(57)【要約】【課題】凍結条件及び非凍結条件のいずれの条件下でも脂質二重膜を有する小胞を安定に保存できる新たな手段を提供すること。【解決手段】脂質二重膜を有する小胞の保存安定化剤であって、両親媒性物質を含むことを特徴とする、保存安定化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重膜を有する小胞の保存安定化剤であって、
両親媒性物質を含むことを特徴とする、
保存安定化剤。
【請求項２】
前記両親媒性物質が、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤である、請求項１に記載の保存安定化剤。
【請求項３】
前記両親媒性物質が、エチレンオキサイドと炭素数３以上のアルキレンオキサイドとの共重合体、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルコールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、及び油脂のエチレンオキサイド付加物から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１又は２に記載の保存安定化剤。
【請求項４】
前記両親媒性物質が、下記式（１）で表されるトリブロック共重合体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存安定化剤。
【化１】
2018130085.tif 000005
〔式（１）中、ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２以上の整数を示す。〕
【請求項５】
前記両親媒性物質が、ポリオキシエチレン鎖を両親媒性物質１００質量部に対して合計で１５〜９９質量部含む両親媒性物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の保存安定化剤。
【請求項６】
前記小胞が、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソーム、細胞外ベシクル、微小小胞体又はアポトーシス小体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の保存安定化剤。
【請求項７】
前記小胞が、生体試料から単離された小胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の保存安定化剤。
【請求項８】
前記小胞が、免疫沈降法、アフィニティー法、分画遠心分離法、クロマトグラフィー法、密度勾配法、電気泳動法、磁気分離法、限外濾過濃縮法、パーコール勾配単離法、マイクロ流体デバイスを利用した方法及びＰＥＧ沈殿法から選ばれる１種又は２種以上により生体試料から単離された小胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の保存安定化剤。
【請求項９】
前記小胞が、２０００〜２５００００×ｇで１〜２４時間にわたる遠心分離を少なくとも１回以上行って生体試料から単離された小胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の保存安定化剤。
【請求項１０】
前記生体試料が、体液又は細胞培養上清である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の保存安定化剤。
【請求項１１】
脂質二重膜を有する小胞と両親媒性物質とを接触させることを特徴とする、
小胞の安定化又は保存方法。
【請求項１２】
前記小胞が、生体試料から単離された小胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触を、両親媒性物質の濃度が０．０００１％（ｗ／ｖ）以上０．１％（ｗ／ｖ）未満となるようにして行う、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
脂質二重膜を有する小胞を生体試料から単離するときに生体試料に添加される添加剤であって、
両親媒性物質を含むことを特徴とする、
添加剤。
【請求項１５】
脂質二重膜を有する小胞を生体試料から単離する単離工程を含み、
前記単離工程を両親媒性物質の存在下で行うことを特徴とする、
小胞の単離方法。
【請求項１６】
脂質二重膜を有する小胞の回収効率を改善させるための回収効率改善剤であって、
両親媒性物質を含むことを特徴とする、
回収効率改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保存安定化剤、安定化方法、保存方法、添加剤、単離方法、及び回収効率改善剤に関する。より詳細には、脂質二重膜を有する小胞の保存安定化剤、安定化方法、保存方法、単離方法及び回収効率改善剤、並びに脂質二重膜を有する小胞を単離するときに使用される添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液中に存在する小胞顆粒としてエクソソームが知られている。エクソソームの表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、また、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも分かってきた。また、免疫系の細胞や各種癌細胞等の種々の細胞からエクソソームが分泌されることが知られており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役としてのエクソソームの機能、エクソソームと生理現象や癌等の疾患との関連性が注目され、これについて検討が進められている。
例えば、腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭの抗体を用いた場合に、卵巣癌患者の循環血中からエクソソームが分離され、エクソソーム由来のマイクロＲＮＡ発現量と卵巣癌の進行との間に関連性があることが既に報告されており（非特許文献１）、培養上清や血清、血漿を含む体液などの生体試料からエクソソームを単離し、エクソソームに含まれるタンパク質やマイクロＲＮＡを新たなバイオマーカーとして疾患の早期診断や再発の発見に利用する試みがされている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１０−５３４４８０号公報
【特許文献２】特表２０１３−５２６８５２号公報
【特許文献３】特開２０１６−２８５８４号公報
【特許文献４】特表２０１３−５４５４６３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄ．Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１０，１３−２１（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
エクソソーム等の脂質二重膜を有する小胞を分析・診断に利用するに先立ち、採取された体液等の検体や培養上清等から小胞を単離した後に保存しておくことがある。この脂質二重膜を有する小胞の保存は凍結保存が一般的であるが、凍結により小胞がダメージを受ける場合がある。また、本発明者らが検討したところ、細胞や大腸菌を凍結保存する際に使用される凍結保存剤を、脂質二重膜を有する小胞の凍結保存に用いた場合は、その凍結保存剤がその後の測定結果に悪影響を及ぼすことが分かった。
一方、非凍結条件下では、液中の小胞の含量が減少し、分析・診断に利用できないほど微量になることがあり、この現象は、小胞が高純度に精製されたものである場合に特によく観察される。そのため、通常、小胞は非凍結条件下では保存されない。また、両親媒性物質が、脂質二重膜を有する小胞の保存安定性に如何なる影響を与えるか否かについては、これまで検討されていない。
