(57)【要約】【課題】細胞外側から細胞質側へプロトンを能動輸送するプロトンポンプを提供すること。【解決手段】レチナールまたはレチナール誘導体からなる発色団と、光受容タンパク質との複合体を有し、光エネルギーにより水素イオン２１を細胞外側５から細胞質側７へ能動輸送するプロトンポンプ。前記光受容タンパク質は、たとえばＰｏＸｅＲタンパク質１１またはその変異体である。【選択図】  図１
2018039744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチナールまたはレチナール誘導体からなる発色団と、光受容タンパク質との複合体を有し、光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ。
【請求項２】
前記光受容タンパク質は、下記（Ａ）および（Ｂ）
（Ａ）ＰｏＸｅＲタンパク質
（Ｂ）ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入および／または付加され、かつ前記発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ活性を有するタンパク質
のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のプロトンポンプ。
【請求項３】
前記光受容タンパク質は、下記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載のプロトンポンプ。
ａ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１１９番目のアスパラギン酸（以下Ｄとする）をグルタミン酸（以下Ｅとする）、アスパラギン（以下Ｎとする）、またはグルタミン（以下Ｑとする）に置換
ｂ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１５８番目のＥをＱ、Ｄ、またはＮに置換
ｃ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において２１６番目のＤをＥ、Ｎ、またはＱに置換
ｄ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において２１９番目のＥをＱ、Ｄ、またはＮに置換
【請求項４】
ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入および／または付加され、かつ、レチナールまたはレチナール誘導体からなる発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
下記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列を有する請求項４に記載のタンパク質。
ａ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１１９番目のＤをＥ、Ｎ、またはＱに置換
ｂ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１５８番目のＥをＱ、Ｄ、またはＮに置換
ｃ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において２１６番目のＤをＥ、Ｎ、またはＱに置換
ｄ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において２１９番目のＥをＱ、Ｄ、またはＮに置換
【請求項６】
請求項４または５に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項４または５に記載のタンパク質をコードするコード領域を保持する発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項９】
請求項６に記載の遺伝子または請求項７に記載の発現ベクターを含むキット。
【請求項１０】
ＰｏＸｅＲタンパク質をコードする遺伝子またはＰｏＸｅＲタンパク質をコードするコード領域を保持する発現ベクターを含む、光エネルギーによって細胞内の水素イオン濃度を制御するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体におけるプロトンポンプおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜の内外でのイオン輸送の方法には、エネルギーを利用してイオンを一定方向へ輸送する能動輸送と、膜内外でのイオン濃度差および膜電位によりイオンを輸送する受動輸送がある。能動輸送を行うイオン輸送体はイオンポンプ、受動輸送を行うイオン輸送体はイオンチャネルと呼ばれる。
【０００３】
プロトン（水素イオン）を能動輸送するプロトンポンプは、生体内の細胞膜においてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の合成、エネルギー変換に関与する。すなわち、プロトンポンプは、細胞質側のプロトンを細胞外側へ輸送する。その結果、生成されたプロトン濃度勾配を利用してＡＴＰ合成酵素が働き、ＡＴＰが合成される。ＡＴＰは、筋肉を動かしたり神経を興奮させたりするなど、様々な生命現象を駆動する分子である。
【０００４】
このようなプロトン能動輸送制御の重要性から、これまでに本発明者らはプロトン輸送についての研究を行っている。また、本発明者らは、非特許文献１に記載されているように、藻類のバクテリアにおいて光センサーとして働くAnabaena sensory rhodopsin（ＡＳＲ）の１個のアミノ酸を（２１７番目のアスパラギン酸をグルタミン酸に）置換したタンパク質とレチナールとの複合体を大腸菌に発現させ、光を照射すると細胞外側から細胞質側へのプロトン輸送が行われることを見出している。なお、非特許文献１に記載された変異タンパク質とレチナールとの複合体によるプロトン輸送は、アミノ酸を変異させた人工的なタンパク質を用いて大腸菌で確認されたものであり、プロトン輸送がどのように行われているかは分かっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｗａｒｄ  ｐｒｏｔｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｅｎｓｏｒ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００９）  Ｋａｗａｎａｂｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
プロトンポンプは、細胞質側のプロトンを細胞外側へ輸送する方向性を有する。そのため、ＡＴＰ合成を妨げてしまう細胞外側のプロトンを細胞質側へ輸送するプロトンポンプは、生命現象に反するので自然界には存在しないと考えられていた。
