(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、液体クロマトグラフィーによる生体試料の分析において、生体試料中の脂質やタンパク質が分析カラム内で非特異的吸着することで生じる凝集物をカラム内に留まることなく流出させることを促進し、カラムの寿命を向上させることが可能なカラムフィルターを提供することにある。【解決手段】  最小粒径が３０μｍ以上であり、最大粒径が５０μｍ以下の粒子径を有する球形粉体を焼結し、粒子が球状粒子のまま維持されたことを特徴とする焼結体で構成される、厚さ１．５ｍｍ以上の液体クロマトグラフィー用カラムフィルター。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
最小粒径が３０μｍ以上であり、最大粒径が５０μｍ以下の粒子径を有する球形粉体を焼結し、粒子が球状粒子のまま維持されたことを特徴とする焼結体で構成される、厚さ１．５ｍｍ以上の液体クロマトグラフィー用カラムフィルター。
【請求項２】
送液方向の出口側のカラムフィルターが請求項１のカラムフィルターであることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、球形粉体で構成される焼結体であることを特徴とするカラムフィルターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーによる分析では、カラム充填剤をカラム外に流出させないためにカラムフィルターを設けることがある。生体試料を測定対象とする液体クロマトグラフィー用カラムフィルターは、試料に対してある程度不活性であるステンレス鋼製のフィルターが用いられている。
【０００３】
このようなステンレス鋼製フィルターの具体例として、ステンレス鋼製の短繊維または微粉末を高温、高圧下で焼結したものが用いられる。従来のステンレス鋼製フィルターは、短繊維または微紛体等の大きさや形が厳密に一定ではない異形粉体を用いていたが、一定の単位構造を有していないため、カラム出口側でカラム充填剤以外の物質が蓄積し凝集することにつながっていた。
【０００４】
また、球形金属粉体を焼結させたものを用いたフィルターについても提案されているが（例えば、特許文献１〜３参照）、カラム充填剤の粒径が十分に考慮されておらず、使用する金属粉体の平均粒径としては適切な範囲ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−８９７３１号公報
【特許文献２】特開平１０−２３７５０４号公報
【特許文献３】特開２００４−１９５４６４公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、液体クロマトグラフィーによる生体試料の分析において、生体試料中の脂質やタンパク質が分析カラム内で非特異的吸着することで生じる凝集物をカラム内に留まることなく流出させることを促進し、カラムの寿命を向上させることが可能なカラムフィルターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意検討を行った結果、球形粉体より形成された焼結体からなる球形粉焼結フィルターを用いることで、圧力上昇に伴うカラムの耐久性悪化を抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【０００９】
本発明は、最小粒径が３０μｍ以上であり、最大粒径が５０μｍ以下の粒子径を有する球形粉体を焼結し、粒子が球状粒子のまま維持されたことを特徴とする焼結体で構成される、厚さ１．５ｍｍ以上の液体クロマトグラフィー用カラムフィルターに関するものである。
【００１０】
最小粒径が３０μｍ以上であり、最大粒径が５０μｍ以下の粒子径を有する球形粉体は、粒径が３０〜５０μｍの範囲内に分級された粉末を使用すれば問題ない。最小粒径が３０μｍ以上とは、カラム充填物の粒径の６〜１２倍程度であることを想定しており、最大粒径が５０μｍ以下とはカラム充填剤の１０〜２０倍程度であることを想定している。本発明の効果は、カラム充填剤の粒子径によらず、カラム圧力上昇の抑制に期待できるが、通常、カラム充填剤の粒子径が小さいカラムで圧力上昇が問題となることから、カラム充填剤の粒子径が５μｍ以下のカラムで大きな効果を期待できる。
【００１１】
本発明は、粒子が球状粒子のまま維持されたことを特徴とする焼結体で構成される必要があるが、その焼結方法は粒子が球状粒子のまま維持される方法であれば特に制限はなく、例えば容器内に無加圧で充填保持し、不活性ガスまたは真空、無加圧下で焼結するような方法で行えば問題ない。
【００１２】
