(57)【要約】      （修正有）【課題】血栓症、塞栓症の治療の治療のための、選択的にトロンビンを阻害する方法の提供【解決手段】トロンビンのエキソサイト１エピトープを認識し、出血を促進することなく選択的にトロンビンを阻害する抗体分子。特定のアミノ酸配列を有する、ＶＨドメイン及び特定のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、トロンビンのエキソサイト１領域に特異的に結合する単離された抗体分子。完全抗体であり、ＩｇＡ又はＩｇＧである、抗体分子。これらの抗体分子は、血栓、塞栓、およびトロンビン介在性のその他の状態の治療および予防に有用であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ、配列番号３、４および５の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメイン、ならびにそれぞれ配列番号８および９の配列を有するＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３および配列番号７の配列を有するＬＣＤＲ１もしくは配列番号６のＳ３０に相当する１アミノ酸残基に置換を導入する変異によりグリコシル化部位が消去された配列番号７の配列を有するＬＣＤＲ１を含むＶＬドメインを含む、トロンビンのエキソサイト１領域に特異的に結合する単離された抗体分子。
【請求項２】
トロンビン活性を阻害する、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項４】
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン又はアミノ酸Ｓ３０における１アミノ酸の置換によりグリコシル化部位が消去された配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン又はアミノ酸Ｓ３０における１アミノ酸の置換によりグリコシル化部位が消去された配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項６】
完全抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項７】
ＩｇＡまたはＩｇＧである、請求項６に記載の抗体分子。
【請求項８】
前記抗体分子は抗体の断片であり、該断片はトロンビンのエキソサイト１領域に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
トロンビン介在性の状態の治療に使用するための医薬の製造における請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子の使用。
【請求項１２】
トロンビン介在性の状態は血栓性の状態である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
血栓性の状態は、血栓症または塞栓症である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
トロンビン介在性の状態は、炎症、感染症、腫瘍の増殖、腫瘍の転移または認知症である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子を含む、トロンビン介在性の状態を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
トロンビン介在性の状態は血栓性の状態である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
血栓性の状態は、血栓症または塞栓症である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
トロンビン介在性の状態は、炎症、感染症、腫瘍の増殖、腫瘍の転移または認知症である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビンを阻害する抗体分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液の凝固は、損傷した血管からの出血の防止（止血）において鍵となるプロセスである。しかし、血管を通る血液の流れを妨げる血塊（血栓）、または破砕して身体の他の場所における血管内に留まる血塊（血栓塞栓症）は、健康への深刻な脅威となり得る。
【０００３】
多数の抗凝固療法が、病的な血液凝固を治療するために利用可能である。これらの治療法の共通の欠点は、出血リスクの増加である（Ｍａｃｋｍａｎ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１８１）：９１４−９１８）。多くの抗凝固剤は、血栓を防ぐ用量と出血を誘発する用量の間の治療域が狭い。この域は、多くの場合、個々の患者の応答性の違いによってさらに制限される。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、トロンビンのエキソサイト１エピトープを認識する抗体分子は、出血を促進することなくトロンビンを選択的に阻害するという予想外の発見に関する。これらの抗体分子は、血栓、塞栓、およびトロンビン介在性のその他の状態の治療および予防に有用であり得る。
【０００５】
本発明の１の態様は、トロンビンのエキソサイト１に特異的に結合する単離された抗体分子を提供する。
【０００６】
単離された抗エキソサイト１抗体分子は、出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）または大出血（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ）を促進または実質的に促進することなく、すなわち、この抗体分子が血管損傷に対する正常な生理的反応（すなわち止血）を阻害または実質的に阻害することなく、インビボでトロンビンを阻害し得る。例えば、この抗体分子により、止血は阻害されないか、または、最小限度で阻害（すなわち、患者の健康に影響を与えないか、または、さらなる介入を必要としないというわずかな程度で阻害）され得る。この抗体分子により、出血は増加しない、または最小限度で増加し得る。
【０００７】
エキソサイト１（「アニオン結合エキソサイト１」および「フィブリノゲン認識エキソサイト」としても知られている）は、よく特徴付けされたトロンビン分子上の二次結合部位である（例えば、Ｊａｍｅｓ  Ａ．Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，２００８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ，ｉｎ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２００８，ｅｄｉｔｏｒｓ；Ｋ．  Ｔａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｅ．Ｗ．Ｄａｖｉｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｊａｐａｎ  ＫＫ，Ｔｏｋｙｏ，ｐｐ．８０−１０６参照）。エキソサイト１は、成熟したトロンビン中には形成されるが、プロトロンビン中には形成されない（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００）ＪＢＣ  ２７７５  １６４２８−１６４３４参照）。
【０００８】
エキソサイト１は、フィブリノゲンなどのトロンビン基質の認識に関与するが、触媒活性部位からは離れている。抗凝固ドデカペプチドヒルゲン（Ｎａｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９０  ＪＢＣ  ２６５  １３４８４−１３４８９）、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、トロンボモジュリン（プロテインＣおよびＴＡＦＩの活性化のための補因子）、フィブリノゲン、ＰＡＲＩおよびフィブリン（第ＸＩＩＩ因子の活性化のための補因子）を含む、様々なトロンビン結合因子が、エキソサイト１に結合する。
【０００９】
抗エキソサイト１抗体は、成熟ヒトトロンビンのエキソサイト１に結合できる。ヒトプレプロトロンビンの配列は、配列番号１に記載の通りである。ヒトプロトロンビンは、配列番号１の残基４４〜６２２の配列を有する。成熟ヒトトロンビンは、残基３１４〜３６３（軽鎖）および残基３６４〜６２２（重鎖）の配列を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、抗エキソサイト１抗体は、他の種由来の成熟トロンビンのエキソサイト１にも結合できる。他の種由来のトロンビン配列は、当該分野において公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベース上で利用可能である。他の種由来のトロンビン配列中の対応する残基は、配列アラインメントツールを用いて容易に同定可能である。
【００１１】
本明細書に記載のトロンビン残基のナンバリングのスキームは、当該分野で通常のものであり、キモトリプシンテンプレート（Ｂｏｄｅ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８９  Ｎｏｖ；８（１１）：３４６７−７５）に基づく。トロンビンは、順番に小文字が付されたキモトリプシンに対する挿入ループを有する。
【００１２】
成熟ヒトトロンビンのエキソサイト１には、配列番号１中に下線が付されており、以下の残基を含み得る：Ｍ３２、Ｆ３４、Ｒ３５、Ｋ３６、Ｓ３６ａ、Ｐ３７、Ｑ３８、Ｅ３９、Ｌ４０、Ｌ６５、Ｒ６７、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｔ７４、Ｒ７５、Ｙ７６、Ｒ７７ａ、Ｎ７８、Ｅ８０、Ｋ８１、Ｉ８２、Ｓ８３、Ｍ８４、Ｋ１０９、Ｋ１１０、Ｋ１４９ｅ、Ｇ１５０、Ｑ１５１、Ｓ１５３およびＶ１５４。いくつかの実施形態では、これらの残基のいずれか１つと近接して（すなわち、０．５ｎｍ以内または１ｎｍ以内）位置する他のトロンビン残基もまたエキソサイト１の一部と考えることができる。