【０００７】
一方、細胞外側のプロトンを細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプは、例えばプロトンポンプを発現する遺伝子を、ベクターを使用して細胞内に導入し、細胞内のプロトン量を増加させる制御を行う実験ツールや、癌細胞特異的にプロトンポンプを発現させ、癌細胞を低ｐＨ状態にして死滅させるような治療方法への応用が期待できるため、付加価値が高い。なお、一般的に、プロトンポンプは細胞膜に逆向きに配向しないことが知られているため、細胞質側から細胞外側へプロトンを輸送するプロトンポンプを上記のような治療方法へ応用することは難しいと考えられている。
【０００８】
本発明は、細胞外側から細胞質側へプロトンを能動輸送するプロトンポンプを提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、以下の手段が提供される。
［１］  レチナールまたはレチナール誘導体からなる発色団と、光受容タンパク質との複合体を有し、光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ。
［２］  前記光受容タンパク質は、下記（Ａ）および（Ｂ）
（Ａ）ＰｏＸｅＲタンパク質
（Ｂ）ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入および／または付加され、かつ前記発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ活性を有するタンパク質
のいずれかであることを特徴とする上記［１］に記載のプロトンポンプ。
［３］  前記光受容タンパク質は、下記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列を有することを特徴とする上記［２］に記載のプロトンポンプ。
ａ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１１９番目のアスパラギン酸（以下Ｄとする）をグルタミン酸（以下Ｅとする）、アスパラギン（以下Ｎとする）、またはグルタミン（以下Ｑとする）に置換
ｂ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１５８番目のＥをＱ、Ｄ、またはＮに置換
ｃ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において２１６番目のＤをＥ、Ｎ、またはＱに置換
ｄ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において２１９番目のＥをＱ、Ｄ、またはＮに置換
［４］  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入および／または付加され、かつ、レチナールまたはレチナール誘導体からなる発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ活性を有するタンパク質。
［５］  上記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列を有する上記［４］に記載のタンパク質。
［６］  上記［４］または［５］に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
［７］  上記［４］または［５］に記載のタンパク質をコードするコード領域を保持する発現ベクター。
［８］  上記［７］の発現ベクターが導入された形質転換体。
［９］  上記［６］に記載の遺伝子または上記［７］に記載の発現ベクターを含むキット。
［１０］  ＰｏＸｅＲタンパク質をコードする遺伝子またはＰｏＸｅＲタンパク質をコードするコード領域を保持する発現ベクターを含む、光エネルギーによって細胞内の水素イオン濃度を制御するためのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプロトンポンプは、光エネルギーによる能動輸送によりプロトンを細胞外側から細胞質側へ輸送するため、光エネルギー量を調整することによって、細胞質側または細胞外側のプロトン量を制御できる。また、哺乳類細胞を用いることで、医学用などへの展開が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体の模式図。
【図２】大腸菌細胞でのレチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体のポンプ活性アッセイの結果を示す図。
【図３】レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体の吸収スペクトル。
【図４】細胞外側に、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４を加えた場合のポンプ活性アッセイの結果を示す図。（ａ）はレチナール−ＰｏＣｌＲタンパク質複合体の結果を示し、（ｂ）はレチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体の結果を示す。
【図５】レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体の哺乳類細胞での電気生理学実験の結果を示す図。
【図６】大腸菌細胞でのレチナールと変異型ＰｏＸｅＲタンパク質との複合体のポンプ活性アッセイの結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照しつつ本発明の実施の形態について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、変更、修正、改良を加え得るものである。
【００１３】
本発明のプロトンポンプは、レチナールまたはレチナール誘導体からなる発色団と、光受容タンパク質との複合体（発色団−タンパク質複合体）を有する。
【００１４】
（発色団）
発色団であるレチナールおよびレチナール誘導体は、光を吸収することによってトランス型からシス型へ異性化し、発色団とタンパク質との複合体のタンパク質部分に構造変化を起こす。レチナールとしては、全トランスレチナール、１１−シスレチナール、１３−シスレチナール、９−シスレチナール等が挙げられる。
【００１５】
