(57)【要約】【課題】ｐ９７ポリペプチド配列および抗体またはその抗原結合フラグメントを含む治療組成物を提供すること。【解決手段】いくつかの実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、細胞表面レセプターなどの細胞表面タンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体は、がん関連抗原またはがん抗原に特異的に結合する。ある特定のがん抗原は、細胞表面タンパク質およびそれらのそれぞれのリガンドを含む。特定の実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質またはヒトＨｅｒ１／ＥＧＦレセプターに特異的に結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１２年６月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／６５８，２１７号、および２０１１年７月５日に出願された米国仮特許出願第６１／５０４，６４６号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（配列表に関する陳述）
本願に関する配列表は、ハードコピーに変わりテキスト形式で提供され、本明細書中に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＩＯＡ＿００３＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは約４１ＫＢであり、２０１２年７月５日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出された。
【０００３】
背景
技術分野
本発明は、概して、ｐ９７−抗体結合体、関連組成物およびそれを使用する方法に関する。ある特定の実施形態は、より詳細には、ｐ９７ポリペプチド配列、および細胞表面レセプターもしくは細胞表面タンパク質またはがん関連抗原（例えば、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質またはＨｅｒ１／ＥＧＦレセプター）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。そのような抗体結合体は、例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現しているがんおよびＨｅｒ１／ＥＧＦＲを発現しているがんなどの腫瘍学的疾患を含む種々の疾患を処置するための方法において有用である。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
脳の特定の領域に治療薬を送達することに関する困難を克服することは、大多数の脳障害の処置についての大きな課題である。血液脳関門（ＢＢＢ）は、神経を保護する役割において、多くの潜在的に重要な診断薬および治療薬を脳に送達することを妨げるように機能する。診断および治療において他の方法では有効であり得る治療分子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）および治療遺伝子は、適切な量でもＢＢＢを越えない。すべての治療分子の９５％超が、血液脳関門を越えないと報告されている。
【０００５】
ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的な承認されたモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、このタンパク質が陽性であるおよそ３０％のヒト乳がんの処置において重要な治療の選択肢である。トラスツズマブは、全身性疾患の処置および管理において有益であると証明されているが；トラスツズマブが血液脳関門を越えることができないという事実に起因して、トラスツズマブは、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＨｅｒ２／ｎｅｕを発現している転移性がん細胞の頻繁に観察される拡散に対処できない。
【０００６】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体またはＨｅｒ１／ＥＧＦＲに特異的な抗体を含む抗体の治療上の可能性を改善することについての満たされていない重要なニーズが存在する。例えば、従来の抗体と比べて改善された活性および／または他の特性を有する、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体または抗Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ抗体および抗原結合フラグメントに対するニーズが存在する。さらに、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋またはＨｅｒ１／ＥＧＦＲ＋がん、特に、ＣＮＳに転移したがんを効率的に処置するために、血液脳関門を越えて抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体または抗Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ抗体を送達することを促進する組成物および方法に対するニーズが存在する。これらの同じニーズは、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、および血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）などに特異的な抗体を含む他のがん抗原特異的抗体に適用される。
【０００７】
本発明は、これらのニーズに対処し、他の関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
全般的な態様によると、本発明は、ｐ９７ポリペプチド配列および抗体またはその抗原結合フラグメントを含む治療組成物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。いくつかの実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、細胞表面レセプターなどの細胞表面タンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体は、がん関連抗原またはがん抗原に特異的に結合する。ある特定のがん抗原は、細胞表面タンパク質およびそれらのそれぞれのリガンドを含む。特定の実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質またはヒトＨｅｒ１／ＥＧＦレセプターに特異的に結合する。
【０００９】
ある特定の態様において、ｐ９７ポリペプチド配列および抗体またはそのフラグメントは、各々、粒子、例えば、ナノ粒子、ビーズ、脂質調合物、脂質粒子またはリポソーム、例えば、免疫リポソームに結合しているか、またはそれらの中に被包されている。特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、粒子の表面上に存在し、抗体またはそのフラグメントは、粒子の表面上に存在し、かつ／または粒子の中に被包されている。
【００１０】
関連する全般的な態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合的に連結したｐ９７ポリペプチド配列を含む治療結合体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）も提供する。特定の実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する。本明細書中に記載されるように、そのような組成物および結合体は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現しているがん（ＣＮＳに転移したがんを含む）の処置において特に価値がある。
【００１１】
本発明の結合体において使用するｐ９７ポリペプチド配列は、本質的に、ｐ９７タンパク質に由来する任意のアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態において、本発明の結合体において使用するｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列である。なおも別の特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に示される配列の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００個またはそれより多くの連続したアミノ酸残基を有するヒトｐ９７タンパク質配列のフラグメントである。別の特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、可溶性ｐ９７ポリペプチド配列である。なおも別の特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、それが連結している抗体の、血液脳関門を越える輸送を促進するのに有効な配列である。
【００１２】
ｐ９７ポリペプチド配列は、種々の公知のおよび確立された方法論（その例証的な実施例は本明細書中に記載される）のいずれかを用いて、任意の治療抗体または抗原結合フラグメント（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体または抗原結合フラグメント）に結合体化され得る。これらの技法には、化学的結合体化技法が含まれる。他の実施形態において、その技法は、標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、融合ポリペプチドを作製するための技術）に依存する。
【００１３】
本発明のあるより特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、リンカーによって抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している。より特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、（ａ）ポリマー架橋剤（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）によって抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結しているか、（ｂ）ナノ粒子を介して抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結しているか、または（ｃ）リポソームを介して抗体またはその抗原結合フラグメントに作動可能に連結している。別の特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、ポリエチレングリコールを含むポリマー架橋剤によって抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している。別の特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、チオエーテル結合（複数可）を含むポリマー架橋剤によって抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している。
【００１４】
本発明に従って使用する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体またはその抗原結合フラグメントは、概して、配列番号２に示される配列を有するヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合することができる。
【００１５】
より特定の実施形態において、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、トラスツズマブまたはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体である。
【００１６】
ｐ９７抗体結合体は、ｐ９７ポリペプチド配列およびＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的抗体または抗原結合配列を含む融合ポリペプチドでもあり得る。その融合ポリペプチドは、本発明の所望の結合体を生成する通例の組換えＤＮＡ方法論を使用して都合よく共発現され得る。
【００１７】
したがって、別の態様において、本発明は、ｐ９７ポリペプチド配列および治療抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的抗体または抗原結合フラグメントを含む融合ポリペプチドをコードする単離融合ポリヌクレオチド、および該単離融合ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【００１８】
なおも別の態様によると、本発明は、ｐ９７抗体結合体またはｐ９７結合体をコードするポリヌクレオチドおよび薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００１９】
なおも別の態様によると、本発明は、本発明のｐ９７−抗体結合体を含む薬学的組成物を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現しているがんを有する被験体に投与することによってその被験体を処置するための方法を提供する。処置されるべきＨｅｒ２／ｎｅｕを発現しているがんは、ある特定の実施形態において、転移性がん、特に、ＣＮＳでの進行を特徴とする転移性がんである。
【００２０】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合的に連結したｐ９７ポリペプチド配列を含む結合体も含まれる。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、真核生物細胞表面タンパク質に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、哺乳動物細胞表面タンパク質、場合によりヒト細胞表面タンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、がん関連抗原に特異的に結合する。
【００２１】
ある特定の実施形態において、がん関連抗原は、乳がん、転移性脳がん（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、消化器がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、扁平上皮癌、ＣＮＳがんもしくは脳がん、メラノーマ、非メラノーマがん、甲状腺がん、子宮体がん、上皮性腫瘍、骨がんまたは造血がん（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）のうちの１つ以上に関連する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、がん関連抗原は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸レセプター１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子レセプター、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）およびメソテリンのうちの１つ以上から選択される。
【００２３】
ある特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、トラスツズマブ、３Ｆ８、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）（ペゴル）、アマツキシマブ（ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、アポリズマブ（ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、バビツキシマブ（ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）（メルタンシン）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、カンツズマブ（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）（メルタンシン）、カンツズマブ（ラブタンシン（ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ））、カプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｂ）（ペンデチド（ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ））、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、セツキシマブ、シタツズマブ（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）（ボガトクス（ｂｏｇａｔｏｘ））、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブ（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）（テトラキセタン（ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ））、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エドレコロマブ、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エナバツズマブ（ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファルレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、フィギツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ゲムツズマブ、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（オゾガマイシン）、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレンバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）（ベドチン）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ（ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）ラブタンシン、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（ＭＤＸ−１０１）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ（ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、レクサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）（メルタンシン）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ、マパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マツズマブ、ミラツズマブ（ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モガムリズマブ、モキセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）（パスドトクス（ｐａｓｕｄｏｔｏｘ））、ナコロマブ（ｎａｃｏｌｏｍａｂ）（タフェナトクス（ｔａｆｅｎａｔｏｘ））、ナプツモマブ（���ａｐｔｕｍｏｍａｂ）（エスタフェナトクス（ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ））、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ、ニボルマブ、Ｎｅｕｒａｄｉａｂ（登録商標）（放射性ヨウ素有りまたは無し）、ＮＲ−ＬＵ−１０、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）（モナトクス（ｍｏｎａｔｏｘ））、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、パニツムマブ、パトリツマブ（ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、パーツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、リロツムマブ（ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サマリズマブ（ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、タバルマブ（ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）（パプトクス（ｐａｐｔｏｘ））、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、チガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ、ＴＲＢＳ０７、ツコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）（セルモロイキン）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ボロシキシマブ、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）およびザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）（それらの抗原結合フラグメントを含む）のうちの１つ以上から選択される。
【００２４】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体である。
【００２５】
本明細書中に記載されるｐ９７−抗体結合体および薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物も含まれる。
【００２６】
ある特定の実施形態は、がんを有する被験体を処置するための方法に関し、その方法は、その被験体に本明細書中に記載される薬学的組成物を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その被験体は、乳がん、転移性脳がん、前立腺がん、消化器がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、扁平上皮癌、ＣＮＳがんもしくは脳がん、メラノーマ、非メラノーマがん、甲状腺がん、子宮体がん、上皮性腫瘍、骨がんまたは造血がんのうちの１つ以上から選択されるがんを有する。
【００２７】
特定の実施形態において、がんは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸レセプター１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子レセプター、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）またはメソテリンのうちの少なくとも１つの発現に関連する。ある特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体のモノクローナル抗体部分は、がん関連抗原に特異的に結合する。
【００２８】
ある特定の実施形態において、がんは、転移性結腸直腸がんまたは頭頸部がんであり、モノクローナル抗体は、Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲに特異的に結合し、かつＥＧＦＲアンタゴニストである。特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１５（Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ）（例えば、それの１つ以上の連続したまたは不連続のエピトープ）に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、がんは、ＥＧＦＲを発現している転移性結腸直腸がんである。特定の実施形態において、結腸直腸がんは、ＫＲＡＳ野生型である。ある特定の実施形態において、結合体は、イリノテカンに基づくレジメンとオキサリプラチン（ｏｘｉｐｌａｔｉｎ）に基づくレジメンの両方の失敗の後に投与される。いくつかの実施形態において、被験体は、イリノテカンに基づくレジメンに不耐性であるか、またはイリノテカンに基づく化学療法に不応性である。他の態様において、がんは、白金に基づく治療の後に進行する、頭頸部の局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）もしくは限局性に（ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ）進行した扁平上皮癌、頭頸部の再発性局所限局性疾患（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）もしくは転移性扁平上皮癌または頭頸部の再発性もしくは転移性扁平上皮癌である。いくつかの実施形態において、結合体は、放射線治療、白金に基づく治療または５−ＦＵを併用した白金に基づく治療と併用して投与される。ある特定のこれらのおよび関連する実施形態において、抗体は、セツキシマブまたはその抗原結合フラグメントである。
【００２９】
ある特定の結合体は、以下の構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−Ａｂまたはｐ９７−Ｒ１−（ＦＧｌｙ）Ａｂ
のうちの１つに係る、抗体（Ａｂ）に共有結合的に連結したｐ９７ポリペプチドを含み、ここで、Ｒ１は、少なくとも１つのアルデヒド反応性結合であり；ＦＧｌｙは、以下の構造：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号５）
を含む異種スルファターゼモチーフ内のホルミルグリシン残基であって、
ここで、Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、異種スルファターゼモチーフがｐ９７ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、必要に応じて存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、シッフ塩基を含む。特定の実施形態において、Ｒ１は、オキシム結合、ヒドラジン結合またはヒドラジンカルボチアミド結合である。
【００３１】
以下の構造：
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号６）
を含む少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフを含む単離ｐ９７ポリペプチドも含み、
ここで、Ｚ１は、システインまたはセリンであり；Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、異種スルファターゼモチーフがアルデヒドタグ化ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、必要に応じて存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸である。
【００３２】
ある特定の単離ｐ９７ポリペプチドは、以下の構造：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号５）
を含む少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフを含み、
ここで、ＦＧｌｙは、ホルミルグリシン残基であり；Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、異種スルファターゼモチーフがｐ９７ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、必要に応じて存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、単離ｐ９７ポリペプチドを、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフを含む抗体（Ａｂ）に共有結合的に連結し、ここで、そのモチーフは、以下の構造：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号５）
を含み、ここで、ＦＧｌｙは、ホルミルグリシン残基であり；Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、異種スルファターゼモチーフが抗体のＮ末端に存在するとき、必要に応じて存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸であり、ｐ９７ポリペプチドおよび抗体は、それらのそれぞれのＦＧｌｙ残基を介して共有結合的に連結することにより、ｐ９７−抗体結合体を形成する。いくつかの実施形態において、単離ｐ９７−抗体結合体は、以下の構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−（ＦＧｌｙ）Ａｂ
を含む。
【００３４】
ここで、Ｒ１およびＲ２は、同じまたは異なるアルデヒド反応性結合であり；Ｌは、リンカー部分である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＣ末端および抗体のＮ末端に存在する。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＮ末端および抗体のＣ末端に存在する。特定の実施形態において、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＮ末端および抗体のＮ末端に存在する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＣ末端および抗体のＣ末端に存在する。特定の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、独立して、シッフ塩基を含む。ある特定の場合において、Ｒ１およびＲ２は、独立して、オキシム結合、ヒドラジド結合またはヒドラジンカルボチアミド結合である。いくつかの場合において、Ｌは、ペプチド、水溶性ポリマー、検出可能な標識またはグリカンである。
【００３６】
ｐ９７ポリペプチドを作製する方法も含まれ、その方法は、ａ）導入ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞を培養する工程（ここで、導入ポリヌクレオチドは、請求項２０に記載のｐ９７ポリペプチドをコードし、宿主細胞は、Ｚ１をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を発現する）；およびｂ）９７ポリペプチドをその細胞から単離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、ｐ９７ポリペプチドは、（ｉ）アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸または（ｉｉ）アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態は、構造（Ｉ）または（ＩＩ）：
【００３８】
【化１】
2018016631.tif 000002
を含む結合体に関し、
ここで、Ｒは、ｐ９７ポリペプチドであり、Ｒｌは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントであるか；またはＲは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントであり、Ｒｌは、ｐ９７ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質または本明細書中に記載される他の細胞表面タンパク質もしくはがん関連抗原に特異的に結合する。特定の例としては、Ｈｅｒ１／ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸レセプター１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子レセプター、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）およびメソテリンが挙げられる。
【００３９】
特定の実施形態において、抗体は、トラスツズマブ、３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アラシズマブ（ペゴル）、アマツキシマブ、アポリズマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ（メルタンシン）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブ（メルタンシン）、カンツズマブ（ラブタンシン）、カプロマブ（ペンデチド）、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ボガトクス）、シクスツムマブ、クリバツズマブ（テトラキセタン）、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エナバツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ＦＢＴＡ０５、フィギツムマブ、フランボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ（オゾガマイシン）、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ（ベドチン）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、インダツキシマブラブタンシン、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１）、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（メルタンシン）、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モキセツモマブ（パスドトクス）、ナコロマブ（タフェナトクス）、ナプツモマブ（エスタフェナトクス）、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ＮＥＵＲＡＤＩＡＢ（登録商標）（放射性ヨウ素有りまたは無し）、ＮＲ−ＬＵ−１０、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ（モナトクス）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サマリズマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、タバルマブ、タプリツモマブ（パプトクス）、テナツモマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、トレメリムマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ、ＴＲＢＳ０７、ツコツズマブ（セルモロイキン）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブもしくはザルツムマブ、またはそれらの抗原結合フラグメントである。
【００４０】
ｐ９７−抗体結合体を作製する方法も含まれ、その方法は、（ａ）（ｉ）アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体またはその抗原結合フラグメントとの間；または（ｉｉ）アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体またはその抗原結合フラグメントとの間でアジド−アルキン付加環化反応を行う工程；および（ｂ）その反応物からｐ９７−抗体結合体を単離することによってｐ９７−抗体結合体を生成する工程を包含する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合的にまたは作動可能に連結したｐ９７ポリペプチド配列を含む結合体。
（項目２）
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、配列番号１を含む、項目１に記載の結合体。
（項目３）
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、配列番号１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、項目１に記載の結合体。
（項目４）
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、配列番号１の配列の少なくとも約２０アミノ酸残基を有するヒトｐ９７タンパク質配列のフラグメントを含む、項目１に記載の結合体。
（項目５）
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、可溶性ｐ９７ポリペプチド配列である、項目１に記載の結合体。
（項目６）
前記ｐ９７ポリペプチド配列および前記抗体または抗原結合フラグメントが、融合ポリペプチドとして共有結合的に連結している、項目１に記載の結合体。
（項目７）
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、リンカーによって前記抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している、項目１に記載の結合体。
（項目８）
