(57)【要約】【課題】生理活性物質を安定的に固定化できる高分子化合物を提供する。【解決手段】高分子化合物は、生理活性物質を固定化するためのものであって、以下の条件１を満たす。（条件１）  前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｗをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を３７℃の純水中に２４時間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｗをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）が、３０％以上９５％以下である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を固定化するための高分子化合物であって、以下の条件１を満たす、高分子化合物。
（条件１）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｗをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を３７℃の純水中に２４時間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｗをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）が、３０％以上９５％以下である。
【請求項２】
さらに、以下の条件２を満たす、請求項１に記載の高分子化合物。
（条件２）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｅをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を２５℃のエタノール中に１０分間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｅをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｅ／Ｔ１ｅ）×１００（％）が、２０％以上７０％以下である。
【請求項３】
前記高分子化合物が、（Ａ）生理活性物質を固定化する官能基を有する構造単位を含む重合体である、請求項１または２に記載の高分子化合物。
【請求項４】
前記高分子化合物が、さらに（Ｂ）疎水性基を有する構造単位を含む共重合体である、請求項１乃至３いずれか一項に記載の高分子化合物。
【請求項５】
前記高分子化合物が、さらに（Ｃ）親水性基を有する構造単位を含む共重合体である、請求項１乃至４いずれか一項に記載の高分子化合物。
【請求項６】
成分（Ａ）の生理活性物質を固定化する官能基を有する構造単位が、下記式（１）ないし（３）のいずれかで表される、請求項１乃至５いずれか一項に記載の高分子化合物。
【化１】
2018039961.tif 000021
（式（１）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘはアルキレン基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示す。Ｗは生理活性物質を固定化する官能基を示す。ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【化２】
2018039961.tif 000022
（式（２）中、Ｒ２は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーである。）
【化３】
2018039961.tif 000023
（式（３）中、Ｒ３はＨ，ＣＨ３または炭素数２〜５の炭化水素鎖、Ｒ４は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【請求項７】
成分（Ｂ）の疎水性基を有する構造単位が、下記式（４）で表される、請求項１乃至６いずれか一項に記載の高分子化合物。
【化４】
2018039961.tif 000024
（式（４）中、Ｒ５は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ６は炭素数１〜２０のアルキル基を示す。）
【請求項８】
成分（Ｃ）の親水性基を有する構造単位が、下記式（１６）ないし（１８）のいずれかで表される、請求項１乃至７いずれか一項に記載の高分子化合物。
【化５】
2018039961.tif 000025
（式（１６）中、中Ｒ８は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ９は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｚは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上の整数の場合、繰り返されるＺは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【化６】
2018039961.tif 000026
（式（１７）中、Ｒ１０は水素原子またはメチル基である。）
【化７】
2018039961.tif 000027
（式（１８）中、Ｒ１１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ１２はＮＨまたは酸素原子であり、＊は結合を表し、ｍは１〜４の整数である。）
【請求項９】
前記高分子化合物の数平均分子量が５０００以上、１００００００以下である、請求項１乃至８いずれか一項に記載の高分子化合物。
【請求項１０】
請求項１乃至９いずれか一項に記載の高分子化合物を含む被覆材料。
【請求項１１】
基材の表面が、請求項１乃至９いずれか一項に記載の高分子化合物または請求項１０に記載の被覆材料で被覆された担体。
【請求項１２】
前記担体に、生理活性物質が固定化された請求項１１に記載の担体。
【請求項１３】
前記生理活性物質が糖、糖質、糖鎖、タンパク質、核酸、細胞、脂質及びこれらを有する生理活性物質から選ばれる少なくとも一つである、請求項１１または１２に記載の担体。
【請求項１４】
前記担体は、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、金属、金属酸化物、珪素酸化物のいずれかが選ばれる基材が被覆されたものである、請求項１１乃至１３いずれか一項に記載の担体。
【請求項１５】
請求項１０に記載の被覆材料を準備する工程と、
前記被覆材料を用いて、基材の表面を被覆し、担体を形成する工程と、
前記担体に、生理活性物質を固定化する工程と、
前記生理活性物質が固定化された前記担体を純水で洗浄する工程と、
を含む、担体の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子化合物、被覆材料、担体、担体の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖、タンパク質、及び核酸等といった生理活性物質による生理活性能を利用した診断や解析についての研究開発が進んでいる。
