析を、Ｌｕｍｉｎｅｘソフトウェア（ＢｉｏＰｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。
【００９６】
２．８．５．増殖アッセイ
Ｆｉｃｏｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）勾配遠心分離により、新鮮に引き出されたヘパリン化血液からＰＢＭＣを単離した。２ｍｌの最終体積における、５％プールされた自己ヒト血清、２ｍＭグルタミン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、およびペニシリン−ストレプトマイシン（１％）を含有するＲＰＭＩ中、単一のペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）でＰＢＭＣ（１．５×１０6細胞／ウェル）を刺激した。精製されたタンパク質誘導体、ＰＰＤ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）での刺激は、ＰＢＭＣの増殖能力についての陽性対照としての役割を果たす。陰性対照として、ＰＢＭＣを培地単独とインキュベートした。ＰＢＭＣを、３７℃で５％ＣＯ2の大気中、４日間、７日間、および１１日間、培養した。これらの時点における増殖を評価するために、各培養物からの３連での１００μｌを９６ウェルプレートの丸底ウェルへ等分し、3Ｈ−チミジンを加え（０．０１８５ＭＢｑ／ウェル）、さらに８時間、３７℃でインキュベートした。培養物を、ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート上に回収し、3Ｈ−チミジンの取り込みをβ−シンチレーションカウンティングにより決定した。エピトープ刺激された培養物の１分間あたりのカウントの平均（ｃｐｍ）対刺激されていない培養物の平均の比率として刺激指数（ＳＩ）を計算することにより結果を評価した。増殖アッセイは、ＳＩ＞２．５である場合、陽性とみなされた。
【００９７】
２．８．６．51Ｃｒ放出アッセイ
標的細胞を、１０μｇ／ｍｌのペプチド有り、または無しで、１．８５ＭＢｑ（51Ｃｒ）クロム酸ナトリウム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｅｓｓｅｘ、ＵＫ）で１時間、標識した。インキュベーション後、それらをＲＰＭＩ中、３回洗浄した。標的５×１０3個／９６ウェルＶ底プレートのウェルを配置し、２００μｌの最終体積のＲＰＭＩ、１０％  ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌ  ペリシリン、および１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン中、異なる密度のエフェクター細胞と共インキュベートした。３７℃での２０時間後、５０μｌの上清を各ウェルから取り出し、Ｌｕｍａｐｌａｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｒｉｇａｗｅｇ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）へ移した。プレートを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で読み取った。パーセンテージ特異的溶解を、以下の式を用いて計算した：特異的溶解＝１００×［（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］
２．９．免疫組織化学的分析
組織アレイ切片をまず、キシレンで脱パラフィンし、段階的アルコールを通して再水和し、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、０．３％過酸化水素を含有するメタノール中に２０分間、浸漬した。抗原性を賦活するために、切片を、５００ｍｌのｐＨ６．０クエン酸緩衝液中に浸漬し、マイクロ波の第６センス設定で２０分間、加熱した。内因性アビジン／ビオチン結合を、アビジン／ビオチン遮断キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いて遮断した。一次抗体の非特異的結合を遮断するために、その後、全ての切片を、ＰＢＳ中、１００μｌの１／５正常ウマ血清（ＮＨＳ）で１５分間、処理した。試験切片を、ＰＢＳ中に希釈された１００μｌの一次抗体と、２２℃で１時間、または４℃で一晩、インキュベートした。陽性対照組織は、１／１０００希釈でのβ２−ミクログロブリン（ＰＢＳ中；Ｄａｋｏ）で染色された結腸直腸癌組織の切片全体を含んだ。一次抗体を陰性対照から取り除き、それをＮＨＳ中、インキュベートの状態にしておいた。ＰＢＳでの洗浄後、全ての切片を、ＮＨＳ中１：１００に希釈された１００μｌのビオチン化ヤギ抗マウス／ウサギ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）と３０分間、インキュベートした。切片をＰＢＳ中で再び洗浄し、１００μｌの前もって形成されたストレプトアビジン−ビオチン／ＨＲＰ複合体（Ｄａｋｏ）と室温（ＲＴ）で６０分間、インキュベートした。その後、エピトープ発現の可視化を、ＤＡＢを用いて達成した。最後に、切片を、ヘマトキシリン（Ｄａｋｏ）で軽く対比染色し、アルコール中で脱水し、キシレン（ＧｅｎｔａＭｅｄｉｃａ、Ｙｏｒｋ、ＵＫ）中で透徹し、ジスチレン、可塑剤、およびキシレン（ＤＰＸ；ＢＤＨ）でマウントした。
【００９８】
染色の評価：スライドの永久貯蔵を可能にするために、それらを、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０スライドイメージングシステム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｈｉｇａｓｈｉ−ｋｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて×２０で画像化した。組織上のマーカーの発現を、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｓｌｉｄｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）における画像を用いて、分析した。マーカー発現のスクリーニングは、臨床情報について知らされていない、以前にスコアリングの経験をもつ２人の研究者によって同時に実施された。Ｈスコアについて、コアを簡単に分析し、陰性、弱い、中程度、および強いコアの代表的なコアを、全組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）についてのガイドとして用いた。染色の強度に加えて、陽性染色された腫瘍細胞のパーセンテージを見積もった。その後、２つのスコアを組み合わせて、Ｈスコアを形成し、その場合、Ｈ＝染色された細胞のパーセンテージ×強度（範囲＝０〜３００）である。ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  Ｓｌｉｄｅ  Ｖｉｅｗｅｒを用いて、腫瘍と間質の両方の領域を測定し、各領域における陽性細胞の数をカウントした。その後、１ｍｍ2あたりの陽性細胞の値を計算した。
【００９９】
２．９．１．結腸直腸腫瘍ＴＭＡ
抗血清を、胃癌ＴＭＡにおいて腫瘍結合についてスクリーニングした。患者研究および設計：研究集団は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫにおける組織学的に証明された散発性原発性結腸直腸癌の待機的外科的切除を受けた一連の４６２人の継続患者を含んだ（表１）。これらの患者は、１９９４年１月１日〜２０００年１２月３１日の間、処置された；この期間は、研究される予後マーカーの意味ある評価を可能にした。この時間枠の間に処置された全ての患者は、本研究への算入について適格とみなされた。腫瘍体積の５０％より多くがムチンからなる場合、腫瘍を粘液性癌腫として分類した。
【表１−１】
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【表１−２】
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【０１００】
臨床病理学：関連病理学的材料が入手できない場合のみ、本研究から排除した。追跡調査を、最初の腫瘍の切除の時点から計算し、２００３年１２月３１日において全ての生存症例をデータ解析のために打ち切りし、これは、全患者について３７カ月間（範囲０〜１１６）および生存者について７５カ月間（範囲３６〜１１６）の追跡期間中央値を生じた。
【０１０１】
