(57)【要約】【課題】細胞増殖阻害とは異なるメカニズムによる癌の予防又は治療剤を提供する。【解決手段】配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド若しくはその誘導体、を有効成分として含有する癌の予防又は治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド若しくはその誘導体、
を有効成分として含有する癌の予防又は治療剤。
【請求項２】
前記癌が、βＩＩＩチューブリンを発現する癌である、請求項１に記載の癌の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記癌が、下記式（１）で計算されるＫＬ１／Ｔａｕ比が１以上である癌である、請求項１又は２に記載の癌の予防又は治療剤。
ＫＬ１／Ｔａｕ比＝（癌組織におけるＫａｔａｎｉｎ−ｌｉｋｅ  １（ＫＬ１）タンパク質の発現量／正常組織におけるＫＬ１タンパク質の発現量）／（癌組織におけるＴａｕタンパク質の発現量／正常組織におけるＴａｕタンパク質の発現量）  …（１）
【請求項４】
前記癌が、乳癌、唾液腺癌又は大腸癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の癌の予防又は治療剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の癌の予防又は治療剤、及び薬学的に許容される担体を含有する、癌の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予防又は治療剤に関する。より詳細には、癌の予防又は治療剤、及び癌の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗癌剤は、細胞増殖阻害剤であることが多く、正常細胞への作用から副作用が問題となる場合がある。
【０００３】
ところで、ＮＡＰペプチド（Ｄａｖｕｎｅｔｉｄｅ）は、８アミノ酸からなる細胞膜透過性ペプチドであり、微小管に結合して様々な病態に伴う微小管の異常を抑制し保護することが知られている。ＮＡＰはこれまで、神経系の疾患に対する治療薬候補として１０年以上研究されてきた。既に軽度認知機能障害、統合失調症、進行性核上性麻痺への適用を目指した臨床試験も行われており、ヒトへの投与での忍容性も示されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Morimoto B. H., et al., Davunetide: a review of safety and efficacy data with a focus on neurodegenerative diseases., Expert Rev. Clin. Pharmacol., 6 (5), 483-502, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌は高齢化社会における重大な疾患の１つであり、副作用が低減された抗癌剤が求められている。そこで、本発明は、細胞増殖阻害とは異なるメカニズムによる癌の予防又は治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド若しくはその誘導体、を有効成分として含有する癌の予防又は治療剤。
［２］前記癌が、βＩＩＩチューブリンを発現する癌である、［１］に記載の癌の予防又は治療剤。
［３］前記癌が、下記式（１）で計算されるＫＬ１／Ｔａｕ比が１以上である癌である、［１］又は［２］に記載の癌の予防又は治療剤。
ＫＬ１／Ｔａｕ比＝（癌組織におけるＫａｔａｎｉｎ−ｌｉｋｅ  １（ＫＬ１）タンパク質の発現量／正常組織におけるＫＬ１タンパク質の発現量）／（癌組織におけるＴａｕタンパク質の発現量／正常組織におけるＴａｕタンパク質の発現量）  …（１）
［４］前記癌が、乳癌、唾液腺癌又は大腸癌である、［１］〜［３］のいずれかに記載の癌の予防又は治療剤。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の癌の予防又は治療剤、及び薬学的に許容される担体を含有する、癌の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細胞増殖阻害とは異なるメカニズムによる癌の予防又は治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１の免疫ブロットの結果を示す写真である。
