(57)【要約】【課題】本方法および本組成物は、過剰または異常なＴ細胞活性化により引き起こされる、自己免疫疾患等の障害の治療に有用である。【解決手段】Ｔ細胞活性化を抑制するための方法であって、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子と接触させてＴ細胞活性化を抑制することを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞活性化を抑制するための方法であって、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子と接触させ、Ｔ細胞活性化を抑制することを含む方法。
【請求項２】
前記細胞集団が末梢血単核球試料である、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団がナイーブ表現型（ＣＤ４５ＲＡ＋）のＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子並びに制御性Ｔ細胞の形成を誘導する一つまたは複数の因子と接触させることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記制御性Ｔ細胞の形成を誘導する一つまたは複数の因子が、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、トランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦ−β２）、ビタミンＤ３および／またはデキサメタゾンからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｔ細胞を含む細胞集団を、インターロイキン、抗原、抗原提示細胞、レクチン、および細胞表面受容体に対する抗体もしくは特異的リガンドからなる群から選択される一つもしくは複数の作用物質またはその組合せと接触させることをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記インターロイキンがＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはその組合せである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られたＴ細胞の組成物。
【請求項９】
Ｔ細胞、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子、制御性Ｔ細胞の形成を誘導する一つまたは複数の因子並びに薬剤的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項１０】
治療を要する対象において自己免疫障害を治療するための方法であって、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子で処置してＴ細胞活性化を抑制すること、および処置された標的細胞を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１１】
過剰または異常なＴ細胞活性化によって引き起こされる障害を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、前記患者においてＴ細胞活性化を抑制するのに有効な量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法。
【請求項１２】
０．１×１０６〜５×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
０．３×１０６〜２×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
低用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記低用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が０．１×１０５〜０．５×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記低用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が約０．３×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に、インターロイキン、抗原、抗原提示細胞、レクチン、および細胞表面受容体に対する抗体もしくは特異的リガンドからなる群から選択される一つもしくは複数の作用物質またはその組合せを投与することをさらに含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記インターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはその組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫抑制剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＳＴＲＯ−１＋細胞がＳＴＲＯ−１強陽性細胞に富化されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＳＴＲＯ−１強陽性細胞および／またはその子孫が同種異系間のものである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴ細胞活性化を抑制するための方法および組成物を提供する。本方法および本組成物は、過剰または異常なＴ細胞活性化により引き起こされる、自己免疫疾患等の障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球（本明細書ではＣＤ４＋Ｔ細胞と称する）は、感染や潜在的癌性細胞を撃退する際に他の白血球に「支援」を与えるため、免疫系において中心的な役割を担っている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、体液性免疫および細胞性免疫の両方において必須な役割を担い、さらに寄生虫の感染中には好酸球およびマスト細胞の分化を促進する働きをする。仮にＣＤ４＋Ｔ細胞集団が失われたとすると（エイズ患者の場合ように）、その宿主は、通常は宿主に対し脅威を及ぼさない多くの病原体および腫瘍に対して感受性が高くなってしまう。
【０００３】
従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞は疾患予防において重要で有益な役割を担う一方で、これらの細胞の異常機能は深刻な問題を生み出す可能性がある。ある個体においては、ＣＤ４＋Ｔ細胞の異常機能は自己免疫および他の病態をもたらす。ＣＤ４＋Ｔ細胞が関係しているとされる自己免疫疾患には、多発性硬化症、関節リウマチおよび自己免疫性ブドウ膜炎が挙げられる。基本的に、これらの疾患には異常な免疫応答が関わっており、その中で、免疫系は侵入病原体を攻撃するというその正常な役割を妨げられ、代わりに宿主の体組織を攻撃することで、病気、さらには死をもたらす。標的とされる宿主組織は自己免疫疾患の間で異なり、例えば、多発性硬化症においては、免疫系は脳および脊髄の白質を攻撃し、関節リウマチにおいては、免疫系は関節の滑膜表層を攻撃する。また、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、移植された組織および臓器の拒絶を含む他の疾病、並びにＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ腫の発生に関係しているとされている。
【０００４】
異常なＣＤ４＋Ｔ細胞の活性によって引き起こされる状態の解明は、いくつかの動物モデルに、具体的には実験的に誘導したいくつかの自己免疫疾患に集中している。動物におけるこれらの実験的に誘導した疾患に関する研究は、対応するヒト疾患の治療において有用な情報を提供するであろうという考えに基づいている。この目的を追求する中で、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、および実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を含む、動物において実験的に誘導されたいくつかの自己免疫疾患に、ＣＤ４＋Ｔ細胞が関与することが示された。
【０００５】
ＥＡＥは、動物をミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、脳および脊髄の白質成分）に対し自己免疫させる（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｚｅ）ことにより誘導され、多発性硬化症で観察されるのと同じ臨床症状（脱髄および麻痺）を生じる。ＥＡＥモデルの多発性硬化症の比較モデルとしての価値は、これらの症状が、原因となる関連を共有していることを示す証拠によって証明された：Ｓｔｅｉｎｍａｎおよびその共同研究者は、多発性硬化症患者の脳病変で見出される主な細胞型がＣＤ４＋Ｔ細胞であること（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：３４４−３４５）、およびこれらの脳病変における細胞と会合するＴ細胞受容体（抗原認識に関係する分子）が、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発生に関わるＣＤ４＋Ｔ細胞上のものと同一の３つのアミノ酸が結合している抗原認識用モチーフを有していたこと（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：６８−７０）を示した。その証拠によって、ＥＡＥモデルが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の異常活性により引き起こされる障害の治療法を試験するのに有用であろうことが示される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：３４４−３４５
【非特許文献２】Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：６８−７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を破壊する治療方法はこれらの自己免疫疾患を改善するのに効果的である場合もあるが、この方法には１つの非常に大きな欠点がある。前記治療法は、抗原反応性であり、それにより自己免疫疾患過程に関わるこれらのＣＤ４＋Ｔ細胞を破壊するだけでなく、静止状態の、疾患に関わっていないＣＤ４＋Ｔ細胞をも破壊してしまう。ＣＤ４＋Ｔ細胞は全身的免疫応答（感染体から身体を保護する）において重要であるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団全ての破壊は、患者を深刻な免疫無防備状態にし、それによって感染に非常に感染しやすくさせる。好ましい方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性が過剰または異常である場合にＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制することであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示はＴ細胞活性化を抑制するための方法を提供し、方法には、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子と接触させて、Ｔ細胞活性化を抑制することが含まれる。
【０００９】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子は、Ｔ細胞受容体の活性化を抑制する。
【００１０】
一例では、前記細胞集団は末梢血単核球試料である。
【００１１】
別の例では、前記細胞集団は、ナイーブ表現型（ＣＤ４５ＲＡ＋）のＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
【００１２】
別の例では、前記方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子並びに制御性Ｔ細胞の形成を誘導する一つまたは複数の因子と接触させることを含む。
【００１３】
制御性Ｔ細胞の形成を誘導する一つまたは複数の因子は、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、トランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦ−β２）、ビタミンＤ３および／またはデキサメタゾンからなる群から選択することができる。
【００１４】
別の例では、前記方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を、インターロイキン、抗原、抗原提示細胞、レクチン、および細胞表面受容体に対する抗体もしくは特異的リガンドからなる群から選択される一つまたは複数の作用物質またはその組合せと接触させることをさらに含む。
【００１５】
インターロイキンはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはその組合せからなる群から選択することができる。
【００１６】
本開示はまた、本明細書に記載の方法によって得られるＴ細胞の組成物を提供する。
【００１７】
本開示はまた、Ｔ細胞、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子、制御性Ｔ細胞の形成を誘導する一つまたは複数の因子並びに薬剤的に許容できる担体を含む組成物を提供する。
【００１８】
本開示はまた、治療を要する対象において自己免疫障害を治療するための方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子で処置し、Ｔ細胞活性化を抑制すること、並びに対象にその処置細胞を投与することを含む。
【００１９】
本開示はまた、過剰または異常なＴ細胞活性化によって引き起こされる障害を治療または予防するための方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、患者においてＴ細胞活性化を抑制するのに有効な量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む。
【００２０】
前記方法は、前記対象に、インターロイキン、抗原、抗原提示細胞、レクチン、および細胞表面受容体に対する抗体もしくは特異的リガンドからなる群から選択される一つもしくは複数の作用物質またはその組合せを投与することをさらに含んでもよい。インターロイキンはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはその組合せからなる群から選択することができる。
【００２１】
処置されたＴ細胞もしくはＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子と共に併用投与することができるさらなる活性薬剤には、限定はされないが、β−インターフェロン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、腫瘍壊死α遮断薬（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｌｐｈａ  ｂｌｏｃｋｅｒ）、抗マラリア剤、シクロスポリン、腫瘍壊死α阻害剤（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｌｐｈａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗体治療薬、細胞ベースの治療薬（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）およびＴ細胞エピトープ（例えば、ＣｉｒｃａｓｓｉａによるＴｏｌｅｒｏＴｒａｎｓ移植片拒絶治療（ＴｏｌｅｒｏＴｒａｎｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ）等）が含まれる。
【００２２】
いくつかの例では、Ｓｔｒｏ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれに由来する可溶性因子は、Ｔ細胞の同時刺激を遮断するための分子を発現するよう遺伝子改変されている。
【００２３】
本開示の方法のいくつかの例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−１強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）細胞に富化される。
【００２４】
ＳＴＲＯ−１＋細胞は自己のものであっても同種異系のものであってもよい。一例では、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞は同種異系のものである。
【００２５】
本方法の別の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、可溶性因子を得るより前に培養液中で増殖済みである。
【００２６】
本方法の別の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、１０５〜１０１０細胞の投与量範囲で投与される。
【００２７】
例示的な細胞の投与量には、０．１×１０６〜５×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が含まれる。例えば、前記方法は、０．３×１０６〜２×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。
【００２８】
