(57)【要約】【課題】デングウイルス感染症に有効な抗デングウイルス剤及びそのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】本発明の一実施形態に係る抗デングウイルス剤のスクリーニング方法は、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物をリード化合物として使用して、抗デングウイルス剤をスクリーニングすることを含む。本発明の一実施形態に係る抗デングウイルス剤は、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物又はその誘導体を有効成分として含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物をリード化合物として使用して、抗デングウイルス剤をスクリーニングすることを含む、抗デングウイルス剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記リード化合物として、少なくともマプロチリンを使用する、
請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記リード化合物として、少なくともＳｅ−メチルセレノシステインを使用する、
請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記リード化合物として、少なくともキナクリンを使用する、
請求項１乃至３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記リード化合物として、少なくともインダトラリンを使用する、
請求項１乃至４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記リード化合物の誘導体を非ヒト動物に投与して、前記非ヒト動物における前記誘導体の抗デングウイルス活性を評価することを含む、
請求項１乃至５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物又はその誘導体を有効成分として含む、抗デングウイルス剤。
【請求項８】
少なくともマプロチリン又はその誘導体を前記有効成分として含む、
請求項７に記載の抗デングウイルス剤。
【請求項９】
少なくともＳｅ−メチルセレノシステイン又はその誘導体を前記有効成分として含む、
請求項７又は８に記載の抗デングウイルス剤。
【請求項１０】
少なくともキナクリン又はその誘導体を前記有効成分として含む、
請求項７乃至９のいずれかに記載の抗デングウイルス剤。
【請求項１１】
少なくともインダトラリン又はその誘導体を前記有効成分として含む、
請求項７乃至１０のいずれかに記載の抗デングウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗デングウイルス剤及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デングウイルスは、蚊によって媒介され、デング熱やデング出血熱といったデングウイルス感染症を引き起こす。デングウイルス感染症は当初、熱帯地域及び亜熱帯地域で問題視されていたが、近年、日本国においても、デング熱の感染事例が報告され、さらに在来種の蚊からもデングウイルスが検出された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Siew Pheng Lim et al., Antiviral Research, 100 (2013), 500-519
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、デングウイルス感染症については、未だ有効な治療薬やワクチンは開発されていないのが現状である。
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、デングウイルス感染症に有効な抗デングウイルス剤及びそのスクリーニング方法を提供することをその目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る抗デングウイルス剤のスクリーニング方法は、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物をリード化合物として使用して、抗デングウイルス剤をスクリーニングすることを含む。本発明によれば、デングウイルス感染症に有効な抗デングウイルス剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【０００７】
