(57)【要約】      （修正有）【課題】嗅覚受容体複合体を用いて、特に人の汗の成分であるオクテノールを被検気体から高感度に検出する。【解決手段】気体状の被検試料に含まれる標的物質１２を検出するための検出装置であって、被検試料と直接接触するハイドロゲルが配置された第１の領域１０と、脂質二重膜２０と、脂質二重膜２０を介して第１の領域１０と隣接している第２の領域１１であって、脂質二重膜形成性の脂質溶液１４／水系媒体１６が配置された、第２の領域１１と、第１の領域１０と第２の領域１１との間に電圧を印加し、かつ、これらの領域間に流れる電流を測定し、標準物質１２を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
気体状の被検試料に含まれる標的物質を検出するための検出装置であって、
被検試料と直接接触するハイドロゲルが配置された第１の領域と、
脂質二重膜と、
前記脂質二重膜を介して前記第１の領域と隣接している第２の領域であって、脂質二重膜形成性の脂質溶液／水系媒体が配置された、第２の領域と、
前記第１の領域と前記第２の領域との間に電圧を印加し、かつ、これらの領域間に流れる電流を測定する測定手段と
を具備し、
前記脂質二重膜が、前記脂質二重膜を貫通する開閉できる透孔を有し、
前記電流は前記透孔を介して流れ、該電流の流れ方が、前記被検試料中に前記標的物質が含まれる場合と含まれない場合とで異なり、
前記透孔が前記脂質二重膜に保持された嗅覚受容体複合体のイオンチャンネルであり、前記嗅覚受容体複合体が標的物質を認識可能な、昆虫の嗅覚受容体と前記昆虫と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体である、検出装置。
【請求項２】
前記標的物質がオクテノールである、請求項１に記載の検出装置。
【請求項３】
前記ハイドロゲルがアガロースである、請求項１又は２に記載の検出装置。
【請求項４】
前記脂質溶液が、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥの重量比が３：１の組成を有する脂質溶液である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出装置。
【請求項５】
前記嗅覚受容体複合体が標的物質を認識可能な、蚊科昆虫の嗅覚受容体と、前記昆虫と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出装置。
【請求項６】
前記嗅覚受容体複合体がネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）の嗅覚受容体ＯＲ８と、ネッタイシマカの嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出装置。
【請求項７】
前記検出装置が、ダブルウェルチャンバーを備え、前記第１の領域及び前記第２の領域がそれぞれ前記ダブルウェルチャンバーの各ウェルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項８】
気体状の被検試料中に含まれる標的物質を検出するための検出方法であって、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の検出装置を用意する工程と、
前記被検試料を前記検出装置に曝露し、前記検出装置の前記第１の領域と前記第２の領域との間に電圧を印加し、これらの領域間に流れる電流を測定する工程と、
測定された電流の値に基づき、前記被検試料中に前記標的物質が含まれるか否かを判断する工程と
を含む、検出方法。
【請求項９】
前記標的物質がオクテノールである、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の検出装置を製造する方法であって、
前記第１の領域と前記第２の領域と前記測定手段とを備えるデバイスを用意する工程と、
前記脂質溶液、前記嗅覚受容体複合体が組み込まれたプロテオリポソームを含む前記水系媒体、及び、前記ハイドロゲルを用意する工程と、
前記ハイドロゲルを加熱溶融し、前記第１の領域に添加し、ゲル化させる工程と、
前記脂質溶液及び前記水系媒体を前記第２の領域に添加し、前記ハイドロゲルとの界面に前記脂質二重膜を形成させる工程と、
を含む、製造方法。
【請求項１１】
前記ハイドロゲルを用意する工程がさらに、前記脂質二重膜を形成させるため、前記第１の領域にも前記脂質溶液を添加することを含む、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記第１の領域に添加された前記脂質溶液を除くことをさらに含む、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記嗅覚受容体複合体が、前記嗅覚受容体及び前記嗅覚受容体共受容体を共発現させた細胞から精製された嗅覚受容体複合体である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嗅覚受容体複合体を用いた標的物質の検出装置及び検出方法並びに検出装置の製造方法に関し、具体的には、嗅覚受容体複合体が組み込まれた脂質二重膜を用いた、気体状の被検試料中の標的物質を検出するための装置及び方法並びに該検出装置の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、揮発性化学物質（匂い物質、匂い分子）を測定する様々な技術が知られている。このような技術は、癌診断等の診断・ヘルスケア分野、人探索、麻薬等の検出等の防災・セキュリティ分野、有害物質の検出等の環境分野等への応用が期待されている。
【０００３】
匂い物質の検出には犬や線虫等の生物を利用することがある。しかしながら、生物を利用する方法は高感度に匂い物質を検知できるものの、体調や個体によってバラツキがあるため安定性に欠け、また、集中力の持続時間に限界があるため長時間の利用が難しいといった側面もあった。
【０００４】
そのため、生物そのものではなく、生物が備える嗅覚機能が注目されている。特に昆虫の嗅覚機能は匂い物質の認識特異性が高いとされており、嗅覚センサ等への利用が模索されている。昆虫の嗅覚器には、匂い物質を認識する嗅覚受容体（ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＯＲ」という場合もある。）と嗅覚受容体共受容体（ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＯＲＣＯ」又は「共受容体」という場合もある。）とが形成した嗅覚受容体複合体が存在しており、匂い物質により活性化されると、上記複合体がイオンチャネル活性を示し、それにより匂い物質が検知される（非特許文献１）。
【０００５】
一方、嗅覚受容体複合体でないチャネルタンパク質を用いた標的物質を検出するための検出装置（センサ）に関しては、脂質二重膜中にチャンネルタンパク質を保持させると、脂質二重膜を介するイオンチャネルを形成したことが報告されており（非特許文献２）、この脂質二重膜中に保持されるチャネルタンパク質のイオンチャネルの開放及び閉塞を電気的に測定することにより、微量のコカイン等の麻薬を検出できる検出装置も報告されている（特許文献１）。しかしながら、このセンサは、液体中に含まれる標的物質であるコカインを高感度で検出できるものの、大気中に含まれる標的物質の高感度の検出は困難であった。
【０００６】
大気中の標的物質を検出するための試みとしては、アガロースゲル等のハイドロゲルを用いた検出装置が報告されている（非特許文献３）。この検出装置は、被検気体中のオメトエートの検出に成功しているが、嗅覚受容体複合体を利用しておらず、また匂い物質を検出するためのものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１０３０５５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｕ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｋａｕｐｐ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  １１（２０１０），ｐ１８８−２００
【非特許文献２】Ｒ．Ｋａｗａｎｏら，Ｓｍａｌｌ，ｖｏｌ  ６（２０１０），ｐ２１００−２１０４
【非特許文献３】Ａｉｋｏ  Ｎｏｂｕｋａｗａら，１９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２５−２９，  ２０１５，Ｇｙｅｏｎｇｊｕ  Ｋｏｒｅａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、嗅覚受容体複合体を用いて、特に人の汗の成分であるオクテノールを被検気体から高感度に検出できる、標的物質の検出装置及び検出方法、並びに該検出装置の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ハイドロゲルを用いた検出装置において、シマカ嗅覚受容体ＯＲ８とシマカ嗅覚受容体共受容体との複合体が組み込まれた脂質二重膜を用いた場合、オクテノールを被検気体から高感度に検出できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［１３］に関する。
［１］  気体状の被検試料に含まれる標的物質を検出するための検出装置であって、
被検試料と直接接触するハイドロゲルが配置された第１の領域と、
脂質二重膜と、
前記脂質二重膜を介して前記第１の領域と隣接している第２の領域であって、脂質二重膜形成性の脂質溶液／水系媒体が配置された、第２の領域と、
前記第１の領域と前記第２の領域との間に電圧を印加し、かつ、これらの領域間に流れる電流を測定する測定手段と
を具備し、
前記脂質二重膜が、前記脂質二重膜を貫通する開閉できる透孔を有し、
前記電流は前記透孔を介して流れ、該電流の流れ方が、前記被検試料中に前記標的物質が含まれる場合と含まれない場合とで異なり、
前記透孔が前記脂質二重膜に保持された嗅覚受容体複合体のイオンチャンネルであり、前記嗅覚受容体複合体が標的物質を認識可能な、昆虫の嗅覚受容体と前記昆虫と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体である、検出装置。
［２］  前記標的物質がオクテノールである、［１］に記載の検出装置。
［３］  前記ハイドロゲルがアガロースである、［１］又は［２］に記載の検出装置。
［４］  前記脂質溶液が、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥの重量比が３：１の組成を有する脂質溶液である、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出装置。
［５］  前記嗅覚受容体複合体が標的物質を認識可能な、蚊科昆虫の嗅覚受容体と、前記昆虫と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体である、［１］〜［４］のいずれかに記載の検出装置。
［６］  前記嗅覚受容体複合体がネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）の嗅覚受容体ＯＲ８と、ネッタイシマカの嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体である、［１］〜［５］のいずれかに記載の検出装置。
［７］  前記検出装置が、ダブルウェルチャンバーを備え、前記第１の領域及び前記第２の領域がそれぞれ前記ダブルウェルチャンバーの各ウェルである、［１］〜［６］のいずれかに記載の検出装置。
［８］  気体状の被検試料中に含まれる標的物質を検出するための検出方法であって、
［１］〜［７］のいずれかに記載の検出装置を用意する工程と、
