(57)【要約】      （修正有）【課題】予測される部位特異的なタンパク質リン酸化陳述の発見のための方法を提供する。【解決手段】既知の部位特異的な陳述を記憶しているリン酸化データセット、キナーゼ・ファミリー・データベースおよびタンパク質配列データベースからのデータを使って、モチーフ・ベースのリン酸化陳述を生成する。モチーフ・ベースの陳述から陰性陳述を生成し、モチーフ・ベースの陳述を組み合わせることによって候補陳述を生成する。候補陳述の陰性陳述との組み合わせによって陰性候補陳述を生成する。候補陳述及び陰性候補陳述を統計的関係学習モデルにおいて使って候補陳述にスコア付けし、予測されるモチーフ・ベースのリン酸化陳述を保持する。タンパク質配列データベースからのデータ入力および一般化されたフォーマットでの予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を受け取り、部位特異的なフォーマットで予測された部位特異的なリン酸化陳述を生成する。【選択図】図１Ｂ
2018206374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予測される部位特異的なタンパク質リン酸化陳述の発見のためのシステムであって、陳述は、キナーゼ、予測されるリン酸化部位およびタンパク質基質をリンクするものであり、当該システムは：
モチーフ変換器であって、前記モチーフ変換器は：
既知の部位特異的な陳述であって、各部位特異的な陳述はキナーゼ、リン酸化部位およびタンパク質基質をリンクする部位特異的なフォーマットである、陳述、を記憶しているリン酸化データセット；
キナーゼ・ファミリー・データベース；および
タンパク質配列データベース
から入力を受け取るものであり、前記モチーフ変換器は、モチーフ・ベースのリン酸化陳述を生成するよう構成されており、各モチーフ・ベースのリン酸化陳述は、キナーゼ、リン酸化部位におけるおよび該リン酸化部位の両側におけるアミノ酸についての一般化されたスコア付け行列の形のモチーフおよびタンパク質基質をリンクする一般化されたフォーマットである、モチーフ変換器と；
新たなモチーフ・ベースの陳述を予測するリンク予測器であって、前記リンク予測器は：
前記モチーフ・ベースの陳述から陰性陳述を生成する陰性モチーフ・ベース陳述生成器；
前記モチーフ・ベースの陳述の組み合わせによって前記一般化されたフォーマットで候補陳述を生成し、前記候補陳述の前記陰性陳述との組み合わせによって陰性候補陳述を生成する候補生成器；および
前記候補陳述および前記陰性候補陳述を統計的関係学習モデルにおいて使って前記候補陳述にスコア付けし、予測されるモチーフ・ベースのリン酸化陳述を前記一般化されたフォーマットで保持する、関係学習器を含む、リンク予測器と；
前記タンパク質配列データベースから入力を受け取り、前記一般化されたフォーマットでの前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を受け取り、前記部位特異的なフォーマットで、予測された部位特異的なリン酸化陳述を生成するよう構成されている、部位特異的変換器とを有する、
システム。
【請求項２】
前記モチーフ変換器は：
それぞれの部位特異的な陳述を、前記キナーゼ・ファミリー・データベースにおけるキナーゼ・ファミリーと関連付ける段階と；
前記タンパク質配列データベースを使って、それぞれの部位特異的な陳述についてのリン酸化部位におけるアミノ酸および該リン酸化部位の両側における複数のアミノ酸のコンテキスト配列を形成する段階と；
前記コンテキスト配列を、キナーゼ・ファミリーによってグループ分けする段階と；
各キナーゼ・ファミリーにおけるコンテキスト配列について、一つまたは複数の位置特異的なスコア付け行列を計算する段階であって、それぞれの位置特異的なスコア付け行列は、コンテキスト配列長さの各位置における、各アミノ酸についてのスコアを与え、それぞれの位置特異的なスコア付け行列はモチーフを定義する、段階と；
各部位特異的な陳述について、その部位特異的な陳述についてのコンテキスト配列と、そのコンテキスト配列がグループ分けされているキナーゼ・ファミリーにおける各モチーフとの間の適合性を計算する段階と；
それぞれの部位特異的な陳述について、前記キナーゼと、最高パフォーマンスのモチーフと、前記タンパク質基質とをリンクするモチーフ・ベースの陳述を生成する段階とを実行するものである、
請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記陰性モチーフ・ベース陳述生成器は、陰性陳述を生成するためにモチーフ・ベースの陳述<K,M,S>における基質を異なる基質で置換すること、およびモチーフ・ベースの陳述におけるキナーゼを異なるキナーゼ・ファミリーからのキナーゼで置換すること、の一つまたは複数によって行なうことによって、陰性陳述を生成する、請求項１または２記載のシステム。
【請求項４】
モチーフ・ベースの陳述<K,M,S>における基質Sが異なる基質S'によって置換され、該異なる基質上の各リン酸化部位について、コンテキスト配列がモチーフ・ベースの陳述のモチーフと比較され、適合性が負であれば、陰性陳述<K,M,S'>が提供される、請求項３記載のシステム。
【請求項５】
モチーフ・ベースの陳述<K,M,S>におけるキナーゼKが異なるキナーゼK'によって置換され、キナーゼKと同じファミリーにない各キナーゼについて、陳述<K',M,S>が提供される、請求項３または４記載のシステム。
【請求項６】
前記陰性モチーフ・ベース陳述生成器は、前記陰性陳述および前記モチーフ・ベースの陳述を比較し、前記陰性陳述の一つおよび前記モチーフ・ベースの陳述の一つの両方として現われるいかなる陳述も、前記陰性陳述から削除するよう構成されている、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項７】
前記候補生成器における陰性陳述フィルタがさらに、候補陳述における各キナーゼおよびモチーフについて、前記キナーゼと、前記モチーフと、前記陰性陳述において前記キナーゼおよび前記モチーフに関連付けられたすべての基質との組み合わせとして、諸陰性候補陳述を生成する、請求項１ないし６のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項８】
前記候補生成器における陰性陳述フィルタがさらに、候補陳述における各モチーフおよび基質について、前記モチーフと、前記基質と、前記陰性陳述において前記基質および前記モチーフに関連付けられたすべてのキナーゼとの組み合わせとして、諸陰性候補陳述を生成する、請求項１ないし７のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項９】
前記陰性陳述フィルタは、陰性候補陳述から、前記陰性候補陳述の一つおよび前記候補陳述の一つの両方として現われるいかなる陳述も前記陰性候補陳述から破棄する、請求項６、７、８のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項１０】
前記関係学習器は、モチーフ・ベースの陳述および陰性陳述を入力し、これらの入力からモデルを学習するものであり、次いで、該モデルが、前記候補陳述および前記陰性候補陳述にスコア付けするために使われる、請求項１ないし９のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項１１】
前記候補生成器は、前記モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆるキナーゼと、前記モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆるモチーフと、前記モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆる基質との組み合わせから前記モチーフ・ベースの陳述自身を除いたものとして、候補陳述を生成する、請求項１ないし１０のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項１２】
前記関係学習器は、候補陳述と、同じキナーゼおよびモチーフをもつまたは同じモチーフおよび基質をもつすべての前記陰性候補陳述とをスコア付けし、ランク付けして、前記候補陳述のランクおよびスコアを出力する、請求項１ないし１１のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項１３】
タンパク質をその相互作用によってリンクするタンパク質コンテキスト・データベースから入力を受け取り、タンパク質コンテキスト陳述を、前記リンク予測器における使用のために生成するタンパク質陳述生成器をさらに有する、請求項１ないし１２のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項１４】
前記部位特異的変換器は：
前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を入力し；
それぞれの予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述について、リン酸化部位データベースから、可能なリン酸化部位のリストを抽出し；
それぞれのリン酸化部位について、前記タンパク質配列データベースから前記部位コンテキスト配列を抽出し、該部位コンテキスト配列の、前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述におけるモチーフとの適合性を計算し；
前記リン酸化部位についての適合性があらかじめ定義されたスコアより上であれる場合には、予測された部位特異的なリン酸化陳述を、前記予測されたモチーフ・ベースの陳述におけるキナーゼおよび基質を前記リン酸化部位とリンクする部位特異的なフォーマットで生成するよう構成されている、
請求項１ないし１３のうちいずれか一項記載のシステム。
【請求項１５】
予測される部位特異的なタンパク質リン酸化陳述の発見のための方法であって、陳述は、キナーゼ、予測されるリン酸化部位およびタンパク質基質をリンクするものであり、当該方法は：
既知の部位特異的な陳述であって、各部位特異的な陳述はキナーゼ、リン酸化部位およびタンパク質基質をリンクする部位特異的なフォーマットである、陳述、を記憶しているリン酸化データセット；
キナーゼ・ファミリー・データベース；および
タンパク質配列データベース
からのデータを使って、
モチーフ・ベースのリン酸化陳述を生成する段階であって、各モチーフ・ベースのリン酸化陳述は、キナーゼ、リン酸化部位におけるおよび該リン酸化部位の両側におけるアミノ酸についての一般化されたスコア付け行列の形のモチーフおよびタンパク質基質をリンクする一般化されたフォーマットである、段階を実行し；
前記モチーフ・ベースの陳述から陰性陳述を生成し；
前記モチーフ・ベースの陳述を組み合わせることによって前記一般化されたフォーマットで候補陳述を生成し；
前記候補陳述の前記陰性陳述との組み合わせによって陰性候補陳述を生成し；
前記候補陳述および陰性候補陳述を統計的関係学習モデルにおいて使って前記候補陳述にスコア付けし、予測されるモチーフ・ベースのリン酸化陳述を前記一般化されたフォーマットで保持し；
前記タンパク質配列データベースからのデータ入力および前記一般化されたフォーマットでの前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を受け取り、前記部位特異的なフォーマットで、予測された部位特異的なリン酸化陳述を生成することを含む、
方法。
【請求項１６】
予測が正しいかどうかを検証するために、物理的な実験室において、前記予測された部位特異的なリン酸化陳述によって予測されるリン酸化があるかどうかを試験することをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
コンピュータ装置上で実行されたときに請求項１５記載の方法を実行するコンピュータ・プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の間の部位特異的なリン酸化反応の発見のためのシステムおよび方法に関する。実施形態は、リン酸化データを知識グラフに変換し、該グラフを関連するコンテキスト情報によって補強し、その後、潜在的特徴モデルを使って予測することに基づく。
【０００２】
本発明は、システム生物学および分子生物学ならびに薬理学の分野において複数の応用をもつ。本発明は、主としてヒトのタンパク質およびキナーゼについて使われるが、適切なデータが利用可能なら他の種に適用されてもよい。
【背景技術】
【０００３】
リン酸化（分子へのホスホリル基（PO3）の付加）は、キナーゼ・タンパク質による特定の基質の翻訳後修飾であり、生きている細胞において多くの重要なシグナル伝達経路を駆動する普遍的なタンパク質相互作用である。リン酸化はしばしば、たとえば、細胞成長、分裂またはプログラム細胞死を調節する。これらの調節プロセスの混乱が、癌のような多くの深刻な疾病の主因である。よって、リン酸化は、システム生物学および分子生物学においてならびに薬理学において研究されている主要なトピックの一つである。
【０００４】
それでも、新たなリン酸化反応およびその機能の発見のペースはかなり緩慢である。主な理由の一つは、可能な部位特異的リン酸化の膨大な数の組み合わせである。この空間を探索することは、現代の高スループット技術を用いても難しい。もう一つの理由は、候補反応のどれが実際に細胞において生起し、有意な効果につながるかを確立することに、実験的な困難があることである。
【０００５】
また、既知のリン酸化部位への特定のキナーゼ結合を見出すこともいまだ困難である。よって、リン酸化予測のための計算ツールには大きな需要がある。だが、既存の手法には限界がある。いくつかの手法は、いくつかのキナーゼおよび／または選択された範囲の基質にのみ焦点を当てる。すべてのツールは、局所的なタンパク質特徴に基づいて予測を計算し、より広いネットワークのコンテキストを度外視する。重要なことに、従来技術のツールはいずれも、特定のキナーゼ／タンパク質について問い合わせすることによってリン酸化の予測を許容するものではない。これは、関心対象のキナーゼに関係した経路をねらいとする半自動的な実験計画のためのそれらのツールの潜在力を実質的に制限する。そうするためには、一般に、何千もの可能な基質についてツールに問い合わせする必要があるからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Maximilian  Nickel  et  al.、"A  review  of  relational  machine  learning  for  knowledge  graphs"、arXivプレプリント、arXiv:  1503.00759  (2015)
【非特許文献２】Matt  Gardner  and  Tom  M  Mitchell、"Efficient  and  Expressive  Knowledge  Base  Completion  Using  Subgraph  Feature  Extraction"、EMNLP.  2015,  pp.1488-149
【非特許文献３】Robert  West  et  al.、"Knowledge  Base  Completion  via  Search-based  Question  Answering"、Proceedings  of  the  23rd  International  Conference  on  World  Wide  Web.  WWW  ’14.  Seoul,  Korea.  ACM,  2014,  pp.515-526
【非特許文献４】https://en.wikipedia.org/wiki/Position_weight_matrix
【非特許文献５】http://meme-suite.org
【非特許文献６】https://academic.oup.com/nar/article/37/suppl_2/W202/1135092/MEME-Suite-tools-for-motif-discovery-and-searching
【非特許文献７】Frank  L  Hitchcock、"The  expression  of  a  tensor  or  a  polyadic  as  a  sum  of  products"、Studies  in  Applied  Mathematics  6.1-4  (1927),  pp.164-189
【非特許文献８】Bishan  Yang  et  al.、"Embedding  entities  and  relations  for  learning  and  inference  in  knowledge  bases"、arXivプレプリント  arXiv:1412.6575  (2014)
【非特許文献９】Maximilian  Nickel,  Volker  Tresp,  and  Hans-Peter  Kriegel、"A  three-way  model  for  collective  learning  on  multi-relational  data"、Proceedings  of  the  28th  international  conference  on  machine  learning  (ICML-11).  2011,  pp.809-816)
【非特許文献１０】Antoine  Bordes  et  al.、"Translating  embeddings  for  modeling  multi-relational  data"、Advances  in  neural  information  processing  systems.  2013,  pp.2787-2795)
【非特許文献１１】Theo  Trouillon  et  al.、"Complex  embeddings  for  simple  link  prediction"、arXivプレプリント  arXiv:1606.06357  (2016)
【非特許文献１２】Richard  Socher  et  al.、"Reasoning  with  neural  tensor  networks  for  knowledge  base  completion"、Advances  in  neural  information  processing  systems.  2013,  pp.926-934
【非特許文献１３】Maximilian  Nickel,  Lorenzo  Rosasco,  and  Tomaso  Poggio、"Holographic  embeddings  of  knowledge  graphs"、arXivプレプリント  arXiv:1510.04935  (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
部位特異的リン酸化候補の自動化された予測は、実験的に検証されるべき可能なリン酸化の空間を実質的に縮小する可能性があるので、大いに望まれている。これは、細胞シグナル伝達における発見率の大幅な上昇につながる可能性があり、それはひいては癌のような疾病の、より効率的な治療に寄与する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の側面のある実施形態によれば、予測される部位特異的なタンパク質リン酸化陳述の発見のためのシステム（または装置）が提供される。陳述（statement）は、予測されるリン酸化部位、タンパク質基質およびキナーゼをリンクする。本システムは：
既知の部位特異的な陳述であって、各陳述はキナーゼ、リン酸化部位およびタンパク質基質をリンクする部位特異的なフォーマットである、陳述、を記憶しているリン酸化データセット；
キナーゼ・ファミリー・データベース；および
タンパク質配列データベース
から入力を受け取るモチーフ変換器であって、
前記モチーフ変換器は、モチーフ・ベースのリン酸化陳述を生成するよう構成されており、各モチーフ・ベースのリン酸化陳述は、キナーゼ、リン酸化部位におけるおよび該リン酸化部位の両側におけるアミノ酸についての一般化されたスコア付け行列の形のモチーフおよびタンパク質基質をリンクする一般化されたフォーマットである、モチーフ変換器と；
新たなモチーフ・ベースの陳述を予測するリンク予測器とを有しており、前記リンク予測器は：
前記モチーフ・ベースの陳述から陰性の陳述を生成する陰性モチーフ・ベース陳述生成器；
前記モチーフ・ベースの陳述の組み合わせによって前記一般化されたフォーマットで候補陳述を生成し、前記候補陳述の前記陰性の陳述との組み合わせによって陰性候補陳述を生成する候補生成器；
前記候補陳述および前記陰性候補陳述を統計的関係学習モデルにおいて使って前記候補陳述にスコア付けし、予測されるモチーフ・ベースのリン酸化陳述を前記一般化されたフォーマットで保持する、関係学習器（relational  learner）；および
前記タンパク質配列データベースから入力を受け取り、前記一般化されたフォーマットでの前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を受け取り、前記部位特異的なフォーマットで、予測された部位特異的なリン酸化陳述を生成するよう構成されている、部位特異的変換器を含んでいる。
【０００９】
本システムは、既知の、手作業でキュレーションされたリン酸化のネットワーク全体に基づいて未知のリン酸化を予測することができる。基質およびキナーゼ問い合わせ両方に基づく予想が可能である。この手法は、現状技術のシステムに性能が勝り、たとえば、以前に知られていなかったヒトにおけるLATS1、AKT1キナーゼによる９個の実際のリン酸化を予測する。
【００１０】
本システムは、予測される部位特異的なタンパク質リン酸化陳述を取得する。該陳述は、キナーゼ、予測されるリン酸化部位およびタンパク質基質をリンクする。これら三つのエンティティをもつ部位特異的な陳述は、〈K（キナーゼ），Lもしくは部位，S（基質）〉として表現されてもよい。このリンクは、そのキナーゼを使う、その基質上での、その所与の部位における予測されるリン酸化相互作用を表わす。
【００１１】
モチーフ変換器は、既知の部位特異的な陳述であって、各陳述はキナーゼ、リン酸化部位およびタンパク質基質をリンクする部位特異的なフォーマットである、陳述、を記憶しているリン酸化データセットを受け取り、これらならびにキナーゼ・ファミリー・データベースおよびタンパク質配列データベースからの追加的な情報を使って、部位特異的な陳述をモチーフ・ベースのリン酸化陳述に変換する。これらは、キナーゼ、リン酸化部位におけるおよび該リン酸化部位の両側におけるアミノ酸についての一般化されたスコア付け行列の形のモチーフおよびタンパク質基質をリンクするという意味で、「一般化された」フォーマットになっている。これら三つのエンティティをもつ一般化された陳述は、〈K（キナーゼ），M（モチーフ），S（基質）〉として表現されてもよい。諸実施形態において、モチーフは、一般化された陳述が作成される前に提供され、それは入力の部位特異的な陳述のグループ化によって導出される（新たな型の）コンセンサス配列パターンとして見られてもよい。モチーフは、リン酸化部位のグループおよびそれらのアミノ酸コンテキストから学習される（一般に、タンパク質配列モチーフは、タンパク質配列の集合から学習される。前記部位およびそのコンテキストはそのようなタンパク質配列の集合の亜型である）。よって、モチーフ作成は、部位ごとのプロセスというより、グループ・プロセスとして見られてもよい。
【００１２】
リンク予測器は、単一のプロセスにおいて動作するとして、あるいは学習フェーズおよび予測フェーズを含むものとして見られてもよい。以下の記述は機能をこれら二つのフェーズに分ける。（新しい、モチーフ・ベースの陳述を予測するために）モデルを構築するために、リンク予測器は、前記モチーフ・ベースの陳述から陰性の陳述を生成する陰性モチーフ・ベース陳述生成器と；前記モチーフ・ベースの陳述の組み合わせによって前記一般化されたフォーマットで候補陳述を生成する候補生成器とを含む。前記候補生成器は、陰性候補陳述（該陳述のキナーゼを使って、該陳述の基質上で、該陳述のモチーフでリン酸化が生起することは期待されないことを示す）をも生成する。陰性候補は、モチーフ・ベースの候補陳述および陰性のモチーフ・ベースの陳述の組み合わせによって生成される。）陽性および陰性は、関係学習器を使ってリンク予測モデルをトレーニングするために必要とされる。最も性能のよいモデルが選択されてもよい。
【００１３】
関係学習器は、前記候補陳述および前記陰性候補陳述を統計的関係学習モデルにおいて使って前記候補陳述（および可能性としては前記陰性候補陳述）にスコア付けし、また可能性としてはランク付けする。これは、（検証された）入力データのトレーニング／試験／有効確認用に分けた部分を用いて前記モデル（単数または複数）をトレーニングすることにおいて使用されることができる。
【００１４】
予測フェーズでは、リンク予測器は、ユーザーによって入力された関心対象のタンパク質に対して、あるいはある範囲のタンパク質に対して、あるいはさらには全タンパク質に対して作用する。候補陳述および陰性候補陳述は前と同様に問い合わせに基づいて、一般化されたフォーマットで生成される（だが、問い合わせに基づいており、たとえば特定の問い合わせタンパク質の、リン酸化ネットワークとのあらゆる可能な相互作用をカバーする）。モデルによる候補陳述のスコア付けは、予測された陳述（最も確からしい未知のリン酸化）として、より高いスコア／ランクの陳述を保持することを許容する。
【００１５】
最後に、部位特異的変換器は、タンパク質配列データベースを使って、予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を部位特異的なフォーマットに変換する（好ましくは、可能なリン酸化部位についてのモチーフ適合性スコアを使って；該モチーフ適合性スコアは、モチーフと特定の配列との間の類似性の数学的指標）。この部位特異的フォーマットは、基質およびキナーゼとともに予測されるリン酸化位置の識別を許容するので、システムのユーザーによって要求される。それはその後さらに活用されてもよい。
【００１６】
モチーフ変換器は、それぞれの部位特異的な陳述を、キナーゼ・ファミリー・データベースにおけるあるキナーゼ・ファミリーと関連付け；
タンパク質配列データベースを使って、それぞれの部位特異的な陳述についてのリン酸化部位におけるアミノ酸および該リン酸化部位の両側における複数のアミノ酸のコンテキスト配列を形成し；
前記コンテキスト配列を、キナーゼ・ファミリーによってグループ分けし；
各キナーゼ・ファミリーにおけるコンテキスト配列について、一つまたは複数の位置特異的なスコア付け行列を計算してもよい。それぞれの位置特異的なスコア付け行列は、コンテキスト配列長さの各位置における、各アミノ酸についてのスコアを与え、それぞれの位置特異的なスコア付け行列はモチーフを定義する。
【００１７】
モチーフ変換器はさらに、
各部位特異的な陳述について、その部位特異的な陳述についてのコンテキスト配列と、そのコンテキスト配列がグループ分けされているキナーゼ・ファミリーにおける各モチーフとの間の適合性（conformance）を計算し；
それぞれの部位特異的な陳述について、前記キナーゼと、最高パフォーマンスのモチーフと、前記タンパク質基質とをリンクするモチーフ・ベースの陳述を生成してもよい。
【００１８】
