(57)【要約】【課題】本発明の目的は、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を高めるように作用する有効成分を含有する、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物を提供することにある。【解決手段】上記目的は、下記（１）〜（４）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物により解決される。（１）アデニン（２）ニコチンアミド（３）ヌクレオシドリン酸化合物（４）上記（１）〜（３）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物の構造を分子内に有する化合物【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（４）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物。
（１）アデニン
（２）ニコチンアミド
（３）ヌクレオシドリン酸化合物
（４）上記（１）〜（３）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物の構造を分子内に有する化合物
【請求項２】
前記ヌクレオシドリン酸化合物は、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、チミジン一リン酸、チミジン二リン酸、チミジン三リン酸、ウリジン一リン酸、ウリジン二リン酸、ウリジン三リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸又はグアノシン三リン酸である、請求項１に記載のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物。
【請求項３】
前記（４）の化合物は、酸化型又は還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型又は還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミド  １，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチド、アセチル補酵素Ａ又はアセトアセチル補酵素Ａである、請求項１〜２のいずれか１項に記載のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物。
【請求項４】
前記組成物は、サイトカインの存在下でＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導するための組成物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物。
【請求項５】
前記組成物は、ＴＧＦ−βの存在下で、該組成物を用いない場合と比べて、１．２倍の強度で、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導するための組成物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物。
【請求項６】
前記組成物は、サイトカインの存在下でＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化を抑制するための組成物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する、免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物、免疫調整用組成物又は腸内環境改善用組成物。
【請求項８】
被験体から採取したＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞に、サイトカインの存在下で、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を接触させる工程を含む、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を誘導するための組成物及びＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーとは、「ダニやホコリ、花粉、食物などの異物によって引き起こされる抗原特異的な免疫学的機序を介して生体にとって不利益な症状が惹起される現象」をいう（例えば、非特許文献１を参照）。また、自己免疫疾患とは、「自分の細胞やホルモン等を異物とみなし、免疫が攻撃をしかけることで惹起される生体にとって不利益な症状」をいう。両者はともに、本来生体に害のあるものに対して働くはずの免疫システムが、無害のものに対して過剰に機能することで、生体に不利益な症状を引き起こす。
【０００３】
しかし、このような免疫の過剰応答を抑制するシステムも、生体は同時に兼ね備えている。例えば、外来のタンパク質に対して免疫反応が起こらない仕組みである経口免疫寛容が働くことで、食物アレルギーが起こらないように制御されている（例えば、非特許文献２を参照）。つまり、食物アレルギーとは特定の食物に対する免疫寛容がうまく働かなくなっている状態と考えられる。
【０００４】
これまでのアレルギー治療は、アレルゲンの徹底除去によるアレルギーの発症防止が主であった。しかし、アレルゲンを除去する生活は患者やその家族に多大な精神的ストレスを与える。また、原因アレルゲンに対する経口免疫寛容が生体に誘導されない限り、根本的な治療にはならない。食物アレルギーに関しては、根本的な治療を目指す治療法として、原因アレルゲンを含む食品を少量ずつ摂取することで原因アレルゲンに対する耐性の獲得を誘導する経口免疫療法が臨床研究されている。しかし、治療経過中にアナフィラキシーショックを起こすことも多く、かつ、重篤な副反応も起こりうるため現段階では、本治療法は、一般診療として推奨されていない（例えば、非特許文献２を参照）。自己免疫疾患に関しても現在対処療法が主で、完治を目指した治療は難しい。
【０００５】
そこで、免疫寛容を効率的に誘導することが可能となれば、アレルギーや自己免疫疾患の根本的な治療を安全に行え、さらには、まだこれらを発症していない人々の発症を未然に防ぐことができる。
【０００６】
生体内の免疫系には様々な免疫細胞が関与する。Ｔ細胞は、免疫系を担う重要な細胞として知られており、その名称は胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）でつくられる細胞ということに由来する。Ｔ細胞は、発現する細胞表面マーカーの種類や数によって数十種類以上に分類され、それぞれが個別の役割を担う。
【０００７】
Ｔ細胞の１種として制御性Ｔ細胞が知られており、その中でもＦｏｘｐ３が陽性である制御性Ｔ細胞（以下、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞やＴｒｅｇなどとよぶ。）は、抗原特異的に異常な又は過剰な他のＴ細胞の働きを抑制する、免疫寛容において重要な役割を果たし得ることが知られている。例えば、ヒト腸内においては常在細菌がＴｒｅｇを誘導し免疫恒常性を保っていることや、Ｔｒｅｇの数やｐｏｐｕｌａｔｉｏｎがアレルギーや自己免疫疾患の発症に影響を与えることが報告されている（非特許文献３及び４を参照）。
【０００８】
Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞に対するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の影響について、ＮＡＤの静脈投与によりＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞が減少することや腫瘍組織においてはＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を活性化すること（非特許文献５を参照）、ＮＡＤはＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞をＴｈ１７細胞に転換すること（非特許文献６を参照）が知られている。また、ＮＡＤはＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞などのヘルパーＴ細胞に作用し、細胞の性質を変化させ得ることが知られている（非特許文献７を参照）。 
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「食物アレルギーの診療の手引き２０１１」２０１１年
【非特許文献２】「食物アレルギー診療ガイドライン２０１２」２０１２年
【非特許文献３】Robinson D.S. et al., The Journal of clinical Investigation., 2004, 114, 1389-1397
【非特許文献４】Fessler, J. et al., BioDrugs., 2013, 27, 281-291
