(57)【要約】【課題】治療剤を細胞に送達するための組成物および方法を提供すること。【解決手段】本発明は、治療剤を細胞に送達するための組成物および方法を提供する。具体的には、それらは、核酸の効果的なカプセル封入およびカプセル封入された核酸のインビボでの細胞への効果的な送達を提供する、新規なトリアルキルカチオン性脂質および核酸−脂質粒子を含む。本発明の組成物は、極めて強力であり、したがって、比較的低用量で、特定の標的タンパク質の効果的なノックダウンを可能にする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月２４日に出願された、米国仮出願第６１／６０２，９９０号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
Ｉ．発明の背景
本発明は、新規なトリアルキルカチオン性脂質、トリアルキルカチオン性脂質のうちの１つ以上を含む脂質粒子、脂質粒子を作製する方法、ならびに脂質粒子の送達および／または投与の方法（例えば、哺乳動物における疾患の治療のための）に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＩＩ．関連技術の説明
治療的核酸には、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、および免疫賦活核酸が含まれる。これらの核酸は、多様な機序を介して作用する。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡ分子の場合、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称されるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方制御し得る。細胞の細胞質内に干渉ＲＮＡを導入した後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物は、ＲＩＳＣと称されるタンパク質に結合することができる。干渉ＲＮＡのセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体から転位され、結合された干渉ＲＮＡのものに相補的な配列を有するｍＲＮＡを認識し、それに結合することができる、ＲＩＳＣ内の鋳型を提供する。相補的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ複合体は、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、タンパク質の合成をコードする、対応するｍＲＮＡの特異的な破壊を標的とすることによって、特定のタンパク質の下方制御をもたらすことができる。
【０００４】
干渉ＲＮＡ構築物は、標的タンパク質を対象とする任意のヌクレオチド配列を用いて合成することができるため、ＲＮＡｉの治療的用途は極めて広範である。これまでに、ｓｉＲＮＡ構築物は、インビトロおよびインビボの両モデルにおいて、標的タンパク質を特異的に下方制御する能力を示している。さらに、ｓｉＲＮＡ構築物は、現在、臨床研究において評価が行われている。
【０００５】
しかしながら、干渉ＲＮＡ構築物が現在直面している２つの問題は、第１に、それらが血漿中でヌクレアーゼ消化されやすいこと、そして第２には、遊離干渉ＲＮＡ分子として全身投与した際に、ＲＩＳＣに結合することができる細胞内区画へのアクセスを獲得する能力が限定されていることである。これらの二本鎖構築物は、分子内に化学修飾されたヌクレオチドリンカー、例えば、ホスホチオエート基を組み込むことによって、安定化され得る。しかしながら、このような化学修飾されたリンカーは、ヌクレアーゼ消化から限定された保護を提供するのみであり、構築物の活性を減少させ得る。干渉ＲＮＡの細胞内送達は、ポリマー、カチオン性リポソーム等の担体系の使用によって、またはコレステロール部分を分子に共有結合させることによって、促進することができる。しかしながら、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡ分子の効力を増加させ、化学修飾されたヌクレオチドリンカーの要件を排除するためには、改善された送達系が必要である。
【０００６】
加えて、干渉ＲＮＡ等の治療的核酸が細胞膜を交差する能力が限定されていること（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１９７：９５−１０８２（１９９４）を参照されたい）、ならびに補体媒介性アナフィラキシー、改変された凝固特性、および血球減少といった、全身毒性と関連する問題（Ｇａｌｂｒａ
ｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，４：２０１−２０６（１９９４））に課題が残る。
【０００７】
有効性を向上させようとするため、研究者らは、化学修飾または非修飾の治療的核酸の送達のために、脂質に基づく担体系もまた利用している。Ｚｅｌｐｈａｔｉら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，４１：９９−１１９（１９９６））は、アニオン性（従来的）リポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポソーム、融合性リポソーム、およびカチオン性脂質／アンチセンス凝集体の使用について記載している。同様に、ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソーム中で全身投与されており、これらの核酸−脂質粒子は、非ヒト霊長類を含む哺乳動物において、標的タンパク質の改善された下方制御をもたらすことが報告されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４１：１１１−１１４（２００６））。
これらの発展にもかかわらず、当該技術分野において、一般的な治療上の使用に好適な、改善された脂質−治療的核酸組成物に対する必要性が残る。好ましくは、これらの組成物は、高い効率で核酸をカプセル封入し、薬物：脂質比が高く、カプセル封入された核酸を血清中での分解およびクリアランスから保護し、全身送達に好適であり、カプセル封入された核酸の細胞内送達を提供するものであろう。さらに、これらの核酸−脂質粒子は、核酸の治療有効用量での患者の治療が、患者に対する著しい毒性および／危険性を伴わないように、十分に耐容性であり、適切な治療指標を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１９７：９５−１０８２（１９９４）
【非特許文献２】Ｇａｌｂｒａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，４：２０１−２０６（１９９４）
【非特許文献３】Ｚｅｌｐｈａｔｉら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，４１：９９−１１９（１９９６）
【非特許文献４】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４１：１１１−１１４（２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、新規なトリアルキルカチオン性（アミノ）脂質、および核酸のインビボ送達に有利なこれらの脂質を含む脂質粒子、ならびにインビボでの治療的使用に好適な核酸−脂質粒子組成物を提供する。本発明はまた、これらの組成物を作製する方法、ならびに、例えば種々の疾患状態の治療のために、これらの組成物を使用して細胞内に核酸を導入する方法を提供する。本発明はまた、本明細書に開示される全ての新規な化合物および中間体を含む。
【００１０】
本明細書の実施例２に記載されるように、本発明のトリアルキルカチオン性脂質は、マウスＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡアッセイにおいて、より長いアルキル鎖を有することを除いて同一である脂質よりも、強力である。
【００１１】
一態様において、本発明は、構造式（Ｉ）を有するカチオン性脂質
【化１】
2018039844.tif 000002
またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｘは、アルキルアミノであり、
Ａは、Ｃ１〜Ｃ６の任意に置換されたアルキルであり、前記Ｃ１〜Ｃ６の任意に置換されたアルキルは、飽和または不飽和であり得、Ａは、存在してもしなくてもよく、
Ｙは、ケタール、エステル、任意に置換されたカルバメート、エーテル、および任意に置換されたアミドからなる群から選択され、
Ｚは、アルキル鎖のそれぞれがＣ８〜Ｃ１１の長さを有する３つのアルキル鎖からなる疎水性部分であり、３つのアルキル鎖のそれぞれは、飽和または不飽和であり得、３つのアルキル鎖のそれぞれは、任意に置換される、カチオン性脂質またはその塩を提供する。
【００１２】
式（Ｉ）の脂質に関して、アルキルアミノ基の代表的な例には、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、およびエチルメチルアミノが挙げられる。
【００１３】
再び式（Ｉ）の脂質に関して、カルバメートおよび／またはアミノ基上に存在する任意の置換基の代表的な例は、飽和または不飽和アルキル基（例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル）である。
【００１４】
再び式（Ｉ）の脂質に関して、疎水性部分Ｚの３つのアルキル鎖のうちの１つ以上に存在し得る任意の置換基の代表的な例は、ヒドロキシル基である。
【００１５】
再び式（Ｉ）の脂質に関して、疎水性部分Ｚのアルキル鎖が１つ以上の二重結合または三重結合を含有する場合、そのアルキル鎖は、不飽和と称されることを理解されたい。
【００１６】
再び式（Ｉ）の脂質に関して、誤解を避けるために、疎水性部分Ｚの１つ以上のアルキル鎖は、シクロアルキル基を含み得る（例えば、シクロプロピル）ことを理解されたい。
【００１７】
再び式（Ｉ）の脂質に関して、「エステル」という用語には、構造−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（＝Ｏ）−を有するエステルが含まれることを理解されたい。「アミド」という用語には、構造−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−または−ＮＲ（＝Ｏ）Ｃ−を有するアミドが含まれる。「カルバメート」という用語には、構造−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ−または−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｏ−を有するカルバメートが含まれる。
【００１８】
式（Ｉ）の脂質は、例えば、例として、治療剤（例えば、ｓｉＲＮＡ等、生物学的に活性な核酸分子）を、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）に送達するために有用な、本発明の脂質粒子を作製するために有用である。
【００１９】
式（Ｉ）の脂質のいくつかの実施形態において、Ｚは、式
【化２】
2018039844.tif 000003
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ８〜Ｃ１１アルキルからなる群から選択され、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のそれぞれは、独立して、飽和または不飽和であり得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のそれぞれは、任意に置換される。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、上述の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば薬学的に許容される塩のうちの１つ以上を含む脂質粒子を提供する。ある特定の実施形態において、脂質粒子は、中性脂質等、１つ以上の非カチオン性脂質をさらに含む。ある特定の他の実施形態において、脂質粒子は、粒子の凝集を低減または阻害することができる１つ以上の複合脂質をさらに含む。さらなる実施形態において、脂質粒子は、１つ以上の
活性剤または治療剤をさらに含む。
【００２１】
ある特定の実施形態において、脂質粒子の非カチオン性脂質構成成分は、リン脂質、コレステロール（もしくはコレステロール誘導体）、またはそれらの組み合わせを含み得る。１つの特定の実施形態において、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子の複合脂質構成成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質複合体を含む。ある特定の事例において、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）複合体、またはそれらの組み合わせを含む。他の実施形態において、脂質複合体は、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、例えばＰＯＺ−ＤＡＡ複合体を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、活性剤または治療剤は、核酸を含む。ある特定の事例において、核酸は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはそれらの混合物といった、干渉ＲＮＡ分子を含む。ある特定の他の事例において、核酸は、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせ等を含む。
【００２３】
他の実施形態において、活性剤または治療剤は、脂質粒子内の活性剤または治療剤が水溶液中で例えばヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる酵素分解に抵抗性となるように、脂質粒子の脂質部分内に完全にカプセル封入される。さらなる実施形態において、脂質粒子は、ヒト等の哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
【００２４】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）１つ以上の核酸、例えば干渉ＲＮＡ分子、（ｂ）１つ以上の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）１つ以上の非カチオン性脂質、および（ｄ）粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質を含む、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）１つ以上の核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％を構成する、１つ以上の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％〜約４９．５ｍｏｌ％を構成する、１つ以上の非カチオン性脂質、および（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質を含む、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を提供する。
【００２６】
この実施形態の一態様において、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、（ａ）核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５２ｍｏｌ％〜約６２ｍｏｌ％を構成する、式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３６ｍｏｌ％〜約４７ｍｏｌ％を構成する、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物、および（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を構成する、ＰＥＧ−脂質複合体を含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態は、概して、本明細書に「１：５７」製剤と称される。１つの特定の実施形態において、１：５７製剤は、約１．４ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約５７．１ｍｏｌ％の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、約７．１ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）、および約３４．３ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む、４成分系である。
【００２７】
この実施形態の別の態様において、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、（ａ）核酸、（ｂ
）粒子中に存在する総脂質の約５６．５ｍｏｌ％〜約６６．５ｍｏｌ％を構成する、式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３１．５ｍｏｌ％〜約４２．５ｍｏｌ％を構成する、コレステロールまたはその誘導体、および（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を構成する、ＰＥＧ−脂質複合体を含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態は、概して、本明細書に「１：６２」製剤と称される。１つの特定の実施形態において、１：６２製剤は、リン脂質不含であり、約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約６１．５ｍｏｌ％の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、および約３６．９ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む、３成分系である。
【００２８】
１：５７および１：６２製剤に関連するさらなる実施形態は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２７０６０号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２９】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）１つ以上の核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する、１つ以上の式ＩまたはＩＩのカチオン性脂質、またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％を構成する、１つ以上の非カチオン性脂質、および（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質を含む、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を提供する。
【００３０】
この実施形態の一態様において、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、（ａ）核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する、式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約４７ｍｏｌ％〜約６９ｍｏｌ％を構成する、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物、および（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％を構成する、ＰＥＧ−脂質複合体を含む。脂質粒子の実施形態は、概して、本明細書に「２：４０」製剤と称される。１つの特定の実施形態において、２：４０製剤は、約２ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約４０ｍｏｌ％の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、約１０ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）、および約４８ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む、４成分系である。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、（ａ）１つ以上の核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を構成する、１つ以上の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を構成する、１つ以上の非カチオン性脂質、および（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質を含む、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を提供する。
【００３２】
この実施形態の一態様において、核酸−脂質粒子は、（ａ）核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％を構成する、式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を構成する、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物、および（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を構成する、ＰＥＧ−脂質複合体を含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態は、概して、本明細書に「７：５４」製剤と称される。ある特定の事例において、７：５４製剤中の非カチオン性脂質混合物は、（ｉ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のリン脂質、および（ｉｉ）粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を含む。１つの特定の実施形態において、７：５４製剤は、約７ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡ）、約５４ｍｏｌ％の式
Ｉのカチオン性脂質またはその塩、約７ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）、および約３２ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む、４成分系である。
【００３３】
この実施形態の別の態様において、核酸−脂質粒子は、（ａ）核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を構成する、式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を構成する、コレステロールまたはその誘導体、および（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を構成する、ＰＥＧ−脂質複合体を含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態は、概して、本明細書に「７：５８」製剤と称される。１つの特定の実施形態において、７：５８製剤は、リン脂質不含であり、約７ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡ）、約５８ｍｏｌ％の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、および約３５ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む、３成分系である。
【００３４】
７：５４および７：５８製剤に関連するさらなる実施形態は、２０１０年６月３０日に出願された米国公開特許出願第ＵＳ２０１１／００７６３３５号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３５】
本発明はまた、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）等の脂質粒子と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、核酸等の１つ以上の治療剤を細胞に導入するための方法を提供し、この方法は、細胞を本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）と接触させることを含む。一実施形態において、細胞は哺乳動物のものであり、哺乳動物はヒトである。
【００３７】
さらに別の態様において、本発明は、核酸等の１つ以上の治療剤のインビボ送達のための方法を提供し、この方法は、哺乳動物に、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を投与することを含む。ある特定の実施形態において、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、次の投与経路のうちの１つによって投与される：経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、および皮内。特定の実施形態において、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、例えば、腸内または非経口の投与経路を介して、全身的に投与される。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は、疾患または障害の治療を、それを必要とする哺乳動物において行うための方法を提供し、この方法は、哺乳動物に、核酸等の１つ以上の治療剤を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の治療有効量を投与することを含む。疾患または障害の非限定的な例には、ウイルス感染症、肝臓疾患または障害、および癌が挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３９】
ある特定の実施形態において、本発明は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の核酸を、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中で、単独または脂質低下剤との組み合わせで投与することによって、肝臓疾患または障害を治療するための方法を提供する。脂質疾患および障害の例には、脂質異常症（例えば、上昇したトリグリセリドレベル（高トリグリセリド血症）および／または上昇したコレステロールレベル（高コレステロール血症）等の高脂血症）、アテローム性動脈硬化症、冠動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化性心血管疾患（ＣＶＤ）、脂肪肝疾患（脂肪）、脂質代謝異常、コレステロール代謝異常、糖尿病（２型糖尿病を含む）、肥満、心血管疾患、および代謝異常に関連する他の障害が挙げられるが、これらに限定されない。脂質低下剤の非限定的な例には、スタチン、フィブラート、エゼチミブ、チアゾリジンジオン、ナイアシン、β遮断剤、ニトログリセリン、カル
シウムアンタゴニスト、および魚油が挙げられる。
【００４０】
１つの特定の実施形態において、本発明は、コレステロールレベルの低下または低減を、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）（例えば、上昇した血中コレステロールレベルを有する哺乳動物）において行うための方法を提供し、この方法は、哺乳動物に、代謝性疾患および障害と関連する１つ以上の遺伝子を標的とする１つ以上の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む、本明細書に記載の核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ製剤）の治療有効量を投与することを含む。別の特定の実施形態において、本発明は、トリグリセリドの低下または低減を、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）（例えば、上昇した血中トリグリセリドレベルを有する哺乳動物）において行うための方法を提供し、この方法は、哺乳動物に、代謝性疾患および障害と関連する１つ以上の遺伝子を標的とする１つ以上の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む、本明細書に記載の核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ製剤）の治療有効量を投与することを含む。これらの方法は、標準的な組織培養技術を使用してインビトロで、または当該技術分野で既知の任意の手段を用いて干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与することによってインビボで、実行することができる。好ましい実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ヒト等の哺乳動物において、肝臓細胞（例えば、肝細胞）に送達される。
【００４１】
脂質粒子を使用して肝臓疾患または障害を治療することに関するさらなる実施形態は、例えば、２０１０年１月２６日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００１２０号および米国特許出願公開第２００６／０１３４１８９号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
他の実施形態において、本発明は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の核酸を、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）において、単独または化学療法薬との組み合わせで投与することによって、癌等の細胞増殖性障害を治療するための方法を提供する。本方法は、標準的な組織培養技術を使用してインビトロで、または当該技術分野で既知の任意の手段を用いて干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与することによってインビボで、実行することができる。好ましい実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、単独または化学療法薬との組み合わせで、ヒト等の哺乳動物の癌細胞に送達される。核酸−脂質粒子および／または化学療法薬はまた、従来的なホルモン療法剤、免疫療法剤、および／または放射線療法剤と共投与することができる。
【００４３】
脂質粒子を使用して細胞増殖性障害を治療することに関するさらなる実施形態は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／０８２８１７号、米国特許出願公開第２００９／０１４９４０３号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２９３１９号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の核酸を、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中で、単独またはウイルス感染症もしくはそれと関連する症状のいずれかを治療または緩和するために使用される従来的な薬剤の投与との組み合わせで投与することによって、出血熱を引き起こすアレナウイルス（例えば、ラッサウイルス）もしくはフィロウイルス（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス等）感染症または急性もしくは慢性肝炎を引き起こす肝炎（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）感染症等のウイルス感染症を予防または治療するための方法を提供する。本方法は、標準的な組織培養技術を使用してインビトロで、または当該技術分野で既知の任意の手段を用いて干渉ＲＮＡを投与することによってインビボで、実行することができる。ある特定の実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、出血熱ウイルスに感染している、および／またはそれに感染しやすい、ヒト等の哺乳動物の細胞、組織、または器官、例えば、細網内皮系の細胞（例えば、単球、マクロファージ等）等に送達される。ある特定
の他の実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、肝炎ウイルスに感染している、および／またはそれに感染しやすい、ヒト等の哺乳動物の細胞、組織、または器官、例えば、肝臓の細胞（例えば、肝細胞）等に送達される。
【００４５】
脂質粒子を使用してウイルス感染症を予防または治療することに関連するさらなる実施形態は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２１８１２２号、米国特許出願公開第２００７／０１３５３７０号、および２０１０年３月１９日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題されるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００４４４号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４６】
１つ以上の式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、例えば、薬学的に許容される塩を含む、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、それらが、循環中に安定しており、血管外部位へのアクセスをもたらす薬力学的挙動に必要な寸法であり、標的細胞集団に達することができるため、干渉ＲＮＡ等の核酸を対象（例えば、ヒト等の哺乳動物）に投与する際の使用に、特に有利かつ好適である。
【００４７】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から、当業者には明らかであろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
構造式（Ｉ）を有する脂質
【化２０１】
2018039844.tif 000004
またはその塩であって、式中、
Ｘは、アルキルアミノであり、
Ａは、Ｃ１〜Ｃ６の任意に置換されたアルキルであり、前記Ｃ１〜Ｃ６の任意に置換されたアルキルは、飽和または不飽和であり得、Ａは、存在してもしなくてもよく、
Ｙは、ケタール、エステル、任意に置換されたカルバメート、エーテル、および任意に置換されたアミドからなる群から選択され、
Ｚは、アルキル鎖のそれぞれがＣ８〜Ｃ１１の長さを有する３つのアルキル鎖からなる疎水性部分であり、前記３つのアルキル鎖のそれぞれは、独立して、飽和または不飽和であり得、前記３つのアルキル鎖のそれぞれは、任意に置換される、脂質またはその塩。
（項目２）
前記アルキル鎖のそれぞれが、Ｃ９〜Ｃ１０の長さを有する、項目１に記載の脂質。
（項目３）
前記アルキル鎖のうちの少なくとも１つは、二重結合を有する、項目１に記載の脂質。（項目４）
前記アルキル鎖のうちの少なくとも１つは、シス二重結合を有する、項目１に記載の脂質。
（項目５）
前記アルキル鎖のうちの少なくとも１つは、シクロアルキル部分を含む、項目１に記載の脂質。
（項目６）
Ｘは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、およびエチルメチルアミノからなる群から選択される、項目１に記載の脂質。
（項目７）
Ａが存在する、項目１に記載の脂質。
（項目８）
Ｙは、エステルまたはケタールである、項目１に記載の脂質。
（項目９）
Ｙは、任意に置換されたカルバメートである、項目１に記載の脂質。
（項目１０）
Ｙは、エーテルである、項目１に記載の脂質。
（項目１１）
Ｙは、任意に置換されたアミドである、項目１に記載の脂質。
（項目１２）
Ｚは、式
【化２０２】
2018039844.tif 000005
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ８〜Ｃ１１アルキルからなる群から選択され、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のそれぞれは、独立して、飽和または不飽和であり得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のそれぞれは、任意に置換される、項目１に記載の脂質。
（項目１３）
前記脂質は、以下からなる群から選択される、項目１に記載の脂質：
【化２０３−１】
2018039844.tif 000006
【化２０３−２】
2018039844.tif 000007
【化２０３−３】
2018039844.tif 000008
【化２０３−４】
2018039844.tif 000009
（項目１４）
項目１〜１３のいずれかに記載の脂質を含む、脂質粒子。
（項目１５）
前記粒子は、非カチオン性脂質をさらに含む、項目１４に記載の脂質粒子。
（項目１６）
前記非カチオン性脂質は、リン脂質、コレステロール、またはリン脂質とコレステロールとの混合物からなる群から選択される、項目１５に記載の脂質粒子。
（項目１７）
前記リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの混合物を含む、項目１６に記載の脂質粒子。
（項目１８）
前記コレステロールは、コレステロール誘導体である、項目１６に記載の脂質粒子。
（項目１９）
前記粒子は、粒子の凝集を阻害する、複合脂質をさらに含む、項目１４〜１８のいずれかに記載の脂質粒子。
（項目２０）
粒子の凝集を阻害する前記複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質複合体を含む、項目１９に記載の脂質粒子。
（項目２１）
前記ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）複合体、またはそれらの混合物を含む、項目２０に記載の脂質粒子。
（項目２２）
前記粒子は、治療剤をさらに含む、項目１４〜２１のいずれかに記載の脂質粒子。
（項目２３）
前記治療剤は、核酸である、項目２２に記載の脂質粒子。
（項目２４）
前記核酸は、干渉ＲＮＡである、項目２３に記載の脂質粒子。
（項目２５）
前記干渉ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（
ｓｈＲＮＡ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、項目２４に記載の脂質粒子。
（項目２６）
前記干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである、項目２５に記載の脂質粒子。
（項目２７）
前記治療剤は、３７℃で３０分間血清中で粒子をインキュベートした後、実質的に分解されない、項目２２に記載の脂質粒子。
（項目２８）
前記治療剤は、前記粒子に完全にカプセル封入される、項目２２に記載の脂質粒子。
（項目２９）
前記粒子は、脂質：治療剤の質量比が約５：１〜約１５：１である、項目２２に記載の脂質粒子。
（項目３０）
前記粒子は、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの中位径を有する、項目１４〜２９のいずれかに記載の脂質粒子。
（項目３１）
項目１４〜３０のいずれかに記載の脂質粒子と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
（項目３２）
治療剤を細胞に導入するための方法であって、
前記細胞を、項目１４に記載の脂質粒子と接触させることを含む、方法。
（項目３３）
前記細胞は、哺乳動物におけるものである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
治療剤をインビボ送達するための方法であって、
哺乳動物に、項目１４に記載の脂質粒子を投与することを含む、方法。
（項目３５）
前記投与は、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、および皮内からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
疾患または障害の治療を、それを必要とする哺乳動物において行うための方法であって、
前記哺乳動物に、項目１４に記載の脂質粒子の治療有効量を投与することを含む、方法。
（項目３８）
前記疾患または障害は、ウイルス感染症、肝臓疾患または障害、および癌からなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目３７に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
Ｉ．  序文
本発明は、核酸等の活性剤または治療剤を哺乳動物の細胞にインビボ送達するために脂質粒子において使用する際に利点を提供する、新規なカチオン性（アミノ）脂質の発見に、部分的に基づく。具体的には、本発明は、向上した核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）の活性および改善されたインビボでの組成物の耐容性を提供する、本明細書に記載の新規なカチオン性脂質のうちの１つ以上を含む、核酸−脂質粒子組成物を提供し、結果として以前に記載された核酸−脂質粒子組成物と比較して、治療指標の著しい向上をもたらす。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡのインビトロおよびインビボ送達のための、改善された組成物の製剤化を可能にする、新規なカチオン性脂質を提供する。これらの改善された脂質粒子組成物は、標的遺伝子のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルを下方制御（例えば、サイレンシング）するのに有効であることが、本明細書に示される。さらに、これらの改善された脂質粒子組成物の活性は、本発明の新規なカチオン性脂質の存在に依存することが、本明細書に示される。
【００５０】
本発明の脂質粒子および組成物は、カプセル封入または会合（例えば、複合体形成）された核酸等の治療剤を、インビトロおよびインビボの両方で、細胞に送達することを含む、種々の目的で使用することができる。したがって、本発明はさらに、疾患または障害の治療を、それを必要とする対象に行うための方法であって、対象を、好適な治療剤をカプセル封入するかまたはそれと会合した脂質粒子と接触させることを含む、方法を提供し、ここで、この脂質粒子は、本明細書に記載の新規なカチオン性脂質のうちの１つ以上を含む。
【００５１】
本明細書に記載されるように、本発明の脂質粒子は、例えば、ｓｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡ分子を含む、核酸の送達に特に有用である。したがって、本発明の脂質粒子および組成物は、細胞を、本明細書に記載の１つ以上の新規なカチオン性脂質を含む脂質粒子と接触させることによって、インビトロおよびインビボの両方で標的遺伝子およびタンパク質の発現を減少させるために使用することができ、ここで、この脂質粒子は、標的遺伝子の発
現を低減させる核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）をカプセル封入するか、またはそれと会合している。あるいは、本発明の脂質粒子および組成物は、細胞を、本明細書に記載の１つ以上の新規なカチオン性脂質を含む脂質粒子と接触させることによって、インビトロおよびインビボの両方で所望されるタンパク質の発現を増加させるために使用することができ、ここで、この脂質粒子は、所望されるタンパク質の発現を強化する核酸（例えば、所望のタンパク質をコードするプラスミド）をカプセル封入するか、またはそれと会合している。
【００５２】
本発明のカチオン性脂質、脂質粒子、およびそれを含む組成物、ならびに遺伝子およびタンパク質の発現を調節する核酸等の活性剤または治療剤を送達するためのそれらの使用が、以下にさらに詳細に説明される。
【００５３】
ＩＩ．  定義
本明細書に使用される際、以下の用語は、別途示されない限り、それら定められた意味を有する。
【００５４】
「約」という用語は、本発明の脂質粒子または製剤中の構成成分の量と関連して使用される際、示された構成成分の量のプラスまたはマイナス５％の値を包含する（例えば、約１０％は、９．５％〜１０．５％の値を包含する）。「約」という用語は、したがって、記述された構成成分の量のプラスまたはマイナス１％、２％、３％、または４％の値もまた包含する。
【００５５】
本明細書に使用される「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列と同じ細胞内にある場合、標的遺伝子または配列の発現を（例えば、分解を媒介すること、もしくは干渉ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって）低減または阻害することができる、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ、ｓｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、ｓｓＤＮＡｉオリゴヌクレオチド）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、もしくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡといった二重鎖ＲＮＡ）を含む。干渉ＲＮＡは、したがって、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ＲＮＡ、または２本の相補鎖または１本の自己相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子もしくは配列に実質的もしくは完全な同一性を有し得るか、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含み得る。干渉ＲＮＡの配列は、全長標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。好ましくは、干渉ＲＮＡ分子は、化学合成される。
【００５６】
干渉ＲＮＡには、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、約１５〜６０、１５〜５０、または１５〜４０（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、より典型的には約１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５（二重鎖）ヌクレオチドの長さの干渉ＲＮＡを含み、好ましくは、約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３（二重鎖）ヌクレオチドの長さである（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３ヌクレオチドの長さであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５塩基対の長さ、好ましくは約１８〜２２、１９〜２０、または１９〜２１塩基対の長さである）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１〜４ヌクレオチドまたは約２〜３ヌクレオチドの３’オーバーハング、および５’リン酸末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例には、限定することなく、一方の鎖がセンス鎖であり、他方が相補的なアンチセンス鎖である、２つの別個の鎖の分子が集合した二本鎖ポリヌクレオチド分子；センス領域とアンチセンス領域とが核酸系または非核酸系リンカーによって結合された一本鎖分子が集合した二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構
造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに、２つ以上のループ構造と環状ポリヌクレオチドがインビボまたはインビトロでプロセシングされて活性な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成する、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する基部と有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子が含まれる。
【００５７】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、化学合成される。ｓｉＲＮＡはまた、より長いｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ヌクレオチドの長さを上回るｄｓＲＮＡ）を大腸菌ＲＮａｓｅ  ＩＩＩまたはＤｉｃｅｒで切断することによって生成することができる。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡを、生物学的に活性なｓｉＲＮＡにプロセシングする（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９９４２−９９４７（２００２）、Ｃａｌｅｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３６（２００２）、Ｂｙｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｂｉｏｎ  ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ，１０（１）：４−６（２００３）、Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：９８１−９８７（２００３）、Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２６９−２２７１（２００１）、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：８２（１９６８）を参照されたい）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド〜約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さである。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチド程の長さ、またはそれ以上であり得る。ｄｓＲＮＡは、全遺伝子転写産物または部分的遺伝子転写産物をコードし得る。ある特定の事例において、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによってコードされ得る（例えば、自動的にヘアピンループを有する二重鎖に折りたたまれる配列として転写される）。
【００５８】
本明細書に使用される際、「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、その標的配列に対する１００％の相補性を有さない、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）配列の一部分を指す。干渉ＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のミスマッチ領域を有し得る。ミスマッチ領域は、連続的であってもよく、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヌクレオチド、もしくはそれ以上離れていてもよい。ミスマッチモチーフまたは領域は、単一のヌクレオチドを含み得るか、または２、３、４、５個、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含んでもよい。
【００５９】
「標的遺伝子の発現を阻害する」という表現は、標的遺伝子の発現をサイレンシング、低減、または阻害する、干渉ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）または別の治療剤の能力を指す。遺伝子のサイレンシングの程度を試験するために、試験試料（例えば、標的遺伝子を発現する培養物中の細胞の試料）または試験哺乳動物（例えば、ヒト等の哺乳動物、もしくは齧歯類（例えばマウス）等の動物モデル、もしくは非ヒト霊長類（例えばサル）モデル）を、標的遺伝子の発現をサイレンシング、低減、または阻害する干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と接触させる。試験試料または試験動物における標的遺伝子の発現を、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と接触していないか、またはそれを投与されていない、対照試料（例えば、標的遺伝子を発現する培養細胞の試料）または対照哺乳動物（例えば、ヒト等の哺乳動物、または齧歯類（例えば、マウス）等の動物モデル、もしくは非ヒト霊長類（例えば、サル）モデル）における標的遺伝子の発現と比較する。対照試料または対照哺乳動物における標的遺伝子の発現に、１００％という値を割り当ててもよい。特定の実施形態において、標的遺伝子の発現のサイレンシング、阻害、または低減は、対照試料または対照哺乳動物における標的遺伝子の発現のレベルと比較して、試験試料または試験哺乳動物における標的遺伝子の発現のレベルが、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％であるときに達成される。換言すると、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と接触して
いないか、またはそれを投与されていない対照試料または対照哺乳動物における標的遺伝子の発現のレベルと比較して、試験試料または試験哺乳動物における標的遺伝子の発現を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％サイレンシング、低減、または阻害する。標的遺伝子の発現レベルを判定するのに好適なアッセイには、限定することなく、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、ならびに当業者に既知の表現型アッセイといった、当業者に既知の技術を使用した、タンパク質またはｍＲＮＡレベルの試験が含まれる。
【００６０】
干渉ＲＮＡ等の活性剤または治療剤の「有効量」または「治療有効量」は、所望される効果、例えば、干渉ＲＮＡの不在下で検出される通常の発現レベルと比較して標的配列の発現の阻害をもたらすのに十分な量である。標的遺伝子または標的配列の発現の阻害は、干渉ＲＮＡを用いて得られた値が、対照と比較して、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％であるときに達成される。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するのに好適なアッセイには、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、ならびに当業者に既知の表現型アッセイといった、当業者に既知の技術を使用した、タンパク質またはＲＮＡレベルの試験が含まれる。
【００６１】
干渉ＲＮＡによる免疫応答の「減少」、「減少させること」、「低減」、「低減すること」とは、所与の干渉ＲＮＡ（例えば、修飾された干渉ＲＮＡ）または他の治療剤に対する免疫応答の検出可能な減少を意味することが意図される。修飾された干渉ＲＮＡによる免疫応答の減少量は、修飾されていない干渉ＲＮＡの存在下における免疫応答のレベルと比較して判定され得る。検出可能な減少は、修飾されていない干渉ＲＮＡの存在下で検出される免疫応答よりも、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上低くあり得る。干渉ＲＮＡに対する免疫応答の減少は、典型的に、インビトロで応答細胞によるサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＩＬ−６、またはＩＬ−１２）の減少、または哺乳動物対象の血清における干渉ＲＮＡの投与後のサイトカイン産生の減少によって測定される。
【００６２】
本明細書に使用される際、「応答細胞」という用語は、修飾されていないｓｉＲＮＡ等の免疫賦活性干渉ＲＮＡと接触したときに、検出可能な免疫応答を生成する、細胞、好ましくは哺乳動物細胞を指す。例となる応答細胞には、例えば、樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、脾細胞等が挙げられる。検出可能な免疫応答には、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＧＦ、およびこれらの組み合わせといった、サイトカインまたは成長因子の生成が含まれる。検出可能な免疫応答にはまた、例えば、テトラトリコペプチド反復配列１（ＩＦＩＴ１）ｍＲＮＡによるインターフェロン誘発タンパク質の誘発が含まれる。
【００６３】
「実質的な同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする配列、または参照配列の指定の領域にわたって指定の割合の同一性を有する配列を指す。
【００６４】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という表現は、核酸が、典型的には核酸の複合混合物中において、その標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況においては、異なるであろう。より長い配列は、特に、より高い温度でハイブリダイ
ズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。通常、ストリンジェントな条件は、定義されるイオン強度ｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（定義されるイオン強度、ｐＨ、および核濃度下で）である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態にある）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加により達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、正のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、好ましくは１０倍である。
【００６５】
例となるストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、次の通りであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄。ＰＣＲについては、約３６℃の温度は、典型的には、低ストリンジェンシーの増幅のものであるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて、３２℃〜４８℃で変動し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅のためには、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に応じて、約５０℃〜約６５℃の範囲に及び得る。高および低のいずれのストリンジェンシーの増幅のための典型的な周期条件も、３０秒間〜２分間の９０℃〜９５℃の変性期、３０秒間〜２分間続くアニーリング期、および１〜２分間の約７２℃の伸長期を含む。低および高ストリンジェンシーの増幅反応のためのプロトコルおよびガイドラインは、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ
Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）に提供される。
