(57)【要約】【課題】複数の生物種のＤＮＡを含む試料において、特定の生物種のＤＮＡを濃縮する技術を提供する。【解決手段】複数の生物種のＤＮＡを含む試料において、特定の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を濃縮する方法であって、（ａ）前記試料と、前記複数の生物種のＤＮＡのうち、前記標的ＤＮＡ以外のＤＮＡ（非標的ＤＮＡ）の少なくとも一部に結合し得る核酸プローブとを混合し、前記核酸プローブを前記非標的ＤＮＡに結合させる工程と、（ｂ）前記非標的ＤＮＡに結合した前記核酸プローブを介して、前記非標的ＤＮＡを前記試料中から除去する工程と、を含む標的ＤＮＡの濃縮方法。【選択図】図１
2018130087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の生物種のＤＮＡを含む試料において、特定の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を濃縮する方法であって、
（ａ）前記試料と、前記複数の生物種のＤＮＡのうち、前記標的ＤＮＡ以外のＤＮＡ（非標的ＤＮＡ）に結合し得る核酸プローブとを混合し、前記核酸プローブを前記非標的ＤＮＡに結合させる工程と、
（ｂ）前記核酸プローブが結合した前記非標的ＤＮＡを、前記試料中から除去する工程と、
を含む、標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項２】
前記核酸プローブは、前記複数の生物種のうち、前記特定の生物種以外の生物種のゲノムＤＮＡを断片化して得られたものである、請求項１に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項３】
前記核酸プローブは結合対の第１要素を有し、
前記工程（ｂ）を、
前記結合対の第２要素を有する担体を前記試料と接触させ、前記結合対の前記第１要素と前記第２要素との結合を介して、前記非標的ＤＮＡに結合した前記核酸プローブと前記担体とを含む複合体を形成させ、前記複合体を前記試料中から分離することによって行う、
請求項１又は２に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項４】
前記非標的ＤＮＡに結合した前記核酸プローブと前記担体とを含む複合体の形成と、前記複合体の前記試料中からの分離とを、２回以上繰り返す、請求項３に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項５】
前記結合対の前記第１要素がビオチン又はビオチン誘導体であり、前記結合対の前記第２要素がアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンである、請求項３又は４に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）の後、さらに、
（ｃ）前記工程（ｂ）で除去されなかった前記核酸プローブを、前記試料中から除去する工程、
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）を、
前記試料をエキソヌクレアーゼと接触させ、前記核酸プローブを前記エキソヌクレアーゼに分解させることによって行う、
請求項６に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）の前に、さらに、
（ａ１）前記試料中に含まれる前記複数の生物種のＤＮＡを脱リン酸化する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）の前に、さらに、
（ａ２）前記試料中に含まれる前記複数の生物種のＤＮＡを断片化する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）の前に、さらに、
（ａ３）前記試料中に含まれる前記複数の生物種のＤＮＡを断片化し、前記断片化したＤＮＡを脱リン酸化する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項１１】
前記複数の生物種のＤＮＡが、感染体のＤＮＡと前記感染体の宿主生物のＤＮＡとを含み、前記標的ＤＮＡが前記感染体のＤＮＡである、請求項１〜１０に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項１２】
前記核酸プローブが前記宿主生物のＤＮＡ断片を含む、請求項１１に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項１３】
前記非標的ＤＮＡがヒトＤＮＡである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項１４】
前記核酸プローブがヒトＤＮＡのＤＮＡ断片を含む、請求項１３に記載の標的ＤＮＡの濃縮方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法で標的ＤＮＡを濃縮する工程と、
前記濃縮した標的ＤＮＡを検出する工程と、
を含む、標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項１６】
前記標的ＤＮＡを検出する工程が、
前記標的ＤＮＡの少なくとも一部を増幅し、前記増幅されたＤＮＡ断片を検出することを含む、請求項１５に記載の標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項１７】
結合対の第１要素を有する、宿主のＤＮＡ断片を含む核酸プローブと、
前記結合対の第２要素を有する担体と、
を含む、前記宿主のＤＮＡと感染体のＤＮＡとを含む試料において、感染体のＤＮＡを濃縮するためのキット。
【請求項１８】
前記結合対の前記第１要素がビオチン又はビオチン誘導体であり、前記結合対の前記第２要素がアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンである、請求項１７に記載の感染体のＤＮＡを濃縮するためのキット。
【請求項１９】
前記宿主がヒトである、請求項１７又は１８に記載の感染体のＤＮＡを濃縮するためのキット。
【請求項２０】
さらに、エキソヌクレアーゼを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の感染体のＤＮＡを濃縮するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の生物種のＤＮＡを含む試料において、特定の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を濃縮する方法、標的ＤＮＡを検出する方法、及び標的ＤＮＡを濃縮するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の生物種のＤＮＡが混在する試料において、微量にしか存在しない特定の生物種のＤＮＡを検出しようとする場合には、検出対象の生物種以外のＤＮＡの存在が障害となる。例えば、ヒト検体中に含まれる病原体ＤＮＡを検出しようとする場合、検体中には大量のヒトＤＮＡが存在する。そのため、ＰＣＲ等により病原体ＤＮＡを検出しようとしても、ヒトＤＮＡによりＰＣＲ反応が阻害され、偽陰性となることが多い。そのため、病原体ＤＮＡを検出するためには、ヒトＤＮＡを除去して病原体ＤＮＡを濃縮する必要がある。
【０００３】
真核細胞のＤＮＡを含む試料において、細菌等のＤＮＡを濃縮するための技術としては、例えば、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドに特異的に結合するタンパク質（非特許文献１）を用いる方法が知られている。ＣｐＧモチーフは、真核生物ではメチル化されていることが多いが、細菌等の原核生物ではメチル化されていないことが多い。そのため、非特許文献１に記載のタンパク質を用いて、非メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡを捕捉することにより、原核生物のＤＮＡを濃縮することができる。
