(57)【要約】【課題】フィルターに捕捉された粒子を、フィルター上で効率よく磁気標識可能な方法を提供する。【解決手段】粒子が捕捉されたフィルター面に、磁気ビーズを含有する懸濁液を供給すること、前記懸濁液の一部を前記フィルター面から他方のフィルター面に向かって送液することにより、前記フィルターの両面に前記磁気ビーズを含む液体が接する状態とすること、及び、前記磁気ビーズを含む液体を、前記他方のフィルター面から前記粒子が捕捉されたフィルター面の方向に逆送液することを含む、複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された粒子を磁気ビーズによって標識する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された粒子を磁気ビーズによって標識する方法であって、
粒子が捕捉されたフィルター面に、磁気ビーズを含有する懸濁液を供給すること、
前記懸濁液の一部を前記フィルター面から他方のフィルター面に向かって送液することにより、前記フィルターの両面に前記磁気ビーズを含む液体が接する状態とすること、及び、
前記磁気ビーズを含む液体を、前記他方のフィルター面から前記粒子が捕捉されたフィルター面の方向に逆送液すること、を含む、磁気標識方法。
【請求項２】
前記逆送液後、前記磁気ビーズを含む液体を、前記粒子が捕捉されたフィルター面で撹拌することを含む、請求項１記載の標識方法。
【請求項３】
細胞が捕捉された前記フィルターに、前記細胞の捕捉のための検体の通液方向とは逆の方向から回収液を通液し、前記フィルター上に溜まっている回収液を吸引回収することを含む、請求項１又は２に記載の標識方法。
【請求項４】
前記粒子を含む検体を前記フィルターに送液することにより、前記粒子を前記フィルターに捕捉させることを含む、請求項１から３のいずれかに記載の標識方法。
【請求項５】
前記検体の流速は、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒〜１００ｍｍ／秒である、請求項４記載の標識方法。
【請求項６】
前記逆送液の流速を、前記検体の流速の１／１０よりも速くする、請求項４又は５に記載の標識方法。
【請求項７】
前記逆送液の流速は、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒以上である、請求項１から６のいずれかに記載の標識方法。
【請求項８】
粒子を磁気ビーズによって標識するための装置であって、
フィルターを保持可能なフィルター部と、
前記フィルター部に磁気ビーズを含む懸濁液を導入可能な導入流路と、
前記フィルター部を通過した液体を保持又は排出可能な排出流路と、
前記フィルター部に前記懸濁液を供給可能な送液手段と、
前記送液手段を制御する制御部とを備え、
前記制御部は、前記フィルターの両面に前記磁気ビーズを含む液体が接する状態となるように、前記懸濁液の一部を一方のフィルター面から他方のフィルター面に向かって送液し、かつ、前記他方のフィルター面から磁気ビーズを含む液体を逆送液するように、前記送液手段を制御する、標識装置。
【請求項９】
前記フィルターの面ないしその近傍で液体を撹拌する手段を含む、請求項８記載の標識装置。
【請求項１０】
フィルター部に捕捉された粒子を回収する回収手段を更に備え、
前記制御手段は、細胞が捕捉された前記フィルターに、前記細胞の捕捉のための検体の通液方向とは逆の方向から回収液を通液し、前記フィルター上に溜まっている回収液を吸引回収するように回収手段を制御する、請求項８又は９に記載の標識装置。
【請求項１１】
前記制御部は、標識する粒子を含む検体を前記フィルター部に供給するように前記送液手段を制御する、請求項８から１０のいずれかに記載の標識装置。
【請求項１２】
前記制御部は、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒〜１００ｍｍ／秒の流速で前記検体を送液するように前記送液手段を制御する、請求項１１記載の標識装置。
【請求項１３】
前記制御部は、前記逆送液の流速が前記検体の流速の１／１０よりも速くなるように前記送液手段を制御する、請求項１１又は１２に記載の標識装置。
【請求項１４】
前記制御部は、前記逆送液の流速が、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒以上となるように前記送液手段を制御する、請求項８から１３のいずれかに記載の標識装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、粒子を磁気粒子（以下、磁気ビーズともいう）によって標識する方法及び標識するための装置に関する。本開示は、とりわけ、フィルターに捕捉された粒子をフィルター上で磁気ビーズによって磁気標識する方法及びそれに用いる標識装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
懸濁液中に含まれる粒子、とりわけ生体試料中の稀少細胞を分離する方法として、磁気分離とサイズ分離とがある。磁気分離は、分離対象の細胞で発現しているタンパク質に依存する方法である。一方、サイズ分離は、粒子のサイズや変形能の違いを利用した方法である。
稀少細胞の分離を行う一般的な方法では、どちらか一方の手法のみで行われている。サイズ分離を用いた方法としては、例えば、所定の特性を有するフィルターを使用する方法が開発されている（例えば、特許文献１）。
一方、近年、稀少細胞の分離精度を向上させる観点から、磁気分離とサイズ分離との原理の異なる分離方法を併用することが提案されている（特許文献２及び非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１５−０８７３８２号公報
【特許文献２】特表２００９−５１１００１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sci Transｌ Med 5, 179ra47 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
稀少細胞には、血中循環腫瘍細胞／Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ（ＣＴＣ）や、ＣＴＣ以外に、免疫細胞等といった医学的に重要な細胞がある。ＣＴＣの一例として、原発腫瘍組織又は転移腫瘍組織から遊離したがん細胞がある。これらのがん細胞は、血液又はリンパ管を通ってその他の臓器等に運ばれることによって転移を起こすといわれている。また、血液中のＣＴＣは、転移性のがんの治療効果の判定や予後予測の因子としての有用であると認められていることから、ＣＴＣの解析が積極的に行われている。
しかしながら、ＣＴＣ等の稀少細胞は、１０ｍｌの血液中に通常０〜１０個程度しか含まれておらず、より正確な分析を行うためには検体から高い精度で稀少細胞を分離又は濃縮することが求められている。
【０００６】
本出願人は、特許文献１のとおり、所定の特性を有するフィルターを使用することによって血液から稀少細胞を効率よく分離できる方法を開発している。しかしながら、血液中には、稀少細胞以外に赤血球や白血球といった血球成分が多量に含まれており（赤血球は数百億個程度、白血球は数千万個程度）、特に白血球のサイズは稀少細胞と同程度又はそれよりも大きいことから、上記フィルターを用いた場合であっても稀少細胞とともに捕捉される場合がある。
稀少細胞と共に、白血球が捕捉された場合、例えば以下の２つの問題点があることを本発明者らは見出している。１つ目としては、血液（検体）に含まれる稀少細胞は微量であるのに対し、白血球は多量であることから、フィルターに捕捉される白血球の量が稀少細胞の数に対して多いことから、白血球の一部を稀少細胞として検出し、その結果、偽陽性が生じ易くなることがある。２つ目としては、稀少細胞に特異的な遺伝子変異の検出を行った場合、稀少細胞ではない白血球の遺伝子型のみを検出し、その結果、偽陰性が生じ易くなることがある。
これらのことから、フィルターに捕捉された白血球と稀少細胞とを効率よく分離する必要がある。
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、フィルターに捕捉された粒子を、フィルター上で効率よく磁気標識可能な方法及び標識装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一態様において、複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された粒子を磁気ビーズによって標識する方法であって、粒子が捕捉されたフィルター面に、磁気ビーズを含有する懸濁液を供給すること、前記懸濁液の一部を前記フィルター面から他方のフィルター面の方向に送液することにより、前記フィルターの両面に前記磁気ビーズを含む液体が接する状態とすること、及び、前記磁気ビーズを含む液体を、前記他方のフィルター面から前記粒子が捕捉されたフィルター面の方向に逆送液することを含む磁気標識方法に関する。
【０００９】
本開示は、一態様において、粒子を磁気ビーズによって標識するための装置であって、フィルターを保持可能なフィルター部と、前記フィルター部に磁気ビーズを含む懸濁液を導入可能な導入流路と、前記フィルター部を通過した液体を保持又は排出可能な排出流路と、前記フィルター部に前記懸濁液を供給可能な送液手段と、前記送液手段を制御する制御部とを備え、前記制御部は、前記フィルターの両面に前記磁気ビーズを含む液体が接する状態となるように、前記懸濁液の一部を一方のフィルター面から他方のフィルター面に向かって送液し、かつ、前記他方のフィルター面から磁気ビーズを含む液体を逆送液するように前記送液手段を制御する標識装置に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、一態様において、フィルターに捕捉された粒子の磁気ビーズによる標識を、フィルター上で効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本開示の磁気標識方法に使用しうる細胞標識装置の一例を示す。
【図２】図２は、本開示の磁気標識方法の手順の一例を説明する概略模式図を示す。
【図３】図３は、実施例１並びに比較例１及び２において残存した（磁気捕捉されなかった）白血球数の一例を示すグラフである。
【図４】図４は、実験例１で使用した稀少細胞捕捉回収装置の一例を示す。
【図５】図５は、本開示の細胞回収方法に使用可能な細胞捕捉回収装置の構成の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
血液中には、血中循環腫瘍細胞／ＣＴＣ等の稀少な細胞が存在することがある。ＣＴＣは、原発腫瘍組織又は転移腫瘍組織から遊離し、血液に浸潤した細胞である。がんの転移は、がん細胞が血管やリンパ管を通って体内の他の部位に運ばれて増殖することにより起こると考えられていることから、血液中のＣＴＣ数と、がんの転移の可能性及び予後とに関係があることが報告されている。また、稀少細胞には、ＣＴＣ以外に、免疫細胞等といった医学的に重要な細胞が含まれている。このため、血液中の稀少細胞の分析は、今後さらに盛んに行われることが予想される。
１０ｍｌの血液中には、通常、赤血球が数百億個、白血球は数千万個が含まれているが、ＣＴＣ等の稀少細胞は通常０〜１０個程度である。このため、より正確な分析を行うためには、血液等の検体からの稀少細胞の分離及び回収を高い精度で行う必要がある。
【００１３】
稀少細胞には、血球よりサイズの大きながん細胞だけでなく、小型の細胞と、変形能の高い細胞とが存在する。小型の細胞としては、例えば、ヒト結腸癌細胞等が挙げられる（市販のＳＷ６２０（細胞株名、ヒト結腸癌細胞）が小型の細胞として確認されている）。変形能の高い細胞としては、例えば、ヒト癌細胞等が挙げられる（市販のＳＮＵ−１（細胞株名、ヒト癌細胞）が変形能の高い細胞として確認されている）。
本出願人は、所定のフィルターを使用することによって、小型の細胞と変形能の高い細胞とを高い捕捉率で捕捉可能な方法を確立している（例えば、特許文献１）。
しかしながら、上記のとおり、該フィルターを用いて血液等の検体を分離した場合であっても、検体中に多量に含まれる白血球が稀少細胞とともに捕捉される場合がある。このため、稀少細胞と白血球とをさらに分離するための処理が求められる。また、分離後の稀少細胞を分析するために、様々な処理を行う必要がある。
一方、稀少細胞は、上述の通り、検体中に存在する数が極めて少ないことから、フィルターによる分離や標識等の処理、さらには回収時における損失をできる限り避ける必要がある。このため、フィルターに細胞を捕捉した状態で、上記の分離又は分析のための様々な処理を行うことが提案されている。フィルター上での処理は、様々な処理液をフィルターに供給し細胞と反応させた後、未反応の処理液を送液して除去することによって行われる。つまり、フィルターは、Ｂ／Ｆ分離（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ分離）の反応場としての機能を有し、細胞の損失を伴うことなく様々な処理を行うことができる。
このフィルター上での様々な処理において、十分な処理効果が得られる処理と、十分な処理効果が得られない処理とがあるという問題点を本発明者らは見出した。具体的には、抗体染色は十分に染色することができるが、磁気粒子による標識は標識効率が非常に低く、十分に磁気標識できないという問題である。
上記の問題点を鑑み、稀少細胞等の細胞をフィルターから回収して磁気粒子による標識を行うことを試みたが、この方法では、フィルターで捕捉された稀少細胞の損失の発生程度が作業者間又は実験間などで大きいという問題や、再現性が低いという問題があった。また、標識処理をした後に、未反応の余剰の磁気粒子と細胞とを十分に分離することができないことが生じていた。その結果、後段の処理工程である磁気分離時において稀少細胞が、多量に存在する余剰な磁気粒子に巻き込まれ、ともに磁気分離されること等によって分離精度が低下するという問題があった。
【００１４】
本開示は、一態様において、細胞がフィルターに捕捉された状態で磁気粒子による標識を行うにあたり、細胞が捕捉されたフィルター全体が磁気粒子を含む懸濁液によって覆われるように、磁気粒子を含む懸濁液を送液すること、その後、前記懸濁液に含まれていた磁気粒子を含む液体を、懸濁液の送液方向とは反対方向に送液（逆送液）することによって、磁気粒子による標識効率を向上でき、細胞と多量に存在する余剰な磁気粒子とを分離できる、という本発明者ら見出した新たな知見に基づく。
【００１５】
