(57)【要約】      （修正有）【課題】線維症および／または炎症状態に関与する、たとえば転写後レベルで、２つ以上の遺伝子の発現を選択的に調整する、１つ以上の活性作用物質を含む組成物を提供すること。【解決手段】線維性疾患ならびに炎症疾患および癌を含む、他の疾患を処置するためにそのような組成物を使用するための方法もまた、提供される。一局面において、個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法が提供され、この方法は、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する１つ以上の核酸を含む、有効量の医薬組成物を上記個体に投与するステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この特許出願は、２０１２年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／６４８，０７６号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、２つ以上の標的遺伝子の発現を調整することによって線維症および炎症性組成物を処置するための組成物および方法の分野に一般に関する。
【背景技術】
【０００３】
線維症は、器官または組織の正常な構成要素としての線維組織の形成とは対照的な、病的な状況における、修復および反応性のプロセスにおける器官または組織における過剰な線維性結合組織の形成である。線維症は、持続感染、自己免疫反応、アレルギー応答、化学的傷害、放射線、および組織損傷を含む様々な刺激によって誘発される慢性炎症性反応の結果となり得る。瘢痕は、下にある器官または組織の構成を壊滅させる集密的な線維症である。様々な器官が、肺線維症（肺）；特発性肺線維症（原因は未知である）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ遺伝子［嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子］の遺伝子突然変異によって引き起こされる）；肝硬変（肝臓）；心内膜心筋線維症（心臓）；進行性腎疾患、縦隔線維症（縦隔の軟部組織）；骨髄線維症（骨髄）、後腹膜線維症（後腹膜の軟部組織）；進行性塊状線維症（肺）；炭鉱従事者肺病の合併症；腎性全身性線維症（皮膚）、クローン病（腸）；ケロイド（皮膚）；陳旧性心筋梗塞（心臓）；強皮症／全身性硬化症（皮膚、肺）；関節線維症（ａｒｔｈｒｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）（膝、肩、他の関節）；およびいくつかの形態の癒着性関節包炎（肩）を含む線維性疾患によって冒され得る。
【０００４】
独特な臨床症状を有するにもかかわらず、ほとんどの慢性線維性障害は、共通して、成長因子、タンパク質分解酵素、血管新生因子、および線維形成サイトカインの産生を持続させる持続性の刺激原を有し、これらは、正常組織構成を進行的にリモデルし、破壊する結合組織エレメントの沈着を刺激する［１〜３］。特発性肺線維症、肝硬変、心血管系線維症、全身性硬化症、強皮症、および腎炎などのようないくつかの疾患において、広範囲な組織リモデリングおよび線維症は、最終的に、器官不全および死に至り得る。
【０００５】
特発性肺線維症、強皮症、および肝線維症／肝硬変は、深刻な臨床上の問題および未だ対処されていない医学的必要性を提示する重篤な線維症関連疾患であり、今日まで承認されたまたは有効な薬剤はない。
【０００６】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）：ＩＰＦは、肺内壁を厚くする肺の瘢痕によって特徴付けられる進行性で、一般に致命的な疾患であり、肺の構造および機能の不可逆的な損失を引き起こす。ＩＰＦは、世界中で５００万人の人々および米国で１３０，０００〜２００，０００人の人々を冒しており、毎年、約４８，０００の新しい症例が診断され、４０，０００人が死んでおり、医療費は、１００，０００人の患者当たり２８億ドルと推定される［２、３］。生存期間中央値は診断後、２〜４年であり、５年の生存は、２０〜４０％である［４、５］。現在、原因は知られておらず、ＦＤＡに承認された処置はなく、ＩＰＦのための治療法はない［６］。ＩＰＦ患者は、コルチコステロイドおよび細胞傷害性剤を含む抗炎症薬により、それらが長期的な患者の生存に対して効果を有するという証拠がないという事実にもかかわらず、典型的に処置される。
【０００７】
ＩＦＮガンマ、エタネルセプト、ボセンタン、およびピルフェニドン、ＱＡＸ５７６（ＩＬ−１３遮断薬）、ＦＧ−３０１９（ＣＴＧＦ抗体）、ＣＮＴＯ−８８８（ＣＣＬ２抗体）、ＧＣ−１００８（ＴＧＦベータ抗体）、ロサルタン、ならびにサリドマイドを含むＩＰＦのための現在調査中の薬剤は、ＩＰＦの病態における標的に対して向けられるが、過多のシグナル伝達経路がＩＰＦに関与するために、単剤療法としてのそれらの臨床上の効能についての問題が、残っている［６］。
【０００８】
全身性強皮症（ＳＳ）：ＳＳは、皮膚、血管、筋肉、および内臓における変化を伴う自己免疫障害および結合組織疾患である。米国において３００，０００人が強皮症を有することが推定され、その３分の１がＳＳを有する［７］。局所性疾患は、皮膚組織のみを冒すが、ＳＳは、皮膚および下にある組織、血管、ならびに心臓、肺、または腎臓を含む主な器官を冒す。びまん性皮膚疾患において、５年の生存は、７０％であり、１０年の生存は、５５％である［８］。現在、強皮症のための治療法および特別の処置はない。ＳＳ処置は、コルチコステロイド、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、およびミコフェノール酸を含む免疫抑制薬および抗炎症薬を含む［９、１０］。
【０００９】
肝硬変（ＬＣ）：肝臓線維形成は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過度の蓄積によって特徴付けられ、肝硬変ならびに門脈圧亢進症、肝不全、および肝細胞がんを含む合併症に至る［１１］。ＬＣは、毎年、世界中で８００，０００人の死の原因となる［１２］。米国において、ＬＣは、毎年、２７，０００人の死の原因となる［１３］。定着した肝硬変は、３４〜６６％の１０年の死亡率を有する［１４］。肝硬変の一般的な原因は、アルコール消費、Ｂ、Ｃ、およびＤ型慢性肝炎、肥満、毒素、胆道疾患、ならびに自己免疫性肝炎を含む［１５］。現在、ＬＣのために利用可能な処置はなく、また、この疾患を管理するための医療費は高い。
【００１０】
組織線維症は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過度の沈着の結果としての、様々な組織の過成長、硬化、および／または瘢痕によって定義される。線維症の重要な細胞性メディエーターは、筋線維芽細胞であり、これは、活性化された場合、コラーゲンなどのような過度の量のＥＣＭ構成成分を産生する（Ｃｌａｍａｎ、１９９１）。筋線維芽細胞は、常在性の間葉細胞、上皮／内皮−間葉（ＥＭＴ／ＥｎｄＭＴ）転換と称されるプロセスにおける上皮および内皮細胞を含む様々な供給源からならびに骨髄幹細胞に由来する線維細胞と呼ばれる、循環する線維芽細胞様細胞から生成される。筋線維芽細胞は、リンパ球およびマクロファージに由来するパラクリンシグナル、筋線維芽細胞によって分泌されるオートクリン因子、ならびに線維芽細胞上のパターン認識受容体（つまりＴＬＲ）によって認識される病原生物によって産生される病原体関連分子パターンを含む、様々なメカニズムによって活性化される。
【００１１】
ＥＣＭは、３つの主な構成成分：構造タンパク質およびプロテオグリカン、非構造マトリックス細胞タンパク質、ならびに成長因子／炎症性サイトカインを含有する（Ｂｒｅｋｋｅｎ、２００１）。コラーゲンなどのような構造タンパク質は、線維性組織において最も顕著に増加するが、マトリックス細胞タンパク質および成長因子は、ＥＣＭにおけるホメオスタシスの維持において主なプレーヤーであると考えられる。多数の研究は、ＥＣＭ生合成ならびに沈着が、マトリックス細胞タンパク質および成長因子によってならびに細胞骨格ネットワークの再編成が伴う、細胞−ＥＣＭ相互作用における変化によって調節されることを示した（Ｖａｒｅｄｉ、１９９７）。
【００１２】
線維性疾患の進行は、３つのＥＣＭ構成成分すべての複雑な相互影響を伴う。成長因子、サイトカイン、およびケモカインは、リンパ球、マクロファージ、および筋線維芽細胞の増殖および活性化を刺激する。活性化された筋線維芽細胞および他の細胞は、マトリックス細胞タンパク質および他の非構造タンパク質ならびにコラーゲン、フィブロネクチン、およびビトロネクチンなどのような構造タンパク質を含む、高レベルの様々なＥＣＭタンパク質を発現する。サイトカイン（ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−ベータ１）、ケモカイン（ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ）、血管新生因子（ＶＥＧＦ）、成長因子（ＰＤＧＦ、ＣＴＧＦ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、急性期タンパク質（ＳＡＰ）、カスパーゼ、およびレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系（ＡＮＧ  ＩＩ）の構成成分は、線維症の重要な制御因子として同定された（Ｗｙｎｎ、２００８）。
【００１３】
マトリックス細胞および他の非構造タンパク質は、ＥＣＭの組織化およびリモデリングにおいて重要な役割を果たす。ＳＰＡＲＣ、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＴＧＦ−ベータ１、ＣＴＧＦ、およびＴＩＭＰを含むいくつかのそのようなタンパク質は、線維症の病気の発生に密接に関連する。
【００１４】
線維性疾患におけるＥＣＭタンパク質の発現および沈着は、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチンなどのような細胞表面受容体、シグナル伝達分子、および転写因子の込み入ったカスケードによって調節される。
【００１５】
ＲＮＡｉは、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの進化的に保存されたプロセスである。ＲＮＡｉは、沈黙させられる遺伝子に対して配列が相同なｄｓＲＮＡによって開始される。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、独立した非コード転写物中にまたはタンパク質コード遺伝子のイントロン中に位置する、約２２ヌクレオチドの内因性の、小さな非コードＲＮＡ分子のクラスであり、ｍＲＮＡの翻訳および安定性を転写後にコントロールする。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列が一致するｍＲＮＡの酵素的分解の開始を通して遺伝子発現を阻害するように作用する、およそ２１〜２５塩基対（ｂｐ）長の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、これは、アンチセンス鎖（ガイド鎖）を選択的に保持し、相補的な対応するｍＲＮＡ鎖を分解することによって遺伝子発現を沈黙させる。
【００１６】
ＲＮＡｉによる標的遺伝子ダウンレギュレーションが、多くの疾患状態のための可能性のある治療戦略として提唱されているが、ＲＮＡｉ治療薬の安全で有効な送達は、課題のままである。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの物理化学的な特徴（つまり大きな分子量およびアニオン電荷）は、ほとんどの細胞型の形質膜を横切る受動拡散を妨げ、ｓｉＲＮＡは、生理学的状態において分解される傾向がある。そのため、生体適合性で、無毒で、非免疫原性のキャリアは、標的部位に、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを送達するために必要とされ、これは、その臨床上の可能性を劇的に改善するであろう。現在のｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ送達方法は、ウイルストランスフェクションまたはリポソーム、デンドリマー、線状高分子、ポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ミセル、ペプチド、ナノ粒子、およびエレクトロトランスファー（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）による局所的な送達を含む非ウイルス技術を含む。
【００１７】
特許出願および刊行物を含む、本明細書において引用される参考文献はすべて、参照によってそれらの全体が組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｗｙｎｎ  ＴＡ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．（２００８  Ｊａｎ）；２１４（２）：１９９〜２１０
【非特許文献２】Ｒａｇｈｕ  Ｇ，  Ｗｅｙｃｋｅｒ  Ｄ，  Ｅｄｅｌｓｂｅｒｇ  Ｊ，  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＷＺ，  Ｏｓｔｅｒ  Ｇ．  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（２００６  Ｏｃｔ）１；１７４（７）：８１０〜６
【非特許文献３】Ｂｕｃｋ  Ｍ，  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．  Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ−Ｔｈｒ２１７  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．（２０１１）；６（１０）：ｅ２５４９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、線維症および／または炎症状態に関与する、たとえば転写後レベルで、２つ以上の遺伝子の発現を選択的に調整する、１つ以上の（２つ以上のなど）活性作用物質を含む組成物を提供する。線維性疾患ならびに炎症疾患および癌を含む、他の疾患を処置するためにそのような組成物を使用するための方法もまた、提供される。
【００２０】
本発明は、いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）など）、およびプラスミドＤＮＡを含むが、これらに限定されない、１つ以上の核酸（オリゴヌクレオチドなど）を使用して、線維症の発症および進行に関与する２つ以上の遺伝子を標的にすることによって、哺乳動物における慢性炎症を伴う線維症および他の疾患を予防するまたは処置するための医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明はまた、肺線維症、特発性肺線維症、肺の進行性塊状線維症、嚢胞性線維症、縦隔線維症、肝線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、心線維症（ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、陳旧性心筋梗塞、進行性腎疾患、腎線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、強皮症／全身性硬化症、関節線維症（ａｒｔｈｒｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、癒着性関節包炎、線維筋痛症、腹膜線維症、放射線誘発性線維症、熱傷誘発性線維症、外傷誘発性線維症、瘢痕線維症（ｓｃａｒｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、および創傷治癒線維症を含むが、これらに限定されない、線維症または炎症状態もしくは疾患を処置するための医薬組成物をも提供する。
【００２２】
本発明の組成物はまた、熱傷などのような外傷性の損傷から生じる創傷治癒または慢性の傷の治癒ならびに瘢痕および線維症の低下に有用である。
【００２３】
本発明はまた、その場所とは無関係な扁平上皮がん、胆膵路（ｂｉｌｉｏ−ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）がん、中皮腫、類腱線維腫、線維形成性円形細胞腫瘍（ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｉｃ  ｒｏｕｎｄ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ）、乳癌、卵巣癌、結腸直腸がんおよび胃腸管の腫瘍、肺癌、リンパ腫、骨髄線維症、白血病、黒色腫、脳腫瘍（膠芽腫、大脳星状細胞腫、神経芽細胞腫、および髄芽腫を含む）、膀胱癌、肝細胞腫瘍および尿路上皮腫瘍、ならびに下垂体の腫瘍を含むが、これらに限定されない、線維形成性の癌または線維性構成成分を有する癌を処置するための医薬組成物をも提供する。
【００２４】
本発明は、ＣＴＧＦ、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１を含むが、これらに限定されない、線維症の発症および進行に関与する２つ以上の遺伝子の活性または発現を阻害するまたは調整する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、またはプラスミドＤＮＡを含む、複数の（２つ以上の）一本鎖または二本鎖核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。
【００２５】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、プラスミドＤＮＡなどを含む複数の（２つ以上の）一本鎖または二本鎖核酸が、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルに共有結合でコンジュゲートされる、それと非共有結合で会合している、またはそれと共に製剤される、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、哺乳動物およびヒトの使用に適している。
【００２６】
本発明は、全身的または局所的な投与によって、線維症および他の炎症状態または疾患を処置するために、１回または複数回、有効量の医薬組成物をヒトおよび他の哺乳動物に投与するための方法および処置の方法を提供する。投与ルートは、経口、静脈内、動脈内、心臓内、内カテーテル、腹腔内、膀胱内、経皮、経鼻吸入、肺送達、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、頭蓋内、髄腔内、皮下、皮内、筋肉内、眼内、局所、直腸、膣、直接的な注射／投与、およびエレクトロトランスファーまたはマイクロニードル注射による局所的な送達を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、プラスミドＤＮＡなどを含む一本鎖または二本鎖核酸が、ペプチドベースのナノ粒子中にカプセル化されるまたは静脈内全身投与を介して投与される。
【００２８】
本発明の組成物は、粉末形態、液体形態、錠剤、またはカプセル形態で、ゲル、クリーム、外用薬、噴霧剤の形態で調製されてもよく、傷包帯剤または溶解ストリップ中に埋め込まれてもよく、上記に記載される方法による投与に適している。
【００２９】
送達に使用されるデバイスは、針、マイクロニードル、対流強化送達デバイス（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ）、カテーテル、膀胱内尿カテーテル、エアロゾル、吸入器、鼻内噴霧剤、膣坐薬、坐剤、使い捨てのデバイスまたは繰り返し使用するデバイス、クリーム、外用薬、パッチなどによる送達を含むことができる。
【００３０】
本発明は、ダウンレギュレーションまたは調整のための、２つ以上の遺伝子標的または対応する発現タンパク質の有効な組み合わせを選択するための方法を含む。これらの遺伝子標的は、ＥＣＭ構成成分（構造タンパク質およびプロテオグリカン、非構造マトリックス細胞タンパク質、ならびに成長因子／炎症性サイトカイン）ならびに線維芽細胞の細胞性構成成分（成長因子／炎症性サイトカインについての受容体、キナーゼ、酵素、およびアダプタータンパク質などのようなシグナル伝達分子、転写因子、ならびに線維芽細胞の増殖、代謝、生存、遊走、および分化を調節する他の細胞性構成成分）を含むが、これらに限定されない、線維症の発症に関係する様々な側面から選択することができる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する１つ以上の核酸を含む、有効量の医薬組成物を上記個体に投与するステップを含む、方法。
（項目２）