【図２】実験例２の結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は実験例３の結果を示すグラフである。（ａ）は紡錘体試料における１視野中の紡錘体の総数を示すグラフである。（ｂ）は紡錘体試料における双極性紡錘体の割合を示すグラフである。
【図４】（ａ）〜（ｄ）は、実験例４における正常な紡錘体を示す写真である。
【図５】（ａ）〜（ｆ）は、実験例４の各条件下における紡錘体の状態を示す写真である。
【図６】（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、実験例４において、Ｔａｕをノックダウンし、更にＮＡＰを添加した細胞から調製した紡錘体の状態を示す写真である。
【図７】（ａ）は、ｐ５３ノックダウン細胞の異数体に検出された、各染色体毎の正常染色体数に対する増減頻度を示すグラフである。（ｂ）は、ｐ５３及びＴａｕノックダウン細胞の異数体に検出された、各染色体毎の正常染色体数に対する増減頻度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［癌の予防又は治療剤］
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド若しくはその誘導体、を有効成分として含有する癌の予防又は治療剤を提供する。本明細書において、癌の予防又は治療とは、正常細胞の癌化を抑制すること、発症した癌の進行を遅らせること等を含む。
【００１０】
ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＮＡＰのアミノ酸配列である。実施例において後述するように、発明者らは、ＮＡＰが癌の予防又は治療剤として有効であることを明らかにした。また、後述するように、ＮＡＰの作用点は細胞増殖阻害とは異なっているため、副作用も少ない。
【００１１】
本実施形態の癌の予防又は治療剤としては、ＮＡＰだけでなく、ＮＡＰ誘導体、ＮＡＰのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド（以下、「ＮＡＰ変異体」という場合がある。）又はその誘導体等が挙げられる。ここで、１若しくは複数個とは、１〜５個、１〜４個、１〜３個又は１〜２個を意味する。
【００１２】
より具体的な癌の予防又は治療剤の例としては、ＮＡＰ、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（「ＮＡＴ」と呼ばれる場合がある。）、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（「ＴＡＰ」と呼ばれる場合がある。）、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（「ＳＡＬ」と呼ばれる場合がある。）、上記のペプチドの誘導体等が挙げられる。
【００１３】
ここで、誘導体としては、例えば、一部又は全部をＤ−アミノ酸に置換したペプチド、アセチル化したペプチド、Ｃ末端をアミノ化したペプチド等が挙げられる。より具体的には、例えば、ＮＡＰを構成する全てのアミノ酸をＤ−アミノ酸に置換したペプチド（「Ｄ−ＮＡＰ」と呼ばれる場合がある。）、上記のＳＡＬを構成する全てのアミノ酸をＤ−アミノ酸に置換したペプチド（「Ｄ−ＳＡＬ」と呼ばれる場合がある。）、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＮ末端をアセチル化したペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＣ末端をアミノ化したペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＮ末端をアセチル化しＣ末端をアミノ化したペプチド等が挙げられる。
【００１４】
これらのＮＡＰ誘導体、ＮＡＰ変異体、ＮＡＰ変異体の誘導体等は、微小管に結合し、ＮＡＰと同様の作用を示す。
【００１５】
本実施形態の癌の予防又は治療剤が対象とする癌は、βＩＩＩチューブリンを発現する癌であることが好ましい。
【００１６】
ＮＡＰが作用するためには、細胞中にβＩＩＩチューブリンが存在することが好ましい。βＩＩＩチューブリンは、本来ニューロン特異的に発現することが知られているタンパク質であり、微小管や中心体の構成成分である。
【００１７】
発明者らは、ヒト培養正常乳腺上皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＭＥＣ）が、本来ニューロン特異的なβＩＩＩチューブリンを発現していることを明らかにした。したがって、ヒト乳腺上皮細胞に由来する癌は、βＩＩＩチューブリンを発現しており、ＮＡＰの投与により予防又は治療することができる。
