(57)【要約】【課題】高い抗菌活性が得られる抗菌用組成物、食品、及び菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法を提供する。【解決手段】抗菌用組成物は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５９菌株の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１菌株、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株及びラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７５菌株からなる群から選択される少なくとも１種以上の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、を含む。【選択図】図１
2018100228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５９菌株の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１菌株、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株及びラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７５菌株からなる群から選択される少なくとも１種以上の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、
を含む、抗菌用組成物。
【請求項２】
ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５菌株の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、
を含む、抗菌用組成物。
【請求項３】
医薬である、
請求項１又は２に記載の抗菌用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の抗菌用組成物を含有する、食品。
【請求項５】
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５９菌株と、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１菌株、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株及びラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７５菌株からなる群から選択される少なくとも１種以上と、を共培養する培養ステップを含む、
菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法。
【請求項６】
ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株と、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５菌株と、を共培養する培養ステップを含む、
菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌用組成物、食品、及び菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕症、口腔カンジダ症及び歯周病は、それぞれう蝕菌、カンジダ菌及び歯周病菌によって引き起こされる。う蝕症等の口腔内疾患の予防又は治療のために、う蝕菌等に対して抗菌活性を示す乳酸菌が単離されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１菌株（以下、単に「ＫＯ３」ともいう）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株（以下、単に「ＹＵ３」ともいう）及びラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７５菌株（以下、単に「ＹＵ４」ともいう）のう蝕菌、カンジダ菌及び歯周病菌に対する抗菌活性が開示されている。特許文献２には、ラクトバチルス・ラムノーサス  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５菌株（以下、単に「ＫＯ１」ともいう）及びＫＯ３の菌体培養物から抽出されるバクテリオシンが、う蝕菌、カンジダ菌及び歯周病菌の増殖を抑制することが示されている。
【０００４】
特許文献３では、ラクトバチルス・ラムノーサス  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５８菌株（以下、単に「ＯＧ４」ともいう）及びラクトバチルス・ラムノーサス  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５９菌株（以下、単に「ＯＧ５」ともいう）の培養上清のう蝕菌、カンジダ菌及び歯周病菌に対する抗菌活性が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／００７５８４号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１０８５１８号