本発明が解決しようとする課題は、凍結条件及び非凍結条件のいずれの条件下でも脂質二重膜を有する小胞を安定に保存できる新たな手段を提供することにある。
【０００６】
また、脂質二重膜を有する小胞の生体試料からの単離は、超遠心法等を利用して行われているが（特許文献４）、小胞の回収効率に改善の余地があった。したがって、本発明は、脂質二重膜を有する小胞の回収効率を改善する新たな手段の提供にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、脂質二重膜を有する小胞に両親媒性物質を接触させて保存することによって、凍結条件及び非凍結条件のいずれの条件下でも小胞を安定に保存できることを見出した。
また、脂質二重膜を有する小胞を両親媒性物質の存在下で生体試料から単離することによって、小胞の回収効率が改善することを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜１６＞を提供するものである。
＜１＞  脂質二重膜を有する小胞の保存安定化剤であって、両親媒性物質を含むことを特徴とする、保存安定化剤。
＜２＞  前記両親媒性物質が、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤である、＜１＞に記載の保存安定化剤。
＜３＞  前記両親媒性物質が、エチレンオキサイドと炭素数３以上のアルキレンオキサイドとの共重合体、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルコールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、及び油脂のエチレンオキサイド付加物から選ばれる１種又は２種以上である、＜１＞又は＜２＞に記載の保存安定化剤。
＜４＞  前記両親媒性物質が、下記式（１）で表されるトリブロック共重合体である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の保存安定化剤。
【０００９】
【化１】
2018130085.tif 000002
【００１０】
〔式（１）中、ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２以上の整数を示す。〕
【００１１】
＜５＞  前記両親媒性物質が、ポリオキシエチレン鎖を両親媒性物質１００質量部に対して合計で１５〜９９質量部含む両親媒性物質である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の保存安定化剤。
＜６＞  前記小胞が、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソーム、細胞外ベシクル、微小小胞体又はアポトーシス小体である、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の保存安定化剤。
＜７＞  前記小胞が、生体試料から単離された小胞である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の保存安定化剤。
＜８＞  前記小胞が、免疫沈降法、アフィニティー法、分画遠心分離法、クロマトグラフィー法、密度勾配法、電気泳動法、磁気分離法、限外濾過濃縮法、パーコール勾配単離法、マイクロ流体デバイスを利用した方法及びＰＥＧ沈殿法から選ばれる１種又は２種以上により生体試料から単離された小胞である、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の保存安定化剤。
＜９＞  前記小胞が、２０００〜２５００００×ｇで１〜２４時間にわたる遠心分離を少なくとも１回以上行って生体試料から単離された小胞である、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の保存安定化剤。
＜１０＞  前記生体試料が、体液又は細胞培養上清である、＜７＞〜＜９＞のいずれかに記載の保存安定化剤。
【００１２】
＜１１＞  脂質二重膜を有する小胞と両親媒性物質とを接触させることを特徴とする、小胞の安定化又は保存方法。
＜１２＞  前記小胞が、生体試料から単離された小胞である、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞  前記接触を、両親媒性物質の濃度が０．０００１％（ｗ／ｖ）以上０．１％（ｗ／ｖ）未満となるようにして行う、＜１１＞又は＜１２＞に記載の方法。
【００１３】
＜１４＞  脂質二重膜を有する小胞を生体試料から単離するときに生体試料に添加される添加剤であって、両親媒性物質を含むことを特徴とする、添加剤。
【００１４】
＜１５＞  脂質二重膜を有する小胞を生体試料から単離する単離工程を含み、前記単離工程を両親媒性物質の存在下で行うことを特徴とする、小胞の単離方法。
【００１５】
＜１６＞  脂質二重膜を有する小胞の回収効率を改善させるための回収効率改善剤であって、両親媒性物質を含むことを特徴とする、回収効率改善剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の保存安定化剤、安定化方法及び保存方法により、凍結条件及び非凍結条件のいずれの条件下でも脂質二重膜を有する小胞を安定に保存できる。
また、本発明の添加剤、単離方法及び回収効率改善剤により、脂質二重膜を有する小胞の回収効率を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】凍結融解１回後及び２回後のエクソソーム活性維持率を示す図である。
【図２】４℃保存時のエクソソーム活性維持率の経時的変化を示す図である。
【図３】エクソソーム回収効率の対比結果を示す図である。
【図４】エクソソーム回収効率の対比結果を示す図である。
【図５】ナノトラッキング法による評価結果を示す図である。
【図６】銀染色による評価結果を示す図である。
【図７】ウェスタンブロッティング法による評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜保存安定化剤、安定化方法及び保存方法＞
本発明の保存安定化剤は、脂質二重膜を有する小胞の保存安定化剤であって、両親媒性物質を含むことを特徴とするものである。
本発明の安定化方法及び保存方法は、脂質二重膜を有する小胞と両親媒性物質とを接触させることを特徴とするものである。
以下、本発明の保存安定化剤、安定化方法及び保存方法を「本発明の保存安定化剤等」と称する。
【００１９】
（両親媒性物質）
本発明に用いる両親媒性物質としては、保存安定化作用に優れ、小胞へのダメージが少ない点で、非イオン性界面活性剤が好ましく、芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤がより好ましい。このような芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤を使用することで、エクソソーム等の小胞を構成する脂質二重膜の破壊を招くことなく、小胞を保存できる。さらに、単離された小胞のプロテオーム解析等への影響を抑えることもできる。
【００２０】
また、非イオン性界面活性剤としては、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤、多価アルコール型非イオン性界面活性剤が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。この中では、保存安定化作用に優れ、小胞へのダメージが少ない点で、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００２１】
