(57)【要約】【課題】本発明の目的は、ケラチノサイトの遊走を阻害できる成分を見出し、ケラチノサイトの遊走阻害剤を提供することである。【解決手段】植物由来セラミドには、ケラチノサイトの遊走を阻害作用があり、ケラチノサイトの遊走阻害剤の有効成分として使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来セラミドを有効成分とする、ケラチノサイトの遊走阻害剤。
【請求項２】
植物由来セラミドがコンニャク由来である、請求項１に記載のケラチノサイトの遊走阻害剤。
【請求項３】
ケラチノサイトの分化を促進しつつ、ケラチノサイトの遊走を阻害するために使用される、請求項１又は２に記載のケラチノサイトの遊走阻害剤。
【請求項４】
皮膚外用剤である、請求項１〜３のいずれかに記載のケラチノサイトの遊走阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチノサイトの遊走を阻害できるケラチノサイトの遊走阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚は、表皮、真皮及び皮下組織の三層から構成され、なかでも表皮は、皮膚の最外層に位置し、外界との境目になる器官であり、水分蒸散、微生物や物理化学的な刺激等から生体を防御するバリアとしての役割を果たしている。
【０００３】
表皮は、内側から「基底層」、「有棘層」、「顆粒層」および「角質層（角層）」に分けられ、主にケラチノサイト（角化細胞）と呼ばれる細胞から構成されている。ケラチノサイトは、最下層の基底層では分裂能力を有する未熟な細胞として単層を形成し、分裂増殖して上層に押し上げられながらその過程で細胞分化（「角化」）を起こして、最終的に核のない死細胞である角質細胞となり、垢となって脱落していく。表皮では、このケラチノサイトの増殖、遊走、分化、及び脱落の過程が一定の周期で生じて常に角質層が円滑にターンオーバーすることによって恒常性が保たれている。そのため、皮膚を健全な状態に維持する上で、ケラチノサイトの遊走を適切に制御することが重要になる。
【０００４】
ケラチノサイトの遊走を適切に亢進させることは、創傷治癒を促進等に有効であることから、従来、ケラチノサイトの遊走を亢進できる成分について種々検討されている。例えば、特許文献１には、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物が、ケラチノサイトの遊走を促進できることが報告されている。また、特許文献２には、ヒュウガナツ抽出物が、ケラチノサイトの遊走を促進できることが報告されている。
【０００５】
一方、ケラチノサイトの遊走が亢進された状態が継続すると、未成熟な状態のケラチノサイトが角質層を形成し、皮膚バリア機能が不十分になり、健全な皮膚状態を維持できなくなる。また、ケラチノサイトの遊走の亢進状態が続くと、角不全症等の皮膚疾患を誘発させることにもなる。そのため、亢進されたケラチノサイトの遊走を阻害することも、皮膚を健全な状態に維持又は改善する上で重要になる。そこで、ケラチノサイトの遊走を阻害できる成分の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−６２２６６号公報
【特許文献２】特開２０１３−２４１３８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ケラチノサイトの遊走を阻害できる成分を見出し、ケラチノサイトの遊走阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、植物由来セラミドには、ケラチノサイトの遊走を阻害作用があり、ケラチノサイトの遊走阻害剤として有用であることを見出した。また、本発明者等は、植物由来セラミドには、ケラチノサイトの遊走の阻害作用に加えて、ケラチノサイトの分化を促進する作用も有しており、ケラチノサイトが未熟な状態で角質層を形成するのを効果的に抑制できることをも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  植物由来セラミドを有効成分とする、ケラチノサイトの遊走阻害剤。
項２．  植物由来セラミドがコンニャク由来である、項１に記載のケラチノサイトの遊走阻害剤。
項３．  ケラチノサイトの分化を促進しつつ、ケラチノサイトの遊走を阻害するために使用される、項１又は２に記載のケラチノサイトの遊走阻害剤。
項４．  皮膚外用剤である、項１〜３のいずれかに記載のケラチノサイトの遊走阻害剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の遊走阻害剤は、ケラチノサイトの遊走を効果的に阻害できるので、ヒスタミンやＣＣＬ１７等によってケラチノサイトの遊走が亢進していても、ケラチノサイトを正常な遊走状態に改善することができる。また、本発明の遊走阻害剤は、ケラチノサイトの遊走の阻害作用だけでなく、ケラチノサイトの分化を促進する作用も有しているので、十分に分化せずに未成熟な状態でケラチノサイトが角層を形成するのを抑制し、皮膚を健全な状態に維持又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】スフィンゴ脂質（こんにゃく由来セラミド、こんにゃく由来グルコシルセラミド、Ｃ２セラミド、Ｃ８セラミド、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、Ｃ２４セラミド）の細胞毒性を評価した結果を示す図である。
【図２】アルカリホスファターゼ融合Ｓｅｍａ３Ａ（ＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を培養し、培養液のＡＬＰ吸光度を経時的に測定した結果を示す図である。
【図３】ＨａＣａＴ細胞に対するアルカリホスファターゼ融合Ｓｅｍａ３Ａ（ＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａ）の結合性を評価した結果を示す図である。
【図４】アルカリホスファターゼ融合Ｓｅｍａ３Ａ（ＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養濃縮液中のＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａをウエスタンロットにて分析した結果を示す図である。
【図５】ＨａＣａＴ細胞の細胞膜へのアルカリホスファターゼ融合Ｓｅｍａ３Ａ（ＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａ）結合性を評価した結果を示す図である。
【図６】Ｓｅｍａ３Ａを０〜１００ｎＭ又はこんにゃく由来セラミドを０〜１００μＭの存在下で、ＨａＣａＴ細胞の細胞膜に対するＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａの結合性を評価した結果を示す図である。
【図７】Ｓｅｍａ３Ａ ５０ｎＭ又はスフィンゴ脂質（こんにゃく由来セラミド、こんにゃく由来グルコシルセラミド、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、Ｃ２４セラミド）５０μＭの存在下で、ＨａＣａＴ細胞の細胞膜に対するＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａの結合性を評価した結果を示す図である。
