(57)【要約】【課題】本発明は、食品に由来する成分を有効成分とする新たな血管内皮機能改善剤、及び新たな血管内皮機能改善作用を有する食品および飼料を提供することを課題とする。本発明は、血管内皮機能改善作用を有し、有効成分の調製が容易な食品素材の探索を課題とする。【解決手段】（１）スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善剤。（２）スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とすることを特徴とする血管内皮機能改善作用を有する食品。（３）スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とすることを特徴とする血管内皮機能改善作用を有する飼料。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善剤。
【請求項２】
スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善用食品。
【請求項３】
スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善用飼料。
【請求項４】
スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善剤の製造方法であって、
乳又は乳素材を原材料とし、孔径が０．１〜２μｍの分離膜または、分画分子量５〜５００ｋＤａの分離膜で処理する工程を含む請求項（１）〜（３）に記載の製造方法。
【請求項５】
スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善作用を有する請求項（１）〜（３）の製造方法であって、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を添加する工程を含む請求項（１）〜（３）のの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンから選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善剤、及びスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンから選ばれる１種類以上を有効成分とすることを特徴とする血管内皮機能改善作用を有する食品および飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活の乱れや慢性的な運動不足、過度のストレスなどにより、肥満や高血圧、高脂血症、糖尿病などの生活習慣病に対するリスクが増加している。これらの生活習慣病の症状が進行すると動脈硬化や心筋梗塞など、より重篤な病気を引き起こす可能性が高くなる。最近、上記したものを含む様々な疾患の要因の一つに血管の内皮機能の低下が関与していることが明らかとなってきた。よって、血管内皮細胞の機能を改善するような食品の開発は、多くの疾患の予防的側面からも大きな意義があると考えられる。
食品素材を原料とした血管内皮機能改善剤として、マメ目マメ科ゲンゲ属植物抽出物を有効成分とする血管内皮機能改善剤（特許文献１）、タマネギ、タマネギ処理物を有効成分とする血管内皮機能改善剤（特許文献２）、シトルリン、または、グルタチオンを有効成分とする血管内皮機能改善剤（特許文献３）などが開示されている。
一方、横山らは、リゾホスファチジルコリンとホスファチジルコリンが血管内皮細胞のＮＯ合成酵素を活性化し、ＮＯ産生量を増加させることで、血管を弛緩させることを報告しているが、血管内皮細胞の細胞死を抑制する手段として、リン脂質を用いることを開示した文献等はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−２２９１７３号公報
【特許文献２】特開２０１３−５３０８４号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１３／１２２１８８号
【非特許文献】
【０００４】
横山光宏、血管内皮細胞のシグナル伝達と脂質、動脈硬化、２２（６・７）：４５３−４５６、１９９４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、食品に由来する成分を有効成分とする新たな血管内皮機能改善剤および新たな血管内皮機能改善作用を有する食品および飼料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の解決手段を提供するものである。
（１）スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善剤。
（２）スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善用食品。
（３）スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善用飼料。
（４）スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善剤の製造方法であって、乳又は乳素材を原材料とし、孔径が０．１〜２μｍの分離膜または、分画分子量５〜５００ｋＤａの分離膜で処理する工程を含む（１）〜（３）に記載の製造方法。
（５）スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を有効成分とする血管内皮機能改善作用を有する（１）〜（３）の製造方法であって、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選ばれる１種類以上を添加する工程を含む（１）〜（３）の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンから選ばれる１種類以上を有効成分とすることを特徴とする血管内皮機能改善剤およびスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンから選ばれる１種類以上を有効成分とすることを特徴とする血管内皮機能改善作用を有する食品および飼料を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】リン脂質組成物の血管内皮細胞に対する細胞死抑制効果を示した図である。
