(57)【要約】【課題】  抗体の分離能が向上したＦｃ結合性タンパク質を提供すること、および前記タンパク質を固定化した不溶性担体を用いた高精度な抗体の分離方法を提供すること。【解決手段】  Ｆｃ結合性タンパク質の特定位置におけるアミノ酸置換が少なくとも生じ、かつ抗体との親和性が低下したＦｃ結合性タンパク質、および前記タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに平衡化緩衝液を通液してカラムを平衡化する工程と、抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む抗体の分離方法により前記課題を解決する。【選択図】  図２
2018197224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質；
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸残基を含み、かつ、抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換されたアミノ酸残基を含むタンパク質であって、抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに平衡化液を添加してカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
【請求項４】
さらに、溶出された抗体を含む画分を分取する工程を含む、請求項３に記載の分離方法。
【請求項５】
前記平衡化液が無機塩を含むｐＨ４．５からｐＨ５．８の緩衝液である、請求項３または４に記載の分離方法。
【請求項６】
抗体発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることにより抗体産生細胞を得る工程、前記抗体産生細胞を培養する工程、  培地及び／又は培養細胞から抗体を得る工程、ならびに前記得られた抗体を、請求項３〜５の何れか一項に記載の方法により分離する工程を含む、抗体産生細胞及び／又は産生抗体の培養経過をモニターする方法。
【請求項７】
抗体発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることにより抗体産生細胞を得る工程、前記抗体産生細胞を培養する工程、培地及び／又は培養細胞から抗体を得る工程、ならびに前記得られた抗体を、請求項３〜５の何れか一項に記載の方法により分離する工程を含む、抗体の糖鎖構造パターンの経時変化をモニターする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によりモニターした結果に基づき、抗体産生細胞の培養条件を所望の糖鎖構造を有した抗体を産生するよう最適化する工程を含む、抗体の産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体（免疫グロブリン）の分離能が向上したＦｃ結合性タンパク質、およびそれを用いた抗体の分離方法に関する。より詳しくは、本発明は従来知られているＦｃ結合性タンパク質よりも抗体への親和性を低下させることで抗体の分離能が向上したＦｃ結合性タンパク質、およびそれを固定化した不溶性担体を用いた抗体の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬品の糖鎖構造は薬効や安定性に大きく関与するため、抗体医薬品を製造する際に糖鎖構造を制御することは極めて重要である。Ｆｃ結合性タンパク質のうちＦｃγＲＩＩＩａは、抗体（免疫グロブリン）の糖鎖構造を認識することが知られており、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いることで、抗体を糖鎖構造に基づき分離できる（特許文献１）。したがって、前記吸着剤は、抗体医薬品製造時の工程分析や分取時に有用である。
【０００３】
一方でＦｃγＲＩＩＩａは、他のＦｃ結合性タンパク質であるＦｃγＲＩと比較して、抗体への結合性が低いことが知られており（非特許文献１）、抗体との結合性を有するタンパク質へ変異を導入し、抗体との親和性を向上させることが知られているが（特許文献２）、抗体の分離度は向上していない。一方、Ｆｃ結合性タンパク質と抗体との相互作用部位が明らかにされ（非特許文献２）、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体との結合に関与するアミノ酸残基が明らかになっているが、抗体の分析に関わる分離度の向上や吸着量の向上には不十分であった。そのため、工業的な抗体医薬品の製造において、ＦｃγＲＩＩＩａを固定化した担体を工程分析や製品の分析に適応するには困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−０８６２１６号公報
【特許文献２】特開２０１５−０１９６１５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐ．Ｂｒｕｈｎｓ等，Ｂｌｏｏｄ，１６，３７１６−３７２５，２００９
【非特許文献２】Ｐ．Ｓｏｎｄｅｒｍａｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，４０６，２６７−２７３５，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来知られているＦｃ結合性タンパク質よりも抗体の分離能が向上したＦｃ結合性タンパク質を提供すること、および前記タンパク質を固定化した不溶性担体を用いた、高精度な抗体（免疫グロブリン）の分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは、ＦｃγＲＩＩＩａ中の抗体に対する結合性に関与する特定のアミノ酸残基を網羅的に置換した結果、当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基へと置換することで、抗体への親和性が低下したＦｃ結合性タンパク質が得られた。そして前記タンパク質を固定化した不溶性担体を用いることで、従来のＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体と比較し、高精度な抗体の分離を可能にした。具体的には、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸置換体）中の抗体との結合性に関与しているアミノ酸残基のうち、配列番号５の１９２番目のバリン（配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａでは１７６番目のバリン）に相当するアミノ酸を他のアミノ酸へと網羅的に置換した結果、抗体の親和性が配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質と比較し低下したＦｃ結合性タンパク質を取得し、当該タンパク質を固定化した不溶性担体を用いることで、従来のＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体と比較し、高精度な抗体の分離を可能にした。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）から（７）に記載の態様を包含する。
【０００９】
（１）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質。
【００１０】
（２）以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される、（１）に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質；
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸残基を含み、かつ、抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換されたアミノ酸残基を含むタンパク質であって、抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
【００１１】
（３）（１）または（２）に記載のＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに平衡化液を添加してカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
【００１２】
（４）さらに、溶出された抗体を含む画分を分取する工程を含む、（３）に記載の分離方法。
【００１３】
（５）前記平衡化液が無機塩を含むｐＨ４．５からｐＨ５．８の緩衝液である、（３）または（４）に記載の分離方法。
【００１４】
（６）抗体発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることにより抗体産生細胞を得る工程、前記抗体産生細胞を培養する工程、培養液から抗体を得る工程、ならびに
前記得られた抗体を、（３）〜（５）の何れかに記載の方法により分離する工程を含む、抗体産生細胞及び産生抗体の培養経過をモニターする方法。
【００１５】
（７）抗体発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることにより抗体産生細胞を得る工程、前記抗体産生細胞を培養する工程、培地及び／又は培養細胞から抗体を得る工程、ならびに前記得られた抗体を、（３）〜（５）の何れかに記載の方法により分離する工程を含む、抗体の糖鎖構造パターンの経時変化をモニターする方法。