前記被検試料を前記検出装置に曝露し、前記検出装置の前記第１の領域と前記第２の領域との間に電圧を印加し、これらの領域間に流れる電流を測定する工程と、
測定された電流の値に基づき、前記被検試料中に前記標的物質が含まれるか否かを判断する工程と
を含む、検出方法。
［９］  前記標的物質がオクテノールである、［８］に記載の検出方法。
［１０］  ［１］〜［７］のいずれかに記載の検出装置を製造する方法であって、
前記第１の領域と前記第２の領域と前記測定手段とを備えるデバイスを用意する工程と、
前記脂質溶液、前記嗅覚受容体複合体が組み込まれたプロテオリポソームを含む前記水系媒体、及び、前記ハイドロゲルを用意する工程と、
前記ハイドロゲルを加熱溶融し、前記第１の領域に添加し、ゲル化させる工程と、
前記脂質溶液及び前記水系媒体を前記第２の領域に添加し、前記ハイドロゲルとの界面に前記脂質二重膜を形成させる工程と、
を含む、製造方法。
［１１］  前記ハイドロゲルを用意する工程がさらに、前記脂質二重膜を形成させるため、前記第１の領域にも前記脂質溶液を添加することを含む、［１０］に記載の製造方法。
［１２］  前記第１の領域に添加された前記脂質溶液を除くことをさらに含む、［１１］に記載の製造方法。
［１３］  前記嗅覚受容体複合体が、前記嗅覚受容体及び前記嗅覚受容体共受容体を共発現させた細胞から精製された嗅覚受容体複合体である、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、特に人の汗の成分であるオクテノールを、被検気体から高感度に検出できる標的物質の検出装置及び検出方法、並びに該検出装置の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】一実施形態の検出装置の模式断面図である。
【図２】アフィニティー精製したＡａＯｒｃｏ、Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８についてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した結果を示す図である。
【図３】アフィニティー精製後、ゲルろ過クロマトグラフィーの結果（Ａ）、及び、ゲルろ過クロマトグラフィーを経たＡａＯｒｃｏ、Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８についてＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した結果（Ｂ）を示す図である。
【図４】アフィニティー精製したタンパク質、凍結融解法によるプロテオリポソーム、及びバイオビーズ法によるプロテオリポソーム（それぞれレーン１、２及び３）についてＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した結果を示す図である。
【図５】密度勾配超遠心法によるプロテオリポソームの組み込みをＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した結果を示す図である。
【図６】液滴接触法による従来の液−液型検出装置の模式図（Ａ）、本実施形態によるハイドロゲル−液型検出装置の模式図（Ｂ）、並びに、両者による匂い分子の吸着量の比較（Ｃ及びＤ）を示す図である。
【図７】液滴接触法による脂質二重膜へのタンパク質の取り込みの結果を示す図である。
【図８】嗅覚受容体複合体が組み込まれた脂質二重膜の標的物質に対する特異性を示す図である。
【図９】未精製（粗精製）又は精製した嗅覚受容体複合体を組み込んだプロテオリポソームを用いた場合のシグナル検出頻度を示す図である。
【図１０】嗅覚受容体複合体の発現方法の最適化の検討結果を示す図である。
【図１１】プロテオリポソームの調製方法の最適化の検討結果を示す図である。
【図１２】脂質溶液の組成の最適化の検討結果を示す図である。
【図１３】嗅覚受容体共受容体Ｏｒｃｏの電気生理学を示す図である。
【図１４】液−液型、液−ゲル型による脂質二重膜の形成率の検討の結果を示す図である。
【図１５】本実施形態の検出装置の一例の形成方法を示す図である。
【図１６】信号ステップの電流値分布を示す図である。
【図１７】オクテノールガスの有無による電流値変化の分布を示す図である。
【図１８】嗅覚受容体複合体、標的物質の存在の有無による電流発生への影響の結果を示す図である。
【図１９】本実施形態の検出装置によるオクテノール及び類似物質に対する応答性の比較の結果を示す図である。
【図２０】給水の有無によるハイドロゲルの乾燥による収縮への影響を示す図である。
【図２１】給水の有無による脂質二重膜の維持時間への影響を示す図である。
【図２２】給水溝を有するデバイスでの脂質二重膜の電気計測による維持時間を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
本実施形態の検出装置は、気体状の被検試料に含まれる標的物質を検出するための検出装置であって、
被検試料と直接接触するハイドロゲルが配置された第１の領域と、
脂質二重膜と、
脂質二重膜を介して第１の領域と隣接している第２の領域であって、脂質二重膜形成性の脂質溶液／水系媒体が配置された、第２の領域と、
第１の領域と第２の領域との間に電圧を印加し、かつ、これらの領域間に流れる電流を測定する測定手段と
を具備し、
脂質二重膜が、脂質二重膜を貫通する開閉できる透孔を有し、
電流は透孔を介して流れ、該電流の流れ方が、被検試料中に標的物質が含まれる場合と含まれない場合とで異なり、
透孔が脂質二重膜に保持された嗅覚受容体複合体のイオンチャネルであり、嗅覚受容体複合体が標的物質を認識可能な、昆虫の嗅覚受容体と該昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体である、検出装置。
【００１６】
（標的物質）
検出の目的である標的物質は、オクテノール（１−Ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌ）である。揮発性匂い物質であり、ヒトなどの動物の汗の成分である。
【００１７】
（気体状の被検試料）
気体状の被検試料は、検出すべき標的物質を含む気体であれば何ら限定されるものではなく、代表的な例として大気や室内の空気等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１８】
（嗅覚受容体複合体）
昆虫の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とがヘテロ複合体を形成したものである。昆虫の嗅覚受容体は、７回膜貫通構造を有するＧタンパク質共役型受容体の一種であり、その匂い物質の認識特異性が高い。いくつかの匂い物質特異的な嗅覚受容体が知られている。一方、昆虫の嗅覚受容体共受容体は、嗅覚受容体と同様に７回膜貫通構造を有する膜タンパク質であるものの、それ自身は匂い物質を認識せず、嗅覚受容体とヘテロ複合体を形成して機能する。Ｏｒｃｏファミリーとして知られている上記嗅覚受容体共受容体は、比較的高い相同性で全ての昆虫に保存されている。嗅覚受容体複合体は、匂い物質で活性化されるイオンチャネル活性が備わっており、活性化されるとナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）等の陽イオンを細胞内に流入させる。
【００１９】
本実施形態における嗅覚受容体複合体として、標的物質を認識可能な、昆虫の嗅覚受容体と該昆虫と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体が好適に適用され得る。該嗅覚受容体複合体は、標的物質で活性化されるイオンチャネル活性を有し、脂質二重膜に存在し、開閉できる透孔を形成する。標的物質を認識可能な、昆虫の嗅覚受容体としては、オクテノールを認識可能な、昆虫の嗅覚受容体が挙げられる。
【００２０】
嗅覚受容体複合体として例えば、標的物質を認識可能な、蚊科昆虫の嗅覚受容体と、該昆虫と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体が挙げられる。標的物質を認識可能な、蚊科昆虫の嗅覚受容体としては、オクテノールを認識可能な、蚊科昆虫の嗅覚受容体が挙げられる。嗅覚受容体複合体としてより具体的には、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）の嗅覚受容体ＯＲ８と、ネッタイシマカの嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体が挙げられる。ネッタイシマカの嗅覚受容体ＯＲ８は、オクテノールを特異的に認識することが知られている。ネッタイシマカの嗅覚受容体ＯＲ８としては、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する嗅覚受容体が挙げられ、ネッタイシマカの嗅覚受容体共受容体としては、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する嗅覚受容体共受容体が挙げられる。
【００２１】
本実施形態の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とが１：１の割合で相互作用して複合体を形成している。嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体は、それぞれ１つずつから複合体が形成されてもよく、それぞれ２つずつから複合体が形成されてもよく、それぞれ４つずつから複合体が形成されてもよい。
【００２２】
本実施形態の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体を同じ細胞の細胞膜に同時に発現させ、場合によって精製する方法、又は、嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体をそれぞれ別の細胞で発現させ、精製した後に混合する方法等により調製することができる。嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体を細胞で発現させる方法は、特に限定されるものではなく公知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、上記嗅覚受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドと、上記嗅覚受容体共受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドとを細胞に導入してこれらを発現させる方法がある。この際、上記嗅覚受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドと、上記嗅覚受容体共受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドとを同じ細胞に導入することで、細胞膜上で嗅覚受容体複合体を形成させ、これを直接調製することもできる。細胞に各種プラスミドが導入されたことは、ＰＣＲ等の方法により確認することができる。細胞で発現させた嗅覚受容体、嗅覚受容体共受容体、又は嗅覚受容体複合体は、細胞膜を可溶化した後、アフィニティー精製又はゲルろ過精製等の各種既知のタンパク質精製方法により精製することができる。得られたタンパク質（嗅覚受容体、嗅覚受容体共受容体、又は嗅覚受容体複合体）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ等の既知の方法によって確認することができる。
【００２３】
