(57)【要約】      （修正有）【課題】歯周炎の原因細胞であるアグレッシブ線維芽細胞の治療薬の提供。【解決手段】アグレッシブ線維芽細胞のｍｉＲＮＡを解析した結果、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐの発現が変化していることが明らかとなった。これらｍｉＲＮＡの発現を調節するポリヌクレオチドを有効成分とする歯周炎の治療剤。前記ｍｉＲＮＡの阻外剤でありｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ−５ｐの発現をミミックするｍｉＲＮＡミミックである歯周炎治療剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、及び／又はｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐからなる群より選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの歯肉組織中の含有量を調節するポリヌクレオチドを有効成分とする歯周炎治療剤。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐのｍｉＲＮＡ阻害剤であり、
ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐの発現をミミックするｍｉＲＮＡミミックである請求項１記載の歯周炎治療剤。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤がｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐの配列と少なくとも９０％以上相補的な配列を有するものであり、
前記ｍｉＲＮＡミミックがｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐのｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも９０％以上相同性を有するものである請求項２記載の歯周炎治療剤。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、ｍｉＲＮＡ阻害剤の５´末端におけるヌクレオチドのリン酸又はヒドロキシルに対する置換基を含む請求項２又は３記載の歯周炎治療剤。
【請求項５】
前記置換基が、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２´Ｏ−Ｍｅ、ＤＭＴＯ、フルオレセイン、チオール、またはアクリジンである請求項４記載の歯周炎治療剤。
【請求項６】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤のポリヌクレオチド配列が、  配列番号１（ＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴ）で示す配列である請求項２〜５のいずれか１項記載の歯周炎治療剤。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが遺伝子治療用ベクターに組み込まれたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の歯周炎治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周炎治療薬、及び歯周炎予防薬に関する。特に、ｍｉＲＮＡを有効成分とし、歯周炎の原因細胞に作用する歯周炎治療薬、予防薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病はう蝕とともに、歯の二大疾患である。歯周病は歯肉炎と歯周炎とに分けられるが、最終的な歯の喪失に至るのは、いわゆる歯槽膿漏といわれる歯周炎である。歯周病は世界で最も多い疾患であるともいわれ、我が国でも成人の約８割が罹患しているとされる。歯喪失の４２％は歯周炎によると報告されており、歯喪失の重要な原因でもある。保持歯数は全身の健康状態とも密接に関連し、心疾患、メタボリック・シンドローム、糖尿病など様々な疾患と関連することが指摘されている。したがって、歯周炎の治療と予防は歯科分野だけではなく、医療全般の問題ともなる。
【０００３】
歯周炎の原因は、これまで歯肉炎同様、細菌感染であると考えられていたことから、現在の治療法としては、抗菌、抗炎症などの対症療法が主流である（例えば、特許文献１、２）。特許文献１には、歯周病の原因は嫌気性グラム陰性桿菌であると考え、嫌気性グラム陰性桿菌に対しては強い殺菌力を有しているが、正常歯垢細菌であるレンサ球菌群に対しては殺菌力が弱い殺菌薬が開示されている。特許文献２は、歯周病は歯周疾患性細菌が原因であり、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の刺激による炎症性サイトカインであるＩＬ−１やＩＬ−６の過剰産生による局所的な炎症によって引き起こされると考えている。特許文献２では、抗ＣＤ１４抗体を有効成分とすることにより、歯周組織の炎症性の症状を緩和し、軽減することができる治療薬が開示されている。
