(57)【要約】      （修正有）【課題】実質的に子宮内膜症、虚血再灌流障害、心筋梗塞、および再狭窄を含む症状の治療または予防に用いる医薬組成物の製造に用いるリポソームの提供。費用対効果が高く、リポソーム処方剤の性質を制御可能な大規模生産に使用可能で、臨床での使用に適した実質的に均一なリポソームを生産できる方法の提供。【解決手段】脂質成分と封入された治療剤を有するリポソームであって、治療剤対脂質の質量比が約１：５〜１：８であり、脂質成分がＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含有し、リポソームの圧縮率が０．７０ｍｌ／ｇ未満であるリポソーム。治療剤がビスホスホネートである、前記リポソームの使用。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に子宮内膜症、虚血再灌流障害、心筋梗塞、および再狭窄を含む症状の治療または予防に用いる医薬組成物の製造に用いるリポソームの使用であって、
当該リポソームは、脂質成分と封入された治療剤を有し、治療剤対脂質の質量比が約１：５〜１：８であり、脂質成分がＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含有し、リポソームの圧縮率が０．７０ｍｌ／ｇ未満であることを特徴とするリポソームの使用。
【請求項２】
リポソームが負に帯電していることを特徴とする請求項１記載のリポソームの使用。
【請求項３】
リポソームのリポソーム内部オスモル濃度が３４０〜４４０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であることを特徴とする請求項１記載のリポソームの使用。
【請求項４】
リポソームのリポソーム内部導電性が１３．５〜１７．５ｍｓ／ｃｍの範囲であることを特徴とする請求項１記載のリポソームの使用。
【請求項５】
治療剤がビスホスホネートであることを特徴とする請求項１記載のリポソームの使用。
【請求項６】
リポソーム内のビスホスホネートの濃度範囲が０．５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする請求項５記載のリポソームの使用。
【請求項７】
リポソームの内部ｐＨが６．８〜７．０の範囲であることを特徴とする請求項１記載のリポソームの使用。
【請求項８】
前記症状がステント留置処置に関するものであることを特徴とする請求項１記載のリポソームの使用。
【請求項９】
実質的に子宮内膜症、虚血再灌流障害、心筋梗塞、および再狭窄を含む症状の治療または予防に用いる処方剤であって、
当該処方剤は、複数のリポソームを含み、リポソームが脂質成分と治療剤を有し、脂質成分がＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含有し、処方剤のＰＤＩが０．０７５未満であることを特徴とする処方剤。
【請求項１０】
リポソームが負に帯電していることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項１１】
リポソームのリポソーム内部オスモル濃度が３４０〜４４０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項１２】
リポソームのリポソーム内部導電性が１３．５〜１７．５ｍｓ／ｃｍの範囲であることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項１３】
治療剤がビスホスホネートであることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項１４】
リポソーム内のビスホスホネートの濃度範囲が０．５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする請求項１３記載の処方剤。
【請求項１５】
リポソームの内部ｐＨが６．８〜７．０の範囲であることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項１６】
リポソームの平均粒径が８０±５ｎｍであることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項１７】
処方剤中の治療剤の９６％以上が封入されていることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項１８】
治療剤対脂質成分の質量比が約１：５〜１：８であることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項１９】
リポソームの圧縮率が０．７０ｍｌ／ｇ以下であることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項２０】
ＰＤＩが０．０２〜０．０５であることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項２１】
前記症状がステント留置処置に関するものであることを特徴とする請求項９記載の処方剤。
【請求項２２】
実質的に子宮内膜症、虚血再灌流障害、心筋梗塞、および再狭窄を含む症状の治療または予防に用いる処方剤を製造する方法であって、
当該処方剤は、ある量の脂質成分と治療剤とを含むリポソームを複数含み、脂質成分がＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含有し、治療剤対脂質の質量比が約１：５〜１：８の範囲であり、当該製造方法が、
（ａ）治療剤を含む溶液を、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含む脂質溶液と混合して、治療剤と脂質の質量比が約１：５〜１：８となるよう小胞を形成する工程と、
（ｂ）実質的に、孔径約１００ｎｍの単一フィルターを複数回通して繰り返し押出すことで、小胞を押出す工程と、
（ｃ）小胞を限外濾過する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
（ｄ）処方剤をリン酸緩衝液で希釈して、前記処方剤の最終治療剤濃度とする工程をさらに含むことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｂ）の押出しを５５℃〜７５℃の範囲で行うことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）の押出しを６０〜９０ｐｓｉの範囲の圧力で行うことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｂ）の押出しを１０〜１８回繰り返してから限外濾過を行うことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記処方剤のリポソームの内部ｐＨが６．８〜７．０の範囲であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
処方剤のＰＤＩが０．０７５未満であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
前記症状がステント留置処置に関するものであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[発明の分野]  本発明は、新規なリポソーム、リポソームを含む処方剤、およびリポソーム処方剤の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
[発明の背景]
当業界において、リポソームは、各種の医学的状態を治療するために、治療剤を標的細胞に送達させる際にキャリアーとして機能することが知られている。ある用途では、リポソームは、マクロファージによって選択的に貪食されるようなかたちで薬剤を封入した処方とすることができる。貪食されたリポソームは、薬剤を細胞内に放出して、とりわけ、マクロファージの炎症機能を阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
当業界では、こうしたリポソームの製造方法がいくつか記載されている（たとえば、Ｍｏｎｋｋｏｎｅｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２：２９９−３０８；  Ｍｏｎｋｋｏｎｅｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，Cａｌｃｉｆ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．，  ５３：１３９−１４５；  Ｌａｓｉｃ  ＤＤ．，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  １９９３，  ６３−１０５．  （３章）；  Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ  Ｍ，  Ｌａｓｉｃ  ＤＤ，Cｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ，  １９９３；  ５４（１−３）：３５−４３を参照）。こうした方法の一つでは、リポソームの形成にあたって、液晶２層の積層物が形成され、それが水和されて水和脂質シートとなり、さらに攪拌によってちぎれて自己閉鎖することで大型多層小胞（ｌａｒｇｅ  ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＭＬＶ）が形成される。この方法は、脂質薄膜水和法として知られている。こうした粒子が形成された場合、粒子の粒径は、当該方法でのそれ以降の工程で使用される方法（音波エネルギー（超音波処理）、機械的エネルギー（押出し））によって変わってくる。超音波処理の場合には、通常、小型の単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ、ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ＳＵＶ）が生成され、浴および／またはプローブチップ超音波処理器が必要とされる。一方、脂質懸濁液を一連のポリカーボネート製フィルターを通して強制的に押出す脂質押出し法（通常、０．８、０．４、０．２、および０．１μｍの膜を高圧（５００ｐｓｉ以下）で使用）では、使用フィルターの孔径に近い直径を有する粒子が生成される。こうした方法は、研究目的で主に使用される少量バッチ生産に限られており、高圧押出法の場合、さらに運転コストが高く、時間がかかるという問題があった。このように、当該技術では、再現性があり、リポソーム生産における品質管理、安定性、生産規模の拡大可能性、滅菌といった問題に対処可能で、工業規模の生産に使用可能なリポソームの製造方法が必要とされている。  
