(57)【要約】【課題】測定時ごと（分析チップごと）に標準濃度溶液による測定を必要とすることなく、使用材料である抗体のロット間差や、製造工程のバラつきによるチップの個体差の影響を抑え、コルチゾール濃度を再現性良く測定することのできるコルチゾール濃度の測定用分析チップおよびそれを用いた測定方法の提供。【解決手段】複数の作用極を含む電気化学測定によるコルチゾール濃度分析チップであって、少なくとも１つの作用極がコルチゾール抗体で修飾された測定用作用極であり、別の少なくとも１つの作用極が、コルチゾール抗体で修飾され、かつコルチゾールを該コルチゾール抗体に飽和状態になるまで結合させた補正用作用極であるコルチゾール濃度分析チップを用い、測定用作用極と補正用作用極のそれぞれの測定値の差分からコルチゾール濃度を測定する。【選択図】図１
2018071995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の作用極を含む電気化学測定によるコルチゾール濃度分析チップであって、
少なくとも１つの作用極がコルチゾール抗体で修飾された測定用作用極であり、
別の少なくとも１つの作用極が、コルチゾール抗体で修飾され、かつコルチゾールを該コルチゾール抗体に飽和状態になるまで結合させた補正用作用極である
コルチゾール濃度分析チップ。
【請求項２】
請求項１記載のコルチゾール濃度分析チップの作用極上に測定対象の生体試料を供給する工程、
一定時間静置し、測定用作用極上のコルチゾール抗体と生体試料中のコルチゾールとの抗原抗体反応を進行させる工程、
測定用作用極および補正用作用極についてそれぞれ電気化学分析測定を行う工程、および
得られた測定値の差分から生体試料中のコルチゾール濃度を求める工程
を含むコルチゾール濃度の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コルチゾールの濃度測定用の分析チップおよびそれを用いたコルチゾール濃度の測定方法に関する。より詳細には、抗原抗体反応を利用して電気化学的に生体試料中のコルチゾール濃度を測定するための分析チップおよびそれを用いたコルチゾール濃度の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コルチゾールは副腎皮質ホルモンの１つであり、唾液、血液、尿などに含まれ、ストレス応答により濃度変動することが知られており、典型的なストレス指標として認知されている。
【０００３】
生体試料中のコルチゾール濃度を測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、電気化学分析などの一般的な分析方法を利用することができる。ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳおよびＥＬＩＳＡは、測定感度が高く定量に適しているが、測定には時間、コストさらには手間がかかり過ぎるという問題がある。この問題を解決する方法として、測定が容易で、装置にコストがかからない電気化学分析が行われている。
【０００４】
電気化学分析では、表面に自己組織化単分子膜等を介してコルチゾール抗体を修飾させた作用極を形成した電気化学分析チップを血液や唾液などの生体液試料に浸漬し、生体液試料中のコルチゾールとの抗原抗体反応の前後で電気化学分析を行い、その出力値の差分からコルチゾール濃度を測定する方法が一般的に利用されている。図３は、標準的な従来の電気化学分析チップの一例の平面図であり、図４はそのＢ−Ｂ断面の説明図である。
【０００５】
また、特許文献１では、コルチゾール濃度を高感度に測定できる方法として、コルチゾール抗体が自己組織化単分子膜などの単分子膜を介して固定化されたくし型電極を備えたセンサチップに、測定試料とペルオキシダーゼ酵素をコルチゾールに標識した酵素標識抗原を含む溶液を滴下して競合させ、基質溶液を添加する、酸化電流測定による電気化学イムノアッセイが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−００２４３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、従来の図３および図４に示す電気化学分析チップや、特許文献１に記載されたくし型電極を用いた分析チップでは、電極に抗体を修飾しており、抗体のロット間差、製造工程のわずかな変動により電気化学分析の出力が変動するため測定値の信頼性および再現性に問題がある。