(57)【要約】【課題】バイオフィルムの形成を抑制する効果に優れたバイオフィルム形成抑制用組成物を提供する。【解決手段】ジグリセリンジカプリル酸エステルを油相に含有し、油滴の粒子径がメジアン径で１５μｍ以下であることを特徴とするバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジグリセリンジカプリル酸エステルを油相に含有し、油滴の粒子径がメジアン径で１５μｍ以下であることを特徴とするバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物を含有することを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるバイオフィルムの形成を抑制するために用いる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムとは、細菌やカビ等の微生物が固体や液体の表面に付着することによって形成される微生物集合体であり、様々な環境に存在する。このバイオフィルムと呼ばれる微生物集合体は、日常生活の分野、食品産業の分野及び医療の分野等、各分野において深く関与して多くの問題を引き起こしている。例えば、日常生活の分野においては、台所、浴室、トイレ等の排水口に存在するヌメリもバイオフィルムであり、悪臭の要因となることが指摘されている。食品産業の分野においては、各種配管や各種製造設備等に微生物が付着してバイオフィルムを形成し、微生物汚染の要因になることが指摘されている。医療の分野に関しては、カテーテル内部やコンタクトレンズ、義歯等にバイオフィルムが形成され、感染症を引き起こす要因となることが指摘されている。
【０００３】
特に、義歯の汚れは義歯性口内炎だけでなく口角炎等を引き起こすことも指摘され、更に、バイオフィルムの形成（デンチャープラークの堆積）が助長され、ますます口腔内環境が悪化することも指摘されている。そして、このバイオフィルムには高頻度でカンジダ菌が検出されることが報告されている。
【０００４】
バイオフィルムの形成を抑制する従来技術としては、モノグリセリンモノカプリル酸エステルを含む炭素数７〜１４の飽和脂肪酸残基を有するモノグリセリンモノ脂肪酸エステル、ジグリセリンモノラウリン酸エステルを有効成分とする、カンジダ菌によるバイオフィルムの形成を抑制するためのバイオフィルム抑制剤（特許文献１）が開示されている。しかし、特許文献１の表２から、グリセリルジラウレート（モノグリセリンジ脂肪酸エステル）は、グリセリルモノラウレート（モノグリセリンモノ脂肪酸エステル）と比較してバイオフィルム抑制力が低いこと、即ち、モノグリセリン脂肪酸エステルを構成する脂肪酸が２分子の場合は好ましくないことが知られている。さらには、特許文献１の表２から、ジグリセリルモノカプリレート（ジグリセリンモノカプリル酸エステル）のバイオフィルム抑制力が低いこと、即ちジグリセリン脂肪酸エステルを構成する脂肪酸としてカプリル酸は好ましくないことが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３‐２３１００２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、バイオフィルムの形成を抑制する効果に優れたバイオフィルム形成抑制用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意研究を重ねた結果、ジグリセリンジカプリル酸エステルを油相に含有する水中油型組成物であって、該水中油型組成物中の油滴が微細化されたものが上記課題を解決することを見出した。本発明者は、これらの知見に基づき更に研究を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記の構成を包含する。
［１］ジグリセリンジカプリル酸エステルを油相に含有し、油滴の粒子径がメジアン径で１５μｍ以下であることを特徴とするバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物［２］上記［１］に記載のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物を含有することを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物は、カンジダ菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制する効果に優れている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物は、有効成分として油相にジグリセリンジカプリル酸エステルを含有し、該水中油型組成物中の油滴の粒子径がメジアン径で１５μｍ以下（好ましくは１０μｍ以下）である。該油滴は、少なくともジグリセリンジカプリル酸エステルから構成される。
【００１０】
上記ジグリセリンジカプリル酸エステルは、１分子のジグリセリンと２分子のカプリル酸とがエステル結合したものである。
【００１１】