【０００４】
また、当業界で公知のリポソーム処方剤は、滅菌製品を製造し、異常に大型のリポソームによって有害な副作用が生じる可能性を防止するうえで医薬組成物として必須の粒径と形状の実質的均一性を備えていない。現状では、粒径が均一なリポソーム処方剤を製造することは難しい。一連のフィルター（たとえば、孔径１００ｎｍのポリカーボネートフィルターを含む）を通して多層小胞を押出す押出法では、粒径１００ｎｍの実質的に均一なリポソームを含む処方剤を安定的に生産することはできない。実際、圧縮率および／または安定性といったリポソームの物理的特性に応じて、押出される小胞の平均小胞径は、使用フィルターの種類と孔径に応じて相当程度変わってしまう。このように、粒径と形状が実質的に均一なリポソームを生成しうる製造方法が必要とされている。  
【０００５】
さらには、リポソーム処方剤の多くの物理的特性がリポソームに対する細胞の応答に影響を及ぼし、医薬組成物としてのリポソームの有効性を左右する。リポソーム処方剤の物理的特性は、多くの面で、製造方法の影響を受ける。しかし、当該技術においては、リポソームの特性を製造過程において制御して、製造効率やリポソームの安定性を操作する方法も、示されてこなかった。したがって、費用対効果が高く、しかも、リポソーム処方剤の性質を制御可能な大規模生産に使用可能で、臨床での使用に適した実質的に均一なリポソームを生産できる方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[発明の概要]  本発明では、治療剤を封入した新規なリポソームを記載する。本発明は、粒径の均一性が高く、副作用が少なく、滅菌プロセスの信頼性の改善されたリポソーム処方剤にも関するものである。本発明は、低圧押出し条件でリポソームを製造するための効率的で費用対効果の高い製造方法についても記載する。この方法で処方されたリポソームは、所望の特性と有効な治療特性を有する。  
【０００７】
リポソーム処方剤は、リポソームが所望の組成と物理的特性を有することを特徴としている。リポソームは、治療剤を封入した脂質成分をからなる。本発明の一観点では、脂質成分は、ジアステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、コレステロールを、３：１：２のモル比（ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ｃｈｏｌ）で含む。  
【０００８】
リポソームは、脂質成分と治療剤から構成され、薬剤：脂質比と称される治療剤の質量対脂質成分の質量の比が、重量で約１：５〜１：８、好ましくは１：６〜１：７である。薬剤：脂質比がこの範囲であると、安定性と効率化が増強され、薬剤放出性とリポソームの一体性も増大する。こうした構造特性によって、本発明の処方剤の予期せぬ利点が実現されている。  
【０００９】
本発明のリポソームの粒径範囲は、３０〜５００ｎｍであり、好ましくは、使用する治療剤および／または賦形剤の種類に応じて、７０〜１２０ｎｍ、１００〜３００ｎｍ、１００〜１８０ｎｍ、７０〜１５０ｎｍである。好適な一態様では、リポソームの粒径を８０±５ｎｍとすることができる。  
【００１０】
リポソーム組成物の他の物性も、安定性と有効性に有意に貢献する。たとえば、リポソームの導電性は、食細胞への選択的取り込みに影響している可能性がある。一態様では、導電性は、１３．５〜１７．５ｍｓ／ｃｍの範囲である。同様に、処方剤外部および内部のオスモル濃度は、安定性および有効性に影響する。外部オスモル濃度は、人体内のオスモル濃度と合致させ、内部オスモル濃度は、十分低いものとして、処方剤を安定させることが好ましい。本発明の一態様では、内部オスモル濃度は、３４０〜４４０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。他の好ましい変数は、リポソームおよび／またはリポソーム処方剤のｐＨである。たとえば、リポソーム処方剤の内部ｐＨが約６．９であると、薬剤漏出度および封入能力ばかりでなく長期安定性にも有利な影響がある。  
【００１１】
本発明のリポソームは、圧縮されにくいリポソーム膜を持つことでも特徴づけられるように、当業界のリポソームと比較して相対的に剛固である。本発明のリポソームは、圧縮率が０．７ｍｌ／ｇ未満である。このように剛固であることから、本発明のリポソームは、安定性と保存性が改善されている。  
【００１２】
このリポソーム処方剤には、新規で有用な特徴もある。本発明のリポソーム処方剤は、剛固であるだけでなく、粒径と形状の分布が実質的に均一なリポソームからなる。この処方剤は、リポソーム同士の粒径のばらつきがほとんどない。ポリダイバーシティ指数（Ｐｏｌｙ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ、ＰＤＩ）で測定したリポソームの均一性は０．０７５未満であり、好ましくは、約０．０２〜０．０５の範囲で、このことからも均一度の高い組成物であることが示される。したがって、本発明のリポソーム処方剤は、大型のリポソームに付随する望ましくない事象の発生回数を減らし、滅菌フィルターでの濾過を効率的に実施することができ、好ましい。  
【００１３】
本発明の別の観点は、リポソーム処方剤の製造方法である。この製造方法は、（１）治療剤をあらかじめ選択した脂質と混合して小胞を作成し、（２）小胞を、単一ステージで、単一サイズのフィルターを通して押出し、（３）限外濾過する工程を含む。限外濾過の後、生成物を必要に応じて所望の最終濃度に標準化してもよい。押出し工程（２）を低圧下の単一ステージでの押出しによって実施するので、本発明の方法は、高圧の多段工程での押出しと比べて、運転コストと時間を省くことができ、収率を挙げることができる。こうした製造工程は、大規模製造にも適合させることができる。  
【００１４】
製造方法の一態様では、処方剤を、（１）治療剤を、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含む脂質と混合して、治療剤と脂質の質量比が約１：５〜１：８となるよう小胞を形成し、（２）小胞を、単一ステージで、孔径約１００ｎｍのフィルターを通して押出し、（３）限外濾過を行うことによって製造する。  
【００１５】
本発明のさらに別の観点は、上述の製造工程にしたがって製造したリポソーム処方剤である。この処方剤は、ある量の治療剤封入脂質成分から構成される複数のリポソームからなる。たとえば、脂質成分は、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含み、治療剤対脂質成分の質量比は、約１：５〜１：８とすることができる。処方剤は、以下の工程、すなわち、（１）治療剤をあらかじめ選択した脂質と混合して小胞を作成し、（２）小胞を、単一ステージで、単一サイズのフィルターを通して押出し、（３）限外濾過することによって製造する。限外濾過の後、生成物を必要に応じて所望の最終濃度に標準化してもよい。好ましくは、この方法にしたがって製造した処方剤は、ＰＤＩを０．０７５未満、より好ましくは０．０２〜０．０５の範囲とする。この方法では、上述の脂質成分の３：１：２の比、薬剤：脂質比、ＰＤＩ、剛性、ｐＨ、オスモル濃度、導電性といった新規で有用な特徴を有するリポソーム処方剤が生成される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のリポソーム処方剤製造方法のフローチャートである。
【図２】本発明の一観点にもとづく、１リットルの静注用リポソーム封入アレンドロネート（容量強さ、５ｍｇ／ｍｌ）の製造方法と、プロセス制御変数をまとめたフローチャートである。
【図３】本発明の一観点にもとづくリポソーム封入アレンドロネートのＴＥＭ像である。
【図４】各種のリポソーム処方剤の比圧縮率を比較するグラフである。
【図５Ａ】本発明のリポソーム処方剤の粒径分布のグラフである。
【図５Ｂ】従来技術のリポソーム処方剤の粒径分布のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[発明の詳細な説明]  本発明は、各種疾患の治療に用いる新規なリポソーム処方剤およびその製造方法に関する。この処方剤は、複数の治療剤封入リポソーム、すなわち、「封入治療剤」を含む複数のリポソームからなる。各リポソームの物性によって、リポソーム処方剤の安定性と効果が実現される。処方剤は、リポソームの粒径と形状が実質的に均一であることを特徴としている。本発明はまた、効率的で費用対効果が高く、大規模な製造の需要にも合致したリポソーム処方剤の製造方法も記載する。また、本発明は、この製造方法によって製造された新規かつ有用な特性を有する処方剤にも関するものである。
【００１８】
Ａ．リポソームの成分
本発明は、新規で有用な形態のリポソームに関する。本発明のリポソームを製造するにあたっては、各種のリポソーム成分を使用することができる。好ましくは、脂質成分は、非毒性で生体適合性の脂質、たとえば、ホスファチジルコリン、ホスホグリセロール、および／またはコレステロールから製造された脂質である。本発明の一形態では、脂質成分は、ジアステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）と、ジアステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）と、コレステロールとを、好ましくは約３：１：２のモル非（ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ｃｈｏｌ）で含有する。
【００１９】
