(57)【要約】【課題】  一酸化窒素を生体内の任意の部位に選択的に且つ効率的に送達可能とする技術、を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はｐＨ７．３〜７．５における電荷がアニオン性を示す脂質分子を、実質的な基本構成脂質分子として含んでなり、一酸化窒素を内包して含んでなることを特徴とする、一酸化窒素内包バブルリポソームに関する。また本発明は、前記一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる、生体内にて部位選択的に一酸化窒素を送達するためのシステムに関する。【選択図】  図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はｐＨ７．３〜７．５における電荷がアニオン性を示す脂質分子を、実質的な基本構成脂質分子として含んでなり、一酸化窒素を内包して含んでなることを特徴とする、一酸化窒素内包バブルリポソーム。
【請求項２】
前記バブルリポソームが、生体内環境において一酸化窒素の保持が可能なものである、請求項１に記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
【請求項３】
前記バブルリポソームが、ｐＨ７．３〜７．５における電荷がカチオン性を示す脂質分子を基本構成脂質分子として実質的に含まないものである、請求項１又は２に記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
【請求項４】
前記バブルリポソームが、ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
【請求項５】
前記バブルリポソームが、ＤＳＰＣ及び／又はＤＰＰＣを実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものである、請求項１〜４のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
【請求項６】
平均粒子径が２００μｍ以下である、請求項１〜５のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
【請求項７】
ポリエチレングリコールにて修飾された脂質分子を基本構成脂質分子の１０ｍｏｌ％以下にて含んでなる、請求項１〜６のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
【請求項８】
更に標的指向性向上分子を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる、血管壁拡張剤、ＥＰＲ効果向上剤、血圧降圧剤、動脈硬化抑制剤、又は中枢神経保護剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる医薬品キット又は医薬組成物。
【請求項１１】
他の薬理成分を有するナノ化製剤を含んでなる、請求項１０に記載の医薬品キット又は医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる、生体内にて部位選択的に一酸化窒素を送達するためのシステム。
【請求項１３】
更に超音波照射手段を含んでなる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
一酸化窒素を内包するバブルリポソームの製造工程において、
ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はｐＨ７．３〜７．５における電荷がアニオン性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるリポソーム内に、一酸化窒素を含むように内包させる工程、を含むことを特徴とする、
生体内環境において一酸化窒素の保持が可能である一酸化窒素内包バブルリポソームを製造する方法。
【請求項１５】
一酸化窒素を内包するバブルリポソームの製造工程において、
ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はｐＨ７．３〜７．５における電荷がアニオン性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるリポソーム内に、一酸化窒素を含むように内包させる工程、を含むことを特徴とする、
生体内環境におけるバブルリポソームの一酸化窒素保持能を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内環境において一酸化窒素の安定した保持が可能な一酸化窒素内包バブルリポソームに関する。また本発明は、前記一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる、生体内にて部位選択的に一酸化窒素を送達するためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界中の国々において高齢化社会に向かう方向で人口動態が推移しつつある。特に日本を含む先進国ではその傾向が著しく、高齢化社会に伴う生活習慣病に起因する心虚血や下肢虚血等の循環器系疾患を患う重症患者数が増加している。
これらの循環器系疾患の病態改善には、生体内コントロールが可能な一酸化窒素（以下、「ＮＯ」と表記する場合がある。）の投与により、健全な血管構築とそれに伴う周辺組織の保護や再生等が可能になることが期待される。ここで、一酸化窒素は、ガス状分子として生理作用を発揮する物質であり、一酸化窒素は、血管壁拡張作用（降圧作用）や抗動脈硬化作用等を発揮するため、健全な循環器系の保持や循環器系疾患の治療に有用な物質と認められる。
当該生体内での一酸化窒素の生理機能を踏まえると、一酸化窒素を任意の部位に選択的に送達させることを可能とする一酸化窒素デリバリーシステムが確立されれば、上記循環器系疾患の病態改善に極めて有効な治療手段となることが期待される。また、任意の腫瘍血管等に選択的に一酸化窒素を送達可能となった場合、任意の腫瘍血管にて選択的に腫瘍血管透過性を亢進（即ち、ＥＰＲ効果を増強）させることが可能となり、抗がん剤を内包したナノ化製剤等の治療効率改善に繋がることも期待される。
【０００３】
ここで、一酸化窒素を気体分子として直接静脈内に投与した場合、一酸化窒素は速やかに酸化されて不活化されてしまい、上記のような一酸化窒素が有する優れた生理作用を発揮させることができない。
そこで、一酸化窒素を生体内にて生成させる技術として、一酸化窒素の前駆物質であるニトログリセリンを経皮投与する技術が報告されている（非特許文献１）。当該技術では、ニトログリセリンを経皮パッチにより毛細血管に吸収投与されることで、血管内にて亜硝酸イオンを介して一酸化窒素の生成が可能なことが報告されている。
しかし、当該技術にて生成される一酸化窒素は、血管内にて酸化されて即座に不活性してしまい、対象患部では一酸化窒素濃度は極めて低いものとなるため、当該技術では十分な一酸化窒素の薬理作用等を期待することができない。また、当該技術ではパッチの貼付位置の調整は可能ではあるところ、パッチから経皮吸収されるニトログリセリンやその派生化合物は、化合物自体が血管内に直接投与された状態となるため、選択的局所送達を行う他のアプリケーション技術等との親和性が低く、応用技術に繋げることが難しい。
【０００４】
上記とは別途の手法としては、一酸化窒素をバブルリポソームに内包させる研究が報告されている（非特許文献２）。そこで、本発明者らは、非特許文献２に記載のバブルリポソームと同じ脂質組成のリポソームを調製し、当該リポソームに一酸化窒素を内包させたバブルリポソームを調製したところ、当該一酸化窒素内包バブルリポソームは血管内環境にて著しく不安定で、僅か３〜５分で内包した一酸化窒素がバブルリポソームから抜けてしまうことが確認された（本願明細書実施例１参照）。即ち、非特許文献２に記載の技術では、生体内の対象組織等に一酸化窒素を送達させることが困難な技術であることが確認された。
【０００５】
以上に示したように、現時点においては、一酸化窒素を活性状態である気体分子状のまま任意の部位に選択的に且つ効率的に送達させることを可能とする技術は確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bioconjugate Chemistry, 2010, 21 (5), p797-802; Hiroshi Maeda; Tumor-Selective Delivery of Macromolecular Drugs via the EPR Effect: Background and Future Prospects.
【非特許文献２】International Journal of Nanomedicine, 2014, 9, p4671-4683; Sutton et al.; Pulsed ultrasound enhances the delivery of nitric oxide from bubble liposomes to ex vivo porcine carotid tissue.
【非特許文献３】薬学雑誌１３０（１１）２０１０年  ｐ１４８９−１４９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の事情に鑑みてなされたものでありその課題とする処は、一酸化窒素を生体内の任意の部位に選択的に且つ効率的に送達可能とする技術、を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記従来技術の状況において本発明者らは鋭意研究を重ねたところ、バブルリポソームを構成する脂質分子に関して、血液内のｐＨに相当するｐＨ７．３〜７．５付近にて電荷が中性又はアニオン性を示す脂質分子を用いたバブルリポソームを用いることを着想した。本発明者らは、当該組成となる脂質分子を基本構成脂質とするリポソームを調製し、これに一酸化窒素の内包したところ、驚くべきことにマウスに経静脈投与を行った場合であっても、バブルリポソーム内に一酸化窒素を長時間安定して保持させることが可能となることを見出した。即ち、当該バブルリポソームにおいては、一酸化窒素を気体分子状のまま安定して全身投与可能となることを見出した。
また、更に本発明者らは、特にｐＨ７．３〜７．５付近の環境下にて中性を示す脂質分子を用いてバブルリポソームを調製した場合において、生体内での一酸化窒素保持能が著しく向上できることを見出した。この点、当該構成が奏する作用効果は、脂質分子の電荷を単にアニオン側にシフトさせれば至適条件となるわけではなく、そのメカニズムの詳細は不明であった。
【０００９】
また、本発明者らは、当該一酸化窒素内包バブルリポソームを対象とする任意の組織部位に皮下投与することによって、当該投与部位周辺での一酸化窒素の緩やかな徐放が生じ、部位選択的に血管壁拡張作用が発揮されることを見出した。更に、本発明者らは、当該一酸化窒素内包バブルリポソームを経静脈注射し、対象とする任意の部位に超音波照射処理を行ったところ、当該超音波照射部位の周辺にて一酸化窒素が放出され、部位選択的な血管壁拡張作用が発揮されることを見出した。ここで、「血管壁拡張作用」は、一酸化窒素の生理機能の一つをエバンスブルーにて可視化して検出したもので、一酸化窒素の送達がされた部位では、一酸化窒素が有する他の生理活性機能も同様に発揮されるものと認められる。
【００１０】
ここで、上記段落に記載したように、非特許文献２にはカチオン性脂質を用いたバブルリポソームに一酸化窒素を内包する研究内容が記載されており、当該バブルリポソームを用いた培養組織の血管緊張を測定する実験が記載されている。しかし、非特許文献２に係る実験は、培養組織に試料を添加してその影響を顕微鏡観察するＥｘ  ｖｉｖо条件下の実験であり、試料添加後の短時間での試験と認められる。即ち、非特許文献２には、生体内に血管投与したＩｎ  ｖｉｖо実験により、実際の長時間の血管内環境下におけるその安定性及び一酸化窒素保持能を確認した実験は示されていない。
