(57)【要約】【課題】形質転換体を用いて、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを立体選択的かつ効率的に製造することを可能とする。【解決手段】Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼβサブユニットをコードする遺伝子を宿主細胞に導入した形質転換体、及びその処理物、該形質転換体の処理物の製造方法、並びに該形質転換体の処理物を用いたＬ−カルボシステインの製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）に記載のＤＮＡのうち少なくとも１つが導入された形質転換体。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の付加及びアミノ酸残基の置換のうち少なくとも１つを行ったアミノ酸配列を有し、欠失したアミノ酸残基数、付加されたアミノ酸残基数及び置換されたアミノ酸残基数の合計が１〜３０個であり、かつＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
前記導入されたＤＮＡが、以下の（４）〜（７）に記載のＤＮＡのうち少なくとも１つである、請求項１に記載の形質転換体。
（４）配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ；
（５）配列番号２に記載のヌクレオチド配列にヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの付加及びヌクレオチドの置換のうち少なくとも１つを行ったヌクレオチド配列を有し、欠失したヌクレオチドの数、付加されたヌクレオチドの数及び置換されたヌクレオチドの数の合計が１〜６０個であり、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（６）配列番号２に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（７）配列番号２に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
前記形質転換体の宿主細胞が大腸菌の細胞である、請求項１又は請求項２に記載の形質転換体。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の形質転換体の処理物の存在下でＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを生成させる工程を含む、Ｌ−カルボシステインの製造方法。
【請求項５】
前記形質転換体の処理物が、前記形質転換体を加熱処理することにより得られたものである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記形質転換体の加熱処理の温度が５５℃以上９０℃以下である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の形質転換体を処理することを含む、形質転換体の処理物の製造方法。
【請求項８】
前記処理が加熱処理である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項７又は請求項８に記載の製造方法により得られる、形質転換体の処理物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、トリプトファンシンターゼβサブユニット遺伝子が導入された形質転換体及びその処理物、該形質転換体の処理物の製造方法、並びに該形質転換体の処理物を用いたＬ−カルボシステインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルボシステインは上気道炎、急性気管支炎、気管支喘息などの疾患における去痰薬として使用されている。
Ｌ−カルボシステインを製造する方法として、モノクロロ酢酸とＬ−シスチンもしくはＬ−システインとを反応させる化学的な合成方法が知られている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、これらの製造方法は、原料のモノクロロ酢酸が有害な物質であるため、安全性の確保のための措置を要するという問題がある。
【０００３】
一方、モノクロロ酢酸を使用しない別の製造方法として、トリプトファンシンターゼの作用によりＬ−セリンとチオグリコール酸からＬ−カルボシステインを生合成する方法が報告されている。たとえば、特許文献３では、エシェリヒア・コリ（大腸菌）より精製された純粋なトリプトファンシンターゼを用いて、Ｌ−セリンとチオグリコール酸からＬ−カルボシステインを生成している。しかし、酵素を精製するには煩雑な操作が必要となり、経済的でない。このため、実用上の観点からは改善の余地がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１−１９３２４５号公報
【特許文献２】特開平７−２６７９２２号公報
【特許文献３】特開昭５８−１８７１９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、Ｌ−カルボシステインの立体選択的かつ効率的な製造が可能な、トリプトファンシンターゼβサブユニット遺伝子が導入された形質転換体及びその処理物、該形質転換体の処理物の製造方法、並びに該形質転換体の処理物を用いたＬ−カルボシステインの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示によれば、以下が提供される。
【０００７】
＜１＞  以下の（１）〜（３）に記載のＤＮＡのうち少なくとも１つが導入された形質転換体。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の付加及びアミノ酸残基の置換のうち少なくとも１つを行ったアミノ酸配列を有し、欠失したアミノ酸残基数、付加されたアミノ酸残基数及び置換されたアミノ酸残基数の合計が１〜３０個であり、かつＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００８】
＜２＞  前記導入されたＤＮＡが、以下の（４）〜（７）に記載のＤＮＡのうち少なくとも１つである、＜１＞に記載の形質転換体。
（４）配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ；
（５）配列番号２に記載のヌクレオチド配列において、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの付加及びヌクレオチドの置換のうち少なくとも１つを行ったヌクレオチド配列を有し、欠失したヌクレオチドの数、付加されたヌクレオチドの数及び置換されたヌクレオチドの数の合計が１〜６０個であり、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（６）配列番号２に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（７）配列番号２に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００９】
＜３＞  前記形質転換体の宿主細胞が大腸菌の細胞である、＜１＞又は＜２＞に記載の形質転換体。
【００１０】
＜４＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の形質転換体の処理物の存在下でＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを生成させる工程を含む、Ｌ−カルボシステインの製造方法。
【００１１】
＜５＞  前記形質転換体の処理物が、前記形質転換体を加熱処理することにより得られたものである、＜４＞に記載の製造方法。
【００１２】
＜６＞  前記形質転換体の加熱処理の温度が５５℃以上９０℃以下である、＜５＞に記載の製造方法。
【００１３】
＜７＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の形質転換体を処理することを含む、形質転換体の処理物の製造方法。
【００１４】
＜８＞  前記処理が加熱処理である＜７＞に記載の製造方法。
＜９＞  ＜７＞又は＜８＞に記載の製造方法により得られる、形質転換体の処理物。
【発明の効果】
【００１５】
