(57)【要約】【課題】大量生産可能なウイルスワクチンの製造方法を提供する。【解決手段】本発明のウイルスワクチンの製造方法は、宿主細胞に波長６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下の光を照射する光照射工程を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞に波長６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下の光を照射する光照射工程を備えることを特徴とするウイルスワクチンの製造方法。
【請求項２】
前記光照射工程において、前記宿主細胞に波長７００ｎｍの光を照射する請求項１に記載のウイルスワクチンの製造方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が鳥類の受精卵である請求項１又は２に記載のウイルスワクチンの製造方法。
【請求項４】
前記光照射工程において、受精直後から漿尿膜が形成されるまでに、前記宿主細胞に前記光を照射する請求項３に記載のウイルスワクチンの製造方法。
【請求項５】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである請求項１〜４のいずれか一項に記載のウイルスワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは細胞に付着し、細胞（以下、「宿主細胞」と称する場合がある。）内に侵入後、核内（又は、細胞質内）でウイルスゲノムの転写及び複製が行われ、子孫ウイルスが産生される。ウイルスの増殖では、宿主細胞の全ての機能がうまく利用されていることがすでに知られている。また、ウイルス感染後は、短時間でウイルスゲノム由来のｍＲＮＡやタンパク質が多く産生されると同時に、宿主細胞側のタンパク質量の増減、修飾や脂質の合成が起こる。
【０００３】
ウイルスに対するワクチンとしては、病原性をできる限りなくしたウイルスや、死滅（不活性化）したウイルス、又は毒素を無毒化したウイルスが用いられる。ワクチンを事前に体内に摂取することによって免疫状態を作り、病原性ウイルスから体を守る。
また、病原性ウイルスに対するワクチンの製造方法としては、例えば、孵化鶏卵培養法、動物接種法、細胞培養法、及び遺伝子組換え法（例えば、特許文献１参照。）等が挙げられる。中でも、孵化鶏卵培養法は、主にインフルエンザワクチンの製造に用いられる方法である。
【０００４】
本発明者は、インフルエンザウイルスについて、細胞への付着及び増殖は、Ｇ１期細胞特異的であることを明らかにした。細胞周期は大きく分類して、静止期と分裂期とがあり、Ｇ１期細胞は静止期の細胞になる。また、分裂期には、ＤＮＡ合成期と、ＤＮＡが分配され、核膜形成が起こり、最終的に２細胞になるように細胞膜が形成される期間とがある。また、本発明者は、静止期と分裂期との細胞をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて選択的に分取し、細胞成分を解析した結果、静止期と分裂期との細胞において、タンパク質組成、脂質成分などに大きな違いがあることを明らかにした、これらの違いは細胞の周期で時間的に細胞機能が変化することを示唆している（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
また、細胞への光照射により、ＤＮＡ、ＲＮＡ合成が誘導され、細胞の増殖速度及び接着性が促進されることが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１４９９２７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boulton M. and Marshall J., “He-Ne laser stimulation of human fibroblast proliferation and attachment in vitro”, Lasers Life Sci., vol.1, p125-134, 1986.