脂質成分は、治療剤を封入し、ここで双方の成分は所定質量を有する。本明細書では、「薬剤対脂質比」（すなわち薬剤：脂質比）とは、リポソームおよび／または処方剤を構成する薬剤対脂質成分の相対的な質量比のことをいう。本発明の一態様では、リポソームは、薬剤：脂質の重量比が、約１：５〜１：８、好ましくは１：６〜１：７である。
【００２０】
Ｂ．リポソームの物性
リポソームの各種の物理変数と特性が、均一性、安定性、処方剤の有効性に影響を及ぼしうる。こうした物性としては、（１）リポソーム内およびリポソーム外のオスモル濃度、（２）（リポソーム内およびリポソーム外の）導電性、（３）薬剤：脂質比、（４）（リポソーム内およびリポソーム外の）ｐＨ、（５）組成物で使用する脂質と薬剤の種類を挙げることができる。
【００２１】
オスモル濃度は、リポソーム処方剤の溶質の濃度についての尺度である。本明細書で使用する場合には、「オスモル濃度」という用語は、溶媒１キログラムあたりのオスモルでの溶質分子数（ｍＯｓｍ）（ｍＯｓｍ／ｋｇ）で規定する溶質の濃度についての尺度である。内部オスモル濃度は、リポソーム内の溶質の濃度であり、外部オスモル濃度は、リポソーム外の溶質の濃度である。本発明の一態様では、リポソームは、低いリポソーム内部オスモル濃度を有する。内部オスモル濃度は、リポソーム内に封入する薬剤の量を変化させることによって調整できる。当業界で記載されているリポソームは、なるべく多くの薬剤を封入し、その結果、オスモル濃度が高い（封入比が高い）リポソームである。しかし、本発明で開示するリポソームは、当業界で使用されているリポソームよりオスモル濃度が低い（または封入比が低い）リポソームである。本明細書で開示するような低めのオスモル濃度、すなわち約３４０〜４４０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を用いると、処方剤中でのリポソームの安定性と、リポソームの均一性が改善される。内部オスモル濃度を下げるための一つの方法としては、リポソーム処方剤への治療剤封入量を減らすことが挙げられる。内部オスモル濃度を下げるための、薬剤：脂質比の変更を要さない別の方法としては、当業界で公知の特定の多糖類または糖類のような非帯電物質の使用を挙げることができる。
【００２２】
外部オスモル濃度は、体内のオスモル濃度と等張とするのが好ましく、特に、注射用処方剤の場合には、体内のオスモル濃度と等張とするのが好ましい。したがって、外部オスモル濃度は、相対的に一定となるようにすることが好ましい。本発明の内部および外部オスモル濃度によって、高い安定性、低い薬剤漏出率、リポソームの適正な薬剤封入能が実現されるものである。
【００２３】
本明細書で使用する「導電性」という用語は、溶液のイオン含量にもとづくリポソームによる電気の導電性である。導電性は、リポソームのイオン含量と関連しており、リポソーム処方剤の安定性、薬剤漏出率、薬剤封入能に影響を与える。リポソームの導電性は、約１３．５〜１７．５ｍｓ／ｃｍの範囲とする。本発明の一態様では、封入された薬剤が帯電している。帯電した薬剤は、リポソームの導電性およびオスモル濃度と一対一の相関を有する。したがって、封入する帯電物質の量を変更すると、それに比例するかたちで、これら双方の特性に影響が及ぶことになる。別の態様としては、ニュートラルな（耐電していない）薬剤物質を使用することもできる。ニュートラルな物質として多糖類のような物質を導電性の調整に使用する場合には、オスモル濃度薬剤の濃度とは独立しており、薬剤の濃度とは独立したかたちで制御できる。
【００２４】
本発明のリポソームのもう一つの新規な観点は、組成物の相対的剛性、すなわち、環境および体内の異なる条件下でのリポソームの安定性と、壊れやすさである。リポソームの剛性は、リポソームの保存性の改善につながるリポソーム膜強度ならびに剪断力・圧力に対する耐性の尺度である。リポソームの剛性は、圧縮率と反比例する。圧縮率の低いリポソームは、剛性が高い。リポソームの剛性の測定方法の一例は、超音波ベロシメトリーとデンシトメトリーを用いるものである。リポソームの剛性の測定方法は当業界で周知であり、たとえば、Ｌｅｉｄｅ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｌｅｎｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ”，Cｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ８５（２０１１）  １５３−１６０；およびＨｉａｎｉｋ，  Ｔｉｂｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  Cｏｍｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｎａ，  Ｋ−ＡＴＰａｓｅ”，  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３０（２０１１）  １４５−１５３に記載されている。これらについては、ここに言及することをもって、そのすべてを本明細書に組み込むものとする。
【００２５】
リポソームについては、リポソーム外の溶剤についてのｐＨ（外部ｐＨ）と、リポソーム内部の封入された部分についてのｐＨ（内部ｐＨ）がある。ｐＨは、安定性、リポソームからの薬剤漏出率、リポソーム処方剤の薬剤封入能に影響を及ぼす。処方剤の一態様では、内部ｐＨを約６．８〜７．０の範囲とする。内部ｐＨが６．８〜７．０であることは、処方剤の安定性にとって有利である。治療剤の溶剤のｐＨは、たとえば、連続的に溶液の滴定をおこないつつｐＨの範囲を６．８〜７．０に保ったり、治療剤を既知の緩衝液を用いて溶解する際に特定のｐＨ、たとえばｐＨ約６．９に保ったりすることによって保持することができる。リポソームの内部ｐＨは、リポソームの外部ｐＨとは異なっていてもよい。ｐＨが異なるようにするには、リポソームの内部および外部環境を構成する溶液のｐＨを変化させればよい。
【００２６】
Ｃ．処方剤
本発明のリポソーム処方剤は、上述のような特徴を有し、粒径と形状が実質的に均一で、つまりリポソーム同士の粒径のばらつきがほとんどない複数のリポソームからなる。処方剤の均一性は、多分散指数（ＰＤＩ）によって測定する。ＰＤＩは、０〜１の非線形のスケール（値０は完璧に均一な製剤、ＰＤＩが１の組成物は、多様性大（不均一））で測定する。本発明の処方剤のＰＤＩは、０．０７５未満、好ましくは０．０２〜０．０５の範囲である。
ＰＤＩの値は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ  ｓｅｒｉｅｓ  ｕｓｅｒ  ｍａｎｕａｌ，  ２００３，  Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  ｐｐ．  ５．５−５．６と、Ｋａｚｕｂａ  Ｍ．，  Ｎａｎｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ＨＰＰＳ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ  Cｈａｐｔｅｒ  １，  ２００３，  Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  ｐｐ．  ９で論じられているようにして計算することができ、これらの文献の内容は、ここに言及することをもって、本発明に組み込むものである。実際、本処方剤のＰＤＩは、ＰＤＩが０．０２未満の粒径測定用標準と似通っている。当業界で公知の処方剤は、ＰＤＩが通常０．３程度であり、本発明の均一性とは実質に異なる均一性を有している。ＰＤＩは非線形なスケールであるため、本発明のＰＤＩは、当業界の処方剤のＰＤＩと実質的に異なっている。実際、本発明の低いＰＤＩによって、大型リポソームにともなう有害な効果が防止され、フィルターによる滅菌に適した処方剤を生成できるので有利である。
【００２７】
本発明の処方剤は、剛性と均一性が増大したリポソームを含み、そのため、安定性と保存性が改善している。本発明の処方剤は、有効であるとも考えられる。（Ｂａｎａｉ，  Ｓｈｍｕｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ：    Ｔｈｅ  Ｂｉｏｒｅｓｔ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅａｌ  Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｅｎｔ  ｓｔｕｄｙ  （ＢＬＡＳＴ）  −  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Cｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ”，  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  （２０１３）  １６５（２）：  ２３４−４０．）
【００２８】
本処方剤のリポソームは、マクロファージおよび単球に取り込まれるように特定の粒径とする。リポソームは、３０〜５００ｎｍの範囲の粒径とすることができる。しかし、使用する薬剤や担体の種類に応じて、リポソームの粒径の範囲は、７０〜１２０ｎｍ、１００〜５００ｎｍ、１００〜３００ｎｍ、１００〜１８０ｎｍ、８０〜１２０ｎｍとすることもできる。しかし、これらの範囲は例として示すものであり、食細胞による取り込みに適当な他の特定の粒径も、本発明の精神や範囲から逸脱することなく見いだすことができるはずである。好適な一態様では、処方剤のリポソーム粒径は、約８０±５ｎｍである。
【００２９】
本発明のリポソームには、各種の治療剤を封入することができる。治療剤は、リポソームが取り込まれたときに、活性を低減させたり阻害させたり、および／または患者内の食細胞の量を減らしたりすることのできる物質である。治療剤は、任意の化学物質とすることができ、大型または小型の分子、化学化合物の混合物、無機または有機化合物、生物学的高分子、たとえばタンパク質、炭水化物、ペプチド、抗体、核酸などとすることができる。治療剤は、既知の生物から誘導した天然生成物であっても、合成化合物でもかまわない。
【００３０】