【０００３】
例えば、特許文献１には、糖鎖が特定の官能基を有するスペーサー基を介して、糖鎖を固相担体に結合させる糖鎖アレイに関する技術が開示されている。
【０００４】
また、特許文献２には、三官能性スペーサーを用いて、第１の官能基を糖鎖に、第２の官能基を固相担体に、第３の官能基を発色団にそれぞれ結合させて糖鎖アレイを作成する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−７８４１８号公報
【特許文献２】特開２００４−１１５６１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の技術では、生理活性物質を担体に結合させる際や、生理活性物質が固定化された担体を使用した際において、生理活性物質が担体から離脱してしまう問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、生理活性物質を安定的に固定化させることに着目し、かかる課題について鋭意検討を行った結果、生理活性物質を固定化するための高分子化合物が特定の条件を満たすことが課題を解決させる指針として有効であるという新たな知見を得た。
【０００８】
すなわち、本発明者らは、高分子化合物を一定の条件下で成膜し、処理したときの膜残存率を制御することで、意外にも、生理活性物質を安定的に固定できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は、生理活性物質を固定化するための高分子化合物であって、以下の条件１を満たす、高分子化合物を提供する。
（条件１）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｗをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を３７℃の純水中に２４時間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｗをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）が、３０％以上９５％以下である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生理活性物質を安定的に固定できる高分子化合物を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について、説明する。
【００１２】
・高分子化合物
本実施形態における高分子化合物は、生理活性物質を固定化するために用いられる。高分子化合物は、以下の条件１を満たす。
（条件１）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｗをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を３７℃の純水中に２４時間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｗをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）が、３０％以上９５％以下である。
【００１３】
上記スライドガラス状に成形した基板とは、平滑な平面を有する薄い基板であって、基板表面の少なくとも一方の面に均一な膜を成膜できるものであればよい。
また、膜厚は、平均値である。
【００１４】
上記膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）は、生理活性物質を安定的に固定化する観点から、３０％以上であり、４０％以上であることが好ましい。一方、高分子化合物の取扱性を向上させ、非特異吸着を抑制する観点から、９５％以下であり、９３％以下であることが好ましい。
本実施形態における高分子化合物によれば、特に生理活性物質を固定化する際、水溶液中に溶解した高分子化合物側に固定化してしまい、その分膜として残った側への生理活性物質の固定化量が少なくなったり、また不安定になったりするのを抑制することで生理活性物質を安定的に固定化できる。
【００１５】
生理活性物質を利用して、対象物の検出などに有効利用するためには、生理活性物質が安定的に固定化されることが重要となる。そのため、単に、生理活性物質を固定化するための高分子化合物を疎水化するだけでは、充分に安定した固定化をえることが困難であった。これに対し、本発明の高分子化合物は、上記のような特定の条件１を満たすことで、生理活性物質を従来にはない水準で安定的に固定できるものである。
【００１６】
また、高分子化合物は、さらに、以下の条件２を満たすものであってもよい。これにより、より安定的に生理活性物質を固定化できる。
（条件２）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｅをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を２５℃のエタノール中に１０分間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｅをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｅ／Ｔ１ｅ）×１００（％）が、２０％以上７０％以下である。
【００１７】
上記膜残存率（Ｔ２ｅ／Ｔ１ｅ）×１００（％）は、生理活性物質を安定的に固定化する観点から、２０％以上であり、３０％以上であることが好ましい。一方、高分子化合物の取扱性を向上し、基板への塗布を効率よく行う観点から、７０％以下であり、６０％以下であることが好ましい。
本実施形態における高分子化合物によれば、特に、残存した膜に生理活性物質含有溶液を反応させる際、疎水性の高い生理活性物質又は界面活性剤等の添加剤を溶解するために微量のアルコール類を混合する場合があったとしても、このような微量のアルコール溶液へポリマーが溶解することを抑制することで生理活性物質を安定的に固定化できる。
【００１８】
高分子化合物を基材に固定化するためには、高分子化合物を溶媒に適切に溶解させることが重要となる。そのため、高分子化合物が溶媒に対して溶解性を有することが重量であるが、単に、溶解性を付与するだけでは、充分に安定した固定化をえることが困難であった。これに対し、本発明の高分子化合物は、上記のような特定の条件２を満たすことで、生理活性物質を従来にはない水準で安定的に固定できるものである。
【００１９】
高分子化合物は、（Ａ）生理活性物質を固定化する官能基を有する構造単位を含む重合体であることが好ましい。
この重合体の由来となるモノマーは、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン不飽和重合性モノマーが好ましく、（メタ）アクリルアミド基または（メタ）アクリル基に生理活性物質等を固定化する官能基が結合した構造であることがさらに好ましい。
【００２０】
