(57)【要約】【課題】活性汚泥法による廃水処理において、余剰汚泥を削減するための技術を提供する。【解決手段】アセチルトランスフェラーゼを生産する第１の微生物を活性汚泥に添加及び接触させて、第１の微生物が生産したアセチルトランスフェラーゼを前記活性汚泥に作用させ、前記活性汚泥中に含まれるアミノ酸又はペプチドのアミノ基をアセチル化する第１の工程を包含する活性汚泥の処理方法と汚泥発生量の抑制方法が提供される。プロテアーゼを生産する第２の微生物を前記活性汚泥に添加及び接触させて、第２の微生物が生産したプロテアーゼを前記活性汚泥に作用させる第２の工程をさらに包含することが好ましい。SAS-1946503 (NITE P-02328)である微生物、SAS-1946502 (NITE P-02327)である微生物も提供される。【選択図】図３
2018039001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルトランスフェラーゼを生産する第１の微生物を活性汚泥に添加及び接触させて、第１の微生物が生産したアセチルトランスフェラーゼを前記活性汚泥に作用させ、前記活性汚泥中に含まれるアミノ酸又はペプチドのアミノ基をアセチル化する第１の工程を包含することを特徴とする活性汚泥の処理方法。
【請求項２】
プロテアーゼを生産する第２の微生物を前記活性汚泥に添加及び接触させて、第２の微生物が生産したプロテアーゼを前記活性汚泥に作用させる第２の工程をさらに包含することを特徴とする請求項１に記載の活性汚泥の処理方法。
【請求項３】
第１の微生物と第２の微生物とを同時に活性汚泥に接触させることを特徴とする請求項２に記載の活性汚泥の処理方法。
【請求項４】
第２の微生物が、Bacillus属に属する微生物であることを特徴とする請求項２又は３に記載の活性汚泥の処理方法。
【請求項５】
第２の微生物が、SAS-1946502 (NITE P-02327)であることを特徴とする請求項２又は３に記載の活性汚泥の処理方法。
【請求項６】
第１の微生物が、Curtobacterium属に属する微生物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の活性汚泥の処理方法。
【請求項７】
第１の微生物が、SAS-1946503 (NITE P-02328)であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の活性汚泥の処理方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の活性汚泥の処理方法によって活性汚泥を処理することを特徴とする汚泥発生量の抑制方法。
【請求項９】
SAS-1946503 (NITE P-02328)である微生物。
【請求項１０】
SAS-1946502 (NITE P-02327)である微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性汚泥の処理方法、汚泥発生量の抑制方法、並びに、微生物に関する。本発明は、活性汚泥法による廃水処理で発生する余剰汚泥の削減に有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
日本における産業廃水処理及び下水処理の多くは活性汚泥法により行われている。活性汚泥法による廃水処理においては、処理過程で大量に発生する余剰汚泥の処分が問題となっている。余剰汚泥は産業廃棄物であり、通常、焼却した後に埋め立てて処理されている。しかし、余剰汚泥の焼却と埋め立てには環境負荷や処理コストの問題があるため、余剰汚泥を減らすための技術開発が必要である。例えば、汚泥発生量がより低い廃水処理技術の開発や、発生した汚泥を減容化する技術の開発が求められる。
【０００３】
特許文献１には、光合成緑藻類の乾燥物を活性汚泥に添加して余剰汚泥を削減する技術が開示されている。この技術では、光合成緑藻類の乾燥物によって活性汚泥中の微生物活性を高めることにより、活性汚泥の発生量を低減している。
【０００４】
