(57)【要約】【課題】透過性や達成可能な流量を損なうことなく、バイオ分子クロマトグラフィー用途に使用できる大表面積繊維とペンダント吸着官能基の組み合わせを提供すること。【解決手段】実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む領域を含む横断面を有する大表面積繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、クロマトグラフィー媒体。【選択図】図１ｃ
2018059952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む領域を含む横断面を有する大表面積繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、クロマトグラフィー媒体。
【請求項２】
前記官能性は陽イオン交換官能性である。請求項１に記載の媒体。
【請求項３】
前記官能性は陰イオン交換官能性である請求項１に記載の媒体。
【請求項４】
前記官能性はアクリル重合体の官能性である請求項１に記載の媒体。
【請求項５】
前記繊維の表面はペンダントスルホプロピル基で変性されたものである請求項１に記載の媒体。
【請求項６】
前記繊維の表面はペンダントトリメチルアンモニウム基で変性されたものである請求項１に記載の媒体。
【請求項７】
前記官能性は前記繊維にグラフトされた基によるものである請求項１に記載の媒体。
【請求項８】
前記繊維はほぼ１５ｍ2／ｇの表面積を有する請求項１に記載の媒体。
【請求項９】
実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する大表面積繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、大表面積繊維の不織布ベッド。
【請求項１０】
実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、ほぐれた又は融着したカット繊維からなる充填ベッドを収容したハウジング。
【請求項１１】
実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、繊維媒体のベッドに、バイオ分子を含む試料を接触させることよりなる、バイオ分子を含む試料の精製方法。
【請求項１２】
前記官能性は貫流形式で精製を可能にする請求項１１に記載の精製方法。
【請求項１３】
前記官能性は結合／溶離形式の精製を可能にする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記イオン交換官能性は陽イオン交換官能性であり、前記精製はｐＨ５〜８で実施される請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質混合物を用意し、
長軸部を形成する本体領域と該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する繊維媒体の低密度ベッドであって、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている繊維媒体のベッドに、前記タンパク質混合物を接触させ、
前記繊維媒体を洗浄して未結合の成分を除去し、
前記繊維媒体を圧縮し、ついで
前記圧縮された繊維媒体を洗浄して結合タンパク質を抽出する、
タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１０年７月３０日出願の米国予備出願第６１／３６９３３１号の優先権を主張する。
本発明はイオン交換クロマトグラフィー等によるなどのバイオ分子の精製に適したクロマトグラフィー媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体等の各種の治療用バイオ分子の商業規模の精製は現在ビーズをベースとしたクロマトグラフィー樹脂を使用して実施されている。モノクローナル抗体（ｍＡＢ）は治療剤及び診断剤としてますます重要性を増している。候補ｍＡＢに対するハイブリドーマライブラリーのスクリーニング工程は時間と大きな労力を要する。一旦適当なｍＡＢを発現するハイブリドーマ細胞種（細胞株）が確立されたら、さらなる特性化のために十分なｍＡＢを生産するための精製方法が開発されなければならない。従来の精製方法はタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ親和クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを使用している。生成された抗体は脱塩され、透析を使用して生理的緩衝液へ交換される。通常、全体のプロセスの完結には数日間かかり、複数のｍＡＢを並行して評価しなければならない場合に特に面倒である。
【０００３】
現在のところ、クロマトグラフィー樹脂はビーズがアフィニティー、陽イオン交換又は陰イオン交換モードで動作することを可能にするような種々のリガンド構造を有するように製造される。これらの樹脂は、大規模（例えば１００００リットル）にバイオ分子をバッチ処理できるに十分な吸着容量を有する材料を提供するように、高多孔質で且つ大表面積を有する。クロマトグラフィー樹脂は典型的には球形構造を有することで、最小の流動不均一性でもって効率的なカラム充填を可能にする。ビーズ間の間隙はクロマトグラフィーカラムを貫く対流輸送流れチャンネルを提供する。これはクロマトグラフィーカラムが、最小の圧力降下と大きい線速度で、大きいベッド深さをもって運転されることを可能にする。これ等の因子の組み合わせは、クロマトグラフィー樹脂がバイオ分子の大規模精製に必要な、所望の効率と高透過率と十分な結合容量を提供することを可能にする。ビーズベースのクロマトグラフィーでは、ほとんどの利用可能な吸着表面積はビーズの内部に存在している。したがって、分離プロセスは、質量輸送速度が典型的には細孔内拡散により制御されるので、本質的に遅い。この拡散抵抗を最小にし、同時に動的な結合容量を最大にするには、小直径のビーズが使用できる。しかし、小直径のビーズを使用すると、カラムの圧力降下が増大する問題が生じる。従って、分取クロマトグラフィー分離の最適化には、しばしば効率／動的容量（小さいビーズが良い）とカラム圧力降下（大きいビーズが良い）の間の妥協を要する。
【０００４】
大規模生産のカラムに対しては、クロマトグラフィー媒体は典型的には高コスト（１０００ドル／Ｌ）であり且つ十分な量が必要とされる。その結果、バイオ薬製造会社はクロマトグラフィー樹脂を数百回もリサイクルさせている。こうした各再生サイクルではかなりの量の媒体が消費され、これ等の再生サイクルの洗浄、殺菌、及びカラム充填の各工程の検証に関連した追加のコストを要する。
【０００５】
官能化繊維媒体及び／又はその複合材に基づくバイオ製薬分離のために、数種の技術が特許文献に記載され或いは実用化されている。ほとんどは適当な結合容量を得るために必要な表面積を有する多孔質ゲルを繊維マトリックスに結合したものである。しかし、このような構造では、ゲルの位置と質量の均一性が乏しく、低い効率（浅い破過と溶離前線）になる。そのうえ、流れ抵抗は、ベッド深さが浅くても高く、さらに、中位の圧力負荷の下でのゲル圧縮により問題はさらに悪化することが多い。他のアプローチでは、繊維マトリックス中に粒子を合体しているが、粒子はしばしば多孔質であり本来的に吸着官能性（例えば活性炭やシリカゲル）を有する。
【０００６】
透過性や達成可能な流量を損なうことなく、バイオ分子クロマトグラフィー用途に使用できる大表面積繊維とペンダント吸着官能基の組み合わせを提供することが望まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書に記載の実施形態を利用して、従来技術の欠点に取り組んだ。該実施形態は、クロマトグラフィー媒体特にイオン交換クロマトグラフィー媒体のための吸着媒体に関する。開示されたクロマトグラフィー媒体は成形された繊維から製造される。本発明のある実施形態では、成形された繊維は繊維状構造又は畝状構造を有する。これ等の畝は通常の繊維に比して表面積を増大させる。したがって、繊維直径を減じる（これは、典型的にはベッドの透過率を減じ対応して流量を減じる）ことなく、大表面積が得られる。本発明の実施例による高表面積の繊維の例は、翼付き繊維であり。米国ノースカロライナ州Ｒａｌｅｉｇｈ）所在のAllasso Industries, Inc.から入手できる。
Allasso社の翼付き繊維の断面走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を図１ｄに示す。これ等の繊維は約１４ｍ2／ｇの表面積を有する。本発明はまた、陽イオン又は陰イオン交換官能性を例えば高表面積繊維に付与するような、表面ペンダント（ＳＰ）官能基を追加する方法を開示する。このペンダント官能基はバイオ分子例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のイオン交換クロマトグラフィー精製に対して有用である。
【０００８】
本発明の実施形態は、高表面積の官能化繊維を含む媒体によるバイオ分子の単離、精製または分離の方法にも関する。これらの方法は貫流モードまたは結合／溶離モードで実施できる。例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の精製は、典型的には陽イオン交換クロマトグラフィーで実施されるものであり、抗体タンパク質の等電位点以下のｐＨで且つ控えめに抑制された溶液導電率で動作されると、抗体タンパク質はイオン交換リガンドを介してイオン的に支持体に結合し、他方未結合の汚染物（ホスト細胞タンパク質、核酸等）はクロマトグラフィーのベッドを自由に通過する。さらにこれらの汚染物は充填されたビーズベッドを適当なバッファー溶液でフラッシュすることにより除去することができ、しかる後に、ビーズ樹脂とタンパク質の間のイオン相互作用を十分に遮蔽する高い伝導率を有する適当な緩衝液により、結合されたｍＡｂ生成物を釈放することができる。
対照的に、陰イオン交換クロマトグラフィーは、しばしばモノクローナル抗体の製造において下流側で使用されて、残留細胞培養物の汚染物をさらに除去するために使用され、この場合の動作は、ｍＡｂタンパク質がビーズ樹脂の陽イオン性表面に結合しないでクロマトグラフィーカラムを自由に通過するようなｐＨと導電性を有する溶液条件下で実施される。他方、正味の負電荷を有するタンパク質と核酸は効果的に陰イオン交換樹脂に結合して製品から除去される。
【０００９】
ある実施形態に従うと、ここに記載した媒体は、ビーズベースのクロマトグラフィー媒体に比して高いベッド透過率（例えば、５００−９００ｍＤａｒｃｙ）と低い材料コストを有し、２０〜６０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ動的結合と、高い分離効率（例えば理論段高さＨＥＴＰ＜０．１ｃｍ）と、５０−１６０ｍｇ／ｇのＩｇＧ静電結合容量と、リガンド結合サイトへの吸着質の速い対流支配型の輸送とを有する。
【００１０】
或る実施形態によると、固有の大表面積を有する押し出し成型繊維（例えば熱可塑性繊維）を使用して、長さ２−６ｍｍに切断した繊維がランダム配向した充填ベッドとして構成するとき、高い流れ透過率（液体）と一様な流れ分布が可能となる。かかる繊維表面を官能化する化学的処理方法が提供され、吸着による相互作用に基づいたバイオ分子及び生物学的分離が可能になる。化学的処理方法はイオン性、親和性、疏水性等の相互作用、またはそれらの組み合わせの相互作用に基づく種々の表面化学的官能性をこの成型繊維に付与する。繊維の製造及び単純な表面化学処理の複合した技術より、バイオ製薬やワクチン製造において、経済的で容易に拡張可能な精製操作技術が提供できる。
【００１１】
ある実施形態によると、速い処理速度を可能にする吸着分離材料が提供される。なぜなら、溶質を繊維表面へまたは繊維表面からの質量輸送が、媒体を通る流体の対流により大きく制御されるからである。これは、拡散型の輸送が長い接触時間を要求しそれ故遅い処理速度であるビーズ型媒体に対して対照的である。ビーズ細孔の殺菌処理が制限される理由から従来のビーズ型の媒体を使用して能率的に分離できなかったウイルスのような大きい生物学的な種を捕捉または除去する能力が、本発明では提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】１ａは本発明の繊維の概略図である。
【図１ｂ】１ｂは本発明のある実施形態で使用できる畝付き繊維の概略図である。
【図１ｃ】１ｃは１ｂの繊維のある実施形態によりペンダント基が付着した繊維の概略図である。
【図１ｄ】１ｄは本発明のある実施形態で使用できる畝付繊維のＳＥＭ像である。
【図１ｅ】本発明のある実施形態により繊維の官能化を工程を示す図である。
【図１ｆ】本発明の他の実施形態により繊維の官能化を工程を示す図である。
【図２】本発明のある実施形態のＳＰ官能化された媒体に対するＩｇＧ破過曲線と溶離ピークを示す。
【図３】本発明のある実施形態の変動する速度でのＳＰ官能化された媒体に対するＩｇＧ破過曲線を示すグラフ（プロット）である。
【図４】本発明のある実施形態の変動する線速度でのＩｇＧ動的結合容量を示すグラフ（プロット）である。
【図５】本発明のある実施形態によるモノクローナル抗体（ｍＡＢ）チャレンジ試験のクロマトグラフ図である。
【図６】本発明のある実施形態による官能化媒体に対するｍＡＢ溶離ピークを示す。
