(57)【要約】      （修正有）【課題】キシレラ・ファスチジオーサによって引き起こされる植物病害を防除する毒性バクテリオファージに基づく治療を開発する方法を提供する。【解決手段】キサントモナス細菌宿主においてＸ．ファスチジオーサに対して毒性のバクテリオファージを単離及び増殖する方法、並びに植物におけるＸ．ファスチジオーサ感染の症状を治療又は軽減する方法を更に提供する。本発明は、キサントモナス・アクソノポディス病原型シトリに対して毒性のバクテリオファージを単離及び増殖する方法、並びに、植物におけるキサントモナス・アクソノポディス病原型シトリ感染の症状を治療又は軽減する方法を更に提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物においてキシレラ・ファスチジオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）又はキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）によって引き起こされる症状又は病害を予防又は軽減する方法であって、該植物と、その宿主域にＸ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナスを含む毒性バクテリオファージとを接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記バクテリオファージが、Ｘｆａｓ１００ファージ、Ｘｆａｓ３００ファージからなる群から選択される少なくとも１種のＸｆａｓ１００タイプ又はＸｆａｓ３００タイプのバクテリオファージであり、前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプが、以下の特性：
（ａ）前記バクテリオファージが前記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することができること、
（ｂ）前記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、
（ｃ）前記バクテリオファージが、シホウイルス科に特有の形態である、非収縮性尾部を含み、直径５５ｍｍ〜７７ｍｍの範囲のカプシドサイズを有すること、
（ｄ）前記バクテリオファージのゲノムサイズが約５５５００ｂｐ〜５６２００ｂｐであること、及び
（ｅ）前記バクテリオファージが植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減すること、
の少なくとも１つを示し、
さらに、前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプが、以下の特性：
（ｆ）前記バクテリオファージが、前記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することができること、
（ｇ）前記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、
（ｈ）前記バクテリオファージが、直径５８ｍｍ〜６８ｍｍの範囲のカプシドサイズを有する非収縮性尾部を特徴とするポドウイルス科に特有の形態を含むこと、
（ｉ）前記バクテリオファージのゲノムサイズが約４３３００ｂｐ〜４４６００ｂｐであること、及び
（ｊ）前記バクテリオファージが、植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減すること、
の少なくとも１つを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接触が、バクテリオファージ粒子を前記植物に導入することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物が、ブドウ蔓、柑橘類、アーモンド、コーヒー、アルファルファ、キョウチクトウ、オーク、モミジバフウ、アメリカハナズオウ、ニレ、モモ、アンズ、プラム、ブラックベリー、クワ、又はチタルパ・タシュケンテンシス植物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記接触が、注入により、媒介昆虫により、根系を介して、注入により、スプレーにより、噴霧により、又は植物と散布接触する（dust contacting）ことにより、バクテリオフ
ァージを植物に導入することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記媒介昆虫がヨコバイである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記植物に導入される前記バクテリオファージの数が１ＰＦＵ／ｍｌ〜１×１０１２ＰＦＵ／ｍｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス種に対して毒性のある２株、３株、４株、５株又は６株のバクテリオファージを前記植物に同時に又は順次導入する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
植物集団においてＸ．ファスチジオーサによって引き起こされる症状を予防又は軽減するために植物集団とバクテリオファージとを接触させることを含むと規定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるＤＮＡ配列を有するゲノムを含み、又は前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるＤＮＡ配列を有するゲノムを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記毒性バクテリオファージが、前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプ及び／又は前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプから選択される少なくとも１種のバクテリオファージであり、該Ｘｆａｓ１００ファージタイプがＸｆａｓ１０３及びＸｆａｓ１０６からなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージであり、該Ｘｆａｓ３００ファージタイプがＸｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４及びＸｆａｓ３０６からなる群から選択される少なくとも１つのバクテリオファージであり、前記ファージタイプが、ファージＸｆａｓ１０３、ファージＸｆａｓ１０６、ファージＸｆａｓ３０２、ファージＸｆａｓ３０３、ファージＸｆａｓ３０４、及びファージＸｆａｓ３０６に対してそれぞれ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９６、ＰＴＡ−１３０９５、ＰＴＡ−１３０９８、ＰＴＡ−１３０９９、ＰＴＡ−１３１００、及びＰＴＡ−１３０９７により寄託されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
植物への送達用に製剤化された植物病害の生物防除組成物であって、前記組成物が、少なくとも１種の担体、及びＸｆａｓ１００ファージタイプ、Ｘｆａｓ３００ファージタイプからなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージを含み、前記バクテリオファージがキシレラ・ファスチジオーサ及びキサントモナス種に対して毒性である、植物病害の生物防除組成物。
【請求項１３】
前記バクテリオファージが、前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプ及び前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプからなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージであり、前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプが、以下の特性：
（ａ）前記バクテリオファージが前記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することができること、
（ｂ）前記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、
（ｃ）前記バクテリオファージが、シホウイルス科に特有の形態である、非収縮性尾部を含み、直径５５ｍｍ〜７７ｍｍの範囲のカプシドサイズを有すること、
（ｄ）前記バクテリオファージのゲノムサイズが約５５５００ｂｐ〜５６２００ｂｐであること、及び
（ｅ）前記バクテリオファージが植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減すること、
の少なくとも１つを示し、
さらに、前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプが、以下の特性：
（ｆ）前記バクテリオファージが、前記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサン
トモナス細菌を溶菌することができること、
（ｇ）前記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、
（ｈ）前記バクテリオファージが、直径５８ｍｍ〜６８ｍｍの範囲のカプシドサイズを有する非収縮性尾部を特徴とするポドウイルス科に特有の形態を含むこと、
（ｉ）前記バクテリオファージのゲノムサイズが約４３３００ｂｐ〜４４６００ｂｐであること、及び
（ｊ）前記バクテリオファージが、植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減すること、
の少なくとも１つを示す、請求項１２に記載の植物病害の生物防除組成物。
【請求項１４】
前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプがＸｆａｓ１０３ファージ及びＸｆａｓ１０６ファージからなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージであり、前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプがＸｆａｓ３０２ファージ、Ｘｆａｓ３０３ファージ、Ｘｆａｓ３０４ファージ及びＸｆａｓ３０６ファージからなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージであり、前記ファージタイプの代表試料が、ファージＸｆａｓ１０３、ファージＸｆａｓ１０６、ファージＸｆａｓ３０２、ファージＸｆａｓ３０３、ファージＸｆａｓ３０４、及びファージＸｆａｓ３０６に対してそれぞれ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９６、ＰＴＡ−１３０９５、ＰＴＡ−１３０９８、ＰＴＡ−１３０９９、ＰＴＡ−１３１００、及びＰＴＡ−１３０９７により寄託されている、請求項１２に記載の植物病害の生物防除組成物。
【請求項１５】
前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるＤＮＡ配列を有するゲノムを含み、前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるＤＮＡ配列を有するゲノムを含む、請求項１２に記載の植物病害の生物防除組成物。
【請求項１６】
注入、スプレー、噴霧又は散布を介して植物に導入するために製剤化されると更に定義される、請求項１２〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
キシレラ・ファスチジオーサ及びキサントモナス種に対して毒性のある単離されたバクテリオファージであって、前記バクテリオファージがＸｆａｓ１００ファージタイプ及びＸｆａｓ３００ファージタイプからなる群から選択される少なくとも１種である、単離されたバクテリオファージ。
【請求項１８】
前記バクテリオファージがキシレラ・ファスチジオーサ及びキサントモナス種に対して毒性であり、前記バクテリオファージが前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプ及び前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプからなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージであり、前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプが、以下の特性、
（ａ）前記バクテリオファージが前記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することができること、
（ｂ）前記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、
（ｃ）前記バクテリオファージが、シホウイルス科に特有の形態である、非収縮性尾部を含み、直径５５ｍｍ〜７７ｍｍの範囲のカプシドサイズを有すること、
（ｄ）前記バクテリオファージのゲノムサイズが約５５５００ｂｐ〜５６２００ｂｐであること、及び
（ｅ）前記バクテリオファージが植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症
状を予防又は軽減すること、
の少なくとも１つを示し、
さらに、前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプが、以下の特性、
（ｆ）前記バクテリオファージが、前記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することができること、
（ｇ）前記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、
（ｈ）前記バクテリオファージが、直径５８ｍｍ〜６８ｍｍの範囲のカプシドサイズを有する非収縮性尾部を特徴とするポドウイルス科に特有の形態を含むこと、
（ｉ）前記バクテリオファージのゲノムサイズが約４３３００ｂｐ〜４４６００ｂｐであること、
（ｊ）前記バクテリオファージが、植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減すること、
の少なくとも１つを示す、請求項１７に記載の単離されたバクテリオファージ。
【請求項１９】
前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプがＸｆａｓ１０３及びＸｆａｓ１０６からなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージを含み、前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプがＸｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４、及びＸｆａｓ３０６からなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージを含み、前記ファージタイプが、ファージＸｆａｓ１０３、ファージＸｆａｓ１０６、ファージＸｆａｓ３０２、ファージＸｆａｓ３０３、ファージＸｆａｓ３０４、及びファージＸｆａｓ３０６に対してそれぞれ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９６、ＰＴＡ−１３０９５、ＰＴＡ−１３０９８、ＰＴＡ−１３０９９、ＰＴＡ−１３１００、及びＰＴＡ−１３０９７により寄託されている、請求項１７に記載の単離されたバクテリオファージ。
【請求項２０】
前記Ｘｆａｓ１００ファージタイプが配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８の群から選択されるＤＮＡ配列を有するゲノムを含み、Ｘｆａｓ３００ファージタイプが配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４の群から選択されるＤＮＡ配列を有するゲノムを含む、請求項１７に記載の単離されたバクテリオファージ。
【請求項２１】
植物においてキサントモナス・アクソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）病原型シトリによって引き起こされる症状又は病害を予防又は軽減する方法であって、該植物と、キサントモナス・アクソノポディス病原型シトリに対して毒性のバクテリオファージと接触することを含み、前記バクテリオファージがＸｆａｓ３００ファージタイプである、方法。
【請求項２２】
前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプの毒性バクテリオファージが、以下の特性：
（ａ）前記バクテリオファージが前記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することができること、
（ｂ）前記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、
（ｃ）前記バクテリオファージが、ポドウイルス科に特有の形態である、直径５８ｍｍ〜６８ｍｍの範囲のカプシドサイズを有する非収縮性尾部を含むこと、
（ｄ）前記バクテリオファージのゲノムサイズが約４３３００ｂｐ〜４４６００ｂｐであること、及び
（ｅ）前記バクテリオファージが植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減すること、
の少なくとも１つを示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
接触が、バクテリオファージ粒子を前記植物に導入することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記植物が、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）属の１種、フォーチュネラ（Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ）属の１種、ポンキルス（Ｐｏｎｃｉｒｕｓ）属の１種、ライム、レモン、オレンジ、グレープフルーツ、ポメロ、又は台木に使用されるカラタチのハイブリッドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記バクテリオファージが、注入により、若しくは媒介昆虫により植物へと導入されるか、又は注入により、スプレーにより、噴霧により、若しくは植物に散布することにより根系を介して送達される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記媒介昆虫がヨコバイである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物に導入される前記バクテリオファージの数が１ＰＦＵ／ｍｌ〜１×１０１２ＰＦＵ／ｍｌである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