また、前記スクリーニング方法において、前記リード化合物として、少なくともマプロチリンを使用することとしてもよい。また、前記スクリーニング方法において、前記リード化合物として、少なくともＳｅ−メチルセレノシステインを使用することとしてもよい。また、前記スクリーニング方法において、前記リード化合物として、少なくともキナクリンを使用することとしてもよい。また、前記スクリーニング方法において、前記リード化合物として、少なくともインダトラリンを使用することとしてもよい。
【０００８】
また、前記スクリーニング方法は、前記リード化合物の誘導体を非ヒト動物に投与して、前記非ヒト動物における前記誘導体の抗デングウイルス活性を評価することを含むこととしてもよい。
【０００９】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る抗デングウイルス剤は、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物又はその誘導体を有効成分として含む。本発明によれば、デングウイルス感染症に有効な抗デングウイルス剤を提供することができる。
【００１０】
また、前記抗デングウイルス剤は、少なくともマプロチリン又はその誘導体を前記有効成分として含むこととしてもよい。また、前記抗デングウイルス剤は、少なくともＳｅ−メチルセレノシステイン又はその誘導体を前記有効成分として含むこととしてもよい。また、前記抗デングウイルス剤は、少なくともキナクリン又はその誘導体を前記有効成分として含むこととしてもよい。また、前記抗デングウイルス剤は、少なくともインダトラリン又はその誘導体を前記有効成分として含むこととしてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、デングウイルス感染症に有効な抗デングウイルス剤及びそのスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係る実施例において、抗デングウイルス剤の有効性を評価した結果を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。
【００１４】
本実施形態に係る抗デングウイルス（以下、「本剤」という。）剤は、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物又はその誘導体を有効成分として含む、抗デングウイルス剤である。
【００１５】
すなわち、本発明の発明者らは、後述の実施例に示すとおり、抗デングウイルス剤について鋭意検討を重ねた結果、意外にも、これまで抗デングウイルス活性が報告されていないマプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンがそれぞれ抗デングウイルス活性を有することを独自に見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本剤は、少なくともマプロチリン又はその誘導体を有効成分として含むこととしてもよい。マプロチリンとしては、例えば、下記化学式Ｉで示されるマプロチリン塩酸塩を使用することとしてもよい。
【００１７】
【化１】
2018009928.tif 000002
【００１８】
マプロチリンの誘導体は、マプロチリンに類似の化学構造を有し、抗デングウイルス活性を有するものであれば特に限られないが、例えば、マプロチリンのメチル基及び／又はトリメチレン基を化学的に修飾して得られる化合物であって、抗デングウイルス活性を有するものであることとしてもよい。マプロチリンのメチル基を化学的に修飾して得られる化合物としては、例えば、デスメチルマプロチリンが挙げられる。
【００１９】
本剤は、少なくともＳｅ−メチルセレノシステイン又はその誘導体を有効成分として含むこととしてもよい。Ｓｅ−メチルセレノシステインとしては、例えば、下記化学式ＩＩで示されるＳｅ−メチルセレノシステイン塩酸塩を使用することとしてもよい。
【００２０】
【化２】
2018009928.tif 000003
【００２１】
Ｓｅ−メチルセレノシステインの誘導体は、Ｓｅ−メチルセレノシステインに類似の化学構造を有し、抗デングウイルス活性を有するものであれば特に限られないが、例えば、Ｓｅ−メチルセレノシステインのメチル基、セレノ基及びアミノ基からなる群より選択される１以上を化学的に修飾して得られる化合物であって、抗デングウイルス活性を有するものであることとしてもよい。Ｓｅ−メチルセレノシステインのメチル基を化学的に修飾して得られる化合物としては、例えば、Ｓｅ−メチル−Ｓｅ−メチルセレノシステインが挙げられる。Ｓｅ−メチルセレノシステインのアミノ基を化学的に修飾して得られる化合物としては、例えば、γ−グルタミル−Ｓｅ−メチルセレノシステインが挙げられる。
