(57)【要約】      （修正有）【課題】より効率的にグルタチオンＳ−トランスファラーゼ（GST）を阻害することができるGSH誘導体の提供。【解決手段】式（1）で表される化合物又はその塩。2018002669.tif 000026［R1はハロゲン原子又は−R11−R12；R11はＯ又はＳ；R12はアルキル基又はアリール基；R2はアルキレン基、アルキレン基で置換／非置換のフェニレン基又は置換／非置換のフェニレン基；R3はＨ、置換／非置換のアリール基又はアラルキル基；R4はヒドロキシ基又は加水分解性基；R5はヒドロキシ基、加水分解性基又は機能分子由来の基］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（1）：
【化１】
2018002669.tif 000025
［式中、R1はハロゲン原子又は−R11−R12（R11は酸素原子又は硫黄原子を示す。R12はアルキル基又はアリール基を示す。）で表される基を示す。R2はアルキレン基、−アルキレン基−置換されていてもよいフェニレン基−で表される基、又は置換されていてもよいフェニレン基を示す。R3は水素原子、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいアラルキル基を示す。R4はヒドロキシ基又は加水分解性基を示す。R5はヒドロキシ基、加水分解性基、又は機能分子由来の基を示す。］
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
前記R1がハロゲン原子である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
前記R1がフッ素原子である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
前記R2がアルキレン基である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
前記機能性分子がタンパク質タグ又は蛍光分子である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
前記加水分解性基がアルコキシ基、アルコキシアルコキシ基、アシルオキシ基、アシルオキシアルコキシキ基、カーボネート基、カルバメート基、又はアミド基である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する生物試験用試薬。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有するグルタチオンS−トランスフェラーゼ阻害剤。
【請求項１０】
前記グルタチオンS−トランスフェラーゼがπ型である、請求項９に記載の阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する抗がん剤。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有するがん診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオンS−トランスフェラーゼ阻害作用を有する化合物又はその塩ン、それを含有する該酵素の阻害剤、抗がん剤、がん診断薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンS−トランスフェラーゼ（本明細書において、GSTと示すこともある。）は、薬物代謝の第II相反応おいてグルタチオン（本明細書において、GSHと示すこともある。）抱合を触媒する酵素である。GSTは、生体異物の解毒や活性酸素の除去などの主な機能によって、生体内の環境変化や酸化ストレスから細胞を守るために重要である。
【０００３】
一方で、GSTは、細胞増殖やアポトーシスの調節にも関与するといわれている。例えば、該酵素には複数のタイプが存在しており（非特許文献１及び２）、π型は、アポトーシスを抑制することによってがん細胞を増殖させることが報告されている（非特許文献３及び４）。具体的には、π型は、JNK（MAPK）との複合体形成によりJNKの活性化を阻害する経路、及びASK（MAPKKK）の活性化を引き起こすタンパク質であるTRAF2との複合体形成によりASKの活性化を阻害する経路の2つの経路により、アポトーシスに対して抑制的に働くことが報告されている。また、π型は、各種組織由来の腫瘍において過剰発現することが報告されている（非特許文献５）。このため、GST（特にπ型）を阻害すれば、アポトーシスが促進されて、抗がん効果が発揮されと考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Crit Rev Biochem Mol. Biol. 1995, 30, 445-600.
【非特許文献２】Trends in Pharmacological Sciences 2012, 33, 656-668.
【非特許文献３】Oncogene 2006, 25, 1639-1648.
【非特許文献４】Oncogene 2006, 25, 5787-5800.
【非特許文献５】Cancer Res 1989, 49, 1422-1428.
【非特許文献６】Proteins 1997, 28, 202-216.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
GST阻害剤としては、基質であるGSHと競合的にGSTに作用するGSH誘導体が考えられる。しかしながら、細胞内のGSH濃度は非常に高いことから（1〜10mMといわれている）、既存のGSH誘導体による競合阻害効果は限定的なものであると考えられた。
【０００６】
そこで、本発明は、より効率的にGSTを阻害することができるGSH誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、特定の構造を有するGSH誘導体又はその塩が、効率的にGSTを阻害できることを見出した。本発明者らはこのような知見に基づき、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００８】
項１．  一般式（1）：
【０００９】
【化１】
2018002669.tif 000002
【００１０】
［式中、R1はハロゲン原子又は−R11−R12（R11は酸素原子又は硫黄原子を示す。R12はアルキル基又はアリール基を示す。）で表される基を示す。R2はアルキレン基、−アルキレン基−置換されていてもよいフェニレン基−で表される基、又は置換されていてもよいフェニレン基を示す。R3は水素原子、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいアラルキル基を示す。R4はヒドロキシ基又は加水分解性基を示す。R5はヒドロキシ基、加水分解性基、又は機能分子由来の基を示す。］
で表される化合物又はその塩．
項２．  前記R1がハロゲン原子である、項１に記載の化合物又はその塩．
項３．  前記R1がフッ素原子である、項１又は２に記載の化合物又はその塩．
項４．  前記R2がアルキレン基である、項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩．
項５．  前記機能性分子がタンパク質タグ又は蛍光分子である、項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩．