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、（ａ）ポリマー架橋剤によって前記抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結しているか、（ｂ）ナノ粒子を介して該抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結しているか、あるいは（ｃ）リポソームを介して該抗体またはその抗原結合フラグメントに作動可能に連結している、項目１に記載の結合体。
（項目９）
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、チオエーテル結合を含むポリマー架橋剤によって前記抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している、項目１に記載の結合体。
（項目１０）
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、ポリエチレングリコールを含むポリマー架橋剤によって前記抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している、項目１に記載の結合体。
（項目１１）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２に示される配列を有するヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的である、項目１に記載の結合体。
（項目１２）
前記抗体が、トラスツズマブまたはその抗原結合フラグメントである、項目１に記載の結合体。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか１項に記載の結合体および薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物。
（項目１４）
Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現しているがんを有する被験体を処置するための方法であって、項目１３に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１５）
前記Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現しているがんが、乳がんまたは転移性脳がんである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合的にまたは作動可能に連結しているｐ９７ポリペプチド配列を含む結合体。
（項目１７）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、真核生物細胞表面タンパク質に特異的に結合する、項目１６に記載の結合体。
（項目１８）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、哺乳動物細胞表面タンパク質、場合によりヒト細胞表面タンパク質に特異的に結合する、項目１６に記載の結合体。
（項目１９）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、がん関連抗原に特異的に結合する、項目１６〜１８のいずれかに記載の結合体。
（項目２０）
前記がん関連抗原が、乳がん、転移性脳がん、前立腺がん、消化器がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、扁平上皮癌、ＣＮＳがんもしくは脳がん、メラノーマ、非メラノーマがん、甲状腺がん、子宮体がん、上皮性腫瘍、骨がんまたは造血がんのうちの１つ以上に関連する、項目１９に記載の結合体。
（項目２１）
前記がん関連抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸レセプター１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子レセプター、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）およびメソテリンのうちの１つ以上から選択される、項目１９または２０に記載の結合体。
（項目２２）
前記モノクローナル抗体が、下記の抗体の抗原結合フラグメントを含め、トラスツズマブ、３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アラシズマブ（ペゴル）、アマツキシマブ、アポリズマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ（メルタンシン）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブ（メルタンシン）、カンツズマブ（ラブタンシン）、カプロマブ（ペンデチド）、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ボガトクス）、シクスツムマブ、クリバツズマブ（テトラキセタン）、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エナバツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ＦＢＴＡ０５、フィギツムマブ、フランボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ（オゾガマイシン）、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ（ベドチン）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、インダツキシマブラブタンシン、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１）、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（メルタンシン）、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モキセツモマブ（パスドトクス）、ナコロマブ（タフェナトクス）、ナプツモマブ（エスタフェナトクス）、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ＮＥＵＲＡＤＩＡＢ（登録商標）（放射性ヨウ素有りまたは無し）、ＮＲ−ＬＵ−１０、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ（モナトクス）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サマリズマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、タバルマブ、タプリツモマブ（パプトクス）、テナツモマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、トレメリムマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ、ＴＲＢＳ０７、ツコツズマブ（セルモロイキン）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブおよびザルツムマブのうちの１つ以上から選択される、項目１６〜２１のいずれかに記載の結合体。
（項目２３）
前記モノクローナル抗体が、ヒト化モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体である、項目１６〜２２のいずれかに記載の結合体。
（項目２４）
項目１６〜２３のいずれか１項に記載の結合体および薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物。
（項目２５）
がんを有する被験体を処置するための方法であって、項目２４に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）
前記被験体が、乳がん、転移性脳がん、前立腺がん、消化器がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、扁平上皮癌、ＣＮＳがんもしくは脳がん、メラノーマ、非メラノーマがん、甲状腺がん、子宮体がん、上皮性腫瘍、骨がんまたは造血がんのうちの１つ以上から選択されるがんを有する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記がんが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸レセプター１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子レセプター、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）またはメソテリンのうちの少なくとも１つの発現に関連する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記モノクローナル抗体が、前記がん関連抗原に特異的に結合する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記がんが、転移性結腸直腸がんまたは頭頸部がんであり、前記モノクローナル抗体が、Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＧＦＲアンタゴニストである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記がんが、ＥＧＦＲを発現している転移性結腸直腸がんである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記結腸直腸がんが、ＫＲＡＳ野生型である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記結合体が、イリノテカンに基づくレジメンとオキサリプラチンに基づくレジメンの両方の失敗の後に投与する、項目２９〜３１のいずれかに記載の方法。
（項目３３）
前記被験体が、イリノテカンに基づくレジメンに不耐性であるか、またはイリノテカンに基づく化学療法に不応性である、項目２９〜３１のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記がんが、白金に基づく治療の後に進行する、頭頸部の局所的もしくは限局性に進行した扁平上皮癌、頭頸部の再発性局所限局性疾患もしくは転移性扁平上皮癌または頭頸部の再発性もしくは転移性扁平上皮癌である、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記結合体が、放射線治療、白金に基づく治療または５−ＦＵを併用した白金に基づく治療と併用して投与される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記抗体が、セツキシマブまたはその抗原結合フラグメントである、項目２９〜３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
以下の構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−Ａｂまたはｐ９７−Ｒ１−（ＦＧｌｙ）Ａｂ
のうちの１つに記載の、抗体（Ａｂ）に共有結合的に連結しているｐ９７ポリペプチドを含む結合体であって、ここで、Ｒ１は、少なくとも１つのアルデヒド反応性結合であり；ＦＧｌｙは、以下の構造：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号５）
を含む異種スルファターゼモチーフ内のホルミルグリシン残基であり、ここで、Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、該異種スルファターゼモチーフが該ｐ９７ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、必要に応じて存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸である、結合体。
（項目３８）
Ｒ１が、シッフ塩基を含む、項目３７に記載の結合体。
（項目３９）
Ｒ１が、オキシム結合、ヒドラジン結合またはヒドラジンカルボチアミド結合である、項目３７または３８に記載の結合体。
（項目４０）
以下の構造：
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号６）を含む少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフを含む単離ｐ９７ポリペプチドであって、ここで、Ｚ１は、システインまたはセリンであり；Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、該異種スルファターゼモチーフが、アルデヒドタグ化ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、必要に応じて存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸である、単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目４１）
以下の構造：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号５）
を含む少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフを含む単離ｐ９７ポリペプチドであって、ここで、ＦＧｌｙは、ホルミルグリシン残基であり；Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、該異種スルファターゼモチーフが、該ｐ９７ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、必要に応じて存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸である、単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目４２）
少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフを含む抗体（Ａｂ）に共有結合的に連結している、項目４１に記載の単離ｐ９７ポリペプチドであって、ここで、該モチーフは、以下の構造：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号５）
を含み、ここで、ＦＧｌｙは、ホルミルグリシン残基であり；Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、該異種スルファターゼモチーフが、該抗体のＮ末端に存在するとき、必要に応じて存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸であり、
該ｐ９７ポリペプチドおよび該抗体は、それらのそれぞれのＦＧｌｙ残基を介して共有結合的に連結することにより、ｐ９７−抗体結合体を形成する、単離ｐ９７ポリペプチド。（項目４３）
ｐ９７−抗体結合体が、以下の構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−（ＦＧｌｙ）Ａｂ
を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２は、同じまたは異なるアルデヒド反応性結合であり；Ｌは、リンカー部分である、項目４２に記載の単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目４４）
前記少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフが、前記ｐ９７ポリペプチドのＣ末端および前記抗体のＮ末端に存在する、項目４２または４３に記載の単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目４５）
前記少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフが、前記ｐ９７ポリペプチドのＮ末端および前記抗体のＣ末端に存在する、項目４２または４３に記載の単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目４６）
前記少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフが、前記ｐ９７ポリペプチドのＮ末端および前記抗体のＮ末端に存在する、項目４２または４３に記載の単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目４７）
前記少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフが、前記ｐ９７ポリペプチドのＣ末端および前記抗体のＣ末端に存在する、項目４２または４３に記載の単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目４８）
Ｒ１およびＲ２が、独立してシッフ塩基を含む、項目４３に記載の単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目４９）
Ｒ１およびＲ２が、独立して、オキシム結合、ヒドラジド結合またはヒドラジンカルボチアミド結合である、項目４３に記載の単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目５０）
Ｌが、ペプチド、水溶性ポリマー、検出可能な標識またはグリカンである、項目４３に記載の単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目５１）
ｐ９７ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）導入ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞を培養する工程であって、該導入ポリヌクレオチドは、項目２０に記載のｐ９７ポリペプチドをコードし、該宿主細胞は、Ｚ１をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を発現する、工程；および
ｂ）該９７ポリペプチドを該細胞から単離する工程
を包含する、方法。
（項目５２）
（ｉ）アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸または（ｉｉ）アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、単離ｐ９７ポリペプチド。
（項目５３）
以下の構造（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化３】
2018016631.tif 000003
を含む結合体であって、ここで、Ｒは、ｐ９７ポリペプチドであり、Ｒｌは、抗体またはその抗原結合フラグメントであるか；あるいはＲは、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、Ｒｌは、ｐ９７ポリペプチドである、結合体。
（項目５４）
前記抗体が、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質、Ｈｅｒ１／ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸レセプター１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子レセプター、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）またはメソテリンに特異的に結合する、項目５３に記載の結合体。
（項目５５）
前記抗体が、下記の抗体の抗原結合フラグメントを含め、トラスツズマブ、３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アラシズマブ（ペゴル）、アマツキシマブ、アポリズマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ（メルタンシン）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブ（メルタンシン）、カンツズマブ（ラブタンシン）、カプロマブ（ペンデチド）、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ボガトクス）、シクスツムマブ、クリバツズマブ（テトラキセタン）、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エナバツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ＦＢＴＡ０５、フィギツムマブ、フランボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ（オゾガマイシン）、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ（ベドチン）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、インダツキシマブラブタンシン、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１）、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（メルタンシン）、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モキセツモマブ（パスドトクス）、ナコロマブ（タフェナトクス）、ナプツモマブ（エスタフェナトクス）、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ＮＥＵＲＡＤＩＡＢ（登録商標）（放射性ヨウ素有りまたは無し）、ＮＲ−ＬＵ−１０、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ（モナトクス）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サマリズマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、タバルマブ、タプリツモマブ（パプトクス）、テナツモマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、トレメリムマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ、ＴＲＢＳ０７、ツコツズマブ（セルモロイキン）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブおよびザルツムマブのうちの１つ以上から選択される、項目５４に記載の結合体。
（項目５６）
ｐ９７−抗体結合体を作製する方法であって、
（ａ）
（ｉ）アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体またはその抗原結合フラグメントとの間；または
（ｉｉ）アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体またはその抗原結合フラグメントとの間
でアジド−アルキン付加環化反応を行う工程；および
（ｂ）該反応物からｐ９７−抗体結合体を単離し、
それによってｐ９７−抗体結合体を生成する工程
を包含する、方法。
（項目５７）
前記結合体が、細胞傷害剤に共有結合的に連結している、前記項目のいずれかに記載の結合体。
（項目５８）
前記結合体が、前記抗体を介して前記細胞傷害剤に共有結合的に連結している、項目５７に記載の結合体。
（項目５９）
前記細胞傷害剤が、リンカーによって前記抗体に共有結合的に連結している、項目５８に記載の結合体。
（項目６０）
前記結合体が、前記ｐ９７ポリペプチドを介して前記細胞傷害剤に共有結合的に連結している、項目５７に記載の結合体。
（項目６１）
前記細胞傷害剤が、リンカーによって前記ｐ９７ポリペプチドに共有結合的に連結している、項目６０に記載の結合体。
（項目６２）
前記細胞傷害剤が、下記の細胞傷害剤のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体を含め、チオテパ、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標）；スルホン酸アルキル類、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン類、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含む、エチレンイミン類およびメチルアメラミン類；ナイトロジェンマスタード類、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎物質、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）．，Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸誘導体、例えば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンディフティトックス）；エスペラミシン類；カペシタビンのうちの１つ以上である、項目５７〜６１のいずれかに記載の結合体。
【００４１】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な記載および添付の図面を参照するとき、明らかになる。本明細書中に開示されるすべての参考文献が、それらの各々が個別に援用されたかのように、参照によりそれらの全体が本明細書によって援用される。
【００４２】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトｐ９７メラノトランスフェリン（ｍｅｌａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）タンパク質（ＮＰ＿００５９２０．２）のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号２は、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質（ＮＰ＿００４４３９．２）のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号３は、配列番号１のポリペプチド配列をコードする核酸配列である。
【００４５】
配列番号４は、配列番号２のポリペプチド配列をコードする核酸配列である。
【００４６】
配列番号５および６は、ペプチドスルファターゼモチーフである。
【００４７】
配列番号８〜１４は、ペプチドリンカーである。
【００４８】
配列番号１５は、ヒトＨｅｒ１／上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ヒト乳がん細胞系ＢＴ４７４についての細胞生存率アッセイの結果を示している。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ヒト乳がん細胞系ＭＣＦ７−ＨＥＲ２についての細胞生存率アッセイの結果を示している。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、ヒト乳がん細胞系ＭＣＦ７−ベクターについての細胞生存率アッセイの結果を示している。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ヒト乳がん細胞系ＳＫＢＲ３についての細胞生存率アッセイの結果を示している。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、マウスの脳組織におけるローダミン（ｒｈｏｄ）標識タンパク質の体内分布を示している。これらの図において、「ＭＴＦ」は、ｐ９７であり、「ＢＴＡ」は、トラスツズマブであり、「ＭＴＦ−ＢＴＡ」は、ｐ９７−トラスツズマブ結合体である。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄは、マウスの脳組織におけるローダミン（ｒｈｏｄ）標識タンパク質の体内分布を示している。これらの図において、「ＭＴＦ」は、ｐ９７であり、「ＢＴＡ」は、トラスツズマブであり、「ＭＴＦ−ＢＴＡ」は、ｐ９７−トラスツズマブ結合体である。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄは、マウスの脳組織におけるローダミン（ｒｈｏｄ）標識タンパク質の体内分布を示している。これらの図において、「ＭＴＦ」は、ｐ９７であり、「ＢＴＡ」は、トラスツズマブであり、「ＭＴＦ−ＢＴＡ」は、ｐ９７−トラスツズマブ結合体である。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、マウスの脳組織におけるローダミン（ｒｈｏｄ）標識タンパク質の体内分布を示している。これらの図において、「ＭＴＦ」は、ｐ９７であり、「ＢＴＡ」は、トラスツズマブであり、「ＭＴＦ−ＢＴＡ」は、ｐ９７−トラスツズマブ結合体である。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｆは、静脈内投与の２４時間後のマウス脳における１２５Ｉ標識トラスツズマブの分布を示している。図６Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図６Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図６Ｃは、１２５Ｉ標識トラスツズマブのオートラジオグラムを示しており、それは、周囲の正常な脳組織と比較したときの抗体の増加倍数を示している。図６Ｆに示されるように、トラスツズマブ単独についてのＫｉｎ値は、正常な脳組織において約１．４６×１０−７ｍＬ／秒／ｇであり、脳転移において約３．８×１０−７ｍＬ／秒／ｇである。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｆは、静脈内投与の２４時間後のマウス脳における１２５Ｉ標識トラスツズマブの分布を示している。図６Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図６Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図６Ｃは、１２５Ｉ標識トラスツズマブのオートラジオグラムを示しており、それは、周囲の正常な脳組織と比較したときの抗体の増加倍数を示している。図６Ｆに示されるように、トラスツズマブ単独についてのＫｉｎ値は、正常な脳組織において約１．４６×１０−７ｍＬ／秒／ｇであり、脳転移において約３．８×１０−７ｍＬ／秒／ｇである。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｅは、静脈内投与の２４時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識トラスツズマブの分布を示している。図７Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図７Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図７Ｃは、１２５Ｉ標識トラスツズマブのオートラジオグラムを示しており、それは、周囲の正常な脳組織と比較したときの抗体の増加倍数を示している。図７Ｄは、様々な組織における１２５Ｉ標識トラスツズマブの組織対血液比を示しており、図７Ｅは、正常な脳組織および脳転移（Ｍｅｔｓ）における分布を示している。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｅは、静脈内投与の２４時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識トラスツズマブの分布を示している。図７Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図７Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図７Ｃは、１２５Ｉ標識トラスツズマブのオートラジオグラムを示しており、それは、周囲の正常な脳組織と比較したときの抗体の増加倍数を示している。図７Ｄは、様々な組織における１２５Ｉ標識トラスツズマブの組織対血液比を示しており、図７Ｅは、正常な脳組織および脳転移（Ｍｅｔｓ）における分布を示している。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｆは、静脈内投与の２時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図８Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図８Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図８Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図８Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図８Ｂの左は、図８Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図８Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図８Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。図８Ｆは、個別の脳転移に認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｆは、静脈内投与の２時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図８Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図８Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図８Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図８Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図８Ｂの左は、図８Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図８Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図８Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。図８Ｆは、個別の脳転移に認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図８−３】図８Ａ〜８Ｆは、静脈内投与の２時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図８Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図８Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図８Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図８Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図８Ｂの左は、図８Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図８Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図８Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。図８Ｆは、個別の脳転移に認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図８−４】図８Ａ〜８Ｆは、静脈内投与の２時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図８Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図８Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図８Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図８Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図８Ｂの左は、図８Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図８Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図８Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。図８Ｆは、個別の脳転移に認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｆは、静脈内投与の８時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図９Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図９Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図９Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図９Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図９Ｂの左は、図９Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図９Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図９Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。