プラスミドを導入するための宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２等の大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ１１４等のバチルス属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２等の酵母、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  由来の  Ｓｆ細胞系もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞系等の昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞等の動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは、哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＰＣ１２細胞、Ｎ１Ｅ−１１５細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞等が挙げられる。
【００２４】
脂質二重膜に組み込む際、上記の方法によって予め形成された嗅覚受容体複合体を利用してもよく、別々に調製した嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体との混合物を利用してもよい。脂質二重膜に組み込むための媒体としては、膜タンパク質が取り込まれたリポソーム（プロテオリポソーム）、膜タンパク質を発現させた細胞から調製した膜画分等が好ましく用いられる。プロテオリポソームは、例えばバイオビーズ法又は凍結融解法、或いは両者の組み合わせ等の既知の方法によって調製することができる。
【００２５】
バイオビーズ法によるプロテオリポソームの作製は、リポソームを調製した後、粗精製又は精製したタンパク質を添加し、界面活性剤を除去するためバイオビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を添加、さらに、バイオビーズを除いた後、超遠心等によりプロテオリポソームを回収することによって調製することができる。
【００２６】
凍結融解法によるプロテオリポソームの作製は、リポソームを調製した後、粗精製又は精製したタンパク質を添加し、脂質とタンパク質の混合溶液を超音波破砕し、液体窒素で凍結後、例えば２５℃に設定した恒温水槽で融解させ、さらに、超遠心等によりプロテオリポソームを回収することによって調製することができる。リポソームに膜タンパク質が組み込まれているかどうかは、Ａｃｃｕｄｅｎｚ等を用いて密度勾配下で超遠心することにより、遠心チューブの上層に膜タンパク質が検出されることによって確認することができる。
【００２７】
リポソームに関しては、既知の方法によって作製することができ、好ましくは、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロールを、クロロホルム等の有機溶媒に溶解し、適切な重量比で混合後、窒素気流及び真空デシケーター等により有機溶媒を除去する。次に、脂質を適切なバッファに溶解し、超音波破砕を行い、凍結融解を繰り返すことにより、リポソームを調製する。さらに、リポソームの直径を、例えば１００ｎｍ〜５００ｎｍに均一化することが好ましい。ホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン：コレステロールの混合比としては、０〜１０：０〜３：０〜３：０〜２の重量比が挙げられ、５：３：３：１の重量比が好ましい。
【００２８】
得られたプロテオリポソームには、所望のタンパク質が含まれていることをＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで確認することができる。
【００２９】
（脂質溶液）
脂質二重膜、すなわち、親水性領域と疎水性領域を１分子中に有する脂質分子が、疎水性領域を内側、親水性領域を外側に向けて２層に並んだ膜を形成できる脂質であれば特に限定されないが、生体膜における反応を模するためには、生体膜と同じか類似したものが好ましく、この分野において従来から広く用いられているリン脂質、例えば、ジフィタノイルフォスファチジルコリン（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙ１ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＰｈＰＣ）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｙｔｏｙ１ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ１ｃｈｏ１ｉｎｅ）、パノレミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（１−Ｐａ１ｍｉｔｏｙｌ  ２−０ｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ１ｃｈｏｌｉｎｅ，ＰＯＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（Ｄｉｏ１ｅｏｙ１ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルセリン（Ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ，ＤＯＰＳ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（Ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ，ＤＯＰＥ）等を好ましい例として挙げることができる。また、生体膜に存在するスフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン；ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴ糖脂質（ガングリオシド；Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、カルジオリピン（Ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ）、又はコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）も混入可能である。これらの多くは市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。
【００３０】
上記の脂質を組み合わせて使用してもよく、例えば、ＤＯＰＣ＋ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ＋ＤＯＰＥ＋カルジオリピン、ＤＯＰＣ＋ＤＯＰＥ＋スフィンゴミエリンが挙げられる。また、これらのリン脂質の組成として、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥの重量比が３：１の組成、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：カルジオリピン＝１：１：０．１、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：スフィンゴミエリンの重量比が１：１：０．４、が挙げられる。ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥの重量比が３：１の組成を有する脂質溶液が好ましく用いられる。
【００３１】
脂質二重膜の形成に用いられる溶液中のリン脂質の濃度は、脂質二重膜が形成可能な濃度であれば特に限定されないが、通常、１９ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌ程度、好ましくは５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ程度である。また、リン脂質溶液の溶媒は、特に限定されないが、有機溶媒が好ましく、ｎ−デカンまたはｎ−ヘキサデカンのような脂肪族炭化水素溶媒が好ましい。
【００３２】
（水系媒体）
水系媒体としては、水又は水を溶媒とする緩衝液が用いられる。緩衝液としては、生物適合性があることが知られている、例えばリン酸緩衝液等の周知の緩衝液を用いることができる。水系媒体を添加すると、水系媒体の周囲を脂質溶液の膜が被覆する形に自発的になる。「脂質溶液/水系媒体」は、このように水系媒体の周囲を脂質溶液の膜が被覆したものを意味する。緩衝液の種類としては、HEPESバッファが好ましい。
【００３３】
水系媒体には、嗅覚受容体複合体は、プロテオリポソームの形態で含むことが好ましい。プロテオリポソームの添加量は、透孔を形成できるように調節すればよく、例えば、１０−９〜１０−１ｍｇ/ｍｌが挙げられる。
【００３４】
（ハイドロゲル）
ハイドロゲルとしては、アガロース、寒天、ゼラチン等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。アガロースが好ましく用いられる。使用される材料の濃度は、ゲル形成できる濃度であればよく特に限定されないが、アガロースの場合は０．１重量％〜５重量％が挙げられ、０．１重量％〜０．５重量％が好ましい。
【００３５】
（脂質二重膜）
脂質二重膜は、第１の領域と第２の領域との間に介在し、脂質二重膜を貫通する開閉できる透孔を形成する嗅覚受容体複合体を担持している。また、ハイドロゲルと、脂質溶液／水系媒体との界面に形成されている。脂質二重膜は、自己支持性フィルムに設けられた微小な貫通孔を塞ぐ形で形成することが安定性の観点から好ましい。すなわち、自己支持性フィルムの微小な貫通孔を塞ぐ形で脂質二重膜を形成し、この脂質二重膜に嗅覚受容体複合体を保持し、この嗅覚受容体複合体のイオンチャネルを透孔として利用することが好ましい。上記微小な貫通孔の直径としては、例えば１００〜２０００μｍが挙げられ、特に４００〜１０００μｍが好ましい。
【００３６】
（検出装置の構造）
一実施形態の検出装置（以下、場合によって「デバイス」という場合がある）の構造について説明する。一実施形態の検出装置は、ダブルウェルチャンバー（２個のウェルを持つ基板）の構造を有し、その模式断面図を図１に示す。図１中、１０はダブルウェルチャンバーの一方のウェルである第１の領域を示し、１３は、第１の領域１０に配置されたハイドロゲル１３を示す。ハイドロゲル１３には、気体状の被検試料中に含まれる標的物質１２が、ハイドロゲルと被検試料の接触の結果として含まれ得る。なお、図１中、標的物質１２は理解のために図示されているが、縮尺は実物とは全く異なっており、実際には標的物質は分子であるから目に見えず、自己支持性フィルムの透孔よりも遥かに小さい。
【００３７】
第２の領域１１を構成する、ダブルウェルチャンバーのもう一方のウェルには、脂質溶液及び水系媒体が含まれる。図１中、脂質溶液は１４で示され、水系媒体は１６で示される。水系媒体は、好ましくは水又は水系緩衝液である。図示のように、水系媒体１６の周囲を脂質溶液１４の膜が被覆している。第１の領域と第２の領域は、上記した、透孔を有する自己支持性フィルム１８により隔てられている。自己支持性フィルム１８の透孔部分には脂質二重膜２０が形成されている。脂質二重膜２０には、図示されていないが、嗅覚受容体複合体が保持され、嗅覚受容体複合体のイオンチャネルが透孔となって脂質二重膜を貫通している。電圧の印加と電流の測定のための測定手段として、各ウェルの底部にはそれぞれ電極２１が配置され、これらの電極の聞に電圧を印加して流れる電流を測定する回路が接続されている。なお、電圧の印加と電流の測定のための回路は、図１に示されるものに限定されるものではなく、電極間に電圧を印加して、電極間に流れる電流を測定可能な回路であればいずれのものでもよい。印加電圧は、５０〜２００ｍＶであればよく、好ましくは５０〜１００ｍＶであり、さらに好ましくは６０ｍＶである。通常、１ｋＨｚのサンプリングレート、２００Ｈｚのローパスフィルター、室温、３０分〜１時間の測定である。
