(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料溶解液から直接核酸増幅する方法において、安定した遺伝子解析を可能とする生体試料溶解液中の核酸増幅阻害物質の影響を軽減する方法の提供。【解決手段】生体試料溶解液から直接核酸増幅する方法であって、かつ、生体試料溶解液にゼラチンを好ましくは０．０１％より高い濃度で共存させる方法。核酸増幅方法がＰＣＲ法又はＲＴ-ＰＣＲ法である生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料溶解液中に、ゼラチンを共存させることを特徴とする生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
【請求項２】
ゼラチンを０．０１％より高い濃度で共存させることを特徴とする請求項１に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
【請求項３】
核酸増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法である請求項１または２に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
【請求項４】
ＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲである請求項３に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
【請求項５】
核酸増幅に１ステップＲＴ−リアルタイムＰＣＲ試薬を用いる請求項４に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料溶解液から、直接核酸増幅を行う際の核酸増幅を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学分野の進歩により、細胞や組織等の生体試料からＤＮＡやＲＮＡといった核酸を抽出し、遺伝子解析を行うことが容易になった。
遺伝子解析法は現在までに様々な方法が開発されており、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）法などの核酸増幅法が比較的一般に普及している。ＰＣＲでは、近年、測定感度の高さや迅速性から、増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングすることが可能なリアルタイムＰＣＲ（以下「ｑＰＣＲ」と略す）が広く実施される。
【０００３】
核酸増幅法において、生体試料に由来するタンパク質等の物質が核酸増幅を阻害することから、一般的に生体試料から抽出・精製された核酸が用いられる。しかし、生体試料から核酸を抽出・精製する作業は煩雑で時間を要するため、ＨＴＳ(Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ)など、大量サンプルの遺伝子解析を行う場合、抽出・精製作業を省略する方法が知られている(特許文献１および２)。
【０００４】
特許文献１では、カオトロピック剤を含む生体試料処理液を用いることで、抽出精製することなく、ＲＴ−ＰＣＲを行う方法が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、ジメチルスルホキシドおよび界面活性剤を含有するｐＨ２．５〜５．０の水溶液からなる生体試料処理液を用いることで阻害物質の影響を低減させて標的核酸を増幅する方法が記載されている。
【０００６】
しかし、上述の方法では、いずれにおいても、阻害物質の影響低減が不十分な場合や、ＲＮＡを検出する際に必要なゲノム除去処理の妨げとなる場合があり、阻害物質の影響を軽減する新規な方法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５３６７０７８号公報
【特許文献２】特許第４７１９４５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、培養細胞や組織等の生体試料に由来する核酸成分を抽出精製することなく直接核酸増幅を行う方法において、核酸増幅時の阻害物質の影響を低減することができる生体試料処理液およびこの生体試料処理液を用いた核酸増幅方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ゼラチンを生体試料溶解液に共存させることで、核酸増幅時の阻害を低減させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．生体試料溶解液中に、ゼラチンを共存させることを特徴とする生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
項２．ゼラチンを０．０１％より高い濃度で共存させることを特徴とする項１に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
項３．核酸増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法である項１または２に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
項４．ＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲである項３に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
