(57)【要約】      （修正有）【課題】目的細胞と非目的細胞とを含む検体から高い純度で目的細胞を回収可能な方法およびそれに用いるシステムを提供する。【解決手段】目的の稀少細胞と非目的細胞を含む検体を、目的の稀少細胞を捕捉可能なフィルターでろ過する工程と、ろ過工程によってフィルターに捕捉された稀少細胞及び非目的細胞のうち非目的細胞を、フィルター上で標識する工程と、標識工程後のフィルターから稀少細胞と標識された非目的細胞とを含む溶液を回収し、溶液から標識された非目的細胞を除去し、稀少細胞を含む溶液を回収する工程と、稀少細胞を含む溶液中から稀少細胞を捕捉する工程とを含む、稀少細胞回収方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の稀少細胞と非目的細胞を含む検体を、前記目的の稀少細胞を捕捉可能なフィルターでろ過する工程と、
前記ろ過工程によって前記フィルターに捕捉された稀少細胞及び非目的細胞のうち前記非目的細胞を、前記フィルター上で標識する工程と、
前記標識工程後のフィルターから前記稀少細胞と前記標識された非目的細胞とを含む溶液を回収し、前記溶液から前記標識された非目的細胞を除去し、前記稀少細胞を含む溶液を回収する工程と、
前記稀少細胞を含む溶液中から前記稀少細胞を捕捉する工程とを含む、稀少細胞回収方法。
【請求項２】
前記非目的細胞が、白血球である、請求項１に記載の回収方法。
【請求項３】
前記検体は、１０ｍｌあたり１個以上１００個以下の稀少細胞を含む、請求項１または２に記載の回収方法。
【請求項４】
前記捕捉工程で捕捉した稀少細胞を回収する工程を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の回収方法。
【請求項５】
前記捕捉工程後の前記稀少細胞の回収工程は、１ｐＬ以上１００μＬ以下の液量で稀少細胞を回収することを含む、請求項４に記載の回収方法。
【請求項６】
前記捕捉工程後の前記稀少細胞の回収工程で得られた回収液に含まれる全細胞に対する前記稀少細胞の比率が、０．１％以上１００％以下である、請求項４または５のいずれかに記載の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞回収または検出方法、および回収システムに関する。本開示は、とりわけ、血液中の稀少細胞を回収または検出する方法、およびそれに用いる稀少細胞回収システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には、赤血球、白血球、および血小板等の様々な成分が含まれている。疾患の早期発見および診断等を目的として、血液中に含まれるこれらの成分の検査が行われている。
【０００３】
血液中には、血中循環腫瘍細胞／Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ（ＣＴＣ）および免疫細胞等といった稀少細胞が含まれており、これらは、医学的に重要な細胞であるとされている。ＣＴＣは、原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から遊離して血流に沿って循環するがん細胞（腫瘍細胞）である。ＣＴＣが、この血流に沿って循環することによりその他の臓器等に運ばれることによって転移を起こすといわれている。このため、血液中のＣＴＣは、転移性のがんの治療効果の判定や予後予測の因子としての有用であると認められていることから、ＣＴＣの解析が積極的に行われている。
【０００４】
特許文献１には、血液をフィルターで処理して血液中の稀少細胞（ＣＴＣ）をフィルターに捕捉させ、それを分析する方法が開示されている。非特許文献１には、白血球および稀少細胞を含む細胞懸濁液を調製し、該細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を複数の穴が設けられた観察領域に展開し、光学的に撮像して得られた画像から稀少細胞を検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／１０８４５４
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】PLOS ONE, April 2013, Volume 8, Issue 4, e61770
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記の方法では非目的細胞（例えば、白血球）の分離が不十分で多くの非目的細胞が残るため、目的細胞（例えば、稀少細胞）の分析には多大な時間と労力が必要となるという問題がある。また、非目的細胞由来のノイズにより、目的細胞の分析結果が正しく得られないとい問題がある。
さらには、稀少細胞の分析を行う際には、検体中の稀少細胞の濃度が非常に希薄であるため、数mlの検体を処理する必要があるが、その後の分析において少数の細胞を扱うには、少量での扱いが必要になるという問題がある。また検体中の稀少細胞の濃度が希薄であることから目的細胞の分析結果が正しく得られないという問題がある。
稀少細胞の遺伝子解析には、高純度で少量かつ遺伝子解析を阻害しない状態のサンプルとしての回収が必要となるという問題がある。
【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、目的細胞と非目的細胞とを含む検体から高い純度で目的細胞を回収可能な方法およびそれに用いるシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、一態様において、
目的の稀少細胞と非目的細胞を含む検体を、前記目的の稀少細胞を捕捉可能なフィルターでろ過する工程（ろ過工程）と、
前記ろ過工程によって前記フィルターに捕捉された稀少細胞及び非目的細胞のうち前記非目的細胞を、前記フィルター上で標識する工程（標識工程）と、
前記標識工程後のフィルターから前記稀少細胞と前記標識された非目的細胞とを含む溶液を回収し、前記溶液から前記標識された非目的細胞を除去し、前記稀少細胞を含む溶液を回収する工程（分離・回収工程）と、
前記稀少細胞を含む溶液中から前記稀少細胞を捕捉する工程（捕捉工程）と、
を含む、検体中の稀少細胞を回収する方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、目的の稀少細胞と非目的細胞とを含む検体から目的細胞を高い純度かつ少量の液量で回収可能な方法を提供できる。即ち、本発明に拠れば、目的細胞を、遺伝子検査に足るレベルの純度および液量で得ることができる。また、本発明に拠れば、一又は複数の実施形態において、核酸精製工程を行わずに、最低４つの工程（ろ過工程、標識工程、分離・回収工程および捕捉工程など）のみで、上記効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本開示の回収方法の一実施形態における動作例の一例を示すフローチャートである。
【図２】図２は、実施例で使用した細胞捕捉・染色装置の構成概略図である。
【図３】図３は、実施例で使用した磁気分離装置の構成概略図である。
【図４】図４は、実施例で使用した誘電泳動装置の構成概略図である。
【図５】図５は、実施例の結果（稀少細胞と白血球とを検出した結果）の一例を示す画像である。
【図６】図６は、実施例の結果（ＥＧＦＲの遺伝子変異を検出した結果）の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
検体中の目的細胞を正確に分析するには、検体から高純度で目的細胞を回収することが求められる。一般的な細胞の場合、検体中に比較的多くの目的細胞が含まれていることから、純化工程を繰り返し行うことによって、目的細胞の純度を向上させることができる。一方、ＣＴＣ等の稀少細胞の場合、血液等の検体に含まれる量はきわめて微量（例えば、血液8mLに数個程度）であり、その他に多量の非目的細胞（例えば、白血球等）を含む。このため、純化工程を繰り返し行った場合、非目的細胞を除去できたとしても、稀少細胞が損失するリスクがある。したがって、稀少細胞の回収には、純度のみならず、目的の稀少細胞の損失を低減することが求められる。また、稀少細胞の分析は、顕微鏡等による観察やＰＣＲ等の遺伝子解析等により行われることから、純化工程後に回収する液量は少量であることが求められる。