そこで、本発明者らは、非特許文献２に係るカチオン性脂質含有バブルリポソームと同じ脂質組成の一酸化窒素内包バブルリポソームを調製して、生体内での安定性を検証したところ、当該バブルリポソームは血管内環境にて著しく不安定であり、僅か３〜５分で内包したはずの一酸化窒素は即座にバブルリポソームから抜けてしまうことが示された（本願明細書実施例１参照）。即ち、非特許文献２に記載のカチオン性脂質を用いたバブルリポソームは、一酸化窒素の一時的な封入は可能ではあるところ、実際の生体内環境では一酸化窒素を保持することができず、血管投与により所望の組織等に一酸化窒素を送達させることができない技術であることが確認された。
【００１１】
ここで、バブルリポソームは、パーフルオロ炭化水素等の造影ガスの生体内送達用途以外に、薬物送達システム用キャリアの研究開発対象となっている（非特許文献３）。特に「カチオン性脂質」を用いたバブルリポソームは、核酸分子等を効率的に表面付加又は搭載可能な点から、遺伝子治療用の薬物送達システム用キャリアとして注目されている。
本発明者らが見出したバブルリポソームの構成脂質組成による電荷と生体内での一酸化窒素保持能に関する知見は、バブルリポソームとして研究実績が多く蓄積しているカチオン性脂質のバブルリポソームにおける反対の技術知見存在下にて見出されたものである。この点は、本発明に係る着想を阻害する方向に作用する技術常識が存在していたものと認められる。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
本発明者らは上記知見に基づいて本発明を完成するに至った。本発明は具体的には以下に記載の発明に関する。
【００１４】
［項１］
ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はｐＨ７．３〜７．５における電荷がアニオン性を示す脂質分子を、実質的な基本構成脂質分子として含んでなり、一酸化窒素を内包して含んでなることを特徴とする、一酸化窒素内包バブルリポソーム。
［項２］
前記バブルリポソームが、生体内環境において一酸化窒素の保持が可能なものである、項１に記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
［項３］
前記バブルリポソームが、ｐＨ７．３〜７．５における電荷がカチオン性を示す脂質分子を基本構成脂質分子として実質的に含まないものである、項１又は２に記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
［項４］
前記バブルリポソームが、ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものである、項１〜３のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
［項５］
前記バブルリポソームが、ＤＳＰＣ及び／又はＤＰＰＣを実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものである、項１〜４のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
［項６］
平均粒子径が２００μｍ以下である、項１〜５のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
［項７］
ポリエチレングリコールにて修飾された脂質分子を基本構成脂質分子の１０ｍｏｌ％以下にて含んでなる、項１〜６のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
［項８］
更に標的指向性向上分子を有する、項１〜７のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソーム。
［項９］
項１〜８のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる、血管壁拡張剤、ＥＰＲ効果向上剤、血圧降圧剤、動脈硬化抑制剤、又は中枢神経保護剤。
［項１０］
項１〜８のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる医薬品キット又は医薬組成物。
［項１１］
他の薬理成分を有するナノ化製剤を含んでなる、項１０に記載の医薬品キット又は医薬組成物。
［項１２］
項１〜８のいずれかに記載の一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる、生体内にて部位選択的に一酸化窒素を送達するためのシステム。
［項１３］
更に超音波照射手段を含んでなる、項１２に記載のシステム。
［項１４］
一酸化窒素を内包するバブルリポソームの製造工程において、
ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はｐＨ７．３〜７．５における電荷がアニオン性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるリポソーム内に、一酸化窒素を含むように内包させる工程、を含むことを特徴とする、
生体内環境において一酸化窒素の保持が可能である一酸化窒素内包バブルリポソームを製造する方法。
［項１５］
一酸化窒素を内包するバブルリポソームの製造工程において、
ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はｐＨ７．３〜７．５における電荷がアニオン性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるリポソーム内に、一酸化窒素を含むように内包させる工程、を含むことを特徴とする、
生体内環境におけるバブルリポソームの一酸化窒素保持能を向上させる方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、一酸化窒素を生体内の任意の部位に選択的に且つ効率的に送達可能とする技術を提供することを可能とする。
本発明により、具体的には、生体内の血管内環境にて一酸化窒素を安定して保持することが可能な一酸化窒素内包バブルリポソームを提供することが可能となる。当該バブルリポソームは、部位選択的な局所投与による一酸化窒素の徐放、及び／又は、全身投与後の部位選択的な超音波照射による一酸化窒素の局所的放出を実現することを可能とする。即ち、本発明では、一酸化窒素を活性状態である気体状態のまま任意の生体内部位に選択的に送達するシステムを提供することが可能となる。
【００１６】
これにより本発明では、血管壁拡張作用、血圧降圧作用、動脈硬化抑制作用等の一酸化窒素一酸化窒素の生理活性機能を、生体内の任意の部位にて発揮させることが可能となり、循環器系疾患の治療用途において有効に利用可能となることが期待される。また、一酸化窒素は、中枢神経保護作用等を有すると認められることから、脳治療用途においても利用可能となることが期待される。
また、本発明では、上記血管拡張を利用したＥＰＲ効果向上作用を生体内の任意の部位にて発揮させることが可能となり、抗がん剤や抗リウマチ薬を内包したナノ化製剤等の治療効率を大幅に向上可能となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１において、バブルリポソーム（中性脂質ＢＬ、カチオン性脂質含有ＢＬ）に内包されていた一酸化窒素量をＤＡＦ−２を用いて測定した結果図である。
【００１８】
【図２】実施例１において、一酸化窒素内包バブルリポソーム（アニオン性脂質ＢＬ、中性脂質ＢＬ）の全身投与後の心エコー強度を測定した結果図である。
【００１９】
【図３】実施例１において、一酸化窒素内包バブルリポソーム（アニオン性脂質ＢＬ、中性脂質ＢＬ）の全身投与後の心エコー画像を示す図である。図中における破線円で示した部分は、心臓の位置を示す。
【００２０】
【図４】実施例１において、一酸化窒素内包バブルリポソーム（カチオン性脂質含有ＢＬ）の全身投与後の心エコー強度を測定した結果図である。
【００２１】
【図５】実施例１において、一酸化窒素内包バブルリポソーム（カチオン性脂質含有ＢＬ）の全身投与後の心エコー画像を示す図である。図中における破線円で示した部分は、心臓の位置を示す。
【００２２】
【図６】実施例２において、一酸化窒素内包バブルリポソーム（ＤＰＰＣ）の全身投与後の心エコー強度を測定した結果図である。
【００２３】
【図７】実施例２において、一酸化窒素内包バブルリポソーム（ＤＰＰＣ）の全身投与後の心エコー画像を示す図である。図中における破線円で示した部分は、心臓の位置を示す。
【００２４】
【図８】実施例３において、一酸化窒素内包バブルリポソーム（ＰＥＧ修飾率の異なる試料）の全身投与後の心エコー強度を測定した結果図である。
【００２５】
【図９】実施例４において、バブルリポソーム（攪拌前のバブルリポソーム、ナノバブルリポソーム）に内包されていた一酸化窒素量をＤＡＦ−２を用いて測定した結果図である。図中の「Ｍ」は、攪拌前におけるμｍスケールのバブルリポソームを示す。図中の「Ｎ」は、ナノバブルリポソームを示す。
【００２６】
【図１０】実施例４において、バブルリポソーム（常圧保管後のナノバブルリポソーム）に内包されていた一酸化窒素量をＤＡＦ−２を用いて測定した結果図である。
【００２７】
【図１１】実施例４において、一酸化窒素内包バブルリポソーム（ナノバブルリポソーム）の全身投与後の心エコー強度を測定した結果図である。
【００２８】
【図１２】実施例５において、バブルリポソーム（加圧保管後のバブルリポソーム）に内包されていた一酸化窒素量をＤＡＦ−２を用いて測定した結果図である。
【００２９】
【図１３】実施例５において、バブルリポソーム（加圧保管後のナノバブルリポソーム）に内包されていた一酸化窒素量をＤＡＦ−２を用いて測定した結果図である。
【００３０】
【図１４】実施例６における一酸化窒素内包バブルリポソームの皮下注射後、背部でのエバンスブルー漏出度合を目視観察した写真像図である。写真像中における投与部位付近の高コントラス部分はエバンスブルーの漏出により青色発色した部位を示す。
【００３１】
【図１５】実施例７において、超音波照射した筋組織でのエバンスブルー量を測定した結果図である。
【００３２】
【図１６】図１６Ａ：本発明に係る一酸化窒素内包バブルリポソームの模式的構造を示した概念図である。図１６Ｂ：本発明に係る一酸化窒素送達システムにおいて、超音波照射手段を含む一態様を示した概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明に係る技術的範囲は、本発明に係る技術的特徴が奏する作用効果を実質的に妨げるものでなければ、下記に記載した構成以外の他の構成を含む態様を除外するものではない。また、本発明に係る技術的範囲は、下記した構成を全て含む態様に限定されるものではない。
【００３４】
本明細書中における「ＮＯ」という略称は、一酸化窒素を指す用語として用いられる場合がある。また、「ＢＬ」という略称はバブルリポソームを示す用語として用いられる場合がある。
本明細書中における「中性脂質バブルリポソーム」等の表現は、バブルリポソームの基本構成脂質を構成する脂質分子の電荷に関する性質を示すものである。
本明細書中において、「ＥＰＲ」とは、Enhanced Permeability Retentionの略称であり、腫瘍や炎症部位の周囲の新生血管の隙間において正常の血管では透過しないスケールの薬剤が蓄積する現象を指す。
【００３５】
１．一酸化窒素内包バブルリポソーム
本発明は、生体内環境において一酸化窒素の安定した保持が可能な一酸化窒素内包バブルリポソームに関する。詳しくは、本発明に係るバブルリポソームは、i）所定の溶液における電荷が中性及び／又はアニオン性を示す脂質分子を、実質的な基本構成脂質分子として含んでなり、ii）一酸化窒素を内包して含んでなる、ことを特徴とするバブルリポソームに関するものである。
