(57)【要約】      （修正有）【課題】被験体において癌を治療するための方法、又は、腫瘍体積の減少、腫瘍増殖の阻害又は遅延、腫瘍進行の阻害、腫瘍の代謝活性の変化、腫瘍の休眠の誘発、転移の阻害又は抑制、腫瘍浸潤の阻害又は抑制、腫瘍重量の減少、腫瘍血管新生の抑制、疾患進行までの時間（ＴＤＰ）の改善、及び／又は生存率の向上を含む抗腫瘍作用を誘発する方法。【解決手段】該方法は、被験体に有効量のアンギオゲニンを投与する方法。【選択図】図１
2018100288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において抗腫瘍作用を誘発する方法であって、該被験体に有効量のアンギオゲニンを投与することを含む方法。
【請求項２】
抗腫瘍作用は、腫瘍体積の減少、腫瘍増殖の阻害又は遅延、腫瘍進行の阻害、腫瘍の代謝活性の変化、腫瘍の休眠の誘発、転移の阻害又は抑制、腫瘍浸潤の阻害又は抑制、腫瘍重量の減少、腫瘍血管新生の抑制、疾患進行までの時間（ＴＤＰ）の改善、及び／又は生存率の向上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アンギオゲニンは、必要に応じてカチオン交換でアンギオゲニンを富化させたミルク抽出物として提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験体に化学療法剤を投与するか、放射線療法を施すか、又はその両方を行うことを更に含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
被験体に化学保護剤を投与することを更に含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
アンギオゲニンを経口投与する、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アンギオゲニンを栄養補助食品として投与する、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アンギオゲニンと化学療法剤とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍増殖の阻害や腫瘍体積の減少、腫瘍進行の阻害、転移の阻害、生存率の向上を含む癌治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は異常且つ制御不能な細胞増殖を特徴とする。癌は体内の如何なる組織にも発症し得、原発組織外に転移することもある。制御不能な細胞増殖、細胞死及び他の細胞異常によって癌性腫瘍が形成されることがある。腫瘍はその原発組織の機能を妨害し、その組織を破壊することがあり、癌細胞が転移すると、一次増殖部位の近傍又はその遠隔部位で二次性腫瘍が発生することがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
利用可能な抗癌療法としては、化学療法剤や免疫療法剤、放射線への曝露、手術が挙げられるが、当該技術分野においては、癌の治療のため、更には癌の進行や腫瘍の増殖の防止のための更なる治療的アプローチに対するニーズが存在する。
【０００４】
本明細書に引用する如何なる特許や特許出願をも含む全ての文献を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。本明細書では数多くの従来文献が参照されているが、それによって、これらの文献の何れかが当該技術分野における一般常識の一部を成すことを自認するものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様は、被験体において癌を治療するための方法であって、該被験体に有効量のアンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストを投与することを含む方法を提供する。
第１の態様は、その他の形態において、被験体において癌を治療するためのアンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニスト、又は癌を治療するための薬物の製造におけるアンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストの使用を提供する。
【０００６】
第２の態様は、抗腫瘍作用を誘発する方法であって、有効量のアンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストを投与することを含む方法を提供する。
第２の態様は、その他の形態において、被験体において抗腫瘍作用を誘発するためのアンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニスト、又は抗腫瘍作用を誘発するための薬物の製造におけるアンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストの使用を提供する。
第２の態様の一実施形態において、該抗腫瘍作用は、腫瘍体積の減少、腫瘍増殖の阻害、腫瘍進行の阻害、腫瘍の代謝活性の変化、腫瘍の休眠の誘発、転移の阻害又は抑制、腫瘍浸潤の阻害又は抑制、腫瘍重量の減少、腫瘍血管新生の抑制、疾患進行までの時間（ＴＤＰ）の改善、及び生存率の向上から選択される。
第１及び第２の態様の一実施形態において、該アンギオゲニンアゴニストは、アンギオゲニンを（必要に応じてカチオン交換で）富化したミルク抽出物である。
【０００７】
本発明者らは、ウシアンギオゲニンを含む食餌を供給すると、アンギオゲニンやアンギオゲニン富化ウシ乳抽出物によって四頭筋重量が増加し、腹部脂肪パッド重量が減少することを見出した。そして、除脂肪筋肉量の増加や脂肪量の減少に果たすアンギオゲニンの役割が示されたことによって、アンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストの投与を伴う方法が、筋組織の増大が治療上有益となり得る様々な用途（例えば、家畜の生産、筋障害、一般的な健康状態や体格の改善のための用途）に適用できることを見出した。
【０００８】
アンギオゲニンは癌に関与しているため、本発明者らは、そのミルク抽出物をマウス癌モデルで試験し、その安全性プロファイルを評価した。驚くべきことに、その抽出物によってマウスモデルで腫瘍の発生が遅延し、腫瘍体積が減少することが分かった。これは特に予想外であり、従来技術の教示に反していた。従って、本発明者らは、アンギオゲニン富化ミルク抽出物、ひいてはアンギオゲニンが、腫瘍増殖を防止又は遅延させ、腫瘍サイズを制御して、癌を防止又は治療する上で有用であることをここに示す。