植物集団において、キサントモナス・アクソノポディス及びその病原型と関連する症状を予防又は軽減するために植物集団と前記バクテリオファージ粒子とを接触することを含むと規定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプが配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含むゲノムを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｘｆａｓ３００ファージタイプのゲノムが配列番号２１を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記バクテリオファージが、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４及びＸｆａｓ３０６からなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージであり、前記バクテリオファージのＸｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４及びＸｆａｓ３０６の代表試料が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９８、ＰＴＡ１３０９９、ＰＴＡ−１３１００、及びＰＴＡ−１３０９７により寄託されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記毒性バクテリオファージがＸｆａｓ３０３であり、その試料がＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９９により寄託されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
Ｘ．ファスチジオーサをその宿主域に含む毒性バクテリオファージを増殖する方法であって、（ａ）前記毒性バクテリオファージをキサントモナス細菌の培養物に感染させる工程、（ｂ）前記バクテリオファージを増殖させる工程、及び（ｃ）前記培養物から毒性バクテリオファージ粒子を単離する工程を含む、方法。
【請求項３４】
前記バクテリオファージが、植物、廃水、及び／又は土壌水から単離された、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記キサントモナス細菌の培養物が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３１０１により寄託されたキサントモナス株ＥＣ−１２を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記バクテリオファージの成長のため寒天重層の使用を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌と、毒性バクテリオファージの集団を含む試料とを接触すること、並びに該集団から該Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することが可能な少なくとも第１のバクテリオファージを単離することを含む、ピアス病に対する候補となる生物防除剤を得る方法。
【請求項３８】
前記試料が、植物、廃水、及び／又は土壌水から単離された、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌宿主の培養重層上の毒性バクテリオファージのゾーン又はプラークの形成を検出することを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病理学の分野に関する。より具体的には、本発明は、細菌のウイルスであるバクテリオファージの使用を含む、バクテリオファージの単離のための、及びキシレラ・ファスチジオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）及びキサントモナス・アクソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）によって引き起こされる植物病害を治療するための方法及び組成物に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２０１２年１０月１９日付で出願された米国仮出願第６１／７１６，２４５号、及び２０１３年３月１４日付で出願された同第６１／７８５，５３５号の利益を主張する。
【０００３】
［連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載］
アメリカ政府は、テキサス州ピアス病研究及び教育プログラムに対する動植物検疫局（ＡＰＨＩＳ）協力協定賞、AgriLife Researchとの協定番号１１−８５００−０９５５−
ＣＡ、及びAgriLife Researchと大塚製薬株式会社の協定番号４０６０３９に従って、本
発明において一定の権利を有する。
【０００４】
［配列表の援用］
Microsoft Windows(登録商標)オペレーティングシステムにより計測され、２０１３年
１０月１７日付で作成された９０７キロバイトの「TAMC019WO_ST25.txt」と名前が付けられたファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に電子出願され、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００５】
細菌は、植物において、ブドウ蔓のピアス病、及び柑橘植物のミカン類潰瘍病を含む多くの病害を引き起こす可能性がある。細菌は植物組織に感染し、萎れ、生育不良、果実の損傷、更には枯死を引き起こす可能性がある。感染は、風、雨、汚染された機器、又は媒介昆虫による蔓延を通して他の植物に容易に拡散し、植物に有害な影響及び大規模な作物被害をもたらす。これらの病害の効果的な治療は、細菌を除外する植物の治療方法を必要とする。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、キサントモナス細菌の培養物にバクテリオファージを感染させること、上記バクテリオファージを増殖させること、及び上記培養物からバクテリオファージ粒子を単離することを含む、Ｘ．ファスチジオーサ（Ｘ. ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）をその宿主域に含む毒性バクテリオファージ（ファージ）を増殖する方法を提供する。別の実施の形態では、キサントモナス細菌は、種株ＥＣ−１２を含む。別の実施の形態では、バクテリオファージは、細胞表面特徴に結合することによって細胞に感染する。別の実施の形態では、上記細胞特徴はＩＶ型線毛である。別の実施の形態では、上記バクテリオファージは、ポドファージ、シホファージ、及びミオファージからなる群から選択される尾部を有するバクテリオファージを含む。別の実施の形態では、上記バクテリオファージは、環境、下水処理場若しくは下水、植物若しくはその表面、又は周囲の土壌から単離される。本発明の別の実施の形態では、毒性バクテリオファージを富化するため代理宿主を使用する。更に別の実施の形態では、上記バクテリオファージはキシレラ・ファスチジオーサにおいて毒性である。他の実施の形態では、バクテリオファージの成長のため寒天重層を使用する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、Ｘ．ファスチジオーサ及びキサントモナス細菌と、毒性バクテリオファージの集団を含む試料とを接触すること、並びに上記Ｘ．ファスチジオーサ及びキサントモナス細菌を溶菌することが可能な上記集団から少なくとも第１のバクテリオファージを単離することを含む、ピアス病に対する候補となる防除剤を得る方法を提供する。１つの実施の形態では、上記バクテリオファージは、細胞表面特徴に結合することによって細胞に感染する。別の実施の形態では、上記細胞表面特徴はＩＶ型線毛である。更に別の実施の形態では、上記細胞表面特徴は、細菌宿主の病原性／毒性に必要である。他の実施の形態は、Ｘ．ファスチジオーサ及びキサントモナスの少なくとも１種の菌叢と試料とを接触させるこ、Ｘ．ファスチジオーサ及びキサントモナスと試料とを同時に接触させるこ、並びにＸ．ファスチジオーサ及びキサントモナスと試料とを順次に接触させることを含む。他の実施の形態では、上記バクテリオファージは、環境、下水処理場若しくは下水、植物若しくはその表面、又は周囲の土壌から単離される。別の実施の形態では、使用される上記バクテリオファージは、キシレラ・ファスチジオーサにおいて毒性である。上記方法は、宿主細菌と上記毒性バクテリオファージとを接触させた後に、溶菌した細菌宿主細胞、又はプラーク形成を検出することを更に含んでもよい。特定の実施の形態では、上記方法は、バクテリオファージの試料が導入された細菌宿主細胞のプレート寒天重層又はプレートを含む。
【０００８】
他の実施の形態では、上記バクテリオファージは、Ｘ．ファスチジオーサ及びキサントモナスを含有する軟寒天重層の使用により調製され、更なる実施の形態では、融合溶菌を呈するＸ．ファスチジオーサ株又はキサントモナス株、例えば、ＥＣ−１２を含む１又は複数の重層プレート（複数の場合がある）を採取した後に、浸軟及び遠心分離による清澄化によって、高力価ファージプレート溶菌物を調製する。濾過滅菌した後、得られた溶菌物を、例えば４℃にて保存することができる。その後、高力価ファージ溶菌物を、例えば、等密度ＣｓＣｌ遠心分離によって精製し、抽出したファージ溶液を透析する。得られたＣｓＣｌ精製バクテリオファージは、典型的には約１×１０１１ＰＦＵ／ｍｌの力価を呈する。
【０００９】
幾つかの実施の形態では、植物組織濾過物（ＰＴＦ）中のバクテリオファージの割合は、Ｘ．ファスチジオーサ株Ｔｅｍｅｃｕｌａについて４日間、又はキサントモナス株ＥＣ−１２について４時間に関し、２０ｍｌの代理宿主（選択した宿主の活発な成長培養物）に対してＰＴＦ約１ｍｌである。
【００１０】
本発明の別の態様は、植物においてＸ．ファスチジオーサと関連する症状又は病害を予防又は軽減する方法であって、植物と、Ｘ．ファスチジオーサをその宿主域に含むバクテリオファージとを接触させることを含み、Ｘ．ファスチジオーサと関連する症状又は病害が、葉が葉縁に沿って黄色又は赤色の外観を示し、最終的には葉縁の壊死を伴うピアス病（ＰＤ）特有の症状を含む、植物においてＸ．ファスチジオーサと関連する症状又は病害を予防又は軽減する方法を提供する。１つの実施の形態では、上記バクテリオファージ粒子は植物中へと導入されてもよい。別の実施の形態では、上記植物は、ブドウ蔓植物、柑橘類植物、アーモンド、コーヒー、アルファルファ、キョウチクトウ、オーク、モミジバフウ、アメリカハナズオウ、ニレ、モモ、アンズ、プラム、ブラックベリー、クワ、及びチタルパ・タシュケンテンシス（Ｃｈｉｔａｌｐａ  ｔａｓｈｋｅｎｔｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。別の実施の形態では、上記バクテリオファージは、注入により、媒介昆虫により植物へと導入されるか、又は注入によって根系を介して送達される。他の実施の形態では、注入は、針又無針系、空気圧又は加圧注入系を含む。他の実施の形態では、上記注入は、手動で行われるか、又は１回若しくは２回以上行われる。別の実施の形態では、上記媒介昆虫はヨコバイ（ｇｌａｓｓｙ  ｗｉｎｇｅｄ  ｓｈａｒｐｓｈｏｏｔｅｒ）である。別の実施の形態では、上記植物に導入されるバクテリオファージは、１Ｐ
ＦＵ／ｍｌ（プラーク形成単位／ｍｌ）〜１０１２ＰＦＵ／ｍｌ、１０４ＰＦＵ／ｍｌ〜１０１１ＰＦＵ／ｍｌ、及び１０７ＰＦＵ／ｍｌ〜１０１０ＰＦＵ／ｍｌである。別の実施の形態では、上記バクテリオファージ粒子は、キサントモナス細菌の培養物にバクテリオファージを感染させること、上記バクテリオファージを増殖させること、及び上記培養物からバクテリオファージ粒子を単離することを含む方法によって得られる。別の実施の形態では、上記方法は、Ｘ．ファスチジオーサと関連する症状を予防又は軽減するため、植物の集団とバクテリオファージ粒子とを接触させることを含む。更に別の実施の形態では、上記バクテリオファージは、下記のＸｆａｓ１００ファージタイプ又はＸｆａｓ３００ファージタイプから選択される少なくとも１種のバクテリオファージ（ファージ）の株を含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は、植物への送達用に製剤化された植物病害の生物防除組成物を提供し、上記組成物は、少なくとも１種の希釈剤、アジュバント又は界面活性剤、及び下記のＸｆａｓ１００ファージタイプ又はＸｆａｓ３００ファージタイプからの少なくとも１種のバクテリオファージを含む。１つの実施の形態では、上記組成物は、注入、スプレー、噴霧、又は散布を介して植物へと導入するために製剤化されると更に規定される。別の実施の形態では、上記組成物は、植物への局所投与用に製剤化されると更に規定される。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ミカン類潰瘍病に対する候補となる生物防除剤を得る方法であって、キサントモナス・アクソノポディス病原型シトリ（pv. citri）細菌と、毒性バ
クテリオファージの集団を含む試料とを接触すること、及び上記キサントモナス・アクソノポディス細菌を溶菌することが可能な上記集団から少なくとも第１のバクテリオファージを単離することを含む、ミカン類潰瘍病に対する候補となる生物防除剤を得る方法を提供する。１つの実施の形態では、上記バクテリオファージは、細胞表面特徴に結合することによって細胞に感染する。別の実施の形態では、上記細胞表面特徴はＩＶ型線毛である。更に別の実施の形態では、上記細胞表面特徴は、細菌宿主の病原性／毒性に必要である。他の実施の形態は、キサントモナスの菌叢と試料とを接触することを含む。別の実施の形態では、使用される上記バクテリオファージは、キサントモナス・アクソノポディスにおいて毒性である。
【００１３】
本発明の別の態様は、植物においてキサントモナス・アクソノポディスと関連する症状又は病害を予防又は軽減する方法であって、植物と、キサントモナス・アクソノポディスをその宿主域に含むバクテリオファージとを接触することを含む、植物においてキサントモナス・アクソノポディスと関連する症状又は病害を予防又は軽減する方法を提供する。１つの実施の形態では、上記バクテリオファージ粒子は、上記植物に導入されてもよい。幾つかの実施の形態では、上記植物は、シトラス属の１種、フォーチュネラ属の１種、ポンキルス属の１種、ライム、レモン、オレンジ、グレープフルーツ、ポメロ、又は台木に使用されるカラタチのハイブリッドからなる群から選択される柑橘類植物である。別の実施の形態では、上記バクテリオファージは、注入により、媒介昆虫により植物へと導入されるか、又は注入によって根系を介して送達される。幾つかの実施の形態では、注入は、針又は無針系、空気圧又は加圧注入系を含む。他の実施の形態では、上記注入は手動で行われるか、又は１回若しくは２回以上行われる。別の実施の形態では、上記媒介昆虫はヨコバイである。別の実施の形態では、上記植物に導入されるバクテリオファージは、１ＰＦＵ／ｍｌ（プラーク形成単位／ｍｌ）〜１０１２ＰＦＵ／ｍｌ、１０４ＰＦＵ／ｍｌ〜１０１１ＰＦＵ／ｍｌ、及び１０７ＰＦＵ／ｍｌ〜１０１０ＰＦＵ／ｍｌの濃度である。別の実施の形態では、上記方法は、植物の集団においてキサントモナス・アクソノポディス及びその病原型と関連する症状を予防又は軽減するため、植物の集団と上記バクテリオファージ粒子とを接触することを含む。更に別の実施の形態では、上記バクテリオファージは、下記のＸｆａｓ１００ファージタイプ又はＸｆａｓ３００ファージタイプから選択
される少なくとも１種のバクテリオファージの株を含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、キサントモナス・アクソノポディスに毒性の単離されたバクテリオファージ、Ｘｆａｓ３０３バクテリオファージを提供し、上記バクテリオファージの代表試料はＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９９により寄託されている。更に別の態様では、本発明は、Ｘｆａｓ１０１、Ｘｆａｓ１０２、Ｘｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０４、Ｘｆａｓ１０５、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ１０７、Ｘｆａｓ１０８、Ｘｆａｓ１０９、Ｘｆａｓ１１０、Ｘｆａｓ３０１、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０４、Ｘｆａｓ３０５、及びＸｆａｓ３０６からなる群から選択されるバクテリオファージの１つとして、キサントモナス・アクソノポディス及び／又はＸ．ファスチジオーサに毒性の単離されたバクテリオファージを提供し、上記バクテリオファージＸｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４、及びＸｆａｓ３０６の代表試料は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９５、ＰＴＡ−１３０９６、ＰＴＡ−１３０９７、ＰＴＡ−１３０９８、ＰＴＡ−１３０９９、及びＰＴＡ−１３１００により寄託されている。
【００１５】
或る特定の実施の形態では、本発明は、植物においてＸ．ファスチジオーサ又はキサントモナス・アクソノポディス病原型シトリと関連するか、又はそれらによって引き起こされる症状又は病害を予防又は軽減する方法であって、上記植物と、Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス・アクソノポディス病原型シトリをその宿主域に含む毒性バクテリオファージとを接触させる工程を含み、さらに、上記バクテリオファージがＸｆａｓ１００ファージタイプ、及びＸｆａｓ３００ファージタイプからなる群から選択される少なくとも１種のバクテリオファージであり、上記Ｘｆａｓ１００タイプファージが、（ａ）上記バクテリオファージが上記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することができること、（ｂ）上記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、（ｃ）上記ファージが、シホウイルス科に特有の形態である、直径５５ｍｍ〜７７ｍｍの範囲のカプシドを有する長い非収縮性尾部を呈する尾部を有するバクテリオファージの群に属すること、（ｄ）上記バクテリオファージのゲノムサイズが約５５５００ｂｐ〜５６２００ｂｐであること、及び（ｅ）上記バクテリオファージが植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減することからなる群から選択される選択される少なくとも１つの特性を有し、上記Ｘｆａｓ３００タイプファージが、（ａ）上記バクテリオファージが、上記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することができること、（ｂ）上記バクテリオファージがＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、（ｃ）上記ファージが、ポドウイルス科に特有の形態である、直径５８ｍｍ〜６８ｍｍの範囲のカプシドを有する短い非収縮性尾部を呈する尾部を有するバクテリオファージの群に属すること、（ｄ）上記バクテリオファージのゲノムサイズが約４３３００ｂｐ〜４４６００ｂｐであること、及び（ｅ）上記バクテリオファージが、植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減する活性を有することからなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、植物においてＸ．ファスチジオーサ又はキサントモナス・アクソノポディス病原型シトリと関連するか、又はそれらによって引き起こされる症状又は病害を予防又は軽減する方法を提供する。或る特定の実施の形態では、単一タイプの毒性バクテリオファージが植物に導入され、他の実施の形態では、２、３、４、５、６又はそれより多い毒性バクテリオファージ単離物又はタイプの組合せが、同時又は順次のいずれかで植物に導入される。或る特定の実施の形態では、上記バクテリオファージは、配列番号１１〜配列番号２４からなる群から選択されるＤＮＡ配列、又はそれらに少なくとも９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のＤＮＡ配列を有するゲノムを含む。よって、或る特定の実施の形態では、植物に導入される上記バクテリオファージは、Ｘｆａｓ１０１、Ｘｆａｓ１０２、Ｘｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０４、Ｘｆａｓ１０５、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ１０７、Ｘｆａｓ１１０、Ｘｆａｓ３０１、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ
３０４、Ｘｆａｓ３０５、及びＸｆａｓ３０６からなる群から選択される。植物への送達用に製剤化され、かかるＸｆａｓ１００及び／又はＸｆａｓ３００タイプのバクテリオファージを含む植物病害の生物防除組成物もまた意図される。上記生物防除組成物は、担体を更に含んでもよい。幾つかの実施の形態では、上記担体は希釈剤、界面活性剤、及び／又はバッファーを含んでもよい。
【００１６】
本発明の特徴及び利点のより完全な理解のため、ここで、添付の図面と共に本発明の詳細な説明が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ポドウイルス科の形態及びサイズ特性と共に、ファージＸｆａｓ３０２、ファージＸｆａｓ３０３、ファージＸｆａｓ３０４及びファージＸｆａｓ３０５のＴＥＭ画像を示す図である。
【図２】シホウイルス科の形態及びサイズ特性と共に、ファージＸｆａｓ１０１、ファージＸｆａｓ１０２、ファージＸｆａｓ１０３及びファージＸｆａｓ１０４のＴＥＭ画像を示す図である。
【図３】廃水から単離され、ＸＦ１５及びＥＣ−１２でプラークを形成できる、Ｘ．ファスチジオーサのポドウイルス科及びシホウイルス科のバクテリオファージを示す図である。
【図４】シホウイルス科Ｘｆａｓ１０３及びＸｆａｓ１０６のゲノム地図を示す図である。
【図５】シホウイルス科Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４及びＸｆａｓ３０６のゲノム地図を示す図である。
【図６】株ＸＦ５４で接種後８週目の、バクテリオファージによるチャレンジ感染に供しなかった、ピアス病の症状を呈するブドウ蔓植物を示す図である。
【図７】ブドウ蔓バクテリオファージの治療的及び予防的チャレンジ感染研究の要約を示す図である。
【図８】ファージ接種後８週目（上）及び１２週目（下）の接種したブドウ蔓における個々のバクテリオファージの移動及び持続性を示す図である。左パネル：根組織に存在するファージ。中パネル：ブドウ蔓の垣根１に存在するファージ。右パネル：ブドウ蔓の垣根２に存在するファージ。
【図９】３週間後にファージカクテルのチャレンジ感染に供された接種したブドウ蔓におけるＸＦ１５のレベルを示す図である。ファージカクテルのチャレンジ感染の９週間後（細菌接種の１２週間後）に試料を採取した。左パネル：根組織に存在する細菌。中パネル：ブドウ蔓の垣根１に存在する細菌。右パネル：ブドウ蔓の垣根２に存在する細菌。灰色の棒グラフは、ＸＦ１５を接種した蔓におけるＸＦ１５のレベルを示す。黒色の棒グラフは、病原体接種の３週間後にファージカクテルのチャレンジ感染に供したＸＦ１５を接種した蔓におけるＸＦ１５のレベルを示す。矢印は、接種点を有する節を示す。各棒グラフは、３本の蔓に関する根及び２つの垣根の平均ＣＦＵ／ｇｐｔ（グラム植物組織）を表す。
【図１０】最初にＸＦ１５を接種し、３週間後にファージカクテルでチャレンジ感染したブドウ蔓におけるカクテルファージのレベルを示す図である。ファージカクテルのチャレンジ感染（最初の細菌接種から８週間後、１０週間後及び１２週間後）の５週間後、７週間後及び９週間後に試料を採取した。左パネル：根組織に存在するファージ。中パネル：ブドウ蔓の垣根１に存在するファージ。右パネル：ブドウ蔓の垣根２に存在するファージ。黒色の棒グラフは、カクテル接種植物におけるファージレベルを示す。灰色の棒グラフは、病原体接種の３週間後にファージカクテルでチャレンジ感染したＸＦ１５を接種した蔓におけるファージのレベルを示す。矢印は、接種点を有する節を示す。各棒グラフは、３本の蔓に関する根及び２つの垣根から求められたカクテル中の４種のファージの平均ＰＦＵ／ｇｐｔ（グラム植物組織）を表す。
【図１１】最初にファージカクテルで接種し、３週間後にＸＦ１５でチャレンジ感染したブドウ蔓におけるファージのレベルを示す図である。ＸＦ１５チャレンジ感染の５週間後、７週間後及び９週間後（最初のファージ接種から８週間後、１０週間後、１２週間後）に試料を採取した。左パネル：根組織に存在するファージ。中パネル：ブドウ蔓の垣根１に存在するファージ。右パネル：ブドウ蔓の垣根２に存在するファージ。黒色の棒グラフは、カクテルを接種した蔓におけるファージレベルを示す。灰色の棒グラフは、ファージ接種後３週目にＸＦ１５でチャレンジ感染したカクテルを接種した蔓におけるファージのレベルを示す。矢印は、接種点を有する節を示す。各棒グラフは、３本の蔓に関する根及び２つの垣根から求められたカクテル中の４種のファージの平均ＰＦＵ／ｇｐｔ（グラム植物組織）を表す。
【図１２】キサントモナス・アクソノポディス病原型シトリ株に対するファージＸｆａｓ３０３のスポット力価測定の結果を示す図である。
【００１８】
配列表の簡単な説明
配列番号１  Ｘ．ファスチジオーサｇｙｒＢに合わせて設計されたＸ．ファスチジオーサ特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号２  Ｘ．ファスチジオーサｇｙｒＢに合わせて設計されたＸ．ファスチジオーサ特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号３  バクテリオファージＤＮＡプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ３０４特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号４  バクテリオファージＤＮＡプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ３０４特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号５  バクテリオファージＤＮＡプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ３０３特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号６  バクテリオファージＤＮＡプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ３０３特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号７  バクテリオファージＤＮＡヘリカーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ１０３特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号８  バクテリオファージＤＮＡヘリカーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ１０３特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号９  バクテリオファージＤＮＡヘリカーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ１０６特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号１０  バクテリオファージＤＮＡヘリカーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ１０６特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号１１  バクテリオファージＸｆａｓ１０１のゲノム配列。
配列番号１２  バクテリオファージＸｆａｓ１０２のゲノム配列。
配列番号１３  バクテリオファージＸｆａｓ１０３のゲノム配列。
配列番号１４  バクテリオファージＸｆａｓ１０４のゲノム配列。
配列番号１５  バクテリオファージＸｆａｓ１０５のゲノム配列。
配列番号１６  バクテリオファージＸｆａｓ１０６のゲノム配列。
配列番号１７  バクテリオファージＸｆａｓ１０７のゲノム配列。
配列番号１８  バクテリオファージＸｆａｓ１１０のゲノム配列。
配列番号１９  バクテリオファージＸｆａｓ３０１のゲノム配列。
配列番号２０  バクテリオファージＸｆａｓ３０２のゲノム配列。
配列番号２１  バクテリオファージＸｆａｓ３０３のゲノム配列。
配列番号２２  バクテリオファージＸｆａｓ３０４のゲノム配列。
配列番号２３  バクテリオファージＸｆａｓ３０５のゲノム配列。
配列番号２４  バクテリオファージＸｆａｓ３０６のゲノム配列。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明をよりよく定義するため、また本発明の実施において当業者を導くために以下の定義及び方法が提供される。特に断りのない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来の使用に従って理解される。
【００２０】
本発明は、Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス・アクソノポディス（Ｘａ）及びその病原型の感染、その中での複製、及びそれらの溶菌が可能なバクテリオファージ（ファージ）の効率的な増殖及び単離を可能とする方法を初めて提供する。また、本発明は、植物における細菌性病害を防除する方法を提供する。本発明により防除され得る植物病害として、限定されないが、ピアス病及びミカン類潰瘍病が挙げられる。本発明による有用な細菌種として、限定されないが、キシレラ・ファスチジオーサ等のキシレラ種、又はキサントモナス・アクソノポディス等のキサントモナス種及びキサントモナス・アクソノポディス病原型シトリ（Ｘａｃ）等のその病原型が挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用される「バクテリオファージ」又は「ファージ」は、細菌のウイルスを指す。本明細書で使用される「キサントモナス・アクソノポディス」又は「Ｘａ」は、キサントモナス・アクソノポディス細菌種、又はその病原型を指し、病原型にはキサントモナス・アクソノポディス病原型シトリ（Ｘａｃ）又はキサントモナス・アクソノポディスの任意の他の病原型が含まれ得る。現在、Ｘ．ファスチジオーサを溶菌することが可能なバクテリオファージの増殖は、実験室においてＸ．ファスチジオーサ宿主細胞及び固体形式の複雑で高価な培地を使用し、多大な労力を要する。これは、低量のバクテリオファージを得るのに７日〜１０日を必要とする場合がある。そのため、本発明は、バクテリオファージを迅速に産生するためキサントモナス種ＥＣ−１２等の成長の早い宿主細菌においてバクテリオファージを成長させることにより、Ｘ．ファスチジオーサに感染可能なバクテリオファージの増殖を提供する飛躍的な進歩であり、これは「代理宿主」アプローチと呼ばれる。その技法は迅速で費用効率がよく、当該技術分野で利用可能な従来の培地成分と共に使用可能である。また、その技法はスケールアップしやすい。非常に複雑な培地中で多くても毎日複製する宿主を使用して、数日ではなく、標準条件下で毎時間複製することができる代理宿主においてＸ．ファスチジオーサ及び／又はＸａを溶菌（殺菌）する毒性ファージを産生する能力は、毒性ファージの使用を含むＸ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス・アクソノポディスが媒介する病害の防除及び治療の方法の産生及び実施を初めて実行可能とする。Ｘａの培養は、およそ２時間〜３時間の世代時間で、栄養培地中で行うことができる。しかしながら、Ｘａは許容病原体であるため、培養するためにはバイオセイフティーレベル２（ＢＬ２）を必要とする。したがって、Ｘ．ファスチジオーサと同様に、Ｘａは大規模生産に実用的ではない場合がある。
【００２２】
バクテリオファージは、Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細胞からファージの単離を可能とする軟寒天重層法により単離することができ、更なる実施形態では、高力価ファージプレート溶菌物を、融合溶菌を呈するＸ．ファスチジオーサ株又はキサントモナス株、例えば株ＥＣ−１２の１又は複数の重層プレート（複数の場合がある）を回収した後、浸軟、遠心分離による清澄化及び濾過滅菌することにより調製する。得られた溶菌物を４℃にて保存することができる。その後、高力価ファージ溶菌物を、例えば、等密度ＣｓＣｌ遠心分離により精製してもよく、抽出したファージ溶液を透析することができる。その結果、約１×１０１１ＰＦＵ／ｍｌの力価を有するＣｓＣｌ精製バクテリオファージをそのようにして得ることができる。他の実施形態では、植物組織濾過物（ＰＴＦ）中のバクテリオファージを濾過してもよい。濾過の好ましい割合は、例えば、Ｘ．ファスチジオーサ株Ｔｅｍｅｃｕｌａについて４日間、又はキサントモナス株ＥＣ−１２について４時間成長させた、代理宿主培養物（選択された宿主の活発な成長培養物）２０ｍｌに対してＰＴＦ１ｍｌである。
【００２３】
Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス・アクソノポディス（「Ｘａ」）病原
型に対して毒性のバクテリオファージの検出及び増殖のための方法を使用して、Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はＸａの溶菌を引き起こすことが可能な毒性バクテリオファージを、植物、廃水、及び／又は土壌水を含む環境等の所望の起源から選択することができ、本発明に従って増殖させることができる。本発明により同定され得るバクテリオファージは、カプシドの形状及び大きさ、ゲノムサイズ、遺伝子の配置及び/又は遺伝子モジュール
、形態学、並びに生活環等のCasjens et al.（Research in Microbiology, 159:340-348,
2008）によって記載される特有の特性により定義され得る。１つの実施形態では、本発
明のバクテリオファージは、毒性で、等密度で、Ｔ＝７の三角形分割数（triangulation number）を有し、約６０ｋｂ又は６０ｋｂの約１５％以内のゲノムサイズを有してもよく、ゲノム中に直列末端反復を含んでもよい。毒性バクテリオファージを、例えば、キシレラ種及び亜種及び／又はキサントモナス・アクソノポディス等のキサントモナス種及びシトリ等のその病原型によって引き起こされる病害を防除及び予防するために使用することができる。
【００２４】
現在、５つのキシレラの亜種が植物病害を引き起こすと認識されている。キシレラによって感染され得る植物種は、例えば、Hernandez-Martinez et al., (American Phytopathological Society, 97(7):857-864, 2007)、及びNunney et al., (PLoS ONE, 5(11):e15488, 2010)に記載されるwww.cnr.berkeley.edu/xylella/control/hosts.htmに列挙され、
また、限定されないが、ブドウ蔓、柑橘類、コーヒー、アーモンド、モモ、アルファルファ、アンズ、プラム、ブラックベリー、クワ等の商品作物、並びにキョウチクトウ、オーク、モミジバフウ、アメリカハナズオウ、ニレ、及びチタルパ・タシュケンテンシス等の園芸植物が挙げられ得る。本発明の１つの実施形態では、バクテリオファージを、Ｘ．ファスチジオーサがその特有の成長要求性のために成長ができない環境から単離することができる。さらに、本発明によれば、キサントモナス・アクソノポディス病原型によって感染され得る植物種として、限定されないが、シトラス属の１種、フォーチュネラ属の１種、ポンキルス属の１種、ライム、レモン、オレンジ、グレープフルーツ、ポメロ、又は台木に使用されるカラタチのハイブリッドが挙げられ得る。
【００２５】
そのため、本発明は、多くの植物において病害を引き起こす、木質部に限られた、昆虫により媒介される、グラム陰性細菌であるＸ．ファスチジオーサによって引き起こされる植物病害の防除のためのバクテリオファージに基づく治療の開発に対する方法を提供する。中でも注目すべきは、Ｘ．ファスチジオーサは、ブドウのピアス病（ＰＤ）の病因であり、現在、テキサス州及びカリフォルニア州を含む米国の地域で高品質のワインブドウの栽培を制限する要素である。Ｘ．ファスチジオーサによって引き起こされる１つの重要な植物病害は、ブドウのピアス病（「ＰＤ」）であり、黄色くなった葉、又は葉縁が赤色の葉を含む視認される症状を引き起こす。最終的には、葉縁及び葉の乾燥及び壊死が起こる場合がある。ヨコバイ類のヨコバイ（「ＧＷＳＳ」）等の媒介昆虫は病害を拡散する可能性があり、またファージは、病原性細菌に感染し、生物防除効率に有用であり得る。
【００２６】
現在、感染した蔓の積極的な淘汰を除き、ＰＤに対して有効な防除手段が存在しない。本発明は、植物の治療を可能とするため費用効率の良い方式で十分なバクテリオファージ量を生み出す実行可能なシステムを初めて提供することにより、かかる病害の治療を可能とする。また、本発明は、ミカン類潰瘍病の病因であるＸａｃを含むＸａによって引き起こされる植物病害の防除のためのバクテリオファージに基づく治療の開発に対する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、植物においてＸａの病害を防除する方法を提供する。
【００２７】
本明細書で使用される「毒性」の用語は、宿主細胞に感染し、その中で複製し、それを溶菌（殺菌）することが可能なウイルス、とりわけバクテリオファージを指す。「テンペレート」の用語は、宿主ゲノムへと組み込まれ得る（溶原化する）か、又は宿主細胞を溶
菌することができるバクテリオファージを指す。本発明の１つの実施形態では、ファージは、本明細書に記載される好適な宿主において増殖される。「宿主」の用語は、大量のバクテリオファージを産生するのに使用できる細菌細胞を指す。本明細書に提示されるバクテリオファージに基づく防除戦略の開発における一工程は、特定の細菌受容体部位を認識する毒性ファージの同定及び増殖である。病原菌に対して毒性のバクテリオファージの産生及び送達は、実行可能な生物防除の選択肢であるために経済的でなければならない。
【００２８】
ファージは、受容体の認識により宿主細胞に感染する。受容体として、限定されないが、ＯｍｐＡ及びＯｍｐＦ等の表面タンパク質、グラム陰性細菌の細菌ＬＰＳのコア及びＯ鎖、性線毛及びＩＶ型線毛（例えば、Roine et al., Mol. Plant Microbe Interact., 11:1048-1056 (1998)）、並びに鞭毛が挙げられる。いかなる所与の理論にも限定されない
が、バクテリオファージは、ＩＶ型線毛を介してＸ．ファスチジオーサ及びＸａの細胞に感染し得ると考えられる。そのため、１つの実施形態では、本開示による宿主は任意のタイプの細菌、とりわけ毒性テンペレートバクテリオファージ、又は継代ファージ等のその誘導体が、ＩＶ型線毛又はＴｏｎＢ様タンパク質等の毒性及び／又は病原性に必要な表面受容体に吸着され、それを介して感染することができる、任意の細菌種であってもよい。「継代ファージ」は、培養された宿主細胞において１又は複数の成長期間により増殖されたファージ集団を意味する。本発明に使用される典型的な宿主は、細菌細胞、とりわけ、キシレラ及びキサントモナスの両方を含むキサントモナス科の細菌種であってもよい。幾つかの実施形態では、本発明の実施に有用な可能性のあるＸ．ファスチジオーサの株として、Ｔｅｍｅｃｕｌａ１（ＡＴＣＣ７００９６４）；Ａｎｎ−１（ＡＴＣＣ７００５９８）；Ｄｉｘｏｎ（ＡＴＣＣ７００９６５）；ＸＦ５３、ＸＦ５４、及びＸＦ９５（Whitehorn et al., Science, 336:351-352 (2012)）；ＸＦ１３４、ＸＦ１３６、ＸＦ１４０、