よって、コルチゾール濃度に変換する際には、事前にコルチゾール非含有の標準溶液を測定し、次に同じ電極で測定対象の生体試料を測定し、それらの測定値を比較して、その変位から濃度に換算するか、あるいは同時に作製した２つの分析チップで標準溶液と測定対象の生体試料を電気化学測定し、その差分から濃度に換算する必要があり、手間とコストがかかるという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、測定時ごと（分析チップごと）に標準濃度溶液による測定を必要とすることなく、使用材料である抗体のロット間差や、製造工程のバラつきによるチップの個体差の影響を抑え、コルチゾール濃度を再現性良く測定することのできるコルチゾール濃度の測定用分析チップおよびそれを用いた測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するため、図１に示すように分析チップ１００上に複数の作用極（測定用作用極１と補正用作用極２）を形成したチップを用いることにより、標準濃度溶液の測定を測定時ごと（分析チップごと）に行うことなく、検査試料に対する測定用作用極１の測定値および補正用作用極２の測定値の差分から事前に求めた検量線を使用して試料中のコルチゾール濃度が求められることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
［１］複数の作用極を含む電気化学測定によるコルチゾール濃度分析チップであって、
少なくとも１つの作用極がコルチゾール抗体で修飾された測定用作用極であり、
別の少なくとも１つの作用極が、コルチゾール抗体で修飾され、かつコルチゾールを該コルチゾール抗体に飽和状態になるまで結合させた補正用作用極である
コルチゾール濃度分析チップ、ならびに
［２］上記［１］記載のコルチゾール濃度分析チップの作用極上に測定対象の生体試料を供給する工程、
一定時間静置し、測定用作用極上のコルチゾール抗体と生体試料中のコルチゾールとの抗原抗体反応を進行させる工程、
測定用作用極および補正用作用極についてそれぞれ電気化学分析測定を行う工程、および
得られた測定値の差分から生体試料中のコルチゾール濃度を求める工程
を含むコルチゾール濃度の測定方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のコルチゾール濃度の分析チップによれば、測定用作用極１と補正用作用極２とを同一チップ上に形成することで、測定時ごと（分析チップごと）に標準濃度溶液による測定を必要とすることなく、使用材料である抗体のロット間差や、製造工程のバラつきによるチップの個体差の影響を抑え、再現性のあるコルチゾール濃度の測定が可能となる。
【００１２】
また、本発明のコルチゾール濃度の分析方法によれば、上述の本発明のコルチゾール濃度の分析チップを用い、測定用作用極および補正用作用極についてそれぞれ電気化学分析測定を行ない、得られた測定値の差分から生体試料中のコルチゾール濃度を求めることにより、測定時ごと（分析チップごと）に標準濃度溶液による測定を必要とすることなく、使用材料である抗体のロット間差や、製造工程のバラつきによるチップの個体差の影響を抑え、再現性のあるコルチゾール濃度の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の分析チップの一例の平面説明図である。
【図２】図１の分析チップのＡ−Ａ断面の説明図である。
【図３】従来の分析チップの一例の平面説明図である。
【図４】図３の分析チップのＢ−Ｂ断面の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の分析チップ１００について、図１および図２を参照して説明するが、本発明はこれらの形態に限定されるものではなく、以下に説明する部材、配置等は、本発明の趣旨の範囲内で種々改変することができるものである。また、図面において、同一符号は同等あるいは同一部分を示す。
【００１５】
図１は、本発明の分析チップを上面から見た場合の平面形状の一実施形態を示す例であり、基板５上の同一面に、測定用作用極１と補正用作用極２が参照極３を挟んで両側に配置され、これら測定用作用極１、補正用作用極２および参照極３を囲むように対極４が設けられている。測定用作用極１は、基板５の端部に設けられた測定機器に接続するための測定用作用極端子１ａとの間を導線１ｂにより接続されている。補正用作用極２、参照極３および対極４もそれぞれ導線２ｂ、３ｂおよび４ｂにより、基板５の端部に設けられた測定機器に接続するためのそれぞれの端子２ａ、３ａおよび４ａに接続されている。図２は、図１のＡ−Ａ断面の説明図であり、測定用作用極１および補正用作用極２の表面には自己組織化単分子膜６が形成され、そこにコルチゾール抗体７が固定されている。さらに、補正用作用電極２に固定されたコルチゾール抗体７には、コルチゾール８が飽和状態で結合している。
