(57)【要約】      （修正有）【課題】患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断するための手法を提供する。【解決手段】患者由来の細胞又は体液由来のＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいて、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無を予測する工程を含む、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無の予測方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無の予測方法であって、
患者由来の細胞又は体液由来のＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいて、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無を予測する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
解析の結果において、ＣＤ５９の発現量が増加している場合、患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さないと判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
解析の結果において、ＣＤ８１の発現量が低下している場合、患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さないと判断する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
解析の結果において、ＰＤ−Ｌ１が増加している場合、患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さないと判断する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
解析の結果において、抗ＣＤ２０抗体医薬品の非存在下において、ＣＤ２０の発現量が低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
微小胞がエキソソームである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
発現量の解析をフローサイトメトリー法によって行う、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
患者由来の細胞又は体液由来のＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいて抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する該患者の感受性の有無を予測する方法において使用するためのキットであって、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーのそれぞれに対する抗体を含む、上記キット。
【請求項１０】
さらに、微小胞を捕捉するための、固相担体に結合されたＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂに対する抗体を含む、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する薬物感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２０はプレＢ細胞から成熟Ｂ細胞に至るＢ細胞において発現される３３〜３７ｋＤａの分子量を有する膜貫通型タンパク質であり、正常細胞だけでなく、大部分のＢ細胞性リンパ腫においても発現が認められる。
【０００３】
今日、Ｂ細胞性リンパ腫の治療においては、このＣＤ２０を標的とする抗ＣＤ２０抗体医薬品が用いられている。中でもリツキシマブ（リツキサン（登録商標））は第一選択薬となっており、広く世界中において利用されている。
【０００４】
一方で、抗ＣＤ２０抗体医薬品の治療に対して抵抗性を有する患者が報告されており、リツキシマブ治療に対して抵抗性を有する患者も確認されている。リツキシマブに対する抵抗性のメカニズムは全て解明されてはいないものの、腫瘍細胞からのＣＤ２０抗原の消失や、補体不活性化因子（例えば、ＣＤ５５、ＣＤ５９等）の発現による補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）の低下等による要因が挙げられる（非特許文献１、２）。リツキシマブは、免疫組織染色法又はフローサイトメトリー法等によりＣＤ２０抗原の検査を行い、陽性であることが確認されている患者のみに投与するとされているが（非特許文献３）、ＣＤ２０が陽性であることが確認された患者であっても、リツキシマブ治療に対して抵抗性を有する患者も認められる。
【０００５】
このため、当該分野においては、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者の選別を可能とする新たな手法が切望されていた。
【０００６】
エキソソーム等の細胞から分泌される脂質膜微小胞は、その表面や内部に、種々のタンパク質、脂質、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ等を含み、当該エキソソームが分泌された細胞の表現型を反映し得る。このため微小胞を分析して、細胞の特性を決定し、それを疾患の診断・治療に利用する方法が開発・報告されている（特許文献１−３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−１６１６７０
【特許文献２】ＷＯ２０１２／１１５８８５
【特許文献３】ＷＯ２０１４／１６７９６９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｉｌａｎｉ  Ｉ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３  Ｎｏｖ  １５；１０２（１０）：３５１４−２０．
【非特許文献２】Ｇｏｌａｙ  Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００１  Ｄｅｃ  １；９８（１２）：３３８３−９．
【非特許文献３】医薬品インタビューフォーム「抗ＣＤ２０モノクローナル抗体  リツキサン（登録商標）注１０ｍｇ／ｍＬ  ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  リツキシマブ（遺伝子組換え）製剤」、２０１５年５月改訂（第１６版））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者の選別を可能とする新たな手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞にて発現するタンパク質マーカーの発現量を指標にして、患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］  抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無の予測方法であって、