【非特許文献２】Honda A., et al., “A Novel Single Virus Infection System Reveals That Influenza Virus Preferentially Infects Cells in G1 Phase”, PLOS ONE, vol.8, issue 7, p1-9, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の孵化鶏卵培養法を用いた病原性ウイルスに対するワクチンの製造方法では、０．５人分のワクチンしか得られなかった。
また、従来の動物接種法を用いた病原性ウイルスに対するワクチンの製造方法では、原料となる動物の供給量により製造量が制限され、さらに、外来微生物による汚染を防ぐために動物の生育管理及び製造管理が厳しく、手間がかかる。
また、従来の細胞培養法を用いた病原性ウイルスに対するワクチンの製造方法では、短期間に大量のワクチンを製造することができるが、１つの細胞で増殖するウイルスの量には限度がある。
また、従来の遺伝子組換え法を用いた病原性ウイルスに対するワクチンの製造方法では、短期間に大量のワクチンを製造することができ、製造に感染性を有するウイルスを用いないことから、ワクチンを安全に生産することが可能である。しかしながら、ウイルス抗原タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを構築する必要があり、前記発現ベクターの細胞への導入効率によって、製造効率が左右される。また、ウイルスの増殖が悪いと考えられている。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、大量生産可能なウイルスワクチンの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ウイルス感染前の宿主細胞に光を照射することにより、宿主細胞におけるウイルス粒子の製造量が増加することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］宿主細胞に波長６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下の光を照射する光照射工程を備えることを特徴とするウイルスワクチンの製造方法。
［２］前記光照射工程において、前記宿主細胞に波長７００ｎｍの光を照射する［１］に記載のウイルスワクチンの製造方法。
［３］前記宿主細胞が鳥類の受精卵である［１］又は［２］に記載のウイルスワクチンの製造方法。
［４］前記光照射工程において、受精直後から漿尿膜が形成されるまでに、前記宿主細胞に前記光を照射する［３］に記載のウイルスワクチンの製造方法。
［５］前記ウイルスがインフルエンザウイルスである［１］〜［４］のいずれか一つに記載のウイルスワクチンの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、大量生産可能なウイルスワクチンの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における光照射によるウイルス産生量の違いをニワトリ赤血球凝集法により検出した結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜＜ウイルスワクチンの製造方法＞＞
一実施形態において、本発明は、宿主細胞に波長６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下の光を照射する光照射工程を備えるウイルスワクチンの製造方法を提供する。
なお、本明細書において、「ウイルス」とは、野生型ウイルス、感染個体から得られた一次ウイルス分離株、組換ウイルス、弱毒化ウイルス、遺伝子リアソートメントにより得られたウイルス、及び逆遺伝学的に製造されたウイルスを包含する。
【００１５】
本明細書において「ワクチン」とは、身体中に投与されて、免疫を生成する、通常感染性因子若しくは感染因子のある部分、又はそのような因子若しくは部分を生成することができる因子（例えば、遺伝子配列等）を含む組成物（例えば、懸濁液又は溶液）を意味する。ワクチンを構成する抗原性部分は、ウイルス粒子、ウイルスから精製された天然の産生物、合成生成物若しくは遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖若しくは同様な産生物、又はそのようなタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であってもよい。ワクチンは、中和抗体を生起することによって、その効果を発現する。
本明細書において医薬として利用され得るワクチンとしては、例えば、病原性ウイルスにより発症する疾病に対するワクチン等が挙げられる。ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ） により、動物（例えば、ヒト、家畜、媒介動物等） の体内に能動的につくられる免疫（体液性免疫、細胞性免疫、又は両者）が病原体の感染、伝播、流行等を阻止することができる。
【００１６】
本実施形態の製造方法によれば、従来よりも１回の製造で大量のウイルスワクチンを得ることができる。
本実施形態の製造方法について、各工程を以下に詳細に説明する。
【００１７】
＜光照射工程＞
まず、宿主細胞に直接波長６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下の光を照射する。
照射する光の波長としては、６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下であることが好ましく、６５０ｎｍ以上７００ｎｍ以下がより好ましく、７００ｎｍであることがさらに好ましい。
上記範囲の波長の光を宿主細胞に照射することによって、ウイルス産生量を従来の製造方法よりも２倍以上４倍以下増加させることができ、ヒト１人分以上２人分以下のウイルスワクチンを得ることができる。これは、光の照射により、細胞が機能変化することで、ウイルス産生量が増加したためであると考えられる。
なお、本明細書において、「細胞の機能変化」とは、合成が誘導されるＤＮＡ及びＲＮＡが変わり、細胞におけるタンパク質組成、脂質成分が変化することで、例えば、細胞増殖が促進又は抑制されることや、細胞での生理活性物質の分泌が促進又は抑制されること等を意味する。
【００１８】
光を照射するタイミングとしては、特別な限定はなく、例えば、鳥類の受精卵（分割期胚も含む。）を用いる場合においては、受精直後から漿尿膜が形成されるまでに光を照射することが好ましい。具体的には、例えば、受精から０日以上８日未満に光を照射すればよい。