上記多価アルコール型非イオン性界面活性剤としては、グリセリン、ペンタエリスリトール、ソルビトール、ソルビタン、ショ糖等の多価アルコールに疎水性基を付加した非イオン性界面活性剤が挙げられる。また、疎水性基として脂肪酸残基を有するものが好ましい。また、上記脂肪酸残基における「脂肪酸」は、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸のいずれでもよい。また、脂肪酸は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好ましくは直鎖状である。また、脂肪酸の炭素数は、好ましくは８〜３０、より好ましくは１０〜２０、特に好ましくは１２〜１８である。具体的には、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等が挙げられる。
多価アルコール型非イオン性界面活性剤としては、具体的には、グリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の多価アルコール脂肪酸エステル；ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド等の脂肪酸アルカノールアミド；アルキル（ポリ）グリコシド等の多価アルコールアルキルエーテル等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。この中では、多価アルコール脂肪酸エステルが好ましく、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルがより好ましく、ソルビタン脂肪酸エステルが特に好ましい。
【００２２】
上記ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン鎖を有する非イオン性界面活性剤であれば特に限定されない。ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤としては、エチレンオキサイドと炭素数３以上のアルキレンオキサイドとの共重合体；多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物；ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等の高級アルコールエチレンオキサイド付加物；ポリエチレングリコールモノラウレート、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールジステアレート等の脂肪酸エチレンオキサイド付加物；ステアリルアミンエチレンオキサイド付加物、オレイルアミンエチレンオキサイド付加物等の高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物；脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の油脂のエチレンオキサイド付加物等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの中でも、保存安定化作用に優れ、小胞へのダメージが少ない点で、エチレンオキサイドと炭素数３以上のアルキレンオキサイドとの共重合体、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物が好ましく、エチレンオキサイドと炭素数３以上のアルキレンオキサイドとの共重合体がより好ましい。
また、両親媒性物質が、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤のようなポリオキシエチレン鎖を分子中に含むものである場合、ポリオキシエチレン鎖の含有割合は、両親媒性物質１００質量部に対して合計で、１５〜９９質量部が好ましく、２０〜９５質量部がより好ましく、３０〜９０質量部が特に好ましい。
【００２３】
上記エチレンオキサイドと炭素数３以上のアルキレンオキサイドとの共重合体としては、ブロック共重合体、すなわち、ポリオキシエチレン鎖からなるブロック（以下、ブロックＡともいう）と、炭素数３以上のアルキレンオキサイド由来の構造単位の繰り返しから構成されるポリオキシアルキレン鎖からなるブロック（以下、ブロックＢともいう）とを有するブロック共重合体が好ましい。
また、エチレンオキサイドと炭素数３以上のアルキレンオキサイドとの共重合体において、炭素数３以上のアルキレンオキサイドとしては、炭素数３〜６のアルキレンオキサイドが好ましく、炭素数３又は４のアルキレンオキサイドがより好ましく、炭素数３のアルキレンオキサイドが特に好ましい。なお、ブロックＢに含まれるアルキレンオキシ基の炭素数が３のものは、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド付加物である。
【００２４】
また、ブロックＡの合計含有量としては、ブロック共重合体中、１５〜９９質量％が好ましく、２０〜９５質量％がより好ましく、３０〜９０質量％が特に好ましい。
また、ブロックＢの合計含有量としては、小胞の溶解を低減させる点から、ブロック共重合体中、１〜８５質量％が好ましく、５〜８０質量％がより好ましく、１０〜７０質量％が特に好ましい。
ブロックＡの合計含有量とブロックＢの合計含有量との質量比率〔（Ａ）：（Ｂ）〕としては、５：９５〜９５：５が好ましく、１０：９０〜９０：１０がより好ましく、１５：８５〜８５：１５が更に好ましく、２０：８０〜８０：２０が特に好ましい。
なお、これら含有量はＮＭＲ等で測定可能であり、ブロックＡが２つ以上ある場合は、２つ以上のブロックＡの各含有量の合計値を意味する。同様に、ブロックＢが２つ以上ある場合は、２つ以上のブロックＢの各含有量の合計値である。
【００２５】
上記ブロック共重合体の中でも、保存安定化作用の点で、プルロニック型非イオン性界面活性剤等に例示されるような、下記式（１）で表されるトリブロック共重合体が好ましい。
【００２６】
【化２】
2018130085.tif 000003
【００２７】
〔式（１）中、ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２以上の整数を示す。〕
【００２８】
式（１）中、ｘ、ｚは、好ましくは２０〜３００の整数であり、より好ましくは３０〜２００の整数であり、特に好ましくは５０〜１５０の整数である。ただし、ｘ＋ｚは、４０〜６００の整数が好ましく、１００〜３００の整数がより好ましい。
また、ｙは、好ましくは５〜２００の整数であり、より好ましくは１０〜１００の整数であり、特に好ましくは２０〜８０の整数である。
【００２９】
エチレンオキサイドと炭素数３以上のアルキレンオキサイドとの共重合体は、常法に従い合成したものでも市販品でもよい。市販品としては、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−６２（いずれもＡＤＥＫＡ製）、プロノン１８８Ｐ、プロノン４０７Ｐ（いずれも日油製）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ９８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ８７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ７７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ３８（いずれもＢＡＳＦ社製）等が挙げられる。
【００３０】