【００３６】
本明細書中、「バブルリポソーム」（Bubble Liposome）とは、脂質二重膜が球状化して形成されてなるリポソームのうち、内部にガスが内包されてなるリポソームを指す。当該内包ガスとしてパーフルオロ炭化水素ガス等の造影ガスを用いた場合、超音波照射によって当該内封ガスが共振し、一定の音圧に達すると破裂する性質を示す。本発明に係るバブルリポソームは、造影ガスだけでなく内包ガスとして一酸化窒素を気体状態にて内包して保持可能な性質を示す。
【００３７】
［基本構成脂質分子］
本発明に係るバブルリポソームとしては、ｐＨ７．３〜７．５における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はｐＨ７．３〜７．５における電荷がアニオン性を示す脂質分子を、実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものである。
【００３８】
本発明に係るバブルリポソームの膜構造は、脂質分子の二重膜によって構成されるものである。ここで、当該膜を構成する脂質分子としては、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質などを挙げることができるが、特に細胞膜成分の主成分であるリン脂質であることが、体内に投与した際の安全性の点で好適である。
本発明に係るバブルリポソームとしては、室温や体内温度において二重膜構造の形成な可能なリン脂質を基本構成脂質として用いることが可能である。具体例としては、ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）、ＤＳＰＡ（ジステアロイルホスファチジン酸）、ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＬＰＧ（ジラウリルホスファチジルグリセロール）、ＨＳＰＧ（水素化大豆ホスファチジルグリセロール）、ＨＥＰＧ（水素化卵ホスファチジルグリセロール）、ＥＰＣ（卵黄ホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）、ＰＳ（ホスファチジルセリン）、ＰＧ（ホスファチジルグリセロール）、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）、等を用いることができるが、これらに制限されるものではない。
【００３９】
本発明に係るバブルリポソームは、所定の電荷状態を示す性質の脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものである。
ここで、当該脂質分子が所定の電荷状態を示すためのｐＨ条件としては、哺乳類の血液ｐＨ値又はその近傍範囲であるｐＨ７．３〜７．５を好適に挙げることができる。より好ましくはｐＨ７．３５〜７．４５、特に好ましくはヒト血液のｐＨ値であるｐＨ７．４付近の値を好適に挙げることができる。
本発明に係る脂質分子が上記所定の電荷状態を示す溶液としては、血液又はこれに類する塩濃度等の水溶液を挙げることができる。当該溶液として具体的には、血清、血漿、生理的食塩水、ＰＢＳ溶液、グルコース緩衝溶液等を好適に挙げることができる。即ち、本発明に係る脂質分子としては、上記ｐＨ範囲にあるこれらの溶液中において、電荷が所定の帯電条件を示すものであることが好適である。
【００４０】
本発明に係るバブルリポソームは、上記所定の溶液中における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はアニオン性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものである。特に好適な態様としては、生体内における一酸化窒素の安定保持能の観点を踏まえると、上記所定の溶液中における電荷が中性を示す脂質分子及び／又はアニオン性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子としてなるものが好適である。
ここで、「基本構成脂質分子」とは、バブルリポソームの基本構造である脂質二重膜を構成する脂質分子を指す用語として用いている。当該脂質二重膜構造の膜中に埋め込まれる又は結合される他の化合物分子、即ち、タンパク質やペプチド等を除いた概念である。
また、本発明において「実質的な基本構成脂質分子として含んでなる」とは、所定の電荷状態を示す性質の脂質分子によって、バブルリポソームの二重膜構造が実質的に構成されてなる状態を示すものである。ここで、「実質的」とは、荷電状態が所定の状態から外れる脂質分子を含有する態様であっても、その含有率が僅かでありバブルリポソームを形成した際の生体内での一酸化窒素内包保持能が下記所定の機能を発揮される場合には、その含有を許容することも可能である。当該実質的に構成されることを示す具体的な内容としては、基本構成脂質分子の脂質組成において、本発明に係る所定の電荷状態を示す脂質分子の含有率が９０ｍｏｌ％以上、好ましくは９４ｍｏｌ％以上、より好ましくは９８ｍｏｌ％以上、特に好ましくは９９．５ｍｏｌ％以上の態様を挙げることができる。
特に好ましくは、生体内における一酸化窒素の安定保持能の観点を踏まえると、本発明に係る基本構成脂質分子としては、その全部が所定の電荷状態を示す脂質分子にて構成されてなる態様が好適である。
【００４１】
中性脂質分子
本発明に係るバブルリポソームにおいては、特に好適な態様としては、上記所定の溶液中における電荷が中性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものが好適である。バブルリポソームを構成する基本構成脂質分子が実質的に中性脂質分子である態様では、生体内における一酸化窒素の安定保持能が極めて良好となる作用効果が発揮される。ここで、実質的等の意味や好適態様については、上記段落を参照することができる。
また、特に好ましくは、生体内における一酸化窒素の安定保持能の観点を踏まえると、本発明に係る基本構成脂質分子としては、その全部が中性の電荷状態を示す脂質分子にて構成されてなる態様が好適である。
【００４２】
本発明に係るバブルリポソームを構成する中性脂質分子としては、上記所定の溶液中において分子全体としての電荷の偏りを示さない又は実質的に電荷の偏りを示さない脂質分子を用いることができる。具体的には、通常のリポソームを構成する脂質分子と同様に、分子内での正電荷と負電荷のチャージが打ち消し合って全体として電荷的に中性を示す脂質分子を用いることができる。なお、当該中性脂質分子としては、ｐＨ条件や塩濃度により多少のチャージの偏りがある場合でも実質的に電荷中性と認められる場合には、本発明に係る中性脂質分子として許容される。例えば、表面修飾をしない態様のバブルリポソーム形成時において、−４ｍＶ〜＋２ｍＶ程度、好ましくは−１ｍＶ〜＋１ｍＶ程度の表面電荷の偏りを示す脂質分子は、中性脂質分子として許容される。
本発明に係る中性脂質分子としては、室温や体内温度において二重膜構造の形成な可能な中性脂質分子を用いることが可能である。当該中性脂質分子としては、ホスファチジルコリン系やホスファチジルエタノールアミン系の脂質分子を挙げることができる。より具体的には、中性脂質分子の一例としては、ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＥＰＣ（卵黄ホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）等を用いることが可能である。
特には、バブルリポソームの一酸化窒素保持の安定性を考慮すると、炭素数１４〜２０のアルキル鎖を備えた脂質分子、好ましくは炭素数１６〜１８のアルキル鎖を備えた脂質分子を用いることが好適である。また、当該アルキル鎖は、直鎖状分子であることが好適である。
実施形態の一例としては、本発明に係る中性脂質分子として特に好ましくは、ＤＳＰＣ／又はＤＰＰＣを用いることが好適である。特には、ＤＳＰＣを用いることがより好適である。
【００４３】
アニオン性脂質分子
本発明に係るバブルリポソームを構成する基本構成脂質分子としては、上記所定の溶液中における電荷が中性を示す脂質分子を用いることが好適であるところ、上記所定の溶液中における電荷がアニオン性を示す脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものも含まれる。また、上記所定の溶液中における電荷が中性を示す脂質分子、及び、上記所定の溶液中における電荷がアニオン性を示す脂質分子、を混合組成にて実質的な基本構成脂質分子として含んでなるものも含まれる。なお、ここで実質的等の意味については、上記段落を参照することができる。
【００４４】
本発明に係るバブルリポソームとしては、基本構成脂質分子の全部又は実質的に全部がアニオン性脂質分子である態様を採用することが可能であるが、一酸化窒素の安定保持能を考慮すると、中性脂質分子及びアニオン性脂質分子を混合組成にて実質的な基本構成脂質分子とする態様においては、アニオン性脂質分子の含有率は少ない方が好ましい。具体的には、当該混合組成において、基本構成脂質分子の脂質組成におけるアニオン性脂質分子の含有率が、９８ｍｏｌ％以下、好ましくは９４ｍｏｌ％以下、より好ましくは９０ｍｏｌ％以下の態様であるものが好適である。特に好ましくは、当該混合組成において、基本構成脂質分子の脂質組成におけるアニオン性脂質分子の含有率が５０ｍｏｌ％以下、より好ましくは３０ｍｏｌ％以下、更に好ましくは１５ｍｏｌ％以下の態様であるものが更に好適である。
【００４５】
本発明に係るバブルリポソームを構成するアニオン性脂質分子としては、上記所定の溶液中において分子全体としての電荷がマイナス側に偏りを示す脂質分子を用いることができる。具体的には、通常のリポソームを構成する脂質分子と同様に、分子内での正電荷と負電荷のチャージにおいて負電荷チャージが優勢となり、全体として負電荷に帯電する性質の脂質分子を用いることができる。
本発明に係るアニオン性脂質分子としては、室温や体内温度において二重膜構造の形成な可能なアニオン性脂質分子を用いることが可能である。当該アニオン性脂質分子としては、ホスファチジルグリセロール系の脂質分子を挙げることができる。より具体的には、アニオン性脂質分子の一例としては、ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＬＰＧ（ジラウリルホスファチジルグリセロール）ＨＳＰＧ（水素化大豆ホスファチジルグリセロール）、ＨＥＰＧ（水素化卵ホスファチジルグリセロール）等を用いることが可能である。
特には、バブルリポソームの一酸化窒素保持の安定性を考慮すると、炭素数１４〜２０のアルキル鎖を備えた脂質分子、好ましくは炭素数１６〜１８のアルキル鎖を備えた脂質分子を用いることが好適である。また、当該アルキル鎖は、直鎖状分子であることが好適である。
実施形態の一例としては、本発明に係るアニオン性脂質分子として特に好ましくは、ＤＳＰＧ／又はＤＰＰＧを用いることが好適である。特には、ＤＳＰＧを用いることがより好適である。
【００４６】
カチオン性脂質分子
本発明に係るバブルリポソームとしては、上記所定の溶液中における電荷がカチオン性を示す脂質分子を基本構成脂質分子として実質的に含んでなるバブルリポソームについては、生体内での一酸化窒素保持能が著しく低く安定性が担保されず好適とは認められない。即ち、本発明に係るバブルリポソームとしては、ｐＨ７．３〜７．５における電荷がカチオン性を示す脂質分子を基本構成脂質分子として実質的に含まないものであることが好適である。
【００４７】
但し、本発明に係るバブルリポソームとしては、基本構成脂質分子の一部にカチオン性脂質分子を含むものであっても、その含有率が僅かでありバブルリポソームを形成した際の生体内での一酸化窒素内包保持能が下記所定の機能を発揮される場合には、その含有を許容することも可能である。
