(57)【要約】【課題】芽胞形成細菌の芽胞の発芽を抑制することができる物質の提供。【解決手段】アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌芽胞の発芽抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌芽胞の発芽抑制剤。
【請求項２】
アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌の増殖抑制剤。
【請求項３】
アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌による微生物汚染防止剤。
【請求項４】
アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌を含む肥料又は微生物製剤の安定性向上剤。
【請求項５】
前記パエニバチルス属細菌が、パエニバチルス・ポリミキサ、パエニバチルス・エスピー、又はパエニバチルス・グルカノリティカスである、請求項１〜４のいずれか１項記載の剤。
【請求項６】
パエニバチルス属細菌芽胞にアスパラギン酸を適用することを含む、パエニバチルス属細菌芽胞の発芽抑制方法。
【請求項７】
パエニバチルス属細菌芽胞にアスパラギン酸を適用することを含む、パエニバチルス属細菌の増殖抑制方法。
【請求項８】
パエニバチルス属細菌芽胞を含むか又はその可能性のある物質にアスパラギン酸を適用することを含む、物質のパエニバチルス属細菌による汚染の防止方法。
【請求項９】
パエニバチルス属細菌芽胞を含む肥料又は微生物製剤にアスパラギン酸を適用することを含む、パエニバチルス属細菌芽胞を含む肥料又は微生物製剤の安定性向上方法。
【請求項１０】
前記パエニバチルス属細菌が、パエニバチルス・ポリミキサ、パエニバチルス・エスピー、又はパエニバチルス・グルカノリティカスである、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の芽胞の発芽を抑制する物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性の芽胞形成細菌は、環境に対する耐性が高く、増殖制御が難しい菌である。芽胞形成細菌は、従前より食品腐敗の原因として知られている。近年、バイオフィルム中で芽胞が形成されること、及び浮遊細胞由来の芽胞とバイオフィルム由来の芽胞とで耐熱性等の性質が異なることが報告された。環境中の細菌の多くはバイオフィルム状態で存在していると考えられるため、細菌の増殖抑制のためには、浮遊細胞中のみならずバイオフィルム中の芽胞の制御が重要である。
【０００３】
芽胞の存在により加熱や殺菌剤による殺菌が容易でない細菌に対して、芽胞を制御することによりその増殖を抑制する技術が提案されている。例えば、全ての芽胞を速やかに発芽させ栄養細胞の状態にして殺菌する方法、または長期にわたり発芽を抑制し増殖を抑える方法などが試みられている。
【０００４】
また従来、芽胞の発芽促進及び発芽阻害に、しばしばアミノ酸が用いられている。例えば、Ｌ−アスパラギン酸は、バチルス属（Bacillus）に対しては発芽促進剤として使用され（非特許文献１）、一方、クロストリジウム属（Clostridium）に対しては発芽阻害剤として使用されている（非特許文献２）。グリシンは、バチルス属に対しては発芽阻害剤として使用され（非特許文献３）、一方、クロストリジウム属に対しては発芽促進剤として使用されている（非特許文献４）。
【０００５】
パエニバチルス属（Paenibacillus）は、バチルス属から再分類された細菌の属であり、土壌、植物の根圏、水、昆虫、食品などに分布している。パエニバチルス属細菌は、芽胞形成細菌であり、食品腐敗危害菌として近年着目されてきている。パエニバチルス属細菌の芽胞は、他種の芽胞形成細菌と比較して、強力な殺菌剤である過酢酸に対してより高い耐性を持ち、かつ低温でも増殖可能である（非特許文献５）。各種飲料食品関連では、過酢酸に対して強い抵抗性を示すパエニバチルス属細菌等の抵抗性菌の問題が顕在化している。さらに、調理食品から腐敗菌Paenibacillus sp.およびPaenibacillus odoriferが分離されたこと、これらの菌が４℃で増殖可能であったこと、パエニバチルス属細菌は芽胞形成能と低温生育能を有するために食品危害を引き起こし得ることが報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
一方で、園芸及び農芸の分野では、パエニバチルス属細菌は、植物増殖促進及び生物防除を目的とした有機生物肥料又は微生物製剤として活用されている。それら有機生物肥料又は微生物製剤においては、パエニバチルス属細菌の芽胞形成が、該肥料や製剤における当該菌の生存率の向上と、該植物増殖促進及び生物防除効果の維持のために有効であると考えられている（非特許文献７を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology, 2016, doi:10.1128/AEM-00594-16.
