(57)【要約】      （修正有）【課題】構造展開が可能な構造で、広い抗菌スペクトル及び高い抗菌活性を保持しながら低い溶血活性をもつ抗菌剤を提供する。【解決手段】ＬｙｓーＬｙｓーＬｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓのペプチド配列またはＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＬｙｓーＬｙｓーＬｙｓーＮＨ２のペプチド配列を含み、８から１６個の炭素原子からなる炭化水素基のアルキル差を複数含むリポペプチド誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表されるリポペプチド誘導体を含む抗菌剤。
【化１】
2018188407.tif 000008
（（１）式中、Ｙ、Ｚの少なくとも１つは（Ｌｙｓ）３を含み、Ｘは２から５個の天然または非天然のアミノ酸を含む直鎖状あるいは環状構造を持つ誘導体、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して６から２０個の炭素原子からなる炭化水素基を示す。）
【請求項２】
前記一般式（１）のＲ１及びＲ２は、８から１６個の炭素原子からなる化水素基である請求項１に記載のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤。
【請求項３】
前記一般式（１）のＸの中性における総電荷は、０である請求項１又は２に記載のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤。
【請求項４】
前記一般式（１）の中のＸは、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐのペプチド配列である請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤。
【請求項５】
前記一般式（１）の中のＲ１及びＲ２は、Ｃ１２の直鎖の炭化水素基である請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポペプチド誘導体を含む抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）や、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に有効な抗菌試薬として、ダプトマイシンが臨床認可され、リポペプチド系薬剤であるダプトマイシン（下記の式（Ａ））は細菌性感染症の治療において重要な役割を果たしている。
【０００３】
【化１】
2018188407.tif 000002
【０００４】
一方、本発明者らの研究グループは、膜蛋白質可溶化剤として、ジェミニ型界面活性剤の分子骨格を持つリポペプチド誘導体（ＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）合成と機能評価を行った（特許文献１）。ＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔの分子骨格は、２つの長鎖アルキル鎖を側鎖に持つシステイン誘導体を２つ含み、この間にリンカーペプチドとなるペプチド配列を有し、さらにＮ−末端側、Ｃ−末端側にペプチド配列を有するものである（非特許文献１、２、３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−２２４２３２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２９，１１６６７−１１６８０（２０１３）
【非特許文献２】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，７２，６８９８−６９０８（２０１６）
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２７，２４６９−２４７９（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、細菌性感染症に対する治療に用いられる抗菌試薬（あるいは抗生物質）は、継続的な使用により病原性細菌が耐性を獲得することが問題となっており、細菌性感染症に対する治療の将来を想定するとき、新たな抗菌試薬のシーズが望まれる。その際、ダプトマイシンに限らずリポペプチド誘導体は、新たな抗菌試薬のシーズとなることが期待されている。ところが、ダプトマイシンなどは微生物由来であるが故に、非常に複雑な立体構造を持つものが多く、これらをリード化合物とし構造展開した誘導体ライブラリーの構築とそれによる高機能化はほとんど進んでいないという問題があった。
【０００８】
一方、ＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔといったアルキル鎖を複数（２本以上）含むようなリポペプチド誘導体は、これまで薬剤候補の検討対象から外されてきた。ＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔの分子構造は、界面活性剤構造でもあるため、抗菌剤とするには溶血活性等についての安全性上の問題がある。
そこで、本発明の目的は、上記のような問題を解決したリポペプチド誘導体を含む抗菌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討したところ、特定のペプチド配列を含むリポペプチド誘導体（ＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）が、安全性上の問題を解決した抗菌剤であることを見出して本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げるリポペプチド誘導体を含む抗菌剤を提供する。
発明１は、下記の一般式（１）で表されるリポペプチド誘導体を含む抗菌剤である。
【化２】
2018188407.tif 000003
