(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｎｒｆ２発現促進効果を有し、生体の抗酸化防御、解毒能力を高める効果を発揮する医薬品、食品、化粧品等、或いはこれらに配合する素材の提供。【解決手段】アボカド又はその抽出物を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。アボカド又はその抽出物を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤。ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アボカド又はその抽出物を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。
【請求項２】
アボカド又はその抽出物を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤。
【請求項３】
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。
【請求項４】
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤。
【請求項５】
アボカド抽出物を有効成分とするＮｒｆ２活性化用食品。
【請求項６】
アボカド抽出物を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防又は改善用食品。
【請求項７】
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とするＮｒｆ２活性化用食品。
【請求項８】
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防又は改善用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｒｆ２活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスは活性酸素種（ＲＯＳ）と、それらを除去する抗酸化物質（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）のバランスが崩れた状態と定義される（非特許文献１）。ＲＯＳは加齢やタバコ、ＵＶによって発生し、脂質、タンパク、ＤＮＡといった生体分子を酸化し、細胞、組織に傷害を負わせる。皮膚は外界との境界であるため、内的要因と外的要因による慢性的な酸化ストレス環境に曝されており、細胞・組織のホメオスタシス維持に抗酸化システムが重要である（非特許文献２）。
【０００３】
生体の抗酸化システムにはグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＲ）などの抗酸化酵素（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ）および、α−トコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオン（ＧＳＨ）などの抗酸化物質（ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）の２つの系がある。これら抗酸化システムに関与する遺伝子の発現を制御する鍵となる転写因子がＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ２（Ｎｒｆ２）である。
【０００４】
Ｎｒｆ２は、抗酸化酵素や解毒酵素などの生体防御系遺伝子群を制御する転写因子である（非特許文献３）。定常状態では、Ｎｒｆ２にＫｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ  ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（Ｋｅａｐ１）が結合し、ユビキチン−プロテアソーム分解を受けているが、ＲＯＳや親電子性物質存在下ではＫｅａｐ１が解離し、Ｎｒｆ２のユビキチン化が停止する。その結果、Ｎｒｆ２は安定化して核へ移行、抗酸化応答配列（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ，ＡＲＥ）に結合し、生体防御系遺伝子群、例えばヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素−１（ＮＱＯ１）、ＧＰＸ、グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ）、グルタミルシステインリガーゼ（ＧＣＬＣ）、チオレドキシン（ＴＸＮ）などの遺伝子発現を誘導する。
【０００５】
このことから、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化は、抗酸化システムの向上、さらには生体防御機構活性化につながると考えられている。実際にＮｒｆ２は幅広い傷害（発がん性物質、親電子性物質、活性酸素種、紫外線、煙草の煙等）から細胞、組織を守る上で重要であることが示唆され（非特許文献４）、Ｎｒｆ２の活性化は酸化ストレスが関与する種々の疾患の予防又は改善に有効であると考えられている。例えば、Ｎｒｆ２活性化物質であるスルフォラファンが網膜変性や白内障における細胞障害を抑制することが報告されている（特許文献１）。また、Ｎｒｆ２は角膜上皮創傷治癒プロセスに貢献すること（非特許文献５）、Ｎｒｆ２活性化物質はドライアイ、点状表層角膜症、角膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍等の角結膜障害に対して有効であることが報告されている（特許文献２）
【０００６】
また、腎臓病における腎機能低下は、酸化ストレスの亢進による腎組織障害が一因であると考えられており（非特許文献６）、Ｎｒｆ２の活性化剤であるバルドキソロンメチルが、腎不全や糖尿病性腎症に有用であることが報告されている（非特許文献７）。また、尿毒症毒素であるインドキシル硫酸の血清レベルを低下させて腎臓の機能不全の進行を抑制するクレメジンがＮｒｆ２活性化剤として機能しうることも報告されている（特許文献３）。
【０００７】
一方、アボカド（Persea americana、別名：ワニナシ）は、その果実部が生食或いは焼き調理によって食されるが、オレイン酸、リノール酸などの不飽和脂肪酸、ビタミン類、ミネラル等を豊富に含有することが知られている。
例えば、特許文献４にはアボカドの抽出物に脂質分解促進作用があり、痩身用皮膚外用剤として使用できることが開示され、また、特許文献５にはワニナシの抽出物にＩｇＥ産生抑制作用があることが開示されている。
【０００８】
しかしながら、アボカド又はそれに含まれる成分に、Ｎｒｆ２活性化作用があることはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００５−５３６４４９号公報
【特許文献２】特開２００８−１１０９６２号公報
【特許文献３】特開２０１３−２３１０１３号公報
【特許文献４】特開平１１−２４６４２５号公報
【特許文献５】特開２０１０−１８０１４１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Durackova Z (2010) Some current insights into oxidative stress. Physiol Res 59 459-469
【非特許文献２】Briganti S, Picardo M (2003) Antioxidant activity, lipid peroxidation and skin diseases. What's new. J Eur Acad Dermatol Venereol 17 663-669
【非特許文献３】Taguchi K, Motohashi H, Yamamoto M (2011) Molecular mechanisms of the Keap1-Nrf2 pathway in stress response and cancer evolution. Genes Cells 16 123-140
【非特許文献４】Lee JM, Li J, Johnson DA, Stein TD, Kraft AD, Calkins MJ, Jakel RJ, Johnson JA (2005) Nrf2, a multi-organ protector? FASEB 19 1061-1066
【非特許文献５】Ryuhei Hayashi et al (2013) The role of the Nrf2-mediated defense system in corneal epithelial wound healing. Free Radical Biology and Medicine 61, 333-342
【非特許文献６】Yoh K, Itoh K, Enomoto A, Hirayama A, Yamaguchi N, Kobayashi M, Morito N, Koyama A, Yamamoto M, Takahashi S (2001) Nrf2-deficient female mice develop lupus-like autoimmune nephritis. Kidney Int 60, 1343-1353.