【図８】５０μＭスフィンゴ脂質（こんにゃく由来セラミド、こんにゃく由来グルコシルセラミド、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、Ｃ２４セラミド）がＨａＣａＴ細胞の遊走性に及ぼす影響について、トランスウェルアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図９】Ｓｅｍａ３Ａ、こんにゃく由来セラミド、ヒスタミン、及びＣＣＬ１７がＨａＣａＴ細胞の遊走性に及ぼす影響について、トランスウェルアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１０】ヒスタミン又はＣＣＬ１７と、こんにゃく由来セラミド又はＳｅｍａ３Ａとの併用がＨａＣａＴ細胞の遊走性に及ぼす影響について、トランスウェルアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１１】前記図１０に示すトランスウェルアッセイにおいて、遊走細胞を染色した像である。
【図１２】ヒスタミンと、こんにゃく由来セラミド又はＳｅｍａ３Ａとの併用がＨａＣａＴ細胞の遊走細胞の分化誘導に及ぼす影響について、トランスウェルアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１３】前記図１２に示すトランスウェルアッセイにおいて、遊走細胞を染色した像である。
【図１４】こんにゃく由来セラミド又はＳｅｍａ３Ａの存在下で培養したＨａＣａＴ細胞において、ＣＲＭＰ２、リン酸化コフィリン(ｐ−Ｃｏｆｉｌｉｎ)、及び総コフィリン(ｔ−Ｃｏｆｉｌｉｎ)の発現量を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のケラチノサイトの遊走阻害剤は、植物由来セラミドを有効成分とすることを特徴とする。以下に、本発明のケラチノサイトの遊走阻害剤（以下、単に「遊走阻害剤」と表記することもある）について詳述する。
【００１３】
本発明の遊走阻害剤は、植物由来セラミドを有効成分とする。セラミドは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造を有する化合物である。スフィンゴイドとは、少なくとも１位と３位の炭素原子に水酸基が結合し、２位の炭素原子にアミノ基が結合した長鎖アミノアルコールである。
【００１４】
本発明において使用されるセラミドは、植物由来である。このように植物由来セラミドを使用することによって、ケラチノサイトの遊走を阻害でき、更にケラチノサイトの分化を促進することも可能になる。
【００１５】
本発明で使用されるセラミドの由来植物としては、特に制限されないが、例えば、アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマクサ、アマチャ、アマチャヅル、アマナツ、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンコール、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イヨカン、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オウゴンカン、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カクテルフルーツ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カラマンダリン、カリン、ガルシニア、カルダモン、カワチバンカン、カンペイ、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キヨミ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クレメンタイン、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、こんにゃく（こんにゃく芋）（こんにゃくトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スイートスプリング、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、セトカ、ゼニアオイ、セミノール、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンカン、タンゴール、タンジン、タンゼロ、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、デコポン、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツミ、ナツミカン、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッサク、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ハルカ、ハルミ、ハレヒメ、バンペイユ、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ヒメノツキ、ヒュウガナツ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ブンタン、ヘチマ、ベニバナ、ベニマドンナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、ポンカン、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マーコット、マタタビ、マリーゴールド、マリヒメ、マンゴー、ミツバ、ミネオラ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイコウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられる。
【００１６】
これらの中でも、好ましくはこんにゃく、サツマ芋、ジャガ芋、サト芋、ヤマ芋、ナガ芋等の芋類；コメ；コムギ、より好ましくは芋類、更に好ましくはこんにゃくが挙げられる。
【００１７】
本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分の構造については、植物由来のものであれば特に制限されないが、好ましくは８-９位炭素間結合が二重結合であるものが挙げられる。本発明で使用されるセラミドを構成しているスフィンゴイド部分の構造として、具体的には、４−ヒドロキシ−トランス−８−スフィンゲニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニン、トランス−８−スフィンゲニン、シス−８−スフィンゲニン、トランス−４，トランス−８−スフィンガジエニン、トランス−４，シス−８−スフィンガジエニン等が挙げられる。これらの中でも、より好ましくはトランス−４，シス−８−スフィンガジエニン、トランス４−トランス８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニン、４−ヒドロシキ−トランス８−スフィンゲニン等が挙げられる。
【００１８】
本発明で使用される植物由来セラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸の炭素数については、特に制限されないが、２〜３０、好ましくは６〜３０、更に好ましくは６〜２４、特に好ましくは１６〜１８が挙げられる。また、当該脂肪酸は、飽和脂肪酸、炭素−炭素二重結合及び／又は炭素−炭素三重結合を含む不飽和脂肪酸、並びにα−ヒドロキシ脂肪酸のいずれであってもよい。