【００１６】
基板５の材質は、対象とする物質の測定に影響を及ぼさない絶縁性の材料であれば、特に限定されるものではなく、例えば、セラミックス、ガラス、シリコン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などの熱可塑性樹脂、エポキシ樹脂などの熱硬化樹脂、ＵＶ硬化樹脂などの合成樹脂材料などが挙げられる。
【００１７】
基板５の形状は、矩形、円形、楕円形などとすることができるが、格子状に個片化する製造上の観点からは矩形が好ましい。
【００１８】
測定用作用極１および補正用作用極２の作用極としては、公知の電極材料を用いることができ、例えば、銅、アルミニウム、金、銀、塩化銀、白金、クロム、ニッケル、鉄、炭素からなる材料が挙げられ、作用極に対する修飾の種類によって、適切な材料を選択することができる。例えば、後述するように作用極にチオール基を介して修飾を行う場合には、作用極は、金、白金、銀および銅からなる群から選択することができる。また、測定用作用極１および補正用作用極２は、それぞれ同じ材料で形成することができる。
【００１９】
基板５に形成される測定用作用極１から延びた導線１ｂとそれに続く測定用作用極端子１ａは、例えば図１に示すように、測定用作用極１から基板端部まで延びており、測定用作用極１と同様の材料で形成することができる。同様に、例えば図１に示すように、補正用作用極２から延びた導線２ｂとそれに続く補正用作用極端子２ａは、補正用作用極２から基板端部まで延びており、補正用作用極２と同様の材料で形成することができる。
【００２０】
測定用作用極１および補正用作用極２の両作用極には、コルチゾール抗体７が固定される。コルチゾール抗体７を固定化する方法としては、バイオセンサの分野において公知の種々の方法を用いることができるが、例えば、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を用いる方法が挙げられる。ＳＡＭとは、基板を有機分子を含む溶液に浸漬または有機分子を含む蒸気中に置くことにより、有機分子の官能基、例えばチオール基が基板表面に化学吸着され、自発的に該基板表面に形成される高密度かつ高配向な単分子膜である。具体的には、アルキルチオールやジスルフィド化合物からなるＳＡＭや、固定基としてチオールを有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を配向させたＳＡＭ、ベンゼン環を有するＳＡＭ、炭素鎖長の異なるアルキルチオール類を混合したＳＡＭなどが挙げられる。これらＳＡＭ構成分子は、基板に化学吸着される官能基とは別に、ＳＡＭ表面に特性を持たせるための官能基を有することが好ましく、この官能基を利用して、コルチゾール抗体を固定化することができる。測定用作用極１および補正用作用極２に選択的なＳＡＭ修飾を行うためには、その他の電極部分をマスクし、測定用作用極１および補正用作用極２のみにＳＡＭを形成させるか、あるいは電極部分全体にＳＡＭ形成処理を行った後、測定用作用極１および補正用作用極２以外の電極に電位を印加し、ＳＡＭを還元脱離させればよい。
【００２１】
コルチゾール抗体７は、コルチゾールを特異的に認識することのできるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、公知の方法により産生することもできるが、市販のものを用いることもできる。
【００２２】
補正用作用極２に固定化されたコルチゾール抗体７には、コルチゾールを飽和状態になるまで結合させる。これは、補正用作用極２に選択的にコルチゾールを含む溶液を滴下し、補正用作用極２上のコルチゾール抗体と溶液中のコルチゾールとの抗原抗体反応が完了するのに十分な時間だけ静置すればよい。未反応のコルチゾールは除去しておく。
【００２３】
測定用作用極１および補正用作用極２の形状は、特に限定されるものではないが、同一の大きさおよび形状が好ましい。センサチップの小型化の観点から平板状、または薄膜状であることが好ましく、スパッタリング法、真空蒸着法、めっき法、種々の印刷法などにより成膜・パターン形成することができる。また、測定用作用極１および補正用作用極２は、くし型電極とすることもできる。
【００２４】