【００１６】
（８）（７）に記載の方法によりモニターした結果に基づき、抗体産生細胞の培養条件を所望の糖鎖構造を有した抗体を産生するよう最適化する工程を含む、抗体の産生方法。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
抗体の分離とは、具体的には夾雑物からの抗体の分離だけでなく、構造・性質・活性等に基づく抗体間での分離も含んでよい。
【００１９】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、配列番号５の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまで（配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａでは、細胞外領域（図１のＥＣの領域）のうち、少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでの領域に相当）のアミノ酸残基を含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において特定位置におけるアミノ酸置換が少なくとも生じたタンパク質である。したがって、本発明に用いるＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞内領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、Ｖａｌ１９２Ｐｈｅ（この表記は、配列番号５の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のバリンがフェニルアラニンに置換されていることを表す、以下同様）のアミノ酸置換である。
【００２０】
なお、野生型ＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ８２Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１６３Ａｓｐ、Ｔｙｒ１７４Ｈｉｓのうち、いずれか１つ以上のアミノ酸置換が生じた変異体が知られているが、前記特定位置におけるアミノ酸置換（Ｖａｌ１９２Ｐｈｅ）以外にこれらのアミノ酸置換を含んでいてもよい。
【００２１】
アミノ酸置換を行なうことで本発明のＦｃ結合性タンパク質を作製する際、特定位置のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよく、具体的には１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加を１つ以上有していてもよい。「１もしくは数個」、「１つ以上」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から５０個であってよく、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、更に好ましくは１から２０個、特に好ましくは１から１０個であってよい。１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加の一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
【００２２】
また、本発明のＦｃ結合性タンパク質は抗体結合活性を有する限り、配列番号５の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基とのアミノ酸配列の相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であるアミノ酸残基において、前記Ｖａｌ１９２Ｐｈｅを有するアミノ酸残基を含んだ、Ｆｃ結合性タンパク質であってもよい。
【００２３】
本発明のＦｃ結合性タンパク質の具体例としては、配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ１９２Ｐｈｅのアミノ酸置換が少なくとも生じたＦｃ結合性タンパク質（配列番号９に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までの領域を少なくとも含むポリペプチド）があげられる。
【００２４】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から目的の抗体を分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどのペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００２５】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を用いて抗体の分離・分析を行なう際は、前述した本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化させた、抗体吸着剤を作製する必要がある。前記Ｆｃ結合性タンパク質に固定化させる不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００２６】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、当該不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介して本発明のＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）が例示できる。
【００２７】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００２８】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボニル−（６−アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００２９】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
【００３０】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００３１】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性やＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００３２】
前述した方法により得られた抗体吸着剤を用いて本発明の分離方法を実施するには、当該抗体吸着剤を充填したカラムに、ポンプ等の送液手段を用いて抗体を含む溶液を添加することで、当該吸着剤に抗体を特異的に吸着させた後、適切な溶出液を当該カラムに添加することで、抗体を溶出すればよい。なお抗体を含む溶液は、カラムに添加する前にあらかじめ適切な緩衝液を用いて溶媒置換させるとよい。また抗体を含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。平衡化に用いる緩衝液（平衡化液）としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示でき、さらに前記緩衝液に、１０ｍＭから１００ｍＭ（好ましくは４０ｍＭから６０ｍＭ）の塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。平衡化液のｐＨは、後述の実施例からｐＨ６．０以上とすると、本発明のＦｃ結合性タンパク質を結合した抗体吸着剤による抗体の分離能が大きく低下するため、ｐＨ３．０から５．８とするとよく、好ましくはｐＨ４．５から５．８、より好ましくはｐＨ５．２からｐＨ５．７である。抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、抗体吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。その緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【００３３】
さらに、溶出された抗体が含まれる画分を分取することができ、得られた画分から抗体を得ることができる。分取は常法により行なってよい。具体的には、例えば、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により画分の分取をすることが挙げられる。
【００３４】