【００１８】
本実施形態の癌の予防又は治療剤が対象とする癌は、下記式（１）で計算されるＫＬ１／Ｔａｕ比が１以上、より好ましくは、１．３以上、更に好ましくは１．６以上である癌であることが好ましい。下記式（１）中、正常組織は、例えば、対象とする癌組織に隣接する正常組織であってもよい。
ＫＬ１／Ｔａｕ比＝（癌組織におけるＫＬ１タンパク質の発現量／正常組織におけるＫＬ１タンパク質の発現量）／（癌組織におけるＴａｕタンパク質の発現量／正常組織におけるＴａｕタンパク質の発現量）  …（１）
【００１９】
いいかえると、本実施形態の癌の予防又は治療剤が対象とする癌は、癌組織におけるＴａｕタンパク質の発現量の正常組織のそれに対する比に対する、ＫＬ１タンパク質の発現量の正常組織のそれに対する比の比が１以上、より好ましくは、１．３以上、更に好ましくは１．６以上である癌であることが好ましい。
【００２０】
Ｔａｕタンパク質は、神経軸索内に多く存在する分子量約３．４〜１２万の微小管結合タンパク質であり、微小管の重合を促進したり安定化したりすることが知られている。乳癌細胞にもＴａｕタンパク質の発現が見られ、従来、Ｔａｕタンパク質の発現レベルが低い乳癌患者と予後不良との相関が報告されてきたが、その関連性は不明であった。
【００２１】
また、ＫＬ１タンパク質とは、カタニンファミリータンパク質の一種である。カタニンファミリータンパク質には、カタニン、ＫＬ１及びＫＬ２が存在することが知られている。これらのカタニンファミリータンパク質のうち、カタニン及びＫＬ１には微小管切断活性があることが知られている。一方、ＫＬ２に微小管切断活性があるか否かは未だ明らかにされていない。また、カタニンは中心体及び紡錘体極に局在する。これに対し、ＫＬ１は紡錘体極のみに局在する。また、ＫＬ２は紡錘体全体に局在する。
【００２２】
発明者らは、Ｔａｕタンパク質の発現量を高低二群に二分した場合に、Ｔａｕタンパク質の発現量が低い乳癌患者群は、予後不良である傾向にあることを確認した。また、ラット線維芽細胞及びヒト正常乳腺上皮細胞でＫＬ１／Ｔａｕ比を実験的に増大させたところ、分裂期紡錘体において微小管切断タンパク質であるＫＬ１の脱抑制を誘導し、過剰な切断による微小管喪失、染色体分配の異常が生じ、癌化の原因となる異数体形成を惹起することを見出した。
【００２３】
上記の実験において、ＫＬ１／Ｔａｕ比の増大の方法として、Ｔａｕのノックダウン及びＫＬ１の強制発現の双方について検討した。その結果、いずれの方法によりＫＬ１／Ｔａｕ比を増大させた場合においても同様の結果が見られた。
【００２４】
実施例において後述するように、発明者らはまた、Ｔａｕを実験的に減少させた乳腺上皮細胞に対し、ＮＡＰを投与したところ、非投与群と比較して有意に微小核形成が抑制されることを明らかにした。発明者らはまた、Ｔａｕの減少で生じた、染色体と紡錘体を連結する微小管束（キネトコアファイバー）の喪失も、ＮＡＰの投与により抑制されることを明らかにした。発明者らはまた、単離した、微小管のみからなる紡錘体において、Ｔａｕ減少時に認められた物理的な脆弱化がＮＡＰの投与により顕著に回復することを明らかにした。
【００２５】
これらの結果は、ＮＡＰが乳癌発生につながるＴａｕタンパク質の減少を人工的に補い、微小管を保護することにより腫瘍の進展を阻害することを示している。異数体化に最も関連すると考えられる、微小核形成、分裂期紡錘体・キネトコアファイバーの喪失、及び単離紡錘体の物理的脆弱化がＮＡＰの作用により抑制されることから、ＮＡＰは、ＫＬ１／Ｔａｕ比が１以上である癌の予防又は治療剤として有用である。ここで、上記の癌は、Ｔａｕタンパク質の発現量が低下することによりＫＬ１／Ｔａｕ比が１以上となっていてもよいし、ＫＬ１タンパク質の発現量が増加することによりＫＬ１／Ｔａｕ比が１以上となっていてもよい。
【００２６】
上述した、βＩＩＩチューブリンを発現する癌又はＫＬ１／Ｔａｕ比が１以上である癌としては、乳癌、唾液腺癌及び大腸癌が挙げられる。
【００２７】
［癌の予防又は治療用医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した癌の予防又は治療剤、及び薬学的に許容される担体を含有する、癌の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【００２８】
本実施形態の医薬組成物は、経口的に使用される剤型又は非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。
【００２９】
