(57)【要約】【課題】光シート面に応じて変動する球面収差を補正しながら対物レンズの焦点面を光シート面に素早く合わせる技術を提供する。【解決手段】光シート顕微鏡１００は、対物レンズ７と、サンプルに光シートを照射するシート照明光学系４と、補正環１８と、サンプルの画像を取得する撮像装置１２と、光シート面と対物レンズ７との相対位置を調整するＺ駆動部８と、光シート面とサンプルとの相対位置を調節するステージ６と、制御装置２０を備える。制御装置２０は、ステージ６により相対位置を変化させたとき対物レンズ７を介して検出される光シート面からの光に基づいて、光シート面と対物レンズ７の焦点面が近づくようにＺ駆動部８を制御し、Ｚ駆動部８により相対位置を変化させたとき撮像装置１２で取得されるサンプルの画像の評価値が大きくなるように補正環１８を制御する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズと、
前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射する照明光学系と、
球面収差を補正する補正装置と、
前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置と、
前記光シートが形成される光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整する第１の調整手段と、
前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調節する第２の調節手段と、
前記第２の調節手段により前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を変化させたとき、前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記対物レンズの焦点面が近づくように前記第１の調整手段を制御する第１合焦処理と、前記第１の調節手段により前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置を変化させたとき、前記撮像装置で取得される前記サンプルの画像の評価値が大きくなるように前記補正装置を制御する球面収差補正処理と、を行う制御装置と、を備える
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、さらに、前記補正装置により球面収差を補正したとき、前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記焦点面が近づくように前記第１の調整手段を制御する第２合焦処理を行う
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項３】
請求項２に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、さらに、前記第２合焦処理と前記球面収差補正処理とを、所定の条件を満たすまで繰り返す
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記焦点面が近づくように前記第１の調整手段を継続的に制御するコンティニュアスＡＦ処理を行う
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、
前記評価値は、前記サンプルの画像のコントラスト又は明るさを示す値である
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、
前記補正装置は、前記対物レンズを構成するレンズを前記光軸方向に移動する電動補正環である
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項７】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、
前記補正装置は、前記対物レンズと前記撮像装置の間に配置された、瞳変調素子である
である
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項８】
請求項７に記載の光シート顕微鏡において、
前記瞳変調素子は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ(Liquid Crystal On Silicon-Spatial Light Modulator)である
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上の位置であって前記撮像装置の受光面に対応する位置より後方に配置される、開口を有する第１の遮光板と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上の位置であって前記受光面に対応する位置より前方に配置される、開口を有する第２の遮光板と、
前記第１の遮光板を通過した前記光シート面からの光を検出する第１の光検出器と、
前記第２の遮光板を通過した前記光シート面からの光を検出する第２の光検出器と、を備え、
前記制御装置は、前記第１の光検出器からの出力信号と前記第２の光検出器からの出力信号に基づいて、前記第１合焦処理を行う
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上に設けられた位相差ＡＦセンサと、を備え、
前記制御装置は、前記位相差ＡＦセンサからの出力信号に基づいて、前記第１合焦処理を行う
ことを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項１１】
対物レンズと球面収差を補正する補正装置とサンプルの画像を取得する撮像装置とを備える光シート顕微鏡の制御方法であって、
前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射し、
前記光シートが形成された光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、
前記光シート面と前記サンプルとの相対位置が調整されたときに、前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記対物レンズの焦点面が近づくように前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置を調整する第１合焦処理を行い、
前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置が調整されたときに、前記撮像装置で取得される前記サンプルの画像の評価値が大きくなるように前記補正装置を制御する球面収差補正処理を行う