レチナール誘導体は、好ましくは、３，４−デヒドロレチナール、１３−エチルレチナール、９−ｄｍ−レチナール、３−ヒドロキシレチナール、４−ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール、３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，４，６，８，１０ペンタエナール、３，７ジメチル−デカ−２，４，６，８−テトラエナール、３，７−ジメチル−オクタ−２，４，６−トリエナール、６−７回転阻止（ｒｏｔａｔｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｅｄ）レチナール、８−９回転阻止レチナール、および１０−１１回転阻止レチナールからなる群から選択される。
【００１６】
（光受容タンパク質）
光受容タンパク質は、発色団と複合体を形成した状態で光を刺激として受容するタンパク質である。発色団−タンパク質複合体において、光受容タンパク質の１つはバクテリオロドプシンである。光エネルギーを利用し細胞外側のプロトンを細胞質側へ輸送するプロトンポンプとして機能する、発色団−タンパク質複合体を構成するタンパク質の形態の１つとしては、自然界に存在するＰｏＸｅＲタンパク質が挙げられる。自然界に存在する生物のゲノムに由来するＰｏＸｅＲタンパク質を用いることにより、構造的に安定し、機能が最適化された人工プロトンポンプとすることができる。
【００１７】
ＰｏＸｅＲタンパク質は、非特許文献（Ｍａｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２４，２１１−２１３（２０１５）  Ｔａｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）で、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ  ｏｃｅａｎｉより機能未知のロドプシンとして報告されたタンパク質である。ＰｏＸｅＲのアミノ酸配列は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によればＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＷＰ＿０５１８８１４６７としてデータベースに保存されている。
【００１８】
発色団−タンパク質複合体を構成する光受容タンパク質としては、ＰｏＸｅＲタンパク質の変異体も挙げられる。ＰｏＸｅＲタンパク質のすべてのアミノ酸がプロトン輸送に関わっているとは考えにくい。野生型ＰｏＸｅＲタンパク質の１または複数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入および／または付加され、かつ発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ活性を有するタンパク質との複合体によれば、細胞質側へのプロトンの能動輸送機能を維持又は当該機能の向上を図ることが可能である。
【００１９】
たとえば、細胞膜貫通部分以外のアミノ酸は、プロトン輸送に関わっている可能性が低いと思われる。したがって、ＰｏＸｅＲタンパク質における細胞膜貫通部分以外の領域、つまり細胞外領域および／または細胞内領域のアミノ酸の１または複数個を欠損、置換、挿入および／または付加を行っても、細胞質側へのプロトン能動輸送機能を維持すると考えられる。実際、本発明者らは、ＰоＸｅＲタンパク質の細胞内領域であるＣ末端側にヒスチジンを６個付加したタンパク質（ＰｏＸｅＲタンパク質との相同性は９７％）で、細胞外側から細胞質側へのプロトンの能動輸送機能を確認している。
【００２０】
光受容タンパク質をＰｏＸｅＲタンパク質の変異体とする場合、ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、欠損、置換、挿入および付加のうちのいずれかであってもよく、これらのうちの２種類以上の組み合わせであってもよい。また、アミノ酸の変異の総数は、発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ活性を有する限り特に制限されないが、好ましくは１個以上１０個以下であり、より好ましくは１個以上６個以下である。
【００２１】
アミノ酸の置換は、保存的置換によるものであることが好ましい。「保存的置換」とは、アミノ酸残基の置換を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基によって行うことを意味する。具体的には、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）のように同様の性質の側鎖を有する群の中で置換する。また、保存的置換に依らない場合でも、発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送することが可能であれば好ましく適用される。
【００２２】
ＰｏＸｅＲタンパク質の変異体としては、野生型のＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、かつ発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ活性を有するタンパク質が挙げられる。同一性は、好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上である。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ等の解析プログラムを用いて決定することができる。
【００２３】
光受容タンパク質は、細胞外側から細胞質側へのプロトン輸送効率がより高いタンパク質複合体を得ることができる点で、中でも、下記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列を有することが好ましい。
ａ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１１９番目のアスパラギン酸（以下Ｄとする）をグルタミン酸（以下Ｅとする）、アスパラギン（以下Ｎとする）、またはグルタミン（以下Ｑとする）に置換。
ｂ）  ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において１５８番目のＥをＱ、Ｄ、またはＮに置換。
ｃ）  ＰｏＸｅＲタンパク質の２１６番目のアミノ酸配列においてＤをＥ、Ｎ、またはＱに置換。
ｄ）  ＰｏＸｅＲタンパク質の２１９番目のアミノ酸配列においてＥをＱ、Ｄ、またはＮに置換。
【００２４】