官能基としては、特に限定されないが、アミノ基やヒドラジド基、オキシルアミノ基など生理活性物質の還元末端と反応する官能基や、生理活性物質または生理活性物質含有物質に付随する官能基や物質と反応する官能基が好ましい。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、マレイミド基、アジド基、スルホネート基、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、受容体基、ビオチンなどが挙げられる。
【００２１】
これらの中でも、糖又は糖鎖を固定化する場合は、その多くが還元末端を有することから、これらとの反応性の高いアミノ基、ヒドラジド基、オキシルアミノ基が好ましい。アミノ基を有する生理活性物質もしくは生理活性物質含有物質を固定化する場合は、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基が好ましく、アミノ基との反応性と保存安定性のバランスから活性エステル基が最も好ましい。また、ヒドラジド基、オキシルアミノ基は、糖または糖鎖の還元末端であるアルデヒド基と反応して、ヒドラジド結合又はオキシム結合により糖鎖を捕捉することができるが、本発明においては、糖鎖のアルデヒド基との結合の強さから、オキシルアミノ基が特に好ましい。
【００２２】
前記活性エステル基とは、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００２３】
このような活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。
【００２４】
本発明の高分子化合物に含まれる、成分（Ａ）の生理活性物質を固定化する官能基を有する構造単位は、特に構造を限定しないが、下記の構造単位（１）ないし（３）いずれかで表されることが好ましい。すなわち、重合後の（メタ）アクリル基と生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する官能基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキレン基を介して結合した構造であることが好ましい。
【００２５】
【化１】
2018039961.tif 000002
（式（１）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘはアルキレン基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示す。Ｗは生理活性物質を固定化する官能基を示す。ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【００２６】
式（２）は、ヒドラジド基を有する構造単位の一実施形態であり、式（２−１）はその具体例である。
【００２７】
【化２】
2018039961.tif 000003
（式（２）中Ｒ２は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーである。）
【００２８】
【化３】
2018039961.tif 000004
【００２９】
式（３）は、オキシルアミノ基を有する構造単位の一実施形態であり、式（３−１）はその具体例である。
【００３０】
【化４】
2018039961.tif 000005
（式（３）中、Ｒ３はＨ，ＣＨ３または炭素数２〜５の炭化水素鎖、Ｒ４は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【００３１】
【化５】
2018039961.tif 000006
【００３２】
（Ａ）生理活性物質を固定化する官能基を有する構造単位を含む重合体の組成割合は、高分子化合物全体に対して、１〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。組成割合が下限値以上とすることにより、シグナルが低減するおそれを低減できる。一方、上限値以下とすることにより、相対的に疎水性基を有する重合体の減少を抑制し、塗布した際のムラの発生や、アッセイ中の高分子化合物の溶出を抑制できる。
【００３３】
高分子化合物は、生理活性物質を固定化する官能基を導入しうる官能基を有する重合体に、生理活性物質を固定化する官能基を導入したものでもよい。官能基の導入方法は特に限定されるものではないが、たとえば、高分子化合物中のアルキルエステル基にヒドラジンを反応させてヒドラジド基を導入する方法が挙げられる。アルキルエステル基としては、メチルエステル基、エチルエステル基、プロピルエステル基等が好適である。あるいは、高分子化合物中のカルボキシル基をカルボジイミドで活性化させて、そこにＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどを反応させて活性エステル化する方法、高分子化合物中の水酸基にｐ−ニトロフェニルクロロフォーメートなど酸クロライドを反応させて活性エステル化する方法などが挙げられる。
生理活性物質を固体化する官能基を導入しうる官能基を有する重合体の由来となるモノマーは、(メタ)アクリルアミド基又は（メタ）アクリル基に生理活性物質を固定化する官能基を導入しうる官能基が結合した構造であることが好ましい。
【００３４】
アルキルエステル基を有するモノマーの具体的な例としては、下記式（５）で表されるようなものが挙げられる。
【００３５】
【化６】
2018039961.tif 000007
【００３６】
カルボキシル基を有するモノマーの具体的な例としては、下記式（６）で表されるものが挙げられる。
【００３７】
【化７】
2018039961.tif 000008
（式（６）中、Ｒ７はＨまたはＣＨ３、ｎは０から３０の整数を示す。）
【００３８】
水酸基を有するモノマーの具体的な例としては、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが挙げられる。
【００３９】
生理活性物質を固定化する官能基を導入しうる官能基を有するエチレン不飽和重合性モノマー由来の構造単位を含む重合体に、生理活性物質を固定化する官能基を導入する場合でも、高分子化合物全体に対するその組成割合は、１〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。組成割合が下限値以上とすることにより、シグナルが低減するおそれを低減できる。一方、上限値以下とすることにより、相対的に疎水性基を有する重合体の減少を抑制し、塗布した際のムラの発生や、アッセイ中の高分子化合物の溶出を抑制できる。
【００４０】
なお、１級アミンなどラジカル重合の阻害剤として働く官能基やイソシアネートなど加熱により反応が進行しやすい官能基については、予め保護基で保護するのが好ましい。保護基の種類は、その官能基が保護されれば特に制限はない。アミノ基、オキシルアミノ基、ヒドラジド基などの１級アミンを有する官能基にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）が用いられる。中でも、脱保護のしやすさからｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）が好ましい。また、イソシアネートはピラゾールやピラゾール誘導体で保護することができる。