【非特許文献７】Pergola P E, Raskin P, Toto R D, Meyer C J, Huff W, Grossman E B, Krauth M, Ruiz S, Audhya P, Christ-Schmidt H, Wittes J, Warnock D G (2011) N Engl J Med 365, 327-336.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、Ｎｒｆ２活性化作用を有し、生体の抗酸化防御、解毒能力を高める効果を発揮する医薬品、食品、化粧品等、或いはこれらに配合する素材を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記の課題に鑑みて検討したところ、アボカドの抽出物及びそれに含まれる特定の成分に優れたＮｒｆ２活性化作用があり、これらが生体の抗酸化防御、解毒能力を高めるために有用であることを見出した。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の１）〜８）に係るものである。
１）アボカド又はその抽出物を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。
２）アボカド又はその抽出物を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤。
３）ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。
４）ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患又は急性腎障害、慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤。
５）アボカド抽出物を有効成分とするＮｒｆ２活性化用食品。
６）アボカド抽出物を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防又は改善用食品。
７）ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とするＮｒｆ２活性化用食品。
８）ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防又は改善用食品。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＮｒｆ２活性化剤によれば、Ｎｒｆ２の活性化を介して、生体の抗酸化防御、解毒・代謝、異物排泄、ストレス応答能力の向上による生体防御が可能となり、酸化ストレスや生体異物の侵入に起因して発症する疾患や症状、例えば網膜変性、白内障、角結膜障害（ドライアイ、点状表層角膜症、角膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍、結膜上皮欠損、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角結膜炎、感染性角膜炎、非感染性角膜炎、感染性結膜炎、非感染性結膜炎など）等の酸化ストレスが関与する眼疾患、腎臓疾患（急性腎障害、慢性腎臓病）、腎臓疾患を伴う糖尿病、腎臓疾患を伴う心臓血管疾患等の予防、治療又は改善が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンの単離工程。
【図２】ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンのＨＰＬＣのクロマトグラフ。化合物１：ペルセノンＡ、化合物２：ペルシン、化合物３：ペルセノンＢ。
【図３】ＡＲＥ下流遺伝子の発現誘導活性。Ａ：アボカド抽出物、焼きアボカド抽出物、Ｂ：ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシン。
【図４】Ｎｒｆ２の核移行促進作用。
【図５】抗酸化遺伝子の発現誘導作用を示すグラフ。Ａ：遺伝子発現量（焼きアボカド抽出物、Ｂ：遺伝子発現量（ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシン）、Ｃ：タンパク質発現量（ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシン）。
【図６】Ｎｒｆ２を介した抗酸化遺伝子の発現誘導作用。
【図７】グルタチオン量増加作用。
【図８】細胞内活性酸素低減作用。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、「アボカド」とは、クスノキ科ワニナシ属のPersea americana（学名）を指し、別名「ワニナシ」（鰐梨）とも云われる。本発明において、アボカドはその種子、果実等が使用できるが、好ましくは果実、より好ましくは果実の果肉部分である。
アボカドは、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物、植物体自身を加熱処理した加熱処理物、若しくはそれらの破砕物、粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましく、加熱処理物（焼きアボカド）の抽出物を用いるのがより好ましい。
ここで、加熱処理としては、例えば、５〜１０ｃｍに分割した植物体をオーブンレンジ等の加熱機器を用いて一定時間処理することが挙げられる。加熱温度は、好ましくは１００℃以上、より好ましくは１５０℃以上、より好ましくは２００℃以上で、且つ好ましくは３００℃以下、より好ましくは２５０℃以下、より好ましくは２３０℃以下である。また、好ましくは１００〜３００℃、より好ましくは１５０〜２５０℃、より好ましくは２００〜２３０℃である。加熱時間は加熱温度に応じて適宜変更すればよいが、概ね５〜１０分であり、好ましくは、６〜８分である。
より好適な加熱処理として、２００〜２５０℃で５〜８分、２００〜２３０℃で５〜６分の処理が挙げられる。
【００１７】
アボカドにはペルセノンＡ、ペルセノンＢ、ペルセノンが含有されるが、本発明において用いるアボカドとしては、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ又はペルセノンの含有量が、アボカド乾燥重量に換算して、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下であり、また好ましくは、０．００１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜１質量％であるものが挙げられる。
【００１８】
抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン等の飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、薬理活性および汎用性の点で、アルコール類、アルコール水溶液が挙げられる。
【００１９】
上記アルコール類としては、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等の１価アルコール類；１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール等の２価アルコール類；グリセリン等の３価以上のアルコール類等が挙げられる。このうち、薬理活性および操作性の点で、１価アルコール類および２価アルコール類が好ましい。また好ましくは、上記アルコール類は、炭素数１〜１０のアルコール、より好ましくは炭素数１〜４のアルコールであり得る。
【００２０】
上記アルコール類の好ましい例としては、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等が挙げられる。