【００１９】
本発明で使用される植物由来セラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸として、具体的には、ヘキサン酸（Ｃ６：０）、オクタン酸（Ｃ８：０）、デカン酸（Ｃ１０：０）、ドデカン酸（Ｃ１２：０）、テトラデカン酸（Ｃ１４：０）、ヘキサデカン酸（Ｃ１６：０）、オクタデカン酸（Ｃ１８：０）、イコサン酸（Ｃ２０：０）、ヘネイコサン酸（Ｃ２１：０）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）、トリコサン酸（Ｃ２３：０）、テトラドコサン酸（Ｃ２４：０）、ペンタコサン酸（Ｃ２５：０）、ヘキサドコサン酸（Ｃ２６：０）、ヘプタコサン酸（Ｃ２７：０）、オクタドコサン酸（２８：０）、シス−９−オクタデセン酸（Ｃ１８：１）等が挙げられる。なお、前記脂肪酸の括弧内に示す表記「ＣＸ：Ｙ」において、ＣＸは１分子当たりの炭素数を示し、Ｙは１分子当たりの不飽和結合の数を示し、例えば「Ｃ１６：０」とは炭素数１６且つ不飽和結合数が０の脂肪酸を表す。これらの脂肪酸の中でも、好ましくは、ヘキサン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、テトラドコサン酸が挙げられる。
【００２０】
植物由来セラミドは、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、植物由来セラミドは、スフィンゴ糖脂質の酵素処理物として得られたものであってもよい。また、セラミドは商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。
【００２１】
前記スフィンゴ糖脂質の酵素処理物としては、前述の由来植物の抽出液、その濃縮液、又は前記濃縮液を精製処理した精製物の酵素処理物などが挙げられる。
【００２２】
前記スフィンゴ糖脂質は、グルコシルセラミド又はラクトシルセラミド等の、セラミドの第１級アルコール性ヒドロキシ基に糖が結合した糖脂質である。スフィンゴ糖脂質としては、前述したセラミドが得られるのであれば、特に制限されず、セラミドに、グルコース、ガラクトース、又は糖鎖等、いずれの糖が結合したものであってもよい。スフィンゴ糖脂質は、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、スフィンゴ糖脂質は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。
【００２３】
スフィンゴ糖脂質の酵素処理に使用する酵素としては、スフィンゴ糖脂質の糖鎖−セラミド間の結合を加水分解する酵素であれば特に制限されず、例えば、エンドグリコセラミダーゼ（ＥＧＣａｓｅ）が挙げられる。
【００２４】
ＥＧＣａｓｅは、等電点及び分子量が異なる３つの分子種（ＥＧＣａｓｅ  Ｉ、ＥＧＣａｓｅ  ＩＩ、及びＥＧＣａｓｅ  ＩＩＩ）が知られており、分子種に応じて基質特異性が異なることが知られている。使用するＥＧＣａｓｅの分子種は、基質となるスフィンゴ糖脂質の構造に応じて適宜設定すればよい。例えば、スフィンゴ糖脂質として、セレブロシド、特にコンニャク由来のスフィンゴ糖脂質の場合であれば、ＥＧＣａｓｅ  Ｉが好適に使用される。酵素処理の条件は、所望の酵素反応が行われるよう適宜選択するとよい。
【００２５】
前記抽出液の濃縮方法としては、エバポレーターのような減圧濃縮装置を用いた公知の濃縮方法が挙げられる。また精製方法としては、アルカリ処理、溶媒分画、シリカゲルクトマトグラフィーなどの公知の精製方法が挙げられる。
【００２６】
酵素処理物として、酵素処理後の反応物をそのままを用いてもよいし、反応物を固液分離した残渣、固液分離した残渣を乾燥させたもの、反応物そのままを乾燥させたもの等用いてもよい。また、反応物を固液分離し、更に水を添加した後、再度固液分離することにより反応物を洗浄して不純物を除去したものでもよい。
【００２７】
本発明の遊走阻害剤において、植物由来セラミドは、１種の構造又は由来のものを単独して使用してもよく、２種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。
【００２８】
本発明の遊走阻害剤において「植物由来セラミドを有効成分とする」とは、遊走を阻害させるケラチノサイトに対して植物由来セラミドを作用させることを指しており、前記植物由来セラミド自体を有効成分として使用することに止まらず、摂取又は投与されて代謝、分解、再合成等を経た後に生体内で植物由来セラミドを生成させることによりエクソソームの産生を促進する成分も有効成分として使用できる。例えば、植物由来のセラミドは、ほとんどがグルコシド化された形態で存在するが、グルコシド化されたセラミドの経口摂取であれば、代謝、分解、再合成を経て生体内でセラミドが生成し、ケラチノサイトに対してセラミドを作用させることができるため、本発明の遊走阻害剤において有効成分として使用できる。具体的には、グルコシド化されたセラミドは、経口摂取すると、小腸で加水分解によりグルコースが遊離し、更にスフィンゴイドと脂肪酸に分解されることがあるが、血中に入るまでにスフィンゴイドと脂肪酸が結合してセラミドに再合成され、当該セラミドがケラチノサイトの遊走を阻害することができる。
【００２９】
本発明の遊走阻害剤におけるセラミドの含有量としては、ケラチノサイトの遊走を阻害できる有効量であればよく、剤型、適用形態等に応じて適宜設定することができる。
【００３０】
添加成分
本発明の遊走阻害剤は、前述した植物由来セラミド以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型、適用形態等に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明の遊走阻害剤に使用できる添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明の遊走阻害剤の剤型等に応じて適宜設定される。
【００３１】
剤型・製剤形態
本発明の遊走阻害剤の剤型については、特に制限されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、遊走阻害剤の適用方法等に応じて適宜設定すればよい。
【００３２】
本発明の遊走阻害剤の適用方法としては、特に制限されず、全身投与、局所投与、等のいずれであってもよい。具体的には、経口、経血管内（動脈内又は静脈内）、経皮、経腸、経肺、経鼻投与等が挙げられる。血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。これらの中でも、ケラチノサイトの遊走阻害効果をより一層効果的に奏させるという観点から、好ましくは経口投与、経皮投与が挙げられる。
【００３３】
本発明の遊走阻害剤の製剤形態については、特に制限されず、適用方法に適した製剤形態に適宜設定することができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、噴霧剤、乳液剤、懸濁液剤、パップ剤、貼付剤、リニメント剤、エアゾール剤、軟膏剤、パック剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができる。例えば、本発明の遊走阻害剤の投与形態が経皮投与である場合は、経皮投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、化粧料、外用医薬品などの皮膚外用剤が挙げられる。