コンテキスト配列およびモチーフは同じ長さであり、該長さは当該アミノ酸（リン酸化部位におけるアミノ酸）のそれぞれの側に3ないし21アミノ酸であってもよく、それぞれの側に7ないし15アミノ酸であってもよい。実のところ、0より大きな任意の整数が本技法とともに機能しうる。よって、潜在的には、当該位置のアミノ酸とそれぞれの側の一つの酸だけが使われることもできる。しかしながら、結果はきわめて大幅に異なってくる。この長さは当該諸方法の重要なハイパーパラメータであり、それぞれの側に7ないし15アミノ酸の長さが、たいていの状況において最も好適でありうるように思われる。非常に短いコンテキスト窓は良好な結果をもたらすとは思えない。窓はリン酸化部位を中心としている必要はない。通常、リン酸化部位の左側および右側の考慮されるアミノ酸の数は等しいが、一方の側のほうに、より多くのアミノ酸があってもよい。たとえば、左には3、右には5個のアミノ酸があって、全長9のコンテキスト配列を生成してもよい。
【００１９】
より詳細には、陰性陳述生成器は、陰性陳述を生成することを：モチーフ・ベースの陳述（<K,M,S>）における基質を異なる基質で置換すること、およびモチーフ・ベースの陳述におけるキナーゼを異なるキナーゼ・ファミリーからのキナーゼで置換すること、の一つまたは複数によって行なう。このように、陰性陳述を作成する二つの方法がある。
【００２０】
第一の方法では、モチーフ・ベースの陳述<K,M,S>における基質Sが異なる基質S'によって置換される。つまり、該異なる基質上の各リン酸化部位について、コンテキスト配列はモチーフ・ベースの陳述のモチーフと比較され、適合性が負であれば、陰性陳述<K,M,S'>が提供される。ちなみに、本稿において使われる陳述におけるエンティティの順序は任意であり、一貫して使われるならばいかなる順序も受け入れ可能であり、等価である。
【００２１】
第二の方法では、モチーフ・ベースの陳述<K,M,S>におけるキナーゼKが異なるキナーゼK'によって置換される。つまり、キナーゼKと同じファミリーにない各キナーゼについて、陳述<K',M,S>が提供される。
【００２２】
陰性陳述の生成において、陰性陳述およびモチーフ・ベースの陳述が比較されてもよく、陰性陳述の一つおよびモチーフ・ベースの陳述の一つの両方として現われるいかなる陳述も、陰性陳述から削除される。
【００２３】
候補生成器における陰性陳述フィルタが、次いで、候補陳述における各キナーゼおよびモチーフについて、前記キナーゼと、前記モチーフと、前記陰性陳述において前記キナーゼおよび前記モチーフに関連付けられたすべての基質との組み合わせとして、諸陰性候補陳述を生成してもよい。
【００２４】
陰性陳述フィルタはまた、候補陳述における各モチーフおよび基質について、前記モチーフと、前記基質と、前記陰性陳述において前記基質および前記モチーフに関連付けられたすべてのキナーゼとの組み合わせとして、諸陰性候補陳述を生成してもよい。よって、使用されうる、陰性候補陳述を生成する二つの方法がある。
【００２５】
陰性陳述フィルタは、陰性候補陳述から、陰性候補陳述の一つおよび候補陳述の一つの両方として現われるあらゆる陳述を破棄してもよい。
【００２６】
関係学習器は、モチーフ・ベースの陳述および陰性陳述からモデルを学習してもよく、次いで、該モデルを、候補陳述および陰性候補陳述にスコア付けするために使ってもよい。
【００２７】
候補生成器は、モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆるキナーゼと、モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆるモチーフと、モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆる基質との組み合わせ（デカルト積）からモチーフ・ベースの陳述自身を除いたものとして、候補陳述を生成してもよい。これらの候補は、モデルのトレーニングにおいては使われず、のちに、ひとたびモデルが生成された後に、スコア付けされるだけである。
【００２８】
これを行なうために、関係学習器は、候補陳述と、同じキナーゼおよびモチーフをもつまたは同じキナーゼおよび基質をもつすべての陰性候補陳述とをスコア付けし、ランク付けして、候補陳述のランクおよびスコアを出力してもよい。
【００２９】
タンパク質陳述生成器は、タンパク質をその相互作用によってリンクするタンパク質コンテキスト・データベースから入力を受け取ってもよく、タンパク質コンテキスト陳述を、リンク予測器における使用のために生成してもよい。この追加的情報は、システムにおいて使われる知識を拡充する。
【００３０】
部位特異的変換器は：
予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を入力し；
それぞれの予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述について、リン酸化部位データベースから、可能なリン酸化部位のリストを抽出し；
それぞれのリン酸化部位について、タンパク質配列データベースから部位コンテキスト配列を抽出し、該部位コンテキスト配列の、予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述におけるモチーフとの適合性を計算し；
リン酸化部位についての適合性があらかじめ定義されたスコア（たとえば0）より上であれば、予測された部位特異的なリン酸化陳述を、部位特異的なフォーマットで生成してもよい。該フォーマットは、前記予測されたモチーフ・ベースの陳述におけるキナーゼおよび基質を、リン酸化部位とリンクする。
【００３１】
本発明の第二の側面のある実施形態によれば、予測される部位特異的なタンパク質リン酸化陳述の発見のためのコンピュータ実装される方法が提供される。陳述は、予測されるリン酸化部位、タンパク質基質およびキナーゼをリンクする。本方法は：
既知の部位特異的な陳述であって、各陳述はキナーゼ、リン酸化部位およびタンパク質基質をリンクする部位特異的なフォーマットである、陳述、を記憶しているリン酸化データセット；
キナーゼ・ファミリー・データベース；および
タンパク質配列データベース
からのデータを使って、
モチーフ・ベースのリン酸化陳述を生成する段階であって、各モチーフ・ベースのリン酸化陳述は、キナーゼ、リン酸化部位におけるおよび該リン酸化部位の両側におけるアミノ酸についての一般化されたスコア付け行列の形のモチーフおよびタンパク質基質をリンクする一般化されたフォーマットである、段階と；
前記モチーフ・ベースの陳述から陰性陳述を生成する段階と；
前記モチーフ・ベースの陳述を組み合わせることによって前記一般化されたフォーマットで候補陳述を生成する段階と；
前記候補陳述の前記陰性陳述との組み合わせによって陰性候補陳述を生成する段階と；
前記候補陳述および陰性候補陳述を統計的関係学習モデルにおいて使って前記候補陳述にスコア付けし、予測されるモチーフ・ベースのリン酸化陳述を前記一般化されたフォーマットで保持する段階と；
前記タンパク質配列データベースからのデータ入力および前記一般化されたフォーマットでの前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を受け取り、前記部位特異的なフォーマットで、予測された部位特異的なリン酸化陳述を生成する段階とを実行することを含む。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態に基づく方法は、前記装置またはコンピュータ・プログラム側面の任意の組み合わせを含みうる。さらなる実施形態に基づく方法またはコンピュータ・プログラムは、処理およびメモリ機能を要求するという点でコンピュータ実装されるものとして記述されてもよい。
【００３３】
好ましい実施形態に基づく装置は、単にある種の機能を実行するよう構成または配置される、あるいは単に実行「する」と記述される。この構成または配置は、ハードウェアまたはミドルウェアまたは他のいかなる好適なシステムを使用によってであることもできる。好ましい実施形態では、構成または配位はソフトウェアによる。
【００３４】
このように、ある側面によれば、少なくとも一つのコンピュータにロードされるとき、該コンピュータに、上記の装置定義の任意のものまたはその任意の組み合わせに基づく装置にならせるプログラムが提供される。
【００３５】
さらなる側面によれば、少なくとも一つのコンピュータ上で実行されたときに前記少なくとも一つのコンピュータを、上記の方法定義の任意のものまたはその任意の組み合わせに基づく方法段階を実行するよう構成するプログラムが提供される
一般に、コンピュータは、定義される機能を提供するよう構成または配置されているものとしてリストされる要素を含んでいてもよい。たとえば、コンピュータは、メモリ、処理およびネットワーク・インターフェースを含んでいてもよい。
【００３６】
本発明は、デジタル電子回路において、またはコンピュータ・ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアまたはそれらの組み合わせにおいて実装されてもよい。本発明は、一つまたは複数のハードウェア・モジュールによる実行のためまたは一つまたは複数のハードウェア・モジュールの動作を制御するためのコンピュータ・プログラムまたはコンピュータ・プログラム・プロダクト、すなわち、非一時的な情報担体に、たとえば機械可読記憶デバイスに、または伝搬される信号において、有体に具現されたコンピュータ・プログラムとして実装されてもよい。
【００３７】
コンピュータ・プログラムは、スタンドアローンのプログラム、コンピュータ・プログラム部分または二つ以上のコンピュータ・プログラムの形であってもよく、コンパイルされるまたはインタープリットされる言語を含むいかなる形のプログラミング言語で書かれてもよく、スタンドアローンのプログラムとして、あるいはモジュール、コンポーネント、サブルーチンまたはデータ処理環境において使うのに好適な他の単位としてを含め、任意の形で展開されてもよい。コンピュータ・プログラムは、一つのサイトにおいて一つのモジュール上または複数のモジュール上で実行されるよう配備されてもよく、あるいは複数のサイトを横断して分散され、通信ネットワークによって相互接続されてもよい。
【００３８】
本発明の方法段階は、入力データに対して作用して出力を生成することによって本発明の機能を実行するようコンピュータ・プログラムを実行する一つまたは複数のプログラム可能なプロセッサによって実行されてもよい。本発明の装置は、プログラムされたハードウェアとして、またはたとえばFPGA（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはASIC（特定用途向け集積回路）を含む特殊目的の論理回路として実装されてもよい。
【００３９】
コンピュータ・プログラムの実行のために好適なプロセッサは、例として、一般的および特殊目的両方のマイクロプロセッサおよび任意の種類のデジタル・コンピュータの任意の一つまたは複数のプロセッサを含む。一般に、プロセッサは、読み出し専用メモリまたはランダム・アクセス・メモリまたは両方から命令およびデータを受け取る。コンピュータの本質的な要素は、命令およびデータを記憶するための一つまたは複数のメモリ・デバイスに結合された、命令を実行するためのプロセッサである。
【００４０】
本発明は、個別的実施形態を用いて記述される。他の実施形態が以下の請求項の範囲内である。たとえば、本発明の段階は異なる順序で実行されて、それでいて望ましい結果を達成してもよい。複数の試験スクリプト・バージョンが編集され、オブジェクト指向プログラミング技術を使うことなく、単位として呼び出されてもよい。たとえば、スクリプト・オブジェクトの諸要素が構造化されたデータベースまたはファイル・システムにおいて組織化されてもよく、スクリプト・オブジェクトによって実行されるものとして記述される動作は試験制御プログラムによって実行されてもよい。
【００４１】
本発明の要素は、用語「変換器」、「予測器」、「生成器」、「学習器」などを使って記述されてきた。当業者は、そのような機能的な用語およびユニットの用語で表現されるその等価物が、空間的には別個だが組み合わさって定義される機能を提供するシステムの諸部分を指してもよいことを認識するであろう。同じく、システムの同じ物理的部分が定義される機能の二つ以上を提供してもよい。
【００４２】
たとえば、別個に定義される手段が、適宜、同じメモリおよび／またはプロセッサを使って実装されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明の好ましい特徴についてこれから、純粋に例として、付属の図面を参照して記述する。
【図１Ａ】システム概観のブロック図である。
【図１Ｂ】一般的実施形態における方法のフローチャートである。
【図１Ｃ】より詳細なシステム概観のブロック図である。
【図２】本発明の一般的実施形態の、リンク予測ユニット／予測器内の主要なシステム・コンポーネントを含むブロック図である。
【図３】モチーフ・ベースの陳述への変換器の図である。
【図４】モチーフ発見ユニットのフローチャートである。
【図５】モチーフ・ベース陳述生成器のフローチャートである。
【図６】タンパク質コンテキスト陳述を加えるための知識ベース拡充ユニットのブロック図である。
【図７】生成ユニットのタンパク質コンテキスト陳述のフローチャートである。
【図８】リンク予測ユニットのブロック図である。
【図９】陰性モチーフ・ベース陳述生成ユニットのフローチャートである。
【図１０】陰性タンパク質コンテキスト陳述生成ユニットのフローチャートである。
【図１１】候補生成ユニットのブロック図である。
【図１２】陽性候補陳述生成ユニットのフローチャートである。
【図１３】陰性候補陳述生成ユニットのフローチャートである。
【図１４】関係学習ユニットのフローチャートである。
【図１５】部位特異的な陳述への変換ユニットのブロック図である。
【図１６】部位特異的な陳述への変換ユニットのフローチャートである。
【図１７】リン酸化予測システムのトレーニングのフローチャートである。
【図１８】特定のリン酸化予測システムを使って予測を行なうフローチャートである。
【図１９】予測されたリン酸化の部分集合の質量分析器確認の三つのプロットのグループである。
【図２０】実施形態の方法を実行するためのコンピューティング装置のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
リン酸化予測に向けたたいていの現行の手法は、リン酸化予測問題に対する概念的に似通った手法をもつ傾向がある。それらは典型的には潜在的なリン酸化部位についてのデータセット（これは、質量分析のような技法のため、大量に入手するのが比較的簡単かつ安価である）を出発点とする。それらは次いで、潜在的なリン酸化部位を含んでいる基質を同定する（通例、比較的少数の可能な部位／基質組み合わせにのみ焦点を当てる）。最後の段階は、それらの基質においてこれらの部位を標的とすることのできるキナーゼ（タンパク質をリン酸化するために使われる酵素）の同定である。個々の従来技術は個別的段階の厳密な方法論において異なるが、一般的な手法においてはそれほど違わない。同じ一般的な手法を使う主な理由は、比較的最近まで、リン酸化を予測することに適用可能な他の型のデータがなかったので、これが可能性としては問題に対する唯一のもっともらしい手法であったということである。しかしながら、この十年間で、いくつかの大規模な、機械可読であり、手作業でキュレーションされたリン酸化ネットワーク・データセットが利用可能になった。これらのデータセットは、グラフ・データベースとしても知られる知識グラフの形のすべての部位特異的なリン酸化関係の現行の知識のまとめを呈する。知識ベース完成（knowledge  base  completion）または知識融合（knowledge  fusion）のような他のドメインにおいて示されたように、そのような知識ベースの潜在的な構造は典型的には多くの新たな発見を生じうるので、これは貴重な情報源である。発明者らは、この知識グラフがコンテキスト情報の他の関連する源（たとえばタンパク質相互作用ネットワーク）と容易に組み合わされることもありうることを認識した。このことは、リン酸化予測のために従来技術によって典型的に使われるデータセットに対するさらなる利点である。それでも、現在のところ、新たなリン酸化を予測するためにこの型の情報を利用することのできる既存の技法はない。
【００４５】
グラフ・データベース／知識グラフは、さまざまな分野における大量の構造化されたおよび構造化されていないデータを格納しうる大規模な「意味ネットワーク（semantic  networks）」を維持するために使われてもよい。グラフ・データは、多次元配列として、あるいは他のシンボルにリンクされたシンボルとして、メモリに記憶されてもよい。グラフ表現のもう一つの形は「多項組」〔タプル〕の使用である。多項組は、それぞれが一様リソース識別子（URI:  Uniform  Resource  Identifier）のような指定された型であるオブジェクトの有限のシーケンスまたは順序付けられたリストである。多くのデータ・ストアがするように、知識ベース自身が多項組を格納のために利用してもよい。n個のオブジェクトを含む多項組は「n項組」〔nタプル〕として知られる。ここで、nは0より大きい任意の負でない整数である。長さ2の多項組（二項組）は通例ペア〔対〕と呼ばれ、三項組はトリプルと呼ばれ、四項組はクワドループルと呼ばれる、などとなる。
【００４６】
三項組は最も一般的に使われる多項組の一つである。それぞれの三項組は、主語‐述語‐目的語（s-p-o）陳述または関係として視覚化されてもよい。三項組は、リソース記述フレームワーク（RDF:  Resource  Description  Framework）三項組であってもよい。リソース記述フレームワークは、意味ネットワークのための標準である情報の概念的な記述またはモデル化のための一般的な方法である。意味ネットワークにおける情報のモデル化を標準化することは、一般的な意味ネットワークで動作するアプリケーションどうしの間の相互運用性を許容する。RDFは、RDFにおける語彙を記述するための言語としてRDFスキーマ（RDFS）を提供することによって、曖昧さのない形式的意味をもつ語彙を維持する。
【００４７】
RDFグラフ／三項組は、SPARQL（SPARQL  Protocol  and  RDF  Query  Language［SPARQLプロトコルおよびRDFクエリー言語］）を使って問い合わせ（アクセス）されてもよい。それは、ワールドワイドウェブ・コンソーシアムのRDFデータ・アクセス作業部会（DAWG:  Data  Access  Working  Group）によって標準化されたものであり、主要なセマンティック・ウェブ技術と考えられている。
【００４８】
発明者らは、関連する生物学的知識をまとめる知識グラフからの新たなリン酸化の予測は、（発明者らが同定した）以下の技術的課題に関連しうるとの認識に至った。
【００４９】
技術的課題A)  知識グラフとして表わされた既知のリン酸化および関係したコンテキスト情報の潜在力を等閑視する。リン酸化知識ベースおよびタンパク質ネットワークは、グラフ統計パターンおよび規則性、たとえば種々の関係型からなるタンパク質の鎖にわたる自己相関、ブロック構造、グローバルおよび長距離の統計的依存性を呈する。これらのパターンは、既知の、キュレーションされたデータセットからの効果的なリン酸化予測のための基礎として使用されうる。しかしながら、そのようなパターンのできるだけ多くの組み合わせを学習する予測モデルを設計することは、リン酸化のコンテキストにおいては、ストレートにはできない。これは、成功裏の解法のためには、生物学、バイオインフォマティクスおよび関係機械学習の多様な分野からの手法が自明でない仕方で組み合わされる必要があるという事実のためである。
【００５０】
技術的課題B)  コンテキスト依存ネットワークから学習することのできるツールの欠如。リン酸化知識グラフは型のない二項関係から構成されるが、これらはコンテキスト（すなわち、リン酸化部位）に依存する。このことは、現状技術の機械学習モデルでのストレートな処理を妨げる。これらのモデルは、コンテキストのない、型のある二項関係に対して機能するよう設計されているからである。よって、モデルが機能するためには、コンテキスト情報が関係型に変換される必要がある。この文脈において、型のある（typed）関係とは、エンティティAとB（たとえばタンパク質）の間のペアごとの関係であって、関係が特定の型R（たとえばリン酸化または阻害）のものである関係であり、型のない（untyped）関係とは、エンティティAとB（たとえばタンパク質）の間のペアごとの関係であって、関係の型が指定されていない関係である（すなわち、AとBが何らかの仕方で関連しているという事実のほかは何も述べない陳述）。
【００５１】
技術的課題C)  リン酸化知識グラフのための標準的な陰性陳述生成技法の不適切さ。知識グラフのマイニング（たとえば統計的な関係学習）のために典型的に使われる機械学習モデルは、陰性の例を要求する。陰性（negative）の例は、多くの現実的な使用事例においては、開世界仮説（欠けている知識は陰性であるとして扱うべきではなく、単に未知であるとして扱うべき）のため、確立するのが難しい。これは、リン酸化でも成り立つ（現在のデータセットにおいて表現されていない陳述は、可能性としては単にまだ発見されていないリン酸化を表わしていることがありうるので、陰性であると単純に解釈することはできない）。
【００５２】
発明者らの知る限り、新たなリン酸化を予測するためにリン酸化知識グラフを利用することのできるバイオインフォマティクスの技法はない。さらに、上記で呈示した技術的課題を解決した者はない。より具体的には：
技術的課題Aは解決されていない。従来技術は、リン酸化予測に対する伝統的な手法（部位を出発点とし、可能性の高い基質およびキナーゼをそれに関連付けていく）を採用しているからである。リン酸化を表現するグラフ様の構造はしばしば従来技術の方法の出力であるが、主要な入力ではない。よって、これらの研究は、リン酸化ネットワークとして表現された、利用可能な手作業でキュレーションされた知識を考慮に入れることができない。これらの研究はまた、このデータを、前記予測をするために非常に有益でありうる他のグラフ様データ（たとえばタンパク質相互作用）と容易に組み合わせることができない。
【００５３】
他の研究はいずれも、グラフ・ベースの手法を用いてリン酸化予測に取り組むものではない。よって、型のないコンテキスト依存のリン酸化データセットを、型のある、コンテキスト独立の関係から構成されるアクショナブルな（actionable）知識グラフに変換する既存の解決策はない。よって、技術的課題Bについての現在提案されている従来技術の解決策はない。
【００５４】
開世界仮説のもとでもっともらしい陰性の例を生成するための技法は現状技術において提案されている。だが、これらの技法は一般に、実社会において陽性であるいくつかの陰性の陳述を理論的に生成しうるので、リン酸化のコンテキストにおいては信頼できない。これは予測モデルのパフォーマンスを深刻に阻害することがありうる。リン酸化部位の陰性の例を生成するための既存の手法があるが、リン酸化陳述全体の陰性の例に関する従来技術はない。
【００５５】
実施形態は、技術的課題AないしCの一つまたは複数を解決または緩和しうる。
【００５６】
課題を解決するための技術的解決策
序
実施形態は、部位特異的なリン酸化反応のコンピューティングによる発見に向けた新たな手法を提示する。本手法は、知識グラフと、関係学習と、キナーゼ・ファミリーのコンセンサス・モチーフを使うリン酸化データの変換とを組み合わせる。実施形態は、技術的課題A)、B)またはC)のいずれかまたは全部を次のように解決しうる。
【００５７】
A)  統計的な関係学習を採用することにより、実施形態は、リン酸化ネットワーク全体および追加的なコンテキスト情報を包括的な知識グラフ（comprehensive  knowledge  graph）として考慮に入れうるので、技術的課題Aを解決しうる。この手法は、データに隠れている統計的なパターンを利用するとともに、位置の個別的な関係の存在を活用して、新たなリン酸化を予測しうる。たとえば、本システムは、種々の関係型をもつタンパク質の鎖にわたる長距離の統計的依存性を活用してもよい。従来技術はいずれも、そのようなことはしていなかった。
【００５８】
B)  技術的課題Bを解決する（すなわち、コンテキスト依存のリン酸化グラフを処理できるモデルがなかったことを克服する）ために、実施形態は、リン酸化データセットを型のある二項関係に変換してもよい。型は、特定のキナーゼ・ファミリーによって好まれる基質配列モチーフの発見に基づく。これらのモチーフは、配列間の構造における類似性をグループ化する二次構造であり、リン酸化部位のコンテキストから抽出される。リン酸化部位のコンテキストとは、リン酸化部位をなすアミノ酸の両側のアミノ酸（より厳密には、アミノ酸残基）である。リン酸化部位コンテキストは、部位コンテキスト配列と最もよい適合性をもつ諸モチーフに対応する諸述語に変換される。これらの述語は、異なる陳述を横断して有意に比較され、よって現状技術の統計的関係学習をサポートしうる、部位コンテキスト情報の一般化を提供する。
【００５９】
C)  発明実施形態は、誤った結果を生じうる（技術的課題C）標準的な方法を使うのではなく、リン酸化の実際の生物学的特性に基づいてリン酸化陳述についての陰性陳述を生成してもよい。この解決策は、述語モチーフに関する基質配列の負の適合性と、異なるファミリーからのキナーゼが異なる部位において異なる基質に結合する傾向があるという事実とを利用する。
【００６０】
システムの概観
図１Ａは、一般的な実施形態の概観を呈示している。システム１０１の図に存在するコンポーネントは次のとおり。
【００６１】
・リン酸化データセットまたはネットワーク１０２がコンポーネント１０５（変換器）への入力として提供される。これは、基質アミノ酸配列における所与の位置におけるタンパク質キナーゼとタンパク質基質との間のリン酸化相互作用の記述からなっていてもよい。各相互作用は〈タンパク質キナーゼ，リン酸化部位の位置，タンパク質基質〉の形の陳述（または三項組）として表現されてもよいことが想定される。
【００６２】
・タンパク質配列データベース１０３は、モチーフ・ベースの陳述への変換器１０５および部位特異的な陳述への変換器１１３のための入力として提供されてもよい。最低限、このデータベースは、タンパク質アミノ酸配列についての情報からなる。それぞれのタンパク質エントリーが少なくとも次の情報〈タンパク質，基質配列〉を含みうることが想定される。たとえば、〈P04637,  MEEPQSDPSVEPPLSQETFS….〉といった具合である。
【００６３】
・キナーゼ・ファミリー・データベース１０４はモチーフ変換器１０５への入力として提供される。これは、すべてのタンパク質キナーゼからその対応するキナーゼ・ファミリーへのマッピングからなる。マッピングは〈タンパク質キナーゼ，キナーゼ・ファミリー〉の形で表わされることが想定される。
【００６４】
・モチーフ・ベースの陳述への変換のためのモチーフ変換器１０５は、部位特異的な陳述からなるリン酸化ネットワークを、一般化されたモチーフ・ベースの陳述１０９に変換する。これについてはのちにより詳細に説明する。モチーフは、一つまたは複数のタンパク質に関係する（アミノ酸の）共通またはコンセンサス配列パターンである。
【００６５】
・モチーフ・ベースの陳述１０９は、（アクショナブルな）モチーフ・ベースの述語をもつ、変換されたリン酸化陳述である。一緒になって、それらは知識グラフを形成する。
【００６６】
・リンク予測器／予測ユニット１１１は、新しいモチーフ・ベースのリン酸化陳述の予測を扱う。これは、モチーフ・ベースの陳述から新たな候補を生成する候補生成器２０３と、学習モデルにおいてそれらの候補陳述を使って、それらにスコア付けし、こうして前記候補陳述の部分集合である、予測される陳述の集合を提供する関係学習器２０４とを使う。出力陳述は、モデルがそれらを関連付ける信頼レベルに基づいてスコア付けされてもよい。そのような重みは、陳述と一緒に（たとえば同じ多項組において）提供されてもよい。
【００６７】