【０００４】
しかしながら、上記の方法は、真核生物のＤＮＡと原核生物のＤＮＡとの組み合わせにしか適用することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chao Xu et al., Nat Commun. 2011;2:227
【発明の概要】
【０００６】
本発明の一実施態様は、複数の生物種のＤＮＡを含む試料において、特定の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を濃縮する方法であって、（ａ）前記試料と、前記複数の生物種のＤＮＡのうち、前記標的ＤＮＡ以外のＤＮＡ（非標的ＤＮＡ）に結合し得る核酸プローブとを混合し、前記核酸プローブを前記非標的ＤＮＡに結合させる工程と、（ｂ）前記核酸プローブが結合した前記非標的ＤＮＡを、前記試料中から除去する工程と、を含む標的ＤＮＡの濃縮方法である。
【０００７】
また、本発明の一実施態様は、上記実施態様の方法で標的ＤＮＡを濃縮する工程と、前記濃縮された標的ＤＮＡを検出する工程と、を含む、標的ＤＮＡの検出方法である。
【０００８】
また、本発明の一実施態様は、結合対の第１要素を有する、宿主のＤＮＡ断片を含む核酸プローブと、結合対の第２要素を有する担体と、を含む、前記宿主由来の生体試料において感染体のＤＮＡを濃縮するためのキットである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の１実施形態にかかる標的ＤＮＡの濃縮方法の概略を示す。
【図２】本発明の１実施形態にかかる標的ＤＮＡの濃縮方法における工程（ｄ）の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
≪標的ＤＮＡの濃縮方法≫
１実施形態において、本発明は、複数の生物種のＤＮＡを含む試料において、特定の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を濃縮する方法を提供する。本実施形態の標的ＤＮＡの濃縮方法は、（ａ）前記試料と、前記複数の生物種のＤＮＡのうち、前記標的ＤＮＡ以外のＤＮＡ（非標的ＤＮＡ）の少なくとも一部に結合し得る核酸プローブとを混合し、前記核酸プローブを前記非標的ＤＮＡに結合させる工程と、（ｂ）前記核酸プローブが結合した前記非標的ＤＮＡを、前記試料中から除去する工程と、を含む。
【００１１】
図１に基づき、本実施形態の方法の概略を説明する。
まず、非標的ＤＮＡ１０と標的ＤＮＡ２０とを含む試料と、核酸プローブ１とを混合し（図１（１）、（２））、熱処理等により、核酸プローブ１、非標的ＤＮＡ１０、及び標的ＤＮＡ２０を１本鎖にする（図１（３））。そして、ハイブリダイゼーション処理を行うと、核酸プローブ１が、非標的ＤＮＡ１０に結合する（図１（４））。（以上、工程（ａ））
【００１２】
なお、図１の例では、核酸プローブ１は、５’末端にリン酸基Ｐを有しているが、５’末端にリン酸基Ｐを有しない状態で核酸プローブ１を準備してもよい。また、図１の例では、核酸プローブ１は、後の工程（ｂ）のために、３’末端にビオチンＢが付加されているが、他の結合対の要素を付加してもよく、何も付加されていなくてもよい。
【００１３】
次に、核酸プローブ１が結合した非標的ＤＮＡ１０を試料中から除去する（工程（ｂ））。図１（５）の例では、核酸プローブ１の３’末端にビオチンを付加し、ストレプトアビジン標識した担体３０を用いて、核酸プローブ１が結合した非標的ＤＮＡ１０と担体３０との複合体４０とし、複合体４０を試料中から分離することにより、核酸プローブ１が結合した非標的ＤＮＡ１０の除去を行っている。ただし、除去方法は、図１（５）の例に限定されない。核酸プローブ１が結合した非標的ＤＮＡ１０が除去された後の試料は、図１（６）に示すように、図１（２）に示す当初の試料よりも、標的ＤＮＡ２０が濃縮された状態になっている。このようにして、本実施形態の方法により、標的ＤＮＡを濃縮することができる。
以下、各工程の詳細を説明する。
【００１４】
［工程（ａ）］
工程（ａ）は、複数の生物種のＤＮＡを含む試料と、前記試料に含まれる複数の生物種のＤＮＡのうち、特定の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）以外のＤＮＡ（非標的ＤＮＡ）に結合し得る核酸プローブとを混合し、前記核酸プローブを前記非標的ＤＮＡに結合させる工程である。
【００１５】
本実施形態の方法において、標的ＤＮＡを濃縮する対象となる試料は、複数の生物種のＤＮＡを含む試料である。前記の複数の生物種は、特に限定されず、いかなる生物種の組み合わせであってもよい。生物種の数は、２種以上であれば特に限定されない。生物種の数は、例えば、２〜１０種であってもよく、２〜５種であってもよい。また、「複数の生物種」は、２種以上の生物種であれば、不特定数の生物種であってもよい。
なお、本明細書において、「生物種」とは、生物分類学上の種を意味する。すなわち、「複数の生物種」とは、分類学的に異なる種に属する２種以上の生物を指す。また、本明細書において使用する「生物」という用語は、ウィルスも包含するものとし、「生物種」という用語は、ウィルスの分類におけるウィルス種も包含するものとする。
【００１６】
「複数の生物種のＤＮＡ」は、２種以上の生物種のＤＮＡから構成される。なお、本明細書において、「生物種のＤＮＡ」とは、その生物種のゲノムＤＮＡの一部又は全部からなるＤＮＡを意味する。すなわち、「生物種のＤＮＡ」は、その生物種のゲノムＤＮＡの全部であってもよく、ゲノムＤＮＡの一部であってもよい。生物種が真核生物種である場合、ゲノムＤＮＡは、核ゲノムＤＮＡ及びオルガネラゲノムＤＮＡのいずれであってもよく、その両方を含むものであってもよい。また、生物種がウィルス種である場合、「生物種のＤＮＡ」は、当該ウィルス種のゲノムＤＮＡの全部であってもよく、ゲノムＤＮＡの一部であってもよい。さらに、生物種がＲＮＡウィルスのウィルス種である場合、「生物種のＤＮＡ」は、当該ウィルス種のＲＮＡゲノムの逆転写産物も包含するものとする。すなわち、生物種がＲＮＡウィルスのウィルス種である場合、「生物種のＤＮＡ」は、当該ウィルス種のＲＮＡゲノムから逆転写されたＤＮＡの全部であってもよく、当該ウィルス種のＲＮＡゲノムから逆転写されたＤＮＡの一部であってもよい。
【００１７】
「特定の生物種のＤＮＡ」とは、上記「複数の生物種のＤＮＡ」のうち、本実施形態の方法において濃縮対象とする生物種のＤＮＡを指す。本明細書において、「特定の生物種のＤＮＡ」は、「標的ＤＮＡ」とも記載される。標的ＤＮＡは、１種の生物のＤＮＡであってもよく、２種以上の生物のＤＮＡであってもよい。例えば、試料が２種の生物種のＤＮＡを含む場合には、そのうちの１種の生物種のＤＮＡを標的ＤＮＡとすることができる。また、例えば、試料が３種以上の生物種のＤＮＡを含む場合には、そのうちの１種、２種又はそれ以上の生物種のＤＮＡを標的ＤＮＡとすることができる。
【００１８】
「試料に含まれる複数の生物種のＤＮＡのうち、標的ＤＮＡ以外のＤＮＡ」は、試料に含まれる複数の生物種のＤＮＡのうち、本実施形態の方法において濃縮対象とする生物種のＤＮＡ以外の生物種のＤＮＡである。「試料に含まれる複数の生物種のＤＮＡのうち、標的ＤＮＡ以外のＤＮＡ」は、本明細書において、「非標的ＤＮＡ」とも記載される。非標的ＤＮＡは、試料に含まれる複数の生物種のＤＮＡのうち、上記の「特定の生物種」以外の生物種のＤＮＡであるともいえる。
【００１９】
