(57)【要約】【課題】１本鎖ＤＮＡ同士の連結効率を改善する【解決手段】受容側1本鎖ＤＮＡに対して予めターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TｄT）を用いて数塩基のリボヌクレオチドを付加しておくことで、５′末端が予めリン酸化された供与側1本鎖ＤＮＡ分子の受容側1本鎖ＤＮＡの３′末端に対するＲＮＡリガーゼによる連結反応の効率を増強することが可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容側１本鎖ＤＮＡの３′末端にＲＮＡリガーゼを用いて５′末端がリン酸化された供与側1本鎖ＤＮＡ分子を連結する反応であって、受容側１本鎖ＤＮＡの３′末端に対してＴｄＴによって１〜５塩基のリボヌクレオチドを付加することによって供与側1本鎖ＤＮＡとの連結効率向上を図るもの。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高効率な１本鎖ＤＮＡ同士の連結方法を提供する
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ同士の連結反応はＤＮＡ を扱う様々な分野で基本となる技術である。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いたＤＮＡ同士の連結反応は高効率であり汎用的に用いられているが、この反応は２本鎖ＤＮＡ同士の連結に特異的であり一部の例外的手法を除いては1本鎖DNAには適用できない。１本鎖ＤＮＡ同士を連結する反応は、これまでにいくつかの方法が考案されているものの、それらの連結効率は低く実用性に乏しいか、あるいは応用に制約があった。
【０００３】
例えば1本鎖ＤＮＡ同士を直接連結する反応としてT４  ＲＮＡリガーゼを用いる反応が知られている。つまり、T４  ＲＮＡリガーゼはＲＮＡ同士を連結するだけでなく、１本鎖ＤＮＡ同士も連結することができる（非特許文献１参照）。しかし、その効率はＲＮＡ同士の連結反応に比べてかなり低い。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（非特許文献１参照）や塩化ヘキサアミンコバルト（ＩＩＩ）（非特許文献２参照）によって反応効率を増強する手法が報告されているが、そういった手法を適用しても連結の効率は依然低いため、連結産物はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する必要がある。近年T４  ＲＮＡリガーゼに構造的に類似するいくつかの耐熱性ＲＮＡリガーゼが同定され、それらのいくつかはＴ４  ＲＮＡリガーゼに比べて高効率に１本鎖ＤＮＡ同士を連結することできることが明らかにされている（特許文献１、非特許文献３および非特許文献４参照）。しかし、これらのＲＮＡリガーゼが高効率に作用できるのは１００塩基以下の比較的短い１本鎖ＤＮＡであり、また自己環状化反応が分子間反応に対して優先的に進行するため、その応用には大きな制約がある。
【０００４】
1本鎖ＤＮＡの末端に人工合成アダプター配列を連結する目的に限るとＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いる連結反応が開発されている。例えば、Ｔｉａｎ等による方法（非特許文献５参照）ではヘアピン構造を形成可能な人工合成アダプター配列を用意する。このヘアピン構造の２本鎖部分の開放側に数塩基のランダム配列を直結したライブラリを用意する。こういったライブラリ中のＤＮＡ分子のうち、標的1本鎖ＤＮＡの末端配列との間でたまたま相補鎖形成可能な分子が存在するとその部分は局所的に２本鎖ＤＮＡ上のニックとなることからＴ４  ＤＮＡリガーゼによる連結反応の基質となり、目的ＤＮＡ断片にアダプター配列を連結することが可能となる。この反応はランダム配列と目的配列の塩基対の対合強度が反応効率に影響を及ぼすため、反応効率は塩基組成に依存性がある。
【０００５】
また、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いる間接的な手法がいくつか開発されている。これはＴｄＴが１本鎖ＤＮＡの３′末端に高効率にヌクレオチドを付加することが可能であるという性質を利用する。１種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸が存在する条件下で、１本鎖ＤＮＡに対してＴｄＴを作用させると１本鎖ＤＮＡの３′末端には当該デオキシリボヌクレオチドのホモポリマーが付加される。このホモポリマーに対し３′末端にその相補鎖配列をもったアダプター配列をプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行うと、目的の１本鎖DNAの相補鎖に対してホモポリマーを介して人工合成アダプターが連結されたDNA断片を得ることができる。