【非特許文献２】Journal of Bacteriology, 2010, 192(2):418-425
【非特許文献３】Microbiology and Immunology, 1985, 29(3):229-241
【非特許文献４】Journal of Bacteriology, 2016, 198(20):2767-2775
【非特許文献５】日本農芸化学会2016年度大会要旨、発表番号2F043
【非特許文献６】Biocontrol science, 2006, 11(1):43-47
【非特許文献７】Bioresource Technology, 2012, 108:190-195
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、芽胞形成細菌の芽胞の発芽を抑制することができる物質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アスパラギン酸がパエニバチルス属細菌の芽胞の発芽を抑制する作用を有することを見出した。
【００１０】
したがって、一実施形態において、本発明は、アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌芽胞の発芽抑制剤を提供する。
別の一実施形態において、本発明は、アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌の増殖抑制剤を提供する。
別の一実施形態において、本発明は、アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌による微生物汚染防止剤を提供する。
別の一実施形態において、本発明は、アスパラギン酸を有効成分とする、パエニバチルス属細菌を含む肥料又は微生物製剤の安定性向上剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、浮遊細胞やバイオフィルムなどの菌の存在状態に関わらず、パエニバチルス属細菌の芽胞の発芽を有効に抑制することができる。また本発明によれば、パエニバチルス属細菌の芽胞の発芽を抑制することで、当該菌の増殖を抑制することができる。本発明は、食品、肥料、微生物製剤等におけるパエニバチルス属細菌芽胞の発芽抑制に適用可能である。本発明によれば、食品の風味を損なう加熱滅菌や薬剤処理を施すことなく、製造工程で汚染した、又は製造工程後に残存するパエニバチルス属細菌芽胞による食品の腐敗や変質を防ぐことが可能となる。また本発明によれば、肥料又は微生物製剤に含まれるパエニバチルス属細菌を芽胞のままに保ってその生存率を向上させ、該肥料又は微生物製剤の効果を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｌ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養したバイオフィルム（ＢＦ）由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養３０分後。
【図２】Ｌ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養したバイオフィルム（ＢＦ）由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養２８時間後。
【図３】Ｌ−Ａｓｐ存在（３〜３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊培養由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養３０分後。
【図４】Ｌ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊培養由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養２８時間後。
【図５】Ｄ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊培養由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養３０分後。
【図６】Ｌ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊培養由来Paenibacillus sp. KMC150芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養２４時間後。
【図７】Ｄ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊培養由来Paenibacillus sp. KMC150芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養１６時間後。
【図８】Ｌ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊培養由来Paenibacillus glucanolyticus KMC129芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養２４時間後。
