(57)【要約】【課題】真核生物のより実用的な育種技術を提供する。【解決手段】真核生物の育種方法として、前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程と、前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、を備えるようにする。【選択図】図１
2018102254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物の育種方法であって、
前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程と、
前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、
を備える、育種方法。
【請求項２】
前記タンパク質は、４塩基配列認識の制限酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限酵素は、回文構造を有する１６種の４塩基配列から選択される塩基配列を認識する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記制限酵素の認識配列は、ＴＴＡＡ、ＧＡＴＣ、ＣＣＧＧ、ＡＣＧＴ、ＡＡＴＴ、ＡＧＣＴ、ＧＣＧＣ、ＧＧＣＣ、ＧＴＡＣ及びＣＧＣＧからなるからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質は、ＢｓｔＵＩ，ＡｆａＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＨｉｎＰ１Ｉ，ＡｌｕＩ，ＭｌｕＣＩ，ＨｐｙＣＨ４ＩＶ，ＭｓｐＩ，ＭｂｏＩ及びＭｓｅＩからなる群から選択される制限酵素である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度は２５℃以上４０℃以下である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記制限酵素は、突出末端を有するように二本鎖ＤＮＡを切断するＤＮＡ二本鎖切断活性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記導入工程は、前記真核生物又はその一部の細胞膜を介した人為的なタンパク質導入法を用いる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記真核生物は植物体である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記導入工程は、前記植物体から得たプロトプラストと前記タンパク質とを、少なくとも１種のタンパク質導入剤の存在下で接触させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝的に改変された真核生物の生産方法であって、
前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程と、
前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、
を備える、生産方法。
【請求項１２】
真核生物のＤＮＡの再編成方法であって、
前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程、
を備え、
前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる、方法。
【請求項１３】
制限酵素によってＤＮＡが再編成された真核生物の評価方法であって、
再編成前の前記真核生物に由来する第１のＤＮＡと、前記第１のＤＮＡに対応する再編成された前記真核生物に由来する第２のＤＮＡと、を比較して、前記第２のＤＮＡにおいて前記制限酵素の認識配列を検出する工程、
を備える、方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質を用いた真核生物の育種方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、真核生物の育種方法として、ゲノムＤＮＡを同時的及び／又は多発的に切断して遺伝的組換えを誘発し、人為的にゲノムの再編成を行って、ゲノム及び真核生物に関し多様性ある集団の創出を介して、有用な真核生物を効率的に取得し、育種する試みがなされている。
【０００３】
例えば、好熱菌由来の制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断酵素をコードするＤＮＡを真核生物に導入して形質転換し、制限酵素を細胞内で発現後、一過的に温度を上昇させるなどして一過的に活性化してゲノムＤＮＡを切断させることで、遺伝的組換えを誘発することが行われている（特許文献１〜３）。
【０００４】
こうしたゲノム再編成は、一時期的に大規模な遺伝子的組換えを伴うため、例えば、植物体の生産性などの多数の遺伝子が関与する量的形質の改良に好適であり、植物体を急速に進化させることができるという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１６０７９８号公報
【特許文献２】特開２００６−１４１３２２号公報
【特許文献３】特開２０１２−４４８８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、本発明者らによれば、上記従来の方法にはいくつかの課題があることがわかった。すなわち、こうした再編成技術によっても、安定して一定の特性を発揮する個体を得るには、５〜６継代程度必要であった。また、制限酵素のＤＮＡ二本鎖切断活性の一過的活性化には、通常、制限酵素の至適温度を考慮して真核生物の一般的な生育温度を超える温度での熱処理となる。かかる熱処理は、植物体には大きなストレスであり、例えば、顕花植物の生殖成長期には、高温に対して相当程度脆弱であって、植物体の生長や収量に影響を及ぼすことが考えられる。
【０００７】
また、制限酵素をコードする遺伝子による真核生物の形質転換によるため、制限酵素遺伝子が転写・翻訳されて、制限酵素として作用するようになるには一定の時間を要してしまう。一方、制限酵素が真核生物内で継続的に発現し作用すると、ゲノム中において予期せぬ遺伝的組換えを生じさせる可能性もあるほか、真核生物の生育・生存に対する障害が懸念される。
【０００８】
さらに、形質転換体内で制限酵素が発現し続けないようにするためには、導入した遺伝子を細胞又はゲノムから除去する必要があるが、バッククロスなどの遺伝分離が、種子繁殖を行う植物では適応可能である。としても、例えば、ジャガイモ、イチゴ、花卉、果樹、サトウキビなどの栄養繁殖を行う植物においては、種子形成能自体が低い植物が多く、遺伝分離が困難である。また、ヘテロ性が高く種子を形成した後代において、親世代と比べて形質が変化する可能性がある。
【０００９】
このように、制限酵素をコードする遺伝子による形質転換を介した人為的な同時多発的遺伝的組換えによる真核生物のゲノム再編成及びそれによる育種には、種々の課題があった。本明細書は、より実用的な育種技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、従来技術である、制限酵素をコードする遺伝子による形質転換に関し、当該遺伝子を真核生物に内在させることにより、種々の育種上の課題が生じてしまっている可能性に着目した。そして、種々の検討の結果、制限酵素を真核生物内において発現させるのではなく、真核生物の外部から供給することによっても、ゲノムＤＮＡを切断して遺伝的組換えを誘発して、ゲノム編成を促進できることを見出した。本明細書によれば、以下の手段が提供される。
【００１１】
すなわち、本明細書によれば、真核生物の育種方法であって、前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程と、前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、を備える、育種方法（以下、本育種方法ともいう。）が提供される。
【００１２】
また、本明細書によれば、遺伝的に改変された真核生物の生産方法であって、前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程と、前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、を備える、生産方法（以下、本生産方法ともいう。）も提供される。
【００１３】