【００３４】
例えば、本発明の遊走阻害剤を化粧料に使用する場合、本発明の遊走阻害剤を香粧学的に許容される基材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような化粧料の形態としては、特に制限されないが、具体的には、クリーム剤、乳液、化粧水（ローション）、パック、洗浄剤、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品、オイル、リップ、口紅、ファンデーション、アイライナー、頬紅、マスカラ、アイシャドー、マニキュア・ペディキュア（及び除去剤）、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、パーマネント剤、染毛料、ひげ剃り剤、石けん（ハンドソープ、ボディソープ、洗顔料）などが挙げられる。
【００３５】
また、本発明の遊走阻害剤を外用医薬品に使用する場合、本発明の遊走阻害剤を単独で、又は他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤や添加成分等と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような外用医薬品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、乳液剤、懸濁液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、パップ剤、リニメント剤、エアゾール剤、軟膏剤、パック剤などの経皮投与製剤などが挙げられる。
【００３６】
本発明の遊走阻害剤が皮膚外用剤の製剤形態である場合、有効成分である植物由来セラミドの含有量としては、特に制限されず、製剤形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．１〜９０質量％が挙げられ、好ましくは０．２〜５０質量％、より好ましくは０．５〜３０質量％が挙げられる。
【００３７】
また、本発明の遊走阻害剤の製剤形態について、例えば、本発明の遊走阻害剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、飲食品及び内服用医薬品が挙げられる。
【００３８】
本発明の遊走阻害剤を飲食品の製剤形態にする場合、本発明の遊走阻害剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的にはカプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；栄養ドリンク、果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；団子、アイス、シャーベット、グミ、キャンディー等の嗜好品等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくはサプリメント、より好ましくはカプセル剤が挙げられる。
【００３９】
本発明の遊走阻害剤を内服用医薬品の製剤形態にする場合、本発明の遊走阻害剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用の医薬品の中でも、好ましくはカプセル剤、更に好ましくはソフトカプセル剤が挙げられる。
【００４０】
本発明の遊走阻害剤が飲食品又は内服用医薬品の製剤形態である場合、有効成分である植物由来セラミドの含有量としては、特に制限されず、製剤形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．１〜９０質量％が挙げられ、好ましくは０．２〜５０質量％、より好ましくは０．５〜３０質量％が挙げられる。
【００４１】
用途
本発明の遊走阻害剤は、ケラチノサイトの遊走を阻害する目的で使用される。本発明の遊走阻害剤は、ヒスタミンやＣＣＬ１７等によってケラチノサイトの遊走が亢進していても、ケラチノサイトを正常な遊走状態に改善することができる。そのため、本発明の遊走阻害剤は、ケラチノサイトの遊走の亢進によって生じる疾患の予防又は治療用途に好適に使用できる。ケラチノサイトの遊走の亢進によって生じる疾患としては、具体的には、角不全症、アトピー性皮膚炎、ヒスタミン食中毒、蕁麻疹、花粉症皮膚炎等が挙げられる。
【００４２】
また、本発明の遊走阻害剤は、ケラチノサイトの分化を促進する作用を併せ持っているので、ケラチノサイトの分化を促進しつつ、ケラチノサイトの遊走を阻害する目的で使用することもできる。ケラチノサイトの遊走が亢進されていると、未成熟なケラチノサイトが角層を形成することにより、皮膚を健全な状態に維持できなくなり、皮膚バリア機能が不十分になるが、本発明の遊走阻害剤は、ケラチノサイトの遊走を阻害しつつ、ケラチノサイトが角層に到達するまでに分化を促進できるので、皮膚バリア機能が高い健全な皮膚状態の維持又は改善に有効である。また、ケラチノサイトの遊走阻害とケラチノサイトの分化促進は、角不全症、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬症候群等の皮膚疾患の改善に有効であることが分かっており、本発明の遊走阻害剤は、これらの疾患の予防又は治療剤として使用することもできる。
【００４３】
本発明の遊走阻害剤の適用量については、特に制限されず、製剤形態、用途、投与対象等に応じて、ケラチノサイトの遊走を阻害できる有効量を適宜設定すればよい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によって何ら限定されるものではない。
【００４５】
１．スフィンゴ脂質の準備・調製
動物性セラミド（Ｃｅｒ）として、Ｃ２セラミド（ｄ１８：１／２：０、Ｎ−アセチル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン）、Ｃ８セラミド（ｄ１８：１／８：０、Ｎ−オクタノイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン）、Ｃ１６セラミド（ｄ１８：１／１６：０、Ｎ−パルミトイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン）、Ｃ１８セラミド（ｄ１８：１／１８：０、Ｎ−ステアロイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン）、及びＣ２４セラミド（ｄ１８：１／２４：０、Ｎ−リグノセロイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン）を使用した。これらの動物性セラミドは、いずれも、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製の精製脂質である。
【００４６】
こんにゃく由来グルコシルセラミド（ｋＧｌｕＣｅｒ）として、精製脂質（ＮＳ１７０３０２  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ｆｒｏｍ  Ｋｏｎｊａｃ，純度≧９９％（ＴＬＣ））を使用した。当該こんにゃく由来グルコシルセラミドは、株式会社長良サイエンス製である。
【００４７】