【００１３】
本開示は、一態様において、目的の稀少細胞（以下、目的細胞ともいう）と、目的細胞よりも多く含まれる非目的細胞（例えば、白血球）とを含有する検体からの目的細胞の回収を、純化工程および濃縮工程（例えば、フィルターによるろ過工程）と、さらに、追加の純化および追加の濃縮工程（例えば、分離・回収工程及び捕捉工程）と、全工程中のいずれかの工程中（好ましくは、ろ過工程後）に、当該工程の後に行う純化または濃縮工程のための細胞への標識工程との少なくとも３つの工程を一連の流れで行うことによって、高い純度かつ少量で目的細胞を回収できるという知見に基づく。
ここで、本開示の回収方法では、「純化工程および濃縮工程」の工程の対を少なくも２回含み、かつ、その他の処理工程を含んでもよいところ、上記「全工程」は、当該回収方法にて行われるあらゆる工程を意味し、そのような全ての工程のいずれかの工程中に、上記標識処理を行うことを意味する。即ち、上記標識処理の実施が、前記純化工程および濃縮工程中であってもよいし、それ以外の工程中であってもよい。
【００１４】
純化工程および濃縮工程としては、一又は複数の実施形態において、目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法によるものが挙げられ、例えば、フィルターを用いた物理的分離、および密度勾配を用いた分離等が挙げられる。追加の純化工程および濃縮工程としては、一又は複数の実施形態において、目的の稀少細胞と非目的細胞の生物学的特性の差を利用した方法および／または目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法によるものが挙げられ、例えば、磁気分離、吸引、フローサイトメトリーおよび誘電泳動等が挙げられる。追加の濃縮工程としては、一又は複数の実施形態において、誘電泳動、磁気分離、吸引およびフローサイトメトリー等が挙げられる。ただし、本開示は上記の例には限定されない。
【００１５】
また、本開示は、一態様において、目的細胞と、目的細胞よりも多く含まれる非目的細胞（例えば、白血球）とを含有する検体からの目的細胞の回収を、前記のとおり行い、かつ、前記標識処理を、フィルターに捕捉された細胞のうち非目的細胞に関し、前記フィルター上で標識することによって、高い純度で目的細胞を回収できるという本発明者らが見出した新たな知見に基づく。
【００１６】
本開示は、一態様において、目的の稀少細胞と非目的細胞を含む検体を、稀少細胞を捕捉可能なフィルターでろ過し、稀少細胞及び非目的細胞が捕捉されたフィルター上で、非目的細胞の標識を行い、標識された非目的細胞及び稀少細胞をフィルターから回収し、該標識を用いて非目的細胞と稀少細胞とを選択的に分離して稀少細胞を含む溶液を回収し、ついで該溶液中の稀少細胞を捕捉することによって、検体中に微量しか含まれない稀少細胞を、処理中の損失を大幅に低減しつつ、高い純度かつ高い残存率で回収できるという本発明者らが見出した新たな知見に基づく。なお、本開示において、“フィルター上で標識する”こととしては、上記のフィルターろ過によって捕捉した細胞を該フィルターから回収せずに（稀少細胞がフィルターに実質的に捕捉された状態で）、非目的細胞標識を行うことをいう。
【００１７】
本開示の方法によって、上記の検体から高い純度で目的細胞を回収できるメカニズムは明らかではないが以下のように推測される。
フィルターろ過等といった目的細胞と非目的細胞との物理的な性質の相違を利用して検体中の非目的細胞の一部を除去して純化を行う純化工程および濃縮工程と、磁気分離及び誘電泳動等といった目的の稀少細胞と非目的細胞の生物学的特性の差を利用した方法および／または目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法の少なくとも一方による追加の純化工程および濃縮工程との原理が異なる少なくとも２段階の純化工程を行うことによって、目的細胞と非目的細胞との分離効率を向上できる。また、特に非目的細胞の標識を先の純化工程に用いるフィルター上で行うことにより、各処理間の目的細胞の損失を低減できる。また、目的細胞が複数種類存在し、これらにおいて発現する抗原が異なる場合であっても、標識を非目的細胞に対して行うことにより、目的細胞の抗原に限定されることなく、標識分離によって非目的細胞と目的細胞とを分離でき、目的細胞を選択的に回収することができる。さらには、これらの工程を上記順番で一連の流れとして行うことから、目的細胞の損失を低減できつつ、非目的細胞を分離・除去することができ、最終的に目的細胞を高い純度で回収できると考えられる。ただし、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１８】
本開示において「目的細胞」とは、回収、検出、分析または解析を行う対象の細胞をいう。本開示において「非目的細胞」とは、回収、検出、分析または解析を行う対象の細胞以外の細胞をいう。
【００１９】
本開示の回収方法は、一又は複数の実施形態において、検体中に含まれる細胞の数が非目的細胞に比較して目的細胞のほうが大幅に少ない検体に好適に利用できる。本開示の方法は、一又は複数の実施形態において、検体が血液試料であり、目的細胞がＣＴＣ等の稀少細胞であり、非目的細胞が白血球である場合に特に好適に利用できる。
【００２０】
血液試料としては、一又は複数の実施形態において、血液を構成する成分を含有する試料であり、特に限定されない一又は複数の実施形態において、血液、血球成分を含む血液由来物、血液または血液由来物が混在する体液や尿、および、これらから調製された試料等が挙げられる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、前記生体としては、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、哺乳類）が挙げられる。血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離または調製されたものであって血球成分を含むものまたはそれらの希釈／濃縮物が挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液または血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理し、赤血球の成分を除去した試料または溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球、特定の画分などを含む。これらの中でも、限定されない一又は複数の実施形態においては、簡便かつ迅速な処理の観点および血液中の稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から、前記血液を含む試料としては血液または血球成分を含む血液由来の検体が好ましい。
【００２１】
稀少細胞としては、特に限定されない一又は複数の実施形態において、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、幹細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である。
【００２２】
本開示において「純化」とは、目的細胞と非目的細胞とを含む検体において目的細胞の割合を向上させること、または非目的細胞の数若しくは割合を減少させることをいう。
【００２３】
本開示において「濃縮」とは、試料中の目的の細胞の割合を向上させることまたは特定の領域に目的の細胞を集めることをいう。
また、本開示において「全工程中のいずれかの工程中」、または「純化工程および濃縮工程中に行う」に関し、「工程中」とは、当該工程の準備から完了までの間を含む。
【００２４】