患者由来の細胞又は体液由来のＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいて、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無を予測する工程を含む、上記方法。
［２］  解析の結果において、ＣＤ５９の発現量が増加している場合、患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さないと判断する、［１］の方法。
［３］  解析の結果において、ＣＤ８１の発現量が低下している場合、患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さないと判断する、［１］又は［２］の方法。
［４］  解析の結果において、ＰＤ−Ｌ１が増加している場合、患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さないと判断する、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］  解析の結果において、抗ＣＤ２０抗体医薬品の非存在下において、ＣＤ２０の発現量が低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］  微小胞がエキソソームである、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］  抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［８］  発現量の解析をフローサイトメトリー法によって行う、［１］〜［７］のいずれかの方法。
［９］  患者由来の細胞又は体液由来のＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいて抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する該患者の感受性の有無を予測する方法において使用するためのキットであって、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーのそれぞれに対する抗体を含む、上記キット。
［１０］  さらに、微小胞を捕捉するための、固相担体に結合されたＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂに対する抗体を含む、［９］のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することを可能とする新たな手法を提供することができる。
【００１３】
本発明によれば、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者を選別することができる。これにより、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さない患者に対して、当該医薬品による治療を続行することを回避して、別の治療を適用することができ、患者の時間的及び経済的な負担を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、リツキシマブの存在下（上段）及び非存在下（下段）における、リツキシマブ感受性細胞：ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞（「Ｓ」と記載）及びリツキシマブ抵抗性細胞：ＲＣ−Ｋ８細胞（「Ｒ」と記載）に由来するＣＤ１９陽性エキソソームのＣＤ５９（Ａ）、ＣＤ８１（Ｂ）、ＰＤ−Ｌ１（Ｃ）、ＣＤ２０（Ｄ）の発現量を比較したヒストグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性又は抵抗性の有無を予測する方法
本発明は、患者由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより、当該患者の薬物感受性を予測する方法に関する。
【００１６】
より詳細には、本発明は、患者由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーの発現量を解析し、次いで、得られた当該解析の結果に基づいて、当該患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することを含む、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性又は抵抗性の予測方法に関する。
【００１７】
（タンパク質発マーカー発現量の解析）
本発明において「患者」とは、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞性細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚又は眼内黒色腫、卵巣癌、直腸癌、肛門部位の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、輪卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系の新生物、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌、下垂体腺腫等（これらに限定はされない）の腫瘍患者、好ましくは抗ＣＤ２０抗体医薬品の治療対象となる腫瘍に罹患する患者が挙げられ、例えば、リンパ腫（ＣＤ２０陽性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ増殖性疾患等）、ヴェゲナ肉芽腫症の患者が挙げられる。
【００１８】
患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品による治療歴を有する患者であってもよく、当該患者の体内に投与された抗ＣＤ２０抗体医薬品が存在していてもよい。また、当該患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品による治療歴を有さない患者であってもよい。ただし、タンパク質マーカーとしてＣＤ２０を利用する場合には、患者は抗ＣＤ２０抗体医薬品による治療歴を有さない患者であることが好ましい。ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品」とは、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤を示し、特に限定されるものではないが、好ましくはリツキシマブが挙げられる。
【００１９】