本実施形態の方法で用いる試料は、複数の生物種のＤＮＡを含むことが想定される試料であれば、特に限定されず、いかなる試料であってもよい。試料は、標的ＤＮＡの種類に応じて、適宜選択される。本実施形態の方法は、非標的ＤＮＡのみを選択的に除去して、標的ＤＮＡを濃縮することができるため、試料中の全ＤＮＡに対する標的ＤＮＡの相対的存在量が微量である場合にも、適用することができる。そのため、非標的ＤＮＡに対する標的ＤＮＡの割合が小さい試料は、本実施形態の方法で用いる試料の好適な例である。非標的ＤＮＡに対する標的ＤＮＡの割合は、特に限定されないが、例えば、標的ＤＮＡ／非標的ＤＮＡ（ゲノムコピー数比）＝１／１〜８，０００，０００、１／１０〜６，０００，０００、１／１００〜１／５，０００，０００、１／１，０００〜１／２，０００，０００、１／１０，０００〜１／１，０００，０００、１／１００，０００〜１／５００，０００等を挙げることができる。また、非標的ＤＮＡに対する標的ＮＤＡの質量比としては、例えば、標的ＤＮＡ／非標的ＤＮＡ（質量比）＝１／６００〜４，８００，０００，０００、１／６，０００〜１／３，６００，０００，０００、１／６０，０００〜１／３，０００，０００，０００、１／６００，０００〜１／１，２００，０００，０００、１／６，０００，０００〜１／６００，０００，０００、１／６０，０００，０００〜１／３００，０００，００等を挙げることができる。
【００２０】
試料としては、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫等の多細胞生物から採取された生体試料を例示することができる。これらの生物が、細菌、真菌類、原虫等に感染している場合には、採取された生体試料には、宿主のＤＮＡと、感染体のＤＮＡとが混在していることがある。この場合、例えば、感染体のＤＮＡを標的ＤＮＡとし、宿主のＤＮＡを非標的ＤＮＡとすることができる。なお、本明細書において、「感染体」とは、他の生物種に感染し、当該生物種の生体内で増殖する生物を指す。感染体は、ウィルス、細菌、真菌、原生生物、原虫等を包含する。また、本明細書において、「宿主」とは、感染体の感染対象となる生物を指す。したがって、感染体の生物種毎に異なる宿主が存在する。
【００２１】
一般的に、宿主から採取した生体試料では、宿主のＤＮＡ（宿主ＤＮＡ）に対する感染体のＤＮＡ（感染体ＤＮＡ）の相対的存在量が微量であることが多い。したがって、感染体の存在が疑われる宿主個体から採取された生体試料は、本実施形態の方法に用いる試料の好適な例である。生体試料の例としては、血液、リンパ、各種器官の組織検体、粘膜細胞、尿、唾液、ぬぐい液、鼻汁喀痰、糞便、吐しゃ物、呼吸器洗浄液等を挙げることができるが、これらに限定されない。試料は、例えば、ヒトの血液、リンパ、各種器官の組織検体、粘膜細胞等であってもよい。例えば、血液は、一般的に、宿主ＤＮＡに対する感染体ＤＮＡの相対的存在量が微量である。そのため、血液試料中で感染体ＤＮＡを検出しようとしても、宿主ＤＮＡによって感染体ＤＮＡの検出が妨げられ、偽陰性となってしまうことがある。本実施形態の方法では、感染体ＤＮＡの相対的存在量が微量である血液などの生体試料においても、感染体ＤＮＡを検出可能な程度に濃縮することができる。したがって、血液試料は、本実施形態の方法に用いる試料の好適な例である。
【００２２】
試料として生体試料を用いる場合、生体試料は、遠心分離処理、細胞溶解処理、ＤＮＡ抽出処理等の処理を施したものであってもよい。例えば、血液試料等の液体試料である場合、遠心分離処理を行い、得られた沈殿を適切な溶解液で溶解して、試料として用いてもよい。また、細胞溶解処理やＤＮＡ抽出処理を行う場合、これらの処理は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細胞溶解処理は、浸透圧ショック法、凍結融解法、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ドデシル硫酸ナトリウムなど）を用いる方法、プロテアーゼＫなどの酵素を用いる方法、超音波処理法、ガラスビーズなどによる物理的粉砕等を挙げることができる。ＤＮＡ抽出処理としては、例えば、フェノール・クロロホルム抽出法等を挙げることができる。また、市販の細胞溶解キットやＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。
【００２３】
本実施形態の方法において、「複数の生物種」は、感染体と当該感染体の宿主とを含むものであってもよい。また、「複数の生物種のＤＮＡ」は、感染体ＤＮＡと当該感染体の宿主ＤＮＡとを含み、標的ＤＮＡが感染体ＤＮＡであってもよい。また、前記の場合において、宿主としては、ヒトを例示することができ、非標的ＤＮＡとしてはヒトＤＮＡを例示することができる。なお、宿主は、ヒトに限定されず、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類、ヘビ等の爬虫類、カエル等の両生類、魚類、昆虫類、その他の多細胞生物であってもよい。また、感染体は、特に限定されず宿主に応じて異なるが、例えば、宿主がヒトである場合には、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、マイコプラズマ等の細菌類；カンジタ、アスペルギルス、ニューモシスチス等の真菌類；インフルエンザウィルス、コロナウィルス、ＨＩＶ等のウィルス類等を挙げることができ、標的ＤＮＡとしてはこれらの生物種のＤＮＡを例示することができる。
【００２４】
また、本実施形態の方法の適用例として、感染体及び宿主がそれぞれ敗血症原因生物種及びヒトであり、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡがそれぞれ敗血症原因生物種ＤＮＡ及びヒトＤＮＡであり、試料が敗血症患者の血液試料である例を挙げることができる。敗血症は、感染症の原因生物種であるウィルス、細菌、真菌等が血液中に侵入することによって起こる症状であるが、敗血症が疑われる場合、当該患者の生体試料を用いて敗血症原因生物種の検出が試みられる。一般的に、敗血症患者の血液中において、敗血症原因生物種は１〜５０個／ｍＬ程度と微量であるのに対し、ヒト白血球は１×１０６〜１×１０７程度存在する。そのため、敗血症患者の血液試料を用いて敗血症原因生物種の検出を試みたとしても、相対的に多量に存在するヒトＤＮＡによって敗血症原因生物種ＤＮＡの検出が阻害され、偽陰性となってしまう場合がある。そのため、敗血症の適切な診断を行うためには、血液等の生体試料中の敗血症原因生物種ＤＮＡを検出可能な程度にまで濃縮する必要がある。本実施形態の方法は、敗血症が疑われる患者から採取された血液等の生体試料において、敗血症原因生物種ＤＮＡを濃縮する方法として、特に好適に用いることができる。
【００２５】
工程（ａ）では、複数の生物種のＤＮＡを含む試料（標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡを含む試料）と、非標的ＤＮＡに結合し得る核酸プローブ（以下、単に「核酸プローブ」と表記する場合がある。）とを混合する。なお、本明細書において、「非標的ＤＮＡに結合し得る」とは、非標的ＤＮＡにハイブリダイズできることをいう。非標的ＤＮＡが２本鎖ＤＮＡである場合には、非標的ＤＮＡが１本鎖となった時に、当該１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズできればよい。そのため、核酸プローブは、非標的ＤＮＡの少なくとも一部に相補的な配列を有する。核酸プローブは、全てが同じ配列を有するものであってもよいが、通常、異なる配列を有する複数種類の核酸プローブから構成される。この場合、各核酸プローブは、非標的ＤＮＡ中の異なる配列にそれぞれハイブリダイズするため、非標的ＤＮＡ中のより多くの配列を核酸プローブによりカバーすることができる。核酸プローブは、非標的ＤＮＡの配列を１００％カバーする必要はなく、一部をカバーしないものであってもよい。例えば、核酸プローブは、非標的ＤＮＡの配列を５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上カバーするものであってもよい。言い換えれば、核酸プローブは、核酸プローブ全体として、非標的ＤＮＡの配列の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上に相補的な配列を有するものであることができる。
【００２６】