特許文献２には、余剰汚泥に廃水原水の一部を混合することにより、廃水原水の水処理と余剰汚泥を分解処理の両方を同時に行う技術が開示されている。この技術によれば、余剰汚泥の処理効率が向上するとされている。また、その背景技術として、余剰汚泥の細胞壁を破壊して溶菌することで余剰汚泥をＢＯＤ成分とし、これを活性汚泥槽に返送して好気的に分解し、余剰汚泥を減容化する技術について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１１１４０号公報
【特許文献２】特開２００６−６１７４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、活性汚泥法による廃水処理において、余剰汚泥を削減するための方策が種々検討されている。しかし、下水道普及率の増加等に伴って余剰汚泥の発生量は増加傾向にあり、余剰汚泥を削減するための更なる技術開発が望まれる。
そこで本発明は、新たな原理に基づいた、活性汚泥を削減するための一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの様相は、アセチルトランスフェラーゼを生産する第１の微生物を活性汚泥に添加及び接触させて、第１の微生物が生産したアセチルトランスフェラーゼを前記活性汚泥に作用させ、前記活性汚泥中に含まれるアミノ酸又はペプチドのアミノ基をアセチル化する第１の工程を包含することを特徴とする活性汚泥の処理方法である。
【０００８】
本様相は活性汚泥の処理方法に係るものである。本様相では、アセチルトランスフェラーゼを生産する第１の微生物（アセチルトランスフェラーゼ生産微生物）を活性汚泥に添加及び接触させることにより、第１の微生物が生産したアセチルトランスフェラーゼを活性汚泥に作用させる。これにより、活性汚泥中に含まれるアミノ酸又はペプチドのアミノ基をアセチル化する（第１の工程）。アミノ基がアセチル化されたアミノ酸やペプチドは微生物に資化され難いので、本様相によれば、活性汚泥中の微生物の無用な増殖が抑えられ、結果として余剰汚泥の発生が抑制される。
【０００９】
好ましくは、プロテアーゼを生産する第２の微生物を前記活性汚泥に添加及び接触させて、第２の微生物が生産したプロテアーゼを前記活性汚泥に作用させる第２の工程をさらに包含する。
【００１０】
本様相では、さらに、プロテアーゼを生産する第２の微生物（プロテアーゼ生産微生物）を活性汚泥に添加及び接触させて、第２の微生物が生産したプロテアーゼを前記活性汚泥に作用させる（第２の工程）。これにより、活性汚泥中に存在する微生物を溶菌させることができる。本様相では、第２の微生物が生産したプロテアーゼによって活性汚泥中の微生物を積極的に溶菌させ、当該微生物に由来するアミノ酸やペプチドを積極的に活性汚泥中に放出させる。そして、これらのアミノ酸やペプチドのアミノ基をアセチル化し（第１の工程）、微生物に資化され難くする。本様相によれば、活性汚泥中の微生物の無用な増殖が抑えられるとともに、活性汚泥中の微生物を積極的に溶菌させることで、余剰汚泥をさらに削減することができる。
【００１１】
好ましくは、第１の微生物と第２の微生物とを同時に活性汚泥に接触させる。
【００１２】
かかる構成により、溶菌した微生物から放出されるアミノ酸やペプチドに対してアセチルトランスフェラーゼを直ちに作用させることができる。
【００１３】
好ましくは、第２の微生物が、Bacillus属に属する微生物である。
【００１４】
好ましくは、第２の微生物が、SAS-1946502 (NITE P-02327)である。
【００１５】
好ましくは、第１の微生物が、Curtobacterium属に属する微生物である。
【００１６】
好ましくは、第１の微生物が、SAS-1946503 (NITE P-02328)である。
【００１７】
本発明の他の様相は、上記の活性汚泥の処理方法によって活性汚泥を処理することを特徴とする汚泥発生量の抑制方法である。
【００１８】
本様相は、上記の活性汚泥の処理方法によって活性汚泥を処理し、余剰汚泥の発生量を抑制するものである。
【００１９】
本発明の他の様相は、SAS-1946503 (NITE P-02328)である微生物である。
【００２０】
本様相の微生物は、活性汚泥中で安定的に保持され、かつアセチルトランスフェラーゼを高生産することができる。本様相の微生物によれば、上記した方法における第１の工程を効率的に行うことができる。
【００２１】