ことを特徴とする制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、光シート顕微鏡、及び、光シート顕微鏡の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光顕微鏡の分野では、対物レンズの光軸に直交する方向からサンプルにレーザ光を照射して、サンプル中に光シートを形成する技術が知られている。この技術を用いた光シート顕微鏡は、例えば、特許文献１、特許文献２に記載されていて、蛍光の退色を抑えてサンプルの良好な三次元立体像を高速に生成することができる。
【０００３】
近年では、この技術の用途は、蛍光タンパクをターゲット分子に標識したゼブラフィッシュのような生物の立体像を得るといった用途に限られない。この技術は、スフェロイド、オルガノイドのような３次元培養細胞の３次元立体像を取得し、画像解析技術を利用して薬効の評価を行う、所謂、“創薬スクリーニング”への適用を目的とした技術としても注目される等、幅広いアプリケーションへの応用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／０２８６０４２号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１５／１８４１２４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
光シート顕微鏡は通常、サンプルの３次元立体像を得るため、光シートとサンプルを観察光軸（対物レンズの光軸）に沿って相対的に移動させながら、複数の断層像を取得する。多くの場合、光シートが対物レンズの焦点面に形成されるように設定された後、光シートと対物レンズは固定され、サンプルを光軸方向に順次移動させることで、複数の断層像が取得される。
【０００６】
しかしながら、この方法でサンプルの観察場所（つまり、サンプル中の光シートが形成されている面、以降、光シート面と記す）を変更すると、対物レンズと光シート面との間の媒質の構成比率（例えば、空気と培養液とサンプル内部の比率）が変化する。これにより、対物レンズと光シート面の間の光路長が変化するため、対物レンズを動かしてないにも関わらず対物レンズの焦点面が光軸方向に移動し、対物レンズの焦点面が光シート面に一致しなくなってしまう。また、サンプル内部の屈折率分布によっても焦点面の移動量が変化してしまう。そして、このズレが及ぼす影響は、三次元立体像の光学的な分解能を上げようとすればするほど、つまり、光シートの厚さを薄くし、対物レンズの開口数を大きくすればするほど、焦点深度は浅くなるため大きくなる。
【０００７】
上述した特許文献１、特許文献２には、観察前に観察対象物を用いてキャリブレーションを行うことで、対物レンズの焦点面のズレを補正するデータを作成する技術が記載されている。この技術を用いることで、対物レンズの焦点面と光シート面のズレをある程度抑えることができる。
【０００８】
ただし、サンプルの屈折率が内部で急峻な変化を有する場合などには、十分な精度でズレを抑制することは難しい。キャリブレーションにおいてより多くの画像を取得することで補正精度を改善することは可能であるが、多くの画像を取得すると、キャリブレーションに時間がかかってしまう。また、キャリブレーションによってサンプルがダメージを受けてしまう虞がある。さらに、対物レンズと光シート面の間の光路長の変化は、球面収差量の変動も引き起こす。上述した特許文献１、特許文献２では、球面収差量の変動については考慮されていない。
【０００９】
以上のような実情を踏まえ、本発明の一側面は、光シート面に応じて変動する球面収差を補正しながら対物レンズの焦点面を光シート面に素早く合わせる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様に係る光シート顕微鏡は、対物レンズと、前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射する照明光学系と、球面収差を補正する補正装置と、前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置と、前記光シートが形成される光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整する第１の調整手段と、前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調節する第２の調節手段と、前記第２の調節手段により前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を変化させたとき、前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記対物レンズの焦点面が近づくように前記第１の調整手段を制御する第１合焦処理と、前記第１の調節手段により前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置を変化させたとき、前記撮像装置で取得される前記サンプルの画像の評価値が大きくなるように前記補正装置を制御する球面収差補正処理と、を行う制御装置と、を備える。
【００１１】
本発明の一態様に係る制御方法は、対物レンズと球面収差を補正する補正装置とサンプルの画像を取得する撮像装置とを備える光シート顕微鏡の制御方法であって、前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射し、前記光シートが形成された光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、前記光シート面と前記サンプルとの相対位置が調整されたときに前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記対物レンズの焦点面が近づくように前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置を調整する第１合焦処理を行い、前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置が調整されたときに前記撮像装置で取得される前記サンプルの画像の評価値が大きくなるように前記補正装置を制御する球面収差補正処理を行う。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一側面によれば、光シート面に応じて変動する球面収差を補正しながら対物レンズの焦点面を光シート面に素早く合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１の実施形態に係る光シート顕微鏡１００の構成を例示した図である。
【図２】制御装置２０のハードウェアの構成を例示した図である。
【図３】第１の実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。