図９Ｆは、個別の脳転移に認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｆは、静脈内投与の８時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図９Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図９Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図９Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図９Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図９Ｂの左は、図９Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図９Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図９Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。図９Ｆは、個別の脳転移に認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図９−３】図９Ａ〜９Ｆは、静脈内投与の８時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図９Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図９Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図９Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図９Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図９Ｂの左は、図９Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図９Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図９Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。図９Ｆは、個別の脳転移に認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図９−４】図９Ａ〜９Ｆは、静脈内投与の８時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図９Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図９Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図９Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図９Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図９Ｂの左は、図９Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図９Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図９Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。図９Ｆは、個別の脳転移に認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｅは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の静脈内投与後の２および８時間の時点のデータを要約している。図１０Ａは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図１０Ｂは、正常な脳組織における結合体のレベルが、（上記２時間の時点と比べて）上記８時間の時点においてわずかにより高いこと、および脳転移における結合体のレベルが、その同じ時点において有意により高いことを示している。図１０Ｃは、正常な脳組織（１．１×１０−４ｍＬ／秒／ｇ）および脳転移（４．９×１０−４ｍＬ／秒／ｇ）におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体についての、測定されたＫｉｎ値を示している。図１０Ｄは、２および８時間後の脳組織における注射量のパーセンテージを示しており、図１０Ｅは、投与の２および８時間後の個別の脳転移における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｅは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の静脈内投与後の２および８時間の時点のデータを要約している。図１０Ａは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図１０Ｂは、正常な脳組織における結合体のレベルが、（上記２時間の時点と比べて）上記８時間の時点においてわずかにより高いこと、および脳転移における結合体のレベルが、その同じ時点において有意により高いことを示している。図１０Ｃは、正常な脳組織（１．１×１０−４ｍＬ／秒／ｇ）および脳転移（４．９×１０−４ｍＬ／秒／ｇ）におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体についての、測定されたＫｉｎ値を示している。図１０Ｄは、２および８時間後の脳組織における注射量のパーセンテージを示しており、図１０Ｅは、投与の２および８時間後の個別の脳転移における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図１０−３】図１０Ａ〜１０Ｅは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の静脈内投与後の２および８時間の時点のデータを要約している。図１０Ａは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。図１０Ｂは、正常な脳組織における結合体のレベルが、（上記２時間の時点と比べて）上記８時間の時点においてわずかにより高いこと、および脳転移における結合体のレベルが、その同じ時点において有意により高いことを示している。図１０Ｃは、正常な脳組織（１．１×１０−４ｍＬ／秒／ｇ）および脳転移（４．９×１０−４ｍＬ／秒／ｇ）におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体についての、測定されたＫｉｎ値を示している。図１０Ｄは、２および８時間後の脳組織における注射量のパーセンテージを示しており、図１０Ｅは、投与の２および８時間後の個別の脳転移における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、ｐ９７−セツキシマブ結合体のＨＰＬＣ解析を示している。図１１Ａは、室温における２４時間後の粗反応混合物のＨＰＬＣプロファイルを示しており、図１１Ｂは、精製１：１ｐ９７−セツキシマブ結合体（＞９６％純度、２２０ｎｍにおけるＨＰＬＣ検出）のサイズ排除ＨＰＬＣプロファイルを示している。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、ｐ９７−セツキシマブ結合体のＨＰＬＣ解析を示している。図１１Ａは、室温における２４時間後の粗反応混合物のＨＰＬＣプロファイルを示しており、図１１Ｂは、精製１：１ｐ９７−セツキシマブ結合体（＞９６％純度、２２０ｎｍにおけるＨＰＬＣ検出）のサイズ排除ＨＰＬＣプロファイルを示している。
【図１２】図１２は、粗反応混合物ならびにｐ９７およびセツキシマブ単独と比較したときの、精製ｐ９７−セツキシマブ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
詳細な説明
本発明は、概して、抗体またはその抗原結合フラグメントに連結したｐ９７ポリペプチド配列を含む結合体分子に関する。ｐ９７ポリペプチド配列および抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物（例えば、粒子に基づく組成物、例えば、リポソーム）も含まれる。本発明のｐ９７ポリペプチド配列は、治療抗体および診断抗体を含む任意の抗体またはその抗原結合フラグメントと結合体化させ得るかまたは構成させ得る。ある特定の治療抗体および／もしくは診断抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞表面レセプターなどの細胞表面タンパク質に特異的に結合する。
【００５１】
特定の実施形態において、抗体またはフラグメントは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する。本明細書中で証明されるように、ＨＥＲ２＋乳がんの処置において臨床上使用するヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））をｐ９７ポリペプチド配列に化学的に連結することにより、ｐ９７−抗体結合体を作製した。予想外なことに、ｐ９７−抗体結合体は、トラスツズマブ単独と比べてがん死滅化活性の有意な改善を示した。さらに、その結果から、予想どおり、トラスツズマブが培養下のヒト脳内皮（ＨＢＥ）細胞に進入しないことが確かめられた。しかしながら、ｐ９７−抗体結合体の場合、結合体のＨＢＥ細胞への著しい輸送が認められたことから、その結合体が脳組織に進入する能力を有することが示された。タンパク質結合体としてのｐ９７とトラスツズマブとの組み合わせは、ｐ９７単独およびトラスツズマブ単独の送達と比べて、血液脳関門を越える実質脳組織への送達も相乗的に増加させた。これらの予想外の知見に基づいて、本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを発現しているがん（ＣＮＳへの転移に関連するがんを含む）の改善された処置のための組成物および方法を提供する。本発明はさらに、他のタイプのがん、特に、抗体療法によって標的となり得る少なくとも１つの抗原に関連するがんの改善された処置のためのｐ９７−抗体結合体、組成物および関連する方法を提供する。
【００５２】
本発明の実施は、明確に反対のことが示されない限り、当該分野の技術範囲内の、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技法の従来の方法（それらの多くは、例証目的のために下記に記載される）を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ＆ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）および他の同様の参考文献を参照のこと。
【００５３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに他のことを指示していない限り、複数の指示対象物を含む。
【００５４】
本明細書全体を通して、文脈が別段要求しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられているエレメントもしくは整数またはエレメントもしくは整数の群を含み、他の任意のエレメントもしくは整数またはエレメントもしくは整数の群を排除しないことを意味すると理解される。
【００５５】
本明細書における各実施形態は、他のことが明示的に述べられない限り、必要な変更を加えて他のすべての実施形態に適用される。
【００５６】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）についての標準的な技法が使用され得る。酵素反応および精製の技法は、製造者の指示に従って、または当該分野において通常行われているように、または本明細書中に記載されるように、実施され得る。これらのおよび関連する技法および手順は、通常、当該分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体において引用されかつ論じられる様々な全般的な参考文献およびより詳細な参考文献に記載されているように、実施され得る。特定の定義が提供されない限り、本明細書中に記載される分子生物学、分析化学、有機合成化学ならびに医化学および薬化学に関連して使用する命名法、ならびにそれらの研究室手順および技法は、当該分野において周知かつ通常使用するものである。組換え技術、分子生物学的合成、微生物学的合成、化学的合成、化学的解析、薬学的調製、製剤化および送達、ならびに患者の処置についての標準的な技法が使用され得る。
【００５７】
本明細書中に記載されるｐ９７−抗体結合体の機能的特性は、例えば、親和性／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合的阻害アッセイ）；細胞傷害性アッセイ、細胞生存率アッセイ、細胞増殖または分化アッセイ、インビトロもしくはインビボのモデルを使用するがん細胞および／または腫瘍の成長阻害を含む、当業者に公知の種々の方法を用いてアッセイされ得る。他のアッセイは、本明細書中に記載される結合体が正常なＨｅｒ２／ｎｅｕ媒介性応答を阻止する能力を試験し得る。本明細書中に記載される結合体は、レセプターの内部移行についての効果、インビトロおよびインビボにおける効力などについても試験され得る。そのようなアッセイは、当業者に公知の十分に確立されたプロトコル（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ編  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹを参照のこと）；または商業的に入手可能なキットを用いて実施され得る。
【００５８】
Ｐ９７ポリペプチド配列
上に記載したように、本発明の例示的な結合体分子および組成物は、ｐ９７ポリペプチド配列を含む。用語「ポリペプチド」は、その従来の意味において、すなわち、アミノ酸の配列として、使用する。ポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されない；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含められ、そのような用語は、別途明確に示されない限り、本明細書中で交換可能に使用され得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を指さないかまたはそれを除外する。ポリペプチドの発現後修飾は、例えば、天然に存在するおよび天然に存在しない両方の、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など、ならびに当該分野で公知の他の修飾である。ポリペプチドは、タンパク質全体またはその部分配列であり得る。
【００５９】
ある特定の実施形態において、本発明の結合体において使用するｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に示されるヒトｐ９７配列を含む。
【００６０】
他の特定の実施形態において、本発明の結合体において使用するｐ９７ポリペプチド配列は、その長さにわたって、配列番号１に示されるヒトｐ９７配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含む。
【００６１】
なおも他の特定の実施形態において、本発明の結合体において使用するｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に示されるヒトｐ９７配列のフラグメントを含み、ここで、例えば、そのフラグメントは、配列番号１に示されるヒトｐ９７配列の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００個またはそれより多くの連続したアミノ酸（すべての中間の長さを含む）を含む。
【００６２】
他の特定の実施形態において、本発明の結合体において使用するｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に示されるヒトｐ９７配列のフラグメントを含み、ここで、そのフラグメントは、配列番号１に示されるヒトｐ９７配列の約１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下、６０個以下、７０個以下、８０個以下、９０個以下もしくは１００個以下、またはそれより多い個数以下の連続したアミノ酸（すべての中間の長さを含む）からなる。
【００６３】
なおも他の特定の実施形態において、本発明の結合体において使用するｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に示されるヒトｐ９７配列のフラグメントを含み、ここで、そのフラグメントは、配列番号１に示されるヒトｐ９７配列の約２０〜５００、２０〜４００、２０〜３００、２０〜２００、２０〜１００または２０〜５０個の連続したアミノ酸を含む。
【００６４】
ある特定の他の実施形態において、目的のｐ９７ポリペプチド配列は、血液脳関門を越えて抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を輸送するための有効なｐ９７のアミノ酸部分配列およびバリアントである。
【００６５】
他の特定の実施形態において、結合体において使用するｐ９７ポリペプチド配列は、可溶性形態のｐ９７ポリペプチド（例えば、Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐ  Ｐｕｒｉｆ．３４：２８−４８，２００４）またはそのフラグメントもしくはバリアントである。いくつかの態様において、ｐ９７ポリペプチドは、単独で、またはシグナルペプチド（配列番号１の残基１〜１９）の全部もしくは一部の欠失とともに、疎水性ドメイン（配列番号１の残基７１０〜７３８）の全部もしくは一部の欠失を有する。特定の態様において、ｐ９７ポリペプチドは、配列番号１の残基２０〜７１１（そのバリアントおよびフラグメントを含む）を含むかまたはそれからなる。
【００６６】
ある特定の他の実施形態において、本発明の結合体において使用するｐ９７フラグメントまたはバリアントは、ｐ９７レセプター、ＬＲＰ１レセプターおよび／またはＬＲＰ１Ｂレセプターに結合することができるフラグメントまたはバリアントである。
【００６７】
結合体は、存在するｐ９７および抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体配列に無関係な追加のアミノ酸も含み得ることが理解される。
【００６８】
ｐ９７ポリペプチド配列は、バリアントｐ９７ポリペプチド配列でもあり得る。ｐ９７ポリペプチド「バリアント」は、この用語が本明細書中で使用するとき、通常、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において、本明細書中に詳細に開示されるｐ９７ポリペプチドと異なるポリペプチドである。そのようなバリアントは、天然に存在し得るか、または例えば、本発明の上記ポリペプチド配列の１つ以上を改変し、本明細書中に記載されるようなそれらの活性を評価し、そして／もしくは当該分野で周知の任意のいくつかの技法を使用することによって、合成的に作製することができる。
【００６９】
多くの場合において、バリアントは、保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｎａｔｕｒｅ）が実質的に変更されないと予想するような、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸の代わりに用いられている置換である。上に記載されたように、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において改変が行われ得るが、なおも望ましい特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子が得られる。本発明のポリペプチドの等価物、または改善されたバリアントもしくはその一部を作製するためにポリペプチドのアミノ酸配列の変更が望まれるとき、当業者は、通常、表１に従って、ＤＮＡ配列をコードするコドンの１つ以上を変更する。
【００７０】
例えば、構造（例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子における結合部位）との相互作用的な結合能を大きく失うことなく、タンパク質構造物における他のアミノ酸の代わりに、ある特定のアミノ酸で置き換えることができる。タンパク質の生物学的機能活性を定めるのは、そのタンパク質の相互作用能および性質なので、ある特定のアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列、および当然のことながらその基礎をなすＤＮＡコード配列において行われ得るが、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質が得られる。したがって、開示される組成のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、その有用性を大きく失わずに様々な変更が行われ得ることが企図される。
【００７１】
【表１】
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そのような変更を行う際、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える際のアミノ酸のヒドロパシー指数の重要性は、当該分野において広く理解されている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，参照により本明細書に援用される）。アミノ酸の相対的なヒドロパシーの特質が、結果として生ずるタンパク質の二次構造に寄与し、そしてその二次構造が、他の分子、例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、および抗原などとタンパク質との相互作用を定めることが認識されている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいてヒドロパシー指数が割り当てられている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００７２】
ある特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換されても、類似の生物学的活性を有するタンパク質がもたらされ得、すなわち、生物学的機能が等価なタンパク質が得られることは、当該分野で公知である。そのような変更を行う際、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸がさらにより特に好ましい。同様のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効率的に行われ得ることも当該分野において理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が参照により本明細書に明確に援用される）は、隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。
【００７３】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸で、類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに置換しても、生物学的等価物、特に、免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることが理解されている。そのような変更において、親水性値が±２以内であるアミノ酸が好ましく、±１以内のアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。
【００７４】
ゆえに、上で概説されたように、アミノ酸の置換は一般に、アミノ酸側鎖の置換基の相対的な類似度、例えば、それらのヒドロパシー、電荷、およびサイズなどに基づく。様々な上記の特徴を考慮した例示的な置換は、当業者に周知であり、それらとしては、アルギニンとリジン；グルタメートとアスパルテート；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリンとロイシンとイソロイシンが挙げられる。
【００７５】
アミノ酸の置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、ヒドロパシーおよび／または両親媒性の性質の類似度に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する無電荷極性の頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変更に相当し得るアミノ酸の他の群としては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。バリアントは、非保存的変更も含み得るか、または非保存的変更を選択的に（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）含む。好ましい実施形態において、バリアントポリペプチドは、５つのアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸の置換、欠失または付加によって、天然の配列と異なる。バリアントは、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびヒドロパシーの性質に最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によっても、改変され得る（または選択的に改変され得る）。
【００７６】
上に記載したように、ポリペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後にタンパク質の移行を指示するシグナル（またはリーダー）配列をタンパク質のＮ末端に含み得る。ポリペプチドはまた、そのポリペプチドの合成、精製もしくは識別を容易にするため（例えば、ポリＨｉｓ）、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーもしくは他の配列に結合体化することもできる。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合体化し得る。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、任意の種々の周知の合成および／または組換え技法（後者は、下記にさらに記載される）を用いて調製することができる。一般に約１５０アミノ酸未満のポリペプチド、一部分および他のバリアントは、当業者に周知の技法を用いる、合成手段によって作製することができる。１つの例証的な実施例において、そのようなポリペプチドは、成長中のアミノ酸鎖にアミノ酸を連続的に付加する商業的に利用可能な固相法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法）のいずれかを用いて合成する。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−４６（１９６３）を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの供給業者から商業的に入手可能であり、それは、製造者の指示に従って運転され得る。
【００７８】
一般に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）は、単離される。「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」ポリペプチドは、その本来の環境から取り出されたポリペプチドである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、天然の系において共存する材料の一部または全部から分離される場合、単離される。好ましくは、そのようなポリペプチドはまた、精製され、例えば、少なくとも約９０％純度、より好ましくは、少なくとも約９５％純度、最も好ましくは、少なくとも約９９％純度である。
【００７９】
ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を比較する場合、２つの配列は、下に記載されるように一致が最大となるようアラインメントしたとき、その２つの配列におけるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が同じであるなら、「同一」であると言う。２つの配列間の比較は、代表的には、配列が類似の局所的領域を識別および比較する比較ウインドウにわたってそれらの配列を比較することによって、行われる。本明細書中で使用する「比較ウインドウ」は、２つの配列を最適にアラインメントした後に、ある配列を同じ数の連続した位置の参照配列と比較し得る場合の、少なくとも約２０個、通常、３０〜約７５個、４０〜約５０個の連続した位置のセグメントのことを指す。
【００８０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて、デフォルトのパラメータを使用して行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されているいくつかのアラインメントスキームを組み込んでいる：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ（１９７８）．Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５巻，ｓｕｐｐ．３，ｐｐ．３４５−５８（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．編）；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３：６２６−４５（１９９０）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−５３（１９８９）；Ｍｙｅｒｓら、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７（１９８８）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５（１９７１）；Ｓａｉｔｏｕら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−２５（１９８７）；Ｓｎｅａｔｈら、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ（１９７３）；Ｗｉｌｂｕｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−３０（１９８３）。
【００８１】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈら、Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２（１９８１）の局所同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって、行われ得る。
【００８２】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの１つの好ましい例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、例えば本明細書中に記載されるパラメータとともに使用することにより、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについてのパーセント配列同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコア行列を使用することができる。各方向におけるワードヒット（ｗｏｒｄ  ｈｉｔ）の拡張は、累積アラインメントスコアが、その最高到達値から量Ｘだけ低下したとき；累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基のアラインメントの累積に起因してゼロ以下になったとき；またはいずれかの配列の末端に達したとき、中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。
【００８３】
１つの好ましいアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントした配列を少なくとも２０個の位置の比較のウインドウにわたって比較することによって決定し、ここで、その比較ウインドウ内のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の一部は、それら２つの配列の最適なアラインメントについて、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較したとき、２０パーセント以下、通常、５〜１５パーセントまたは１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。そのパーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定することにより、マッチした位置の数を得て、そのマッチした位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、その結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算する。
【００８４】
抗体
本発明の結合体または組成物において使用する抗体または抗原結合フラグメントは、本質的に任意のタイプであり得る。特定の例としては、治療抗体および診断抗体が挙げられる。当該分野で周知であるように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、標的（例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用するとき、その用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、それらのフラグメント（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの合成バリアント、天然に存在するバリアント、必要とされる特異性を有する抗原結合フラグメントを有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性を有する抗原結合部位またはフラグメント（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された構造（ｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎ））も含む。遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性フラグメントである「ダイアボディ」（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３）もまた、本明細書中で企図される抗体の特定の形態である。ＣＨ３ドメインに結合させたｓｃＦｖを含むミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）もまた本明細書中に含められる（Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６）。例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３；Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６；Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６を参照のこと。
【００８５】
用語「抗原結合フラグメント」は、本明細書中で使用するとき、目的の抗原、例えば、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に結合する免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチドフラグメントのことを指す。この点において、本明細書中に記載される抗体の抗原結合フラグメントは、治療上または診断上の標的（例えば、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ）に結合する抗体のＶＨおよびＶＬ配列の１、２、３、４、５個または６個すべてのＣＤＲを含み得る。
【００８６】
用語「抗原」とは、抗体などの選択的結合作用物質（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）が結合することが可能であり、さらに、動物において使用するとその抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生させることが可能である、分子または分子の一部のことを指す。抗原は、１つまたはそれより多くのエピトープを有し得る。
【００８７】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターへの特異的結合が可能な任意の決定基、好ましくは、ポリペプチド決定基を含む。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態において、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面の群（例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル）を含み、ある特定の実施形態において、特定の３次元構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。ある特定の実施形態において、抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を優先的に認識するとき、抗原に特異的に結合すると言われる。抗体は、その平衡解離定数が≦１０−７または１０−８Ｍであるとき、抗原に特異的に結合すると言われる。いくつかの実施形態において、平衡解離定数は、≦１０−９Ｍまたは≦１０−１０Ｍであり得る。