【０００４】
これに対し本発明者らのグループは、歯周炎は細菌が原因である歯肉炎と異なり、細菌感染が直接の原因ではなく、患者の線維芽細胞に原因があると考えている。歯周炎は慢性的な炎症と、これに付随する細胞外マトリックスの再構成によって進行する。歯周炎は進行すると、主としてコラーゲンからなる歯と歯槽骨との結合組織性付着が喪失するアタッチメント・ロスが生じ、歯周ポケットが深くなり、やがて歯の喪失につながる。歯肉線維芽細胞は、種々の細胞の足場ともなる結合組織中の細胞外マトリックスを産生しており、細胞外マトリックスのターンオーバーに関与していると考えられる。したがって、歯と歯槽骨との結合組織性付着の喪失と歯肉線維芽細胞の正常な機能の喪失は深く関わっていると考えられる。
【０００５】
本発明者らは、歯周炎の研究の過程で、重度歯周炎患者の歯肉由来の線維芽細胞をコラーゲンゲル三次元細胞培養法によって培養を行うと、培地であるゲルのコラーゲンが分解され小さくなるということを見出した（非特許文献１、２）。本願発明者らは、コラーゲン分解能が極度に高い線維芽細胞を歯周炎関連線維芽細胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＰＡＦ、あるいはアグレッシブ線維芽細胞ともいう。）と名付け、歯周炎の主因であると考えて研究を進めている。
【０００６】
現在までに５０症例以上の歯周炎患者から、歯周炎関連線維芽細胞の単離を試み、すべての歯周炎患者歯肉から歯周炎関連線維芽細胞は単離できている。さらに、プラーク量が少なく、炎症の程度は軽いが、結合組織性付着の急速な消失が起こる疾患である侵襲性歯周炎罹患歯肉からは、コラーゲン分解能の非常に高い歯周炎関連線維芽細胞が分離できることが明らかとなった。
【０００７】
本発明者らは、歯周炎関連線維芽細胞はコラーゲン分解能が高いことから、歯と歯槽骨との間に存在するコラーゲンを主成分とする歯根膜を分解する原因となっていると考え、歯周炎の部位特異性についても、歯周炎関連線維芽細胞が存在することで説明できると考えている。
【０００８】
本発明者らのグループはすでに歯周炎関連線維芽細胞の分子生物学的な特徴を解析するために、歯周炎関連線維芽細胞（ＰＡＦｓ）についてＦＡＮＴＯＭ５においてＣＡＧＥ法による解析を行った。その結果、歯周炎関連線維芽細胞では、歯肉線維芽細胞と比較していくつかの特徴的な遺伝子発現が見出されたが、特にＤＬＸ５及びＲＵＮＸ２のバリアントの発現に変化が見られることを報告している（非特許文献３）。したがって、歯周炎関連線維芽細胞は、遺伝子発現が正常な組織由来の線維芽細胞とは異なるものであることは明らかである。本発明者らは、歯周炎関連線維芽細胞の分子学的な特徴を解析し、医薬を開発することができれば、歯周炎を根本的に治療する医薬を開発することができると考え、さらに歯周炎関連線維芽細胞のｍｉＲＮＡ発現の解析を行った。
【０００９】
今までに、コラーゲン分解能の高い歯周組織由来の細胞に着目してｍｉＲＮＡを解析している文献はないが、歯周炎において、ｍｉＲＮＡ発現を解析している文献は見受けられる（特許文献３）。特許文献３には、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐを上方調節することによる歯周病治療薬が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−２７４９５７号公報
【特許文献２】特開平１０−１１４６７９号公報
【特許文献３】特表２０１３−５０４５４２号公報
【特許文献４】特開２０１０−２２０５６１号公報
【特許文献５】特開２０１１−２５６１３６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ohshima et al., 2010, J. Dent. Res., Vol.89(11), pp.1315-1321.
【非特許文献２】大島光宏、山口洋子、2013年、日本薬理学雑誌、第141巻、p.314-320.
【非特許文献３】Horie, M., 2016, Scientific Reports6:33666, DOI:10.1038/srep33666.
【非特許文献４】Rupaimoole, R. & Slack, F.J., 2017, Nat Rev Drug Discov. Vol.16,pp.203-222.
【非特許文献５】Ohshima et al., 1994, J. Periodontal. Res., Vol.29, pp.421-429.