本開示は、一態様において、フィルターに捕捉される細胞数が稀少細胞よりも白血球の方が多いことから、回収目的ではない細胞である白血球を磁気粒子で標識すれば、稀少細胞の分離精度を向上できる、という本発明者ら見出した新たな知見に基づく。具体的には、以下のとおりである。すなわち、稀少細胞であるＣＴＣには、ＥｐＣＡＭやｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎといった上皮系細胞抗原を発現している群や、これら上皮マーカーの発現が低下しＶｉｍｅｎｔｉｎのような間葉系細胞抗原を発現する上皮間葉移行を起こしている群が存在することが明らかになっている。このため、特定の抗原では全てのＣＴＣを認識することは困難である。したがって、ＣＴＣに替えて、特定の抗原を有することが知られている白血球を磁気粒子で標識して分離することによって、ＣＴＣと白血球との分離精度をより向上できるとともに、抗原によらずすべてのＣＴＣを回収することができうるという本発明者ら見出した新たな知見に基づく。なお、ＣＴＣ等の稀少細胞の分析における本開示の標識対象は、白血球に限定されるものではなく、稀少細胞であってもよい。
【００１６】
本開示によって、フィルターに捕捉された細胞をフィルター上で効率よく磁気粒子による標識を行うことができるメカニズムは明らかではないが、以下のように推測される。
複数の貫通孔を有するフィルターに全血を送液して濾過する場合、全血は層流として送液されることから、流路の壁面近傍の流速は低下し、結果として壁面周辺のフィルターには捕捉対象ではない赤血球や白血球がフィルタリングされず比較的多く残存することになる。この状態で染色処理や標識処理を行った場合、溶解性の試薬である抗体染色液では、試薬自身の拡散により十分な染色が可能になるものの、磁気粒子による標識では、壁面周辺の白血球に磁気粒子を十分に接触させることができず、標識効率が低い。この理由として、白血球が多数存在する壁面周辺の流速はフィルター中央部と比較して遅く、また磁気粒子の拡散が比較的穏やかであることが考えられる。これに対し、本開示の方法では、フィルターの両主面が、磁気粒子を含む液体に接するように懸濁液を送液し、その後逆送液させる。フィルターの両主面を磁気粒子を含む液体に浸漬させることにより、フィルターに捕捉された細胞が、フィルターの細胞捕捉面と、細胞捕捉面とは反対側のフィルター面との両方の面（フィルター上面及びフィルター下面）並びに貫通孔内において懸濁液と接触できるようになり、細胞が懸濁液（磁気粒子）とが接触する表面積が大幅に増える。この状態で、フィルターの捕捉面とは反対側のフィルター面から細胞捕捉面（フィルター下面側から上面側）に向かって逆送液させることによって、フィルターの貫通孔に嵌まり込んだ細胞が孔から遊離するとともに、この逆送液によって生じる乱流により磁気粒子を含む懸濁液が撹拌されることから、細胞と磁気粒子との接触頻度がさらに向上される。これらの結果、磁気粒子による標識効率を向上できると考えられる。ただし、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１７】
［磁気粒子（磁気ビーズ）による標識方法］
本開示は、一態様において、複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された粒子を磁気ビーズによって標識する方法（本開示の標識方法）に関する。本開示の標識は、一態様において、粒子が捕捉されたフィルター面に、磁気ビーズを含有する懸濁液を供給すること、前記懸濁液の一部を前記フィルター面から他方のフィルター面の方向に送液することにより、前記フィルターの両面に前記磁気ビーズを含む液体が接する状態とすること、及び、前記磁気ビーズを含む液体を、前記他方のフィルター面から前記粒子が捕捉されたフィルター面の方向に逆送液することを含む。また、本開示の標識方法は、一態様において、前記粒子が捕捉されたフィルターの上面に、磁気ビーズを含有する懸濁液を供給すること、前記懸濁液の上部液面と下部液面とが前記フィルターを挟むように、前記懸濁液の一部を前記フィルターの下面側に向かって送液すること、及び前記フィルターに対し、前記フィルターの下面側から上面側に向かって送液することを含む。本開示の標識方法によれば、一又は複数の実施形態において、フィルターに捕捉された粒子の磁気ビーズによる標識を、フィルターから回収することなくフィルター上において効率よく行うことができる。
【００１８】
本開示の標識方法は、粒子が捕捉されたフィルター面に磁気ビーズを含有する懸濁液を供給することを含む。
【００１９】
磁気ビーズを含有する懸濁液の供給量は、特に制限されるものではなく、フィルターのろ過面積等に応じて適宜決定できる。供給量は、一又は複数の実施形態において、フィルター上で磁気ビーズを効率よく均一に懸濁できるという点から、ろ過面積（２８ｍｍ2）あたり５０μＬ以上又は１００μＬ以上であり、又は少量の液で磁気ビーズを効率よく均一に懸濁できるという点から、５００μＬ以下又は３００μＬ以下である。
【００２０】
磁気ビーズを含有する懸濁液における磁気ビーズの含有量（固形分濃度）は、一又は複数の実施形態において、磁気ビーズと細胞とを効率的に反応させる点から、０．００２５％以上又は０．００４％以上であり、磁気ビーズと細胞との非特異的な反応を抑制する点から、０．０６２５％以下又は０．０３７５％以下である。
【００２１】
磁気ビーズ（磁性粒子）としては、特に制限されるものではなく、標識対象である粒子の種類等に応じて適宜決定できる。磁気ビーズとしては、一又は複数の実施形態において、細胞等の粒子を磁気標識するために使用される公知の磁気ビーズ又は今後開発されうる磁気ビーズが使用できる。磁気ビーズとしては、一又は複数の実施形態において、標識対象である粒子の結合分子に特異的に反応する物質が表面に固定された磁性粒子（ビーズ）が挙げられる。該物質としては、一又は複数の実施形態において、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗体、及び抗原等が挙げられる。磁気ビーズのサイズは、特に制限されるものではなく、粒子のサイズ及び／又は磁気標識に使用するフィルターの開口部（孔）の大きさに応じて適宜決定できる。標識対象となる粒子のサイズが、白血球やＣＴＣのように直径が５μｍ〜２０μｍである場合、一又は複数の実施形態において、標識効率向上の点から、１μｍ以下、０．８μｍ以下、又は０．５μｍ以下である。磁気分離効率向上の点から、０．０５μｍ以上、又は０．１μｍ以上である。磁気標識後の洗浄により過剰な磁気ビーズを除去できる観点から、磁気ビーズの大きさは、磁気標識に使用するフィルターの開口部（孔）の大きさよりも小さい。
【００２２】
本開示の標識方法は、粒子が捕捉されたフィルター面（粒子捕捉面又はフィルター上面）に供給された懸濁液の一部を、他方のフィルター面（粒子捕捉面とは反対側のフィルター面（反対面又はフィルター下面））に向かって送液し、これによりフィルターの両方の面（粒子捕捉面と反対面との両方の面）に磁気ビーズを含む液体が接する状態とすることを含む。また、該懸濁液の送液は、一又は複数の実施形態において、磁気ビーズを含む液体の上部液面と下部液面とがフィルターを挟むように、懸濁液の一部をフィルターの下面側に向かって送液することを含みうる。該送液は、一又は複数の実施形態において、反対側のフィルター面近傍に磁気ビーズを含む液体が保持されるように行う。該送液は、一又は複数の実施形態において、懸濁液がフィルターを通過し、磁気ビーズを含む液体がフィルターの両方の面に接するように、反対面側からポンプで引くことによって行うことができる。即ち、本開示の標識方法では、懸濁液の一部を粒子捕捉面とは反対側のフィルター面側に向かって積極的に送液する点で、意図せずフィルターに液が浸透ないし拡散し、フィルター下面近傍まで当該液が到達する現象とは相違する。
【００２３】
磁気ビーズを含む液体としては、磁気ビーズを含む液体であれば特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、フィルター面に供給された磁気ビーズを含有する懸濁液、及び該懸濁液がその他の液体と混合して希釈された液体等が挙げられる。磁気ビーズを含む液体における磁気ビーズの濃度（固形分濃度）は、一又は複数の実施形態において、０．００００９％以上、０．０００１２％以上若しくは０．０００２１％以上であり、又は０．０５８１％以下、０．０４１５％以下若しくは０．００２４９％以下である。その他の液体としては、一又は複数の実施形態において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰＢＳ−ＢＳＡ（例えば０．２％）、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（例えば１ｍｇ／ｍｌ）及び緩衝液、等張液及び水等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液等が挙げられる。また、等張液としては、生理食塩水、ショ糖等張液、グルコース等張液、マンノース等張液等が挙げられる。
【００２４】
反対面側に送液する懸濁液の割合としては、一又は複数の実施形態において、フィルター両面が磁気ビーズを含む液体と十分に接するようにする点から、粒子捕捉面に供給された懸濁液の１０％以上、２０％以上、又は４０％以上であり、反対面側から粒子捕捉面側に向かって送液する際に効率よく懸濁液の全てを送液する点から、９０％以下、８０％以下、又は６０％以下である。
【００２５】
懸濁液の流速は、一又は複数の実施形態において、フィルター捕捉された粒子と磁気ビーズとの反応効率向上の点から、フィルターの開口面積あたり、０．０７ｍｍ／秒以上、０．１ｍｍ／秒以上又は０．３ｍｍ／秒以上であり、同様にフィルター捕捉された粒子と磁気ビーズとの反応効率向上の点から、フィルターの開口面積あたり、１４ｍｍ／秒以下、１．４ｍｍ／秒以下又は０．７ｍｍ／秒以下である。懸濁液の流量は、フィルター捕捉された粒子と磁気ビーズとの反応効率向上の点から、０．０５μＬ／分以上、０．１μＬ／分以上又は０．２μＬ／分以上であり、同様にフィルター捕捉された粒子と磁気ビーズとの反応効率向上の点から、１００００μＬ／分以下、１０００μＬ／分以下又は５００μＬ／分以下である。本開示における「フィルターの開口面積あたりの流速」とは、フィルターの開口部（孔）を通る液体の速度をいう。開口面積あたりの流速は、一又は複数の実施形態において、系全体の流量を開口部（孔）の総面積で除することにより算出することができる。本開示における「流量」とは、単位時間に流れる液体の量（体積）をいう。流量としては、一又は複数の実施形態において、単位時間においてフィルターを通過する液体の量（体積）が挙げられる。
【００２６】
本開示の標識方法は、両面が懸濁液に浸漬したフィルターに対し、粒子捕捉面とは反対側のフィルター面側から粒子が捕捉されたフィルター面側（フィルター下面側から上面側）に向かって送液する（逆流させる）ことを含む。両主面が磁気ビーズを含有する液体に接した状態（浸漬した状態）のフィルターに対して、反対面側から粒子捕捉面側に向かって送液して、磁気ビーズを含む懸濁液を送流させるとともに、フィルターに捕捉された粒子をフィルターから遊離することによって、磁気ビーズと標識対象である粒子との反応性を向上させ、標識効率を向上させることができる。
【００２７】
逆流は、一又は複数の実施形態において、粒子捕捉面とは反対側のフィルター面側（フィルター下面側）に位置する懸濁液のみを送液してもよいし、懸濁液とは異なる液体を送液してもよい。懸濁液とは異なる液体は、一又は複数の実施形態において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰＢＳ−ＢＳＡ（例えば０．２％）、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（例えば１ｍｇ／ｍｌ）及び緩衝液、等張液及び水等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液等が挙げられる。また、等張液としては、生理食塩水、ショ糖等張液、グルコース等張液、マンノース等張液等が挙げられる。
【００２８】
反対面側から粒子捕捉面側への送液流速（逆流流速）は、一又は複数の実施形態において、粒子をフィルターに捕捉させる際の検体の流速によって適宜決定してもよい。逆流流速は、一又は複数の実施形態において、検体の流速よりも速くてもよいし、検体の流速よりも遅くてもよい。逆流流速としては、一又は複数の実施形態において、検体流速の１／１０倍以上の流速、１／５倍以上の流速、１／２倍以上の流速、１倍以上の流速、２倍以上の流速、３倍以上の流速、又は５倍以上の流速が挙げられる。逆流流速は、一又は複数の実施形態において、磁気ビーズによる標識効率を向上させる点から、検体の流速よりも速くすることが挙げられる。
【００２９】
反対面側から粒子捕捉面側への送液流速は、一又は複数の実施形態において、磁気ビーズによる標識効率をさらに向上させる点から、フィルターの開口面積あたり、０．０１ｍｍ／秒以上、０．１ｍｍ／秒以上又は１ｍｍ／秒以上であり、細胞へのダメージ抑制の点から、フィルターの開口面積あたり、１５００００ｍｍ／秒以下、１０００００ｍｍ／秒以下又は５００００ｍｍ／秒以下である。逆流流量は、磁気ビーズによる標識効率を向上させる点から、１０μＬ／分以上、１００μＬ／分以上又は１０００μＬ／分以上であり、細胞へのダメージ抑制の点から、１億μＬ／分以下、５０００万μＬ／分以下又は１０００万μＬ／分以下である。
【００３０】
逆流させる液体の量は、一又は複数の実施形態において、磁気ビーズを含有する液体を粒子捕捉面に効率よく送液させる点から、ろ過面積（２８ｍｍ2）あたり５０μＬ以上又は１００μＬ以上であり、又は懸濁液の濃度を維持する点から、１０００μＬ以下、５００μＬ以下又は３００μＬ以下である。
【００３１】
フィルターの懸濁液への浸漬及び上記の反対面側から粒子捕捉面側への送液（逆流）を行う回数は、特に制限されるものではなく、１回であってもよいし２回以上であってもよい。
【００３２】
本開示の標識方法は、磁気ビーズによる標識効率をさらに向上させる点から、一又は複数の実施形態において、上記の逆流後に粒子捕捉面の磁気ビーズ及び標識対象である粒子を含有する液体を撹拌することを含んでいてもよい。撹拌としては、一又は複数の実施形態において、ピペッティングが挙げられる。
【００３３】
本開示の標識方法は、磁気ビーズによる標識効率をさらに向上させる点から、一又は複数の実施形態において、撹拌後に静置することを含んでいてもよい。静置時間は、一又は複数の実施形態において、粒子と磁気ビーズを十分に反応させる点から、１分以上、５分以上、又は１０分以上であり、粒子と磁気ビーズとの非特異反応を防止する点から、６０分以下、４５分以下、又は３０分以下である。
【００３４】
本開示の標識方法は、磁気ビーズによる標識効率をさらに向上させる点から、一又は複数の実施形態において、ピペッティング後、磁気ビーズ及び標識対象の粒子を含有する液体を、フィルター濾過すること、その後静置することを含んでいてもよい。これにより、標識対象の粒子を含むフィルターに予め捕捉されていた粒子を、再度フィルターに捕捉させるとともに、該粒子と磁気ビーズとを再度接触させることができる。静置は、一又は複数の実施形態において、フィルターの両面が、磁気ビーズ及び標識対象の粒子を含有する液体によって覆われた状態で行うことが好ましい。
【００３５】
