(57)【要約】【課題】機械的強度に優れるタンパク質凝縮体ゲルおよびその製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係るタンパク質凝縮体ゲルは、タンパク質の水溶液を加熱することによりゲル化するタンパク質と、界面活性剤とを水中で混合し、  表面が前記界面活性剤により疎水性を示し、前記タンパク質および前記水が内包されている複合体を形成して、当該複合体が自発的に水相から分離された集合体を形成し、前記集合体の加熱によりゲル化したものである。【選択図】図５
2018130663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の水溶液を加熱することによりゲル化するタンパク質と、界面活性剤とを水中で混合し、
表面が前記界面活性剤により疎水性を示し、前記タンパク質および水が内包されている複合体を形成して、当該複合体が自発的に水相から分離された集合体を形成し、前記集合体の加熱によりゲル化したタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項２】
前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と親和性を有する親タンパク質部、前記疎水部と前記親タンパク質部との間に配置される親水部を含む請求項１に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項３】
前記界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくともいずれかである請求項１又は２に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項４】
前記タンパク質が、卵白またはオボアルブミンである請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項５】
タンパク質と界面活性剤を水中で溶解させる工程ａと、
表面が前記界面活性剤により疎水性を示し、前記タンパク質および水が内包されている複合体を形成して、当該複合体が自発的に水相から分離される集合体を形成する工程ｂと、
前記集合体を加熱によりゲル化する工程ｃとを含み、
前記タンパク質は、当該タンパク質の水溶液の加熱によりゲル化するタンパク質であるタンパク質凝縮体ゲルの製造方法。
【請求項６】
前記界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくともいずれかである請求項５に記載のタンパク質凝縮体ゲルの製造方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、卵白またはオボアルブミンである請求項５又は６に記載のタンパク質凝縮体ゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質凝縮体ゲルおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
架橋して三次元網目構造体を形成するゲル素材は、固体と液体の中間的な性質を併せ持ち、寒天やゼラチン等の食品関連、コンタクトレンズ等の医療関連をはじめとするソフトマテリアル、高吸水性材料、薬剤放出制御剤等として種々の用途に応用展開されている。
【０００３】
しかしながら、ゲル素材は、一般に充分な機械的強度を有さず、産業での応用が限られている。ゲルの優れた特性に、機械的強度を加えることができれば広範囲な分野での実用化が見込めることから、高強度ゲルの開発・研究が精力的にすすめられている。例えば、高強度ゲルとして、均一ネットワーク構造ゲルやダブルネットワークゲル等が提案されている(非特許文献１，２)。
【０００４】
ところで、タンパク質ゲルとして、卵白が知られている。卵白には加熱ゲル化性があり、卵白の水溶液を加熱することによりゲルを調製することができる。この卵白ゲルは、数１０ｋＰａのゲル強度を有することが報告されている（非特許文献３）。なお、本発明者らは、先般、タンパク質を高濃度に凝縮した集合体であるタンパク質凝縮体を報告した（特許文献１、非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／００２３５８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Macromolecules, 2008, Vol.41, No.14, 5379-5384 “Design and Fabrication of a High-Strength Hydrogel with Ideally Homogeneous Network Structure from Tetrahedron-like Macromonomers”、
【非特許文献２】Advanced Materials, 2003, 15, No.14, 1144-1158, “Double-Network Hydrogels with Extremely High Mechanical Strength