光を照射する時間としては、短時間の照射でよく、また、光の出力強度によって適宜調整すればよく、例えば３秒以上１０秒未満でよく、例えば５秒程度でよい。
光の出力強度としては、例えば、宿主細胞１個当たり１０ｍＷ以上２０ｍＷ以下であればよい。
光を照射する部位としては、宿主細胞全体に万遍なく照射することが好ましい。例えば、鳥類の受精卵（分割期胚も含む。）を用いる場合においては、胚に照射することが好ましい。
【００１９】
光を照射するために使用する装置としては、特別な限定はなく、例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、半導体レーザ（例えば、ＧａＡｓ系、ＧａＡｌＡｓ系、ＧａＩｎＡｓ系等）、Ｈｅ−Ｎｅレーザ等のレーザ；発光ダイオード（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ：ＬＥＤ）等が挙げられる。
【００２０】
（宿主細胞）
本実施形態の製造方法に用いられる宿主細胞としては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。
【００２１】
前記原核細胞としては、例えば、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、より具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２２】
前記酵母としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ等の酵母株が挙げられ、これらに限定されない。
【００２３】
前記動物細胞としては、例えば、ヒト胎児肺線維芽細胞（ヒト正常二倍体細胞）であるＭＲＣ−５細胞、ＭＲＣ−９細胞、及びＷＩ−３８細胞、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、マウスミエローマ細胞、ラットミエローマ細胞、ヒトミエローマ細胞、マウスハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨｍＬｕ−１細胞、及びＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、イヌ腎臓細胞であるＭＤＣＫ細胞、鳥類の受精卵（分割期胚も含む。）、鳥類の胚細胞、ウサギ腎臓細胞であるＲＫ−１３細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ヒト大腸癌細胞株等を挙げることができる。
前記マウスミエローマ細胞としては、例えば、ｐｓ２０細胞、ＮＳＯ細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
前記ラットミエローマ細胞としては、例えば、ＹＢ２／０細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
前記ヒト胎児腎臓細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等が挙げられ、これらに限定されない。
前記ヒト白血病細胞としては、例えば、ＢＡＬＬ−１細胞、ＨＥＬ細胞、ＨＢＴ５６３７細胞（参考文献：特開昭６３−２９９号公報。）等が挙げられ、これらに限定されない。
前記アフリカミドリザル腎臓細胞としては、例えば、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１、ＣＲＬ−１５８７等）等が挙げられ、これらに限定されない。
前記ヒト大腸癌細胞株としては、例えば、ＨＣＴ−１５細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２４】
前記鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、ガチョウ、アヒル等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２５】
前記植物細胞としては、例えば、タバコ属の植物、シロイヌナズナ、トウモロコシ、イネ、藻類、アオウキクサ、キノコ等の植物由来の細胞が挙げられ、これらに限定されない。
前記タバコ属の植物由来の細胞としては、例えば、ＢＹ−２細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
前記イネ由来の細胞としては、例えば、Ｏｃ細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
前記シロイヌナズナ由来の細胞としては、例えば、Ｔ８７細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２６】
前記昆虫細胞としては、例えば、イラクサギンウワバ由来細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳＦ−９細胞、及びＳＦ−２１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５細胞、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、カイコ卵巣由来の培養細胞であるＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ  Ｎ４細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２７】
中でも、本実施形態の製造方法において用いられる宿主細胞としては、鳥類の受精卵であることが好ましく、ニワトリの受精卵であることがより好ましい。鳥類の受精卵を用いることで、従来の孵化鶏卵培養法を用いて、ウイルスワクチンを製造することができる。
【００２８】
光照射後の宿主細胞は、例えば２日以上１０日以下培養すればよい。より具体的には、宿主細胞が鳥類の受精卵である場合、光照射後の鳥類の受精卵を例えば８日以上１０日以下培養すればよい。
【００２９】
（細胞培養用培地）
宿主細胞の培養に用いられる細胞培養用培地としては、宿主細胞の培養に適した組成であればよく、栄養源として利用し得る炭素源、窒素源、ビタミン類、無機塩類等を含有するものであればよい。