上記２つ以上の遺伝子が、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ならびにＰａｔｃｈｅｄ−１からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、Ｐａｔｃｈｅｄ−１から選択される、線維症または炎症の発症および進行に関与する２つ以上の遺伝子の活性または発現を調整する、１つ以上の活性作用物質を含む有効量の医薬組成物を上記個体に投与するステップを含む、方法。
（項目４）
上記１つ以上の活性作用物質が、核酸である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、項目１、２、または４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、二本鎖オリゴヌクレオチドである、項目１、２、または４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡからなる群より選択される、項目１、２、または４〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、ＲＮＡｉである、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、ｓｉＲＮＡである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、ｓｈＲＮＡである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、約１０〜約５０ヌクレオチド長である、項目１、２、または４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
上記組成物が、２つ以上の核酸を含む、項目１〜２または４〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
上記２つ以上の核酸が、同じ種類のものである、項目１２に記載の医薬組成物。
（項目１４）
上記２つ以上の核酸が、異なる種類のものである、項目１２に記載の医薬組成物。
（項目１５）
上記組成物が、２つの核酸を含み、かつ上記２つの核酸のモル比が、約０．１：１〜約１０：１である、項目１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
上記医薬組成物における上記２つ以上の核酸が、等モルの割合である、項目１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
上記核酸が、キャリア分子と会合している、項目１、２、または４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記核酸が、上記キャリア分子と共有結合で会合している、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記核酸が、上記キャリア分子と非共有結合で会合している、項目１７に記載の方法。（項目２０）
上記キャリア分子が、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルからなる群より選択される、項目１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
上記キャリア分子が、ペプチドである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記ペプチドが、細胞浸透性ペプチドである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記細胞浸透性ペプチドが、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、Ｐｅｐ−１ペプチド、またはＰｅｐ−２ペプチドからなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記核酸および上記細胞浸透性ペプチドが、複合体で存在する、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２５）
上記組成物が、上記核酸および上記細胞浸透性ペプチドの上記複合体を含むナノ粒子を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記ナノ粒子の平均サイズが、５０ｎｍ〜４００ｎｍである、項目２５に記載の方法。（項目２７）
上記組成物における上記細胞浸透性ペプチドおよび上記核酸のモル比が、約１００：１〜約１：５０である、項目２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
上記活性作用物質が、ＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、ＴＩＭＰから選択される２つ以上の遺伝子の活性または発現を調整する、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
上記活性作用物質が、ＳＰＡＲＣおよびＴＧＦベータ１の活性を調整する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記線維性状態または上記炎症状態が、肺線維症、特発性肺線維症、肺の進行性塊状線維症、嚢胞性線維症、縦隔線維症、肝線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、心線維症、陳旧性心筋梗塞、進行性腎疾患、腎線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、強皮症／全身性硬化症、関節線維症、癒着性関節包炎、線維筋痛症、腹膜線維症、放射線誘発性線維症、熱傷誘発性線維症、外傷誘発性線維症、瘢痕線維症、および創傷治癒線維症からなる群より選択される、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
上記線維性状態または上記炎症状態が、線維形成性の癌であり、上記線維形成性の癌が、その場所とは無関係な扁平上皮がん、胆膵路がん、中皮腫、類腱線維腫、線維形成性円形細胞腫瘍、乳癌、卵巣癌、結腸直腸がんおよび胃腸管の腫瘍、肺癌、リンパ腫、骨髄線維症、白血病、黒色腫、脳腫瘍（膠芽腫、大脳星状細胞腫、神経芽細胞腫、および髄芽腫を含む）、膀胱癌、肝細胞腫瘍および尿路上皮腫瘍、ならびに下垂体の腫瘍からなる群より選択される、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
上記医薬組成物が、経口、静脈内、動脈内、心臓内、内カテーテル、腹腔内、膀胱内、経皮、経鼻吸入、肺送達、腔内、頭蓋内、髄腔内、皮下、皮内、筋肉内、眼内、局所、直腸、膣、直接的な注射／投与、またはエレクトロトランスファーもしくはマイクロニードル注射による局所的な送達によって投与される、項目１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
上記個体が、線維症または炎症の発症および進行に関与する、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいて選択される、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
上記医薬組成物の投与の前に少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含む、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する２つ以上の活性作用物質を含む医薬組成物。
（項目３６）
上記２つ以上の遺伝子が、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ならびにＰａｔｃｈｅｄ−１からなる群より選択される、項目３５に記載の医薬組成物。
（項目３７）
上記２つ以上の活性作用物質が、同じ種類のものである、項目３５〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３８）
上記２つ以上の活性作用物質が、異なる種類のものである、項目３５〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３９）
上記組成物が、２つの活性作用物質を含み、上記２つの活性作用物質のモル比が、約０．１：１〜約１０：１である、項目３５〜３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４０）
上記医薬組成物における上記２つ以上の活性作用物質が、等モルの割合である、項目３５〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４１）
上記２つ以上の活性作用物質が、核酸である、項目３５〜４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４２）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、項目４１に記載の医薬組成物。
（項目４３）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、二本鎖オリゴヌクレオチドである、項目４１に記載の医薬組成物。
（項目４４）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡからなる群より選択される、項目４１〜４３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４５）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、ＲＮＡｉである、項目４４に記載の医薬組成物。（項目４６）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、ｓｉＲＮＡである、項目４５に記載の医薬組成物。
（項目４７）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、ｓｈＲＮＡである、項目４５に記載の医薬組成物。
（項目４８）
上記核酸のうちの少なくとも１つが、約１０〜約５０ヌクレオチド長である、項目４１〜４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４９）
上記核酸が、キャリア分子と会合している、項目４１〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５０）
上記核酸が、上記キャリア分子と共有結合で会合している、項目４９に記載の医薬組成物。
（項目５１）
上記核酸が、上記キャリア分子と非共有結合で会合している、項目４９に記載の医薬組成物。
（項目５２）
上記キャリア分子が、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルからなる群より選択される、項目４９〜５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５３）
上記キャリア分子が、ペプチドである、項目５２に記載の医薬組成物。
（項目５４）
上記ペプチドが、細胞浸透性ペプチドである、項目５３に記載の医薬組成物。
（項目５５）
上記細胞浸透性ペプチドが、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、Ｐｅｐ−１ペプチド、またはＰｅｐ−２ペプチドからなる群より選択される、項目５４に記載の医薬組成物。
（項目５６）
上記核酸および上記細胞浸透性ペプチドが、複合体で存在する、項目５４〜５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５７）
上記組成物が、上記核酸および上記細胞浸透性ペプチドの上記複合体を含むナノ粒子を含む、項目５６に記載の医薬組成物。
（項目５８）
上記ナノ粒子の平均サイズが、５０〜４００ｎｍである、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
上記組成物における上記細胞浸透性ペプチドおよび上記核酸のモル比が、約１００：１〜約１：５０である、項目５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
近年、複数のタンパク質が、線維性疾患の病気の発生を促す、可能性のある重要な制御因子として結びつけられ、いくつかの研究は、ＲＮＡｉアプローチによる個々の遺伝子の標的ダウンレギュレーションが、線維症に対する治療効果を有し得ることを示唆した。しかしながら、線維症に関与する２つ以上の遺伝子の発現を阻害することによって線維性疾患を予防し、処置するための多標的ＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および／もしくはｍｉＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ治療薬を開発する努力は、ほとんどなされていない。本発明は、線維症に関与する２つ以上の標的遺伝子の阻害の組み合わせを目的とする治療薬（たとえば、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子などのような複数の核酸を含む組成物）を提供する。
【００３２】
本発明は、したがって、いくつかの実施形態において、たとえば転写後レベルで、２つ以上の遺伝子の発現を選択的に調整する（阻害するなど）ための、複数の一本鎖または二本鎖核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、およびプラスミドＤＮＡなど）の組み合わせの使用に関するが、これらの遺伝子は、同じまたは別個のシグナル伝達経路および細胞の手順をコントロールし、様々な器官を冒す線維症疾患の病態および進行において本質的な役割を果たす。本発明はまた、線維性疾患の処置のためのオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせのキャリアとして新規なペプチドベースのナノ粒子オリゴヌクレオチド送達ビヒクルの使用を含む、標的器官における線維性疾患部位に核酸（オリゴヌクレオチドなど）の組み合わせの組成物および送達の方法をも提供する。本発明はまた、線維性疾患ならびに炎症疾患および癌を含む他の疾患を有する患者を処置するためのオリゴヌクレオチド化合物を含有するそのような組成物の治療上の使用をも記載する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、組成物が、所定の比で２つ以上の活性作用物質を含む。これは、複数の活性作用物質の同時の送達を可能にし、これは、様々な標的の発現を調整してもよい。所定の比は、最も有効な送達および／または標的調整を可能にするように選択することができる。
【００３４】
そのため、本出願は、一態様において、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を特異的に標的にする、１つ以上の核酸（オリゴヌクレオチドなど）を含む医薬組成物を提供する。他の態様において、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ならびにヘッジホッグ経路における関連する遺伝子−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１から選択される、線維症または炎症の発症および進行に関与する２つ以上の遺伝子の活性または発現を調整する１つ以上の活性作用物質を含む医薬組成物が提供される。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。
【００３５】
他の態様において、個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、本明細書において記載される有効量の医薬組成物のいずれかを前記個体に投与するステップを含む方法が提供される。本明細書において記載される方法に有用なキット、単位投薬量、および製造品もまた、提供される。
【００３６】
本明細書において記載される本発明の態様および実施形態が、態様および実施形態「からなる」および／または「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００３７】
本明細書において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、別段の指示がない限り、複数形の指示内容を含む。
【００３８】
当業者によって理解されるように、本明細書における「約」値またはパラメーターについての言及は、その値またはパラメーター自体に関する実施形態を含む（記載する）。たとえば、「約Ｘ」を表す記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【００３９】
Ｉ．本発明の方法および組成物
いくつかの実施形態において、個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する、１つ以上の（２、３、４、５、６、７、または８のいずれかなど）核酸（たとえば一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド）を含む有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、２つ以上の遺伝子が、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ならびにヘッジホッグ経路における関連する遺伝子−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１からなる群より選択される。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡからなる群より選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ならびにヘッジホッグ経路における関連する遺伝子−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１から選択される、線維症または炎症の発症および進行に関与する２つ以上の遺伝子の活性または発現を調整する、１つ以上の（２、３、４、５、６、７、または８のいずれかなど）活性作用物質（核酸、たとえば一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドなど）を含む有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法が提供される。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの活性作用物質が、タンパク質（抗体など）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの活性作用物質が、小分子である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの活性作用物質が、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、２つの活性作用物質が、同じ種類のものである。いくつかの実施形態において、２つの活性作用物質が、異なる種類のものである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する、１つ以上の（２、３、４、５、６、７、または８のいずれかなど）ＲＮＡｉ（たとえばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を含む有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、２つ以上の遺伝子が、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ならびにヘッジホッグ経路における関連する遺伝子−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１からなる群より選択される。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。いくつかの実施形態において、核酸が、約１０〜約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、２つ以上の核酸が、同じ種類のものである。いくつかの実施形態において、２つ以上の核酸が、異なる種類のものである。
【００４２】
