(57)【要約】      （修正有）【課題】治療上有効量の抗体、酢酸緩衝液、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬製剤。【解決手段】抗ＨＥＲ２抗体、又はその断片、１又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤及び酢酸緩衝液を含む医薬製剤。医薬製剤が、液体製剤、凍結乾燥製剤または再構成製剤であり、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片が、医薬製剤内に１０〜４０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。薬学的に許容可能な賦形剤としては、１又は複数の界面活性剤、凍結乾燥保護剤、充填剤、無機もしくは有機塩、安定化剤、希釈剤、可溶化剤、還元剤、抗酸化剤、キレート剤及び／又は保存剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、１または複数の薬学的に許容可能な賦形剤および酢酸緩衝液を含んでなる、医薬製剤。
【請求項２】
医薬製剤が、液体製剤、凍結乾燥製剤または再構成製剤である、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
抗ＨＥＲ２抗体またはその断片が、医薬製剤内に１０〜４０ｍｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１または２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
製剤のｐＨが５．０〜６．０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項５】
製剤のｐＨが５．７±０．２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項６】
酢酸緩衝液が、医薬製剤内に１〜１０ｍＭの量で存在する酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項７】
薬学的に許容可能な賦形剤が、１または複数の界面活性剤、凍結乾燥保護剤、充填剤、無機もしくは有機塩、安定化剤、希釈剤、可溶化剤、還元剤、抗酸化剤、キレート剤および／または保存剤を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項８】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項９】
界面活性剤が、医薬製剤内に０．００１％〜０．１％（ｗ／ｗ）の量で存在するポリソルベート８０である、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
凍結乾燥保護剤が、非還元糖および／または糖アルコールを含んでなる、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
凍結乾燥保護剤が、医薬製剤内に５％〜１５％（ｗ／ｗ）の量で存在するスクロースである、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
凍結乾燥保護剤が、医薬製剤内にそれぞれ５％〜１５％（ｗ／ｗ）および０．５％〜５％（ｗ／ｗ）の量で存在するスクロースおよびマンニトールである、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
凍結乾燥保護剤が、抗体１モルに対してスクロース１５００〜２０００モルの、抗体に対する凍結乾燥保護剤のモル比で医薬製剤内に存在するスクロースである、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
凍結乾燥保護剤が、抗体１モルに対してスクロース約１７５０モルの、抗体に対する凍結乾燥保護剤のモル比で医薬製剤内に存在するスクロースである、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
充填剤が、医薬製剤内に０．５％〜１．５％（ｗ／ｗ）の量で存在するグリシンである、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
製剤が、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、凍結乾燥保護剤、充填剤、界面活性剤および
酢酸緩衝液を含んでなり、かつ、製剤のｐＨが５．７±０．２である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
製剤が凍結乾燥される、請求項１６に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、スクロース、グリシン、ポリソルベート８０および酢酸ナトリウムを含んでなり、かつ、製剤のｐＨが５．７±０．２である、請求項１６に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
３０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、１２％（ｗ／ｗ）スクロース、１％（ｗ／ｗ）グリシンおよび０．０１４％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０ならびに５．７５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含んでなり、かつ、製剤のｐＨが５．７±０．２である、請求項１７または１８に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
４０℃で少なくとも２か月間安定である、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
２５℃で少なくとも１２か月間安定である、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
製剤が、希釈剤を含んでなり、かつ、再構成製剤である、請求項１７に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
再構成製剤が、１０〜３０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、スクロース、グリシン、ポリソルベート８０、希釈剤および酢酸ナトリウムを含んでなり、かつ、製剤のｐＨが５．７±０．２である、請求項２２に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
２１ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、８．４％（ｗ／ｗ）スクロース、０．７％（ｗ／ｗ）グリシン、０．０１％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０、ＷＦＩおよび４ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含んでなり、かつ、製剤のｐＨが５．７±０．２である、請求項２３に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
抗ＨＥＲ２抗体またはその断片が、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
抗ＨＥＲ２抗体またはその断片が、配列番号１０の重鎖と配列番号１１の軽鎖とを有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
ＨＥＲ２関連障害の処置に用いるための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
ＨＥＲ２関連障害の処置のための医薬の製造における、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬製剤の使用。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬製剤の治療上有効量を対象に投与することを含んでなる、ＨＥＲ２関連障害を処置する方法。
【請求項３０】
ＨＥＲ２関連障害が、転移性乳癌、早期乳癌および転移性胃癌等のＨＥＲ２陽性癌から選択される、請求項２７もしくは２８の使用または請求項２９の方法。
【請求項３１】
ＨＥＲ２関連障害が、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌である、請求項２７もしくは２８の使用または請求項２９の方法。
【請求項３２】
（ｉ）請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤を有する容器；および
（ｉｉ）凍結乾燥製剤を希釈剤で再構成し、再構成製剤における抗体濃度を約１０〜４０ｍｇ／ｍｌとするための説明書
を含んでなる、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ＨＥＲ２抗体を含んでなる医薬製剤に関する。好ましくは、該医薬製剤は凍結乾燥された抗ＨＥＲ２抗体製剤を含んでなる。より好ましくは、該製剤は、安定な再構成製剤を生成させるために希釈剤で再構成された、安定な凍結乾燥された抗ＨＥＲ２抗体製剤を含んでなる。
【背景技術】
【０００２】
ＥｒｂＢ受容体ファミリーは４つの細胞膜結合受容体チロシンキナーゼ：ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ−２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ−４から構成される。ホモおよびヘテロ二量体のいずれもＥＧＦＲファミリーの４つのメンバーにより形成され、ＨＥＲ２は他のＥｒｂＢ受容体に対し好適かつ最も強力な二量化パートナーである（Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ  Ｄら、（１９９７）Ｅｍｂｏ  Ｊ、１６：１６４７−１６５５；Ｔａｏ  ＲＨら、（２００８）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１２１：３２０７−３２１７）。４つの受容体はいずれも細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび多数のシグナル分子と相互作用できる細胞内ドメインを含有し、リガンド依存的活性およびリガンド非依存的活性の双方を示す。Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０（分化クラスター３４０）またはｐ１８５としても知られるＨＥＲ２（ヒト表皮成長因子受容体２）は、ヒトにおいてＥＲＢＢ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＨＥＲ２の活性化は受容体のリン酸化をもたらし、これが、成長、生存および分化等の多数の細胞機能の調節を最終的にもたらす、ＭＡＰＫ、ホスホイノシトール３キナーゼ／ＡＫＴ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴおよびＰＫＣ等の多数のシグナル伝達経路を介する下流シグナルのカスケードを引き起こす（Ｈｕａｎｇ  Ｚら、（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、９：９７−１１０）。この遺伝子の過剰発現は特定の侵攻性乳癌の発症および進行において重要な役割を果たすことが示されている。
【０００３】
ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅または過剰発現はおよそ３０％の乳癌で生じる。これは疾患の再発の増加や予後の悪化と強く関連している（Ｒｏｙ  ＶおよびＰｅｒｅｚ  ＥＡ（２００９）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１４（１１）：１０６１−９）。過剰発現はまた、前立腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌および侵攻型の子宮がん（例えば子宮漿液性子宮内膜癌等）を含む他のヒト癌型とも関連している（Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏ  Ｉら、（１９９３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ、８：２３３−２３９；Ｒｏｓｓ  ＪＳら、（２００３）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、８：３０７−３２５；Ｏｓｍａｎ  Ｉら、（２００５）Ｊ  Ｕｒｏｌ、１７４：２１７４−２１７７；Ｋａｐｉｔａｎｏｖｉｃ  Ｓら、（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１２：１１０３−１１１３；Ｔｕｒｋｅｎ  Ｏら、（２００３）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ、５０：２５７−２６１；Ｏｓｈｉｍａ  ＣＴら、（２００１）Ｉｎｔ  Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ、１６：２５０−２５４；Ｓａｎｔｉｎ  ＡＤら、（２００８）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  Ｏｂｓｔｅｔ、１０２（２）：１２８−３１）。
【０００４】
ＨＥＲ２を標的にする既知の薬剤としては、ＨＥＲ２を過剰発現する癌において効果を有するモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））が挙げられる。別のモノクローナル抗体ペルツズマブ（パージェタ（商標）／オムニターグ（商標））はＨＥＲ２およびＨＥＲ３受容体の二量化を阻害する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明によれば、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片の製剤および１または複数の薬学的に許容可能な賦形剤および酢酸緩衝液を含んでなる医薬製剤が提供される。
【０００６】
本出願人は、液体製剤の調製において酢酸緩衝液を使用すると抗ＨＥＲ２抗体製剤に顕著な安定性を付与できることを見出し、この緩衝液を凍結乾燥製剤と続く再構成製剤の開発に使用した。
【０００７】
よって、本発明はまた、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、凍結乾燥保護剤、充填剤、界面活性剤および酢酸緩衝液を含んでなり、ｐＨがｐＨ５．０〜６．０である凍結乾燥製剤とその再構成製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、抗ＨＥＲ２抗体の３７℃での安定性加速試験の結果を示す。抗ＨＥＲ２抗体は、液体形態において抗体を安定化させる能力が確認された種々の賦形剤とともに製剤化した。ＨＰ−ＣＥＸによる主要ピーク割合の結果は図１ａに、ＨＰ−ＳＥＣによる単量体の割合は図１ｂに、凝集の割合は図１ｃに、抗ＨＥＲ２抗体濃度の消失割合は図１ｄに示す。
【図２】図２は、液体製剤における抗ＨＥＲ２抗体の３７℃での安定性加速試験の結果を示す。種々の濃度の抗ＨＥＲ２抗体をｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲のｐＨ値で、種々の緩衝液、クエン酸塩または酢酸塩のいずれかとともに製剤化した。ＨＰ−ＣＥＸによる主要ピークの結果は図２ａに、ＨＰ−ＳＥＣによる単量体の割合は図２ｂに、凝集の割合は図２ｃに、断片化の割合は図２ｄに、抗ＨＥＲ２抗体濃度の消失割合は図２ｅに示す。
【図３】図３は、１か月間、３７℃で維持される抗ＨＥＲ２抗体の液体製剤のための最適な塩濃度の範囲、緩衝液の種類および抗酸化剤を評価するためのスクリーニングの結果を示す。図３ａは、ｐＨ５．５、種々のＮａＣｌ濃度での凝集および断片化を示す。ｙ軸は凝集または断片化の割合を示す。ＮａＣｌの各濃度について、凝集は左側の薄い灰色のバーで示し、断片化は右側の濃い灰色のバーで示す。図３ｂは、ｐＨ５．５、種々のＮａＣｌ濃度での抗ＨＥＲ２抗体の脱アミド化を示す。図３ｃは、ｐＨ５．５で種々の濃度のクエン酸塩または酢酸塩とともに製剤化したときの抗ＨＥＲ２抗体の凝集および断片化の割合を示す。クエン酸塩または酢酸塩の各濃度について、凝集は左側の薄い灰色のバーで示し、断片化は右側の濃い灰色のバーで示す。
【図４】図４は、０時間（淡色のバー、左側）および５サイクルの凍結融解後（暗色のバー、右側）に試験した２２の製剤に存在する単量体の割合を示す（詳細は表８を参照）。試験した各製剤はｘ軸に、単量体の割合はｙ軸に示す。製剤６、８、１０および１９はさらに行う実験のために選択された。
【図５】図５は、ケークの再構成後に試験した４つの製剤に存在する単量体の割合を示す。すべての量は、前回のスクリーニングで選択された製剤６、８、１０および１９についての％単量体として示す。１番右のカラムは０時間での対照である。
【図６】図６は、０時間（淡色のバー、左側）および５サイクルの凍結融解後（暗色のバー、右側）に試験した１２の製剤に存在する単量体の割合を示す（詳細は表１１を参照）。試験した各製剤はｘ軸に、単量体の割合はｙ軸に示す。製剤１、４、７、１０および１１は凍結乾燥のために選択された。
【図７】図７は、０時間（淡色のバー、左側）ならびに凍結乾燥および高圧液体クロマトグラフィー−サイズ排斥の後（暗色のバー、右側）に試験した１８の製剤に存在する単量体の割合を示す（詳細は表１２を参照）。試験した各製剤はｘ軸に、単量体の割合はｙ軸に示す。