細胞培養用培地に含まれる炭素源としては、例えば、デンプン、グリコーゲン等の多糖類；ラフィノース、スタキオース等の少糖類；スクロース、マルトース等の二糖類；六炭糖（例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等のアルドヘキソース；プリコース、フルクトース、ソルボース、タガロース等のケトヘキトース；フコース、フクロース、ラムノース等のデオキシ糖等）、五炭糖（例えば、リブロース、キシルロース等のケトペントース；リボース、アルビノース、キシロース、リキロース等のアルドペントース等）等の単糖類等；エタノール、プロパノール等のアルコール類等が挙げられる。これらの炭素源を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる炭素源の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上１５００ｍｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３０】
また、細胞培養用培地に含まれる窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩；ペプトン、酵母エキス、カゼイン加水分解物；Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等のアミノ酸類等が挙げられる。これらの窒素源を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる窒素源の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上１５００ｍｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３１】
また、細胞培養用培地に含まれるビタミン類としては、例えば、Ｄ−ビオチン、フォリニック酸、ＤＬ−α−リポ酸、ニコチンアミド、Ｄ−パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビンン、チアミン、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アデニン、コリン、ｍｙｏ−イノシトール、プトレッシン、ピルビン酸、チミジン等が挙げられる。これらのビタミン類を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれるビタミン類の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．５μｇ／ｍＬ以上１５０ｍｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３２】
また、細胞培養用培地に含まれる無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等、及びこれらの塩等が挙げられる。これらの無機塩を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる無機塩の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．０５μｇ／ｍＬ以上１００００ｍｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３３】
より具体的には、宿主細胞が原核細胞である場合における細胞培養用培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。
宿主細胞が酵母である場合における細胞培養用培地としては、例えば、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地、ＹＰＡＤ培地、ＹＰＥＤ培地等が挙げられる。
【００３４】
宿主細胞が動物細胞である場合における細胞培養用培地としては、例えば、最小基本培地（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ：ＭＥＭ）、イーグル最小基本培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ）、改変イーグルダルベッコ最小基本培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ）、改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ウエイマウス培地、Ｍ１９９培地、ＩＭＥＭ培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＩＴＣ５７−１培地等が挙げられる。
【００３５】
宿主細胞が植物細胞である場合における細胞培養用培地としては、例えば、ムラシゲ・スクーグ培地（ＭＳ培地）（参考文献：Murashige and Skoog, Phyiol.Plant., vol.15,p473-496, 1962.）等が挙げられる。
宿主細胞が昆虫細胞である場合における細胞培養用培地としては、例えば、ＴＮＭ−ＦＨ培地（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ-９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）等が挙げられる。
【００３６】
細胞培養用培地は、さらに、使用する宿主細胞の種類に応じて、以下に例示する血清、成長因子、ホルモン、抗生物質等のその他の添加物を含有していてもよい。
【００３７】
細胞培養用培地に含まれる血清としては、例えば、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）；Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ））等が挙げられる。細胞培養用培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下であればよい。
【００３８】
細胞培養用培地に含まれる成長因子としては、例えば、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、内皮細胞成長因子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＣＧＦ）、内皮細胞増殖因子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：ＥＣＧＳ）、内皮細胞由来成長因子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＣＤＧＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００３９】