【図４】合焦処理の手順を示すフローチャートである。
【図５】球面収差補正処理の手順を示すフローチャートである。
【図６】ピンホールアレイ１９ａを備える遮光板１９の構成を例示した図である。
【図７】第２の実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。
【図８】第３の実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。
【図９】第４の実施形態に係る光シート顕微鏡２００の構成を例示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［第１の実施形態］
図１は、本実施形態に係る光シート顕微鏡１００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡１００は、培養液、透明化溶液などの媒質Ｍに浸されているサンプルＳの断層像を取得する装置であり、サンプルＳは、例えば、蛍光色素により標識された生体細胞である。サンプルＳは、ステージ６に載置された、例えばキュベットなどのサンプル容器５に収容されている。  
【００１５】
光シート顕微鏡１００は、レーザ１と、光ファイバー２と、シート照明光学系４と、ステージ６と、乾燥系の対物レンズ７と、Ｚ駆動部８と、結像レンズ９と、ダイクロイックミラー１０と、エミッションフィルタ１１と、撮像装置１２と、補正環１８を備える。
【００１６】
シート照明光学系４は、例えば、コレクタレンズとシリンドリカルレンズを含み、対物レンズ７の光軸方向とは異なる方向からサンプルＳに光シートを照射する。より具体的には、シート照明光学系４は、シート照明光学系４の出射光軸が対物レンズ７の光軸と略直交するように配置されていて、対物レンズ７の光軸と略直交する方向からサンプルＳに光シートＬＳを照射するように構成されている。ここで、光シートとはシート形状の照明領域を形成する照明光のことである。光シートＬＳは、サンプルＳ内で対物レンズ７の光軸方向に薄いシート形状を有する。また、略直交とは、直交した状態から当業者が設定上又は製造上の誤差と認識し得るような範囲をいう。
【００１７】
ステージ６は、対物レンズ７の光軸方向へ移動する電動ステージであり、光シート面とサンプルＳとの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する第２の調整手段である。ステージ６の移動は後述する制御装置２０によって制御される。
【００１８】
Ｚ駆動部８は、対物レンズ７を対物レンズ７の光軸方向に動かす電動部であり、光シートＬＳが形成される光シート面と対物レンズ７との相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する第１の調整手段である。Ｚ駆動部８を介した対物レンズ７の移動は後述する制御装置２０によって制御される。
【００１９】
ダイクロイックミラー１０は、レーザ光を反射することで、レーザ光と蛍光を分離する。エミッションフィルタ１１は、レーザ光を遮断し蛍光を透過させる。ダイクロイックミラー１０及びエミッションフィルタ１１により、撮像装置１２へのレーザ光の入射が制限される。
【００２０】
撮像装置１２は、光シートＬＳが照射されたサンプルＳの画像を、対物レンズ７を介して取得する。撮像装置１２は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの２次元イメージセンサを備えたデジタルカメラである。撮像装置１２は、受光面Ｓ１を有し、対物レンズ７の前側焦点位置が受光面Ｓ１に投影されるように配置されている。図１に示す受光面Ｓ１上の位置Ｐ１は、対物レンズ７の前側焦点位置が投影される位置、即ち、対物レンズ７の前側焦点位置と光学的に共役な位置である。
【００２１】
補正環１８は、球面収差を補正する補正装置である。補正環１８は、対物レンズ７を構成するレンズを対物レンズ７の光軸方向に移動する電動補正環であり、補正環１８による球面収差の補正は後述する制御装置２０によって制御される。
【００２２】
光シート顕微鏡１００は、さらに、ダイクロイックミラー１０の反射光路（ダイクロイックミラー１０により撮像装置１２と対物レンズ７の間の光路から分岐した光路）上に、ビームスプリッタ１３と、２つの遮光板（ピンホール板１４、ピンホール板１６）と、２つの光検出器（光検出器１５、光検出器１７）を備える。
【００２３】
ビームスプリッタ１３は、ダイクロイックミラー１０で反射したレーザ光を５０：５０の割合で分離する。ピンホール板１４及び光検出器１５は、ビームスプリッタ１３で分岐した一方の光路上に配置され、ピンホール板１６及び光検出器１７は、ビームスプリッタ１３で分岐した他方の光路上に配置されている。
【００２４】
ピンホール板１４は、開口を有する第１の遮光板であり、対物レンズ７の前側焦点位置が投影される位置Ｐ２よりも後方に配置されている。一方、ピンホール板１６は、開口を有する第２の遮光板であり、対物レンズ７の前側焦点位置が投影される位置Ｐ３よりも前方に配置されている。位置Ｐ２及び位置Ｐ３は、対物レンズ７の前側焦点位置と光学的に共役な位置であり、換言すると、撮像装置１２の受光面Ｓ１（位置Ｐ１）に対応する位置である。以降では、位置Ｐ２及び位置Ｐ３のことを、それぞれ必要に応じて基準位置とも記す。ここで、前方とは光の進行方向を基準にして手前側のことであり、後方とは光の進行方向を基準にして奥側のことである。
【００２５】
光検出器１５は、ピンホール板１４を通過した光シート面からの光を検出する第１の光検出器であり、専らレーザ光を検出する。光検出器１７は、ピンホール板１６を通過した光シート面からの光を検出する第２の光検出器であり、専らレーザ光を検出する。光検出器１５及び光検出器１７は、例えば、光電子増倍管（PMT：Photomultiplier Tube）であり、検出光量に応じた信号を出力する。
【００２６】
光シート顕微鏡１００は、さらに、制御装置２０を備える。制御装置２０は、サンプルＳの複数の断層像を取得する断層像取得処理を実行するように構成されている。断層像取得処理の詳細については後述するが、その概要は次のとおりである。
【００２７】
断層像取得処理では、制御装置２０は、光シートをサンプルＳの異なる位置に照射して複数の断層像を取得するために、ステージ６を制御して光シート面とサンプルＳとの相対位置を変化させる。このとき、光シート面と対物レンズ７の間の媒質（空気と媒質ＭとサンプルＳ内部を含む）の屈折率分布が変化するため、対物レンズ７を動かしてないにも関わらず対物レンズ７の焦点面が光軸方向に動いてしまう。従って、ステージ６を制御するだけでは、光シート面と対物レンズの焦点面にズレが生じてしまう。このため、制御装置２０は、ステージ６を制御すると、さらに、対物レンズ７を介して検出される光シート面からの光に基づいて、Ｚ駆動部８を制御し、光シート面と対物レンズ７の相対位置を調整する。より具体的には、対物レンズ７の焦点面を光シート面に近づけることで、これらの位置が合うようにＺ駆動部８を制御する。
