(57)【要約】【課題】本発明は、循環多発性骨髄腫細胞を単離する方法、及び異常な形質細胞の疾病を有する疑いのある患者を治療する方法に関する。【解決手段】循環多発性骨髄腫細胞を捕獲、単離、及び分析する方法であって、（ａ）被験者から血液試料を入手する工程と、（ｂ）前記試料を、第１のリガンドとコンジュゲートされたコロイド状磁性粒子と接触させる工程と、（ｃ）磁性粒子と結合した循環多発性骨髄腫細胞の分離された分画を産生するために、前記工程（ｂ）の試料を磁場にさらす工程と、（ｄ）第１の追加的マーカーで前記工程（ｃ）の試料を処置する工程と、（ｅ）循環多発性骨髄腫細胞を分析する工程と、を含む。【選択図】図１
2018100978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環多発性骨髄腫細胞を捕獲、単離、及び分析する方法であって、
（ａ）被験者から血液試料を入手する工程と、
（ｂ）前記試料を、第１のリガンドとコンジュゲートされたコロイド状磁性粒子と接触させる工程と、
（ｃ）磁性粒子と結合した循環多発性骨髄腫細胞の分離された分画を産生するために、前記工程（ｂ）の試料を磁場にさらす工程と、
（ｄ）第１の追加的マーカーで前記工程（ｃ）の試料を処置する工程と、
（ｅ）循環多発性骨髄腫細胞を分析する工程と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この非仮出願は、２０１１年７月２１日付で出願された米国仮特許出願第６１／５１０，１７０号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫（骨髄腫又は形質細胞性骨髄腫としても知られる）は、形質細胞の進行性血液癌である。その状態は、骨髄中の形質細胞の過剰な数、及び無傷のモノクローナル免疫グロブリン又は遊離モノクローナル軽鎖の過剰産生を特徴とする。
【０００３】
当該疾病の臨床的な診断、ステージの決定、及び治療は、血清及び／又は尿中のモノクローナル（又は骨髄腫）タンパク質（Ｍタンパク質）の量に基づく骨髄腫腫瘍細胞塊、並びにヘモグロビン及び血清カルシウムの濃度、骨格調査に基づく溶解性骨病変の数、並びに腎不全の存在又は不在を含む種々のパラメータに基づいて行われる。その状態を特徴付けるための追加的なアプローチとしては、骨髄検査で１０パーセント（１０％）超の形質細胞の検出、軟組織形質細胞腫の存在、及び遊離κ及びλ血清免疫グロブリン軽鎖の検出が挙げられる。骨髄検査は、標準的な組織学及び免疫組織化学技術を用いて行われる。予後を決定するために骨髄試料の追加的な細胞遺伝学が実施される場合がある。侵襲的な性質のために臨床的に指示された場合の経過観察調査は、化学的評価及び骨髄評価からなる。
【０００４】
現在、疾病の特徴付け、正常な形質細胞からの腫瘍性形質細胞疾病の区別、及び微小残存病変の検出のツールとして、骨髄のフローサイトメトリー分析の評価が行われている。しかしながら、このアプローチは引き続き侵襲的手技に依存している。当該疾病を、その全病歴を通じて検出、モニタリング、及び特徴付けるための、より侵襲性の低い技術を開発する大きな必要性があり、血中におけるこれらの細胞の存在は、その機会を提供する可能性がある。
【０００５】
加えて、より正確なリスク評価のための、並びに不特定の意義を持つ単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）及びくすぶり型多発性骨髄腫を含む疾病の早期ステージにおける疾病の進行のモニタリングのための、より高感度のツールを開発する必要がある。疾病の早期ステージに循環形質細胞が検出される場合があり、それが予後と相関し得ることを一部の研究データは示唆しており、疾病の早期ステージにこれらの細胞を捕獲し、計数し、特徴付けるための標準的方法の使用を裏付けている。
【０００６】
特にフローサイトメトリーによる異常形質細胞の同定に関する文献（Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ａｎｄｙ  Ｃ．Ｒａｗｓｔｒｏｎら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００８；９３（３））における一般的コンセンサスには、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、及びＣＤ４５によって主に構成されるいくつかの重要なバイオマーカーが含まれている。ＣＤ１９及びＣＤ５６のような追加的バイオマーカーもまた、診断における有用性が実証されている。
【０００７】
本発明は、循環骨髄腫細胞を調査することにより、異常な循環形質細胞の捕獲及び検出（微小な残存疾患の検出を含む）の両方にこれらの特定のバイオマーカーを単独で、あるいは１つ若しくは２つ以上の追加的バイオマーカー又はＦＩＳＨとの併用で使用できるかどうかを評価する。ＦＩＳＨは、多発性骨髄腫に特徴的な数々の細胞遺伝学的異常の検出に使用することができる。ＩＧＨ遺伝子座ｔ（４；１４）での転座、及びｐ５３遺伝子座、デル（１７ｐ）での欠失は、多発性骨髄腫における無イベント生存及び全生存に関する予後のための価値を有することが示されている。（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ：Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｎｔｅｒＧｒｏｕｐｅ  Ｆｒａｎｃｏｐｈｏｎｅ  ｄｕ  Ｍｙｅｌｏｍｅ、Ｈｅｒｖｅ  Ａｖｅｔ−Ｌｏｉｓｅａｕら、Ｂｌｏｏｄ，２００７；１０９：３４８９〜３４９５）。これらのプローブ及び他のいくつかの多発性骨髄腫マーカーは、Ｐｏｓｅｉｄｏｎカタログで使用可能であり、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）プラットフォームで応用することができる。
【０００８】