【図８】図８は、４０℃での１か月安定性試験において試験した７つの凍結乾燥製剤についての安定性の結果を示す（詳細は表１３を参照）。図８ａは、０時間（白色のバー、左側）、凍結乾燥後（淡色のバー、中央）および４０℃で１か月後（暗色のバー、右側）に試験した製剤に存在する単量体の割合を示す。試験した各製剤はｘ軸に、単量体の割合はｙ軸に示す。図８ｂは、０時間（白色のバー、左側）、凍結乾燥後（淡色のバー、中央）および４０℃で１か月後（暗色のバー、右側）に試験した製剤についての陽イオン交換クロマトグラフィー後の％主要ピークを示す。カラムと連結した線は、４０℃で１か月保存した後の各製剤についての主要ピークの消失割合を示す。図８ｃは、凍結乾燥後（淡色のバー、左側）および４０℃で１か月間保存後（暗色のバー、右側）に試験した各製剤に存在する水分の割合を示す。
【図９】図９は、０時間（液体および凍結乾燥製剤がそれぞれ透明および薄い灰色のバー）、４０℃で１か月（濃い灰色のバー）および４０℃で２か月（黒色のバー）の期間についての安定性加速試験における製剤１および２の安定性結果を示す（詳細は表１６を参照）。図９ａは、ＨＰＬＣ−ＳＥＣで測定された製剤１および２に存在する単量体の割合（ｙ軸）を示し、図９ｂは、製剤１および２についてのＨＰＬＣ−ＣＥＸ主要ピーク割合（ｙ軸）を示す。
【図１０】図１０は、ｘ軸に示す期間についての長期安定性試験における凍結乾燥された抗ＨＥＲ２抗体製剤についての安定性結果を示す。図１０ａは、１、２、３、６、９および１２か月の期間でのＨＰＬＣ−ＳＥＣで測定された製剤に存在する単量体の割合（ｙ軸）を示す。図１０ｂは、１、２、３、６、９および１２か月の期間での製剤についてのＨＰＬＣ−ＣＥＸ主要ピーク割合（ｙ軸）を示す。
【発明の具体的説明】
【０００９】
本開示は、ヒトＨＥＲ２を認識し、これに結合する抗体またはその断片を含んでなる医薬製剤に関する。
【００１０】
本明細書で用いられる用語「ヒトＨＥＲ２」は、ヒトＨＥＲ２のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログを含む。したがって、本発明の抗体は、ある場合において、ヒト以外の種由来のＨＥＲ２と交差反応することがある。ある態様では、抗体は、１または複数のヒトＨＥＲ２タンパク質に完全に特異的であってよく、非ヒトの種またはその他の型の交差反応性を示さないことがある。例示的なヒトＨＥＲ２の完全アミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２６（ＥＲＢＢ２＿ＨＵＭＡＮ；配列番号１）を有する。ＨＥＲ２は、ＣＤ３４０、ＭＬＮ１９、Ｎｅｕ、ｃ−ＥｒｂＢ−２およびｐ１８５ｅｒｂＢ２としても知られる。ヒトＨＥＲ２には、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅによりＧｅｎｅＩＤ：２０６４およびＨＧＮＣによりＨＧＮＣ：３４３０が割り当てられている。ＨＥＲ２は、ＥＲＢＢ２と表される遺伝子によりコードされ得る。
【００１１】
本明細書における「ヒトＨＥＲ２」の使用は、ヒトＨＥＲ２のすべての既知またはまだ見出されていない対立遺伝子および多型を包含する。用語「ヒトＨＥＲ２」または「ＨＥＲ２」は、本明細書において等価に用いられ、特に示されない限り「ヒトＨＥＲ２」を意味する。
【００１２】
用語「ＨＥＲ２と結合する抗体」および「抗ＨＥＲ２抗体」は、本明細書では互換的に用いられ、ヒトＨＥＲ２、例えば単離形態のヒトＨＥＲ２と結合する抗体またはその断片を含む。
【００１３】
用語「拮抗性抗体」または「アンタゴニスト抗体」は、本明細書において等価に用いられ、例えばＨＥＲ２とリガンドとの結合を阻止または実質的に結合を低減し、よってＨＥＲ２により引き起こされるシグナル伝達経路を阻害もしくは低減し、および／または細胞増殖のようなＨＥＲ２媒介性細胞応答を阻害もしくは低減することにより、ＨＥＲ２の生物学的シグナル伝達活性を阻害および／または中和できる抗体を含む。
【００１４】
本明細書で言及される用語「抗体」は、全抗体およびその任意の抗原結合断片または単鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合で相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含んでなる糖タンパク質またはその抗原結合断片のことをいう。
各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、ＣＤＲは、配列が超可変性であり、かつ／または抗原認識に関与し、かつ／またはより保存されたフレームワーク領域（ＦＲまたはＦＷ）とよばれる領域に散在している、構造が規定されたループを通常形成する。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＷで構成される：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３およびＦＷ４。ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列はすべて一緒に、本明細書で言及するように、ＶＨまたはＶＬの「非ＣＤＲ領域」または「非拡張ＣＤＲ領域」を構成する。
【００１５】
抗体は、定常領域により遺伝子的に決定される、アイソタイプともよばれるクラスに群分けされる。ヒト定常軽鎖は、カッパ（ＣΚ）およびラムダ（Ｃλ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはイプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。よって、本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴により定義される免疫グロブリンのクラスおよび／またはサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）およびＩｇＥ（ＩＧＨＥ）である。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に用いられている。ヒトにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。
【００１６】
抗体断片は、それらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一可変領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ＥＳら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４−５４６頁）、（ｖ）２つの連結されたＦａｂ断片を含んでなる２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成できるようにするペプチドリンカーで連結された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ＲＥら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−８３）、（ｖｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ２量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性断片である「ジアボディ」または「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩおよびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  Ｐ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−７９；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−４８）および（ｉｘ）同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合されたｓｃＦｖ（Ｃｏｌｏｍａ  ＭＪおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５（２）：１５９−１６３）が挙げられる。
【００１７】
二重特異性抗体が使用される場合、これらは、種々の方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＰおよびＷｉｎｔｅｒ  Ｇ（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４：４４６−４４９）で製造、例えば化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製することができる従来の二重特異性抗体であってもよく、あるいは上述の二重特異性抗体断片のいずれかであってよい。ジアボディおよびｓｃＦｖは、抗イディオタイプ反
応の影響を潜在的に減少させる可変ドメインのみを使用してＦｃ領域を用いることなく構築することができる。
【００１８】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体、を含む。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「ヒト化抗体」または「ヒト化抗ＨＥＲ２抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含む。さらなるフレームワーク領域改変を、ヒトフレームワーク配列内および別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列内で行ってよい。
【００２０】
好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片はモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体であり、より好ましくはヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。例えば、ある特定の好ましい態様において、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片はＨＣＤＲ１〜３（配列番号２〜配列番号４）およびＬＣＤＲ１〜３（配列番号５〜配列番号７）を含んでなる重鎖および軽鎖ＣＤＲのセットを有する。
【００２１】
関連性のあるＣＤＲのセットは抗体フレームワーク領域内に提供される。好ましくは、抗体フレームワーク領域が採用され、好ましくは生殖細胞系列であり、より好ましくは、重鎖のための抗体フレームワーク領域がＩＧＨＶ３−６６であってよい。軽鎖のための好ましいフレームワーク領域はＩＧＫＶ１−３９であってよい。好ましい態様において、ＶＨドメインは配列番号８のアミノ酸配列で提供される。より好ましい態様において、ＶＬドメインは配列番号９のアミノ酸配列で提供される。さらに好ましい態様において、抗ＨＥＲ２抗体は配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「バリアント抗体」または「抗体バリアント」は、親と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変により親抗体配列のものと異なる抗体配列を含む。本明細書においてバリアント抗体配列は、親抗体配列と好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。抗体バリアントは、抗体自体、抗体バリアントを含んでなる製剤またはこれをコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。
【００２３】
本明細書において用語「アミノ酸改変」は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む。本明細書において「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置での別のアミノ酸へのアミノ酸の置き換えを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、バリアントポリペプチド、この場合、９４位のアルギニンがリシンで置き換えられた重鎖可変フレームワーク領域バリアントのことをいう。前出の例について、９４Ｋは、９４位でのリシンへの置換を示す。本明細書における目的のために、複数の置換は、典型的には斜線により分けられる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは、置換Ｒ９４ＫおよびＬ７８Ｖを含んでなる二重バリアントのことをいう。本明細書で用いられる「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入−９４は、９４位での挿入を示す。本明細書で用いられる「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位でのアルギニンの欠失を示す。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「保存的改変」または「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に著しく影響を与えないかまたは前記特性を著しく変更しないアミノ酸改変のことをいうことを意図する。このような保存的改変は、アミノ酸置換、挿入および欠失を含む。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘
発などの当技術分野において知られる標準的な技術により本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。よって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内またはフレームワーク領域内の１または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変更された抗体（バリアント抗体）は保持された機能について試験することができる。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を含む。エフェクター機能は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）およびＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介性食作用）などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能ならびにＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）などの補体媒介性エフェクター機能を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ受容体または補体成分などのエフェクター分子に対する抗体の親和性を変更、すなわち増進または低減、好ましくは増進させることにより変更できる。結合親和性は、エフェクター分子結合部位を改変することにより一般的に変動され、この場合、対象の部位を置き、前記部位の少なくとも一部を適切な方法で改変することが適当である。エフェクター分子についての抗体の結合部位における変更は、全体的な結合親和性を著しく変更する必要はないが、相互作用の幾何学的配置を変更して、非生産的結合におけるようにエフェクター機序を無効にすることも構想される。エフェクター分子結合に直接関与しないがエフェクター機能の性能に関与する部位を改変することにより、エフェクター機能を変更することもさらに構想される。抗体のエフェクター機能を変更することにより、免疫応答の様々な側面を制御すること、例えば免疫系の様々な反応を増進または抑制することが可能になり、診断および療法において有益な効果を有する可能性がある。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「ＨＥＲ２関連障害」は、癌、特には転移性乳癌、早期乳癌および転移性胃癌、さらに特にはＨＥＲ２陽性転移性乳癌、のような状態を含む。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００２８】
「安定な」製剤とは、その中のタンパク質が保存時にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的安定性を本質的に保持するものである。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術が当技術分野において利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７−３０１、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ  Ａ（１９９３）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ、１０：２９−９０において概説される。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたり測定することができる。好ましくは、製剤は、室温（２５℃）または４０℃で少なくとも１か月間、好ましくは２か月間、より好ましくは６か月間安定であり、かつ／または約５℃で少なくとも１年間、好ましくは２年間安定である。さらに、製剤は、好ましくは、凍結（例えば−４０℃にする）および
融解の後、安定である。
【００２９】