項６．  前記加水分解性基がアルコキシ基、アルコキシアルコキシ基、アシルオキシ基、アシルオキシアルコキシキ基、カーボネート基、カルバメート基、又はアミド基である、項１〜５のいずれかに記載の化合物又はその塩．
項７．  項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する医薬組成物．
項８．  項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する生物試験用試薬．
項９．  項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有するグルタチオンS−トランスフェラーゼ阻害剤．
項１０．  前記グルタチオンS−トランスフェラーゼがπ型である、項９に記載の阻害剤．
項１１．  項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する抗がん剤．
項１２．  項１〜６のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有するがん診断薬．
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物は、GSHの存在下であっても（特に高濃度に存在する場合であっても）、効率的にGSTを阻害することができる。このため、本発明の化合物又はその塩は、各種生物試験用試薬、医薬組成物等として、特にGST阻害剤、抗がん剤等として有用である。
【００１２】
また、本発明の化合物は、GSTと不可逆的に結合すると考えられ、このため該化合物を用いて組織からGSTを分離することができると考えられる。分離されたGST（特にGSTπ型）の量や型を測定することにより、がんを診断することも可能である。よって、本発明の化合物又はその塩は、GST分離剤、がん診断剤等としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】上段は実施例6の試験結果を示し、下段は実施例6の試験のスキームを示す。縦軸は、酵素反応の初速度を示し、横軸は、反応溶液内のGS-ESF濃度を示す。◆はプレインキュベートの時間が1分間である場合の結果を示し、■は同時間が30分間である場合の結果を示す。
【図２】上段は実施例7の試験結果を示し、下段は実施例7の試験のスキームを示す。縦軸は、酵素反応の初速度を示し、横軸は、反応溶液内のGS-ESF濃度を示す。◆はGS-ESFのみをプレインキュベートした場合（反応溶液1）の結果を示し、■はGS-ESFと共にGSHをプレインキュベートした場合（反応溶液2）の結果を示す。
【図３】上段は実施例8の試験結果を示し、下段は実施例8の試験のスキームを示す。縦軸は、酵素反応の初速度を示し、横軸は、プレインキュベートの時間を示す。◆はGS-ESFを反応溶液に加えなかった場合の結果を示し、■はGS-ESFを反応溶液に加えた場合の結果を示す。各プロット上のバーは、標準誤差（n=3）を示す。
【図４】上段は実施例9の試験結果を示し、下段は実施例9の試験のスキームを示す。縦軸は、酵素反応の初速度を示し、横軸は、プレインキュベートの時間を示す。◆はGSTπのみをプレインキュベートした場合（反応溶液3）の結果を示し、■はGSTπと共にGS-ESFをプレインキュベートした場合（反応溶液4）の結果を示す。各プロット上のバーは、標準誤差（n=3）を示す。
【図５】上段は実施例10の試験結果を示し、下段は実施例10の試験のスキームを示す。縦軸は、酵素反応の初速度を示し、横軸は、反応溶液5又は6のインキュベート時間を示す。◆はGSHのみをインキュベートした場合（反応溶液5）の結果を示し、■はGSHと共にGS-ESFをインキュベートした場合（反応溶液6）の結果を示す。各プロット上のバーは、標準誤差（n=3）を示す。
【図６】上段は実施例11の試験結果を示し、下段は実施例11の試験のスキームを示す。縦軸は、楕円率を示し、横軸は、波長を示す。「GST」は反応溶液7の結果を示し、「GST+3%NaOHaq.」は反応溶液8の結果を示し、「GST+GSH(1.0mM)」は反応溶液9の結果を示し、「GST+ESF(0.1mM)」は反応溶液10の結果を示す。
【図７】実施例11で得られた検量線を示す。縦軸は、HPLC分析で得られたピーク面積を示し、横軸は、HPLC分析に供した溶液のGS-ESF濃度を示す。
【図８】実施例11で得られた、-In([GS-ESF]/[GS-ESF]0)を示すグラフである。横軸は、反応溶液のインキュベート時間を示す。◆はGSH濃度が1.4 Mの場合の結果を示し、■はGSH濃度が1 Mの場合の結果を示し、▲はGSH濃度が0.4 Mの場合の結果を示す。
【図９】実施例11で得られた、kappを示すグラフである。横軸は、反応溶液中のGSH濃度を示す。
【図１０】実施例11で得られた、非酵素反応による生成物量を示すグラフである。横軸は、反応溶液のインキュベート時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「含有」とは、comprise、consist essentially of及びconsist ofのいずれも包含する概念である。また、本明細書において、「置換されていてもよい」とは、「置換及び／又は非置換」を意味する。
【００１５】
1．化合物又はその塩
本発明は、その一態様として、一般式（1）：
【００１６】
【化２】
2018002669.tif 000003
【００１７】
［式中、R1はハロゲン原子又は−R11−R12（R11は酸素原子又は硫黄原子を示す。R12はアルキル基又はアリール基を示す。）で表される基を示す。R2はアルキレン基、−アルキレン基−置換されていてもよいフェニレン基−で表される基、又は置換されていてもよいフェニレン基を示す。R3は水素原子、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいアラルキル基を示す。R4はヒドロキシ基又は加水分解性基を示す。R5はヒドロキシ基、加水分解性基、又は機能分子由来の基を示す。］
で表される化合物又はその塩に関する。以下、これについて説明する。
【００１８】
本発明においては、限定的な解釈を望むものではないが、一般式（1）におけるR1がGSTの活性残基（例えば、GSTπ型におけるN末端から7番目のアミノ酸（チロシン）残基）と共有結合することにより、GSTを効率的に阻害できると考えられる。よって、R1はこの限りにおいて特に限定されない。
【００１９】
一般式（1）において、R1で示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。これらの中でも、GST阻害活性の観点から、好ましくはフッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられ、より好ましくはフッ素原子が挙げられる。
【００２０】
一般式（1）において、R12で示されるアルキル基には、直鎖状又は分枝鎖状のいずれのものも包含される。該アルキル基の炭素数は、特に制限されないが、例えば1〜8、好ましくは1〜6、より好ましくは1〜4である。該アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、sec−ブチル基、n−ペンチル基、ネオペンチル基、n−ヘキシル基、3−メチルペンチル基等が挙げられる。
【００２１】
一般式（1）において、R12で示されるアリール基としては、単環アリール基（フェニル基）及び多環（好ましくは2〜3環、より好ましくは2環）アリール基のいずれも採用することができ、例えば、フェニル基、ナフチル基、フルオレニル基、アントリル基、ビフェニリル基、テトラヒドロナフチル基、フェナントリル基等が挙げられる。