【図２】リン脂質による血管内皮細胞の細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｎｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ：ＥＲＫ）のリン酸化度を示した図である。
【図３】リン脂質による血管内皮細胞の細胞死抑制活性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（血管内皮機能改善作用）
本発明の血管内皮機能改善作用とは、血管内皮細胞の機能改善、又は血管内皮細胞の機能低下抑制をいう。
血管内皮機能改善作用は、血管内皮細胞の細胞死の抑制作用（生存率の向上）または血管内皮細胞自身の機能促進作用などにより評価することができる。例えば、以下の方法で評価することができる。
（１）血管内皮細胞の細胞死抑制活性の測定方法
血管内皮細胞の細胞死抑制活性を評価する方法の一様態を以下に示す。
細胞は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）、培地はＨｕ−Ｍｅｄｉａ−ＥＧ２、または１％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）を含むロズウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ）１６４０を用いる。細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で行い、４〜６世代継代目の細胞を実験に供する。
初発細胞濃度を５×１０５／ｍｌに調整した細胞浮遊液（Ｈｕ−Ｍｅｄｉａ−ＥＧ２を使用）を６ウエルプレートに１ｍｌを播種後、６時間程度培養し、プレートに接着したことを確認する。その後、供試試料を含む１％ＦＢＳを含むＲＰＩＭ１６４０に交換して４０時間培養し、培養後の細胞を回収し、以下の染色を行う。なお、対照群には溶媒であるリン酸緩衝液のみを添加した培地を用いる。
染色には、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ  ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ベルギー）Ｐｒｏｐｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ社製、米国）を用いる。培養上清を回収し、冷リン酸緩衝液で細胞を２回洗浄し、１×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに再浮遊させる。１.５ｍｌのチューブに１００μｌの上記細胞浮遊液とＡｎｎｅｘｉｎＶ試薬を５μＬ、Ｐｒｏｐｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅを２μＬ加え、穏やかに混和し、室温・暗所で１５分間反応させ、反応液中の生細胞数をフローサイトメーターで解析する。
（２）細胞増殖及び細胞運動能の亢進の指標である細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｎｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ：ＥＲＫ）のリン酸化の評価
細胞増殖及び細胞運動能の亢進を評価する方法の一様態を以下に示す。
６ウエルプレートに１×１０６／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞を播種し、Ｈｕ−Ｍｅｄｉａ−ＥＧ２培地で一晩培養する。供試試料のリン酸緩衝液による懸濁液を添加して１５分間培養する。培養終了後、細胞を回収し、細胞をＰＢＳで洗浄後、ＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＮａＤｏｃ、０．１％ＳＤＳ）を１００μｌ加え、細胞溶解液を回収する。本溶解液を氷上で１０分間静置後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を得る。上清に６倍量のサンプルバッファー（０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．７、１２％ＳＤＳ、３０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、５％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、適量のＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を加え、９５℃、５分間加熱することでＳＤＳ化を行う。分離ゲル濃度が７．５％のポリアクリルアミドゲルを用いて、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ナイロン膜に転写し、ウエスタンブロットを実施する。
一次抗体に抗リン酸化Ｅｒｋ抗体、２次抗体に西洋ワサビオキシダーゼ（ＨｏｕｒｓｅＲａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａａｓｅ：ＨＲＰ）標識抗ラビットＩｇＧ抗体を用いて、ルミノイメージアナライザーによりバンドを検出する。
【００１０】
（有効成分）