【００４１】
脱保護条件は保護基に応じて適宜選択してよい。例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）の脱保護は、トリフルオロ酢酸、塩酸、塩酸−ジオキサン溶液、塩酸−酢酸エチル溶液など強酸を作用させるとよい。脱保護のタイミングは任意であるが、より活性の高い状態で生理活性物質と反応させる方が有利であることから、それらとの反応の直前に行うのが好ましい。
【００４２】
具体的なモノマーとしては、下記式（７）又は（８）で表されるモノマーが挙げられる。
【００４３】
【化８】
2018039961.tif 000009
【００４４】
（式（７）及び（８）中、Ｒ１３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、及び−ＣＯＮＨ−からなる群から選択される少なくとも一つで中断されてもよい炭素数１以上２０以下の炭化水素鎖を示し、Ｒ１４はＨ、ＣＨ３又は炭素数２以上５以下の炭化水素鎖を示し、［Ｐ］は、保護基を示す。）
【００４５】
式（７）中、Ｒ１３としては、下記式（９）又は（１０）で表されるものが挙げられる。下記式中、ｅ、ｆ及びｈは１以上５以下の整数を表し、ｇは１以上１０以下の整数を表す。
【００４６】
【化９】
2018039961.tif 000010
【００４７】
式（８）中、Ｒ１３としては、下記式（１１）又は（１２）で表されるものが挙げられる。式（１１）又は（１２）中、ｉ及びｋは１以上５以下の整数を表し、ｊは１以上１０以下の整数を表す。
【００４８】
【化１０】
2018039961.tif 000011
【００４９】
式（７）又は（８）で表される化合物としては、例えば、それぞれ下記式（１３）又は（１４）で表されるものが挙げられる。
【００５０】
【化１１】
2018039961.tif 000012
【００５１】
保護基［Ｐ］としては、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、２，２，２-トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、４−メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）、アミノ基、炭素数３から２０個のアルキル基、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル基、キサンチル基（Ｘａｎ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル基（Ｍｔｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル基（Ｍｂｈ）、トシル基（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル基（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル基（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ基（ＢｚｌＯ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル基（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル基（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル基（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル基（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ基（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル基（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ基（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、アセチル基（Ａｃ）、トリフルオロアセチル基（ＴＦＡ）ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、２−クロロベンジル（Ｃｌ−ｚ）基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、イソプロピル基、ピバリル基、テトラヒドロピラン−２−イル基、トリメチルシリル基等が挙げられる。
【００５２】
具体的なモノマーとしては、例えば、下記式（１５−１）、（１５−２）で表される化合物である。
【００５３】
【化１２】
2018039961.tif 000013
【００５４】
高分子化合物は、さらに（Ｂ）疎水性基を有する構造単位を含む共重合体であることが好ましい。これにより、高分子化合物を基材に固定化させる役割を果たすとともに、高分子化合物が洗浄工程において溶解しにくくすることができる。
【００５５】
成分（Ｂ）の疎水性基を有する構造単位の由来となるモノマーは、（メタ）アクリル基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は、特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。
【００５６】
成分（Ｂ）の疎水性基を有する構造単位は、下記式（４）で表される構造であることが好ましい。
【００５７】
【化１３】
2018039961.tif 000014
（式（４）中、Ｒ５は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ６は炭素数１〜２０のアルキル基を示す。）
【００５８】
Ｒ６のアルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは３〜６である。
【００５９】