本開示によれば、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを効率的かつ高光学純度で製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上述のとおり特許文献３に記載のＬ−カルボシステインの製造では、精製した酵素を用いており、酵素を精製するのに煩雑な操作が必要となっていた。これに対して、本発明者等は酵素を純粋な状態に精製しなくても、酵素を生産した微生物を用いてＬ−カルボシステインを製造することが可能かどうかについて検討を行った。その結果、本発明者等は、一般的なトリプトファンシンターゼ遺伝子で宿主細胞を形質転換して、得られた形質転換体を用いてＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとを基質にＬ−カルボシステインを製造させた場合、得られたＬ−カルボシステインの光学純度が十分には高くないことを見いだした。より具体的には、医薬品用途に用いられるＬ−カルボシステインは高光学純度が要求されるが、上記の方法で合成したＬ−カルボシステインの光学純度は満足のいくものではなかった。Ｌ体選択性は高いことが知られているトリプトファンシンターゼを用いた酵素反応であるにも関わらず、光学純度が低下した理由は、宿主細胞が元々保有する別の酵素（内性酵素）の働きによりＤ−カルボシステインが副生したためであると考えられる。このような、Ｌ−カルボシステインの生物的プロセスによる生産における、光学純度の低下は、本発明者等が初めて見いだしたものである。
【００１７】
この、光学純度の低下という問題に対して、本発明者等は、Ｄ−カルボシステインを合成する内性酵素を選択的に熱失活させ、Ｌ−カルボシステイン合成反応において光学純度を向上させることを目的に、Ｌ−カルボシステイン合成反応の前に、形質転換体を加熱により前処理することを検討した。しかしながら、実際に加熱による前処理を実施したところ、加熱による前処理により形質転換体のＤ−カルボシステイン合成活性は低下するものの、トリプトファンシンターゼが担うＬ−カルボシステイン合成活性も著しく低下し、効率的なＬ−カルボシステイン製造が困難であることが明らかとなった。
【００１８】
以上の研究により、本発明者等は、一般的なトリプトファンシンターゼ遺伝子が導入された形質転換体を用いてＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを製造しようとしても、Ｌ−カルボシステインの製造効率と立体選択性とを両立させることは困難であることを見いだした。
しかしながら、本発明者等は鋭意研究の結果、驚くべきことに、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼβサブユニットをコードする遺伝子を宿主細胞に導入した形質転換体を熱処理して形質転換体の処理物を得て、該処理物を用いてＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを生産させた場合、立体選択的かつ効率的にＬ−カルボシステインが得られることを発見した。これは、該特定のトリプトファンシンターゼβサブユニットの有する高い熱安定性及びＬ−カルボシステイン合成活性のためと考えられる。
【００１９】
以下、実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
＜形質転換体＞
本開示によれば、以下の（１）〜（３）に記載のＤＮＡのうち少なくとも１つが宿主細胞に導入された形質転換体が提供される。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の付加及びアミノ酸残基の置換のうち少なくとも１つを行ったアミノ酸配列を有し、欠失したアミノ酸残基数、付加されたアミノ酸残基数及び置換されたアミノ酸残基数の合計が１〜３０個であり、かつＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２１】
本開示によれば、また、以下の（４）〜（７）に記載のＤＮＡのうち少なくとも１つが宿主細胞に導入された形質転換体も提供される。
（４）配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ；
（５）配列番号２に記載のヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの付加及びヌクレオチドの置換のうち少なくとも１つを行ったヌクレオチド配列を有し、欠失したヌクレオチドの数、付加されたヌクレオチドの数及び置換されたヌクレオチドの数の合計が１〜６０個であり、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（６）配列番号２に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（７）配列番号２に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２２】
以下、形質転換体の詳細について説明する。
【００２３】
１．導入するＤＮＡ
形質転換体を作製するために宿主細胞に導入するＤＮＡとしては、上述の（１）〜（７）を挙げることができる。以降の説明では、導入の対象となる、（１）〜（７）のＤＮＡを本開示に係るＤＮＡともいう。なお、本開示において「導入」とは、細胞外からＤＮＡを細胞内に取り込ませることをいう。例えば、所望のＤＮＡを組み込んだベクター（例えばプラスミド）を細胞外から細胞内に取り込ませることができる。言い換えると、所望のＤＮＡを導入した細胞とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）である所望のＤＮＡを含む細胞（組換え菌）であるともいうことができる。
配列番号１はＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＹＰ＿４３０１９３）のアミノ酸配列であり、配列番号２はその遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２４】
細菌のトリプトファンシンターゼはα２β２の四量体であり、βサブユニット単独ではその活性が１／１０以下となることが知られている。一方、本開示では、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのβサブユニットが単独でも高いＬ−カルボシステイン合成活性を有し、αサブユニットを共発現させなくともＬ−カルボシステインの効率的な製造に利用可能であることを見出した。本開示に係る製造方法においては、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのβサブユニット遺伝子のみを導入することにより得られる形質転換体を用いてもよいが、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのβサブユニットとＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのαサブユニットを共発現する形質転換体を用いてもよい。
【００２５】
なお、本開示において、「Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのβサブユニット」とは、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られた配列番号１で表されるβサブユニットだけでなく、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性（本明細書中では、Ｌ−カルボシステイン合成活性ともいう）を保持する程度に改変を加えたアミノ酸配列を有するその変異体も含む概念である。また、本開示においてはＤＮＡの一方の鎖状の配列に焦点を当てて説明が行われるが、そのような説明においても、ＤＮＡ鎖は一本鎖の状態でなければならないわけではなく、その相補鎖と共に二本鎖を形成した状態で存在してよい。
【００２６】
本開示において、「トリプトファンシンターゼ」は、Ｌ−カルボシステイン合成活性を有していればよく、構成するサブユニットはβサブユニット単独であってもよく、αサブユニットとβサブユニットを含む複合体を形成していてもよい。そのような複合体は、α２β２の複合体であってもよい。
本開示における「Ｌ−カルボシステイン合成活性」とは、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する活性のことを言う。