【００１３】
抗エキソサイト１抗体は、エキソサイト１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０個を超える残基を含むエピトープに結合し得る。好ましくは、抗エキソサイト１抗体は、エキソサイト１残基全体から構成されるエピトープに結合する。
【００１４】
例えば、抗エキソサイト１抗体は、ヒトトロンビンまたは他の種由来のトロンビンにおける等価残基のＭ３２、Ｆ３４、Ｓ３６ａ、Ｐ３７、Ｑ３８、Ｅ３９、Ｌ４０、Ｌ６５、Ｒ６７、Ｒ７３、Ｔ７４、Ｒ７５、Ｙ７６、Ｒ７７ａ、Ｉ８２  およびＱ１５１からなる群より選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または全１６個の残基を含むエピトープに結合し得る。いくつかの好ましい実施形態では、エピトープは、トロンビン残基Ｑ３８、Ｒ７３、Ｔ７４、Ｙ７６  およびＲ７７ａ、そして場合により１つ以上の追加残基を含み得る。
【００１５】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、トロンビンエキソサイト１に特異的であり、このエピトープに対し、他のエピトープ、例えば、成熟トロンビン以外の哺乳動物タンパク質由来のエピトープ、よりも高い親和性で結合する。例えば、抗エキソサイト抗体１分子は、トロンビンエキソサイト１に対し、他のエピトープよりも、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、または他よりも少なくとも２０００倍高い結合親和性を示し得る。
【００１６】
好ましくは、エキソサイト１に特異的な本明細書に記載の抗体分子は、成熟トロンビンに結合し得るが、プロトロンビンには結合しないまたは実質的に結合しないことを示し得る。
【００１７】
いかなる理論にも束縛されないが、抗エキソサイト１抗体は、止血性血塊のコア内にあるトロンビンにアクセス不能なので血管損傷の部位における正常なトロンビンの機能を阻害することで止血に対し影響することがない可能性がある。しかしながら、抗エキソサイト１抗体は依然として血塊の表面および血塊の外殻でトロンビンに結合するので、血栓が防止される、すなわち、非止血性血塊の伸長が防止される。
【００１８】
抗エキソサイト１抗体分子は、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎΜ未満、または１ｎＭ未満のエキソサイト１に対する解離定数を有し得る。例えば、抗体分子は、０．１〜５０ｎＭ、例えば、０．５〜１０ｎＭのエキソサイト１に対する親和性を有し得る。好適な抗エキソサイト１抗体分子は、例えば、約１ｎＭのトロンビンエキソサイト１に対する親和性を有し得る。
【００１９】
抗エキソサイト１抗体分子の結合動態（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）および親和性（平衡解離定数Ｋdとして表される）は、標準的な手法、例えばＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用した表面プラズモン共鳴などを用いて決定できる。
【００２０】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、免疫グロブリンまたはその断片であってもよく、天然または部分的もしくは完全に合成して生成されるもの、例えば組換え分子であってもよい。
【００２１】
抗エキソサイト１抗体分子は、任意のアイソタイプまたはサブクラスの抗体の全体ならびに、Ｆａｂ、Ｆａｂ2、Ｆａｂ3、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディおよび単一ドメイン抗体（ナノボディを含む）等の抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはプロテインを含み得る。抗体分子ならびにそれらの構築方法および使用方法は、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３（９）：１１２６−１１３６（２００５）に記載される。
【００２２】
いくつかの好ましい実施形態では、抗エキソサイト１抗体分子は、完全抗体であり得る。例えば、抗エキソサイト１抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、あるいは任意のアイソタイプのサブクラス、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４であってもよい。抗エキソサイト１抗体分子は、モノクローナル抗体であってもよい。他の好ましい実施形態では、抗エキソサイト１抗体分子は、抗体の断片であってもよい。
【００２３】
抗エキソサイト１抗体分子は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であってもよい。
【００２４】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、他のポリペプチドおよび／または血清成分に結合可能な抗体等の汚染物質がないという意味で、単離可能である。モノクローナル抗体がいくつかの目的のために好ましいことがあるが、ポリクローナル抗体を用いてもよい。
【００２５】
抗エキソサイト１抗体分子は、当該分野で標準的な技術を用いて得ることができる。抗体を生産する方法には、タンパク質またはその断片を用いて、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を免疫化することが挙げられる。抗体は、当該分野で公知の様々な技術のいずれかを用いて免疫動物から得ることができ、好ましくは、目的の抗原に対する抗体の結合を利用して、スクリーニングできる。例えば、ウェスタンブロッティング法または免疫沈降を用いることができる（Ａｒｍｉｔａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｎａｔｕｒｅ３５７：８０−８２）。動物から抗体および／または抗体産生細胞を単離するのに、動物を犠牲にする工程を伴う場合がある。
【００２６】
ペプチドで哺乳動物を免疫する代わりまたは補完として、組換えにより製造した、発現した免疫グロブリン可変ドメインのライブラリーから（例えば、その表面に機能的免疫グロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを用いることにより；例として、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、タンパク質に特異的な抗体を得ることができる。このライブラリーは、いかなるタンパク質（または断片）にも免疫化されていない生物から得た配列から構築したナイーブなものであってもよく、あるいは目的の抗原に曝した生物から得た配列を使用して構築したものであってもよい。
【００２７】
他の抗エキソサイト１抗体分子は、エキソサイト１に結合する抗体について、患者の血清をスクリーニングすることによって同定できる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、抗トロンビン抗体分子は、例えば、上述の方法等の任意の便利な手段によって生産することができ、そして、エキソサイト１に変異を有するトロンビン、ガンマトロンビン（自己消化によりＲ７５およびＲ７７ａが欠損するエキソサイト１）またはプロトロンビンと比較した成熟トロンビンに対する結合の違いによってスクリーニングできる。好適なスクリーニング方法は、当該分野において周知である。
【００２９】
トロンビン以外のタンパク質、エキソサイト１変異を有するトロンビン、ガンマトロンビンまたはプロトロンビンと比較して成熟トロンビンに対する結合の増加を示す抗体、例えば、成熟トロンビンに結合するが、エキソサイトＩに変異を有するトロンビン、ガンマトロンビンまたはプロトロンビンに結合しない抗体を、抗エキソサイト１抗体分子として同定し得る。
【００３０】
生産および／または単離後、抗エキソサイト１抗体分子の生物学的活性を検査してもよい。例えば、抗体分子のトロンビン基質阻害能、トロンビンによる補因子または阻害因子の結合および／または切断を決定してもよく、および／または出血を促進することなく血栓を阻害する抗体分子の能力を決定してもよい。
【００３１】
好適な抗体分子を、フィブリノゲン凝血またはトロンビン時間アッセイを用いて活性について検査してもよい。好適なアッセイは、当該分野において周知である。
【００３２】
凝固および出血に対する抗体分子の効果は、標準的な技術を用いて決定し得る。例えば、血栓に対する抗体分子の効果は、血管中に塩化第二鉄誘導性血栓を有するマウスモデルなどの動物モデルにおいて決定し得る。止血への効果もまた、例えば、マウスの尾出血を測定することなどにより、動物モデルにおいて決定し得る。
【００３３】
抗体分子は、通常、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合ドメインを含むが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のみを含む抗原結合ドメイン（例えば、ラクダ科動物またはサメの抗体）も可能である。
【００３４】
ＶＨおよびＶＬドメインの各々は、典型的に、フレームワーク領域により散在し、抗原結合に関与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、エキソサイト１への結合は、完全または実質的に抗エキソサイト１抗体分子のＶＨＣＤＲ３を介して起こり得る。
【００３６】