【００６６】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子コードによって許容される最大のコドン縮退を用いて作製される場合に生じる。このような場合では、核酸は、典型的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例となる「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、３７℃で１％ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および４５℃で１×ＳＳＣ中での洗浄、が含まれる。正のハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者であれば、代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いて類似のストリンジェンシーの条件を提供することができることを容易に理解するであろう。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するためのさらなるガイドラインは、多数の参考文献、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓに提供される。
【００６７】
２つ以上の核酸に関して、「実質的に同一な」または「実質的な同一性」という用語は、比較ウインドウ、または以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、もしくは手動アライメントおよび目視検査によって測定される指定領域にわたって最大対応について比較およびアライメントしたときに、同じであるか、指定の割合のヌクレオチドが同じである（すなわち、指定領域にわたる少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性）、２つ以上の配列または部分配列を指す。この定義は、文脈が示す場合、配列の相補性も同様に指す。
好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヌクレオチドの長さの領域にわたって存在する。
【００６８】
配列比較のために、典型的に、１つの配列が参照配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよく、または代替的なパラメータを指定してもよい。配列比較アルゴリズムは、次いで、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００６９】
本明細書に使用される際、「比較ウインドウ」は、ある配列を、２つの配列が最適にアライメントされた後に、同じ連続位置数の参照配列と比較することができる、約５〜約６０、通例的には約１０〜約４５、より通例的には約１５〜約３０からなる群から選択される、いくつかの連続位置のうちのいずれか１つのセグメントへの参照を含む。比較のための配列アライメントの方法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似方法の探求によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動アライメントおよび目視検査によって行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）。
【００７０】
配列同一性および配列類似性パーセントを判定するのに好適なアルゴリズムの非限定的な例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ
２．０を、本明細書に記載のパラメータで使用して、本発明の核酸の配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。別の例は、タンパク質またはヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム等、配列同一性パーセントを判定するためのグローバルアライメントアルゴリズムである。
【００７１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸とを比較した際の最小和確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似するとみなされる。
【００７２】
本明細書に使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖いずれかの形態の少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、事前濃縮ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの集団の誘導体および組み合わせの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｄｉｃｅｒ−基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、多価ＲＮＡ（ＭＶ  ＲＮＡ）、およびこれらの組み合わせの形態であり得る。核酸には、合成、天然、および非天然であり、参照核酸と類似の結合特性を有する、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含有する核酸が含まれる。このような類似体の例には、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途指定されない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示される配列と同様に、それらの保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列を暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が、混合基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−２６０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８（１９９４））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を通じて一緒に結合される。「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、これらには、さらに、天然の化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、ならびにプリンおよびピリミジンの天然の類似体および合成の誘導体が含まれ、それらには、アミン、アルコール、チオール、カルボン酸塩、およびハロゲン化アルキル等であるがこれらに限定されない新たな反応基を置く修飾が含まれるが、これに限定されない。
【００７３】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの生成に必要な部分長または全長コード配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。
【００７４】
「遺伝子産物」は、本明細書に使用される際、ＲＮＡ転写産物またはポリペプチドといった遺伝子の生成物を指す。
【００７５】
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれに限定されない有機化合物の群を指し、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする。これらは、少なくとも３つのクラスに分類される：（１）脂肪および油ならびにろうを含む「単純脂質」、（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」、ならびに（３）ステロイド等の「誘導脂質」。
【００７６】
「脂質粒子」という用語は、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）等の活性剤または治療剤を、目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官等）に送達するために使用可能な脂質製剤を含む。好ましい実施形態において、本発明の脂質粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および場合によっては粒子の凝集を阻止する複合脂質から典型的に形成される、脂質ナノ粒子である。他の好ましい実施形態において、これは、「核酸−脂質粒子」と称され得、核酸等の活性剤または治療剤は、粒子の脂質部分にカプセル封入され、それによっ
て酵素分解から保護され得る。
【００７７】
本明細書に使用される際、「ＬＮＰ」という用語は、脂質ナノ粒子を指す。ＬＮＰは、脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および場合によっては粒子の凝集を阻止する複合脂質）でできた粒子核酸を指し、ここで、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）は、脂質内に完全にカプセル封入される。ある特定の事例において、ＬＮＰは全身適用に極めて有用であり、これは、ＬＮＰが、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の長い循環寿命を呈し得、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に集積し得、そしてこれらの遠位部位で標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介し得るためである。核酸は、その開示があらゆる目的のために参照によりその全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ
００／０３６８３号に記載のように、縮合剤と複合体を形成し、ＬＮＰ内にカプセル封入することができる。
【００７８】
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、典型的に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍの平均粒径を有し、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の脂質粒子中に存在するとき、水溶液中でのヌクレアーゼによる分解に耐性である。脂質ナノ粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１４２０２５号および同第２００７／００４２０３１号に開示されており、それらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７９】
本明細書に使用される際、「脂質にカプセル封入された」とは、完全なカプセル封入、部分的カプセル封入、またはその両方で、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）等の活性剤または治療剤を提供する脂質粒子を指す。好ましい実施形態において、核酸は、脂質粒子に完全にカプセル封入される（例えば、ＬＮＰを形成する）。
【００８０】
「脂質複合体」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害する、複合脂質を指す。このような脂質複合体には、例えば、ジアルキルオキシプロピルに結合されたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体）、ジアシルグリセロールに結合されたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＧ複合体）、コレステロールに結合されたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンに結合されたＰＥＧ、およびセラミドに複合体化されたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）等のＰＥＧ−脂質複合体、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ−脂質複合体）、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＯＺ−脂質複合体のさらなる例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接複合体化されてもよく、またはリンカー部分を介して脂質に結合されてもよい。例えば、エステル不含リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺと脂質との結合に好適な任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態において、アミドまたはカルバメート等、非エステル含有リンカー部分が使用される。上述の特許文書のそれぞれの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
「両親媒性脂質」という用語は、部分的に、脂質物質の疎水性部分が疎水性相と馴染み、同時に親水性部分が水相と馴染む、任意の好適な物質を指す。親水特性は、炭水化物、
リン酸、カルボン酸、硫酸（ｓｕｌｆａｔｏ）、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシル等の基といった、極性または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基（複数可）によって置換されるような基を含むがこれらに限定されない、無極性基の包含によって与えられ得る。両親媒性化合物の例には、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
リン脂質の代表的な例には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイル  ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸（ａｃｙｌｏｘｙａｃｉｄ）等、リンを欠く他の化合物もまた、両親媒性脂質として示される群の範囲内である。さらに、上述の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合することができる。
【００８３】
「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨにおいて、非荷電または中性のいずれかの双性イオン性形態で存在する多数の脂質種のうちのいずれかを指す。生理的ｐＨにおいて、このような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが含まれる。
【００８４】
「非カチオン性脂質」とは、任意の両親媒性脂質、ならびに任意の他の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。
【００８５】
「アニオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨで負の電荷を有する任意の脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌ）ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、および中性脂質に結合された他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和および不飽和の脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基（複数可）によって任意に置換されるような基を含むがこれらに限定されない、無極性基を有する化合物を指す。好適な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン、および１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
「融合性」という用語は、ＬＮＰ等の脂質粒子が、細胞の膜と融合する能力を指す。この膜は、原形質膜、または細胞小器官、例えば、エンドソーム、核等を包囲する膜のいずれかであり得る。
【００８８】
本明細書に使用される際、「水溶液」という用語は、全体として、または部分的に、水を含む組成物を指す。
【００８９】
本明細書に使用される際、「有機脂質溶液」という用語は、全体として、または部分的
に、脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
【００９０】
「遠位部位」とは、本明細書に使用される際、物理的に離れた部位を指し、これは、隣接する毛細血管床に限定されず、生体全体に広く分布する部位も含む。
【００９１】
ＬＮＰ等の核酸−脂質粒子に関する「血清中で安定な」とは、粒子が、血清への暴露または遊離ＤＮＡもしくはＲＮＡを著しく分解するヌクレアーゼアッセイの後に、実質的に分解されないことを意味する。好適なアッセイには、例えば、標準血清アッセイ、ＤＮＡｓｅアッセイ、またはＲＮＡｓｅアッセイが挙げられる。
【００９２】
「全身送達」とは、本明細書に使用される際、生物内での干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性剤の広い生体内分布をもたらす、脂質粒子の送達を指す。いくつかの投与技術は、ある特定の薬剤の全身送達をもたらし得るが、他の薬剤の全身送達はもたらさない。全身送達とは、有用な、好ましくは治療的な量の薬剤が、身体の大部分に暴露されることを意味する。広範な生体内分布を得るには、通常、薬剤が、投与部位に対して遠位である疾患部位に達する前に、（初回通過器官（肝臓、肺等）または急速な非特異的細胞結合等によって）急速に分解または除去されないような、血中寿命を要する。脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、および腹腔内を含む、当該技術分野で既知の任意の手段によるものであり得る。好ましい実施形態において、脂質粒子の全身送達は、静脈内送達による。
【００９３】
「局所送達」とは、本明細書に使用される際、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性剤を生物内の標的部位に直接送達することを指す。例えば、薬剤は、腫瘍等の疾患部位、または炎症部位等の他の標的部位、または肝臓、心臓、膵臓、腎臓等の標的組織への直接注射によって局所的に送達され得る。
【００９４】
「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜等といった、任意の哺乳動物種を指す。
【００９５】
「癌」という用語は、異常な細胞の制御されない成長を特徴とする疾患のクラスの任意のメンバーを指す。この用語には、悪性、良性、軟組織、または固体として特徴づけられるかにかかわらず、全ての既知の癌および新生物状態、ならびに転移前および後の癌を含む全ての病期および悪性度の癌が含まれる。異なる種類の癌の例には、肝臓癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ））、食道癌；胆嚢癌、膵臓癌、虫垂癌、乳癌、卵巣癌；子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、中枢神経系の癌、膠芽腫、皮膚癌、リンパ腫、絨毛種、頭頸部癌、骨肉腫、および血液癌が挙げられるがこれらに限定されない。特定の種類の肝臓癌の非限定的な例には、肝細胞癌（ＨＣＣ）、続発性肝臓癌（例えば、何らかの他の非肝臓癌細胞型の転移によって引き起こされる）、および肝芽腫が挙げられる。本明細書に使用される際、「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。
【００９６】
「ＭＶ  ＲＮＡ」と略される「多価ＲＮＡ」という用語は、少なくとも３つのポリヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド複合体を指し、ここで、各ポリヌクレオチドは、その長さの全体または一部に沿って、複合体中の他のポリヌクレオチドの少なくとも２つとハイブリダイズし、これらのポリヌクレオチドのうちの１つ以上が、標的核酸配列とハイブリダイズすることができる標的化領域を任意に含む。各ポリヌクレオチドは、例えば、１０〜６０ヌクレオチドの長さであり得る。ポリヌクレオチド内の標的領域（複数可）は、複合体中の他のポリヌクレオチドの標的領域（複数可）がハイブリダイズする標的核酸配列（複数可）と同じかまたは異なる標的核酸配列とハイブリダイズすることができ得る。多価ＲＮＡは、インビトロで（例えば、化学合成によって）合成することができる
か、または、例えば、生細胞内で前駆体からプロセシングされ得る。例えば、前駆体は、多価ＲＮＡのポリヌクレオチドのそれぞれを含む直鎖ポリヌクレオチドであり得、これは、生細胞内に導入され、そこで切断されて多価ＲＮＡを形成する。「多価ＲＮＡ」という用語には、生細胞内で切断されることが意図されるこのような前駆体が含まれる。「多価ＲＮＡ」という用語はまた、例として、具体的または一般的に、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３６９６２号である公開済みの国際特許出願に記載される三部構成のポリヌクレオチド複合体も包含する。
【００９７】
ＩＩＩ．  新規なカチオン性脂質
本発明は、とりわけ、核酸等の治療剤をインビトロおよび／またはインビボで細胞に送達するために、本明細書に記載の脂質粒子中で有利に使用することができる、新規なカチオン性（アミノ）脂質を提供する。本発明の新規なカチオン性脂質は、本明細書の式Ｉに記載される構造を有し、それらの（Ｒ）および／または（Ｓ）エナンチオマーを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本発明の脂質は、ラセミ混合物を含む。他の実施形態において、本発明の脂質は、１つ以上のジアステレオマーの混合物を含む。ある特定の実施形態において、本発明の脂質は、１つのエナンチオマーが富化されており、結果として、脂質は、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のエナンチオマー過剰率を有する。ある特定の他の実施形態において、本発明の脂質は、１つのジアステレオマーが豊富であり、結果として、脂質は、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のジアステレオマー過剰率を有する。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の脂質は、キラル的に純粋である（例えば、単一の光学異性体を含む）。さらなる実施形態において、本発明の脂質は、１つの光学異性体（例えば、光学的に活性な異性体）が富化されており、結果として、脂質は、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の異性体過剰率を有する。本発明は、ラセミ混合物として、または光学的に純粋な形態での式Ｉのカチオン性脂質の合成を提供する。
【００９９】
「カチオン性脂質」および「アミノ脂質」という用語は、１、２、３個、またはそれ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖と、ｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基）とを有する、脂質およびその塩、例えば、薬学的に許容される塩を含んで本明細書に互換的に使用される。カチオン性脂質は、典型的に、カチオン性脂質のｐＫａよりも低いｐＨではプロトン化され（すなわち、正の電荷を有する）、ｐＫａよりも高いｐＨでは実質的に中性である。本発明のカチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質とも称され得る。
【０１００】
「塩」という用語には、本明細書に開示されるカチオン性脂質と１つ以上のアニオンとの間で形成される複合体等、任意のアニオン性およびカチオン性の複合体が含まれる。アニオンの非限定的な例には、無機および有機アニオン、例えば、水素化物、フッ化物、塩化物、ヨウ化物、シュウ酸塩（例えば、ヘミシュウ酸塩）、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、亜硫酸水素塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリレート、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、二クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、およびこれらの混合物が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書に開示されるカチオン性脂質の塩は、結晶塩である。特定の実施形態において、「塩
」は、「薬学的に許容される塩」である。
【０１０１】
「薬学的に許容される塩」という用語は、その塩が、当該技術分野で周知の種々の有機および無機対イオンに由来する、化合物の薬学的に許容される塩を指す。薬学的に許容される塩には、金属（無機）塩および有機塩の両方が含まれ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｇ．１４１８（１９８５）に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩には、単なる例として、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、および硝酸塩等の無機酸の塩、またはリンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩もしくはパモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、サリチル酸塩、およびステアリン酸塩等の有機酸の塩が挙げられる。同様に薬学的に許容されるカチオンには、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウム（特に第二級アミンを有するアンモニウム塩）が含まれるが、これらに限定されない。上記の理由により、本発明の特定の塩には、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびアンモニウム塩が含まれる。
【０１０２】
「アルキル」という用語には、１〜２４個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖の非環式または環式の飽和脂肪族炭化水素が含まれる。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が含まれるがこれらに限定されず、一方で飽和分岐鎖アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が含まれるがこれらに限定されない。代表的な飽和環式アルキルには、本明細書に記載のＣ３−８シクロアルキルが含まれるがこれに限定されず、一方で不飽和環式アルキルには、本明細書に記載のＣ３−８シクロアルケニルが含まれるがこれに限定されない。
【０１０３】
「ヘテロアルキル」という用語には、約１〜約５個のヘテロ原子（すなわち、１、２、３、４、または５個のヘテロ原子）、例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、および／またはＳ等を有し、窒素および硫黄原子が任意に酸化され得、窒素ヘテロ原子が任意に四級化され得る、上に定義される直鎖または分岐鎖の非環式または環式の飽和脂肪族炭化水素が含まれる。ヘテロアルキル基は、炭素原子またはヘテロ原子を通じて、分子の残りに結合され得る。
【０１０４】
「環式アルキル」という用語には、以下に記載される、置換または非置換のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基の全てが含まれる。
【０１０５】
「シクロアルキル」という用語には、環頂点として約３〜約８個の炭素原子（すなわち、３、４、５、６、７、または８個の炭素原子）を有する置換または非置換の環式アルキル基が含まれる。好ましいシクロアルキル基には、環頂点として約３〜約６個の炭素原子を有するものが含まれる。Ｃ３−８シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、メチル−シクロプロピル、ジメチル−シクロプロピル、シクロブチル、メチル−シクロブチル、シクロペンチル、メチル−シクロペンチル、シクロヘキシル、メチル−シクロヘキシル、ジメチル−シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル、ならびに他の置換Ｃ３−８シクロアルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
「ヘテロシクロアルキル」という用語には、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択され、窒素および硫黄原子が任意に酸化され得、窒素ヘテロ原子が任意に四級化され得る、約１〜約３個のヘテロ原子を環員として有する、上に定義される置換または非置換環式アルキル基が含まれる。ヘテロシクロアルキル基は、炭素原子またはヘテロ原子を通じて、分子の残りに結合され得る。
【０１０７】
「シクロアルケニル」という用語には、環頂点として約３〜約８個の炭素原子（すなわち、３、４、５、６、７、または８個の炭素原子）を有する置換または非置換の環式アルケニル基が含まれる。好ましいシクロアルケニル基は、環頂点として約３〜約６個の炭素原子を有するものである。Ｃ３−８シクロアルケニル基の例には、シクロプロペニル、メチル−シクロプロペニル、ジメチル−シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロへプテニル、およびシクロオクテニル、ならびに他の置換Ｃ３−８シクロアルケニル基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
「ヘテロシクロアルケニル」という用語には、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択され、窒素および硫黄原子が任意に酸化され得、窒素ヘテロ原子が任意に四級化され得る、約１〜約３個のヘテロ原子を環員として有する、上に定義される置換または非置換環式アルケニル基が含まれる。ヘテロシクロアルケニル基は、炭素原子またはヘテロ原子を通じて、分子の残りに結合され得る。
【０１０９】
「アルコキシ」という用語には、式アルキル−Ｏ−の基が含まれ、ここで、「アルキル」は、前に与えられた定義を有する。アルコキシ基の非限定的な例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシが挙げられる。
【０１１０】
「アルケニル」という用語には、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上に定義されたアルキルが含まれる。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の両方を含む。代表的な直鎖および分岐鎖アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な環式アルケニルは、上に記載されている。
【０１１１】
「アルキニル」という用語には、隣接する炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上に定義されたアルキルまたはアルケニルが含まれる。代表的な直鎖および分岐鎖アルキニルには、限定することなく、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニル等が挙げられる。
【０１１２】
「アリール」という用語には、一緒に融合されるかまたは共有結合される、単環または多環（最大３つの環）であり得、任意に１つ以上の置換基、例えば、ハロゲン、トリフルオロメチル、アミノ、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、シアノ、カルバモイル、アルコキシカルバモイル、メチレンジオキシ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ヒドロキシ、ニトロ等を有する、ポリ不飽和で典型的には芳香族の炭化水素基が含まれる。非置換アリール基の非限定的な例には、フェニル、ナフチル、およびビフェニルが挙げられる。置換アリール基の例には、フェニル、クロロフェニル、トリフルオロメチルフェニル、クロロフルオロフェニル、およびアミノフェニルが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１３】
「アルキルチオ」、「アルキルスルホニル」、「アルキルスルフィニル」、および「アリールスルホニル」という用語には、それぞれ、式−Ｓ−Ｒｉ、−Ｓ（Ｏ）２−Ｒｉ、−Ｓ（Ｏ）−Ｒｉ、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊを有する基が含まれ、式中、Ｒｉは、前に定義されたアルキル基であり、Ｒｊは、前に定義されたアリール基である。
【０１１４】
「アルケニルオキシ」および「アルキニルオキシ」という用語には、式−Ｏ−Ｒｉを有
する基が含まれ、式中、Ｒｉは、それぞれ、アルケニルまたはアルキニル基である。
【０１１５】
「アルケニルチオ」および「アルキニルチオ」という用語には、式−Ｓ−Ｒｋを有する基が含まれ、式中、Ｒｋは、それぞれ、アルケニルまたはアルキニル基である。
【０１１６】
「アルコキシカルボニル」という用語には、式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒｉを有する基が含まれ、式中、Ｒｉは、上に定義されたアルキル基であり、炭素原子の総数は、アルキルおよびカルボニル部分の合計を指す。
【０１１７】
「アシル」という用語には、結合点の炭素が、以下に定義されるオキソ基で置換される、任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルが含まれる。次のものが、アシル基の非限定的な例である：−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニル。
【０１１８】
「複素環」という用語には、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する、上述の複素環のいずれかがベンゼン環に融合された二環式環を含む５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式環が含まれ、ここで、窒素および硫黄ヘテロ原子は任意に酸化され得、窒素ヘテロ原子は任意に四級化され得る。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。複素環には、以下に定義されるヘテロアリール、ならびにモルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔａｍｙｌ）、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
「ヘテロアリール」という用語には、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、および硫黄（Ｓ）から選択される１、２個、またはそれ以上のヘテロ原子を含有する、芳香族５〜１０員複素環が含まれる。ヘテロアリールは、１つ以上の炭素原子が、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、複素環（例えば、モルホリニルまたはピロリジニル）等といった置換基で置換され得る。ヘテロアリールの非限定的な例には、ピリジニルおよびフラニルが挙げられる。
【０１２０】
「ハロゲン」という用語には、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードが含まれる。
【０１２１】
「任意に置換されたアルキル」、「任意に置換された環式アルキル」、「任意に置換されたアルケニル」、「任意に置換されたアルキニル」、「任意に置換されたアシル」、および「任意に置換された複素環」とは、置換される場合、少なくとも１つの水素原子が置換基と置き換えられることを意味する。「オキソ」置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置き換えられる。置換基の非限定的な例には、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および−ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、式中、ｎは、０、１、または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じかまたは異なり、独立して、水素、アルキル、または複素環であり、アルキルおよび複素環置換基のそれぞれは、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つ以上でさらに置換され得る。「任意に置換された」という用語は、一覧の置換基の前に使用される際、一覧に含まれる置換基のそれぞれが、本明細書に記載のように
任意に置換され得ることを意味する。
【０１２２】
一態様において、本発明は、構造式（Ｉ）を有するカチオン性脂質
【化３】
2018039844.tif 000010
またはその塩であって、式中、
Ｘは、アルキルアミノであり、
Ａは、Ｃ１〜Ｃ６の任意に置換されたアルキルであり、前記Ｃ１〜Ｃ６の任意に置換されたアルキルは、飽和または不飽和であり得、Ａは、存在してもしなくてもよく、
Ｙは、ケタール、エステル、任意に置換されたカルバメート、エーテル、および任意に置換されたアミドからなる群から選択され、
Ｚは、アルキル鎖のそれぞれがＣ８〜Ｃ１１の長さを有する３つのアルキル鎖からなる疎水性部分であり、３つのアルキル鎖のそれぞれは、独立して、飽和または不飽和であり得、３つのアルキル鎖のそれぞれは、任意に置換される、カチオン性脂質またはその塩を提供する。
【０１２３】
式（Ｉ）の脂質のいくつかの実施形態において、Ｚは、式
【化４】
2018039844.tif 000011
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ８〜Ｃ１１アルキルからなる群から選択され、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のそれぞれは、独立して、飽和または不飽和であり得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のそれぞれは、任意に置換される。
【０１２４】
特定の実施形態において、式（Ｉ）の脂質は、次の構造のうちの１つを有する：
【化５−１】
2018039844.tif 000012
【化５−２】
2018039844.tif 000013
【化５−３】
2018039844.tif 000014
【化５−４】
2018039844.tif 000015
【０１２５】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、１つ以上のアニオンとともに塩（例えば、結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態において、カチオン性脂質は、そのシュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸）塩であり、これは、好ましくは結晶塩である。特定の実施形態において、カチオン性脂質は、１つ以上のアニオンとともに薬学的に許容される塩を形成する。
【０１２６】
本明細書に記載の化合物の結晶形態、水和物、および溶媒和物もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２７】
本発明の化合物は、実施例に記載される方法を含む、既知の有機合成技術によって調製することができる。いくつかの実施形態において、本発明のカチオン性脂質の合成は、保護基の使用を必要とする場合がある。保護基の方法論は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，１９９９を参照されたい）。簡単に言うと、本発明の文脈内での保護基は、官能基の不要な反応性を低減または排除する、任意の基である。保護基を、官能基に付加してある特定の反応の間その反応性を遮蔽し、次いで、これを除去して元の官能基を露呈することができる。ある特定の事例では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の不要な反応性を減少または排除する、任意の基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を使用して付加および除去することができる。
【０１２８】
ある特定の実施形態において、本発明のカチオン性脂質は、少なくとも１つのプロトン化可能または脱プロトン化可能な基を有し、結果として、脂質は、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下では正の電荷を有し、第２のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨ以上では、中性となる。ｐＨに応じたプロトンの付加または除去は、平衡プロセスであること、および荷電脂質または中性脂質への言及は、主要な種の性質を指し、脂質の全てが荷電または中性形態で存在することを要するものではないことが、当業者には理解されるであろう。１つを上回るプロトン化可能もしくは脱プロトン化可能基を有する脂質、または双性イオン性であるものは、本発明での使用から除外されない。
【０１２９】
ある特定の他の実施形態において、本発明によるプロトン化可能脂質は、プロトン化可能基のｐＫａが、約４〜約１１の範囲である。これらの脂質は、より低いｐＨの製剤化段階ではカチオン性であり、およそｐＨ７．４の生理的ｐＨでは粒子の大部分の表面が（完全ではないが）中和されるため、約４〜約７のｐＫａが最も好ましい。このｐＫａの利点の１つは、粒子の外側表面と会合する少なくとも一部の核酸が、生理的ｐＨではその静電相互作用を失い、単純な透析で除去され、したがって、粒子の易排除性を大幅に低減することである。
【０１３０】
ＩＶ．  活性剤
活性剤（例えば、治療剤）には、細胞、組織、器官、または対象に対して所望の効果を呈することが可能な任意の分子が含まれる。そのような効果は、例えば、生物学的、生理学的、および／または美容的であり得る。活性剤は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、小分子、およびそれらの混合物を含むがこれらに限定されない、任意の種類の分子または化合物であり得る。核酸の非限定的な例には、干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、および／またはｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、リボザイム、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、およびこれらの混合物が挙げられる。ペプチドまたはポリペプチドの例には、限定することなく、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント；ヒト化抗体、組み換え抗体、組み換えヒト抗体、および／またはＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体）、サイトカイン、成長因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、細胞表面受容体およびそれらのリガンド、ホルモン、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。小分子の例には、当業者に既知の任意の従来的な薬剤または薬物等の有機小分子または化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、活性剤は、治療剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤誘導体は、それ自体が治療的に活性であり得るか、またはさらなる修飾によって活性となるプロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態において、治療剤誘導体は、修飾されていない薬剤と比較して、一部または全ての治療活性を保持し、一方で別
の実施形態では、治療剤誘導体は、治療活性を欠くがさらなる修飾時に活性となる、プロドラッグである。
【０１３２】
Ａ．  核酸
ある特定の実施形態において、本発明の脂質粒子は、核酸と会合し、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）をもたらす。いくつかの実施形態において、核酸は、脂質粒子に完全にカプセル封入される。本明細書に使用される際、「核酸」という用語には、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれ、６０個までのヌクレオチドを含有するフラグメントは、一般的に、オリゴヌクレオチドと称され、それよりも長いフラグメントは、ポリヌクレオチドと称される。特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、約１５〜約６０ヌクレオチドの長さである。核酸は、本発明の脂質粒子中、単独で投与されてもよく、またはペプチド、ポリペプチド、もしくは従来的な薬物等の小分子を含む本発明の脂質粒子と組み合わせて投与（例えば、共投与）されてもよい。
【０１３３】
本発明の文脈において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、天然の塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなる、ヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、非天然のモノマーまたは同様に機能するその部分を含む、ポリマーまたはオリゴマーも含む。このような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの強化、免疫原性の低下、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の向上といった特性のため、元の形態よりも好ましいことが多い。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドは、概して、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースと称される５炭糖が、この糖の５’および３’の炭素でリン酸と共有結合されて、交互の非分岐鎖ポリマーを形成するものからなる。リボオリゴヌクレオチドは、５炭糖がリボースである類似の反復構造からなる。
【０１３５】
本発明による核酸−脂質粒子中に存在する核酸には、既知である核酸の任意の形態が含まれる。本明細書に使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例は、本明細書に記載されており、例えば、構造遺伝子、制御および終止領域を含む遺伝子、ならびにウイルスまたはプラスミドＤＮＡといった自己複製系が含まれる。二本鎖ＲＮＡの例は、本明細書に記載されており、例えば、ｓｉＲＮＡ、ならびにＤｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡといった他のＲＮＡｉ剤が含まれる。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、成熟ｍｉＲＮＡ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１３６】
本発明の核酸は、通常は核酸の具体的な形態に応じて、種々の長さであり得る。例えば、特定の実施形態において、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００〜約１００，０００ヌクレオチド残基の長さであり得る。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０〜約１００ヌクレオチドの長さに及び得る。種々の関連する実施形態において、一本鎖、二本鎖、および三本鎖のいずれのオリゴヌクレオチドも、長さが約１０〜約６０ヌクレオチド、約１５〜約６０ヌクレオチド、約２０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、または約２０〜約３０ヌクレオチドの長さに及び得る。
【０１３７】
特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするか、またはそれに相補的である。本明細書に使用される「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」という用語は、安定かつ特異的な結合がＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間に生じるような、
十分な程度の相補性を示す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列に対して１００％相補的である必要はないことを理解されたい。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的配列へのオリゴヌクレオチドの結合が、標的配列の正常な機能を妨害して、有用性またはそこからの発現の喪失をもたらす場合、特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的な結合が所望される条件下、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的治療の場合には生理的条件下において、またはインビトロアッセイの場合にはそのアッセイが行われる条件下において、オリゴヌクレオチドと非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。したがって、オリゴヌクレオチドは、それが標的とするかまたはそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比較して、１、２、３個、またはそれ以上の塩基置換を含み得る。
【０１３８】
１．  ｓｉＲＮＡ
本発明の核酸−脂質粒子のｓｉＲＮＡ構成成分は、目的の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は、典型的に、約１５〜約６０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さである。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ｓｉＲＮＡは、通常、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫賦活性が低く、目的の標的遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を保持する。いくつかの実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ−グアノシン、２’ＯＭｅ−ウリジン、２’ＯＭｅ−アデノシン、および／または２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドといった、少なくとも１つの２’ＯＭｅプリンまたはピリミジンヌクレオチドを含有する。修飾ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）、または両方の鎖に存在し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡの一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖において、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾される（例えば、２’ＯＭｅ−修飾される）。これらの実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡは、１つ以上の修飾（例えば、２’ＯＭｅ−修飾）アデノシンおよび／または修飾（例えば、２’ＯＭｅ−修飾）シトシンヌクレオチドをさらに含み得る。他の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡの一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖において、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドのみが修飾される（例えば、２’ＯＭｅ−修飾される）。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１）もしくはＮｙｋaｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９（２００
１）に記載される３’もしくは５’オーバーハング）を有し得るか、またはオーバーハングを欠いてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。
【０１３９】
特定の実施形態において、２’ＯＭｅウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドといった修飾ヌクレオチドの、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖の二本鎖領域への選択的な組み込みは、そのｓｉＲＮＡ分子に対する免疫応答を低減させるか、または完全に無効にする。ある特定の事例において、特異的ｓｉＲＮＡ配列の免疫賦活特性と遺伝子発現をサイレンシングするそれらの能力とは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域内への最小限かつ選択的な２’ＯＭｅ修飾の導入によって、両立または最適化することができる。これは、非修飾ｓｉＲＮＡの使用と関連するサイトカイン誘発、毒性、および標的外作用を有することなく、治療的に実行可能なｓｉＲＮＡの用量で達成することができる。
【０１４０】
修飾ｓｉＲＮＡは、一般に、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域に、約１％〜約１００％（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、または１００％）の修飾ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上が、修飾ヌクレオチドを含む。ある特定の他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域の修飾ヌクレオチドのうちの一部または全てが、互いに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド、またはそれ以上離れている。１つの好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域の修飾ヌクレオチドはいずれも、互いに隣接しない（例えば、それぞれの修飾ヌクレオチドの間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の非修飾ヌクレオチドのギャップが存在する）。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約５０％未満（例えば、約４９％未満、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、または３６％、好ましくは約３５％未満、３４％、３３％、３２％、３１％、または３０％）が、修飾（例えば、２’ＯＭｅ）ヌクレオチドを含む。これらの実施形態の一態様において、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖の二本鎖領域のウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドの約５０％未満が、選択的に（例えば、それだけが）修飾される。これらの実施形態の別の態様において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約５０％未満が２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドを含み、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドだけが、二本鎖領域に存在する２’ＯＭｅヌクレオチドである。これらの実施形態のさらに別の態様において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約５０％未満が２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡの両方の鎖に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチド、およびこれらの混合物からなる群から選択される２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域に２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態のさらなる態様において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約５０％未満が２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域に２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の別の態様において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約５０％未満が２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡの両方の鎖に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチド、およびこれらの混合物からなる群から選択される２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、二本鎖領域内の２’ＯＭｅヌクレオチドは、互いに隣接しない。
【０１４２】
他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約１％〜約５０％（例えば、約５％〜５０％、１０％〜５０％、１５％〜５０％、２０％〜５０％、２５％〜５０％、３０％〜５０％、３５％〜５０％、４０％〜５０％、４５％〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４５％、１５％〜４５％、２０％〜４５％、２５％〜４５％、３０％〜４５％、３５％〜４５％、４０％〜４５％、５％〜４０％、１０％〜４０％、１５％〜４０％、２０％〜４０％、２５％〜４０％、２５％〜３９％、２５％〜３８％、２５％〜３７％、２５％〜３６％、２６％〜３９％、２６％〜３８％、２６％〜３７％、２６％〜３６％、２７％〜３９％、２７％〜３８％、２７％〜３７％、２７％〜３６％、２８％〜３９％、２８％〜３８％、２８％〜３７％、２８％〜３６％、２９％〜３９％、２９％〜３８％、２９％〜３７％、２９％〜３６％、３０％〜４０％、３０％〜３９％、３０％〜３８