Ｌ−カルボシステインは一般名であり、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインと呼ばれることもある。Ｌ−カルボシステインの構造を以下に示す。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
本明細書中の、ヌクレオチドの欠失、付加又は置換は、部位特異的変異導入法により実施することができる。部位特異的変異導入法については、（Nucleic Acid Res., 10, pp. 6487 (1982); Nucleic Acid Res., 13, pp. 4431 (1985); Methods in Enzymol., 100, pp. 448(1983); Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); PCR A Practical Approach IRL Press pp. 200 (1991); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &;Sons (1987-1997); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, pp. 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, pp.488 (1985)）などを参照できる。アミノ酸残基の欠失、付加又は置換は、元々のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、該欠失、付加又は置換後のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列へと、部位特異的変異導入法を用いて変更することにより、行うことができる。
【００２９】
上記（２）のＤＮＡにおいて、欠失、付加又は置換されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法により欠失、付加又は置換できる程度の数であることが好ましく、例えば１〜数十個であってもよく、１〜３０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。（２）のＤＮＡにおいては、アミノ酸残基欠失、アミノ酸残基付加及びアミノ酸残基置換のうちいずれかのみを含んでいてもよく、アミノ酸残基欠失、アミノ酸残基付加及びアミノ酸残基置換のうち２つ以上を含んでいてもよく、アミノ酸残基欠失、アミノ酸残基付加及びアミノ酸残基置換のうち全てを含んでいてもよい。なお、欠失、付加及び置換のうち２つ以上が含まれている場合は、上記のアミノ酸残基数の範囲は、欠失したアミノ酸残基数、付加されたアミノ酸残基数及び置換されたアミノ酸残基数の合計数を指す。
欠失したアミノ酸残基数は１〜３０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。付加したアミノ酸残基数は１〜３０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。置換したアミノ酸残基数は１〜３０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。
【００３０】
また、上記（３）のＤＮＡとして記載のとおり、本開示においては、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いることができる。ここで、前記配列同一性は、９５％以上であってもよく、９７％以上であってもよく、９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。
アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の配列同一性は、ＦＡＳＴＡ  ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍ（いずれもデフォールトパラメータ）などを用いて、例えば、インターネット上で求めることができる。
【００３１】
上記（１）〜（３）のＤＮＡにおいて、そのＤＮＡ配列は所望のアミノ酸配列中の各アミノ酸残基に対応するコドンを用いて求めることができる。アミノ酸残基の種類によっては、縮重により複数のコドンが対応する場合もあるが、その場合はどのコドンを用いてもよい。ただし、宿主細胞内において高効率で発現させる観点からは、宿主細胞における使用頻度がより高いコドンを用いることが好ましい。
【００３２】
（５）のＤＮＡにおいて、欠失、付加又は置換されるヌクレオチドの数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法により欠失、付加又は置換できる程度の数であることが好ましく、例えば１〜数十個であってもよく、１〜６０個であってもよく、１〜４０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。（５）のＤＮＡにおいては、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド付加及びヌクレオチド置換のうちいずれか（例えばヌクレオチド置換）のみを含んでいてもよく、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド付加及びヌクレオチド置換のうち２つ以上を含んでいてもよく、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド付加及びヌクレオチド置換のうち全てを含んでいてもよい。なお、欠失、付加及び置換のうち２つ以上が含まれている場合は、上記のヌクレオチド数の範囲は、欠失したヌクレオチド数、付加されたヌクレオチド数及び置換されたヌクレオチド数の合計数を指す。
欠失したヌクレオチドの数は１〜６０個であってもよく、１〜４０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。挿入したヌクレオチドの数は１〜６０個であってもよく、１〜４０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。置換したヌクレオチドの数は１〜６０個であってもよく、１〜４０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。欠失や挿入はフレームシフトを伴わないことが好ましい。
【００３３】
また、（６）のＤＮＡにおいて、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションとは以下のようにして行うことができる。
ハイブリダイゼーションでは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列からなるＤＮＡをプローブとして、対象とするＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した２０ヌクレオチド以上、好ましくは５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１００ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２００ヌクレオチド以上を用いることができる。配列番号２に記載のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド長を有し、全長に渡って相補的なＤＮＡをプローブとして用いることも好ましい。ハイブリダイゼーションのための条件とは、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般的に用いている条件を例示できる。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件を意味する。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中でプローブとともに５５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。ついでフィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄するなどを例示することができる。ストリンジェントな条件としては、フィルターの洗浄工程における０．１×ＳＳＣ、５０℃の条件であり、更にストリンジェントな条件としては、同工程における０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件を挙げることができる。