【特許文献３】特開２０１４−２１８４９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年の研究の進展により、う蝕症等の口腔内疾患と、全身疾患との関連性が重視されている。口腔内疾患の予防又は治療が全身疾患の予防又は治療に寄与すると考えられる。口腔内疾患の防止、あるいは口腔内疾患の完治を目指して、抗菌活性のさらなる向上が求められている。
【０００７】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、高い抗菌活性が得られる抗菌用組成物、食品、及び菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の観点に係る抗菌用組成物は、
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５９菌株の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１菌株、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株及びラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７５菌株からなる群から選択される少なくとも１種以上の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、
を含む。
【０００９】
本発明の第２の観点に係る抗菌用組成物は、
ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５菌株の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、
を含む。
【００１０】
上記本発明の第１の観点に係る抗菌用組成物又は第２の観点に係る抗菌用組成物は、
医薬である、
こととしてもよい。
【００１１】
本発明の第３の観点に係る食品は、
上記本発明の第１の観点に係る抗菌用組成物又は第２の観点に係る抗菌用組成物を含有する。
【００１２】
本発明の第４の観点に係る菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法は、
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５９菌株と、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１菌株、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株及びラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７５菌株からなる群から選択される少なくとも１種以上と、を共培養する培養ステップを含む。
【００１３】
本発明の第５の観点に係る菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法は、
ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２菌株と、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５菌株と、を共培養する培養ステップを含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、高い抗菌活性が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】各菌株の培養上清及び個別に培養した２種の菌株の培養上清のカンジダ菌に対する抗菌活性を示す図である。
【図２】共培養した２種の菌株の培養上清のカンジダ菌に対する抗菌活性を示す図である。
【図３】各菌株の培養上清及び個別に培養した２種の菌株の培養上清のう蝕菌に対する抗菌活性を示す図である。
【図４】共培養した２種の菌株の培養上清のう蝕菌に対する抗菌活性を示す図である。
【図５】各菌株の培養上清及び個別に培養した２種の菌株の培養上清の歯周病菌に対する抗菌活性を示す図である。
【図６】共培養した２種の菌株の培養上清の歯周病菌に対する抗菌活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。
【００１７】
（実施の形態１）
本実施の形態に係るＯＧ５、ＫＯ１、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４はいずれも、う蝕罹患歴のないヒトの安静時全唾液から単離された乳酸菌である。これらの乳酸菌は、ホモ型乳酸発酵を行うカタラーゼ陰性細菌であり、芽胞を形成しない。これらの乳酸菌の培養は、好気条件下でも可能である。これらの乳酸菌は、菌体外多糖類を産生する。
【００１８】
上記の乳酸菌は、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託されている。ＯＧ５、ＫＯ１、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４の受託番号は、それぞれＮＩＴＥ  Ｐ−１５５９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５、ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７２及びＮＩＴＥ  ＢＰ−７７５である。
【００１９】