％、３０％〜３７％、３０％〜３６％、３１％〜３９％、３１％〜３８％、３１％〜３７％、３１％〜３６％、３２％〜３９％、３２％〜３８％、３２％〜３７％、３２％〜３６％、３３％〜３９％、３３％〜３８％、３３％〜３７％、３３％〜３６％、３４％〜３９％、３４％〜３８％、３４％〜３７％、３４％〜３６％、３５％〜４０％、５％〜３５％、１０％〜３５％、１５％〜３５％、２０％〜３５％、２１％〜３５％、２２％〜３５％、２３％〜３５％、２４％〜３５％、２５％〜３５％、２６％〜３５％、２７％〜３５％、２８％〜３５％、２９％〜３５％、３０％〜３５％、３１％〜３５％、３２％〜３５％、３３％〜３５％、３４％〜３５％、３０％〜３４％、３１％〜３４％、３２％〜３４％、３３％〜３４％、３０％〜３３％、３１％〜３３％、３２％〜３３％、３０％〜３２％、３１％〜３２％、２５％〜３４％、２５％〜３３％、２５％〜３２％、２５％〜３１％、２６％〜３４％、２６％〜３３％、２６％〜３２％、２６％〜３１％、２７％〜３４％、２７％〜３３％、２７％〜３２％、２７％〜３１％、２８％〜３４％、２８％〜３３％、２８％〜３２％、２８％〜３１％、２９％〜３４％、２９％〜３３％、２９％〜３２％、２９％〜３１％、５％〜３０％、１０％〜３０％、１５％〜３０％、２０％〜３４％、２０％〜３３％、２０％〜３２％、２０％〜３１％、２０％〜３０％、２１％〜３０％、２２％〜３０％、２３％〜３０％、２４％〜３０％、２５％〜３０％、２５％〜２９％、２５％〜２８％、２５％〜２７％、２５％〜２６％、２６％〜３０％、２６％〜２９％、２６％〜２８％、２６％〜２７％、２７％〜３０％、２７％〜２９％、２７％〜２８％、２８％〜３０％、２８％〜２９％、２９％〜３０％、５％〜２５％、１０％〜２５％、１５％〜２５％、２０％〜２９％、２０％〜２８％、２０％〜２７％、２０％〜２６％、２０％〜２５％、５％〜２０％、１０％〜２０％、１５％〜２０％、５％〜１５％、１０％〜１５％、または５％〜１０％）が、修飾ヌクレオチドを含む。これらの実施形態の一態様において、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖の二本鎖領域のウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドの約１〜約５０％が、選択的に（例えば、それだけが）修飾される。これらの実施形態の別の態様において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約１％〜約５０％が２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドを含み、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドだけが、二本鎖領域に存在する２’ＯＭｅヌクレオチドである。これらの実施形態のさらに別の態様において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約１％〜約５０％が２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡの両方の鎖に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチド、およびこれらの混合物からなる群から選択される２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域に２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態のさらなる態様において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約１〜約５０％が２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域に２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の別の態様において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約１％〜約５０％が２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡの両方の鎖に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチド、およびこれらの混合物からなる群から選択される２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、二本鎖領域の２’ＯＭｅヌクレオチドは、互いに隣接しない。
【０１４３】
ｓｉＲＮＡに導入され得る修飾のさらなる範囲、割合（％）、およびパターンが、米国特許出願公開第２００７／０１３５３７２号に記載され、この開示は、あらゆる目的のた
めに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
ａ）  ｓｉＲＮＡ配列の選択
好適なｓｉＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知の任意の手段を用いて特定することができる。典型的には、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８（２００１）およびＥｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７−６８８８（２００１）に記載される方法を、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（３）：３２６−３３０（２００４）に記載される合理的設計規則と組み合わせる。
【０１４５】
非限定的な例として、目的の標的遺伝子に由来する転写産物のＡＵＧ開始コドンの３’側のヌクレオチド配列を、ジヌクレオチド配列（例えば、ＡＡ、ＮＡ、ＣＣ、ＧＧ、またはＵＵであり、Ｎ＝Ｃ、Ｇ、またはＵである）に対して走査することができる（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７−６８８８（２００１）を参照されたい）。ジヌクレオチド配列のすぐ３’側のヌクレオチドは、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列（すなわち、標的配列またはセンス鎖配列）として識別される。典型的に、ジヌクレオチド配列のすぐ３’側の１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５個、またはそれ以上のヌクレオチドは、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列として識別される。いくつかの実施形態において、ジヌクレオチド配列は、ＡＡまたはＮＡ配列であり、ＡＡまたはＮＡジヌクレオチドのすぐ３’側の１９個のヌクレオチドは、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列として識別される。ｓｉＲＮＡ配列は、通常、標的遺伝子の長さに沿って、異なる位置で間隔を開けて配置される。ｓｉＲＮＡ配列のサイレンシング効率をさらに高めるために、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列を分析して、例えば、標的細胞または生物において、他のコード配列に相同性の領域を含有しない部位を特定してもよい。例えば、約２１塩基対の好適なｓｉＲＮＡ配列は、典型的に、標的細胞または生物において、１６〜１７個を上回ってコード配列に相同性の連続する塩基対を有することはない。ｓｉＲＮＡ配列がＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターから発現される場合、４個を上回って連続するＡまたはＴの配列を欠くｓｉＲＮＡ配列を、選択する。
【０１４６】
可能性のあるｓｉＲＮＡ配列を特定した後、相補的配列（すなわち、アンチセンス鎖配列）を設計することができる。可能性のあるｓｉＲＮＡ配列はまた、当該技術分野で既知の種々の基準を用いて分析することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ配列を、それらのサイレンシング効率を高めるために、論理的設計アルゴリズムによって分析して、次の特徴のうちの１つ以上を有する配列を特定することができる：（１）約２５％〜約６０％Ｇ／ＣのＧ／Ｃ含量、（２）センス鎖の１５〜１９位に少なくとも３つのＡ／Ｕがある、（３）内部反復がない、（４）センス鎖の１９位にＡがある、（５）センス鎖の３位にＡがある、（６）センス鎖の１０位にＵがある、（７）センス鎖の１９位にＧ／Ｃがない、および（８）センス鎖の１３位にＧがない。これらの特徴のそれぞれの好適な値を割り当てるアルゴリズムを組み込み、ｓｉＲＮＡの選択に有用であるｓｉＲＮＡ設計ツールは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｉｈｏｍｅ．ｕｓｔ．ｈｋ／〜ｂｏｋｃｍｈｏ／ｓｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ．ｈｔｍｌに見出すことができる。当業者であれば、前述の特徴のうちの１つ以上を有する配列を、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列として、さらなる分析および試験に選択することができることを理解するであろう。
【０１４７】
さらに、次の基準のうちの１つ以上を有する、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡとして排除されることが多い：（１）連続して４個以上並んだ同じ塩基を含む配列、（２）Ｇのホモポリマーを含む配列（すなわち、これらのポリマーの構造的特徴に起因する、可能性のある非特異的な作用を低減するため）、（３）三重塩基モチーフを含む配列（例えば、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＡＡＡ、またはＴＴＴ）、（４）連続して７個以上並んだＧ／Ｃを含む配列、および（５）候補内に４個以上の塩基の直接的な反復を含み、内部折り
畳み構造をもたらす配列。しかしながら、当業者であれば、前述の特徴のうちの１つ以上を有する配列が、依然として、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列としてのさらなる分析および試験に選択され得ることを理解するであろう。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列を、例えば、Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：２０９−２１６（２００３）、およびＳｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：１９９−２０８（２００３）に記載されるように、ｓｉＲＮＡ二重鎖の非対称性に基づいてさらに分析してもよい。他の実施形態において、可能性のあるｓｉＲＮＡ配列を、Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１８：３０３−３１０（２００４）に記載されるように、標的部位における二次構造に基づいてさらに分析してもよい。例えば、標的部位における二次構造を、Ｍｆｏｌｄアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｂｕｒｎｅｔ．ｅｄｕ．ａｕ／ｒｎａ＿ｆｏｒｍで利用可能）を使用してモデル化して、塩基対の形態にある二次構造が少なく、ステムループが存在する、標的部位でのアクセス可能性に有利なｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。
【０１４９】
可能性のあるｓｉＲＮＡ配列を特定した後、この配列を、例えば、インビトロサイトカインアッセイまたはインビボ動物モデルを用いて、何らかの免疫賦活特性の存在について分析することができる。ＧＵリッチモチーフ（例えば、５’−ＧＵ−３’、５’−ＵＧＵ−３’、５’−ＧＵＧＵ−３’、５’−ＵＧＵＧＵ−３’等）等、ｓｉＲＮＡ配列のセンスおよび／またはアンチセンス鎖内のモチーフはまた、配列が免疫賦活性であり得るかどうかの指標を提供し得る。ｓｉＲＮＡ分子が免疫賦活性であることが判明すると、これを、次いで、本明細書に記載されるように、その免疫賦活特性を減少させるように修飾してもよい。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ配列を、細胞が検出可能な免疫応答をもたらすような条件下で、哺乳動物の応答細胞と接触させて、ｓｉＲＮＡが免疫賦活性ｓｉＲＮＡであるかまたは非免疫賦活性ｓｉＲＮＡであるかを判定することができる。哺乳動物の応答細胞は、ナイーブ哺乳動物（すなわち、これまでにｓｉＲＮＡ配列の遺伝子産物と接触したことのない哺乳動物）に由来し得る。哺乳動物の応答細胞は、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、マクロファージ等であり得る。検出可能な免疫応答は、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、またはこれらの組み合わせといった、サイトカインまたは成長因子の生成を含み得る。免疫賦活性であるとして特定されたｓｉＲＮＡ分子を、次いで、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のヌクレオチドのうちの少なくとも１つを修飾ヌクレオチドと置き換えることによって、その免疫賦活性を減少させるように修飾してもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域内のヌクレオチドの約３０％未満（例えば、約３０％未満、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％）を、２’ＯＭｅヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドと置き換えてもよい。修飾ｓｉＲＮＡを、次いで、上述のように哺乳動物の応答細胞と接触させて、その免疫賦活特性が低減されたかまたは無効となったことを確認することができる。
【０１５０】
免疫応答の検出に好適なインビトロアッセイには、Ｄａｖｉｄらの二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫アッセイ技術（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｋｉｒｋｈａｍ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｄｓ．，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９７０））、Ｇｏｒｄｏｎらの「ウエスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）、標識化リガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：４９８０−４９８３（１９８０））、例えばＲａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：５１５４−５１６０（１９８２）に記載される酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学技術（Ｂｒｏｏｋｓ
ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９：４７７（１９８０））、
および活性中和法（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：２３９６−２４００（１９８４））が挙げられるが、これらに限定されない。上述の免疫アッセイに加えて、米国特許第３，８１７，８２７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、および同第４，０９８，８７６号を含む、多数の他の免疫アッセイが利用可能である。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
免疫応答検出のためのインビボモデルの非限定的な例には、例えば、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：４９４−５０５（２００６）に記載されるインビボマウスサイトカイン誘導アッセイが挙げられる。ある特定の実施形態において、次のように実行することができるアッセイ：（１）ｓｉＲＮＡを、尾静脈への標準的な静脈内注射によって投与することができ、（２）血液を、投与の６時間後に心穿刺によって採取し、サイトカイン分析のために血漿として処理することができ、（３）サイトカインを、製造業者の説明に従ってサンドイッチＥＬＩＳＡキットを用いて定量化することができる（例えば、マウスおよびヒトＩＦＮ−α（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ヒトＩＬ−６およびＴＮＦ−α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ならびにマウスＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））。
【０１５２】
サイトカインおよび成長因子に特異的に結合するモノクローナル抗体は、複数の供給源から市販入手可能であり、当該技術分野で既知の方法を用いて生成することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照されたい）。モノクローナル抗体の生成は、既に説明されており、当該技術分野で既知の任意の手段によって達成することができる（Ｂｕｈｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐｐ．７７−７８（１９９１））。いくつかの方法では、検出を容易にするために、モノクローナル抗体を標識化する（例えば、分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、または化学的手段で検出可能な任意の組成物で）。
【０１５３】
ｂ）  ｓｉＲＮＡ分子の生成
ｓｉＲＮＡは、例えば、１つ以上の単離された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖として、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として、またはＤＮＡプラスミドにおいて転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡとしてを含む、複数の形態で提供され得る。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、酵素的に、または部分的／完全な有機合成によって生成することができ、修飾リボヌクレオチドは、インビトロ酵素または有機合成によって導入することができる。ある特定の事例において、各鎖は、化学的に調製される。ＲＮＡ分子の合成方法は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）に記載されるか、または本明細書に記載される化学合成方法である。
【０１５４】
ＲＮＡ集団を使用して、長い前駆体ＲＮＡをもたらすことができるか、または選択された標的配列に実質的もしくは完全な同一性を有する長い前駆体ＲＮＡを使用して、ｓｉＲＮＡを作製することができる。ＲＮＡを、当業者に既知の方法に従って、細胞または組織から単離する、合成する、および／またはクローニングすることができる。ＲＮＡは、（細胞もしくは組織から得られる、ｃＤＮＡから転写される、引き出される、選択される等の）混合集団であってもよく、または、単一の標的配列を表してもよい。ＲＮＡは、天然に存在するか（例えば、組織もしくは細胞試料から単離される）、インビトロで合成され
るか（例えば、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼ、およびＰＣＲ産物もしくはクローンｃＤＮＡを使用して）、または化学合成され得る。
【０１５５】
合成ＲＮＡのための長いｄｓＲＮＡを形成するために、補体もまた、インビトロで転写し、ハイブリダイズして、ｄｓＲＮＡを形成する。天然に存在するＲＮＡ集団を使用する場合、ＲＮＡの補体もまた、例えば、ＲＮＡ集団に対応するｃＤＮＡを転写することによって、またはＲＮＡポリメラーゼを使用して、提供される（例えば、大腸菌ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩもしくはＤｉｃｅｒによる消化のためのｄｓＲＮＡを形成するため）。次いで、前駆体ＲＮＡをハイブリダイズして、消化のための二本鎖ＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡは、対象に直接投与することができるか、または投与の前にインビトロで消化され得る。
【０１５６】
ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸のハイブリダイズ、ｃＤＮＡライブラリの作製およびスクリーニング、ならびにＰＣＲの実行のための方法は、当該技術分野で周知であり（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９（１９８３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）を参照されたい）、ＰＣＲ法も同様である（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照されたい）。発現ライブラリもまた、当業者には周知である。本発明における一般的な使用方法を開示するさらなる基礎的文書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が挙げられる。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、化学合成される。本発明のｓｉＲＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドは、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５（１９８７）、Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５４３３（１９９０）、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：２６７７−２６８４（１９９５）、およびＷｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４：５９（１９９７）に記載されるもの等、当該技術分野で既知の種々の技術のいずれかを使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端のジメトキシトリチルおよび３’末端のホスホラミダイトといった、一般的な核酸保護および結合基を利用する。非限定的な例として、小規模な合成を、０．２μｍｏｌ規模のプロトコルを用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ合成器で行うことができる。あるいは、０．２μｍｏｌ規模の合成は、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からの９６ウェルプレート合成器で行ってもよい。しかしながら、より大きいかまたは小さい規模の合成もまた、本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチドの合成に好適な試薬、ＲＮＡ脱保護の方法、ＲＮＡ精製の方法は、当業者に既知である。
【０１５８】
ｓｉＲＮＡ分子はまた、タンデム合成技術を介して合成することができ、ここでは、両方の鎖を、切断可能なリンカーによって分離される単一の連続するオリゴヌクレオチドフラグメントまたは鎖として合成され、このリンカーが後で切断されて、別個のフラグメントまたは鎖をもたらし、これがハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。ｓｉＲＮＡのタンデム合成は、複数ウェル／複数プレートの合成プラットフォーム、ならびにバッチ
式反応器、合成カラム等を用いる大規模な合成プラットフォームに、容易に適合可能である。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、一方のオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、他方がアンチセンス鎖を含む、２つの異なるオリゴヌクレオチドから構築されてもよい。例えば、各鎖を別個に合成し、合成および／または脱保護後にハイブリダイゼーションまたはライゲーションによって一緒に結合させることができる。ある特定の他の事例において、ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域がハイブリダイズして、ヘアピン二次構造を有するｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する、単一の連続するオリゴヌクレオチドフラグメントとして合成され得る。
【０１５９】
ｃ）  ｓｉＲＮＡ配列の修飾
ある特定の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、２つの鎖と、二本鎖領域に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドとを有する二重鎖を含み、ここで、各鎖は、約１５〜約６０ヌクレオチドの長さである。有利なことに、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫賦活性が低いが、標的配列の発現をサイレンシングする能力は保持する。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子に導入される化学修飾の程度は、ｓｉＲＮＡの免疫賦活特性の低減または無効化と、ＲＮＡｉ活性の保持とをうまく両立させる。非限定的な例として、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡによって生成される免疫応答を排除し、同時に標的遺伝子の発現をサイレンシングするその能力を保持するように、ｓｉＲＮＡ二重鎖内の選択的なウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドが最小限に修飾され得る（例えば、約３０％未満、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％修飾される）。
【０１６０】
本発明での使用に好適な修飾ヌクレオチドの例には、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’Ｆ）、２’−デオキシ、５−Ｃ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’−チオ、２’−アミノ、または２’−Ｃ−アリル基を有するリボヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｅｄ．（１９８４）に記載されるもの等、ノーザン配置（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有する修飾ヌクレオチドもまた、ｓｉＲＮＡ分子における使用に好適である。このような修飾ヌクレオチドには、限定することなく、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロ（２’Ｃｌ）ヌクレオチド、および２’−アジドヌクレオチドが挙げられる。ある特定の事例において、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、１つ以上のＧ−クランプヌクレオチドを含む。Ｇ−クランプヌクレオチドは、修飾により、二重鎖内の相補的なグアニンヌクレオチドのワトソンクリックおよびフーグスティーン面（ｆａｃｅ）の両方に水素結合する能力を得る、修飾シトシン類似体を指す（例えば、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：８５３１−８５３２（１９９８）を参照されたい）。さらに、ヌクレオチド塩基類似体、例えば、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル等、他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびにニトロアゾール誘導体、例えば、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールを有する、ヌクレオチド（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２４３７−２４４７（２００１））を、ｓｉＲＮＡ分子に組み込んでもよい。
【０１６１】
ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、末端キャップ部分、リン酸骨格修飾等といった、１つ以上の化学修飾をさらに含み得る。末端キャップ部分の例には、限定することなく、逆位脱塩基残基、グリセリル修飾、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌ
クレオチド、１，５−ａｎヒドリドヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分、３’−３’−逆位脱塩基部分、３’−２’−逆位ヌクレオチド部分、３’−２’−逆位脱塩基部分、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分、５’−５’−逆位脱塩基部分、３’−５’−逆位デオキシ脱塩基部分、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１，２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、５’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、５’−アミノ、３’−ホスホロチオエート、５’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および架橋もしくは非架橋メチルホスホネートまたは５’−メルカプト部分が挙げられる（例えば、米国特許第５，９９８，２０３号、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９：１９２５（１９９３）を参照されたい）。リン酸骨格修飾（すなわち、修飾されたヌクレオチド間結合をもたらす）の非限定的な例には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、およびアルキルシリル置換が挙げられる（例えば、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７（１９９５）、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９（１９９４）を参照されたい）。このような化学修飾は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端  およ  び／または３’末端で生じ得る。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、約１〜約４個（例えば、１、２、３、もしくは４個）の２’−デオキシリボヌクレオチド、修飾（例えば、２’ＯＭｅ）および／もしくは非修飾ウリジンリボヌクレオチド、ならびに／または修飾（例えば、２’ＯＭｅ）および非修飾ヌクレオチドの任意の他の組み合わせを有する、３’末端オーバーハングをさらに含み得る。
【０１６３】
ｓｉＲＮＡ分子に導入することができる修飾ヌクレオチドおよび化学修飾の種類のさらなる例は、例えば、英国特許第ＧＢ  ２，３９７，８１８  Ｂ号および米国特許出願公開第２００４／０１９２６２６号、同第２００５／０２８２１８８号、および同第２００７／０１３５３７２号に記載され、それらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖に、１つ以上の非ヌクレオチドを任意に含み得る。本明細書に使用される際、「非ヌクレオチド」という用語は、糖および／またはリン酸置換を含む、１つ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み込むことができ、残りの塩基がそれらの活性を呈することを許す、任意の基または化合物を指す。この基または化合物は、それが、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンといった、広く認識されているヌクレオチド塩基を有さず、したがって、１’位に塩基を欠くという点で、脱塩基性である。
【０１６５】
他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの化学修飾は、複合体をｓｉＲＮＡ分子に結合させることを含む。複合体は、例えば、生分解性リンカー等の共有結合を介して、ｓｉＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’および／または３’末端に結合され得る。複合体はまた、例えば、カルバメート基または他の結合基を通じて、ｓｉＲＮＡに結合され得る（例えば、米国特許出願公開第２００５／００７４７７１号、同第２００５／００４３２１９、および同第２００５／０１５８７２７号を参照されたい）。ある特定の事例において、複合体は、細胞内へのｓｉＲＮＡの送達を促進する分子である。ｓｉＲＮＡへの結合に好適な複合体分子には、限定することなく、コレステロール等のステロイド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のグリコール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸塩（例えば、葉酸、葉酸塩類似体、およびその誘導体）、糖類（例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコース等）リン脂質、ペプチド、細胞取り込みを媒介することが可能な細胞受容体のリガンド、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１３０１８６号、同第２００４／０１１０２９６号、および同第２００４／０２４９１７８号、米国特許第６，７５３，４２３号を参照されたい）。他の例には、米国特許出願公開第２００５／０１１９４７０号および同第２００５／０１０７３２５号に記載される、親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子、オリゴ糖、炭水化物のクラスター、介入物質、小溝結合剤、切断剤、および架橋剤の複合体分子が挙げられる。さらに他の例には、米国特許出願公開第２００５／０１５３３３７号に記載される、２’−Ｏ−アルキルアミン、２’−Ｏ−アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、Ｃ５−カチオン性修飾ピリミジン、カチオン性ペプチド、グアニジニウム基、アミジニニウム（ａｍｉｄｉｎｉｎｉｕｍ）基、カチオン性アミノ酸複合体分子が挙げられる。さらなる例には、米国特許出願公開第２００４／０１６７０９０号に記載される、疎水性基、膜活性化化合物、細胞貫通化合物、細胞標的化シグナル、相互作用修飾因子、および立体安定剤複合体分子が挙げられる。さらなる例には、米国特許出願公開第２００５／０２３９７３９号に記載の複合体分子が挙げられる。使用される複合体の種類およびｓｉＲＮＡ分子との複合体化の程度を、ＲＮＡｉ活性を保持すると同時に、改善されたｓｉＲＮＡの薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティ、および／または安定性について、評価することができる。このように、当業者であれば、種々の複合体がそこに結合しているｓｉＲＮＡ分子をスクリーニングして、様々な周知のインビトロ細胞培養物またはインビボ動物モデルを用いて、改善された特性および完全なＲＮＡｉ活性を有するものを特定することができる。上述の特許文書の開示は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
ｄ）  標的遺伝子
本明細書に記載の核酸−脂質粒子のｓｉＲＮＡ成分を使用して、目的の遺伝子の翻訳（すなわち、発現）を下方制御するか、またはサイレンシングすることができる。目的の遺伝子には、ウイルスの感染および生存と関連する遺伝子、代謝性疾患および障害（例えば、肝臓疾患および障害）と関連する遺伝子、腫瘍形成または細胞形質転換（例えば、癌）と関連する遺伝子、血管形成遺伝子、炎症および自己免疫応答と関連するもの等の免疫調節遺伝子、受容体リガンド遺伝子、ならびに神経変性障害と関連する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
特定の実施形態において、本発明は、複数の目的遺伝子の発現をサイレンシングする、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のｓｉＲＮＡ分子の混合物を提供する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の混合物は、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）等の脂質粒子に完全にカプセル封入される。ｓｉＲＮＡ分子は、同じ脂質粒子内に一緒にカプセル封入されてもよく、または、混合物中に存在する各ｓｉＲＮＡ種は、別個の粒子に製剤化されてもよい。
【０１６８】
ウイルス感染および生存に関連する遺伝子には、宿主（例えば、組織因子等の宿主因子）により発現されるもの、または細胞に結合し、そこに侵入し、そこで複製するためにウイルスにより発現されるものが含まれる。慢性ウイルス疾患と関連するウイルス配列が、特に興味深い。特に興味深いウイルス配列には、エボラウイルスおよびマールブルグウイルス等のフィロウイルス（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９３：１６５０−１６５７（２００６）を参照されたい）、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、およびサビアウイルス等のアレナウイルス（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｋｎｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），４ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（２００１））、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣウイルス等のインフルエンザウイルス（例えば、Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．，３６：３０５−３３２（２００２）およびＮｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，８３：２６３５−２６６２（２００２）を参照されたい）、肝炎ウイルス（例えば、Ｈａｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５４３：５１（２００３）、Ｙｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，４：６０２（２００３）、Ｓｃｈｌｏｍａｉ  ｅｔ
ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３７：７６４（２００３）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：２７８３（２００３）、Ｋａｐａｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：２０１４（２００３）、およびＦｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｋｎｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），４ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（２００１）を参照されたい）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｎｅｒｊｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８：６２（２００３）、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：７１７４（２００３）、Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，ＪＡＭＡ，２８９：１４９４（２００３）、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１８３（２００３））、ヘルペスウイルス（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：３３０１（２００３））、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：６０６６（２００３）、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：６０４１（２００２））の配列が挙げられる。
【０１６９】
サイレンシングされ得る例となるフィロウイルスの核酸配列には、構造タンパク質（例えば、ＶＰ３０、ＶＰ３５、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ−ｐｏｌ））、および膜結合タンパク質（例えば、ＶＰ４０、糖タンパク質（ＧＰ）、ＶＰ２４）をコードする核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。エボラウイルスの完全なゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２５４９、ＡＹ７６９３６２、ＮＣ＿００６４３２、ＮＣ＿００４１６１、ＡＹ７２９６５４、ＡＹ３５４４５８、ＡＹ１４２９６０、ＡＢ０５０９３６、ＡＦ５２２８７４、ＡＦ４９９１０１、ＡＦ２７２００１、およびＡＦ０８６８３３に記載されている。エボラウイルスのＶＰ２４配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ７７３８５およびＡＹ０５８８９７に記載されている。エボラウイルスのＬ−ｐｏｌ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６７１１０に記載されている。エボラウイルスのＶＰ４０配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９６に記載されている。エボラウイルスのＮＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９５に記載されている。エボラウイルスのＧＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９８、Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２９：２１５−２４０（１９９３）、Ｗｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：１２０３−１２１０（１９９３）、Ｖｏｌｃｈｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３０５：１８１−１８４（１９９２）、および米国特許第６，７１３，０６９号に記載されている。さらなるエボラウイルスの配列は、例えば、Ｇｅｎｂ
ａｎｋ受託番号Ｌ１１３６５およびＸ６１２７４に記載されている。マールブルグウイルスの完全なゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１６０８、ＡＹ４３０３６５、ＡＹ４３０３６６、およびＡＹ３５８０２５に記載されている。マールブルグウイルスのＧＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００５７３４、ＡＦ００５７３３、およびＡＦ００５７３２に記載されている。マールブルグウイルスのＶＰ３５配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００５７３１およびＡＦ００５７３０に記載されている。さらなるマールブルグウイルスの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６４４０６、Ｚ２９３３７、ＡＦ００５７３５、およびＺ１２１３２に記載されている。エボラウイルスおよびマールブルグウイルスの核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００７／０１３５３７０号および２００９年１２月１５日に出願された米国仮出願第６１／２８６，７４１号に記載のものが挙げられ、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
サイレンシングされ得る例となるアレナウイルスの核酸配列には、核タンパク質（ＮＰ）、糖タンパク質（ＧＰ）、Ｌ−ポリメラーゼ（Ｌ）、およびＺタンパク質（Ｚ）をコードする核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。ラッサウイルスの完全なゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４２９６（ＬＡＳＶセグメントＳ）およびＮＣ＿００４２９７（ＬＡＳＶセグメントＬ）に記載されている。ラッサウイルスの核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、２０１０年３月３１日に出願された米国仮出願第６１／３１９，８５５号に記載のものが含まれ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
サイレンシングされ得る例となる宿主の核酸配列には、出血熱ウイルスの病因において役割を果たすことが既知である、組織因子（ＴＦ）等の宿主因子をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。ＴＦのｍＲＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９９３に記載されている。当業者であれば、ＴＦが、Ｆ３、凝固因子ＩＩＩ、トロンボプラスチン、およびＣＤ１４２としても知られることを理解するであろう。ＴＦ核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、２０１０年３月３１日に出願された米国仮出願第６１／３１９，８５５号に記載のものが挙げられ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
サイレンシングされ得る例となるインフルエンザウイルスの核酸配列には、核タンパク質（ＮＰ）、マトリクスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ならびに赤血球凝集素（ＨＡ）をコードする核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザＡのＮＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４５２２、ＡＹ８１８１３８、ＡＢ１６６８６３、ＡＢ１８８８１７、ＡＢ１８９０４６、ＡＢ１８９０５４、ＡＢ１８９０６２、ＡＹ６４６１６９、ＡＹ６４６１７７、ＡＹ６５１４８６、ＡＹ６５１４９３、ＡＹ６５１４９４、ＡＹ６５１４９５、ＡＹ６５１４９６、ＡＹ６５１４９７、ＡＹ６５１４９８、ＡＹ６５１４９９、ＡＹ６５１５００、ＡＹ６５１５０１、ＡＹ６５１５０２、ＡＹ６５１５０３、ＡＹ６５１５０４、ＡＹ６５１５０５、ＡＹ６５１５０６、ＡＹ６５１５０７、ＡＹ６５１５０９、ＡＹ６５１５２８、ＡＹ７７０９９６、ＡＹ７９０３０８、ＡＹ８１８１３８、およびＡＹ８１８１４０に記載されている。インフルエンザＡのＰＡ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ８１８１３２、ＡＹ７９０２８０、ＡＹ６４６１７１、ＡＹ８１８１３２、ＡＹ８１８１３３、ＡＹ６４６１７９、ＡＹ８１８１３４、ＡＹ５５１９３４、ＡＹ６５１６１３、ＡＹ６５１６１０、ＡＹ６５１６２０、ＡＹ６５１６１７、ＡＹ６５１６００、ＡＹ６５１６１１、ＡＹ６５１６０６、ＡＹ６５１６１８、ＡＹ６５１６０８、ＡＹ６５１６０７、ＡＹ６５１６０５、ＡＹ６５１６０９、ＡＹ６５１６１５、ＡＹ６５１６１６、ＡＹ６５１６４
０、ＡＹ６５１６１４、ＡＹ６５１６１２、ＡＹ６５１６２１、ＡＹ６５１６１９、ＡＹ７７０９９５、およびＡＹ７２４７８６に記載されている。インフルエンザウイルスの核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００７／０２１８１２２号に記載のものが挙げられ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
サイレンシングされ得る例となる肝炎ウイルスの核酸配列には、転写および翻訳に関与する核酸配列（例えば、Ｅｎ１、Ｅｎ２、Ｘ、Ｐ）、ならびに構造タンパク質（例えば、ＣおよびＣ関連タンパク質を含むコアタンパク質、Ｓ、Ｍ、および／もしくはＬタンパク質を含むカプシドおよびエンベロープタンパク質、またはそれらのフラグメント）をコードする核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，上記を参照されたい）。サイレンシングされ得る例となるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の核酸配列には、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、ポリタンパク質翻訳開始コドン領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、ならびに／またはコアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、および／もしくはＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶのゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４１０２（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）、ＡＪ２３８７９９（ＨＣＶ遺伝子型１ｂ）、ＮＣ＿００９８２３（ＨＣＶ遺伝子型２）、ＮＣ＿００９８２４（ＨＣＶ遺伝子型３）、ＮＣ＿００９８２５（ＨＣＶ遺伝子型４）、ＮＣ＿００９８２６（ＨＣＶ遺伝子型５）、およびＮＣ＿００９８２７（ＨＣＶ遺伝子型６）に記載されている。Ａ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４８９に記載されており、Ｂ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３９７７に記載されており、Ｄ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１６５３に記載されており、Ｅ型肝炎ウイルス核の酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４３４に記載されており、Ｇ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１７１０に記載さている。ウイルス感染および生存と関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、ウイルス性状態の治療に使用される従来の薬剤の投与と組み合わせて便宜的に用いることができる。肝炎ウイルスの核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００６／０２８１１７５号、同第２００５／００５８９８２号、および同第２００７／０１４９４７０号、米国特許第７，３４８，３１４号、ならびに２０１０年３月１９日に出願され、弁理士整理番号０２０８０１−００８９１０ＰＣを有する「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題されるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００４４４号に記載されるものが挙げられ、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
代謝性疾患および障害（例えば、肝臓が標的である障害、ならびに肝臓疾患および障害）と関連する遺伝子には、脂質異常症において発現する遺伝子、例えば、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３８４）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４０およびＮＧ＿００８９４９  ＲＥＧＩＯＮ：５００１．．８１６４）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４１およびＮＧ＿００７０８４  ＲＥＧＩＯＮ：５００１．．８６１２）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７４９３６）、ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ１型（ＤＧＡＴ１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２０７９）、ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ２型（ＤＧＡＴ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２５６４）、ＬＸＲαおよびＬＸＲβ等の肝臓Ｘ受容体（
Ｇｅｎｂａｃｋ受託番号ＮＭ＿００７１２１）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１２３）、ステロール調節因子結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、部位−１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素−Ａ還元酵素（ＨＭＧ補酵素−Ａ還元酵素）等、ならびに糖尿病において発現する遺伝子、例えば、グルコース６−ホスファターゼ等（例えば、Ｆｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８１：６８７（１９９５）、Ｓｅｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，９：７２（１９９５）、Ｚａｖａｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：７９０９（１９９７）、Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８５：１０３７−１０４６（１９９６）、Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１２７７８−１２７８５（１９９７）、Ｗｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１０３３−１０４５（１９９５）、Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：３１３７−３１４０（１９９７）、Ｊａｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８３：７２８−７３１（１９９６）、およびＰｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９３：６９３−７０４（１９９８）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
当業者であれば、代謝性疾患および障害（例えば、肝臓が標的である疾患および障害、ならびに肝臓疾患および障害）と関連する遺伝子には、肝臓自体に発現する遺伝子、ならびに他の器官および組織に発現する遺伝子が含まれる。代謝性疾患および障害と関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、疾患または障害の治療に使用される従来の薬剤の投与と組み合わせて、便宜的に用いることができる。ＡＰＯＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００６／０１３４１８９号、同第２００６／０１０５９７６号、および同第２００７／０１３５３７２号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ０４／０９１５１５号に記載のものが挙げられ、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＰＯＣ３遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、２０１０年１月２６日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００１２０号に記載のものが含まれ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００７／０１７３４７３号、同第２００８／０１１３９３０号、および同第２００８／０３０６０１５号に記載のものが挙げられ、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＧＡＴ１遺伝子を標的とする例となるｓｉＲＮＡ分子は、米国特許出願公開第２００４／０１８５５５９号に記載のアンチセンス化合物を使用して設計することができ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＧＡＴ２遺伝子を標的とする例となるｓｉＲＮＡ分子は、米国特許出願公開第２００５／００４３５２４号に記載のアンチセンス化合物を使用して設計することができ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
腫瘍形成または細胞形質転換（例えば、癌または他の新生物形成）と関連する遺伝子には、例えば、ｐ５３ユビキチン化、ｃ−Ｊｕｎユビキチン化、ヒストン脱アセチル化、細胞周期制御、およびこれらの組み合わせに関与する遺伝子が含まれる。腫瘍形成または細胞形質転換と関連する遺伝子配列の非限定的な例には、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５０３０、Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：４２９−４４０（２００４））およびサイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７５）等のセリン／スレオニンキナーゼ；ＣＯＰ１（ＲＦＷＤ２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２２４５７およびＮＭ＿００１００１７４０）およびリングボックス１（ＲＢＸ１）（ＲＯＣ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４２４８）等のユビキチンリガーゼ；ＷＥＥ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９０およびＮＭ＿００１１４３９７６）等のチロシンキナーゼ；Ｅｇ５（ＫＳＰ、ＫＩＦ１１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５
２３）等の有糸分裂キネシン；フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０２００２、ＮＭ＿０２１９５３、およびＮＭ＿２０２００３）およびＲＡＭ２（Ｒ１またはＣＤＣＡ７Ｌ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１８７１９、ＮＭ＿００１１２７３７０、およびＮＭ＿００１１２７３７１）等の転写因子；ＸＩＡＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１６７）等のアポトーシス阻害因子；ＣＳＮ１、ＣＳＮ２、ＣＳＮ３、ＣＳＮ４、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６８３７）等のＣＯＰ９シグナロソームサブユニット；ＣＳＮ６、ＣＳＮ７Ａ、ＣＳＮ７Ｂ、およびＣＳＮ８；ならびにＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５２７）、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９等のヒストン脱アセチル化酵素等が挙げられる。
【０１７７】
ＰＬＫ−１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００５／０１０７３１６号および同第２００７／０２６５４３８号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／０８２８１７号に記載のものが挙げられ、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｅｇ５およびＸＩＡＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００９／０１４９４０３号に記載のものが挙げられ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＳＮ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２９３１９号に記載のものが挙げられ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＯＰ１、ＣＳＮ５、ＲＢＸ１、ＨＤＡＣ２、ＣＤＫ４、ＷＥＥ１、ＦＯＸＭ１、およびＲＡＭ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、２００９年９月２３日に出願された米国仮出願第６１／２４５，１４３号に記載のものが挙げられ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