【００２２】
一般式（1）において、R1としては、GST阻害活性の観点から、好ましくはハロゲン原子が挙げられる。
【００２３】
一般式（1）において、R2で示されるアルキレン基には、直鎖状又は分枝鎖状のいずれのものも包含される。該アルキレン基は、好ましくは直鎖状である。炭素数は、特に制限されないが、GST阻害活性の観点から、例えば1〜8、好ましくは1〜6、より好ましくは2〜6、さらに好ましくは2〜4、よりさらに好ましくは2〜3、特に好ましくは2である。主鎖上の炭素数は、特に制限されないが、GST阻害活性の観点から、例えば1〜8、好ましくは1〜6、より好ましくは2〜6、さらに好ましくは2〜4、よりさらに好ましくは2〜3、特に好ましくは2である。該アルキレン基の具体例としては、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｎ−ヘキシレン基等が挙げられる。
【００２４】
一般式（1）において、R2で示されるフェニレン基としては、例えば1,2−フェニレン基、1,3−フェニレン基、1,4−フェニレン基等が挙げられる。これらの中でも、GST阻害活性の観点から、好ましくは1,4−フェニレン基が挙げられる。該フェニレン基は、例えばニトロ基等の置換基を1〜3個（特に1個）有することもできる。
【００２５】
一般式（1）において、R2で示される−アルキレン基−置換されていてもよいフェニレン基−で表される基とは、上記R2で示されるアルキレン基とR2で示されるフェニレン基が連結してなる二価の基であり、この限りにおいて特に制限されない。
【００２６】
一般式（1）において、R2としては、GST阻害活性の観点から、好ましくはアルキレン基が挙げられる。
【００２７】
一般式（1）において、R3で示されるアリール基としては、単環アリール基（フェニル基）及び多環（好ましくは2〜3環、より好ましくは2環）アリール基のいずれも採用することができ、例えば、フェニル基、ナフチル基、フルオレニル基、アントリル基、ビフェニリル基、テトラヒドロナフチル基、フェナントリル基等が挙げられる。該アリール基は、例えばフッ素原子、臭素原子等のハロゲン原子やその他の置換基を1〜3個（特に1個）有することもできる。
【００２８】
一般式（1）において、R3で示されるアラルキル基としては、例えば1〜3個（特に1個）の上記R3で示されるアリール基で置換されたアルキル基を採用することができる。このアルキル基は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。このアルキル基の炭素数は、特に制限されないが、例えば1〜8、好ましくは1〜6、より好ましくは1〜4である。R3で示されるアラルキル基の具体例としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、フェニルベンジル基等が挙げられる。該アラルキル基は、例えばフッ素原子、臭素原子等のハロゲン原子やその他の置換基を1〜3個（特に1個）有することもできる。
【００２９】
一般式（1）において、R3は、GSTの各タイプへの選択性に関与することが知られている（非特許文献６等）。例えば、R3を、上記置換されていてもよいアリール基や上記置換されていてもよいアラルキル基等の嵩高い基とすることにより、GSTπ型に対する選択性をより高めることが可能である。
【００３０】
一般式（1）において、R4は、ヒドロキシ基である場合に、GST中のアミノ酸と相互作用することができる。このため、R4で示される加水分解性基とは、ヒドロキシ基に比べて本発明の化合物の細胞膜透過性をより高めることができ且つ加水分解して（好ましくは生理的条件下で加水分解して）ヒドロキシ基を生じる基である限り特に制限されない。加水分解性基の具体例としては、アルコキシ基、アルコキシアルコキシ基、アシルオキシ基、アシルオキシアルコキシキ基、カーボネート基、カルバメート基、アミド基等が挙げられ、好ましくはアルコキシ基、アルコキシアルコキシ基、アシルオキシ基、アシルオキシアルコキシキ基等が挙げられ、より好ましくはアルコキシ基が挙げられ、さらに好ましくは炭素原子数１〜８（好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３）のアルコキシ基が挙げられる。
【００３１】
一般式（1）において、R4としては、細胞膜透過性をより向上させることができるという観点から、加水分解性基であることが望ましい。一方で、細胞膜透過を必要としない実施態様の場合であれば、R4はヒドロキシ基が好ましい。
【００３２】
一般式（1）において、R5で示される加水分解性基は、R4で示される加水分解性基と同様である。
【００３３】
一般式（1）において、R5で示される機能性分子由来の基とは、機能性分子（或いは機能性分子に適当なリンカーが連結してなる分子）から1つの官能基又は原子が除かれてなる基であり、この限りにおいて特に制限されない。
【００３４】
本発明の化合物において、R5の部位は、GSTと直接相互作用する部位（R4）とは反対側にあるので、R5の種類が本発明の化合物の活性に与える影響は少ないと考えられる。ただ、GSTへの認識をより妨げないとの観点から、機能性分子の分子量は比較的低いことが望ましく、例えば２０００以下、好ましくは１０００以下、より好ましくは５００以下である。
【００３５】
タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。タンパク質タグを採用することにより、本発明の化合物を用いて、公知のアフィニティー精製方法に従って、生体内のGSTを分離することができる。分離されたGST（特にGSTπ型）の量や型を測定することにより、がんを診断することも可能である。
【００３６】
蛍光分子としては、例えばフルオレセイン系蛍光化合物、ローダミン系蛍光化合物、クマリン系蛍光化合物、ピレン系蛍光化合物、シアニン系蛍光化合物、BODIPY系蛍光化合物、CyDye系蛍光化合物、ダンシル系蛍光化合物、ベンゾオキサジアゾール系蛍光化合物、希土類蛍光標識化合物等が挙げられる。蛍光分子を採用することにより、生体内のGSTが過剰発現している部位（例えばがん組織部位）を蛍光発光させることができる。
【００３７】
一般式（1）において、R5としては、細胞膜透過性をより向上させることができるという観点から、加水分解性基であることが望ましい。一方で、細胞膜透過を必要としない実施態様の場合であれば、GST阻害活性の観点から、R5はヒドロキシ基が好ましい。
【００３８】
一般式（1）で表される化合物としては、GST阻害活性の観点から、好ましくは一般式（1A）：
【００３９】
【化３】
2018002669.tif 000004
【００４０】
［式中、R2aはアルキレン基を示す。R3〜R5は前記に同じである。］
で表される化合物が挙げられ、より好ましくは一般式（1B）：
【００４１】
【化４】
2018002669.tif 000005
【００４２】
［式中、R3〜R5は前記に同じである。］
で表される化合物が挙げられる。
【００４３】
一般式（1）で表される化合物の塩は、薬学的に許容される塩である限り、特に制限されるものではない。該塩としては、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、塩基性塩の例としては、ナトリウム塩、及びカリウム塩等のアルカリ金属塩；  並びにカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；  アンモニアとの塩；  モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、モノ（ヒドロキシアルキル）アミン、ジ（ヒドロキシアルキル）アミン、トリ（ヒドロキシアルキル）アミン等の有機アミンとの塩等が挙げられる。