また、上記多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物としては、ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物、ソルビトール脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物が好ましく、ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物がより好ましい。
また、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物における「脂肪酸」は、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸のいずれでもよい。また、脂肪酸は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好ましくは直鎖状である。また、脂肪酸の炭素数は、好ましくは８〜１８、より好ましくは１０〜２０、特に好ましくは１２〜１８である。具体的には、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等が挙げられる。また、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物は、モノエステル、ジエステル、トリエステルのいずれでもよい。
多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物としては、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物は、常法に従い合成したものでも市販品でもよい。多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物の市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８５（いずれも和光純薬製）などが挙げられる。
【００３２】
また、両親媒性物質のＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ）値は、好ましくは１２〜３０、より好ましくは１８〜３０、特に好ましくは２０〜３０である。
なお、使用する両親媒性物質が式（１）で表される化合物である場合には、ＨＬＢの値は、A.V. Kabanov et al., Journal of Controlled Release, 82 (2002) 189 - 212を参照することができる。
【００３３】
また、両親媒性物質の重量平均分子量としては、５００〜５００００が好ましく、３０００〜３００００がより好ましく、５０００〜２００００が特に好ましい。
なお、重量平均分子量は、液体クロマトグラフィー、ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ等で測定可能である。
【００３４】
なお、本発明の保存安定化剤は、両親媒性物質の他に、水系媒体を含んでいてもよい。水系媒体としては、水の他、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の各種緩衝液が挙げられる。
【００３５】
そして、後記実施例に示すように、両親媒性物質を、脂質二重膜を有する小胞に接触させることにより、凍結条件及び非凍結条件のいずれの条件下でも脂質二重膜を有する小胞を安定に保存できる。なお、本発明において「保存安定化」及び「安定化」とは、脂質二重膜を有する小胞を安定に保存できるようにすることをいう。
したがって、両親媒性物質は、脂質二重膜を有する小胞の保存安定化剤としてそのまま用いることができ、また、脂質二重膜を有する小胞の保存安定化剤を製造するための素材として使用することができる。
【００３６】
（脂質二重膜を有する小胞）
脂質二重膜を有する小胞としては、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソーム、細胞外ベシクル、微小胞体、アポトーシス小体等が挙げられる。この中でも、本発明の保存安定化剤等は、エクソソームの保存・安定化に特に適する。
【００３７】
また、脂質二重膜を有する小胞は、生体試料に含まれているものでも、生体試料から単離されたものでもよいが、生体試料から単離された小胞が好ましい。本発明の保存安定化剤等は、生体試料から単離された小胞の保存・安定化に特に適する。一般的に、脂質二重膜を有する小胞は、生体試料から単離され、細胞培養液や体液に含まれる小胞以外の成分が除去された状態になると、懸濁液等の中で安定に存在しにくくなり、含量が大幅に減少する傾向があるが、本発明の保存安定化剤等を用いた場合は、生体試料から単離された小胞も安定に保存することができる。
【００３８】
また、生体試料としては、上記小胞を含有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。培地、培養上清、破砕液に含まれる細胞は、真核生物由来でも細菌由来でもよい。これらの中でも、生体試料としては、体液、細胞培養上清が好ましい。
体液としては、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分の他、汗、胃液、間質液、関節液、眼房水、喀痰、胸水、口腔粘膜群、骨髄液、精液、消化液、組織液、体腔液、唾液、胆汁、膣液、涙、乳汁、尿、脳脊髄液、鼻腔液、糞便、腹水、羊水、リンパ液等が挙げられ、好ましくは血液組成成分である。なお、血液組成成分は、クエン酸、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
生体試料の採取元には、上記小胞を有する全ての動物が包含される。例えば、哺乳動物、ヒト又は非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、他の農場動物又は齧歯類（たとえば、マウス、ラット、モルモット等）が挙げられる。
【００３９】
（小胞の単離）
ここで、生体試料から小胞を単離する方法について具体的に説明する。
小胞の単離は、公知の方法と同様にして行えばよい。また、小胞の単離は、水系媒体存在下で行うのが好ましい。水系媒体としては、水の他、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の各種緩衝液が挙げられる。
【００４０】
生体試料から小胞を単離する手法としては、例えば、免疫沈降法、アフィニティー法、分画遠心分離法、クロマトグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル浸透クロマトグラフィー法）、密度勾配法（例えば、ショ糖密度勾配法）、電気泳動法（例えば、オルガネラ電気泳動法）、磁気分離法（例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）法）、限外濾過濃縮法（例えば、ナノ膜限外濾過濃縮法）、パーコール勾配単離法、マイクロ流体デバイスを利用した方法、ＰＥＧ沈殿法が挙げられる。これら単離法のうち１種のみで単離しても、２種以上を組み合わせて単離してもよい。また、１種の手法による単離を２回以上繰り返してもよい。
これらの中では、小胞に夾雑物が混在しにくい点やエクソソームの分離に適する点から、分画遠心分離法、クロマトグラフィー法、密度勾配法、磁気分離法、パーコール勾配単離法が好ましく、分画遠心分離法、密度勾配法、パーコール勾配単離法がより好ましい。
【００４１】
また、小胞の単離としては、エクソソームの単離に適するという点からは、遠心分離による単離が好ましく、超遠心法による単離が特に好ましい。超遠心法としては、ペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法が挙げられる。
【００４２】