本発明の血管内皮機能改善作用を有する有効成分は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンから選択される１種類以上である。これらは乳、大豆、卵黄などの食品素材等から調製したものを用いることができるが、化学的に合成したものでもよい。
また、本発明に用いるスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンは、分離・精製された高純度のものだけでなく、未精製の組成物であってもよい。すなわち、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選択される１種類以上を含むものであれば、これらが分離されていないリン脂質の混合物である組成物を用いてもよい。
【００１１】
（摂取量）
本発明で、血管内皮機能改善効果を発揮させるためには、成人の場合、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンから選択される１種類以上を一日当たり１０〜２，５００ｍｇ、好ましくは、５０〜２，５００ｍｇを摂取すればよい。
また、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンから選択される１種類以上を食品に配合する場合は、１食で上記の量を摂取してもよいし、数回に分けて、上記の摂取量になるように配合して摂取してもよい。
【００１２】
（製造方法）
乳由来のスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群から選択される１種類以上を含むリン脂質組成物（以下、リン脂質組成物）の製造方法一様態を以下に示す。
本発明のリン脂質組成物の原材料には、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等の獣乳やヒト等の哺乳類の乳及びこれらに由来する乳素材や大豆、卵黄などの食品素材等を用いることができるが、このなかでウシ由来の乳や乳素材を用いることが好ましい。乳素材としては、バターゼーラムやバターミルクを用いることが好ましい。
バターゼーラムとは、脂肪分６０重量％以上の高脂肪クリーム又はバターを、遠心分離、加温、又はせん断処理することにより得られる脂肪分３０〜５１重量％の水層画分をいう。
バターミルクとは、バターを製造する際に生じた脂肪粒以外の部分をいい、乳脂肪分３０〜４０％に調製したクリームよりバターを製造する際に、チャーニングのような乳脂肪球同士の衝突による乳化破壊等の物理的分画操作より、バターと共に副産物として発生する淡黄色の液体である。なお、上記したバターは発酵バターであってもよい。
これらの原材料を用いて、乳由来リン脂質組成物は、以下のような方法等により調製することができる。
すなわち、乳または乳素材を精密ろ過（ＭＦ）膜または限外ろ過膜（ＵＦ）処理することにより、本発明のリン脂質組成物を得ることができる。
精密ろ過膜（ＭＦ）は、孔径０．１μｍ〜２．０μｍのものが好ましい。孔径が０．１μｍ未満になると、ホエイタンパク質等の夾雑物が濃縮液側に残存するようになり、固形当たりの脂質含量が減少することにより血管内皮機能改善剤としての効果が弱くなる。また、孔径が２．０μｍを越えると、脂肪球が膜を通過して透過液側に漏れるようになるため、血管内皮機能改善効果を有する脂質画分が濃縮画分から減少するために、血管内皮機能改善剤としての効果が弱くなる。混入するタンパク質の量やリン脂質の回収量を考慮すると、孔径０．１μｍ〜２．０μｍ程度の精密ろ過膜（ＭＦ）が最も好ましい。この孔径０．１μｍ〜２μｍの精密ろ過膜（ＭＦ）としては、たとえば、Ｍｅｍｂｒａｒｏｘ（ＳＣＴ、Ｓｏｃｉｅｔｉｅ  Ｃｅｒａｍｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｔ社製）を使用することができる。
限外ろ過膜（ＵＦ）は、分画分子量５〜５００ｋＤａのものが好ましい。５ｋＤａ未満になると、乳糖が濃縮され、脂質の割合が高くならないため、好ましくなく、５００ｋＤａはＵＦ膜の分画分子量の上限である。
なお、ＭＦ処理またはＵＦ処理を行う前に、上記原料に対して酸を加えてｐＨ４〜５程度に調整し、カゼインタンパク質を等電点沈殿させて除去しおくことで、膜処理における膜の汚れ付着を防止できるとともに、得られる濃縮液中に含まれる固形物当たりの脂質含量を高くすることが可能となり好ましい。
さらに、ｐＨを４〜５に調整した後に塩化カルシウムを加えること、カゼインタンパク質の沈殿がより促進されるのでより好ましい。塩化カルシウムの添加量は、全体の０．０１〜０．０５重量％が好ましい。また、ｐＨ調整の際に加える酸の種類は特に限定されないが、塩酸や硫酸等の無機酸等が好ましい。
【００１３】
リン脂質組成物の回収方法は特に限定されないが、フィルタープレス、デカンター等を用いることが好ましい。得られた濃縮液は、特に方法を限定しないが、凍結乾燥、噴霧乾燥等の操作により粉体あるいはペースト状の組成物にしておくことが保存の上で好ましい。
なお、このリン脂質組成物中のその他の成分は、特に限定されないが、上記したような方法によれば、全固形中、タンパク質を１５〜２０重量％、糖質を１０〜５０重量％、灰分を５〜１０重量％含有するものが得られる。また、組成物中の水分は５重量％以下である。また、リン脂質組成物はスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンを少なくとも１種類以上含み、その含有量が全固形物中１０重量％以上であることが望ましい。より望ましくは、１５％以上であり、２０％以上がよりいっそう望ましい。スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルセリンのいずれか２種以上含む場合には、合計量が上記割合で含まれることが望ましい。
得られたリン脂質組成物は血管内皮機能改善剤や血管内皮機能改善作用を有する食品や飼料の有効成分として用いることができる。