いくつかの実施形態において本明細書において記載される線維性状態または炎症状態は、肺線維症、特発性肺線維症、肺の進行性塊状線維症、嚢胞性線維症、縦隔線維症、肝線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、心線維症、陳旧性心筋梗塞、進行性腎疾患、腎線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、強皮症／全身性硬化症、関節線維症、癒着性関節包炎、線維筋痛症、腹膜線維症、放射線誘発性線維症、熱傷誘発性線維症、外傷誘発性線維症、瘢痕線維症、および創傷治癒線維症からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、線維性状態または炎症状態が、線維形成性の癌であり、線維形成性の癌が、その場所とは無関係な扁平上皮がん、胆膵路がん、中皮腫、類腱線維腫、線維形成性円形細胞腫瘍、乳癌、卵巣癌、結腸直腸がんおよび胃腸管の腫瘍、肺癌、リンパ腫、骨髄線維症、白血病、黒色腫、脳腫瘍（膠芽腫、大脳星状細胞腫、神経芽細胞腫、および髄芽腫を含む）、膀胱癌、肝細胞腫瘍および尿路上皮腫瘍、ならびに下垂体の腫瘍からなる群より選択される。医薬組成物は、適したルートのいずれかによって投与することができる。経口、静脈内、動脈内、心臓内、内カテーテル、腹腔内、膀胱内、経皮、経鼻吸入、肺送達、腔内、頭蓋内、髄腔内、皮下、皮内、筋肉内、眼内、局所、直腸、膣、直接的な注射／投与、またはエレクトロトランスファーもしくはマイクロニードル注射による局所的な送達を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
上記に記載される方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態において、処置のための個体が、線維症または炎症の発症および進行に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいて選択される。いくつかの実施形態において、方法が、医薬組成物の投与の前に少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む。
【００４４】
活性または発現の「調整」は、遺伝子もしくはｍＲＮＡのステータスもしくはコピー数を調節することもしくは改変することまたは産生されるタンパク質などのような遺伝子産物の量を変化させることを意味する。いくつかの実施形態において、活性作用物質が、標的遺伝子の発現を阻害する。いくつかの実施形態において、調整（阻害など）が、転写後レベルで行われる。いくつかの実施形態において、活性作用物質が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで、遺伝子または遺伝子産物の発現を阻害する。プラスミド送達の場合などのようないくつかの実施形態において、活性作用物質が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで、遺伝子または遺伝子産物の発現を増加させてもよい。
【００４５】
他の態様において、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ならびにヘッジホッグ経路における関連する遺伝子−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１を含むが、これらに限定されない、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する、２つ以上の（２、３、４、５、６、７、または８のいずれかなど）活性作用物質（核酸、たとえば一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドなど）を含む医薬組成物が、提供される。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。本明細書において記載されるこれらの医薬組成物は、本明細書において記載される方法のいずれか１つに有用である。いくつかの実施形態において、２つ以上の活性作用物質が、同じ種類のものである。いくつかの実施形態において、２つ以上の活性作用物質が、異なる種類のものである。いくつかの実施形態において、医薬組成物が、２つの活性作用物質を含み、２つの活性作用物質のモル比が、約０．１：１〜約１０：１である。いくつかの実施形態において、医薬組成物における２つ以上の活性作用物質が、等モルの割合である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ならびにヘッジホッグ経路における関連する遺伝子−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１を含むが、これらに限定されない、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する、２つ以上の（２、３、４、５、６、７、または８のいずれかなど）ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）を含む医薬組成物が、提供される。いくつかの実施形態において、２つの干渉ＲＮＡが、同じ種類のものである。いくつかの実施形態において、２つ以上の干渉ＲＮＡが、異なる種類のものである。いくつかの実施形態において、医薬組成物が、２つの干渉ＲＮＡを含み、２つの活性作用物質のモル比が、約０．１：１〜約１０：１である。いくつかの実施形態において、医薬組成物における２つ以上の干渉ＲＮＡが、等モルの割合である。
【００４７】
上記の実施形態のいずれかにおいて記載される核酸は、たとえば約１５〜８０、１８〜６０、２０〜５０、または２５〜３０ヌクレオチド長のいずれかを含む、約１２〜約１００ヌクレオチド長の任意の長さとすることができる。いくつかの実施形態において、核酸が、対応する標的遺伝子に対して、少なくとも約６０％（たとえば少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％のいずれかを含む）同一である。いくつかの実施形態において、核酸が、たとえば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって修飾される。
【００４８】
上記の実施形態のいずれかにおいて記載される活性作用物質（核酸など）は、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、ミセル、または電荷相互作用および／もしくは疎水性相互作用を通して活性作用物質と相互作用することができる、上記のもののいずれかを含む合成組成物、たとえば荷電種および脂質を含有する分子もしくは荷電ペプチドおよび脂質を含有する分子を含むことができるが、これらに限定されないキャリア分子と会合させることができる（共有結合でまたは非共有結合で会合させるなど）。いくつかの実施形態において、キャリア分子が、ペプチド（細胞浸透性ペプチド、たとえばポリカチオンペプチドまたは両親媒性ペプチドなど）である。適した細胞浸透性ペプチドは、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、またはＰｅｐ−１もしくはＰｅｐ−２ペプチドを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、組成物が、２つ以上の異なるタイプのペプチド（異なるタイプの細胞浸透性ペプチドなど）を含む。たとえば、いくつかの実施形態において、組成物が、ポリカチオンペプチドおよび両親媒性ペプチドの両方を含む。いくつかの実施形態において、組成物が、ＭＰＧペプチドおよびＣＡＤＹペプチドを含む。キャリアペプチドの他の組み合わせもまた、企図される。
【００４９】
いくつかの実施形態における核酸および細胞浸透性ペプチドが、複合体で存在することができる。いくつかの実施形態において、核酸および細胞浸透性ペプチドが、核酸および細胞浸透性ペプチドの複合体を含むナノ粒子中に存在する。ナノ粒子の平均サイズは、たとえば約５０ｎｍ〜約１ミクロン、約５０ｎｍ〜約４００ｎｍを含む、約３０ｎｍ〜約１０ミクロンのいずれかとすることができる。組成物中の細胞浸透性ペプチドおよび核酸のモル比は、約５０：１〜１：２０、２０：１〜１：１０、およびその他同種のもののいずれかを含む、約１００：１〜約１：５０とすることができる。
【００５０】
この部において記載される組成物および方法は、より詳細に下記にさらに記載される。
【００５１】
ＩＩ．２つ以上の活性作用物質を含む医薬組成物
本明細書において記載される活性作用物質は、オリゴヌクレオチド、核酸、ポリヌクレオチド、一本鎖または二本鎖オリゴおよびポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどのような異なる形態のＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンタゴｍｉｒ、リボザイム、アプタマー、プラスミドＤＮＡなど、ならびに１つ以上のこれらの作用物質の適した組み合わせなどのような、核酸ベースの分子を含む。そのうえ、活性作用物質はまた、特定の所望の効果を有する酵素もしくは抗体または所望の特定の活性を有する小分子などのようなタンパク質を含んでいてもよい。適した組み合わせとして共有結合で互いに付加されるまたはいかなる共有結合をも伴うことなく提供されるタンパク質または小分子との核酸ベースの作用物質の組み合わせもまた、企図される。
【００５２】
標的遺伝子：特定の好ましい活性作用物質およびそれらの標的は、線維症および炎症に関するものを含む。これらは、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、およびＳＴＡＴ５ならびにヘッジホッグ経路における関連する遺伝子−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１に関する作用物質を含む。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。これらの標的に対して作用する、関心のある特定の作用物質は、上記に記載されるように、核酸ベースの分子、タンパク質、酵素または抗体、および小分子、ならびにそれらの組み合わせを含む。１つを超える活性作用物質を含有し、それによって、線維症または炎症と関係する１つを超える標的に同時に影響を及ぼすまたはそれを調整する能力を有する組成物が、最も好ましい。
【００５３】
特発性肺線維症、全身性強皮症、および肝硬変などのような、線維性疾患の病態に結びつけられる好ましい分子標的および重要なシグナル伝達経路は、線維芽細胞、炎症応答、ＥＣＭ沈着、および組織修復の活性化に関与する、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータおよびその受容体、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、アデノシン受容体、ＳＰＡＲＣ（酸性で、システインが豊富な分泌タンパク質）、ならびにメタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）を含む。
【００５４】
本明細書において記載される活性作用物質（複数可）は、同じシグナル伝達経路における２つ以上の遺伝子の発現を調整してもよいまたはそれらは、異なる経路における２つ以上の遺伝子の発現を調整する。たとえば、いくつかの実施形態において、活性作用物質（核酸、たとえばＲＮＡｉなど）が、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路の発現を調整する。いくつかの実施形態において、活性作用物質（核酸、たとえばＲＮＡｉなど）が、ＣＴＧＦシグナル伝達経路の発現を調整する。いくつかの実施形態において、活性作用物質（核酸、たとえばＲＮＡｉなど）が、ヘッジホッグ経路に関与するタンパク質（Ｐａｔｃｈｅｄ−１、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ−２を含むが、これらに限定されない）の発現を調整する。いくつかの実施形態において、活性作用物質（核酸、たとえばＲＮＡｉなど）が、ＥＣＭタンパク質（コラーゲン、フィブロネクチン、およびビトロネクチンを含むが、これらに限定されない）の発現を調整する。いくつかの実施形態において、活性作用物質（核酸、たとえばＲＮＡｉなど）が、ＥＣＭ（ＳＰＡＲＣ、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＴＧＦベータ−１、ＣＴＧＦ、およびＴＩＭＰを含むが、これらに限定されない）の組織化およびリモデリングに関与する非構造タンパク質の発現を調整する。いくつかの実施形態において、活性作用物質（核酸、たとえばＲＮＡｉなど）が、線維症の制御因子（サイトカイン、ケモカイン、血管新生因子、成長因子、ＰＰＡＰ、ＳＡＰ、カスパーゼ、およびレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系（ＡＮＧ
ＩＩ）の構成成分を含むが、これらに限定されない）の発現を調整する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、活性作用物質（複数可）が、同じシグナル伝達形質導入経路における２つ以上の標的タンパク質の発現を調整する。いくつかの実施形態において、活性作用物質（複数可）が、２つ以上の異なるシグナル伝達経路における標的タンパク質の発現を調整する。活性作用物質（複数可）は、上記に記載される標的の任意の組み合わせを調整することができる。たとえば、いくつかの実施形態において、活性作用物質（核酸、たとえばＲＮＡｉなど）が、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路およびＣＴＧＦ経路の両方またはＳＰＡＲＣおよびＣＴＧＦ経路の両方の発現を調整する。他の標的の組み合わせは、ＣＴＧＦと形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体１または２、ＳＰＡＲＣと形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体１または２、アデノシン受容体と形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体１または２、ＴＩＭＰと形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体１または２、ＣＴＧＦとＳＰＡＲＣ、アデノシン受容体とＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰとＳＰＡＲＣ、アデノシン受容体とＣＴＧＦ、ＴＩＭＰとＣＴＧＦ、ＴＩＭＰとアデノシン受容体を含むが、これらに限定されず、標的の３種類の組み合わせは、上記に述べられるさらなる単一の標的との、上記に示される２種類の組み合わせのいずれかを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＴＧＦ−ベータを含むＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路に関与する遺伝子である。ＴＧＦ−ベータの作用は、ＥＣＭ構成成分の産生の増加ならびに間葉細胞増殖、分化、遊走、および蓄積によって特徴付けられる［１６、１７］。ＴＧＦ−ベータはまた、ＣＴＧＦの産生を誘発し、これは、線維形成を促し、肝臓における結節性線維症の原因となる［１８、１９］。肺線維芽細胞において、ＴＧＦ−ベータは、ＳＰＡＲＣの発現をアップレギュレートし、これは、ＥＣＭ組織化の重要なモデュレーターであり、ＩＰＦにおいて過剰発現される［２０］。
【００５７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＣＴＧＦを含むＣＴＧＦシグナル伝達経路に関与する遺伝子である。ＣＴＧＦは、放射線誘発性線維症、肺線維症、および強皮症に関与する［１８］。線維芽細胞においてＣＴＧＦを過剰発現するトランスジェニックマウスは、強皮症と観察される線維症に類似する多臓器線維症を示す［２１、２２］。ＣＴＧＦ  ｓｉＲＮＡは、インビトロにおいて、線維芽細胞におけるＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、コラーゲン１、およびＴＧＦ−ベータ１のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを低下させ、皮膚および肺におけるブレオマイシン誘発性線維症を弱める［２３］。
【００５８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子が、アデノシン受容体Ａ２ＡおよびＡ２Ｂを含むアデノシンシグナル伝達経路に関与する遺伝子である。病的な状態におけるアデノシンならびにその受容体Ａ２ＡおよびＡ２Ｂは、皮膚、肺、および肝臓における線維症を促す［２４］。Ａ２Ｂ受容体過剰発現は、重度の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびＩＰＦ患者由来の外科的肺生検材料において観察される［２５］。アデノシンは、Ａ２Ａ受容体に作用することによって、コラーゲンＩおよびＩＩＩの産生を増加させることにより、肝臓の肝星細胞媒介性線維症を刺激する［２６、２７］。
【００５９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＳＰＡＲＣを含むＳＰＡＲＣシグナル伝達経路に関与する遺伝子である。ＳＰＡＲＣ、マトリックス細胞タンパク質は、ＩＰＦ、強皮症、および肝線維症において線維形成を促す［２８〜３０］。ＳＰＡＲＣは、ＴＧＦ−ベータ１活性の重要な下流のメディエーターであり［３１］、その発現は、ＩＰＦ線維芽細胞においてＰＩ３ｋシグナル伝達経路を介してＴＧＦ−ベータによってアップレギュレートされる［２０］。ＳＰＡＲＣはまた、さらには、ＴＧＦ−ベータ１の発現をも調節する［３２］。マウスにおいてブレオマイシンによって誘発された皮膚および肺線維症は、それぞれ皮下注射および気管内滴下注入によって送達されたＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡによって著しく低下した［２９］。チオアセトアミド（ｔｈｉｏｃｅｔａｍｉｄｅ）により処置されたラットにおける肝線維症は、ＳＰＡＲＣアンチセンスによる処置によって有意に弱められた［３３］。
【００６０】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＴＩＭＰを含むＴＩＭＰ（メタロプロテアーゼの組織阻害剤）シグナル伝達経路に関与する遺伝子である。メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）は、マトリックスメタロプロテアーゼファミリーの内因性阻害剤である。ＴＩＭＰ−１は、大多数のＭＭＰを阻害するが、ＴＩＭＰ−３は、知られているすべての間質および膜結合ＭＭＰを阻害する［３４］。ＴＩＭＰは、肝臓線維形成において中心的な役割を果たし［３５］、ＩＰＦ患者由来の肺組織サンプルは、ＴＩＭＰの高い発現を示し、ＴＩＭＰが、非分解線維性コラーゲン微小環境の一因となるという仮説を支持する［３６］。
【００６１】
本明細書において記載される方法および組成物は、２つ以上の標的遺伝子の発現の調整を可能にする。例示的な標的の組み合わせは、ＣＴＧＦと形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体１または２、ＳＰＡＲＣと形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体１または２、アデノシン受容体と形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体１または２、ＴＩＭＰと形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ受容体１または２、ＣＴＧＦとＳＰＡＲＣ、アデノシン受容体とＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰとＳＰＡＲＣ、アデノシン受容体とＣＴＧＦ、ＴＩＭＰとＣＴＧＦ、ＴＩＭＰとアデノシン受容体を含むが、これらに限定されず、標的の３種類の組み合わせは、上記に述べられるさらなる単一の標的との、上記に示される２種類の組み合わせのいずれかを含む。
【００６２】
核酸：いくつかの実施形態において、医薬組成物中に存在する活性作用物質が、核酸（オリゴヌクレオチドなど）である。
【００６３】