【非特許文献３】Food Sci. Technol. Res., 15 (1), 5 - 10, 2009 “Electron Microscopic Analysis of the Effects of Tea Extract on Strength Improvement”
【非特許文献４】Angewandte Chemie International Edition, Vol. 56(5), pp. 1308-1312, 2017 “Water-Rich Fluid Material Containing Orderly Condensed Protein”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質を主たる成分とするゲルにおいて、機械的強度に優れる材料を提供できれば、様々な用途への実用化が期待できる。
【０００８】
本発明は、上記背景に鑑みて成されたものであり、機械的強度に優れるタンパク質凝縮体ゲルおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意検討を重ねたところ、以下の態様において、本発明の課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
［１］：  タンパク質の水溶液を加熱することによりゲル化するタンパク質と、界面活性剤とを水中で混合し、
表面が前記界面活性剤により疎水性を示し、前記タンパク質および水が内包されている複合体を形成して、当該複合体が自発的に水相から分離された集合体を形成し、前記集合体の加熱によりゲル化したタンパク質凝縮体ゲル。
［２］  ：前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と親和性を有する親タンパク質部、前記疎水部と前記親タンパク質部との間に配置される親水部を含む請求項１に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
［３］  ：  前記界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくともいずれかである［１］又は［２］に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
［４］  ：前記タンパク質が、卵白またはオボアルブミンである［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質凝縮体ゲル。
［５］  ：  タンパク質と界面活性剤を水中で溶解させる工程ａと、
表面が前記界面活性剤により疎水性を示し、前記タンパク質および前記水が内包されている複合体を形成して、当該複合体が自発的に水相から分離される集合体を形成する工程ｂと、
前記集合体を加熱によりゲル化する工程ｃとを含み、
前記タンパク質は、当該タンパク質の水溶液の加熱によりゲル化するタンパク質であるタンパク質凝縮体ゲルの製造方法。
［６］  ：前記界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくともいずれかである［５］に記載のタンパク質凝縮体ゲルの製造方法。
［７］  ：前記タンパク質が、卵白またはオボアルブミンである［５］又は［６］に記載のタンパク質凝縮体ゲルの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、機械的強度に優れるタンパク質凝縮体ゲルおよびその製造方法を提供できるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施形態に係るタンパク質凝縮体の一例を示す模式図。
【図２】本実施形態に係る界面活性剤の一例を示す模式的説明図。
【図３】卵白タンパク質水溶液の写真。
【図４】本実施例に係る卵白タンパク質凝縮体の写真。
【図５】本実施例に係る卵白タンパク質凝縮体（左）および卵白タンパク質凝縮体ゲル（右）の写真。
【図６】例１に係るタンパク質凝縮体の熱重量測定プロファイル。
【図７】実施例１に係るタンパク質凝縮体ゲルの熱重量測定プロファイル。
【図８】実施例１に係るタンパク質凝縮体ゲルの圧縮強度測定曲線。
【図９】実施例２に係るタンパク質凝縮体ゲルの圧縮強度測定曲線。
【図１０】実施例３に係るタンパク質凝縮体ゲルの圧縮強度測定曲線。
【図１１】実施例４に係るタンパク質凝縮体ゲルの圧縮強度測定曲線。
【図１２】実施例１に係る卵白タンパク質凝縮体ゲルの分解試験結果を示す写真。
【図１３】実施例２に係る卵白タンパク質凝縮体ゲルの分解試験結果を示す写真。
【図１４】実施例３に係る卵白タンパク質凝縮体ゲルの分解試験結果を示す写真。
【図１５】実施例４に係る卵白タンパク質凝縮体ゲルの分解試験結果を示す写真。