前向きに維持されたデータベースを用いて、関連した臨床病理学的データを記録し、データは、ＵＫ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓから提供された；これは９９％より多い症例において入手できた。収集された情報は、死亡した患者の症例記録再調査を通して、独立的に確証された。疾患特異的生存率を主要エンドポイントとして用いた；しかしながら、様々な他の関連した臨床的および組織病理学的パラメーターに関してもデータを収集し、これらは、表２．３に要約されている。ＦＯＬＦＯＸからなるアジュバント化学療法が、陽性リンパ節を有する患者のために準備されたが、監督医師の裁量により、外科およびアジュバント処置であった。本研究の事前倫理審査は、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｌｏｃａｌ  ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＥｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって行われ、彼らは、本研究の承認を与えた。
【０１０２】
アレイブロックの構築は、広範な、待機的に切除された結腸直腸腫瘍を組み入れ、ＵＫにおける結腸直腸癌集団を広く代表することが見出された。２６６人（５８％）患者が男性であり、１９６人（４２％）が女性であった。手術時の年齢中央値は７２歳であり、ＵＫにおける７０〜７４歳の結腸直腸癌の診断時の年齢中央値と一致した［８５］。アレイされた６９個（１５％）の腫瘍は、腫瘍、リンパ節転移（ＴＮＭ）ステージ１であり、１７４個（３８％）がステージ２、１５５個（３４％）がステージ３、５４個（１１％）がステージ４であった；インサイチュ疾患の３個の症例があった。これらの数字は、それぞれ、１１％、３５％、２６％、および２９％の、診断時のステージ１〜４の分布についての全国の数字と同等である［８５］。腫瘍の大部分（３９２個、８５％）は腺癌腫であり、最も高い頻度では、中程度の組織学的グレードであった（３５３個、７７％）。１２８個（２８％）の腫瘍は、壁外血管侵入の組織学的証拠を有することが注目され、２２４個（４８％）は血管侵入の証拠はなく、この情報は１１０個（２４％）の症例において入手できなかった。データ解析のための打ち切り時点において、２２８人（４９％）の患者が、彼らの疾患から死んでおり、６４人（１４％）があらゆる他の原因から死亡し、１６９人（３７％）が生きていた。コホートについての５年疾患特異的生存率の中央値は５８カ月間であり、ＵＫにおける結腸直腸癌についての約４５％の５年生存の全国平均と同等であった。
【０１０３】
２．９．２．卵巣癌ＴＭＡ
抗血清を、卵巣癌ＴＭＡにおいて腫瘍結合についてスクリーニングした。卵巣癌ＴＭＡは、２０００年〜２００７年の間にＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｓで処置された原発性卵巣癌を有する３６２人の患者のコホートを表す。癌の病期分類を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ（ＦＩＧＯ）判定基準を用いて実施した。この研究に含まれる全患者を、現在の標準化学療法レジメンに従って処置し、６５人の患者（４１．４％）において単一の薬剤カルボプラチン、または８９人の患者（５６．７％）において白金に基づいた併用化学療法のいずれかであり、３人の患者は化学療法を拒否した。白金抵抗性症例を、処置の間、初回白金化学療法において進行した患者、または処置後６カ月以内に再発した患者として定義した。全ての患者は手術を受けた；症例（ｎ＝６９）の４４％より多くが、最初の手術後、最適以下に減量した（残存腫瘍＜１ｃｍ）とみなされた。患者を物理学的検査、コンピュータ断層撮影、およびＣＡ−１２５レベルにより追跡調査した。これらの患者の腫瘍からのヘマトキシリンおよびエオシン染色切片は、臨床データおよび病理診断を知らされていない婦人科病理学者により再検査された。各腫瘍について、その型および分化の再検査もまた、ＳＤによって行われた。各症例に関連した臨床データを、患者のメモから、または病院の電子記録（ＮｏｔＩＳ）を介して収集および記録した。そのような情報は以下を含んだ：診断時の患者の年齢、ＦＩＧＯステージ、外科的腫瘍縮小の程度、ならびに化学療法の型、持続期間、および応答。アジュバント処置、疾患特異的生存率（ＤＳＳ）、および全生存（ＯＳ）の詳細を、全ての患者について文書化した。生存期間は、手術日から、いかなる残っている生存者も打ち切られる２００８年５月３０日までで計算された。追跡期間中央値は３６カ月間であった。本研究のために試料および関連データを収集することへの倫理的承認は、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって与えられた。
【０１０４】
２．９．３．正常組織ＴＭＡ
正常組織ＴＭＡは、３８個の正常器官を表す５９個のコアを含有した。各コアを、以下の試料の起源に従って分類した；非癌患者由来の正常組織、癌患者由来の正常組織であるが、その癌は非関連器官に関わり、正常組織がその癌に隣接している。組織型およびカテゴリーは表２に詳細が示されている。
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１０５】
例１
自己および外来エピトープに対する野生型マウスにおけるＣＤ４応答
腫瘍関連エピトープに対するＴ細胞応答は、寛容および胸腺内のＴ細胞除去のせいで弱く、または存在しない場合が多い。それにも関わらず、本発明者らは、様々な自己および外来ＣＤ４エピトープをそれらのヘルパー応答を刺激する能力についてスクリーニングした。以前の研究により抗体ＤＮＡ構築物が最も強い免疫応答を与えたことが示されているため［８４］、様々なＣＤ４外来および自己エピトープを、別々の構築物中へ組み入れ、野生型マウスにおいてスクリーニングした。表３は、全てのエピトープの配列、および必要に応じて、それらのマウス相同体を列挙している。
【表３】
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【０１０６】
アルギニン残基は下線が引かれている
非相同残基はイタリック体で示されている
図５は、外来ＣＤ４エピトープの大部分に対して良いＣＤ４応答であるが、自己エピトープに対して良い応答ではないことを示す。ＣＤ４  Ｉ−Ａｂヘルパーエピトープである、Ｂ型肝炎核タンパク質１２８〜１４０は、Ｃ５７Ｂｌマウスにおいて５０〜１，０００／脾細胞１００万個（平均３８２／脾細胞１００万個）のＥＬＩＳＰＯＴによる応答を示した。癌精巣エピトープＮＹＥＳＯ−１およびＳＳＸ２は、マウスにおいて外来エピトープであり、ＤＲ１エピトープＮＹＥＳＯ−１（８７〜１１１）およびＳＳＸ２（３４〜４８）は、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウスにおいて良い応答を刺激した；ＮＹＥＳＯ−１（８７〜１１１）について２５０〜９００／脾細胞１００万個（平均５６７／脾細胞１００万個）であり、ＳＳＸ２（３４〜４８）については５００〜１２００／脾細胞１００万個（平均７６５／脾細胞１００万個）であった。野生型と１アミノ酸、異なるだけであるＨＬＡ−ＤＲ１突然変異型ＴＰＩエピトープは、３００〜１３００／脾細胞１００万個の応答を示す。ヒトｇｐ１００  ＨＬＡ−ＤＲ４エピトープ４４〜５９は、相同性マウスエピトープからの１つのアミノ酸変化を有し、２６３〜１５２１／脾細胞１００万個（平均７４５／脾細胞１００万個）の応答を示す。対照的に、相同性マウス自己エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて応答を刺激することができなかった。ヒトＨＬＡ−ＤＲ４チロシナーゼエピトープは、相同性マウスエピトープから６つのアミノ酸変化を有し、４０５〜８３２／脾細胞１００万個（平均５５５／脾細胞１００万個）の応答を示す。ＨＬＡ−ＤＲ１  ＭＭＰ７  ２４７〜２６２エピトープは、マウスとヒトとの間で４つのアミノ酸変化を有し、そのうちの１つは、コアＭＨＣ結合／ＴＣＲ認識領域内にあると予測される（表３）。このエピトープは、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウスにおいてバックグラウンドより高い応答を刺激することができなかった。ＨＬＡ−ＤＲ４ビメンチン４１５〜４３３エピトープは、ヒトとマウスとの間で２つのアミノ酸相違を有するが、コアＭＨＣ結合／ＴＣＲ認識領域内にあるとは予測されていない（表３）。それは、野生型ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて応答を刺激することができなかった。対照的に、ビメンチン２８〜４９は、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいてマウスとヒトにおいて相同であり、２００〜５００／脾細胞１００万個（平均３９０／脾細胞１００万個）の応答を刺激する真の自己エピトープである。この応答は、興味をそそられ、本発明者らを、なぜこのエピトープに対して除去／寛容がないのかを説明してみたいと思わせた。