成分（Ｂ）の疎水性基を有する構造単位の由来となるモノマーの具体例としては、ｉｓｏ−ブチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、フェノキシ（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート、２−エチルフェノキシ（メタ）アクリレート、２−エチルチオフェニル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、２−フェニルエチル（メタ）アクリレート、３−フェニルプロピル（メタ）アクリレート、４−フェニルブチル（メタ）アクリレート、２−２−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−３−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−４−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−（４−プロピルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−（１−メチルエチル）フェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−メトキシフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−シクロへキシルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（２−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（３−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−ブロモフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（３−フェニルフェニル）エチル（メタ）アクリレートおよび２−（４−ベンジルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、メタクリル酸ｎ−ブチル、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート等が挙げられるが、担体上での安定性(膜の保持性)と重合のしやすさのバランスの観点からシクロヘキシル（メタ）アクリレート又はメタクリル酸ｎ−ブチルが好ましい。
【００６０】
（Ｂ）疎水性基を有する構造単位が含まれていることにより、プラスチックなど、疎水性の基材に対しても密着性が向上し、アッセイ中に該高分子化合物が溶出してしまうことを防止することができる。
【００６１】
（Ｂ）疎水性基を有する構造単位を含む共重合体における組成の割合は、高分子化合物全体に対して、２０〜９９ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９５ｍｏｌ％、最も好ましくは５０〜９５ｍｏｌ％である。組成割合を下限値以上とすることにより、アッセイ中の該高分子化合物の溶出を低減できる。一方、上限値以下とすることにより、生理活性物質を固定化する官能基を有する重合体の減少を抑制し、シグナルの低減、非特異吸着の発生を低減できる。
【００６２】
高分子化合物は、さらに（Ｃ）親水性基を有する構造単位を含む共重合体であることが好ましい。これにより、検出対象物質が高分子化合物に非特異的に吸着することを抑制できる。
【００６３】
成分（Ｃ）の親水性基を有する構造単位は、重合後の（メタ）アクリル基または（メタ）アクリルアミド基に親水性基が結合した構造であることが好ましく、下記式（１６）ないし（１８）のいずれかで表されることがより好ましい。これらは１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６４】
【化１４】
2018039961.tif 000015
（式（１６）中、Ｒ８は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ９は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｚは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上の整数の場合、繰り返されるＺは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【００６５】
式（１６）中、アルキレングリコール残基Ｚの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｚの繰り返し数ｑは１〜１００の整数であり、好ましくは２〜１００の整数であり、より好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは４〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｚの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００６６】
式（１６）で表される構造単位の由来となるモノマーの具体例としては、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手容易性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００６７】
【化１５】
2018039961.tif 000016
（式（１７）中、Ｒ１０は、水素原子、またはメチル基である。）
【００６８】
式（１７）で表される構造単位の由来となるモノマーの具体例としては、リン酸２−（メタクリロイルオキシ）エチル２−（トリメチルアンモニオ）エチル（ＭＰＣ）が挙げられる。
【００６９】
【化１６】
2018039961.tif 000017
（式（１８）中、Ｒ１１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ１２はＮＨまたは酸素原子であり、＊は結合を表し、ｍは１〜４の整数である。）
【００７０】
式（１８）において、得られる高分子化合物の親水性を向上させる観点から、ｍは２または３であることが好ましい。
【００７１】
式（１８）で表される構造単位の由来となるモノマーの具体例としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）等が挙げられる。
【００７２】
（Ｃ）親水性基を有する構造単位を含む共重合体の組成割合は、高分子化合物全体に対して、０〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは０〜４０ｍｏｌ％、最も好ましくは０〜３０ｍｏｌ％である。組成割合を上限値以下とすることにより、相対的に生理活性物質を固定化する官能基を有する重合体の減少を抑制し、アッセイ中の高分子化合物の溶出を低減できる。
【００７３】
本発明の高分子化合物の化学構造は、上記のモノマーが（共）重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
【００７４】
高分子化合物の数平均分子量は、高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製を容易にし、生理活性物質の固定化を安定させる観点から、５０００以上であることが好ましく、１００００以上であることがより好ましく、１００００００以下であることが好ましく、５０００００以下であることがより好ましく、２０００００以下であることがさらに好ましい。数平均分子量が５０００以上とすることで、溶解性を適度にし、膜の維持性を良好に保持できる。一方、数平均分子量が１００００００以下とすることにより、塗布時のハンドリングを良好に維持できるようになる。
【００７５】
・高分子化合物の重合法