前記方法の１つの形態には、低用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することが含まれる。そのような低用量は、例えば、約０．３×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫等の、０．１×１０５〜０．５×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫である。
【００２９】
本開示は前記細胞および／または可溶性因子を多数投与することも企図している。例えば、そのような方法は、前記細胞を投与すること、および対象をモニターして自己免疫障害の一つまたは複数の症状がいつ発生または再発するかを決定すること、並びにさらなる投与量の前記細胞および／または可溶性因子を投与することを含み得る。自己免疫障害の症状を評価するのに適切な方法は、当業者には明らかである、および／または本明細書に記載されるだろう。
【００３０】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫に富化された集団並びに／またはそれに由来する可溶性因子は、週に１回またはそれより少ない頻度、例えば、４週間毎に１回またはそれより少ない頻度で投与される。
【００３１】
別の実施形態では、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団並びに／またはそれに由来する可溶性因子は、全身投与される。例えば、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団並びに／またはそれに由来する可溶性因子は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、大動脈中、心臓の心房もしくは心室中、または臓器に連結した血管中、例えば、腹大動脈、上腸間膜動脈、膵十二指腸動脈もしくは脾動脈中に投与することができる。
【００３２】
別の例では、本開示の方法はさらに、免疫抑制剤を投与することを含む。免疫抑制剤は、前記移植細胞が機能的であることを可能にするのに十分な時間投与され得る。一例では、免疫抑制剤はシクロスポリンである。シクロスポリンは５〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与され得る。
【００３３】
本明細書の全体を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載される要素、整数もしくはステップ、または複数の要素、整数もしくはステップの群の包含を意味するが、他のいかなる要素、整数もしくはステップ、または複数の要素、整数もしくはステップの群の排除を意味するものではないことは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】成人ＢＭＭＮＣによるＴＮＡＰ（ＳＴＲＯ−３）および間葉系前駆細胞マーカー、ＳＴＲＯ−１強陽性の共発現。  ＳＴＲＯ−１  ＭＡＣＳで選別したＢＭＭＮＣのインキュベーション、およびＦＩＴＣ共役型ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体での間接標識（ｘ軸）、およびＰＥ共役型ヤギ抗マウスＩｇＧで間接標識されたＳＴＲＯ−３ｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）（ｙ軸）によって、二色免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを行った。ドットプロットヒストグラムはリストモードデータとして収集した５×１０４個の事象を表わしている。垂直線および水平線は、同条件下で処置したアイソタイプ一致の対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた平均蛍光の１．０％未満の活性レベルに設定した。結果は、少数のＳＴＲＯ−１強陽性細胞集団がＴＮＡＰを共発現したが（右上の象現）、一方残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３ｍＡｂと反応しなかったことを示している。
【図２−１】培養および増殖したＳＴＲＯ−１強陽性ＭＰＣのＳＴＲＯ−１強陽性またはＳＴＲＯ−１弱陽性（ｄｉｍ）子孫の遺伝子発現プロファイル  ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた骨髄ＭＰＣの単個細胞浮遊液をトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって調製した。細胞をＳＴＲＯ−１抗体で染色（ｓｔａｉｎ）し、続いてその抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートと一緒にインキュベートすることによって明らかにした。蛍光標識細胞分取後に、細胞内全ＲＮＡをＳＴＲＯ−１弱陽性またはＳＴＲＯ−１強陽性発現細胞の精製集団から調製した（Ａ）。ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法、および標準的な手順を用いて、各亜集団から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。前述した標準的なプロトコール（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１６：１８２７−１８３５，  ２００３）を用いて、種々の転写物の発現をＰＣＲ増幅によって評価した。本研究に用いたプライマーセットを表２に示す。増幅後、各反応混合物を１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、エチジウムブロマイド染色で可視化した（Ｂ）。各細胞マーカーについての相対的な遺伝子発現を、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェア（Ｃ）を用い、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして、評価した。
【図２−２】培養および増殖したＳＴＲＯ−１強陽性ＭＰＣのＳＴＲＯ−１強陽性またはＳＴＲＯ−１弱陽性（ｄｉｍ）子孫の遺伝子発現プロファイル  ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた骨髄ＭＰＣの単個細胞浮遊液をトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって調製した。細胞をＳＴＲＯ−１抗体で染色（ｓｔａｉｎ）し、続いてその抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートと一緒にインキュベートすることによって明らかにした。蛍光標識細胞分取後に、細胞内全ＲＮＡをＳＴＲＯ−１弱陽性またはＳＴＲＯ−１強陽性発現細胞の精製集団から調製した（Ａ）。ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法、および標準的な手順を用いて、各亜集団から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。前述した標準的なプロトコール（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１６：１８２７−１８３５，  ２００３）を用いて、種々の転写物の発現をＰＣＲ増幅によって評価した。本研究に用いたプライマーセットを表２に示す。増幅後、各反応混合物を１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、エチジウムブロマイド染色で可視化した（Ｂ）。各細胞マーカーについての相対的な遺伝子発現を、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェア（Ｃ）を用い、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして、評価した。
【図３】培養および増殖後ＳＴＲＯ−１＋ＭＰＣのＳＴＲＯ−１強陽性子孫は高レベルのＳＤＦ−１を発現するが、ＳＴＲＯ−１弱陽性子孫は発現しない。  （Ａ）ＭＡＣＳで単離したＳＴＲＯ−１＋ＢＭＭＮＣの調製物を、ＦＡＣＳを用いて、領域に応じた異なるＳＴＲＯ−１サブセット、ＳＴＲＯ−１強陽性およびＳＴＲＯ−１弱陽性／微陽性（ｄｉｍ／ｄｕｌｌ）に区画した。各ＳＴＲＯ−１亜集団から全ＲＮＡを調製し、ＳＴＲＯ−１強陽性サブトラクションハイブリダイゼーションライブラリーを構築するのに用いた（Ｂ−Ｃ）。ＳＴＲＯ−１強陽性サブトラクテッドｃＤＮＡで形質転換した細菌のクローンから増幅した代表的なＰＣＲ産物でブロットされている複製ニトロセルロースフィルター。その後、フィルターを［３２Ｐ］デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）‐標識ＳＴＲＯ−１強陽性（Ｂ）またはＳＴＲＯ−１弱陽性／微陽性（Ｃ）サブトラクテッドｃＤＮＡのいずれかで精査した。矢印は、ヒトＳＤＦ−１に対応するｃＤＮＡ断片を含む１クローンの特異的な発現を示している。（Ｄ）培養前に新たにＭＡＣＳ／ＦＡＣＳで単離したＢＭＭＮＣ  ＳＴＲＯ−１集団から調製した全ＲＮＡ中のＳＤＦ−１およびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）転写物の相対的な発現を示している逆転写酵素（ＲＴ）‐ＰＣＲ分析。ｂｐは塩基対を示している。
【図４】Ｔ細胞増殖阻害におけるＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１強陽性ＭＰＣ（調製物Ｂ）の比較効率。  ＰＢＭＣを、調製物ＡまたはＢの非存在下または存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８被膜ビーズで４日間刺激した。Ｔ細胞の増殖を、カウント／分（ｃｐｍ）として、３Ｈ−Ｔｄｒ取り込みによって測定した。
【図５】Ｔ細胞増殖阻害におけるＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１強陽性ＭＰＣ（調製物Ｂ）の比較効率  ＰＢＭＣを異なる濃度の調製物ＡまたはＢの存在下でＣＤ３／ＣＤ２８被膜ビーズで４日間刺激した。種々の培地におけるＴ細胞増殖を３Ｈ−Ｔｄｒ取り込みによって測定し、ＰＢＭＣをＭＳＣ非存在下で刺激した対照Ｔ細胞増殖の百分率として報告した。
【図６】ＳＴＲＯ−１強陽性ＭＰＣは特異的抗原に対するＴ細胞の免疫応答を低減または阻止する。  ＭＯＧ３５−５５免疫後３６日目に、脾細胞をＭＰＣ処置マウスおよび対照から得た。脾細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、ＭＯＧ３５−５５で再刺激し、Ｔ細胞増殖応答を［３Ｈ］−チミジン取り込みによって測定した。
【図７】ＳＴＲＯ−３で免疫選択し培養増殖したヒトＭＰＣはＴ細胞のＰＨＡ活性化を阻害する。  ＰＭＢＣを、違法の（ｉｌｌｉｃｉｔ）リンパ球増殖に対し、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激した。ＳＴＲＯ−３選別ＭＰＣは、ある濃度範囲に渡って、ＰＭＢＣによるＴ細胞増殖を有意に抑制することができた。
【図８】ＳＴＲＯ−３で免疫選択し培養増殖したヒツジＳＴＲＯ−１強陽性細胞（ＭＰＣ）は、非常に低レベルの同種免疫反応を誘導し、Ｔ細胞のＰＨＡ活性化を阻害する。  ヒツジＭＰＣは、１％、５％、１０％、２０％または５０％の希釈で刺激細胞で使用された場合、リンパ球（ｌｙｍｐｈｃｙｔｅ）増殖を直接的に誘導せず、ＰＨＡで刺激したヒツジＰＢＭＣに対する同種免疫反応のレベルを有意に阻害することができた。
【図９】ＳＴＲＯ−３で免疫選択し培養増殖したヒツジＳＴＲＯ−１強陽性細胞（ＭＰＣ）の、ＰＨＡを介したリンパ球増殖に対する用量依存的免疫抑制効果  ヒツジＭＰＣは、ヒツジＰＢＭＣまたは精製ヒツジＴ細胞（ミルテニー社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）製Ｔ細胞単離キットを用いて選別）に対するスティミュレーターとして使用された場合、用量依存的にリンパ球増殖を抑制することができた。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本開示は、ＳＴＲＯ−１＋細胞が、抗原特異的機構および非抗原特異的機構を介してＴ細胞活性化を阻害することを示している。例えば、本開示は、ＳＴＲＯ−１＋細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＯＧ−特異的Ｔ細胞増殖応答を阻害することを示している。本開示はまた、ＳＴＲＯ−１＋細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ＣＤ３を介したＴ細胞増殖応答を阻害することを示している。従って、本開示は、制御性Ｔ細胞の数および／または機能における異常が観察された疾患（例えば、自己免疫障害）を治療または予防するための新規の治療方法を提供する。
【００３６】
定義
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」等の用語は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。前記効果は、障害もしくはその症状を完全に、もしくは部分的に予防するという観点から予防的なものであってもよく、並びに／または、障害（例えば、自己免疫疾患）および／もしくは障害に起因する悪影響の部分的または完全な治療という観点から治療的なものであってもよい。「治療」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおけるあらゆる疾患の治療を包含し、（ａ）生存期間を増加させること；（ｂ）疾患による死亡リスクを減少させること；（ｃ）疾患に罹り易いがそれを患っているとはまだ診断されていない対象において疾患が発生することを予防すること；（ｄ）疾患を阻害すること、すなわち、その進行を抑止すること（例えば、疾患増悪の速度を減少させること）；および（ｅ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすこと、を含む。
【００３７】
本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬とは、統計的な検体において、無処置対照検体と比較した場合、処置された検体において障害もしくは状態の発生を減少させる、または無処置対照検体と比較した場合、障害もしくは状態の発症を遅延する、もしくは障害もしくは状態の一つもしくは複数の症状の重症度を減少させる化合物を指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、哺乳動物、例えばヒトを含む動物を指す。「哺乳動物」という用語には、霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットを含む家畜、動物園の動物等の捕獲動物、および野生動物が含まれる。
【００３９】
治療法
本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもたらされ得る、Ｔ細胞活性化を抑制するための方法を提供する。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｔ細胞活性化を抑制するための方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子と、Ｔ細胞活性化を抑制するのに十分な時間接触させることを含む。
【００４１】
一部の実施形態では、前記方法は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）を含む細胞集団を得ること、並びにそのＴ細胞をＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子と、Ｔ細胞受容体活性化を抑制するのに十分な時間接触させることを含む。
【００４２】
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子は、前記細胞集団内の制御性Ｔ細胞の形成または増殖を刺激する。制御性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞の活性を抑制し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋マーカーによって特徴づけられる一部のＴ細胞である。一部の実施形態では、制御性Ｔ細胞はＦｏｘＰ３＋および／またはＩＬ−１０産生制御性Ｔ細胞である。
【００４３】
従って、さらなる実施形態では、本開示の方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、有効量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子、並びにα−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）および／またはトランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦ−β２）等の、制御性Ｔ細胞の形成を刺激する一つまたは複数の因子と一緒に培養することを含む。一部の態様では、培地には、ＩＬ−１０産生制御性Ｔ細胞の発生を促進することが明らかにされているビタミンＤ３および／またはデキサメタゾンも含まれる（Ｂａｒｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９５（５）：  ２００２，  ６０３−６１６）。
【００４４】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子への曝露に先立ち、哺乳類試料から単離される。
【００４５】