【００８８】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載されるような抗体およびその抗原結合フラグメントは、重鎖ＣＤＲセットおよび軽鎖ＣＤＲセット（それぞれ、ＣＤＲに支持を提供し、かつＣＤＲの空間的関係を、互いに関して定める重鎖および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）セットの間にある）を含む。本明細書中で使用するとき、用語「ＣＤＲセット」とは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域のことを指す。これらの領域は、重鎖または軽鎖のＮ末端から続けて、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表される。ゆえに、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々由来のＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識単位」と称される。いくつかの抗原抗体複合体の結晶学的解析から、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合される抗原との広範な接触を形成することが証明されており、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。したがって、分子認識単位は、主に抗原結合部位の特異性に関与する。
【００８９】
本明細書中で使用するとき、用語「ＦＲセット」とは、重鎖または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを形作る４つの隣接アミノ酸配列のことを指す。いくつかのＦＲ残基は、結合した抗原と接触し得る；しかしながら、ＦＲは、主にＶ領域の抗原結合部位への折り畳みに関与し、特に、そのＦＲ残基は、ＣＤＲに直接隣接する。ＦＲ内では、ある特定のアミノ残基およびある特定の構造的特徴は、非常に高度に保存されている。この点において、すべてのＶ領域配列が、およそ９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が結合部位に折り畳まれるとき、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出ループモチーフとして表れる。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、ＣＤＲループがある特定の「カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」構造に折り畳まれるその形状に影響するＦＲの保存された構造領域が存在することが広く認識されている。さらに、ある特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合性のドメイン間接触に関与すると知られている。
【００９０】
免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第４版  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７およびその最新版（インターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）上で現在入手可能なもの）を参照することにより決定され得る。
【００９１】
「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団のことを指し、ここで、そのモノクローナル抗体は、エピトープの選択的結合に関わるアミノ酸（天然に存在するおよび天然に存在しない）を含む。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一のエピトープに対して指向する。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体だけでなく、それらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、それらのバリアント、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性およびエピトープに結合する能力を有する抗原結合フラグメント（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された構造も含む。それは、抗体の供給源またはそれが作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物など）について限定することを意図していない。この用語は、「抗体」の定義の下において上に記載された免疫グロブリン全体ならびにフラグメントなどを含む。
【００９２】
タンパク分解性酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断することにより、いくつかのフラグメントをもたらし、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）フラグメント）の各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合性のヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断し、それにより、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントを含むいくつかのフラグメントを提供することができる。本発明のある特定の実施形態に従って使用するためのＦｖフラグメントは、ＩｇＭおよびごくまれにＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク分解性切断によって生成され得る。しかしながら、Ｆｖフラグメントは、より一般的には、当該分野で公知の組換え技法を用いて得られる。Ｆｖフラグメントは、天然の抗体分子の抗原認識能および抗原結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【００９３】
ある特定の実施形態において、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体が企図される。例えば、カッパーボディ（Ｋａｐｐａ  ｂｏｄｙ）（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９−５７（１９９７）；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５３０５−９（１９９４）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ９０：６４４４−８（１９９３）；またはＪａｎｕｓｉｎｓ（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２（１９９２）は、所望の特異性を有する抗体の選択に関して本願の教示に従って標準的な分子生物学技法を用いて調製され得る。
【００９４】
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結したＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される共有結合的に連結したＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。天然には集合しているが化学的に分離される、抗体Ｖ領域の軽鎖および重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造と実質的に類似の３次元構造に折り畳まれるｓＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するいくつかの方法が記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらに対する米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらに対する米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと。
【００９５】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載されるような抗体は、ダイアボディの形態である。ダイアボディは、ポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１ドメインおよび免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２ドメインを含み、それらの２つのドメインは連結している（例えば、ペプチドリンカーによって）が、互いに結合して抗原結合部位を形成することができず：抗原結合部位は、その多量体内の１つのポリペプチドの第１ドメインとその多量体内の別のポリペプチドの第２ドメインとの結合によって形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。抗体のｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））。
【００９６】
二重特異性抗体が使用される場合、これらは、種々の方法において製作され得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６−４４９（１９９３））、例えば、化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製され得る、従来の二重特異性抗体であり得るか、または上で言及された任意の二重特異性抗体フラグメントであり得る。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、唯一の可変ドメインを使用してＦｃ領域無しで構築され、それにより、抗イディオタイプ反応の影響が潜在的に減少し得る。
【００９７】
二重特異性ダイアボディは、二重特異性完全抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは対照的に、大腸菌において容易に構築および発現され得るので、特に有用であり得る。適切な結合特異性を有するダイアボディ（および抗体フラグメントなどの他の多くのポリペプチド）は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を使用してライブラリーから容易に選択され得る。ダイアボディの一方のアームが、例えば、抗原Ｘに対して指向する特異性を有するように一定に維持される場合、他方のアームが変更されたライブラリーが作製され得、適切な特異性を有する抗体が選択され得る。二重特異性完全抗体は、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）操作によって作製され得る（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６）。
【００９８】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供され得る。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照のこと；例えば、ＵＳ２００９０２２６４２１も参照のこと）。この抗体技術は、現行の小さい抗体形式（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ）よりも長い治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）を有すると予期される安定的なより小さい抗体形式を作り出す。ＩｇＧ４抗体は、不活性であると考えられるので、免疫系と相互作用しない。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、その抗体のヒンジ領域を除去することによって改変され、それにより、対応するインタクトなＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）と比べ異なる安定性特性を有する半分子フラグメントが得られ得る。ＩｇＧ４分子を半分にすることにより、同族抗原（ｃｏｇｎａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）（例えば、疾患標的）に結合し得る１つの領域だけがＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）に残され、ゆえにそのＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上のただ１つの部位に一価で結合する。ある特定のがん細胞表面抗原の場合、この一価の結合は、同じ抗原特異性を有する二価の抗体を使用するときに認められ得るような、そのがん細胞が成長するのを刺激しない可能性があり、ゆえに、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）技術は、従来の抗体による処置に不応性であり得るいくつかのタイプのがんに対して処置の選択肢を提供し得る。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）が小さいサイズであることは、がんのいくつかの形態を処置するとき、大きな利点であり得、それにより、より大きな固形腫瘍に対してより良好なその分子の分布がもたらされ、潜在的に効力を高める。
【００９９】
ある特定の実施形態において、本開示の抗体は、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）の形態をとり得る。ナノボディは、単一の遺伝子によってコードされ、ほとんどすべての原核生物および真核生物の宿主、例えば、大腸菌（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号を参照のこと）、カビ（例えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ、ＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号を参照のこと）において効率的に産生される。その産生プロセスは、拡大でき、数キログラムの量のナノボディが産生されている。ナノボディは、長い有効期間を有する使用準備済みの液剤として製剤化され得る。ナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）法（例えば、ＷＯ０６／０７９３７２を参照のこと）は、Ｂ細胞の自動化されたハイスループット選択に基づいて、所望の標的に対するナノボディを作製するための専有の方法である。
【０１００】
ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。これは、キメラ分子であって、通常、組換え技法を用いて調製される、非ヒト種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位、ならびにヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づくその分子の残りの免疫グロブリン構造を有するキメラ分子のことを指す。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変ドメインまたは可変ドメインの適切なフレームワーク領域に移植したＣＤＲだけのいずれかを含み得る。エピトープ結合部位は、野生型であってもよいし、１つ以上のアミノ酸置換によって改変されてもよい。これにより、ヒト個体における免疫原としての定常領域は排除されるが、外来可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｑｕｅｅｎら、ＰＮＡＳ（１９８８）８６：１００２９−１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３−３２７）。抗体をヒト化するための例証的な方法としては、米国特許第７，４６２，６９７号に記載されている方法が挙げられる。
【０１０１】
別のアプローチは、ヒト由来の定常領域を提供することだけでなく、可変領域をできるだけヒトの形態に近く再形成するように可変領域を改変することにも注目している。重鎖と軽鎖の両方の可変領域が、所与の種において比較的保存されており、推定的にはＣＤＲに対して足場を提供する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に隣接した３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（それは、対象のエピトープに応じて異なり、結合能を決定する）を含むことが知られている。非ヒト抗体が、特定のエピトープに対して調製されるとき、可変領域は、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、改変するべきヒト抗体に存在するＦＲに移植することによって、「再形成」または「ヒト化」され得る。このアプローチの様々な抗体への適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．，ら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．，ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．，ら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．，ら（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，ら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．，ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４によって報告されている。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列を保存している（例えば、マウス抗体由来の６つすべてのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）。他の実施形態において、ヒト化抗体は、元の抗体の１つ以上のＣＤＲ「に由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる、元の抗体に対して変更された１つ以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６個）を有する。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、キメラ抗体であり得る。この点において、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に作動可能に連結したまたは別の方法で融合した抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、異種Ｆｃドメインは、ヒト起源である。他の実施形態において、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）およびＩｇＭを含む、親抗体と異なるＩｇクラスに由来し得る。さらなる実施形態において、異種Ｆｃドメインは、異なるＩｇクラスの１つ以上に由来するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み得る。ヒト化抗体に関して上に記載したように、キメラ抗体の抗原結合フラグメントは、本明細書中に記載される抗体のＣＤＲの１つ以上（例えば、本明細書中に記載される抗体の１、２、３、４、５または６個のＣＤＲ）だけを含み得るか、または可変ドメイン全体（ＶＬ、ＶＨまたは両方）を含み得る。
【０１０３】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（これらは、本明細書中で交換可能に使用する）エピトープは、当該分野において十分に理解された用語であり、そのような特異的結合または優先的結合を決定する方法も当該分野で周知である。
【０１０４】
ある分子は、それが代替の細胞または物質と反応または結合するよりも、特定の細胞または物質と、より頻繁に、より迅速に、より長い時間にわたっておよび／またはより大きな親和性で反応または結合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体は、それが他の物質に結合するよりも、より大きな親和性、アビディティーで、より容易におよび／またはより長い時間にわたって結合する場合、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、特定のエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、それが他のエピトープに結合するよりも、より大きな親和性、アビディティーで、より容易におよび／またはより長い時間にわたってその特異的エピトープに結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合することもあるし、しないこともあることが理解される。同様に、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも独占的な結合を要求しない（が、それを含み得る）。通常、結合についての言及は、優先的結合のことを意味するが、必ずしもそうでない。
【０１０５】
免疫学的結合とは通常、例えば、限定ではなく例証目的で、静電気的、イオン性、親水性および／もしくは疎水性の引力または反発力、立体力、水素結合、ファンデルワールス力ならびに他の相互作用の結果として、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンに対して特異的な抗原との間に生じるタイプの非共有結合性相互作用のことを指す。免疫学的結合相互作用の強度もしくは親和性は、その相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関して表現され得、ここで、Ｋｄが小さいほど親和性が大きいことを表す。選択したポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を用いて定量化し得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度の測定を伴い、ここで、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向におけるその速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、「オン（ｏｎ）速度定数」（Ｋｏｎ）と「オフ（ｏｆｆ）速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに結合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しないすべてのパラメータの削除を可能にし、ゆえに、解離定数Ｋｄに等しい。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を広く参照のこと。
【０１０６】
ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、がん関連抗原またはがん抗原に特異的に結合する。例示的ながん抗原としては、細胞表面レセプターなどの細胞表面タンパク質が挙げられる。そのような細胞表面タンパク質またはレセプターに結合するリガンドもがん関連抗原として含まれる。特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、細胞内のがん抗原に特異的に結合する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、がん抗原に関連するがんは、乳がん、転移性脳がん、前立腺がん、消化器がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、扁平上皮癌、ＣＮＳがんもしくは脳がん、メラノーマ、非メラノーマがん、甲状腺がん、子宮体がん、上皮性腫瘍、骨がんまたは造血がんのうちの１つ以上である。
【０１０８】
特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦレセプター、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸レセプター１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子レセプター、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）およびメソテリンから選択される少なくとも１つのがん抗原に特異的に結合する。
【０１０９】
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する。本質的に任意の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗原結合フラグメントまたは他のＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的結合作用物質が、本発明のｐ９７−抗体結合体を作製する際に使用され得る。例証的な抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、例えば、米国特許第５，６７７，１７１号；同第５，７２０，９３７号；同第５，７２０，９５４号；同第５，７２５，８５６号；同第５，７７０，１９５号；同第５，７７２，９９７号；同第６，１６５，４６４号；同第６，３８７，３７１号；および同第６，３９９，０６３号（これらの内容は、その全体が参照により援用される）に記載されている。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＨｅｒ１／ＥＧＦＲ（上皮成長因子レセプター）に特異的に結合する。本質的に任意の抗Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ抗体、抗原結合フラグメントまたは他のＨｅｒ１−ＥＧＦＲ特異的結合作用物質が、本発明のｐ９７−抗体結合体を作製する際に使用され得る。例証的な抗Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ抗体は、例えば、米国特許第５，８４４，０９３号；同第７，１３２，５１１号；同第７，２４７，３０１号；同第７，５９５，３７８号；同第７，７２３，４８４号；同第７，９３９，０７２号；および同第７，９６０，５１６号（これらの内容は、その全体が参照により援用される）に記載されている。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、抗体は、例示的な抗体（例えば、３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アラシズマブ（ペゴル）、アマツキシマブ、アポリズマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ（メルタンシン）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブ（メルタンシン）、カンツズマブ（ラブタンシン）、カプロマブ（ペンデチド）、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ボガトクス）、シクスツムマブ、クリバツズマブ（テトラキセタン）、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エナバツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ＦＢＴＡ０５、フィギツムマブ、フランボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ（オゾガマイシン）、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ（ベドチン）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、インダツキシマブラブタンシン、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１）、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（メルタンシン）、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モキセツモマブ（パスドトクス）、ナコロマブ（タフェナトクス）、ナプツモマブ（エスタフェナトクス）、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ｎｅｕｒａｄｉａｂ（登録商標）（放射性ヨウ素有りまたは無し）、ＮＲ−ＬＵ−１０、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ（モナトクス）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サマリズマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、タバルマブ、タプリツモマブ（パプトクス）、テナツモマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、トレメリムマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ、ＴＲＢＳ０７、トラスツズマブ、ツコツズマブ（セルモロイキン）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブおよびザルツムマブ）を含む抗がん治療抗体である。これらの抗体のフラグメント、バリアントおよび誘導体も含まれる。
【０１１２】
特定の実施形態において、本発明の結合体において使用する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））またはそのフラグメントもしくは誘導体である。トラスツズマブは、ヒト乳がんの処置について承認されたＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的モノクローナル抗体である。本明細書中で証明されるように、トラスツズマブ抗体へのｐ９７アミノ酸配列の結合体化は、予想外にも、トラスツズマブ抗体単独を用いるときよりも高いレベルのがん細胞死滅化をもたらした。さらに、ｐ９７−抗体結合体のＨＢＥ細胞への著しい輸送が認められ、これは、その結合体が血液脳関門を越える送達にとって有効であることを示唆した。さらなるデータは、治療有効濃度のｐ９７−トラスツズマブ結合体が、そのような結合体の全身性（例えば、静脈内）投与によっても、脳組織転移に達し得ることを強く示唆している。これらのデータは、ｐ９７およびトラスツズマブが、ｐ９７−トラスツズマブ結合体を正常な脳組織よりも脳転移に選択的に向かわせるように、およびトラスツズマブ単独よりも有意に速い速度で（約１０００倍）相乗的に働くことも示唆している。したがって、ｐ９７への結合体化は、血液脳関門だけでなく血液腫瘍関門も越えるトラスツズマブの輸送を増大させる。さらに、他の組織と比べて心臓組織への分布が減少したので、これらのデータは、ｐ９７への結合体化がトラスツズマブなどの抗体の心毒性作用を減少させ得ることを示唆している。したがって、本発明のｐ９７−抗体結合体は、ある特定の実施形態において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現しているがん（ＣＮＳに転移したがんを含むがこれらに限定されない）の処置において特定の利点をもたらす。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合フラグメントは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体のＣＤＲの１つ以上を含む。この点において、いくつかの場合において、抗体のＶＨＣＤＲ３だけの移行を行うことができるが、なおも所望の特異的結合を保持することが示されている（Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ（１９９５）９２：２５２９−２５３３）。ＭｃＬａｎｅら、ＰＮＡＳ（１９９５）９２：５２１４−５２１８，Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：２１６１−２１６２もまた参照のこと。
【０１１４】
特定の実施形態において、本発明の結合体において使用する抗Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））またはそのフラグメントもしくは誘導体である。ある特定の実施形態において、抗Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲ結合フラグメントは、セツキシマブなどのＨｅｒ１／ＥＧＦＲ抗体のＣＤＲの１つ以上を含む。セツキシマブは、頭頸部がんおよび結腸直腸がんの処置について承認されている。セツキシマブは、ヒトＩｇＧ１重鎖およびカッパー軽鎖定常（フレームワーク）領域とともに、ヒトＥＧＦＲのＮ末端部分に特異的な２２５マウスＥＧＦＲモノクローナル抗体のＦｖ（可変；抗原結合）領域から構成される。
【０１１５】
抗体は、当業者に公知の任意の種々の技法によって調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。目的のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技法およびそれについて改善されたものを用いて調製され得る。ヒト抗体を発現させるためにマウスなどのトランスジェニック動物を使用する方法も含まれる。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６，１９９６；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１，１９９４；およびＬｏｎｂｅｒｇら、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：６５−９３，１９９５を参照のこと。特定の例としては、ＲＥＧＥＮＥＲＥＸ（登録商標）によるＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）プラットフォーム（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号を参照のこと）が挙げられる。
【０１１６】
抗体は、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母ディスプレイライブラリーを使用することによっても生成または同定することができる（例えば、米国特許第７，２４４，５９２号；Ｃｈａｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１：７５５−７６８，２００６を参照のこと）。利用可能なライブラリーの非限定的な例としては、クローニングしたまたは合成のライブラリー（例えば、ヒト抗体レパートリーの構造多様性が、７つの重鎖可変領域遺伝子および７つの軽鎖可変領域遺伝子によって表される、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ））が挙げられる。これらの遺伝子の組み合わせは、マスターライブラリーにおいて４９個のフレームワークをもたらす。高度に可変性の遺伝子カセット（ＣＤＲ＝相補性決定領域）をこれらのフレームワークに重ね合わせることによって、莫大なヒト抗体レパートリーが再度作製され得る。軽鎖可変領域をコードするヒトドナー起源フラグメント、重鎖ＣＤＲ−３、重鎖ＣＤＲ−１における多様性をコードする合成ＤＮＡおよび重鎖ＣＤＲ−２における多様性をコードする合成ＤＮＡを用いてデザインしたヒトライブラリーも含まれる。使用に適した他のライブラリーは、当業者に明らかである。本明細書中に記載されるおよび当該分野で公知のｐ９７ポリペプチドは、精製プロセス、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程において使用され得る。
【０１１７】
直ぐ上に記載されたこれらの技法は、それ自体当該分野において公知である。しかしながら、当業者は、そのような技法を、抗体またはその抗原結合フラグメントを得るため、および本明細書中に記載される本発明のいくつかの実施形態に従って、それらをｐ９７ポリペプチド配列に共有結合的に結合させるために使用することができる。
【０１１８】
Ｐ９７−抗体結合体
ｐ９７ポリペプチド配列と抗体またはその結合フラグメントとの結合体化は、標準的な化学的、生化学的および／または分子技法を用いて行われ得る。実際に、本開示に照らして、当該分野において認識されている利用可能な方法論を用いて、ｐ９７−抗体結合体を作製する方法は明らかである。当然のことながら、本発明の結合体の主要な構成要素を連結するとき、使用する結合体化の技法および生じる連結化学反応が、結合体の個別の構成要素の所望の機能性または活性を実質的に妨げないことが通常好ましい。
【０１１９】
ある特定の実施形態において、本発明の結合体は、異種ポリペプチド配列を抗体または抗原結合配列に結合させるために、当該分野で公知の任意の好適な連結基または連結タイプを使用し得る。好ましくは、結合体の抗原（例えば、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質、ヒトＨｅｒ１／ＥＧＦＲ）結合能および／または活性は、使用する結合体化の技法の結果として、例えば、結合体化していない抗体（例えば、結合体化していない抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体）と比べて、実質的に低下しない。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、好適な抗体またはその結合フラグメント（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕモノクローナル抗体）に直接または間接的に（例えば、リンカー基を介して）結合させ得る（例えば、共有結合的に結合させ得る）。ｐ９７ポリペプチド配列と抗体との間の直接的な反応は、各々が他方と反応することができる置換基を有するとき、可能である。例えば、一方における求核基（例えば、アミノまたはスルフヒドリル基）は、他方におけるカルボニル含有基（例えば、無水物または酸ハロゲン化物）または優良な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応することができ得る。
【０１２１】
