(57)【要約】【課題】血液試料から赤血球を瞬時に十分な大きさで凝集させることができ、血液試料から赤血球を完全に分離することが出来る、赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬を提供する。【解決手段】本発明は、血液試料に、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する溶液を添加することを含む、赤血球の凝集方法を提供する。また、本発明は、前記本発明方法により凝集させた赤血球を分離することを含む、血液試料からの赤血球の分離方法を提供する。更に、本発明は、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する赤血球凝集用試薬を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料に、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する溶液を添加することを含む、赤血球の凝集方法。
【請求項２】
前記溶液のｐＨが、２．５〜４．０である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コール酸系界面活性剤が、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の方法により凝集させた赤血球を分離することを含む、血液試料からの赤血球の分離方法。
【請求項５】
コール酸系界面活性剤及び酸を含有する赤血球凝集用試薬。
【請求項６】
前記試薬のｐＨが、２．５〜４．０である請求項５記載の試薬。
【請求項７】
前記コール酸系界面活性剤が、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物である請求項５又は６記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液は様々な疾患の診断や治療の判定に使用されており、赤血球、白血球及び血小板等の血球成分と、液体成分である血漿からなる。この血液に含まれる血漿（液体成分）や、血液から血球成分とフィブリンを除いた血清は、タンパク質、糖類、脂質等の生体の機能維持に必要な様々な成分を含んでおり、内臓系疾患等の診断や治療を行うための生化学検査用の分析用試料として用いられている。
【０００３】
しかしながら、生化学検査を行う際に血球成分が分析用試料中に存在すると、血球成分が検査を阻害する場合があり、特に比色分析等を利用して生化学検査を行う場合には、赤血球が試料の色や濁度に影響を与え検査を阻害する場合があった。
【０００４】
そのため、生化学検査においては、全血試料から赤血球等の血球成分を予め分離した血漿又は血清が分析用試料として使用されている。血球成分を血漿又は血清と分離する方法としては、患者から採血針を用いて採血した血液を採血管に入れ、血液を含む採血管を遠心分離器に掛けて遠心分離する方法が用いられている。しかし、このような遠心分離器を用いた分離は長時間を要し、手技が煩雑である等の問題点があり、より簡便な分離方法が求められていた。
【０００５】
また遠心分離以外の分離方法として、血球分離膜、血球分離材、中空糸といった特殊なフィルタを使用する方法がある。例えば、固層支持体粒子、固層支持体結合剤膜、赤血球凝集素からなるフィルタを用いて、全血液サンプルから赤血球を分離し、血漿を生成する方法が報告されている（特許文献１）。
【０００６】
しかしながら、これらのフィルタを用いた場合には、滴下した血液試料がフィルタ内に浸透して広がり、フィルタ中に血漿又は血清が残存することとなる。そのため、血液試料が少量の場合には、赤血球を分離した後の血漿又は血清の量が少なくなり、生化学検査を行うのに十分な量の分析用試料が得られないという問題があった。更に、分離操作の過程においてフィルタに何らかの圧力が掛かることから、溶血が生じたり、血液が飛散する等の問題があった。
【０００７】
全血から赤血球を除去する他の方法としては、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸及びマロン酸からなる群から選択される酸を含む溶液を、赤血球が凝集するのに効果的な条件下で全血試料と接触させ、次いで繊維状材料を用いてろ過する方法が報告されている（特許文献２）。
【０００８】
一方、界面活性剤の一種であるコール酸系界面活性剤は、膜タンパク質の抽出や分離に使用される陰イオン性界面活性剤であり、例えば、バイオセンサを備えた装置を用いてヘモグロビン濃度を測定する際に、コール酸系界面活性剤を溶血剤として用いることが報告されている（特許文献３）。しかし、赤血球を凝集させる際にコール酸系界面活性剤を用いた例は、これまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５９８１２９４号
【特許文献２】米国特許第５１１８４２８号
【特許文献３】特開２０１４−１０２１４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、従来の遠心分離法や特殊なフィルタを用いた赤血球の分離法では、長時間を要する複雑な操作であったり、溶血や血液の飛散の問題があった。また、酸を用いて赤血球を凝集させる方法（特許文献２）の場合でも、凝集した赤血球の大きさが細かいため赤血球の分離が不完全であり、生化学検査のための分析用試薬としては不十分であった。