【図９】Ｄ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊培養由来Paenibacillus glucanolyticus KMC129芽胞の位相差顕微鏡観察像。培養１６時間後。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、アスパラギン酸は、パエニバチルス属細菌の芽胞の発芽抑制のための有効成分として使用される。
【００１４】
さらに、本発明においては、アスパラギン酸によりパエニバチルス属細菌の芽胞の発芽を抑制することで、該菌の増殖を抑え、さらには該菌による微生物汚染を防止することができる。したがって本発明において、アスパラギン酸は、パエニバチルス属細菌の増殖抑制のため、又はパエニバチルス属細菌による微生物汚染の防止のための有効成分としても使用され得る。これらの本発明の態様は、食品製造等の分野において有用である。
【００１５】
さらに本発明において、アスパラギン酸は、パエニバチルス属細菌を含有する肥料又は微生物製剤の安定性向上のための有効成分として使用することができる。当該パエニバチルス属細菌を含有する肥料又は微生物製剤においては、アスパラギン酸により該細菌の芽胞の発芽を抑制することで、該肥料又は製剤中の該細菌の生存率を向上させるとともに、該肥料又は製剤の植物増殖促進又は生物防除効果を維持することができる。好ましくは、本発明における肥料又は微生物製剤の安定性向上とは、アスパラギン酸未添加の場合と比べたときの、該肥料又は製剤中のパエニバチルス属細菌の生存率、又は該肥料又は製剤の品質（例えばその植物増殖促進もしくは生物防除効果）の向上又は低下防止をいう。
【００１６】
本発明において、該パエニバチルス属細菌の種は、特に限定されないが、好ましい例としては、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、パエニバチルス・チベンシス（Paenibacillus chibensis）、パエニバチルス・グルカノリティカス（Paenibacillus glucanolyticus）、パエニバチルス・マシリエンシス（Paenibacillus massiliensis）、パエニバチルス・ポピリエ（Paenibacillus popilliae）、パエニバチルス・アルベイ（Paenibacillus alvei）、パエニバチルス・エスピー（Paenibacillus sp.）などが挙げられ、より好ましい例としては、パエニバチルス・ポリミキサ、パエニバチルス・グルカノリティカス、パエニバチルス・エスピーが挙げられ、さらに好ましい例としては、Paenibacillus polymyxa ATCC39564、Paenibacillus sp. KMC150、Paenibacillus glucanolyticus KMC129が挙げられる。
【００１７】
該パエニバチルス属細菌の芽胞は、浮遊細胞の状態であっても、バイオフィルム中に存在するものであってもよい。いずれの場合も、アスパラギン酸は、パエニバチルス属細菌の芽胞に対して優れた発芽抑制作用を発揮する。
【００１８】
本発明において用いられるアスパラギン酸は、Ｌ−アスパラギン酸及びＤ−アスパラギン酸のいずれであってもよい。また、該アスパラギン酸は、遊離体であっても、又は塩の形態であってもよい。当該塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。当該酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α−ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩が挙げられる。当該金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。当該アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。当該有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩が挙げられる。当該アミノ酸付加塩としては、アルギニン、リジン等との塩が挙げられる。本発明で用いられるアスパラギン酸としては、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であればよい。
【００１９】
本発明で用いられるアスパラギン酸又はその塩は、常法により生産することができる。例えば、アスパラギン酸の遊離体又はその塩は、それらを含む動植物から単離精製する方法、化学合成、発酵生産等により得ることができる。あるいは市販品を購入してもよい。
【００２０】
本発明において、該アスパラギン酸を適用する対象としては、上述したパエニバチルス属細菌の芽胞、又は該パエニバチルス属細菌の芽胞を含むかもしくはその可能性のある物質が挙げられる。好ましくは、本発明におけるアスパラギン酸は、パエニバチルス属細菌芽胞を含むかその可能性のある物質であって、パエニバチルス属細菌芽胞の発芽を抑制したい物質、パエニバチルス属細菌の増殖を抑制したい物質、パエニバチルス属細菌による微生物汚染を防止したい物質、などに適用され得る。そのような適用対象物質の例としては、食品、その包装体もしくは保存容器、パエニバチルス属細菌を含む肥料又は微生物製剤、パエニバチルス属細菌を含むかもしくはその可能性のある液体もしくはバイオフィルム、などが挙げられる。
【００２１】