【００２８】
さらに、光シート面と対物レンズ７の間の媒質の屈折率分布の変化は、球面収差量の変動も引き起こす。このため、制御装置２０は、Ｚ駆動部８を制御すると、さらに、撮像装置１２で取得されるサンプルＳの画像のコントラスト又は明るさが大きくなるように、補正環１８を制御し、球面収差を補正する。これにより、対物レンズ７の焦点面と光シート面が高精度に合った状態で、球面収差が補正された複数の断層像を取得することができる。
【００２９】
図２は、制御装置２０のハードウェアの構成を例示した図である。制御装置２０は、例えば、標準的なコンピュータであり、プロセッサ２１、メモリ２２、入出力インターフェース２３、ストレージ２４、及び、可搬記録媒体２６が挿入される可搬記録媒体駆動装置２５を備え、これらがバス２７によって相互に接続されている。なお、図２は、制御装置２０のハードウェア構成の一例であり、制御装置２０はこの構成に限定されるものではない。
【００３０】
プロセッサ２１は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＭＰＵ（Micro Processing Unit）、ＤＳＰ（Digital Signal Processor）などであり、プログラムを実行してプログラムされた処理、例えば、上述した断層像取得処理を行う。メモリ２２は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）であり、プログラムの実行の際に、ストレージ２４または可搬記録媒体２６に記録されているプログラムまたはデータを一時的に記憶する。
【００３１】
入出力インターフェース２３は、制御装置２０以外の装置（例えば、ステージ６、Ｚ駆動部８、光検出器１５、光検出器１７、補正環１８など）と信号をやり取りする回路である。ストレージ２４は、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリであり、主に各種データやプログラムの記録に用いられる。可搬記録媒体駆動装置２５は、光ディスクやコンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記録媒体２６を収容するものである。可搬記録媒体２６は、ストレージ２４を補助する役割を有する。
【００３２】
図３は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。図４は、合焦処理の手順を示すフローチャートである。図５は、球面収差補正処理の手順を示すフローチャートである。以下、図３から図５を参照しながら、光シート顕微鏡１００で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
【００３３】
光シート顕微鏡１００は、まず、断層像を取得する高さ範囲の指定を受け付ける（ステップＳ１０１）。ここでは、利用者が図示しない入力装置を用いて断層像を取得する高さ範囲を入力することで、制御装置２０が高さ範囲の指定を受け付ける。制御装置２０は、さらに、受け付けた高さ範囲に基づいて、断層像を取得する位置、つまり、サンプルＳ中における光シート面の位置を決定する。
【００３４】
次に、光シート顕微鏡１００は、サンプルＳに光シートＬＳを照射し（ステップＳ１０２）、サンプルＳの画像を取得する（ステップＳ１０３）。ここでは、サンプルＳ中における光シート面の位置は特に限定されない。このため、光シートＬＳを任意の位置に照射し、サンプルＳの画像、つまり、光シート面の画像を、撮像装置１２で取得すればよい。
【００３５】
その後、光シート顕微鏡１００は、取得した画像に基づいて、合焦判定を行う（ステップＳ１０４）。ここでは、対物レンズ７の焦点面が光シート面に合っているか否かを、例えば、制御装置２０が画像のコントラストに基づいて判定する。また、制御装置２０が判定する代わりに、人間が画像を目視することで判定し、その判定結果に従って制御装置２０が合焦状態か否かを判定してもよい。
【００３６】
合焦状態に無いと判定されると（ステップＳ１０４ＮＯ）、光シート顕微鏡１００は、光シート面と対物レンズ７の相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ１０５）。ここでは、制御装置２０がＺ駆動部８を制御して光シート面と対物レンズ７の相対位置を調整する。その後、再びサンプルＳの画像を取得する（ステップＳ１０３）。そして、合焦状態にあると判定されるまで（ステップＳ１０４ＹＥＳ）、ステップＳ１０３からステップＳ１０５の処理を繰り返す。なお、この合焦判定処理は取得した画像全体に対して行う必要はない。撮像装置１２が有する撮像素子の一部分により取得された画像の一部分に対して行っても良い。
【００３７】
合焦状態にあると判定されると、光シート顕微鏡１００は、合焦評価値を算出する（ステップＳ１０６）。ここでは、制御装置２０が光シート面で散乱したレーザ光を検出した光検出器１５及び光検出器１７からの出力信号に基づいて所定の演算を行うことで、合焦評価値を算出する。合焦評価値は、対物レンズ７の焦点面と光シート面の一致度合いに応じて変化する値である。合焦評価値は、光検出器１５からの出力信号値をＡとし、光検出器１７からの出力信号値をＢとすると、特にこれに限定されないが、例えば、（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）で算出されてもよい。
【００３８】
その後、光シート顕微鏡１００は、ステップＳ１０６で算出した値から基準範囲を設定する（ステップＳ１０７）。ステップＳ１０６で算出した値は、合焦状態において算出される合焦評価値であるため、合焦評価値がステップＳ１０６で算出した値を含む所定範囲内にある場合には、光シート顕微鏡１００は合焦状態にあるとみなすことができる。このため、ステップＳ１０７では、ステップＳ１０６で算出した値を含む所定範囲を後述するステップで利用するために、基準範囲に設定する。
【００３９】
次に、光シート顕微鏡１００は、光シート面が初期位置に移動するように、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ１０８）。ここでは、制御装置２０は、ステージ６を制御して、ステップＳ１０１で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである初期位置に光シート面を動かす。
【００４０】
ステージ６により光シート面とサンプルＳとの相対位置を変化させると、その後、光シート顕微鏡１００は、合焦処理を行う（ステップＳ１０９）。ここでは、制御装置２０が、対物レンズ７を介して検出される光シート面からの光に基づいて、光シート面と対物レンズ７の焦点面が近づくようにＺ駆動部８を制御する合焦処理（以降、第１合焦処理と記す。）を行う。