【００４４】
本発明の化合物は溶媒和物とすることもできる。溶媒としては、例えば、水や、薬学的に許容される有機溶媒（例えばエタノール、グリセロール、酢酸等）等が挙げられる。
【００４５】
2．製造方法
本発明の化合物は、様々な方法で合成することができる。
【００４６】
例えば、一般式（1B）で表される化合物の内、R4及びR5がヒドロキシ基又は加水分解性基である場合の化合物については、例えば以下の反応式：
【００４７】
【化５】
2018002669.tif 000006
【００４８】
［式中、R4a及びR5aは同一又は異なって加水分解性基を示す。］
に従って合成することができる。
【００４９】
（2-1）一般式（2）で表される化合物→一般式（1C）で表される化合物
本工程では、一般式（2）で表される化合物とエタンスルホニルフルオリドとを反応させることで、一般式（1C）で表される化合物を得ることができる。
【００５０】
エタンスルホニルフルオリドの使用量は、収率、合成の容易さ等の観点から、通常、一般式（2）で表される化合物1モルに対して0.1〜1.5モルが好ましく、0.2〜0.8モルがより好ましい。
【００５１】
本工程は溶媒を添加して行ってもよい。溶媒としては、例えばアセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、ヘキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の1種又は2種以上を使用することができる。これらの中でも、収率、合成の容易さ等の観点から、アセトニトリルが好ましい。
【００５２】
本工程においては、上記成分以外にも、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜添加剤を使用することもできる。
【００５３】
反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、0〜100℃で行うことが好ましい。反応時間は特に制限されず、通常、8時間〜48時間、特に16時間〜36時間とすることができる。
【００５４】
反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
【００５５】
（2-2）一般式（1C）で表される化合物→一般式（1D）で表される化合物
本工程では、一般式（1C）で表される化合物と、R4a−OH及びR5a−OHとを反応させることで、一般式（1D）で表される化合物を得ることができる。
【００５６】
R4a−OH及びR5a−OHの使用総量は、収率、合成の容易さ等の観点から、通常、一般式（1C）で表される化合物1モルに対して10〜300モルが好ましく、30〜200モルがより好ましい。
【００５７】
本工程は溶媒を添加して行ってもよい。溶媒としては、例えばアセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、ヘキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の1種又は2種以上を使用することができる。
【００５８】
本工程においては、上記成分以外にも、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜添加剤を使用することもできる。例えば、塩化チオニル等のハロゲン化剤や、脱水剤、縮合剤等が挙げられる。
【００５９】
或いは、R4a及びR5aがメトキシ基である場合であれば、本工程は、一般式（1C）で表される化合物と、トリメチルシリルジアゾメタンやジアゾメタン等のメチル化剤とを反応させることによっても行うことができる。この際、メタノールを添加することにより、効率的に目的化合物を得ることが可能である。
【００６０】
反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、0〜100℃（特に15〜50℃）で行うことが好ましい。反応時間は特に制限されず、通常、30分間〜12時間、特に2時間〜8時間とすることができる。
【００６１】
反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
【００６２】
（2-3）その他の化合物の合成方法
上記した以外の一般式（1）で表される化合物についても、公知の方法に従って又は準じて合成することができる。
【００６３】
例えば、R4及び／又はR5が機能性分子由来の基である場合の化合物については、必要に応じてアミノ基等を保護した上で、R4及び／又はR5がヒドロキシ基である化合物の該ヒドロキシ基と、機能性分子（或いは機能性分子に適当なリンカーが連結してなる分子）のアミノ基とをペプチド結合させることにより合成することができる。この際、必要に応じて縮合剤を添加することが望ましい。
【００６４】
例えば、R4及び／又はR5がアシルオキシアルコキシキ基である場合の化合物については、以下の反応式：
【００６５】
【化６】
2018002669.tif 000007
【００６６】
に従って又は準じて合成することができる。
【００６７】
例えば、R1が塩素原子又は臭素原子である場合の化合物については、以下の反応式：
【００６８】
【化７】
2018002669.tif 000008
【００６９】
に従って又は準じて合成することができる。
【００７０】
例えば、R2が−アルキレン基−置換されていてもよいフェニレン基−で表される基、又は置換されていてもよいフェニレン基である場合の化合物は、以下の反応式：
【００７１】
【化８】
2018002669.tif 000009
【００７２】
又は以下の反応式：
【００７３】
【化９】
2018002669.tif 000010
【００７４】
に従って又は準じて合成することができる。
【００７５】
例えば、R3が置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいアラルキル基である場合の化合物は、以下の反応式：
【００７６】
【化１０】
2018002669.tif 000011
【００７７】
又は以下の反応式：
【００７８】
【化１１】
2018002669.tif 000012
【００７９】
又は以下の反応式：
【００８０】
【化１２】
2018002669.tif 000013
【００８１】
に従って又は準じて合成することができる。
【００８２】
例えば、R2が各種炭素原子数のアルキレン基である場合の化合物は、以下の反応式：
【００８３】
【化１３】
2018002669.tif 000014
【００８４】
に従って又は準じて合成することができる。
【００８５】
例えば、R1が−O−R12である場合の化合物は、以下の反応式：
【００８６】
【化１４】
2018002669.tif 000015
【００８７】
に従って又は準じて合成することができる。
【００８８】
例えば、R1が−S−R12である場合の化合物は、以下の反応式：
【００８９】
【化１５】
2018002669.tif 000016
【００９０】
に従って又は準じて合成することができる。
【００９１】
3．用途