【００３４】
（７）のＤＮＡにおいては、配列番号２に記載のヌクレオチド配列との配列同一性は８０％以上であり、例えば８５％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、９７％以上であってもよく、９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。このような変異の中には、コドンの縮重のためにアミノ酸残基の変化をもたらさないサイレントな変異が含まれていてもよい。
【００３５】
上記の（２）、（３）及び（５）〜（７）に記載の程度の、配列上の差異が含まれている場合であっても、コードされるトリプトファンシンターゼβサブユニットはＬ−カルボシステインの立体選択的かつ効率的な製造が可能である。（２）、（３）及び（５）〜（７）のいずれかのＤＮＡにコードされるトリプトファンシンターゼβサブユニットは、０．０５ｍＭ  ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）における７０℃３０分の熱処理の後に残存するＬ−カルボシステイン合成活性が熱処理前の８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。Ｌ−カルボシステイン合成活性は、６５０ｍＭのＬ−セリン、５０ｍＭのチオグリコール酸アンモニウム及び０．０２５ｍＭのピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍＬに、酵素液０．５ｍＬを加え、４５℃で３０分間反応させ、生成したＬ−カルボシステインの量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定することで測定できる。活性は、１分間あたりのＬ−カルボシステインの生成量により評価できる。
【００３６】
（２）、（３）及び（５）〜（７）のいずれかのＤＮＡにコードされるトリプトファンシンターゼβサブユニットは、熱処理前のＬ−カルボシステイン合成活性が、同じ質量の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するβサブユニットが熱処理前に有するＬ−カルボシステイン合成活性に対して７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
【００３７】
なお、（１）〜（３）のＤＮＡにおいては、（１）〜（３）の各々に規定されたアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のうち少なくとも一方にシグナル配列を有していてもよいし有していなくてもよい。シグナル配列の長さは３〜７０アミノ酸残基であってもよく、５〜５０アミノ酸残基であってもよく、１０〜４０アミノ酸残基であってもよい。同様に、（４）〜（７）のＤＮＡにおいても、各々に規定されたヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに有していてもよい。この付加的なヌクレオチド配列の長さは９〜２１０ヌクレオチド長であってもよく、１５〜１５０ヌクレオチド長であってもよく、３０〜１２０ヌクレオチド長であってもよい。シグナル配列の例としてはＯｍｐＡシグナル配列などがある。
【００３８】
なお、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られたトリプトファンシンターゼのαサブユニットのアミノ酸配列は配列番号１０に記載のアミノ酸配列であり、その遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１１で表される配列である。Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのβサブユニットと組み合わせて用いることができるＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのαサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に限らず、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのβサブユニットと組み合わせて用いることでＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有する範囲内で、以下のような改変を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００３９】
具体的には、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのαサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の付加及びアミノ酸残基の置換のうち少なくとも１つを行ったアミノ酸配列であって、欠失したアミノ酸残基数、付加されたアミノ酸残基数及び置換されたアミノ酸残基数の合計が１〜３０個であるアミノ酸配列であってもよい。欠失、付加又は置換されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、例えば、１〜３０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのαサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸残基欠失、アミノ酸残基付加及びアミノ酸残基置換のうちいずれかのみを含んでいてもよく、アミノ酸残基欠失、アミノ酸残基付加及びアミノ酸残基置換のうち２つ以上を含んでいてもよく、アミノ酸残基欠失、アミノ酸残基付加及びアミノ酸残基置換のうち全てを含んでいてもよい。なお、欠失、付加及び置換のうち２つ以上が含まれている場合は、上記のアミノ酸残基数の範囲は、欠失したアミノ酸残基数、付加されたアミノ酸残基数及び置換されたアミノ酸残基数の合計数を指す。
【００４０】
欠失したアミノ酸残基数は１〜３０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。付加したアミノ酸残基数は１〜３０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。置換したアミノ酸残基数は１〜３０個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。
【００４１】
また、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのαサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記配列同一性は、９５％以上であってもよく、９７％以上であってもよく、９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。
【００４２】
また、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのαサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列に限定されず、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列に対して以下のような改変を加えた改変配列であってもよい。具体的には、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来トリプトファンシンターゼのαサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオドの付加及びヌクレオチドの置換のうち少なくとも１つを行ったヌクレオチド配列であって、欠失したヌクレオチドの数、付加されたヌクレオチドの数及び置換されたヌクレオチドの数の合計が１〜６０個であり、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとからＬ−カルボシステインを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であってもよく、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であってもよく、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であってもよい。ここで、欠失、付加及び置換の程度の例や好ましい範囲、ストリンジェントな条件、並びに配列同一性の程度や好ましい範囲については、上記（５）〜（７）のＤＮＡの説明において説明した事項を、配列番号２を配列番号１１と読み替えて適用できる。