ここで、当該「カチオン性脂質を実質的に含まない」ことを示す具体的な内容としては、基本構成脂質分子の脂質組成において、カチオン性を示す脂質分子の含有率が４ｍｏｌ％以下、好ましくは２ｍｏｌ％以下、より好ましくは１ｍｏｌ％以下、特に好ましくは０．５ｍｏｌ％以下の態様を挙げることができる。また、カチオン性脂質を含むバブルリポソームとして許容される態様としては、カチオン性脂質分子が一部分に偏って局在する態様よりも、バブルリポソーム全体に均質に分布する態様である方が好適である。
本発明に係るバブルリポソームとして特に好ましくは、生体内における一酸化窒素の安定保持能の観点を踏まえると、カチオン性を示す脂質分子を基本構成脂質分子として含まない態様であることが好適である。
【００４８】
［ＰＥＧ修飾脂質］
本発明に係るバブルリポソームとしては、脂質二重膜の表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ、Polyethylene glycol）を所定の含有率にて含んでなる態様であることが好適である。即ち、本発明に係るバブルリポソームとしては、ポリエチレングリコールにて修飾された脂質分子を、基本構成脂質に対して所定のモル含有率以下にて含んでなる態様であることが好適である。
ここで、ＰＥＧ分子は、基本構成脂質分子にＰＥＧを結合したＰＥＧ修飾脂質分子として、本発明に係るバブルリポソームの構成分子の一部とすることが可能である。ＰＥＧ分子と基本構成脂質分子との結合態様としては、通常のリポソームの調製において使用可能な結合態様のものを採用することが可能である。
【００４９】
本発明に係るバブルリポソームでは、ＰＥＧ修飾脂質分子が基本構成脂質分子に含まれる態様の場合、バブルリポソームの表面のＰＥＧ間の相互作用によって水和層が形成され、マクロファージや各種分解酵素等からの保護が可能となる。結果として当該水和層によって血管内等の生体内環境におけるバブルリポソームの安定性を劇的向上させることが可能となる。
本発明に係るバブルリポソームとしては、生体内安定性を付与する水和層の形成のために、所定の割合以上のＰＥＧ分子を含むことが好適である。具体的には、基本構成脂質分子の脂質組成におけるＰＥＧ修飾脂質分子の含有率が、０．１ｍｏｌ％以上、好ましくは１ｍｏｌ％以上、より好ましくは２ｍｏｌ％以上の態様であるものが好適である。ここで、ＰＥＧ修飾脂質分子の含有率が０ｍｏｌ％のバブルリポソームでは、バブルリポソームの膜表面に水和層が形成されず、血管内等の生体内環境におけるバブルリポソームの安定性が良好とはいえない。そのため、一酸化窒素送達キャリアとして利用するバブルリポソームとしては、僅かでも表面にＰＥＧ修飾を有するものである方が好適と認められる。
また、本発明に係るバブルリポソームのＰＥＧ含有率としては、一酸化窒素の安定保持能に影響すると認められ、ＰＥＧ含有率があまりに高すぎるものは好適ではない。当該上限値として具体的には、基本構成脂質分子の脂質組成におけるＰＥＧ修飾脂質分子の含有率が、３０ｍｏｌ％以下、好ましくは１０ｍｏｌ％以下の態様が好適である。特に好ましくは、基本構成脂質分子の脂質組成におけるＰＥＧ修飾脂質分子の含有率が６ｍｏｌ％以下の態様が好適である。
【００５０】
本発明に係るＰＥＧ修飾脂質分子としては、上記した基本構成脂質分子の一部にＰＥＧ鎖が結合されてなる分子構造を有する。二重膜構造が形成された際に、バブルリポソームの外側表面及び／又は内側表面の親水性側にＰＥＧ分子鎖が突出する構造を備える。
本発明に係るＰＥＧ修飾脂質分子としては、水和層を形成させるのに好適な分子量のＰＥＧ分子を用いることが好ましい。当該ＰＥＧ平均分子量としては、例えば、平均分子量が２００〜５００００、好ましくは５００〜２００００、より好ましくは７５０〜５０００を好適に挙げることができる。
また、基本構成脂質分子を修飾するＰＥＧ分子としては、通常のＰＥＧの他にもＰＥＧ誘導体を用いることも可能である。ＰＥＧ誘導体としては、マレイミド基、アルデヒド基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基等が付与されたものや、末端がＮＨＳ化されているものを用いることも可能である。
【００５１】
［標的指向性向上分子］
本発明に係るバブルリポソームは、生体内の所望の部位への一酸化窒素送達での選択性及び送達効率を向上させるために、標的指向性向上分子を有する態様とすることが好適である。
ここで、当該標的指向性向上分子としては、好適態様としては、通常の薬物送達システム（ＤＤＳ）等に用いるリポソーム修飾に利用可能なリガンド分子や抗体等を好適に挙げることができる。即ち、本発明に係るバブルリポソームとしては、リガンド分子及び／又は抗体が結合されてなる態様を採用することが可能である。本発明では、バブルリポソームの外側表面にこれらの分子が露出した構造とすることによって、標的とする組織等への送達指向性を劇的に向上させることが可能となる。
ここで、抗体やリガンド分子等としては、所定の標的との結合又は付着等が可能なペプチド、タンパク質、糖タンパク質等を挙げることができる。より好ましくは標的特異性の高いものが好適である。また、抗体やリガンド分子が標的とするタンパク質等としては、細胞膜や細胞外マトリックス中に存在する抗原、レセプター、細胞接着分子等を挙げることできるが、これらに制限されるものではない。
【００５２】
また、本発明にて使用可能な標的指向性向上分子としては、バブルリポソーム表面に結合が可能なものであれば、上記抗体等以外のタンパク質やペプチド性の高分子化合物を採用することも可能である。例えば、細胞膜透過性ペプチド、シグナルペプチド、ＩｇＧのＦｃ結合性ペプチド等をバブルリポソーム表面に結合した態様とすることも可能である。
また、標的指向性向上分子としては、タンパク質やペプチド性以外の他の化合物を採用することも可能である。例えば、所定の標的組織等の細胞が認識及び結合等が可能な化合物等がある場合には、当該化合物を本発明に係る標的指向性向上分子として採用して、バブルリポソーム表面に結合した態様とすることが可能である。
【００５３】
本発明に係るバブルリポソーム表面に標的指向性向上分子を有する態様としては、具体的には、ＰＥＧ修飾脂質分子のＰＥＧ分子鎖に当該分子を結合する態様を挙げることができる。例えば、抗体やリガンド分子等を用いる場合の具体的な結合態様としては、リンカーとなる分子や官能基を介して容易に行うことが可能である。一例としては、ＰＥＧ分子鎖の末端にマレイミドを付加し、一方、抗体やリガンド分子等の末端にシステインを付加することによって、当該システインのＳＨ基とマレイミドに由来する官能基とを結合させる態様を挙げることができるが、抗体やリガンド分子等の結合態様は特に当該態様に制限されない。
【００５４】
［内包ガス］
本発明に係るバブルリポソームは、基本構成脂質分子にて形成される脂質二重膜の球状体（リポソーム）の内部に一酸化窒素を内包して含んでなるものである。ここで本明細書中の「内包」には、内封や封入等の概念も含まれる。
ここで、バブルリポソーム内への一酸化窒素の一時的又は短時間の内包状態の実現は、基本構成脂質分子の電荷状態に関わらず実行可能であるところ、基本構成脂質分子としてカチオン性脂質を所定以上に含んでなるバブルリポソーム（非特許文献２）では、生体内では僅か３〜５分で内包した一酸化窒素がバブルリポソームから抜けてしまうため、生体内を循環する血管内環境下において安定して一酸化窒素を保持することができない（本願明細書実施例１参照）。
それに対して、上記した本発明に係る基本構成脂質分子にて構成されるバブルリポソームでは、生体内を循環する血管内環境下においてもバブルリポソーム内に一酸化窒素を気体状態（気体分子状、ガス状）にて安定して保持することが可能となる。具体的には、本発明に係るバブルリポソームでは、１０分〜数十分程度の体内の血液循環に十分な時間の一酸化窒素の安定保持が可能であるため、生体中の任意の標的組織又は部位に対する一酸化窒素送達を行うことが実現可能となる。
【００５５】
本発明に係るバブルリポソームとしては、一酸化窒素の純粋気体又は純度の高い状態での気体として内包させることが好適である。また、所望に応じて、一酸化窒素と他の気体との混合気体として内包させることも可能である。
当該混合気体として一酸化窒素を内包させる態様では、一酸化窒素の混合比率は任意であるが、送達効率を考慮すると、例えば内包気体の体積の１０％以上、好ましく３０％以上、より好ましくは５０％以上の比率にて、一酸化窒素を内包させる態様を挙げることができる。ここで、本発明に係るバブルリポソーム内に内包可能な混合気体としては、バブルリポソーム内に内包可能あり且つ一酸化窒素との実質的な反応性を示さない気体であれば、特に制限なく使用することが可能である。一例としては、超音波造影ガスであるパーフルオロ炭化水素ガス等を、一酸化窒素との混合気体として内包させることも可能である。
なお、パーフルオロ炭化水素ガスとして具体的には、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロヘプタン、パーフルオロオクタン、等を挙げることができる。
【００５６】
［バブルリポソームの粒子径］
本発明に係るバブルリポソームでは、一酸化窒素を内包し且つ生体内にてそのバブル構造の安定維持が可能な粒径サイズであれば特に制限はないが、血管内の循環に適した粒径サイズの小さいものが好適である。本発明において一酸化窒素を内包した状態でのバブルリポソームの粒径サイズとしては、例えば、平均粒子径が２．５μｍ以下、好ましくは２μｍ以下、より好ましくは１．６μｍ以下のものを挙げることができる。
【００５７】
本発明に係るバブルリポソームでは、粒径サイズが微細なもの程、バブル構造が安定して内包可能な一酸化窒素の保持量が増加する傾向が認められ、更に生体内環境での安定性も向上して一酸化窒素保持能が向上したものとなる。そのため、本発明に係るバブルリポソームとしては、上記μｍスケールにあるバブルリポソームよりも微細化されたバブルリポソームを用いる方がより好適である。本明細書中、このような微細化バブルリポソームは、ナノバブルリポソームと呼ばれる。
本発明に係るバブルリポソームとしてナノバブルリポソームを用いる態様としては、平均粒子径が３００ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ以下のものを挙げることができる。当該バブルリポソームでは、粒径サイズが微細のものである程、毛細血管内の移動に適して組織深部への移行性も良くなり好適と認められる。特にがん組織や炎症部位への集積に有効である１００ｎｍ以下のスケール態様のものが特に好適である。
【００５８】
本発明に係るバブルリポソームの粒径サイズの下限としては、特に制限はないが、ナノバブルリポソームの調製が可能な下限サイズ付近である２０ｎｍ以上、好ましくは４０ｎｍ以上を挙げることができる。
【００５９】
［その他］
本発明に係るバブルリポソームにおいては、本発明に係る技術的特徴が奏する作用効果を実質的に妨げる態様でない限りは、上記した構成以外の分子や化合物等を有する又は含んだ態様とすることが可能である。
例えば、バブルリポソームの表面に他の化合物や構造物等を搭載、付加、又は結合等して含む態様とすることが可能である。また、ＰＥＧ分子又はＰＥＧに結合させたリンカー分子等に、他の化合物や構造物等を付加又は結合等して含む態様とすることが可能である。また、バブルリポソーム内に他の化合物、構造物、気体分子等を内包して含む態様とすることも可能である。
当該態様の一例としては、核酸分子や化合物等の薬理成分等を、バブルリポソームの表面に搭載、付加、又は結合等して、薬物送達システム用のキャリアとして併用する態様を採用することも可能である。
【００６０】
２．一酸化窒素送達システム及び各種剤用途
本発明に係るバブルリポソームは、一酸化窒素送達システムの構成手段及び各種剤用途において有効に利用することが可能となる。
【００６１】
［一酸化窒素送達システム］