【非特許文献５】Hubert, S., et al., J. Ex. Med., 2010, pp.2561-2568
【非特許文献６】Elkhal et al., Scientific reports, 2016, pp.1-12
【非特許文献７】Tullius et al., Nature Communications, 2014, pp.1-17
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のとおり、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞は、生体内において免疫寛容を促進する作用を有し、該作用によりアレルギー症状や自己免疫症状などの免疫系症状を改善、緩和、抑制などをし得る。また、非特許文献５〜６には、ＮＡＤがＴｈ１７細胞に転換するなどしてＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の細胞数を減じること、腫瘍組織におけるＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を活性化し得ることが記載されている。しかし、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を効率的に高めることについては、これまでに知られていない。
【００１１】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を高めるように作用する有効成分を含有する、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物を提供すること及び該組成物を利用したＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、驚くべきことに、ＮＡＤをはじめとして、アデニン、ニコチンアミド、ヌクレオシドリン酸化合物及びこれらの化合物の構造を分子内に有する化合物（以下、ＮＡＤ等ともよぶ。）がＦｏｘｐ３陰性であるナイーブＴ細胞（以下、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞ともよぶ。）をＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞へ分化誘導する作用を示すことを見出した。
【００１３】
これまでに、ＮＡＤがＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の細胞数を減じることや特定部位にあるＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を活性化することは知られていた。また、非特許文献７のＦｉｇｕｒｅ  １０に示されているとおり、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）やインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で、並びにＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γに対する抗体の存在下で、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を分化誘導できることは知られていた。
【００１４】
しかし、ＮＡＤ等が有する作用として、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞のようなＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導し、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を高める作用は、本発明者らによって初めて見出された作用である。そして、本発明者らは、上記ＮＡＤ等が有する作用に基づいて、ＮＡＤ等を有効成分として含有する、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物及び該組成物を利用したＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の製造方法を創作することに成功した。本発明はこれらの知見及び成功例に基づいて完成するに至った発明である。
【００１５】
したがって、本発明によれば、下記（１）〜（４）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物が提供される。
（１）アデニン
（２）ニコチンアミド
（３）ヌクレオシドリン酸化合物
（４）上記（１）〜（３）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物の構造を分子内に有する化合物
【００１６】
本発明の別の側面によれば、本発明のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物を有効成分として含有する、免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物、免疫調整用組成物又は腸内環境改善用組成物が提供される。
【００１７】
好ましくは、本発明の組成物において、前記ヌクレオシドリン酸化合物は、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、チミジン一リン酸、チミジン二リン酸、チミジン三リン酸、ウリジン一リン酸、ウリジン二リン酸、ウリジン三リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸又はグアノシン三リン酸である。
好ましくは、本発明の組成物において、前記（４）の化合物は、酸化型又は還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型又は還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミド  １，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチド、アセチル補酵素Ａ又はアセトアセチル補酵素Ａである。
好ましくは、本発明の組成物は、サイトカインの存在下でＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導するための組成物である。
好ましくは、本発明の組成物は、ＴＧＦ−βの存在下で、該組成物を用いない場合と比べて、１．２倍の強度で、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導するための組成物である。
好ましくは、本発明の組成物は、サイトカインの存在下でＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化を抑制するための組成物である。
【００１８】
本発明の別の側面によれば、被験体から採取したＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞に、サイトカインの存在下で、本発明の組成物を接触させる工程を含む、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の組成物は、有効成分によるナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞のようなＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導する作用並びに免疫抑制作用、免疫寛容促進作用、免疫調整作用及び腸内環境改善作用を通じて、経口的又は非経口的な形態で、ぜんそく、アトピー、花粉症、食物アレルギーなどのアレルギー症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防するための組成物及び免疫療法のための組成物として使用できる。
【００２０】
特に、食物アレルギーの発症者にとって、アレルゲン除去食品の摂取は該発症者やその周囲の者にとって負担が甚大であるが、免疫寛容を増強し得る本発明の組成物を飲食品や医薬品などに配合又はそれら自体として使用することでアレルギー症状の改善が期待できる。
【００２１】
また、本発明の製造方法によれば、生体外でのＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の製造が可能であることから、生体外で製造したＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を生体内に移入することにより、上記したアレルギー症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、後述する実施例の例１に記載があるとおり、ＮＡＤによるＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の分化誘導作用及びＴｈ１７細胞の減少化作用の結果を示す図である。