抗体医薬の分野において、目的抗体を得る手段としては、目的抗体を産生する能力を有する細胞（以下、「抗体産生細胞」と記す）を培養し、その培養液（培地及び／又は抗体産生細胞）から目的抗体を回収することが挙げられる。抗体産生細胞を得る方法としては、例えば、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の全部もしくは一部をコードするＤＮＡを含む発現ベクター（以下、「抗体発現ベクター」と記す）を作製し、これを宿主細胞に導入することで行なうことができる。抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、安定的にタンパク質を発現可能な細胞であれば良く、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真核細胞、原核細胞が挙げられるが、抗体生産の効率性から動物細胞が好ましい、さらにＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）やＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、Ｓｐ２／０細胞やＮＳ０細胞（マウス骨髄腫細胞）がより好ましい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、従来のＦｃ結合性タンパク質（具体的には配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸置換体）と比較し、抗体への親和性が低下している。従って本発明により、Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体を用いた、抗体の工程分析における精度や抗体分取時における分離効率が向上する。
【００３６】
さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸置換体（変異体）であり、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は糖鎖構造に基づく抗体の分離ができる（特開２０１５−０８６２１６号公報）。また、該吸着剤を用いた分離によって、抗体依存性細胞傷害活性の強さに基づいた分離ができる（特開２０１６−２３１５２号公報）。従って、本発明は特に抗体医薬品の工程分析や分取に有用といえる。
【００３７】
例えば、抗体産生細胞の培養において、本発明の分離方法を用いて、培養途中の培養液中に含まれる抗体を糖鎖構造に基づき分離することで、培養の経過や産生した抗体の糖鎖構造パターンをモニターする工程分析を容易に実施できる。また前記糖鎖構造パターンのモニター結果に基づき、最適な糖鎖構造を有した抗体医薬品を製造するための培養条件の設定を容易に実施できる。また本発明を用いて得られた、精製抗体の分離パターンから、糖鎖構造を推定することができるため、抗体医薬品の品質管理や品質分析にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。
【図２】本発明のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）を固定化した充填剤を充填したカラムを用いて、モノクローナル抗体を分離したときの溶出パターン（クロマトグラム）である。
【図３】従来のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９）を固定化した充填剤を充填したカラムを用いて、モノクローナル抗体を分離したときの溶出パターン（クロマトグラム）である。
【図４】実施例６において、平衡化緩衝液のｐＨを５．５としたときの溶出パターン（クロマトグラム）である。
【図５】実施例６において、平衡化緩衝液のｐＨを５．６としたときの溶出パターン（クロマトグラム）である。
【図６】実施例６において、平衡化緩衝液のｐＨを６．０としたときの溶出パターン（クロマトグラム）である。
【図７】実施例７において、分取ピークに含まれるモノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果のグラフである。
【図８】実施例８において、抗体産生細胞を培養した培養日数ごとの生細胞密度の推移を表すグラフである。
【図９】実施例８において、抗体産生細胞を培養した培養日数ごとの細胞生存率の推移を表すグラフである。
【図１０】実施例８において、抗体産生細胞を培養した培養日数ごとの抗体濃度（抗体生産量）の推移を表すグラフである。
【図１１】実施例８において、抗体を含む培養液をＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いて分析した結果のクロマトグラムである。
【図１２】図１１に示すクロマトグラムのうち、溶出時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）１０分から３０分までの領域を拡大した図である。
【図１３】実施例８において、培養日数の異なる抗体を含む培養液をＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いて分析した結果のクロマトグラム（溶出時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）１０分から３０分までの領域）であり、培養日数ごとのピーク形状の違いを表したクロマトグラムである。
【図１４】実施例９において、培養日数の異なる培養液から得られた抗体をＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いて分析した結果のクロマトグラム（溶出時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）５分から２０分までの領域）であり、培養日数ごとのピーク形状の違いを表したクロマトグラムである。
【図１５】実施例９において、培養した抗体産生細胞の培養日数ごとの抗体濃度（白四角棒）および生細胞濃度（黒ひし形）の推移を表したグラフである。
【図１６】実施例９において、各培養日数で得られた抗体の構成糖鎖構造の比率を表したグラフである。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１  ＦｃＲ９アミノ酸置換体の作製
ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）に対し、１９２番目のバリン（配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａでは１７６番目のバリンに相当）を他のアミノ酸へ置換することの有用性を確認するため、以下に示すアミノ酸置換を行なった。具体的にはＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号）に対し、ＰＣＲを用いてアミノ酸の置換を行ない、ＦｃＲ９（配列番号５）のうち１９２番目のバリンを他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を作製した。なおＦｃＲ９（配列番号５）は、配列番号４に示す野生型ＦｃγＲＩＩＩ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、４３番目のＶａｌをＧｌｕに（配列番号１では２７番目に相当）、４５番目のＰｈｅをＩｌｅに（配列番号１では２９番目に相当）、５１番目のＴｙｒをＡｓｎに（配列番号１では３５番目に相当）、６４番目のＧｌｎをＡｒｇに（配列番号１では４８番目に相当）、９１番目のＰｈｅをＬｅｕに（配列番号１では７５番目に相当）、１０８番目のＡｓｎをＳｅｒに（配列番号１では９２番目に相当）、１３３番目のＶａｌをＧｌｕに（配列番号１では１１７番目に相当）、１３７番目のＧｌｕをＧｌｙに（配列番号１では１２１番目に相当）および１８７番目のＰｈｅをＳｅｒに（配列番号１では１７１番目に相当）、それぞれアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質である。
【００４１】
以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【００４２】
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目（配列番号１では１７６番目に相当）のバリンを他のアミノ酸へ置換することの有用性を確認するため、ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製したＦｃＲ９（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号記載）を鋳型とし、配列番号２（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）および配列番号７（５’−ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＭＮＮＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴプライマーを用いて、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することでＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ１とした。
【００４３】
【表１】
2018197224.tif 000003
【００４４】
（２）ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製したＦｃＲ９（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号記載）を鋳型とし、配列番号３（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）および配列番号８（５’−ＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧＮＮＫＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴプライマーを用いて、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することでＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ２とした。