本発明に係るバブルリポソームは、生体内環境における一酸化窒素の安定した保持が可能であることに加えて、任意の部位にて選択的に一酸化窒素を放出する手段が確立された技術である。
従って、本発明においては、上記バブルリポソームを構成手段として含んでなる一酸化窒素送達システム（ＮＯデリバリーシステム）に関する発明が含まれる。即ち、本発明には、生体内にて部位選択的に一酸化窒素を送達するためのシステムに関する発明が含まれる。
なお、ここでの生体内における「部位」という表現は、組織や器官等を含む表現として用いている。
【００６２】
自然徐放
本発明に係るシステムでは、一酸化窒素の自然徐放作用を利用した一酸化窒素送達システムの構築が可能となる。
詳しくは、本発明に係るシステムを構成するバブルリポソームでは、生体内環境への投与から１０分〜数十分の一酸化窒素の安定保持の後、数十分〜数時間程度の適度な時間経過に伴って一酸化窒素の自然徐放が生じる。そのため、当該バブルリポソームを局所的に投与した場合、当該部位及び／又はその周辺部において選択的に一酸化窒素を送達させることが可能となる。即ち、局所投与により一酸化窒素が有する生理機能を部位選択的に且つ効率良く発揮させることが可能となる。
【００６３】
当該投与形態の具体的態様としては、所望の対象となる部位に局所的投与が実現される投与形態であれば特に制限はなく様々な投与形態を想定することが可能である。
当該投与態様として好ましくは、皮下注射等の皮下投与、止血帯を用いた局所的血管投与、等の態様を採用することが好適である。これらの態様では、例えば、注射器具や輸液器具等を用いた簡易な投与手段を用いるのみによって、一酸化窒素が有する生理機能を部位選択的に発揮させることが可能となる。当該皮下投与態様では、例えば、筋肉組織、皮下組織、脳内、眼内、腫瘍、中枢神経等の組織や器官等を対象として、選択的に且つ効率的に一酸化窒素を送達することが実現可能となる。
【００６４】
超音波照射手段の利用
本発明に係るシステムでは、超音波照射によってバブルリポソーム内の内包ガスが放出される現象を利用した一酸化窒素送達システムの構築が可能となる（図１６）。
詳しくは、本発明に係るシステムを構成するバブルリポソームでは、血管投与を行った後に所望の部位に局所的な超音波照射を行うことによって、バブルリポソームから一酸化窒素の放出を誘導することが可能となる。そのため、当該態様では、超音波照射を行う任意の部位及び／又はその周辺部において選択的に一酸化窒素を送達することが可能となる。即ち、体外からの局所的な超音波照射を行って、一酸化窒素が有する生理機能を部位選択的に且つ効率良く発揮させることが可能となる。
【００６５】
当該超音波照射を利用した形態の具体的態様としては、i）上記バブルリポソームを血管内に投与して、対象となる投与部位を含む全身の血管系に上記バブルリポソームを循環した状態とすることが好適である。
ここで、血管投与にて全身投与を行った場合では、ヒトの場合５〜２０分程度で、全ての臓器や組織への送達が可能となるため、本発明における超音波照射は、当該循環時間を考慮した後に行うことが好適である。即ち、本発明では、バブルリポソームを血管投与して標的組織に十分に到達する時間が経過した後、標的部位に対して超音波を照射することが好適である。
ここで、当該態様にて全身投与を行うための血管投与形態としては、静脈への血管投与、動脈への血管投与、毛細管への投与、腸管投与、経口投与、等の血流への投与が可能な様々な投与形態を想定することが可能である。
当該投与形態として好ましくは、静脈内への血管投与を行う態様を挙げることができる。例えば、経静脈への静脈注射や点滴静注等の投与手法を採用することができる。
なお、当該超音波照射を利用した形態の具体的態様としては、ii）標的部位となる組織等によっては、止血帯等を用いての局所投与を行った後に、標的部位に対して超音波照射を行う態様を採用することも可能である。この場合、全身投与ではなく局所的投与後での超音波照射を行う態様となる。
【００６６】
本発明に係るシステムにおいて超音波照射手段を利用する態様では、特に上記 i）に記載の全身投与の態様が好適である。当該態様では、脳、心臓、筋肉、その他内臓などのあらゆる臓器や組織への送達が可能であり、皮下注射等では送達不可能な全身の任意の部位に選択的に一酸化窒素を送達することが可能となる。また、筋肉組織、皮下組織、脳内、眼内、腫瘍、中枢神経等に選択的に一酸化窒素を送達することも可能である。
また、上記段落にて記載した抗体やリガンド分子等の指向性向上分子を結合したバブルリポソームを用いる場合であれば、標的に集積する時間の後に超音波照射を行うことにより、更に高い一酸化窒素の送達効果が実現可能となる。
【００６７】
本発明に係るシステムにおいて超音波照射手段を利用する態様では、超音波照射手段がシステムの構成手段として含まれる。即ち、本発明に係るシステムには、構成手段として超音波照射手段を含んでなる一酸化窒素送達システムに関する発明が含まれる。
ここで、当該システムにおける内包ガスの放出態様としては、内包ガスの共振現象による脂質膜からの漏出促進、バブルリポソーム自体の破裂、等が挙げられるが、当該システムの一酸化窒素の放出誘導としては、当該超音波照射によって誘導される一酸化窒素の放出誘導であれば、如何なる作用機序のものも含まれる。
【００６８】
当該システムにおける超音波照射条件としては、詳しくは、照射周波数（frequency）が０．２〜１０ＭＨｚ、好ましくは０．５〜５ＭＨｚの超音波照射を採用することが可能である。当該範囲の周波数の超音波を照射した場合、内包ガスの放出誘導が促進される方向に作用する。当該バブルリポソームの内包ガスとしてパーフルオロ炭化水素ガスを多く含む場合には、共振破裂が誘導されやすくなると認められる。
なお、照射周波数が当該範囲の高周波側又は低周波側に大きく外れる条件では、内包ガスの放出を誘導し難くなるため、本発明に係る照射条件としては好適でない。
【００６９】
当該システムにおける超音波照射条件としては、バブルリポソーム内に内包した一酸化窒素の放出誘導の容易性の観点から、超音波治療にて採用される程度の比較的弱い強度の超音波照射を採用することが可能である。詳しくは、照射強度（intensity）としては、０．１Ｗ／ｃｍ２以上、好ましくは０．５Ｗ／ｃｍ２以上、さらに好ましくは１Ｗ／ｃｍ２以上の条件を採用することが可能である。
当該照射強度の上限としては、人体に影響が実質的にない範囲であれば特に制限はなく、集束超音波照射を利用する態様であれば、例えば２０００Ｗ／ｃｍ２以下を挙げることができる。また、人体への影響がより安全な治療用超音波を利用する態様であれば、例えば２０Ｗ／ｃｍ２以下、好ましくは１０Ｗ／ｃｍ２以下を採用することが好適である。
【００７０】
当該システムにおける照射時間としては、上記照射強度に応じて設定することが好ましく、バブルリポソームからの内包ガスの放出誘導が可能な時間であり且つ人体に影響が実質的にない範囲を採用することが好適である。
具体的には、集束超音波等の強い照射強度を採用する場合であれば、照射部位が高温となることを避けるために比較的短い時間を設定することが好適である。一例としては、１秒〜３分の範囲での設定条件を挙げることができる。
また、超音波治療用の弱い照射強度を採用する場合であれば、一酸化窒素放出を十分に誘導するために、比較的長い時間を設定することが好適である。一例としては、１０秒〜６０分の範囲での設定条件を挙げることができる。
【００７１】
本発明に係るシステムを構成する超音波照射手段としては、上記条件を満たす超音波を照射することが可能な手段を備えた装置又は機器等であれば、特に制限なく使用することが可能である。
詳しくは、本発明に係るシステムでは、バブルリポソーム内に内包した一酸化窒素の放出誘導の容易性の観点から、弱い超音波照射が可能な超音波照射装置又は器具等を使用することが可能である。
当該態様では、例えば、臨床にて使用される治療用の超音波照射装置を使用することが可能となる。また、診断用の超音波診断装置を流用して使用することも可能である。これらの装置は、医療現場等において通常に広く普及している装置であるため、多くの患者等が容易に利用可能な態様となる。
また、本発明に係るシステムでは、照射域をピンポイントに狭めた集束超音波を照射可能な装置を使用することも可能である。集束超音波装置を用いる態様では、例えば、頭蓋骨に覆われた脳組織や体腔内の深部にある内臓組織に対しても、所定の超音波照射を減衰させずに行うことが可能となる。
また、本発明に係るシステムでは、骨折治療等に用いる低周波超音波装置を使用することも可能である。
【００７２】
超音波照射手段を用いた超音波照射は、生体内の標的部位に対して体外から超音波発生部であるプローブ等を当てて実行することができる。本発明に係るシステムにおける超音波照射手段は、通常は切開等の外科的操作が不要であるため、患者への負担が少ない処置であると認められる。
【００７３】
投与量
本発明に係るシステムにおけるバブルリポソームの投与量としては、所望の一酸化窒素の生理機能や対象組織等に応じて適宜決定することが可能である。一態様を挙げると、バブルリポソームの総脂質量に換算して、被検者（動物の場合は非検体）の体重１ｋｇあたり０．００１〜１００ｍｇ程度、好ましくは０．１〜５０ｍｇ程度の投与が可能である。
【００７４】
［各種剤用途］
本発明に係るバブルリポソームでは、生体内の任意の部位にて選択的に一酸化窒素が有する各種生理機能を発揮させることが可能となる。従って、本発明には、上記一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなることを特徴とする各種薬剤に関する発明が含まれる。
【００７５】
本発明においては、体内の任意の部位（組織や器官等）への一酸化窒素の気体状態の直接送達によって発揮される一酸化窒素の各種生理活性機能を利用した医薬用途への利用が可能となる。具体的に本発明においては、上記一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる血管壁拡張剤、血圧降圧剤、動脈硬化抑制剤、等が含まれる。これらの薬剤を用いることによって、特に循環器系疾患に関する治療や症状改善が可能となる。
また、本発明においては、一酸化窒素の中枢神経保護作用を利用した医薬用途への利用も可能となる。上記一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる中枢神経保護剤が含まれる。当該薬剤では、特に脳治療や神経系疾患の症状改善が可能となる。
【００７６】
更に、本発明としては、一酸化窒素の血管拡張を利用したＥＰＲ効果向上作用を、生体内の任意の部位にて選択的に且つ効率的に発揮させることが可能となる。即ち、本発明には、上記一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなるＥＰＲ効果向上剤が含まれる。
ここで、「ＥＰＲ」とは、Enhanced Permeability Retentionの略称であり、腫瘍や炎症部位の周囲の新生血管の隙間において、正常の血管では透過しない数十ｎｍ〜数百ｎｍスケールの薬剤が蓄積する現象を指す。
当該ＥＰＲ効果向上剤では、薬理成分を内包、結合、付着、又は搭載等したナノ化製剤等と併用投与することで、当該ナノ化製剤を対象の組織等の血管壁を通過させて、選択的に当該ナノ化製剤を集積させることを可能とする。当該薬剤ではこのＥＰＲ効果向上作用により、併用投与したナノ化製剤の治療効率を大幅に向上させることが可能となる。
ここで、当該ＥＰＲ効果向上剤と併用投与するナノ化製剤を構成するＤＤＳキャリアとしては、通常では血管状態では血管壁を通過しないが、血管拡張作用に応じて当該拡張した血管壁を通過可能なものであれば、特に制限なく使用することが可能である。一例としては、リポソーム、ミセル、カプセル状のタンパク質複合体、ウィルス粒子、金属ナノ粒子、ナノクリスタル、デンドリマーナノ粒子、等を挙げることができるが、本発明に係るＥＰＲ効果向上作用が発揮可能なものであれば、特にこれらに制限されるものではない。