【図２】図２は、後述する実施例の例２に記載があるとおり、ＩＬ−２存在下で、ＮＡＤがＴｈ１７細胞の分化を誘導しなかった結果を示す図である。
【図３】図３は、後述する実施例の例２に記載があるとおり、ＩＬ−２存在下で、ＮＡＤがＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の分化を誘導した結果を示す図である。
【図４】図４は、後述する実施例の例３に記載があるとおり、Ｔｈ１７細胞への分化を誘導するための各種抗体及びサイトカインの存在下で、ＮＡＤがＴｈ１７細胞の分化を促進しなかった結果を示す図である。
【図５】図５は、後述する実施例の例３に記載があるとおり、Ｔｈ１７細胞への分化を誘導するための各種抗体及びサイトカインの存在下で、ＮＡＤがＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の分化を誘導した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の詳細について説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００２４】
［Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物］
本発明の組成物の一態様は、下記（１）〜（４）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物である。
（１）アデニン
（２）ニコチンアミド
（３）ヌクレオシドリン酸化合物
（４）上記（１）〜（３）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物の構造を分子内に有する化合物
【００２５】
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用される。例えば、「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形担体又は溶媒の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。
【００２６】
一般に、骨髄で産生されたＴ細胞は胸腺で分化及び成熟した後、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞として血流を循環している。ナイーブＴ細胞が、各種サイトカインによる刺激を受けることにより、各サブセットへと分化する。例えば、ナイーブＴ細胞は、ＴＧＦ−βやＩＬ−６などの刺激により、Ｔｈ１７細胞やＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞に分化する。また、Ｔｈ１７細胞はＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞へと可逆的又は不可逆的に転換することが示唆されている。分化とは、一般的に、特性をもたない細胞が様々な特性を持つ細胞に変化することをいうところ、本明細書における「分化」は、ある特性を有する細胞が別の特性を有する細胞に転じることを広く意味することに加え、一般に分化細胞として知られている２種の細胞の間での、可逆的又は不可逆的な相互の転換をも含む、より広範な概念として用いられ得る。
【００２７】
上記（１）〜（４）の化合物は、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導する作用、すなわち、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用を有するものであれば特に限定されず、例えば、それら化合物自体に加えて、被験体に適用した場合に上記化合物になり得るものや上記化合物のように機能し得るものを含み、具体的にはアデニン、ニコチンアミド及びヌクレオシドリン酸化合物並びにアデニン、ニコチンアミド及び／又はヌクレオシドリン酸化合物の構造を分子内に有する化合物の薬学的に許容可能な塩といった塩や類似体（アナログ）などを包含する、一定の範囲を有するものである。
【００２８】
上記（１）〜（４）の化合物は、組成物の形態や用途などに応じて適宜変更し得るものであり、例えば、経口用組成物として使用される場合は、経口した際に被験体に対して安全性が認められるものであることが好ましい。上記（１）〜（４）の化合物は、上記（１）の化合物、上記（２）の化合物、上記（３）の化合物及び上記（４）の化合物をそれぞれ単独で、又はこれらの２種以上を組み合わせて使用し得る。
【００２９】
上記（３）の化合物であるヌクレオシドリン酸化合物は、分子内に塩基、糖（グリコシル基）及びリン酸基を有する構造を有し、かつ、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用を有するものであれば特に限定されないが、例えば、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）やＡＤＰの構造において置換、欠失、挿入などの修飾がなされているＡＤＰアナログが挙げられ、具体的にはアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）などが挙げられ、好ましくはＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用が高く、かつ、細胞障害性が低い、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＣＭＰ、ＴＭＰ、ＵＭＰ及びＧＭＰである。ヌクレオシドリン酸化合物は、例えば、ｃＡＭＰなどの環状型であってもよく、ｄＡＭＰなどのデオキシ型であってもよい。上記（３）の化合物は、例えば、ヌクレオシドリン酸化合物のいずれか１種を単独で、又はヌクレオシドリン酸化合物の２種以上を組み合わせて使用し得る。
【００３０】
上記（４）の化合物は、アデニン、ニコチンアミド及び／又はヌクレオシドリン酸化合物の構造を分子内に有し、かつ、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用を有するものであれば特に限定されないが、例えば、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ、ＮＡＤ＋）や還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）といったニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰ＋）や還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）といったニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（ＮＧＤ）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミド  １，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチド、アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）又はアセトアセチル補酵素Ａ（アセトアセチルＣｏＡ）などが挙げられ、好ましくはＡＤＰの構造を分子内に有し、かつ、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用が顕著に高い、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、アセチルＣｏＡ及びアセトアセチルＣｏＡである。上記（４）の化合物は、例えば、上記（４）の化合物のいずれか１種を単独で、又は上記（４）の化合物の２種以上を組み合わせて使用し得る。
【００３１】
上記（４）の化合物のその他の例としては、構造の一部にニコチンアミドを有する化合物及びその類似体が挙げられ、具体的にはニコチンアミドを構成するピリジン及び／又はカルボン酸アミドにおいて部分的に置換、欠失、挿入などの修飾がなされたピリジンカルボン酸アミド誘導体などが挙げられる。ピリジンカルボン酸アミド誘導体としては、例えば、２−クロロニコチンアミド、６−メチルニコチンアミド、イソニコチンアミド、４−ピリジンカルボン酸アミド、チミン、シトシン、ウラシル、ナイアシン、ピコリン、ビニルピリジン、２−アミノ−３−メチルピリジン、３−アミノピリジン、３−メチルピリジン、３−シアノピリジン、３−エチルピリジン、３−ピリジンメタノール、３−ビニルピリジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
上記（１）〜（４）に記載の化合物は、その入手方法について特に限定されず、例えば、市販されているものや当業者に通常知られている合成的手法により製造したものなどとして入手することができる。例えば、上記（１）〜（４）の化合物は、その製造方法に微生物発酵工程が含まれるとき、上記（１）〜（４）の化合物の添加とは別に、又は該添加と組み合わせて、微生物の体内、例えば乳酸菌などの細菌の菌体内に存在する上記（１）〜（４）の化合物を増大させるような手法を採用することにより製造することができる。このようにして得た微生物発酵物は、それ自体、本発明の組成物の一態様として使用できる。