【００４３】
２．導入のためのベクター
宿主細胞に導入する本開示に係るＤＮＡは、例えばベクターに組み込まれた状態で宿主細胞に導入することができる。前記宿主細胞に導入するＤＮＡを含むベクターを、以降の説明では本開示に係る組換えＤＮＡと称する。
本開示に係る組換えＤＮＡは、本開示に係るＤＮＡ（（１）〜（７）に記載のＤＮＡのうちの少なくとも１つ）をベクターに組込むことにより得ることができる。ベクターはファージベクターでもプラスミドでもよい。
クローニングする際のベクターとしては、宿主細胞内で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主細胞とする場合にはＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１などが例示することができる。また、プラスミドとしては、例えばＥｓｃｈｅｎｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主細胞とする場合には、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）等を例示することができる。
【００４４】
ベクターは、本開示に係るＤＮＡを転写させるためのプロモーターを有していてもよい。プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。更にバチルス属細菌中で発現させるためにＮｐプロモーター（特公平８−２４５８６号公報）なども用いることができる。
【００４５】
ベクターは、リボソーム結合配列を含んでいてもよい。リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８ヌクレオチド）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
転写及び翻訳を効率的に行うため、タンパク質のＮ末端は発現ベクターのコードする別のタンパク質のＮ末端部分に融合されていてもよい。
【００４６】
目的とするタンパク質の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
クローニングの際、前記のようなベクターを、挿入ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクターＤＮＡ断片を得ることができるが、必ずしも該ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。該ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば該ＤＮＡ断片の付着末端とベクターＤＮＡ断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により該ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えＤＮＡを作製する。必要に応じて、アニーリングの後、微生物等の宿主細胞に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えＤＮＡを作製することもできる。
【００４７】
本開示に係る組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）等に記載されている分子生物学、生物工学及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用することができる。例えばコンピテントセルを用いる方法や、エレクトロポレーションを用いる方法が挙げられる。
【００４８】
３．形質転換体の作製及び利用
本開示に係る形質転換体は、本開示に係るＤＮＡ又は本開示に係る組換えＤＮＡを含む形質転換体である。
形質転換体作製に使用する宿主細胞としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよい。宿主細胞は、微生物の細胞であることが好ましい。前記微生物の細胞は、真核生物（例えば酵母）の細胞であっても、原核生物の細胞であってもよい。宿主細胞の例として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の細胞が挙げられるが、特に大腸菌の細胞に限定されるものではなく、エシェリヒア属細菌の細胞、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属細菌の細胞、シュードモナス属細菌などの細菌類の細胞、サッカロミセス属、ピキア属、カンジダ属などの酵母類の細胞、アスペルギルス属などの糸状菌類の細胞などが使用できる。
【００４９】
宿主細胞に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば宿主細胞が大腸菌の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。このようにして得られた形質転換体は、培養されることにより、多量のトリプトファンシンターゼのβサブユニットを安定に生産することができる。
本開示に係るＤＮＡを保有する組換えＤＮＡは、形質転換体から取り出すことができ、他の微生物に移入させることも可能である。また、本開示に係るＤＮＡを保有する組換えＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲによりトリプトファンシンターゼのβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素等で処理した後、他のベクターＤＮＡ断片と結合させ、宿主細胞に移入することも容易に実施できる。
【００５０】
培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で、振とう培養、通気攪拌培養、連続培養又は流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
培養条件は、培地の種類、培養方法により適宜選択すればよく、宿主細胞が生育しＬ−カルボシステイン合成活性を有するタンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。
例えば、好気条件下でｐＨは６以上８以下、温度は２５℃以上４０℃以下の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養した場合、培養に必要な時間は４８時間以内である。
【００５１】
形質転換体が産生したトリプトファンシンターゼのβサブユニットは、培養物中の形質転換体を含む培養液をそのまま採取して利用することもできる。また、得られた培養物から濾過又は遠心分離などの手段により形質転換体を採取して利用することもできる。採取した形質転換体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）等のキレート剤及び又は界面活性剤を添加してトリプトファンシンターゼのβサブユニットを可溶化し、溶液として分離採取することができる。
【００５２】
＜形質転換体の処理物＞
前記形質転換体を処理することにより、形質転換体の処理物を得ることができる。形質転換体の処理方法としては、Ｌ−カルボシステイン合成活性を大幅に低減させず、かつ形質転換体の内性Ｄ−カルボシステイン合成活性を低減又は消失させることにより形質転換体によるＬ−カルボシステイン合成についての立体選択性を向上させることが可能であればどのような方法でも構わない。具体的には、加熱処理、有機溶媒処理、酸処理又はアルカリ処理などの方法を挙げることができる。また、これら２つ以上の方法を組み合わせて行うこともできる。
一実施形態では、前記処理はタンパク質変性処理である。本開示に係るＤＮＡにコードされるトリプトファンシンターゼは、立体構造が安定しているため、タンパク質変性処理を行っても活性の減少割合が内性Ｄ−カルボシステイン合成活性の減少割合よりも小さく、形質転換体によるＬ−カルボシステイン合成についての立体選択性がタンパク質変性処理により向上する。