薬学的に許容される担体としては、通常製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができ、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００３０】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
【００３１】
医薬組成物は、上記の薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００３２】
注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【００３３】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００３４】
医薬組成物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１０００ｍｇ、例えば約１．０から５００ｍｇ、例えば約１０から４００ｍｇの有効成分（癌の予防又は治療剤）であってもよい。また、上記の量を１日あたり１回又は数回に分けて投与してもよい。
【００３５】
また、非経口的に投与する場合には、その１回あたりの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３００ｍｇ、例えば約０．１から２００ｍｇ、例えば約０．１から１００ｍｇの有効成分（癌の予防又は治療剤）を静脈注射又は局所投与により投与することが考えられる。また、上記の量を１日あたり１回又は数回に分けて投与してもよい。
【００３６】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド若しくはその誘導体の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、癌の予防又は治療方法を提供する。
【００３７】
１実施形態において、本発明は、癌の予防又は治療のための、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド若しくはその誘導体を提供する。
【００３８】
１実施形態において、本発明は、癌の予防又は治療剤を製造するための、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド若しくはその誘導体の使用を提供する。
【００３９】
上記の各実施形態において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ微小管結合活性を有するペプチド若しくはその誘導体としては、上述したものが挙げられる。また、対象とする癌としては、上述したものが挙げられる。
【実施例】
【００４０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
［実験例１］
（乳癌組織におけるＫＬ１タンパク質とＴａｕタンパク質の発現量の検討）
市販されている、ヒト女性乳癌組織及び隣接正常組織の組織ライセート・ストリップアレイ（５症例：乳管癌、Ｐｒｏｔｅｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用した。
【００４２】
症例１として、上記ストリップアレイの型式「ＳＴ２−６Ｘ−１」、「Ｔ２−００５−Ｔ／Ｎ−１」を使用した。また、症例２として、上記ストリップアレイの型式「ＳＴ２−６Ｘ−１」、「Ｔ２−０３４−Ｔ／Ｎ−１」を使用した。また、症例３として、上記ストリップアレイの型式「ＳＴ２−６Ｘ−２」、「Ｔ２−０１７−Ｔ／Ｎ−１」を使用した。また、症例４として、上記ストリップアレイの型式「ＳＴ２−６Ｘ−２」、「Ｔ２−０１８−Ｔ／Ｎ−１」を使用した。また、症例５として、上記ストリップアレイの型式「ＳＴ２−６Ｘ−２」、「Ｔ２−０２９−Ｔ／Ｎ−１」を使用した。
【００４３】
各ストリップアレイを、抗ＫＬ１抗体（型式「ＨＰＡ０４６２０５」、シグマ社）及び抗Ｔａｕ抗体（型式「Ｔ１０２９」、ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を用いてそれぞれ免疫ブロットし、各組織中のＫＬ１タンパク質及びＴａｕタンパク質を検出した。まず、ストリップアレイのプロトコルにしたがい、ストリップアレイをメタノール処理後、ブロッキング処理した。続いて、各ストリップアレイを抗ＫＬ１抗体及び抗Ｔａｕ抗体と４℃で一晩振盪しながら反応させた。続いて、各ストリップアレイを洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合２次抗体を室温で１時間反応させた。続いて各ストリップアレイを洗浄し、ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社）を反応させて化学発光させＸ線フィルムに現像した。