本発明の高分子化合物の重合方法は、特に限定されるものではないが、重合の容易さから、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン不飽和重合性モノマー（任意に疎水性基を有するエチレン不飽和重合性モノマー）を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。ラジカル重合させるための混合物には、さらに親水性基を有するエチレン不飽和重合性モノマーを含むことができる。また、後述する基材上に重合性官能基や連鎖移動基等を導入し、基材上で上記高分子化合物を合成してもよい。
【００７６】
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、メチルエチルケトン、アセトン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノール、２−ブタノン、およびこれらの混合溶媒が基材を変性させないため好ましい。
【００７７】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２'−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１'−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００７８】
・担体
担体は、上述の高分子化合物で基材表面が被覆されているものである。これにより、担体に、特定の生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する性質を容易に付与することが可能となる。高分子化合物が親水性基を有する構造単位を含む場合には、該担体にタンパク質等の非特異的吸着を抑制する性質を付与することが可能である。さらに、高分子化合物が疎水性基を有する構造単位を含む場合には、高分子化合物の基材表面からの脱離を抑制することができる。
【００７９】
基材表面への高分子化合物の被覆は、例えば、有機溶媒に高分子化合物を０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した被覆材料を調製し、当該被覆材料中に基材を浸漬、または基材に当該被覆材料を吹きつける等の公知の方法で、基材表面に被覆材料を付着させた後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。また、前記記載のとおり、基材上で高分子化合物を合成した場合は、その状態で高分子化合物に被覆されていることとなる。
なお、被覆とは、すべてまたは連続であるものに限られず、一部または非連続であるものも含む。
【００８０】
上記有機溶媒としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶媒が使用される。中でも、エタノール、メタノール、２−ブタノン、およびこれらの混合溶媒がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００８１】
上記基材としては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、金属、金属酸化物、及びシリカ、ガラス等の珪素酸化物の中から選ばれることが好ましい。表面処理の容易性、量産性の観点から、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂がより好ましく、熱可塑性樹脂がさらに好ましい。
【００８２】
基材の形状は特に制限を受けるものではないが、担体をバイオチップとして用いる場合、例えばスライドガラス形状の基材やマルチウェルプレート等が好適に用いられる。
【００８３】
担体をバイオチップとして用いる場合、熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【００８４】
基材表面と、被覆される高分子化合物との密着性を高めるために、基材表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、フッ化アルゴン、フッ化クリプトンなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。
【００８５】
・生理活性物質などが固定化された担体
本発明の担体を使用して各種の生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化することができる。生理活性物質としては、糖、糖質、糖鎖、タンパク質、核酸、細胞、脂質及びこれらを有する生理活性物質が挙げられる。また、糖鎖または糖鎖含有物質としては、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体などがある。
【００８６】
担体表面に被覆した高分子化合物における生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する官能基が、生理活性物質の還元末端と反応する官能基である場合は、還元末端を有する生理活性物質をｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中に溶解し、担体上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することで固定できる。
【００８７】
一方、生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する官能基が、活性エステル基などアミノ基と反応する基である場合は、生理活性物質または生理活性物質含有物質にアミノ基が必要である。アミノ基を有する糖鎖や糖アミノ酸、糖ペプチドまたは糖タンパク質をｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中に溶解し、担体上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することで固定できるが、アミノ基を持たない糖鎖の場合はそれを導入する必要がある。この場合、アミノ基は還元末端側に導入されていることが好ましい。
こうして得られた生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化した担体は、十分な量の生理活性物質または生理活性物質含有物質が化学結合で強固に固定化され、さらに検出対象以外の非特異吸着が少なくできることから、該生理活性物質または生理活性物質含有物質と特異的に結合する物質を選択的に捕捉することができる。特に、担体が基板である場合、バイオチップとして好適に用いることができる。
【００８８】
本発明において生理活性物質または生理活性物質含有物質をバイオチップ用担体上に固定化する際には、生理活性物質または生理活性物質含有物質を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。点着後、静置すると、生理活性物質または生理活性物質含有物質が基材上の官能基と化学的に結合し、生理活性物質または生理活性物質含有物質が表面に固定化される。例えばアミノ基を有する糖鎖を用いた場合は、前に示した方法を適用できる。