【図１６】乾燥−再膨潤試験の結果を示す写真。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を適用した実施形態の一例について説明する。説明を明確にするため、以下の記載および図面は、適宜、簡略化されている。また、同一の要素部材は、異なる実施形態においても同一符号で示す。本明細書中に出てくる各種成分は特に注釈しない限り、其々独立に一種単独でも二種以上を併用してもよい。
【００１３】
（タンパク質凝縮体ゲル）
タンパク質凝縮体ゲルは、タンパク質凝縮体を加熱によりゲル化したものである。タンパク質凝縮体は、タンパク質と、界面活性剤を水中で溶解し、表面が界面活性剤により疎水性を示し、タンパク質および水が内包されている複合体を形成して、当該複合体が自発的に水相から分離される集合体をいう。
【００１４】
本実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルは、固形分の主成分がタンパク質であり、タンパク質と、界面活性剤とを含むゲルである。ここで主成分とは、固形部のうちの最多成分をいう。本実施形態に係るタンパク質は、タンパク質水溶液を加熱したときにゲル化するタンパク質を用いる。
【００１５】
タンパク質凝縮体ゲルの圧縮強度は、機械的強度の観点から、０．１〜１００ＭＰａが好ましく、１〜１００ＭＰａがより好ましく、更に好ましくは１〜５０ＭＰａである。
【００１６】
図１に、タンパク質凝縮体１の一例の模式図を示す。タンパク質凝縮体１は、界面活性剤１２により表面が疎水性を示し、タンパク質１０および水１１が内包された複合体３の集合体よりなる。このタンパク質凝縮体１を加熱することによりタンパク質凝縮体ゲルが得られる。
【００１７】
タンパク質凝縮体ゲルは、任意の形状とすることができる。例えば、任意の厚みのシート、所望の形状の成型体とすることができる。例えば、シート状、板状、球状、直方体、ビーズ状等が挙げられる。また、任意の形状を組み合わせて用いたり、複数のゲルを重ねて用いたりしてもよい。
【００１８】
紫外線照射等によりゲル化させる場合、ゲルの厚み等に制約がある。一方、本実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルによれば、加熱によりゲル化させるので、形状によらずに均質なゲルを得やすいというメリットを有している。
【００１９】
複合体３は、図１に示すように、主として表層に界面活性剤１２が配され、水１１およびタンパク質１０を内包する。界面活性剤１２は、図２に示すように、疎水部２１、親タンパク質部２２および親水部２３を有する。疎水部２１および親タンパク質部２３の間に親水部２２が配置される。ここで「親タンパク質部」とは、タンパク質と親和性を示す界面活性剤の部分をいう。また、本明細書において「タンパク質」は、純粋なタンパク質であることは必須ではなく、タンパク質特有の立体構造に起因した作用効果を少なくとも一部に有するものであればよく、タンパク質の一部の構造を置換、欠失または付加したもの、更に、タンパク質の表面を化学修飾したもの或いは一部を改変したものも含むものとする。また、「親水部」とは、複合体内で当該ユニット近傍に水を保持する機能を有するユニットをいう。
【００２０】
複合体３において界面活性剤１２の疎水部２１が外側に、親タンパク質部２３が内側に配向するので、複合体１の表層は疎水性を示す。水１１は主として界面活性剤１２の親水部２２と相互作用し、タンパク質１０は主として界面活性剤１２の親タンパク質部２３と相互作用している。このような複合体１が集合して、水相と分離された集合体がタンパク質凝縮体１である。
【００２１】
複合体３同士は、疎水結合をベースに結合されている。複合体３に内包される水は、界面活性剤１２の疎水部２１の隙間部を介して複合体３の間に存在する水や他の複合体３との間で拡散可能になっている。複合体３の間に水分子が存在していなくてもよいが、複合体３の間に水分子が存在していてもよい。
【００２２】
界面活性剤１２は、図２に示すように、親水部２２、疎水部２１および親タンパク質部２３を有する。複合体３内の水の含有量を調節するためには、親水部２２が重要な役割を担う。界面活性剤において、親タンパク質部２３よりも親水部２２のユニットの方が大きいことが好ましく、水１１がタンパク質１０を取り囲むように、複合体１内の水の質量％がタンパク質の質量％よりも大きいことが好ましい。親水部２２の好ましい例として、ポリエチレングルコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテルユニットまたはポリオールユニットが例示できるまた、エーテルユニットと水酸基ユニットの共重合体ユニットも好適である。これらの基には、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で置換基を有していてもよい。
【００２３】
なお、親水部２２と親タンパク質部２３は必ずしも明確に区別される必要はなく、同一部分が親水部および親タンパク質部として機能してもよい。但し、本発明の親水部は、タンパク質を取り囲むような水を保持できるための充分な長さを備えている必要がある。また、複合体１の構造は、実質的に上述した構造であればよく、タンパク質凝縮体２を得られる限度において上述した構造を有していない部分があってもよい。