具体的には、遠心分離における遠心力としては、２０００〜２５００００×ｇが好ましく、２５００〜２０００００×ｇがより好ましく、１００００〜１５００００×ｇが更に好ましく、２５０００〜１３００００×ｇが更に好ましく、５００００〜１２００００×ｇが特に好ましい。
遠心分離時間は、遠心分離１回あたり、好ましくは５分間以上、より好ましくは２０分間以上、更に好ましくは３０分間以上、特に好ましくは１時間以上であり、また、遠心分離１回あたり、好ましくは２４時間以下、より好ましくは５時間以下、特に好ましくは２時間以下である。
また、遠心分離の回数は、１回以上が好ましく、１〜１０回がより好ましく、１〜５回が特に好ましい。
上記遠心力、遠心分離時間、遠心分離の回数の各範囲は、小胞の量や容器の体積などに応じて適宜組み合わせればよい。例えば、２０００〜２５００００×ｇで１〜２４時間にわたる遠心分離を少なくとも１回以上行うことができる。
遠心分離の温度は特に限定されないが、３０℃より低い温度が好ましい。酵素などの夾雑物の活性を低下させることができる点では、０〜１０℃がより好ましく、１〜７℃が更に好ましく、３〜５℃が特に好ましい。一方、処理時間を短縮できる点では、常温（２５℃前後）で遠心分離するのが好ましい。
なお、特表２０１３−５４５４６３号公報に記載のＫファクターが３００〜１０００の範囲内になるように遠心分離してもよい。
【００４３】
また、超遠心法による単離をする場合においては、当該超遠心法による単離に先立ち、遠心力１００〜４００×ｇ程度の分画遠心分離、遠心力１０００〜２００００×ｇ程度の分画遠心分離、濾過（孔径：０．８μｍ、０．４５μｍ又は０．２２μｍ）などを適宜組み合わせて行ってもよい。また、分画遠心分離、濾過は、どちらか一方のみを行ってもよく、また、分画遠心分離、濾過の両方を行う場合は、どちらを先に行ってもよい。このようにして単離することにより、生体試料中の大きい粒子や破片を取り除くことができる。
【００４４】
（小胞と両親媒性物質との接触）
次に、本発明の安定化方法及び保存方法における、脂質二重膜を有する小胞と両親媒性物質とを接触させる工程について、具体的に説明する。
脂質二重膜を有する小胞と両親媒性物質との接触は、液中で行うのが好ましく、水系媒体存在下で行うのがより好ましい。水系媒体としては、水の他、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の各種緩衝液が挙げられる。
【００４５】
脂質二重膜を有する小胞の濃度は特に限定されないが、系内の液相の総量（小胞や緩衝液などを含む全容積）に対して、１〜１００００μｇ／ｍＬが好ましく、５〜５０００μｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜５００μｇ／ｍＬが特に好ましい。
【００４６】
両親媒性物質の濃度は、保存安定化作用や小胞へのダメージを抑える点で、系内の液相の総量（小胞や緩衝液などを含む全容積）に対して、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．０１５％（ｗ／ｖ）以上、特に好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上である。また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）未満、更に好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは０．０６％（ｗ／ｖ）以下である。
特に、両親媒性物質の濃度を０．０００１％（ｗ／ｖ）以上０．１％（ｗ／ｖ）未満とすることにより、保存安定化作用が向上する。
【００４７】
接触温度は、好ましくは２〜４２℃の範囲内であり、より好ましくは２〜３２℃の範囲内であり、特に好ましくは２〜２２℃の範囲内である。
接触の際の系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するためには、通常、上記した緩衝液が用いられる。
【００４８】
脂質二重膜を有する小胞と両親媒性物質との接触の具体的な手法としては、
（１−１）脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料に両親媒性物質を添加する手法（例えば、小胞単離前の生体試料に両親媒性物質を直接添加する手法、両親媒性物質を緩衝液に含有せしめ、これを小胞単離前の生体試料に添加する手法）、
（１−２）生体試料から単離された小胞に両親媒性物質を添加する手法（例えば、生体試料から単離された小胞の懸濁液に両親媒性物質を添加する手法）
が挙げられる。なお、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料に両親媒性物質を添加し、生体試料から小胞を単離した後、再度、両親媒性物質を添加してもよい。
本発明は、生体試料から単離された小胞の保存・安定化に特に適するため、上記手法（１−１）、（１−２）の中では、手法（１−２）が好ましい。
【００４９】
（小胞の保存）
本発明の保存方法としては、脂質二重膜を有する小胞と両親媒性物質とを上記のようにして接触させた後、凍結条件又は非凍結条件で保存する方法が好ましい。また、脂質二重膜を有する小胞と両親媒性物質とを接触させたまま、共存させた状態で保存することが好ましい。
保存の条件は凍結条件でも非凍結条件でもよく、保存温度は、−８０〜４２℃の範囲内であればよい。非凍結条件で保存する場合、保存温度は２〜８℃の範囲内が好ましい。
【００５０】
本発明の保存方法としては、より具体的には、
（２−１）脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料に両親媒性物質を添加し、凍結条件又は非凍結条件で保存する方法、
（２−２）生体試料から単離された小胞に両親媒性物質を添加し、凍結条件又は非凍結条件で保存する方法
が挙げられる。
また、脂質二重膜を有する小胞を凍結保存させる際に予め両親媒性物質を添加しておくことで、小胞の分析・診断の際の解凍から分析・診断までの間、非凍結条件で保存することもできる。
【００５１】
＜添加剤、小胞の単離方法及び回収効率改善剤＞
本発明の添加剤は、脂質二重膜を有する小胞を生体試料から単離するときに生体試料に添加される添加剤であって、両親媒性物質を含むことを特徴とするものである。
本発明の小胞の単離方法は、脂質二重膜を有する小胞を生体試料から単離する単離工程を含み、前記単離工程を両親媒性物質の存在下で行うことを特徴とするものである。
本発明の回収効率改善剤は、脂質二重膜を有する小胞の回収効率を改善させるための回収効率改善剤であって、両親媒性物質を含むことを特徴とするものである。
両親媒性物質の存在下で小胞を単離することによって、小胞の回収効率を改善することができる。なお、脂質二重膜を有する小胞、生体試料、両親媒性物質は、本発明の保存安定化剤で説明したものと同義である。
【００５２】
小胞の単離は、両親媒性物質を用いる以外は公知の方法と同様にして行えばよい。
両親媒性物質の使用量は、単離工程における系内の液相の総量に対して、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．０１５％（ｗ／ｖ）以上、特に好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上である。また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）未満、更に好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは０．０６％（ｗ／ｖ）以下である。
また、小胞の単離は、水系媒体存在下で行うのが好ましい。水系媒体としては、水の他、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の各種緩衝液が挙げられる。