【０１０７】
例２
ＤＮＡ免疫化は、シトルリン化ｖｉｍ  ２８、ｖｉｍ  ４１５、ＭＭＰ７、およびＮＹ−ＥＳＯ−１に対する応答を生じる
ＲＡ患者は、シトルリン化ビメンチンエピトープに対してＴ細胞応答を起こすことが示されている。ＡＰＣはエピトープを恒常的にシトルリン化することができるので、抗体ＤＮＡ構築物がシトルリン化され、これが応答を刺激するだろうことは起こり得た。したがって、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、自己ｖｉｍ  ２８エピトープをコードする抗体−ＤＮＡ構築物で免疫化した。これらのマウス由来の刺激されたＴ細胞を、インビトロで、シトルリン化ｖｉｍ  ２８ペプチドと非シトルリン化ｖｉｍ  ２８ペプチドの両方に対するＩＦＮγ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−２応答についてスクリーニングした。図６は、マウスが、ＥＬＩＳＰＯＴによりアッセイされた場合、３つ全てのサイトカインの産生（平均：ＩＦＮγ  ４００、ＩＬ−１７  １２０、およびＩＬ−２  １５０／脾細胞１００万個）により野生型ペプチドに対して応答したが、シトルリン化ペプチドに対する応答は、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７について有意に高かったが、ＩＬ−２についてはそうではなかった（平均：ＩＦＮγ  １２５０／脾細胞１００万個；ｐ＝０．００４６、ＩＬ−１７  ２５０／脾細胞１００万個；ｐ＝０．０３９２、ＩＬ−２  ２５０／脾細胞１００万個）ことを示している。同様の応答がｖｉｍ  ４１５エピトープに対して発生するかどうかをみるために、抗体ＤＮＡ構築物を用いてマウスを免疫化した（図７）。ｖｉｍ  ２８〜４９とは対照的に、かつ本発明者らの最初の観察と一致して、野生型ｖｉｍ  ４１５〜４３３に対する応答はなかったが、そのシトルリン化ペプチドに対する強い応答があり、ＩＬ−１７への応答は、ＩＦＮγ応答と同じくらい強かった（平均：ＩＦＮγ  ４００／脾細胞１００万個；ｐ＝０．００６７、ＩＬ−１７  ３５０／脾細胞１００万個；ｐ＝０．００２、およびＩＬ−２  ２５０／脾細胞１００万個；ｐ＝０．００５６）。これにより、抗体ＤＮＡが翻訳される時、それがシトルリン化されることが確認される。
【０１０８】
対照的に、ＭＭＰ７  ２４７〜２６２をＤＮＡワクチンへ組み入れた場合（図８）、野生型ペプチドまたはシトルリン化ペプチドのいずれに対してもＩＦＮγ応答は見られなかったが、野生型ペプチド（平均：３１２／脾細胞１００万個；ｐ＝０．００６１）とシトルリン化ペプチド（平均：３０９／脾細胞１００万個；ｐ＝０．０２６７）の両方に対して有意なＩＬ−１７応答が見られた。
【０１０９】
マウスにＢ１６  ＨＨＤＩＩ  ＮＹＥＳＯ−１腫瘍細胞を注射し、その後、ｈｏｍｓｐｅｒａアジュバント有り、または無しで、抗体−ＤＮＡワクチンへ組み入れられたＮＹＥＳＯ−１  １１９で免疫化した場合（図９）、ＩＦＮγ応答はシトルリン化ペプチドに対して見られただけで、野生型ペプチドに対して見られず、これは、抗腫瘍応答を伴った。
【０１１０】
抗原提示細胞がエピトープを恒常的にシトルリン化することができるので、ＤＮＡワクチンとして送達される完全長抗原を用いて、シトルリン化自己エピトープ特異的応答が誘導され得るかどうかを見ることは興味深かった。したがって、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、マウスビメンチン抗原全体をコードするＤＮＡ構築物で免疫化した。これらのマウス由来の刺激されたＴ細胞を、シトルリン化および非シトルリン化のｖｉｍ  ２８〜４９ペプチドとｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドの両方に対するＩＦＮγ応答についてインビトロでスクリーニングした。図１０は、そのＤＮＡ構築物で免疫化したマウスが、両方のシトルリン化ペプチドに対してＩＦＮγ応答を示したが、野生型バージョンに対しては示さなかったことを示している。このことにより、そのＤＮＡが翻訳される時、それがシトルリン化されることが確認される。
【０１１１】
これらの結果は、抗体−ＤＮＡ構築物由来のエピトープがシトルリン化されるだろうこと、およびこれらの修飾型ペプチドを認識するＴ細胞が除去／アネルギー化されていないことを示唆する。
【０１１２】
例３
ペプチド免疫化は、シトルリン化ｖｉｍ  ２８、ｖｉｍ  ４１５、およびｖｉｍ  ６５に対する応答を生じる。
【０１１３】
これがＤＮＡワクチンに限定されるかどうか、またはシトルリン化ペプチドもまたこのレパートリーを刺激することができるかどうかを決定するために、マウスを、野生型およびシトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４９ペプチドならびにシトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドで、ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバントと組み合わせて、免疫化した。図１１は、シトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４９が、そのシトルリン化ペプチドに対して強いＩＦＮγ応答（平均６００／脾細胞１００万個；ｐ＝０．００３７）を刺激し、野生型ペプチドに対してより弱い応答（平均２５０／脾細胞１００万個；ｐ＝０．０１７５）を刺激した。野生型ペプチドは、非シトルリン化ペプチド（平均７００／脾細胞１００万個；ｐ＝０．００３）およびシトルリン化ペプチド（平均１，１００／脾細胞１００万個；ｐ＝０．０１８２）に対して類似したＩＦＮγ応答を刺激し、弱いＩＬ−１７およびＩＬ−２応答を刺激した。有意なＩＬ−１０応答は観察されていない。ＩＦＮγとＩＬ−１７の両方への応答の結合活性は１０-6Ｍであった。ｖｉｍ  ２８〜４９に対するマウスにおける応答は、そのアミノ酸配列がマウスおよびヒトにおいて同一であるため、自己に対してであり、このエピトープに対するＴ細胞レパートリーは除去されていないことを示唆している。シトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４９に対する応答は、修飾型自己に対してであるが、マウスはまた野生型ペプチドを認識することができる。以前の研究より、位置３６および４５においてシトルリン化されたペプチド３０〜４９が、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいてＴ細胞応答を刺激し得ることが示されている。本発明者らは、位置２８においてさらなるアルギニンがあることに気づき、それゆえに、本発明者らは、このペプチドを拡張して、２８〜４９を生じさせ、位置２８、３６、および４５をシトルリン化した（図１１ｃ）。三重シトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４９ペプチドは、位置３６、４５でシトルリン化されたｖｉｍ  ２８〜４９ペプチドより有意に強い応答を与えた（それぞれ、ｐ＝０．０２およびｐ＝０．０００７）。位置２８でシトルリン化されただけのｖｉｍ  ２８〜４９は、３シトルリン化ペプチドおよびｖｉｍ  ４５シトルリン化ペプチドに対する応答を与えた。ｖｉｍ  ２８および３６シトルリン化ペプチドもまた三重に対して応答した。このデータは、シトルリンの位置が、この配列について発生される免疫応答の大きさに差を生じることを実証し、最も重要であるのは２８位置であることを示唆している。しかしながら、三重ｃｉｔペプチドは、他のシトルリン化バージョンへのより高い交差反応性をもつ応答を誘導する。ｖｉｍ  ２８〜４９  ３シトルリン化ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ０４０１結合アッセイにおいてＨＡ306〜318参照ペプチドとより高い競合により示されているように、野生型バージョンと比較してＨＬＡ−ＤＲ０４０１へのより高い結合を示す（図１２）。図１３は、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５が、そのシトルリン化ペプチドに対して強いＩＦＮγ応答（平均１０００／脾細胞１００万個；ｐ＝＜０．０００１）を刺激し、野生型ペプチドに対しては応答を刺激しなかった。それはまた、そのシトルリン化ペプチドに対して強いＩＬ−１７応答（平均５３０／脾細胞１００万個；ｐ＝＜０．