(57)【要約】【課題】慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための、新規なデータ取得方法を提供する。【解決手段】被験体の膵組織において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌の有無を決定する工程を含む、上記被験体における慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための、データ取得方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の膵組織において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌の有無を決定する工程を含む、上記被験体における慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための、データ取得方法。
【請求項２】
上記細菌の有無を決定する工程が、上記被験体の血液を試料として行われる、請求項１に記載のデータ取得方法。
【請求項３】
上記細菌の有無を決定する工程が、上記被験体における上記細菌の少なくとも１種以上の抗体価を測定する工程を含む、請求項１または２に記載のデータ取得方法。
【請求項４】
上記抗体価が、上記細菌の少なくとも１種以上の細菌由来ＣＰＳに対する抗体価である、請求項３に記載のデータ取得方法。
【請求項５】
上記細菌の有無を決定する工程が、上記被験体の膵液または膵組織を試料として行われる、請求項１に記載のデータ取得方法。
【請求項６】
上記被験体における、アミラーゼおよびヘモグロビンＡ１ｃの少なくとも１種以上のレベルを測定する工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
【請求項７】
上記細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
【請求項８】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌由来のＣＰＳに対する抗体を含むことを特徴とする、慢性膵炎または膵がんの発症可能性の判定キット。
【請求項９】
抗Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ剤および抗Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含む、慢性膵炎または膵がんの処置用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するためのデータ取得方法に関する。本発明はまた、慢性膵炎または膵がんの発症可能性の判定キット、および慢性膵炎または膵がんの処置用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の日本国では、１年に約３２，０００人が膵がんで死亡しており（「平成２７年人口動態統計」、表６）、約３４，０００人の膵がん患者が常時存在していると推計されている（「地域がん登録全国推計によるがん罹患データ」、国立がん研究センターがん対策情報センター、２０１２年の推計値）。膵がんは、診断時には手術適応のない患者が多く、５年生存率が７．９％と、非常に予後不良な疾患として知られている（「地域がん登録による生存率データ」、国立がん研究センターがん対策情報センター、２００６〜２００８年の値）。膵がんの診断時に手術適応のない理由としては、画像による早期診断、およびハイリスク群の囲い込みが困難であることが挙げられる。
【０００３】
現在の医療水準における膵がんの診断方法は、例えば非特許文献１に概観される。上記文献には、膵がんの発見方法として、初発症状（腹痛、黄疸、腰背部痛など）の出現、血中膵酵素測定、腫瘍マーカー測定、腹部超音波検査などが挙げられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本膵臓学会膵癌診療ガイドライン改訂委員会 編『科学的根拠に基づく膵癌診療ガイドライン  ２０１３年度版』金原出版株式会社、２０１３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、診断後の生存率の見地に立つと、現在の膵がんの診断には、改善の余地が残されている。また、膵がんに関連の深い疾患であると考えられる慢性膵炎の診断にも、同様に改善の余地が残されている。
【０００６】
本発明は、慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための新規なデータ取得方法を提供することを目的とする。本発明はまた、上記の新規なデータ取得方法と関連して、慢性膵炎または膵がんの発症可能性を判定する新規なキット、および慢性膵炎または膵がんの処置用の新規な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、慢性膵炎および／または膵がんの患者の膵臓中に、細菌が存在すること、とりわけ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属および／またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌が存在することを初めて見出した。本発明者らはまた、膵臓中に存在するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属および／またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌が、慢性膵炎および／または膵がんの発症に関連していることを初めて見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【０００８】
＜１＞被験体の膵組織において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌の有無を決定する工程を含む、上記被験体における慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための、データ取得方法。
【０００９】
＜２＞上記細菌の有無を決定する工程が、上記被験体の血液を試料として行われる、＜１＞に記載のデータ取得方法。
【００１０】
＜３＞上記細菌の有無を決定する工程が、上記被験体における上記細菌の少なくとも１種以上の抗体価を測定する工程を含む、＜１＞または＜２＞に記載のデータ取得方法。
【００１１】
＜４＞上記抗体価が、上記細菌の少なくとも１種以上の細菌由来ＣＰＳに対する抗体価である、＜３＞に記載のデータ取得方法。
【００１２】
＜５＞上記細菌の有無を決定する工程が、上記被験体の膵液または膵組織を試料として行われる、＜１＞に記載のデータ取得方法。
【００１３】
＜６＞上記被験体における、アミラーゼおよびヘモグロビンＡ１ｃの少なくとも１種以上のレベルを測定する工程を更に含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載のデータ取得方法。
【００１４】
＜７＞上記細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓである、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載のデータ取得方法。
【００１５】
＜８＞Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌由来のＣＰＳに対する抗体を含むことを特徴とする、慢性膵炎または膵がんの発症可能性の判定キット。
【００１６】
＜９＞抗Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ剤および抗Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含む、慢性膵炎または膵がんの処置用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の一態様によれば、慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための、新規なデータ取得方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（ａ）は、膵がん患者の膵液中から、細菌が検出されたことを示す電気泳動像である。（ｂ）は、膵がん患者の膵組織中から、細菌が検出されたことを示す電気泳動像である。（ｃ）は、膵液に胆汁を添加した試料から検出された細菌の、種類および割合を表す円グラフである。
【図２】（ａ）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に特異的なプライマーを用い、膵液または膵組織から抽出したＤＮＡを増幅した結果を表す電気泳動像である。（ｂ）は、膵がん組織をグラム染色した結果、膵がん組織中に細菌が検出されたことを示す顕微鏡像である。
【図３】Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓに特異的なプライマーおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍに特異的なプライマーを用い、膵液から抽出したＤＮＡを増幅した結果を示す電気泳動像である。
【図４】（ａ）は、健常人、大腸がん患者、慢性膵炎患者、膵がん患者における、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を比較した散布図である。（ｂ）は、健常人、軽度の慢性膵炎患者、中程度の慢性膵炎患者、膵がん患者における、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を比較した散布図である。（ｃ）は、年齢とＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価との相関関係を示す散布図である。（ｄ）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を４群に分類した際の、各群と年齢との関係を示した散布図である。（ｅ）は、健常人、慢性膵炎患者、膵がん患者における、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を比較した散布図である。
【図５】（ａ）は、セルレイン投与モデルマウスにおける、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価の上昇を示す散布図である。（ｂ）は、セルレイン投与マウスの膵組織における、抗Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．免疫染色の結果を示す顕微鏡像である。
【図６】（ａ）は、セルレイン投与モデルマウスにおける、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価と、膵組織中におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの存在量との相関を示す散布図である。（ｂ）は、膵がん手術の術式により、術前術後のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価の変化が異なることを示す散布図である。（ｃ）は、膵がん手術の術式による、術前のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を比較した散布図である。（ｄ）は、膵がん手術の術式による、術後のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を比較した散布図である。