本発明において「微小胞」とは、細胞より放出される微粒子、エクトソーム、アルゴソーム、エキソソーム、腫瘍小胞等の膜小胞体を意味する。特に、腫瘍細胞より放出される微小胞は腫瘍細胞にて発現されるｍｉＲＮＡやタンパク質を含み、腫瘍細胞の膜表面上に発現するタンパク質と微小胞の膜表面上に発現するタンパク質とは相関関係を有し、微小胞の膜表面上に発現するタンパク質の発現プロファイルを得ることによって、腫瘍細胞のプロファイルを得ることができる。
【００２０】
本発明において「微小胞」は、その膜表面上にＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂといったタンパク質を発現する、すなわち、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞である。
【００２１】
「ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞」は患者における腫瘍細胞又は体液より採取することができる。
「患者における腫瘍細胞」としては、上記腫瘍由来の細胞を利用することができる。
【００２２】
また、患者の「体液」としては、腫瘍由来の微小胞を含み得る体液であればよく、このような体液としては、血液、血清、血漿、リンパ液、髄液、尿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、血液、血清、又は血漿であり、より好ましくは血清である。
【００２３】
本発明においては、採取された腫瘍細胞又は体液をそのまま微小胞を含む試料として利用してもよいし、あるいは採取された腫瘍細胞又は体液より精製もしくは粗精製された形態の微小胞を試料として利用してもよい。
【００２４】
微小胞を含む試料からの微小胞の精製もしくは粗精製は、微小胞の精製もしくは粗精製に一般的に用いられる手法により行うことができ、細胞を破砕して得られた破砕液又は体液中に含まれる微小胞を、例えば、超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過カラム、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）、フィルター法、ポリマーによる沈殿法、抗体やレクチンによる吸着法等の一又は複数を組み合わせた手法により行うことができる。
【００２５】
ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性である微小胞の精製もしくは粗精製には、微小胞の細胞表面にて発現するＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂに結合することが可能な抗体を「捕捉手段」として用いた吸着法を含む手法を利用することができる。すなわち、微小胞を含む試料と「捕捉手段」としての抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、又は抗ＣＤ７９ｂ抗体とを接触させて、試料中のＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性の微小胞を抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、又は抗ＣＤ７９ｂ抗体でそれぞれ捕捉し、当該試料から分離することにより、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ７９ｂ陽性の微小胞をより精製された形態で得ることができる。
【００２６】
本発明において「捕捉手段」として利用可能な抗体は、標的となるタンパク質と結合可能なものであればよく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、標的となるタンパク質の特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。また、抗体の種類は、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれの種類も利用することができる。また、抗体には、標的となるＢ細胞の細胞表面にて発現するタンパク質と結合することが可能な抗体断片も含まれる、本発明において利用可能な「抗体断片」には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｃｂ、Ｆｄ等が含まれるが、これらに限定はされない。
【００２７】
本発明において「捕捉手段」として利用可能な抗体は、標識抗体について後述する手法に準じて製造されたものを用いても良いし、あるいは市販のものを用いても良い。
【００２８】
「捕捉手段」として利用可能な抗体は、固相担体に結合されていてもよい。固相担体には、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等（これらに限定はされない）の材質、ならびにこれらの組み合わせからなるものを利用することができる。固相担体の形状は特に限定されることなく、ビーズ、プレート、球、スティック等の形状とすることができ、好ましくは、ビーズである。ビーズの大きさは特に限定されないが、例えば、直径７．０から８．０μｍ程度、例えば７．５μｍ程度の大きさのものを利用することができる。具体的には、ラテックスビーズ、磁性体ビーズ等が挙げられる。固相担体への抗ＣＤ１９抗体の結合は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。
【００２９】
本発明において「タンパク質マーカー」とは、微小胞の膜表面にて発現するタンパク質を意味し、このようなタンパク質にはＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ｂ等が挙げられ、これらより選択される一又は複数のタンパク質を「タンパク質マーカー」として利用することができる。なお、ここで「複数」とは、２、３、４又は５つの組み合わせを意味する。
【００３０】
微小胞における各タンパク質マーカーの発現量の定量は、タンパク質の定量解析において一般的に用いられる手法により行うことができ、例えば、各タンパク質マーカーに結合可能な抗体を「標識抗体」として利用する免疫学的手法を用いた定量解析方法により行うことができる。
【００３１】
「標識抗体」として利用する、各タンパク質マーカーに対する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、各タンパク質マーカーの特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。また、抗体の種類は、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれの種類も利用することができる。各タンパク質マーカーの抗体には、微小胞上に発現する各タンパク質マーカーと結合することが可能な抗体断片も含まれる。このような抗体断片には、上述したものが挙げられる。
【００３２】