ジグリセリンジカプリル酸エステルは、ジグリセリンジカプリル酸エステルを含む混合物であってもよく、例えば、ジグリセリンとカプリル酸とのエステル化物が挙げられる。これらは、通常、ジグリセリンジカプリル酸エステルの他に、ジグリセリンモノカプリル酸エステル、ジグリセリントリカプリル酸エステル、ジグリセリンテトラカプリル酸エステル、ジグリセリン、カプリル酸等を含む混合物である。
【００１２】
ジグリセリンジカプリル酸エステルを含む混合物としては、好ましくは、エステル中のジエステル含量が２０％以上であり、より好ましくはジエステル含量が３５％以上である。
【００１３】
ジグリセリンジカプリル酸エステルの原料として用いられるジグリセリンとしては、通常グリセリンに、好ましくは少量の酸又はアルカリを触媒として添加し、窒素又は二酸化炭素等の任意の不活性ガス雰囲気下で、例えば約１８０℃以上の温度で加熱し、重縮合反応させて得られるグリセリンの平均重合度が約１．５〜２．４、好ましくは平均重合度が約２．０のジグリセリン混合物が挙げられる。また、ジグリセリンはグリシドール又はエピクロルヒドリン等を原料として得られるものであっても良い。反応終了後、必要であれば中和、脱塩、脱色等の処理を行ってよい。
【００１４】
本発明においては、上記ジグリセリン混合物を、例えば蒸留又はカラムクロマトグラフィー等を用いる公知方法又は自体公知の方法を用いて精製し、グリセリン２分子からなるジグリセリンを約５０質量％以上、好ましくは約８５質量％以上に高濃度化した高純度ジグリセリンが、好ましく用いられる。
【００１５】
ジグリセリンジカプリル酸エステルの原料として用いられるカプリル酸としては、食用可能な動植物油脂を起源とするものであれば特に制限はないが、純度が５０％以上のものが好ましい。純度が５０％未満であると、本発明のバイオフィルム形成抑制効果が十分に発揮されない虞がある。なお、カプリル酸は、化学合成で得られるものであってもよい。
【００１６】
ジグリセリンジカプリル酸エステルのエステル化反応による製造方法を例示すれば以下の通りである。例えば、撹拌機、加熱用のジャケット又は邪魔板等を備えた通常の反応容器に、ジグリセリンとカプリル酸を約１．０：０．７〜１．０：２．５、のモル比で仕込み、通常触媒として水酸化ナトリウムを加えて撹拌混合し、窒素ガス雰囲気下で、エステル化反応により生成する水を系外に除去しながら、所定温度で加熱する。前記所定温度は通常、約１８０〜２６０℃の範囲、好ましくは約２００〜２５０℃の範囲である。また、反応における圧力条件は減圧下又は常圧下で、反応時間は約０．５〜１５時間、好ましくは約１〜３時間である。反応の終点は、通常反応混合物の酸価を測定し、酸価約３以下を目安とするのが好ましい。得られた反応液は、未反応のカプリル酸、未反応のジグリセリン、ジグリセリンモノカプリル酸エステル、ジグリセリンジカプリル酸エステル、ジグリセリントリカプリル酸エステル及びジグリセリンテトラカプリル酸エステル等を含む混合物である。この混合物を本発明で使用してもよい。
【００１７】
エステル化反応終了後、所望により反応混合物中に残存する触媒を中和してもよい。その際、エステル化反応の温度が約２００℃以上の場合は、液温を約１８０〜２００℃に冷却してから中和処理を行うのが好ましい。中和後、得られた反応混合物を、所望により冷却して、約１００〜１８０℃、好ましくは約１３０〜１５０℃に保ち、好ましくは約０．５時間以上、更に好ましくは約１〜１０時間放置するのが好ましい。未反応のジグリセリンが下層に分離した場合はそれを除去するのが好ましい。
【００１８】
上記処理により得られたジグリセリンジカプリル酸エステルは、ジエステル体の含有量が通常約２０％以上４０％未満のものであるが、所望により、該ジグリセリンジカプリル酸エステルを、例えば流下薄膜式分子蒸留装置又は遠心式分子蒸留装置等を用いて分子蒸留するか、又はカラムクロマトグラフィーもしくは液液抽出等自体公知の方法を用いて精製することにより、全体に対してジエステル体を約５０％以上、好ましくは約７０％以上含むジグリセリンジカプリル酸エステルを得ることもできる。また所望により、蒸留後脱色、脱臭等の処理を行ってよい。
【００１９】
ジグリセリンジカプリル酸エステルは、市販されているものを用いることができ、例えば、ポエムＦＢ‐２８（商品名；理研ビタミン社製  ジエステル含量３８％）が挙げられる。
【００２０】
本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物は、少なくともジグリセリンジカプリル酸エステルが油相を構成し、水性成分が水相として連続相を構成する。該水性成分に特に制限はないが、例えば水及び多価アルコール（即ち、多価アルコール水溶液）を使用することができる。また、本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物が後述する「ジグリセリンジカプリル酸エステル以外の乳化剤」を含有する場合は、水性成分として水を単独で使用することもできる。
【００２１】
上記水としては、飲用可能なものであれば特に制限はなく、例えば蒸留水、イオン交換樹脂処理水、逆浸透膜（ＲＯ）処理水又は限外ろ過膜（ＵＦ）処理水等の精製水、水道水、地下水あるいは涌水等の天然水又はアルカリイオン水等が挙げられる。
【００２２】
