(57)【要約】【課題】Th1型サイトカインの産生誘導を作用機序とする免疫アジュバントを提供する。【解決手段】可溶性リグニンポリマーを含み、アレルギー関連因子を産生せず、Tヘルパー１（Th1）型サイトカインの誘導および主要組織適合抗原（MHC）クラスII分子の発現亢進を特徴とする免疫アジュバント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性リグニンポリマーを含み、アレルギー関連因子を産生せず、Tヘルパー１（Th1）型サイトカインの誘導および主要組織適合抗原（MHC）クラスII分子の発現亢進を特徴とする免疫アジュバント。
【請求項２】
可溶性リグニンポリがリグニンモノマー誘導体の酵素処理物である請求項１の免疫アジュバント。
【請求項３】
リグニンモノマー誘導体がカフェ酸である請求項２の免疫アジュバント。
【請求項４】
酵素がペルオキシダーゼである請求項２の免疫アジュバント。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の免疫アジュバントと抗原とを有するワクチン。
【請求項６】
粘膜を投与経路とする請求項５のワクチン。
【請求項７】
抗原が呼吸器感染症の原因物質である請求項６のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、Tヘルパー１（Th1）型サイトカインの誘導および主要組織適合抗原（MHC）クラスII分子の発現亢進を特徴とする免疫アジュバントに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫アジュバントとは、生体内に投与された際に、生体の免疫応答を誘導することができる物質であり、抗原と組み合わせ投与することによって抗原特異的免疫応答を引き起こすことができる物質である。アジュバントの材料としては、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム（アラム、Alum）、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマーなどの無機物、抗原水溶液を封入する流動パラフィン、ラノリン、フロイントなどの乳化剤などが一般的である。
【０００３】
植物成分である「リグニン」はフェニルプロパノイド類がランダムに重合した芳香族ポリマーであり、ヘミセルロース、セルロースと共に植物細胞壁を構成している。難消化性であり腸内環境を整える食物繊維としても知られている。
【０００４】
発明者らはこれまで、フェニルプロパノイド類とペルオキシダーゼを用いて可溶性リグニンポリマーを合成し、リグニン類が強力な免疫賦活活性を示すことを報告した（非特許文献１、２）。また、可溶性リグニンポリマーをマウスに経口投与することでNK細胞活性を上昇させ、移植した同系腫瘍に対し抵抗性を向上させることを明らかにした（非特許文献３）。
【０００５】
さらに、発明者らは、サイトカイン種を解析した結果、免疫系で機能するインターフェロンγ（IFN-γ）が可溶性リグニンポリマーにより産生誘導されることも報告している（非特許文献２）。
【０００６】
なお、発明者らによる以上の知見や考察は、可溶性リグニンポリマーの合成方法なども含め、非特許文献４にも詳細に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Daisuke Yamanaka, Yumi Tamiya, Masuro Motoi, Ken-ichi Ishibashi, Noriko N. Miura, Yoshiyuki Adachi, and Naohito Ohno, PLoS ONE, 7:e36025. (2012)
【非特許文献２】Daisuke Yamanaka, Masuro Motoi, Ken-ichi Ishibashi, Noriko N. Miura, Yoshiyuki Adachi, and Naohito Ohno, Food Chemistry, 141:4073-80. (2013)
【非特許文献３】Daisuke Yamanaka, Katsuya Tajima, Yoshiyuki Adachi, Ken-ichi Ishibashi, Noriko N. Miura, Masuro Motoi, and Naohito Ohno, Journal of Functional Foods, 6:513-22. (2014)