本明細書において「食品」は、固形、半固形もしくは液状の、食品、飲料、飼料、ペットフードなど、およびそれらの原料を包含する。該食品の例としては、パン類、麺類、飯類、クッキー等の菓子類、タブレット類、ゼリー類、乳製品、スープ類、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工魚肉製品、その他加工食品、調味料、栄養補助食品、及び茶飲料、コーヒー飲料、乳飲料、果実飲料、ニアウォーター、炭酸飲料、ゼリー状飲料等の飲料が挙げられる。
【００２２】
本明細書において「肥料」は、当該技術分野で公知の形態、例えば固体、液体もしくは粉末の肥料を包含する。好ましくは、当該肥料は有機生物肥料である。該肥料は、上記パエニバチルス属細菌に加えて、有機肥料材料、微量栄養素肥料材料、殺虫剤、除草剤、植物成長改良剤、殺真菌剤、殺貝剤、殺藻剤、細菌接種材料、真菌接種材料、またはそれらの組み合わせなどをさらに含み得る。該肥料は、植物成長媒体（例えば、土壌、溶液等）に適用されてもよく、又は植物もしくは種子に直接適用されてもよい。
【００２３】
本明細書において「微生物製剤」は、園芸又は農芸の分野において一般的に使用される、植物増殖促進、生物防除効果等を目的とした微生物製剤を包含する。該微生物製剤は、通常の園芸用又は農芸用の微生物製剤と同様の形態（例えば粉剤、水和剤、粒剤、乳剤、液剤、懸濁液、フロアブル剤、塗布剤等の形態）であればよい。該微生物製剤は、上記パエニバチルス属細菌の培養液、高濃度物又は乾燥物を単独で含んでいてもよく、又は該パエニバチルス属細菌に加えて、他の微生物、固体担体、補助剤などの植物への適用が許容される他の任意成分をさらに含んでいてもよい。該微生物製剤は、植物成長媒体（例えば、土壌、溶液等）に適用されてもよく、植物に与える肥料や水に適用されてもよく、又は植物もしくは種子に直接適用されてもよい。
【００２４】
該肥料及び微生物製剤に植物増殖促進もしくは生物防除効果を目的として使用されるパエニバチルス属細菌としては、好ましくは、上述したパエニバチルス・ポリミキサ、パエニバチルス・チベンシス、パエニバチルス・グルカノリティカス、パエニバチルス・マシリエンシス、パエニバチルス・ポピリエ、パエニバチルス・アルベイ等が挙げられる。
【００２５】
上記適用対象物質に含有されるパエニバチルス属細菌芽胞の発芽を抑制する場合、該物質中にアスパラギン酸を添加するか、該物質の表面にアスパラギン酸を含む液体を塗布もしくは噴霧するか、又はアスパラギン酸を含む液体に該物質を浸漬させればよい。食品、肥料又は微生物製剤に存在するパエニバチルス属細菌芽胞の発芽を抑制する場合には、該食品、肥料又は微生物製剤にアスパラギン酸を添加することが好ましい。食品の包装体又は保存容器に存在するパエニバチルス属細菌芽胞の発芽を抑制する場合には、それらの包装体又は保存容器の表面にアスパラギン酸を含む液体を塗布又は噴霧し、付着させることが好ましい。バイオフィルムに存在するパエニバチルス属細菌芽胞の発芽を抑制する場合には、該バイオフィルムにアスパラギン酸を含む液体を塗布もしくは噴霧するか、又はアスパラギン酸を含む液体に該バイオフィルムを浸漬させて、該バイオフィルム内部にアスパラギン酸を浸透させることが好ましい。
【００２６】
本発明において、アスパラギン酸の適用濃度は、その適用対象におけるパエニバチルス属細菌芽胞の発芽が抑制できる有効量であればよく、特に限定されないが、好ましくは２ｍＭ以上、より好ましくは３ｍＭ以上であり、さらに好ましくは５ｍＭ以上であり、他方、経済性の観点からは、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは３０ｍＭ以下である（アスパラギン酸遊離体換算、本明細書において以下同じ）。本発明におけるアスパラギン酸の適用濃度の範囲の例としては、２〜３００ｍＭ、２〜３０ｍＭ、３〜３００ｍＭ、３〜３０ｍＭ、５〜３００ｍＭ及び５〜３０ｍＭが挙げられる。
【００２７】
したがって、本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、食品、肥料、微生物製剤等の適用対象物質に対して、該物質中のアスパラギン酸の濃度が０．０２７〜４．０質量％、０．０２７〜０．４０質量％、０．０４０〜４．０質量％、０．０４０〜０．４０質量％、０．０６７〜４．０質量％、又は０．０６７〜０．４０質量％になるように、アスパラギン酸を添加すればよい。あるいは、適用対象物質が食品の包装体又は保存容器である場合、０．０２７〜４．０質量％、０．０２７〜０．４０質量％、０．０４０〜４．０質量％、０．０４０〜０．４０質量％、０．０６７〜４．０質量％、又は０．０６７〜０．４０質量％のアスパラギン酸を含む液体を、該物質に塗布又は噴霧するか、該液体に該物質を浸漬させて、該物質の表面に該液体を付着させればよい。またあるいは、適用対象物質がバイオフィルムである場合、アスパラギン酸を含む液体を、該物質に塗布又は噴霧するか、該液体に該物質を浸漬させて、該物質中のアスパラギン酸の濃度が０．０２７〜４．０質量％、０．０２７〜０．４０質量％、０．０４０〜４．０質量％、０．０４０〜０．４０質量％、０．０６７〜４．０質量％、又は０．０６７〜０．４０質量％になるようにすればよい。
【００２８】
また好ましい実施形態において、本発明のパエニバチルス属細菌芽胞の発芽抑制剤、パエニバチルス属細菌の増殖抑制剤、及びパエニバチルス属細菌による微生物汚染防止剤におけるアスパラギン酸の濃度は、好ましくは２〜３００ｍＭ、２〜３０ｍＭ、３〜３００ｍＭ、３〜３０ｍＭ、５〜３００ｍＭ又は５〜３０ｍＭである。