フィルター濾過の送液流速は、一又は複数の実施形態において、フィルター捕捉された粒子と磁気ビーズとの反応効率向上の点から、フィルターの開口面積あたり、０．０７ｍｍ／秒以上、０．１ｍｍ／秒以上又は０．３ｍｍ／秒以上であり、同様にフィルター捕捉された粒子と磁気ビーズとの反応効率向上の点から、フィルターの開口面積あたり、１４ｍｍ／秒以下、１．４ｍｍ／秒以下又は０．７ｍｍ／秒以下である。懸濁液の流量は、フィルター捕捉された粒子と磁気ビーズとの反応効率向上の点から、０．０５μＬ／分以上、０．１μＬ／分以上又は０．２μＬ／分以上であり、同様にフィルター捕捉された粒子と磁気ビーズとの反応効率向上の点から、１００００μＬ／分以下、１０００μＬ／分以下又は５００μＬ／分以下である。
【００３６】
静置時間は、一又は複数の実施形態において、粒子と磁気ビーズを十分に反応させる点から、１分以上、５分以上、又は１０分以上であり、粒子と磁気ビーズとの非特異反応を防止する点から、６０分以下、４５分以下、又は３０分以下である。
【００３７】
本開示の標識方法は、一又は複数の実施形態において、標識に使用されなかった余分な磁気ビーズを洗浄するために、洗浄液を送液することを含んでいてもよい。洗浄液としては、一又は複数の実施形態において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰＢＳ−ＢＳＡ（例えば０．２％）、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（例えば１ｍｇ／ｍｌ）及び緩衝液、等張液及び水等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液等が挙げられる。また、等張液としては、生理食塩水、ショ糖等張液、グルコース等張液、マンノース等張液等が挙げられる。
【００３８】
本開示の標識方法は、一又は複数の実施形態において、予めフィルターに粒子が捕捉されていてもよいし、磁気ビーズを含有する懸濁液の供給に先立ち、フィルターを用いて粒子を捕捉することを含んでいてもよい。フィルターによる粒子の捕捉は、一又は複数の実施形態において、標識対象である粒子を含む検体を、フィルターに供給してフィルター濾過することによって行うことができる。
【００３９】
検体の流速は、検体中の粒子の捕捉率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、開口面積当たり、０．０１ｍｍ／秒以上、０．０５ｍｍ／秒以上、又は０．１ｍｍ／秒以上であり、同様の点から、１００ｍｍ／秒以下、５０ｍｍ／秒以下、２５ｍｍ／秒以下、１０ｍｍ／秒以下、５ｍｍ／秒以下、又は２ｍｍ／秒以下である。検体の流量は、検体中の粒子の捕捉率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、０．０１ｍｌ／分以上、０．０５ｍｌ／分以上、又は０．１ｍｌ／分以上であり、同様の点から、１００ｍｌ／分以下、５０ｍｌ／分以下、２５ｍｌ／分以下、又は１０ｍｌ／分以下である。
【００４０】
本開示の標識方法は、一又は複数の実施形態において、磁気ビーズを含有する懸濁液の供給に先立ち、粒子が捕捉されたフィルター面とは反対側のフィルター面側の流路に液体を充填することを含んでいてもよい。液体の充填は、一又は複数の実施形態において、粒子が捕捉されたフィルターが該液体に浸漬するように行ってもよい。液体としては、一又は複数の実施形態において、上記の洗浄液として使用可能な液体があげられる。
【００４１】
本開示の標識方法は、一又は複数の実施形態において、複数の貫通孔を有するフィルターを備える分離部を有する装置等を用いて行うことができる。本開示の標識方法は、操作性を向上でき、また少量の磁気ビーズ懸濁液であっても効率よく標識できるという点から、一又は複数の実施形態において、フィルターの上部が解放された開放系の装置で行うことが好ましい。
【００４２】
本開示の標識方法における懸濁液の供給、送液及び攪拌等の上記の処理は、一又は複数の実施形態において、自動で行ってもよいし、手動で行ってもよい。また、一部の処理を手動で行い、残りの処理を自動で行ってもよい。
【００４３】
本開示の標識方法に用いるフィルターとしては、一又は複数の実施形態において、検体中の稀少細胞を捕捉可能なフィルターが挙げられる。フィルターは、一又は複数の実施形態において、小型のがん細胞、変形能の高い癌細胞、又はこれらの両方の細胞を少なくとも捕捉可能なフィルターであることが好ましい。また、フィルターは、一又は複数の実施形態において、ＳＮＵ−１、ＳＷ６２０又はこれらの両方を少なくとも捕捉可能なフィルターであることが好ましく、より好ましくは検体中のＣＴＣを捕捉可能なフィルターである。フィルターとしては、一又は複数の実施形態において、従来公知又は今後開発される稀少細胞を捕捉可能なフィルターが使用できる。フィルターとしては、一又は複数の実施形態において、特許文献１に記載のフィルター、及び特願２０１６−０５７３１３に記載のフィルター等が挙げられる。また、例えば、短軸径が１μｍ〜５０μｍの楕円、真円又は矩形等の貫通孔を多数含むシート状の単一メンブレンが挙げられ、不織布以外のものが好ましい。
【００４４】
フィルターの材質は、一又は複数の実施形態において、ニッケル、ＳＵＳ、金、銀、胴、アルミニウム、タングステン、又はクロム等の金属が挙げられる。
【００４５】
ろ過面積は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、５ｍｍ2以上、又は１０ｍｍ2以上であり、又は２，０００ｍｍ2以下、１，０００ｍｍ2以下、５００ｍｍ2以下、２００ｍｍ2以下、１５０ｍｍ2以下、１００ｍｍ2以下、８０ｍｍ2以下、５０ｍｍ2以下、４０ｍｍ2以下、３０ｍｍ2以下又は２５ｍｍ2以下である。本開示における「ろ過面積」とは、フィルターの全体面積のうち、磁気ビーズを含有する懸濁液又は検体が接触する（送液される）部分の面積のことをいう。
【００４６】
本開示の標識方法により標識された粒子は、一又は複数の実施形態において、公知の磁気分離装置によって目的の粒子を分離することができる。
【００４７】
本開示の標識方法は、一又は複数の実施形態において、複数種類の粒子がフィルターに捕捉されている場合であっても、粒子の特性や粒子で発現しているタンパク質に応じて、標識を行う対象となる粒子を特異的に標識することができる。一又は複数の実施形態において、ＣＴＣ等の稀少細胞の解析において、フィルターに稀少細胞と白血球とが捕捉された場合であっても、本開示の標識方法によれば、白血球を高い標識効率で磁気標識することができる。このため、本開示の標識方法による標識後、回収した懸濁液を磁気分離することによって稀少細胞と磁気標識された白血球とを精度よく分離でき、それにより稀少細胞を高い精度で回収することができる。フィルターに稀少細胞と白血球とが捕捉された場合の一又は複数の実施形態において、白血球に替えて稀少細胞を磁気標識してもよい。
標識後の回収は、一又は複数の実施形態において、フィルターによる粒子捕捉時の濾過方向とは反対の方向に回収液を送液することにより行うことができる。回収液は、一又は複数の実施形態において、後述する細胞の回収方法と同様に、細胞が捕捉された前記フィルターに、細胞の捕捉のための検体の通液方向とは逆の方向から、回収液の通液流量と検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上となるように通液するか、又は開口面積あたり１ｍｍ／秒以上の流速で通液することにより行うことができる。具体的な条件等は、後述する細胞の回収方法と同様である。
【００４８】
本開示における粒子としては、特に限定されるものではなく、ヒト又はヒト以外の動物の細胞が挙げられる。特に限定されない細胞の例としては、稀少細胞、白血球、赤血球、血小板およびそれらの未分化細胞等が挙げられる。稀少細胞とは、ヒト又はヒト以外の動物の血液中に含まれ得る血球成分（赤血球、白血球、及び血小板）以外の細胞をいう。稀少細胞としては、一又は複数の実施形態において、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、幹細胞、未分化白血球、未分化赤血球及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞等が挙げられる。
【００４９】
本開示における検体としては、本開示の標識方法に適用されうる粒子細胞を含みうる試料が挙げられる。検体としては、一又は複数の実施形態において、血液検体が挙げられる。血液検体としては、限定されない一又は複数の実施形態において、簡便かつ迅速な処理の観点及び血液中の稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から、血液又はその希釈物等が挙げられる。
【００５０】
［標識装置］
本開示は、一態様において、粒子を磁気ビーズによって標識するための装置（本開示の標識装置）に関する。本開示の標識装置は、フィルターを保持可能なフィルター部と、フィルター部に磁気ビーズを含む懸濁液を導入可能な導入流路と、フィルター部を通過した液体を保持又は排出可能な排出流路と、フィルター部に懸濁液を供給可能な送液手段と、送液手段を制御する制御部とを備える。本開示の標識装置において、制御部は、フィルター部に供給する前記懸濁液の少なくとも一部が前記フィルター部を通過して保持されるように前記懸濁液を送液しかつ、通過した磁気ビーズを含む液体を逆送液するように、送液手段を制御する。本開示の標識装置によれば、本開示の標識方法を簡便に行うことができる。
【００５１】
本開示の標識装置は、一又は複数の実施形態において、フィルターの面ないしその近傍で液体を攪拌する攪拌手段を含んでいてもよい。
【００５２】
制御部は、一又は複数の実施形態において、標識する粒子を含む検体をフィルター部に供給するように送液手段を制御してもよい。制御部は、該検体を、フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒〜１００ｍｍ／秒の流速で送液するように送液手段を制御してもよい。制御部は、逆送液の流速が、検体の流速の１／１０よりも速くなるように送液手段を制御してもよい。制御部は、逆送液の送液流速が、フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒以上となるように送液手段を制御してもよい。
【００５３】
以下に、本開示の標識方法について、限定されない一実施形態を説明する。
【００５４】
図１に示す稀少細胞標識装置を用い説明する。
【００５５】
本開示の標識方法に利用可能な稀少細胞標識装置の一例を図１に示す。
図１に示す稀少細胞標識装置は、磁気ビーズを含有する懸濁液、洗浄液及び染色液等を供給するための供給口１、洗浄液等の廃液を排出するための排出口２、デバイス上部３、デバイス下部４、フィルター部５、並びに矢印Ａ及びＢ方向に送液可能な送液機構（図示せず）を有する。フィルター部５は、デバイス上部３とデバイス下部４との間に配置されている。デバイス上部３は、流路６と、フィルター部５を固定するための支持部材７とを有し、流路６は供給口１と連通する。デバイス下部４は、流路８と、フィルター部５を固定するための支持部材９とを有し、流路８は排出口２と連通する。フィルター部５は、フィルター１０と、フィルター１０を固定するための接合材（例えば、両面テープ等）１１，１２とを含む。フィルター１０は、接合材１１，１２によってデバイス上部３及びデバイス下部４と固定化されている。供給口１とフィルター部５とをつなぐ流路６には、フィルター部５の上部に接続部（図示せず）及び液の切り替えが可能な三方活栓弁（図示せず）を配置してもよい。また、供給口１とフィルター部５とを接続する流路６には、ろ過にかかる圧力が一定になるように、（一定の圧で送液可能な機構又は一定流量で送液可能な機構としての）加圧手段（図示せず）を配置してもよい。また、濾過にかかる圧力が一定以上にならように、シリンジポンプで引いてもよい。
【００５６】
つぎに、図１の稀少細胞標識装置を用いた粒子の標識方法の一例について図２を用いて説明する。本実施形態では、フィルターとして稀少細胞を捕捉可能なフィルターを使用し、該フィルターで稀少細胞を含有する全血をフィルター濾過することによって、フィルターに捕捉された白血球を磁気ビーズで標識する形態を例にとり説明する。また、図２において灰色の部分は、磁気ビーズを含む部分を模式的に示すものである。おいてなお、本開示は、該実施形態に限定されるものではない。
【００５７】
まず、血液検体を流路６を通じて分離部に送液し、フィルター１０によってフィルターろ過する。これにより、フィルター１０には稀少細胞と白血球とが捕捉される。
【００５８】
ついで、白血球に対する試薬の反応性を向上させる観点から、溶血剤を供給して処理することによって、フィルター１０に残存する赤血球を除去することを行ってもよい。
【００５９】
つぎに、供給口１から緩衝液を供給して、流路８に緩衝液を充填する。緩衝液は、フィルター１０の細胞捕捉面（上面）１０ａが浸漬するように供給する。ついで、フィルター１０の細胞捕捉面１０ａに、磁気粒子を含有する懸濁液２１を供給する（図２（ａ））。磁気粒子と白血球との反応性を向上させる点から、懸濁液２１の供給に先立ち、白血球を抗体によって免疫染色してもよい。抗体としては、例えば、結合分子を結合させた抗体等が挙げられる。結合分子としては、一又は複数の実施形態において、ビオチン等が挙げられる。また、磁気粒子としては、例えば、上記結合分子に特異的に反応する物質が固定化された磁性粒子を使用してもよい。特異的に反応する物質としては、一又は複数の実施形態において、ストレプトアビジン、及びニュートラアビジン等のタンパク質が挙げられる。
【００６０】
磁気粒子を含有する懸濁液２１の一部が細胞捕捉面１０ａとは反対側のフィルター面（下面）１０ｂ側（流路８側）に移動するように、懸濁液２１をフィルター１０の細胞捕捉面１０ａ側から、フィルター面１０ｂ側に向かって（図１及び２の矢印Ａ方向）送液する（図２（ｂ））。
【００６１】
次に、フィルター面１０ｂ側から細胞捕捉面１０ａ側に向かって（図１及び２の矢印Ｂ方向）、液体を送液する（逆送液させる）（図２（ｃ））。これにより、フィルター１０から遊離した細胞がフィルター１０の細胞捕捉面（上面）１０ａ上で撹拌されるとともに、フィルター１０の細胞捕捉面１０ａの磁気粒子を含有する液体が撹拌され、その結果、白血球と磁気粒子との接触頻度を向上させることができ、標識効率を向上できる。フィルター面１０ｂ側に位置する懸濁液のみを逆送液してもよいし、該懸濁液に合わせて異なる液体を逆送液してもよい。前記異なる液体は、磁気粒子を含有していてもよいし、磁気粒子を含有していなくてもよい。
【００６２】
次に、フィルター１０の細胞捕捉面１０ａにおいて、磁気粒子及び細胞を含有する懸濁液をピペット等によって撹拌し、その後所定の時間静置する。これにより、白血球と磁気粒子との接触頻度をさらに向上させることができ、標識効率を向上できる。
【００６３】