【００２２】
本剤は、少なくともキナクリン又はその誘導体を有効成分として含むこととしてもよい。キナクリンとしては、例えば、下記化学式ＩＩＩで示されるキナクリン二塩酸塩を使用することとしてもよい。また、キナクリンとしては、例えば、キナクリン二塩酸塩二水和物やキナクリン２メタンスルホン酸を使用することとしてもよい。
【００２３】
【化３】
2018009928.tif 000004
【００２４】
キナクリンの誘導体は、キナクリンに類似の化学構造を有し、抗デングウイルス活性を有するものであれば特に限られないが、例えば、キナクリンのエチル基及び／又はメトキシ基を化学的に修飾して得られる化合物であって、抗デングウイルス活性を有するものであることとしてもよい。キナクリンのエチル基を化学的に修飾して得られる化合物としては、例えば、キナクリンマスタードが挙げられる。
【００２５】
本剤は、少なくともインダトラリン又はその誘導体を有効成分として含むこととしてもよい。インダトラリンとしては、例えば、下記化学式ＩＶで示されるインダトラリン塩酸塩を使用することとしてもよい。
【００２６】
【化４】
2018009928.tif 000005
【００２７】
インダトラリンの誘導体は、インダトラリンに類似の化学構造を有し、抗デングウイルス活性を有するものであれば特に限られないが、例えば、インダトラリンのメチルアミノ基及び／又はクロロ基を化学的に修飾して得られる化合物であって、抗デングウイルス活性を有するものであることとしてもよい。
【００２８】
上記有効成分は、上述のとおり、抗デングウイルス活性を有する。すなわち、上記有効成分は、例えば、動物に投与した場合、又は動物由来の細胞に接触させた場合における、当該動物又は細胞に対するデングウイルスの感染の抑制、当該動物又は細胞におけるデングウイルスの増殖の抑制、当該動物におけるデングウイルス感染症（例えば、デング熱又はデング出血熱）の発症の抑制、症状の進行の抑制又は症状の緩和といった効果を示す。なお、デングウイルスには、４つの血清型、すなわち、Ｉ型（ＤＥＮＶ−１）、ＩＩ型（ＤＥＮＶ−２）、ＩＩＩ型（ＤＥＮＶ−３）及びＩＶ型（ＤＥＮＶ−４）が存在する。
【００２９】
本剤は、上記有効成分を含む医薬組成物である。本剤は、デングウイルス感染症の予防及び／又は治療剤であることとしてもよい。本剤の剤形は特に限られないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、坐剤又は液剤であることとしてもよい。本剤の形状は特に限られず、例えば、固形、粉末状、液状、ペースト状又はゲル状であることとしてもよい。本剤は、さらに添加剤（例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、矯味矯臭剤、溶剤、安定剤、基剤、湿潤剤及び保存剤からなる群より選択される１以上）を含むこととしてもよい。
【００３０】
本実施形態に係る抗デングウイルス剤のスクリーニング方法（以下、「本方法」という。）は、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物をリード化合物として使用して、抗デングウイルス剤をスクリーニングすることを含む。
【００３１】
すなわち、上述のとおり、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンは、それぞれ抗デングウイルス活性を有する。そこで、本方法では、これら抗デングウイルス活性を有する化合物をリード化合物として使用して、新たな抗デングウイルス剤をスクリーニングする。
【００３２】
本方法においては、リード化合物として、少なくともマプロチリンを使用することとしてもよい。本方法においては、リード化合物として、少なくともＳｅ−メチルセレノシステインを使用することとしてもよい。本方法においては、リード化合物として、少なくともキナクリンを使用することとしてもよい。本方法においては、リード化合物として、少なくともインダトラリンを使用することとしてもよい。
【００３３】
すなわち、本方法は、次の（ａ）−（ｄ）からなる群より選択される１以上を含む方法であることとしてもよい：（ａ）マプロチリンをリード化合物として使用して、抗デングウイルス剤をスクリーニングすること；、（ｂ）Ｓｅ−メチルセレノシステインをリード化合物として使用して、抗デングウイルス剤をスクリーニングすること；、（ｃ）キナクリンをリード化合物として使用して、抗デングウイルス剤をスクリーニングすること；及び（ｄ）インダトラリンをリード化合物として使用して、抗デングウイルス剤をスクリーニングすること。
【００３４】
本方法は、リード化合物の誘導体を非ヒト動物に投与して、当該非ヒト動物における当該誘導体の抗デングウイルス活性を評価することを含むこととしてもよい。