こんにゃく由来セラミド（ｋＣｅｒ）は、前記のこんにゃく由来グルコシルセラミドに、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ由来エンドグリコシダーゼ（ＥＧＣａｓｅ  Ｉ）を用いて加水分解を行って、グルコースを遊離させ、精製して得たものを使用した。
【００４８】
２．ヒト表皮角化細胞（ＨａＣａＴ細胞）の準備
ヒトの表皮角化細胞由来の不死化株（ＨａＣａＴ）細胞を炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）で培養した。培養には１０ｍＬの１０％牛胎児血清（ＦＣＳ、Ｃｈｅｌｅｘ１００  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｒｅｓｈｉｎで処理)、×１００希釈ペニシリン・ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ、１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、及びＧｌｕｔａＭＡＸTMＩ(１００×)含むダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ、＃２１０６８、塩化カルシウム不含)（Ｃｈｅｌｅｘ処理ＤＭＥＭ培地）を用いて、１０ｃｍプラスチック培養デッシュに接着させて培養した。プレコンフルエント細胞密度（５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）となるようにＨａＣａＴ細胞を播種して３〜４日後にコンフルエントになった時点で０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液(Ｇｉｂｃｏ)を用いて接着した細胞を剥離させ、得られた細胞をプレコンフルエントに新培地で希釈して新しい１０ｃｍデッシュに播種することにより継代培養し、ＨａＣａＴ細胞を得た。また、Ｃｈｅｌｅｘ１００  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｒｅｓｈｉｎで処理していないＦＣＳに代えたこと以外は同組成の培地（Ｃｈｅｌｅｘ未処理ＤＭＥＭ培地）を用いて、同様の操作で、ＨａＣａＴ細胞を得た。
【００４９】
ＨａＣａＴ細胞は、Ｃｈｅｌｅｘ処理ＤＭＥＭ培地で培養することで細胞分化が抑制されて細胞形態は紡錘状であったが、Ｃｈｅｌｅｘ未処理ＤＭＥＭ培地（通常のＤＭＥＭ培地）では敷石状の形態であった。また、Ｃｈｅｌｅｘ処理ＤＭＥＭ培地では細胞増殖の遅延が見られた。以下に示す実験では、Ｃｈｅｌｅｘ処理ＤＭＥＭ培地で継代培養したＨａＣａＴ細胞を使用した。
【００５０】
３．細胞毒性の測定
１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養したＨａＣａＴ細胞を、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭのスフィンゴ脂質（こんにゃく由来セラミド、Ｃ２セラミド、Ｃ８セラミド、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、Ｃ２４セラミド、こんにゃく由来グルコシルセラミド）を含むＤＭＥＭ培地を用いて、炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）で２４時間培養した。培養２時間後にＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)テスト、培養２４時間後にニュートラルレッド染色法及びＣＣＫ−８テストを行った。
【００５１】
ＬＤＨテストは、培養２時間後に培養上清を回収し、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ５，  １６０−１６７，  ２０１６に記載の方法に従って、細胞障害率（％）を求めた。
【００５２】
ニュートラルレッド染色法は、培養２４時間後に回収した細胞について、Ａｒｅｃｈａｂａｌａ  Ｂ：  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  １９，  １６３−１６５，  １９９９に記載の方法に従って、生細胞率（％）を求めた。
【００５３】
ＣＣＫ−８テストは、培養２４時間後に回収した細胞について、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ５，  １６０−１６７，  ２０１６に記載の方法に従って、増殖機能率（％）を求めた。
【００５４】
なお、細胞毒性測定において、コントロールとしてスフィンゴ脂質を添加しない条件でも同様に試験を行った。コントロールにおける細胞障害率、及び生細胞率を１００とする相対値として、各スフィンゴ脂質を添加した場合の細胞障害率、及び生細胞率を算出した。また、コントロールにおける増殖機能率を１とする相対値として、各スフィンゴ脂質を添加した場合の増殖機能率を算出した。
【００５５】
細胞遊走活性の阻害は細胞毒性に伴っても非特異的に起きることが知られている。本実験で行ったＬＤＨテストによる評価は短期毒性（細胞膜障害率）、ニュートラルレッド染色法による評価は長期毒性（生細胞率）、及びＣＣＫ−８テストによる評価は機能毒性（増殖機能率）の指標となるものである。
【００５６】
結果を図１に示す。この結果、Ｃ２セラミド及びＣ８セラミドは、ＣＣＫ−８テストにおいて１０μＭ以上で顕著な細胞毒性が認められた。一方、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、Ｃ２４セラミド、こんにゃく由来セラミド、及びこんにゃく由来グルコシルセラミドでは、１００μＭの濃度で若干の細胞毒性が認められたが、５０μＭ以下では、短期毒性、長期毒性及び機能毒性のいずれでも、細胞毒性は認められなかった。そこで、以下の実験において、スフィンゴ脂質を使用した細胞の処理は、５０μＭ以下の条件を採用した。
【００５７】
４．アルカリホスファターゼ融合Ｓｅｍａ３Ａの準備
Ｓｅｍａ３ＡのＮ末端にアルカリホスファターゼが連結されているアルカリホスファターゼ融合Ｓｅｍａ３Ａ（ＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａ）を含むプラスミドをヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中でトランスフェクトし、炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）にて５日間培養した。培養液中のＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａ濃度（ＡＬＰ吸光度）を経時的に測定した。ＡＬＰ吸光度の測定方法は、以下の通りである。
（ＡＬＰ吸光度の測定方法）
ＴａＫａＲａ  ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、培養液ＡＬＰの吸光度を測定した。具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに２０μＬの培養上清、及び１００μＬの基質緩衝液を入れ、３７℃で３０分インキュベートした後に８０μＬ反応停止液を加えて2秒間振とうした。その後、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度（ＡＬＰ吸光度）を測定した。
【００５８】