腫瘍形成または細胞形質転換と関連する遺伝子配列のさらなる例には、ＭＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ−ＡＢＬ（Ｗｉｌｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：５７１６（２００２）、Ｓｃｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：１５６６（２００３））、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１、ＴＬＳ−ＦＵＳ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、ＢＣＬ−２、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、およびＡＭＬ１−ＭＴＧ８（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  ｅｔ
ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：３１５７（２００３））等の転座配列、多剤耐性遺伝子（Ｎｉｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５４５：１４４（２００３）、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：１５１５（２００３））、サイクリン（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：３５９３（２００３）、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１６：２９２３（２００２））、β−カテニン（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，９：１２９１（２００３））、テロメラーゼ遺伝子（Ｋｏｓｃｉｏｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２：２０９（２００３））、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＢＣＬ−２、成長因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８、ＮＭ＿２０１２８２、ＮＭ＿２０１２８３、およびＮＭ＿２０１２８４；Ｎａｇｙ
ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２８５：３９−４９（２００３）もまた参照されたい）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４８およびＮＭ＿００１００５８６２）、ＥｒｂＢ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９８２およびＮＭ＿００１００５９１５）、およびＥｒｂＢ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２３５およびＮＭ＿００１０４２５９９））等の過剰発現配列、ならびにＲＡＳ（Ｔｕｓｃｈｌ  ａｎｄ  Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ，２：１５８（２００２））等の突然変異配列が挙げられる。ＥＧＦＲを標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００９／０１４９４０３号に記載のものが挙げられ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＶＥＧＦＲ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、例えば、ＧＢ  ２３９
６８６４号、米国特許出願公開第２００４／０１４２８９５号、およびＣＡ  ２４５６４４４号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
ＤＮＡ修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法剤の投与と組み合わせた使用が見出される（Ｃｏｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：１５５０（２００３）。腫瘍移動と関連するタンパク質をコードする遺伝子はまた、目的の標的配列、例えば、インテグリン、セレクチン、およびメタロプロテイナーゼである。前述の例は、限定的なものではない。当業者であれば、腫瘍形成もしくは細胞形質転換、腫瘍の成長、または腫瘍の移動を促進するかまたは推進する、いずれの全体的又は部分的遺伝子配列も、鋳型配列として含まれ得ることを理解するであろう。
【０１８０】
血管形成遺伝子は、新しい血管の形成を促進することができる。特に興味深い血管形成遺伝子には、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，９：２１０（２００３））、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）等が挙げられるが、これらに限定されない。ＶＥＧＦＲ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、例えば、ＧＢ  ２３９６８６４号、米国特許出願公開第２００４／０１４２８９５号、およびＣＡ  ２４５６４４４号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
免疫調節遺伝子は、１つ以上の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節遺伝子の例には、限定することなく、成長因子（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ等）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：６９１（２００３））、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０等）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等）、およびＴＮＦが挙げられる。ＦａｓおよびＦａｓリガンド遺伝子もまた、目的の免疫調節因子の標的配列である（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：３４７（２００３））。造血およびリンパ系細胞において二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子、例えば、Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）（Ｈｅｉｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５２７：２７４（２００２））といった、Ｔｅｃファミリーキナーゼもまた、本発明に含まれる。
【０１８２】
細胞受容体リガンド遺伝子には、細胞表面受容体（例えば、サイトカイン受容体、成長因子受容体、チロシンキナーゼ活性を有する受容体、Ｇ−タンパク質結合受容体、インスリン受容体、ＥＰＯ受容体等）に結合して、その受容体が関与する生理学的経路（例えば、細胞増殖、腫瘍形成、細胞形質転換、有糸分裂等）を調節（例えば、阻害）することができるリガンドが含まれる。細胞受容体リガンド遺伝子の非限定的な例には、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、、およびＩＦＮ−γ等のインターフェロン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７等のインターロイキン、ケモカイン等）、成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＥＤＦ、ＳＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ１−ＢＭＰ１５、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、β−ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＧＤＦ−９、ＣＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ−８、ＥＰＯ、ＴＰＯ等）、インスリン、グルカゴン、Ｇタンパク質結合受容体リガンド等が挙げられる。
【０１８３】
トリヌクレオチド反復（例えば、ＣＡＧ反復）の拡張をコードする鋳型は、球脊髄性筋
萎縮症およびハンチントン病といった、トリヌクレオチド反復の拡張によって引き起こされる神経変性障害における病因配列のサイレンシングに使用を見出す（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：１７５（２００２））。
【０１８４】
治療目的で上述の遺伝子のいずれかをサイレンシングすることにおけるその有用性に加えて、本明細書に記載のｓｉＲＮＡはまた、研究および開発用途、ならびに診断、予防、臨床、および他の医療用途にも有用である。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子が治療標的となる可能性を有するかどうかの試験を対象とする、標的検証研究に使用することができる。ｓｉＲＮＡはまた、可能性のある治療標的としての遺伝子を発見することを目的とする、標的特定研究にも使用することができる。
【０１８５】
ｅ）  例となるｓｉＲＮＡの実施形態
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、約１５〜約６０ヌクレオチドの長さ（例えば、約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、もしくは１９〜２５ヌクレオチドの長さ、または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチドの長さ）を含む。１つの特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、化学合成される。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、インビトロおよび／またはインビボで標的配列の発現をサイレンシングすることができる。
【０１８６】
他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約５０％未満（例えば、約５０％未満、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％）が、修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの約１％〜約５０％（例えば、約５％〜５０％、１０％〜５０％、１５％〜５０％、２０％〜５０％、２５％〜５０％、３０％〜５０％、３５％〜５０％、４０％〜５０％、４５％〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４５％、１５％〜４５％、２０％〜４５％、２５％〜４５％、３０％〜４５％、３５％〜４５％、４０％〜４５％、５％〜４０％、１０％〜４０％、１５％〜４０％、２０％〜４０％、２５％〜４０％、３０％〜４０％、３５％〜４０％、５％〜３５％、１０％〜３５％、１５％〜３５％、２０％〜３５％、２５％〜３５％、３０％〜３５％、５％〜３０％、１０％〜３０％、１５％〜３０％、２０％〜３０％、２５％〜３０％、５％〜２５％、１０％〜２５％、１５％〜２５％、２０％〜２５％、５％〜２０％、１０％〜２０％、１５％〜２０％、５％〜１５％、１０％〜１５％、または５％〜１０％）が、修飾ヌクレオチドを含む。
【０１８７】
さらなる実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、およびこれらの混合物を含むがこれらに限定されない、修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチド、またはこれらの混合物等の２’ＯＭｅヌクレオチド（例えば、２’ＯＭｅプリンおよび／もしくはピリミジンヌクレオチド）を含む。１つの特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、またはこれらの混合物を含む。ある特定の事例において、ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ヘアピンループ構造を含む。
【０１８８】
ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖領域の一方の鎖
（例えば、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含む。好ましくは、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域の選択的な位置で修飾される。ウリジンヌクレオチドの修飾に関して、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上が、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド等の修飾ウリジンヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全てのウリジンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドである。グアノシンヌクレオチドの修飾に関して、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上が、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド等の修飾グアノジンヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全てのグアノシンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドである。
【０１８９】
ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列内の少なくとも１、２、３、４、５、６、７個、またはそれ以上の５’−ＧＵ−３’モチーフが、例えば、５’−ＧＵ−３’モチーフを排除するためのミスマッチを導入することによって、および／または２’ＯＭｅヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドを導入することによって、修飾され得る。５’−ＧＵ−３’モチーフは、ｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖に存在し得る。５’−ＧＵ−３’モチーフは、互いに隣接していてもよく、あるいは、それらは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヌクレオチド、またはそれ以上離れていてもよい。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫賦活性が低い。このような実施形態において、低減された免疫賦活特性を有する修飾ｓｉＲＮＡ分子は、有利なことに、標的配列に対するＲＮＡｉ活性を保持する。別の実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ分子の免疫賦活特性と標的遺伝子の発現をサイレンシングするその能力とは、例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域内等、ｓｉＲＮＡ配列内への最小限かつ選択的な２’ＯＭｅ修飾の導入によって、両立または最適化することができる。ある特定の事例において、修飾ｓｉＲＮＡは、免疫賦活性が、対応する非修飾ｓｉＲＮＡよりも、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％低い。修飾ｓｉＲＮＡ分子および対応する非修飾ｓｉＲＮＡ分子の免疫賦活特性を、例えば、適切な脂質に基づく送達系（本明細書に開示されるＬＮＰ送達系等）を使用した哺乳動物での全身投与または哺乳動物応答細胞のトランスフェクションの約２〜約１２時間後に、ＩＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６レベルを測定することによって判定することができることが、当業者には容易に明らかであろう。
【０１９１】
他の実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡのものの１０倍以下のＩＣ５０（すなわち、半最大阻害濃度）を有する（すなわち、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の１０倍以下であるＩＣ５０を有する）。他の実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列のものの３倍以下のＩＣ５０を有する。さらに他の実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡのものの２倍以下のＩＣ５０を有する。用量応答曲線を生成することができ、修飾ｓｉＲＮＡおよび対応する非修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値が、当業者に既知の方法を用いて容易に判定できることが、当業者には容易に明らかであろう。
【０１９２】
別の実施形態において、非修飾または修飾ｓｉＲＮＡ分子は、陰性対照（例えば、緩衝液のみ、異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列、スクランブルｓｉＲＮＡ配列等）と比較して、標的配列の発現を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０
％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％サイレンシングすることができる。
【０１９３】
さらに別の実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列と比較して、標的配列の発現を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％サイレンシングすることができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、例えば、二本鎖領域のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、リン酸骨格修飾を含まない。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、１、２、３、４個、またはそれ以上のリン酸骨格修飾を含む。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、リン酸骨格修飾を含まない。
【０１９５】
さらなる実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、２’−デオキシヌクレオチドを含まない。なおもさらなる実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、１、２、３、４個、またはそれ以上の２’−デオキシヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２’−デオキシヌクレオチドを含まない。
【０１９６】
ある特定の事例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の二本鎖領域の３’末端のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。ある特定の他の事例において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の二本鎖領域の３’末端付近のヌクレオチド（例えば、３’末端から１、２、３、または４個以内のヌクレオチド）は、修飾ヌクレオチドではない。
【０１９７】
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖領域の片側もしくは両側に１、２、３、４個、もしくはそれ以上のヌクレオチドの３’オーバーハングを有し得るか、二本鎖領域の片側もしくは両側に、オーバーハングを欠いてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。ある特定の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’オーバーハングは、独立して、１、２、３、４個、またはそれ以上の、２’ＯＭｅヌクレオチドおよび／または本明細書に記載されるかもしくは当該技術分野で既知の任意の他の修飾ヌクレオチドといった修飾ヌクレオチドを含む。
【０１９８】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、核酸−脂質粒子等の担体系を用いて投与される。好ましい実施形態において、核酸−脂質粒子は、（ａ）１つ以上のｓｉＲＮＡ分子、（ｂ）式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、ならびに（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、および／もしくはコレステロール）を含む。ある特定の事例において、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を阻止する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含み得る。
【０１９９】
２．  Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ
本明細書に使用される際、「Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ」または「前駆体ＲＮＡｉ分子」という用語は、インビボでＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、標的遺伝子のＲＮＡ干渉のためにＲＩＳＣ複合体に組み込まれる活性なｓｉＲＮＡをもたらす、任意の前駆体分子を含むことを意図する。
【０２００】
一実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、ＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡをもたらすように、十分な長さを有する。この実施形態によると、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、（ｉ）約２５〜約６０ヌクレオチドの長さ（例えば、約２５〜６０、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、または２５〜３０ヌクレオチドの長さ）、好ましくは約２５〜約３０ヌクレオチドの長さ（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さ）である、第１のオリゴヌクレオチド配列（センス鎖とも称される）、および（ｉｉ）細胞の細胞質にみられる条件等、生物学的条件下において、第１の配列とアニーリングする第２のオリゴヌクレオチド配列（アンチセンス鎖とも称される）を含む。第２のオリゴヌクレオチド配列は、約２５〜約６０ヌクレオチドの長さ（例えば、約２５〜６０、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、または２５〜３０ヌクレオチドの長さ）であり、好ましくは、約２５〜約３０ヌクレオチドの長さ（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さ）である。さらに、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡの配列のうちの一方のある領域、特にアンチセンス鎖のものは、標的遺伝子から生成されるＲＮＡのヌクレオチド配列に対して、ＲＮＡｉ応答を引き起こすのに十分に相補的である、少なくとも約１９ヌクレオチド、例えば、約１９〜約６０ヌクレオチド（例えば、約１９〜６０、１９〜５５、１９〜５０、１９〜４５、１９〜４０、１９〜３５、１９〜３０、または１９〜２５ヌクレオチド）、好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド）の配列長を有する。
【０２０１】
第２の実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによるそのプロセシングを強化する複数の特性を有する。この実施形態によると、ｄｓＲＮＡは、ＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡをもたらすように、十分な長さを有し、次の特性のうち少なくとも１つを有する：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、非対称であり、例えば、アンチセンス鎖に３’オーバーハングを有する、および／または（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒが結合し、ｄｓＲＮＡを活性なｓｉＲＮＡにプロセシングする方向を指示するために、センス鎖に修飾３’末端を有する。この後者の実施形態によると、センス鎖は、約２２〜約２８個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、約２４〜約３０個のヌクレオチドを含む。
【０２０２】
一実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する。別の実施形態において、センス鎖は、センス鎖の３’末端に位置付けられる好適な修飾因子によって、Ｄｉｃｅｒの結合およびプロセシングのために修飾される。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、非環式ヌクレオチド等のヌクレオチド、ならびに蛍光分子等の立体的障害型分子が含まれる。ヌクレオチド修飾因子を使用する場合、それらは、ｄｓＲＮＡのリボヌクレオチドを、ｄｓＲＮＡの長さが変化しないように、置き換える。別の実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有し、センス鎖は、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングのために修飾される。別の実施形態において、センス鎖の５’末端は、リン酸を有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端はリン酸を有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖、または両方の鎖が、１つ以上の２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含有する。アンチセンス鎖はまた、追加の２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含んでもよい。センス鎖とアンチセンス鎖は、細胞の細胞質にみられる条件等、生物学的条件下でアニーリングする。さらに、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡの配列のうちの一方のある領域、特にアンチセンス鎖のものは、少なくとも約１９ヌクレオチドの配列長を有し、ここで、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する２１ヌクレオチドの領域に含まれ、標的遺伝子から生成される
ＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。さらに、この実施形態によると、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡはまた、次の追加の特性のうち１つ以上を有し得る：（ａ）アンチセンス鎖は、典型的な２１量体からの右方偏移を有する（すなわち、アンチセンス鎖は、典型的な２１量体と比較して、分子の右側にヌクレオチドを含む）、（ｂ）鎖は、完全に相補的でなくてもよい、すなわち、鎖は、単純なミスマッチ対合を含有し得る、および（ｃ）ロックド核酸（複数可）等の塩基修飾が、センス鎖の５’末端に含まれ得る。
【０２０３】
第３の実施形態において、センス鎖は、約２５〜約２８個のヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７、または２８個のヌクレオチド）を含み、ここで、センス鎖の３’末端上の２つのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。センス鎖は、５’末端にリン酸を含有する。アンチセンス鎖は、約２６〜約３０個のヌクレオチド（例えば、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチド）を含み、１〜４個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含有する。３’オーバーハングを含むヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドで修飾される。アンチセンス鎖は、３’オーバーハングに隣接するアンチセンス鎖の第１のモノマーで開始する交互の２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および３’オーバーハングに隣接する第１のモノマーから伸長する１５〜１９個のヌクレオチドを含有する。例えば、２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖で、アンチセンス鎖の５’末端の最初の塩基を１位と数えると、２’ＯＭｅ修飾は、塩基９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２６、および２７に配置される。一実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、次の構造を有し、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’式中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「ｐ」＝リン酸基であり、「Ｘ」＝２’ＯＭｅ  ＲＮＡであり、「Ｙ」は、場合によっては２’ＯＭｅ  ＲＮＡモノマーである１、２、３、または４個のＲＮＡモノマーから構成されるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。
【０２０４】
第４の実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによるそのプロセシングを強化する複数の特性を有する。この実施形態によると、ｄｓＲＮＡは、ＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡをもたらすように、十分な長さを有し、次の特性のうち少なくとも１つを有する：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、非対称であり、例えば、センス鎖に３’オーバーハングを有する、および（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒが結合し、ｄｓＲＮＡを活性なｓｉＲＮＡにプロセシングする方向を指示するために、アンチセンス鎖に修飾３’末端を有する。この実施形態によると、センス鎖は、約２４〜約３０個のヌクレオチド（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチド）を含み、アンチセンス鎖は、約２２〜約２８個のヌクレオチド（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８個のヌクレオチド）を含む。一実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端にオーバーハングを有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に位置付けられる好適な修飾因子によって、Ｄｉｃｅｒの結合およびプロセシングのために修飾される。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、非環式ヌクレオチド等のヌクレオチド、ならびに蛍光分子等の立体的障害型分子が含まれる。ヌクレオチド修飾因子を使用する場合、それらは、ｄｓＲＮＡのリボヌクレオチドを、ｄｓＲＮＡの長さが変化しないように、置き換える。別の実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端にオーバーハングを有し、アンチセンス鎖は、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングのために修飾される。一実施形態において、アンチセンス鎖は、５’リン酸を有する。センス鎖とアンチセンス鎖は、細胞の細胞質にみられる条件等、生物学的条件下でアニーリングする。さらに、ｄｓＲＮＡの配列のうちの一方のある領域、特にアンチセンス鎖のものは、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を有し、ここで、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、標的遺伝子から生成されるＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補
的である。さらに、この実施形態によると、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡはまた、次の追加の特性のうち１つ以上を有し得る：（ａ）アンチセンス鎖は、典型的な２１量体からの左方偏移を有する（すなわち、アンチセンス鎖は、典型的な２１量体と比較して、分子の左側にヌクレオチドを含む）、および（ｂ）鎖は、完全に相補的でなくてもよい、すなわち、鎖は単純なミスマッチ対合を含有し得る。
【０２０５】
好ましい実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、センス鎖が２５塩基対の長さを有し、アンチセンス鎖が、２塩基の３’オーバーハングを伴う２７塩基対の長さを有する、非対称構造を有する。ある特定の事例において、この非対称構造を有するｄｓＲＮＡは、さらに、センス鎖の３’末端に、リボヌクレオチドのうちの２つの代わりに２つのデオキシヌクレオチドを含有する。ある特定の他の事例において、この非対称構造を有するｄｓＲＮＡは、さらに、アンチセンス鎖の９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、および２５位（アンチセンス鎖の５’末端の最初の塩基を１位として）に、２’ＯＭｅ修飾を含有する。ある特定のさらなる事例において、この非対称構造を有するｄｓＲＮＡは、さらに、１、２、３、または４個の２’ＯＭｅヌクレオチドを含むアンチセンス鎖に、３’オーバーハング（例えば、アンチセンス鎖の２６および２７位に、２’ＯＭｅヌクレオチドの３’オーバーハング）を含有する。
【０２０６】
別の実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、まず、少なくとも１９ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡ配列を選択することによって、設計することができる。いくつかの事例において、アンチセンスｓｉＲＮＡは、約２４〜約３０ヌクレオチドの長さをもたらすために、５’末端に約５〜約１１個のリボヌクレオチドを含むように修飾される。アンチセンス鎖が、２１ヌクレオチドの長さを有する場合、３〜９個、好ましくは４〜７個、またはより好ましくは６個のヌクレオチドが、５’末端に付加され得る。付加されたリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的であり得るが、標的配列とアンチセンｓｉＲＮＡとの間に完全な相補性は必要ない。すなわち、結果として得られるアンチセンスｓｉＲＮＡは、標的配列に十分に相補的である。約２２〜約２８個のヌクレオチドを有するセンス鎖が、次いで、生成される。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖とアニーリングするために、アンチセンス鎖と実質的に相補的である。一実施形態において、センス鎖は、Ｄｉｃｅｒによるアンチセンス鎖のプロセシングを指示するために、修飾３’末端を含有するように合成される。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’オーバーハングを有する。さらなる実施形態において、センス鎖は、Ｄｉｃｅｒによる結合およびプロセシングのために、修飾３’末端を含有するように合成され、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’オーバーハングを有する。
【０２０７】
関連する実施形態において、アンチセンスｓｉＲＮＡは、約２２〜約２８ヌクレオチドの長さを提供するために、５’末端に約１〜約９個のリボヌクレオチドを含むように修飾される。アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチドの長さを有する場合、１〜７個、好ましくは２〜５個、またはより好ましくは４個のリボヌクレオチドが、３’末端に付加され得る。付加されたリボヌクレオチドは、任意の配列を有し得る。付加されたリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的であり得るが、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡとの間に完全な相補性は必要ない。すなわち、結果として得られるアンチセンスｓｉＲＮＡは、標的配列に十分に相補的である。約２４〜約３０個のヌクレオチドを有するセンス鎖が、次いで、生成される。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖とアニーリングするために、アンチセンス鎖と実質的に相補的である。一実施形態において、アンチセンス鎖は、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングを指示するために、修飾３’末端を含有するように合成される。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’オーバーハングを有する。さらなる実施形態において、アンチセンス鎖は、Ｄｉｃｅｒによる結合およびプロセシングのために、修飾３’末端を含有するように合成され、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’オーバーハングを有する。
【０２０８】
好適なＤｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列の設計、合成、および修飾のための、当該技術分野で既知の任意の手段を用いて、特定、合成、および修飾することができる。特定の実施形態において、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡは、核酸−脂質粒子等の担体系を使用して投与される。好ましい実施形態において、核酸−脂質粒子は、（ａ）１つ以上のＤｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ分子、（ｂ）式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、ならびに（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、および／もしくはコレステロール）を含む。ある特定の事例において、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を阻止する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含み得る。
【０２０９】
本発明のＤｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡに関連する追加の実施形態、ならびにこのようなｄｓＲＮＡの設計および合成の方法は、米国特許出願公開第２００５／０２４４８５８号、同第２００５／０２７７６１０号、および同第２００７／０２６５２２０号、ならびに２００９年６月５日に出願された米国仮出願第６１／１８４，６５２号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
３．  ｓｈＲＮＡ
「低分子ヘアピンＲＮＡ」または「短いヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」には、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子の発現をサイレンシングするために使用可能である、急なヘアピンカーブを生じる短いＲＮＡ配列が含まれる。本発明のｓｈＲＮＡは、化学合成され得るか、またはＤＮＡプラスミドにおいて転写カセットから転写され得る。ｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡに切断され、これが、次いで、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。
【０２１１】
本発明のｓｈＲＮＡは、典型的に、約１５〜６０、１５〜５０、または１５〜４０（二重鎖）ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５（二重鎖）ヌクレオチドの長さであり、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３（二重鎖）ヌクレオチドの長さである（例えば、二本鎖ｓｈＲＮＡの各相補配列が、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、もしくは１９〜２５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２、もしくは２１〜２３ヌクレオチドの長さであり、二本鎖ｓｈＲＮＡが、約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、もしくは１９〜２５塩基対の長さ、好ましくは約１８〜２２、１９〜２０、もしくは１９〜２１塩基対の長さである）。ｓｈＲＮＡ二重鎖は、アンチセンス鎖に約１〜約４ヌクレオチドもしくは約２〜約３ヌクレオチドの３’オーバーハング、および／またはセンス鎖に５’−リン酸末端を含み得る。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、約１５〜約６０ヌクレオチドの長さ（例えば、約１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、または１５〜２５ヌクレオチドの長さ）、好ましくは約１９〜約４０ヌクレオチドの長さ（例えば、約１９〜４０、１９〜３５、１９〜３０、または１９〜２５ヌクレオチドの長さ）、より好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチドの長さ（例えば、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドの長さ）のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖配列を含む。
【０２１２】
ｓｈＲＮＡの非限定的な例には、センスおよびアンチセンス領域が核酸系または非核酸系リンカーによって結合され、一本鎖分子から構築される二本鎖ポリヌクレオチド分子、ならびに自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子が挙げられる。好ましい実施形態において、ｓｈＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、約１〜約２５個のヌクレオチド、約２〜約２０個のヌクレオチド、約４〜約１５個のヌクレオチド、約５〜約１２個のヌクレオチド、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含む、ループ構造によって結合される。
【０２１３】
好適なｓｈＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を設計、合成、および修飾するための、当該技術分野で既知の任意の手段を用いて、特定、合成、および修飾することができる。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、核酸−脂質粒子等の担体系を使用して投与される。好ましい実施形態において、核酸−脂質粒子は、（ａ）１つ以上のｓｈＲＮＡ分子、（ｂ）式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、ならびに（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、および／もしくはコレステロール）を含む。ある特定の事例において、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を阻止する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含み得る。
【０２１４】
本発明のｓｈＲＮＡ、ならびにこのようなｓｈＲＮＡを設計および合成する方法に関連するさらなる実施形態は、２００９年６月５日に出願された米国仮出願第６１／１８４，６５２号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
４．  ａｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡと同様に、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を動員し、アンチセンス鎖の５’末端に対するヌクレオチド１０と１１との間で標的配列の配列特異的切断を媒介することによって、哺乳動物細胞における種々の遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６：１３７９−１３８２（２００８））。典型的に、ａｉＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する短いＲＮＡ二重鎖を含み、この二重鎖は、アンチセンス鎖の３’および５’末端にオーバーハングを含有する。ａｉＲＮＡは、一般に、センス鎖が、相補的アンチセンス鎖と比較して、両方の末端で短いため、非対称である。いくつかの態様において、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子に使用されるものと類似の条件下で、設計、合成、およびアニーリングすることができる。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を選択するための上述の方法を使用して選択および生成することができる。
【０２１６】
別の実施形態において、種々の長さ（例えば、約１０〜２５、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１３〜１７、または１４〜１７塩基対、より典型的には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０塩基対）のａｉＲＮＡ二重鎖は、目的のｍＲＮＡを標的とするアンチセンス鎖の３’および５’末端にオーバーハングを有して設計され得る。ある特定の事例において、ａｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、約１０〜２５、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１３〜１７、または１４〜１７ヌクレオチドの長さであり、より典型的には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さである。ある特定の他の事例において、ａｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、約１５〜６０、１５〜５０、または１５〜４０ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５ヌクレオチドの長さであり、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３ヌクレオチドの長さである。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、５’アンチセンスオーバーハングは、１、２、３、４個、またはそれ以上の非標的化ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」等）を含有する。他の実施形態において、３’アンチセンスオーバーハングは、１、２、３、４個、またはそれ以上の非標的化ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」等）を含有する。ある特定の態様において、本明細書に記載のａｉＲＮＡ分子は、例えば、二本鎖（二重鎖）領域および／またはアンチセンスオーバーハングに、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ
配列に関して上述された修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含み得る。好ましい実施形態において、ａｉＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、またはこれらの混合物といった、２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。
【０２１８】
ある特定の実施形態において、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子のうちの１つのアンチセンス鎖に対応する、アンチセンス鎖を含み得る。特定の実施形態において、ａｉＲＮＡは、核酸−脂質粒子等の担体系を使用して投与される。好ましい実施形態において、核酸−脂質粒子は、（ａ）１つ以上のａｉＲＮＡ分子、（ｂ）式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、ならびに（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、および／もしくはコレステロール）を含む。ある特定の事例において、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を阻止する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含み得る。
【０２１９】
好適なａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列の設計、合成、および修飾のための当該技術分野で既知の任意の手段を用いて、特定、合成、および修飾することができる。本発明のａｉＲＮＡ分子に関連するさらなる実施形態は、米国特許出願公開第２００９／０２９１１３１号およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２７０６０号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
５．  ｍｉＲＮＡ
一般に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２１〜２３ヌクレオチドの長さの一本鎖ＲＮＡ分子であり、遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、遺伝子によってコードされ、その遺伝子のＤＮＡからｍｉＲＮＡが転写されるが、ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されず（非コードＲＮＡ）、代わりに、各一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと称される短いステムのループ構造にプロセシングされ、最終的に機能的な成熟ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に部分的または完全にのいずれかで相補的であり、それらの主要な機能は、遺伝子の発現を下方制御することである。ｍｉＲＮＡ分子の特定は、例えば、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５３−８５８、Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５８−８６２、およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８６２−８６４に記載されている。
【０２２１】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、プロセシングされた成熟ｍｉＲＮＡ分子よりもかなり長い。ｍｉＲＮＡは、まず、キャップおよびポリＡ末端を有する一次転写産物またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして転写され、細胞核において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドの短いステムループ構造にプロセシングされる。このプロセシングは、動物においては、ヌクレアーゼＤｒｏｓｈａおよび二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質Ｐａｓｈａからなるマイクロプロセッサー複合体として知られるタンパク質によって、行われる（Ｄｅｎｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：２３１−２３５（２００４））。これらのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、次いで、エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒとの相互作用によって、細胞質内で成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、それはまたＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成を開始する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−３６６（２００１）。ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが、ｍｉＲＮＡを生じさせるための鋳型として機能し得る。
【０２２２】
Ｄｉｃｅｒがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループを切断すると、２つの相補的な短いＲＮＡ分子が形成されるが、その１つだけが、ＲＩＳＣ複合体に統合される。この鎖は、ガイド鎖として知られており、５’末端の安定性に基づいて、ＲＩＳＣ複合体における触媒活性ＲＮａｓｅであるアルゴノートタンパク質によって選択される（Ｐｒｅａｌｌ  ｅｔ  
ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１６：５３０−５３５（２００６））。アンチガイドまたはパッセンジャー鎖として知られる残りの鎖は、ＲＩＳＣ複合体基質として分解される（Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２３：６３１−６４０（２００５））。活性なＲＩＳＣ複合体に統合された後、ｍｉＲＮＡは、それらの相補的ｍＲＮＡ分子と塩基対合し、標的ｍＲＮＡの分解および／または翻訳のサイレンシングを誘発する。
【０２２３】
哺乳動物のｍｉＲＮＡ分子は、通常、標的ｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ内の部位に相補的である。ある特定の事例において、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡへのアニーリングは、タンパク質の翻訳機序を遮断することによってタンパク質の翻訳を阻害する。ある特定の他の事例において、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡへのアニーリングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に類似のプロセスを通じて、標的ｍＲＮＡの切断および分解を促進する。ｍｉＲＮＡはまた、標的とされるｍＲＮＡに対応するゲノム部分のメチル化を標的とし得る。一般に、ｍｉＲＮＡは、まとめてｍｉＲＮＰと称されるタンパク質の補体と関連して機能する。
【０２２４】
ある特定の態様において、本明細書に記載のｍｉＲＮＡ分子は、約１５〜１００、１５〜９０、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６０、１５〜５０、または１５〜４０ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５ヌクレオチドの長さであり、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３ヌクレオチドの長さである。ある特定の他の態様において、ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列に関して上述された修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含み得る。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、またはこれらの混合物といった、２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。
【０２２５】
特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、核酸−脂質粒子等の担体系を使用して投与される。好ましい実施形態において、核酸−脂質粒子は、（ａ）１つ以上のｍｉＲＮＡ分子、（ｂ）式Ｉのカチオン性脂質またはその塩、ならびに（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、および／もしくはコレステロール）を含む。ある特定の事例において、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を阻止する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含み得る。
【０２２６】
他の実施形態において、目的のｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡの活性を遮断する１つ以上の薬剤を、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ等の核酸−脂質粒子）を使用して投与する。遮断剤の例には、立体遮断オリゴヌクレオチド、ロックド核酸オリゴヌクレオチド、およびモルホリノオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。このような遮断剤は、ｍｉＲＮＡに直接、または標的ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位に結合し得る。
【０２２７】
本発明のｍｉＲＮＡ分子に関連するさらなる実施形態は、米国特許出願公開第２００９／０２９１１３１号およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２７０６０号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