・部位特異的な陳述への変換のための部位特異的変換器１１３は、予測されたモチーフ・ベースの陳述を、その後エンドユーザー（たとえば生物医学者）によって自分の目的のために処理されうる、部位特異的なリン酸化陳述の「標準的」フォーマットに変換する。このコンポーネントは、リンク予測器１１１によって生成されたいかなるスコアも保存し、可能性としては、該スコアを変換プロセスに固有のスコアを用いて補強する。その結果、予測される部位特異的なリン酸化の陳述１１４が構築される。
【００６８】
・予測される部位特異的なリン酸化陳述１１４は、〈タンパク質キナーゼ，リン酸化部位位置，タンパク質基質，［スコア］〉の形の陳述のリスト（単数または複数）であってもよい。各陳述は、リンク予測器１１１および部位特異的変換器１１３によって生成されるスコアの集合を含んでいてもよい。これらのスコアは、結果をランク付けするために使われてもよい（もちろん、ランキングは、実際のリン酸化に対応する可能性が最も高い諸陳述を決定するために使われてもよい）。
【００６９】
図１Ａに描かれる実施形態の一つの発想は、リンク予測技術を使って、既知のリン酸化データおよび潜在的にはまた、関係したコンテキスト・データを、モチーフ・ベースの陳述１０９の知識グラフとして処理することである。この手法は、以前に未知であった（予測された）リン酸化陳述１１４を与えうる。予測モデルは、公に利用可能なリン酸化およびタンパク質相互作用ネットワーク（たとえばPhosphoSitePlus）上でトレーニングされることができる。部位特異的なリン酸化陳述と、部位情報を一般化する述語をもつ陳述との間の双方向の変換は、リン酸化ネットワークを知識グラフとして扱うことを許容する。変換は、諸キナーゼ・ファミリーによって好まれるコンセンサス部位モチーフを識別することに基づく。変換されたデータは、候補リン酸化反応を発見するためのリンク予測の使用を許容する――統計的関係学習における近年の進歩である。
【００７０】
部位特異的な（すなわちタンパク質部位コンテキストに依存する）陳述のアクショナブルな述語（すなわちリンク）への変換は、リン酸化部位の（モチーフとしての）一般化に基づく。これらの型の陳述の間の変換は、二つの変換器によって実現され、タンパク質およびリン酸化部位についての補助情報を使ってもよい。実施形態は、入力データに存在するキナーゼおよび基質と、入力データから生成されるモチーフに対応する部位とを含む任意の陳述を生成し、スコア付けすることができてもよい。これは、入力データに存在する任意のタンパク質に対して幅広い範囲の予測を生成するために使用できる。
【００７１】
図１Ｂは、一般的な発明実施形態の方法を描いているフローチャートである。段階Ｓ１０では、モチーフ・ベースの陳述<K,M,S>が、<K,部位,S>の形の陳述をもつリン酸化データセットの入力から生成される。これを行なうために、本方法は、キナーゼがグループ化されるファミリーを示すキナーゼ・データならびにタンパク質についての配列を与えるタンパク質配列データを使う。段階Ｓ１０で生成されたモチーフ・ベースの陳述から、段階Ｓ２０において、異なる陳述からのキナーゼ、モチーフおよび基質を組み合わせることによって、候補配列が生成される。これは、各キナーゼが各モチーフおよび各基質と組み合わされるという意味で、デカルト積のようでありうる。段階Ｓ３０では、陰性候補が生成される。これは、モチーフ・ベースの陳述を否定にして、次いで可能性としてはデカルト積を使った組み合わせを使うことによる。否定の好ましい方法はのちに詳述する。
【００７２】
段階Ｓ４０では、候補陳述が（陰性の候補陳述も使って）スコア付けされ、高めのスコアの候補陳述のみが、予測されたモチーフ・ベースの陳述として保持される。
【００７３】
最後に段階Ｓ５０においては、タンパク質配列データが入力されて、モチーフ・ベースの陳述が<K,部位,S>の形の予測された部位特異的な陳述に変換できる。
【実施例１】
【００７４】
リン酸化についての既存の知識（すなわち、部位特異的なリン酸化陳述）の例は：<P04049,  S99,  Q92934>,  <P23588,  S497,  P04049>,  <P04049,  259,  04049>である。これらの陳述において、第一の要素はキナーゼ・タンパク質（リン酸化「動作者（agent）」）に対応し、第三の要素は基質タンパク質（リン酸化「受動者（patient）」）に対応する。第二の要素は、基質アミノ酸配列におけるリン酸化部位に対応する。部位識別子は、アミノ酸残基（文字によって示される）および基質配列における残基の位置（数字によって示される）から構成される。
【００７５】
上記の陳述におけるP04049はRAF1という、癌に関係した多くの経路に関わる重要なヒトの調節キナーゼを指す。これらの例は、いかにキナーゼが基質としても作用し、よっていわゆるリン酸化カスケードに参加しうるかを示す。キナーゼは、フィードバック・ループにおいて自らをリン酸化してもよい。
【００７６】
生物学者がRAF1/P04049が基質Q92915をリン酸化できるかどうかを見出すことを望んでいるとする。基質Q92915は繊維芽細胞増殖因子14というあまりよく理解されていないタンパク質を指し、これは神経系の発達に、および可能性としては関係した悪性腫瘍にも関わっていると疑われている。
【００７７】
既存の技法は、単に上記のような陳述のリスト（すなわち知識グラフ）だけを与えられたのでは、何も予測できない。既存の技法は典型的には、タンパク質およびリン酸化部位データベースから構築されるカスタム・データセット、手作業で処理された特徴および陽性／陰性の例のバッチを要求する。
【００７８】
しかしながら、実施形態は、公共に利用可能なリソースからのデータを純粋に自動的に処理して、<P04049,T190,Q92915>のような予測をもたらす。これはその後、生物学者によって、シミュレーションや数学的探求ではない物理的な実社会の研究室であるウェットラボで処理されてもよい■。
【実施例２】
【００７９】
しかしながら、リンク予測ユニット１１１は、意味のある予測を生成できるためには、リン酸化部位情報ではなく、アクショナブルな述語をもつ陳述を要求する。<P04049,  S99,  Q92934>のような陳述を用いたリンク予測における従来技術を使うと、意味のない結果が与えられる。タンパク質Q92934内のS99は一般に、他の何らかのタンパク質におけるS99とは全く異なる何かを意味するからである。これは、S99が単に基質タンパク質配列における特定の位置へのポインターであって、異なるタンパク質を横断して一般化されうる何か（リンク予測の範囲におけるアクショナブルな述語についての主要な要件）ではないという事実のためである。
【００８０】
よって、発明者らは、陳述は、意味のある結果を生成するためには、リンク予測の前後において変換される必要があることを認識した。リンク予測によって意味のある仕方で処理されうる内部フォーマットに変換された陳述の例は、<P04049,  TKL2,  Q92934>である。ここで、TKL2は複数のリン酸化部位についての情報を一般化し、よって異なる基質タンパク質を横断して比較されうる述語を指す。
【００８１】
このことは技術的課題Bに対処するものであり、図１Ａにおいて部位特異的と一般化（モチーフ・ベース）との間を接続する変換器１０５、１１３によって扱われる。変換プロセスにおけるさらなる技術的な詳細の例は、個々のコンポーネントの記述の後に与える■。
【００８２】
図１Ｃは、より具体的な実施形態の概観である。上記の図１Ａについてすでに述べた部分に加えて、図１Ｃは以下のコンポーネントを含んでいる。
【００８３】
・タンパク質コンテキスト知識グラフ１０６がコンポーネント１０７（タンパク質コンテキスト陳述生成器）への入力として提供されている。これは、追加的なタンパク質‐タンパク質相互作用のような、タンパク質キナーゼおよびタンパク質基質に関係した陳述からなる。知識グラフは多項組〈subject,relation,object〉の形で表現されると想定される。これは、主語（subject）および目的語（object）エンティティがrelationという関係（たとえば両者が結合する）をもつことを示している。
【００８４】
・タンパク質コンテキスト陳述生成ユニット１０７は、モチーフ・ベースの陳述のタンパク質キナーゼおよび基質の部分についてのタンパク質コンテキスト知識グラフからの追加的な陳述を抽出する。これは、多項組<subject,relation,object>の形で表わされる、部位特異的な陳述があるタンパク質についての、タンパク質コンテキスト陳述の構築につながる。
【００８５】
・タンパク質コンテキスト陳述１０８  タンパク質コンテキスト知識グラフ１０６からの選択された三項組であり、モチーフ・ベースの陳述１０９に由来するタンパク質キナーゼおよびタンパク質基質についての追加的なコンテキスト情報を表わす。
【００８６】
・関心対象タンパク質１１０  関心対象のキナーゼおよび基質タンパク質がコンポーネント１１１（リンク予測器）への入力として提供されてもよい。この入力は、ユーザーが予測（たとえばキナーゼが与えられたときにどの基質がどの特定の部位でリン酸化する可能性があるかについての情報）を得たい一つまたは複数のタンパク質のリストからなっていてもよい。この入力が与えられなければ、予測は、入力データに存在するキナーゼおよび基質によって誘導されるあらゆる可能なリン酸化の集合に対して計算されうる。
【００８７】
・リン酸化部位データベース１１２がコンポーネント１１３のための入力として提供されてもよい。これは、タンパク質基質のすべての潜在的なリン酸化部位についての情報からなる。各タンパク質エントリーは、少なくとも次の情報〈タンパク質，リン酸化部位のリスト〉を含むと想定される。たとえば、<P04637,[S106,T523,...]>といった具合である。
【００８８】
技術的課題Cを解決する実施形態の手法が、図２に示されている（図２は、図１のリンク予測器１１１で使われうるコンポーネントのさらなる詳細を与えている）。図に存在するコンポーネントは次のとおり。
【００８９】
・陰性タンパク質コンテキスト陳述生成ユニット２０１は、リンク予測の現状技術における既知の主語および目的語改変（corruption）技法を使って、任意の陽性タンパク質コンテキスト陳述に基づいて陰性陳述を生成する（たとえば非特許文献１参照）。
【００９０】
・陰性モチーフ・ベース陳述生成ユニット２０２は、ある実施形態に基づく技法を使って、モチーフ・ベースの陽性リン酸化陳述１０９から陰性陳述を生成する。
【００９１】
・候補生成ユニット２０３は、関心対象タンパク質１１０（または入力データに存在するキナーゼおよび基質からのすべてのタンパク質）に関係した候補のモチーフ・ベースの陳述の集合と、陰性候補陳述の対応する部分集合とを生成する。これらの陳述は、ひとたびのちに説明するようにしてモデルが学習されたら、関係学習器２０４によって、ランク付けされたリン酸化予測を生成するために使用されてもよい。
【００９２】
・関係学習ユニット２０４は、拡充された（enriched）知識グラフ（たとえば陽性および陰性のモチーフ・ベースの陳述および任意的な陽性および陰性のタンパク質コンテキスト陳述）から学習する（可能性としては既製の）統計的関係学習モデルであり、学習されたモデルをリンク予測のために、すなわち候補生成器２０３によって生成された候補陳述のスコアを計算するために使う。スコアは、それらの陳述のうちのどれが実際のリン酸化である可能性が最も高いかを決定するためにのちに使われうる。
【００９３】
リンク予測器／予測ユニット（図１からの１１１のマクロ・コンポーネント）は図２に詳しく記されている。グラフ様の知識ベースにおいてリンクを予測するための複数の可能な解決策がある（たとえば非特許文献２もしくは非特許文献３、あるいは非特許文献１によってレビューされている諸手法を参照）。リンク予測器１１１を実装するために、既製のいかなる関係学習アルゴリズムが使われてもよい。しかしながら、たいていの容易に適用でき、正確で、扱いやすい解決策は、リン酸化についておよび任意のタンパク質コンテキスト陳述１０８、１０９について両方の陰性陳述の例を要求する（非特許文献１参照）。そのままのモデルによって（すなわち異なるフォーマットへの変換なしに）処理されるタンパク質コンテキスト陳述１０８については、一つの戦略は、陰性タンパク質コンテキスト生成器２０１においてリンク予測の分野で使われる標準的な技法を使うことである。しかしながら、モチーフ・ベースの陳述１０９は、技術的課題Cへの有利な解決策のコアとなる特定の方法２０２を必要とする。
【００９４】
関係学習ユニット２０４は、陽性および陰性のリン酸化ならびに任意のタンパク質コンテキスト陳述を一次入力として取り、予測モデルを学習する。次いで、モデルは、関心対象タンパク質１１０の（たとえば専門家によって）外部的に定義されたリストに関係した、ランク付けされたリン酸化陳述を生成するために使用されうる。モデルによって生成されたランク付けされた陳述は、（変換器１１３によって）システムの最終的な産物となる部位特異的な予測されたリン酸化陳述１１４に変換される。
【実施例３】
【００９５】
いくつかの関係学習ユニットが機能するためには、先の例からの変換された陽性陳述<P04049,  TKL2,  Q92934>に、対応する陰性陳述が伴っていることが必要である。しかしながら、伝統的なリンク予測手法において適用される標準的な改変ベースの技法（非特許文献１参照）は、この特定の場合には、安全でないことがある。
【００９６】
これは、述語TKL2の間接的な性質のためである。従来技術において一般的な標準的な手法を使う結果は、改変したキナーゼまたは基質の、陽性陳述の相補（complement）である陳述<X,  TKL2  Q9293>または<P04049,  TKL2  Y>との関連付けを与える。ここで、XおよびYはそれぞれ<TKL2,  Q9293>および<P04049,  TKL2>（述語，目的語）および（主語，述語）対とは決して共起しない。
【００９７】
これらの改変した陳述は、部位特異的なフォーマットへの逆変換１１３後にはいまだ陽性であることがある。たとえば、改変<P04049,  TKL2,  Q02750>は部位特異的な陳述<P04049,  S222,  Q02750>に対応するが、この陳述は実際の既知のリン酸化を表わし、よってその対応物<P04049,  TKL2,  Q02750>を考えることは、リンク予測モデルのトレーニングを損なう結果となる。
【００９８】
したがって、ここでは、変換器によってモチーフ・ベースの陳述１０５に変換された陳述に対応する陰性陳述を生成するための、別の、より生物学的に安全な方法が提案される。この手法は、変換プロセスと同じ生物学的想定（のちにさらなる例において詳細に説明する）に基づくプロセスを利用する。これは、従来技術において可能であるよりもよく、技術的課題Cに対処する■。
【００９９】
以下のセクションは、高レベルの図１および図２に存在する個々のコンポーネントの詳細を提供する。これらの例において表が参照される。リン酸化ネットワーク１０２におけるキナーゼ（kinase）および基質（substrate）はそれぞれKin＋<数字>およびSub+<数字>として記される。タンパク質コンテキスト知識グラフ１０６に現われるがリン酸化ネットワーク１０２には現われないタンパク質（protein）は、Prot+<数字>として記される。キナーゼおよび基質もタンパク質であり、いくつかのタンパク質はキナーゼでありかつ基質であるが、理解しやすさおよび簡単さのためにこれらの記法を使っていることを注意しておく。
【０１００】
モチーフ・ベースの陳述への変換
図３は、モチーフ・ベースの陳述への変換を詳細に記載している。
【０１０１】
変換器１０５は、次の個別コンポーネントから構成される「マクロ・コンポーネント」である。
・モチーフ発見ユニット３０２は、それぞれのキナーゼ・ファミリーについて（モチーフとして使われる）位置特異的なスコア付け行列を見出すことをねらいとする。
・モチーフ・ベース陳述生成ユニット３０３は、部位特異的リン酸化陳述を、同じキナーゼ・ファミリーからの最良の適合するモチーフを使って（陽性の）モチーフ・ベースの陳述１０９に変換する。
【０１０２】
図４のフローチャートは、ある実施形態が下記の段階４０１ないし４０５を使って、部位特異的陳述からどのようにモチーフを発見するかを記載している。
【０１０３】
・４０１。このプロセスは、リン酸化ネットワーク１０２から
〈タンパク質キナーゼ，リン酸化部位位置，タンパク質基質〉
の形のすべての部位特異的な陳述を読むことによって始まる。
【０１０４】
・４０２。次いで、各陳述のキナーゼについて、システムはその対応するキナーゼ・ファミリーをキナーゼ・ファミリー・データベース１０４においてさがす。キナーゼ・ファミリーについての情報が部位特異的な陳述に付加される。
【０１０５】
・４０３。同様に、タンパク質配列データベース１０３からの情報を使って、（リン酸化部位の）タンパク質配列におけるそれぞれの側への（左側／右側）アミノ酸のコンテキスト区間がそれぞれの部位特異的な陳述について付加される。この結果は、アミノ酸の「コンテキスト配列」を与える。
【０１０６】
・４０４。次の段階は、コンテキスト配列をキナーゼ・ファミリーによってグループ化し、その結果、キナーゼ・ファミリーから、そのファミリーのキナーゼによってリン酸化されるタンパク質基質のリン酸化部位コンテキスト配列のリストへのマッピングを与える。
【０１０７】
・４０５。最後の段階は、モチーフの位置特異的なスコア付け行列を計算する。位置的なスコア付け行列はモチーフの表現であり、これら二つの用語は本稿の残りの部分では交換可能に使われる。リン酸化部位を中心とする（たとえばそれぞれの側に7ないし15個の位置の）モチーフ配列におけるそれぞれの可能なアミノ酸位置について、モチーフは、その位置におけるそれぞれのアミノ酸についてのスコア（たとえば対数尤度スコア）を提供する。位置重み行列についてのさらなる詳細は、非特許文献４に見出されうる。
【０１０８】
モチーフを計算するために、既製のバイオインフォマティクス・ツールが使われてもよい。このプロセスの結果として、各キナーゼ・ファミリーについてモチーフのリストが生成される。キナーゼ・ファミリーについてのすべてのモチーフが同時に処理されてもよく、モチーフを分割することによって作成されたいくつかのバッチが別個に処理されてもよい（結果がマージされる）ことを注意しておく。バッチを作成するために、モチーフは、バッチの事前固定されたサイズによって分割されてもよく、リン酸化部位のタンパク質（一文字コードを使うと一つのアルファベット文字）によって分割されてもよく、あるいは両方が組み合わされてもよい。
【実施例４】
【０１０９】
モチーフ発見ユニット
段階４０１は、表１のようなリン酸化ネットワークから部位特異的な陳述を読み込み、
【表１】
2018206374.tif 000003
陳述ID（stmt.  idと略称される）、空のキナーゼ・ファミリーおよび空のコンテキスト配列（のちに中身を入れられる）をもつ補強されたリン酸化テーブル（表２）を作成する。表１に示されるように、キナーゼは一般には二つ以上の基質をリン酸化しうる。キナーゼは、一般には同じ基質に対して二つ以上の部位をリン酸化しうる（表には示していない）。たとえば、表１の第一のレコードについて、陳述id「000」をもつ表２の第一のレコードが生成される。
【表２】
2018206374.tif 000004
【０１１０】
段階４０２は、キナーゼ・ファミリー・データベース（１０４）にあるキナーゼ・ファミリー・テーブル（表３）を参照し、補強されたリン酸化テーブル（表２）における各レコードについて、「キナーゼ・ファミリー」セルに、「キナーゼ」セル内のキナーゼに対応するキナーゼ・ファミリーを入れる。
【表３】
2018206374.tif 000005
【０１１１】
たとえば、表２における第一のレコード（陳述id「000」）について、キナーゼは「Kin000」であり、そのファミリーは表３から導出される「TKL」なので、「キナーゼ・ファミリー」セルには「TKL」が入れられる。最後に、補強されたリン酸化テーブル（表２）は補強されたリン酸化テーブル（表４）になる。
【表４】
2018206374.tif 000006
【０１１２】
段階４０３は、タンパク質配列データベース（１０３）におけるタンパク質配列テーブル（表５）を参照し、補強されたリン酸化テーブル（表４）における各レコードについて、「コンテキスト配列」を入れる。
【表５】
2018206374.tif 000007
【０１１３】
表４における第一のレコード（陳述id「000」）の処理は、具体例として次のように示される。基質は「Sub000」なので、タンパク質「Sub000」をもつレコードが検索されて、配列「MFQIPEFEPS  EQEDSSSAER  GLGPSPAGDG  PSGSGKHHRQ  APGLLWDASH  QQEQPTSSSH  HGGAGAVEIR  SRHSSYPAGT  EDDEGMGEEP  SPFRGRSRSA PPNLWAAQRY  GRELRRMSDE  FVDSFKKGLP  RPKSAGTATQ  MRQSSSWTRV  FQSWWDRNLG  RGSSAPSQ」（可視性のために10文字ごとにスペースを挿入してある）が得られる。リン酸化部位は「S99」なので、99番目の文字Sのまわりの部位コンテキストが抽出される。任意の長さが可能でありうるが、ここでは左の7文字および右の7文字（および99番目の文字自身）がコンテキスト（配列の関連部分）として定義される。この例では、92番目の文字から106番目の文字の配列、すなわちPFRGRSRSAPPNLWA（下線を付した）が抽出され、「コンテキスト配列」セルに入れられる。最後に、補強されたリン酸化テーブル（表４）は補強されたリン酸化テーブル（表６）となる。
【表６】
2018206374.tif 000008
【０１１４】
段階４０４は、コンテキスト配列を、それぞれのキナーゼ・ファミリーによってグループ化し、コンテキスト配列テーブル（表７）を生成する。
【表７】
2018206374.tif 000009
【０１１５】
たとえば、キナーゼ・ファミリー「TKL」について、最初の三つのレコード（陳述ID「000」「001」「002」をもつ）におけるコンテキスト配列がグループ化される。例示したレコードでは三つのレコードしかないが、テーブル全体にはもっとレコードがあってもよいことを注意しておく。結果として、第一のレコードに示されるように、「TKL」について「FPFRGRSRSAPPNLWA,  SLPKINRSASEPSLH,…}」が得られ、コンテキスト配列テーブル（表７）に格納される。
【０１１６】
段階４０５は、それぞれのキナーゼ・ファミリーについてモチーフを計算し、モチーフ・テーブル（表８）を生成する。
【表８】
2018206374.tif 000010
【０１１７】
あるファミリーについて配列が存在しない場合には、モチーフは生成されない。ここで、モチーフは位置特異的行列（PSSM:  position-specific  matrix）として表現されているが、他の任意の形が採用されうる。モチーフが定義され、各モチーフとコンテキスト配列との間のスコアが計算できればよい。この例では、MEME（非特許文献５参照）が使われる。MEMEは、同じ長さの配列の集合を入力し（諸実施形態に基づくこの用法の場合；一般には、MEMEの入力はさまざまな長さの配列の集合でありうる）、モチーフの集合を出力する。本質的には、アルゴリズムは、便利なモチーフ表現の形の配列のバッチの一般化を与えるために、入力配列における特定の諸位置における特定のアミノ酸の生起の頻度におけるパターンを見出そうとする。EMアルゴリズムは、ランダム・ノイズからできるだけ遠く離れた解を見出そうとすることによって、頻度分布の合理的な程度に最適なパターンを見出すために使われる。ツール作者からの権威のある説明は、非特許文献６の論文および関係した参考文献に見出すことができる。
【０１１８】
各モチーフは、位置特異的な行列である。位置特異的な行列は20列（タンパク質アルファベットの20文字に対応）と行の行列である。行数はコンテキスト配列の長さに等しく（やはりこの用法の場合；一般には、行列の行は任意のさまざまな長さでありうる）、すなわちここでは15である（リン酸化部位のそれぞれの側に7ずつ）。各セルはスコアを表わす。スコアの意味および行列の用法はのちの例において示す。
【０１１９】
モチーフ・テーブル（表８）において、たとえば、「TKL」について、いくつかのモチーフがMEMEまたは他の好適なツールによって生成される。
【０１２０】
モチーフはMEMEによって発見される。しかしながら、それぞれのファミリーごとのモチーフの数および粒度は、モチーフ抽出ツールの二つのハイパーパラメータ、コンテキスト窓のサイズおよび同時にMEMEによって処理されるランダム化されたサンプルにおける配列の数によって影響される（少なくとも今の実施形態では）。
【０１２１】
ファミリー当たりに発見されるモチーフの数はユーザーが直接設定することはできない。実際の数はデータに依存し、コンテキスト窓およびランダム化されたサンプルにおける配列の数の値にも依存するが、これらは非常に間接的に反映されるだけである。ユーザー定義される信頼閾値はない。MEMEアルゴリズムは、期待値最大化（expectation  maximisation）に基づき、この統計的方法は、ひとたび良好なモチーフの十分に多い数が指定されたら（今の実施形態のように；見出されたすべての最適なモチーフが含まれることを確実にするためである）、外部パラメータなしに最適なモチーフを見出す。今の実施形態では10が使われてもよいが、典型的には実験を実行するために使われるハイパーパラメータの任意の組み合わせについて見出されるモチーフはたった5個までである。
【０１２２】
各モチーフは「TKL0」および「TKL1」のようなモチーフIDを付加される。「PSSM」行では、モチーフIDについてPSSMが入れられる（「TKL0」についてのPSSMのみが示されている）■。
【０１２３】
図５のフローチャートは、部位特異的な陳述がどのようにモチーフ・ベースの陳述に変換されるかを記載している。
【０１２４】
・５０１。このプロセスは、キナーゼ・ファミリーおよびリン酸化部位コンテキスト配列の情報で拡充された部位特異的な陳述すべてを読み込むことによって始まる。結果として得られる陳述は
〈キナーゼ，キナーゼ・ファミリー，基質，リン酸化部位コンテキスト配列〉
の形である。
【０１２５】
・５０２。次いで、各陳述のコンテキスト配列について、システムは、所与のコンテキスト配列と、その陳述におけるキナーゼのファミリーについて発見された一つ一つのモチーフとの間の適合性を計算する。適合性スコアは、次の関数を使って得られる。
【数１】
2018206374.tif 000011
ここで、S、Mはそれぞれ配列（線形鎖、すなわちベクトルとして表現されている）およびモチーフ・スコア付け行列である。idはタンパク質アルファベットの文字をモチーフ行列における対応する列インデックスにマッピングする関数である。
〈陳述，同じキナーゼ・ファミリーのリン酸化モチーフ〉
の各対について、適合性スコアが与えられる。
【０１２６】
・５０３。
〈陳述，同じキナーゼ・ファミリーのリン酸化モチーフ〉
の対のうち正の適合性スコアをもつもののみが保持される。負の適合性は、適合性がなく、よってそのモチーフは陳述のコンテキスト配列を表わしていると考えられることができないことを意味する。
【０１２７】
・５０４。それぞれの部位特異的な陳述について、（適合性スコアとの関係で）最良のパフォーマンスのモチーフを選択することによって、モチーフ・ベースの陳述が作成される。よって、このプロセスは、
〈タンパク質キナーゼ，モチーフ，タンパク質基質〉
の形の陽性の（現実世界において実際に生起するという意味での陽性）モチーフ・ベースの陳述のリストを生成する。
【０１２８】
これらの陳述はもはやコンテキスト依存ではない。モチーフ・ベースの述語は、複数のリン酸化陳述を横断して比較されうる仕方（これはその後のリンク予測のための必要条件）でコンテキスト情報を一般化しているからである。
【実施例５】
【０１２９】
モチーフ・ベース陳述生成ユニット