例えば、抗エキソサイト１抗体分子は、配列番号５のアミノ酸配列、あるいは配列番号５の配列に１つ以上、例えば２、３、４または５つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、削除または挿入された配列を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含み得る。置換は、保存的置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ３は、配列番号５の４位〜９位のアミノ酸残基（ＳＥＦＥＰＦ）を含み得る、あるいは、より好ましくは、配列番号５の２位、および４位〜１０位のアミノ酸残基（ＤおよびＳＥＦＥＰＦＳ）を含み、配列番号５のその他の位置の１つ以上が置換、削除または挿入され得る。ＨＣＤＲ３は、トロンビンエキソサイト１エピトープと相互作用する抗体分子の唯一の領域または実質的に唯一の領域であり得る。ＨＣＤＲ３は、したがって、トロンビンのエキソサイト１領域に対する抗体分子の特異性および／または親和性を決定し得る。
【００３７】
抗エキソサイト１抗体分子のＶＨドメインは、追加的に、配列番号４のアミノ酸配列、あるいは配列番号４の配列に１つ以上、例えば２、３、４または５つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、削除または挿入された配列を有するＨＣＤＲ２を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ２は、配列番号４の３位〜７位のアミノ酸残基（ＤＰＱＤＧ）を含み得る、あるいは、配列番号４の２位、および４位〜７位のアミノ酸残基（ＬおよびＰＱＤＧ）を含み、配列番号４のその他の位置の１つ以上が置換、削除または挿入され得る。
【００３８】
抗エキソサイト１抗体分子のＶＨドメインは、さらに、配列番号３のアミノ酸配列、あるいは配列番号３の配列に１つ以上、例えば２、３、４または５つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、削除または挿入された配列を有するＨＣＤＲ１を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１は、配列番号３の５位のアミノ酸残基Ｔを含み、配列番号３のその他の位置の１つ以上が置換、削除または挿入され得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、抗体分子は、それぞれ、配列番号３、４および５つの配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含み得る。例えば、抗体分子は、配列番号２の配列、あるいは配列番号２の配列に１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸が置換、削除または挿入された配列を有するＶＨドメインを含み得る。
【００４０】
抗エキソサイト１抗体分子は、さらに、ＶＬドメイン、例えば、それぞれ配列番号７、８および９の配列、あるいは、それぞれ配列番号７、８および９の配列に、独立して１つ以上、例えば２、３、４または５つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、削除または挿入された配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含み得る。置換は、保存的置換であってもよい。例えば、抗体分子は、配列番号６の配列、あるいは配列番号６の配列に１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸が置換、削除または挿入された配列を有するＶＬドメインを含み得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、Ｔｙｒ４９を含み得る。
【００４２】
抗エキソサイト１抗体分子は、例えば、親和性、機能的半減期、正反応および逆反応速度（ｏｎ  ａｎｄ  ｏｆｆ  ｒａｔｅｓ）といった抗体の１つ以上の特性を向上させる１つ以上のアミノ酸の置換、削除または挿入を含み得る。
【００４３】
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメイン、および抗体のアミノ酸配列内に置換、削除または挿入を導入するのに必要な技術は、当該分野で一般的に利用可能である。変異配列は、活性に対し最小限または有益な効果を有すると予測し得るまたはし得ない置換、削除または挿入により作製することができ、そしてトロンビンのエキソサイト１への結合能および／または他の任意の所望の特性についてについて検査してもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、抗エキソサイト１抗体分子は、それぞれ、配列番号３、４および５の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメイン、ならびにそれぞれ配列番号７、８および９の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含み得る。
【００４５】
例えば、ＶＨおよびＶＬドメインは、それぞれ、配列番号２および配列番号６のアミノ酸配列を有してもよく；あるいは、配列番号２および配列番号６のアミノ酸配列に、独立して、１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸が置換、削除または挿入された配列を有してもよい。置換は、保存的置換であってもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、抗体は、グリコシル化部位を消去する１つ以上の置換、削除または挿入を含み得る。例えば、配列番号６のＶＬドメイン中のグリコシル化部位を、Ｎ２８またはＳ３０にいずれかの置換を導入する変異で消去してもよい。
【００４７】
抗エキソサイト１抗体分子は、上述したように、任意のフォーマットであってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、抗エキソサイト１抗体分子は、完全抗体、例えば、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４等のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり得る。
【００４８】
本発明の抗エキソサイト１抗体分子は、上述の抗体分子、例えば、
（１）トロンビンエキソサイト１に結合し、そして
（２）配列番号２のＶＨドメインおよび／または配列番号６のＶＬドメイン；配列番号５のＨＣＤＲ３；それぞれ配列番号３、４、７、８または９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３；それぞれ配列番号３、４および５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含むＶＨドメイン；
および／またはそれぞれ配列番号３、４および５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含むＶＨドメインならびに配列番号７、８および９のＬＣＤＲ１、ＬＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含むＶＬドメインを含む抗体分子が、エキソサイト１へ結合するのを競合するものであってもよい。
【００４９】
抗体分子間の競合は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、および／または、１つ以上の他のタグなしの抗体分子の存在下で検出可能な１つの抗体分子に特異的なレポーター分子をタグ付けすることによって、インビトロで容易にアッセイすることができ、同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する抗体分子の同定が可能になる。このような方法は、当業者に容易に公知である。従って、本発明のさらなる態様は、抗体分子、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＨＣＤＲ３もしくはトロンビンのエキソサイト１に結合する上述の親抗体のＣＤＲセット等のＣＤＲを含む抗体分子、と競合する抗体抗原結合部位を含む抗体分子を提供する。好適な抗体分子は、エキソサイト１へ結合する抗体抗原結合部位と競合する抗原結合部位を含み得る、ここで当該抗体抗原結合部位は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成され、ここで、当該ＶＨおよびＶＬドメインは、それぞれ配列番号３、４、および５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列ならびに配列番号７、８、および９のＬＣＤＲ１、ＬＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む、例えば、配列番号２および６のＶＨおよびＶＬドメインである。
【００５０】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、エキソサイト１に結合する因子等のトロンビン結合因子の結合を阻害し得る。例えば、抗体分子は、ｆＶ、ｆＶＩＩＩ、トロンボモジュリン、フィブリノゲンもしくはフィブリン、ＰＡＲ１および／またはヒルゲンおよびヒルゲンアナログの１つ以上がトロンビンへ結合するのを競合的または非競合的に阻害し得る。
【００５１】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、トロンビンの１つ以上の活性を阻害し得る。例えば、抗エキソサイト１抗体分子は、１つ以上のトロンビン基質、例えばフィブリノゲン、血小板受容体ＰＡＲ−１および凝固因子ＦＶＩＩＩの加水分解による切断を阻害し得る。例えば、抗体分子がトロンビンに結合すると、フィブリノゲン、ＰＡＲ−１、凝固因子ＦＶＩＩＩおよび／または他のトロンビン基質、例えば第Ｖ因子、フィブリン存在下における第ＸＩＩＩ因子、プロテインＣおよび／またはトロンボモジュリン存在下におけるＴＡＦＩ、の加水分解が少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍減少するという結果となり得る。いくつかの実施形態では、抗エキソサイト１抗体分子がトロンビンに結合すると、トロンビンによるトロンビン基質の切断が検知不能になるという結果になり得る。