６．  アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態において、核酸は、目的の標的遺伝子または配列を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語には、標的とされるポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ鎖の翻訳を、そのＲＮＡに結合することによって阻止する。アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを使用して、特定の相補的（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的とすることができる。結合が生じると、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素ＲＮａｓｅ  Ｈによって分解され得る。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約６０個のヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約３０個のヌクレオチドを含む。この用語はまた、所望の標的遺伝子に厳密に相補的でない可能性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、本発明は、非標的特異的活性がアンチセンスにみられる場合、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が特定の使用に最も好ましい場合に、利用可能である。
【０２２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効かつ標的化された阻害因子であることが示されており、結果として、標的とされる遺伝子のタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）およびムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、それらのそれぞれのｍＲＮＡ配列を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および同第５，７５９，８２９号を参照されたい）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、およびヒトＥＧＦにより示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１５４４−６（１９８８）、Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１：２２５−３２（１９８９）、Ｐｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１５；５７：３１０−２０（１９９８）、ならびに米国特許第５，８０１，１５４号、同第５，７８９，５７３号、同第５，７１８，７０９号、および同第５，６１０，２８８号を参照されたい）。さらに、種々の異常細胞増殖、例えば、癌を阻害し、それを治療するために使用することができるアンチセンス構築物もまた説明されている（米国特許第５，７４７，４７０号、同第５，５９１，３１７号、および同第５，７８３，６８３号を参照されたい）。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する方法は当該技術分野で既知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するように容易に適合することができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の分析、ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的安定性の判定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞内で標的ｍＲＮＡへの特異的結合を低減または制止する、それらのダイマー、ヘアピン、または他の構造の形成の相対的不能性に基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの高度に好ましい標的領域には、ＡＵＧ翻訳開始コドンにあるか、またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列が含まれる。これらの二次構造分析および標的部位選択の考察は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）および／またはＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２（１９９７））を用いて行うことができる。
【０２３１】
７．  リボザイム
本発明の実施形態によると、核酸−脂質粒子は、リボザイムと関連する。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ−タンパク質複合体である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４：８７８８−９２（１９８７）およびＦｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４９：２１１−２０（１９８７）を参照されたい）。例えば、多数のリボザイムは、リン酸
エステル転移反応を、高度な特異性で加速させ、オリゴヌクレオチド基質において複数のリン酸エステルのうちの１つだけを切断することが多い（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２７：４８７−９６（１９８１）、Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６：５８５−６１０（１９９０）、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：１７３−６（１９９２）を参照されたい）。この特異性は、基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に特異的な塩基対相互作用を介して結合するという要件に起因している。
【０２３２】
少なくとも６つの基本的な種類の天然の酵素ＲＮＡ分子が、現在知られている。それぞれ、生理的条件下において、トランスでＲＮＡリン酸ジエステル結合の加水分解を触媒し得る（したがって、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素核酸の標的結合部分を通じて生じる。したがって、酵素核酸は、相補的塩基対を通じて標的ＲＮＡをまず認識し、次いでそれに結合し、正しい部位に結合した後、標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力を破壊する。酵素核酸が、そのＲＮＡ標的に結合してそれを切断した後、それは、別の標的を探すためにそのＲＮＡをから放出され、新しい標的に繰り返し結合し、その切断を行うことができる。
【０２３３】
酵素核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎δウイルス、Ｉ群イントロンもしくはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と関連して）、またはニューロスポラＶＳ  ＲＮＡモチーフの形態であり得る。ハンマーヘッドモチーフの具体的な例は、例えば、Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：４５５９−６５（１９９２）に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、例えば、ＥＰ  ０３６０２５７号、Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：４９２９−３３（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：２９９−３０４（１９９０）、および米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。肝炎δウイルスモチーフの例は、例えば、Ｐｅｒｒｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：１１８４３−５２（１９９２）に記載されている。ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、例えば、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３５：８４９−５７（１９８３）に記載されている。ニューロスポラＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、例えば、Ｓａｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６１：６８５−９６（１９９０）、Ｓａｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８８２６−３０（１９９１）、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：２７９５−９（１９９３）に記載されている。Ｉ群イントロンの例は、例えば、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明に従って使用される酵素核酸分子の重要な特徴は、それらが、標的遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡ領域のうちの１つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有すること、およびそれらが、ＲＮＡ切断活性を分子に与える、その基質結合部位内またはその周囲のヌクレオチド配列を有することである。したがって、リボザイム構築物は、必ずしも本明細書で言及される特定のモチーフに限定されない。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３４】
任意のポリヌクレオチド配列を標的とするリボザイムを生成する方法は、当該技術分野で既知である。リボザイムは、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９３／２３５６９号および同第ＷＯ  ９４／０２５９５号に記載のように設計し、それらに記載されるようにインビトロおよび／またはインビボで試験するために合成することができる。これらのＰＣＴ公開の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３５】
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変化させること、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を阻止する修飾（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９２／０７０６５号、同第ＷＯ  ９３／１５１８７号、同第ＷＯ  ９１／０３１６２号、および同第ＷＯ  ９４／１３６８８号、ＥＰ  ９２１１０２９８．４号、ならびに米国特許第５，３３４，７１１号を参照されたく、これらは、酵素ＲＮＡ分子の糖部分に行うことができる種々の化学修飾について記載しており、これらの開示は、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、細胞内でのそれらの有効性を強化する修飾、ならびにＲＮＡ合成時間の短縮および化学的要件の低減ためのステムＩＩ塩基の除去を有するリボザイムを化学合成することによって、最適化することができる。
【０２３６】
８．  免疫賦活性オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子と関連する核酸は、免疫賦活性であり得、ヒト等の哺乳動物であり得る対象に投与した際に、免疫応答を誘発することができる免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ、一本鎖または二本鎖）を含む。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす、ある特定のパリンドローム（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：４０７２−６（１９９２））、またはＣｐＧモチーフ、ならびに他の既知のＩＳＳ特徴（多重Ｇドメイン等、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９６／１１２６６号を参照されたく、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれる。
【０２３７】
免疫賦活性核酸は、それらが、免疫応答を誘起するために、標的配列に特異的に結合し、その発現を低減させることが必要ない場合、非配列特異性と見なされる。したがって、ある特定の免疫賦活性核酸は、天然に存在する遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含み得るが、それらは、依然として、非配列特異的な免疫賦活性核酸と見なされ得る。
【０２３８】
一実施形態において、免疫賦活性核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化またはメチル化であり得る。別の実施形態において、免疫賦活性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態において、核酸は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンは、メチル化されている。代替的な実施形態において、核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、ＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１つのシトシンが、メチル化されている。さらなる実施形態において、配列内に存在するＣｐＧジヌクレオチド中の各シトシンは、メチル化されている。別の実施形態において、核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、ＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、メチル化シトシンを含む。本発明の組成物および方法での使用に好適な免疫賦活性オリゴヌクレオチドの例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０２／０６９３６９号、同第ＷＯ  ０１／１５７２６号、および同第ＷＯ  ０９／０８６５５８号、米国特許第６，４０６，７０５号、ならびにＲａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．，２９８：１１８５−９２（２００１）に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル（「ＰＯ」）骨格もしくはホスホロチオエート（「ＰＳ」）骨格、および／またはＣｐＧモチーフ内の少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
【０２３９】
Ｂ．  他の活性剤
ある特定の実施形態において、本発明の脂質粒子と関連する活性剤は、１つ以上の治療的タンパク質、ポリペプチド、または有機小分子もしくは化合物を含み得る。このような治療上有効な薬剤または薬物の非限定的な例には、腫瘍学的薬物（例えば、化学療法薬、
ホルモン療法剤、免疫療法剤、放射線療法剤等）、脂質低下剤、抗ウイルス薬、抗炎症化合物、抗鬱剤、刺激剤、鎮痛剤、抗生物質、受胎調節薬、解熱剤、血管拡張剤、抗血管形成剤、細胞血管剤（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅｎｔ）、シグナル伝達阻害剤、心血管薬、例えば抗不整脈剤、ホルモン、血管収縮剤、およびステロイドが挙げられる。これらの活性剤は、本発明の脂質粒子中、単独で投与されてもよく、または干渉ＲＮＡ等の核酸を含む本発明の脂質粒子と組み合わせて投与されてもよい（例えば、共投与）。
【０２４０】
化学療法薬の非限定的な例には、白金系薬物（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン等）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソ尿素等）、抗体謝剤（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、アザチオプリン、メトトレキサート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド等）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン（ＣＰＴ−１１、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシド等）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン等）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６、ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ  １０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＳＴＩ５７１）、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ（商標）、ＺＤ６４７４）等）、これらの薬学的に許容される塩、これらの立体異性体、これらの誘導体、これらの類似体、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２４１】
従来的なホルモン療法剤の例には、限定することなく、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、アロマターゼ阻害剤、タモキシフェン、およびゴセレリン、ならびに他のゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）が挙げられる。
【０２４２】
従来的な免疫療法剤の例には、免疫賦活剤（例えば、カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）、レバミゾール、インターロイキン−２、α−インターフェロン等）、モノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗，ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＨＬＡ−ＤＲ、および抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体−カリケアマイシン複合体、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−シュードモナス外毒素複合体等）、ならびに放射免疫療法（例えば、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、または１３１Ｉ等と複合体形成された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
従来的な放射線療法剤の例には、場合によっては腫瘍抗原を対象とする抗体と複合体形成された、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉ等の放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４４】
本発明に従って使用され得るさらなる腫瘍学的薬物には、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、ベキサロ
テン、ｂｉＣＮＵ、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シトシンアラビノシド、シトキサン、デクスラゾキサン、ＤＴＩＣ、エストラムスチン、エキセメスタン、ＦＫ５０６、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、インターフェロン、レトロゾール、ロイスタチン、ロイプロリド、リトレチノイン（ｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、メガストロール（ｍｅｇａｓｔｒｏｌ）、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトキサレン、ミトラマイシン、ナイトロジェンマスタード、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タキソテール、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、ＶＭ−２６、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、およびベルバン（ｖｅｌｂａｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用され得る腫瘍学的薬物の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシン類似体または誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、ならびにカンプトテシンである。
【０２４５】
上昇したトリグリセリド、コレステロール、および／またはグルコースと関連する脂質疾患または障害を治療するための脂質低下剤の非限定的な例には、スタチン、フィブラート、エゼチミブ、チアゾリジンジオン、ナイアシン、β遮断剤、ニトログリセリン、カルシウムアンタゴニスト、魚油、およびこれらの混合物が挙げられる。
【０２４６】
抗ウイルス薬の例には、アバカビル、アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入阻害剤、ファムシクロビル、固定用量複合剤、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、融合阻害剤、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、ＩＩＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、およびＩＦＮ−λ３等のＩＦＮ−λ分子）、ＩＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＰＥＧ化ＩＦＮ−α等のＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ω、およびＩＦＮ−ζ）、インターフェロン、ラミブシン、ロピナビル、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、ＭＫ−０５１８、マラビロク、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル（ｎｅｘａｖｉｒ）、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サクイナビル、スタブジン、相乗作用促進剤、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジン、これらの薬学的に許容される塩、これらの立体異性体、これらの誘導体、これらの類似体、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４７】
Ｖ．  脂質粒子
ある特定の態様において、本発明は、本明細書に記載のカチオン性（アミノ）脂質またはその塩を含む、脂質粒子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の脂質粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質をさらに含む。他の実施形態において、脂質粒子は、粒子の凝集を低減または阻害することができる１つ以上の複合脂質をさらに含む。さらなる実施形態において、脂質粒子は、治療的核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡ）等の１つ以上の活性剤または治療剤をさらに含む。
【０２４８】
脂質粒子には、リポソーム等の脂質小胞が含まれるが、これに限定されない。本明細書
に使用される際、脂質小胞は、水溶性の内部を封入する脂質含有膜を有する構造を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載のカチオン性脂質のうちの１つ以上を含む脂質小胞が、脂質小胞内に核酸をカプセル封入するために使用される。他の実施形態において、本明細書に記載のカチオン性脂質のうちの１つ以上を含む脂質小胞は、核酸と複合体形成して、リポプレックスを形成する。
【０２４９】
本発明の脂質粒子は、典型的に、活性剤または治療剤、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。いくつかの実施形態において、活性剤または治療剤は、脂質粒子内の活性剤または治療剤が水溶液中で例えばヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる酵素分解に抵抗性となるように、脂質粒子の脂質部分内に完全にカプセル封入される。他の実施形態において、本明細書に記載の脂質粒子は、ヒト等の哺乳動物に対して実質的に非毒性である。本発明の脂質粒子は、典型的に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または約７０〜約９０ｎｍの平均粒径を有する。本発明の脂質粒子はまた、典型的に、脂質：治療剤（例えば、脂質：核酸）の比（質量／質量比）が、約１：１〜約１００：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約２５：１、約３：１〜約２０：１、約５：１〜約１５：１、または約５：１〜約１０：１である。
【０２５０】
好ましい実施形態において、本発明の脂質粒子は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、および／またはｍｉＲＮＡ）、カチオン性脂質（例えば、１つ以上の本明細書に記載される式Ｉのカチオン性脂質またはその塩）、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質とコレステロールとの混合物）、ならびに粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、１つ以上のＰＥＧ−脂質および／またはＰＯＺ−脂質複合体）を含む、血清安定性核酸−脂質粒子（ＬＮＰ）である。ＬＮＰは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の非修飾および／または修飾干渉ＲＮＡ分子を含み得る。核酸−脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，７５３，６１３号、同第５，７８５，９９２号、同第５，７０５，３８５号、同第５，９７６，５６７号、同第５，９８１，５０１号、同第６，１１０，７４５号、および同第６，３２０，０１７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ９６／４０９６４号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５１】
本発明の核酸−脂質粒子において、核酸は、粒子の脂質部分に完全にカプセル封入され得、それによって、核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。好ましい実施形態において、干渉ＲＮＡ等の核酸を含むＬＮＰは、粒子の脂質部分の中に完全にカプセル封入され、それによって、核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。ある特定の事例において、ＬＮＰ中の核酸は、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間、粒子をヌクレアーゼに暴露した後、実質的に分解されない。ある特定の他の事例において、ＬＮＰ中の核酸は、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分間、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間、血清中で粒子をインキュベートした後、実質的に分解されない。他の実施形態において、核酸は、粒子の脂質部分と複合体を形成する。本発明の製剤の利点のうちの１つは、核酸−脂質粒子組成物が、ヒト等の哺乳動物に対して実質的に非毒性であることである。
【０２５２】
「完全にカプセル封入される」という用語は、核酸−脂質粒子中の核酸が、血清への暴露または遊離ＤＮＡまたはＲＮＡを著しく分解するヌクレアーゼアッセイの後に、実質的に分解されないことを指す。完全にカプセル封入された系では、好ましくは、通常は１００％の遊離核酸を分解する処理において、粒子中の核酸のうちの約２５％未満が分解され、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは粒子中の核酸のうちの約５％未満が、分
解される。「完全にカプセル封入される」とは、核酸−脂質粒子が、血清安定性である、すなわち、それらが、インビボ投与後にそれらの構成成分へと急速に分解されないことも指す。
【０２５３】
核酸に関して、完全なカプセル封入は、核酸と会合した際に向上した蛍光を有する色素を使用する、膜非透過性蛍光色素排除アッセイを行うことにより判定することができる。ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）およびＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）等の特定の色素が、プラスミドＤＮＡ、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、および／または一本鎖もしくは二本鎖リボヌクレオチドの定量的判定に利用可能である。カプセル封入は、色素をリポソーム製剤に添加し、結果として得られる蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって判定される。界面活性剤に媒介されるリポソーム二重膜の破壊により、カプセル封入された核酸が放出され、それが膜非透過性色素と相互作用することが可能となる。核酸のカプセル封入は、Ｅ＝（Ｉｏ−  Ｉ）／Ｉｏとして計算することができ、式中、ＩおよびＩｏは、界面活性剤の添加の前および後の蛍光強度を指す（Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，６：２７１−２８１（１９９９）を参照されたい）。
【０２５４】
他の実施形態において、本発明は、複数の核酸−脂質粒子を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）組成物を提供する。
【０２５５】
いくつかの事例において、ＬＮＰ組成物は、粒子の約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）が、中にカプセル封入された核酸を有するように、粒子の脂質部分内に完全にカプセル封入された核酸を含む。
【０２５６】
他の事例においては、ＬＮＰ組成物は、投入される核酸の約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）が、粒子内にカプセル封入されるように、粒子の脂質部分内に完全にカプセル封入された核酸を含む。
【０２５７】
本発明の脂質粒子の使用目的に応じて、構成成分の比率は変動させることができ、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを用いて測定することができる。
【０２５８】
特定の実施形態において、本発明は、複数の本発明に記載の脂質粒子と酸化防止剤とを
含む、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）組成物を提供する。ある特定の事例において、脂質粒子組成物中の酸化防止剤は、脂質粒子中に存在するカチオン性脂質の分解を低減、阻止、および／または阻害する。活性剤が、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の治療的核酸である事例において、脂質粒子組成物中の酸化防止剤は、例えば、核酸とカチオン性脂質との間の付加物形成を低減、阻止、および／または阻害することによって、核酸負荷量の分解を低減、阻止、および／または阻害する。酸化防止剤の非限定的な例には、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸等といった金属キレート剤）等の親水性酸化防止剤、親油性酸化防止剤（例えば、ビタミンＥ異性体、ポリフェノール等）、それらの塩、およびそれらの混合物が挙げられる。必要に応じて、酸化防止剤は、典型的に、粒子中に存在するカチオン性脂質および／または活性剤の分解を阻止、阻害、および／または低減させるのに十分な量で存在し、例えば、少なくとも約２０ｍＭのＥＤＴＡもしくはその塩、または少なくとも約１００ｍＭのクエン酸もしくはその塩が存在する。ＥＤＴＡおよび／またはクエン酸等の酸化防止剤は、節ＶＩに記載される脂質粒子形成プロセス中のいずれかのステップまたは複数のステップで含まれ得る（例えば、脂質粒子形成の前、最中、および／または後）。
【０２５９】
脂質粒子中に存在するカチオン性脂質および／または活性剤（例えば、治療的核酸）の分解を阻止する方法、これらの方法によって安定化された脂質粒子を含む組成物、これらの脂質粒子を作製する方法、ならびにこれらの脂質粒子の送達および／または投与の方法に関連するさらなる実施形態は、２０１０年１２月１日に出願された「ＳＮＡＬＰ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ」と題される国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１９１９号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６０】
Ａ．  カチオン性脂質
本明細書に記載される新規な式Ｉのカチオン性脂質またはその塩のいずれも、単独または１つ以上の他のカチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種との組み合わせのいずれかで、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）において使用することができる。
【０２６１】
同様に本発明の脂質粒子に含まれ得る他のカチオン性脂質またはその塩には、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレオイルオキシ−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＡＰ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、「ＸＴＣ２」または「Ｃ２Ｋ」としても知られる）、２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、「Ｃ３Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−４−（４−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、「Ｃ４Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキサン（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−メチルペピアジノ（ｍｅｔｈｙｌｐｅｐｉａｚｉｎｏ）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジオレオイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジステアロイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−モルホリノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−ジオキソランクロリド（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、２，２−ジリノレイル−４，５−ビス（ジメチルアミノ
メチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−メチルピペラジン（ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｚｉｎｅ）−［１，３］−ジオキソラン（Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペラジン）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、「ＭＣ３」）、ジリノレイルメチル−３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡもしくはＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡとしても知られる）、１，２−ジオエイルカルバモイルオキシ（ｄｉｏｅｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジミリストレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト（ｃｈｏｌｅｓｔ）−５−エン−３−β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−��，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、これらの類似体、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６２】
本明細書に記載の脂質粒子中に存在し得る追加のカチオン性脂質またはその塩には、ＣＰ−ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ−γ−ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ−ＭＣ３、ＣＰ−ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＣＰ−γＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＣＰ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＣＰ−ＤＯＤＭＡ、ＣＰ−ＤＰｅｔｒｏＤＭＡ、ＣＰ−ＤＬｉｎＤＭＡ、ＣＰ−ＤＬｅｎＤＭＡ、ＣＰ−γＤＬｅｎＤＭＡ、これらの類似体、およびこれらの組み合わせといった、新規なカチオン
性脂質が挙げられる。本明細書に記載の脂質粒子中に存在し得る追加のカチオン性脂質またはその塩には、ＬｅｎＭＣ３、γ−ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２Ｃ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３チオエーテル、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３  アルキン、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ−ＭＣ３、Ｐａｎ−ＭＣ４、Ｐａｎ−ＭＣ５、およびこれらの類似体といった、ＭＣ３類似体が挙げられる。本明細書に記載の脂質粒子中に存在し得る追加のカチオン性脂質またはその塩には、２０１０年６月３０日に出願された、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題される国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１０２９号に記載される新規なカチオン性脂質が挙げられる。本明細書に記載の脂質粒子中に存在し得る追加のカチオン性脂質またはその塩には、米国特許出願公開第２００９／００２３６７３号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。これらの特許文書のそれぞれの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、追加のカチオン性脂質は、１つ以上のアニオンとともに塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態において、追加のカチオン性脂質は、そのシュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸）塩であり、これは、好ましくは結晶塩である。
【０２６４】
ＤＬｉｎＤＭＡおよびＤＬｅｎＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６５】
γ−ＤＬｅｎＤＭＡ、Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ、およびＣ２−ＤＬｉｎＤＡＰ等のカチオン性脂質、ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、２０１０年６月３０日に出願された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題される国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１０２９号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６６】
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／０８６５５８号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６７】
ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ、ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ、Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペラジン、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、およびＤＯＴＡＰ．Ｃｌ等のカチオン性脂質、ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、２００９年１０月９日に出願された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題されるＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１０／０４２８７７号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６８】
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、例えば、２０１０年９月１７日に出願された「Ｎｏｖｅｌ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題される米国仮出願第６１／３８４，０５０号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６９】
ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＣ、ＤＬｉｎＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、およびＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／０８６５５８号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７０】
ＣＬｉｎＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、米国特許出願公開第２００６／０２４０５５４号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７１】
多数の他のカチオン性脂質および関連する類似体の合成は、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、同第５，２８３，１８５号、同第５，７５３，６１３号、および同第５，７８５，９９２号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ９６／１０３９０号に記載されており、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）、ならびにＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から入手可能）等の、多数の市販のカチオン性脂質調製物を使用してもよい。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、または約５５ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成する。特定の実施形態において、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％、５１ｍｏｌ％、５２ｍｏｌ％、５３ｍｏｌ％、５４ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、５６ｍｏｌ％、５７ｍｏｌ％、５８ｍｏｌ％、５９ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、６１ｍｏｌ％、６２ｍｏｌ％、６３ｍｏｌ％、６４ｍｏｌ％、または６５ｍｏｌ％（またはその任意の分率）を構成する。
【０２７３】
他の実施形態において、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２７４】
本発明の脂質粒子での使用に好適なカチオン性脂質のさらなる割合および範囲は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２７０６０号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
本発明の脂質粒子中に存在するカチオン性脂質の割合は、目標量であり、製剤中に存在するカチオン性脂質の実際の量は、例えば、±５ｍｏｌ％で変動し得ることを理解されたい。例えば、１：５７脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）製剤の場合、カチオン性脂質の目標量は、５７．１ｍｏｌ％であるが、カチオン性脂質の実際の量は、目標量の±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であり得、製剤の残りの部
分は、他の脂質構成成分で構成される（粒子中に存在する総脂質の１００ｍｏｌ％まで添加する）。
【０２７６】
Ｂ．  非カチオン性脂質
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）に使用される非カチオン性脂質は、安定な化合物を生成することができる、種々の中性非荷電、双性イオン性、またはアニオン性脂質のいずれかであり得る。
【０２７７】
非カチオン性脂質の非限定的な例には、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイオル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ｌ−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、およびこれらの混合物等のリン脂質が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用可能である。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０−Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸を有するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。
【０２７８】
非カチオン性脂質のさらなる例には、コレステロールおよびその誘導体等のステロールが挙げられる。コレステロール誘導体の非限定的な例には、５α−コレスタノール、５β−コプロスタノール、コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテル、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテル、および６−ケトコレスタノール等の極性類似体、５α−コレスタン、コレステノン、５α−コレスタノン、５β−コレスタノン、およびデカン酸コレステリル等の非極性類似体、ならびにこれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態において、コレステロール誘導体は、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテル等の極性類似体である。コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテルの合成は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２７０６０号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物を含むか、またはそれからなる。他の実施形態において、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質、例えば、コレステロール不含の脂質粒子製剤を含むか、またはそれからなる。さらに他の実施形態において、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、リン脂質不含の脂質粒子製剤を含むか、またはそれからなる。
【０２８０】
本発明での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例には、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート（ａｃｅｔｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、グリセロールリシノレエート（ｇｌｙｃｅｒｏｌｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）、ヘキサデシルステレエート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｓｔｅｒｅａｔｅ）、ミリスチン酸イソプロピル、良性アクリル系ポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル−アリール硫酸ポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリン等といった、リンを含有しない脂質が挙げられる。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％〜約４２ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、もしくは４５ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２８２】
脂質粒子が、リン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物を含有する実施形態において、この混合物は、粒子中に存在する総脂質の最大約４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％を構成し得る。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、混合物中のリン脂質成分は、粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、または約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成し得る。ある特定の好ましい実施形態において、混合物中のリン脂質成分は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成する。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む１：５７脂質粒子製剤は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約３４ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物として、約７ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を含み得る。別の非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む７：５４脂質粒子製剤は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約３２ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物として、約７ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を含み得る。
【０２８４】
他の実施形態において、混合物中のコレステロール成分は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成し得る。ある特定の好ましい実施形態において、混合物中のコレステロール成分は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３４ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３３ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、もしくは３５ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成す
る。典型的に、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む１：５７脂質粒子製剤は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質との混合物として、約３４ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含み得る。典型的に、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む７：５４脂質粒子製剤は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質との混合物として、約３２ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含み得る。
【０２８５】
脂質粒子がリン脂質不含である実施形態において、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の最大約２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％を構成し得る。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、リン脂質不含の脂質粒子製剤中のコレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３９ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％〜約３８ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、もしくは４０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成し得る。非限定的な例として、１：６２脂質粒子製剤は、粒子中に存在する総脂質の約３７ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のコレステロールを含み得る。別の非限定的な例として、７：５８脂質粒子製剤は、粒子中に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％（またはその任意の分率）のコレステロールを含み得る。
【０２８７】
他の実施形態において、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質のみ）、または約６０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質およびコレステロールまたはその誘導体）（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２８８】
本発明の脂質粒子での使用に好適な非カチオン性脂質のさらなる割合および範囲は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２７０６０号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８９】
本発明の脂質粒子中に存在する非カチオン性脂質の割合は、目標量であり、製剤中に存在する非カチオン性脂質の実際の量は、例えば、±５ｍｏｌ％で変動し得ることを理解されたい。例えば、１：５７脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）製剤において、リン脂質の目標量は７．１ｍｏｌ％であり、コレステロールの目標量は３４．３ｍｏｌ％であるが、リン脂質の実際の量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であり得、コレステロールの実際の量は、その目標量の±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であり得、製剤の残りの部分は、他の脂質成分で構成される（粒子中に存在する総脂質の１００ｍｏｌ％まで添加する）。同様に、７：５４脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）製剤において、リン脂質の目標量は６．７５ｍｏｌ％であり、コレステロールの目標量は３２．４３ｍｏｌ％であるが、リン脂質の実際の量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ
％、または±０．１ｍｏｌ％であり得、コレステロールの実際の量は、その目標量の±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であり得、製剤の残りの部分は、他の脂質成分で構成される（粒子中に存在する総脂質の１００ｍｏｌ％まで添加する）。
【０２９０】
Ｃ．  脂質複合体
カチオン性および非カチオン性脂質に加えて、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、脂質複合体をさらに含み得る。複合脂質は、それが粒子の凝集を阻止するという点で、有用である。好適な複合脂質には、ＰＥＧ−脂質複合体、ＰＯＺ−脂質複合体、ＡＴＴＡ−脂質複合体、カチオン性−ポリマー−脂質複合体（ＣＰＬ）、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、粒子は、ＰＥＧ−脂質複合体またはＡＴＴＡ−脂質複合体のいずれかを、ＣＰＬとともに含む。
【０２９１】