本明細書において区別なく使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを表し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、もしくは塩基、および／またはそれらのアナログまたはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーの中に組み込むことができる任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどのような修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書において使用される用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態をした、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するポリマーを表し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ＤＮＡは、たとえばアンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、あらかじめ凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、または誘導体およびこれらの群の組み合わせの形態をしていてもよい。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびその組み合わせの形態をしていてもよい。核酸は、合成の、天然に存在する、および天然に存在しない、また、参照核酸と類似する結合特性を有する、知られているヌクレオチドアナログまたは修飾骨格残基または連結を含有する核酸を含む。そのようなアナログの例は、限定を伴うことなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。特に限定されない限り、用語は、参照核酸と類似する結合特性を有する、天然のヌクレオチドの知られている類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示される配列と同様に、その保存的修飾変異体（たとえば縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列をも、暗示的に包含する。特に、縮重コドン置換体は、１つ以上の選択されるコドンの第３の位置（またはすべて）が、混合塩基（ｍｉｘｅｄ−ｂａｓｅ）および／またはデオキシイノシン残基と置換される配列を生成することによって実現されてもよい（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ，  ８：９１−９８（１９９４））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を通して一緒に連結される。「塩基」は、プリンおよびピリミジンを含み、これは、天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然のアナログならびにこれらに限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボン酸、およびハロゲン化アルキルなどのような新しい反応基を配置する修飾を含むプリンおよびピリミジンの合成誘導体をさらに含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」は、必ずではないが、一般に、長さが約２００ヌクレオチド未満である、短く、一般に合成のポリヌクレオチドを一般に表す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに等しく完全に適用可能である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、核酸が、一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、核酸が、二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書において記載される核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒの場合には必ずではないが、２００ヌクレオチドまでまたはプラスミドＤＮＡの場合には１０００キロ塩基までの任意の長さの範囲にあってもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、核酸が、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのような干渉ＲＮＡである。「用語「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列と同じ細胞中にある場合に標的遺伝子または配列の発現を低下させるまたは阻害することができる（たとえば分解を媒介することまたは干渉ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって）、一本鎖ＲＮＡ（たとえば成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（つまりｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、もしくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡなどのような二重鎖ＲＮＡ）を表す。干渉ＲＮＡは、したがって、標的ｍＲＮＡ配列に相補的である一本鎖ＲＮＡまたは２つの相補鎖によってもしくは１つの自己相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを表す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子または配列に実質的なまたは完全な同一性を有していてもよいまたはミスマッチの領域（つまりミスマッチモチーフ）を含んでいてもよい。干渉ＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子またはそのサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対応することができる。干渉ＲＮＡは、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、たとえば、約１５〜６０、１５〜５０、または１５〜４０（二重鎖）ヌクレオチド長、より典型的には、約１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５（二重鎖）ヌクレオチド長の干渉ＲＮＡを含み、好ましくは、約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３（二重鎖）ヌクレオチド長である（たとえば、二本鎖ｓｉＲＮＡのそれぞれの相補的配列は、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは、約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５塩基対長、好ましくは、約１８〜２２、１９〜２０、または１９〜２１塩基対長である）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１〜約４ヌクレオチドまたは約２〜約３ヌクレオチドの３’オーバーハングおよび５’リン酸末端を含んでいてもよい。ｓｉＲＮＡの例は、限定を伴うことなく、一方の鎖がセンス鎖であり、他方が相補的なアンチセンス鎖である、２つの個別の鎖分子から構築された二本鎖ポリヌクレオチド分子；センスおよびアンチセンス領域が、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結される、一本鎖分子から構築された二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的なセンスおよびアンチセンスの領域を有するヘアピン型二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに環状ポリヌクレオチドが、インビボにおいてまたはインビトロにおいてプロセシングされて、活性二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる、２つ以上のループ構造および自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、化学的に合成される。ｓｉＲＮＡはまた、大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩまたはダイサーによる、より長いｄｓＲＮＡ（たとえば約２５ヌクレオチド長よりも大きなｄｓＲＮＡ）の切断によって生成することができる。これらの酵素は、生物学的に活性なｓｉＲＮＡにｄｓＲＮＡをプロセシングする（たとえばＹａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９９：９９４２−９９４７（２００２）；Ｃａｌｅｇａｒｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９９：１４２３６（２００２）；Ｂｙｒｏｍら、Ａｍｂｉｏｎ  ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ，  １０（１）：４−６（２００３）；Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３１：９８１−９８７（２００３）；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９３：２２６９−２２７１（２００１）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２４３：８２（１９６８）を参照されたい）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド〜約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチド長、またはそれ以上であってもよい。ｄｓＲＮＡは、遺伝子転写物全体または部分的な遺伝子転写物をコードすることができる。ある実例において、ｓｉＲＮＡが、プラスミドによってコードされてもよい（たとえば、ヘアピン型ループを有する二重鎖に自動的にフォールドする配列として転写される）。低分子ヘアピン型ＲＮＡまたは小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現を沈黙させるために使用することができる、堅固なヘアピン型カーブ（ｈａｉｒｐｉｎ  ｔｕｒｎ）を作製するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡヘアピン型構造は、細胞性の機構によってｓｉＲＮＡに切断され、これは、次いで、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、ｍＲＮＡが結合するｓｉＲＮＡにマッチするｍＲＮＡに結合し、切断する。干渉ＲＮＡの適した長さは、約５〜約２００ヌクレオチドまたは１０〜５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５〜３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡが、対応する標的遺伝子に実質的に相補的である（少なくとも約６０％  ７０％  ８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるなど）。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡが、たとえば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって、修飾される。いくつかの実施形態において、標的および対応する配列が、下記に示される。
【００６６】
【表１】
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いくつかの実施形態において、核酸が、二本鎖アンチセンスＲＮＡである。干渉ＲＮＡの適した長さは、約５〜約２００ヌクレオチドまたは１０〜５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５〜３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡが、対応する標的遺伝子に実質的に相補的である（少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるなど）。いくつかの実施形態において、アンチセンスＲＮＡが、たとえば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって、修飾される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、核酸が、ｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略される）は、真核細胞において見つけられる短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。マイクロＲＮＡ分子は、他のＲＮＡと比較して、数少ないヌクレオチド（平均２２）を有する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補的配列に結合する転写後制御因子であり、普通、翻訳の抑制または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらす。ヒトゲノムは、１０００を超えるｍｉＲＮＡをコードし得、これらは、約６０％の哺乳動物遺伝子を標的にし、多くのヒト細胞型において豊富である。ｍｉＲＮＡの適した長さは、約５〜約２００ヌクレオチドまたは１０〜５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５〜３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡが、対応する標的遺伝子に実質的に相補的である（少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるなど）。いくつかの実施形態において、アンチセンスｍｉＲＮＡが、たとえば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって、修飾される。
【００６８】
いくつかの実施形態において、核酸が、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメント（たとえば、約１０００ｂｐまでの長さのＤＮＡフラグメント）である。そのうえ、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは、超メチル化のものまたは低メチル化のものであってもよい。
【００６９】
キャリア分子：いくつかの実施形態において本明細書において記載される活性作用物質は、キャリア分子と会合している。いくつかの実施形態において、キャリア分子が、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、ポリカチオンポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、またはミセルからなる群より選択することができる。キャリア分子は、送達されることになっている関心のある所望の活性作用物質と組み合わせることができる。組み合わせは、キャリアおよび活性作用物質の間の共有結合または非共有結合相互作用を含んでいてもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態において、キャリア分子が、細胞透過性ペプチドなどのようなペプチドである。本明細書において使用される「細胞浸透性ペプチド」は、様々な分子カーゴ（ナノサイズ粒子から小さな化学分子およびＤＮＡの大きなフラグメントまで）の細胞の取込みを容易にする、短いペプチドを表す。「カーゴ」は、共有結合を介してのまたは非共有結合の相互作用を通しての化学結合を通してペプチドと会合している。ＣＰＰの機能は、細胞の中にカーゴを送達することであり、これは、生きている哺乳動物細胞のエンドソームに送達されたカーゴのエンドサイトーシスを通してよく起こるプロセスである。ＣＰＰは、典型的に、リシンもしくはアルギニンなどのような、相対的存在量の高い正に荷電しているアミノ酸を含有するまたは極性／荷電アミノ酸および無極性疎水性アミノ酸の交互のパターンを含有する配列を有するアミノ酸組成を有する。これらの２つのタイプの構造は、それぞれ、ポリカチオンまたは両親媒性と呼ばれる。いくつかの実施形態において、細胞浸透性ペプチドおよび活性作用物質が、複合体またはナノ粒子を形成するように組み合わせられる。
【００７１】
適した細胞浸透性ペプチドは、米国特許第７９０６４８４号明細書において開示されるものおよびその対応物を含み、この内容は、それらの全体が参照によって本明細書において含まれる。関心のあるペプチドは、式ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡＺ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４によって同定されるものであり、それぞれのＸが、独立して、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、それぞれのＺ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４が、独立して、Ｈ、Ｋ、Ｒ、またはＱである。特定の配列は、ＧＬＦＲＡＬＬＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＬＲＡＨＨＨＨおよびＧＬＦＲＡＬＬＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＬＲＡＲＲＲＲを含む。関心のある他のペプチドは、米国特許第６８４１５３５号明細書、米国特許第７５１４５３０号明細書、米国特許第７５７９３１８号明細書、米国特許第７９４３５８１号明細書、Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２０１２）、Ｓｍａｌｌ，  ＤＯＩ：１０．１００２／ｓｍｌｌ．２０１１０２４１３、およびＲｙｄｓｔｒｏｍら（２０１１）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（１０）：ｅ２５９２４．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２５９２４において同定されるものであり、これらの内容は、それらの全体が参照によって本明細書において含まれる。関心のあるペプチドは、たとえばペプチドＡｃ−ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ−システアミドおよびＡｃ−ＸＬＷＲＡＬＷＲＬＸＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ−システアミド［Ｘ＝Ｇ、Ｌ、ベータ−Ａ、Ｓ、Ｌ、Ｗ、Ｃ、もしくはＩ］またはＡｃ−ＸＷＲＳＸＧＷＲＷＲＸＬＷＲＷＸＸＷＸＲ−システアミド［Ｘ＝Ｌ、Ｓ、Ｇ、ベータ−Ａ、Ｗ、Ｃ、もしくはＩ］を含む対応する修飾体を含む。そのうえ、上記のペプチドのいずれも、Ｚｈａｎｇら（２０１１）［［  Ｚｈａｎｇ  Ｈ、Ｃｕｒｒｅｌｉ  Ｆ、Ｚｈａｎｇ  Ｘ、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ
Ｓ、Ｗａｈｅｅｄ  ＡＡ、Ｃｏｏｐｅｒ  Ａ、Ｃｏｗｂｕｒｎ  Ｄ、Ｆｒｅｅｄ  ＥＯ、Ｄｅｂｎａｔｈ  ＡＫ．（２０１１）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｓｔａｐｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  ｃａｐｓｉｄ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ２０１１  Ｍａｙ  ３；８：２８．  ］］によって記載されるように、それらの活性を改善するためにステープルする（ｓｔａｐｌｅ）ことができ、これらの内容は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【００７２】
本発明の使用に適したさらなる細胞浸透性ペプチドは、国際公開第２０１２／１３７１５０  Ａ２号パンフレットおよび国際公開第２０１２／１３７０３６  Ａ１号パンフレットにおいて開示され、これらの両方は、それらの全体が本明細書において参照によって組み込まれる。これらは、ＶＥＰＥＰ−６シリーズとして命名されるペプチドおよびＳＴ−ＶＥＰＥＰ−６シリーズとして命名されるステープルされたペプチドおよびその修飾体を含む。
【００７３】