【００３８】
（検出装置の製造方法）
図１に示す検出装置の製造方法（作製方法）を説明する。使用するデバイスとしてのダブルウェルチャンバー、脂質溶液、水系媒体及びハイドロゲルは上述のとおりである。
【００３９】
ダブルウェルチャンバーの一方のウェル（第１の領域）に、加熱溶融したハイドロゲルを添加し、室温に放置する等して固化・ゲル化させる。ハイドロゲルを添加する前に、脂質溶液を第１の領域に添加する場合としない場合がある。脂質溶液を添加した場合は第１の領域と第２の領域の界面に脂質二重膜が形成しやすくなる。ハイドロゲルと脂質溶液の添加順が前後してもよい。
【００４０】
他方のウェル（第２の領域）に脂質溶液と水系媒体を添加する。
【００４１】
脂質溶液及び水系媒体を第２の領域に添加し、貫通孔においてハイドロゲルとの界面に脂質二重膜を形成させる。水系媒体にプロテオリポソームの形態で含まれる嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体を共発現させた細胞から精製した嗅覚受容体複合体であることが好ましい。
【００４２】
脂質溶液と水系媒体は同時に添加してもよく、前後に添加してもよい。また、複数回に分けて少量ずつ、同時に又は交互に添加してもよい。好ましくは、脂質溶液を先に少量添加し、その後、水系媒体をスポイト等で少量添加し、これを複数回繰り返す。脂質溶液に水系媒体を添加すると、水系媒体の周囲を脂質溶液の膜が被覆する形に自発的になる。
【００４３】
なお、ハイドロゲルと被検試料を接触させてから、第２の領域に脂質溶液／水系媒体を添加して界面に脂質二重膜を形成してもよいが、先にこの脂質二重膜を形成した後、ハイドロゲルを被検試料と接触させてもよい。いずれの条件でも、被検試料中の標的物質がハイドロゲルに吸収されるため、検出することができる。
【００４４】
なお、上記の説明では、第１の領域及び第２の領域として、ダブルウェルチャンバーの各ウェルを用いた実施形態について説明したが、第１の領域及び第２の領域はダブルウェルチャンバーの各ウェルに限定されるものではなく、例えば、特開２０１４−２１０２５号公報に示される、基板上の親水性パターン上に第１の水系媒体、脂質溶液、第２の水系媒体を順次積層していく方法により作製したものでもよく、この場合、第２の水系媒体として上記ハイドロゲルを用いることができる。すなわち、この場合、ハイドロゲル及び脂質溶液が存在する領域が第１の領域となり、水系媒体と脂質溶液が存在する領域が第２の領域となる。
【００４５】
（検出方法）
上記の検出装置を用いて、気体状の被検試料中に含まれる標的物質を検出するための検出方法について説明する。
【００４６】
本実施形態の方法は、上記の検出装置を用意する工程と、被検試料を検出装置に曝露し、検出装置の第１の領域と第２の領域との間に電圧を印加し、これらの領域間に流れる電流を測定する工程と、測定された電流の値に基づき、被検試料中に標的物質が含まれるか否かを判断する工程とを含む、検出方法。
【００４７】
電流を測定する工程については、上述したとおり、標的物質がハイドロゲルに吸収されると、速やかにハイドロゲルの中に拡散し、脂質二重膜に担持される嗅覚受容体複合体と結合し、イオンチャネルが活性化し、開放することにより、陽イオンを人工細胞膜の第２の領域側に取り込み、一時的に電流を発生させる。
【００４８】
被検試料中に標的物質が含まれるかどうか判断する工程については、電流の変化が測定された場合、被検試料が存在すると判断できる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
Ｉ  嗅覚受容体複合体の作製
（１）発現プラスミドの作製
（ｉ）シマカの嗅覚受容体共受容体（以下、ＡａＯＲＣＯという場合もある）の発現プラスミドの作製
ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）の頭部を液体窒素で凍結させた後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、ＴＲＩｚｏｌ試薬に添付の説明書に従いＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にし、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc；配列番号１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaacacc；配列番号２）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号３で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号３で示される塩基配列は配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５１】
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏ ０．１μｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＨａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ―１−５’（5’-cagagcgataacgcgatgaacgtccaaccgacaaagtac；配列番号５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＨａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ―１−３’（5’-agcccgaattcgtttttatttcaactgcaccaacaccatg；配列番号６）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｓｇｆ１及びＰｍｅ１で消化されたｐＦＮ２１Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐＦＮ２１Ａ−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐＦＮ２１Ａ−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号７で示される塩基配列は配列番号８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５２】
プラスミドｐＦＮ２１Ａ−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ ０．１μｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＨａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ―２−５’（5’-aaccaagtgaccatggcagaaatcggtactggctttcc；配列番号９）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＨａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ―２−３’（5’-ctgccaattgggatcttatttcaactgcaccaacaccatg；配列番号１０）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｎｃｏ１及びＢａｍＨ１で消化されたｐＩＥＸ−４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐＩＥＸ−４−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐＩＥＸ４−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号７で示される塩基配列は配列番号８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５３】
プラスミドｐＩＥＸ−４−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ ０．１μｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＨａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ―３−５’（5’-catcgggcgcggatcatggcagaaatcggtactggctttc；配列番号１１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＨａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ―３−３’（5’-gtaggcctttgaattttatttcaactgcaccaacaccatg；配列番号１２）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１で消化されたｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌ−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号７で示される塩基配列は配列番号８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５４】
（ｉｉ）シマカ由来の嗅覚受容体（ＡａＯＲ８）の発現プラスミドの作製
上記方法により調製されたシマカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯＲ８−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgacctggtgaagtttgagt；配列番号１３）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯＲ８−３’（5’-gccactgtgctggattcacttctgacttggttcatagatggt；配列番号１４）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３０サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８と名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１５で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１５で示される塩基配列は配列番号１６で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５５】
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８ ０．１μｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＨａｌｏ−ＡａＯＲ８−１−５’（5’-cagagcgataacgcgatgaacgacctggtgaagtttg；配列番号１７）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＨａｌｏ−ＡａＯＲ８−１−３’（5’-agcccgaattcgttttcacttctgacttggttcatag；配列番号１８）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｓｇｆ１及びＰｍｅ１で消化されたｐＦＮ２１Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐＦＮ２１Ａ−Ｈａｌｏ−ＡａＯＲ８と名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐＦＮ２１Ａ−Ｈａｌｏ−ＡａＯＲ８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１９で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１９で示される塩基配列は配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５６】