上記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列を有するタンパク質は、自然界に存在する生物のゲノムに由来するタンパク質よりも、細胞外側から細胞質側へのプロトン輸送効率が高い人工的なタンパク質であり、プロトンポンプの適用範囲を拡大することが可能な点で好適である。当該タンパク質は、上記ａ）〜ｄ）のうちの１種類を満たすアミノ酸配列からなるものであってもよいし、これらの２種類以上を組み合わせたアミノ酸配列からなるものであってもよい。また、レチナールまたはレチナール誘導体からなる発色団との複合体において光エネルギーにより水素イオンを細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプ活性を有する限り、上記ａ）〜ｄ）のうちの少なくともいずれかのアミノ酸位置以外の部分に、１または複数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入および／または付加されていてもよい。
【００２５】
（レチナールとＰｏＸｅＲタンパク質の複合体）
図１に、発色団−タンパク質複合体の好ましい形態の一つである、レチナール１７と野生型または変異型のＰｏＸｅＲタンパク質（以下、「ＰｏＸｅＲタンパク質１１」ともいう。）との複合体１０の模式図を示す。複合体１０は、宿主で発現されると、図１のように、Ｎ末端側１３を細胞外側５に、Ｃ末端側１５を細胞質側７に位置するように細胞膜上に存在する。具体的には、ＰｏＸｅＲタンパク質１１は、細胞膜３を貫通し、ＰｏＸｅＲタンパク質１１のＮ末端側１３を細胞外側５に、Ｃ末端側１５を細胞質側７に接するように配置される。複合体１０において、レチナール１７は、ＰｏＸｅＲタンパク質１１に付着している。なお、符号１２は、ＰｏＸｅＲタンパク質１１を変異型とした場合のアミノ酸の変異位置を示す。図１では、ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から２１６番目のアミノ酸位置を示している。
【００２６】
光源３１で光照射を開始すると、光を吸収することによってレチナール１７が異性化し、ＰｏＸｅＲタンパク質１１の構造変化が起こる。これにより、細胞外側５に存在するプロトン２１は、ＰｏＸｅＲタンパク質１１内を通り、細胞質側７へ輸送される。
【００２７】
図３に、大腸菌に発現させた場合のレチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体の吸収スペクトルを示す。レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体がプロトン輸送をするためには、図３によれば、５００ｎｍから６１５ｎｍの波長の光を照射することが好ましく、特に５７０ｎｍ付近の光（緑色光）を照射することが好ましい。
【００２８】
（発現ベクター）
本発明の発現ベクターは、上記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするコード領域を保持するベクターである。こうしたベクターは、細胞内に導入されて目的とする遺伝子が発現されることで、細胞内のプロトン量を増加させる制御を行う実験ツールや、癌細胞特異的にプロトンポンプを発現させ、癌細胞を低ｐＨ状態にして死滅させるような治療方法等への応用の際に使用することができる。
【００２９】
発現ベクターにおいて、遺伝子を挿入するベクターの種類としては、これに限定されるものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、及び他のプラスミドＤＮＡ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及び他のプラスミドＤＮＡ）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、及び他のプラスミドＤＮＡ）、λファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、哺乳動物用プラスミド（ｐＣＭＶ、ｐＳＶ４０）、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクター等）、植物用ベクター（バイナリベクターｐＢＩ系等）、コスミドベクターなどを用いることができる。
【００３０】
上記遺伝子は、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能に連結される。用いるプロモーターの種類は特に限定されず、形質転換する宿主に応じて種々のプロモーターを用いることができる。また、本発明の発現ベクターは、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、スプライシングシグナル、リボソーム結合配列、選択マーカーなどを有していてもよい。
【００３１】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、上記発現ベクターが導入されたものである。ベクターの導入方法としては、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できるが、その具体例としては、これに限定されるものではないが、非ウイルスベクター系には、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト法等を用いることができ、ウイルスベクター系にはウイルスを感染させることで導入することができる。宿主としては、上記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を発現可能であれば特に限定されない。宿主として哺乳類細胞を用いることで、たとえば癌細胞特異的にプロトンポンプを発現させ、癌細胞を低ｐＨ状態にして死滅させるような治療方法などへの展開が可能になる。哺乳類細胞としては、例えばヒト、ウシ、マウス、ラット、チャイニーズハムスター等が挙げられる。
【００３２】
（キット）
本発明のキットは、上記ａ）〜ｄ）の少なくともいずれかを満たすアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、または当該遺伝子が挿入されたベクターを含む。本発明のキットは、これら遺伝子またはベクター以外のその他の成分を、当該遺伝子またはベクターと一体に、または別個に含んでいてもよい。こうしたその他の成分としては、例えば、溶液、バッファー、試薬、塩などが挙げられる。本発明のキットは、例えば、動物細胞や植物細胞における水素イオン濃度勾配のメカニズムの研究、癌治療用キット、プロトンポンプ阻害薬の代替用キット、神経活動制御のツール、シナプス小胞における神経伝達物質の制御等に利用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（遺伝子構築、タンパク質発現および精製）