本発明の他の様相は、SAS-1946502 (NITE P-02327)である微生物である。
【００２２】
本様相の微生物は、活性汚泥中で安定的に保持され、かつプロテアーゼを高生産することができる。本様相の微生物によれば、上記した方法における第２の工程を効率的に行うことができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、活性汚泥法による廃水処理において、余剰汚泥の発生量を効率的に削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ハロー形成試験の結果を表す写真であり、（ａ）は開始時、（ｂ）は２４時間経過後、（ｃ）は４８時間経過後、（ｄ）は７２経過後の状態を表す。
【図２】薄層クロマトグラフィーの結果を表す写真である。
【図３】別の薄層クロマトグラフィーの結果を表す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
まず本発明の微生物、すなわち、アセチルトランスフェラーゼ生産微生物であるSAS-1946503 (NITE P-02328)と、プロテアーゼ生産微生物であるSAS-1946502 (NITE P-02327)について説明する。これらの微生物は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。寄託の詳細を以下に示す。
【００２６】
＜アセチルトランスフェラーゼ生産微生物＞
表示：SAS-1946503
受託番号：NITE P-02328
受領日：２０１６年８月９日
【００２７】
＜プロテアーゼ生産微生物＞
表示：SAS-1946502
受託番号：NITE P-02327
受領日：２０１６年８月９日
【００２８】
SAS-1946503 (NITE P-02328)の菌学的性質は以下のとおりである。「＋」は陽性、「−」は陰性を示す。
【００２９】
〔形態等〕
・細胞形態：桿菌（０．７〜０．８μｍ×１．５〜２．０μｍ）
・グラム染色性：＋
・胞子の有無：−
・運動性：＋
・コロニー形態（培地：Nutrient agar、培養時間：４８時間、培養温度：３０℃）
直径：１．０ｍｍ
色調：黄色
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：全縁
表面の形状など：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
【００３０】
〔生育温度〕
・３７℃：＋（弱い）
・４５℃：−
【００３１】
・カタラーゼ反応：＋
・オキシダーゼ反応：−
・グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）：−／−
・グルコースのＯ／Ｆテスト（酸化／発酵）：−／−
【００３２】
〔生化学試験〕
・硝酸塩還元：−
・ピラジンアミダーゼ：＋
・ピロリドニルアリルアミダーゼ：−
・アルカリフォスファターゼ：−
・β−グルクロニダーゼ：−
・β−ガラクトシダーゼ：＋
・α−グルコシダーゼ：＋
・Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：−
・エスクリン（β−グルコシダーゼ）：＋
・ウレアーゼ：−
・ゼラチン加水分解：＋
・カタラーゼ：＋
【００３３】
〔発酵性試験〕
・ブドウ糖：＋
・リボース：−
・キシロース：＋
・マンニトール：−
・マルトース：＋
・乳糖：−
・白糖：−
・グリコーゲン：−
【００３４】
・カゼイン加水分解：＋
・リパーゼ活性（Tween 80）：＋
・Acetate資化性：＋（弱い）
・Fumarate資化性：＋（弱い）
【００３５】
・１６ｒＤＮＡ塩基配列の相同性
Curtobacterium flaccumfaciens：９９．９％
【００３６】
以上の結果より、SAS-1946503 (NITE P-02328)はCurtobacterium flaccumfaciensと同定された。
【００３７】
SAS-1946502 (NITE P-02327)の菌学的性質は以下のとおりである。「＋」は陽性、「−」は陰性を示す。
【００３８】
〔形態等〕
・細胞形態：桿菌（０．８〜０．９μｍ×１．５〜２．５μｍ）