各タンパク質マーカーに対する抗体の製造は、抗体製造において一般的に用いられる手法（Ｋｅｎｎｅｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）に基づいて行うことができる。
【００３３】
すなわち、各タンパク質マーカーについて、免疫原（抗原）となるタンパク質又はポリペプチド（以下、「抗原ペプチド」と記載する）を調製する。ＣＤ１９、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースにその遺伝子配列情報及びアミノ酸配列情報等が開示されている。例えば、ヒトＣＤ１９はＭ８４３７１．１やＡＡＡ６９９６６．１に、ヒトＣＤ５９はＣＡＧ４６５２３．１やＡＨ００３３５２．１に、ヒトＣＤ８１はＥＡＸ０２５０８．１やＢＣ０９３０４７．１に、ヒトＰＤ−Ｌ１はＱ９ＮＺＱ７．１やＢＣ０６９３８１．１に、ヒトＣＤ２０はＣＢＧ７６６９５．１やＸ１２５３０．１に、ヒトＣＤ２２は、Ｐ２０２７３．２やＫＲ７１１８７２．１に、ヒトＣＤ７９ｂは、ＫＲ７１０８９５．１やＰ４０２５９．１にそれぞれ登録されており、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。抗原ペプチドのアミノ酸配列は、これらのアミノ酸配列情報に基づいて決定することができ、予測される二次構造、表面への露出のしやすさ、柔軟性、抗原性、溶媒との接触率、親水性、極性等の要素を考慮して、さらに他のタンパク質との配列同一性がないかまたは低い領域から、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の連続したアミノ酸からなる領域を選択することができる。抗原ペプチドは、公知のペプチド合成手法（例えば固相ペプチド合成法等）を利用して合成されたものを用いてもよい。あるいは、抗原ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターにより形質転換された微生物より産生されたタンパク質又はポリペプチドを精製して用いてもよい。
【００３４】
ポリクローナル抗体は、抗原ペプチドを用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等の動物を免疫感作し、一定期間経過後血清を採取し、プロテインＡ、プロテインＧ、抗原ペプチドなどを固相化したカラムなど用いて、各タンパク質に結合する抗体を精製することにより得ることができる。
【００３５】
モノクローナル抗体は、上記と同様に動物を免疫感作して一定期間経過した後、例えば脾臓細胞を採取し、当該脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合し、得られたハイブリドーマをスクリーニングし、各タンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマから抗体を採取・精製することにより得ることができる。
【００３６】
各タンパク質マーカーに対する抗体は上述のとおり製造されたものだけでなく、市販の抗体も使用することができる。
【００３７】
「標識抗体」として利用される抗体は、検出可能な標識化合物により標識されていてもよい。このような標識化合物としては、例えば蛍光色素（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリオジニンクロロフィルプロテイン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等）、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性物質、ビオチン等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３８】
なお、本発明において、「捕捉手段」と結合する標的となるタンパク質と、「標識抗体」と結合するタンパク質マーカーとが、微小胞における同一のタンパク質である場合、「捕捉手段」として利用される抗体と、「標識抗体」として利用される抗体とは、互いの結合が干渉しないように両者の結合部位（エピトープ）は異なるものであることが好ましい。また、この場合において、当該「捕捉手段」と、当該「標識抗体」とは、両者を区別して検出できるように、異なる動物種から産生されたものを利用することができる。
【００３９】
免疫学的手法を用いたタンパク質の定量解析方法としては、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロット法、ナノトラッキング法（ナノサイト（登録商標））等を利用する方法が挙げられるがこれらに限定はされない。好ましくは迅速かつ簡便であり、また定量性に優れたフローサイトメトリー法やナノトラッキング法（ナノサイト（登録商標））を利用することができる。
【００４０】
本発明の一例においては、固相担体であるビーズに結合された「捕捉手段」である抗ＣＤ１９抗体を、微小胞を含む試料と接触させ、また、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２０より選択される一又は複数のタンパク質それぞれと結合することが可能な抗体である「標識抗体」を接触させ、これにより捕捉抗体−ＣＤ１９陽性の微小胞−標識抗体からなるサンドイッチ複合体を形成する。次いで、当該複合体における標識抗体をフローサイトメーターを用いて検出・定量することによって、ＣＤ１９陽性の微小胞にて発現するＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２０より選択される一又は複数のタンパク質の発現量を定量することができる。標識抗体の検出は、標識抗体に付された標識化合物を当該化合物の検出に適した方法で検出することによって行ってもよいし、あるいは標識抗体に結合することが可能な二次抗体を上述した標識化合物で標識し、当該二次抗体を用いて標識抗体を検出してもよい。「二次抗体」としては、標識抗体を産生した動物種の免疫グロブリンに対する、別の動物種によって産生された抗体を利用することができる。
【００４１】
（判定基準）
上述の手法により、「捕捉手段」と結合した微小胞について定量解析されたタンパク質マーカーの発現量の値を、「基準値」と比較することによって、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することができる。
【００４２】
本発明において「抗ＣＤ２０抗体医薬品」としては、リツキシマブ、ＢＭ−ｃａ、オファツムマブ、ＡＭＥ１３３ｖ、ＧＡ１０１等が挙げられるが、好ましくはリツキシマブである。
【００４３】
本発明の一例において、「基準値」とは、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知である細胞、あるいは抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知であるヒト由来の細胞又は体液より、患者由来の微小胞と同様に、同じ「捕捉手段」を用いて結合・取得された微小胞におけるタンパク質マーカーの発現量とすることができる。当該発現量は、試験対象となる患者より「捕捉手段」を用いて結合・取得された微小胞における各タンパク質マーカーの発現量と同じ定量解析手法を用いて得られた値とすることができる。基準値はまた、当該発現量に基づく平均値、中央値、又はＲＯＣ曲線を作製して得られたカットオフ値とすることができる。