細胞培養用培地に含まれるホルモンとしては、例えば、インシュリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００４０】
細胞培養用培地に含まれる抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常、細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００４１】
（培養条件）
また、宿主細胞の培養条件としては、例えば、静置培養、振盪培養、又は攪拌培養等、使用する宿主細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。
培養温度は、例えば３４℃以上３７℃以下であればよい。
また、培養環境は、例えば、約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
【００４２】
本実施形態の製造方法において、光照射工程の後に、公知のウイルスワクチンの製造方法に基づき、感染工程、増殖工程、及び精製工程等を備えていてもよい。
【００４３】
＜感染工程＞
次いで、光照射工程後の宿主細胞にウイルスを接種し、感染させる。
【００４４】
本実施形態の感染工程において用いられるウイルスとしては、ウイルスワクチンを必要とする病原性を有するウイルスである。前記ウイルスとしては、ＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれかをゲノムとして有するウイルスであって、例えば、アデノウイルス科、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ等）、トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス等）、コロナウイルス科、フラビウイルス科（例えば、日本脳炎ウイルス等）、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス等）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス等）、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス等）、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、バキュロウイルス科、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス等）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス等）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス等）等に属するウイルス等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、本実施形態の製造方法は、オルトミクソウイルス科に属するウイルス、特にインフルエンザウイルスに対するワクチンの製造に用いられることが好ましい。
【００４５】
本明細書において、「インフルエンザウイルス」としては、あらゆるインフルエンザウイルスを含み、特にヒト、トリ、ウマ、ブタ、及びネコの各インフルエンザウイルスを意味する。インフルエンザウイルスとしては、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型が挙げられる。中でも、本実施形態の製造方法の対象となるインフルエンザウイルスはＡ型であることが好ましい。
Ａ型インフルエンザウイルスとしては、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ４Ｎ２株、Ｈ４Ｎ６株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株、Ｈ９Ｎ２株等が挙げられる。
Ｈ１Ｎ１株の具体例としては、Ａ／ポルトリコ／８／３４（Ａ／ＰＲ／８／３４）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９、Ａ／北京／２６２／９５、Ａ／ヨハネスブルグ／２８２／９６、Ａ／テキサス／３６／９１、Ａ／カリフォルニア／９６９／０９  Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｓｏｖ等が挙げられる。
Ｈ３Ｎ２株の具体例としては、Ａ／パナマ／２００７／９９、Ａ／モスクワ／１０／９９、Ａ／ヨハネスブルグ／３３／９４等が挙げられる。
Ｂ型インフルエンザウイルスとしては、例えば、Ｂ／ポルトリコ／８／３４、Ｂ／ヨハネスブルグ／５／９９、Ｂ／ウィーン／１／９９、Ｂ／アナーバー／１／８６、Ｂ／メンフィス／１／９３、Ｂ／ハルビン／７／９４、Ｎ／山東／７／９７、Ｂ／香港／３３０／０１、Ｂ／山梨／１６６／９８型等が挙げられる。
由来を問わず全てのインフルエンザウイルスが本実施形態の対象ではあるが、本実施形態の製造方法は、ヒトインフルエンザウイルス、特にヒト個体群で循環するインフルエンザウイルスに対するワクチンの製造に用いられることが有益である。
【００４６】
宿主細胞にウイルスを接種し、感染させる方法としては、例えば、予めウイルスを細胞培養用培地に混合し、培地交換の際に、宿主細胞に前記ウイルス含有細胞培養用培地を添加する方法を用いてもよい。
細胞へのウイルス接種は、使用する培地や、ウイルス及び細胞の種類によって異なるが、感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）が、例えば０．０００１以上０．１以下であればよい。
感染工程において用いられる細胞培養用培地としては、上述の＜光照射工程＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、感染工程において用いられる細胞培養用培地は、無血清又は低蛋白濃度の細胞培養用培地であることが好ましい。無血清又は低蛋白濃度の細胞培養用培地であることにより、除去すべき不純物質が少なくなるために精製が容易となり、また、血清由来の未知の病原体が混入する可能性を排除できる。
【００４７】
または、例えば、鳥類の受精卵を宿主細胞として使用する場合、受精卵（孵化卵）の中の漿尿膜腔内にウイルスを接種して、感染させる方法を用いてもよい。細胞へのウイルスの接種量は、受精卵１個に対して、例えば１０３ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）以上１０４ＰＦＵ以下であればよい。
【００４８】