本開示の方法によれば、一又は複数の実施形態において、検体中の目的細胞の数が１０個以下である場合であっても、目的細胞を回収することができる。また、本開示の回収方法によれば、一又は複数の実施形態において、検体１０ｍｌに対して100個以下という少量しか目的細胞を含まない検体から目的細胞を検出でき、さらには、検体１０ｍｌに対して10個以下という少量しか目的細胞を含まない検体から目的細胞を検出できる。また、処理前（検体）は検体中の全細胞に対する目的細胞の割合（目的細胞／全細胞）が０.０００００００１％〜０．０００３％であったものを、例えば、処理後に得られた回収液中の全細胞に対する目的細胞の割合を、０．１％以上、もしくはそれより多く、例えば、１％以上とすることができる。本開示の回収方法によれば、一又は複数の実施形態において、８ｍＬの検体を、例えば、追加の濃縮工程で得られる目的細胞を含む懸濁液の液量を１００μＬ以下、もしくはそれよりも少なく、例えば、５０μＬ以下までに濃縮することができる。
本開示において、「少量」は、遺伝子解析に用いる際の反応液が少量であるところ、目的細胞の成分を含むサンプルの液量も少量であることを意味する。すなわち一般的には、遺伝子増幅は50μL〜100μLの液量で行われ、目的細胞の成分を含むサンプルの液量は前記液量よりも少ない量である。また、一般的には目的の稀少細胞と非目的細胞とを含む血液検体は1ml〜10mlが利用されるため、本開示の「少量」とは、ろ過工程で処理する血液検体の液量に比べて圧倒的に少ないことを意味する。
【００２５】
［本開示の回収方法］
本開示は、一態様において、目的の稀少細胞と非目的細胞を含む検体中の稀少細胞を回収する方法（本開示の回収方法）に関する。
本開示の回収方法は、以下のろ過工程、標識工程、分離・回収工程、及び捕捉工程を含む。
ろ過工程：目的の稀少細胞と非目的細胞を含む検体を、前記目的の稀少細胞を捕捉可能なフィルターでろ過する工程
標識工程：前記ろ過工程によって前記フィルターに捕捉された稀少細胞及び非目的細胞のうち前記非目的細胞を、前記フィルター上で標識する工程
分離・回収工程：前記標識工程後のフィルターから前記稀少細胞と前記標識された非目的細胞とを含む溶液を回収し、前記溶液から前記標識された非目的細胞を除去し、前記稀少細胞を含む溶液を回収する工程
捕捉工程：前記回収工程で回収した前記稀少細胞を含む溶液中から前記稀少細胞を捕捉する工程
【００２６】
本開示の回収方法によれば、上記のろ過工程、標識工程、分離・回収工程、及び捕捉工程をこの順番で行うことから、一又は複数の実施形態において、以下の効果を奏することができる。
標識処理前にフィルターろ過処理を行うことから、検体中の夾雑物を除去しかつ非目的細胞の量を低減できることから、非目的細胞と標識物質との反応性を向上でき、標識に要するコストを低減することができる。また、ろ過処理によって細胞の捕捉しながら細胞の周囲の液体を置換することができることから、目的細胞の損失を低減しながら非目的細胞と標識物質との反応に適した環境で、標識処理を行うことができる。
標識処理を、細胞を捕捉したフィルター上で行う、つまり、ろ過工程と標識工程との間にフィルターから目的細胞を回収する工程を含まないことから、フィルターからの回収時に発生しうる目的細胞の損失を低減することができる。
目的細胞の捕捉（又は濃縮）に先立ち、標識した非目的細胞を分離して目的細胞を選択的に回収することから、標識した非目的細胞を効率よく分離することができ、最終的に得られる回収液（例えば濃縮液）における純度を向上させることができる。
【００２７】
［純化工程および濃縮工程］
純化工程および濃縮工程は、例えば、目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、複数の貫通孔を有し、かつ前記目的の稀少細胞を捕捉可能なフィルターで前記検体をろ過する工程や、複数の貫通孔を有し、かつ前記目的の稀少細胞を選択的に捕捉可能なフィルターで前記検体をろ過して前記検体中の非目的細胞の一部を除去する工程や、検体を密度勾配法によって前記目的の稀少細胞を含む層とそれ以外の層の少なくとも２層に分離し、前記目的の稀少細胞を含む細胞懸濁液を得る工程が含まれる。前者の例としては、目的細胞と非目的細胞とを含む検体を、複数の貫通孔を有し、かつ目的の稀少細胞を捕捉可能なフィルターでろ過して検体中の非目的細胞の一部を除去する工程であり、好ましくは目的細胞を選択的に捕捉可能なフィルターでろ過して検体中の非目的細胞の一部を除去する工程が挙げられる。この場合、純化工程および濃縮工程において、検体中の目的細胞はフィルターにより捕捉される。また、一又は複数の実施形態において、検体中の非目的細胞の一部が、フィルターによって捕捉されてもよい。後者の例としては、当業者に公知の密度勾配法を用いた工程を、適宜、使用できる。
【００２８】
純化工程および濃縮工程を、上記フィルターを用いて行う場合（本開示の回収方法におけるろ過工程）を例にとり説明する。複数の貫通孔を有し、かつ検体中の目的細胞を捕捉可能なフィルターとしては、一又は複数の実施形態において、複数の貫通孔を有するスリット状のフィルターが挙げられる。貫通孔の形状としては、一又は複数の実施形態において、角丸長方形、または楕円形が挙げられる。フィルターの材質は、一又は複数の実施形態において、パリレン、ポリカーボネート等のプラスチック材料、ニッケル、ＳＵＳ、金、銀、胴、アルミニウム、タングステン、またはクロム等の金属が挙げられる。
【００２９】
フィルターとしては、一又は複数の実施形態において、検体中の稀少細胞を捕捉可能なフィルターが挙げられ、例えば、目的細胞と非目的細胞を、両者の変形能ないし粘弾性上の差を利用して、濾過分離可能なフィルターを好適に利用できる。また、フィルターは、一又は複数の実施形態において、白血球の大部分を通過させ、稀少細胞が捕捉可能なフィルターであることが好ましく、より好ましくは検体中のＣＴＣを捕捉可能なフィルターであり、例えば、ＳＮＵ−１、ＳＷ６２０またはこれらの両方を少なくとも捕捉可能なフィルターが挙げられるが、これらには限定されない。フィルターとしては、一又は複数の実施形態において、従来公知または今後開発される稀少細胞を捕捉可能なフィルターが使用できる。フィルターとしては、一又は複数の実施形態において、特許文献１に記載のフィルター、および特願２０１６−０５７３１３に記載のフィルター等が挙げられる。また、例えば、短軸径が１〜５０μｍの楕円、真円または矩形、角が丸い矩形状、スリット状等の貫通孔を多数含むシート状の単一メンブレンが挙げられ、不織布以外のものが好ましい。
短軸径は、小型の稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、一又は複数の実施形態において、５μｍ以上、５μｍより大きい、又は６μｍ以上であり、同様の観点から、１０μｍ以下、８μｍ以下又は７μｍ以下である。長軸径は、変形能の高い稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、一又は複数の実施形態において、１０μｍ以上、２０μｍ以上、３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、又は８０μｍ以上であり、フィルターのたわみやよれ等の発生を抑制し、稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、５０００μｍ以下、４０００μｍ以下、３０００μｍ以下、２０００μｍ以下、１０００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、２００μｍ以下、又は１００μｍ以下である。
【００３０】
フィルターのろ過面積は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、５ｍｍ2以上若しくは１０ｍｍ2以上であり、または１０，０００ｍｍ2以下、２，０００ｍｍ2以下、１，０００ｍｍ2以下、５００ｍｍ2以下、２００ｍｍ2以下、１５０ｍｍ2以下、１００ｍｍ2以下、８０ｍｍ2以下、５０ｍｍ2以下、４０ｍｍ2以下、３０ｍｍ2以下若しくは２５ｍｍ2以下である。本開示において「フィルターのろ過面積」とは、フィルターの全体面積のうち、検体または回収液が接触する（通液する）部分の面積のことをいう。
【００３１】