ＸＦ１４１、ＸＦ１５−１、ＸＦ１５−１−１、ＴＭ１（Jones, et al., Ann. Rev Phytopathol., 45:245-262 (2007)）；及びｔｏｎＢ１（Summer et al., J. Bacteriol. 192:179-190 (2010)）が挙げられ得る。開示されるバクテリオファージ単離物の１又は複数に感受性であり、本発明に有用な可能性のあるキサントモナスの株の例として、とりわけＥＣ１２、Ｐｒｅｓ−４、及びＪａｌ−４（フロリダ州ゲインズビル、フロリダ大学のN. Wang博士により提供される）、Ｎｏｔｈ４０、Ｆｔ．Ｂａｓｉｎｇｅｒ及びＢｌｏｃｋ２
２が挙げられる。他のキサントモナス細菌もまた、それらのＸｆａｓ１００及び／又はＸｆａｓ３００のバクテリオファージに対する感受性を考慮して利用され得る。
【００２９】
本明細書で使用される「単離」の用語は、生物の混合培養物を含有する溶液からの生物の分離及び同定と定義される。単離され得る生物として、ウイルス、細菌、植物細胞等が挙げられ得る。バクテリオファージは、本明細書に記載されるように、また当該技術分野で知られているように単離され得る。１つの実施形態では、バクテリオファージを単離するための一般的な実験室的方法として、限定されないが、とりわけ培養細胞における成長、バクテリオファージアッセイ、二重寒天法、及びプラークアッセイが挙げられ得る。本発明は、両方の宿主細胞型において感染及び増殖することができるバクテリオファージを単離するため、異なる株の細菌宿主細胞を共に含む少なくとも第１の試料を重層することを含む方法によってバクテリオファージを単離する方法を提供する。
【００３０】
また、本発明は、キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はＸａに毒性のウイルス（バクテリオファージ）を増殖する方法を提供する。バクテリオファージを増殖する方法は、当該技術分野において既知であり、植物病害を治療するのに十分な量のバクテリオファージを産生することが可能な任意の方法を包含し得る。１つの実施形態では、Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はＸａｃに毒性のバクテリオファージの増殖は、キサントモナス細菌においてバクテリオファージを成長させること、上記バクテリオファージを増殖させること、及び上記培養物からバクテリオファージ粒子を単離することを含み得る。
【００３１】
Ｘ．ファスチジオーサに毒性のバクテリオファージは、軟寒天重層法を使用して調製されてもよい。高力価ファージプレート溶菌物は、例えば、Ｘ．ファスチジオーサ株Ｔｅｍｅｃｕｌａ又は融合溶菌を呈するキサントモナス株ＥＣ−１２の重層プレートを回収した後、浸軟及び遠心分離による清澄化によって調製されてもよい。濾過滅菌の後、得られた溶菌物を４℃で保存することができる。その後、高力価ファージプレート溶菌物を、等密度ＣｓＣｌ遠心分離によって精製してもよく、抽出したファージ溶液を透析する。例えば、１×１０１１ＰＦＵ／ｍｌの力価を有するＣｓＣｌ精製バクテリオファージを得ることができる。
【００３２】
濾過のための植物組織濾過物（ＰＴＦ）中のバクテリオファージの好ましい割合は、例えば、Ｘ．ファスチジオーサ株Ｔｅｍｅｃｕｌａについては４日間、又はキサントモナス株ＥＣ−１２については４時間に亘って成長させた代理宿主培養物（選択された宿主の活発な成長培養物）２０ｍｌに対してＰＴＦ１ｍｌである。
【００３３】
また、本発明は、植物（単数又は複数）においてＸ．ファスチジオーサ及び／又はＸａ病原型と関連する症状を治療又は軽減する方法を提供する。典型的なピアス病（ＰＤ）の症状として、それぞれ、葉がわずかに黄色くなるか、又は葉縁に沿って赤くなることが挙げられ、最終的には葉縁がその領域で乾燥又は枯死する場合がある。
【００３４】
意図される方法の１つの実施形態は、Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はＸａに感染した植物に、植物の治療をもたらす方式でＸ．ファスチジオーサ及び／又はＸａに毒性のバクテリオファージ（複数の場合がある）を投与することを含む。感染に対する植物の治療は、スプレー、噴霧、散布、注入、又は当該技術分野で既知の任意の他の方法によって行われ得る。かかる適用のための組成物を製剤化する方法もまた、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｘ．ファスチジオーサは植物の維管束組織に感染し、そのため、本明細書に記載されるように本発明は、上記バクテリオファージがＸ．ファスチジオーサ細胞に感染して溶菌し、それにより植物感染症を治療することができるように、Ｘ．ファスチジオーサに感染した植物にＸ．ファスチジオーサに対して毒性のバクテリオファージ粒子の精製した集団を注入により導入することを含んでもよい。しかしながら、当業者は、他の方法の使用も同様に成功することを認識するであろう。Ｘａは葉の病原体であり、葉の気孔に直接雨がかかることにより、又は強風の間若しくは昆虫により生じた傷により、植物の葉、茎、及び果実に自然感染する。そのため、１つの実施形態では、本発明は、Ｘａに感染した植物にＸａに毒性のバクテリオファージ粒子の精製した集団を含む組成物をスプレーすることにより導入することを含んでもよい。
【００３５】
本明細書で使用される「治療、処理」、「治療、処理すること」、及び「治療、処理する」の用語は、病害、障害若しくは状態及び／又はその症状の生理学的影響を軽減又は緩和するための薬剤を用いて病害、障害、又は状態に対して作用することと定義される。本明細書で使用される「治療、処理」は、宿主（例えば、食用植物等の農業目的のもの、又は食用製品を生産するために使用されるものを含む植物種、及び観賞植物種）における病害の任意の治療を包含し、（ａ）植物において病害が発生するリスクを減少すること、（ｂ）病害の発症を妨げること、及び（ｃ）病害の緩和すること、すなわち、病害の退行及び／又は１若しくは複数の病害症状の緩和をもたらすことを含む。また、「治療、処理」は、病害又は状態がなくても効果をもたらす阻害剤の送達を包含することを意味する。例えば、「治療、処理」は、植物における増強された又は所望の効果（例えば、病原体の負荷の軽減、病害症状の軽減等）を提供する病害又は病原体の阻害剤の送達を包含する。
【００３６】
また、本発明は、植物への送達用に製剤化された植物病害の生物防除組成物を提供し、上記組成物は、少なくとも１種の担体と、キシレラ・ファスチジオーサ及びＸａ等のキサントモナス種に毒性の少なくとも１種のバクテリオファージとを含む。
【００３７】
本発明の組成物中の有効成分としてのキシレラ・ファスチジオーサ及び／又はＸａ等のキサントモナス種に毒性のバクテリオファージもＸｆａｓ１０１、Ｘｆａｓ１０２、Ｘｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０４、Ｘｆａｓ１０５、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ１０７、Ｘｆａｓ１０８、Ｘｆａｓ１０９、及びＸｆａｓ１１０等のＸｆａｓ１００ファージタイプ及び／又はＸｆａｓ３０１、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４、Ｘｆａｓ３０５、及びＸｆａｓ３０６等のＸｆａｓ３００ファージタイプからなる群から選択されるバクテリオファージの１つとして提供され、ここで、Ｘｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４、及びＸｆａｓ３０６の上記ファージタイプは、それぞれＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９６、ＰＴＡ−１３０９５、ＰＴＡ−１３０９８、ＰＴＡ−１３０９９、ＰＴＡ−１３１００、及びＰＴＡ−１３０９７により寄託されている。
【００３８】
本発明における有効成分としてのＸｆａｓ１００ファージタイプの毒性バクテリオファージは、以下の特性、（ａ）上記バクテリオファージは上記キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス細菌を溶菌することが可能な活性を有すること、（ｂ）上記バクテリオファージはＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、（ｃ）尾部を有する上記バクテリオファージは、シホウイルス科に特有の形態である、直径５５ｍｍ〜７７ｍｍの範囲のカプシドを有する長い非収縮性尾部を呈すること、（ｄ）上記バクテリオファージのゲノムサイズが約５５５００ｂｐ〜５６２００ｂｐであること、及び（ｅ）上記バクテリオファージは植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減する活性を有することの少なくとも１つを示す。
【００３９】
本発明における有効成分としてのＸｆａｓ３００ファージタイプの毒性バクテリオファージは、少なくとも１つの特性を有し、該特性は、（ａ）上記バクテリオファージは、上記キシレラ・ファスチジオーサ及びキサントモナス細菌を溶菌することが可能な活性を有すること、（ｂ）上記バクテリオファージはＩＶ型線毛に結合することによって細胞に感染すること、（ｃ）尾部を有するバクテリオファージの群は、ポドウイルス科に特有の形態である、直径５８ｍｍ〜６８ｍｍの範囲のカプシドを有する短い非収縮性尾部を呈すること、（ｄ）上記バクテリオファージのゲノムサイズが約４３３００ｂｐ〜４４６００ｂｐであること、並びに（ｅ）上記バクテリオファージは、植物（単数又は複数）においてピアス病と関連する症状を予防又は軽減する活性を有することである。本発明の組成物中の有効成分としての毒性バクテリオファージは、Ｘｆａｓ１００ファージタイプ及び／又はＸｆａｓ３００ファージタイプから選択される少なくとも１種のバクテリオファージを更に含み、上記ＸｆａｓファージタイプがＸｆａｓ１０３及びＸｆａｓ１０６であり、及び／又は上記Ｘｆａｓ３００ファージタイプがＸｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４及びＸｆａｓ３０６である。
【００４０】
また、本発明の組成物中の有効成分として使用されるキシレラ・ファスチジオーサ及びＸａ等のキサントモナス種に対して毒性のバクテリオファージは、２、３、４、５、６、又はそれより多い毒性バクテリオファージ単離物又はファージタイプのカクテル等のファージの組合せによって提供され、担体との併用を含め、同時に又は順次に提供されてもよい。「キャリア」という用語は、ファージを投与するのに用いられる希釈剤、アジュバント、界面活性剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなキャリアは、水並びに例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油及びゴマ油等の石油、動物、植物又は合成由来のものを含む油等の無菌液体であってもよい。リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液を含む生理食塩水もまた、特に注射溶液用の液体キャリアとして用いることができる。好適な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、
乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、及びエタノール等を挙げることができる。
【００４１】
また、植物病害の生物防除組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
【００４２】
限定されないが、カゼイン系製剤、小麦粉系製剤、ショ糖、コンゴレッド、Ｎ−プロピル−ガレート、及びリグニン系製剤等の保護剤を、植物病害の生物防除組成物に添加することができる。
【００４３】
効率的な病害の防除に必要なファージ濃度は、限定されないが、例えば、１×１０ＰＦＵ／ｍｌ〜１×１０１２ＰＦＵ／ｍｌ、１×１０４ＰＦＵ／ｍｌ〜１×１０１１ＰＦＵ／ｍｌ、又は１×１０７ＰＦＵ／ｍｌ〜１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌとすることができる。
【００４４】
樹木の栽培年数に応じて、幹の太さ、根の大きさ、用量を適切に調整する。植物病害の生物防除組成物は、乾燥製品、実質的に乾燥した製品、液体製品、又は実質的に液体の製品であってもよい。幾つかの実施形態では、乾燥又は実質的に乾燥した製品を、液体（例えば、水等）において再構成した後、植物に適用することができる。他の実施形態では、かかる組成物を乾燥又は実質的に乾燥した形態で適用でき、既に植物に存在する、植物に同時に適用される、又は後に植物に生じる液体（例えば、適用、濃縮等により）が、標的細菌へのバクテリオファージの曝露を促進する。別の実施形態では、かかる組成物は、植物にスプレー、噴霧、又は散布によって適用され得る。
【００４５】
植物病害の生物防除組成物は、溶液、懸濁液、乳状液、粉末、錠剤等の形態をとることができる。
【００４６】
植物病害の生物防除組成物を適用するタイミングは、限定されないが、例えば、毎日、毎週、又は１週間に２回、毎月、隔月、又は３ヶ月毎であってもよい。
【００４７】
また、本発明は、キシレラ・ファスチジオーサ、並びにＸａ等のキサントモナス種及びその病原型に毒性の単離されたバクテリオファージを提供する。
【００４８】
本発明は、Ｘｆａｓ１０１〜Ｘｆａｓ１１０等のＸｆａｓ１００ファージタイプ、及び／又はＸｆａｓ３０１〜Ｘｆａｓ３０６等のＸｆａｓ３００ファージタイプからなる群から選択されるバクテリオファージの１つとして単離されたバクテリオファージも提供し、ここで、Ｘｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４、及びＸｆａｓ３０６は、それぞれＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０９６、ＰＴＡ−１３０９５、ＰＴＡ−１３０９８、ＰＴＡ−１３０９９、ＰＴＡ−１３１００、及びＰＴＡ−１３０９７により寄託されている。
【００４９】
かかるバクテリオファージは、キシレラ・ファスチジオーサ及び／又はキサントモナス種上にプラークを形成する能力を確認することによって検出され得る。
【００５０】
寄託情報
Ｘｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４及びＸｆａｓ３０６の各株の代表的なバクテリオファージの寄託、並びに本明細書において上記に開示され、特許請求項の範囲において参照されるＸ．アクソノポディス（X. axonopodis）ＥＣ−１２の代表的な細菌の寄託は、米国２０１０８バージニア州マナサス私
書箱１５４９に位置するＡＴＣＣにより行われた。上記アクセッションに対する寄託の日は、２０１２年７月２４日であり、上記寄託された株のアクセッション番号はそれぞれＰ
ＴＡ−１３０９６、ＰＴＡ−１３０９５、ＰＴＡ−１３０９８、ＰＴＡ−１３０９９、ＰＴＡ１３１００、ＰＴＡ１３０９７、及びＰＴＡ−１３１０１である。上記寄託に対する全ての制限は、特許査定により除外され、上記寄託は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．第１．８０１節〜第１．８０９節の全ての要求を満たすと意図される。上記寄託は、３０年間、又は最後の請求から５年、又は特許の有効期間のいずれか長いものの間受託機関に維持され、必要に応じてその期間中に交換される。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。下記の実施例に開示される技法は、本発明の実施において良好に機能するように本発明者らによって見出された技法であり、ひいてはその実施について好ましい様式を構成すると考えられることが当業者によって理解される。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、なおも、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく類似又は同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
【００５２】
実施例１
培地、培養条件及び細菌株
本実施例は、Ｘ．ファスチジオーサ及びキサントモナス種に対して毒性のバクテリオファージの単離、増殖、並びに形態学的特性評価及びゲノム特性評価を記載する。この研究で使用される培地は、Ｘ．ファスチジオーサの成長に使用される、急速な成長を可能とするが、バクテリオファージの感染能力に影響を及ぼす標準培地とは異なる。Hill及びPurcell（Phytopathology 85(12):1368-1372, 1995）によって改変されるように最終ウシ血清アルブミン含有量が０．３％であること以外は、ＰＷ−Ｍと名付けられた、Sherald et al.（Plant Disease 67:849-852, 1983）によって改変されたＰＷブロス培地を、Ｘ．ファスチジオーサ単離物の成長に使用した。固体培地（ＰＷ−ＭＡ）及び軟寒天用に、ＰＷ−Ｍブロスを１５ｇ／ｌ及び７．５ｇ／ｌのＰｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｓｔｅｄ  ａｇａｒ（Sigma）でそれぞれ補正した。非Ｘ．ファスチジオーサ培養物の日
常的な維持のため、複合培地ＴＮブロス（ＴＮＢ）を使用した。固体培地（ＴＮＡ）は、ＫＮＯ３を欠き、２０ｇ／Ｌ寒天を追加したこと以外は、同一であった。軟寒天重層用にＴＮ培地を７．５ｇ／Ｌ寒天（ＴＮＳＡ）で補正した。植物抽出物を平板培養して菌総数を得るため、ＴＮＡ培地をシクロヘキシミド（４０μｇ／ｍｌ；ＴＮＡＣ）で補正した。全ての培養物を２８℃で成長させ、液体培養物を、ネフェロフラスコを使用してλ＝６００ｎｍでモニターした。研究に含まれるカリフォルニアＸ．ファスチジオーサ単離物としては、Ｘ．ファスチジオーサ亜種ファスチジオーサを代表するＴｅｍｅｃｕｌａ（ＸＦ１５）、Ｘ．ファスチジオーサ亜種サンディ（sandyi）を代表するＡｎｎ１（ＸＦ１０８）、及びＸ．ファスチジオーサ亜種マルチプレックス（multiplex）を代表するＤｉｘｏｎ
（ＸＦ１０２）が挙げられる（Hendson et al., Applied and Environmental Microbiology 67(2):895-903, 2001）。テキサスＸ．ファスチジオーサ単離物としては、それぞれプラタナス・オシデンタリス（Platanus occidentalis）（ＸＦ１）、ヘリアンツス・アナ
ス（Helianthus annuus）（ＸＦ５）、アイバ・アンヌア（Iva annua）（ＸＦ１８）、ブタクサモドキ（Ambrosia psilostachya）（ＸＦ２３）、ラティビダ・コルムニフェラ（Ratibida columnifera）（ＸＦ３７）、ヴィティス・アエスティバリス（Vitis aestivalis）（ＸＦ３９）、ヴィティス・マスタンゲンシス（Vitis mustangensis）（ＸＦ４１）
からの単離物、アンブロシア・トリフィダ（Ambrosia trifida）変種テキサナ（texana）（ＸＦ１６、４０、及び４３）からの３種類の単離物、キョウチクトウ（Nerium oleander）（ＸＦ９３及び９５）からの２種類の単離物、及びヴィティス・ヴィニフェラ（Vitis
vinifera）（ＸＦ４８、５０、５２、５３、５４、５６、５８、５９、６０、６６、６
７、７０、７１、７６、及び７８）からの１５種類の単離物が挙げられる。全ての単離物は、ストリーク（streak：画線）単離法により精製された単一コロニーであり、最終濃度の２０％グリセロール（ｖ／ｖ）までＰＷ−Ｍブロス培養物を補正した後に−８０℃で保
存した。Ｘ．ファスチジオーサ単離物を、以前に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析（Hernandez-Martinez et al., Plant Disease 90(11):1382-1388, 2006）を使