【００３３】
Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物は、含有する上記（１）〜（４）の化合物が有効成分として機能することにより、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用を示す。Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用は、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導する作用であって、結果としてＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を高め得る作用であれば、その作用機序、合わせて伴う他の作用、程度などについては特に限定されない。
【００３４】
通常、生体内にはＴＧＦ−βやＩＬ−２などのサイトカインが存在する。そこで、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物が生体内に適用されると、サイトカインの存在下でＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化が誘導される。したがって、本発明の組成物の具体的な一態様は、サイトカインの存在下でＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導するための組成物である。サイトカインとしては、例えば、Ｔ細胞の増殖や分化に関連するサイトカインなどが挙げられ、具体的にはＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−２３などが挙げられるが、好ましくはＴＧＦ−β及びＩＬ−２である。サイトカインはこれらを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３５】
上記（１）〜（４）の化合物は、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化を誘導する作用と関係して、又は該作用とは関係なく、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化を抑制する作用、すなわち、Ｔｈ１７陽性Ｔ細胞への分化抑制作用を示し得る。したがって、本発明の組成物の具体的な一態様は、サイトカインの存在下でＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化を抑制するための組成物である。
【００３６】
Ｔｈ１７陽性Ｔ細胞が産生するＩＬ−１７は、炎症性サイトカインや炎症メディエーター（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２２、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＮＯＳ−２、メタロプロテアーゼ、ケモカインなど）の産生を誘導することが知られている。したがって、上記（１）〜（４）の化合物は、Ｔｈ１７陽性Ｔ細胞への分化抑制作用を介して、上記の炎症性サイトカインや炎症メディエーターの産生を抑制することができる。
【００３７】
Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用及びＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化抑制作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載があるように、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞及びＴｈ１７陽性Ｔ細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定することやこれらの細胞の細胞数や割合を測定することにより評価することができる。
【００３８】
Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用及びＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化抑制作用の評価方法の一具体例は、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞とＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを得て、次いで得られたｃＤＮＡライブラリーを基にＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞及びＴｈ１７陽性Ｔ細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定することを含む方法である。
【００３９】
Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用及びＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化抑制作用の評価方法の別の一具体例は、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞とＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物とを共培養し、次いで培養した細胞における細胞内標識又は細胞外標識によってＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞やＴｈ１７陽性Ｔ細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを測定することを含む方法である。Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞やＴｈ１７陽性Ｔ細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ＥＬＩＳＡやラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができる。
【００４０】
Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用は、その程度について特に限定されないが、例えば、ＴＧＦ−βの存在下で、本発明の組成物を用いない場合よりもＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を高める作用であり、好ましくは本発明の組成物を用いない場合よりもＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を１．１倍以上に高める作用であり、より好ましくは本発明の組成物を用いない場合よりもＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を１．２倍以上に高める作用であり、さらに好ましくは本発明の組成物を用いない場合よりもＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を１．３倍以上に高める作用であり、なおさらに好ましくは本発明の組成物を用いない場合よりもＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合を１．４倍以上に高める作用である。
【００４１】
Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞からＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化を抑制する作用は、その程度について特に限定されないが、例えば、本発明の組成物を用いない場合よりもＴｈ１７陽性Ｔ細胞の割合を低める作用であり、好ましくは本発明の組成物を用いない場合よりもＴｈ１７陽性Ｔ細胞の割合を０．９倍以下に低める作用であり、より好ましくは本発明の組成物を用いない場合よりもＴｈ１７陽性Ｔ細胞の割合を０．８５倍以下に低める作用であり、さらに好ましくは本発明の組成物を用いない場合よりもＴｈ１７陽性Ｔ細胞の割合を０．８０倍以下に低める作用である。
【００４２】
［免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物、免疫調整用組成物及び腸内環境改善用組成物］
本発明の組成物の具体的な一態様は、上記（１）〜（４）の化合物を有効成分として含有する、又はＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物を有効成分として含有する、免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物、免疫調整用組成物及び腸内環境改善用組成物である。