また、本発明は、厚さ１．５ｍｍ以上であることが必要であり、好ましくは１．５ｍｍ以上２．５ｍｍ以下である。厚さ１．５ｍｍ未満であると、外圧からの変形に伴うフィルターの強度不足や、フィルターの性能が低下することによりカラム充填剤の漏れが生じる可能性がある。一方で、厚さが２．５ｍｍを超えるとデッドボリュームが増加し、測定結果の理論段数が低下するなどカラムの性能が低下する傾向がある。
【００１３】
さらに、カラムフィルターの濾過精度は、カラム充填剤の粒子径分布の平均値に対して０．１倍〜１．０倍程度が望ましい。濾過精度が小さすぎると、フィルター自体の圧力損失が大きくなり、またカラムフィルターからの流出効果が期待できないおそれがあり、カラム濾過精度が大きすぎるとカラム充填剤が漏れてしまうおそれがある。
【００１４】
従来の異形粉焼結フィルターは、密度が大きく、図１に示す通り、流路が袋小路状となるものが生じていたため、フィルター自体の圧力損失が大きかった。一方、球形粉焼結フィルターは、球形同士が接するため、濾過精度に比して密度が小さくなり、その単位構造が維持されやすくなるために、図２に示す通り、流路が塞がりにくく、フィルター自体の圧力損失を小さくすることができる。密度が小さくなることで、カラム内に存在する、凝集を伴った不純物を含む各物質はカラム出口側のカラム充填剤とフィルターの接面やカラムフィルター内部に留まることなく流出させることができ、カラムの寿命を向上させることができる。球形粉焼結フィルターはカラムの入口側でも使用可能であるが、本効果は送液方向の出口側（流出側）に適用することが効果的である。
【００１５】
本発明における球形粉体としては、ガラスやエンジニアリングプラスチック樹脂でも適用できるが、上述のような生体試料に対してある程度不活性であり、強度も高い球形金属粉体が好ましく、特にステンレス鋼のものが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】異形粉焼結フィルターの拡大写真を示したものである。
【図２】球形粉焼結フィルターの拡大写真を示したものである。
【図３】カラムおよびカラムフィルターの概略図を示したものである。
【図４】液体クロマトグラフ装置のシステム概要を示したものである。
【図５】図４の装置で得られたクロマトグラムを示したものである。
【図６】検体の注入回数とカラムにかかる圧力の関係を示すグラフを示したものである。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
（実施例１）
直径が３０〜５０μｍの範囲内に分級された粒子径であるステンレス鋼製の球形粉体を焼結させることにより形成された球形粉焼結フィルター（φ３．１ｍｍ×厚さ２．０ｍｍ、濾過精度１μｍ）を株式会社巴製作所より提供を受けた。
【００１９】
この球形粉焼結フィルターを、自動リポ蛋白分析計（東ソー株式会社製、商品名「ＨＬＣ−７２９ＬＰＩＩ」）専用カラムである「ＴＳＫｇｅｌ  Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ−ＡＥＸＩＩ」（東ソー株式会社製）の出口側カラムフィルターに適用した。
【００２０】
この「ＨＬＣ−７２９ＬＰＩＩ」は、陰イオン交換クロマトグラフィー法を原理として、血清中のリポ蛋白を高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）を含む５つのリポ蛋白に１検体あたり５．２分で分離測定することができる。カラムとカラムフィルターの概略図を図３に示す。流入側のカラムフィルター（００２）として異形粉焼結フィルター、流出側のカラムフィルター（００４）として球形粉焼結フィルターを適用した。その両者の間にカラム充填剤（００３）があり、各フィルターはテフロン製のスリーブ（００１）にはめられている。カラム両端には、システムと結ぶ送液ライン（００５）が接続されている。システム概要を図４に示した。「ＴＳＫｇｅｌ  Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ−ＡＥＸＩＩ」は陰イオン交換基であるＤＥＡＥ基を有する粒径２．５μｍを中心値とする充填剤を有する陰イオン交換カラムである。溶出液として、上記装置専用溶離液である溶離液第１液（１００）（Ｔｒｉｓ緩衝液）、溶離液第２液（１０１）（Ｔｒｉｓ緩衝液、２５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム）、溶離液第３液（１０２）（Ｔｒｉｓ緩衝液、４００ｍＭ過塩素酸ナトリウム）を用いる。それぞれの溶離液に対応したポンプ（１０３、１０４および１０５）による塩濃度を変化させたステップグラジエントにより送液され、ミキサー（１０６）で混合され、カラムフィルター（１０９）を有する陰イオン交換カラム（１０８）で分離溶出し、リポ蛋白を分画する。