医薬製剤におけるタンパク質の「物理的安定性」は、色および／または透明度の目視試験で、あるいは紫外線散乱またはサイズ排斥クロマトグラフィーで測定して、凝集、沈殿および／または変性の兆候が示されない場合は保持されている。
【００３０】
タンパク質の「化学的安定性」は、タンパク質の化学的に変性された形態を検出および定量化することで評価することができる。化学的変性は、例えば、サイズ排斥クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法／飛行時間型質量分析法（ＭＡＲＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて評価することができるサイズの変更（例えば、切り出し）を含んでよい。他の種類の化学的変性としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより評価することができる電荷の変更（例えば、脱アミド化の結果として起こる）が挙げられる。
【００３１】
用語「緩衝液」は、その酸−塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液を意味する。本発明の緩衝液は約５．０〜約６．０の範囲、好ましくは５．７のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲に制御できる緩衝液の例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウム等）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が挙げられる。
【００３２】
「凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」は、目的のタンパク質と組み合わされた時に、凍結乾燥およびこれに続く保存の際のタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を著しく防止または低減する分子である。凍結乾燥保護剤の例としては、ポリオール、アミノ酸、ベタイン等のメチルアミン、硫酸マグネシウム等のリオトロピック塩、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プルロニックおよびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい凍結乾燥保護剤は、スクロース等の非還元糖および／またはマンニトール等の糖アルコールであり、より好ましくはスクロース等の非還元糖である。凍結乾燥保護剤は、「凍結乾燥から保護する量」で凍結乾燥前の製剤に加えられ、これは、凍結乾燥から保護する量の凍結乾燥保護剤の存在下でのタンパク質の凍結乾燥の後に、タンパク質がその物理的および化学的安定性ならびに凍結乾燥および保存の際の完全性を保持することを意味する。
【００３３】
「ポリオール」は、複数のヒドロキシル基を有する物質であり、糖（還元および非還元糖）、糖アルコールおよび糖酸を含む。本明細書における好ましいポリオールは、約６００ｋＤ未満（例えば、約１２０〜約４００ｋＤの範囲）の分子量を有する。「還元糖」は金属イオンを還元またはリシンおよびタンパク質中の他のアミノ基と共有結合的に反応できるヘミアセタール基を含有するものであり、「非還元糖」は還元糖のこれらの特性を有しないものである。還元糖の例としては、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトースおよびグルコースである。非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ソルボースおよびラフィノースが挙げられる。糖アルコールとしては、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトールおよびグリセロールが挙げられる。凍結融解に安定な製剤に用いられるポリオールは、製剤中の抗体を不安定化させるような凍結温度（例えば、−２０℃）で結晶化しないものである。
【００３４】
「充填剤」は、凍結乾燥された混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケークに物理的構造を付与する（例えば、開気孔構造を維持する本質的に均質な凍結乾燥ケークの生産を促進する）化合物である。充填剤の例としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトール（ｘｏｒｂｉｔｏｌ）が挙げられる。
【００３５】
「液体」製剤は、液体形式に調製されたものである。そのような製剤は、対象への直接投与に適切である得、あるいは、後に液体形態または対象への投与に適切な他の形態に再構成するために、液体形態、凍結状態または乾燥形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存するためにパッケージすることもできる。
【００３６】
「凍結乾燥」製剤は、液体または凍結乾燥前の製剤を凍結乾燥することにより調製されたものである。凍結乾燥は、製剤を凍結し、その後一次乾燥に適切な温度で凍結内容から氷を昇華させることにより行う。このような条件の下では生産物温度は製剤の崩壊温度より下である。その後二次乾燥段階を行ってよく、これにより好適な凍結乾燥ケークが生産される。
【００３７】
「再構成」製剤は、タンパク質が再構成製剤に分散されるように凍結乾燥されたタンパク質製剤を希釈剤において溶解させることにより調製されたものである。再構成製剤は、目的のタンパク質で処置される対象に投与（例えば、非経口投与）するのに適切であるといえる。再構成製剤の調製に有用である適切な「希釈剤」としては、薬学的に許容可能な（ヒトへの投与に安全かつ非毒性である）ものが挙げられる。適切な希釈剤の例としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、注射用水（ＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等のｐＨ緩衝溶液、滅菌生理食塩水、リンガー液またはブドウ糖液が挙げられる。
【００３８】
本発明の製剤に含まれる抗体は、例えば組換え技術により生産することができる。本発明のＨＥＲ２抗体（ＣＤＲまたはＣＤＲセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えば、提供されるｓｃＦｖまたはＩｇＧ１）をコードする核酸は、該核酸を含有する組換え宿主細胞を適当な条件の下で培養することにより発現させてもよい。発現による生産の後、例えばＶＨおよび／またはＶＬドメインは、適切な任意の技術を用いて単離および／または精製し、その後必要に応じて使用されてよい。
【００３９】
抗体、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびに核酸コード分子およびベクターは、天然環境等から、実質的に純粋または均質の形で（核酸の場合は、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子起源がないまたは実質的にない）、提供、単離および／または精製されてよい。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、全体的または部分的に合成されてもよい。
【００４０】
種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングおよび発現する系はよく知られている。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系ならびにトランスジェニック植物および動物が挙げられる。
【００４１】
当技術分野で入手可能な異種ポリペプチド発現のための哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト胎児網膜細胞および他の多くのものが挙げられる。
【００４２】
好ましくは、哺乳動物細胞株はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。これらはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）欠損であってよく、それにより増殖のためにチミジンおよびヒポキサンチン依存性であってよい。（Ｕｒｌａｕｂ  ＧおよびＣｈａｓｉｎ  ＬＡ（１９８０）ＰＮＡＳ、７７：４２１６−４２２０）。親ｄｈｆｒＣＨＯ細胞株は、抗体遺伝子とｄｈｆｒ陽性表現型のＣＨＯ細胞形質転換体の選択を可能にするｄｈｆｒ遺伝子とでトランスフェクトされる。選択は、チミジンおよびヒポキサンチン（その不在が非形質転換細胞の増殖と形質転換細胞の葉酸経路の再利用およびそれによる選択系の回避とを妨げる）を欠く培地でコロニーを培養することにより行われる。これらの形
質転換体は通常、両方のトランスフェクト遺伝子の共組込みのために産物遺伝子の発現レベルが低い。抗体遺伝子の発現レベルはメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いた増幅により増加させてもよい。この薬剤はｄｈｆｒ酵素の直接的な阻害剤であり、このような条件下で生存するのに十分なｄｈｆｒ遺伝子コピー数を増幅する耐性コロニーの単離を可能にする。ｄｈｆｒおよび抗体遺伝子は本来の形質転換体ではより密接に関係しているため、通常同時に増幅され、それゆえ所望の抗体遺伝子の発現が増加する。ＣＨＯまたは骨髄腫細胞とともに用いるための他の選択系は、ＷＯ８７／０４４６２に記載されるグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）増幅系である。この系は、ＧＳ酵素をコードする遺伝子と所望の抗体遺伝子での細胞のトランスフェクションを含む。細胞は次にグルタミンフリー培地で増殖するものが選択される。選択されたこれらのクローンは次にメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を用いるＧＳ酵素阻害に供される。細胞は生存のためにＧＳ遺伝子を増幅し、同時に目的の抗体をコードする遺伝子を増幅するであろう。
【００４３】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じて他の配列等の適当な調節配列を含有する適切なベクターは選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドであってよい。さらなる詳細は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照できる。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現等における核酸の操作ならびにタンパク質の分析についての多くの公知の技術およびプロトコールの詳細はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９８８、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９９に記載される。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら（双方）の開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００４４】
核酸の宿主細胞への導入には任意の入手可能な技術を用いてよい。真核細胞については、適切な技術として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクションおよびレトロウイルスまたは他のウイルス（例えば、ワクシニアまたは昆虫細胞についてはバキュロウイルス）を用いる導入を挙げることができる。宿主細胞、特には真核細胞への核酸の導入はウイルスまたはプラスミドに基づく系を用いてよい。プラスミド系はエピソームに維持されてもよく、または宿主細胞もしくは人工染色体に取り込まれてもよい（Ｃｓｏｎｋａ  Ｅら（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１３：３２０７−３２１６；Ｖａｎｄｅｒｂｙｌ  Ｓら（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５（５）：１０。取り込みは、単一または複数の座位での１または複数のコピーのランダムまたは標的組み込みのいずれかによるものであってよい。細菌細胞については、適切な技術として、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔およびバクテリオファージを用いる感染を挙げることができる。
【００４５】
導入に続き、例えば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現が引き起こされるまたは許可される。１つの態様において、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。組み込みは、標準的技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を包含することにより促進されてもよい。
【００４６】
さらなる態様は、１または複数のクロマトグラフ分離工程を含んでなり、各分離工程が、１または複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含んでなる溶出緩衝液での溶出を含んでなる、ＨＥＲ２抗体の精製方法を提供する。
【００４７】
好ましくは、１または複数のクロマトグラフ分離工程は、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルクロマトグラフィー）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排斥クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、親硫黄性吸着クロマトグラフィー、真性グロブリン吸着クロマトグラフィー、色素リガンドクロマトグラフィーまたは固定化ボロン酸クロマトグラフィーから選択される。より好ましくは、クロマトグラフ分離は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続く陽イオン交換クロマトグラフィーおよび／または続く疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくは陰イオン交換クロマトグラフィーにより行われる。
【００４８】
医薬製剤
本発明の医薬製剤は、液体製剤、凍結乾燥製剤または再構成製剤であってよい。
【００４９】
製剤に含まれる抗ＨＥＲ２抗体またはその断片の量を決定する際には製剤の所望の１回投与量、容量および最終的な投与方法が考慮される。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、医薬製剤内に１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、特には２０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【００５０】
製剤はｐＨ５．０〜６．０、好ましくはｐＨ５．５〜５．９、より好ましくはｐＨ５．６〜５．８、さらに好ましくはｐＨ５．７±０．２、最も好ましくはｐＨｐＨ５．７±０．１に緩衝することができる。この範囲にｐＨを制御するのに用いることができる緩衝液の例としては、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、グルタル酸塩、カコジル酸塩、マレイン酸水素ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、イミダゾールおよび他の有機酸緩衝液が挙げられる。好ましくは、緩衝液は酢酸緩衝液であり、より好ましくは酢酸ナトリウムである。好ましくは、酢酸緩衝液は、製剤内に１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜２０ｍＭ、さらに好ましくは１〜１０ｍＭの量で存在する。
【００５１】
好ましくは、「薬学的に許容可能な賦形剤」が液体製剤に加えられる。「薬学的に許容可能な賦形剤」についての言及は、医薬製剤に従来から用いられる任意の賦形剤についての言及を含むと理解されるであろう。そのような賦形剤としては典型的には、１または複数の界面活性剤、凍結乾燥保護剤、充填剤、無機もしくは有機塩、安定化剤、希釈剤、可溶化剤、還元剤、抗酸化剤、キレート剤、保存剤等を含んでよい。
【００５２】
非経口製剤の場合は体液（すなわち、およそ２８４ｍＯｓｍ／Ｌ）と等張にすることが望ましいため、等張化剤を医薬製剤に加えてもよい。一般に用いられる等張化剤の例は塩化ナトリウム塩である。好ましくは、等張化剤は５０〜４００ｍＭ、より好ましくは１００〜３００ｍＭ、さらに好ましくは２００〜２５０ｍＭの濃度で液体製剤に存在する。しかしながら、等張化剤は通常は凍結乾燥製剤には加えられず、よって、凍結乾燥前に等張化剤を製剤から除去してもよい。等張化剤は再構成製剤のための希釈剤に存在してもよい。
【００５３】
典型的な界面活性剤の例としては、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノカプリル
酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン）、グリセリン脂肪酸エステル（例えば、モノカプリル酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン）、ポリグリセリン脂肪酸エステル（例えば、モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、モノリノール酸デカグリセリル）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（例えば、テトラステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール）、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ジステアリン酸ポリエチレングリコール）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（例えば、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）、ポリオキシエチレンミツロウ誘導体（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールミツロウ）、ポリオキシエチレンラノリン誘導体（例えば、ポリオキシエチレンラノリン）およびポリオキシエチレン脂肪酸アミド（例えば、ポリオキシエチレンステアリン酸アミド）等の非イオン界面活性剤（ＨＬＢ６〜１８）；Ｃ10−Ｃ18アルキル硫酸塩（例えば、セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム）、平均２〜４モルのエチレンオキシドとのポリオキシエチレンＣ10−Ｃ18アルキルエーテル硫酸塩（例えば、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム）およびＣ8−Ｃ18アルキルスルホコハク酸エステル塩（例えば、
ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム）等の陰イオン界面活性剤；ならびにレシチン、グリセリリン脂質、スフィンゴリン脂質（例えば、スフィンゴミエリン）およびＣ12−Ｃ18脂肪酸のスクロースエステル等の天然界面活性剤が挙げられる。
【００５４】
好ましくは、界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される。特に好ましくは、界面活性剤はポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１および８５であり、最も好ましくは、ポリソルベート８０である。ポリソルベート８０はＴｗｅｅｎ８０（商標）（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，Ｉｎｃ．）という商標名でも知られている。
【００５５】
好ましくは、界面活性剤は、製剤内に０．００１〜０．１％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．００１〜０．０５％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）の量で存在する。
【００５６】
また、溶液における抗体の可溶化作用を増加させるために可溶化剤を加えてもよい。可溶化剤の例としては、プロリンまたはグリシン等のアミノ酸、プロピレングリコール、プラスドンＣおよびＫポビドン、シクロデキストリンならびにプラスドンＫポリマーが挙げられる。好ましくは、可溶化剤は１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤に加えられる。
【００５７】
本発明の医薬製剤はまた、還元剤、抗酸化剤および／またはキレート剤等のさらなる賦形剤を含んでもよい。
【００５８】
還元剤の例としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオク
ト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオンならびにＣ1−Ｃ7チオアルカン酸が挙げられる。
【００５９】
抗酸化剤の例としては、メチオニン等のアミノ酸、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミルならびに没食子酸プロピルが挙げられる。
【００６０】
キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ジナトリウム、ピロリン酸ナトリウムおよびメタリン酸ナトリウムが挙げられる。
【００６１】
液体製剤中のすべての賦形剤が凍結乾燥形態の製剤に含まれるのに適しているとは限らず、よって、凍結乾燥に適するように液体製剤にいくつかの変更を加えてもよい。
【００６２】
凍結乾燥形態においてタンパク質を安定させるために安定化剤を製剤に加えてもよい。安定化剤の例としては、クレアチニン；ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、アスパラギン酸、アルギニン、リジンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸；スクロース、トレハロース、ソルビトール、キシリトールおよびマンノースから選択される炭水化物；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；  例えば、ＰＥＧ３３５０またはＰＥＧ４０００）もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）から選択される界面活性剤；またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００６３】
好ましい態様において、安定化剤は、非還元糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）および／または糖アルコール（例えば、マンニトール）から選択され得る凍結乾燥保護剤を含んでなる。凍結乾燥保護剤の添加は、凍結乾燥にあたりタンパク質の分解または凝集の量の低減を助ける。好ましくは、凍結乾燥製剤は再構成の際に等張性であり、よって、凍結乾燥製剤における凍結乾燥保護剤の量は、等張性の再構成製剤を達成するのに十分な量であるといえる。あるいは、再構成製剤は高張性であってよく、それゆえ凍結乾燥製剤においてさらなる量の凍結乾燥保護剤が必要とされる。逆に、凍結乾燥製剤に加えられる凍結乾燥保護剤が少なすぎる場合は、凍結乾燥にあたり受け入れがたい量の抗体の分解または凝集が起こり得る。
【００６４】
好ましくは、凍結乾燥製剤における凍結乾燥保護剤は非還元糖および／または糖アルコールであり、より好ましくはスクロースおよび／またはマンニトールである。好ましい態様において、凍結乾燥製剤における凍結乾燥保護剤はスクロースである。好ましくは、凍結乾燥保護剤は約１０ｍＭ〜約７００ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、より好ましくは約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、さらに好ましくは約２００ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度で凍結乾燥製剤に存在する。
【００６５】
好ましくは、凍結乾燥保護剤は、１〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは２〜５０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは３〜２５％、さらに好ましくは５〜２０％（ｗ／ｗ）の量で凍結乾燥製剤に存在する。
【００６６】
凍結乾燥保護剤を含んでなる凍結乾燥製剤において、好ましくは、凍結乾燥保護剤に対する抗体のモル比が、抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤１００〜約３０００モル、好ましくは抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤約５００〜約２５００モル、より好ましくは抗体１
モルに対し凍結乾燥保護剤約１０００〜約２２５０モル、さらに好ましくは約１５００〜２０００モルの範囲であってよい。
【００６７】
好ましくは、凍結乾燥製剤は充填剤を含んでなる。充填剤の例としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、ソルビトール（ｘｏｒｂｉｔｏｌ）、無水ラクトース、スクロース、Ｄ（＋）−トレハロース、デキストラン４０およびポビドン（ＰＶＰ
Ｋ２４）が挙げられる。好ましくは、充填剤は約５０〜２００ｍＭ、好ましくは約１００〜１５０ｍＭの濃度で凍結乾燥製剤に存在する。好ましくは、充填剤は０．１〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．２〜８％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．５〜５％（ｗ／ｗ）の量で凍結乾燥製剤に存在する。
【００６８】
一度、凍結乾燥製剤が準備されると、材料は凍結乾燥に供される。これはいくつかの市販の凍結乾燥器を用いて達成することができる。これらは、材料を冷凍し、その後周囲の圧力を減少させて材料中の凍結水を固相から気層に直接昇華させることにより機能する。第二の乾燥相もまた実行される。好ましくは、凍結乾燥製剤は５％未満、好ましくは４％未満、より好ましくは３％未満、さらに好ましくは２％未満の水分含量を含んでなる。
【００６９】
凍結乾燥製剤は、再構成製剤における抗体濃度が１〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜５０ｍｇ／ｍｌの量で存在するように、希釈剤で再構成されてもよい。
【００７０】
凍結乾燥製剤の再構成に用いられる希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、注射用水（ＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水等のｐＨ緩衝溶液、滅菌生理食塩水、リンガー液、ブドウ糖液が挙げられる。
【００７１】
再構成製剤における細菌作用を低減させるために保存剤を希釈剤に加えてもよい。保存剤の例としては、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルおよびベンジルアルコール等の芳香族アルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールが挙げられる。
【００７２】
本発明の一面において、医薬製剤は液体製剤として生産される。好ましくは、抗ＨＥＲ２またはその断片は、液体製剤内に１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、２０〜２５ｍｇ／ｍｌ、特には２１ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【００７３】
液体製剤は、ｐＨ５．０〜６．０、好ましくはｐＨ５．５〜５．９、より好ましくはｐＨ５．６〜５．８、さらに好ましくはｐＨ５．７±０．２、最も好ましくはｐＨ５．７±０．１、特にはｐＨ５．７に緩衝することができる。実施例１に記載されるように、出願人は、例えばクエン酸緩衝液と比較して、酢酸緩衝液が液体製剤に顕著な安定性を付与することを見出した。よって、好ましい酢酸緩衝液は酢酸緩衝液、より好ましくは酢酸ナトリウムである。好ましくは、酢酸緩衝液は、液体製剤内に１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは２〜７ｍＭ、特に４ｍＭの量で存在する。
【００７４】
好ましくは、等張化剤は５０〜４００ｍＭ、好ましくは１００〜３００ｍＭ、より好ましくは２００〜２５０ｍＭ、さらに好ましくは２１０〜２２０ｍＭ、特には２１４ｍＭの濃度で液体製剤に存在する。
【００７５】
好ましくは、界面活性剤が液体製剤に加えられ、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択されてよい。特に好ましくは、界面活性剤はポリソルベート８０（商標名Ｔｗｅｅｎ８０（商標）でも知られる（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，Ｉｎｃ．））である。
【００７６】
好ましくは、界面活性剤は、液体製剤内に０．００１〜０．１％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．００２〜０．０５％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）、特には０．０１％（ｗ／ｗ）の量で存在する。
【００７７】
好ましくは、可溶化剤が液体製剤に加えられる。可溶化剤はプロリンまたはグリシンであってよく、好ましくは プロリンである。好ましくは、可溶化剤は１〜５０ｍｇ／ｍｌ
、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１５〜２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤に加えられる。
【００７８】
本発明の好ましい態様において、液体製剤は、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片および薬学的に許容可能な賦形剤を含んでなり、酢酸緩衝液によりｐＨ５．７±０．２に緩衝される。本発明のさらに好ましい態様において、液体製剤は、ｐＨ５．７で、ＮａＣｌ、プロリン、ポリソルベート８０および酢酸ナトリウムと製剤化された抗ＨＥＲ２抗体またはその断片を含んでなる。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００７９】
本発明のさらに一層好ましい態様において、液体製剤は１０〜４０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、２００〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜３０ｍｇ／ｍｌプロリン、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０および１〜１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７±０．２である。好ましくは, 抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００８０】
本発明のより好ましい態様において、液体製剤は、２１ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、２１４ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍｇ／ｍｌプロリン、０．０１％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０および４ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００８１】
本発明のさらなる面において、医薬製剤は、抗体の凍結乾燥製剤を含んでなる。
【００８２】
好ましくは 抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、凍結乾燥製剤内に１ｍｇ／ｍｌ〜１０
０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは  ２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２５〜３５ｍｇ／ｍｌ、特には３０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【００８３】
凍結乾燥製剤は、ｐＨ５．０〜６．０、好ましくはｐＨ５．５〜５．９、より好ましくはｐＨ５．６〜５．８、さらに好ましくはｐＨ５．７±０．２、最も好ましくはｐＨ５．７±０．１、特にはｐＨ５．７に緩衝することができる。好ましい緩衝液は酢酸緩衝液、より好ましくは酢酸ナトリウムである。好ましくは、酢酸緩衝液は、凍結乾燥製剤内に１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは３〜７ｍＭ、特には５〜６ｍＭの量で存在する。
【００８４】
好ましい態様において、凍結乾燥製剤は安定化剤を含んでなる。好ましくは、安定化剤は、非還元糖および／または糖アルコールである凍結乾燥保護剤である。好ましくは、凍結乾燥保護剤は、スクロースおよび／またはマンニトールであり、最も好ましくはスクロースである。好ましくは、凍結乾燥保護剤は、約５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、好ましくは約１００ｍＭ〜約６００ｍＭ、より好ましくは約２００ｍＭ〜約５００ｍＭ、さらに好ましくは約３００ｍＭ〜約４００ｍＭ、および最も好ましくは約３５０ｍＭの濃度で凍結乾燥製剤に存在する。
【００８５】
凍結乾燥保護剤としてスクロースを含んでなる凍結乾燥製剤において、好ましくは、スクロースは、１〜９０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは４〜２５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは７〜２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは１０〜１５％（ｗ／ｗ）、および最も好ましくは１２％（ｗ／ｗ）の量で凍結乾燥製剤に存在する。
【００８６】
凍結乾燥保護剤としてマンニトールを含んでなる凍結乾燥製剤において、好ましくは、マンニトールは、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．５〜１０％、より好ましくは１〜６％、さらに好ましくは２〜４％、最も好ましくは２％の量で凍結乾燥製剤に存在する。