【０００９】
第１及び第２の態様の方法は、その幾つかの実施形態において、被験体に一以上の化学療法剤を投与するか、放射線療法を施すか、又はその両方を行うことを更に含む。
化学療法剤は、アンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストと同時に、別々に又は連続的に投与してもよく、連続的又は別々に投与する場合には如何なる順序で行ってもよい。
【００１０】
第１及び第２の態様の方法は、化学保護剤を投与することを更に含んでもよい。このような剤を特定の化学療法プログラムと共に用いて、体への化学療法の影響を低減又は最小限に抑制することができる。
第１又は第２の態様の一実施形態においては、アンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストを経口投与する。
【００１１】
第３の態様は、アンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストと化学療法剤とを含む組成物を提供する。
第１〜第３の態様のいずれかの一実施形態においては、アンギオゲニンは組換えアンギオゲニンであり、ヒト又はウシ組換えアンギオゲニンであることが好ましい。
第１〜第３の態様のいずれかの一実施形態においては、アンギオゲニンはミルク又は血漿由来、特にウシ乳由来又はウシ若しくはヒト血漿由来の富化抽出物として提供される。このような富化抽出物は、純粋なアンギオゲニンではないがアンギオゲニンを提供する点でアンギオゲニンアゴニストである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】癌誘発後のヌードマウスにおける平均腫瘍増殖に対するアンギオゲニン富化ミルク分画の補給の効果を示す。１５日目以降の腫瘍サイズの減少はマウスの安楽死に起因し、平均値の変化は群サイズの減少に起因する（体重がベースライン重量の２５％に達したとき、又は腫瘍体積が１０００ｍｍ３に達したときのうちのいずれか早い方が起こった場合、動物を安楽死させる必要があることを指示する倫理指針による）。
【図２】実施例２に従って試験したマウスの生存率を示す。
【図３】実施例３の研究デザインを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
アンギオゲニンは、血管内皮細胞や大動脈平滑筋細胞、線維芽細胞等の幾つかの増殖細胞種及び結腸癌や卵巣癌、乳癌等のある種の腫瘍によって産生される１４ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。アンギオゲニンは、正常ヒト血漿やウシ血漿、ウシ乳、マウス血清、ウサギ血清、ブタ血清等の各種原料から単離されている。
【００１４】
アンギオゲニンは膵臓リボヌクレアーゼと相同であるが、全く異なるリボ核酸分解活性を有する。アンギオゲニンは新しい血管の成長を誘発することができるが、このタンパク質によって誘発される血管新生においてアンギオゲニンのリボ核酸分解活性がどのような役割を果たしているかは未だ解明されていない。
【００１５】
アンギオゲニンは血管新生の強力な刺激剤であると共に、他の多くの活性を有することが分かっている。しかし、アンギオゲニンの癌細胞への作用に関してはこれまで何ら開示されていない。
本発明は、その一態様において癌の治療に関する。
【００１６】
「治療する（treating）」又は「治療（treatment）」とは、癌の防止、改善、抑制又は遅延（軽減）を目的とする治療的処置及び予防的措置の両方を意味する。本明細書における治療としては、腫瘍体積の減少、腫瘍増殖の阻害、腫瘍進行の阻害、腫瘍の代謝活性の変化、腫瘍の休眠の誘発、転移の阻害又は抑制、腫瘍浸潤の阻害又は抑制、腫瘍重量の減少、腫瘍血管新生の抑制、疾患進行までの時間（ＴＤＰ）の改善、及び生存率の向上が挙げられる。
また、治療することには、他の抗癌療法を用いた治療に対して癌又は癌細胞を感受性にする（或いは感受性をより高くする）ことも含まれる。
【００１７】
「防止する（preventing）」、「防止（prevention）」、「防止的（preventative）」又は「予防的（prophylactic）」とは、癌が発生しないようにすること、又は癌（異常や症状を含む）の発生を妨げるか、癌の発生から防御又は保護することを意味する。防止を必要とする被験体は、癌を発症する傾向にあるか、一以上の癌マーカーを有していてもよい。
「改善する（ameliorate）」又は「改善（amelioration）」という用語は、癌（異常や症状を含む）の減少、抑制又は除去を意味する。治療を必要とする被験体は、既に癌を有しているか、癌を有する傾向にあるか、一以上の癌マーカーを有しているか、腫瘍があると診断されているか、腫瘍を有していないか、癌が転移性又は前転移性（pre-metastatic）であってもよい。
【００１８】
「被験体」には哺乳動物が含まれる。哺乳動物はヒトであってもよく、家畜、動物園の動物、ペット又は環境貴重動物であってもよい。本発明の方法はヒトの医療に適していることが特に意図されているが、該方法は動物治療、例えば、イヌやネコ等のペット、ウマ（競走馬を含む）やウシ、ヒツジ等の家畜、ネコ科動物やイヌ科動物、ウシ科動物、有蹄動物等の動物園の動物、タスマニアデビル等の環境貴重動物の治療に用いることもできる。被験体は癌を患っていてもよく、癌を患っていなくてもよい（即ち、検出可能な疾患を患っていない）。被験体は、悪性腫瘍、癌、腫瘍、腫瘍性疾患又は腫瘍性障害を有していてもよく、そのような疾患を発症しやすくてもよい。
【００１９】
「癌」及び「癌性」という用語は、制御不能な細胞増殖を通常特徴とする哺乳動物の生理的状態を意味するか、又はそのような状態を説明するものである。本発明の方法を用いて固形腫瘍（例えば、細胞癌）の形成に伴う癌、又は血液悪性腫瘍を治療することができる。
【００２０】
本発明の方法によって治療することができる固形腫瘍の形成を伴う癌としては、細胞癌（腺癌や上皮癌等）や扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌及び大細胞癌、結腸癌、肝転移結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、腎癌、腎臓癌、膀胱癌、肝臓癌、肝細胞癌、消化管癌、直腸癌、食道癌、膵臓癌、胃癌、婦人科癌（子宮頸癌や外陰癌、子宮癌、子宮内膜癌等）、前立腺癌、精巣癌、上咽頭癌、甲状腺癌、甲状腺乳頭癌、頭部、頸部又は脳癌、神経系癌（神経芽細胞腫等）、皮膚癌（メラノーマ等）、肉腫（骨肉腫やユーイング肉腫等）、神経膠芽腫、唾液腺癌が挙げられる。
【００２１】