フィルターにおける貫通孔の孔数は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、試料が通過する領域において、孔あたりの血液量に応じて適宜設定できる。フィルターの孔密度（１ｍｍ2あたりの孔数）は、一又は複数の実施形態において、４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下である。孔密度は、変形能の高い稀少細胞の捕捉率をさらに向上する観点、及び濾過面積抑制の観点、及び／又はフィルターから稀少細胞を効率よく回収する観点から、４５個／ｍｍ2以上、６０個／ｍｍ2以上、７０個／ｍｍ2以上、９０個／ｍｍ2以上、２００個／ｍｍ2以上、３００個／ｍｍ2以上、４００個／ｍｍ2以上、５００個／ｍｍ2以上、６００個／ｍｍ2以上又は７００個／ｍｍ2以上であり、同様の観点から、４００００個/ｍｍ2以下、１００００個/ｍｍ2以下、４０００個/ｍｍ2以下、１５００個／ｍｍ2以下、１０００個／ｍｍ2以下、９００個／ｍｍ2以下又は８００個／ｍｍ2以下である。
【００３２】
フィルターの厚みは、一又は複数の実施形態において、１〜１０００μm、１〜1００μm、１〜５０μm又は１〜２０μｍであり、好ましくは１〜１０μｍであり、より好ましくは１〜８μmである。
【００３３】
フィルターの開口率は、稀少細胞の捕捉率をさらに向上する観点、濾過面積抑制の観点、及び／又はフィルターから稀少細胞を効率よく回収する観点から、一又は複数の実施形態において、１０％以上６０％以下である。フィルターの開口率は、同様の観点から、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３１％以上、３５％以上又は４０％以上であり、同様の観点から、５５％以下又は４５％以下である。
【００３４】
検体の流速は、細胞の捕捉率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、開口面積当たり、０．０１ｍｍ／秒以上、０．０５ｍｍ／秒以上または０．１ｍｍ／秒以上であり、同様の点から、１００ｍｍ／秒以下、５０ｍｍ／秒以下、２５ｍｍ／秒以下、１０ｍｍ／秒以下、５ｍｍ／秒以下または２ｍｍ／秒以下である。
【００３５】
検体の通液量（フィルターを通過させる血液検体の量）は、例えば、５ｍｍ2〜１００００ｍｍ2のろ過面積に対して、０．０７ｍｌ以上、０．２５ｍｌ以上、０．５ｍｌ以上、１ｍｌ以上、１ｍｌより多い量、２ｍｌ以上、３ｍｌ以上または４ｍｌ以上である。また、検体の通液量は、一又は複数の実施形態において、稀少細胞の捕捉率を維持する点から、５ｍｍ2〜１００００ｍｍ2のろ過面積に対して、６Ｌ以下、４Ｌ以下、２Ｌ以下、４００ｍｌ以下、２００ｍｌ以下、１００ｍｌ以下、８０ｍｌ以下、５０ｍｌ以下、３０ｍｌ以下、２５ｍｌ以下、１２ｍｌ以下、１１ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、９ｍｌ以下、または８ｍｌ以下である。或いは、フィルター容量は、一又は複数の実施形態において、一度に多くの試料を処理する観点、変形しやすい細胞を捕捉する観点および稀少細胞の捕捉率を維持する点から、１５ｍｍ2〜２００ｍｍ2のろ過面積に対して、０．２ｍｌより多く、または１３０ｍｌ未満若しくは１３０ｍｌ以下であり、同様の観点から、０．８ｍｌ〜９０ｍｌ、０．８ｍｌ〜６０ｍｌ、２ｍｌ〜５０ｍｌ、２ｍｌ〜４０ｍｌである。
【００３６】
検体の通液圧力は、細胞の捕捉率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、０．１ｋＰａ以上若しくは０．２ｋＰａ以上であり、または２．６ｋＰａ以下、１．５ｋＰａ以下、１．３ｋＰａ以下、１．０ｋＰａ若しくは０．５ｋＰａ以下である。本開示における「検体の通液圧力」とは、系の入口から出口までの系全体の圧力差をいい、例えば、検体を配置したタンクから廃液タンクまでを含む流路を含めた系の圧力差をいう。このため流路構造によっては記載以上の圧力であってもよい。通液圧力（系の圧力差）は、公知の方法で市販の圧力計を用いて測定でき、または流量と流路構造の関係から算出できる。
【００３７】
または、フィルターの孔（１個）あたり、１ｍｍ／ｍｉｎ以上６００ｍｍ／ｍｉｎ以下の平均流速で血液検体を送液することで、稀少細胞を捕捉することが可能である。血液検体の送液条件は、一又は複数の実施形態において、２ｍｍ／ｍｉｎ以上３００ｍｍ／ｍｉｎ以下の流速、３ｍｍ／ｍｉｎ以上１００ｍｍ／ｍｉｎ以下の流速、４ｍｍ／ｍｉｎ以上８０ｍｍ／ｍｉｎ以下の流速又は４ｍｍ／ｍｉｎ以上４０ｍｍ／ｍｉｎ以下の流速である。また平均流量から換算して送液条件を設定してもよい。算出方法としては、単位時間あたりのろ過廃液出口の流量（全孔合算平均流量）又は単位量あたりの濾過時間を測定して平均流量を求め、これを孔数で割ることで、各孔あたりの平均流量が得られる。またその平均流量を孔面積で割ることで平均流速を求めることができる。そして前述した孔あたりの平均流速、又は平均流量の範囲に収まるように送液すればよい。一又は複数の実施形態において、ろ過廃液出口の流量（全孔合算平均流量）を全孔面積で割って算出してもよい。
【００３８】
ろ過処理は、好ましくは血液を濾過工程又は濾過工程と標識工程後に回収された細胞懸濁液に含まれる非目的細胞の総数が１０００００個以下、５００００個以下、１００００個以下、又は６０００個以下となるように行ってもよい。
【００３９】
［標識工程（標識処理）］
標識工程は、例えば、先の純化工程（例えば、ろ過工程）において目的細胞とともにフィルターに捕捉された非目的細胞をフィルター上で標識することができる。標識方法としては、一又は複数の実施形態において、磁気標識が挙げられる。
【００４０】
磁気標識は、一又は複数の実施形態において、非目的細胞の結合分子と、磁気粒子の表面に固定された物質（非目的細胞の結合分子に特異的に反応する物質）とを結合させて非目的細胞に磁気粒子を固定させることにより行うことができる。磁気粒子に固定される物質は、一又は複数の実施形態において、非目的細胞の結合分子に応じて適宜決定できる。磁気粒子としては、一又は複数の実施形態において、表面にアビジンが固定された磁性粒子、表面にストレプトアビジンが固定された磁性粒子、表面にニュートラアビジンが固定された磁性粒子、表面にビオチンが固定された磁性粒子、表面にビオチン誘導体が固定された磁性粒子、表面に抗体が固定された磁性粒子、表面に抗原が固定された磁性粒子等があげられる。磁気粒子のサイズは、特に制限されるものではない。
【００４１】
標識工程は、磁気粒子による標識効率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、磁気粒子を含有する懸濁液を、目的細胞が捕捉されたフィルター面に供給し、供給された懸濁液の一部をフィルター面から他方のフィルター面に向かって、例えば、ポンプ等の送液手段を用いて送液することによるものである。即ち、本開示の標識工程では、懸濁液の一部を粒子捕捉面とは反対側のフィルター面（フィルター下面）側に向かって積極的に送液する点で、意図せずフィルターに液が浸透ないし拡散し、フィルター下面近傍まで当該液が到達する現象とは相違する。本開示の標識工程では、例えば、目的細胞が捕捉されたフィルター面に供給し、供給された懸濁液の一部をフィルター面から他方のフィルター面に向かって送液することにより、フィルターの両面に磁気粒子を含む液体が接する状態とし、ついで、磁気粒子を含む液体を、他方のフィルター面から目的細胞が捕捉されたフィルター面の方向に逆送液することにより行うことが好ましい。この懸濁液の送液は、一又は複数の実施形態において、磁気粒子を含む液体の上部液面と下部液面とがフィルターを挟むように、懸濁液の一部をフィルターの下面側に向かって送液することを含みうる。該送液は、一又は複数の実施形態において、反対側のフィルター面（フィルター下面）近傍に磁気粒子を含む液体が保持されるように行う。該送液は、一又は複数の実施形態において、懸濁液がフィルターを通過し、磁気粒子を含む液体がフィルターの両方の面に接するように、反対面（フィルター下面）側からポンプで引くことによって行うことができる。
【００４２】
標識工程は、一又は複数の実施形態において、磁気粒子を含有する懸濁液の送液に先立ち、非目的細胞に結合分子を固定する処理を行うことを含んでいてもよい。
【００４３】
［追加の純化］
追加の純化は、一又は複数の実施形態において、先の純化工程および濃縮工程で得られた目的細胞と非目的細胞とを含む懸濁液を分離して目的細胞を含む懸濁液を得る工程を含む。
【００４４】