【００２４】
タンパク質１０は、水に溶解可能な水溶性タンパク質であればよく、その種類は特に限定されない。タンパク質１０に合わせて界面活性剤１２の親タンパク質部２３を適宜選定する。疎水性タンパク質、水溶液中で立体構造を安定に保持し難いタンパク質、或いはそれ自身が集合して不均一な構造を形成するタンパク質等は、表面改質等を行って親水性を導入して水溶性タンパク質に誘導することにより、好適に適用できる。従って、本発明でいう「水溶性タンパク質」とは、本来的に水溶性を示すタンパク質の他、表面改質等により水溶性を示すタンパク質を含む。タンパク質凝縮体は、単一種類の複合体３が集合したものでも、異なる種類の複合体３がブレンドされたものでもよい。
【００２５】
タンパク質は、水溶液を加熱することによりゲル化するタンパク質を用いる。好適な例として、卵白タンパク質、オボアルブミン等が例示できる。複合体１内には、単数または複数のタンパク質分子が内包されている。複合体１内に異なる種類のタンパク質分子が含有されていてもよい。
【００２６】
界面活性剤１２は、図２に示すように端部に親タンパク質部２３、他端部に疎水部２１、これらの間に親水部２２を有する構造が好ましい例として例示できるが、複合体１を形成できるものであればよく、図１の構成に限定されるものではない。例えば、両端部に疎水部、その隣接位に親水部が配置され、親水部に挟持された略中央部に親タンパク質部を有する折り畳み構造の界面活性剤を用いてもよい。また、親タンパク質部が複数ユニットあるものを用いてもよい。また、高分子界面活性剤を用いてもよい。生体適合性が求められる用途においては、生体適合性を有する界面活性剤を用いることが好ましい。
【００２７】
水１１は純水でもよいし、添加剤が含まれていてもよい。添加剤としては、金属をはじめとする無機化合物や、薬剤、化粧成分等の有機化合物や、有機無機ハイブリッド化合物等の添加剤が含まれていてもよい。図２においては、複合体３のコア部中心にタンパク質が配置されている例を示しているが、水１１がコア部中心に存在する態様、複数のタンパク質分子の間に存在する態様でもよい。タンパク質内には、別のタンパク質、有機物、金属等の無機物等が含まれていてもよい。
【００２８】
タンパク質１０と界面活性剤１２とが相互作用して複合体を形成するために、タンパク質１０の種類に応じて、用いる界面活性剤１２を適切に組み合わせる必要がある。用いるタンパク質１０への界面活性剤１２の結合量が少ないという理由でタンパク質凝縮体が得られない場合には、表面電荷を変更すればよい。例えば、アミノ酸残基の改変を行うことにより適切に表面電荷を変更することができる。表面電荷を変更する方法は特に限定されないが、好適な例として遺伝子工学的な手法を用いる方法がある。
【００２９】
タンパク質１０と界面活性剤１２の相互作用は、複合体３を形成できればよく特に限定されないが、本実施形態においては、静電相互作用により複合体を形成する方法、共有結合により複合体を形成する方法が好適である。
【００３０】
静電相互作用によりタンパク質１０と界面活性剤１２を相互作用させる場合には、タンパク質１０の表面電荷の量に応じて界面活性剤の親タンパク質部２３にアニオン性ユニットを有するアニオン性界面活性剤または／および親タンパク質部２３にカチオン性ユニットを有するカチオン性界面活性剤を用いる方法が好適である。また、両性界面活性剤も好適である。タンパク質１０の表面電荷や電荷部分の立体配置などを考慮して、アニオン性界面活性剤または／およびカチオン性界面活性剤の添加量を決定すればよい。
【００３１】
タンパク質１０内にプラスの電荷を有する部分とマイナスの電荷を有する部分が存在する場合には、アニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤を、タンパク質１０内の電荷の分布や立体配置を考慮しつつ添加量比を調整すればよい。アニオン性ユニットとしてはカルボキシル基やスルホン酸基が挙げられ、カチオン性ユニットとしてはアミノ基が例示できる。また、親水部の好適な例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテルユニット、ポリビニルアルコール等が好ましい。これらの親水性を示す部分のユニットは、主鎖を構成する原子数で１０以上の長鎖ユニットからなることが好ましい。親水部は、構成する原子のうち１／４以上が親水性を示す原子（例えば、Ｏ原子）により構成されていることが好ましい。疎水部としてはアルキル基等が好ましい。カルボキシル基やスルホン酸基等のアニオン性ユニット、アミノ基等のカチオン性ユニットとは別に、ポリエーテルユニット、ポリビニルアルコール等の長鎖ユニットからなる親水部を有し、アルキル基等の疎水部をさらに有する界面活性剤を用いることにより、本実施形態のタンパク質凝縮体を容易に得ることができる。
【００３２】
タンパク質凝縮体１のタンパク質含有量は、用途により適宜設計することができる。例えば、タンパク質凝縮体１に対して、例えば、タンパク質の含有量を１〜４０質量％とすることができる。タンパク質の質量％を増やすためには親水部２２の長さを短くすることが有効であり、タンパク質の質量％を減らすためには親水部２２の長さを長くすることが有効である。