また、上記したリン脂質組成物を各種クロマトグラフィー等の常法により、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンの純度を高くしたものを調製することも可能である。
【００１４】
血管内皮機能改善剤や血管内皮機能改善作用を有する食品や飼料の製造の際には、糖類、タンパク質、ビタミン類、ミネラル類やフレーバー等、他の飲食品や飼料に通常使用される原材料等、安定剤、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合した錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、シロップ剤等の製剤を用いることができる。
さらに、乳、乳飲料、発酵乳、チーズ、アイスクリームなどの乳製品、パン、スナック菓子、ケーキ、プリン、飲料、麺類、ソーセージ、各種粉乳や離乳食等の飲食品や飼料に配合することも可能である。
【００１５】
以下に、実施例および試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
バターゼーラムを材料として、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンの高濃度画分を得た。手順を下記に示す。
バターゼーラム粉（ＳＭ２、Ｃｏｒｍａｎ社製、ベルギー）の２５％溶液を調製し、５Ｍ塩酸を添加してｐＨ４．５に調整した。この溶液を５０℃で１時間静置し、カゼインタンパク質を沈殿させた。フィルタープレスを用いてこの沈殿を除去し、得られた水溶液を孔径１．０μｍのＭＦで処理して濃縮液画分を得た。この乳由来リン脂質含有組成物（実施例品１）は、全固形当たり脂質を５３％、リン脂質を３１％、タンパク質を２４％、糖質を１５％、灰分を８％含有していた。また、リン脂質中の８％がスフィンゴミエリン、８％がホスファチジルコリン、５％がホスファチジルセリンであった。
【００１７】
〔試験例１〕
実施例品１を使用して、乳由来リン脂質組成物の血管内皮細胞の細胞死に与える影響について試験した。
（１）試験方法
ＨＵＶＥＣ細胞（ＫＵＲＡＢＯ社製、東京）のを用いて、培地は、Ｈｕ−Ｍｅｄｉａ−ＥＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）また、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いた。細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で行い、４〜６世代継代目の細胞を実験に供した。
初発細胞濃度を５×１０５／ｍｌに調整した細胞浮遊液（Ｈｕ−Ｍｅｄｉａ−ＥＧ２を使用）を６ウエルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウエルに１ｍｌずつ播種した。６時間程度培養し、プレートに接着したことを確認した。その後、乳由来リン脂質組成物のリン酸緩衝液による懸濁液を含む１％ＦＢＳを含むＲＰＩＭ１６４０に交換して、４０時間培養後細胞を回収し、以下の染色を行った。なお、対照群には溶媒であるリン酸緩衝液のみを添加した培地を用いた。図１に示す乳由来リン脂質組成物濃度は、培養液中の濃度を示す。
染色には、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ  ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とＰＩ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いて行った。培養上清を回収し、冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、１ラｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに再浮遊させた。１．５ｍｌのチューブに１００μＬの上記細胞浮遊液とＡｎｎｅｘｉｎＶ試薬を５μＬ、ＰＩを２μＬ加え、穏やかに混和し、室温・暗所で１５分間反応させた。反応液をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析を行った。染色された生細胞数の全細胞数に対する割合（％）を図１に示す。
（２）試験結果
培養液中への乳由来リン脂質組成物の添加により、無添加の場合に比べて血管内皮細胞の生細胞の割合が高く、添加濃度に依存して、細胞死の抑制が見られた（図１）。
したがって、本発明の乳由来リン脂質組成物が血管内皮細胞の細胞死を濃度依存的に抑制していることが明らかとなり、血管内皮機能改善剤として用いることが出来ることが分かった。
【００１８】
〔試験例２〕
試験例１で乳由来リン脂質組成物が血管内皮細胞の細胞死を抑制することが明らかとなったため、血管内皮細胞内のシグナルの変化を調べた。シグナルとしては、細胞増殖および細胞運動能の亢進の指標であるＥｒｋのリン酸化を測定した。乳由来リン脂質としては、スフィンゴミエリン（長良サイエンス社製、岐阜）、ホスファチジルコリン（長良サイエンス社製、岐阜）またはホスファチジルセリン（長良サイエンス社製、岐阜）を用いて添加濃度は３０μｇ/ｍｌとした。
（１）試験方法