あるいは、リンカー基を介して、ｐ９７ポリペプチド配列および抗体またはその結合フラグメント（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体またはその結合フラグメント）を結合させることが望ましい場合がある。リンカー基は、結合能、標的化能または他の機能性の干渉を回避するために、抗体とｐ９７ポリペプチド配列との間隔を開けるスペーサーとしても機能し得る。リンカー基は、作用物質（ａｇｅｎｔ）におけるまたは抗体における置換基の化学反応性を高めるように、およびゆえに結合効率を高めるようにも役立ち得る。化学反応性の増大はまた、他の方法では可能にならない、作用物質の使用または作用物質における官能基の使用を促進し得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、２つ以上のｐ９７ポリペプチド配列を抗体（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体）に結合させることまたはその逆を行うことが望ましい場合がある。例えば、ある特定の実施形態において、複数のｐ９７ポリペプチド配列を、１つの抗体分子またはその結合フラグメントに結合させる。１つの実施形態において、複数のｐ９７ポリペプチド配列を、１つの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体分子またはその結合フラグメントに結合させる。それらのｐ９７ポリペプチド配列は、同じであり得るかまたは異なり得る。特定の実施形態に関係なく、複数のｐ９７ポリペプチド配列を含む結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、２つ以上のポリペプチドを、抗体分子に直接結合させ得るか、または結合のための複数の部位を提供するリンカーを使用し得る。種々の任意の公知のヘテロ二官能性架橋ストラテジーが、本発明の結合体を作製するために使用され得る。これらの実施形態の多くが、結合体化／架橋手順の間に使用する材料の化学量論を制御することによって達成され得ることが理解される。
【０１２３】
本発明のより特定の実施形態において、アミン−スルフヒドリル架橋剤（ａｍｉｎｅ−ｔｏ−ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）が、結合体を調製するために使用する。１つの好ましい実施形態において、例えば、その架橋剤は、中程度の長さのシクロヘキサン安定化スペーサーアーム（８．３オングストローム）の反対端にＮＨＳ−エステルおよびマレイミド反応基を含むスルフヒドリル架橋剤であるスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＳＭＣＣは、その後のｐ９７ポリペプチド配列との反応のためのスルフヒドリル反応性のマレイミド活性化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用され得る、切断可能でない膜透過性架橋剤である。ＮＨＳエステルは、ｐＨ７〜９において第１級アミンと反応して、安定なアミド結合を形成する。マレイミドは、ｐＨ６．５〜７．５においてスルフヒドリル基と反応して、安定なチオエーテル結合を形成する。したがって、ＳＭＣＣのアミン反応性ＮＨＳエステルは、迅速に抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の第１級アミンと架橋し、次いで、生じたスルフヒドリル反応性マレイミド基が使用可能となって、ｐ９７のシステイン残基と反応し、目的の特定の結合体がもたらされる。
【０１２４】
ある特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、露出したスルフヒドリル基を含むように改変され、架橋を促進する、例えば、マレイミド活性化抗体（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体）との架橋を促進する。より特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列は、保護されたチオールスルフヒドリル基を付加するように第１級アミンを改変する試薬を用いて改変される。さらにより特定の実施形態において、試薬Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、チオール化（ｔｈｉｏｌａｔｅｄ）ｐ９７ポリペプチドを生成する。
【０１２５】
他の特定の実施形態において、マレイミド活性化抗体が、好適な条件下において、チオール化ｐ９７ポリペプチドと反応することにより、本発明の結合体が生成される。これらの反応におけるＳＭＣＣとＳＡＴＡと抗体（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体）とｐ９７ポリペプチドとの比を操作することによって、異なる化学量論、分子量および特性を有する結合体を生成することが可能であることが理解される。
【０１２６】
上で論じた（および下記で例証される）特定の架橋ストラテジーは、本発明の結合体を作製する際に使用され得る好適な結合体化ストラテジーの多くの例の１つにすぎない。他の種々の二官能性または多官能性試薬（ホモ官能性とヘテロ官能性の両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログに記載されているもの））が、リンカー基として使用され得ることは、当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化炭水化物残基を介して行われ得る。そのような方法を記載している数多くの参考文献が存在する（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）。
【０１２７】
他の例証的な実施形態において、結合体は、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号およびＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されている連結基などの連結基を含む。例証的な連結基としては、例えば、ジスルフィド（ｄｉｓｕｆｉｄｅ）基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が挙げられる。
【０１２８】
なおも他の例証的な実施形態において、結合体は、二機能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性（ｂｉｓ−ａｃｔｉｖｅ）フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製される。特定のカップリング剤には、ジスルフィド結合をもたらす、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。上記リンカーは、１つ以上の切断可能な構成要素の放出を促進する「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカーが使用され得る（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）。
【０１２９】
他の実施形態において、非タンパク質性ポリマーが、ｐ９７ポリペプチド配列をＨｅｒ２／ｎｅｕ抗体などの抗体に結合するためのリンカーにおいて使用する。これらとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールの共重合体、およびポリプロピレングリコールなどが挙げられ得る。
【０１３０】
結合体の１つの構成要素が、その結合体から遊離したときにより強力であり得る場合、細胞への内部移行の間または内部移行の際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましい場合がある。いくつかの異なる切断可能なリンカー基が報告されている。これらのリンカー基からの作用物質の細胞内放出についての機序は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒに対する米国特許第４，４８９，７１０号）による、光不安定結合への照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらに対する米国特許第４，６２５，０１４号）による、誘導体化したアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらに対する米国特許第４，６３８，０４５号）による、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）による、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらに対する米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０１３１】
ある特定の実施形態は、ｐ９７ポリペプチドと抗体またはその抗原結合フラグメントとの間の結合体化を促進するために１つ以上のアルデヒドタグを使用し得る（参照により援用される米国特許第８，０９７，７０１号および同第７，９８５，７８３号を参照のこと）。ここで、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用を介したアルデヒドタグのスルファターゼモチーフにおける酵素改変によって、ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基が生成する。次いで、そのＦＧｌｙ残基のアルデヒド部分は、目的の部分とそのポリペプチドとの部位特異的結合のための化学的ハンドルとして利用され得る。いくつかの態様において、その目的の部分は、抗体などの別のポリペプチドである。
【０１３２】
したがって、特定の実施形態は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの異種スルファターゼモチーフを含むｐ９７ポリペプチドまたは抗体または抗原結合フラグメント（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体）を含み、ここで、そのモチーフは、以下の構造：
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号６）
を含み、
ここで、Ｚ１は、システインまたはセリンであり；Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、異種スルファターゼモチーフがアルデヒドタグ化ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、好ましくはそれが存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸である。
【０１３３】
上に記載されたモチーフを有するポリペプチドは、ＦＧＥ酵素によって改変されることにより、ＦＧｌｙ残基を有するモチーフを生成し得、次いでそのＦＧｌｙ残基は、上に記載したように、例えばリンカー部分を介した、第２のポリペプチドの部位特異的結合に使用され得る。そのような改変は、例えば、ＦＧＥ酵素を発現する哺乳動物細胞、酵母細胞もしくは細菌細胞においてスルファターゼモチーフ含有ポリペプチド（例えば、ｐ９７、抗体）を発現させることによって、または単離ＦＧＥ酵素による単離ポリペプチドのインビトロ改変によって行われ得る（Ｗｕら、ＰＮＡＳ．１０６：３０００−３００５，２００９；ＲｕｓｈおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１３０：１２２４０−１，２００８；ならびにＣａｒｌｓｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３：２０１１７−２５，２００８を参照のこと）。
【０１３４】
ゆえに、いくつかの実施形態は、ホルミルグリシン残基を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの異種スルファターゼモチーフを含むｐ９７ポリペプチドまたは抗体（または抗原結合フラグメント）を含み、ここで、そのモチーフは、以下の構造：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号５）
を含み、
ここで、ＦＧｌｙは、ホルミルグリシン残基であり；Ｚ２は、プロリンまたはアラニン残基であり；Ｘ１は、存在するかまたは存在せず、そしてそれが存在するとき、それは任意のアミノ酸であり、ここで、Ｘ１は、異種スルファターゼモチーフがアルデヒドタグ化ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、好ましくはそれが存在し；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して任意のアミノ酸である。
【０１３５】
特定の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸または極性無電荷アミノ酸である。例えば、Ｘ１は、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴであり得；Ｘ２および／またはＸ３は、独立して、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであり得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、異種スルファターゼモチーフ（複数可）は、（ａ）１６アミノ酸残基長未満（約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５残基長を含む）であり得るか、（ｂ）ポリペプチドのＮ末端に位置し得るか、（ｃ）ポリペプチドのＣ末端に位置し得るか、（ｄ）ポリペプチドの本来のアミノ酸配列の内部の部位に位置し得るか、（ｅ）ポリペプチドの末端のループに位置し得るか、（ｆ）ポリペプチドの翻訳後修飾の部位（例えば、グリコシル化部位）に位置し得るか、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態において、１つ以上の異種スルファターゼモチーフ（複数可）を含む抗体は、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕに特異的に結合する（例えば、トラスツズマブ）。
【０１３７】
いくつかの実施形態は、（ｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ｐ９７ポリペプチドおよび（ｉｉ）アルデヒド反応基によって官能化した抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその逆の結合体に関し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）を、スルファターゼモチーフのＦＧｌｙ残基およびアルデヒド反応基を介して共有結合的に連結する。そのような結合体は、以下の一般構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−Ａｂまたはｐ９７−Ｒ１−（ＦＧｌｙ）Ａｂ
のうちの１つを有し得、
ここで、Ｒ１は、少なくとも１つのアルデヒド反応性結合であり；ＦＧｌｙは、異種スルファターゼ内のホルミルグリシン残基である。
【０１３８】
非アルデヒドタグ含有タンパク質（例えば、抗体、ｐ９７ポリペプチド）は、１つ以上のアルデヒド反応基（例えば、アミノオキシ、ヒドラジドおよびチオセミカルバジド）によって官能化し、次いで、少なくとも１つのＦＧｌｙ残基を介してアルデヒドタグ含有ポリペプチドに共有結合的に連結してアルデヒド反応性結合を形成し得る。アミノオキシ官能化タンパク質の結合により、ＦＧｌｙ残基とその官能化タンパク質との間にオキシム結合を形成し；ヒドラジド官能化タンパク質の結合により、ＦＧｌｙ残基とその官能化タンパク質との間にヒドラジン結合を形成し；チオセミカルバジド官能化タンパク質の結合により、ＦＧｌｙ残基とその官能化タンパク質との間にヒドラジンカルボチアミド結合を形成する。
【０１３９】
ある特定の実施形態は、（ｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ｐ９７ポリペプチドおよび（ｉｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有抗体の結合体を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、それらのそれぞれのＦＧｌｙ残基を介して、必要に応じて二官能化したリンカー部分によって、共有結合的に連結される。例えば、ある特定のｐ９７−抗体結合体は、以下の構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−（ＦＧｌｙ）Ａｂ
を含み得、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、同じまたは異なるアルデヒド反応性結合であり；Ｌは、リンカー部分であり、ｐ９７（ＦＧｌｙ）は、アルデヒドタグ含有ｐ９７ポリペプチドであり、（ＦＧｌｙ）Ａｂは、アルデヒドタグ含有抗体（例えば、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕに特異的に結合する抗体（例えば、トラスツズマブ））である。単なる例証目的で、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＣ末端および抗体のＮ末端に存在し得る。他の実施形態において、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＮ末端および抗体のＣ末端に存在し得る。なおも他の実施形態において、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＮ末端および抗体のＮ末端に存在し得る。さらなる実施形態において、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＣ末端および抗体のＣ末端に存在し得る。上に記載したように、少なくとも１つの異種モチーフは、ｐ９７ポリペプチドおよび／または抗体の内部の位置に存在し得る。当業者は、他の組み合わせが可能であることを認識する。
【０１４０】
Ｒ１およびＲ２のアルデヒド反応性結合は独立して、（ｉ）アルデヒドタグのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基と、（ｉｉ）前記アルデヒド反応基によって官能化したリンカー部分（例えば、同じであり得るかまたは異なり得る２つのアルデヒド反応基によって二官能化したリンカー）との間に共有結合を形成する任意のアルデヒド反応基によって形成し得る。アルデヒド反応基の例としては、アミノオキシ、ヒドラジドおよびチオセミカルバジド基が挙げられる（それらは、ＦＧｌｙ残基とシッフ塩基を含む結合（それぞれオキシム結合、ヒドラジン結合およびヒドラジンカルボチアミド結合を含む）を形成する）。ゆえに、Ｒ１およびＲ２は、独立して、シッフ塩基を含む結合（例えば、オキシム結合、ヒドラジン結合またはヒドラジンカルボチアミド結合）であり得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、アルデヒドタグ含有ｐ９７ポリペプチドおよびアルデヒドタグ含有抗体を、多官能化したリンカー（例えば、二官能化したリンカー）（後者は、同じまたは異なるアルデヒド反応基（複数可）によって官能化する）を介して連結する（例えば、共有結合的に連結する）。これらのおよび関連する実施形態において、アルデヒド反応基は、リンカーが、ｐ９７ポリペプチドと抗体との間に共有結合性架橋を、それらのそれぞれのＦＧｌｙ残基を介して形成することを可能にする。リンカー部分は、１つ以上のアルデヒド反応基によって官能化し得る、そして、好ましくは、二官能化または多官能化し得る、任意の部分または化学物質を含む。特定の例としては、ペプチド、水溶性ポリマー、検出可能な標識、他の治療化合物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（例えば、細胞傷害性化合物）、ビオチン／ストレプトアビジン部分およびグリカンが挙げられる（Ｈｕｄａｋら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１３３：１６１２７−３５，２０１１を参照のこと）。グリカン（またはグリコシド）の特定の例としては、アミノオキシグリカン（例えば、グリコシルＮ−ペンテノイルヒドロキサメート中間体から構成される高次（ｈｉｇｈｅｒ−ｏｒｄｅｒ）グリカン（上掲））が挙げられる。
【０１４２】
ペプチドリンカー（またはスペーサー）は、下に記載する。ペプチドリンカーは、当該分野における通例の技法に従って、アルデヒド反応基によって官能化し得る（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏら、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．３：３２１−３２２，２００７を参照のこと）。
【０１４３】
「水溶性ポリマー」とは、水に可溶性であり、通常、実質的に非免疫原性であり、通常、約１，０００ダルトンを超える原子分子量（ａｔｏｍｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を有するポリマーのことを指す。水溶性ポリマーを介した２つのポリペプチドの結合は、そのような改変（複数可）が、血清半減期を延長することによって、例えば、タンパク分解性に対する安定性を高めることおよび／または腎クリアランスを減少させることによって、治療指数を高め得る場合、妥当であり得る。さらに、１つ以上のポリマーを介した結合は、タンパク質医薬の免疫原性を低下させ得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、約１０，０００Ｄａを超える、約２０，０００〜５００，０００Ｄａを超える、約４０，０００Ｄａ〜３００，０００Ｄａを超える、約５０，０００Ｄａ〜７０，０００Ｄａを超える、通常、約６０，０００Ｄａを超える、有効な水力学的分子量を有する。「有効な水力学的分子量」とは、水系サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定したとき、ポリマー鎖の有効な水溶媒和サイズのことを指す。水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド繰り返し単位（例えば、エチレンオキシド繰り返し単位）を有するポリマー鎖を含むとき、各鎖は、約２００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａまたは約１，５００Ｄａ〜約４２，０００Ｄａの原子分子量を有し得、２，０００〜約２０，０００Ｄａが、特に興味深い。直鎖状、分枝状および末端が荷電した水溶性ポリマーも含まれる。
【０１４５】
アルデヒドタグ化ポリペプチド間のリンカーとして有用なポリマーは、広範な範囲の分子量およびポリマーサブユニットを有し得る。これらのサブユニットは、生物学的ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組み合わせを含み得る。そのような水溶性ポリマーの例としては、デキストランおよびデキストラン誘導体（デキストラン硫酸、Ｐ−アミノ架橋デキストリンおよびカルボキシメチルデキストリンを含む）、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む）、デンプンおよびデキストリン、ならびにデンプンの誘導体および加水分解産物（ｈｙｄｒｏｙｌａｃｔｅ）、ポリアルキレン（ｐｏｌｙａｌｋｌｙｅｎｅ）グリコールおよびその誘導体（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体を含む）（前記ホモポリマーおよび共重合体は、置換されていないかまたは一方の末端においてアルキル基で置換されている）、ヘパリンおよびヘパリンのフラグメント、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルトアミドならびにポリオキシエチル化ポリオールが、そのデキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体とともに挙げられる。具体的に記載した水溶性ポリマーの様々な誘導体も含まれることが認識される。
【０１４６】
水溶性ポリマー、特に、ポリアルキレンオキシド系ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール「ＰＥＧ」）は、当該分野で公知である（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；およびＰｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編，ＡＣＳ（１９９７）；ならびに国際特許出願：ＷＯ９０／１３５４０、ＷＯ９２／００７４８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８９３７、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９６／２３７９４、ＷＯ９８／０７７１３、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３０７２７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３３４８３、ＷＯ９９／５３９５１、ＷＯ０１／２６６９２、ＷＯ９５／１３３１２、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９９／４５９６４および米国特許第４，１７９，３３７号；同第５，０７５，０４６号；同第５，０８９，２６１号；同第５，１００，９９２号；同第５，１３４，１９２号；同第５，１６６，３０９号；同第５，１７１，２６４号；同第５，２１３，８９１号；同第５，２１９，５６４号；同第５，２７５，８３８号；同第５，２８１，６９８号；同第５，２９８，６４３号；同第５，３１２，８０８号；同第５，３２１，０９５号；同第５，３２４，８４４号；同第５，３４９，００１号；同第５，３５２，７５６号；同第５，４０５，８７７号；同第５，４５５，０２７号；同第５，４４６，０９０号；同第５，４７０，８２９号；同第５，４７８，８０５号；同第５，５６７，４２２号；同第５，６０５，９７６号；同第５，６１２，４６０号；同第５，６１４，５４９号；同第５，６１８，５２８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，６３７，７４９号；同第５，６４３，５７５号；同第５，６５０，３８８号；同第５，６８１，５６７号；同第５，６８６，１１０号；同第５，７３０，９９０号；同第５，７３９，２０８号；同第５，７５６，５９３号；同第５，８０８，０９６号；同第５，８２４，７７８号；同第５，８２４，７８４号；同第５，８４０，９００号；同第５，８７４，５００号；同第５，８８０，１３１号；同第５，９００，４６１号；同第５，９０２，５８８号；同第５，９１９，４４２号；同第５，９１９，４５５号；同第５，９３２，４６２号；同第５，９６５，１１９号；同第５，９６５，５６６号；同第５，９８５，２６３号；同第５，９９０，２３７号；同第６，０１１，０４２号；同第６，０１３，２８３号；同第６，０７７，９３９号；同第６，１１３，９０６号；同第６，１２７，３５５号；同第６，１７７，０８７号；同第６，１８０，０９５号；同第６，１９４，５８０号；同第６，２１４，９６６号（これらは参照により援用される）を参照のこと）。
【０１４７】
例示的な目的のポリマーとしては、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドまたはそれらの誘導体を含むポリマー（式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシド繰り返し単位を含むポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドを含む）が挙げられる。さらなる例示的な目的のポリマーとしては、式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−の約１，０００ダルトンを超える分子量を有するポリアミドが挙げられ、式中、ＸおよびＹは、同じであっても異なってもよく、かつ分枝状であっても直鎖状であってもよい二価のラジカルであり、ｎは、２〜１００、通常、２〜５０の不連続整数であり、ここで、ＸおよびＹのいずれかまたは両方が、直鎖状であっても分枝状であってもよい、生体適合性の実質的に非抗原性の水溶性繰り返し単位を含む。
【０１４８】
さらなる例示的な水溶性繰り返し単位は、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシドを含む。そのような水溶性の繰り返し単位の数は、大きく異なり得、そのような単位の通常の数は、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、および最も通常では２〜５０である。例示的な実施形態は、ＸおよびＹの一方または両方が、−（（ＣＨ２）ｎ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ２−（ＣＨ２）−または−（（ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）から選択されるものであり、式中、ｎ１は、１〜６、１〜５、１〜４、および最も通常では１〜３であり、ｎ２は、２〜５０、２〜２５、２〜１５、２〜１０、２〜８、および最も通常では２〜５である。さらなる例示的な実施形態は、他のバリエーションの中でも、Ｘが−（ＣＨ２−ＣＨ２）−であり、Ｙが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）−であるものである。
【０１４９】
ビオチン／ストレプトアビジン（またはアビジン）部分については、アルデヒドタグ（複数可）含有ｐ９７ポリペプチドを、アルデヒド反応基によって官能化させるビオチン分子にＦＧｌｙ残基を介して共有結合的に結合させ得、かつ、アルデヒドタグ（複数可）含有抗体を、アルデヒド反応基によって官能化させるストレプトアビジン分子にＦＧｌｙ残基を介して共有結合的に結合させ得るか、またはその逆であり得る。次いで、ｐ９７−ビオチン（またはストレプトアビジン）は、抗体−ストレプトアビジン（またはビオチン）と混合することにより、ビオチンとストレプトアビジンとの強力な相互作用を介するｐ９７−抗体結合体を形成し得る。
【０１５０】
ｐ９７−抗体結合体は、モジュール式であり、範囲が広く、非常に高収量をもたらし、非クロマトグラフ法によって除去され得る主に無害な副産物を生成し、立体特異的であり得るが必ずしもエナンチオ選択性でない反応を含む様々な「クリックケミストリー」技法によっても調製することができる（Ｋｏｌｂら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４０：２００４−２０２１，２００１を参照のこと）。特定の例としては、「アジド−アルキン付加環化」反応とも称される、アジドおよびアルキンのＨｕｉｓｇｅｎ１，３−双極子付加環化を使用する結合体化の技法が挙げられる（Ｈｅｉｎら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２５：２２１６−２２３０，２００８を参照のこと）。アジド−アルキン付加環化反応の非限定的な例としては、銅触媒アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応およびルテニウム触媒アジド−アルキン付加環化（ＲｕＡＡＣ）反応が挙げられる。
【０１５１】
ＣｕＡＡＣは、広範な温度範囲にわたって働き、水性の条件および４〜１２のｐＨ範囲にわたって非感受性であり、広範な範囲の官能基を許容する（Ｈｉｍｏら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１２７：２１０−２１６，２００５を参照のこと）。活性なＣｕ（Ｉ）触媒は、還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを使用して、例えば、Ｃｕ（Ｉ）塩またはＣｕ（ＩＩ）塩から生成し得る。この反応により、１，４−置換した生成物が形成され、それは領域特異的になる（Ｈｅｉｎら、上掲を参照のこと）。
【０１５２】
ＲｕＡＡＣは、末端のアルキンへのアジドの付加環化を触媒することができ、それにより位置選択的に１，５−二置換１，２，３−トリアゾールをもたらす、ペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウムクロリド［Ｃｐ＊ＲｕＣｌ］複合体を利用する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．９：５３３７−５３３９，２００７を参照のこと）。さらに、ＣｕＡＡＣとは対照的に、ＲｕＡＡＣを、内部のアルキンとともに使用して、完全に置換した１，２，３−トリアゾールも提供し得る。
【０１５３】
したがって、ある特定の実施形態は、アジド側鎖またはアルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸（内部および末端の非天然アミノ酸（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端）を含む）を含むｐ９７ポリペプチドを含む。ある特定のこれらのｐ９７ポリペプチドを、インビボまたはインビトロ（例えば、無細胞系）における、アジド側鎖またはアルキン側鎖を含む非天然アミノ酸の組み込みによって形成することができる。例示的なインビボの技法としては、例えば、改変した大腸菌を使用する細胞培養法が挙げられ（ＴｒａｖｉｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８５：１１０３９−４４，２０１０；ならびにＤｅｉｔｅｒｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．１５：１５２１−１５２４，２００５を参照のこと）、例示的なインビトロの技法としては、無細胞系が挙げられる（Ｂｕｎｄｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２１：２５５−６３，２０１０を参照のこと）。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを、アジド−アルキン付加環化によって、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化する。他の実施形態において、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを、アジド−アルキン付加環化によって、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化する。ゆえに、ある特定の実施形態は、１，２，３−トリアゾール結合を介して抗体に共有結合的に連結したｐ９７ポリペプチドを含む結合体を含む。特定の実施形態において、抗体は、トラスツズマブなどの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体である。
【０１５５】
特定のｐ９７−抗体結合体は、以下のＣｕＡＡＣに基づく反応またはＲｕＡＡＣに基づく反応によって形成させて、以下のそれぞれの構造（Ｉ）または（ＩＩ）を含み得る：
【０１５６】
【化２】
2018016631.tif 000005
ここで、Ｒは、ｐ９７ポリペプチドであり、Ｒｌは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントであるか；またはＲは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントであり、Ｒｌは、ｐ９７ポリペプチドである。
【０１５７】
上に記載したように、いくつかの実施形態において、アジド側鎖を有する非天然アミノ酸および／またはアルキン側鎖を有する非天然アミノ酸は、末端のアミノ酸（Ｎ末端、Ｃ末端）である。ある特定の実施形態において、非天然アミノ酸の１つ以上は、内部に存在する。特定の実施形態は、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化した、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。他の実施形態は、アルキン側鎖を有するＣ末端の非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化した、アジド側鎖を有するＣ末端の非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおも他の実施形態は、アルキン側鎖を有するＣ末端の非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化した、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化した、アジド側鎖を有するＣ末端の非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
【０１５８】
他の実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化した、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおもさらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＣ末端の非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化した、アルキン側鎖を有するＣ末端の非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＣ末端の非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化した、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおもさらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然アミノ酸を含む抗体に結合体化した、アルキン側鎖を有するＣ末端の非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
【０１５９】