本発明の化合物は、GSHの存在下であっても（特に高濃度に存在する場合であっても）、効率的にGSTを阻害することができる。このため、本発明の化合物又はその塩は、各種生物試験用試薬、医薬組成物等として、特にGST阻害剤、抗がん剤等として有用である。また、本発明の化合物は、GSTと不可逆的に結合すると考えられ、このため該化合物を用いて公知のアフィニティー精製方法に従えば組織からGSTを分離することができると考えられる。分離されたGST（特にGSTπ型）の量や型を測定することにより、がんを診断することも可能である。よって、本発明の化合物又はその塩は、GST分離剤、がん診断剤等としても有用である。以下、これらを総称して「本発明の剤」と示すこともある。
【００９２】
本発明の剤が阻害する（或いは共有結合する）標的となるGSTの型は特に制限されない。GSTの型としては、例えばヒトの場合であれば、α型、μ型、π型、θ型、ζ型、ω型、σ型等が挙げられ、好ましくはπ型が挙げられる。
【００９３】
本発明の剤は、本発明の化合物を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【００９４】
本発明の剤の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の剤は、例えばin vitroで使用する（例えば、培養細胞の培地に添加する）こともできるし、in vivoで使用する（例えば、動物に投与する）こともできる。
【００９５】
本発明の剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類動物；  動物細胞等が挙げられる。細胞の種類も特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
【００９６】
本発明の剤を抗がん剤として用いる場合、そのがん細胞の種類は特に限定されず、例えば腎臓がん細胞、白血病細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、大腸がん細胞、肝臓がん細胞、すい臓がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、乳がん細胞、子宮頚がん細胞等が挙げられる。
【００９７】
本発明の剤の剤形は特に制限されず、その使用態様に応じて適切な剤形を採ることができる。例えば、動物に投与する場合であれば、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ剤、腸溶剤、徐方性カプセル剤、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放剤、徐放性顆粒剤等の経口剤；  点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤等の外用剤等が挙げられる。また、本発明の剤は、固形剤、半固形剤、液剤のいずれでもよい。
【００９８】
本発明の剤中の本発明の化合物の含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100重量％、好ましくは0.001〜50重量％とすることができる。
【００９９】
本発明の剤を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分である本発明の化合物の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1〜1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5〜50 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01〜100 mg/kg体重、好ましくは0.1〜10 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2〜3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【０１００】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１０１】
実施例1：GS-ESFの合成
【０１０２】
【化１６】
2018002669.tif 000017
【０１０３】
丸底フラスコにグルタチオン (1.53 g, 4.97 mmol) 及び水 (18.0 mL) を加え、アルゴンバブリングを5分間行った。攪拌しながらエタンスルホニルフルオリド (148.4 μL, 1.79 mmol) のアセトニトリル溶液 (2.0 mL) を添加し、そのまま室温で24時間攪拌した。メンブランフィルター (0.45 μm) でろ過し、分取RP-HPLCクロマトグラフィー [Hydosphere C18, 250 × 20 mm, 5 μm, UV 220 nm, 10.0 mL/min, 水 (1‰ トリフルオロ酢酸)/アセトニトリル (1‰トリフルオロ酢酸)] で精製して、目的化合物を白色固体として得た (1.05 g, 51%) 。1H NMR (400 MHz, D2O) δ: 4.64 (1H, dd, J= 8.8, 8.6 Hz), 4.07―3.98 (5H, m), 3.17―3.10 (3H, m), 2.97 (1H, dd, J= 14.4, 8.8 Hz), 2.62―2.55 (2H, m), 2.26―2.20 (2H, m); 13C NMR (100 MHz, D2O) δ: 174.5, 173.0, 172.5, 172.0, 52.9, 52.6, 50.4, 50.3, 41.2, 32.9, 31.0, 25.6, 24.6。
【０１０４】
実施例2：GS-ESF methyl esterの合成
【０１０５】
【化１７】
2018002669.tif 000018
【０１０６】
GS-ESF (28.0 mg, 0.0671 mmol) のジクロロホルム:メタノール (4:1, 0.7 mL)溶液を、0℃、アルゴン雰囲気下で攪拌した。そこへ、トリメチルシリルジアゾメタン (80.6 μL, 2.0 M in hexane) を滴下して、得られた溶液を25℃で4時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーにより反応を終了させた。濃縮後、得られた残渣を分取RP-HPLCクロマトグラフィー [Hydosphere C18, 250 × 20 mm, 5 μm, UV 220 nm, 10.0 mL/min, 水 (1‰トリフルオロ酢酸)/アセトニトリル (1‰トリフルオロ酢酸)] で精製して、目的化合物を白色固体として得た (16.3 mg, 55%) 。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 4.63 (1H, dd, J = 8.6, 8.4 Hz), 4.12 (1H, t, J= 6.8 Hz), 3.98―3.92 (4H, m), 3.85 (3H, s), 3.73 (3H, s), 3.12―3.05 (3H, m), 2.86 (1H, dd, J = 14.4, 8.4 Hz), 2.57―2.53 (2H, m), 2.24―2.16 (2H, m); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 172.8, 171.5, 170.3, 169.3, 52.4, 52.2, 51.4, 50.4, 50.2, 40.5, 33.4, 30.8, 25.6, 24.7。