血液悪性腫瘍は血液、骨髄及びリンパ節に影響を及ぼす癌であり、その例としては白血病やリンパ腫、骨髄腫が挙げられる。このような悪性腫瘍は通常、非固形腫瘍又は非固形腫瘤の形成を伴う。
本発明の方法によって治療することができる血液悪性腫瘍としては、白血病（急性リンパ性白血病や慢性リンパ球白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、白血病性細網内皮症、骨髄性白血病等）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫、成熟Ｂ細胞腫瘍、成熟Ｔ細胞腫瘍、ナチュラルキラー細胞腫瘍、免疫不全関連リンパ増殖性障害、組織球性腫瘍、樹状細胞腫瘍等）、骨髄腫（多発性骨髄腫等）が挙げられる。
【００２２】
癌はステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶまで進行し得る。
アンギオゲニンの配列及び機能は生物種を超えて高度に保存されるため、本発明の方法は、ミオスタチンの存在が望ましくない病理学的影響の原因若しくは一因となるか又はミオスタチンレベルを低下させることで治療効果が得られる、ヒト以外の哺乳動物又は鳥類（例えば、家畜（例えば、イヌやネコ）、競技用動物（例えば、ウマ）、食用動物（例えば、ウシやブタ、ヒツジ）、鳥類（例えば、ニワトリやシチメンチョウ、他の狩猟鳥又は家禽））にも適用可能である。
アンギオゲニン又はアンギオゲニンアゴニストは、医薬、獣医学的若しくは栄養補助食品組成物又は食品として提供してもよい。
【００２３】
医薬組成物はヒトに投与するのに適したものである。獣医学的組成物は動物に投与するのに適したものである。一般に、この種の組成物は、精製されたアンギオゲニンやアンギオゲニンアゴニストを含むか又は最低でも組成物の全成分を確認することができるであろう。
第１及び第２の態様の方法に用いられる組成物は、一以上の担体と必要に応じて他の治療剤を含むことができる。各担体、希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤は、医薬的に「許容される」ものとすることができる。
【００２４】
「医薬的に許容される担体」とは、生物学的にもそれ以外の点でも望ましくないものではない材料を意味する。即ち、この材料は、選択された有効成分と共に個体に投与することができ、それを含有する医薬組成物中の他の成分の何れとも望ましくない生物学的効果をもたらすことも、有害な機構で相互作用もすることもない。同様に、本発明において提供される新規化合物の「医薬的に許容される」塩又はエステルは、生物学的にもそれ以外の点でも望ましくないものではない塩又はエステルである。
【００２５】
本明細書において「医薬担体」とは、剤を被験体に送達するための医薬的に許容される溶媒、懸濁剤又はビヒクルである。担体は、液体でも固体でもよく、意図された投与計画に合わせて選択される。各担体は、生物学的又はそれ以外の点で望ましくないものではないという意味で、医薬的に「許容される」ものでなければならない。即ちこの担体は、有害な反応を全く又は実質的に引き起こすことなく剤と共に被験体に投与することができる。
【００２６】
本発明の組成物は経口、局所、非経口の各経路で投与することができ、通常の非毒性の医薬的に許容される担体、添加剤、ビヒクルを含む処方とすることができる。
【００２７】
本明細書で用いられる「非経口」としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、結膜下、腔内、経皮、皮下注射、肺又は鼻腔投与用エアロゾル、又は点滴投与（例えば、浸透圧ポンプによる）が挙げられる。
【００２８】
本発明の組成物は、錠剤、水中若しくは油中懸濁液、ロゼンジ剤、トローチ剤、散剤、顆粒剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤又はエリキシル剤として経口投与することができる。経口用の組成物は、医薬的に洗練された風味のよい製剤を製造するための、甘味剤、風味剤、着色剤及び防腐剤の群から選択される１種以上の剤を含むことができる。好適な甘味剤としては、スクロースやラクトース、グルコース、アスパルテーム、サッカリンが挙げられる。好適な崩壊剤としては、コーンスターチやメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸、寒天が挙げられる。好適な風味剤としては、ハッカ油やウインターグリーン油、チェリー、オレンジ、ラズベリーの各風味剤が挙げられる。好適な防腐剤としては、安息香酸ナトリウムやビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、重亜硫酸ナトリウムが挙げられる。好適な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウムやステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、タルクが挙げられる。好適な徐放剤としては、モノステアリン酸グリセリルやジステアリン酸グリセリルが挙げられる。錠剤に関しては、錠剤の製造に好適な医薬的に許容される非毒性の補形剤との混合物中に当該剤を含むことができる。
【００２９】
これらの補形剤は、例えば、（１）炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の不活性希釈剤、（２）コーンスターチ、アルギン酸等の造粒・崩壊剤、（３）デンプン、ゼラチン、アラビアゴム等の結合剤及び（４）ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク等の滑沢剤であることができる。これらの錠剤は、コーティングされていなくても、或いは崩壊及び胃腸管への吸収を遅延させることによって長期間に亘り徐放作用が得られるように公知の技法でコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルやジステアリン酸グリセリル等の徐放材料を用いることができる。本剤はカプセル化、マイクロカプセル化することができ、ナノ粒子に含有させることもできる。
【００３０】