ＣＤ１３８磁性粒子を用いた免疫磁気選択キットが市販されている。Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、骨髄及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ１３８陽性細胞を選択することができるＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１３８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを有しており、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈは、骨髄、ＰＢＭＣ、及び全血からＣＤ１３８陽性細胞を選択するためのＣＤ１３８  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄを有する。収集した試料の解析は、通常、フローサイトメトリーを使用して行われる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載される本発明は、循環形質細胞（ＣＰＣ）及び異常形質細胞又は多発性骨髄腫細胞（「ＣＭＭＣ」）の捕獲及び検出（抹消血からの微小な残存疾患の検出を含む）方法からなる。本発明は、当該疾病をその全病歴を通じて検出、モニタリング、及び特徴付けるために、ミリリットル体積の血液試料中の非常に低いＣＭＭＣ数値を検出する非侵襲的手段を提供し、かつ、リスクをより正確に評価するためのより感度の高いツール、並びに不特定の意義を有する単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）及びくすぶり型多発性骨髄腫を含む疾病の早期ステージにおける循環形質細胞の検出を含む、疾病の早期ステージにおける疾病の進行のモニタリングを提供する。抹消血からこれらの循環形質細胞を捕獲及び特徴付けることは、多発性骨髄腫患者の管理のための新規なバイオマーカーを提供することが可能である。
【００１０】
血液は、細胞の劣化を最小限に抑えながら血液の輸送及び貯蔵を可能にする保存剤を含有するＣｅｌｌＳａｖｅチューブに収集される。細胞は、形質細胞上に存在する細胞表面マーカーであるシンデカン−１又はＣＤ１３８とコンジュゲートされたコロイド磁性粒子を使用して捕獲される。細胞が捕獲されたら、バックグラウンドの汚染白血球（白血球）から多発性骨髄腫細胞を差別化するために、ＣＤ３８−ＰＥ（フィコエリトリン）、ＣＤ１９及びＣＤ４５−ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、並びにＣＤ５６−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）を追加的細胞マーカーとして、それらを標識する。磁性流体と細胞マーカー試薬は全て、新しいＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＭＭＣサービスキットの一部である。このキットは７つの構成要素で構成されており、うち４つはＣｅｌｌｓｅａｒｃｈ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌキットに含まれている試薬と同じである。これらの共通の４種類の試薬は、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｍ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｙｅ、及びＣｅｌｌＦｉｘである。新たな３種類の試薬は、ＣＤ１３８  Ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄと、ＣＤ３８−ＰＥ、ＣＤ１９及びＣＤ４５−ＡＰＣからなる染色試薬と、ＣＤ５６−ＦＩＴＣからなる別のマーカー染色試薬で構成される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】特定の細胞株とのＣＤ  １３８抗体の反応性を示す。
【図２】特定の細胞株とのＣＤ  ３８抗体の反応性を示す。
【図３】ＰＢＭＣ上で試験した異なるＣＤ１９  ＡＰＣ抗体の反応性を示す。
【図４】様々な希釈でのＣＤ  １９  ＡＰＣの染色を示す。
【図５】ＰＢＭＣ上のＣＤ  ５６抗体の染色を示す。
【図６】様々な細胞株上でのＣＤ  ５６の染色を示す。
【図７】ＣＤ  ５６なしでの染色を示す。
【図８】希釈での細胞株のＣＤ  ５６  ＦＩＴＣの染色を示す。
【図９】希釈での細胞株のＣＤ  ５６  ＦＩＴＣの染色を示す。
【図１０】希釈での細胞株のＣＤ  ５６  ＦＩＴＣの染色を示す。
【図１１】ＭＭ  １Ｓ細胞からの代表的な画像を示す。
【図１２】Ｈ９２９細胞からの代表的な画像を示す。
【図１３】キャリーオーバー白血球の代表的な画像を示す。
【図１４】患者試料の画像を示す。
【図１５】患者試料の画像を示す。
【図１６】患者試料の画像を示す。
【図１７】患者試料の画像を示す。
【図１８】正常ドナーからの画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、循環多発性骨髄腫細胞を捕獲、単離、及び分析する方法を含み、
（ａ）被験者から血液試料を入手する工程と、
（ｂ）前記試料を、第１のリガンドとコンジュゲートされたコロイド状磁性粒子と接触させる工程と、
（ｃ）磁性粒子と結合した循環多発性骨髄腫細胞の分離された分画を産生するために、工程（ｂ）の試料を磁場にさらす工程と、
（ｄ）第１の追加的マーカーで工程（ｃ）の試料を処置する工程と、
（ｅ）循環多発性骨髄腫細胞を分析する工程と、を含む。
【００１３】
本明細書で使用するとき、「試料」という用語は、好ましくは体積測定値として表される血液の量を指す。血液試料の好ましい体積は、約２ｍＬ〜約１０ｍＬ、より好ましくは３〜７．５ｍＬ、最も好ましくは４ｍＬである。「コロイド状磁性粒子」という用語は、金属又は有機金属の粒子を指す。かかる粒子の例は、米国特許第５，５９７，５３１号、同第５，６９８，２７１号、同第５，６９８，２７１号、同第６，３６５，６６２号に開示されており、それらの全容（特に、かかるコロイド状磁性粒子の説明）は参考として本明細書に組み込まれる。それらは、所望により、例えばウシ血清アルブミン及びカゼインなどの、好ましくは生物由来のポリマーであるポリマーでコーティングすることができる。