さらに、本明細書によれば、真核生物のＤＮＡの再編成方法であって、前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程、を備え、前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる、方法（以下、本再編成方法ともいう。）も提供される。
【００１４】
さらに、本明細書によれば、制限酵素によってＤＮＡが再編成された真核生物の評価方法であって、再編成前の前記真核生物に由来する第１のＤＮＡと、前記第１のＤＮＡに対応する再編成された前記真核生物に由来する第２のＤＮＡと、を比較して、前記第２のＤＮＡにおいて前記制限酵素の認識配列を検出する工程、を備える、方法（以下、本評価方法ともいう。）も提供される。
【００１５】
なお、本明細書によれば、上記手段を含んで以下の各種態様の手段を含むことができる。
【００１６】
［１］真核生物の育種方法であって、
前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程と、
前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、
を備える、育種方法。
［２］前記タンパク質は、４塩基配列認識の制限酵素である、［１］に記載の方法。
［３］前記制限酵素は、回文構造を有する１６種の４塩基配列から選択される塩基配列を認識する、［２］に記載の方法。
［４］前記制限酵素の認識配列は、ＴＴＡＡ、ＧＡＴＣ、ＣＣＧＧ、ＡＣＧＴ、ＡＡＴＴ、ＡＧＣＴ、ＧＣＧＣ、ＧＧＣＣ、ＧＴＡＣ及びＣＧＣＧからなるからなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記タンパク質は、ＢｓｔＵＩ，ＡｆａＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＨｉｎＰ１Ｉ，ＡｌｕＩ，ＭｌｕＣＩ，ＨｐｙＣＨ４ＩＶ，ＭｓｐＩ，ＭｂｏＩ及びＭｓｅＩからなる群から選択される制限酵素である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度は２５℃以上４０℃以下である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記制限酵素は、突出末端を有するように二本鎖ＤＮＡを切断するＤＮＡ二本鎖切断活性を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記導入工程は、前記真核生物又はその一部の細胞膜を介した人為的なタンパク質導入法を用いる、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記真核生物は植物体である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記導入工程は、前記植物体から得たプロトプラストと前記タンパク質とを、少なくとも１種のタンパク質導入剤の存在下で接触させることを含む、［９］に記載の方法。
［１１］遺伝的に改変された真核生物の生産方法であって、
前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程と、
前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、
を備える、生産方法。
［１２］真核生物のＤＮＡの再編成方法であって、
前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程、
を備え、
前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる、方法。
［１３］制限酵素によってＤＮＡが再編成された真核生物の評価方法であって、
再編成前の前記真核生物に由来する第１のＤＮＡと、前記第１のＤＮＡに対応する再編成された前記真核生物に由来する第２のＤＮＡと、を比較して、前記第２のＤＮＡにおいて前記制限酵素の認識配列を検出する工程、
を備える、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本明細書に開示される育種方法の概要を示す図である。
【図２】本明細書に開示される育種方法と従来法とのゲノム再編個体を得るまでの工程数の差を示す図である。
【図３】６塩基配列を認識する常温型多頻度制限酵素を導入したときのＢＲＣＡ１発現量を示す図である。
【図４】４塩基配列を認識する常温型多頻度制限酵素を導入したときのＢＲＣＡ１発現量を示す図である。
【図５】常温型多頻度制限酵素ＭｓｅＩを導入したときのＢＲＣＡ１発現量を示す図である。
【図６】常温型多頻度制限酵素ＭｓｅＩによりゲノム再編を引き起こした配列の特徴を示す図である。
【図７】常温型多頻度制限酵素Ｈｉｎｐ１Ｉによりゲノム再編を引き起こした配列の特徴を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書は、真核生物のＤＮＡを編成することによる育種技術等に関し、詳しくは、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質を真核生物又はその一部に、当該タンパク質自体を導入することにより真核生物のＤＮＡを編成することによる育種技術等及びその利用に関する。本育種方法によれば、制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を、真核生物に導入することにより、従来法による種々の課題を一挙に解決できることを見出した。
【００１９】
本技術によれば、以下に示すメリットの少なくとも一部を達成できる。（ｉ）ゲノム再編個体の作出までのステップを大きく削減できる、（ｉｉ）タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性の活性化処理を回避できる、（ｉｉｉ）前記活性化処理に伴う熱負荷を回避できる、（ｉｖ）遺伝子導入及び組換え体の作製を回避できる、（ｖ）栄養繁殖植物などのヘテロ性の高い植物の多様性創出に有利である、（ｖｉ）遺伝子導入を伴わないため、真核生物に広く適用できる、等が挙げられる。
【００２０】
本技術によれば、ゲノム組成及び形質の多様性に富む真核生物集団を、形質転換を経ることなく簡易にかつ効率的に構築することができる。この真核生物集団は、進化の過程で生じうる新たな形質を獲得した真核生物、形質を喪失又は劣化した真核生物、形質が向上した真核生物など、形質の獲得、向上、喪失、低下、改変などを種々の態様で備えうる真核生物の集団となっていると考えられる。
【００２１】
図１に本技術の概要を示し、図２に、本技術と従来法との対比の概要を示す。なお、形質転換に用いる細胞をＴ０世代、形質変化が固定された確立系統をＴ１世代と称し、以後種子を形成させた後代をＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５及びＴ６世代などと称する。図１及び図２に示すように、本技術は、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質を、例えば、プロトプラストなどの植物細胞に導入する（図２のタンパク質導入ステップ（Ｔ０））。導入されたタンパク質は、特に活性化を要しなくても、細胞内において、本来の活性に基づいてゲノムＤＮＡを切断し、遺伝的組換えを誘発して、ゲノムＤＮＡの編成を促進できる。これにより、種々の互いに異なる新たなゲノム組成を有するプロトプラスト（集団）が形成されうる。導入されたタンパク質は、細胞内におけるタンパク質分解システムに従い、一定期間経過後には、分解されて細胞内において機能することはない。タンパク質が分解されるなどして不活性化されることで、新たなゲノム組成は、その細胞（プロトプラスト）において固有のものとなる。
【００２２】
次いで、こうした種々のプロトプラストを常法に従い植物体に再分化することで、一定の割合で、多様性のあるゲノム組成を有する植物体の集団を得ることができる（図２における個体再分化ステップ（Ｔ０））。
【００２３】
さらに、新たなゲノム組成を有する種々の形質の植物体から、所定の指標に基づいて植物体を選抜することができる（図２における系等確立ステップ）。選抜された植物体は、制限酵素をコードする外来遺伝子を持たないため、遺伝子分離を要する必要はなく、なく、したがって、本育種方法は、こうして得られる集団に対して所定の特性で選抜するだけで、特性が固定化された植物体を得ることができる。
【００２４】