【図７】ａ、ｂ、ｃは本発明のある実施形態にしたがうタンパク質ＡＨＰＬＣによるＩｇＧの定量化を示す図である。
【図８】ａ、ｂ、ｃは本発明のある実施形態にしたがうＣＨＯ−ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡデータを示す。
【図９】本発明のある実施形態にしたがった、モノクローナル抗体供給の総合クリアランスを流通する流れを示すグラフである。
【図１０】本発明のある実施形態にしたがったＳＰ触手で官能化された媒体に対するＩｇＧ破過曲線のプロットを示す。
【図１１】本発明のある実施形態にしたがった変化する速度でのＳＰ触手官能化された陽イオン交換媒体に対するＩｇＧ破過曲線を示す。
【図１２】本発明のある実施形態にしたがった変化する速度でのＳＰ触手官能化された陽イオン交換媒体に対するＩｇＧ動的結合容量を示す。
【００１３】
本書に記載した本発明の実施形態による賦形された繊維媒体は繊維自体の表面に依存する。賦形された繊維は大表面積と高流れ透過率を有するので、ヒドロゲルや多孔質粒子の追加のような修飾を要しないで容量及び効率などの性能目標を満たすことができる。さらに、ヒドロゲルや多孔質粒子を追加して表面積を増大させないので、ここに記載の媒体の製造コストは最低に抑制される。
【００１４】
繊維は任意の長さ及び直径を有することができ、好ましくはカット繊維、人絹（ｓｔａｐｌｅ）、又は不織布である。これ等は一体的な構造を有するように接合される必要はなく、個々のものとして有効に使用できる。繊維は糸のような連続した長さのものでもよいし、中間長さの単繊維でもよいし、或いは結晶成長法等により形成された不織布または織物などの繊維材料（例えば人絹）を切断（連続的な長さの繊維を個々の切片にカット）したより短い繊維の形であってもよい。繊維は好ましくはポリプロピレン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリアミド、熱可塑性ウレタン、コポリエステル、または液状結晶性重合体のような熱可塑性重合体から選択される。約１〜３デニールの繊維が好ましい。ある実施形態では、繊維の断面長は約１〜１００μｍ、断面幅は約１〜１００μｍである。適当な繊維の例では、繊維の断面長は約２０μｍ、断面幅は約１０μｍであり、その結果デニールは約１．５である。約１００，０００ｃｍ2／ｇ〜１，０００，０００ｃｍ2／ｇの表面積を有する繊維が適当である。好ましくは、繊維の断面長は約１０〜２０μｍである。
【００１５】
ある実施形態では、繊維は適当な入口と記載の用途に適合する寸法とを有する装置または容器に圧縮して容易に充填することができる。また、繊維については、不織布工業において共通のスパンボンド（連続繊維）又はウエットレイド（カット繊維）により製造される不織布シート材料のような、予備成形ベッド形式で使用できる。適当な予備成形繊維形式にはシート、マット、ウェブ、モノリス、等が含まれる。
【００１６】
ある実施形態では、繊維の断面は一般に翼付き形状であって、本体領域は実質的に長手方向の軸を形成し、複数の翼が本体領域から放射状に外側へ延びて複数の突起を形成している。突起はそれらの間に繊維の長手方向に延びる共軸の複数の溝を形成する。溝の数は１繊維当たり２０〜３０本である。ある実施形態では、突起の長さは本体領域の長さよりも短い。ある実施形態では繊維の断面はほぼ翼形をなしているとともに、中間領域が繊維の中心を延びる長軸部を形成し、この中間領域から複数の突起が延びている（図１ｄ）。ある実施形態では複数の突起は中間領域からほぼ放射状に延びている。この構造の結果、複数の溝は突起により規定される。突起間の適当な溝幅は約２００〜１０００ナノメータである。適当な繊維は米国特許公開２００８／０１０５６１２に記載されているので、引用して本書の一部とする。
【００１７】
大表面積の繊維の表面官能化は二段階で達成できる。適当な官能化方法は図１ｅのスキーム１に例示したようにグラフト重合である。官能化はペンダントアリル基をナイロン６の繊維の表面に固着することから開始される。この固着は水性水酸化ナトリウムの存在下に繊維を温度５０℃で１２時間かけてアリルグリシジルエーテルで処理することで行われる。繊維表面のペンダントアリル基はペンダントアクリルアミド重合体官能基に対する付着点として繊維表面の固定点（アンカー）の役目をする。アクリルアミド単量体の溶液重合条件が与えられ、繊維表面のペンダントアリル基は溶液中で成長しつつある重合体鎖に固着する。このようにしてアリルで官能化された繊維は引き続いて、温度８０℃で４時間かけて、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、及び過硫酸アンモニウムの水溶液により処理される。８０℃へ加熱されると、過硫酸塩の分解によりアクリル単量体のフリーラジカル重合が開始される。かかる条件下では、繊維表面のペンダントアリル基はペンダントアクリル重合体官能基に対する固着点として役立つ。このようにして、アクリル重合体は繊維表面に共有結合する。
【００１８】
ある実施形態では、アクリルアミド重合体は別個に調製され、次いで表面被覆としてナイロン繊維に塗布されてもよい。得られる表面被覆繊維はアリルをグラフト結合した材料に比肩できるＩｇＧ結合容量を有することが分かった。
【００１９】
本発明のある実施形態によると、官能化は、図１ｆに例示したように、高表面積の繊維表面にヒドロキシプロピルアクリレート（ＨＰＡ）とＮ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）（ＭＢＡｍ）を交差結合被覆として付着させることで開始される。この工程はそれに続くセリウムイオンで開始されるアクリルアミド単量体のレドックス重合に対する反応性ヒドロキシアルキル官能基を提供する。
【００２０】
このＨＰＳ／ＭＢＡｍで処理された繊維は、窒素雰囲気中３５℃の温度で、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）及びＨＮＯ3の水溶液と反応させる。この条件下で、繊維表面の交差結合したヒドロキシアルキル（ヒドロキシプロピルアクリレート）官能基のセリウム酸化により、繊維表面に遊離ラジカルが生じて、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸単量体の表面グラフト重合を開始させる。これ等の条件下に、表面で開始した重合プロセスは、重合した２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸単量体の重合触手（tentacle）を生成する。このようにして、アクリルアミド重合体は繊維表面に共有結合する。かかる方法はグラフト重合として知られている。
【００２１】
ベッド高さ１〜５ｃｍで、約０．１〜０．４ｇ／ｍｌ好ましくは０．３２ｇ／ｍｌの適宜のカラム充填密度は、クロマトグラフ評価における受容可能な性能に対して十分な均一流れを提供するであろう。
【００２２】
ある実施形態では、従来のビーズベッド媒体とは異なり、媒体（官能化充填繊維）は乾燥し予め充填された形態でユーザに配達できる。繊維は熱または化学的な手段で互いに融合でき、圧力容器に収納できる半剛性の構造を提供できる。かかる構造により、媒体及びそれを収納した容器はそのままで使用が可能となる。クロマトグラフビーズを基本とする媒体は一般に緩い材料（濡れた）として配送でき、ユーザはそれを圧力容器（カラム）に装荷し、いろいろな手段で隙間（ボイド）や通路（チャンネル）を生じないで十分に充填されたベッドを形成できる。通常は均一な充填を確保するために追跡テストが必要であるが、これとは対照的に、本発明の実施形態では製品がそのまま使用できる形で到着するのでユーザによる充填は必要がない。
【００２３】
賦形した繊維媒体はその形態上の性質により多孔質クロマトグラフビーズに優る幾つかのすぐれた効果を提供する。ビーズ型クロマトグラフーでは、典型的には、分離工程における速度制限段階は、拡散により支配される吸着質（溶質）の多孔質ビーズへの侵入である。タンパク質のような巨大分子に対しては、この拡散による輸送は比較的遅い。ここに記載した本発明の大きい表面積を有する繊維に対しては、結合サイトは繊維の外表面に露出されているので、流れ中にある吸着質分子は結合サイトに容易に接近できる。本発明の方法により提供される迅速な輸送は短い滞留時間（高流速）を可能にし、それにより移動床システムのような手段に類似する手段による媒体の迅速な循環を可能にする。処理速度は生物学的生産における重要なパラメータであるので、本書に記載した繊維に基づくクロマトグラフ媒体は従来のビーズに基づくクロマトグラフ媒体に比して特別な方法上の利益を提供する。
【００２４】
従来のクロマトグラフ樹脂は多孔質ビーズ、典型的にはアガロース、合成重合体、シリカ、又はガラスから出発する。これ等の材料は一般に高価である。たとえば、未官能化アガロースビーズは３００−３５０ドル／Ｌ、制御された細孔を有するガラスは６００―１０００ドル／Ｌもする。これに対して、本書で記載する高表面積の繊維の不織ベッドであって、適当な密度と厚さを有し、良好なクロマトグラフ性能を達成するベッドは、２０−５０ドル／Ｌである。この費用面からの利益は、本発明の新規なクロマトグラフ媒体が一回の製造で一回恐らくは数回の使用で廃棄できる「使い捨て可能な」技術として適正な価格で市販できる可能性を増すであろう。      
【００２５】
本発明の実施形態の表面官能化繊維媒体（例えばＳＰ官能化したＡｌｌａｓｓｏ繊維ＳＰＦ１）は充填ベッド形式で高い透過率を示す。充填密度に依存して、ベッドの透過率は１４０００ｍＤａｒｃｙ超から１０００ｍＤａｒｃｙ未満の範囲になる。０．１ｇ／ｍＬ（１ｇの媒体／９．３ｍＬのカラム容積）の低い充填密度では、線速度９００ｃｍ／ｈｒで、ベッド透過率１４２００ｍＤａｒｃｙが観測された。この値は広い速度範囲（４００〜１３００ｃｍ／ｈｒ）にわたり変わらなかった。かかる挙動は充填繊維ベッドが高い線速度で圧縮されないことを示している。表面官能化繊維媒体（ＳＰ官能化Ａｌｌａｓｓｏ繊維ＳＰＦ１）のさらに高い充填密度０．３３ｇ／ｍＬ（１ｇの媒体／２．８５ｍＬのカラム容積）への引き続く圧縮は線速度９００ｃｍ／ｈｒで、ベッド透過率１０００ｍＤａｒｃｙを与えた。同様にこのベッド透過率１０００ｍＤａｒｃｙは線速度４００〜１３００ｃｍ／ｈｒの範囲にわたり変化しなかった。適当な充填密度は約０．１〜約０．５ｇ／ｍｌを含む。
【００２６】
バイオ分離のために従来の充填ベッド式イオン交換クロマトグラフィー媒体、例えばＰｒｏＲｅｓ−Ｓ（米国マサチューセッツ州ビレリカ所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ製）等に対しては、同様な寸法から上記の場合の寸法（３ｃｍベッド深さ、内径１１ｍｍでカラム容積２．８５ｍＬのＶａｎｔａｇｅカラム（同社製）までの充填ベッドに対して１９００ｍＤａｒｃｙの透過率が測定されている。膜式吸着器に対しては、典型的な透過率は１〜１０ｍＤａｒｃｙの範囲にある。ＰｒｏＲｅｓ−Ｓに対しては、４００−１３００ｃｍ／ｈｒの速度範囲にわたり実質的に変化のないベッド透過率が測定されている。この挙動はＰｒｏＲｅｓ−Ｓのような半剛性のビーズに対しては予期されるが、より圧縮性の媒体（例えばアガロースビーズ）は高い線速度（＞２００ｃｍ／ｈｒ）では充填ベッドの実質的な圧縮によりベッド透過率の実質的な減少が考えられる。
【００２７】
表２には、ここに記載した実施例の表面官能化繊維媒体（ＳＰＦ１）に対するＩｇＧ動的結合容量（ＤＢＣ）のデータを示す。２００〜１５００ｃｍ／ｈｒの線速度の範囲で１．５、１０及び５０％破過で測定したＩｇＧのＤＢＣ値に実質的な変化は測定されず、図３に示したＩｇＧ破過曲線の形に実質的な変化は存在しなかった。
【００２８】
下記の表Ａにおいて、ＩｇＧ動的結合容量（ＤＢＣ）のデータは広範囲の線速度で測定したＰｒｏＲｅｓ−Ｓに対するものである。この伝統的な充填ベッド式のビーズを用いたイオン交換クロマトグラフィー媒体（ＰｒｏＲｅｓ−Ｓ）に対し、結合及び溶離捕捉形クロマトグラフィーの用途におけるＤＢＣを最大化するには線速度６０ｃｍ／ｈｒが推奨される。６０ｃｍ／ｈｒより高い線速度ではＩｇＧ動的結合容量が有意に減少する。測定された最大の線速度１２００ｃｍ／ｈｒではＩｇＧのＤＢＣは６０ｃｍ／ｈｒでの値の何分の１かに減じる。ＰｒｏＲｅｓ−Ｓが速度６０ｃｍ／ｈｒより大きい速度で運転されると、ＩｇＧ破過曲線の有意な拡大が観測された。
【００２９】
６０ｃｍ／ｈｒより大きい線速度、特に２００ｃｍ／ｈｒより大きい線速度において非常に短時間の滞留時間やカラム操作が必要な用途では、ＳＰ官能化繊維媒体（ＳＰＦ１）は従来のＰｒｏＲｅｓ−Ｓ等のビーズ型のクロマトグラフィー樹脂よりも適している。
【００３０】
【表Ａ】
2018059952.tif 000003
【００３１】
表Ａ：異なる線速度における１．５％、１０％及び５０％破過におけるＰｒｏＲｅｓ−Ｓに対するＩｇＧ  ＤＢＣ（動的結合容量）
【実施例】
【００３２】
以下に大表面積繊維表面の官能化及び遊離ラジカルグラフト重合法を説明する。
例１（ペンダントアリル基による大表面積繊維の表面変性）
ナイロン繊維表面のアリルグリシジルエーテルによる変性。
ガラスボトルにアリルグリシジルエーテル（２８．９ｇ、２５０ｍｍｏｌ）、硫酸ナトリウム（６．０ｇ、４２ｍｍｏｌ）及び４Ｎの水酸化ナトリウム溶液（６０ｍＬ）を入れた。この混合物に４ｇのほぐれたナイロン繊維（供給者ロットＩＤ）を加えた。この濡れた固形物を５０℃で１２時間加熱した。
室温まで冷却後、固形物をブッフナー漏斗に移し、蒸留水（４００ｍＬ）で洗浄し、次いでこの材料を３０分間真空乾燥した。