・グラム染色性：＋
・胞子の有無：＋
・運動性：＋
・コロニー形態（培地：Nutrient agar、培養時間：４８時間、培養温度：３０℃）
直径：２．０〜３．０ｍｍ
色調：クリーム色
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：糸状
表面の形状など：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
【００３９】
〔生育温度〕
・３７℃：＋
・４５℃：＋
【００４０】
・カタラーゼ反応：＋
・オキシダーゼ反応：＋
・グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）：−／−
・グルコースのＯ／Ｆテスト（酸化／発酵）：−／−
【００４１】
〔発酵性試験〕
・グリセロール：＋
・エリスリトール：−
・Ｄ−アラビノース：−
・Ｌ−アラビノース：＋
・リボース：＋
・Ｄ−キシロース：＋
・Ｌ−キシロース：−
・アドニトール：−
・β−メチル−Ｄ−キシロース：−
・ガラクトース：＋
・グルコース：＋
・フラクトース：＋
・マンノース：＋
・ソルボース：−
・ラムノース：−
・ズルシトール：−
・イノシトール：−
・マンニトール：＋
・ソルビトール：＋
・α−メチル−Ｄ−マンノシド：−
・α−メチル−Ｄ−グルコシド：＋
・Ｎ−アセチルグルコサミン：−
・アミグダリン：＋
・アルブチン：＋
・エスクリン：＋
・サリシン：＋
・セロビオース：＋
・マルトース：＋
・ラクトース：＋
・メリビオース：−
・サッカロース：＋
・トレハロース：＋
・イヌリン：＋
・メレチトース：−
・ラフィノース：＋
・でんぷん：−
・グリコーゲン：−
・キシリトール：−
・ゲンチオビオース：＋
・Ｄ−ツラノース：−
・Ｄ−リキソース：−
・Ｄ−タガトース：−
・Ｄ−フコース：−
・Ｌ−フコース：−
・Ｄ−アラビトール：−
・Ｌ−アラビトール：−
・グルコネート：−
・２−ケトグルコネート：−
・５−ケトグルコネート：−
【００４２】
〔生化学試験〕
・β−ガラクトシダーゼ：−
・アルギニンジヒドロラーゼ：−
・リシンデカルボキシラーゼ：−
・オルニチンデカルボキシラーゼ：−
・クエン酸の利用性：−
・Ｈ2Ｓ産生：−
・ウレアーゼ：−
・トリプトファンデアミナーゼ：−
・インドール産生：−
・アセトイン産生（ＶＰ）：−
・ゼラチナーゼ：＋
・硝酸塩還元：−
【００４３】
・嫌気条件下での生育：＋（弱い）
・５０℃での生育：＋
・１０％ ＮａＣｌでの生育：−
・カゼインの加水分解：＋
・でんぷんの加水分解：−
【００４４】
・１６ｒＤＮＡ塩基配列の相同性
Bacillus amyloliquefaciens：９９．８％
【００４５】
以上の結果より、SAS-1946502 (NITE P-02327)はBacillus amyloliquefaciensに近縁なBacillus sp.と同定された。
【００４６】
本発明の微生物を培養する方法としては、好気性微生物の培養方法として一般的な方法をそのまま採用することができる。例えば、適当な炭素源等を含有する液体培地を用いて、通気及び撹拌して培養することができる。培養温度としては、例えば５℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃の範囲を選択することができる。
【００４７】
本発明の活性汚泥の処理方法は、アセチルトランスフェラーゼを生産する第１の微生物を活性汚泥に添加及び接触させて、第１の微生物が生産したアセチルトランスフェラーゼを前記活性汚泥に作用させ、前記活性汚泥中に含まれるアミノ酸又はペプチドのアミノ基をアセチル化する第１の工程を包含する。
また本発明の汚泥発生量の抑制方法は、上記の活性汚泥の処理方法によって活性汚泥を処理し、汚泥発生量を抑制するものである。
【００４８】
第１の微生物を活性汚泥に添加及び接触させる方法としては、第１の微生物を活性汚泥に添加して組み込み、他微生物と共存（共生）させることが挙げられる。すなわち、第１の微生物を活性汚泥に添加し、活性汚泥内で安定的に維持されるよう調整する。
第１の微生物の活性汚泥への添加は、１回だけ行ってもよいし、複数回行ってもよい。
【００４９】