項５．核酸増幅に１ステップＲＴ−リアルタイムＰＣＲ試薬を用いる項４に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、生体試料溶解液から直接核酸増幅する方法において、検出手順などの条件を変えることや、特殊な前処理を行うことなく、極めて簡単に核酸増幅阻害物質の影響を軽減し、安定した核酸増幅が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１における、ｑＰＣＲの増幅曲線を示した図（ゼラチンの含有の有無における対比）である。
【図２】実施例１における、ｑＰＣＲの増幅曲線を示した図（ゼラチン濃度における対比）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、生体試料溶解液からの直接核酸増幅法であって、生体試料溶解液にゼラチンを共存させる方法である。
【００１４】
（標的核酸）
本発明において、標的となる核酸は特に限定されず、後述する生体試料由来のＲＮＡやＤＮＡが挙げられる。
【００１５】
（核酸増幅法）
本発明における「核酸増幅法」は、核酸を増幅する方法であれば特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ-ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が挙げられる。ＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法が、ｑＰＣＲであることがより好ましい。また、ＲＴ-ＰＣＲ法の場合は、１ステップＲＴ-ＰＣＲ法であることが特に好ましい。更には、これに限らず、例えば、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）法なども挙げることができる。
【００１６】
（生体試料）
本発明において、生体試料とは、生物に由来する試料であれば特に限定されないが、例えばヒトや動物から採取した組織や培養した細胞、血液などの体液などが挙げられる。また、植物や微生物等に由来する試料も挙げられる。
【００１７】
（生体試料溶解液）
生体試料と生体試料処理液を混合して得られる生体試料溶解液が核酸増幅の鋳型となる核酸を含有する。生体試料溶解液は、核酸増幅反応液と混合して核酸増幅に使用される。ここで、生体試料処理液とは、細胞を溶解する液であり、溶解するために含有しうる成分としては水、界面活性剤、カオトロピック塩、あるいは有機溶媒などが挙げられる。生体試料と生体試料処理液とを混合する際の条件としては、例えば、４℃から３０℃の温度で、１から６０分間処理することが好ましい。
【００１８】
（直接核酸増幅方法）
本発明における「直接核酸増幅方法」とは、生体試料溶解液から標的核酸を抽出精製することなく核酸を増幅する方法であれば、特に限定されない。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合は、核酸増幅反応液と生体試料溶解液を混合すればよい。標的核酸がＲＮＡである場合は、核酸増幅反応の前に、逆転写反応試薬と生体試料溶解液を混合して作成したｃＤＮＡを核酸増幅反応液と混合してもよいし、逆転写試薬を含有する核酸増幅反応液と生体試料溶解液を混合してもよい。逆転写試薬を含有する核酸増幅反応液としては、例えば１ステップＲＴ−ＰＣＲ試薬が挙げられる。
【００１９】
（核酸増幅反応液）
本発明における「核酸増幅反応液」は、核酸増幅反応を実行するのに必要な成分（物質）が揃っていれば、特に限定されない。一般に、核酸のハイブリダイゼーションに必要な金属イオンを含んでいることが好ましい。核酸増幅法がｑＰＣＲである場合は、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸等の基質を含んでおり、さらに金属イオンも含んでいればより好ましい。
【００２０】
（阻害物質）
本発明において「阻害物質」とは、核酸増幅反応を阻害する物質全般をいうものであり、例えば、生体試料や生体試料処理液に含まれるプロテアーゼ等のタンパク質、脂質等が挙げられる。生体試料溶解液が阻害物質を含有すると核酸増幅反応は阻害される。
【００２１】
（本発明の効果）
本発明においては、生体試料溶解液から直接核酸増幅を行う場合において、生体試料溶解液にゼラチンを共存させることにより、核酸増幅反応における阻害物質の影響を軽減することができることを特徴とする。
【００２２】
（増幅の改善）
本発明において「増幅の改善」の程度は、ｑＰＣＲでのＣｔ値を比較することで定量的に確認することができる。また、本発明における「増幅の改善」とは、検出できなかったＣｔ値が検出できるようになるか、あるいはＣｔ値が小さくなった場合を言う。
【００２３】
本発明者らは、上述の通り、ＰＣＲ法を例にとって検討を行い、生体試料溶解液にゼラチンを共存させることで、阻害物質の影響を軽減できることを見出した。
【００２４】
（生体試料溶解液にゼラチンを共存させる方法）
本発明において、生体試料溶解液にゼラチンを共存させる方法は特に限定されない。
例えば、ゼラチンを、生体試料処理液にあらかじめ加えておいても良いし、あるいは生体試料と共に生体試料処理液に加えても良い。あるいは、生体試料を含む生体試料溶解液に加えてもよい。また、生体試料処理液が、例えば、核酸検出キット等の形態の場合において、反応開始前にいくつかの組成に分割されていて、反応時に混合して用いるように構成されている場合は、その分割されている各組成物の少なくともいずれか１つの中に加えておけばよい。
【００２５】
本発明において、ゼラチンの生体試料溶解液中における濃度は、０．０１％より高く、１０％以下であることが好ましく、より好ましくは０．０３から０．５％であり、さらに好ましくは０．０５から０．１％である。また本発明において、ゼラチンの由来は特に限定されない。例えば豚、牛、魚の組織から抽出したものが挙げられる。