次に、フィルター１０の細胞捕捉面１０ａの細胞と磁気粒子とを含有する懸濁液２３を、細胞捕捉面１０ａ側から反対側のフィルター面１０ｂ側に向かって（図１及び２の矢印Ａ方向）再度送液し、その後所定の時間静置する（図２（ｄ））。これにより、懸濁液に含まれる細胞がフィルター１０に捕捉される。また、磁気粒子はフィルター１０を通過するが、フィルター１０の通過時に、磁気粒子を、フィルター１０に捕捉された細胞と再度接触させることができることから、白血球と磁気粒子との接触頻度をさらに向上させることができ、標識効率を向上できる。該送液は、フィルター１０の細胞捕捉面１０ａ及び反対側のフィルター面１０ｂが、磁気粒子を含有する液体によって挟み込まれるように行うことが好ましい。
【００６４】
そして、磁気粒子を含む液体２３をフィルター１０の細胞捕捉面１０ａ近くまで下げた後、フィルター１０の細胞捕捉面１０ａ側から（図１及び２の矢印Ａ方向）洗浄液２４を供給し（図２（ｅ））、洗浄液２４の液面がフィルター１０の細胞捕捉面１０ａ近くになるように送液する（図２（ｆ））。これにより、フィルター１０に残った未反応の磁気粒子を除去する。洗浄液２４の送液は繰り返し複数回行ってもよい。
【００６５】
上記の磁気粒子による白血球の標識後、稀少細胞を抗体によって免疫染色してもよい。これにより、分離回収後の稀少細胞の検出を効率よく行うことができる。抗体としては、例えばＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎのようなＣＴＣの細胞内で発現する抗原を認識する抗体等が挙げられる。稀少細胞内の抗原に抗体を反応させる点から、抗体による標識に先立ち、固定化処理及び膜透過処理を行ってもよい。
【００６６】
最後に、フィルター面１０ｂ側から（図１及び２の矢印Ｂ方向）回収液を送液することによって、フィルター１０に捕捉された細胞（白血球及び稀少細胞）を含む回収液を細胞捕捉面１０ａ上に押し出し、それをピペット等を用いて回収する。回収した回収液を別途磁気分離を行うことにより、磁気粒子で標識された白血球と稀少細胞とを分離することができる。
【００６７】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕  複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された粒子を磁気粒子によって標識する方法であって、
粒子が捕捉されたフィルター面に、磁気粒子を含有する懸濁液を供給すること、
前記懸濁液の一部を前記フィルター面から他方のフィルター面の方向に送液することにより、前記フィルターの両面に前記磁気粒子を含む液体が接する状態とすること、及び、
前記磁気粒子を含む液体を、前記他方のフィルター面から前記粒子が捕捉されたフィルター面の方向に逆送液すること、を含む、磁気標識方法。
〔２〕  前記他方のフィルター面から前記粒子が捕捉されたフィルター面への送液後、前記磁気粒子を含む液体を前記粒子が捕捉されたフィルター面で撹拌することを含む、〔１〕記載の標識方法。
〔３〕  前記粒子を含む検体を、前記フィルターに送液することにより、前記粒子を前記フィルターに捕捉させることを含む、〔１〕又は〔２〕に記載の標識方法。
〔４〕  前記検体の流速は、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒〜１００ｍｍ／秒である、〔３〕記載の標識方法。
〔５〕  前記逆送液流速を、前記検体の流速の１／１０よりも速くする、〔３〕又は〔４〕に記載の標識方法。
〔６〕  前記逆送液流速は、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒以上である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の標識方法。
【００６８】
また、本開示は、上記方法に加え、以下の装置を提供する。以下の装置が、上記記載において当業者において明確かつ十分に開示されていることは言うまでもない。
（Ａ１）複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された粒子を磁気粒子によって標識するための装置であって、
前記粒子が捕捉されたフィルターの上面に、磁気粒子を含有する懸濁液を供給する手段、
前記懸濁液の上部液面と下部液面とが前記フィルターを挟むように、前記懸濁液の一部を前記フィルターの下面側に向かって送液する手段、及び
前記フィルターに対し、前記フィルターの下面側から上面側に向かって送液する手段、を含む、磁気標識装置。
（Ａ２）前記フィルターの下面側から上面側への送液後、前記フィルターの上面の懸濁液を撹拌する手段を含む、（Ａ１）に記載の標識装置。
（Ａ３）前記粒子を含む検体を、前記フィルターの上面に送液する手段を含む、（Ａ１）又は（Ａ２）に記載の標識装置。
（Ａ４）前記検体送液手段が、検体の流速が、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒〜１００ｍｍ／秒となるよう、送液する、（Ａ３）記載の標識装置。
（Ａ５）前記フィルターの下面側から上面側に向かって送液する手段が、前記フィルターの下面側から上面側への送液流速が、前記検体の流速の１／１０よりも速くなるよう、送液する、（Ａ３）又は（Ａ４）に記載の標識装置。
（Ａ６）前記フィルターの下面側から上面側に向かって送液する手段が、前記フィルターの下面側から上面側への送液流速が、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒以上となるよう、送液する、（Ａ１）から（Ａ５）のいずれかに記載の標識装置。
〔Ｂ１〕  粒子を磁気粒子によって標識するための装置であって、
フィルターを保持可能なフィルター部と、
前記フィルター部に磁気粒子を含む懸濁液を導入可能な導入流路と、
前記フィルター部を通過した液体を保持又は排出可能な排出流路と、
前記フィルター部に前記懸濁液を供給可能な送液手段と、
前記送液手段を制御する制御部とを備え、
前記制御部は、前記フィルターの両面に前記磁気粒子を含む液体が接する状態となるように、前記懸濁液の一部を一方のフィルター面から他方のフィルター面に向かって送液し、かつ、前記他方のフィルター面から磁気粒子を含む液体を逆送液するように、前記送液手段を制御する、標識装置。
〔Ｂ２〕  液体を撹拌する手段を含む、〔Ｂ１〕記載の標識装置。
〔Ｂ３〕  前記フィルター面ないしその近傍で液体を撹拌する手段を含む、〔Ｂ１〕又は〔Ｂ２〕記載の標識装置。
〔Ｂ４〕  前記制御部は、前記標識する粒子を含む検体を前記フィルター部に供給するように前記送液手段を制御する、〔Ｂ１〕から〔Ｂ３〕のいずれかに記載の標識装置。
〔Ｂ５〕  前記制御部は、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒〜１００ｍｍ／秒の流速で前記検体を送液するように前記送液手段を制御する、〔Ｂ４〕記載の標識装置。
〔Ｂ６〕  前記制御部は、前記逆送液の流速が前記検体の流速の１／１０よりも速くなるように前記送液手段を制御する、〔Ｂ４〕又は〔Ｂ５〕に記載の標識装置。
〔Ｂ７〕  前記制御部は、前記逆送液の送液流速が、前記フィルターの開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒以上となるように前記送液手段を制御する、〔Ｂ１〕から〔Ｂ６〕のいずれかに記載の標識装置。
【００６９】
［検体中の細胞を回収する方法］
稀少細胞を高い精度で分析するためには、フィルターに捕捉された細胞を高い精度で回収することが求められる。そこで、本開示は、その他の態様において、フィルターに捕捉された細胞を高い回収率でフィルターから回収可能な方法に関する。
【００７０】
血液から特定の成分を分離又は回収する方法として、例えば、特許文献１には、所定の特性を有するフィルターで血液を処理して血液中の稀少細胞をフィルターに捕捉させ、それを分析する方法が開示されている。
【００７１】
体液からの細胞の回収は、検査以外の用途においても行われている。例えば、特開平１０−２０１４７０号公報（特許４４１２６２１）は、造血幹細胞移植等のために、骨髄等の体液から目的の細胞を回収する方法を開示する。特開平１０−２０１４７０号公報の実施例では、骨髄又は末梢血等を不織布に導入し、白血球又はＣＤ３４陽性細胞を不織布で捕捉した後、１７．２ｍＰａ・ｓ以上３１．８ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有する液体を逆流させることによって、不織布に捕捉された白血球又はＣＤ３４陽性細胞を回収する方法を開示する。
【００７２】
しかしながら、特開平１０−２０１４７０号公報の方法では、回収に用いる回収液の粘度が５ｍＰａ・ｓ以上３１．８ｍＰａ・ｓ以下である必要があり、回収液に使用する組成が限定されるという問題がある。また、特開平１０−２０１４７０号公報は、上記のとおり、造血幹細胞移植等のための細胞の分離回収方法であることから、捕捉手段に捕捉された細胞の回収を、多量の回収液量で行われるため、回収後の細胞を分析に供するには適さないという問題がある。
特許文献１には、フィルターに捕捉した稀少細胞を回収する技術についての開示はない。
【００７３】
本出願人は、所定のフィルターを使用することによって、上記の通り、ＳＷ６２０のような小型の細胞とＳＮＵ−１のような変形能の高い細胞とを高い捕捉率で捕捉可能な方法を確立している（例えば、特許文献１）。
一方で、稀少細胞の分析は、例えば、稀少細胞の観察、及び数の計測、並びに稀少細胞から抽出した核酸を測定すること等により行われる。これらの分析を精度よく行うためには、フィルターに捕捉された稀少細胞をフィルターから分離して回収すること必要がある。
【００７４】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた過程で、稀少細胞が捕捉されたフィルターから稀少細胞を回収するにあたり、稀少細胞を捕捉時の検体の通液流量に対する回収液の通液流量の比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上となるように、回収液を逆流させることによって、高い回収率かつ少量の回収液で細胞を回収できることを見出した。また、本発明者らは、稀少細胞を捕捉したフィルターに対し、フィルターの開口面積あたり１ｍｍ／秒以上の流速で回収液を逆流させることによって、細胞へのダメージを抑えつつ、フィルターに捕捉された細胞を高い回収率で回収することができることを見出した。
【００７５】
本発明者らは、フィルターに捕捉された稀少細胞を高い回収率かつ少量の回収液で回収できない原因の一つとして、稀少細胞の濾過（捕捉）時に稀少細胞や混在するその他の細胞が一部の孔を閉塞し、回収時のフィルターには閉塞した孔と閉塞していない孔とが混在し、その結果、閉塞した孔に捕捉された稀少細胞には回収液の通液による押し出す力が十分に作用しないことを見出した。そして、回収液を、細胞の捕捉のための検体の通液方向とは逆の方向から通液し、かつ、その流速を、回収液を通液するフィルター面（フィルターの細胞捕捉面とは反対側のフィルター面）において乱流が生じる流速とすることにより、フィルターに捕捉された稀少細胞を高い回収率かつ少量の回収液で回収できることを見出した。
【００７６】
特開平１０−２０１４７０号公報には、ポリエステル不織布製のフィルターに、末梢全血５０ｍｌを流速約５ｍｌ／分で通液した後、粘度が１７ｍＰａ・ｓを超える回収液３０ｍｌを１００ｍｌ／分で通液することによってフィルターに捕捉された細胞を回収することが開示されている（実施例１〜５）。一方で、同文献には、上記の粘度の回収液に替えて粘度が１．０ｍＰａ・ｓの回収液（生理食塩水）を使用したところ、回収率が３１％以下であることも開示されている（比較例１及び２）。
これに対し、本開示の方法によれば、細胞捕捉時の検体の通液流量に対する回収液の通液流量の比又は回収液の流速を特定の範囲に設定し、かつ、特定のフィルター（複数の貫通孔を有するフィルター）を使用することによって、回収液の粘度に関わらず、フィルターに捕捉された細胞を高い回収率で回収できることを実現するものである。さらに、本開示の方法は、特開平１０−２０１４７０号公報では十分な回収率が得られない粘度の回収液であっても、高い回収率で回収できることが実現できている。つまり、本開示の方法は、特開平１０−２０１４７０号公報とは技術的思想が全く異なる技術である。
また、特開平１０−２０１４７０号公報の方法は、造血幹細胞移植等のために、白血球、血小板及び赤血球の混合物から白血球を選択的に効率に回収する方法であり、特開平１０−２０１４７０号公報には、細胞（白血球）を捕捉するための手段として、不織布のような体積当たりの表面積が大きいものが好ましく例示されている。これに対し、本開示の方法は、分析・診断等のために、複数の貫通孔を有するフィルターによって捕捉された稀少細胞の回収に好適に使用できる技術である。つまり、特開平１０−２０１４７０号公報と本開示の方法では、目的が全く異なる。また、特開平１０−２０１４７０号公報で使用される不織布と、本開示に使用される複数の貫通孔を有するフィルターとでは、細胞が捕捉されるメカニズムや捕捉される状態が大きく異なり、本開示の方法と特開平１０−２０１４７０号公報とは全く異なる技術思想である。
【００７７】
本開示において「通液流量」とは、単位時間に流れる液体の量（体積）をいう。通液流量としては、一又は複数の実施形態において、単位時間においてフィルターを通過する液体の量（体積）が挙げられる。
【００７８】
本開示において「フィルターの開口面積あたりの流速」とは、フィルターの開口部（孔）を通る液体の速度をいう。開口面積あたりの流速は、一又は複数の実施形態において、通液流量を開口部（孔）の総面積で除することにより算出することができる。
【００７９】
［細胞の回収方法］
本開示は、一態様において、複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された細胞を前記フィルターから回収する方法（本開示の回収方法）に関する。本開示の回収方法は、一態様において、細胞が捕捉された前記フィルターに、細胞の捕捉のための検体の通液方向とは逆の方向から、回収液の通液流量と検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上となるように、回収液を通液すること、及び前記フィルター上に溜まっている回収液を回収することを含む。また、本開示の回収方法は、一態様において、回収液を、細胞の捕捉のための検体の通液方向とは逆の方向から、開口面積あたり１ｍｍ／秒以上の流速で、細胞が捕捉された前記フィルターに通液すること、及び前記フィルター上に溜まっている回収液を回収することを含む。
【００８０】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、フィルターに捕捉された細胞を高い回収率で回収することができる。本開示によれば、一又は複数の実施形態において、細胞へのダメージを抑えつつ、フィルターに捕捉された細胞を高い回収率で回収することができる。また、本開示によれば、一又は複数の実施形態において、少量の回収液（例えば、マイクロチューブに収めることができるレベル）で細胞を回収することができる。