Ｔ細胞に対しての「単離された」という用語は、少なくとも７０、８０、９０、９５、９９、または１００％のＴ細胞を有するような細胞集団調製物を指す。一部の態様では、所望の細胞集団を他の細胞成分から単離し、場合によっては、単離状態の細胞の研究を「汚染する」または妨げる可能性がある他の細胞型を特異的に排除する。しかしながら、そのような「単離された」細胞集団が、細胞生存に必要な、または本開示によって提供される所望の結果を達成するためのさらなる細胞型を組み込んでもよいことは理解されるべきである。例えば、単球（マクロファージ）または樹状細胞等の抗原提示細胞は、Ｔ細胞の「単離された」細胞集団中に存在してもよく、または制御性Ｔ細胞の発生を目的として単離されたＴ細胞の集団に添加されてもよい。一部の態様では、これらの抗原提示細胞は、活性化された単球または樹状細胞であってもよい。
【００４６】
本開示の方法で用いるＴ細胞を含む細胞集団は、哺乳類の対象から取った生物試料より単離されてもよい。前記試料は、いくつかの源、例えば、限定はされないが、末梢血、白血球アフェレーシス血液製剤、アフェレーシス血液製剤、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節組織、消化管関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ組織、肝臓、免疫性病変部位（例えば、滑液）、膵臓、および脳脊髄液に由来するものであってもよい。ドナーとなる対象は好ましくはヒトであり、胎児、新生児、小児、成人であってよく、正常の、病気の、または注目の疾患に罹り易いものであってよい。
【００４７】
一部の実施形態では、Ｔ細胞試料は血液試料から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含む。「末梢血単核球」または「ＰＢＭＣ」が意味するものは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等を含む）および単球である。通常は、ＰＢＭＣは標準的な技術を用いて患者から単離される。一部の実施形態では、実質的に全ての赤血球および多形核白血球をドナーに残すまたは戻すことによって、ＰＢＭＣのみが採取される。ＰＢＭＣは、白血球フェレーシス（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）等の、当該技術分野において周知の方法を用いて単離することができる。通常、５〜７リットルの白血球フェレーシス（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ステップが行われ、患者からＰＢＭＣが原則的に除去され、残りの血液成分が戻される。試料の収集は、好ましくは、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）の存在下で行われる。
【００４８】
ＰＢＭＣまたは単離Ｔ細胞を含むＴ細胞含有試料は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子で処置する前に、種々の方法を用いて前処置することができる。一般的に、収集した時点で、収集または細胞をさらに精製および／もしくは濃縮することと同時にこれを行わない場合、細胞をさらに濃縮することができる。例えば、ＰＢＭＣは、密度勾配遠心（例えば、フィコール−ハイパック比重差）によって、部分的に精製することができる。通常、ドナーの試料から単離された細胞は、当該技術分野において周知の技術を用いて、洗浄され、自己抗体、阻害剤等の血清タンパク質および可溶性血液成分が除去される。通常、これには生理的培地または緩衝液の添加と、それに続く遠心が含まれる。これは必要に応じて繰り返してもよい。その後、細胞をカウントすることができるが、一般的に、１×１０９〜２×１０９個の白血球が、５〜７リットルの白血球アフェレーシスから回収される。精製した細胞を適切な培地または緩衝液に再懸濁し、生存率を維持することができる。適切な再懸濁用溶液は、一般的には、低濃度、通常５〜５０ｍＭの許容できる緩衝液と共に、ウシ胎仔血清、ＢＳＡ、ＨＳＡ、正常ヤギ血清、および／または他の天然因子を所望により補添した平衡塩類溶液（例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液等）であるだろう。都合のよい緩衝液には、限定はされないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が含まれる。
【００４９】
所望の特性（例えば、ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋等）を有する細胞を富化する技術を用いて、特定の細胞型（例えば、エフェクターＴ細胞、制御性Ｔ細胞等）を細胞の混合物から分別することができる。最も標準的な分別法は、親和性精製技術を用いており、実質的に単離された細胞集団が得られる。親和性分別のための技術には、限定はされないが、磁気分別（例えば、抗体被膜磁気ビーズを用いる）、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に連結された細胞毒（例えば、補体および細胞毒）、並びに固体基盤に結合された抗体での「パニング」が含まれ得る。厳密な分別を提供する技術には、蛍光標識細胞分取が含まれ、それは多色チャネル、インピーダンスチャネル等、様々な程度に高度化（ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｉｏｎ）され得る。死細胞と会合する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム、ＬＤＳ等）を使用することによって、死細胞から、生細胞を選別することができる。選別された細胞の生存能に対し過度に有害ではない技術は全て使用することができる。
【００５０】
使用される親和性試薬は、細胞表面の分子（例えば、ＣＤ４、ＣＤ２５等）に対して特異的な受容体またはリガンドであってもよい。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、遺伝子導入動物、免疫動物、不死化Ｂ細胞、およびその抗体をコードしているＤＮＡベクターを形質移入された細胞によって産生されてもよい。抗体作製および特定の結合メンバーとしての使用へのそれらの適合性に関する詳細は当業者に周知である。抗体試薬に加えて、ペプチド−ＭＨＣ抗原およびＴ細胞受容体対、並びにペプチドリガンド、エフェクター分子および受容体分子を使用してもよい。
【００５１】
精製のための親和性試薬として用いられる抗体は、通常、分別用の標識と結合している。標識には、磁気ビーズ（直接分別を可能にする）、ビオチン（担体に結合したアビジンもしくはストレプトアビジンで除去できる）、蛍光色素（蛍光標示式細胞分取器で用いることができる）、または特定の細胞型の分別の容易さを可能にするような他の標識が含まれ得る。蛍光色素には、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン等のフィコビリタンパク質、フルオレセイン並びにテキサスレッドが含まれ得る。しばしば、各々のマーカーに対する別個の分取を可能とするために、各々の抗体は異なる蛍光色素で標識される。
【００５２】
所望の細胞集団の精製のために、細胞特異的抗体を細胞の懸濁液に加え、利用可能な細胞表面抗原に結合するのに十分な時間インキュベートする。インキュベーションは、通常少なくとも約５分で、通常約３０分未満となる。分別効率が抗体の不足によって制限されないように、反応混合物中には十分な濃度の抗体が存在することが望ましい（すなわち、飽和量の抗体を用いる）。適切な濃度は滴定によって決定することもできる。細胞の生存能を維持するいかなる培地も、細胞が分別される培地となる。好ましい培地は、０．１％〜０．５％ＢＳＡ含有リン酸緩衝食塩水である。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて使用することができ、例えば、ウシ胎仔血清、ＢＳＡ、ＨＳＡ等を所望により補添された、ダルベッコ変法イーグル培地、ハンクス塩基性塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ＲＰＭＩ、イスコフ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ等が挙げられる。
【００５３】
細胞の染色強度はフローサイトメトリーでモニターすることができるが、フローサイトメトリーではレーザーによって蛍光色素の量的レベル（抗体が結合した細胞表面抗原量に比例）が検出される。フローサイトメトリー、または蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）は、抗体染色の強度、並びに細胞サイズおよび光散乱等の他のパラメーターに基づいて細胞集団を分別するのにも使用することができる。染色の絶対レベルは特定の蛍光色素および抗体製剤によって様々であり得るが、データは対照に基準化することができる。
【００５４】
標識された細胞は、続いて、指定のマーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ２５等）の発現に応じて分別される。分別された細胞は、通常、回収用チューブの底に血清のクッション（ｃｕｓｈｉｏｎ）を有する、細胞の生存能を維持するあらゆる適切な培地に回収することができる。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて用いることができ、例えば、しばしばウシ胎仔血清が補添されているｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。
【００５５】
所望の特性（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞等）が高度に富化された細胞集団はこのようにして得られる。前記所望の集団は、細胞組成の７０％以上または約７０％以上、通常は細胞組成の９０％以上または約９０％以上になり、細胞集団の約９５％以上程にすることもできる。富化された細胞集団は即時使用することができる。細胞は凍結することも可能であるが、分別手順前に細胞を凍結することが好ましい。あるいは、細胞は液体窒素温度で凍結し、長期間保存することができ、解凍して再利用することが可能である。細胞は通常、ＤＭＳＯおよび／またはＦＣＳ中に、培地、グルコース等と共に保存される。解凍されると、細胞は、増殖および分化のための増殖因子、抗原、刺激、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）等を用いることで増殖することができる。
【００５６】
ＰＢＭＣまたは単離Ｔ細胞が必要な前処置全てを施された後、その細胞はＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子で処置される。「処置」とは、本明細書においては、細胞を、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子を含む適切な栄養培地中で、エフェクターＴ細胞を介した免疫応答を阻害する能力を有する制御性Ｔ細胞を生じさせるのに十分な期間、インキュベートすることを意味する。一部の実施形態では、最初の培養液は、おおよそ等体積の栄養培地で希釈される。他の態様では、最初の細胞培養液は２つ以上の部分に分割され、続いて栄養培地で希釈される。培養液分割の利点は、最初の培養液を分割する間に、最初の培養液中に形成された細胞塊（数千の細胞）が自動的に崩れ、より小さな細胞塊（数十〜数百の細胞）を形成することである。これらの小塊は、その後、次の成長期の間により大きな塊に成長することができる。このようにして作製した細胞培養液は、同様の方法を用いて、２倍以上継代することができる。
【００５７】
細胞集団は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、種々の培養条件下で成長することができる。培地は液体であっても半固体（例えば、寒天、メチルセルロース等を含有する）であってもよい。細胞集団は、好都合にも、通常はウシ胎仔血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、および抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）が補添されている、イスコフ改変ダルベッコ培地、またはＲＰＭＩ−１６４０を含むが限定はされないあらゆる適切な栄養培地中に懸濁することができる。
【００５８】
細胞培養液は細胞が応答する増殖因子を含有してもよい。本明細書で定義される増殖因子とは、膜貫通受容体に対する特異的な作用を介して、培養液または無傷組織のいずれかにおいて細胞の生存、成長および／または分化を促進することが可能な分子である。増殖因子には、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子が含まれる。対象の細胞を培養するのに用いることができる具体的な増殖因子には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等）および抗原（例えば、ペプチド抗原、タンパク質抗原、例えば同種抗原）が含まれ、好ましくは抗原提示細胞、レクチン、非特異的な刺激（例えば、ＣｏｎＡ；ＬＰＳ等）と共に用いられる。培養液は、制御性Ｔ細胞の活性を刺激することができる細胞表面受容体に対する抗体（例えば抗ＣＤ３）、または特異的リガンド（精製されたリガンド形態、Ｆｃ融合タンパク質形態、またはロイシンジッパー形態のような組換えにより標識された他の形態）を含有してもよい。例えば、制御性Ｔ細胞上のＴＮＦＲまたは他の共起刺激分子と結合し、制御性Ｔ細胞の活性を刺激し、増加することができるｍＡｂまたはリガンド。
【００５９】
Ｔ細胞集団は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子処置の前、間、後に、未成熟または成熟樹状細胞、並びに他の抗原提示細胞（例えば、単球、Ｂ細胞、マクロファージ等）と一緒に共培養することができる。
【００６０】
一部の態様では、本発明の方法は、患者に移植するための制御性Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの産生、または制御性Ｔ細胞機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよび分析法の開発に有用である。制御性Ｔ細胞培養は新規の制御因子および医薬品の貴重な源として有用である。
【００６１】
Ｔ細胞の養子移入法は、当該技術分野においては十分に説明がなされており、例えば、米国特許出願第２００６／０１１５８９９号、同第２００５／０１９６３８６号、同第２００３／００４９６９６号、同第２００６／０２９２１６４号、および同第２００７／０１７２９４７号を参照されたい（それらの内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。従って、熟練した実施者ならば、本開示の方法によって得られた処置後Ｔ細胞集団を、それを必要とする患者に移植または再導入することは容易であろう。移植されたＴ細胞は、患者自身または治療を受けていない別のドナーから得られたＴ細胞を含む試料に由来するものであってもよい。これは、通常、当該技術分野で知られている通りに行われ、通常は注入、または他の導入方法を含み、処置された細胞は患者に静脈内投与によって戻される。例えば、細胞は無菌の注射器または他の無菌の導入機構を用いる注入によって、フェンウォール社製の５０ｍｌ輸液バッグに入れることができる。細胞は、その後直ちに、一定期間に渡って、患者のフリーフローの静脈ライン中に静脈投与によって注入することが可能である。一部の態様では、緩衝液または塩等のさらなる試薬も加えることができる。
【００６２】
本開示の別の態様は、本開示の方法により得られた処置後Ｔ細胞および少なくとも１つのさらなる活性薬剤の同時投与（ｃｏｎｊｏｉｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって、自己免疫関連障害を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、前記さらなる活性薬剤は、自己免疫疾患を治療または予防するために用いられる治療薬である。本発明の活性薬剤には、限定はされないが、β−インターフェロン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、腫瘍壊死遮断薬、抗マラリア剤、シクロスポリン、腫瘍壊死α阻害剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、サイトカイン、抗移植片拒絶治療薬、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、抗体治療薬、およびＴ細胞エピトープ（例えば、ＣｉｒｃａｓｓｉａによるＴｏｌｅｒｏＴｒａｎｓ移植片拒絶治療（ＴｏｌｅｒｏＴｒａｎｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ）等）が含まれ得る。同時投与（ｃｏｎｊｏｉｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に適したサイトカインには、限定はされないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１７が含まれ得る。一部の実施形態では、前記さらなる活性薬剤は、制御性Ｔ細胞以外の細胞型を含む細胞集団であり得る。例えば、処置後Ｔ細胞は、治療を必要とする患者に、単球または樹状細胞等の一つまたは複数の抗原提示細胞型と共に、同時に投与され得る。一部の態様では、これらの抗原提示細胞は、活性化された単球または樹状細胞であり得る。
【００６３】
前記細胞を患者に移植した後、必要であれば、治療の効果を評価することができる。当業者ならば、自己免疫疾患の免疫学的徴候を評価するための多くの方法が存在することを認めるであろう（例えば、全抗体価の定量化または特異的免疫グロブリンの定量化、腎機能試験、組織損傷の評価等）。Ｔ細胞の数、表現型、活性化状態並びに抗原および／またはマイトジェンへの応答能等のＴ細胞の機能の試験を行うこともできる。
【００６４】
本開示の一態様は、治療を要する患者に、患者におけるＴ細胞活性化を抑制するのに有効な量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子を投与することによって、患者における、自己免疫性の障害または状態等の、過剰なＴ細胞活性化によって引き起こされる障害を治療または予防するための方法を提供する。