【００２６】
本発明により、簡便かつ効果的に生体試料溶解液中の阻害物質の影響を軽減することが可能になり、従来技術と比べて顕著に優れた効果を示す。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例に基づき、本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：ゼラチンによる阻害物質の影響軽減効果
生体試料処理液にゼラチンを加えることによる阻害物質の影響を軽減する効果を確認する目的で、ｑＰＣＲを用いて解析を行った。
サンプルは、Ｋ５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病由来の細胞）１０３ｃｅｌｌｓ、あるいはＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来の細胞）１０３ ｃｅｌｌｓを用いた。細胞の溶解には、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲ（東洋紡株式会社）を用いた。この際、Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに、ゼラチン（シグマ アルドリッチ株式会社）濃度が０％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．１７％、０．２％になるように調製した。その他の手順は取扱説明書に従って行った。
【００２９】
ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（東洋紡株式会社）を用いて２０μＬの反応液をそれぞれ調製した。２０μＬの反応系に、鋳型としてＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲを用いて処理した生体試料溶解液を２μＬ用いた。プライマー・プローブは、ＴｆＲ (Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ)遺伝子をターゲットとするＨｕｍａｎ ＴＦＲＣ（ＣＤ７１） (Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ) Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＶＩＣ(登録商標)／ＴＡＭＲＡ  ｐｒｏｂｅ, ｐｒｉｍｅｒ ｌｉｍｉｔｅｄ)  Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：４３１０８９２Ｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）（以下「ＴｆＲ」と略す）、あるいはＡＣＴＢ (β―ａｃｔｉｎ)遺伝子をターゲットとするＨｕｍａｎ ＡＣＴＢ（Ｂｅｔａ Ａｃｔｉｎ） Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＶＩＣ(登録商標)／ＴＡＭＲＡ  ｐｒｏｂｅ, ｐｒｉｍｅｒ ｌｉｍｉｔｅｄ)  Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：４３１０８８１Ｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）（以下「ＡＣＴＢ」と略す）を用いた。本製品は、２０倍濃度のプライマー・プローブ混合液である。反応は５０℃、１０分の逆転写反応、９５℃、１分の前反応の後、「９５℃、１５秒→６０℃、４５秒」を４０サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて行った。
【００３０】
（ゼラチンの効果）
Ｋ５６２細胞、プライマー・プローブＴｆＲを使用したｑＰＣＲにより得られた増幅曲線を、図１に示した。図中の番号は、以下に示す通りである。
１：ゼラチン０％（Ｃｔ２７．８、２７．８）
２：ゼラチン０．１７％（Ｃｔ２６．９、２７．２）
【００３１】
その結果、ゼラチン含有していないコントロールと比較して、ゼラチンを含有する場合には、Ｃｔ値の改善がみられた（図１）。
【００３２】
ＨｅＬａ細胞、プライマー・プローブＡＣＴＢを使用したｑＰＣＲにより得られた増幅曲線を、図２に示した。図中の番号は、以下に示す通りである。
１：ゼラチン０％（Ｃｔ測定不可、Ｃｔ測定不可）
２：ゼラチン０．０１％（Ｃｔ測定不可、Ｃｔ測定不可）
３：ゼラチン０．０５％（Ｃｔ２１．０、２４．９）
４：ゼラチン０．１％（Ｃｔ２４．０、２５．０）
５：ゼラチン０．１５％（Ｃｔ２５．０、２８．５）
６：ゼラチン０．２％（Ｃｔ２５．０、Ｃｔ測定不可）
【００３３】
その結果、ゼラチンを含有していないコントロールでは、Ｃｔ値が検出できなかった。一方、ゼラチンを０．０１％より高い濃度で含有した場合には、Ｃｔ値を検出することができた。特に、ゼラチンを０．１％含有した場合に、Ｃｔ値の顕著な改善がみられた。（図２）。これは、ゼラチンが生体試料溶解液中の阻害物質の影響を軽減したためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、生体試料溶解液から直接核酸増幅を行う場合において効果的に働く。これにより、プロテアーゼ等の阻害物質の影響を軽減して、安定したデータ収集を可能にする。本発明は、核酸増幅阻害物質を含有する生体試料溶解液を用いて遺伝子発現解析を行う場合に特に有用であり、研究用途のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【図１】
2018042472.tif 000002
【図２】
2018042472.tif 000003