【００４４】
図１は、免疫ブロットの結果を示す写真である。図中、「Ｔ」は癌組織を示し、「Ｎ」は隣接正常組織を示す。また、「ＫＬ１」は抗ＫＬ１抗体を反応させた結果であることを示し、「Ｔａｕ」は抗Ｔａｕ抗体を反応させた結果であることを示す。
【００４５】
その結果、正常組織におけるＫＬ１タンパク質の発現量に対する、癌組織におけるＫＬ１タンパク質の発現量の比は、症例１〜５の順にそれぞれ１．９０、０．９２、１．００、２．１０及び２．８３であった。また、正常組織におけるＴａｕタンパク質の発現量に対する、癌組織におけるＴａｕタンパク質の発現量の比は、症例１〜５の順にそれぞれ１．０４、０．５１、０．１８、０．６０及び０．８２であった。
【００４６】
これらの結果から、各癌組織におけるＫＬ１／Ｔａｕ比を計算すると、症例１〜５の順に１．８、１．８、５．６、３．５及び３．５と算出された。
【００４７】
以上の結果から、ヒト乳癌組織でＫＬ１タンパク質が発現していることが明らかとなった。また、ヒト乳癌組織では、ＫＬ１／Ｔａｕ比が高い傾向にあることが明らかとなった。
【００４８】
［実験例２］
（Ｔａｕノックダウンによる微小核形成の検討）
ヒト培養正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ、型式「ＣＣ−２２５１」、ロンザ社）に、Ｔａｕに対するｓｉＲＮＡ（センス鎖の塩基配列を配列番号６に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示す。以下、「ｓｉＴａｕ」という場合がある。）、ＫＬ１に対するｓｉＲＮＡ（型式「ｓｉＲＮＡ  ｓｍａｒｔ  ｐｏｏｌｓ」、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、以下、「ｓｉＫＬ１」という場合がある。）、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ（センス鎖の塩基配列を配列番号８に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示す。以下、「ｓｉｐ５３」という場合がある。）、対照としてのノンターゲッティングコントロールｓｉＲＮＡ（以下、「Ｃｔｒｌ」という場合がある。）、上記ｓｉＴａｕに非感受性のＴａｕ発現ベクター（Ｔａｕ  ｒｓｔ．ｍｔ）、対照としての空の発現ベクター（ｍｏｃｋ）、ＮＡＰペプチド（Ｂｉｏｒｂｉｔ社）を様々な組み合わせで導入し、全細胞に対する抗セントロメア抗体染色陽性の微小核を有する細胞の割合（％）を測定した。
【００４９】
Ｔａｕ  ｒｓｔ．ｍｔは、Ｒ．Ｂｒａｎｄｔ博士（オスナブリュック大学、ドイツ）より分与された野生型Ｔａｕの発現ベクター（ｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｆｌａｇ−ｈｔａｕ４４１）におけるｓｉＴａｕの標的領域に、変異プライマーを使用した部位特異的突然変異誘発により３塩基の変異を導入して作製した。
【００５０】
ｓｉＫＬ１は、終濃度３５ｎＭで使用した。ｓｉＴａｕは、終濃度５０ｎＭで使用した。ｓｉｐ５３は、終濃度１０ｎＭで使用した。ＮＡＰは、終濃度３０ｎＭで使用した。
【００５１】
各ｓｉＲＮＡ又は発現ベクターによる処理は２日間行った。その後、細胞をパラホルムアルデヒド固定し、抗チューブリン抗体（シグマ社）、抗セントロメア抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）、及びＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｈｙｄｒａｔｅ、シグマ社）で染色した。
【００５２】
続いて、２００個以上の間期の細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察し、全細胞に対する抗セントロメア抗体染色陽性の微小核を持つ細胞の割合を計算した（ｎ＝３）。
【００５３】
図２は、測定結果を示すグラフである。グラフ中、「＊」はスチューデントｔ検定により危険率１％未満で有意差が存在することを意味する。
【００５４】
その結果、ヒト培養正常乳腺上皮細胞においてＴａｕをノックダウン（ｓｉＴａｕ）することにより、対照（Ｃｔｒｌ）と比較して有意な微小核形成の増加が認められた。これは、更にｓｉＴａｕに非感受性のＴａｕの発現ベクターを導入することにより抑制された（Ｔａｕ  ｒｓｔ．ｍｔ＋ｓｉＴａｕ）。