【００２１】
上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上であり、且つ好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、さらに好ましくは８５質量％以下である。また、上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０〜９５質量％、より好ましくは２０〜９０質量％、さらに好ましくは３０〜８５質量％である。
【００２２】
上記アルコール類のうち、汎用性の観点から、エタノールがより好ましい。したがって、アボカドの抽出物を調製するためのより好適な溶媒としては、エタノール、エタノール水溶液が挙げられる。
エタノールを用いる場合のエタノール濃度は、３０質量％以上であるのが好ましく、より好ましくは４０質量％以上、より好ましくは４５質量％以上であり、且つ９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８５質量％以下である。また、好ましくは３０〜９５質量％、より好ましくは４０〜９０質量％、より好ましくは４５〜９５質量％、より好ましくは４５〜８５質量％である。
【００２３】
抽出における溶媒の使用量としては、アボカド（乾燥質量換算）１ｇに対して５〜１００ｍＬが好ましい。
抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されない。例えば、抽出時間は好ましくは１時間以上、より好ましくは３時間以上であり、他方、好ましくは２ヶ月以下、より好ましくは５週間以下、より好ましくは２週間以下である。抽出温度は０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、他方、溶媒沸点以下が好ましく、９０℃以下がより好ましい。通常、低温なら長時間、高温なら短時間の抽出を行う。抽出条件の例としては、１５〜４０℃で１日〜５週間、好ましくは１〜２週間、６０〜９０℃で１〜５時間等が挙げられるが、これらに限定されず、当業者によって適宜選択され得る。
【００２４】
抽出手段は、特に限定されないが、例えば、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、ソックスレー抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の通常の手段を用いることができる。これらの抽出手段は組み合わせてもよい。例えば、浸漬や固液抽出と液液抽出を組み合わせてもよく、または抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出をおこなってもよい。さらに、抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化性雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。また、抽出操作は、収率の向上を図るべく、抽出したろ過残渣を再度抽出する等、繰り返して行うことができる。
【００２５】
本発明のアボカド抽出物は、例えば食品や医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂、澱出し等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができる。
また、さらに公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００２６】
本発明の、ペルセノンＡは酢酸（５Ｅ，１２Ｚ，１５Ｚ）−２−ヒドロキシ−４−オキサヘニコサ−５，１２，１５−トリエニル、ペルセノンＢは酢酸（５Ｅ）−２−ヒドロキシ−４−オキソノナデセ−５−エニル、及びペルシンは酢酸（１２Ｚ，１５Ｚ）−２−ヒドロキシ−４−オキソヘニコサ−１２，１５−ジエニルであり、下記式で示される。
【００２７】
【化１】
2018039752.tif 000002
【００２８】
本発明においては、斯かるペルセノンＡ（ＰｅｒｓｅｎｏｎｅＡ）、ペルセノンＢ（ＰｅｒｓｅｎｏｎｅＢ）及びペルシン（Ｐｅｒｓｉｎ）（「本発明の化合物」とも称する）は、これらを単独で用いてもよく２種以上を混合していて用いてもよい。
【００２９】
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンは、アボカドから抽出・精製することにより取得することができる。具体的には、アボカド果実から溶剤抽出して得られる抽出物を、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を用いて分離・精製することにより得ることができる。以下に、その単離例（図１参照）を示す。
【００３０】
１）アボカドの果実乾燥物に５０質量％エタノールを加え、攪拌抽出し、アボカド抽出液を得る。
２）１）で得られたアボカド抽出液を、溶媒留去したのち、得られた固形物をヘキサン−水で液−液分配し、ヘキサン層を濃縮して濃縮物を得る。
３）２）で得られた濃縮物をヘキサンに溶解して、シリカゲルカラムに供し、ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒で溶出し、８画分を得る。
４）３）で得られた一画分（画分２）をヘキサンに溶解し、分取ＴＬＣに供し、クロロホルム−アセトン混合溶媒で展開し、６画分を得る。
５）４）で得られた一画分（画分２’）を更にＯＤＳ−ＨＰＬＣ（アセトニトリル−ギ酸水溶液の混合溶媒）で分画し、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンを単離する。
【００３１】
得られたペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンは、そのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、あるいは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、水・エタノール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００３２】
後記実施例に示すとおり、アボカド抽出物、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシン（以下、「アボカド抽出物等」という）は、Ｎｒｆ２遺伝子の発現を促進し、さらに、Ｎｒｆ２が結合するＡＲＥの下流に位置する、ＨＭＯＸ１（ヘムオキシゲナーゼ１）、ＧＣＬＣ（グルタミルシステインリガーゼ）の発現を促進する。すなわち、本発明のアボカド抽出物等は、Ｎｒｆ２によって制御される抗酸化防御、解毒・代謝、異物排泄、ストレス応答機構に関わる第二相酵素群の発現を誘導することができ、酸化ストレスからの防御（生体内抗酸化作用）や生体異物の解毒を亢進することができる。このことは、アボカド抽出物等にグルタチオンの産生が促進され、また、細胞内活性酸素量が低減されることにより確認されている（実施例５及び６参照）。そして、酸化ストレス防御系や異物代謝系が亢進されれば、酸化ストレスや生体異物の侵入により起因して発症する疾患や症状を予防、改善又は治療することが可能となる。斯かる疾患又は症状としては、例えば、網膜変性、白内障、角結膜障害（ドライアイ、点状表層角膜症、角膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍、結膜上皮欠損、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角結膜炎、感染性角膜炎、非感染性角膜炎、感染性結膜炎、非感染性結膜炎など）等の眼疾患、腎臓疾患（急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症、多発性嚢胞腎）、更には腎臓疾患を伴う糖尿病、腎臓疾患を伴う心臓血管疾患等が挙げられる（前記特許文献１、２、非特許文献５参照）。
