(57)【要約】【課題】吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置の提供。【解決手段】光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴２１０を吐出させる液滴吐出手段１０と、液滴吐出手段１０から吐出された液滴２１０に光を照射する光照射手段３０と、光を照射された粒子からの発光Ｌ１、Ｌ２をそれぞれ受光する２以上の受光手段４１、４２と、２以上の受光手段４１、４２により受光した各発光Ｌ１、Ｌ２の情報に基づき、液滴２１０に含まれる粒子を計数する粒子計数手段５１とを有する粒子計数装置１００である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、
前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、
前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する２以上の受光手段と、
２以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、
を有することを特徴とする粒子計数装置。
【請求項２】
前記受光手段が、受光面の略法線方向に受光した前記発光の輝度値及び前記発光の前記受光面における形状の情報を得て、
前記粒子計数手段が、前記発光の輝度値に基づいて前記液滴に含まれる前記粒子を計数する第一の計数処理、及び、前記発光の前記受光面における形状の情報に基づいて前記液滴に含まれる前記粒子を計数する第二の計数処理の少なくともいずれかを行う請求項１に記載の粒子計数装置。
【請求項３】
前記粒子計数手段が、前記第一の計数処理を行い、前記粒子を計数できないと判定したとき、前記第二の計数処理を行い、前記粒子を計数する請求項２に記載の粒子計数装置。
【請求項４】
前記粒子計数手段が、前記発光の前記受光面における形状の情報に基づき曲率半径を算出し、所定の範囲内にある前記曲率半径を算出した際の円の中心の個数を前記粒子の個数として計数する前記第二の計数処理を行う請求項２から３のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項５】
２以上の前記受光手段のうち少なくとも１の前記受光手段が、その受光方向が他の前記受光手段の受光方向と略直交方向に位置するように配された請求項１から４のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項６】
前記受光手段が、その受光方向が前記液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配された請求項１から５のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項７】
前記受光手段が、ＣＭＯＳ撮像素子を有するカメラである請求項１から６のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項８】
前記粒子計数手段が、前記粒子の数が０個であると判定したとき、
前記液滴吐出手段が、前記液滴を更に吐出する請求項１から７のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項９】
前記粒子計数手段が、前記粒子の数が所定の数未満であると判定したとき、
前記液滴吐出手段が、前記液滴を更に吐出する請求項１から７のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項１０】
前記粒子計数手段が、前記粒子の数が所定の数であると判定したとき、次工程に移行する請求項１から７のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項１１】
光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、
吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射工程と、
前記光を照射された前記粒子からの発光を２以上の受光手段により受光する受光工程と、
２以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程と、
を含むことを特徴とする粒子計数方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、吐出させた液滴に含まれる粒子を計数する粒子計数装置及び粒子計数方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞をインクジェットにより吐出して組織体を形成する技術の開発が行われている。細胞を代表とする粒子状の物質を含む液滴を吐出する際に、吐出された液滴中の粒子状の物質の数がどの程度含まれているかを受光することが重要である。
【０００３】
このような機能を備えた装置の一例として、液状体に含まれる粒状体の個数を受光する吐出装置を提案されている（例えば、特許文献１参照）。この吐出装置では、吐出装置のキャビティとノズルとの間に設けられた検出部を通過する液状体に含まれる粒子の個数を検出することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための手段としての本発明の粒子計数装置は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する２以上の受光手段と、２以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段とを有する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によると、吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、本発明の粒子計数装置の一例を示す説明図である。
【図２】図２は、図１に示した粒子計数装置における２つの受光手段の位置関係の一例を示す説明図である。
【図３】図３は、図２に示した位置関係とした２つの受光手段により得られる発光の画像の説明図である。
【図４Ａ】図４Ａは、２つの発光が重なる場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の一例を示す説明図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、２つの発光が重なる場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の他の一例を示す説明図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、２つの発光が重なる場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の他の一例を示す説明図である。
【図５Ａ】図５Ａは、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の一例を示す説明図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の他の一例を示す説明図である。
【図６Ａ】図６Ａは、受光手段により受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の一例を示す画像である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、受光手段により受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の他の一例を示す画像である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、受光手段により受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の他の一例を示す画像である。
【図７】図７は、２以上の受光手段により受光された発光の輝度値に基づき粒子の個数を判定する検量線の一例を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの一例を示すフローチャートである。
【図９】図９は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
【図１０】図１０は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
【図１４】図１４は、本発明の粒子計数装置の他の一例を示す説明図である。
【図１５】図１５は、本発明の粒子計数装置の更に他の一例を示す説明図である。
【図１６】図１６は、本発明の粒子計数装置を用いて、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を所定の数にするフローの一例を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、本発明の粒子計数装置を用いて、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を所定の数にするフローの他の一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（粒子計数装置及び粒子計数方法）