ＰｏＸｅＲ遺伝子は、大腸菌での発現用にコドンを最適化したものを遺伝子合成することによって作製し、精製用の６×ＨｉｓタグをＣ末端側に付加した。これをｐＥＴ２１ａ（＋）ベクターに導入した。アミノ酸変異体の作製は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法を用いて行った。野生型および変異型タンパク質は、ＰｏＸｅＲ遺伝子を用いて形質転換した大腸菌  Ｃ４３（ＤＥ３）株の懸濁液に、１０μＭ  全トランスレチナール（シグマアルドリッチ）と共に０．２１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加えることで、３７℃において４時間誘導をかけ発現させた。その後、ＰｏＸｅＲの精製は、過去の井上らの方法（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４，１６７８（２０１３））を参考にした。フレンチプレスによって大腸菌の菌体を破砕し、１２５，０００×ｇの条件で超遠心を行って膜断片を回収し、膜タンパク質を２％  ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ  （ＤＤＭ）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）中で可溶化した。さらに、Ｃｏ２＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した後、回収した画分を０．１％ＤＤＭ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）に透析して、イミダゾールを取り除いた。
【００３５】
（実施例１）
まず、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体のイオン輸送について調べた。ＰｏＸｅＲタンパク質としては野生型のものを用いた（実施例２，３についても同じ）。図２に、大腸菌細胞でのレチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体のポンプ活性アッセイの結果を示す。
【００３６】
大腸菌細胞中でのレチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体による光駆動ポンプ活性アッセイは以下のようにして行った。
ＰｏＸｅＲを発現させた大腸菌を遠心（４，８００×ｇ、３分）により回収し、１００ｍＭの塩（ＮａＣｌ、ＣｓＣｌまたはＮａ２ＳＯ４）を用いて懸濁および洗浄を行った。この大腸菌菌体について、６６０ｎｍにおける濁度が２になるように菌体濃度を調節した懸濁液７．５ｍＬ分を測定に用いた。懸濁液を暗条件においた後、ロングパスガラスフィルターで５００ｎｍより短波長側の光をカットした１−ｋＷのタングステンハロゲンプロジェクターランプの光を照射し、その時に生じる光誘起のｐＨ変化を、ｐＨメーターを用いて測定することで、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体のポンプ活性のアッセイを行った。また同様の測定を１０μＭ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｍ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｈｙｄｒａｚｉｎｅ（図２では、ＣＣＣＰと記載。以下ＣＣＣＰとする）を加えた条件でも行った。
【００３７】
なお、図２において、縦軸は細胞外側のｐＨ、横軸は時間（秒）を示す。光の照射は０ｓで開始し、１５０ｓで終了した。実線はＣＣＣＰを加えないとき、破線はＣＣＣＰは加えたときを示す。ここで、ＣＣＣＰは、プロトンの細胞膜の透過性を上昇させる働きがある。したがって、ＣＣＣＰを加えると、細胞内外でプロトン以外のイオンによる電荷に差が見られない場合には、細胞外側のｐＨと細胞質側のｐＨは互いに近づくことになる。
【００３８】
・結果と考察
レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体を発現させた大腸菌では、図２に実線で示すように、ＣＣＣＰの非存在下において光を照射すると細胞外側のｐＨが高くなった。これは、細胞外側のプロトンが細胞質側へ輸送されることで細胞外側のプロトンが減り、ｐＨが高くなったことによるものと考えられる。また、ＣＣＣＰを加えた場合には、図２に破線で示すように、光の照射中において細胞外側のｐＨは殆ど変化しなかった。ＣＣＣＰを加えた場合には、細胞質側に輸送されたプロトンが、ＣＣＣＰの影響により細胞膜を透過して細胞質側に戻ったため、プロトンの量の変化が少なかったと考えられる。これらのことから、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体は、光エネルギーによりプロトンを細胞外側から細胞質側へ輸送することが示唆された。
自然界に存在する生物のゲノムに由来するタンパク質は、一般的には、進化の過程で環境に適応した構造的に安定し機能が最適化されたタンパク質と考えられる。そのため、ＰｏＸｅＲタンパク質によるプロトンポンプは、実験ツールや治療方法へ応用の際に安定したプロトン輸送機能を発揮すると考えられる。
【００３９】
（実施例２）
次に、細胞外側にＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４をそれぞれ添加した場合のレチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体のイオン輸送について調べた。図４にその結果を示す。図４（ａ）は、比較のため、Ｃｌ−を内向きに輸送する機能を持つレチナール−ＰｏＣｌＲタンパク質複合体の結果を示し、図４（ｂ）は、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体の結果を示す。図４において、縦軸は、細胞外側のｐＨ、横軸は時間（秒）を示す。グラフは、上から順に、細胞外側に、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４をそれぞれ加えた場合の結果を示す。
【００４０】
なお、タンパク質複合体がＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４を構成するいずれかのイオンを細胞外側から細胞内側へ輸送する機能を有する場合には、３種類の物質を添加した実験結果のグラフに違いが現れると考えられる。また、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４が細胞外に存在していた場合の輸送機能に対する影響も確認することができると考えられる。図４では、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４毎に、ＣＣＣＰを加えないときを実線で示し、ＣＣＣＰは加えたときを破線で示す。また、グラフには、上から順にＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４と表示されているが、光の照射開始時刻である０ｓにおける各ｐＨの値は同じであり、ＣＣＣＰの有無によるｐＨの差を示している。