脂質ベースのキャリアの場合には、これらは、米国特許第８０５８０６９号明細書または米国特許第８０３４３７６号明細書において記載され、これらの内容は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。用語「脂質」は、脂肪酸のエステルを含むが、これらに限定されない、有機化合物のグループを表し、水中で不溶性であるが、多くの有機溶媒中で可溶性であることによって特徴付けられる。それらは、普通、少なくとも３つのクラスに分類される：（１）油脂およびワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；ならびに（３）ステロイドなどのような「誘導脂質」。「脂質粒子」は、核酸（たとえば干渉ＲＮＡ）などのような活性作用物質または治療剤を関心のある標的部位に送達するために使用することができる脂質製剤を表すために本明細書において使用される。典型的に、粒子の凝集を予防するカチオン脂質、非カチオン脂質、およびコンジュゲート脂質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ）から形成される、本発明の脂質粒子において、活性作用物質または治療剤は、脂質中にカプセル化され、それによって、酵素的分解から作用物質を保護してもよい。本明細書において使用されるように、用語「ＳＮＡＬＰ」は、安定性の核酸脂質粒子を表す。ＳＮＡＬＰは、脂質（たとえば、粒子の凝集を予防するカチオン脂質、非カチオン脂質、およびコンジュゲート脂質）から作製される粒子を示し、核酸（たとえばｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ、または干渉ＲＮＡが転写されるプラスミドを含むプラスミド）が、脂質内に完全にカプセル化される。本明細書において使用されるように、用語「ＳＮＡＬＰ」は、ＳＰＬＰを含み、これは、脂質内にカプセル化された核酸（たとえばプラスミド）を含む核酸−脂質粒子を表すために使用される用語である。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的に、カチオン脂質、非カチオン脂質、および脂質コンジュゲート（たとえばＰＥＧ脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、それらが静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長い循環寿命を示すことができ、それらが、遠位の部位（たとえば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積することができ、それらが、これらの遠位の部位で、トランスフェクトされた遺伝子の発現または標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるので、全身的な適用に非常に有用である。ＳＰＬＰは、国際公開第００／０３６８３号パンフレットにおいて記載されるカプセル化縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含み、この開示は、事実上その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【００７４】
他の適したキャリアは、ＥＣＨＯ（Ｗａｎｇら、２００９、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＳ  ＶＯＬ．  ６、ＮＯ．  ３、７３８−７４６）およびそれらの修飾体などのようなものを含む。ＥＨＣＯ（１−アミノエチル）イミノビス［Ｎ−（オレイニルシステイニルヒスチニル（ｏｌｅｉｃｙｌｃｙｓｔｅｉｎｙｌｈｉｓｔｉｎｙｌ）−１−アミノエチル）プロピオンアミド］は、ｐＨ感受性両親媒性細胞膜破壊を示す。ＥＨＣＯは、ｓｉＲＮＡと安定性のナノ粒子を形成する。標的ｓｉＲＮＡ送達系は、ナノ粒子の表面修飾によって容易に形成される。ｓｉＲＮＡ／ＥＨＣＯナノ粒子のペグ化は、非特異的な細胞取込みを有意に低下させる。ＰＥＧスペーサーを介してのボンベシンペプチドまたはＲＧＤペプチドの組み込みは、Ｕ８７細胞における受容体媒介性の細胞性の取込みおよび高遺伝子サイレンシング効率をもたらす。蛍光共焦点顕微鏡的研究は、ＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡナノ粒子およびＰＥＧ修飾ＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡナノ粒子が、ｓｉＲＮＡ送達系のエンドソームからの脱出を容易にすることを実証する。ペプチド標的送達系による治療用抗ＨＩＦ−１Ｒ  ｓｉＲＮＡの全身投与は、ヒト神経膠腫Ｕ８７異種移植片を有するヌードマウスにおいて、静脈内注射を介しての非標的送達系または遊離ｓｉＲＮＡよりも、有意な腫瘍成長阻害をもたらす。ＥＣＨＯの修飾もまた、この目的に有用である。
【００７５】
医薬組成物：本発明の好ましい組成物は、１つを超える核酸ベースの活性作用物質を有する。２つの活性作用物質が使用される場合、それらは、約１：９〜９：１のモル比で、より好ましくは、約３：７〜約７：３および４：６〜約６：４の範囲で、最も好ましくは、１：１の比で存在する。３つの活性作用物質が使用される場合、それぞれの活性作用物質の好ましい範囲は、１：１：８〜８：１：１のモルの割合もしくは２：２：６〜６：２：２の範囲もしくは３：３：４〜４：３：３の範囲であるまたは等しい割合で存在する。さらに４つの活性作用物質が使用される場合、１：１：１：７〜７：１：１：１のモルの割合の範囲でもしくは２：２：２：４〜４：２：２：２の範囲でそれらを使用することまたはそれらを等しい割合で存在させることが好ましい。４つを超える活性作用物質が使用される場合、それらを等しいモルの割合で存在させることが好ましい。
【００７６】
本発明のペプチドベースの粒子は、典型的に、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または約７０〜約９０ｎｍの平均径を有し、実質的に無毒性である。
【００７７】
好ましくは、複合体におけるモル比（ペプチド）：（核酸）は、１：１００〜１００：１、より好ましくは、１：１〜８０：１、より好ましくは、５：１〜３０：１、最も好ましくは、８：１〜２０：１、特に１０：１、１５：１、または２０：１である。最適なモル比は、たとえば本明細書において下記に記載されるように、当業者によって容易に決定される。特に、当業者は、任意の所定のペプチド／核酸の組み合わせについて、様々なモル比（ペプチド）：（核酸）を有する複合体のトランスフェクション効率を試験することができ、最善のトランスフェクション効率をもたらす比を選ぶであろう。
【００７８】
本発明の脂質粒子（たとえばＳＮＡＬＰ）は、典型的に、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または約７０〜約９０ｎｍの平均径を有し、実質的に無毒性である。そのうえ、核酸は、本発明の脂質粒子中に存在する場合、水溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である。核酸脂質粒子およびそれらの調製方法は、たとえば米国特許出願公開第２００４０１４２０２５号明細書および米国特許出願公開第２００７００４２０３１号明細書、米国特許第８０３４３７６号明細書において開示され、これらの開示は、事実上それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【００７９】
ターゲティング：特定の実施形態によれば、本発明の複合体が、細胞特異的および／または核ターゲティングが可能な少なくとも１つのリガンドを含む。細胞膜表面受容体は、高い親和性で、好ましくは高い特異性で前記リガンドと結合することができる分子または構造である。前記細胞膜表面受容体は、好ましくは、特定の細胞について特異的である、つまり、それは、他のタイプの細胞においてよりはむしろ、あるタイプの細胞において主に見つけられる（たとえば、肝細胞の表面上のアシアロ糖タンパク質受容体を標的にするためのガラクトシル残基）。細胞膜表面受容体は、細胞ターゲティングならびにリガンド（つまり、細胞特異的なターゲティングに関与するペプチド）および付加された分子（つまり本発明の複合体）の標的細胞の中への内部移行を容易にする。本発明との関連において使用されてもよい多くのリガンド成分／リガンド結合パートナーは、文献において広く記載される。そのようなリガンド成分は、所定の結合パートナー分子または少なくとも１つの標的細胞の表面に局在化したあるクラスの結合パートナー分子に結合する能力を本発明の複合体に対して与えることができる。適した結合パートナー分子は、限定を伴うことなく、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞性受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープ、および腫瘍関連マーカーからなる群より選択されるポリペプチドを含む。結合パートナー分子は、さらに、１つ以上の糖、脂質、糖脂質、または抗体分子からなってもよいまたは含んでいてもよい。本発明によれば、リガンド成分は、たとえば脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（たとえばＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＩ）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチンのすべてもしくは一部分、たとえばＪＴＳ１（国際公開第９４／４０９５８号パンフレット）などのようなポリペプチドのすべてもしくは一部分、抗体もしくはそのフラグメント、またはその組み合わせであってもよい。好ましくは、本発明において使用されるリガンド成分は、７アミノ酸の最小限の長さを有するペプチドまたはポリペプチドである。それは、未変性ポリペプチドまたは未変性ポリペプチドから誘導されたポリペプチドである。「誘導された」は、（ａ）未変性配列に関して１つ以上の修飾（たとえば、１つ以上の残基の追加、欠失、および／もしくは置換）、（ｂ）天然に存在しないアミノ酸を含むアミノ酸アナログまたは（ｃ）置換された連結または（ｄ）当技術分野において知られている他の修飾を含有することを意味する。リガンド成分として果たすポリペプチドは、変異体ならびにたとえば、マウス抗体の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を組み合わせるヒト化抗体などのような、様々な起源の配列を融合することによって得られるキメラポリペプチドを包含する。そのうえ、そのようなポリペプチドは、直鎖または環化構造（たとえばシステイン残基が両方の末端でポリペプチドリガンドの側面に位置することによって）を有してもよい。そのうえ、リガンド成分として使用するポリペプチドは、化学成分の置換または追加を介しての、その本来の構造の修飾を含んでいてもよい（たとえばグリコシル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、リン酸化、スルフヒドリル基、およびその他同種のものの追加）。本発明は、リガンド成分を検出可能にする修飾をさらに企図する。この目的のために、検出可能な成分による修飾を想定することができる（つまりシンチグラフィー、放射性、もしくは蛍光成分または染料標識およびその他同種のもの）。適した放射性標識は、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、および１１１Ｉｎを含むが、これらに限定されない。そのような検出可能な標識は、任意の従来の技術によってリガンド成分に対して付加されてもよく、診断目的（たとえば、腫瘍細胞の画像化）のために使用されてもよい。特定の一実施形態において、結合パートナー分子が、抗原（たとえば標的細胞に特異的な抗原、疾患に特異的な抗原、遺伝子操作された標的細胞の表面上に特異的に発現される抗原）であり、リガンド成分が、免疫学のマニュアルにおいて詳細に記載されるものなどのような抗体、フラグメント、またはその最小限の認識単位である（つまり、なお抗原特異性を提示するフラグメント）（たとえばＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９３、Ｒｏｉｔｔ、Ｂｒｏｓｔｏｆｆ、およびＭａｌｅ編  Ｇａｍｂｌｉ、Ｍｏｓｂｙを参照されたい）。リガンド成分は、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗原の多くに結合するであろうモノクローナル抗体は、既に知られているが、どのような場合でも、モノクローナル抗体技術に関しての今日の技術により、抗体は、ほとんどの抗原に対して調製され得る。リガンド成分は、抗体（たとえばＦａｂフラグメント）または合成抗体フラグメント（たとえばｓｃＦｖ）の一部分であってもよい。有利な実施形態によれば、リガンド成分は、抗体全体よりはむしろ、抗体フラグメントの中から選択される。補体結合などのような抗体全体の有効な機能が、除去される。ｓｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントは、１つ以上の他のポリペプチドとの融合物として発現されてもよい。最小限の認識単位は、Ｆｖフラグメントの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列から誘導されてもよい。抗体全体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、「二価である」。「二価の」によって、本発明者らは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが、２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂフラグメント、および最小限の認識単位は、１価であり、１つの抗原結合部位のみを有する。好ましい実施形態において、リガンド成分が、腫瘍細胞を標的にするのを可能にし、腫瘍に特異的な抗原、腫瘍細胞において他と異なってもしくは過剰発現される細胞タンパク質、または癌に関連するウイルスの遺伝子産物などのような、腫瘍ステータスと関係する分子を認識し、結合することができる。癌に特異的な抗原の例は、乳癌に関係するＭＵＣ−１（Ｈａｒｅｕｖｅｎｉら、１９９０、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８９、４７５−４８６）、乳癌および卵巣癌に関係する、突然変異したＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子によってコードされる産物（Ｍｉｋｉら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６、６６−７１；Ｆｕｔｒｅａｌら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６、１２０−１２２；Ｗｏｏｓｔｅｒら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８、７８９−７９２）、結腸癌に関係するＡＰＣ（Ｐｏｌａｋｉｓ、１９９５、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ５、６６−７１）、前立腺癌に関係する前立腺に特異的な抗原（ＰＳＡ）（Ｓｔａｍｅｙら、１９８７、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１７、９０９）、結腸癌に関係するがん胎児抗原（ＣＥＡ）（Ｓｃｈｒｅｗｅら、１９９０、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０、２７３８−２７４８）、黒色腫に関係するチロシナーゼ（Ｖｉｌｅら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．
５３、３８６０−３８６４）、メラノーマ細胞において高い数値で発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）に対する受容体、乳癌および膵臓癌に関係するＥｒｂＢ−２（Ｈａｒｒｉｓら、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １、１７０−１７５）、ならびに肝臓癌に関係するアルファ−フェトプロテイン（ｆｏｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｋａｎａｉら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７、４６１−４６５）を含むが、これらに限定されない。本発明において使用される特定のリガンド成分は、ＭＵＣ−１抗原を認識して、結合し、したがって、ＭＵＣ−１ポジティブ腫瘍細胞を標的にすることができる抗体のフラグメントである。より好ましいリガンド成分は、ＭＵＣ−１抗原の縦列反復配列領域を認識するＳＭ３モノクローナル抗体のｓｃＦｖフラグメントである（Ｂｕｒｓｈｅｌｌら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７、５４７６−５４８２；Ｇｉｒｌｉｎｇら、１９８９、Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４３、１０７２−１０７６；Ｄｏｋｕｒｎｏら、１９９８、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８４、７１３−７２８）。腫瘍細胞において他と異なってまたは過剰発現される細胞タンパク質の例は、いくつかのリンパ系腫瘍において過剰発現されるインターロイキン２（ＩＬ−２）に対する受容体、肺がん細胞、膵臓、前立腺、および胃の腫瘍において過剰発現されるＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９５、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２、６６０−６６８）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体、上皮成長因子受容体、Ｆａｓ受容体、ＣＤ４０受容体、ＣＤ３０受容体、ＣＤ２７受容体、ＯＸ−４０、アルファ−ｖインテグリン（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４、５６９）、ならびにある血管新生促進因子に対する受容体（Ｈａｎａｈａｎ、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７、４８）を含むが、これらに限定されない。これらの指示に基づいて、そのようなタンパク質に結合し、認識することができる適切なリガンド成分を決定することは当業者らの範囲内にある。示すように、ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体に結合する適したリガンド成分である。線維症および炎症に特異的な受容体の場合には、これらは、上記に同定され、本発明の組成物に対して適した標的であるＴＧＦベータ受容体またはアデノシン受容体を含む。本出願はまた、本明細書において記載される組成物のいずれか１つを作製するための方法をも提供した。たとえば、細胞透過性ペプチドおよび２つ以上の活性作用物質を含むナノ粒子を含む医薬組成物を作製するための方法は、一般に、以下のステップを含む。複数のｓｉＲＮＡの組み合わせを有するペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、両親媒性ペプチドおよび所望の個々のｓｉＲＮＡを混合することによって調製される。両親媒性ペプチドの原液を、蒸留水中１ｍｇ／ｍＬ（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲）で調製し、１０分間、超音波処理する。複数のｓｉＲＮＡの原液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡバッファー中１００μＭ（１０〜２００ｕＭの範囲）の総濃度で一緒に調製する。複数のｓｉＲＮＡを含有するペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体は、等しい割合（または任意の所望の割合）で取り、ペプチド（３７３μ��原液（５０〜５００ｕＭの範囲））を、ｓｉＲＮＡ混合物と、３０分間（１分間〜６０分間の範囲）、３７℃（５０℃までの冷蔵範囲）で、２０：１（１：１〜１００：１の範囲）のペプチドおよびｓｉＲＮＡの最終モル比でインキュベートすることによって、純水中で形成させる。その代わりに、コアとなる複合体を、約５：１（０．１：１〜１０：１の範囲）のペプチド対ｓｉＲＮＡ比で第１に形成させ、その後、ペプチドの、コアとなる複合体との２０：１（１：１〜１００：１の範囲）の比でのインキュベーションの第２のステップを続けてもよい。ペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、粒径、表面電荷、懸濁液および血漿中での粒子安定性、ならびに血漿中のｓｉＲＮＡ完全性を含む、重要なパラメーターについて、インビトロにおける物理化学的な特性についてさらに特徴付けることができる。そのうえ、これらの粒子は、糖またはアルブミンなどのようなタンパク質などのような適した賦形剤の追加と共に凍結乾燥させてもよい。
【００８０】
ＩＩＩ．本発明の方法
本明細書において記載される医薬組成物は、線維症および／または炎症状態を処置するのに有用である。いくつかの実施形態において、組成物が、線維症を有する個体において線維性結合組織を低下させるのに有用である。いくつかの実施形態において、組成物が、個体において炎症を阻害するのに有用である。これらの組成物は、肺、皮膚、肝臓などにおいてなどのような、関連する組織におけるコラーゲンの低下によって示されるように、線維症を低下させることができる。そのうえ、ＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦベータ受容体、ＴＩＭＰなどのような、線維症のマーカーならびに関連する線維症および炎症に関係する遺伝子または遺伝子産物は、有効性の指標として関連する組織において直接測定されてもよい。平均６分間歩行距離、血中酸素濃度などのような肺機能のインジケーターである、患者における、特に特発性肺線維症を有する患者における機能的エンドポイントもまた、療法の有効性についての関連するインジケーターである。そのため、本明細書において記載される組成物は、任意の１つ以上の以下のものに有用となり得る：１）線維症の阻害；２）炎症の阻害；３）コラーゲンの量の低下；４）２つ以上の標的遺伝子（本明細書において記載される標的遺伝子など）の発現の阻害（同時の阻害など）；５）増加性の機能的歩行距離；および６）クオリティオブライフの改善。