【００８７】
凍結乾燥保護剤としてスクロースを含んでなる凍結乾燥製剤において、好ましくは、凍結乾燥保護剤に対する抗ＨＥＲ２抗体のモル比は、抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤１００〜約３０００モル、好ましくは抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤約５００〜約２５００モル、より好ましくは抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤約１０００〜約２２５０モル、さらに好ましくは約１５００〜２０００モルの範囲であってよい。最も好ましくは、凍結乾燥保護剤に対する抗ＨＥＲ２抗体のモル比は、抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤約１７５０モルであってよい。
【００８８】
好ましくは、凍結乾燥製剤は充填剤を含んでなる。好ましくは、充填剤は約５０〜２００ｍＭ、好ましくは約１００〜１５０ｍＭ、より好ましくは約１２０〜１４０ｍＭ、さらに好ましくは約１３０ｍＭ〜１３５ｍＭの濃度で凍結乾燥製剤に存在するグリシンである。好ましくは、充填剤は、０．１〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．２〜８％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．５〜５％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．７〜３％（ｗ／ｗ）、および最も好ましくは１％（ｗ／ｗ）の量で凍結乾燥製剤に存在する。
【００８９】
好ましくは、凍結乾燥製剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される界面活性剤を含んでなる。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート８０（商標名Ｔｗｅｅｎ８０（商標）でも知られる（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，  Ｉｎｃ．））である。好ましくは、界面活性剤は、凍結乾燥製剤内に０．００１〜０．１％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．００２〜０．０５％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）、および特には０．０１４％（ｗ／ｗ）の量で存在する。
【００９０】
本発明の好ましい態様において、凍結乾燥製剤は、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、安定化剤および界面活性剤を含んでなり、酢酸緩衝液でｐＨ５．７±０．２に緩衝されている。本発明のさらに好ましい態様において、凍結乾燥製剤は、ｐＨ５．７±０．２で、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、グリシン、スクロース、ポリソルベート８０および酢酸ナトリウムを含んでなる。好ましくは 抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０お
よび配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００９１】
本発明のさらに好ましい態様において、凍結乾燥製剤は、２０〜４０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、１０〜１５％（ｗ／ｗ）スクロース、０．５〜５％（ｗ／ｗ）グリシン、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０および１−１０ｍＭ
酢酸ナトリウムを含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７±０．２である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００９２】
本発明のさらにより好ましい態様において、凍結乾燥製剤は、３０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、１２％（ｗ／ｗ）スクロース、１％（ｗ／ｗ）グリシン、０．０１４％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０および５．７５ｍＭ酢酸ナトリウムを含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００９３】
本発明のさらに一層好ましい態様において、凍結乾燥製剤は、２０〜４０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、３００〜４００ｍＭスクロース、１２０〜１４０ｍＭグリシン、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０および１〜１０ｍＭ酢酸ナトリウムを含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７±０．２である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００９４】
本発明のさらに一層より好ましい態様において、凍結乾燥製剤は、３０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、３５０ｍＭスクロース、１３３ｍＭグリシン、０．０１４％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０および５．７５ｍＭ酢酸ナトリウムを含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【００９５】
一度、凍結乾燥製剤が準備されると、材料は凍結乾燥に供される。好ましくは、凍結乾燥後の製剤は、５％未満、好ましくは４％未満、より好ましくは３％未満、さらに好ましくは２％未満、および特には１％〜２％の水分含量を含んでなる。
【００９６】
本発明のさらなる面において、医薬製剤は、抗体の再構成製剤を含んでなる。
【００９７】
凍結乾燥製剤は、再構成製剤における抗ＨＥＲ２抗体またはその断片の濃度が１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２０〜２５ｍｇ／ｍｌ、特には２１ｍｇ／ｍｌの量で存在するように希釈剤で再構成されてよい。
【００９８】
凍結乾燥製剤の再構成に用いられる希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、注射用水（ＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水等のｐＨ緩衝溶液、滅菌生理食塩水、リンガー液またはブドウ糖液が挙げられる。好ましくは、本発明の凍結乾燥製剤の再構成に用いられる希釈剤はＷＦＩである。
【００９９】
希釈剤は、所望の濃度の抗体溶液を得るために、０．１〜１００ｍｌ、好ましくは１〜５０ｍｌ、より好ましくは２〜３０ｍｌ、さらに好ましくは３〜１５ｍｌ、特には５〜１０ｍｌの量で加えられてよい。好ましくは、凍結乾燥製剤は、２１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得るために７．２ｍｌのＷＦＩで再構成される。
【０１００】
好ましくは、再構成製剤は、ｐＨ５．０〜６．０、より好ましくはｐＨ５．７±０．２、さらに好ましくは５．７±０．１、最も好ましくはｐＨ５．７に緩衝される。好ましくは、緩衝液は酢酸緩衝液であり、より好ましくは酢酸ナトリウムである。好ましくは、酢酸ナトリウムは、再構成製剤内に１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは２〜６ｍＭ、特には４ｍＭの量で存在する。
【０１０１】
好ましくは、再構成製剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される界面活性剤を含んでなる。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート８０（商標名Ｔｗｅｅｎ８０（商標）でも知られる（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，  Ｉｎｃ．））である。好ましくは、界面活性剤は、再構成製剤内に０．００１〜０．１％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．００２〜０．０５％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）、および特には０．０１％（ｗ／ｗ）の量で存在する。
【０１０２】
好ましい態様において、再構成製剤は安定化剤を含んでなる。好ましくは、安定化剤は、非還元糖および／または糖アルコールである凍結乾燥保護剤である。好ましくは、凍結乾燥保護剤は、スクロースおよび／またはマンニトール、最も好ましくはスクロースである。好ましくは、凍結乾燥保護剤は、約１０ｍＭ〜約７００ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、より好ましくは約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、さらに好ましくは約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ、および最も好ましくは約２２５ｍＭ〜約２７５ｍＭ、特には約２５０ｍＭの濃度で再構成製剤に存在する。
【０１０３】
好ましくは、凍結乾燥保護剤は、１〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２〜２５％（ｗ／ｗ）、好ましくは４〜２０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは５〜１５％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは６〜１０％（ｗ／ｗ）および最も好ましくは８．４％（ｗ／ｗ）の量で再構成製剤に存在するスクロースである。
【０１０４】
凍結乾燥保護剤としてマンニトールを含んでなる再構成製剤において、好ましくは、マンニトールが、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．５〜１０％、より好ましくは１〜６％、さらに好ましくは２〜４％、最も好ましくは２％の量で凍結乾燥製剤に存在する。
【０１０５】
凍結乾燥保護剤としてスクロースを含んでなる再構成製剤において、好ましくは、凍結乾燥保護剤に対する抗ＨＥＲ２抗体のモル比は、抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤１００〜約３０００モル、好ましくは抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤約５００〜約２５００モル、より好ましくは抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤約１０００〜約２０００モルの範囲であってよい。最も好ましくは、凍結乾燥保護剤に対する抗ＨＥＲ２抗体のモル比は、抗体１モルに対し凍結乾燥保護剤約１７５０モルであってよい。
【０１０６】
好ましくは、再構成製剤は充填剤を含んでなる。好ましくは、充填剤は約５０〜２００ｍＭ、好ましくは約６０〜１５０ｍＭ、より好ましくは約７０〜１２０ｍＭ、さらに好ましくは約８０ｍＭ〜１００ｍＭ、最も好ましくは約９０ｍＭの濃度で再構成製剤に存在するグリシンである。好ましくは、充填剤は０．１〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．２〜５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．５〜２％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．７％（ｗ／ｗ）の量で凍結乾燥製剤に存在する。
【０１０７】
本発明の好ましい態様において、再構成された凍結乾燥製剤は、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、安定化剤、界面活性剤および希釈剤を含んでなり、酢酸緩衝液でｐＨ５．７±０．２に緩衝されている。本発明のさらに好ましい態様において、再構成された凍結乾燥製剤は、ｐＨ５．７±０．２で、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、グリシン、スクロース、ポリソルベート８０、ＷＦＩおよび酢酸ナトリウムを含んでなる。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【０１０８】
本発明の好ましい態様において、再構成された凍結乾燥製剤は、１５〜３０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、５〜１５％（ｗ／ｗ）スクロース、０．５〜２％（ｗ
／ｗ）グリシン、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０、ＷＦＩおよび１〜１０ｍＭ酢酸ナトリウムを含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７±０．２である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【０１０９】
本発明のより好ましい態様において、再構成された凍結乾燥製剤は、２１ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、８．４％（ｗ／ｗ）スクロース、０．７％（ｗ／ｗ）グリシン、０．０１％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０、ＷＦＩおよび４ｍＭ酢酸ナトリウムを含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【０１１０】
本発明のさらに好ましい態様において、再構成された凍結乾燥製剤は、１５〜３０ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、２２５〜２７５ｍＭスクロース、８０〜１００ｍＭグリシン、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０、５〜１０ｍｌ  ＷＦＩおよび１〜１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７±０．２である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【０１１１】
本発明のさらにより好ましい態様において、再構成された凍結乾燥製剤は、２１ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、２４６ｍＭスクロース、９０ｍＭグリシン、０．０１％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０、７．２ｍｌ  ＷＦＩおよび４ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含んでなり、製剤のｐＨがｐＨ５．７である。好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片は、配列番号１０および配列番号１１の重鎖および軽鎖を含んでなる。
【０１１２】
本発明のさらなる面によれば、本明細書において定義される医薬抗体製剤のＨＥＲ２関連障害の処置のための使用が提供される。
【０１１３】
好ましくは、ＨＥＲ２関連障害は癌から選択される。本発明において処置される癌の例としては、それらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病またはリンパ性腫瘍が挙げられる。このような癌の特定の例としては扁平上皮（ｓｑｕａｍｏｕｓ
ｃｅｌｌ）癌（例えば、扁平上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ）癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌、陰茎癌ならびに頭頸部癌が挙げられる。より好ましい例としては、転移性乳癌、早期乳癌および転移性胃癌等のＨＥＲ２陽性癌が挙げられる。より好ましくは、ＨＥＲ２関連障害はＨＥＲ２陽性転移性乳癌である。
【０１１４】
本発明は、本明細書において定義される医薬抗体製剤の治療上有効量を対象に投与することを含んでなるＨＥＲ２関連障害を処置または予防する方法が提供される。
【０１１５】
本発明はまた、ＨＥＲ２関連障害の処置に用いるための、本明細書において定義される医薬抗体製剤を提供する。
【０１１６】
本発明の医薬製剤は、液体製剤、凍結乾燥製剤または再構成製剤（すなわち、使用前に再構成される凍結乾燥製剤）であってよい。液体製剤は、通常、密封および滅菌されたプラスチックまたはガラス製のバイアル、アンプルおよびシリンジ等の所定の容量の容器の