【００４１】
まず、レチナール−ＰｏＣｌＲタンパク質複合体について、ＣＣＣＰの非存在下では、図４（ａ）に実線で示すように、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌを加えると、光照射に伴い細胞外側のｐＨが高くなった。これは、細胞質側にＣｌ−が輸送されて細胞質側が電気的にマイナスになったことにより、細胞外側のプロトン（Ｈ＋）が電気的に細胞質側に移動し、その結果、細胞外側のプロトンは減りｐＨが高くなったことによるものと考えられる。また、ＣＣＣＰを加えると、図４（ａ）に破線で示すように、細胞外側のｐＨは、ＣＣＣＰを加えない場合に比べて更に高くなった。これは、ＣＣＣＰの添加により細胞膜の透過性が高くなり、更に細胞外側のプロトンが細胞質側に移動したことによるものと考えられる。
【００４２】
一方、Ｎａ２ＳＯ４を添加した場合には、「＋ＣＣＣＰ」と「−ＣＣＣＰ」で細胞外ｐＨの変化に差がなく、細胞外にＣｌ−がないためイオン輸送が行われていないことを示した。
【００４３】
レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体については、図４（ｂ）に実線で示すように、ＣＣＣＰの非存在下では、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４をそれぞれ添加した場合、光の照射により細胞外側のｐＨは高くなった。一方、ＣＣＣＰの存在下では、図４（ｂ）に破線で示すように、光を照射しても細胞外側のｐＨは殆ど変化しなかった。これは、ＣＣＣＰの非存在下では、細胞外側のプロトンが細胞質側へ輸送されるため、細胞外側のプロトンは減りｐＨが高くなり、ＣＣＣＰの存在下では、細胞質側に輸送されたプロトンが、細胞膜を透過して細胞質側に戻ったためであると考えられる。
【００４４】
このように、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体を発現させた大腸菌では、細胞外側にＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４を加えて光照射した場合、３種類の物質を添加した実験結果のグラフに違いが殆ど現れなかった。また、「＋ＣＣＣＰ」の細胞外側ｐＨに対して、「−ＣＣＣＰ」の細胞外側ｐＨが上昇することが確認された。これらの結果は、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体が、光エネルギーを駆動源としてプロトンを細胞外側から細胞質側へ輸送することを示唆している。また、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４を細胞外側に添加しても機能確認できたことから、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体は、細胞外側の環境状態に左右されず、細胞外側から細胞質側へのプロトンを輸送する機能を有することが確認された。
【００４５】
（実施例３）
レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体を哺乳類細胞で発現させ、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体のイオン輸送について解析を行った。実施例１の大腸菌を用いた実験では、細胞内電位を変化させることができず、細胞内の電位も通常状態の１水準のみでしか測定できなかったが、哺乳類細胞で発現させることができれば、細胞内電位を変化させることが可能となり、プロトンの輸送方法が能動輸送、受動輸送のいずれであるかを調べることができる。また、哺乳類細胞を用いることで、たとえば癌細胞特異的にプロトンポンプを発現させ、癌細胞を低ｐＨ状態にして死滅させるような治療方法などへの展開が可能になる。
【００４６】
（哺乳類細胞への発現）
ヒトコドンに最適化したＰｏＸｅＲ遺伝子を遺伝子合成によって作製したものを、ｐＥＧＦＰベクターのＨｉｎｄＩＩＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間にクローニングした。発現用にはＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社より購入したＮＤ７／２３細胞を用い、高グルコースのＤＭＥＭ培地（和光純薬）で３７℃、５％  ＣＯ２環境下で培養を行った。ＮＤ７／２３細胞へのＰｏＸｅＲ遺伝子を含むプラスミドのトランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。さらに細胞へのトランスフェクションを行った培地中に１μＭ全トランスレチナール（シグマアルドリッチ）を加えた。タンパク質の発現は蛍光顕微鏡（ＩＸ−７３、オリンパス）を用いて確認した。その結果、哺乳類細胞であるＮＤ７／２３細胞への発現が確認できた。またこの結果から、ヒト細胞への発現が可能と考えられる。
【００４７】
（電気生理学実験）
次に、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体を哺乳類細胞（ＮＤ７／２３細胞）に発現させ、細胞内電位を変化させてレチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体のプロトンの能動輸送を確認した。測定はホールセルパッチクランプ法にて行い、具体的には以下のようにして行った。
・測定方法
ホールセルパッチクランプ測定は、アンプ（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ）を用いて行った。ＯＳＧ  Ｌ１２１９４−００−３９０７０（浜松ホトニクス）からの光をライトガイドを用いて倒立型顕微鏡（ＩＭＴ−２、オリンパス）に導入することで連続光照射を行った。照射光はメカニカルシャッター（ＬＳ６Ｓ、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いて制御した。ガラスピペットはマイクロピペットピラー（Ｐ−９７、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて成形し、マイクロフォージ（ＭＦ−８３０、ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を用いて火仕上げを行った。ピペット抵抗は１．５−２．５ＭΩ程度とした。ピペット電極はマイクロマニピュレーター（ＰＣＳ−５０００、Ｂｕｒｌｅｉｇｈ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて操作した。電流は１０  ｋＨｚで記録し、アンプ中の内部回路によって２  ｋＨｚでフィルタリングした。データの保存とシャッターの開閉は、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １５５０を用いて、ソフトウェアｐＣｌａｍｐ  １０によって行われた。得られたデータはソフトウェアＣｌａｍｐｆｉｔ１０を用いて解析した。