上記の乳酸菌は一種単独でも十分な抗菌活性を示すが、下記実施例に示すように、乳酸菌を特定の組み合わせで併用した場合、さらに高い抗菌活性が得られる。高い抗菌活性が得られる乳酸菌の第１の組み合わせは、ＯＧ５と、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４からなる群から選択される少なくとも１種と、である。乳酸菌の第２の組み合わせは、ＹＵ３と、ＫＯ１と、である。
【００２０】
したがって、本実施の形態に係る抗菌用組成物は、ＯＧ５の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４からなる群から選択される少なくとも１種以上の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、を含む。
【００２１】
また、本実施の形態に係る抗菌用組成物は、ＹＵ３の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、ＫＯ１の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物と、を含む。
【００２２】
上記乳酸菌の菌体は、常法によって得られる生菌の菌体のみならず、死菌の菌体であってもよい。菌体培養物とは、発酵液及び培養上清等である。菌体又は菌体培養物の抽出物とは、菌体若しくは菌体培養物を処理して得られる細胞質又は細胞壁画分、及び菌体若しくは菌体培養物を、溶媒抽出することで得られる抽出液、抽出液の希釈液、濃縮液又は乾燥末等である。以下では、菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物を、単に「菌体等」ともいう。
【００２３】
上述の抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤及び非極性溶剤のいずれをも使用することができる。極性溶剤及び非極性溶剤を混合して用いてもよい。例えば、水、メタノール等のアルコール類、プロピレングリコール等の多価アルコール類、アセトン等のケトン類、酢酸メチル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル類、ヘキサン等の炭化水素類、ベンゼン等の芳香族炭化水素類、ピリジン類等が抽出溶剤として挙げられる。好ましくは、抽出溶剤は、酢酸エチル等のエステル類又はエタノール等のアルコール類である。
【００２４】
抽出条件は、使用する溶剤によって適宜設定される。例えば、培養液１質量部に対して１〜１０質量部の溶剤を用いて、０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、０．５〜３時間抽出するのが好ましい。
【００２５】
抽出物は、そのまま用いてもよく、希釈、濃縮又は凍結乾燥した後、必要に応じて粉末又はペースト状に調製して用いてもよい。また、公知の方法で適宜精製して用いることもできる。
【００２６】
上記乳酸菌を培養する培地には、果汁培地、野菜汁培地、牛乳培地、脱脂粉乳培地及び半合成培地等の種々の培地を用いることができる。具体的には、培地として、脱脂乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地、酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、ＭＲＳ培地及びＧＡＭ培地等が挙げられる。
【００２７】
上記乳酸菌の培養方法は、菌体が良好に生育する方法であれば特に限定されず、静置培養、ｐＨを一定にした中和培養、回分培養及び連続培養等である。ＯＧ５、ＫＯ１、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４は、それぞれ個別に培養されてもよい。個別に培養した場合、それぞれの菌体等を回収し、上記乳酸菌の第１の組み合わせ又は第２の組み合わせに従って混合することで、抗菌用組成物が得られる。
【００２８】
上記菌体等の抗菌活性をさらに高めるのに好適な製造方法は、複数種の乳酸菌を同一の培地で共培養する培養ステップを含む。当該培養ステップでは、ＯＧ５と、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４からなる群から選択される少なくとも１種と、を共培養する。あるいは、共培養ステップでは、ＹＵ３と、ＫＯ１と、を共培養する。
【００２９】
例えば、ＯＧ５とＫＯ３とを共培養する場合、共培養ステップでは、ＯＧ５及びＫＯ３それぞれを所定の菌濃度で懸濁液を調製し、ＯＧ５の懸濁液とＫＯ３の懸濁液とを、培地に接種した後、３７℃で４８時間、培養すればよい。共培養ステップの後には、上記のように菌体等を回収すればよい。
【００３０】
本実施の形態に係る抗菌用組成物が抗菌活性を示すのは、例えば、う蝕菌、カンジダ菌及び歯周病菌である。う蝕菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）及びストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）等が挙げられる。
【００３１】
カンジダ菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）及びカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等が挙げられる。
【００３２】
歯周病菌としては、例えば、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、プレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）、トレポネーマ・デンティコーラ（Treponema denticola）、タンネレラ・フォーサイセンシス（Tannerellaforsythensis）及びフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）等が挙げられる。