９．４ｇの湿った固形分を得た。この材料を直ちに次の工程で使用した。
【００３３】
例２（アリル変性し、ペンダントスルホプロピル陽イオン交換官能基を有する大表面積繊維の遊離ラジカルグラフト重合）
アリル変性したナイロン（ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭ５５／４５）のグラフト重合
ガラスボトルに２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ、５．０２ｇ、２４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＭ、１．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）、過硫酸アンモニウム（０．４９ｇ、２ｍｍｏｌ）及び水（７２．８ｍＬ）を加えた。この混合物に９．４ｇのほぐれたナイロン繊維（実施例１）を加え、この濡れた固形物を８０℃で４時間加熱した。
室温まで冷却後、固形分をブッフナー漏斗に移し、蒸留水（４５０ｍＬ）とメタノール（２５０ｍＬ）で洗浄した。この材料をオーブン中７０℃で１２時間乾燥した。
４．０ｇの白色繊維固形分が得られた。    
【００３４】
例３（得られた媒体の官能性能）
実施例２からのスルホプロピルで官能化した大表面積の繊維を、ポリクローナル・ヒトガンマイミュノグロブリン（ＩｇＧ）の精製のため、陽イオン交換クロマトグラフィーで評価した。ＩｇＧに対する静的結合容量測定の結果は下記の表１に示す。この研究において、Ａｌｌａｓｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから市販されている未官能化の「翼付き繊維」の試料（ロット番号０９０６０２ＰＡ６Ｃ）の静的結合容量を、上記の例１及び例２に記載された紫外線照射重合法及び熱開始重合体グラフト法によりに製造されたスルホプロピル官能化繊維試料と比較した。熱開始遊離ラジカルグラフト法は、紫外線開始法による静的表面結合容量（１０〜３０ｍｇＩｇＧ／ｇ繊維試料）や未官能化繊維のみの静的表面結合容量（２０ｍｇ  ＩｇＧ／ｇ繊維試料）よりも十分に高い静的表面結合容量（５０〜８０ｍｇＩｇＧ／ｇ繊維試料）を有するＳＰ官能化繊維媒体を提供した。また、１ＭのＮａＣｌ溶液によるＩｇＧ溶離試験をこれ等の試料に対して行った。これらの溶離条件下に、ＳＰ官能化繊維材料から５０〜７０％の結合ＩｇＧの回収が得られた。これ等の結果に基づき、ＳＰ官能化繊維媒体はバイオ分子クロマトグラフィーの用途における官能性能試験に対して十分な静的結合容量及び塩溶出特性を示すことが分かった。
【００３５】
【表１】
2018059952.tif 000004
【００３６】
表１：静的結合容量の測定。チャレンジ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム中２ｇ／Ｌのポリクローナル・ヒトＩｇＧ（SeraCare LifeSciences, Milford, MA）（ｐＨ５）。洗浄バッファー：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）。溶離バッファ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム中１Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ５）。
【００３７】
例４
約０．３ｇのほぐれたＳＰ官能化Allasso翼付き繊維を内径６．６ｍｍの（ＩＤ）Ｏｍｎｉｆｉｔクロマトグラフィーカラムに充填した。ベッド体積は頂部溶剤分配ヘッダーの圧縮により２ｃｍに調整してカラム容積を０．６８ｍＬにした。ＩｇＧ動的結合容量の測定を次の手順で実施した。
１０ＣＶ（カラム容積）  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）（平衡化）
６０ＣＶ  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）中２ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（ＳｅｒａＣａｒｅ）
（ＩｇＧチャレンジ）
８０ＣＶ  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）（洗浄）
５０ＣＶ  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）中１ＭのＮａＣｌ（溶離）
２０ＣＶ  ０．５ＭのＮａＯＨ（洗浄）
６０ＣＶ  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）（洗浄）
【００３８】
図２はいくつかの実施形態に従った、例２に記載されたＳＰＦ１繊維に対する代表的なＩｇＧ破過曲線の例である。２０〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲で鋭い破過曲線とＩｇＧ動的結合容量（ＤＢＣ）が測定された（表２）。５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）中の１Ｍの塩化ナトリウムで溶離することにより、結合ＩｇＧの定量的な回収が達成された。
【００３９】
【表２】
2018059952.tif 000005
【００４０】
表２：実施例２のＳＰ官能化媒体（ＳＰＦ１）の異なる線速度における１、５、１０及び５０％の破過でのＩｇＧのＤＢＣの値
【００４１】
図３は２００〜１５００ｃｍ／ｈｒの範囲の種々の線速度でのＳＰＦ１繊維媒体カラムに対する重畳したＩｇＧ破過曲線である。線流れ速度が増加しても破過曲線の形に差がない。
【００４２】
図４は非常に高速（１５００ｃｍ／ｈｒ）ですら測定したＩｇＧ動的結合容量がわずかしか変動しないことを示す。この挙動はシステムがＩｇＧ分子のイオン性リガンド結合サイトへの対流による輸送に支配されることを示している。
【００４３】
これに対して従来のビーズによるイオン交換クロマトグラフィー樹脂は速度が増すと動的結合容量が減少し、破過曲線がより拡散する。非常に高い速度では、ベッドの圧縮がビーズの一体性を損われ、その結果として流れの一様性が乏しくなり、クロマトグラフ性能が低下する。
【００４４】
例５（アクリルアミド共重合体被覆によるナイロン表面の変性）
ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭが５５／４５の溶液重合
２５０ｍＬの三口丸底フラスコに、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ、１０．０４ｇ、４８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＭ、３．９２ｇ、４０ｍｍｏｌ）、過硫酸アンモニウム（０．９８ｇ、４ｍｍｏｌ）及び水（１４６ｍＬ）を装入した。この溶液を８０℃に４時間加熱した。室温に冷却したのち、この重合体溶液を直ちに次に示す工程に使用した。
【００４５】
ナイロン繊維表面のＡＭＰＳ／ＤＭＡＭ重合体被覆（Ｃｏａｔｉｎｇ）による変性
ガラスボトルに１９ｇの上記の工程で調製したＡＭＰＳ／ＤＭＡＭ５５／４５共重合体溶液と、１ｇのほぐれたナイロン繊維（Ａｌｌａｓｓｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．#090602PA6C）を加えた。この濡れた固形物を８０℃で２４時間加熱した。室温に冷却後、固形物をブッフナー漏斗に移し、蒸留水（３×５０ｍＬ）とメタノール（１×５０ｍＬ）で洗浄した。この材料を真空中で１０分間乾燥した。この材料をオーブンに入れて４０℃で２４時間乾燥した。
０．９ｇの白色繊維状固形物が得られた。
【００４６】
静的結合容量の測定
ＩｇＧに対する静的結合容量の測定結果は表３に示す。この研究ではAllasso (lot ID 090602PA6C)の未官能化の「翼付き繊維」試料の静的結合容量を、この例５の溶液重合体被覆法に従って調製したスルホプロピル（ＳＰ）官能化繊維の試料と比較した。この研究では溶液重合体被覆法では、ＳＰ官能化繊維媒体の方が、ＳＰ未官能化繊維媒体単独（１ｍｇのＩｇＧ／ｇ繊維試料）よりも高い静的結合容量（３０〜４０ｍｇのＩｇＧ／ｇ繊維試料）を提供した。これ等の結果に基づき、ＳＰ官能化重合体繊維被覆はＡＭＰＳ／ＤＭＡＭ共重合体の単なる被覆と熱アニールだけで設けることができる。
【００４７】
【表３】
2018059952.tif 000006
【００４８】
表３：静的結合容量の測定。チャレンジ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中の２ｇ／ＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（SeraCare LifeSciences, Milford, MA）。
【００４９】
例６（ペンダントアリル基による大表面積繊維の表面変性）
アリルグリシジルエーテルによるナイロン繊維表面の変性
０．５Ｌのフラスコに、アリルグリシジルエーテル（７０．７ｇ、６２０ｍｍｏｌ）、硫酸ナトリウム（１４．９ｇ、１０５ｍｍｏｌ）及び４Ｎの水酸化ナトリウム溶液（３５０ｍＬ）を装入した。この混合物に１０ｇのほぐれたナイロン繊維（Allasso Industries, #090602PA6C）を追加した。濡れた固形物を５０℃で１２時間加熱した。室温に冷却後、固形分をブッフナー漏斗に移し、蒸留水（１．５Ｌ）とメタノール（０．５Ｌ）で洗浄した。得られた材料を真空中で３０分乾燥し、次いでオーブンに入れ５０℃で１８時間乾燥した。
８．８ｇの白色繊維固体が得られた。
【００５０】
例７（ペンダントスルホプロピル陽イオン交換官能基での、アリル変性大表面積繊維の遊離ラジカルグラフト重合）  
アリル変性ナイロン（ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭ５５／４５）のグラフト重合 
ガラス容器に２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＭ）、過硫酸アンモニウム、及び水を、下の表４に記載した比率で装入した。ほぐれたアリルグリシジルエーテル変性ナイロン繊維（実施例６）を各混合物に加えた。この濡れた固形物を８０℃で４時間加熱した。室温に冷却後、濡れた固形物を各々ブッフナー漏斗に移し、蒸留水（３×５０ｍＬ）とメタノール（１×５０ｍＬ）で洗浄した。得られた材料はオーブン中、４０℃で１２時間乾燥した。
乾燥した表面変性繊維の試料はＩｇＧチャレンジ溶液で静的結合容量を測定する用意が整う。
【００５１】
静的結合容量の測定
ＩｇＧに対する静的結合容量の測定結果も表４に示す。この研究では、Allasso (lot ID 090602PA6C)からの官能化されていない「翼付き繊維」試料の静的結合容量が、熱開始重合体のグラフト工程により調製されたスルホプロピル官能化繊維の試料（試料Ａ〜Ｇ）と比較された。この研究では、ＳＰ官能化繊維媒体のＩｇＧ静的結合容量はＡＭＰＳ／ＤＭＡＭ重合体組成と反応溶液の濃度に影響されうる。例えば、試料ＥとＧは、より高いＡＭＰＳ濃度で調製された試料ＡとＣと同様に、官能化しないナイロン繊維単独（６ｍｇＩｇＧ／ｇ繊維）よりも実質的に高いＩｇＧ静的結合容量を示す。
【００５２】
【表４】
2018059952.tif 000007
【００５３】
表４：グラフト重合組成物とＩｇＧ静的結合容量測定データ。チャレンジ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中２ｇ／ＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（SeraCare LifeSciences, Milford, MA）
【００５４】
媒体の官能性能
例２で得たスルホプロピル官能化高表面積繊維の性能を次の例でモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の陽イオン交換クロマトグラフィーによる結合及び溶離精製で評価した。ｍＡｂは濃度６．７（ｍｇ／ｍＬ）でタンパク質Ａカラムからの溶離物として用意した。
【００５５】
例８（モノクローナル抗体の結合及び溶離精製）
カラム充填 
例２で得た０．９ｇのスルホプロピル官能化した大表面積繊維を１００ｇのイソプロパノール中で３０分間かけてスラリー化した。４００ｍＬの脱イオン水を加え、スラリーを一晩撹拌した。この繊維スラリーを内径１１ｍｍのＶａｎｔａｇｅカラムに移し、真空を用いて過剰の液をカラムから引いて人絹繊維の圧縮を促進した。スラリーをカラムに移送したのち、カラムの頂部ヘッダをセットし、ヘッダーで圧縮して、最終のカラム堆積２．７６ｍＬにした（目標性能に向けてベッドを圧縮）。２重量％のアセトン溶液を用いてＨＥＴＰ（理論弾高さ）及びピーク非対称の測定を実行した。ＨＥＴＰは０．１ｃｍ未満であり、ピーク非対称性は２．０未満であった。
【００５６】
陽イオン交換クロマトグラフフィーによるｍＡｂの精製