【００４４】
ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知である細胞」としては、例えば、リツキシマブに対する感受性を有することが公知である、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＬ細胞、Ｕ２９３２細胞、Ｇｒａｎｔａ細胞、ＨＢＬ−２細胞、Ｊｅｋｏ−１細胞、Ｍｉｎｏ細胞、Ｒｅｃ１細胞、Ｚ−１３８細胞等が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくはＳＵ−ＤＨＬ−４細胞である。また、「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知であるヒト」としては、リツキシマブに対する感受性を有することが公知であるヒトが挙げられ、例えば、リツキシマブによる治療歴を有し、リツキシマブ治療による効果が認められた患者等が挙げられる。
【００４５】
抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである場合、リツキシマブに対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無は、以下の一又は複数の基準に基づいて行うことができる。
（ｉ）ＣＤ５９の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉ）ＣＤ８１の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉｉ）ＰＤ−Ｌ１の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；ならびに、
（ｉｖ）抗ＣＤ２０抗体医薬品の非存在下にて、ＣＤ２０の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する。
【００４６】
ここで「低下している」とは、基準値の発現量に対して、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又はそれ以下に発現量が低下していることを意味する。また、「増加している」とは、基準値の発現量に対して、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上、５００％以上、又はそれ以上に発現量が増大していることを意味する。
【００４７】
ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品の非存在下」とは、捕捉手段を用いて結合・取得された微小胞におけるタンパク質マーカーＣＤ２０に対して抗ＣＤ２０抗体医薬品が結合していないことを意味し、例えば、抗ＣＤ２０抗体医薬品による治療歴を有さない患者由来の微小胞を示す。
【００４８】
あるいは、本発明の別の例において、「基準値」とは、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知である細胞、あるいは抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知であるヒト由来の細胞又は体液より、患者由来の微小胞と同様に、同じ「捕捉手段」を用いて結合・取得した微小胞におけるタンパク質マーカーの発現量とすることができる。当該発現量は、試験対象となる患者より「捕捉手段」を用いて結合・取得した微小胞における各タンパク質マーカーの発現量と同じ定量解析手法を用いて得られた値とすることができる。基準値はまた、当該発現量に基づく平均値、中央値、又はＲＯＣ曲線を作製して得られたカットオフ値とすることができる。
【００４９】
ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知である細胞」としては、例えば、リツキシマブに対する感受性を有さないことが公知であるＲＣ−Ｋ８細胞、Ｒａｊｉ−２Ｒ細胞、Ｒａｊｉ  ４ＲＨ細胞、ＲＬ−４ＲＨ細胞、Ｕ２９３２−４ＲＨ細胞等が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくはＲＣ−Ｋ８細胞である。また、「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知であるヒト」としては、リツキシマブに対する感受性を有さないことが公知であるヒトが挙げられ、例えば、リツキシマブによる治療歴を有し、リツキシマブ治療による効果が認められなかった患者等が挙げられる。
【００５０】
抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである場合、リツキシマブに対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無は、以下の一又は複数の基準に基づいて行うことができる。
（ｉ’）ＣＤ５９の発現量が基準値と比べて、低下している場合、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；
（ｉｉ’）ＣＤ８１の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；
（ｉｉｉ’）ＰＤ−Ｌ１の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；ならびに、
（ｉｖ’）抗ＣＤ２０抗体医薬品の非存在下にて、ＣＤ２０の発現量が基準値と比べて、増加している場合、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する。
【００５１】
ここで「低下している」及び「増加している」とは、上述したとおりである。
ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品の非存在下」とは、上述したとおりである。
【００５２】
なお、上記基準値はいずれも毎回測定する必要はなく、一旦、基準値が得られれば、以降は当該基準値に基づいて、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性、又は抵抗性の有無の予測・判断に用いることができる。
【００５３】
また、いずれの例においても、患者由来の「捕捉手段」に結合した微小胞における各タンパク質の発現量は、平均値又は中央値とすることができる。
【００５４】
（患者の選別・治療の最適化）
本発明は、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することができることから、本発明方法を利用することにより、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有する患者、又は抵抗性を有する患者を選別することができる。