このような原理を利用する例としてはPｅｎｇ等によって報告されたTELP法（非特許文献６参照）やクロンテック社のＤＮＡ  ＳＭＡＲＴ法がある（非特許文献７参照）。ただし、これらの手法はTdTによって導入された長いホモポリマーの存在がその生成物の応用を制約する場合がある。こういったＴｄＴによって合成されるホモポリマーの長さを制御する手法として、アテニュエーターオリゴヌクレオチドを使う方法（非特許文献８）があるが、この場合も十数塩基のホモポリマーの付与は避けることが出来ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許７３０３９０１Ｂ２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｂ．他、「Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−  ａｎｄ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｔ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４年、１２巻、２１号、ｐ．８２３５−８２５１（英語）
【非特許文献２】Ｔｅｓｓｉｅｒ  Ｄ．Ｃ．他、「Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８６年、１５８巻、１号、ｐ．１７１−１７８（英語）
【非特許文献３】Ｂｌｏｎｄａｌ  Ｔ．他、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、３１巻、２４号、ｐ．７２４７−７２５４（英語）
【非特許文献４】Ｂｌｏｎｄａｌ  Ｔ．他、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  １  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＴＳ２１２６  ｗｉｔｈ  ｇｏｏｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、３３巻、１号、ｐ．１３５−１４２（英語）
【非特許文献５】Ｔｉａｎ  Ｗ．Ｌｉ  他、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、３４９巻、２号、ｐ．２４２−２４６（英語）
【非特許文献６】Ｐｅｎｇ  Ｘ．他、「ＴＥＬＰ，  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年、４３巻、６号、ｅ３５（英語）
【非特許文献７】タカラバイオ株式会社ホームページ、ＤＮＡ  ＳＭＡＲＴ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ  ｋｉｔ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂａｓｉｃ＿ｉｎｆｏ．ｐｈｐ？ｃａｔｃｄ＝Ｂ１０００８７９＆ｓｕｂｃａｔｃｄ＝Ｂ１０００８８２＆ｕｎｉｔｉｄ＝Ｕ１００００９０６１）
【非特許文献８】米国特許出願公開第２０１５／００８７０２７Ａ１号明細書（Ｓｗｉｆｔ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
１本鎖ＤＮＡ同士を連結する既存の手法は反応効率が低かった。あるいはＴ４  ＤＮＡリガーゼやＴｄＴを用いる手法も利用可能だが、得られる反応産物のその後の利用に制約があった。そこで連結反応効率が高く、かつ反応産物の利用の制約が少ない１本鎖ＤＮＡ同士の連結反応が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、１本鎖ＤＮＡの３′末端に予めTｄTを用いてリボヌクレオチドを数個取り込ませることによって、その一本鎖ＤＮＡと５'末端がリン酸化された別の一本鎖ＤＮＡとの間をＲＮＡリガーゼによって連結する反応を増強する手法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
ＲＮＡリガーゼの連結反応の前処理としてTｄTによるリボヌクレオチドの伸長反応を実施するだけで１本鎖ＤＮＡ同士のＲＮＡリガーゼによる連結反応を増強することが可能となる。ＴｄＴによって付与されるリボヌクレオチドは自己限定的で１〜５塩基程度と短いため、ライゲーション後の生成物を応用する際の制約がＴｄＴによるデオキシリボヌクレオチドのホモポリマー付加を利用する従来法に比べて大きく低減される。また、T４  ＲＮＡリガーゼやＴｄＴといったこれまでの利用実績が高く、かつ市場における供給体制が確立されている試薬を組み合わせることによっても目的の効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は本発明におけるＤＮＡの状態の変化を示した模式図である。（実施例１）