用して種及び亜種のレベルで確認した。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＦＡＭＥ）により脂肪酸メチルエステルを分析するＭＩＤＩ  Ｓｈｅｒｌｏｃｋ（商標）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してキサントモナス種を同定した。
【００５３】
実施例２
植物試料の加工及び細菌の単離
テキサス州のブラゾス郡及びワシントン郡のブドウ園からヴィティス・ヴィニフェラ、Ｖ.マスタンゲンシス（V. mustangensis）及び草の植物試料を得た。テキサス州のジェファーソン郡及びワートン郡の水田からコメ（オリザ・サティバ（Oryza sativa））植物組織及び草を得た。テキサス州ボーモントのTexas AgriLife Research Centerから種もみ試料を得た。テキサス州ブラゾス郡においてバラ植物由来の試料（バラ属の１種；ノックアウト）及びハラペーニョ（ＴＡＭ−ｍｉｌｄ；カプシカム・アンナム（Capsicum annuum
））を得た。植物抽出物を得るため、１０ｇの植物組織を乳鉢と乳棒とを使用して５０ｍｌのバクテリオファージバッファー（Ｐ−バッファー；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４）中ですりつぶし、ボルテックスを行い、二層のチーズクロスで濾して大きな粒子を除去した。その後、Ｘ．ファスチジオーサ及び非Ｘ．ファスチジオーサ細菌の単離のため、抽出物をそれぞれＰＷ−Ｍ及びＴＮＡＣの両方に希釈平板法を行い、２８℃でインキュベートした。１０日目まで毎日、成長に関してプレートを評価した。
【００５４】
実施例３
植物試料からのバクテリオファージの単離、精製及び力価測定
植物組織濾過物（ＰＴＦ）を得るため、清澄植物抽出物を、２回遠心分離し（１００００×ｇ、４℃にて１０分間）、その組織抽出物を、０．２２μｍフィルター（Ｓｕｐｏｒ、Pall Life Sciences）を通して濾過した。ＰＴＦ中のバクテリオファージの存在を、一連のＸ．ファスチジオーサ及びキサントモナス種の宿主の重層上に１０μｌの１０倍希釈系列をスポッティングし、菌叢の発生後（Ｘ．ファスチジオーサ単離物については６日間〜７日間、キサントモナス種単離物については１８時間）のゾーン又はプラークの形成について観察することにより直接求めた。代替的には、バクテリオファージを、各濾過物１ｍｌを２０ｍｌのＸ．ファスチジオーサ単離物の活発な成長培養物（４日間培養物；Ａ６００＝０．３０）又はキサントモナス種宿主のＡ６００＝０．２５（４時間）培養物に添加することにより、ＰＴＦより富化した。Ｘ．ファスチジオーサ又はキサントモナス種の富化について、それぞれ７２時間又は２４時間の成長の後、培養物を遠心分離し（１００００×ｇ、４℃で１０分間）、濾過滅菌（０．２２μｍフィルター）した。富化した上清中のバクテリオファージの存在を判定するため、１０μｌの１０倍希釈系列を、一連のＸ．ファスチジオーサ及びキサントモナス種の宿主の重層上にスポットし、ゾーン又はプラークの形成を観察した。ＰＷ−ＭＡ上で成長させたＸ．ファスチジオーサ単離物の５日目の培養物を使用して、ＰＷ−Ｍブロス（Ａ６００＝０．５）中の宿主懸濁液を作製し、一方、培地ＴＮＡ上で成長させたキサントモナス種単離物の１８時間培養物を使用してＴＮブロス（Ａ６００＝０．５）中の懸濁液を作製し、重層の作製に使用した。バクテリオファージ活性に関して細菌上清を調査するために使用する軟寒天重層を、１００μｌの細菌懸濁液と７ｍｌの溶解したＰＷ−Ｍ又はＴＮ軟寒天とを混合し、ＰＷ−ＭＡプレート又はＴＮＡプレート上に混合物を注いで、凝固させ乾燥させることにより作製した。プラーク又は透明ゾーンの形成のいずれかを示すスポットした重層を、ＰＴＦ希釈物を重層する前に個々の宿主指標懸濁液と直接混合したこと以外は、上述の通り平板培養することによって更に調査した。Ｘ．ファスチジオーサ又はキサントモナス種の宿主重層のいずれかに形成された個々のプラークを切り取り、Ｐ−バッファー中に懸濁して力価測定を行った。こ
の手順を３回繰り返して単一のプラーク単離物を得た。高力価溶菌物（１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）を、５ｍｌのＰ−バッファーを用いて融合溶菌を呈するプレートの重層を回収し、軟寒天重層をふやかし、遠心分離（１００００×ｇ、４℃で１５分間）により溶菌物を清澄にし、０．２２μｍフィルターを通して濾過滅菌することにより調製した。溶菌物を４℃で保存した。
【００５５】
Ｘ．ファスチジオーサの選択のため、及び総菌数を得るため、植物抽出物をそれぞれＰＷ−Ｍ及びＴＮＡＣの両方に平板培養した。アッセイした全ての植物からの植物抽出物は、何らのＸ．ファスチジオーサ単離物の痕跡も生じなかった。しかしながら、非選択的平板培養により、多種多様な細菌コロニータイプを生じた。黄色に着色した細菌の代表的な単一コロニーをプレートから選択し、ストリーク精製してストックを得た。そのストックを、ゾーン又はプラークの形成を観察するためにＰＴＦがスポットされる重層を作製するために使用した。種もみ、ハラペーニョの葉、及びコメ組織の抽出物からそれぞれ得られた細菌単離物Ｐｒｅｓｉｄｉｏ−４、Ｊａｌ−４、及びＥＣ−１２を全て、ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸メチルエステル分析（ＧＣ−ＦＡＭＥ）を使用してキサントモナス種として同定し、ＰＴＦの評価用宿主として使用した。他のＸａ株も、かかる株に関して開示された１又は複数のバクテリオファージの毒性を考慮して利用してもよい。
【００５６】
５日間〜６日間のインキュベーション後、幾つかのＰＴＦの希釈物が単離物ＸＦ１５、ＸＦ５３、ＸＦ５４、ＸＦ９５上にプラークを産生し、これはこれらの宿主上にプラークを形成することができるバクテリオファージが植物組織中に存在したことを示していた。抽出物から観察された初期力価は、５×１０１ＰＦＵ／組織グラム〜７×１０５ＰＦＵ／組織グラムの範囲であった。全てのＰＴＦがＸＦ１５、ＸＦ５３、ＸＦ５４及びＸＦ９５に対して同じ産生パターンを示したことから、株ＸＦ１５をプラーク精製及び産生の宿主として使用した。この富化されていないＰＴＦにおいて見出される高力価は、植物組織と関連する天然の細菌宿主が、Ｘ．ファスチジオーサの重層上にプラークを産生することができるバクテリオファージの宿主として役立つ可能性があることを示す。ＰＴＦの連続した平板培養は、大きさが均一の個々のプラークを生じた。個々のプラークを切り取り、ＸＦ１５を宿主として使用してプラーク精製を３回行ってクローン単離物を得た。Ｘ．ファスチジオーサ株ＸＦ１５（Jones et al., 2007）又はＸ．ファスチジオーサＴｅｍｅｃｕｌａ株（ＡＴＣＣ７００９６４）上でバクテリオファージＸｆａｓ３０２が増殖したことを示す、キシレラ・ファスチジオーサ宿主株Ｔｅｍｅｃｕｌａ（１×１０９ＰＦＵ（プラーク形成単位／ｍｌ））を使用して精製及び増加し、キサントモナス種単離物Ｐｒｅｓ−４及びＥＣ−１２（いずれも５×１０７ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌ）に対して力価を測定したバクテリオファージＸｆａｓ３０２の培養皿は、キサントモナス種株Ｐｒｅｓ−４及びＥＣ１２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３１０１により寄託されたＥＣ１２）上にプラークを形成することができ、Ｘ．ファスチジオーサ上で増殖したバクテリオファージがキサントモナス株上で吸着、複製及びプラーク形成できるという証拠を提供した。下記に提示される宿主域研究は、これらの結果を更に実証する。
【００５７】
ファージＸｆａｓ１０１〜ファージＸｆａｓ１０５は全て、ＸＦ１５菌叢上に小さな透明プラークを産生したのに対し、ファージＸｆａｓ３０１〜ファージＸｆａｓ３０５は、同じ宿主上に大きな透明プラークを産生した。Ｘｆａｓ３０２〜Ｘｆａｓ３０５及びＸｆａｓ１０１〜Ｘｆａｓ１０４のＴＥＭ画像をそれぞれ図１及び図２に示す。ＸＦ１５を使用して産生された高力価の溶菌物を使用して、各バクテリオファージのＣｓＣｌ精製調製物を得て、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）研究を行うために使用した。ファージＸｆａｓ１０１〜ファージＸｆａｓ１０５は全て、直径５５ｎｍ〜６４ｎｍの範囲のカプシドを有する長い非収縮性尾部を呈し、そのため、シホウイルス科に属すると判断された。Ｘｆａｓ３０１〜Ｘｆａｓ３０５は全て、ポドウイルス科に特有の形態である、直径５８ｎｍ〜６５ｎｍの範囲のカプシドを有する短い非収縮性尾部を呈した。
【００５８】
実施例４
廃水からのバクテリオファージの富化
テキサス州地域のブライアンの処理施設から、清澄にした廃水試料を得た。スティルクリーク、カータークリーク、ターキークリーク、及びバートンクリークの施設から試料を得た。試料を２回遠心分離（１００００×ｇ、４℃で１０分間）、組織抽出物を、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。各濾過物１ｍｌを上述の選択した宿主の活発な成長培養物２０ｍｌに添加することによりファージを富化した。Ｘ．ファスチジオーサ又はキサントモナス種の富化のため、それぞれ７２時間及び２４時間の成長の後、培養物を遠心分離して濾過滅菌した。富化した濾過物を、上述のように重層上にスポットして力価測定を行った。
【００５９】
ファージＸｆａｓ１０６〜１０９及びファージＸｆａｓ３０６を、宿主ＥＣ−１２を宿主として使用して４種の廃水処理場から得られた富化試料から個別に単離した。精製したバクテリオファージ濃縮物のＴＥＭ研究は、直径６８ｎｍのカプシドを有する短い非収縮性尾部によりバクテリオファージＸｆａｓ３０６をポドウイルス科として形態学的に同定したのに対し（図３）、単離されたファージＸｆａｓ１０６〜１０９は、シホウイルス科の特性である直径約７７ｎｍのカプシドを有する長い非収縮性尾部を呈した（図３）。バクテリオファージＸｆａｓ３０６は、ＥＣ−１２及びＸＦ１５の両方の宿主上に大きな透明プラークを産生したのに対し、ファージＸｆａｓ１０６〜１０９は、同じ宿主上に小さい透明プラークを産生した（図３）。したがって、この実験で使用した方法は、Ｘ．ファスチジオーサバクテリオファージを環境試料から単離することを可能とした。
【００６０】
実施例５
ＣｓＣｌ精製
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−７０Ｍ超遠心機において６０Ｔｉ型ローターを使用する遠心分離（９００００×ｇ、５℃で２．５時間）により、濾過滅菌したバクテリオファージ懸濁液を濃縮した。ペレットをＰ−バッファーに再懸濁し、２５℃にて２時間、１μｇ／ｍｌの最終濃度でＤＮａｓｅＩ及びＲＮａｓｅＡ（Sigma）を用いて処理した。最終濃度０．
７５ｇ／ｍｌでＣｓＣｌをバクテリオファージ懸濁液に添加し、ＶＴｉ６５．２ローターにおいて遠心分離（３０００００×ｇ、５℃にて１８時間）した。視認することができたバクテリオファージバンドを、１８ゲージシリンジ針を使用して抽出し、１Ｍ  ＮａＣｌに補正したＰ−バッファー対して４℃で一晩、Ｐ−バッファーに対して２５℃で４時間２回に亘って透析し、１×１０１１ＰＦＵ／ｍｌの懸濁液を得た。ＣｓＣｌ精製バクテリオファージを４℃で保存した。
【００６１】
実施例６
透過型電子顕微鏡法
Ｐ−バッファーで希釈し、新たにグロー放電ホルムバール炭素被覆グリッド上に１分間に亘って５μｌを塗布することにより、ＣｓＣｌ精製バクテリオファージ（１×１０１１ＰＦＵ／ｍｌ）の電子顕微鏡法を行った。その後、グリッドを脱イオン水滴上で簡単に洗浄し、２％（ｗ／ｖ）水性酢酸ウラニルで染色した。１００ＫＶの加速電圧で操作するＪＥＯＬ  １２００ＥＸ透過型電子顕微鏡上で被検査物を観察した。
【００６２】
実施例７
平板効率及び宿主域
同種（増殖性）宿主に対して得られたバクテリオファージプラーク力価に対する異種（非増殖性）宿主を用いて得られたバクテリオファージプラーク力価の比を計算することによって、平板効率（ＥＯＰ）を得た。固体培地上に重層する前に、１００μｌのバクテリオファージストック希釈物と、軟寒天（７ｍｌ）中の個々の宿主指標懸濁液（Ａ６００＝
０．５）とを混合することによる適切な培地を使用して、Ｘ．ファスチジオーサ又はキサントモナス種宿主のいずれかに対してバクテリオファージストックの力価を測定した。
【００６３】
ＸｆａｓファージのＥＯＰを比較する研究を表１に示す。キサントモナス種株ＥＣ−１２を使用して増殖させ、その後、宿主としてＸ．ファスチジオーサ株ＸＦ１５を使用して力価測定を行った植物試料から単離されたファージに関するＥＯＰは、１×１０−１〜１×１０−３の範囲であり、株ＸＦ１５を使用して増殖させたバクテリオファージを、その後ＥＣ−１２を宿主として使用して力価測定を行った場合に同様の結果が見られた。廃水濾過物から単離され、株ＥＣ−１２上で増殖させたファージを用いる同様の研究は、１×１０−１〜５×１０−１の範囲のＥＯＰを呈した。ファージＸｆａｓ１０６〜１０９を株ＸＦ１５上で増殖させ、宿主ＥＣ−１２上で平板培養した場合に１×１０−１〜３×１０−１のＥＯＰが得られ、ＤＮＡ制限及び修飾のバリアが存在し得ると同時に、１日で急速に成長する株ＥＣ−１２において増殖したファージは、Ｘ．ファスチジオーサ単独では最大１０日に及ぶ可能性があるプロセスである、Ｘ．ファスチジオーサ上で吸着、複製及びプラーク形成することができることを示す。
【００６４】
【表１】
2018150340.tif 000002
【００６５】
個々の宿主を含む同種の軟寒天シードを用いて適切な培地、ＰＷ−Ｍ（ＸＦ１５用）又はＴＮＡ（ＥＣ−１２用）のプレートを重層することにより、宿主の菌叢を作製した。個々のバクテリオファージ調製物の高力価溶菌物（１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ）を、その後、１０μｌの１０倍希釈系列をＸ．ファスチジオーサ又はキサントモナス種の宿主の重層上にスポッティングすることにより、個々の菌叢に対してスポット力価測定を行った。プレートを適切な時間２８℃でインキュベートした後、（ＥＣ−１２に対して２４時間、又はＸＦ１５に対して５日間〜７日間）プレートをゾーン及びプラークの形成について評価した。
【００６６】
表２に示される初期の宿主域研究は、Ｘ．ファスチジオーサ宿主であるＸＦ１５上にプラークを形成することができた全てのファージは宿主ＥＣ−１２上にもプラークを形成し
たが、一方で、宿主Ｊａｌ−４及びＰｒｅｓ４は、ほとんどのシホファージに対して感受性を呈しなかったことを示す。耐性の理由は、吸着の欠如又はバクテリオファージゲノムの取り込み阻害、重感染免疫、制限修飾、及びクラスター化等間隔短回文反復配列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）等の他の
吸着後メカニズムに及ぶ。
【００６７】
【表２】
2018150340.tif 000003
【００６８】
実施例８
Ｘｆａｓ吸着部位の予備同定
植物組織又は廃水試料のいずれかから得られた又は富化されたＸ．ファスチジオーサファージがＸ．ファスチジオーサ上にプラークを形成したという観察に基づき、細胞表面成分が吸着部位として働くことができるかどうかを判定することを目的とした。ファージの既知の吸着部位として、ＯｍｐＡ及びＯｍｐＦ等の表面タンパク質、グラム陰性細菌の細菌ＬＰＳのコア及びＯ鎖、性線毛及びＩＶ型線毛、並びに鞭毛が挙げられる。野生型、及びＩＶ型線毛を欠く誘導体をもたらすｐｉｌＡの欠失を伴う誘導突然多様体を、Ｘｆａｓファージの宿主として評価した。試験した全てのバクテリオファージはＸＦ１５野生型株上にプラークを形成したが、ＸＦ１５ΔｐｉｌＡ突然多様体上にはプラークを形成しなかった。結果は、ＩＶ型線毛がＸｆａｓファージに対する付着の主な部位である可能性を示
唆した。
【００６９】
ＸＦ１５−ΔｐｉｌＡにより得られた結果に基づき、キサントモナス種株ＥＣ−１２のｐｉｌＡ欠失突然多様体が、ＸｆａｓファージであるＸｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ３０２、Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４及びＸｆａｓ３０６に非感受性になり得るかどうかを判定することを目的とした。株ＥＣ−１２ΔｐｉｌＡは、プレート力価アッセイにおいてファージに対して非感受性であり、ファージＸｆａｓ３０３を用いる吸着実験では宿主に対する吸着は観察されなかった。ｐｉｌＡに対してｉｎ  ｔｒａｎｓでのＥＣ−１２ΔｐｉｌＡ補完は、試験した全てのファージに対して感受性であった。これは、ＩＶ型線毛がＸ．ファスチジオーサについて観察されるようにファージに対して主な付着部位であることを更に実証した。
【００７０】
実施例９
バクテリオファージＤＮＡ単離及びゲノムシークエンシング
Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Promega）の変型
を使用して、濾過滅菌した高力価（１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ超）ＣｓＣｌ精製バクテリオファージ溶菌物１０ｍｌ〜２０ｍｌからバクテリオファージゲノムＤＮＡを調製した。簡単には、１０ｍｌ〜２０ｍｌのバクテリオファージ溶菌物を、各ＤＮａｓｅＩ及びＲＮａｓｅＡ（Sigma）１０μｇ／ｍｌを用いて３７℃で３０分間消化し、１０％（ｗ／ｖ）ポ
リエチレングリコール８０００及び１Ｍ  ＮａＣｌの存在下で４℃にて１６時間〜２０時間沈殿させた。沈殿物を１００００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、ペレットを０．５ｍｌのＰ−バッファーに再懸濁した。Ｗｉｚａｒｄキットにより供給される１ｍｌのＤＮＡ精製樹脂を、再懸濁したバクテリオファージに添加し、ミニカラムに充填して２ｍｌの８０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールで洗浄した。８０℃まで予備加熱した１００μｌの水を添加し、直後にミニカラムの遠心分離により樹脂からＤＮＡを溶出した。０．８％アガロースゲル上で泳動し、エチジウムブロミドで染色することによりＤＮＡの完全性を確認し、バンドデンシトメトリーによりＤＮＡを定量した。１％アガロースゲル（Ｐｕｌｓｅｄ−Ｆｉｅｌｄ  ａｇａｒｏｓｅ、BioRad）上でのゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）分析及びサイズマーカー（ＭｉｄＲａｎｇｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｉ、NEB）との比較によりバクテリオファージゲノムサイズを推定した。
【００７１】
「４５４」パイロシークエンシング（米国コネチカット州ブランフォードのRoche/454 Life Sciences、ジョージア州アトランタのエモリー大学、エモリーＧＲＡゲノムコアに
て）を使用してファージを配列決定した。上述のようにバクテリオファージ単離物からバクテリオファージゲノムＤＮＡを調製し、約１００ｎｇ／μｌの最終濃度まで等モル量で混合した。プールしたＤＮＡを切断し、４つのプールの各々に特異的なマルチプレックス識別子（ＭＩＤ）タグと連結し、製造業者のプロトコルに従って、Ｒｏｃｈｅ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上でフルプレート反応を使用するパイロシークエンシングにより配列決定した。プールしたバクテリオファージＤＮＡは、２つのシークエンシング反応に存在した。上記反応は、３９のゲノム要素を表す、合計約３３３１ｋｂのゲノム配列のゲノムＤＮＡを含有し、シークエンシングの実行により、平均４０５ｂｐ長の９８７８１５リードを生じ、プール全体について合計１２０倍のカバー率を提供した。４つのプールの各々に対応する整形ＦＬＸチタンフローグラムアウトプットを、Ｎｅｗｂｌｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５．３（454 Life Sciences）を使