【００４３】
免疫抑制用組成物は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、適用された被験体の免疫応答を抑制又は低減するための組成物であり得る。
【００４４】
免疫寛容促進用組成物は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、適用した被験体における抗原に対し免疫応答が抑制される状態（すなわち免疫寛容状態）になることを促進するための組成物や自己に対し過剰に応答する免疫が抑制される状態になることを促進するための組成物であり得る。
【００４５】
免疫調整用組成物は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、適用された被験体に対して、免疫抑制や免疫寛容促進を介して、又はこれらに関係なく、免疫応答を緩和や改善するなどして適正化するための組成物であり得る。
【００４６】
腸内環境改善用組成物は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、適用された被験体の腸内の免疫応答を適正化して、腸内環境が良好になるように改善又は維持するための組成物であり得る。
【００４７】
免疫応答や免疫寛容のメカニズムは未解明な部分が多く、本発明の技術的範囲はいかなる理論や推測にも拘泥されるものではないが、本発明の組成物の具体的な一態様である免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物、免疫調整用組成物及び腸内環境改善用組成物は、例えば、適用された被験体において、Ｔｒｅｇの割合を高めることにより、それぞれの作用が発揮され得る。
【００４８】
免疫抑制状態や免疫寛容状態は、その評価方法について当業者にとって公知の方法を特に制限せずに挙げることができ、例えば、Ｔｒｅｇの反応性を測定することにより評価する方法が挙げられ、具体的には上記したようなＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用及びＴｈ１７陽性Ｔ細胞への分化抑制作用の評価方法が挙げられる。
【００４９】
免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物及び免疫調整用組成物は、Ｔｒｅｇを誘導して免疫寛容、特に経口免疫寛容を増強するために使用するものであってもよい。例えば、食物アレルギーの治療又は予防が望まれる対象に対し、免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物及び免疫調整用組成物を配合した飲食品や医薬品を適用することにより、経口免疫寛容が誘導され、食物アレルギーなどのアレルギー症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが可能である。免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物及び免疫調整用組成物は、非経口免疫寛容を誘導するものであってもよい。
【００５０】
また、免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物及び免疫調整用組成物は、ＩＬ−１７の産生やＩＬ−１７によって惹起される炎症性サイトカインや炎症メディエーターの産生に伴う、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病などの症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。
【００５１】
Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物、免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物、免疫調整用組成物及び腸内環境改善用組成物は、それらを単独で、又はそれらを配合する飲食品組成物や医薬品組成物などの形態をとり得る。したがって、本発明の組成物の具体的な一実施態様は、上記（１）〜（４）の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、又はＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物、免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物、免疫調整用組成物若しくは腸内環境改善用組成物を含有する、飲食品組成物、医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物、動物飼料組成物などである。
【００５２】
Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導用組成物、免疫抑制用組成物、免疫寛容促進用組成物、免疫調整用組成物及び腸内環境改善用組成物は、その適用対象や適用方法について特に限定されず、例えば、適用対象は動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。
【００５３】
［飲食品組成物］
飲食品組成物は、摂取後に少なくともＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用が発揮し得る限り、あらゆる飲食品の形態をとり得るが、例えば、果汁飲料、野菜ジュース、果物野菜ジュース、茶飲料、コーヒー飲料、スポーツドリンク、清涼飲料、健康飲料などの飲料；ヨーグルトやチーズなどの乳製品；スープ、麺、プリン、ジャムなどの加工飲食品；チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット、スナックなどの菓子；アイスクリーム、シャーベット、氷菓などの冷菓；醤油や味噌などの調味料などが挙げられる。飲食品組成物には、本発明の目的を達成し得る限り、上記（１）〜（４）の化合物以外の他のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用、免疫抑制作用、免疫寛容促進作用、免疫調整作用及び／又は腸内環境改善作用を有し、かつ、食経験のある、天然物若しくは非天然物やこれらの含有物を配合してもよい。例えば、飲食品組成物には、経口免疫寛容増強効果が知られている、乳酸菌や該乳酸菌を含む発酵産物；フラボノイド、ゲニステイン、ゲニスチンなどを含む豆乳；醤油などに含まれる大豆発酵多糖類；ビタミンＣなどのビタミン類などを配合することが好ましい。
【００５４】
乳酸菌とは、例えば、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属の乳酸菌が挙げられるが、ラクトコッカス属の乳酸菌が好ましく、ラクトコッカス・ラクティスがより好ましく、ラクトコッ力ス・ラクティスＫ４７８株（ラクトコッ力ス・ラクティスＫ４７８株は、Ｋ４７８として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１４年１月９目に受領され、受託番号ＮＩＴＥ−Ｐ０１７８６が付与されている。）がさらに好ましい。
【００５５】
飲食品組成物における有効成分の含有量は、摂取後に少なくともＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用が発揮し得る程度の量であれば特に限定されないが、例えば、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用は用量依存的である傾向を鑑みて、摂取者の体格、年齢、所望の効果の程度などに合わせて適宜設定することができる。具体的には、有効成分がＮＡＤ又はＮＡＤＨである場合、有効成分の摂取量が、例えば、１〜１，０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日となるように、飲食品組成物における有効成分の含有量を適宜設定することができるが、これに限定されない。摂取回数は特に限定されないが、例えば、１日１〜３回であり、摂取量に応じて適宜回数を増減することができる。
【００５６】
有効成分は、上記（１）〜（４）の化合物のいずれかを単独で、又はこれらの２種以上を組み合わせて使用することができ、或いは、これらと、上記（１）〜（４）の化合物と同様の作用を有することが知られている他の成分とを組み合わせて使用することができる。
【００５７】
飲食品組成物は、本発明の目的を達成し得る限り、他の成分と混合して使用することができる。他の成分としては、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油などの通常の食品加工に使用される添加物をさらに含有することができる。添加物の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。
【００５８】