【００５２】
例えば、インビトロでトロンビン基質の加水分解を測定することによってトロンビン活性を測定するための技術は、当該分野において標準的なもので、本明細書に記載される。
【００５３】
抗エキソサイト１抗体分子は、さらに、例えば、ＰＥＧ化等の化学修飾、または、例えば、インビボでの半減期を伸ばす等により医薬的特性を改善するためのリポソームへの組み込みにより修飾してもよい。
【００５４】
凝固および出血に対する抗エキソサイト１抗体分子の効果は、標準的な技術を用いて決定し得る。例えば、血栓モデルに対する抗体の効果を決定し得る。好適なモデルとしては、マウスモデルの血管において塩化第二鉄血栓を誘導し、その後尾部出血させ正常な止血を検査したものが挙げられる。他の好適な血栓モデルが、当該分野で周知である（例えば、Ｗｅｓｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ  ＡＴＶＢ（２００７）２７：２０７９−２０９３参照）。
【００５５】
抗エキソサイト１抗体分子は、医薬的に許容される賦形剤を有する医薬組成物中に含まれていてもよい。
【００５６】
医薬的に許容される賦形剤は、二次反応を誘発せず、そして、例えば、抗エキソサイト１抗体分子の投与、当該分子の寿命および／または身体における有効性の増加、あるいは溶液中における当該分子の溶解を容易にできるようにする医薬組成物中へ入る化合物または化合物の組み合わせであってもよい。これらの医薬的に許容されるビヒクルは周知であり、当業者は、抗エキソサイト１抗体分子の投与様式に応じて、適宜変更するであろう。
【００５７】
いくつかの実施形態では、抗エキソサイト１抗体分子は、投与前に再構成するための凍結乾燥した形態で提供してもよい。例えば、凍結乾燥した抗体分子を、滅菌水中で再構成し、個体への投与前に生理食塩水と混合してもよい。
【００５８】
抗エキソサイト１抗体分子は、通常、抗体分子に加え、少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって医薬組成物は、抗エキソサイト１抗体分子に加え、医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を含んでもよい。このような材料は、非毒性であるべきで、そして抗エキソサイト１抗体分子の効力を妨げるものであってはならない。担体またはその他の物質の正確な性質は、以下に説明するように、ボーラス、点滴、注射または他の任意の適切な経路であり得る投与経路に依存するだろう。
【００５９】
非経口、例えば注射による皮下または静脈内投与では、抗エキソサイト１抗体分子を含む医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であってもよい。当該分野における関連技術の当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて、適切な溶液を上手く調製できる。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を必要に応じて採用してもよく、例えば、かかる添加剤には、以下のものが挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニン等の抗酸化剤；（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）等の防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤。
【００６０】
抗エキソサイト１抗体分子を含む医薬組成物は、治療すべき状態により、単独で、あるいは、同時または逐次的に他の療法と組み合わせて投与できる。
【００６１】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、予防または防止のため（例えば、個体における症状の発症前にその個体での発症リスク低減するため；発症を遅延するため；または発症後その重症度を軽減するため）の治療を含む、ヒトまたは動物の治療方法において使用することができる。その治療方法は、治療を必要とする個体に抗エキソサイト１抗体分子を投与することを含んでもよい。
【００６２】
投与は、通常「治療的有効量」で行われ、これは、患者が恩恵を受けるのに十分な量ということである。そのような恩恵は少なくとも１つの症状についての少なくとも改善であってもよい。実際の投与量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療する症状の性質および重症度、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師に公知の他の要因に依存するであろう。治療の処方、例えば投与量の決定等、は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、症状の重症度および／または治療する疾患の進行度に依存し得る。抗体分子の適切な用量は、当該分野で周知である（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４７：６５９−６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５−９２２）。具体的な投与量は、投与する薬剤の種類に適切なものとして、本明細書またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）に示される。抗体分子の治療的有効量または適切な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性およびインビボ活性を比較することにより、決定できる。マウスおよび他の試験動物における有効投与量をヒト用に推定する方法は公知である。正確な用量は、抗体が予防用であるかまたは治療用であるか、治療すべき領域のサイズおよび位置、抗体の正確な性質（例えば、抗体の全体であるか断片であるか等）、ならびに任意の検出可能な標識または抗体に結合した他の分子を含む多くの要因に依存するであろう。
【００６３】
典型的な抗体の用量は、全身投与では１００μｇ〜１ｇ、そして局所投与では１μｇ〜１ｍｇの範囲内であるだろう。初期に高い負荷の用量を投与し、それに続いて１つ以上の低い用量を投与してもよい。典型的には、抗体は、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプといった完全抗体となるだろう。これは、成人患者の一回の治療用の用量であり、これを、子供や乳幼児用に比例的に調整してもよく、そして、分子量に比例して他の抗体の構成に合わせて調整してもよい。治療は、医師の裁量で、毎日、週２回、毎週または毎月の間隔で繰り返すことができる。個々の治療スケジュールは、抗体組成物の薬物動態的および薬力学的性質、投与経路および治療する症状の性質に依存し得る。
【００６４】
治療は定期的であってもよく、投与の間隔は、約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、約１月に１回以上、約５週間以上、または約６週間以上であってもよい。例えば、治療は２〜４週間毎又は４〜８週間毎であってもよい。治療は、手術前および／または手術後に行ってもよく、そして／あるいは外科的処置または侵襲的手技の解剖部位に直接投与または塗布してもよい。好適な製剤及び投与経路は、上記に記載の通りである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、皮下注射として投与してもよい。皮下注射は、例えば、長期的な予防／治療に、自動注射器を用いて投与してもよい。
【００６６】
いくつかの好ましい実施形態では、抗エキソサイト１抗体分子の治療効果は、用量に応じ、いくつかの半減期にわたり持続し得る。例えば、抗エキソサイト１抗体分子の単回投与の治療効果は、ある個体において、１ヶ月以上、２ヶ月以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、または６ヶ月以上、持続し得る。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＩｇＡのヒトトロンビン−セファロースカラムへの結合および溶出を示す。（Ａ）ｐＨ勾配（中性から低ｐＨ、上方傾斜線で示す）を用いたトロンビン−セファロースカラムからのＩｇＡの溶出プロファイル（狭いピーク）を示す。（Ｂ）総ＩｇＡの充填量、ヒトトロンビンカラムからのフロースルー、低ｐＨで溶出後の溶出液を示す青色ゲルそのものを示す。
【００６８】
【図２】ＩｇＡがトロンビンに結合するがプロトロンビンには結合しないことを示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。このプルダウンアッセイでは、レクチンアガロースを使用して、ＩｇＡをトロンビンまたはプロトロンビンの存在下で結合させる。次いで、上清をＳＤＳゲルに流す。レーン１はサイズの基準である；レーン２は、上清からトロンビンが消失したことを示す；レーン３は、消失がＩｇＡの存在に依存することを示す；レーン３および４は、プロトロンビンは消失していないので、ＩｇＡに結合していないことを示す。
【００６９】
【図３】ＩｇＡの存在または非存在下におけるトロンビンによるＳ２２３８切断の相対速度（すなわち、Ｓ２２３８の加水分解について時間に対するＡｂｓ４０５の単純な傾き）を示す。これは、ＩｇＡがトロンビン活性部位に結合しないことを示す。
【００７０】
【図４】ＩｇＡがトロンビンへの結合について蛍光標識ドデカヒルゲンと競合することを示す結合試験の結果を示す。
【００７１】
【図５】トロンビンによるＳ２２３８の切断に対するＩｇＡの効果を示す。この分析により、ＩｇＡ−トロンビン相互作用のＫｄが１２ｎＭであると推定できる。
【００７２】