用して、１つの統合当たり単一のＭＩＤ識別子を含有するリードのみを含むように条件を調整することにより、個別に統合させた。個々のコンティグの同定を、コンティグ配列及びテンプレートとして個々のバクテリオファージゲノムＤＮＡ調製物に対して作製されたプライマーを使用するＰＣＲによって求め、バクテリオファージＤＮＡテンプレートに由来する予測されるサイズの生成物の作製を使用して、それらのコンティグに個々のファージを一致させた。シーケンサー（Gene Codes Corporation）を配列の統合及び編集に使用
した。タンパク質コーディング領域を、Ｇｅｎｅｍａｒｋ（opal.biology.gatech.edu/GeneMark/gmhmm2_prok.cgi）を使用して予測し、Ａｒｔｅｍｉｓ（www.sanger.ac.uk/Software/Artemis/）において手作業で編集した（Lukashin et al., Nucleic Acids Research 26(4):1107-1115, 1998; Rutherford et al., Bioinformatics 16(10):944-945, 2000）
。ＤＯＴＴＥＲ（Brodie et al., Bioinformatics 20(2): 279-281, 2004）を使用してドットプロットを作製した。予測されるタンパク質をＢＬＡＳＴ（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）を使用してＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるタンパク質と比較した。保存ドメイン、リポタンパク質プロセッシングシグナル及び膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/interproscan）、ＬｉｐｏＰ（www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）、及びＴＭＨＭＭ（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）をそれぞれ用いて同定した。
【００７２】
【表３】
2018150340.tif 000004
【００７３】
実施例１０
Ｘｆａｓファージのゲノム分析、並びにＸｆａｓ１００及びＸｆａｓ３００ファージタイプの説明
溶原性コロニーを感染症から単離できず、テンペレートな生活様式（リプレッサー、インテグラーゼ）と関連する遺伝子がゲノム配列中に見出されないことから、キサントモナスＥＣ−１２並びにＸ．ファスチジオーサ及び亜種を攻撃する能力について単離されたファージは、いずれも感染にＩＶ型線毛を必要とし、いずれも毒性である。上記ファージは、Casjens et al.（Research in Microbiology, 159:340-348, 2008）により定義される
２つのファージタイプに更に分類され得る。
【００７４】
（１）Ｘｆａｓ１００ファージタイプ：Ｘｆａｓ１００ファージタイプは、キサントモナス及びキシレラの毒性シホファージ（ＩＣＴＶシホウイルス科）で構成され、そのプロトタイプはファージＸｆａｓ１０１、ファージＸｆａｓ１０２、ファージＸｆａｓ１０３、ファージＸｆａｓ１０４、ファージＸｆａｓ１０５、ファージＸｆａｓ１０６、ファージＸｆａｓ１０７、ファージＸｆａｓ１０８、ファージＸｆａｓ１０９、及びファージＸｆａｓ１１０（表１２）であり、その更なる例は、ｎが任意の数の「Ｘｆａｓ１ｎｎ」で示される任意のファージとして表３に列挙される（Ｘｆａｓ１００シリーズと呼ぶ）。この柔軟な命名システムは、Ｘｆａｓ１ｎｎファージタイプの更なる多様体が単離されると予想されることから必要である。Ｘｆａｓ１００タイプファージはシホファージであり、生活様式において毒性であり、キシレラ種及びキサントモナス種の感染にＩＶ型線毛を必要とする。Ｘｆａｓ１００タイプファージは、直径およそ５５ｎｍ〜７７ｎｍの寸法の正二十面体のカプシド頭部、及び長さおよそ２００ｎｍ〜２６２ｎｍの柔軟な尾部を有し、いずれの寸法値も陰性染色電子顕微鏡法の標準的な精度において求められる（図２及び図３を参照されたい）。Ｘｆａｓ１００シリーズのウイルスＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを特徴とする付着（ｃｏｓ）末端を有し（Casjens, et al., Methods Mol Biol 502:91-111, 2009）、これは、ｃｏｓ  ＤＮＡパッケージングが病因決定要素の送達作用を高め得る一般化された導入粒子の生成を回避することから、抗菌適用において使用されるファージに重要である。Ｘｆａｓ１００ゲノムは、２つの相違する遺伝子クラスター、ＡＬ及びＡＲとＢＬ及びＢＲとにおいて整列される遺伝子を伴う特徴的な全体構成（図４を参照されたい）を有する。Ｘｆａｓ１００ファージタイプは、ファージの必須の構造遺伝子及び溶菌遺伝子が右方遺伝子クラスターＢＬにグループ分けされるという事実により更に区別される。Ｘｆａｓ１００シリーズファージタイプもまた、それ自体の単一分子ＤＮＡポリメラーゼ（Ｘｆａｓ１０３ｇｐ７１及びＸｆａｓ１０６ｇｐ６６）、プライマーゼ（Ｘｆａｓ１０３ｇｐ７６及びＸｆａｓ１０６ｇｐ７１）及びヘリカーゼ（Ｘｆａｓ１０３ｇｐ６９及びＸｆａｓ１０６ｇｐ６４）をコードすることにより区別される。
【００７５】
（２）Ｘｆａｓ３００ファージタイプ：Ｘｆａｓ３００ファージタイプは、キサントモナス及びキシレラの毒性ポドファージ（ＩＣＴＶポドウイルス科）で構成され、そのプロトタイプはファージＸｆａｓ３０１、ファージＸｆａｓ３０２、ファージＸｆａｓ３０３、ファージＸｆａｓ３０４、ファージＸｆａｓ３０５及びファージＸｆａｓ３０６であり、その更なる例は表３に列挙され、ｎが任意の数である「Ｘｆａｓ３ｎｎ」と示される任意のファージを指す（Ｘｆａｓ３００シリーズと呼ぶ）。この柔軟な命名システムは、Ｘｆａｓ３００ファージタイプの更なる多様体が単離されると予想されることから必要である。Ｘｆａｓ３００タイプファージは、直径およそ５８ｎｍ〜６８ｎｍの寸法の正二十面体のカプシド頭部を有し、この寸法値は陰性染色電子顕微鏡法の標準的な精度において求められる（図１及び図３を参照されたい）。Ｘｆａｓ３０２〜３０６ゲノムは、構造タンパク質領域に隣接する単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼをコードする。Ｘｆａｓ３００シリーズゲノムは、ファージの複製遺伝子、構造遺伝子及び溶菌遺伝子を含む１本の鎖上に整列された遺伝子を有する特徴的な全体構成（図５を参照されたい）を有する。Ｘｆａｓ３００ファージタイプもまた、それ自体の単一分子ＤＮＡポリメラーゼ（Ｘｆａｓ３０２ｇｐ１８、Ｘｆａｓ３０３ｇｐ１７、Ｘｆａｓ３０４ｇｐ１７及びＸｆａｓ３０６ｇｐ１７）、単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼ（それぞれ、Ｘｆａｓ３０２ｇｐ３１、Ｘｆａｓ３０３ｇｐ２８、Ｘｆａｓ３０４ｇｐ２７及びＸｆａｓ３０６ｇｐ３０）及びヘリカーゼ（Ｘｆａｓ３０２ｇｐ１５、Ｘｆａｓ３０３ｇｐ１４、Ｘｆａｓ３０４ｇｐ１５及びＸｆａｓ３０６ｇｐ１４）をコードすることにより区別される（ファージゲノムの概略図について図５を参照されたい）。
【００７６】
実施例１１
バクテリオファージＸｆａｓ３０４を使用するブドウ蔓における移動、チャレンジ感染及び保護の研究
バクテリオファージＸｆａｓ３０４は、ポドウイルス科のメンバーであり、Ｘ．ファスチジオーサ及びキサントモナス種の両方を含む宿主域を有する環境試料から単離された。ここで提示される研究では、バクテリオファージを用いた植物の処理が後のＸ．ファスチジオーサによる感染を予防し得るかどうかを判定するため、感受性宿主の不在下でブドウ蔓においてＸｆａｓ３０４の移動及び持続性を求めた。さらに、上記バクテリオファージがピアス病の発症を治療的に防除し得るかどうかを判定するため、最初にＸ．ファスチジオーサで接種したブドウ蔓を、その後、バクテリオファージＸｆａｓ３０４を用いて病原体接種の４週間後にチャレンジ感染に供した。
【００７７】
予防研究のため、ブドウ蔓を４０μｌのバクテリオファージＸｆａｓ３０４懸濁液（１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）を用いて接種し、その後、Ｘ．ファスチジオーサを用いてバクテリオファージ接種の４週間後にチャレンジ感染に供した。接種に使用した細菌Ｘ．ファスチジオーサ懸濁液を分光光度的に調整した（Ａ６００＝０．４；１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）。Hopkins（Plant Dis. 89:1348-1352, 2005）により記載される針接種技法を使用して、４０μｌの細菌懸濁液を用いて反対側の第２及び第３の結節の間（１つの垣根当たり２点）で個々の垣根を接種した。上記と同じ接種点でリン酸バッファーを用いて対照蔓を模擬接種した。
【００７８】
結果は、バクテリオファージＸｆａｓ３０４は、ブドウ蔓においてＸ．ファスチジオーサ亜種ファスチジオーサにより引き起こされるピアス病を治療及び予防するために使用できることを示した。よって、これらの研究より同定されたバクテリオファージＸｆａｓ３０４及び他の毒性キシレラ−キサントモナスファージは、他のＸ．ファスチジオーサ亜種及びキサントモナス種により引き起こされる病害に対する植物の保護及び治療における使用可能性を有する。
【００７９】
本研究で使用される細菌は、それぞれ、カリフォルニア州及びテキサス州でブドウ蔓のピアス病と関連するＸ．ファスチジオーサ株Ｔｅｍｅｃｕｌａ（ＸＦ１５）及びＸＦ５４を含むものであった。Ｘ．ファスチジオーサの培養物をＰＷ−Ｍ寒天培地（Summer et al., J Bacteriol 192(1): 179-190, 2010）上で２８℃にて５日間〜７日間維持した。ＰＷ−ＭＡ上で成長させたＸ．ファスチジオーサ単離物の５日目の培養物を使用して、蔓接種用のリン酸バッファー（０．１２５Ｍ、ｐＨ７．１）中の細菌懸濁液を作製した。
【００８０】
１１０３Ｐ根茎に対する休眠状態のＶ．ヴィニフェラｃｖ．カベルネ・ソーヴィニヨンクローン０８をVintage Nurseries（米国カリフォルニア州ワスコ）から購入した。蔓を
１０１  Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  １（カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのSun Gro Horticulture）を使用して７ガロンポットに植えた。ナトリウムランプからの照明を追加した１６時間明（２６℃、３００μＥ／ｍ２・ｓ〜４００μＥ／ｍ２・ｓ）／８時間暗（１８℃）サイクルの温室で植物を生育させた。１日おきに水道水で植物を潤した。１５日毎にＰｅｔｅｒ’ｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ２０−２０−２０肥料及び微量栄養素を用いて蔓に肥料を与えた。以下の通り均一な植物を提供するために植物を積極的に刈り込んだ：１００ｃｍ〜１５０ｃｍの２本の枝分かれしていない単一の側枝を産生する際、２本の側枝を８０ｃｍまで刈り込んだ。側枝及び芽を取り除いた。２つの垣根をくいで支えて、上記実験に蔓を使用する前に各垣根の長さが約２．５ｍ〜７．５ｍになるまで生育させた。
【００８１】
Ｘ．ファスチジオーサ株ＸＦ１５及びＸＦ５４について、また同じくバクテリオファージＸｆａｓ３０４について標準的なｑＲＴ−ＰＣＲの線プロットを得たところ、いずれも０．９より大きいＲ２値を有し、それぞれ１５７％、１３０％及び１２３％の効率を有し
ていた。ＸＦ１５及びＸＦ５４の三連の試料に由来する二連の垣根の定量的評価は、それぞれ、葉がわずかに黄色くなる又は葉縁に沿って赤くなる、そして最終的には接種後８週目までに葉縁の乾燥又はそのゾーンの枯死等の視認される典型的なピアス病（ＰＤ）の症状を伴う、アッセイした全ての節全体に亘る病原体の分布を示した（図６）。バクテリオファージＸｆａｓ３０４で接種した蔓では、許容宿主の不在下で、接種後２週目、４週目及び６週目にバクテリオファージの分布の進行が観察され、８週目〜１２週目の間に減退して蔓の症状は見られなかった。
【００８２】
実施例１２
細菌及びバクテリオファージを用いたブドウ蔓の接種
バクテリオファージ処理の治療評価のため、１５本の蔓（それぞれ２つの垣根）をＸファスチジオーサ株ＸＦ１５又はＸＦ５４で接種した。接種に使用した細菌懸濁液を分光光度的に調整した（Ａ６００＝０．４；１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）。３組の蔓から同様の位置にある３つの節（例えば、１／１ａ、１／１ｂ、１／１ｃ）からのｑＲＴ−ＰＣＲ結果の平均を使用してＣＦＵ／グラム植物組織（ｇｐｔ）及びＰＦＵ／ｇｐｔを求めた。Hopkins（Plant Dis. 89:1348-1352, 2005）によって記載される針接種技法を使用して４０μｌの細菌懸濁液により、反対側の第２及び第３の結節の間（１つの垣根当たり２点）で個々の垣根を接種した。同じプロトコルに従ってリン酸バッファーを用いて対照蔓を模擬接種した。病原体の接種の４週間後、各処理に由来する１５本の蔓を、同じ接種プロトコル及び技法を使用して４０μｌのバクテリオファージＸｆａｓ３０４懸濁液（１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）を用いチャレンジ感染した。１２週間に亘って週２回、症状の発症について蔓を採点し、以下に記載されるように接種時、並びに８週目、１０週目及び１２週目にＸ．ファスチジオーサ及びバクテリオファージについて三連でアッセイした。予防的な方法でバクテリオファージが作用するかどうかを判定するため、９本の蔓（それぞれ２つの垣根）を上記と同じ接種プロトコル及び接種技法を使用して４０μｌのバクテリオファージＸｆａｓ３０４で接種した。バクテリオファージ接種後４週目において、上記と同じ接種プロトコルを使用して４０μｌ（Ａ６００＝０．４；１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）の株ＸＦ１５を用いて蔓をチャレンジ感染した。
【００８３】
ブドウ蔓における細菌及びバクテリオファージの移動を評価するため、上記と同じ接種プロトコルを使用して、それぞれ１５本の蔓をＸＦ１５又はＸＦ５４のいずれかで接種し、２４本の蔓をバクテリオファージＸｆａｓ３０４のみで接種した。ＸＦ１５又はＸＦ５４で接種した蔓を接種直後、並びに接種後８週目、１０週目及び１２週目に三連でアッセイした。バクテリオファージで接種した蔓を接種直後、及び１２週間に亘って２週間毎に三連でアッセイした。アッセイの方法を以下に記載する。
【００８４】
バクテリオファージがどのように蔓において病原体集団及び病害発症に影響を与え得るのかを判定するため、Ｘ．ファスチジオーサ接種蔓を、病原体接種後４週目にバクテリオファージＸｆａｓ３０４でチャレンジ感染した。ＸＦ１５の接種後８週目、Ｘｆａｓ３０４によるチャレンジ感染の４週目に、蔓は何らのＰＤ症状も示さず、チャレンジ感染に供していない蔓と比べ、バクテリオファージでチャレンジ感染した蔓において細菌集団は１ログ〜３ログ低かった。バクテリオファージでチャレンジ感染していない植物はＰＤ症状を示したのに対し（図７、２欄）、バクテリオファージでチャレンジ感染した蔓は５週間後に何らのＰＤ症状も示さなかった（図７、６欄）。ＸＦ１５の接種後８週間〜１２週間の間（Ｘｆａｓ３０４チャレンジ感染後４週間〜８週間）、バクテリオファージでチャレンジ感染した蔓では何らのＰＤ症状も観察されず、ＸＦ１５集団は、バクテリオファージでチャレンジ感染していない蔓と比べてほとんど検出不可能なレベルまで減退し続けた。
【００８５】
導入した宿主（ＸＦ１５）の存在下及び不在下でのバクテリオファージ集団の定量的評価は、蔓において成長する感受性宿主においてバクテリオファージが複製することができ
、感受性宿主の不在下で減退したことを示した。病原体接種後４週目にＸｆａｓ３０４でチャレンジ感染した株ＸＦ５４を用いる実験は、ＸＦ１５でチャレンジ感染した蔓について観察された結果と同様の結果を示した。抽出物のＣＦＵ／ｍｌにより計測される蔓抽出物中のＸＦ５４集団は、バクテリオファージでチャレンジ感染していない蔓で観察されたものと比較して、バクテリオファージでチャレンジ感染した蔓において８週目〜１２週目に減退した。ＸＦ５４接種後８週目〜１２週目（Ｘｆａｓ３０４チャレンジ感染後４週目〜８週目）において、バクテリオファージでチャレンジ感染した蔓では何らのＰＤ症状も観察されなかった（図７、７欄）。ＸＦ５４の存在下においてチャレンジ感染期間後に亘り増加し、宿主の不在下で減少したバクテリオファージ集団は、ここでも、バクテリオファージは、蔓に感受性宿主が存在する場合にその中で複製できたことを示した。チャレンジ感染研究の要約は図７に提示され、バクテリオファージＸｆａｓ３０４（病原体の接種後４週目）でチャレンジ感染したＸＦ１５又はＸＦ５４で接種した蔓では、５週間後に更なるＰＤ症状は観察されなかったのに対し（図７、６欄及び７欄）、株ＸＦ１５又はＸＦ５４でそれぞれ接種した、バクテリオファージでチャレンジ感染しなかった蔓では、９週目〜１０週目に症状が発症した（図７、２欄及び３欄）。
【００８６】
バクテリオファージ処理の保護（予防）可能性を判定するため、バクテリオファージＸｆａｓ３０４で接種した後、バクテリオファージ接種後４週目にＸＦ１５でチャレンジ感染した蔓を用いて更なる研究を行った。ＸＦ１５によるチャレンジ感染後４週目及び８週目に蔓は何らのＰＤ症状も示さなかったのに対し（図７、８欄）、ファージで処理しなかった蔓は症状を発症した（図７、２欄）。バクテリオファージ集団は、ＸＦ１５の存在下でチャレンジ感染期間後８週目〜１２週目に増加し、宿主の不在下で減少した。
【００８７】
これらの結果により、バクテリオファージ処理が、植物においてＸ．ファスチジオーサによるＰＤ症状を予防又は軽減すること、及びファージ処理が植物に対して何らの副作用も引き起こさないことが確認される。
【００８８】
実施例１３
試料採取及び加工
各蔓に由来する二連の垣根を５〜６の節に分け、下から上に節に番号を付した。各節を２０ｍｍ×１１５ｍｍのジェネレータ（米国コネチカット州のPRO Scientific）を備えたＰＲＯ２５０ホモジナイザーを使用し、１５ｍｌのＰ−バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４）中でホモジナイズし、滅菌チーズクロス（米国、Fisher Scientific）を通して濾過して植物組織残屑を除
去した。バクテリオファージをアッセイするため、濾過物を遠心分離し（１００００×ｇで１５分間）、濾過滅菌した。濾過物をバクテリオファージＤＮＡ抽出に使用した。細菌ＤＮＡ抽出用にペレットを１ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁すること以外は、同じプロトコルを細菌アッセイについて使用した。
【００８９】
実施例１４
試料のプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）処理
Nocker（J Microbiol Meth 67:310-20, 2006）により記載されるＰＭＡプロトコルを使用して、アッセイ用及び蔓組織抽出物をアッセイするための標準曲線を作製するために使用されるアッセイからＸ．ファスチジオーサの死細胞を排除した。簡単には、ＰＭＡ（カリフォルニア州ヘイワード、Biotium Inc.）を２０％のジメチルスルホキシド（ドイツのSigma-Aldrich）に溶解して、２０ｍＭのストック溶液を得て、暗所に−２０℃で保存し
た。１．２５μｌの容量のＰＭＡストック溶液を５００μｌのＸ．ファスチジオーサ細胞懸濁液（Ａ６００＝０．４；１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）又は対照及び接種した蔓に由来する抽出物に添加した。調製物を繰り返しひっくり返しながら５分間暗所で透明な微量遠沈管中でインキュベートした。インキュベーションに続き、微量遠沈管を氷上に置き、２０