飲食品組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態をとり得る。
【００５９】
飲食品組成物の具体的な一態様は、例えば、生体に対して一定の機能性を有する飲食品である機能性飲食品である。機能性飲食品は、例えば、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品に加えて、乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品を包含する。さらに機能性飲食品は、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ  ｃｌａｉｍ）が適用される健康飲食品を包含する。
【００６０】
飲食品組成物の包装形態は特に限定されず、剤形などに応じて適宜選択できるが、例えば、ＰＴＰなどのブリスターパック；ストリップ包装；ヒートシール；アルミパウチ；プラスチックや合成樹脂などを用いるフィルム包装；バイアルなどのガラス容器；アンプルなどのプラスチック容器などが挙げられる。
【００６１】
［医薬品組成物］
医薬品組成物は、適用後に少なくともＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用が発揮し、それに伴い免疫疾患を治療及び／又は予防し得る限り、あらゆる医薬品の形態をとり得る。医薬品組成物には、本発明の目的を達成し得る限り、上記（１）〜（４）の化合物以外の他のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用、免疫抑制作用、免疫寛容促進作用、免疫調整作用及び／又は腸内環境改善作用を有する生理活性物質を配合してもよい。例えば、医薬品組成物の有効成分として、上記（１）〜（４）の化合物と、Ｔｒｅｇの分化誘導において重要な役割を果たすＴＧＦ−βやＴｒｅｇの機能維持に重要とされるＩＬ−２、Ｔ細胞の分化や活性化に寄与する共刺激分子抗ＣＤ２８抗体、抗体刺激分子抗ＣＤ３ｅ抗体、ビタミンＡやその誘導体であるレチノイン酸などとを併用することが考えられる。
【００６２】
医薬品組成物で治療及び／又は予防し得る免疫疾患は特に限定されないが、例えば、種々の自己免疫疾患、アレルギー疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症性疾患、感染性疾患、腫瘍性疾患などが挙げられ、具体的には生体内でＴｒｅｇを誘導すると、花粉症などのアレルギー疾患が治療され得る。
【００６３】
医薬品組成物は、有効成分を水溶性溶剤に溶かして、製薬上許容される塩の形態で製剤にした状態で存在し得る。このような製薬上許容される塩の形態としては、生理的に受け入れられる水溶性の塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどの塩の形で生理的なｐＨにて緩衝させた形態が挙げられる。また、水溶性溶剤の他に、非水溶性溶剤を用いることができ、このような非水溶性溶剤としては、例えばアルコール、エタノール、プロピレングリコールなどが挙げられる。
【００６４】
医薬品組成物には、有効成分以外に様々な目的に対するその他の成分を含めてもよく、このようなその他の成分としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のｐＨを２〜９、好ましくは４〜８の間で維持することができる量で存在することができる。
【００６５】
医薬品組成物の剤型は特に限定されないが、例えば、注射剤（筋肉、皮下、皮内）、経口製剤、点鼻製剤などが例示される。例えば、医薬品組成物が花粉症などのアレルギー疾患を治療するためのワクチンとして調製することができる。医薬品組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。
【００６６】
医薬品組成物をワクチンとして使用する場合、医薬品組成物以外の成分であり、それ自身には活性がなく、医薬品組成物のワクチンとしての効果をより一層高める効果のある成分を含んだ不活性成分含有ワクチンであってもよい。不活性成分としては、アジュバント、トキソイドなどが挙げられる。アジュバントの例としては、限定することを意図するものではないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウムなどの沈降性タイプのもの、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントなどの油性タイプのものが挙げられる。
【００６７】
医薬品組成物は、ワクチンの形態で存在する場合、好ましくは皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射又は注入、あるいは経皮、又は鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などにより、体内に投与され得る。
【００６８】
医薬品組成物を調製する場合、かかる免疫抑制効果は用量依存的であるため、有効成分量は患者の年齢、体格、症状などに合わせて適宜設定することができる。ＮＡＤ又はＮＡＤＨを有効成分とする場合、その用量は、例えば、１〜１，０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。医薬品組成物の投与が必要な患者には、アレルギー患者、例えば、経口免疫寛容が破綻している食物アレルギー患者や、消化管機能や経口免疫寛容が未熟な乳幼児が含まれる。
【００６９】
［Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の製造方法］
本発明の別の態様として、被験体から採取したＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞に、ＴＧＦ−βやＩＬ−２などのサイトカインの存在下で、本発明の組成物のいずれかの一態様を接触させる工程（以下、接触工程ともよぶ。）を含む、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の製造方法が提供される。
【００７０】
接触工程で使用されるＦｏｘｐ３陰性Ｔ細胞は特に限定されず、例えば、被験体の血液や脾臓から単離した細胞の中から、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４５ＲＡを発現している細胞などを適宜選択することにより調製することができる。被験体は特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコといった哺乳動物などが挙げられる。細胞を分取する方法も特に限定されず、例えば、いずれかの分子を指標に分取することができる。
【００７１】
Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞と本発明の組成物との接触は適当な培地中で行うことが好ましい。本発明の組成物のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用が用量依存的である傾向を鑑みて、本発明の組成物の使用量は当業者が適宜決定することができる。ＮＡＤ又はＮＡＤＨを培地中に添加する場合、その添加量は、例えば、培地１ｍｌ当たり２〜５０μｇ程度である。接触時間は、例えば、２．５〜３日間程度である。上記接触工程は他の追加成分の存在下で行ってもよく、例えば抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３ｅ抗体などを培地に添加してもよい。
【００７２】
サイトカインの添加方法は特に限定されず、例えば、Ｆｏｘｐ３陰性Ｔ細胞と本発明の組成物とを接触するときに同時に、又はそのときに前後して、添加することができる。
【００７３】
上記方法により製造されるＴｒｅｇは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの使用が考えられる。例えば、製造されたＴｒｅｇを血管などを介して免疫疾患に罹患している被験体に戻すことにより、被験体において免疫抑制が発揮し得る。
【００７４】
本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、接触工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。また、工程内及び工程間は、連続的又は断続的に実施することができる。
【００７５】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【００７６】
［例１．ＮＡＤによるＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞誘導性の評価］
ヒトＴ細胞株Jｕｒｋａｔを用いて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導を、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより評価した。
【００７７】