【００５３】
加熱処理の条件としては、たとえば、１０分間〜６時間程度、攪拌しながら、５５℃〜９０℃、好ましくは６０℃〜８５℃、より好ましくは６５℃〜８０℃で保温する方法が挙げられる。加熱処理の温度は、５５℃〜９０℃でもよく、６０℃〜８５℃でもよく、６５℃〜８５℃でもよく、７０℃〜８０℃でもよい。また、加熱処理の時間は、１５分間〜２時間であってもよく、２０分間〜１時間であってもよい。加熱処理が、Ｌ−カルボシステイン合成活性が失われない範囲で行われる限りは、より高い温度及び／又はより長い時間の加熱処理によって、光学活性はより向上しうる。
また、加熱処理時に、ピリドキサールリン酸（以下、ＰＬＰと呼ぶことがある）を添加することによりトリプトファンシンターゼβサブユニットの酵素活性が更に安定化することがある。ピリドキサールリン酸の処理液中の濃度としては通常、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭである。
前記処理物の存在下で、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとを反応させることにより、Ｄ−カルボシステインの副生を抑制しながら効率よくＬ−カルボシステインを製造することができる。
【００５４】
前記処理物は、処理された形質転換体の細胞を含む培養液の形態であっても、濾過又は遠心分離などの手段により採取された処理済み形質転換体の形態であっても、機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法による形質転換体の破壊物の形態であっても、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び又は界面活性剤を添加してトリプトファンシンターゼのβサブユニットを可溶化した溶液の形態であってもよい。
【００５５】
前記処理物は、必要なＬ−カルボシステイン合成活性を有しつつも、Ｄ−カルボシステインの合成活性が抑制あるいは失活している。前記処理物は、酵素の単離プロセスを経て得られる精製トリプトファンシンターゼとは異なる。また、本開示に係るＤＮＡがコードする特定のトリプトファンシンターゼβサブユニットとは異なる、一般的なトリプトファンシンターゼを発現する細胞に対して前記処理を行った場合、Ｌ−カルボシステイン合成活性は大きく損なわれる。従って、本開示に係る処理物は、このような一般的なトリプトファンシンターゼを発現する細胞の処理物とも異なる。
【００５６】
＜Ｌ−カルボシステインの製造方法＞
前記形質転換体処理物の存在下でＬ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとを反応させることによりＬ−カルボシステインを製造することができる。
Ｌ−カルボシステインの製造は、ｐＨ６．０〜９．０、温度２０〜７０℃で振盪、もしくは攪拌条件下で行うのが好ましい。反応開始時もしくは反応途中において、反応液のｐＨを６．０〜９．０に維持するためアルカリを使用することができる。反応液に添加するアルカリとしては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物の他、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど水に溶解して、液性を塩基性とするものであればよい。なお、ｐＨは６．５〜８．５であってもよい。また、温度は２５℃〜６０℃であってもよい。
【００５７】
上記製造は、例えば、空気雰囲気下で行ってもよく、脱酸素雰囲気下で行ってもよい。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。
形質転換体処理物の使用量は、Ｌ−セリンとチオグリコール酸及びその塩のうち少なくとも１つとの反応が十分に進行すれば特に制限されないが、通常Ｌ−セリン１ｇに対して少なくても１０ｕｎｉｔ、好ましくは５０ｕｎｉｔ以上のＬ−カルボシステイン合成活性となる量を添加することが望ましい。形質転換体処理物の添加時期は、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。
【００５８】
反応液中のＬ−セリンの濃度は、１００ｍＭ以上であり、好ましくは０．５Ｍ以上２．５Ｍ以下である。Ｌ−セリンの添加時期は、反応開始時に一括添加しても、反応の進行に伴い分割して又は連続して添加してもよい。
チオグリコール酸はチオグリコール酸の塩の形態で使用することもできる。たとえば、チオグリコール酸ナトリウムもしくはチオグリコール酸アンモニウムが挙げられる。チオグリコール酸若しくはその塩の濃度は、１００ｍＭ以上であり、好ましくは０．５Ｍ以上２．５Ｍ以下である。チオグリコール酸若しくはその塩の添加時期は反応開始時に一括添加しても、反応の進行に伴い分割して又は連続して添加してもよい。
【００５９】
トリプトファンシンターゼはＰＬＰ依存性の酵素であり、反応液にはＰＬＰを添加するのが好ましい。反応液中のＰＬＰの濃度としては通常、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭである。
反応液の媒体としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒又は水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えばアセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施形態を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、Ｌ−カルボシステイン及びＤ−カルボシステインは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。定量のための分析条件及び、酵素活性の測定方法は次のとおりである。
【００６１】
（１）Ｌ−カルボシステインの光学純度の定量のための分析条件
（１） の分析は主に、Ｌ−カルボシステインの光学純度の測定を目的とする。光学純度は（１）に示す分析条件下で得られたクロマトグラムにおけるＬ−カルボシステインのピークと、Ｄ−カルボシステインのピークのピーク面積値から（Ｌ−カルボシステイン−Ｄカルボシステイン）／（Ｌ−カルボシステイン＋Ｄ−カルボシステイン）の比の値（鏡像体過剰率：ｅ．ｅ．）として算出した。
カラム；ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）  ５μｍ、４．０×１５０ｍｍ（商品名、株式会社ダイセル）
カラム温度；２５℃
ポンプ流速；０．２ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液；ＨＣｌＯ４  ａｑ．（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５（ｖ／ｖ）
ＨＣｌＯ４  ａｑ．（ｐＨ１．５）：約６０％ＨＣｌＯ４（和光純薬工業）６ｇ
をイオン交換水で１Ｌに希釈し、約７０％ＨＣｌＯ４でｐＨ１．５に調整
検出；ＵＶ２４０ｎｍ
【００６２】
（２）Ｌ−カルボシステインの定量のための分析条件
（２） の分析は主に、酵素活性又は反応収率の測定を目的とする。反応収率は、（２）に示す分析条件下で得られたクロマトグラムにおけるＬ−カルボシステインのピークのピーク面積値から算出した。具体的には既知量のＬ−カルボシステインのクロマトグラムからＬ−カルボシステイン量とピーク面積値との間の検量線を作成し、測定対象のサンプル中のＬ−カルボシステイン量を検量線を参照して求めた。反応収率（モル収率）は、測定対象のサンプル中のＬ−カルボシステインのモル数の、反応に用いたＬ−セリンのモル数に対する比の値として求めることができる。
カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３  ５μｍ、４．６×２５０ｍｍ（商品名、ジーエルサイエンス株式会社）
カラム温度；５０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液；３ｍｍｏｌ／ｌヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ２．０５、リン酸にて調整）：アセトニトリル＝１００：１（ｖ／ｖ）
検出；ＵＶ２４０ｎｍ
【００６３】
（３）Ｌ−カルボシステイン合成活性の測定方法