標準外部溶液には、１４０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２  ｍＭ  ＣａＣｌ２、２  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  （ｐＨ  ７．２）を用いた。一方、標準内部液には、１１０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  １  ｍＭ  ＣａＣｌ２、５  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  （ｐＨ  ７．２）を用いた。溶液の浸透圧は適切な量のスクロースを加えることで３００ｍＯｓｍに調節した。
【００４８】
・結果と考察
図５に、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体の哺乳類細胞での電気生理学実験の結果を示す。図５（ａ）は、細胞外側ｐＨを７．２として、光（５７０ｎｍ）を照射した際の細胞膜の電流の測定結果である。パラメータは細胞質側の電圧であり、細胞質側の電圧を２０ｍＶ，０ｍＶ，−２０ｍＶ，−４０ｍＶ，−６０ｍＶとしてそれぞれ測定した。
図５（ａ）に示すように、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体を発現させた哺乳類細胞の細胞外側に光を照射すると、電流が発生して一旦大きく下がった。また、光を照射している間、安定な電流が流れた。安定時の電流値（絶対値）は、細胞質側の電圧が−６０ｍＶで最も大きく、２０ｍＶで最も小さかった。また、電圧値が低いほど（−６０ｍＶ、−４０ｍＶ、−２０ｍＶ、０ｍＶ、２０ｍＶの順に）安定時の電流値（絶対値）は大きくなった。これは、細胞内電圧が低いほど大きな電流が流れることを示している。光の照射を止めると、細胞質側の電圧による電流値の差はなくなり、光を照射しない元の電流値に戻った。
【００４９】
図５（ｂ）は、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体を発現させた哺乳類細胞（ＮＤ７／２３細胞）に光（５７０ｎｍ）を照射した際の電流測定結果につき、横軸を細胞質側の電圧、縦軸を、光照射したときの安定時の電流値とした図である。黒丸は、細胞外側ｐＨを７．２としたときの結果であり、白丸は、細胞外側ｐＨを９．０としたときの結果である。黒丸による実験線を実線で示し、白丸による実験線を破線で示す。また、図５（ｂ）には、ｐＨ７．２の実験値を用いて、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体がチャネルであると仮定した場合のｐＨ９．０での理論値を破線（上の破線）で示している。破線（上の破線）で示す通り、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体がチャネルの場合、細胞外のｐＨが上昇することで、プロトン輸送が小さくなることが予想される。
【００５０】
図５（ｂ）に示すように、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体を発現させた哺乳類細胞では、細胞外側のｐＨが７．２（実線）と９．０（破線）で、電圧値に関わらずほぼ同じくらいの電流値を示した。これは、レチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体は、細胞外側のｐＨ（プロトン量）に影響されず同等の輸送能を持つことを示しており、イオン濃度勾配により輸送を行う受動輸送ではなく、能動輸送を行っていることが判明した。つまり、ＰｏＸｅＲタンパク質は、プロトンを光エネルギーにより細胞外側から細胞質側へ能動輸送するプロトンポンプとしての機能を有するタンパク質であるといえる。
【００５１】
また、図５（ｂ）の結果では、黒丸（ｐＨ７．２）の近似線である実線と電流値が０ｐＡとの交点は１６４ｍＶであり、白丸（ｐＨ９．０）の近似線である破線と電流値が０ｐＡとの交点は１５０ｍＶであった。また、図５（ｂ）の結果から、細胞質側の電圧が−７５ｍＶから１５０ｍＶの範囲まで、哺乳類細胞内で、光エネルギーによってＰｏＸｅＲタンパク質によるプロトンの逆向きの能動輸送（細胞質側から細胞外側への能動輸送）が行われることが実証された。
なお、−７５ｍＶから１５０ｍＶという電圧範囲は、細胞内で発生しうる電圧をカバーしているため、あらゆる状態にある様々な細胞種に適用することができると言える。例えば、プロトンポンプを発現させる遺伝子を、ベクターを使用し導入し細胞内のプロトン量を増加させる制御を行うなどの利用が可能となる。
【００５２】
（実施例４）
次に、ＰｏＸｅＲタンパク質の変異体を作成し、プロトン輸送能を測定した。図６に、野生型または変異型ＰｏＸｅＲタンパク質を用いて、大腸菌細胞中でレチナール−ＰｏＸｅＲタンパク質複合体を発現させた場合のポンプ活性アッセイの結果を示す。図６中、（ａ）は、光照射したときの細胞外側ｐＨの時間変化を示し、（ｂ）はＣＣＣＰの非存在下において細胞外側ｐＨがピークに至るまでのｐＨ変化速度（ΔｐＨ／ｓ）を示す。ポンプ活性アッセイは実施例１と同様の方法により行った。なお、光照射は、図６（ａ）の横軸目盛りの０秒、５００秒で開始し、光照射時間は１５０秒とした。
【００５３】
変異体は、野生型ＰｏＸｅＲタンパク質のαへリックス内に含まれるアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）を他のアミノ酸（グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン（Ｎ））に置換することにより、図６に示す合計１１個の変異体を作成した。図６中の表示は、以下に対応する。
ＰｏＸｅＲ  ＷＴ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＷＴ
Ｅ３Ｑ          ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から３番目のＥをＱに置換
Ｅ３５Ｄ        ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から３５番目のＥをＤに置換