本発明の粒子計数装置は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する光照射手段と、光を照射された粒子からの発光を受光する２以上の受光手段と、２以上の受光手段により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する粒子計数手段とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
また、本発明の粒子計数装置における各手段は通信可能に接続されており、粒子計数手段が計数した粒子の数に基づいて液滴吐出手段を制御することが好ましい。更に、本発明の粒子計数装置は、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数した結果に基づいて液滴吐出手段を制御するフィードバックユニットを有することが好ましい。
【０００９】
本発明の粒子計数方法は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、吐出された液滴に光を照射する光照射工程と、光を照射された粒子からの発光を２以上の受光手段により受光する受光工程と、２以上の受光手段により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する粒子計数工程とを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
また、本発明の粒子計数方法は、粒子計数工程で計数した粒子の数に基づいて液滴吐出工程における液滴の吐出を制御する第一のフィードバック工程を含むことが好ましい。更に、本発明の粒子計数方法は、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数した結果に基づいて液滴吐出工程における液滴の吐出を制御する第二のフィードバック工程を含むことが好ましい。
【００１０】
本発明の粒子計数方法は、本発明の粒子計数装置により好適に行うことができる。
以下、本発明の粒子計数装置の説明を通して本発明の粒子計数方法の詳細についても明らかにする。
【００１１】
本発明の粒子計数装置は、特許文献１の吐出装置では、液滴を吐出させる前、すなわち吐出ノズル開口に至る前の液滴に含まれる粒子を計数しているため、実際に吐出させた液滴に含まれる粒子の個数と必ずしも一致せず、粒子の計数精度が低下するという知見に基づくものである。
【００１２】
また、吐出させた液滴に含まれる粒子を計数する場合、本発明の粒子計数装置のように、液滴に光を照射して粒子を発光させ、粒子からの発光に基づき粒子を計数するときには、以下の問題がある。
吐出させた液滴は大気圧などにより球体あるいは楕円体となり、粒子を受光する方向において奥行きをもつため、粒子が重なりやすい。それゆえ、粒子からの発光が重なると粒子が受光しにくくなるという問題がある。また、粒子を受光する方向において奥行きがあることから、受光手段の奥側に存在する粒子からの発光は、液滴を通過する分だけ、屈折や散乱などにより発光の輝度値が減衰するため、受光手段に対する液滴の中の位置に起因して発光の輝度値がばらつきやすいという問題がある。更に、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する場合、光を照射して粒子を発光させると、粒子からの発光が液滴の球面内側に反射してぼやけやすいという問題がある。
本発明の粒子計数装置は、吐出させた液滴に含まれる粒子を計数する場合、これらの問題により、発光の輝度値に基づく検量線を明確に引くことが難しく、粒子の個数を判定することが困難になり、粒子の計数精度が低下するという本発明者らが見出した知見に基づくものである。
【００１３】
＜液滴吐出手段及び液滴吐出工程＞
液滴吐出手段は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる手段である。
液滴吐出工程は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる工程であり、液滴吐出手段により好適に行うことができる。
【００１４】
液滴吐出手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、圧電素子を用いた圧電加圧方式、ヒータを用いたサーマル方式、静電引力によって液を誘導する静電方式、圧電素子を用いたメンブレン振動方式等のインクジェットヘッドなどが挙げられる。これらの中でも、メンブレン振動方式のインクジェットヘッドが好ましい。
メンブレン振動方式のインクジェットヘッドは、振動による慣性力で液滴を吐出する方式であり、インクジェットヘッドの上部を大気解放することが可能であるため、特に粒子が細胞である場合、細胞に対する熱、電場、圧力などのダメージを低減できる。
メンブレン振動方式のインクジェットヘッドに用いる圧電素子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）を用いた素子が好ましい。
【００１５】
発光可能な粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光タンパク質を発現する細胞、蛍光色素により染色された染色細胞、蛍光色素により染色された無機微粒子、蛍光色素により染色された有機ポリマー粒子などが挙げられる。
【００１６】
蛍光色素により染色された有機ポリマー粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＰＨＥＲＯ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ベイバイオサイエンス株式会社製、１％（ｗ／ｖ）、直径１０μｍ〜１４μｍ）などが挙げられる。
蛍光タンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ；Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ；Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。
染色細胞における蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルトラッカーオレンジ、セルトラッカーレッドなどが挙げられる。
【００１７】
なお、粒子が凝集する場合、液滴吐出手段に充填する粒子を含む懸濁液の粒子の濃度を調整することにより、懸濁液中の粒子の濃度と、懸濁液中の粒子の個数とがポアソン分布に従う理論から、懸濁液中の粒子の個数を数個以下に調整することができる。
懸濁液の液成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン交換水などが挙げられる。
液滴の直径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２５μｍ以上１５０μｍ以下が好ましい。液滴の直径が２５μｍ以上であれば、液滴の径が小さくなく、内包する粒子の直径が小さいものだけになりにくく、適用できる粒子の種類が少なくなりにくい。１５０μｍ以下であれば、液滴としては問題なく、液滴を吐出するためには、インクジェットヘッドの穴径を大きくする必要もなく、液滴の吐出が不安定となりにくい。
また、液滴の直径をＲとし、粒子の直径をｒとすると、Ｒ＞３ｒであることが好ましい。Ｒ＞３ｒであると、粒子の直径が液滴の直径に対して大きくないため、液滴の縁の影響を受けにくく、粒子の計数精度が低下しにくい。
【００１８】
＜光照射手段及び光照射工程＞
光照射手段は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。
光照射工程は、吐出された液滴に光を照射する工程であり、光照射手段により好適に行うことができる。
【００１９】
光照射手段としては、液滴吐出手段による液滴の吐出に同期して光を照射できることが好ましい。これにより、液滴吐出手段から吐出された液滴に、光をより確実に照射することができる。
ここで、同期するとは、前記液滴が吐出されて所定位置に達したときに前記光照射手段が前記光を照射することを意味する。つまり、前記光照射手段は、前記液滴吐出手段による前記液滴の吐出に対して、所定時間だけ遅延して前記光を照射する。
【００２０】
光照射手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザーなどが挙げられる。
固体レーザーとしては、例えば、ＹＡＧレーザー、ルビーレーザー、ガラスレーザーなどが挙げられる。
ＹＡＧレーザーの市販品としては、例えば、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ（スペクトラ・フィジックス株式会社製）などが挙げられる。
これらの中でも、パルス発振によりパルス光を照射できることが好ましい。
【００２１】
パルス光のパルス幅としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。
単位パルスあたりのエネルギーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、集光の有無等の光学系に大きく依存するが、０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【００２２】
＜受光手段及び受光工程＞
受光手段は、光を照射された粒子からの発光を受光する手段である。
受光工程は、光を照射された粒子からの発光を２以上の受光手段により受光する工程であり、受光手段により好適に行うことができる。
【００２３】