形態、ならびに瓶のような大容量の容器の形態で提供される。凍結乾燥製剤は、通常、密封および滅菌されたプラスチックまたはガラス製のバイアル中の所定の重量の粉末の形態で提供される。粉末は使用前に再構成される。好ましくは、本発明の医薬製剤は、凍結乾燥製剤である。より好ましくは、本発明の医薬製剤は、再構成製剤である。本発明の医薬製剤は、経口的に、または注射により（例えば、皮下に、静脈内に、腹腔内にまたは筋肉内に）、または吸入により、または局所的に（例えば、眼内に、鼻腔内に、直腸に、創傷に、皮膚に）投与されてもよい。投与経路は、処置の物理化学的特性、疾患に対する特別な配慮または有効性を最適化もしくは副作用を最小限にするための要件により決定することができる。好ましくは、本発明の製剤は、静脈注入、例えば、ボーラスとして、および／または一定期間にわたる持続注入により投与される。
【０１１７】
本発明の態様は、
（ｉ）抗ＨＥＲ２抗体またはその断片、凍結乾燥保護剤および酢酸緩衝液の凍結乾燥製剤を有する容器；および
（ｉｉ）凍結乾燥製剤を希釈剤で再構成し、再構成製剤における抗体濃度を約１０〜４０ｍｇ／ｍｌとするための説明書
を含んでなる製品を含んでもよい。
【０１１８】
好ましくは、凍結乾燥製剤は、約１２〜３０ｍｇ／ｍｌの抗体濃度を得るために希釈剤で再構成される。より好ましくは、抗体濃度は約１５〜２５ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約２１ｍｇ／ｍｌである。
【０１１９】
本発明に従って、提供される製剤は個人に投与されてもよい。投与は好ましくは「治療上有効量」、すなわち対象に対し利益を示すのに十分な量でなされる。このような利益は少なくとも１つの症状の少なくとも改善であってよい。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間経過は処置されるものの性質や重症度による。処置の処方、例えば投与量の決定等、は医師の責任の範囲内である。抗体の適当な１回投与量は当技術分野において公知である（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  ＪＡら（１９９９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９−６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ  ＫＤら（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、４：９１５−９２２）。正確な１回投与量は、処置される領域のサイズおよび位置、対象の体重、抗体の正確な性質（例えば、全抗体または断片）ならびに抗体投与の前、その時点、または後に投与された（投与される）任意の追加の治療薬を含む多数の因子に依存するであろう。典型的な抗体の１回投与量は、静脈投与のための２ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。
【０１２０】
抗体またはその断片は、一回または一連の処置で対象に適切に投与される。疾患の種類および重症度によるが、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの抗体が、例えば１または複数の別々の投与または連続注入による、対象への投与のための初回候補投与量である。典型的な１日投与量は、上記の因子に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれ以上である。数日またはそれ以上にわたる繰り返し投与については、状態に応じて、疾患の症状の所望の抑制が起こるまで処置が継続される。抗体の好ましい投与量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（あるいはこれらの任意の組み合わせ）の１または複数の１回投与量が対象に投与されてもよい。このような１回投与量は断続的に、例えば、毎週または３週間ごとに（例えば、対象が、抗ＨＥＲ２抗体の１回投与量を約２〜約２０回、例えば、約６回受けるように）投与されてもよい。初回高負荷量とこれに続く１または複数の低負荷量が投与されてもよい。例示的な投与レジメンは約４ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇの初回負荷量とこれに続く１週ごとの抗ＨＥＲ２抗体の約２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇの維持量の投与を含んでなる。好ましくは、８ｍｇ／ｋ
ｇの初回負荷量とこれに続く週に１回または３週に１回、それぞれ２ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇの量である。
【０１２１】
他の療法レジメンを抗ＨＥＲ２抗体またはその断片の投与と組み合わせてもよい。併用投与は、別個の複数の製剤または単一の医薬製剤を用いる共投与およびいずれかの順序（好ましくは、双方（あるいはすべて）の活性物質がそれらの生物学的活性を同時に発揮できる期間を有する）での連続投与が挙げられる。
【０１２２】
抗ＨＥＲ２抗体またはその断片の投与と別の腫瘍関連抗原に対する抗体またはその断片の投与とを組み合わせることが望ましいこともある。この場合の他の抗体は、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合してもよい。
【０１２３】
１つの態様において、本発明の処置は、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片と、種々の化学療法剤のカクテルの共投与を含む１または複数の化学療法剤または増殖阻害剤との併用投与を含む。好ましい化学療法剤としては、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）および／またはアントラサイクリン系抗生物質が挙げられる。このような化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造業者の説明書に従って、または熟練した専門家により経験的に決定されて使用されてよい。このような化学療法の調製および投薬スケジュールはＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ編、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９９２）にも記載されている。抗体は、抗ホルモン化合物、例えば、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物、オナプリストン（欧州特許６１６８１２号参照）等の抗プロゲステロンまたはフルタミド等の抗アンドロゲンと、これらの分子に既知の投与量で組み合わせることができる。処置される癌がホルモン非依存性癌である場合、対象は、あらかじめ抗ホルモン療法を受けていてもよく、癌がホルモン非依存性になった後に、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片（および場合によっては本明細書に記載される他の物質）を対象に投与してもよい。
【０１２４】
いくつかの状況においては、心保護薬（療法に関連する心筋障害を予防または低減するため）または１もしくは複数のサイトカインを対象に共投与することが有益であることがある。ＥＧＦＲ標的薬剤または血管新生阻害剤を共投与してもよい。上記の療法レジメンに加えて、対象は癌細胞の外科的除去および／または放射線療法を受けてもよい。
【０１２５】
本発明は、単に例示とする以下の方法および実施例を参照して、以下に説明する。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：液体製剤の開発
この実施例の目的は、抗体の凍結乾燥製剤の基礎として使用できる液体製剤における抗ＨＥＲ２抗体の安定性に影響を及ぼす主要な製剤化条件を決定することであった。
【０１２７】
一般的な材料および方法
抗ＨＥＲ２抗体をウェーブバイオリアクターにおいて生産し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥヘルスケア；www.gelifesciences.com）を用いてタンパク質Ａで捕捉した。カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００ｐｇ、１２０ｍｌ（ＧＥヘルスケア）をランニングバッファー（１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．５）とともに用いる調製用サイズ排斥クロマトグラフィーによって生産物を洗練した。賦形剤の添加前にＵＦＤＦにより生産物を５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。カラムＢａｋｅｒｂｏｎｄ  Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ  ＣＢＸ  ５μｍ  ４．６ｘ２５０ｍｍ、３００Ａ（ＪＴベイカー  ７１１４−００；www.jtbaker.nl）でＣＥＸ−ＨＰＬＣを行い、続けてカラムＢｉｏＳｅｐ  Ｓ３０００  ３００ｍｍｘ４．６ｍｍ、３００Ａ、分離範囲：５〜５００ｋＤａ（フェノメネッ
クス  ００Ｈ−２１４６−Ｅ０；www.phenomenex.com）を用いてＳＥＣ−ＨＰＬＣを行った。
【０１２８】
以下の化学物質を製剤スクリーニングに使用した：酢酸ナトリウム三水和物（メルク；www.merckmillipore.com）、酢酸（シグマ；www.sigmaaldrich.com）、クエン酸ナトリウム（シグマ）、硫酸アンモニウム（フルカ；www.sigmaaldrich.com）、塩化ナトリウム（メルク）、塩酸３７％（シグマ）および水酸化ナトリウム５０％（シグマ）。以下の賦形剤を製剤スクリーニングに使用した：Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ＶＷＲ；https://uk.vwr.com）、ソルビトール（シグマ）、ＰＥＧ８０００（シグマ）、グリセロール（ＶＷＲプロラボ）、スクロース（シグマ）、マンニトール（メルク）およびグリシン（メルク）、ならびにアミノ酸：グルタミン（フルカ）、プロリン（メルク）、ロイシン（メルク）、アスパラギン酸（メルク）、メチオニン（シグマ）およびヒスチジン（シグマ）。これらのスクリーニング中に使用される化学物質および賦形剤は、水酸化ナトリウム５０％溶液を除いてすべて薬局方等級（ＵＳまたはＥＰ）であり、非経口に適切である。緩衝液および賦形剤は使用前に０．２２μｍフィルターを通して濾過された。
【０１２９】
１．１：スクリーニング１
目的：試験された条件は：ｐＨ、緩衝液濃度、等張化剤濃度、界面活性剤濃度、アミノ酸およびポリオールである。
【０１３０】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに詳述されるように抗ＨＥＲ２抗体を調製した。抗ＨＥＲ２抗体の製剤化サンプルを、低温室にて５±３℃、２２±５℃（実験室温度、制御されていない温度）および細胞培養インキュベーター（Ｈｅｒａ
Ｃｅｌｌ  １５０、Ｔｈｅｒｍｏ（Ｒ−０２２）または同等物）にて３７±１℃でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌ濃縮抗ＨＥＲ２抗体サンプルのための緩衝液交換はＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア）で行った。製剤化条件は次の通りであった：ｐＨ５．００〜８．００、緩衝液濃度１０〜５０ｍＭ、アミノ酸濃度０〜２０ｇ／Ｌ、アミノ酸の種類（グルタミン、プロリン、ロイシン、アスパラギン酸）、スクロース０〜１０ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度０〜１５ｇ／ＬおよびＴｗｅｅｎ８０（商標）濃度０〜０．０１％
。試験する緩衝液は次の通りであった：酢酸塩、ｐＨ範囲３．７〜５．７；ヒスチジン、ｐＨ範囲５．０〜７．０；クエン酸塩、ｐＨ範囲５．４〜７．４およびリン酸塩、ｐＨ範囲６．２〜８．２。抗ＨＥＲ２抗体の最終容量は２１ｍｇ／ｍｌの目的濃度に到達するように調整した。
【０１３１】
手順：統計ソフトウェアＪＭＰ（商標）（ＳＡＳ）で設計した３２の製剤において、抗ＨＥＲ２抗体を目的濃度２１ｇ／Ｌで製剤化した。サンプルを３７±１℃で１か月間インキュベートし、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣにより分析した。実験アプローチの設計には統計ソフトウェアＪＭＰ（商標）を用いた。次頁の表１は、試験した緩衝液、ｐＨ範囲および緩衝液濃度を示す。
【０１３２】
結果：大部分のサンプルで断片化および凝集が視認できた；しかしながら、生産物の安定性に重要な影響を及ぼしたパラメーターはｐＨのみであった。ｐＨ５．００〜６．００、より好ましくは約ｐＨ５．５０のｐＨ範囲において、最大割合の非脱アミド化抗ＨＥＲ２抗体が得られた。このｐＨ範囲（ｐＨ５．００〜６．００）を本明細書で詳述されるさらなる実験で使用した。
【０１３３】
【表１】
2018199720.tif 000002
【０１３４】
１．２：スクリーニング２
目的：スクリーニング１で決定された最適なｐＨにおける生産物の安定化能について種々の賦形剤を試験した。
【０１３５】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに詳述されるように抗ＨＥＲ２抗体を調製した。抗ＨＥＲ２抗体の製剤化サンプルを、細胞培養インキュベーター、Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０、Ｔｈｅｒｍｏ（Ｒ−０２２）または同等物にて３７±１℃でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌ濃縮抗ＨＥＲ２抗体サンプルのための緩衝液交換はＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア）で行った。最終容量を２１ｍｇ／ｍｌの目的濃度に到達するように調整した。評価したパラメーターは：種々の濃度のアスパラギン、スク
ロース、ＰＥＧ８０００、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルタミン、エタノールおよびＴｗｅｅｎ８０（商標）であった。
【０１３６】
手順：抗ＨＥＲ２抗体を２１ｇ／Ｌまたは５０ｇ／Ｌの目的濃度で製剤化した。試験した製剤を次頁の表２に示す。種々の賦形剤の生産物の安定化能について試験した。サンプルに３７℃で１か月間、加速試験によるストレスをかけ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１３７】
結果：図１ａは、製剤の脱アミノ化率の変化が小さかったことを示す。０時間では、生産物の７５％が非脱アミド化形態であったが、３７℃で１か月後には、すべてのサンプルの３６％〜４３％が非脱アミド化形態であった。高濃度のＴｗｅｅｎ８０（商標）存在下または高塩濃度における高濃度抗ＨＥＲ２抗体の製剤が最も良好な脱アミド化の結果をもたらした。図１ｂ、ｃおよびｄは、最も低い脱アミド化をもたらす条件が、最も高い凝集レベルおよびまた抗体の可溶性の最も大きい消失をもたらした。結論として、極端な製剤組成物を使用することにより脱アミド化率を低い範囲に低減することが可能であった。これらは高濃度のタンパク質、塩および界面活性剤を含む。最も良い条件が非脱アミド化形態の６％の増加をもたらした；しかしながら、同一の条件が凝集および可溶性の重大な消失について最大の割合をもたらした。
【０１３８】
【表２】
2018199720.tif 000003
【０１３９】
１．３：スクリーニング３
目的：このスクリーニングの目的は、スクリーニング２に由来する最良のパラメーターを微調整することにより抗ＨＥＲ２抗体の脱アミド化を低減することであった。
【０１４０】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに詳述されるように抗ＨＥＲ２抗体を調製した。加速試験のために、製剤化された抗ＨＥＲ２抗体サンプルを細胞培養インキュベーター、Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０、Ｔｈｅｒｍｏ（Ｒ−０２２）または同等物にて３７±１℃でインキュベートした。試験したパラメーターは：ｐＨ４．００〜ｐＨ６．００、緩衝液の種類は酢酸塩またはクエン酸塩であり、塩濃度は１００ｍＭまたは２５０ｍＭのいずれかであった。条件は次頁の表３に詳述する。８４ｍｇ／ｍｌの出発サンプル濃度からＮａＣｌおよび緩衝液の濃縮溶液を添加し所望の濃度に到達させた。最終容量は抗ＨＥＲ２抗体の目的濃度が２１ｍｇ／ｍｌ、４２ｍｇ／ｍｌまたは６３ｍｇ／ｍｌに到達するように調整した。
【０１４１】
手順：抗ＨＥＲ２抗体を２１ｍｇ／ｍｌ、４２ｍｇ／ｍｌまたは６３ｍｇ／ｍｌの目的濃度で製剤化した。酸性ｐＫａを有する２種の緩衝液についてｐＨ４．００〜ｐＨ６．００の最適なｐＨ範囲における生産物の安定化能を評価した。サンプルに３７℃で、加速試験において、１か月間ストレスをかけ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１４２】
結果：前回のスクリーニングによれば、抗ＨＥＲ２抗体の安定性について最も良い結果は弱酸性ｐＨ値で得られることが観察された。脱アミド化は、より高い抗体濃度または塩濃度の存在下で大部分が阻害されるといえる。このスクリーニングでは、高い抗体濃度または塩濃度および弱酸性ｐＨで抗ＨＥＲ２抗体の製剤を評価した。０時間では、生産物の７５％が非脱アミド化形態であった。図２ａにおいて、ＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果は非脱アミド化形態の最大割合が４５％に低減されたことを示す。脱アミド化は非常に低いｐＨではより重要であり、最適ｐＨはｐＨ５．０〜ｐＨ６．０の範囲であることが見出された。低ｐＨでの脱アミド化の程度は、緩衝液がクエン酸塩ではなく酢酸塩である場合に低減された。高濃度（２５０ｍＭ）のＮａＣｌは低ｐＨ値での脱アミド化を低減させた。製剤中の抗ＨＥＲ２抗体の濃度を変更しても結果に影響を及ぼさなかった 。