核酸プローブは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。また、核酸プローブは、天然核酸からなるものに限定されず、ＢＮＡ、エチレン−架橋化核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ等の人工核酸を含むものであってもよい。非違標的ＤＮＡに既知の配列が存在すれば、当該既知の配列に基づいて、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成法を用いて核酸プローブを合成することができる。
【００２７】
また、上記のように、非標的ＤＮＡは、試料に含まれる複数の生物種のＤＮＡのうち、濃縮対象とする特定の生物種（標的ＤＮＡ生物種）のＤＮＡ以外の生物種（非標的ＤＮＡ生物種）のＤＮＡである。そのため、核酸プローブは、非標的ＤＮＡ生物種の細胞から抽出したＤＮＡの一部又は全部を用いて準備することができる。非標的ＤＮＡ生物種が２種以上である場合、核酸プローブは、非標的ＤＮＡ生物種のうちの少なくとも１種の生物種の細胞から抽出したＤＮＡの一部又は全部を用いて準備すればよい。非標的ＤＮＡ生物種の一部が不特定の生物種である場合には、非標的ＤＮＡ生物種のうちの既知の生物種の細胞から抽出したＤＮＡの一部又は全部を用いて、核酸プローブを準備すればよい。核酸プローブの準備に用いる細胞は、特に限定されないが、例えば、非標的ＤＮＡ生物種の正常組織から採取した細胞、正常組織の培養細胞等を用いることができる。また、ゲノムＤＮＡが市販されている生物種については、市販のゲノムＤＮＡを用いてもよい。
【００２８】
宿主から採取した生体試料において、感染体ＤＮＡを標的ＤＮＡとする場合、宿主細胞から抽出したＤＮＡの一部又は全部を用いて、核酸プローブを準備することができる。例えば、宿主がヒトである場合、ヒト細胞から抽出したＤＮＡの一部又は全部を核酸プローブ用ＤＮＡとして用いることができる。
【００２９】
なお、非標的ＤＮＡ生物種の細胞から抽出したＤＮＡの一部を核酸プローブ用のＤＮＡとして用いる場合、非標的ＤＮＡの量に応じて、用いる割合を選択してもよい。例えば、抽出したＤＮＡの５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上を用いることができる。
また、核酸プローブを準備するためにＤＮＡを抽出する細胞は、非標的ＤＮＡ生物種の細胞に限定されず、非標的ＤＮＡ生物種と大部分のゲノムＤＮＡが一致する非標的ＤＮＡ生物種の近縁種の細胞であってもよい。前記の場合、非標的ＤＮＡ生物種とのゲノムＤＮＡの一致の程度は特に限定されないが、例えば、８０％以上、又は９０％以上のゲノムＤＮＡが一致する近縁種の細胞を用いることができる。
【００３０】
核酸プローブ用ＤＮＡとして、非標的ＤＮＡ生物種の細胞から抽出したＤＮＡを用いる場合又は非標的ＤＮＡ生物種の市販のゲノムＤＮＡを用いる場合、抽出したＤＮＡ又は市販のゲノムＤＮＡを断片化して、核酸プローブを調製する。したがって、非標的ＤＮＡ生物種のゲノムＤＮＡを断片化して得られた核酸プローブは、本実施形態の方法で用いる核酸プローブの好適な例である。ＤＮＡを断片化する方法は、特に限定されず、一般に用いられる方法を使用すればよい。例えば、ＤＮＡの断片化方法としては、制限酵素を使用する方法、超音波を使用する方法等を例示することができる。制限酵素を使用して断片化した場合、断片化されたＤＮＡの５’末端には、通常、リン酸基が残される。したがって、制限酵素を用いて調製した核酸プローブは、通常、図１に示されるように、５’末端にリン酸基を有する。一方、超音波により断片化されて調製された核酸プローブは、５’末端にリン酸基を有さない。なお、核酸プローブの調製に制限酵素を使用する場合、制限酵素は特に限定されず、任意の制限酵素を用いることができる。
【００３１】
上記のように調製された核酸プローブの長さは、特に限定されないが、例えば、５０〜５００塩基対を例示することができる。核酸プローブの長さは、１００〜４００塩基対、又は２００〜３００塩基対であってもよい。
【００３２】
制限酵素によって核酸プローブを調製した場合、制限酵素によるＤＮＡ断片化後に高温処理等を行って制限酵素を失活させてもよい。高温処理の例としては、温度条件として９０〜１１０℃、処理時間として１〜３０分程度を挙げることができる。
【００３３】
核酸プローブは、上記のように準備したものをそのまま用いてもよいが、後の工程（ｂ）のために、結合対の第１要素により標識化してもよい。なお、本明細書において、「結合対」とは、互いに結合する２分子を意味する。また、結合対の「第１要素」とは、結合対を構成する２分子のうちの一方の分子を意味し、結合対の「第２要素」とは、その他方の分子を意味する。結合対の例としては、例えば、ビオチン又はビオチン誘導体及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを挙げることができる。この場合、結合対の第１要素をビオチン又はビオチン誘導体とし、第２要素をアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンとすることができる。また、結合対の他の例としては、抗原及び抗体、リガンド及び受容体等を挙げることができる。抗原及び抗体の例としては、フルオレセイン及び抗フルオレセイン抗体、ジゴキシゲニン及び抗ジゴキシゲニン抗体等を挙げることができる。
【００３４】
例えば、結合対として、ビオチン又はビオチン誘導体及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを使用する場合、結合対の第１要素として、ビオチン又はビオチン誘導体を用いて核酸プローブを標識化してもよい。同様に、フルオレセイン又はジゴキシゲニン等を結合対の第１要素として、核酸プローブの標識化を行ってもよい。標識化は、公知の方法で行うことができ、市販の標識化キット等を用いることもできる。標識化は、核酸プローブの５’末端及び３’末端のいずれに行ってもよいが、５’末端がリン酸基を有する場合には、３’末端を標識化してもよい。
【００３５】
試料と核酸プローブとを混合する際の混合割合は、特に限定されないが、核酸プローブの量を多くする程、後の工程（ｂ）における非標的ＤＮＡの除去量を多くすることができる。そのため、標的ＤＮＡの希望する濃縮率に応じて、適宜、混合割合を設定してもよい。
【００３６】
例えば、試料が敗血症患者のヒト全血試料、非標的ＤＮＡがヒトＤＮＡ、標的ＤＮＡが敗血症原因生物種ＤＮＡである場合、ヒト全血１ｍＬ（白血球数５ｘ１０６／ｍＬと仮定）に１０個の敗血症原因生物種が存在すると仮定すると、ヒトＤＮＡと敗血症原因生物種ＤＮＡのコピー数の比は、ヒトＤＮＡ：敗血症原因生物種ＤＮＡ＝５００，０００：１と仮定される。敗血症原因生物種ＤＮＡをＰＣＲで検出可能なレベルまで濃縮しようとする場合、例えば、ヒトＤＮＡ：敗血症原因生物種ＤＮＡ＝１０，０００：１程度まで濃縮することが考えられる。この場合、標的ＤＮＡである敗血症原因生物種ＤＮＡの濃縮率は、５０倍程度となる。したがって、非標的ＤＮＡであるヒトＤＮＡと同程度の量か過剰量の核酸プローブを、試料と混合するようにしてもよい。
【００３７】
非標的ＤＮＡ及び核酸プローブが、いずれも１本鎖である場合には、試料と核酸プローブとを混合し、核酸プローブを非標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより、核酸プローブを非標的ＤＮＡに結合させることができる。ハイブリダイゼーションは、一般的に用いられる方法で行えばよく、例えば、温度条件として３０〜６５℃、ｐＨ条件としてｐＨ５〜９（ｐＨ６〜８など）、反応時間として３０分〜３０時間等を挙げることができる。
【００３８】
一方、図１（２）の例のように、非標的ＤＮＡ及び核酸プローブのいずれか又は両方が２本鎖である場合には、ハイブリダイゼーションを行う前に、図１（３）の例のように、１本鎖にする必要がある。２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする方法としては、熱変性を挙げることができる。熱変性は、一般的に用いられる方法で行えばよく、例えば、温度条件として９０〜１００℃、処理時間として３〜６０分等を挙げることができる。