【００３５】
すなわち、この場合、本方法は、例えば、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンからなる群より選択される１以上の化合物をリード化合物として選択すること、次いで、当該各リード化合物の１以上の誘導体を用意すること、さらに、当該各誘導体を非ヒト動物に投与すること、その後、当該動物における当該各誘導体の抗デングウイルス活性を評価すること、を含む。
【００３６】
本方法において用意するリード化合物の誘導体は、当該リード化合物に類似の化学構造を有し、抗デングウイルス活性を有し得る化合物であれば特に限られず、上記各リード化合物について、上述したような誘導体が使用される。
【００３７】
なお、本方法においては、既にリード化合物が決定されているため、当業者であれば、スクリーニングの対象として使用され得る当該リード化合物の誘導体を適宜合成し、又は購入して用意することができる。
【００３８】
非ヒト動物は、ヒト以外の動物であれば特に限られないが、例えば、マウス、ラット、モルモット、ツパイ、ウサギ、イヌ、ブタ又はサル（例えば、チンパンジー、マーモセット）であることとしてもよい。
【００３９】
リード化合物誘導体の非ヒト動物への投与方法は、特に限られず、経口投与であってもよいし、非経口投与であってもよい。非経口投与は、例えば、血管内（例えば、静脈内）投与、皮下投与又は腹腔内投与であることとしてもよい。
【００４０】
リード化合物誘導体を非ヒト動物に投与するタイミングは、当該動物における当該誘導体の抗デングウイルス活性を評価することができるタイミングであれば特に限られず、当該動物のデングウイルス感染の前、当該感染と同時、及び当該感染の後からなる群より選択される１以上のタイミングで当該誘導体を投与すればよい。
【００４１】
すなわち、例えば、まずリード化合物誘導体を、デングウイルスに感染する前の非ヒト動物に投与し、次いで、当該誘導体を体内に含む当該動物にデングウイルスを感染させ、その後、当該動物における当該誘導体の抗デングウイルス活性を評価する。
【００４２】
また、例えば、非ヒト動物のデングウイルス感染と同時に、リード化合物誘導体を当該動物に投与し、その後、当該動物における当該誘導体の抗デングウイルス活性を評価する。
【００４３】
また、例えば、まず非ヒト動物にデングウイルスを感染させ、次いで、リード化合物誘導体を、デングウイルスに感染した当該動物に投与し、その後、当該動物における当該誘導体の抗デングウイルス活性を評価する。
【００４４】
非ヒト動物におけるリード化合物誘導体の抗デングウイルス活性の評価は、例えば、当該誘導体が、当該動物におけるデングウイルス感染症（例えば、デング熱又はデング出血熱）の予防及び／又は治療に有効であるかを評価することにより行う。
【００４５】
より具体的に、例えば、非ヒト動物に対するデングウイルスの感染の抑制、当該動物におけるデングウイルスの増殖の抑制、当該動物におけるデングウイルス感染症の発症の抑制、症状の進行の抑制又は症状の緩和を評価する。
【００４６】
なお、後述の実施例にも記載のとおり、上記有効成分は、候補化合物を所定濃度で培養細胞に添加した場合の抗デングウイルス活性を評価する一次スクリーニング、当該一次スクリーニングで選択された候補化合物の細胞毒性試験を行う二次スクリーニング、当該二次スクリーニングで選択された候補化合物を当該一次スクリーニングより低濃度で培養細胞に添加した場合の抗デングウイルス活性を評価する三次スクリーニング、及び当該三次スクリーニングで選択された候補化合物の安全域を評価する四次スクリーニングによって選択された。
【００４７】
ここで、上記一次スクリーニング及び三次スクリーニングは、フォーカスアッセイにより行った。この点、フォーカスアッセイに代えて、一過性発現型のレプリコンの系又は恒常発現型のレプリコン細胞を使用してスクリーニングを行うこともできる。
【００４８】
すなわち、例えば、デングウイルス遺伝子を一過性に発現するレプリコンを使用することができる。具体的に、まず、ウイルス粒子形成に必須な構造遺伝子領域を削除し当該箇所に分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を挿入することにより、一過性発現型レプリコンプラスミドＤＮＡ（ＤＧＬ２）を作製する。次に、このＤＧＬ２を培養細胞（例えば、ＢＨＫ２１細胞（ハムスター腎臓由来細胞）、Ｈｕｈ７細胞（ヒト肝癌由来細胞）又はＶｅｒо細胞（アフリカミドリザル腎臓由来細胞））にトランスフェクションする。
【００４９】