【非特許文献４】山中大輔、博士（薬学）、東京薬科大学、2013年度、32659甲第267号（https://toyaku.repo.nii.ac.jp/?action=repository_uri&item_id=21&file_id=20&file_no=1）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明者らは、可溶性リグニンポリマーにより産生誘導されるサイトカイン種についてさらに網羅的に解析した結果IL-4、IL-13、eotaxin、RANTESなどのアレルギー関連因子の産生はほとんど認めず、IL-2などのTヘルパー１（Th1）型サイトカインを誘導し、加えて主要組織適合抗原（MHC）クラスII分子の発現を有意に上昇させることを新たに見出した。
【０００９】
本願発明は、発明者らによる前記の知見（非特許文献１−４）に加え、上記の新規知見に基づき、Th1型サイトカインの産生誘導を作用機序とする免疫アジュバントを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明は前記課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。
（１）可溶性リグニンポリマーを含み、アレルギー関連因子を産生せず、Tヘルパー１（Th1）型サイトカインの誘導および主要組織適合抗原（MHC）クラスII分子の発現亢進を特徴とする免疫アジュバント。
（２）可溶性リグニンポリマーがリグニンモノマー誘導体の酵素処理物である前記（１）の免疫アジュバント。
（３）リグニンモノマー誘導体がカフェ酸である前記（２）の免疫アジュバント。
（４）酵素がペルオキシダーゼである前記（２）の免疫アジュバント。
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載の免疫アジュバントと抗原とを有するワクチン。
（６）粘膜を投与経路とする前記（５）のワクチン。
（７）抗原が呼吸器感染症の原因物質である前記（６）のワクチン。
【発明の効果】
【００１１】
本願発明によって、アレルギー関連因子を産生せず、Th1型サイトカインの誘導を作用機序とする免疫アジュバントと、この免疫アジュバントおよび抗原を含むワクチンが提供される。特に、粘膜を投与経路とするワクチン（粘膜ワクチン）は、呼吸器感染症の初期感染経路である鼻腔等においてIgA抗体を顕著に誘導する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】は、可溶性リグニンポリマーの合成方法である。
【図２】は、可溶性リグニンポリマーの基本構造である。
【図３】は、可溶性リグニンポリマーの腹腔内投与と試験のプロトコルである。
【図４】は、BALB/cマウス、C57BL/6マウスおよびC3H/HeJマウスにOVA（抗原）と可溶性リグニンポリマーを腹腔内投与した場合の、抗体産生量を示したグラフである。
【図５】は、可溶性リグニンポリマーの経鼻投与と試験のプロトコルである。
【図６】は、BALB/cマウスに可溶性リグニンポリマーとOVAを経鼻投与した場合の抗体産生量を示したグラフである。
【図７】は、C57BL/6マウス脾臓細胞を可溶性リグニンポリマーで刺激した際のMHCクラスII分子の発現量の上昇を表したグラフである。
【図８】は、B10.BRマウス脾臓細胞を可溶性リグニンポリマーで刺激した際に産生誘導されるサイトカイン量を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
可溶性リグニンポリマーは、カフェ酸、フェルラ酸、クマル酸などのリグニンモノマー誘導体を酵素処理することによって合成することができる。実施例では、カフェ酸をペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ）で処理した可溶性リグニンポリマーを開示しているが、その合成方法な非特許文献４に詳しく記載されている。酵素は、ペルオキシダーゼ以外にも、ラッカーゼ、ポリフェノールオキシダーゼなどの酵素、あるいは、マッシュルームなどの真菌、または細菌、真菌または細菌の培養液、西洋わさびをはじめとする野菜、果実などの食品や触媒を使用することができる。
【００１４】
本願発明のワクチンは、前記の可溶性リグニンポリマーと抗原とを有している。抗原と可溶性リグニンポリマーと混合、あるいは抗原を可溶性リグニンポリマーに吸着させるなどしてワクチンを調製することができる。可溶性リグニンポリマー（L）と抗原（A）の割合L/Aは、抗原の種類やワクチンの投与経路等に応じて0.1から100の範囲内で任意に設定することができる。またワクチンには薬理学的に許容される単体を含有させてもよい。
【００１５】