培養液のＡＬＰ吸光度を経時的に測定した結果を図２に示す。トランスフェクト後に、培養液のＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａ量は経時的に増大して３日後に最大となりその後にプラトーから減少に転じることが確認された。
【００５９】
形質転換ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクト３日目に回収した培養上清をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５  ３０Ｋで１６倍に濃縮した。得られた培養濃縮液１ｍｌ中に、ＨａＣａＴ細胞を１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後に、ＨａＣａＴ細胞を回収し、ＨＨ−ｂｕｆｆｅｒ(Ｈａｎｋ‘ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｂｕｆｆｅｒ＋２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０)で洗浄した。次いで、ＨａＣａＴ細胞をＲＩＰＡ  （Ｒａｄｉｏ−Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）溶解緩衝液で可溶化して、ＡＬＰ吸光度を測定した。結果を図３に示す。その結果、形質転換ＨＥＫ２９３細胞の培養濃縮液は、ＡＬＰ吸光度で６．０を超える測定予測値を示したので、ＡＬＰ−Ｓｅｍａ３ＡはＨａＣａＴ細胞に結合したと考えられた。
【００６０】
次に、前記培養濃縮液中のＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａについて、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体(ｓｃ−１１４８、ＳａｎｔａＣｒｕｚ)を用いたウエスタンロット分析を行った。結果を図４に示す。その結果、６５ｋＤにＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａの特異的バンドを検出できた。
【００６１】
次に、２４ウェルプレートでＨａＣａＴ細胞をコンフルエントの状態になるまで培養した後に、ウェル中の培養上清をＡＬＰ吸光度０．８及び０．４に調整したトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の培養濃縮液に置換し、２２℃で９０分間インキュベートした。その後、ＨａＣａＴ細胞をＨＨ−ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、更に３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。次いで、固定化したＨａＣａＴ細胞を６５℃で３０分間処理し、細胞常在のアルカリホスファターゼを不活化させた。その後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴキットを用いて、プラスミド由来のアルカリホスファターゼに起因する発色を生じさせ、細胞を観察した。結果を図５に示す。図５から分かるように、ＨａＣａＴ細胞の細胞膜において、発色の増加が認められたことから、ＡＬＰ−Ｓｅｍａ３ＡはＨａＣａＴ細胞の細胞膜レセプターに結合したと考えられた。
【００６２】
５．ＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａと細胞膜との結合性の評価
ＡＬＰ吸光度０．８に調整したトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の培養上清を準備した。当該培養上清中のＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａ濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定したところ、２２．３ｎＭであった。
【００６３】
ＨａＣａＴ細胞を２４ウェルプレートに６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）で２４時間培養した。その後、ウェル中の培養上清を、ＡＬＰ吸光度０．８に調整したトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の培養上清（ＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａ濃度２２．３ｎＭ）に置換し、更にＳｅｍａ３Ａを０〜１００ｎＭ又はコンニャク由来セラミドを０〜１００μＭとなるように添加して、２２℃で９０分間インキュベートした。次いで、ＨａＣａＴ細胞をＨＨ−ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後に３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。その後、ＨａＣａＴ細胞をＨＨ−ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、更に３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。次いで、固定化したＨａＣａＴ細胞を６５℃で３０分間処理し、細胞常在のアルカリホスファターゼを不活化させた。その後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴキットを用いてプラスミド由来のアルカリホスファターゼに起因する発色を生じさせた。その後、発色させたＨａＣａＴ細胞を洗浄した後に、組織培養用ルーチン倒立顕微鏡（Leica DMi1）で明視野撮影して、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ−Ｊ（１．５０ｇ）を用いて、輝度の画像定量によりＡＬＰ−Ｓｅｍａ３Ａの細胞膜での結合量を求めた。ALP-Sema3Aの細胞膜での結合量は、Ｓｅｍａ３Ａ及びコンニャク由来セラミドを添加していない条件にけるＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａの細胞膜への結合量を１００％として算出した。結果を図６に示す。その結果、ＨａＣａＴ細胞の細胞膜に対するＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａの結合は、Ｓｅｍａ３Ａが約２５ｎＭで５０％の結合阻害作用を示したのに対して、コンニャク由来セラミドでは約１０μＭで５０％の結合阻害作用が認められた。
【００６４】
次に、Ｓｅｍａ３Ａ及びコンニャク由来セラミドの代わりに、コンニャク由来グルコシルセラミド、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、又はＣ２４セラミドを５０μＭとなるように添加したこと以外は、前記と同条件で実験を行い、ＨａＣａＴ細胞の細胞膜に対するＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａの結合量を測定した。結果を図７に示す。図７には、５０μＭのコンニャク由来セラミド、及び５０ｎＭのＳｅｍａ３Ａを添加した場合の結果も併せて示す。その結果、コンニャク由来グルコシルセラミド、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、及びＣ２４セラミドには、ＨａＣａＴ細胞の細胞膜に対するＡＬＰ-Ｓｅｍａ３Ａの結合阻害作用は認められなかった。