【００５５】
また、Ｔａｕのノックダウンによる微小核形成の増加は、更にＫＬ１ノックダウンを同時に行うと有意に抑制された（ｓｉＫＬ１＋ｓｉＴａｕ）。
【００５６】
また、Ｔａｕのノックダウンによる微小核形成の増加は、ＮＡＰの添加により有意に抑制された（ｓｉＴａｕ＋ＮＡＰ）。この結果は、ＮＡＰがＴａｕの減少（ＫＬ１／Ｔａｕ比の上昇）に起因する微小核形成を抑制することを示し、癌の予防又は治療剤として有効であることを示す。
【００５７】
また、上記と同様の実験をｐ５３のノックダウンと共に行うと、Ｔａｕノックダウン単独に対し、約２倍の微小核が形成され（ｓｉｐ５３＋ｓｉＴａｕ）、これは上記と同様に、ＫＬ１ノックダウンと、ＮＡＰ処理により有意に抑制された。ｐ５３のノックダウンにより、Ｔａｕノックダウンの効果がより顕著に表れたものと考えられた。
【００５８】
［実験例３］
（Ｔａｕノックダウンによる紡錘体への影響の検討）
ヒト培養正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ、型式「ＣＣ−２２５１」、ロンザ社）に、上述したＣｔｒｌ、ｓｉＴａｕ、ｓｉＫＬ１又はＮＡＰを様々な組み合わせで導入し２日間処理した。続いて、ＭＧ１３２（セルシグナリングテクノロジー社）処理により細胞を分裂期に同調させた。続いて、定法（例えば、Sillje H.H. and Nigg E.A.Purification of mitotic spindles from cultured human cells., Methods, 38, 25-28, 2006.を参照。）により、各細胞から微小管成分のみにより構成される分裂期紡錘体を単離し、遠心分離（１５００×ｇ、１５分間）による物理ストレスを加え、液体低融点アガロースゲルと共にガラスボトムディッシュに添加して撹拌後固化した。続いて、紡錘体の構造的強度を評価した。
【００５９】
紡錘体の構造的強度の指標として、（１）全紡錘体数、（２）双極性紡錘体（ｂｉｐｏｌａｒ  ｓｐｉｎｄｌｅ）が占める割合、（３）紡錘体の各部分の状態を評価した。（３）紡錘体の各部分の状態は、紡錘体を免疫染色し、中心体、紡錘体極、及び極を基準とする遠位部分を観察することにより評価した。
【００６０】
中心体マーカーとしては、γ−チューブリンを抗γ−チューブリン抗体（シグマ社）で免疫染色した。紡錘体極マーカーとしては、ダイニン（ＤＹＮＣ１ＬＩ１）を、抗ダイニン抗体（型式「ＧＴＸ１２０１１４」、ジーンテックス社）で免疫染色した。極を基準とする遠位部分のマーカーとしては、Ｅｇ５（ＫＩＦ１１）を抗Ｅｇ５抗体（型式「ＧＴＸ１０９０５４」、ジーンテックス社）で免疫染色した。
【００６１】
図３（ａ）は各紡錘体試料における１視野中の紡錘体の総数を示すグラフである。グラフ中、「＊」はスチューデントｔ検定により危険率１％未満で有意差が存在することを意味する。
【００６２】
その結果、対照（Ｃｔｒｌ）と比較して、Ｔａｕをノックダウンすることにより紡錘体の総数が約９０％減少することが明らかとなった（ｓｉＴａｕ）。
【００６３】
また、上記の紡錘体数の減少は、ＫＬ１の同時ノックダウン（ｓｉＫＬ１）により有意に抑制された（ｓｉＴａｕ＋ｓｉＫＬ１）。また、上記の紡錘体数の減少は、ＮＡＰの添加によっても有意に抑制された（ＮＡＰ＋ｓｉＴａｕ）。この結果は、ＮＡＰがＴａｕの減少（ＫＬ１／Ｔａｕ比の上昇）に起因する紡錘体の異常を抑制することを示し、癌の予防又は治療剤として有効であることを示す。
【００６４】
図３（ｂ）は各紡錘体試料における双極性紡錘体の割合を示すグラフである。グラフ中、「＊」はスチューデントｔ検定により危険率１％未満で有意差が存在することを意味する。
【００６５】
その結果、対照（Ｃｔｒｌ）では、双極性紡錘体が約２５％の割合で存在するのに対し、Ｔａｕをノックダウンすることにより双極性紡錘体がほとんど検出されなくなることが明らかとなった（ｓｉＴａｕ）。
【００６６】
また、上記の双極性紡錘体数の減少は、ＫＬ１の同時ノックダウン（ｓｉＫＬ１）により有意に抑制された（ｓｉＴａｕ＋ｓｉＫＬ１）。また、上記の双極性紡錘体数の減少は、ＮＡＰの添加によっても有意に抑制された（ＮＡＰ＋ｓｉＴａｕ）。この結果は、ＮＡＰがＴａｕの減少（ＫＬ１／Ｔａｕ比の上昇）に起因する紡錘体の異常を抑制することを示し、癌の予防又は治療剤として有効であることを更に支持するものである。
【００６７】
図４（ａ）は、上述した方法により単離した双極性紡錘体の形状を示す代表的な微分干渉顕微鏡写真である。
【００６８】