６ウエルプレートに１×１０６／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞を播種し、Ｈｕ−Ｍｅｄｉａ−ＥＧ２培地で一晩培養した。各種の乳由来リン脂質のリン酸緩衝液による懸濁液を添加して１５分間培養した。培養終了後、細胞を回収し、細胞をＰＢＳで洗浄後、ＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＮａＤｏｃ、０．１％ＳＤＳ）を１００μｌ加え、細胞溶解液を回収した。本溶解液を氷上で１０分間静置後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を得た。コントロールとして培養液１ｍｌあたり１０μｌ のＮＮ−ジメチルスルホキシドを添加した。上清に６倍量のサンプルバッファー（０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．７、１２％  ＳＤＳ、３０％  Ｓｕｃｒｏｓｅ、５％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、適量のＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を加え、９５℃、５分間加熱することでＳＤＳ化を行った。分離ゲル濃度が７．５％のポリアクリルアミドゲルを用いて、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）に転写し、ウエスタンブロットを実施した。一次抗体に抗リン酸化Ｅｒｋ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）、２次抗体にＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、米国）を用いて、ＬＡＳ３０００  ｍｉｍｉ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、東京）によりバンドの検出を行った。
（２）試験結果
ＨＵＶＥＣ細胞を各種の乳由来リン脂質であるスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルセリンで処理することで、Ｅｒｋのリン酸化がいずれにおいても亢進されていることが明らかとなった（図２）。
したがって、本発明の乳由来リン脂質であるスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルセリンが血管内皮細胞のＥｒｋのリン酸化を促進して、血管内皮細胞の細胞死を抑制していることが明らかとなり、血管内皮機能改善剤として用いることが出来ることを確認した。
【００１９】
〔試験例３〕
乳由来リン脂質の精製品として、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンを用いてそれぞれの血管内皮機能の改善効果を評価した。
（１）試験方法
試験例１と同様に長良サイエンス社製のスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンを培養液中の濃度が３０μｇ／ｍｌ及び３００μｇ／ｍｌとなるように培養液１ｍｌあたり１０μｌ添加し、試験例１と同様に血管内皮細胞の細胞死を測定した。コントロールとして培養液１ｍｌあたり１０μｌ のＮＮ−ジメチルスルホキシドを添加した。
（２）試験結果
スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンのいずれかを添加した場合は、コントロールに対して、ＨＵＶＥＣ細胞の生細胞の割合が高く、濃度依存的に細胞死を抑制した。（図３）。
したがって、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンは、いずれも濃度依存的に血管内皮細胞の細胞死を抑制していることが明らかとなり、血管内皮機能改善剤として用いることが出来ることを確認した。
【００２０】
（血管内皮機能改善用カプセル剤の調製）
表１に示す配合で原材料を混合した後、常法により造粒し、ソフトカプセルに充填して、本発明の血管内皮機能改善用カプセル剤を製造した。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
（血管内皮機能改善用錠剤の調製）
表２に示す配合で原材料を混合した後、常法により１ｇに成型、打錠して本発明の血管内皮機能改善用錠剤を製造した。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
（血管内皮機能改善用液状栄養組成物）
実施例品１の乳由来リン脂質組成物５０ｇを４，９５０ｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫ ＲＯＢＯ ＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６,０００ｒｐｍで３０分間撹拌混合して５０ｇ／５ｋｇのバターミルク溶液を得た。このバターミルク溶液５．０ｋｇに、カゼイン５．０ｋｇ、大豆タンパク質５．０ｋｇ、魚油１．０ｋｇ、シソ油３．０ｋｇ、デキストリン１７．０ｋｇ、ミネラル混合物６．０ｋｇ、ビタミン混合物１．９５ｋｇ、乳化剤２．０ｋｇ、安定剤４．０ｋｇ、香料０．０５ｋｇを配合し、２００ｍｌのレトルトパウチに分注し、レトルト殺菌機 (第１種圧力容器、ＴＹＰＥ: ＲＣＳ−４ＣＲＴＧＮ、日阪製作所製)で１２１℃、２０分間殺菌して、本発明の血管内皮機能改善用液状栄養組成物５０ｋｇを製造した。
【００２５】
（血管内皮機能改善用飲料の製造）
脱脂粉乳３００ｇを４００ｇの脱イオン水に溶解した後、実施例品１の乳由来リン脂質組成物１０ｇを溶解し、５０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ Ｔ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９,５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、酸味料２ｇ、還元水飴２０ｇ、香料２ｇ、脱イオン水１６６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に１００ｇずつ充填し、９５℃、１５秒間殺菌後、密栓し、本発明の血管内皮機能改善用飲料１０本（１００ｇ入り）を調製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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