【００３３】
本実施の形態に係る抗菌用組成物の用途は、特に限定されないが、好ましくは、医薬である。医薬は、例えば、口腔内疾患用の予防剤、改善剤又は治療剤である。口腔内疾患とは、例えば、う蝕菌、カンジダ菌及び歯周病菌によって引き起こされる口腔内疾患である。具体的には、口腔内疾患として、う蝕症、舌炎、鵞口瘡及び口角炎等の口腔カンジダ症、歯肉炎及び歯周炎等の歯周病等が挙げられる。
【００３４】
本実施の形態に係る抗菌用組成物の医薬用途は、口腔内疾患用に限らず、例えば皮膚感染症及び性感染症にも使用できる。皮膚感染症としては、皮膚カンジダ症が挙げられる。性感染症としては、性器カンジダ症が挙げられる。
【００３５】
上記医薬の剤形は、特に限定されず、種々の剤形を適用できる。上記医薬は、内服剤であってもよく、外用剤であってもよい。当該医薬の剤形は、例えば錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、軟膏、クリーム剤、液剤、点鼻薬、坐剤及び貼付剤等である。皮膚感染症用の医薬の場合、上記医薬の剤形としては、軟膏、クリーム剤又は液剤が好ましい。
【００３６】
本実施の形態に係る医薬には、上記菌体等の抗菌活性を妨げない範囲で、他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体及び希釈剤等を適宜用いることができる。
【００３７】
医薬中の上記乳酸菌の菌体等の含有量は、医薬の全組成中の１〜８０質量％、５〜５０質量％又は１０〜２０質量％である。菌体を医薬に用いる場合、医薬における菌体の含有量は、特に限定されないが、例えば剤型が液体の場合には、菌体濃度を１×１０６〜１×１０８細胞／ｍｌとすることが好ましく、固体の場合には、１×１０７〜１×１０１０細胞／ｇとすることが好ましい。上記医薬が乳酸菌を生菌として含む場合は、好ましくは、該医薬は、成人一人当たり、１×１０８〜１×１０１０ｃｆｕ／日で投与される。
【００３８】
以上詳細に説明したように、上記抗菌用組成物は、２種以上の乳酸菌由来の菌体等を含むので、１種の乳酸菌由来の菌体等よりも高い抗菌活性を有する。
【００３９】
また、本実施の形態に係る菌体等の製造方法では、複数種の上記乳酸菌を共培養してもよいこととした。こうすることで、下記実施例に示すように、さらに高い抗菌活性を得ることができる。なお、乳酸菌の組み合わせは、２種に限らず、３〜５種であってもよいし、う蝕菌等に抗菌活性を有するその他の乳酸菌をさらに追加してもよい。また、上記抗菌用組成物は、う蝕菌等に抗菌活性を有するその他の化合物等を含有してもよい。
【００４０】
なお、別の実施の形態では、口腔内疾患、皮膚感染症及び性感染症の治療方法が提供される。該治療方法は、上記抗菌用組成物を患者に投与する投与ステップを含む。また、別の実施の形態では、上記抗菌用組成物は、口腔内疾患、皮膚感染症及び性感染症の治療に使用される。
【００４１】
なお、本実施の形態に係る抗菌用組成物は、口腔用組成物として用いてもよい。口腔用組成物の具体的な形態としては、洗口剤、マウスウオッシュ、練歯磨、粉歯磨、水歯磨、口腔用軟膏剤、ゲル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、グミゼリー、トローチ、タブレット、カプセル、キャンディー及びチューインガム等が挙げられる。好ましくは、口腔用組成物は、練歯磨、洗口剤、グミゼリー及びトローチである。また、本実施の形態に係る抗菌用組成物は、薬用化粧品等に配合されてもよい。
【００４２】
（実施の形態２）
続いて、実施の形態２について、上記実施の形態１と異なる点について主に説明する。本実施の形態に係る食品は、上述の抗菌用組成物を含有する。
【００４３】
具体的には、上記食品は、果汁飲料、野菜汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、発酵乳、発酵果汁、発酵野菜汁、アルコール飲料及び清涼飲料等の飲料である。また、上記食品は、ゼリー状食品、各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ジャム、パン、ガム、飴、スープ類、漬物及び佃煮等の各種食品の他、サプリメント、健康食品及び特定保健用食品等の機能性食品であってもよい。
【００４４】
ＯＧ５、ＫＯ１、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４は乳酸菌であるため、本実施の形態に係る食品は、好ましくは、菌体培養物としてのヨーグルト、チーズ、味噌、醤油及び漬物等の発酵物を含む。当該食品は、当該発酵物を素材として製造される、う蝕、歯周病及び口腔カンジダ症の予防、改善又は治療用のパン、スナック菓子又はケーキ等であってもよい。
【００４５】
上記乳酸菌の発酵は、好ましくは、予め用意したスターターを発酵用原料物質に接種して行う。スターターとしては、例えば、殺菌処理を行った発酵用原料物質（例えば酵母エキスを添加した１０％脱脂粉乳等）に、上記乳酸菌を接種して培養したものを挙げることができる。
【００４６】
発酵用原料物質には、必要に応じて発酵促進物質、例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール及びフラクトース等の炭素源、酵母エキス及びペプトン等の窒素源、ビタミン類並びにミネラル類等を加えてもよい。