（ａ）（ｉ）アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体またはその抗原結合フラグメントとの間；または（ｉｉ）アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体またはその抗原結合フラグメントとの間でアジド−アルキン付加環化反応を行う工程；および（ｂ）その反応物からｐ９７−抗体結合体を単離することによってｐ９７−抗体結合体を生成する工程を包含する、ｐ９７−抗体結合体を作製する方法も含まれる。
【０１６０】
ｐ９７−抗体結合体が融合ポリペプチドである場合、その融合ポリペプチドは、通常、化学的結合体化を含む標準的な技法を用いて調製し得る。しかしながら、好ましくは、融合ポリペプチドは、下記に記載されるような発現系において組換えポリペプチドとして発現される。本発明の融合ポリペプチドは、１コピーまたは複数コピーのｐ９７ポリペプチド配列を含み得、任意の所望の配置で存在する１コピーまたは複数コピーの抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体またはその抗原結合フラグメント）を含み得る。
【０１６１】
ペプチドリンカー配列を使用して、各ポリペプチドが確実にその二次構造および三次構造に折り畳まれるために十分な距離だけ第１および第２のポリペプチド構成要素を引き離すことができる。そのようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技法を用いて融合ポリペプチドに組み込まれ得る。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）拡張された可撓性のコンフォメーションをとることができること；（２）第１および第２のポリペプチドにおける機能性エピトープと相互作用し得る二次構造をとることができないこと；および（３）ポリペプチド機能性エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基を欠いていること。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、通常、１〜約５０アミノ酸長であり得る。第１および第２のポリペプチドが、機能ドメインを引き離すためおよび立体的干渉を防ぐために使用され得る非必須のＮ末端のアミノ酸領域を有するとき、リンカー配列は必要とされない。
【０１６２】
ある特定の例証的な実施形態において、ペプチドスペーサーは、１〜５アミノ酸、５〜１０アミノ酸、５〜２５アミノ酸、５〜５０アミノ酸、１０〜２５アミノ酸、１０〜５０アミノ酸、１０〜１００アミノ酸または任意のその間の範囲のアミノ酸である。他の例証的な実施形態において、ペプチドスペーサーは、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多くのアミノ酸長を含む。特定のリンカーは、約１〜２００アミノ酸、１〜１５０アミノ酸、１〜１００アミノ酸、１〜９０アミノ酸、１〜８０アミノ酸、１〜７０アミノ酸、１〜６０アミノ酸、１〜５０アミノ酸、１〜４０アミノ酸、１〜３０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜５アミノ酸、１〜４アミノ酸、１〜３アミノ酸または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくはそれより多くのアミノ酸という全体のアミノ酸長を有し得る。
【０１６３】
ペプチドリンカーは、本明細書の他の箇所に記載されているようなおよび当該分野で公知であるような任意の１つ以上の天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸（複数可）、アミノ酸アナログおよび／またはアミノ酸模倣物を使用し得る。リンカーとして有用に使用され得るある特定のアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているアミノ酸配列を含む。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒおよび／またはＡｓｎ残基を含む。他の中性に近いアミノ酸（例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ）もまた、所望であれば、ペプチドリンカー配列において使用され得る。
【０１６４】
ある特定の例示的なリンカーは、以下のようなＧｌｙ、Ｓｅｒおよび／またはＡｓｎ含有リンカーを含む：［Ｇ］ｘ、［Ｓ］ｘ、［Ｎ］ｘ、［ＧＳ］ｘ、［ＧＧＳ］ｘ、［ＧＳＳ］ｘ、［ＧＳＧＳ］ｘ（配列番号７）、［ＧＧＳＧ］ｘ（配列番号８）、［ＧＧＧＳ］ｘ（配列番号９）、［ＧＧＧＧＳ］ｘ（配列番号１０）、［ＧＮ］ｘ、［ＧＧＮ］ｘ、［ＧＮＮ］ｘ、［ＧＮＧＮ］ｘ（配列番号１１）、［ＧＧＮＧ］ｘ（配列番号１２）、［ＧＧＧＮ］ｘ（配列番号１３）、［ＧＧＧＧＮ］ｘ（配列番号１４）リンカー、ここで、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはそれより大きい。これらのおよび関連するアミノ酸の他の組み合わせは、当業者に明らかである。
【０１６５】
特定の実施形態において、リンカー配列は、３つのグリシン残基を含むＧｌｙ３リンカー配列を含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合部位とペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ．９０：２２５６−２２６０，１９９３；およびＰＮＡＳ．９１：１１０９９−１１１０３，１９９４）またはファージディスプレイ法によって、可撓性リンカーを合理的にデザインすることができる。
【０１６６】
ペプチドリンカーは、生理的に安定であり得るか、または遊離可能なリンカー（例えば、生理的に分解可能または酵素的に切断可能なリンカー（例えば、タンパク分解性に（ｐｒｏｔｅａｌｙｔｉｃａｌｌｙ）切断可能なリンカー））を含み得る。ある特定の実施形態において、１つ以上の遊離可能なリンカーは、結合体のより短い半減期およびより速いクリアランスをもたらし得る。これらのおよび関連する実施形態は、リンカー分解の後はｐ９７配列を実質的に含まない抗体を血流に（またはＢＢＢを越えて）送達しつつも、例えば、血流中のｐ９７−抗体結合体の溶解性を高めるためおよび血液循環中の存在時間を延長するために使用され得る。これらの態様は、抗体が、ｐ９７配列に永続的に結合体化されたとき低い活性を示す場合に、特に有用である。そのような抗体は、本明細書中に提供されるようなリンカーを使用することによって、結合体化された形態のとき、治療活性を維持し得る。これらのおよび他の方法において、ｐ９７−抗体結合体の特性がより効率的に調整され得、期間の経過と共に、抗体の生物活性と循環半減期のバランスを取ることができる。
【０１６７】
特定の実施形態において、遊離可能なリンカーは、ｐＨ７．４、２５℃、例えば、生理学的ｐＨ、ヒト体温（例えば、インビボ、血清中、所与の組織内）において、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間もしくは約９６時間またはそれより長い半減期、あるいはその間の任意の半減期を有する。当業者であれば、ｐ９７−抗体結合体の半減期が、特定の遊離可能なリンカーを使用することによって細かく調整され得ることを認識する。
【０１６８】
しかしながらある特定の実施形態において、ペプチドリンカーの任意の１つ以上は、随意である。例えば、第１および第２のポリペプチドが、機能ドメインを引き離すためおよび立体的干渉を防ぐために使用され得る非必須のＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸領域を有するとき、リンカー配列は必要とされない場合がある。
【０１６９】
他の実施形態において、本明細書中に記載されるようなｐ９７抗体結合体をさらに、別の治療化合物に結合体化し得るか、または作動可能に連結し得る。その結合体は、例えば、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、抗脈管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤、トキシン、放射性同位体または他の治療上活性な作用物質を含み得る。
【０１７０】
融合ポリヌクレオチド、宿主細胞および組換え産生
本発明はさらに、ある特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチドおよび本発明の９７−抗体結合体（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体または抗原結合フラグメントおよびｐ９７ポリペプチド配列またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む融合ポリペプチド）をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。アルデヒドタグを含むｐ９７ポリペプチドおよび抗体をコードする単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド、ならびに少なくとも１つの非天然アミノ酸、例えば、アジド側鎖またはアルキン側鎖を有する非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドおよび抗体、ならびに関連する宿主細胞も含まれる。これらのおよび関連する実施形態は、本明細書中に記載されるｐ９７−抗体融合タンパク質および非融合結合体の組換え産生のために使用され得る。
【０１７１】
融合タンパク質の場合、ｐ９７および抗体（例えば、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体）の構成要素をコードするＤＮＡ配列を、別個に組み立て、次いで、適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。１つのポリペプチド構成要素をコードするＤＮＡ配列の３’末端を、配列の読み枠が一致するように、ペプチドリンカー有りまたは無しで、第２のポリペプチド構成要素をコードするＤＮＡ配列の５’末端にライゲーションする。ライゲーションしたＤＮＡ配列を、好適な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結する。ＤＮＡの発現に関与する調節エレメントは、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’にだけ配置される。同様に、翻訳を終結させるために必要な終止コドンおよび転写終結シグナルは、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して３’にだけ存在する。これにより、両方の構成要素のポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳が可能になる。
【０１７２】
同様の技法、主に、調節エレメント（例えば、プロモーター、終止コドンおよび転写終結シグナル）の配置が、非融合結合体を作製するための非融合タンパク質、例えば、ｐ９７ポリペプチドおよび抗体の組換え産生に適用され得る。
【０１７３】
本発明のポリヌクレオチドおよび融合ポリヌクレオチドは、ｐ９７ポリペプチド配列をコードする１コピーもしくは複数コピーの核酸を含み得、そして／または抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする１コピーもしくは複数コピーの核酸を含み得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、対象のｐ９７ポリペプチド、抗体および／またはｐ９７−抗体融合物をコードする核酸は、宿主細胞に直接導入され、その細胞は、コードされるポリペプチド（複数可）の発現を誘導するのに十分な条件下でインキュベートされる。本開示のポリペプチド配列は、本明細書中に提供されるポリペプチド配列および核酸配列と組み合わせて、当業者に周知の標準的な技法を用いて調製され得る。
【０１７５】
ゆえに、ある特定の関連する実施形態によると、本明細書中に記載されるようなポリヌクレオチドまたは融合ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供される。宿主細胞におけるｐ９７ポリペプチド、抗体またはｐ９７−抗体融合物の発現は、上記ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、都合よく達成し得る。発現による産生の後、そのポリペプチド（複数可）は、任意の好適な技法を用いて単離および／または精製され得、次いで、所望のとおり使用され得る。
【０１７６】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該分野において利用可能な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞および他の多くの細胞が挙げられる。通常の好ましい細菌宿主は、大腸菌である。
【０１７７】
大腸菌などの原核生物細胞における抗体および抗原結合フラグメントの発現は、当該分野において十分に確立されている。概説として、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９：５４５−５５１（１９９１）を参照のこと。培養下の真核生物細胞における発現もまた、抗体またはその抗原結合フラグメントの産生のための選択肢として、当業者に利用可能であり、最近の概説、例えば、Ｒｅｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３−５６０を参照のこと。
【０１７８】
必要に応じて適切な制御配列（プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む）を含む好適なベクターが選択され得るかまたは構築され得る。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージまたはファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。核酸の操作のため、例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の解析における多くの公知の技法およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２またはそれについてのその後の最新版に詳細に記載されている。
【０１７９】
用語「宿主細胞」は、本明細書中に記載されるポリペプチドの１つ以上をコードする核酸配列が導入されているかまたは導入されていることが可能であり、さらに、選択した目的の遺伝子（例えば、本明細書中に記載される任意のポリペプチドをコードする遺伝子）を発現するかまたは発現することができる、細胞のことを指すために使用する。この用語は、子孫が元の親と形態または遺伝子構造が同じであるか否かに関係なく、選択した遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫を含む。宿主細胞は、ある特定の特徴、例えば、スルファターゼモチーフ内のシステインもしくはセリン残基をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の発現、または、アジド側鎖、アルキン側鎖または他の所望の側鎖を有する非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込んで結合体化を促進することができるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（複数可）の発現について選択され得る。
【０１８０】
したがって、そのような核酸（複数可）を宿主細胞に導入する工程を包含する方法も企図される。その導入は、任意の利用可能な技法を使用し得る。真核生物細胞の場合、好適な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニアまたは昆虫細胞の場合、バキュロウイルスを使用した形質導入が挙げられ得る。細菌細胞の場合、好適な技法としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用したトランスフェクションが挙げられ得る。その導入の後には、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能にすること、例えば、遺伝子を発現するための条件下で宿主細胞を培養することが続き得る。１つの実施形態において、核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）にインテグレートされる。インテグレーションは、標準的な技法に従って、そのゲノムとの組み換えを促進する配列を含めることによって促進され得る。
【０１８１】
本発明は、ある特定の実施形態において、特定のポリペプチド（例えば、本明細書中に記載されるようなｐ９７ポリペプチド、抗体またはｐ９７−抗体融合タンパク質）を発現させるために、上に記載したような構築物をある発現系において使用する工程を包含する方法も提供する。
【０１８２】
例証的には、所望であれば、各ポリペプチドが確実にその二次構造および三次構造に折り畳まれるために十分な距離だけｐ９７−抗体融合タンパク質の構成要素を引き離すために、ペプチドリンカー／スペーサー配列が使用され得る。そのようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技法を用いて融合ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０１８３】
組成物および使用方法
本開示は、ｐ９７−抗体結合体を含む組成物および本発明の組成物ならびに治療目的のためのそのような組成物の投与も提供する。
【０１８４】
純粋な形態または適切な薬学的組成物での、本明細書中に記載される結合体の投与は、同様の効用をもたらすためのある薬剤の承認された任意の投与様式を介して行われ得る。薬学的組成物は、結合体または結合体含有組成物を、適切な生理的に許容され得るキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせることによって調製され得、固体、半固体、液体または気体の形態の調製物（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェアおよびエアロゾル剤）に製剤化され得る。さらに、他の薬学的に活性な成分（本明細書中の他の箇所に記載されるような他の抗がん剤を含む）および／または好適な賦形剤（例えば、塩、緩衝剤および安定剤）が、組成物内に存在してよいが、存在する必要はない。投与は、経口、非経口、鼻、静脈内、皮内、皮下または局所をはじめとした種々の異なる経路によって達成され得る。好ましい投与様式は、処置または予防される状態の性質に依存する。投与後に、がんの進行および／または転移を減少させるか、阻害するか、予防するかまたは遅延させる量は、有効であると考えられる。
【０１８５】
キャリアは、例えば、使用する投与量および濃度において、それに曝露される細胞または哺乳動物にとって無毒性である薬学的に許容され得るキャリア、賦形剤または安定剤を含み得る。生理的に許容され得るキャリアは、水性のｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理的に許容され得るキャリアの例としては、緩衝剤（例えば、ホスフェート、シトレートおよび他の有機酸）；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標））ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））など）が挙げられる。
【０１８６】
本発明は、ｐ９７ポリペプチド配列ならびに任意の治療抗体および／もしくは診断抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する抗体もしくはフラグメントまたは本明細書中に記載される他の抗体）を含む治療組成物を提供する。
【０１８７】
ある特定の態様において、ｐ９７ポリペプチド配列および抗体またはそのフラグメントは、各々、個別にまたは既存の結合体として、粒子、例えば、ナノ粒子、ビーズ、脂質調合物、脂質粒子またはリポソーム、例えば、免疫リポソームに結合されるかまたはその中に被包される。例えば、特定の実施形態において、ｐ９７ポリペプチド配列を、粒子の表面に結合させ、抗体またはそのフラグメントを、粒子の表面に結合させ、かつ／または粒子内に被包させる。ある特定のこれらのおよび関連する実施形態において、ｐ９７ポリペプチドおよび抗体を、粒子自体（例えば、ナノ粒子、リポソーム）を介してのみ互いに共有結合的にまたは作動可能に連結させ、他の任意の方法では互いに共有結合的に連結させない；すなわち、それらは、個別に同じ粒子に結合される。他の実施形態において、ｐ９７ポリペプチドおよび抗体は、まず、本明細書中に記載されるように（例えば、リンカー分子を介して）互いに共有結合的に結合体化され、次いで、粒子（例えば、免疫リポソーム、ナノ粒子）に結合されるかまたはその中に被包される。特定の実施形態において、粒子は、リポソームであり、組成物は、１つ以上のｐ９７ポリペプチド、１つ以上の抗体またはその抗原結合フラグメントおよびリポソームを形成する脂質の混合物（例えば、リン脂質、界面活性剤の特性を有する混合脂質鎖）を含む。いくつかの態様において、ｐ９７ポリペプチドおよび抗体（または抗原結合フラグメント）を個別に、リポソーム構造の形成により、共有結合性の結合体化の必要なく、ｐ９７ポリペプチドと抗体とが作動可能に連結するように、脂質／リポソーム混合物と混合する。他の態様において、ｐ９７ポリペプチドおよび抗体（または抗原結合フラグメント）を、まず、本明細書中に記載されるように互いに共有結合的に結合体化し、次いで、脂質と混合することにより、リポソームが形成される。ｐ９７ポリペプチド、抗体またはｐ９７抗体−結合体は、例えば、コアセルベーション法もしくは界面重合（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル）によって、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、調製されたマイクロカプセルに封入され得る。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｌｏ，Ａ．編，（１９８０）に開示されている。粒子（複数可）またはリポソームは、他の細胞傷害剤をさらに含み得る。
【０１８８】
正確な投与量および処置期間は、処置される疾患に応じて変化するものであり、公知の試験プロトコルを用いて、または当該分野で公知のモデル系において組成物を試験し、それから外挿することによって、経験的に決定され得る。比較臨床試験も行われ得る。投与量は、緩和される状態の重症度によっても変動し得る。薬学的組成物は通常、望ましくない副作用を最小限にしつつ、治療上有用な効果を発揮するように製剤化され、投与する。その組成物は、一度だけ投与し得るか、またはある時間間隔で投与するいくつかのより少ない用量に分割され得る。任意の特定の被験体に対しては、特定の投与レジメンが個体のニーズに従って時間をかけて調整され得る。
【０１８９】
結合体含有組成物は、単独で、または他の公知のがん処置（例えば、放射線治療、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法など）と併用して投与され得る。その組成物はまた、抗生物質と併用して投与され得る。
【０１９０】
したがって、これらのおよび関連する薬学的組成物を投与する代表的な経路としては、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸、膣および鼻腔内が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用する非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入の技法を含む。本発明のある特定の実施形態に係る薬学的組成物は、その組成物が患者に投与されたとき、その中に含まれる活性成分が生物学的に利用可能になるように、製剤化される。被験体または患者に投与する組成物は、１つ以上の投与単位の形態をとり得、ここで、例えば、錠剤は、単一の投与単位であり得、エアロゾル形態の本明細書中に記載される結合体の容器は、複数の投与単位を保持し得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００）を参照のこと。投与する組成物は、いずれにしても、本明細書中の教示に従って目的の疾患または状態を処置するための、治療有効量の本開示の結合体を含む。
【０１９１】
薬学的組成物は、固体または液体の形態であり得る。１つの実施形態において、組成物が、例えば、錠剤または散剤の形態で存在するように、キャリア（複数可）は粒状である。キャリア（複数可）は、液体であり得、ここで、その組成物は、例えば、経口オイル、注射可能な液体、または吸入投与において有用な、例えば、エアロゾルである。経口投与が意図されるとき、薬学的組成物は、好ましくは、固体または液体の形態であり、ここで、半固体、半液体、懸濁液およびゲルの形態が、本明細書中で固体または液体と考えられる形態の中に含められる。
【０１９２】
経口投与用の固体組成物として、薬学的組成物は、散剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム、およびオブラートなどに製剤化され得る。そのような固体組成物は、代表的には、１つ以上の不活性な希釈剤または可食キャリアを含む。さらに、以下のうちの１つ以上が存在してもよい：結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプン、ラクトースまたはデキストリン）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、およびトウモロコシデンプンなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘ）；滑剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料）；および着色剤。薬学的組成物が、カプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態であるとき、それは、上記のタイプの材料に加えて、ポリエチレングリコールまたはオイルなどの液体キャリアを含み得る。
【０１９３】
薬学的組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、エマルジョンまたは懸濁剤であり得る。その液体は、２つの例として、経口投与用または注射による送達用であり得る。経口投与が意図されるとき、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、甘味剤、保存剤、色素／着色料および風味向上剤のうちの１つ以上を含む。注射によって投与することが意図される組成物では、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤および等張剤のうちの１つまたは複数が含められ得る。
【０１９４】
液体の薬学的組成物は、それが液剤であるか、懸濁剤であるか、または他の同様の形態であるかに関係なく、以下の補助剤のうちの１つまたは複数を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム）、固定油（例えば、溶媒もしくは懸濁媒として役立ち得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェートおよび張度を調整するための剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース））。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作製されたアンプル、使い捨て注射器またはマルチドーズバイアルに封入され得る。生理食塩水が、好ましい補助剤である。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは、滅菌されている。
【０１９５】
非経口または経口投与のいずれかが意図された液体の薬学的組成物は、好適な投与量が得られるような量の本明細書中に開示される結合体を含むべきである。代表的には、この量は、組成物中の少なくとも０．０１％の抗体である。経口投与が意図されるとき、この量は、組成物の重量の０．１〜約７０％で変動し得る。ある特定の経口薬学的組成物は、約４％〜約７５％の抗体を含む。ある特定の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物および調製物は、希釈前に非経口投与単位が０．０１〜１０重量％の抗体を含むように調製される。
【０１９６】
薬学的組成物は、局所的投与が意図され得、その場合、キャリアは、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲル基剤を適切に含み得る。例えば、基剤は、以下のうちの１つまたは複数を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤（例えば、水およびアルコール）ならびに乳化剤および安定剤。局所的投与用の薬学的組成物には増粘剤も存在し得る。経皮投与が意図される場合、組成物には、経皮パッチまたはイオン導入デバイスが含まれ得る。例えば、直腸において融解し、薬物を放出する坐剤の形態の薬学的組成物は、直腸投与が意図され得る。直腸投与用の組成物は、好適な非刺激性賦形剤として油性の基剤を含み得る。そのような基剤としては、ラノリン、カカオ脂およびポリエチレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９７】
薬学的組成物は、固体または液体の投与単位の物理的形状を改変する様々な材料を含み得る。例えば、組成物は、活性成分の周りにコーティングシェルを形成する材料を含み得る。コーティングシェルを形成する材料は、代表的には不活性であり、例えば、糖、シェラックおよび他の腸溶コーティング剤から選択され得る。あるいは、活性成分は、ゼラチンカプセルに入れられ得る。固体または液体の形態の薬学的組成物は、本発明の抗体に結合することにより化合物の送達を補助する作用物質を含み得る。この能力として作用し得る好適な作用物質としては、他のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、１つ以上のタンパク質またはリポソームが挙げられる。薬学的組成物は、エアロゾルとして投与され得る投与単位から本質的になり得る。エアロゾルという用語は、コロイド的性質の系から、加圧包装からなる系にまで及ぶ、種々の系を表すために使用する。送達は、液化ガスもしくは圧縮ガスによるもの、または活性成分を分配する好適なポンプシステムによるものであり得る。エアロゾルは、活性成分（複数可）を送達するために、単相系、二相系または三相系で送達され得る。エアロゾルの送達には、必要な容器、アクチベーター、バルブ、および副容器（ｓｕｂｃｏｎｔａｉｎｅｒ）など（これらは、共にキットを形成し得る）が含まれる。当業者は、過度の実験を行うことなく好ましいエアロゾルを決定し得る。
【０１９８】
薬学的組成物は、薬学分野において周知の方法論によって調製され得る。例えば、注射によって投与することが意図された薬学的組成物は、溶液を形成するように、本明細書中に記載されるような結合体、ならびに必要に応じて塩、緩衝剤および／または安定剤のうちの１つ以上を含む組成物を滅菌蒸留水と組み合わせることによって調製され得る。均一な溶液または懸濁液の形成を促進するために界面活性剤が加えられ得る。界面活性剤は、水性送達系における抗体の溶解または均一な懸濁を促進するように抗体組成物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
【０１９９】
組成物は、使用する特定の化合物（例えば、結合体）の活性；化合物の代謝的安定性および作用の長さ；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；投与の様式および時間；排出速度；薬物の組み合わせ；特定の障害または状態の重症度；ならびに被験体が受けている治療をはじめとした種々の因子に応じて変動する治療有効量で投与され得る。通常、治療上有効な１日量は、（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７．０ｇ）であり；好ましくは、治療上有効な用量は、（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、３．５ｇ）であり；より好ましくは、治療上有効な用量は、（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１．７５ｇ）である。
【０２００】
本開示の結合体を含む組成物は、また、１つ以上の他の治療薬の投与と同時に、その投与前にまたはその投与後に投与され得る。そのような併用療法は、本発明の化合物および１つ以上のさらなる活性作用物質を含む単一の薬学的投与製剤の投与、ならびに本発明の結合体を含む組成物および、各活性作用物質をそれ自体の別個の薬学的投与製剤に含む組成物の投与を含み得る。例えば、本明細書中に記載されるような結合体および他の活性作用物質は、単一の経口投与組成物（例えば、錠剤またはカプセル）として一緒に患者に投与され得るか、または各活性作用物質は別個の経口投与製剤で投与することができる。同様に、本明細書中に記載されるような結合体および他の活性作用物質は、単一の非経口投与組成物（例えば、食塩溶液または他の生理的に許容され得る溶液におけるもの）として一緒に患者に投与され得るか、または各活性作用物質は別個の非経口投与製剤で投与することができる。別個の投与製剤が使用される場合、結合体を含む組成物および１つ以上のさらなる活性作用物質は、本質的に同時に、すなわち、併せて投与され得るか、または時間をずらして別々に、すなわち、逐次的にかつ任意の順序で投与され得る；併用療法は、これらのレジメンのすべてを含むと理解される。
【０２０１】
したがって、ある特定の実施形態において、１つ以上の他の治療薬と組み合わせた本開示の結合体組成物の投与も企図される。そのような治療薬は、本明細書中に記載されるような特定の疾患状態（例えば、関節リウマチ、炎症またはがん）に対する標準的な処置として当該分野において認められ得る。企図される例示的な治療薬としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬または他の活性作用物質および補助的作用物質が挙げられる。
【０２０２】
ある特定の実施形態において、本明細書中に開示される結合体は、任意の数の化学療法剤または細胞傷害剤とともに投与され得る。化学療法剤または細胞傷害剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標）））；スルホン酸アルキル類（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ））；アジリジン類（例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ）；エチレンイミン類およびメチルアメラミン類（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；ナイトロジェンマスタード類（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素類（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎物質（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充剤（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ
ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）．，Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸誘導体（例えば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン））；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンディフティトックス）；エスペラミシン類（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤（例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；および抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン））；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体も含まれる。
【０２０３】
他の種々の治療薬が、本明細書中に記載される結合体とともに使用され得る。１つの実施形態において、結合体は、抗炎症剤とともに投与する。抗炎症剤または抗炎症薬としては、ステロイドおよび糖質コルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ剤、シクロホスファミドおよびミコフェノレートを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
組成物は、本明細書中に記載されるような疾患に悩まされている個体に投与され得、その疾患としては、腫瘍性疾患、代謝性疾患、神経性疾患、感染症、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患および異常な新脈管形成を伴う疾患が挙げられるが、これらに限定されない。特定の疾患としては、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現しているがんなどのＨｅｒ２／ｎｅｕを発現している障害が挙げられる。
【０２０５】
ある特定の実施形態は、被験体におけるがんを処置する方法を含み、その方法は、本明細書中に記載されるｐ９７−抗体結合体、またはｐ９７−抗体結合体および薬学的に許容され得るキャリアもしくは賦形剤を含む組成物をその被験体に投与する工程を包含する。「がん」は、一般に、細胞の群が、制御されない成長（すなわち、正常限界を超えた分裂）、浸潤（すなわち、隣接組織への侵入およびその破壊）および／または転移（すなわち、リンパまたは血液を介した身体の他の位置への拡大）のうちの１つ以上を示す、あるクラスの疾患または状態に関する。これらのがんの悪性の特性は、自己限定性であって代表的には浸潤しないし転移もしない良性のがんと区別する。
【０２０６】