図４（ｂ）上段は、対照（Ｃｔｒｌ）において単離された半紡錘体（ｈａｌｆ  ｓｐｉｎｄｌｅ）の微分干渉顕微鏡写真を示す。図４（ｂ）下段は、図４（ｂ）上段に示す半紡錘体を抗Ｅｇ５抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【００６９】
図４（ｃ）上段は、対照（Ｃｔｒｌ）において単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図４（ｃ）下段は、図４（ｃ）上段に示す半紡錘体を抗γ−チューブリン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【００７０】
図４（ｄ）上段は、対照（Ｃｔｒｌ）において単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図４（ｄ）下段は、図４（ｄ）上段に示す半紡錘体を抗ダイニン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図４（ａ）〜（ｄ）は、正常な紡錘体の形状を示している。
【００７１】
図５（ａ）及び（ｂ）は、ｓｉＴａｕを導入した細胞から調製した紡錘体を示す写真である。図５（ａ）上段は、単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図５（ａ）中段は、図５（ａ）上段に示す半紡錘体を抗γ−チューブリン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図５（ａ）下段は、図５（ａ）上段に示す半紡錘体を抗ダイニン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図５（ｂ）上段は、単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図５（ｂ）下段は、図５（ｂ）上段に示す半紡錘体を抗Ｅｇ５抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【００７２】
また、図５（ｃ）及び（ｄ）は、ｓｉＫＬ１を導入した細胞から調製した紡錘体を示す写真である。図５（ｃ）上段は、単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図５（ｃ）中段は、図５（ｃ）上段に示す半紡錘体を抗γ−チューブリン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図５（ｃ）下段は、図５（ｃ）上段に示す半紡錘体を抗ダイニン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図５（ｃ）上段は、単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図５（ｃ）下段は、図５（ｃ）上段に示す半紡錘体を抗Ｅｇ５抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【００７３】
また、図５（ｅ）及び（ｆ）は、ｓｉＴａｕ及びｓｉＫＬ１を導入した細胞から調製した紡錘体を示す写真である（ｓｉＴａｕ＋ｓｉＫＬ１）。図５（ｅ）上段は、単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図５（ｅ）中段は、図５（ｅ）上段に示す半紡錘体を抗γ−チューブリン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図５（ｅ）下段は、図５（ｅ）上段に示す半紡錘体を抗ダイニン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図５（ｆ）上段は、単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図５（ｆ）下段は、図５（ｆ）上段に示す半紡錘体を抗Ｅｇ５抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【００７４】