本発明の粒子計数装置は、２以上の受光手段を有する。粒子計数装置が２以上の受光手段を有することにより、１の受光手段により発光が重なった状態を受光した場合であっても、他の受光手段により発光が重なっていない状態を受光できていれば、他の受光手段により受光された発光に基づいて、液滴に含まれる粒子を精度よく計数することができる。
【００２４】
光を照射された粒子からの発光は、粒子から全方位に発せられる。このため、２以上の受光手段としては、発光を受光可能な位置に配されれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、それぞれの受光方向とのなす角が０°とならない位置に配されることが好ましい。発光の重なりが少ない状態の情報が得られる点で有利である。
【００２５】
２以上の受光手段のうち少なくとも１の受光手段は、その受光方向が他の受光手段の受光方向と略直交方向に位置するように配されることが好ましい。これにより、１の受光手段及び他の受光手段を用いた場合、１の受光手段及び他の受光手段により受光した情報のうち、いずれかの情報を選択する際に、発光の重なりが少ない状態の情報を選択できる。なお、略直交とは、８０°以上１００°以下を意味する。
【００２６】
上記の２の受光手段以外の受光手段における受光方向としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。受光手段が２以上の場合、２以上の受光手段を同一平面上に位置するように配されるとき、隣り合う受光手段の受光方向がなす角を、３６０°を受光手段の個数で等分した角度になるようにすることが好ましい。例えば、３の受光手段を同一平面上に位置するように配されるときは、隣り合う受光手段の受光方向をそれぞれ１２０°となる位置するように配されることが好ましい。
【００２７】
受光手段は、その受光方向が液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配されることが好ましく、すべての受光手段がその受光方向が液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配されることがより好ましい。これにより、受光手段の位置を調整しやすくすることができ、粒子計数装置の構造が複雑にならない点で有利である。
なお、コントラストを向上するため、光照射手段から出射される光が直接入射しない位置に受光手段を配置することが好ましい。
【００２８】
受光手段としては、受光面の略法線方向に受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を得ることが好ましい。これにより、粒子計数手段は、発光の輝度値に基づいて液滴に含まれる粒子を計数する第一の計数処理、及び、発光の受光面における形状の情報に基づいて液滴に含まれる粒子を計数する第二の計数処理の少なくともいずれかを行うことができるため、粒子の計数精度を向上させることができる。
【００２９】
受光手段としては、液滴吐出手段による液滴の吐出に同期して発光を受光できることが好ましい。これにより、液滴吐出手段から吐出された液滴に、光照射手段から光が照射され、粒子からの発光をより確実に受光することができる。
なお、ここで、同期するとは、例えば、液滴が吐出されて所定位置に達したときに液滴に光が照射され、粒子が発光するタイミングで、受光手段が発光を受光することを意味する。つまり、受光手段は、液滴吐出手段による液滴の吐出、及び光照射手段による光の照射に対して、それぞれ所定時間だけ遅延して発光を検出する。
【００３０】
受光手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１次元素子、２次元素子等を有するカメラなどが挙げられる。これらの中でも、２次元素子を有するカメラが好ましい。受光手段が２次元素子を有するカメラであると、発光の輝度値のみならず、発光の受光面における形状を得やすい点で有利である。
【００３１】
１次元素子としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサなどが挙げられる。これらの中でも、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオードが好ましい。１次元素子が光電子増倍管、アバランシェフォトダイオードであると、高感度な測定が可能となる。
２次元素子としては、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）撮像素子、ゲートＣＣＤなどが挙げられる。
受光手段としては、ＣＭＯＳ撮像素子を有するカメラが好ましい。
ＣＭＯＳ撮像素子を有するカメラの市販品としては、高感度カメラ（ｐｃｏ．ｅｄｇｅ、ｓＣＭＯＳ、株式会社東京インスツルメンツ製）が好ましい。
【００３２】
なお、光照射手段が照射する光と比較して粒子からの発光が弱い場合、受光手段の受光面側に光の波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。フィルタを設置することにより、ノイズの少ない状態で受光手段が発光を受光できる。
フィルタとしては、例えば、光の波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタなどが挙げられる。
【００３３】
前述のように、光照射手段から照射される光は、パルス光が好ましいが、連続発振させた光としてもよい。この場合、吐出された飛翔中の液滴に連続発振させた光が照射されるタイミングで受光手段が発光を受光可能となるように制御することが好ましい。
【００３４】
＜粒子計数手段及び粒子計数工程＞
粒子計数手段は、２以上の受光手段により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する手段である。
粒子計数工程は、２以上の受光手段により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する工程であり、粒子計数手段により好適に行うことができる。
【００３５】
粒子計数手段は、発光の輝度値に基づいて液滴に含まれる粒子を計数する第一の計数処理、及び、発光の受光面における形状の情報に基づいて液滴に含まれる粒子を計数する第二の計数処理の少なくともいずれかを行うことが好ましい。
次に、粒子計数手段が行う第一の計数処理及び第二の計数処理について説明する。
【００３６】
［発光の輝度値に基づいて粒子を計数する第一の計数処理］
発光の輝度値に基づいて粒子を計数する第一の計数処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）少なくとも２の受光手段が受光した発光の輝度値に基づき、あらかじめ取得した検量線を用いて粒子の個数を判定する処理、（２）受光手段が受光した発光の個数のうち最も多い発光の個数を粒子の個数として計数する処理などが挙げられる。
【００３７】
上記（１）の処理では、発光が透過可能な粒子であれば、発光が重なる場合でも、発光の総輝度値により検量線を用いて粒子の個数を判定することができる。発光が透過しない粒子であっても、２以上の受光手段から発光の輝度値を得るため、発光が重なっていない、あるいは発光の重なりが少ない発光の輝度値に基づいて、粒子を計数することができる。
【００３８】
上記（２）の処理では、それぞれの受光手段が受光した発光の輝度値に基づいて、輝度値が所定の範囲内にある発光の個数をそれぞれ求め、求めた発光の個数のうち最も多い発光の個数を粒子の個数として計数することができる。
【００３９】
これらの中でも、上記（１）の処理が好ましい。第一の計数処理が上記（１）の処理であると、粒子の個数を計数する精度が高まる点で有利である。
第一の計数処理を行う場合、受光手段としては、１次元素子を用いてもよく、２次元素子を用いてもよい。
【００４０】
［発光の受光面における形状の情報に基づいて粒子を計数する第二の計数処理］
発光の受光面における形状の情報に基づいて粒子を計数する第二の計数処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（３）発光の受光面における形状の曲率半径を求め、求めた曲率半径のうち所定の範囲内にある曲率半径の中心の個数を粒子の個数として計数する処理、（４）発光の受光面における形状の外周の長さが所定の範囲内にある発光の個数を計数する処理、（５）発光の受光面における形状の外周の変曲点の個数を粒子の個数として計数する処理、（６）発光の受光面における形状の外周の接線の傾きの符号が変わる回数を粒子の個数として計数する処理などが挙げられる。
【００４１】
上記（３）の処理では、曲率半径が所定の範囲より小さい場合、粒子からの発光以外の屈折した光や散乱した光などが受光されているため、曲率半径が所定の範囲より小さい発光は除外する。また、曲率半径が所定の範囲より大きい場合、粒子が液滴の外辺部近傍に存在しているとき、光を照射して粒子を発光させると、粒子からの発光が液滴の球面内側に反射する現象により、液滴の外辺部が発光して見えるため、粒子からの発光ではないと判定して除外する。発光の受光面における形状の情報に基づき算出した曲率半径のうち所定の範囲内にある曲率半径を算出した際の円の中心の個数を粒子の個数として計数することができる。
【００４２】
上記（４）の処理は、上記（３）の処理における曲率半径を発光の受光面における形状の外周の長さに置き換えたものである。
【００４３】
上記（５）の処理では、例えば、２つの発光が重なったときには変曲点の個数が２個になり、３つの発光が重なったときには変曲点の個数が３個になるため、変曲点の個数を粒子の個数として計数することができる。
【００４４】