（１）式中、Ｙ、Ｚの少なくとも１つは（Ｌｙｓ）３を含み、Ｘは２から５個の天然または非天然のアミノ酸を含む直鎖状あるいは環状構造を持つ誘導体、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して６から２０個の炭素原子からなる炭化水素基を示す。
非天然アミノ酸とは、オルニチンといった、天然タンパク質に一般に含まれる２０種類のアミノ酸以外のものをいう。
Ｃ６からＣ２０の炭化水素基とは、炭素数が６から２０のうちいずれかの数の、直鎖又は分岐又は環状構造の炭化水素基をいう。
【００１１】
高い抗菌活性と共に低い溶血活性を達成させる観点から、Ｙ又はＺに含まれるＬｙｓの数は３個以上が好ましく、特に連続するＬｙｓの数が３〜５個が好ましい。すなわち（１）式中のＹ、Ｚに含まれる組み合わせとしては、以下のものが特に好ましい。ＹがＡｃ（Ｌｙｓ）３でＺが（Ｌｙｓ）３ＮＨ２（以下、［Ｙ、Ｚ］＝［Ａｃ（Ｌｙｓ）３、（Ｌｙｓ）３ＮＨ２］のように記載する）、［Ｙ、Ｚ］＝［Ａｃ（Ｌｙｓ）３、（Ｌｙｓ）４ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）３、（Ｌｙｓ）５ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）４、（Ｌｙｓ）３ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）４、（Ｌｙｓ）４ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）４、（Ｌｙｓ）５ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）５、（Ｌｙｓ）３ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）５、（Ｌｙｓ）４ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）５、（Ｌｙｓ）５ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）３、ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）４、ＮＨ２］、［Ａｃ（Ｌｙｓ）５、ＮＨ２］、［Ａｃ、（Ｌｙｓ）３ＮＨ２］、［Ａｃ、（Ｌｙｓ）４ＮＨ２］、又は［Ａｃ、（Ｌｙｓ）５ＮＨ２］である。ここで、Ａｃ（Ｌｙｓ）ｎ（ｎは自然数）とは、アミノ酸リシンがｎ個結合した配列にＮ末端側のαアミノ基の保護基としてアセチル基が結合していることをいう。（Ｌｙｓ）ｎＮＨ２（ｎは自然数）とは、アミノ酸リシンがｎ個結合した配列にＣ末端側のカルボキシ基がアミド基に誘導体化されていることをいう。
【００１２】
発明２は、一般式（１）のＲ１及びＲ２は、８から１６個の炭素原子からなる炭化水素基である発明１に記載のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤である。生体膜との相互作用部位としての観点から、Ｒ１及びＲ２は、好ましくは１０から１４個の炭素原子からなる炭化水素基である。
【００１３】
発明３は、一般式（１）のＸの中性における総電荷は、０である発明１又は２に記載のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤である。Ｘを構成する複数のアミノ酸の荷電状態は、正電荷又は負電荷を取りうるが、それら複数のアミノ酸全体の総電荷が０であれば、いわゆるベタインの電荷状態をとることになる。
【００１４】
発明４は、一般式（１）の中のＸは、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐのペプチド配列である発明１〜３のいずれかに記載のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤である。中性におけるＬｙｓの電荷状態は＋１、Ａｓｐの電荷状態は−１であるため、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐのペプチド配列の総電荷は０になっている。
【００１５】
発明５は、一般式（１）の中のＲ１及びＲ２は、Ｃ１２の直鎖の炭化水素基である発明１〜４のいずれかに記載のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤は、特定のリシンを含む配列を持つことにより、溶血活性等についての安全性が確保されている。すなわち、本発明のリポペプチド誘導体を含む抗菌剤は、広い抗菌スペクトル及び高い抗菌活性を保持しながら低い溶血活性をもつ抗菌剤である。さらに本発明は、構造展開が容易な構造であり、耐性菌への対応が可能な構成である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
アルキル鎖を複数（２本以上）含むようなリポペプチド誘導体は、ほぼこれまでコンビナトリアルケミストリーにおいてその研究対象とされてきていない。幾つかこの状況が発生してきた原因は考えられる。
【００１８】
ひとつは、とかくコンビケムに於いてはハイスループットなスクリーニング系の確立も同時に意識されるため、細菌や酵母といった微生物の生合成系を利用し簡便に得られない今回のようなリポペプチド誘導体は、その研究対象から外されざるを得なかったことが考えられる。
【００１９】
また、仮に有機合成化学的に各誘導体の合成をするにしても、比較的親水性の高いペプチド部位と疎水性のアルキル鎖という真逆の性質が混ざりあった分子は、化合物としての扱いや単離精製が難しかったことも考えられる。
【００２０】
もし仮にこれを微生物の生合成系で行う場合には、細胞由来の夾雑物も混在するために単離精製がより一層困難となることは想像に難くないが、コアシェル型シリカを基体としたＯＤＳカラムの登場により、比較的ルーチンに化合物の単離精製が可能となった。
【００２１】
ところで、細菌性感染症を抗菌剤の経口あるいは血中投与によって治療するには、抗菌剤が血中に存在することになるため、血液に対する抗菌剤の安全性が確保される必要がある。その安全性の程度は抗菌剤の溶血活性を指標とすることができる。
【００２２】
ジェミニ型界面活性剤の分子骨格を有する抗菌剤は、血液に接すると界面活性剤の有する界面活性の作用によって、溶血活性を示す。一方、抗菌活性も同様に、界面活性の作用によって起こされるものであるから、ジェミニ型界面活性剤の分子骨格を有する抗菌剤では抗菌活性と溶血活性は、いわゆるトレードオフの関係にあるといえる。