Ｔｒｅｇは、免疫寛容に影響する因子として知られている。ＮＡＤがＴｒｅｇを誘導することを検証するために、ＮＡＤ及びＴＧＦ−βとヒトＣＤ４陽性細胞（Ｔ細胞）株であるＪｕｒｋａｔとを共培養し、ＮＡＤによるＴｒｅｇ誘導活性を評価した。また、Ｔｈ１７細胞は、Ｔｒｅｇが増加すると減少することが知られている。そこで、Ｔｈ１７細胞がＮＡＤによりどのように変化するかについても検証した。
【００７８】
Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７細胞への誘導は、Ｔｒｅｇのマーカー遺伝子であるＦｏｘｐ３のｍＲＮＡ及びＴｈ１７細胞のマーカー遺伝子であるＲＯＲγｔ（以下、ＰＯＲｇｔともよぶ。）のｍＲＮＡの発現量を定量することにより評価した。ＮＡＤに対するポジティブ・コントロールとして、Ｔｒｅｇ誘導活性をもつことが知られているレチノイン酸（ＲＡ）を使用した。
【００７９】
ＮＡＤは１，０００μＭに、又はＲＡは５００μＭになるように、１×ＰＢＳバッファーに溶解して、ＮＡＤ溶液及びＲＡ溶液を調製した。ＮＡＤ溶液及びＲＡ溶液をそれぞれ終濃度が１００μＭ（ＮＡＤ）又は５０μＭ（ＲＡ）になるように後述する細胞懸濁液に添加した。
【００８０】
Ｊｕｒｋａｔを培養するための培地は、Ｇｉｂｃｏ社製ＲＰＭＩ１６４０倍地に、下記の終濃度になるように試薬を添加することにより調製した。
１０％（ｖ／ｖ）  ＦＢＳ
１％（ｗ／ｖ）  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  
１０ ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
１ ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ
【００８１】
Jｕｒｋａｔ（Ｃｌｏｎｅ  Ｅ６−１、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）凍結ストックを培地に添加し、週に２回程度培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２条件で培養し、第５継代（Ｐ５）の時点で３×１０６ ｃｅｌｌｓ/ｍＬのワーキングストックを作製した。ワーキングストックを培地に添加し培養後２回継代し、Ｐ９時点での細胞を回収し、培地で１回洗浄した後、再度細胞を回収した。回収した細胞の一部を抜き取り、血球計算板を用いて細胞数を計測して求めた値より、回収した細胞に培地を適量加えて、細胞懸濁液（５．７×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。
【００８２】
９６ウェル平底プレート（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ社製）に下記の試薬及び細胞懸濁液を下記の最終濃度になるように添加し、該プレートを３７℃、５％ＣＯ２条件で、３日間培養することにより、ＪｕｒｋａｔをＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞へ誘導した。ここで、ＮＡＤ群はＪｕｒｋａｔ、ＴＧＦ−β及びＮＡＤを含む群であり；ＲＡ群はＪｕｒｋａｔ、ＴＧＦ−β及びＲＡを含む群であり；ＰＢＳ群はＪｕｒｋａｔ、ＴＧＦ−β及び１×ＰＢＳ（ＮＡＤ及びＲＡと同量）を含む群である。
Ｊｕｒｋａｔ細胞１×１０５／ウェル
ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）２ｎｇ／ｍＬ
ＮＡＤ  １００μＭ、ＲＡ  ５０μＭ又は１×ＰＢＳ
【００８３】
誘導後の細胞を回収し、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡキットを用いて細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを該キットの指示にしたがって逆転写した後、得られたｃＤＮＡをＴＡＫＡＲＡ社製ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ ＩＩ及びＴＡＫＡＲＡ社製プライマーを用いて定量ＰＣＲを行い、Ｆｏｘｐ３のｍＲＮＡ（ｍＦｏｘｐ３）の発現量及びＲＯＲｇｔのｍＲＮＡ（ｍＲＯＲｇｔ）の発現量を定量した。ＰＢＳ群を基準（１）として、ＮＡＤ群及びＲＡ群のｍＦｏｘｐ３発現量及びｍＲＯＲｇｔ発現量を相対的に示した結果を図１に示す。
【００８４】
図１が示すとおり、サンプルを添加せず、溶媒である１×ＰＢＳのみを添加し培養した場合のＰＢＳ群と比較して、ＮＡＤ群は、ＲＡ群と同様に、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡの発現を有意に誘導した（危険率５％）。また、ＮＡＤ群は、ＲＡ群と同様に、ＲＯＲｇｔ  ｍＲＮＡの発現を低下させた。これらの結果より、ＮＡＤは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｒｅｇへと分化誘導する作用を有することが確認された。
【００８５】
また、別のアッセイ系を採用することにより、以下の事項が確認された：ＮＡＤ及び還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）は、添加量が２０μＭ程度よりも多い場合に、Ｔｈ１７細胞分化条件であるＴＧＦ−β及びＩＬ−６の存在下で、ＣＤ４陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞を濃度依存的にＴｒｅｇへ誘導する作用を示すこと；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、還元型ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（ＮＧＤ）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ニコチンアミド、アデニン、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）及びアセトアセチル補酵素Ａ（アセトアセチルＣｏＡ）は、ＴＧＦ−β及びＩＬ−６の存在下で、ＣＤ４陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞をＴｒｅｇへ誘導する作用を示すこと；γ−グルタミルチロシン（γ-Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）は、ＴＧＦ−β及びＩＬ−６の存在下で、ＣＤ４陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞をＴｒｅｇへ誘導する作用を示さないこと；これらの化合物のうち、分子内にＡＤＰの構造を有するＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、アセチルＣｏＡ及びアセトアセチルＣｏＡ並びにＡＤＰは、格別顕著なＴｒｅｇへの分化誘導作用を示すこと。
【００８６】
以上の事項より、ＮＡＤ及び分子内にＡＤＰの構造を有する化合物、並びにアデニン、ニコチンアミド、ヌクレオシド一リン酸及びヌクレオシド二リン酸、特にＮＡＤ及び分子内にＡＤＰの構造を有する化合物は、未分化Ｔ細胞をＴｒｅｇへ分化誘導する作用を有することが確認された。
【００８７】
［例２．ＩＬ−２存在下でのＮＡＤによるＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞誘導性の評価］
ヒトから単離したナイーブＴ細胞を用いて、ＩＬ−２存在下におけるＮＡＤのＴｒｅｇの誘導を、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７細胞に特異的なマーカーの発現を測定することにより評価した。
【００８８】
被験者より採血を行い、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）の分離を常法に従って行った。すなわち、血液及び生理食塩水を等量ずつ混合した混合液を、該混合液の半量であるＦｉｃｏｌｌへ重層となるように加えた。得られた溶液を、６００ｇで３０分間遠心し、中間層を回収することでＰＢＭＣを得た。
【００８９】
回収したＰＢＭＣをｐＨ７．２のリン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗浄した後、ヒトＮａｉｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ミルテニー・バイオテク社）を用いることで、ナイーブＴ細胞を回収した。回収したナイーブＴ細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）  ２０μｇ／ｍｌ−ＰＢＳでコーティング（３７℃、２時間）した９６ウェル平底プレート（日本ＢＤ社）に、５μｇ／ｍｌ  抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、及び２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を添加した１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社）を用いて、５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（培養液量  ２００μｌ）となるように播種した。ここで、ＮＡＤは終濃度５０μＭとなるように添加した。また、コントロールとしてはＮＡＤを添加しない系を用いた。ナイーブＴ細胞を播種した９６ウェル平底プレートを培養した。