【図７】（ａ）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価（ＣＰＳ単独）、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ単独）、およびこれらの組み合わせ（ＨｂＡ１ｃ＋ＣＰＳ）の３種の指標に対して、ＲＯＣ解析により、慢性膵炎の診断能を評価した結果である。（ｂ）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価（ＣＰＳ単独）、アミラーゼ（ＡＭＹ単独）、およびこれらの組み合わせ（ＡＭＹ＋ＣＰＳ）の３種の指標に対して、ＲＯＣ解析により、慢性膵炎の診断能を評価した結果である。（ｃ）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価、ヘモグロビンＡ１ｃおよびアミラーゼの３種を組み合わせた指標（ＡＭＹ＋ＨｂＡ１ｃ＋ＣＰＳ）に対して、ＲＯＣ解析により、慢性膵炎の診断能を評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
【００２０】
本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００２１】
〔１．慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための、データ取得方法〕
本発明の一実施形態において、被験体の膵組織において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌の有無を決定する工程を含む、上記被験体における慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための、データ取得方法を提供する。本実施形態における方法は、被験体が慢性膵炎または膵がんを発症していること、または将来的に発症する可能性があることを診断する際に、判断の補助となるデータを提供することができる。
【００２２】
〔用語の定義〕
本明細書において「膵がん」とは、膵臓に発生するあらゆる癌腫または肉腫を意味する。一般的には、上記膵がんは浸潤性膵管癌を意味するものであるが、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ）、漿液性嚢胞腫瘍（ＳＣＮ）、腺房細胞腫瘍など、その他の外分泌腫瘍に加え、内分泌腫瘍、併存腫瘍なども包含する概念である。
【００２３】
本明細書において「慢性膵炎」とは、膵臓の内部に不規則な線維化、細胞浸潤、実質の脱落、肉芽組織などの慢性変化が生じ、進行すると膵外分泌および／または内分泌機能の低下を伴う疾患の全般を意味する。上記慢性膵炎には、アルコール性慢性膵炎、非アルコール性慢性膵炎（突発性慢性膵炎、遺伝性慢性膵炎、家族性慢性膵炎など）などの病型が存在する。本明細書における「慢性膵炎」は、通常の診断基準（例えば、日本膵臓学会が策定した「慢性膵炎臨床診断基準２００９」）に従って慢性膵炎と診断される疾患に限定されず、上述の病理学的変異が膵臓に観察される状態を広く包含する概念である。本発明者らは、上記病理学的変異が、慢性膵炎と診断されていない患者においても観察されることを以前に見出しており（Tomita Y, Miyoshi E et. al., (2014) "Pancreatic FattyDegeneration and Fibrosis as Predisposing Factors for the Development ofPancreatic Ductal Adenocarcinoma", Pancreas, Vol.43 (No.7), pp.1032-41）、このような症例を便宜的に「潜在性慢性膵炎」と呼称している。本明細書においては、このような「潜在性慢性膵炎」もまた、「慢性膵炎」の概念に包含される。
【００２４】
本明細書において「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌」および「Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌」とは、それぞれ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に分類される細菌を意味する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌は、腸内細菌の一種であるグラム陽性球菌（一般的に「腸球菌」とも呼ばれる。）であり、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（本明細書において「Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ」と略記することもある。）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ（本明細書において「Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ」と略記することもある。）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ（本明細書において「Ｅ．ｈｉｒａｅ」と略記することもある。）などが含まれる。また、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌は、腸内細菌の一種であるグラム陰性桿菌であり、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅなどが含まれる。
【００２５】
なお、本明細書においては、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属を「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．」、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属を「Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．」と表記する場合がある。他の属についても同様の表記法を使用する場合がある。
【００２６】
細菌の分類に際して準拠する体系は、特に限定されないが、一般的な生物分類学における分類（界・門・綱・目・科・属・種による分類）、生物学的特徴（形態、生化学的性状）に基づく分類、生理学的特徴に基づく分類、免疫学的性状に基づく分類、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列による分類などが挙げられる。本明細書に記載されている細菌は、例えば、上記に例示された分類体系に基づき特定される。
【００２７】
また、分類体系の改定により、属の分割または統廃合が行われる場合があるが、少なくとも本願出願時においてＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に分類されると当業者に認識されていた細菌は、それぞれ「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌」、「Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌」の概念に含まれるものとする。なお、本明細書においては、例外的に、近年Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属から分離されたＰａｎｔｏｅａ属もまた、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の概念に含まれるものとする。
【００２８】
〔推定される作用機序〕
以下に、本発明の実施形態に関して、推定される作用機序を説明する。なお、下記の説明は、本発明の実施形態の理解を助けるために、推定される作用機序を例示として示したに過ぎない。したがって、下記の説明に、本発明を限定する意図は全く存在しない。もっとも、下記の説明を支持する根拠が存在することは、本明細書の実施例を読んだ当業者には明らかであろう。
【００２９】
本発明の実施形態は、以下の推定作用機序に基づく。すなわち、通常は腸管に棲息している細菌であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．は、総胆管から膵管に逆流して膵臓へ達し、膵液中で生存することができる。このとき、菌体成分の一部（例えば、ＬＰＳ、ＬＴＡなど）が膵臓の星細胞や膵管細胞、マクロファージなどを刺激して、様々なサイトカインが産生されることにより、周囲の膵組織が線維化し、慢性膵炎の発症に至る。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．は、同様の推定作用機序により、慢性膵炎の増悪にも影響を及ぼす。そして、増悪した慢性膵炎は、膵がんの発症に至る可能性が高まる。
【００３０】
上記推定作用機序においては、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．は、膵組織の線維化の初期段階において、特に関与していると考えられる。一方、膵組織の線維化が進んで、重度の段階となった場合には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．以外の要因によっても、さらなる線維化が進行するものと考えられる。したがって、このような推定作用機序に基づくと、本発明の一実施形態におけるデータ取得方法は、慢性膵炎の発症の可能性を判定するために用いられることが好ましく、中程度以下の慢性膵炎または潜在性慢性膵炎の発症の可能性を判定するために用いられることがより好ましい。
【００３１】
以下、慢性膵炎の重症度について説明する。本明細書において、「中程度の慢性膵炎」とは、「慢性膵炎臨床診断基準２００９」において、慢性膵炎準確診例、早期慢性膵炎例、慢性膵炎疑診例に分類され、腹痛などの明確な臨床症状が認められる症例である。また、本明細書において、「中程度以下の慢性膵炎」とは、重症度が上記中程度の慢性膵炎と同等であるか、それ未満である慢性膵炎である。上記中程度以下の慢性膵炎には、例えば、「軽度の慢性膵炎」が含まれる。一例において、軽度の慢性膵炎は、入院治療を必要としない程度に重症度の低い慢性膵炎である。潜在性慢性膵炎は、慢性膵炎と診断されていない患者に見られる疾患であるが、膵臓に慢性膵炎様の病理学的変異が見られるという意味において、本明細書においては、中程度以下の慢性膵炎に準じて扱うことができる。
【００３２】