０００１）を刺激し、野生型ペプチドに対して弱い応答（平均１４０／脾細胞１００万個；ｐ＝０．０４）を刺激した。ＩＦＮγとＩＬ−１７の両方への応答の結合活性は１０-6Ｍであった。シトルリン化ペプチドに対するＩＬ−２応答はより変わりやすかったが（平均３５０／脾細胞１００万個；ｐ＝０．０４６）、野生型ペプチドに対する応答はなかった。野生型ｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドはそのシトルリン化ペプチドに対して弱いＩＬ−２応答を刺激した。有意なＩＬ−１０応答は観察されなかった。ヒトｖｉｍ  ４１５〜４３３エピトープは、コアＭＨＣ結合／ＴＣＲ認識領域内にあると予測されない２アミノ酸だけ、相同性マウスエピトープと異なる。この仮説を試験するために、マウスをヒトｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔペプチドで免疫化し、その後、マウスｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔに対してスクリーニングした。Ｔ細胞は、両方のペプチドに対して等しい応答を示した（図１４）。ｖｉｍ  ４１５〜４３３  ｃｉｔおよび２８〜４９  ｃｉｔ応答は、エクスビボｅｌｉｓｐｏｔアッセイの前のＣＤ４細胞の枯渇またはＭＨＣクラスＩＩ遮断抗体のｅｌｉｓｏｐｔ培養への添加により、ＣＤ４媒介されることが示された（図１５）。ｖｉｍ  ２８ｃｉｔとｖｉｍ  ４１５ｃｉｔの両方を用いて、Ｃ５７ＢｌマウスおよびＨＨＤ１／ＤＲ１マウスを免疫化したが、それらは、これらの系統のいずれにおいても応答を生じることができず、そのエピトープがＩ−ＡｂまたはＨＬＡ−ＤＲ０１０１のいずれにおいても提示されないことを示唆した。
【０１１４】
図１６ａは、シトルリン化ｖｉｍ  ６５ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲ４マウスにおいてそのシトルリン化ペプチドに対してＩＦＮγ応答（平均５５０／脾細胞１００万個；ｐ＝０．００４６）を刺激し、野生型ペプチドに対して応答を刺激しなかった。それはまた、そのシトルリン化ペプチドに対してＩＬ−１７応答（平均５５０／脾細胞１００万個）を刺激し、野生型ペプチドに対して応答を刺激しなかった。野生型ｖｉｍ  ６５〜７７ペプチドは、その野生型およびシトルリン化ペプチドに対して弱いＩＦＮγおよびＩＬ−１７応答を刺激した。ｖｉｍ  ６５〜７７ペプチドはまた、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１マウスにおいて試験され、そのシトルリン化ペプチドに対する高頻度のＩＦＮγ応答を示し、それは野生型ペプチドへのいくらかの交差反応性を示した（図１６ｂ）。低頻度のＩＬ−１０応答もまた、そのシトルリン化ペプチドに対して観察された。ＭＨＣクラスＩＩの遮断は、シトルリン化ペプチド特異的応答を排除せず、したがって、ｖｉｍ  ６５〜７７特異的応答が、ＭＨＣクラスＩ拘束性であることを示している（図１６ｃ）。これは、ｖｉｍ  ６５〜７７シトルリン化ペプチドでの刺激に応答してＩＦＮγおよびＴＮＦａを産生する細胞がＣＤ８陽性であることを示す細胞内サイトカイン染色によりさらに確認される（図１６ｄ）。ｖｉｍ  ６５〜７７  ｃｉｔ特異的応答はまた、ペプチドパルスされたＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞の細胞傷害性を示し（図１６ｅ）、ＨＬＡ−Ａ２を通しての拘束を示す。高いと予測されるＨＬＡ−Ａ２結合を有する２つの９ｍｅｒペプチドを用いてｖｉｍ  ６５〜７７配列内に最小ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープをマッピングすることにおける試みにより、最適な配列がｖｉｍ  ６８〜７６の領域内にあることが明らかにされている（図１６ｆ）。シトルリン化９ｍｅｒペプチドに特異的な応答は、野生型バージョンと交差反応しない。腫瘍標的細胞への応答の分析により、ｖｉｍ  ６５〜７７  ｃｉｔペプチドによる、トランスジェニックＨＬＡ−Ａ２操作型ＥＬ４細胞株（ＥＬ４  ＨＨＤ）の、ＨＬＡミスマッチ型Ｂ１６細胞の認識を凌ぐ高い認識が、エクスビボで応答を誘導したことが明らかにされている（図１６ｇ）。
【０１１５】
例４
自己エピトープに対するＣＤ４応答はナイーブ応答か、メモリー応答か、またはＴｒｅｇ応答かの決定
マウスは、ヒトｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔの単一免疫化に対して強力なＩＦＮγおよびＩＬ−１７応答を起こし、それが、メモリー応答またはＴｒｅｇ応答をブーストしていることが示唆された。これが、ＩＦＮγ／ＩＬ−１７応答へ変換されるだろう内在性Ｔｒｅｇ応答であるかどうかを決定するために、抗ＣＤ２５  ｍＡｂを用いてマウスから内在性Ｔｒｅｇを枯渇し、マウスをマウスｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔで免疫化した。内在性Ｔｒｅｇの枯渇は、応答の頻度または結合活性に影響を及ぼさず、内在性Ｔｒｅｇが応答集団ではないことが示唆された（図１７）。この応答がまた他のアジュバントで誘導されるかどうかを決定するために、マウスを、アラム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＧＭＣＳＦ、ＭＰＬＡ、ＴＭＸ２０１、ＭＰＬＡ／ＴＭＸ２０１、またはＣｐＧ／ＭＰＬＡのいずれかにおいてｖｉｍ  ４１５〜４３３  ｃｉｔおよび２８〜４９  ｃｉｔで免疫化し、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、またはＩＬ−１０の産生についてスクリーニングした（図１８）。ｖｉｍ  ４１５〜４３３  ｃｉｔおよび２８〜４９  ｃｉｔエピトープに対する強力なＩＦＮγ／ＩＬ−１７応答は、ＣｐＧ／ＭＰＬＡ、ＧＭＣＳＦ、およびＴＭＸ２０１アジュバントで誘導されたが、そのペプチドがアラムまたはＩＦＡにおいて投与された場合、応答は見られなかった。ＩＦＡにおけるペプチドでの免疫化は、そのシトルリン化ペプチドに対して高頻度のＩＬ−１０応答を誘導した。
【０１１６】
抗ＣＴＬＡ−４  ｍａｂは、ＣＴＬＡ−４のそれの同族受容体ＣＤ８０／８６との相互作用を遮断することができ、したがって、このリガンドによって誘導されるＴ細胞の阻害を阻止することができる。抗ＣＴＬＡ−４  ｍａｂの存在下におけるｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔペプチドでのマウスの免疫化は、Ｔ細胞応答の結合活性を１０-6Ｍから１０-8Ｍへ有意に増加させた（図１９）。
【０１１７】
例５
癌患者は自己ペプチドに応答する
９人のメラノーマ患者を、一連の自己ペプチドに対する彼らの応答についてスクリーニングした（図２０）。８人の患者のうち５人は、４日目において（１人）、７日目において（１人）、または１１日目より後（３人）において、ｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔに対する応答を示した。１１人の患者のうちの６人は、１０日目より後に、非修飾型ｖｉｍ  ４１５に対して応答した。これらの患者の４人だけが、修飾型ペプチドと非修飾型ペプチドの両方に対して応答した。８人の患者のうちの２人は、１１日目にｖｉｍ  ２８に対する応答を示したが、５人の患者は、ｖｉｍ  ２８  ｃｉｔに対して応答した。非修飾型ペプチドに対して応答したその２人の患者はまた、修飾型ペプチドを認識した。８人の患者のうちの４人は、ｖｉｍ  ６５に対して応答し、８人のうちの３人はｖｉｍ  ６５  ｃｉｔに対して応答した。これらの患者のうちの２人だけが、修飾型ペプチドと非修飾型ペプチドの両方に対して応答した。８人の患者はまた、シトルリン化ＮＹＥＳＯ−１  １１９〜１４３に対する応答を示した；これらの応答のうちの６つは、４〜７日目にピークに達し、強いまたはメモリー応答を示唆した。８人の患者は非修飾型ＮＹＥＳＯ−１  １１９〜１４３に対する応答を示した。これらの患者は、様々なＨＬＡ型を有する（表４）。１人だけが、ＨＬＡ−ＤＲ４であり、そのことは、他のＨＬＡハプロタイプがこれらのペプチドに応答できることを示唆した。
【表４】
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【０１１８】
例６
ＰＡＤ酵素、ビメンチン、およびシトルリンの発現
シトルリン化は、ＰＡＤ酵素、特にＰＡＤ２およびＰＡＤ４酵素によって実行される。これらは、高レベルのカルシウムを必要とし、通常、死細胞または瀕死の細胞において活性化される。したがって、健康な腫瘍細胞がシトルリン化タンパク質を発現するだろうとは可能性が低いように思われる。したがって、結腸直腸および卵巣腫瘍、ならびに正常組織を、ビメンチン、シトルリン化、ならびにＰＡＤ２およびＰＡＤ４酵素の発現について染色した。