【００８１】
本開示の回収方法は、細胞が捕捉された複数の貫通孔を有するフィルターに対し、前記細胞を捕捉するための検体の通液方向とは逆の方向から、回収液を通液することを含む。回収液の通液は、一又は複数の実施形態において、回収液の通液流量と検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上となるように行うか又は開口面積あたり１ｍｍ／秒以上の流速で通液することにより行うことができる。複数の貫通孔を有するフィルターに対し、上記通液条件で回収液を逆流させることによって、一又は複数の実施形態において、細胞へのダメージを抑えつつ、フィルターに捕捉された細胞を高い回収率で回収することができる。本開示の回収方法において「逆方向から通液する（逆流する）」こととしては、細胞を捕捉するために検体を導入した側のフィルター面とは反対側のフィルター面から回収液を導入すること、又は検体の通液時に検体が流出した側（下流側）から検体を流入した側（上流側）に向かって回収液を流入させることともいうことができる。
【００８２】
回収液の通液流量と検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）は、一又は複数の実施形態において、２５以上であり、フィルターからの細胞の回収率を向上させる点から、１００以上、１５０以上、２００以上、３００以上又は４００以上である。細胞へのダメージを抑制する点から、１００，０００以下、５０，０００以下又は２５，０００以下である。また、細胞の回収率をさらに向上させる点から、１，０００以上、１，２００以上、１，５００以上、２，０００以上、２，２００以上又は４，０００以上であり、同様の点から１５，０００以下、１２，０００以下又は１０，０００以下である。
【００８３】
回収液の流量は、フィルターからの細胞の回収率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、２５ｍｌ／分以上、５０ｍｌ／分以上、１００ｍｌ／分以上、１１０ｍｌ／分以上又は１２０ｍｌ／分以上である。細胞へのダメージを抑制する点から、１００，０００ｍｌ／分以下、５０，０００ｍｌ／分以下又は１０，０００ｍｌ／分以下である。また、細胞の回収率をさらに向上させる点から、３００ｍｌ／分以上、５００ｍｌ／分以上又は５５０ｍｌ／分以上であり、同様の点から７，０００ｍｌ／分以下、６，０００ｍｌ／分以下、５，０００ｍｌ／分以下、４，０００ｍｌ／分以下、３，０００ｍｌ／分以下、２，０００ｍｌ／分以下又は１，０００ｍｌ／分以下である。
【００８４】
回収液の流速としては、一又は複数の実施形態において、細胞を捕捉するために検体を導入した側のフィルター面とは反対側のフィルター面において乱流を生じさせ、フィルターからの細胞の回収率を向上させる点から、開口面積当たり、１ｍｍ／秒以上、５ｍｍ／秒以上、１０ｍｍ／秒以上、１５ｍｍ／秒以上、２０ｍｍ／秒以上、２５ｍｍ／秒以上、３０ｍｍ／秒以上、又は３５ｍｍ／秒以上である。細胞へのダメージを抑制する点から、１００，０００ｍｍ／秒以下、５０，０００ｍｍ／秒以下、３０，０００ｍｍ／秒以下、１０，０００ｍｍ／秒以下又は５，０００ｍｍ／秒以下である。細胞の回収率をさらに向上させる点から、１００ｍｍ／秒以上、１５０ｍｍ／秒以上又は１６０ｍｍ／秒以上であり、同様の点から４，０００ｍｍ／秒以下、３，５００ｍｍ／秒以下、３，０００ｍｍ／秒以下、２，０００ｍｍ／秒以下又は１，５００ｍｍ／秒以下である。
【００８５】
回収液の通液量と検体の通液量との比（［回収液の容積］／［フィルターを通過させる検体の容積］）は、一又は複数の実施形態において、０．６未満であり、フィルターからの細胞の回収率を向上させる点から、０．００１以上、０．００２以上、０．００３以上、０．００４以上又は０．００５以上である。回収した細胞の分析を容易にする点から、０．６未満、０．５以下又は０．４以下である。また、細胞の回収率をさらに向上させる点から、０．００６以上、０．００７以上、０．００８以上、０．００９以上又は０．０１以上であり、同様の点から０．３以下、０．２以下又は０．１以下である。
【００８６】
回収液の通液圧力は、３０ｋＰａ以上１５０ｋＰａ以下である。回収液の通液圧力は、フィルターからの稀少細胞の回収率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、３５ｋＰａ以上、４０ｋＰａ以上、４５ｋＰａ以上、５０ｋＰａ以上又５５ｋＰａ以上であり、同様の点から、１３０ｋＰａ以下、又は１２０ｋＰａ以下である。
【００８７】
回収液としては、一又は複数の実施形態において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰＢＳ−ＢＳＡ（例えば０．２％）、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（例えば１ｍｇ／ｍｌ）及び緩衝液、等張液および水等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液等が挙げられる。また、等張液としては、生理食塩水、ショ糖等張液、グルコース等張液、マンノース等張液等が挙げられる。
【００８８】
本開示の回収方法において、回収液の粘度は、特開平１０−２０１４７０号公報に規定された特定の範囲に限られず、その他の範囲の粘度であってもよい。回収液の粘度は、特に限定されるものではなく、細胞の回収率をさらに向上させる点から、一又は複数の実施形態において、２５℃における粘度が５ｍＰａ・ｓ未満、又は２５℃における粘度が０．５ｍＰａ・ｓ以上である。
【００８９】
回収液の通液は、一又は複数の実施形態において、上記通液圧力又は流量を満たすように回収液を通液可能な駆動力を用いて行うことができる。回収液の導入としては、一又は複数の実施形態において、流路の出口方向（検体が流出した側（下流側））からの加圧を用いる方法、流路の入口方向（検体を流入した側（上流側））からの減圧を用いる方法、シリンジポンプ、チューブポンプ（ローラーポンプ又はペリスタルティックポンプともいう）又はプランジャーポンプを使用する方法、又は機械駆動を利用した方法等が挙げられる。
【００９０】
本開示の回収方法によれば、一又は複数の実施形態において、少量の回収液で、フィルターから細胞を高い回収率で回収することができる。回収液の通液量としては、一又は複数の実施形態において、１０ｍｌ以下、８ｍｌ以下、６ｍｌ以下、５ｍｌ以下、４ｍｌ以下、２ｍｌ以下若しくは１ｍｌ以下であり、又は０．０５ｍｌ以上、０．１ｍｌ以上若しくは０．２ｍｌ以上である。
【００９１】
本開示の回収方法は、一又は複数の実施形態において、細胞を含む検体をフィルターに通液することを含んでいてもよい。検体をフィルターに通液することによって、検体中に含まれうる稀少細胞をフィルターに捕捉させることができる。
【００９２】
検体の通液流量は、細胞の捕捉率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、０．０１ｍｌ／分以上、０．０５ｍｌ／分以上又は０．１ｍｌ／分以上であり、同様の点から、１００ｍｌ／分以下、５０ｍｌ／分以下、２５ｍｌ／分以下又は１０ｍｌ／分以下である。
【００９３】
検体の流速は、細胞の捕捉率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、開口面積当たり、０．０１ｍｍ／秒以上、０．０５ｍｍ／秒以上又は０．１ｍｍ／秒以上であり、同様の点から、１００ｍｍ／秒以下、５０ｍｍ／秒以下、２５ｍｍ／秒以下、１０ｍｍ／秒以下、５ｍｍ／秒以下又は２ｍｍ／秒以下である。
【００９４】
検体の通液量（フィルターを通過させる血液検体の量）は、例えば、５ｍｍ2〜１０，０００ｍｍ2のろ過面積に対して、０．０７ｍｌ以上、０．２５ｍｌ以上、０．５ｍｌ以上、１ｍｌ以上、１ｍｌより多い量、２ｍｌ以上、３ｍｌ以上又は４ｍｌ以上である。また、検体の通液量は、一又は複数の実施形態において、稀少細胞の捕捉率を維持する点から、５ｍｍ2〜１０，０００ｍｍ2のろ過面積に対して、６Ｌ以下、４Ｌ以下、２Ｌ以下、４００ｍｌ以下、２００ｍｌ以下、１００ｍｌ以下、８０ｍｌ以下、５０ｍｌ以下、３０ｍｌ以下、２５ｍｌ以下、１２ｍｌ以下、１１ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、９ｍｌ以下、又は８ｍｌ以下である。或いは、フィルター容量は、一又は複数の実施形態において、一度に多くの試料を処理する観点、変形しやすい細胞を捕捉する観点及び稀少細胞の捕捉率を維持する点から、１５ｍｍ2〜２００ｍｍ2のろ過面積に対して、０．２ｍｌより多く、又は１３０ｍｌ未満若しくは１３０ｍｌ以下であり、同様の観点から、０．８ｍｌ〜９０ｍｌ、０．８ｍｌ〜６０ｍｌ、２ｍｌ〜５０ｍｌ又は２ｍｌ〜４０ｍｌである。
【００９５】
検体の通液圧力（ΔＰ１）は、細胞の捕捉率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、０．１ｋＰａ以上若しくは０．２ｋＰａ以上であり、又は２．６ｋＰａ以下、１．５ｋＰａ以下、１．３ｋＰａ以下、１．０ｋＰａ若しくは０．５ｋＰａ以下である。本開示における「検体の通液圧力」とは、系の入口から出口までの系全体の圧力差をいい、例えば、検体を配置したタンクから廃液タンクまでを含む流路を含めた系の圧力差をいう。このため流路構造によっては記載以上の圧力であってもよい。通液圧力（系の圧力差）は、公知の方法で市販の圧力計を用いて測定でき、又は流量と流路構造の関係から算出できる。
【００９６】
本開示の回収方法に用いるフィルターは、複数の貫通孔を有するフィルターである。貫通孔を有するフィルターによって細胞が捕捉されていることから、不織布と比べて、一又は複数の実施形態において、細胞へのダメージを低減しつつ、少量の回収液かつ高い回収率でフィルターから細胞を回収することができる。フィルターとしては、一又は複数の実施形態において、複数の貫通孔を有するスリット状のフィルターが挙げられる。貫通孔の形状としては、一又は複数の実施形態において、角丸長方形、又は楕円形が挙げられる。
【００９７】
本開示の回収方法に用いるフィルターとしては、一又は複数の実施形態において、検体中の稀少細胞を捕捉可能なフィルターが挙げられる。フィルターとしては、本開示の標識方法に使用可能なフィルターが使用できる。
【００９８】
検体を通液した後のフィルターに、検体を通液した方向とは逆方向から回収液を通液することによって、稀少細胞がフィルターから分離し、分離した稀少細胞を含む回収液がフィルター上に存在する。本開示の回収方法は、一又は複数の実施形態において、回収液を通液後のフィルター上に存在する回収液を回収することを含んでいてもよい。回収液の回収は、一又は複数の実施形態において、ピペット等を用いて行うことができる。また、当該回収の際、回収液を撹拌してもよいし、攪拌しなくてもよい。
【００９９】
本開示の回収方法は、一又は複数の実施形態において、フィルターに捕捉された細胞に対し、フィルター上で処理を行うことを含んでいてもよい。処理としては、一又は複数の実施形態において、固定処理、細胞膜透過処理及び染色処理等が挙げられる。
【０１００】
［稀少細胞の分析方法］
本開示は、その他の態様として、本開示の回収方法により稀少細胞を回収すること、及び該細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液検体中の稀少細胞の分析方法（本開示の分析方法）に関する。本開示の分析方法によれば、本開示の回収方法によって稀少細胞を回収することから、高い回収率で稀少細胞を回収することができる。このため、本開示の分析方法によれば、高い精度で稀少細胞の計測又は分析を行うことができる。
【０１０１】
［細胞回収装置］
本開示は、その他の態様として、細胞回収装置（本開示の細胞回収装置）に関する。本開示の細胞回収装置によれば、本開示の回収方法により高い回収率で細胞の回収を行うことができる。本開示の細胞回収装置は、一又は複数の実施形態において、フィルターに捕捉された細胞の該フィルターからの回収、及びフィルターを用いた細胞の捕捉等を行うことができる。
【０１０２】
本開示の細胞回収装置は、一態様として、細胞を捕捉するための複数の貫通孔を有するフィルターとフィルターを保持する保持部とを備える分離部と、細胞を含有する検体を分離部に導入するための少なくとも一つの導入流路と、導入流路を通じて前記検体を分離部に供給少なくとも一つの送液手段と、分離部を通過した検体を外部に排出するための排出流路と、分離部で捕捉された細胞を回収するための回収液を収納するための容器と、容器から前出流路を通じて回収液を分離部に供給するための逆送液手段と、本開示の細胞回収方法により細胞の回収を行うために前記逆送液手段を制御する制御部とを備える。制御部は、一又は複数の実施形態において、前記回収液の通液流量と前記検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上、及び／又は回収液の流速が開口面積あたり１ｍｍ／秒以上となる逆送液手段を制御する。
【０１０３】
分離部は、一又は複数の実施形態において、フィルターを少なくとも備え、導入流路及び排出流路に対して着脱可能に取り付けられている。フィルターとしては、一又は複数の実施形態において、上記のフィルターが挙げられる。
【０１０４】
送液手段及び逆送液手段としては、一又は複数の実施形態において、加圧手段、減圧手段、シリンジポンプ、チューブポンプ（ローラーポンプ又はペリスタルティックポンプともいう）、プランジャーポンプ、又は機械駆動等が挙げられる。
【０１０５】
送液手段は、一又は複数の実施形態において、検体中の細胞を処理するための処理液を導入流路を通じて分離部に導入可能であってもよい。処理液としては、一又は複数の実施形態において、固定処理、細胞膜透過処理又は染色処理等に使用される処理液が挙げられる。本開示の細胞回収装置は、一又は複数の実施形態において、検体中の細胞を処理するための処理液を収容するための容器を備えていてもよい。
【０１０６】
制御部は、一又は複数の実施形態において、細胞の捕捉時に用いたフィルター及び濾過条件等を記録することができる。制御部は、一又は複数の実施形態において、回収装置のコンピュータが備えるプロセッサが、所定のプログラムを実行することによって実現することができる。
【０１０７】
本開示の細胞回収装置は、一又は複数の実施形態において、分離部に供給された回収液を回収する回収手段を備える。回収手段としては、一又は複数の実施形態において、ノズル機構等が挙げられる。ノズル又はピペット等で、フィルター上部に溜まっている回収液を吸引することで、細胞を回収することができる。
【０１０８】
本開示の細胞回収装置は、その他の態様として、本開示の回収方法により細胞の回収を行うことが可能な制御プログラムを備える。
【０１０９】
［細胞回収システム］