上記（６）の処理では、例えば、２つの発光が重なったときには接線の傾きの符号が２回変わり、３つの発光が重なったときには接線の傾きの符号が３回変わるため、接線の傾きの符号が変わる回数を粒子の個数として計数することができる。
【００４５】
これらの中でも、上記（３）の処理が好ましい。すなわち、粒子計数手段が、発光の受光面における形状の情報に基づき曲率半径を算出し、所定の範囲内にある曲率半径を算出した際の円の中心の個数を粒子の個数として計数する第二の計数処理を行うことがより好ましい。第二の計数処理が上記（３）の処理であると、粒子が複数であっても計数が容易となり、粒子を計数する精度が高まる点で有利である。
【００４６】
第二の計数処理を行う場合、受光手段としては、２次元素子を用いることが好ましい。受光手段が２次元素子であれば、２次元画像を得やすい点で有利である。
受光手段から得られた２次元画像に基づいて、発光の受光面における形状に基づいて曲率半径を算出するための画像処理を行うソフトウェアを用いてもよい。
画像処理を行うソフトウェアとしては、例えば、ＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所製、オープンソース）などが挙げられる。
【００４７】
［第一の計数処理と第二の計数処理の順序］
第一の計数処理と第二の計数処理の順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、粒子計数手段が、第一の計数処理を行い、粒子を計数できないと判定したとき、第二の計数処理を行い、粒子を計数することが好ましい。
第一の計数処理のほうが第二の計数処理よりも処理速度が速いため、第一の計数処理を先に行う。第一の計数処理の際に、例えば、粒子からの発光が液滴の球面内側に反射する現象のため、発光の輝度値に基づいて検量線により粒子を計数することが困難な場合がある。この場合、あらかじめ検量線に判定不可領域を設けておくことにより、第一の計数処理では粒子を計数できないと判定し、第二の計数処理に切り換えることにより、液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる。
【００４８】
［粒子計数手段による第一のフィードバック工程］
第一のフィードバック工程では、被付着物としてのウェル内に着弾した液滴に含まれる粒子の数を１個にしたい場合、粒子計数手段が、飛翔液滴に含まれる粒子の数が０個であると判定したとき、液滴吐出手段に液滴を更に吐出させるように制御することが好ましい。また、粒子の数が１個ではないと判定した飛翔液滴を被付着物に付着させないようにすることがより好ましい。これにより、被付着物の汚損を防止することができる。更に、粒子の個数が１個以上であると判定した飛翔液滴が被付着物に着弾した後、被付着物に着弾した位置とは別の位置に次の液滴を着弾させるなどの次工程に移行するようにしてもよい。
【００４９】
また、第一のフィードバック工程では、ウェル内に着弾させる液滴に含まれる粒子の数を所定の数にしたい場合、粒子計数手段が、飛翔液滴に含まれる粒子の数が所定の数未満であると判定したとき、液滴吐出手段に液滴を更に吐出させるように制御することが好ましい。また、飛翔液滴に含まれる粒子の数が０個又は所定の数以上であると粒子計数手段が判定したとき、飛翔液滴を被付着物に着弾させないようにすることが好ましい。この点、飛翔液滴に含まれる粒子を計数して液滴吐出手段にフィードバックする工程のほうが、後述する、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数して液滴吐出手段にフィードバックする工程よりも生産性の面で有利である。
なお、液滴吐出手段により所定の回数の液滴を吐出した後に、後述する記憶手段に記憶した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を読み出し、吐出させた各々の液滴に含まれる粒子を計数するようにしてもよい。
【００５０】
粒子計数手段は、本発明の粒子計数装置の各動作を制御するＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）、メインメモリなどを有し、粒子計数装置全体の動作を制御するための制御プログラムに基づいて各種処理を実行する。
【００５１】
＜フィードバックユニット＞
フィードバックユニットは、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数することができ、また、計数した粒子の数に基づいて液滴吐出手段をフィードバック制御することができる。
フィードバックユニットは、撮像手段と、粒子計数手段とを有する。
以下、フィードバックユニットの粒子計数手段と、本発明の粒子計数装置の粒子計数手段とを識別するため、前述の粒子計数装置の粒子計数手段を「第一の粒子計数手段」と称し、フィードバックユニットの粒子計数手段を「第二の粒子計数手段」と称することがある。
【００５２】
撮像手段としては、光照射手段と、ダイクロイックミラーと、対物レンズと、撮像素子と、スキャン部とを有する。
以下、フィードバックユニットの光照射手段と、本発明の粒子計数装置の光照射手段とを識別するため、前述の粒子計数装置の光照射手段を「第一の光照射手段」と称し、フィードバックユニットの光照射手段を「第二の光照射手段」と称することがある。
【００５３】
撮像手段には、着弾した液滴を観察可能な位置に対物レンズが設置されている。撮像手段の第二の光照射手段から発せられたレーザー光は、ダイクロイックミラーを介して対物レンズを通過し、被付着物としてのウェル内の蛍光粒子に照射される。蛍光粒子から発せられた蛍光は、対物レンズを通過して撮像素子に入射することにより画像情報が取得できる。
【００５４】
第二の光照射手段としては、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー、ＬＥＤなどが挙げられる。光照射手段のレーザー光を、ウェル内に着弾した液滴内に存在する蛍光粒子に照射すると、蛍光粒子が発光するため、粒子の計数精度が向上する。
【００５５】
対物レンズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高倍率のレンズを用いると計数精度が向上するが、視野が狭くなるため、視野外に液滴が着弾しやすくなり、カウントエラー頻度が高くなりやすい。一方、低倍率のレンズを用いると視野が広がるためカウントエラー頻度を下げることができるが、１０μｍ以下の細胞を捉えにくくなる。
対物レンズで１０μｍ以下の細胞を捉える場合、液滴吐出手段の着弾位置精度から、０．５ｍｍ角程度の視野の対物レンズを用いることが好ましい。市販品としては、例えば、無限補正対物レンズ  Ｍ−ＰＬＡＮ  ＡＰＯ  ５Ｘ（株式会社ミツトヨ製）などが挙げられる。
【００５６】
撮像素子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、粒子の画像を取得する場合には、例えば、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ゲートＣＣＤ等の２次元素子などが挙げられる。また、発光の輝度値に基づき粒子数を判定する場合には、撮像素子として、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子を用いてもよい。高感度の撮像素子が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードなどを用いることが好ましい。
第二の光照射手段を用いない場合、被付着物に着弾した液滴内の蛍光粒子は液滴周縁部の影に隠れてしまい、図５Ｂに示すように粒子の計数が困難になってしまう。このため、液滴が着弾した後、乾燥するまでの間に撮像するようにタイムディレイを設けることが好ましい。第二の光照射手段を用いる場合、液滴内の蛍光粒子が蛍光を発することにより、蛍光粒子の確認が容易になるため、液滴が乾燥する前に撮像することが可能である。
なお、第二の光照射手段が発するレーザー光と比較すると蛍光粒子が発する蛍光が弱いため、撮像素子の前段（受光面側）にレーザー光の波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、撮像素子において、非常にコントラストの高い蛍光粒子の画像を得やすくなる。フィルタとしては、例えば、レーザー光の波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタなどが挙げられる。
【００５７】
スキャン部は、対物レンズの焦点位置を移動させ、蛍光粒子をスキャンして撮像するためのものである。蛍光粒子に対する焦点位置がずれると画像のコントラストが悪化し、取得した画像から粒子数を正確に計数することが困難となりやすい。このため、ウェル内に液滴が着弾した後、スキャン部により複数枚の画像を取得することにより、コントラストの高い画像を選択して取得することが可能となる。
【００５８】
フィードバックユニットは、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数することができ、また、得られた計数値と、第一の粒子計数手段により得られた計数値とを比較した結果を液滴吐出手段にフィードバックすることができる。
被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数する方法としては、前述した、第一の計数処理、第二の計数処理などの方法を適用することができる。
【００５９】
フィードバックユニットは、撮像素子として２次元素子を用いた場合、画像処理により蛍光粒子の発光している箇所の面積値を算出し、予め設定された閾値と比較することにより、液滴に含まれる粒子を計数することができる。この場合、フィードバックユニットは、画像の形状に基づく個数判定アルゴリズムを有することが好ましい。
