(57)【要約】      （修正有）【課題】安全性の点で問題のない軟骨形成促進用組成物、並びに、前記物質を配合した軟骨形成促進用サプリメント、飲食品及び軟骨形成促進用化粧料の提供。【解決手段】Ｅ-カドヘリン及び／又はＥ-カドヘリンをペプシンやパンクレアチン等のタンパク質分解酵素で分解して得られるＥ-カドヘリン分解物を有効成分して含有する軟骨形成促進用組成物、軟骨形成促進用サプリメント、飲食品及び軟骨形成促進用化粧料。好ましくは、前記Ｅ−カドヘリン及び／又はＥ−カドヘリン分解物を１日当たり、１０．０μｇ以上経口摂取するか又は０．０５〜０．５重量％配合した組成物を塗布する、関節痛の改善方法。【効果】前記Ｅ-カドヘリン及び／又はＥ-カドヘリン分解物には、軟骨形成を促進させる働きがある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ−カドヘリン及び／又はＥ−カドヘリン分解物を有効成分とする軟骨形成生促進用組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のＥ−カドヘリン及び／又はＥ−カドヘリン分解物を配合した軟骨形成促進用サプリメント。
【請求項３】
請求項１に記載のＥ−カドヘリン及び／又はＥ−カドヘリン分解物を配合した軟骨形成促進用飲食品。
【請求項４】
請求項１に記載のＥ−カドヘリン及び／又はＥ−カドヘリン分解物を配合した軟骨形成促進用化粧料。
【請求項５】
Ｅ−カドヘリン及び／又はＥ−カドヘリン分解物を１日あたり１０．０μｇ以上経口摂取するか、又は０．０５〜０．５重量％配合した組成物を塗布することによる関節痛の改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節機能低下等を防止するのに有用な軟骨形成促進用組成物、軟骨形成促進用サプリメント、飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（Osteoarthritis、ＯＡ）は骨粗鬆症と並び高齢者の日常生活動作(ＡＤＬ)や生活の質(ＱＯＬ)を低下させることから、根治的な治療方法の確立が望まれている。関節軟骨組織は、軟骨細胞が産生するコラーゲンやヒアルロン酸、プロテオグリカンから構成され、網目構造を取るコラーゲン繊維間にプロテオグリカンやヒアルロン酸が存在することで、多量の水分を保持している。つまり、関節軟骨は、コラーゲンならびにプロテオグリカンによりそのクッション性を保持している。
【０００３】
関節周囲の血行が悪くなり酸素の供給が低下すると、軟骨細胞によるプロテオグリカンなどの産生が低下することや、死滅した軟骨細胞が滑膜を刺激、炎症を起こし、関節に痛みが生じることとなる。さらに、炎症時のサイトカインの放出により、さらに軟骨細胞死を誘導し、痛みの症状が激化する。このため、ＯＡの対症療法としては、痛み止めや抗炎症製剤の投与、高分子ヒアルロン酸(ヒアルロン酸ナトリウム)の関節腔内への注入等があげられ、また、対症療法以外の方法としては、近年、軟骨細胞の分化促進または軟骨細胞の肥大化の抑制、軟骨細胞によるコラーゲン、プロテオグリカンの転写、合成促進などのアプローチが取られ始めている。
【０００４】
軟骨形成においては、Ｓｏｘ９という転写因子の機能が重要であることが知られており、Ｓｏｘ９遺伝子を欠失させた遺伝子改変マウスの解析から、Ｓｏｘ９が軟骨形成のあらゆる段階で必須であることが示されていることから、軟骨形成促進に関しては、Ｓｏｘ９の活性促進が重要であると考えられている（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００５】
２００９年のＲＯＡＤプロジェクト調査結果によると、日本の患者数は、膝については２５００万人、腰椎については３８００万人と報告されており、その男女の内訳は、膝は男性８６０万人、女性１６７０万人、腰椎は男性１８９０万人、女性１９００万人であるが、この数は年々増加している。  
そのような背景から、ＯＡの予防や治療等に関する発明が開示されている。特許文献１には乳由来塩基性タンパク質を含む軟骨形成促進剤が開示されている。特許文献２には変形性関節症を治療するためのＰＥＤＦ-由来のポリペプチドの使用が開示されている。特許文献３には軟骨細胞とＴＧＦ-βを用いた軟骨再生が開示されているが、軟骨形成を促進する新たな食品等が依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１３／１６４９９２号
【特許文献２】特表２０１５-５３０３９２号公報
【特許文献３】特表２００５−５１９６９８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Haruhiko Akiyama, Chaboissier MC, Martin JF, Schedl A, de Crombrugghe B: The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16(21), 2813-28, 2002.