【００５５】
本発明により、リツキシマブに対して感受性を有さない、またはリツキシマブに対して抵抗性を有すると予測・判断された患者の治療には、リツキシマブに代えて、別の抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＢＭ−ｃａ、オファツムマブ、ＡＭＥ１３３ｖ、ＧＡ１０１）を当該患者に投与して治療することができる。
【００５６】
２．抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性又は抵抗性の有無を予測ためのキット
本発明はまた、上述の方法において使用するためのキットに関する。本キットには、上述の標識手段としての抗体、例えば、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ２０抗体より選択される一又は複数の抗体を含めることができる。本キットにはまた、上述の捕捉手段として利用される抗体、例えば、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ５９抗体、ＣＤ８１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ７９ｂ抗体より選択される一又は複数の抗体を含めることができ、好ましくは捕捉手段である抗体は固相担体に結合されている。本キットにはさらに、患者由来の細胞又は体液由来の微小胞を抽出するのに適当な緩衝液、非特異的な抗体結合を阻害するためのブロッキング試薬等を含めることができる。
【００５７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
実施例１：細胞からのエキソソームの抽出
細胞はリツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、及びリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞を用いた。細胞をそれぞれ細胞培養用フラスコにて培養し、回収の前日に無血清培地に培地交換し、一晩培養する。次いで、細胞１×１０７個をそれぞれ回収し、遠心分離を行い（２０℃、１，０００ｇ、５分間）、上清を回収した。
【００５９】
回収した上清に対して、その半分量のＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、均一になるまで混合した。得られた混合溶液を２〜８℃で一晩静置した後、遠心分離を行い（２〜８℃、１０，０００ｇ、１時間）、上清を除去してペレットを回収した。得られたペレットを、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、ペレットを溶解した。次いで、このペレット溶解液を遠心分離し（２〜８℃、１０，０００ｇ、１時間）、上清を除去して再びペレットを回収した。
【００６０】
得られたペレットは、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、各細胞由来のエキソソームを含む懸濁液を得た。
【００６１】
実施例２：抗ＣＤ１９抗体ビーズの作製
エキソソームの捕捉手段として抗ＣＤ１９抗体がビーズに固定化されてなる抗ＣＤ１９抗体ビーズの作製は、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂｅａｄ  Ａ４ビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５５８５７８）とＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｅａｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５５８５５６）を製造元の指示書に従い使用して作製した。すなわち、直径７．５μｍのラテックスビーズ（ベクトン・ディッキンソン）７５μＬに１Ｍ  ＤＴＴ（１．９μＬ）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＬ）を添加して混合した後、遠心分離（９００×ｇ、３分間）して上清を捨てた。本操作を３回繰り返した後、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０μＬ）を添加して、ビーズを再浮遊させビーズ懸濁液を調製した。
【００６２】
ＰＢＳに抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１ｍｇ／ｍＬの量にて加え、そこに２μＬのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ＤＩ  Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍＬにて調製されたもの）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。インキュベーション後、未反応のＳＭＣＣをスピンカラムを用いて除去し、抗ＣＤ１９抗体／Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液を調製した。
【００６３】
ビーズ懸濁液に、抗ＣＤ１９抗体／Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液の全量を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。インキュベーション後、２μＬ  ＮＥＭ（ＤＭＳＯ中にＮ−Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅを２ｍｇ／ｍＬにて調製されたもの）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１５間、インキュベーションした。Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＬ）を添加した後、遠心分離（９００×ｇ、３分間）して上清を捨てた。本操作を３回繰り返した後、Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（５００μＬ）を添加して、抗ＣＤ１９抗体が結合したビーズ（抗ＣＤ１９抗体ビーズ）を再浮遊させ、抗ＣＤ１９抗体ビーズ懸濁液を調製した。得られた抗ＣＤ１９抗体ビーズ懸濁液は使用するまで４℃にて保管した。
【００６４】
実施例３：エキソソームにリツキシマブを結合
実施例１で調製したエキソソーム懸濁液に対して、１０ｍｇ／ｍＬリツキシマブを１００倍希釈となるように添加し、１時間、室温で振盪しながらインキュベートした。対照には、リツキシマブと同量の２５ｍＭクエン酸緩衝塩を加えて、上述のエキソソーム懸濁液と同様に処理した。
【００６５】
実施例４：エキソソーム結合抗ＣＤ１９抗体ビーズの作製