ｃｍの距離で１分間、６５０Ｗのハロゲン光源（米国のUshio）に曝露した。遠沈管を１
５秒毎に手で簡単に回転し、光照射（illumination）の３０秒後にひっくり返して、利用可能なＤＮＡの完全な架橋及び遊離ＰＭＡのヒドロキシアミノプロピジウムへの転化を確実にした。光誘導性架橋の後、遠心分離（１２０００×ｇ、２５℃で２分間）により生存細胞を採取し、５００μｌの滅菌蒸留水で洗浄し、ＤＮＡ抽出のためＭｉｌｉ−Ｑ水に再懸濁した。
【００９０】
ＺＲ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（米国のZymo Research）を使用し、製造業者の指示書により、ＰＭＡ処理細胞調製物及び蔓抽出物から
細菌ＤＮＡを抽出した。
【００９１】
Summer（Methods Mol. Biol. 502:27-46, 2009）によって記載される改変を伴うＷｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（米国ウィスコンシン州のPromega）
を使用して、対照調製物及び植物抽出物に由来するバクテリオファージＤＮＡを抽出した。
【００９２】
実施例１５
リアルタイムＰＣＲを使用するＸ．ファスチジオーサ及びバクテリオファージＸｆａｓ３０４の検出
ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎベースリアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）は、７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国カリフォルニア州のApplied Biosystems）でｇｙｒＢに合わせて設計されたＸ．ファスチジオーサ特異的プライマーＩＮＦ２  ５’−ＧＴＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＡＧ−３’（配列番号１）及びＩＮＲ１  ５’−ＣＡＴＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＧＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号２）（Bextine and Child, FEMS Microbiology Letters 276: 48-54, 2007）、並びにＤＮＡプライマ
ーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージＸｆａｓ３０４特異的プライマー３０４−ＰｒｉｍＦ  ５’−ＡＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣ−３’（配列番号３）及び３０４−ＰｒｉｍＲ  ５’−ＣＴＡＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号４）を使用して実施した。１つの反応当たり、１０μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Invitrogen）、０．４μｌの両プライマー（１０μＭの濃度）、８．５６μｌの滅菌分子グレード水、０．０４μｌのＲＯＸ参照色素（Invitrogen）、及び１μｌのＤＮＡテンプレートを使用して、マスターミックスを作製した。全ての反応について、９５℃で３分の最初の変性工程、その後、４０サイクルの以下のパラメーター：９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒による標準条件を使用した。ＰＣＲの最後に、０．５℃／１０秒の速度で温度を７２℃から９９℃に上昇させ、１０秒毎に蛍光発光を計測した。各ＤＮＡ試料を三連で分析した。陽性対照として、上述の方法を使用してＤＮＡをＸ．ファスチジオーサ細胞、及びバクテリオファージＸｆａｓ３０４溶菌物から抽出した。ベースラインよりも蛍光発光が上がるＰＣＲサイクル数を説明するサイクル閾値（Ｃｔ）を、Applied Biosystemsにより提供されるソフトウェアパッケージを使用して求めた。
【００９３】
絶対定量用の標準曲線を求めるため、１ｍｌ容量のＸＦ１５及びＸＦ５４の１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ細胞懸濁液を、ＰＭＡプロトコルを使用して処理した。細菌ＤＮＡを上述の通り抽出し、１×１０−１〜１×１０−５に段階希釈し、上述のリアルタイムＰＣＲアッセイに供した。同様に、バクテリオファージＤＮＡを１ｍｌ容量の１×１０９ＰＦＵ／ｍｌの上述のバクテリオファージＸｆａｓ３０４から抽出し、１×１０−１〜１×１０−６に希釈し、リアルタイムＰＣＲアッセイに供した。Ｘ．ファスチジオーサ及びバクテリオファージＸｆａｓ３０４について各々三連の試料を使用して標準曲線を作成した。Ｘ．ファスチジオーサＤＮＡ濃縮物（Ａ２６０により求められる１μｌ当たりのＬｏｇ  ＤＮＡ濃度）に対するリアルタイムＰＣＲから作製されたＣｔ値をプロットすることにより標準
曲線を構築した。効率（Ｅ）を以下の通り計算した：Ｅ＝１０（−１／傾き）−１（Klein et al., Electrophoresis 20:291-299, 1999）。
【００９４】
実施例１６
溶原菌形成アッセイ研究
ファージ溶原菌形成についてアッセイするため、ファージ感染の生存細胞（survivors
）をプロファージの存在について試験した。各ファージについて、細菌を約３のインプットＭＯＩで感染させ、軟寒天重層法で平板培養した。コロニー成長に関してプレートをモニターした（Ｘ．ファスチジオーサ株Ｔｅｍｅｃｕｌａについては１０日間〜１５日間、キサントモナス株ＥＣ−１２については２日間〜３日間）。出現した個々のコロニーを選択し、精製し（３回）、軟寒天重層において同じファージの希釈物のスポッティングによりファージ感受性について再度試験した。その後、Ｘｆａｓ１０３及びＸｆａｓ１０６ヘリカーゼ遺伝子、又はＸｆａｓ３０３及びＸｆａｓ３０４プライマーゼ遺伝子に特異的なプライマー対（表５）を使用して、ファージ非感受性単離物中のプロファージ配列の存在について試験した。野生型細菌ＤＮＡを陰性対照として使用し、ファージＤＮＡが添加された野生型細菌ＤＮＡを陽性対照とした。
【００９５】
未成熟な溶原性（すなわち、阻止の確立）に関し、痕跡が見つかるかどうかを試験するため、本発明者らは、可逆的に結合したファージを３回の連続する洗浄により除去すること以外は、Gill et. al（Gill J.J., et al., J. Bacteriol., 193:5300-5313 (2011)）
の手順に従った。対数的に成長するキサントモナス株ＥＣ−１２の液体培養物を約０．３〜０．５のＯＤ６００まで培養した。１ｍｌのアリコートを遠心分離によりペレット化し、０．２０ｍｌのファージ溶菌物（ＴＮＢ中に回収された）又は滅菌ＴＮＢに再懸濁した。２５℃にて３０分間のインキュベーションの後、細胞−ファージ混合物を遠心分離し、上清を除去し、力価測定を行って吸着されたファージを特定した。予備実験では、ファージが可逆的に結合されることが特定され、これは、ＭＩＯ実測の計算に影響を及ぼした（Kasman, L.M., et al., J. Virol., 76:5557-5564 (2002)）。この問題を回避するため、また正確なＭＯＩ実測を得るため、細胞を滅菌ＴＮＢに再懸濁し、２５℃で５分間インキュベートさせ、遠心分離し、上清を除去した。結合していないファージを除去するため、この手順を３回繰り返した。各上清の力価測定を行ってＰＦＵを求めた。ファージ曝露後に残る生存細菌を数えるため、細胞ペレットを０．２０ｍｌの滅菌ＴＮＢに再懸濁し、段階希釈して平板培養した。これらのデータより、ＭＯＩ実測（すなわち、ファージを含まない対照におけるＣＦＵの数に対する吸着されたファージの数の比）を計算した。ポアソン分布を使用して非感染細胞の予測される割合を計算するため、これらのＭＯＩ実測値を使用した。この実験をＸｆａｓ１０３及びＸｆａｓ３０３の両方を使用して３回繰り返した。
【００９６】
溶原性。
溶原性の可能性を検査するため、Ｘ．ファスチジオーサ株Ｔｅｍｅｃｕｌａ及びキサントモナス株ＥＣ−１２のそれぞれ４０個のファージ非感受性単離物を、ファージＸｆａｓ１０３、Ｘｆａｓ１０６、Ｘｆａｓ３０３又はＸｆａｓ３０４によるチャレンジ感染の後に回収した。ファージ特異的プライマーを使用するＰＣＲは、耐性単離物においてファージ溶原菌の存在を検出せず、耐性は溶原性によるものではないことを示した。さらに、未熟な溶原性の可能性を、高ＭＯＩでの感染の使用及び生存の計測（Gill et. al (2011)）により調査した。表４に示されるように、感染後に、予測された生存細胞と実際の生存細胞との間に有意差はなく、高ＭＯＩでのファージ感染は阻止の確立をもたらさなかったことを示した。併せると、これらの結果は、溶原性又は阻止に関して何らの痕跡もないことを示し、４種のファージが毒性であるという結論を支持する。
【００９７】
【表４】
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【００９８】
実施例１７
ファージカクテルの保護及び予防の研究
細菌株、ファージ、及び接種調製物：本研究で使用した細菌単離物は、Ｘ．ファスチジオーサ株Ｔｅｍｅｃｕｌａ（ＸＦ１５）及びＸＦ５４（実施例３を参照されたい）であった。Ｘ．ファスチジオーサの培養物を、実施例１に記載されるＰＷ−Ｍ上で維持した。ＸＦ１５及びＸＦ５４の接種菌液を実施例１１に記載されるように調製した。Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４、Ｘｆａｓ１０３及びＸｆａｓ１０６の高力価ファージ溶菌物（１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）を、実施例３に記載されるように調製し、力価測定を行った。ファージカクテルを各々４種のファージを混合することにより調製し、カクテル中の各ファージについて１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００９９】
細菌及びファージカクテルによるブドウ蔓の接種：ブドウ蔓を、Ｘ．ファスチジオーサ株ＸＦ１５又はＸＦ５４のいずれかで接種して、ブドウ蔓における細菌の移動を評価した。ブドウ蔓を、接種直後（０分）、並びに接種後８週目及び１２週目に三連でアッセイした。さらに、ＸＦ１５又はＸＦ５４で接種したブドウ蔓を、ファージカクテルによる接種後３週目にチャレンジ感染に供し、治療効果を評価した。ファージカクテルで接種したブドウ蔓を、ＸＦ１５又はＸＦ５４のいずれかのファージ接種後３週目にチャレンジ感染に供し、上記カクテルの予防効果を評価した。各処理に由来するブドウ蔓を毎週２回、症状の発症について採点した。上記カクテルを含む個々のファージの分布を特定するため、ブドウ蔓を以下に記載されるように接種後０週目、２週目、４週目、６週目、８週目、１０週目及び１２週目にアッセイした。ファージ又は病原体のチャレンジ感染研究のいずれかにおいて接種したブドウ蔓を、以下に記載されるように０週目、６週目、８週目、１０週目及び１２週目にファージ及び／又はＸ．ファスチジオーサ感染についてアッセイした。対照ブドウ蔓を、病原体の分布及び病害の発症をモニターするために接種後０週目、８週目及び１２週目にアッセイした。全てのブドウ蔓アッセイを、２つの垣根を含む蔓を用いて三連で行った。各垣根（例えば、垣根１＝Ｓ１、又は垣根２＝Ｓ２）を５節〜６節（５インチ）に分けた。蔓節に接種点（０）から番号を付し、５インチの節において接種点の下（−）又は上（＋）として番号を付した。根部分を３つの節：Ｒ１、Ｒ２又はＲ３に分けた。
【０１００】
試料採取及び加工：カクテルファージ及び病原体の定量のため、実施例１３に記載されるように試料を得た。ファージのアッセイのため、濾過物を遠心分離し（１００００×ｇ、４℃で１５分間）、濾過滅菌した。濾過物をファージＤＮＡ抽出に使用して定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）を成し遂げた（以下を参照されたい）。ｑＲＴＰＣＲで
使用される細菌ＤＮＡの単離のためペレットを１ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁すること以外は、細菌アッセイに同じプロトコルを使用した。三連の蔓からの同様の位置の３つの節（例えば、０ａ、０ｂ、０ｃ）に由来するｑＲＴＰＣＲ結果の平均を使用して、ＣＦＵ及びＰＦＵを求めた。ファージチャレンジ感染実験の結果としてファージ耐性Ｘ．ファスチジオーサが発生するかどうかを判定するため、病原体の接種後１２週目のブドウ蔓から採取した試料を実施例１３に記載されるように加工した。簡単には、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水１ｍｌ中のペレットの懸濁液１００μｌを４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＰＷ−ＭＡＣ）を追加したＰＷ−ＭＡ（実施例１）上に平板培養し、２８℃でインキュベートした。１０日後〜１２日後に個々のコロニーを選択し、ＰＷ−ＭＡＣ上で３回ストリーク精製を行った。各ブドウ蔓試料に由来する代表的な個々のコロニー（合計２０コロニー）を、Hernandez-Martinez et al.（実施例１）により記載されるＰＣＲ分析を使用して種及び
亜種レベルで確認した。確認した単離物のファージ感受性を、実施例３に記載される重層上の段階希釈スポットアッセイ及び軟寒天重層法により求めた。
【０１０１】
ＰＭＡ処理及びｑＲＴＰＣＲ：ＰＭＡ処理及びＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎベースｑＲＴＰＣＲプロトコルを、実施例１５に記載されているように、表５に列挙されているＸ．ファスチジオーサ特異的プライマーＩＮＦ２（配列番号１）及びＩＮＲ１（配列番号２）及びバクテリオファージＸｆａｓ３０３特異的プライマー３０３−ＰｒｉｍＦ（配列番号５）及び３０３−ＰｒｉｍＲ（配列番号６）、Ｘｆａｓ３０４特異的プライマー３０４−ＰｒｉｍＦ（配列番号３）及び３０４−ＰｒｉｍＲ（配列番号４）、Ｘｆａｓ１０３特異的プライマー１０３−ＨｅｌＦ（配列番号７）及び１０３−ＨｅｌＲ（配列番号８）；並びにＸｆａｓ１０６特異的プライマー１０６−ＨｅｌＦ（配列番号９）、及び１０６−ＨｅｌＲ（配列番号１０）を使用して行った。
【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
ブドウ蔓におけるＸ．ファスチジオーサの移動及び病害の発症：ＸＦ１５又はＸＦ５４
を接種したブドウ蔓の三連の試料に由来する二連の垣根の定量的評価は、アッセイしたブドウ蔓節における病原体の分布を示した。ｑＲＴＰＣＲは、節（Ｓｅｇ）Ｓ１／１（垣根１、接種点上の５インチ節１）及びＳ２／１において、それぞれ、平均１×１０４ＣＦＵ／グラム植物組織（ｇｐｔ）及び１×１０５ＣＦＵ／ｇｐｔのＸＦ１５の存在を検出し、接種後８週目にＳ１／２及びＳ２／２において平均１×１０４ＣＦＵ／ｇｐｔのＸＦ５４を検出した。カクテルでチャレンジ感染しなかったブドウ蔓において接種後８週目までに、葉がわずかに黄色くなるか又は葉縁が赤くなり、そして葉縁が乾燥又は壊死する等の典型的なピアス病の症状が視認された。接種後１２週目において、平均１×１０４ＣＦＵ／ｇｐｔ及び１×１０６ＣＦＵ／ｇｐｔのＸＦ１５を、それぞれＳ１／３及びＳ２／２で検出した。同じアッセイ間隔で、ＰＤ症状を呈するブドウ蔓を用い、接種後１２週目において、平均１×１０５ＣＦＵ／ｇｐｔ及び１×１０４ＣＦＵ／ｇｐｔのＸＦ５４を、それぞれＳ１／３及びＳ２／１で検出した。平均１×１０１ＣＦＵ／ｇｐｔ〜１×１０２ＣＦＵ／ｇｐｔでの病原体接種後８週目及び１２週目に、ブドウ蔓の根系において両方の病原体（ＸＦ１５及びＸＦ５４）を検出した。
【０１０４】
ブドウ蔓におけるファージ移動及び持続性：Ｒ２値が０．９より大きく、それぞれ１２７％、１２３％、１２９％、及び１２０％の効率を有するファージＸｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４、Ｘｆａｓ１０３及びＸｆａｓ１０６について標準的なｑＲＴＰＣＲ線プロットを得た。ファージカクテル（Ｘｆａｓ３０３、Ｘｆａｓ３０４、Ｘｆａｓ１０３、及びＸｆａｓ１０６）で接種したブドウ蔓の三連の試料に由来する二連の垣根の定量的評価は、カクテル接種後２週目〜８週目にアッセイしたブドウ蔓節において個別に全てのファージの分布を示した（図８）。８週目及び１２週目までに、根では個々のファージはもはや検出不可能であり、アッセイした節では何らのブドウ蔓症状も観察されずに１２週目までに平均１×１０１ＰＦＵ／ｇｐｔ〜１×１０２ＰＦＵ／ｇｐｔまで減退した（図８）。
【０１０５】
ブドウ蔓におけるＸ．ファスチジオーサに対するファージの治療効果：ＸＦ１５で接種したブドウ蔓を病原体接種後３週目にファージカクテルでチャレンジ感染した。８週目において（カクテルでチャレンジ感染後５週目）、チャレンジ感染しなかったブドウ蔓においてＸＦ１５集団は、チャレンジ感染したブドウ蔓と比べて平均２ログ〜３ログ高かった。治療的処理をしてないブドウ蔓は典型的なＰＤ症状を示したのに対し、チャレンジ感染したブドウ蔓はＰＤ症状を示さなかった。ＸＦ１５接種後１２週目（カクテルでチャレンジ感染後９週目）において、チャレンジ感染していないブドウ蔓において細菌集団は、ファージカクテルでチャレンジ感染したブドウ蔓と比べた場合に、平均２ログ〜３ログ高かった（図９）。試験を通して（１２週間）ファージでチャレンジ感染したブドウ蔓ではＰＤ症状は観察されなかったのに対し、カクテルで処理なかったブドウ蔓は、４週目に早くも症状を呈し、それは１２週間に亘り進行した。同様に、ＸＦ５４接種カクテルでチャレンジ感染したブドウ蔓における細菌集団は、チャレンジ感染していないブドウ蔓と比べて８週目〜１２週目に顕著に減退し、カクテルでチャレンジ感染したブドウ蔓では何らの症状も観察されなかった。１２週目のカクテルでチャレンジ感染したブドウ蔓に由来する植物抽出物の平板培養により、平均１×１０２ＣＦＵ／ｇｐｔを得た。３本の各ブドウ蔓の各垣根からＸ．ファスチジオーサとして確認された代表的な単離物（２０ｅａ）は、上記カクテルを構成する４種のファージに対していずれも感受性であった。
【０１０６】
ブドウ蔓におけるＰＤを予防するためのカクテル処理の予防効果：上記カクテルでブドウ蔓を最初に接種し、その後、カクテル接種後３週目にＸ．ファスチジオーサ株ＸＦ１５又はＦＸ５４でチャレンジ感染することにより、ファージカクテルの予防効果を評価した。予防的に処理されたブドウ蔓は、カクテル接種後８週目及び１２週目において何らのＰＤ症状も示さなかった。ＸＦ１５でチャレンジ感染したカクテル接種ブドウ蔓では、８週目及び１２週目に調査したブドウ蔓の節において病原体集団は最大で平均１×１０３ＣＦＵ／ｇｐｔに達し、予防的に処理されていないブドウ蔓では平均１×１０６ＣＦＵ／ｇｐ
ｔにまで達した。カクテルで予防的に処理した後、ファージカクテル接種後３週目にＸＦ５４でチャレンジ感染したブドウ蔓において同様の結果が観察された。１２週目のカクテルでチャレンジ感染したブドウ蔓に由来する植物抽出物の平板培養により、平均３×１０２ＣＦＵ／ｇｐｔを得た。各々３本のブドウ蔓に由来する各垣根よりＸ．ファスチジオーサとして確認された代表的な単離物（２０ｅａ）は、上記カクテルを構成する４種のファージに対していずれも感受性であった。
【０１０７】
ブドウ蔓におけるファージの持続性及び複製：導入した宿主（ＸＦ１５及びＸＦ５４）の存在下又は不在下において、ブドウ蔓でファージ集団を求めることを目的とした。宿主の存在下又は不在下でのファージ集団の定量により、治療的及び予防的な研究の両方において、感受性宿主がブドウ蔓に存在する場合、カクテルファージは複製し、より大きな集団を維持することができ、その後、感受性宿主の不在下では減退することを確認した（図１０及び図１１）。宿主を含まないブドウ蔓におけるファージ集団は８週目〜１２週目の間に減少したのに対し、ＸＦ１５又はＸＦ５４を接種し、ファージカクテルでチャレンジ感染（治療的処理）したブドウ蔓では、ファージ集団は、同じ期間中に平均１ログ〜２ログ増加した（図１０）。同様の結果が予防研究で得られ、ファージ集団は宿主を含まないブドウ蔓において観察されたファージ集団に対して平均１ログ〜２ログ増加した（図１１）。これらの結果は、バクテリオファージ処理が植物におけるＸ．ファスチジオーサによるＰＤ症状を予防又は軽減し、処理した植物に対して何らの副作用も示さないことを確認した。