【００１１】
本発明は、以上の事情に鑑みなされたものであって、その目的は、血液試料から赤血球を瞬時に十分な大きさで凝集させることができ、血液試料から赤血球を完全に分離することが出来る、赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、血液試料中の赤血球を凝集させる方法において、酸と共にコール酸系界面活性剤を含む溶液を血液試料に添加することにより、従来の酸のみを添加する赤血球凝集法に比べ、瞬時に十分な大きさの赤血球の凝集させることが出来ることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
コール酸系界面活性剤は、従来、溶血剤として知られていたが、赤血球を凝集させる際に、コール酸系界面活性剤を酸と組み合わせて含む溶液を血液試料に添加することにより、溶血を起こすことなく、赤血球を瞬時に十分な大きさで凝集させることが出来たことは、従来は予想出来なかった事実である。
【００１４】
すなわち、本発明は、血液試料に、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する溶液を添加することを含む、赤血球の凝集方法を提供する。また、本発明は、前記本発明方法により凝集させた赤血球を分離することを含む、血液試料からの赤血球の分離方法を提供する。更に、本発明は、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する赤血球凝集用試薬を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法及び試薬を用いることにより、血液試料から、十分な大きさの赤血球を瞬時に凝集させることができ、従来のような長時間の遠心分離や特殊なフィルタを用いた分離法を用いなくても、赤血球を完全に分離することが出来、血清及び血漿を含む成分と赤血球とを容易にかつ簡便に分離することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】比較例１−１、比較例１−２及び実施例１で行った赤血球凝集確認実験の結果を示す写真である。
【図２】比較例２−１、比較例２−２及び実施例２で行った赤血球凝集確認実験の結果を示す写真である。
【図３】比較例３−１、比較例３−２及び実施例３で行った赤血球凝集確認実験の結果を示す写真である。
【図４】比較例４−１、比較例４−２及び実施例４で行った赤血球凝集確認実験の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明にかかる赤血球の凝集方法は、血液試料に、コール酸系界面活性剤及び酸を含む溶液を添加することを特徴とする。
【００１８】
（血液試料）
本発明において、血液試料とは、ヒト又は動物の被検者から採血により取得した、赤血球が含まれる試料である。血液試料としては、被検者から採血した全血をそのまま使用してもよく、採取した全血を生理食塩水等で希釈した試料を用いてもよいが、操作の簡便性の点から、被検者から採血した全血をそのまま使用するのが好ましい。本発明の方法において使用する血液試料の量は、通常１０μｌ〜５０ｍｌであり、望ましくは１０μｌ〜１ｍｌであり、より望ましくは１０μｌ〜１００μｌである。
【００１９】
（コール酸系界面活性剤）
本発明で使用するコール酸系界面活性剤とは、分子内にステロイド骨格を有する界面活性剤であり、具体的にはコール酸又はコール酸の誘導体の構造を有する界面活性剤である。ここで、コール酸誘導体とは、コール酸から誘導されるあらゆる化合物を意味するが、具体的には、デオキシコール酸等の脱ヒドロキシル基化合物、タウロデオキシコール酸等の置換アミド化合物等が挙げられる。
【００２０】
本発明で使用するコール酸系界面活性剤は、望ましくは、コール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸、グリココール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸ナトリウム、グリコリトコール酸、グリコリトコール酸ナトリウム、リトコール酸、リトコール酸ナトリウム、タウロコール酸、タウロコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤；ポリオキシエチレンコレステリルエーテル、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド（ＢＩＧＣＨＡＰＳ）等の非イオン性界面活性剤；硫酸−３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパン（ＣＨＡＰＳ）等の両イオン性界面活性剤、又はこれらの水和物から成る群から選択されるものである。これらのコール酸系界面活性剤は、単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