追加の純化工程は、目的の稀少細胞と非目的細胞の生物学的特性の差を利用した方法および／または目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法により行うことができる。このような方法としては、磁気標識された細胞を磁気標識されていない細胞から分ける方法、目的の稀少細胞をそれ以外の細胞から吸引で分ける方法、目的の稀少細胞をそれ以外の細胞からフローサイトメトリーで分ける方法、および誘電泳動を用いた方法の少なくともいずれかが挙げられる。前記追加の純化工程として、生物学的特性の差を利用した方法と目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法としては、例えば、一又は複数の実施形態において、目的の稀少細胞と非目的細胞を、流路中で、異なる方向に偏向させる技術を用いた工程が挙げられる。このような追加の純化工程は、例えば、標識された細胞と標識されていない細胞とを分離する方法であって、流路の一端から、標識された細胞と標識されていない細胞とを含む懸濁液を供給すること、前記流路内において、前記標識された細胞を、前記標識されていない細胞とは異なる方向に偏向させること、前記標識された細胞を流路内壁面に固定すること、および前記標識された細胞が流路内壁面に固定された状態で、前記流路の一端から流路内に気相を導入して前記流路の他端から前記流路内の懸濁液を排出し、前記標識されていない細胞を回収することを含む。例えば、標識工程後に回収した懸濁液を流路内に供給し、標識された非目的細胞を流路内壁面に固定することにより行うことができる。
【００４５】
追加の純化工程は、一又は複数の実施形態において、磁気分離により行うことができる（本開示の回収方法における分離・回収工程の一形態）。追加の純化（例えば、本開示の回収方法における分離・回収工程）は、一又は複数の実施形態において、磁気分離によって標識工程で磁気標識した非目的細胞と目的細胞とを含む溶液から標識した非目的細胞を除去して、目的細胞を選択的に回収することを含む。
【００４６】
追加の純化工程（本開示の回収方法における分離・回収工程）は、磁気標識されていない目的細胞と磁気標識された非目的細胞とを高い精度で分離することができる点から、一又は複数の実施形態において、磁界を生じさせた流路内に標識工程後に回収した懸濁液を供給し、磁気標識された非目的細胞を流路内壁面に固定することを含むことが好ましい。追加の純化工程は、分離精度をさらに向上できる点から、流路内において、磁気標識された非目的細胞を、目的細胞とは異なる方向に偏向させること、および偏向方向の流路内壁面に磁気標識された非目的細胞を固定することを含むことが好ましい。また目的細胞のロスの低減の点から、流路の一端から流路内に気相を導入して流路の他端から流路内の懸濁液を排出することにより行うことが好ましい。
【００４７】
本開示における「気相」とは、気体によって構成される相のことをいう。気相の導入は、一又は複数の実施形態において、導入された気相の圧力で流路内の懸濁液を標識されていない細胞とともに流路の他端側から排出されるように行うことができる。気相の導入は、一又は複数の実施形態において、流路内の懸濁液と導入した気相との間に気液界面が形成されるように行うことができ、さらには、この気液界面が流路の一端（流入口）から他端（流出口）に向かって移動するように行うことができる。気液界面は、一又は複数の実施形態において、流路の内壁面との間に非点ないし非線形の一定領域を有する。また、気液界面と流路の内壁面との接触点が、一又は複数の実施形態において、連続したラインを形成している。気体としては、一又は複数の実施形態において、空気、酸素、窒素、アルゴン、炭酸ガス等が使用できる。
【００４８】
気相は、一又は複数の実施形態において、流路の一端に配置された圧力発生機構等によって導入することができる。圧力発生機構としては、一又は複数の実施形態において、シリンジポンプ、チューブポンプ、加圧ポンプ、真空ポンプ等が挙げられる。
【００４９】
気相の流量は、安定した気液界面形成でき、標識されていない細胞の分離精度をより向上できる点、および流路内壁面に固定した標識された細胞の固定を維持する点から、一又は複数の実施形態において、２５μｌ／分以上、５０μｌ／分以上若しくは７５μｌ／分以上であり、または５００μｌ／分以下若しくは２５０μｌ／分以下である。
【００５０】
［追加の濃縮工程］
追加の濃縮工程は、例えば、追加の純化工程の後で行うこともできる。追加の濃縮工程は、例えば、追加の純化工程で得られた懸濁液の濃縮を行う。このような追加の濃縮工程は、目的の稀少細胞と非目的細胞の生物学的特性の差を利用した方法および／または目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法により行うことができる。このような方法としては、磁気標識された細胞を磁気標識されていない細胞から分ける方法、目的の稀少細胞をそれ以外の細胞から吸引で分ける方法、目的の稀少細胞をそれ以外の細胞からフローサイトメトリーで分ける方法、および誘電泳動を用いた方法の少なくともいずれかが挙げられる。前記濃縮工程として、生物学的特性の差を利用した方法および／または目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法としては、例えば、誘電泳動を利用した方法が挙げられる（本開示の回収方法における捕捉工程の一形態）。
【００５１】
即ち、懸濁液の濃縮（例えば、本開示の回収方法における捕捉工程）は、目的細胞を小空間に集めることができることから、一又は複数の実施形態において、誘電泳動により行うことが好ましい。誘電泳動による濃縮は、一又は複数の実施形態において、誘電泳動を生じさせたチャンバー内に追加の純化工程で得られた懸濁液を導入すること、および誘電泳動によりチャンバー内に目的細胞を捕捉させることにより行うことができる。
【００５２】
目的細胞における分極の発生の低減を抑制する点、電流が流れることによる目的細胞へのダメージを低減する点、または誘電泳動による捕捉率をより向上させる点から、追加の純化工程（分離・回収工程）で得られた懸濁液の媒体は、電気伝導率（導電率）が出来る限り低いことが望ましい。同様の観点から、媒体は、一又は複数の実施形態として、電解質の含有量が少ないことが好ましい。同様の観点から、生細胞の場合、媒体は、一又は複数の実施形態として、ショ糖等張液等の非電解質の等張液が好ましい。また遺伝子増幅の阻害の低減の観点からショ糖等張液等の非電解質の溶液が好ましい。
【００５３】
本開示においては、一または複数の実施態様において、純化工程および濃縮工程として、複数の貫通孔を有し、かつ前記目的の稀少細胞を選択的に捕捉可能なフィルターで前記検体をろ過して前記検体中の非目的細胞の一部を除去する工程Ａを行い、次いで、追加の純化工程として、磁気標識された細胞を磁気標識されていない細胞から分ける方法による工程Ｂを行い、次いで追加の濃縮工程として、誘電泳動を用いた方法による工程を行い、前記工程Ａにおいて、前記工程Ｂのための細胞への標識処理を行う。この態様により、これら４工程のみで、目的の稀少細胞と非目的細胞とを含む検体から目的細胞を高い純度かつ少量で回収できる。
【００５４】
［本開示の分析または検出方法］
本開示は、一態様において、目的細胞と非目的細胞とを含む検体から目的細胞を分析または検出するための方法（本開示の分析または検出方法）に関する。
【００５５】
本開示の分析または検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の回収方法の実施中または完了後に、細胞を分析または検出する工程を含むことを特徴とする。
【００５６】
本開示の分析または検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の回収方法と同様に行うことができる。
【００５７】
本開示の分析または検出方法は、濃縮工程（捕捉工程）で得られた懸濁液中の細胞を分析または検出する分析または検出工程を含む。分析または検出工程は、前記懸濁液中の目的細胞を撮像すること、および撮像により得られた画像を解析することを含む。また、分析または検出工程は、前記濃縮工程で得られた懸濁液を回収すること、および前記懸濁液中の細胞の遺伝子を解析または検出することを含む。遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、EGFR、ALK、RAS、BRAF、PIK3CA、SYT-SSX、IDH1、JAK2、CALR、MPL、BCR-ABL、c-kit、NPM1、MYD88、RHOA、ABCG2、HER2、RET、ROS1、EML4-ALK、MEK1、MET、KIF5B-RETまたはこれらの組