段階５０１は、先の例において生成された補強されたリン酸化テーブル（表６）を読み込む。
（外１）
2018206374.tif 000012
【０１３０】
表６における各レコードならびに先の例において生成されたモチーフ・テーブル（表８）における当該レコードのキナーゼ・ファミリーの各モチーフについて、段階５０２は、適合性スコアを計算し、対応するレコードを適合性スコア・テーブル（表９）に格納する。
【表９】
2018206374.tif 000013
【０１３１】
具体的に、表６における陳述ID「000」をもつ第一のレコードが処理されるとする。キナーゼ・ファミリーは「TKL」なので、表８においてキナーゼ・ファミリーが「TKL」であるモチーフが処理される。ここで、計算の詳細を「TKL0」について説明する。
【０１３２】
キナーゼ・ファミリーに対応するPSSMの意味は次の通り。まず、セル内のスコアの意味：
・列i行Xにおけるスコアが0より大きければ、問題のキナーゼ・ファミリーに対応する配列における位置iでアミノ酸Xが生起する確からしさが、純粋にランダムな場合よりも大きい（すなわち、キナーゼ・ファミリーはその位置においてそのアミノ酸を選好する傾向がある）。
・列i行Xにおけるスコアが0に等しい場合には、位置iでのアミノ酸Xの生起がランダムな場合と区別できない（すなわち、キナーゼ・ファミリーはその位置においてそのアミノ酸についていかなる選好ももたない）。
・列i行Xにおけるスコアが0より小さければ、問題のキナーゼ・ファミリーに対応する配列における位置iでアミノ酸Xが生起する確からしさが、純粋にランダムな場合よりも小さい（すなわち、キナーゼ・ファミリーはその位置においてそのアミノ酸に関わらない傾向がある）。
【０１３３】
たとえば、モチーフID「TKL0」についてのPSSMのいくつかのセルは次のことを意味する。
・列3行Rにおけるスコアは93であり、これは0より大きい。よって、配列の三番目の文字がRであれば、その配列はその三番目の文字においてそのモチーフと正に関連している。
・列6行Sにおけるスコアは0である。よって、配列の六番目の文字がSであれば、その配列の六番目の文字におけるそのモチーフとの関連は、ランダムな場合と同じくらいの確からしさなので、決定できない。
・列9行Aにおけるスコアは−16であり、これは0より小さい。よって、配列の九番目の文字がAであれば、その配列は九番目の文字においてそのモチーフと脱関連されている（disassociated）。
【０１３４】
配列の適合性スコアは、配列中のすべての位置のスコアを合計することによって計算される。これは、すべての配列文字にわたる、その配列の、そのモチーフへの適合性の確からしさに対応する。今の例では、入力配列は「PFRGRSRSAPPNLWA」（陳述ID「000」についてのもの）である。適合性スコアは、表１０における15個の網掛けされたスコアを合計することによって計算される。
【表１０】
2018206374.tif 000014
【０１３５】
たとえば、第一の文字はPなので、列1行Pにおけるセル値37は網掛けされている。同様に、第二の文字はFなので、列2行Fにおけるセル値29は網掛けされている。37＋29＋93＋19＋44＋0−52＋207−16＋53−20＋15＋26＋46＋47の計算によって、適合性スコアが528として得られる。このスコアは、前掲の表９に格納される。
【０１３６】
同様に、他の適合性スコアが表９に示されるように計算されるとする。すなわち、陳述ID「000」およびモチーフID「TKL1」についての適合性スコアは−35であり、「000」および「TKL2」についての適合性スコアは187である。
【０１３７】
段階５０３は、適合性スコアテーブル（表９）における負の適合性スコアをもつレコードを破棄する。今の例では、二番目のレコードが負の適合性スコア−35をもつ。破棄の結果、適合性スコアテーブル（表９）は適合性スコアテーブル（表１１）になる。ここでは破棄のための閾値は0であったが、任意の値が使用されうる。あるいは指定された値Nを用いて、上位N個が選択されてもよい。
【表１１】
2018206374.tif 000015
【０１３８】
補強されたリン酸化テーブル（表６）における各陳述IDについて、段階５０４は、陳述idについての最良の適合性スコアをもつモチーフについて
〈キナーゼ，モチーフid，基質〉
陳述を生成し、それを陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１２）に格納する。
【表１２】
2018206374.tif 000016
正の適合性スコアがない場合には、変換された陳述は生成されない。今の例では、陳述ID「000」について陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１１）には二つのレコードがある。第一のレコードの適合性スコア528は第二のレコードの適合性スコア187より大きいので、前者が選択される。すなわち、モチーフid「TKL0」が選択される。結果として、陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１２）に示されるように、<Kin00,TKL0,Sub00>が生成される■。
【０１３９】
タンパク質コンテキスト情報による知識ベースの拡充
図６および図７は、タンパク質コンテキスト陳述生成ユニット１０７を詳細に記載している。図６は図２にすでに記載された関連部分を含んでいる。図７のフローチャートは以下の個別的段階からなる。
【０１４０】
・６０１。このプロセスは、
〈タンパク質キナーゼ，モチーフ，タンパク質基質〉
の形のすべての陽性のモチーフ・ベースの陳述１０９を読み込むことによって始まる。
【０１４１】
・６０２。次いで、システムは、タンパク質コンテキスト知識グラフ１０６を使って、陽性のモチーフ・ベースの陳述に含まれるタンパク質キナーゼおよび基質から所与の距離内にある、知識グラフ内の近傍陳述を抽出する。結果として、タンパク質コンテキスト陳述１０８が生成される。それらの陳述は任意的には、リン酸化に現われるタンパク質についてのさらなる知識（すなわち関係／陳述）を加えることによってモデルの予測力を改善するために使われることができる。この追加は、諸実施形態の方法では簡単である。一方、従来技術はこの追加情報を含めることを許容しないか、あるいは非常に表層的な仕方で（実際に予測を計算するためではなく、単に予測をフィルタリングするために）許容する。
【実施例６】
【０１４２】
タンパク質コンテキスト陳述生成ユニット
段階６０１は、陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１２）内のモチーフ・ベースの陳述を読み込む。
【０１４３】
段階６０２はまず、タンパク質コンテキスト知識グラフProCSGU-1（単純化された例が図７に示されている）を読む。可視性のため、グラフはテーブルではなくグラフとして表現される。ノードはタンパク質を表わし、矢印は、つないでいる二つのタンパク質の間の関係を表わす。段階６０２は次いで、陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１２）の各タンパク質（キナーゼ、基質）について、所与の距離内のそのタンパク質の近傍陳述を取得し、それをテーブルに格納する。前記距離が2と設定されており、現在のタンパク質が「Kin00」であるとする。すべての関連する陳述を取得するために、任意のグラフ検索方法が使用されうる。「Prot00」および「Prot01」は「Kin00」および「Prot02」から1ステップ離れており、「Prot03」は「Kin00」から2ステップ離れているので、太い矢印をもつ五つの関係が取得される。「Kin00」のみを処理した後の結果として得られるテーブルは陽性タンパク質コンテキスト陳述テーブル（表１３）である。たとえば、「Prot03」から「Prot00」への「ptmod」矢印はレコード<Prot03,ptmod,Prot00>として記憶される。
【表１３】
2018206374.tif 000017
■。
【０１４４】
リンク予測ユニット
リンク予測ユニット１１１の詳細が図８に描かれている。これは図２についてすでに述べた関連部分と、予測されたモチーフ・ベースの陳述の形の出力とを含んでいる。
【０１４５】
いくつかの実施形態のコンテキストにおけるリンク予測器１１１の一つの重要な部分は、図９で詳述される、モチーフ・ベースの陰性陳述の生成である。
【０１４６】
陰性モチーフ・ベース陳述生成ユニット２０２のフローチャートは次のとおり。
【０１４７】
・７０１。このプロセスは、すべての陽性のモチーフ・ベースの陳述１０９を読むことによって始まる。
【０１４８】
・７０２。
〈タンパク質キナーゼK，モチーフM、タンパク質基質S〉
の形をもつ各陳述について、システムは、最終的な陰性集合にマージされる基質（基質改変または所与のキナーゼを使って所与のモチーフにおいてリン酸化を許容しないと見なされる基質）からの対応する陰性のモチーフ・ベースの陳述の集合を生成する。
【数２】
2018206374.tif 000018
ここで、sites(X)は、位置Lにおけるすべての部位S'であって定義されるようなスコアをもつものについての基質Xのリン酸化部位（sites）の集合を返す関数である。関数scoreは、上記のモチーフ発見器３０２の記述において定義されるモチーフ・ベースのスコア付け関数である。sequence(U,V,k)はV内のサイズkの、部位Uのコンテキスト、すなわち、当該部位自身を中心に含み、基質Vの配列における部位Uの左側および右側のk個のアミノ酸の対称的な配列を返す。モチーフMの幅（すなわち、当該モチーフに対して有意味な比較がされるべき配列中のアミノ酸の数）を示すために|M|を使う。現在のところ、実施形態はハイパーパラメータとしての配列コンテキスト・サイズ7および15に対応する15および31を使う。たとえば、コンテキスト・サイズ7は、リン酸化部位のそれぞれの側に7個のアミノ酸およびリン酸化部位自身を含むことをいう。より具体的には、15は、1（実際の部位であるアミノ酸について）＋7＋7（左右7個ずつのアミノ酸）に対応する。31は同様の仕方で15に対応する。
【０１４９】
本質的には、Sではない基質について、前記コンテキスト配列が同じキナーゼについて見出され、モチーフMとの適合性について検査される。これが負である場合、陳述<K,M,S'>が陰性陳述として記憶される。コードでは、計算をより効率的にするために、陰性陳述は、のちにオンザフライで（コンテキスト配列が見出されるにつれて個々にではなく）生成されてもよい。
【０１５０】
・７０３。
〈タンパク質キナーゼK，モチーフM，タンパク質基質S〉
の形をもつ各陳述について、システムは、キナーゼ（キナーゼ改変または所与の基質に関し、所与のモチーフにおいてリン酸化を許容しないと見なされるキナーゼ）からの対応する陰性のモチーフ・ベースの陳述の集合を生成し、それを次式によって最終的な集合にマージする。
【数３】
2018206374.tif 000019
ここで、family(X)は、キナーゼXのファミリーを返す関数である。
【０１５１】
・７０４。生成された陰性のモチーフ・ベースの陳述であって陽性のモチーフ・ベースの陳述にすでに存在しているものがあればそれは除去される。このプロセスの出力は、陽性のモチーフ・ベースの陳述から生成された陰性のモチーフ・ベースの陳述のリストである。
【０１５２】
段階７０２および７０３の背後にある動機付けは三つの側面がある。
【０１５３】
・第一に、陰性陳述が局所的な閉世界仮説（非特許文献１参照）に従うこと、すなわち、述語は陽性三項組と同じであり、改変は主語（キナーゼ）においてまたは目的語（基質）位置において起こるが、両方では決して起こらないことを確実にすることが重要である。これは、関係学習ユニット（２０４）が正しく機能するために必要である。
【０１５４】
・改変した（corrupted）基質は、たとえ部位特異的なフォーマットに変換し戻された後であっても、結果として得られる三項組が高い信頼度で陰性であるためには、述語モチーフに適合するべきではない。それを達成する自然なやり方は、改変基質におけるすべての部位のスコアが、陽性三項組の述語モチーフに関して0より小さいことを保証することである。つまり、改変は、実際の部位情報に基づいて、述語に関連付けられていることの負の確からしさをもつことになる。
【０１５５】
・同様に、改変したキナーゼも、述語モチーフに不適合であるべきである。これは、陽性陳述におけるキナーゼのファミリーとは異なるファミリーからのキナーゼを使って実施されうる。これは、改変したキナーゼを、陽性述語と不適合にする。キナーゼ・ファミリーは互いに素であり、モチーフは常に、単一のファミリー内の配列から計算されるからである。
【０１５６】
図１０のフローチャートは、陽性のタンパク質コンテキスト陳述からの陰性のタンパク質コンテキスト陳述２０１の生成のプロセスを記述する。
【０１５７】
陰性タンパク質コンテキスト陳述生成ユニット
プロセスは次のとおり。
【０１５８】
・８０１。このプロセスは、前掲の表１３からすべての陽性タンパク質コンテキスト陳述１０８を読み込むことによって始まる。
【０１５９】
・８０２。
〈主語S，関係P，目的語O〉
の形の各陳述について、システムは、主語要素のみを、陽性陳述における関係Pおよび目的語Oと決して共起しない主語のうちのランダムに選ばれた主語で置き換える新たな陰性陳述を生成する。
【０１６０】
・８０３。
〈主語S，関係P，目的語O〉
の形の各陳述について、システムは、目的語要素のみを、陽性陳述における主語Sおよび関係Pと決して共起しない目的語のうちのランダムに選ばれた目的語で置き換える新たな陰性陳述を生成する。
【０１６１】
・８０４。最後に、生成された陰性陳述であって陽性タンパク質コンテキスト陳述に存在するものがすべて除去される。
【０１６２】
タンパク質コンテキスト陳述（陰性および陽性両方）は、知識グラフを拡充してもよく、よってリン酸化予測のよりよい精度につながることがある。モデルが、（たとえば他の型のタンパク質相互作用関係または刊行物ベースの共起により）キナーゼおよび基質に関係している可能性がありうるものについての、より充実した情報をもつ場合、非常にしばしば、データにおけるずっと多くの暗黙的な規則性を発見し、それをよりよい予測のために使用しうる。
【実施例７】
【０１６３】
陰性モチーフ・ベース陳述生成ユニット
段階７０１は、陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１２）内のすべてのモチーフ・ベースの陳述を読み込む。
【０１６４】
段階７０２は、表１２における各陽性陳述レコードについて陰性陳述レコードを生成し、陰性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１５）に格納する。ここでは、説明のために第一のレコード<KIn00,TKL0,Sub00>が使われる。
【表１４】
2018206374.tif 000020
【０１６５】
段階７０２は、補強されたリン酸化テーブル（表１４）（あるいは表１２；どちらを使ってもよい）におけるすべての可能な基質について、以下のサブ段階を処理する。表１４は表６の拡充されたバージョンであり、ここでの説明のために必要とされるレコード（陳述ID  100、101、102、103をもつ）を含んでいる。
【０１６６】
表１４における明示的に記載されたレコードにおいて、基質はSub00、Sub01、Sub02、Sub03、Sub10およびSub11である。以下の説明ではSub10およびSub11が使われる。
【０１６７】
●Sub10
○サブ段階７０２−１では、Sub10についてのすべての可能なコンテキスト配列（たとえば、その基質についてリン酸化が実際に生起した部位のまわりの配列）が発見される。それらはレコード１００では「SDSEDDSSEFDEDDW」であり、レコード１０１では「IAVEYSDSEDDSSEF」である。
【０１６８】
○第一のレコード<Kin00,TKL0,Sub00>が出発点であり、基質のみが変更されることを想起されたい。サブ段階７０２−２では、発見された各コンテキスト配列について、モチーフ「TKL0」についての適合性スコアが計算される。モチーフ・テーブル（表８）に関する段階５０２と同じように、「SDSEDDSSEFDEDDW」および「IAVEYSDSEDDSSEF」の適合性スコアがそれぞれ−426および−56として計算される。
【０１６９】
○サブ段階７０２−３では、すべての計算された適合性スコアが負であるか否かが検査される。−426および−56両方が負なので、答えはyesであり、陰性陳述が生成される。該陰性陳述のキナーゼおよびモチーフidは陽性陳述におけるのと同じであり、該陰性陳述の基質は当該関わっている基質である。ここで表わされる具体例では、キナーゼおよびモチーフは表１２における第一のレコードにおけるKin00およびTKL0であり、基質はSub10である。結果として、陰性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１５）における第一のレコードが格納される。
【表１５】
2018206374.tif 000021
【０１７０】
●Sub11
○サブ段階７０２−１では、Sub11についてのすべての可能なコンテキスト配列が発見される。それらはレコード１０２では「LGGGRVKTWKRRWFI」であり、レコード１０３では「AARKKRISVKKKQEQ」である。
【０１７１】
○サブ段階７０２−２では、発見された各コンテキスト配列について、モチーフ「TKL0」についての適合性スコアが計算される。モチーフ・テーブル（表８）に関する段階５０２と同じように、「LGGGRVKTWKRRWFI」および「AARKKRISVKKKQEQ」の適合性スコアがそれぞれ−635および312として計算される。
【０１７２】
○サブ段階７０２−３では、すべての計算された適合性スコアが負であるか否かが検査される。312が正なので、答えはnoであり、陰性陳述は生成されない。
【０１７３】
段階７０３は、表１２におけるそれぞれの陽性陳述レコードについても陰性陳述を生成し、それらを陰性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１５）に格納する。ここでは第一のレコード<Kin00,TKL0,Sub00>が説明のために使われる。
【０１７４】
段階７０３は、キナーゼ・ファミリー・テーブル（表３）（あるいは表１４の補強されたリン酸化テーブル；どちらを使ってもよい）におけるすべての可能なキナーゼについて、以下のサブ段階を処理する。表３における明示的に記述されるレコードにおいて、キナーゼはKin00、Kn01およびKin02である。以下の説明では、Kin01およびKin02が使われる。
【０１７５】
Kin01について、「Kin01」および陽性陳述のキナーゼ「Kin00」が同じキナーゼ・ファミリーに属するかどうかが、キナーゼ・ファミリー・テーブル（表３）を参照することによって検査される。両者とも「TKL」に属するので、答えはyesであり、陰性陳述は記憶されない。
【０１７６】
Kin02について、「Kin02」および陽性陳述のキナーゼ「Kin00」が同じキナーゼ・ファミリーに属するかどうかが、キナーゼ・ファミリー・テーブル（表３）を参照することによって検査される。前者は「AGC」に属し後者は「TKL」に属するので、答えはnoであり、モチーフidおよび基質が陽性陳述と同じであり、キナーゼが当該キナーゼである陰性陳述が記憶される。具体的には、モチーフおよび基質は、表１２の第一のレコードではTKL0およびSub00であり、キナーゼはKin02である。結果として、陰性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１５）に第二のレコードが格納される。
【０１７７】
段階７０４は、表１２に現われるすべてのレコードを、陰性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１５）から破棄する。今の例ではそのようなレコードはなく、表１５はそのまま保持される■。
【実施例８】
【０１７８】
陰性タンパク質コンテキスト陳述生成ユニット
段階８０１は、陽性タンパク質コンテキスト陳述テーブル（表１３）内のすべての（陽性の）タンパク質コンテキスト陳述を読み込む。
【０１７９】
段階８０２は、各陽性タンパク質コンテキスト陳述について陰性タンパク質コンテキスト陳述を生成し、陰性タンパク質コンテキスト陳述テーブル（表１６）に格納する。
【表１６】
2018206374.tif 000022
【０１８０】
ここで、説明のために第一のレコード<Kin00,結合する,Prot00>を使う。この段階はまず、<SUBJECT,結合する,Prot00>というレコード（述語および目的語は陽性陳述と同じ）がないそれぞれの(SUBJECT)について、すべての可能な主語を収集する。それはProt00およびProt01である。五番目のレコードにおけるProt03は含まれない。その陳述は上記条件を破るからである。下記では、すべての主語が使われてもよく、そのいくつかがランダムにまたは他の任意の方法によって選択されてもよい。Prot00およびProt01の両方が選択されるとする。すると、この段階は、それぞれの主語についてのレコード<SUBJECT,結合する,Prot00>を陰性タンパク質コンテキスト陳述テーブル（表１６）に格納する。今の例では、表１６における最初の二つのレコードが格納される。ここで、第一のレコードにおける主語および目的語は同じであるが、そのようなレコードは、あらゆる場合について、あるいはいくつかの指定された述語について、除外されてもよい。
【０１８１】
段階８０３はまた、各陽性タンパク質コンテキスト陳述について陰性タンパク質コンテキスト陳述を生成し、陰性タンパク質コンテキスト陳述テーブル（表１６）に格納する。ここで、説明のために第一のレコード<Kin00,結合する,Prot00>を使う。この段階はまず、<Kin00,結合する,OBJECT>というレコード（主語述語および述語は陽性陳述と同じ）がないそれぞれの(OBJECT)について、すべての可能な目的語を収集する。それはKin00、Prot01およびProt02である。下記では、すべての目的語が使われてもよく、そのいくつかがランダムにまたは他の任意の方法によって選択されてもよい。Kin00、Prot01およびProt02のすべてが選択されるとする。すると、この段階は、それぞれの目的語についてのレコード<Kin00,結合する,OBJECT>を表１６に格納する。今の例では、陰性タンパク質コンテキスト陳述テーブル（表１６）における三番目から五番目の三つのレコードが格納される。ここで、第三のレコードにおける主語および目的語は同じであるが、そのようなレコードは、あらゆる場合について、あるいはいくつかの指定された述語について、除外されてもよい。
【０１８２】
段階８０４は、陽性タンパク質コンテキスト陳述テーブル（表１３）に現われるすべてのレコードを、陰性タンパク質コンテキスト陳述テーブル（表１６）から破棄する。今の例ではそのようなレコードはなく、表１６はそのまま保持される■。
【０１８３】
図１１は、ある実施形態に基づく、候補生成器／生成ユニット２０３を詳細に記載している。
【０１８４】
このマクロ・コンポーネントは、以下の個別的なコンポーネントから構成されていてもよい。
・候補陳述生成ユニット９０２は、システムによる予測の間に考慮されるべき候補陳述を生成する。候補陳述は、入力として与えられる関心対象のタンパク質キナーゼまたは基質１１０に（あるいは具体的な関心対象のリストが与えられない場合には陽性陳述におけるすべてのタンパク質に）基づく。このユニットは、モチーフ・ベースの陳述を入力する。
・陰性陳述フィルタ（または陰性候補陳述生成ユニット）９０３は、予測プロセスによって要求される陰性の候補モチーフ・ベース陳述を生成する。これは、モチーフ・ベースの陰性陳述（９０１）の集合をフィルタリングして、９０２によって生成される各候補陳述について、同じ述語（モチーフ）と、主語もしくは目的語のどちらかとを共有する陰性モチーフ・ベース陳述のみが存在するようにすることによって達成される。
【０１８５】
図１２のフローチャートは、関心対象のタンパク質のリストに基づく、候補陳述の生成のプロセス９０２を記述している。
・１００１。このプロセスは、陽性のモチーフ・ベースの陳述１０９を読み込むことによって始まる。
・１００２。次いで、当該コンポーネントは、関心対象のすべてのキナーゼ１１０（またはすべてのキナーゼ）を読み込む。
・１００３。システムは、陽性のモチーフ・ベースの陳述によってカバーされるすべての関心対象のキナーゼ、リン酸化モチーフおよびタンパク質基質のデカルト積として、候補陳述を生成する。
・１００４。最後に、陽性のモチーフ・ベースの陳述（すなわち、すべての既知の部位特異的なリン酸化陳述についてのデータを含む）にも存在するすべての候補陳述が除去されて、予測がトレーニング・フェーズの間に使われた陳述によってバイアスを受けないことを保証する。
【０１８６】
図１３のフローチャートは、陽性候補陳述のリストに基づく陰性候補陳述の生成のプロセス９０３を記述する。
・１１０１。このプロセスは、すべての候補陳述を読み込むことによって始まる。
・１１０２。次いで、当該コンポーネントは、すべての陰性のモチーフ・ベースの陳述８０１を読み込む。
・１１０３。候補陳述におけるそれぞれのタンパク質キナーゼおよびリン酸化モチーフについて、システムは、陰性のモチーフ・ベースの陳述におけるキナーゼ、リン酸化モチーフおよび該キナーゼおよびリン酸化モチーフに関連付けられたすべての関連する基質のデカルト積として、陰性候補陳述を生成する。
・１１０４。同様に、候補陳述におけるそれぞれのリン酸化モチーフおよび基質について、システムは、陰性のモチーフ・ベースの陳述における基質、リン酸化モチーフおよび該基質およびリン酸化モチーフに関連付けられたすべての関連するキナーゼのデカルト積として、陰性候補陳述を生成する。
・１１０５。最後に、候補陳述にも存在する、候補陳述ランキングについてのすべての陰性陳述が除去される。
【実施例９】
【０１８７】
陽性候補陳述生成ユニット
段階１００１は、陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１７）におけるすべてのモチーフ・ベースの陳述を読み込む。表１７は、この特定のフローチャートを説明するための表１２の修正版であり、示されるような五つのレコードをもつ。
【表１７】
2018206374.tif 000023
【０１８８】
段階１００２は、関心対象キナーゼ・テーブルにおける関心対象キナーゼすべてを読み込む。エンドユーザーがそれらを指定してもよい。一つのキナーゼKin00を含む関心対象キナーゼ・テーブル（表１８）が与えられているとする。
【表１８】
2018206374.tif 000024
【０１８９】
それぞれの関心対象キナーゼについて、段階１００３は、主語がそのキナーゼであり、属性が陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１７）に現われるモチーフidであり、目的語が陽性モチーフ・ベース陳述テーブルに現われる基質である陳述のあらゆる可能な組み合わせを構築する。三つの一意的なモチーフid（AGC0、TKL0およびTKL1）および三つの一意的な基質（Sub00、Sub20およびSub21）があるので、9個（＝3×3）個のレコードが、下記のような陽性候補テーブル（表１９）に記憶される。
【表１９】
2018206374.tif 000025
【０１９０】
段階１００４は、陽性候補テーブル（表１９）から、陽性モチーフ・ベース陳述テーブル（表１７）に現われるすべてのレコードを破棄する。今の例では、<Kin00,TLK0,Sub00>および<Kin00,TKL1,Sub20>は表１７に現われるので、破棄される。結果として、陽性候補テーブル（表１９）は陽性候補テーブル（表２０）になる（のちの処理のためにそれぞれの候補idも入れられている）。
【表２０】
2018206374.tif 000026