プラスミドｐＦＮ２１Ａ−Ｈａｌｏ−ＡａＯＲ８ ０．１μｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＨａｌｏ−ＡａＯＲ８−２−５’（5’-aaccaagtgaccatggcagaaatcggtactggctttcc；配列番号２１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＨａｌｏ−ＡａＯＲ８−２−３’（5’-ctgccaattgggatctcacttctgacttggttcatagatg；配列番号２２）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｎｃｏ１及びＢａｍＨ１で消化されたｐＩＥＸ−４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐＩＥＸ−４−Ｈａｌｏ−ＡａＯＲ８と名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐＩＥＸ４−Ｈａｌｏ−ＡａＯＲ８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１９で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１９で示される塩基配列は配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５７】
プラスミドｐＩＥＸ４−Ｈａｌｏ−ＡａＯＲ８ ０．１μｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＨａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８−１−５’（5’-cagagcgataacgcggattacaaggatgacgacgataagatggcagaaatcggtactgg；配列番号２３）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＨａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８−１−３’（5’-ctgccaattgggatctcacttctgacttggttcatagatg；配列番号２４）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。また、プラスミドｐＩＥＸ４−Ｈａｌｏ−ＡａＯＲ７０．１μｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーｉｎｖｅｒｓｅ−５’（5’-gatcccaattggcagatctc；配列番号２５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーｉｎｖｅｒｓｅ−３’（5’-cgcgttatcgctctgaaag；配列番号２６）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られた２つのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐＩＥＸ−４−Ｈａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８と名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐＩＥＸ４−Ｈａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号２７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号２７で示される塩基配列は配列番号２８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５８】
プラスミドｐＩＥＸ−４−Ｈａｌｏ―Ｆｌａｇ―ＡａＯＲ８  ０．１μｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＨａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８−２−５’（5’-catcgggcgcggatcatggcagaaatcggtactggctttc；配列番号２９）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＨａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８−２−３’（5’-gtaggcctttgaatttcacttctgacttggttcatagatg；配列番号３０）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１で消化されたｐＦａｓｔＢａｃ  Ｄｕａｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ−Ｈａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８と名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌ−Ｈａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号２７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号２７で示される塩基配列は配列番号２８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５９】
（２）バキュロウイルスの作製
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、以下の通りバキュロウイルスを作製した。ＤＨ１０Ｂａｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２０μＬにプラスミド（ｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌ−Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏまたはｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌ−Ｈａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８）を０．１ μｇ加え、氷上で２０分、４２℃で１分、氷上で２分インキュベートした。それからＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を２００μＬ加え、３７℃で４時間培養した。得られた培養液をＬＢ寒天プレート（５０μｇ/ｍＬ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、７μｇ/ｍＬ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、１０μｇ/ｍＬＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、１００μｇ/ｍＬ Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、４０μｇ/ｍＬ ＩＰＴＧ含有）にて３７℃で約４８時間培養し、白色コロニーの生成を確認した。その白色コロニーをＬＢ液体培地（５０μｇ/ｍＬ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、７μｇ/ｍＬ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、１０μｇ/ｍＬ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ含有）で培養し、Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏまたはＨａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８のバキュロウイルスＤＮＡを得た。
【００６０】
Ｓｆ９細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、５％ＦＢＳを含むＳｆ−９００ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）中で、２７℃にて約２４時間培養した。作製したいずれかのバキュロウイルスＤＮＡ２．５μｇを、２５０μＬのグレース培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及び５μＬのＴｒａｎｓＩＴ−Ｉｎｓｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）と混合し、１５分間保持した。その後、この混合液を上記細胞に添加した。２７℃にて７日間培養後、培地を回収し、遠心によりＨａｌｏ−ＡａＯｒｃｏまたはＨａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８のバキュロウイルスを得た。さらに、得られたバキュロウイルスをＳｆ９細胞にトランスフェクションすることにより、バキュロウイルスの増殖を行った。
【００６１】
（３）ＡａＯｒｃｏ又はＡａＯＲ８を発現させた粗精製膜画分の作製
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を３×１０６ｃｅｌｌｓで播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて約２４時間培養した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏ  ３μｇと、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８  ６μｇとを、１２．５μＬのＰｌｕｓ試薬及び３１．２５μＬのリポフェクトアミンＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と混合し、３０分間保持した。その後、この混合液を上記細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション１日後に細胞を回収し、細胞をバッファ（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ ７．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、８％  ｓｕｃｒｏｓｅ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０  ｍＭ  ＫＣｌ）で懸濁した。懸濁液を超音波破砕し、遠心（１００００ｇ、１０分）により上清を回収した。さらに、上清を超遠心（１２００００ ｇ、４５ 分）により沈殿を回収し、バッファ（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、８  ％  ｓｕｃｒｏｓｅ）で懸濁した。最後に、スイングローター用チューブにバッファ（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、４０  ％  ｓｕｃｒｏｓｅ）、超遠心後の沈殿溶液を順番に加え、超遠心（１８００００ ｇ、９０ 分）により粗精製膜画分を回収した。