本開示は、その他の態様として、細胞回収システム（本開示の細胞回収システム）に関する。本開示の細胞回収システムによれば、本開示の回収方法により高い回収率で細胞の回収を行うことができる。本開示の細胞回収システムは、一又は複数の実施形態において、フィルターに捕捉された細胞の該フィルターからの回収、及びフィルターを用いた細胞の捕捉等を行うことができる。
【０１１０】
本開示の細胞回収システムは、一又は複数の実施形態において、細胞を捕捉するための複数の貫通孔を有するフィルターと、前記フィルターを保持する保持部とを備えるフィルターユニットと、前記フィルターユニットを配置可能な流路部と、細胞を含有する検体を前記流路部を通じて前記フィルターに通液可能な送液手段とを備える分離ユニットと、フィルターユニットを配置可能な流路部と、分離ユニットの通液方向とは逆の方向から流路部を通じて前記フィルターに回収液を通液可能な逆送液手段とを備える回収ユニットと、本開示の細胞回収方法により細胞の回収を行うために前記逆送液手段を制御する制御ユニットとを備える。制御ユニットは、一又は複数の実施形態において、回収液の通液流量と検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上、及び／又は回収液の流速が開口面積あたり１ｍｍ／秒以上となるように、分離ユニットの送液手段と回収ユニットの送液手段とを制御する。フィルターユニットは、一又は複数の実施形態において、分離ユニット及び回収ユニットの流路部に着脱可能である。本開示の細胞回収システムによれば、一又は複数の実施形態において、分離ユニットにおいて細胞の補足を行った後、回収ユニットにフィルターユニットを移し替え、回収ユニットにおいてフィルターに捕捉された細胞を回収することができる。
【０１１１】
本開示の細胞回収システムは、一又は複数の実施形態において、細胞を捕捉するための複数の貫通孔を有するフィルターとフィルターを保持する保持部とを備える分離部と、細胞を含有する検体を分離部に導入するための少なくとも一つの導入流路と、導入流路を通じて検体を分離部に供給少なくとも一つの送液手段と、分離部を通過した検体を外部に排出するための排出流路と、分離部で捕捉された細胞を回収するための回収液を収納するための容器と、容器から排出流路を通じて回収液を分離部に供給するための逆送液手段と、本開示の細胞回収方法により細胞の回収を行うために前記逆送液手段を制御する制御手段とを備える。制御手段は、一又は複数の実施形態において、前記回収液の通液流量と前記検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上、及び／又は回収液の流速が開口面積あたり１ｍｍ／秒以上となるように前記逆送液手段を制御する。
【０１１２】
本開示の回収方法又は分析方法に利用可能な稀少細胞捕捉回収装置の一例を図４に示す。図４に示す稀少細胞捕捉回収装置は、検体や洗浄液、染色液等をフィルターに供給するための供給口４１、排出口４２、供給口４１と排出口４２とを連通する流路４３、及び流路４３の一部に相当する位置に配置された分離部を有する。分離部は、フィルター４４とフィルター４４を保持するフィルターホルダー４５を含む。フィルターホルダー４５は、フィルター４４を設置可能な支持部（ベース）４６、フィルター４４を固定するＯリング４７及びカバー４８により構成される。支持部４６にフィルター４４を設置し、フィルター４４の上面にＯリング４７及びカバー４８を載せ、フィルター４４を固定することにより、孔を有するフィルターを備える分離部（フィルターデバイス）が形成される。供給口４１と分離部及び分離部と排出口４２をつなぐ流路４３は、分離部の両端にサフィード（商標）チューブ（テルモ社製）を接続することにより形成される。供給口４１と分離部とをつなぐ流路４３には、分離部の上部に接続部（図示せず）及び液の切り替えが可能な三方活栓（図示せず）を配置してもよい。また、供給口４１と分離部とを接続する流路４３には（一定の圧で送液可能な機構又は一定流量で送液可能な機構としての）加圧手段４９を配置してろ過にかかる圧力が一定になるようにしてもよいし、又はシリンジポンプで引いて濾過にかかる圧力が一定以上にならように送液してもよい。
【０１１３】
本開示の回収方法又は分析方法に利用可能な稀少細胞捕捉回収装置のその他の例を図５に示す。図５に示す稀少細胞捕捉回収装置は、容器５２内の検体を分離部５１に導入するための導入流路５６、フィルターを備える分離部５１、回収液を収容する容器５５、分離部５１から排出される廃液を排出するための排出流路５７を備える。回収液を収容する容器５５は、排出流路５７を通じて分離部５１に回収液を逆送液可能なように、流路を通じて排出流路５７と接続されている。容器５５には、回収液を分離部５１に逆送液するためのポンプ等の送液手段が接続されている。導入流路５６には、検体を収容する容器５２以外に、例えば、洗浄液を収容する容器１３及び検体中の細胞を処理するための処理液を収容する容器５４が流路を通じて接続可能である。排出流路５７の一端には廃液を回収するための容器５８が配置可能である。
【０１１４】
本開示において「細胞」としては、特に限定されるものではなく、ヒト又はヒト以外の動物の細胞が挙げられる。
【０１１５】
本開示において「稀少細胞」とは、ヒト又はヒト以外の動物の血液中に含まれ得る血球成分（赤血球、白血球、及び血小板）以外の細胞をいう。稀少細胞としては、一又は複数の実施形態において、腫瘍細胞又はがん細胞が挙げられる。一般に血液中に循環する腫瘍細胞やがん細胞をＣＴＣという。血液中の稀少細胞数としては、検体にもよるが血液１０ｍｌ中に数個〜数十個、多くて数百〜千個含まれている場合がある。「稀少細胞」は、一又は複数の実施形態において、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、幹細胞及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である。
稀少細胞としては、特に限定されない一又は複数の実施形態において、ヒト結腸癌細胞、ヒト胃癌細胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト肺癌細胞及びヒト肺癌細胞等が挙げられる。
【０１１６】
本開示において「検体」とは、本開示の回収方法に適用されうる細胞を含みうる試料が挙げられる。検体としては、一又は複数の実施形態において、血液検体が挙げられる。血液検体としては、一又は複数の実施形態において、血液を構成する成分を含有する試料であり、特に限定されない一又は複数の実施形態において、血液、血球成分を含む血液由来物、血液又は血液由来物が混在する体液や尿、及び、これらから調製された試料等が挙げられる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、前記生体としては、ヒト又はヒト以外の動物（例えば、哺乳類）が挙げられる。血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって血球成分を含むもの又はそれらの希釈／濃縮物が挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理し、赤血球の成分を除去した試料又は溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球、特定の画分などを含む。これらの中でも、限定されない一又は複数の実施形態においては、簡便かつ迅速な処理の観点及び血液中の稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から、前記血液を含む試料としては血液又は血球成分を含む血液由来の検体が好ましい。
【０１１７】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔Ｃ１〕  複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された細胞を前記フィルターから回収する方法であって、
細胞が捕捉された前記フィルターに、前記細胞の捕捉のための検体の通液方向とは逆の方向から回収液を通液することを含み、
前記回収液の通液は、前記回収液の通液流量と前記検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上となるように行う、細胞の回収方法。
〔Ｃ２〕  複数の貫通孔を有するフィルターに捕捉された細胞を前記フィルターから回収する方法であって、
細胞が捕捉された前記フィルターに、前記細胞の捕捉のための検体の通液方向とは逆の方向から、回収液を、前記フィルターの開口面積あたり１ｍｍ／秒以上の流速で通液することを含む、細胞の回収方法。
〔Ｃ３〕  前記回収液を、前記フィルターの開口面積あたり１ｍｍ／秒以上の流速で、前記フィルターに通液することを含む、〔Ｃ１〕に記載の回収方法。
〔Ｃ４〕  細胞を含む検体を、開口面積あたり０．０１ｍｍ／秒〜１００ｍｍ／秒の流速で前記フィルターに通液することにより、前記細胞を前記フィルターに捕捉することを含む、〔Ｃ１〕から〔Ｃ３〕のいずれかに記載の回収方法。
〔Ｃ５〕  前記フィルターは、稀少細胞を捕捉可能なフィルターである、〔Ｃ１〕から〔Ｃ４〕のいずれかに記載の回収方法。
〔Ｃ６〕  前記フィルターの材質は、ニッケル、ＳＵＳ、金、銀、胴、アルミニウム、タングステン、及びクロムからなる群から選択される、〔Ｃ１〕から〔Ｃ５〕のいずれかに記載の回収方法。
〔Ｃ７〕  前記細胞は、稀少細胞である、〔Ｃ１〕から〔Ｃ７〕のいずれかに記載の回収方法。〔Ｃ８〕  〔Ｃ１〕から〔Ｃ７〕のいずれかに記載の回収方法によって稀少細胞を回収すること、及び該細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液検体中の稀少細胞の分析方法。
〔Ｃ９〕  細胞を捕捉するための複数の貫通孔を有するフィルターと、前記フィルターを保持する保持部とを備える分離部と、
細胞を含有する検体を、前記分離部に導入するための少なくとも一つの導入流路と、
前記導入流路を通じて前記検体を前記分離部に供給するための少なくとも一つの送液手段と、
前記分離部を通過した検体を外部に排出するための排出流路と、
前記分離部で捕捉された細胞を回収するための回収液を収納するための容器と、
前記容器から前記排出流路を通じて前記回収液を前記分離部に供給するための逆送液手段と、
前記回収液の通液流量と前記検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上となるように前記逆送液手段を制御する制御部とを備える、細胞回収装置。
〔Ｃ１０〕  細胞を捕捉するための複数の貫通孔を有するフィルターと、前記フィルターを保持する保持部とを備える分離部と、
細胞を含有する検体を、前記分離部に導入するための少なくとも一つの導入流路と、
前記導入流路を通じて前記検体を前記分離部に供給するための少なくとも一つの送液手段と、
前記分離部を通過した検体を外部に排出するための排出流路と、
前記分離部で捕捉された細胞を回収するための回収液を収納するための容器と、
前記容器から前記排出流路を通じて前記回収液を前記分離部に供給するための逆送液手段と、
開口面積あたり１ｍｍ／秒以上の流速で前記回収液の通液が行われるように前記逆送液手段を制御する制御部とを備える、細胞回収装置。
〔Ｃ１１〕  〔Ｃ１〕から〔Ｃ７〕のいずれかに記載の回収方法の制御プログラムを備えた、細胞回収装置。
〔Ｃ１２〕  〔Ｃ１〕から〔Ｃ７〕のいずれかに記載の回収方法の制御プログラムを備えた、〔Ｃ９〕又は〔Ｃ１０〕に記載の細胞回収装置。
〔Ｃ１３〕  前記分離部に供給された回収液を回収する回収手段を備える、〔Ｃ９〕から〔Ｃ１２〕のいずれかに記載の細胞回収装置。
〔Ｃ１４〕  細胞を捕捉するための複数の貫通孔を有するフィルターと、前記フィルターを保持する保持部とを備えるフィルターユニットと、
前記フィルターユニットを配置可能な流路部と、細胞を含有する検体を前記流路部を通じて前記フィルターに通液可能な送液手段とを備える分離ユニットと、
前記フィルターユニットを配置可能な流路部と、前記分離ユニットの通液方向とは逆の方向から前記流路部を通じて前記フィルターに回収液を通液可能な逆送液手段とを備える回収ユニットと、
前記回収液の通液流量と前記検体の通液流量との比（［回収液の流量］／［検体の流量］）が２５以上となるように、前記分離ユニットの送液手段と前記回収ユニットの送液手段とを制御する制御ユニットとを備える、細胞回収システム。
〔Ｃ１５〕  細胞を捕捉するための複数の貫通孔を有するフィルターと、前記フィルターを保持する保持部とを備えるフィルターユニットと、
前記フィルターユニットを配置可能な流路部と、細胞を含有する検体を前記流路部を通じて前記フィルターに通液可能な送液手段とを備える分離ユニットと、
前記フィルターユニットを配置可能な流路部と、前記分離ユニットの通液方向とは逆の方向から前記流路部を通じて前記フィルターに回収液を通液可能な逆送液手段とを備える回収ユニットと、
開口面積あたり１ｍｍ／秒以上の流速で前記回収液の通液が行われるように、前記分離ユニットの送液手段と前記回収ユニットの送液手段とを制御する制御ユニットとを備える、細胞回収システム。
【０１１８】
以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。なお、下記の細胞捕捉・標識装置及び細胞捕捉装置は、複数のユニットを組み合わせて構成されていてもよい。
【実施例】
【０１１９】
１．磁気標識効率の確認
（実施例１）
図１に示す細胞捕捉・標識装置を用いて、細胞（白血球）の捕捉及び磁気粒子による標識を行い、標識効率を確認した。
【０１２０】
［細胞標識装置］
図１に示す細胞標識装置を準備した。図１の細胞標識装置は、デバイス上部３、フィルター１０を含むフィルター部５及びデバイス下部４、並びに矢印Ａ方向及び矢印Ｂ方向に送液可能な送液機構（図示せず）を備える。フィルター１０は、デバイス上部３とデバイス下部４との間に配置され、かつ両面テープ１１，１２によって固定されている。フィルター１０は、複数の貫通孔を備え、かつ下記特性を有するフィルターを使用した。
＜フィルターの特性＞
・孔    短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、面積：５７２μｍ2、形状：ス
リット
・孔の中心間のピッチ：１４μｍ×１００μｍ（短軸径側×長軸径側）
・孔密度：７１４個／ｍｍ2
・開口率：４１％
・膜厚：５μｍ
・材質：ニッケル
・ろ過面積：７９ｍｍ2
【０１２１】
［磁気粒子標識］
図１の細胞標識装置を使用し、下記工程１〜８の手順で、血液中に含まれる細胞（白血球）を磁気粒子により標識した。
工程１：細胞標識装置に、稀少細胞及び白血球を含有する血液８ｍＬを導入し、血液をフィルター濾過してサイズ選択的に稀少細胞及び白血球等の細胞を捕捉した（濾過流量：１００μＬ／分、流速：０．１４４ｍｍ／秒）。
工程２：ＣＤ４５及びＣＤ５０に対する抗体を含む抗体液と、前記抗体を認識するＢｉｏｔｉｎ化抗体を含む抗体液とをこの順でフィルターに供給し細胞と反応させ、ＣＤ４５及びＣＤ５０発現細胞（例えば、白血球）にＢｉｏｔｉｎ標識を行った。抗体液は、フィルターの両面に接するように、フィルター上部のみならず、フィルター下部にも滞留している。