また、併用投与されるナノ化製剤に内包、結合、付着、又は搭載等される薬剤としては、所望の用途に応じた如何なる薬剤を用いることができるが、特には、抗がん剤、抗リウマチ薬等の薬理成分を内包する態様では、治療効果を大幅に向上させることが可能となる。また、核酸医薬を内包する態様でもその効果が期待される。
【００７７】
本発明に係る各種薬剤の剤型としては、液状、粘性液状、半固形状、固形状、カプセル封入型、粉末状、顆粒状、賦形剤混合型、等のあらゆる剤の態様を想定することが可能であるが、投与時の使用の際には血管投与や皮下投与が可能な液体状の剤型であることが好適である。好ましくは、アンプル液、濃縮液等の形状が好適である。
また、一酸化窒素を内包した状態での数日以上の長期保管のためには、好ましくは密閉容器内に加圧封入された液状状態にて保管される剤形態が好適である。
また、所望に応じて、ｐＨ調整剤、抗生物質、他の薬剤、等との混合組成物とする態様を採用することも可能である。
【００７８】
ここで、本発明では、上記一酸化窒素内包バブルリポソームが有するＥＰＲ向上作用を利用した医薬品キット又は医薬組成物に関する発明が含まれる。即ち、本発明には、上記一酸化窒素内包バブルリポソームを含んでなる医薬品キット又は医薬組成物が含まれる。
ここで、医薬品キットの一例としては、例えば、上記一酸化窒素内包バブルリポソーム、及び、他の薬理成分、をそれぞれ別途に含んでなるキット形態の医薬製品を挙げることができる。また、医薬組成物の一例としては、例えば、上記一酸化窒素内包バブルリポソーム、及び、他の薬理成分、を混合組成物として含んでなる組成物形態の医薬製品を挙げることができる。
特に本発明では、他の薬理成分を有するナノ化製剤を含んでなる態様のものが好適である。当該態様では、上記段落に記載したナノ化製剤のＥＰＲ効果の劇的向上が可能となる。
【００７９】
本発明に係る各種薬剤の投与形態としては、上記段落にて記載された一酸化窒素送達システムの投与形態を参照することができる。また、投与量も上記段落にて記載された一酸化窒素送達システムの投与形態を参照することができる。
【００８０】
３．各種方法 
本発明においては、上記した一酸化窒素内包バブルリポソームの製造及びその関連技術に関する各種方法に関する発明が含まれる。
【００８１】
［製造方法］
本発明では、上記所定の性質を有する脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるバブルリポソームを用いることによって、生体内環境におけるバブルリポソームの一酸化窒素の安定保持が可能となるものである。
即ち、本発明においては、一酸化窒素を内包するバブルリポソームの製造工程において、上記所定の性質を有する脂質分子を実質的な基本構成脂質分子として含んでなるリポソーム内に、一酸化窒素を含むように内包させる工程、を含むことを特徴とする、生体内環境において一酸化窒素の保持が可能である一酸化窒素内包バブルリポソームを製造する方法に関する発明が含まれる。
【００８２】
本発明に係るバブルリポソームの製造工程では、基本構成脂質分子の種類や組成等の特徴を上記段落に記載のものを用いることを除いては、公知又は非公知である如何なるバブルリポソームの製造手法を用いることが可能である。また、本発明に係るバブルリポソームの製造工程の一実施形態としては、実施例１の記載を参照することができる。
【００８３】
本発明に係る製造方法の一態様としては、例えば、常法によって粒子径の大きなリポソームを調製した後、ナノフィルター等を通過させて微小化させ、これを一酸化窒素が加圧封入された密閉式の試薬瓶等に入れて超音波処理等を行う方法を挙げることができる。当該操作を行うことによって一酸化窒素が内包されたバブルリポソームを調製することが可能となり、その粒径サイズとしては、上記粒径範囲の上限に近いμｍスケールの一酸化窒素バブルリポソームを得ることが可能となる。
【００８４】
また、本発明に係る製造方法の別態様としては、上記段落に記載のμｍスケールの一酸化窒素内包バブルリポソームを調製した後、これを一酸化窒素が加圧封入された密閉式の試薬瓶等に入れて高速撹拌機等にて激しい懸濁を行う方法を挙げることができる。当該操作を行うことによって一酸化窒素が内包されたナノバブルリポソームを調製することが可能となり、その粒径サイズとしては、２０〜３００ｎｍ、好ましくは４０〜２００ｎｍ、より好ましくは５０〜１８０ｎｍ程度に微細化されたナノバブルリポソームに該当するものを得ることが可能となる。
【００８５】
［保管方法］
上記製造された一酸化窒素封入バブルリポソームは、密閉容器等内に封入して加圧条件下にて保管することによって、製品としての製造流通等を考慮した長期保管が可能となる。即ち、本発明においては、一酸化窒素内包バブルリポソームの保管方法に関する発明が含まれる。
【００８６】
当該長期保管のための加圧条件としては、バブルリポソーム内からの内包ガスの漏出が防止されるように１気圧より大きい圧力を採用することができる。好ましくは１．２気圧以上、より好ましくは１．５気圧以上、更に好ましくは１．８気圧以上、特に好ましくは２気圧以上の圧力条件にて保管することが好適である。特に数日以上の保管状態の維持を確実にするためには、圧力条件を高くすることが好適である。圧力条件の上限としては、密閉容器の耐圧条件の範囲等を採用することが可能であるが、例えば、５気圧以下を挙げることができる。
当該保管においては、液体試料を内封可能な耐圧性を備えた密閉容器であれば特に制限なく採用することが可能である。市販されているガラス製バイアル瓶、樹脂製試料容器、等を使用することも可能である。密閉容器に充填する加圧用の気体としては、バブルリポソームに内包した内包ガスと同組成の気体を用いることが好適である。好ましくは、一酸化窒素を用いることが好適である。
【００８７】
［各種方法］
本発明では、上記した製造方法や保管方法以外にも、本発明に係るバブルリポソームが奏する各種作用効果を利用した各種方法に関する発明が含まれる。
例えば、本発明には、上記した製造方法に記載の工程を含むことを特徴とする生体内環境におけるバブルリポソームの一酸化窒素保持能を向上させる方法が含まれる。即ち、本発明には、バブルリポソームの一酸化窒素保持能向上方法、一酸化窒素内包バブルリポソームの生体内安定化方法等が含まれる。
また、本発明には、上記した一酸化窒素送達システムに関する記載の処理や操作等を含むことを特徴とする生体内にて部位選択的に一酸化窒素を送達する方法が含まれる。
また、本発明には、上記した一酸化窒素の生理機能を利用した各種疾患の治療や症状改善に関する方法が含まれる。即ち、本発明には、血管壁拡張方法、血圧降圧方法、動脈硬化抑制方法、中枢神経保護方法、ＥＰＲ効果向上方法、等に関する発明が含まれる。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【００８９】
［実施例１］『バブルリポソームの生体内における一酸化窒素保持能』
リポソーム内部に一酸化窒素を内包したバブルリポソームを調製し、生体内に経静脈注射にて全身投与した際の一酸化窒素保持能を評価した。
【００９０】
（１）「一酸化窒素内包バブルリポソームの調製」
脂質組成が下記表に示す組成になるようにして、各脂質を有機溶媒（クロロホルム：ジイソプロピルエーテル：ＰＢＳ＝１：１：１）に添加して溶解した。
ここで、基本構成脂質としては、アニオン性脂質であるＤＳＰＧ（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho- (1'-rac-glycerol) (sodium salt)、アバンティポーラリピッド社製）、中性脂質であるＤＳＰＣ（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、日油株式会社製）、中性脂質であるＤＰＰＣ（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、日油株式会社製）、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium methyl-sulfate、Avanti Polar Lipids, Inc. 社製）を、下記表の組成になるようにして用いた。また、ＰＥＧ結合脂質としては、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（Distearoyl phosphatidyl ethanolamine-PEG2000-OMe、日油株式会社製）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ750（Distearoyl phosphatidyl ethanolamine-PEG750-OMe、日油株式会社製）を用いた。
当該溶液に対してプローブ型ソニケーター（２０ｋＨｚ）を用いて超音波処理した後、ロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒を留去してリポソームを得た。
得られたリポソームは、凍結融解を行った後、エクストルーダー（Lipex Biomembrane Inc.）を用いてポアサイズ０．２μｍのポリカーボネート膜を通過させ、粒子径を約１００〜２００ｎｍに調製した。その後、ポアサイズ０．４５μｍのセルロースアセテート膜シリンジフィルターを用いて濾過滅菌した。
【００９１】
調製したリポソーム溶液（脂質換算濃度：１ｍｇ／ｍＬ）０．８ｍＬを、パーフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）にて飽和状態の密閉バイアル瓶に封入した後、更に当該バイアル瓶に対して一酸化窒素を加圧封入した。当該試料に対してバス型ソニケーター（４２ｋＨｚ）を用いて５分間の超音波処理することで、一酸化窒素を内包したバブルリポソームの懸濁液を調製した。ここで、本実施例に係るバブルリポソームでは、一酸化窒素ガスとＣ３Ｆ８ガスが１：１の混合気体になるように内包しているが、Ｃ３Ｆ８ガスは検出用の超音波造影用ガスとして混入させた気体である。本実施例にて得られたバブルリポソームの性質を下記表に示す。
【００９２】
その結果、基本構成脂質の電荷に関する性質が異なる３種類のリポソームを用いたいずれの場合であっても、ガスの内包操作を行うことによって粒径サイズが増大したバブルリポソームの調製が可能であることが示された。
【００９３】
【表２】
2018197208.tif 000004
【００９４】
（２）「一酸化窒素の同定及び定量」
上記調製した一酸化窒素内包バブルリポソームについて、内包された一酸化窒素が生理活性を有する気体状のまま内包されているかを確認した。
【００９５】
上記（１）にて調製した一酸化窒素内包バブルリポソーム２０μＬに、１０μＭ ＤＡＦ−２（Diaminofluorescein-2、五稜化薬株式会社製）のＰＢＳ溶液１００μＬを添加後、バス型ソニケーター（４２ｋＨｚ）を用いて超音波破砕を１０秒間行った。得られた溶液の相対的な蛍光強度（ＲＦＵ値）を蛍光光度計（Ｅｍ：４９５ｎｍ、Ｅｘ：５１５ｎｍ）にて測定した。結果を下記表に示した。
【００９６】
その結果、中性脂質バブルリポソーム（試料１−２）及びカチオン性脂質含有バブルリポソーム（試料１−３）のいずれについても、ＤＡＦ−２の構造変化に由来する同程度の蛍光強度が検出された。即ち、当該実施例にて調製したバブルリポソーム内には、一酸化窒素が生理活性を有する気体の状態にて内包されていることが確認された。
【００９７】
【表３】
2018197208.tif 000005
【００９８】
（３）「常圧での経時変化」
上記調製した一酸化窒素内包バブルリポソームについて、常圧にて３０分間保管した後の一酸化窒素保持量を測定した。一酸化窒素保持量の測定は、上記（２）に記載の方法と同様にしてＤＡＦ−２を用いた相対定量にて行った。結果を下記表及び図１に示した。
【００９９】