【００６２】
（４）ＡａＯｒｃｏ又はＦｌａｇ−ＡａＯＲ８の発現及び精製
Ｓｆ９細胞を０．５〜１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、５％ＦＢＳを含むＳｆ−９００ＩＩ培地中で、２７℃にて約２４時間培養した。次に、作製したバキュロウイルス（Ｈａｌｏ−ＡａＯｒｃｏ、Ｈａｌｏ−Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８）を別々に、もしくは同時にＳｆ９細胞に多重感染度（ＭＯＩ）５で添加し、２７℃にて約７２〜９６時間培養し、ＡａＯｒｃｏの単独発現、Ｆｌａｇ−ＡａＯＲ８の単独発現、又は、ＡａＯｒｃｏ及びＦｌａｇ−ＡａＯＲ８を共発現したＳｆ９細胞を得た。培養後、遠心により細胞ペレットを回収し、バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）で懸濁した。
【００６３】
可溶化のため、細胞ペレット懸濁液にＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６を０．１％（ｗ/ｖ）となるように添加し、超音波破砕後、遠心により上清を回収した。
【００６４】
ＨａｌｏＬｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）をバッファ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６）で平衡化後、上記の上清をＲｅｓｉｎに添加し、バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１〜０．０１％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６）で複数回洗浄した。続いて、Ｈａｌｏタグの切断用の酵素Ｈａｌｏ−ＴＥＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を加えたバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６）でＲｅｓｉｎを約１時間、室温でインキュベートすることにより、アフィニティー精製されたサンプルを回収した。最後に、アフィニティー精製後のサンプルの一部をゲルろ過クロマトグラフィー（カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６またはＳｕｐｅｒｏｓｅ１２（ＧＥ社製））に供し、最終精製サンプルとした。
【００６５】
（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０％ポリアクリルアミドゲル（ミニプロティアンＴＧＸプレキャストゲル、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いて、Ｂｉｏ−ｒａｄ社のマニュアルに従い実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルは、トリスβＭＥサンプルバッファ（コスモバイオ製）と１：２の割合で混合し、室温でインキュベート後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施後のポリアクリルアミドゲルをｉＢｌｏｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてニトロセルロース膜に転写し、ｉＢｉｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によりブロッキング、１次抗体、２次抗体反応後の洗浄をマニュアルに従い実施した。１次抗体としては、ａｎｔｉ−ｆｌａｇ  Ｍ２  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、またはａｎｔｉ−ＡｇＯｒｃｏ（ガンビエハマダラカＯＲＣＯに対する抗体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のカスタム抗体作製（ポリクローナル））、２次抗体としては、Ａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ, ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ａｂ ＳｈｅｅｐまたはＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ, ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ａｂ Ｄｏｎｋｅｙ（ＧＥ社製）を用いた。
【００６６】
ＡａＯｒｃｏとＦｌａｇ−ＡａＯＲ８とを共発現した細胞から得られた粗精製膜画分をアフィニティー精製したサンプルについてＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した結果を図２に示した。ＡａＯｒｃｏ及びＦｌａｇ−ＡａＯＲ８のバンドが確認できたことから、アフィニティー精製が成功したことが確認できた。
【００６７】
また、アフィニティー精製後、ゲルろ過クロマトグラフィーした結果（Ａ２８０の吸光度）を図３のＡに示した。Ｖｏｉｄ  Ｖｏｌｕｍｅに検出されたピークは凝集体由来のものと考えられた。また、凝集体以降に検出された初めのピークについてＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した結果を図３のＢに示した。ＡａＯｒｃｏ及びＦｌａｇ−ＡａＯＲ８のバンドが確認できたことから、このピークはＡａＯｒｃｏとＦｌａｇ−ＡａＯＲ８の複合体由来と考えられた。
【００６８】
（６）プロテオリポソームの作製
バイオビーズ法によるプロテオリポソームの作製を以下の通り行った。脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロール）をそれぞれクロロホルムに溶解し、５：３：３：１の重量比で混合後、窒素気流及び真空デシケーターによりクロロホルムを除去した。次に、これら脂質をバッファ（１５ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ）に溶解し、超音波破砕を行い、凍結融解を繰り返すことにより、リポソームを調製した。さらに、リポソームのポアサイズを均一化するため、１００ｎｍのフィルターをセットしたｍｉｎｉ−ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）で合計１１回処理した。調製したリポソームを０．２％  ＣＨＡＰＳで１５分間、室温でインキュベート後、アフィニティー精製したタンパク質、もしくはゲルろ過精製したタンパク質を添加した。次に、界面活性剤を除去するため、バイオビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を添加した。さらに、遠心によりバイオビーズを除いた後、超遠心（１０００００ｇ、１ｈ）によりプロテオリポソームを回収した。
【００６９】
凍結融解法によるプロテオリポソームの作製を以下の通り行った。脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロール）をそれぞれクロロホルムに溶解し、５：３：３：１の重量比で混合後、窒素気流及び真空デシケーターによりクロロホルムを除去した。次に、脂質をバッファ（１５ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ）に溶解後、アフィニティー精製したタンパク質、もしくはゲルろ過精製したタンパク質を添加した。脂質とタンパク質の混合溶液を超音波破砕し、液体窒素で凍結後、２５℃に設定した恒温水槽で融解させた。この操作は２回実施した。さらに、超遠心（１０００００ｇ、１ｈ）によりプロテオリポソームを回収した。
【００７０】
凍結融解及びバイオビーズ法によるプロテオリポソームの作製を以下の通り行った。脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロール）をそれぞれクロロホルムに溶解し、５：３：３：１の重量比で混合後、窒素気流及び真空デシケーターによりクロロホルムを除去した。次に、脂質をバッファ（１５ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ）に溶解後、アフィニティー精製したタンパク質、もしくはゲルろ過精製したタンパク質を添加した。脂質とタンパク質の混合溶液を超音波破砕し、液体窒素で凍結後、２５℃に設定した恒温水槽で融解させた。この操作は２回実施した。続いて、界面活性剤を除去するため、バイオビーズを添加した。遠心によりバイオビーズを除いた後、超遠心（１０００００ｇ、１ｈ）によりプロテオリポソームを回収した。
【００７１】
上記（５）で得られたアフィニティー精製タンパク質を上記の３つの方法に従って、得られた各種プロテオリポソームについてＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した。その結果を図４に示した。レーン１、２及び３はそれぞれ、アフィニティー精製したタンパク質、凍結融解法によるプロテオリポソーム、及びバイオビーズ法によるプロテオリポソームの結果を示す。
【００７２】
（７）密度勾配超遠心法によるプロテオリポソームの組み込み確認
Ａｃｃｕｄｅｎｚ濃度が８０、３５、３０ ％の溶液（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、３００ ｍＭ ＮａＣｌ）を作製した。次に、プロテオリポソーム及びアフィニティー精製後のタンパク質とＡｃｃｕｄｅｎｚの８０％溶液を等量混合し、スイングローター用チューブに、Ａｃｃｕｄｅｎｚ濃度が３０、３５、４０％の順で重層した。さらに、バッファ（２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を重層した後、１０００００ｇ、４℃で４時間超遠心を行った。超遠心終了後、チューブの上層から溶液を等量ずつ回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇに供した。回収した溶液１〜１０（レーン１〜１０）をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した結果を図５に示す。プロテオリポソームは遠心チューブの上部（フラクションＮｏ．２〜４）において検出されたことから、ＯｒｃｏおよびＦｌａｇ−ＯＲ８はリポソームに組み込まれていると考えられた。
【００７３】
ＩＩ  液滴接触法で形成した脂質二重膜を用いた系