【００４５】
（３）（１）および（２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（Ｖ１９２ｐ１、Ｖ１９２ｐ２）を混合し、表２に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、Ｖ１９２ｐ１とＶ１９２ｐ２を連結したＰＣＲ産物Ｖ１９２ｐを得た。
【００４６】
【表２】
2018197224.tif 000004
【００４７】
（４）（３）で得られたＰＣＲ産物Ｖ１９２ｐを鋳型とし、配列番号２および３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９）の１９２番目のアミノ酸が任意のアミノ酸に置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたポリヌクレオチドをＶ１９２ｐ３とした。
【００４８】
【表３】
2018197224.tif 000005
【００４９】
（５）（４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【００５０】
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出した。
【００５１】
（７）得られたプラスミドのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２または配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。配列解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のＶａｌがＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐおよびＴｙｒに置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。
【００５２】
実施例２  Ｆｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合性評価
（１）実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【００５３】
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１０００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を１０ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
【００５４】
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
【００５５】
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０
ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で懸濁し、超音波破砕した。その後、遠
心分離により上清を回収した。
【００５６】
（５）回収した上清は、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌと５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で溶出し、当該溶出画分を回収した。
【００５７】
（６）（５）で回収した溶出画分を、ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出し、当該溶出画分を回収した。
【００５８】
（７）（６）の溶出画分として回収したＦｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合性評価を表面プラズモン共鳴法を用いて行なった。表面プラズモン共鳴法を用いた結合性の測定において、測定装置としてはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥヘルスケア製）を、センサーチップとしてはＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を、解析ソフトとしてはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア製）を、それぞれ用いた。
【００５９】
（８）Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてＦｃ結合性タンパク質を固定化したセンサーチップに対し、ＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）をＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を流すことでセンサグラムを得た。当該センサグラムを基にカーブフィッティングを行なうことで、ＩｇＧ１に対する結合性を算出した。
【００６０】
ここで、一般的にＦｃ結合性タンパク質と抗体との親和性が低下すると、Ｆｃ結合性タンパク質が抗体を保持する力が弱まり、吸着できる容量は低下することが知られている。一方で、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体（充填剤）を充填したカラムでは、Ｆｃ結合性タンパク質と抗体との結合性が低下すると、抗体を添加し、溶出させる際の保持力が弱まることから、分離する際にはより弱い力で溶出することが可能となり、分離が容易となる。前記方法でＩｇＧ１抗体に対する親和性を算出した結果、作製したＦｃ結合性タンパク質のうち、配列番号５の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸ＶａｌをＰｈｅに置換したタンパク質（以下、ＦｃＲ９＿Ｆと記載）が、基準としたＦｃＲ９（配列番号５）よりも低い抗体親和性を示すことを見出した。
【００６１】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ９＿Ｆのアミノ酸配列を配列番号９に、前記ＦｃＲ９＿Ｆをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１０に示す。なお配列番号９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９＿Ｆのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｐｈｅのフェニルアラニンは配列番号９では１９２番目の位置に存在する。
【００６２】
ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表４に示す。なお表４において、ＫＤ値（解離定数）が低いほど、高いアフィニティ（親和性）を有している。Ｖａｌ１９２Ｐｈｅのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号９）は、当該置換を含まないＦｃＲ９（配列番号５）と比較して、高い解離定数、すなわち抗体との低い親和性を有していることがわかる。このことから、前記Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記担体に吸着させる工程と前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む方法で抗体の分離を行なう際、前記Ｆｃ結合性タンパク質として、ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）に対してＶａｌ１９２Ｐｈｅのアミノ酸置換が少なくとも生じたタンパク質を用いると、ＦｃＲ９を用いたときと比較し抗体との親和性が低下しているので、抗体を高分離かつ高効率に分離できることが示唆される。
【００６３】
【表４】
2018197224.tif 000006
【００６４】
実施例３  システインタグを付加した本発明のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ）の作製
（１）実施例２で作製した配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする配列番号１０に記載のポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ９＿Ｆを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号１１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号１２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【００６５】
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製の発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
【００６６】
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを得た。
【００６７】