本発明で有用な治療剤の一種が、ビスホスホネートである。ビスホスホネート（旧称ホスホネート）は、Ｃ−Ｐ結合を２つ持つことを特徴とする化合物である。ビスホスホネートは、２つの結合が、同じ炭素原子上に存在する場合（Ｐ−Ｃ−Ｐ）、ジェミナルなビスホスホネートと称される。ビスホスホネートは、骨形成や再吸収の調節に関与している内在性無機ピロリン酸塩の類似物質である。ビスホスホネートは、場合によっては、重合鎖を形成することもある。ビスホスホネートは親水性が高く、負に帯電しているので、そのままの遊離形態では、細胞膜を通過することは、ほぼ完全に不可能である。
【００３１】
本明細書で使用するビスホスホネートという用語は、ジェミナルなビスホスホネートとジェミナルでないビスホスホネートの双方を指す。好適なビスホスホネートは、下記の式（Ｉ）を有する。
【００３２】
【化１】
2018199705.tif 000003
【００３３】
ここで、Ｒ１はＨ、ＯＨ、またはハロゲン原子であり、Ｒ２はハロゲン、ヘテロアリールまたは複素環式Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノまたはＣ３〜Ｃ８シクロアルキルアミノ（アミノは一級、二級または三級）で必要に応じて置換された直鎖または枝分かれＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニル、−ＮＨＹ（式中のＹは水素）、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるか、−ＳＺ（式中のＺは、クロロ置換フェニルまたはピリジニル）である。
【００３４】
ビスホスホネート剤の一例は、下記式（ＩＩ）を有するアレンドロネートである。
【００３５】
【化２】
2018199705.tif 000004
【００３６】
多くのビスホスホネートが、アレンドロネートと似た活性を有しており、本発明の治療剤として有用である。こうしたビスホスホネートは、アレンドロネートの生物学的活性にどこまで近づけるかというところで選ぶことができる。アレンドロネートの生物学的活性としては、たとえば、食細胞、たとえばマクロファージおよび繊維芽細胞内に入った場合に、それらの細胞の活性を阻害するインビトロの活性、マクロファージからのＩＬ−１および／またはＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αの分泌の阻害、インビトロの活性、たとえば試験に供した処方剤が、動物モデルまたはヒトで血液の単球を欠乏または無能化させる能力、または心筋梗塞を治療し、梗塞の領域を減らす能力を挙げることができる。
【００３７】
本発明で適用可能なビスホスホネートとしては、クロドロネート、チルドロネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸、たとえばジメチル−ＡＰＤ；１−ヒドロキシ−エチリデン−１，１−ビスホスホン酸、たとえばエチドロネート；１−ヒドロキシ−３（メチルペンチルアミノ）−プロピリデン−ビスホスホン酸、（イバンドロン酸）、たとえばイバンドロネート；６−アミノ−１−ヒドロキシヘキサン−１，１−ジホスホン酸、たとえばアミノ−ヘキシル−ＢＰ；３−（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸、たとえばメチル−ペンチル−ＡＰＤ；１−ヒドロキシ−２−（イミダゾール−１−イル）エタン−１，１−ジホスホン酸、たとえばゾレドロン酸；１−ヒドロキシ−２−（３−ピリジル）エタン−１，１−ジホスホン酸（リセドロン酸）、たとえばリセドロネート；３−［Ｎ−（２−フェニルチオエチル）−Ｎ−メチルアミノ］−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ビスホスホン酸；１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）プロパン−１，１−ビスホスホン酸、１−（Ｎ−フェニルアミノチオカルボニル）メタン−１，１−ジホスホン酸、たとえばＦＲ  ７８８４４（Ｆｕｊｉｓａｗａ）；５−ベンゾイル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾール−３，３−ジホスホン酸テトラエチルエステル、たとえばＵ８１５８１（Ｕｐｊｏｈｎ）；および１−ヒドロキシ−２−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−ｙｌ）エタン−１，１−ジホスホン酸、たとえばＹＭ５２９が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
特定の実施態様では、たとえばナトリウムアレンドロネートがＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、およびコレステロールに封入されているような態様では、１：５．７の薬剤：脂質質量比（ナトリウム・アレンドロネートについては、約１：３のモル比と同等）を用いることができる。別の治療剤であるクロドロン酸ニナトリウムが同じ脂質成分に封入されている場合には、約１：５．４の質量比（１：３のモル比と同等）を使用することができる。本発明では、増殖の阻害または遅延、および／または食細胞の活性のダウンレギュレーションによって食細胞を阻害したり低減させたりするような他の治療剤を封入してもよい。具体的な治療剤としては、細胞毒性または細胞増殖抑制性の任意の薬剤を挙げることができ、たとえば、ガリウム、金、シリカ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、アルキル化剤、ミトラマイシン、パクリタキソールを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。上記治療剤のどれにおいても、リポソームの薬剤：脂質比（重量）は、約１：５〜１：８、好ましくは１：６〜１：７である。
【００３９】
一実施態様では、処方剤は、リポソームに封入した治療剤を含み、この治療剤が食作用を通じて細胞に入り、食細胞以外に影響を及ぼすことなくマクロファージと単球を標的とする。正常状態のマクロファージと単球は細胞が傷ついた領域に誘導され、疾患や症状によって生じる炎症のレベルを超えた炎症を促進するので、単球／マクロファージの阻害および／または欠乏は、そのダメージを受けた領域ヘの悪影響を抑制する。食細胞の内部に取り込まれると、薬剤が放出され、虚血再灌流障害または炎症性障害、たとえば心筋梗塞、梗塞の最終領域の低減、急性心筋梗塞後の心臓修復およびアウトカムの改善をはじめとする食細胞免疫応答をともなう各種の症状の治療を行うべく、単球および／またはマクロファージを阻害、不活性化、機能不全化、死滅、および／または欠乏させる。処方剤のリポソームは、粒径、帯電、ｐＨ、導電性、主に食作用を通じての取り込みを促進するような粒径、帯電、ｐＨ、導電性、オスモル濃度などの特定の性質を有する。
【００４０】
単球／マクロファージに取り込まれた後、処方剤は、単球／マクロファージに対する持続的な阻害活性を発揮する。この持続的な活性は、単球／マクロファージの炎症作用を弱めるうえで十分なものであり、したがって、阻害作用を保持するうえで、処方剤を持続的に放出する必要はない。したがって、ある疾患を、たとえばリポソームに封入された処方剤を使用して単球／マクロファージを阻害することによって治療する方法は、処方剤が循環する単球およびマクロファージを標的とするような全身的な治療であることが好ましい。封入された治療剤の種類に応じて、食細胞の反応は異なる可能性がある。たとえば、アレンドロネートを封入したリポソームは、アポトーシスを生じるのに対し、クロドロネートを封入したリポソームは、壊死を生じる。食細胞以外の細胞には、リポソーム処方剤に固有の生理科学的特性ゆえに、処方剤は相対的に取り込まれにくい。
【００４１】
また、本発明のリポソームは、治療剤を十分な時間保持して体液中で治療剤が放出されないようにするだけでなく、標的細胞内では効率的に処方剤を放出する。本発明のリポソームは、有効量の処方剤を標的細胞に送達する。「有効量」という用語は、所望の治療上の結果、たとえば、子宮内膜症、再狭窄、虚血再灌流障害（ＩＲＩ）、心筋梗塞または関連症状の治療を実現するうえで有効な処方剤の量のことをいう。たとえば、障害が心筋のダメージに関連している場合には、活性化されたマクロファージおよび単球の数および／または活性が低減すれば、梗塞の領域が狭まり、および／または修復が改善される。有効量は、いくつもの要因、たとえば治療対象患者の体重および性別、処方剤の投与形態（すなわち、全身投与か、部位への直接投与か）、治療計画（たとえば、治療剤の投与の１日１回の投与、１日数回の投与、何日かおきの投与、単回投与などの別）、炎症の臨床指標、治療対象症状の悪化速度に影響する臨床要因、喫煙の有無、高コレステロール血症、炎症促進性状態、腎疾患、組成物の剤形などにも左右されるが、要因はこれらに限定されない。リポソーム処方剤が成功裏に送達されるか否かは、リポソーム処方剤の安定性と有効性に左右される。各リポソームに封入させる治療剤分子の数（ペイロード）、小胞の粒径、遊離非封入物質のレベルは、製品の治療指数を決定する重要な変数である。
【００４２】
Ｄ．用量および投与
リポソーム処方剤は、リポソームが効果的に適切または所望の作用部位まで輸送できれば任意の経路で投与することができる。好適な投与形態としては、（ラインでの投与に特に適した）静脈内（ＩＶ）投与および動脈内（ＩＡ）投与がある。他の適当な投与形態としては、筋肉内（ＩＭ）投与、皮下（ＳＣ）投与、および腹膜内（ＩＰ）投与を挙げることができる。こうした投与は、急速な注射または点滴によって行うことができる。別の投与形態としては、血管周囲への送達によるものを挙げることができる。処方剤は直接投与しても、希釈後に投与してもよい。本発明にしたがって、上記投与経路の任意のものを組み合わせて使用することも可能である。粒子が食細胞（循環する単球または腹膜マクロファージ）と接触するのであれば、任意の投与経路を用いることができる。
【００４３】
本発明にしたがって使用する製剤組成物は、活性成分の製剤への加工を容易にし、製剤上使用可能な、当業界で公知の賦形剤と助剤からなる生理学的に許容される担体１種以上を使用することによって処方することができる。