【図６】還元条件および非還元（ｏｘ）条件下における全ＩｇＡおよびＦａｂ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。非還元ＩｇＡは１００〜２００ｋＤａの間の分子量を有し、非還元Ｆａｂは約５０ｋＤａの分子量を有することが示される。
【００７３】
【図７】トロンビンのエキソサイト１とＦａｂ断片のＨＣＤＲ３間の相互作用を示すトロンビン−Ｆａｂ複合体の結晶構造を示す。
【００７４】
【図８】トロンビンのエキソサイト１の特異的残基とＦａｂ断片のＨＣＤＲ３間の相互作用を示す結晶構造の詳細を示す。
【００７５】
【図９】ＦＩＴＣで標識したフィブリノゲンを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿静脈損傷部におけるＦｅＣｌ3誘発性血塊を２〜３０分の間に撮影した蛍光顕微鏡画像を示す。１００μｌのＰＢＳを投与した（ビヒクル対照）。
【００７６】
【図１０】ＦＩＴＣで標識したフィブリノゲンおよび４００ｎＭ（マウス血中最終濃度、約０．６ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）の抗エキソサイト１ＩｇＡ（ＰＢＳ中１００μｌ）を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿静脈損傷部におけるＦｅＣｌ3誘発性血塊を撮影した蛍光顕微鏡画像を示す。
【００７７】
【図１１】ＦＩＴＣで標識したフィブリノゲンおよび８０ｎＭ（マウス血中最終濃度、約１．２ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）の抗エキソサイト１ＩｇＡ（ＰＢＳ中１００μｌ）を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿静脈損傷部におけるＦｅＣｌ3誘発性血塊、ならびに比較のために損傷部の外側の領域を撮影した蛍光顕微鏡画像を示す。
【００７８】
【図１２】ＦＩＴＣで標識したフィブリノゲンおよび２００ｎＭ（マウス血中最終濃度、約３ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）の抗エキソサイト１ＩｇＡ（ＰＢＳ中１００μｌ）を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿静脈損傷部におけるＦｅＣｌ3誘発性血塊、ならびに比較のために損傷部の外側の領域を撮影した蛍光顕微鏡画像を示す。
【００７９】
【図１３】ＦＩＴＣで標識したフィブリノゲンおよび４００ｎＭ（マウス血中最終濃度、約６ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）の抗エキソサイト１ＩｇＡ（ＰＢＳ中１００μｌ）を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿静脈損傷部におけるＦｅＣｌ3誘発性血塊を撮影した蛍光顕微鏡画像を示す。
【００８０】
【図１４】ＦＩＴＣで標識したフィブリノゲンおよび４μＭ（マウス血中最終濃度、約６０ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）の抗エキソサイト１ＩｇＡ（ＰＢＳ中１００μｌ）で処理したＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿静脈損傷部におけるＦｅＣｌ3誘発性血塊を撮影した蛍光顕微鏡画像を示す。
【００８１】
【図１５】図９〜１３に示す蛍光像からの抗エキソサイト１ＩｇＡに対する用量反応の定量を示す。
【００８２】
【図１６】対照Ｃ５７ＢＬ／６マウス、および抗エキソサイト１ＩｇＡの量を増加しながら処理したマウスにおける尾の出血時間を示す。二番目の平均値は、外れ値を除外したものである。
【００８３】
【図１７】ＩｇＡまたはＰＢＳのいずれかを尾静脈内へ注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（ｎ＝５）における尾クリップアッセイの結果を示す。注射から１５分後に尾を直径３ｍｍで切断し、１０分にわたり失血をモニターした。
【００８４】
【図１８Ａ】５％ＦｅＣｌ3による損傷の１５分前に前もって、ＰＢＳを２分間注射した９週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスのＦｅＣｌ3頸動脈閉塞モデルの結果を示す。ＰＢＳを注射したマウスの典型的な結果（２０分の閉塞）を示す。
【図１８Ｂ】５％ＦｅＣｌ3による損傷の１５分前に前もって、４００ｎＭ抗トロンビンＩｇＡ（血中最終濃度、約６ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）を２分間注射した９週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスのＦｅＣｌ3頸動脈閉塞モデルの結果を示す。４００ｎＭ抗トロンビンＩｇＡで処理したマウスの結果（閉塞なし）の例を示す。
【図１８Ｃ】５％ＦｅＣｌ3による損傷の１５分前に前もって、４００ｎＭ抗トロンビンＩｇＡ（血中最終濃度、約６ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）を２分間注射した９週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスのＦｅＣｌ3頸動脈閉塞モデルの結果を示す。４００ｎＭ抗トロンビンＩｇＡで処理したマウスの結果（閉塞なし）の例を示す。
【図１８Ｄ】５％ＦｅＣｌ3による損傷の１５分前に前もって、４００ｎＭ抗トロンビンＩｇＡ（血中最終濃度、約６ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）を２分間注射した９週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスのＦｅＣｌ3頸動脈閉塞モデルの結果を示す。４００ｎＭ抗トロンビンＩｇＡで処理したマウスの結果（閉塞なし）の例を示す。
【００８５】
【図１９】２０ｎＭヒトトロンビンを添加した上で、本発明のＩｇＧおよびＩｇＡの濃度を増加させた場合のトロンビン時間（すなわち、プールした血漿の凝血）を示す。
【００８６】
【図２０】固定化トロンビンへの合成ＩｇＧの結合を示す（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用）。
【００８７】
【図２１】オン段階（ｏｎ  ｐｈａｓｅ）、続いてオフ段階（ｏｆｆ  ｐｈａｓｅ）を示す固定化ＩｇＧへの２４ｎＭ  Ｓ１９５Ａトロンビンの結合についての典型的なオクテットトレース（Ｏｃｔｅｔ  ｔｒａｃｅ）を示す。黒線は適合する。
【００８８】
【図２２】固定化ＩｇＧを充填したチップを用いた５００ｎＭプロトロンビンのオクテットトレースを示す。図２１中のトロンビンの実験と同一の条件を使用した。このような高濃度であっても、結合した証拠がみられない。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、トロンビンを阻害し、トロンビン介在性の状態の治療に有用であり得る。
【００９０】
止血（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）は、正常な凝固反応である、すなわち、例えば損傷した血管からの出血または大出血を防ぐものである。止血は、体内の血管からの出血または大出血を止めるものである。
【００９１】
抗エキソサイト１抗体分子は、止血に対し影響がないまたは実質的に影響がない、すなわち、出血または大出血を促進しない。
【００９２】
本発明の態様は：ヒトまたは動物の治療方法において使用するための、本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子；トロンビン介在性の障害の治療方法に使用するための、本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子；トロンビン介在性の状態の治療用の医薬の製造における、本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子の使用；およびトロンビン介在性の状態の治療を必要とする個体に、本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子を投与することを含む、トロンビン介在性の状態の治療方法を提供する。
【００９３】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体によるトロンビンの阻害は、任意のトロンビン介在性の状態の治療において、臨床上有益であり得る。トロンビン介在性の状態には、トロンビンの形成または活性に関連する障害が含まれる。
【００９４】
トロンビンは、止血、凝固および血栓において重要な役割を果たしている。トロンビン介在性の状態には、血栓症や塞栓症などの血栓性の状態が含まれる。
【００９５】
血栓は、止血に必要な範囲を超えた過剰な凝固（すなわち、過剰凝固）、または止血に不要な凝固（すなわち、余分に止血性または非止血性の凝固）である。
【００９６】
血栓は、血管腔内の血液の凝固である。これは、止血に必要な範囲を超えているかまたは止血に不要な血塊（血栓）を形成するという特徴を有する。この血塊は、血管を通る血液の流れを妨げることがあり、医学的合併症につながることがある。血塊は、破砕して形成された場所から離れることがあり、それが循環器系の別の場所における塞栓につながることがある。動脈系において、血栓は、典型的には、動脈硬化性プラークの破裂の結果である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、血栓は、初期の生理学的止血性応答、例えば、血管内の内皮細胞の損傷、の後に生じることがある。他の実施形態では、血栓は、いずれかの生理学的止血性応答の非存在下で生じることがある。
【００９８】
血栓は、内因性の血栓症傾向（すなわち、栓友病）を有する個体で生じることがあり、または、内因性の血栓症傾向を有さない「正常な」個体で、例えば、外因性の刺激に応答して生じることがある。
【００９９】