（４）ｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号１３（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号１４（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシーケンス用プライマーに使用した以外は、実施例１（７）と同様の方法で行なった。
【００６８】
発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６にそれぞれ示す。なお配列番号１５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆのアミノ酸配列（配列番号９の３３番目から２０８番目までの領域）、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
【００６９】
実施例４  ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓの調製
（１）実施例３で作製したＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【００７０】
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよびカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
【００７１】
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
【００７２】
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【００７３】
（５）回収した菌体を２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
【００７４】
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１２ｍＭリン酸水素二ナトリウム）（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速５ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。
【００７５】
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア製）９０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
【００７６】
前記精製により、高純度のＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを約２０ｍｇ得た。
【００７７】
実施例５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）固定化ゲルの作製と抗体の分離
（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：トヨパール）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例４で調製したＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。
【００７８】
（２）（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル１．２ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填してＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。
【００７９】
（３）（２）で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー製）に接続し、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の平衡化緩衝液で平衡化した。
【００８０】
（４）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎにて５μＬ添加した。
【００８１】
（５）流速０．６ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で２分洗浄後、１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（２８分で１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
【００８２】
結果（溶出パターン）を図２に示す。モノクローナル抗体はＦｃ結合性タンパク質と相
互作用するため、ゲルろ過クロマトグラフィーのような単一のピークではなく、複数のピ
ークに分離された。
【００８３】
（６）図２に記載の溶出パターン中のピーク１から３の各ピークを別々の容器に回収し、各ピークの分取画分を得た。
【００８４】
比較例１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９）固定化ゲルの作製と抗体分離
不溶性担体に固定化させるＦｃ結合性タンパク質として、ＷＯ２０１５／１９９１５４号記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）を用いた他は、実施例３から５と同様にＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９）固定化ゲルを作製し、抗体分離を実施した。
【００８５】
結果（溶出パターン）を図３に示す。実施例５の溶出パターン（図２）と比較すると、溶出ピークが近く、分離度が小さいことがわかる。すなわち、Ｖａｌ１９２Ｐｈｅのアミノ酸置換を導入した本発明のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）を固定化したゲルを用いることで、前記アミノ酸置換がないＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９）を固定化したゲルを用いたときと比較し、抗体の分離能が向上することがわかった。
【００８６】
実施例６  平衡化緩衝液の検討
実施例５（３）で用いる平衡化緩衝液を以下のいずれかとした他は、実施例５と同様に実施した。
（ａ）５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
（ｂ）５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）
（ｃ）５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）
得られた溶出パターンを、図４（平衡化緩衝液（ａ））、図５（平衡化緩衝液（ｂ））および図６（平衡化緩衝液（ｃ））に示す。また本実施例、実施例５（図２）および比較例１（図３）で得られた溶出パターンのうち、モノクローナル抗体に相当するピークを、溶出時間の早い順にピーク１、ピーク２、及びピーク３と命名し、ピーク１とピーク２との間、ピーク２とピーク３との分離度を下記の式を用いてそれぞれ算出した結果を表５に示す。
【００８７】
分離度（Ｒｓ値）＝１．１８×（溶出時間の遅いピークの溶出時間−溶出時間の早いピークの溶出時間）／（溶出時間の早いピークの半値幅＋溶出時間の遅いピークの半値幅）
分離度（Ｒｓ値）は高いほど分離性能が良いことを表している。
【００８８】
当該ピーク１、ピーク２、及びピーク３に基づく溶出画分を分取して得られた抗体は、それぞれ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の強さが異なることが本発明者らにより示されている（特開２０１６−２３１５２号公報）。従って、分離度の高い実施例５の分離方法を用いて抗体の分離を行なうことで、例えばＡＤＣＣの強さが異なる抗体を精度よく分離することができる。
【００８９】
【表５】
2018197224.tif 000007
【００９０】
表５中の、比較例１（ＦｃＲ９）の結果と実施例５（ＦｃＲ９＿Ｆ）の結果とを比較すると、実施例５の方が分離度Ｒｓ値が高く、抗体の分離能が高いことがわかる。すなわち計算で求めた分離度からも、ＦｃＲ９にＶａｌ１９２Ｐｈｅのアミノ酸置換を導入したＦｃ結合性タンパク質を固定化したゲルを用いることで、ＦｃＲ９を固定化したゲルを用いたときと比較して、抗体の分離能が向上することがわかる。
【００９１】
また実施例５および実施例６の結果から、平衡化緩衝液のｐＨは、５．０（実施例５）よりも５．５や５．６（実施例６（ａ）および（ｂ））のほうが、分離度（Ｒｓ値）が高くなる一方、ｐＨ６．０（実施例６（ｃ））とすると分離度は極端に低下し、ほとんど分離できていないことがわかる。これらの結果から、平衡化緩衝液のｐＨは４．５から５．８までの間とするとよく、ｐＨ５．２から５．７とすると抗体の分離能がさらに向上する点で好ましいといえる。
【００９２】
実施例７  分離した抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性測定
（１）実施例５で分離し、図２に記載のクロマトグラフ中に示されたピーク１（Ｐｅａｋ１）およびピーク３（Ｐｅａｋ３）の領域を分取した。繰り返し分取し、プールしたＰｅａｋ１およびＰｅａｋ３を限外ろ過膜（メルクミリポア製）で濃縮しながらＰＢＳ（１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．７６ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム）（ｐＨ７．４）に緩衝液を交換した。その後、濃縮、緩衝液交換したＰｅａｋ１およびＰｅａｋ３に含まれるモノクローナル抗体および分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光で測定した。