【００４４】
投与量および投与間隔は個別に調整して、血漿での処方剤のレベルを、生物学的効果を誘導したり抑制したりする上で十分なもの（最小有効濃度、ＭＥＣ）とすることができる。ＭＥＣは、個々の製剤によって変化するが、インビトロでのデータから決定できる。ＭＥＣを達成するのに必要な容量は、個々の特性と投与経路に応じてきまる。血漿濃度の測定には、各種の検出アッセイを使用することができる。
【００４５】
治療対象症状の程度や応答性に応じて、投与は、単回または複数回の投与とすることができ、治療期間も、数時間〜数週間、または治療完了までとすることができる。投与頻度も、症状や程度に応じて変化させることができる。一態様では、処方剤を定期的に投与することができる。用量は、所望の治療で必要とされる任意の量または体積に処方することができる。たとえば、１マイクログラムまたは１０マイクログラムの用量を、血管内処置、たとえばステント留置を受けている患者に投与して、その後のステント内の内径損失（ｉｎ−ｓｔｅｎｔ  ｌａｔｅ  ｌｏｓｓ）の発生や重症化を防止することができる。別の例では、用量を１００マイクログラム以上とすることもできる。この意味で、処方剤は、単回投与、複数回投与、および／または、たとえば所定期間の連続点滴連続投与のかたちで投与することができる。たとえば、容量は、上掲のＢａｎａｉ，  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  （２０１３）の記載内容にしたがって投与することができる。
【００４６】
Ｅ．リポソームの製造方法
本発明の別の観点は、製品の商業生産に適したリポソームおよびリポソーム処方剤の製造方法である。この製造方法では、以上で説明してきたような物理的特性を操作することができ、水：溶剤比、溶剤の組成と溶剤比、小胞調製温度、小胞調製剪断速度、押出し温度、押出し圧力、押出し膜粒径、膜の種類といった特定のプロセス変数を制御することもできる。
【００４７】
リポソーム処方剤の製造は、（１）治療剤とあらかじめ選択した脂質とを混合して小胞を形成する工程、（２）小胞を単一段階（ステージ）で単一サイズのフィルターを通して押出す工程、（３）限外濾過の工程を含むものである。ここで「単一段階でフィルターを用いて押出す工程」という表現が意味するのは、「押出し工程では、単一孔径の濾過工程」を用いるということである。つまり、単一サイズのフィルターを複数回通過させてもよいが、従来技術で公知であるような異なるサイズのフィルターを複数回および／または連続して通過させねばならないようなこと（たとえば、１．０、０．８、０．６、０．４、０．２マイクロメートルの膜の連続通過）はない。限外濾過の後、製品を標準化して所望の最終濃度とすることができる。工程（２）の押出しを低圧での単一段階での押出しによって行うので、本発明の方法を用いると、複数段階での高圧押出しと比べて、運転コストと時間が短縮され、収量が増大する。図１は、製造方法の各工程を例示したものである。
【００４８】
第一工程は、治療剤とあらかじめ選択した脂質成分とを溶液中で混合して小胞を形成する工程からなる。多くの場合、治療剤と脂質成分は、治療剤溶液と脂質成分溶液いうかたちに可溶化し、その後両溶液を混合する。この態様では、治療剤溶液は、ｐＨ、オスモル濃度、導電性をはじめとする特定の物理的特性を有する。治療剤溶液は、リポソーム処方剤の内部環境を形成している。したがって、治療剤溶液のｐＨ、導電性、オスモル濃度は、リポソーム処方剤の内部ｐＨ、導電性、オスモル濃度に影響を及ぼす。リポソームの内部オスモル濃度は好ましくは、３４０〜４４０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であり、一方、リポソームの外部オスモル濃度は、２７０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。溶液のｐＨは、治療剤溶液のｐＨが所望のｐＨ範囲となるようにする。したがって、酸性の治療剤、たとえばビスホスホネートを使用するときには、ｐＨが塩基性の溶液を用いて、溶液のｐＨが６．８〜７．０の範囲に保たれるようにする。たとえば、治療剤溶液は、アレンドロン酸ナトリウムをＮａＯＨ溶液に溶解した溶液から調製することができ、その結果得られたアレンドロネート溶液のｐＨは約６．８、導電性は約１８．０ｍｓ／ｃｍとなる。溶液は、必要に応じて、この過程の間に加熱してもよい。別の態様では、クロドロン酸ナトリウムまたはアレンドロネートの一水和物を使用することができる。溶液は、ビスホスホネートの塩基性溶剤中での可溶化が促進されるような５５〜７５℃の温度、たとえば７０℃に加熱することができる。溶解している治療剤と他の賦形剤の量に応じて、溶液は、３４０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有するものとすることができ、このオスモル濃度が内部オスモル濃度となる。また溶液は、治療剤と賦形剤の量に応じて、１４．０〜２１．０ｍｓ／ｃｍの範囲の導電性を有するものとすることができ、この導電性が内部導電性となる。内部ｐＨ、オスモル濃度、導電性は、リポソーム製剤の安定性と有効性に関わる要因である。一態様では、製造過程の工程（１）での治療剤溶液の濃度を２０〜１２０ｇ／Ｌとすることができる。治療剤溶液は、ここで議論した製造過程とは別に、および／または製造過程以前に調製することができる。
【００４９】
脂質成分は、１種以上の脂質溶剤中に脂質成分を所望の出発量含有する溶液の形態とすることができる。任意の適当な脂質成分と脂質溶剤を使用することができる。たとえば、脂質成分は、リポソーム形成前の時点で、モル比で３：１：２のＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールからなるものとすることができる。脂質をこの組み合わせとすることによって得られたリポソームも、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールのモル比が３：１：２となる可能性がある。さらに、脂質溶剤は、たとえば、ｖ／ｖ／ｖ比で７７／７７／６のｔ−ブタノール、エタノール、水からなるものとすることができる。本発明のリポソームの処方時に使用できる他の脂質溶剤としては、クロロホルムまたはメタノールがある。脂質成分は、脂質溶剤に溶解する。脂質溶剤は、５５〜７５℃の範囲の脂質成分の可溶化を促進するような温度、たとえば、７０℃まで加熱して、脂質溶液とすることができる。溶解した脂質溶液の濃度は、５０〜３５０ｇ／Ｌの範囲とすることができる。脂質溶液は、ここで議論した製造過程とは別に、および／または製造過程以前に調製することができる。
【００５０】
治療剤溶液と脂質溶液を混合することで、多層小胞（ＭＬＶ）が形成される。薬剤：脂質比は、脂質溶液または治療剤溶液の量を変えることによって制御できる。溶液同士の混合を促進する目的で、必要に応じて２種の溶液を穏やかに加熱してもよい。この過程によって、治療剤を多層小胞に効率的に封入することが可能になる。一例では、脂質溶液を治療剤溶液に、５．３部の脂質と１部の治療剤の割合で加えることができる。この脂質対薬剤（重量）比は、送達を有意に犠牲にすることなく、リポソーム処方剤の安定性を増大させる。実際、この過程での薬剤：脂質比は、重量で１：４〜１：８、好ましくは１：５〜１：６の範囲で変化させることができる。また、溶剤濃度は、リポソームの一体性を犠牲にすることなく、押出し工程の前に調整することができる。
【００５１】
処方剤の製造方法の次の工程は、小胞を単一サイズのフィルターを通して単一段階で押出す工程を含む。小胞を押出すと、上述の多層小胞の粒径が小さくなる。この方法では、単一の押出し工程と低圧を使用し、その結果、粒径と形状の均一性の高いリポソームが生成される。押出しの過程では、マイクロフルイダイザーまたは他の通常のホモジェナイザーを使用することができる。ホモジェナイザーは、剪断エネルギーを用いて、大型リポソームを小型リポソームへと分割する。本発明での使用に適したホモジェナイザーとしては、各種の製造業者、たとえば米国マサチューセッツ州ボストンのマイクロフルイディクス社によって製造されたマイクロフルイダイザーを挙げることができる。粒径分布は、通常のレーザービームによる粒径の弁別によって監視することができる。ポリカーボネート膜または非対称なセラミック膜を通したリポソームの濾過は、リポソームの粒径を、相対的によく画定された粒径分布へと限定するうえで効果的な方法である。押出し温度は、粒径を低減するうえでは、リポソームの転移相温度より高温とするのが好ましい。たとえば、ＤＳＰＧ、ＤＳＰＣ、コレステロールを用いる場合には、約５５℃とするのが望ましい。他の脂質を使用することもでき、押出し工程の所望の温度の指標としては、公知の転移相温度を用いることができる。所望の小胞粒径と均一さと均質性を実現するうえでは、複数回の通過が必要となる場合もある。この工程の間には、試料をリアルタイムで分析して、小胞の粒径と細菌カウントを評価することができる。
【００５２】
押出し工程は、単一段階低圧押出し法によって行う。押出しの過程では、（従来法で実施されてきたように）大型リポソームを孔径の大きな膜から小さな膜へと高圧の押出し機を用いて順次通過させる多段押出しによって小型の単層リポソームを形成するのではなく、ＭＬＶを低圧をかけつつ１種の膜を通して直接押出すことによって単一段階で加工を行う。一態様では、単一段階押出しの過程を、孔径０．１マイクロメートルのポリカーボネートまたはセラミック膜を用いて、６０〜９０ｐｓｉの低圧を加えつつ直接実施して、粒径が１００ｎｍのリポソームを得る。また、この過程では、高圧押出しでの高圧（５００ｐｓｉ）とは対照的な６０〜９０ｐｓｉという低圧を用いる。
【００５３】
多層膜が生成されぬように低圧で押出す本発明の方法には、いくつもの利点がある。まず、単一段階の押出しプロセスには、多段プロセスより短時間で押出しプロセスを行える。また、高圧押出しの必要性がなくなったことで、押出し用機器類にともなう高コストも避けられる。低圧押出し機は、有意に低価格である。本発明の適当な押出し機の一例としては、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ  から販売されているＬＩＰＥＸ（登録商標）  Ｅｘｔｒｕｄｅｒを挙げることができる。さらに、低圧押出機で使用する材料、たとえば圧縮空気も、高圧押出機で使用する材料、たとえば窒素より、一般に低価格である。さらに、多段押出しを単一段階の押出しに変更したことで、廃棄物も同様に低減し、収率も上昇した。