【００２９】
本発明において、該アスパラギン酸は、パエニバチルス属の芽胞の発芽を抑制する作用を有する他の物質と併用されてもよい。そのような他の物質の例としては、インドール及びその類縁体が挙げられる。さらに、本発明のアスパラギン酸は、そのパエニバチルス属の芽胞の発芽を抑制する作用を損なわない限りにおいて、他の物質と併用されてもよい。例えば、既存の殺菌剤や保存剤等と併用することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
（方法）
（１）芽胞培養液の調製
パエニバチルス属細菌は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より分譲されたPaenibacillus polymyxa ATCC39564、食品充填ライン環境から常法により分離し１６ＳリボソームＲＮＡの配列によって同定したPaenibacillus  sp. KMC150、及び原料から常法により分離し１６ＳリボソームＲＮＡの配列によって同定したPaenibacillus glucanolyticus KMC129のいずれかを用いた。上記パエニバチルス属細菌をＴＳＢ培地（ＢＡＣＴＯ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ：Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社，ｃａｔａｌｏｇ＃２１１８２５）で一晩培養した。その後、Paenibacillus polymyxa ATCC39564およびPaenibacillus sp. KMC150の培養液を、ＯＤ600＝０．０１となるように２×ＳＧＧ（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ’ｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  １％［ｗｔ／ｖｏｌ］ｇｌｙｃｅｒｏｌ）培地（組成はJournal of bacteriology, 2007, 189(13):4920-4931に従う）１００ｍＬに懸濁した。ＯＤ600の測定にはＪＡＳＣＯ社のＶ−５３０を用いた。また、Paenibacillus glucanolyticus KMC129の培養液を、ＯＤ600＝０．０１となるようにＤＳ（Ｄｉｆｃｏ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ）培地（組成はMolecular biological methods for Bacillus, C. R. Harwood, and S. M. Cutting (eds.), Wiley, 1990に従う）１００ｍＬに懸濁した。Paenibacillus polymyxa ATCC39564の懸濁液を５００ｍＬビーカーにて３０℃で２００時間静置培養することで、芽胞を含有するバイオフィルムを含む培養液を得た。また、各菌株の懸濁液を５００ｍＬ羽根つき三角フラスコにて３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養（Paenibacillus polymyxa ATCC39564は６０時間、Paenibacillus glucanolyticus KMC129は５０時間、Paenibacillus sp. KMC150は９６時間）することで、パエニバチルス属細菌芽胞を含有する浮遊細胞を含む培養液を得た。
【００３２】
（２）芽胞精製液の調製
位相差顕微鏡にて（１）の培養液を観察し、芽胞の形成を確認した。各菌の培養液から芽胞を精製した。Paenibacillus polymyxaの芽胞は、培養液を４℃、９０００Ｇ、１５分間遠心分離することにより集菌し、次いで集めた菌を滅菌水に懸濁し、４℃、９０００Ｇ、１５分間遠心分離を行って芽胞を沈殿させることにより、精製した。また、Paenibacillus sp. またはPaenibacillus glucanolyticusの芽胞は、培養液を４℃、３０００Ｇ、１５分間遠心分離することにより集菌し、次いで集めた菌を滅菌水に懸濁し、４℃、７０００Ｇ、１５分間遠心分離を行って芽胞を沈殿させることにより、精製した。芽胞の精製の手順は、精製物を位相差顕微鏡で観察した際に、細胞破片や栄養細胞が除去され、９０％以上の細胞が芽胞となるまで繰り返した。得られた芽胞のペレットを冷却滅菌水に懸濁し、これを芽胞精製液とした。精製液は使用前まで４℃で保存した。
【００３３】
（３）アスパラギン酸存在下での培養及び芽胞観察