【０１４３】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果（図２ｂ、ｃ、ｄおよびｅ）は、低ｐＨ値および高塩濃度で最大分解を示した。ｐＨ４．０およびｐＨ４．５では、単量体型の抗体が最少量であり、凝集が多く、断片化が多かった。これらの低ｐＨ分解は緩衝液が酢酸塩である場合により多く表れた。最も良い結果はｐＨ５．５およびｐＨ６．０で得られ、ここでは抗ＨＥＲ２抗体の安定化について酢酸塩とクエン酸塩とは同等であることが認められた。２５０ｍＭのＮａＣｌは１００ｍＭのＮａＣｌよりも低ｐＨ値でよりより分解をもたらした。抗ＨＥＲ２抗体の濃度は違いをもたらさなかった。
【０１４４】
【表３】
2018199720.tif 000004
【０１４５】
結論として、製剤に最も重要な影響を及ぼすパラメーターはサンプルのｐＨであった。最も安定なｐＨ範囲はｐＨ５．５およびｐＨ６．０の範囲で認められた。抗体濃度は脱アミド化に対し顕著な違いをもたらさなかった。
【０１４６】
１．４：スクリーニング４
目的：この工程の目的は、凍結乾燥製剤の基礎として使用できる最終液体製剤を定義する
ことであった。第一工程は、最良のパラメーターをこれらの最適な範囲に絞ることから構成されていた。第二工程は、抗ＨＥＲ２抗体液体製剤として単一最終組成物を選択するための統計ソフトウェアを用いた実験を設計することであった。
【０１４７】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに詳述されるように抗ＨＥＲ２抗体を調製した。加速試験のために、抗ＨＥＲ２抗体の製剤化サンプルを、低温室にて５±３℃、２２±５℃（実験室温度、制御されていない温度）および細胞培養インキュベーター、Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０、Ｔｈｅｒｍｏ（Ｒ−０２２）または同等物にて３７±１℃でインキュベートした。使用した統計ソフトウェアはＪＭＰ（商標）（ＳＡＳ）であった。
【０１４８】
手順：実験設計のためにパラメーターを絞るための予備スクリーニングを行った。緩衝液のスクリーニングは、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ中の抗ＨＥＲ２抗体を、ｐＨ５．５で以下の濃度：１．０、２．５、５．０、７．５、１０．０、１５．０および２０．０ｍＭで酢酸塩またはクエン酸塩を加えて透析することにより行った。最適な塩濃度は、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５．５）中の抗ＨＥＲ２抗体を、以下の濃度のＮａＣｌ：０、１０、５０、１００、２００、４００、６００、８００および１０００ｍＭを加えて透析することにより決定した。抗酸化剤であるメチオニンを、５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌに透析された抗ＨＥＲ２抗体において、１、４または８ｍＭの濃度で試験した。実験は統計的設計に従って行われた。統計ソフトウェアＪＭＰ（商標）において使用したパラメーター範囲は：ｐＨ５．５０〜ｐＨ６．２５、緩衝液濃度０〜２０ｍＭ、ＮａＣｌ濃度５０ｍＭ〜２５０ｍＭ、ポリオール（ソルビトール、グリセロール、またはなしのいずれか）、アミノ酸（プロリン、グリシン、またはなし）、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）０％または０．０１％、メチオニン０ｍＭまたは４ｍＭであった。実験アプローチの設計は以下の表４に示す。
【０１４９】
【表４】
2018199720.tif 000005
【０１５０】
結果：結果は図３および表５に示す。図３ａは、ＮａＣｌ濃度が２００ｍＭよりも高い場合に凝集および断片化が増加することを示す。図３ｂは、非脱アミド化形態の割合がＮａＣｌの０ｍＭ〜５０ｍＭで最も低く、また塩濃度に比例して増加したことを示す。図３ｃは、ｐＨ５．５で、酢酸緩衝液が断片と凝集をより少なくすることを示す。抗酸化剤であるメチオニンは抗ＨＥＲ２抗体の安定性に影響を及ぼさなかった。
【０１５１】
【表５】
2018199720.tif 000006
【０１５２】
よって、最終実験設計について、５０ｍＭ〜２５０ｍＭの範囲のＮａＣｌおよび１．０ｍＭ〜２０．０ｍＭの範囲の酢酸緩衝液を含めることを決めた。メチオニンの単一濃度はまた、４．０ｍＭの濃度で含まれる。
【０１５３】
抗ＨＥＲ２抗体の最終液体製剤組成物は、表４に示されるように統計ソフトウェアＪＭＰ（商標）を用いて実験において決定した。サンプルを３７℃で１か月間インキュベートし、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣにより分析した。結果は、単量体の割合、凝集の割合、生産物濃度（結果の掲載省略）について統計ソフトウェアに入力し、統計的有意差（Ｐ＜０．０５）を検出した。応答は、Ｒスクエアが１．００と質が優れており、帰無仮説の誤った棄却の可能性が小さく（Ｐ＜０．０５）、かつＲＭＳＥ値が小さかった。断片の応答はＲスクエアが０．９４であったが、ＲＭＳＥおよびＰ値は大きかった。断片の割合はいずれの緩衝液組成物に関しても統計的に有意な差はなかった。
【０１５４】
プロフィールの予測（結果の掲載省略）は、ポリオール、アミノ酸、メチオニンおよびＴｗｅｅｎ８０（商標）ではエラーバーが非常に大きく、結論が出せないことを示した。ｐＨ、緩衝液濃度および塩濃度は生産物の安定性に最大の影響を及ぼした。ｐＨは、最小限の凝集にはｐＨ５．９〜ｐＨ６．１の範囲が最適であるが、最小限の脱アミド化にはｐＨ５．５〜ｐＨ５．８が最適であった。低凝集のための最適なＮａＣｌ濃度は７５ｍＭ〜１７５ｍＭの範囲であり、最小限の脱アミド化には２００ｍＭ〜２２５ｍＭが最適であった。最小限の凝集について予測される最適な緩衝液濃度は、７．５ｍＭ〜１７．５ｍＭの範囲であり、最小限の脱アミド化には緩衝液濃度５ｍＭ未満が最適であった。要すると、脱アミド化を回避するのに最適な条件は、凝集を回避するのに最適な条件とは異なった。
【０１５５】
スクリーニング実験を通して、凝集レベルは脱アミド化レベルよりもはるかに低かった。３７℃、ｐＨ５．５での１か月の加速試験の後、上述のスクリーニングにおいて凝集は概して０．５％の範囲であったのに対し、脱アミド化形態は３０％増加した。最大の分解／脱アミド化を低減する条件で製剤化することを決めた。よって、最終組成物が４ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．７）と２１４ｍＭ  ＮａＣｌとを含有することを決めた。これらの条件は、抗ＨＥＲ２抗体の可溶性に好ましくないため、可溶化特性を有する賦形剤も含めることとし、最終組成物に２０ｇ／Ｌのプロリンを加えた。最後に、示されてはいないが、運搬の際に起こる機械的ストレスによる生産物の損失を回避するために、製剤中に界面活性剤が存在することが望ましいことが知られている（Ｍａｈｌｅｒ  Ｈ−Ｃら、（２００９）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９８（１２）：４５２５−３３）。スクリーニング実験を通して、低濃度のＴｗｅｅｎ８０（商標）は可溶性を改善し、生産物の完全性に悪影響を及ぼさなかった。よって、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０（商標）を最終組成物に加えた。
【０１５６】
抗ＨＥＲ２抗体の安定性に最も重要なパラメーターはｐＨであり、よって、酢酸緩衝液がクエン酸緩衝液よりも製剤に大きな安定性を付与することが示されたため（図３ｃ参照）、最終濃度として酢酸緩衝液を選択した。等張化剤および緩衝液の最適な濃度は最適な
ｐＨ範囲で検出された。アミノ酸についてはまた、抗ＨＥＲ２抗体に有用な可溶化特性を有するものを試験した。試験した界面活性剤については、低濃度では抗ＨＥＲ２抗体の安定性に悪影響を及ぼさず、よって、機械的ストレスに対する保護剤として最終組成物に含めることとした。最終組成物は表６に示す。
【０１５７】
【表６】
2018199720.tif 000007
【０１５８】
実施例２：凍結乾燥製剤の開発
実施例１で決定された 抗ＨＥＲ２抗体の液体製剤を、同一抗体の最適な凍結乾燥製剤
を開発するための出発点として使用した。製剤におけるこの抗ＨＥＲ２抗体の安定性のための最も重要なパラメーターはｐＨであることが実施例１のスクリーニングで明確に示された。酢酸ナトリウムの形態の酢酸緩衝液の使用がクエン酸緩衝液と比較して最適な結果をもたらすことが認められ、よって、酢酸緩衝液を最終液体製剤に含めた。凍結乾燥のための抗ＨＥＲ２抗体の製剤をさらに安定化させるためには凍結乾燥保護剤が必要とされた。本明細書で詳述するように、多種の凍結乾燥保護剤が利用可能であり、この実験の目的のためには、以下の凍結乾燥保護剤を初めに選択した：スクロース、マンニトール、グルコース、ソルビトールおよびラクトース。しかしながら、グルコース、ラクトースおよびソルビトールは還元糖であることが広く知られており、よって、これらの凍結乾燥保護剤をさらなる実験研究に選択しなかった。第一の実行に関し、抗ＨＥＲ２抗体凍結乾燥製剤のための凍結乾燥保護剤としてマンニトールを選択した。
【０１５９】
一般的な材料および方法
以下の化学物質を製剤スクリーニングに使用した：酢酸ナトリウム三水和物（メルク）、酢酸（シグマ）、塩酸３７％（シグマ）および水酸化ナトリウム５０％（シグマ）。以下の賦形剤を製剤スクリーニングに使用した：Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ＶＷＲ）、スクロース（シグマ）、マンニトール（メルク）およびグリシン（メルク）。スクロース（６００ｇ／ｌ）、グリシン（１３０ｇ／ｌ）、マンニトール（１５０ｇ／ｌ）およびＴｗｅｅｎ８０（商標）（１０％）のストック溶液を５．７５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．７）に調製した。ＨＣｌ  ３７％およびＮａＯＨはｐＨ調整に使用した。その後、所望の濃度を達成するために、製剤におけるストック溶液の希釈により賦形剤を抗ＨＥＲ２抗体製剤に加えた。緩衝液の明細は、ｐＨが５．７±０．１であり、電導度が０．４２〜０．６６ｍＳ／ｃｍであった。ＩＳＯ３６９６タイプＩＩ水を最初から最後まで使用した。この高度に精製された水は浸透膜およびオゾン殺菌システムを用いて社内で調製した（クリス
トアクア、スイス）。すべての化学物質および賦形剤は非経口投与に適切なものであった。緩衝液は使用前に０．２２μｍフィルターを通して濾過した。
【０１６０】
この試験に使用する抗ＨＥＲ２抗体試験材料をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥヘルスケア）を用いるタンパク質Ａアフィニティ―クロマトグラフィーを用いてまず精製した。タンパク質Ａの後の生産物の純度が高かったため（単量体含量＞９９％）、生産物のダイアフィルトレーションおよび濃縮の前にこれ以上精製工程を行わなかった。
【０１６１】
精製抗ＨＥＲ２抗体を５．７５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．７）中でタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により７〜１０回ダイアフィルトレーションし、その後５０〜６０ｇ／ｌに濃縮した。ＴＦＦ後、スクロース、グリシンおよびＴｗｅｅｎ８０（商標）を添加することにより抗ＨＥＲ２抗体を製剤化し、３０ｇ／ｌの最終緩衝組成物とした。分析試験に使用する参照標準材料はＤＲＳ−抗ＨＥＲ２抗体であり、−６０℃以下の温度で品質管理が維持された。
【０１６２】
凍結乾燥された薬剤生産物を調製するために、Ｔｅｌｓｔａｒ凍結乾燥系を用いた（Ｌｙｏｂｅｔａ  １５  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ；Ｔｅｌｓｔａｒ、Ｔｅｒｒａｓｓａ、スペイン）。ＶＰ６００  Ｖｏｅｔｓｃｈ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｖｏｅｔｓｃｈ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を、４０±２℃、５０±５％相対湿度試験での３か月試験、および２５±２℃、±５％相対湿度試験での１２か月試験に用いた。標準研究室冷蔵庫を５±３℃での３６か月安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）に用いた。
【０１６３】
使用するバイアルと栓の材料は臨床試験製品を意図するものであった。バイアルはＳｃｈｏｔｔから購入した２０ｍｌ  Ｆｉｏｌａｘ  ｃｌｅａｒ、ＵＳＰ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｇｌａｓｓ  ｖｉａｌｓ（Ａｒｔ．Ｎｏ：１１５６５２１）であり、栓はウェストファーマにより流通されるＦｌｕｒｏｔｅｃ（ｒｅｆ  ＦＤ２０ＴＴ３ＷＲＳ）であった。
【０１６４】
薬剤生産物の安定性は数種の試験を用いて決定し、薬剤生産物の経時的変化を評価した。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎａｘ、ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０４ｘ２５０ｍｍ）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＹＡＲＲＡ  ３ｕ  ＳＥＣ−３０００  ７．８ｘ３００ｍｍ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが生産物の破壊の高感度インジケーターである。サンプルが分解されやすい場合は、これらのアッセイを用いる薬剤生産物のプロフィールは経時的に変化するであろう。Ａ２８０アッセイは、生産物の破壊または容器壁への接着の指標となり得るタンパク質レベルの変化の検出に使用することができる。ＥＬＩＳＡ細胞ベースのアッセイおよびＥＬＩＳＡ結合アッセイは、生産物の変質の指標となるサンプルの能力の変化を用いて生産物の能力を決定するのに使用することができる。生産物の残留水分をカール・フィッシャーアッセイにより評価した。
【０１６５】
２．１：スクリーニング１
目的：抗体の安定性に対する凍結乾燥保護剤マンニトールの効果の 判定
【０１６６】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに従って製剤を調製した。このスクリーニングでは、異なる濃度のＴｗｅｅｎ８０（商標）とともにマンニトールを含有する２種の製剤を試験した。賦形剤、緩衝液および抗体は液体製剤中におけるよりも濃縮し（×１．４３）、１５０ｍｇ凍結乾燥産物／バイアル、かつ、わずか１ｃｍのケーク高を達成した。試験した製剤は：３０ｍｇ／ｍｌ抗ＨＥＲ２抗体、５．７６ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．７）、７２ｍｇ／ｍｌマンニトール、０．０１４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）；および３０ｍｇ／ｍｌ抗ＨＥＲ２抗体、５．７６ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．７）、７２ｍｇ／ｍｌマンニトール、０．０４３％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）であった。
【０１６７】
実行する凍結乾燥サイクルは以下の表７に詳述し、さらに、結晶化度を増加するアニーリング工程を含有した。
【０１６８】
【表７】
2018199720.tif 000008
【０１６９】
結果：精製後、出発生産物は９９．８％の単量体を含有した。第一の試験実行後、生産物は９８．０％の単量体（および２．０％の二量体）を含有し、単量体、二量体の割合については各製剤で違いは観察されなかった。よって、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）の濃度の違いは凍結乾燥製剤における単量体の割合に影響を与えなかった。結論として、第一の実行は、マンニトールは凍結保護効果が低い（単量体含量の減少）ことを示す。よって、凍結保護能力に基づいて賦形剤を選択するために次の凍結乾燥実行の前に凍結融解試験を行う。Ｔｗｅｅｎ濃度のわずかな効果を考慮し（ケークの再構成の間、凝集の形成を防止するはずである）、本試験では最も低いＴｗｅｅｎ８０（商標）濃度（０．０１４％）の使用継続を決めた。
【０１７０】
２．２：スクリーニング２
目的：ケーク外観と安定性との間の最適条件を決定するために、マンニトールおよびスクロースの種々の混合物を５回の凍結融解サイクルにわたり試験した。
【０１７１】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに従って製剤を調製した。試験した製剤は以下の表９に示し、これらを−４０℃および２５℃で５回の凍結融解サイクルに供した。その後、単量体の割合が最も高い製剤を、表７に詳述されるような凍結乾燥サイクルを用いる凍結乾燥のために選択した。凍結乾燥の後、ケークは再構成し、各製剤について単量体の割合を決定した。
【０１７２】
結果：５回の凍結融解サイクルの結果を図４に示す。製剤６、８、１０および１９は、凍結融解後に存在する単量体の割合が最も高かったことから、これらを凍結乾燥のために選択した。凍結乾燥後、製剤１０は最も良いケークの外観を示した（結果の掲載省略）。ケークの再構成後、単量体の割合を決定し、その結果を図５に示す。結論として、凍結乾燥