【００９０】
培養７日後、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、シグマ社）、イオノマイシン（シグマ社）及びＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ社）を、それぞれ終濃度が０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ及び２μｌ／ｍｌとなるように添加した。これらの試薬を添加した４時間後に回収した細胞を、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及びＰＥ標識抗ヒトＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で染色した。染色後の細胞について、Ｆｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により細胞を固定し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＬ−１７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、ＢＶ４２１標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＦｏｘｐ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で染色し、フローサイトメーターにより各マーカーの発現を解析した。
【００９１】
マーカーの発現解析から、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ−１７産生細胞）のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを表わした結果を図２に示し、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを表わした結果を図３に示す。図２の事象Ｑ１の比較から、ＮＡＤの添加の有無により、Ｔｈ１７細胞の割合に差異がみられなかったことが確認できる。これは、ＮＡＤによってＴｈ１７細胞への分化は誘導されなかったことを示す。
【００９２】
それに対して、図３の事象Ｐ４の比較から、ＮＡＤの添加の有無により、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合に差異があったことが確認できる。これは、ＮＡＤによってＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化が誘導されたことを示す。
【００９３】
［例３．Ｔｈ１７細胞誘導条件下におけるＮＡＤによるＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞誘導性の評価］
ヒトから単離したナイーブＴ細胞を用いて、Ｔｈ１７細胞への分化を誘導するための各種抗体及びサイトカインの存在下におけるＮＡＤのＴｒｅｇの誘導を、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７細胞に特異的なマーカーの発現を測定することにより評価した。
【００９４】
例２と同様にして回収したナイーブＴ細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）  ２０μｇ／ｍｌ−ＰＢＳでコーティング（３７℃、２時間）した９６ウェル平底プレート（日本ＢＤ社）に、５μｇ／ｍｌ  抗ヒトＣＤ２８抗体、５μｇ／ｍｌ及び抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）並びに１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＬ−２３、１ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＧＦ−β及び２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を添加した１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社）を用いて、５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（培養液量  ２００μｌ）となるように播種した。ここで、ＮＡＤは終濃度２０μＭ及び４０μＭとなるように添加した。また、コントロールとしてはＮＡＤを添加しない系を用いた。ナイーブＴ細胞を播種した９６ウェル平底プレートを培養した。
【００９５】
培養７日後、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、シグマ社）、イオノマイシン（シグマ社）及びＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ社）を、それぞれ終濃度が０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ及び２μｌ／ｍｌとなるように添加した。これらの試薬を添加した４時間後に回収した細胞を、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で染色した。染色後の細胞について、Ｆｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により細胞を固定し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＬ−１７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、ＢＶ４２１標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＦｏｘｐ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で染色し、フローサイトメーターにより各マーカーの発現を解析した。
【００９６】
マーカーの発現解析から、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ−１７産生細胞）のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを表わした結果を図４に示し、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを表わした結果を図５に示す。図４中の各図の比較から、ＮＡＤの添加の有無や添加量にかかわらず、Ｔｈ１７細胞の割合に差異がみられなかったことが確認できる。これは、ナイーブＴ細胞をＴｈ１７細胞への分化を誘導する条件であったにもかかわらず、ＮＡＤが存在することによりＴｈ１７細胞への分化は誘導されなかったことを示す。
【００９７】
それに対して、図５中の各図の比較から、ＮＡＤの添加の有無により、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の割合に差異があったことが確認できる。図４との結果をあわせて考えれば、例えＴｈ１７細胞への分化を誘導する条件であったとしても、ＮＡＤによってＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化が優先して誘導されたことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の組成物は、経口的及び非経口的のいずれの態様においても適用可能な有効成分を含むものであり、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞への分化誘導作用、免疫抑制作用、免疫寛容促進作用、免疫調整作用及び腸内環境改善作用を通じて、抗アレルギー活性、抗炎症活性、抗感染症活性、抗腫瘍活性などを期待する摂取者にとって有用なものであり、このような摂取者の健康及び福祉に資する飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、サプリメントなどとして利用可能なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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