【００５３】
生体試料から小胞を単離する手法としては、例えば、免疫沈降法、アフィニティー法、分画遠心分離法、クロマトグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル浸透クロマトグラフィー法）、密度勾配法（例えば、ショ糖密度勾配法）、電気泳動法（例えば、オルガネラ電気泳動法）、磁気分離法（例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）法）、限外濾過濃縮法（例えば、ナノ膜限外濾過濃縮法）、パーコール勾配単離法、マイクロ流体デバイスを利用した方法、ＰＥＧ沈殿法が挙げられる。これら単離法のうち１種のみで単離しても、２種以上を組み合わせて単離してもよい。また、１種の手法による単離を２回以上繰り返してもよい。また、１種又は２種以上の単離を２回以上繰り返す場合、このうち少なくとも１回を両親媒性物質存在下で行えばよい。
これらの中では、小胞に夾雑物が混在しにくい点やエクソソームの分離に適する点から、分画遠心分離法、クロマトグラフィー法、密度勾配法、磁気分離法、パーコール勾配単離法が好ましく、分画遠心分離法、密度勾配法、パーコール勾配単離法がより好ましい。
【００５４】
なお、小胞の単離は、特表２０１３−５４５４６３号公報、特表２０１６−５０２８６２号公報等に記載の方法を参考にして行えばよい。また、上記単離法のうち、分画遠心分離法は、Ｒａｐｏｓｏらの論文（１９９６年）、Ｓｋｏｇらの論文（２００８年）、Ｎｉｌｓｓｏｎらの論文（２００９年）に記載されている。クロマトグラフィー法は、米国特許第６８９９８６３号明細書及び米国特許第６８１２０２３号明細書に記載されている。密度勾配法、電気泳動法は、米国特許第７１９８９２３号明細書に記載されている。磁気分離法は、Ｔａｙｌｏｒ及びＧｅｒｃｅｌ  Ｔａｙｌｏｒの論文（２００８年）に記載されている。限外濾過濃縮法は、Ｃｈｅｒｕｖａｎｋｙらの論文（２００７年）に記載されている。パーコール勾配単離法は、Ｍｉｒａｎｄａらの刊行物（Ｍｉｒａｎｄａら、２０１０年）に記載されている。マイクロ流体デバイスを利用した方法は、Ｃｈｅｎらによって２０１０年に報告されている。
【００５５】
本発明において、両親媒性物質の存在下で行う小胞の単離としては、エクソソームの単離に適するという点からは、遠心分離による単離が好ましく、超遠心法による単離が特に好ましい。超遠心法としては、ペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法が挙げられる。
【００５６】
具体的には、遠心分離における遠心力としては、２０００〜２５００００×ｇが好ましく、２５００〜２０００００×ｇがより好ましく、１００００〜１５００００×ｇが更に好ましく、２５０００〜１３００００×ｇが更に好ましく、５００００〜１２００００×ｇが特に好ましい。
遠心分離時間は、遠心分離１回あたり、好ましくは５分間以上、より好ましくは２０分間以上、更に好ましくは３０分間以上、特に好ましくは１時間以上であり、また、遠心分離１回あたり、好ましくは２４時間以下、より好ましくは５時間以下、特に好ましくは２時間以下である。
また、遠心分離の回数は、１回以上が好ましく、１〜１０回がより好ましく、１〜５回が特に好ましい。
上記遠心力、遠心分離時間、遠心分離の回数の各範囲は、小胞の量や容器の体積などに応じて適宜組み合わせればよい。例えば、２０００〜２５００００×ｇで１〜２４時間にわたる遠心分離を少なくとも１回以上、両親媒性物質の存在下で行うことができる。
遠心分離の温度は特に限定されないが、３０℃より低い温度が好ましい。酵素などの夾雑物の活性を低下させることができる点では、０〜１０℃がより好ましく、１〜７℃が更に好ましく、３〜５℃が特に好ましい。一方、処理時間を短縮できる点では、常温（２５℃前後）で遠心分離するのが好ましい。
なお、特表２０１３−５４５４６３号公報に記載のＫファクターが３００〜１０００の範囲内になるように遠心分離してもよい。
【００５７】
また、両親媒性物質の存在下で超遠心法による単離をする場合においては、当該超遠心法による単離に先立ち、遠心力１００〜４００×ｇ程度の分画遠心分離、遠心力１０００〜２００００×ｇ程度の分画遠心分離、濾過（孔径：０．８μｍ、０．４５μｍ又は０．２２μｍ）などを適宜組み合わせて行ってもよい。また、分画遠心分離、濾過は、どちらか一方のみを行ってもよく、また、分画遠心分離、濾過の両方を行う場合は、どちらを先に行ってもよい。これら分画遠心分離、濾過は、両親媒性物質の存在下又は非存在下で行うことができる。このようにして単離することにより、生体試料中の大きい粒子や破片を取り除くことができる。
また、本発明の小胞の単離方法は、小胞の単離に先立ち、生体試料を採取又は調製する工程を含んでいてもよい。生体試料の採取、調製は常法に従って行えばよい。また、単離工程の後、単離した小胞から核酸を抽出することもできる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５９】
〔調製例１  培養上清の調製〕
ＨＴ２９細胞（ヒト大腸がん由来の細胞株）を、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬社製）を用いて、細胞密度が約８０％（ｗ／ｖ）に達するまで培養した。次いで、ＰＢＳ（和光純薬社製）で細胞を２回洗浄し、無血清Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬社製）で約３日間培養し、培養上清を回収した。この培養上清を、４℃、３００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収し、この回収した上清を、４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収し、次いで、孔径０．２２μｍのフィルターでろ過した。この培養上清を「エクソソーム評価用培養上清」と称する。
【００６０】
実施例におけるＣＬＥＩＡ法による発光強度測定は、以下の試験例Ａに従って行った。
〔試験例Ａ  ＣＬＥＩＡ法による発光強度測定〕
ＣＬＥＩＡ法による発光強度測定は、ＥｘｏＣａｐTM  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｋｉｔ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ−ＳＡ）を用いて行った。
すなわち、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  ２ｍＬを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）にとり、磁気スタンドを用いて集磁し、上澄みを除去した。次いで、Ｗａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬに懸濁し、Ａｎｔｉ−ＣＤ８１（ＴＡＰＡ１）ｍＡｂ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００３−６）を２０μｇ添加し、室温で６０分間ローテーターにて反応させた。
反応終了後、磁気スタンドを用いて集磁し、上澄みを除去し、Ｗａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ０．５ｍＬに分散させた。この集磁〜分散の工程を計３回繰り返した後、Ｗａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２ｍＬに懸濁してＣａｐｔｕｒｅ  Ｂｅａｄｓとし、使用時まで４℃で保存した。