保護剤であるマンニトールおよびスクロースの組み合わせは、抗ＨＥＲ２抗体の凍結乾燥製剤に良好な安定性を与えた；しかしながら、凍結乾燥製剤はケークの外観が劣っていた。これらの結果よりも改善された製剤安定性について試験するために、より高い濃度のスクロースについて試験することにした。さらに、ケーク外観を改善するために、充填剤であるグリシンを製剤に添加することについて試験することに決めた。
【０１７３】
【表８】
2018199720.tif 000009
【０１７４】
２．３：スクリーニング３
目的：スクリーニング２に由来する４％マンニトールおよび６％スクロースを含んでなる好ましい製剤の水分およびケーク外観を決定すること、また、より高濃度の両方の凍結乾燥保護剤について試験し、ケーク外観を改善できるか否かを立証すること。加えて、製剤の安定性に対するマンニトールおよびグリシンの混合物の効果を試験した。
【０１７５】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに従って製剤を調製した。試験した製剤は以下の表９に示し、これらを表７中のパラメーターに従う凍結乾燥に供した。
【０１７６】
【表９】
2018199720.tif 000010
【０１７７】
結果：試験した各製剤についての水分割合およびケーク外観は以下の表１０に記載する。製剤１、２および７は良好なケーク外観を示した；しかしながら、製剤2は水分含量が最
も高かった。スクロースのみ含有する製剤３〜６は、１０および１２％のより高いスクロース濃度では低減されるが（データの掲載省略）、縮んだりひび割れたりするケーク外観であった。
【０１７８】
【表１０】
2018199720.tif 000011
【０１７９】
２．４：スクリーニング４
目的：このスクリーニングの目的は賦形剤としてマンニトール、グリシンおよびＴｗｅｅｎ８０（商標）を含有する抗ＨＥＲ２抗体の製剤の安定性を決定することであった。製剤をまず凍結融解の５サイクルに供し、最も安定な製剤をさらなる凍結乾燥のために選択した。
【０１８０】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに従って製剤を調製した。試験した製剤は以下の表１１に示し、これらを−４０℃および２５℃で５回の凍結融解サイクルに供した。
【０１８１】
【表１１】
2018199720.tif 000012
【０１８２】
結果：試験した抗ＨＥＲ２抗体の１２の製剤の５回の凍結融解サイクルにおける安定性を、存在する単量体の割合として図６に示す。試験の期間中、マンニトール：グリシンの比率が抗ＨＥＲ２抗体の安定化に重要であることが観察された。使用したマンニトール：グリシンの比率が凍結融解の５サイクルの前後で製剤の安定性にほとんど影響を与えなかったので、製剤１、４、７、１０および１１をさらなる凍結乾燥のために選択した。
【０１８３】
２．５：スクリーニング５
目的：スクリーニング４において凍結融解サイクルに供したマンニトール／グリシン製剤で初期の良好な安定性結果が観察されたことから、凍結乾燥サイクルにおいて選択したマンニトール／グリシン製剤と並行して、スクロース／グリシンの混合物製剤と高濃度スクロース製剤を試験することに決めた。
【０１８４】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに従って製剤を調製した。試験した製剤は以下の表１２に示し、これらを表７中のパラメーターに従う凍結乾燥に供した。
【０１８５】
【表１２】
2018199720.tif 000013
【０１８６】
結果：凍結融解の５サイクルで試験した抗ＨＥＲ２抗体の１２の製剤の安定性を、存在する単量体の割合として図７に示す。ケーク外観も評価し（結果は掲載省略）、最も良い安定性およびケーク外観を示した７つの製剤４、８、１０、１２、１５〜１７を４０℃での１か月間安定性試験に選択した。
【０１８７】
２．５：スクリーニング６
目的：７つの凍結乾燥された抗ＨＥＲ２抗体製剤の４０℃で１か月間の安定性の判定。
【０１８８】
材料および方法：上記の一般的な材料および方法のセクションに従って製剤を調製した。表１３に列挙される賦形剤を含有する７つの製剤を、表１４に示されるパラメーターに従う凍結乾燥サイクルに供した。
【０１８９】
【表１３】
2018199720.tif 000014
【０１９０】
【表１４】
2018199720.tif 000015
【０１９１】
結果：４０℃で１か月間の安定性試験の結果は、図８ａ、８ｂおよび８ｃに示される通りである。製剤１〜４は１か月後、単量体の高い割合（図８ａ）と、類似したＣＥＸプロフィール（図８ｂ）とを示した。凍結乾燥されたケークで測定された水分の割合は製剤１〜４で最も低いことが示された。これらの結果に基づいて、製剤２および４をさらなるスクリーニングに用いるために選択した。
【０１９２】
２．７：スクリーニング７
目的：凍結乾燥サイクルを最適化し、二次乾燥において観察されるひび割れや縮みを低減することによりケーク外観を改善すること。
【０１９３】
材料および方法：製剤２および４はスクリーニング６から選択し、崩壊温度（Ｔｇ’）を決定するためにこれらをＴｅｌｓｔａｒ（Ｔｅｒｒａｓｓａ、スペイン）に送った。
【０１９４】
凍結乾燥サイクルの二次乾燥工程は、ケーク外観を改善し、ケーク中の水分割合を低減するために検討された。二次乾燥工程の速度を落とす２つの新しい凍結乾燥プロトコールを試験した。表１４を参照し、２つの二次乾燥工程についての時間を、１サイクルにおいて５および２４時間から１５および９時間にそれぞれ変更し、第二のサイクルにおいて５および２４時間から２０および４時間にそれぞれ変更したが、二次乾燥工程を通じて０．１ｍｂａｒｓの減圧を維持した。
【０１９５】
結果：試験した２つの製剤の崩壊温度を製剤の組成とともに以下の表１５に示す。両製剤は非常に類似した崩壊温度を有すると考えられた。
【０１９６】
【表１５】
2018199720.tif 000016
【０１９７】
１５および９時間の二次乾燥工程での凍結乾燥の後、水分含量は、製剤１については０．９４％、製剤２については１．１９％と決定された。２０および４時間の二次乾燥工程での凍結乾燥の後、水分含量は、製剤１については１．２０％、製剤２については１．７０％と決定された。
【０１９８】
２．８：スクリーニング８
目的：選択した２つの抗ＨＥＲ２抗体凍結乾燥製剤の４０℃で１か月間の安定性を判定すること。この試験は、上記セクション２．７に記載される凍結乾燥サイクルにおける変化が繰り返される以外は、スクリーニング６についてセクション２．６に記載される１か月安定性試験と同一である。
【０１９９】
材料および方法: 製剤１および２の組成を以下の表１６に示す。両製剤を以下の表１７に示される凍結乾燥サイクル（二次乾燥時間が２０および４時間に選択される）に供した。４０℃で１および２か月保存した後、サンプルをＳＥＣおよびＣＥＸにより分析した。
【０２００】
【表１６】
2018199720.tif 000017
【０２０１】
【表１７】
2018199720.tif 000018
【０２０２】
結果：ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより測定した、１および２か月後の両候補製剤における単量体の割合は図９ａに示される通りである。ＨＰＬＣ−ＣＥＸの結果を図９ｂに示す。０時間では、液体および凍結乾燥製剤に関し、製剤１および２についての安定性にはほとんど差異がなかった。４０℃で１か月の保存後、ＨＰＬＣ−ＣＥＸでは製剤間に違いはなかった；しかしながら、図９ａによれば、ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより示されるように小さな違いがある。２か月の保存後、製剤２は製剤１よりも安定であることが図９ａおよび９ｂの双方から明らかに分かる。その後、長期安定性試験に進めるために製剤２を選択した。
【０２０３】
実施例３：長期安定性試験  
目的：この安定性試験の目的は、５±３℃での意図される保存、２５±２℃での加速試験および４０±２℃でのストレス試験について、３０ｇ／Ｌの目的濃度の凍結乾燥された抗ＨＥＲ２抗体製剤の安定性を決定することであった。凍結乾燥された抗ＨＥＲ２抗体製剤の安定性は、５±３℃で３６か月間、２５±２℃で１２か月間および４０±２℃で３か月間フォローする。
【０２０４】
材料および方法：製剤緩衝液は５．７５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．７）（メルク）、１２％スクロース（シグマ）、１％グリシン（メルク）および０．０１４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ＶＷＲ）であった。塩酸３７％（シグマ）をｐＨ調整に用いた。緩衝液の明細は、ｐＨが５．７±０．１であり、電導度が０．４２〜０．６６ｍＳ／ｃｍであった。すべての化学物質は非経口投与に適切なものであった。緩衝液はその後０．２２μｍフィルターを通してバッグに濾過した。
【０２０５】
賦形剤の３つのファミリー、凍結乾燥保護剤（スクロース）、充填剤（グリシン）および界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））のストック溶液は、５．７５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．７）に調製した。スクロース、グリシンおよびＴｗｅｅｎ８０（商標）のストック溶液は、６００ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌおよび１００ｇ／Ｌの濃度でそれぞれ調製した。その後、所望の濃度を達成するために、製剤におけるストック溶液の希釈により賦形剤を抗ＨＥＲ２抗体製剤に加えた。
【０２０６】
精製抗ＨＥＲ２抗体を５．７５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．７）においてタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により７〜１０回ダイアフィルトレーションし、その後５０〜５５ｇ／Ｌに濃縮した。ＴＦＦ後、スクロース、グリシンおよびＴｗｅｅｎ８０（商標）を添加することにより抗ＨＥＲ２抗体を製剤化し、最終緩衝組成物とした。使用した参照標準は分析試験に使用するためのＤＲＳ−抗ＨＥＲ２抗体−０１であり、−６０℃以下の温度で品質管理が維持された。
【０２０７】
凍結乾燥された薬剤生産物を調製するために、Ｔｅｌｓｔａｒ凍結乾燥系を用いた（Ｌｙｏｂｅｔａ  １５  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ；Ｔｅｌｓｔａｒ、Ｔｅｒｒａｓｓａ、スペイン）。ＶＰ６００  Ｖｏｅｔｓｃｈ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｖｏｅｔｓｃｈ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を、４０±２℃、±５％相対湿度試験での３か月試験、およびまた２５±２℃，±５％相対湿度試験での１２か月試験に用いた。標準研究室冷蔵庫を５±３℃での３６か月安定に用いた。
【０２０８】
使用するバイアルと栓の材料は臨床試験製品を意図するものであった。バイアルはＳｃｈｏｔｔから購入した２０ｍｌ  Ｆｉｏｌａｘ  ｃｌｅａｒ、ＵＳＰ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｇｌａｓｓ  ｖｉａｌｓ（Ａｒｔ．Ｎｏ：１１５６５２１）であり、栓はウェストファーマにより流通されるＦｌｕｒｏｔｅｃ（ｒｅｆ  ＦＤ２０ＴＴ３ＷＲＳ）であった。すべてのバイアルは圧着された。
【０２０９】
製剤化した抗ＨＥＲ２抗体を、２０ｍｌのＳｃｈｏｔｔバイアルに５ｍｌ／バイアルの容量で分取した。全体で６２のバイアルを調製した。棚の残りはプラセボバイアルで満たした。バイアルを以下の表１８に示されるパラメーターに従って凍結乾燥した。
【０２１０】
【表１８】
2018199720.tif 000019
【０２１１】
薬剤生産物の安定性は数種の試験を用いて決定し、薬剤生産物の経時的変化を評価した。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎａｘ、ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０４ｘ２５０ｍｍ）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＹＡＲＲＡ  ３ｕ  ＳＥＣ−３０００  ７．８
ｘ３００ｍｍ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが生産物の破壊の高感度インジケーターである。サンプルが分解されやすい場合は、これらのアッセイを用いる薬剤生産物のプロフィールは経時的に変化するであろう。Ａ２８０アッセイは、生産物の破壊または容器壁への接着の指標となり得るタンパク質レベルの変化の検出に使用することができる。ＥＬＩＳＡ細胞ベースのアッセイおよびＥＬＩＳＡ結合アッセイは、生産物の能力の決定に使用することができる。サンプルの能力の時間による変化は生産物の変質の指標となる。ｐＨ安定性を決定するために製剤のｐＨを経時的に確認し、溶液の物理的外観も監視する。ケーク溶解後のサブビジブル粒子の存在または不存在もまた確認する。生産物の水分の任意の変動を監視する。これは凍結乾燥された生産物の分解への感受性を増加させることができ、カール・フィッシャー滴定により確認する。最後に、再構成時間を測定し、凍結乾燥された生産物ケークの完全溶解時間を決定するのに使用する。温度５℃、２５℃および４０℃について、各時点で、これらのパラメーターを以下の表１９に示される基準に従って評価する。
【０２１２】
【表１９】
2018199720.tif 000020
【０２１３】
結果：ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより測定した、１２か月後の凍結乾燥された抗ＨＥＲ２抗体製剤における単量体の割合を図１０ａに示す。この図は、試験したすべての時点およびすべての温度で製剤サンプルにおける単量体の割合に差異がなかったことを示す。１２か月間のＨＰＬＣ−ＣＥＸの結果を図１０ｂに示す。グラフのｙ軸で使用した大縮尺は、製剤サンプル間の安定性に大きな違いがあるという印象を与える（特に４０℃および後の時点）；しかしながら、実際には多くてもおよそ１．５％というわずかな違いであり、製剤は１２か月試験の期間安定であると考えられた。試験した他のパラメーターについての結果は
以下の表２０に要約し、各評価パラメーターの明細を満たしているか否かを示す。
【０２１４】
試験したパラメーターの大部分について、試験した抗ＨＥＲ２抗体製剤は、１２か月を含むそれまでに試験したすべての温度および時点で、表１９で示される明細の範囲内であることが認められた。生産物の破壊または容器壁への接着の指標となり得るタンパク質レベルの変化の検出に使用することができるＡ２８０アッセイについて、最初の評価明細の≧２０および≦２４ｍｇ／ｍｌは誤って計算された。安定性試験の開始時、Ａ２８０アッセイについての結果は実際には１８ｍｇ／ｍｌであり（すでに評価明細外）、この数字は試験を通じて依然として変わらず、実際には生産物の破壊も容器壁への接着もなかったことを示す。ｐＨの評価について、ｐＨの明細は≧５．６および≦５．８に設定された。６か月の時点、５℃および２５℃での読み取りについて、ｐＨ値の記録は５．８６５であり、わずか部分的に設定されたｐＨ範囲外であった。試験した他のすべての時点および温度ではｐＨ明細は設定された範囲内であった。
【０２１５】
結論として、１２か月にわたるこの安定性試験は、本発明の抗ＨＥＲ２抗体製剤が安定性の評価パラメーターの大部分を満たし、よって、長期安定性試験の残りの期間も安定であることが期待できることを示した。
【表２０】
2018199720.tif 000021
【図１ａ】
2018199720.tif 000022
【図１ｂ】
2018199720.tif 000023
【図１ｃ】
2018199720.tif 000024
【図１ｄ】
2018199720.tif 000025
【図２ａ】
2018199720.tif 000026
【図２ｂ】
2018199720.tif 000027
【図２ｃ】
2018199720.tif 000028
【図２ｄ】
2018199720.tif 000029
【図２ｅ】
2018199720.tif 000030
【図３ａ】
2018199720.tif 000031
【図３ｂ】
2018199720.tif 000032
【図３ｃ】
2018199720.tif 000033
【図４】
2018199720.tif 000034
【図５】
2018199720.tif 000035
【図６】
2018199720.tif 000036
【図７】
2018199720.tif 000037
【図８ａ】
2018199720.tif 000038
【図８ｂ】
2018199720.tif 000039
【図８ｃ】
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【図９ａ】
2018199720.tif 000041
【図９ｂ】
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【図１０ａ】
2018199720.tif 000043
【図１０ｂ】
2018199720.tif 000044
【配列表】
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