その結果、一酸化窒素内包バブルリポソームを常圧条件にて３０分間の静置保管を行った場合、カチオン性脂質含有バブルリポソーム（試料１−３）では、上記（２）に記載の製造直後の一酸化窒素量の約１２％にまで減少することが示された。それに対して、中性脂質バブルリポソーム（試料１−２）では、製造直後の一酸化窒素量の約３１％が残存しており、カチオン性脂質含有バブルリポソームよりも常圧３０分保管後の残存率が約２．５倍に増加した。
このことから、中性脂質バブルリポソームにおいては、カチオン性脂質含有バブルリポソームよりも常圧での一酸化窒素保持能が大幅に向上した性質を有することが示された。なお、ここで試料１−３に記載のカチオン性脂質含有バブルリポソームは、従来技術の非特許文献２に記載のバブルリポソームの脂質組成と同一のものである。
【０１００】
【表４】
2018197208.tif 000006
【０１０１】
（４）「全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影」
上記調製したアニオン性脂質バブルリポソーム（試料１−１）、中性脂質バブルリポソーム（試料１−２）、カチオン性脂質含有バブルリポソーム（試料１−３）について、経静脈注射による全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影を行って、生体内での一酸化窒素保持能に関する評価を行った。
【０１０２】
５〜６週齢のＩＣＲ系統マウスに、上記調製したバブルリポソーム溶液２００μＬ（脂質換算濃度：１μｇ／μＬ）を尾静脈注射により全身投与した。投与後、超音波診断装置を用いて経時的に心臓のエコー画像を１分毎に撮影した。当該超音診断装置のエコー照射（１２ＭＨｚ）では、バブルリポソームの破裂は起こらないため、当該エコーでの造影画像は、破裂していないバブルリポソーム内の造影ガスであるＣ３Ｆ８ガスを検出することによって、一酸化窒素内包バブルリポソームの挙動を示すものとなる。なお、当該バブルリポソームは経静脈投与により全身の血管を造影しているが、画像のイメージング解析を容易とする理由により心臓を選択して撮影した。
撮影した写真像について、画像解析ソフト（ImageＪ）を用いて輝度を測定し、ＲＯＩ値（Region of intensity）を算出した。当該ＲＯＩ値は、心エコーの強度を示す値を数値化した値である。結果を図２及び図４に示した。また、撮影画像の一部を図３及び図５に示した。
【０１０３】
その結果、アニオン性脂質バブルリポソーム（試料１−１）又は中性脂質バブルリポソーム（試料１−２）内に一酸化窒素を内包した場合では、全身投与後の長時間において造影ガス由来の高い心エコー強度が検出された（図２、図３）。即ち、これらのバブルリポソームでは、生体内を循環する血管内環境下においても安定性が高く、ヒトの血液循環時間を超える少なくとも２１分間の一酸化窒素の安定保持が可能であることが示された。特に中性脂質バブルリポソーム（試料１−２）では一酸化窒素の安定保持能が顕著に高く、生体内にて２９分間の長時間の一酸化窒素の安定保持が可能であることが示された。
【０１０４】
一方、カチオン性脂質含有バブルリポソーム（試料１−３）内に一酸化窒素を封入した場合では、全身投与後の僅か３分間で造影ガス由来の心エコー強度が激減し、全身投与後５分経過までには当該シグナルが検出されなくなった（図４、図５）。即ち、カチオン性のバブルリポソームは、生体内を循環する血管内環境下において著しく不安定であり、内包した一酸化窒素を長時間保持できない性質であることが示された。
【０１０５】
（５）「小括」
以上の結果から、バブルリポソームには構成脂質の電荷の違いによらず一酸化窒素の封入が可能であるところ、カチオン性のバブルリポソーム（非特許文献２と同一の脂質組成のもの）では、生体内を循環する血管内環境下にて一酸化窒素を安定保持することができず、一酸化窒素の送達キャリアとして用いることができないことが示された。
一方、中性脂質バブルリポソーム及びアニオン性脂質バブルリポソームでは、生体内を循環する血管内環境下においても一酸化窒素を安定保持することが可能であり、一酸化窒素送達キャリアとして好適に用いることが可能であることが示された。特に中性脂質バブルリポソームではその保持状態の持続時間が優れたものであり、一酸化窒素送達キャリアとして好適に利用可能であることが示された。
【０１０６】
［実施例２］『中性脂質バブルリポソームの効果確認試験』
上記実施例とは異なる中性脂質を用いてバブルリポソームを調製して、中性脂質バブルリポソームが有する生体内での一酸化窒素保持能の効果を確認した。
【０１０７】
（１）「一酸化窒素内包バブルリポソームの調製」
基本構成脂質として中性脂質であるＤＰＰＣを用いたことを除いては、実施例１に記載の方法と同様にして一酸化窒素内包バブルリポソームを調製した。ここで、ＤＰＰＣとしては、1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（日油株式会社製）を下記表の組成になるようにして用いた。
なお、本実施例に係るバブルリポソームにおいても、実施例１と同様に超音波造影用Ｃ３Ｆ８ガスと一酸化窒素ガスとの比が１：１の混合気体になるようにして内包した。本実施例にて得られたバブルリポソームの性質を下記表に示す。
その結果、ＤＰＰＣを用いた場合であっても、ガスの内包操作を行うことによって粒径サイズが増大したバブルリポソームの調製が可能であることが確認された。
【０１０８】
【表５】
2018197208.tif 000007
【０１０９】
（２）「全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影」
上記調製した中性脂質バブルリポソーム（試料２−１）について、経静脈注射による全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影を行って、生体内での一酸化窒素保持能に関する評価を行った。マウスへの全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影による心エコーの強度の測定は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。結果を図６及び図７に示した。
その結果、基本構成脂質としてＤＰＰＣを用いてバブルリポソームを調製して一酸化窒素を内包した場合であっても、生体内を循環する血管内環境下において、内包した一酸化窒素の安定保持が可能であることが確認された。
【０１１０】
以上の結果から、ＤＳＰＣとはアルキル鎖の炭素数が異なる脂質分子を用いて中性脂質バブルリポソームを調製した場合であっても、生体内での一酸化窒素保持能が良好に発揮されることが確認された。
【０１１１】
［実施例３］『ＰＥＧ修飾率の検討』
バブルリポソームを構成する脂質のＰＥＧ分子の修飾が、血管内の循環におけるバブルリポソームの一酸化窒素保持能に与える影響を検討した。
【０１１２】
（１）「一酸化窒素内包バブルリポソームの調製」
脂質組成が下記表に示す組成になるようにして、実施例１に記載の方法と同様にして一酸化窒素内包バブルリポソームを調製した。本実施例に係るバブルリポソームでは、基本構成脂質としてＤＳＰＣを用い、ＰＥＧ結合脂質としては、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000を用いた。
なお、本実施例に係るバブルリポソームにおいても、実施例１と同様に超音波造影用Ｃ３Ｆ８ガスと一酸化窒素ガスとの比が１：１の混合気体になるようにして内包した。本実施例にて得られたバブルリポソームの性質を下記表に示す。
【０１１３】
その結果、ＰＥＧ修飾率が２〜１０ｍｏｌ％にあるリポソームのいずれを用いた場合であっても、ガスの内包操作を行うことによって粒径サイズが増大したバブルリポソームの調製が可能であることが示された。
【０１１４】
【表６】
2018197208.tif 000008
【０１１５】
（２）「一酸化窒素の同定及び定量」
上記調製した一酸化窒素内包バブルリポソームについて、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける一酸化窒素の相対定量を行って調製時における一酸化窒素の保持量を測定した。当該一酸化窒素の相対定量は、一酸化窒素検出指示薬であるＤＡＦ−２を用いて実施例１に記載の方法と同様にして行った。結果を下記表に示した。
その結果、ＰＥＧ修飾率が２〜１０ｍｏｌ％にあるバブルリポソームのいずれにおいても、同程度の一酸化窒素量が生理活性を有する気体分子の状態にて内包されていることが確認された。
【０１１６】
【表７】
2018197208.tif 000009
【０１１７】
（３）「全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影」
上記調製したＰＥＧ修飾率が異なるバブルリポソームについて、経静脈注射による全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影を行って、生体内での一酸化窒素保持能に関する評価を行った。マウスへの全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影による心エコーの強度の測定は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。結果を図８に示した。
【０１１８】
その結果、ＰＥＧ修飾率が２〜１０ｍｏｌ％にあるバブルリポソームのいずれについても、生体内を循環する血管内環境下においても安定性が高く、ヒトの血液循環時間を超える少なくとも１７分間の一酸化窒素の安定保持が可能であることが示された。特にＰＥＧ修飾率２〜６ｍｏｌ％のバブルリポソーム（試料３−１、試料３−２）では、一酸化窒素の安定保持能が顕著に高く、生体内にて３０分間以上の長時間の一酸化窒素の安定保持が可能であることが示された。
【０１１９】
（４）「小括」
以上の結果から、バブルリポソームにはＰＥＧ修飾率の違いによらず一酸化窒素の封入が可能であり、生体内を循環する血管内環境下においても一酸化窒素の安定保持が可能であることが示された。即ち、生体内でも一酸化窒素送達キャリアとして好適に用いることが可能であるが示された。特には、ＰＥＧ修飾率２〜６ｍｏｌ％の範囲にある場合においては、生体内での安定性が向上して一酸化窒素の漏れ等が大幅に低減され、一酸化窒素送達キャリアとして好適に利用可能であることが示された。
なお、ＰＥＧ修飾率が０％のバブルリポソームでは脂質膜表面に水和層が形成されず、血管内等の生体内環境におけるバブルリポソームの安定性が良好とはいえない。そのため、一酸化窒素送達キャリアとして利用するバブルリポソームとしては、僅かでも表面にＰＥＧ修飾を有するものである方が好適と認められる。
【０１２０】
［実施例４］『ナノバブルリポソームの調製』
上記調製したμｍスケールのバブルリポソームから更に微細化したバブルリポソームを調製し、その性質を検証した。
【０１２１】
（１）「一酸化窒素内包バブルリポソームの調製」
中性脂質バブルリポソームを調製した実施例３の試料３−１〜試料３−３、カチオン性脂質含有バブルリポソームを調製した実施例１の試料１−３を、それぞれバイアル瓶に封入した。これらを高速撹拌機（AMALGAMATOR TP-103, Goldsmith & Revere, Inc）を用いて４４００ｒｐｍ、２０秒間、常温にて激しく攪拌混合し、粒子径が微細化された一酸化窒素内包バブルリポソームを得た。
なお、本実施例に係るバブルリポソームにおいても、実施例１と同様に超音波造影用Ｃ３Ｆ８ガスと一酸化窒素ガスとの比が１：１の混合気体になるようにして内包した。本実施例にて得られたバブルリポソームの性質を下記表に示す。
【０１２２】