【００５４】
本発明の最後の工程は、押出された小胞の緩衝液への限外濾過からなる。押出しの過程で生成したリポソームは、粒径と形状が均一であるが、限外濾過では、処方剤に圧力をかけて膜を通過させ、封入されたリポソームを、封入されなかった治療剤、溶剤、脂質から分離する。この工程は、処方剤で使用する脂質の転移相温度より低い温度、たとえば通例では４５℃未満で実施するのが好ましい。限外濾過の過程では、各種の濾過膜を使用することができる。限外濾過の一態様では、中空繊維膜を使用し、圧力をかけて処方剤を繊維内側中空部分を通過させることにより、相対的に大型のリポソームが繊維内にとどまるのに対し、小型分子（すなわち溶剤、未封入ビスホスホネート、脂質）が繊維外側の膜を通して濾過されるようにする。この限外濾過によって、治療剤の９６％以上が封入されている処方剤が得られる。
【００５５】
限外濾過工程は、処方剤を特定量の緩衝液に対して透析する透析工程をさらに含んでもよい。緩衝液の一例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であるが、正と負のイオンをあるバランスで含む生理学的浸透圧に保たれた任意の緩衝液を使用することができる。他の緩衝液添加剤は当業界で公知であり、たとえば、スクロース、グリシン、コハク酸ナトリウム、および／またはアルブミンを含有してもよい。緩衝液は、溶液のｐＨと導電性を注意深く監視して、最終処方剤の外部環境を反映するものとするのが好ましい。緩衝液は、等張液で、細胞に対して毒性のないものであることが好ましい。緩衝液を濾過して、さらに混入物を減らすことも、製造プロセスの前に調製しておくこともできる。透析の最終点は、処方剤の所望のｐＨおよび導電性に到達した時点とする。
【００５６】
限外濾過工程の最後に、処方剤を必要に応じて滅菌のために、すなわち生物汚染を制御する目的で濾過してもよい。このプロセスの一態様では、滅菌フィルターをリポソーム処方剤の入った圧力容器に接続し、滅菌フィルターをさらに滅菌された受入れタンクに接続する。リポソーム処方剤に圧力をかけると、処方剤が滅菌フィルターを通過する。この工程では、さらに、別の試料を採取して、細菌の含量を調べることもできる。滅菌フィルターの孔径は、０．２〜０．４５マイクロメートルの範囲とすることができる。処方剤のリポソームは実質的に均一で、大型リポソームは含まれていないので、滅菌濾過は特段煩雑になることもなく実施できる。
【００５７】
製造後、処方剤を標準化することができる。最終的な標準化によって、標準濃度を有するリポソーム処方剤が得られる。標準化では、収率、粒径、脂質の組成、薬剤と遊離薬剤の含量、生成物の濃度について分析する。濃度の分析は、当業界で公知の方法、たとえばＨＰＬＣ、分光光度計を用いたホスフェートの分析によって実施することができる。限外濾過生成物の濃度を確認したら、特定量の緩衝液を使用して、処方剤を標準濃度まで希釈する。最終的な標準化は、リポソーム生成物の滅菌濾過も含む。たとえば、限外濾過後の封入ビスホスホネート処方剤は、適当量の緩衝液で希釈して、最終濃度とすることができる。同様に、限外濾過生成物を複数のバッチに分け、異なる量の緩衝液を希釈剤として各バッチで使用することによって、異なった最終濃度で使用することもできる。試料を取得して、その時点での処方剤の濃度を測定してもよい。
【００５８】
この製造方法には、リポソームの生理学・化学的特徴を制御・監視・再現できるという利点がある。たとえば、リポソームの内部ｐＨは、治療剤を溶解する溶液の組成によって制御できる。内部オスモル濃度も、治療剤の量を、たとえば、治療剤の帯電の有無に応じて変化させることによって、同様に操作できる。薬剤：脂質比は、リポソームを構成する脂質成分、すなわち溶解した活性治療剤に加える脂質の量を選択することによって管理することができる。脂質成分の量を増やすと、薬剤：脂質比が減り、逆も同様である。また、薬剤：脂質比が低いと、リポソーム処方剤の内部オスモル濃度が低減する。組成物の外部ｐＨと外部オスモル濃度は、部分的には、最終生成物を含む緩衝液の組成によって影響を受ける。導電性は、リポソームに封入する治療剤および他の賦形剤の性質によって制御することができる。他の要因、たとえば粘度、賦形剤の質、滅菌性、塩類溶液、輸液キット、シリンジとの適合性（注射用製剤の場合）、加工用機器との適合性も、本発明の方法によって、それぞれ独立に制御可能である。
【００５９】
上記記載にかんがみ、製造方法の一好適態様では、処方剤を、（１）治療剤を含む溶液と、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含む溶液とを混合して、前記の治療剤対脂質の質量比が約１：５〜１：８となるよう小胞を形成し、（２）この小胞を単一段階で孔径約１００ｎｍのフィルターを通して押出し、（３）限外濾過を行うことによって製造した。
【００６０】
本発明の別の観点は、上述の製造工程にしたがって製造したリポソーム処方剤であり、ここで、処方剤は、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロールをモル比約３：１：２で含み、治療剤対脂質成分の質量比は、約１：５〜１：８とすることができ、以下の工程：（１）治療剤を含む溶液と、脂質成分を含む溶液とを混合して小胞を形成し、（２）小胞を、単一ステージで、単一サイズのフィルターを通して押出し、（３）限外濾過することによって製造される。限外濾過の後、製品を標準化して所望の最終濃度とすることができる。この方法にしたがって製造した処方剤はのＰＤＩは、０．０７５未満、好ましくは０．０２〜０．０５の範囲である。この方法では、３：１：２の脂質成分比、１：５〜１：８の薬剤：脂質比をはじめとする上述のような新規で有用な特徴を有するリポソーム処方剤が生成される。さらに、ｐＨ、オスモル濃度、導電性、剛性をはじめとする個々のリポソーム特性は、上述したようにそれぞれ別々に制御することができる。
【００６１】
以下の実施例は、本発明を実施するうえでの各種の観点を具体的に例示しつつ説明するためのものであり、本発明を限定するようなものではない。以下の実施例では、本発明を実施例というかたちで図面を参照しつつ説明するのにとどまるということである。図面に関しても具体的に言及しておくと、図面に示した各部の詳細は、本発明の好適態様具体的なかたちで行う目的で示したのみであって、本発明の原理や概念的側面を説明するうえで、もっとも有用で理解しやすいと思われるものを具体的に示すということで提示した。説明については、本発明のいくつかの形態が実際にはどう具現化されうるのかを当業者に対して明らかにした図面と一緒に考慮されたい。
【００６２】
実施例１：リポソーム処方剤のバッチ製造
上述の方法にしたがい、試験バッチを調製した。バッチの粒径を、商業生産用に所望に応じて変化させることができるのはもちろんである。この実施例では、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧを含むリポソームにアレンドロネートを封入したリポソームを分散させたリン酸緩衝生理食塩水の１リットルのバッチを製造した。リポソーム封入アレンドロネートは、臨床上の利便性にかんがみ、５ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌの２種の濃度で滅菌した白濁リポソーム分散液として製造することができる。これらの濃度については、さらに適宜処方を行って、所望の量の治療剤を特定の量得ることができる。脂質成分は、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧから構成されるものとした。分散液は、ｐＨを制御し、点滴を適当なかたちで行い、等張性を保つために、リン酸緩衝液も含むものとした。最終生成物中の薬剤の９６％以上が、リポソーム内に封入されていた。投与にあたっては、バイアルの内容物（または必要に応じてその一部）を塩類溶液で希釈し、点滴によって投与した。
【００６３】
製造過程で使用した諸成分の量と品質を含めたバッチでの処方を、表１に示す。量は、バッチ１リットルあたりの量を示す。
【００６４】
【表１】
2018199705.tif 000005
【００６５】
表１の１リットルバッチで製造した静注用リポソーム封入アレンドロネートの含量と量的組成を下記の表２に示す。このバッチでは、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロールのモル比は３：１：２であった。薬剤：脂質比は、約１：５．７±１．５（ｗ：ｗ）であると計算された。
【００６６】
【表２】
2018199705.tif 000006
【００６７】
本明細書に記載した新規な製造方法で実際に製造した静注用リポソーム封入アレンドロネート処方剤について、下記の表３に示す。
【００６８】
【表３】
2018199705.tif 000007
【００６９】
図２は、有効性成分含量５ｍｇ／ｍｌ用の静注用リポソーム封入アレンドロネート１リットルの製造方法と、プロセス制御パラメータをまとめたフローチャートである。０．５ｍｇ／ｍｌの有効性成分含量の製造方法は、５ｍｇ／ｍｌの有効性成分含量に用いるのと同じである。最終標準化工程のみ、投与用に異なる最終処方剤濃度とする点で異なる。当業者であれば、過度の実験を行わなくても、この方法で他の用量も製造できることが理解できるはずである。
【００７０】
治療剤の溶液（アレンドロネート溶液）と脂質の溶液は、以下のようにして調製した。
【００７１】
アレンドロネート溶液ＮａＯＨ（６．８〜８．０ｇ）を秤量し、８５０ｍｌの注射用水（ＷＦＩ）に溶解した。目視にて、完全に溶解したことを確認した。アレンドロン酸ナトリウム（６８〜８０．７５ｇ）を、温度７０±３℃で、６００±１５０ＲＰＭにてかきまぜながらＮａＯＨ溶液に溶解した。目視にて、完全に溶解したことを確認した（すなわち透明な溶液）、導電性とｐＨ測定値を確認した（ｐＨ＝６．８±０．３、導電性＝１８．０±１ｍｓ／ｃｍ）。
【００７２】