図５〜６には、例２の陽イオン交換媒体を用いてｍＡｂの結合／溶離精製するクロマトグラフィー法を実施する例が示されている。この例では、６．７ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ（１４．７ｍｇのｍＡｂ）を含有するタンパク質Ａ溶離液０．７９ＣＶ（２．１８ｍＬ）が、カラムに適用され、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中２５０ｍＭのＮａＣｌで溶離される。ｍＡｂの溶離ピークは２０個の０．５ＣＶ画分（各画分＝１．３８ｍＬ）で収集された。２８０ｎｍでの各画分のＵＶ吸収の測定によるｍＡｂ溶出画分の定量は１３．８ｍｇ（収率９４％）の回収を示した。図７のタンパク質ＡのＨＰＬＣによる各溶離画分のＩｇＧ分析も行った。この分析もまた各溶離画分のＩｇＧ濃度を与える。この分析により、ｍＡｂ溶離が主として画分第５〜９に存在すること及びｍＡｂの回収率が９０％であることを示した。
【００５７】
図８にはチャイニーズハムスターの卵巣−各ｍＡｂ溶離画分のホスト細胞タンパク質濃度（ＣＨＯ−ＨＣＰ）に対するＥＬＩＳＡデータが記載されている。ＨＣＰは主として画分第５〜９において濃度４７９ｎｇ／ｍＬの平均濃度で溶離される。ｍＡｂチャレンジ溶液は６９４４ｎｇ／ｍＬのＨＣＰ濃度を有し、ＨＣＰクリアランス対数減少値（ＬＲＶ）は１．１と算出された。
【００５８】
例９（ペンダントアリル基を有する大表面積繊維の表面変性）
アリルグリシジルエーテルによるナイロン繊維の表面変性
ガラスボトルにアリルグリシジルエーテル（２８．８ｇ、２５２ｍｍｏｌ）硫酸ナトリウム（６．０ｇ、４３ｍｍｏｌ）、及び４Ｎの水酸化ナトリウム溶液（６０ｍＬ）を装入した。この混合物に４ｇのほぐれたナイロン繊維（Allasso Industries, #090602PA6C）を追加し、この濡れた固形物を５０℃で１２時間加熱した。
室温に冷却したのち、この固形物をブッフナー漏斗に移して蒸留水（０．５Ｌ）で洗浄した。得られた材料を真空中で３０分乾燥した。この湿った材料を直ちに次の工程で使用した。
【００５９】
例１０（ペンダントトリメチルアンモニウム陽イオン交換官能性を有するアリル変性大表面積繊維の遊離ラジカルグラフト重合）
アリル変性ナイロン（ＡＰＴＡＣ１００）のグラフト重合
カラスボトルに（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロライド（ＡＰＴＡＣ、９．１ｇ、４４ｍｍｏｌ）、過硫酸アンモニウム（０．６４ｇ、３ｍｍｏｌ）、水（２７ｍＬ）、及び１０ｇの濡れたアリルグリシジルエーテル変性した上記例９の繊維を装入した。この溶液を８０℃で４時間加熱した。
室温に冷却したのち、この濡れた固形物をブッフナー漏斗に移して蒸留水（１００ｍＬ）とメタノール（３０ｍＬ）で洗浄した。得られた材料を真空中５０℃で１２０分乾燥した。材料をオーブンにおいて５０℃で１２時間乾燥させた。
６．１ｇの明黄色の繊維固形物を得た。
乾燥しかつ表面変性した繊維試料はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）試験溶液と静的結合容量の測定をうける用意ができた。
【００６０】
例１１（静的結合容量の測定）
トリメチルアンモニウム官能化繊維の陰イオン交換への適用における性能を試験するために、ＢＳＡ静的結合容量測定を実施した。その結果を下の表５に示す。この研究では、例１０の熱開始重合体グラフト法により調製されたトリメチルアンモニウム官能化繊維試料の静的結合容量が記録された。例１０からのトリメチルアンモニウム官能化繊維媒体のＢＳＡ静的結合容量は１〜１９ｍｇ／ｇである。
【００６１】
【表５】
2018059952.tif 000008
【００６２】
表５：静的結合容量の測定。チャレンジ：２５ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８）中０．５ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
【００６３】
例１２（変性しないナイロン繊維のグラフト重合）
２００ｍＬの６個のガラスボトルに３−スルホプロピルメタクリレートのカリウム塩（３−ＳＰＭＡ）、水、ナイロン繊維（Allasso Industries製）、及び１ＭのＨＮＯ3溶液（下記の表に記載の量で）を装入した。１Ｍの硝酸中０．４Ｍの硝酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ）の溶液を各ボトルに添加した。反応ボトルに蓋をし、これらの混合物を３５℃で１８時間加熱した。
室温に冷却後、各ボトルからの繊維固形物を０．５Ｍの硫酸中０．２Ｍのアスコルビン酸溶液（３×５０ｍＬ）、脱イオン水（３×５０ｍＬ）、１Ｍ  水酸化ナトリウム溶液（３×５０ｍＬ）、脱イオン水（３×５０ｍＬ）、及びアセトン（１×５０ｍＬ）で洗浄した。ついでこの材料をオーブンにおいて４０℃で１２時間乾燥した。
白色繊維固形物の試料が得られた（表６の回収及び重量付加データ参照）。
【００６４】
【表６】
2018059952.tif 000009
【００６５】
表６：セリウムレドックスグラフト重合組成物と回収データ。
【００６６】
静的結合容量の測定
ＩｇＧに対する静的結合容量の測定結果を次の表７に示す。ＳＰ−官能化触手繊維媒体は市販のバイオ分子クロマトグラフ用に使用されるビーズベースの陽イオン交換媒体に比肩できるＩｇＧ静的結合容量を示す。
【００６７】
【表７】
2018059952.tif 000010
【００６８】
注１：０．３３ｇ／ｍＬの繊維充填密度
表７：静的結合容量の測定。チャレンジ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中２ｇ／ＬポリクローナルヒトＩｇＧ（SeraCare Life Sciences,Milford,MA）
【００６９】
動的結合容量の測定
例１２−６のＳＰ官能化繊維媒体に対するＩｇＧ動的結合容量の測定結果を次の表８に示す。１．０ｇの媒体を１１ｍｍ内径のＶａｎｔａｇｅカラムに充填し、ベッド深さ２．９ｃｍ（２．７５ｍＬのカラム容積、０．３６ｇ／ｍＬの繊維充填密度）になるまで圧縮した。動的結合容量の測定は、６０〜１２００ｃｍ／ｈｒの線速度範囲にわたり行った。これ等の速度は９〜１８０秒の滞留時間に相当する。例１２−６の繊維媒体は３０〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲のＩｇＧ動的結合容量を示す。
【００７０】
【表８】
2018059952.tif 000011
【００７１】
表８：ＳＰ触手官能化Allasso翼付繊維の陽イオン交換媒体の各種線速度における１,５,１０及び５０％破過でのＩｇＧ  ＤＢＣ値（ＲＴは滞留時間）。チャレンジ：５０ｍＭ酢酸塩溶液（ｐＨ５）中の２０ｇ／ＬポリクローナルヒトＩｇＧ。
【００７２】
例１３（未変性ナイロン繊維のグラフト重合）
６個の２００ｍＬのボトルにグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、水、ナイロン繊維（Allasso Industries製）及び１ＭのＨＮＯ3溶液（下記の表に記載の量）を装入した。１ＭのＨＮＯ3硝酸中の硝酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ）の０．４Ｍ溶液を各ボトルに添加した。反応ボトルに蓋をし、これらの混合物を３５℃で１８時間加熱した。
室温に冷却後、各ボトルからの繊維固形物を０．５Ｍの硫酸中０．２Ｍのアスコルビン酸溶液（３×５０ｍＬ）、脱イオン水（３×５０ｍＬ）、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（３×５０ｍＬ）、脱イオン水（３×５０ｍＬ）及びアセトン（１×５０ｍＬ）で洗浄した。
ついでこの材料をオーブンにおいて４０℃で１２時間乾燥した。
白色繊維固形物の試料が得られた（表９の回収及び重量追加データ参照）。
【００７３】
【表９】
2018059952.tif 000012
【００７４】
注１：１／３分離画分に基づく計算
表９：セリウムレドックスグラフト重合組成物と回収データ
【００７５】
エポキシ官能化繊維のジエチルアミン官能化
６個の２５０ｍＬボトルに上例からの湿ったＧＭＡ官能化繊維の部分と、２５重量％のジエチルアミン水溶液を加えた（下記の表に記載の量）。これ等の混合物を室温で３時間撹拌した。
続いて繊維固形分を脱イオン水（３×５０ｍＬ）とエタノール（１×５０ｍＬ）で洗浄した。これ等の材料をオーブンに入れて４０℃で１２時間乾燥した。
白色繊維固形物が得られた（回収及び重量付加データについては表１０参照）。
【００７６】
【表１０】
2018059952.tif 000013
【００７７】
注１；初期の１．５ｇの繊維装入量の２／３の部分に基づいて算出
表１０：エポキシ官能化繊維のジエチルアミンによる変性に対する組成と回収データ
【００７８】
静的結合容量の測定
ＢＳＡに対する静的結合容量測定の結果を次の表１１に示す。ＧＭＡ触手のグラフト密度に依存して、ジエチルアミン官能化結合手を有する繊維媒体は広い範囲のＢＳＡ静的結合容量（ＳＢＣ）を示すことができる。この系列では、例１３−２Ｂと例１３−３Ｂの組成は、商用のバイオ分子クロマトフィーの用途において、ビーズベースの陽イオン交換媒体に比肩できるＢＳＡのＳＢＣ値を与えることが分かった。
【００７９】
【表１１】
2018059952.tif 000014
【００８０】
注１：０．３３ｇ／ｍＬの繊維充填密度に基づく
表１１：静的結合容量の測定。チャレンジ：２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）中２ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
【００８１】
動的結合容量の測定
例１３−３Ｂのジメチルアミンで官能化した繊維媒体のＢＳＡ動的結合容量の測定結果を次の表１２に示す。この媒体０．５ｇを内径１１ｍｍのVantageカラムに充填し、ベッド深さ１．５ｃｍまで圧縮した（１．４２ｍＬのカラム容積で０．３５ｇ／ｍＬの繊維充填密度）。動的結合容量の測定を線速度２００ｃｍ／ｈｒで行った。この速度は滞留時間２７秒に相当する。例１３−３Ｂの繊維媒体は１０％破過で３０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ動的結合容量を示した。
【００８２】
【表１２】
2018059952.tif 000015
【００８３】
表１２：ジメチルアミン触手官能化されたＡｌｌａｓｓｏ翼付き繊維の陰イオン交換媒体での２００ｃｍ／ｈｒにおけるＢＳＡの１、５、１０及び５０％破過におけるＤＢＣ値（動的結合容量値）（ＲＴは滞留時間）。チャレンジ：２５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ＰＨ８）中２ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
【００８４】
例１４
未変性ナイロン繊維のグラフト重合
５００ｍＬのボトルにグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ，１．７０ｇ、１２ｍｍｏｌ）と水（２３２．８ｍＬ）を入れた。５ｇのAllassoナイロン繊維をこの溶液に加えた。１ＭのＨＮＯ3溶液（７．２２ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、次いで１ＭのＨＮＯ3（０．６０２ｍＬ，０．２４０ｍｍｏｌ）中０．４Ｍの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）の溶液を加えた。
この反応混合物を３５℃で１時間加熱した。
室温まで冷却した後、固形分を脱イオン水（３×１００ｍＬ）で洗浄した後、この濡れた材料（１２．２１ｇ）を直ちに次工程で使用した。
【００８５】
エポキシ官能化繊維のＱ官能化
４個の２５０ｍＬのボトルに、上例からの濡れたＧＭＡ官能化繊維の部分とメタノール（次の表１３に記載の量で）中５０重量％のトリメチルアミン（水溶液）を装入した。この混合物を室温で１８時間撹拌した。
ついで繊維固形物を０．５Ｍの硫酸中０．２Ｍのアスコルビン酸の溶液（３×５０ｍＬ）、脱イオン水（３×５０ｍＬ）、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（３×５０ｍＬ）、脱イオン水（３×５０ｍＬ）、及びエタノール（１×５０ｍＬ）で洗浄した。次いでこの材料をオーブンに入れ、４０℃で１２時間乾燥した。
白色繊維固形分の試料が得られた（表１３の回収及び重量追加データ参照）。
【００８６】
【表１３】
2018059952.tif 000016
【００８７】
表１３：トリメチルアミンによるエポキシ官能化繊維の変性のための組成及び回収データ
【００８８】
静的結合容量の測定
ＢＳＡに対する静的結合容量の測定の結果は下記の表１４に示す。Ｑ−官能化触手繊維媒体は３０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ静的結合容量を与えた。この系列においては、例１４Ｃ及び１４Ｄの組成が最高のＢＳＡ  ＳＢＣ値を与える。これは商用バイオ分子クロマトグラフの用途で使用されているビーズベースの陰イオン交換媒体と同等である。
【００８９】
【表１４】
2018059952.tif 000017
【００９０】
注１：０．３３ｇ／ｍＬの繊維充填密度
表１４：静的結合容量測定。チャレンジ：２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８）中２ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
【００９１】
動的結合容量の測定