【００６５】
本開示の実施例は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子のマウスモデルへの投与によって、エフェクターＴ細胞活性の抑制がもたらされたことを示している。
【００６６】
一実施形態では、本開示は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子を投与して、自己免疫性の障害または状態の制御性Ｔ細胞を介した抑制を促進する方法を提供する。
【００６７】
本発明の方法は自己免疫障害を患う患者を治療するために用いることができるが、一部の実施形態では、方法は、自己免疫応答を患ってはいないが、発症の危険性がある患者にも適用される。
【００６８】
本開示は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれに由来する可溶性因子並びに少なくとも１つのさらなる活性薬剤の同時投与（ｃｏｎｊｏｉｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって、自己免疫関連障害を治療するための方法を提供する。本発明の活性薬剤には、限定はされないが、β−インターフェロン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、腫瘍壊死遮断薬、抗マラリア剤、シクロスポリン、腫瘍壊死α阻害剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、サイトカイン、抗移植片拒絶治療薬、細胞ベースの治療薬（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ビタミンＤ３、デキサメタゾンおよび抗体治療薬が含まれ得る。同時投与（ｃｏｎｊｏｉｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に適したサイトカインには、限定はされないがＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１７が含まれ得る。一部の実施形態では、前記さらなる活性薬剤は、自己免疫疾患を治療または予防するために用いられる治療薬である。
【００６９】
いくつかの自己免疫疾患の病因は、臓器に存在する自己抗原に対する自己免疫性のＴ細胞応答によって生じると考えられている。例えば、自己反応性Ｔ細胞は、以下の病因に関係付けられている：Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、自己免疫性心筋炎、天疱瘡、セリアック病、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、自己免疫性肝炎、慢性ライム関節炎、家族性拡張型心筋症、若年性皮膚筋炎、多発性軟骨炎、シェーグレン症候群、乾癬、若年性特発性関節炎、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、および移植片対宿主病。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「可溶性因子」という用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫によって産生される、水溶性のあらゆる分子、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、リポ蛋白、リポペプチド、炭水化物等を意味すると解されるものとする。そのような可溶性因子は、細胞内に存在し得る、および／または細胞によって分泌され得る。そのような可溶性因子は、複雑な混合物（例えば、上清）および／もしくはその画分であり得る、並びに／または精製された因子であり得る。本発明の一実施形態では、可溶性因子は、上清中に存在するか、上清中に含有される。従って、一つまたは複数の可溶性因子の投与を対象とする本明細書のいかなる実施形態も、上清の投与に準用すると解されるものとする。
【００７１】
本発明の方法には、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団単独、並びに／またはそれに由来する可溶性因子の投与が含まれ得る。本発明の方法には、子孫細胞単独、または子孫細胞由来の可溶性因子の投与も含まれ得る。本発明の方法には、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞およびその子孫細胞の混合集団、またはＳＴＲＯ−１強陽性細胞およびその子孫細胞の混合培養から得た可溶性因子の投与も含まれ得る。
【００７２】
さらに、本発明のＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞、並びに／またはそれに由来する可溶性因子を用いた１回のみの処置は、長期に渡る免疫抑制剤治療の必要性を排除するため、必要とされ得ると考えられる。あるいは、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれに由来する可溶性因子の複数回投与が採用され得る。
【００７３】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれに由来する可溶性因子の投与量は、広い範囲内で変化し、当然ながら、各々の特殊な症例における個々の要求に合わせられるだろう。通常、非経口投与の場合、レシピエントの体重１キログラム当たり約０．０１〜約５百万個の細胞を投与することが通例である。使用される細胞数は、レシピエントの体重および状態、投与の回数または頻度、並びに当業者に知られる他の可変要素（ｖａｒｉａｂｌｅ）によって決まる。
【００７４】
細胞の投与量の例としては、０．１×１０６〜５×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が挙げられる。例えば、本方法は、０．３×１０６〜２×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。
【００７５】
本方法の１つの形態には、低用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することが含まれる。かかる低用量とは、例えば、０．１×１０５〜０．５×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫であり、例えば、約０．３×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫である。
【００７６】
前記細胞は、約０．０１〜約５×１０６細胞／ｍｌの濃度で、適切な希釈液中に懸濁することができる。注射液に用いる適切な賦形剤は、緩衝食塩水溶液または他の適した賦形剤等の、生物学的および生理学的に細胞およびレシピエントに適合するものである。投与用の組成物は、好ましくは、適当な無菌性および安定性を満たして、標準方法に従って製剤化、製造および保存される。
【００７７】
以下の例は本発明の態様をさらに説明するものである。もっとも、それらは本明細書に記載される本発明の教示または開示を限定するものではない。
【００７８】
ＳＴＲＯ−１＋細胞または子孫細胞、およびそれに由来する上清または１つもしくは複数の可溶性因子
ＳＴＲＯ−１＋細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靱帯、腱、骨格筋、真皮、および骨膜で見出される細胞であり；中胚葉および／または内胚葉および／または外胚葉等の生殖細胞系に分化することができる。
【００７９】
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、多数の細胞型、例えば、限定はされないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織、および線維性結合組織に分化可能な多能性細胞である。これらの細胞が迎える具体的な細胞系譜の決定および分化経路は、増殖因子、サイトカイン、および／または宿主組織によって構築される局所的な微小環境の条件等の機械的影響および／または内在性生物活性因子からの種々の影響に依存する。従って、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、分裂して、どちらも幹細胞である娘細胞を生じる非造血系前駆細胞であるか、または適切な時期に不可逆的に分化して表現型を持つ細胞（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｅｌｌ）を生じる前駆細胞である。
【００８０】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、対象、例えば、治療を受ける対象または近縁の（ｒｅｌａｔｅｄ）対象もしくは非近縁の（ｕｎｒｅｌａｔｅｄ）対象（同一種か異種かに関わらない）から得られた試料から富化される。「富化された」、「富化」という用語またはその変化形は、無処置の細胞集団（例えば、天然環境にある細胞）と比較したときに、ある特定の細胞型の割合またはいくつかの特定の細胞型の割合が増加している細胞集団を記述するために本明細書では使用される。
【００８１】
一例では、本開示で用いられる細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０β）、ＳＴＲＯ−２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋またはその組合せからなる群から、個々に、または集合的に選択される一つまたは複数のマーカーを発現する。
【００８２】
「個々に」とは、本開示が、列挙されたマーカーまたはマーカー群を個別に含むこと、および、個々のマーカーまたはマーカー群が本明細書では個別に記載されてはならないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲は、かかるマーカーまたはマーカー群を互いから個別に、且つ可分的に定義してもよいことを意味している。
【００８３】
「集合的に」とは、本開示があらゆる数の、またはあらゆる組合せの列挙されたマーカーまたはペプチド群を含むこと、および、かかるあらゆる数の、またはあらゆる組合せの列挙されたマーカーまたはマーカー群が本明細書では具体的に記載されてはならないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲は、かかる組合せまたは部分的な組合せを、マーカーまたはマーカー群の他のあらゆる組合せから個別に、且つ可分的に定義してもよいことを意味している。
【００８４】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−１強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）（ＳＴＲＯ−１強陽性（ｂｒｉ）と同義）である。一例では、Ｓｔｒｏ−１強陽性細胞は、ＳＴＲＯ−１弱陽性またはＳＴＲＯ−１中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）細胞と比較して優先的に富化される。
【００８５】
一例では、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞は、さらに、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０β）、ＳＴＲＯ−２＋および／またはＣＤ１４６＋のうちの一つまたは複数である。
【００８６】
一例では、前記間葉系前駆細胞は、ＷＯ２００４／８５６３０で定義されたように、血管周囲の間葉系前駆細胞である。
【００８７】
所与のマーカーに関して「陽性」であると見なされる細胞は、用語が蛍光の強度に関連する場合、マーカーが細胞表面上に存在している程度に応じた、低（低（ｌｏ）または弱陽性（ｄｉｍ））レベルもしくは高（強陽性（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ））レベルのマーカー、または細胞の分取過程で使用される他のマーカーのどちらかを発現している場合がある。低（または弱陽性もしくは微陽性）および強陽性の差異は、分取されている特定の細胞集団上の使用されるマーカーとの関連で理解されるだろう。所与のマーカーに関して「陰性」であるとみなされる細胞は、必ずしもその細胞に全く存在していないわけではない。この用語は、マーカーが、前記細胞によって相対的に非常に低いレベルで発現されていること、および、検出可能な程度に標識された場合に、マーカーが非常に小さなシグナルを発すること、またはバックグラウンドレベル、例えば、アイソタイプ対照抗体を用いて（ｓｕｉｎｇ）検出されたレベル以上には検出不能であること、を意味する。
【００８８】
「強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能な程度に標識された場合に、相対的に大きなシグナルを発する細胞表面上マーカーを指している。理論に制限されることを望むものではないが、「強陽性」細胞は、試料中の他の細胞よりもいっそう多くの標的マーカータンパク質（例えばＳＴＲＯ−１から識別される抗原）を発現すると提唱されている。例えば、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞は、ＦＩＴＣ結合ＳＴＲＯ−１抗体で標識された場合、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって測定される、非強陽性細胞（ＳＴＲＯ−１微陽性／弱陽性）よりも大きな蛍光シグナルを発する。一例では、「強陽性」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞のうちの少なくとも約０．１％を構成している。他の例では、「強陽性」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞のうちの少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％を構成している。一例では、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞は、「バックグラウンド」、すなわちＳＴＲＯ−１−である細胞と比較して、ＳＴＲＯ−１の細胞表面発現が２対数分（２  ｌｏｇ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）高い。比較した場合、ＳＴＲＯ−１弱陽性および／またはＳＴＲＯ−１中間細胞は、「バックグラウンド」よりも、ＳＴＲＯ−１の細胞表面発現が２対数未満分高く、典型的には、約１対数以下分高い。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的なアルカリホスファターゼの全てのアイソフォームを包含することが意図されている。例えば、前記用語には、肝アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎アイソフォーム（ＫＡＰ）が包含される。一例では、ＴＮＡＰはＢＡＰである。一例では、ＴＮＡＰは、本明細書で使用される場合、ブダペスト条約の規定に基づきＰＴＡ−７２８２の受託番号で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるＳＴＲＯ−３抗体と結合することができる分子を指す。
【００９０】
さらに、一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞はクローン原性のＣＦＵ−Ｆを生じさせることができる。
【００９１】
一例では、かなりの割合のＳＴＲＯ−１＋多能性細胞が、少なくとも２種類の異なる生殖細胞系に分化することができる。多能性細胞が分化決定され得る系譜の例としては、限定はされないが、骨前駆細胞；胆管上皮細胞および肝細胞への多分化能を有する肝細胞前駆細胞；乏突起膠細胞および星状膠細胞へと進行するグリア細胞前駆細胞を生じることができる神経限定細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）；ニューロンへと進行する神経前駆細胞；心筋および心筋細胞の前駆細胞、グルコース応答性インスリン分泌膵β細胞株が挙げられる。他の系譜としては、限定はされないが、象牙芽細胞、象牙質産生細胞および軟骨細胞、並びに以下の前駆細胞：網膜色素上皮細胞、 線維芽細胞、ケラチノサイト等の皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、尿細管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靱帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、星状膠細胞および乏突起膠細胞が挙げられる。
【００９２】
別の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、培養後、造血細胞を生じさせることができない。
【００９３】
一例では、本細胞は治療を受ける対象から採取され、標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、自己成分または同種異系成分としてその対象に投与するための上清または可溶性因子または増殖した細胞を得るために用いられる。別の例では、樹立されたヒト細胞株のうちの一つまたは複数の細胞が用いられる。本開示の別の有用な例では、非ヒト動物の（または、患者がヒトでない場合は別の種に由来の）細胞が用いられる。
【００９４】
本開示は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞（後者は増殖後細胞（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｃｅｌｌ）とも称される）から得られる、または由来する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養から生成される上清または可溶性因子の使用も企図している。本開示の増殖後細胞は、培養条件（培地中の刺激因子の数および／または種類を含む）、継代数等に応じて、種々様々な表現型を有し得る。ある例では、子孫細胞は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０回の継代後に、親集団から得られる。もっとも、子孫細胞は、任意の回数の継代後に親集団から得ることができる。