その結果、μｍスケールのバブルリポソームに対して激しい攪拌操作を行うことによって、中性脂質バブルリポソームにおいては平均粒子径が５０〜２００ｎｍにまで微細化されたナノバブルリポソーム（試料４−１〜試料４−３）の調製が可能となることが示された。一方、カチオン性脂質含有バブルリポソームでは、同様の攪拌操作を行った場合でも平均粒子径６６０ｎｍ程度のもの（試料４−４）しか得ることができず、小型化することが困難であることが示された。
【０１２３】
【表８】
2018197208.tif 000010
【０１２４】
（２）「一酸化窒素の同定及び定量」
上記調製した一酸化窒素内包バブルリポソームについて、内包された一酸化窒素が生理作用活性体である気体のまま内包されているかを確認した。一酸化窒素の同定は、実施例１に記載の方法と同様にしてＤＡＦ−２を用いて行った。結果を下記表及び図９に示した。
【０１２５】
その結果、中性脂質ナノバブルリポソーム（試料４−１〜試料４−３）のいずれについても、ＤＡＦ−２の構造変化に由来する同程度の蛍光強度が検出された。即ち、当該実施例にて調製したナノバブルリポソーム内には、一酸化窒素が生理活性を有する気体状態にて内包されていることが確認された。
また、中性脂質ナノバブルリポソーム（試料４−１〜試料４−３）では、攪拌前のμｍスケールのバブルリポソームよりも内包可能な一酸化窒素量が増加することが示された。
【０１２６】
【表９】
2018197208.tif 000011
【０１２７】
（３）「常圧での経時変化」
上記一酸化窒素内包バブルリポソームについて、常圧にて３０分間保管した後の一酸化窒素保持量を測定した。一酸化窒素保持量の測定は、上記（２）に記載の方法と同様にしてＤＡＦ−２を用いた相対定量にて行った。結果を下記表及び図１０に示した。
【０１２８】
その結果、中性脂質ナノバブルリポソーム（試料４−１〜試料４−３）では、常圧条件にて３０分間の静置保管を行った場合でも一酸化窒素保持量を示す蛍光強度は高い値を示した。これらの値は、製造直後の値を示す上記（２）の値の５０〜７４％に相当する高い値であり、実施例１にて示したμｍスケールの中性脂質バブルリポソーム（試料１−２）での同条件でのガス保持率（約３１％）よりも大幅に高い値であった。
このことから、平均粒子径を５０〜２００ｎｍに調製したナノバブルリポソームにおいては、常圧での一酸化窒素保持能が向上した性質を有することが示された。
【０１２９】
【表１０】
2018197208.tif 000012
【０１３０】
（４）「全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影」
上記調製した一酸化窒素内包ナノバブルリポソームについて、経静脈注射による全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影を行って、生体内での一酸化窒素保持能に関する評価を行った。マウスへの全身投与及びＩｎ  ｖｉｖｏ造影による心エコーの強度の測定は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。結果を図１１に示した。
【０１３１】
その結果、ＰＥＧ修飾率が２〜１０ｍｏｌ％にあるナノバブルリポソームのいずれについても、生体内を循環する血管内環境下においても安定性が高く、ヒトの血液循環時間を大幅に超える少なくとも３０分間以上の一酸化窒素の安定保持が可能であることが示された。本試験にて検出されたＲＯＩ値は、実施例３にて調製したＰＥＧ修飾率が２〜１０ｍｏｌ％にあるμｍスケールバブルリポソームでの同様の試験での結果と比較して、全体的に心エコー強度が強く、バブルリポソームの微細化により一酸化窒素保持能が向上していることが示された。
特にＰＥＧ修飾率６ｍｏｌ％のナノバブルリポソーム（試料４−２）では、検出される心エコー強度が特に高い値を示し、生体内にて非常に安定して一酸化窒素の安定保持が可能であることが示された。
【０１３２】
（５）「小括」
以上の結果から、μｍスケールにある一酸化窒素内包バブルリポソームを激しく懸濁することで、がん組織や炎症部位への集積に有効である２００ｎｍ以下の一酸化窒素内包ナノバブルリポソームの調製が可能であることが示された。
当該ナノバブルリポソームでは、μｍスケールのバブルリポソームよりも内包可能な一酸化窒素の保持量が増加しており、生体内環境での一酸化窒素保持能も向上することが示された。特に、ＰＥＧ修飾率６ｍｏｌ％のナノバブルリポソームでは生体内安定性が非常に高く、一酸化窒素送達キャリアとして特に好適に利用可能であることが示された。
【０１３３】
［実施例５］『一酸化窒素内包バブルリポソームの加圧保管試験』
上記調製した一酸化窒素内包バブルリポソームについて、製造流通等を考慮した長期保管を可能とする手段を検討した。
【０１３４】
（１）「一酸化窒素内包バブルリポソームの準備」
実施例３にて調製したμｍスケールでのバブルリポソームを試料５−１〜試料５−３として用いた。また、実施例４にて調製した５０〜２００ｎｍスケールでのナノバブルリポソームを試料５−４〜試料５−６として用いた。
【０１３５】
（２）「加圧条件での経時変化」
上記一酸化窒素内包バブルリポソームについて、バイアル瓶内の圧力を２気圧に加圧した条件にて６０分間保管し、一酸化窒素保持量を測定した。一酸化窒素保持量の測定は、実施例１に記載の方法と同様にしてＤＡＦ−２を用いた相対定量にて行った。結果を下記表、図１２、図１３に示した。
【０１３６】
その結果、バイアル瓶内の圧力を２気圧に加圧した保管条件においては、μｍスケールでのバブルリポソーム（試料５−１〜試料５−３）、及び、ナノバブルリポソーム（試料５−４〜試料５−６）のいずれにおいても、６０分保管後での蛍光強度の減少は全く検出されず、製造直後の一酸化窒素量がそのまま安定保持されていることが示された。
【０１３７】
【表１１】
2018197208.tif 000013
【０１３８】
【表１２】
2018197208.tif 000014
【０１３９】
以上の結果から、一酸化窒素内包バブルリポソームは、バイアル瓶等の内部を加圧条件にして保管することによって、製造流通等を考慮した長期保管が可能であることが示された。具体的な加圧条件としては、２気圧以上の加圧条件が有効であることが示された。
【０１４０】
［実施例６］『体内での生理機能評価』
上記調製した一酸化窒素内包バブルリポソームについて、体内への局所的な皮下投与によって一酸化窒素の生理活性機能を部位選択的に発揮させることが可能かを検証した。
【０１４１】
（１）「皮下投与試験」
エバンスブルーを用いて、一酸化窒素内包バブルリポソームに由来する一酸化窒素の血管拡張作用の有無を検出した。ここで、エバンスブルーは血清アルブミンと結合して青色発色する化合物であり、血管壁拡張が生じて当該化合物が血管外に透過した部位を検出することが可能となる。
【０１４２】
５〜６週齢のＩＣＲ系統マウスに対して、エバンスブルー溶液（１０μｇ／μＬ）１０ｍｇ／体重ｋｇ相当量を尾静脈注射により全身投与した。次いで、当該マウスの背部皮下に、実施例１にて試料１−２として調製したバブルリポソーム溶液（脂質換算濃度：１μｇ／μＬ）を下記表に示す量を皮下注射にて投与した。ここで、試料１−２は、粒子径がμｍスケールである一酸化窒素内包の中性脂質バブルリポソーム（DSPC ： DSPE-PEG2000 ＝ 94：6）である。皮下投与から１８０分経過後、当該投与部位を目視観察して微少血管からのエバンスブルーの漏出度合を目視観察して、次の基準により評価した。
また、比較試験として、造影ガスであるＣ３Ｆ８ガスのみを内包させたバブルリポソームを試料１−２と同様にして調製して、当該バブルリポソームを皮下投与したこと以外は上記と同様にして試験を行った。また、対照としては、ＰＢＳのみを皮下投与したこと以外は上記同様にして試験を行った。これらの試験結果を下記表及び図１４に示した。
【０１４３】
［目視評価の基準］
漏出が確認されない：        −
漏出が僅かだが確認された：  ±
漏出が確認された：          ＋
漏出が多量に確認された：  ＋＋
【０１４４】
その結果、一酸化窒素内包バブルリポソームを皮下投与した部位では、毛細血管からのエバンスブルーの漏出が確認された（試験６−１〜試験６−３）。一方、造影ガスのみを皮下投与した部位では、毛細血管からのエバンスブルーの漏出は全く確認されなかった（試験６−４〜試験６−６）。
【０１４５】
【表１３】
2018197208.tif 000015
【０１４６】
【表１４】
2018197208.tif 000016
【０１４７】
以上の結果から、一酸化窒素内包バブルリポソームを皮下投与することによって、内包された一酸化窒素が緩やかに自然徐放されて、当該投与部位付近の血管壁を拡張可能であることが示された。即ち、本実施例の結果により、本発明に係る一酸化窒素内包バブルリポソームを任意の部位に局所的に皮下投与することによって、一酸化窒素の生理機能である血管拡張作用を任意の投与部位に選択的に発揮させることが可能となることが示された。
【０１４８】
［実施例７］『超音波照射による選択的一酸化窒素放出』
体外からの超音波照射を行うことによって、上記調製した一酸化窒素内包バブルリポソームから任意の部位に選択的に一酸化窒素放出を行うことが可能かを検証した。
【０１４９】
（１）「全身投与及び超音波照射」
５〜６週齢のＩＣＲ系統マウスに、実施例１にて試料１−２として調製したバブルリポソーム溶液２００μＬ（脂質換算濃度：１μｇ／μＬ）を尾静脈注射により全身投与した。ここで、試料１−２は、粒子径がμｍスケールである一酸化窒素内包の中性脂質バブルリポソーム（DSPC ： DSPE-PEG2000 ＝ 94：6）である。
投与後、治療用の超音波照射装置（Sonitron 2000、ネッパジーン株式会社）のプローブを下肢部筋組織に当て、体外からの超音波照射を行った。当該超音波照射は、周波数１ＭＨｚ、照射強度２Ｗ／ｃｍ２、照射時間６０秒の照射条件にて行った。次いで、エバンスブルー溶液（１０μｇ／μＬ）１０ｍｇ／体重ｋｇ相当量を尾静脈注射により全身投与した。当該静脈投与から１８０分経過後、上記超音波照射部位の筋組織を回収し、当該筋組織に含まれるエバンスブルー量を定量した。
また、対照としては、超音波照射を行わなかったこと以外は上記同様にして試験を行った。これらの試験結果を下記表及び図１５に示した。
【０１５０】
その結果、一酸化窒素内包バブルリポソームを全身投与した後に筋組織に局所的に超音波照射を行うことによって、超音波照射を行わなかった場合と比較して、当該筋組織におけるエバンスブルーの蓄積量が大幅に増加することが示された。なお、当該試験における超音波照射は、治療用超音波照射装置を用いた弱い超音波照射を用いて実行することが可能であった。
【０１５１】
【表１５】
2018197208.tif 000017
【０１５２】
以上の結果から、本発明に係る一酸化窒素内包バブルリポソームを全身投与した後、所望の部位に局所的な超音波照射を行うことによって、任意の組織や部位等に選択的に一酸化窒素を送達することが可能となることが示された。即ち、一酸化窒素の生理機能である血管拡張作用を、任意の超音波照射部位に選択的に発揮させることが可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明は、医薬分野、医療分野、ライフサイエンス研究分野等において有効に利用される技術となることが期待される。
【符号の説明】
【０１５４】
１．一酸化窒素内包バブルリポソーム
２．脂質二重膜
３．ＰＥＧ
４．一酸化窒素
【０１５５】
１１．心臓の位置
１２．投与部位
１３．正中線
【０１５６】
２１．被験者
２２．注射器具
２３．超音波発生手段
２４．超音波
２５．血管系
２６．標的部位、標的組織
２７．薬液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2018197208.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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