【００２３】
ここで、本発明のリポペプチド誘導体（ＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）は、そのトレードオフの関係にある抗菌活性と溶血活性を両立して、溶血活性を抑えかつ、高い抗菌活性を有する抗菌剤である。なお、本発明においては、抗菌活性は最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を指標とした。
【００２４】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。以下に記載する実施例である例えばＫ３−ＤＫＤＫＣ１２はＫ３−Ｃ１２ＤＫＤＫＣ１２を、Ｋ４−ＤＫＤＫＣ１２はＫ４−Ｃ１２ＤＫＤＫＣ１２を、ＤＫＤＫＣ１２−Ｋ３はＣ１２ＤＫＤＫＣ１２−Ｋ３を、それぞれ意味する。同様に、比較例である例えばＫ１−ＤＫＤＫＣ１２はＫ１−Ｃ１２ＤＫＤＫＣ１２を、Ｋ２−ＤＫＤＫＣ１２はＫ２−Ｃ１２ＤＫＤＫＣ１２を、Ｒ３−ＤＫＤＫＣ１２はＲ３−Ｃ１２ＤＫＤＫＣ１２を、それぞれ意味する。すなわち上記一般式（１）におけるＲ１及びＲ２が炭素数１２の直鎖の炭化水素基であることをいう。
【００２５】
（実施例１〜５及び比較例１〜５）
（Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２等のＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔの調製）
Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２（実施例１）を含む一連のＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔとして、以下の実施例１〜５及び比較例１〜５を調製した。
実施例１：Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２、実施例２：Ｋ４−ＤＫＤＫＣ１２、実施例３：Ｋ５−ＤＫＤＫＣ１２、実施例４：ＤＫＤＫＣ１２−Ｋ３、実施例５：Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２−Ｋ３
比較例１：Ｋ１−ＤＫＤＫＣ１２、比較例２：Ｋ２−ＤＫＤＫＣ１２、比較例３：Ｒ３−ＤＫＤＫＣ１２、比較例４：Ｋ３−Ｃ１ＤＫＤＫＣ１２、比較例５：Ｋ３−Ｃ１２ＤＫＤＫＣ１
比較例１〜５は、Ｙ及びＺは３個以上のＬｙｓを含むことはないか、あるいはＲ１及びＲ２は６から２０個の炭素原子からなる炭化水素基でないＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔであった。
表１に実施例１〜５、表２に比較例１〜５についてＹ、Ｘ及びＺをまとめて記載したものを示す。
【００２６】
【表１】
2018188407.tif 000004
【００２７】
【表２】
2018188407.tif 000005
【００２８】
抗菌活性を持つＫ３−ＤＫＤＫＣ１２を含む一連のＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔは、Ｆｍｏｃ固相合成法に従い、Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭ  ｒｅｓｉｎ（２００−４００ｍｅｓｈ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）上にて行った。側鎖に保護基の入った市販のＦｍｏｃアミノ酸の他に、アルキルアミド鎖をシステイン側鎖に修飾したＦｍｏｃシステイン誘導体を用い、縮合試薬にはＨＢＴＵ＋ＨＯＢＴを用いた。樹脂から切り出し後は、逆相液体クロマトグラフィーにて単離精製を行った。化合物の同定は、高分解質量分析により行った。
【００２９】
（最小発育阻濃度の決定）
Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２を含む一連のＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定は、以下に示す微量液体希釈法により行った。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地を用いて、グラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）とネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、グラム陽性菌である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）をそれぞれ１４ｈ、３７℃で試験管培養を行った。その後、グラム陰性菌では菌液を、生理食塩水を用いて１０００倍希釈し、グラム陽性菌では菌液を、生理食塩水を用いて２０００倍希釈した。この菌液をストック菌液として用いた。評価に用いるＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔは滅菌水を用いて５．１２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、ろ過滅菌後に滅菌水を用いて２．５６、１．２８、０．６４、０．３２、０．１６、０．０８、０．０４ｍｇ／ｍＬに調製した。こちらをＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔのストック溶液として用いた。調製した各ストック菌液２０μＬと各濃度のＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔのストック溶液５μＬ、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地７５μＬを９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅのそれぞれのウェルに添加し、３７℃で２０ｈインキュベートした。その後、目視により菌の発育が認められないウェルの内、最小の抗菌試薬濃度を最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。