【００３３】
したがって、本発明のアボカド抽出物等は、Ｎｒｆ２活性化剤、網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤（以下、「眼疾患若しくは腎臓疾患の予防、改善又は治療剤」という）となり得、またこれらを製造するために使用できる。
また、本発明のアボカド抽出物等は、Ｎｒｆ２の活性化のため、眼疾患若しくは腎臓疾患を予防、改善又は治療するために使用することができる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００３４】
本発明のＮｒｆ２活性化剤、眼疾患若しくは腎臓疾患の予防、改善又は治療剤は、Ｎｒｆ２活性化用、眼疾患若しくは腎臓疾患の予防、改善又は治療用の、医薬品、医薬部外品、サプリメント、食品又は飼料としての態様、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤としての態様であり得る。
【００３５】
本発明において、「Ｎｒｆ２活性化」とは、Ｎｒｆ２の転写促進によりＮｒｆ２の発現を促進すること、Ｎｒｆ２の翻訳を促進すること、Ｎｒｆ２のｍＲＮＡや蛋白質の分解を抑制すること、Ｋｅａｐ１との結合を阻害することや乖離を促進すること、Ｎｒｆ２の核移行を促進すること、Ｎｒｆ２の標的ＤＮＡ配列への結合を促進することなどにより、Ｎｒｆ２に発現が制御される遺伝子の発現を促進することを意味する。
また、酸化ストレスからの防御（生体内抗酸化）とは、生体内に発生するフリーラジカルや活性酸素等の活性酸素種を低減し、タンパク、脂質、ＤＮＡ等の過酸化物量を低減することを意味する。
【００３６】
本発明のアボカド抽出物等を含有する上記医薬品（医薬部外品又はサプリメントも含む）の剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、バップ剤、軟膏、ローション、クリーム、チンキ剤、リニメント剤、懸濁液、ローション、バップ、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル又はオイル剤、口腔用製剤（歯磨剤、液状歯磨剤、洗口液、歯肉マッサージクリーム、口腔用軟膏、うがい用錠剤、トローチ、のど飴等）等のいずれでもよい。医薬品、医薬部外品、或いはサプリメントとして用いる場合の投与形態としては、例えば経口投与非経口投与、又は局所投与などいずれの経路によっても使用することができる。
【００３７】
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のアボカド抽出物等を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、浸透圧調整剤、流動性促進剤、吸収助剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、湿潤剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、固着剤、香料、被膜剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
【００３８】
本発明のアボカド抽出物等を含有する上記食品としては、例えば、Ｎｒｆ２の活性化、眼疾患や腎臓疾患の予防又は改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品等が包含される。
【００３９】
上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得る。食品としては、パン類、麺類、クッキー等の菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、コーヒー飲料等の飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等の各種食品組成物、及びそれらの原料が挙げられる。また、食品組成物は、上記の経口投与製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。
【００４０】
斯かる食品は、本発明の有効成分の他、他の飲食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、固着剤、分散剤、湿潤剤等を適宜組み合わせて配合し、調製することができる。
【００４１】
本発明のアボカド抽出物等を含有する上記飼料としては、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫等に用いるペットフード等の飼料等が挙げられ、上記食品と同様の形態に調製できる。
【００４２】
上記の各種製剤における、本発明の有効成分の含有量は、アボカド抽出物として、当該抽出物の乾燥重量に換算して、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは５０質量％以下、より好ましく１０質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜５０質量％、より好ましくは０．１〜１０質量％である。
また、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ又はペルシンとして、製剤全質量中に、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、好ましくは８０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下である。また、好ましくは０．００００１〜８０質量％、より好ましくは０．００１〜２０質量％である。
【００４３】
本発明のＮｒｆ２活性化剤、眼疾患若しくは腎臓疾患の予防、改善又は治療剤を医薬品、或いは各種機能性食品（例えば特定保健用食品、機能性表示食品等）として、或いはこれらに配合して使用する場合の投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人、１日当たり、アボカド抽出物（乾燥物換算）として、好ましくは０．０１ｇ以上、より好ましくは０．１ｇ以上であり、且つ好ましくは１０ｇ以下、より好ましくは１．５ｇ以下である。
また、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ又はペルシンとして、好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．１ｍｇ以上であり、好ましくは１０ｇ以下、より好ましくは１．５ｇ以下である。また、好ましくは０．０１〜１０ｇ、より好ましくは０．１〜１．５ｇである。
上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。投与又は摂取対象としては、生体の抗酸化防御や解毒能力の亢進を必要としている若しくは希望しているヒト、例えば網膜変性、白内障、角結膜障害等の眼疾患、腎臓疾患（急性腎障害、慢性腎臓病）の患者やそれらの予備軍などが挙げられる。
【００４４】
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞アボカド又はその抽出物を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。
＜２＞アボカド又はその抽出物を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤。