上記多価アルコールは、１分子中に２つ以上のヒドロキシ基をもつ化合物であれば特に制限はなく、例えば、キシロース、ブドウ糖、果糖等の単糖類、ショ糖、乳糖、麦芽糖等のオリゴ糖類、デキストリンあるいは水飴等のでん粉分解物、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース等のマルトオリゴ糖類、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖等の異性化糖、蜂蜜等の転化糖、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、還元水飴等の糖アルコール類、グリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール等が挙げられる。これらの中でも、グリセリン及び還元水飴等が好ましく、特にグリセリンが好ましい。これら多価アルコールは、一種類のみを単独で用いてもよく、二種類以上を任意に組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物は、ジグリセリンジカプリル酸エステル以外の乳化剤を含有することができる。該ジグリセリンジカプリル酸エステル以外の乳化剤は、水中油型組成物中に含まれる油滴を微細な状態〔例えば、粒子径（メジアン径）１０μｍ以下、好ましくは５μｍ以下〕で安定に存在させるために用いられる。
【００２４】
ジグリセリンジカプリル酸エステル以外の乳化剤としては、水中油型組成物中に含まれる油滴を微細な状態で安定に存在させる作用を有するものであれば特に制限はないが、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、レシチン又はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。ここで、グリセリン脂肪酸エステルには、グリセリンと脂肪酸のエステルの他、グリセリン酢酸エステル、グリセリン酢酸脂肪酸エステル、グリセリン乳酸脂肪酸エステル、グリセリンクエン酸脂肪酸エステル、グリセリンコハク酸脂肪酸エステル、グリセリンジアセチル酒石酸脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル（但し、ジグリセリンジカプリル酸エステルを除く。以下同じ）及びポリグリセリン縮合リシノール酸エステル等が含まれる。またレシチンには、分別レシチン、酵素分解レシチン及び酵素処理レシチン等が含まれる。これらの中でも、レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びポリグリセリン脂肪酸エステルが好ましい。また、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びポリグリセリン脂肪酸エステルは、アトラス法により計算されたＨＬＢ値（以下、単に「ＨＬＢ」という）が１０以上、好ましくは１１以上、更に好ましくは１３以上のものが好ましい。
【００２５】
本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の製造方法に特に制限はないが、その好ましい製造方法の概略は以下の通りである。
【００２６】
即ち、上記ジグリセリンジカプリル酸エステル及び水性成分（例えば、水及び多価アルコール等）並びに必要に応じてジグリセリンジカプリル酸エステル以外の乳化剤を６５〜９０℃に加熱し、これを撹拌することにより油滴の粒子径がメジアン径で１５μｍ以下（好ましくは１０μｍ以下）となるように乳化又は可溶化し、水中油型組成物とする。次に、必要であれば得られた水中油型組成物を冷却し、本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物を得る。得られた水中油型組成物の性状は乳化剤の濃度等により異なり一様ではないが、液状、ペースト状又はゲル状を呈する。
【００２７】
上記撹拌を実施するための装置としては特に限定されず、例えば、撹拌機、加熱用のジャケット又は邪魔板等を備えた通常の撹拌・混合槽を用いることができる。撹拌機に装備する撹拌翼の形状はプロペラ型、かい十字型、ファンタービン型、ディスクタービン型又はいかり型のいずれでも良いが、好ましくはディスクタービン型又はいかり型である。また、ＴＫホモミクサー（製品名；プライミクス社製）、クレアミックス（製品名；エムテクニック社製）等の高速回転式ホモジナイザーも使用することができる。乳化液の冷却は、前記加熱用のジャケットに水又は冷媒を通すことにより行われるのが好ましい。
【００２８】
また、上記撹拌では、水中油型組成物の油滴を所望の粒子径にするため、撹拌機の回転速度を適宜調整することができる。その回転速度が大きいと油滴の粒子径の小さい水中油型組成物が得られる傾向にある。
【００２９】
本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物１００質量％中のジグリセリンジカプリル酸エステル及び水性成分の配合割合は特に制限されないが、例えばジグリセリンジカプリル酸エステルが１．０〜４０．０質量％、好ましくは５．０〜２０．０質量％であり、残余が水性成分となるように調整するのが好ましい。また、本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物がジグリセリンジカプリル酸エステル以外の乳化剤を含有する場合、その配合割合は、該水中油型組成物１００質量％中、０．１〜２０．０質量％、好ましくは０．５〜１０．０質量％となるように調整するのが好ましい。