これに対して、制限酵素等をコードする遺伝子導入による場合を図２の下段に示す。図２に示すように、例えば、種子などの植物体に遺伝子を導入し（再編用遺伝子導入ステップ）、当該種子から植物個体を再生して再編用遺伝子が導入された植物個体を選抜する（系統選抜ステップ（Ｔ１））。次いで、選抜した植物個体同士を交配して、再編用遺伝子がホモ化した植物体を得る（遺伝子ホモ化ステップ（Ｔ２））。Ｔ２種子から得た植物体（Ｔ３）を熱処理して制限酵素を活性化し、ゲノム組成の再編成を促進する（再編活性化ステップ（Ｔ３））。その後、Ｔ４植物及びＴ５植物において、再編用遺伝子の除去を実施する（再編用遺伝子除去ステップ（Ｔ４）及び再編用遺伝子除去ステップ（Ｔ５））。その後、有用な形質を有する植物系統が確立できる（系統確立（Ｔ６））。
【００２５】
本明細書において「ゲノムセット」とは、真核細胞において染色体ＤＮＡとして存在し、真核細胞において自己複製可能であって娘細胞に伝達されるＤＮＡをいうものとする。
【００２６】
また、本明細書において「遺伝的組換え」とは、広い意味において、ＤＮＡ間で起きるＤＮＡ切断・再結合現象を意味する。したがって、本明細書における「遺伝的組換え」には、相同組換え、非相同組換を包含する。さらに、本明細書における「遺伝的組換え」は、１又は２以上の塩基の置換、挿入及び欠失等による遺伝子突然変異及び染色体の逆位、不等交叉、交叉、転座、重複、欠失、コピー数の低下、コピー数の増大、染色体倍数化及び染色体異数化等の染色体突然変異を包含する。また、本明細書における「遺伝的組換え」には、同一染色体内における遺伝的組換えと異なる染色体間における遺伝的組換えの双方を包含する。
【００２７】
以下、本明細書の開示の各種実施形態について、詳細に説明する。
【００２８】
（真核生物の育種方法）
本育種方法は、前記真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する導入工程と、前記タンパク質により前記真核生物又はその一部の細胞内において前記真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、を備えることができる。
【００２９】
（真核生物）
本育種方法は、任意の真核生物に適用可能である。真核生物が多細胞生物であるときには、真核生物の一部（例えば、後述するように、細胞、組織、器官等）に対して導入工程が実施されうる。
【００３０】
本育種方法に適用される真核生物としては、動物、植物、真核性微生物が挙げられる。動物としては特に限定しないで、非ヒト哺乳動物及び各種の魚類などの非哺乳動物が挙げられる。また、本育種方法に適用される動物としては、動物に由来するものであればよく、各種細胞、組織、器官、未受精、精子、受精卵などいずれの形態であってもよい。受精卵など、完全な動物に再生する能力を保持しているものであれば、改変した動物を得るのに都合がよい。
【００３１】
本育種方法に適用される植物としても特に限定するものではないが、例えば、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する植物（下記参照）が挙げられる。
【００３２】
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Brassica Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）など。
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solaneum tuberosum）、トマト（Lycopersicon lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis. hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）など。
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）など。
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）など。
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）など。
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）など。
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。
フトモモ科：ユーカリ（Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis）など。
【００３３】
本育種方法に適用される植物としては、植物に由来するものであればよいが、完全な植物に再生する能力を保持しているものであれば、ゲノム再編成した植物を得るのに都合がよい。したがって、植物としては、プロトプラスト、細胞、各種組織、器官、葉、幼芽、腋芽、側芽、不定芽、花芽などのシュート、シュート頂、茎、枝、茎、雌しべ又は胚珠などのその一部、雄しべ又は花粉などのその一部、種子又は胚などのその一部、根又はその一部、カルスなどいずれの形態であってもよい。
【００３４】
本育種方法に適用される植物としては、特に限定しないで、広く種子生殖性植物及び栄養生殖性植物等に適用できる。なかでも、栄養生殖が植物に適用することで、遺伝分離を容易にし、形質を安定化することができる。栄養生殖性植物としては、例えば、鱗茎を有するタマネギ、ニンニク、ユリなどのユリ科植物、塊茎を有するジャガイモ、シクラメンなど、球茎を有するサトイモ、クワイ、グラジオラスなど、根茎を有するハス、タケなど、ランナーを有するイチゴ、ユキノシタなど、塊根を有するサツマイモなど、横走根を有するガガイモなど、葉の周縁部に不定芽を有するカランコエなど、零余子を有するヤマイモ、ムカゴラクサ、オニユリなど、担根体を有するヤムイモなど類などの栄養生殖器官を有する植物が挙げられる。また、本育種方法が適用される植物としては、挿し木・接ぎ木で増殖させる果樹などの木本植物など、挿し木・株分けで増殖させるサトウキビ、花卉、サボテンなどの育種上の栄養繁殖植物にも好適である。
【００３５】
植物体の細胞は、細胞壁を有している。本育種方法においては、タンパク質の細胞膜透過性を考慮すると、植物体を真核生物として用いるとき、プロトプラストを用いることが好適である。
【００３６】
微生物としては、特に限定するものではないが、物質生産等を考慮すると、麹菌などのカビや酵母などの微生物細胞が挙げられる。麹菌としては、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus orizae）等のアスペルギルス属が挙げられる。また、酵母としては、公知の各種酵母を利用できるが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピキア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、クロッケラ属（Klocckera）の酵母、スワニオマイセス属（Schwanniomyces）の酵母及びヤロイア属（Yarrowia）の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）等のイサトケンキア属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。
【００３７】
酵母としては、ヘテロタリズム性の酵母のほか、ホモタリズム性酵母であってもよい。ホモタリズム性酵母は、再編工程後に選抜工程を行う場合において、胞子育種を経ることで、正の（優れた）遺伝的組換え結果を増強し、負の遺伝的組換えの影響を排除することができる。また、負の遺伝的組換えを有するゲノムセットを保持する酵母を効率的に排除して正の遺伝的組換え結果を有するゲノムセットを保持するホモタリズム性酵母集団を得ることができるため、さらに１又は２以上の再編工程を繰り返す場合であっても、優れたゲノム再編効率を得ることができる。
【００３８】
（導入工程）
導入工程は、真核生物又はその一部に対して、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質それ自体を導入する工程である。本育種方法における導入工程は、タンパク質それ自体を真核生物又はその一部に直接導入する。
【００３９】
（ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質：本タンパク質）
本タンパク質としては、特に限定しないが、例えば、公知のＤＮＡ二本鎖切断酵素を用いることができる。また、本タンパク質としては、真核生物又はその一部に直接供給したときに、ゲノムＤＮＡ等に有効に作用してＤＮＡを切断し、遺伝的組換えを誘発し、ゲノムを再編成できるものであれば、この種のタンパク質を特徴付ける種々の特徴である、ＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度、認識配列、切断部位等など、特に限定しないで用いることができる。