＜３＞ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。
＜４＞ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤。
＜５＞アボカド抽出物を有効成分とするＮｒｆ２活性化用食品。
＜６＞アボカド抽出物を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防又は改善用食品。
＜７＞ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とするＮｒｆ２活性化用食品。
＜８＞ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上を有効成分とする網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防又は改善用食品。
【００４５】
＜９＞Ｎｒｆ２活性化剤を製造するための、アボカド又はその抽出物の使用。
＜１０＞網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤を製造するための、アボカド又はその抽出物の使用。
＜１１＞Ｎｒｆ２活性化剤を製造するための、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上の使用。
＜１２＞網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療剤を製造するための、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上の使用。
＜１３＞Ｎｒｆ２活性化用食品を製造するための、アボカド抽出物の使用。
＜１４＞網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防又は改善用食品を製造するための、アボカド抽出物の使用。
＜１５＞Ｎｒｆ２活性化用食品を製造するための、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上の使用。
＜１６＞網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防又は改善用食品を製造するための、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上の使用。
【００４６】
＜１７＞Ｎｒｆ２活性化に使用するための、アボカド又はその抽出物。
＜１８＞白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療に使用するための、アボカド又はその抽出物。
＜１９＞Ｎｒｆ２活性化に使用するための、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上。
＜２０＞網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療に使用するための、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上。
【００４７】
＜２１＞アボカド又はその抽出物をヒト若しくは動物に投与するＮｒｆ２活性化方法。
＜２２＞アボカド又はその抽出物をヒト若しくは動物に投与する網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療方法。
＜２３＞ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上をヒト若しくは動物に投与するＮｒｆ２活性化方法。
＜２４＞ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンから選ばれる１種以上をヒト若しくは動物に投与する網膜変性、白内障及び角結膜障害から選ばれる眼疾患若しくは急性腎障害及び慢性腎臓病から選ばれる腎臓疾患の予防、改善又は治療方法。
＜２５＞＜１７＞〜＜２０＞において、使用は非治療的使用である。
＜２６＞＜２１＞〜＜２４＞において、方法は非治療的方法である。
＜２７＞＜１＞、＜２＞、＜５＞、＜６＞において、アボカドは、好ましくはアボカド加熱処理物である。
＜２８＞＜１＞、＜２＞、＜５＞、＜６＞、＜９＞、＜１０＞、＜１３＞、＜１４＞、＜１７＞、＜１８＞において、アボカド抽出物は、好ましくはアボカドのエタノール抽出物である。
＜２９＞＜１＞、＜２＞、＜５＞、＜６＞、＜９＞、＜１０＞、＜１３＞、＜１４＞、＜１７＞、＜１８＞において、アボカド抽出物中のペルセノンＡ、ペルセノンＢ又はペルシンの含有量は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは５０質量％以下、より好ましく１０質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜５０質量％、より好ましくは０．１〜１０質量％である。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４９】
製造例１  アボカド抽出物の調製
アボカドの果肉部分を凍結乾燥して得た乾燥果実５０．０ｇに０．５Ｌの５０質量％エタノールを加え、７日間室温で静置抽出した。抽出液を分離し、残渣に再度０．５Ｌの５０質量％エタノールを加え、７日間室温で静置抽出した。抽出液はそれぞれエバポレーターにより濃縮することにより４．９ｇの油状濃縮物を得た。
【００５０】
製造例２  焼きアボカド抽出物の調製
約５ｍｍの厚さにスライスした１５０〜２００ｇのアボガド果実を凍結乾燥した。乾燥果実を２００℃に設定したオーブンレンジで５分間加熱処理を行った。加熱処理したアボカド果実５０．０ｇに０．５Ｌの５０質量％エタノールを加え、７日間室温で静置抽出した。抽出液を分離し、残渣に再度０．５Ｌの５０質量％エタノールを加え、７日間室温で静置抽出した。抽出液はそれぞれエバポレーターにより濃縮することにより５．８ｇの油状濃縮物を得た。
【００５１】
製造例３  ペルセノンＡ、ペルセノンＢ及びペルシンの単離
（１）製造例１で得られたアボカドエタノール抽出物を、２００ｍＬのヘキサンと２００ｍＬの水よりなる二相非混和溶剤系の入った分液漏斗に加え、抽出物中の極性化合物と非極性化合物を分離した。ヘキサンと水による液―液分配を３回行った。それぞれのヘキサン層を合わせて、エバポレーターで乾燥状態まで蒸発させ、０．６６ｇの油状濃縮物を得た。
【００５２】
（２）上記（１）で得られたヘキサン画分の油状濃縮物０．６ｇを、ヘキサン３ｍＬに再溶解し、シリカゲルカラム（山善株式会社製  ＨＩ−ＦＬＡＳＨ  ＣＯＬＵＭＮ  ３Ｌ）に供し、組成を変化させた溶媒により溶出した。ここで使用した溶出溶媒は、ヘキサン／酢酸エチル（９９／１ｖ/ｖ％、６００ ｍＬ）、ヘキサン／酢酸エチル（９５／５ｖ/ｖ％、６００ ｍＬ）、ヘキサン／酢酸エチル（７５／２５ｖ/ｖ％、９００ ｍＬ）、ヘキサン／酢酸エチル（５０／５０ｖ/ｖ％、６００ ｍＬ）、酢酸エチル（９００ ｍＬ）、メタノール（９００ ｍＬ）であり、溶出液を経時的に採取することにより分画した。これら分画された溶出液の分画物について薄層クロマトグラフィー（メルク社製シリカゲル６０、展開溶媒；クロロホルム／メタノール＝２０／１）を行い、ＵＶランプ（波長２５４ ｎｍ）を指標としたＲｆ値の結果を指標として、最終的に８画分に分けた。それぞれの画分の収量は、画分〔１〕は３３．５ｍｇ、画分〔２〕は１４０．３ｍｇ、画分〔３〕は１４．５ｍｇ、画分〔４〕は５０．５ｍｇ、画分〔５〕は３３．７ｍｇ、画分〔６〕は７１．４ｍｇ、画分〔７〕は１５．６ｍｇ、画分〔８〕は１９５．７ｍｇであった。各画分の薄層クロマトグラフィーにおけるＲｆ値、分配率および溶出溶媒の組成は表１に示す通りである。
【００５３】
【表１】