また、フィードバックユニットは、撮像素子として１次元素子を用いた場合、得られた発光の輝度値に基づき、予め設定された閾値と比較することにより、液滴に含まれる粒子を計数することができる。
【００６０】
なお、本発明の粒子計数装置は、飛翔中の液滴に含まれる粒子を計数することに限定するものではなく、飛翔中の液滴に含まれる粒子を計数せずに、フィードバックユニットを用いて、被付着物に着弾した後の液滴に含まれる粒子を計数してもよい。
【００６１】
［第二の粒子計数手段による第二のフィードバック工程］
第二のフィードバック工程では、被付着物としてのウェル内に着弾した液滴に含まれる粒子の数を１個にしたい場合、第二の粒子計数手段が、着弾した液滴に含まれる粒子の数が０個であると判定したとき、液滴吐出手段に液滴を更に吐出させるように制御することが好ましい。更に、第二の粒子計数手段が、着弾した液滴に含まれる粒子の数が１個以上であると判定したとき、着弾した位置とは別の位置に着弾させるなどの次工程に移行するようにしてもよい。
【００６２】
また、第二のフィードバック工程では、着弾した液滴に含まれる粒子の数を所定の数にしたい場合、第二の粒子計数手段が、着弾した液滴に含まれる粒子の数が所定の数未満であると判定したとき、液滴吐出手段に液滴を更に吐出させるように制御することが好ましい。また、着弾した液滴に含まれる粒子の数が所定の数を超えたと第二の粒子計数手段が判定したとき、被付着物に着弾した位置とは別の位置に次の液滴を着弾させるなどの次工程に移行するようにしてもよい。
なお、液滴吐出手段より所定の回数の液滴を吐出した後に、後述する記憶手段に記憶した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を読み出し、吐出させた各々の液滴に含まれる粒子を計数するようにしてもよい。
【００６３】
以上のように、フィードバック工程は、第一又は第二の粒子計数手段が液滴吐出手段にフィードバックする工程であり、フィードバックユニットにより好適に行うことができる。
【００６４】
＜その他の手段及びその他の工程＞
その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、光学系、駆動手段、記憶手段、被付着物を有することが好ましい。
その他の工程としては、その他の手段により好適に行われる。
【００６５】
光学系としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、光照射手段から出射された光を液滴に集光させるためのレンズ、光をフィルタリングして受光手段が発光を受光しやすくするためのフィルタなどが挙げられる。
【００６６】
駆動手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液滴吐出手段が圧電加圧方式によるインクジェットヘッドである場合、液滴吐出手段に駆動電圧を入力する手段などが挙げられる。この場合、駆動手段が圧電素子を変形させることにより微小な液滴を吐出させることができる。
【００６７】
記憶手段としては、受光手段により受光された発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を記憶できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＡＭなどが挙げられる。
【００６８】
吐出された液滴が付着する被付着物は、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、粒子が細胞である場合、ウェルなどが挙げられる。
【００６９】
ここで、本発明における粒子計数装置の一例について図面を参照して説明する。
なお、各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。また、下記構成部材の数、位置、形状等は本実施の形態に限定されず、本発明を実施する上で好ましい数、位置、形状等にすることができる。
【００７０】
図１は、本発明の粒子計数装置の一例を示す説明図である。
図１に示すように、粒子計数装置１００は、液滴吐出手段１０と、駆動手段２０と、光照射手段３０と、受光手段４１及び４２と、粒子計数手段５１とを有する。
【００７１】
液滴吐出手段１０は、キャビティ１１に蛍光粒子２０１を含む蛍光粒子懸濁液２００を収容し、キャビティ１１に配置された図示しない圧電素子の変形により、蛍光粒子２０１を含んだ球体あるいは楕円体の液滴２１０を、図３中のＤ３で示す吐出方向にノズル１２から吐出することができる。
【００７２】
駆動手段２０は、液滴吐出手段１０の圧電素子と電気的に接続されており、圧電素子に駆動電圧を印加し、圧電素子を変形させることにより液滴２１０を吐出させる。
【００７３】
光照射手段３０は、駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Ｌを液滴２１０に照射する。
【００７４】
２つの受光手段４１及び４２は、いずれも光照射手段３０を介して駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光Ｌにより蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、発光Ｌ１及び発光Ｌ２を受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報をそれぞれ得る。
【００７５】
粒子計数手段５１は、２つの受光手段４１及び４２により受光した発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報に基づき、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を計数する。
【００７６】
図２は、図１に示した粒子計数装置における２つの受光手段の位置関係の一例を示す説明図である。なお、図２では、液滴の吐出方向を紙面奥行き方向としており、ノズル１２の直下には、被付着物３００が配置されている。
図２に示すように、光照射手段３０、ミラー６０、及びレンズ７０は、光照射手段３０により照射されたレーザー光Ｌがミラー６０に反射してレンズ７０を介して吐出方向に吐出された液滴（図２中のノズル１２の位置）に集光されるように配置されている。
２つの受光手段４１及び４２は、吐出方向を法線とする平面上に、受光手段４１の受光方向Ｄ１と、受光手段４２の受光方向Ｄ２とがなす角を９０°として配置されている。
【００７７】
図３は、図２に示した位置関係とした２つの受光手段により得られる発光の画像の説明図である。図３では、受光手段４１が受光した発光の輝度及び発光の受光面における形状を１つの画像Ｐ１に示し、受光手段４２が受光した発光の輝度及び発光の受光面における形状を１つの画像Ｐ２に示している。
図３に示すように、画像Ｐ１では発光が重なっていないが、画像Ｐ２では発光が重なっている。
画像Ｐ１及び画像Ｐ２から発光の輝度に基づいて蛍光粒子２０１を計数するとき、上記（１）又は（２）の処理のいずれかを行い、蛍光粒子２０１の個数を計数してもよい。
画像Ｐ１及び画像Ｐ２から発光の受光面における形状に基づいて粒子２０１を計数するとき、上記（３）〜（６）の処理のいずれかを行い、蛍光粒子２０１の個数を計数してもよい。
【００７８】
図４Ａ〜図４Ｃは、２つの発光が重なる場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の一例を示す説明図である。図４Ａ〜図４Ｃでは、発光が透過可能な粒子を想定しており、画像の濃淡が発光の輝度を示し、淡色であるほど発光の輝度が高いことを示している。
【００７９】
図４Ａに示すように、粒子からの発光の重なり程度であれば、発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定できる。
図４Ｂに示すように、粒子からの発光の重なり程度である場合、発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定できないとき、発光の受光面における形状に基づいて発光の受光面における形状の曲率半径を算出し、算出した曲率半径の中心の個数を粒子の個数として判定する。
図４Ｃに示すように、粒子からの発光が完全に重なった場合でも、輝度が高いほど重なっている粒子の個数が多いと判定できるため、検量線を用いて粒子の個数を判定することができる。
なお、発光が透過しない粒子であっても、２以上の受光手段を有することにより、いずれかの受光手段により発光が重なっていない状態を受光できていれば、粒子同士が接触した重なりでない限り、発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定できる。
【００８０】
図５Ａ及び図５Ｂは、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する場合における発光の輝度及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の一例を示す説明図である。図５Ａ及び図５Ｂでは、図４Ａ〜図４Ｃと同様に、画像の濃淡が発光の輝度を示し、淡色であるほど発光の輝度が高いことを示している。ただし、液滴の中に粒子が１個含まれており、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する点で図４Ａ〜図４Ｃと異なる。