【００１４】
「リガンド」という用語は、ＣＭＭＣの細胞関連マーカー又は循環形質細胞（「ＣＰＣ」）と結合するタンパク質を指す。好ましいタンパク質は抗体であり、好ましくは抗ＣＤ  １３８、抗−ＣＤ  ３８、及び抗ＣＤ  ５６であり、より好ましくは抗ＣＤ  １３８、及び抗−ＣＤ  ３８、更により好ましくは抗ＣＤ−１３８である。かかるリガンドは、第６，３６５，６６２号に開示されている方法とほぼ同様の方法によって、コロイド状磁性粒子とコンジュゲートされ得る。本発明の工程（ｂ）において２つ又は３つ以上のリガンドを使用してもよく、少なくとも２つのリガンドをこの工程に使用することが好ましい。
【００１５】
用語「磁場」は、多くの方法のいずれかによって製造することができ、具体的には、実質的に米国特許第７，９０１，９５０号に記載されているものである、２つの磁気分離器による方法である場合があり、当該特許の全容は参考として本明細書に組み込まれる。用語「追加的マーカー」は、ＣＭＭＣに特定の、又はＣＭＭＣを除く、細胞と関連付けられるタンパク質を意味する。かかるタンパク質としては、非限定的に、抗−ＣＤ３８抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ４５抗ＣＤ  １３８、抗ＣＤ  ５６、抗λ、抗κ抗ＣＤ  ２００、抗Ｋｉ６７からなる群から選択される抗体が含まれる。そのような抗体を、例えばフィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート、及びアロフィコシアニンなどの指標で標識することが可能であり、それらは、１つ又は２つ以上のマーカーで標識されていることが好ましい。追加的マーカーは、例えば、ＤＡＰＩなどの核酸染料を含むことができる。好ましい追加的マーカーは、抗−ＣＤ３８、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ４５からなる群から選択され、特に好ましい追加的マーカーは抗ＣＤ３８である。２つ又は３つ以上の追加的マーカーを、本発明の工程（ｄ）で使用することができ、好ましくは、少なくとも２つの追加的マーカーが使用され、より好ましくは、３つの追加的マーカー、最も好ましくは４つの追加的マーカーが使用される。
【００１６】
用語「分析する」は、試料がＣＭＭＣ又はＣＰＣの１個又は２個以上を含有するかどうかを決定するために、磁性により捕獲した試料を評価することを意味する。そのような同定は、磁性により捕獲した試料の蛍光の程度を決定するために、目視又は電子的に行うことができる。そのような分析方法は、本明細書に参考として組み込まれる米国特許第７，０１１，７９４号に開示されている。具体的には、磁性により捕獲した試料のうち、ＣＤ３８に関して陽性かつＣＤ１９及びＣＤ４５に関して陰性のものがＣＭＭＣとして同定される。
【００１７】
本発明は、患者が異常な形質細胞と関連付けられる疾病の治療的介入の候補である可能性が高い患者かどうかを決定する方法を含み、
（ａ）試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｂ）前記試料に存在するＣＭＭＣ細胞の数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、を含む。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「試料」は、前述の意味及び好ましい範囲を有する。用語「処理する」は、ＣＭＭＣを単離及び同定するために、本明細書に記載の方法によって患者の血液試料を処置することを意味する。
【００１９】
用語「治療的介入」は、異常な血漿レベルに関連付けられる疾病の処置のための任意の医療的介入を求めること又は得ることである。そのような疾病としては、非限定的に、多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ、及びくすぶり型多発性骨髄腫が挙げられる。そのような治療的介入としては、非限定的に、医師を訪問すること、放射線などの治療処置を得ること、異常な血漿レベルに関連付けられる任意の疾病を処置する治療薬で治療すること、及びそのような治療的処置の効果をモニタリングすることが挙げられる。例えば、患者が薬剤で処置される場合は、処置のコースの間に患者のＣＭＭＣレベルを評価して、その薬剤が作用しているかどうかを決定することができる。そのような薬剤としては、非限定的に、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ボルテゾミブ、メルファラン、ゾメタ、アロキシ、レナリドマイド、ドキソルビシンなどが挙げられる。
【００２０】
用語「正常範囲」は、異常な形質細胞に関連付けられる疾病を有していない試料母集団に存在するＣＭＭＣ細胞の数を意味する。好ましくは、正常範囲は、約３ｍＬ〜約７．５ｍＬの血液試料中にＣＭＭＣが７個未満である。用語「正常範囲を超える」は、この正常範囲を超えるＣＭＭＣの数である。この数が高いほど、患者が異常な形質細胞と関連付けられる疾病のいずれか１つを有する可能性が高い。患者が、血液試料中に８〜２０個のＣＭＭＣを有する場合、そのような患者は、異常な形質細胞に関連する疾病の１つを有する確率がより高い。患者が２１〜４９個のＣＭＭＣを有する場合、その患者は高いレベルを有しており、異常な形質細胞に関連する疾病の１つを有する可能性がより高い。患者が５０〜数万個のＣＭＭＣを有する場合、その患者は非常に高いレベルを有しており、そのような疾病の１つを有する可能性が更に高い。
【００２１】
また更に、本発明は、治療的介入が進行中の患者のＣＭＭＣの数が減少しているかどうかを決定する方法を含み、この方法は、
（ａ）第１の時点における試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｂ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、