【０１０７】
実施例3：GS-ESF ethyl esterの合成
【０１０８】
【化１８】
2018002669.tif 000019
【０１０９】
GS-ESF (44.7 mg, 0.107 mmol) のエタノール (1.1 mL) 溶液に、0℃、不活性雰囲気下で塩化チオニル (23.3 μL, 0.321 mmol) を滴下した。得られた溶液を還流しながら2時間攪拌し、濃縮した。残渣を分取RP-HPLCクロマトグラフィー [Hydosphere C18, 250 × 20 mm, 5 μm, UV 220 nm, 10.0 mL/min, 水 (1‰トリフルオロ酢酸)/アセトニトリル (1‰トリフルオロ酢酸)] で精製して、目的化合物を白色固体として得た (43.0 mg, 68%) 。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 4.63 (1H, dd, J = 8.8, 8.6 Hz), 4.31 (2H, q, J= 7.2 Hz), 4.18 (2H, q, J = 7.2 Hz), 4.10 (1H, t, J = 6.8 Hz), 3.97―3.91 (4H, m), 3.13―3.04 (3H, m), 2.86 (1H, dd, J = 14.4, 8.8 Hz), 2.56 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.25―2.16 (2H, m), 1.33 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.2 Hz); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 172.2, 170.9, 169.1, 168.2, 61.8, 60.4, 52.0, 51.6, 49.7, 49.6, 40.1, 32.7, 30.1, 25.0, 24.1, 12.4, 12.3。
【０１１０】
合成例1：9-BBN protected GS-ESFの合成
【０１１１】
【化１９】
2018002669.tif 000020
【０１１２】
GS-ESF (613.6 mg, 1.47 mmol) を、アルゴン雰囲気下でメタノール (9.8 mL) に懸濁した。そこへ、9-ボラビシクロ[3.3.1]ノナン (3.2 mL, 0.5 M in テトラヒドロフラン) を滴下した。得られた溶液を還流しながら3時間攪拌した。ニンヒドリン染色型薄層クロマトグラフィー (4:1:1 ブタノール/酢酸/水) による評価の結果、両方が保護されたアミノ酸への変換はほぼ定量的であった。残渣を分取RP-HPLCクロマトグラフィー [Hydosphere C18, 250 × 20 mm, 5 μm, UV 220 nm, 10.0 mL/min, 水 (1‰トリフルオロ酢酸)/アセトニトリル (1‰トリフルオロ酢酸)] で精製して、目的化合物を白色固体として得た (616.8 mg, 78%) 。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.39―6.29 (2H, m), 4.64 (1H, dd, J = 8.8, 8.8 Hz), 3.99―3.88 (4H, m), 3.80―3.74 (1H, m), 3.14―3.01 (3H, m), 2.84 (1H, dd, J = 14.4, 8.8 Hz), 2.65―2.55 (2H, m), 2.26―2.19 (1H, m), 2.14―2.07 (1H, m), 1.91―1.65 (10H, m), 1.48―1.45 (2H, m), 0.56 (2H, s); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 176.9, 175.3, 172.8, 56.2, 53.8, 51.7, 51.6, 41.9, 34.7, 33.1, 32.5, 32.4, 32.3, 27.3, 26.0, 25.7, 25.2。
【０１１３】
実施例4：GS-ESF biotinの合成
【０１１４】
【化２０】
2018002669.tif 000021
【０１１５】
N-ビオチニル-3,6-ジオキサオクタン-1,8-ジアミンのトリフルオロ酢酸塩 (281.5 mg, 0.752 mmol) をN,N-ジメチルホルムアミド (5.0 mL) に溶解して、トリメチルアミン (85.0 μL, 0.610 mmol)を用いてpHを8に調整した。得られた溶液に、9-BBN protected GS-ESF (269.3 mg, 0.501 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (101.6 mg, 0.752 mmol) 及び 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (144.1 mg, 0.752 mmol) を添加し、室温下で40時間攪拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、中間体化合物（9-BBN protected GS-ESF biotin）を白色固体として得た (191.0 mg, 43%) 。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.55―8.48 (1H, m), 6.39―6.25 (2H, m), 4.59 (1H, dd, J = 7.2, 7.2 Hz), 4.50 (1H, dd, J = 7.8, 7.6 Hz), 4.32 (1H, dd, J = 7.8, 7.6 Hz), 3.99―3.94 (2H, m), 3.89 (2H, s), 3.84―3.77 (1H, m), 3.62 (4H, s), 3.56 (4H, ddd, J = 5.2 Hz), 3.41―3.37 (4H, m), 3.21 (1H, dt, J = 4.8, 4.8, 4.4, 4.4 Hz), 3.13―3.04 (3H, m), 2.96―2.86 (2H, m), 2.72 (1H, d, J= 12.8 Hz), 2.63―2.59 (2H, m), 2.27―2.21 (3H, m), 2.14―2.07 (1H, m), 1.89―1.85 (4H, m), 1.79―1.56 (10H, m), 1.48―1.41 (4H, m), 0.57 (2H, s); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 174.9, 174.1, 173.4, 170.9, 169.2, 164.0, 69.3, 69.2, 68.6, 68.4, 61.3, 59.6, 55.0, 54.1, 52.2, 49.7, 49.5, 41.5, 39.1, 38.4, 38.3, 34.8, 32.4, 31.0, 30.5, 30.4, 30.3, 27.7, 27.5, 25.4, 24.9, 24.0, 23.7, 23.2。
【０１１６】