【００４０】
（本タンパク質が有する認識配列）
ＤＮＡ二本鎖切断酵素が二本鎖ＤＮＡを切断する際の認識配列は特に限定するものではない。本育種方法における遺伝的組換えの効率の観点からは、ＤＮＡ上の４塩基又は５塩基程塩基配列を認識配列とすることが好適である。このような本タンパク質は、いわゆる多頻度制限酵素と称される。ゲノムにおける切断箇所の数がゲノム再編効率に寄与する。６塩基配列を認識するＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の場合、真核生物導入時に遺伝的組換えを十分に誘発することができない。本タンパク質は、４塩基配列を認識することが好ましい。
【００４１】
本タンパク質は、回文構造を有する１６種の４塩基配列から選択される塩基配列を認識することが好ましい。認識配列が回文構造を有していることにより、安定的にＤＮＡ二本鎖を切断できる傾向がある。ここで回文構造は、ＡＡＴＴ、ＡＣＧＴ、ＡＧＣＴ、ＡＴＡＴ、ＣＡＴＧ、ＣＣＧＧ、ＣＧＣＧ、ＣＴＡＧ、ＧＡＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＧＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＡＴＡ、ＴＣＧＡ、ＴＧＣＡ及びＴＴＡＡの全１６種類である。このような回文構造を認識配列とする制限酵素などの本タンパク質は、当業者であれば、商業的に入手可能な制限酵素カタログから選択することができる。
【００４２】
本タンパク質は、例えば、ＴＴＡＡ、ＧＡＴＣ、ＣＣＧＧ、ＡＣＧＴ、ＡＡＴＴ、ＡＧＣＴ、ＧＣＧＣ、ＧＧＣＣ、ＧＴＡＣ及びＣＧＣＧからなるからなる群から選択されるいずれかの４塩基配列を認識することが好ましい。これらの回文配列については、いずれも、コントロール（遺伝的組換え誘発なし）に対して２倍以上の遺伝的組換え（ＢＲＣＡ１発現量）を誘発することができる。これら１０種の回文配列を認識配列とする酵素を以下の表１に例示することができるが、これら以外の制限酵素も同様に用いることができる。
【００４３】
また例えば、ＴＴＡＡ、ＧＡＴＣ、ＣＣＧＧ、ＡＣＧＴ、ＡＡＴＴ、ＡＧＣＴ、ＧＣＧＣから選択されるいずれかの４塩基配列を認識する本タンパク質は、コントロールに対して３倍以上の遺伝的組換えを誘発することができる。かかるまた例えば、ＴＴＡＡ、ＧＡＴＣ、ＣＣＧＧ及びＡＣＧＴから選択されるいずれかの４塩基配列を認識する本タンパク質は、コントロールに対して４倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは６倍以上、さらに好ましくは７倍以上の遺伝的組換えを誘発することができる。
【００４４】
本タンパク質の認識配列における切断部位も特に限定するものではないが、例えば、突出末端を有するように切断することが好ましい。必ずしも理由は明らかではないが、本発明者らによれば、平滑末端よりも突出末端となるような切断態様の制限酵素が遺伝的組換えを促進する傾向があることがわかっている。例えば、突出末端としては、２ｂｐ末端、４ｂｐ末端、２ｂｐ突出末端などが挙げられる。このような切断部位を認識配列とする制限酵素などの本タンパク質は、当業者であれば、商業的に入手可能な制限酵素カタログから選択することができる。
【００４５】
例えば、上記した４塩基回文配列を認識する制限酵素とその切断末端は以下に示すとおりである。これらの制限酵素は、いずれも、認識配列及び至適温度の観点からも本育種方法において好適である。
【００４６】
【表１】
2018102254.tif 000003
【００４７】
本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度は、特に限定するものではなく、直接導入により細胞内ＤＮＡを切断し、遺伝的組換えを誘発できるものであればよいが、熱処理を抑制又は回避する観点からは、本タンパク質は、概ね最大のＤＮＡ二本鎖切断酵素活性を有する温度である至適温度（インキュベーション温度ともいう。）を高温域でなくより低温域に有する制限酵素（以下、常温型制限酵素という。）を用いることができる。ここで、高温域とは、５０℃以上の温度域とすることができる。より好ましくは４５℃以上の温度域である。したがって、本明細書における常温型制限酵素としては、５０℃未満にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有する酵素が挙げられ、好ましくは４５℃未満に同至適温度を有する制限酵素が挙げられる。常温型制限酵素によれば、本タンパク質を真核生物又はその一部に導入する際において、本タンパク質をＤＮＡに作用させるための熱処理を抑制又は回避でき、熱処理による不都合を抑制又は回避できる。また、本タンパク質を直接導入する場合、熱処理は回避すべきであるからである。
【００４８】
常温型制限酵素は、より好ましくは常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有することができる。ここで、「常温域」とは、１５℃以上４２℃以下、より好ましくは１５℃以上４０℃以下、さらに好ましくは２５℃以上４０℃以下、さらに好ましくは２５℃以上３７℃以下、なお好ましくは３０℃以上３７℃以下を意味するものとする。
【００４９】
概して、常温型制限酵素は、２５℃以上４０℃以下程度（典型的には、２５℃又は３７℃）に至適温度を有することができる。また、常温型制限酵素は、概して、６０〜７０℃、１５分〜２０分のインキュベートにより不活性化されうる。１５分〜２０分のインキュベートによって酵素活性を失活する温度を失活温度というものとする。常温型制限酵素であっても、８０℃以上の失活温度を有する場合もある。
【００５０】
なお、本育種方法においては、本タンパク質の直接導入によりゲノムの再編が可能である限り、常温型制限酵素以外の制限酵素を本タンパク質として用いることもできる。例えば、好熱菌でない細菌に由来する制限酵素（非好熱菌由来制限酵素）を用いることもできる。好熱菌は、至適生育温度が４５℃以上又は生育限界温度が５５℃以上である細菌をいう。好熱菌は概して古細菌である。非好熱菌由来制限酵素は、概して常温型制限酵素でありうる。一方、好熱菌由来制限酵素は、概して、８０℃又はそれ以上の温度を失活温度としうる。また、好熱菌由来制限酵素は、至適温度が３７℃以上８０℃以下程度である。
【００５１】
常温型制限酵素又は非好熱菌由来制限酵素は、適用する真核生物に一般的に適用される温度（生育温度や培養温度）の温度域においてそのＤＮＡ二本鎖切断活性をある程度有するため、各種作用条件を調節することでその作用強度（レベル）を高い自由度で設定できる。
【００５２】
常温型制限酵素としては、至適温度が２５℃以上４０℃以下程度（典型的には、２５℃又は３７℃）として商業的に入手可能な制限酵素を用いることができる。好ましくは、こうした至適温度を備え、さらに、失活温度が６０℃以上７０℃以下として商業的に入手可能な制限酵素を用いることができる。
【００５３】
また、非好熱菌由来制限酵素としては、公知の非好熱菌由来制限酵素を適宜選択して用いることができる。
【００５４】
こうした制限酵素としては、特に限定しないが、例えば、４塩基配列を認識するものとして、ＭｌｕＣ１、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ，ＴａｉＩ（ＭａｅＩＩ）、ＡｌｕＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＦａｔＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｆａＩ、ＤｐｎＩＩ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＣｖｉＱＩ、ＲｓａＩ、ＡｆａＩ、ＴａｑＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＭｓｅＩ等が挙げられる。また、４塩基配列を認識し、突出末端を形成するものとしては、ＭｌｕＣ１、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ，ＴａｉＩ、ＦａｔＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｆａＩ、ＤｐｎＩＩ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＣｖｉＱＩ、ＴａｑＩ、ＭｓｅＩ等が挙げられる。また、これらのうち、至適温度が３７℃であるものとして、ＭｌｕＣ１、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ，ＡｌｕＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＮｌａＩＩＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｆａＩ、ＤｐｎＩＩ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＲｓａＩ、ＡｆａＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＭｓｅＩ等が挙げられる。また、これらのうち至適温度が２５℃であるものとして、ＣｖｉＡＩＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＣｖｉＱＩが挙げられる。