第１の微生物としては、アセチルトランスフェラーゼを生産する微生物であれば特に限定はない。第１の微生物は、アセチルトランスフェラーゼを細胞外に分泌する微生物であることが好ましい。ただし、アセチルトランスフェラーゼが細胞内に保持されている場合でも、第１の工程が有効に行われることが十分に期待できる。なぜならば、アミノ酸レベルの物質は、微生物の細胞内外を自由に透過できることがアミノ酸発酵により明確化されているからである。
また第１の微生物は、Curtobacterium属に属する微生物であることが好ましく、SAS-1946503 (NITE P-02328)であることが特に好ましい。
【００５０】
第１の工程では、第１の微生物が生産したアセチルトランスフェラーゼの作用により、活性汚泥中のアミノ酸やペプチドのアミノ基をアセチル化する。これにより、アミノ酸とペプチドが微生物に資化され難くなり、結果的に活性汚泥の発生量が抑えられる。
【００５１】
好ましい実施形態では、プロテアーゼを生産する第２の微生物を活性汚泥に添加及び接触させて、第２の微生物が生産したプロテアーゼを活性汚泥に作用させる第２の工程をさらに行う。
【００５２】
第２の微生物を活性汚泥に添加及び接触させる方法としては、第２の微生物を活性汚泥に添加して組み込み、他微生物と共存（共生）させることが挙げられる。例えば、第１の微生物とともに第２の微生物を活性汚泥に添加し、活性汚泥内で安定的に維持されるよう調整する。
第２の微生物の添加は、１回だけ行ってもよいし、複数回行ってもよい。また第２の微生物の添加は、第１の微生物の添加と同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。
【００５３】
第２の微生物としては、プロテアーゼを生産する微生物であれば特に限定はない。第２の微生物は、プロテアーゼを細胞外に分泌する微生物であることが好ましい。第２の微生物は、Bacillus属に属する微生物であることが好ましく、SAS-1946502 (NITE P-02327)であることが特に好ましい。
【００５４】
第２の工程では、第２の微生物が生産したプロテアーゼの作用により、活性汚泥中に存在する微生物を溶菌させる。溶菌させることにより、微生物内のアミノ酸とペプチドを活性汚泥中に積極的に放出させる。そして活性汚泥中のアミノ酸とペプチドは、第１の工程によってアミノ基がアセチル化される。
【００５５】
本発明の活性汚泥の処理方法は、回分法、連続法のいずれの手法にも用いることができる。例えば、活性汚泥に第１の微生物と第２の微生物を添加して活性汚泥に組み込む。そして、第１の微生物と第２の微生物が活性汚泥中で安定的に維持されることにより、廃水の連続処理に対応することができる。
【００５６】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
（１）新規微生物のスクリーニング
余剰汚泥発生量が少なく（余剰汚泥引き抜き量が少なく）かつ汚泥沈降性が良好（ＳＶ６０≒５５〜６５）な活性汚泥実処理施設における硝化槽、返送汚泥槽、調整槽の汚泥を分離源とした。特にプロテアーゼを生産する第２の微生物の選抜については、各汚泥に８０℃、３０分間のヒートショックを与え、各汚泥の上清を含有する平板培地にて複数の微生物を分離した。アセチルトランスフェラ―ゼを生産する第１の微生物の選抜については、ヒートショックを行わず室温にて複数の微生物を分離した。これらの分離により、強力にアセチルトランスフェラーゼ生産能を有する微生物と強力にプロテアーゼ生産能を有する微生物を各々１つ選抜した。
【００５８】
選抜されたアセチルトランスフェラーゼ生産微生物は、上述した形態と生理・生化学的性状を有していた。さらに、ｒＤＮＡの塩基配列を解析したところ、配列番号１に示す塩基配列を有しており、Curtobacterium flaccumfaciensの当該配列と９９．９％の相同性を有していた。以上の結果より、アセチルトランスフェラーゼ生産微生物はCurtobacterium flaccumfaciensと同定された。当該微生物を「SAS-1946503」と命名し、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（NITE P-02328）。