（ｃ）第２の時点における試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｄ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、
（ｅ）工程（ｂ）での数と工程（ｄ）での数とを比較する工程と、を含む。
【００２２】
上記に定義した用語の全ては、同じ意味及び好ましい範囲を有する。
【００２３】
更にまた、本発明は、異常な形質細胞の疾病のあった患者で、そのような疾病の治療に成功した患者が、寛解のまま留まっているかどうかを決定する方法を含み、この方法は、
（ａ）第１の時点における試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｂ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、
（ｃ）第２の時点における試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｄ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、
（ｅ）工程（ｂ）での数と工程（ｄ）での数とを比較する工程と、を含む。
【００２４】
上記に定義した用語の全ては、同じ意味及び好ましい範囲を有する。
【００２５】
また更に、本発明は、コロイド状磁性粒子及び少なくとも１つのリガンドを含む、循環多発性骨髄腫細胞を捕獲するための試薬を含む。
【００２６】
上記に定義した用語の全ては、同じ意味及び好ましい範囲を有する。
【００２７】
また更に、本発明は、循環形質細胞を捕獲、単離、及び分析する方法を含み、
（ａ）被験者から血液試料を入手する工程と、
（ｂ）前記試料を、第１のリガンドとコンジュゲートされたコロイド状磁性粒子と接触させる工程と、
（ｃ）磁性粒子と結合した循環多発性骨髄腫細胞の分離された分画を産生するために、工程（ｂ）の試料を磁場にさらす工程と、
（ｄ）第１の追加的マーカーで工程（ｃ）の試料を処置する工程と、
（ｅ）循環形質細胞を分析する工程と、を含む。
【００２８】
上記に定義した用語の全ては、同じ意味及び好ましい範囲を有する。
【００２９】
血液から捕獲される異常な形質細胞の形態である循環多発性骨髄腫細胞（ＣＭＭＣ）は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）システムを使用して捕獲し、分析した。この手順では、異常な形質細胞を同定し、汚染白血球及び組織片と区別するために、捕獲試薬（磁性流体）と、蛍光バイオマーカー（抗ＣＤ３８フィコエリトリン（ＰＥ）抗体など）と、染料（核酸染料ＤＡＰＩなど）との組み合わせを使用した。ＣＤ１３８又はシンデカン−１は、成熟した形質細胞上、及び多発性骨髄腫のような形質細胞悪性腫瘍に見出されるが他の正常な末梢血白血球には見出されない細胞表面マーカーである。この理由のために、抗−ＣＤ１３８を磁性流体と結合させ、末梢血試料から循環形質細胞を磁性により選択するために磁性ナノ粒子を使用した。汚染白血球から異常な形質細胞を検出するために、いくつかの蛍光バイオマーカーを使用する。抗−ＣＤ３８をフィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲートし、形質細胞の検出のための陽性マーカーとして使用する。しかし、ＣＤ３８はまた、白血球のいくつかのタイプ（活性化Ｔ細胞及びＢ細胞）にも見出されるので、このアッセイは、陰性マーカーとして、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）とコンジュゲートされた抗−ＣＤ４５、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）とコンジュゲートされた抗−ＣＤ１９もまた使用する。ＣＤ４５は、末梢血白血球上に見出される汎白血球マーカーであり、ＣＤ１９は特定のＢ細胞マーカーである。骨髄腫細胞は、ＣＤ４５又はＣＤ１９のいずれも発現しない、機能的に分化されたＢ細胞である。このアッセイでの最後のマーカーは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートされた抗−ＣＤ５６である。ＣＤ５６は、ＮＫ細胞のようないくつかの末梢血白血球のサブセットに見出され得るが、骨髄腫細胞の７５％にも発現し、しばしば、より芳しくない患者の予後と関連付けられる。したがって、ＣＤ５６は、多発性骨髄腫の陽性マーカーでも陰性マーカーでもないが、患者の薬剤治療中に細胞におけるその発現レベルをモニタリングすることができる。
【００３０】
このアッセイは、最初、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、及びＣＤ５６を含む多発性骨髄腫細胞上に存在すると決定されたマーカーに対する異なる抗体を評価するために、ＲＰＭＩ  ８２２６、Ｈ９２９及びＭＭ．１Ｓなどの細胞株を使用して開発された。これらの細胞株はＣＤ４５及びＣＤ１９に関して陰性であったので、代わりにＰＢＭＣを使用してそれらの抗体を評価した。
【００３１】