血栓および塞栓は、循環系内の静脈、動脈またはその他の血管内のいずれかに生じることがあり、微小血管の血栓を含み得る。
【０１００】
血栓および塞栓は、外科手術（手術中またはその後のいずれか）、あるいは、患者内への冠動脈ステントなどの異物の挿入に関連することもある。
【０１０１】
例えば、本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体は、血液が人工物の表面に露出する心臓切開手術や透析などの外科手術および他の処置において有用なことがある。
【０１０２】
血栓性の状態には、栓友病、血栓性脳卒中および冠状動脈閉塞が挙げられる。
【０１０３】
本明細書に記載の治療に適する患者には、血栓症が症状もしくは治療の副作用である状態、または血栓のリスクを増加させる状態にある患者、あるいは一般集団に比べて血栓のリスクが増加しそうなまたは増加している患者が挙げられる。例えば、本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、癌患者における静脈血栓症の治療または予防、および院内血栓症の治療または予防に有用なこともあり、院内血栓症は、静脈血栓塞栓症の症例の５０％の原因である。
【０１０４】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子は、実質的に止血を阻害または妨げることなく、血栓性の状態などのトロンビン介在性の状態に対し治療的またはその他の有益な効果を発揮し得る。例えば、抗エキソサイト１抗体分子で処理した患者における大出血のリスクが、未治療の個体に比べ増加または実質的に増加し得ない。
【０１０５】
天然および合成ヘパリン、ワルファリン、直接的なセリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、アルガトロバン、ダビガトラン、アピキサバン、およびリバロキサバン）、ヒルジンおよびその誘導体（例えば、レピルジンおよびビバリルジン）、ならびに抗血小板剤（例えばクロピドグレル、チクロピジンおよびアブシキシマブ）などの従来の抗凝固剤で処理した個体では出血が引き起こされる。本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子で処理した患者における出血のリスクは、従来の抗凝固剤で処理した個体に比べ減少し得る。
【０１０６】
トロンビン介在性の状態には、炎症、感染症、腫瘍の増殖および転移、臓器拒絶反応ならびに認知症（血管性および非血管性、例えば、アルツハイマー病）を含む、トロンビン活性に関連する非血栓性の状態を含む（Ｌｉｃａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｅｍｅｒｇ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ）．２００９  Ｆｅｂ；１９（１）：１１−２２；Ｔｓｏｐａｎｏｇｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．２００９  Ｄｅｃ１；２０（４）：１７１−９）。
【０１０７】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子はまた、インビトロ試験、例えば、患者から得た試料における凝固の分析および特徴付け、において有用なこともある。
【０１０８】
抗エキソサイト１抗体分子は、トロンビン生成の測定に有用なことがある。トロンビン生成の分析は、フィブリノゲンからフィブリンに変換すると濁りが生じ、簡単に発色のエンドポイントが利用できなくなるので、技術的に問題がある。
【０１０９】
本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子を血液試料に添加すると、フィブリン形成そして濁りを防止または阻害するので、脱フィブリン化工程を必要とせずに、発色基質を用いてトロンビン生成を測定できる。
【０１１０】
例えば、トロンビン生成を測定する方法は、本明細書に記載の抗エキソサイト抗体１分子の存在下で、血液試料を発色性トロンビン基質に接触させ、この基質からの発色性シグナルを測定することを含んでもよく；ここで、発色性シグナルが、試料中のトロンビン生成の指標であってよい。
【０１１１】
発色性シグナルは、試料の脱フィブリン化をせずに直接測定できる。
【０１１２】
好適な基質は、当該分野で周知であり、Ｓ２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮａ）、β−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド二酢酸（Ｐｒａｓａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７８、１２１５；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ）およびＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮａ．ＡｃＯＨ（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＣＳ−０１（８１）；Ａｎｉａｒａ  Ｉｎｃ  ＯＨ  ＵＳＡ）が挙げられる。
【０１１３】
抗エキソサイト１抗体分子はまた、血液透析および体外膜型酸素供給などの体外循環において、上記のように血液の凝固を阻害または予防する上で有用なこともある。
【０１１４】
例えば、インビトロまたはエクスビボでの血液凝固を阻害または予防する方法は、血液試料に本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子を導入することを含み得る。血液試料は、抗エキソサイト１抗体を導入する前、同時、または後で、体外循環系に導入してもよく、そして、場合により、血液透析または酸素供給等の処理を施してもよい。いくつかの実施形態では、処理した血液を、その後個体に投与してもよい。他の実施形態は、エクスビボでの血液試料中の血液凝固を阻害または予防する方法に使用するための本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子、ならびに、エクスビボでの血液試料中の血液凝固を阻害または予防する方法において使用するための医薬の製造における本明細書に記載の抗エキソサイト１抗体分子の使用を提供する。
【０１１５】
本発明の他の態様は、トロンビンのエキソサイト１エピトープに結合し、例えば、病的な血液凝固または血栓の治療において有用であり得る抗体分子の製造に関する。
【０１１６】
トロンビンのエキソサイト１エピトープに対する抗体抗原結合ドメインを製造する方法は；
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む親ＶＨドメインのアミノ酸配列中に１つ以上のアミノ酸を付加、削除、置換または挿入することにより、親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを設け、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３、４および５のアミノ酸配列を有し；そして
場合により、このようにして設けたＶＨドメインを、１つ以上のＶＬドメインと結合して１つ以上のＶＨ／ＶＬの組み合わせを設け；そして
親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である前記ＶＨドメインまたは１つもしくは複数のＶＨ／ＶＬの組み合わせを検査して、トロンビンのエキソサイト１エピトープに対する抗体抗原結合ドメインを同定する、
ことを含んでもよい。
【０１１７】
親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインは、配列番号５のＨＣＤＲ３配列、あるいは１、２、３つまたはそれ以上のアミノ酸が付加、削除、置換または挿入された変異を有し得る。
【０１１８】
親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインは、それぞれ配列番号３および４のＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２配列、あるいは１、２、３つまたはそれ以上のアミノ酸が付加、削除、置換または挿入された変異を有し得る。
【０１１９】
トロンビンのエキソサイト１エピトープに特異的に結合する抗体分子を製造する方法は；
ＶＨドメインをコードする出発核酸または各々がＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを設け、ここで、１つまたは複数のＶＨドメインは、置換されるべきＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３を含むか、あるいはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３コード領域を欠くかのいずれかであり；
前記出発核酸または出発レパートリーを、それぞれ配列番号３、４および５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ３のアミノ酸配列の変異をコードするかまたは当該変異により生産した１つまたは複数の供与核酸に結合して、前記１つまたは複数の供与核酸が出発核酸または出発レパートリーのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域に挿入されるようにすることで、ＶＨドメインをコードする核酸の生成レパートリーを設け；
前記生成レパートリーの核酸を発現させて生成ＶＨドメインを生産し；
場合により、前記生成ＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと結合し；
トロンビンのエキソサイト１に結合する抗体分子であって、生成ＶＨドメインそして場合によりＶＬドメインを含む抗体分子を選択し；そして
前記抗体分子またはそれをコードする核酸を回収する、