【００５９】
選抜されたプロテアーゼ生産微生物は、上述した形態と生理・生化学的性状を有していた。さらに、ｒＤＮＡの塩基配列を解析したところ、配列番号２に示す塩基配列を有しており、Bacillus amyloliquefaciensの当該配列と９９．８％の相同性を有していた。以上の結果より、プロテアーゼ生産微生物はBacillus amyloliquefaciensに近縁なBacillus sp.と同定された。当該微生物を「SAS-1946502」と命名し、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（NITE P-02327）。
【００６０】
（２）ハロー形成試験
上記の実処理の活性汚泥（返送汚泥槽）を遠心分離（10,000rpm、10分間）した後、フィルター（ADVANTEC No.1 保留粒子径:6.0μm）でろ過した溶液（返送汚泥上清）を調製した。
表１に示す組成の基本培地に返送汚泥上清を最終濃度１０％となるよう添加した液体培地（以下、「返送汚泥上清含有培地」を称する）に、SAS-1946502（目的菌）と上記の活性汚泥より分離同定した大腸菌（宿主菌）を１：１の割合で植菌し、数日間振とう培養した（目的菌の前培養）。
【００６１】
【表１】
2018039001.tif 000003
【００６２】
１％ジェランガムを含む返送汚泥上清含有培地の平板培地に、上記の大腸菌（宿主菌）の培養液２０μＬをアプライし、スプレッダーで均一に塗り広げた。この操作を２回繰り返した（培養液４０μＬ分）。平板培地を３０℃で１日間静置培養した（宿主菌の前培養）。
【００６３】
静置培養後の平板培地に、目的菌の前培養液を１プレートあたり１０μＬ×３スポットとしてアプライした。クリーンベンチ内でスポット面が垂れない程度に乾燥させた後、３０℃で静置し、ハロー形成を経時観察した。結果を図１に示す。図１（ａ）〜図１（ｄ）はそれぞれ静置後０時間（試験開始時）、２４時間、４８時間、７２時間経過時の平板培地の写真である。
すなわち、静置後２４時間で宿主菌の溶菌に起因するハロー形成が認められ（図１（ｂ））、４８時間経過時にはシャーレの広範囲まで行き渡る強いハロー形成が認められた（図１（ｃ））。
【００６４】
（３）プロテアーゼ活性測定
返送汚泥上清含有培地にSAS-1946502を植菌し、３０℃で１日間振とう培養した。培養液を遠心分離し、上清を回収した。Ａｍｐｌｉｔｅプロテアーゼ測定キット（コスモバイオ社）を用い、下記手順で上清のプロテアーゼ活性を測定した。基質としてカゼインの蛍光接合体を用いた。陽性コントロールとしてトリプシンを用いた。
【００６５】
９６穴ブラックプレートの各穴に試料５０μＬと基質希釈液５０μＬを入れ、混合した。蛍光プレートリーダー（SynergyTM H1 (BIOTeK) Gen5 2.01）を用いて、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２５ｎｍの条件で蛍光増加量を検出し、５分毎に３０分間、蛍光強度を測定した。この間、暗室で３０℃の条件で酵素反応させた。
その結果、SAS-1946502の上清に強いプロテアーゼ活性が認められた。陽性コントロールのトリプシンのプロテアーゼ活性を１００Ｕ／ｍＬとした場合、SAS-1946502の上清のプロテアーゼ活性は４７Ｕ／ｍＬであった。なお、トリプシンは高純度の精製品であるのに対し、SAS-1946502の上清は未精製の培養液である。
【００６６】
（４）薄層クロマトグラフィーによるアセチルトランスフェラーゼ活性確認＜１＞
返送汚泥上清含有培地にSAS-1946503を１白金耳植菌し、３０℃で１日間振とう培養した（前培養）。３００ｍＬ容の三角フラスコ（バッフル付）に返送汚泥上清含有培地１００ｍＬを仕込み、前培養液１００μＬを添加して、３０℃で１日間振とう培養した（本培養）。
本培養液を遠心分離して上清を廃棄し、菌体を得た。菌体に０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と３，４−ジクロロアニリン（３，４−ＤＣＡ）とアセチル−ＣｏＡリチウム塩を添加して、３０℃で１日振とうした（酵素反応）。１Ｎ ＮａＯＨを添加してｐＨを１０〜１１にすることにより酵素反応を停止させた。