Ｅ３５Ｑ        ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から３５番目のＥをＱに置換
Ｄ７４Ｅ        ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から７４番目のＤをＥに置換
Ｄ１０８Ｅ      ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から１０８番目のＤをＥに置換
Ｄ１０８Ｎ      ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から１０８番目のＤをＮに置換
Ｄ１１９Ｎ      ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から１１９番目のＤをＮに置換
Ｅ１５８Ｑ      ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から１５８番目のＥをＱに置換
Ｄ２１６Ｅ      ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から２１６番目のＤをＥに置換
Ｄ２１６Ｎ      ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から２１６番目のＤをＮに置換
Ｅ２１９Ｑ      ：ＰｏＸｅＲタンパク質のＮ末端側から２１９番目のＥをＱに置換
【００５４】
なお、この実施例では、タンパク質の発現量の差がプロトン輸送能に影響を与えないよう、レチナール−タンパク質複合体の発現量を定量し、光照射直後のｐＨ変化速度をレチナール−タンパク質複合体の発現量当たりの変化速度とすることにより、野生型および変異型タンパク質のイオン輸送活性を比較した。
（大腸菌細胞中のレチナール−タンパク質複合体の発現量の定量）
大腸菌中におけるレチナール−タンパク質複合体の発現量は、井上らの方法（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ４，  １６７８  （２０１３））を参考にして定量した。菌体を４，８００×ｇ、４°Ｃの条件で回収したあと、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）の溶媒に懸濁し、体積を３  ｍＬに調整した。１  ｍＭリゾチーム溶液を２００μＬ加え、室温で１時間ゆっくりと混和した。大腸菌の細胞は超音波によって破砕し、３．０％  ＤＤＭで可溶化した。終濃度５００ｍＭのヒドロキシルアミン（ＨＡ）を加え、ロングパスガラスフィルターで吸収波長が短波長側にシフトした変異体については（図６中のＤ７４ＥおよびＤ１０８Ｅ）４６０ｎｍ、それ以外の変異体では５００ｎｍより短波長側の光をカットした１−ｋＷのタングステンハロゲンプロジェクターランプの光を照射し、その時に生じた、レチナール−タンパク質複合体のＨＡによるブリーチ過程を表す吸収変化を、積分球ユニットを取り付けた紫外可視吸光光度計を用いて測定した。そして、その時に生じるレチナールオキシム（３６０ｎｍにおけるモル吸収断面積：ε＝３３，６００Ｍ−１  ｃｍ−１）の吸収量から、大腸菌中に含まれていたレチナール−タンパク質複合体の物質量を算出した。
【００５５】
・結果と考察
図６（ａ）に実線で示すように、野生型および変異型のＰｏＸｅＲタンパク質を用いた複合体を発現させた大腸菌は、光照射をすると細胞外側のｐＨは大きくなった。また、ｐＨの変化速度（ΔｐＨ／ｓ）については、図６（ｂ）に示すように、変異によりｐＨの変化速度が低下するものもあったが、いずれの変異体もプロトン輸送能を有していた。また、Ｅ３Ｑ、Ｄ１１９Ｎ、Ｅ１５８Ｑ、Ｄ２１６Ｎ、Ｅ２１９Ｑの変異体については、野生型（ＰｏＷｅＲ  ＷＴ）よりもｐＨ変化速度が上昇した。これらの結果から、ＰｏＸｅＲタンパク質のアミノ酸配列において３番目、１１９番目、１５８番目、２１６番目、２１９番目のアミノ酸残基を変異させることよりプロトン輸送能を上昇させることができた。特に、１１９番目、１５８番目、２１６番目、２１９番目のアミノ酸残基を変異した変異体で、細胞外側から細胞質側へのプロトン輸送活性が大きく向上した。
【００５６】
以上より、自然界に存在する生物のゲノムに由来するタンパク質より高い輸送機能をもつ人工的なタンパク質である、タンパク質のＮ末端側から１１９、１５８、２１６、２１９番目の位置にあるアスパラギン酸、グルタミン酸を置換した変異体を見出した（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の発色団−タンパク質複合体は、光エネルギーによって細胞内の水素イオン濃度を操作できるため、付加価値が高い。本発明の発色団−タンパク質複合体、遺伝子、発現ベクター及び形質転換体は、例えば以下のようにして利用することができる。
（１）水素イオン濃度勾配メカニズムの研究用としての利用
水素イオン濃度勾配のメカニズムの基礎研究として利用することができる。例えば、基礎研究で用いる動物細胞の遺伝子操作用に、ＰｏＸｅＲ遺伝子を含むＤＮＡとして、試薬キット等として販売する。
（２）癌治療における利用
本発明の発色団−タンパク質複合体を癌細胞に組み込み、癌細胞を光で死滅させる治療薬または試薬キット等として販売する。
（３）プロトンポンプ阻害薬の代替治療としての利用
患者の細胞に野生型または変異型のＰｏＸｅＲを発現させ、体内のプロトンポンプによるプロトン輸送を緩和する。
（４）光源のＲＧＢ３色を駆使した神経活動制御のツールとしての利用
光源のＲＧＢ３色を駆使した神経活動制御のツールの一つとして、野生型または変異型のＰｏＸｅＲタンパク質を、緑色光（Ｇ）を利用した細胞質向きプロトンポンプとして利用する。例えば、ｉＰＳ細胞などにＰｏＸｅＲ遺伝子を組み込み、治療に用いる。ツール例としては、ＲＧＢ３色につき、Ｒ：高度好塩古細菌由来のクロライドポンプ（公知物質）、Ｇ：ＰｏＸｅＲタンパク質とレチナールの複合体（本発明）、Ｂ：藻類由来のチャネルロドプシン（公知物質）を用いる例が挙げられる。
（５）シナプス小胞における神経伝達物質の制御における利用
シナプス小胞で特異的にＰｏＸｅＲを発現可能な試薬として利用する。
【符号の説明】
【００５８】
３      細胞膜
５      細胞外側
７      細胞質側
１０    複合体
１１    ＰｏＸｅＲタンパク質
１２    変異位置
１３    Ｎ末端側
１５    Ｃ末端側
１７    レチナール
２１    プロトン
３１    光源
【図１】
2018039744.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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