また、発明者らは、膵がん患者において、多くの膵がんの周辺組織に慢性膵炎様の病理所見が存在することを見出している（Tomita Y, Miyoshi E et. al., (2014) "Pancreatic FattyDegeneration and Fibrosis as Predisposing Factors for the Development ofPancreatic Ductal Adenocarcinoma", Pancreas, Vol.43 (No.7), pp.1032-41）。加えて、慢性膵炎患者の膵がん発症率は、健常人の４〜８倍になることが知られている。これらのことから、慢性膵炎の診断は、将来的な膵がん予備軍を発見するとみることもできる。したがって、本発明の一実施形態におけるデータ取得方法は、膵がんのハイリスク群の判定に用いることができる。
【００３３】
〔細菌の種類および細菌の有無の決定方法〕
本実施形態では、被験体の膵組織において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌の有無を決定する工程を含む、上記被験体における慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するための、データ取得方法を提供する。
【００３４】
本実施形態における細菌の有無を決定する工程は、任意の公知の手法が取られ得る。上記工程は、例えば、被験体において上記細菌自体または菌体の一部（例えば、菌体を構成するタンパク質、多糖類、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、菌体抗原、鞭毛抗原など）を直接検出する方法、被験体において上記細菌自体または菌体の一部が存在することを間接的に検出する方法が挙げられる。
【００３５】
前者の方法が用いられる場合、試料としては、例えば、膵液、膵組織などが用いられる。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．は、健常人においても腸管に棲息している。このため、膵液または膵組織を試料とすることにより、健常人に対して慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を誤って高く見積もる過誤の発生を減じることができる。
【００３６】
本明細書において「膵液」とは、膵臓から十二指腸に外分泌される消化液を意味し、多種の消化酵素を含む。膵液に含まれる消化酵素には、例えば、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼなどのタンパク質分解酵素、リパーゼなどの脂肪分解酵素、アミラーゼなどの炭水化物分解酵素、ヌクレアーゼなどの核酸分解酵素などがある。
【００３７】
また、本明細書において「膵組織」とは、膵臓を構成する一まとまりの細胞集団を意味し、膵臓の少なくとも一部を構成する細胞集団であれば特段限定されない。膵組織は、例えば、外分泌部、内分泌部、膵管、腺房などの組織学的単位からなる細胞集団であってもよいし、上述した組織のうち複数に由来する細胞集団であってもよい。
【００３８】
膵液または膵組織を試料として、上記細菌の有無を決定する具体的な方法としては、例えば、以下で示す実施例２−１および実施例４−２において使用された方法が挙げられる。
【００３９】
一方、後者の方法では、例えば、細菌または菌体の一部が被験体の体内（例えば、膵組織）に分布することにより生じる、各種の物質を検出する手法を用いることもできる。当該各種の物質が、循環系などにより身体の他の箇所へ運ばれる場合は、膵液または膵組織以外を試料とすることができる。例えば、血液、脳脊髄液、リンパ液、母乳、唾液、鼻汁、汗、尿、便、呼気などを試料とすることができ、とりわけ、血液は、採取が容易であり、かつ、他の生体検査も同時に行えるなどの利点を有することから、好ましい試料である。ここで、上記血液は、全血であってもよいし、血漿、血清、血餅、赤血球、白血球、血小板など全血を構成する成分であってもよい。
【００４０】
なお、本実施形態において用いられる試料は、上記で例示列挙したものの他に、上記公知の手法により、上記細菌の検出が可能である試料であれば特段限定されない。また、本実施形態における試料は、当該技術分野における公知の方法を用いて、適宜調整することができる。
【００４１】
上記各種の物質の例としては、抗体、ホルモン、細胞間伝達物質などが挙げられる。このうち、抗体は、抗原に対する特異性を有していること、多くの被験体が抗体を産生しうること、測定が容易であること、保存血清でも測定に利用できることなどの利点があり、本実施形態における検出対象として好ましい。
【００４２】
したがって、本発明の一実施形態において、細菌または菌体の一部が体内（例えば、膵組織）に分布することにより生じる、各種の物質を検出する手法としては、被験体から採取した試料に含まれる抗体の量または抗体価を測定する手法を用いることが好ましく、抗体価を測定する手法を用いることがより好ましい。
【００４３】
基準値の設定方法について、当業者は、健常者における定量値（正常値）、典型的な慢性膵炎または膵がんの定量値（疾患値）や、軽度、中度または重度の慢性膵炎または膵がんの定量値（疾患値）を参考に、適切に基準値を設定することができる。すなわち、一般に診断における基準値は、臨床試験から得られた健常者や患者の多くの測定値を基に、その目的に合わせて当業者が適切に設定するものであり、本明細書の開示事項および本願出願時の技術常識に基づき、当業者は容易に診断のための基準値を決定することができる。
【００４４】
すなわち、例えば、「細菌が存在する（有）」ということは、測定した抗体価などの指標が上記基準値（例えば、健常者の抗体価の値）を上回るか否かによって判断することができ、「細菌が存在しない（無）」ということは、測定した抗体価などの指標が上記基準値を下回るか否かによって判断することができる。測定した抗体価などの指標が上記基準値（例えば、健常者の抗体価の値）を上回った場合は、「細菌が存在する（有）」と判定でき、測定した抗体価などの指標が上記基準値を下回った場合は、「細菌が存在しない（無）」と判定できる。
【００４５】
本明細書において「抗体」とは、抗原となる物質に対して結合能を有するタンパク質を意味し、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、抗体断片（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）などを包含する。また、本明細書における抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体、完全ヒト化抗体、キメラ化抗体でありうるが、これらに限定されない。更に、本明細書における抗体は、任意の動物に由来するのもであってもよく、例えば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、マウス由来抗体、ヤギ由来抗体などであり得る。
【００４６】
本実施形態における抗体は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．の菌体を構成する、任意の部分を認識する抗体でありうる。あるいは、上記抗体は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．の存在によって生じる任意の物質（例えば、細菌の排出する物質、細菌の存在により周辺組織から排出される物質、など）を認識する抗体でありうる。このような抗体の中でも、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．の莢膜ポリサッカライド（Capsular polysaccharide；本明細書において、「ＣＰＳ」とも略記する）を認識する抗体が好ましい。細菌の属間および種間においてＣＰＳには多様性が存在するため、特定の属または種の細菌のＣＰＳを認識する抗体は、特異性が高いという特徴がある。このため、ＣＰＳを認識する抗体の抗体価を測定することは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌の有無を決定する工程として好適である。
【００４７】
本実施形態において、抗体価は、試料中に含まれる、特定の抗原に対して特異的に結合する抗体を定量することによって測定される。上記抗体価の測定は、当該技術分野における公知の方法を用いて行うことができる。このような方法には、例えば、（間接）蛍光抗体法、ドットブロットアッセイ法、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を含む）、放射性イムノアッセイ法（ＲＩＡ）、免疫拡散アッセイ法などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態において、抗体価は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法により測定される。細菌のＣＰＳを認識する抗体の抗体価を測定する具体的な方法としては、例えば、実施例３−１において記載されている方法が用いられる。
【００４８】
本実施形態において、有無が決定される対象となる上記細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌であればよく、特段限定されない。より高い精度で慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定できる、との利点から、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌を対象とすることが好ましく、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅを対象とすることがより好ましく、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓを対象とすることが更に好ましい。
【００４９】
本明細書において「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ」とは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する腸内細菌の一種であり、ヒト腸管の正常細菌叢に常在するグラム陽性Ｄ群レンサ球菌（腸球菌）である。「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ」は、また、ＡＴＣＣ番号１９４３３として、ＡＴＣＣに寄託されている。
【００５０】
本明細書において「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ」とは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する腸内細菌の一種であり、ヒト腸管の正常細菌叢に常在するグラム陽性Ｄ群レンサ球菌（腸球菌）である。「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ」は、また、ＡＴＣＣ番号１９４３４として、ＡＴＣＣに寄託されている。
【００５１】
本明細書において「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ」とは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する腸内細菌の一種であり、ヒト腸管の正常細菌叢に常在するグラム陽性Ｄ群レンサ球菌（腸球菌）である。「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ」は、また、ＡＴＣＣ番号８０４３として、ＡＴＣＣに寄託されている。
【００５２】