非経口投与用の製剤としては、無菌の水性又は非水性液剤、懸濁剤及び乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油等）及び注射可能な有機エステル（オレイン酸エチル等）が挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、乳化液及び懸濁液が挙げられ、これらは生理食塩水及び緩衝化された媒体を含む。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液やデキストロース加リンゲル液、デキストロ−ス及び塩化ナトリウムが挙げられ、乳酸リンゲル静注用ビヒクルは水分（fluid）と栄養補給剤と電解質補給剤（デキストロース加リンゲル液をベースとするものなど）等を含む。防腐剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、成長因子、不活性ガス等も存在させることができる。
【００３１】
本組成物は、治療的機能を補足、付加及び向上するための他の活性化合物も含むことができる。本医薬組成物はまた、投与説明書と共に、容器、パック、ディスペンサーに収容することができる。
【００３２】
第１及び第２の態様の方法及び第３の態様の組成物と共に用いるのに適した化学療法剤としては、例えば、アルキル化剤やニトロソ尿素、代謝拮抗剤、アントラサイクリン及び関連薬物、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、コルチコステロイドホルモン、微小管毒が挙げられる。
アルキル化剤としては次のものが挙げられる。
・マスタードガス誘導体：メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン及びイホスファミド
・エチレンイミン類：チオテパ及びヘキサメチルメラミン
・アルキルスルホネート類：ブスルファン
・ヒドラジン類及びトリアジン類：アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン及びテモゾロミド
・ニトロソ尿素類：カルムスチン、ロムスチン及びストレプトゾシン
・金属塩：カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン
植物アルカロイドとしては以下のものが挙げられる。
・ビンカアルカロイド類：ビンクリスチン、ビンブラスチン及びビノレルビン
・タキサン類：パクリタキセル及びドセタキセル
・ポドフィロトキシン類：エトポシド及びテニポシド
・カンプトテカン類似体：イリノテカン及びトポテカン
抗腫瘍抗生物質としては以下のものが挙げられる。
・アントラサイクリン類：ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン及びイダルビシン
・クロモマイシン類：ダクチノマイシン及びプリカマイシン
・その他：マイトマイシン及びブレオマイシン
代謝拮抗剤としては次のものが挙げられる。
・葉酸拮抗剤：メトトレキサート
・ピリミジン拮抗剤：５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、カペシタビン及びゲムシタビン
・プリン拮抗剤：６−メルカプトプリン及び６−チオグアニン
・アデノシンデアミナーゼ阻害剤：クラドリビン、フルダラビン、ネララビン及びペントスタチン
トポイソメラーゼ阻害剤としては以下のものが挙げられる。
・トポイソメラーゼＩ阻害剤：イリノテカン、トポテカン
・トポイソメラーゼＩＩ阻害剤：アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド及びテニポシド
種々の抗悪性腫瘍剤としては次のものが挙げられる。
・リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤：ヒドロキシ尿素、副腎皮質ステロイド阻害剤：ミトタン
・酵素：アスパラギナーゼ及びペグアスパルガーゼ
・微小管阻害剤：エストラムスチン
・レチノイド類：ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ）
【００３３】
上述の化学療法剤に加え、他の多くの化学療法（例えば、癌分子標的療法や免疫療法、ホルモン療法）が存在するが、このような療法に用いる剤も本明細書に記載の「化学療法剤」の定義の範囲内である。
【００３４】
癌分子標的療法としては以下のものが挙げられる。
・シグナル伝達阻害剤：メシル酸イマチニブ（タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤）、ゲフィチニブ（上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤：ＥＧＦＲ−ＴＫ）、セツキシマブ（上皮増殖因子受容体）、ラパチニブ（上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）及びヒト上皮受容体２型（ＨＥＲ２）チロシンキナーゼ阻害剤
・生物反応修飾剤：デニロイキンジフチトクス
・プロテアソーム阻害剤：ボルテゾミブ
モノクローナル抗体：アレムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トラスツズマブ、イブリツモマブ、ベバシズマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ及びチウキセタン
免疫療法としては次のものが挙げられる。
・サイトカイン類：インターロイキン類及びインターフェロン
・コロニー刺激因子
・腫瘍ワクチン
ホルモン療法としては次のものが挙げられる。
・副腎ステロイド阻害剤：アミノグルテチミド、ミトタン
・アンドロゲン類：フルオキシメステロン、テストステロン、テストラクトン
・抗アンドロゲン剤：ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド
・抗エストロゲン剤：タモキシフェン、トレミフェン
・アロマターゼ阻害剤：アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール
・エストロゲン類：ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール（エストラセ）、プレマリン
・ＬＨＲＨアゴニスト：酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、パモ酸トリプトレリン
・プロゲステロン作用剤：酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メゲストロール、プロゲスチン
・選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）：ラロキシフェン
【００３５】
アンギオゲニン又はアンギオゲニン含有組成物は単回投与であってもよく、１日１回や週１回、月１回等の間隔で投与してもよい。
投与スケジュールは、アンギオゲニン又はそのアゴニストの半減期、又は患者の病態の重篤度に応じて調整することができる。