■。
【実施例１０】
【０１９１】
陰性候補陳述生成ユニット
段階１１０１は、陽性候補テーブル（表２０）におけるすべての陽性候補陳述を読み込む。
【０１９２】
段階１１０２は、陰性モチーフ・ベース陳述テーブル（表２１）におけるすべての陰性のモチーフ・ベースの陳述を読み込む。
【表２１】
2018206374.tif 000027
表２１は、本方法のこの部分を説明するための表１５の修正版であり、示されるような六つのレコードをもつ。
【０１９３】
それぞれの陽性候補について、段階１１０３は、陰性候補陳述を生成し、それらを陰性候補テーブル（表２２）に格納する。
【表２２】
2018206374.tif 000028
【０１９４】
候補id「100」をもつ陳述が処理されるべきであるとする。この段階は、陰性モチーフ・ベース陳述テーブル（表２１）から、主語および述語が陽性候補のものと同じである陳述を拾い上げ、それらを陰性候補テーブルに格納する。今の例では、「100」の陳述の主語および述語はKin00およびTKL0なので、表２１におけるKin00およびTKL0をもつ最初の二つのレコードが選ばれて、表２２に格納される。第三のレコードは、主語が同じ（Kin00）だが述語が異なる（TKL0とTKL1）ので選ばれていないことを注意しておく。
【０１９５】
それぞれの陽性候補について、段階１１０４は、陰性の候補陳述を生成し、それらを陰性候補テーブルに格納する。候補id「100」をもつ陳述が処理されるべきであるとする。この段階は、陰性モチーフ・ベース陳述テーブル（表２１）から、述語および目的語が陽性候補のものと同じである陳述を拾い上げ、それらを陰性候補テーブル（表２２）に格納する。今の例では、「100」の陳述の述語および目的語はTKL0およびSub20なので、表２１におけるTKL0およびSubj20をもつ四番目および五番目のレコードが選ばれて、表２２に格納される。結果として、表２２は表２３になる。六番目のレコードは、目的語が同じ（Sub20）だが述語が異なる（TKL0とAGC0）ので選ばれていないことを注意しておく。
【表２３】
2018206374.tif 000029
【０１９６】
段階１１０５は、陰性候補テーブル（表２３）から、陽性候補テーブル（表２０）に現われるすべてのレコードを破棄する。今の例では、そのようなレコードはなく、テーブル２３はそのまま保持される■。
【０１９７】
関係学習ユニット
関係学習ユニット２０４は、陽性および陰性のモチーフ・ベースの陳述（モチーフ変換器１０５および陰性モチーフ・ベース陳述生成器２０２の出力）から、また可能性としては陽性および陰性のタンパク質コンテキスト陳述（タンパク質コンテキスト陳述生成器１０７および陰性タンパク質コンテキスト陳述生成器２０１の出力）から学習する、既製の統計的な関係学習モデル（非特許文献１参照）からなる。学習されたモデルは、リンク予測のために、すなわち候補生成器２０３によって生成された候補陳述の存在を予測するために使われる。
【０１９８】
図１４のフローチャートは、関係学習ユニット２０４のプロセスを記述している。
【０１９９】
・１４０１。モチーフ・ベースの陳述（陽性１０９および陰性――陰性陳述生成器２０２の出力）およびタンパク質コンテキスト陳述（陽性１０８および陰性――陰性陳述生成器２０１の出力）を読み込む。
【０２００】
・１４０２。モチーフ・ベースの陳述をトレーニング集合および試験集合に分ける。トレーニング集合にタンパク質コンテキスト陳述を加える。モデルをトレーニングする。トレーニングは、ハイパーパラメータの諸組み合わせに対するモデル選択を含んでいてもよく、（クロス確認（cross-validation）を採用してもよく、）現状技術のランキング学習（learning-to-rank）評価プロトコルを採用してもよい。
【０２０１】
より詳細には、選択は、複数の埋め込みモデルに対するクロス確認およびハイパーパラメータの複数の組み合わせに対する網羅的なグリッド探索によって実行される。クロス確認の各反復工程において、モデルはリン酸化ネットワークの一部でトレーニングされ、別個の確認集合で試験される。
【０２０２】
モデル選択は、最高の選択されるパフォーマンス・メトリックをもつモデルを最良のものとして選ぶ。このメトリックは典型的には、平均逆順位（MRR:  mean  reciprocal  rank）のようなランキング学習メトリックである。採用されるプロトコルもランキング学習に基づく：確認集合におけるそれぞれの陽性陳述が、適切なヒューリスティックにより（たとえば陽性の関係の主語または述語を改変することにより）オンザフライで生成されるまたはゴールドスタンダードから取得されるいくつかの陰性陳述とともに、システムによってスコア付けされる。陽性および陰性のスコアがランク付けされ、ランクが、ランキング学習パフォーマンス・メトリック（たとえばMRR）を計算するために使われる。
【０２０３】
・１４０３。１４０２で得られた最良のパフォーマンスのモデルが、陽性候補陳述９０４の存在を予測するために使われる。そのような存在は、ランキング学習の仕方で、これらの陳述のそれぞれをすべてのもっともらしい陰性陳述９０５（そのような陰性陳述は、同じ述語と、主語もしくは目的語とを共有する）に対してランク付けすることによって、判定される。ランキングに加えて、関係学習ユニットは、スコア（たとえば規格化された信頼重み）をも出力してもよい。かかるスコアは、のちにカスタム・ランキングおよびフィルタリングを実装するために使われてもよい。
【実施例１１】
【０２０４】
関係学習ユニット
段階１４０１は、陽性モチーフ・ベース陳述テーブル、陰性モチーフ・ベース陳述テーブル、陽性タンパク質コンテキスト陳述テーブルおよび陰性タンパク質コンテキスト陳述テーブルを読み込む。これらのテーブルの例は、表１２、表１５、表１３、表１６である（すべて既出）。これらは単に例であり、テーブルのサイズは通例、ずっと大きい。
【０２０５】
段階１４０２は、関係学習方法を用いてモデルをトレーニングする。以下の条件を満たすいかなる方法が使われてもよい。
【０２０６】
●モチーフ・ベースの陳述に変換された既知のリン酸化およびこれらの陳述の否定に基づくトレーニング・フェーズと、候補陳述を使う予測フェーズとを含む。
【０２０７】
●トレーニング・フェーズでは：
○陽性の三元（三項）陳述および陰性の三元陳述を入力する。
○各入力陽性陳述にはより高いスコアを、各入力陰性陳述にはより低いスコアをできるだけ与えようとすることによって、モデルをトレーニングする。モデルは、トレーニング後、陳述にスコアを与える。
【０２０８】
●予測フェーズでは：
○現実世界において誤りであるとわかっているファクトをモデル化する陰性の三元陳述および陽性の三元陳述を入力する。陰性の候補三元陳述は、陽性の陳述の改変されたバージョンとして（すなわち、陳述の主語または目的語を、生物学的に意味をなさない別の何かで置き換えることによって）生成されたものであってもよい。
○各陽性陳述について、スコアと、その陽性陳述および対応する陰性陳述におけるスコア・ランクとを出力する。
【０２０９】
そのような方法の例は、CP（非特許文献７）、DistMult（非特許文献８）、RESCAL（非特許文献９）、TransE（非特許文献１０）ComplEx（非特許文献１１）、NTN（非特許文献１２）、HolE（非特許文献１３）などがある。
【０２１０】
今の例では、ComplExが使われ、上記の方法および入力データ（上記の四つのテーブル）を用いてモデルが学習されるとする。トレーニングの詳細は割愛する。
【０２１１】
段階１４０３は、先に示した陽性候補テーブル（表２０）におけるそれぞれの陽性候補について、ランクおよびスコアを予測し、それらを出力テーブルに格納する。
【０２１２】
予測の詳細をここに示す。表２０における「100」の陽性候補が処理されるとする。この陽性候補に対応する陰性候補は、陰性候補テーブル（表２３）における四つのレコードである。段階１４０３はまず、五つの候補のそれぞれについてスコアを計算する。スコアは、モデルの推論（すなわち予測）段階によって計算される。学習の間に、関係学習モデルは、三元入力を実数（スコア）にマッピングするスコア付け関数のパラメータを学習する。実際の関数は、採用される関係モデルに依存する（DistMultおよびComplEXはドット積を使い、TransEはベクトル・ノルムを使い、RESCALは行列積を使う、など）。スコアは、確率推定値であってもなくてもよいことを注意しておく。確率推定値でない場合には、シグモイド関数を使って変換されることができる。スコアが上記陽性陳述について0.78であり、上記四つの陰性陳述について0.23、0.85、0.45、0.87であるとする。すると、0.78は五つのスコアのうちで三番目に大きいので、陽性陳述のランクは3である。次いで、段階１４０３は、3および0.78を、陳述情報とともに、出力テーブルにおいて格納する。出力テーブル２４の第一のレコードは「100」についてのこのプロセスの結果である。同様にして他の候補が処理されて、出力テーブル２４が得られる。
【表２４】
2018206374.tif 000030
■。
【０２１３】
図１６のフローチャートは、図１５に示される、部位特異的陳述への変換器１１３の動作を詳述している。図１５は、図１の関連する部分および予測されたモチーフ・ベースの陳述の入力を示しており、予測されたモチーフ・ベースの陳述の、予測された部位特異的な陳述への変換のプロセスを記載している。
【０２１４】
・１３０１。このプロセスは、すべての予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述１２０１を読み込むことによって始まる。
【０２１５】
・１３０２。それぞれの予測されたモチーフ・ベースの陳述について、システムは、入力陳述における基質についてのすべての可能なリン酸化部位のリストを、リン酸化部位データベース１１２から抽出する。
【０２１６】
・１３０３。それぞれのリン酸化部位について、システムは、部位コンテキスト配列を、タンパク質配列データベース１０３から抽出する。
【０２１７】
・１３０４。それぞれの可能なリン酸化部位について、システムは、予測される三項組におけるリン酸化モチーフに関する、リン酸化部位配列の適合性スコアを計算する。
【０２１８】
・１３０５。システムは、変換された部位特異的な陳述１１４の集合を生成する。ここで、キナーゼおよび基質は予測されたモチーフ・ベースの陳述に存在する通りであり、部位は、正の述語モチーフ適合性スコアをもつものである。スコアは、関係学習器／学習ユニット２０４によって生成された陳述スコアに取り付けられる。これらのスコアは、システム結果の任意のランキング、フィルタリングなどのために使用されうる。
【実施例１２】
【０２１９】
段階１３０１は、出力テーブル２４における予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を読み込む。
【０２２０】
段階１３０２は、それぞれの予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述について、可能なリン酸化部位のリストを、リン酸化部位テーブル２５から得て、モチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２８）を生成する。下記の説明では、表２４における第一のレコード（予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述）のみが使われる。「100」のレコードにおいては基質はSub20なので、リン酸化部位テーブル（表２５）における対応するレコードにおけるリン酸化部位S269、S27およびT271が得られる。
【表２５】
2018206374.tif 000031
【０２２１】
次いで、段階１３０２はモチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２６）を生成する。
【表２６】
2018206374.tif 000032
【０２２２】
表２６における各レコードは表２４のリン酸化部位に対応する（出力テーブルとモチーフ・マッチ・スコア・テーブルとの間のデータをリンクするために「候補id」も挿入されている）。空のフィールド「コンテキスト配列」および「モチーフ・マッチ・スコア」はのちの段階で埋められる。
【０２２３】
それぞれの可能なリン酸化部位について、段階１３０３は、タンパク質配列テーブル（表２７）を参照し、モチーフ・マッチ・スコア・テーブルを更新する（表２８）。
【表２７】
2018206374.tif 000033
【０２２４】
表２７は、表５の拡充版であり、「Sub20」のレコードがある。モチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２６）における第一のレコードの処理は次の通り。
【０２２５】
・基質はSub20（候補id「100」によって表２４の出力テーブルから得られた）なので、タンパク質配列テーブル２７におけるSub20についてのレコードが検索される。段階４０３と同様に、リン酸化部位S85への対応する配列が抽出される。具体的には、配列「MYQAINPCPQ…」における78番目（＝85−7）の文字から92番目（＝85＋7）の文字までの配列、すなわち「TSLGMVDSPPHINPP」が抽出されて、モチーフ・マッチ・スコア・テーブルに入れられる。
【０２２６】
すべてを処理した後、モチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２６）はモチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２８）になる。
【表２８】
2018206374.tif 000034
【０２２７】
それぞれの可能なリン酸化部位について、段階１３０４は適合性スコアを計算して、モチーフ・マッチ・スコア・テーブルを更新する。モチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２８）における第一のレコードの処理は次の通り。
【０２２８】
・モチーフidはTKL0（候補id「100」によって表２４の出力テーブルから得られた）なので、配列は「TSLGMVDSPPHINPP」であり、モチーフ・テーブル（表８）のPSSMについての「TSLGMVDSPPHINPP」の適合性スコアが段階５０２と同様にして計算される。「32」が得られたとする。すると、モチーフ・マッチ・スコア・テーブルは、表２９の第一のレコードに示されるように更新される。
【０２２９】
すべてを処理した後、モチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２８）はモチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２９）になる。
【表２９】
2018206374.tif 000035
【０２３０】
段階１３０５は、出力テーブル（表２４）およびモチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２９）に基づいて予測テーブル（表３０）を生成する。モチーフ・マッチ・スコア・テーブル（表２９）における各レコードについて、そのモチーフ・マッチ・スコアが正である限り、表３０においてレコードが作成される。これは最もゆるい戦略であり、述語モチーフに関連付けられる可能性がランダムよりも高い部位をもつ陳述を生成する（負のスコアをもつ部位は、無関連（disassociation）を示すので、決して含められるべきではない）。もう一つのオプション（ここでは示されないが、実施形態に関して完全に可能である）は、単に最良の正のスコアをもつ部位を使うことである。これは、変換の高い精度に重点を置くが、多くの潜在的に有効な予測を破棄することがありうる。これら両極端の中間の手法も実現可能である。
【０２３１】
表２９における第一のレコードが処理されるとする。スコアは32であり、正なので、このレコードは使用される。「100」についてのキナーゼKin00、基質Sub20、ランク3およびスコア0.78が表２４から取られて、リン酸化部位S85およびモチーフ・マッチ・スコア32が表２９から取られて、表３０における第一のレコードが作成される。
【０２３２】
次に、表２９における第二のレコードが処理されるとする。スコアは−47であり、負なので、このレコードは破棄される。
【０２３３】
最後に、予測テーブル（表３０）が使われる。
【表３０】
2018206374.tif 000036
【０２３４】
そのような生物学者にとって、ランク、スコアおよびモチーフ・マッチ・スコアは、実験の優先順位を決定するために使用されうる。そのような生物学者を助けるために、システムは、予測テーブル（表３０）のレコードをソートおよび／またはフィルタリングしてもよい。たとえば、モチーフ・マッチ・スコアについての閾値50が設定されて、この値より低いモチーフ・マッチ・スコアをもつレコードがフィルタ除去されてもよい。すると、32〈50なので、第一のレコードは除外され、296〉50なので第二のレコードは保持される。
【０２３５】
範囲
部位特異的なリン酸化の定量的なランク付けされた予測を提供することによって、実施形態は、リン酸化経路の機能的な影響の発見をねらいとする生物医学的実験の設計を支援する。システムの予測の品質は、入力データの品質に直接関係している。システムは、手作業でキュレーションされた入力を用いることで最良のパフォーマンスを発揮するが、データにおけるあるレベルのノイズには対処してもよい。
【０２３６】
システムは、すべてのタンパク質に関係した入力データベース（つまり、リン酸化ネットワーク１０２、タンパク質データベース１０３、キナーゼ・ファミリー・データベース１０４、関心対象キナーゼ１０８およびタンパク質コンテキスト知識グラフ１０６）が、同じエンティティを参照するには同じ識別方式を使っていること（たとえば、タンパク質キナーゼ「Q02156」はすべてのデータベースにおいて同じ識別子をもつこと）を期待する。これは、タンパク質のような単一のエンティティが、システムによって使用される知識グラフにおける単一のノードとして表現されることを保証する。これは、関係学習モデルが追加の変換なしに知識グラフから正しく特徴を学習するための重要な条件である。
【０２３７】
機能、効果
実施形態は、リン酸化知識ベースおよび可能性としては追加的なコンテキスト情報、たとえばタンパク質‐タンパク質相互作用ネットワークから、新たなリン酸化を予測するための装置および方法を提供する。実施形態は、信頼できるリン酸化予測を、従来技術よりも包括的な仕方で（すなわち、既知のキナーゼ、部位および基質の任意の組み合わせについて）与えうる。また、本手法は、完全に自動化されており（最適な特徴さえも自律的に抽出される）、よって、いかなる人間の介入もなしに、公に利用可能なデータセットから結果を生成しうる。これは、適正に機能するためにはデータ準備および特徴エンジニアリングにおいてしばしば膨大な手作業を必要とする従来技術と比べたときのもう一つの利点である。
【０２３８】
実施形態は、次のように三つの技術的課題A)、B)およびC)を解決しうる。
A.  実施形態は、リン酸化ネットワーク全体（および利用可能な場合には追加的なコンテキスト情報）から学習する関係学習モデルによって抽出される潜在的な特徴を活用するリン酸化予測を与えることによって、技術的課題Aを解決しうる。
B.  実施形態は、特定のキナーゼ・ファミリーに固有のモチーフの発見に基づいて、リン酸化知識ベースを型のある二項関係に変換することによって、コンテキスト依存データに適用可能なモデルの欠如を克服することによって、技術的課題Bを解決しうる。
C.  実施形態は、標準的な技法で生成される陰性陳述よりもずっと信頼できる、実際のリン酸化の生物学的特性に基づく陰性陳述を生成することによって、技術的課題Cを解決しうる。
【０２３９】
いくつかの実施形態は、以下の実際上の効果の一つまたは複数を有する。
【０２４０】
・計算機実験の、より効率的な設計。提示される方法のすべての段階は完全に自動化されており（特徴エンジニアリングも含めて）、モジュール・パラメータをチューニングすることによって簡単に調整されうるので、本技術は、リン酸化予測実験の多くの異なるセットアップについて使用されうる。これは、下流の実験室での実験の要求（たとえば、ある種のパフォーマンス・メトリックを最大化するまたはキナーゼの限られた部分集合に焦点を当てる）に従う最良のモデルの効率的な同定を容易にしうる。
【０２４１】
・リン酸化経路の機能的影響の発見をねらいとする生物医学的実験の、より時間のかからない、より安価な設計。これは、少数の（ランク付けされた）リン酸化候補の自動化された発見のためである。かかる少数のリン酸化候補は、ウェットラボ（物理的な実験室）での実験によって検証されるべき、特定的な仮定上のリン酸化ネットワークの、ずっと高速な設計において使用されうる。
【０２４２】
・ウェットラボ実験を設計することにおけるさらなる柔軟性。実施形態はいかなる型のリン酸化についても予測候補を簡単に生成しうるので、実施形態は、既製品ですべての既知のキナーゼおよび／または基質をカバーする幅広い範囲の実験設計のために使用されうる。これは従来技術ではそれほどストレートにはできない。
【０２４３】
・コンテキスト情報のより包括的なサポート。実施形態は、キナーゼまたは基質についての関連する情報をもつ追加的な知識グラフ（たとえばタンパク質相互作用ネットワークまたはタンパク質データベース）を簡単に組み込みうる。これは、生物医学研究者が、これまでにない容易さで、リン酸化に関連する追加的なファクト源を利用することを許容する。これは、より焦点が合った、信頼できる予測結果につながる。
【０２４４】
実施形態は、
・タンパク質コンテキスト知識グラフのような知識グラフ（発見システム１０１参照）の形で、リン酸化データを関係するタンパク質コンテキスト・データを組み合わせること；
・組み合わされたデータから、リンク予測技法を使って、以前には未知であった部位特異的なリン酸化陳述を予測すること（リンク予測ユニット１１１参照）、
を自動的に行ないうるシステムを提供しうるシステムを提供しうる。
【０２４５】
これらの特徴は技術的課題Aに対処する。
【０２４６】
実施形態は、部位特異的なリン酸化陳述と、モチーフに基づく一般化された述語をもつアクショナブルな三項組との間の双方向変換（変換器１０５、１１３）を実現しうるシステムを提供しうる。これらの特徴は技術的課題Bに対処する。
【０２４７】
既存のリンク予測技法は、リン酸化ネットワークから意味のある結果を生成することができない。発明者らは、データは予測をするために内部フォーマットに変換されてもよく、ユーザーが予測の恩恵を受けられるように標準的な部位特異的なリン酸化陳述に変換し戻されてもよいとの認識に至った。
【０２４８】
最後に、実施形態は、リンク予測のために安全に使用されうる陰性のモチーフ・ベースのリン酸化陳述の生成を実現しうるシステムを提供しうる（陰性モチーフ・ベース陳述生成ユニット２０２を使って）。これらの特徴は技術的課題Cに対処する。図９の段階７０２および段階７０３は、別個に考慮しても、一緒に考慮しても、基質によっておよび／またはキナーゼによって陰性のモチーフ・ベースの陳述を生成する仕方において、発明的である。
【０２４９】
適用可能なリンク予測技法は、従来技術で典型的に使われる技法では安全に生成できない、信頼できる陰性陳述の例を必要とする。
【０２５０】
実地の例―LinkPhinder
１．はじめに
細胞挙動のほぼすべての側面は、リン酸化イベントと、これらのリン酸化を媒介するキナーゼ‐基質関係の込み入ったネットワークによって制御される。リン酸化は、キナーゼによるその基質への、リン酸基の取り付けであり、通例、基質の活性を変更し、それによりシグナル伝達、区別、移動、細胞分裂およびアポトーシスといった重要な細胞機能を媒介する。これらのキナーゼ‐基質関係の調節異常は、壊滅的な帰結をもつことがあり、しばしば癌または免疫疾患といった疾病につながる。おそらく驚くには当たらないが、キナーゼは、ヒトのゲノム内の最大のタンパク質ファミリーの一つを呈する。500〜800のキナーゼがそのタンパク質基質上の約200,000の異なるリン酸化部位をリン酸化すると推定されている。キナーゼは、しばしばその3D構造内に薬物が結合できる明確なポケットを呈するので、すぐれた薬物標的をもなす。
【０２５１】
200,000のキナーゼ‐基質相互作用のほんの小さな割合がマッピング済みである。現代の高スループットの質量分析ベースのホスホプロテオミクスの到来により、基質タンパク質におけるリン酸化部位の識別は比較的容易になった。どのキナーゼがどの基質をどの部位でリン酸化できるかを予測することは、今日の生物学における最大の未解決の課題の一つである。高スループットの方法はこの場合には使用できず、一回限りのための実験は、試験されるべき候補相互作用の数の多さのため、ありえないほど高価であり、時間がかかる。結果として、新たなリン酸化反応およびその機能の発見のレートはいまだかなり低い。
【０２５２】
よって、リン酸化候補の信頼できる自動化された予測が強く望まれている。実験的に試験されなければならない可能性の数を実質的に減らすことができるからである。この十年間に、リン酸化を予測するためのいくつかのツールが利用可能となった。最も人気のある最近のおよび／または積極的にメンテナンスされているものは以下のとおりである：
Scansite  [J.  C.  Obenauer,  L.  C.  Cantley,  and  M.  B.  Yaffe.  Scansite  2.0:  Proteome-wide  prediction  of  cell  signaling  interactions  using  short  sequence  motifs.  Nucleic  acids  research,  31(13):3635-3641,  2003],  
GPS  [Y.  Xue,  J.  Ren,  X.  Gao,  C.  Jin,  L.  Wen,  and  X.  Yao.  GPS  2.0,  a  tool  to  predict  kinase-specific  phosphorylation  sites  in  hierarchy.  Molecular  &  cellular  proteomics,  7(9):1598-1608,  2008],  
NetPhos  [N.  Blom,    T.  Sicheritz-Pont´en,  R.  Gupta,    S.  Gammeltoft,    and  S.  Brunak.  Prediction  of  post-translational  glycosylation  and  phosphorylation  of  proteins  from  the  amino  acid  sequence.  Pro-mics,  4(6):1633-1649,  2004],  
NetPhorest  [H.  Horn,  E.  M.  Schoof,  J.  Kim,  X.  Robin,  M.  L.  Miller,  F.  Diella,  A.  Palma,  G.  Cesareni,  L.  J.  Jensen,  and  R.  Linding.  KinomeXplorer:  an  integrated  platform  for  kinome  biology  studies.  Nature  methods,  11(6):603-604,  2014],  
NetworKin  [H.  Horn,  E.  M.  Schoof,  J.  Kim,  X.  Robin,  M.  L.  Miller,  F.  Diella,  A.  Palma,  G.  Cesareni,  L.  J.  Jensen,  and  R.  Linding.  KinomeX-plorer:  an  integrated  platform  for  kinome  biology  studies.  Nature  methods,  11(6):  603-604,  2014],  