本明細書において「発症の可能性を判定するためのデータ取得」とは、医師および医療関係者などが診断を下すことを補助するデータ（例えば、血液、膵液、膵組織などの試料から得られる生体データ）を取得することを意味する。上記診断とは、以下の類型に分類される行為でありうる。
（１）被験体が、特定の疾患に罹患しているか否かを判断する行為。
（２）被験体が、特定の疾患に罹患する可能性の高低を判断する行為。
（３）被験体が特定の疾患に罹患している場合、当該疾患の重症度を判断する行為。
【００５３】
なお、上記診断は、一度に行われるものでもよいし、継時的に複数回にわたって行われるものでもよい。また、上記被験体はヒトに限定されず、例えば、ヒト以外の哺乳類（家畜、コンパニオンアニマル、野生生物を含む）にも拡張されうる。
【００５４】
上記データ取得方法は、被験体における上記細菌の有無を決定することであってもよいし、別の実施形態においては、被験体における上記細菌のレベルを決定することであってもよい。被験体における上記細菌のレベルを決定する場合、被験体における上記細菌のレベルの高低を、慢性膵炎または膵がんの重症度の判定、現在または未来における慢性膵炎または膵がんの発症確率の高低の判定、などの判断材料とすることもできる。本発明の一実施形態におけるデータ取得方法を、公知の他の診断方法（例えば、画像診断）と組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
本明細書において「細菌の有無を決定する」ことは、「細菌が存在する」または「細菌が存在しない」のいずれかに分類することが、含まれていればよい。また、本明細書において「細菌のレベルを決定する」とは、上記細菌に関する任意の指標を、序列の中に位置付けることを意味する。一例において、上記細菌レベルの決定は、数量化を伴わないものであり得て、例えば、「全く細菌が存在しない」、「少量の細菌が存在する」、「多量に細菌が存在する」のいずれかに分類する方法が挙げられる。他の例において、上記細菌レベルの決定は、数量化を伴うものであり得て、例えば、増幅されたＤＮＡバンドの定量、抗体価の測定のような方法により分類されることが挙げられる。
【００５６】
〔２．他のバイオマーカーとの併用〕
本発明の一実施形態において、上記１．のデータ取得方法は、被験体の膵組織においてＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌の有無を決定する工程と、他の公知のバイオマーカーを測定する工程とを組み合わせてよい。上記細菌の有無を決定する工程と、他の公知のバイオマーカーを測定する工程とを組み合わせることにより、公知のバイオマーカーのみを用いた場合と比較して、より高精度に、慢性膵炎および／または膵がんの発症可能性を判定することができる。
【００５７】
上記他のバイオマーカーとしては、上記細菌の有無を決定する工程と組み合わせて用いた場合に、慢性膵炎および／または膵がんの発症可能性の判定がより高精度に行えるものであればよく、例えば、慢性膵炎または膵がんの存在を示唆するものや、膵機能の指標を表すものが挙げられる。前者の例としては、ＣＡ１９−９、エラスターゼＩ、ＤＵＰＡＮ−ＩＩ、ＳｐａｎＩなどが挙げられる。また、後者の例としては、ヘモグロビンＡ１ｃ、アミラーゼ、リパーゼなどが挙げられる。本実施形態における他のバイオマーカーは、慢性膵炎または膵がんの診断能を高められるという利点のため、ヘモグロビンＡ１ｃまたはアミラーゼが好ましく、アミラーゼがより好ましく、ヘモグロビンＡ１ｃおよびアミラーゼの両方であることが更に好ましい。すなわち、本実施形態において特に好ましい態様は、上記細菌の有無を決定する工程と、ヘモグロビンＡ１ｃおよびアミラーゼを測定する工程とを組み合わせた態様であり得る。
【００５８】
本明細書において「ヘモグロビンＡ１ｃ」とは、糖化タンパク質の一種で、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端にグルコースが結合しているグリコヘモグロビンを意味する。ヘモグロビンＡ１ｃを測定する方法は特に限定されず、適宜、公知の方法を用いることが可能である。例えば、ヘモグロビンＡ１ｃの測定は、公知のキット（例えば、Direct HbA1c Assay Kit（Diazyme Laboratories製））を用い、当該キットに付属のマニュアルに基づいて行うことができる。
【００５９】
本明細書において「アミラーゼ」とは、主として膵臓および唾液腺から分泌される、デンプンを分解する消化酵素の一種を意味する。アミラーゼを測定する方法は特に限定されず、適宜、公知の方法を用いることが可能である。例えば、アミラーゼの測定は、公知のキット（例えば、MaxDiscovery（商標）Amylase Assay（Bioo Scientific製））を用い、当該キットに付属のマニュアルに基づいて行うことができる。
【００６０】
〔３．慢性膵炎または膵がんの発症可能性の判定キット〕
本発明の一実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌由来のＣＰＳに対する抗体を含むことを特徴とする、慢性膵炎または膵がんの発症可能性の判定キットを提供する。本実施形態におけるキットは、被験体が慢性膵炎または膵がんを発症していること、または将来的に発症する可能性があることを診断する際に、判断の補助となるデータを提供することができる。
【００６１】
本明細書において「キット」とは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌由来のＣＰＳに対する抗体、上記抗体と共に使用する種々の薬剤または添加物、上記抗体および上記薬剤または添加物が封入されている容器、および使用に関する説明書などを備える製品を意味する。また、一部の薬剤、添加物、容器を別の製品として用意し、当該製品と組み合わせて使用することにより、上記キットの構成を備えることのできる製品もまた、本発明の一実施形態におけるキットに含まれる。上記キットは、被験体におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌由来のＣＰＳに対する抗体価を測定するために使用されうる。
【００６２】
本実施形態において、上記キットは、好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の少なくとも１種以上の細菌由来のＣＰＳに対する抗体を含んでおり、より好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍおよび／またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ由来のＣＰＳに対する抗体を含んでおり、更に好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来のＣＰＳに対する抗体を含んでいる。
【００６３】
上記キットを用いた、慢性膵炎または膵がんの発症可能性の判定は、本発明の一実施形態におけるデータ取得方法（例えば、上記〔１〕または〔２〕の方法）に準じた手法により行われる。例えば、上記キットを用いてＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌由来のＣＰＳに対する抗体価を測定し、測定した値を上記細菌のレベルとみなすことによって、上記発症可能性を判定することができる。
【００６４】
〔４．慢性膵炎または膵がんの処置用医薬組成物〕
本発明の一実施形態において、抗Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ剤および抗Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含む、慢性膵炎または膵がんの処置用医薬組成物を提供する。本実施形態における医薬組成物は、慢性膵炎または膵がんに罹患している被験体、または罹患する可能性がある被験体を処置することができる。
【００６５】
本明細書において「抗Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ剤」とは、被験体において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の機能を阻害する薬剤を意味する。抗Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ剤は、上記定義に基づくものであれば特に限定されないが、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対して有効な抗生剤や抗体などが挙げられる。上記Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対して有効な抗生剤は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対して特異的な抗生剤でも、非特異的な抗生剤であってもよい。入手容易性の観点から、好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対して非特異的な抗生剤、例えば、腸内細菌に対して有効な抗生剤が使用される。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対して有効な抗生剤の具体例としては、ペニシリン系抗生剤、ニューキノロン系抗生剤、マクロライド系抗生剤、カルバペネム系抗生剤、グリコペプチド系抗生剤（バンコマイシンなど）などが挙げられる。
【００６６】
本明細書において「抗Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ剤」とは、被験体において、抗Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ剤属の細菌の機能を阻害する薬剤を意味する。抗Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ剤は、上記定義に基づくものであれば特に限定されないが、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌に対して有効な抗生剤や抗体などが挙げられる。上記Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌に対して有効な抗生剤は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌に対して特異的な抗生剤でも、非特異的な抗生剤であってもよい。入手容易性の観点から、好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌に対して非特異的な抗生剤、例えば、腸内細菌に対して有効な抗生剤が使用される。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌に対して有効な抗生剤の具体例としては、ニューキノロン系抗生剤、アミノグリコシド系抗生剤、セフェム系抗生剤などが挙げられる。
【００６７】