測定試料は血清を用いて、サンプラー（１０７）で自動注入した。分離された各リポ蛋白はコレステロール反応液（１１０）、および反応液ポンプ（１１１）によりコレステロール染色され、検出器（１１２）において５９０ｎｍの波長で検出した。また、ポンプ・カラム間に圧力センサー（１１３）を設けた。このシステムにより得られたクロマトグラム例を図５に示した。ヒト血清中のリポ蛋白であるＨＤＬ（２０１）、ＬＤＬ（２０２）、ＩＤＬ（２０３）、ＶＬＤＬ（２０４）、Ｏｔｈｅｒ（２０５）（ＯｔｈｅｒにはカイロミクロンおよびＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が含まれる）中のコレステロールが測定された。血清試料として健常人のプール検体を用いた。この血清検体を前処理や希釈をすることなく、上記装置により一測定あたり１．０μＬを自動注入した。測定は、１バッチの測定あたり５０〜１００検体の測定を実施し、圧力上昇が顕著に確認されるまで実施した。この測定を同じ方法で製造した３個のカラムで実施した。測定注入回数とカラム圧力｛圧力センサー（１１３）で測定｝の結果を図６に示した。いずれのカラムも４５０検体以上の測定でシステム圧力が１０ＭＰａに達した。
【００２１】
（比較例１）
「ＴＳＫｇｅｌ  Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ−ＡＥＸＩＩ」（東ソー株式会社製）の出口側カラムフィルター以外は実施例１と同様にして測定を行った。出口側フィルターには、ステンレス鋼製の異形粉体を焼結させることにより形成された異形粉焼結フィルター（φ３．５ｍｍ×厚さ１．０ｍｍ、濾過精度１μｍ）を用いた。この異形粉焼結フィルターは株式会社巴製作所より提供を受けた。この測定を同じ方法で製造した３個のカラムで実施した。測定注入回数とカラム圧力｛圧力センサー（１１３）で測定｝の結果を図６に示した。いずれのカラムも３００検体以下の測定でシステム圧力が１０ＭＰａに達した。
【００２２】
実施例１ではいずれのカラムも、比較例１のカラムと比較して圧力上昇がゆるやかになった。これは、実施例１で出口側カラムフィルターとして、ステンレス鋼製の球形粉体を焼結させることにより形成された球形粉焼結フィルターを採用したことで、カラム内部に堆積または凝集した血液由来の物質が、出口側カラムフィルターに留まることなく流出が促進された結果だと示唆された。
【００２３】
（比較例２）
直径が５０〜１００μｍの範囲内に分級された粒子径であるステンレス鋼製の球形粉体を焼結させることにより形成された球形粉焼結フィルター（φ３．１ｍｍ×厚さ２．０ｍｍ、濾過精度２μｍ）を株式会社巴製作所より提供を受けた。
【００２４】
この球形粉焼結フィルターを、自動リポ蛋白分析計（東ソー株式会社製、商品名「ＨＬＣ−７２９ＬＰＩＩ」）専用カラムである「ＴＳＫｇｅｌ  Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ−ＡＥＸＩＩ」（東ソー株式会社製）の出口側カラムフィルターに適用した。陰イオン交換基であるＤＥＡＥ基を有する粒径２．５μｍを中心値とする充填剤をカラムに充填した場合、本実施例ではゲル漏れが発生した。これは、５０μｍ以上の粒子径であるステンレス鋼製の球形粉体を焼結させることにより形成された球形粉焼結フィルターでは、カラム充填剤をカラム外に流出させないことが主な役割であるカラムフィルターの機能が果たされていない結果となった。
【符号の説明】
【００２５】
（００１）  カラムフィルタースリーブ
（００２）  流入側（入口側）の異形粉焼結カラムフィルター
（００３）  カラム充填剤
（００４）  流出側（出口側）の球形粉焼結カラムフィルター
（００５）  送液ライン
（１００）  溶離液１
（１０１）  溶離液２
（１０２）  溶離液３
（１０３）  ポンプ１
（１０４）  ポンプ２
（１０５）  ポンプ３
（１０６）  ミキサー
（１０７）  オートサンプラー
（１０８）  カラム
（１０９）  カラムフィルター
（１１０）  コレステロール反応液
（１１１）  コレステロール反応液を送液するためのポンプ
（１１２）  検出器
（１１３）  圧力センサー
（２０１）  ＨＤＬコレステロールのピーク
（２０２）  ＬＤＬコレステロールのピーク
（２０３）  ＩＤＬコレステロールのピーク
（２０４）  ＶＬＤＬコレステロールのピーク
（２０５）  Ｏｔｈｅｒコレステロールのピーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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