【０１１９】
正常組織
ビメンチン、ＰＡＤ２、ＰＡＤ４、およびシトルリンの発現は、正常組織について表５に示されている。
【０１２０】
間葉系細胞、例えば、結合組織細胞、血液細胞、および神経細胞は全て、細胞骨格タンパク質としてビメンチンを発現する。脾臓、甲状腺、精巣、頚部、卵巣、扁桃腺、子宮、肺、胸腺、および乳房内の細胞の大部分はビメンチンについて強く染まった。細胞の５０％未満の弱い染色は、胎盤、直腸、結腸、膵臓および十二指腸、骨格筋および平滑筋、胆嚢、食道、腎臓、肝臓、膀胱、回腸、空腸、胃において見られた。皮膚、脂肪組織、骨格筋、直腸、脳、小脳、横隔膜、または心臓においては染色が観察されなかった。
【０１２１】
肝臓細胞の大部分は、抗ＰＡＤ２  ｍＡｂで強く染まった。平滑筋細胞および脳細胞の大部分は、弱く染まった。小脳、膵臓、および精巣内の細胞の過半数は、ＰＡＤ２に関して強く染まった。胆嚢、回腸、空腸、胃、および結腸内の細胞の５０％未満が、ＰＡＤ２について強く染まった。食道、直腸、骨格筋、膀胱、乳房、腎臓、胎盤、心臓、横隔膜、十二指腸、甲状腺、および肺の細胞は、それらの細胞の５０％未満、弱く染まった。皮膚、脂肪組織、脾臓、扁桃腺、胸腺、卵巣、および子宮は陰性だった。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【０１２２】
肝臓および小脳細胞の大部分は、抗ＰＡＤ４  ｍａｂで強く染まった。脳および心臓細胞の大部分は、弱く染まった。結腸および胃内の細胞の５０％未満はＰＡＤ４について強く染まったが、回腸、横隔膜、十二指腸、甲状腺、精巣、乳房、胆嚢、食道内の細胞の５０％未満は弱く染まった。皮膚、骨格筋および平滑筋、膀胱、脾臓、空腸、腎臓、肝臓、頚部、肺、卵巣、扁桃腺、膵臓、子宮、直腸、脂肪組織、胸腺、および子宮は陰性だった。
【０１２３】
小脳および肝臓は、抗シトルリンｍａｂで強く染まった。皮膚、心臓、腎臓、肺、膵臓、および脳の細胞の大部分は、弱く染まった。十二指腸の５０％より多くが、強く染まり、乳房および精巣の細胞の５０％より多くが、弱く染まった。胸腺および結腸および空腸内の細胞の５０％未満は、弱く染まった。胸腺内の細胞の２５％未満は強く染まり、食道、直腸、胆嚢、骨格筋、膀胱、回腸、胸腺、扁桃腺、横隔膜、および子宮内の２５％より多くが、弱く染まった。脾臓、皮膚、胃、卵巣、扁桃腺、脂肪組織、胎盤、および頚部はシトルリンについて陰性であった。
【０１２４】
卵巣腫瘍
卵巣腫瘍は、間葉系起源であり、したがって、ビメンチンを発現することが予想される。ＰＡＤ４は、正常卵巣により弱く発現している。２１９個の卵巣腫瘍を、ビメンチン特異的ｍＡｂで染色した。腫瘍の９個／２１９個（４％）だけが染まることができず、さらなる１６個／２１９個（７％）が弱く染まったが、１９４個／２１９個（８９％）は強く染まった。カプラン・マイヤー生存分析により、ビメンチン発現と生存の相関はないことが示された。ビメンチンの発現と、ストレス関連タンパク質ＵＬＢＰ１（ｐ＝０．０１７）、ＰＡＤ４（ｐ＝０．０１８）、およびＣＥＡ−ＣＡＭ４（ｐ＝０．０３３）との間に弱い相関があった。
【０１２５】
２１９個の卵巣腫瘍を、ＰＡＤ４特異的ｍＡｂで染色した（図２３）。腫瘍の９個／２１９個（４％）だけが染まることができず、さらなる１２６個／２１９個（５８％）が弱く染まったが、８４個／２１６個（３８％）は強く染まった。カプラン・マイヤー生存分析により、ＰＡＤ４発現と生存の相関はないことが示された。ＰＡＤ４の発現と、ストレス関連タンパク質ＲＡＥＴ１Ｅ（ｐ＝０．０３６）およびＵＬＢＰ１（ｐ＝０．０１６）との間に弱い相関があり、ビメンチンの発現（ｐ＝０．００１）とＬｅｗｉｓy（ｐ＝０．００６）の強い相関があった。
【０１２６】
腫瘍はＰＡＤ４を発現するが、それは瀕死の細胞において活性化されるのみのはずである。これが真実かどうかを評価するために、卵巣腫瘍を、抗シトルリンペプチド特異的ｍＡｂで染色した。腫瘍の７個／２２８個（３％）だけが染まることができず、さらなる３４個／２２８個（１５％）が弱く染まったが、１８７個／２２８個（８２％）は強く染まった。しかしながら、腫瘍内の細胞の全部が染まるとは限らなかった。６９個／２２８個（３０％）において、細胞の２５％未満が染まった。８３個／２２８個（３６％）は、細胞の２５〜５０％、染まり、前述のとおり、これらは主に間質起源であった。５３個／２２８個（２３％）において、いくつかの上皮細胞を含む、細胞の５０〜７５％が染まり、腫瘍の１６個／２２８個（７％）において、細胞の７５％より多くが染まった。カプラン・マイヤー生存分析により、シトルリン発現と生存の相関はないことが示された。シトルリンの発現の強度と、ＣＥＡ−ＣＡＭ５（ｐ＝０．０３７）、ＢＣＬ２（ｐ＝０．０１１）、およびＬｅｗｉｓy（ｐ＝０．０５３）との間に相関があった。シトルリンを発現する細胞のパーセンテージと、グレード（ｐ＝０．０３４）、ＢＣＬ２（ｐ＝０．０３５）、ＣＤ５９（ｐ＝０．０４９）、およびＵＬＢＰ１（ｐ＝０．０４４）との間に相関があった。
【０１２７】
３６０個の卵巣腫瘍をＰＡＤ２について染色した。９％は、十分な組織コアが存在しないこと、またはコアにおいて評価可能な腫瘍細胞がない（すなわち、全部が間質）ことのために、評価することができなかった。ＰＡＤ２特異的ｍＡｂで染色された３２９個の評価可能な卵巣腫瘍のうち、全腫瘍がＰＡＤ２を発現した。さらなる２７７個／３２９個（８４％）は弱く染まり、５２個／３２９個（１６％）は強く染まった。カプラン・マイヤー分析（図２１ａ）により、ＰＡＤ２発現と生存との相関があり、高発現のＰＡＤ２が保護的であった（ｐ＝０．０３３）。ＰＡＤ２の発現と、ＭＨＣ（ｐ＝０．０３８）発現およびＨＭＧＢ１（Ｐ＝０．００８）発現との間に相関があった。多変量分析後も、ＰＡＤ２は依然として、独立予後因子にとどまった（ｐ＝０．００２）。
【０１２８】
３６０個の卵巣腫瘍を、ＨＭＧＢ１について染色した。１０％は、十分な組織コアが存在しないこと、またはコアにおいて評価可能な腫瘍細胞がない（すなわち、全部が間質）ことのために、評価することができなかった。ＨＭＧＢ−１特異的ｍＡｂで染色された３１６個の評価可能な腫瘍細胞のうち、２３個／３６０個（７％）の腫瘍だけが、染まることができなかった。さらなる４２個／３１６個（１３％）は弱く染まり、５２個／３２９個（８７％）は強く染まった。カプラン・マイヤー分析（図２１ｂ）により、ＨＭＧＢ１発現と生存の相関があり、低発現のＨＭＧＢ１は保護的であることが示された（ｐ＝０．００２）。ＨＭＧＢ１の発現とビメンチンとの間に弱い相関があった（ｐ＝０．０３４）。多変量分析後も、ＨＭＧＢ１は依然として、独立予後因子にとどまった（ｐ＝０．０２）。腫瘍ステージ、腫瘍型、および化学療法に対する応答もまた、患者生存と相関する。多変量モデルにおいて、ＴＮＭステージ（ｐ＝＜０．０００１）、腫瘍型（ｐ＝＜０．０３１）、化学療法に対する応答（ｐ＝＜０．０００１）、およびＨＭＧＢ１発現（ｐ＝０．００２）は、患者生存の独立予測因子であった。
【０１２９】
腫瘍細胞の高および低ＰＡＤ２の発現を高および低ＨＭＧＢ１発現と比較した場合（図２１ｃ）、高ＨＭＧＢ１および低ＰＡＤ２発現を示した患者において、３１０人の患者のうちの２１９人（７０％）は、５０カ月間の最も悪い生存期間中央値を有し、低ＨＭＧＢ１および低ＰＡＤ２を有する患者は、より良い生存期間を示し、３１０人の患者のうちの４１人（１３％）は、１０１カ月間の生存期間中央値を有した。
【０１３０】
結腸直腸腫瘍
結腸直腸腫瘍は、上皮起源であり、それらが、上皮間葉転換を受けるだろうことがない限り、ビメンチンを発現するとは予想されない。ＰＡＤ２およびＰＡＤ４の発現は正常結腸において見られた。
【０１３１】
２８２個の結腸直腸腫瘍を、ビメンチン特異的ｍＡｂで染色した。腫瘍の２５個／２８２個（９％）は、染まることができず、さらなる４個／２８２個（１％）は弱く染まったが、２５３個／２８２個（９０％）は強く染まった。しかしながら、腫瘍内の細胞の全部が染まったとは限らない。１１４個／２８２個（４０％）は細胞の２５％未満、染まり、これらは全て間質細胞であった。６８個／２８２個（２４％）は、細胞の２５〜５０％、染まり、この場合もやはり、これらは、主に間質起源であった。４２個／２８２個（１５％）は、いくつかの上皮細胞を含む、細胞の５０〜７５％、染まり、腫瘍の３３個／２８２個（１２％）において、細胞の７５％より多くが染まった。カプラン・マイヤー生存分析により、染色された細胞のビメンチン強度またはパーセンテージと生存の相関がないことが示された。ビメンチンの発現と、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２（ｐ＝０．００３）、腫瘍におけるＩＬ−１７（ｐ＝．０２１）、ＭＵＣ１（ｐ＝０．００１）、ＰＡＤ２（ｐ＝０．０２５）、およびＰＡＤ４（ｐ＝＜０．０００１）との間に相関があった。