同量のジエチルエーテルを添加し、ボルテックスミキサーで３０分間攪拌した後、室温で１日静置した。自然分離した上澄み（有機相）を回収し、TLC Silica gel 60 F254 (Millipore)にスポットした。展開液（クロロホルム：アセトン＝９１：９）で展開した後に、紫外線でスポットを検出した。結果を図２に示す。図２中、（ａ）は３，４−ＤＣＡ（コントロール）、（ｂ）は測定試料をスポットして展開したものである。
すなわち測定試料から、３，４−ＤＣＡのアミノ基がアセチル化されて生成した３，４−ジクロロアセトアニリン（３，４−ＤＣＡＡ）のスポットが検出された。これにより、SAS-1946503がアミノ基をアセチル化するアセチルトランスフェラーゼを生産することが示された。
【００６７】
（５）薄層クロマトグラフィーによるアセチルトランスフェラーゼ活性確認＜２＞
返送汚泥上清含有培地にSAS-1946503を１白金耳植菌し、３０℃で１日間振とう培養した（前培養）。３００ｍＬ容の三角フラスコ（バッフル付）に返送汚泥上清含有培地１００ｍＬを仕込み、前培養液１００μＬを添加して、３０℃で３日間振とう培養した（本培養）。
本培養液を遠心分離して沈殿以外の上清を得た。上清に３，４−ＤＣＡとアセチル−ＣｏＡリチウム塩を添加して、３０℃で１日振とうした（酵素反応）。１Ｎ ＮａＯＨを添加してｐＨを１０〜１１にすることにより酵素反応を停止させた。別途、１Ｎ ＮａＯＨを添加しない（酵素反応を停止させない）試料も作製した。
ジエチルエーテルを１０ｍＬ添加し、ボルテックスミキサーで３０分間攪拌した後、上相（ジエチルエーテル層）を別の３０ｍＬ褐色ビンに移した。下相（水層）を再びジエチルエーテルで抽出し、上相（ジエチルエーテル層）を３０ｍＬ褐色ビンに移した。ジエチルエーテルで２回抽出した溶液を熱水（１００℃程度）で加熱濃縮し、TLC Silica gel 60 F254 (Millipore)にスポットした。展開液（クロロホルム：アセトン＝９１：９）で展開した後に、紫外線でスポットを検出した。結果を図３に示す。図３中、（ａ）は３，４−ＤＣＡと３，４−ＤＣＡＡの混合物（コントロール）、（ｂ）は３，４−ＤＣＡ（コントロール）、（ｃ）は１Ｎ ＮａＯＨを添加しなかった測定試料、（ｄ）は１Ｎ ＮａＯＨを添加した測定試料をスポットして展開したものである。
すなわち（ｃ）と（ｄ）の測定試料から、３，４−ＤＣＡのアミノ基がアセチル化されて生成した３，４−ＤＣＡＡのスポットが検出された。これにより、SAS-1946503がアミノ基をアセチル化するアセチルトランスフェラーゼを生産し、細胞外に分泌することが示された。
【００６８】
（６）活性汚泥の処理実験
SAS-1946503（NITE P-02328）とSAS-1946502（NITE P-02327）を、それぞれ表１に示す基本培地を用いて３０℃で４８時間振とう培養した。得られた各培養液を遠心分離して菌体を集め、生理食塩水で２回洗浄した。洗浄した各菌体を生理食塩水で懸濁し（濁度：SAS-1946503：OD＝13.6、SAS-1946502：OD＝0.87）、SAS-1946503とSAS-1946502の各菌体懸濁液を調製した。表２の組成からなる原水１Ｌに、各菌体懸濁液を１０ｍＬずつ添加した。表２において、活性汚泥は、活性汚泥浮遊物質（ＭＬＳＳ）が９０００ｍｇ／Ｌの濃縮汚泥を終濃度２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。
【００６９】
【表２】
2018039001.tif 000004
【００７０】
菌体懸濁液を添加した原水について、スターラーを用いて通気攪拌処理（２５℃、２５０ｒｐｍ）を行った。処理開始から０時間、２時間、１６時間、２４時間、４０時間経過時における汚泥濃度を、ガラス繊維ろ紙法によって測定し、各処理時間における汚泥減容率を算出した。コントロールとして、菌体懸濁液を添加しない原水を用いて同様の操作を行った。結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
2018039001.tif 000005
【００７２】