実施例３で調製した各エキソソーム懸濁液（２５μＬ）をマイクロチューブに分取し、そこに実施例２で調製した抗ＣＤ１９抗体ビーズ懸濁液（１μＬ）をそれぞれ加えて、プレートミキサーを使い８００ｒｐｍにて攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートした。
【００６６】
次いで、１０ｍＭ  ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートし、エキソソームと抗ＣＤ１９抗体ビーズとを結合させた。
【００６７】
インキュベート後、１００ｍＭグリシン（１ｍＬ）及び、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートした。
【００６８】
インキュベート後、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、再び遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートし、ビーズのブロッキングを行った。
【００６９】
次いで、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ピペッティングして沈降したビーズをリンスした後、再び、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨てた後、１００μＬ  ＰＢＳを添加して沈降したビーズを懸濁し、エキソソーム結合抗ＣＤ１９抗体ビーズの懸濁液を調製した。
【００７０】
実施例５：エキソソーム結合抗ＣＤ１９抗体ビーズの標識
エキソソーム結合抗ＣＤ１９抗体ビーズの懸濁液に、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識された以下のいずれかの抗体の溶液（２０μＬ）を添加して、ローテーターを使い攪拌しながら、４℃にて３０分間、インキュベートした。
抗体：
抗ＣＤ５９抗体：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ５９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ８１抗体：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ８１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＰＤ−１抗体：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ２７４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ２０抗体：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
【００７１】
インキュベーション後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、上清を捨てた後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ１９抗体ビーズの複合体を調製した。
【００７２】
実施例６：フローサイト測定
（方法）
フローサイトメトリーを使用して、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ１９抗体ビーズの複合体をそれぞれ検出・定量した。
【００７３】
測定条件は、Ｌａｓｅｒ：４８８ｎｍ（Ｂｌｕｅ  Ｌａｓｅｒ）  ５０ｍＷ  ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅで励起し、検出器（ＢＤ  ＡｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、４８８ｎｍＢｌｕｅ  Ｌａｓｅｒ、５０ｎＷ、ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅで励起し、５３３±１５ｎｍまたは、５８５±２０ｎｍで検出した。５３３±１５ｎｍはＦＩＴＣ検出用フィルターとして、５８５±２０ｎｍはＰＥ検出用フィルターとして用いた。
【００７４】
（結果）
リツキシマブを添加した条件下における、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、及びリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞のそれぞれ由来するＣＤ１９陽性エキソソームにおけるＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２０の発現量の測定結果を図１にそれぞれ示す。
【００７５】
ＣＤ５９の発現量はリツキシマブの添加の有無に関わらず、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞における発現量と比べて、ＲＣ−Ｋ８細胞における発現量が高いことが確認された（Ａ）。
【００７６】
ＣＤ８１の発現量はリツキシマブの添加の有無に関わらず、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞における発現量と比べて、ＲＣ−Ｋ８細胞における発現量が低いことが確認された（Ｂ）。
【００７７】
ＰＤ−Ｌ１の発現量はリツキシマブの添加の有無に関わらず、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞における発現量と比べて、ＲＣ−Ｋ８細胞における発現量が高いことが確認された（Ｃ）。
【００７８】
ＣＤ２０の発現量はリツキシマブの添加の有無により結果が異なり、リツキシマブの存在下においてはＳＵ−ＤＨＬ−４細胞における発現量とＲＣ−Ｋ８細胞における発現量とで違いは認められなかったが、リツキシマブの非存在下においてはＳＵ−ＤＨＬ−４細胞における発現量と比べて、ＲＣ−Ｋ８細胞における発現量が低いことが確認された（Ｄ）。これはリツキシマブの存在下においては、リツキシマブがエキソソーム上のＣＤ２０と結合し、標識抗体である抗ＣＤ２０抗体の結合に干渉し、その結果、ＣＤ２０の発現量を適正に測定できないことによるものと考えられる。
【００７９】
これらの結果より、リツキシマブに対する感受性の有無によって、ＣＤ１９陽性エキソソームにおけるＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＤ２０の発現量には違いがあり、これらタンパク質の発現量を指標にして、リツキシマブに対する感受性の有無を判定できることが明らかになった。
【００８０】
特に、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１の結果は、リツキシマブの添加の有無に左右されないことから、これらタンパク質マーカーを利用することにより、リツキシマブによる治療歴を有する患者由来の試料であっても（すなわち、試料中にリツキシマブが含まれていても）、当該リツキシマブの干渉を受けることなく、リツキシマブに対する感受性の有無を判定できることが明らかになった。
【図１】
2018059865.tif 000002