（２）で得られたバイオフィルム（ＢＦ）由来又は浮遊培養由来のPaenibacillus polymyxaの芽胞精製液に、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）又はＤ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈを添加し（Ｌ−Ａｓｐの最終濃度は０、１、２、３、４、５又は３０ｍＭ、Ｄ−Ａｓｐの最終濃度は０又は３０ｍＭ）、試験管内にて３０℃で培養した。また、（２）で得られた浮遊培養由来のPaenibacillus sp. 又はPaenibacillus glucanolyticusの芽胞精製液は、８０℃で１５分間加熱した後、０もしく３０ｍＭのＬ−Ａｓｐを含有するＡＧＦＫ溶液（１００ｍＭ  Ｌ−アスパラギン、１００ｍＭ  Ｄ−グルコース、１０ｍＭ  Ｄ−フルクトース、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．４）、又は０もしくは３０ｍＭのＤ−Ａｓｐを含有する１/２ ＡＧＦＫ溶液に接種し、試験管内にて３０℃で培養した。発芽した芽胞は位相差顕微鏡観察では黒い芽胞（Ｄａｒｋ  ｓｐｏｒｅ）として観察される。そこで、培養３０分後、ならびに１６、２４及び２８時間後に該芽胞培養液を位相差顕微鏡を用いて観察した。また、芽胞は発芽すると水分を吸収するため濁度が低下する。そこで、培養０分〜１２０分後に芽胞培養液の濁度ＯＤ660を測定し、初期濁度（培養０分）を基準とした濁度変化率を算出し、発芽効率の指標とした。ＯＤ660の測定にはＴＡＩＴＥＣ社のｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒを用いた。
【００３４】
（実施例１）Ｌ−ＡｓｐによるPaenibacillus polymyxa芽胞の発芽抑制
Ｌ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で３０分間及び２８時間培養したＢＦ由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞の位相差顕微鏡観察像を、それぞれ図１及び図２に示す。培養３０分後及び２８時間後のいずれにおいても、Ｌ−Ａｓｐの存在下では、非存在下と比べて、全芽胞中のＤａｒｋ  ｓｐｏｒｅ（発芽した芽胞）の割合が少なかった。
【００３５】
Ｌ−Ａｓｐ存在下又は非存在下で培養したＢＦ由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞培養液の濁度測定の結果を表１に示す。２ｍＭ以上のＬ−Ａｓｐ存在下で培養による濁度低下が抑制されており、芽胞の発芽が阻害されたことが示された。
【００３６】
【表１】
2018199632.tif 000002
【００３７】
Ｌ−Ａｓｐ存在（３〜３０ｍＭ）下又は非存在（０ｍＭ）下で３０分間及び２８時間培養した浮遊培養由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞の位相差顕微鏡観察像を、それぞれ図３及び図４に示す。培養３０分後及び２８時間後のいずれにおいても、Ｌ−Ａｓｐの存在下においては、非存在下と比べて、全芽胞中のＤａｒｋ  ｓｐｏｒｅの割合が減少した。さらに培養３０分後ではＬ−Ａｓｐの濃度依存的に全芽胞中のＤａｒｋ  ｓｐｏｒｅの割合が減少した。
【００３８】
（実施例２）Ｄ−ＡｓｐによるPaenibacillus polymyxa芽胞の発芽抑制
Ｄ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊細胞由来Paenibacillus polymyxa ATCC39564芽胞の位相差顕微鏡観察像（培養３０分後）を図５に示す。Ｄ−Ａｓｐ存在下で芽胞の発芽が抑制された。
【００３９】
（実施例３）Ｌ−ＡｓｐによるPaenibacillus sp. 芽胞の発芽抑制
Ｌ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊細胞由来Paenibacillus sp. KMC150芽胞の位相差顕微鏡観察像（培養２４時間後）を図６に示す。Ｌ−Ａｓｐ存在下で芽胞の発芽が抑制された。
【００４０】
（実施例４）Ｄ−ＡｓｐによるPaenibacillus sp. 芽胞の発芽抑制
Ｄ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊細胞由来Paenibacillus sp. KMC150芽胞の位相差顕微鏡観察像（培養１６時間後）を図７に示す。Ｄ−Ａｓｐ存在下で芽胞の発芽が抑制された。
【００４１】
（実施例５）Ｌ−ＡｓｐによるPaenibacillus glucanolyticus芽胞の発芽抑制
Ｌ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊細胞由来Paenibacillus glucanolyticus KMC129芽胞の位相差顕微鏡観察像（培養２４時間後）を図８に示す。Ｌ−Ａｓｐ存在下で芽胞の発芽が抑制された。
【００４２】
（実施例６）Ｄ−ＡｓｐによるPaenibacillus glucanolyticus芽胞の発芽抑制
Ｄ−Ａｓｐ存在（３０ｍＭ）下及び非存在（０ｍＭ）下で培養した浮遊細胞由来Paenibacillus glucanolyticus KMC129芽胞の位相差顕微鏡観察像（培養１６時間後）を図９に示す。Ｄ−Ａｓｐ存在下で芽胞の発芽が抑制された。
【図１】
2018199632.tif 000003
【図２】
2018199632.tif 000004
【図３】
2018199632.tif 000005
【図４】
2018199632.tif 000006
【図５】
2018199632.tif 000007
【図６】
2018199632.tif 000008
【図７】
2018199632.tif 000009
【図８】
2018199632.tif 000010
【図９】
2018199632.tif 000011