ことを含んでもよい。
【０１２０】
抗体分子の成熟および最適化のための適切な技術は、当該分野において周知である。
【０１２１】
上述したように、トロンビンのエキソサイト１エピトープに対する抗体抗原結合ドメインおよび抗体分子を検査してもよい。例えば、トロンビンへの結合および／またはトロンビン基質の切断を阻害する能力を決定してもよい。
【０１２２】
凝固および出血に対する抗体分子の効果は、標準的な技術を用いて決定してもよい。例えば、大腿静脈または頚動脈などの血管内に塩化第二鉄により血塊を誘導し、その後尾を出血させ正常な止血があるかを検査したマウス血栓症モデルを用いてもよい。
【０１２３】
本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮することで当業者には明らかであろう。
【０１２４】
本明細書で言及する全ての文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
特に明記しない限り、本明細書において抗体残基はカバットナンバリングスキーム（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）に従ってナンバリングされている。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「および／または」は、２つの指定された特徴または成分の各々について、もう一方があるまたはない場合の具体的な開示として解釈すべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂそして（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々についてあたかもそれぞれが個別で本明細書に記載されているかのような具体的な開示として解釈すべきである。
【０１２７】
文脈が指示しない限り、上述の特徴についての記載および定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されるものではなく、記載されるすべての態様および実施形態に等しく適用される。このように、上述の特徴は、すべての組み合わせおよび置換について開示される。
【０１２８】
本発明の特定の態様および実施形態を、図および表を参照しながら例として説明する。
【実施例】
【０１２９】
１．抗体の単離および特徴付け
凝固スクリーニングを、患者の血漿試料について行った。凝固検査は、頭部損傷後の硬膜下血腫を負った患者で実施した。血腫は、介入なしに自然消失した。出血について過去の病歴はなく、患者が血腫を示してからの４年間、それ以外の出血エピソードはなかった。結果を表１に示す。
【０１３０】
この患者のプロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、およびトロンビン時間（ＴＴ）は全て、対照と比較して長かったが、レプチラーゼ時間は正常であった。
【０１３１】
トロンビン時間は、ヘパリナーゼにより補正されなかったので、ヘパリン治療または汚染の関与はなかったことが示唆される。この患者のフィブリノゲンレベルは、ＥＬＩＳＡおよびレプチラーゼアッセイによると正常であった。クラウスアッセイでは、フィブリノゲンレベルがこのトロンビン阻害剤の存在により人為的に低かった。ＰＴおよびＡＰＴＴ凝固時間は、正常な個体からプールした血漿との５０：５０混合物を用いた混合検査でも、長いままであることが分かった。このことより、患者の試料中に阻害因子が存在することを示唆された。
【０１３２】
患者の血漿は、高いＩｇＡ力価を有することが分かった。このＩｇＡ分子は、ヒトトロンビンカラムに結合することが分かった（図１）。トロンビンは、レクチンアガロースに結合したＩｇＡの存在下ではプルダウンされていれたが、ＩｇＡの非存在下ではそうではなかった。プロトロンビンは、ＩｇＡの存在下でもプルダウンされなかったので、このＩｇＡは、プロトロンビンではなく、トロンビンに特異的に結合することが示唆された（図２）。
【０１３３】
次いで、トロンビン分子上のＩｇＡの結合部位を調べた。
【０１３４】
ＩｇＡの存在下ではトロンビンによるＳ２２３８の切断速度がわずかに高くなったことが測定され、よってＩｇＡはトロンビンの活性部位をブロックしないことが示唆された（図３）。
【０１３５】
トロンビンへの蛍光標識ヒルゲンの結合が７００ｎＭ  ＩｇＡの存在により阻害され、これにより抗体に対するエピトープは、トロンビン、すなわち、トロンビンのエキソサイト１上のヒルゲンの結合部位と重なることが示唆された（図４）。
【０１３６】
いくつかのトロンビンの凝固促進基質の加水分解に対するＩｇＡの効果を検査した。結果を表２に示す。これらの結果は、患者試料から単離されたＩｇＡ分子は、トロンビンの複数の凝固促進活性を阻害することを実証する。
【０１３７】
ＩｇＡの存在下におけるアンチトロンビン（ＡＴ）によるトロンビンの阻害は、ヘパリンの非存在下および存在下の両方でほんのわずか影響された（表３）。
【０１３８】
トロンビンに対するＩｇＡの解離定数（Ｋd）を、Ｓ２２３８の加水分解の速度に基づいて最初に推定したところ、約１２ｎＭであった（図５）。Ｓ１９５Ａトロンビン（触媒セリンの変異により不活化されたもの）へのＩｇＡの結合についてのＫdは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて、２ｎＭであると決定された（表４）。
【０１３９】
精製したＩｇＡをパパインで切断し（図６）、Ｆａｂ断片を単離し、ヒトＰＰＡＣＫ−トロンビン（ＰＰＡＣＫは共有結合性の活性部位阻害剤である）と結合させた。ヒトＰＰＡＣＫ−トロンビン−ＦＡＢ複合体を結晶化し、構造解析に用いた。得られた構造の統計は以下のようであった：解像度は１．９Å；Ｒ因子＝１９．４３％；Ｒｆｒｅｅ＝２３．４２％；非対称単位中に１つの複合体；ラマチャンドラン：好適値（ｆａｖｏｕｒｅｄ）＝９７．０％、外れ値（ｏｕｔｌｉｅｒｓ）＝０％。結晶構造により、ＩｇＡ  ＦａｂのＨＣＤＲ３とトロンビンのエキソサイト１との間で密接に関連していることが明らかになった（図７）。
【０１４０】
特に、エキソサイト１の残基Ｍ３２、Ｆ３４、Ｑ３８、Ｅ３９、Ｌ４０、Ｌ６５、Ｒ６７、Ｒ７３、Ｔ７４、Ｒ７５、Ｙ７６、Ｒ７７ａおよびＩ８２は全て直接ＩｇＡ  ＦａｂのＨＣＤＲ３ループと相互作用する（図８）。
【０１４１】
抗体−トロンビン界面のＰＩＳＡ分析により、複合体中の全埋没表面積が１０７５Å2であることが示された。ＩｇＡ重鎖中の接触残基は、（カバットナンバリングで）：３０、５１、５２ａ、５３−５５、９６、９８、９９、１００、１００ａ、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄであった。これらは全てＣＤＲ：ＣＤＲＨ１−ＧＹＴＬＴＥＡＡＩＨ；ＣＤＲＨ２−ＧＬＤＰＱＤＧＥＴＶＹＡＱＱＦＫＧ；ＣＤＲＨ３−ＧＤＦＳＥＦＥＰＦＳＭＤＹＦＨＦ中にあった（下線を付した残基が接触している）。ＣＤＲＨ３は、抗体上の埋没表面積の８５％を示し、最も重要であることが分かった。軽鎖は、周辺部の一か所で、ＣＤＲＬ２の直前のＴｙｒ４９（トロンビンのＳｅｒ３６ａ）と接触していた。埋没表面をもたらしたいくつかの貢献要素は、それぞれ：Ｇｌｕ９９  ５４Å2、Ｐｈｅ１００  １３４．８Å2、Ｇｌｕ１００ａ  ８０．６Å2、Ｐｈｅ１００ｃ  １４１．７Å2であった。
【０１４２】
トロンビンにおける接触残基は、（キモトリプシンナンバリングで）：３２、３４、３６ａ−４０、６５、６７、７３−７６、７７ａ、８２、および１５１あることが分かった。埋没表面をもたらした最も重要な貢献要素は、それぞれ：Ｇｌｎ３８  ８６．４Å2、Ａｒｇ７３  ４４．５Å2、Ｔｈｒ７４  ６０．１Å2、Ｔｙｒ７６  ７８．４Å2、Ａｒｇ７７ａ  ８６．９Å2であった。
【０１４３】
患者は、このＩｇＡの循環レベルが３ｇ／ｌであるにもかかわらず、増加または異常な出血または大出血を示さなかったので、この抗体が正常な止血に影響を与えずにトロンビンを阻害することが実証された。
【０１４４】
２．動物血栓症モデルに対するＩｇＡの効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを麻酔した。（化合物を注入するため）カテーテルを頸動脈に挿入した。ＦＩＴＣ標識したフィブリノゲン（２ｍｇ／ｍｌ）を頸動脈から注入した。ＰＢＳ（対照）またはＩｇＡも、頸動脈から注射した。大腿静脈を露出し、凝血を誘導するために３分間１０％ＦｅＣｌ3（飽和させた長さ３ｍｍの吸い取り紙）を付した。
【０１４５】
蛍光顕微鏡技術を用いて、ＦｅＣｌ3による損傷から０、５、１０、および２０分後に、損傷部位の長さ方向に沿って蛍光顕微鏡画像を撮影した。
【０１４６】
大腿静脈中の血塊（フィブリン沈着）は、明るい部分としてはっきりと視認できた（図９）。最低用量の抗体でも凝血の有意な阻害を引き起こすことが観察されたが、用量が増加するにつれて、凝血が減少した。（図１０〜１５）。
【０１４７】
マウスの出血時間も測定した。出血時間は、尾の切断から血流の停止までの時間として評価した。１つ外れ値の試料があったにもかかわらず、出血時間は抗エキソサイト１ＩｇＡの処理によって影響を受けないことがわかった（図１６）。
【０１４８】
これらの結果により、抗エキソサイト１ＩｇＡ抗体は、血栓の強力な阻害因子であるが、出血時間には影響を及ぼさないことが示される。
【０１４９】
３．尾クリップ（Ｔａｉｌ  ｃｌｉｐ）アッセイ
尾クリップアッセイを、４００ｎＭのＩｇＡ（血中最終濃度、約６ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）またはＰＢＳのいずれかを注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスで行った。注射から１５分後に尾を直径３ｍｍで切断し、その後１０分にわたり失血をモニターした。総失血は、抗エキソサイト１ＩｇＡによる処理によって影響を受けないことが分かった（図１７）。
【０１５０】
４．ＦｅＣｌ3損傷性頸動脈閉塞