図５Ａに示すように、液滴の外辺部が発光しており、発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定しようとすると、粒子が１個であるか２個であるかの判定が困難であるが、発光の受光面における形状に基づいて粒子の個数を判定すると、液滴の外辺部の発光における曲率半径が大きいため除外することができる。
図５Ｂに示すように、図５Ａの場合と同様に、記発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定しようとすると、粒子が１個であるか２個であるかの判定が困難であるが、発光の受光面における形状に基づいて粒子の個数を判定すると、発光の曲率半径から１個であると判定できる。
【００８１】
図６Ａ〜図６Ｃは、受光手段により受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の一例を示す画像である。図６Ａ〜図６Ｃは、粒子としてＳＰＨＥＲＯ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ベイバイオサイエンス株式会社製、１％（ｗ／ｖ）、直径１０μｍ〜１４μｍ）、懸濁液の液成分としてイオン交換水を用いて、圧電素子を用いたメンブレン振動方式のインクジェットヘッドを正弦波電圧（２０，０００Ｈｚ、１周期、４．６Ｖ）で圧電素子を駆動させ、粒子を含む液滴を直径８０μｍの球体になるように吐出させ、受光手段として高感度カメラ（ｐｃｏ．ｅｄｇｅ、株式会社東京インスツルメンツ製）の露光時間を１０ｍｓに設定し、吐出させた液滴に光照射手段としてのＹＡＧレーザー（Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ、スペクトラ・フィジックス株式会社製）が出射したレーザービーム（１０ｋＨｚで１００μＪ）を照射して粒子を発光させた状態の画像である。なお、インクジェットヘッド、ＹＡＧレーザー、及び高感度カメラを同期させ、ＹＡＧレーザーのみを遅れさせるようにディレイ時間を０．１ｍｓとした。ただし、上記の条件は、画像が得られる条件であれば、特に制限はなく、用いる機器や吐出する液の物性及び蛍光粒子などにより、適宜選択することができる。
【００８２】
図６Ａは、奥行きがある球体あるいは楕円体の液滴の中に粒子が２つ存在し、粒子の１つは液滴の中の紙面手前側に存在し、もう１つの粒子は液滴の中の紙面奥側に存在するような受光方向から受光されたときの画像である。
図６Ａに示すように、液滴の中の紙面奥側に存在する粒子からの発光は、液滴を通過する分だけ、屈折や散乱などにより発光の輝度値が減衰するため、受光手段に対する液滴の中の位置に起因して発光の輝度値がばらつくときがある。
【００８３】
図６Ｂは、奥行きがある球体あるいは楕円体の液滴の中に粒子が３つ存在し、粒子の１つが液滴の外辺部近傍に存在するような受光方向から受光されたときの画像である。
図６Ｂに示すように、液滴の外辺部近傍に存在する粒子からの発光は、液滴の球面内側に反射するときがある。
【００８４】
図６Ｃは、奥行きがある球体あるいは楕円体の液滴の中に粒子が１つ存在し、粒子が紙面奥側における液滴の外辺部近傍に存在するような受光方向から受光されたときの画像である。
図６Ｃに示すように、粒子が紙面奥側における液滴の外辺部近傍に存在する場合の粒子からの発光は、輝度値が低く、受光面における形状が不明瞭となるときがある。
【００８５】
図７は、２以上の受光手段により受光された発光の輝度値に基づき粒子の個数を判定する検量線の一例を示すグラフである。
図７に示すように、発光の輝度値に基づき粒子の個数を判定する検量線を用いることにより、第一の受光手段により受光された発光の輝度値１と、撮像手段により受光された発光の輝度値２に基づいて、粒子の個数を判定することができる。
また、図６Ａ〜図６Ｃに示したように、発光の輝度値が不明確となり、検量線を求めることができない場合があるため、この場合、境界線近傍の所定の領域において粒子の個数を判定できない領域を判定不可領域として設けるようにする。２つの受光手段により受光された輝度値に基づき判定不可領域にプロットされる場合、輝度値だけでは粒子を計数できないと判定して、発光の受光面における形状の情報に基づき粒子を計数するようにすることが好ましい。
なお、検量線のデータは、粒子の種類や発光条件などに応じてあらかじめ取得し、記憶手段などに記憶させておく。
【００８６】
次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図８に示すフローチャートの図中Ｓで表すステップにしたがって図１などを参照しながら説明する。
本フローチャートは、発光が重なることがない場合、あるいは発光が液滴の球面内側に反射して不明確になることがない場合に用いられる手順である。
【００８７】
Ｓ１０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含んだ液滴２１０を、図１中のＤ３で示す吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ１０２に移行させる。
【００８８】
Ｓ１０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された液滴吐出手段１０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Ｌを液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光Ｌにより蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、発光Ｌ１及び発光Ｌ２を受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ１０３に移行させる。
【００８９】
Ｓ１０３では、粒子計数手段５１は、２つの受光手段４１及び４２により受光した、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報に基づき、図７に示した検量線を用いて液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を計数して、本処理を終了する。
【００９０】
次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図９に示すフローチャートの図中Ｓで表すステップにしたがって図１などを参照しながら説明する。
本フローチャートは、例えば、液滴吐出手段１０により吐出させる液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数が吐出毎にばらつく場合に用いられる手順である。すなわち、蛍光粒子２０１の個数のばらつき程度を確認するため、吐出する毎に蛍光粒子２０１からの発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報を得て、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値のみに基づき、蛍光粒子２０１の計数を行う手順である。
【００９１】
Ｓ２０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含んだ液滴２１０を、図１中のＤ３で示す吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ２０２に移行する。
【００９２】
Ｓ２０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された液滴吐出手段１０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Ｌを液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光Ｌにより蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、発光Ｌ１及び発光Ｌ２を受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ２０３に移行する。
【００９３】
Ｓ２０３では、粒子計数手段５１は、２つの受光手段４１及び４２により受光した発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値に基づき、図７に示した検量線を用いて液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を計数する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ２０４に移行する。
【００９４】
Ｓ２０４では、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を計数した粒子計数手段５１は、液滴吐出手段１０が所定の回数の液滴２１０を吐出したか否かを判定する。粒子計数手段５１は、液滴吐出手段１０により液滴２１０を所定の回数吐出したと判定すると、本処理を終了する。粒子計数手段５１は、液滴吐出手段１０により液滴２１０を所定の回数吐出していないと判定すると、処理をＳ２０１に戻す。
【００９５】
次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図１０に示すフローチャートの図中Ｓで表すステップにしたがって図１などを参照しながら説明する。
本フローチャートは、例えば、液滴吐出手段１０により液滴２１０を連続して吐出させた後、連続して吐出させた液滴２１０に蛍光粒子２０１がどのくらい含まれたのか確認したい場合に用いられる手順である。
【００９６】