【非特許文献６】ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｔａｒｂａｓｅ．ｍｂｃ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／ｐｈｐ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ？ｏｐｔ＝ｓｅａｒｃｈ＿ｂｏｘ＆ｋｗ＝ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ＆ｓｏｒｔ＝ｐａｐｅｒｓ＆ｏｒｄｅｒ＝ｄｅｓｃ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
今までに開発され、市販されている歯周炎の治療薬は、上述のように細菌感染、それに付随する炎症が原因であると考えている。しかしながら、発明者らが分離し、歯周炎原因細胞と考えているコラーゲン分解能が高い線維芽細胞である歯周炎関連線維芽細胞を標的とした薬剤ではない。そのため、抗菌薬や抗炎症薬は、疾患の症状を緩和する対症療法としての意義はあるものの根本的な治療を行うことはできなかった。また、抗菌薬や抗炎症薬には耐性菌の出現や、胃腸炎などの副作用があるため、一般的には長期連用ができなかった。
【００１３】
また、特許文献３のようにｍｉＲＮＡの解析により歯周炎治療薬の開発を行っている文献もあるが、コラーゲン分解能が高い線維芽細胞に着目しているわけではなく、本願発明とは得られた結果が全く異なるものである。以下に詳細に説明するが、本願発明者らは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１ではなく、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐの発現が歯周炎関連線維芽細胞で特徴的に発現が上昇していることを見出し、さらにこれを抑制することが治療に繋がる可能性があることを見出した。本願発明では歯周炎の原因と考えられる歯周炎関連線維芽細胞について解析を行っているため、特許文献３の結果とは得られた結果が異なるものと考えられる。
【００１４】
本発明者らはすでに、コラーゲン分解能が高い線維芽細胞を標的とし得る治療薬として、歯周組織破壊を抑制、改善する有効成分をスクリーニングする方法を開示するとともに、コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする治療薬を開発している（特許文献４、５）。
【００１５】
しかしながら、上記治療薬は、歯周炎関連線維芽細胞の遺伝子発現変化に対応し、これを根本から治療する薬剤ではなかった。本発明は、遺伝子発現が変化した歯周組織構成細胞を標的とした遺伝子治療薬の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、以下の歯周炎治療剤に関する。
（１）ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、及び／又はｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐからなる群より選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの歯肉組織中の含有量を調節するポリヌクレオチドを有効成分とする歯周炎治療剤。
（２）前記ポリヌクレオチドが、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐのｍｉＲＮＡ阻害剤であり、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐの発現をミミックするｍｉＲＮＡミミックである（１）記載の歯周炎治療剤。
（３）前記ｍｉＲＮＡ阻害剤がｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐの配列と少なくとも９０％以上相補的な配列を有するものであり、前記ｍｉＲＮＡミミックがｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐのｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも９０％以上相同性を有するものである（２）記載の歯周炎治療剤。
（４）前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、ｍｉＲＮＡ阻害剤の５´末端におけるヌクレオチドのリン酸又はヒドロキシルに対する置換基を含む（２）又は（３）記載の歯周炎治療剤。
（５）前記置換基が、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２´Ｏ−Ｍｅ、ＤＭＴＯ、フルオレセイン、チオール、またはアクリジンである（４）記載の歯周炎治療剤。
（６）前記ｍｉＲＮＡ阻害剤のポリヌクレオチド配列が、配列番号１（ＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴ）で示す配列である（２）〜（５）のいずれか１つ記載の歯周炎治療剤。
（７）前記ポリヌクレオチドが遺伝子治療用ベクターに組み込まれたものであることを特徴とする（１）〜（６）のいずれか１つ記載の歯周炎治療剤。
【発明の効果】
【００１７】
注射などによる局所投与が可能な歯周炎の治療薬を提供することができる。抗菌薬や抗炎症薬とは異なり、歯周炎の原因細胞を標的とした治療薬であることから、歯周炎を根本的に治療、予防することができる薬剤となる。また、抗菌薬や抗炎症薬とは異なり、副作用が低いことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】歯周炎関連線維芽細胞で、正常な歯肉組織由来の線維芽細胞と比較し発現が上昇していたｍｉＲＮＡを示す図。
【図２】歯周炎関連線維芽細胞で、正常な歯肉組織由来の線維芽細胞と比較し発現が減少していたｍｉＲＮＡを示す図。
【図３】正常な歯肉組織由来の線維芽細胞にｍｉＲ−２１−５ｐ  ｍｉｍｉｃを強制発現させた細胞の形質変化を示す図。
【図４】歯周炎関連線維芽細胞にｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤を強制発現させた細胞の形質変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に詳細に説明するが、同一の患者から得られた歯周炎の原因細胞であるコラーゲン分解能が高い歯周炎関連線維芽細胞（ＰＡＦｓ）と、正常な歯肉組織由来の線維芽細胞（ｎｏｎ-ＰＡＦｓ）を培養し、発現に差が見られるｍｉＲＮＡを検出し、歯周炎発症の原因となる可能性の高いｍｉＲＮＡを見出した。本発明の歯周炎治療剤、及び予防剤はこれらｍｉＲＮＡ、あるいはその阻害剤を有効成分とする。