【００３０】
本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物は、有害微生物、特にカンジダ菌に由来するバイオフィルムの形成抑制に有効である。対象となるカンジダ菌は特に制限はなく、カンジダ属に属する真菌全般を指し、具体的には例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラシロシス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ等が挙げられる。
【００３１】
バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物を含有するバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物も本発明の形態の１つである。
【００３２】
バイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物としては、本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物を含有する、例えば、練歯磨、液状歯磨、泡状歯磨等の歯磨剤、入歯安定剤、歯肉マッサージクリーム、局所塗布剤、洗口剤、マウスウォッシュ、口中清涼剤、タブレット、口腔用ウエットティッシュ、口腔湿潤用ジェル剤等が挙げられる。バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物を含有するバイオフィルム形成を抑制する食品も本発明の形態の１つである。バイオフィルム形成を抑制する食品としては、本発明のバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物を含有する、例えば、トローチ剤、チューインガム、フィルム状食品等が挙げられる。これらはデンチャープラークの堆積等を防止することができる。
この他、バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物を含有するバイオフィルム形成を抑制する化粧品、医薬部外品、医薬品等も本発明の形態に包含される。
【００３３】
上記したバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれるバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の配合量は、有効成分であるジグリセリンジカプリル酸エステルとして、好ましくは０．０００１〜５．０質量％であり、より好ましくは０．０００５〜１．０質量％である。０．０００１質量％未満であるとバイオフィルム形成抑制効果が不十分である場合があり、５．０質量％を超えると風味に悪影響を与える場合がある。
【００３４】
以下に本発明を実施例で説明するが、これは本発明を単に説明するだけのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３５】
［製造例１：ジグリセリンジカプリル酸エステルの製造］
先ず、撹拌機、温度計、ガス吹込管及び水分離器を取り付けた反応釜にグリセリン２０ｋｇを仕込み、触媒として水酸化ナトリウム２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬを加え、窒素ガス気流中２５０℃で４時間グリセリン縮合反応を行った。得られた反応生成物を約９０℃まで冷却し、リン酸約２０ｇを添加して中和した後ろ過し、ろ液を１６０℃、２５０Ｐａの条件下で減圧蒸留してグリセリンを除き、続いて２００℃、２０Ｐａの高真空条件下で真空蒸留してグリセリン３％、ジグリセリン９２％、トリグリセリン５％を含む留分（ジグリセリン混合物）約３．０ｋｇを得た。次に、留分に対して１質量％の活性炭を加え、減圧下にて脱色処理した後ろ過した。得られたジグリセリンは、水酸基価が約１３５９、平均重合度が約２．０であり、ジグリセリンの含有量は９８質量％であった。
次に、撹拌機、温度計、ガス吹込管及び水分離器を取り付けた５００ｍＬの四つ口フラスコに、上記方法で得たジグリセリン１７６．６ｇ（約１．０６モル）及びカプリル酸（商品名：ＮＡＡ−８２；日油社製）１２３．４ｇ（約０．８６モル）を仕込み、触媒として水酸化ナトリウム１０ｗ／ｖ％水溶液１．５ｍＬを加え、常圧下、窒素ガス気流中、２００℃で１時間エステル化反応した後、更に温度を２３０℃に上げ、酸価１．０以下となるまで約２時間エステル化反応を行った。得られた反応混合物を冷却してジグリセリンジカプリル酸エステル（試作品）約２７０ｇを得た。
【００３６】
上記製造例１により得られたジグリセリンジカプリル酸エステル（試作品）の各形態のエステル含量を表１に示す。なお、各形態のエステル含量の測定方法は、下記方法で行った。
【００３７】
［各形態のエステル含量の測定方法］