【００９３】
（２）ＡＤＣＣ活性測定
ＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（プロメガ製）のマニュアルに従い、以下に示す方法にて、各ピークに含まれるモノクローナル抗体および分離前のモノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性を測定した。
（２−１）１．４ｍＬのＬｏｗ  ＩｇＧ  Ｓｅｒｕｍと３３．６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を混合しＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒとした。このＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを用いてＰｅａｋ１およびＰｅａｋ３に含まれるモノクローナル抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体を３μｇ／ｍＬから３倍希釈で８段階の希釈系列を調製した。
（２−２）Ｒａｊｉ細胞をＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒにて約５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ウェルプレート（３９１７：コーニング製）に２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。Ｒａｊｉ細胞を加えたｗｅｌｌに、（２−１）で調製したＰｅａｋ１、Ｐｅａｋ３および分離前のモノクローナル抗体の希釈系列、ならびにブランクであるＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒのみを、それぞれ２５μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
（２−３）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞（プロメガ製）をＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒにて約３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、Ｒａｊｉ細胞および抗体を加えたｗｅｌｌに２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。その後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）に６時間静置した。
（２−４）９６穴プレートを室温で５分から３０分静置した後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ製）を７５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。室温で３０分反応させたのち、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で発光を測定した。
【００９４】
（３）測定した発光強度からブランクの発光強度を差し引き算出した、実施例５で分離したピーク１（Ｐｅａｋ１）およびピーク３（Ｐｅａｋ３）ならびに分離前のモノクローナル抗体の発光強度を比較した結果を図７に示した。この結果は、発光強度が高い程ＡＤＣＣ活性が高いことを示している。分離前に比べてＰｅａｋ１のＡＤＣＣ活性は低下しているが、Ｐｅａｋ３の発光強度は分離前に比べて約１．５倍に向上していた。この結果から、分離前のモノクローナル抗体およびＰｅａｋ１に含まれるモノクローナル抗体と比べて、Ｐｅａｋ３に含まれるモノクローナル抗体はＡＤＣＣ活性が高いことが分かる。そのため実施例５で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムからの溶出が遅い（カラムに保持される時間が長い）方がよりＡＤＣＣ活性の高い抗体であることが分かり、当該ゲルによりモノクローナル抗体をＡＤＣＣ活性に基づいて分離できることが確認できた。
【００９５】
実施例８  培養液中に含まれる抗体の分析と分離パターンの解析（その１）
（１）抗体産生細胞の構築
（１−１）リツキシマブ（重鎖のアミノ酸配列：配列番号１７、軽鎖のアミノ酸配列：配列番号１８）またはベバシズマブ（重鎖のアミノ酸配列：配列番号１９、軽鎖のアミノ酸配列：配列番号２０）をコードするポリヌクレオチド（リツキシマブ重鎖のヌクレオチド配列：配列番号２１、リツキシマブ軽鎖のヌクレオチド配列：配列番号２２、ベバシズマブ重鎖のヌクレオチド配列：配列番号２３、ベバシズマブ軽鎖のヌクレオチド配列：配列番号２４）の５’末端側に、分泌発現のための抗体由来シグナルペプチド（重鎖用シグナルペプチドのアミノ酸配列：配列番号２５、軽鎖用シグナルペプチドのアミノ酸配列：配列番号２６）をコードするポリヌクレオチド（重鎖用シグナルペプチドのヌクレオチド配列：配列番号２７、軽鎖用シグナルペプチドのヌクレオチド配列：配列番号２８）を付加させたポリヌクレオチドを、常法により市販のベクター（ｐＣＡＧ−Ｎｅｏ、和光純薬工業製）に導入した。
（１−２）構築した抗体発現ベクターを用いて、リポフェクトアミン法により、ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）へのトランスフェクションを実施し、抗生物質を用いた選別により抗体産生細胞を取得した。
（１−３）取得した抗体産生細胞群から高発現株をシングルクローン化により選択し、高発現抗体産生細胞を樹立した。
【００９６】
（２）抗体産生細胞の培養
（２−１）グルタミン溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）および抗生物質Ｇ４１８（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を添加したＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）２０ｍＬを含んだ１２５ｍＬ三角フラスコ（コーニング製）に、抗体産生細胞を５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬとなるよう播種し、３７℃、８％ＣＯ２存在下、１２５ｒｐｍにて振とう培養を実施した。
（２−２）１日ごとに生細胞密度、細胞生存率を市販の自動セルカウンター（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）により計測した。
（２−３）定法により、順次培養スケールを拡大し、最終的に培地１Ｌでの本培養を開始した。（２−２）と同様に生細胞密度、細胞生存率を計測し、適宜（２−１）に記載の培地を追加することで、培養を継続した。
【００９７】
（３）培養液のサンプリングおよびＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析
（３−１）培養日数ごとに培養液をサンプリングし、生細胞密度、細胞生存率を計測した。また前記サンプリングした培養液を、抗体定量用アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いたＨＰＬＣ法（ＴＳＫｇｅｌＰｒｏｔｅｉｎＡ−５ＰＷ、東ソー製）により抗体生産量を測定した。
（３−２）培養日数ごとにサンプリングした培養液を、実施例５で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いて実施例６（ｂ）と同様な方法で分析し、培養液に含まれる抗体の分離パターンを得た。
【００９８】
培養日数ごとの生細胞密度、細胞生存率および抗体濃度（抗体生産量）の結果を図８から図１０に、それぞれ示す。また培養３日目の培養液をＦｃＲ９＿Ｆカラムにより分析し得られた結果（クロマトグラム）を図１１に示す。培養液中の大部分を占める夾雑物質は素通り画分として溶出時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）１分から５分付近のピークに観測できた。一方、溶出時間１０分から３０分の領域を拡大する（図１２）と、培養液中に含まれる抗体に由来する複数のピークが確認できた。以上の結果から、培養途中の培養液中に含まれる抗体を本発明のＦｃＲ９＿Ｆカラムにより分析することで、培養途中の培養液中に含まれる抗体を糖鎖構造に基づき分離できることがわかる。
【００９９】
さらに培養４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目および１４日目の培養液を、同様にＦｃＲ９＿Ｆカラムにより分析した。分析結果（クロマトグラム）のうち、抗体に由来するピークが確認できる、溶出時間１０分から３０分の領域を拡大したものを図１３に示す。図１３より、培養日数の経過とともに、抗体の糖鎖構造に由来する分離ピークの形状および高さの違いを確認することができ、抗体の糖鎖構造パターンの経時変化をモニターできた。以上の結果から、培養途中の培養液を本発明のＦｃＲ９＿Ｆカラムにより経時的に分析することで、培養経過をモニターする工程分析が容易に行なえることが示唆される。また前記分析結果に基づき、抗体医薬品の製造に最適な培養条件の検討や、培養中の抗体糖鎖構造の推定が容易に行なえることが示唆される。