さらに、トランスフェクションされた細胞を、スクリーニング対象の化合物を添加した培養液中で３日間培養する。その後、培養液中のルシフェラーゼ活性を測定する。そして、ルシフェラーゼ活性が、化合物を添加しなかった場合より減少した化合物を、抗デングウイルス活性を有する化合物として選択する。
【００５０】
また、例えば、デングウイルス遺伝子を恒常的に発現するレプリコン細胞を使用することもできる。具体的に、まず、ウイルス粒子形成に必須な構造遺伝子領域を削除し当該箇所に分泌型ルシフェラーゼ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子とを挿入したレプリコンプラスミドＤＮＡ（ＧＬＲ２）を作製し、さらにＧＬＲ２を鋳型としてｉｎ  ｖｉｔｒо合成したＲＮＡを作製する。
【００５１】
次に、このＲＮＡを培養細胞（例えば、ＢＨＫ２１細胞（ハムスター腎臓由来細胞）、Ｈｕｈ７細胞（ヒト肝癌由来細胞）又はＶｅｒо細胞（アフリカミドリザル腎臓由来細胞））にトランスフェクションし、Ｇ４１８（Geneticin）によってネオマイシン耐性細胞を選択する。選択した各細胞のルシフェラーゼ活性及び非構造タンパク質の発現を解析し、共に高発現の細胞をレプリコン細胞として選択する。
【００５２】
さらに、このレプリコン細胞を、スクリーニング対象の化合物が添加された培養液中で１〜３日間培養する。その後、培養液中のルシフェラーゼ活性を測定する。そして、ルシフェラーゼ活性が化合物を添加しなかった場合より減少した化合物を、抗デングウイルス活性を有する化合物として選択する。
【００５３】
フォーカスアッセイでは、宿主細胞への吸着から当該宿主細胞からのウイルス放出までのウイルス生活環の全てを対象とした試験を行うことができるが、その操作には、多くの手間と時間がかかる。
【００５４】
これに対し、一過性発現型のレプリコンの系や恒常発現型のレプリコン細胞を使用する方法によれば、ウイルスの吸着及び放出過程を評価することはできないが、より少ない手間と時間で抗デングウイルス活性を評価することができる。
【００５５】
すなわち、例えば、一過性発現のレプリコンの系を使用する場合、実験の都度、遺伝子を導入する必要があるが、ウイルス構造遺伝子を欠失させているため、ウイルス遺伝子の増幅過程を効果的に評価することができる。また、分泌型のルシフェラーゼが発現するため、細胞を溶解することなく、ルシフェラーゼ活性を指標にして、簡便にウイルス遺伝子の増減を評価することができる。
【００５６】
また、恒常発現のレプリコン細胞を使用する場合、ウイルス遺伝子が細胞内で維持されるため、一過性発現のレプリコン細胞を使用する場合に比べて、より簡便にウイルス遺伝子の増減を評価することができる。また、恒常発現のレプリコン細胞は、抗ウイルス化合物耐性変異体の評価にも利用することができる。
【００５７】
また、上記リード化合物を使用することにより、抗デングウイルス活性を有する化合物がデングウイルスに作用する作用機序を評価することもできる。
【００５８】
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
【実施例】
【００５９】
国立大学法人京都大学が保有する化合物データベースに登録されている化合物のうち、約２万個の化合物から、抗デングウイルス活性を有する化合物をスクリーニングした。このスクリーニングは、４段階の方法で行った。
【００６０】
すなわち、まず一次スクリーニングとして、２０８８０個の化合物について、フォーカスアッセイを行った。具体的に、まず９６ウェルプレートのウェル内の培養液中でＢＨＫ２１細胞（ハムスター腎臓由来株化細胞）を培養し、次いで、当該培養液に、添加後の濃度が１ウェル当たり５０フォーカスフォーミングユニットとなる量のデングウイルスと、添加後の濃度が１０μＭとなる量の化合物とを含む溶液を添加し、その後、当該細胞を３日間培養した。培養３日後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定した。
【００６１】
そして、細胞の免疫染色を行った。すなわち、まず固定された細胞を含む溶液中に、一次抗体として、デングウイルスの外被タンパク質に対する抗体（抗フラビウイルス抗体４Ｇ２、ＡＴＣＣ社製）を添加した。次いで、二次抗体として、ＨＲＰ（horse radish peroxidase）結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社製）を添加した。その後、ＨＲＰの基質であるＤｉａｍｉｎｏＢｅｎｚｉｄｉｎｅ（和光純薬工業社製）を添加した。
【００６２】
そして、各ウェル内において、免疫染色によって観察されるフォーカスの数を評価した。すなわち、例えば、スクリーニング対象の化合物を添加した場合のフォーカス数が、当該化合物を添加しなかった場合のフォーカス数より少ない場合、又はスクリーニング対象の化合物を添加した場合のフォーカスの大きさが、当該化合物を添加しなかった場合のフォーカスの大きさより小さくなった場合、当該化合物は抗デングウイルス活性を有する可能性があると評価することが考えられる。