上記のように１本鎖にする処理を行った後、上述のようにハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸プローブを非標的ＤＮＡに結合させることができる。
【００３９】
［工程（ｂ）］
工程（ｂ）は、核酸プローブが結合した非標的ＤＮＡを、試料中から除去する工程である。
【００４０】
核酸プローブが結合した非標的ＤＮＡ（以下、「核酸プローブ結合非標的ＤＮＡ」という。）を、試料中から除去する方法は、特に限定されない。核酸プローブ結合非標的ＤＮＡを試料中から除去する方法としては、例えば、結合対を利用する方法、核酸プローブを予め担体等に固定しておく方法等が挙げられる。
【００４１】
結合対を利用する場合、核酸プローブに結合対の第１要素を有するものを用い、結合対の第２要素を有する担体を試料と接触させ、結合対の第１要素と第２要素との結合を介して、非標的ＤＮＡに結合した核酸プローブと担体とを含む複合体（以下、「核酸プローブ担体複合体」という。）を形成させ、核酸プローブ担体複合体を試料中から分離することによって、プローブ結合非標的ＤＮＡの除去を行うようにしてもよい。結合対としては、上記「［工程（ａ）］」で記載したもの等を挙げることができる。例えば、結合対の第１要素としてビオチン又はビオチン誘導体、結合対の第２要素としてアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを用いてもよい。
【００４２】
上記のような方法において、担体は、試料から分離できるものであれば、特に限定されない。担体としては、例えば、磁気ビーズ、カラム粒子、ウェルや容器の底面又は壁面等を挙げることができるが、これらに限定されない。結合対の第２要素を有する担体は、前記のような担体を、結合対の第２要素で標識化することにより調製することができる。標識化は、結合対の第２要素の種類に応じて、公知の方法を用いて行うことができる。第２要素での担体の標識化方法としては、例えば、シランカップリング剤等で担体表面を処理し、結合対の第２要素を担体表面に結合させる方法等を挙げることができる。また、市販の標識化担体を使用してもよい。
【００４３】
例えば、担体として磁気ビーズを用いる場合には、結合対の第２要素で標識化した磁気ビーズを試料に添加し、核酸プローブが有する結合対の第１要素と磁気ビーズが有する第２要素との結合反応を行う。これにより、結合対の第１要素と第２要素との結合を介して、核酸プローブ担体複合体が形成される。そして、磁石を用いて、磁気ビーズを磁石に吸着することにより、核酸プローブ担体複合体を試料中から分離することができる。
【００４４】
また、担体としてカラム粒子を用いる場合には、結合対の第２要素で標識化したカラム粒子を充填したカラムに試料をロードすることにより、核酸プローブ担体複合体の形成と、核酸プローブ担体複合体の試料からの分離を行うことができる。また、担体としてウェルや容器の底面又は壁面を用いる場合には、結合対の第２要素で底面や壁面を標識化したウェルや容器に試料を入れ、核酸プローブが有する結合対の第１要素と当該ウェルや容器が有する第２要素との結合反応を行うことにより、核酸プローブ担体複合体の形成を行うことができる。そして、当該ウェルや容器から試料を他のウェルや容器等に移すことにより、核酸プローブ担体複合体を試料中から分離することができる。
【００４５】
なお、結合対を利用する場合、核酸プローブ担体複合体の形成と、核酸プローブ担体複合体の試料中からの分離とを（以下、合わせて「分離操作」という。）、２回以上行うようにしてもよい。当該複合体形成・分離操作を２回以上行うことにより、１回の分離操作では除去できなかった核酸プローブ結合非標的ＤＮＡがある場合でも、２回目以降の操作により、当該残余の核酸プローブ結合非標的ＤＮＡを試料中から除去することができる。分離操作を２回以上行う場合、分離操作の回数は、特に限定されないが、例えば、２〜２０回、２〜１５回、２〜１０回、又は２〜５回等を例示することができる。
【００４６】
なお、試料中に、非標的ＤＮＡに結合していない核酸プローブ（以下、「未反応プローブ」という。）が存在する場合、未反応プローブの有する結合対の第１要素が、担体の有する第２要素と結合するため、未反応プローブと担体とを含む複合体も形成される。そのため、複合体形成・分離操作を行うことにより、未反応プローブも試料中から除去することができる。なお、本明細書において、「核酸プローブ担体複合体」という用語は、核酸プローブと担体とを含む複合体を指し、非標的ＤＮＡに結合した核酸プローブと担体とを含む複合体、及び未反応プローブと担体とを含む複合体を包含する。また、核酸プローブ担体複合体は、前記のもの以外の要素を含むものであってもよい。１回の分離操作では除去できなかった未反応プローブがある場合も、核酸プローブ結合非標的ＤＮＡと同様に、分離操作を２回以上繰り返すことにより、当該残余の未反応プローブを試料中から除去することができる。
【００４７】
また、核酸プローブを予め担体等に固定しておいた場合には、結合対を利用することなく、核酸プローブ結合非標的ＤＮＡを試料中から除去することができる。核酸プローブの担体への固定方法は、特に限定されず、公知の方法で行えばよい。核酸プローブの担体への固定方法としては、例えば、ニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン等に核酸プローブを吸着させる方法、ポリリジン等でコーティングした担体上に核酸プローブを吸着させる方法、シランカップリング剤等で処理した担体表面上に核酸プローブを結合させる方法等を挙げることができる。
【００４８】
上記のように、核酸プローブ結合非標的ＤＮＡが除去された後の試料においては、非標的ＤＮＡに対する標的ＤＮＡの割合が、当初の試料における割合よりも高くなる（例えば、図１（２）と図１（６））。このようにして、複数の生物種のＤＮＡを含む試料において、標的ＤＮＡの濃縮を行うことができる。
【００４９】
本実施形態の標的ＤＮＡの濃縮方法によれば、複数の生物種のＤＮＡが存在する試料において、非標的ＤＮＡのみを選択的に試料中から除去し、目的とする標的ＤＮＡを濃縮することができる。そのため、非標的ＤＮＡに対して、標的ＤＮＡが微量しか存在しない試料であっても、本実施形態の方法で標的ＤＮＡを濃縮することにより、標的ＤＮＡの解析試料として調製することができる。
また、本実施形態の方法では、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡが由来する生物種は問わないため、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの組み合わせが、真核生物種のＤＮＡ同士であっても、原核生物種のＤＮＡ同士であっても、標的ＤＮＡの濃縮を行うことができる。
【００５０】
［任意工程］
本実施形態の方法は、上記工程（ａ）及び（ｂ）の他、任意の工程を含んでいてもよい。任意の工程は、特に限定されないが、例えば、後述する工程（ｃ）、工程（ａ１）〜（ａ３）等を挙げることができる。
【００５１】
〔工程（ｃ）〕
本実施形態の方法は、上記工程（ｂ）の後、さらに、上記工程（ｂ）で除去されなかった前記核酸プローブを、前記試料中から除去する工程（工程（ｃ））、を含んでいてもよい。
【００５２】
上記工程（ａ）において、非標的ＤＮＡに対して、過剰量の核酸プローブを試料と混合した場合等、上記工程（ｂ）の後に、未反応プローブが試料中に残る場合がある（例えば、図２（１））。そのため、工程（ｂ）の後に、当該残余の未反応プローブを除去する工程を行ってもよい。未反応プローブを除去する方法は、特に限定されないが、例えば、エキソヌクレアーゼにより分解する方法、結合対の第２要素を有する担体を用いる方法等を挙げることができる。
【００５３】
（エキソヌクレアーゼにより分解する方法）