【００９５】
子孫細胞は任意の適切な培地中で培養することによって得ることができる。「培地」という用語は、細胞培養に関して使用される場合、細胞周辺の環境の成分を含む。培地は固体、液体、気体または相および物質の混合物であってもよい。培地には、液体の増殖培地、および細胞増殖を維持しない液体培地が含まれる。また、培地には、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質等のゼラチン質の培地も含まれる。気体培地の例としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体の担体上で増殖している細胞が曝される気相が挙げられる。また、「培地」という用語は、それが未だ細胞と接触していない場合であっても、細胞培養での使用を目的としている物質を指す。すなわち、細菌培養用に調製された栄養分に富んだ液体が培地である。水または他の液体と混合されたときに細胞培養に適したものとなる粉末状混合物は、「粉末状培地」と称することができる。
【００９６】
一例では、本開示の方法に有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体で標識した磁気ビーズを用いて、ＴＮＡＰ＋ＳＴＲＯ−１＋細胞を骨髄から単離し、その後、その単離細胞を培養増殖することによって得られる（適切な培養条件の例は、Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ８５：  ９２９−９４０，  １９９５を参照）。
【００９７】
一例では、そのような増殖後細胞（子孫）（例えば、少なくとも５回継代後）は、ＴＮＡＰ−、ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−、ＣＤ３４−および／またはＣＤ８０−であり得る。しかし、可能性としては、本明細書に記載の条件とは異なる培養条件下では、種々のマーカーの発現は異なる場合がある。また、これらの表現型の細胞は増殖後の細胞集団において優勢であり得るが、一方で、そのことはこの表現型を有さない細胞の割合が小さいことを意味するものではない（例えば、わずかな比率の増殖後細胞はＣＣ９−であり得る）。一例では、増殖後細胞は異なる細胞型への分化能をまだなお有している。
【００９８】
一例では、上清もしくは可溶性因子、または細胞それ自体を得るために用いられる消費後（ｅｘｐｅｎｄｅｄ）細胞集団が含む細胞は、そのうち少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％等がＣＣ９＋である。
【００９９】
別の例では、上清もしくは可溶性因子、または細胞それ自体を得るために用いられる増殖後細胞集団が含む細胞は、そのうち少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％等がＳＴＲＯ−１＋である。
【０１００】
さらなる例では、増殖後細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２はレプチン−Ｒである）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１強陽性およびＣＤ１４６からなる群から集合的に、もしくは個々に選択される一つもしくは複数のマーカー、またはこれらのマーカーのあらゆる組合せを発現し得る。
【０１０１】
一例では、子孫細胞は、ＷＯ２００６／０３２０９２で定義および／または記載される、多能性増殖後ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞子孫（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＳＴＲＯ−１＋  Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｇｅｎｙ）（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１＋多能性細胞が富化された集団を調製する方法は、ＷＯ０１／０４２６８およびＷＯ２００４／０８５６３０に記載されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの状況では、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は完全に純粋な調製物として存在することはまれであり、通常は組織特異的分化決定済み（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞（ＴＳＣＣ）である他の細胞と一緒に存在している。ＷＯ０１／０４２６８は、そのような細胞を骨髄から約０．１％〜９０％の純度レベルで回収することに言及している。子孫が由来するＭＰＣを含む集団は、組織源から直接回収してもよいし、あるいは、ｅｘ  ｖｉｖｏで既に増殖させてある集団であってもよい。
【０１０２】
例えば、子孫は、それらが存在する集団の全細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、収集され、増殖していない、実質的に精製されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞の集団から得てもよい。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１強陽性、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から個々に、または集合的に選択される少なくとも１つのマーカーが陽性である細胞を選別することによって達成することができる。
【０１０３】
ＭＥＭＰＳは、ＳＴＲＯ−１強陽性マーカーに対し陽性であり、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）マーカーに対し陰性であるという点で、新たに収集されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞と区別することができる。対照的に、新たに単離されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、ＳＴＲＯ−１強陽性およびＡＬＰの両方に対し陽性である。本開示の一例では、投与される細胞のうち少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、ＳＴＲＯ−１強陽性、ＡＬＰ−の表現型を有する。一例では、ＭＥＭＰＳはＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１マーカーのうちの一つまたは複数に対し陽性である。さらなる例では、ＭＥＭＰはＴＥＲＴ活性を示さず、および／または、ＣＤ１８マーカーに対し陰性である。
【０１０４】
ＳＴＲＯ−１＋細胞出発集団は、ＷＯ０１／０４２６８またはＷＯ２００４／０８５６３０に記載される、あらゆる一つまたは複数の組織型、すなわち、骨髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚由来、あるいは、より広範に、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靱帯、骨髄、腱および骨格筋由来であってもよい。
【０１０５】
本開示を実施する際、任意の所与の細胞表面マーカーを保有している細胞の分別は、いくつかの異なる方法によって達成できるが、一部の方法は、結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を関係するマーカーに結合し、高レベル結合、または低レベル結合または結合なしのいずれかである、結合を示す細胞を分別することに依存することは理解されるだろう。最も都合のよい結合物質は、モノクローナル抗体等の、抗体または抗体ベースの分子であるか、またはこれらの後者の作用物質の特異性によってモノクローナル抗体に基づいている。抗体は両方のステップに用いることができるが、他の作用物質を用いてもよく、従って、マーカーを保有している細胞、またはマーカーがない細胞を富化するために、これらのマーカーに対するリガンドを使用してもよい。
【０１０６】
抗体またはリガンドを固体の担体に付着させることで、粗分別が可能となる
分別技術は、収集される画分の生存能の保持率を最大とすることが好ましい。異なる効率の種々の技術が、比較的粗い分別を行うために使用可能である。使用される具体的な技術は、分別効率、随伴する細胞毒性、実施の容易さおよび速さ、並びに高性能機器および／または技巧の必要性に応じたものとなるだろう。分別の手順には、限定はされないが、抗体被膜磁気ビーズを用いた磁気分別、アフィニティークロマトグラフィーおよび固体の基盤に付着した抗体での「パニング」が含まれ得る。正確な分別を提供する技術としては、限定はされないが、ＦＡＣＳが挙げられる。ＦＡＣＳを実施するための方法は、当業者には明らかであるだろう。
【０１０７】
本明細書に記載のマーカーの各々に対する抗体は市販されており（例えば、ＳＴＲＯ−１に対するモノクローナル抗体はＲ＆Ｄシステム社、米国から購入できる）、ＡＴＣＣまたは他の預託機関から入手可能であり、および／または、当該分野で認知されている技術を用いて作製することができる。
【０１０８】
ＳＴＲＯ−１＋細胞を単離するための方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベル発現を認識する磁気細胞分取（ＭＡＣＳ）を利用する固相分取ステップである第一ステップを含む。所望であれば、より高レベルの前駆細胞発現をもたらすために、ＷＯ０１／１４２６８の特許明細書に記載される第二の分取ステップを続けることができる。この第二の分取ステップには、２つ以上のマーカーの使用が含まれ得る。
【０１０９】
ＳＴＲＯ−１＋細胞を得るための方法には、既知の技術を用いた第一富化ステップの前に、細胞の源を収集することが含まれてもよい。従って、組織が外科的に摘出される。源組織を構成する細胞は、その後分別されて、いわゆる単一細胞浮遊液にされる。この分別は、物理的手段および／または酵素的手段によって達成することができる。
【０１１０】
適切なＳＴＲＯ−１＋細胞集団を得た後、細胞を任意の適切な手段で培養または増殖させてＭＥＭＰを得ることができる。
【０１１１】
一例では、前記細胞は治療を受ける対象から採取され、標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、その対象に自己または同種異系間の組成物として投与することを目的とした上清または可溶性因子または増殖後細胞を得るために用いられる。別の例では、樹立されたヒト細胞株のうちの一つまたは複数の細胞が、上清または可溶性因子を得るために使用される。本開示の別の有用な例では、非ヒト動物（または、患者がヒトでない場合は別の種に由来）の細胞が、上清または可溶性因子を得るために使用される。
【０１１２】
本開示は、あらゆる非ヒト動物種由来の細胞、例えば、限定はされないが、非ヒト霊長類細胞、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、トリ、および魚の細胞を用いて実施できる。本開示を実施することができる霊長類細胞としては、限定はされないが、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、および他のあらゆる新世界ザルまたは旧世界ザルの細胞が挙げられる。本開示を実施することができる有蹄動物細胞としては、限定はされないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、水牛およびバイソンの細胞が挙げられる。本開示を実施することができるげっ歯類細胞としては、限定はされないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミの細胞が挙げられる。本開示を実施することができるウサギ種の例としては、家畜化されたウサギ、ノウサギ（ｊａｃｋ  ｒａｂｂｉｔ、ｈａｒｅ）、ワタオウサギ、カンジキウサギ、およびナキウサギが挙げられる。ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）は、本開示を実施することができるトリ種の一例である。
【０１１３】
本開示の方法に有用な細胞は、使用前、または上清もしくは可溶性因子を得る前に、保存することができる。真核細胞、具体的には哺乳類細胞を保存および保管するための方法およびプロトコールは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ｊ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．  （１９９７）  Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．；  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．  （２０００）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  Ｎ．Ｊ．を参照）。間葉系幹／前駆細胞、またはその子孫等の単離された幹細胞の生物活性を維持するための方法は、本開示と一緒に利用することができる。一例では、前記細胞は凍結保存を用いて維持および保管される。
【０１１４】
遺伝子改変細胞
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、遺伝子改変されて、例えば、関心のタンパク質、例えば、治療効果および／または予防効果を与えるタンパク質、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、膵リパーゼもしくは膵アミラーゼ、または促進された血管新生に関連するもしくはその原因となるポリペプチド、または細胞の膵細胞もしくは血管細胞への分化に関連するポリペプチドを発現および／または分泌する。
【０１１５】
細胞を遺伝子改変する方法は、当業者には明らかであるだろう。例えば、細胞で発現されるべき核酸は、細胞での発現を誘導するためのプロモーターと機能的に連結される。例えば、核酸は、例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーター等の、対象の種々の細胞中で機能できるプロモーターに連結される。さらなる適切なプロモーターは当該技術分野において周知であり、本発明の実施形態に準用すると解されるものとする。
【０１１６】
好ましくは、核酸は発現コンストラクトの形態で提供される。本明細書で使用される場合、「発現コンストラクト」という用語は、細胞中で機能的に連結された核酸（例えば、レポーター遺伝子および／または対抗選択可能な（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）レポーター遺伝子）を発現させる能力を有する核酸を指す。本発明の枠組みにおいては、発現コンストラクトは、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスのサブゲノム断片もしくはゲノム断片、または異種ＤＮＡを発現可能な形態で維持および／または複製できる他の核酸を含むか、またはそれら自身であってもよいことは理解されるべきである。
【０１１７】
本発明を実施するための適切な発現コンストラクトを構築するための方法は、当業者には明らかであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  （Ｉｎ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ＩＳＢＮ  ０４７  １５０３３８，  １９８７）または Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  （Ｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１）に記載されている。例えば、発現コンストラクトの各成分は、例えばＰＣＲを用いて適切な鋳型核酸から増幅され、その後、例えばプラスミドまたはファージミド等の適切な発現コンストラクト中にクローニングされる。
【０１１８】
そのような発現コンストラクトに適切なベクターは、当該技術分野において周知であり、および／または、本明細書に記載されている。例えば、哺乳類細胞における、本発明の方法に適切な発現ベクターは、例えば、インビトロジェン社より提供されるｐｃＤＮＡベクター一式のベクター、ｐＣＩベクター一式（プロメガ社）のベクター、ｐＣＭＶベクター一式（クロンテック社）のベクター、ｐＭベクター（クロンテック社）、ｐＳＩベクター（プロメガ社）、ＶＰ１６ベクター（クロンテック社）またはｐｃＤＮＡベクター一式（インビトロジェン社）のベクターである。
【０１１９】
当業者は、さらなるベクター、および例えば、インビトロジェン社、クロンテック社またはプロメガ社等の、そのようなベクターの供給源は承知しているだろう。
【０１２０】
単離された核酸分子またはそれを含む遺伝子コンストラクトを発現のために細胞に導入する手段は、当業者に周知である。所与の生物体に用いられる技術は、既知の優れた技術に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入するための手段としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介されるトランスフェクション、例えばリポフェクタミン（ギブコ社、米国メリーランド州）および／またはセルフェクチン（ギブコ社、米国メリーランド州）による、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧによって媒介されるＤＮＡの取り込み、エレクトロポレーション、並びに、例えばＤＮＡを被膜したタングステンまたは金粒子（アグラセタス社（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．）、米国ウィスコンシン州）による微小粒子照射（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）が特に挙げられる。