濃縮し、染色した細胞の磁気マウンティングのために、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）カートリッジ及びＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）に移した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）を使用してこのカートリッジをスキャンした。細胞の個々の画像は、評価のためにオペレータに提示され、蛍光及び細胞の形態に基づいてＣＭＭＣとしてスコアされた。モデルのスパイクインシステムで、アッセイは、健康なドナーからの４．０ｍＬの血液にスパイクされた多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９から一貫して約６０％の細胞を回収した。アッセイは、スパイクされたＨ９２９細胞０〜２０００個の試験範囲にかけて線形であった（ｒ２  ０．９８、勾配０．５０、切片１０）。アッセイは、年齢一致の健康ドナー（ｎ＝２２）、並びに骨髄腫（ｎ＝６６）及びＭＧＵＳ（ｎ＝７）を有する患者からの血液を使用して検証した。正常ドナーからの４．０ｍＬの血液では、２２人中１２人（５５％）においてＣＰＣは０であり、２２人中１０人（４５％）に少数（１〜６個のＣＰＣ）が検出された。興味深いことに、正常ドナーにＣＤ５６陽性のＣＰＣが１個見つかった。多発性骨髄腫患者における血中のＣＭＭＣは、０〜１７，０００個／４．０ｍＬの範囲であった。患者の９１％に１個又は２個以上のＣＭＭＣが検出された（６８％において≧５個、５８％において≧１０個、３５％において≧１００個）。この患者母集団におけるＣＤ５６の発現には非常にばらつきがあった。ＭＧＵＳ患者における血中のＣＭＭＣは、０〜１１２個／４．０ｍＬの範囲であった。患者７人中６人に１個又は２個以上のＣＭＭＣが検出された（６人中４人において＞５個、６人中２人において＞１０個、６人中１人において＞１００個）。
【００３２】
ＣＭＭＣを更に特徴付け、ＣＰＣとＣＭＭＣを差異化するために、上記の捕獲及び検出システムとともに使用するために間期蛍光体のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを開発した。高リスク変異の同時検出に４色ＦＩＳＨプローブを使用した。本発明を例示する実施例は以下のとおり。
【実施例】
【００３３】
【表１】
2018100978.tif 000003
【００３４】
実施例１  捕獲標的
図１は、細胞株ＲＰＭＩ  ８２２６、Ｈ９２９、及びＭＭ．１Ｓとの反応性が試験された抗−ＣＤ１３８抗体のものを示し、最も優れた働きをした抗体はクローンＢ−Ａ３８であった。最初に、全てマウスの抗ヒト抗体である異なる抗体で細胞株を標識し、次いで、抗−マウスＰＥコンジュゲートで標識し、フローサイトメトリーで分析した。クローンＢ−Ａ３８は、全ての多発性骨髄腫細胞株に最高の蛍光染色をもたらした。
【００３５】
実施例２  検出標的
図２は、細胞株ＲＰＭＩ  ８２２６、Ｈ９２９、及びＭＭ．１Ｓとの反応性を試験した抗−ＣＤ３８抗体のものを示し、最も優れた働きをした抗体はクローン２４０７４２であった。細胞株は、最初に直接的に抗−ＣＤ３８−ＦＩＴＣコンジュゲートを使用して試験したが、このＦＴＴＣコンジュゲートは、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）のプラットフォームでの検出には不十分であることが後に見出された。この抗体のＰＥコンジュゲートを後に調製し、試験し、検出に適していることを見出した。
【００３６】
実施例３  希釈測定
いずれもＡＰＣコンジュゲートである抗ＣＤ１９及び抗−ＣＤ４５の両方の欠如は異常な形質細胞の指標であるので、それら両方を陰性検出マーカーとして選択した。抗−ＣＤ４５ＡＰＣは、既にＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣ染色試薬の成分であるので、追加的な最適化は必要なかった。評価した骨髄腫細胞株のいずれもＣＤ１９を発現しなかったため、ＰＢＭＣを使用し、異なる抗−ＣＤ１９ＡＰＣクローンを評価した。ＰＢＭＣでの抗−ＣＤ１９試験の結果を図３に示す。ＥＤＴＡ及びＣｅｌｌＳａｖｅ試験管から収集したＰＢＭＣに関して製造業者の推奨するプロトコルに従って、染色を実施した。クローンＳＪ２５Ｃ１が最高性能のコンジュゲートとして選択された。次いで、このコンジュゲートを、ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）で使用したのと同じ反応体積で種々の希釈で試験した（図４）。染色の最終希釈として１：５希釈を選択した。
【００３７】
実施例４  ＣＤ５６及びＰＢＭＣの染色
異常な発現を有する骨髄腫症例の７５％に抗−ＣＤ５６が発現されたので、それをＦＩＴＣマーカー試薬として選択した。製造業者の推奨プロトコルに従って、細胞株（図６）及びＰＢＭＣ（図５）で試験を行った。ＮＣＡＭ  １６．２が最高性能のコンジュゲートとして選択された。
【００３８】
実施例５  ＣＤ５６  ＦＩＴＣ希釈
抗−ＣＤ５６  ＦＩＴＣコンジュゲートＮＣＡＭ  １６．２を、ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）でＨ９２９細胞での種々の希釈にて試験した（図７〜１０を参照）。この細胞株で試験した希釈のうち、明らかに最良の希釈はなかった。最適な濃度の決定を助けるために患者の試料を試験することができるまで、染色の最終希釈として１：４希釈を選択した。
【００３９】
実施例６  画像
次いで、抗−ＣＤ１３８磁性流体と、抗−ＣＤ３８  ＰＥ、抗−ＣＤ４５  ＡＰＣ及び抗−ＣＤ１９  ＡＰＣからなる染色試薬と、抗−ＣＤ５６  ＦＩＴＣマーカー試薬と、からなるＣＭＭＣプロトタイプキットを構築した。キットの残りの構成要素は、捕獲機能改善試薬（ＰＮ  ７０３７）、透過処理試薬（ＰＮ  ７０３８）、核酸染料（ＰＮ  ７０４１）、及びＣｅｌｌＦｉｘ（ＰＮ  ７０４２）であった。試験の最初のラウンドは、異なる濃度で抗−ＣＤ１３８磁性流体を使用した。最終的な抗−ＣＤ３８  ＰＥ濃度は、以前のフローデータに基づいて、１μｇ／ｍＬ（５．７μｇ／ｍＬの染色試薬濃度）に設定した。最終的な抗−ＣＤ４５  ＡＰＣ濃度は約２μｇ／ｍＬ（ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣキットと同じ１３μｇ／ｍＬの染色試薬濃度）であり、ストックの抗−ＣＤ１９  ＡＰＣコンジュゲートは染色試薬に１：５希釈した。抗−ＣＤ５６  ＦＩＴＣを、マーカー試薬バイアル内で１：４の濃度で使用した。ＣｅｌｌＳａｖｅ血液７．５ｍＬ中にＨ９２９細胞をスパイクし、１３５、１８５、２２０、及び２７０μｇ／ｍＬの磁性流体濃度でＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）で処理した。次いで、試料をＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）で分析したところ、Ｈ９２９細胞の回収は、約２２０μｇ／ｍＬで５５〜６０％のプラトーに達した。