み合わせがあげられる。
【００５８】
［本開示の回収システム］
本開示は、一態様において、稀少細胞を回収するためのシステム（本開示の回収システム）に関する。
【００５９】
本開示の回収システムは、一又は複数の実施形態において、純化工程および濃縮工程（ろ過工程）を実施する純化・濃縮ユニット（ろ過ユニット）と、前記純化工程および濃縮工程に対し、追加的に、純化工程および濃縮工程（分離・回収工程及び捕捉工程）を実施する追加の純化・濃縮ユニット（分離・回収ユニット及び捕捉ユニット）を含み、
前記システムで実施されるいずれかの工程中に、当該工程の後に行う純化工程または濃縮工程のための細胞への標識処理を実施可能に構成されている。
上記「追加的に、」は、純化工程および濃縮工程の工程の対を、少なくとも２回実施することを意味し、先の純化工程および濃縮工程と後の純化工程および濃縮工程とで、主従をつけることを意味しない。
【００６０】
本開示の回収システムは、一又は複数の実施形態において、前記純化・濃縮ユニットが、目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用する物理的分離手段を有し、前記追加の純化・濃縮ユニットが、目的の稀少細胞と非目的細胞の生物学的特性の差を検出する生物学的分離手段および／または目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を検出する物理的分離手段を有する。
【００６１】
本開示の回収システムにおいて、純化・濃縮ユニットは、純化を行う部分と濃縮を行う部分が同一であるか、ないし一体化したものであってもよいし、別体であってもよい。また、追加の純化・濃縮ユニットも、純化を行う部分と濃縮を行う部分が同一であるか、ないし一体化したものであってもよいし、別体であってもよい。
【００６２】
純化・濃縮ユニットは、例えば、分離ユニットを配置可能であり、場合により、分離ユニットに検体を送液可能な送液手段を有していてよい。また、純化・濃縮ユニットは、標識工程に使用する磁気粒子等の標識を含む懸濁液および洗浄液を送液可能な送液手段を備えていてもよい。純化・濃縮ユニットは、一又は複数の実施形態において、本開示の回収方法における純化・濃縮工程を行うことができ、また、所望により、標識工程を行うことができる。
【００６３】
追加の純化・濃縮ユニットは、一又は複数の実施形態において、例えば懸濁液を供給可能な流路と、流路の上部および側面の少なくとも一方に配置された磁場照射体と、流路内の懸濁液を流路外に排出するための導入手段とを有する。磁場照射体から磁界を発生させることにより、磁場照射体を配置した箇所に対応する流路内壁面に、磁気標識された白血球を固定することができる。磁場照射体は、一又は複数の実施形態において、流路の長手方向にわたって配置してもよいし、流路の長手方向の少なくとも一部に配置してもよい。磁場照射体の数は、一又は複数の実施形態において、１個であってもよいし、２個以上の複数であってもよい。磁場照射体としては、一又は複数の実施形態において、磁石、電磁石等が挙げられる。導入手段は、一又は複数の実施形態において、液相を導入可能であってもよいし、気相を導入可能であってもよい。気相の導入手段としては、一又は複数の実施形態において、シリンジポンプ、チューブポンプ、加圧ポンプ、真空ポンプ等の圧力発生機構等があげられる。
【００６４】
捕捉ユニット（追加の純化・濃縮ユニット）は、一又は複数の実施形態において、例えば、懸濁液を供給可能な流路チャンバーと、誘電泳動を生じさせるための電界発生手段とを有し、電界発生手段は流路チャンバーに配置されている。観察のし易さ（視認性）を向上させる点から、電界発生手段は、流路チャンバーの底面に配置することが好ましい。電界発生手段としては、一又は複数の実施形態において、誘電泳動のための対向電極が挙げられる。
捕捉ユニットのチャンバーは、一又は複数の実施形態において、回収ユニットの流路から排出された懸濁液が直接該チャンバーに供給可能なように、回収ユニットの流路と連結していてもよい。
【００６５】
以下に、本開示の回収／検出方法について、限定されない一実施形態を説明する。
【００６６】
図１は、本開示の回収／検出方法の一実施形態を示すフローチャートである。
まず、ろ過工程（第１純化・濃縮工程）（Ｓ０１）では、複数の貫通孔を有するフィルターを用いて、血液中の稀少細胞（目的細胞）とその他の細胞（非目的細胞）との粗分離を行う。粗分離は、血液を、複数の貫通孔を有するフィルターに送液することにより行うことができる。フィルターは、稀少細胞を捕捉可能な貫通孔が複数形成されている。送液条件は上記の通りである。なお、該フィルターは、稀少細胞を捕捉可能であるが、血液中には多量（１０ｍｌあたり３千万〜７千万個）の白血球が含まれており、また、白血球の径は稀少細胞と同程度またはそれよりも大きいことから、該フィルター処理により、検体中の一部の白血球が稀少細胞とともにフィルターに捕捉されうる。この例において、フィルター処理により、目的の稀少細胞と白血球等の非目的細胞とを含む検体において、目的の稀少細胞の割合が向上し、かつ、フィルター上に、検体中の目的の稀少細胞を集積できるから、この例は、本発明におけるろ過工程（純化・濃縮工程）を、一つのユニットで行う例である。
【００６７】
標識工程（Ｓ０２）に先立ち、白血球に対する試薬の反応性を向上させる観点から、溶血剤を供給して処理することによって、フィルターに残存する赤血球を除去することを行ってもよい。
【００６８】
標識工程（Ｓ０２）では、ろ過工程（Ｓ０１）でフィルターに捕捉された白血球に対し、磁気粒子による磁気標識を行う。稀少細胞の損失を低減し回収率を向上させる点から、磁気標識はフィルター上で行う。
磁気粒子と白血球との反応性を向上させる点から、懸濁液の供給に先立ち、白血球を抗体によって免疫染色してもよい。抗体としては、例えば、結合分子を結合させた抗体等が挙げられる。結合分子としては、一又は複数の実施形態において、ビオチン等が挙げられる。また、磁気粒子としては、例えば、上記結合分子に特異的に反応する物質が固定化された磁性粒子を使用してもよい。特異的に反応する物質としては、一又は複数の実施形態において、ストレプトアビジン、およびニュートラアビジン等のタンパク質が挙げられる。
ついで、磁気粒子を含む懸濁液を、稀少細胞および白血球が捕捉されたフィルターに送液して磁気標識を行う。磁気標識は、フィルターの両主面が磁気粒子を含む懸濁液の上部液面と下部液面とによって挟み込まれるように該懸濁液を送液し、その後逆方向に送液した後、フィルター上で攪拌し、ついで磁気粒子と白血球とを反応させることにより行う。磁気粒子と白血球との反応性を向上させる点から、これらの操作を繰り返し行ってもよい。
【００６９】
分離回収後の稀少細胞の検出効率を向上させる点から、磁気標識後に、稀少細胞を抗体によって免疫染色を行ってもよい。抗体としては、例えばＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎのようなＣＴＣの細胞内で発現する抗原を認識する抗体等が挙げられる。稀少細胞内の抗原に抗体を反応させる点から、抗体による標識に先立ち、固定化処理および膜透過処理を行ってもよい。
【００７０】
分離・回収工程（第２純化工程）（Ｓ０３）では、標識工程Ｓ０２で得られた懸濁液の磁気分離を行う。磁気分離は、回収した懸濁液を、磁界を生じさせた流路内に供給することによって、流路内壁面に磁気標識した白血球を固定させ、その状態で稀少細胞を流路外に排出することにより行う。磁界は、稀少細胞の排出効率を向上させる点から、流路の底側以外の壁面に白血球が固定されるように生じさせることが好ましい。稀少細胞の排出は、流路に液相または気相を導入することにより行うことができる。稀少細胞と白血球との分離効率をさらに向上させる点からは、気相を導入することにより行うことが好ましい。稀少細胞の排出は、流路により排出される稀少細胞が、後述する捕捉工程（第２濃縮工程）（Ｓ０４）で使用されるチャンバーに直接供給されるように行ってもよい。