【図２】図２は１００塩基、あるいは２００塩基の完全縮重配列の１本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡ（Ｎ１００、あるいはＮ２００）を連結反応の５′側（受容側）分子として、また３３塩基の５′リン酸化オリゴヌクレオチドＤＮＡを連結反応の３′側（供与側）分子としてとして、本発明による分子間連結反応を試みた結果のトリス−ホウ酸緩衝液を用いた変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示している。（実施例１）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、受容側１本鎖ＤＮＡの３′末端に数塩基のＲＮＡ構造が存在すると供与側５′リン酸化１本鎖ＤＮＡのＲＮＡリガーゼによる受容側１本鎖ＤＮＡに対する連結効率が向上するという性質を利用する。つまり、TdTによる受容側１本鎖ＤＮＡの３′末端へのリボヌクレオチド付加反応とＲＮＡリガーゼによる受容側ＤＮＡに対する供与側ＤＮＡの連結反応の２つの反応をそれぞれ遂行することで高効率な１本鎖ＤＮＡ同士の連結反応を実現する。この二つの反応を独立した反応としてそれぞれ実施することも可能であるが、１本の試験管内で連続した反応として実施することも可能である。また、ＴｄＴによるリボヌクレオチドの付加反応は自己限定的であり、１〜５塩基の付加の後に自動的に伸長が停止するため、リボヌクレオチドの伸長反応の程度は特別に制御する必要はない。なお、連続反応として実施する場合は、供与側1本鎖ＤＮＡの３′末端に対してＴｄＴによるＲＮＡ構造の付加反応が起こらぬように、予め供与側1本鎖ＤＮＡの３′末端にはこれを防ぐ構造、例えば３′リン酸化やアミノ基誘導体などの修飾を付与しておくことが望ましい。また、ＲＮＡリガーゼの基質となるためには、供与側ＤＮＡの５′末端が予めリン酸化されている必要がある。この５′末端のリン酸化はオリゴヌクレオチド合成の際に化学的に導入する方法や、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて酵素的に導入する方法等を用いることかできる。受容側ＤＮＡの５′末端のリン酸化は受容側ＤＮＡが供与側ＤＮＡとして挙動し副産物を生成してしまう可能性があるため、必要に応じてアルカリフォスファターゼ等を用いて予め脱リン酸化処理を行っておくことが望ましい。また、ＲＮＡリガーゼとしては、T４  ＲＮＡリガーゼ、ＲＭ３７８  ＲＮＡリガーゼ、Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼ、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ等が利用可能である。それぞれの酵素はＴｄＴによる処理で受容側１本鎖ＤＮＡの３′末端にＲＮＡ構造が付加されることにより、供与側１本鎖ＤＮＡとの連結反応効率が改善される。
【実施例１】
【００１３】
図１は、本発明の２段階の反応それぞれにおいて１本鎖ＤＮＡの構造が変化する様を模式的に示したものである。まず、ＴｄＴによって受容側の1本鎖ＤＮＡの３′末端に１〜５塩基のリボヌクレオチドが付加される。次いで、５′末端がリン酸化された供与側１本鎖ＤＮＡとＲＮＡリガーゼを作用させることにより、受容側１本鎖ＤＮＡの３′末端の１〜５塩基のＲＮＡを介して供与側１本鎖ＤＮＡが連結された産物を得ることが出来る。
【００１４】
図２は、モデルＤＮＡを用いて本発明の効果を実証した結果の電気泳動写真である。全ての反応は、５  ｍＭ  塩化マグネシウム、２５％ポリエチレングリコール６００（ナカライテスク）、１００μＭ（１と表記）あるいは５００μＭ（５と表記）のＡＴＰを含む５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）に、２μＭの受容側1本鎖ＤＮＡ（１００塩基あるいは２００塩基の化学合成したランダム配列のＤＮＡでそれぞれＮ１００あるいはＮ２００と表記）および２０μＭの供与側１本鎖ＤＮＡ（５′リン酸―ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴ−リン酸―３′）が含まれる。ＴｄＴ（タカラバイオ株式会社）を含む場合は１０μｌの反応液当たり１５ユニットを、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（ＴＳ２１２６  Ｒｎｌ）を含む場合は１０μｌの反応液当たり３  μｇを加えた。反応液は、３７℃で１時間インキュベーションした後、６５℃１時間のインキュベーションを行った。反応産物は１０％のＮｏｖｅｘ  ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ（ライフテクノロジーズ社）ゲルにて分離し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（ライフテクノロジーズ社）染色にて検出・分析を行った。
【図１】
2018042465.tif 000002
【図２】
2018042465.tif 000003