好ましい実施形態において、脂質複合体は、ＰＥＧ−脂質である。ＰＥＧ−脂質の例には、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０５／０２６３７２号に記載されるジアルキルオキシプロピルと結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、例えば、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号および同第２００５／００８６８９号に記載されるジアシルグリセロールと結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質と結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、例えば、米国特許第５，８８５，６１３号に記載されるセラミドと複合体形成したＰＥＧ、コレステロールまたはその誘導体と複合体形成したＰＥＧ、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの特許文書の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明での使用に好適なさらなるＰＥＧ−脂質には、限定することなく、ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）が挙げられる。ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧの合成は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／０８６５５８号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。なおもさらに好適なＰＥＧ−脂質複合体には、限定することなく、１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパノキシ）−カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ）が挙げられる。２ＫＰＥＧ−ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９２】
ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有する、エチレンＰＥＧ反復単位の直鎖の水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、その分子量によって分類され、例えば、ＰＥＧ  ２０００は、約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ  ５０００は、約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．および他の企業から市販入手可能であり、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）、ならびに末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含有する化合物（例えば、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２等）。米国特許第６，７７４，１８０号および同第７，０５３，１５０号に記載のもの等の他のＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ（２０ＫＤａ）アミン）もまた、本発明のＰＥＧ−脂質複合体の調製に有用である。これらの特許の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥ
Ｇ−ＤＡＡ複合体を含むＰＥＧ−脂質複合体の調製に、特に有用である。
【０２９３】
本明細書に記載のＰＥＧ−脂質複合体のＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を含み得る。ある特定の事例において、ＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。好ましい実施形態において、ＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
【０２９４】
ある特定の事例において、ＰＥＧは、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基によって任意に置換され得る。ＰＥＧは、脂質に直接に複合体化されてもよく、またはリンカー部分を介して脂質に結合されてもよい。例えば、エステル不含リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧと脂質との結合に好適な任意のリンカー部分を使用することができる。好ましい実施形態において、リンカー部分は、エステル不含リンカー部分である。本明細書に使用される際、「エステル不含リンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル結合（−ＯＣ（Ｏ）−）を含有しないリンカー部分を指す。好適なエステル不含リンカー部分には、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、アミノ（−ＮＲ−）、カルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−）、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、スクシニル（−（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）、スクシンアミジル（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｙｌ）（−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、エーテル、ジスルフィド、ならびにこれらの組み合わせ（カルバメートリンカー部分およびアミドリンカー部分の両方を含有するリンカー等）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、カルバメートリンカーを使用して、ＰＥＧを脂質に結合させる。
【０２９５】
他の実施形態において、エステル含有リンカー部分を使用して、ＰＥＧを脂質に結合させる。好適なエステル含有リンカー部分には、例えば、炭酸塩（−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、スクシノイル、リン酸エステル（−Ｏ−（Ｏ）ＰＯＨ−Ｏ−）、スルホン酸エステル、およびこれらの組み合わせが上げられる。
【０２９６】
鎖長および飽和の程度が多様である種々のアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンを、ＰＥＧに複合体化して、脂質複合体を形成することができる。このようなホスファチジルエタノールアミンは、市販入手可能であるか、または当業者に既知の従来的な技術を使用して単離もしくは合成することができる。Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を含有するホスファチジル−エタノールアミンが好ましい。モノまたはジ不飽和脂肪酸、ならびに飽和および不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルエタノールアミンもまた、使用可能である。好適なホスファチジルエタノールアミンには、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９７】
「ＡＴＴＡ」または「ポリアミド」という用語には、限定することなく、米国特許第６，３２０，０１７号および同第６，５８６，５５９号に記載の化合物が含まれ、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの化合物には、式
【化６】
2018039844.tif 000016
を有する化合物が含まれ、式中、Ｒは、水素、アルキル、およびアシルからなる群から選択されるメンバーであり、Ｒ１は、水素およびアルキルからなる群から選択されるメンバーであるか、または、場合によっては、ＲおよびＲ１、ならびにそれらが結合する窒素は、アジド部分を形成し、Ｒ２は、水素、任意置換アルキル、任意置換アリール、およびアミノ酸の側鎖から選択される群のメンバーであり、Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノ、およびＮＲ４Ｒ５からなる群から選択されるメンバーであり、式中、Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素またはアルキルであり、ｎは４〜８０であり、ｍは２〜６であり、ｐは１〜４であり、ｑは０または１である。他のポリアミドを、本発明の化合物に使用してもよいことが、当業者には明らかであろう。
【０２９８】
「ジアシルグリセロール」または「ＤＡＧ」という用語には、２つの脂肪酸アシル鎖であるＲ１およびＲ２を有し、これらのいずれも、独立して、エステル結合によってグリセロールの１位および２位に結合される２〜３０個の炭素を有する、化合物が含まれる。アシル基は、飽和であってもよく、または多様な程度の不飽和を有してもよい。好適なアシル基には、ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）、およびイコソイル（ｉｃｏｓｏｙｌ）（Ｃ２０）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、同じである、すなわち、Ｒ１およびＲ２はいずれもミリストイルである（すなわち、ジミリストイル）、Ｒ１およびＲ２はいずれもステアロイルである（すなわち、ジステアロイル）等である。ジアシルグリセロールは、次の一般式を有する。
【化７】
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【０２９９】
「ジアルキルオキシプロピル」または「ＤＡＡ」という用語には、いずれも独立して２〜３０個の炭素を有する２つのアルキル鎖、Ｒ１およびＲ２を有する、化合物が含まれる。アルキル基は、飽和であってもよく、または様々な程度の不飽和を有してもよい。ジアルキルオキシプロピルは、次の一般式を有する。
【化８】
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【０３００】
好ましい実施形態において、ＰＥＧ−脂質は、次の式を有するＰＥＧ−ＤＡＡ複合体であり、
【化９】
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式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択され、約１０〜約２２個の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコールであり、Ｌは上述のエステル不含リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。長鎖アルキル基は、飽和または不飽和であり得る。好適なアルキル基には、デシル（Ｃ１０）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、およびイコシル（Ｃ２０）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、同じである、すなわち、Ｒ１およびＲ２はいずれもミリスチルである（すなわち、ジミリスチル）、Ｒ１およびＲ２はいずれもステアリルである（すなわち、ジステアリル）等である。
【０３０１】
上の式Ｖにおいて、ＰＥＧは、約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する。ある特定の事例において、ＰＥＧは、約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。好ましい実施形態において、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基で任意に置換され得る。ある特定の実施形態において、末端ヒドロキシル基は、メトキシまたはメチル基で置換される。
【０３０２】
好ましい実施形態において、「Ｌ」は、エステル不含リンカー部分である。好適なエステル不含リンカーには、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、エステル不含リンカー部分は、カルバメートリンカー部分である（すなわち、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＡＡ複合体）。別の好ましい実施形態において、エステル不含リンカー部分は、アミドリンカー部分である（すなわち、ＰＥＧ−Ａ−ＤＡＡ複合体）。さらに別の好ましい実施形態において、エステル不含リンカー部分は、スクシンイミジルリンカー部分である（すなわち、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＡ複合体）。
【０３０３】
特定の実施形態において、ＰＥＧ−脂質複合体は、
【化１０】
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【０３０４】
ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、当業者に既知の標準的な技術および試薬を使用して合成される。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、種々のアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメート、および尿素結合を含有する。当業者であれば、これらの結合を形成するための方法および試薬が周知であり、容易に利用可能であることを理解するであろう。例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｗｉｌｅｙ  １９９２）、Ｌａｒｏｃｋ，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ（ＶＣＨ  １９８９）、およびＦｕｒｎｉｓｓ，ＶＯＧＥＬ’Ｓ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，５ｔｈ  ｅｄ．（Ｌｏｎｇｍａｎ  １９８９）を参照されたい。存在する任意の官能基が、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体の合成の際、異なる点での保護および脱保護を要することもまた、理解される。当業者であれば、このような技術が周知であることを理解するであろう。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｗｉｌｅｙ  １９９１）を参照されたい。
【０３０５】
好ましくは、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ−ジパルミトイルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体である。これらの実施形態において、ＰＥＧは、好ましくは、約７５０または約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。１つの特に好ましい実施形態において、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡを含み、ここで、「２０００」は、ＰＥＧの平均分子量を示し、「Ｃ」は、カルバメートリンカー部分を示し、「ＤＭＡ」は、ジミリスチルオキシプロピルを示す。別の特に好ましい実施形態において、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡを含み、ここで、「７５０」は、ＰＥＧの平均分子量を示し、「Ｃ」は、カルバメートリンカー部分を示し、「ＤＭＡ」は、ジミリスチルオキシプロピルを示す。特定の実施形態において、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、メチル基で置換される。当業者であれば、他のジアルキルオキシプロピルを、本発明のＰＥＧ−ＤＡＡ複合体に使用してもよいことを理解するであろう。
【０３０６】
前述のことに加えて、他の親水性ポリマーをＰＥＧの代わりに用いてもよいことが、当業者には明らかであろう。ＰＥＧの代わりに使用され得る好適なポリマーの例には、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシオキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ならびにヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース等の誘導体化セルロースが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０７】
前述の構成成分に加えて、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、カチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質またはＣＰＬをさらに含み得る（例えば、Ｃｈｅｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１１：４３３−４３７（２０００）、米国特許第６，８５２，３３４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／６２８１３号を参照されたく、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３０８】
好適なＣＰＬには、式ＶＩの化合物が含まれ、
【化１１】
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式中、Ａ、Ｗ、およびＹは、以下に記載の通りである。
【０３０９】
式ＶＩに関して、「Ａ」は、脂質アンカーとして作用する、両親媒性脂質、中性脂質、または疎水性脂質等の脂質部分である。好適な脂質には、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン、および１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１０】
「Ｗ」は、親水性ポリマーまたはオリゴマー等のポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、親水性ポリマーは、非免疫原性であるか、または生来の免疫原性が低い、生体適合性ポリマーである。あるいは、親水性ポリマーは、適切なアジュバントとともに使用した場合に、弱抗原性となり得る。好適な非免疫原性ポリマーには、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリマーは、約２５０〜約７，０００ダルトンの分子量を有する。
【０３１１】
「Ｙ」は、ポリカチオン性部分である。ポリカチオン性部分という用語は、選択されたｐＨ、好ましくは生理的ｐＨにおいて、正の電荷、好ましくは２の正の電荷を有する、化合物、誘導体、または官能基を指す。好適なポリカチオン性部分には、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、およびヒスチジン等の塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体；スペルミン；スペルミジン；カチオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖類；ならびにアミノ多糖類が挙げられる。ポリカチオン性部分は、構造が、直鎖テトラリジン等の直鎖であってもよく、または分枝もしくは樹状であってもよい。ポリカチオン性部分は、選択されたｐＨ値で、約２〜約１５の正の電荷を有し、好ましくは約２〜約１２の正の電荷を有し、より好ましくは約２〜約８の正の電荷を有する。どのポリカチオン性部分を利用するかの選択は、所望される粒子の用途の種類によって決定され得る。
【０３１２】
ポリカチオン性部分の電荷は、粒子部分全体にわたって分布し得るか、または代替として、それらが、粒子部分の１つの特定の領域において異なる濃度の電荷密度、例えば、電荷スパイクであり得るか、のいずれかである。電荷密度が粒子上に分布している場合、電荷密度は、均一に分布するか、または不均一に分布し得る。ポリカチオン性部分の電荷分布の全ての変形が、本発明に包含される。
【０３１３】
脂質「Ａ」および非免疫原性ポリマー「Ｗ」は、種々の方法によって、好ましくは共有結合によって、結合され得る。当業者に既知の方法を、「Ａ」と「Ｗ」との共有結合に使用することができる。好適な結合には、アミド、アミン、カルボキシル、カーボネート、カルバメート、エステル、およびヒドラゾン結合が挙げられるが、これらに限定されない。「Ａ」および「Ｗ」が、結合を生じさせるために相補的官能基を有する必要があること
は、当業者には明らかであろう。一方は脂質上で他方はポリマー上でのこれらの２つの基の反応により、所望の結合をもたらす。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、末端ヒドロキシルが例としてＮＨＳおよびＤＣＣで活性化されて活性なエステルを形成し、次いでアミノ基を含有するポリマー、例えばポリアミドと反応する場合（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号および同第６，５８６，５５９号を参照されたく、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、アミド結合が、２つの基の間に形成されるであろう。
【０３１４】
ある特定の事例において、ポリカチオン性部分は、標的リガンドまたはカルシウムと錯体形成するためのキレート部分といった、リガンドが結合されていてもよい。好ましくは、リガンドが結合した後、カチオン性部分は、正の電荷を維持する。ある特定の事例において、結合されたリガンドは、正の電荷を有する。好適なリガンドには、反応性官能基を有する化合物またはデバイスが挙げられるがこれらに限定されず、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生体親和性化合物、生体材料、バイオポリマー、生体医学的デバイス、分析的に検出可能な化合物、治療的に活性な化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫賦活剤、放射標識、蛍光物質、ビオチン、薬物、ヘプタン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、リポソーム、ビロゾーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的化部分、または毒素が挙げられる。
【０３１５】
いくつかの実施形態において、脂質複合体（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％〜約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％〜約１．６ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％〜約１．６ｍｏｌ％、または約１．４ｍｏｌ％〜約１．５ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成する。
【０３１６】
他の実施形態において、脂質複合体（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する脂質の約０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約１８ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、または約２ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成する。
【０３１７】
さらなる実施形態において、脂質複合体（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）を構成する。
【０３１８】
本発明の脂質粒子における使用に好適な脂質複合体のさらなる例、割合（％）、および／または範囲は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０９／１２７０６０号およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１０／００６２８２号に記載され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３１９】
本発明の脂質粒子中に存在する脂質複合体（例えば、ＰＥＧ−脂質）の割合（％）は、目標量であり、製剤中に存在する脂質複合体の実際の量は、例えば、±２ｍｏｌ％で変動し得ることを理解されたい。例えば、１：５７脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）製剤では、脂
質複合体の目標量は１．４ｍｏｌ％であるが、脂質複合体の実際の量は、目標量の±０．５ｍｏｌ％、±０．４ｍｏｌ％、±０．３ｍｏｌ％、±０．２ｍｏｌ％、±０．１ｍｏｌ％、または±０．０５ｍｏｌ％であり得、製剤の残りの部分は、他の脂質成分で構成される（粒子中に存在する総脂質の１００ｍｏｌ％まで添加する）。同様に、７：５４脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）製剤では、脂質複合体の目標量は６．７６ｍｏｌ％であるが、脂質複合体の実際の量は、目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であり得、製剤の残りの部分は、他の脂質成分で構成される（粒子中に存在する総脂質の１００ｍｏｌ％まで添加する）。
【０３２０】
当業者であれば、脂質複合体の濃度を、用いられる脂質複合体および脂質粒子が融合性となる速度に応じて変化させ得ることを理解するであろう。
【０３２１】
脂質複合体の組成および濃度を制御することによって、脂質複合体が脂質粒子の外側に入れ替わる速度、および今度は脂質粒子が融合性となる速度を制御することができる。例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体を脂質複合体として使用する場合、脂質粒子が融合性となる速度は、例えば、脂質複合体の濃度を変化させることによって、ＰＥＧの分子量を変化させることによって、またはＰＥＧ−ＤＡＡ複合体上のアルキル基の鎖長および飽和の程度を変化させることによって、変化させることができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、イオン強度等を含む他の変数を使用して、脂質粒子が融合性となる速度を変化および／制御することができる。脂質粒子が融合性となる速度を制御するために使用することができる他の方法は、本開示を読むことで当業者には明らかとなろう。また、脂質複合体の組成及び濃度を制御することによって、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の寸法を制御することができる。
【０３２２】
ＶＩ．  脂質粒子の調製
干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性剤または治療剤が粒子の脂質部分内に封入され、分解から保護される、本発明の脂質粒子、例えば、ＬＮＰは、連続混合方法、直接希釈プロセス、および直列（ｉｎ−ｌｉｎｅ）希釈プロセスを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の方法によって形成することができる。
【０３２３】
特定の実施形態において、カチオン性脂質は、式Ｉの脂質またはその塩を、単独でまたは他のカチオン性脂質と組み合わせて含んでもよい。他の実施形態において、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、１４：０  ＰＥ（１，２−ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１６：０  ＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１８：０  ＰＥ（１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１８：１  ＰＥ（１，２−ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１８：１トランスＰＥ（１，２−ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１８：０−１８：１  ＰＥ（１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１６：０−１８：１  ＰＥ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ポリエチレングリコール系ポリマー（例えば、ＰＥＧ  ２０００、ＰＥＧ  ５０００、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、またはＰＥＧ修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせである。
【０３２４】
ある特定の実施形態において、本発明は、連続混合方法、すなわち、例えば、第１のリ
ザーバ中に核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）を含む水溶液を提供し、第２のリザーバ中に有機脂質溶液を提供し（ここで有機脂質溶液中に存在する脂質は、有機溶媒、例えば、エタノール等の低級アルカノール中に可溶化される）、脂質小胞内に核酸をカプセル封入する脂質小胞（例えば、リポソーム）を実質的に即座に生成するように有機脂質溶液が水溶液と混合するように、水溶液を有機脂質溶液と混合することを含むプロセスを介して生成される、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を提供する。このプロセスおよびこのプロセスを行うための装置は、米国特許出願公開第２００４／０１４２０２５号に詳述され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２５】
脂質および緩衝液を混合チャンバ等の混合する環境に連続的に導入する動作は、緩衝液での脂質溶液の連続希釈を引き起こし、それによって、混合すると実質的に即在に脂質小胞を生成する。本明細書に使用される際、「脂質溶液を緩衝液で連続希釈すること」（および変形）という表現は、概して、脂質溶液が水和プロセスにおいて、小胞生成を達成するのに十分な力を用いて、十分に迅速に希釈されることを意味する。核酸を含む水溶液を有機脂質溶液と混合することによって、有機脂質溶液は、緩衝液（すなわち、水溶液）の存在下で連続的な段階希釈を経て、核酸−脂質粒子をもたらす。
【０３２６】
連続混合方法を使用して形成される核酸−脂質粒子は、典型的に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、もしくは８０ｎｍ未満、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍ（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）の寸法を有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、任意に、均一な粒径を達成するように寸法調整される。
【０３２７】
別の実施形態において、本発明は、脂質小胞（例えば、リポソーム）溶液を形成し、脂質小胞溶液を、制御された量の希釈緩衝液を含有する収集容器に即座にかつ直接に導入することを含む、直接希釈プロセスを介して生成される、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を提供する。好ましい態様において、収集容器は、希釈を促進するために収集容器の内容物を撹拌するように構成される、１つ以上の構成要素を含む。一態様において、収集容器中に存在する希釈緩衝液の量は、そこに導入された脂質小胞溶液の体積に実質的に等しい。非限定的な例として、等体積の希釈緩衝液を含有する収集容器に導入されたときの４５％エタノール中の脂質小胞溶液は、より小さい粒子を有利にもたらすであろう。
【０３２８】
さらに別の実施形態において、本発明は、希釈緩衝液を含有する第３のリザーバが第２の混合領域に流体連結される、直列希釈プロセスを介して生成される、核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を提供する。この実施形態において、第１の混合領域において形成された脂質小胞（例えば、リポソーム）溶液は、第２の混合領域において希釈緩衝液と即座にかつ直接に混合される。好ましい態様において、第２の混合領域は、脂質小胞溶液の流れと希釈緩衝液の流れとが対抗する１８０°の流れとして合流するように配置されるＴコネクタを含むが、例えば、約２７o〜約１８０o（例えば、約９０o）のより浅い角度を提供
するコネクタを使用することができる。ポンプ機構は、緩衝液の制御可能な流れを第２の混合領域に送達する。一態様において、第２の混合領域に提供される希釈緩衝液の流量は、第１の混合領域からそこに導入される脂質小胞溶液の流量に実質的に等しくなるように制御される。この実施形態は、第２の混合領域における脂質小胞溶液と混合している希釈緩衝液の流れ、したがってまた、第２の混合プロセス全体にわたる緩衝液中の脂質小胞溶
液の濃縮のさらなる制御を有利に可能にする。希釈緩衝液の流量のこのような制御は、低減された濃度での小さい粒径形成を有利に可能にする。
【０３２９】
これらのプロセスならびにこれらの直接希釈および直列希釈プロセスを行うための装置は、米国特許出願公開第２００７／００４２０３１号に詳述され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３０】
直接希釈および直列希釈プロセスを使用して形成される核酸−脂質粒子は、典型的に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、もしくは８０ｎｍ未満、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍ（またはその任意の分率もしくはその中の範囲）の寸法を有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、任意に、均一な粒径を達成するように寸法調整される。
【０３３１】
必要とされる場合、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、リポソームを寸法調整するために利用可能な方法のうちのいずれかによって寸法調整することができる。寸法調整は、所望の寸法範囲および比較的狭い粒径の分布を達成するために行われてもよい。
【０３３２】
粒子を所望の寸法に寸法調整するために複数の技法が利用可能である。リポソームのために使用され、本粒子にも同等に適用可能な１つの寸法調整方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。粒子懸濁液を液槽超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによって超音波処理することにより、約５０ｎｍ未満の寸法の粒子までの寸法漸減がもたらされる。均一化は、より大きい粒子をより小さい粒子へと断片化するためにせん断エネルギーに依存する、別の方法である。典型的な均一化手順において、粒子は、典型的に約６０〜約８０ｎｍの間の、選択される粒径が観察されるまで、標準の乳濁液ホモジナイザーを通じて再循環させられる。両方の方法において、粒径分布は、従来のレーザビーム粒径識別、またはＱＥＬＳによって監視することができる。
【０３３３】
細孔ポリカーボネート膜または不均整のセラミック膜を通した粒子の押出しもまた、粒径を比較的明確な寸法分布へと低減するために有効な方法である。典型的に、懸濁液は、所望の粒径分布が達成されるまで、膜を通して１回以上循環させられる。粒子は、寸法の段階的低減を達成するために、順次に小さくなる細孔膜を通して押出しされてもよい。
【０３３４】
いくつかの実施形態において、粒子中に存在する核酸は、例えば、米国特許出願第０９／７４４，１０３号に記載されるように予め凝縮され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３５】
他の実施形態において、方法は、本組成物を使用して細胞のリポフェクションを達成するのに有用である、非脂質ポリカチオンを添加することをさらに含んでもよい。好適な非脂質ポリカチオンの例としては、臭化ヘキサジメトリン（ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）の商標名の下に、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから販売される）またはヘキサジメトリン他の塩が挙げられる。他の好適なポリカチオンには、例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミ
ンの塩が含まれる。これらの塩の添加は、好ましくは、粒子が形成された後である。
【０３３６】
いくつかの実施形態において、形成された核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中の核酸対脂質比（質量／質量比）は、約０．０１〜約０．２、約０．０５〜約０．２、約０．０２〜約０．１、約０．０３〜約０．１、または約０．０１〜約０．０８の範囲であろう。出発物質の比率（投入量）もまた、この範囲内となる。他の実施形態において、粒子調製は、１０ｍｇの総脂質当たり約４００μｇの核酸、または約０．０１〜約０．０８の核酸対脂質の質量比、およびより好ましくは、５０μｇの核酸当たり１．２５ｍｇの総脂質に対応する約０．０４の核酸対脂質の質量比を使用する。他の好ましい実施形態において、粒子は、約０．０８の核酸：脂質の質量比を有する。
【０３３７】
他の実施形態において、形成された核酸−脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中の脂質対核酸比（質量／質量比）は、約１（１：１）〜約１００（１００：１）、約５（５：１）〜約１００（１００：１）、約１（１：１）〜約５０（５０：１）、約２（２：１）〜約５０（５０：１）、約３（３：１）〜約５０（５０：１）、約４（４：１）〜約５０（５０：１）、約５（５：１）〜約５０（５０：１）、約１（１：１）〜約２５（２５：１）、約２（２：１）〜約２５（２５：１）、約３（３：１）〜約２５（２５：１）、約４（４：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２０（２０：１）、約５（５：１）〜約１５（１５：１）、約５（５：１）〜約１０（１０：１）の範囲、または約５（５：１）、６（６：１）、７（７：１）、８（８：１）、９（９：１）、１０（１０：１）、１１（１１：１）、１２（１２：１）、１３（１３：１）、１４（１４：１）、１５（１５：１）、１６（１６：１）、１７（１７：１）、１８（１８：１）、１９（１９：１）、２０（２０：１）、２１（２１：１）、２２（２２：１）、２３（２３：１）、２４（２４：１）、もしくは２５（２５：１）、またはその任意の分率もしくはその中の範囲であろう。出発物質の比率（投入量）もまた、この範囲内となる。
【０３３８】
前述のように、複合脂質は、ＣＰＬをさらに含んでもよい。ＬＮＰ−ＣＰＬ（ＣＰＬ含有ＬＮＰ）を作製するための多様な一般的方法が本明細書に考察される。２つの一般的技法としては、「後挿入（ｐｏｓｔ−ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）」技法、つまり、例えば、予め形成されたＬＮＰへの、ＣＰＬの挿入、およびＣＰＬが、例えば、ＬＮＰ形成ステップ中に脂質混合物に含められる、「標準」技法が挙げられる。後挿入技法は、ＣＰＬを主にＬＮＰ二重層膜の外面に有するＬＮＰをもたらすが、一方で標準技法は、ＣＰＬを内面および外面の両方に有するＬＮＰを提供する。この方法は、リン脂質（コレステロールを含有し得る）から作製される小胞に、およびまたＰＥＧ−脂質（ＰＥＧ−ＤＡＡおよびＰＥＧ−ＤＡＧ等）を含有する小胞にも、特に有用である。ＬＮＰ−ＣＰＬを作製する方法は、例えば、米国特許第５，７０５，３８５号、同第６，５８６，４１０号、同第５，９８１，５０１号、同第６，５３４，４８４号、および同第６，８５２，３３４号、米国特許出願公開第２００２／００７２１２１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／６２８１３号に教示され、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３９】
ＶＩＩ．  キット
本発明はまた、キット形態での脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）も提供する。いくつかの実施形態において、キットは、脂質粒子の種々の要素（例えば、核酸等の活性剤または治療剤および粒子の個々の脂質構成成分）を保持するために区画化された容器を含む。好ましくは、キットは、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を保持する容器（例えば、バイアルまたはアンプル）を含み、この粒子は、本明細書に記載されるプロセスのうちの１つによって生成される。ある特定の実施形態において、キットは、エンドソーム膜不安定化剤（例えば、カルシウムイオン）をさらに含んでもよい。キットは典型的に、本発明の粒子
組成物を、薬学的に許容される担体中の懸濁液または脱水型でのいずれかとして、それらの再水和（凍結乾燥されている場合）および投与のための指示書とともに含有する。
【０３４０】
本発明の脂質粒子は、目的とする特定の組織、臓器、または腫瘍を優先的に標的とするように適合させることができる。いくつかの事例において、１：５７脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）製剤を使用して、肝臓（例えば、正常な肝臓組織）を優先的に標的とすることができる。他の事例において、７：５４脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）製剤を使用して、肝臓腫瘍および肝臓の外側の腫瘍等の固形腫瘍を優先的に標的とすることができる。好ましい実施形態において、本発明のキットは、これらの肝臓指向性および／または腫瘍指向性の脂質粒子を含み、この粒子は、懸濁液としてまたは脱水型で容器中に存在する。
【０３４１】
ある特定の他の事例において、粒子の標的化をさらに向上させるために、脂質粒子の表面に結合された標的化部分を有することが望ましい場合がある。標的化部分（例えば、抗体、タンパク質等）を脂質（本粒子において使用されるもの等）に結合する方法は、当業者に知られている。
【０３４２】
ＶＩＩＩ．  脂質粒子の投与
一旦形成されると、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、活性剤または治療剤（例えば、干渉ＲＮＡ等の核酸）の細胞内への導入に有用である。したがって、本発明はまた、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）等の活性剤または治療剤を細胞内に導入するための方法も提供する。いくつかの事例において、細胞は、例えば、肝臓組織内に存在する肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）等の肝臓細胞（ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）である。他の事例において、細胞は、例えば、固形腫瘍中に存在する腫瘍細胞等の腫瘍細胞である。本方法は、上述のように粒子を形成し、次いで活性剤または治療剤の細胞への送達が生じるのに十分な一定期間にわたって粒子を細胞と接触させることによって、インビトロまたはインビボで行われる。
【０３４３】
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、それらが混合されるまたは接触させられる、ほぼいずれの細胞型にも吸着させることができる。一旦吸着させらせると、粒子は、細胞の一部分によって形質膜陥入され得るか、脂質を細胞膜と交換し得るか、または細胞と融合し得るかのいずれかである。粒子の活性剤または治療剤（例えば、核酸）部分の移入または組み込みは、これらの経路のうちのいずれか１つを介して起こり得る。特に、融合が起こるとき、粒子膜は、細胞膜内に組み込まれ、粒子の内容物は、細胞内液と組み合わさる。
【０３４４】
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、単独で、または投与経路および標準的な薬務に従って選択される薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）と混合してのいずれかで、投与することができる。概して、生理緩衝食塩水（例えば、１３５〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）が薬学的に許容される担体として用いられるであろう。他の好適な担体には、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性向上のための糖タンパク質を含む、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等が含まれる。さらなる好適な担体は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に記載される。本明細書に使用される際、「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等が挙げられる。「薬学的に許容される」という表現は、ヒトに投与されるときにアレルギー性のまたは同様の不都合な反応をもたらさない、分子実体および組成物を指す。
【０３４５】
薬学的に許容される担体は、概して脂質粒子形成に次いで添加される。したがって、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）が形成された後に、粒子は、生理緩衝食塩水等の薬学的に許容される担体中に希釈することができる。
【０３４６】
薬学的製剤中の粒子の濃度は、大幅に、すなわち、約０．０５重量％未満、通常は約２〜５重量％または少なくとも約２〜５重量％から、最大約１０〜９０重量％まで変動し得、主に流体の体積、粘度等によって、選択される特定の投与様式に従って、選択されるであろう。例えば、濃度は、治療に関連する流体負荷を低下させるために増加させられてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症関連の鬱血性心不全または重度の高血圧を有する患者において特に望ましい場合がある。あるいは、刺激性の脂質から構成される粒子は、投与部位の炎症を軽減するために低濃度に希釈されてもよい。
【０３４７】
本発明の薬学的組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌されてもよい。水溶液は、使用のためにパッケージ化するか、または無菌条件下で濾過し、凍結乾燥することができ、この凍結乾燥された調製物が、投与前に滅菌水溶液と組み合わされる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要に応じて、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウム等の、薬学的に許容される補助材料を含有することができる。さらに、粒子懸濁液は、保管時に脂質をフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷に対して保護する、脂質保護剤を含んでもよい。αトコフェロール等の親油性のフリーラジカル消去剤、およびフェリオキサミン等の水溶性の鉄特異的キレート剤が好適である。
【０３４８】
いくつかの実施形態において、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、干渉ＲＮＡ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む１つ以上の核酸の治療的送達ための方法において特に有用である。特に、目的とする１つ以上の標的核酸配列または遺伝子の転写および／または翻訳を下方制御またはサイレンシングすることによる、哺乳動物（例えば、マウス等の齧歯類またはヒト、チンパンジー、もしくはサル等の霊長類）における疾患または障害の治療のためのインビトロおよびインビボ方法を提供することが、本発明の目的である。非限定的な例として、本発明の方法は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の、哺乳類対象の肝臓および／または腫瘍へのインビボ送達に有用である。ある特定の実施形態において、疾患または障害は、遺伝子の発現および／または過剰発現に関連し、この遺伝子の発現または過剰発現が、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって低減される。ある特定の他の実施形態において、治療有効量の脂質粒子が哺乳動物に投与され得る。いくつかの事例において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＬＮＰへと製剤化され、この粒子が、このような治療を必要とする患者に投与される。他の事例において、細胞が患者から取り出され、干渉ＲＮＡがインビトロで（例えば、本明細書に記載されるＬＮＰを使用して）投与され、この細胞が患者に再注入される。
【０３４９】
Ａ．  インビボ投与
インビボ療法のための全身送達、例えば、循環等の身体のシステムを介した遠位の標的細胞への治療的核酸の送達は、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０５／００７１９６号、同第ＷＯ  ０５／１２１３４８号、同第ＷＯ  ０５／１２０１５２号、および同第ＷＯ  ０４／００２４５３号に記載されるもの等の核酸−脂質粒子を使用して達成されてきており、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明はまた、核酸を血清中のヌクレアーゼ分解から保護し、非免疫原性であり、分包が小さく、かつ反復投薬に好適である、完全にカプセル封入された脂質粒子も提供する。
【０３５０】
インビボ投与のために、投与は、当該技術分野で既知の任意の様態、例えば、注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）、経皮適用、または直腸投与によるものであり得る。投与は、単回用量または分割用量を介して遂行することができる。薬学的組成
物は、非経口で、すなわち、関節内に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または筋肉内に投与することができる。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、ボーラス注射によって静脈内にまたは腹腔内に投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号を参照されたい）。細胞内核酸送達はまた、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：５１２（１９８３）、Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）、Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ
ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，６：２３９（１９８９）、およびＢｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６：２７４（１９９３）にも考察されている。脂質に基づく治療薬を投与するさらに他の方法は、例えば、米国特許第３，９９３，７５４号、同第４，１４５，４１０号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２２４，１７９号、同第４，５２２，８０３号、および同第４，５８８，５７８号に記載される。脂質粒子は、疾患部位での直接注射によって、または疾患部位から遠位の部位での注射によって、投与することができる（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４）を参照されたい）。上述の参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３５１】
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）が静脈内に投与される場合の実施形態において、粒子の総注射量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％が、注射の約８、１２、２４、３６、または４８時間後に血漿中に存在する。他の実施形態において、脂質粒子の総注射量の約２０％、３０％、４０％超、および最大約６０％、７０％、または８０％が、注射の約８、１２、２４、３６、または４８時間後に血漿中に存在する。ある特定の事例において、複数の粒子の約１０％超が、注射の約１時間後に哺乳動物の血漿中に存在する。ある特定の他の事例において、脂質粒子の存在は、粒子の投与の少なくとも約１時間後に検出可能である。ある特定の実施形態において、核酸等の治療剤の存在は、肺、肝臓、腫瘍の細胞内で、または炎症部位で、投与後の約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、または９６時間時点で検出可能である。他の実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の標的配列の発現の下方制御は、投与後の約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、または９６時間時点で検出可能である。さらに他の実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の標的配列の発現の下方制御は、肝臓細胞（例えば、肝細胞）、腫瘍細胞内で、または炎症部位の細胞内で優先的に生じる。さらなる実施形態において、投与部位に近位もしくは遠位の部位の細胞内、または肺、肝臓、もしくは腫瘍の細胞内における干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の存在または効果は、投与後の約１２、２４、４８、７２、もしくは９６時間時点で、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６、もしくは２８日時点で検出可能である。さらなる実施形態において、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、非経口でまたは腹腔内に投与される。
【０３５２】
本発明の組成物は、単独でまたは他の好適な構成成分と組み合わせてのいずれかで、吸入（例えば、鼻腔内にまたは気管内に）を介して投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧され」得る）へと作製することができる（Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）を参照されたい）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の、加圧された許容される噴射剤中に配置することができる。
【０３５３】
ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達されてもよい。鼻腔エアロゾルスプレーを介して核酸組成物を肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号に記載されている。同じく、鼻腔内微粒子樹脂およ
びリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を使用した薬物の送達もまた、薬学技術分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達が、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。上述の特許の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３５４】
例えば、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内（ｉｎ  ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔｓ））、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路によるもの等の非経口投与に好適な製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図される受容者の血液と等張性にする溶質を含有し得る、水性および非水性の等張滅菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る、水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。本発明の実施において、組成物は、好ましくは、例えば、静脈内注入によって、経口で、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に投与される。
【０３５５】
概して、静脈内に投与されるとき、脂質粒子製剤は、好適な薬学的担体とともに製剤化される。多くの薬学的に許容される担体が、本発明の組成物および方法において用いられてもよい。本発明において使用するための好適な製剤は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に見出される。例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等の、多様な水性担体が使用されてもよく、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性向上のための糖タンパク質を含んでもよい。概して、生理緩衝食塩水（１３５〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）が薬学的に許容される担体として用いられるであろうが、他の好適な担体でも十分であろう。これらの組成物は、濾過等の従来のリポソーム滅菌技法によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要に応じて、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤等、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等の、薬学的に許容される補助材料を含有することができる。これらの組成物は、上に参照される技法を使用して滅菌することができるか、または代替的に、それらは滅菌条件下で生成することができる。結果として生じる水溶液は、使用のためにパッケージ化され得るか、または無菌条件下で濾過され、凍結乾燥させられ得、この凍結乾燥された調製物が、投与前に滅菌水溶液と組み合わせられる。
【０３５６】
ある特定に適用において、本明細書に開示される脂質粒子は、経口投与を介して個体に送達されてもよい。粒子は、賦形剤とともに組み込まれ、摂取できる錠剤（ｉｎｇｅｓｔｉｂｌｅ  ｔａｂｌｅｔｓ）、口腔錠、トローチ、カプセル、丸薬、ロゼンジ、エリキシル、マウスウォッシュ、懸濁液、経口スプレー、シロップ、ウエハ等の形態で使用されてもよい（例えば、米国特許第５，６４１，５１５号、同第５，５８０，５７９号、および同第５，７９２，４５１号を参照されたく、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの経口剤形はまた、次のものを含有してもよい：結合剤、ゼラチン；賦形剤、滑沢剤、および／または香味剤。単位剤形がカプセルであるとき、それは、上述の物質に加えて、液体担体を含有してもよい。種々の他の物質が、コーティング剤として、または投薬単位の物理的形態を他の方法で修正するために、存在してもよい。当然のことながら、いかなる単位剤形を調製する際に使用されるいかなる物質も、薬学的に純粋であり、用いられる量で実質的に非毒性であるべきである。
【０３５７】
典型的に、これらの経口製剤は、少なくとも約０．１％の脂質粒子またはそれよりも多い脂質粒子を含有してもよいが、粒子の割合は、当然のことながら多様であり得、好都合に、総製剤の重量または体積の約１％もしくは２％〜約６０％もしくは７０％の間または
それよりも多くてもよい。必然的に、各治療上有用な組成物中の粒子の量は、好適な投薬量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方式で調製され得る。可溶性、バイオアベイラビリティ、生体半減期、投与経路、生成物の貯蔵寿命等の要因、ならびに他の薬理的考慮事項が、このような薬学的製剤を調製する技術分野の専門家によって企図されることになり、したがって、多様な投薬量および治療レジメンが望ましいことがある。
【０３５８】