【００６５】
６．ケラチノサイトの遊走阻害効果の評価（１）
トランスウェルアッセイによって、スフィンゴ脂質がケラチノサイトの遊走活性に及ぼす影響を評価した。具体的な実験方法は、以下の通りである。先ず、トランスウェルインサート（２４−ｗｅｌｌ、ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ８．０μｍ、ポリカーボネート製メンブレンインサート、Ｃｏｓｔａｒ＃３４２２)に１×１０4ｃｅｌｌｓのＨａＣａＴ細胞を含む無血清Ｃｈｅｌｅｘ処理ＤＭＥＭ培地３００μＬを加えた。受皿となるウェルプレートのウェルには、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地(ウエル液)７５０μＬを入れた。当該ウェル液にコンニャク由来セラミド、コンニャク由来グルコシルセラミド、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、又はＣ２４セラミドを５０μＭになるように添加した後に、ウェルプレートに前記トランスウェルインサートをセットして、炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）で２日間培養した。その後、トランスウェルインサートを取り出して洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定、１００％メタノール処理、及びギムザ染色を行った。メンブレンポアからトランスウェルインサートの底面に移動・付着した細胞（遊走細胞）を組織培養用ルーチン倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭｉ１）で明視野撮影し、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ−Ｊ（１．５０ｇ）を用いて、輝度の画像定量により細胞遊走（Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）率（％）を求めた。なお、細胞遊走率は、スフィンゴ脂質を添加していない１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地をウェル液として使用したコントロールにおける遊走細胞数を１００％とする相対値として算出した。
【００６６】
結果を図８に示す。この結果、コンニャク由来セラミドを使用した場合には、ＨａＣａＴ細胞の遊走が５０％程度阻害されていたが、コンニャク由来グルコシルセラミド、Ｃ１６セラミド、Ｃ１８セラミド、及びＣ２４セラミドを使用した場合には、ＨａＣａＴ細胞の遊走に変化は認められなかった。
【００６７】
７．ケラチノサイトの遊走阻害効果の評価（２）
ウェル液にＳｅｍａ３Ａ、コンニャク由来セラミド、ヒスタミン、又はＣＣＬ１７を図９に示す濃度となるように添加したこと以外は、前記「６．トランスウェルアッセイ（１）」と同様の条件でトランスウェルアッセイを行い、細胞遊走率を求めた。
【００６８】
結果を図９に示す。２００ｎＭのＳｅｍａ３Ａの添加により細胞遊走率が５０％まで低下した。同様な低下効果が１００μＭのこんにゃく由来セラミドの添加でも認められた。一方、ヒスタミンを添加した場合には１μＭまでの低濃度では細胞遊走率を約１．５倍上昇させたが、１０μＭと１００μＭの高濃度では逆に細胞遊走率が低下した。ヒスタミンレセプター４（Ｈ４Ｒ）のリガンドであるＣＣＬ１７は０．１〜２０ｎＭの濃度で細胞遊走率が２倍程度まで上昇した。
【００６９】
以上の結果より、ＨａＣａＴ細胞にＳｅｍａ３Ａを介した細胞遊走阻害のシグナル経路とＨ４Ｒを介した細胞遊走促進のシグナル経路があることが明らかになり、こんにゃく由来セラミドはＳｅｍａ３Ａ類似のリガンドとして作用していることが示唆された。
【００７０】
８．Ｈ４Ｒ活性化による遊走活性化に対するこんにゃく由来セラミドの抑制効果の評価
前記結果から、ヒスタミン又はＣＣＬ１７によってＨ４Ｒを介した遊走活性化が起きることが分かったので、次に、ヒスタミン又はＣＣＬ１７と、こんにゃく由来セラミド又はＳｅｍａ３Ａとを併用した場合に、ＨａＣａＴ細胞の遊走活性化に及ぼす影響を調べた。具体的には、ウェル液に、０又は１００ｎＭのＳｅｍａ３Ａと、１μＭのヒスタミン又は１０ｎｍのＣＣＬ１７とを添加したこと以外は、前記「６．トランスウェルアッセイ（１）」と同様の条件でトランスウェルアッセイを行い、細胞遊走率を求めた。更に、ウェル液に、０又は２５μＭのこんにゃく由来セラミドと、１μＭのヒスタミン又は１０ｎｍのＣＣＬ１７とを添加したこと以外は、前記「６．トランスウェルアッセイ（１）」と同様の条件でトランスウェルアッセイを行い、細胞遊走率を求めた。
【００７１】
細胞遊走率の測定結果を図１０に示し、遊走細胞の染色画像を図１１に示す。その結果、ヒスタミン及びＣＣＬ１７によるＨａＣａＴ細胞の遊走活性の亢進を１００ｎＭのＳｅｍａ３Ａによって正常レベルまで抑制できることが確認された。また、２５μＭのこんにゃく由来セラミドでも、同様の遊走亢進抑制効果が認められた。即ち、本結果により、Ｓｅｍａ３Ａの遊走阻害のシグナル経路とＨ４Ｒの遊走促進のシグナル経路が細胞内でクロスートークしている可能性が示唆された。
【００７２】
９．Ｈ４Ｒ活性化によって遊走活性化したＨａＣａＴ細胞の分化誘導に対するこんにゃく由来セラミドの促進効果の評価
トランスウェルアッセイによって、Ｈ４Ｒ活性化によって遊走活性化したＨａＣａＴ細胞の分化誘導に対して、こんにゃく由来セラミドが及ぼす影響を評価した。具体的な実験方法は、以下の通りである。先ず、トランスウェルインサート（２４−ｗｅｌｌ、ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ８．０μｍ、ポリカーボネート製メンブレンインサート、Ｃｏｓｔａｒ＃３４２２)に１×１０4ｃｅｌｌｓのＨａＣａＴ細胞を含む無血清Ｃｈｅｌｅｘ処理ＤＭＥＭ培地３００μＬを加えた。受皿となるウェルプレートのウェルには、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地(ウエル液)７５０μＬを入れた。当該ウェル液に０μＭ又は１μＭのヒスタミンと共に、２５μＭのこんにゃく由来セラミド、又は１００ｎＭのＳｅｍａ３Ａを添加した後に、ウェルプレートに前記トランスウェルインサートをセットして、炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）で３日間培養した。その後、トランスウェルインサートからメンブレンを解剖メスで切り出した後、メンブレンポアからトランスウェルインサートの底面に移動・付着した細胞（遊走細胞）をＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｈａｒｄ＋Ｓｅｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ）でスライドグラスに固定した。更に、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ処理、及びブロッキング液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ、ナカライテスク社製）処理を行った後に、ウサギ抗インボルクリンポリクローナル抗体(ＧＴＸ１６０１２、ＧｅｎｅＴｅｘ)を含むブロッキング液（１００×／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）での処理を４℃で終夜行った。