本実施形態における医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤などを含むことができる。予防または治療的使用のための薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤は、薬学分野で周知であり、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤の選択は、意図された投与経路および標準的薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択されうる。また、本実施形態における医薬組成物は、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、被覆剤または可溶化剤をさらに含みうる。
【００６８】
本実施形態における医薬組成物は、任意の剤型をとることができ、また任意の投与経路により投与される。長期投与が可能であるという観点からは、上記医薬組成物を経口投与により投与することが好ましい。上記医薬組成物の処方は、対象となる疾患、当該疾患の重症度、有効成分、投与経路などに応じて、適宜設定される。
【００６９】
本明細書において「処置」とは、処置効果をもたらす行為を意味する。処置効果とは、予防効果および治療効果を包含する概念で、例えば、以下の類型に含まれる効果を奏するものである。
（１）医薬組成物を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の発症を防止する、またはリスクを低減する。
（２）医薬組成物を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の再発を防止する、またはリスクを低減する。
（３）医薬組成物を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、またはリスクを低減する。
（４）医薬組成物を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。
（５）医薬組成物を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または進行を防止する。
（６）医薬組成物を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または進行速度を低減する。
【００７０】
本実施形態における医薬組成物の処置対象は、慢性膵炎または膵がんの発症の可能性がある対象であれば特に限定されず、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。また、本実施形態における医薬組成物の処置対象は、上記〔１〕または〔２〕の方法により得られたデータを基に慢性膵炎または膵がんの発症の可能性があると判定された被験者、または上記〔３〕のキットにより、慢性膵炎または膵がんの発症の可能性があると判定された被験者であることが好ましい。その場合には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属やＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属などの細菌が慢性膵炎または膵がんの発症に起因している可能性が高い被験者に対して、本実施形態における医薬組成物を作用させることとなるため、より有効な処置効果が期待される。
【００７１】
その他、上記〔１〕〜〔４〕の各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できることを付言する。また、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
〔使用した臨床サンプル〕
以下の実施例１〜６において使用した臨床サンプルは、別途記載のない限り、下記のとおり入手したものである。
【００７３】
膵液は、膵がん除去手術の術後膵液ドレナージに伴い得られたものである。なお、対照実験用の膵液としては、胆道がん除去手術または十二指腸がん除去手術の術後膵液ドレナージに伴い得られたものを用いた。
【００７４】
膵組織は、膵がん手術または剖検により入手した。
【００７５】
胆汁は、胆管がんおよび総胆管結石の術後胆汁ドレナージに伴い得られたものである。
【００７６】
健常人の血清は、人間ドックに伴い生じた残血清を使用した。健常人の選抜方法としては、上記人間ドックの受検者のうち、肝機能および肝臓検査の結果に異常所見が認められなかった者を健常人とした。慢性膵炎患者および膵がん患者の血清は、原則として、疾患の治療前に採取したものである。
【００７７】
上述した臨床サンプルは、大阪大学附属病院および大阪大学関連病院において採取された。
【００７８】
〔使用したプライマー〕
以下の実施例においては、下表のプライマーを使用した。なお、下表のプライマーは、別途記載がない限り、Invitrogenから取得した。
【００７９】
【表１】
2018100861.tif 000002
【００８０】
〔実施例１〕
［実施例１−１］
膵がん患者の膵液または膵組織中に細菌が存在することを確認し、上記細菌の種類を同定した。まず、膵がん患者の膵液または膵組織中に細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードしているＤＮＡが含まれることを、ＰＣＲ法により確かめた。次いで、上記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードしているＤＮＡをシークエンス解析し、上記細菌の種類を同定した。
【００８１】
（膵組織からのＤＮＡの抽出）
１．膵がん手術後、−８０℃にて保存していた膵組織の一部を採取し、DNeasyBlood & Tissue kit（QIAGEN製）を用いて、上記膵組織中のＤＮＡを抽出した。詳細な方法は、上記DNeasy Blood & Tissue kit添付の説明書に従った。
【００８２】
（１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードしているＤＮＡの増幅、細菌の同定）
２．作製した試料、および各種試薬を下記の通り混合した後、PCR Thermalcycler（タカラバイオ製）を用いて、ＤＮＡを増幅させた。
・試料（膵組織から抽出したＤＮＡまたは膵液）  ２μＬ
・２０μＭ Forward primer（S-D-Bact-0341b-S-17）  １μＬ
・２０μＭ Reverse primer（S-D-Bact-0785-a-A-21）  １μＬ
・Go Taq Green Master Mix（Promega製）１０μＬ
・超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水；以下、単に「超純水」とのみ表記する）  ６μＬ。
【００８３】
３．ＰＣＲ産物（細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ３−Ｖ４領域を含む配列をコードしているＤＮＡ配列）を、２％アガロースゲル（ニッポンジーン製、粉末）を用いて電気泳動させた。その結果、膵がん患者の膵液および膵組織から作製したサンプルには、バンドが形成された（それぞれ図１の（ａ）、図１の（ｂ））。
【００８４】
４．上記バンドを切り出し、QIAquick Gel ExtractionKit（QIAGEN製。QIAquickは登録商標。）を用いてＤＮＡを精製した。詳細な方法は、上記QIAquick Gel Extraction Kit添付の説明書に従った。
【００８５】
５．精製したＤＮＡを、pGEM T Easy Vector system（プロメガ株式会社製。pGEMは登録商標。）によって、T Easy Vector（プロメガ株式会社製）へライゲーションした。
【００８６】
６．ライゲーションにより得られたベクターＤＮＡを、コンピテントセル（ＤＨ５α）に導入した後、ＬＢ培地に播種した。上記コンピテントセルの播種に際しては、上記ＬＢ培地にＸ−ｇａｌを塗布した。翌日、青白選択により、目的のＤＮＡが組み込まれているベクターＤＮＡを有するコロニーを選抜、採取した。
【００８７】
７．選抜、採取したコロニーを、液体ＬＢ中で、３７℃にて６時間浸透培養した。その後、Qiaprep Spin miniprep kit（QIAGEN製。Qiaprepは登録商標。）を用いてＤＮＡを精製した。詳細な方法は、上記QiaprepSpin miniprep kit添付の説明書に従った。
【００８８】
８．精製されたＤＮＡを、Bigdye terminator v3.1cycle sequencing kit（Thermo製。Bigdyeは登録商標。）を用いたＰＣＲにより、増幅させた。プライマーとしては、T7 primerおよびSP6 primer（共にタカラバイオ製）を使用し、５’方向および３’方向の両方向同時にＰＣＲ反応を進めた。
【００８９】
９．得られたＰＣＲ産物に、５μＬの１２５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび４５μＬの９９．５％エタノールを加え、氷上に１０分間静置した。
【００９０】
１０．４℃、２０，０００ｇの条件で、２０分間遠心分離した。
【００９１】
１１．上清を捨てた後、７０％エタノール（３００μＬ）を加え、残渣を洗浄した。
【００９２】
１２．４℃、２０，０００ｇの条件で、５分間遠心分離した。
【００９３】
１３．上清を捨て、Micro Vac（トミー精工製）を用いてエタノールを蒸発させた。
【００９４】
１４．得られた残渣をホルムアミド（２０μＬ）に溶解させ、９５℃にて２分間ヒートブロックした。その後、Applied Biosystems・310（Applied Biosystems製）を用いて、目的のＤＮＡをシークエンス解析した。
【００９５】
１５．得られたシークエンスを基に、NCBIの提供するBLASTを利用して、細菌の種類を同定した。結果を表２に示す。
【００９６】
（結果）
【００９７】
【表２】
2018100861.tif 000003
【００９８】
表２に示されるように、一部の試料からはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌が検出された。なお、表中のＰａｎｔｏｅａ属は、近年Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属から分離された属である。本明細書においては、例外的に、Ｐａｎｔｏｅａ属もまた、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の概念に含まれるものとする。
【００９９】
［実施例１−２］
胆汁を添加した膵液サンプルを作製し、当該サンプル中で増殖が可能な細菌の種類を調べた。
【０１００】
（胆汁添加実験）
１．膵液５０μＬに胆汁１μＬを添加し、３７℃で２４時間培養した。
【０１０１】
２．実施例１−１の２〜５の手順と同様に、サンプルに含まれる細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードしているＤＮＡ配列を増幅、精製した後、ベクターを作製した。上記ベクターをコンピテントセルに導入し、ＬＢ培地に播種した。
【０１０２】
３．翌日、数個のコロニーを無作為に選抜し、当該コロニーについて、実施例１−１の７〜１５と同様の手順により、細菌の種類を同定した。
【０１０３】
４．同定された細菌のコロニー数が、３において選抜したコロニーの総数に対して占める比率を求めた。結果を図１の（ｃ）に示す。
【０１０４】
（結果）
図１の（ｃ）に示されるように、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．が、膵液に胆汁を添加したサンプルにおいて顕著に多く見られた。