工程（ｂ）で除去されなかった核酸プローブは、工程（ｂ）の後の試料をエキソヌクレアーゼと接触させ、核酸プローブをエキソヌクレアーゼに分解させることによって、試料中から除去することができる。
【００５４】
上記工程（ａ）において、制限酵素により断片化されたＤＮＡを核酸プローブとして用いた場合、核酸プローブの５’末端には、通常、リン酸基が存在する。そのため、５’末端にリン酸基を有するＤＮＡに対して基質特異性を有する、５’→３’エキソヌクレアーゼにより、分解することができる。そこで、工程（ｃ）の後の試料を５’→３’エキソヌクレアーゼと接触させ、核酸プローブを５’→３’エキソヌクレアーゼに分解させることにより、試料中に残存する未反応プローブの除去を行ってもよい。
【００５５】
なお、超音波等により断片化されたＤＮＡを核酸プローブとして用いた場合には、核酸プローブは５’末端にリン酸基を有さない。この場合には、核酸プローブの５’末端をリン酸化し、工程（ｃ）の後に、５’→３’エキソヌクレアーゼにより、核酸プローブを分解してもよい。核酸プローブの５’末端をリン酸化する方法としては、例えば、ヌクレオチドキナーゼを用いる方法等を挙げることができる。ヌクレオチドキナーゼを用いて核酸プローブの５’末端をリン酸化した場合には、リン酸化反応後に、高温処理等を行ってヌクレオチドキナーゼを失活させてもよい。高温処理の例としては、温度条件として９０〜１１０℃、処理時間として１〜３０分程度を挙げることができる。
【００５６】
図２の例では、核酸プローブ担体複合体４０の分離により、核酸プローブ結合非標的ＤＮＡが除去された後、核酸プローブ１（未反応プローブ）が残されている（図２（１））。図２（１）の例では、核酸プローブ１は、５’末端にリン酸基Ｐを有し、３’末端にビオチンＢを有している。ここで、試料を５’→３’エキソヌクレアーゼ５０と接触させると、試料中に残存する核酸プローブ１が５’→３’エキソヌクレアーゼ５０によって分解される（図２（２））。これにより、試料中に残存する核酸プローブ１を除去することができる（図２（３））。
【００５７】
本工程で用いる５’→３’エキソヌクレアーゼは、５’末端にリン酸基を有するＤＮＡに対して基質特異性を有するものであれば特に限定されず、公知のものを用いることができる。５’末端にリン酸基を有する二本鎖ＤＮＡを基質とする５’→３’エキソヌクレアーゼとしては、例えば、λエキソヌクレアーゼ等を挙げることができる。
【００５８】
また、核酸プローブの末端形状と、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの末端形状とが、互いに異なる形状である場合には、核酸プローブが有する末端形状に対して基質特異性を有するエキソヌクレアーゼを用いて、試料中に残存する未反応プローブを除去することができる。例えば、核酸プローブが平滑末端又は３’陥没末端を有し、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡが３’突出末端を有する場合には、平滑末端又は３’陥没末端に対して基質特異性を有する３’→５’エキソヌクレアーゼにより、試料中に残存する未反応プローブを選択的に分解することができる。平滑末端又は３’陥没末端を有する二本鎖ＤＮＡに対して基質特異性を有する３’→５’エキソヌクレアーゼとしては、例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ等を挙げることができる。核酸プローブ、並びに標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの末端形状は、これらを調製する際に用いる制限酵素により制御することができる。例えば、３’陥没末端を形成する制限酵素としては、ＢａｍＨ１、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等を挙げることができ、３’突出末端を形成する制限酵素としては、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ等を挙げることができ、平滑末端を形成せする制限酵素としてはＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩＩ、ＳｍａＩ等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５９】
なお、核酸プローブとして１本鎖ＤＮＡを用いた場合、又は核酸プローブとして二本鎖ＤＮＡを用いた場合であっても、工程（ｂ）の後に１本鎖ＤＮＡとして試料中に残存する未反応プローブを除去したい場合には、１本鎖ＤＮＡに対して基質特異性を有するエキソヌクレアーゼを用いて、核酸プローブを除去してもよい。この場合、標的ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡであれば、標的ＤＮＡは、当該エキソヌクレアーゼによる分解の影響は受けない。１本鎖ＤＮＡに対して基質特異性を有するエキソヌクレアーゼとしては、例えば、エキソヌクレアーゼＶＩＩ等を挙げることができる。
【００６０】
上記のようなエキソヌクレアーゼにより、核酸プローブを分解する際の反応条件は、一般的な酵素反応に用いる条件を使用すればよい。例えば、反応温度として２０〜４０℃、反応時間として１〜６０分等を挙げることができる。エキソヌクレアーゼによる核酸プローブの分解反応後は、高温処理等を行ってエキソヌクレアーゼを失活させてもよい。高温処理の例としては、温度条件として９０〜１１０℃、処理時間として１〜３０分程度を挙げることができる。
【００６１】
（結合対の第２要素を有する担体を用いる方法）
核酸プローブが、結合対の第１要素を有する場合には、工程（ｂ）の後、さらに結合対の第２要素を有する担体を用いて、試料中に残存する未反応プローブを除去してもよい。
【００６２】
工程（ｂ）におけるプローブ結合非標的ＤＮＡの除去を、結合対を利用して行った場合、通常、未反応プローブも、核酸プローブ結合非標的ＤＮＡとともに除去される。しかし、非標的ＤＮＡに対して過剰量の核酸プローブを用いた場合等には、工程（ｂ）の後、試料中に未反応プローブが残る場合がある。
【００６３】
そのような未反応プローブは、さらに、結合対の第２要素を有する担体を試料に接触させ、担体の有する結合対の第２要素に、未反応プローブの有する結合対の第１要素を結合させて、未反応プローブの結合した担体を試料中から分離することにより（以下、「未反応プローブ分離操作」という。）、試料中から未反応プローブの除去を行うことができる。未反応プローブ分離操作を行う回数は、特に限定されず、工程（ａ）において、試料との混合に用いた核酸プローブの量に応じて、適宜選択すればよい。未反応プローブ分離操作の回数としては、例えば、１〜１０回、１〜５回、１〜３回等と挙げることができる。
【００６４】
〔工程（ａ１）〜（ａ３）〕
本実施形態の方法は、上記工程（ａ）の前に、さらに、以下の（ａ１）〜（ａ３）のいずれかの工程を含んでいてもよい。
（ａ１）試料中に含まれる複数の生物種のＤＮＡを脱リン酸化する工程、
（ａ２）試料中に含まれる複数の生物種のＤＮＡを断片化する工程、及び
（ａ３）試料中に含まれる複数の生物種のＤＮＡを断片化し、前記断片化したＤＮＡを脱リン酸化する工程。
【００６５】
（工程（ａ１））
本実施形態の方法においては、工程（ａ）において試料と核酸プローブとを混合する前に、試料中に含まれる複数の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡ）の脱リン酸化を行ってもよい。これにより、工程（ｂ）の後に工程（ｃ）を行う場合であって、工程（ｃ）を、５’末端にリン酸基を有するＤＮＡに対して基質特異性を有する５’→３’エキソヌクレアーゼを用いて行う場合に、非標的ＤＮＡが、５’→３’エキソヌクレアーゼに分解される可能性を低減することができる。
【００６６】
ＤＮＡの脱リン酸化を行う方法は、特に限定されず、公知の方法を用いて行うことができる。ＤＮＡの脱リン酸化を行う方法としては、例えば、脱リン酸化酵素を用いる方法を挙げることができる。脱リン酸化酵素の例としては、例えば、アルカリホスファターゼを挙げることができる。