【０１３２】
２９６個の結腸直腸腫瘍をＰＡＤ２特異的ｍＡｂで染色した（図２６）。腫瘍の４５個／２９６個（１５％）は、染まることができず、さらなる６０個／２９６個（２０％）は弱く染まったが、１９１個／２９６個（６５％）は強く染まった。しかしながら、腫瘍内の細胞の全部が染まったとは限らない。９９個／２９６個（３３％）は細胞の２５％未満、染まった。８２個／２９６個（２８％）は、細胞の２５〜５０％、染まり、この場合もやはり、これらは、主に間質起源であった。５５個／２９６個（１９％）は、細胞の５０〜７５％、染まり、腫瘍の１５個／２９６個（５％）において、細胞の７５％より多くが染まった。カプラン・マイヤー生存分析により、染色された細胞のＰＡＤ２強度またはパーセンテージと生存の相関がないことが示された。ＰＡＤ２の発現と、ＣＤ５９（ｐ＝０．００６）、β−カテニン（ｐ＝０．００５）、いくつかのＣＤ８  Ｔ細胞（ｐ＝０．００９）、ＭＵＣ１（ｐ＝０．０１２）、ビメンチン（ｐ＝０．０３８）、およびＰＡＤ４（ｐ＝０．０００）との間に相関があった。
【０１３３】
２９１個の結腸直腸腫瘍をＰＡＤ４特異的ｍＡｂで染色した（図２６）。腫瘍の１８個／２９１個（６％）は、染まることができず、さらなる１５８個／２９１個（５４％）は弱く染まったが、１１５個／２９１個（４０％）は強く染まった。しかしながら、腫瘍内の細胞の全部が染まったとは限らない。６５個／２９１個（２２％）は細胞の２５％未満、染まった。６８個／２９１個（２３％）は、細胞の２５〜５０％、染まり、この場合もやはり、これらは、主に間質起源であった。９８個／２９１個（３４％）は、細胞の５０〜７５％、染まり、腫瘍の４２個／２９１個（１４％）において、細胞の７５％より多くが染まった。カプラン・マイヤー生存分析により、ＰＡＤ４強度と生存の相関があることが示された（図２１ｄ、表６；ｐ＝０．０３２）。
【表６】
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【０１３４】
推定値は、打ち切られた場合、最大の生存期間に限定される。
【０１３５】
腫瘍ステージおよび血管侵入もまた患者生存と相関する。多変量モデルにおいて、ＴＮＭステージ（ｐ＝＜０．０００１）、血管侵入（ｐ＝＜０．０００１）、およびＰＡＤ４発現（ｐ＝０．０１７）は患者生存の独立予測因子であった。
【０１３６】
ＰＡＤ４の発現と、ＢＣＬ２（ｐ＝０．０１）、β−カテニン（ｐ＝０．００１）、いくつかのＣＤ８  Ｔ細胞（ｐ＝０．００６）、ＭＵＣ１（ｐ＝０．０００）、ＣＥＡ．ＣＡＭ５（ｐ＝０．０００）、ＣＤ５９（ｐ＝０．０３８）、ビメンチン（ｐ＝０．０００）、およびＰＡＤ２（ｐ＝０．０００）との間に相関があった。
【０１３７】
腫瘍はＰＡＤ４を発現するが、それは瀕死の細胞において活性化されるのみのはずである。これが真実かどうかを評価するために、結腸直腸腫瘍を、抗シトルリンペプチド特異的ｍＡｂで染色した。腫瘍の全部が染まり、４１個／３１６個（１３％）が弱く染まったが、２７５個／３１６個（８７％）は強く染まった。カプラン・マイヤー生存分析により、シトルリン発現と生存の弱い相関があることが示された（ｐ＝０．０７８）。シトルリンの発現と放射線治療の相関があった（ｐ＞０．００１）。
【０１３８】
例７
シトルリン化ペプチドに対する抗腫瘍応答
マウスとヒトのどちらも、シトルリン化自己ペプチドおよびＤＮＡワクチンに対する応答を示す。しかしながら、これらのエピトープは、腫瘍においてシトルリン化されず、それゆえに、Ｔ細胞は抗腫瘍活性を生じないだろう。
【０１３９】
ヒト腫瘍は、ビメンチン、ＰＡＤ２／４、およびシトルリンを発現するため、シトルリン化ビメンチンの抗腫瘍応答をマウスモデルにおいて評価した。シトルリン化ビメンチン４１５〜４３３と２８−４９ペプチドの両方で免疫化したマウス由来の脾細胞を、Ｂ１６腫瘍細胞に応答する能力についてインビトロで評価した。図２２ａは、未処理細胞またはＨＬＡミスマッチ型細胞と比較した、血清欠乏状態によりオートファジーを起こすように誘導されているＨＬＡ−ＤＲ４（Ｂ１６ＤＲ４）を発現するＢ１６腫瘍細胞に特異的なＩＦＮγ放出を示しており、腫瘍細胞の認識を示した（ｐ＜０．０００１）。オートファジー阻害剤３−メチルアデニン（３−ＭＡ）（ｐ＜０．０００１）またはＰＡＤ阻害剤ＣＩアミジン（ｐ＝０．００１２）の存在下において処理された場合、オートファジー誘導化Ｂ１６ＤＲ４細胞の認識は有意に減少する。したがって、この認識がオートファジーおよびシトルリン化依存性であることを示している。シトルリン化ｖｉｍ  ２８〜４９もしくはｖｉｍ  ４１５〜４３３ペプチドのいずれか、または両方で免疫化したマウス由来脾細胞は、Ｖｉｍ  ４１５〜４３３（ｐ＜０．０００１）およびｖｉｍ  ２８〜４９（ｐ＜０．０００１）シトルリン化ペプチドでの刺激で、細胞傷害性のマーカーである、グランザイムＢの放出を示すが、野生型バージョンでの刺激では示さない（図２２ｂ〜ｄ）。グランザイムＢはまた、血清欠乏状態Ｂ１６ＤＲ４腫瘍標的細胞に対する応答で放出され、シトルリン化エピトープを提示する腫瘍標的の細胞傷害性を示唆する（ｐ＝０．０１４）（図２２ｅ）。
【０１４０】
ｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔまたはｖｉｍ  ２８  ｃｉｔのいずれかで免疫化したマウスを、ヒトＤＲ４をトランスフェクションされたＴ２腫瘍細胞を殺すそれらの能力についてインビトロで評価した。図２３ａは、どちらのシトルリン化ペプチドも、トランスフェクションされた標的を、それらが適切なペプチドでパルスされたか、されなかったかに関わらず、殺すＣＤ４細胞を誘導することができたことを示している。Ｔ２細胞はビメンチンを発現するため、これは、これらのペプチドがＴ２細胞によって内因的に提示されることを意味する。対照的に、同様にビメンチンを発現するが、ＰＡＤ酵素を発現しない、正常な脾細胞の殺害はなかった。
【０１４１】
ＨＬＡ／ＤＲ４トランスジェニックマウスに、ＤＲ４をトランスフェクションされたＢ１６腫瘍を移植した。それらを、ｖｉｍ  ４１５〜４３３シトルリン化ペプチド、またはｖｉｍ  ４１５〜４３３配列をコードするＤＮＡワクチンで免疫化し、腫瘍成長を監視した。ｖｉｍ  ４１５〜４３３  ｃｉｔペプチドまたはＤＮＡワクチン内でコードされたｖｉｍ  ４１５〜４３３のいずれかで免疫化したマウスは、強い抗腫瘍応答を刺激する（図２４ａ）。非免疫化マウスにおいて、腫瘍は急速に成長し、全てのマウスは、２３日目までに屠殺されなければならなかった。対照的に、ｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔペプチドで免疫化したマウスの５０％は、３５日目において腫瘍を有さず、３０％はそれらの腫瘍が治癒した。ｖｉｍ  ２８〜４９シトルリン化ペプチドまたはｖｉｍ  ２８〜４９配列をコードするＤＮＡワクチンでのマウスの免疫化は、非免疫化対照またはｖｉｍ  ２８〜４９野生型ペプチドで免疫化したマウスを超える、有意に増強した生存を示す（図２４ｂ）。野生型ｖｉｍ  ２８〜４９ペプチドで免疫化したマウスは、ほとんど有意性に達する抗腫瘍応答を示した。ｖｉｍ  ４１５〜４３３および２８〜４９シトルリン化ペプチドの組み合わせでの免疫化は、対照と比較してさらにより良い腫瘍保護および全生存を示す（ｐ＜０．０００１）（図２４ｃ）。これらの研究により、腫瘍が、後に細胞傷害性ＣＤ４キラーＴ細胞の標的である、シトルリン化ビメンチンを発現することが示されている。これらの抗腫瘍応答がＣＤ４  Ｔ細胞によって媒介されることを実証するために、マウスを、インビボで、抗ＣＤ４抗体で処理し、ＣＤ４細胞を枯渇した。ＣＤ４  Ｔ細胞の枯渇と組み合わせてのワクチン接種は、Ｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔ（ｐ＝０．０００５）とＶｉｍ  ２８  ｃｉｔペプチド（ｐ＝０．０００１）の両方により媒介される抗腫瘍応答を完全に抑止した（図２４ｄおよびｅ）。
【０１４２】
ｖｉｍ  ４１５〜４３３シトルリン化ペプチドとｖｉｍ  ２８〜４９シトルリン化ペプチドのどちらも、高頻度のＩＦＮγ応答を誘導する。インビボでのＩＦＮγの遮断は、ｖｉｍ  ４１５〜４３３シトルリン化ペプチド特異的抗腫瘍応答とｖｉｍ  ２８〜４９シトルリン化ペプチド特異的抗腫瘍応答の両方を抑止する（図２５ａおよびｂ）。ｖｉｍ  ４１５〜４３３  ｃｉｔ特異的応答もまたＩＬ−１７応答を示す。インビボでのこれらの遮断は、インビボでの抗腫瘍効果への影響の有意性は低い（図２５ｃ）。ＩＬ−１７の遮断はまた、インビボで、ｖｉｍ  ２８〜４９  ｃｉｔ特異的抗腫瘍応答への影響の有意性は小さかった（図２５ｄ）。