図６のＡは、特開２０１２−８１４０５号公報や特開２０１５−７７５５９号公報に記載されたような、液滴接触法による従来の液−液型検出装置の模式図を示す。このような液−液型検出装置の脂質二重膜に嗅覚受容体複合体を組み込む場合は、該複合体の匂い分子結合部位は液相（バッファ）に接している。匂い分子が嗅覚受容体複合体に届くためには、液相に届く必要がある。しかしながら、Ａに示す従来の液−液型検出装置の場合、オイル（脂質）で液相が覆われているため、気中匂い分子が液相に直接接触できないという問題点がある。一方、図６のＢの模式図に示すような、本実施形態のハイドロゲル−液型検出装置は、ハイドロゲルが空気中に曝露しており、匂い分子を吸着できるため、空気中の標的物質の検出が可能となる。図６のＣは、従来型と本実施形態の検出装置による匂い分子が溶け込んだ量（吸着量）の経時的変化のガスクロマトグラフィによる計測結果（当業者にとって周知の方法であるため、詳細な計測方法は省略する）を示しており、このグラフからも分かるように、従来の液−液型検出装置に比べて、本実施形態によるハイドロゲル−液型検出装置が空気中の匂い分子の吸着に適している。本計測は１０８８ｐｐｍの気化した１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌを十分量（実験時の体積は２Ｌ程度だが、常に溶液から揮発して飽和蒸気圧を継続した実験系になっているので濃度の変化はない）、ハイドロゲル２５０μＬ（図６のＣ）、若しくは３６μＬ（図６のＤ）に曝露し、継時的にハイドロゲルに吸着した量を解析した。
【００７４】
以下、従来の液滴接触法によって脂質二重膜を形成し、このような従来の液滴接触法による系（液−液型検出装置）において、嗅覚受容体複合体が匂い分子を検出することを確認した。液−液型検出装置は、特開２０１２−８１４０５号公報や特開２０１５−７７５５９号公報に記載のものを使用した。
【００７５】
ダブルウェルチャンバーの作製は、以下のとおりに行った。まず、特開２０１２−８１４０５号公報の実施例に記載のとおりダブルウェルチャンバー（ＤＷＣ）を作製した。ただし、７５μｍ厚のアクリルフィルムに直径６００μｍの貫通孔を１箇所設けたものを作製し、隔壁とした。
【００７６】
（１）液滴接触法による脂質二重膜へのタンパク質の取り込み
脂質二重膜に組み込むタンパク質としてヘモリシンを用い、上記液−液型検出装置において、脂質二重膜（人工細胞膜）を形成した。ヘモリシンは、リポソームが人工細胞膜に融合すれば、すぐにイオン電流値の変化が検出されるからである。
【００７７】
特開２０１５−７７５５９号公報に記載とおりに、ダブルウェルチャンバーを用意し、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ＝３：１のデカン溶液４．２μＬずつを各ウェルに滴下した。続いて、双方のウェルにアルファヘモリシンが脂質膜に組み込まれたプロテオリポソーム２１μＬを滴下した。プロテオリポソームの作成方法は脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロール）をそれぞれクロロホルムに溶解し、５：３：３：１の重量比で混合後、窒素気流及び真空デシケーターによりクロロホルムを除去し、アルファヘモリシン５μＭを含むバッファ（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ２）溶液と混合することで調製した。プロテオリポソーム液は２００００Ｇ、１０分の遠心操作によって沈殿として回収し、同上のバッファ組成（アルファヘモリシンは含まない）で懸濁した後に、１００  ｎｍのフィルターをセットしたｍｉｎｉ−ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）で合計１１回処理した。器具にＴｅｃｅｌｌａ社の微小電流測定アンプであるＪＥＴを接続し、ウェル間に６０ｍＶの電圧を印加し、サンプリングレート５ｋＨｚ、フィルター約１ｋＨｚの条件下で電流測定を行いながらしばらく静置すると、脂質二分子膜が形成されアルファヘモリシンが再構成されチャネル電流が確認された。
【００７８】
結果を図７に示す。Ａは、膜タンパク質が脂質二重膜に取り込まれることを示す模式図であり、Ｂは膜タンパク質の組み込みによる電流の変化を示し、横軸は時間、縦軸はウェル間の電流をそれぞれ示す。図７は、人工細胞膜にリポソームが融合する過程を直接測定した結果であり、この結果から、人工細胞膜にリポソームが間違いなく融合することが確認できた。また、電流の変化に基づき、組み込みの頻度も定量できると考えられる。
【００７９】
（２）嗅覚受容体複合体が組み込まれた脂質二重膜の標的物質に対する応答性
上記（１）におけるヘモリシンの代わりに、嗅覚受容体複合体が取り込まれたリポソームを用いて上記液−液型検出装置において、嗅覚受容体複合体が組み込まれた脂質二重膜を形成した。
【００８０】
標的物質として１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌ、対照物質としてその類似物質である１−ｏｃｔｅｎ及び３−Ｏｃｔａｎｏｎｅを用いた。それぞれの物質の１μＭの溶液（バッファ：５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解したもの）を検出装置の双方のウェルに滴下した後、電流の変化を測定した。また、１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌと嗅覚受容体複合体との結合を阻害する阻害剤（ＩＲ３５３５、１ｍＭ；バッファ５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解したもの）を滴下した後にも、電流の変化を測定した。
【００８１】
電流変化の結果を図８に示した。図８のＡは、１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌが滴下された後に、イオン電流値が上昇し、阻害剤が滴下された後、イオン電流値が降下したことを示した。
【００８２】
図８のＢは、１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌと構造が似ている物質に対しては反応がないのに対して、１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌに対して高いシグナル強度を示した。
【００８３】
これらの結果によって、嗅覚受容体複合体が組み込まれた脂質二重膜が１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌに特異的に応答していることが確認された。
【００８４】
（３）タンパク質の精製の有無の影響
未精製（粗精製）又は精製した嗅覚受容体複合体を組み込んだプロテオリポソームを、上記（２）の方法にしたがって液−液型検出装置の脂質二重膜に組み込んだ。未精製（粗精製）又は精製した嗅覚受容体複合体は、「Ｉ  嗅覚受容体複合体の作製」の「（３）ＡａＯｒｃｏ又はＡａＯＲ８を発現させた粗精製膜画分の作製」、及び、「（４）ＡａＯｒｃｏ又はＦｌａｇ−ＡａＯＲ８の発現及び精製」に記載の方法にしたがって作製した。未精製（粗精製）又は精製した嗅覚受容体複合体を「Ｉ  嗅覚受容体複合体の作製」の「（６）プロテオリポソームの作製」に記載の方法にしたがって、リポソームに組み込んだ（凍結融解及びバイオビーズ法の作製法が混合したデータを用いてた。）。得られたプロテオリポソームを、上記（２）の方法にしたがって液−液型検出装置の脂質二重膜に組み込んだ。上記「（２）嗅覚受容体複合体が組み込まれた脂質二重膜の標的物質に対する応答性」と同様に１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌを滴下し、滴下した時にシグナルを検出した割合（シグナル検出頻度）を計測し、タンパク質の精製の有無による装置の検出頻度への影響を検討した（凍結融解及びバイオビーズ法の作製法が混合したデータを用いた。）。
【００８５】
結果を図９に示した。縦軸は、匂い分子溶液を滴下した時のシグナルを検出する割合を示す。未精製に比べて、精製した嗅覚受容体複合体を用いた場合、より高い検出頻度を示した。
【００８６】
（４）膜タンパク質の調製方法の最適化
（ｉ）嗅覚受容体複合体の発現方法の最適化
嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とを同じ細胞内において共発現させて複合体を得た場合（共発現による複合体）と、別々の細胞において発現させたタンパク質を混合して複合体を得た場合（混合による複合体）とを用いて、液−液型検出装置の脂質二重膜に組み込み、電気計測に用いて匂い物質（液体の滴下）に対する応答確率（歩留り）比較することによって、嗅覚受容体複合体の発現方法の最適化を図った。
【００８７】
共発現による複合体及び混合による複合体及び該複合体を取り込んだプロテオリポソームの作製方法は、「Ｉ  嗅覚受容体複合体の作製」の「（４）ＡａＯｒｃｏ又はＦｌａｇ−ＡａＯＲ８の発現及び精製」、及び「（６）プロテオリポソームの作製」に記載とおりであった（凍結融解及びバイオビーズ法の作製法が混合したデータを用いた。）。
【００８８】
結果を図１０に示す。試行回数は、共発現で１３回、混合で７回行っており、それぞれ歩留りが高い順番に計測結果を並べた。図１０によれば、混合に比べて共発現で調製したプロテオリポソームを用いたほうがより高い歩留りを示し、より有用であると確認された。
（ｉｉ）プロテオリポソームの調製方法の最適化
【００８９】
複合体として共発現したものを用い、プロテオリポソームの調製方法の違いによる歩留りの違いに基づき、プロテオリポソームの調製方法の最適化を図った。精製した３種類の複合体（ＨａｌｏＬｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎによる精製を行い、ゲル濾過カラムによる精製は行っていないサンプルを用いた。）を、（１）凍結融解法、（２）凍結融解法後バイオビーズ法、（３）バイオビーズ法によってプロテオリポソームを調製した。
【００９０】
それぞれ複合体及びプロテオリポソームの作製方法は、「Ｉ  嗅覚受容体複合体の作製」の「（４）ＡａＯｒｃｏ又はＦｌａｇ−ＡａＯＲ８の発現及び精製」、及び「（６）プロテオリポソームの作製」に記載とおりであった（凍結融解及びバイオビーズ法の作製法が混合したデータを用いた。）。
【００９１】
結果を図１１に示す。試行回数は、（１）凍結融解法で１３回、（２）凍結融解法後バイオビーズ法で４回、（３）バイオビーズ法で３回行っており、それぞれ歩留りが高い順番に計測結果を並べた。図１１によれば、凍結融解法で調製したプロテオリポソームを用いたほうがより高い歩留りを示し、より有用であると確認された。
【００９２】
（５）脂質溶液の組成の最適化
液滴接触法によって形成する人工細胞膜を異なる１４種類の脂質組成で調製した。それぞれ脂質組成は図１２の左側に示している（）。これらの１４種類の脂質組成を用いて、液−液型検出装置における人工細胞膜を形成し、人工細胞膜に嗅覚受容体を組み込み、匂い物質（液体）を滴下した時の応答確率を解析した。
【００９３】
図１２の右側は応答確率の結果を示す。横軸の数値は試行回数８回のうち、シグナルを検出した回数を表している。脂質組成によって、脂質がオイルに混和することなく析出したものがあり、計測データが得られていない（ＮＤ：脂質白濁）もある。各種組成を検討した結果、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ＝３：１で作成した脂質溶液が最も適していることが示された。
【００９４】
（６）嗅覚受容体共受容体Ｏｒｃｏの電気生理学
嗅覚受容体共受容体Ｏｒｃｏは、単独でもＶＵＡＡ１という物質に応答してイオン電流を発生させる機能を持っている。Ｏｒｃｏ単独で調製したプロテオリポソームを人工細胞膜に組み込み、ＶＵＡＡ１に対する応答性を評価した。
【００９５】
結果を図１３に示す。Ａは、嗅覚受容体複合体を示す模式図である。Ｂは、Ｏｒｃｏを組み込んだ人工細胞膜に対し、ＶＵＡＡ１を滴下し、各種印加電圧（−９０〜９０ｍＶ）を供した時に応答したイオン電流値をプロットした結果である。イオン電流値は電圧に対して正の相関を示すことが示された。
【００９６】
ＩＩＩ  脂質溶液とハイドロゲルとの界面で形成した脂質二重膜を用いた系
（１）液−液型、液−ゲル型による脂質二重膜の形成率の検討