【０１０５】
［実施例１−３］
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に特異的なプライマーを用いて、膵がん患者の膵液または膵組織中にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌が含まれているか否かを調べた。
【０１０６】
（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．特異的ＰＣＲ）
１．試料および各種試薬を下記の通り混合した後、PCR Thermalcycler（タカラバイオ製）を用いて、ＤＮＡを増幅させた。
・試料（膵組織から抽出したＤＮＡまたは膵液）  ２μＬ
・２０μＭ Forward primer（rpoB-forward）  １μＬ
・２０μＭ Reverse primer（rpoB-reverse）  １μＬ
・Go Taq Green Master Mix（Promega製。Go Taqhaは登録商標。）  １０μＬ
・超純水  ６μＬ
なお、膵組織からのＤＮＡの抽出は、実施例１−１と同様の方法で行った。
【０１０７】
２．ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（ニッポンジーン製、粉末）にて電気泳動した後、卓上ＵＶトランスイルミネーターを用いてバンドを確認した。
【０１０８】
（結果）
図２の（ａ）に示されているように、膵がん患者の膵液および膵組織サンプルからは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に特有のｒｐｏＢ配列をコードしているＤＮＡが検出された。
【０１０９】
［実施例１−４］
膵がん組織に対してグラム染色（Modified Brown &Brenn法）を行い、膵がん組織に細菌が存在するかを調べた。染色には、Gram StainKit(Modified Brown&Brenn)（Scy Tek製）を用いた。
【０１１０】
（脱パラフィン）
１．パラフィン包埋された組織切片を貼付したスライドガラスを、５０℃のインキュベーター内にて１０分間インキュベートした。
【０１１１】
２．上記組織切片をキシレンで５分間洗浄する工程を、３回繰り返した。
【０１１２】
３．上記組織切片を無水エタノールで３分間洗浄する工程を、２回繰り返した。
【０１１３】
４．上記組織切片を、９０％エタノールで３分間洗浄した。次いで、上記組織切片を、８０％エタノールで３分間洗浄した。更に、上記切片を、７０％エタノールで３分間洗浄した。
【０１１４】
５．上記組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４、組成（最終濃度）：ＮａＣｌ（１３７ｍＭ）、ＫＣｌ（２７ｍＭ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（８１ｍＭ）、Ｋ２ＰＯ４（１４．７ｍＭ）；以下、ＰＢＳの組成およびｐＨは全て同じ）で５分間洗浄する工程を、３回繰り返した。
【０１１５】
（染色）
６．上記組織切片に１ｍＬのゲンチアナ紫を滴下し、２分間インキュベートした。
【０１１６】
７．ゲンチアナ紫を、超純水で洗い流した。
【０１１７】
８．上記組織切片に１ｍＬのルゴール・ローディンを滴下し、２分間インキュベートした。
【０１１８】
９．ルゴール・ローディンを、水道水で洗い流した。
【０１１９】
１０．上記組織切片を、超純水層に軽く１回浸漬した（２秒間程度）。
【０１２０】
１１．Gram's Decolorizer dropwiseを、組織片の青色が脱色されるまで繰り返し滴下した（３回程度）。
【０１２１】
１２．Gram's Decolorizer dropwiseを、超純水で洗い流した（２〜５秒間）。
【０１２２】
１３．上記組織片に、プレパラート全体が覆われる程度（約１ｍＬ）にサフラニンＯを滴下し、４分間インキュベートした。
【０１２３】
１４．サフラニンＯを、超純水で洗い流した。
【０１２４】
１５．上記組織片を、無水エタノールに軽く１回浸漬した（１〜２秒間）。その後、濾紙を用いて素早く乾燥させた。
【０１２５】
１６．上記組織片に、プレパラート全体が覆われる程度（約１ｍＬ）に０．１％ピクリン酸およびアセトンを滴下し、２〜１０秒間振盪した。振盪後、速やかに脱水工程へ移行した。
【０１２６】
（脱水・透徹・封入）
１７．上記組織片を、無水エタノールに１秒間〜２秒間浸漬する工程を、２回繰り返した。
【０１２７】
１８．上記組織片を、キシレンに１分間浸漬する工程を、３回繰り返した。
【０１２８】
１９．上記組織片を封入剤であるＮｅｗ  Ｍ・Ｘ（松浪硝子工業株式会社製）によって封入し、顕微鏡にて観察した。顕微鏡写真を図２の（ｂ）に示す。
【０１２９】
（結果）
図２の（ｂ）に示されるように、膵がん組織中にはグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のいずれもが観察された。
【０１３０】
細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーを用いたＰＣＲの結果（実施例１−１）、およびグラム染色による組織の観察（実施例１−４）により、膵がん患者の膵液中および膵組織中には、複数の種類の細菌が検出されることが明らかになった。
【０１３１】
このうち、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．は、アルカリ耐性のある細菌であるため、膵液中でも増殖が可能であると考えられる。この見解を裏付けるように、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．は、健常人では腸管に棲息している腸球菌であるが、膵がん患者においては膵液および膵組織にも分布している（実施例１−３）。これは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．が総胆管を逆流して膵管および膵組織へと移動しているためであると推測される。この見解は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．が、胆汁中から膵液中に移動しても生存できることを示唆する実施例１−２の結果により、支持される。
【０１３２】
〔実施例２〕
［実施例２−１］
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓに特異的なプライマーを用い、膵液から抽出したＤＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した。
【０１３３】
１．以下の試料および試薬を混合し、PCR Thermal cycler（タカラバイオ製）を用いて、ＰＣＲ法によりＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードしているＤＮＡ配列を増幅した。
・試料（膵液）  ２μＬ
・２０μＭ Forward primer（E.faecalis 16SrDNA-forward）  １μＬ
・２０μＭ Reverse primer（E.faecalis 16SrDNA-reverse）  １μＬ
・Go Taq Green Master Mix（Promega製。Go Taqは登録商標。）１０μＬ
・超純水  ６μＬ。
【０１３４】
２．ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（ニッポンジーン製、粉末）にて電気泳動した後、卓上ＵＶトランスイルミネーターを用いてバンドを確認した（図３）。
【０１３５】
［実施例２−２］
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍに特異的なプライマーを用い、膵液から抽出したＤＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した。
【０１３６】
１．以下の試料および試薬を混合し、PCR Thermal cycler（タカラバイオ製）を用いて、ＰＣＲ法によりＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍのＳｏｄＡ配列をコードしているＤＮＡ配列を増幅した。
・試料（膵液）  ２μＬ
・２０μＭ Forward primer（Efm1）  １μＬ
・２０μＭ Reverse primer（Efm2）  １μＬ
・Go Taq Green Master Mix（Promega製）１０μＬ
・超純水  ６μＬ。
【０１３７】
２．ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（ニッポンジーン製、粉末）にて電気泳動した後、卓上ＵＶトランスイルミネーターを用いてバンドを確認した。
【０１３８】
（結果）
図３に示されるように、膵がん患者の膵液からは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードしているＤＮＡが検出された。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓよりは存在数が少ないものの、膵がん患者の膵液からは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍのＳｏｄＡ配列をコードしているＤＮＡが検出された。この結果は、膵がん患者の膵液中に、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが多く分布しており、それより数は少ないものの、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍも分布していることを示唆する。
【０１３９】
〔実施例３〕
［実施例３−１］
健常人、大腸がん患者、慢性膵炎患者、膵がん患者における、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を比較した。
【０１４０】
（Ｅ．ｆｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳの精製）
１．エンテロコッコセル寒天培地（BD製）にて膵液を培養することにより、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓを分離した。次いで、上記Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓを、５ｍＬのエンテロコッコセルブロス（BD製）を用い、３７℃にて一晩培養した。
【０１４１】
２．１で得られた培養液５ｍＬを、５０ｍＬのエンテロコッコセルブロスに加え、２時間培養した。
【０１４２】
３．室温にて１０分間、１２，０００ｒｐｍの条件で遠心分離した。
【０１４３】
４．沈殿したペレットを、５００μＬの１０％トリクロロ酢酸に溶解させ、４℃にて２４時間、振盪させながらインキュベートした。
【０１４４】
５．室温にて１０分間、１２，０００ｒｐｍの条件で遠心分離した。
【０１４５】
６．上清を回収した。回収した上清に１．２５ｍＬの９９．５％エタノールを加え、−２０℃にて２４時間インキュベートした。
【０１４６】
７．室温にて１０分間、１２，０００ｒｐｍの条件で遠心分離した。
【０１４７】