すなわち、菌体懸濁液を添加した場合（微生物添加）には、時間の経過とともに汚泥が減容し、２４時間経過時には２１％の減容率を示した。４０時間経過時でも１５％の減容率を示しており、微生物溶菌後の再増殖が抑制されていた。
一方、コントロールでは２４時間経過時に減容率が０％となり、溶菌後に微生物が再増殖していた。
以上より、SAS-1946503（NITE P-02328）とSAS-1946502（NITE P-02327）を活性汚泥に添加することにより、汚泥発生量を抑制できることが明らかとなった。
【００７３】
（７）アセチルトランスフェラーゼの基質特異性
SAS-1946503（NITE P-02328）を、表１に示す基本培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。遠心式限外ろ過フィルター(30K, Merck Millipore Ltd.)を用いて、粗酵素液１５ｍＬを５００μＬ程度まで濃縮した。得られた濃縮液を脱イオン水で５倍希釈したものを濃縮粗酵素液とした。
コントロールとして、粗酵素液に代えて基本培地を用いて同様の操作を行い、ブランク用濃縮液を得た。
【００７４】
濃縮粗酵素液１ｍＬに各種Ｌ−アミノ酸を２０〜２５ｍｇ、アセチル基供与体としてアセチルコエンザイムＡ三リチウム塩約０．５ｍｇを添加して、インキュベーターシェーカーにて３０℃で２４時間反応させた。ブランク用濃縮液を用いて同様の反応を行ったものをブランク溶液とした。反応終了後、反応液を脱イオン水で４倍に希釈し、遠心式限外ろ過フィルター(3K, Merck Millipore Ltd.)で２回ろ過した。得られたろ過液を、高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を行うまで４℃で保存した。
【００７５】
ろ過液を３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで希釈し、遠心分離した。上清を孔径０．２０μｍのフィルターでろ過し、ＬＣ／ＭＳで分析した。得られたデータを解析ソフト(Bruker Daltonics Data Analysis)でデータ処理を行い、粗酵素液ピークと標準試料ピークを比較することで、アセチルアミノ酸のピークを判別した。そして、粗酵素液ピークとブランク溶液ピークを比較し、アセチルトランスフェラーゼの影響を検討した。ブランク溶液ピークに対する粗酵素液ピークのピーク面積比を算出し、ピーク面積比２．０以上を「○：アセチル化あり」、ピーク面積比１．０超２．０未満を「△：アセチル化あり（弱い）」、１．０以下を「×：アセチル化なし」と評価した。
【００７６】
＜ＬＣ／ＭＳの条件＞
・ＬＣ機器：Agilent 1100 Series
・ＭＳ機器：Bruker Esquire 3000 Plus
・ＬＣ条件：移動相：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液／超純水＝３０／７０
試薬注入量：２μＬ
流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：３０℃
・カラム：ジーエルサイエンスInertsil ODS-3 (３μｍ、３．０×１５０ｍｍ）
・ＭＳ条件：ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、Ion Polarity Positive
・解析ソフト：Bruker Daltonics Data Analysis
【００７７】
結果を表４に示す。表４ではアミノ酸を酸性、塩基性、親水性、疎水性に分類している。すなわち、セリン、アスパラギン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンについて、アミノ基のアセチル化が確認された。リジン、グルタミン、及びバリンについても、活性は弱かったがアミノ基のアセチル化が確認された。他のアミノ酸については、アミノ基のアセチル化は確認されなかった。
【００７８】
【表４】
2018039001.tif 000006
【図１】
2018039001.tif 000007
【図２】
2018039001.tif 000008
【図３】
2018039001.tif 000009
【配列表】
2018039001000001.app