経口投与に好適な製剤は、次のものからなることができる：（ａ）水、食塩水、またはＰＥＧ  ４００等の希釈剤中に懸濁させた核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）等の有効量のパッケージ化された治療剤等の、液体溶液、（ｂ）それぞれが液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）等の既定量の治療剤を含有する、カプセル、小袋、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、および（ｄ）好適な乳濁液。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合性の担体のうちの１つ以上を含むことができる。ロゼンジ形態は、香味、例えば、スクロース中に核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）等の治療剤、ならびに治療剤に加えて、当該技術分野で既知の担体を含有するゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア乳濁液、ゲル等の、不活性基剤中に治療剤を含む香錠を含むことができる。
【０３５９】
脂質粒子は、それらの使用の別の例において、広範な局所剤形に組み込むことができる。例えば、ＬＮＰ等の核酸−脂質粒子を含有する懸濁液は、ゲル、油、乳濁液、局所クリーム、ペースト、軟膏、ローション、泡状物質、ムースとして、製剤化し、投与することができる。
【０３６０】
本発明の脂質粒子の薬学的調製物を調製するとき、中空粒子または外部表面と会合した核酸等の治療剤を有する粒子を低減または除去するために精製された粒子の量を使用することが好ましい。
【０３６１】
本発明の方法は、多様な宿主において実施されてもよい。好ましい宿主には、霊長類（例えば、ヒトおよびチンパンジーならびに他の非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ、およびブタ等の哺乳類種が含まれる。
【０３６２】
投与される粒子の量は、治療剤（例えば、核酸）対脂質の比率、使用される特定の治療剤（例えば、核酸）、治療されている疾患または障害、患者の年齢、体重、および病態、ならびに臨床医の判断に依存するであろうが、概して、体重１キログラム当たり約０．０１〜約５０ｍｇの間、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／体重ｋｇ、または１投与（例えば、注射）当たり約１０８〜１０１０粒子であろう。
【０３６３】
Ｂ．  インビトロ投与
インビトロ適用のために、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）等の治療剤の送達は、植物起源または動物起源の細胞、脊椎動物または無脊椎動物、および任意の組織または型の細胞にかかわらず、培養において成長させられる任意の細胞へと行うことができる。好ましい実施形態において、細胞は、動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞、および最も好ましくはヒト細胞（例えば、腫瘍細胞または肝細胞）である。
【０３６４】
細胞と脂質粒子との間の接触は、インビトロで行われるとき、生物学的に適合性の培地中で起こる。粒子の濃度は、特定の適用に応じて大幅に異なるが、概して約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌであろう。脂質粒子での細胞の処理は、概して、生理的温度（約３７oＣ
）で、約１〜４８時間、好ましくは約２〜４時間の一定期間にわたって、行われる。
【０３６５】
好ましい実施形態の１つの群において、脂質粒子懸濁液は、約１０３〜約１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍＬの細胞密度を有する、６０〜８０％コンフルエントにプレートされた細胞に添加される。細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜０．２μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１μｇ／ｍＬの濃度である。
【０３６６】
細胞の組織培養物が必要とされ得る範囲内で、それは当該技術分野で周知である。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、Ｋｕｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．（１９７７）、およびその中に引用される参考文献は、細胞の培養に対する一般的手引きを提供する。培養された細胞系は、しばしば、細胞の単層の形態となろうが、細胞懸濁液もまた使用される。
【０３６７】
Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ（ＥＲＰ）アッセイを使用して、本発明のＬＮＰまたは他の脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ＥＲＰアッセイは、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号に詳述され、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より詳細には、ＥＲＰアッセイの目的は、エンドソーム膜の結合／取り込みまたはエンドソーム膜との融合／その不安定化に対するそれらの相対的効果に基づいて、ＬＮＰの種々のカチオン性脂質およびヘルパー脂質構成成分または他の脂質粒子の効果を識別することである。このアッセイは、ＬＮＰまたは他の脂質粒子の各構成成分がどのように送達効率に影響を及ぼすかを定量的に決定して、それによってＬＮＰまたは他の脂質粒子を最適化することを可能にする。通常、ＥＲＰアッセイは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）の発現を測定し、いくつかの事例においては、発現プラスミドに対して最適化されたＬＮＰ製剤もまた、干渉ＲＮＡをカプセル封入するのに適切であろう。他の事例において、ＥＲＰアッセイは、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の存在または不在下で標的配列の転写または翻訳の下方制御を測定するように適応させることができる。種々のＬＮＰまたは他の脂質粒子の各々についてＥＲＰを比較することによって、最適化された系、例えば、細胞内の最大の取り込みを有するＬＮＰまたは他の脂質粒子を容易に決定することができる。
【０３６８】
Ｃ．  脂質粒子の送達のための細胞
本発明の組成物および方法は、インビボおよびインビトロで、多種多様な細胞型を処理するために使用される。好適な細胞には、肝細胞、細網内皮細胞（例えば、単球、マクロファージ等）、線維芽細胞、内皮細胞、血小板細胞、ウイルスに感染したおよび／またはウイルスに感染しやすい他の細胞型、造血前駆（幹）細胞、角化細胞、骨格筋および平滑筋細胞、骨芽細胞、ニューロン、静止リンパ球、最終分化細胞、分裂速度が遅いまたは分裂していない（ｎｏｎｃｙｃｌｉｎｇ）初代細胞、実質細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、骨細胞等が含まれるが、これらに限定されない。
【０３６９】
特定の実施形態において、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）等の活性剤または治療剤は、肝臓癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肛門癌細胞、胆管癌細胞、小腸癌細胞、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ））細胞、食道癌細胞、胆嚢癌細胞、膵臓癌細胞、虫垂癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、中枢神経系の癌細胞、膠芽腫瘍細胞、皮膚癌細胞、リンパ腫細胞、絨毛腫瘍細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫腫瘍細胞、および血液癌細胞を含むが、これらに限定されない癌細胞
（例えば、固形腫瘍の細胞）に送達される。
【０３７０】
核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）をカプセル封入するＬＮＰ等の脂質粒子のインビボ送達は、任意の細胞型の標的化細胞に適合される。本方法および組成物は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）、ウサギ、ブタ、および霊長類（例えば、サル、チンパンジー、およびヒト）等の哺乳動物を含む、多種多様な脊椎動物の細胞とともに用いることができる。
【０３７１】
Ｄ．  脂質粒子の検出
いくつかの実施形態において、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、対象において、約１、２、３、４、５、６、７、８時間、またはそれを超える時間時点で検出可能である。他の実施形態において、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、対象において、粒子の投与後の約８、１２、２４、４８、６０、７２、もしくは９６時間、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２２、２４、２５、もしくは２８日時点で検出可能である。粒子の存在は、対象からの細胞、組織、または他の生体試料内で検出され得る。粒子は、例えば、粒子の直接検出、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）配列等の治療的干渉ＲＮＡの検出、目的の標的配列の検出（すなわち、目的の配列の発現または低減された発現を検出することによって）、またはそれらの組み合わせによって、検出されてもよい。
【０３７２】
１．  粒子の検出
ＬＮＰ等の本発明の脂質粒子は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して検出することができる。例えば、標識が、当該技術分野で既知の方法を使用して脂質粒子の構成成分に直接的または間接的に結合され得る。多種多様な標識を使用することができ、このうち標識の選定は、必要とされる感受性、脂質粒子構成成分との複合体化の容易さ、安定性要件、ならびに利用可能な器具類および自由に使用できる設備に依存する。好適な標識には、蛍光色素等のスペクトル標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）等のフルオレセインおよび誘導体；テキサスレッド、テトラローダミン（ｔｅｔｒａｒｈｏｄｉｍｉｎｅ）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等のローダミンおよび誘導体、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓ（商標）等；３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ等の放射標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素；コロイド金もしくは着色ガラスまたはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等のプラスチックビーズ等の分光測色スペクトル比色定量標識が含まれるが、これらに限定されない。標識は、当該技術分野で既知の任意の手段を使用して検出することができる。
【０３７３】
２．  核酸の検出
核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）は、本明細書において、当業者に周知の多数の手段によって検出および定量化される。核酸の検出は、サザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射標識、シンチレーション計数、および親和性クロマトグラフィーといった、周知の方法によって処理され得る。分光光度法、放射線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および高拡散クロマトグラフィー（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）といった追加の分析生化学法もまた、利用可能である。
【０３７４】
核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は、重要ではない。種々の核酸ハイブリダイゼーション形式が、当業者に既知である。例えば、一般的な形式には、サンドイッチアッセイおよび競合または置換アッセイが挙げられる。ハイブリダイゼーション技術は、概して、例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｅｄｓ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ（１９８５）に記載されている。
【０３７５】
ハイブリダイゼーションアッセイの感受性は、検出される標的核酸を増やす、核酸増幅系の使用を通じて強化することができる。分子プローブとして使用するための配列の増幅または後続のサブクローニングのための核酸フラグメントの生成に好適なインビトロ増幅技術が、既知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼに媒介される技術（例えば、ＮＡＳＢＡ（商標））を含む、このようなインビトロ増幅技術を通して当業者に示すのに十分な技術の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）、ならびに米国特許第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，１９９０），Ｃ＆ＥＮ３６、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：８１（１９９１）、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９）、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０）、Ｌｏｍｅｌｌ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１（１９９０）、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｅ，４：５６０（１９８９）、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）、およびＳｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３（１９９５）に見出される。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改善された方法は、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。当該技術分野で説明されている他の技術は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ（商標），Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱβ−レプリカーゼ系である。これらの系は、ＰＣＲまたはＬＣＲのプライマーが、選択配列が存在するときにのみ伸長または結合されるように設計される場合に、突然変異体を直接的に識別するために使用され得る。あるいは、選択配列は、一般に、例えば、非特異的ＰＣＲプライマーを使用して増幅し、その後で、増幅された標的領域を、突然変異を示す特定の配列についてプローブすることができる。上述の参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３７６】
例えば、インビトロ増幅方法においてプローブとして使用するため、遺伝子プローブとして使用するため、または阻害性成分としての核酸は、典型的に、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９  １８６２（１９８１）に記載される固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ  ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：６１５９（１９８４）に記載のように、自動合成器を使用して、化学合成される。必要な場合、ポリヌクレオチドの精製は、典型的に、天然アクリルアミドゲル電気泳動またはＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，２５５：１３７  １４９（１９８３）に記載されるアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって行われる。合成ポリヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）ｉｎ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９の化学分解法を使用して検証することができる。
【０３７７】
転写のレベルを判定するための代替的な手段は、インサイツハイブリダイゼーションである。インサイツハイブリダイゼーションアッセイは、周知であり、概して、Ａｎｇｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６４９（１９８７）に記載されている。インサイツハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞は、固体支持体、典型的にはガラススライドに固定される。ＤＮＡをプローブする場合、細胞は、熱またはアルカリで変性させる。細胞を、次いで、中等度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させて、標識化された特定のプローブのアニーリングを可能にする。プローブは、好ましくは、放射同位体または蛍光レポーターで標識化される。
【実施例】
【０３７８】
ＩＸ．  実施例
本発明は、具体的な実施例を用いてより詳細に記載される。次の実施例は、例示説明の目的で提供され、本発明をいかなる様態でも限定することを意図されない。当業者であれば、変更または修正して本質的に同様の結果を得ることができる、多様な重要性の低いパラメータを容易に認識するであろう。
【０３７９】
一般的方法：別途定めのない限り、全ての反応を室温で、窒素の陽圧下で行った。全ての試薬を商業的供給源から購入し、さらに精製することなく使用した。反応進行をシリカゲル６０  Ｆ２５４（０．２５ｍｍ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）上のＴＬＣによって監視した。スポットをＵＶ光下でまたはアニスアルデヒドでの炭化もしくは硫酸銅発色によって検出した。全てのカラムクロマトグラフィーをシリカゲル６０（４０〜６０μＭ）上で行った。シリカゲルと粗生成物との間の比率は、１００〜５０：１の範囲であった。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚまたは４００ＭＨｚで記録し、化学シフトには、残留プロトン性溶媒（７．２７ｐｐｍ  ＣＨＣｌ３）を内部標準とした。有機溶液を真空下で、４０℃未満で濃縮した。
（実施例１）
【０３８０】
この実施例は、本発明の例となるトリアルキルカチオン性脂質の合成を記載する。
化合物９のための合成スキーム
【化１２】
2018039844.tif 000022
化合物２の合成
【化１３】
2018039844.tif 000023
【０３８１】
無水ジクロロメタン（２００ｍＬ）中の（Ｚ）−デカ−４−エン−１−オール９（２０ｇ、１２８．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２６．７ｍＬ、１９１．９ｍｍｏｌ
）の冷却した溶液（０℃）に、メタンスルホニルクロリド（１４．９ｍＬ、１９１．９ｍｍｏｌ）を緩徐に添加した。溶液を室温で３０分間撹拌し、次いでジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈した。溶液を飽和炭酸水素ナトリウム（３×１５０ｍＬ）で洗浄し、次いで組み合わせた水性洗浄物質をジクロロメタン（１５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせたジクロロメタン抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。残渣をシリカのパッド（１００％ジクロロメタン）に通して濾過して、黄色の油（２８．５ｇ、９５％）として（Ｚ）−デカ−４−エニルメタンスルホネート２を得た。Ｒｆ０．５（１００％ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物３の合成
【化１４】
2018039844.tif 000024
【０３８２】
２−メチルテトラヒドロフラン（２８０ｍＬ）中の（Ｚ）−デカ−４−エニルメタンスルホネート２（２８．５ｇ、１２１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラブチルアンモニウムブロミド（４８．８ｇ、１５１．４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を８０℃で３０分間、窒素下で撹拌し、次いでエーテル（１５０ｍＬ）で希釈し、水（７５ｍＬ）およびブライン（７５ｍＬ）で洗浄した。エーテル溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。淡黄色の油をシリカのパッド（１００％ヘキサン）に通して濾過して、無色の油（２３．０ｇ、８７％）として（Ｚ）−１−ブロモデカ−４−エン３を得た。Ｒｆ０．９（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物４の合成
【化１５】
2018039844.tif 000025
【０３８３】
窒素下で無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中の削り状マグネシウム（１．４ｇ、５５．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の（Ｚ）−１−ブロモデカ−４−エン３（１１．５ｇ、５２．５ｍｍｏｌ）の溶液を緩徐に添加した。反応混合物を４５℃で３０分間、窒素下で撹拌した。溶液を０℃まで冷却し、ＴＨＦ（１２ｍＬ）中のギ酸エチル（４．１ｇ、５５．１ｍｍｏｌ）の溶液を５分間にわたって滴加した。溶液を室温で２時間撹拌し、次いで−１５℃まで冷却し、水（１０ｍＬ）、続いて５Ｍ塩酸（１５ｍＬ）で緩徐に反応停止処理した。マグネシウムが完全に溶解した時点で、溶液を水（５０ｍＬ）で希釈し、ヘキサン（３×７５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。得られた残渣をエタノール（４０ｍＬ）中に溶解させ、水酸化カリウム（４．４ｇ、７８．７ｍｍｏｌ））の水溶液（１０ｍＬ）を添加した。反応混合物を３０分間激しく撹拌し、次いで真空下で濃縮して、エタノールを除去した。溶液を次いで５Ｍ塩酸（１５ｍＬ）で酸性にし、ヘキサン（３×７５ｍＬ）で抽出した。組み合わせたヘキサン抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（１００％ヘキサン〜ヘキサン中２．５％酢酸エチル）によって精製して、淡黄色の油（５．６ｇ、３５％）として（６Ｚ，１５Ｚ）−ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１１−オール４を得た。Ｒｆ０．４（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物５の合成
【化１６】
2018039844.tif 000026
【０３８４】
無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の（６Ｚ，１５Ｚ）−ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１１−オール４（５．６ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．８ｍＬ、２７．２ｍｍｏｌ）の冷却した溶液（０℃）に、メタンスルホニルクロリド（２．１
ｍＬ、２７．２ｍｍｏｌ）を緩徐に添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いでジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈した。溶液を飽和炭酸水素ナトリウム（３×２５ｍＬ）で洗浄し、次いで組み合わせた水性洗浄物質をジクロロメタン（５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせたジクロロメタン抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。淡黄色の油をシリカのパッド（１００％ＤＣＭ）に通して濾過して、粗製の無色の油（７．６ｇ）として（６Ｚ，１５Ｚ）−ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１１−イルメタンスルホネート５を得た。Ｒｆ０．８（１００％ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物６の合成
【化１７】
2018039844.tif 000027
【０３８５】
無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）中の（６Ｚ，１５Ｚ）−ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１１−イルメタンスルホネート５（７．６ｇ、１９．６ｍｍｏｌ）およびシアン化ナトリウム（４．８ｇ、９８．１ｍｍｏｌ）の溶液を６０℃まで一晩加熱した。完了すると、反応混合物を水（２００ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。組み合わせた酢酸エチル抽出物をブライン（３×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。生成物をカラムクロマトグラフィー（１００％ヘキサン〜ヘキサン中１％酢酸エチル）によって精製して、無色の油（６．６ｇ、９７％）として（Ｚ）−２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドデカ−６−エンニトリル６を得た。Ｒｆ０．７５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物７の合成
【化１８】
2018039844.tif 000028
【０３８６】
無水ジクロロメタン（１２５ｍＬ）中の（Ｚ）−２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドデカ−６−エンニトリル６（４．０ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）の冷却した溶液（−７８℃）に、ヘキサン中の水素化ジイソブチルアルミニウムの１Ｍ溶液（５．６ｍＬ、３１．５ｍｍｏｌ）を緩徐に添加した。溶液を−１５℃まで加温し、１時間撹拌した。完了すると、反応物を５％塩酸（３０ｍＬ）で反応停止処理し、水素ガスの放散が終止するまで−１５℃で撹拌した。溶液を次いでジクロロメタン（７５ｍＬ）で希釈し、有機層を５Ｍ塩酸（１００ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００％ヘキサン〜ヘキサン中２％酢酸エチル）によって精製して、無色の油（３．９ｇ、９７％）として（Ｚ）−２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドデカ−６−エナール７を得た。Ｒｆ０．６５（５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物８の合成
【化１９】
2018039844.tif 000029
【０３８７】
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の削り状マグネシウム（０．６ｇ、２３．９ｍｍｏｌ）の懸濁液に、テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の（Ｚ）−１−ブロモデカ−４−エン３（４．５ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）の溶液を緩徐に添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いでテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の（Ｚ）−２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドデカ−６−エナール７の溶液を添加した。溶液を室温で１５分間撹拌し、次いで５％塩酸（５０ｍＬ）および氷（１００ｍＬ）中に注いだ。溶液をエーテル（２×１５０
ｍＬ）で抽出した。組み合わせたエーテル抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中１％酢酸エチル）によって精製して、無色の油（４．８ｇ、７６％）として（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８を得た。Ｒｆ０．４５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物９の合成
【化２０】
2018039844.tif 000030
【０３８８】
無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８（０．４ｇ、０．９ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（０．２ｇ、１．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（０．２５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）を添加した。溶液を２時間還流させ、次いで室温で２時間撹拌した。混合物を真空下で濃縮乾固し、カラムクロマトグラフィー（１００％酢酸エチル）によって精製して、淡黄色の油として（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート９を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．３６（ｍ、６Ｈ）、４．９３（ｍ、１Ｈ）、２．３０（ｍ、４Ｈ）、２．２２（ｓ、６Ｈ）、２．０３（ｍ、１２Ｈ）、１．８８（ｍ、２Ｈ）、１．６６〜１．１８（ｍ、３１Ｈ）、０．９０（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．３（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物１１および１３のための合成スキーム
【化２１】
2018039844.tif 000031
化合物１０の合成
【化２２】
2018039844.tif 000032
【０３８９】
無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８（２．４ｇ、５．２ｍｍｏｌ）、６−ブロモヘキサン酸（１．５ｇ、７．８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（１．５ｇ、７．８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（２．０ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジメチルアミノピリジン（１５ｍｇ）を添加した。溶液を２時間還流させ、室温まで冷却し、真空下で濃縮乾固した。反応混合物をシリカゲル６０（２インチ幅×１０インチ長、５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘで溶出）上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、無色の油（３．１ｇ、９４％）として（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）
ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−ブロモヘキサノエート１０を得た。Ｒｆ０．５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物１１の合成
【化２３】
2018039844.tif 000033
【０３９０】
テフロン（登録商標）密封圧力容器中の（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−ブロモヘキサノエート１０（３．１ｇ、４．９ｍｍｏｌ）に、エタノール中５．６Ｍジメチルアミン（２０ｍＬ）を添加し、反応物を７０°Ｃまで加熱し、一晩撹拌した。完了すると、反応を真空下で濃縮乾固した。残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）中に溶解させ、炭酸水素ナトリウム溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、淡黄色の油（２．０ｇ、６９％）として（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート１１を得た、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．３６（ｍ、６Ｈ）、４．９３（ｍ、１Ｈ）、２．２７（ｍ、１０Ｈ）、２．００（ｍ、１２Ｈ）、１．６３（ｍ、６Ｈ）、１．５１（ｍ、６Ｈ）、１．２８（ｍ、２５Ｈ）、０．９０（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．３（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物１２の合成
【化２４】
2018039844.tif 000034
【０３９１】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−ブロモヘキサノエート１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−ブロモペンタノエート１２を無色の油（３．３ｇ、６１％）として、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８（４．０ｇ、８．７ｍｍｏｌ）、６−ブロモ−ｎ−吉草酸（２．４ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（２．５ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３．４ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）、およびジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）から得た。Ｒｆ０．５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物１３の合成
【化２５】
2018039844.tif 000035
【０３９２】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート１３を淡黄色の油（１．９ｇ、６２％）として、エタノール中５．６Ｍジメチルアミン（２０ｍＬ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４５〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、４．９５〜４．９０（ｍ、１Ｈ）、２．３４〜２．２３（ｍ、４Ｈ）、２．２３〜２．２０（ｓ、６Ｈ）、２．０６〜１．９２（ｍ、１２Ｈ）、１．７０〜１．５８（ｍ、５Ｈ
）、１．５８〜１．４４（ｍ、５Ｈ）、１．４４〜１．１５（ｍ、２５Ｈ）、０．９２〜０．８７（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．４（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物１４のための合成スキーム
【化２６】
2018039844.tif 000036
化合物１４の合成
【化２７】
2018039844.tif 000037
【０３９３】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−ノナ−４−エン−１−イル）トリコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート１３（２００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を含有するフラスコを排気し、窒素でバックフィルを行い（２回）、次いでＰｄ／Ｃ（１５０ｍｇ、１０ｗ／ｗ％）で処理し、その後ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）中に懸濁させた。反応フラスコを次いで排気し、Ｈ２でバックフィルを行い（３回）、混合物を激しく撹拌した（１８時間）。Ｈ２を次いで排気し、フラスコにＮ２でバックフィルを行った。反応混合物をセライトに通して濾過し、フィルターケーキをＥｔＯＡｃですすぎ、濾液を濃縮した。粗物質をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）に供して、無色の油として１２−ノニルトリコサン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート１４（１００ｍｇ、５０％）を得た。Ｒｆ０．３５（１０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δＨ）４．９５〜４．９０（ｍ、１Ｈ）、２．３１（ｔ、２Ｈ）、２．２７（ｔ、２Ｈ）、２．２１（ｓ、６Ｈ）、１．６８〜１．６０（ｍ、３Ｈ）、１．５８〜１．４２（ｍ、５Ｈ）、１．３８〜１．１６（ｍ、５４Ｈ）、０．８８（ｔ、６Ｈ）。
化合物１９および２１のための合成スキーム
【化２８】
2018039844.tif 000038
化合物１５の合成
【化２９】
2018039844.tif 000039
【０３９４】
（Ｚ）−デカ−４−エニルメタンスルホネート２の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−ノナ−３−エニルメタンスルホネート１５を黄色の油（２
８．５ｇ、９２％）として、（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−オール（２０．０ｇ、１２８．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６．７ｍＬ、１９１．９ｍｍｏｌ）、およびメタンスルホニルクロリド（１４．９ｍＬ、１９１．９ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．１５（３０％酢酸エチル−ヘキサン）。
化合物１６の合成
【化３０】
2018039844.tif 000040
【０３９５】
（Ｚ）−１−ブロモデカ−４−エン３の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１−ブロモノナ−３−エン１６を無色の油（２７．０ｇ、定量）として、（Ｚ）−デカ−４−エニルメタンスルホネート１５（２８．５ｇ、１２９ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムブロミド（５２．０ｇ、１６１．４ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．６（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物１７の合成
【化３１】
2018039844.tif 000041
【０３９６】
１００ｍＬ丸底フラスコに、削り状マグネシウム（０．６ｇ、２５．７ｍｍｏｌ）および撹拌子を充填した。フラスコを熱線銃で５分間乾燥させた。フラスコにＴＨＦ（５ｍＬ）およびヨウ素上の単一粒子を充填した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中の（Ｚ）−１−ブロモノナ−３−エン（４．５ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）の溶液を混合物に緩徐に添加し、反応を窒素下で３０分間還流させた。溶液を室温まで冷却し、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の（Ｚ）−２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドデカ−６−エナール７（４．７ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、完了すると、混合物を５％ＨＣｌ（５０ｍＬ）および氷（１００ｍＬ）中に注いだ。溶液をエーテル（２×１５０ｍＬ）で抽出し、組み合わせたエーテル抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィー（カラム：２インチ幅×８インチ長、１００％ヘキサン〜ヘキサン中５％酢酸エチルで溶出）によって精製して、無色の油（５．４ｇ、８２％）として（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−オール１７を得た。Ｒｆ０．５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。化合物１８の合成
【化３２】
2018039844.tif 000042
【０３９７】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−ブロモヘキサノエート１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−イル５−ブロモペンタノエート１８を無色の油（０．９ｇ、６６％）として、（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−オール１７（０．３５ｇ、０．７ｍｍｏｌ）、５−ブロモ−ｎ−吉草酸（０．６０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．６０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．９０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（５ｍｇ、触媒）から得た。Ｒｆ０．５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物１９の合成
【化３３】
2018039844.tif 000043
【０３９８】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート１９を無色の油（０．２ｇ、２４％）として、エタノール中５．６Ｍジメチルアミン（１０ｍＬ）および（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−オール１７（０．３５ｇ、０．７ｍｍｏｌ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４０〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、４．９７〜４．８８（ｍ、１Ｈ）、２．３５〜２．２４（ｍ、４Ｈ）、２．２４〜２．１９（ｍ、６Ｈ）、２．０８〜１．９３（ｍ、１２Ｈ）、１．７０〜１．５５（ｍ、３Ｈ）、１．５５〜１．４５（ｍ、５Ｈ）、１．４５〜１．１３（ｍ、２５Ｈ）、０．９３〜０．８２（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．４（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物２０の合成
【化３４】
2018039844.tif 000044
【０３９９】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−ブロモヘキサノエート１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−イル６−ブロモヘキサノエート２０を無色の油（１．４ｇ、９９％）として、（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−オール１７（０．３５ｇ、０．７ｍｍｏｌ）、６−ブロモ−ｎ−カプロン酸（０．７０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．６０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．９０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（５ｍｇ、触媒）から得た。Ｒｆ０．６（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物２１の合成
【化３５】
2018039844.tif 000045
【０４００】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート２１を無色の油（１．２ｇ、９２％）として、エタノール中５．６Ｍジメチルアミン（１５ｍＬ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４４〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、４．９５〜４．８８（ｍ、１Ｈ）、２．３３〜２．１９（ｍ、１０Ｈ）、２．０８〜１．９０（ｍ、１２Ｈ）、１．７０〜１．２３（ｍ、９Ｈ）、１．２３〜１．１４（ｍ、２６Ｈ）、０．９３〜０．８５（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．１５（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物２２のための合成スキーム
【化３６】
2018039844.tif 000046
化合物２２の合成
【化３７】
2018039844.tif 000047
【０４０１】
無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−オール１７（０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（０．３ｇ、１．７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（０．３ｇ、１．７ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（５ｍｇ）を添加した。溶液を室温で一晩、窒素雰囲気下で撹拌した。混合物を真空下で濃縮乾固し、次いでＤＣＭ（１５０ｍＬ）中に取り込み、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出する。反応混合物をシリカゲル６０（１：１酢酸エチル／ヘキサン）上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、無色の油（０．４ｇ、６７％）として（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート２２を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４０〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、４．９７〜４．９０（ｍ、１Ｈ）、２．３６〜２．２５（ｍ、４Ｈ）、２．２５〜２．１９（ｍ、６Ｈ）、２．０７〜１．９５（ｍ、１２Ｈ）、１．８５〜１．７３（ｍ、２Ｈ）、１．５８〜１．４５（ｍ、３Ｈ）、１．４５〜１．１０（ｍ、２４Ｈ）、０．９３〜０．８５（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．４（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物２３、２４、および２５のための合成スキーム
【化３８】
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化合物２３の合成
【化３９】
2018039844.tif 000049
【０４０２】
無水ジエチルエーテル（１０ｍＬ）中の（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８（０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液を、無水ジエチルエーテル中のジホスゲン（０．２ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に緩徐に添加し、およそ−１５℃まで冷却した。溶液を１時間撹拌し、次いでＮ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−１，３−プロパンジアミン（１．３ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を−１５℃で添加した。溶液を室温まで加温し、１時間撹拌し、次いで濾過して、アンモニウム塩および尿素を除去した。ジエチルエーテル濾液を真空下で濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００％酢酸エチル）によって精製して、無色の油（０．１５ｇ、２３％）として（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジ
エン−１１−イル３−（ジメチルアミノ）プロピル（メチル）カルバメート２３を得た、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４１〜５．２９（ｍ、６Ｈ）、４．８５〜４．７７（ｍ、１Ｈ）、３．３５〜３．２１（ｍ、２Ｈ）、２．９３〜２．８１（ｍ、３Ｈ）、２．３１〜２．１７（ｍ、８Ｈ）、２．０８〜１．９２（ｍ、１２Ｈ）、１．７５〜１．６４（ｍ、２Ｈ）、１．６４〜１．１５（ｍ、３１Ｈ）、０．９２〜０．８５（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．４５（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物２４の合成
【化４０】
2018039844.tif 000050
【０４０３】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル３−（ジメチルアミノ）プロピル（メチル）カルバメート２３の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル３−（ジメチルアミノ）プロピルカルバメート２４を無色の油（０．１ｇ、１７％）として、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８（０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ジホスゲン（０．２ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）、ピリジン、および３−（ジメチルアミノ）−１−プロピルアミン（０．９ｇ、８．７ｍｍｏｌ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４４〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、４．８１〜４．７２（ｂｓ、１Ｈ）、４．５５〜４．４５（ｂｓ、１Ｈ）、３．３４〜３．１５（ｍ、３Ｈ）、２．４５〜２．１３（ｍ、７Ｈ）、２．１０〜１．８６（ｍ、１２Ｈ）、１．７５〜１．５７（ｍ、３Ｈ）、１．５７〜１．０３（ｍ、３０Ｈ）、０．９３〜０．８５（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．２（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物２５の合成
【化４１】
2018039844.tif 000051
【０４０４】
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル３−（ジメチルアミノ）プロピル（メチル）カルバメート２３の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル２−（ジメチルアミノ）エチルカルバメート２５を無色の油（０．２０ｇ、３３％）として、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８（０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ジホスゲン（０．２ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（０．８ｇ、８．７ｍｍｏｌ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４０〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、５．０８〜５．０１（ｂｓ、１Ｈ）、４．８２〜４．７３（ｂｓ、１Ｈ）、３．３０〜３．１８（ｍ、２Ｈ）、２．４４〜２．３５（ｍ、２Ｈ）、２．３０〜２．２０（ｍ、６Ｈ）、２．０７〜１．９１（ｍ、１２Ｈ）、１．６５〜１．１１（ｍ、３１Ｈ）、０．９３〜０．８５（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．４（１０％ＭｅＯＨ−ＤＣＭ）。
化合物２６、２７、および２８のための合成スキーム
【化４２】
2018039844.tif 000052
化合物２６の合成
【化４３】
2018039844.tif 000053
【０４０５】
無水Ｅｔ２Ｏ（１５ｍＬ）中の（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１５−ジエン−１０−オール１７（２．２５ｇ、５．０３６ｍｍｏｌ）およびピリジン（６１１μＬ、７．６ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｅｔ２Ｏ（１５ｍＬ）中のジホスゲン（９１０μＬ、７．６ｍｍｏｌ）の冷却した（０°Ｃ）溶液に添加した。撹拌した後（１０分間）、反応混合物を濾過し、濃縮して、溶媒および残りのホスゲンガスを除去した。このクロロギ酸塩のうちの３分の１（０．８７９ｇ、１．６７９ｍｍｏｌ）を、Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）中に取り込み、無水Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）中のＮ，Ｎジメチルエチレンジアミン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｈｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）（３６７μＬ、３．４ｍｍｏｌ）の冷却した（０°Ｃ）溶液に添加した。撹拌した後（２０分間）、混合物を濾過し、濃縮し、クロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃ）に供して、無色透明な油として（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１５−ジエン−１０−イル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメート２６（６０３ｍｇ、６４％）を得た。Ｒｆ０．２８（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δＨ）５．４５〜５．３６（ｍ、６Ｈ）、５．３０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、４．８９〜４．７８（ｍ、１Ｈ）、３．３２〜３．２１（ｍ、２Ｈ）、２．４２（ｔ、２Ｈ）、２．２５（ｓ、６Ｈ）、２．１６〜１．９４（ｍ、１２Ｈ）、１．６３〜１．１９（ｍ、２９Ｈ）、０．９２（ｔ、９Ｈ）。
化合物２７の合成
【化４４】
2018039844.tif 000054
【０４０６】
クロロギ酸塩（０．８８ｇ、１．７ｍｍｏｌ）（（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１５−ジエン−１０−イル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメート２６の合成において調製した）の冷却した（０℃）溶液を、無水Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）中に溶解させ、無水Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）中のＮ，Ｎジメチルプロピルジアミン（４２２μＬ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。完了すると（２０分間）、溶液を濾過し、濃縮し、次いで粗物質をカラムクロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、無色透明な油として（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１５−ジエン−１０−イル（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルバメート２７（６７５ｍｇ、７０％）を得た。Ｒｆ０．３２（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δＨ）５．４４〜５．３３（ｍ、６Ｈ）、４．８６〜４．７８（ｍ、１Ｈ）、３．３２〜３．２１（ｍ、２Ｈ）、２．３６（ｔ、２Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、２．１４〜１．９７（ｍ、１２Ｈ）、１．６９（見かけ上ｐ、２Ｈ）、１．６１〜１．５０（ｍ、３Ｈ）、１．５０〜１．２０（ｍ、２７Ｈ）、０．９１（ｔ、９Ｈ）。
化合物２８の合成
【化４５】
2018039844.tif 000055
【０４０７】
クロロギ酸塩（０．８８ｇ、１．７ｍｍｏｌ）（（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１５−ジエン−１０−イル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメート２６の合成において調製した）の冷却した（０℃）溶液を、無水Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）中に溶解させ、無水Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）中のＮ，Ｎ，Ｎ’トリメチルプロピルジアミン（４９２μＬ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。完了すると（２０分間）、溶液を濾過し、濃縮し、次いで粗物質をカラムクロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、無色透明な油として（６Ｚ，１５Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１０−イル（３−（ジメチルアミノ）プロピル）（メチル）カルバメート２８（６７２ｍｇ、６８％）を得た。Ｒｆ０．４４（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δＨ）５．４３〜５．３２（ｍ、６Ｈ）、４．８５（ｂｒ．ｓ、１Ｈ）、３．３８〜３．２７（ｍ、２Ｈ）、２．９５〜２．８７（ｍ、３Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、２．１４〜１．９６（ｍ、１２Ｈ）、１．７２（見かけ上ｐ、２Ｈ）、１．６７〜１．４９（ｍ、３Ｈ）、１．４９〜１．２０（ｍ、２６Ｈ）、０．９１（ｔ、９Ｈ）。
化合物３０および３１のための合成スキーム
【化４６】
2018039844.tif 000056
化合物２９の合成
【化４７】
2018039844.tif 000057
【０４０８】