【００４０】
したがって、キット内の最終的な磁性流体濃度は、他の多くのＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）キットに使用されている濃度と同様である、７．５ｍＬの血液試料あたり２２０μｇ／ｍＬとなることが決定された。
【００４１】
回収したＨ９２９及びＭＭ．１Ｓ細胞のＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）の画像は、それぞれ図１１及び図１２に示されている。ＭＭ．１Ｓ細胞と比較して、Ｈ９２９細胞のより大きなＣＤ５６染色に注意されたい。キャリーオーバー白血球（ＣＤ３８＋／ＣＤ４５＋）を図１３に見ることができる。
【００４２】
実施例７  患者試料
合計６６人の多発性骨髄腫患者の試料のＣＭＭＣを試験した。これらの試料はＣｏｎｖｅｒｓａｎｔから取得し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＣＭＭＣサービスキットを使用して、元々は７．５ｍＬの血液を試験したが、多くの試料が多数のＣＭＭＣを有することが明らかになったので、試験する血液の体積を４ｍＬに減らす決定をした。これらの試料をＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）で処理し、次いで、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）でスキャンした。図１０は、患者の血液試料から生成されたデータの表である。多発性骨髄腫患者における血中のＣＭＭＣは、０〜１７，０００個／４．０ｍＬの範囲であった。患者の９１％に１個又は２個以上のＣＭＭＣが検出された（６８％において≧５、５８％において≧１０、３５％において≧１００）。この患者母集団におけるＣＤ５６の発現には非常にばらつきがあった。ＭＧＵＳ患者における血中のＣＭＭＣは、０〜１１２個／４．０ｍＬの範囲であった。７人中６人の患者に１個又は２個以上のＣＭＭＣが検出された（６人中４人に＞５個、６人中２人に＞１０個、及び６人中１人に＞１００個）。図１４〜１７は、患者の試料から得た、いくつかの代表的なＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）の画像である。
【００４３】
凡例表１
ステージ：ステージＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む骨髄腫細胞の範囲及び特徴の診断分類。癌細胞数は、ステージが進行するにつれて比較的少数、中程度の数、比較的多数へと増加する。Ｍタンパク質、貧血、及び血清カルシウムのような追加的な症状もまた、ステージの進行につれて増加する。
処置ステータス：疾病のステータス及び処置方法を表す。
処置のタイプ：薬剤又は放射線療法
体積：ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで処理した末梢血の体積
合計イベント：多発性骨髄腫細胞を手作業で分類するためにユーザーに提示されるＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ブラウザ画像の総数
合計ＭＭ細胞（ＣＤ３８＋、ＣＤ１９／４５−）：多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の基準を満たすとユーザーが決定した合計イベントをもとにした画像の総数。これらの細胞は、ＣＤ３８陽性及びＣＤ１９／４５陰性である。
ＣＤ３８＋、ＣＤ１９／４５−、ＣＤ５６＋：ＣＤ５６陽性であった多発性骨髄腫細胞の数。
ＣＤ３８＋、ＣＤ１９／４５−、ＣＤ５６−：ＣＤ５６陰性であった多発性骨髄腫細胞の数。
割り当てられていないイベント：合計イベントから、多発性骨髄腫細胞としてユーザーが分類したイベントである合計ＭＭ細胞を引いたもの。割り当てられないイベントは、白血球、コンピュータノイズ、又は、ＭＭ細胞として分類されない他の組織片の組み合わせである。
【００４４】
【表２−１】
2018100978.tif 000004
【００４５】
【表２−２】
2018100978.tif 000005
【００４６】
実施例８  正常被験者
次に、２２人の同年齢の正常被験者の試験も行った。これらの試料もまたＣｏｎｖｅｒｓａｎｔから取得し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＣＭＭＣサービスキットを使用して、血液４ｍＬを試験した。これらの試料をＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）で処理し、次いで、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）でスキャンした。表２は、４ｍＬの血液試料から生成されたデータの表である。正常ドナーからの４．０ｍＬの血液では、２２人中１２人（５５％）においてＣＰＣは０であり、２２人中１０人（４５％）に少数（１〜６個のＣＰＣ）が検出された。興味深いことに、正常ドナーにＣＤ５６陽性のＣＰＣが１個見つかった。図１８を参照されたい。合計ブラウザイベント数の平均は約１５００であった。
【００４７】
ＣＭＭＣを更に特徴付け、ＣＰＣとＣＭＭＣを差異化するために、上記の捕獲及び検出システムとともに使用するために間期蛍光体ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを開発した。２つの再発性ＩｇＨ遺伝子座（ｔ（４；１４）（ｐ１６；ｑ３２）の転座及びｔ（１４；１６）（ｑ３２；ｑ２３））、並びにＴＰ５３遺伝子座（Δ１７ｐ１３）の欠失を含む高リスク変異を同時に検出するために、４色のＦＩＳＨプローブを使用した。細胞株Ｈ９２９、ＭＭ１ｓ、及びＵ２６６で検証したＦＩＳＨアッセイは、それぞれ、ｔ（４；１４）、ｔ（１４；１６）、及びΔ１７ｐ１３に変異を示した。ＦＩＳＨアッセイは９つのＣＭＭＣ患者試料で試験し、うち８つの試料から評価可能な結果が得られた。２つの試料がｔ（４；１４）融合を示し、患者３人が、第４又は第１４染色体の異数性を示す異常なＦＩＳＨ信号パターンを示し、残りの患者は正常なＦＩＳＨパターンを示した。