【００４７】
上記乳酸菌の接種量は、例えば、発酵用原料物質含有液１ｍｌ中に菌体が約１×１０６細胞以上、好ましくは１×１０７細胞前後である。発酵温度は、例えば、２０〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃である。発酵時間は、例えば５〜７２時間である。
【００４８】
上記乳酸菌を発酵して得られる菌体培養物としての乳酸発酵物は、凝固したカード状（ヨーグルト状）の形態を有している。乳酸発酵物は、固形食品、または粉砕して均質化して飲料として利用できる。
【００４９】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る食品は、上述の抗菌用組成物を含有するため、経口摂取されることで、う蝕菌等の発育及び増殖を阻害できる。このため、口腔内疾患等の予防、改善又は治療に有用である。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１：カンジダ菌に対する抗菌活性の評価）
乳酸菌の菌株として、ＯＧ５、ＫＯ１、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４に加え、上述のＯＧ４を用いた。ＯＧ４は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ  Ｐ−１５５８として寄託されている。
【００５２】
ＭＲＳ液体培地で前培養した各乳酸菌を遠心分離（３０００ｒｐｍ×５分）にて回収後、超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水、以下「ＭＱ」ともいう）で２回洗浄し、ＯＤ６００で０．２８〜０．３０とすることにより、所定の菌濃度（約１．０×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）に調整した。
【００５３】
所定の菌濃度に調整した各菌株の懸濁液５０μｌを、１００倍希釈になるように４．９５ｍｌのＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で２４時間、静置培養を行った。その後、室温にて３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、得られた培養上清を回収した。後述する抗菌アッセイでは、回収した培養上清を用いた。
【００５４】
一方、所定の菌濃度のＫＯ１及びＯＧ５を共培養した。ＫＯ１及びＯＧ５の懸濁液それぞれ５０μｌを、４．９５ｍｌのＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で２４時間、静置培養を行った。培養後、上記と同様に培養上清を回収した。共培養は、ＫＯ１及びＯＧ５の組み合わせの他、ＫＯ３及びＯＧ５、ＫＯ１及びＹＵ３、ＹＵ３及びＹＵ４、ＹＵ３及びＯＧ５、ＹＵ４及びＯＧ５の５通りの組み合わせで行った。
【００５５】
カンジダ菌として、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ＭＹＡ２７４株を用いた。サブローデキストロース液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に、ＭＹＡ２７４株を接種し、３７℃で２４時間前培養した。その後、３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を用いて滅菌精製水で２回洗浄した後、ＯＤ６００で０．２８〜０．３０（約１．０×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。
【００５６】
抗菌アッセイには２４穴プレートを用いた。２４穴プレートの各ウェルに、サブローデキストロース液体培地を１ｍｌ添加した。単独の菌株の培養上清の場合は、各ウェルに、各培養上清１ｍｌを個別に加え、ＭＹＡ２７４株の菌懸濁液を５０μｌ接種し、テストサンプルとした。個別に培養した２種の菌株の培養上清の組み合わせの場合は、各ウェルに、各培養上清１．０ｍｌを加え、ＭＹＡ２７４株の菌懸濁液を５０μｌ接種し、テストサンプルとした。以下では、例えば、個別に培養したＫＯ１とＫＯ３の各培養上清を加えたテストサンプルを、「ＫＯ１＋ＫＯ３」と示す。
【００５７】
共培養の培養上清の場合、抗菌アッセイでは、各ウェルに、共培養で得られた培養上清１ｍｌを加え、ＭＹＡ２７４株の菌懸濁液を５０μｌ接種し、テストサンプルとした。以下では、例えば、ＫＯ１及びＯＧ５を共培養して得られた培養上清を加えたテストサンプルを、「ＫＯ１＿ＯＧ５」と示す。
【００５８】
コントロールサンプルとして、サブローデキストロース液体培地１ｍｌを添加した各ウェルに、ＭＱ又はＭＲＳ液体培地を１ｍｌ添加し、ＭＹＡ２７４株の菌懸濁液を個別に５０μｌ接種した。テストサンプル及びコントロールサンプルを、いずれも同じ操作で４つずつ作製した（ｎ＝４）。
【００５９】
テストサンプル及びコントロールサンプルを、３７℃で２４時間培養した後、菌量の指標として、ＡＴＰ量を測定した。ＡＴＰ量は、ルミノメーター（ＡＢ２２００  ルミネッセンサーＰＳＮ、アトー社製）で常法に従って測定した。
【００６０】
（結果）
図１は、単独の菌株の培養上清のテストサンプル及び個別に培養した２種の菌株の各培養上清を加えたテストサンプルにおけるＡＴＰ濃度を対数で示す。単独で培養した上記菌株の培養上清は、いずれもＭＹＡ２７４株に対して抗菌活性を示した。２種の菌株の各培養上清を加えたテストサンプルでは、ＫＯ１＋ＹＵ３、ＫＯ３＋ＯＧ５、ＹＵ３＋ＹＵ４、ＹＵ３＋ＯＧ５及びＹＵ４＋ＯＧ５において、ＭＹＡ２７４株に対して単独の菌株の培養上清よりも高い抗菌活性が示された。