【００８１】
処置されることになっている様々な疾患：本発明は、肺線維症、特発性肺線維症、肺の進行性塊状線維症、嚢胞性線維症、縦隔線維症、肝線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、心線維症、陳旧性心筋梗塞、進行性腎疾患、腎線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、強皮症／全身性硬化症、関節線維症、癒着性関節包炎、線維筋痛症、腹膜線維症、放射線誘発性線維症、熱傷誘発性線維症、外傷誘発性線維症、瘢痕線維症、および創傷治癒線維症を含むが、これらに限定されない、線維症または炎症状態もしくは疾患を処置するための医薬組成物を含む。本発明の組成物はまた、熱傷などのような外傷性の損傷から生じる創傷治癒または慢性の傷の治癒ならびに瘢痕および線維症の低下に有用である。
【００８２】
本発明は、その場所とは無関係な扁平上皮がん、胆膵路がん、中皮腫、類腱線維腫、線維形成性円形細胞腫瘍、乳癌、卵巣癌、結腸直腸がんおよび胃腸管の腫瘍、肺癌、リンパ腫、骨髄線維症、白血病、黒色腫、脳腫瘍（膠芽腫、大脳星状細胞腫、神経芽細胞腫、および髄芽腫を含む）、膀胱癌、肝細胞腫瘍および尿路上皮腫瘍、ならびに下垂体の腫瘍を含むが、これらに限定されない、線維形成性の癌または線維性構成成分を有する癌を処置するための医薬組成物を含む。
【００８３】
疾患：特発性肺線維症（ＩＰＦ）：ＩＰＦは、肺内壁を厚くする肺の瘢痕によって特徴付けられる進行性で、一般に致命的な疾患であり、肺の構造および機能の不可逆的な損失を引き起こす。ＩＰＦは、世界中で５００万人の人々および米国で１３０，０００〜２００，０００人の人々を冒しており、毎年、約４８，０００の新しい症例が診断され、４０，０００人が死んでおり、医療費は、１００，０００人の患者当たり２８億ドルと推定される［２および３］。生存期間中央値は診断後、２〜４年であり、５年の生存は、２０〜４０％である［４および５］。現在、原因は知られておらず、ＦＤＡに承認された処置はなく、ＩＰＦのための治療法はない［６］。ＩＰＦ患者は、コルチコステロイドおよび細胞傷害性剤を含む抗炎症薬により、それらが長期的な患者の生存に対して効果を有するという証拠がないという事実にもかかわらず、典型的に処置される。
【００８４】
全身性強皮症（ＳＳ）：ＳＳは、皮膚、血管、筋肉、および内臓における変化を伴う自己免疫障害および結合組織疾患である。米国において３００，０００人が強皮症を有することが推定され、その３分の１がＳＳを有する［７］。局所性疾患は、皮膚組織のみを冒すが、ＳＳは、皮膚および下にある組織、血管、ならびに心臓、肺、または腎臓を含む主な器官を冒す。びまん性皮膚疾患において、５年の生存は、７０％であり、１０年の生存は、５５％のである［８］。現在、強皮症のための治療法および特別の処置はない。ＳＳ処置は、コルチコステロイド、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、およびミコフェノール酸を含む免疫抑制薬および抗炎症薬を含む［９、１０］。
【００８５】
肝硬変（ＬＣ）：肝臓線維形成は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過度の蓄積によって特徴付けられ、肝硬変ならびに門脈圧亢進症、肝不全、および肝細胞がんを含む合併症に至る［１１］。ＬＣは、毎年、世界中で８００，０００人の死の原因となる［１２］。米国において、ＬＣは、毎年、２７，０００人の死の原因となる［１３］。定着した肝硬変は、３４〜６６％の１０年の死亡率を有する［１４］。肝硬変の一般的な原因は、アルコール消費、Ｂ、Ｃ、およびＤ型慢性肝炎、肥満、毒素、胆道疾患、ならびに自己免疫性肝炎を含む［１５］。現在、ＬＣのために利用可能な処置はなく、また、この疾患を管理するための医療費は高い。
【００８６】
膵癌および他のいくつかの癌は、線維性または線維形成性の間質を有することが知られている。しかしながら、膵癌の間質性構成成分を特異的に標的にする研究はなかった。ＣＴＧＦ、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ、ＴＧＦベータ１または２、ＭＭＰ、およびベータ−カテニンを標的にするｓｉＲＮＡを含有する、ペプチドベースのナノ粒子は、膵癌について特に関心がある。
【００８７】
遺伝子およびタンパク質発現プロファイリングに基づく患者の選択：患者サンプルにおけるＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、および他のバイオマーカーのレベルを決定するための遺伝子発現プロファイリング、組織診断、免疫組織化学的検査、プロテオミクス分析、および他の十分に認められている技術の標準的な技術は、患者を処置するのに特に関心のある遺伝子またはタンパク質を同定するために利用することができる。たとえば、患者が、高レベルの特定の遺伝子またはタンパク質の発現を有することが検出される場合、医薬組成物は、患者の特定の状態とマッチするように適切に調節されてもよい。したがって、患者が高レベルのＣＴＧＦまたはＳＰＡＲＣを有する場合、前記患者に投与されることになっている医薬組成物は、ＣＴＧＦまたはＳＰＡＲＣを抑制するために、適切な量の活性作用物質を含有してもよい。この分析に基づいて、適した医薬組成物は、病的な状態を寛解させるために特定の遺伝子またはタンパク質を処置するまたは阻害するために選択的に選択されてもよい。したがって、たとえば、本出願は、いくつかの実施形態において、個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する１つ以上の活性作用物質（オリゴヌクレオチド、たとえば干渉ＲＮＡを含む核酸などのような）を含む、有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含み、個体が、線維症または炎症の発症および進行に関与する、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいて選択される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、活性作用物質が、選択される標的遺伝子の発現を阻害するために、発現プロファイルに基づいて選択される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、１）線維症または炎症の発症および進行に関与する、少なくとも１つの（たとえば少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、またはそれ以上のいずれかを含む）遺伝子の発現レベルを決定するステップならびに２）線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する１つ以上の活性作用物質（オリゴヌクレオチド、たとえば干渉ＲＮＡなどのような核酸を含む）を含む、有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、活性作用物質が、選択される標的遺伝子の発現を阻害するために、発現プロファイルに基づいて選択される。
【００８９】
投薬量、投与ルート：医薬組成物は、経口、静脈内、動脈内、心臓内、内カテーテル、腹腔内、膀胱内、経皮、経鼻吸入、肺送達、腔内、頭蓋内、髄腔内、皮下、皮内、筋肉内、眼内、局所、直腸、膣、直接的な注射／投与、またはエレクトロトランスファーもしくはマイクロニードル注射による局所的な送達によって投与されてもよい。
【００９０】
ヒトまたは哺乳動物被験体の処置に適していることがわかっている本発明の医薬組成物の投薬量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの活性作用物質の範囲にある。より好ましい投薬量の範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇである、より好ましくは、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、たとえば０．１〜０．５、０．５〜１の範囲にある。被験体に対する投与のスケジュールは、処置全体を構成する単一の投与〜毎日の投与の範囲にわたってもよい。より好ましくは、投与は、３〜３０日毎に１回、最も好ましくは、４〜７日毎に１回である。
【００９１】
ＩＶ．キット、組成物、試薬、および製造品
本明細書において記載される方法に有用なキット、試薬、および製造品もまた、本明細書において提供される。そのようなキットは、活性作用物質を含有するバイアルとは別々に、キャリア分子を含有するバイアルを含有してもよい。患者の処置の時に、たとえば患者サンプルの遺伝子発現解析またはプロテオミクスもしくは組織学的分析に基づいてどの特定の病態の状態が処置されるべきかが、第１に決定される。それらの結果が得られたら、キャリア分子は、有効な処置を患者に投与することができる複合体またはナノ粒子をもたらすように、適切な活性作用物質分子と混合される。したがって、いくつかの実施形態において、１）２つ以上の活性作用物質（核酸、たとえばオリゴヌクレオチドなど）；２）細胞浸透性ペプチドを含むキットが、提供される。いくつかの実施形態において、キットが、遺伝子発現プロファイルを決定するための作用物質をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットが、薬学的に許容できるキャリアをさらに含む。
【００９２】
本明細書において記載されるキットは、本発明の方法を実施するために、キットの構成成分を使用するための説明書（たとえば、本明細書において記載される医薬組成物を作製するためのおよび／または医薬組成物の使用のための説明書）を含む。本発明の方法を実施するための説明書は、一般に、適した記録メディア上に記録される。たとえば、説明書は、紙またはプラスチックなどのような基体上に印刷されてもよい。そのため、説明書は、添付文書としてキット中に、キットまたはその構成成分の容器の標識に（すなわち、パッケージまたはサブパッケージと関連して）、などに存在してもよい。いくつかの実施形態において、説明書が、適したコンピューター読取り可能な記憶メディア、たとえばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット上などに存在する電子記憶装置データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明書が、キット中に存在しないが、たとえばインターネットを介して遠隔の供給源から説明書を得るための手段が、提供される。この実施形態の例として、説明書を見ることができるおよび／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットがある。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、適した基体上に記録される。
【００９３】
キットの様々な成分は、別々の容器中にあってもよく、容器は、単一のケース、たとえばボックス内に含有されてもよい。
【００９４】
本明細書において記載される製造品のいずれかを作製するための方法が、本明細書においてさらに提供される。
【００９５】
本発明は、下記に詳細に記載され、次のものを含む。
【００９６】
個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する１つ以上の核酸を含む、有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法。
【００９７】
いくつかの実施形態において、２つ以上の遺伝子が、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１からなる群より選択される。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。
【００９８】
いくつかの実施形態において、個体における線維性状態または炎症状態を処置するための方法であって、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ならびにｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＰａｔｃｈｅｄ−１から選択される、線維症または炎症の発症および進行に関与する２つ以上の遺伝子の活性または発現を調整する、１つ以上の活性作用物質を含む有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法が提供される。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、１つ以上の活性作用物質が、核酸である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、少なくとも１つの核酸が、一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、少なくとも１つの核酸が、二本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、少なくとも１つの核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡからなる群より選択される。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、少なくとも１つの核酸が、ＲＮＡｉである。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、少なくとも１つの核酸が、ｓｉＲＮＡである。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、少なくとも１つの核酸が、ｓｈＲＮＡである。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、少なくとも１つの核酸が、約１０〜約５０ヌクレオチド長である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、組成物が、２つ以上の核酸を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、２つ以上の核酸が、同じ種類のものである。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、２つ以上の核酸が、様々な種類のものである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、組成物が、２つの核酸を含み、２つの核酸のモル比が、約０．１：１〜約１０：１である。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、医薬組成物における２つ以上の核酸が、等モルの割合である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、核酸が、キャリア分子と会合している。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、核酸が、キャリア分子と共有結合で会合している。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、核酸が、キャリア分子と非共有結合で会合している。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、キャリア分子が、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルからなる群より選択される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、キャリア分子が、ペプチドである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、ペプチドが、細胞浸透性ペプチドである。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、細胞浸透性ペプチドが、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、Ｐｅｐ−１ペプチド、またはＰｅｐ−２ペプチドからなる群より選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、核酸および細胞浸透性ペプチドが、複合体で存在する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、組成物が、核酸および細胞浸透性ペプチドの複合体を含むナノ粒子を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、ナノ粒子の平均サイズが、５０〜４００ｎｍである。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、組成物における細胞浸透性ペプチドおよび核酸のモル比が、約１００：１〜約１：５０である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、活性作用物質が、ＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、ＴＩＭＰから選択される２つ以上の遺伝子の活性または発現を調整する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、活性作用物質が、ＳＰＡＲＣおよびＴＧＦベータ１の活性を調整する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、線維性状態または炎症状態が、肺線維症、特発性肺線維症、肺の進行性塊状線維症、嚢胞性線維症、縦隔線維症、肝線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、心線維症、陳旧性心筋梗塞、進行性腎疾患、腎線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、強皮症／全身性硬化症、関節線維症、癒着性関節包炎、線維筋痛症、腹膜線維症、放射線誘発性線維症、熱傷誘発性線維症、外傷誘発性線維症、瘢痕線維症、および創傷治癒線維症からなる群より選択される。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、線維性状態または炎症状態が、線維形成性の癌であり、線維形成性の癌が、その場所とは無関係な扁平上皮がん、胆膵路がん、中皮腫、類腱線維腫、線維形成性円形細胞腫瘍、乳癌、卵巣癌、結腸直腸がんおよび胃腸管の腫瘍、肺癌、リンパ腫、骨髄線維症、白血病、黒色腫、脳腫瘍（膠芽腫、大脳星状細胞腫、神経芽細胞腫、および髄芽腫を含む）、膀胱癌、肝細胞腫瘍および尿路上皮腫瘍、ならびに下垂体の腫瘍からなる群より選択される。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、前記医薬組成物が、経口、静脈内、動脈内、心臓内、内カテーテル、腹腔内、膀胱内、経皮、経鼻吸入、肺送達、腔内、頭蓋内、髄腔内、皮下、皮内、筋肉内、眼内、局所、直腸、膣、直接的な注射／投与、またはエレクトロトランスファーもしくはマイクロニードル注射による局所的な送達によって投与される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、個体が、線維症または炎症の発症および進行に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに対して基づいて選択される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法によれば、本発明が、さらに、医薬組成物の投与の前に少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを必要とする。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、本発明が、線維症または炎症の発症または進行に関与する２つ以上の遺伝子の発現を調整する２つ以上の活性作用物質を含む医薬組成物を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本発明が、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２）、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ受容体１、ＴＧＦベータ受容体２、ＴＧＦベータ受容体３、ベータ−カテニン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ  ３、Ｓｍａｄ  ４、Ｓｍａｄ  ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−ｋＢおよびＰＡＲＰ−１  ＧＡＤ６５、ｓＧＡＤ６５、ＢＡＸ、ｐ５３  ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ならびにＰａｔｃｈｅｄ−１からなる群より選択される２つ以上の遺伝子を必要とする。