１００ｍＬ丸底フラスコに、削り状マグネシウム（２６３ｍｇ、１０．９ｍｍｏｌ）および撹拌子を充填した。フラスコを熱線銃で５分間乾燥させ、窒素下で冷却した後、ＴＨＦ（５ｍＬ）およびヨウ素の小粒子を添加した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中の（Ｚ）−１−ブロモデカ−４−エン３（２ｇ、９．１ｍｍｏｌ）の溶液を緩徐に添加した。溶液を室温で２時間撹拌し、次いでグリオキサル酸エチル（０．３７５ｍＬ、１．８２ｍｍｏｌ、トルエン中５０％溶液）を添加した。完了すると、溶液を飽和塩化アンモニウム溶液（５ｍＬ）で反応停止処理し、過剰のマグネシウムが溶解するまで撹拌した。溶液を水で希釈し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００％ヘキサン〜ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、無色の油（７００ｍｇ、４８％
）として（６Ｚ，１６Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１，１２−ジオール２９を得た。
化合物３０の合成
【化４８】
2018039844.tif 000058
【０４０９】
６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート９の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）−１２−ヒドロキシドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート３０を無色の油（０．１０ｇ、２５％）として、（６Ｚ，１６Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１，１２−ジオール（０．３５ｇ、０．７ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（０．２０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．２０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（５ｍｇ、触媒）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４４〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、５．０３〜４．９５（ｍ、１Ｈ）、２．２５〜２．１７（ｍ、６Ｈ）、２．１４〜１．６５（ｍ、１４Ｈ）、１．６５〜１．１０（ｍ、３３Ｈ）、０．９３〜０．８２（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．２（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物３１の合成
【化４９】
2018039844.tif 000059
【０４１０】
６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート９の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）−１２−ヒドロキシドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル３−（ジメチルアミノ）プロパノエート３１を無色の油（０．４ｇ、３３％）として、（６Ｚ，１６Ｚ）−１１−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１，１２−ジオール（１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（０．５０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．６０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．８０ｇ、６．３ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（５ｍｇ、触媒）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４０〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、５．１２〜５．０７（ｍ、１Ｈ）、４．７５〜４．５５（ｂｓ、１Ｈ）、２．７７〜２．６５（ｍ、１Ｈ）、２．６５〜２．４１（ｍ、３Ｈ）、２．２８〜２．１５（ｍ、６Ｈ）、２．１５〜１．９２（ｍ、１２Ｈ）、１．６７〜１．１０（ｍ、３０Ｈ）、０．９３〜０．８２（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．５（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物４０のための合成スキーム
【化５０】
2018039844.tif 000060
化合物３３の合成
【化５１】
2018039844.tif 000061
【０４１１】
２の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−ノナ−３−エニルメタンスルホネート３３を黄色の油（３３ｇ、８５％）として、（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−オール３２（２５．０ｇ、１７６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２５．０ｍＬ）、およびメタンスルホニルクロリド（２７．２ｍＬ、３５２ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．６８（ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物３４の合成
【化５２】
2018039844.tif 000062
【０４１２】
３の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−ノナ−３−エニルブロミド３４を黄色の油（２０．２ｇ、８５％）として、（Ｚ）−ノナ−３−エニルメタンスルホネート（２５．７ｇ、１１７ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムブロミド（５２．６ｇ、１６３ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．７３（ヘキサン）。
化合物３５の合成
【化５３】
2018039844.tif 000063
【０４１３】
４の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−６，１３−ジエン−１０−オール３５（９．１１ｇ、８５％）を無色の油として、（Ｚ）−ノナ−３−エニルブロミド（１５．８ｇ、７６．８ｍｍｏｌ）、削り状マグネシウム（２．０ｇ、８２ｍｍｏｌ）、ギ酸エチル（６．３６ｍＬ、７９．１ｍｍｏｌ）、および水酸化カリウム（３．８８ｇ、６９．１ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．４３（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物３６の合成
【化５４】
2018039844.tif 000064
【０４１４】
５の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−６，１３−ジエン−１０−イルメタンスルホネート３６（１１．６ｇ、９９％）を無色の油として、（６Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−６，１３−ジエン−１０−オール（９．
１１ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１０ｍＬ）、およびメタンスルホニルクロリド（５．０ｍＬ、６５ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．７３（ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物３７の合成
【化５５】
2018039844.tif 000065
【０４１５】
６の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ウンデカ−５−エンニトリル３７（７．２ｇ、７７％）を無色の油として、（６Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−６，１３−ジエン−１０−イルメタンスルホネート（１１．６ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）およびシアン化ナトリウム（３．９６ｇ、８０．９ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．７５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物３８の合成
【化５６】
2018039844.tif 000066
【０４１６】
７の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ウンデカ−５−エナール３８（５．０ｇ、６９％）を無色の油として、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ウンデカ−５−エンニトリル（７．２ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）およびＤＩＢＡＬ（ヘキサン中１Ｍ溶液として４９．７ｍＬ、４９．７ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．６９（１０  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物３９の合成
【化５７】
2018039844.tif 000067
【０４１７】
８の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１４Ｚ）−１１−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）イコサ−６，１４−ジエン−１０−オール３９（１．６４ｇ、７６％）を無色の油として、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ウンデカ−５−エナール（１．５ｇ、５．１ｍｍｏｌ）、（Ｚ）−ノナ−３−エニルブロミド（１．５８ｇ、７．７ｍｍｏｌ）および削り状マグネシウム（２０６ｍｇ、８．５ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．４６（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物４０の合成
【化５８】
2018039844.tif 000068
【０４１８】
９の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート４０（４８３ｍｇ、７６％）を無色の油として、（６Ｚ，１４Ｚ）−１１−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）イコサ−６，１４−ジエン−１０−オール（５００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６８６ｍｇ、３．５８ｍｍｏｌ）、ヒューニッヒ塩基（７２６μＬ、４．１７ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎジメチルアミノ酪酸塩酸塩（６００ｍｇ、３．５８ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．４３（１０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物４２のための合成スキーム
【化５９】
2018039844.tif 000069
化合物４１の合成
【化６０】
2018039844.tif 000070
【０４１９】
１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１４Ｚ）−１１−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）イコサ−６，１４−ジエン−１０−イル５−ブロモペンタノエート４１（６５５ｍｇ、９５％）を無色の油として、（６Ｚ，１４Ｚ）−１１−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）イコサ−６，１４−ジエン−１０−オール（５００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６８６ｍｇ、３．５８ｍｍｏｌ）、および５−ブロモ吉草酸（６４９ｍｇ、３．５８ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．５４（５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物４２の合成
【化６１】
2018039844.tif 000071
【０４２０】
１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１４Ｚ）−１１−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）イコサ−６，１４−ジエン−１０−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート４２（４２１ｍｇ、６８％）を無色の油として、（６Ｚ，１４Ｚ）−１１−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）イコサ−６，１４−ジエン−１０−イル５−ブロモペンタノエート（６５５ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）およびジメチルアミン（ＥｔＯＨ中５．６Ｍ溶液として２５ｍＬ）から得た。Ｒｆ０．４（１０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物５０のための合成スキーム
【化６２】
2018039844.tif 000072
化合物４４の合成
【化６３】
2018039844.tif 000073
【０４２１】
４の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、ヘンイコサン−１１−オール４４（７．０６ｇ、９９％）を無色の油として、ブロモデカン（９．４ｍＬ、４５．２ｍｍｏｌ）、削り状（ｔｕｒｉｎｉｎｇｓ）マグネシウム（１．１８ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）、ギ酸エチル（３．７４ｍＬ、４６．６ｍｍｏｌ）、および水酸化カリウム（２．２８ｇ、４０．７ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．３６（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）、ＦＷ  ３１２．５７、Ｃ２１Ｈ４４Ｏ。
化合物４５の合成
【化６４】
2018039844.tif 000074
【０４２２】
５の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、ヘンイコサン−１１−イルメタンスルホネート４５（６．８７ｇ、７８％）を無色の油として、ヘンイコサン−１１−オール（７．０６ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２２ｍＬ）、およびメタンスルホニルクロリド（３．５ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．８６（ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物４６の合成
【化６５】
2018039844.tif 000075
【０４２３】
６の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、２−デシルドデカンニトリル４６（２．２５ｇ、４０％）を無色の油として、ヘンイコサン−１１−イルメタンス
ルホネート（６．８７ｇ、１７．６ｍｍｏｌ）およびシアン化ナトリウム（４．３１ｇ、８７．９ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．８４（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物４７の合成
【化６６】
2018039844.tif 000076
【０４２４】
７の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、２−デシルドデカナール４７（１．９１ｇ、８４％）を無色の油として、２−デシルドデカンニトリル（２．２５ｇ、７．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＢＡＬ（ヘキサン中１Ｍ溶液として１４ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．５１（５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物４８の合成
【化６７】
2018039844.tif 000077
【０４２５】
８の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−デシルドコサ−６−エン−１１−オール４８（１．０８ｇ、４０％）を無色の油として、２−デシルドデカナール（１．９１ｇ、５．８７ｍｍｏｌ）、（Ｚ）−デカ−４−エニルブロミド（１．４５ｇ、７．０５ｍｍｏｌ）、および削り状マグネシウム（１８３ｍｇ、７．５４ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．２６（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物４９の合成
【化６８】
2018039844.tif 000078
【０４２６】
１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−デシルドコサ−６−エン−１１−イル５−ブロモペンタノエート４９（９１６ｍｇ、６３％）を無色の油として、（Ｚ）−１２−デシルドコサ−６−エン−１１−オール（１．０８ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（８０４ｍｇ、４．１９ｍｍｏｌ）、および５−ブロモ吉草酸（１．２７ｇ、６．９９ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．２９（５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物５０の合成
【化６９】
2018039844.tif 000079
【０４２７】
１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−デシルドコサ−６−エン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート５０（６６２ｍｇ、８０％）を無色の油として、（Ｚ）−１２−デシルドコサ−６−エン−１１−イル５−ブロモペンタノエート（９１６ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミン（ＥｔＯＨ中５．６Ｍ溶液として２７ｍＬ）から得た。Ｒｆ０．５１（１０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物５３のための合成スキーム
【化７０】
2018039844.tif 000080
化合物５１の合成
【化７１】
2018039844.tif 000081
【０４２８】
８の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−１６−エン−１１−オール５１（３．３７ｇ、６５％）を無色の油として、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドデカ−６−エナール７（３．６ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）、１−ブロモデカン（３．５ｍＬ、１６．９ｍｍｏｌ）、および削り状マグネシウム（４３８ｍｇ、１８．０ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．３１（５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物５２の合成
【化７２】
2018039844.tif 000082
【０４２９】
１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−１６−エン−１１−イル５−ブロモペンタノエート５２（４．６９ｇ、９９％）を無色の油として、（Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−１６−エン−１１−オール（３．３７ｇ、７．２９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．５１ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）、および５−ブロモ吉草酸（３．９６ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．５６（５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物５３の合成
【化７３】
2018039844.tif 000083
【０４３０】
１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−デシルドコサ−６−エン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート５３（９４３ｍｇ、９９％）を無色の油として、（Ｚ）−１２−デシルドコサ−６−エン−１１−イル５−ブロモペンタノエート（１．０ｇ、１．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミン（ＥｔＯＨ中５．６Ｍ溶液として３０ｍＬ）から得た。Ｒｆ０．５０（１０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ
２）。
（実施例２）
【０４３１】
この実施例は、マウスＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ活性モデルにおいて、本発明の短鎖トリアルキル脂質の有効性を、より長いアルキル鎖を有するが、それ以外はこの短鎖トリアルキル脂質と構造的に同一である脂質と比較する。
【０４３２】
カチオン性脂質を含有する核酸−脂質粒子製剤を、７〜９週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓においてＡｐｏＢ発現をノックダウンするそれらの能力について評価した。０．０２、０．０３、または０．０５ｍｇ／ｋｇのいずれかの３つの群においてマウスに静脈内（尾静脈）投与した。ＡｐｏＢノックダウン（ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化）を、陰性対照としてのＰＢＳと比べて測定した。各実験を投薬の４８時間後に終了した。
【０４３３】
陽性対照との比較のために、本発明の短鎖トリアルキル脂質の性能を、インビボで核酸−脂質粒子における核酸送達を促進することが知られている、Ｃ２Ｋと称される強力なカチオン性脂質と比較した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｖｏｌ  ２８（２），１７２（２０１０）。Ｃ２Ｋは、次の構造を有する：
【化７４】
2018039844.tif 000084
【０４３４】
表１に示されるように、０．０２ｍｇ／ｋｇの注射量で、本発明の１１個のカチオン性脂質のうちの１０個（化合物９、１３、１４、１９、２２、２７、４０、４２、５０、および５３）が、Ｃ２Ｋよりも大きい活性を示した。
【表１】
2018039844.tif 000085
【０４３５】
表２に示されるように、別個の実験において、０．０３ｍｇ／ｋｇの注射量で、本発明の７個のカチオン性脂質のうちの５個（化合物１１、１３、１９、２３、および２５）が、Ｃ２Ｋよりも大きい活性を示した。
【表２】
2018039844.tif 000086
【０４３６】
本発明のカチオン性脂質の活性をまた、アルキル鎖がより長いことを除いて本発明の脂質と構造的に同一である、対応するトリアルキルカチオン性脂質とも比較した。これらのより長鎖のトリアルキルカチオン性脂質（化合物５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０として特定される）の構造が表３に示される。
【表３】
2018039844.tif 000087
化合物５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１１年９月１６日に出願された米国特許出願第１３／２３５，２５３号に記載される手順に従って調製した。
【０４３７】
表４に示されるように、より長鎖の脂質５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０を０．０５ｍｇ／ｋｇ（表１に記載される用量の２．５倍）で投薬し、それはＣ２Ｋの６０％と比較して＋２５％〜−６９％の範囲のＡｐｏＢノックダウンを示した（すなわち、いくつかの化合物は、Ｃ２Ｋを上回る中程度の改善を示した）。
【表４】
2018039844.tif 000088
【０４３８】
一般に、本発明のより短鎖の（Ｃ９〜Ｃ１０）トリアルキルカチオン性脂質の活性は、同等の脂質である、対応するより長鎖のトリリノレイル（Ｃ１８）と比較したとき、大幅に改善された。例えば、化合物１３と、そのトリリノレイル変形５４との直接比較は、化合物１３の用量が２．５倍低かったという事実にもかかわらず、ＡｐｏＢノックダウンにおいて−６％（０．０５ｍｇ／ｋｇ）〜−８０％（０．０２ｍｇ／ｋｇ）の改善を示した。同じ傾向が、化合物５５を１１と、５６を２４と、および５７を２５と比較したときに観察された。
（実施例３）
【０４３９】
マウスＡｐｏＢモデルにおけるさらなる実験は、陽性対照として異なるカチオン性脂質、すなわちＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡを使用した。ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡは、特許出願第ＷＯ  ２０１１／１４１７０５号に記載され、次の構造を有する：
【化７５】
2018039844.tif 000089
【０４４０】
表５に示されるように、同じマウスＡｐｏＢモデルにおいて、ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡは、３つの別個の実験においてＣ２Ｋよりも有効であることが示されたことから、妥当な陽性対照である：
【表５−１】
2018039844.tif 000090
【表５−２】
2018039844.tif 000091
【０４４１】
別の実験において、本発明のさらに２つの脂質（化合物６２および７１）を、ＡｐｏＢを標的とするｓｉＲＮＡを含む脂質ナノ粒子へと製剤化した。マウスに静脈内（尾静脈）投与し、投薬の４８時間後に屠殺した。肝臓を採取し、均質化し、ＡｐｏＢサイレンシングのレベル（ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化）を次いで、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイを介して測定した。結果が表６に示され、ＰＢＳ処理陰性対照群に対する割合（％）として表される。この実験に使用されたｓｉＲＮＡ配列は異なり、実施例２に使用されたものよりも効力が低かった。実験間の比較はしたがって可能でない：
【表６】
2018039844.tif 000092
【０４４２】
化合物７１は、ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ対照と同様の活性を有した。化合物６２は、大幅により活性であった。これらのおよび他の化合物の合成が実施例４に記載される。
（実施例４）
【０４４３】
この実施例は、本発明のさらなる化合物の合成を記載する。
化合物６２のための合成スキーム
【化７６】
2018039844.tif 000093
化合物６１の合成
【化７７】
2018039844.tif 000094
５の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イルメタンスルホネート６１（１．１８ｇ、９０％）を無色の油として、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８（１．１２ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（８ｍＬ）、およびメタンスルホニルクロリド（０．３８ｍＬ、４．９ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．９１（ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物６２の合成
【化７８】
2018039844.tif 000095
トルエン（３０ｍＬ）中のメシル酸塩６１（１．０９ｇ、２．０１ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブタノール（１．３４ｍＬ、１０．１ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（６０％の油中分散体として４４２ｍｇ、１１．１ｍｍｏｌ）で順次に処理した。ガス放散が終止した時点で、反応混合物を還流させ（１１５°Ｃ溶液槽温度）、撹拌した（５０時間）。反応混合物を次いで冷却し（室温）、冷水中に注ぎ、次いでＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせた有機物を水およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、クロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃ）を介して精製して、淡黄色の油として４−（（（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタン−１−アミン６２（１４３ｍｇ、１３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４１〜５．３０（ｍ、６Ｈ）、３．４６〜３．３５（ｍ、２Ｈ）、３．１９〜３．１４（ｍ、１Ｈ）、２．３４（ｔ、２Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、２．１０〜１．９３（ｍ、１２Ｈ）、１．６０〜１．０９（ｍ、３５Ｈ）、０．９０（ｔ、９Ｈ）。Ｒｆ０．５４（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物７１のための合成スキーム
【化７９】
2018039844.tif 000096
化合物６３の合成
【化８０】
2018039844.tif 000097
５の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、３，７−ジメチルオクチルメタンスルホネート６３（７．４７ｇ、９９％超）を無色の油として、３，７−ジメチルオクタン−１−オール（５．０ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（８ｍＬ）、およびメタンスルホニルクロリド（４．８９ｍＬ、６３．２ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．６９（ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物６４の合成
【化８１】
2018039844.tif 000098
３の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、１−ブロモ−３，７−ジメチルオクタン６４を無色の油（６．０ｇ、８６％）として、３，７−ジメチルオクチルメタンスルホネート６３（７．４７ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムブロミド（１３．２ｇ、４１．１ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．９２（ヘキサン）。
化合物６５の合成
【化８２】
2018039844.tif 000099
４の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、２，６，１２，１６−テトラメチルヘプタデカン−９−オール６５（７．０ｇ、定量）を無色の油として、１−ブロモ−３，７−ジメチルオクタン６４（１０ｇ、４５．２ｍｍｏｌ）、削り状マグネシウム（１．２１ｇ、４９．８ｍｍｏｌ）、ギ酸エチル（３．８ｍＬ、４７．５ｍｍｏｌ）、および水酸化カリウム（３．８ｇ、６７．８ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．３８（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物６６の合成
【化８３】
2018039844.tif 000100
５の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、２，６，１２，１６−テトラメチルヘプタデカン−９−イルメタンスルホネート６６（１．５６ｇ、８７％）を無色の油として、２，６，１２，１６−テトラメチルヘプタデカン−９−オール６５（１．３９ｇ、５．１４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３ｍＬ）、およびメタンスルホニルクロリド（０．８ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．８（ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物６７の合成
【化８４】
2018039844.tif 000101
６の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、２−（３，７−ジメチルオクチル）−５，９−ジメチルデカンニトリル６７（０．８ｇ、５６％）を無色の油として、２，６，１２，１６−テトラメチルヘプタデカン−９−イルメタンスルホネート６６（１．５６ｇ、４．４８ｍｍｏｌ）およびシアン化ナトリウム（０．５５ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．８（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物６８の合成
【化８５】
2018039844.tif 000102
７の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、２−（３，７−ジメチルオクチル）−５，９−ジメチルデカナール６８（０．６３ｇ、７８％）を無色の油として、２−（３，７−ジメチルオクチル）−５，９−ジメチルデカンニトリル６７（０．８ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）およびＤＩＢＡＬ（ヘキサン中１Ｍ溶液として５．７４ｍＬ、５．７４ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．６（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物６９の合成
【化８６】
2018039844.tif 000103
８の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、１０−（３，７−ジメチルオクチル）−２，６，１３，１７−テトラメチルオクタデカン−９−オール６９（０．５３ｇ、６２％）を無色の油として、２−（３，７−ジメチルオクチル）−５，９−ジメチルデカナール６８（０．６ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、１−ブロモ−３，７−ジメチルオクタン６４（２．０ｇ、９．０ｍｍｏｌ）、および削り状マグネシウム（２３２ｍｇ、９．６７ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．３７（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物７０の合成
【化８７】
2018039844.tif 000104
１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、１０−（３，７−ジメチルオクチル）−２，６，１３，１７−テトラメチルオクタデカン−９−イル５−ブロモペンタノエート６８（４５０ｍｇ、粗）を黄色の油として、１０−（３，７−ジメチルオクチル）−２，６，１３，１７−テトラメチルオクタデカン−９−オール６９（２００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２４６ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）、および５−ブロモ吉草酸（２４６ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．４９（５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物７１の合成
【化８８】
2018039844.tif 000105
１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、１０−（３，７−ジメチルオクチル）−２，６，１３，１７−テトラメチルオクタデカン−９−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート７１（１８４ｍｇ、７２％、２ステップ）を無色の油として、１０−（３，７−ジメチルオクチル）−２，６，１３，１７−テトラメチルオクタデカン−９−イル５−ブロモペンタノエート６８（４５０ｍｇ、粗）およびジメチルアミン（ＥｔＯＨ中２．０Ｍ溶液として１０ｍＬ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．９５〜４．８７（ｍ、１Ｈ）、２．３３（ｔ、２Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．２３（ｓ、６Ｈ）、１．７４〜１．６０（ｍ、４Ｈ）、１．５８〜０．９９（ｍ、３７Ｈ）、０．９３〜０．７９（ｍ、２７Ｈ）。Ｒｆ０．４３（１０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物７４のための合成スキーム
【化８９】
2018039844.tif 000106
化合物７２の合成
【化９０】
2018039844.tif 000107
８の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１０−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）−２，６−ジメチルイコサ−１４−エン−９−オール７２（０．６２ｇ、７２％）を無色の油として、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドデカ−６−エナール７（０．６ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）、１−ブロモ−３，７−ジメチルオクタン６４（３．９ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）、および削り状マグネシウム（４５４ｍｇ、１８．７ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．６１（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物７３の合成
【化９１】
2018039844.tif 000108
１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１０−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）−２，６−ジメチルイコサ−１４−エン−９−イル５−ブロモペンタノエート７３（９００ｍｇ、粗）を黄色の油として、（Ｚ）−１０−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）−２，６−ジメチルイコサ−１４−エン−９−オール７２（６２０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）、および５−ブロモ吉草酸（５００ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．７２（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物７４の合成
【化９２】
2018039844.tif 000109
１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１０−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）−２，６−ジメチルイコサ−１４−エン−９−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート７４（４６６ｍｇ、５８％、２ステップ）を無色の油として、（Ｚ）−１０−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）−２，６−ジメチルイコサ−１４−エン−９−イル５−ブロモペンタノエート７３（９００ｍｇ、粗）およびジメチルアミン（ＥｔＯＨ中２．０Ｍ溶液として１５ｍＬ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４３〜５．２９（ｍ、４Ｈ）、４．９４〜４．８８（ｍ、１Ｈ）、２．３２（ｔ、２Ｈ）、２．２６（ｔ、２Ｈ）、２．１５（ｓ、６Ｈ）、２．０８〜１．９３（ｍ、８Ｈ）、１．７０〜１．００（ｍ、４３Ｈ）、０．９５〜０．８３（ｍ、１５Ｈ）。Ｒｆ０．４２（１０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物７６のための合成スキーム
【化９３】
2018039844.tif 000110
化合物７５の合成
【化９４】
2018039844.tif 000111
５−ブロモペンタン−１−オール（１．０ｇ、５．９９ｍｍｏｌ）の溶液を、密封容器中でジメチルアミン（ＥｔＯＨ中２Ｍ溶液として１０ｍＬ）とともに調製し、加熱した（８０°Ｃ）。撹拌した後（１６時間）、ジメチルアミンおよびＥｔＯＨを減圧下で除去して、黄色がかったオレンジ色の固体として５−（ジメチルアミノ）ペンタン−１−オール臭
化水素酸塩７５（１．２６ｇ、定量）を得た。Ｒｆ０．２５（１０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物７６の合成
【化９５】
2018039844.tif 000112
６２の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、５−（（（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタン−１−アミン７６（８６４ｍｇ、３７％）を淡黄色の油として、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エン−１−イル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イルメタンスルホネート６１（１．８６ｇ、３．４５ｍｍｏｌ）、５−（ジメチルアミノ）ペンタン−１−オール臭化水素酸塩７５（１．２６ｇ、５．９９ｍｍｏｌ）、およびＮａＨ（６０％の油中分散体として２８８ｍｇ、７．２ｍｍｏｌ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４３〜５．３２（ｍ、６Ｈ）、３．４６〜３．３３（ｍ、２Ｈ）、３．１８〜３．１２（ｍ、１Ｈ）、２．３０〜２．１８（ｍ、８Ｈ）、２．０７〜１．９３（ｍ、１２Ｈ）、１．６１〜１．０４（ｍ、３７Ｈ）、０．８９（ｔ、９Ｈ）。Ｒｆ０．４７（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物７９のための合成スキーム
【化９６】
2018039844.tif 000113
化合物７７の合成
【化９７】
2018039844.tif 000114
無水ジクロロメタン（１２５ｍＬ）中の（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８（５ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）の冷却した溶液（−１５°Ｃ）に、ジエチル亜鉛（ヘキサン中１Ｍ、８２ｍＬ、８１．８ｍｍｏｌ）を窒素下で２０分間にわたって滴加した。溶液を０°Ｃで７０分間撹拌し、次いでジヨードメタン（６．６ｍＬ、８１．８ｍｍｏｌ）を注意深く添加した。溶液を一晩撹拌して、室温まで温めさせた。完了すると、溶液を氷水（３５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（４５０ｍＬ）で希釈した。次いで５％ＨＣｌ（３５０ｍＬ）を添加して、形成した乳濁
液を軽減する一助とした。有機層をＮａＨＣＯ３（飽和水溶液５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ）、およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。組み合わせた水層を酢酸エチルで逆抽出した。組み合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固した。残渣をシリカゲル（ヘキサン中２．５％酢酸エチル）上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、ピンク色の油を得た。この色（Ｉ２）を除去するために、精製した生成物をジクロロメタン（１５０ｍＬ）中に溶解させ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（飽和水溶液２×４０ｍＬ）で洗浄して、淡黄色の油（５．５４ｇ、９６．５％）として１，８−ビス（２−ペンチルシクロプロピル）−５−（３−（２−ペンチルシクロプロピル）プロピル）オクタン−４−オール７７を得た。
化合物７８の合成
【化９８】
2018039844.tif 000115
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６ブロモヘキサノエート１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、１，８−ビス（２−ペンチルシクロプロピル）−５−（３−（２−ペンチルシクロプロピル）プロピル）オクタン−４−イル６−ブロモヘキサノエートを粗製の油として、１，８−ビス（２−ペンチルシクロプロピル）−５−（３−（２−ペンチルシクロプロピル）プロピル）オクタン−４−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート（０．７５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（５．２ｍｌ）、６−ブロモヘキサン酸（０．８８ｇ、４．５ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．８７ｇ、４．５ｍｍｏｌ）、および４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）から得た。生成物を次のステップで、さらに精製することなく使用した。
化合物７９の合成
【化９９】
2018039844.tif 000116
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ（ｄｉｍｅｔｈｙａｍｉｎｏ））ヘキサノエート１１の合成について記載する手順と類似した手順を使用して、油（０．５６ｇ、５９％）として、１，８−ビス（２−ペンチルシクロプロピル）−５−（３−（２−ペンチルシクロプロピル）プロピル）オクタン−４−イル６−ブロモヘキサノエート（１．０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびエタノール中２．０Ｍジメチルアミン（３．５ｍＬ）から得た。Ｒｆ０．５０（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物８３のための合成スキーム
【化１００】
2018039844.tif 000117
化合物８０の合成
【化１０１】
2018039844.tif 000118
無水ジクロロメタン（５００ｍＬ）中の２−オクチルドデカン−１−オール（２０ｇ、６７．０ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロクロム酸ピリジニウム（４３．２ｇ、２００ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で３時間撹拌し、次いでシリカのパッドに通して濾過し、ジクロロメタンで溶出して、無色の油（１０．５ｇ、５０％）として２−オクチルドデカナール８０を得た。
化合物８１の合成
【化１０２】
2018039844.tif 000119
（６Ｚ，１５Ｚ）−ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１１−オール４の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−オクチルドコサ−６−エン−１１−オール８１を無色の（ｃｏｌｏｌｅｓｓ）油（０．６７ｇ、９２％）として、２−オクチルドデカナール８０（０．５ｇ、１．６ｍｍｏｌ）、（Ｚ）−１−ブロモデセ−４−エン（０．７ｇ、３．１ｍｍｏｌ）、マグネシウム（８０ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）、無水テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）、水（２ｍＬ）、ＥｔＯＨ（２ｍＬ）、およびＫＯＨ（０．２ｇ、２．８ｍｍｏｌ）から得た。
化合物８２の合成
【化１０３】
2018039844.tif 000120
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６ブロモヘキサノエート１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−オクチルドコサ−６−エン−１１−イル６−ブロモヘキサノエート８２を無色の油（０．７８ｇ、８５％）として、（Ｚ）−１２−オクチルドコサ−６−エン−１１−オール８１（０．６７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（５ｍＬ）、６−ブロモヘキサン酸（０．８０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．８５ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、および４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）から得た。生成物を次のステップで、さらに精製することなく使用した。
化合物８３の合成
【化１０４】
2018039844.tif 000121
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ（ｄｉｍｅｔｈｙａｍｉｎｏ））ヘキサノエート１１の合成について記載する手順と類似した手順を使用して、（Ｚ）−１２−オクチルドコサ−６−エン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート８３を油（１０３ｍｇ、１４％）として、（Ｚ）−１２−オクチルドコサ−６−エン−１１−イル６−ブロモヘキサノエート８２（０．７８ｇ、１．３ｍｍｏｌ）およびエタノール中２．０Ｍジメチルアミン（３ｍＬ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４３〜５．２６（ｍ、２Ｈ）、４．９６〜４．９１（ｍ、１Ｈ）、２．３３（ｔ、４Ｈ）、２．２６（ｓ、６Ｈ）、２．０８〜１．９３（ｍ、４Ｈ）、１．７０〜１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．５７〜１．４３（ｍ、４Ｈ）、１．４０〜１．１５（ｍ、４３Ｈ）、０．９４〜０．８５（ｍ、９Ｈ）。
化合物８９のための合成スキーム
【化１０５】
2018039844.tif 000122
化合物８４の合成
【化１０６】
2018039844.tif 000123
無水ジエチルエーテル（３５０ｍＬ）中の（Ｅ）−エチルデカ−４−エノエート（２０ｇ、１０１ｍｍｏｌ）の冷却した溶液（０℃）に、水素化アルミニウムリチウム（８．９ｇ、２１２ｍｍｏｌ）を窒素下で添加した。溶液を室温（ａｔ  ｒｏｏｍ）で１時間撹拌し、次いで０℃まで冷却し、５Ｍ  ＮａＯＨ（３０ｍＬ）で緩徐に反応停止処理し、エチルエーテル（１００ｍＬ）で希釈した。溶液を３０分間撹拌し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固して、油（１６．１ｇ、定量）として（Ｅ）−デカ−４−エン−１−オール８４を得た。
化合物８５の合成
【化１０７−１】
2018039844.tif 000124
（Ｚ）−デカ−４−エニルメタンスルホネート２の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｅ）−デカ−４−エニルメタンスルホネート８５をオレンジ色の油（３２．７ｇ）として、（Ｅ）−デカ−４−エン−１−オール（１６．１ｇ、９４．７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１５．５ｍＬ、１１１．７ｍｍｏｌ）、およびメタンスルホニルクロリド（１５．６ｍＬ、２０１．７ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．６５（１００％ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物８６の合成
【化１０７−２】
2018039844.tif 000125
（Ｚ）−１−ブロモデカ−４−エン３の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（Ｅ）−１−ブロモデカ−４−エン８６を油（１７．９ｇ、８１％）として、（Ｅ）−デカ−４−エニルメタンスルホネート８５（２３．５ｇ、９４．７ｍｍｏｌ）、およびテトラブチルアンモニウムブロミド（４０．０ｇ、１２４．１ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．８５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物８７の合成
【化１０８】
2018039844.tif 000126
（６Ｚ，１５Ｚ）−ヘンイコサ−６，１５−ジエン−１１−オール４を得る合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｅ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８７を油（１．２８ｇ、７１％）として、（Ｅ）−１−ブロモデカ−４−エン８６（１．７ｇ、７．８ｍｍｏｌ）、削り状マグネシウム（０．１９ｇ、７．８ｍｍｏｌ）、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドデカ−６−エナール７（１．２５ｇ、３．９ｍｍｏｌ）、および水酸化カリウム（０．６６ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）から得た。Ｒｆ０．４３（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
化合物８８の合成
【化１０９】
2018039844.tif 000127
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−ブロモヘキサノエート１０の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｅ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−ブロモペンタノエート８８を油（１．３６ｇ、７８％）として、（６Ｅ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−オール８７（１．２８ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、および５−ブロモ−ｎ−吉草酸（１．００ｇ、５．６ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．０６ｇ、５．６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｇ、８３．０ｍｍｏｌ）、およびジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）から得た。
化合物８９の合成
【化１１０】
2018039844.tif 000128
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート１１の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、（６Ｅ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート８９を油（０．４５ｇ、３５％）として、（６Ｅ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−ブロモペンタノエート８８（１．３６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、およびエタノール中２Ｍジメチルアミン（５ｍＬ）から得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．４５〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、４．９６〜４．９１（ｍ、１Ｈ）、２．３４〜２．２５（ｍ、２Ｈ）、２．０６〜１．９０（ｍ、１２Ｈ）、１．６８〜１．６１（ｍ、２Ｈ）、１．５５〜１．４５（ｍ、５Ｈ）、１．４５〜１．１６（ｍ、２８Ｈ）、０．９５〜０．８４（ｍ、９Ｈ）。Ｒｆ０．４６（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
化合物９０のための合成スキーム
【化１１１】
2018039844.tif 000129
化合物８９の合成
【化１１２】
2018039844.tif 000130
５の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、無色の油として１，８−ビス（２−ペンチルシクロプロピル）−５−（３−（２−ペンチルシクロプロピル）プロピル）オクタン−４−イルメタンスルホネート８９を得た。
化合物９０の合成
【化１１３】
2018039844.tif 000131
６２の合成について記載される手順と類似した手順を使用して、淡黄色の油として５−（（１，８−ビス（２−ペンチルシクロプロピル）−５−（３−（２−ペンチルシクロプロピル）プロピル）オクタン−４−イル）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタン−１−アミン９０（５８０ｍｇ）を得た。Ｒｆ０．４８（１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）。
【０４４４】
上の説明は、例示説明となるように意図され、制限するようには意図されないことを理解されたい。上の説明を読むと、多くの実施形態が当業者に明らかとなろう。本発明の範囲は、したがって、上の説明を参照して決定されるべきではなく、代わりに添付の特許請求の範囲を参照して、かかる特許請求の範囲がそれらに対して権利を有する均等物の全範囲とともに決定されるべきである。特許出願、特許、ＰＣＴ公開、ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号およびその中に記載される配列を含む、全ての論文および参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【外国語明細書】
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