一般には、組成物の投与をボーラス投与で行ってアンギオゲニンの循環レベルを最大限にし、投与後の期間を最長にする。ボーラス投与後に持続点滴を行うこともできる。
【００３６】
上述の方法においては、栄養補助食品を用いてアンギオゲニンを提供することも意図されている。上述の方法において用いられる栄養補助食品が提供される。
本明細書において「栄養補助食品」とは、食品から単離・精製される可食製品を意味する。ミルク製品から得られる場合には、経口投与した際に生理的利点を示し、また急性・慢性の疾患又は障害の防止又は軽減を提供することを示す製品である。従って、栄養補助食品は、単独或いは食品・飲料に混合されて、食物製剤又はサプリメントの形態とすることができる。
【００３７】
栄養補助食品組成物は、水溶性粉末、液体又は即席飲料の形態とすることができる。また、手軽に食べられるバーや朝食シリアル等の固形食品とすることができる。この組成物は種々のフレーバー、ファイバー、甘味料、他の添加物等を含むことができる。
【００３８】
栄養補助食品は、好ましくは満足できる官能的性質（許容される香り、味、風味等）を有し、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１１、Ｂ１２、ビオチン、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ及びＫ、カルシウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛及び鉄から選択される一以上のビタミン及び／又はミネラルを更に含むことができる。
【００３９】
栄養補助食品組成物は従来通りに、例えばタンパク質と他の添加物をブレンドして製造することができる。必要であれば、乳化剤を含有させることもできる。この時点でビタミン及びミネラルを追加することもできるが、通常は熱による変性を避けるために後で加える。
【００４０】
粉末状の栄養補助食品組成物を製造したい場合、タンパク質を粉末状の追加成分と混和することができる。この粉末は水分量約５重量％未満でなければならない。水、好ましくは逆浸透処理済の水を更に混合して混合液体とすることができる。
栄養補助食品組成物を即席液体として提供する場合、バクテリア量を低減するために組成物を加熱することができる。液状の栄養補助食品組成物を製造したい場合、液体混合物を好ましくは無菌状態で適切な容器に充填する。容器への無菌充填は当業界で通常可能な技法により行うことができる。この種の無菌充填に好適な装置は市販されている。
【００４１】
好ましくは、本組成物は一以上の医薬的に許容される担体、希釈剤又は補形剤を含むこともできる。栄養補助食品組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等のバッファー；グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン等の炭水化物；マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；及び補助剤及び保存剤を含むことができる。
本栄養補助食品は、乳児用調製物、特に、乳児に投与するために母乳に近づけた調整乳とすることができる。
【００４２】
本発明の方法に使用されるアンギオゲニンはいかなる原料からも得ることができる。この原料は天然、合成或いは組換体であることができる。組換えアンギオゲニンは、ヒト、雌ウシ、ヒツジ、マウス等のいかなる生物種のアンギオゲニン配列にも基づくことができる。組換えヒトアンギオゲニンは、Ｒ＆Ｄシステムズ社より入手可能である。
アンギオゲニンは、正常なヒト血漿、ウシ血漿、ウシ乳、ウシ血漿、マウス血清、ウサギ血清及びブタ血清中に存在することが知られている。少なくともヒトアンギオゲニンのＤＮＡ配列及びタンパク質配列が入手可能であり、組換えヒトアンギオゲニンはアブノバ・コーポレーション社（台湾）より小規模用途用に市販されている。
【００４３】
一実施形態においてアンギオゲニンは、商業的に容易に入手可能なアンギオゲニンの原料としての家畜動物の血漿又はミルクから調製される。
ミルクは、授乳中の動物、例えば、ウシ、ヒツジ、スイギュウ、ヤギ、シカ等の反芻動物、ヒト等の霊長類及びブタ等の単胃動物等の非反芻動物のいずれかから得ることができる。好ましい実施形態においては、アンギオゲニンは牛乳から抽出される。アンギオゲニンを産生する動物は、その乳中でアンギオゲニンを過剰発現するように設計されたトランスジェニック動物であってもよい。
【００４４】
本発明者らは、泌乳の初日〜１４日以内のウシ乳中にアンギオゲニンが最大量又は最も濃厚な量（最高で１２ｍｇ／Ｌ）で存在することを示した。その後、濃度は約１〜２ｍｇ／Ｌのベースレベルまで低下する。従って、本発明の方法においては泌乳の最初の１４日目以内に得られる牛乳をアンギオゲニン原料として第１〜第１１の態様の方法において用いることが好ましい。その後の泌乳から得られた牛乳に残留しているアンギオゲニンの量を考えると、これでも本発明の方法の原料として使用することができる。
【００４５】
本発明の方法に使用されるアンギオゲニン及び本発明組成物は単離又は精製することができる。精製又は単離されたアンギオゲニンは、天然の状態で共に存在する少なくとも１種の剤又は化合物を実質的に含まない。例えば、単離されたタンパク質は、少なくともその起源となる細胞や組織原料に由来する何らかの細胞性物質又は混入タンパク質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」というのは、アンギオゲニンの純度が少なくとも５０〜５９％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０〜６９％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０〜７９％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０〜８９％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０〜９５％、又は少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（ｗ／ｗ）である調製物を意味する。
【００４６】
バクテリア中で調製された組換えアンギオゲニンをアンギオゲニン原料として使用することができ、これをタンパク質凝集体の形態で提供することができる。