【００６７】
脱リン酸化酵素により、ＤＮＡの脱リン酸化を行う際の反応条件は、一般的な酵素反応に用いる条件を使用すればよい。例えば、反応温度として２０〜４０℃、反応時間として１〜６０分等を挙げることができる。脱リン酸化酵素による脱リン酸化反応後は、高温処理等を行って脱リン酸化酵素を失活させてもよい。高温処理の例としては、温度条件として９０〜１１０℃、処理時間として１〜３０分程度を挙げることができる。
【００６８】
（工程（ａ２））
本実施形態の方法においては、工程（ａ）において試料と核酸プローブとを混合する前に、試料中に含まれる複数の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡ）の断片化を行ってもよい。これにより、試料の粘度を下げることができる。また、工程（ｂ）において、標的ＤＮＡが非選択的に除去される可能性を低減することができる。
【００６９】
標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡを断片化する場合、断片化後のＤＮＡ断片のサイズは、特に限定されない。本実施形態の方法により標的ＤＮＡを濃縮した後、さらに標的ＤＮＡの解析を行う場合には、当該解析に適したサイズの断片となるようにしてもよい。また、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡのサイズは、核酸プローブよりも、大きいサイズとなるようにしてもよい。標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡのサイズを、核酸プローブのサイズよりも大きくすることにより、核酸プローブの非標的ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの効率及び特異性が高くなる。標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡのサイズの例としては、例えば、５００〜１０，０００塩基対、５００〜５，０００塩基対、５００〜３，０００塩基対等を挙げることができる。
【００７０】
標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの断片化の方法は、特に限定されず、公知の方法を用いて行うことができる。標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの断片化の方法としては、例えば、制限酵素を使用する方法、超音波等を使用する方法等を挙げることができる。
【００７１】
制限酵素を使用して断片化を行う場合、制限酵素は特に限定されず、公知のものを用いることができる。工程（ｂ）の後に工程（ｃ）を行う場合であって、工程（ｃ）を、エキソヌクレアーゼを用いて行う場合には、当該エキソヌクレアーゼが基質特異性を有するＤＮＡとは異なる切断末端を形成する制限酵素を用いてもよい。例えば、工程（ｃ）を、平滑末端又は３’陥没末端に基質特異性を有する３’→５’エキソヌクレアーゼを用いて行う場合、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの断片化を３’突出末端を形成する制限酵素を用いて行ってもよい。
【００７２】
また、本実施形態の方法により標的ＤＮＡを濃縮した後、さらに標的ＤＮＡの解析を行う場合には、当該解析の障害とならないような制限酵素を選択してもよい。例えば、標的ＤＮＡの解析の際にＰＣＲ等を行う場合には、当該ＰＣＲ増幅断片中に含まれる配列を認識配列としない制限酵素を選択することができる。
【００７３】
また、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡのサイズを、核酸プローブのサイズよりも大きくする場合には、核酸プローブの調製に用いる制限酵素の認識配列よりも、長い認識配列を有する制限酵素を用いて標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの断片化を行ってもよい。例えば、核酸プローブの調製を４塩基認識制限酵素により行い、標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの断片化を６〜８塩基認識制限酵素により行ってもよい。
【００７４】
制限酵素により断片化を行う場合、制限酵素の反応条件は、一般的な酵素反応に用いる条件を使用すればよい。例えば、反応温度として２０〜４０℃、反応時間として１〜６０分等を挙げることができる。制限酵素による標識ＤＮＡ及び非標識ＤＮＡの断片化後は、高温処理等を行って制限酵素を失活させてもよい。高温処理の例としては、温度条件として９０〜１１０℃、処理時間として１〜３０分程度を挙げることができる。
【００７５】
（工程（ａ３））
本実施形態の方法においては、工程（ａ）において試料と核酸プローブとを混合する前に、試料中に含まれる複数の生物種のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡ）を断片化し、前記断片化したＤＮＡを脱リン酸化する工程を含んでいてもよい。標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの断片化により、試料の粘度を下げることができ、工程（ｂ）において、標的ＤＮＡが非選択的に除去される可能性を低減することができる。また、断片化したＤＮＡの脱リン酸化により、工程（ｂ）の後に工程（ｃ）を行う場合であって、工程（ｃ）を５’→３’エキソヌクレアーゼを用いて行う場合に、非標的ＤＮＡが、５’→３’エキソヌクレアーゼに分解される可能性を低減することができる。
【００７６】
標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの断片化は、上記工程（ａ１）で記載した方法と同様に行うことができる。また、断片化された標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの脱リン酸化は、上記工程（ａ２）で記載した方法と同様に行うことができる。
【００７７】
≪標的ＤＮＡの検出方法≫
１実施形態において、本発明は、複数の生物種のＤＮＡを含む試料中の標的ＤＮＡを検出する方法を提供する。本実施形態の標的ＤＮＡの検出方法は、上記実施形態の方法で標的ＤＮＡを濃縮する工程と、前記濃縮した標的ＤＮＡを検出する工程と、を含む。
【００７８】
上記実施形態の方法により標的ＤＮＡが濃縮された試料は、標的ＤＮＡを検出するための試料として使用することができる。標的ＤＮＡを検出する方法は、特に限定されず、公知のＤＮＡ検出方法を用いることができる。標的ＤＮＡの検出方法の例としては、例えば、標的ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、当該増幅したＤＮＡ断片を検出する方法、プローブ等を用いて標的ＤＮＡを検出する方法、標的ＤＮＡをシーケンシングして検出する方法、インベーダー法により検出する方法等を挙げることができる。
【００７９】
標的ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、当該増幅したＤＮＡ断片を検出する場合、標的ＤＮＡの塩基配列に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲを行えばよい。ＰＣＲ後は、電気泳動やハイブリダイゼーション等の公知の方法により、増幅断片を検出することができる。また、サイバーグリーン等の二本鎖ＤＮＡに結合する色素を用いて、増幅ＤＮＡ断片を検出してもよい。増幅断片の検出には、リアルタイムＰＣＲ法を用いてもよい。また、標的ＤＮＡの増幅は、ＬＡＭＰ法等の等温増幅法により行ってもよい。
【００８０】
プローブ等を用いて標的ＤＮＡを検出する場合、標的ＤＮＡの塩基配列に基づいてプローブを設計し、プローブを標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより、標的ＤＮＡを検出することができる。蛍光標識やＲＩ標識等によって標識化したプローブを用いれば、当該標識に基づいて、標的ＤＮＡの検出を行うことができる。