【００２０】
本発明の歯周炎治療剤、若しくは予防剤は、有効成分であるｍｉＲＮＡ、又はその阻害剤を、ｍｉＲＮＡ、又はその前駆体であるＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ、Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）などの形態として投与することができれば、特に制限はなく、周知の方法（例えば非特許文献４）を用いて投与すればよい。投与方法としてはベクターを用いて投与してもよいし、送達試薬を用いてｍｉＲＮＡ又はその前駆体や阻害剤をそのまま投与してもよい。ベクターを用いる場合には、ウイルスベクター系、非ウイルスベクター系のどちらを用いてもよい。本発明の治療剤、若しくは予防剤はどのような投与方法によって投与してもよいが、患部へ注射、歯周ポケット内貼付あるいは塗布するなどの投与方法で投与することにより、治療が必要な患部へ局所的に投与することが好ましい。
【００２１】
注射剤として使用する場合には、当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。患部に挿入あるいは塗布して用いる場合には、クリーム剤、ゲル剤、液剤など、塗布に適した剤形にすればよく、適切な溶剤、増粘剤、乳化剤など当該分野において周知の添加剤を加えて調整することができる。
【００２２】
本発明の薬剤の有効成分であるｍｉＲＮＡ、若しくはその前駆体、又は阻害剤を直接導入する場合には、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法、マイクロインジェクション法など周知の方法によって核酸分子を細胞に導入する方法を利用し、患部の細胞に導入してもよい。
【００２３】
また、本発明のｍｉＲＮＡ、又はその阻害剤を生体内で転写、誘導させる場合には、ｍｉＲＮＡ、Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、阻害剤等をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入して投与する方法も用いられる。ここで、発現ベクターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどを用いることができる。
【００２４】
本発明の薬剤の投与量は、疾患の重篤度、患者の年齢などを考慮して、当業者が決定することができる。また、本発明の薬剤の投与頻度としては、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の頻度で投与することができる。
【００２５】
１．細胞培養
歯肉組織は、日本大学歯学部附属歯科病院、東京医科歯科大学歯学部附属病院において、歯周外科手術の際に得られた歯周組織から正常組織、歯周炎組織を得て歯肉線維芽細胞を単離、培養して用いた。なお、実験は各機関の倫理委員会の認可を受けたうえで、また、歯周組織は、患者にインフォームドコンセントを得たうえで採取している。
【００２６】
歯肉組織の単離培養方法は非特許文献５の方法によって行った。さらに、非特許文献１に記載のコラーゲンゲルの構築方法、三次元細胞培養方法によって、歯肉線維芽細胞を歯肉上皮細胞とともに培養することにより歯周炎関連線維芽細胞、あるいは正常歯肉線維芽細胞であるかを判別し、以下の解析に用いた。
【００２７】
同一の患者から得られた正常歯肉線維芽細胞とコラーゲン分解能が高い歯周炎関連線維芽細胞からｍｉＲＮＡを単離し、以下の解析に用いた。したがって、遺伝的なバックグラウンドは同一の歯肉線維芽細胞において、歯周炎組織から得られたコラーゲン分解能が高い線維芽細胞と、正常な歯肉組織由来の線維芽細胞とのｍｉＲＮＡ発現の差を解析していることになる。用いた線維芽細胞の詳細については表１に記載する。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
なお、表１中、ＰＤは歯周ポケット深さを、ＧＩ（Ｇｉｎｇｉｖａｌ  Ｉｎｄｅｘ）は歯肉の炎症の程度を示し、ＧＩ２は０（なし）から３（重度）の指標において中程度の炎症であり、検査時に出血が確認された（ＢＯＰ、Ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｏｎ  ｐｒｏｂｉｎｇ＋）ことを示す。
【００３０】
２．ｍｉＲＮＡの単離
ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。精製したＲＮＡの品質は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（アジレント社製）によって確認した。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｍｉＲＮＡ  ４．０  Ａｒｒａｙ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、２５７８のヒト成熟ｍｉＲＮＡについて解析を行った。得られたｍｉＲＮＡの発現データは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）によって解析を行った。
【００３１】
３．歯周炎関連線維芽細胞で特異的に発現が上昇しているｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡアレイ解析によって２５７８のヒト成熟ｍｉＲＮＡについて、同一の患者の歯周炎関連線維芽細胞と正常歯肉線維芽細胞との間で有意に発現が異なっているものを検出した。侵襲性歯周炎患者Ａにおいては、３５のｍｉＲＮＡが、侵襲性歯周炎患者Ｂにおいては、５４のｍｉＲＮＡが、慢性歯周炎患者Ｃでは、９４のｍｉＲＮＡが各々の正常歯肉線維芽細胞と比較して有意に発現が上昇していた（図１）。
【００３２】