ＨＰＬＣを用いてエステル組成分析を行い、定量は絶対検量線法により行った。即ち、データ処理装置によってクロマトグラム上に記録された被検試料の各形態のエステルに相当するピーク面積を測定し、順相系カラムクロマトグラフィーにより精製したモノグリセリンモノステアリン酸エステル、ジグリセリンモノステアリン酸エステル、又はトリグリセリンモノステアリン酸エステルを標準試料として作成した検量線から、被検試料の各形態のエステル含量を求めた。ＨＰＬＣ分析条件を以下に示した。
【００３８】
［ＨＰＬＣ分析条件］
装置          島津高速液体クロマトグラフ
ポンプ（型式：ＬＣ−１０Ａ；島津製作所社製）
カラムオーブン（型式：ＣＴＯ−１０Ａ；島津製作所社製）
データ処理装置（型式：Ｃ−Ｒ７Ａ；島津製作所社製）
カラム        ＧＰＣカラム（型式：ＳＨＯＤＥＸ  ＫＦ−８０２；昭和電工社製）
２本連結
移動相        ＴＨＦ
流量          １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器        ＲＩ検出器（型式：ＲＩＤ−６Ａ；島津製作所社製）
カラム温度    ４０℃
検液注入量    １５μＬ（ｉｎ  ＴＨＦ）
【００３９】
【表１】
2018002641.tif 000002
【００４０】
［バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の製造］
（１）原材料
１）ジグリセリンジカプリル酸エステル（試作品）
２）高純度粉末レシチン（商品名：レシオンＰ；理研ビタミン社製）
３）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（ＨＬＢ１５．０；和光純薬社製）
４）ポリグリセリンオレイン酸エステル（商品名：ポエムＪ−０３８１Ｖ；ＨＬＢ１４．０；理研ビタミン社製）
５）グリセリン（ミヨシ油脂社製）
６）還元水飴（商品名：アマミール；三菱商事フードテック社製）
７）水
【００４１】
（２）バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の配合
上記原材料を用いて作製したバイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の本発明品１〜６及び比較例品（各７０ｇ）の配合組成を表２に示した。
【００４２】
【表２】
2018002641.tif 000003
【００４３】
（３）バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の製造方法
（３−１）本発明品１〜４及び比較例品の製造
表２に示す成分を１００ｍＬ容ビーカーに秤量し、湯浴中で加温した。８０℃に達温後、ＴＫホモミクサー（製品名；プライミクス社製）を用いて７，０００ｒｐｍで５分間撹拌した。撹拌後、加温及び撹拌により蒸発した分の水を補うため加水して重量調整し、本発明品１〜４及び比較例品（各７０ｇ）を得た。
【００４４】
（３−２）本発明品５及び６の製造
ＴＫホモミクサーの回転速度を１０，０００ｒｐｍとしたこと以外は、前記（３−１）と同様に実施し、本発明品５及び６（各７０ｇ）を得た。
【００４５】
（４）バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の粒子径測定
６００ｎｍにおける透過率が８０〜９０％となるよう、０．１ｇ〜０．５ｇの本発明品１〜６及び比較例品をそれぞれ水１００ｍＬに分散させて得た液をレーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ−９５０（堀場製作所社製）を用いて粒子径（メジアン径）を測定した。結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2018002641.tif 000004
【００４７】
［バイオフィルム形成抑制効果の評価］
バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の本発明品１〜６及び比較例品のそれぞれを用いて、供試菌（カンジダ・アルビカンス  ＮＢＲＣ  １５９４株）に由来するバイオフィルムの形成抑制効果の評価を行った。
（１）供試菌液の調整
１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したポテトデキストロース寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）を滅菌済みシャーレにて加えて固化し、寒天平板を作製した。凍結保存品の供試菌をこの寒天平板に塗抹して、３０℃にて２日間培養した。２％グルコース含有酵母ニトロゲンベース（ＤＩＦＣＯ社製）を１０倍希釈し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した培地２０ｍｌをバッフル付き三角フラスコに分注し、上記寒天培地で培養した供試菌を一白金耳取り植菌した。その後、３０℃、１５０ｒｐｍにて２４時間撹拌培養し、前培養液とした。次いで、遠心分離（４７００ｒｐｍ、１０分、２０℃）をおこない集菌した。集菌した菌を生理食塩水２０ｍｌを用いて洗浄し、再び遠心分離（４７００ｒｐｍ、１０分、２０℃）をおこない集菌した。集菌した菌をサブローブドウ糖培地（ペプトン１．０質量％、ブドウ糖４．０質量％を含み、１規定の塩酸を用いてｐＨ５．７に調整した液体培地。以下、「ＳＧ培地」という。）１０ｍｌに加え、再懸濁した。この再懸濁液をＳＧ培地で２０倍希釈したものを供試菌液として用いた。供試菌液中の菌数は、３．２×１０６個／ｍｌであった。