翌日、メンブレンをＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ＰＢＳ）で２度洗浄後に室温で２時間、標識抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ＦＩＴＣ）×１０００で処理した。次いで、ＤＰＢＳで３回洗浄後にカバーグラスを置いて、共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡（ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ１０ｉ、ＯＬＹＭＰＵＳ）でＥＸ：４９３ｎｍ、ＥＭ：５２８ｎｍで蛍光撮影した。また、組織培養用ルーチン倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭｉ１）で明視野撮影し、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ−Ｊ（１．５０ｇ）を用いて、輝度の画像定量により、細胞１００個当たりの蛍光強度を求めた。また、トランスウェルインサートにＨａＣａＴ細胞を含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地３００μＬを加え、ヒスタミンを添加しなかったこと以外は、前記と同条件で細胞１００個当たりの蛍光強度を求めた（コントロール）。コントロールにおける細胞１００個当たりの蛍光強度を１００％として、各条件での細胞１００個当たりの蛍光強度の相対値をインボルクリンの相対値（％）として算出した。なお、インボルクリンは表皮角化細胞の分化マーカーである。また、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養したケラチノサイト（コントロール）では、分化が促進されているのでインボクリンを強く発現している。また、Ｃｈｅｌｅｘ処理ＤＭＥＭ培地で培養したケラチノサイトは未分化に戻っているのでインボクリンの発現が弱まっている。コントロールを含む全ての条件において、受皿となるウェルプレートには、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を加えているので、遊走刺激と同時に分化誘導の刺激を受ける条件になっている。
【００７３】
インボルクリンの相対値（％）の結果を図１２に示し、遊走細胞を画像撮影した結果を図１３に示す。Ｓｅｍａ３Ａ及びこんにゃく由来セラミドを添加していない条件（図１２中のＮｏｎｅ）では、ヒスタミン非存在下では遊走細胞において５０％程度のインボルクリンの発現が認められたが、ヒスタミン存在下では遊走細胞におけるインボルクリンの発現は１０％以下であった。また、ヒスタミン存在下では細胞遊走率は増加していたが、遊走細胞は未成熟であった（図１３中のＮｏｎｅ及び１μＭ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ参照）。一方、Ｓｅｍａ３Ａ又はこんにゃく由来セラミドを添加した条件では、インボルクリンの発現の増大が認められた。特に、ヒスタミン存在下でも、ｅｍａ３Ａ又はこんにゃく由来セラミドを添加した条件では、インボルクリンの発現の亢進が認められ、未成熟な状態で細胞が遊走するのを抑制できていた。
【００７４】
以上の通り、Ｓｅｍａ３Ａによる細胞遊走阻害は遊走した細胞の分化を促進していたことが明らかになった。ところが、Histamine存在下では遊走した細胞はほとんど未熟であった。更に、Ｓｅｍａ３Ａとこんにゃく由来セラミドがヒスタミン存在下での遊走を抑制すると同時に遊走した細胞を分化促進していた。これらの結果から、こんにゃく由来セラミドには、皮膚角質バリアの損傷により成熟を伴わない未成熟な角化細胞が基底層から遊走して来ることを抑制し、ターンオーバーを正常化する効果があると考える。
【００７５】
１０．こんにゃく由来セラミドがＣＲＭＰ２の発現、及びコフィリンのリン酸化活性に及ぼす影響の評価
こんにゃく由来セラミドが、微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の切断とＦ-Ａｃｉｎの脱重合活性に及ぼす影響を明らかにするために、ＨａＣａＴ細胞におけるＣＲＭＰ２、リン酸化コフィリン(ｐ−Ｃｏｆｉｌｉｎ)、及び総コフィリン(ｔ−Ｃｏｆｉｌｉｎ)の発現特性について調べた。
【００７６】
先ず、６ウェルプレートに、１．５ｍＬの血清含有ＤＭＥＭ培地で４×１０5ｃｅｌｌｓ/ｍＬとなるようにＨａＣａＴ細胞を播種した。次いで、５０μＭのこんにゃく由来セラミド又は１００ｎＭのＳｅｍａ３Ａを含む無血清ＤＭＥＭ培地に置換して、０分、３０分、６０分、２４時間、及び４８時間培養後に細胞をＰＢＳで洗浄し、ｃＣｏｍｐｌｅｔｅ（ロッシェ）とＰｈｏｓＳＴＯＰフォスファターゼインヒビターカクテル（ロッシェ）を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液（和光純薬）で細胞蛋白質を溶解して、蛋白質を回収した。回収した蛋白質をウエスタンブロットに供し、ウェスタンブロッティング用化学発光検出試薬（ケミルミワンＳｕｐｅｒ、ナカライテスク)を用いて蛍光・化学ルミネッセンスイメージングシステム（ケンブリッジ）で、ＣＲＭＰ２（リン酸化されていない状態）、リン酸化ＣＲＭＰ２（Ｐ−ＣＲＭＰ２）、リン酸化コフィリン(ｐ−Ｃｏｆｉｌｉｎ)、及び総コフィリン(ｔ−Ｃｏｆｉｌｉｎ)を定量した。各蛋白質量は、グリセルアルデヒド３リン酸デハイドロゲナーゼ(ＧＡＤＰＨ)に対する相対量比で定量化した。
【００７７】
結果を図１４に示す。こんにゃく由来セラミド及びＳｅｍａ３Ａを添加しなかった場合、ＣＲＭＰ２及びｐ−ＣＲＭＰ２のタンパクレベルでの発現は認められなかった。また、こんにゃく由来セラミド及びＳｅｍａ３Ａを添加した場合でも、ＣＲＭＰ２及びｐ−ＣＲＭＰ２の発現量は増加しなかった。一方、コフィリンは、こんにゃく由来セラミド及びＳｅｍａ３Ａを添加しなかった場合でも発現が認められ、こんにゃく由来セラミド及びＳｅｍａ３Ａを添加した場合にはリン酸化コフィリンの発現量が増加していた。
【００７８】
即ち、こんにゃく由来セラミドは、コフィリンのリン酸化を促進し、その結果、アクチンの脱重合を促進することにより細胞の遊走を抑制していることが示唆された。
【００７９】
以上の通り、ＨａＣａＴ細胞にはＳｅｍａ３Ａが細胞膜レセプターＮｒｐ１に結合してＦ-Ａｃｉｎの脱重合を促進して細胞運動を阻害する経路が機能していることが明らかになった。こんにゃく由来セラミドも、Ｓｅｍａ３Ａ類似性リガンドとして作用して、Ｆ-Ａｃｔｉｎの脱重合を促進することによって細胞遊走を抑制すると考えられた。
【００８０】
１１．備考
前記に示す実験データは、統計解析ソフトＧａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．ｍ  ＣＡ、  ＵＳＡ）を用いてBonferroni法による有意差検定（***Ｐ＜０．００１、**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５）を行った結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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