工程３：Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ標識磁気粒子懸濁液をフィルター上面に供給し、懸濁液の下面がフィルター下面よりも下の位置になるように、フィルター上部から図１の矢印Ａ方向に一部を送液した。
工程４：フィルター下部から図１の矢印Ｂ方向に逆流させた（逆流流量：１０，０００μＬ／分、流速：１４．４４１ｍｍ／秒）。
工程５：フィルター上部の懸濁液をピペッティングした。
工程６：フィルター上部の懸濁液（細胞と磁気粒子の攪拌液）を図１の矢印Ａ方向から再度送液（２５０μＬ／分）した。
工程７：磁気粒子を含まない洗浄液を図１の矢印Ａ方向から送液した。これにより、未反応の磁気粒子を除去した。
工程８：フィルター下部から図１の矢印Ｂ方向に回収液を送液し、フィルター上部に溜まっている回収液をピペットで吸引し、回収液とともに磁気粒子で標識された細胞（白血球）及び稀少細胞を回収した。
【０１２２】
［標識効率の評価］
工程８で回収した細胞を、ネオジム磁石を用いて磁気分離を行った。磁石に捕捉されることなく回収された白血球の数をカウントした。その結果を図３に示す。
【０１２３】
（比較例１）
工程４〜６を行わなかった以外は、実施例１と同様に行った。その結果を図３に示す。
【０１２４】
（比較例２）
工程４を行わなかった以外は、実施例１と同様に行った。その結果を図３に示す。
【０１２５】
図３に示す通り、実施例１の方法によれば、残存した白血球の数、つまり磁気分離により磁石で捕捉されなかった白血球の数を大幅に低減できた。よって、実施例１の方法によれば、フィルター上において、白血球を高い標識効率で磁気標識することができたといえる。
【０１２６】
（実施例２）
［試料の調製］
下記の手順で、蛍光及びBiotin標識した白血球を調製した。
まず、真空採血管（EDTA 2K）を用いてヒトから採血を行った。
ついで、HetaSep（STEMCELL社）の添付文書に従い、採血した全血から白血球の分離を行った。
HetaSepで分離した1×106個の白血球に対して、ブロッキング液（ダルベッコPBS（−）に、10%ヤギ血清、0.000001%Avidin及び0.2%BSAを溶解）で23℃10分間反応させた。遠心し、上清を除いた後、ダルベッコPBS（−）を用いて再懸濁した。再度遠心し、上清を除いた。
つぎに、10%ヤギ血清、0.01%Biotin、0.2%BSAを溶解したダルベッコPBS（−）に、抗CD45抗体及び抗CD50抗体をそれぞれ添付文書に従い添加して1次抗体反応液を調製した。調製した1次抗体反応液で細胞（白血球）を懸濁し、23℃15分間反応させた。遠心し、上清を除いた後、ダルベッコPBS（−）を用いて懸濁した。その後、遠心して上清を除く工程を合計３回行い、細胞を十分に洗浄した。
2μg/ml Hoechst33342、10%ヤギ血清及び0.2%BSAを溶解したダルベッコPBS（−）に、Alexa594標識抗マウスIgG(Fab)及びBiotin標識抗マウスIgG(Fc)をそれぞれ添付文書に従い添加して2次抗体反応液を調製した。調製した2次抗体反応液で洗浄した細胞を懸濁し、23℃15分間反応させた。遠心し、上清を除いた後、ダルベッコPBS（−）を用いて懸濁した。遠心して上清を除く工程を合計３回行い、細胞（白血球）を十分に洗浄した。
これにより、蛍光及びBiotin標識された白血球を含む試料を調製した。
【０１２７】
［細胞の捕捉］
蛍光及びBiotin標識した白血球（１×１０5個）を含む試料を、実施例１と同様に図１の細胞標識装置に矢印１方向から導入し、１００μＬ／分の流量（流速：０．１４４ｍｍ／秒）でフィルターろ過した。
フィルター１０は、複数の貫通孔を備え、かつ下記特性を有するフィルターを使用した。＜フィルターの特性＞
・孔    短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、面積：５７２μｍ2、形状：スリット
・孔の中心間のピッチ：１４μｍ×１００μｍ（短軸径側×長軸径側）
・孔密度：７１４個／ｍｍ2
・開口率：４１％
・膜厚：５μｍ
・材質：ニッケル
・ろ過面積：２８ｍｍ2。
【０１２８】
［磁気粒子標識］
ダルベッコPBS（−）に0.2%BSAを溶解した溶液を図１の装置に送液し、流路８に充填した。フィルター１０の上面に、200μLの磁気粒子液（Neutravidin標識磁気粒子懸濁液、固形分濃度:0.0125%）を添加し、磁気粒子液の下面は、フィルター１０よりも下に位置するように、添加した磁気粒子液の一部（100μL）を送液濾過した。ダルベッコPBS（−）に0.2%BSAを溶解した溶液200μLを、逆流送液機構を用いて10000μL/分の流量で逆流送液した（図１の矢印Ｂ方向）。フィルター１０上の溶液（固形分濃度:0.0062%）をピペット攪拌後、23℃で15分間反応させた。ついで、フィルター１０上面の白血球を含む磁気粒子液を250μL/分の流量で300μL送液し（図１の矢印Ａ方向）、23℃でさらに15分間反応させた。これにより、磁気粒子により白血球を磁気標識した。
【０１２９】
［磁気粒子の洗浄］
その後、1mg/mL EDTAを溶解したダルベッコPBS（−）1000μLをフィルター１０の上面に添加し、ついで1000μL/分の流量で送液した（図１の矢印Ａ方向）。この工程を合計4回行い、フィルター１０上の余剰磁気粒子を洗浄した。
【０１３０】
［細胞の回収］
ダルベッコPBS（−）に0.2%BSAを溶解した溶液1000μLを、逆流送液機構を用いて10000μL/分の流量（14mm/秒）で逆流送液した（図１の矢印Ｂ方向）。そして、フィルター１０上の溶液1100μLをピペット吸引によって全量回収した。
【０１３１】
［標識効率の評価］
回収した懸濁液を磁気分離し、磁気分離されなかった（磁石で捕捉されなかった）白血球を、磁気標識されなかった（又は標識が不十分であった）と判断して標識効率の評価を行った。
すなわち、回収した細胞を、ネオジウム磁石を用いて磁気分離を行った。磁石に捕捉されることなく回収された白血球の数をカウントした。
具体的には、回収した懸濁液1000μLに含まれる細胞のうち、Alexa594およびHoechst33342が両方陽性の細胞を、蛍光顕微鏡を用いてカウントした（磁気分離後の白血球数（ＬＥＵＫ−ａ））。
一方、標識後回収した懸濁液のうち、磁気分離に使用しなかった懸濁液100μL中の白血球を、血球計数機（Moxi-Z）を用いて白血球濃度をカウントし、1000μL中の白血球数をカウントした（磁気分離前の白血球数（ＬＥＵＫ−ｂ））。
得られた白血球数（ＬＥＵＫ−ａ及びＬＥＵＫ−ｂ）を用いて、下記式より非標識率を算出した。その結果を下記表１に示す。
［非標識率］＝｛１-([ＬＥＵＫ−ｂ]-[ＬＥＵＫ−ａ]/[ＬＥＵＫ−ｂ])｝×100
【０１３２】
（実施例３〜５）
実施例２と同じ調製方法で新たに調製した試料を使用し、かつ磁気粒子の懸濁液の逆流送液時の流量を下記表１の流量とした以外は、実施例２と同様に行った。その結果を下記表１に示す。
【０１３３】
（比較例３）
実施例２と同じ調製方法で新たに調製した試料を使用し、かつ磁気粒子標識において逆流送液を行わなかった以外は、実施例２と同様に行った。すなわち、フィルターの上面に添加した磁気粒子液(200μL)の一部（100μL）を送液濾過した後、フィルター上の溶液をピペット攪拌後、23℃で30分間反応させることにより磁気粒子標識を行った。その結果を下記表１に示す。
【０１３４】
【表１】
2018059931.tif 000002
【０１３５】
表１に示す通り、実施例２〜５の方法により標識することによって、非標識率、つまり磁気標識されなかった（又は標識が不十分であった）白血球の割合を１％未満にまで低減することができた。つまり、実施例２〜５の方法によれば、フィルター上で白血球を高い標識効率で磁気標識することができたといえる。
【０１３６】
（実施例６）
実施例２と同様の方法で新たに調製した試料を使用し、磁気粒子液の一部の送液濾過後の逆流送液を100μLずつ２回に分けて行った（合計の送液量：200μL）以外は、実施例２と同様に行った。その結果を下記表２に示す。
【０１３７】
（実施例７）
実施例２と同様の方法で新たに調製した試料を使用した以外は実施例２と同様に行った。その結果を下記表２に示す。
【０１３８】
【表２】
2018059931.tif 000003
【０１３９】
表２に示す通り、実施例６及び７の方法のいずれの場合においても、フィルター上で白血球を高い標識効率で磁気標識することができた。また、磁気粒子液の送液濾過後の逆流送液を少なくとも１回行うことで所望の効果が得られることが分かった。
なお、処理条件が同一である実施例７と実施例２とで非標識率が異なる理由については、使用した検体の違い、具体的には検体中に含まれる白血球の違いが考えられる。上記実施例では、白血球の表面に発現するＣＤ抗原を用いて磁気粒子の標識を行っているが、ＣＤ抗原の発現には個体間変動（個人差）や個体内変動から生じる検体間差があることが知られている。この検体間差によって、非標識率が相違したものと考えられる。なお、本開示の方法では、同一の検体であれば、標識率について十分な再現性が得られることを確認済みである。
【０１４０】
（実施例８）
実施例２と同様の方法で新たに調製した試料を使用した以外は実施例２と同様に行った。その結果を下記表３に示す。
【０１４１】
（実施例９）
実施例２と同様の方法で新たに調製した試料を使用し、かつピペット撹拌を行わなかった以外は実施例８と同様に行った。その結果を下記表３に示す。
【０１４２】
【表３】
2018059931.tif 000004
【０１４３】
表３に示す通り、実施例８及び９の方法によって、フィルター上で白血球を高い標識効率で磁気標識することができた。特に、逆流送液後のピペット撹拌を行うことによって、磁気標識効率をさらに向上できた。
【０１４４】
（比較例４）
実施例２と同様の方法で新たに調製した試料を使用し、かつ逆流送液前に磁気粒子液の一部の送液（図２（ｂ））を行わなかった以外は実施例８と同様に行った。その結果を実施例８の結果と併せて下記表４に示す。
【０１４５】
【表４】
2018059931.tif 000005
【０１４６】
表４に示す通り、逆流送液に先立ち、フィルター上面に添加した磁気粒子液の一部を送液濾過することによって、フィルターに捕捉された白血球を高い標識効率で磁気標識することができた。すなわち、フィルターの両面を懸濁液に浸漬した後に逆流することで、標識効率が向上することが分かる。
【０１４７】
２．フィルターによる細胞の捕捉及び回収試験
（実験例１）
図４に示す稀少細胞捕捉装置を用いて、血液検体中の稀少細胞の回収を行った。
【０１４８】
フィルターは、下記特性を有するフィルターを使用した。下記特性を有するフィルターは、ＳＮＵ−１及びＳＷ６２０の双方が捕捉可能である。
＜フィルターの特性＞
孔  短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、面積：５７２μｍ2、形状：スリット
孔の中心間のピッチ（短軸径側×長軸径側）：１４μｍ×１００μｍ
孔密度：７１４個／ｍｍ2
開口率：４１％
膜厚：５μｍ
材質：ニッケル
ろ過面積：７９ｍｍ2
【０１４９】
上記フィルターと、逆流送液機構を含む送液ユニットとを含む、図４に示す稀少細胞捕捉・回収装置を構成した。フィルターを固定する部材支持部４６は、アルミ製の部材を使用した。該稀少細胞捕捉・回収装置を用い、下記表５に示す条件で稀少細胞のフィルター濾過による捕捉、及び捕捉された細胞のフィルターからの回収を行った。具体的には以下のようにした。
【０１５０】
まず、濾過による細胞の捕捉を行った。Ｃｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで染色済みのＳＮＵ−１を含む血液検体７．５ｍｌを図４の矢印Ａ方向から約３０分かけて定圧で通液した（ΔＰ１＝０．７５ｋＰａ：濾過流量０．２５ｍｌ／分）（この低圧での通液は、水頭圧を利用してもよいし、上記逆流送液機構と同一ないし別個のポンプを利用してもよい。）。これにより、フィルター上にＳＮＵ−１を捕捉した。ついで、ＰＢＳ（−）４ｍＬを２回通液することによりフィルターの洗浄を行った後、塩化アンモニウム溶液（ＡＣＳ）９００μＬを３回通液し、室温で１０分溶血させた。ＰＢＳ（−）４ｍＬを通液して洗浄し、デバイス内液置換を行った。供給口４１と分離部をつなぐ流路を外し、カバーガラスで封した後、フィルター上に捕捉されたＳＮＵ−１の数を顕微鏡観察によりカウントした。
カウント後、カバーガラスを取り、フィルター上部の流路と位置・サイズが合うように設計された回収用のウェルが設けられたアクリルプレートを、カバー４８の上にセットした。
その後、フィルターに捕捉された細胞の回収を行った。フィルターに、上記細胞の捕捉を行った通液方向とは逆の方向（図４の矢印Ｂ方向）から、逆流送液機構を用いてＰＢＳ（−）（回収液、粘度：０．９５ｍＰａ・ｓ）１ｍｌを通液した（流量１２０ｍｌ／分）。フィルター上部に溜まっている回収液をピペットで吸引し、全量を回収した。回収した液中のＳＮＵ−１の数を顕微鏡観察によりカウントした。回収した液中のＳＮＵ−１の数を、フィルター上に捕捉されていたＳＮＵ−１の数で除することにより、回収率を求めた。その結果を下記表５に示す。
【０１５１】
（実験例２）
回収液の液量を０．２５ｍｌとし、流量を６，０００ｍｌ／分とした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１５２】
（実験例３）
回収液の液量を０．５ｍｌとし、流量を６，０００ｍｌ／分とした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１５３】
（実験例４）
回収液の流量を６，０００ｍｌ／分とした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１５４】
（実験例５）
回収液の液量を０．２５ｍｌとし、流量を６００ｍｌ／分とした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１５５】
（実験例６）
回収液の流量を６００ｍｌ／分とした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１５６】
（実験例７）
ろ過面積を２０ｍｍ2、ΔＰ１を０．４ｋＰａ（約６０〜１２０分かけて送液）とし、回収液の流量を６００ｍｌ／分とした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１５７】
（実験例８）
ろ過面積を２０ｍｍ2とし、ΔＰ１を０．４ｋＰａ（約６０〜１２０分かけて送液）とした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１５８】
（実験例９）
ろ過面積を２０ｍｍ2、ΔＰ１を０．４ｋＰａ（約３０分かけて送液）とし、血液検体量を４ｍｌにした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１５９】