【００４８】
（２）バイオフィルム形成方法
バイオフィルム形成抑制用水中油型組成物の本発明品１〜６及び比較例品を被験試料とし、各被験試料を水で溶解して被験試料液とし、該被験試料液２μＬ、供試菌液１９８μＬを、９６穴マイクロプレート（商品名：ＴＣプレート９６ｗｅｌｌ（Ｃｅｌｌ＋）；ザルスタット社製）の各ウェル（穴）に加えた。なお、被験試料液中の被験試料濃度は、供試菌液と加えた際の濃度、即ち各ウェル中のジグリセリンジカプリル酸エステルの濃度がそれぞれ１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍとなるように調製した。その後、被験試料液及び供試菌液を加えた９６穴マイクロプレートを３０℃、２日間の静置培養を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
また、コントロール（被験試料無添加）として、被験試料液２μＬと供試菌液１９８μＬをウェルに加えるのに替えて、被験試料を用いずに水２μＬと供試菌液１９８μＬをウェルに加える以外は同様の操作を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
【００４９】
（３）形成させたバイオフィルムの定量方法
静置培養終了後、各ウェルの被験試料液及び培養液等の液部を除去し、各ウェルの付着物（菌体、分泌物及び沈着物等）をバイオフィルムとし、各ウェルに０．０１質量％のクリスタルバイオレット水溶液（商品名：Ｂｅｃｔｏｎ；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）５０μＬを添加し、バイオフィルムを染色した。次いで、各ウェルから添加したクリスタルバイオレット液を除き、２００μＬの蒸留水で２回洗浄後、エタノール２００μＬを加えて各ウェルからバイオフィルムを染色していたクリスタルバイオレットを溶出させることにより、マイクロプレートに固着したバイオフィルムを定量した。定量方法としては、マイクロプレートリーダー（型式：ＳＨ−９０００Ｌａｂ；ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ社製）を用いて、各ウェルの６００ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）を測定した。
【００５０】
（４）バイオフィルム形成抑制効果の評価方法
コントロールのウェルに形成したバイオフィルムの６００ｎｍにおける吸光度を基準吸光度とし、その数値の時にバイオフィルム形成率１００％とした。それぞれの被験試料の吸光度と基準吸光度と対比してバイオフィルム形成率を計算し、各被験試料のバイオフィルム形成率を縦軸、ジグリセリンジカプリル酸エステルの濃度を横軸とした対数近似曲線グラフを作成した。
上記対数近似曲線のグラフを用い、各ウェルの吸光度が、基準吸光度の５０％に相当するバイオフィルム形成率、すなわちバイオフィルム形成率５０％となるジグリセリンジカプリル酸エステルの濃度（以下、「５０％阻害濃度」という。）を各被験試料について算出した。
被験試料のバイオフィルム形成抑制効果の判定は、被験試料の５０％阻害濃度が２０ｐｐｍ以下の場合にバイオフィルム形成の抑制に優れているとし、被験試料の５０％阻害濃度が２０ｐｐｍを超える場合にバイオフィルム形成の抑制に劣ると判定した。得られた結果を表４に示す。
【００５１】
【表４】
2018002641.tif 000005
【００５２】
表４の結果より、本発明品１〜６は、バイオフィルム形成抑制効果の評価が、いずれも５０％阻害濃度が２０ｐｐｍ以下でありバイオフィルム形成抑制効果に優れていた。
一方、比較例品のバイオフィルム形成抑制効果の評価は５０％阻害濃度が２０ｐｐｍを超えるものでありバイオフィルム形成抑制効果に劣っていた。
【００５３】
［製造例１：タブレットの製造］
下記表５の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後、乾燥させて単発式打錠機にて本発明品１を含有するタブレットを製造した。
【００５４】
【表５】
2018002641.tif 000006
【００５５】
［製造例２：フィルム状食品の製造］
下記表６の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後プラスチックフィルムに展延し乾燥させ、本発明品１を含有するフィルム状食品を製造した。
【００５６】
【表６】
2018002641.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、バイオフィルム形成の抑制が求められる食品及び化粧品産業の分野並びに医療の分野等、各分野において利用することができる。