【００５５】
また、制限酵素としては、上記以外の酵素、すなわち、至適温度が５０℃以上の制限酵素や好熱菌由来の制限酵素を用いることもできる。こうした制限酵素を常温域近傍温度で作用させても、その作用条件を適宜設定して作用強度を調節することにより、真核生物への悪影響を回避しつつ効率的に細胞内においてＤＮＡを切断することができる。こうした制限酵素としては、適宜公知の制限酵素を用いることができる。
【００５６】
なお、制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の至適温度は、当該酵素の入手先のプロトコルに記載されるほか、当該酵素に好適とされているバッファ中、所定の基質の所定濃度存在下、各種温度で酵素反応評価した結果に基づくことができる。
【００５７】
例えば、制限酵素の至適温度の測定方法としては、文献（Greene, P.J., Poonian, M.S., Nussbaum, A.L., Tobias, L., Garfin, D.E., Boyer, H. W., & Goodman, H. M (1975), Restriction and modification of a self-complementary octanucleotide containing the Eco RI substrate.  Journal of molecular biology, 99(2), 237-261）の方法が挙げられる。具体的には、制限酵素による、ＳＶ４０ ＤＮＡ（32Ｐ標識）の切断に関して定量解析する。すなわち、全量５０μｌの反応液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、１．６ｐＭ、 ＳＶ４０ ＤＮＡ）に５μｌ制限酵素溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮＰ４０, ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．７ｐＭ制限酵素）を加え、各温度（０℃〜８０℃程度において適度な温度間隔に設定された温度）において、制限酵素処理を数分間程度適切な時間行う。１％ＳＤＳを添加して反応を停止後、アガロース電気泳動により、supercoil DNA（フォームＩ）、open circle DNA（フォームII）及び線状DNA（フォームIII）に分離する。各フォームの線量（ｃｐｍ）を測定し、制限酵素処理により切り出されたホスホジエステル結合数（ｐｍｏｌ）を下記計算式で求める。各温度において切り出されたホスホジエステル結合数をグラフ化して、ピーク値近傍をその酵素の至適温度（ＤＮＡ二本鎖切断活性の）とすることができる。
ホスホジエステル結合数（ｐｍｏｌ）＝
[２×フォームIIIの線量（ｃｐｍ）＋フォームIIの線量（ｃｐｍ））／（フォームＩ、II及びIIIの合計線量（ｃｐｍ））]×ＤＮＡ量（ｐｍｏｌ）
【００５８】
また、例えば、制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の失活温度は、当該酵素を、各種温度で１５分〜２０分程度維持する熱処理の前後の活性を測定することにより得ることができる。活性が検出できなくなる温度が失活温度である。
【００５９】
（本タンパク質の真核生物又はその一部への直接導入）
本タンパク質を真核生物又はその一部において作用させるには、本タンパク質を直接真核生物又はその一部に導入する。本タンパク質の真核生物又はその一部への導入方法は、特に限定するものではない。タンパク質の細胞への導入自体は、当業者において周知の技術であり、当業者であれば、公知の種々の手法から、導入効率や導入対象となる真核生物等に応じて適宜選択して用いることができる。
【００６０】
タンパク質の細胞等への導入法としては、真核生物の細胞膜を介した人為的なタンパク質導入法が好適に用いられる。例えば、以下の方法が挙げられる。例えば、ポリエチレングリコールの利用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、エキソソーム様小胞による輸送、陽イオン性脂質の利用、細胞膜透過能とタンパク質との複合体形成能を併せ持つペプチドの利用、リポトランスフェクション等が挙げられる。
【００６１】
ポリエチレングリコールを利用する方法は、例えば、DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology, 2015 ; 33, 1162-1164、Woo, J. W., Kim, J., Kwon, S. I., Corvalan, C., Cho, S. W., Kim, H., Kim S. G., Kim, S. T., Choe, S., & Kim, J. S.らなどに開示されている。
【００６２】
エレクトロポレーションによる方法は、例えば、Bulletin 1365 ”Introduction of Proteins into Cells by Electroporation” (BioRad)に開示されるほか、 Neon（商品名） Transfection System (Invitorogen)やNEPA21エレクトロポレーター (Nepagene)などとしてシステムや装置を入手することで実施できる。
【００６３】
マイクロインジェクション法は、ガラスキャピラリーを用いて細胞にタンパク質等を注入する方法であり広く利用されており、当業者に周知である。
【００６４】
エキソソーム様小胞による輸送を用いる方法は、例えば、 Gesicle system (Takara)などとして商業的に入手及び利用可能である。
【００６５】
陽イオン性脂質を利用する方法は、例えば、BioPORTER Protein Delivery Reagent (Genlantis)などとして商業的に入手及び利用可能である。すなわち、正電荷のBioPORTER/タンパク質複合体を細胞に添加すると、負に帯電した細胞表面へ結合。BioPORTER試薬は細胞膜と直接融合し、捕捉していたタンパク質を細胞に吸収させるか、あるいはBioPORTER/タンパク質複合体がエンドサイトーシスによりエンドソームへと取り込まれ、捕捉していたタンパク質が細胞質へと放出される。単純な運搬機構と、他の融合なく共有結合も生じないため、様々な細胞種へと効果的に活性タンパク質を運搬できるとされている。また本法は、Zuris, J. A., Thompson, D. B., Shu, Y., Guilinger, J. P., Bessen, J. L., Hu, J. H., Maeder, M. L., Joung, J. K., Chen, Z. Y., and Liu, D. R. (2015). Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature biotechnology, 33(1), 73-80にも開示されている。
【００６６】
細胞膜透過能とタンパク質との複合体形成能を併せ持つペプチドを利用する方法は、例えば、”Prote-in” Transfection Reagent（Hygieia Bioscience）、Xfect Protein トランスフェクション試薬（Clontech）、Pierce Protein Transfection Reagent（ThermoFisher）などとして、商業的に入手及び利用可能である。
【００６７】
リポトランスフェクションによる方法は、リン脂質二重膜の小胞を用いる方法であり、例えば、 Pro-DeliverIN CRISPR（OZ Bioscience）などとして商業的に入手及び利用可能である。