【００６１】
図２は、共培養のテストサンプルの結果を示す。ＫＯ３＿ＯＧ５、ＹＵ３＿ＹＵ４及びＹＵ３＿ＯＧ５において、ＭＹＡ２７４株に対して特に高い抗菌活性が示された。なお、本実施例において、ＭＲＳ液体培地のＡＴＰ量は、ＭＱと同程度であった。
【００６２】
（実施例２：う蝕菌に対する抗菌活性の評価）
う蝕菌として、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＵＡ１３０株を用いた。５％の酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）を添加したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＳＢＹ液体培地：Ｄｉｆｃｏ社製）にＵＡ１３０株を接種し、３７℃で２４時間培養した。その後、３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を用いて滅菌精製水で２回洗浄した後、ＯＤ６００で０．２８〜０．３０（約１．０×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。
【００６３】
２４穴プレートの各ウェルに、ＴＳＢＹ液体培地を１ｍｌ添加し、実施例１と同様にテストサンプル及びコントロールサンプルを調製した。テストサンプル及びコントロールサンプルを、３７℃で２４時間培養した後、ＡＴＰ量を測定した。
【００６４】
（結果）
図３は、単独の菌株の培養上清のテストサンプル及び個別に培養した２種の菌株の各培養上清を加えたテストサンプルにおけるＡＴＰ濃度を対数で示す。単独で培養した上記菌株の培養上清は、いずれもＵＡ１３０株に対して抗菌活性を示した。２種の菌株の各培養上清を加えたテストサンプルでは、ＫＯ３＋ＹＵ４において単独の菌株の培養上清よりも高い抗菌活性がＵＡ１３０株に対して示された。また、ＫＯ３＋ＯＧ５及びＹＵ４＋ＯＧ５の培養上清において、単独で培養したＫＯ３、ＹＵ４及びＯＧ５の培養上清と同程度の抗菌活性がＵＡ１３０株に対して示された。なお、ＭＲＳ液体培地のＡＴＰ量は、ＭＱと同程度であった。
【００６５】
図４は、共培養のテストサンプルの結果を示す。ＹＵ４＿ＯＧ５において、ＵＡ１３０株に対して最も高い抗菌活性が示された。共培養することでＫＯ１＿ＹＵ３において、単独で培養したＫＯ３等と同程度の抗菌活性を示したＫＯ３＋ＯＧ５と同じ組み合わせのＫＯ３＿ＯＧ５よりも強い抗菌活性が示された。また、共培養することでＹＵ３＿ＯＧ５において、ＫＯ３＿ＯＧ５と同等の抗菌活性が示された。なお、本実施例において、ＭＲＳ液体培地のＡＴＰ量は、ＭＱと同程度であった。
【００６６】
（実施例３：歯周病菌に対する抗菌活性の評価）
歯周病菌として、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）ＮＣＴＣ９７１０株を用いた。ＧＡＭ培地（１％ヘミンおよび０．２％ビタミンＫを添加）に、ＮＣＴＣ９７１０株を接種し、３７℃で７日間、アネロパック（三菱ガス化学社製）を入れた嫌気ジャー（１０％ＣＯ２）中で前培養を行った。その後、３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を用いてリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、ＯＤ６００で０．２８〜０．３０（約１．０×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。
【００６７】
２４穴プレートの各ウェルに、ＧＡＭ培地を１ｍｌ添加し、実施例１と同様にテストサンプル及びコントロールサンプルを調製した。テストサンプル及びコントロールサンプルを、３７℃で２４時間培養した後、ＡＴＰ量を測定した。
【００６８】
（結果）
図５は、単独の菌株の培養上清のテストサンプル及び個別に培養した２種の菌株の各培養上清を加えたテストサンプルにおけるＡＴＰ濃度を対数で示す。単独で培養した上記菌株の培養上清は、いずれもＮＣＴＣ９７１０株に対して抗菌活性を示した。２種の菌株の各培養上清を加えたテストサンプルでも、単独の菌株の培養上清と同等の抗菌活性が示された。
【００６９】
図６は、共培養のテストサンプルの結果を示す。ＫＯ１＿ＯＧ５、ＫＯ３＿ＯＧ５、ＹＵ４＿ＯＧ５において、ＮＣＴＣ９７１０株に対して高い抗菌活性が示された。なお、本実施例において、ＭＲＳ液体培地のＡＴＰ量は、ＭＱと同程度であった。
【００７０】
以上により、個別に培養又は共培養した場合、ＯＧ５と、ＫＯ３、ＹＵ３及びＹＵ４からなる群から選択される１種以上との組み合わせ、並びにＹＵ３と、ＫＯ１との組み合わせに係る培養上清が、それぞれう蝕菌、カンジダ菌及び歯周病菌の少なくとも１種に対して高い抗菌活性を有する。特に当該組み合わせでは、う蝕菌及びカンジダ菌の両方に高い抗菌活性を有する。したがって、これら組み合わせの菌株由来の菌体等は、う蝕菌、カンジダ菌又は歯周病菌を原因とする疾患の予防、改善又は治療に有効である。
【００７１】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、う蝕菌、カンジダ菌又は歯周病菌を原因とする疾患の予防、改善又は治療に好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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