３人の患者で共通して発現の上昇が見られたｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐは、歯周炎との相関が高いｍｉＲＮＡであると考えられるため、さらに詳細に解析を進めることにした。これら４種のｍｉＲＮＡについては、定量的ＰＣＲを行い、検証を行ったところ、定量的ＰＣＲによっても発現が上昇していることが確認された。ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐは歯周炎と相関の高いｍｉＲＮＡであることから、この発現を阻害することにより、歯周炎の治療を行うことができる可能性がある。
【００３３】
また、侵襲性歯周炎患者ＡとＢとで共通して高発現が認められるｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８０については、侵襲性歯周炎を特徴付けるｍｉＲＮＡである可能性がある。
【００３４】
また、侵襲性歯周炎患者Ａと、慢性歯周炎患者Ｃとの間で差が認められた５種のｍｉＲＮＡ、侵襲性歯周炎患者Ｂと、慢性歯周炎患者Ｃとの間で差が認められた１５種のｍｉＲＮＡは、侵襲性歯周炎と慢性歯周炎との差を示すｍｉＲＮＡである可能性もあるが、個人間での発現の差である可能性が高い。
【００３５】
４．歯周炎関連線維芽細胞で特異的に発現が減少しているｍｉＲＮＡ
さらに、歯周炎関連線維芽細胞において、正常歯肉線維芽細胞と比較して、発現が低下しているｍｉＲＮＡについても解析を行った（図２）。その結果、侵襲性歯周炎患者Ａにおいては１４のｍｉＲＮＡが、侵襲性歯周炎患者Ｂにおいては、６８のｍｉＲＮＡが、慢性歯周炎患者Ｃでは７２のｍｉＲＮＡが正常歯肉線維芽細胞と比較して有意に発現が低下していた。
【００３６】
特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐは、解析した歯周炎関連線維芽細胞すべてで発現低下が認められたことから、歯周炎との相関が高いｍｉＲＮＡであると認められる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ-５ｐの発現を増加させることによって、歯周炎の治療を行うことができる可能性がある。また、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５２９−３ｐは、侵襲性歯周炎患者ＡとＢとで共通して発現が低下しているｍｉＲＮＡであり、侵襲性歯周炎を特徴付けるｍｉＲＮＡである可能性がある。
【００３７】
５．ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ発現による細胞の形質変化
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐが発現調節に関与していると報告されている遺伝子にはＰＴＥＮ、ＦＤＣＤ４、ＲＰＳ７、ＲＥＣＫ、ＢＣＬ２などをはじめとする多くの遺伝子が報告されている（非特許文献６）。また、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐは、膠芽細胞腫やびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などのがんで特異的に発現が認められていることから、診断や治療に用いることができることが報告されている。ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐは多くの疾患と関連が認められていることから、歯周炎の場合も疾患原因となっている可能性があると考え、詳細な解析を行った。
【００３８】
まず、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ  ｍｉｍｉｃを正常な歯肉組織由来の線維芽細胞（ｎｏｎ−ＰＡＦ）に導入し、形質が変化するか解析を行った。配列番号１に示すｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐの作用を再現することのできる核酸（ＥＸＩＱＯＮ社製、ＬＮＡ、２１−５ｐ  ｍｉｍｉｃ）、配列番号２に示すネガティブコントロール（ＥＸＩＱＯＮ社製、ＬＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｍｉｍｉｃ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてリポフェンクションにより正常な歯肉由来の線維芽細胞に導入した。細胞は、リポフェクション後、一晩から２４時間培養し、トリプシン処理によって細胞を回収し、非特許文献１に記載の方法によりコラーゲンゲルを用いて３次元培養を行った。
【００３９】
コラーゲンゲルを用いた３次元培養法によれば、細胞のコラーゲン分解能が高ければ、ゲルが収縮する。図３に示すように、２１−５ｐ  ｍｉｍｉｃを導入した細胞は、コントロールと比較してゲル収縮が促されているのが観察された。
【００４０】
次に、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐの作用を阻害する配列番号３で示す核酸（ＥＸＩＱＯＮ社製、ＬＮＡ、２１−５ｐ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を上記と同様にして、３症例から得られた歯周炎関連線維芽細胞にリポフェクションにより導入し、コラーゲンゲルで培養して細胞の形質が変化するか解析を行った。
【００４１】
図４に示すように、２１−５ｐ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを導入した歯周炎関連線維芽細胞では、いずれもコントロール（配列番号２の核酸）に較べてゲルの収縮が阻害されるのが観察された。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐは歯肉線維芽細胞においてコラーゲン分解に関わっており、歯周炎における歯周炎関連細胞のコラーゲン分解能に密接に関与していることが示唆された。
【００４２】
以上のように、ｍｉＲＮＡアレイ解析の結果、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐをはじめとするｍｉＲＮＡが歯周炎発症の原因である可能性が強く示唆された。歯と歯槽骨との結合組織性付着の主成分であるコラーゲンを分解し、アタッチメント・ロスを引き起こす歯周炎原因細胞の形質を転換することのできるｍｉＲＮＡは歯周炎の遺伝子治療を行う治療薬となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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