８．沈殿したペレットとして、精製されたＣＰＳを得た。上記ＣＰＳを、１ｍＬのＰＢＳに溶解させた。
【０１４８】
（ヘキソースアッセイによるＣＰＳの定量）
９．グルコース２μｇ、４μｇ、６μｇ、８μｇ、１０μｇ、２０μｇを、それぞれ２０μＬのＰＢＳに溶解させ、標準溶液とした。
【０１４９】
１０．８．で得たＣＰＳ溶液および９．で得た６種類の標準溶液を、それぞれ２０μＬずつ、ウェルに加えた。
【０１５０】
１１．それぞれのウェルに、２５μＬの４％フェノールを加えた。
【０１５１】
１２．室温で５分間静置した。
【０１５２】
１３．それぞれのウェルに、２００μＬの濃硫酸を加えた。
【０１５３】
１４．iMark（商標）マイクロプレートリーダー（BIO-RAD製）を用いて、それぞれのウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準溶液における吸光度を基に、８．で得たＣＰＳの量を算出した。
【０１５４】
（ヒトＥ．ｆｅａｃａｌｉｓ由来ＣＰＳ抗体ＥＬＩＳＡ）
１５．１４．にて算出したＣＰＳの量を基に、ＣＰＳ溶液をＰＢＳで希釈し、１０μｇ／ｍＬのＣＰＳ希釈液とした。
【０１５５】
１６．９６穴のmicro titer plate Nunc Maxi soap（Nunc製。Nunc Maxi soapは登録商標。）に、上記ＣＰＳ希釈液を１００μＬ／ウェルずつ注入した（ＣＰＳ量に換算すると１μｇ／ウェル）。
【０１５６】
１７．４℃にて一晩静置した。
【０１５７】
１８．０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有させたＰＢＳで、ウェルを３回ずつ洗浄した。
【０１５８】
１９．カーボネートバッファー／１％ＢＳＡを、５０μＬ／ウェルずつ加えた。
【０１５９】
２０．３７℃にて１時間インキュベートした。
【０１６０】
２１．反応液を捨て、ウェルをＰＢＳで２回ずつ洗浄した。
【０１６１】
２２．分析対象となるヒト血清（健常人、大腸がん患者、慢性膵炎患者または膵がん患者の血清）を１００倍に希釈し、５０μＬ／ウェルずつ加えた。希釈に際しては、ＰＢＳ／１％ＢＳＡを使用した。
【０１６２】
２３．３７℃にて１時間インキュベートした。
【０１６３】
２４．０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有させたＰＢＳで、ウェルを３回ずつ洗浄した。
【０１６４】
２５．二次抗体として、sheep anti-human IgG HRPconjugated（GE Healthcare製）を１０００倍に希釈し、５０μＬ／ウェルずつ加えた。上記二次抗体の希釈液は、１プレート当たりで換算すると、６ｍＬのＰＢＳ／１％ＢＳＡと、６μＬの二次抗体とを合わせたものであった。
【０１６５】
２６．室温にて１時間インキュベートした。
【０１６６】
２７．０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有させたＰＢＳで、ウェルを３回ずつ洗浄した。
【０１６７】
２８．３０％Ｈ２Ｏ２を、１プレート当たり４μＬ加えた。
【０１６８】
２９．１５ｍＬチューブに、プレート１枚当たり１１ｍＬのperoxidasebufferおよび１錠のOPD tablet 10mg（sigma製）を加えて懸濁し、１００μＬ／ウェルずつ加えた。
【０１６９】
３０．５分間静置し、発色させた。
【０１７０】
３１．１Ｍ硫酸を、５０μＬ／ウェルずつ加えた。
【０１７１】
３２．iMark（商標）マイクロプレートリーダー（BIO RAD製）を用い、それぞれのウェルの、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図４の（ａ）に示す。
【０１７２】
（結果）
図４の（ａ）に示されるように、膵がん患者におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価は、健常人に対して有意に高かった（ｐ＜０．０５）。また、慢性膵炎患者における上記抗体価は、健常人に対してより有意に高かった（ｐ＜０．００５）。
【０１７３】
さらに、膵がん患者における上記抗体価は、大腸がん患者に対して有意に高かった（ｐ＜０．０５）。また、慢性膵炎患者における上記抗体価は、大腸がん患者に対してより有意に高かった（ｐ＜０．００５）。
【０１７４】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価のバイオマーカーとしての性質は、膵がんおよび慢性膵炎に特異的である可能性がある。これは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが本来棲息している腸管の疾患（大腸がん）を有する患者よりも、膵がん患者または慢性膵炎患者の方が、上記抗体価が高い傾向にあることから示唆される（図４の（ａ））。
【０１７５】
さらに、膵がん患者および慢性膵炎患者におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を健常人と比較した場合の有意差は、大腸がん患者と比較した場合の有意差よりも大きくなることが見出された（図４の（ｅ））。すなわち、膵がん患者と健常人との間で上記抗体価を比較した場合のｐ値はｐ＜０．０１であり、慢性膵炎患者と健常人との間で上記抗体価を比較した場合のｐ値はｐ＜０．０００５であった。したがって、上記抗体価（または抗体）は、健常人における上記抗体価のレベルを基準値とすることにより、感度の高い慢性膵炎または膵がんのバイオマーカーとなり得る可能性が高いことが示唆される。
【０１７６】
［実施例３−２］
実施例３−１と同様の手法により、健常人、軽度の慢性膵炎患者、中程度の慢性膵炎患者、膵がん患者における、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を比較した。結果を図４の（ｂ）に示す。
【０１７７】
（結果）
図４の（ｂ）に示されるように、軽度の慢性膵炎患者、中程度の慢性膵炎患者、膵がん患者はいずれも、健常人に対して有意に高いＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を示した。特に、中程度の慢性膵炎患者における上記抗体価は、健常人における上記抗体価と比較すると、特に有意差が大きかった。
【０１７８】
実施例３−１および実施例３−２の結果より、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価（または抗体）は、慢性膵炎または膵がんを検出するための有効なバイオマーカーとなりうることが示された。また、ｐ値の比較から、上記抗体価（または抗体）は、慢性膵炎を検出するためのバイオマーカーとしてより好ましく、中程度の慢性膵炎を検出するためのバイオマーカーとして更に好ましいことが示唆される。
【０１７９】
［実施例３−３］
実施例３−１と同様の方法にて、慢性膵炎患者におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を測定し、年齢と当該抗体価との相関を調べた。結果を図４の（ｃ）に示す。
【０１８０】
また、実施例３−１と同様の方法にて、慢性膵炎患者におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を測定した上で、上記抗体価の高低を基準に被験体を４群に分類した。すなわち、上記抗体価が１．０５２〜１．１５６であるＨＨ群、上記抗体価が０．８１３〜１．０３であるＨ群、上記抗体価が０．５９３〜０．６３９であるＬ群、上記抗体価が０．０５４〜０．５１９であるＬＬ群である。次いで、各群の被験体を年齢別にプロットした（図４の（ｄ））。
【０１８１】
（結果）
本実施例の結果からは、年齢の高さとＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価との間に、相関関係があることが示される。一般的に、慢性膵炎患者における膵臓の線維化は、年齢と共に進行することが知られている。他の実施例（例えば、実施例３−２）の結果をも考慮すると、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価が高い症例においては、慢性膵炎の原因または増悪因子としてＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが関与している可能性が示唆される。この示唆に基づくと、上記抗体価は、慢性膵炎患者における膵臓の線維化の発症または進行（慢性膵炎の重症度）を示す指標となりうる。
【０１８２】
〔実施例４〕
［実施例４−１］
セルレイン投与モデルマウスにおける、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を調べた。
【０１８３】
（セルレイン投与モデルマウスの作製）
１．１０週齢のマウス（C57BL/6J；オリエンタル酵母製）１８匹に、週２日、５０μｇ／ｋｇ、６／日の条件で、セルレイン（sigma製）を腹腔内投与した。
【０１８４】
２．上記投与条件を８週間続けた翌週に、膵組織を摘出し、一部を凍結保存（実施例５−１にて使用）、残る部分をパラフィン包埋した（実施例４−２にて使用）。
【０１８５】
（マウスＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳ抗体ＥＬＩＳＡ）
セルレイン投与開始から６週間後および８週間後のマウス血清における、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を測定した。以下の２点を除いては、ヒトＥ．ｆｅａｃａｌｉｓ由来ＣＰＳ抗体ＥＬＩＳＡ（実施例３−１）と同様の方法を用いて行った。
【０１８６】
Ａ．マウス血清は１０倍希釈で加えた（実施例３−１の２２．に相当）。
【０１８７】
Ｂ．二次抗体として、sheep anti-mouse IgG HRPconjugated（GE Healthcare製）を使用した（実施例３−１の２５．に相当）。結果を、図５の（ａ）に示す。
【０１８８】
［実施例４−２］
セルレイン投与マウスの膵組織を、抗Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．免疫を用いて染色した。
【０１８９】
（脱パラフィン）
脱パラフィンは、実施例１−４の脱パラフィン（工程番号１.〜５.）と同様の方法を用いて行った。
【０１９０】
（内因性ペルオキシダーゼの阻害）
１．組織切片を、３％Ｈ２Ｏ２（１５ｍＬの３０％Ｈ２Ｏ２を１３５ｍＬのメタノールで希釈したもの）に、１０分間浸漬した。
【０１９１】
２．上記組織切片を、ＰＢＳで５分間洗浄する工程を、３回繰り返した。
【０１９２】
（ブロッキングおよび一次抗体反応）
３．上記組織切片付近のスライドから水分を拭き取り、ＤＡＫＯペン（DAKO製）で上記組織片の周囲を囲んだ。
【０１９３】
４．３で囲んだ範囲内に、Dako Cytomotion ProteinBrock Serum-Free Ready-to-use（DAKO製）を滴下し、１０分間反応させた。
【０１９４】
５．上記組織切片を、ＰＢＳで５分間洗浄した。
【０１９５】
６．一次抗体のanti-Enterococcus.spp antibodyab19980（abcam製）を、DakoCytomotion Diluent with Background Reducing Gomponents（Dako製）で１０００倍に希釈した。上記組織切片に、希釈液を２００μＬ滴下した。