9-BBN protected GS-ESF biotin (5.2 mg, 5.82 μmol) をジオキサン:水 (1:2.7) 混合物に溶解し、そこに12 N 塩酸水溶液 (24.0 μL, 0.291 mmol) を添加した。得られた溶液を40℃で2日間攪拌した。反応混合物を濃縮し、分取RP-HPLC クロマトグラフィー [Hydosphere C18, 250 × 20 mm, 5 μm, UV 220 nm, 10.0 mL/min, 水 (1‰トリフルオロ酢酸)/アセトニトリル (1‰トリフルオロ酢酸)] で精製して、目的化合物を白色固体として得た (0.6 mg, 12%) 。1H NMR (400 MHz, D2O) δ: 4.62 (2H, dd, J= 8.4, 8.2 Hz), 4.43 (1H, dd, J = 8.4, 8.2 Hz), 4.07―4.02 (2H, m), 3.94 (2H, s), 3.84 (1H, dd, J = 6.8, 6.4 Hz), 3.69 (4H, s), 3.64 (4H, dd, J = 5.2, 4.8 Hz), 3.45―3.39 (4H, m), 3.37―3.32 (1H, m), 3.17―3.12 (3H, m), 3.03―2.94 (2H, m), 2.79 (1H, d, J = 13.2 Hz), 2.55 (2H, q, J = 7.6 Hz), 2.29 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.18 (2H, dd, J = 7.6, 6.8 Hz), 1.75―1.60 (4H, m), 1.46―1.41 (2H, m); 13C NMR (100 MHz, D2O) δ: 177.0, 174.4, 172.5, 171.6, 171.0, 165.4, 69.5, 68.9, 68.8, 62.1, 60.3, 55.4, 53.1, 52.3, 50.4, 50.3, 42.6, 39.7, 39.0, 38.9, 35.5, 32.8, 30.9, 27.9, 27.7, 25.5, 25.2, 24.6. 。
【０１１７】
実施例5：GS-ESF BODIPYの合成
【０１１８】
【化２１】
2018002669.tif 000022
【０１１９】
Amine-terminated BODIPY (8.5 mg, 0.0340 mmol) をN,N-ジメチルホルムアミド (0.68 mL) に溶解した。得られた溶液に、GS-ESF (14.2 mg, 0.0340 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (4.6 mg, 0.0340 mmol), 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (6.5 mg, 0.0.340 mmol) 及びトリメチルアミン (9.7 μL, 0.0680 mmol) を0℃で添加し、室温下で1時間攪拌した。1時間後、反応混合物に50 mM TEAA 緩衝液 (5% アセトニトリル) を添加して、得られた反応混合物を0.45 μm 親水性 PTFE膜フィルターでろ過した。ろ液を分取RP-HPLC クロマトグラフィー [Hydosphere C18, 250 ×20 mm, 5 μm, UV 400 nm, 10.0 mL/min, 50 mM TEAA 緩衝液 (5% アセトニトリル)/アセトニトリル] で精製して、目的化合物を白色固体として得た (0.5 mg, 2% yield) 。 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.58 (1H, bs), 7.41―7.32 (3H, m), 6.56 (1H, bs), 6.40 (1H, bs), 4.60 (2H, bs), 4.50 (1H, dd, J = 5.6, 5.2 Hz), 3.95―3.89 (5H, m), 3.73―3.70 (2H, m), 3.64―3.59 (2H, m), 3.101―3.00 (3H, m), 2.86 (1H, dd, J = 8.8 Hz), 2.52―2.48 (2H, m), 2.19―2.12 (1H, m), 2.06―2.03 (1H, m),; 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 172.6, 171.1, 170.8, 169.6, 154.0, 130.0, 129.5, 123.8, 123.1, 122.3, 119.6, 112.2, 112.1. 52.3, 51.5, 49.7, 49.5, 47.3, 41.7, 37.7, 32.4, 30.1, 25.0, 24.1。
【０１２０】
実施例6：GST抑制効果解析試験1
図１の下段に示すスキームに従って、次のように試験を行った。各種濃度のGST誘導体, GSH (0.5 mM), 及びGST (4 μg/mL) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL) を、1分間又は30分間、プレインキュベートした。その後、2,4-ジニトロクロロベンゼン（本明細書において、CDNBと示すこともある。）(0.2 mM) を添加し、添加後の各時間においてUV波長の吸光度を測定した (光路長: 5 mm, 反応時間: 90秒, 37℃, 検出波長: 340 nm)。吸光度に基づいて以下に示す式に従って酵素反応の初速度（nmol/min）を算出した。
【０１２１】
【数１】
2018002669.tif 000023
【０１２２】
GST誘導体としてGS-ESFを用いた場合の結果を図１に示す。図１に示されるように、GS-ESF濃度依存的に、さらにはプレインキュベート時間依存的に、GST酵素反応が抑制された。
【０１２３】
実施例7：GST抑制効果解析試験2
実施例6の試験においては、GS-ESF濃度がGSH濃度よりも非常に高い。よって、実施例6の結果は、GSH（求核試薬）がGS-ESF（求電子試薬）と反応し、その結果として酵素反応が起こらなくなったことに起因する可能性がある。この点を確認すべく、GS-ESFとGSHとの反応速度を評価した。具体的には、図２の下段に示すスキームに従って、以下のように行った。
【０１２４】
各種濃度のGS-ESFを含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液1）, 並びに各種濃度のGS-ESF及びGSH (0.5 mM) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液2） を、30分間プレインキュベートした。その後、反応溶液1にはGSH (0.5 mM), CDNB (0.2 mM), 及びGSTπ (4 μg/mL) を添加し、反応溶液2にはCDNB (0.2 mM), 及びGSTπ (4 μg/mL) を添加し、添加後の各時間においてUV波長の吸光度を測定した (光路長: 5 mm, 反応時間: 90秒, 37℃, 検出波長: 340 nm)。吸光度に基づいて定法に従って酵素反応の初速度（nmol/min）を算出した。
【０１２５】
結果を図２に示す。図２に示されるように、GS-ESFとGSHとのプレインキュベートは酵素反応の初速度に対して影響が無かった。このことから、GS-ESFはGSHとほとんど反応しないことが示唆された。
【０１２６】
実施例8：GST抑制効果解析試験3
図３の下段に示すスキームに従って、次のように試験を行った。GS-ESF (0.1 mM), GSH (1.0 mM), 及びGSTπ (4 μg/mL) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL) を各時間（〜120分間）プレインキュベートした。その後、CDNB (0.2 mM) を添加し、添加後の各時間においてUV波長の吸光度を測定した (光路長: 5 mm, 反応時間: 90秒, 37℃, 検出波長: 340 nm)。吸光度に基づいて定法に従って酵素反応の初速度（nmol/min）を算出した。試験は計3回行った。