【００３３】
アニオン型界面活性剤として、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型、リン酸エステル型のものが例示できる。また、カチオン型界面活性剤として、第４級アンモニウム塩型、アルキルアミン塩型、ピリジン環型構造を有する化合物が例示できる。両性界面活性剤としては、アルキルべタイン型、脂肪酸アミドプロピルベタイン型、アルキルイミダゾール型、アミノ酸型、アミンオキシド型構造を有する化合物が挙げられる。
【００３４】
本実施形態に好適な界面活性剤としては、例えば、以下のような化合物（１）〜（３）等が例示できる。
【化１】
2018130663.tif 000003
但し、ｘは３〜１８、ｙは３〜２０、好ましくはｙ＝５〜２０、より好ましくはｙ＝８〜２０である。
【化２】
2018130663.tif 000004
但し、ｐは３〜１８、ｑは３〜２０、好ましくはｙ＝５〜２０、より好ましくはｙ＝８〜２０である。
【化３】
2018130663.tif 000005
但し、ｎは３〜２０、好ましくは５〜２０、より好ましくは６〜２０である。
【００３５】
共有結合によりタンパク質１０と界面活性剤１２を相互作用させる場合には、タンパク質と親タンパク質部とを共有結合させる方法が好適である。例えば、タンパク質のリジン残基のアミノ基と共有結合させる界面活性剤として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化界面活性剤が有効である。また、タンパク質のシステイン残基のメルカプト基と共有結合させる界面活性剤として、マレイミド化界面活性剤が有効である。
【００３６】
共有結合は、予め、タンパク質と界面活性剤を共有結合させてもよいし、タンパク質と界面活性剤を水中で混合する際に共有結合させてもよい。共有結合によりタンパク質と界面活性剤を結合することにより、より安定な複合体を形成できる。なお、共有結合とイオン結合の両者を含む複合体でもよい。すなわち、一の複合体において、タンパク質と界面活性剤が、共有結合により結合された部位とイオン結合により結合された部位を有していてもよい。また、タンパク質凝縮体ゲル内においてイオン結合により結合された複合粒子と共有結合により結合された複合粒子が混在していてもよい。
【００３７】
本実施形態のタンパク質凝縮体ゲルは、タンパク質を内包する水は、生体に無害であるので製剤、化粧品、食品の分野の他、他の素材とハイブリッドして医療用途、センサー用途などへの応用が期待できる。また、機械的強度が高く、柔軟性が高いことから、人工関節等の生体材料への応用が期待できる。
【００３８】
次に、本実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルの製造方法の一例について説明する。但し、本実施形態のタンパク質凝縮体の製造方法は、以下の製造方法に何ら限定されるものではない。
【００３９】
タンパク質凝縮体ゲルの製造方法は、タンパク質と界面活性剤を水中で溶解させる工程ａと、表面が界面活性剤により疎水性を示し、タンパク質および水が内包されている複合体を形成して、当該複合体が自発的に水相から分離される集合体を形成する工程ｂと、集合体を加熱によりゲル化する工程ｃとを含む。タンパク質は、当該タンパク質の水溶液の加熱によりゲル化するタンパク質である。
【００４０】
まず、タンパク質を常温下で水に加え、タンパク質含有溶液を得る（工程ａ１）。なお、ここでいう水には、タンパク質安定化のための成分（塩、酵素などの反応基質、グリセロール、ｐＨ緩衝成分）が溶解されているものや電解質水溶液も含まれる。電解質水溶液は、例えば、ＮａＣｌ等の塩を含む所定濃度のＴｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）−ＨＣｌ等を好適に用いることができる。
【００４１】
次に、前記溶液に界面活性剤を加えて混合する（工程ａ２）。界面活性剤を直接加えてもよいが、均一分散性やタンパク質の変性を回避する観点からは、タンパク質含有水溶液と界面活性剤の水溶液を混合する方法がよい。タンパク質含有水溶液、界面活性剤水溶液は、必要に応じてタンパク質が変性しないようにｐＨ調整を行うことができる。混合液の電解質濃度は、タンパク質凝縮体ゲルが得られればよく特に限定されないが、界面活性剤との相互作用を阻害しない観点からは５０ｍＭ以下とすることが好ましく、１０ｍＭ以下とすることがより好ましく、１ｍＭ以下とすることがさらに好ましい。タンパク質水溶液の濃度は、混合液にしたときに上述の電解質濃度になるように調整する方法が好ましい。
【００４２】