【０１９６】
７．上記組織切片を、４℃にて一晩反応させた。
【０１９７】
（二次抗体反応）
８．上記組織切片を、ＰＢＳで３分間洗浄する工程を、３回繰り返した。
【０１９８】
９．二次抗体として、Dako EnVision + System-HRPLabelled Polymer Anti-Rabbit（Dako製）を、約２００μＬ滴下した。
【０１９９】
１０．湿潤箱内で、室温にて３０分間静置した。
【０２００】
１１．上記組織切片を、ＰＢＳで５分間洗浄する工程を、３回繰り返した。
【０２０１】
（ＤＡＢ発色）
１２．Liquid DAB + Substute ChromogenSystem（Dako製）を使用して、ＤＡＢ溶液を調製した。具体的には、１滴のDAB Chromogenおよび１ｍＬのSubstrute Bufferを混合した。
【０２０２】
１３．上記組織切片に、上記ＤＡＢ溶液を、スポイトで５、６滴滴下した。ＤＡＢ反応は顕微鏡での観察下で行い、反応時間は３０秒間であった。
【０２０３】
１４．上記組織切片を、超純水に浸漬し、反応を停止させた。
【０２０４】
１５．上記組織切片を、超純水で５分間洗浄する工程を、３回繰り返した。
【０２０５】
（核染色）
１６．上記組織切片を、ヘマトキシリンに浸漬し、３分間静置した。
【０２０６】
１７．上記ヘマトキシリンを、流水で２分間、洗い流した。
【０２０７】
１８．上記組織切片を、４１℃の微温湯に２分間浸漬した。
【０２０８】
（脱水・透徹・封入）
１９．上記組織切片を、７０％エタノールで３分間洗浄した。次いで、上記組織切片を、８０％エタノールで３分間洗浄した。更に、上記切片を、９０％エタノールで３分間洗浄した。続いて、上記切片を、無水エタノールで３分間洗浄した（１〜２回）。
【０２０９】
２０．上記組織切片を、キシレンで３分間洗浄する工程を、３回繰り返した。
【０２１０】
２１．上記組織切片を封入し、トップコートでカバーガラスをシールした。
【０２１１】
２２．完成した試料を、乾燥させてから検鏡した。結果を図５の（ｂ）に示す。
【０２１２】
（結果）
セルレイン投与モデルマウスは、人工的に慢性膵炎を発症させたモデルマウスである。本実施例では、人工的に慢性膵炎を発症させたマウスにおいて、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価が有意に上昇していることが示された。また、人工的に慢性膵炎を発症させたマウスの膵組織には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．が分布していることも示された。これにより、慢性膵炎の発症は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価によって検出できることが見出された。また、この結果は、慢性膵炎の発症とＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．の膵組織への分布に関連があることも示唆されている。
【０２１３】
〔実施例５〕
［実施例５−１］
セルレイン投与モデルマウスにおける、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価と、膵組織中におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの存在との相関を調べた。
【０２１４】
（マウス膵組織からのＤＮＡ抽出）
１．実施例４−１において、−８０℃にて凍結保存していた膵組織から一部を採取し、DNeasyBlood & Tissue kit（QIAGEN製。DNeasyは登録商標。）を用いて、膵組織中のＤＮＡを抽出した。
【０２１５】
２．精製したＤＮＡを、５０ｎｇ／μＬとなるように、上記キット付属のElutionbufferにて希釈した。
【０２１６】
（マウス膵組織中のＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの定量）
実施例１−３とほぼ同様の手順にて、セルレイン投与モデルマウスの膵組織に含まれている、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓに特異的な１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードしているＤＮＡを定量した。変更点は以下の２点である。
【０２１７】
Ａ．テンプレートＤＮＡの使用量は、２μＬ（ＤＮＡ１００ｎｇ含有）とした。
【０２１８】
Ｂ．バンドの定量には、画像処理ソフトウェアであるImageJを用いた。
【０２１９】
（マウスのＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価の測定）
実施例４−１における、マウスＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳ抗体ＥＬＩＳＡと同じ手法により、上記セルレイン投与モデルマウスの抗体価を測定した。
【０２２０】
（相関の確認）
JMP Pro 10.0 software（SAS Institute Inc.製, Cary, NC）を用いて、セルレイン投与モデルマウスにおける定量された膵組織中のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの量と、上記セルレイン投与モデルマウスのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価との相関関係を求めた。結果を図６の（ａ）に示す。
【０２２１】
（結果）
図６の（ａ）に示されるように、セルレイン投与モデルマウスにおける定量された膵組織中のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの量と、上記セルレイン投与モデルマウスのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価との間には相関関係が見られた。このことから、上記抗体価が高い個体は、膵組織中にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが多く存在する傾向があることが示された。
【０２２２】
［実施例５−２］
膵がん手術の術式による、術前術後のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価の変化を調べた。
【０２２３】
実施例３−１と同様の方法により、膵がん手術を施術される患者の、術前および術後におけるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価を測定した。上記手術の術式は、膵体尾部切除術（ＤＰ）または膵頭十二指腸切除術（ＰＤ）のいずれかであった。手術前を基準とした手術後の上記抗体価の変化を図６の（ｂ）に、手術前の上記抗体価を図６の（ｃ）に、手術後の上記抗体価を図６の（ｄ）に、それぞれ示す。
【０２２４】
（結果）
膵体尾部切除術は、膵臓の尾部を切除する手術であり、膵臓と腸管とが接続している箇所は、手術により物理的な影響を受けない。一方、膵頭十二指腸切除術は、膵臓の頭部および周辺組織を切除し、膵臓を小腸へ接続する手術であり、膵管と腸管との距離が手術前より短くなる。実施例５−２の結果より、通常は腸管に分布しているＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが、膵管を経由して膵組織へ移動し、分布していることが、間接的に示された。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓは、腸管の正常細菌叢にも含まれる細菌であることから、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価は、腸管にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが存在することでは上昇せず、膵管または膵組織にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが存在することによって上昇することが示唆された。
【０２２５】
〔実施例６〕
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価、並びに膵機能を評価する公知のバイオマーカーであるヘモグロビンＡ１ｃおよびアミラーゼに対して、ＲＯＣ解析により、慢性膵炎の診断能を評価した。
【０２２６】
解析に使用した試料は、健常人の血清１１０人分および慢性膵炎患者の血清１６０人分であった。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価は、実施例３−１と同様の方法で測定した。
【０２２７】
ヘモグロビンＡ１ｃおよびアミラーゼのレベルは、血清試料を入手した病院において測定されたデータを使用した。また、上記ヘモグロビンＡ１ｃおよびアミラーゼのレベルの測定および定量は、常法に則って行われた。得られたデータは、JMP Pro 10.0 software（SAS Institute Inc.製, Cary, NC）を用いてＲＯＣ解析し、ＡＵＣの値を算出した。
【０２２８】
また、上記複数の指標を組み合わせた場合のスコアの導出は、各ＲＯＣに対応するロジット（Ｌｏｇｉｔ）式およびカットオフ値を設定し、それぞれのＬｏｇｉｔ式に各項目の測定値を当てはめ、算出された値より陽性/陰性を判定することにより行った。本実施例において、具体的には、以下の表の通り行った。Ｌｏｇｉｔ式は全て、JMP Pro 10.0 software（SAS Institute Inc., Cary, NC）を用いて算出した。結果を図７の（ａ）〜（ｃ）に示す。
【０２２９】
【表３】
2018100861.tif 000004
【０２３０】
（結果）
図７の（ａ）に示されるように、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価は、膵機能を評価する公知のバイオマーカーであるヘモグロビンＡ１ｃよりも、慢性膵炎の診断能が高かった。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価とヘモグロビンＡ１ｃを組み合わせた指標は、ヘモグロビンＡ１ｃ単独よりも、慢性膵炎の診断能が高かった。
【０２３１】
図７の（ｂ）に示されるように、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価と、膵機能を評価する公知のバイオマーカーであるアミラーゼとを組み合わせた指標は、それぞれを単独で指標とするよりも、慢性膵炎の診断能が高かった。
【０２３２】
図７の（ｃ）に示されるように、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ＣＰＳに対する抗体価、ヘモグロビンＡ１ｃおよびアミラーゼを組み合わせた指標は、上述したいずれの指標よりも高い慢性膵炎の診断能を有することが見出された。
【産業上の利用可能性】
【０２３３】
本発明は、慢性膵炎または膵がんの発症の可能性を判定するためのデータ取得に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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