ＦｅＣｌ3損傷性頸動脈閉塞試験を、９週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスで実施した。マウスは、５％ＦｅＣｌ3による損傷の１５分前に、４００ｎＭ抗ＩＩａ型ＩｇＡ（血中最終濃度、約６ｍｇ／Ｋｇの用量に相当）またはＰＢＳを２分間注射した。その後、血流をドップラーによりモニターし、閉塞までの時間を計測した。「血塊」は、血流が典型的には０．１ｍｌ／ｍｉｎ未満の値に減少し、そして減少したままであるという安定した閉塞性血栓であると定義した。対照マウスでは、安定した血塊が、損傷後約２０分で形成されることが観察された（図１８Ａ）。しかし、４００ｎＭ抗ＩＩａ型ＩｇＡで処理したマウスの大多数は、安定した血塊を形成できず、血塊は速やかに溶解し、繰り返し溶解するか、または全く形成されなかったというトレース（ｔｒａｃｅ）を示した。３つの代表的なトレースを、図１８Ｂ〜１８Ｄに示す。
【０１５１】
５．抗エキソサイト１ＩｇＧ
前述の患者において同定したＩｇＡ分子を、標準的な技術を用いてＩｇＧとして再構成（ｒｅ−ｆｏｒｍａｔｔｅｄ）した。
【０１５２】
２０ｎＭまでヒトトロンビンを添加した上で、もとのＩｇＡおよび新たなＩｇＧの量を増加させながら加えたプールしたヒト血漿の凝固時間を検査した（図１９）。親ＩｇＡおよび合成ＩｇＧの両者は、同一の濃度依存性をもって血塊形成までの時間が増加したので、トロンビンへの親和性が同一であることが示唆された。
【０１５３】
これは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて固定化Ｓ１９５Ａトロンビンへの合成ＩｇＧの結合を測定することにより確認した。トロンビンを、プローブに結合させ、（様々な濃度における）抗体の結合をモニターした。正反応速度（ｏｎ−ｒａｔｅｓ）および逆反応速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ）を決定した。両方の抗体は、約３×１０5Ｍ-1ｓ-1の正反応速度、約５×１０-4ｓ-1の逆反応速度、および約２ｎＭの解離定数（Ｋｄ）という似たような値を示した。約２ｎＭという解離定数（Ｋｄ）は、定常解析によるＩｇＡおよびＩｇＧについても得られた（表４）。代表的な定常曲線を、図２０に示す。したがって、ＩｇＡの特性がＩｇＧの構造で再現された。
【０１５４】
ＩｇＧ抗体へのプロトロンビンの結合を、オクテットシステムを用いてＩｇＧを固定化して検査した。トロンビンは、固定化トロンビンを用いて得られたものと同等の速度および親和性で固定化ＩｇＧに結合したが（表４）；プロトロンビンは、ＩｇＧに結合しなかった。図２１は、固定化ＩｇＧに結合し解離する２４ｎＭトロンビンのトレースである。図２２は、５００ｎＭプロトロンビンを使用した同様の実験であり、結合した証拠がみられない。
【０１５５】
ヒトプレプロトロンビンのアミノ酸配列（配列番号１；ＧｅｎｅＩＤ：２１４７；ＮＰ＿０００４９７．１  ＧＩ：４５０３６３５；エキソサイト１残基に下線を付す）
【０１５６】
【化１】
2018039798.tif 000002
【０１５７】
カバットナンバリングによる抗エキソサイト１ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＶＨドメインのアミノ酸配列（ＣＤＲに下線を付す）：（配列番号２）
【０１５８】
【化２】
2018039798.tif 000003
【０１５９】
抗エキソサイト１ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号３）
ＧＹＴＬＴＥＡＡＩＨ
【０１６０】
抗エキソサイト１ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号４）
ＧＬＤＰＱＤＧＥＴＶＹＡＱＱＦＫＧ
【０１６１】
抗エキソサイト１ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号５）
ＧＤＦＳＥＦＥＰＦＳＭＤＹＦＨＦ
【０１６２】
カバットナンバリングによる抗エキソサイト１ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＶＬドメインのアミノ酸配列：（配列番号６）
【０１６３】
【化３】
2018039798.tif 000004
【０１６４】
抗エキソサイト１ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号７）
ＲＡＳＱＮＶＳＳＦＬＡ
【０１６５】
抗エキソサイト１ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号８）
ＤＡＳＳＲＡＴ
【０１６６】
抗エキソサイト１ＩｇＡ  およびＩｇＧ  ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号９）
ＱＱＲＲＳＷＰＰＬＴ
【０１６７】
【表１】
2018039798.tif 000005
【０１６８】
【表２】
2018039798.tif 000006
【０１６９】
【表３】
2018039798.tif 000007
【０１７０】
【表４】
2018039798.tif 000008
【図１】
2018039798.tif 000009
【図２】
2018039798.tif 000010
【図３】
2018039798.tif 000011
【図４】
2018039798.tif 000012
【図５】
2018039798.tif 000013
【図６】
2018039798.tif 000014
【図７】
2018039798.tif 000015
【図８】
2018039798.tif 000016
【図９】
2018039798.tif 000017
【図１０】
2018039798.tif 000018
【図１１】
2018039798.tif 000019
【図１２】
2018039798.tif 000020
【図１３】
2018039798.tif 000021
【図１４】
2018039798.tif 000022
【図１５】
2018039798.tif 000023
【図１６】
2018039798.tif 000024
【図１７】
2018039798.tif 000025
【図１８Ａ】
2018039798.tif 000026
【図１８Ｂ】
2018039798.tif 000027
【図１８Ｃ】
2018039798.tif 000028
【図１８Ｄ】
2018039798.tif 000029
【図１９】
2018039798.tif 000030
【図２０】
2018039798.tif 000031
【図２１】
2018039798.tif 000032
【図２２】
2018039798.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月29日(2017.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ、配列番号３、４および５の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメイン、ならびにそれぞれ配列番号８および９の配列を有するＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３および配列番号７の配列を有するＬＣＤＲ１もしくは配列番号６のＮ２８に相当する１アミノ酸残基に置換を導入する変異によりグリコシル化部位が消去された配列番号７の配列を有するＬＣＤＲ１を含むＶＬドメインを含む、トロンビンのエキソサイト１領域に特異的に結合する単離された抗体分子。
【請求項２】
トロンビン活性を阻害する、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項４】
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン又はアミノ酸Ｎ２８における１アミノ酸の置換によりグリコシル化部位が消去された配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン又はアミノ酸Ｎ２８における１アミノ酸の置換によりグリコシル化部位が消去された配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項６】
完全抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項７】
ＩｇＡまたはＩｇＧである、請求項６に記載の抗体分子。
【請求項８】
前記抗体分子は抗体の断片であり、該断片はトロンビンのエキソサイト１領域に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
トロンビン介在性の状態の治療に使用するための医薬の製造における請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子の使用。
【請求項１２】
トロンビン介在性の状態は血栓性の状態である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
血栓性の状態は、血栓症または塞栓症である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
トロンビン介在性の状態は、炎症、感染症、腫瘍の増殖、腫瘍の転移または認知症である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子を含む、トロンビン介在性の状態を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
トロンビン介在性の状態は血栓性の状態である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
血栓性の状態は、血栓症または塞栓症である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
トロンビン介在性の状態は、炎症、感染症、腫瘍の増殖、腫瘍の転移または認知症である、請求項１５に記載の医薬組成物。