ウシ乳は何百年もの間食品として用いられてきたの天然産物であり、栄養補助食品として使用されるアンギオゲニンが完全に純粋である必要はない。しかしながら、投与される組成物の量を低減させるためには、アンギオゲニンをミルク中の濃度よりもかなり濃縮することが好ましい。アンギオゲニンは、ミルク中の濃度の少なくとも１０倍の濃度、より好ましくはミルク中の濃度の２０、３０、４０又は５０倍の濃度で投与されることが好ましい。
【００４７】
アンギオゲニンが食品として提供される場合、食品サプリメント、栄養製剤、スポーツ栄養サプリメント又は乳児用粉乳の形態をとることができる。
【００４８】
当業者であればウシアンギオゲニンの突然変異体が天然に存在し、これを製造できることを理解するであろう。本発明はこの種の変異体の使用も意図している。
【００４９】
当業者であれば、アンギオゲニンがその生物学的性質を変えることなくアミノ酸配列中に任意の数の保存的変異を含み得ることを認識するであろう。このような保存的なアミノ酸修飾は、アミノ酸側鎖置換基が疎水性、親水性、電荷、サイズ等に関し比較的類似していることに基づいている。種々の前述の特徴を考慮した保存的置換の例は当業者に知られており、アルギニン−リジン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩、セリン−トレオニン、グルタミン−アスパラギン及びバリン−ロイシン−イソロイシンが挙げられる。
【００５０】
本発明はまた、アンギオゲニンの変異体、類縁体又はフラグメントの使用も含む。例えば、アンギオゲニンの核酸配列又はアミノ酸配列は、天然のタンパク質の核酸又はアミノ酸と同一の配列を少なくとも７０％〜７９％、少なくとも８０％〜８９％、少なくとも９０％〜９５％又は少なくとも９６％〜１００％含むことができる。
【００５１】
当業者であれば、アンギオゲニンヌクレオチド及びアミノ酸配列のホモログを設計することが可能な多くのソフトウェアパッケージ、例えば「ＢＬＡＳＴ」プログラム又は他の好適なパッケージを非常によく理解しているであろう。
当業者は、アンギオゲニンの活性に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質構造において特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換してもよいことを理解するであろう。従って、本発明者らは、明らかな生物学的有用性又は活性を損なうことなくアンギオゲニンのアミノ酸配列に種々の改変を導入することができることを想定している。このような改変としては、欠失、挿入、トランケート、置換、融合、モチーフ配列の組換え等が挙げられるであろう。
【００５２】
更にアンギオゲニンを、例えばグリコシル化、循環半減期を延長するための高分子との複合体化、ＰＥＧ化又は他の化学修飾によって修飾することができる。この種の修飾されたタンパク質を本発明の方法に使用することも想定されている。
【００５３】
当業者は、使用されるアンギオゲニンを貯蔵安定性、生理活性、循環半減期の改善又は他のいずれかの目的で、当該技術分野において利用可能な方法を用いて修飾することができることを理解するであろう。例えば、貯蔵安定性を改善するために修飾を導入することが望ましいであろう。しかしながら、アンギオゲニンは分解に対する耐性が特に高いためこのような修飾は必ずしも必要ないと思われる。
【００５４】
本発明は、アンギオゲニンのアゴニストに関する。アゴニストはアンギオゲニンによって活性化される受容体を介して直接的又は間接的な作用をもたらすことができる化合物である。好ましくは、アンギオゲニンアゴニストはアンギオゲニン受容体を介して作用し、好ましくはこの受容体に結合する。当業者は、アンギオゲニンのアゴニストを設計する方法を理解しているであろう。好適なアゴニストとしては、アンギオゲニンアゴニスト抗体及び擬似化合物が挙げられる。
【００５５】
アンギオゲニン、そのアゴニスト及び変異体は、本発明の方法に使用するための医薬品の製造に使用することができる。
本発明の方法及び使用の好ましい実施形態においては、アンギオゲニンは経口的に、特に、ミルク若しくは血漿由来のアンギオゲニン富化抽出物の形態又は組換えアンギオゲニンの形態で投与される。
【００５６】
特に、経口投与されるアンギオゲニンは牛乳又はその分画から、例えば実施例１に記載するプロセスを利用して調製される。このような分画は、腸内で実質的に分解されることなく全身に作用することができるアンギオゲニンを提供することがわかっている。このような分画は、アンギオゲニンのバイオアベイラビリティを増大させるための担体又は他の機構を用いることなく経口的に提供することができる。
【００５７】
本明細書において特に断らない限り「含む（comprise、comprises、comprising等）」とは、述べられている一構成要素や一完全体、或いは構成要素群や完全体群を含むが、その他の一構成要素や一完全体、或いは構成要素群や完全体群を排除するものではないことを意味すると解釈されたい。
本明細書においては、文脈上明確に断らない限り単数表現（a、an及びtheを伴う）は複数概念も含むことを付記する。
【００５８】
本発明についての明確さと理解し易さの目的で、ある程度詳細な説明をしているが、本明細書に開示される発明概念の範囲を逸脱しない限り、記載される実施形態及び方法の変形や改変が可能なことは当業者には明白であろう。
【００５９】
以下、実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが、これは単に例示の目的に提供されるものであって、特に断らない限り本発明は実施例に限定するとは解釈されない。従って、本発明は、ここに提供される教示の結果明白となる全てのいかなる変形例も包含する。
【００６０】
実施例１ａ：スキムミルクからのアンギオゲニン富化分画の調製プロセス
１０ｃｍ長のカラムにＳＰセファロースビッグビーズ（ＧＥヘルスケア社製）をカラム中の全ベッド体積が２９．７Ｌとなるように充填した。ウシスキムミルクを線流量が３３１ｃｍ／時（スキムミルク３４Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）で２時間カラムに流通させ、適用したスキムミルクの体積がカラムに充填した樹脂の６８倍となるようにした。
【００６１】
２．５カラム体積（ＣＶ）の水を線流量１４７ｃｍ／時（バッファー１５Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．２５ＣＶ／分で１０分間加えることにより、カラムに残存するミルクを除去した。
【００６２】
アンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画は、２．０％（０．３４Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）２．５ＣＶを用いてカラムから溶出させた。このカチオンバッファー溶液は、線流量７５ｃｍ／時（カチオンバッファー溶液７．５Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．１２５ＣＶ／分で２０分間流通させた。最初に樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を廃棄排出し、樹脂１Ｌ当たり２．５Ｌの次のカチオンバッファー溶液を回収してアンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画（樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を含み、次のバッファーの適用時間（ブレイクスルー時間）は重複する）とした。
【００６３】
次いで、アンギオゲニン富化分画を、２．５％ｗ／ｖ（０．４３Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）２．５ＣＶを用いてカラムから溶出させた。このカチオンバッファー溶液は、線流量７５ｃｍ／時（カチオンバッファー溶液７．５Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．１２５ＣＶ／分で２０分間流通させた。最初に樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を廃棄排出し、樹脂１Ｌ当たり２．５Ｌの次のカチオンバッファー溶液を回収してアンギオゲニン富化分画（樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を含み、次のバッファーの適用時間は重複する）とした。
【００６４】
最後にラクトフェリン分画を、８．７５％ｗ／ｖ（１．５Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）２．５ＣＶを用いてカラムから溶出させた。このカチオンバッファー溶液は、線流量７５ｃｍ／時（カチオンバッファー溶液７．５Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．１２５ＣＶ／分で２０分間流通させた。最初に樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を廃棄排出し、樹脂１Ｌ当たり２．５Ｌの次のカチオンバッファー溶液を回収してラクトフェリン分画とした。
【００６５】
回収されたアンギオゲニン富化分画は限外ろ過（ＮＭＷＣＯ  ５ｋＤａ）して濃縮し且つ塩分を低減させた。得られた濃縮物を凍結乾燥し、室温で貯蔵し、次の使用に供した。
アンギオゲニン富化分画のアンギオゲニン含有量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、この分画は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳによってアンギオゲニンと同定された（結果は示さず）低分子量（１４ｋＤａ）タンパク質を５７％（タンパク質基準）含むことがわかった。この分画をＮａｔｒａＧｕａｒｄと称する。
【００６６】
当業者であれば、他の原料に由来或いは他の手段で精製したアンギオゲニンも本発明の方法に使用できることを理解するであろう。
【００６７】
実施例１ｂ：スキムミルクからのアンギオゲニン富化分画の調製プロセス
スキムミルクを用いて成長因子を含むミルク分画を得た。ＳＰ（スルホプロピル）セファロースを充填したカラムにスキムミルクを流通させた。ミルクの体積はカラムに充填した樹脂の１２０倍までとした。低イオン強度（＜０．００８Ｍ  ＮａＣｌ又は相当物）のバッファーを１０分間加えることにより、カラムに残存するミルクを除去した。成長因子分画は、０．４〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ（他のカチオンが適切でもあるが）相当のナトリウムイオンを含むバッファーを用いてカラムから溶離した。最も好ましくは０．４Ｍ  ＮａＣｌである。ｐＨの範囲が５．５〜７．５で最大収率を達成した。
【００６８】
１０ｃｍ長のカラムにＳＰセファロースビッグビーズ（ＧＥヘルスケア社製）をカラム中の全ベッド体積が２９．７Ｌとなるように充填した。１％〜１．５％のタンパク質を含む成長因子分画（必要であればリン酸クエン酸バッファーにてｐＨ６．５に調整）をカラムに流通させた。該分画は線流量が３９３ｃｍ／時（ＷＧＦＥ４０Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）で８分間カラムに流通させ、適用したスキムミルクの体積がカラムに充填した樹脂の５．４倍となるようにした。
【００６９】
アンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画は、２．０％（０．３４Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）１０．８ＣＶを用いてカラムから溶出させた。このカチオンバッファー溶液は、線流量３９３ｃｍ／時（カチオンバッファー溶液４０Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．６７ＣＶ／分で１６分間流通させた。
アンギオゲニン富化ラクトペルオキシダーゼ分画は、２．５％ｗ／ｖ（０．４３Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）５．４ＣＶを用いてカラムから溶出させた。このバッファーは、線流量３９３ｃｍ／時（カチオンバッファー溶液４０Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．６７ＣＶ／分で８分間流通させた。
【００７０】
最後にラクトフェリン分画を、８．７５％ｗ／ｖ（１．５Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）５．４ＣＶを用いてカラムから溶出させた。このカチオンバッファー溶液は、線流量３９３ｃｍ／時（カチオンバッファー溶液４０Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．６７ＣＶ／分で８分間流通させた。
回収されたアンギオゲニン富化分画は限外ろ過（ＮＭＷＣＯ  ５ｋＤａ）して濃縮し且つ塩分を低減させた。更にスパイラル状に巻いた０．１μｍフィルターでミクロ濾過してマイクロビーズを除去し、限外ろ過（ＮＭＷＣＯ  ５ｋＤａ）して最終的に濃縮した。得られた濃縮物を凍結乾燥し、４〜８℃で貯蔵し、次の使用に供した。