例１４Ｃにより調製したＱ官能化繊維媒体に対するＢＳＡの動的結合容量の測定の結果は下記の表１５に示す。１．０ｇの同媒体を内径１１ｍｍのVantageカラムに入れ、ベッド深さ３．０ｃｍ（２．８５ｍＬのカラム容積、０．３５ｇ／ｍＬ繊維充填密度）に圧縮した。動的結合容量の測定は６０〜１２００ｃｍ／ｈｒの線速度範囲で行った。これ等の速度は９〜１８０秒の滞留時間に相当する。例１４Ｃの繊維媒体は３０〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲のＢＳＡ動的結合容量を示している。
【００９２】
【表１５】
2018059952.tif 000018
【００９３】
表１５：Ｑ−触手官能化したAllasso翼付き陰イオン交換繊維媒体に対するＢＳＡの動的結合容量ＤＢＣの、各種線速度破過１、５、１０及び５０％に対する値（ＲＴ＝滞留時間）。チャレンジ：２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）中２ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
【００９４】
例１５（未変性ナイロン繊維のグラフト重合）
５００ｍＬのボトルにヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）（１．６９ｇ、１３ｍｍｏｌ）と水（２３２．５ｍＬ）を装入した。この溶液に５．００ｇのAllassoナイロン繊維を加えた。１ＭのＨＮＯ3溶液（７．２１ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、次いで１ＭのＨＮＯ3溶液（０．６０１ｍＬ、０．２４０ｍｍｏｌ）中０．４Ｍの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）の溶液を添加した。
反応混合物を３５℃で１時間加熱した。
室温に冷却後、固形分を０．５Ｍの硫酸中０．２Ｍのアスコルビン酸溶液（３×１００ｍＬ）、脱イオン水（３×１００ｍＬ）、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（３×１００ｍＬ）、脱イオン水（３×１００ｍＬ）、及びエタノール（１×１００ｍＬ）で洗浄した。得られた材料をオーブンに入れ４０℃で１２時間乾燥した。
白色繊維固形物５．５８ｇが得られた。
【００９５】
例１６（ポリ（ＨＥＭＡ）官能化繊維の硫酸化）
アルゴン雰囲気と磁気撹拌子と３ＮのＮａＯＨバッブラーを有する５００ｍＬの３口フラスコに、酢酸を加え、０℃に冷却した。クロロスルホン酸（５．０ｇ、４３ｍｍｏｌ）を加えた。上記の例からの２．５ｇのポリ（ＨＥＭＡ）官能化繊維をこの反応混合物に添加し、室温まで放置して温め、１時間撹拌した。
次いでこの繊維固形物に５ｍＬの水と３００ｍＬの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液の添加で中和した。固形の炭酸ナトリウムをこの反応混合物に分割して添加してｐＨ＞７にした。繊維固形物を１Ｍの炭酸ナトリウム溶液（３×１００ｍＬ）、脱イオン水（３×１００ｍＬ）、及びエタノール（１×１００ｍＬ）で順次洗浄した。この材料をオーブンにて４０℃で１２時間乾燥した。
３．６４ｇの白色のゴム状固体を得た。
【００９６】
比較例１（未変性ＥＶＯＨ繊維のグラフト重合）
４個の３０ｍＬのボトルに２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩溶液（ＡｍＰＳ−Ｎａ，５０％水溶液）、水、及びＥＶＯＨ繊維（Engineered Fiber Technologies，Ｓ０３０−０．５ｄｘ５ｍｍ）を装入した。反応混合物を真空パージし、窒素で３回裏込め（バックフィル）した。１ＭのＨＮＯ3溶液と１ＭのＨＮＯ3溶液中硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ）の０．４Ｍ溶液を各ボトルに加えた（下記の表１６に記載した分量で）。これらの反応ボトルに蓋をし、それらの混合物を４０℃で１２時間加熱した。
室温まで冷却したのち、各ボトルから繊維固形物を脱イオン水（３×３０ｍＬ）、０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液中０．２Ｍのアスコルビン酸（３×３０ｍＬ）、脱イオン水（３×３０ｍＬ）、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（２×３０ｍＬ）、脱イオン水（３×３０ｍＬ）、及びメタノール（２×３０ｍＬ）で洗浄した。この材料をオーブンに入れて４０℃で８時間乾燥した。
白色繊維固形物を得た（表１６の回収と収率のデータ参照）
【００９７】
【表１６】
2018059952.tif 000019
【００９８】
表１６：セリウムレドックスグラフト重合組成と回収のデータ
【００９９】
比較例２（未変性ＰＶＡ繊維のグラフと重合）
４個の３０ｍＬのボトルに２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩溶液（ＡｍＰＳ−Ｎａ、５０％水溶液）、水、及びＰＶＡ繊維（Engineered Fiber Technologies，ＶＰＢ０５２×３ｍｍ）を装入した。この反応混合物を真空パージし、窒素で３回裏込め（バックフィル）した。１ＭのＨＮＯ3溶液と１ＭのＨＮＯ3溶液中硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ）の０．４Ｍ溶液を各ボトルに加えた（下記の表１７に記載した分量）。これらの反応ボトルに蓋をし、それらの混合物を４０℃で１２時間加熱した。
室温まで冷却したのち、各ボトルから繊維固形物を脱イオン水（３×３０ｍＬ）、０．５Ｍの硫酸溶液中０．２Ｍのアスコルビン酸（３×３０ｍＬ）、脱イオン水（３×３０ｍＬ）、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（２×３０ｍＬ）、脱イオン水（３×３０ｍＬ）、及びメタノール（２×３０ｍＬ）で洗浄した。この材料をオーブンに入れて４０℃で８時間乾燥した。
白色繊維固形物を得た（表１７の回収と収率のデータ参照）
【０１００】
【表１７】
2018059952.tif 000020
【０１０１】
表１７：セリウムレドックスグラフト重合組成と回収のデータ
【０１０２】
静的結合容量の測定
ＩｇＧに対する静的結合容量の測定結果を下の表１８に示す。ＥＶＯＨ繊維ベースの母材に基づくＳＰ官能化触手媒体（比較例１）は低いＩｇＧ静的結合容量を示すに過ぎない。ＰＶＣ繊維ベースの母材に基づくＳＰ官能化触手媒体（比較例２）はある組成（比較例２−１）に対してわずかに高いＩｇＧ静的結合容量を示すに過ぎない。すべての場合において、ＩｇＧ  ＳＢＣ値は市販のバイオ分子クロマトグラフで使用される市販のビーズベースの陽イオン交換媒体よりもはるかに低い。これらの例は翼付き繊維媒体（Allasso Industries製）が示す表面積増加の利点を示すのに役立っている。もしもＰＶＡ又はＥＶＯＨベースの母材に同様な表面積の増強が実行されれば、本書に記載したセリウムイオンレドックスグラフト法を使用して直接表面を官能化した後で高いＩｇＧ結合容量を得ることができるであろう。
【０１０３】
【表１８】
2018059952.tif 000021
【０１０４】
注：０．３３ｇ／ｍＬの繊維充填密度に基づく
表１８：  静的結合容量の測定。チャレンジ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中２ｇ／ＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（SeraCare Life Sciences, Milford, MA）。
【０１０５】
例１６（ＨＰＡ／ＭＢＡｍ９５／５によるナイロン繊維表面の変性）
機械撹拌器、還流コンデンサ及び温度制御器を備えた２０００ｍＬの三口フラスコに、ヒドロキシプロピルアクリレート（ＨＰＡ、  １３．７ｇ、９５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）（ＭＢＡｍ、０．７７ｇ、５ｍｍｏｌ）、及び水（７１０ｍＬ）を装入した。この混合物に１６．８ｇのほぐれたナイロン繊維（Allasso Industries, #090602PA6C）を加え、次いで過硫酸アンモニウム（１．６０ｇ、７ｍｍｏｌ）を添加した。濡れた固形物を８０℃で４時間加熱した。
室温に冷却後、固形分をブッフナー漏斗に移し、熱水（３×５００ｍＬ）とメタノール（１×５００ｍＬ）で洗浄した。この材料を真空中で２０分間乾燥した。この材料をオーブンに移し、４０℃で１８時間乾燥した。
１７．６ｇの白色繊維が得られた。
【０１０６】
例１７（ＨＰＡ／ＭＢＡｍ変性ナイロン繊維のグラフト重合）
４個の２００ｍＬのボトルにグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、水、ＨＰＡ／ＭＢＡｍ変性ナイロン繊維（例１６）及び１ＭのＨＮＯ3溶液（下記の表１９に記載の量）を装入した。１ＭのＨＮＯ3中０．４Ｍの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ）溶液を各ボトルに添加した。反応ボトルに蓋をし、これらの混合物を３５℃で１２時間加熱した。
室温に冷却したのち、各ボトルからの繊維固形物を脱イオン水（３×１５０ｍＬ）及びメタノール（１×１５０ｍＬ）で洗浄した。この材料をオーブン中で４０℃にて１２時間乾燥した。
白色の繊維質固形物のサンプルが得られた（表１９参照の回収及び重量付加データ参照）。
【０１０７】
【表１９】
2018059952.tif 000022
【０１０８】
表１９：セリウムレドックスグラフト重合組成と回収データ
【０１０９】
例１８（組み換えタンパク質Ａ親和性リガンドｒＳＰＡによるナイロン繊維表面の変性）
２５０ｍＬのボトルに１Ｍの重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）、組み換えタンパク質Ａ（４７．５ｍｇ／ｍＬ水溶液としてｒＳＰＡ#RN091139、１５０ｍｇ）及び水（９０ｍＬ）を装入した。上記の例１７−４からのＧＭＡグラフト繊維（３５０ｍｇ）をこの反応混合物に加え、３７℃で２．５時間加熱した。
室温への冷却後、固形分をブッフナー漏斗に移し、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム（３×１００ｍＬ）で洗浄した。濡れた繊維固形物を、０．２Ｍの重炭酸ナトリウム／０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液中１０重量％のチオグリセロール溶液１００ｍＬ中に懸濁した。この混合物を室温で一夜撹拌した。
固形分をブッフナー漏斗に移し、０．１ＭのTRIZMA塩基溶液、０．１５Ｍの塩化ナトリウム（１×７５ｍＬ）、及び０．１５Ｍの酢酸（１×７５ｍＬ）による洗浄サイクルを行った。TRIZMA塩基溶液と酢酸溶液による洗浄はさらに２回反復した。最後にこの繊維固形物を脱イオン水（１×７５ｍＬ）と２０％エタノール（１×７５ｍＬ）で洗浄した。この繊維固形物を２０％エタノール中に保存した。
【０１１０】
静的結合容量の測定
例１８に従って製造したタンパク質Ａで官能化された繊維媒体に対するＩｇＧ静的結合容量の測定の結果を次の表２０に示す。タンパク質Ａで官能化された触手を有する繊維媒体は４ｍｇ／ｍＬ程度のＩｇＧ静的結合容量を有する。タンパク質Ａのリガンド結合方法をさらに最適化すれば、バイオ分子アフィニティークロマトグラフの用途で低コストで且つ増大したＩｇＧ静的結合容量が提供されるであろう。
【０１１１】
【表２０】
2018059952.tif 000023
【０１１２】
注１：０．３３ｇ／ｍＬの繊維充填密度に基づく
表２０：静的結合容量の測定  チャレンジ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２ｇ／ＬのポリクローなるＩｇＧ（ＳｅｒａＣａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）
【０１１３】
動的結合容量の測定
例１８のタンパク質Ａ官能化繊維媒体に対するＩｇＧ動的結合容量の測定の結果は下記の表２１に示す。０．３５ｇの媒体を内径１１ｍｍのVantageカラムに充填し、ベッド深さ１．１ｃｍまで圧縮した（１．０４ｍＬのカラム容積、０．３４ｇ／ｍＬの繊維充填密度）。動的結合容量測定を６０〜８００ｃｍ／ｈｒの線速度範囲で行った。これらの速度は５〜６０秒の滞留時間に相当している。例１８の繊維媒体は５ｇ／ｍＬの範囲のＩｇＧ動的結合容量を示している。タンパク質Ａリガンド結合方法のさらなる最適化は低コストのバイオ分子親和クロマトグラフィーの応用に対して増大したＩｇＧ動的結合容量を提供するであろう。
【０１１４】
【表２１】
2018059952.tif 000024
【０１１５】
表２１：種々の線速度（ＲＴは滞留時間）における１、５、１０及び５０％破過におけるタンパク質Ａ官能化したＡｌｌａｓｓｏ翼付繊維の親和クロマトグラフ媒体に対するＩｇＧ動的結合容量の測定ＤＢＣ（動的結合容量）。チャレンジ：リン酸塩緩衝塩水（ｐＨ７.４）中２ｇ／ＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（SeraCare Life Sciences, Milford, MA）。
【０１１６】
例１９（ＨＰＡ／ＭＢＡｍで変性したナイロン繊維の貫流通式グラフト重合）