脂質溶液    ３０ｇのＤＳＰＣ（３７．９ｍｍｏｌｅｓ）、１０ｇのＤＳＰＧ（１２．５ｍｍｏｌｅｓ）、１０ｇのコレステロール（２５．８ｍｍｏｌｅｓ）（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ；３／１／２ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）からなる脂質を秤量し、加熱した磁気スターラーを使用し、２５０ｍｌのビーカーに入った温度７０±３℃の１６０ｍｌのｔ−ブタノール／ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（７７／７７／６、ｖ／ｖ／ｖ）に溶解したところ、濃度３１２ｍｇ／ｍｌの脂質溶液が形成された。温度が範囲内になったところで、透明黄色溶液が形成された。
【００７３】
ＭＬＶの形成
６００＋１５０ＲＰＭで混合し、温度を７０±３℃に保ちつつ、脂質溶液をアレンドロネート溶液に加えた（１部の薬剤：５．３部の脂質）。５分以上経過後に、１００ｍｌの注射用水（全容量の１０％）を加え、押出し前に溶剤濃度を下げた。処方剤をさらに１０分間混合した。
【００７４】
押出し
処方剤を、０．１４マイクロメートルのセラミック膜１枚またはポリカーボネート膜２枚（たとえば、０．２マイクロメートルのプレフィルターと０．１マイクロメートルの膜）を装着した１．２Ｌの加熱ステンレス鋼押出機を用いて押出し、圧力９０±１５ｐｓｉ、温度６８±５℃にて、小胞の粒径を低減させ、小胞の均質性を高めた。この過程では、小胞を８０〜１００ｎｍとするのに、１２〜１８回の通過が必要であった。押出し物は、その場で試料を採取し、小胞の粒径を確認してから限外濾過に供した。リポソーム処方剤の粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ  ＺＳ分析装置（合格限界：９５±２０ｎｍ）を使用して分析を行った。押出し試料は、好気性細菌数（生物汚染の管理）についてもカウントした。合格限界は、１００ＣＦＵ／ｍｌ未満とした。
【００７５】
限外濾過とダイアフィルトレーション
まず、限外濾過を行う前に、処方剤を４５℃未満まで放冷した。限外濾過は、５００Ｋの中空糸膜を備えたＡｍｅｒｓｈａｍのＱｕｉｘＳｔａｎｄシステムを使用して実施した。処方剤は、入り口圧力が２５ｐｓｉ以下となるようにして濃縮した。最小容量に達したところで、処方剤を、初期量の１０倍（約７Ｌ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に対して透析した。ＰＢＳ溶液は、１４５ｍＭのＮａＣｌ、１３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４を１０Ｌの注射用水に溶解することによって調製した。ＰＢＳのｐＨは約６．９、導電性は約１６．９ｍｓ／ｃｍとした。ＰＢＳを、０．２マイクロメートルのフィルターで濾過した。透析済み処方剤のｐＨと導電性を測定することによって、ダイアフィルトレーションの終点を判断した。初期容量の１２０％（約１．２リットル）を超えない処方剤を、限外濾過システムから排出した。一般的な分析と、好気性細菌数（生物汚染の管理）のために試料を採取した。合格限界は、１，０００ＣＦＵ／ｍｌ未満とした。
【００７６】
透析を終えたところで、生物汚染について管理された状態を維持するべく、処方剤を、０．２マイクロのフィルターで濾過した。処方剤の入った圧力容器を、滅菌０．２マイクロメートルフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ）に接続した。フィルターは、前もって滅菌受け入れ側タンクに接続しておいた。濾過は、圧力容器に５〜３０ｐｓｉの圧力を加えることによって実施した。一般的な分析と、好気性細菌数（生物汚染の管理）のために試料を採取した。合格限界は、１，０００ＣＦＵ／ｍｌ未満とした。
【００７７】
最終標準化
処方剤の粒径、リポソーム注の脂質／治療剤の組成、薬剤と遊離治療剤の含量を、ＨＰＬＣによって分析した。本実施例での予想収率は、処方剤１リットルが、約６ｍｇ／ｍｌのリポソーム封入アレンドロネートと、３５ｍｇ／ｍｌの脂質を含むというものであった。アレンドロネートの濃度についての結果に基づいて、約１リットルの最終処方剤の濃度を５ｍｇ／ｍｌまたは０．５ｍｇ／ｍｌとするのに必要な希釈について計算した。５ｍｇ／ｍｌの処方剤を調製するために、限外濾過後、約９００ｍｌのリポソーム封入アレンドロネートを、上述したようにして調製したＰＢＳ約１００ｍｌで希釈した。また、０．５ｍｇ／ｍｌの処方剤を調製するために、限外濾過後、約１００ｍｌのリポソーム封入アレンドロネートを、約９００ｍｌのＰＢＳで希釈して、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとした。試料を採取して、アレンドロネートの実際の濃度を測定した。
【００７８】
標準濃度の処方剤を調製後、処方剤の入った瓶を、クラス１００の部屋または滅菌バイオロジカルフード内に連続して載置した０．２マイクロメートル滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ）２枚と接続した。フィルターは、あらかじめ、滅菌済みの使い捨て受け入れバッグまたは瓶に接続した。蠕動性ポンプまたは加圧窒素を用いて濾過を行った。圧力は、１０ｐｓｉを超えてはならない。濾過終了時点で、フィルターの一体性について、試験を行った。
【００７９】
上記実施例で製造した静注用リポソーム封入アレンドロネートは、いくつもの所望の特性、たとえば、（ｉ）少なくともアレンドロネートと脂質について５℃（２〜８℃の範囲）での３年間の保存性、（ｉｉ）平均小胞径８０±５（粒状物質なし）、（ｉｉｉ）５ｍｇ／ｍｌ以下（０．１〜５．０ｍｇ／ｍｌ）の範囲のナトリウムアレンドロネート濃度、（ｉｖ）９６％以上のアレンドロネート封入率、（ｖ）３／１／２（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）のジアステアロイルホスファチジルコリン／ジアステアロイルホスファチジルグリセロール／コレステロール（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ）脂質組成、（ｖｉ）２７０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの生理オスモル濃度、（ｖｉｉ）水に似た粘度、すなわち２０℃で１．０ｍＰａ．ｓの動粘度、（ｖｉｉｉ）ｐＨ６．８（６．８〜７．０の範囲）、（ｉｘ）グローバルに許容される米国または欧州薬局方準拠の賦形剤の質、（ｘ）米国薬局方の指針（ＵＳＰ  ２４−ＮＦ  １９）に合致した滅菌状態および発熱物質、（ｘｉ）塩類溶液、輸液キット、注射器との適合性（使用）、（ｘｉｉ）フィルター、ステンレス鋼およびガラス製チューブ類との適合性（方法）を有していた。
【００８０】
図３は、上記実施例で製造したリポソームのアレンドロネートのＴＥＭＳ画像である。リポソーム群について良い均質性と均一性が観察され、画像中のリポソームの粒径は、４０〜１２０ｎｍの範囲であった。
【００８１】
実施例２  リポソームの剛性についての試験
大型単層リポソーム（径約１００ｎｍ）の試料４種を、剛性について調べた。すなわち、本発明にしたがって製造した中空リポソームのＰＢＳ懸濁液をＬＰＯを称し、本発明にしたがって製造した５．０ｍｇ／ｍｌのアレンドロネートを含むリポソーム処方剤をＬＳＡと称した。ＨＥＰＥＳに溶解した２種の他のリポソームの試料（ＫＳおよびＨＵ）は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒａｓｈ，  Ｈｉｌａ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  ｔｈｅｒａｐｙ：    Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，  Cｅｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Cｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Cｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Cｅｌｌ  ｄｅａｔｈ”，  Ｊ．  Cｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４６  （２０１０）  １８２−１９５に記載された従来技術の方法にしたがって製造した。
【００８２】
各試料は、リポソームの比容積圧縮率について調べた。超音波速度測定を用いて、リポソームの弾性特性を以下の関係式に基づいて評価した。
【００８３】
【数１】
2018199705.tif 000008
【００８４】
式中のβＳ、ρ、ｕは、それぞれ、懸濁液の断熱圧縮率、密度、音速である。Ｈｉａｎｉｋ  Ｔ．，  Ｈａｂｕｒｃａｋ  Ｍ．，  Ｌｏｈｎｅｒ  Ｋ．，  Ｐｒｅｎｎｅｒ  Ｅ．，  Ｐａｌｔａｕｆ  Ｆ．，  Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ  Ａ．  （１９９８）：Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ  Cｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Cｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，  Cｏｌｌ．  Ｓｕｒｆ．  Ａ  １３９，  １８９−１９７；  Ｈｉａｎｉｋ  Ｔ．，  Ｒｙｂａｒ  Ｐ．，  Ｋｒｉｖａｎｅｋ  Ｒ．  Ｐｅｔｒｉｋｏｖａ  Ｍ．，  Ｍｉｌｅｎａ  Ｒｏｕｄｎａ  Ｍ．  Ｈａｎｓ−Ｊｕｒｇｅｎ  Ａｐｅｌｌ，  ＨＪ．  （２０１１）：  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  Cｏｍｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３０，  １４５−１５３。したがって、音速と密度の変化を測定することによって、圧縮率の変化も決定することができる。