抗原は、ワクチン用に高度精製された純度が約90%以上の細菌由来抗原、ウイルス抗原、トキソイド等である。また、スギ花粉やダニ等に由来の純度が約90%以上のアレルゲン、タンパク質、糖タンパク質、高分子の糖質や核酸等を使用することもできる。ワクチンが特に鼻腔粘膜を投与経路とする粘膜ワクチンの場合には、呼吸器感染症の原因となる細菌、ウイルスなどの抗原、あるいはアレルゲン等を抗原とすることが好ましい。
【００１６】
以下、実施例として、本願発明の基礎となった実験結果を示す。
実験１：可溶性リグニンポリマーのアジュバント活性の検討
１．手続
リグニンモノマー誘導体であるカフェ酸（CA）、フェルラ酸（FA）、クマル酸（CoA）（東京化成）に、H2O2存在下、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（Sigma）を作用させることにより，高分子量可溶性リグニンポリマーを作製した（図１）。カフェ酸重合体（pCA）、フェルラ酸重合体（pFA）、クマル酸重合体（pCoA）の収率はそれぞれ40.0%、35.2%、40.0%であった。合成した可溶性リグニンポリマーの基本構造を図２に示した。作製した可溶性リグニンポリマーはいずれもサイトカイン産生誘導作用を示すことを既に報告している（非特許文献２、４）。これらのポリマーのうち、収量の高かったカフェ酸重合体（pCA）を用いてアジュバントとしての機能を評価した。
【００１７】
はじめに、腹腔内投与でのアジュバント活性について評価するため、雌性BALB/c、C3H/HeJ、雄性C57BL/6マウス（日本SLC）の腹腔内に卵白アルブミン（OVA）（5 μg/head）ならびにpCA（200μg/head）または水酸化アルミニウム（Alum）を投与した。初回投与から21日後の血清を回収し、血中抗OVA抗体（IgG1、IgG2a、IgE）量をELISAにより解析した。
【００１８】
さらに、OVAならびにpCA（比較としてカンジダアルビカンス由来可溶性βグルカン；CSBG、粒子状βグルカン；OX-CAを使用）を雌性BALB/cマウスへ経鼻投与し、初回投与から21日後の血清，肺洗浄液，鼻洗浄液，膣洗浄液を回収した。各溶液中に含まれるOVA特異的抗体（IgG、IgG1、IgG2a、IgA）量をELISAにより解析し，粘膜アジュバントとしてのpCAの機能について検討した。
２．結果
図３のプロトコルに従いOVAまたはpCAをBALB/cマウス腹腔内投与したところ、OVA＋pCA投与群において、21日目の血清中に抗OVA IgG1が検出された（図４A）。OVA単独投与群ではIgG1クラスの上昇が確認され、Alum併用群ではIgG1、IgG2aクラスの抗体量が上昇した。これらの結果は、pCAがBALB/cマウスに対し、腹腔内投与によってTh2優位な抗体産生を誘導できることを示唆している。
【００１９】
一方、C3H/HeJまたはC57BL/6マウスにOVA+pCAを腹腔内投与したところ、IgG1、IgG2a（IgG2c）クラスの抗体量が増加した(図４B-C)。従って、これらのマウス種においてpCAはTh2のみならずTh1型の応答を誘導する免疫アジュバントであることが明らかとなった。
【００２０】
次に、図５のプロトコルに従い、OVAまたはpCAをBALB/cマウスに経鼻投与したところ、21日目の血清中に抗OVA IgG（IgG1、IgG2a）の産生が認められた(図４A-C)。さらに肺洗浄液中には抗OVA IgG、IgAが有意に増加した（図６D、E）。鼻粘膜、膣洗浄液中には抗OVA IgAの有意な上昇が認められた（図６F、G）。OVA特異的抗体の強力な産生誘導は，リグニン類同様にサイトカイン産生誘導など自然免疫賦活作用を持つβグルカンであるCSBGならびにOX-CAでは認められなかったことから（図６H、I）、粘膜アジュバント活性は，可溶性リグニンポリマーの有する特徴的な生物活性であることが確認された。
実験２：可溶性リグニンポリマーによる産生誘導物質の検討
C57BL/6マウス（日本SLC）の脾臓細胞をpCAで刺激し，24時間培養後の細胞を抗MHCクラスII抗体（BD Bioscience）で染色した。MHCクラスII高発現細胞の割合をFACSで解析した（図７）。pCA刺激によってMHCクラスII高発現細胞の割合が上昇することが確認された。
【００２１】
次に、B10.BRマウス（日本SLC）の脾臓細胞をpCAで刺激し、48時間培養後の細胞上清中に含まれるサイトカイン・ケモカイン量を測定した（図８）。pCAはIL-4、IL-13、eotaxin、RANTESなどの産生をほとんど誘導せず、IL-2 などのTh1型サイトカインを誘導することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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