内径２２ｍｍのＶａｎｔａｇｅクロマトグラフカラムに、例１６からのＨＰＡ／ＭＢＡｍ変性ナイロン繊維（１００ｍＬの脱イオン水中１．５２ｇの繊維）のスラリーを装入した。真空を用いて過分の液体をカラムを通して引いて人絹繊維の圧縮を容易にした。スラリーをカラムに移したのち、カラムに上部ヘッダを取り付けて最終の容積が４．５４ｍＬ（ベッド深さ１．２ｃｍ）になるようにヘッダを圧縮した。磁気攪拌棒、還流コンデンサ、温度調整器及び加熱マントルを有する２５０ｍＬの３口フラスコに、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルフォン酸ナトリウム塩溶液（ＡｍＰＳ−Ｎａ、５０％水溶液、２３．０ｇ、１００ｍｍｏｌ）と水（５３．５ｍＬ）を加えた。この単量体溶液をアルゴンで１０分間撹散した。１ＭのＨＮＯ3（０．６２ｍＬ、０．２５０ｍｍｏｌ）中０．４Ｍの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）溶液と１ＭのＨＮＯ3溶液（２．５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、それを３５℃に加熱した。この単量体溶液をVantageカラムに３．５ｍＬ／分の流量で１２時間ポンプ送りした。この単量体溶液の粘度は反応中増大することが分かった。これはカラムを流れる単量体溶液の流量をほぼ３時間後に実質的に減少する結果となった。
室温に冷却後、Ｖａｎｔａｇｅカラムから繊維固形分を取り出し、０．５Ｍの硫酸中０．２Ｍのアスコルビン酸溶液（３×１５０ｍＬ）、脱イオン水（３×１５０ｍＬ）、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（３×１５０ｍＬ）、脱イオン水（３×１５０ＭＬ）及びメタノール（１×１５０ｍＬ）で洗浄した。この材料をオーブンに入れ、４０℃で１２時間乾燥した。
１．５２ｇの白色繊維固形物を得た。
【０１１７】
静的結合容量の測定
ＩｇＧに対する静的結合容量の測定結果を下の表２２に示す。貫流グラフト重合法により製造されたＳＰ官能化触手繊維媒体は、市販のバイオ分子クロマトブラフ用ビーズベース陽イオン交換媒体と同等の静的ＩｇＧ結合容量を示した。ＨＰＡ／ＭＢＡｍ変性繊維前駆体（例１６）はごくわずかなＩｇＧに対する静的結合容量しか示さなかった。
【０１１８】
【表２２】
2018059952.tif 000025
【０１１９】
注１：０．３３ｇ／ｍＬの繊維充填密度に基づく。
表２２：静的結合容量測定。チャレンジ：５０ｍＭの酢酸塩溶液(ｐＨ５)中２ｇ／ＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（SeraCare Life Sciences, Milford, MA）
【０１２０】
動的結合容量の測定
例１９のＳＰ官能化繊維媒体に対するＩｇＧ動的結合容量の測定結果は下の表２３に示す。０．６４ｇの媒体を内径１１ｍｍのＶａｎｔａｇｅカラムに装入し、ベッド深さ２．０ｃｍの深さまで圧縮した（１．９０ｍＬのカラム容積、０．３２ｇ／ｍＬの繊維充填密度）。動的結合容量の測定を線速度２００ｃｍ／ｈｒで行った。この速度は滞留時間３６秒に相当する。例１９の繊維媒体のＩｇＧ動的結合容量は４０ｍｇ／ｍＬであった。
【０１２１】
【表２３】
2018059952.tif 000026
【０１２２】
表２３：  種々の線速度（ＲＴは滞留時間、ｎｄはデータなし）における１、５、１０及び５０％破過における、ＳＰ触手官能化Ａｌｌａｓｓｏ翼付繊維陽イオン交換媒体に対するＩｇＧ動的結合容量の測定ＤＢＣ（動的結合容量）値。チャレンジ：５０ｍＭの酢酸塩溶液（ｐＨ５）中２．０ｇ／ＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（SeraCare Life Sciences, Milford, MA）
【０１２３】
例２０（未変性ナイロン繊維のグラフト共重合）
４個の２５０ｍＬボトルに、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロライド溶液（ＡＰＴＡＣ、７５ｗｔ％水溶液）、水、翼付きナイロン繊維(Allasso Industries製)、及び１ＭのＨＮＯ3（量は表２４参照）を装入した。１ＭのＨＮＯ3中０．４Ｍの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ）溶液を各ボトルに加えた。反応ボトルに蓋をし、この混合物を３５℃で３時間加熱した。
室温まで冷却し、各ボトルからの繊維固形物をアセトン（３×１００ｍＬ）で洗浄した。この濡れた材料をオーブンに入れて４０℃で１２時間乾燥した。
白色繊維固形物の試料が得られた（表２４の回収及び重量付加データ参照）。
【０１２４】
【表２４】
2018059952.tif 000027
【０１２５】
表２４：セリウムレドックスグラフト重合組成物と回収データ
【０１２６】
例２１（エポキシ官能化繊維のポリ（アリルアミン）変性）
３０ｍＬのボトルに、上記例２０−２のＧＭＡ／ＡＰＴＡＣグラフト繊維（０．５ｇ）、水（１０ｍＬ）、４０％ポリ（アリルアミン）ヒドロクロリド溶液（１．２５ｇの４０ｗｔ％溶液）、及び１．０Ｍの水酸化ナトリウム（１０ｍＬ）を装入した。この反応混合物を３５℃で１８時間加熱した。
室温に冷却後、固形分を脱イオン水（３×５０ｍＬ）及びアセトン（１×５０ｍＬ）で洗浄した。
この濡れた材料をオーブンに入れ、４０℃で１２時間乾燥した。  
０．４８ｇの明るい黄色の繊維状固形物が得られた。
【０１２７】
例２２（スルホプロピル官能化繊維のポリ（アリルアミン）変性）
磁気撹拌棒を備えた５００ｍＬのビーカーに例２のスルホプロピル官能化繊維１．０ｇとポリアリルアミン水溶液（ＰＡＡ  ＭＷ＝１５ｋＤａ、２０％（ｗ／ｗ）、７５ｍＬ）を装入した。ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（７５０μＬ、Aldrich #475696）を加え、その混合物を室温で５分間ですばやく撹拌し、次いで２５０ｍＬの水で急冷した。混合物をメジウムガラスフリットフィルタでろ過し、次いで水洗した（３×２５０ｍＬ）。この繊維を４０℃で一夜乾燥した。（例２２）
【０１２８】
例２３（スルホプロピル官能化繊維のポリ（アリルアミン）変性）
磁気撹拌棒を備えた５００ｍＬのビーカーに例２のスルホプロピル官能化繊維１．０ｇとポリアリルアミン水溶液（ＰＡＡ  ＭＷ＝１５ｋＤａ、２０％（ｗ／ｗ）、７５ｍＬ）を装入した。ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（７５０μＬ、Aldrich #475696）を加え、その混合物を室温で１０分間すばやく撹拌し、次いで２５０ｍＬの水で急冷した。混合物をメジウムガラスフリットフィルタでろ過し、次いで水洗した（３×２５０ｍＬ）。この繊維を４０℃で一夜乾燥した。（例２３）
【０１２９】
例２４（スルホプロピル官能化繊維のポリ（アリルアミン）変性）
磁気撹拌棒を備えた５００ｍＬのビーカーに例２３のポリアリルアミン官能化繊維１．０ｇとポリアリルアミンの水溶液（ＰＡＡ  ＭＷ＝１５ｋＤａ、２０％（ｗ／ｗ）、７５ｍＬ）を装入した。ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（７５０μＬ、Aldrich #475696）を加え、その混合物を室温で１０分間すばやく撹拌し、次いで２５０ｍＬの水で急冷した。混合物をメジウムガラスフリットフィルタでろ過し、次いで水洗した（３×２５０ｍＬ）。この繊維を４０℃で一夜乾燥した。（例２４）
【０１３０】
静的結合容量の測定
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する静的結合容量の測定結果を下の表２５に示す。このポリ（アリルアミン）官能化繊維媒体は２０〜６０ｍｇ／ｍＬの範囲のＢＳＡ静的結合容量を与えた。この系列では、例２４からの組成はＢＳＡに対する最高の静的結合容量（ＳＢＣ）を与えたが、これは商用のバイオ分子クロマトグラフの応用に使用されているビーズに基づく陰イオン交換媒体と同等である。
【０１３１】
【表２５】
2018059952.tif 000028
【０１３２】
注１：０．３３ｇ／ｍＬの繊維充填密度
表２５：  静的結合容量の測定。チャレンジ：５０ｍＭのトリスバッファ（ｐＨ８）中２ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
【０１３３】
動的結合容量の測定
例２４のポリ（アリルアミン）官能化繊維媒体に対するＢＳＡ動的結合容量の測定結果を下の表２６に示す。１．０ｇの繊維媒体を内径１１ｍｍのＶａｎｔａｇｅカラムに充填し、ベッド深さ３．０ｃｍ（２．８５ｍＬのカラム容積、０．３５ｇ／ｍＬの繊維充填密度）まで圧縮した。動的結合容量の測定を線速度２００ｃｍ／ｈｒで実施した。この速度は５４秒の滞留時間に相当する。例２４の繊維媒体は、１０％破過において５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ動的結合容量を示した。
【０１３４】
【表２６】
2018059952.tif 000029
【０１３５】
表２６：２００ｃｍ／ｈｒ（ＲＴは滞留時間）での１、５、１０及び５０％破過における、ポリ（アリルアミン）官能化Ａｌｌａｓｓｏ翼付繊維の陰イオン交換媒体に対するＢＳＡ動的結合容量（ＤＢＣ）の測定。チャレンジ：２５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）中０．５ｇ／ＬのＢＳＡ
【０１３６】
例２５（ＨＰＡ／ＭＢＡｍ９５／５によるナイロン繊維表面の変性）
機械的攪拌器、還流コンデンサ及び温度制御器を備えた１０００ｍＬの３口丸底フラスコにヒドロキシプロピルアクリレート（ＨＰＡ、１３．７ｇ、９５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）（ＭＢＡｍ、０．７７ｇ、５ｍｍｏｌ）及び水（７１０ｍＬ）を装入した。この混合物に１６．８ｇのほぐれたナイロン繊維（Allaso Industries, #090602PA6C）を加えた。過硫酸アンモニウム（１．６０ｇ、７ｍｍｏｌ）を加えた。濡れた固形物を８０℃で４時間加熱した。
室温に冷却したのち、固形物をブッフナー漏斗に移し、熱水で洗浄し（３×５００ｍＬ）、ついでメタノール（１×５００ｍＬ）で洗浄した。この材料を真空中で３０分乾燥した。ついでオーブンに移し、４０℃で１２時間乾燥した。
１７．３ｇの白色繊維を得た。
【０１３７】
例２６（ＨＰＡ／ＭＢＡｍで変性され、ペンダントスルホプロピル陽イオン交換官能性を有する高表面積繊維のセリウムイオンレドックスによるグラフト重合）
ＨＰＡ／ＭＢＡｍ変性ナイロン繊維のグラフト重合
機械的攪拌器、還流コンデンサ及び温度制御器を備えた２００ｍＬの３口丸底フラスコに、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩（ＡＭＰＳ−Ｎａ、２３．１ｇ、１００ｍｍｏｌ）と水（７６．３ｍＬ）を装入した。この溶液に２．５０ｇのＨＰＡ／ＭＢＡｍ変性ナイロン繊維（例２５）を加えた。この反応混合物を真空中で掃気し、窒素ガスの３サイクル裏込め（充填）を行った。
１ＭのＨＮＯ3（０．６２０ｍＬ、０．２５０ｍｍｏｌ）中０．４Ｍの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）溶液、及び１ＭのＨＮＯ3溶液（２．４６ｍＬ、２．４６ｍｍｏｌ）をこの反応混合物に加えた。
この反応混合物を３５℃で１８時間加熱した。
室温まで冷却した後、固形物を、０．５Ｍの硫酸中０．２Ｍのアスコルビン酸溶液（３×１５０ｍＬ）、脱イオン水（３×１５０ｍＬ）、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（３×１５０ｍＬ）、脱イオン水（３×１５０ｍＬ）、及びアセトン（３×１５０ｍＬ）で洗浄した。この材料をオーブンに入れて４０℃で１２時間乾燥した。
２．５２ｇの白色繊維質固形物を得た。
【０１３８】
媒体の機能性能
例２６からのスルホプロピル官能化高表面積繊維を、陽イオン交換クロマトグラフ媒体で、ポリクローナルヒトガンマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）の精製に対して評価した。
【０１３９】
ＩｇＧに対する静的結合容量の測定結果を表２７に示す。この研究では、Ａｌｌａｓｓｏ（ロットＩＤ“３ｋｇバッチ−製造ロットＩＤなし”）からの未官能化「翼付き繊維」の試料の静的結合容量を、例２６のセリウムイオンレドックス重合法により製造されたスルホプロピル触手官能化繊維の試料、及び例２の熱開始グラフト重合法の試料と比較した。セリウムイオンレドックス重合法は、熱開始重合体グラフト法（５０ｍｇＩｇＧ／ｇ繊維試料）及び未官能化繊維のみ（１０ｍｇＩｇＧ／ｇ繊維試料）と比較して、相当に高い静的結合容量（１５０ｍｇＩｇＧ／ｇ繊維試料）を有するスルホプロピル（ＳＰ）触手官能化繊維媒体を提供することが分かった。ＳＰ触手官能化繊維媒体は商用のバイオ分子クロマトグラフィーの用途で使用されるビーズベースの樹脂媒体に比肩できるＩｇＧ静的結合容量を示す。
【０１４０】
【表２７】
2018059952.tif 000030
【０１４１】
表２７：  静的結合容量測定。チャレンジ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中２ｇ／ＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（SeraCare  LifeSciences,  Milford,  MA）  