【００６８】
さらに、上記以外の方法として、例えば、 ProteoJuiceTM Protein Transfection Reagent (Merck)、 PULSinTM Protein, antibody and peptide delivery reagent (Polyplus)、TransPassTM P Protein Transfection Reagent (NEB)、Chariot (ACTIVEMOTIF) U.S.patentNo.6,841,535などが商業的に入手及び利用できる。
【００６９】
本育種方法においては、ポリエチレングリコール、陽イオン性脂質、エキソソーム様小胞、リポソーム、細胞膜透過性タンパク質などの、各種のタンパク質の細胞膜透過を促進するタンパク質導入剤とともに行うことが好適である。
【００７０】
本タンパク質の真核生物又はその一部に対する導入に際しての操作、溶媒などの試薬、温度や処理時間などの条件は、用いる方法に応じて文献などや製造元のプロトコルに記載される内容をそのままあるいは適宜改変して用いることができる。本タンパク質の認識配列、切断部位及び至適温度のほか、本タンパク質の使用量も、求めるゲノム再編レベルや真核生物又はその一部の種類等により適宜設定することができる。
【００７１】
本タンパク質の導入時の温度等や条件は、特に限定しないが、本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度近傍でなく、至適温度より低い温度であることが好ましい。例えば、ＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度が３７℃程度の場合、供給時の温度は３０℃以下とすることが好ましく、より好ましくは２５℃以下である。
【００７２】
なお、真核生物又はその一部が細胞壁を有する場合には、公知の方法により細胞壁を除去してプロトプラストとして用いることが好適である。
【００７３】
（編成工程）
編成工程は、本タンパク質により、真核生物又はその一部の細胞内において真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる工程である。本タンパク質は、真核生物の細胞内でＤＮＡ二本鎖切断活性を発揮し、ゲノムＤＮＡを切断し、遺伝的組換えを誘発し、この結果、ゲノムＤＮＡの編成、すなわち、ゲノムの再編成を生じさせることができる。本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性を発揮させるために、編成工程は、必要に応じ１又は２回以上繰り返して実施することができる。また、編成工程後に各種の選抜工程を行うことができる。また、こうした編成工程と選抜工程とを繰り返して実施することもできる。
【００７４】
次いで、真核生物の細胞内において本タンパク質を作用させる態様について説明する。真核生物の細胞内において本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性を発揮、すなわち、本タンパク質を作用させるには、そのまま真核生物の生育条件下で作用させるだけでもよい。本育種方法によれば、本タンパク質自体を直接真核生物に導入するため、特別な活性を要しなくても、直ちに本タンパク質が作用する。すなわち、遺伝子の発現誘導、タンパク質産生等のプロセスを経る必要がなく、そのまま細胞内で機能すると推測される。一方、外部から導入されたタンパク質は一定期間で分解ないし不活性化されるため、意図しない本タンパク質の作用による不都合も確実に回避される。
【００７５】
本タンパク質は、温度感受性が高い傾向があるが、本発明者らによれば、特別な熱処理などをすることなく、真核生物本来の生育条件で一定期間生育（培養）することで、本タンパク質をＤＮＡに作用させることが可能である。熱処理をしないため、真核生物に対して熱処理による悪影響を回避できる。熱処理を回避する場合に組換え効率を確保するには、既述のとおり、常温型制限酵素が有利である。また、本タンパク質の直接導入には、４塩基配列を認識する制限酵素がその組換え効率の観点から有利である。なお、組換え効率を抑制する場合には、熱処理をすることなく、既述の非好熱菌由来の制限酵素や公知の好熱菌由来の制限酵素を本タンパク質として用いることも可能である。
【００７６】
常温型制限酵素を用いた場合において、真核生物本来の生育条件の範囲であるいは当該条件の範囲を超えるか又は上限近傍で真核生物を熱処理することなど、必要に応じて本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性に応じて熱処理をすることは可能である。
【００７７】
編成工程における本タンパク質の作用温度としての上記生育条件は、育種する真核生物の種類に応じて設定される。概して、真核生物本来のあるいは好適な生育条件としては、例えば、既に説明した各種態様の常温域を含む温度範囲を採用することができる。例えば、下限は、好ましくは１０℃以上であり、より好ましくは１５℃以上である。また例えば２０℃以上、また例えば２５℃以上とすることもできる。上限は、好ましくは４７℃以下であり、より好ましくは４５℃以下であり、さらに好ましくは４２℃以下である。また例えば４０℃以下であり、また例えば３７℃以下であり、また例えば３５℃以下であり、また例えば３０℃以下である。また、その範囲としては、好ましくは１０℃以上４７℃以下であり、より好ましくは１０℃以上４５℃以下、さらに好ましくは１５℃以上４５℃以下、さらに好ましくは２０℃以上４２℃以下、なお好ましくは２５℃以上４２℃以下である。編成工程における温度は、用いる真核生物、本タンパク質の種類のほか、意図する組換え効率等を考慮して設定することができる。
【００７８】
編成工程における本タンパク質の作用時間は、作用温度や本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度にもよって適宜される。特に限定するものではないが、例えば、３０分以上〜７２時間以下程度とすることができる。また例えば１時間以上、また例えば２時間以上、また例えば３時間以上、また例えば６時間以上、また例えば８時間以上、また例えば１２時間以上、また例えば１８時間以上、また例えば２０時間以上などとすることができる。また、例えば、６０時間以下、また例えば４８時間以下、また例えば３６時間以下、また例えば２４時間以下などとすることができる。また、作用時間の温度範囲は、既述の下限及び上限の時間を適宜組み合わせて設定することができるが、例えば、１時間以上７２時間以下、また例えば２時間以上６０時間以下、また例えば２時間以上４８時間以下、また例えば２時間以上２４時間以下などとすることができる。
【００７９】
こうした編成工程は、真核生物が植物の場合には、プロトプラストを２０℃以上３０℃以下で１時間以上４時間以下程度培養することで実施できる。
【００８０】
なお、こうした編成工程における本タンパク質の選定や各種作用条件の設定にあたり、本タンパク質の作用による遺伝的組換えを、Ｂｒｃａ１などの遺伝子の修復に関する遺伝子の発現量やＧＵＳレポーター遺伝子を用いた相同組換えのレベルを指標として評価する評価工程を予め実施することができる。こうすることで、意図した組換え効率を得るのに好適な本タンパク質や好適な条件を選定することができる。
【００８１】
こうして新たなゲノム組成を有する真核生物又はその一部を取得することができれば、従来公知の方法により、この細胞等を用いて、真核生物等を真核生物の種類に応じて分化及び／又は再生させて、所望の真核生物又はその一部を取得することができる。個体としての真核生物を得るには、本タンパク質を導入する真核生物又はその一部として、再生能を有する細胞等を用いることができる。
【００８２】
したがって、本明細書によれば、真核生物の育種システムの評価方法であって、真核生物又はその一部に対して、本タンパク質を導入する導入工程と、本タンパク質により、真核生物又はその一部の細胞内において真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、真核生物における遺伝的組換えを指標として本タンパク質の作用を評価する評価工程と、を備えることができる。
【００８３】
また、本明細書によれば、真核生物の育種システムに用いる本タンパク質及び／又はその作用条件の決定方法であって、真核生物又はその一部に対して、本タンパク質を導入する導入工程と、本タンパク質により、真核生物又はその一部の細胞内において真核生物のＤＮＡの編成を生じさせる編成工程と、真核生物における遺伝的組換えを指標として本タンパク質の作用を評価する評価工程と、前記評価に基づいて前記システムに用いるタンパク質及び／又はその作用条件を決定する、方法も提供される。