【００４１】
具体的には、図４に示すように、まず、光シート顕微鏡１００は、合焦評価値を算出する（ステップＳ２０１）。この処理は、ステップＳ１０６と同様である。次に、光シート顕微鏡１００は、ステップＳ２０１で算出した合焦評価値がステップＳ１０７で設定した基準範囲内か否かを判定する（ステップＳ２０２）。この処理は、ステップＳ１０８でのステージ６の移動により対物レンズ７の焦点面が移動している可能性があるために行われる。なお、ステップＳ２０２の処理は、合焦状態にあるか否かを判定する点はステップＳ１０４と同様であるが、光検出器１５及び光検出器１７からの出力信号に基づいて合焦判定を行う点が、撮像装置１２で取得した画像に基づいて合焦判定を行うステップＳ１０４とは異なる。
【００４２】
ステップＳ２０２で合焦評価値が基準範囲内にないと判定されると、光シート顕微鏡１００は、光シート面と対物レンズの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ２０３）。ここでは、制御装置２０は、合焦評価値が基準値に近づくようにＺ駆動部８を制御して、光シート面と対物レンズ７の相対位置を調整する。
【００４３】
光シート顕微鏡１００は、その後、再び合焦評価値を算出する（ステップＳ２０１）。そして、合焦評価値が基準範囲内にあると判定されるまで、即ち、合焦評価値が所定範囲内の値になるまで、ステップＳ２０１からステップＳ２０３の処理を繰り返す。
【００４４】
そして、合焦処理が終了すると、即ち、合焦評価値が基準範囲内にあると判定されると、光シート顕微鏡１００は、球面収差補正処理を行う（ステップＳ１１０）。ここでは、制御装置２０が、撮像装置１２で取得されるサンプルＳの画像の評価値が大きくなるように補正環１８を制御する球面収差補正処理を行う。
【００４５】
具体的には、図５に示すように、まず、光シート顕微鏡１００は、サンプルの画像を取得し（ステップＳ３０１）、画像評価値を算出する（ステップＳ３０２）。ここでは、制御装置２０は、撮像装置１２で取得した画像から画像評価値を算出する。画像評価値は、球面収差の補正度合いに応じて変化する値であり、例えば、画像のコントラスト又は明るさを示す値である。
【００４６】
次に、光シート顕微鏡１００は、所定の複数の補正値で画像評価値を算出済みか否かを判定する（ステップＳ３０３）。補正値とは、補正装置で補正される球面収差量（即ち、補正量）を決定する値であり、例えば、補正装置の設定値である。所定の複数の補正値は、補正装置に設定可能な設定値の範囲内から選択された複数の設定値であり、例えば、一定の設定値間隔で選択された複数の設定値である。ここでは、制御装置２０は、補正環１８を所定の複数の設定値の各々に設定した状態で画像を取得し、取得したそれぞれの画像の画像評価値を算出済みか否か判定する。
【００４７】
ステップＳ３０３で所定の複数の補正値で画像評価値を算出済みではないと判定されると、光シート顕微鏡１００は、補正装置の補正値を調整する（ステップＳ３０４）。ここでは、制御装置２０は、補正環１８の設定値を所定の複数の設定値のうちの画像評価値が算出されていない設定値に変更する。
【００４８】
光シート顕微鏡１００は、その後、サンプルの画像を取得し（ステップＳ３０１）、画像評価値を算出する（ステップＳ３０２）。そして、所定の複数の補正値で画像評価値を算出済みであると判定されるまで、ステップＳ３０１からステップＳ３０４の処理を繰り返す。
【００４９】
所定の複数の補正値で画像評価値を算出済みであると判定されると、光シート顕微鏡１００は、補正装置の補正値を画像評価値が最大になる補正値に調整する（ステップＳ３０５）。ここでは、制御装置２０は、まず、所定の複数の設定値とステップＳ３０２で算出された複数の画像評価値に基づいて、画像評価値が最大になる設定値を算出する。例えば、ステップＳ３０２で算出された複数の画像評価値のうちの最大の画像評価値を選択し、選択された画像評価値に対応する補正環１８の設定値を画像評価値が最大になる設定値として算出してもよい。また、ステップＳ３０２で算出された複数の画像評価値と対応する複数の設定値の組み合わせから画像評価値と設定値の関係を算出し、算出された関係に基づいて画像評価値が最大となる設定値を推定してもよい。その後、制御装置２０は、補正環１８の設定値を画像評価値が最大になる設定値に変更する。これにより、球面収差が補正される。
【００５０】
そして、球面収差補正処理が終了すると、光シート顕微鏡１００は、サンプルＳの画像である断層像を取得する（ステップＳ１１１）。これにより、対物レンズ７の焦点面と光シート面が合った状態で且つ球面収差が補正された状態で断層像が取得される。
【００５１】
その後、光シート顕微鏡１００は、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する（ステップＳ１１２）。ここでは、制御装置２０は、ステップＳ１０１で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである最終位置にまで光シート面が移動済みか否かを判定する。
【００５２】
最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡１００は、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ１１３）。ここでは、制御装置２０は、ステージ６を制御して、ステップＳ１０１で決定した断層像を取得する位置のうちの次の位置に光シート面を移動する。その後、光シート顕微鏡１００は、ステップＳ１０９からステップＳ１１３の処理を繰り返し、ステップＳ１１２で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図３に示す断層像取得処理を終了する。
【００５３】
光シート顕微鏡１００では、ステージ６により光シート面とサンプルＳとの相対位置を変化させたときに、制御装置２０が合焦処理を行う。具体的には、光シート面とサンプルＳの相対位置を変更後に取得される光検出器からの出力信号に基づいて合焦状態が判定される。このため、人間が画像に基づいて合焦状態を判定する場合よりも、光シート面を対物レンズ７の焦点面に素早く合わせることができる。制御装置が画像に基づいて合焦状態を判定する場合と比較しても計算量が少ないため、光シート面を対物レンズ７の焦点面に素早く合わせることができる。
【００５４】
また、光シート顕微鏡１００では、Ｚ駆動部８により光シート面と対物レンズ７との相対位置を変化させたときに、制御装置２０が球面収差補正処理を行う。具体的には、光シート面を対物レンズ７の焦点面に合わせた後に、撮像装置１２で取得した画像に基づいて補正環１８の設定値が変更される。これにより、対物レンズと光シート面との間の媒質の構成比率の変動に起因して生じた球面収差を補正することができる。