Ｓ３０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含んだ液滴２１０を、図１中のＤ３で示す吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ３０２に移行する。
【００９７】
Ｓ３０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された液滴吐出手段１０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Ｌを液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光Ｌにより蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、発光Ｌ１及び発光Ｌ２を受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報を得る。粒子計数手段５１は、液滴２１０毎に発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報を図示しない記憶手段に記憶し、処理をＳ３０３に移行する。
【００９８】
Ｓ３０３では、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を計数した粒子計数手段５１は、液滴吐出手段１０が所定の回数の液滴２１０を吐出したか否かを判定する。粒子計数手段５１は、液滴吐出手段１０により液滴２１０を所定の回数吐出したと判定すると、処理をＳ３０４に移行する。粒子計数手段５１は、液滴吐出手段１０により液滴２１０を所定の回数吐出していないと判定すると、処理をＳ３０１に戻す。
【００９９】
Ｓ３０４では、液滴２１０を所定の回数吐出したと判定した粒子計数手段５１は、記憶手段に記憶した発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報に基づき、図７に示した検量線を用いて液滴２１０毎に蛍光粒子２０１を計数して、本処理を終了する。
【０１００】
次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図１１に示すフローチャートの図中Ｓで表すステップにしたがって図１などを参照しながら説明する。
本フローチャートは、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値のみに基づいて蛍光粒子２０１の個数を計数できないと判定した場合、発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状に基づいて蛍光粒子２０１の個数を判定する手順である。
【０１０１】
Ｓ４０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含んだ液滴２１０を、図１中のＤ３で示す吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ４０２に移行する。
【０１０２】
Ｓ４０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された液滴吐出手段１０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Ｌを液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光Ｌにより蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、発光Ｌ１及び発光Ｌ２を受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ４０３に移行する。
【０１０３】
Ｓ４０３では、粒子計数手段５１は、２つの受光手段４１及び４２により受光した発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値に基づき、図７に示した検量線を用いて液滴２１０毎に蛍光粒子２０１の個数を判定する。このとき、粒子計数手段５１は、受光した発光Ｌ２の輝度値が図７に示した判定不可領域に含まれないと判定すると、処理をＳ４０４に移行する。粒子計数手段５１は、判定不可領域に含まれると判定すると、処理をＳ４０５に移行する。
【０１０４】
Ｓ４０４では、判定不可領域に含まれないと判定した粒子計数手段５１は、２つの受光手段４１及び４２により受光した発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値に基づき、図７に示した検量線を用いて液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を計数して、本処理を終了する。
【０１０５】
Ｓ４０５では、判定不可領域に含まれると判定した粒子計数手段５１は、２つの受光手段４１及び４２により受光した発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報、即ち形状データに基づき、曲率半径を求める。
次に、粒子計数手段５１は、求めた曲率半径が所定の範囲内であるか否かを判定する。粒子計数手段５１は、求めたすべての曲率半径が所定の範囲内であると判定すると、処理をＳ４０６に移行し、求めた曲率半径が１つでも所定の範囲内にないと判定すると、処理をＳ４０４に移行する。
【０１０６】
Ｓ４０６では、すべての曲率半径が所定の範囲内であると判定した粒子計数手段５１は、求めた曲率半径の中心の個数を液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数として計数し、本処理を終了する。
【０１０７】
次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図１２に示すフローチャートの図中Ｓで表すステップにしたがって図１を参照しながら説明する。
【０１０８】
Ｓ５０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含んだ液滴２１０を、図１中のＤ３で示す吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ５０２に移行する。
【０１０９】
Ｓ５０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された液滴吐出手段１０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Ｌを液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光Ｌにより蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、発光Ｌ１及び発光Ｌ２を受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ５０３に移行する。
【０１１０】
Ｓ５０３では、粒子計数手段５１は、２つの受光手段４１及び４２により受光した発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値に基づき、図７に示した検量線を用いて液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を計数する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ５０４に移行する。
【０１１１】
Ｓ５０４では、粒子計数手段５１は、計数した蛍光粒子２０１が０個であるか否かを判定する。粒子計数手段５１は、計数した蛍光粒子２０１が０個であると判定すると、処理をＳ５０１に移行する。粒子計数手段５１は、計数した蛍光粒子２０１が０個でないと判定すると、本処理を終了する。
【０１１２】
次に、本発明の粒子計数装置を用いて、粒子計数手段が、吐出させた液滴に含まれる粒子は０個であると判定した場合、液滴吐出手段により液滴を再度吐出させ、蛍光粒子２０１が計数されるまで繰り返すフローを、図１３に示すフローチャートの図中Ｓで表すステップにしたがって図１を参照しながら説明する。
【０１１３】
Ｓ６０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含んだ液滴２１０を、図１中のＤ３で示す吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ６０２に移行する。
【０１１４】
Ｓ６０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された液滴吐出手段１０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Ｌを液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光Ｌにより蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、発光Ｌ１及び発光Ｌ２を受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値、並びに発光Ｌ１の受光面における形状及び発光Ｌ２の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ６０３に移行する。
【０１１５】
Ｓ６０３では、粒子計数手段５１は、２つの受光手段４１及び４２により受光した発光Ｌ１の輝度値及び発光Ｌ２の輝度値に基づき、図７に示した検量線を用いて液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を計数する。その後、粒子計数手段５１は、処理をＳ６０４に移行する。