「がん細胞」または「腫瘍細胞」とは、がん性の成長または組織の個別の細胞のことを指す。腫瘍とは、一般に、良性、前悪性または悪性であり得る細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変のことを指す。ほとんどのがんは、固形腫瘍を形成するが、一部のもの、例えば、白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成するそれらのがんの場合、がん（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は、交換可能に使用する。一般的な例としては、原発性がんおよび転移性がんが挙げられる。原発性がんまたは転移性がんの特定の例としては、前立腺がん、乳がん、消化器がん（例えば、結腸がん、結腸直腸癌、直腸がん）、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺癌）、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん（例えば、膀胱癌）、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、扁平上皮癌、原発性および転移性ＣＮＳがんまたは原発性および転移性脳がん（例えば、神経芽細胞腫、神経膠芽腫）、メラノーマ（例えば、悪性黒色腫）、非メラノーマ皮膚がん、甲状腺がん（例えば、髄様甲状腺がん（ＭＴＣ））、子宮体がん、上皮性腫瘍  骨がんおよび造血がん（例えば、リンパ腫（例えば、Ｔ細胞リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ））、Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ種、マントル（ｍａｎｇｌｅ）細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、濾胞性リンパ腫）、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｏｒ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ））、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫ならびに非ホジキンリンパ腫）が挙げられるがこれらに限定されない。ゆえに、ある特定の実施形態において、被験体は、上に記載されたがんのうちの１つ以上を有する。
【０２０７】
ある特定の実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）のがん、場合により脳のがんを処置するための方法に関する。いくつかの実施形態において、がんは、脳の原発性がんなどのＣＮＳの原発性がんである。例えば、方法は、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫または原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）を処置するための方法であり得る。いくつかの実施形態において、神経膠腫は、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫または脈絡叢乳頭腫である。ある特定の実施形態において、原発性ＣＮＳがんまたは原発性脳がんは、多形神経膠芽腫（例えば、巨細胞膠芽腫（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｇｌｉｏｂａｓｔｏｍａ）または神経膠肉腫）である。
【０２０８】
特定の実施形態において、がんは、ＣＮＳの転移性がん、例えば、脳に転移したがんである。そのようながんの例としては、乳がん、肺がん、泌尿生殖器がん、消化管がん（例えば、結腸直腸がん、膵臓癌）、骨肉腫、メラノーマ、頭頸部がん、前立腺がん（例えば、前立腺腺がん）および造血がん（例えば、リンパ腫）が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、ある特定の実施形態は、治療有効量の本明細書中に記載されるｐ９７−抗体結合体を（例えば、統計学的に有意な様式で、すなわち、当業者に公知であるような適切なコントロールと比べて、投与後に、抗体抵抗性のがんの転移を阻害するか、予防するか、または遅延させる量で）患者に投与することによって、がんの転移を処置するため、阻害するためまたは予防するための方法を含む。特定の実施形態において、被験体は、当該分野で公知の他のもののうち、上に記載されたがんの１つ以上を含む、まだ中枢神経系に転移していないがんを有する。
【０２０９】
いくつかの態様において、がんまたはがん細胞は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦレセプター、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥレセプター）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸レセプター１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子レセプター、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）またはメソテリンのうちの少なくとも１つの発現に関連する。特定の態様において、ｐ９７−抗体結合体のモノクローナル抗体部分は、上記のがん関連抗原またはがん抗原の１つ以上に特異的に結合する。
【０２１０】
特定の態様は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現に関連するがんの処置に関する。例えば、本発明の１つの実施形態は、治療有効量の本明細書中に開示される結合体を患者に投与することによって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現している乳がんおよび転移性乳がんを含むがこれらに限定されないがんを処置するため、阻害するためまたは予防するための方法を提供する。投与後に、統計学的に有意な様式で（すなわち、当業者に公知であるような適切なコントロールと比べて）がんの進行および／または転移を阻害するか、予防するかまたは遅延させる量は、有効であると考えられる。
【０２１１】
別の実施形態は、治療有効量の本明細書中に開示される結合体を（例えば、投与後に、統計学的に有意な様式で、すなわち、当業者に公知であるような適切なコントロールと比べて、がんの転移を阻害するか、予防するか、または遅延させる量で）患者に投与することによって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現している乳がんの転移を処置するため、阻害するためまたは予防するための方法を提供する。
【０２１２】
特定の態様は、転移性乳がんを有する患者（その腫瘍は、Ｈｅｒ２タンパク質を過剰発現していて、それらの転移性疾患に対する１つ以上の化学療法レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔｓ）を受けたことがある）を処置するためのｐ９７−トラスツズマブの使用を含む。いくつかの態様は、転移性乳がんを有する患者（患者の腫瘍は、Ｈｅｒ２タンパク質を過剰発現していて、その患者は、それらの転移性疾患に対する化学療法を受けたことがない）を処置するための、パクリタキセルと併用するｐ９７−トラスツズマブを含む。
【０２１３】
特定の態様は、Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲの発現に関連するがんの処置に関する。例えば、ある特定の態様は、転移性結腸直腸がんまたは頭頸部がんの処置を含み、ここで、ｐ９７−抗体結合体は、Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲに特異的に結合し、かつそれはＥＧＦＲアンタゴニストである。いくつかの態様において、がんは、ＥＧＦＲを発現している転移性結腸直腸がんであり、場合によりＫＲＡＳ野生型である。特定の態様において、ｐ９７−抗体結合体は、イリノテカンに基づくレジメンとオキサリプラチンに基づくレジメン（ｏｘｉｐｌａｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｇｉｍｅｎ）の両方の失敗の後に、ＥＧＦＲを発現している転移性結腸直腸がんを有する被験体に投与する。いくつかの態様において、転移性結腸直腸がんを有する被験体は、イリノテカンに基づくレジメンに不耐性であるか、またはイリノテカンに基づく化学療法に不応性である。他の態様において、がんは、白金に基づく治療の後に進行する、頭頸部の局所的もしくは限局性に進行した扁平上皮癌、頭頸部の再発性局所限局性疾患もしくは転移性扁平上皮癌または頭頸部の再発性もしくは転移性扁平上皮癌である。ある特定のこれらのおよび関連する実施形態において、ｐ９７−抗体結合体の抗体部分は、セツキシマブまたはその抗原結合フラグメントである。
【０２１４】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕに特異的に結合する抗体（例えば、トラスツズマブ）を含み、被験体は、場合により、本明細書中に記載されるような乳がんもしくは転移性乳がんまたはＣＮＳの（転移性）がんを有する。他の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＧＤ２に特異的に結合する抗体（例えば、３Ｆ８）を含み、被験体は、場合により神経芽細胞腫を有する。ある特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＡ−１２５に特異的に結合する抗体（例えば、アバゴボマブ）を含み、被験体は、場合により卵巣がんを有する。
【０２１５】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体（例えば、アデカツムマブ）を含み、被験体は、場合により前立腺がんまたは乳がんを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体（例えば、アフツズマブ）を含み、被験体は、場合によりリンパ腫を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ５２に特異的に結合する抗体（例えば、アレムツズマブ）を含み、被験体は、場合により慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）またはＣＴＣＬを有する。
【０２１６】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＶＥＧＦ−Ｒ２に特異的に結合する抗体（例えば、アラシズマブ（ペゴル））を含む。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体（例えば、アポリズマブ）を含み、被験体は、場合により血液系がんを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＢＡＦＦに特異的に結合する抗体（例えば、ベリムマブ）を含み、被験体は、場合により造血がん（例えば、非ホジキンリンパ腫）を有する。
【０２１７】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合する抗体（例えば、ベバシズマブ）を含み、被験体は、場合により転移性がんまたは結腸直腸がんを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ４４に特異的に結合する抗体（例えば、ビバツズマブ（メルタンシン））を含み、被験体は、場合により扁平上皮癌を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ３０に特異的に結合する抗体（例えば、ブレンツキシマブベドチン）を含み、被験体は、場合により血液系がん（例えば、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）またはホジキンリンパ腫）を有する。
【０２１８】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ムチンに特異的に結合する抗体（例えば、カンツズマブ（メルタンシン））を含み、被験体は、場合により結腸直腸がんを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体（例えば、カプロマブ）を含み、被験体は、場合により前立腺がんを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥｐＣＡＭおよび必要に応じてＣＤ３に特異的に結合する抗体（例えば、セツキシマブ）を含み、被験体は、場合により（転移性）結腸直腸がんまたは頭頸部がんを有する。
【０２１９】
ある特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体（例えば、シタツズマブ（ボガトクス））を含み、被験体は、場合により固形腫瘍（例えば、卵巣がん）を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＩＧＦ−１レセプターに特異的に結合する抗体（例えば、シクスツムマブ）を含み、被験体は、場合により固形腫瘍を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体（例えば、クリバツズマブ（テトラキセタン））を含み、被験体は、場合により膵臓がんを有する。
【０２２０】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体（例えば、ダセツズマブ）を含み、被験体は、場合により血液系がんを有する。いくつかの実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＧＤ３ガングリオシドに特異的に結合する抗体（例えば、エクロメキシマブ）を含み、被験体は、場合により悪性黒色腫を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体（例えば、エドレコロマブ）を含み、被験体は、場合により結腸直腸癌を有する。
【０２２１】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する抗体（例えば、エロツズマブ）を含み、被験体は、場合により多発性骨髄腫を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、インテグリンαｖβ３に特異的に結合する抗体（例えば、エタラシズマブ）を含み、被験体は、場合によりメラノーマ、前立腺がん、卵巣がんまたは他の固形腫瘍を有する。ある特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、葉酸レセプター１に特異的に結合する抗体（例えば、ファルレツズマブ））を含み、被験体は、場合により卵巣がんを有する。
【０２２２】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＩＧＦ−１レセプターに特異的に結合する抗体（例えば、フィギツムマブ）を含み、被験体は、場合により副腎皮質癌または非小細胞肺癌を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、糖タンパク質７５に特異的に結合する抗体（例えば、フランボツマブ）を含み、被験体は、場合によりメラノーマを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ８０に特異的に結合する抗体（例えば、ガリキシマブ）を含み、被験体は、場合によりＢ細胞リンパ腫を有する。
【０２２３】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ３３に特異的に結合する抗体（例えば、ゲムツズマブ（オゾガマイシン））を含み、被験体は、場合により骨髄性白血病を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＡ−ＩＸに特異的に結合する抗体（例えば、ギレンツキシマブ）を含み、被験体は、場合により腎細胞癌を有する。さらなる実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＧＰＭＮＢに特異的に結合する抗体（例えば、グレンバツムマブ（ベドチン））を含み、被験体は、場合によりメラノーマまたは乳がんを有する。
【０２２４】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体（例えば、イブリツモマブチウキセタン）を含み、被験体は、場合により造血がん（例えば、非ホジキンリンパ腫）を有する。いくつかの実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１））を含み、被験体は、場合により固形腫瘍（例えば、メラノーマ）を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ５１に特異的に結合する抗体（例えば、インテツムマブ）を含み、被験体は、場合により固形腫瘍（例えば、前立腺がんまたはメラノーマ）を有する。
【０２２５】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ３０に特異的に結合する抗体（例えば、イラツムマブ）を含み、被験体は、場合により造血がん（例えば、ホジキンリンパ腫）を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体（例えば、ラベツズマブ）を含み、被験体は、場合により結腸直腸がんを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体（例えば、ルカツムマブ）を含み、被験体は、場合により造血（ｈｅｍｏｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）がん（例えば、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫）を有する。
【０２２６】
ある特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ２３に特異的に結合する抗体（例えば、ルミリキシマブ）を含み、被験体は、場合によりＣＬＬを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体（例えば、マツズマブ）を含み、被験体は、場合により結腸直腸がん、肺がんまたは胃がんを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ７４に特異的に結合する抗体（例えば、ミラツズマブ）を含み、被験体は、場合により血液系（ｈｅｍｏｔｏｌｏｇｉｃａｌ）がん（例えば、多発性骨髄腫）を有する。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＧＤ３ガングリオシドに特異的に結合する抗体（例えば、ミツモマブ）を含み、被験体は、場合により小細胞肺癌を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、５Ｔ４に特異的に結合する抗体（例えば、ナプツモマブ（エスタフェナトクス））を含み、被験体は、場合により非小細胞肺癌または腎細胞癌を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体（例えば、ネシツムマブ）を含み、被験体は、場合により非小細胞肺癌を有する。
【０２２８】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体（例えば、ニモツズマブ）を含み、被験体は、場合により扁平上皮癌、頭頸部がん、鼻咽頭がんまたは神経膠腫を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体（例えば、オファツムマブ）を含み、被験体は、場合により造血がん（例えば、ＣＬＬ）を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＡ−１２５に特異的に結合する抗体（例えば、オレゴボマブ）を含み、被験体は、場合により卵巣がんを有する。
【０２２９】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体（例えば、パニツムマブ）を含み、被験体は、場合により結腸直腸がんを有する。いくつかの実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ビメンチンに特異的に結合する抗体（例えば、プリツムマブ）を含み、被験体は、場合により脳がんを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体（例えば、リツキシマブ）を含み、被験体は、場合により造血がん（例えば、リンパ腫または白血病）を有する。
【０２３０】
ある特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体（例えば、トシツモマブ）を含み、被験体は、場合によりリンパ腫（例えば、濾胞性リンパ腫）を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＧＤ２に特異的に結合する抗体（例えば、ＴＲＢＳ０７）を含み、被験体は、場合によりメラノーマを有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、インテグリンα５β１に特異的に結合する抗体（例えば、ボロシキシマブ）を含み、被験体は、場合により固形腫瘍を有する。
【０２３１】
特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８に特異的に結合する抗体（例えば、ボツムマブ）を含み、被験体は、場合により結腸直腸腫瘍を有する。特定の実施形態において、ｐ９７−抗体結合体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体（例えば、ザルツムマブ）を含み、被験体は、場合により頭頸部の扁平上皮癌を有する。
【０２３２】
上に記載したように、がんを処置するためのｐ９７−抗体結合体の使用は、他の治療様式と併用され得る。例えば、ｐ９７−抗体結合体を含む組成物は、症状に対するケア、放射線治療、手術、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法、化学療法、抗生物質療法またはそれらの任意の組み合わせを含む他の治療的介入の前、その最中またはその後に、被験体に投与され得る。症状に対するケアは、脳浮腫、頭痛、認知機能不全および嘔吐を減少させるコルチコステロイドの投与ならびに発作を減少させる抗痙攣薬の投与を含む。放射線治療は、従来の手術とさらに併用され得る、全脳照射、分割放射線治療および放射線手術（例えば、定位的放射線手術）を含む。
【０２３３】
特定の併用療法において、ｐ９７−抗体結合体の抗体部分は、セツキシマブを含み、そのｐ９７−セツキシマブ結合体は、頭頸部の局所的もしくは限局性に進行した扁平上皮癌を有する被験体を、放射線治療と併用して処置するために使用する。他の態様において、ｐ９７−セツキシマブ結合体は、頭頸部の再発性局所限局性疾患もしくは転移性扁平上皮癌を有する被験体を、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を用いた白金に基づく治療と併用して処置するために使用する。いくつかの場合において、ｐ９７−セツキシマブ結合体を、白金に基づく薬剤（例えば、５−フルオロウラシル）に共有結合的に連結する。いくつかの態様において、ｐ９７−セツキシマブ結合体は、ＥＧＦＲを発現している結腸直腸がんを有し、イリノテカンに基づく化学療法に不応性である被験体を処置するために、イリノテカンと併用して使用する。特定の場合において、ｐ９７−セツキシマブ結合体を、イリノテカンに共有結合的に連結する。
【０２３４】
本明細書中に記載される疾患または状態の１つ以上を有する被験体を識別するための方法は、当該分野で公知である。
【０２３５】
ヒト疾患を処置するためにインビボにおいて使用する場合、本明細書中に記載される結合体は、通常、投与前に薬学的組成物に組み込まれる。薬学的組成物は、本明細書中の他の箇所に記載されているような生理的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、本明細書中に記載される結合体の１つ以上を含む。薬学的組成物を調製するために、有効量の１つ以上の上記化合物が、特定の投与様式に適するように、当業者に公知の任意の薬学的キャリア（複数可）または賦形剤と混合される。薬学的キャリアは、液体、半液体または固体であり得る。非経口、皮内、皮下または局所的適用のために使用する溶液または懸濁液としては、例えば、滅菌希釈剤（例えば、水）、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウム）およびキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、アセテート、シトレートおよびホスフェート）が挙げられ得る。静脈内に投与する場合、好適なキャリアとしては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および可溶化剤（例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物）を含む溶液が挙げられる。
【０２３６】
本明細書中に記載されるような結合体を含む組成物は、身体からの迅速な排除から結合体を保護するキャリア（例えば、徐放性の調合物またはコーティング）とともに調製され得る。そのようなキャリアとしては、制御放出調合物（例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系）および生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸および当業者に公知の他のもの）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３７】
以下の実施例は、例証目的で提供されるものであって、限定目的で提供されていない。
【実施例】
【０２３８】
実施例１
抗ＨＥＲ２／ＮＥＵ抗体へのＰ９７の結合体化
Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的であり、ＨＥＲ２＋乳がんの処置において臨床で使用するヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブを、下記に記載されるようにｐ９７送達ベクター（Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ；ＢｉＯａｓｉｓ）に化学的に連結した。
【０２３９】
抗体の最初の調製
１．ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合するおよそ１００ｍｇ（賦形剤などを含む製剤化された重量）の「ＢＴＡ」抗体（Ｒｏｃｈｅ）を、１．５ｍｌの脱イオン水に溶解し、単一のＰＤ１０カラム（ＧＥ１７０８５１−０１）において０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に緩衝液交換することにより、２８０ｎｍにおけるＵＶ可視分光測定法によって示され、抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．４０であると仮定したとき、１８．１０ｍｇ／ｍｌの３．０ｍｌの抗体溶液を得た（抗体Ａ）。
【０２４０】
２．およそ１００ｍｇ（賦形剤などを含む製剤化された重量）の「ＢＴＡ」抗体（Ｒｏｃｈｅ）を、４．０ｍｌの脱イオン水に溶解し、３つのＰＤ１０カラム（ＧＥ１７０８５１−０１）において０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に緩衝液交換することにより、２８０ｎｍにおけるＵＶ可視分光測定法によって示され、抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．４０であると仮定したとき、６．５０ｍｇ／ｍｌの８．１ｍｌの抗体溶液を得た（抗体Ｂ）。
【０２４１】
抗体のＣｙ５．５標識
３．５３．４ｍｇ（２．９５ｍｌ）の抗体Ｂに、１．８９ｍｇ（１８９μｌ）の、ＤＭＳＯ中のＣｙ５．５ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ２４０２０）の１０．０ｍｇ／ｍｌ溶液を加えた（７：１  Ｃｙ５．５：抗体過剰に等しい）。
【０２４２】
４．色素−抗体反応を、２０℃で６０分間続けた。
【０２４３】
５．粗抗体−色素結合体を、溶出剤として０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．５を使用する、２つのＰＤ１０カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することにより、低分子量副産物を除去した。これにより、２８０ｎｍおよび６７３ｎｍにおけるＵＶ可視分光測定法によって示され、抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．４０でありかつＣｙ５．５についての６７３ｎｍにおけるモル吸光係数が１３３，０００Ｍ−１ｃｍ−１であると仮定したとき、９．４５ｍｇ／ｍｌという抗体濃度および抗体分子１つあたり２．０１個の色素分子という見かけ上の組み込みを有する色素標識抗体の溶液が得られた（色素標識抗体Ｂ）。
【０２４４】
非標識抗体へのマレイミドの組み込み
６．４０ｍｇ（６．１５ｍｌ）の抗体Ａに、０．３１ｍｇ（６２μｌ）の、ＤＭＳＯ中の４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  ２２３６０）の５．０ｍｇ／ｍｌ溶液を加えた（３．５：１というＳＭＣＣ：抗体過剰に等しい）。
【０２４５】
７．抗体活性化反応を２０℃において６０分間続けた。
【０２４６】
８．粗マレイミド活性化非標識抗体を、溶出剤として５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液のｐＨ７．０緩衝液を使用する、４つのＰＤ１０カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することにより、低分子量副産物を除去した。これにより、抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．４０であると仮定して、３．３４ｍｇ／ｍｌという抗体濃度を有するマレイミド活性化非標識抗体の溶液を得た（マレイミド活性化非標識抗体Ａ１）。
【０２４７】
９．５ｍｇ（７６９μｌ）の抗体Ａに、０．１７ｍｇ（３３μｌ）の、ＤＭＳＯ中の４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  ２２３６０）の５．０ｍｇ／ｍｌ溶液を加えた（１５：１のＳＭＣＣ：抗体過剰に等しい）。
【０２４８】
１０．抗体活性化反応を２０℃において６０分間続けた。
【０２４９】
１１．粗マレイミド活性化非標識抗体を、溶出剤として５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液のｐＨ７．０緩衝液を使用する、単一のＰＤ１０カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することにより、低分子量副産物を除去した。これにより、抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．４０であると仮定して、２．３６ｍｇ／ｍｌという抗体濃度を有するマレイミド活性化非標識抗体の溶液を得た（マレイミド活性化非標識抗体Ａ２）。
【０２５０】
Ｃｙ５．５標識抗体へのマレイミドの組み込み
１２．４０ｍｇ（４．２３ｍｌ）の色素標識抗体Ｂに、０．４５ｍｇ（８９μｌ）の、ＤＭＳＯ中の４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  ２２３６０）の５．０ｍｇ／ｍｌ溶液を加えた（５：１のＳＭＣＣ：抗体過剰に等しい）。
【０２５１】
１３．抗体活性化反応を２０℃において６０分間続けた。
【０２５２】
１４．粗マレイミド活性化色素標識抗体を、溶出剤として５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液のｐＨ７．０緩衝液を使用する、３つのＰＤ１０カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することにより、低分子量副産物を除去した。これにより、２８０ｎｍおよび６７３ｎｍにおけるＵＶ可視分光測定法によって示され、抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．４０でありかつＣｙ５．５についての６７３ｎｍにおけるモル吸光係数が１３３，０００Ｍ−１ｃｍ−１であると仮定したとき、４．４６ｍｇ／ｍｌという抗体濃度および抗体分子１つあたり１．０５個の色素分子という見かけ上の組み込みを有するマレイミド活性化色素標識抗体の溶液を得た（マレイミド活性化色素標識抗体Ｂ１）。
【０２５３】
１５．５ｍｇ（５２９μｌ）の色素標識抗体Ｂに、０．２０ｍｇ（４０μｌ）の、ＤＭＳＯ中の４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  ２２３６０）の５．０ｍｇ／ｍｌ溶液を加えた（１８：１のＳＭＣＣ：抗体過剰に等しい）。
【０２５４】
１６．抗体活性化反応を２０℃において６０分間続けた。
【０２５５】
１７．粗マレイミド活性化色素標識抗体を、溶出剤として５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液のｐＨ７．０緩衝液を使用する、単一のＰＤ１０カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することにより、低分子量副産物を除去した。これにより、２８０ｎｍおよび６７３ｎｍにおけるＵＶ可視分光測定法によって示され、抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．４０でありかつＣｙ５．５についての６７３ｎｍにおけるモル吸光係数が１３３，０００Ｍ−１ｃｍ−１であると仮定したとき、１．８５ｍｇ／ｍｌという抗体濃度および抗体分子１つあたり０．６６個の色素分子という見かけ上の組み込みを有するマレイミド活性化色素標識抗体の溶液を得た（マレイミド活性化色素標識抗体Ｂ２）。
【０２５６】
ｐ９７の最初の調製
１８．工程１〜１７と並行して、およそ７０ｍｇのｐ９７（ＢｉＯａｓｉｓ）を、３つのＰＤ１０カラムで０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に緩衝液交換することにより、２８０ｎｍにおけるＵＶ可視分光測定法によって示され、ｐ９７の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．１９であると仮定したとき、６．３７ｍｇ／ｍｌの１１．２ｍｌのｐ９７溶液を得た。
【０２５７】
ｐ９７のチオール化
１９．５４ｍｇ（８．４８ｍｌ）の緩衝液交換されたｐ９７に、０．４１ｍｇ（８２μｌ）の、ＤＭＳＯ中のＳ−アセチルチオ酢酸，スクシンイミジルエステル（ＳＡＴＡ，Ｔｈｅｒｍｏ  ２６１０２）の５．０ｍｇ／ｍｌ溶液を加えた（３．２：１のＳＡＴＡ：ｐ９７比に等しい）。
【０２５８】
２０．Ｓ−アセチルチオール化反応を２０℃で５５分間進めた。
【０２５９】
２１．８４８μｌの、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム塩および２．５Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン，ｐＨ７．０の水溶液を加えることにより、チオールを脱保護し、その脱保護反応を２０℃で１７分間進めた。
【０２６０】
２２．粗製のチオール化ｐ９７を、溶出剤として５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液のｐＨ７．０緩衝液を使用する、５つのＰＤ１０カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することにより、低分子量副産物を除去した。これにより、２８０ｎｍにおけるＵＶ可視分光測定法によって示され、ｐ９７の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．１９であると仮定したとき、３．６５ｍｇ／ｍｌというｐ９７濃度を有するチオール化ｐ９７の溶液が得られた。Ｅｌｌｍａｎ試薬を使用してチオール含有量についてサンプルをアッセイしたところ、ｐ９７分子１つあたり０．９個のチオール基という組み込みが示された（チオール化ｐ９７  Ｃ１）。
【０２６１】
２３．８ｍｇ（１．２６ｍｌ）の緩衝液交換したｐ９７に、０．２９ｍｇ（５７μｌ）の、ＤＭＳＯ中のＳ−アセチルチオ酢酸，スクシンイミジルエステル（ＳＡＴＡ，Ｔｈｅｒｍｏ  ２６１０２）の５．０ｍｇ／ｍｌ溶液を加えた（１５：１のＳＡＴＡ：ｐ９７比に等しい）。
【０２６２】
２４．Ｓ−アセチルチオール化反応を２０℃で５５分間進めた。
【０２６３】
２５．１２６μｌの、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム塩および２．５Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン，ｐＨ７．０の水溶液を加えることにより、チオールを脱保護し、その脱保護反応を２０℃で１７分間進めた。
【０２６４】
２６．粗製のチオール化ｐ９７を、溶出剤として５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液のｐＨ７．０緩衝液を使用する、単一のＰＤ１０カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することにより、低分子量副産物を除去した。これにより、２８０ｎｍにおけるＵＶ可視分光測定法によって示され、かつ、ｐ９７の１ｍｇ／ｍｌ溶液についてのこの波長における吸光度が１．１９であると仮定したとき、２．８３ｍｇ／ｍｌというｐ９７濃度を有するチオール化ｐ９７の溶液が得られた。Ｅｌｌｍａｎ試薬を使用してチオール含有量についてサンプルをアッセイしたところ、ｐ９７分子１つあたり３．８個のチオール基という組み込みが示された（チオール化ｐ９７  Ｃ２）。
【０２６５】
ｐ９７−抗体の結合体化
２７．（ＢＯＡ２／１）５．０ｍｇ（１．５０ｍｌ）のマレイミド活性化非標識抗体Ａ１および１２．９３ｍｇ（３．５５ｍｌ）のチオール化ｐ９７  Ｃ１（４．０：１のｐ９７：抗体比に等しい）を２０℃で１８時間、一緒に反応させた。
【０２６６】