【００５５】
また、光シート顕微鏡１００では、２つの検出器と２つのピンホール板の組み合わせによって、いわゆる、前ピン状態と後ピン状態とを判別することができる。これにより、対物レンズ７の焦点面と光シート面の間でズレが生じている方向を知ることが可能であり、光シート面と対物レンズ７の相対位置を調整する方向を特定することができる。この点も、光シート面を対物レンズ７の焦点面に素早く合わせることに寄与する。
【００５６】
さらに、光シート顕微鏡１００では、光シート面とサンプルＳの相対位置を変更する度に、その相対位置で実際に検出された信号に基づいて合焦処理が行われる。このため、キャリブレーションデータに基づいて合焦処理を行う場合よりも、光シート面を対物レンズ７の焦点面に高精度にあわせることができる。
【００５７】
以上のように、光シート顕微鏡１００によれば、光シート面に応じて変動する球面収差を補正しながら、対物レンズ７の焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。
【００５８】
なお、本実施形態では、サンプルＳを対物レンズ７の光軸の方向に動かしたときのみを説明したが、サンプルＳが大きなときには、シート光に対してサンプルＳを対物レンズ７の光軸と直交する方向に相対的に動かして撮像することがある。この場合、サンプルＳ内の位置によって屈折率が変化し対物レンズ７の焦点面がずれる可能性があるが、このときも本方法で光シート面に合焦させることが可能である。
【００５９】
また、光シート顕微鏡１００では、制御装置２０がソフトウェア処理により合焦評価値を算出してＺ駆動部８を制御する例を示したが、例えば、制御装置２０の代わりにコンパレータなどの回路によって合焦評価値を評価して評価結果に応じた制御信号をＺ駆動部８へ出力してもよい。この場合、ソフトウェア処理よりも更に高速に合焦処理を行うことができる。
【００６０】
また、光シート顕微鏡１００では、ピンホール板１４及びピンホール板１６を備える例を示したが、ピンホール板１４及びピンホール板１６のそれぞれの代わりに、例えば、図６に示すピンホールアレイ１９ａを有する遮光板１９を備えてもよい。遮光板１９を用いることで、サンプルＳ中の多点からの光を検出することができる。これにより、サンプルＳ中の特異な点（散乱が少ない場所）が及ぼす影響を軽減することができるため、より信頼性の高い合焦判定結果を得ることができる。
【００６１】
また、光シート顕微鏡１００では、光シート面とサンプルの相対位置が調整される度に、制御装置２０が合焦処理を行う例を示したが、このような動作は、制御装置２０がコンティニュアスオートフォーカス（以降、コンティニュアスＡＦと記す）処理を行うことで実現されてもよい。即ち、制御装置２０は、対物レンズ７を介して光検出器１５及び光検出器１７で検出される光シート面からの光に基づいて、光シート面と焦点面が近づくようにＺ駆動部８を継続的に制御するコンティニュアスＡＦ処理を行ってもよい。
【００６２】
また、光シート顕微鏡１００では、球面収差補正処理において、所定の複数の補正値でサンプルの画像を取得することで画像評価値が最大となる補正値を算出する例を示したが、球面収差補正処理は特にこの方法に限らない。例えば、山登り法（hill-climbing）などの任意の探索法を用いて、画像評価値が最大となる補正値を算出してもよい。
【００６３】
また、光シート顕微鏡１００では、光シート面とサンプルの相対位置が変化する度に、球面収差補正処理において、補正値を算出するために画像を取得する例を示したが、画像取得はすべての相対位置で行われなくてもよい。少なくとも２つの相対位置で補正値を算出するために画像を取得すればよく、その他の相対位置における補正値は、既に算出された少なくとも２つの相対位置における補正値から補間等によって算出されてもよい。この場合、画像取得回数を大幅に減らすことができるため、球面収差の補正に要する時間を短縮することができる。また、画像取得のために光シートを照射する回数が減るため、サンプルＳに与えるダメージを抑えることができる。
【００６４】
［第２の実施形態］
図７は、本実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。本実施形態に係る光シート顕微鏡（以降、単に光シート顕微鏡と記す。）は、制御装置２０が図３に示す断層像取得処理の代わりに、図７に示す断層像取得処理を行う点を除き、光シート顕微鏡１００と同様である。なお、図７に示す断層像取得処理は、球面収差補正処理の後に再度、合焦処理が行われる点が、図３に示す断層像取得処理と異なる。
【００６５】
光シート顕微鏡は、断層像取得処理を開始すると、まず、断層像を取得する高さ範囲の指定を受け付ける（ステップＳ４０１）。この処理は、図３のステップＳ１０１と同様である。次に、光シート顕微鏡は、基準範囲設定処理を行い（ステップＳ４０２）、その後、光シート面が初期位置に移動するように、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ４０３）。基準範囲設定処理は、図３のステップＳ１０２からステップＳ１０７と同様であり、ステップＳ４０３の処理は、図３のステップＳ１０８と同様である。その後、光シート顕微鏡は、合焦処理を行い（ステップＳ４０４）、さらに、球面収差補正処理を行う（ステップＳ４０５）。これらの処理は、図３のステップＳ１０９、ステップＳ１１０と同様である。
【００６６】
球面収差補正処理が終了すると、光シート顕微鏡は、再度、合焦処理を行う（ステップＳ４０６）。つまり、制御装置２０は、補正環１８により球面収差を補正したときに、対物レンズ７を介して検出される光シート面からの光に基づいて、光シート面と対物レンズ７の焦点面が近づくようにＺ駆動部８を制御する合焦処理（以降、第２合焦処理と記す）を行う。なお、第２合焦処理の内容は、ステップＳ４０４の第１合焦処理と同様である。
【００６７】
第２合焦処理が行われる理由は、対物レンズ７によっては補正環１８の設定により焦点距離が変化することがあるからである。補正環１８の設定により焦点距離が変化する対物レンズ７が使用されている場合に球面収差補正処理が行われると、補正環１８の設定値の変更により焦点面が光軸方向に移動してしまう。このため、第１合焦処理によって一致した光シート面と焦点面が再びずれてしまうことがある。第２合焦処理は、このズレに対処するものである。
【００６８】
通常の顕微鏡では、球面収差補正処理により対物レンズ７の焦点面がわずかに移動しても移動後の焦点面で球面収差が補正されていれば明るく高画質な画像が得られる。これに対して、光シート顕微鏡では、対物レンズ７の焦点面がわずかに移動するだけで、焦点面が光シート面からずれてしまい、画像が暗くなってしまう。このため、球面収差補正処理後に再度合焦処理を行うことは、光シート顕微鏡では特に効果的である。