[R.  Linding,  L.  J.  Jensen,  G.  J.  Ostheimer,  M.  A.  van  Vugt,  C.  Jorgensen,  I.  M.  Miron,  F.  Diella,  K.  Colwill,  L.  Taylor,  K.  Elder,  et  al.  Systematic  discovery  of  in  vivo  phosphorylation  networks.  Cell,  129(7):1415-1426,  2007],  
PhosphoPredict  [J.  Song,  H.  Wang,  J.  Wang,  A.  Leier,  T.  Marquez-Lago,  B.  Yang,  Z.  Zhang,  T.  Akutsu,  G.  I.  Webb,  and  R.  J.  Daly.  Phosphopredict:  A  bioinformatics  tool  for  prediction  of  human  kinase-specific  phosphorylation  substrates  and  sites  by  integrating  heterogeneous  feature  selection.  Scientific  Reports,  7(1):6862,  2017]。
【０２５３】
既存のツールのいくつかは、所与のリン酸化部位またはモチーフについての推定上のキナーゼを予測できるが、それらはみな本来的な限界がある――予測をするために主として、局所的なタンパク質特徴（たとえばコンセンサス配列モチーフまたはタンパク質構造）を使っているのである。R.  Linding,  L.  J.  Jensen,  G.  J.  Ostheimer,  M.  A.  van  Vugt,  C.  Jorgensen,  I.  M.  Miron,  F.  Diella,  K.  Colwill,  L.  Taylor,  K.  Elder,  et  al.  Systematic  discovery  of  in  vivo  phosphorylation  networks.  Cell,  129(7):1415-1426,  2007において指摘されたように、相互作用コンテキストが可能なリン酸化の重要な予測因子である。それでも、同じ著者のシステムNetworKinにあっても、相互作用コンテキストは、実際に予測を計算するためではなく、予測をフィルタリングするために使われている。結果として、現在のツールはいくつかの仕方で制限されている。
１．その予測は、既存のリン酸化およびタンパク質相互作用ネットワークについての豊富な知識をほぼ度外視している。
２．局所的な特徴に依拠するため、既存のツールは、よく研究されていないおよび／または典型的でない多数のタンパク質について、よく機能しない傾向がある。
３．既存のツールは、タンパク質相互作用および経路ネットワークまたは刊行データのような関連するコンテキスト情報を簡単に組み込むことができない。
この実地の例は、これらすべての限界が、既知のリン酸化ネットワークを知識グラフとして表現することによって克服できることを示す。知識グラフ表現は、ネットワーク知識を、フィルタリング機構として使うのではなく、予測プロセス自身に組み込むこと、現行のツールでは計算できない多くを含む、ネットワークにおける任意のキナーゼおよび基質についてのきわめて柔軟な、有意な予測を計算すること、ならびに原理において、コンテキストを、予測プロセスへの入力として組み込むことをを許容する。
【０２５４】
２．結果
２．１  LinkPhinderの概観
この手法は、既存のリン酸化ネットワークにおいて利用可能な部位特異的な陳述
（キナーゼ，部位，基質）
を、モチーフ・ベースの陳述
（キナーゼ，述語，基質）
に変換するための方法に基づく。ここで、述語は、もとの陳述の意味内容を保存する関係ラベルである。具体的には、述語は、キナーゼ・ファミリー・コンセンサス・モチーフを介して部位情報を一般化し、よって、複数の基質を横断して比較され、（知識グラフにおける）キナーゼ‐基質リンクとして解釈されることができる。これはもとの陳述では可能ではない。部位の意味が基質に依存し、よって、一般的な関係型として使用できないからである。部位情報を度外視すればデータをグラフとして扱うことができるが、非特異的なキナーゼ‐基質リンクのみをもつグラフとなり、部位コンテキストを失ってしまう。これらの問題に取り組む提案される変換は：
・知識グラフについての最近提案された堅牢な発見技法、つまり統計的関係学習を用いてリン酸化予測を計算すること；
・予測モデルをトレーニングするために必要とされる生物学的に意味のある陰性の例を生成すること；
・将来の研究における、リン酸化情報の、他の関連するグラフ・ベースのデータ（たとえば、刊行物または経路から抽出されるタンパク質相互作用、共起）との簡単な統合を許容する。
【０２５５】
LinkPhinderのはたらきは、それぞれモデルのトレーニングおよび該モデルの予測のための使用の概観を与える図１７および図１８において示されている。具体的な段階についてのさらなる詳細は下記の諸セクションにおいて与えられる。
【０２５６】
図１７は、LinkPhinderシステムのトレーニングを示している。既存のリン酸化ネットワークが入力として取られ（左上）、そこで表現されている各基質／リン酸化部位について、リン酸化部位を囲む基質の部分配列が識別される（図におけるネットワークの表現の右に示されるように）。知識グラフ変換１において、結合するキナーゼ・ファミリーに基づいてグループ化されたこれらの配列のコンセンサス・モチーフが計算される。入力ネットワークからのリン酸化陳述は、互換なコンセンサス・モチーフを使って知識グラフ関係に変換される。それは、ある互換なコンセンサス・モチーフ（図では、より高い確率のアミノ酸を表わすより大きな文字で示されている）を割り当て、このようにして生成されたすべての陳述を知識グラフ・フォーマット（図に示されるような、データの表ビューではなく、グラフ・ビュー）に格納することによる。ここで、RAF1は述語TKL  02とともに示されている。先述したような双対プロセスが、図の右上に示されるもののような知識グラフにおける陽性陳述から陰性の例を生成２するために使われる。陽性および陰性は、教師付きの統計的関係学習によってリンク予測モデルをトレーニングするために要求される。ハイパーパラメータの包括的な集合に基づいて、幅広い範囲のモデルがトレーニング３される。入力データのトレーニング／試験／確認用の分割でのパフォーマンスに基づいて最良のモデルを見出すためである。
【０２５７】
図１８は、入力問い合わせタンパク質と、モデルをトレーニングするために使われたリン酸化ネットワークとに基づく、LinkPhinderシステムを用いて予測を行なうことの概観を与える、同じコンポーネントを使った同様の図である。第一に、候補リン酸化陳述の集合が生成１０される。それらの候補は、前記問い合わせタンパク質の、トレーニング・データ内に存在するキナーゼおよび基質との、あらゆる可能なリン酸化部位にまたがる、あらゆる可能な相互作用をスパンする。トレーニング段と同様に、候補陳述は知識グラフ関係に変換２０される。次いで、最良のパフォーマンスのモデルを使って、すべての候補陳述の確率スコアが計算３０される。スコア付けされた陳述はランク付けされ、以前に計算されたコンセンサス・モチーフを使って、リン酸化陳述に変換４０し戻される。次いで、キナーゼとしてまたは基質としての問い合わせタンパク質に関わる候補リン酸化は、予測スコアによって降順にソートされた出力リストから、便利にブラウズされ、あるいはフィルタ除去されることができる。任意的に、結果リストに対して、厳密性の高いカットオフが適用されることができる。
【０２５８】
２．１．１  知識グラフ変換
一次的な入力は、PhosphoSitePlus  [P.  V.  Hornbeck,  J.  M.  Kornhauser,  S.  Tkachev,  B.  Zhang,  E.  Skrzypek,  B.  Murray,  V.  Latham,  and  M.  Sullivan.  PhosphoSitePlus:  a  comprehensive  resource  for  investigating  the  structure  and  function  of  experimentally  determined  post-translational  modifications  in  man  and  mouse.  Nucleic  acids  research,  40(D1):11-22,  2011]のデータセットからコンパイルされたリン酸化ネットワークである。該ネットワークは、陳述<K,L,S>からなる。ここで、K,L,Sはそれぞれキナーゼ、リン酸化部位および基質である。そのような陳述の意味内容は、キナーゼKが基質Sに部位Lにおいて結合することによって基質Sをリン酸化する、というものである。
【０２５９】
リン酸化ネットワークの知識グラフへの変換は、個別のキナーゼ・ファミリーによって好まれるリン酸化部位のモチーフを利用する。各キナーゼ・ファミリーについて[G.  Manning,  D.  B.  Whyte,  R.  Martinez,  T.  Hunter,  and  S.  Sudarsanam.  The  protein  kinase  complement  of  the  human  genome.  Science,  298(5600):1912-1934,  2002]方法は、そのファミリーのキナーゼが結合する基質における諸部位の局所的なコンテキストに特徴的なモチーフの集合を計算する。局所的なコンテキストは、基質配列におけるリン酸化部位のまわりの2k＋1個のアミノ酸の窓である。ここで、kは変換アルゴリズムの構成設定可能なパラメータである。これは、コンテキストとして考慮に入れられるべき、リン酸化部位の左側および右側のアミノ酸の数を与える。
【０２６０】
モチーフは、(K,L,S)リン酸化ネットワーク陳述をラベル付けされた知識グラフのエッジ(K,M,S)に変換するために使われる。ここで、Mは、Kのファミリーおよび基質Sにおける部位Lと適合するモチーフに対応する述語ラベルである。換言すれば、モチーフMのスコア付け行列は、SにおけるLの局所的コンテキストについての陽性スコアを計算する。
【０２６１】
２．１．２  陰性による拡充
リン酸化ネットワークから生成される知識グラフは、リンク予測によって新たなリン酸化を発見するために使用できる。しかしながら、リンク予測モデルをトレーニングすることは、教師付き機械学習プロセスであり、よって、リン酸化知識グラフにおける陽性陳述に加えて、陰性の例を必要とする。そのような陰性の例は典型的には、陽性陳述の改変によって生成される。この場合、そのような技法は、実際のリン酸化が、知識グラフの間接的な性質のため陰性として扱われることにつながりうる。したがって、リン酸化の生物学に基づいて、陰性陳述に対して、特定の制約が課される。
【０２６２】
改変使用は二つの事実に基づく。第一に、異なるファミリーのキナーゼは異なる基質をリン酸化する傾向がある。第二に、ある種の基質がキナーゼ・コンセンサス・モチーフに関してきわめて不適合なリン酸化部位をもつ場合には、基質は、該ある種のキナーゼによってリン酸化される可能性が低い。これは、直接的に、二つの型の改変に対応する。陳述(K,M,S)について、有効な変更は陳述(K',M,S)および(K,M,S')であり、KlはKとは異なるファミリーからであり、Slにおけるすべてのリン酸化部位はモチーフMのスコア付け行列に関して負にスコア付けされる。
【０２６３】
２．１．３  トレーニングおよびモデル選択
陰性陳述によって拡充されたリン酸化知識グラフは、リンク予測を実行するために（そしてそれによりそれまで知られていなかったリン酸化の潜在的な発見を許容するために）統計的関係学習モデルをトレーニングするために使用できる。リンク予測モデルのトレーニングは、本質的には、スコア付け関数のパラメータが知識グラフの陽性および陰性陳述に基づいて最適化されるランキング学習である。
【０２６４】
知識グラフ上でトレーニングされることのできる可能なモデルの範囲は、トレーニング・プロセスのさまざまなハイパーパラメータのすべての組み合わせの空間に対応する。最も重要なハイパーパラメータは、モチーフ発見に（たとえば、リン酸化部位のまわりの配列のサイズまたはモチーフ発見のために一時に処理される配列の数）、また知識グラフ埋め込みを学習するために使われるモデルの型およびパラメータに関するものである。可能なオプションの範囲についての詳細は、附属書Aにおいて与えられる。
【０２６５】
すべてのハイパーパラメータ組み合わせの空間における網羅的探索によって、最もパフォーマンスのよいモデルが選択されることができる。ここで、各組み合わせのパフォーマンスは、対応するモデルを知識グラフのある部分でトレーニングし、それを別の部分で試験することによって、試験される。最終的なモデルを選択するために、平均精度メトリック（精度‐再現曲線（precision-recall  curve）の下の面積と等価）が使われる。それが、機械学習の全体的なパフォーマンスを評価し、特にモデルをランク付けするために最も適切なメトリックと考えられるからである。
【０２６６】
知識グラフ埋め込みに基づくこの手法は、既知のリン酸化ネットワークの長距離属性、グローバル特徴および多変量性質を包括的な仕方で反映するモデルを見出すことを許容する。これは、基質タンパク質の局所的な特徴（配列、構造、キナーゼ親和性など）を使うだけであり、スコア付けを計算する際にリン酸化ネットワーク・コンテキスト全体を考慮に入れることをしない既存の手法とは、実質的に異なっている。
【０２６７】
２．１．４  予測およびランク付け
ひとたびパフォーマンスが最良の予測モデルが同定されたら、該モデルは、その一般化力（generalisation  power）を最大化するよう、リン酸化知識グラフ全体でトレーニングされることができる。このモデルは、次いで、トレーニング・データにおいて提供されるキナーゼ、部位および基質のあらゆる可能な組み合わせにまたがる陳述のランク付けスコア（0から1までの間の値）を計算するために使用されることができる。単一のタンパク質をクエリーとして与えられて、モデルは、基質としてまたはキナーゼとしてのそのタンパク質に関わる候補リン酸化のランク付けされた集合を生成することができる。ランク付けされたリストは、任意的に、高いまたは中程度の厳密性の閾値を使うことに基づいてフィルタリングされることができる。使用される閾値は、入力リン酸化ネットワークから導出される――高い厳密性の閾値は、既知のリン酸化の99.5%がそれより上のスコアとなるような値である（報告されたモデルではその値は0.672）。中程度の厳密性の閾値は0.5である（すなわち、所与の陳述の、その確率解釈に基づく、ランダムよりも高いもっともらしさを示すスコア）。
【０２６８】
結果のランク付けは、入力知識グラフにおいて表わされるすべての既知のリン酸化のグローバルなネットワーク・コンテキストを反映する。これは、他のいかなる既存のツールによっても行なわれていない。さらに、予測は、キナーゼであれ基質であれ、任意のタンパク質に基づいて生成できる。このため、このモデルは、基質タンパク質について問い合わせされることができるだけであるたいていの既存のリン酸化予測ツールよりも強力である（GPSツールでは、キナーゼから予測を生成することを開始できるが、約80のキナーゼしかカバーされない。これに対し、本願のシステムの場合は300超である）。
【０２６９】
２．１．５  リン酸化ネットワークへの変換
リンク予測モデルは、変換された知識グラフ上で機能する（すなわち、(K,M,S)の形のモチーフ・ベースの陳述を生成する）。よって、モデルがスコアを計算すべき対象となるべき候補リン酸化は、この形に変換されることが要求される。モチーフ・ベースの陳述がスコア付けされた後、それをユーザーに呈示する前に、実際のリン酸化陳述に変換し戻される必要がある。この変換は、知識グラフ変換に対する双対である――各陳述(K,M,S)は陳述(K,L,S)に対応し、Lは、モチーフMのスコア付け行列に関して正のスコアとなる（PhosphoSitePlusデータセットにより）Sにおける有効なリン酸化部位である。
【０２７０】
２．２  使用されたデータセットおよびツール
LinkPhinderモデルを構築するための主要な入力であるリン酸化ネットワークをコンパイルするために、本方法は2017年6月26日に入手可能であったバージョンにおけるPhosphoSitePlusデータセットを使った（https://www.phosphosite.org/staticDownloads.action参照）。コンパイルされたリン酸化ネットワーク内のそれぞれ362、7302および2377個の相異なるキナーゼ、基質‐部位組み合わせおよび基質に対して10173個のリン酸化陳述があった。特に断わりのない限り、すべてのデータセットの構築がホモサピエンス種にのみ焦点を当てていることを注意されたい。
【０２７１】
PhosphoSitePlusから抽出されたリン酸化陳述を知識グラフに変換するために、本方法は、リン酸化部位のコンテキスト配列に特徴的なモチーフを計算した。そのタスクのために、MEMEツール、バージョン4.11.2が使われる（http://meme-suite.org/doc/download.html?man_type=web参照）。
【０２７２】
三つの現状技術の知識グラフ埋め込みおよびリンク予測方法が、リン酸化知識グラフにおける新たなリンクを発見できるモデルをトレーニングするために用いられた。それらの方法はTransE  [A.  Bordes,    N.    Usunier,    A.  Garcia-Duran,    J.  Weston,    and  O.  Yakhnenko.    Translating  embeddings  for  modeling  multi-  relational  data.    In  Advances  in  neural  information  processing  systems,  pages  2787-2795,  2013]、DistMult  [B.  Yang,  W.-t.  Yih,  X.  He,  J.  Gao,  and  L.  Deng.  Embedding  entities  and  relations  for  learning  and  inference  in  knowledge  bases.  arXiv  preprint  arXiv:1412.6575,  2014]およびComplEx  [T.  Trouillon,  J.  Welbl,  S.  Riedel,  E´  .  Gaussier,  and  G.  Bouchard.  Complex  embeddings  for  simple  link  prediction.    arXiv  preprint  arXiv:1606.06357,  2016]である。
【０２７３】
PhosphoSitePlusデータセットは、UniProt（http://www.uniprot.org/参照）と一緒に、基質とその可能なリン酸化部位との間のマッピングを生成するためにも使われた。このマッピングは、以前に知られていなかった可能なリン酸化のスコアを計算するときに、内部的なモチーフ・ベースの知識グラフ陳述の、リン酸化陳述への変換において使用された。焦点は、知識グラフに存在する基質のみに向けられ、結果として、候補リン酸化（すなわち、潜在的な発見）を生成するために使用できる74142個の相異なる基質‐部位対を与えた。
【０２７４】
関係する現状技術のシステムとの比較においてLinkPhinderを評価するために、発明者は、以下のツールを用いてできるリン酸化予測の諸フルセットをダウンロードおよび／または生成した：Scansite  3  （http://scansite3.mit.edu参照）、KinomeExplorer  （二つのツールNetworKINおよびNetPhosKによって生成される予測、http://kinomexplorer.  info/参照）、Netphos  （http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/参照）およびGPS  （http://gps.biocuckoo.org/index.php参照）。対応するツールを用いてできる予測の数は次のとおり：6,908,157  (GPS)、5,192,236  (KinomeExplorer)、3,614,298  (Netphos)、401,260  (Scansite  3)、2,006,185  (PhosphoPredict)。
【０２７５】
計算機実験において使用されたデータに到達するために用いられたデータ源、ツール設定および処理段階は附属書Aにおいて与えられる。
【０２７６】
２．３  LinkPhinderモデルの予測力
モデルの予測力を検証するのに使ったメトリックは、二分分類システムの診断能力を示すために一般的に使われるROC曲線の下の面積（AU-ROC:  area  under  the  ROC  curve）および精度‐再現曲線の下の面積（AU-PR:  area  under  the  precision-recall  curve）に等価な平均精度（AP:  average  precision）である。これらのメトリックは、ランク付けに基づく予測モデルを検証するために議論はあるが最も適切なものである[T.-Y.  Liu  et  al.  Learning  to  rank  for  information  retrieval.  Foundations  and  Trends  in  Information  Retrieval,  3(3):225-331,  2009]。これらのメトリックは、モデルを、その動作範囲全体を通じて検証し、よってその一般的な予測力（general  predictive  power）を決定するために有用である[J.  Davis  and  M.  Goadrich.  The  relationship  between  precision-recall  and  roc  curves.    In  Proceedings  of  the  23rd  international  conference  on  Machine  learning,  pages  233-240.  ACM,  2006]。
【０２７７】
まず、構築されたモデルのハイパーパラメータの、パフォーマンスが最良の構成設定が、これまでのセクションで述べてきたように、見出された（ハイパーパラメータなどについての完全な詳細は附属書Aで与えられる）。リン酸化ネットワークの、トレーニング・データセットおよび試験データセットへのランダムな80‐20%の分割が使われた。パフォーマンスが最良のモデルが、トレーニング分割で10分割の（10-fold）クロス確認を使ってトレーニングされ、試験分割からの、見られていない陳述を使って確認された。この実験は、結果の安定性を検証するために、毎回、異なるランダムな分割を用いて、100回実行された。反復回数は、測定されたメトリックの値の信頼区間を安定にするように設定された。
【０２７８】
モデルは、それぞれAU-PRおよびAU-ROCのメトリックにおいて、対応するベースラインの0.51および0.506（均衡した陽性／陰性クラス）に対して、0.906（±0.02）および0.958（±0.006）の安定したスコアを達成した。これは典型的には、非常に高い予測力を示すものと考えられる。この特定の実験における関係した既存のツールとの直接比較は、残念ながら可能ではない。理由は、これらのツールの公に利用可能なインターフェースおよびデータ・ダンプが、発明者のデータセットに存在するあらゆる陰性陳述および一部の陽性陳述のスコアを生成するために使用できないということである。選択されたメトリックの値を計算し、それらを比較することは無意味であろう。既存のツールのこの限界は、グローバルなネットワーク・コンテキストおよびあらゆる可能なリン酸化組み合わせではなく、単一のタンパク質に焦点を当てた種々の予測方法論に内在するものである。
【０２７９】
２．４  目標を絞った実験が二つの生物学的に意味のある予測を確証する
2700万近い候補予測の豊富なデータセットが、臨床上有意なリン酸化反応を発見するためのその潜在力に関して評価された。この目的に向け、発明者らは、LATS1およびAKT1キナーゼについて厳密性の高い予測を抽出した。このリストの目視検査により、彼らはすぐに、これらのキナーゼの、いくつかの既知のおよび有望な基質をピンポイントで特定できた。たとえばYAP1はLATS1の最もよく特徴付けされた基質であり、ツールは、LATS1はセリン127においてYAPをリン酸化することを予測した。さらに、AKTについての上位200の予測のリストは八つの真正なAKT基質を含んでおり（https://www.cellsignal.com/contents/resources-reference-tables/pi3k-akt-substrates-table/science-tables-akt-substrate）、それらについていくつかの部位特異的なリン酸化反応が予測された。これは、ツールが興味深い、生物学的に有意な予測を生成したことを意味する。
【０２８０】
次に、新たな基質のいくつかが実験的に検証された。最も有望な候補を選択するために、より幅広いLATS1シグナル伝達ネットワークの一部であり、かつそれについての抗体が商業的に入手可能な三つのタンパク質が選択された。我々が使用したLATS1基質を確認するために、以下の戦略が使われた。LATS1レベルを下方調節〔ダウンレギュレーション〕（ノックダウン）するために、HEK293細胞が、LAST1に対抗して二つの特異的siRNAを移入された。このLATS1ノックダウン後、LATS1基質のリン酸化における期待される減少。確証のために、既知のLATS1基質YAP1-S127のリン酸化を測定することによって陽性の対照が使われ、実際に、全溶解物におけるYAP1-S127リン酸化の減少が観察された。この対照実験は、LATS1ノックダウンが期待されたとおりに機能し、潜在的なLATS1基質を確証するために使用できることを実証した。
【０２８１】
確認のために選択されたタンパク質の一つはCREBであった。これは、リン酸化によって調節される転写因子である。この転写因子は、MAPKおよびPKA経路の最もよく特徴付けされたエフェクターの一つである。文献にある証拠は、CREBが、YAP1との直接相互作用および転写の調節によって、重要なヒッポ（hippo）経路機能を変調することを示している。ツールは、CREBのセリン133（CREB-S133）を、LAST1の推定される基質として予測した。これを確証するために、CREB-S133に対抗する特定の抗体が使われ、LATS1の下方調節の結果、CREB-S133リン酸化の約50%減となった。この結果は、CREBがLATS1基質であることを明瞭に示しており、以前に知られていなかったキナーゼ基質を識別する本ツールの潜在力をハイライトしている。
【０２８２】
試験されたもう一つの予測は、セリン46におけるp53のリン酸化であった。p53は、DNA損傷に応答した細胞サイクル停止およびアポトーシスのような、細胞の運命を調節する重要な転写因子である。p53-S46は潜在的なLATS基質として予測されたが、LATS1ノックダウン実験における減少したp53-S46リン酸化は観察されなかった。このことは、この予測が、使用された実験条件についての偽陽性であることを示している。