次いで、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｂｅａｄｓを、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃３６００）に１ウェルあたり１２．５μＬ分注し、集磁し、上澄みを除去し、直ちにＴｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒを１ウェルあたり５０μＬ分注した。
次に、超遠心前の試料の液量１００質量部に対して１質量部相当量となるように、試験例１〜４の各試料をＰＢＳで希釈し、これを１ウェルあたり５０μＬ添加し、２５℃で９０分間撹拌した後、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製  ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を８回洗浄した。
次いで、アルカリホスファターゼ標識抗ＣＤ９抗体液を１ウェルあたり５０μＬ添加し、２５℃で２０分間反応させた。次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製  ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を８回洗浄し、発光基質（ＬＳＩ社製、基質液（Ｒ５）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）を５０μＬ添加し、１０分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。
【００６１】
〔試験例１  保存安定性試験（凍結融解）〕
（実施例１）
エクソソーム評価用培養上清６６ｍＬを、４℃、１０００００×ｇで７０分間にわたり超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０、ローターＳＷ３２Ｔｉ、チューブ３４４０５８）した。上清を廃棄した後、沈殿をＰＢＳに懸濁し、その懸濁液を４℃、１０００００×ｇで７０分間にわたり超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０、ローターＳＷ４０Ｔｉ、チューブ３４４０６０）した。更に、上清を廃棄し、沈殿をＰＢＳに懸濁し、０．６６ｍＬにメスアップしてエクソソーム懸濁液を得た。この懸濁液はエクソソーム評価用培養上清が１００倍濃縮されたものであり、これを「エクソソーム懸濁液Ａ」と称する。
次いで、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）と１０×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０倍濃縮液）とを混合し、このプルロニックＦ６８含有液１０質量部とＰＢＳ４０質量部をエクソソーム懸濁液Ａ５０質量部に加えた。なお、この試料はエクソソーム評価用培養上清の５０倍濃縮に相当し、プルロニックＦ６８の濃度は約０．０５％（ｗ／ｖ）であり、エクソソームの濃度は約２０μｇ／ｍＬである。
次に、上記試料を、−８０℃で５日間保存した後、融解させ、試験例Ａに示すＣＬＥＩＡ法で発光強度（凍結融解１回の発光強度）を測定した。その後、−８０℃で５日間再度保存した後、融解させ、試験例Ａに示すＣＬＥＩＡ法で発光強度（凍結融解２回の発光強度）を測定し、以下の式でエクソソーム活性維持率を求めた。
【００６２】
（エクソソーム活性維持率）  ＝  （凍結融解２回の発光強度）／（凍結融解１回の発光強度）  ×  １００
【００６３】
（参考例１）
従来のエクソソーム保存法（添加剤不使用、凍結保存）にて保存した後のエクソソームの活性を確認した。
すなわち、プルロニックＦ６８含有液の代わりに、両親媒性物質を含まない１０×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０倍濃縮液）を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行い、エクソソーム活性維持率を求めた。
【００６４】
（比較例１〜４）
細胞の凍結保存に一般的に使用されるセルバンカー（タカラバイオ社製）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬社製）１０質量部とＰＢＳ４０質量部とをエクソソーム懸濁液Ａ５０質量部に加えた。別に、細胞の凍結保存に一般的に使用されるセルバンカー（タカラバイオ社製）又は大腸菌の凍結保存に一般的に使用されるグリセロール（和光純薬社製）５０質量部をエクソソーム懸濁液Ａ５０質量部に加えた。これらの液はエクソソーム評価用培養上清の５０倍濃縮に相当する。なお、これら試料において、各添加剤の最終濃度は表１に示す濃度であり、エクソソームの濃度は約２０μｇ／ｍＬである。
上記試料を、−８０℃で５日間保存した後、融解させ、試験例Ａに示すＣＬＥＩＡ法で発光強度（凍結融解１回の発光強度）を測定した。その後、−８０℃で５日間再度保存した後、融解させ、試験例Ａに示すＣＬＥＩＡ法で発光強度（凍結融解２回の発光強度）を測定し、上記式でエクソソーム活性維持率を求めた。
試験例１の結果を、図１及び表１に示す。
【００６５】
【表１】
2018130085.tif 000004
【００６６】
図１に示すとおり、セルバンカー、ＤＭＳＯ又はグリセロールの存在下で凍結保存した場合（比較例１〜４）は、添加剤を用いずに凍結保存した場合（参考例１）と比較して、凍結融解１回後の発光強度が大幅に低下することがわかった。
これに対し、プルロニックＦ６８の存在下で凍結保存した場合（実施例１）は、凍結融解１回後の発光強度が、添加剤を用いずに凍結保存した場合（参考例１）と同程度であった。また、表１に示すとおり、エクソソーム活性維持率も高かった。
【００６７】
〔試験例２  保存安定性試験（４℃保存）〕
（実施例２）
プルロニックＦ６８と１０×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０倍濃縮液）とを混合し、このプルロニックＦ６８含有液１０質量部とＰＢＳ４０質量部を、試験例１と同様にして得たエクソソーム懸濁液Ａ５０質量部に加えた。この試料はエクソソーム評価用培養上清の５０倍濃縮に相当する。また、この試料において、プルロニックＦ６８の濃度は約０．０５％（ｗ／ｖ）であり、エクソソームの濃度は約２０μｇ／ｍＬである。
次に、この試料を、−８０℃で凍結して５日間保管し、その時点から０日目、１４日目、２１日目、２５日目、２７日目及び２８日目に試料を取り出し、取り出した日からそれ以降は２８日目まで４℃で保管し、それぞれ４℃保管期間２８日、１４日、７日、３日、１日および０日の安定性試験試料とした。２８日目に、試験例Ａに示すＣＬＥＩＡ法で発光強度を測定した。０日の安定性試験試料の発光強度を１００％とし、１日、３日、７日、１４日及び２８日の安定性試験試料それぞれの発光強度の強度比を算出した。
（比較例５）
プルロニックＦ６８含有液の代わりに、両親媒性物質を含まない１０×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０倍濃縮液）を用いた以外は、実施例２と同様の操作を行い、０日の安定性試験試料の発光強度を１００％とし、１日、３日、７日、１４日及び２８日の安定性試験試料それぞれの発光強度の強度比を算出した。
試験例２の結果を図２に示す。
【００６８】
図２に示すとおり、両親媒性物質を用いずに４℃で保存した場合（比較例５）、１日で反応性が６０％以下に落ち込む一方で、プルロニックＦ６８の存在下４℃で保存した場合（実施例２）は、２８日間経過後でもエクソソームの反応性が維持されていた。
【００６９】