その後、タンパク質と界面活性剤の混合液（溶液または懸濁液）からタンパク質凝縮体を得る（工程ｂ）。短時間で複合体を得る観点からは、遠心分離が好ましいが、揺動させる方法や静置させる方法でもよい。遠心分離は、懸濁液が得られた後、直ちに行ってもよいし、所望のタイミングで行ってもよい。遠心分離の温度は、タンパク質の種類、タンパク質凝縮体の状態に応じて常温で行うほか、加温したり、冷却したりすることができる。遠心分離を行うことにより、タンパク質凝縮体と不要の界面活性剤および塩とを分離することができる。上記工程を経て得られるタンパク質凝縮体は、例えば、液体、固体として取り出すことができる。タンパク質凝縮体が液体の場合には、マイクロピペットなどにより回収できる。固体の場合には、沈殿または濾過により回収すればよい。なお、ここでいう液体には粘性のある液体も含むものとする。
【００４３】
その後、タンパク質凝縮体を加熱によりゲル化する（工程ｃ）。加熱温度および加熱時間は、用いるタンパク質のゲル化する温度等を考慮して適宜決めればよい。
【００４４】
上記方法によれば、用いた物質の質量および体積を把握できるので、用いた物質の質量、体積が求まり、タンパク質と界面活性剤の濃度を定量することができる。さらに、界面活性剤を滴定することにより、本実施形態のタンパク質凝縮体を得るための最適な条件（界面活性剤の種類、添加量等）を容易に決定できるというメリットがある。このため、電解質等の添加剤の影響についての知見も容易に得ることができる。さらに、回収時のロスが少ないというメリットもある。また、最適な界面活性剤量を加えて混合した後、遠心分離することにより直ぐにタンパク質凝縮体が得られるので、製造工程の点からも優れている。このため、大量調製にも好適である。
【００４５】
本実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルの製造方法によれば、冷却・加熱処理工程を必須とせずにタンパク質凝縮体を自発的に水相から分離させ、得られたタンパク質凝縮体を加熱によりゲル化できるので製造工程が簡便である。タンパク質凝縮体は、界面活性剤の親水部とそれにより保持される水に囲まれているため、タンパク質を適切に保護することができる。
【００４６】
また、タンパク質凝縮体が液状の場合、所望の形状の型に流し込んだ後に加熱すればよく、ゲルの成型が容易であるというメリットもある。
【００４７】
本実施形態におけるタンパク質凝縮体ゲルは、外部の水との間で物質の出入りが可能である。ここでいう外部の水とは、タンパク質凝縮体ゲルに接した水のことである。この特性により任意の物質を溶解させた水溶液とタンパク質凝縮体ゲルを接触させることで、タンパク質凝縮体ゲル内部の水に物質を取り込むことが可能となる。本実施形態によれば、拡散可能な水の存在により様々な応用が期待できる。例えば複合体内の水を反応場として利用した反応リアクター等への応用が期待できる
【００４８】
また、本実施形態に係るゲルは、タンパク質を主成分とするものであるため、タンパク質分解酵素等を利用することにより分解性を示す。このため、本実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルは、環境負荷低減型のゲルでもある。
【００４９】
≪実施例≫        
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。但し、本発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。なお、実施例および比較例における物性値の測定等は以下の方法により実施した。
【００５０】
（卵白タンパク質水溶液の調製）
鶏卵より白身を回収し、キッチン用水切りネットで濾した。次いで、濾した卵白と同質量の純水を加え、泡立たないように４℃で１時間撹拌した。遠心分離（１００００Ｇ、２０分）後の上清を回収し、分画分子量３５００の透析膜を用いて純水に対して透析を行った。透析膜より回収した溶液を遠心分離（１５０００Ｇ、１０分以上）し、その上清を回収し、卵白タンパク質水溶液として実験に使用した。卵白タンパク質水溶液に含まれるタンパク質の濃度定量は、ウシ血清アルブミンを検量線作製の標準サンプルとして用いてＢＣＡ法（サーモフィッシャーサイエンス社、BCA Protein Assay Kit）で行った。
【００５１】
（オボアルブミン水溶液の調製）
オボアルブミンの乾燥粉末（シグマアルドリッチ、アルブミンニワトリ卵白由来、カタログ番号Ａ５５０３）を、１ｍＭジチオスレイトールを含む、５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させ、分画分子量３５００の透析膜を用いて１ｍＭジチオスレイトールを含む、５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に対して透析した。透析膜より回収した溶液を遠心分離（１５０００Ｇ、１０分以上）し、その上清を回収してオボアルブミン水溶液とした。オボアルブミン水溶液のタンパク質濃度は、水溶液の２８０ｎｍにおける吸光度より分子吸光係数（Ｅ１％１ｃｍ（２８０ｎｍ）＝７．０１）を用いて求めた。
【００５２】
（界面活性剤）