【００６９】
第２合焦処理が終了すると、光シート顕微鏡は、サンプルＳの画像である断層像を取得し（ステップＳ４０７）、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する（ステップＳ４０８）。最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡は、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ４０９）。なお、ステップＳ４０７からステップＳ４０９までの処理は、図３のステップＳ１１１からステップＳ１１３までの処理と同様である。
【００７０】
その後、光シート顕微鏡は、ステップＳ４０４からステップＳ４０９の処理を繰り返し、ステップＳ４０８で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図７に示す断層像取得処理を終了する。
【００７１】
本実施形態に係る光シート顕微鏡によっても、光シート顕微鏡１００と同様に、光シート面に応じて変動する球面収差を補正しながら、対物レンズ７の焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。特に、本実施形態に係る光シート顕微鏡によれば、球面収差補正処理後に再度合焦処理が行われるため、補正環１８の設定値によって焦点距離が変化する対物レンズが使用される場合であっても、上記の効果を得ることができる。
【００７２】
また、本実施形態に係る光シート顕微鏡も、光シート顕微鏡１００と同様に、種々の変形が可能である。例えば、制御装置２０がコンティニュアスＡＦ処理を行うことで、ステップＳ４０４及びステップＳ４０６の合焦処理が行われてもよい。
【００７３】
［第３の実施形態］
図８は、本実施形態に係る断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。本実施形態に係る光シート顕微鏡（以降、単に光シート顕微鏡と記す。）は、制御装置２０が図３に示す断層像取得処理の代わりに、図８に示す断層像取得処理を行う点を除き、光シート顕微鏡１００と同様である。なお、図８に示す断層像取得処理は、球面収差補正処理と合焦処理が所定の条件が満されるまで繰り返し行われる点が、図３に示す断層像取得処理と異なる。
【００７４】
光シート顕微鏡は、断層像取得処理を開始すると、まず、断層像を取得する高さ範囲の指定を受け付ける（ステップＳ５０１）。この処理は、図３のステップＳ１０１と同様である。次に、光シート顕微鏡は、基準範囲設定処理を行い（ステップＳ５０２）、その後、光シート面が初期位置に移動するように、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ５０３）。基準範囲設定処理は、図３のステップＳ１０２からステップＳ１０７と同様であり、ステップＳ５０３の処理は、図３のステップＳ１０８と同様である。
【００７５】
光シート面とサンプルＳの相対位置が調整されると、光シート顕微鏡は、繰り返し変数ｉに１を設定する（ステップＳ５０４）。その後、光シート顕微鏡は、合焦処理（第１合焦処理）を行い（ステップＳ５０５）、球面収差補正処理を行う（ステップＳ５０６）。これらの処理は、図３のステップＳ１０９、ステップＳ１１０と同様である。球面収差補正処理が終了すると、光シート顕微鏡は、球面収差補正処理で設定した補正装置の補正値に対応する画像評価値Ｃ（０）を記憶する（ステップＳ５０７）。ここでは、制御装置２０は、メモリ２２に画像評価値Ｃ（０）を記憶させる。
【００７６】
画像評価値Ｃ（０）が記憶されると、光シート顕微鏡は、合焦処理（第２合焦処理）を行い（ステップＳ５０８）、球面収差補正処理を行う（ステップＳ５０９）。球面収差補正処理が終了すると、光シート顕微鏡は、球面収差補正処理で設定した補正装置の補正値に対応する画像評価値Ｃ（ｉ）を記憶する（ステップＳ５１０）。ここでは、制御装置２０は、メモリ２２に画像評価値Ｃ（ｉ）を記憶させる。なお、ステップＳ５０８からステップＳ５１０までの処理は、ステップＳ５０５からステップＳ５０７までの処理と同じである。
【００７７】
画像評価値Ｃ（ｉ）が記憶されると、光シート顕微鏡は、所定の条件が満たされているか否かを判定する（ステップＳ５１１）。ここでは、制御装置２０は、メモリ２２から画像評価値Ｃ（ｉ）と画像評価値Ｃ（ｉ−１）を読み出して、所定の条件Ｃ（ｉ）／Ｃ（ｉ−１）＜αを満たしているか否かを判定する。
【００７８】
Ｃ（ｉ）／Ｃ（ｉ−１）は、直前に行われた球面収差補正処理で算出された画像評価値Ｃ（ｉ）とそれよりも以前に行われた球面収差補正処理で算出された画像評価値Ｃ（ｉ−１）の比であり、合焦処理と球面収差補正処理の組み合わせの実行前後で画像評価値がどの程度変化したかを示している。補正環１８の設定値によって焦点距離が変化する対物レンズが使用される場合、合焦処理と球面収差補正処理を繰り返し行うことで、画像評価値が球面収差補正された状態で且つ合焦状態で得られる一定の値に向かって収束するのが通常である。そこで、ステップＳ５１１では、Ｃ（ｉ）／Ｃ（ｉ−１）が１に十分に近づいたか否かを判定することで、値が収束したか否かを判定する。なお、αは、特に限定されないが、例えば１．１である。
【００７９】
所定の条件が満たされていないと判定されると、光シート顕微鏡は、繰り返し変数ｉをインクリメントし（ステップＳ５１２）、その後、所定の条件が満されるまで、ステップＳ５０８からステップＳ５１２の処理を繰り返す。つまり、制御装置２０は、第２合焦処理と球面収差補正処理とを、所定の条件を満たすまで、つまり、合焦状態で且つ球面収差が補正された状態を得られるまで繰り返す。
【００８０】
所定の条件が満たされたと判定されると、光シート顕微鏡は、サンプルＳの画像である断層像を取得し（ステップＳ５１３）、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する（ステップＳ５１４）。最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡は、光シート面とサンプルＳの相対位置を対物レンズ７の光軸方向に調整する（ステップＳ５１５）。なお、ステップＳ５１３からステップＳ５１５までの処理は、図３のステップＳ１１１からステップＳ１１３までの処理と同様である。
【００８１】
その後、光シート顕微鏡は、ステップＳ５０４からステップＳ５１５の処理を繰り返し、ステップＳ５１４で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図８に示す断層像取得処理を終了する。
【００８２】