【０１２７】
結果を図３に示す。図３に示されるように、プレインキュベート時間依存的に、GST酵素反応が抑制された。
【０１２８】
実施例9：GST抑制効果解析試験4
実施例8の結果は、GS-ESFがGSHと反応していることに起因する可能性がある。この可能性を調べるために、GSH非存在下においてGSTとGS-ESFとをプレインキュベートした後に、酵素反応の初速度を測定した。具体的には、図４の下段に示すスキームに従って、以下のように行った。
【０１２９】
GSTπ (4 μg/mL) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液3）, 並びにGSTπ (4 μg/mL) 及びGS-ESF (0.1 mM) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液4） を、各時間（〜120分間）プレインキュベートした。その後、GSH (1.0 mM)及びCDNB (0.2 mM) を添加し、添加後の各時間においてUV波長の吸光度を測定した (光路長: 5 mm, 反応時間: 90秒, 37℃, 検出波長: 340 nm)。吸光度に基づいて定法に従って酵素反応の初速度（nmol/min）を算出した。試験は計3回行った。
【０１３０】
結果を図４に示す。図４に示されるように、実施例8に示される酵素反応の抑制は、GS-ESFがGSHと反応することによるものではなく、GS-ESFがGSTに作用することによるものであることが示唆された。
【０１３１】
実施例10：GST抑制効果解析試験5
GS-ESFとGSHとの非酵素的反応の影響を確認するために、GST非存在下においてGS-ESFとGSHとを反応させた後に、酵素反応の初速度を測定した。もし、GS-ESFとGSHとが、GST非存在下で反応するのであれば、酵素反応の開始速度は、GS-ESFとGSHとの反応時間に応じて徐々に減少することが予想される。具体的には、図５の下段に示すスキームに従って、以下のように行った。
【０１３２】
GSH (1.0 mM) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液5）, 並びにGSH (1.0 mM) 及びGS-ESF (0.1 mM) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液6）を、30分間インキュベートした。その後、CDNB (0.2 mM) 及びGSTπ (4 μg/mL) を添加し、添加後の各時間においてUV波長の吸光度を測定した (光路長: 5 mm, 反応時間: 90秒, 37℃, 検出波長: 340 nm)。吸光度に基づいて定法に従って酵素反応の初速度（nmol/min）を算出した。試験は計3回行った。
【０１３３】
結果を図５に示す。図５に示されるように、酵素反応の開始速度は、GS-ESFとGSHとの反応時間の長さに関わらず、ほぼ一定であった。このことから、GS-ESFはGSHとほとんど反応しないことが示唆された。
【０１３４】
実施例11：GST抑制効果解析試験6
GS-ESFによるGST活性の抑制が、タンパク質の変性に起因するのか否かを調べた。具体的には、図６の下段に示すスキームに従って、以下のように行った。
【０１３５】
GSTπ (4 μg/mL) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液7）、GSTπ (4 μg/mL) 及びNaOH（3％）を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液8）、GSTπ (4 μg/mL) 及びGSH (1.0 mM) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液9）、並びにGSTπ (4 μg/mL) 及びGS-ESF (0.1 mM) を含有する1×PBS緩衝溶液 (total 500 μL)（反応溶液10）を30分間インキュベートした。その後、CDスペクトルを測定した。
【０１３６】
結果を図６に示す。図６に示されるように、水酸化ナトリウムを含む反応溶液8の場合はタンパク変性を示すCDスペクトルとなったが、GS-ESFを含む反応溶液10の場合はこのようなCDスペクトルとはならなかった。このことから、GS-ESFによるGST活性の抑制はタンパク質の変性に起因するのではないことが示唆された。
【０１３７】
実施例11：GST抑制効果解析試験7
GS-ESFとGSHが反応しているか否かを調べるために、下記スキームで示される反応の速度を評価した。
【０１３８】
【化２２】
2018002669.tif 000024
【０１３９】
反応物GS-ESFの損失速度は、次式：-d[GS-ESF]/dt=k[GS-ESF][GSH]である。もし、GSH濃度がGS-ESF濃度よりも大きく高ければ、反応（擬似一次反応）中、GSH濃度は定数（=[GSH]0）であるとみなすことができる。よって、新たな見かけ上の速度定数kappは、kapp=k[GSH]0と公式化することができる。よって、-d[GS-ESF]/dt=k[GS-ESF][GSH]0=kapp[GS-ESF]→-∫1/[GS-ESF] d[GS-ESF]= kapp∫dtとなり、それ故、-In([GS-ESF]/[GS-ESF]0)= kapptとなる。{-In([GS-ESF]/[GS-ESF]0)}を時間に対してプロットすると、kappと等しい傾きの直線が得られる。
【０１４０】
以上を踏まえて、まずは各種濃度のGS-ESF溶液をHPLC分析し、GS-ESFピークの面積とGS-ESF濃度との検量線を作成した。該検量線を図７に示す。
【０１４１】
次に、以下の試験よって、見かけ上の速度定数kappを決定した。具体的には次のように行った。GS-ESF (50 mM) 及び各種濃度（0.4 M, 1 M, 1.4 M）のGSHを含有する1×PBS緩衝溶液 (total 24 μL) を各時間（〜120分間）インキュベートした。0.1％トリフルオロ酢酸を30μL添加し、得られた溶液の内の20μLをHPLC分析に供した。得られた結果から、-In([GS-ESF]/[GS-ESF]0)及びkappを求めた。結果を図８及び９に示す。
【０１４２】
kapp = k[GSH]0の関係式が確立されているので、二次速度定数kは、0.8×10-3 (M-1 min-1)であることが導かれた。この結果から、非酵素反応（上記スキーム）による生成物量を計算した結果、120分間の反応で0.0096％であった（図１０）。以上より、GS-ESFはGSHとほとんど反応しないことが示唆された。
【図１】
2018002669.tif 000027
【図２】
2018002669.tif 000028
【図３】
2018002669.tif 000029
【図４】
2018002669.tif 000030
【図５】
2018002669.tif 000031
【図６】
2018002669.tif 000032
【図７】
2018002669.tif 000033
【図８】
2018002669.tif 000034
【図９】
2018002669.tif 000035
【図１０】
2018002669.tif 000036