【００３０】
（溶血活性の決定）
Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２を含む一連のＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔの溶血活性（ＨＣ５０）の決定は、以下の方法により行った。ウサギ保存血（株式会社日本バイオテスト研究所）  ２ｍＬと生理食塩水８ｍＬを１５ｍＬファルコンチューブにとり、遠心分離（２２００  ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）を行った。その後上澄みを捨てた。この操作で遊離のヘモグロビンを除いた（洗浄操作とする）。新たに生理食塩水８ｍＬを加えて、同様に遠心分離を行い、上澄みを捨てた。計３回洗浄操作を行った後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を体積比で１０倍希釈されるように加えることで、１０％ヘマトクリット溶液を調製した。評価に用いるＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔは滅菌水を用いて５．１２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、ろ過滅菌後に滅菌水を用いて２．５６、１．２８、０．６４、０．３２、０．１６、０．０８、０．０４ｍｇ／ｍＬに調製し、ＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔのストック溶液とした。１０％ヘマトクリット溶液５０μＬと０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）９００μＬ、各濃度のＰＧ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔのストック溶液５０μＬを１．５ｍＬエッペンチューブにとり、３７  ℃、９０ストローク／ｍｉｎで３０ｍｉｎインキュベートした。その後遠心分離（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）を行い上澄み溶液の吸光度Ａ５４０を測定することで、赤血球が破壊され溶出されたヘモグロビン量を定量した。コントロールとなる赤血球が１００％溶血した場合のサンプルは、５０μＭ  Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン（卵黄由来、和光純薬）を抗菌試薬の代わりに利用し検討した。３７℃、９０ストローク／ｍｉｎで３０ｍｉｎインキュベート後、同様に遠心分離（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）を行い、上澄み溶液の吸光度Ａ５４０を測定することで、赤血球が１００％破壊された場合のヘモグロビン量とした。
【００３１】
実施例１〜５を用い、供試菌に対する最小発育阻止濃度（μｇ／ｍＬ（μｍｏｌ／Ｌ））と、溶血活性（ＨＣ５０）（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した結果を表３に示す。供試菌にはグラム陰性菌として大腸菌及びネズミチフス菌、並びにグラム陽性菌として枯草菌及び黄色ブドウ球菌を選択した。なお、表３中の括弧内の数値は、単位をμｍｏｌ／Ｌとした時の最小発育阻止濃度である。
【００３２】
【表３】
2018188407.tif 000006
【００３３】
比較例１〜５を用い、実施例１〜５と同様にして最小発育阻止濃度と、溶血活性（ＨＣ５０）を決定した結果を表４に示す。
【表４】
2018188407.tif 000007
【００３４】
表３から全ての実施例すなわち実施例１（Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２）〜５（Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２−Ｋ３）について、溶血活性（ＨＣ５０）は６００μｍｏｌ／Ｌを超えていた。溶血活性（ＨＣ５０）が６００μｍｏｌ／Ｌを超えることは非常に溶血活性が低いことを示すことら、全ての実施例は高い安全性を有していることが分かった。一方、最小発育阻止濃度は、ネズミチフス菌に対する実施例４（ＤＫＤＫＣ１２−Ｋ３）と実施例５（Ｋ３−ＤＫＤＫＣ１２−Ｋ３）の１６μｇ／ｍＬが最大であった（枯草菌に対する実施例５を除く）。最小発育阻止濃度が１６μｇ／ｍＬ以下であることは高い抗菌活性を発現することを示すことから、すべての実施例は高い抗菌活性を有していることが分かった。したがって、すべての実施例は、広い抗菌スペクトル及び高い抗菌活性を保持しながら低い溶血活性をもつ抗菌剤であることが分かった。なお、表２中の括弧内の数値は、単位をμｍｏｌ／Ｌとした時の最小発育阻止濃度である。
【００３５】
それに対して、表４に示すように、比較例１（Ｋ１−ＤＫＤＫＣ１２）では、最小発育阻止濃度は最小でも１６μｇ／ｍＬより大きい３２μｇ／ｍｌであり、溶血活性（ＨＣ５０）は１０μｍｏｌ／Ｌ未満であって、特に溶血活性（ＨＣ５０）が高かった。比較例２（Ｋ２−ＤＫＤＫＣ１２）では、溶血活性（ＨＣ５０）は６００μｍｏｌ／Ｌを超えていても、大腸菌に対する最小発育阻止濃度は３２μｇ／ｍＬで抗菌活性が高くなかった。比較例３（Ｒ３−ＤＫＤＫＣ１２）は全ての試供菌に対して最小発育阻止濃度は８．０μｇ／ｍＬで抗菌活性は高かったが、溶血活性（ＨＣ５０）は５０μｍｏｌ／Ｌと高かった。比較例４（Ｋ３−Ｃ１ＤＫＤＫＣ１２）及び比較例５（Ｋ３−Ｃ１ＤＫＤＫＣ１）では、溶血活性（ＨＣ５０）は６００μｍｏｌ／Ｌを超えていても、全ての試供菌に対して最小発育阻止濃度は２５６μｇ／ｍＬを超えており抗菌活性が低かった。すなわち比較例１〜５は広い抗菌スペクトル及び高い抗菌活性を保持しながら低い溶血活性をもつものではなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のリポペプチド誘導体を含む剤は抗菌剤として利用可能である。