【０１００】
実施例９  培養液中に含まれる抗体の分析と分離パターンの解析（その２）
（１）配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなる抗インターロイキン６レセプター（以下、ＩＬ−６Ｒ）抗体の重鎖、および配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなる抗ＩＬ−６Ｒ抗体の軽鎖を発現させるためのベクターを以下の方法で構築した。
（１−１）配列番号３１に記載のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｄｈｆｒ）およびＳＶ４０のＰｏｌｙＡをコードする遺伝子に制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列列（ＣＣＧＣＧＧ）を５’末端３’末端の両方に付加して全合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）プラスミドにクローニングした。
（１−２）（１−１）で作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出したのち、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することで、ｄｈｆｒ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡをコードする遺伝子を調製しｄｈｆｒ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ−Ｐ１と命名した。
（１−３）ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号３２（５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＣＧ−３’）および配列番号３３（５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。
【０１０１】
【表６】
2018197224.tif 000008
【０１０２】
（１−４）（１−３）で作製したＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＳａｃＩＩで消化し、（１−２）で調製したｄｈｆｒ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ−Ｐ１とライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｄｈｆｒ遺伝子を含んだ発現ベクターｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを得た。
【０１０３】
（２）（１）で作製したｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを鋳型として配列番号３４（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣ−３’）および配列番号３５（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で７分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒベクターのＣＭＶプロモーター遺伝子を除いた領域を増幅し、ｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒ−Ｐ２と命名した。
【０１０４】
（３）（２）で作製したｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒ−Ｐ２を鋳型として配列番号３６（５’−ＴＴＴＡＡＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧ−３’）および配列番号３７（５’―ＡＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＧＡＴＣＧＴＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧＣ―３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物（ＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡまでの領域を）をｄｈｆｒ−Ｐ３（配列番号３８）と命名した。
【０１０５】
【表７】
2018197224.tif 000009
【０１０６】
（４）ヒト抗体の重鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）および（３）で作製したｄｈｆｒ−Ｐ３をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化・精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡを含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１を得た。ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１にＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒと命名した。
【０１０７】
（５）配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなる抗ＩＬ−６Ｒ抗体の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドに、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）を付加したポリヌクレオチド（配列番号４０）を全合成し（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）プラスミドにクローニング後、各当該プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた各形質転換体を培養し、プラスミドを抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化し精製することで、シグナルペプチドを含んだ抗ＩＬ−６Ｒ抗体の重鎖をコードする遺伝子を取得し、ａＩＬ６ＲＨ―Ｐ４と命名した
（６）（４）で作製したｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化し精製したものと、（５）で作製したａＩＬ６ＲＨ―Ｐ４をライゲーションし、当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。前記形質転換体の培養液からプラスミドを抽出することで、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の重鎖を発現するための発現ベクターｐＦＵ−ａＩＬ６ＲＨを得た。
【０１０８】
（７）ヒト抗体の軽鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）および（３）で作製したｄｈｆｒ−Ｐ３をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化・精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡを含んだｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋを得た。ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋにＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒと命名した。
【０１０９】
（８）配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなる抗ＩＬ−６Ｒ抗体の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドに、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を付加したポリヌクレオチド（配列番号４２）を全合成し（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）プラスミドにクローニング後、当該プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた各形質転換体を培養し、プラスミドを抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化し精製することで、シグナルペプチドを含んだ抗ＩＬ−６Ｒ抗体の軽鎖をコードする遺伝子を取得し、ａＩＬ６ＲＬ―Ｐ５と命名した。
【０１１０】