【０１４２】
ＨＥＴＰ（理論段高さ）値は、例２６からの１．００ｇのＳＰ−触手変性ナイロン繊維を内径１１ｍｍのＶａｎｔａｇｅカラムに充填し、繊維ベッドを深さ３．０ｃｍに圧縮したもの（カラム容積２．８５ｍＬ）にアセトン注入法を用いて測定した。ＨＥＴＰの許容値（０．０８ｃｍ）とピーク非対称性（１．８〜２．０）が見出された。これ等の結果に基づき、０．３５ｇ／ｍＬのＳＰ−触手変性繊維充填密度がクロマトグラフの評価において十分な一様流れ性能を与えると考えられる。
同じカラムを使用して次の手順によりＩｇＧ動的結合容量の測定も行った。
５ＣＶ（カラム容積）  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）（平衡化）
６０ＣＶ  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）中１．７ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（SeraCare）（ＩｇＧ  チャレンジ）
３０ＣＶ  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５）（洗浄）
１５ＣＶ  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液中１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５）（溶離）
１０ＣＶ  ０．５ＭのＮａＯＨ（洗浄）
１０ＣＶ  ５０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）（洗浄）
【０１４３】
図１０は特定の実施形態に従ったＳＰ−触手変性繊維に対する代表的なＩｇＧ破過曲線の例を示す。鋭い破過曲線と１０％ＩｇＧ破過で４０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ動的結合容量がある（表２８）。
【０１４４】
【表２８】
2018059952.tif 000031
【０１４５】
表２８：種々の線速度での１、５、１０、及び５０％破過（ＲＴ＝滞留時間）におけるＳＰ−触手変性繊維Ａｌｌａｓｓｏ翼付き繊維陽イオン交換媒体に対するＩｇＧ動的結合容量  
【０１４６】
図１１は２００〜１２００ｃｍ／ｈｒの種々の線速度でのＳＰ−触手繊維カラムに対する重畳したＩｇＧ破過曲線を示す。線速度が大きくなるにつれてＩｇＧ破過曲線の傾斜がわずかに減じる。本書に記載された実施形態に従った繊維媒体に対するＩｇＧ動的結合容量に対する速度の効果は、ビーズに基づく装置で典型的に観測される速度の効果よりははるかに小さい。図１２において、最高速度（１２００ｃｍ／ｈｒ、９秒の滞留時間）で測定されたＩｇＧ動的結合容量のわずかな減少が見られる。この挙動は、このシステムがＩｇＧ分子のイオン性リガンド結合サイトへの対流による輸送に大きく支配されることを示している。
【０１４７】
これに対して、従来のビーズに基づくイオン交換クロマトグラフィー樹脂は、速度の増加につれて動的結合容量がかなり減少し且つより大きい拡散破過曲線を示すであろう。非常な高速度ではベッドの圧縮がビーズの完全性を損ない、流れの一様性を損なってクロマトグラフ性能を減じる。
【０１４８】
例２７
貫流ホスト細胞タンパク質クリアランス
例２６に従って製造したスルホプロピル官能化繊維媒体を貫流精製（ポリッシュ）モードでのＨＣＰ除去活性に対して評価した。０．３ｇのスルホプロピル官能化繊維媒体を内径１４．５ｍｍのカラムに装入し、ベッド深さ０．６ｃｍ（１．００ｍＬの容積、０．３０ｇ／ｍＬの繊維充填密度）まで圧縮した。このカラムを単独に、及び商用の膜式吸着器（ChromaSorb（商標），Millipore Corp，膜体積０．２ｍＬ）と組み合わせて試験した。
【０１４９】
モノクローナル抗体を含んでいる細胞培地を清澄化し、次いでタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーを用いて分離し、溶液をｐＨ５に調節した。次いでタンパク質Ａの溶離ｐＨをＴＲＩＳでｐＨ７に調節し、次いで０．２μの膜を通過させて濾過した。
【０１５０】
このカラムとＣｈｒｏｍａｓｏｒｂ（商標）膜装置を緩衝溶液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７）で平衡化した。
このスルホプロピル官能化繊維媒体及びＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜式吸着器（Millipore Corpの商品名）を表２９に記載したように独立に評価し、また直列で評価した。７．３ｇ／Ｌのモノクローナル抗体たんぱく質Ａ（プロテインＡ）の７２ｍＬの溶離物（ｐＨ７）を０．２５ｍＬ／分で同装置に流通させた。６つの１２ｍＬ分画を捕集した。８つの貫流分画と１つの保留試料をＨＣＰ−ＥＬＩＳＡとタンパク質Ａ  ＨＰＬＣにより分析して、ＨＣＰクリアランス及びモノクローナル抗体回収レベルをそれぞれ決定した。
【０１５１】
ＳＰ繊維（０．３８ＬＲＶ）はＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商品名）膜吸着器（１．４２ＬＲＶ）ほどにはＨＣＰを除去しなかったが、ｐＨ７での２個の貫流型吸着器の直列接続配置はＨＣＰクリアランス（２．１３ＬＲＶ）で独立したいずれかの吸着器よりも有効であった。これらの吸着媒体はこの用途に限定されない容量なので、これら２個の吸着器は別個の明確に異なるＨＣＰの個体群を除去するであろうことを示唆している。ＨＣＰがより正の有効電荷を有する場合には、ＳＰ繊維はより低いｐＨでより多くのＨＣＰを除去するのではないかと思われるが、しかし、ＳＰ繊維に対するモノクローナル抗体の親和性も増大して製品回収率を減じるであろう。
【０１５２】
【表２９】
2018059952.tif 000032
【０１５３】
注１：貫流画分容積の総和
表２９：モノクローナル抗体の貫流精製。３つの貫流洗練列の評価。ＳＰ−繊維（例２６）（頂部）、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商品名）（中段）、ＳＰ繊維（例２６）／ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商品名）直列（底部）。５個の貫流と１つのプールした画分に対するモノクローナル抗体回収（タンパク質Ａ  ＨＰＬＣ）及びＨＣＰクリアランス（ＨＣＰ−ＥＬＩＳＡ）。
チャレンジ：０．２５ｍＬ／分の流量での７．３ｇ／Ｌのモノクローナル抗体タンパク質Ａ溶離液（ｐＨ７）。
【０１５４】
例２８
還流ホスト細胞タンパク質クリアランス
例１４で作製したＱ−官能化繊維媒体（例１４Ｃ）を貫流精製モードでＨＣＰ除去活性に対する評価を行った。０．３４ｇのＱ−官能化繊維媒体を１４．５ｍｍの内径を有するカラムに充填し、ベッド深さ０．６ｃｍ（１．００ｍＬのカラム容積、０．３４ｇ／ｍＬの繊維充填密度）に圧縮した。
モノクローナル抗体を含んだ細胞培養媒体を清澄し、次いでタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーを用いて単離し、ｐＨを５に調整した。引き続いてタンパク質Ａの溶離をＴＲＩＺＭＡ塩基でｐＨ８に調整し、次いで０．２μのろ過膜でろ過した。
【０１５５】
Ｑ−官能化繊維媒体のカラムを緩衝溶液（２５ｍＭのｐＨ８のＴｒｉｓ）で平衡化した。
Ｑ−官能化繊維媒体の評価からのデータを表３０に示した。８．２ｇ／Ｌのモノクローナル抗体タンパク質Ａ溶離物（ｐＨ８）１００ｍＬを流量１．０ｍＬ／分でカラム装置に通した。１０個の１０ｍＬ画分を集めた。溶離緩衝液として２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）中１Ｍの塩化ナトリウム溶液で、結合ＨＣＰを溶離した。２個の１０ｍＬ溶離画分も集めた。これら１０個の貫流画分と２個の溶離画分をＨＣＰ−ＥＬＩＳＡとタンパク質Ａ  ＨＰＬＣで分析して、ＨＣＰクリアランスのレベルとモノクローナル抗体回収をそれぞれ決定した。
【０１５６】
Ｑ−官能化繊維は貫流モードでのＨＣＰクリアランスで有効であった。０．３のＨＣＰ（ホスト細胞タンパク質）のＬＲＶ（除去活対数減少値）が高いｍＡｂ（モノクローナル抗体）回収率（９８％）で達成された。ここに開示した実施形態のＱ官能化繊維媒体は、モノクローナル抗体の製造のための貫流ポリッシュ（精製）においてビーズベースの樹脂媒体及び膜吸着媒体の装置に代わる便利で低コストの代替物として使用できる。Ｑ−官能化繊維媒体（例１４Ｃにより製造したＱ−官能化繊維媒体に対して７００ｍＤａ）の高い透過性は膜吸着器を用いて達成できない流量でｍＡｂ供給流の高速処理を可能にしうる。
【０１５７】
【表３０】
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【０１５８】
注１：貫流及び溶離画分容積の会合
表３０：モノクローナル抗体供給物の貫流精製。充填ベッド形式のＱ−官能化繊維媒体を用いる貫流ポリッシュ法による流れの評価（１．０ｍＬカラム容量、０．３４ｇ／ｍＬ充填密度）。５つの貫流画分及び２つの溶離画分に対するモノクローナル抗体の回収（タンパク質Ａ  ＨＰＬＣ）及びＨＣＰクリアランス（ＨＣＰ−ＥＬＩＳＡ）。集めた画分データは算出値である。チャレンジ：流量１．０ｍＬ／分で８．２ｇ／Ｌのモノクローナル抗体タンパク質Ａ溶出液（ｐＨ８）（滞留時間６０秒）。
【０１５９】
例２９（貫流モノクローナル抗体の会合クリアランス）
例２６で製造したスルホプロピル繊維媒体によるモノクローナル抗体の総合除去活性を貫流ポリッシュモードで評価した。１．０ｇのスルホプロピル官能化繊維媒体を内径１１ｍｍのＶａｎｔａｇｅカラムに充填し、ベッド深さ３．０ｃｍに圧縮した（カラム容積２．８５ｍＬ、繊維充填密度０．３５ｇ／ｍＬ）。
２０ｇ／Ｌのモノクローナル抗体を含有するタンパク質Ａ溶離プールを、５０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ５）中０．５ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ５）で希釈し、ｐＨ５と導電率１９ｍＳ／ｃｍの６．９ｇ／Ｌの溶液を得た。導電率１９ｍＳ／ｃｍは単量体モノクローナル抗体の結合を弱め、タンパク質Ａの供給溶液中の総合したモノクローナル抗体の結合を有利にするために選択した。
スルホプロピル官能化繊維媒体のカラムは緩衝液（ｐＨ５の５０ｍＭの酢酸塩）で平衡化した。
【０１６０】
スルホプロピル官能化繊維媒体の評価データは表３１と図９に示す。６．９ｇ／Ｌ  のモノクローナル抗体タンパク質Ａ溶出液（ｐＨ５、１９ｍＳ／ｃｍ）２８５ｍＬを３．２ｍＬ／分（２００ｃｍ／ｈｒ）の流量でカラムに通過させた。３３個の８．６ｍＬ（３カラム容積）画分を捕集した。結合した単量体及び会合モノクローナル抗体を、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ５）中０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液を溶離緩衝液（バッファ）として使用して溶離した。５個の８．６ｍＬ（３カラム容積）の溶離画分を捕集した。これ等３３個の貫流画分と５個の溶離画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）とタンパク質Ａ  ＨＰＬＣで分析して会合クリアランスとモノクローナル抗体タンパク質の回収のレベルをそれぞれ決定した。
【０１６１】
スルホプロピル官能化繊維は、貫流モード動作で、単量体モノクローナル抗体種の存在下に、会合したモノクローナル抗体に結合する能力を示した。タンパク質ＡのＨＰＬＣデータからは、９２％という高いｍＡｂ回収率を見出した。ＳＥＣデータの分析によると貫流画分２に単量体ｍＡｂの完全な破過が見られ、一方、会合ｍＡｂは貫流画分５まで初期供給濃度０．６％（１００％破過）に適合しなかった。溶離画分３５、３６及び３７のＳＥＣ分析は、ｍＡｂ集団の会合した高分子量（ＨＭＷ）の種に富み、単量体ｍＡｂが枯渇していることを示した。本書に示した実施形態によるスルホプロピル官能化繊維媒体は本実施例に記載した方法に従って会合クリアランスの手段として役立つ。スルホプロピル官能化繊維媒体の高度な透過性（例２６により調製したスルホプロピル官能化繊維媒体に対し５２０ｍＤａ）は、模擬した動的ベッド動作に適する高い流量で高速かつ迅速サイクルのｍＡｂ供給流れを可能にする。
【０１６２】
【表３１】
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【０１６３】
注１：貫流及び溶離画分体積の総計
表３１：  モノクローナル抗体の貫流総合クリアランス。スルホプロピル官能化繊維媒体の充填ベッド形式（２．８５ｍＬのカラム容積、０．３５ｇ／ｍＬの充填密度）での貫流総合クリアランス法の評価。３１個の貫流、３個の溶離画分に対するモノクローナル抗体回収（タンパク質Ａ  ＨＰＬＣ）と％単量体、％ＨＭＷ会合（ＳＥＣ）。プールした画分のデータは計算値。チャレンジ：３．２ｍＬ／分（滞留時間５４秒）での６．９ｇ／Ｌのモノクローナル抗体タンパク質Ａの溶離（ｐＨ５、１９ｍＳ）
【０１６４】
例３２（圧縮性ベッドへの直接捕捉）