本実施形態に係る光シート顕微鏡によっても、光シート顕微鏡１００と同様に、光シート面に応じて変動する球面収差を補正しながら、対物レンズ７の焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。特に、本実施形態に係る光シート顕微鏡によれば、合焦処理と球面収差補正処理を繰り返し行うことで、補正環１８の設定値によって焦点距離が変化する対物レンズが使用される場合であっても、合焦状態で且つ球面収差が補正された状態を得ることができる。
【００８３】
また、本実施形態に係る光シート顕微鏡も、光シート顕微鏡１００と同様に、種々の変形が可能である。例えば、制御装置２０がコンティニュアスＡＦ処理を行うことで、ステップＳ５０５及びステップＳ５０８の合焦処理が行われてもよい。
【００８４】
また、本実施形態に係る光シート顕微鏡では、合焦処理と球面収差補正処理の繰り返しを終了するための所定の条件として、補正値の比（Ｃ（ｉ）／Ｃ（ｉ−１））を利用する例を示したが、所定の条件は、特にこの例に限らない。合焦状態で且つ球面収差が補正された状態に達したか否かを判定できる条件であればよい。
【００８５】
［第４の実施形態］
図９は、本実施形態に係る光シート顕微鏡２００の構成を例示した図である。光シート顕微鏡２００は、補正環１８の代わりに、レンズ３０、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ(Liquid Crystal On Silicon-Spatial Light Modulator)３１及びレンズ３２を備える点と、ビームスプリッタ１３、２つのピンホール板及び２つの光検出器の代わりに、位相差ＡＦセンサ３３を備える点、制御装置２０の代わりに制御装置４０を備える点が、光シート顕微鏡１００とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡１００と同様である。
【００８６】
レンズ３０は、結像レンズ９とともに瞳リレー光学系を構成するレンズであり、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ３１に対物レンズ７の瞳を投影するように構成されている。ＬＣＯＳ−ＳＬＭ３１は、球面収差を補正する補正装置である。ＬＣＯＳ−ＳＬＭ３１は、対物レンズ７と撮像装置１２の間に配置されたプログラマブルな瞳変調素子であり、対物レンズ７の瞳位置と光学的に共役な位置に配置される。レンズ３２は、レンズ３０とともに像リレー光学系を構成するレンズであり、位置Ｐ１に形成されたサンプルＳの像を撮像装置１２に投影するように構成されている。
【００８７】
位相差ＡＦセンサ３３は、セパレータレンズ３４とセンサ３５を備える、位相差ＡＦ処理を実行するセンサユニットであり、撮像装置１２と対物レンズ７の間の光路から分岐した光路上に設けられている。
【００８８】
制御装置４０は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ３１及び位相差ＡＦセンサ３３に接続されている点、球面収差が補正されるようにＬＣＯＳ−ＳＬＭ３１を制御する点、位相差ＡＦセンサ３３からの出力信号に基づいてＺ駆動部８を制御する点が制御装置２０とは異なる。制御装置４０のハードウェア構成は、制御装置２０のハードウェア構成と同様である。また、制御装置４０は、図３に示す断層像取得処理を実行するように構成されている点も制御装置２０と同様である。ただし、制御装置４０は、制御装置２０とは異なり、位相差ＡＦセンサ３３からの出力信号に基づいて合焦処理を行い、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ３１を制御して球面収差補正処理を行う。
【００８９】
光シート顕微鏡２００によっても、光シート顕微鏡１００と同様に、光シート面に応じて変動する球面収差を補正しながら、対物レンズ７の焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡２００では、補正装置として補正環１８の代わりにＬＣＯＳ−ＳＬＭ３１を備えるため、機械的な駆動を伴うことなく球面収差を補正することができる。このため、高速に球面収差を補正することができる。さらに、焦点移動が生じないように球面収差を補正することができる。また、耐久性も高いため、長寿命で信頼性の高い装置を提供することができる。さらに、光シート顕微鏡２００では、位相差ＡＦセンサ３３を用いて合焦状態を検出することで、光シート顕微鏡１００と比較して光学系の構成をシンプルにすることができる。このため、安価に装置を構成することができる。
【００９０】
上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。光シート顕微鏡、及びその制御方法は、特許請求の範囲に記載された発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
【００９１】
光シート顕微鏡１００は、合焦状態を検出するための構造として、ビームスプリッタ１３、２つのピンホール板及び２つの光検出器の代わりに、位相差ＡＦセンサ３３を備えるように変形されてもよい。また、光シート顕微鏡１００は、合焦状態を検出するための構造として、ビームスプリッタ１３、２つのピンホール板及び２つの光検出器の代わりに、像面位相差センサを備えてもよく、像面位相差センサは、撮像装置１２に設けられてもよい。また、光シート顕微鏡２００は、合焦状態を検出するための構造として、位相差ＡＦセンサ３３の代わりに、像面位相差センサを備えてもよく、像面位相差センサは、撮像装置１２に設けられてもよい。
【符号の説明】
【００９２】
１・・・レーザ、２・・・光ファイバー、４・・・シート照明光学系、５・・・サンプル容器、６・・・ステージ、７・・・対物レンズ、８・・・Ｚ駆動部、９・・・結像レンズ、１０・・・ダイクロイックミラー、１１・・・エミッションフィルタ、１２・・・撮像装置、１３・・・ビームスプリッタ、１４、１６・・・ピンホール板、１５、１７・・・光検出器、１８・・・補正環、１９・・・遮光板、１９ａ・・・ピンホールアレイ、２０、４０・・・制御装置、２１・・・プロセッサ、２２・・・メモリ、２３・・・入出力インターフェース、２４・・・記憶装置、２５・・・可搬記録媒体駆動装置、２６・・・可搬記録媒体、２７・・・バス、３０、３２、・・・レンズ、３１・・・ＬＣＯＳ−ＳＬＭ、３３・・・位相差ＡＦセンサ、３４・・・セパレータレンズ、３５・・・センサ、１００、２００・・・光シート顕微鏡、Ｓ・・・サンプル、Ｓ１・・・受光面、ＬＳ・・・光シート、Ｍ・・・媒質、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３・・・位置
【図１】
2018017970.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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