本発明について関心のある他の遺伝子は、ＨＩＦ−１アルファである。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本発明は、２つ以上の活性作用物質が同じ種類のものであることを必要とする。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本発明は、２つ以上の活性作用物質が様々な種類のものであることを必要とする。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本発明は、組成物が、２つの活性作用物質を含み、２つの活性作用物質のモル比が、約０．１：１〜約１０：１であることを必要とする。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、本発明は、医薬組成物における２つ以上の活性作用物質が、等モルの割合であることを必要とする。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本発明は、２つ以上の活性作用物質が、核酸であることを必要とする。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの核酸が、一本鎖オリゴヌクレオチドであることを必要とする。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの核酸が、二本鎖オリゴヌクレオチドであることを必要とする。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡからなる群より選択されることを必要とする。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの核酸が、ＲＮＡｉであることを必要とする。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの核酸が、ｓｉＲＮＡであることを必要とする。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの核酸が、ｓｈＲＮＡであることを必要とする。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの核酸が、約１０〜約５０ヌクレオチド長であることを必要とする。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本発明は、核酸が、キャリア分子と会合していることを必要とする。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、本発明は、核酸が、キャリア分子と共有結合で会合していることを必要とする。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本発明は、核酸が、キャリア分子と非共有結合で会合していることを必要とする。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本発明は、キャリア分子が、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルからなる群より選択されることを必要とする。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本発明は、キャリア分子が、ペプチドであることを必要とする。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本発明は、ペプチドが、細胞浸透性ペプチドであることを必要とする。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞浸透性ペプチドが、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、Ｐｅｐ−１ペプチド、またはＰｅｐ−２ペプチドからなる群より選択されることを必要とする。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、本発明は、核酸および細胞浸透性ペプチドが、複合体で存在することを必要とする。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本発明は、組成物が、核酸および細胞浸透性ペプチドの複合体を含むナノ粒子を含むことを必要とする。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本発明は、ナノ粒子の平均サイズが、５０〜４００ｎｍであることを必要とする。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本発明は、組成物における細胞浸透性ペプチドおよび核酸のモル比が、約１００：１〜約１：５０であることを必要とする。
【実施例】
【０１５５】
以下のものは、本発明の方法および組成物の例である。様々な他の実施形態が、上記に提供される一般的な説明を考慮して、実施され得ることが理解される。
【０１５６】
実施例１ａ：
この実施例は、ペプチド−ｓｉＲＮＡ複合体の調製についての情報を提供する。ペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子の調製および特徴付け：ｓｉＲＮＡ配列は、８つの選択したマウス遺伝子を標的にするために設計されるであろう：ＴＧＦベータ受容体１および２、ＣＴＧＦ、アデノシン受容体Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ、ＳＰＡＲＣ、ならびにＴＩＭＰ−１および−３。ペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、両親媒性ペプチドおよび線維症関連遺伝子を標的にする個々のｓｉＲＮＡを混合することによって調製する。両親媒性ペプチドの原液を、蒸留水中１ｍｇ／ｍＬで調製し、１０分間、超音波処理する。ｓｉＲＮＡの原液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡバッファー中１００μＭの濃度で調製する。ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体は、ペプチド（３７３μＭ原液）を、ｓｉＲＮＡ（１００μＭ原液）と、３０分間、３７℃で、２０：１のペプチドおよびｓｉＲＮＡの最終モル比でインキュベートすることによって、純水中で形成させる。ペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、粒径、表面電荷、懸濁液および血漿中での粒子安定性、ならびに血漿中のｓｉＲＮＡ完全性を含む、重要なパラメーターについて、インビトロにおける物理化学的な特性について特徴付られるであろう。
【０１５７】
実施例１ｂ：
この実施例は、ペプチド−複数のｓｉＲＮＡの複合体の調製についての情報を提供する。ペプチドｓｉＲＮＡナノ粒子の調製および特徴付け：ｓｉＲＮＡ配列は、８つの選択したマウス遺伝子を標的にするために設計されるであろう：ＴＧＦベータ受容体１および２、ＣＴＧＦ、アデノシン受容体Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ、ＳＰＡＲＣ、ならびにＴＩＭＰ−１および−３。複数のｓｉＲＮＡの組み合わせを有するペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、両親媒性ペプチドおよび線維症関連遺伝子を標的にする所望の個々のｓｉＲＮＡを混合することによって調製する。両親媒性ペプチドの原液を、蒸留水中１ｍｇ／ｍＬで調製し、１０分間、超音波処理する。複数のｓｉＲＮＡの原液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡバッファー中１００μＭの総濃度で一緒に調製する。複数のｓｉＲＮＡ、たとえばＳＰＡＲＣ、ＴＧＦベータ受容体１、およびアデノシン受容体Ａ２Ａに対するｓｉＲＮＡを含有するペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を、等しい割合で取り、ペプチド（３７３μＭ原液）を、ｓｉＲＮＡ混合物（１００μＭ原液）と、３０分間、３７℃で、２０：１のペプチドおよびｓｉＲＮＡの最終モル比でインキュベートすることによって、純水中で形成させる。その代わりに、コアとなる複合体を、約５：１のペプチド対ｓｉＲＮＡ比で第１に形成させ、その後、ペプチドの、コアとなる複合体との２０：１の比でのインキュベーションの第２のステップを続けてもよい。ペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、粒径、表面電荷、懸濁液および血漿中での粒子安定性、ならびに血漿中のｓｉＲＮＡ完全性を含む、重要なパラメーターについて、インビトロにおける物理化学的な特性について特徴付られるであろう。
【０１５８】
実施例２：
この実施例は、ＳＰＡＲＣおよびＣＴＧＦ  ｓｉＲＮＡが、ＣＴＧＦトランスジェニックマウスの皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン１型の発現を低下させることを示すための情報を提供する。Ｃｏｌ１ａ２遺伝子（Ｃｏｌｌａ２−ＣＴＧＦ）のエンハンサー／プロモーターエレメントのコントロール下で線維芽細胞において結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｃｏｌ１ａ２−ＣＴＧＦ）は、強皮症（ＳＳｃ）において観察される線維症に類似する多臓器線維症を再現する。この研究において、Ｃｏｌ１ａ２−ＣＴＧＦトランスジェニックマウスに由来する線維芽細胞におけるいくつかの細胞外マトリックス構成成分の発現に対するＳｐａｒｃ  ｓｉＲＮＡおよびＣｔｇｆ  ｓｉＲＮＡの調節を調査した。３つの線維芽細胞系を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＣＴＧＦトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６のそれぞれから得、Ｓｐａｒｃ  ｓｉＲＮＡまたはＣｔｇｆ  ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトした。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングは、Ｉ型コラーゲン、ＣＴＧＦ、およびＳＰＡＲＣの転写レベルおよびタンパク質レベルを検査するために使用した。スチューデントのｔ−検定は、結果の有意性を決定するために使用した。結果は、それらの通常の野生型同腹仔由来の線維芽細胞と比較して、Ｃｏｌ１ａ２−ＣＴＧＦトランスジェニックマウス由来の線維芽細胞において転写レベルおよび翻訳レベルでＣｏｌ１ａ２およびＣｔｇｆの発現が増加することを示した。Ｓｐａｒｃ  ｓｉＲＮＡまたはＣｔｇｆ  ｓｉＲＮＡによる処置は、これらの線維芽細胞におけるＣｏｌ１ａ２、Ｃｔｇｆ、およびＳｐａｒｃのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を弱めた。Ｓｐａｒｃ  ｓｉＲＮＡおよびＣｔｇｆ  ｓｉＲＮＡはまた、転写物レベルでの相互の阻害を示した。そのため、結果は、ＳＰＡＲＣおよびＣＴＧＦの両方が、独立して、同じ生物学的経路に関与するように思われたことならびにそれらが、ＳＳｃなどのような線維性疾患についての治療標的として果たす可能性を有することを示した。
【０１５９】
実施例３：
この実施例は、ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡおよびＣＴＧＦ  ｓｉＲＮＡが、マウスにおけるブレオマイシン誘発性の皮膚および肺の線維症を低下させることを示すための情報を提供する。ＳＰＡＲＣは、マトリックス細胞タンパク質であり、これは、コラーゲンを含む他の細胞外マトリックス構成成分に加えて、線維性疾患において一般に過剰発現される。この研究の目的は、ＳＰＡＲＣの阻害が、インビトロおよびインビボにおいて、コラーゲン発現を調節することができるかどうかおよび続いてマウス皮膚および肺におけるブレオマイシンによる線維性の刺激を弱めることができるかどうかを検査することとした。インビトロにおける研究において、Ｔｇｆｂｒ１ノックインマウス（ＴＢＲ１ＣＡ；Ｃｒｅ−ＥＲ）から得られた皮膚線維芽細胞に、ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。Ｃｏｌ１ａ２およびＣｔｇｆの遺伝子およびタンパク質の発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによってそれぞれ検査した。インビボにおける研究において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ブレオマイシンによって皮膚および肺の線維症を誘発させ、その後、それぞれ皮下注射および気管内滴下注入を通してＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡにより処置した。皮膚および肺の病的な変化は、ヘマトキシリンおよびエオシンおよびマッソンのトリクローム染色によって評価した。組織におけるコラーゲンの発現変化は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび非架橋線維性コラーゲン含有量アッセイによって評価した。ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡは、恒常的に活性なＴＧＦ−ベータ受容体Ｉについて誘発させたＴＢＲ１ＣＡ；Ｃｒｅ−ＥＲマウスから得られた線維芽細胞におけるコラーゲン１型の遺伝子およびタンパク質発現を有意に低下させた。ブレオマイシンによって誘発された皮膚および肺の線維症は、ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡによる処置によって著しく低下した。インビボにおけるＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡの抗線維性の効果は、これらの同じ組織においてＣｔｇｆ発現の阻害が伴った。ＳＰＡＲＣの特異的な阻害は、インビトロおよびインビボにおいて線維性の変化を有効に低下させた。ＳＰＡＲＣ阻害は、線維性疾患に対する可能性のある治療上のアプローチに相当し得る。
【０１６０】
実施例４：
この実施例は、ペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子のビトロ評価を示すための情報を提供する。
【０１６１】
線維形成遺伝子に対する個々のｓｉＲＮＡおよびそれらの組み合わせを持つペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、細胞へのｓｉＲＮＡ送達、標的ダウンレギュレーション、およびコラーゲン沈着の阻害の効能について、３つの異なる線維症モデルの細胞培養においてインビトロにおいて評価されるであろう。異なるｓｉＲＮＡの効果は、複数の線維形成遺伝子および経路の間の相互作用を同定するためにならびに線維症マウスモデルに対するインビボ試験について最適な組み合わせを合理的に選択するために比較されるであろう。３つの線維芽細胞モデルの細胞培養物におけるペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子によるインビトロｓｉＲＮＡ送達：
−細胞培養：線維症の３つの樹立インビトロ細胞株を選択する：ＣＴＧＦトランスジェニックマウスから単離される、ＣＴＧＦを過剰発現するマウス線維芽細胞［２１］、ＴＧＦベータＲ１ノックインマウスで単離される、ＴＧＦベータ受容体１を過剰発現するマウス皮膚線維芽細胞［２９］、およびＡＤＡヌルマウスから単離されるマウス皮膚線維芽細胞［３９］。
【０１６２】
−インビトロｓｉＲＮＡ送達：異なるｓｉＲＮＡおよびそれらの組み合わせおよびスクランブルｓｉＲＮＡを含有するナノ粒子は、３０分間、マウス線維芽細胞と共に、その後新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳと共にインキュベートする。
【０１６３】
サンプルの回収およびプロセシング：ｓｉＲＮＡ送達の７２時間後に、細胞を収集し、その後、ｍＲＮＡおよびタンパク質精製を続ける。
【０１６４】
分析：標的遺伝子およびコラーゲンＩのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、それぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによって分析する。
【０１６５】
結果：標的およびコラーゲンＩのｍＲＮＡのレベルおよびタンパク質は、遺伝子ノックダウンの程度およびコラーゲン沈着に対する効果を決定するために、コントロールおよび処置グループの間で比較されるであろう。重要な線維形成遺伝子の有効なダウンレギュレーションは、インビトロ線維症モデルにおいて示されるコラーゲン沈着を防止することができる。様々な線維形成遺伝子に対する個々のｓｉＲＮＡおよび組み合わせの効果は、複数の線維性遺伝子およびシグナル伝達経路の間の相互作用を決定し、可能性のある相乗的な相互作用を同定するために分析されるであろう。
【０１６６】
実施例５：
この実施例は、ペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子のインビボスクリーニングおよび用量範囲探索試験（ｄｏｓｅ  ｒａｎｇｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ）を示すための情報を提供する
インビボスクリーニングおよび用量範囲探索試験は、最適なｓｉＲＮＡの組み合わせおよび用量を同定するために、ブレオマイシン肺およびアデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡヌル）マウスモデルにおいて行われるであろう。異なるマウス線維症モデルは、疾患進行について別個の分子的な病態を有する。そのため、線維症の２つの独立したモデルを、実施例４においてインビトロスクリーニングを通して選択したペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子のインビボ試験のために用いる。ブレオマイシンの気管内（ＩＴ）滴下注入によって引き起こされた肺線維症モデルは、以前に報告された［２９］。アデノシンデアミナーゼを欠くＡＤＡヌルマウスは、高レベルのアデノシンを蓄積し、これは、肺の炎症および線維症のために、重度のびまん性皮膚線維症および誕生の３週間後に早死にをもたらす［４０］。異なる用量レベルでの、選択したペプチド−ｓｉＲＮＡナノ粒子の試験は、標的遺伝子ダウンレギュレーションについて安全で有効な用量を決定し、インビボにおける抗線維形成効能に対する予備的な指標を提供するであろう。ｓｉＲＮＡナノ粒子は、全身的および局所的な送達の安全性および効能を比較するために、静脈内（ＩＶ）およびＩＴの両方で、ブレオマイシン肺線維症モデルに投与されるであろう。ＡＤＡヌルマウスは、広汎性で全身的な線維性疾患をコントロールするための全身的な療法についての能力を試験するために、ＩＶ投与されるであろう。異なるモデルにおける線維症の重要なプロモーターは、実施例５において、インビボ効能試験に最適なｓｉＲＮＡの組み合わせを合理的に設計するために同定し、使用することができる。
【０１６７】
マウス線維症モデル：ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルは、食塩水中に溶解した３．５単位／ｋｇのブレオマイシンによるＣ５７ＢＬ／６マウスの一度だけのＩＴ滴下注入による確立された方法の後に生成されるであろう［２９］。ＡＤＡ欠損マウスは、以前に記載されるように生成した［３９］。
【０１６８】
インビボにおけるｓｉＲＮＡナノ粒子の投与：
−ブレオマイシン肺線維症モデル：ブレオマイシン処置後の２、５、１２日目に、それぞれのｓｉＲＮＡナノ粒子グループに、ｓｉＲＮＡを３つの異なる用量レベルでＩＶまたはＩＴ投与する：０．１５ｍｇ／ｋｇ（３ｕｇ／マウス）、０．５ｍｇ／ｋｇ（１０ｕｇ／マウス）、および１．５ｍｇ／ｋｇ（３０ｕｇ／マウス）。動物グループ（ｎ＝３／グループ）は、１）コントロール（食塩水の１回のＩＴ滴下注入を受けるＣ５７ＢＬ／６マウス）；２）ブレオマイシン（ブレオマイシンの１回のＩＴ滴下注入を受けるＣ５７ＢＬ／６マウス）；３）スクランブルＩＶ（スクランブルｓｉＲＮＡを持つ３用量のナノ粒子によりＩＶ処置したブレオマイシンマウス）；４）スクランブルＩＴ；５〜１４）ｓｉＲＮＡ  ＩＶ（推定された４つの個々のｓｉＲＮＡおよび６つの異なるｓｉＲＮＡの組み合わせ、３用量レベルでＩＶ処置した合計１０のｓｉＲＮＡ処置グループ−１匹の動物／レベル）；１５〜２４）ｓｉＲＮＡ  ＩＴとする。動物の総数：３×２４グループ＝７２匹のＣ５７ＢＬ／６マウス。