【０１２１】
あるいは、本発明の発現コンストラクトはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは当該技術分野において周知であり、市販されている。核酸の運搬および宿主細胞ゲノムへの核酸の組込みを目的とした従来のウイルスベースの系としては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。あるいは、アデノウイルスベクターが、エピソームのままの核酸を宿主細胞に導入するのに有用である。ウイルスベクターは、標的細胞および標的組織における遺伝子導入の、効率的で且つ用途の広い方法である。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織で確認されている。
【０１２２】
例えば、レトロウイルスベクターは、通常、最大６〜１０ｋｂの外来配列パッケージング容量を有する、シス作動性長末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。最小のシス作動性ＬＴＲであってもベクターの複製およびパッケージングには十分であり、その後、発現コンストラクトを標的細胞に組み込むのに使用され、長期発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳｒＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合せをベースとするものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ５６：２７３１−２７３９  （１９９２）；  Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：１６３５−１６４０  （１９９２）；  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：５８−５９  （１９９０）；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：２７４−２３１８  （１９８９）；  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２２２０−２２２４  （１９９１）；  ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００；  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０，  １９８９；  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｄ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５−１４，  １９９０；  Ｓｃａｒｐａ  ｅｔ  ａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：８４９−８５２，  １９９１；  Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７，  １９９３を参照）。
【０１２３】
また、様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が核酸運搬用に開発されている。ＡＡＶベクターは、当該技術分野において周知の技術を用いて容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号および同第ＷＯ９３／０３７６９号；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３９８８−３９９６，  １９８８；  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５３３−５３９，  １９９２；  Ｍｕｚｙｃｚｋａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７−１２９，  １９９２；  Ｋｏｔｉｎ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１，  １９９４；  Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１６５−１６９，  １９９４；並びにＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９：１８６７−１８７５，  １９９４を参照されたい。
【０１２４】
本発明の発現コンストラクトを運搬するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルス等の痘ファミリー（ｐｏｘ  ｆａｍｉｌｙ）のウイルス由来のもの、またはアルファウイルス属または複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ウイルスベクター（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５６：３１７−３２１，  １９８９に記載のもの）が挙げられる。
【０１２５】
細胞および可溶性因子の治療／予防における有用性試験
ＳＴＲＯ−１強陽性細胞由来の可溶性因子の、Ｔ細胞活性化を抑制する能力を測定する方法は、当業者には明らかであるだろう。
【０１２６】
例えば、可溶性因子の免疫抑制活性を測定するための適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、本明細書の実施例５および８に記載されている。
【０１２７】
別の例では、本明細書に記載の細胞および／または可溶性因子の有効性は、本明細書中の実施例６に記載されるように、実験的炎症性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて評価される。
【０１２８】
上記のことから当業者には明らかであるが、本開示はまた、Ｔ細胞活性化を抑制するための可溶性因子を同定または単離するための方法を提供し、方法には、
（ｉ）  ＥＡＥを患っている試験対象に可溶性因子を投与すること、およびその対象におけるＥＡＥの進行を評価すること；
（ｉｉ）  （ｉ）の対象におけるＥＡＥレベルを、可溶性因子を投与されていないＥＡＥを患っている対照となる対象におけるＥＡＥレベルと比較すること、を含み、
ここで、対照となる対象と比較して試験対象のＥＡＥが減少していることは、可溶性因子がＥＡＥを治療、防止または遅延させたことを示唆する。
【０１２９】
細胞性組成物
一実施形態では、本発明のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、組成物の形態で投与される。好ましくは、かかる組成物は薬剤的に許容できる担体および／または賦形剤を含む。
【０１３０】
「担体」および「賦形剤」という用語は、貯蔵、投与、および／または活性化合物の生物活性を促進するために当該技術分野において従来的に用いられる組成物を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９８０）を参照）。担体は活性化合物のあらゆる望ましくない副作用を減らすこともできる。適切な担体は、例えば、安定であり、例えば、担体中の他の成分と反応できない。一例では、担体は、治療に使用された投与量および濃度において、重大な局所的または全身的な有害作用をレシピエントにもたらさない。
【０１３１】
本発明のための適切な担体には、従来的に使用されるものが含まれ、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナンおよびグリコールは、特に（等張である場合）水剤用に、好ましい液体担体である。適切な医薬担体および賦形剤としては、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。
【０１３２】
別の例では、担体は、例えば、その中で細胞が生育または懸濁される、培地組成物である。好ましくは、かかる培地組成物は、それを投与された対象においていかなる有害作用も誘導しない。
【０１３３】
好ましい担体および賦形剤は、細胞の生存能および／または膵機能障害を減少、防止または遅延させる細胞の能力に悪影響を及ぼさない。
【０１３４】
一例では、担体または賦形剤によって緩衝作用（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）がもたらされ、それにより細胞および／または可溶性因子が適切なｐＨに維持されることで生物活性が発現される。例えば、前記担体または賦形剤はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、魅力的な担体または賦形剤であるが、その理由は、血流中または組織もしくは組織の周辺もしくは隣接領域中への、例えば、注射による直接的な適用を目的として、本発明の組成物が液体として製造されるような場合に、ＰＢＳが細胞および因子と最小限にしか相互作用せず、細胞および因子の迅速な放出を可能とするためである。
【０１３５】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、レシピエント適合性であり、レシピエントに対し有害ではない産物に分解される足場に組み込む、または埋め込むこともできる。これらの足場によって、レシピエントである対象に移植されるべき細胞に、支持および保護がもたらされる。天然および／または合成の生分解性足場は、そのような足場の例である。
【０１３６】
種々の異なる足場が、本発明の実施において成功裏に使用され得る。好ましい足場としては、限定はされないが、生物的で、分解可能な足場が挙げられる。天然の生分解性足場としては、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン足場が挙げられる。細胞移植の足場のための適切な合成材料は、広範な細胞成長および細胞機能を支持可能なものであるべきである。そのような足場は再吸収可能なものであってもよい。適切な足場としては、例えば、Ｖａｃａｎｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｐｅｄ．  Ｓｕｒｇ．  ２３：３−９  １９８８；  Ｃｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ３８：１４５  １９９１；  Ｖａｃａｎｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｔ．  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．  Ｓｕｒｇ．  ８８：７５３−９  １９９１に記載されるような、ポリグリコール酸の足場；またはポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の合成高分子が挙げられる。
【０１３７】
別の例では、本細胞はゲル状足場（アップジョン社のゼルフォーム等）に投与され得る。
【０１３８】
本発明に有用な本細胞性組成物は、単独で、または他の細胞との混合物として投与されてもよい。本発明の組成物と併せて投与され得る細胞としては、限定はされないが、他の多分化能もしくは多能性を有する細胞もしくは幹細胞、または骨髄細胞が挙げられる。異なる型の細胞は、本発明の組成物と、投与の直前または少し前に混合することができ、あるいは、それらを投与前にある一定期間一緒に共培養してもよい。
【０１３９】
好ましくは、本組成物は、有効量または治療的もしくは予防的に有効量の細胞を含む。例えば、本組成物は、約１×１０５ＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇまたは約１×１０６ＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇ〜約５×１０６ＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇを含む。投与されるべき細胞の正確な量は、種々の因子、例えば、患者の年齢、体重、および性別、並びに膵機能障害の範囲および重症度に応じて決定される。
【０１４０】
一部の実施形態では、細胞は、細胞が対象の血行路に出て行くことを拒むが、細胞から分泌された因子が血行路に進入することは許すチャンバー内に含まれる。このように、本細胞が対象の血行路に因子を分泌することを可能とさせることにより、可溶性因子は対象に投与され得る。そのようなチャンバーは、対象におけるある部位に均等に埋め込むことで可溶性因子の局所レベルを増加させることができ、例えば、移植臓器の中または近くに埋め込まれる。
【０１４１】
本発明の一部の実施形態では、細胞性組成物を用いた治療の開始前に患者を免疫抑制することは、必ずしも必要であったり、望まれるわけではない。従って、Ｓｔｒｏ−１強陽性細胞またはその子孫の、同種異系間、さらには異種間での移植であっても、場合によっては許容されることがある。
【０１４２】
しかし、他の場合においては、細胞治療開始前に、患者を薬理学的に免疫抑制することが望ましいか、または適切であり得る。これは、全身的または局所的な免疫抑制剤の使用によって達成することができ、あるいは封入デバイスにて本細胞を送達することによって達成することもできる。本細胞は、細胞および治療因子に必要とされる栄養分および酸素を透過させるが、免疫液性因子および細胞は透過させないカプセルに封入してもよい。好ましくは、カプセルの材料は、アレルギーを起こしにくいもので、標的組織内に容易に且つ安定して位置し、移植された構造体に保護を与える。移植細胞に対する免疫応答を低減または除去するためのこれらおよび他の手段は、当該技術分野において周知である。代わりに、本細胞を、それらの免疫原性を低減させるために、遺伝的に改変してもよい。
【０１４３】
可溶性因子の組成物
本発明の一実施形態では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子は、例えば、適切な担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で、投与される。好ましくは、担体または賦形剤は可溶性因子または上清の生物学的効果に悪影響を及ぼさない。
【０１４４】
一実施形態では、本組成物は、可溶性因子または上清の成分、例えば、プロテアーゼ阻害剤を安定化させるための組成物を含む。好ましくは、プロテアーゼ阻害剤は、対象に対し有害作用を有するのに十分な量では含まれない。
【０１４５】
ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子を含む組成物は、例えば、培地中で、または安定な担体もしくは緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水中で、適切な液体懸濁液として調製してもよい。適切な担体は本明細書の上記の通りである。別の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子を含む懸濁液は、注射用の油状懸濁液である。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油；またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル；またはリポソームが挙げられる。注射用に使用されるべき懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。所望により懸濁液は、化合物の溶解性を増加させ、高濃度での溶液の調製を可能とさせる、適切な安定剤または作用物質を含んでもよい。
【０１４６】
無菌の注射剤は、必要とされる量の上清または可溶性因子を、上記成分のうちの１つまたは組合せと一緒に、適切な溶媒に組み入れ、必要に応じて、その後フィルター滅菌を行うことによって、調製できる。
【０１４７】
通常、分散液は、上清または可溶性因子を、基本（ｂａｓｉｃ）分散媒および上に列挙されたものから必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに組み入れることによって調製される。無菌注射剤調製用の無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それによって、活性成分およびその予め細菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。本発明の別の態様によれば、上清または可溶性因子は、その溶解性を増強する一つまたは複数のさらなる化合物と共に製剤化され得る。
【０１４８】
担体または賦形剤の他の例は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．；  Ｇｅｎｎａｒｏ  （２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．；  Ａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９３）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｔａｂｌｅｔｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ  （２０００）  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．に記載されている。
【０１４９】