例１９のスルホプロピル官能化繊維媒体を、貫流モード動作で、未清澄化細胞培養液からの直接的なモノクローナル抗体の捕捉に対して評価した。０．４９ｇのスルホプロピル官能化繊維媒体を内径１４．５ｍｍのカラムに充填し、ベッド深さ３．０ｃｍ（５．０ｍＬのカラム容積、０．１０ｇ／ｍＬの繊維充填密度）に圧縮した。スルホプロピル官能化繊維媒体のカラムを緩衝液（５０ｍＭの酢酸塩緩衝液ｐＨ５）で平衡化した。０．８ｇ／Ｌのモノクローナル抗体を含む未清澄化チャイニーズハムスター卵細胞の培養液（ｐＨ６．５、５．７ｍＳ／ｃｍ）を用意した。
【０１６５】
０．８ｇ／Ｌのモノクローナル抗体を含む１００ｍＬの未清澄化の細胞培養液を流量１２．５ｍＬ／分（４６０ｃｍ／ｈｒ）でカラムに通した。９個の１０ｍＬ（２カラム容積）の貫流画分を収集した。低密度繊維ベッドを５０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ５）で、繊維ベッドを繰り返して圧縮及び膨張することにより洗浄した。この圧縮及び膨張はカラムの流れ分配ヘッダーを調整することにより行った。１３個の１０ｍＬ（２カラム容積）の５０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５）洗浄画分を捕集した。結合したモノクローナル抗体を溶離緩衝液として５０ｍＭの酢酸塩溶液中（ｐＨ５）１．０Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いて溶離した。溶離工程は、モノクローナル抗体溶離物をさらに濃縮するために、圧縮ベッド方式（ベッド深さ１．０ｃｍ、１．６５ｍＬのカラム容積、０．３０ｇ／ｍＬの繊維充填密度）で実施することが好ましい。３個の１０ｍＬ（２カラム容積）溶離画分を捕集した。９個の貫流画分、１３個の洗浄画分、及び３個の溶離画分をタンパク質Ａ  ＨＰＬＣで分析して、モノクローナル抗体回収を測定した。スルホプロピル官能化繊維媒体の評価データを表３２に示す。
【０１６６】
これらスルホプロピル官能化繊維は未清澄化チャイニーズハムスター卵細胞の培養培地の存在下に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）へ結合する能力を有することを示した。タンパク質Ａ  ＨＰＬＣのデータは、画分７によるｍＡｂ捕捉動作中にｍＡｂの完全な破過が起きることを示している。５０ｍＭ酢酸塩溶液（ｐＨ５）での洗浄段階は、洗浄画分６により未結合のｍＡｂをカラムと装置から除去する。５０ｍＭの酢酸塩溶液（ｐＨ５）中１．０Ｍの塩化ナトリウムによる溶離は、結合したｍＡｂをスルホプロピル官能化繊維媒体カラムから溶離する。当業者は種々のプロセスの変形によりモノクローナルＩｇＧ結合容量の十分な利得が実現できることを認識するであろう。それらには、細胞培養供給物導通性の減少、未清澄脂肪培養供給物の希釈、或いは本例のスルホプロピルに基づく陽イオン交換性リガンドの官能性に代わるタンパク質Ａ親和リガンド構造の使用等が含まれる。当業者には例１８のタンパク質Ａ官能化繊維媒体又はその誘導体がこの直接捕捉に好ましいことが理解されよう。低充填密度の形式では、表面官能化繊維媒体は、未清澄化の供給流から直接のＩｇＧ捕捉が可能である。引き続くベッド圧縮は圧縮ベッド形式でのｍＡｂ溶離の濃縮を可能にする。この方法は、モノクローナル抗体のような治療用のバイオ薬剤の下流側の工程で、第１清澄化（遠心）工程及び第２清澄化（深濾過）工程を省略することができるであろう。
【０１６７】
【表３２】
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【０１６８】
注１：貫流、洗浄、及び溶離画分体積の総計
表３２：未清澄化細胞培地からのモノクローナル抗体の直接捕捉。直接ｍＡｂ捕捉法の評価は、スルホプロピル官能化繊維媒体を充填したベッドの形式で行う（容積：５．００ｍＬカラム容積。充填密度：０．１０ｇ／ｍＬ）。モノクローナル抗体濃度及び回収（タンパク質Ａ  ＨＰＬＣ）４個の貫流、４個の洗出し、及び３個の塩化ナトリウム溶出画分。チャレンジ：０．８７ｇ／Ｌのモノクローナル抗体を含む１００ｍＬの未清澄チャイニーズハムスター卵細胞液（ｐＨ６．５、５．７ｍＳ）で流量１２．５ｍＬ／分（滞留時間：２４秒）
【０１６９】
例３３（ウイルスの結合／溶離精製のための繊維媒体の可能性）
バクテリオファージφ６に対する静的結合容量と溶離回収測定の結果が表３１に挙げてある。５個のプラスチック遠心管に例１４ＣのＱ−官能化触手繊維媒体と未官能化Ａｌｌａｓｓｏ繊維試料を下表３３に記載した量で装入した。各繊維試料と対照の管を５ｍＬの２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８、０．１８ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ）で１０分間撹拌しながら平衡化した。これ等の管を室温で最高４０００ｒｐｍの卓上型遠心分離器で１０分間回転して繊維媒体をペレット化した。２．５ｍＬの上澄みを取り除き、２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８、０．１８ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ）中１．７×１０7ｐｆｕ／ｍＬのφ６溶液２．５ｍＬを各管に加えた。これらの試料を室温で１時間撹拌した。その後、管を卓上遠心分離器で室温で４０００ｒｐｍで１５分間回転し繊維媒体をペレット化した。２．５ｍＬの上澄みを除去し、これ等の試料をプラーク形成分析法により未結合φ６に対する分析を行った。管を２．５ｍＬの２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８、０．１８ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ）で遠心下で３回洗浄し、繊維媒体を各洗浄と２．５ｍＬの上澄み除去の間にペレット化した。洗浄後に２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８，０．１８ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ）中１．０Ｍの塩化ナトリウムの溶液２．５ｍＬを各管に加えた（５ｍＬの全容積、最終ＮａＣｌ濃度０．５Ｍ）。これらの試料を室温で１０分間撹拌した。その後、管を卓上遠心分離器中、室温で１０分間４０００ｒｐｍで回転し、繊維媒体をペレット化した。２．５ｍＬの上澄みを除去し、これ等の溶離試料のプラーク形成分析法により溶離φ６を分析した。試料１４ＣのＱ−官能化触手繊維媒体は有意なバクテリオファージφ６の対数減少値（ＬＲＶ）３．１を示し、溶離回収率が４０％を示した。この性能は商業的なウイルスクロマトグラフで使用されている膜ベースの陰イオン交換媒体と同等である。本発明のＱ−官能化繊維媒体は予め充填される装置形式又は貫流ウイルスクリアランス又は結合／溶離ウイルス精製のためのクロマトグラフィーカラムに一体に組込むことができる。
【０１７０】
【表３３】
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【０１７１】
表３３：静的結合容量測定。
チャレンジ：０．１８ｍｇ／ｍＬのＨＳＡでの２５ｍＭトリス（ｐＨ８）中２．５ｍＬの１．７×１０7ｐｆｕ／ｍＬバクテリオファージφ６。
溶出緩衝液：０．１８ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを有する２５ｍＭトリス（ｐＨ８）中０．５ＭのＮａＣｌ。
【図１ａ】
2018059952.tif 000037
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
2018059952.tif 000041
【図１ｆ】
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【図２】
2018059952.tif 000043
【図３】
2018059952.tif 000044
【図４】
2018059952.tif 000045
【図５】
2018059952.tif 000046
【図６】
2018059952.tif 000047
【図７】
2018059952.tif 000048
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月15日(2018.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
負に帯電したウイルスを精製する方法であって、前記方法は、以下のステップを含む、該方法：
負に帯電したウイルスを含むサンプルを提供するステップ；
前記負に帯電したウイルスを含むサンプルを、カットナイロン人絹繊維媒体の軸方向に圧縮したベッドと接触させるステップ、ここで、前記カット繊維は、実質的な長軸部を形成する本体領域を含む断面積を有し、前記本体領域から外方へ延びた複数の突起を有し、前記繊維上にはポリマー官能性が付与されており、前記ポリマー官能性の表面がペンダントトリメチルアンモニウム基で改変されている；
前記繊維を洗浄して、未結合の成分を除去するステップ；
前記負に帯電したウイルスを溶出させ、これにより前記負に帯電したウイルスを精製するステップ。
【請求項２】
負に帯電したウイルスをサンプルから除去する方法であって、前記方法は、以下のステップを含む、該方法：
負に帯電したウイルスを含むサンプルを提供するステップ；
前記負に帯電したウイルスを含むサンプルを、カットナイロン人絹繊維媒体の軸方向に圧縮したベッドと接触させるステップ、ここで、前記カット繊維は、実質的な長軸部を形成する本体領域を含む断面積を有し、前記本体領域から外方へ延びた複数の突起を有し、前記繊維上にはポリマー官能性が付与されており、前記ポリマー官能性の表面がペンダントトリメチルアンモニウム基で改変されており、これにより前記負に帯電したウイルスを前記繊維に結合させる；
前記繊維を洗浄して、未結合の成分を除去するステップ；
前記負に帯電したウイルスを溶出させるステップ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
ある実施形態によると、速い処理速度を可能にする吸着分離材料が提供される。なぜなら、溶質を繊維表面へまたは繊維表面からの質量輸送が、媒体を通る流体の対流により大きく制御されるからである。これは、拡散型の輸送が長い接触時間を要求しそれ故遅い処理速度であるビーズ型媒体に対して対照的である。ビーズ細孔の殺菌処理が制限される理由から従来のビーズ型の媒体を使用して能率的に分離できなかったウイルスのような大きい生物学的な種を捕捉または除去する能力が、本発明では提供される。
一側面において本願発明は以下の発明を包含する。
（発明１）
実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む領域を含む横断面を有する大表面積繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、クロマトグラフィー媒体。
（発明２）
前記官能性は陽イオン交換官能性である。発明１に記載の媒体。
（発明３）
前記官能性は陰イオン交換官能性である発明１に記載の媒体。
（発明４）
前記官能性はアクリル重合体の官能性である発明１に記載の媒体。
（発明５）
前記繊維の表面はペンダントスルホプロピル基で変性されたものである発明１に記載の媒体。
（発明６）
前記繊維の表面はペンダントトリメチルアンモニウム基で変性されたものである発明１に記載の媒体。
（発明７）
前記官能性は前記繊維にグラフトされた基によるものである発明１に記載の媒体。
（発明８）
前記繊維はほぼ１５ｍ2／ｇの表面積を有する発明１に記載の媒体。
（発明９）
実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する大表面積繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、大表面積繊維の不織布ベッド。
（発明１０）
実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、ほぐれた又は融着したカット繊維からなる充填ベッドを収容したハウジング。
（発明１１）
実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、繊維媒体のベッドに、バイオ分子を含む試料を接触させることよりなる、バイオ分子を含む試料の精製方法。
（発明１２）
前記官能性は貫流形式で精製を可能にする発明１１に記載の精製方法。
（発明１３）
前記官能性は結合／溶離形式の精製を可能にする発明１１に記載の方法。
（発明１４）
前記イオン交換官能性は陽イオン交換官能性であり、前記精製はｐＨ５〜８で実施される発明１１に記載の方法。
（発明１５）
タンパク質混合物を用意し、
長軸部を形成する本体領域と該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する繊維媒体の低密度ベッドであって、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている繊維媒体のベッドに、前記タンパク質混合物を接触させ、
前記繊維媒体を洗浄して未結合の成分を除去し、
前記繊維媒体を圧縮し、ついで
前記圧縮された繊維媒体を洗浄して結合タンパク質を抽出する、
タンパク質の精製方法。
【外国語明細書】
2018059952000001.pdf