（９）（７）で作製したｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化し精製したものと、（８）で作製したａＩＬ６ＲＬ―Ｐ５をライゲーションし、当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。前記形質転換体の培養液からプラスミドを抽出することで、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の軽鎖を発現するための発現ベクターｐＦＵ−ａＩＬ６ＲＬを得た。
【０１１１】
（１０）（６）で作製したｐＦＵ−ａＩＬ６ＲＨおよび（９）で作製したｐＦＵ−ａＩＬ６ＲＬを、ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）にＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入した。その後、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で形質転換細胞を培養し、５０ｎｇ／ｍＬのメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いて遺伝子増幅を行なった。
【０１１２】
（１１）限外希釈法により単クローン化し、下記に記載のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）にて安定に抗ＩＬ−６Ｒ抗体を高生産する細胞を選択した。
（１１−１）可溶性ヒトＩＬ−６Ｒ（和光純薬社製）または抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化した（４℃で一晩）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（１１−２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌとを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体を含んだ培養上清を添加し、抗体と固定化タンパク質とを反応させた（３０℃で１時間）。
（１１−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したペルオキシターゼで標識された抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（１１−４）３０℃で１時間反応し、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後、１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、測定値の高い抗ＩＬ−６Ｒ抗体高生産細胞株を選択した。
【０１１３】
（１２）ＭＴＸ濃度を段階的に上昇させながら、限外希釈を行ない（１１）に記載のＥＬＩＳＡでクローン選択を行なうことをＭＴＸ濃度が６４μｇ／ｍＬになるまで繰り返すことで抗ＩＬ−６Ｒ抗体高生産細胞株を得た。
【０１１４】
（１３）（１２）で得られた細胞株を段階的にスケールアップし、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだ１００ｍＬのＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍおよび５００ｍＬの三角フラスコ２本を用いてＣＯ２インキュベーター中で振盪培養（３７℃、８％のＣＯ２）した。その後、ジャーファンメーター（バイオット社製）に植菌し、最終的に１Ｌとなるよう５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍを加えた。８０ｒｐｍ、ｐＨ７．０、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を行ない、培養１日目に二酸化炭素を５から８％に変更し、培養５日目に撹拌を８０ｒｐｍから１００ｒｐｍに変更し９日間培養した。培養日数３、５、７および９日目に８０ｍＬの培養液を採取した。
【０１１５】
（１４）（１３）で得られた培養液から遠心分離によって細胞および不純物を除去し、得られた上清をあらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したオープンカラムに詰めた０．５ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＣ−６５０Ｆ（東ソー社製）にアプライした。前記平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、１００ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）４ｍＬで溶出した。溶出液に１ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性領域に戻し、限外ろ過膜で５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に緩衝液交換することで培養３，５、７および９日目の高純度な可溶性抗ＩＬ−６Ｒ抗体を得た。
【０１１６】
（１５）実施例５（２）で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを用いて、下記記載の方法により（１４）で得られた精製抗ＩＬ−６Ｒ抗体を分析した。
（１５−１）実施例５（２）で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー製）に接続し、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の平衡化緩衝液で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて平衡化した。
（１５−２）同平衡化緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した（５）で得た精製抗体を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて５μＬ添加した。
（１５−３）流速１．０ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で２分洗浄後、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）によるｐＨグラジエント（１８分で５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）が１００％となるグラジエント）で吸着した抗体を溶出した。
【０１１７】
（１６）（１４）で得られた精製抗ＩＬ−６Ｒ抗体が有する糖鎖の構造解析を、特開２０１６−１６９１９７号記載の方法と同様な方法で実施した。
【０１１８】
培養日数の異なる培養液から得られた、各精製抗体のクロマトグラム（溶出パターン）および当該クロマトグラムより算出される各ピークの面積比をまとめた結果を図１４および表８にそれぞれ示す。また、培養日数ごとの生細胞濃度（培養生細胞数）および抗体濃度（抗体生産量）をまとめた結果を図１５に示す。さらに精製抗体が有する糖鎖構造解析結果を図１６および表９に示す。なお、表９中のｏｔｈｅｒｓを具体的に示すと、Ｍａｎ８、Ｇ０Ｆｂ−ＧＮ、Ｇ２、Ｇ１Ｆｂ−ＧＮ、Ｇ０Ｆａ−ＧＮ、Ｇ１Ｆａ−ＧＮ、Ｇ１Ｆ＋ＳＡ、Ｇ２Ｆ＋ＳＡ、Ｇ２Ｆ＋ＳＡ２、Ｇ１Ｆ＋ＧＮであった。このうちＧ１Ｆ＋ＳＡは５日目以降から、Ｍａｎ８は７日目以降から検出された。
【０１１９】
図１４および表８の結果から、培養液を用いたときの結果（実施例８および図１３）と同様、培養日数の経過とともに、抗体の糖鎖構造に由来する分離ピークの形状および高さ（ピーク面積比）の違いが確認できた。また図１６および表９の結果から、分離ピークの形状および高さ（ピーク面積比）の違いが抗体に結合した糖鎖構造の違いに基づくことを確認した。以上の結果から、培養途中の培養液を本発明のＦｃＲ９＿Ｆカラムにより経時的に分析することで、抗体産生細胞培養工程での分析や、当該細胞より産生した抗体の糖鎖構造パターンの経時的なモニターが行なえる。さらに前記糖鎖構造パターンのモニター結果に基づき、所望の（例えば、抗体医薬品としての性能を発揮可能な）糖鎖構造を有した抗体を得る為の培養条件の最適化や、培養工程のモニタリングも行なえる。
【０１２０】
【表８】
2018197224.tif 000010
【０１２１】
【表９】
2018197224.tif 000011
【図１】
2018197224.tif 000012
【図２】
2018197224.tif 000013
【図３】
2018197224.tif 000014
【図４】
2018197224.tif 000015
【図５】
2018197224.tif 000016
【図６】
2018197224.tif 000017
【図７】
2018197224.tif 000018
【図８】
2018197224.tif 000019
【図９】
2018197224.tif 000020
【図１０】
2018197224.tif 000021
【図１１】
2018197224.tif 000022
【図１２】
2018197224.tif 000023
【図１３】
2018197224.tif 000024
【図１４】
2018197224.tif 000025
【図１５】
2018197224.tif 000026
【図１６】
2018197224.tif 000027
【配列表】
2018197224000001.app