治療組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下では無菌且つ安定であるべきである。本組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、および適切なその混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等の被膜の使用によって、分散の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、本組成物中に等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール等、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射用組成物の持続的吸収は、本組成物中に、吸収を遅らせる作用物質、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。さらに、可溶性因子を、徐放性製剤、例えば徐放性ポリマーを含む組成物中に、投与してもよい。例えば、移植片およびマイクロカプセル化した送達系を含む徐放性製剤等、活性化合物は化合物を急速な放出から保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）等の、生分解性、生体適合性の高分子を使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、特許をとられているか、または当業者に一般的に知られている。
【０１５０】
上清または可溶性因子は、例えば、可溶性因子を除放させるために、適切な基質と併せて投与してもよい。
【０１５１】
投与様式
ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、外科的に移植、注射、送達（例えば、カテーテルまたは注射器を手段として）されてもよいし、あるいは、修復または増強を必要としている部位、例えば臓器に、または対象の血液系に直接的または間接的に投与されてもよい。
【０１５２】
好ましくは、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、対象の血流に送達される。例えば、Ｓｔｒｏ−１強陽性細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は非経口的に送達される。非経口投与の経路の例としては、限定はされないが、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、腹腔内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ，  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、くも膜下腔内が挙げられる。好ましくは、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、動脈内、大動脈中、心臓の心房もしくは心室中、または膵臓に連結した血管、例えば、腹大動脈、上腸間膜動脈、膵十二指腸動脈または脾動脈中に送達される。
【０１５３】
心臓の心房または心室への細胞送達の場合、肺への急速な細胞送達によって生じ得る合併症を避けるため、細胞は左心房または左心室に投与されることが好ましい。
【０１５４】
好ましくは、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、例えば、注射器を用いて、またはカテーテルもしくは中心静脈カテーテル（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｉｎｅ）を通じて、送達部位に注入される。
【０１５５】
治療製剤の投与計画の選択は、いくつかの因子、例えば、血清または組織での実体（ｅｎｔｉｔｙ）の代謝回転速度、症状レベル、および実体（ｅｎｔｉｔｙ）の免疫原性に依存する。投与計画は、許容できる副作用レベルを一貫させて、患者に送達される治療化合物の量を最大とすることが望ましい。従って、送達される製剤の量は、特定の実体（ｅｎｔｉｔｙ）および治療されている状態の重症度に部分的に依存する。
【０１５６】
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、単回急速投与量として送達される。あるいは、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、持続点滴によって、または、例えば、１日、１週間の間隔の、もしくは週に１〜７回の投与によって、投与される。好ましい投与プロトコールは、重大な望ましくない副作用を回避する、最大の投与量または投与頻度を含むものである。週当たりの合計投与量は、使用される化合物のタイプおよび活性に応じて決定される。適切な投与量の決定は、臨床医によって、例えば、当該技術分野において、治療に影響を与えると知られている、もしくは疑われている、または治療に影響を与えると予想されるパラメーターまたは因子を用いて、行われる。通常、投与はやや適量未満の量から開始され、その後、あらゆる負の副作用と比較して所望の、または最適の効果が達成されるまで、小さな増加量で増加される。重要な診断法には、糖尿病の症状の診断法が含まれる。
【実施例】
【０１５７】
実施例１：ＭＳＣ調製
ＭＳＣを、ＵＳ５，８３７，５３９に記載の通りに、骨髄から新規に生成する。およそ８０〜１００ｍｌの髄を無菌のヘパリン含有注射器内に吸引させ、ＭＳＣ生成のためＭＤＡＣＣ細胞治療研究所（ＭＤＡＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に搬送した。骨髄単核細胞をフィコール‐ハイパークを用いて単離し、ゲンタマイシン、グルタミン（２ｍＭ）および２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ハイクローン社（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を含有するα改変ＭＥＭ（αＭＥＭ）を含む、フラスコ当たり５０ｍｌのＭＳＣ増殖培地と共に、２本のＴ１７５フラスコ内に入れた。
【０１５８】
前記細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２〜３日間培養し、その時点で非接着細胞を除去した；残った接着細胞を細胞コンフルエンスが７０％以上に達するまで続けて培養し（７〜１０日間）、その後細胞をトリプシン処理し、ＭＳＣ増殖培地（フラスコ当たり５０ｍｌの培地）と共に６本のＴ１７５フラスコに移した。ＵＳ５，８３７，５３９の表５に記載のように、このように単離して増殖させたＭＳＣはＳＴＲＯ−１陰性である。
【０１５９】
実施例２：ＳＴＲＯ−３＋細胞の選択によるＭＰＣの免疫選択
骨髄（ＢＭ）を、ロイヤルアデレード病院（Ｒｏｙａｌ  Ａｄｅｌａｉｄｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の施設倫理委員会により承認された方法に従って、健康な正常成人の志願者（２０〜３５歳）から採取する。簡潔には、４０ｍｌのＢＭを、後腸骨稜から、リチウム−ヘパリン抗凝固剤含有チューブに吸引する。
【０１６０】
ＢＭＭＮＣを、前述（Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ，  Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｌｏｏｄ  ９２：  ２６１３−２６２８）の通りに、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ニコメッドファーマ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）、ノルウェイ、オスロ）を用いて、密度勾配分別によって調製する。４００×ｇ、４℃、３０分間の遠心分離後、淡黄色の層をホールピペットで除去し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ＣＳＬリミテッド社（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、オーストラリア、ヴィクトリア）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイサーズバーグ）から成る「ＨＨＦ」中で３回洗浄する。
【０１６１】
続いて、ＳＴＲＯ−３＋（またはＴＮＡＰ＋）細胞を、前述（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６：  １８２７−１８３５；  Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｐ．Ｊ．  （１９９５）  Ｂｌｏｏｄ  ８５：  ９２９−９４０）の通りに、磁気活性化細胞分取で単離した。簡潔には、およそ１〜３×１０８個のＢＭＭＮＣを、ＨＨＦ中１０％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清から成るブロッキング緩衝液中で、２０分間、氷上でインキュベートする。細胞を、ブロッキング緩衝液中１０μｇ／ｍｌのＳＴＲＯ−３ｍＡｂ溶液２００μｌと一緒に、氷上で１時間インキュベートする。続いて、細胞を４００×ｇでの遠心分離によってＨＨＦ中で２回洗浄する。ＨＨＦ緩衝液中１／５０希釈のヤギ抗マウスγ−ビオチン（サザンバイオテクノロジー社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、英国バーミンガム）を加え、細胞を氷上で１時間インキュベートする。細胞を、上記と同様に、ＭＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを補充したＣａ２＋およびＭｎ２＋を含まないＰＢＳ）中で２回洗浄し、最終体積０．９ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。
【０１６２】
１００μｌのストレプトアビジンミクロビーズ（ミルテニーバイオテック社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）；ドイツ、ベルギッシュグラートバハ）を細胞懸濁液に添加し、氷上で１５分間インキュベートする。細胞懸濁液を２回洗浄し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、ミニＭＡＣＳカラム（ＭＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ミルテニーバイオテック社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ））上に充填し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄して、ＳＴＲＯ−３ｍＡｂ（２００５年１２月１９日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にＰＴＡ−７２８２の受託番号で寄託；国際公開第ＷＯ２００６／１０８２２９号を参照）と結合しなかった細胞を回収する。さらに１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を加えた後、カラムを磁石から取り除き、ＴＮＡＰ＋細胞を陽圧で単離した。各画分からの細胞の一定分量をストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、純度をフローサイトメトリーで評価することができる。
【０１６３】
実施例３：ＳＴＲＯ−３ｍＡｂによって選択された細胞はＳＴＲＯ−１強陽性細胞である。
ＳＴＲＯ−３ｍＡｂをＳＴＲＯ−１強陽性細胞を単離するための単一試薬として用いることの可能性を確認することを目的とする実験を設計した。
【０１６４】
ＳＴＲＯ−３（ＩｇＧ１）はＳＴＲＯ−１（ＩｇＭ）とは異なるアイソタイプであることを考慮し、ＳＴＲＯ−３のクローン原性ＣＦＵ−Ｆを同定する能力を、ＭＡＣＳ方法を用いて単離されたＳＴＲＯ−１＋細胞とのその共発現に基づく２色ＦＡＣＳ分析によって評価した（図１）。ドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集された５×１０４個の事象を表わしている。垂直線および水平線は、同条件下で処理したアイソタイプ対応対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた平均蛍光の１．０％未満の反応性レベルに設定された。結果は、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞のうち微量の集団がＴＮＡＰを共発現したが（右上象限）、残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３ｍＡｂと反応しなかったことを示している。その後、４つの象限全てからＦＡＣＳで単離された細胞をＣＦＵ−Ｆの発生率に対して評価した（表１）。
【０１６５】
【表１】
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【０１６６】
実施例４：Ｓｔｒｏ−１微陽性細胞およびＳｔｒｏ−１強陽性細胞の相対的な遺伝子および細胞表面タンパク質の発現
最初の一連の実験では、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、蛍光標識細胞分取により単離されたＳＴＲＯ−１微陽性またはＳＴＲＯ−１強陽性集団によって発現される種々の系譜関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルを調べた（図２Ａ）。第二の一連の実験では、フローサイトメトリーおよび平均チャネル蛍光分析を用いて、蛍光標識細胞分取によって単離されたＳＴＲＯ−１微陽性またはＳＴＲＯ−１強陽性集団により発現される、種々の系譜関連タンパク質のうちの細胞表面タンパク質の発現プロファイルを調べた。
【０１６７】
全細胞内ＲＮＡを、２×１０６個のＳＴＲＯ−１強陽性またはＳＴＲＯ−１微陽性分取一次細胞、軟骨細胞ペレットおよび他の誘導された培養液のいずれかから調製し、ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法（バイオテックスラボラトリーズ社（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）、テキサス州ヒューストン）を用い、製造元の推奨に従って、溶解した。その後、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ファルマシアバイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、スウェーデン、ウプサラ）を用いて調製された、各亜集団から単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。種々の転写物の発現を、前述（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎ．  Ｒｅｓ．  １４：４８−５７，  １９９９）の通りに、標準的なプロトコールを用いてＰＣＲ増幅によって評価した。本研究で用いられたプライマーセットを表２に示す。増幅後、各反応混合物を１．５％アガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。ＲＮＡ完全性をＧＡＰＤＨの発現によって評価した。
【０１６８】
各細胞マーカーについての相対的な遺伝子発現を、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用い、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして評価した（図２Ｂ、Ｃ）。さらに、２色フローサイトメトリー分析を用い、ＳＴＲＯ−１抗体と組み合わせて、広範の細胞系譜関連マーカーの発現に基づくｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＭＰＣのタンパク質発現プロファイルを調べた。ＳＴＲＯ−１微陽性およびＳＴＲＯ−１強陽性培養細胞の、遺伝子およびタンパク質発現に基づく一般的な表現型の概要を表３に示す。データは、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＳＴＲＯ−１強陽性ＭＰＣが、アンジオポエチン−１、ＶＣＡＭ−１、ＳＤＦ−１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、およびＲＡＮＫＬを含む血管周囲細胞に関連するマーカーの、特異的なより高い発現を示すことを表わしている。ＳＴＲＯ−１微陽性およびＳＴＲＯ−１強陽性培養細胞のタンパク質および遺伝子発現プロファイルの比較を、表３および表４に要約する。
【０１６９】
また、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞によって唯一発現される遺伝子を同定するために、サブトラクティブハイブリダイゼーション研究を行った。簡潔には、ＳＴＲＯ−１微陽性およびＳＴＲＯ−１強陽性を、上記の通りに単離した（図３Ａ参照）。全ＲＮＡを、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ）を用いて５つの異なる髄試料からプールしたＳＴＲＯ−１微陽性およびＳＴＲＯ−１強陽性細胞から調製した。ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ合成キット（クロンテック社）を用いてファーストストランド合成を行った。製造元の仕様書に従って、最初の室温プロセス中に形成される３’および５’プライマー末端の特異的なプライマー部位を用いる長距離ＰＣＲ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲキット；クロンテック社）によって、得られたｍＲＮＡ／一本鎖ｃＤＮＡハイブリッドを増幅した。ＳＴＲＯ−１強陽性ｃＤＮＡのＲｓａＩ消化後、２つの分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）を使用して、クロンテック社製ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡサブトラクションキットを用いて、異なる特異的なアダプターオリゴヌクレオチドを連結した。製造元のプロトコールに従って、ＳＴＲＯ−１強陽性（テスター）およびＳＴＲＯ−１微陽性（ドライバー）ｃＤＮＡを用いて、逆の場合も同様に、２回のサブトラクティブハイブリダイゼーションを行った。また、この方法を逆に、ＳＴＲＯ−１強陽性ドライバーｃＤＮＡに対してハイブリダイズしたＳＴＲＯ−１微陽性テスターｃＤＮＡを用いて行った。