【００７１】
捕捉工程（第２濃縮工程）（Ｓ０４）では、分離・回収工程（第２純化工程）（Ｓ０３）を経た稀少細胞を含む懸濁液を濃縮する。濃縮は、目的細胞を小空間に集めることができることから、誘電泳動により行う。誘電泳動による濃縮は、誘電泳動を生じさせたチャンバー内に分離・回収工程（Ｓ０３）で得られた懸濁液を導入し、誘電泳動によりチャンバー内に目的細胞を捕捉させつつ、液体（懸濁液の媒体）をチャンバー外に排出することにより行う。
【００７２】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
[１] 目的の稀少細胞と非目的細胞とを含む検体から目的の稀少細胞を高純度・少量で回収するための方法であって、
純化工程および濃縮工程と、さらに、追加の純化工程および追加の濃縮工程を含み、
全工程中のいずれかの工程中に、当該工程の後に行う純化工程または濃縮工程のための細胞への標識処理を行うことを特徴とする回収方法。
[２] 前記純化工程および濃縮工程が、目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法によるものであり、
前記追加の純化および濃縮工程が、目的の稀少細胞と非目的細胞の生物学的特性の差を利用した方法および／または目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用した方法によるものである、［１］に記載の回収方法。
[３] 前記純化工程および濃縮工程が、
複数の貫通孔を有し、かつ前記目的の稀少細胞を選択的に捕捉可能なフィルターで前記検体をろ過して前記検体中の非目的細胞の一部を除去する工程と、
検体を密度勾配法によって前記目的の稀少細胞を含む層とそれ以外の層の少なくとも２層に分離し、前記目的の稀少細胞を含む細胞懸濁液を得る工程、
の少なくとも一方を含む、［１］または［２]に記載の回収方法。
[４] 前記追加の純化および濃縮工程が、磁気標識された細胞を磁気標識されていない細胞から分ける方法、目的の稀少細胞をそれ以外の細胞から吸引で分ける方法、目的の稀少細胞をそれ以外の細胞からフローサイトメトリーで分ける方法、および誘電泳動を用いた方法の少なくともいずれかによるものである、[１]〜[３]のいずれかに記載の回収方法。[５] 前記標識処理が、フィルターに捕捉された細胞のうち非目的細胞を、前記フィルター上で標識するものである、[１]〜[４]のいずれかに記載の回収方法。
[６] 前記標識処理が、前記純化工程および濃縮工程中に行われるものである、［１］〜［５］のいずれかに記載の回収方法。
[７] 前記標識処理により標識される細胞が、白血球である、［１］〜［６］のいずれかに記載の回収方法。
[８] 前記検体中の前記目的の稀少細胞が、前記検体１０ｍｌに対して1個以上、100個以下の割合で存在する、[１]〜[７]のいずれかに記載の回収方法。
[９] 前記検体中の前記目的の稀少細胞が、前記検体１０ｍｌに対して1個以上、10個以下の割合で存在する、[１]〜[８]のいずれかに記載の回収方法。
[１０] 得られた回収液中の前記目的の稀少細胞の全細胞に対する比率が、0.1%以上、100%以下である、[１]〜[９]のいずれかに記載の回収方法。
[１１] 得られた回収液中の前記目的の稀少細胞の全細胞に対する比率が、1%以上、100%以下である、[１]〜[１０]のいずれかに記載の回収方法。
[１２] 得られた回収液の量が、1pL以上、100μL以下である、[１]〜[１１]のいずれかに記載の回収方法。
[１３] 得られた回収液の量が、1pL以上、50μL以下である、[１]〜[１２]のいずれかに記載の回収方法。
[１４] [１]〜[１３]のいずれか１項に記載の回収方法の実施中または完了後に、細胞を分析または検出する工程を含む、分析または検出方法。
[１５] 前記分析または検出する工程は、前記目的の稀少細胞を撮像すること、および撮像により得られた画像を解析することを含む、[１４]記載の分析または検出方法。
[１６] 前記分析または検出工程は、前記目的の稀少細胞の遺伝子を解析または検出することを含む、[１４]または[１５]に記載の分析または検出方法。
[１７] 目的の稀少細胞と非目的細胞とを含む検体から目的の稀少細胞を高純度・少量で回収するためのシステムであって、
純化工程および濃縮工程を実施する純化・濃縮ユニットと、
前記純化工程および濃縮工程に対し、追加的に純化および濃縮工程を実施する追加の純化・濃縮ユニットを含み、
前記システムで実施されるいずれかの工程中に、当該工程の後に行う純化または濃縮工程のための細胞への標識処理を実施可能に構成されていることを特徴とする稀少細胞回収システム。
[１８] 前記純化・濃縮ユニットが、目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用する物理的分離手段を有し、
前記追加の純化・濃縮ユニットが、目的の稀少細胞と非目的細胞の生物学的特性の差を利用する生物学的分離手段および／または目的の稀少細胞と非目的細胞の物理的特性の差を利用する物理的分離手段を有する、[１７]に記載の稀少細胞回収システム。
[１９] 前記純化・濃縮ユニットが、複数の貫通孔を有し、かつ前記目的の稀少細胞を選択的に捕捉可能なフィルターおよび密度勾配装置の少なくとも一方を含む、[１７]または[１８]に記載の稀少細胞回収システム。
[２０] 前記追加の純化・濃縮ユニットが、磁界発生装置、誘電泳動装置、吸引装置およびフローサイトメトリーの少なくとも１つを含む、[１７]〜[１９]のいずれかに記載の稀少細胞回収システム。
[２１] 前記純化・濃縮ユニットが、フィルターに捕捉された細胞のうち非目的細胞を、前記フィルター上で標識可能に構成されている、[１７]〜[２０]のいずれかに記載の稀少細胞回収システム。
【００７３】
以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００７４】
［細胞捕捉・染色装置］
図２に示す細胞捕捉・染色装置を準備した。図２の細胞捕捉・染色装置は、磁気ビーズを含有する懸濁液、洗浄液及び染色液等を供給するための供給口１、洗浄液等の廃液を排出するための排出口２、デバイス上部３、フィルター１０を含むフィルター部５およびデバイス下部４、並びに矢印Ａ方向および矢印Ｂ方向に送液可能な送液機構（図示せず）を備える。デバイス上部３は、流路６と、フィルター部５を固定するための支持部材７とを有し、流路６は供給口１と連通する。デバイス下部４は、流路８と、フィルター部５を固定するための支持部材９とを有し、流路８は排出口２と連通する。フィルター１０は、デバイス上部３とデバイス下部４との間に配置され、かつ両面テープ１１，１２によって固定されている。フィルター１０は、複数の貫通孔を備え、かつ下記特性を有するフィルターを使用した。
＜フィルターの特性＞
・孔  短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、面積：５７２μｍ2、形状：スリット
・孔の中心間のピッチ：１４μｍ×１００μｍ（短軸径側×長軸径側）
・孔密度：７１４個／ｍｍ2
・開口率：４１％
・膜厚：５μｍ
・材質：ニッケル
・ろ過面積：２８ｍｍ2
【００７５】
［磁気分離装置］
図３に示す磁気分離装置を準備した。
サフィード（商標）チューブ２１（内径３．１ｍｍ、チューブ長２６ｃｍ、容積２ｃｍ3）の一端２６には、管２４およびシリンジ（１０ｍＬ）を介してシリンジポンプ２３を接続し、かつ、他端２７にはサフィード（商標）チューブから排出された液を回収するための容器２５を配置した。管２４には三方弁２８が配置されている。サフィード（商標）チューブの側面には、磁石（ネオジム磁石（Ｎ４０、角型、２００ｘ１５ｘ５（ｍｍ）、５ｍｍ方向、表面磁束密２２９ｍＴ））を配置した。
【００７６】
［誘電泳動装置］
図４に示す誘電泳動装置を準備した。図４において、（Ａ）は誘電泳動装置３１の上面からの模式図であり、（Ｂ）はチャンバー３２底面における櫛形電極３５の配置の様子を示す。
図４の誘電泳動装置は、マイクロデバイス３１は、流入口３３と、チャンバー３２と、流出口３４と、櫛形電極３５とを有する。流入口３３および流出口３４は、誘電泳動装置３１の上面に形成され、誘電泳動装置３１の底面に沿って長手方向に形成されたチャンバー３２と連通している。櫛形電極３５は、チャンバー３２の底面を構成する基板の上面に形成されている。