【００８９】
生理活性物質または生理活性物質含有物質をバイオチップ用担体上に固定化した後は、生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化した部分以外の担体表面の官能基を不活性化処理するのが好ましい。担体の官能基が活性エステル基やアルデヒド基などの場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。
【００９０】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。
【００９１】
また、基材の官能基がヒドラジド基又はオキシルアミノ基などの場合は、例えば、酸無水物との反応やオキソ酸との縮合により行うことができる。酸無水物は特に限定されないが、反応性からカルボン酸無水物が好ましい。カルボン酸無水物の例としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、無水安息香酸などが挙げられるが、中でも無水酢酸、無水コハク酸がより好ましい。また、オキソ酸も特に限定されないが、反応性からカルボン酸が好ましい。カルボン酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸等が挙げられるが、中でもギ酸、酢酸が好ましい。
【００９２】
また、前記不活性化処理工程では、担体の官能基と結合しなかった生理活性物質または生理活性物質含有物質も同時に洗浄・除去することができることが多い。除去できない場合は、不活性化処理前に基材を洗浄することで除去することが好ましい。例えば基材を超純水、界面活性剤含有緩衝液等で１〜５分間浸漬し洗浄することで、除去できる。
【００９３】
担体は、以下の使用方法を含む。
上記被覆材料を準備する工程と、前記被覆材料を用いて、基材の表面を被覆し、担体を形成する工程と、前記担体に、生理活性物質を固定化する工程と、前記生理活性物質が固定化された前記担体を純水またはバッファで洗浄する工程と、を含む。
純水またはバッファで洗浄する工程としては、上記のように担体の官能基と結合しなかった生理活性物質または生理活性物質含有物質も同時に洗浄・除去する工程や、過剰な検出対象物または非検出対象物を洗浄・除去する工程が挙げられる。
本発明の高分子化合物によれば、特定の条件１を満たすため、上記のような洗浄工程を含む使用方法において好適に用いられる。
【００９４】
このように生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化することによって得られたバイオチップは免疫診断システム、糖鎖マイクロアレイシステム、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。
【００９５】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００９６】
次に、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明の内容は実施例に限られるものではない。
【００９７】
［メチルエステル含有モノマーの合成］
以下の（スキーム１）に示すルートで、メチルエステル含有モノマーを合成した。
【００９８】
【化１７】
2018039961.tif 000018
【００９９】
ステップ１：化合物（ｈ）の合成
まず、無水メタクリル酸（ＭＡＨ：５ｇ，０．０３ｍｏｌ）（ｆ）を１００ｍＬのクロロホルムに溶解させた溶液を、２５ｇの（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＢＥＡ：２５ｇ，０．１７ｍｏｌ）（ｇ）を１００ｍＬのクロロホルムに溶解させた溶液に氷浴上で滴下投入した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｈ）を得た。
【０１００】
ステップ２：化合物（ｊ）の合成
次に、５ｇの化合物（ｈ）（０．０２３ｍｏｌ）を１００ｍＬのクロロホルムに溶解させた溶液に、１．５当量のコハク酸モノメチル（ｉ）および１．５当量の水溶性カルボジイミド化合物（ＷＳＣ）である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを加えて、密栓した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０体積％／メタノール１０体積％の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｊ）を得た。
また、得られた物質は、ＮＭＲ、マトリックス支援レーザイオン化−飛行時間型質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により化合物（ｊ）、すなわち「メチルエステル含有モノマー」であることを確認した。
【０１０１】
［高分子化合物の合成例１］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．４０ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例１とした。
【０１０２】
［高分子化合物の合成例２］
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（平均分子量４７５）、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．１７５ｍｏｌ／Ｌ、０．２８ｍｏｌ／Ｌ、０．２４５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトンを７０／３０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例２とした。
【０１０３】
［高分子化合物の合成例３］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸ｎ−ブチルをそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．４０ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例３とした。
【０１０４】
［高分子化合物の合成例４］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．５０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例４とした。
【０１０５】
［高分子化合物の合成例５］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．３０ｍｏｌ／Ｌ、０．５０ｍｏｌ／Ｌ、０．２０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例５とした。