【００８１】
また、濃縮された標的ＤＮＡのシーケンシングを行い、標的ＤＮＡを解析してもよい。標的ＤＮＡのシーケンシングには、公知のＤＮＡシーケンシング法を用いることができる。また、公知の各種次世代シーケンシング法により、標的ＤＮＡのシーケンシングを行ってもよい。
また、インベーダー法により、標的ＤＮＡの検出を行ってもよい。
【００８２】
≪感染体由来のＤＮＡを濃縮するためのキット≫
１実施形態において、本発明は、宿主由来の生体試料において、感染体のＤＮＡを濃縮するためのキットを提供する。本実施形態のキットは、結合対の第１要素を有する、宿主のＤＮＡ断片を含む核酸プローブと、前記結合対の第２要素を有する担体と、を含む。
【００８３】
［結合対の第１要素を有する、宿主のＤＮＡ断片を含む核酸プローブ］
本実施形態のキットは、結合対の第１要素を有する、宿主のＤＮＡ断片を含む核酸プローブを含む。
【００８４】
宿主のＤＮＡ断片は、宿主ＤＮＡが断片化されたものである。当該宿主は、本実施形態のキットにより、感染体のＤＮＡを濃縮しようとする生体試料が由来する宿主と、同じ宿主である。宿主としては、上記「≪標的ＤＮＡの濃縮方法≫」の「工程（ａ）」で記載したものと、同様のものを例示することができる。宿主の具体例としては、例えば、ヒトを挙げることができる。また、宿主のＤＮＡ断片の具体例としては、例えば、ヒトＤＮＡのＤＮＡ断片を挙げることができる。
【００８５】
宿主のＤＮＡ断片を含む核酸プローブは、宿主細胞から抽出したＤＮＡの一部又は全部を用いて準備することができる。核酸プローブの調製は、上記「≪標的ＤＮＡの濃縮方法≫」の「工程（ａ）」で記載した方法と、同様の方法を例示することができる。
【００８６】
本実施形態のキットに含まれる核酸プローブは、結合対の第１要素を有している。結合対としては、上記「≪標的ＤＮＡの濃縮方法≫」の「工程（ａ）」で記載したものと、同様のものを例示することができる。結合対の具体例としては、例えば、結合対の第１要素がビオチン又はビオチン誘導体であり、結合対の第２要素がアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンであるものを挙げることができる。結合対として前記具体例のものを用いる場合、核酸プローブには、結合対の第１要素として、ビオチン又はビオチン誘導体を有するものを使用すればよい。例えば、本実施形態に含まれる核酸プローブとしては、ビオチン又はビオチン誘導体を有する、ヒトＤＮＡ断片を含む核酸プローブを例示することができる。
【００８７】
結合対の第１要素を有する、核酸プローブの調製は、宿主のＤＮＡ断片を結合対の第１要素により標識化することにより、行うことができる。ＤＮＡ断片を結合対の第１要素により標識化する方法としては、上記「≪標的ＤＮＡの濃縮方法≫」の「工程（ａ）」で記載した方法と、同様の方法を例示することができる。
【００８８】
［結合対の第２要素を有する担体］
本実施形態のキットは、結合対の第２要素を有する担体を含む。
【００８９】
本実施形態のキットにおいて、担体が有する結合対の第２要素は、核酸プローブが有する結合対の第１要素に応じて、適宜選択すればよい。例えば、核酸プローブが、結合対の第１要素としてビオチン又はビオチン誘導体を有する場合、担体は結合対の第２要素としてアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを有することができる。
【００９０】
結合対の第２要素を有する担体は、上記「≪標的ＤＮＡの濃縮方法≫」の「工程（ｂ）」で記載したものと同様のものを用いることができる。結合対の第２要素を有する担体の調製方法としては、上記「≪標的ＤＮＡの濃縮方法≫」の「工程（ｂ）」で記載した方法と、同様の方法を例示することができる。
【００９１】
本実施形態のキットが濃縮の対象とする感染体ＤＮＡは、核酸プローブに含まれるＤＮＡ断片の宿主を感染対象とする感染体のＤＮＡであれば、特に限定されない。例えば、宿主がヒトである場合、感染体としては、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、マイコプラズマ等の細菌類；カンジタ、アスペルギルス、ニューモシスチス等の真菌類；インフルエンザウィルス、コロナウィルス、ＨＩＶ等のウィルス類等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９２】
本実施形態のキットは、上記「≪標的ＤＮＡの濃縮方法≫」で記載した標的ＤＮＡの濃縮方法において、標的ＤＮＡが感染体ＤＮＡであり、非標的ＤＮＡが宿主ＤＮＡである場合に使用することができる。
【００９３】
［任意の構成］
本実施形態のキットは、上記構成に加えて、任意の構成を含むことができる。
【００９４】
（エキソヌクレアーゼ）
本実施形態のキットが含み得る任意の構成としては、エキソヌクレアーゼを例示することができる。エキソヌクレアーゼは、本実施形態のキットを用いて、上記実施形態の標的ＤＮＡの濃縮方法を行う場合に、工程（ｂ）の後に試料中に残存する未反応プローブを除去するために用いることができる。
【００９５】
エキソヌクレアーゼは、核酸プローブに応じて、適宜適切なものを選択すればよい。例えば、核酸プローブが、５’末端にリン酸基を有する場合には、５’末端にリン酸基を有するＤＮＡに基質特異性を有する５’→３’エキソヌクレアーゼを選択することができる。また、核酸プローブが平滑末端を有する場合には、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡに基質特異性を有するエキソヌクレアーゼを選択することができる。また、核酸プローブが３’陥没末端を有する場合には、３’陥没末端を有する二本鎖ＤＮＡに基質特異性を有する３’→５’エキソヌクレアーゼを選択することができる。さらに、核酸プローブが一本鎖ＤＮＡである場合には、一本鎖ＤＮＡに基質特異性を有するエキソヌクレアーゼを選択することができる。
【００９６】
（その他の構成）
本実施形態のキットは、制限酵素、ＤＮＡ脱リン化酵素、反応バッファー等を含んでいてもよい。制限酵素は、宿主ＤＮＡ及び感染体ＤＮＡを断片化するために用いることができ。本実施形態のキットが含むことのできる制限酵素は、特に限定されないが、例えば、６〜８塩基認識制限酵素を選択することができる。また、本実施形態のキットがエキソヌクレアーゼを含む場合には、当該エキソヌクレアーゼが基質特異性を有するＤＮＡとは異なる切断末端を形成する制限酵素を選択してもよい。
【００９７】
本実施形態のキットが、５’末端にリン酸基を有するＤＮＡに基質特異性を有するエキソヌクレアーゼを含む場合には、キットはさらにＤＮＡ脱リン酸化酵素を含んでいてもよい。ＤＮＡ脱リン酸化酵素は、宿主ＤＮＡ及び感染体ＤＮＡを脱リン酸化するために用いることができる。
【００９８】
本実施形態のキットは、また、各種酵素反応を行うための反応バッファー等を含んでいてもよい。
【００９９】
また、結合対の第２要素を有する担体が磁気ビーズである場合には、本実施形態のキットは、磁石を含んでいてもよい。磁石は、本実施形態のキットを用いて、上記実施形態の標的ＤＮＡの濃縮方法を行う場合に、工程（ｂ）において試料から核酸プローブ担体複合体を分離するために用いることができる。
また、結合対の第２要素を有する担体がカラム粒子である場合には、本実施形態のキットは、当該カラム粒子を充填するためのカラムを含んでいてもよい。
【０１００】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【符号の説明】
【０１０１】
１…核酸プローブ、１０…非標的ＤＮＡ、２０…標的ＤＮＡ、３０…結合対の第２要素を有する担体、４０…非標的ＤＮＡと核酸プローブと担体とを含む複合体（核酸プローブ担体複合体）、５０…５’→３’エキソヌクレアーゼ
【図１】
2018130087.tif 000003
【図２】
2018130087.tif 000004