＜増殖工程＞
次いで、感染工程後の宿主細胞を培養し、宿主細胞内で前記ウイルスを増殖させる。
増殖工程において用いられる細胞培養用培地としては、上述の＜光照射工程＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、増殖工程において用いられる細胞培養用培地は、無血清又は低蛋白濃度の細胞培養用培地であることが好ましい。無血清又は低蛋白濃度の細胞培養用培地であることにより、除去すべき不純物質が少なくなるために精製が容易となり、また、血清由来の未知の病原体が混入する可能性を排除できる。
【００４９】
また、増殖工程における宿主細胞の培養条件としては、例えば、静置培養、振盪培養、又は攪拌培養等、使用する宿主細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。
培養温度は、例えば３４℃以上３７℃以下であればよい。
また、培養環境は、例えば、約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
【００５０】
また、例えば、鳥類の受精卵を宿主細胞として用いた場合では、細胞培養用培地は必要とせず、鳥類の受精卵を市販の孵化器を用いて温めればよい。温度は、例えば３０℃以上３９℃以下に設定すればよく、湿度は、例えば５０％以上６０％以上に設定すればよい。
【００５１】
＜精製工程＞
次いで、増殖工程後の宿主細胞からウイルスを抽出し、精製する。
【００５２】
ウイルスの精製方法としては、例えば、以下のような方法が挙げられる。
増殖工程後の培養物、すなわち、細胞の破砕液、及び培養上清には大量のウイルスが含まれるため、まず培養物から細胞溶解処理によってウイルスを抽出し、例えば、ポリエチレングリコール塩析法、超遠心法、クロロホルム分別法、核酸分解処理、ゲルクロマトグラフィー等を行い、ウイルスを高度に精製する。
【００５３】
または、例えば、鳥類の受精卵を宿主細胞として用いた場合では、以下のような方法が挙げられる。
まず、増殖工程後の鳥類の受精卵から尿膜腔液をとり、ゾーナル遠心機を用いたショ糖密度勾配遠心法により精製濃縮する。次いで、得られたウイルス濃縮液にエーテルを加えてウイルス粒子を分解し脂質等を除き、ＨＡ分画浮遊液を採取する。
【００５４】
＜無毒化又は不活化工程＞
さらに、精製工程の前、又は精製工程の後に、ウイルスの無毒化、又は不活化を行う無毒化又は不活化工程を備えていてもよい。
なお、本明細書において、「無毒化」とは、ウイルスが有する菌体外毒素や蛇毒等の毒性をほとんど無毒にすることを意味し、トキソイド化ともいわれる。無毒化は、例えば、ホルマリン等の化学薬品での処理によって達成される。
また、本明細書において、「不活性化」とは、ゲノムが不活化されることを意味する。不活化されたウイルスは、複製欠損である。不活化されたウイルスは、細胞融合能を通常保持するが、ウイルスが有していた病原性は消失していることが好ましい。不活化は、例えば、紫外線照射、Ｘ線照射、電子線照射、γ線照射、アルキル化剤での処理によって達成される。
【００５５】
本明細書において「アルキル化」とは、有機化合物の水素原子をアルキル基で置換する作用を有すことを意味し、「アルキル化剤」（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）とは、アルキル基を与える化合物をいう。アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アルキル、 硫酸ジアルキル、スルホン酸アルキル、アルキル亜鉛等の有機金属化合物が挙げられる。アルキル化剤としてより具体的は、例えば、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５６】
ウイルスを無毒化する方法としては、例えば、以下のような方法が挙げられる。
精製されたウイルス抗原液に０．０８％ホルマリンを添加し、４℃前後で１ヶ月以上静置することで、無毒化されたウイルス抗原液が得られる。
【００５７】
ウイルスを不活化する方法としては、例えば、以下のような方法が挙げられる。
精製されたウイルス抗原液に１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ（０．０１％  β−プリピオラクトン含有）を添加し、氷上で６０分間インキュベートし、次いで、３７℃で２時間インキュベートする。次いで、チューブに移し、遠心分離を行うことで、不活性化されたウイルス抗原を沈殿として得られる。
【００５８】
＜製剤化工程＞
無毒化、又は不活化された精製ウイルス抗原液は、薬学的に受容可能なキャリア等と混合し、製剤化したワクチンを製造すればよい。
【００５９】
ワクチンの製剤化において用いられる薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤、薬学的アジュバント等が挙げられ、これらに限定されない。代表的には、ワクチンは、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤、又は希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。
【００６０】
一般に、「アジュバンド」とは、薬物の作用を増強する目的で併用される物質及び成分の総称であって、本明細書においては、抗原抗体反応を活性化させる非特異的免疫賦活剤を意味する。アジュバントとしては、沈降性アジュバントと油性アジュバントとに大別される。
【００６１】
沈降性アジュバントとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。
油性アジュバントとしては、例えば、流動パラフィン、ラノリン、フロイント、不完全フロイントアジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ：ＩＦＡ）（パラフィンとアラセルとの混合物)、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ：ＣＦＡ）（ＩＦＡに死滅したミコバクテリア又は結核菌の死菌を加え、抗原性をさらに増強させたもの）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６２】
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、本実施形態の製造方法により得られるウイルス抗原の生体内安定性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、例えば、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質等が挙げられる。