アルキル鎖とイオン部の中間にポリエチレングリコール鎖を有する、陰イオン性界面活性剤と陽イオン性界面活性剤を使用した。アルキル鎖の長さをｘ、ポリエチレングリコール鎖の長さをｙとする界面活性剤をイオン性ＣｘＥｙと呼ぶ。実施例では、陰イオン性界面活性剤である化学式（４）に示すＣ１２Ｅ９と化学式（５）に示すＣ１２Ｅ５を用いた。また、陽イオン性界面活性剤である化学式（６）に示すＣ１２Ｅ９と化学式（７）に示すＣ１２Ｅ５を用いた。各界面活性剤の１００ｍＭ水溶液を調製し、ＫＯＨおよびＨＣｌにて水溶液のｐＨを中性に調製した。
【化４】
2018130663.tif 000006
【化５】
2018130663.tif 000007
【化６】
2018130663.tif 000008
【化７】
2018130663.tif 000009
【００５３】
［卵白水溶液からタンパク質凝縮体（卵白タンパク質凝縮体）の作製］
上記手法で調製した濃度既知の卵白タンパク質水溶液を純水で希釈してタンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍＬとした。
【００５４】
（例１：Ｃ１２Ｅ９を用いた卵白タンパク質凝縮体の作製）
１０ｍｇ／ｍＬ卵白タンパク質水溶液を用意した（図３参照）。そして、この卵白タンパク質水溶液１ｍＬあたり、１００ｍＭの陰イオン性Ｃ１２Ｅ９を２０μＬ、１００ｍＭ陽イオン性Ｃ１２Ｅ９を８０μＬ加え、遠心分離を行った。その結果、図４に示すように、液体が２層に相分離した。下層側の液体状のタンパク質凝縮体（卵白タンパク質凝縮体）を回収した。これらの工程を経て、無色−淡黄色色の液状のタンパク質凝縮体が得られた。得られたタンパク質凝縮体は水相と明確に相分離することを確認した。
【００５５】
（例２：Ｃ１２Ｅ５を用いた卵白タンパク質凝縮体の作製）
１０ｍｇ／ｍＬ卵白タンパク質水溶液１ｍＬあたり、１００ｍＭ陰イオン性Ｃ１２Ｅ５を２０μＬ、１００ｍＭ陽イオン性Ｃ１２Ｅ５を８０μＬ加え、遠心分離を行い２層に別れた下層の液体状のタンパク質凝縮体（卵白タンパク質凝縮体）を回収した。
【００５６】
［オボアルブミン水溶液からのタンパク質凝縮体（オボアルブミン凝縮体）の作製］
上記方法で調製した濃度既知のオボアルブミン水溶液を純水で希釈してタンパク質濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。
【００５７】
（例３：Ｃ１２Ｅ９を用いたオボアルブミン凝縮体の作製）
５ｍｇ／ｍＬオボアルブミン水溶液１ｍＬあたり、１００ｍＭ陰イオン性Ｃ１２Ｅ９を６μＬ、１００ｍＭ陽イオン性Ｃ１２Ｅ９を２４μＬ加え、遠心分離を行い２層に別れた下層の液体状のタンパク質凝縮体（オボアルブミン凝縮体）を回収した。
【００５８】
（例４：Ｃ１２Ｅ５を用いたオボアルブミン凝縮体の作製）
５ｍｇ／ｍＬオボアルブミン水溶液１ｍＬあたり、１００ｍＭ陰イオン性Ｃ１２Ｅ５を１０μＬ、１００ｍＭ陽イオン性Ｃ１２Ｅ５を４０μＬ加え、遠心分離を行い２層に別れた下層の液体状のタンパク質凝縮体（オボアルブミン凝縮体）を回収した。
【００５９】
（実施例１：卵白タンパク質凝縮体）
例１の卵白タンパク質凝縮体をポリエチレン製の１．５ｍＬチューブに入れた状態（図３参照）で、７０℃で５分以上保持することにより、ゲル化卵白タンパク質凝縮体を得た。試験管より取り出したゲルの写真を図５に示す。作製したゲルは各種試験に用いるまで純水中で保存した（以下の実施例においても同様とする）。
【００６０】
（実施例２：卵白タンパク質凝縮体）
例１の卵白タンパク質凝縮体を例２の卵白タンパク質凝縮体に変更した以外は、実施例１と同様の方法によりゲル化卵白タンパク質凝縮体を得た。
【００６１】
（実施例３：オボアルブミン凝縮体からのゲルの作製）
例１の卵白タンパク質凝縮体を例３のオボアルブミン凝縮体に変更した以外は、実施例１と同様の方法によりゲル化オボアルブミン凝縮体を得た。
【００６２】
（実施例４：オボアルブミン凝縮体からのゲルの作製）
例１の卵白タンパク質凝縮体を例４のオボアルブミン凝縮体に変更した以外は、実施例１と同様の方法によりゲル化オボアルブミン凝縮体を得た。
【００６３】
（成型体の作製）
任意の形状の凹部を有するポリエチレン製の型を用意し、例１の液体状のタンパク質凝縮体を型に充填し、その後、ポリプロピレン製シートをかぶせた。その後、７０℃のヒートブロックを上部より乗せ、同時に下部からも加熱した。加熱時間は２０分とした。その結果、図１６の左図に示すように、型通りのゲルが得られることを確認した。
【００６４】
（熱重量測定）
図６に例１の卵白タンパク質凝縮体の熱重量測定のプロファイルを、図７に実施例１の卵白タンパク質凝縮体ゲルの熱重量測定のプロファイルを示す。なお、測定は、セイコーインスツルメンツ社製、ＥＸＳＴＲＡ６０００  ＴＧ／ＤＴＡ６３００を用いた。図６、７に示すように、１００℃近傍まで急激に重量が減少し、１００〜２８０℃の範囲では重量減少が見られなかった。これらの結果より、１００℃までに水が気化し、１００〜２８０℃の範囲ではタンパク質と界面活性剤の分解が見られないことがわかる。例２〜４、実施例２〜４についても同様の測定を行ったところ、同様のプロファイルが得られた。また、各例および各実施例について、１００℃までの重量減少温度から水分量を算出した結果を表１に表す。いずれもゲル化前後で水分量が実質的に同じであることを確認した。