【００８４】
こうした編成工程を実施することで、遺伝子導入を伴うことなく、真核生物のゲノムＤＮＡは編成され、新たなゲノム組成を有するものとなる。本タンパク質は、真核生物又はその一部から、真核生物が本来的に有する分解システムにより排除されるため、本タンパク質を排除する必要もなく、また、その新たなゲノム組成はその細胞において固定されるため、遺伝子導入によってなされていた育種における多数の工程を省略することができる。また、本タンパク質が直接真核生物又はその一部に導入されるため、特別な熱処理などの活性化処理をしなくても本タンパク質はＤＮＡに作用することができ、活性化処理による真核生物への負担が回避又は抑制される。新たなゲノム組成を有する細胞等から植物体を再生できるため、栄養繁殖植物の育種にも有利である。
【００８５】
本育種方法は、遺伝的に改変された、換言すれば、改変されたゲノム組成を有する真核生物の生産方法として実施することができる。また、本育種方法は、真核生物のＤＮＡの再編成方法としても実施できる。
【００８６】
（制限酵素によってＤＮＡが再編成された真核生物の評価方法）
本明細書によれば、制限酵素によってＤＮＡが再編成された真核生物の評価方法でって、再編成前の前記真核生物に由来する第１のＤＮＡと、前記第１のＤＮＡに対応する再編成された前記真核生物に由来する第２のＤＮＡと、を比較して、前記第２のＤＮＡにおいて前記制限酵素の認識配列を検出する工程、を備えることができる。
【００８７】
本育種方法では、本タンパク質を細胞に直接導入し、例えば、特別な活性化処理などすることなくゲノムＤＮＡを切断し、遺伝的組換えを誘発し、ゲノムＤＮＡを再編する。このため、ゲノムＤＮＡに対する本タンパク質以外のＤＮＡ切断活性が真核生物内で生じたりすることが抑制され、また、その他のＤＮＡ再編を誘発することもない。このため、本育種方法における遺伝的組換え部位を予め推測できるほか、ゲノムＤＮＡに対する本タンパク質の認識配列における遺伝的組換えの程度や頻度を明確に検出できる。
【００８８】
このため、再編前後の真核生物のゲノムＤＮＡなど、対応箇所を対比して、再編後のＤＮＡにおける本タンパク質の認識配列を確認することで、どこでゲノムＤＮＡが切断されて遺伝的組換えが生じたかを確認することができる。この評価方法によれば、染色体、ゲノムＤＮＡに関する新たな知見も得ることができる。
【実施例】
【００８９】
以下、本明細書の開示を具現化した実施例について説明する。なお、以下の実施例は、本開示を説明するものであってその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００９０】
（植物体からの葉肉細胞プロトプラストの単離）
シロイヌナズナからのプロトプラストの単離はＫｉｍら（Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature protocols, 2007; 2(7), 1565-1572, Yoo, S. D., Cho, Y. H., & Sheen, J.）の方法を一部改変して行った。
【００９１】
４〜５週齢の植物体の葉を切り出し、カミソリで細く刻んだのちに、酵素液（２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７），１．５％（ｗ／ｖ） ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｒ１０，０．４％（ｗ／ｖ）ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ１０，０．４Ｍ ｍａｎｎｉｔｏｌ，２０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭＣａＣｌ２，０．１％ ＢＳＡ）中に移し、３０分間脱気することにより酵素液を葉の中へ浸透させた。室温環境下で遮光し、３時間で静置することで葉からプロトプラストを遊離させた。次に酵素液と等量のＷ５液（２ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７），１５４ｍＭ  ＮａＣｌ，１２５ｍＭ ＣａＣｌ２，５ｍＭ ＫＣｌ）を添加して酵素消化反応を停止させ、フィルター（５０ｍｍメッシュ）にかけたプロトプラスト液を１００ｘｇ、２分の遠心操作により植物残渣を除去した。回収したプロトプラストはＷ５溶液に懸濁して氷上に静置することで、正常のプロトプラストのみを自然沈降させ回収した後、ＭＭＧ溶液（４ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７），０．４Ｍ ｍａｎｎｉｔｏｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁し、以降の制限酵素導入実験に用いた。使用する細胞数は１ｘ１０４から１ｘ１０６ｃｅｌｌｓとした。
【実施例２】
【００９２】
（プロトプラストへの制限酵素の導入及び制限酵素による遺伝的組換え）
シロイヌナズナからのプロトプラストの単離はＫｉｍら（非特許文献５）の方法を一部改変して行った。本実験で用いる各種制限酵素（Ｔａｋａｒａ社もしくはＮＥＢ社、以下に示す。）を１００Ｕ分、チューブに加えたのち、単離したプロトプラスト２００ｍｌとタッピングにより混和した。さらにトランスフェクション液（４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００ ｉｎ ｄｄＨ２Ｏ，０．４Ｍ ｍａｎｎｉｔｏｌ，１００ ｍＭ ＣａＣｌ2）を２１０ ｍｌ加えて転倒混和させ、内容物を均一にした。１０分間室温で静置したのちに、ＷＩ溶液を１ｍｌ加えトランスフェクションを停止させ、１００ｘｇ、３分の遠心操作でトランスフェクション済みプロトプラストを回収し、ＷＩ溶液（４ ｍＭ ＭＥＳ （ｐＨ５．７），０．５ Ｍ ｍａｎｎｉｔｏｌ，２０ ｍＭ ＣａＣｌ２）に懸濁して２〜３時間、室温（２２〜２５℃）で培養した。また、以下にこれらの制限酵素について示す。
【００９３】
認識配列が６塩基である制限酵素：ＢａｍＨＩ（３０〜３７℃），ＥｃｏＲＩ（３７℃），ＰｓｔＩ（３７℃），ＳｍａＩ（２５℃），ＳｎａＢＩ（３７℃），ＳｐｈＩ（３７℃），ＸｂａＩ（３７℃），ＸｈｏＩ（３７℃）
認識配列が４塩基である制限酵素：ＢｓｔＵＩ（６０℃），ＡｆａＩ（３７℃），ＨａｅＩＩＩ（３７℃），ＨｉｎＰ１Ｉ（３７℃），ＡｌｕＩ（３７℃），ＭｌｕＣＩ（３７℃），ＨｐｙＣＨ４ＩＶ（３７℃），ＭｓｐＩ（３７℃），ＭｂｏＩ（３７℃），ＭｓｅＩ（３７℃）
【００９４】
【表２】
2018102254.tif 000004
【実施例３】
【００９５】
（プロトプラストにおける制限酵素によるＤＮＡ二本鎖切断効果の確認）
トランスフェクション後、室温で培養したプロトプラストは１００ｘｇ，３分の遠心操作の後、上清を取り除いてから液体窒素中で凍結させ保存することが可能である。次に、制限酵素によるＤＮＡ二本鎖切断（double strand break; ＤＳＢ）効果を確認するため、トランスフェクション後のプロトプラストからＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ切断修復の重要因子であるＢＲＣＡ１（Characterization of Arabidopsis thaliana ortholog of the human breast cancer susceptibility gene 1: AtBRCA1, strongly induced by gamma rays. Nucleic acids research, 2003 ; 31(4), 1148-1155. Lafarge, S., & Montane, M. H.の遺伝子発現を解析した。ＲＮＡ抽出にはRNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を用いてメーカーの指示するプロトコル通りに行った。
【００９６】
逆転写キットにより抽出ＲＮＡからｃＤＮＡを合成したのち、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ライフテクノロジー）により、リアルタイムＰＣＲ解析を行った。逆転写反応およびリアルタイムＰＣＲ解析においてもメーカーが指示する手順に従って行った。内部標準として１８ｒＲＮＡ（検出プライマー；配列番号１および０２）を測定し、ＤＳＢ修復遺伝子ＢＲＣＡ１（検出プライマー；配列番号３および４）についても遺伝子発現量を解析した。ＢＲＣＡ１の発現量は相対値（サンプル中のＢＲＣＡ１発現量／サンプル中の１８ＳｒＲＮＡ発現量）として示した。結果を、図３及び図４に示す。