【０１０８】
実施例１８
ヨコバイによるＸ．ファスチジオーサの伝染
ヨコバイ（ＧＷＳＳ）、ホマロジスカ・ビトリペニス（Homalodisca vitripennis）は
、Ｘ．ファスチジオーサを伝染する木質部を摂食するヨコバイ類である。ＧＷＳＳは、南カリフォルニア及びテキサス州のブドウ生育地域全体で流行している。ＧＷＳＳによるＸ．ファスチジオーサ又はファージの取り込みを調査するため、３つの試験において４８時間に亘って実験室で育てられたＸ．ファスチジオーサを伴わないＧＷＳＳにＸ．ファスチジオーサ又は毒性ファージＸｆａｓ３０４のいずれかを有するカウピー（ビグナ・ウンギィクラタ亜種ウンギィクラタ（Vigna unguiculata subsp. unguiculata））植物を与えた。ＧＷＳＳの細菌又はファージを植物に伝染する能力を判定するため、細菌又はファージを有するＧＷＳＳに細菌又はファージを含まない植物を与えた。細菌を有するＧＷＳＳのサブセットに、４８時間又は９６時間に亘ってファージを有する植物を与えることによりチャレンジ感染させた。ＧＷＳＳ及び植物を全ての実験において個別にアッセイし、ｑＲＴＰＣＲを使用して細菌及び／又はファージの取り込み、伝染又は持続性を評価した。ＧＷＳＳはＸ．ファスチジオーサ及び／又はファージを取り込んで伝達することができた。Ｘ．ファスチジオーサを有し、ファージでチャレンジ感染されたＧＷＳＳでは、ファージＸｆａｓ３０４の力価は、Ｘ．ファスチジオーサを伴わないＧＷＳＳで観察された力価と比較して２倍増加した。ファージＸｆａｓ３０４でチャレンジ感染した場合、チャレンジ感染しなかったものと比較して、ＧＷＳＳにおいて細菌集団の２倍の減退が観察された。ＧＷＳＳは、Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はファージを植物へと伝染した。これは、ＧＷＳＳによるファージ伝達の最初の報告であると考えられる。
【０１０９】
細菌株、ファージ及び接種調製物：Ｘ．ファスチジオーサ株ＸＦ５４（実施例１を参照されたい）及びファージＸｆａｓ３０４（実施例３を参照されたい）を本研究で使用した。ＸＦ５４の培養物を実施例１に記載されるＰＷ−Ｍ上で成長させた。ＰＷ−ＭＡ上で成長させたＸＦ５４の５日目の培養物を使用して、リン酸バッファー（０．１２５Ｍ、ｐＨ７．１）中の細菌懸濁液を作製した。Ｘｆａｓ３０４（１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）の高力価ファージ溶菌物を調製し、滅菌脱イオン水（ＳＤＷ）中で実施例３に記載されるように力価測定を行った。
【０１１０】
植物成長条件及び調製：カウピー（ビグナ・ウンギィクラタ亜種ウンギィクラタ）植物をＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘを使用し、３インチのポットで２４℃〜２９℃に維持して（それぞれ、１６時間の明期及び８時間の暗期）必要に応じて水を与えて生育させた。
【０１１１】
ヨコバイ：実験室で育てられたＧＷＳＳは、もともと、２箇所の場所：（ｉ）アーヴィンのカリフォルニア農業食糧省（ＣＤＦＡ）、又は（ｉｉ）カリフォルニア州サンマルコのカリフォルニア大学協同エクステンションのいずれかの温室において複数世代に亘って育てられた。本研究で使用した全てのＧＷＳＳは、成体の雄及び雌であり、上記２箇所から送達された。受け取った後、実験に使用する前に新しい気候に順応させるため、２４℃〜２９℃に維持して（それぞれ、１６時間の明期及び８時間の暗期）、２日間に亘り昆虫にカウピー植物を与えた。
【０１１２】
実験計画：各実験単位（すなわち、ケージ）は、３葉期〜４葉期の１５ｃｍの長さの茎のカウピー、及び必要に応じて５０ｍｌのファージ又は細菌のＳＤＷ中の懸濁液を含む５０ｍｌの平底チューブを含むものであった。蓋の穴を通して挿入された２週間齢又は３週間齢の植物から３葉期〜４葉期の葉が付いたカウピーの茎（裁断茎）を採取し、適所にパラフィルムで固定した（固定した裁断茎）。ＧＷＳＳ（ＧＷＳＳ３匹／裁断茎／ケージ）をケージに入れ、必要に応じて餌を与えた。
【０１１３】
ＧＷＳＳによるＸ．ファスチジオーサ及びファージの取り込み：ＧＷＳＳによるＸ．ファスチジオーサ及び／又はファージの取り込みを判定するため、葉が付いたカウピー裁断茎をＸ．ファスチジオーサ（１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）又はファージＸｆａｓ３０４（１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）の懸濁液で満たしたチューブに固定し、４時間に亘って、Ｘ．ファスチジオーサ又はファージの毛細管取り込みをさせた。対照裁断茎をＳＤＷ中に置いた。４時間に亘って適切な懸濁液を裁断茎に取り込ませた後、サブセット（裁断茎３本）をアッセイしてＸ．ファスチジオーサ又はＸｆａｓ３０４を定量した。４時間の取り込み期間の後、ＧＷＳＳ（ＧＷＳＳ３匹／裁断茎／ケージ）に裁断茎を与えた。各実験セットを三連で行った（裁断茎１本×ＧＷＳＳ３匹×３ケージ）。４８時間後、全てのカウピー裁断茎及びＧＷＳＳをアッセイして、ｑＲＴＰＣＲによりＸ．ファスチジオーサ及び／又はファージの存在を定量した。同じ条件下で水を取り込む対照を全ての実験について行い、Ｘ．ファスチジオーサ及びファージについてアッセイした。
【０１１４】
最初の実験は、病原体又はファージを有する裁断茎からＧＷＳＳがＸ．ファスチジオーサ又はファージを取得できるかどうかを判定し、もしそうであれば、ＧＷＳＳがＸ．ファスチジオーサ又はファージを他の裁断茎へと伝達できるかどうかを判定するために計画された。４８時間後、裁断茎及びＧＷＳＳは、それぞれ、平均２×１０８±１×１０８ＣＦＵ／グラム植物組織（ｇｐｔ）及び１×１０６±０．７×１０６ＣＦＵ／ＧＷＳＳを有し、以前に報告されるように（Bextine et al., Biotechniques 38:184, 186, 2005）ＧＷ
ＳＳがＸ．ファスチジオーサを取得できたことを確認した。ＧＷＳＳが裁断茎を摂食することによりファージを取得するかどうかを判定するための平行実験において、４８時間後にアッセイしたＧＷＳＳは、２×１０８±１×１０８ＰＦＵ／ｇｐｔを含有する裁断茎から取得された平均２×１０６±０．９×１０６ＰＦＵ／ＧＷＳＳを有していた。結果は、裁断茎を摂食することによってファージをＧＷＳＳが取得できたことを示した。
【０１１５】
ＧＷＳＳによるファージの取り込み及び伝達：ＧＷＳＳによるファージの取り込み及び伝達を判定するため、カウピー裁断茎（９本）をファージＸｆａｓ３０４懸濁液（１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）で満たした５０ｍｌチューブに固定した。対照（３本の裁断茎）をＳＤＷ中に置いた。両セットの裁断茎に各培地を取り込ませた。４時間後、ファージを取り込ませた３本の裁断茎をアッセイしてファージ濃度を求めた。残りの６本の裁断茎を、
各々ＧＷＳＳ（ＧＷＳＳ３匹／裁断茎／ケージ）を含む個別のケージに入れた。４８時間後、９匹のＧＷＳＳ及びそれらの各３本の裁断茎をファージ含有量についてアッセイし、残りの９匹のＧＷＳＳをＳＤＷ中に固定された新たなカウピー裁断茎に移し（ＧＷＳＳ３匹／裁断茎×３ケージ）、さらに４８時間カウピーを与えて、裁断茎へのファージ伝達を判定した。裁断茎（３本）及びＧＷＳＳ（９匹）を指定期間後にファージについてアッセイした。同じ条件下で水を取り込む対照を全ての実験について行い、ファージについてアッセイした。
【０１１６】
ファージ及び細菌の両方がＧＷＳＳにより取得され得ることが特定されたことから、裁断茎からファージを取得したＧＷＳＳがファージ及び／又は細菌を別の裁断茎へと伝達し得るかどうかを特定することを目的とした。ファージを有するＧＷＳＳのサブセットをＳＤＷ中の新たなカウピー裁断茎へと移し、摂食させた。４８時間後、裁断茎及びＧＷＳＳは、それぞれ、平均３×１０２±２．５×１０２ＰＦＵ／ｇｐｔ及び平均３×１０３±１．６×１０３ＰＦＵ／ＧＷＳＳを有し、ＧＷＳＳがファージを伝達できたことを示した。
【０１１７】
ＧＷＳＳを有するＸ．ファスチジオーサのファージチャレンジ感染：ファージがＧＷＳＳにおいてＸ．ファスチジオーサ集団に影響を与え得るかどうかを判定するため、Ｘ．ファスチジオーサを有するＧＷＳＳをファージでチャレンジ感染した。簡単には、三連の反復実験を使用する上述の方法を使用して、Ｘ．ファスチジオーサを含有する裁断茎を摂食し、Ｘ．ファスチジオーサを含有すると確認したＧＷＳＳを、ファージＸｆａｓ３０４を取り込んだカウピー裁断茎に移して摂食させた。４８時間又は９６時間の摂食の後に、裁断茎及びＧＷＳＳをファージ及び／又はＸ．ファスチジオーサについてアッセイした。Ｘ．ファスチジオーサの取り込みについて、ＧＷＳＳを導入する前にカウピー裁断茎（１５本）をＸＦ５４懸濁液（１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）中に４時間置いた。４時間目に、３本の裁断茎をＸ．ファスチジオーサについてアッセイした。１２本の残りの裁断茎の各々を１本の裁断茎当たりＧＷＳＳ３匹を含むケージに入れ、ＧＷＳＳにＸ．ファスチジオーサを含有する裁断茎を４８時間摂食させた。４８時間後、Ｘ．ファスチジオーサを摂食したＧＷＳＳ及び宿主の裁断茎を３つの群に細分した：群１をＸ．ファスチジオーサについてアッセイし（裁断茎３本及びＧＷＳＳ９匹）；群２（ＧＷＳＳ９匹）をＳＤＷに置いた新たなカウピー裁断茎（３本）に移し、ＧＷＳＳ及び裁断茎をＸ．ファスチジオーサについてアッセイする前に４８時間に亘り摂食させ；群３（ＧＷＳＳ１８匹）をＸＦａｓ３０４懸濁液（１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）に入れたカウピー裁断茎（３本）に移し、ＧＷＳＳ及び裁断茎をＸ．ファスチジオーサ及びファージについてアッセイする前に、４８時間又は９６時間に亘り摂食させた。同じ条件下で水を取り込む対照を全ての実験について行い、Ｘ．ファスチジオーサ及びファージの両方についてアッセイした。
【０１１８】
３６匹のＧＷＳＳにＸ．ファスチジオーサ懸濁液中のカウピー裁断茎を摂食させ、その後、Ｘ．ファスチジオーサの取り込み、Ｘ．ファスチジオーサ及び／又はファージの伝達、並びにＧＷＳＳにおけるファージ及び／又はＸ．ファスチジオーサの効果を判定するためにアッセイした。Ｘ．ファスチジオーサ株ＸＦ５４（３×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）の懸濁液中に入れた裁断茎を４８時間摂食させたＧＷＳＳ（群１）は、平均１×１０６±０．７×１０６ＣＦＵ／ＧＷＳＳを有すると特定され、裁断茎摂食宿主は、平均２×１０８±１×１０８ＣＦＵ／ｇｐｔを有すると特定された。Ｘ．ファスチジオーサ有するＧＷＳＳ（群２；１×１０６±０．７×１０６ＣＦＵ／ＧＷＳＳ）にＳＤＷ中の新たな裁断茎を４８時間摂食させた後、裁断茎は平均１×１０３±１．３×１０３ＣＦＵ／ｇｐｔを示し、ＧＷＳＳは平均２×１０３±１×１０３ＣＦＵ／ＧＷＳＳの残渣Ｘ．ファスチジオーサを示し、ＧＷＳＳによるＸ．ファスチジオーサ伝達の以前の結果を再確認した。Ｘｆａｓ３０４懸濁液（２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）で裁断茎に伝達され、４８時間に亘って摂食させた群３のＸ．ファスチジオーサを有するＧＷＳＳは、ファージの取り込み及びＸ．ファスチジオーサの持続を示した。アッセイしたＧＷＳＳは、４８時間の摂食で、平均３×１０
４±１．８×１０４ＰＦＵ／ＧＷＳＳのＸｆａｓ３０４を有し、２×１０３±１．１×１０３ＣＦＵ／ＧＷＳＳのＸＦ５４を保持した。同じ時間間隔でアッセイした裁断茎は、平均３×１０８±２×１０８ＰＦＵ／ｇｐｔ及び２×１０３±０．６×１０３ＣＦＵ／ｇｐｔを含んだ。９６時間に亘って摂食させたＧＷＳＳは、平均２×１０５±１．２×１０５ＰＦＵ／ＧＷＳＳのＸｆａｓ３０４及び１×１０２±０．９×１０２ＣＦＵ／ＧＷＳＳのＸＦ５４を有し、ＸＦ５４における減少及びＸｆａｓ３０６における平均６倍の増加を示した。
【０１１９】
カウピー裁断茎及びＧＷＳＳの採取及びアッセイ：ＧＷＳＳを−２０℃で５分間凍結することにより屠殺し、滅菌カミソリでチューブキャップの接合を切断することによりカウピー裁断茎を採取した。各三連のＧＷＳＳのそれぞれを０．５ｍｌのＰ−バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４）を含む１．５ｍｌ微量遠沈管に入れ、滅菌プラスチックマイクロ乳棒（Fisher）を使用してホモジナイズし、滅菌チーズクロス（米国のFisher Scientific）を通して濾過して組
織残屑を除去した。各三連の裁断茎のそれぞれを計量し、滅菌したカミソリ刃を使用して交換し（commuted）、乳鉢及び乳棒を使用して１ｍｌのＰ−バッファー中でホモジナイズし、滅菌チーズクロス（米国のFisher Scientific）を通して濾過して組織残屑を除去し
た。ファージをアッセイするため、濾過物を遠心分離し（１００００×ｇで１５分間）、濾過滅菌した。実施例９のようにファージＤＮＡ抽出に濾過物の一部を使用し、その後、以下に記載されるｑＲＴＰＣＲに使用した。濾過物の残部を使用して実施例３に記載されるようにファージの力価測定を行った。以下に記載されるようにＰＭＡ処理、細菌ＤＮＡ抽出及びｑＲＴＰＣＲのためペレットを０．５ｍｌの滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁したこと以外は、同じプロトコルを細菌アッセイ（ＣＦＵ）に使用した。
【０１２０】
ＰＭＡ処理及びｑＲＴＰＣＲ：ＰＭＡ処理及びＳＹＢＲグリーンに基づくｑＲＴＰＣＲプロトコルを、Ｘ．ファスチジオーサ及びファージに特異的なプライマーを使用して実施例１７に記載されるように行った。
【０１２１】
実施例１９
キサントモナス・アクソノポディス病原型シトリに対するファージ活性
以前の研究はミカン類潰瘍病の防除に対するファージの使用を評価したが、何らの決定的なデータもファージの毒性の特徴を確認しなかった（Balogh et al., Plant Disease, 92:1048-1052, 2008）。毒性で非形質導入ファージのみを持続可能なファージ生物防除系の評価及び実行に使用すべきである。それぞれ、ポドウイルス科（Ｘｆａｓ３０３）及びシホウイルス科（Ｘｆａｓ１０３）の代表的な２種の完全に特性評価された毒性ファージに対するフロリダから得られた３種のＸａｃ分野の株（Ｎｏｒｔｈ  ４０、Ｂｌｏｃｋ  ２２、Ｆｏｒｔ  Ｂａｓｉｎｇｅｒ）の感受性を試験した。結果は、試験した３種のＸａｃ株は、ファージＸｆａｓ３０３にのみ感受性であったことを示す（図１２）。ファージＸｆａｓ３０３は、試験した３種のＸａｃ株上で透明プラークを形成することができた。Ｘｆａｓ３０３ゲノムに対して４５４パイロシークエンシングを行い、予測した遺伝子を完全にアノテートした（annotated）。Ｔ７及びＫＭＶ（Dunn et al., J. Mol. Biol. 166:477-53521, 1983; Lavigne et al., Virology 312:49-59, 2003）等の毒性ファージの
指標である、単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼ（ＳＳＲＮＡＰ）の存在が見出された。さらに、上記細菌においてｐｉｌＡのインフレーム欠失突然多様体を作製することにより、キサントモナス亜種株ＥＣ−１２のＩＶ型線毛がファージＸｆａｓ３０３に対する主な受容体部位であることを特定した。ファージＸｆａｓ３０３及びファージＸｆａｓ１０３はいずれも吸着して株ＥＣ−１２上に透明プラークを形成するが、ΔｐｉｌＡ誘導体には形成せず、ＥＣ−１２又はＥＣ−１２ΔｐｉｌＡ上のファージＸｆａｓ３０３の平板培養に関する結果のみを示す。また、ＩＶ型線毛は、ファージＸｆａｓ３０３に対する主な受容体部位あるため、このファージが感染に必要な異なる第２の受容体部位を有し得るか
、又はファージＤＮＡが制限されることを特定した。結果は、開発したＸａｃ非依存性の手法は、平板効率（ＥＯＰ  ０．７５）を損なわずにＸａｃに対して毒性のファージを単離するのに使用され得ることを示す。
【０１２２】
実施例２０
ＸａｃにおけるＩＶ型線毛の発現に関する証拠
文献における報告は、感染過程におけるＩＶ型線毛の発現及び役割、並びにＸａｃの病因と矛盾する（Brunings et al., Mol. Plant. Pathol. 4:141-57, 2003; Li et al., PLoS ONE6:e21804, 2011; Yang et al., Curr. Microbiol. 48:251-61, 2004）。上記に提
示される結果は、ファージの吸着及び感染を促進するために線毛を縮めなければならないため、試験した３種全てのＸａｃ株は機能性のＩＶ型線毛を発現することを示す。光学顕微鏡研究を使用することにより、上記３種のＸａｃ株を、機能性のＩＶ型線毛の指標である単攣縮運動性（twitching motility）について評価した。シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）株ＰＡＯ１及びキサントモナス亜種株ＥＣ−１２を陽性対照として使用し、Ｅ−１２ΔｐｉｌＡを陰性対照として使用した。３種のＸａｃ株（Ｎｏｒｔｈ  ４０、Ｂｌｏｃｋ  ２２及びＦｏｒｔ  Ｂａｓｉｎｇｅｒ）を単攣縮運動性について評価した。ＰＡＯ１、ＥＣ−１２、及び３種のＸａｃ株は、単攣縮運動性を呈したのに対し、ＥＣ−１２ΔｐｉｌＡは単攣縮運動性を呈しなかった。顕微鏡研究は、ファージ感受性試験により得られた結果を確認し、３種のＸａｃ株がファージＸｆａｓ３０３に対する吸着部位として作用する機能性ＩＶ型線毛を有することを示した。結果は、ＩＶ型線毛がＸａｃにより発現されるという他者（Brunings et al., Mol. Plant. Pathol. 4:141-57, 2003; Li et al., PLoS ONE 6:e21804, 2011; Yang et al., Curr. Microbiol. 48:251-61, 2004）の観察を確認する。
【受託番号】
【０１２３】
ＰＴＡ−１３０９５
ＰＴＡ−１３０９６
ＰＴＡ−１３０９７
ＰＴＡ−１３０９８
ＰＴＡ−１３０９９
ＰＴＡ−１３１００
ＰＴＡ−１３１０１
【図１】
2018150340.tif 000007
【図２】
2018150340.tif 000008
【図３】
2018150340.tif 000009
【図４】
2018150340.tif 000010
【図５】
2018150340.tif 000011
【図６】
2018150340.tif 000012
【図７】
2018150340.tif 000013
【図８】
2018150340.tif 000014
【図９】
2018150340.tif 000015
【図１０】
2018150340.tif 000016
【図１１】
2018150340.tif 000017
【図１２】
2018150340.tif 000018
【配列表】
2018150340000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月13日(2018.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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2018150340000002.pdf
2018150340000003.pdf
2018150340000004.pdf