【００６３】
ただし、本実施例では、より強い抗デングウイルス活性を有する化合物を同定するため、添加することによってフォーカス数が消失した化合物を、抗デングウイルス活性を有する可能性があると評価した。そして、その結果、添加することによってフォーカス数が消失した１９６個の化合物が選択された。
【００６４】
次に、二次スクリーニングとして、上記一次スクリーニングで選択された１９６個の化合物について、ＭＴＴアッセイによる細胞毒性試験を行った。すなわち、まず９６ウェルプレートのウェル内の培養液中でＢＨＫ２１細胞（ハムスター腎臓由来株化細胞）を培養し、次いで、当該培養液に、添加後の濃度が１０μＭとなる量の化合物を含む溶液を添加して３日間培養し、その後、当該培養液に、添加後の濃度が０．５％となる量のＭＴＴ（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）を添加した。
【００６５】
そして、ホルマザン溶液を加え、分光光度計にて５７０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、細胞毒性を示さなかった７８個の化合物が選択された。
【００６６】
さらに、三次スクリーニングとして、上記二次スクリーニングで選択された７８個の化合物について、上記一次スクリーニングより低濃度でのフォーカスアッセイを行った。すなわち、添加後の濃度が１μＭとなる量の化合物を含む溶液を添加して３日間培養した。その結果、６個の化合物についてフォーカスの消失が認められた。
【００６７】
さらに、四次スクリーニングとして、上記三次スクリーニングで選択された６個の化合物について、プラークアッセイを行った。すなわち、添加後の濃度を１０μＭから０．３μＭまで２段階希釈となる量の化合物を含む溶液を添加して３日間培養した。さらに、Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ  ｍｅｔｈｏｄ（Reed, L.J., Muench, H., 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 27, 493-497）を用いることにより、５０％効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。また同様に、添加後の濃度を１００μＭから３.１μＭまで２段階希釈となる量の化合物を含む溶液を添加して３日間培養し、５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を算出した。その結果、最終的に、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンを含む６個の化合物（三次スクリーニングで選択された６個の化合物の全て）が選択された。
【００６８】
図１には、マプロチリン、Ｓｅ−メチルセレノシステイン、キナクリン及びインダトラリンのそれぞれについて、抗デングウイルス活性を評価した結果を示す。すなわち、図１には、４つの血清型のデングウイルス（ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４）の各々についてのＥＣ５０（μＭ）と、ＣＣ５０（μＭ）とを示す。なお、図１において、「Ｎ．Ｄ．」は、評価を行わなかったことを示す。
【００６９】
図１に示すように、マプロチリンは、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４の全てに対して、高い抗デングウイルス活性（ＥＣ５０が２．９μＭ〜７．０μＭ）を示し、ＣＣ５０は３３．４μＭであった。
【００７０】
Ｓｅ−メチルセレノシステインもまた、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４の全てに対して、高い抗デングウイルス活性（ＥＣ５０が、ＤＥＮＶ−１に対して６．８μＭ、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４に対して１０μＭ未満）を示し、ＣＣ５０は４１．１μＭであった。
【００７１】
キナクリンは、ＤＥＮＶ−１及びＤＥＮＶ−２に対して、高い抗デングウイルス活性（ＥＣ５０が０．８μＭ〜１．２μＭ）を示し、ＣＣ５０は１８．７μＭであった。
【００７２】
インダトラリンは、ＤＥＮＶ−１に対して、高い抗デングウイルス活性（ＥＣ５０が３．０μＭ）を示し、ＣＣ５０は１１．８μＭであった。
【図１】
2018009928.tif 000006