【００４８】
【表３】
2018100978.tif 000006
【００４９】
実施例９  抗−ＣＤ  ３８及び抗ＣＤ  １３８患者試料を用いた捕獲
本発明において骨髄腫細胞を捕獲するために使用したコロイド状磁性粒子とコンジュゲートされた細胞表面マーカーである抗ＣＤ１３８は、経時的に骨髄腫細胞から脱落する場合がある。同じく骨髄腫細胞上に存在する表面マーカーであるＣＤ３８は、細胞表面から脱落することがない。磁性ナノ粒子を開発し、抗−ＣＤ１３８及び抗−ＣＤ３８の両方と結合し、患者試料及び正常ドナーの両方を用いて、骨髄腫細胞を捕獲する能力に関する試験を行った。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）とコンジュゲートされた抗−ＣＤ４５及び抗−ＣＤ１９とともに、フィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲートされた抗−ＣＤ３８及び抗−ＣＤ  １３８の両方、並びに磁性ナノ粒子の作製に使用された抗ＣＤ３８及び抗−ＣＤ  １３８以外のエピトープを認識するそれら両方を、検出に使用した。
【００５０】
この代替捕獲試薬を使用して、合計２２人の多発性骨髄腫患者の試料のＣＭＭＣを試験した。これらの試料をＣｏｎｖｅｒｓａｎｔから取得し、４ｍＬをＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）で処理し、次いで、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）でスキャンした。表３は、患者試料から生成された表である。多発性骨髄腫患者におけるＣＭＭＣは、０〜２２４４個／４．０ｍＬの範囲であった。患者の８２％に１個又は２個以上のＣＭＭＣが検出された（６４％において≧５個、５９％おいて≧１０個、２３％おいて≧１００個）。
【００５１】
【表４】
2018100978.tif 000007
【００５２】
実施例９  抗−ＣＤ  ３８及び抗ＣＤ  １３８の正常な試料を用いた捕獲
次いで、実施例８と同じキット設定を使用して、１２人の正常ドナーの試験を行った。これらの試料は社内ドナーからのものであり、血液４ｍＬをＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）で処理し、次いで、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（登録商標）でスキャンした。表４は、４ｍＬの血液試料から生成された表である。正常ドナーからの４．０ｍＬの血液試料中、１２人中５人（４２％）に０ＣＰＣが検出され、１２人中７人（５８％）に少数（１〜３個のＣＰＣ）が検出された。
【００５３】
【表５】
2018100978.tif 000008
【００５４】
〔実施の態様〕
（１）  循環多発性骨髄腫細胞を捕獲、単離、及び分析する方法であって、
（ａ）被験者から血液試料を入手する工程と、
（ｂ）前記試料を、第１のリガンドとコンジュゲートされたコロイド状磁性粒子と接触させる工程と、
（ｃ）磁性粒子と結合した循環多発性骨髄腫細胞の分離された分画（separated faction）を産生するために、前記工程（ｂ）の試料を磁場にさらす工程と、
（ｄ）第１の追加的マーカーで前記工程（ｃ）の試料を処置する工程と、
（ｅ）循環多発性骨髄腫細胞を分析する工程と、を含む、方法。
（２）  前記試料が、約２ｍＬ〜約１０ｍＬの体積を有する、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記試料が、約３ｍＬ〜約７．５ｍＬの体積を有する、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記試料が、約４ｍＬの体積を有する、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記第１のリガンドが、抗−ＣＤ１３８、抗−ＣＤ３８、及び抗−ＣＤ５６からなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
【００５５】
（６）  前記第１のリガンドが、抗−ＣＤ１３８及び抗−ＣＤ３８からなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
（７）  前記第１のリガンドが、抗−ＣＤ１３８からなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
（８）  前記第１のリガンドが、抗−５６からなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
（９）  前記コロイド状磁性粒子が第２のリガンドとコンジュゲートされ、前記第１のリガンドが、抗ＣＤ１３８及び抗−ＣＤ５６からなる群から選択され、前記第２のリガンドがＣＤ３８である、実施態様１に記載の方法。
（１０）  前記第１のリガンドがＣＤ１３８であり、前記第２のリガンドがＣＤ３８である、実施態様９に記載の方法。
【００５６】
（１１）  前記コロイド状磁性粒子が、３つ以上のリガンドとコンジュゲートされる、実施態様１に記載の方法。
（１２）  前記コロイド状磁性粒子が、抗−ＣＤ１３８、抗−ＣＤ３８、及び抗−ＣＤ５６とコンジュゲートされる、実施態様１１に記載の方法。
（１３）  前記第１の追加的マーカーが、ＤＡＰＩ、抗−ＣＤ３８抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ４５抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ５６、抗λ、抗κ抗ＣＤ２００、抗Ｋｉ６７からなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