【００６５】
【表１】
2018130663.tif 000010
【００６６】
（圧縮試験）
例１〜４のタンパク質凝縮体ゲルを、９ｍｍ直径、４ｍｍ厚の円形状のポリエチレン製型に充填し、加熱することによりゲルを作製した。圧縮強度測定は、インストロン社製万能試験装置タイプ５５６５を用いて０．４ｍｍ／ｍｉｎの速度で厚み方向に圧縮した。得られた荷重−変形曲線を図８〜１１に示す。また、得られた荷重−変形曲線から圧縮強度と最大変位を求めた。
【表２】
2018130663.tif 000011
【００６７】
卵白タンパク質水溶液を単に加熱して調製したゲル強度は数10キロパスカル(非特許文献１参照)であり、本実施例では、その100倍から1000倍の強度になることがわかった。この強度は、人工高分子によって作製される既存の高強度ゲル(非特許文献１，２)に匹敵あるいは凌駕するものである。
【００６８】
（分解試験）
実施例１のゲルを用意し、以下の試験（１）〜（４）を行った。詳細には、タンパク質質量として5mgを使用して作製した卵白タンパク質凝縮体ゲルを用意し、試験（１）〜（４）の４種類の水溶液１．５ｍL中に、其々サンプルを３７℃で浸漬した。
試験（１）：２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８）水溶液
試験（２）：試験（１）の水溶液に、２００ｍＭのＮａＣｌを加えた水溶液
試験（３）：試験（２）に１０マイクログラム/ｍLのタンパク質分解酵素アルファキモトリプシン（シグマアルドリッチ、α−キモトリプシン  ウシ膵臓由来  カタログ番号Ｃ４１２９）を加えた水溶液
試験（４）：試験（３）にアルファキモトリプシンの阻害剤であるフッ化フェニルメチルスルホニルを１ｍＭ加えた水溶液
【００６９】
図１２に、２４時間および４８時間浸漬した後の実施例１に係るタンパク質凝縮体ゲルの写真を示す。図中の（１）〜（４）は試験（１）〜（４）に対応する。同図より明らかなように、試験（３）においてゲルの分解が認められた。即ち、タンパク質分解酵素によって卵白タンパク質凝縮体ゲルが分解されたことを確認した。
【００７０】
実施例２〜４についても同様の実験を行った。図１３に実施例２、図１４に実施例３、図１５に実施例４の結果を示す。その結果、実施例１と同様に、いずれの実施例においても、試験（３）においてゲルの分解が認められ、分解性を示すことを確認した。
【００７１】
（乾燥−再膨潤試験）
実施例１の卵白タンパク質凝縮体ゲルを真空乾燥させた乾燥品を作製し、再膨潤させる試験を行った。その結果を図１６に示す。図中の写真は、左側から、卵白タンパク質凝縮体ゲルの乾燥前の写真、真空乾燥後の写真、再膨潤後の写真である。同図より明らかなように、真空乾燥（２４時間）を行うと、乾燥前に比べてゲルの収縮が観察された。また、この乾燥品を純水中に浸漬（６時間）すると再膨潤し、乾燥前の体積への戻りを確認し、乾燥により体積および質量を減少させた状態での保存や輸送が可能であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のタンパク質凝縮体ゲルによれば、前述した様に、食品工業、化粧品製造の分野に好適である。また、フィルムやシートに成形して医療用途をはじめとする各種部材に適用できる。また、人工関節等への応用も期待される。また、複合体の内部に金属イオンを導入して、金属構造体の作製、ゾルゲル法で無機化合物の合成にも応用が期待できる。さらに、燃料電池の触媒として、廃棄物処理用としても利用できる可能性がある。
【符号の説明】
【００７３】
１      タンパク質凝縮体
３      複合体
１０    タンパク質
１１    水
１２    界面活性剤
２１    疎水部
２２    親水部
２３    親タンパク質部
【図１】
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【図２】
2018130663.tif 000013
【図３】
2018130663.tif 000014
【図４】
2018130663.tif 000015
【図５】
2018130663.tif 000016
【図６】
2018130663.tif 000017
【図７】
2018130663.tif 000018
【図８】
2018130663.tif 000019
【図９】
2018130663.tif 000020
【図１０】
2018130663.tif 000021
【図１１】
2018130663.tif 000022
【図１２】
2018130663.tif 000023
【図１３】
2018130663.tif 000024
【図１４】
2018130663.tif 000025
【図１５】
2018130663.tif 000026
【図１６】
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