２８．（ＢＯＡ２／２）５．０ｍｇ（１．１２ｍｌ）のマレイミド活性化色素標識抗体Ｂ１および１２．９３ｍｇ（３．５５ｍｌ）のチオール化ｐ９７  Ｃ１（４．０：１のｐ９７：抗体比に等しい）を２０℃で１８時間、一緒に反応させた。
【０２６７】
２９．（ＢＯＡ２／３）２．５ｍｇ（１．０６ｍｌ）のマレイミド活性化非標識抗体Ａ２および１２．９３ｍｇ（３．５５ｍｌ）のチオール化ｐ９７  Ｃ１（８．０：１のｐ９７：抗体比に等しい）を２０℃で１８時間、一緒に反応させた。
【０２６８】
３０．（ＢＯＡ２／４）２．５ｍｇ（１．３５ｍｌ）のマレイミド活性化色素標識抗体Ｂ２および１２．９３ｍｇ（３．５５ｍｌ）のチオール化ｐ９７  Ｃ１（８．０：１のｐ９７：抗体比に等しい）を２０℃で１８時間、一緒に反応させた。
【０２６９】
３１．（ＢＯＡ２／５）２３．０ｍｇ（６．８９ｍｌ）のマレイミド活性化非標識抗体Ａ１および２．４７ｍｇ（０．８７ｍｌ）のチオール化ｐ９７  Ｃ２（１：６．０のｐ９７：抗体比に等しい）を２０℃で１８時間、一緒に反応させた。
【０２７０】
３２．（ＢＯＡ２／６）２３．０ｍｇ（５．１６ｍｌ）のマレイミド活性化色素標識抗体Ｂ１および２．４７ｍｇ（０．８７ｍｌ）のチオール化ｐ９７  Ｃ２（１：６．０のｐ９７：抗体比に等しい）を２０℃で１８時間、一緒に反応させた。
【０２７１】
３３．工程２７〜３２からの６つの粗抗体−ｐ９７および抗体−Ｃｙ５．５−ｐ９７結合体を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ６（３０ｋＤａカットオフ）スピンフィルターを使用して１〜１．５ｍｌに濃縮し、溶出剤として５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液＋１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ６．７を用い２．０ｍｌ／分での、１．６×３６ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＰＧカラムを使用する高分解能サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０２７２】
３４．これにより、ＵＶ分光測定法によるデータおよびサイズ排除クロマトグラフィーによるデータによって示されるような、下記に示されるおおよそのｐ９７：抗体比を有する結合体が得られた。
【０２７３】
【表２】
2018016631.tif 000006
実施例２
Ｐ９７−ＨＥＲ２／ＮＥＵ抗体結合体は乳がん細胞の細胞死を増強する
この実施例は、本発明のｐ９７−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体結合体が、ｐ９７と結合体化していない抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体と比べて、乳がん細胞に対して活性を増強したことを証明する。
【０２７４】
下記で述べられる化合物を、下記でさらに記載されるように、乳がん細胞系ＭＣＦ−７ベクター、ＭＣＦ−７／Ｈｅｒ２、ＢＴ４７４およびＳＫＢｒ３に対して試験した。ビヒクルは、ＰＢＳ，ｐＨ６．７だった。
【０２７５】
【表３】
2018016631.tif 000007
材料および方法
細胞系
ＭＣＦ−７ベクター（ヒト乳がん）細胞系を、以下の条件下で維持した：ＲＰＭＩ１６４０培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８。ＭＣＦ−７  ＨＥＲ２（ヒト乳がん，トランスフェクト済み）細胞系を、以下の条件下で維持した：ＲＰＭＩ１６４０培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８。ＳＫＢＲ３（ヒト乳がん）細胞系を、以下の条件下で維持した：ＭｃＣｏｙｓ  ５Ａ培地、１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ。ＢＴ４７４（ヒト乳がん）細胞系を、以下の条件下で維持した：ＤＭＥＭ培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ。
【０２７６】
細胞成長の最適化
細胞成長の最適化研究を、薬物スクリーニング研究の前に行う。細胞成長研究の目的は、確実に、各細胞系が９６時間のインキュベーション後に９５〜１００％培養密度に達する最適な播種密度を決定すること（低および高血清条件の両方において）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｈ３３３４２）についての最適な染色条件を決定することである。以下の細胞密度を試験する：正常血清条件での５０μＬにおける５００、１０００、１５００、２０００、２５００および３０００細胞／ウェル（表４）ならびに低（１％）血清条件での５０μＬにおける２０００、４０００、６０００、８０００、１００００および１２０００細胞／ウェル（表５）。以下の表に基づいて、細胞を２ｍＬの９６ウェルディープブロックにおいて異なる濃度に希釈する：
【０２７７】
【表４】
2018016631.tif 000008
【０２７８】
【表５】
2018016631.tif 000009
＊６０，０００／２５ｍＬのストック細胞液を取り、遠心沈殿させ、６．５ｍＬの培地を加える
Ｈｙｄｒａを用いて、上記９６ウェルディープブロックから、対応するＧｒｅｎｉｅｒ
Ｂｉｏの、4つの領域にある４つのウェル（４  ｑｕａｄｒａｎｔ  ｗｅｌｌｓ）に移
すことによって、またはマルチチャネルピペットを用いて、プレーティングを行う。その３８４ウェルプレートの各ウェルに５０μＬを加え、これを繰り返す。２４時間後、培地を吸引し、正常血清を含む培地または血清を含まない培地で置き換える。吸引工程において、およそ４５μＬの培地を除去し、新しい培地で置き換える。イメージングされる１枚のプレートにおいて毎日染色を行う。その時間経過にわたって、各細胞系についての像を比較することにより、最適な播種密度を決定する。
【０２７９】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色の最適化
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の最適化は、色素を沈殿させないかまたは細胞を死滅させずに最も強いシグナル対ノイズ比を与えるのに重要である。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、細胞核を標識して効率的な画像ベースのセグメント化（ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）およびカウントを可能にする細胞透過性色素である。４つの異なる濃度のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（０．５、１、５、１０μＭ）を有効性について試験する。ＥｔｈＤ１は、細胞膜が損なわれた細胞（すなわち死細胞）の核内のＤＮＡに結合する膜不透過性核酸色素である。ＥｔｈＤ１は、１μＭという最終濃度において使用する。この２つの染色は、効率的な細胞の計数のための生／死細胞を識別する体系的な方法を提供する。１枚のプレートを使用して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を、以下の表に示される作業濃度に細胞培養培地で希釈する：
【０２８０】
【表６】
2018016631.tif 000010
１０μＬの染色溶液を、各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートすることにより、色素を取り込ませる。ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００機器において、画像の最適化を行う。
【０２８１】
薬物スクリーニングプロトコル：
０日目：細胞のプレーティング−３８４ウェルプレート：
細胞を回収し、細胞成長の最適化研究における最適な細胞数に基づいて、２枚の３８４ウェルＧｒｅｎｉｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ  ＴＣ処理済μＣｌｅａｒ３８４プレートにプレーティングする。ストック細胞液からの５０μＬを、Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ  Ｌａｙｏｕｔに従ってアッセイプレートに加える（１２０ウェル／細胞系）。
【０２８２】
１日目：薬物処理：
被験物質の段階希釈を９６ウェルプレートにおいて行う。被験物質およびコントロール物質を希釈した後、１つの薬物濃度あたり２０μＬ／ウェル×２ウェルを、下記に示されるＡｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ  Ｌａｙｏｕｔに従って加える。
【０２８３】
【表７】
2018016631.tif 000011
下記の表は、所望の作業溶液を得るためのストックの例証的な希釈を示している。
【０２８４】
表８
作業溶液を得るためのストックの希釈。２００４年４月８日にオンラインで公開されたＣｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０：２５１２−２５２４に基づく用量。
【０２８５】
【表８】
2018016631.tif 000012
＊これらは、１ｍＬの材料を得るための希釈である。これの１０倍希釈（１  ｉｎ  １０  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）は、１０μｇ／ｍＬの等価物をもたらす。
【０２８６】
このプレートにおいて使用する希釈スキームは、上記の「例示的な薬物希釈レザバー」で概説されたスキームである。
【０２８７】
表９
【０２８８】
【表９】
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２〜３日目：インキュベーション：
細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器において７２時間、薬物とともにインキュベートする。
【０２８９】
４日目：イメージング：
プレートを、染色最適化研究に基づいてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（全細胞）およびエチジウムホモダイマー（死細胞）で染色することにより、生細胞の数を決定する。ＧＥ  ＩｎＣｅｌｌ  １０００  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてプレートをイメージングする。
【０２９０】
結果
実質的に上に記載されたような手順を用いて、本発明の様々な結合体を、結合体化していない抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体と比較して、乳がん細胞系に対する活性について試験した。細胞生存率アッセイの結果を図１〜４に要約する。驚いたことに、いくつかのＨＥＲ２＋乳がん細胞系において、ｐ９７−抗体結合体は、トラスツズマブ単独と比べてがん死滅化活性の有意な改善を示した。例えば、ＢＴ４７４細胞系（図１）の場合、結合体ＢＯＡ２／１およびＢＯＡ２／５は、２２９ｎＭにおいて細胞死に関して著明な効果を示した。細胞生存率に対するこれらの結合体の効果は、トラスツズマブ単独（ＢＯＡ２／８）で処理された細胞に対して観察された効果よりもかなり著明だった。
【０２９１】
さらに、他の実験の結果から、トラスツズマブが、培養下のヒト脳内皮（ＨＢＥ）細胞に進入せずかつ動物のインタクトな血液脳関門を越えないことが確かめられた。しかしながら、ｐ９７−抗体結合体は、ＨＢＥ細胞への著しい輸送を示したことから、その結合体が、血液脳関門を越えて脳組織に進入する能力を有することが示唆される。
【０２９２】
これらの知見に照らすと、本発明の結合体が、抗体の活性を改善することによって、および／または抗体が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現しているＣＮＳにおける転移性がん細胞に接近することを可能にすることによって、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の治療上の可能性を改善し得ることが明らかである。
【０２９３】
実施例３
脳組織におけるＰ９７−トラスツズマブ結合体の分布
脳組織コンパートメントにおけるｐ９７−トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））結合体の分布を評価する実験を行った。まず、以下のローダミン標識タンパク質を約２３グラムのサイズのマウスの静脈内に注射した：約４．３５ｍｇ／ｋｇでの１００μｇのｐ９７−ローダミン；約８．４７ｍｇ／ｋｇでの１９５μｇのｐ９７−ローダミン；約１６．３ｍｇ／ｋｇでの３７５μｇのｐ９７−ＢＴＡ−ローダミン；およびローダミン単独。
【０２９４】
標識タンパク質の場合、３つの２０μｍ切片および３つの５０μｍ切片を、ＩＶ注射の２時間後に回収し、２つの２０μｍ切片および２つの５０μｍ切片をＩＶ注射の２４時間後に回収した。ローダミン単独の場合、４つの２０μｍ切片および２つの５０μｍ切片をＩＶ注射の２時間後に回収した。これらの切片を、共焦点解析のためにｉＣａｐｔｕｒｅ
Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに送った。
【０２９５】
血管コンパートメント（毛細血管）および脳実質（血管コンパートメントを除くすべての組織）の２０ミクロン切片におけるボクセル数を測定した。ボクセルは、組織切片の共焦点イメージングから得られる３次元ピクセルである。脳実質における蛍光ボクセル数をボクセルの総数で除算することにより、実質における所与の結合体の体積分率が得られた。脳毛細血管における蛍光ボクセル数をボクセルの総数で除算することにより、脈管構造（毛細血管）における結合体の体積分率が得られた。
【０２９６】
結果を図５Ａ〜５Ｄに示す。これらの図において、「ＭＴｆ」は、ｐ９７であり、「ＢＴＡ」は、トラスツズマブである。図５Ａは、注射量に対して正規化されたときの脳組織におけるｐ９７−トラスツズマブ（ＢＴ２１１１；ＭＴｆ−ＢＴＡ）の分布を示しており、図５Ｂは、蛍光に対して正規化したときの同じものを示している。ここで、蛍光タンパク質の大部分が、毛細血管に認められるが、ｐ９７単独またはトラスツズマブ単独と比べたとき、ｐ９７−トラスツズマブ結合体は、特に上記２時間の時点において、実質に選択的に分布する。この結果は、ｐ９７−トラスツズマブ結合体についての脳実質に局在化した有意に増加した蛍光を示している図５Ｃ、ならびにｐ９７−トラスツズマブ結合体の実質のレベルがトラスツズマブ単独よりも１２倍高いおよびｐ９７単独よりも４倍高いことを示している図５Ｄにおいてさらに例証されている。
【０２９７】
これらの知見は、タンパク質結合体としてのｐ９７とトラスツズマブとの組み合わせが、各タンパク質単独の送達と比べて、血液脳関門を越える脳実質組織への送達を相乗的に増大させることを示唆している。
【０２９８】
実施例４
脳転移におけるＰ９７−トラスツズマブ結合体の分布
トラスツズマブ単独と比べたときの、正常脳組織および脳転移における２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の分布を評価する実験を行った。全身組織における相対分布も調べた。
【０２９９】
放射性標識ｐ９７、トラスツズマブおよびｐ９７−トラスツズマブの静脈内薬物投与を、乳がんの実験的脳転移を有するマウスにおいて行った。詳細には、これらの腫瘍実験は、心臓内注射を介して、ｅＧＦＰを発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＲ  Ｈｉｇｈ  Ｈｅｒ−２ヒト乳がん細胞を移植した、免疫力が低下したＮｕＮｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）を利用した。その腫瘍細胞を、約３〜６週間の期間にわたって、脳に移植させ、脳転移を形成させた。
【０３００】
動物が腫瘍成長の症状を示した時点で、被験薬物を投与した。次いで、放射性、蛍光性および定量的オートラジオグラフィー解析によって、組織分布についてモニタリングを行った。ＨＰＬＣによって測定されたとき、＞９９％の純度の、１２５Ｉ標識ｐ９７、トラスツズマブおよびｐ９７−トラスツズマブタンパク質を使用して、これらの実験を行った。
【０３０１】
２、８および２４時間の時点において、放射性標識タンパク質の取り込みを調べた。血液腫瘍関門の受動的透過性を測定するために、安楽死の約１０分前から２時間前にテキサスレッド−デキストランも投与した（ｉ．ｖ．）。２．７％アルブミンおよびインドシアニングリーン（ｉｏｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ）を、安楽死後の約３０〜６０秒間、脳に灌流させることにより、脳内および脳転移内における血管の分布をマッピングし、血管内の標識タンパク質を除去した。脳を、灌流洗浄の直後に急速凍結し、クライオスタットを使用して２０μｍの冠状切片に切断した。腫瘍細胞の脳分布をマッピングするため、血液腫瘍関門の透過性を定量するためおよび腫瘍内の脈管構造を局在化させるために、それぞれ緑色蛍光、赤色蛍光および近赤外蛍光について、それらの切片を解析した。組織切片をマッチさせる際、脳における１２５Ｉ−タンパク質の分布を、標準放射性物質とともにリン光イメージングによって測定した。解析後、組織切片を染色することにより、腫瘍細胞の分布を確かめた。１２５Ｉ−タンパク質（ｄｐｍ／ｇ）のレベル／分布を測定および比較するために、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、筋肉および脂肪を含む他の組織においても解剖を行った。
【０３０２】
画像解析を用いることにより、選択した脳転移および周囲の正常な脳における１２５Ｉ標識タンパク質のレベルを決定し、ｎＣｉ／ｇ組織またはｎｇタンパク質／ｇ組織という単位で表されるオートラジオグラフィーの像を得た。脳転移における標識タンパク質の取り込みを、転移のサイズ、血液腫瘍関門の透過性および循環時間に関して解析した。脳、脳転移、血液および他の組織についての、インタクトな薬物の１ｇまたは１ｍｌあたりのパーセンテージ線量を測定するための計算も行った。
【０３０３】
結果は、図６〜１０に示されている。図６および７は、１２５Ｉ標識トラスツズマブについての結果を示しており、図８〜１０は、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体についての結果を示している。
【０３０４】
図６Ａ〜６Ｆは、静脈内投与の２４時間後のマウス脳における１２５Ｉ標識トラスツズマブの分布を示している。図６Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図６Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図６Ｃは、１２５Ｉ標識トラスツズマブのオートラジオグラムを示しており、周囲の正常な脳組織と比較したときの抗体の増加倍数を示している。ここで、１２５Ｉ標識トラスツズマブは、検出限界である。図６Ｆに示されるように、トラスツズマブ単独の場合のＫｉｎ値は、正常な脳組織において約１．４６×１０−７ｍＬ／秒／ｇおよび脳転移において約３．８×１０−７ｍＬ／秒／ｇであり、タンパク質では比較的に低いＫｉｎ値であり、ｐ９７−トラスツズマブ結合体についてのＫｉｎ値よりも約１０００低い。
【０３０５】
図７Ａ〜７Ｄは、静脈内投与の２４時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識トラスツズマブの分布を示している。図７Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図７Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図７Ｃは、１２５Ｉ標識トラスツズマブのオートラジオグラムを示しており、周囲の正常な脳組織と比較したときの抗体の増加倍数を示している。図７Ｄは、様々な組織における１２５Ｉ標識トラスツズマブの組織対血液比を示している。ここで、トラスツズマブは、肺および脾臓については約０．２〜０．３という組織対血液比で器官に分布しており、心臓における分布は、肝臓と比べてかなり高い。正常な脳組織および脳転移における分布は、比較的低い（図７Ｄにおける挿入図を参照のこと）。脳／血液についての０．０２という比は、非常に低く、脈管性間隙に認められる比（すなわち、約０．０１〜０．０２である、脳脈管構造に認められるトラスツズマブの量）よりもわずかに優れているだけである。これらの転移が、有意な漏出性を示すとしても、非常に少ない取り込みが脳転移において観察される（図７Ｂを参照のこと）。
【０３０６】
図８Ａ〜８Ｆは、静脈内投与の２時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図８Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図８Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図８Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図８Ｃの左は、各転移において認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図８Ｂの左は、図８Ａに示されている腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比べたときの、各転移において認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図８Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。ここで、心臓への分布は、他の組織への分布よりも有意に少ない（例えば、肺、肝臓および脾臓よりも約１０倍少ない）。図８Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示している。正常な脳／血液についての比は、約０．０６であり（１２５Ｉ標識ｐ９７単独についての０．０４と比較される（データ示さず））、脳転移／血液についての比は、約０．１４である（１２５Ｉ標識ｐ９７単独についての０．０６と比較される（データ示さず））。図８Ｆは、個別の脳転移において認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約しており、濃度は、約２５〜１７５ｎｇ／ｇ組織の範囲である。
【０３０７】
図９Ａ〜９Ｆは、静脈内投与の８時間後のマウス脳および他の組織における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブの分布を示している。図９Ａは、赤色で輪郭が描かれた領域内の不均一サイズの脳転移を示しており、図９Ｂは、それらの転移のテキサスレッド−デキストラン染色を示している。図９Ｃは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体のオートラジオグラムを示しており、図９Ｃの左は、各転移に認められる結合体の量（ｎｇ／ｇ）を示している。図９Ｂの左は、図９Ａに示された腫瘍に対して遠位の脳（ＢＤＴ）領域と比較したときの、各転移に認められるｐ９７−トラスツズマブ結合体の増加倍数を示している。図９Ｄは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。ここで、心臓へのｐ９７−トラスツズマブの分布は、他の組織への分布よりも有意に少ない。図９Ｅは、正常な脳／血液および脳転移／血液におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体の比を示しており、ここで、正常な脳／血液における比は、約０．０４であり（上記２時間の時点についての０．０６と比較して、図８Ｅを参照のこと）、脳転移／血液における比は、約０．４４である（上記２時間の時点についての０．１４と比較して、図８Ｅを参照のこと）。図９Ｆは、個別の脳転移において認められる１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約しており、濃度は、約２５〜１２５ｎｇ／ｇ組織の範囲である。
【０３０８】
図１０Ａ〜１０Ｅは、１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の静脈内投与後の２および８時間の時点のデータを要約している。図１０Ａは、種々の組織についてのｐ９７−トラスツズマブ結合体の組織／血液比を示している。それらの比は、上記２時間および８時間の時点との間で大きく変動しない；しかしながら、心臓組織における結合体の比（レベル）は、他の組織よりも有意に低い（例えば、肺および肝臓組織よりも約１０倍低い）。対照的に、心臓組織におけるトラスツズマブ単独の分布は、肝臓と似ていた（図７Ｄを参照のこと）。図１０Ｂは、正常な脳組織における結合体のレベルが上記８時間の時点においてわずかに低いこと（上記２時間の時点と比べて）、および脳転移における結合体のレベルがその同じ時点において有意に高いことを示している。図１０Ｃは、正常な脳組織（１．１×１０−４ｍＬ／秒／ｇ）および脳転移（４．９×１０−４ｍＬ／秒／ｇ）におけるｐ９７−トラスツズマブ結合体について測定されたＫｉｎ値を示している。トラスツズマブについてのＫｉｎ値（図６Ｆを参照のこと）と比べて、ｐ９７−トラスツズマブ結合体は、トラスツズマブ単独よりも約１０００倍速く脳に輸送される。図１０Ｄは、２および８時間後における脳組織内の注射量のパーセンテージを示しており、図１０Ｅは、投与の２および８時間後の個々の脳転移における１２５Ｉ標識ｐ９７−トラスツズマブ結合体の濃度を要約している。
【０３０９】
上記２および８時間の時点におけるデータに基づいて、ｐ９７−トラスツズマブ結合体の薬物動態学的プロファイルも計算した。これらのデータを下記の表１０に示す。
【０３１０】
【表１０】
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全体的に見て、これらのデータは、治療有効濃度のｐ９７−トラスツズマブ結合体が、そのような結合体の全身性（例えば、静脈内）投与によるものだとしても、脳組織転移に達し得ることを強く示唆している。これらのデータは、ｐ９７およびトラスツズマブが、ｐ９７−トラスツズマブ結合体を正常な脳組織と比べて脳転移に、トラスツズマブ単独よりも有意に速い速度で（約１０００倍）選択的に向かわせるように互いに相乗的に働くことも示唆している。したがって、ｐ９７への結合体化は、血液脳関門を越えるトラスツズマブの輸送を増大させるだけでなく、血液腫瘍関門を越える輸送も増大させる。さらに、他の組織と比べて心臓組織への分布が少ないので、これらのデータは、ｐ９７への結合体化が、トラスツズマブなどの抗体の心毒性作用を減少させ得ることを示唆している。
【０３１１】
実施例５
Ｐ９７−セツキシマブ（ＣＥＴＩＸＵＭＡＢ）結合体の作製およびインビトロ細胞傷害性についてのアッセイ
インビトロ抗がん効力アッセイを、２つのヒトがん細胞系Ａ−４３１およびＨＴ−２９において行うことにより、ｐ９７単独およびビヒクルコントロールとしてのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と比較したときの、セツキシマブおよびｐ９７−セツキシマブ結合体のＩＣ５０として相対的効力を評価する。Ａ−４３１細胞系は、ＥＧＦＲを発現しているヒト類表皮癌であり、ＨＴ−２９細胞系は、ヒト結腸直腸腺癌である。
【０３１２】
上に記載したように、ｐ９７（メラノトランスフェリン）は、トランスフェリン、ラクトフェリンおよびオボトランスフェリン（ｏｖａｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）を含む、鉄結合タンパク質ファミリーに属する単量体シアロ糖タンパク質である。それは、メラノーマ細胞の表面の９７ｋＤのＧＰＩ結合型膜結合タンパク質として最初に同定され、メラノーマ関連抗原ｐ９７と命名された。ＧＰＩアンカーを欠損している可溶性形態（８２ｋＤ）が、組換え技法を用いて作製された。セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに作用することによってある特定のヒトがんを処置するための使用について承認されたヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体薬物であり、その作用機序は、リガンド結合に干渉することによるＥＧＦＲ活性化のブロックに関係している。
【０３１３】
チオエーテルリンカーを介して可溶性ｐ９７をセツキシマブに共有結合的に連結させることによって、ｐ９７−セツキシマブ結合体を調製した。図１１Ａは、室温における２４時間後の粗反応混合物のＨＰＬＣプロファイルを示している。
【０３１４】
次いで、その反応産物を、濃度を測定するためにサイズ排除ＨＰＬＣによって、および分子量を測定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、解析した。濃縮し滅菌したｐ９７−セツキシマブ結合体のアリコートを、１×ＰＢＳで１０倍希釈し、アリコートをＨＰＬＣサイズ排除カラムに注入した。図１１Ｂに示されるように、溶出プロファイルは、セツキシマブ（９．７０分）またはｐ９７（１０．０３分）のＲｔより早い、８．８７５分のＲｔを有する主要なピーク（９６％）を示した。２２０ｎｍにおけるピーク面積（１８５６．９）を、ｐ９７およびセツキシマブの検量線とともに使用することにより、４．０ｍｇ／ｍｌの生成物の濃度を測定した。
【０３１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の場合、精製タンパク質または反応混合物（各々１μｇ）のサンプルを、非還元条件下において、１×ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液を用いて、４％〜１２％ビス−トリスゲルにおいて解析した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）１〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミディゲル（ｍｉｄｉ  ｇｅｌ））。そのゲルを一定の１２５Ｖにおいて１５０分間泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。図１２に示されるように、結合体の分子量は、タンパク質ラダー分子量標準物質との比較に基づいて約２３０ＫＤａであると推定された；この推定値は、１：１のｐ９７−セツキシマブ比と一致する。
【０３１６】
インビトロ活性アッセイの場合、まず、Ａ−４３１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＡＴＣＣ製（ＡＴＣＣ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ダルベッコ改変イーグル培地において成長させ、ＨＴ−２９細胞を、１０％ＦＢＳを含むＡＴＣＣ製マッコイ５ａ改変培地において成長させる。信頼できるＩＣ５０アッセイの結果を確実にするために、顕微鏡観察による細胞の形態、トリパンブルー排除アッセイによってモニターされる増殖倍加時間、および被験作用物質による処理前の細胞分裂比データ（ｃｅｌｌ  ｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ  ｄａｔａ）に基づいて、最適な培養条件を検証する。
【０３１７】
３日間の処理インキュベーション期間の間、１％および１０％という２つのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）濃度において、各被験作用物質濃度点およびすべてのコントロールについて平底９６ウェルプレートにおいて３つ組でＩＣ５０アッセイを行う。それらの被験作用物質およびコントロールを、関連するヒト腫瘍細胞系におけるセツキシマブのＩＣ５０に基づいて１０００倍の用量範囲を網羅する８つの濃度で各細胞系培養物に投与する。詳細には、片対数濃度スケールにおける合計８つの被験作用物質濃度を、ＰＢＳ中の、２つの被験作用物質であるセツキシマブおよびｐ９７−セツキシマブ、ならびにコントロール（ｐ９７）およびビヒクル（ＰＢＳ）の各々について、下記の表１１に示されている濃度において評価する。
【０３１８】
【表１１】
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２つの細胞培養物の各々における被験作用物質の７２時間のインキュベーションの後、ＢＲＩ  ＳＯＰ：ＳＯＰ−ＴＭ−ＧＥＮ−０２９（ＭＴＴアッセイ）に従って、細胞アポトーシスを評価するためにＭＴＴ細胞傷害アッセイを行う。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびＳｉｇｍａＰｌｏｔ（商標）Ｖ５．０によって作動するＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）Ｍ２プレートリーダーを用いて、ＩＣ５０値および薬物応答曲線を作成する。
【０３１９】
上に記載された様々な実施形態は、組み合されることにより、さらなる実施形態を提供し得る。本明細書に言及されたおよび／または出願データシートに列挙された、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべてが、参照により本明細書にそれらの全体が援用される。様々な特許、出願および刊行物の概念を用いてなおもさらなる実施形態を提供することが必要である場合、実施形態の態様は、改変され得る。
【０３２０】
これらおよび他の変更は、上記の詳細な記載に照らしてそれらの実施形態に対して行われ得る。通常、以下の特許請求の範囲において、使用する用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきでなく、権利が与えられるそのような特許請求の範囲に対する等価物の全範囲に加えて、可能性のあるすべての実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月20日(2017.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セツキシマブ、またはその抗原結合フラグメントであって、セツキシマブの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ヒトＨｅｒ１／ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する、抗原結合フラグメントに共有結合的に連結した可溶性ヒトｐ９７ポリペプチド配列を含む結合体であって、該可溶性ヒトｐ９７ポリペプチドが、疎水性ドメイン（配列番号１の残基７１０〜７３８）の全部もしくは一部の欠失、およびシグナルペプチド（配列番号１の残基１〜１９）の全部もしくは一部の欠失を含み、該可溶性ヒトｐ９７ポリペプチドが、セツキシマブまたはその抗原結合フラグメントの血液脳関門を超える輸送およびがん細胞死滅化の増大に有効である、結合体。
【請求項２】
前記ｐ９７ポリペプチド配列および前記セツキシマブまたは抗原結合フラグメントが、融合ポリペプチドとして共有結合的に連結している、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、リンカーによって前記セツキシマブまたは抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している、請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、（ａ）ポリマー架橋剤によって前記セツキシマブまたは抗原結合フラグメントに共有結合的に連結しているか、あるいは（ｂ）ナノ粒子を介して該セツキシマブまたは抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している、請求項１に記載の結合体。
【請求項５】
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、チオエーテル結合を含むポリマー架橋剤によって前記セツキシマブまたは抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している、請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
前記ｐ９７ポリペプチド配列が、ポリエチレングリコールを含むポリマー架橋剤によって前記セツキシマブまたは抗原結合フラグメントに共有結合的に連結している、請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
前記セツキシマブまたはその抗原結合フラグメントが、配列番号１５に示される配列を有するヒトＨｅｒ１／ＥＧＦＲタンパク質に特異的である、請求項１に記載の結合体。
【請求項８】
前記可溶性ヒトｐ９７ポリペプチド配列が、チオエーテル結合を含むポリマー架橋剤によりセツキシマブに共有結合的に連結している、請求項１に記載の結合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合体および薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項１０】
Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲを発現しているがんを有する被験体を処置するための、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲを発現しているがんが、中枢神経系（ＣＮＳ）の原発性がんである、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ＣＮＳの原発性がんが、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫および原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）から選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲを発現しているがんが、中枢神経系（ＣＮＳ）の転移性がんである、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記転移性がんが、乳がん、肺がん、泌尿生殖器がん、結腸直腸がんおよび膵臓癌を含む消化管がん、骨肉腫、メラノーマ、頭頸部がん、前立腺がん、または造血がんから前記ＣＮＳに転移したものである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記Ｈｅｒ１／ＥＧＦＲを発現しているがんが、頭頚部がんまたは結腸直腸がんである、請求項１４に記載の薬学的組成物。