【００６３】
本実施形態の製造方法により得られるウイルス抗原の製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００６４】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００６５】
本実施形態の製造方法により得られるワクチンが注射剤である場合、無菌組成物は、例えば、注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。また、注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤（例えば、アルコール（具体的には、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等））、又は非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等）と併用してもよい。
【００６６】
また、油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、又は酸化防止剤をさらに配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００６７】
また、注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類等）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００６８】
（ワクチンの投与方法）
ワクチンの投与方法としては、経口投与であってもよく、非経口投与であってもよい。非経口投与方法としては、例えば、局所、動脈内（例えば、頚動脈を介する投与方法）、筋肉内、皮下的、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻孔内等からの投与が挙げられる。
本実施形態の製造方法により得られるワクチンの投与方法は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。中でも、好ましい非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、又は腹腔内の投与である。
【００６９】
（ワクチンの投与量）
本実施形態の製造方法により得られるワクチンの１回の投与量は、投与の目的により、または、感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて、適宜選択することができる。
例えば、再感染により惹起される疾患の治療を目的とする場合、本実施形態の製造方法により得られるワクチンの投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１ｎｇ以上１０ｍｇ以下であることが好ましく、０．１ｎｇ以上１ｍｇ以下であることがより好ましい。
【００７０】
（ワクチンの投与回数）
本実施形態の製造方法により得られるワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なり、例えば、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与すればよい。より具体的には、例えば１週間以上４週間以下の間隔で、例えば１回以上２回以下投与すればよい。また、疾患症候学、又は抗体価を用いる基本的な検査により、疾患の状態をモニターしながら投与回数（投与時間）を決定することが好ましい。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７２】
［実施例１］
（１）光照射工程
まず、受精０日目のニワトリ受精卵（Ｎ＝５０個）の胚に、ＬＥＤ照射器を用いて、６００ｎｍの波長の光を５秒間照射した。ネガティブコントロールとして、光を照射していないものも準備した。その後、８日間３７℃で培養した。なお、Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ実験を行った際に、光照射後８日間培養した受精卵と光照射後１０日間培養した受精卵とでのウイルス増殖量（ＨＡ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ法を用いて測定。）は同じであった。そのため、今回は光照射後、受精卵を８日間培養した。
【００７３】
（２）感染工程
次いで、受精卵の気質の部分からツベルクリン注射器で１００μＬのウイルス溶液を注入した。また、コントロールとして、ウイルスを感染させていないものも準備した。
【００７４】
（３）増殖工程
次いで、ニワトリ孵化器を用いて、３７℃で１日間培養しウイルスを増殖させた。なお、一般的には、４８時間培養であるが、２４〜４８時間培養は培養時間に相関していたため、実験時間を短縮することを目的として、２４時間培養で検討した。
【００７５】
（４）ウイルス粒子の検出
次いで、培養後の各ニワトリ受精卵から漿尿液を採取し、９６ウェルプレートに分注した。次いで、０．５％（Ｖ／Ｖ）ニワトリ赤血球（日本バイオテスト社製）を５０μＬずつ添加し、室温で６０分間反応させた。結果を図１に示す。図１について、「−ｖｉｒｕｓ」とは光照射を行い、ウイルスを感染させていないニワトリ受精卵由来の漿尿液を用いたものを示し、「−Ｌａｓｅｒ」とは光照射を行わず、ウイルスを感染させたニワトリ受精卵由来の漿尿液を用いたものを示し、「６００ｎｍ」とは６００ｎｍの光照射を行い、ウイルスを感染させたニワトリ受精卵由来の漿尿液を用いたものを示す。また、「−Ｌａｓｅｒ」とは２行目の黒い線で囲われたウェルであり、「６００ｎｍ」とは３行目の黒い線で囲われたウェルであり、「−ｖｉｒｕｓ」は上記以外の全てのウェルである。
【００７６】
図１から、６００ｎｍの光照射を行い、ウイルス感染を行ったニワトリ受精卵由来の漿尿液を用いたものにおいて、光照射を行わず、ウイルスを感染させていないニワトリ受精卵由来の漿尿液を用いたもの及び光照射を行わず、ウイルスを感染させたニワトリ受精卵由来の漿尿液を用いたものと比較して、大きな赤血球の凝集体が検出された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明によれば、従来よりも１回の製造で大量のウイルスワクチンを得ることができる。
【図１】
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