【０１４３】
ｖｉｍ  ４１５〜４３３ｃｉｔ特異的応答およびｖｉｍ  ２８〜４９  ｃｉｔ特異的応答による直接的腫瘍認識の重要性を決定するために、マウスに、ＨＬＡ−ＤＲ０４０１の発現を欠損するＢ１６腫瘍を負荷し、その後、Ｖｉｍ  ４１５〜４３３シトルリン化ペプチドまたはｖｉｍ  ２８〜４９シトルリン化ペプチドで免疫化した。ｖｉｍ  ２８〜４９シトルリン化ペプチドで免疫化したマウスは、対照と比較して、腫瘍成長の遅延、および生存の増強を示し（図２６ａ）、腫瘍細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ４および同族ペプチドの直接的認識が抗腫瘍応答に必要ではないが、腫瘍環境内での同族ペプチドおよびＨＬＡ−ＤＲ４を発現する抗原提示細胞に応答したＩＦＮγの傍観者放出が抗腫瘍応答に関与することを示唆した。対照的に、シトルリン化ｖｉｍ  ４１５〜４３３で免疫化したマウスは、このモデルにおいて、少しの腫瘍応答も示すことができず、ＨＬＡ−ＤＲ４および同族ペプチドを発現する腫瘍細胞の直接的認識がこのエピトープの抗腫瘍応答に必須であることを示唆した。ｖｉｍ  ４１５〜４３３特異的応答が直接的腫瘍認識に依存することを確認するために、ＨＬＡ−ＤＲ０４０１を発現するＢ１６腫瘍を負荷されたマウスを、抗ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体と組み合わせて、ｖｉｍ  ４１５〜４３３シトルリン化ペプチドで免疫化した。ＨＬＡ−ＤＲの遮断は、抗腫瘍応答を阻止した（図２６ｂ）。
【０１４４】
例８
異なる種間のビメンチンの相同性
ビメンチンは、ニワトリ、マウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、およびヒトの間で高度に保存されている（図２７）。ワクチンは、ヒトおよびマウスにおいてＴ細胞応答を、ならびにマウスにおいて抗腫瘍応答を誘導するため、類似した応答が他の種において見られるだろうと想定することができる。
【０１４５】
例９
他のＨＬＡハプロタイプにより拘束されるビメンチン応答
ＨＬＡ−ＤＲ４マウスは、ヒトｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔペプチドの単一免疫化に対して強力なＩＦＮγおよびＩＬ−１７応答を起こした。このまたは他のシトルリン化ビメンチンエピトープが他のハプロタイプにおいて免疫応答を誘導することができるかどうかを決定するために、ビメンチンの全スパンを網羅し、かつあらゆるアルギニンをシトルリン残基で置きかえて組み入れた、様々な２０ｍｅｒペプチド（表８）を、ＨＬＡ−ＤＲ１およびＣ５７／ＢｌマウスにおいてＩＦＮγ／ＩＬ−１７応答についてスクリーニングした（図２８）。ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバントと組み合わせて、３つのシトルリン化ｖｉｍペプチドの組み合わせでマウスを免疫化し、その後、組み合わせにおけるそれぞれ個々のペプチドに対するＩＦＮγおよびＩＬ−１７応答についてスクリーニングした。図２８ａは、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウスにおいて、シトルリン化ｖｉｍペプチド９、１０、１４、１５、および１６は有意なＩＦＮγ応答（２００〜３５０スポット／脾細胞１００万個、ｐ＜０．０２）を示し、ペプチド１０はＩＬ−１７応答（３５０スポット／脾細胞１００万個）を示したことを示す。図２８ｂは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、シトルリン化ｖｉｍペプチド１６、１７、１８、１９、および２０は有意なＩＦＮγ応答（３００〜５００スポット／脾細胞１００万個、ｐ＜０．０２）を示し、ペプチド１９および２０は、ＩＬ−１７応答（約４００スポット／脾細胞１００万個、ｐ＜０．０５）を示したことを示す。表７は、これらのペプチドの配列、シトルリンアミノ酸の位置、およびビメンチンタンパク質内の位置を示す。
【０１４６】
図２８ｃは、ｖｉｍ  １４シトルリン化ペプチドで免疫化したＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１マウスにおける応答を示す。
【表７−１】
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【表７−２】
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【０１４７】
例１０
シトルリン化Ｔ細胞エピトープについてスクリーニングする方法
文献に記載されているいかなるシトルリン化タンパク質もＴ細胞の潜在的な標的であり得る。しかしながら、それは、まず、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ  ＭＨＣ抗原上に提示される能力を有しなければならず、かつそれは、Ｔ細胞受容体によって認識されなければならない。抗原提示細胞は、恒常的に、オートファジーを起こし、それはこれらの二重膜オートファゴソーム内であり、そのオートファゴソームは十分な細胞内Ｃａ2+を蓄積して、ＰＡＤ酵素を活性化することができ、その酵素はエピトープをシトルリン化し、その後、そのエピトープはＭＨＣ抗原上に提示される。最後に、抗腫瘍標的であるために、腫瘍細胞もまた、オートファゴソーム内でシトルリン化を誘導し、ＭＨＣ抗原上に同じ修飾型エピトープを提示しなければならない。したがって、なお抗腫瘍免疫を刺激することができるシトルリン化エピトープを同定するために、Ｔ細胞応答の誘導および腫瘍認識について標的タンパク質をスクリーニングすることが必要である。
【０１４８】
ａ）シトルリン化ペプチドによるヒト末梢血のインビトロＴ細胞増殖
ヒト末梢血は、例５において概要が示されているように、インビトロで刺激することができる。タンパク質全体に及ぶシトルリン化２０ｍｅｒペプチドを、Ｔ細胞増殖についてスクリーニングすることができる。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のソーティングは、ＣＤ４およびＣＤ８エピトープを同定することができ、ＨＬＡ拘束性は、ドナーのＨＬＡタイピングによって同定することができる。
【０１４９】
ｂ）標的タンパク質の全体に及ぶ２０ｍｅｒシトルリン化ペプチドで、インビトロまたはインビボで、通常の、またはＨＬＡトランスジェニックマウス由来の細胞を刺激する  シトルリン化サイトケラチン−８エピトープが免疫応答を誘導することができるかどうかを決定するために、サイトケラチン−８の全スパンを網羅し、かつ推定のコア結合領域内のアルギニンをシトルリン残基で置きかえて組み入れている、様々な２０ｍｅｒペプチド（表８）を、ＨＬＡ−ＤＲ１およびＣ５７  ＢＩマウスにおいてＩＦＮγ／ＩＬ−１７応答についてスクリーニングした（図２９）。ＣｐＧおよびＭＰＬＡアジュバントと組み合わせて、３つのサイトケラチン８ペプチドの組み合わせでマウスを免疫化し、その後、組み合わせにおけるそれぞれ個々のペプチドに対するＩＦＮγおよびＩＬ−１７応答についてスクリーニングした。図２８ａは、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウスにおいて、シトルリン化サイトケラチン８ペプチド１、２、３、１３、１６、および１７は有意なＩＦＮγ応答（２００〜３００スポット／脾細胞１００万個、ｐ＜０．０２）を示し、ペプチド１、２、３、１３、および１４はＩＬ−１７応答（２５０〜３５０スポット／脾細胞１００万個；ｐ＜０．０２）を示したことを示す。図２９ｂは、Ｃ５７Ｂｌマウスにおいて、サイトケラチン８ペプチドは応答を刺激しなかったことを示す。
【表８】
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【０１５０】
ｃ）Ｔ細胞応答についての既知のシトルリン化エピトープのスクリーニング
ＩＮＧ４タンパク質は、それのＮＬＳ領域内の位置１３３においてＰＡＤ４によってシトルリン化される。これは、ｐ５３活性化に必須である、それのｐ５３との会合を阻止する。シトルリン化ＩＮＧ４タンパク質は、迅速に分解され、それがＭＨＣクラスＩＩ上に多量に発現され得ることを示唆している。ＩＮＧ４ペプチドＡＱＫＫＬＫＬＶＲＴＳＰＥＹＧＭＰは、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウスにおいて少しの免疫応答も刺激することができなかったが、ＡＱＫＫＬＫＬＶｃｉｔＴＳＰＥＹＧＭＰは、シトルリン化ペプチドに対するＩＦＮγ／ＩＬ−１７応答（平均２００スポット／脾細胞１００万個）を刺激したが、野生型ペプチドに対する応答を刺激しなかった。シトルリン化ペプチドに対する応答は、ＭＨＣクラスＩＩ遮断ｍａｂで遮断された（図３１ａ）。これは、シトルリン化／腫瘍特異的ＣＤ４応答を刺激することができるタンパク質のさらなる例である。