（実験例１０）
ろ過面積を２０ｍｍ2とし、ΔＰ１を０．７５ｋＰａ（約１０分かけて送液）とし、血液検体量を４ｍｌにした以外は、実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１６０】
（実験例１１）
まず、フィルター濾過による細胞の捕捉を行った。Ｃｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで染色済みのＳＷ６２０を含む血液検体２ｍｌを図４の矢印Ａ方向から約８分かけて実験例１と同様の方法で定圧で通液した（ΔＰ１＝０．４ｋＰａ：濾過流量０．２５ｍｌ／分）。これにより、下記のフィルター上にＳＷ６２０を捕捉した。実験例１と同様に溶血処理し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、フィルター上で固定化処理及び細胞膜透過処理を行った。固定化処理は、４％  パラホルムアミド：ＰＦＡ（ＰＢＳ（−）溶液）を通液してフィルター近傍に満たした後、室温で１５分間反応させることにより行った。細胞膜透過処理は、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＰＢＳ（−）溶液）を通液してフィルター近傍に満たした後、室温で１５分間反応させることにより行った。ＰＢＳ（−）で洗浄し、デバイス内液置換を行った。供給口４１と分離部をつなぐ流路を外し、カバーガラスで封した後、フィルター上に捕捉されたＳＷ６２０の数を顕微鏡観察によりカウントした。
カウント後、カバーガラスを取り、フィルター上部の流路と位置・サイズが合うように設計された回収用のウェルが設けられたアクリルプレートを、カバー４８の上にセットした。
その後、フィルターに捕捉された細胞の回収を行った。フィルターに、上記細胞の捕捉を行った通液方向とは逆の方向（図４の矢印Ｂ方向）から逆流送液機構を用いてＰＢＳ（−）（回収液）１ｍｌを通液した（流量６，０００ｍｌ／分）。フィルター上部に溜まっている回収液をピペットで吸引し、全量を回収した。回収した液中のＳＷ６２０の数を顕微鏡観察によりカウントした。回収した液中のＳＷ６２０の数を、フィルター上に捕捉されていたＳＷ６２０の数で除することにより、回収率を求めた。その結果を下記表５に示す。
＜フィルターの特性＞
孔  短軸径：６．５μｍ、長軸径：９．８μｍ、面積：５０μｍ2、形状：楕円
孔の中心間のピッチ（短軸径側×長軸径側）：１９μｍ×１４μｍ
孔密度：３，７５９個／ｍｍ2
開口率：１９％
膜厚：５μｍ
材質：ニッケル
ろ過面積：２０ｍｍ2
【０１６１】
（実験例１２）
固定化処理は１％  ＰＦＡ（ＰＢＳ（−）溶液）により室温で１０分間反応させることにより行い、細胞膜透過処理は０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＰＢＳ（−）溶液）をフィルターに通液するのみ（フィルター近傍を満たした状態での反応時間は取らず、通液中の時間のみで反応させる）とした以外は、実験例１１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１６２】
（実験例１３）
固定化処理を５ｍｇ／ｍｌ  ジメチルスベリミデート：ＤＭＳ（ＰＢＳ（−）溶液）により室温で１０分間、細胞膜透過処理を０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＰＢＳ（−）溶液）を通液するのみに変更した以外は、実験例１１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１６３】
（実験例１４）
まず、フィルター濾過による細胞の捕捉を行った。未染色のＳＷ６２０を含む血液検体２ｍｌを図４の矢印Ａ方向から約８分かけて実験例１と同様の方法で定圧で通液した（ΔＰ１＝０．４ｋＰａ：濾過流量０．２５ｍｌ／分）。これにより、フィルター（ろ過面積が２０ｍｍ2である以外は実験例１と同じフィルター）上にＳＷ６２０を捕捉した。実験例１と同様に溶血処理し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄後、フィルター上で、１％  ＰＦＡ（ＰＢＳ（−）溶液）により室温で１０分間固定化処理し、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＰＢＳ（−）溶液）を通液して細胞膜透過処理を行った。その後、ＦｃＲブロッキング処理し、蛍光標識抗サイトケラチン抗体で染色した。ＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、デバイス内液置換を行った。供給口４１と分離部をつなぐ流路を外し、カバーガラスで封した後、フィルター上に捕捉されたＳＷ６２０の数を顕微鏡観察によりカウントした。
カウント後、カバーガラスを取り、フィルター上部の流路と位置・サイズが合うように設計された回収用のウェルが設けられたアクリルプレートを、カバー４８の上にセットした。
その後、フィルターに捕捉された細胞の回収を行った。フィルターに、上記細胞の捕捉を行った通液方向とは逆の方向（図４の矢印Ｂ方向）からＰＢＳ−ＥＤＴＡ（回収液）１ｍｌを逆流送液機構を用いて通液した（流量６，０００ｍｌ／分）。フィルター上部に溜まっている回収液をピペットで吸引し、全量を回収した。回収した液中のＳＷ６２０の数を顕微鏡観察によりカウントした。回収した液中のＳＷ６２０の数をフィルター上に捕捉されていたＳＷ６２０の数で除することにより、回収率を求めた。その結果を下記表５に示す。
【０１６４】
（実験例１５）
まず、フィルター濾過による細胞の捕捉を行った。フィルターを固定する部材として樹脂製の部材を使用し、Ｃｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで染色済みのＳＵＮ−１とＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ  ｏｒａｎｇｅで染色済みのＳＷ６２０を含む血液検体８ｍｌを図４の矢印Ａ方向から約３２分かけて定流量で通液した（濾過流量０．２５ｍｌ／分）。これにより、フィルター（実験例１と同じフィルター）上にＳＮＵ−１およびＳＷ６２０を捕捉した。ついで、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ  ２ｍＬで４回、フィルターの洗浄を行った後、ＡＣＳ  ９００μＬを３回通液し、実験例１と同様に室温で溶血させる（回収後のカウントの正確性を高めるため）。ＰＢＳ−ＢＳＡ  ２ｍＬで４回洗浄し、デバイス内液置換を行った。
ついで、フィルターに捕捉された細胞の回収を行った。上記細胞の捕捉を行った通液方向とは逆の方向（図４の矢印Ｂ方向）から逆流送液機構を用いてＰＢＳ−ＢＳＡ（回収液、粘度：１．５０ｍＰａ・ｓ）１ｍｌを通液した（流量６００ｍｌ／分）。その後、フィルター上部の回収液をピペットで２回撹拌した後、フィルター上部に溜まっている回収液５００μｌをピペットで吸引して回収し、ついでさらに２回撹拌した後残りの全量を同様に回収した。回収した液中のＳＮＵ−１及びＳＷ６２０の数を顕微鏡観察によりカウントした。回収された各細胞の数を添加した各細胞の数で除することにより、各細胞の回収率を求めた。その結果を下記表５に示す。
【０１６５】
（実験例１６）
回収液の流量を３１６ｍｌ／分（通液圧力５８ｋＰａ）にした以外は、実験例１５と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１６６】
（実験例１７）
ろ過面積を２８ｍｍ2、濾過流量を０．１ｍｌ／分、使用する細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで染色済みのＮＣＩ−Ｈ１６５０（ヒト肺癌）にした以外は、実験例１５と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１６７】
（実験例１８）
まず、フィルター濾過による細胞の捕捉を行った。フィルターを固定する部材として樹脂製の部材を使用し、未染色のＮＣＩ−Ｈ１６５０を含む血液検体８ｍｌを図４の矢印Ａ方向から約８０分かけて定流量で通液した（濾過流量０．１ｍｌ／分）。これにより、フィルター（ろ過面積が２８ｍｍ2である以外は実験例１と同じフィルター）上にＮＣＩ−Ｈ１６５０を捕捉した。ついで、溶血処理、固定化・細胞膜透過処理や抗体染色などの細胞染色を捕捉されているＮＣＩ−Ｈ１６５０に対して行い、最後にショ糖・グルコースベースの等張液で洗浄することで、デバイス内液置換を行った。
ついで、フィルターに捕捉された細胞の回収を行った。上記細胞の捕捉を行った通液方向とは逆の方向（図４の矢印Ｂ方向）から上記等張液（回収液、粘度：１．７５ｍＰａ・ｓ）１ｍｌを逆流送液機構を用いて通液した（流量６００ｍｌ／分）。その後、フィルター上部の回収液をピペットで２回撹拌した後、フィルター上に溜まっている回収液２５０μｌを回収し、ついでさらに２回撹拌した後残りの全量を同様に回収した。回収した液中のＮＣＩ−Ｈ１６５０の数を顕微鏡観察によりカウントした。回収された各細胞の数を添加した各細胞の数で除することにより、各細胞の回収率を求めた。その結果を下記表５に示す。
【０１６８】
（実験例１９）
回収液の液量を０．５ｍｌにした以外は、実験例１８と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１６９】
（実験例２０）
回収液の液量を０．５ｍｌにし、濾過流量を１ｍｌ／分にした以外は、実験例１８と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７０】
（実験例２１）
ろ過面積を２８ｍｍ2、濾過流量を１ｍｌ／分、回収液の液量を０．５ｍｌ、流量を１００ｍｌ／分にし、使用する細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎで染色済みのＮＣＩ−Ｈ１９７５（ヒト肺癌）にした以外は、実験例１５と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７１】
（実験例２２）
使用する細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ ｏｒａｎｇｅで染色済みのＳＷ６２０にした以外は、実験例２１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７２】
（実験例２３）
使用する細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎで染色済みのＮＣＩ−Ｈ１６５０にした以外は、実験例２１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７３】
（実験例２４）
使用する細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎで染色済みのＮＣＩ−Ｈ１６５０にし、溶血後に固定化処理を追加した以外は、実験例２１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７４】
（実験例２５）
回収液の流量を５０ｍｌ／分にした以外は、実験例２１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７５】
（実験例２６）
回収液の流量を５０ｍｌ／分にした以外は、実験例２２と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７６】
（実験例２７）
回収液の流量を５０ｍｌ／分にした以外は、実験例２３と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７７】
（実験例２８）
回収液の流量を２５ｍｌ／分にした以外は、実験例２１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７８】
（実験例２９）
回収液の流量を２５ｍｌ／分にした以外は、実験例２２と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１７９】
（実験例３０）
回収液の流量を２５ｍｌ／分にした以外は、実験例２３と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１８０】
（実験例３１）
回収液の流量を２５ｍｌ／分にした以外は、実験例２４と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１８１】
（比較実験例１）
回収液の流量を１０ｍｌ／分、使用する細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎで染色済みのＳＮＵ−１にした以外は、実験例２１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１８２】
（比較実験例２）
回収液の流量を５ｍｌ／分にした以外は、比較実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１８３】
（比較実験例３）
回収液の流量を２．５ｍｌ／分にした以外は、比較実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１８４】
（比較実験例４）
回収液の流量を１ｍｌ／分にした以外は、比較実験例１と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１８５】
（比較実験例５）
使用する細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ ｏｒａｎｇｅで染色済みのＳＷ６２０にした以外は、比較実験例３と同様にして細胞の捕捉及び回収を行った。その結果を下記表５に示す。
【０１８６】
【表５】
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【０１８７】
表５に示すように、いずれの実験例でも７０％を超える回収率でフィルターから細胞を回収することができた。また、少ない回収液量で、高い回収率を実現することができた。
【０１８８】
上記実験例１〜３０では、逆流送液機構を用いた回収液の通液後、フィルター上部に溜まっている回収液を全量回収したが、フィルター上に微量の回収液を残すように回収した後、再度、逆流送液機構を用いた回収液の通液を行うことにより、回収率をさらに向上できる場合があった。
【０１８９】
表５に示すように、回収液の流速（開口面積当たり）を、少なくとも１５ｍｍ／秒以上、好ましくは３６ｍｍ／秒以上とすることにより、７０％を超える高い回収率で、フィルターから細胞を回収することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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