2018039752.tif 000003
【００５４】
次に、画分〔２〕をヘキサン１．５ｍＬに再溶解し、分取ＴＬＣ（メルク製ＰＬＣ  シリカゲル６０Ｆ２５４）に供し、分画した。展開溶媒は、クロロホルム／アセトン（９５／５）で、２回展開した。別途同じ長さを展開したＵＶランプ（波長２５４ ｎｍ）を指標としたＲｆ値を指標として、最終的に６画分に分けた。それぞれの画分の収量は、画分〔１’〕は８．２ｍｇ、画分〔２’〕は８１．１ｍｇ、画分〔３〕は２８．４ｍｇ、画分〔４〕は１０．８ｍｇ、画分〔５〕は６．０ｍｇ、画分〔６〕は６．４ｍｇであった。各画分の薄層クロマトグラフィーにおけるＲｆ値、分配率は表２に示す通りである。
【００５５】
【表２】
2018039752.tif 000004
【００５６】
（３）画分〔２’〕をさらに高速液体クロマトグラフィーにより分画し、分画物中の化合物の特定を行った。ＨＰＬＣ等級のメタノールで１０ｍｇ／ｍＬに調整し、１００μＬずつを注入した。使用カラムは、Ｌ  ｃｏｌｕｍｎ  ２（ＯＤＳ，１０×２５０ｍｍ、５．０μｍ、 一般財団法人 化学物質評価研究機構）で、移動相は、Ａ相（０．１％  ギ酸水溶液）２５％、Ｂ相（アセトニトリル）７５％を用いた。カラム温度は、４０℃とし、４．７ｍＬ／分の流量で供給した。検出装置は、波長２２５ｎｍに設定した。それぞれの画分の収量は、化合物１は１８．８ｍｇ、化合物２は２７．１ｍｇ、化合物３は１２．１ｍｇであった。
画分〔２’〕の典型的なクロマトグラフを図２に示す。クロマトグラム中に分取した範囲を１〜３で示す。
分画物の分子量（機器；SCIEX製TripleTOFTM 4600+ System、カラム；Capcell Core C18（2.1×7.5 mm、2.7 μm、資生堂））、NMR（Bruker、600 MHz）による解析から、それぞれ、ペルセノンＡ（化合物１）、ペルシン（化合物２）、ペルセノンＢ（化合物３）であると同定された。それぞれの分析値は以下のとおりである。
【００５７】
化合物１（ペルセノンＡ）
1H-NMR (600 MHz, CDCl3); 0.87 (t, 7.0, 3H), 1.27 (m, 2H), 1.27 (m, 2H), 1.33 (m, 2H), 1.33 (m, 2H), 1.33 (m, 2H), 1.46 (m, 2H), 2.03 (m, 2H), 2.04 (m, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.23 (dt, 7.0, 6.4, 2H), 2.75 (m, 2H), 2.76 (m, 2H), 4.09 (dd, 11.4, 6.3, 1H), 4.14 (dd, 11.4, 4.1, 1H), 4.32 (m, 1H), 5.32 (m, 1H), 5.32 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 6.10 (d, 16.0, 1H), 6.87 (dt, 16.0, 7.0, 1H)
13C-NMR (150 MHz, CDCl3); 14.1, 20.9, 22.6, 25.6, 27.0, 27.2, 27.9, 28.8, 29.3, 29.3, 31.5, 32.5, 42.3, 66.2, 67.3, 127.8, 128.3, 129.7, 130.3, 149.4, 171.0, 199.7
HRESIMS m/z 379.2843 (M+H+), cald for C23H39O4 379.2848
【００５８】
化合物２（ペルシン）
1H-NMR (600 MHz, CDCl3); 0.88 (t, 7.0, 3H), 1.27 (m, 2H), 1.27 (m, 2H), 1.27 (m, 2H), 1.27 (m, 2H), 1.27 (m, 2H), 1.32 (m, 2H), 1.32 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 2.03 (m, 2H), 2.04 (m, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.44 (t, 7.5, 2H), 2.61 (m, 2H), 2.76 (m, 2H), 4.04 (dd, 11.4, 6.3, 1H), 4.09 (dd, 11.4, 4.1, 1H), 4.29 (m, 1H), 5.32 (m, 1H), 5.32 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 5.35 (m, 1H)
13C-NMR (150 MHz, CDCl3); 14.1, 20.8, 21.9, 22.5, 23.5, 25.6, 27.2, 27.2, 29.1, 29.1, 29.2, 29.3, 29.6, 31.5, 43.6, 45.1, 66.0, 67.2, 127.9, 127.9, 130.0, 130.2, 171.0
HRESIMS m/z 381.2999 (M+H+), cald for C23H41O4 381.3005
【００５９】
化合物３（ペルセノンＢ）
1H-NMR (600 MHz, CDCl3); 0.88 (t, 7.0, 3H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.27-1.28 (m, 2H), 1.47 (m, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.23 (dt, 7.0, 6.4, 2H), 2.76 (m, 2H), 4.09 (dd, 11.4, 6.3, 1H), 4.14 (dd, 11.4, 4.1, 1H), 4.34 (m, 1H), 6.10 (d, 16.0, 1H), 6.89 (dt, 16.0, 7.0, 1H)
13C-NMR (150 MHz, CDCl3); 14.1, 20.8, 22.6, 28.8, 29.2-29.7, 29.2-29.7, 29.2-29.7, 29.2-29.7, 29.2-29.7, 29.2-29.7, 29.2-29.7, 29.2-29.7, 31.9, 32.5, 42.2, 66.2, 67.3, 130.3, 149.6, 171.0, 199.7
HRESIMS m/z 355.2843 (M+H+), cald for C21H39O4 355.2848
【００６０】
実施例１  ＡＲＥ−Ｌｕｃ活性
（１）方法
１）プラスミド作製
ヒトにおいてＡＲＥ配列として機能検証されている配列(GCLC: TCCCCGTGACTCAGCGCTTTG（配列番号１）)をｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込んだプラスミドを以下のように作製した。
ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ認識サイトを末端に付加し、リンカーを入れた３ｘ  ＡＲＥタンデムリピート配列のオリゴＤＮＡを設計し合成した（グライナー）。３ｘＡＲＥ＿Ｆおよび３ｘＡＲＥ＿Ｒにリン酸基付加（Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ：タカラバイオ）後、９５℃  ５ｍｉｎ、３７℃  ３０ｍｉｎの条件でアニーリングした。アニーリング済みＤＮＡを、あらかじめＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ（タカラバイオ）で処理したｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒとライゲーションし、大腸菌（ＥＣＯＳTM  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α：和光純薬）に形質転換した。アンピシリン選択培地のコロニーからプラスミドを抽出し、配列を確認した。