６５０ｍＭのＬ−セリン、５０ｍＭのチオグリコール酸アンモニウム及び０．０２５ｍＭのピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍＬに、菌体懸濁液もしくは菌体処理液を適度に希釈し超音波破砕した酵素液を０．５ｍＬ加え、４５℃で３０分間反応させた。
生成したＬ−カルボシステインの量を上記（２）の分析条件に従ってＨＰＬＣにて測定し、Ｌ−カルボシステイン合成活性を測定した。活性の単位としては、１分間に１μｍｏｌのＬ−カルボシステインを生成する活性を１ｕｎｉｔとした。
【００６４】
（比較例１）
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット及びαサブユニットをコードする遺伝子の取得）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。３０℃で一夜培養した後、集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じた染色体ＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００６５】
ＰＣＲ用のプライマーには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５から得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ｂ１２６１）及びαサブユニット遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ｂ１２６０）に基づいて設計した配列番号３及び４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマーは、５’末端付近にそれぞれＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を有する。
前記染色体ＤＮＡ５ｎｇ／μｌ及びプライマー各５μＭを含むＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、２分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００６６】
ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ライゲーション・ハイ（商品名；東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。前記形質転換処理後の大腸菌を、アンピシリン（Ａｍ）１００μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出した。プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を通常のヌクレオチド配列の決定法に従い確認した。配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット遺伝子及びαサブユニット遺伝子を含む発現プラスミドをｐＥｃＴｒｐＢＡと命名した。本発現プラスミドにはプロモーターの下流にβサブユニット遺伝子、αサブユニット遺伝子の順でＤＮＡ断片が挿入されていた。
【００６７】
（形質転換体の作製）
ｐＥｃＴｒｐＢＡを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＤＨ／ｐＥｃＴｒｐＢＡと命名した。
形質転換体を２Ｌのバッフル付き三角フラスコにＡｍ１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍＬに接種し、３０℃にてＯＤ６６０が０．５になるまで培養し、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）をその濃度が１ｍＭとなるように添加し、更に１６時間振盪培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた菌体を５ｍＬの０．０５ｍＭ  ＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、菌体懸濁液を得た。該菌体懸濁液の必要量に応じて、培養するフラスコの数を増やした。
【００６８】
（比較例２）
（形質転換体の熱処理）
比較例１で得られた形質転換体の懸濁液を、表１に示す温度で３０分間保温することで熱処理を行った。
前記熱処理後の菌体懸濁液を用いて、Ｌ−カルボシステイン合成活性を測定した。熱処理を行っていない菌体懸濁液のＬ−カルボシステイン合成活性に対する熱処理後の菌体懸濁液のＬ−カルボシステイン合成活性の比をパーセントで表した値である酵素活性残存率を表１に示す。熱処理後の菌体懸濁液のことを、以後、菌体処理液ともいう。
【００６９】
【表１】
2018102282.tif 000003
【００７０】
表１に示された結果から、比較例１で得られた形質転換体ＤＨ／ｐＥｃＴｒｐＢＡは熱処理によって大幅にＬ−カルボシステイン合成活性を失うことが分かる。
【００７１】
（比較例３）
（ＤＨ／ｐＥｃＴｒｐＢＡを用いたＬ−カルボシステインの合成反応）
水２５ｇにＬ−セリン６．６５ｇ、チオグリコール酸ナトリウム７．６ｇ、ピリドキサールリン酸一水和物５．２５ｍｇを加え溶解させ、４０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．４５に調整したのち、水で４０ｇにメスアップして基質溶液を得た。該基質溶液に比較例１で得た菌体懸濁液もしくは比較例２で得た菌体処理液を１０ｇ添加し反応を開始した。添加した菌体懸濁液もしくは菌体処理液を表２に示す。反応液を攪拌し、１０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．４５に制御しながら、５５℃にて２４時間反応を行った。結果を表２にまとめて示した。
【００７２】
反応収率は添加したＬ−セリンに対する、生成したＬ−カルボシステインのモル収率で示した。
無処理の菌体懸濁液を用いた場合は、Ｌ−カルボシステインの光学純度が８４％ｅ．ｅ．と低かった。一方、菌体懸濁液に６０℃および７０℃で熱処理を施して得られた菌体処理液を用いた場合には、Ｌ−カルボシステインの光学純度は９０％以上に向上したが、反応収率は４７％以下と大幅に低下した。
【００７３】
【表２】
2018102282.tif 000004
【００７４】
（実施例１）
（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニットをコードする遺伝子の取得）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）からＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ３９０７３の染色体ＤＮＡを購入した。
【００７５】
ＰＣＲ用のプライマーには、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍｏｔｈ＿１３３７）に基づいて設計した配列番号６及び７に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマーは、５’末端付近にそれぞれＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を有する。
前記染色体ＤＮＡ５ｎｇ／μｌ及びプライマー各５μＭを含むＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、１分１２秒間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００７６】
ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ライゲーション・ハイ（商品名；東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。前記形質転換処理後の大腸菌を、アンピシリン（Ａｍ）１００μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出した。プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を通常のヌクレオチド配列の決定法に従い確認した。配列番号２に示すＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット遺伝子を含む発現プラスミドをｐＭｔＴｒｐＢと命名した。