コール酸系界面活性剤としては、中でも、凝集速度と赤血球のより完全な分離の観点から、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム及びそれらの水和物等の陰イオン性コール酸系界面活性剤が望ましく、特には、タウロデオキシコール酸ナトリウム及びその水和物が望ましい。
【００２２】
（酸）
本発明で使用する酸としては、水溶液中で水素イオン（Ｈ＋）を出す物質であればよい。具体的には、無機酸及び有機酸並びにそれらの塩が挙げられる。無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等が挙げられる。有機酸としては、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、マロン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、アジピン酸、アルギン酸、アスパラギン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、グルコヘプタン酸、グリセロリン塩、ヘミスルファニックアシッド（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタン酸、ヘキサン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、ペクチニン酸、リン酸、硫酸、３−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酪酸、カンフル酸、ショウノウスルホン酸、ジグルコン酸、シクロペンタンプロピオン酸、双硫酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、及びウンデカン酸等が挙げられる。本発明において酸は、単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
本発明で用いる酸としては、凝集速度と赤血球のより完全な分離の観点から、有機酸が望ましく、中でも、酢酸、酒石酸、マロン酸、リンゴ酸及びクエン酸からなる群から選ばれる有機酸が望ましく、更には多価カルボン酸が望ましく、特にはクエン酸が好ましい。
【００２４】
（赤血球凝集用試薬）
本発明においては、血液試料に、前記コール酸系界面活性剤及び酸を含む溶液を添加することにより、赤血球を凝集させる。血液試料に添加する、このようなコール酸系界面活性剤及び酸を含む溶液は、赤血球を凝集させるための試薬（赤血球凝集用試薬）として用いることが出来る。
【００２５】
このようなコール酸系界面活性剤及び酸を含む溶液（以下、「赤血球凝集試薬」とする）は、酸を生理食塩水等で希釈して得られた酸水溶液にコール酸系界面活性剤を添加する方法等により調製することが出来る。また、凝集速度と赤血球のより完全な分離の観点から、赤血球凝集試薬中の酸の濃度としては、通常１ｍＭ〜１Ｍであり、５ｍＭ〜５００ｍＭが望ましく、１０ｍＭ〜２００ｍＭがより望ましく、赤血球凝集試薬のｐＨは、２．０〜５．０が望ましく、２．２〜４．５がより望ましく、２．５〜４．０が更に望ましい。ここで、赤血球凝集試薬のｐＨは、ガラス電極法による市販のｐＨメーターを用いて測定することが出来る。赤血球凝集試薬には、前記酸、コール酸系界面活性剤、生理食塩水の他、溶血させない界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０やエマルゲンＡ５００等の界面活性剤）や試薬等を含んでいてもよい。
【００２６】
赤血球凝集試薬中のコール酸系界面活性剤の濃度は、通常０．０５〜１５．０重量％であり、０．０６〜１３．０重量％が望ましく、０．０７５〜８．０重量％がより望ましく、０．１〜６．０重量％が特に望ましい。
赤血球凝集試薬中のコール酸系界面活性剤と酸との比率（モル比）は、凝集速度と赤血球のより完全な分離の観点から、通常１：７〜１：２０００であり、１：８〜１：１６６７が望ましく、１：１３〜１：１３３３がより望ましく、１：１７〜１：１０００が特に望ましい。使用する血液試料に対する赤血球凝集試薬の添加量（体積比）は、通常１：４〜１：８０好ましくは１：８〜１：２０、より好ましくは１：１０〜１：１３である。
【００２７】
（赤血球の凝集方法）
本発明においては、血液試料に上記赤血球凝集試薬を室温でそのまま添加すれば、赤血球が十分な大きさに瞬時に凝集するが、凝集をより完全に進行させるためには、血液試料を赤血球凝集試薬と接触させた状態で、５秒〜３０秒、望ましくは５秒程度静置後、数回転倒混和するのがよい。このようにして赤血球を凝集させることにより、十分な大きさを有する凝集物を得ることが出来る。
【００２８】
本発明の方法及び試薬を用いて凝集させた赤血球は十分な大きさを有しているため、容易にかつ簡便に血液試料から分離することが出来る。凝集した赤血球の分離方法としては、赤血球の凝集物が沈殿した後の上清を回収する方法や、濾紙を用いた濾過により分離する方法が挙げられる。このようにして赤血球を分離した後の血清成分及び血漿成分は、実質的に赤血球を含まないため、生化学検査用の分析用試料として使用することが出来る。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１〜４、比較例１−１〜４−２）
コール酸系界面活性剤及び塩の有無とｐＨ範囲による赤血球凝集
【００３１】