【０１１６】
Ｓ６０４では、蛍光粒子２０１を計数した粒子計数手段５１は、計数した光粒子２０１が０個であるか否かを判定する。粒子計数手段５１は、計数した光粒子２０１が０個であると判定すると、処理をＳ６０５に移行する。粒子計数手段５１は、計数した光粒子２０１が０個でないと判定すると、本処理を終了する。
【０１１７】
Ｓ６０５では、粒子計数手段５１は、蛍光粒子２０１が０個であると判定した液滴２１０を被付着物に付着させないように排出して、処理をＳ６０１に戻す。
【０１１８】
図１４及び図１５は、上述した本発明の粒子計数装置の実施態様とは別の実施態様を示す説明図である。
【０１１９】
図１４は、本発明の粒子計数装置の他の一例を示す説明図である。図１４に示すように、図１に示した粒子計数装置と同様に、液滴２１０を吐出し被付着物７１へ着弾させるが、被付着物７１に着弾した蛍光粒子２０１を被付着物７１の下から第二の粒子計数手段５２により計数し、その結果を液滴吐出手段１０にフィードバックする点で相違する。
なお、撮像手段８０には、着弾した液滴を観察可能な位置に対物レンズ８３が設置されている。撮像手段８０の第二の光照射手段８１から発せられたレーザー光Ｌは、ダイクロイックミラー８３を介して対物レンズ８３を通過し、被付着物としてのウェル内の蛍光粒子に照射される。蛍光粒子から発せられた蛍光Ｌ３は、対物レンズ６３を通過して撮像素子６５に入射することにより画像情報が取得できる。
【０１２０】
図１５は、本発明の粒子計数装置の更に他の一例を示す説明図である。図１５に示すように、図１に示した粒子計数装置と同様に、液滴を吐出し被付着物７１へ着弾させるが、被付着物７１の所定の位置に蛍光粒子２０１を含む液滴２１０を着弾させた後、着弾した液滴を観察可能なように、撮像手段８０の対物レンズ８３が設置されている場所まで被付着物７１をステージ７２で移動させ、被付着物７１に着弾した蛍光粒子２０１を被付着物７１の上から粒子数計数手段５２により計数し、その結果を液滴吐出手段１０にフィードバックする点で相違する。
【０１２１】
図１６は、本発明の粒子計数装置を用いて、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を所定の数にするフローの一例を示すフローチャートである。図１６に示すように、図１２と同様なフローであるが、図１２のステップＳ５０４における「粒子の数が０個であるか否かの判定」を、「粒子の数が所定の数であるか否かの判定」に変え、所定の数の粒子を被付着物に着弾させる場合のフローチャートを示している。
【０１２２】
図１７は、本発明の粒子計数装置を用いて、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を所定の数にするフローの他の一例を示すフローチャートである。図１６と同様に所定の数を被付着物に着弾させる場合のフロー図を示しており、更に粒子の数が所定の数以上となる場合に液滴を排出する場合のフローチャートを示している。
【０１２３】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、  前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する２以上の受光手段と、２以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段とを有することを特徴とする粒子計数装置である。
＜２＞  前記受光手段が、受光面の略法線方向に受光した前記発光の輝度値及び前記発光の前記受光面における形状の情報を得て、前記粒子計数手段が、前記発光の輝度値に基づいて前記液滴に含まれる前記粒子を計数する第一の計数処理、及び、前記発光の前記受光面における形状の情報に基づいて前記液滴に含まれる前記粒子を計数する第二の計数処理の少なくともいずれかを行う前記＜１＞に記載の粒子計数装置である。
＜３＞  前記粒子計数手段が、前記第一の計数処理を行い、前記粒子を計数できないと判定したとき、前記第二の計数処理を行い、前記粒子を計数する前記＜２＞に記載の粒子計数装置。
＜４＞  前記粒子計数手段が、前記発光の受光面における形状の情報に基づき曲率半径を算出し、所定の範囲内にある前記曲率半径を算出した際の円の中心の個数を前記粒子の個数として計数する前記第二の計数処理を行う前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜５＞  ２以上の前記受光手段のうち少なくとも１の前記受光手段が、その受光方向が他の前記受光手段の受光方向と略直交方向に位置するように配された前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜６＞  前記受光手段が、その受光方向が前記液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配された前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜７＞  前記受光手段が、ＣＭＯＳ撮像素子を有するカメラである前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜８＞  前記粒子計数手段が、前記粒子の数が０個であると判定したとき、前記液滴吐出手段が、前記液滴を更に吐出する前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜９＞  前記粒子計数手段が、前記粒子の数が所定の数未満であると判定したとき、前記液滴吐出手段が、前記液滴を更に吐出する前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜１０＞  前記粒子計数手段が、前記粒子の数が所定の数であると判定したとき、次工程に移行する前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の粒子計数装置。
＜１１＞  前記液滴吐出手段が、圧電素子を用いた圧電加圧方式によるインクジェットヘッドである前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜１２＞  前記圧電素子が、チタン酸ジルコン酸鉛を用いた素子である前記＜１１＞に記載の粒子計数装置である。
＜１３＞  前記光照射手段が、固体レーザーである前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜１４＞  前記光が、パルス光である前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜１５＞  前記パルス光のパルス幅が、１０μｓ以下である前記＜１４＞に記載の粒子計数装置である。
＜１６＞  前記パルス光における単位パルスあたりのエネルギーが、０．１μＪ以上である前記＜１４＞から＜１５＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜１７＞  光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射工程と、前記光を照射された前記粒子からの発光を２以上の受光手段により受光する受光工程と、２以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程とを含むことを特徴とする粒子計数方法である。
【０１２４】
前記＜１＞から＜１６＞のいずれかに記載の粒子計数装置、及び前記＜１７＞に記載の粒子計数方法は、従来における上記諸問題を解決し、本発明の目的を達成することができる。
【符号の説明】
【０１２５】
１０    液滴吐出手段
２０    駆動手段
３０、８１    光照射手段
４１、４２    受光手段
５１    粒子計数手段
５２    第二の粒子計数手段
７１    被付着物
８０    撮像手段
１００    粒子計数装置
２０１    蛍光粒子
２１０    液滴
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１２６】
【特許文献１】特許第５７１６２１３号公報
【図１】
2018009956.tif 000003
【図２】
2018009956.tif 000004
【図３】
2018009956.tif 000005
【図４Ａ】
2018009956.tif 000006
【図４Ｂ】
2018009956.tif 000007
【図４Ｃ】
2018009956.tif 000008
【図５Ａ】
2018009956.tif 000009
【図５Ｂ】
2018009956.tif 000010
【図６Ａ】
2018009956.tif 000011
【図６Ｂ】
2018009956.tif 000012
【図６Ｃ】
2018009956.tif 000013
【図７】
2018009956.tif 000014
【図８】
2018009956.tif 000015
【図９】
2018009956.tif 000016
【図１０】
2018009956.tif 000017
【図１１】
2018009956.tif 000018
【図１２】
2018009956.tif 000019
【図１３】
2018009956.tif 000020
【図１４】
2018009956.tif 000021
【図１５】
2018009956.tif 000022
【図１６】
2018009956.tif 000023
【図１７】
2018009956.tif 000024