【００７１】
アンギオゲニン富化分画のアンギオゲニン含有量をカチオン交換ＨＰＬＣで分析したところ、この分画は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳによってアンギオゲニンと同定された（結果は示さず）低分子量（１４ｋＤａ）タンパク質を３９．４％（タンパク質基準）含むことがわかった。この分画をＮａｔｒａＧｕａｒｄと称する。
【００７２】
当業者であれば、他の原料に由来或いは他の手段で精製したアンギオゲニンも本発明の方法に使用できることを理解するであろう。
【００７３】
実施例２：
実施例１ｂに記載の方法に従ってウシスキムミルクから調製した富化抽出物としてアンギオゲニンを用意した。
【００７４】
８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕヌードマウス（動物資源センター、西オーストラリア州）を１週間気候順応させた後、癌細胞株の注入を行った。標準的な固形飼料と水を自由に摂取させた。実験期間を通じて飼料と水を秤量し、癌対照群における重量減少がカロリー摂取量の低下によるものではないようにした。マウスを無作為に重量対応の３種類の群、即ち、癌治療を行わない群（対照）、６０μｇ／飼料（ｇ）のＮａｔｒａＧｕａｒｄを含む食餌を補給した癌の群（６０μｇＮａｔｒａＧｕａｒｄ）、及び３００μｇ／飼料（ｇ）のＮａｔｒａＧｕａｒｄを含む食餌を補給した癌の群（３００μｇＮａｔｒａＧｕａｒｄ）に分けた。
【００７５】
腫瘍を発生させるマウス腺癌（ＭＡＣ）細胞株１６（ＭＡＣ１６）を１０％ＦＢＳ及び０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン）を添加したＲＰＭＩ中で培養した。加湿インキュベータ内で３７℃、１０％ＣＯ２の条件下、細胞を維持した。細胞を８０％コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン処理によって細胞培養フラスコから取り出した。これらの細胞を５００×ｇで５分間、４℃で遠心分離し、増殖培地から単離した。その後、３７℃までプレインキュベートさせた滅菌ＰＢＳに細胞を再懸濁させ、２５ゲージ針を有する滅菌シリンジ内に吸引した後、マウスに注入した。マウスの腫瘍体積はノギスを用いて測定した。対照群での重量減少が初期重量の２５％に達する前、又は腫瘍増殖が１０００ｍｍ３を超える前にマウスを安楽死させた。組織を回収し、直ぐに液体窒素に入れた後、−８０℃の冷凍庫で保存して解析に備えた。
【００７６】
本研究は、ある種の癌を有するマウスにＮａｔｒａＧｕａｒｄを摂取させる最初の研究である。従って、ＮａｔｒａＧｕａｒｄの補給によってマウスで腫瘍増殖が促進されたり、他の負の健康的影響が生じたりしないようにすることが重要であった。
【００７７】
ＮａｔｒａＧｕａｒｄの補給は、マウスモデルにおける癌の誘発には影響を及ぼさなかった（表１）。ＭＡＣ１６細胞注入部位での目に見える腫瘍又は触知可能な腫瘍は、対照マウスでは１２．２±１．０日目までに、６０μｇのＮａｔｒａＧｕａｒｄを補給したマウスでは１３．３±１．６日目までに、３００μｇのＮａｔｒａＧｕａｒｄを補給したマウスでは１４．３±２．６日目までに検出された。同様に、ＮａｔｒａＧｕａｒｄの補給は、腫瘍の増殖率にも影響を及ぼさなかった（図１）。最終平均腫瘍サイズはこれらの群の間で差がなく（表１）、３１３±１８７ｍｍ３（悪液質）、４１２±８８ｍｍ３（６０μｇＮａｔｒａＧｕａｒｄ）及び３３４±１１４ｍｍ３（３００μｇＮａｔｒａＧｕａｒｄ）であった。いずれの群においても転移は存在しなかった。
【００７８】
【表１】
2018100288.tif 000003
【００７９】
これらの結果から、ＮａｔｒａＧｕａｒｄ（即ち、実施例１ｂに記載の方法で調製したアンギオゲニン富化ウシ乳抽出物）は、対照と比較していずれの用量においても寿命を延ばすことができ（生存率、図２参照）、腫瘍の発生を遅延させることができることが示唆される。
【００８０】
実施例３：
マウス腺癌１６（ＭＡＣ１６）細胞株をマウスに注入した後、無作為に３種類の群、即ち、癌性悪液質の群（対照）、３００μｇ／飼料（ｇ）のＮａｔｒａＧｕａｒｄを含む食餌の補給を癌の誘発時に開始した癌性悪液質の群（誘発）、及び３００μｇ／飼料（ｇ）のＮａｔｒａＧｕａｒｄを含む食餌の補給を腫瘍が最初に検出可能になった時点で開始した癌性悪液質の群（腫瘍）に分けた。体重の変化、ノギスで測定した腫瘍サイズ、飼料摂取及び水摂取に関してマウスを毎日モニターした。癌誘発後０日目、１２日目、２１日目及び２９日目のマウス対してナトリウムペントバルビタールを注射（３０ｍｇ／ｋｇ）して死亡させた。また、重量減少が２５％に達するか、腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に達した時点（いずれか早い方）で各治療群の１０匹のマウスも同様に死亡させた。心臓と共に筋組織（腓腹筋や四頭筋を含む）を取り出して秤量した。全ての試料をスナップ凍結させて−８０℃で保存した。研究デザインを図３に要約する。
【００８１】
ＮａｔｒａＧｕａｒｄの癌誘発への影響
癌誘発時からＮａｔｒａＧｕａｒｄを補給した場合、対照群や腫瘍群と比べて、最初に検出可能となる腫瘍の発生が有意に２日間遅延した（表２、Ｐ＜０．００５）。最終平均腫瘍サイズはこれらの群の間で差がなかった（表２）。いずれの群においても転移は存在しなかった。
【００８２】
【表２】
2018100288.tif 000004
【００８３】
癌誘発時から３００μｇ／飼料（ｇ）の用量でＮａｔｒａＧｕａｒｄを補給すると、腫瘍発生の開始が遅延し、最終腫瘍サイズが減少した。
【図１】
2018100288.tif 000005
【図２】
2018100288.tif 000006
【図３】
2018100288.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月14日(2018.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンギオゲニンを有効成分とする、被験体における腫瘍の発生を遅延させるための抗腫瘍剤。
【請求項２】
アンギオゲニンが、ミルク抽出物として経口投与される、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記ミルク抽出物が、アンギオゲニンを３９．４〜５７％含む、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
前記腫瘍が腺癌である、請求項１から３のいずれかに記載の抗腫瘍剤。