【０２８３】
AKTの場合、推測される基質は、二つの戦略を使って、AKT活性化のレベルを操作することによって、モニタリングされた。第一に、AKT活性が、特異的な化学的抑制剤AKT  IVを使うことによって抑制された。第二に、AKT活性が、AKTのキナーゼ過活性形態gag-AKTを移入することによって増大された。予測されたAKT基質の一つはSTK3（MST2）であった。これはヒッポ経路における重要なタンパク質であり、予測によれば、セリン18でリン酸化されるはずである。
【０２８４】
残念ながら、このリン酸化部位を測定することのできる商業的に入手可能な抗体は存在しなかった。よって、この予測を確認するために間接的な手法が用いられた。これは、リン酸化されたAKT基質に特異的に結合する抗体を使った。これは、AKTによってリン酸化されたすべてのタンパク質を免疫沈降させる（IP）。次に、このIPが、STK3に対抗する特異的な抗体を使ってブロットに固定された。これらの実験は、AKTの抑制がSTK3リン酸化のわずかな減少につながったこと、活性なAKTの発現は10倍増につながったことを示している。これらの結果は、AKT1がSTK3をリン酸化するという予測を確認している。
【０２８５】
これらの発見のどれも、クエリーとしてのLATS1またはAKT1キナーゼで出発する、関係した既存のツール六つのうちの四つでは、予測できなかった。GPSおよびPhosphoPredictはそのようなクエリーをサポートするが、それぞれLinkPhinderシステムによってカバーされるキナーゼの25%未満および3.5%未満についてのみである。さらに、直接、基質について問い合わせすることは、厳密性の高い設定での（該当する場合；厳密性の制御が特定のツールによって提供されていない場合には、実験は所与のツールによってなされるすべての予測を使った）既存のどのシステムでも、LinkPhinderの予測を再現しなかった。中程度の厳密さでは、GPSツールは一つの予測、LATS1によるCREB1リン酸化を再現できる。低い厳密さでは、NetPhosKツールも一つの予測、ATK1によるSTK3リン酸化を再現できる。任意の設定で両方の予測を再現できるツールはなかった。
【０２８６】
２．５  質量分析実験が追加的な7個のリン酸化予測を確証した
相補的な検査室検証では、厳密性が高いおよび厳密性が中程度の予測が、LATS1インタラクトームでの高スループット・ホスホプロテオミクス・データと相互参照された。基本的な発想は次のとおり。標的をリン酸化するためには、LATS1は標的に結合してリン酸化する必要がある。よって、免疫沈降（IP）によってLATS1に結合されるあらゆるタンパク質を孤立させて、質量分析に基づくプロテオミクスを使ってこのインタラクトームを解析することによって、多数のLATS1リン酸化標的を識別することが可能であるはずである。こうして、LATS1インタラクトームでのホスホプロテオミクス・データが二つのアポトーシス促進性シグナル、FASおよびエトポシドで処置された細胞から得られた。インタラクトームを同定するために、過渡的に発現したGFP-LAST1が免疫沈降され、関連するタンパク質複合体がトリプシンを使って消化され、結果として得られるペプチドが質量分析を使って解析され、リン酸化された残基がMaxQuantを使って識別された。これは、LATS1に結合され、少なくとも一つの残基においてリン酸化された六つのタンパク質を同定した。（非LATS1移入の対照においても識別された非特異的なリンタンパク質は破棄した。）
このリストはLATS1基質を含むことになるが、これらのリンタンパク質のすべてがLATS1の標的ではないことを注意しておくことが重要である。LATS1は他のキナーゼによってリン酸化されるタンパク質にも結合する。次に、リン酸化されたLATS1インタラクタのこのリストがLinkPhinderからの予測されたLATS1リン酸化標的のリストと  された。これは、三つの基質上での七つの以前に知られていなかったリン酸化を確証した；五つの残基がLATS1上で、一つがMAP4上で、一つがZMYM2上でリン酸化された。図１９は、予測されたリン酸化の部分集合の質量分析器による検証を示している。示されているのは、示されている条件におけるLATS1-IPの検出されたリンタンパク質の生の強度値（点）（n＝6個の複製）と、対応する平均値（線）とである。これらのリン酸化は異なる処置条件（図１９に示される）のもとで得られたので、それらはFASおよびエトポシド処置の生物学的効果を媒介するための主要な候補となる。これは、LinkPhinderが興味深い生物学的に有意な予測をするために有用であることを実証する。
【０２８７】
重要なことに、これらの実験的に検証された予測の大半は、既存の予測ツールのいずれによっても予測できなかった。特に、あるツール（GPS）は高い厳密性で予測の一つ（LATS1-Ser464）を予測することができた（より低い厳密性でもそれ以上予測できなかった）。他の五つのツールは、これらのツールが提供するセッティングとは独立に我々の予測のいずれも再現できなかった。他のツールによってなされたLATS1予測のリストを相互参照するとき、LinkPhinderによってできなかった追加的な予測がみつかることはなかった。
【０２８８】
まとめると、これらの結果は、LinkPhinderは、他のツールではできないような、多くの有用な、生物学的に意味があり、実験的に検証可能な予測をすることができることを実証している。
【０２８９】
２．６  LinkPhinder結果の概観
計算機による検証では、システムは、それぞれ精度‐再現およびROC曲線の下の面積のメトリック〔AU-PRおよびAU-ROC〕のメトリックにおいて、0.906（±0.02）および0.958（±0.006）のスコアを達成した。これは高い一般化力を示している。以前に知られていなかったリン酸化を予測するという点でのツールの能力を評価するために、二つの型の検査室検証が実行された――二つの臨床的に有意なキナーゼ（LATS1、AKT1）での選択された高い厳密性のリン酸化予測を目標とする実験と、LATS1によってリン酸化された基質に焦点を当てた質量分析実験とである。目標とされた実験は、二つの実際の発見を確証した：LATS1はSer133においてCREB1をリン酸化し、AKT1はSer18においてSTK3をリン酸化する。これらの発見はいずれも、クエリーとしてLATS1またはAKT1キナーゼを出発点とする五つの現状技術のうちの四つでは予測できなかった（GPSおよびPhosphoPredictだけはそのようなクエリーをサポートしているが、それぞれLinkPhinderによってカバーされるキナーゼの25%未満および3.5%未満についてのみである）。基質についての問い合わせは、高い厳密性の設定でのいかなるツールを用いても、LinkPhinderの高い厳密性の予測を再現しなかった。中程度の厳密性では、GPSツールは一つの予測（LATS1によるCREB1リン酸化）を再現できた。低い厳密性では、NetPhosKツールは他方の予測（AKT1によるSTK3リン酸化）を再現できた。
【０２９０】
相補的な検査室検証は、厳密性が高いおよび厳密性が中程度の予測を、LATS1での質量分析データと相互参照した。これは、LATS1の以前に知られていなかった自己リン酸化をさらに五つ（高い厳密性）、LATS1によるMAP4およびZMYM2の二つのリン酸化（中程度の厳密性）を確証した。六つのうち五つのツールは、これらの予測のどれも全く再現できなかった。GPSツールは予測の一つをもたらした（14%）。GPSができるすべての予測のリストをLATS1についての発明者の質量分析データと相互参照すると、LinkPhinderツールができなかった追加的な予測はみつからなかった。これらの結果は、関係する現状技術の解決策に比べたときの本願の手法の優越性を明確に実証するとともに、ホスホプロテオミクスにおける発見のペースを増すための高い潜在力を示している。
【０２９１】
議論
LinkPhinderは、リン酸化ネットワークを知識グラフとして表現することによって、現行のリン酸化予測ツールのいくつかの限界を克服する。これは、この分野においてこれまで試みられたことのなかった、新規な手法である。知識グラフは、機械学習、人工知能およびセマンティックウェブ・コミュニティーにおいて関連知識を表現することへの、比較的新しい手法である。知識グラフは、二つの主要な理由のため、急速に人気を得た。まず第一に、知識グラフは、簡単なフォーマットを使って多様な型の知識を表現できる。第二に、知識グラフは、新たな事実を発見するようなタスクのために使用できる統計的関係学習の堅牢な技法になじみやすい。発見は、当然ながら、知識グラフの構造全体（すなわち、単に局所的で明示的な特徴ではなく、潜在的な特徴や長距離の、暗黙的な関係）を利用する。このため、かかる表現は、複雑なネットワーク依存性が想定される分野では、非常に有用である。リン酸化はそのような分野の例であるので、発明者の初期の想定は、リン酸化ネットワークを知識グラフとして表現することで、幅広い範囲のタンパク質に対して正確な予測をするという点で、根本的に新しい可能性をもたらすことができるというものであった。呈示した結果は、この考えが正しかったことを実証している。
【０２９２】
特に、キナーゼ、リン酸化モチーフおよび基質が主語、述語および目的語の役割を担うキナーゼ・ネットワークの本質を知識グラフが「自然に」捕捉できることが示された。それにより、現代のリンク予測の諸方法を使って、ネットワーク・コンテキスト全体に基づいて、新規なリン酸化反応を予測し、その確からしさを推定することができる。知識グラフおよびリンク予測技法の上に構築されるモデルは、入力データにおいて表現されている任意のタンパク質についての予測をすることを許容する。これは、既存のツールと比べたときに、実質的な使い勝手の利点である。既存のツールはしばしば、初期クエリーとして基質を許容するだけであり、限られた数のキナーゼしか含まない。発明実施形態が、既存のツールよりもずっと広い範囲の可能なリン酸化をカバーするのみならず、非常に高い一般化力をも示すことが実証された。この側面は、実施形態が他のツールでは可能でない多くの生物学的に有効な予測を生成できることを示す実験において検証された。
【０２９３】
〈附属書A〉
計算機実験の詳細な説明
Ａ．１  リン酸化ネットワークと、モデルをトレーニングするための知識グラフとの構築
リン酸化ネットワークの構築は、キナーゼ、基質および基質のアミノ酸リン酸化部位の関係情報を含んでいるデータ源を必要とする。実験は、PhosphoSitePlus（登録商標）というキナーゼ‐基質データセット、実験的に決定された基質、配列、コグネート・キナーゼ（cognate  kinase）および文献からキュレーションされたメタデータを使った。ヒト種についてのキナーゼおよび基質タンパク質に関わる関係のみが考慮された（KIN  ORGANISM==SUB  ORGANISM==’human’)）。データセットはリン酸化部位の、サイズ7のアミノ酸コンテキスト配列を含むが、異なる、潜在的にはより大きなコンテキスト配列サイズで実験するために、その情報は使われなかった。その代わりに、UniProt（Universal  Protein  Resource）からのコンテキスト配列が抽出された。より特定的には、レビューされた（Swiss-Prot）メイン・タンパク質配列（uniprot  sprot.fasta）から、およびアイソフォーム配列（uniprot  sprot  varsplic.fasta）からである。キナーゼ‐基質データセットにおいて、リン酸化部位がUniProt配列にマッチしない任意の関係。表３１は、リン酸化ネットワークについてのいくつかの統計を呈示している。
【０２９４】
［表３１］
リン酸化ネットワーク・コンポーネント統計  リン酸化ネットワークにおける要素数
リン酸化関係                  9802
キナーゼ                      327
基質                          2350
リン酸化部位                  7083
基質／キナーゼの平均数        7.19
基質の部位／キナーゼの平均数  21.66
。
【０２９５】
知識グラフ変換は、リン酸化ネットワーク陳述を知識グラフ関係に変換するために、キナーゼ・ファミリー・コンセンサス・モチーフを利用する。キナーゼ・ファミリー辞書がUniProtのヒトおよびマウスのタンパク質キナーゼ：分類およびインデックスから抽出される。リン酸化ネットワークのヒトのキナーゼ部分についての情報のみが保持される。
【０２９６】
リン酸化ネットワーク・データの知識への変換は、MEMEツールを利用した。MEMEは、同じファミリーの諸キナーゼによって標的とされる諸基質から引き出された部位コンテキスト配列の諸バッチに対して並列に適用された。それらのバッチのサイズは、変換およびモデル・トレーニング・プロセスの構成設定可能なハイパーパラメータであった。{50,100}の範囲の値が使われた。MEMEツールのすべての呼び出しに使われる静的パラメータは：-text、-protein、-mod  zoops、-x  branch、-minw  2であった。
【０２９７】
配列バッチの特定の属性および／またはモデル全体のハイパーパラメータに依存するMEMEパラメータは'-maxw  MW、-maxsize  MS、-nmotifs  NM、-bfile  BFであって。ここで、MWはバッチにおける配列の最大幅、MSは該最大幅にバッチにおける配列数を乗算したもの、NMは生成されるべきモチーフの最大数（報告された実験では保守的に10に設定した；試験されたどの設定のもとでもそれより多くのモチーフを生成したバッチはなかったので）、BFは配列バッチから生成される次数5の背景マルコフ・モデルであった。
【０２９８】
表３２は、生成された知識グラフについてのいくつかの統計を呈示している。
【０２９９】
［表３２］
知識グラフ・コンポーネント統計  知識グラフにおける要素数
モチーフ・ベースの関係                    9956
キナーゼ・ファミリー                      12
キナーゼ・ファミリー・モチーフ（述語型）  24
モチーフ／キナーゼ・ファミリーの平均数    2.00
。
【０３００】
Ａ．２  現状技術の予測データセットの構築
Scansite  3  Scansiteは、特定のタンパク質キナーゼによってリン酸化される可能性が高いタンパク質基質内のモチーフを探す。Scansiteは入力としてタンパク質基質IDおよび配列を取り、出力として所与の基質アミノ酸部位が、システムによって扱われる70のキナーゼの一つによってリン酸化されることの信頼スコアを与える。システムは、検証データセットに含まれる93個の基質すべてをもって問い合わせされた。ScansiteはAKT1およびMAPK1キナーゼについての予測を提供できるだけである。生成されるスコアに関わりなく、検証セットと交わりをもつシステム陳述応答のみが保持された（同じキナーゼ、リン酸化部位、基質）。
【０３０１】
NetworKINおよびNetPhorest  KinomeXplorerフレームワークは、NetworKINおよびNetPhorestシステム両方の結果を含み、スコアのみが変わり、ダウンロードのためのダンプがある。KinomeXplorerデータセットは遺伝子識別子を使ってタンパク質リン酸化を参照する。結果を検証セットと比較するために、まず、タンパク質識別子を回復するためにUniProt遺伝子クエリーが使われた。データセットをダウンロードした後、タンパク質IDを解決するために、UniProtはEmbIDおよび遺伝子名両方を使って問い合わせされた。クエリーがいかなる結果も与えなかった場合、あるいは複数のタンパク質が返される場合、もとの陳述はドロップされる。最後に、システムのタンパク質識別子ベースの陳述応答であって、検証セットと交わりのあるもの（同じキナーゼ、リン酸化部位、基質）のみが保持された。
【０３０２】
NetPhos3.1  NetPhos3.1システムは、ニューラルネットワークのアンサンブルを使って、真核生物タンパク質におけるセリン、トレオニンまたはチロシン・リン酸化部位を予測する。システムは、検証データセットからのAKT1を含む17個のキナーゼについての予測を提供できるだけである。スタンドアローンのソフトウェア・パッケージを使って、システムは、検証データセットに含まれるすべての93個の基質および関連する配列を用いて問い合わせされた。最後に、NetoPhos3.1陳述応答であって、検証セットと交わりのあるもの（同じキナーゼ、リン酸化部位、基質）のみが保持された。
【０３０３】
GPS3.0  グループ・ベース予測システム（GPS:  Group-based  Prediction  System）は、複数種における四レベルのキナーゼ階層構造を使って、コグネート・プロテインキナーゼでのリン酸化部位を予測する。このデスクトップ・アプリケーションのおかげで、検証データセットに含まれる93個の基質および関連する配列についての結果を引き出すために、バッチ予測器が使われた。システムは、プロテインキナーゼKAPK1、AKT1およびAKT2を扱う。検証セットと交わりのある陳述応答のみが保持された（同じキナーゼ、リン酸化部位、基質）。
【０３０４】
PhosphoPredict  PhosphoPredictシステムは、キナーゼ特異的な基質および対応するリン酸化部位を、ATM、CaM、CDKs、CK1、CK2、GRK、GSK-3、MAPKs、PKA、PKB（AKT1としても知られる）、PKCおよびSRCを含む12のヒトのキナーゼについて予測する。PhosphoPredictは、最も情報のある特徴部分集合であって、各キナーゼ・ファミリーの予測成功に寄与するものを選択するために、最小冗長性・最大適合性（mRMR:  minimum  Redundancy  and  Maximum  Relevance）に基づく特徴選択方法を用いる。AKT1に対応する陳述応答のみが保持された（システムはLATS1キナーゼを扱うことができない）。
【０３０５】
B  生物学的実験の詳細な説明
標的を絞った検証のための細胞培養実験
Hek-293細胞は通常は、10%の胎児血清で補足されたDulbeccos修正培地において培養された。サブコンフルエントの細胞に、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン（Invitrogene社）が移入された。pSG5-gag-AKTは当分野で記述された。LATS1  siRNAおよびAKT  siRNAはDhamacorn社からで、配列は当分野で記述されている。移入の24時間後、HEK293細胞は16時間にわたって無血清にされた。その後、細胞は20mM  HEPES（pH7.5）、150mM  NaCl、1%  NP-40、2mM  NaF、10mMb-Gycerolphosphate、2MM  Na4P2O4およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤において溶解された。細胞溶解物はSDS-PAGEによって分離され、ウェスタンブロットによって解析された。リン酸化されたタンパク質はpAKT‐基質特異的抗体を用いて免疫沈降された。手短かには、溶解物は1ulの抗体および5ulのタンパク質-Gセファロース・ビーズを用いて、オービタル・ホイール（an  orbital  wheel）において4Cで1時間にわたってインキュベーションされた。免疫沈降物は溶解緩衝液で3回洗浄された。2ベッド体積の変成させるlaemli緩衝液がドライ・ペレットにされたビーズに加えられ、試料を100Cで5分間煮沸することによって免疫複合体が溶離された。抗creb、抗LATS1抗P53抗tub、mTOR、p-YAP-S127。
【０３０６】
拡張された検証のための質量分析実験
HeLa細胞は過渡的にGFPでタグ付けされたLATS1構造体を移入された。二日後、それらの細胞は、一晩飢餓状態にされた、あるいはFasL、エトポシド3で処置された。細胞は溶解緩衝液（20mM  4-(2ヒドロキシエチル)-1ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）pH7.5、150M  NaCl、1%  NP-40、ホスファターゼ阻害剤、10mM  Gly、1MmNa3VO4、2mM  Na4P2O7、2mM  Na）、プロテアーゼ阻害剤5g/ml  Leu）を用いて溶解され、タンパク質はGFP-trap  A（Chromotek社）を使って免疫沈降された。ビーズは洗浄緩衝液を使って3回洗浄された。GFPビーズに免疫沈降されたタンパク質は、当分野において記述されているように消化された。手短かには、免疫沈降物は二段階で消化された。第一に、60lの溶離緩衝液１（2M尿素、50mM  Tris-HCL  pH7.5、5g/mlトリプシン）を各試料に加え、シェイカーで27Cでインキュベーションされることによって。30分のインキュベーション後、試料は13000rpmで30秒間、遠心分離され、上澄みが新しいオートクレーブ・エッペンドルフ管の中に集められた。第二に、試料当たり溶離緩衝液２（2M尿素、50mM  Tris-HCL  pH7.5、1mMジチオトレイトール）の25lを2回加えて、その後上記のように遠心分離することによって、上澄みがオートクレーブ・エッペンドルフ管の中に集められた。両方の上澄みが組み合わされて、室温で一晩インキュベーションされた。試料はアルキル化された（20lヨードアセトアミド、5mg/ml、室温で暗所で30分）。次いで、各試料に1l  100%トリフルオロ酢酸（TFA）を加えることによって反応が停止され、試料の100lがすぐに、オクタデシルC18ディスク（Supelco社）を含んでいる平衡にされた手製のC18ステージ・ティップにロードされた。ティップは、50%  AcN＋0.1%TFAを50lロードすることによって、以前に活性化された。手早い遠心分離後、0.1%TFAのさらに50%がティップにロードされ、破棄された。試料は、0.1%TFAの50lを二回使うことによって脱塩され、50%AcNおよび0.1%TFA溶液の25lを二回用いて溶離された。最終的な溶離物は組み合わされ、体積が5lに減るまでCentriVap濃縮器（Labconco社）を使って濃縮された。0.1%TFAを加えて13000rpmで10分間遠心分離することによって、試料は希釈されて、15lの最終的な体積が得られた。試料の12lは、スナップリング付き小型瓶PP  0.3ml（VWR社）に移され、スナップリング・キャップ11mm、ブルー（VWR社）でロックされ、MSによって解析された。MS/MS解析に先立って、12の最も強烈なイオンを選択する自動データ依存スイッチング・モードで動作する質量分析器を用いて、データが収集された。質量スペクトルがMaxQuantによって解析された。MaxQuantを使ってラベルフリー定量が実行された。
【０３０７】
ペプチド識別
MaxQuant（バージョン1.3.0.5）が、LC-MS/MSからの生の質量分析データ・ファイルを、タンパク質定量のために解析するために使われた。特に断わりのない限り、以下のパラメータを含むデフォルト設定が使われた：トリプシン/P消化：可変修飾は酸化およびアセチルを含んだ：固定修飾はカルバミドメチル（Cys）のみを含んだ：多重度＝1：20ppmでの第一の探索：6ppmの質量精度（MS）でのメインの探索および断片イオンについての20質量偏差：データはヒトのデータベース（Uniprot  HUMAN）に対して探索された：最小ペプチド長6：ラベル付けされたアミノ酸についてのフィルタリングなし：ペプチドおよびタンパク質について選択された偽発見率（FDR:  false  discovery  rate）0.01：結果は再定量オプションを通じて洗練される：1分の時間窓で選択された試行と試行の間のマッチ：最小の比カウント（minimum  ratio  count）は1を設定したラベルフリー定量。
【０３０８】
コンピュータ実装
図２０は、本発明を具現し、特定的なリン酸化部位を見出す方法を実装するために使用されうるデータ記憶サーバーのようなコンピューティング装置のブロック図である。本コンピューティング装置はプロセッサ９９３およびメモリ９９４を有する。任意的に、本コンピューティング装置は、他のコンピューティング装置との、たとえば発明実施形態の他のコンピューティング装置との通信のための、あるいは実施形態において使われるリン酸化データセット／ネットワーク１０２、タンパク質配列データベース１０３およびキナーゼ・ファミリー・データベース１０４への接続のための、ネットワーク・インターフェース９９７をも含む。あるいはまた、この情報はローカルなデータ記憶に記憶されていてもよい。
【０３０９】
たとえば、ある実施形態は、そのようなコンピューティング装置のネットワークから構成されてもよい。任意的に、コンピューティング装置は、たとえば関心対象タンパク質１１０を入力するためのキーボードおよびマウスのような一つまたは複数の入力機構９９６と、表３０のような結果をユーザーに対して表示しうる一つまたは複数のモニタのようなディスプレイ・ユニット９９５とを含む。コンポーネントはバス９９２を介して互いに接続可能である。
【０３１０】
メモリ９９４はコンピュータ可読媒体を含んでいてもよい。この用語は、単一の媒体または複数の媒体（たとえば中央集中式のまたは分散式のデータベースおよび／または関連するキャッシュおよびサーバー）であって、コンピュータ実行可能命令を担持するまたはデータ構造が記憶されているよう構成されたものを指しうる。コンピュータ実行可能命令はたとえば、汎用コンピュータ、特殊目的コンピュータまたは特殊目的処理装置（たとえば一つまたは複数のプロセッサ）によってアクセス可能であり、それに一つまたは複数の機能または動作を実行させる命令およびデータを含んでいてもよい。よって、用語「コンピュータ可読記憶媒体」は、半導体メモリ、光学式メディアおよび磁気メディアを含むがそれに限られないものと解釈されうる。限定ではなく例として、そのようなコンピュータ可読媒体は、ランダム・アクセス・メモリ（RAM）、読み出し専用メモリ（ROM）、電気的に消去可能なプログラム可能型読み出し専用メモリ（EEPROM）、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（CD-ROM）または他の光ディスク記憶、磁気ディスク記憶または他の磁気記憶デバイス、フラッシュ・メモリ・デバイス（たとえば半導体メモリ・デバイス）を含む非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を含みうる。
【０３１１】
プロセッサ９９３はコンピューティング装置を制御し、処理動作を実行する、たとえば本稿に記述され、請求項において定義されているモジュール（変換器１０５、１０３、リンク予測器１１１それらのサブコンポーネント）のさまざまな異なる機能を実装するためにメモリに記憶されているコードを実行するよう構成されている。メモリ９９４は、プロセッサ９９３によって読まれ、書かれるデータを記憶する。本稿で言うところでは、プロセッサは、マイクロプロセッサ、中央処理ユニットなどといった一つまたは複数の汎用処理装置を含みうる。プロセッサは、複雑命令セット・コンピューティング（CISC）マイクロプロセッサ、縮小命令セット・コンピューティング（RISC）マイクロプロセッサ、超長命令語（VLIW:  very  long  instruction  word）マイクロプロセッサまたは他の命令セットを実装するプロセッサまたは命令セットの組み合わせを実装する諸プロセッサを含みうる。プロセッサは、特定用途向け集積回路（ASIC）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）、デジタル信号プロセッサ（DSP）、ネットワーク・プロセッサなどといった一つまたは複数の特殊目的処理装置をも含みうる。一つまたは複数の実施形態では、プロセッサは、本稿で論じられる動作および段階を実行するための命令を実行するよう構成されている。