（１４）  前記第１の追加的マーカーが、抗−ＣＤ３８である、実施態様１に記載の方法。
（１５）  前記工程（ｃ）の試料を第２の追加的マーカーと接触させる工程を更に含む、実施態様１に記載の方法。
【００５７】
（１６）  前記第２の追加的マーカーが、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ４５、及びＤＡＰＩからなる群から選択される、実施態様１５に記載の方法。
（１７）  前記第２の追加的マーカーが、ＤＡＰＩである、実施態様１５に記載の方法。
（１８）  前記工程（ｃ）の試料を第３の追加的マーカーと接触させる工程を更に含む、実施態様１５に記載の方法。
（１９）  前記第３の追加的マーカーが、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ４５、及びＤＡＰＩからなる群から選択される、実施態様１８に記載の方法。
（２０）  前記第３の追加的マーカーが、抗−ＣＤ１９である、実施態様１８に記載の方法。
【００５８】
（２１）  前記工程（ｃ）の試料を第４の追加的マーカーと接触させる工程を更に含む、実施態様１８に記載の方法。
（２２）  前記第４の追加的マーカーが、抗−ＣＤ４５である、実施態様２１に記載の方法。
（２３）  前記工程（ｃ）の試料を４つ又は５つ以上の追加的マーカーと接触させる工程を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（２４）  異常な形質細胞と関連付けられる疾病の治療的介入の候補である可能性が高い患者かどうかを決定する方法であって、
（ａ）試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｂ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、を含む、方法。
（２５）  処理する工程が、
（ａ）被験者から血液試料を入手することと、
（ｂ）前記試料を、第１のリガンドとコンジュゲートされたコロイド状磁性粒子と接触させることと、
（ｃ）磁性粒子と結合した循環多発性骨髄腫細胞の分離された分画を産生するために、前記工程（ｂ）の試料を磁場にさらすことと、
（ｄ）第１の追加的マーカーで前記工程（ｃ）の試料を処置することと、
（ｅ）循環多発性骨髄腫細胞を分析することと、を含む、実施態様２４に記載の方法。
【００５９】
（２６）  患者の試料中のＣＭＭＣの正常範囲が、約２ｍＬ〜１０ｍＬの血液中にＣＭＭＣ  ７個未満である、実施態様２４に記載の方法。
（２７）  約２ｍＬ〜約１０ｍＬの血液中に８個を超える数のＣＭＭＣがある場合に、治療的介入を推奨する工程を更に含む、実施態様２４に記載の方法。
（２８）  治療的介入が進行中の患者のＣＭＭＣの数が減少しているかどうかを決定する方法であって、
（ａ）第１の時点における試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｂ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、
（ｃ）第２の時点における試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｄ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、
（ｅ）前記工程（ｂ）での数と前記工程（ｄ）での数とを比較する工程と、を含む、方法。
（２９）  異常な形質細胞の疾病のあった患者で、そのような疾病の治療に成功した患者が、寛解のまま留まっているかどうかを決定する方法であって、
（ａ）第１の時点における試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｂ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、
（ｃ）第２の時点における試料中のＣＭＭＣの数を決定するために前記患者の血液を処理する工程と、
（ｄ）前記試料に存在するＣＭＭＣの数を数えることによって、その数が正常範囲以上であるか、又は正常範囲と同等であるかを決定する工程と、
（ｅ）前記工程（ｂ）での数と前記工程（ｄ）での数とを比較する工程と、を含む、方法。
（３０）  コロイド状磁性粒子及び少なくとも１つのリガンドを含む、循環多発性骨髄腫細胞を捕獲するための、試薬。
【００６０】
（３１）  前記リガンドが、抗ＣＤ１３８、抗−ＣＤ３８、及び抗−ＣＤからなる群から選択される、実施態様３０に記載の試薬。
（３２）  少なくとも２つのリガンドを更に含む、実施態様３０に記載の試薬。
（３３）  少なくとも３つのリガンドを更に含む、実施態様３０に記載の試薬。
【図１】
2018100978.tif 000009
【図２】
2018100978.tif 000010
【図３】
2018100978.tif 000011
【図４】
2018100978.tif 000012
【図５】
2018100978.tif 000013
【図６】
2018100978.tif 000014
【図７】
2018100978.tif 000015
【図８】
2018100978.tif 000016
【図９】
2018100978.tif 000017
【図１０】
2018100978.tif 000018
【図１１】
2018100978.tif 000019
【図１２】
2018100978.tif 000020
【図１３】
2018100978.tif 000021
【図１４】
2018100978.tif 000022
【図１５】
2018100978.tif 000023
【図１６】
2018100978.tif 000024
【図１７】
2018100978.tif 000025
【図１８】
2018100978.tif 000026