【００８５】
超音速は、約７．２ＭＨｚの周波数で運転されるほぼ同一の音波キャビティ共鳴体２つからなる固定路示差速度計を用いて測定した（Ｓａｒｖａｚｙａｎ  Ａ．Ｐ．  （１９９１）：  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｖｅｌｏｃｉｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Cｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Cｈｅｍ．  ２０，  ３２１−３４２；  Ｓａｒｖａｚｙａｎ  Ａ．Ｐ．，  Cｈａｌｉｋｉａｎ  Ｔ．Ｖ．  （１９９１）：  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅｓ，  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ２９，  １１９−１２４）。セルの共振周波数は、コンピュータ制御のネットワーク分析装置（ＵＳＡＴ、ＵＳＡ）を用いて測定した（ＵＳＡＴ、ＵＳＡ）。試料の容積は０．７ｍｌとした。共鳴体のセルは、磁気スターラーを備えるものとし、測定の間に試料が均質に分散するようにした。１つの共鳴体が、リポソーム溶液をリン脂質に対して濃度１０ｍｇ／ｍｌで含有し、他の１つが、対照として、小胞を含まない同じ緩衝液（ＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ）で充填されるようにした。一連の測定の開始時には、まず、双方の共鳴体の共振周波数を、同一の参照用液体を用いて双方のセルを測定することによって比較した。音波シグナルのエネルギー密度は、全体を通して小さかったので（超音波の圧力振幅は１０３Ｐａ未満）、音波が小胞の構造的特性に及ぼす影響はどれも防止された。一般に、以下の数式に示すように、超音波速度測定を行うことで、音速［ｕ］、またはむしろ音速［ｕ］の濃度依存的増分が測定可能である。（Ｓａｒｖａｚｙａｎ  Ａ．Ｐ．  （１９８２）：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄｓ，  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ２０，  １５１−１５４）。
【００８６】
【数２】
2018199705.tif 000009
【００８７】
ここでｃは溶質の濃度（ｍｇ／ｍｌ）、下付きの「０」は溶剤（緩衝液）に関するものである。値［ｕ］は、双方の共鳴体の共振周波数ｆおよびｆ０（ｆは、試料の共振周波数、ｆ０は参照緩衝液の共振周波数）の変化：
【００８８】
【数３】
2018199705.tif 000010
【００８９】
（この係数は、γ＜＜１の条件を満たすものであり、計算では無視することができる）
から直接決定することができる。
【００９０】
小胞溶液の密度（ρ）は、振動管原理（Ｋｒａｔｋｙ  Ｏ．，  Ｌｅｏｐｏｌｄ  Ｈ．，  Ｓｔａｂｉｎｇｅｒ  Ｈ．  （１９７３）：  Ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  Ｉｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｅｄ．  Ｅ．  Ｇｒｅｌｌ），  ｖｏｌ．  ２７，  ｐｐ．  ９８−１１０，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ）にしたがって運転される高精度濃度計システム（ＤＭＡ６０、ＤＭＡ６０２Ｍの試料室２つ、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＫＧ，  Ｇｒａｚ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して測定した。みかけの比部分容積（φＶ）を、密度のデータから、下記の数式を用いて計算した。
【００９１】
【数４】
2018199705.tif 000011
【００９２】
ここで、下付きの０は、参照溶剤のことを指し、［ρ］＝（ρ−ρ０）／（ρ０ｃ）は、密度の濃度増分である。細胞の温度は、Ｌａｕｄａ  ＲＫ  ８  CＳ  ｕｌｔｒａ−ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ（Ｌａｕｄａ、ドイツ）を用いて、±０．０２℃の範囲で制御した。
【００９３】
音波速度濃度の増分に加えて比容積を決定することによって、下記の数式にもとづいて、小胞の低減したみかけの比圧縮率のφＫ／β０の予測を行うことが可能になった。
【００９４】
【数５】
2018199705.tif 000012
【００９５】
式中のβ０は圧縮率の係数、ρ０は緩衝液の密度である（Ｓａｒｖａｚｙａｎ  １９９１）。φＫ／β０の値は、リポソームの緩衝液に対する容積圧縮率を示す。φＫ／β０の値が高い方が、リポソームの圧縮率が高い（すなわち、剛性が低い）。
【００９６】
すなわち、リポソームの比容積圧縮率を決定するために、超音波速度の濃度増分［ｕ］と密度ρを測定し、次に、比容積φＶと見かけの比圧縮率φＫ／β０を数式（４，５）によって決定したのである。
【００９７】
図４からは、本発明のリポソームが、他のリポソーム処方剤や中空リポソームと比べて実質的に剛固であることがわかる。図４に示すように、ＬＳＡリポソームの比圧縮率（剛性と反比例）は、通常の従来技術の処方で製造した中空リポソームの比圧縮率より有意に低い。中空リポソームの比圧縮率が約０．９０であるのに対し、ＬＳＡリポソームの圧縮率は約０．７０である。ＫＳおよびＨＵリポソームの比圧縮率は、０．７５にて、有意に異なる。この実施例からは、機械的特性が、処方や、リポソーム内部の薬剤の有無によって左右されることがわかる。
【００９８】
実施例３：リポソームの安定性の分析
実施例１にしたがって製造したリポソーム処方剤の安定性を表４および表５に示す。表４に示されているように、本発明のリポソームは、４℃での貯蔵時には少なくとも３６ヶ月安定であり、処方剤は、必要とされる仕様のすべてを満たしている。
【００９９】
【表４】
2018199705.tif 000013
【０１００】
表５に示されているように、本発明のリポソームは、２５℃での貯蔵時には、少なくとも７ヶ月までは安定であり、処方剤は、必要とされる仕様のすべてを満たしている。
【０１０１】
【表５】
2018199705.tif 000014
【０１０２】
実施例４：リポソームの均一性についての分析
リポソーム製剤の均一性を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ  ｚｓ粒径測定装置を用いて測定した。この方法では、リポソーム処方剤小胞の粒径の均一性を動的光散乱（ＤＬＳ）で測定し、液状媒体に懸濁させた粒子の粒径分布を調べる。この技術は、１０〜１０００ｎｍの範囲の粒径分布を測定することができ、リポソーム乳液、ナノ粒子、合成ポリマーのような粒子群に有用である。この技術は、均質なリポソーム製剤の平均径ならびに処方の異質性についての指標を得るべく用いることができる。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ−ｚｓ粒径測定装置での測定結果を操作指示書にしたがって標準化した後、０．５ｍｇ／ｍｌのリポソームの試料を、まず、ＰＢＳで１／３希釈した。希釈溶液のＵＶ  λｍａｘ  ６００ｎｍを、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ２１００ｐｒｏ  ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で確認した。リポソームの試料を、光学濃度（Ｏ．Ｄ．）の値が０．１０±０．０２となるまで再度希釈した。再度、第二の希釈溶液のＵＶ  λｍａｘ  ６００ｎｍが光学濃度の値で０．１０±０．０２であることを確認した。次に１．０〜１．５ｍｌの希釈試料を、培養チューブに入れ、小胞の粒径を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ−ｚｓ粒径測定装置を用いて測定した。分析は、周囲温度（２３℃±２℃）で、固定角１７３°にてレーザー波長６３３ｎｍで実施する。データは、１５０〜５００Ｋｃｐｓ（キロカウント／秒）となるまで蓄積した。
【０１０３】
表６は、本発明に従って製造した処方剤についての測定結果を示す。リポソームの平均粒径は８０．４１ｎｍで、ＰＤＩは０．０４であった。
【０１０４】
【表６】
2018199705.tif 000015
【０１０５】
ＨＵリポソームと上記実施例２の従来技術のリポソームの均一性を、上述の手順にしたがって分析した。ＨＵリポソームのＺ平均粒径は１７６．５ｎｍであった。
【０１０６】
図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、本発明にしたがって製造したリポソームとＨＵリポソームの粒径分布を示す。図５Ａからは、本発明のリポソーム処方剤の平均径が約８８ｎｍであり、粒径が６９〜１０７ｎｍの狭い範囲に含まれることがわかる。それに対し、図５Ｂからは、ＨＵリポソーム処方剤の平均径が約２０１ｎｍであり、リポソームの径が８０ｎｍという小径から５００ｎｍという大径にまで広がっていることがわかる。図５Ａの処方剤のＰＤＩは０．０２５であった。図５ＢのＨＵ処方剤のＰＤＩは、０．１１８であった。
【０１０７】
本発明が関わる技術の現状をさらに十分に記載するうえで、本明細書で引用したすべての公表済み記事、書籍、参考マニュアル、要旨の内容は、ここに言及することをもって、そのすべてを本明細書に組み込むものとする。
【０１０８】
上述した主題については、本発明の範囲や精神から逸脱することなく各種の変更を加えることができるため、以上の記載に包含、ならびに請求の範囲で規定されたすべての主題は、本発明を説明、例示するものと解釈されたい。本発明には、上記教示内容に照らして、多くの改変や変更を加えることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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