【０３１２】
ディスプレイ・ユニット９９７は、コンピューティング装置によって記憶されているデータ（たとえば、入力されるおよび生成されるさまざまな陳述）の表現を表示し、カーソルおよびダイアログ・ボックスならびにスクリーンを表示し、ユーザーとコンピューティング装置に記憶されているプログラムおよびデータとの間の対話を可能にする。入力機構９９６はユーザーがデータおよび命令をコンピューティング装置に入力できるようにしうる。たとえば、関係学習器のための任意のパラメータおよび関心対象の任意のタンパク質である。
【０３１３】
ネットワーク・インターフェース（ネットワークI/F）９９７はインターネットのようなネットワークに接続されてもよく、該ネットワークを介して他のそのようなコンピューティング装置に接続可能である。ネットワークI/F  ９９７はネットワークを介した他の装置との間のデータ入出力を制御しうる。マイクロフォン、スピーカー、プリンター、電源ユニット、ファン、ケース、スキャナ、トラックボールなどといった他の周辺装置がコンピューティング装置に含まれていてもよい。
【０３１４】
変換器１０５、１０３は、メモリ９９４の一部に記憶されている処理命令を含んでいてもよく、プロセッサ９９３が該処理命令を実行してもよく、メモリ９９４の一部が、モチーフ・ベースおよび部位特異的な陳述の間の変換のための処理命令の実行の間に陳述を記憶してもよい。変換された陳述は、メモリ９９４におよび／または接続されている記憶ユニットに記憶されてもよい。
【０３１５】
リンク予測器１１１は、メモリ９９４の一部に記憶されている処理命令を含んでいてもよく、プロセッサ９９３が該処理命令を実行してもよく、メモリ９９４の一部が、候補陳述、陰性陳述、陰性候補陳述および予測される陳述を生成するための処理命令の実行の間に陳述を記憶してもよい。変換された陳述は、メモリ９９４におよび／または接続されている記憶ユニットに記憶されてもよい。
【０３１６】
本発明を具現する方法は、図２０に示されるようなコンピューティング装置で実行されてもよい。そのようなコンピューティング装置は図２０に示されるすべてのコンポーネントを有する必要はなく、それらのコンポーネントの部分集合から構成されていてもよい。本発明を具現する方法は、一つまたは複数のデータ記憶サーバーとネットワークを介して通信する単一のコンピューティング装置によって実行されてもよい。該コンピューティング装置は、最終的な予測された陳述を含むさまざまな陳述およびそのスコアを含む記憶しているデータ記憶自身であってもよい。
【０３１７】
本発明を具現する方法は、互いと協働して動作する複数のコンピューティング装置によって実行されてもよい。前記複数のコンピューティング装置の一つまたは複数は、さまざまな陳述の少なくとも一部分を記憶するデータ記憶サーバーであってもよい。
【０３１８】
用語集
キナーゼ
「リン酸と呼ばれる化合物を他の分子に加える型の酵素（身体内の化学反応をを加速するタンパク質）。これは、細胞内の他の分子を活性または不活性にならせることがある。キナーゼは多くの細胞プロセスの一部である。いくつかの癌治療は、癌にリンクしているある種のキナーゼを標的とする。」https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms?CdrID=641114。
【０３１９】
リン酸化
リン酸化（ホスホリル基PO3の付加）は、あらゆる生命体における多くの主要なシグナル伝達経路にとって本質的な、最も重要なタンパク質相互作用の一つである。リン酸化は有向で、コンテキスト依存の関係である――動作者（キナーゼ）タンパク質Kが受動者（基質）タンパク質Sを部位L（基質タンパク質のアミノ酸鎖内のある位置）においてリン酸化する。リン酸化は基質タンパク質の挙動を調節する。これは、活性化または不活性化されてもよく、あるいはその機能がより複雑な仕方で修正されてもよい。リン酸化経路の下流の影響は、しばしば、対応する細胞の挙動における主要な変化につながる――細胞が成長、増殖を始めたり、あるいはプログラム細胞死（アポトーシス）の過程にはいったりすることがある。
【０３２０】
リン酸化部位
基質タンパク質のアミノ酸鎖内の（あるアミノ酸のところの）位置。
【０３２１】
（サイズ2k＋1の）リン酸化部位コンテキスト
中央の当該リン酸化部位および左側および右側の両方のk個のアミノ酸をカバーする、基質アミノ酸配列の部分配列。
【０３２２】
リン酸化ネットワーク
（ヒトまたは他の動物の）リン酸化反応の知識ベース。キナーゼと基質における特定のリン酸化部位との間の諸関係からなる。
【０３２３】
基質
「化学では、典型的には、化学反応において観察される、反応体と反応して産物を生成する化学種」https://en.wikipedia.org/wiki/Substrate_(chemistry)。
【０３２４】
シグナル伝達経路
「細胞分裂または細胞死のような一つまたは複数の細胞機能を制御するために一緒にはたらく、細胞内の分子の群をいう。経路の最初の分子がシグナルを受信した後、それは別の分子を活性化する。このプロセスが繰り返されて、ついには最後の分子が活性化されて、細胞機能が実行される。シグナル伝達経路の異常な活性化は癌につながることがあり、これらの経路をブロックするための薬が開発中である。これらの薬は、癌細胞の成長を阻止し、癌細胞を殺す助けとなりうる。」https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms?cdrid=561720。
【０３２５】
モチーフ
確からしいと思われる生物学的機能をもつタンパク質の共通（またはコンセンサス）配列パターン。これはタンパク質配列の一部または全部でありえ、このコンテキストでは、配列の群からのコンセンサスとして導出される。モチーフは「位置特異的スコア付け行列」（position-specific  scoring  matrix）またはPSSMとして表わされてもよい。モチーフは、配列中の所与の位置において、各アミノ酸についての対数尤度スコアを与えてもよい。諸実施形態において、モチーフは、リン酸化知識グラフにおける述語に直接対応する。
【０３２６】
部位特異的陳述（site-specific  statement）
部位特異的陳述は、特定のアミノ酸残基（部位位置）に関する、タンパク質キナーゼと基質キナーゼとの間の、タンパク質残基に対してリン酸化が起こるリン酸化相互作用を表わす。陳述は、
〈タンパク質キナーゼ，リン酸化部位位置，タンパク質基質〉
と記載される三項組の形であると想定されるが、より長い多項組をなしてもよい。
【０３２７】
モチーフ・ベースの陳述（motif-based  statement）
モチーフ・ベースの陳述は、モチーフというリン酸化部位の抽象的な（例に特異的でない）概念に関する、タンパク質キナーゼとタンパク質基質との間のリン酸化相互作用を表わす。このモチーフは、キナーゼ・ファミリーのうちでのリン酸化部位配列における規則性から学習される。モチーフは、配列中の所与の位置において、各アミノ酸についての対数尤度スコアを与える。モチーフ・ベースの陳述は、上記と同様の
〈タンパク質キナーゼ，モチーフ，タンパク質基質〉
の多項組の形である。
【０３２８】
そのような陳述の集合は自然にリン酸化知識グラフを形成する。キナーゼおよび基質がそれぞれ主語および目的語に対応し、モチーフが述語の役割を果たす（それらは異なる陳述を横断して有意味に比較されることができるので；そのようなことは、部位特異的な陳述における単なる基質依存の部位位置では可能ではない）。
【０３２９】
タンパク質コンテキスト陳述（protein  context  statement）
タンパク質コンテキスト陳述は、タンパク質キナーゼおよびタンパク質基質に関係した、追加的なタンパク質‐タンパク質相互作用のような関係陳述である。これは他の陳述と同様に、
〈主語，関係，目的語〉
の多項組の形で与えられる。これは、主語（subject）および目的語（object）エンティティが関係relationをもつことを示す。
【０３３０】
候補陳述（candidate  statement）
候補陳述は、システムによって予測段階の間に考慮されるべき陳述である。このように、候補陳述は、初期のリン酸化ネットワークには含まれていないが、可能なリン酸化としてモデルによって予測される陳述である。候補陳述は、ユーザーによる入力として与えられる関心対象のキナーゼに基づいていてもよい。予測段階は、選択された候補陳述に、トレーニングされたモデルによってランク付けスコアを関連付けることからなる。次いで、ランク付けは、（モデルおよび選択された判定閾値を使って）最も確からしい未知のリン酸化を決定するために、ストレートな仕方で使われる。候補陳述は典型的には部位特異的であり、予測プロセスの間に、モチーフ・ベースに変換し、変換し戻されてもよい。候補陳述は、その候補陳述の確率に関する情報を含んでいてもよい。
【０３３１】
知識グラフ〔ナレッジグラフ〕
（ノードまたはエンティティによって表わされる）項目の集まりであって、その任意の項目がそれらの間のリンク（二項関係）によって接続されうるようなもの。これは、グラフ構造の知識ベース／データベースとして理解されうる。
【０３３２】
リンクが有向であれば、知識グラフは典型的には
〈主語，述語，目的語〉
の形の関係の集合として表わされる。ここで、述語は関係の型を表わし、主語および目的語は典型的には、能動および受動エンティティと解釈される。ホスホプロテオミクスのコンテキストでは、述語はリン酸化に対応し、一方、主語および目的語はそれぞれキナーゼおよび基質になる。
【０３３３】
知識グラフ埋め込み
知識グラフ・エンティティーおよび関係の低次元連続空間におけるベクトルとしての表現。知識グラフの内在的な構造を保存しつつ知識グラフに含まれる関係情報から計算される。本来的に多変量の大規模問題（たとえば知識グラフにおける発見）の効率的な解法のために使用可能。
【０３３４】
統計的関係学習
機械学習の分枝。入力項目を表わす特徴ベクトルが、その入力項目の、他の入力項目に対する関係を含んでいてもよい。
【０３３５】
リンク予測
二つのノードの間のリンクの存在の確からしさを、観察されるノードおよびノードの属性に基づいて推定しようとする技法。典型的な使用事例は、知識グラフに明示的に存在しない新たなリンクの発見。
【０３３６】
以上の実施例を含む実施形態に関し、さらに以下の付記を開示する。
（付記１）
予測される部位特異的なタンパク質リン酸化陳述の発見のためのシステムであって、陳述は、キナーゼ、予測されるリン酸化部位およびタンパク質基質をリンクするものであり、当該システムは：
モチーフ変換器であって、前記モチーフ変換器は：
既知の部位特異的な陳述であって、各部位特異的な陳述はキナーゼ、リン酸化部位およびタンパク質基質をリンクする部位特異的なフォーマットである、陳述、を記憶しているリン酸化データセット；
キナーゼ・ファミリー・データベース；および
タンパク質配列データベース
から入力を受け取るものであり、前記モチーフ変換器は、モチーフ・ベースのリン酸化陳述を生成するよう構成されており、各モチーフ・ベースのリン酸化陳述は、キナーゼ、リン酸化部位におけるおよび該リン酸化部位の両側におけるアミノ酸についての一般化されたスコア付け行列の形のモチーフおよびタンパク質基質をリンクする一般化されたフォーマットである、モチーフ変換器と；
新たなモチーフ・ベースの陳述を予測するリンク予測器であって、前記リンク予測器は：
前記モチーフ・ベースの陳述から陰性陳述を生成する陰性モチーフ・ベース陳述生成器；
前記モチーフ・ベースの陳述の組み合わせによって前記一般化されたフォーマットで候補陳述を生成し、前記候補陳述の前記陰性陳述との組み合わせによって陰性候補陳述を生成する候補生成器；および
前記候補陳述および前記陰性候補陳述を統計的関係学習モデルにおいて使って前記候補陳述にスコア付けし、予測されるモチーフ・ベースのリン酸化陳述を前記一般化されたフォーマットで保持する、関係学習器を含む、リンク予測器と；
前記タンパク質配列データベースから入力を受け取り、前記一般化されたフォーマットでの前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を受け取り、前記部位特異的なフォーマットで、予測された部位特異的なリン酸化陳述を生成するよう構成されている、部位特異的変換器とを有する、
システム。
（付記２）
前記モチーフ変換器は：
それぞれの部位特異的な陳述を、前記キナーゼ・ファミリー・データベースにおけるキナーゼ・ファミリーと関連付ける段階と；
前記タンパク質配列データベースを使って、それぞれの部位特異的な陳述についてのリン酸化部位におけるアミノ酸および該リン酸化部位の両側における複数のアミノ酸のコンテキスト配列を形成する段階と；
前記コンテキスト配列を、キナーゼ・ファミリーによってグループ分けする段階と；
各キナーゼ・ファミリーにおけるコンテキスト配列について、一つまたは複数の位置特異的なスコア付け行列を計算する段階であって、それぞれの位置特異的なスコア付け行列は、コンテキスト配列長さの各位置における、各アミノ酸についてのスコアを与え、それぞれの位置特異的なスコア付け行列はモチーフを定義する、段階と；
各部位特異的な陳述について、その部位特異的な陳述についてのコンテキスト配列と、そのコンテキスト配列がグループ分けされているキナーゼ・ファミリーにおける各モチーフとの間の適合性を計算する段階と；
それぞれの部位特異的な陳述について、前記キナーゼと、最高パフォーマンスのモチーフと、前記タンパク質基質とをリンクするモチーフ・ベースの陳述を生成する段階とを実行するものである、
付記１記載のシステム。
（付記３）
前記陰性モチーフ・ベース陳述生成器は、陰性陳述を生成するためにモチーフ・ベースの陳述<K,M,S>における基質を異なる基質で置換すること、およびモチーフ・ベースの陳述におけるキナーゼを異なるキナーゼ・ファミリーからのキナーゼで置換すること、の一つまたは複数によって行なうことによって、陰性陳述を生成する、付記１または２記載のシステム。
（付記４）
モチーフ・ベースの陳述<K,M,S>における基質Sが異なる基質S'によって置換され、該異なる基質上の各リン酸化部位について、コンテキスト配列がモチーフ・ベースの陳述のモチーフと比較され、適合性が負であれば、陰性陳述<K,M,S'>が提供される、付記３記載のシステム。
（付記５）
モチーフ・ベースの陳述<K,M,S>におけるキナーゼKが異なるキナーゼK'によって置換され、キナーゼKと同じファミリーにない各キナーゼについて、陳述<K',M,S>が提供される、付記３または４記載のシステム。
（付記６）
前記陰性モチーフ・ベース陳述生成器は、前記陰性陳述および前記モチーフ・ベースの陳述を比較し、前記陰性陳述の一つおよび前記モチーフ・ベースの陳述の一つの両方として現われるいかなる陳述も、前記陰性陳述から削除するよう構成されている、付記１ないし５のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記７）
前記候補生成器における陰性陳述フィルタがさらに、候補陳述における各キナーゼおよびモチーフについて、前記キナーゼと、前記モチーフと、前記陰性陳述において前記キナーゼおよび前記モチーフに関連付けられたすべての基質との組み合わせとして、諸陰性候補陳述を生成する、付記１ないし６のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記８）
前記候補生成器における陰性陳述フィルタがさらに、候補陳述における各モチーフおよび基質について、前記モチーフと、前記基質と、前記陰性陳述において前記基質および前記モチーフに関連付けられたすべてのキナーゼとの組み合わせとして、諸陰性候補陳述を生成する、付記１ないし７のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記９）
前記陰性陳述フィルタは、陰性候補陳述から、前記陰性候補陳述の一つおよび前記候補陳述の一つの両方として現われるいかなる陳述も前記陰性候補陳述から破棄する、付記６、７、８のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記１０）
前記関係学習器は、モチーフ・ベースの陳述および陰性陳述を入力し、これらの入力からモデルを学習するものであり、次いで、該モデルが、前記候補陳述および前記陰性候補陳述にスコア付けするために使われる、付記１ないし９のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記１１）
前記候補生成器は、前記モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆるキナーゼと、前記モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆるモチーフと、前記モチーフ・ベースの陳述に含まれるあらゆる基質との組み合わせから前記モチーフ・ベースの陳述自身を除いたものとして、候補陳述を生成する、付記１ないし１０のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記１２）
前記関係学習器は、候補陳述と、同じキナーゼおよびモチーフをもつまたは同じモチーフおよび基質をもつすべての前記陰性候補陳述とをスコア付けし、ランク付けして、前記候補陳述のランクおよびスコアを出力する、付記１ないし１１のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記１３）
タンパク質をその相互作用によってリンクするタンパク質コンテキスト・データベースから入力を受け取り、タンパク質コンテキスト陳述を、前記リンク予測器における使用のために生成するタンパク質陳述生成器をさらに有する、付記１ないし１２のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記１４）
前記部位特異的変換器は：
前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を入力し；
それぞれの予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述について、リン酸化部位データベースから、可能なリン酸化部位のリストを抽出し；
それぞれのリン酸化部位について、前記タンパク質配列データベースから前記部位コンテキスト配列を抽出し、該部位コンテキスト配列の、前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述におけるモチーフとの適合性を計算し；
前記リン酸化部位についての適合性があらかじめ定義されたスコアより上であれる場合には、予測された部位特異的なリン酸化陳述を、前記予測されたモチーフ・ベースの陳述におけるキナーゼおよび基質を前記リン酸化部位とリンクする部位特異的なフォーマットで生成するよう構成されている、
付記１ないし１３のうちいずれか一項記載のシステム。
（付記１５）
予測される部位特異的なタンパク質リン酸化陳述の発見のための方法であって、陳述は、キナーゼ、予測されるリン酸化部位およびタンパク質基質をリンクするものであり、当該方法は：
既知の部位特異的な陳述であって、各部位特異的な陳述はキナーゼ、リン酸化部位およびタンパク質基質をリンクする部位特異的なフォーマットである、陳述、を記憶しているリン酸化データセット；
キナーゼ・ファミリー・データベース；および
タンパク質配列データベース
からのデータを使って、
モチーフ・ベースのリン酸化陳述を生成する段階であって、各モチーフ・ベースのリン酸化陳述は、キナーゼ、リン酸化部位におけるおよび該リン酸化部位の両側におけるアミノ酸についての一般化されたスコア付け行列の形のモチーフおよびタンパク質基質をリンクする一般化されたフォーマットである、段階を実行し；
前記モチーフ・ベースの陳述から陰性陳述を生成し；
前記モチーフ・ベースの陳述を組み合わせることによって前記一般化されたフォーマットで候補陳述を生成し；
前記候補陳述の前記陰性陳述との組み合わせによって陰性候補陳述を生成し；
前記候補陳述および陰性候補陳述を統計的関係学習モデルにおいて使って前記候補陳述にスコア付けし、予測されるモチーフ・ベースのリン酸化陳述を前記一般化されたフォーマットで保持し；
前記タンパク質配列データベースからのデータ入力および前記一般化されたフォーマットでの前記予測されたモチーフ・ベースのリン酸化陳述を受け取り、前記部位特異的なフォーマットで、予測された部位特異的なリン酸化陳述を生成することを含む、
方法。
（付記１６）
予測が正しいかどうかを検証するために、物理的な実験室において、前記予測された部位特異的なリン酸化陳述によって予測されるリン酸化があるかどうかを試験することをさらに含む、付記１５記載の方法。
（付記１７）
コンピュータ装置上で実行されたときに付記１５記載の方法を実行するコンピュータ・プログラム。
【符号の説明】
【０３３７】
S10  モチーフ・ベースの陳述<K,M,S>を生成
S20  異なる陳述からのK,M,Sを組み合わせることで候補陳述を生成
S30  モチーフ・ベースの陳述を否定にして組み合わせることによって陰性候補陳述を生成
S40  予測されたモチーフ・ベースの陳述を保持するために候補陳述にスコア付け
S50  予測された部位特異的な陳述<K,site,S>を生成
１０１  部位特異的なタンパク質リン酸化の発見システム
１０２  リン酸化データセット／リン酸化ネットワーク
１０３  タンパク質配列データベース
１０４  キナーゼ・ファミリー・データベース
１０５  モチーフ変換器／モチーフ・ベース陳述への変換ユニット
１０６  タンパク質コンテキスト知識グラフ
１０７  タンパク質コンテキスト陳述生成ユニット
１０８  タンパク質コンテキスト陳述
１０９  モチーフ・ベースの陳述
１１０  関心対象タンパク質
１１１  リンク予測器／リンク予測ユニット
１１２  リン酸化部位データベース
１１３  部位特異的変換器／部位特異的な陳述への変換ユニット
１１４  予測された部位特異的リン酸化陳述
２０１  陰性タンパク質コンテキスト陳述生成ユニット
２０２  陰性モチーフ・ベース陳述生成ユニット
２０３  候補生成器／候補生成ユニット
２０４  関係学習器／関係学習ユニット
３０２  モチーフ発見ユニット
３０３  モチーフ・ベース陳述生成ユニット
４０１  リン酸化ネットワークから部位特異的な陳述を読み込む
４０２  各部位特異的な陳述について、キナーゼ・ファミリー・データベースからキナーゼのファミリーを追加
４０３  各部位特異的な陳述について、タンパク質配列データベースから部位コンテキストのアミノ酸配列情報を追加
４０４  リン酸化配列をキナーゼ・ファミリーごとにグループ化
４０４  各キナーゼ・ファミリーについて、一特異的なスコア付け行列（＝モチーフ）を計算
５０１  キナーゼ・ファミリーおよび部位コンテキスト配列情報とともに部位特異的な陳述を読み込む
５０２  各陳述について、陳述内のキナーゼと同じキナーゼ・ファミリーから得られる各モチーフとの適合性を計算
５０３  所与の陳述との負の適合性をもつモチーフ候補を破棄
５０４  各陳述について、部位特異的な陳述内のキナーゼと同じファミリーのモチーフのうちで適合性が最良のモチーフについて、<キナーゼ,モチーフID,基質>の形のモチーフ・ベース陳述を生成
６０１  モチーフ・ベースの陳述を読み込む
６０２  タンパク質コンテキスト知識グラフから所与の距離内のキナーゼおよび基質の近傍陳述を取得
７０１  全モチーフ・ベース陳述を読み込む
７０２  各入力陳述<K,M,S>について、対応する陰性モチーフ・ベース陳述<K,M,S'>の集合を生成
７０３  各入力陳述<K,M,S>について、対応する陰性モチーフ・ベース陳述<K',M,S>の集合を生成
７０４  入力の陽性陳述に存在しているすべての陰性陳述を破棄
８０１  全タンパク質コンテキスト陳述を読み込む
８０２  各入力陳述について、主語要素のみを、諸陽性陳述からのランダムに選んだ主語で置換することによって、新たな陰性陳述を構築：
<新たな主語,関係,目的語>
８０３  各入力陳述について、目的語要素のみを、諸陽性陳述からのランダムに選んだ目的語で置換することによって、新たな陰性陳述を構築：
<主語,関係,新たな目的語>
８０４  入力陽性陳述に存在するすべての陰性陳述を破棄
９０１  陰性モチーフ・ベース陳述
９０２  候補陳述生成ユニット
９０３  陰性陳述フィルタ
９０４  候補陳述
９０５  候補陳述ランキングのための陰性陳述
９９３  プロセッサ
９９４  メモリ
９９５  ディスプレイ
９９６  入力
９９７  ネットワークI/F
１００１  全モチーフ・ベース陳述を読み込む
１００２  全関心対象キナーゼを読み込む
１００３  陽性モチーフ・ベース陳述におけるすべての関心対象キナーゼ、リン酸化モチーフおよび基質のデカルト積として候補陳述を構築
１００４  陽性モチーフ・ベース陳述に存在するすべての陳述を破棄
１１０１  全候補陳述を読み込む
１１０２  全陰性モチーフ・ベース陳述を読み込む
１１０３  
各陽性候補陳述について、次を行なう：
当該陽性候補陳述における各キナーゼおよびリン酸化モチーフについて、
諸陰性モチーフ・ベース陳述における該キナーゼと、該リン酸化モチーフと、該キナーゼおよびリン酸化モチーフに関連付けられた全関連基質とのデカルト積として、陰性候補陳述を構築
１１０４  
各陽性候補陳述について、次を行なう：
当該陽性候補陳述における各リン酸化モチーフおよび基質について、
諸陰性モチーフ・ベース陳述における該基質と、該リン酸化モチーフと、該基質およびリン酸化モチーフに関連付けられた全関連基質とのデカルト積として、陰性候補陳述を構築
１１０５  陽性候補陳述に存在するすべての陰性陳述を破棄
１４０１  モチーフ・ベース陳述（陽性および陰性）およびタンパク質コンテキスト陳述（陽性および陰性）を読み込む
１４０２  モデルをトレーニング
１４０３  候補陳述のスコアおよびもっともらしい陰性陳述に対するそれらのランキングを予測
１２０１  予測されたモチーフ・ベースの陳述
１３０１  予測されたモチーフ・ベースリン酸化陳述を読み込む
１３０２  各予測されたモチーフ・ベース陳述について、可能なリン酸化部位のリストを取得
１３０３  各可能なリン酸化部位について、コンテキスト配列を取得
１３０４  各可能なリン酸化部位について、予測される三項組におけるリン酸化モチーフのPSSM行列に関するリン酸化部位配列の適合性スコアを計算
１３０５  正の適合性スコアをもつ全リン酸化部位配列についての予測陳述を構築
【図１Ａ】
2018206374.tif 000037
【図１Ｂ】
2018206374.tif 000038
【図１Ｃ】
2018206374.tif 000039
【図２】
2018206374.tif 000040
【図３】
2018206374.tif 000041
【図４】
2018206374.tif 000042
【図５】
2018206374.tif 000043
【図６】
2018206374.tif 000044
【図７】
2018206374.tif 000045
【図８】
2018206374.tif 000046
【図９】
2018206374.tif 000047
【図１０】
2018206374.tif 000048
【図１１】
2018206374.tif 000049
【図１２】
2018206374.tif 000050
【図１３】
2018206374.tif 000051
【図１４】
2018206374.tif 000052
【図１５】
2018206374.tif 000053
【図１６】
2018206374.tif 000054
【図１７】
2018206374.tif 000055
【図１８】
2018206374.tif 000056
【図１９】
2018206374.tif 000057
【図２０】
2018206374.tif 000058
【外国語明細書】
2018206374000001.pdf