７１ｍＬの蒸留水に１０％ｗ／ｖタウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＴＤＯＣ）１０ｍＬと、１Ｍクエン酸１０ｍＬ、１０％ｗ／ｖ塩化ナトリウム９ｍＬを加え、終濃度が１００ｍＭクエン酸、１％ＴＤＯＣ、０．９％塩化ナトリウムとなる溶液（赤血球凝集用試薬）と、ＴＤＯＣ無しあるいは塩化ナトリウム無しの溶液を同様に調製し、コール酸系界面活性剤及び塩の有無とｐＨ範囲が赤血球の凝集に与える影響を比較した。
【００３２】
赤血球凝集用試薬４００μＬに全血検体６０μＬを添加して、赤血球の凝集速度を目視により確認した。凝集速度は以下に記載した基準に基づき、速い順に＋＋＋＞＋＋＞＋＞±とし、凝集せずに溶血した場合は−とした。
【００３３】
＋＋＋：赤血球が瞬時に十分な大きさに凝集し、赤血球の凝集物が沈殿した
＋＋：赤血球が数秒静置後に凝集しはじめ、次第に赤血球の凝集物が沈殿した
＋：赤血球の凝集は起こったが、凝集物は微小であり凝集が不完全であった
±：赤血球の凝集はごく僅かであった
−：凝集せずに溶血した
結果を下記表１に示す。
なお、赤血球凝集用試薬のｐＨは、ＨＯＲＩＢＡ  卓上型ｐＨメーターを用いて測定した（以下の実施例及び比較例において同様である）。
【００３４】
【表１】
2018059791.tif 000003
【００３５】
表３の結果から、赤血球凝集用試薬がコール酸系界面活性剤と酸を含む場合には、ｐＨが２．５〜５．０の範囲内において、ＮａＣｌの有無にかかわらず、凝集速度は「＋＋＋」となり、優れた凝集効果が見られた。一方、赤血球凝集用試薬がコール酸系界面活性剤を含まず、酸のみを含むか、又は酸と塩のみを場合には、凝集速度は「−」と又は「＋」となり、溶血が生じるか、又は赤血球の凝集は起こっても、凝集物が微小であり凝集が不完全であった。この結果から、赤血球の凝集においては、コール酸系界面活性剤の存在が大きな影響を与えることが分かる。
【００３６】
（実施例５〜７）コール酸系界面活性剤と酸による赤血球凝集
生理食塩水に各種コール酸系界面活性剤（１重量％）とクエン酸（１００ｍＭ）を添加して赤血球凝集用試薬（ｐＨ３．０）を調製し、赤血球の凝集能を比較した。
赤血球凝集用試薬４００μＬに全血検体６０μＬを添加して、赤血球の凝集速度を確認した。凝集速度は以下に記載した基準に基づき、速い順に＋＋＋＞＋＋＞＋＞±とし、凝集せずに溶血した場合は−とした。なお、以下の基準は、上記実施例１〜４、及び比較例１−１〜４−２の基準と同一である。
【００３７】
＋＋＋：赤血球が瞬時に十分な大きさに凝集し、赤血球の凝集物が沈殿した
＋＋：赤血球が数秒静置後に凝集しはじめ、次第に赤血球の凝集物が沈殿した
＋：赤血球の凝集は起こったが、凝集物は微小であり凝集が不完全であった
±：赤血球の凝集はごく僅かであった
−：凝集せずに溶血した
結果を下記表２に示す。
【００３８】
【表２】
2018059791.tif 000004
【００３９】
表２の結果から、赤血球凝集用試薬が、酸と共に各種のコール酸系界面活性剤を含む場合でも、凝集速度は「＋＋」又は「＋＋＋」となり、優れた凝集効果が得られることが分かる。特にタウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＴＤＯＣ）の赤血球凝集効果が最も顕著であった。
【００４０】
（実施例８）コール酸系界面活性剤の濃度による赤血球凝集
生理食塩水にタウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＴＤＯＣ）とクエン酸（１００ｍＭ）を添加して赤血球凝集用試薬（ｐＨ３．０）を調製し、下記表に示すＴＤＯＣの濃度範囲について赤血球の凝集能を比較した。
【００４１】
赤血球凝集用試薬４００μＬに全血検体６０μＬを添加して、赤血球の凝集速度を確認した。凝集速度は以下の基準に基づき、速い順に＋＋＋＞＋＋＞＋＞±とし、凝集せずに溶血した場合は−とした。なお、以下の基準は、上記実施例１〜７、及び比較例１−１〜４−２の基準と同一である。
【００４２】
＋＋＋：赤血球が瞬時に十分な大きさに凝集し、赤血球の凝集物が沈殿した
＋＋：赤血球が数秒静置後に凝集しはじめ、次第に赤血球の凝集物が沈殿した
＋：赤血球の凝集は起こったが、凝集物は微小であり凝集が不完全であった
±：赤血球の凝集はごく僅かであった
−：凝集せずに溶血した
結果を下記表３に示す。
【００４３】
【表３】
2018059791.tif 000005
【００４４】
表３の結果から、コール酸系界面活性剤の濃度が０．１〜６．０重量％の場合には、凝集速度は「＋＋＋」となり、優れた凝集効果が得られることが分かる。
また、上記実施例１〜４において赤血球の凝集物が沈殿した後の上清を分離し、この分離した上清をイムノクロマトキット（ＱｕｉｃｋＮａｖｉ（登録商標）−Ｅｂｏｌａ）に滴下して、メンブレン上の移動を観察したところ、メンブレンは赤色に着色しなかった。この結果からも、上記分離後の上清は実質的に赤血球を含まず、生化学検査用の分析用試料として好適であることが裏付けられた。
【図１】
2018059791.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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