参照極３および対極４には、公知の電極材料を用いることができ、例えば、銅、アルミニウム、金、銀、塩化銀、白金、クロム、ニッケル、鉄、炭素からなる材料が挙げられる。参照極３および対極４の形状は、特に限定されるものではないが、センサチップの小型化の観点から平板状、または薄膜状であることが好ましく、スパッタリング法、真空蒸着法、めっき法、種々の印刷法などにより成膜・パターン形成することができる。
【００２５】
基板５に形成される参照極３から延びた導線３ｂとそれに続く参照極端子３ａは、参照極３から基板端部まで延びており、参照極３と同様の材料で形成することができる。同様に対極４から延びた導線４ｂとそれに続く対極端子４ａは、対極４と同様の材料で形成することができる、
【００２６】
電極端子（１ａ、２ａ、３ａ、４ａ）は、それぞれ測定機器につなぎやすいように、基板の端部に設けることが好ましく、対応する電極（１、２、３、４）および導線（１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂ）と一体として形成することができる。
【００２７】
生体試料としては、体液、血液、唾液などが挙げられ、唾液が好ましい。
【００２８】
分析チップ１００の測定対象はコルチゾールである。例えば、ストレス指標としてコルチゾールを手軽に測定することができれば、近年のストレスチェックの義務化に伴うストレスチェックの簡便な測定方法を提供でき好適である。
【００２９】
生体試料は、測定用作用極１の表面および補正用作用極２の表面を全て同時に覆うように当該部分に適用する。具体的には、滴下による適用および浸漬による適用のいずれも用いることができる。
【００３０】
本発明のコルチゾール濃度の測定方法は、上述のような本発明のコルチゾール濃度分析チップを用いることを特徴とし、（１）作用極上に測定対象の生体試料を供給する工程、（２）一定時間静置し、測定用作用極１上のコルチゾール抗体と生体試料のコルチゾールとの抗原抗体反応を進行させる工程、（３）測定用作用極１および補正用作用極２についてそれぞれ電気化学分析測定を行う工程、および（４）得られた測定値の差分から生体試料中のコルチゾール濃度を求める工程を含む。
【００３１】
工程（１）の作用極上への測定対象の生体試料の供給は、作用極表面への生体試料の滴下、または作用極の生体試料への浸漬等により行われる。供給領域は、測定用作用極１および補正用作用極２の全領域、参照極３および対極４を含むものであり、各導線（１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂ）の一部を含んでもよいが、各電極端子（１ａ、２ａ、３ａ、４ａ）には生体試料が接触しないことが好ましい。
【００３２】
工程（２）の静置時間は、作用極上のコルチゾール抗体と測定対象の生体試料中のコルチゾールとの抗原抗体反応が完了するのに十分な時間に設定する。
【００３３】
工程（３）の電気化学分析測定は、インピーダンス法、サイクリックボルタンメトリー法など既知の手法を利用することができる。
【００３４】
工程（４）のコルチゾール濃度は、測定用作用極１および補正用作用極２のそれぞれの測定値の差分から求められるが、その際、事前に作製したこの差分による検量線を使用する。差分による検量線の作製は、事前にコルチゾール濃度が既知である複数の生体試料を用いて測定用作用極１および補正用作用極２の電気化学分析を交互に行い、その測定値の差分とコルチゾール濃度から作製することができる。このような差分による検量線を使用することにより、測定ごと（分析チップごと）にコルチゾールの標準濃度溶液と比較することなく、コルチゾール濃度を求めることができる。したがって、分析チップ、測定機器および測定対象の生体試料のみでコルチゾール濃度を高い信頼性および再現性で測定することができ、非常に簡便であるため、ポイントオブケアへの適用が可能となる。
【符号の説明】
【００３５】
１００  分析チップ
１      測定用作用極
２      補正用作用極
３      参照極
４      対極
１ａ    測定用作用極端子
２ａ    補正用作用極端子
３ａ    参照極端子
４ａ    対極端子
５      基板
６      自己組織化単分子膜
７      コルチゾール抗体
８      コルチゾール
【図１】
2018071995.tif 000003
【図２】
2018071995.tif 000004
【図３】
2018071995.tif 000005
【図４】
2018071995.tif 000006