【０１５１】
ｄ）シトルリン化Ｔ細胞エピトープについての任意のタンパク質のスクリーニング
本発明者らが例２において示しているように、抗原全体をコードするＤＮＡで免疫化することは、結果として、シトルリン化ペプチドに対する応答を生じる。ここで、本発明者らが、抗原全体をコードするＤＮＡで免疫化し、全ての可能なシトルリン化２０ｍｅｒペプチドに対してスクリーニングした場合、ＨＬＡ分子によって提示されたシトルリン化エピトープに対するＴ細胞応答だけが、免疫応答を刺激することを本発明者らは示す。シトルリン化ペプチドのパネルは表７に詳細を示している。図３３ａは、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおけるビメンチンＤＮＡ免疫化から生じた応答を示し、図３４ｂは、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおける応答を示す。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスは、シトルリン化ビメンチン２８〜４９および４１５〜４３３ペプチドに特異的な高頻度の応答、加えて、ビメンチン１９〜３３、２６〜４４、および３６〜５４ペプチドに対するより低い頻度の応答を示す。ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスは、シトルリン化ビメンチン６５〜７７ペプチドに特異的な高頻度応答を示す。これは、抗原全体をコードするＤＮＡを用いて、シトルリン化されてＴ細胞応答を誘導することを例示し、さらなるシトルリン化Ｔ細胞エピトープについてスクリーニングするための優れた方法である。同様に、タンパク質は、高レベルのカルシウムの存在下でＰＡＤ酵素とインキュベートすることによりエクスビボでシトルリン化することができる。これらのタンパク質を、マウスを免疫化するために用いることができ、その後、全ての可能なシトルリン化２０ｍｅｒペプチドに対してＴ細胞をスクリーニングする。
【０１５２】
ｅ）ＭＨＣ結合スコアおよびコア領域内のアルギニン残基に基づいて選択された、予測されるペプチドのスクリーニング
本発明者らは、既知のシトルリン化エピトープに対して応答を誘導することができることを示しているが、ここで、本発明者らはまた、ペプチドエピトープが、予測されるＭＨＣ結合スコアおよびコアＭＨＣ結合領域内のアルギニン残基の存在に基づいて選択し得ることを実証する。この例として、ペプチドを、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ予測アルゴリズム（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）を用いてＨＬＡ−ＤＲ４への高いと予測される結合を有するＢｉＰ、ＨＳＰ９０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、およびＩＮＧ４から選択し、その後、（ＩＥＤＢ予測アルゴリズム（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）を用いて決定される）コア結合領域内のアルギニンの存在を通してさらに限定した（表９）。全てのアルギニンをシトルリンへ変化させて含有するペプチドを試験した。
【表９】
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【０１５３】
ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、シトルリン化ペプチドで最高３回まで免疫化し、関連シトルリン化および非修飾型ペプチドに対するＩＦＮｇ  ｅｌｉｓｐｏｔによりエクスビボで応答を評価した。図３４は、非修飾型ペプチドまたはバックグラウンド対照に対する応答を超える、シトルリン化ＢｉＰ  ３９〜５３、ＢｉＰ  １７２〜１８６、ＨＳＰ９０  ３４６〜３６０、ＨＳＰ９０  ４５６〜４７７、およびＩＮＧ４  ４４〜５８に対する有意な応答を示す。これは、シトルリン化Ｔ細胞エピトープの選択のための別の効率的な方法を提供する。
【０１５４】
Ｔ細胞が腫瘍を認識することを証明するために、それらは、腫瘍標的細胞の認識についてスクリーニングし、ＭＨＣリサイクリングを促進するために酸剥奪し、かつオートファジーを誘導するために血清欠乏状態にすることができる（図２２ａおよびｅ）。シトルリン化およびオートファジーの役割は、ＰＡＤ阻害剤およびオートファジー阻害剤を用いて確認することができる（図２２ａ）。インビボの抗腫瘍応答は、腫瘍を惹起し、シトルリン化ペプチドで免疫化し、図（２４〜２６）に示されているように、腫瘍成長を監視することにより測定することができる。
【０１５５】
例１１
以前の研究により、ナイーブＣＤ４細胞の、それらが刺激された時に存在するそれらのサイトカイン環境に依存して、異なるヘルパー表現型への分化を決定することは可能であることが示されている。対照的に、本発明者らは、ある特定のエピトープが、サイトカイン環境に関わらず、Ｔヘルパー細胞分化を決定することができることを図１５において初めて示している。ｖｉｍ  ４１５  ｃｉｔは、Ｔｈ２アジュバント完全フロイントアジュバントの存在下で免疫化した場合でさえも、Ｔｈ１／ＩＬ−１７表現型を刺激した。これは、ＭＨＣペプチドとのＣＤ４  Ｔ細胞受容体結合の強さがＴ細胞分化を決定することができることを示唆している。この関連において、本発明者らは、野生型ｖｉｍ  ４１５が、Ｔｈ１アジュバントＣｐＧ／ＭＰＬＡの存在下でさえも、ＩＬ−１０応答（図３０；平均５８０スポット／脾細胞１００万個、ｐ＝０．０２４９）を刺激することを示している。しかしながら、それは、有意なＩＦＮγまたはＩＬ−１７応答を刺激することができなかった。
【０１５６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ−１】
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【図１１ａ−２】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１６ｅｆ】
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【図１６ｇ】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃｄ】
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【図２２ｅ】
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【図２３】
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【図２４ａｂ】
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【図２４ｃｄ】
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【図２４ｅ】
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【図２５ａｂ】
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【図２５ｃｄ】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８ａ−１】
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【図２８ａ−２】
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【図２８ｂ−１】
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【図２８ｂ−２】
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【図２８ｃ】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３ａ】
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【図３３ｂ】
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【図３４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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