【００６１】
ＧＣＬＣ  ３ｘＡＲＥ  Ｆ
CTAGCTCCCCGTGACTCAGCGCTTTGCCCTCCCCGTGACTCAGCGCTTTGCCCTCCCCGTGACTCAGCGCTTTGC（配列番号２）
ＧＣＬＣ  ３ｘＡＲＥ  Ｒ
TCGAGCAAAGCGCTGAGTCACGGGGAGGGCAAAGCGCTGAGTCACGGGGAGGGCAAAGCGCTGAGTCACGGGGAG（配列番号３）
【００６２】
２）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３を２４ｗｅｌｌプレートに播種し、ｃｈａｃｏｌ ｔｒｅａｔｅｄ ５％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）にて培養した。サブコンフルエントになったところでＡＲＥ−Ｌｕｃプラスミドおよび内部標準としてｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてトランスフェクションした。その後、評価素材（アボカド抽出物溶媒：５０％ＥｔＯＨ、単離品溶媒：９９．５％ＥｔＯＨ）またはコントロールとして同体積の５０％ＥｔＯＨまたは９９．５％ＥｔＯＨを添加し、１６時間後にＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ＡＲＥ−Ｌｕｃ活性（ホタルルシフェラーゼ活性）はｐｈＲＬ−ＴＫ活性（ウミシイタケルシフェラーゼ活性）によって補正した。図３ではＣｔｒｌに対する相対値（ｎ＝２の平均値）を示した。
【００６３】
（２）結果
アボカドおよび焼きアボカド抽出物にＡＲＥ−Ｌｕｃ活性上昇が認められた（図３Ａ）。同様にペルセノンＡ、ペルセノンＢ、およびペルシンにも濃度依存的なＡＲＥ−Ｌｕｃ活性上昇が認められた（図３Ｂ）。
【００６４】
実施例２  Ｎｒｆ２核移行促進作用
（１）方法
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を１０ｃｍディッシュに播種し、増殖添加剤含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｃａｓｃａｄｅ. Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にて培養した。サブコンフルエントになったところで、ペルセノンＡ、Ｂまたはペルシン（１０００ｘ濃度、溶媒：９９．５％ＥｔＯＨ）を最終濃度５０μＭとなるように、またコントロールとして同体積の９９．５％ＥｔＯＨを添加し、１６時間処理した。細胞をＰＢＳ  ｗａｓｈ後、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｋｉｔ  （Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を用いて、細胞質画分と核画分に分け、核画分抽出タンパクをウエスタンブロッティングに供した。一次抗体はａｎｔｉ−Ｎｒｆ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｓｃ−７２２）、ａｎｔｉ−Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｓｃ−２０６８１）を、二次抗体はＡｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ  Ｌｉｎｋｅｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いた。Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃは内部標準として用いた。
（２）結果
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ、またはペルシン処理により核内Ｎｒｆ２量の増加が認められた（図４）。このことからペルセノンＡ、ペルセノンＢ、ペルシンはＮｒｆ２の核移行を促進し、Ｎｒｆ２経路を活性化することが明らかとなった。
【００６５】
実施例３  抗酸化遺伝子発現（１）
（１）方法
１）正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）にて培養した。サブコンフルエントになったところで、アボカドもしくは焼きアボカドエキス（０．００２５，０．００５，０．０１，０．０２％、溶媒：５０％  ＥｔＯＨ）を１６時間処理した。ＣｔｒｌはＤＭＳＯを処理した。細胞からＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲにて遺伝子発現量を解析した（ｎ＝３，ｍｅａｎ±ＳＥ，＊  Ｐ＜０．０５  ＊＊  Ｐ＜０．０１（ｖｓ  Ｃｔｒｌ））。目的の遺伝子を特異的に検出するＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブはＧＣＬＣ（Ｈｓ００１５５２４９＿ｍ１）、ＨＯ−１  （ＨＭＯＸ１，  Ｈｓ０１１１０２５０＿ｍ１）を用いた。目的遺伝子発現量は内部標準遺伝子ＲＰＬＰ０  （Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）の発現量で補正した。解析には７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００６６】
２）正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、増殖添加剤含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｃａｓｃａｄｅ. Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にて培養した。サブコンフルエントになったところでペルセノンＡ、ペルセノンＢ、またはペルシン（１０００ｘ濃度、溶媒：９９．５％ＥｔＯＨ）を最終濃度１０，２５，５０μＭとなるよう添加し、２４時間処理した。Ｃｔｒｌは９９．５％ＥｔＯＨとした。細胞からＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲにて遺伝子発現量を解析した（ｎ＝３，ｍｅａｎ±ＳＥ，＊  Ｐ＜０．０５  ＊＊  Ｐ＜０．０１（ｖｓ  Ｃｔｒｌ））。目的の遺伝子を特異的に検出するＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブはＧＣＬＣ（Ｈｓ００１５５２４９＿ｍ１）、ＨＯ−１（ＨＭＯＸ１，  Ｈｓ０１１１０２５０＿ｍ１）を用いた。目的遺伝子発現量は内部標準遺伝子ＲＰＬＰ０（Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）の発現量で補正した。解析には７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００６７】
同様に細胞を回収後、タンパクを抽出し、ウエスタンブロッティングに供した。一次抗体はａｎｔｉ−Ｈｅｍｅ  Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−１０７８９）、ａｎｔｉ−ＧＣＬＣ（Ａｂｃａｍ，ａｂ５３１７９）、ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，＃４９７０）を、二次抗体はＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ  Ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。β−ａｃｔｉｎは内部標準として用いた。