【００７７】
（形質転換体の作製）
ｐＭｔＴｒｐＢを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢと命名した。
形質転換体を２Ｌのバッフル付き三角フラスコにＡｍ１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍＬに接種し、３０℃にてＯＤ６６０が０．５になるまで培養し、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）をその濃度が１ｍＭとなるように添加し、更に１６時間振盪培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた菌体を５ｍＬの０．０５ｍＭＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、菌体懸濁液を得た。該菌体懸濁液の必要量に応じて、培養するフラスコの数を増やした。
【００７８】
（実施例２）
（形質転換体のＬ−カルボシステイン合成活性の比較）
比較例１で得られた形質転換体の懸濁液及び実施例１で得られた形質転換体の懸濁液を用いて、上記（３）Ｌ−カルボシステイン合成活性の測定方法に従ってＬ−カルボシステイン合成活性を測定した。活性値は乾燥菌体重量あたりで算出した。比較例１の形質転換体ＤＨ／ｐＥｃＴｒｐＢＡの乾燥菌体重量あたりのＬ−カルボシステイン合成活性を１００とすると、実施例１の形質転換体ＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢの乾燥菌体重量あたりのＬ−カルボシステイン合成活性は１６０であった。
【００７９】
（実施例３）
（形質転換体の熱処理）
比較例１及び実施例１で得られた形質転換体の懸濁液を、表３に示す温度で３０分間保温することで熱処理を行った。
前記の熱処理後の菌体懸濁液（菌体処理液）を用いて、Ｌ−カルボシステイン合成活性を測定した。熱処理を行っていない菌体懸濁液のＬ−カルボシステイン合成活性に対する熱処理後の菌体懸濁液（菌体処理液）のＬ−カルボシステイン合成活性の比をパーセントで表した値である酵素活性残存率を表３に示す。
【００８０】
【表３】
2018102282.tif 000005
【００８１】
表３に示された結果から、実施例１で得られた形質転換体ＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢは熱処理を経てもＬ−カルボシステイン合成活性を高い残存率で保持することが分かる。
【００８２】
（実施例４）
（ＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢを用いたＬ−カルボシステインの合成反応）
水２５ｇにＬ−セリン６．６５ｇ、チオグリコール酸ナトリウム７．６ｇ、ピリドキサールリン酸一水和物５．２５ｍｇを加え溶解させ、４０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．４５に調整したのち、水で４０ｇにメスアップして基質溶液を得た。該基質溶液に実施例１で得た菌体懸濁液もしくは実施例３で得た菌体処理液を１０ｇ添加し反応を開始した。添加した菌体懸濁液もしくは菌体処理液を表４に示す。反応液を攪拌し、１０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．４５に制御しながら、５５℃にて２４時間反応を行った。結果を表４にまとめて示した。
【００８３】
反応収率は添加したＬ−セリンに対する、生成したＬ−カルボシステインのモル収率で示した。
無処理の菌体懸濁液を用いた場合は、Ｌ−カルボシステインの光学純度が８６％ｅ．ｅ．と低かった。一方、菌体懸濁液に６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、又は８０℃で熱処理を施して得られた菌体処理液を用いた場合には、Ｌ−カルボシステインの光学純度は９３％ｅ．ｅ．以上に向上した。また、反応収率は７４％以上であった。
【００８４】
【表４】
2018102282.tif 000006
【００８５】
表４に示された結果から、実施例１で得られた形質転換体ＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢを熱処理した処理物は、酵素タンパク質の精製を経ることなく、Ｌ−カルボシステインを立体選択的にかつ効率的に合成できることが分かる。反応収率も良好であった。
【００８６】
（実施例５）
（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット及びαサブユニットをコードする遺伝子の取得）
ＰＣＲ用のプライマーには、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍｏｔｈ＿１３３７）及びαサブユニット遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍｏｔｈ＿１３３６）に基づいて設計した配列番号６及び８に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマーは、５’末端付近にそれぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００８７】
前記Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ３９０７３の染色体ＤＮＡ５ｎｇ／μｌ及びプライマー各５μＭを含むＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、１分１２秒間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００８８】
得られたＰＣＲ反応産物を用い、ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））の消化を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで行ったこと以外は、実施例１と同様の方法で、配列番号９に示すＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから得られたトリプトファンシンターゼのβサブユニット遺伝子及びαサブユニット遺伝子を含む発現プラスミドｐＭｔＴｒｐＢＡを得た。本発現プラスミドにはプロモーターの下流にβサブユニット遺伝子、αサブユニット遺伝子の順でＤＮＡ断片が挿入されていた。
【００８９】
（形質転換体の作製）
ｐＭｔＴｒｐＢＡを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢＡと命名した。
ＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢＡの菌体懸濁液を実施例１と同様の方法で調製した。
【００９０】
（実施例６）
（ＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢＡを用いたＬ−カルボシステインの合成反応）
ＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢの代わりにＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢＡを用いた以外は、実施例４と同様の方法でＬ−カルボシステインの合成反応を行った。結果を表５に示した。
反応収率は添加したＬ−セリンに対する、生成したＬ−カルボシステインのモル収率で示した。
無処理の菌体懸濁液を用いた場合は、Ｌ−カルボシステインの光学純度が８４％ｅ．ｅ．と低かった。一方、菌体懸濁液に６０℃、７０℃又は７５℃で熱処理を施して得られた菌体処理液を用いた場合には、Ｌ−カルボシステインの光学純度は９１％ｅ．ｅ．以上に向上した。また、反応収率は８６％以上であった。
【００９１】
【表５】
2018102282.tif 000007
【００９２】
表５に示された結果から、実施例５で得られた形質転換体ＤＨ／ｐＭｔＴｒｐＢＡを熱処理した処理物は、酵素タンパク質の精製を経ることなく、Ｌ−カルボシステインを立体選択的にかつ効率的に合成できることが分かる。反応収率も良好であった。
【配列表】
2018102282000001.app