【００７７】
図４に示す誘電泳動装置を以下の手順で作製した。
１）  ＩＴＯ基板にウェットエッチングで電極をパターニングした。
２）  シリコンウェハ上に、リソグラフィー技術を用いてＳＵ−８で流路のモールドを作製した。
３）  上記モールドを用いて、ＰＤＭＳで流路を作製した。
４）  電極をパターニングしたＩＴＯ基板と、ＰＤＭＳで作製した流路とを、酸素プラズマで表面を活性化し、ＩＴＯ基板上にパターニングされた電極が流路と向き合うように貼りあわせた。
なお、チャンバー体積は約４μｌとした。
【００７８】
（実施例１）
上記の装置を用い、以下の手順で先の純化工程および濃縮工程、並びに追加の純化工程および濃縮工程を行い、血液から稀少細胞の回収および回収した稀少細胞の解析を行った。
【００７９】
［先の純化工程および濃縮工程］
図２の細胞捕捉・染色装置を使用し、下記工程１〜６の手順で、血液中に含まれる細胞（白血球）を磁気粒子により標識した。
工程１：細胞捕捉・染色装置に、稀少細胞を含有する血液８ｍＬを導入し、血液をフィルター濾過してサイズ選択的に白血球等の細胞を捕捉した（濾過流量：１０００μＬ／分、流速：１.４４４ｍｍ／秒）。
工程２：ＣＤ４５およびＣＤ５０に対する抗体を含む染色液1と、前記抗体を認識するＢｉｏｔｉｎ標識抗体、Alexa594標識抗体、およびHoechst33342を含む染色液2とをこの順でフィルターに添加し細胞と反応させ、ＣＤ４５およびＣＤ５０発現細胞（例えば、白血球）にＢｉｏｔｉｎ標識を行った。
工程３：Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ標識磁気粒子懸濁液をフィルター上面に添加し、細胞と反応させ、Ｂｉｏｔｉｎ標識した細胞にＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ標識磁気粒子標識を行った。
工程４：PFA（paraformaldehyde）を含む固定化液と、Tween20を含む膜透過液とをこの順でフィルターに添加し細胞と反応させ、細胞の固定化と細胞膜の透過を行った。
工程５：FITC標識抗Cytokeratin抗体を含む染色液3をフィルター上面に添加し、細胞と反応させ、Cytokeratin発現細胞（例えば、稀少細胞）にFITC標識を行った。
工程６：誘電泳動液をフィルター上面に添加して十分に送液し、溶液を誘電泳動液に置換し、フィルター上部の細胞懸濁液６００μＬを得た。
なお、得られた細胞懸濁液（600μL）中に含まれている白血球（非目的細胞）の数は、５０００個弱程度であった。
【００８０】
［追加の純化工程］
上記工程６で得られた細胞懸濁液を用いて、図３に示す磁気分離装置による純化を、下記工程７〜１１の手順で行った。
工程７：液相のない、空気で満たされた気相の状態のサフィード（商標）チューブの前半まで、三方弁（三方活栓弁）を通じて工程６で回収した細胞懸濁液６００μＬを導入し、細胞懸濁液からなる液相をサフィード（商標）チューブ内で構築した。
工程８：細胞懸濁液を導入した導入口を三方弁で閉じることで、シリンジポンプ内から細胞懸濁液の末端界面までを一続きの気相にした。
工程９：その後にネオジム磁石（Ｎ４０、角型、２００ｘ１５ｘ５（ｍｍ）、５ｍｍ方向）をサフィード（商標）チューブに隣接させ１５分間、室温で静置した。
工程１０：シリンジポンプから流量１００μＬ／ｍｉｎでサフィード（商標）チューブに空気を導入し、サフィード（商標）チューブ内の液体をチューブの後半まで移動させ、さらに１５分間、室温で静置した。
工程１１：シリンジポンプから流量１００μＬ／ｍｉｎでサフィード（商標）チューブに空気を導入し、サフィード（商標）チューブ内の液体すべてをサフィード（商標）チューブから排出した。
【００８１】
［追加の濃縮工程］
上記工程１１で得られた細胞懸濁液を用いて、図４に示す誘電泳動装置による濃縮を、下記工程１２の手順で行った。
工程１２：誘電泳動液を充填しておいた誘電泳動装置に、２０Ｖｐ−ｐ，１ＭＨｚ，正弦波の交流電流を櫛形電極に印加して誘電泳動力を発生させた状態で、工程１２で得られた細胞懸濁液６００μＬを流量２０μＬ／ｍｉｎで送液することで、細胞懸濁液中の細胞を櫛形電極に捕捉し、濃縮した。
【００８２】
［解析］
上記工程１２まで処理された誘電泳動装置を蛍光顕微鏡（オリンパス社）で撮影を行った。Hoechct33342は蛍光フィルタセット1で、FITC標識抗Cytokeratin抗体は蛍光フィルタセット2で、Alexa594標識抗CD45抗体および、Alexa594標識抗CD50抗体は蛍光フィルタセット3で検出した。
＜蛍光フィルタセット＞
・蛍光フィルタセット１の波長：ＥＸ（励起波長）３６５±５ｎｍ、ＤＭ ４００ｎ以上、ＢＡ（蛍光波長）４７０±２０ｎｍ。
・蛍光フィルタセット２の波長：ＥＸ（励起波長）４７７．５±１７．５ｎｍ、ＤＭ５０５ｎｍ以上、ＢＡ（蛍光波長）５２５±１０ｎｍ。
・蛍光フィルタセット３の波長：ＥＸ（励起波長）５８０±１０ｎｍ、ＤＭ６００ｎｍ以上、ＢＡ（蛍光波長）６２５±１５ｎｍ。
【００８３】
画像解析ソフト（製品名ＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ニコン社）を用いて、取得した画像を解析し、FITC陽性、Alexa594陰性、Hoechct33342陽性の細胞を稀少細胞として、Alexa594陽性、Hoechct33342陽性の細胞を白血球として検出した。
【００８４】
［回収］
解析後に誘電泳動装置から細胞懸濁液を、下記工程１３の手順で回収した。
工程１３：交流電流が印加されていない、すなわち誘電泳動力が発生していない状態で、誘電泳動装置の流出口から、下記工程１４に記載の試薬２０μＬを導入し、流入口に押し出された細胞懸濁液を回収した。
【００８５】
［遺伝子検出］
上記工程１３で回収された細胞懸濁液を、下記工程１４〜１７の手順でEGFRの遺伝子解析を行った。
工程１４：非イオン界面活性剤（NP-40）とタンパク質分解酵素（Proteinase K）を含む試薬と混合し、56℃で5分加温する。
工程１５：更に95℃で15分加温する。
工程１６：核酸精製を行わずにそのままTm解析用蛍光プローブを含むPCR反応液と混合する。
工程１７：2stageからなる2stepのPCR後にTm解析によって変異型を判定する。
＜PCR条件＞
条件1：2stageからなる2step（熱変性step→アニーリング/伸長step）のPCR
条件2：1st stageの熱変性時間が2秒、2nd stageの熱変性時間が1秒
条件3：1st stageのアニーリング/伸長温度が56℃、2nd stageのアニーリング/伸長温度が58℃
条件4：1st stageのサイクル数が10回、2nd stageのサイクル数が50回
【００８６】
図５に示す通り、実施例の方法によって、稀少細胞（白矢印）と白血球（黒矢印）を検出できた。
【００８７】
図６に示す通り、実施例の方法によって、EGFRの遺伝子変異を検出できた。
【００８８】
【表１】
2018059935.tif 000002
【００８９】
表１に示す通り、実施例の方法によって、稀少細胞が10個以下の血液サンプルを処理して、稀少細胞の存在比率1%以上のサンプルを50μL以下で取得できた。
【００９０】
（比較例１）
第２純化工程、第２濃縮工程、および遺伝子解析工程を行わない以外は、実施例１と同様の方法で行った。その結果を下記表２に示す。
【００９１】
【表２】
2018059935.tif 000003
【００９２】
表２に示すとおり、白血球の残存数、サンプル量ともに多く、稀少細胞の存在比率1%以上、サンプル50μL以下は達成できない結果であった。
【００９３】
（比較例２）
第２濃縮工程および遺伝子解析工程を行わない以外は、実施例１と同様の方法で行った。その結果を下記表３に示す。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
表３に示すとおり、サンプル量が多く、サンプル50μL以下は達成できない結果であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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