また、図６（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、ｓｉＴａｕを導入し、更にＮＡＰを添加した細胞から調製した紡錘体を示す写真である（ＮＡＰ＋ｓｉＴａｕ）。図６（ａ）上段は、単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図６（ａ）中段は、図６（ａ）上段に示す半紡錘体を抗γ−チューブリン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図６（ａ）下段は、図６（ａ）上段に示す半紡錘体を抗ダイニン抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図６（ｂ）上段は、単離された半紡錘体の微分干渉顕微鏡写真を示す。図６（ｂ）下段は、図６（ｂ）上段に示す半紡錘体を抗Ｅｇ５抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図６（ｃ）は、単離された双極性紡錘体の形状を示す代表的な微分干渉顕微鏡写真である。
【００７５】
図５（ａ）に示すように、Ｔａｕノックダウンにおいて見出された半紡錘体の約半数は、微小管の中心部への収斂に欠く形態を示し（図５（ａ）上段）、中心体マーカーの欠損（図５（ａ）中段）と紡錘体極マーカーの減少（図５（ａ）下段）を伴っていた。また、図５（ｂ）に示すように、残る約半数の半紡錘体では、遠位マーカーの欠損（図５（ｂ）下段）が見出された。
【００７６】
図５（ｅ）及び（ｆ）に示すように、Ｔａｕノックダウンによる紡錘体の異常はＫＬ１の同時ノックダウン（ｓｉＴａｕ＋ｓｉＫＬ１）により回復した。
【００７７】
また、図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｔａｕノックダウンによる紡錘体の異常はＮＡＰの添加によっても（ＮＡＰ＋ｓｉＴａｕ）回復した。また、図３（ｂ）及び図６（ｃ）に示すように、ＮＡＰを添加することにより、Ｔａｕノックダウンに起因する双極性紡錘体の減少が回復した。これらの結果は、ＮＡＰがＴａｕの減少（ＫＬ１／Ｔａｕ比の上昇）に起因する紡錘体の異常を抑制することを示し、癌の予防又は治療剤として有効であることを更に支持するものである。
【００７８】
［実験例４］
（Ｔａｕノックダウンによる核型への影響の検討）
ヒト培養正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ、型式「ＣＣ−２２５１」、ロンザ社）に、上述したｓｉｐ５３単独、又はｓｉｐ５３及びｓｉＴａｕを導入し３日間処理した。
【００７９】
続いて、定法に基づきＧバンド法による核型解析を行った。顕微鏡下でメタフェーズ展開像を取得し、解析システム（型式「ＧｅｎＡＳＩｓ  ＢａｎｄＶｉｅｗ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ社）を用いて画像解析した。６４個の対照細胞、９８個のｐ５３ノックダウン細胞、１３６個のＴａｕ及びｐ５３ノックダウン細胞、１２７個のＴａｕノックダウン細胞を解析した。
【００８０】
図７（ａ）は、ｐ５３ノックダウン細胞（ｓｉｐ５３）の異数体に検出された、各染色体毎の正常染色体数に対する増減頻度を示すグラフである。また、図７（ｂ）は、ｐ５３及びＴａｕノックダウン細胞（ｓｉｐ５３＋ｓｉＴａｕ）の異数体に検出された、各染色体毎の正常染色体数に対する増減頻度を示すグラフである。
【００８１】
その結果、対照細胞の約９割は正常核型（４６ＸＸ）であり、約１割に異数体（正常２倍体から数個の染色体増加又は減少）が認められた。
【００８２】
また、図７（ａ）に示すように、ｐ５３ノックダウン単独では、この傾向は大きくは変化せず、対照同様、約９割の細胞で正常核型を検出した。
【００８３】
これに対し、ｐ５３及びＴａｕノックダウン（ｓｉｐ５３＋ｓｉＴａｕ）では、２５％に異数体が認められた。これらの異数体の核型は各染色体に関してランダムではなく、図７（ｂ）に示すように、１個のＸ染色体の喪失（図中、「２−１」と示す。）にピークが認められ（１４％）、次いで２１番染色体のトリソミー（図中、「２＋１」と示す。）にピークが認められた（９％）。
【００８４】
また、Ｔａｕノックダウン単独では、ｐ５３及びＴａｕノックダウンと比較して程度は小さくなるものの（異数体：１８％）、同様な傾向（Ｘ染色体喪失：８％、２１番染色体トリソミー：５％）が認められた。
【００８５】
上述した実験例１〜４の結果から、Ｔａｕの減少（ＫＬ１／Ｔａｕ比の上昇）により細胞に紡錘体異常が生じ、染色体分配異常が起こり、癌化につながることが明らかとなった。また、ＮＡＰはＴａｕの減少（ＫＬ１／Ｔａｕ比の上昇）に起因する紡錘体の異常を抑制することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、細胞増殖阻害とは異なるメカニズムによる癌の予防又は治療剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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