【０１７０】
ＳＴＲＯ−１強陽性集団によって唯一発現される遺伝子を同定するため、ＳＴＲＯ−１強陽性−サブトラクテッドｃＤＮＡを用いて、Ｔ／Ａクローニングベクターに連結されたＳＴＲＯ−１強陽性サブトラクテッドｃＤＮＡで形質転換された２００の無作為に選択された細菌クローンを含む、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）低密度マイクロアレイフィルターを構築した。続いて、マイクロアレイを［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＳＴＲＯ−１強陽性またはＳＴＲＯ−１微陽性サブトラクテッドｃＤＮＡで精査した（図３Ｂ−Ｃ）。ディファレンシャルスクリーニングによって、ＳＴＲＯ−１微陽性およびＳＴＲＯ−１強陽性亜集団の間で高度に特異的に発現される合計４４のクローンが同定された。特異的に発現されるクローン全てのＤＮＡ塩基配列決定によって、１つのクローンのみが既知の間質細胞マイトジェンで代表的なもの；すなわち、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）であることが明らかにされた（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｂｌｏｏｄ．  ８５：  ９２９−９４０，  １９９５）。興味深いことに、４４のクローンのうち６つが、ケモカインである間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）に対応しているＤＮＡ挿入断片を含むことが発見された。ヒトＳＴＲＯ−１強陽性細胞中の多量のＳＤＦ−１転写物を、新しく分取したＳＴＲＯ−１強陽性、ＳＴＲＯ−１微陽性、およびＳＴＲＯ−１陰性骨髄亜集団から調製した全ＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した（図３Ｄおよび表３）。
【０１７１】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１７２】
【表３】
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【０１７３】
タンパク質細胞表面発現とＳＴＲＯ−１発現の密度を関連させるため、ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖後細胞由来の骨髄ＭＰＣの単個細胞浮遊液をトリプシン／ＥＤＴＡ剥離によって調製し、続いて広範な細胞系譜関連マーカーを同定する抗体と組み合わせて、ＳＴＲＯ−１抗体と一緒にインキュベートした。ＳＴＲＯ−１をヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートを用いて同定し、一方で他の全てのマーカーはヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ−フィコエリトリンのいずれかを用いて同定した。細胞内抗原を同定するこれらの抗体について、細胞調製物を最初にＳＴＲＯ−１抗体で標識し、冷７０％エタノールで固定して細胞膜を透過性にし、その後、細胞内抗原に特異的な抗体と一緒にインキュベートした。アイソタイプ一致の対照抗体を同一の条件下で使用した。ＣＯＵＬＴＥＲ  ＥＰＩＣＳフローサイトメーターおよび収集されたリストモードのデータを用いて、２色フローサイトメトリー分析を行った。ドットプロットは、各系譜の細胞マーカー（ｙ軸）およびＳＴＲＯ−１（ｘ軸）の蛍光強度レベルを示している５，０００個のリストモードの事象を表わしている。垂直および水平の象限は、アイソタイプ一致の負の対照抗体を基準にして確立した。
【０１７４】
【表４】
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【０１７５】
これらの結果は、ＳＤＦ−１αおよびＲＡＮＫＬがＳＴＲＯ−１強陽性細胞によって高発現されることを示している。これら両方のタンパク質は、ＧＶＨＤ等の免疫不全に対する保護を与えるＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の増加に関わることが知られているため、このことは重要である（Ｌｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２：１３７２−１３７９，  ２００６；  Ｈｅｓｓ，  Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  １２  （１  Ｓｕｐｐｌ  ２）：１３−２１，  ２００６；  ａｎｄ  Ｍｅｉｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０５：２６４３−２６５５，  ２００８）。
【０１７６】
実施例５．
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫抑制活性
培養増殖されたＳＴＲＯ−１強陽性細胞（ＭＰＣ（Ｂ））の免疫抑制活性を評価するため、読み取り（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）として、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を用いた。結果を、実施例１の通りに単離した、培養増殖された、骨髄由来ＳＴＲＯ−１陰性細胞（ＭＳＣ（Ａ））の集団と比較した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、４つの上昇する濃度のＭＳＣおよびＭＰＣ調製物の存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８被膜ビーズで刺激した。Ｔ細胞の増殖を３Ｈ−Ｔｄｒ取り込みによって測定した。
【０１７７】
ＭＳＣ（Ａ）およびＳｔｒｏ−１強陽性ＭＰＣ（Ｂ）を、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対する応答を抑制するそれらの能力について試験した。ＭＳＣおよびＭＰＣまたは市販品の対照ヒトＭＳＣ（ロンザ社（Ｌｏｎｚａ））を、ＰＢＭＣの培養液に異なる比率で加えた。３日後、３Ｈ−Ｔｄｒを１８時間加え、培養液を回収した。
【０１７８】
ＣＤ３／ＣＤ２８に応答してのＰＢＭＣ増殖は全ての調製物によって用量依存的に阻害された。しかし、調製物Ｂは調製物Ａおよび対照ｈＭＳＣによって生じた効果よりも明らかに優れていた（図４）。ＭＳＣ：ＰＢＭＣ比が１：１００のとき、ＭＰＣ  Ｂは７０％の対照Ｔ細胞増殖をなお阻害したが、一方で対照の市販品ＭＳＣ（ロンザ社）およびＭＳＣ  Ａは、それぞれ５０％および６０％の阻害を生じた（図５）。
【０１７９】
実施例６：Ｔ細胞増殖に対するＭＰＣのＩｎ  ｖｉｖｏ効果
以下の実験のために、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおけるミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）誘導性実験的炎症性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を使用した。Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスはＭＳ患者のものに類似した表現型の症状（進行性麻痺）を示し、ＣＮＳにおいて広範な炎症、脱髄および軸索消失／損傷を示す。用いられるＥＡＥ誘導、臨床症状の評価およびＭＰＣ移植のための免疫化手順は以下の通りである。
【０１８０】
ＥＡＥの能動誘導
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、４００μｇの不活化ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒａを含有する等量のフロイント完全アジュバントと混合した２００μｇの組換えＭＯＧでマウスを免疫した。０．１ｍｌのこの混合物を、２５ゲージ（Ｇ）の針を用いて、左右の側腹部に皮下注射した（合計０．２ｍｌ／マウス）。また、マウスを、０．３０ｍｌのＰＢＳ中の３５０ｎｇの不活化された百日咳菌毒素で、０日目および２日目に２９Ｇ針を用い尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）に免疫した。静脈注射部位からの出血のリスクを低減させるために、注射後に３０秒間、静脈注射部位に圧力を穏やかに加えた。
【０１８１】
マウスを２〜５分毎に、１０〜１５分間モニターして、活動性出血がないことを確認した。
【０１８２】
ＭＰＣを用いた治療
ＭＰＣを、基本的には実施例２に記載の通りに単離した。疾患誘導から８、１０および１２日後に、２×１０５個または４×１０５個のＭＰＣを、体積２００μｌのＰＢＳ中の単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射として、投与した（表５参照）。対照は等量のＰＢＳのみの静脈内注射を受けた。マウスを毎日モニターし、臨床徴候を下記の尺度に従ってスコア化した。およそ３６日間、実験を継続し、疾患の経過をモニターした。実験終了時に、脳、脊髄および視神経を解剖し、ホルマリン溶液中で固定した。
【０１８３】
【表５】
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【０１８４】
ＭＰＣ処置マウスおよび対照を疾患誘導（ＭＯＧ３５−５５免疫化）後３６日目に選別した。脾細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、培地単独で培養、またはＭＯＧ３５−５５で再刺激し、その後［３Ｈ］−チミジン取り込みを介してＴ細胞増殖応答を測定した。ＭＯＧに対して特異的な増殖応答を、培地単独（刺激なし）で培養された対応脾細胞と比較した。ＰＭＡ／イオノマイシン中で培養した脾細胞は、Ｔ細胞増殖の非特異的な（抗原非依存的な）刺激を測定するのに有用である。
【０１８５】
図６に示されるデータは、対照動物由来で培養されたＴ細胞と比較して、ＭＯＧを用いた第二のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原刺激に対するＴ細胞免疫応答が阻害されることを示している。
【０１８６】
これらのデータは、ヒトＭＰＣが特異的抗原（例えば、ＭＯＧによる抗原刺激）に対するＴ細胞の免疫応答を、ＭＰＣの最終投与から２４日後であっても、低減または阻止することを示している。データは、ＳＴＲＯ−１富化ＭＰＣが多発性硬化症抗原に対する耐性を誘導することを示している。
【０１８７】
実施例７：ＭＰＣのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ効果
ＭＰＣの免疫調節性を、下記の通りに、増殖アッセイ、混合リンパ球培養反応およびサイトカイン産生によって試験した。
【０１８８】
増殖アッセイおよび混合リンパ球培養反応
単核細胞を、基本的には実施例４に記載の通りに、ＭＰＣまたはビヒクル単独で処置した健康なＣ５７ＢＬ／６マウス、２Ｄ２遺伝子導入マウスまたはＭＯＧ−免疫化マウスの脾臓から採取する。単個細胞浮遊液を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（全てインビトロジェン社より入手）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（シグマ社）および５０μＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ社）を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で調製する。赤血球溶解後、細胞を２回洗浄し、その後、２０μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５（ＧＬバイオケム社（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ））、８００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンおよび２０ｐｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（共にシグマ社から入手）いずれかの存在下で、または１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ８（共にＢＤ社から入手）で予め被膜したウェルに、２．５×１０５細胞／ウェルの濃度で９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に３連で播種した。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを培養の最後の１８時間の間加えた。細胞をろ過マット上で回収し、組み込まれた放射活性核酸をＴｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（パッカードバイオサイエンス社（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））上でカウントした。ＭＰＣによるＴ細胞増殖の阻害を含む実験のために、脾細胞添加前に２．５〜０．００２×１０４細胞／ウェルの濃度範囲のＭＰＣを播種する。
【０１８９】
混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（レスポンダー）由来の２×１０５個の脾細胞を、等数の照射済み（２０Ｇｙ）Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーターまたは照射済みＭＰＣと共にインキュベートし、５日間培養し、培養の最後の２４時間の間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを添加する。
【０１９０】
Ｔ細胞阻害に関するＭＬＲにおいて、２×１０４個の照射済みＭＰＣを、脾細胞の添加前にウェルに播種する。
【０１９１】
サイトカイン産生
サイトカイン産生の分析に使用される上清を、２０μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５単独で、または２×１０４個のＭＰＣ存在下（１：１０のＭＰＣ：脾細胞比）で刺激した２Ｄ２遺伝子導入マウス由来の２．５×１０６個の脾細胞の２日目の共培養液から得た。サイトカインの定量分析を、マウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ社）を用い、基本的には製造元の説明書に従って行い、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ  フローサイトメーターで分析する。以下のサイトカインを測定する：インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）。
【０１９２】
この予備研究のデータは一貫して、ＳＴＲＯ−１強陽性ＭＰＣが、無処置またはＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ処置と比べて、優れた免疫抑制能を示したことを表わしている。これはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて明らかであって、そして最も重要な事だが、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいても明らかであった。
【０１９３】
実施例８：ＰＨＡ媒介リンパ球増殖に対するＭＰＣの効果
ＰＢＭＣを、違法な（ｉｌｌｉｃｉｔ）リンパ球増殖のために、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；１０ｕｇ／ｍｌ；シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）で刺激した。ある濃度範囲（表６参照）のＳＴＲＯ−１強陽性細胞は、図７に示すように、ＰＢＭＣ  Ｔ細胞増殖応答を有意に抑制することができた。
【０１９４】
【表６】
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【０１９５】
ヒトにおける研究結果と同様に、ヒツジＭＰＣは、ＰＨＡで刺激したヒツジＰＢＭＣに対する同種免疫反応のレベルを有意に阻害することができた（図８）。また、ヒツジＳＴＲＯ−３選別細胞も、ヒツジＰＢＭＣまたは精製ヒツジＴ細胞（ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）社製Ｔ細胞単離キットを用いて選別）に対するスティミュレーターとして用いられた場合に、用量依存的にリンパ球増殖を抑制することができた（図９）。
【０１９６】
本文書で引用された参照は全て、参照によって本明細書に組み込まれたものとする。
【０１９７】
広義に記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、多数の変更および／または改変を特定の実施形態において示される本発明に対し行うことが可能であることは、当業者には理解されるだろう。従って、本発明の実施形態は、あらゆる観点において、説明のためのものであり、限定するものではないと見なされるべきである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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