【非特許文献２】Haruhiko Akiyama, H. Scott Stadler, James F. Martin, Takahiro M. Ishii, Philip A. Beachy , Takashi Nakamura , and Benoit de Crombrugghe. Misexpression of Sox9 in mouse limb bud mesenchyme induces polydactyly and rescues hypodactyly mice. Matrix Biology, 26, 224-233, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、これまでにない軟骨形成促進用組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、そのような物質を配合した軟骨形成促進用飲食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の態様を含むものである。
（１）Ｅ-カドヘリン及び／又はＥ-カドヘリン分解物を有効成分とする軟骨形成促進用組成物。
（２）前記Ｅ-カドヘリン分解物が、Ｅ-カドヘリンをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする（１）記載の軟骨形成促進用組成物。
（３）前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする（２）記載の軟骨形成促進用組成物。（４）前記Ｅ-カドヘリン分解物が、分子量５００以上、８０００以下であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の軟骨形成促進用組成物。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のＥ-カドヘリン及び／またはＥ-カドヘリン分解物を配合した軟骨形生促進用飲食品。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、Ｅ-カドヘリン及び／またはＥ-カドヘリン分解物を有効成分とする軟骨形生産促進剤、及び軟骨形生促進用飲食品が提供される。本発明の軟骨形生産促進剤、及び軟骨形生促進用飲食品は、軟骨形成を促進させる作用を有し、関節炎や関節機能障害の予防や治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は軟骨細胞分化制御因子であるＳｏｘ９のｍＲＮＡの発現へ及ぼすＥ-カドヘリンが濃度変化の影響を示す。
【図２】図２は軟骨細胞分化制御因子であるＳｏｘ９のｍＲＮＡの発現へ及ぼすＥ-カドヘリンの作用時間変化の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、上述の課題を解決するために、広く食品素材に含まれている軟骨形成促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めたところ、１２０ｋＤａの膜貫通型の細胞接着分子であるＥ-カドヘリンあるいはそのＥ-カドヘリンを分解して得られるＥ-カドヘリン分解物が、軟骨細胞分化制御因子であるＳｏｘ９のｍＲＮＡの発現を促進することにより軟骨形成を促進させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明の軟骨形成促進用組成物の特徴は、Ｅ-カドヘリン及び／またはＥ-カドヘリン分解物を有効成分とすることにある。本発明のＥ-カドヘリンはどのような由来のものであっても使用可能である。たとえば、ヒト及びウシ由来のＥ-カドヘリンはすでにその遺伝子配列が明らかになっており、遺伝子組換えによる生産が可能であるが、本発明では、遺伝子工学的手法により生産されたＥ-カドヘリンも使用可能であり、細胞培養の培養液から回収した細胞由来のものも使用可能である。また、Ｅ-カドヘリンはウシ初乳中に含有
されており、乳から回収したものであっても良く、生乳や粉乳、脱脂乳、還元乳等から、加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマト処理、限外濾過処理等によって取得することも可能である。 さらに、Ｅ-カドヘリン分解物はＥ-カドヘリンと同様のアミノ酸組成を有しており、Ｅ-カドヘリンをタンパク質分解酵素で処理して分子量５００以上、８０００以下として得ることができる。タンパク質分解酵素としては、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼをあげることが出来る。また、これらタンパク質分解酵素を１種以上使用してもよい。
【００１４】
本発明の軟骨形成促進用組成物は、経口投与あるいは塗布することにより、軟骨形成促進効果を発揮する。本発明の軟骨形成促進用組成物を経口投与するに際しては、有効成分であるＥ-カドヘリンをそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。
【００１５】
本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化することが可能である。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用してもよい。
【００１６】
結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられ、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。また、界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
【００１７】
さらには、これらのＥ-カドヘリンをそのままあるいは製剤化した後、これをサプリメント、栄養剤や飲食品等に配合することも可能である。なお、Ｅ-カドヘリンは、比較的熱に対して安定であるので、Ｅ-カドヘリンを含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。
【００１８】
本発明の軟骨形成促進用組成物を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明の軟骨形成促進用組成物をワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、軟骨形成促進用化粧料や医薬品を製造することができる。
【００１９】
本発明の軟骨形成促進用組成物の投与による有効量は、成人一人当たり一日１０μｇ以上である。この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与すれば良い。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。
【００２０】
本発明の軟骨形成促進用組成物の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１〜２重量％となるように、Ｅ-カドヘリンを配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。
【００２１】
（評価方法）
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｃ社より購入したＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  を試料Ａとし、軟骨細胞分化制御因子であるＳｏｘ９のｍＲＮＡ発現へ及ぼす影響について、マウスＥＣ由来間葉系細胞であるＡＴＤＣ５を用いた細胞実験及びリアルタイムＰＣＲ法を用いて確認した。
【実施例】
【００２２】
（実施例品１）