【０１０６】
[高分子化合物の合成例６]
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０８ｍｏｌ／Ｌ、０．０７ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ‐ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例６とした。
【０１０７】
［比較例１］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．５７ｍｏｌ／Ｌ、０．４０ｍｏｌ／Ｌ、０．０３ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。
【０１０８】
［比較例２］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．１０ｍｏｌ／Ｌ、０．１０ｍｏｌ／Ｌ、０．８０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応途中から高分子化合物が析出し始め、反応終了まで溶解することはなかった。析出した高分子化合物を回収し、乾燥させたのち、０．３ｗｔ％になるようにメタノール、エタノール、イソプロパノール、メチルエチルケトンなどシクロオレフィンコポリマー基板を侵さない溶媒に分散させたが、いずれも完全に溶解させることはできず、基板への塗布はできないと判断した。
【０１０９】
上記高分子化合物の合成例１〜６および比較例１で得られた高分子化合物の数平均分子量（ポリオキシエチレン換算値）を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定により求めた。測定条件は以下の通りである。
装置：ゲルパーミエーションクロマトグラフィー装置（日本分光株式会社製、ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓシリーズ）
カラム：東ソー社製、ＴＳＫ−ＧＥＬＡＬＰＨＡ−Ｍ、ＡＬＰＨＡ−２５００
検出器：液体クロマトグラム用ＲＩ検出器
測定温度：４０℃
溶媒：メタノール／水＝７／３(ｖｏｌ／ｖｏｌ)混合溶媒（１０ｍＭ臭化リチウム添加）
試料濃度：０．０５ｗｔ％
【０１１０】
上記高分子化合物の合成例１〜６および比較例１で得られた高分子化合物を用いて、以下の条件１、２を満たすかどうか判定を行った。結果を表１、２に示す。
なお、エリプソメーターは、ファイブラボ株式会社製の「ＭＡＲＹ-１０２」を用いた。
（条件１）
（基板の膜厚測定）
上記高分子化合物の合成例１〜６および比較例１で得られた高分子化合物の０．３ｗｔ％エタノール溶液を調製し、スライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマー基板を浸漬、３０分間静置した。その後、エタノール／純水＝７５／２５の溶液で基板をリンスし、遠心乾燥した。得られた基板上に付着しているポリマーによる膜の厚さ（Ｔ１ｗ）をエリプソメーターで測定した。さらに３７℃の純水中に２４時間浸漬した後の基板上に付着しているポリマーによる膜の厚さ（Ｔ２ｗ）をエリプソメーターで測定し、膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）を算出した。測定は各基板３点測定した。
【０１１１】
（３７℃の純水中に２４時間浸漬した基板への糖の固定化の評価）
（ｉ）糖の固定化
ラクトース（和光純薬工業製、１２４−０００９２）を０．５ｍｇ／ｍＬに調製し、３７℃の純水中に２４時間浸漬した後の基板上に５点スポットした。溶媒は１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋界面活性剤（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００）を用いた。その後８０℃で１時間反応させて基板に糖鎖を固定化した。
（ｉｉ）余剰官能基のキャッピング
基板を水洗した後、１０ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸（和光純薬工業製、１９８−０４３５５）水溶液に浸漬し、室温にて１時間静置することで余剰官能基のキャッピングを実施した。その後、水洗を３回実施し、基板を乾燥させた。
（ｉｉｉ）ＰＡＳ法による基板上の糖鎖検出
糖を固定化後キャッピングおよび洗浄を施した基板を、１０ｍｇ／ｍＬに調整した過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬、１９７−０２４０２）水溶液に浸漬し、３７℃で３０分反応させて固定化糖鎖を酸化した。次にマイクロアレイを純水で洗浄後、０．１ｍｇ／ｍＬに調整した６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン（同仁化学製、製品コード：Ｂ３０２）の３００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）溶液に浸漬し、３７℃で３０分反応させて糖鎖をビオチン化した。１０ｍＭ  ＨＣｌ水溶液で２回、純水で２回洗浄後、このマイクロアレイを０．５μｇ／ｍＬに調整したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３（アマシャム バイオサイエンス、ＰＡ４３００１）の１％ＢＳＡ／ＰＢＳバッファ溶液に浸漬し、遮光下室温にて１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳバッファで洗浄後、基板を蛍光スキャナーで測定を行った。測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝５０）。
評価については、糖を５点スポットした場所全てで有意なシグナルが得られた場合を○、５点中３点又は４点で有意なシグナルが得られた場合を△、有意なシグナルが得られた点が５点中２点以下の場合を×とした。
【０１１２】
（条件２）
上記高分子化合物の合成例１〜６および比較例１で得られた高分子化合物の０．３ｗｔ％エタノール溶液を調製し、スライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマー基板を浸漬、３０分間静置した。その後、エタノール／純水＝７５／２５の溶液で基板をリンスし、遠心乾燥した。得られた基板上に付着しているポリマーによる膜の厚さ（Ｔ１ｅ）をエリプソメーターで測定した。さらに２５℃のエタノール中に１０分浸漬した後の基板上に付着しているポリマーによる膜の厚さ（Ｔ２ｅ）をエリプソメーターで測定し、膜残存率（Ｔ２ｅ／Ｔ１ｅ）×１００（％）を算出した。測定は各基板３点測定した。２５℃のエタノール中に１０分浸漬した後の基板への糖の固定化確認は前述の評価１と同様に実施した。
【０１１３】
【表１】
2018039961.tif 000019
【０１１４】
【表２】
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