【００６８】
（２）結果
焼きアボカドにＨＯ−１、ＧＣＬＣ遺伝子発現誘導作用が認められた（図５Ａ）。さらにペルセノンＡ、ペルセノンＢ、ペルシンに濃度依存的なＨＯ−１，ＧＣＬＣ遺伝子発現、タンパク発現誘導作用が認められた（図５Ｂ，Ｃ）。
【００６９】
実施例４  抗酸化遺伝子発現（２）
（１）方法
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、増殖添加剤含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｃａｓｃａｄｅ. Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で培養した。サブコンフルエントになったところでＮｒｆ２  ｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ：ｓｃ−３７０３０）もしくはＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ：ｓｃ−３７００７）をＨｉＰｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）にてトランスフェクションした。翌日に、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ、またはペルシン（１０００ｘ濃度、溶媒：９９．５％ＥｔＯＨ）を最終濃度５０μＭとなるよう添加し、８時間処理した。Ｃｔｒｌは９９．５％ＥｔＯＨとした。細胞からＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲにて遺伝子発現量を解析した（ｎ＝３、ｍｅａｎ±ＳＥ，＊＊  Ｐ＜０．０１（ｖｓ  Ｃｔｒｌ），†  Ｐ＜０．０５，  ††  Ｐ＜０．０１（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ））。目的の遺伝子を特異的に検出するＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブはＧＣＬＣ  （Ｈｓ００１５５２４９＿ｍ１）、ＨＯ−１（ＨＭＯＸ１，Ｈｓ０１１１０２５０＿ｍ１）を用いた。目的遺伝子発現量は内部標準遺伝子ＲＰＬＰ０（Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）の発現量で補正した。解析には７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００７０】
（２）結果
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ、ペルシンによるＨＯ−１，ＧＣＬＣ発現誘導作用はＮｒｆ２ノックダウンにより見られなくなった（図６）。このことからペルセノンＡ、ペルセノンＢ、ペルシンはＮｒｆ２を介して抗酸化遺伝子発現を亢進することが明らかとなった。
【００７１】
実施例５  グルタチオン産生促進作用
（１）方法
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、増殖添加剤含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｃａｓｃａｄｅ. Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で培養した。サブコンフルエントになったところでペルセノンＡ、ペルセノンＢ、またはペルシン（１０００ｘ濃度、溶媒：９９．５％ＥｔＯＨ）を最終濃度１０，２５，５０μＭとなるよう添加し、２４時間処理した。Ｃｔｒｌは９９．５％ＥｔＯＨとした。細胞をＰＢＳ洗浄後、５％  Ｍｅｔａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄに懸濁し、−８０℃で凍結させた。２度の凍結融解操作後、１０００ｘｇで５分間遠心し上清を回収した。グルタチオン測定キット（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）を用いてプロトコルに従い、上清中の総グルタチオン量（Ｔｏｔａｌ  ＧＳＨ  ＝  ＧＳＨ  ＋  ＧＳＳＧ）を定量した。同様の素材処理を行ったウェルから細胞を回収し、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク濃度を測定し、その値をＧＳＨ量の補正に用いた（ｎ＝３，ｍｅａｎ±ＳＥ，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓ  Ｃｔｒｌ））。
【００７２】
（２）結果
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ、ペルシン（５０  μＭ）処理でＣｔｒｌに比べ、それぞれ２．０、１．５、１．７倍までグルタチオン量が増加した（図７）。すなわち、ペルセノン類はグルタチオン合成酵素であるＧＣＬＣ発現を誘導し、最終的にはグルタチオン量を増加させることが明らかとなった。
【００７３】
実施例６  細胞内活性酸素低減作用
（１）方法
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）をＢｉｏｃｏａｔ  Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ  ９６ｗｅｌｌ  Ｂｌａｃｋ／Ｃｌｅａｒ  ｐｌａｔｅに播種し、サブコンフルエントになったところで実験を行った。アボカド、焼きアボカドエキス、ペルセノンＡ、ペルセノンＢ、またはペルシンを１６時間処理した。細胞内ＲＯＳレベルは２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  （Ｈ２ＤＣＦＤＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。評価素材処理後の培地を、Ｈ２ＤＣＦＤＡを最終濃度１０μＭに調製したＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に置換し、３７℃、暗所で２０分間処理した。次いで、Ｈ２ＤＣＦＤＡ溶液を、はＨＢＳＳで濃度を合わせたＨ２Ｏ２（１００μＭ）溶液に置換することでＨ２Ｏ２処理をおこなった。Ｈ２Ｏ２処理３０分後に蛍光マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０４  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ４８５ｎｍおよびｅｍｉｓｓｉｏｎ  ５３５ｎｍを測定した。
【００７４】
（２）結果
ペルセノンＡ、ペルセノンＢ、またはペルシンを５０μＭ前処理しておくと、Ｈ２Ｏ２による細胞内ＲＯＳ量の増加がそれぞれ４１，３８，３２％低減した（図８）。アボカドおよび焼きアボカド（０．００５％処理）も同様に、Ｈ２Ｏ２によるＲＯＳ量の増加をそれぞれ４５，５８％抑制した（図８）。以上のことから、アボカド、焼きアボカドエキスおよびペルセノンＡ、ペルセノンＢ、ペルシンはＮｒｆ２を活性化し、酸化ストレス低減作用を有することが明らかとなった。
【図１】
2018039752.tif 000005
【図２】
2018039752.tif 000006
【図３】
2018039752.tif 000007
【図４】
2018039752.tif 000008
【図５】
2018039752.tif 000009
【図６】
2018039752.tif 000010
【図７】
2018039752.tif 000011
【図８】
2018039752.tif 000012
【配列表】
2018039752000001.app