本検討において使用したデバイスとして、特開２０１２−８１４０５号公報や特開２０１５−７７５５９号公報に記載のダブルウェルチャンバーを用いた。ただし、ダブルウェルチャンバーのウェル同士の間にある隔壁（セパレータ）には、直径６００μｍの貫通孔を１箇所設けた。
【００９７】
使用する主な材料は、以下のとおりである。液−液型に関しては、脂質溶液（オイル）として、脂質（ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ＝３：１，２０ｍｇ／ｍＬ）／デカンを、水系媒体（水溶液）として、嗅覚受容体複合体が組み込まれたプロテオリポソーム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．６）、９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むバッファ（以下、場合によって「嗅覚受容体複合体バッファ」、又は「ＯＲ８バッファ」という）を使用した。液−ゲル型に関しては、さらにハイドロゲルとして、１％又は０．１％（ｗｔ／ｗｔ）ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ａｇａｒｏｓｅ（溶融温度＜５０℃、転移温度８〜１７℃）ストック（以下、単に「アガロース」又は「ゲル」という）を使用した。
【００９８】
（Ｉ）両方のウェルに水溶液及びオイルを添加した場合（水溶液・オイル／水溶液／オイル）、
（ＩＩ）信号電極側（バッファ側、第２の領域）のウェルに水溶液及びオイルを添加し、反対側（ゲル側、第１の領域）のウェルに水溶液のみを添加した場合（水溶液・オイル／水溶液）、
（ＩＩＩ）信号電極側（バッファ側、第２の領域）のウェルに水溶液及びオイルを添加し、反対側（ゲル側、第１の領域）のウェルに０．１％ゲルのみを添加した場合（水溶液・オイル／０．１％ゲル）、
（ＩＶ）信号電極側（バッファ側、第２の領域）のウェルに水溶液及びオイルを添加し、反対側（ゲル側、第１の領域）のウェルに１％ゲルのみを添加した場合（水溶液・オイル／１％ゲル）、及び
（Ｖ）信号電極側（バッファ側、第２の領域）のウェルに水溶液及びオイルを添加し、反対側（ゲル側、第１の領域）のウェルに１％ゲル及びオイルを添加した場合（水溶液・オイル／１％ゲル・オイル）
について、その脂質二重膜の形成率を顕微鏡観察にて評価した。図１５のＢに示す脂質二重膜の領域の有無で脂質二重膜形成の有無を判断した。
【００９９】
結果は図１４に示す。（Ｖ）ウェルの両側にオイルを入れた場合、脂質二重膜の形成率が高く、（Ｉ）に液−液型に比べて、その膜形成率が同等レベルであった。
【０１００】
（２）本実施形態の検出装置の一例
本実施形態の検出装置（以下、場合によって「デバイス」という）の一例は、ダブルウェルチャンバーを用いて、以下のとおりに形成した。模式図は図１５のＡに示す。ダブルウェルチャンバーは、特開２０１２−８１４０５号公報や特開２０１５−７７５５９号公報に記載のものを使用した。ただし、ダブルウェルチャンバーのウェル同士の間にある隔壁（セパレータ）には、直径６００μｍの貫通孔を１箇所設けた。
【０１０１】
使用する主な材料は、以下のとおりである。ハイドロゲルとして、１％（ｗｔ／ｗｔ）ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ａｇａｒｏｓｅ（溶融温度＜５０℃、転移温度８〜１７℃）ストック（以下、単に「１％アガロース」という）を、脂質溶液（オイル）として、脂質（ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ＝３：１，２０ｍｇ／ｍＬ）／デカンを、水系媒体として、嗅覚受容体複合体が組み込まれたプロテオリポソーム（共発現により精製された嗅覚受容体複合体を組み込んだプロテオリポソームを前述のプロトコルのとおり作成し、使用時にはバッファ５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ２で１００倍希釈して使用した。）、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．６）、９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むバッファ（以下、場合によって「嗅覚受容体複合体バッファ」、又は「ＯＲ８バッファ」という）を使用した。
【０１０２】
作成の手順は以下に示す（番号は、図１５のＡ中の番号に対応する。）
（Ｉ）４℃に保管してある１％アガロースを予め９８℃に５分以上温めておいた。
（ＩＩ）上記ゲルを９８℃から取り出し、約１０分間放冷して室温に戻した。
（ＩＩＩ）デバイスに＋６０ｍＶの印加電圧をかけておいた。
（ＩＶ）デバイスの両方のウェルにオイルを４．２μＬ加えた。
（Ｖ）信号電極側（バッファ側、第２の領域）のウェルにＯＲ８バッファを２１μＬ加えた。
（ＶＩ）反対側（ゲル側、第１の領域）のウェルに１％アガロースを２１μＬ加えた。
（ＶＩＩ）バッファ側のウェルにＯＲ８バッファを５μＬ追加した。
（ＶＩＩＩ）ゲル側のウェルに１％アガロースを５μＬ追加した。
（ＩＸ）バッファ側のウェルにＯＲ８バッファを５μＬ追加した。
（Ｘ）ゲル側のウェルに１％アガロースを５μＬ追加した。
（ＸＩ）バッファ側のウェルにＯＲ８バッファを４μＬ追加した（バッファ総体積：３５μＬ）。
（ＸＩＩ）ゲル側のウェルに１％アガロースを５μＬ追加した。
（ＸＩＩＩ）ゲル側のウェルに１％アガロースを４μＬ追加した（ゲル総体積：４０μＬ）。
（ＸＩＶ）嗅覚受容体が脂質二重膜に再構成され、ゲルが外気に触れた匂いセンサ素子（検出装置、検出デバイス）が形成された。
【０１０３】
得られた脂質二重膜の領域の顕微鏡写真及びその模式図は、図１５のＢに示す。
【０１０４】
（３）信号ステップの電流値分布
測定方法は以下に示す条件と同様に行い、各測定結果において確認される信号の電流値を横軸、その回数を縦軸にとり、測定結果全体の分布図を得た。
・印加電圧６０ｍＶ
・サンプリングレート１０００〜５０００Ｈｚ
・ベッセルフィルター（ローパスフィルター）２００〜１０００Ｈｚ
・計測温度：室温
・計測時間  ０分〜２時間
【０１０５】
結果は図１６に示す。得られた電流値の変化のうち、数百ｐＡの電流値変化も見受けられたが、概ね数〜２０ｐＡの範囲内で頻繁に見られることが確認された。類似の系で実験している先行研究の報告では数百ｐＡレベルの電流値の変化は観測されないか、もしくはシグナルとしては処理されないことから、本実施形態の系は想定されるイオンチャネル以外に起因する電流変化を含んでいる可能性を有するが、主たる電流範囲は想定されるシグナルに該当すると考える。
【０１０６】
（４）オクテノールガスの有無による電流値変化の分布
６．５５Ｍのオクテノール溶液を１μＬ濾紙に滴下し、デバイスの横約５ｍｍ離れた位置に設置した。匂い分子の気体（ガス）に曝露している間に、以下の条件にてイオン電流を測定した：
・印加電圧６０ｍＶ
・サンプリングレート１０００〜５０００Ｈｚ
・ベッセルフィルター（ローパスフィルター）２００〜１０００Ｈｚ
・計測温度：室温
・計測時間  ０分〜２時間
【０１０７】
対照としてオクテノール無しの場合も測定した。結果は図１７に示す。測定結果は、数〜２０ｐＡ程度の電流値変化が測定され、オクテノール無しの場合、イオンチャネル閉状態が長く、０ｐＡ付近を中央として電流値変化が分布しているのに対して、オクテノールガスに曝露した場合は、イオンチャネル開状態が確認され、約１５ｐＡ付近にもピーク（下向き黒矢印）が出現していた。
【０１０８】
（５）嗅覚受容体複合体、標的物質の存在の有無による電流発生への影響
上記（４）に準じた方法にしたがって、嗅覚受容体複合体（ＯＲ）の有無、ＯＲ無リポソーム若しくはＯＲ有リポソームの有無、オクテノールの有無での信号ステップ検出頻度分布を計測した。結果を図１８に示す。表に示すように、嗅覚受容体複合体有及びオクテノール有の場合にのみ頻繁に信号が確認された。
（６）オクテノールとその類似物質との比較
【０１０９】
上記（４）に準じた方法にしたがって、標的物質としてオクテノール、対照物質としてオクテノールの類似物質であるゲラニオール、３−オクタノン、３−オクタノールを用いて、信号ステップ検出頻度（検出された信号数を計測した時間で割った値）を計測した。本発明の検出装置による標的物質に対する応答性を検討した。その結果を図１９に示す。標的としているオクテノールにのみ特異的に応答していることが分かった。
【０１１０】
（７）検出装置におけるハイドロゲルの収縮及び給水の検討
ハイドロゲルの乾燥による収縮を防止する目的で、ゲル用ウェルに給水溝（ウォーターサーバー）を併設したデバイスを作製して、評価試験をした。すなわち、厚さ４ｍｍのアクリル板上に略円柱状（底面の直径が約３ｍｍ）のウェルを穿ち、当該ウェルの上部の周囲に外壁（中間壁）を立てるように、底面がドーナツ形をした柱状の給水溝（外側の直径が約７ｍｍ。ウェルと給水溝との間にできた外壁（中間壁）にはスリットが略等間隔で４箇所に設けられ、給水溝はスリットを介してウェルと連通している。）を切削して、モデルデバイスを作製した。図２０には、ウェルに４０μＬの１％アガロースゲルを設置し、アガロースゲルが外壁（中間壁）の４箇所のスリットを介して計７０μＬの水と接している場合（給水有りの場合）と、同じモデルデバイスに同じアガロースゲルを設置して給水をしない場合（給水無しの場合）とにおける、アガロースゲルの収縮についての比較結果を示す。少なくとも３０分間以内では、給水無しの場合（２５℃、湿度約２０％にて）に０．２ｍｇ／分の減少率を呈した。一方、給水有りの場合には０．０４ｍｇ／分の減少率（水の蒸発による減少率は別途測定の上、その効果を除いて算出した。）となり、乾燥によるゲル収縮が給水によって低減されたことが確認できた。
【０１１１】
給水溝を有するダブルウェルチャンバーは以下のとおりに作製した。厚さ４ｍｍのアクリル板にドリルでダブルウェルチャンバーを穿ち、ダブルウェルチャンバーのウェル同士の間に隔壁を収納するための溝と、ダブルウェルチャンバーの一方のウェルの周囲に給水溝と、を形成した。ダブルウェルチャンバーの直径は４ｍｍ、溝の長さは６ｍｍ、幅は０．４５ｍｍ、深さ３ｍｍであった。隔壁には、直径６００μｍの貫通孔を１箇所設け、隔壁を収納するための溝に隔壁を収納した。各ウェルの底部にスルーホールを形成し、各スルーホール内にＡｇ／ＡｇＣｌペーストを充填して各ウェルの底部に電極を形成し、給水溝を有するダブルウェルチャンバーを作製した。
上記に準じた方法にしたがって、ダブルウェルチャンバーに給水溝を設け、アガロースゲルは７箇所で水と接している系を用いて、給水の有無で脂質二重膜の維持時間に差があるか顕微鏡観察にて評価した結果を図２１に示す。給水有無にかかわらず脂質二重膜は顕微鏡観察で確認できる限りではどちらも１時間近く維持していた。給水溝を設けたデバイスでの電気計測による脂質二重膜維持時間の評価結果を図２２に示す。評価基準は図２２に示したとおりである。給水の有無にかかわらず、印加電圧が上昇するに従い、電気計測上での脂質二重膜の維持時間は減少傾向にある。
以上のように、別の独立した発明の一形態として、脂質二重膜を利用した検出装置に用いられるチャンバー（セル）であって、基板と、当該基板上に穿設されたダブルウェルと、当該ダブルウェルの一方のウェルの上部の周囲に設けられた外壁（中間壁）と、当該外壁の周囲に穿設された給水部（給水溝）と、を備え、当該外壁に連通孔（スリット）が設けられていること、を特徴とする脂質二重膜検出装置用チャンバー、を提供することができた。なお、本段落以外に表れた構成は適宜本形態に流用することができる。
【符号の説明】
【０１１２】
１０…第１の領域、１１…第２の領域、１２…標的物質、１３…ハイドロゲル、１４…脂質溶液、１６…水系媒体、１８…自己支持性フィルム、２０…脂質二重膜、２１…電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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