【０１６９】
−ＡＤＡヌルマウス：誕生後の２、５、１２日目に、マウスを３用量レベルで異なるｓｉＲＮＡナノ粒子によりＩＶ処置した：０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、および１．５ｍｇ／ｋｇ。ＡＤＡヌルマウスを有する動物グループ（（ｎ＝３／グループ）を、１）食塩水；２）スクランブルｓｉＲＮＡ；３〜１２）ｓｉＲＮＡ（３用量レベルの１０のｓｉＲＮＡナノ粒子グループ−１匹の動物／レベル）により処置する。動物の総数：３×１２グループ＝３６匹のＡＤＡヌルマウス。
【０１７０】
サンプルの回収およびプロセシング：ブレオマイシン処置マウスについて、マウスはすべて、２３日目に屠殺されるであろう、また、肺サンプルが回収される。左肺を４％ホルマリンによって固定し、さらなる組織学的分析に使用する。右肺は、細かく切って小片にし、ＲＮＡ抽出およびコラーゲン含有量分析に分ける。ＡＤＡヌルマウスについては、マウスはすべて、誕生後２３日目に屠殺されるであろう、また、肺、皮膚、および肝臓は、回収し、組織診断、ＲＮＡ、およびコラーゲンタンパク質レベルについて分析する。
【０１７１】
分析：スクランブルまたは試験ｓｉＲＮＡにより処置したマウスから収集したサンプルは、ＲＮＡレベルについてはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、また、タンパク質発現についてはウェスタンブロットによって、標的遺伝子ダウンレギュレーションについて分析する。コラーゲンは、Ｈ＆Ｅおよびマッソン三色染色を使用して視覚化し、以前に記載される方法に続いてＳｉｒｃｏｌ比色定量アッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、Ｂｅｌｆａｓｔ、ＵＫ）により測定する［２９］。
【０１７２】
結果：コントロール、ブレオマイシン処置、およびｓｉＲＮＡ処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスの間のｍＲＮＡおよびタンパク質発現プロファイルの比較は、重要な線維性遺伝子およびそれらの相互作用を明らかにするであろう。ＩＶまたはＩＴによるｓｉＲＮＡナノ粒子による処置は、用量依存的な形で、標的遺伝子および可能性として他の線維性遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを有意にダウンレギュレートするであろう。重要な線維性遺伝子の強いノックダウンは、組織診断およびコラーゲン含有量測定の両方によって実証されるように、コラーゲン沈着の有意な低下と相関するであろう。ＡＤＡヌルマウスの生存は、ｓｉＲＮＡナノ粒子処置によって可能性として延長され得る。３つの最も有効なｓｉＲＮＡナノ粒子の組み合わせは、実施例５において拡張効能試験のために選択されるであろう。
【０１７３】
実施例６：
この実施例は、選択したｓｉＲＮＡの組み合わせの安全性および抗線維症効能のインビボにおける評価を示すための情報を提供する。
【０１７４】
３つの選択したｓｉＲＮＡの組み合わせのインビボにおける安全性および抗線維症効能は、ブレオマイシン肺線維症およびＡＤＡヌルマウスモデルにおいて評価されるであろう。実施例５における予備的研究は、ＩＶおよびＩＴのルートを介してのインビボにおける送達について、３つの最も有効なｓｉＲＮＡナノ粒子の組み合わせおよび安全な用量を示唆するであろう。この目的における研究は、より長い繰り返しの処置による、選択したｓｉＲＮＡの組み合わせの安全性および効能を実証し、可能性のある治療剤へのさらなる開発のために１つの最適なｓｉＲＮＡの組み合わせにしぼることを試みるものである。
【０１７５】
マウス線維症モデル：ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルおよびＡＤＡ欠損マウスは、実施例５において記載される。
【０１７６】
インビボにおけるｓｉＲＮＡナノ粒子の投与：
−ブレオマイシン肺線維症モデル：ブレオマイシン処置後の２、５、１２、１９、２６日目に、マウスは、実施例５において決定される用量で、選択したｓｉＲＮＡの組み合わせにより処置されるであろう。マウスは、ｓｉＲＮＡ処置後に、体重減少および毒性徴候についてモニターする。動物グループ（ｎ＝８／グループ）は、１）コントロール；２）ブレオマイシン；３）スクランブルＩＶ；４）スクランブルＩＴ；５〜７）ｓｉＲＮＡ  ＩＶ；８〜１０）ｓｉＲＮＡ  ＩＴとする。動物の総数：８×１０グループ＝８０匹のＣ５７ＢＬ／６マウス。
【０１７７】
−ＡＤＡヌルマウス：誕生後の２、５、１２日目に、マウスを、実施例４において決定される用量で、選択したｓｉＲＮＡの組み合わせによりＩＶ処置する。マウスは、ｓｉＲＮＡ処置後に、体重減少および毒性徴候についてモニターする。ＡＤＡヌルマウス（ｎ＝８／グループ）を有する動物グループを、１）食塩水；２）スクランブルｓｉＲＮＡ；３〜５）ｓｉＲＮＡより処置する。動物の総数：８×５グループ＝４０匹のＡＤＡヌルマウス。
【０１７８】
サンプルの回収およびプロセシング：サンプル回収およびプロセシングは、３６日目に、実施例４において概説された方法に従うであろう。
【０１７９】
分析：サンプル分析は、実施例５において概説される方法に従うであろう。
【０１８０】
結果：この研究からの結果は、概して、実施例４からの予備的なデータと一致するであろう。標的および他の線維性遺伝子のノックダウンは、組織学的分析およびコラーゲン含有量測定によって示されるように、線維症病変におけるコラーゲン沈着の減少によって示されるような抗線維性の効能と相関するであろう。２つのマウス線維症モデルにおいて重要な線維性遺伝子のレベルを減少させ、線維症を低下させるのに最も有効なｓｉＲＮＡの組み合わせは、ヒト線維性疾患のための治療剤へのさらなる開発のために選択されるであろう。
【０１８１】
実施例７：
この実施例は、ペプチド−プラスミドＤＮＡナノ粒子の安定性の増加を示すための情報を提供する。
【０１８２】
ペプチド−プラスミドナノ粒子は、両親媒性ペプチドおよびプラスミドを混合することによって調製した。両親媒性ペプチドの原液を、蒸留水中１ｍｇ／ｍＬで調製し、１０分間、超音波処理する。プラスミドの原液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡバッファー中１００μＭの濃度で調製する。ペプチド／プラスミド複合体またはナノ粒子を、ペプチド（３７３μＭ原液）を、プラスミド（１００μＭ原液）と、３０分間、３７℃で、１０：１または２０：１のペプチドおよびプラスミドの最終モル比でインキュベートすることによって、純水中で形成させる。プラスミドのみおよびペプチド／プラスミド複合体は、プラスミドの安定性を試験するために４０℃で１週間、ＰＢＳ中で保存する。スーパーコイルＤＮＡのパーセンテージは、標準的な技術を使用して、アガロースゲル電気泳動法を使用して１週間後に測定する（たとえばＰｉｌｌａｉ  ＶＢ、Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ  Ｍ、Ｙｕ  Ｔ、Ａｍａｒａ  ＲＲ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＨＬ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ  ａｎｄ  ｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００８  Ｆｅｂ  ２０；２６（８）：１１３６−４１を参照されたい）。ＰＢＳ中９５％のスーパーコイルＤＮＡが４０℃で８０％スーパーコイルに到達するのにおよそ７日間かかる。ペプチドプラスミド複合体の場合には、スーパーコイルのレベルは、１週間で＞９０％に維持される。
【０１８３】
実施例８：
この実施例は、選択したｓｉＲＮＡの組み合わせによる、線維症および炎症を有する癌（膵癌）の処置を示すための情報を提供する。
【０１８４】
膵癌および他のいくつかの癌は、線維性または線維形成性の間質を有することが知られている。しかしながら、膵癌の間質性構成成分を特異的に標的にする研究はなかった。ＣＴＧＦ、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ、ＴＧＦベータ１または２、ＭＭＰ、およびベータ−カテニンを標的にするｓｉＲＮＡを含有する、ペプチドベースのナノ粒子は、上記に記載されるように調製し、患者からの直接の膵臓異種移植片を有する無胸腺マウスに投与したまたは膵癌を自発的に発症する、遺伝子操作マウスにおいて使用した。一旦腫瘍が検出可能となったら、静脈内投与を開始した。動物は、コントロールグループと共に５回の処置について、４日毎に処置した。腫瘍サイズは、研究の過程の全体にわたってモニターし、腫瘍組織診断は、５回の処置の後に決定した。間質性構成成分、特にコラーゲンの有意な低下が処置の後に観察された。
【０１８５】
すべての使用のためにそれらの全体が本明細書において組み込まれる参考文献の一覧
Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ［２０１１、ｈｔｔｐ：／／ｆ１０００．ｃｏｍ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ｂ／３／２１；ｈｔｔｐ：／／ｆ１０００．ｃｏｍ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ｂ／３／２１／ｐｄｆ］による刊行物は、アデノシン受容体および線維症の重要性を強調し、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
Ｗａｎｇら（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０；１２（２）：Ｒ６０．  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ａｐｒ  １．）による刊行物Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗｉｔｈ  ＳＰＡＲＣ
ｓｉＲＮＡ：は、ＳＰＡＲＣおよび線維症の重要性を強調し、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
【０１８６】
Ｗａｎｇら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１１  Ｊｕｌ−Ｓｅｐ；２４（３）：５９５−６０１）による刊行物Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉＲＮＡｓ  ｔｏ  Ｓｐａｒｃ  ａｎｄ  Ｃｔｇｆ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｏｆ  ＣＴＧＦ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．は、ＳＰＡＲＣおよび線維症の重要性を強調し、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
【０１８７】
Ｃｈａｎｇら［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．  ２８５、ＮＯ．  １１、ｐｐ．  ８１９６−８２０６、Ｍａｒｃｈ  １２，  ２０１０］による刊行物ＳＰＡＲＣ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ：は、肺線維症におけるＳＰＡＲＣの関連性を強調し、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
【０１８８】
Ｓ．  Ｓｈｉｂａｔａ１、Ｊ．  Ｉｓｈｉｙａｍａ１、Ｋ．  Ｈａｇｉｈａｒａ１、Ｋ．  Ｍｕｒａｋａｍｉ（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８３；２０１１：Ａ３４７８）による刊行物Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｉｄｉｃ  Ａｎｄ  Ｒｉｃｈ  Ｉｎ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ｓｐａｒｃ）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｂｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｔｇｆ−Ｂｅｔａ  Ｖｉａ
Ｐｉ３ｋ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：は、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
【０１８９】
Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＰＡＲＣ
ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ：Ｃａｍｉｎｏ  ＡＭ、Ａｔｏｒｒａｓａｇａｓｔｉ  Ｃ、Ｍａｃｃｉｏ  Ｄ、Ｐｒａｄａ  Ｆ、Ｓａｌｖａｔｉｅｒｒａ  Ｅ、Ｒｉｚｚｏ  Ｍ、Ａｌａｎｉｚ  Ｌ、Ａｑｕｉｎｏ  ＪＢ、Ｐｏｄｈａｊｃｅｒ  ＯＬ、Ｓｉｌｖａ  Ｍ、Ｍａｚｚｏｌｉｎｉ  Ｇ．［Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ２００８  Ｓｅｐ；１０（９）：９９３−１００４．］この刊行物の内容は、その全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９０】
ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｒｇａｎｓ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｍｐｒｉｎｔｓ：Ｐｏｈｌｅｒｓ  Ｄ、Ｂｒｅｎｍｏｅｈｌ  Ｊ、Ｌｏｆｆｌｅｒ  Ｉ、Ｍｕｌｌｅｒ  ＣＫ、Ｌｅｉｐｎｅｒ  Ｃ、Ｓｃｈｕｌｔｚｅ−Ｍｏｓｇａｕ  Ｓ、Ｓｔａｌｌｍａｃｈ  Ａ、Ｋｉｎｎｅ  ＲＷ、Ｗｏｌｆ  Ｇ．［Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  ２００９  Ａｕｇ；１７９２（８）：７４６−５６．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｎ  １７］この刊行物の内容は、その全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９１】
ＴＧＦ−ｂｅｔａ１  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：（Ｋｕｎ  Ｃｈｅｎｇ、Ｎｉｎｇｎｉｎｇ  Ｙａｎｇ、およびＲａｍ  Ｉ．  Ｍａｈａｔｏ：Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ２００９，  ６（３）、ｐｐ  ７７２−７７９）−この刊行物の内容は、その全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９２】
Ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ  ｐａｉｒ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔｓ：Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ［Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ８、７７３（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００９）｜  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ３００５］この刊行物の内容は、その全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９３】
Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ＴＧＦｂｅｔａ，  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ，  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ，  ＣＣＮ２（ＣＴＧＦ），  ａｎｄ  ＰＤＧＦ，  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ａｎｄｒｅｗ  Ｌｅａｓｋ［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２０１０；１０６：１６７５−１６８０］この刊行物の内容は、その全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９４】
Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ＴＧＦ−ｂｅｔａ１  ｍＲＮＡ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ａｓｂｅｓｔｏｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ１  ａｎｄ  ＣＴＧＦ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：（Ｌａｉ  ＴＣ、Ｐｏｃｉａｓｋ  ＤＡ、Ｆｅｒｒｉｓ  Ｍ、Ｎｇｕｙｅｎ  ＨＴ、Ｍｉｌｌｅｒ  ＣＡ、Ｂｒｏｄｙ  Ａ、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｄ；Ｊ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００９  ．  ２８（２）：１０９−１９）この刊行物の内容は、その全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９５】
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ  ｂｙ  ｓｉＲＮＡ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｔ２４  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：Ｌｉ  Ｙ、Ｙａｎｇ  Ｋ、Ｍａｏ  Ｑ、Ｚｈｅｎｇ  Ｘ、Ｋｏｎｇ
Ｄ、Ｘｉｅ  Ｌ  ；Ｉｎｔ  Ｕｒｏｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ２０１０  Ｊｕｎ；４２（２）：３１５−２３．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ａｕｇ  ８．この刊行物の内容は、その全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９６】
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｋｅｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｓｍａｄ２  ｗｉｔｈ  ｓｉＲＮＡ：Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．  ２００６  Ｎｏｖ；１１８（６）：１３２８−３７．  Ｇａｏ  Ｚ  、Ｗａｎｇ  Ｚ  、Ｓｈｉ  Ｙ、Ｌｉｎ  Ｚ、Ｊｉａｎｇ  Ｈ、Ｈｏｕ  Ｔ、Ｗａｎｇ  Ｑ、Ｙｕａｎ  Ｘ、Ｚｈａｏ  Ｙ、Ｗｕ  Ｈ、Ｊｉｎ  Ｙ．この刊行物の内容は、その全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９７】
米国特許第８，０６７，３８９号明細書は、特異的なｓｉＲＮＡ配列によるＴＧＦベータＩＩ型受容体発現のサイレンシング記載し、この内容は、それらの全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９８】
米国特許第８，００３，６２１号明細書は、カチオンポリマーキャリア、標的作用物質、および標的器官もしくは組織内の線維症を阻害するまたは癌細胞の成長を阻害するなどのような治療活性を有する治療剤を含むことができる組成物を開示し、この内容は、それらの全体が本明細書において組み込まれる。
【０１９９】
［以下の番号付けされた参考文献は、本文中の数字と対応する］
【０２００】
【化１】
2018100284.tif 000003
【０２０１】
【化２】
2018100284.tif 000004
【０２０２】
【化３】
2018100284.tif 000005
【配列表】
2018100284000001.app
【外国語明細書】
2018100284000001.pdf