【００９７】
18SrRNA-F：CGGCTACCACATCCAAGGAA（配列番号1）
18SrRNA-R：TGTCACTACCTCCCCGTGTCA（配列番号2）
BRCA1-F：CCATGTATTTTGCAATGCGTG（配列番号3）
BRAC1-R：TGTGGAGCACCTCGAATCTCT（配列番号4）
【００９８】
図３に示すように、認識配列が６塩基である制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｈＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ）では、ＢＲＣＡ１発現量の顕著な上昇（無処理群と比較して２倍以上の発現量変動）が認められなかった。一方、図４に示すように、認識配列が４塩基である制限酵素（ＢｓｔＵＩ、ＡｆａＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＡｌｕＩ、ＭｌｕＣＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｓｐＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｅＩ）をプロトプラストに導入した場合には、いずれの酵素においても、無処理群（コントロール）と比較して量比２倍以上の顕著なＢＲＣＡ１発現上昇が認められた。なお、耐熱制限酵素ＴａｑＩを導入した場合には、コントロール群とほぼ同程度の発現量であった（コントロール比１．０５倍）。
【００９９】
また、図４に示す結果からは、４塩基配列を認識するとともに、２塩基又は４塩基突出末端を有する制限酵素が高いＢＲＣＡ発現量上昇を呈し、これらの断端構造が有利であることがわかった。また、４塩基配列を認識する酵素によれば、コントロールに対して２倍以上のＢＲＣＡ発現量を引き起こすことが可能であり、なかでも、ＴＴＡＡ、ＧＡＴＣ、ＣＣＧＧ、ＡＣＧＴ、ＡＡＴＴ、ＡＧＣＴ、ＧＣＧＣ、ＧＧＣＣ、ＧＴＡＣ及びＣＧＣＧなどの回文配列を認識する制限酵素であり、典型的には、ＢｓｔＵＩ、ＡｆａＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＡｌｕＩ、ＭｌｕＣＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｓｐＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｅＩが好ましいことがわかった。さらに、コントロールに対して３倍以上のＢＲＣＡ発現量を示すものとしては、ＴＴＡＡ、ＧＡＴＣ、ＣＣＧＧ、ＡＣＧＴ、ＡＡＴＴ、ＡＧＣＴ、ＧＣＧＣを認識する制限酵素であり、典型的には、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＡｌｕＩ、ＭｌｕＣＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｓｐＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｅＩが好適であることがわかった。さらに、コントロールに対して４倍以上のＢＲＣＡ発現量を示すものとしては、ＴＴＡＡ、ＧＡＴＣ、ＣＣＧＧ及びＡＣＧＴの塩基配列を認識する制限酵素であり、典型的には、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｓｐＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｅＩであることがわかった。
【０１００】
本実施例で使用した酵素種の認識配列や切断末端の形状（平滑・突出）は多岐に渡り、４塩基認識で至適活性温度２５℃〜３７℃にある制限酵素であれば、どのような酵素でもＢＲＣＡ１の発現を顕著に上昇させられると考えられる（表１）。以上の結果より、プロトプラストに４塩基認識の常温型制限酵素タンパク質が導入されると熱処理などの酵素活性化を必要とせず、ＤＮＡ二本鎖切断が引き起こされることが示唆された。ＢＲＣＡ１などの修復遺伝子の発現上昇に伴いゲノム再編が誘発されることから、プロトプラストへの制限酵素導入によりゲノム再編が誘発されると考えられる。
【０１０１】
また、等量の細胞に対して制限酵素量（ＭｓｅＩ；２．５，１２．５，１５．６２５ Ｕｎｉｔ／１０４ｃｅｌｌｓ）を増加させたときの、ＢＲＣＡ１の発現量も併せて評価した。結果を図６に示す。図６に示すように、ＢＲＣＡ１の発現量は顕著に増大した。この結果から、酵素量を調節することにより、引き起こしたいゲノム再編の程度をコントロールできることがわかった。
【実施例４】
【０１０２】
（プロトプラストから植物体への再分化）
プロトプラストから植物体への再分化には複数のステップがある。まず、プロトプラストを増殖させたのちにシュートの分化を誘導し次に根の分化を誘導することで植物体を得る。種子繁殖の植物においては、さらに土に植え替えることで後代種子を得ることができる（Characterization of the early events leading to totipotency in an Arabidopsis protoplast liquid culture by temporal transcript profiling. The Plant Cell; 2013; 25(7), 2444-2463.Chupeau, M. C., Granier, F., Pichon, O., Renou, J. P., Gaudin, V., & Chupeau, Y.）。具体的には、たとえば下記の方法を用いることで植物体を取得できる（ DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology, 2015 ; 33, 1162-1164.
Woo, J. W., Kim, J., Kwon, S. I., Corvalan, C., Cho, S. W., Kim, H., Kim S. G., Kim, S. T., Choe, S., & Kim, J. S）。
【０１０３】
制限酵素を導入したプロトプラストを0.5×B5液体培地（0.5× B5混合塩、375 mg/l CaCl2・2H2O, 18.35 mg/l NaFe-EDTA, 270 mg/l sodium succinate, 103 g/l sucrose, 0.2 mg/l 2,4−dichlo−rophenoxyacetic acid (2,4-D), 0.3 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP) and 0.1 g/l MES）に懸濁し、終濃度１．２％となるように低融点アガロースと混合した後、６ウェルプレートに展開した。固化したアガロース培地上に0.5×B5液体培地を重ね、２２℃暗闇にて７日間静置した。適宜液体培地を交換しながら、明条件（明１６時間／暗８時間）にて直径数ミリのマイクロカルスが形成されるまで培養した。
【０１０４】
次にマイクロカルスをＭＳ再分化培地（MS 混合塩、30 g/l sucrose, 0.6% plant agar, 0.1 mg/l α-naphthalaneacetic acid (NAA), 0.5 mg/l BAP）に移しシュートが形成されてくるまで培養を続けた。次に、ホルモンフリー0.5×MS培地（0.5×MS 混合塩、30 g/l sucrose）で根の分化を誘導した後に、土に移し替え、種子を形成させ後代種子を取得した。
【実施例５】
【０１０５】
（ゲノム再編個体の検出）
再分化させて得られた植物体において、次世代シーケンサー解析により大規模ゲノム再編箇所の配列を塩基レベルで高解像度に特定した。本方法により誘発された大規模再編箇所の配列には、制限酵素の認識配列が含まれることがわかった。図７に示すように、例えば、認識配列がTTAAであるMseIを導入したとき、TTAAをまたぐ領域での再編が生じていることがわかった。一方、図８に示すように、例えば、認識配列がGCGCであるHinP1Iを導入したとき、GCGCをまたぐ領域での再編が生じていることもわかった。また、再編染色体のペアとしては同一染色体間のほか、異染色体間どちらの場合もあることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号１〜４：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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