Ｓセファロース３,０００ｇを充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄し、脱脂乳１０,０００Ｌを通液して、脱イオン水で充分洗浄した後、０．１〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。その後、Ｅ−カドヘリンを含む溶出画分を再度フェニルＳセファロース疎水性カラムクロマトグラフィーで分画した。さらに、この画分をＨＰＬＣシステムにてＣ４およびＣ８逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーで順次処理し、Ｅ−カドヘリン２５００ｍｇを得た。なお、このようにして得られたＥ−カドヘリンは、そのまま軟骨形成促進剤として使用可能である。
【００２３】
［試験例１］
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｃ社より購入したＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  を試料Ａとし、軟骨細胞分化制御因子であるＳｏｘ９のｍＲＮＡ発現へ及ぼすＣＤＨ１の濃度変化の影響について、マウスＥＣ由来間葉系細胞であるＡＴＤＣ５を用いた細胞実験及びリアルタイムＰＣＲ法を用いて確認した。
具体的には、ＡＴＤＣ５細胞を２４穴プレートに０．５×１０５cells/wellになる様に播種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（シグマ社製）にて３７℃、５％ＣＯ２環境下にて７日間培養した。７日間の培養期間のうち最終の４時間について、ＣＤＨ１をそれぞれ１０ｎＭ、５０ｎＭ、1００ｎＭになるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に溶解したものを細胞に添加した後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収しｃＤＮＡを合成した。
培養した細胞にＲＮＡ抽出剤であるＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン社製)を０．５ｍｌ添加し５分間静置した後、ピペッティングにて可溶化させた細胞液を１．５ｍｌ容チューブに回収した。細胞液に０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、十分に攪拌した後、二層に分離した上層(水層)を新たな１．５ｍｌ容チューブに回収した。回収液に０．２５ｍｌの２−プロピルアルコールを添加し、１０分間静置後、１５,０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿物を得た。得られた沈殿物は、７０％エタノールにて洗浄した後、ＤＥＰＣ水に溶解しＲＮＡ液とした。１μg分のＲＮＡから商品名「Takara PrimeScriptTM RT reagent Kit」を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、SYBR Green (Takara SYBR Prime Ex Taq II)を使用したリアルタイムＰＣＲを行った。反応条件は、９５℃、３０秒の初期変性後、９５℃、５秒の変性、５７℃、１５秒のアニーリング、７２℃、２０秒の伸張であり、合計４０サイクル反応させた。プライマーは表１に記載のＳｏｘ９遺伝子発現確認用プライマーを使用した。結果を図１に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
図１に示すように、ＣＤＨ１をＡＴＤＣ５細胞に添加した時に、遺伝子のＳｏｘ９発現量は、ＣＤＨ１の濃度に依存して有意に亢進した。また、カドヘリンファミリーの一つでＣＤＨ１とのアミノ酸相同性が４７％であるＣＤＨ２（Ｎ−カドヘリン）や、ラクトフェリン(ＬＦ)、ラクトパーオキシターゼ(ＬＰＯ)に比較してより高いＳｏｘ９のｍＲＮＡ発現亢進効果を有することが明らかとなった。
【００２６】
試料Ａによる軟骨分化制御因子のｍＲＮＡ発現への作用時間による影響についてリアルタイムＰＣＲ方法を用いて検討した。方法は試験例１に記載の方法に準じた。すなわち、試料Ａを２時間から４８時間までＡＴＤＣ５細胞に添加した後、ｔｏｔａｌＲＮＡを回収しｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲを行った。対照区は、ＣＤＨ１を投与せず、４時間から２４時間まで培養したＡＴＤＣ５細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを合成してリアルタイムＰＣＲを行った。結果を図２に示す。
【００２７】
図２に示すように、ＣＤＨ１によるＳｏｘ９のｍＲＮＡ発現は、ＣＤＨ１をＡＴＤＣ５細胞に作用させてから４時間で有意に上昇し、２４時間までほぼ一定に有意に亢進した。
【００２８】
（実施例１）
表２に示す配合の軟骨形成促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風味は良好で沈殿等の問題もなかった。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
（実施例２）
表３に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼して軟骨形成促進用ビスケットを製造した。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
（実施例３）
表４に示す配合の軟骨形成促進用組成物を常法により製造した。
【表４】
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【００３３】
（実施例４）
表５に示す配合の化粧水を常法により製造した。
【表５】
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【００３４】
（実施例５）
表６に示す配合のクリームを常法により製造した。
【表６】
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（実施例６）
Ｅ−カドヘリン３００ｍｇを精製水３０ｍＬに溶かした後、１Ｎ塩酸にてｐＨ２〜３に調整し、３７℃に保持してペプシンを３ｍｇ添加し、一晩反応させた。１Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨ７．３に調整し、凍結乾燥してＥ−カドヘリン分解物３００ｍｇを得た。
【００３５】
［試験例２］
変形性関節炎による軽度の痛みを有する患者２０名を対象に、実施例１の飲料を１日１回１００ｇ飲用し、１年間の臨床試験を行った。関節の疼痛および機能の評価を、疼痛に対するビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）、及び、関節炎の関節における疼痛、機能、および硬直に関するＷｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ  ａｎｄ  ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ）指標にて変形性関節症の評価を行った。結果を表７に示す。
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、関節機能低下等を防止するのに有用な軟骨形成促進用組成物、軟骨形成促進用サプリメント、飲食品及び軟骨形成促進用化粧料に関する。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月13日(2018.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018188395000001.app