試験例１及び２の結果から、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）を用いることによって、凍結条件及び非凍結条件のいずれの条件下でも脂質二重膜を有する小胞を安定に保存できることがわかった。
【００７０】
〔試験例３  超遠心によるエクソソームの単離〕
（実施例３）
プルロニックＦ６８と１０×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０倍濃縮液）とを混合し、このプルロニックＦ６８含有液１０質量部を、エクソソーム評価用培養上清９０質量部に加えてよく混合した。この混合液を「混合液Ｂ」と称する。なお、混合液Ｂにおいて、プルロニックＦ６８の濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）である。
次いで、上記混合液Ｂを、４℃、１０００００×ｇで７０分間にわたり超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０、ローターＳＷ３２Ｔｉ、チューブ３４４０５８）し、上清を廃棄した後、プルロニックＦ６８と１０×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０倍濃縮液）の混合液を水で１０倍希釈した液で再分散した。この混合液を「混合液Ｃ」と称する。なお、混合液Ｃにおいて、プルロニックＦ６８の濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）である。再度、４℃、１０００００×ｇで７０分間にわたり超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０、ローターＳＷ４０Ｔｉ、チューブ３４４０６０）した後、上清を廃棄し、超遠心前の試料の液量の１００倍濃縮になるように、プルロニックＦ６８と１０×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０倍濃縮液）の混合液を水で１０倍希釈した液を用いて再分散した。この試料について、試験例Ａに示すＣＬＥＩＡ法で発光強度を測定し、超遠心処理前の試料の発光強度を１００％とし、発光強度の強度比（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を算出した。
（実施例４〜６）
混合液Ｂ及び混合液ＣのプルロニックＦ６８の濃度を、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．００１％（ｗ／ｖ）に変更した以外は、実施例３と同様の操作を行い、発光強度の強度比（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を算出した。
（実施例７）
プルロニックＦ６８の代わりにポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）を用いた以外は、実施例３と同様の操作を行い、発光強度の強度比（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を算出した。
（実施例８〜１０）
混合液Ｂ及び混合液ＣのプルロニックＦ１２７の濃度を、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．００１％（ｗ／ｖ）に変更した以外は、実施例７と同様の操作を行い、発光強度の強度比（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を算出した。
（比較例６）
プルロニックＦ６８を使用せずに行った以外は、実施例３と同様の操作を行い、発光強度の強度比（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を算出した。
試験例３の結果を図３に示す。
【００７１】
図３に示すとおり、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールまたはポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコールを０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）添加することにより、未添加（比較例６：「Ｎｏ  ａｄｄｉｔｉｖｅ」）と比較して、超遠心による小胞の回収効率が４〜６倍に向上した。
【００７２】
〔試験例４  超遠心によるエクソソームの単離〕
（実施例１１）
プルロニックＦ６８と１０×ＰＢＳ（ＰＢＳ１０倍濃縮液）とを混合し、このプルロニックＦ６８含有液１０質量部を、エクソソーム評価用培養上清９０質量部に加えてよく混合した。なお、この混合液において、プルロニックＦ６８の濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）である。
次いで、上記混合液を、４℃、１０００００×ｇで７０分間にわたり超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０、ローターＳＷ３２Ｔｉ、チューブ３４４０５８）し、上清を廃棄した後、プルロニックＦ６８と１０×ＰＢＳとの混合液を水で１０倍希釈した液で再分散した。なお、この混合液において、プルロニックＦ６８の濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）である。再度、４℃、１０００００×ｇで７０分間にわたり超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０、ローターＳＷ４０Ｔｉ、チューブ３４４０６０）した後、上清を廃棄し、超遠心前の試料の液量の１００倍濃縮になるように、プルロニックＦ６８と１０×ＰＢＳとの混合液を水で１０倍希釈した液を用いて再分散した。この懸濁液を、「プルロニックＦ６８含有エクソソーム懸濁液Ｄ」と称する。
（比較例７）
プルロニックＦ６８を使用せずに行った以外は、実施例１１と同様の操作を行い、懸濁液を得た。この懸濁液を、「プルロニックＦ６８非含有エクソソーム懸濁液Ｅ」と称する。
上記懸濁液Ｄ、Ｅについて、試験例Ａに示すＣＬＥＩＡ法で発光強度を測定し、超遠心処理前の試料の発光強度を１００％とし、発光強度の強度比（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を算出した。結果を図４に示す。
【００７３】
図４に示すとおり、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールを添加することによって、未添加と比較して、超遠心による小胞の回収効率が約６．１倍に向上した。
【００７４】
〔試験例５  ナノトラッキング法による評価〕
プルロニックＦ６８含有エクソソーム懸濁液Ｄ、プルロニックＦ６８非含有エクソソーム懸濁液Ｅのそれぞれについて、ナノ粒子解析装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＬＭ１０）により、粒子数および粒径分布を計測した。３回計測した粒子数の平均値と３回計測した粒径分布を図５に示す（懸濁液Ｄ：「エクソソーム／添加剤（＋）」、懸濁液Ｅ：「エクソソーム／添加剤（−）」）。
図５に示すとおり、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールを添加しても、粒子数および粒径分布に変化はみられなかった。したがって、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールによるエクソソーム構造への影響はほとんどないと考えられる。
【００７５】
〔試験例６  銀染色による評価〕
（実施例１２）
実施例１１と同様の操作を行い、懸濁液を得た。この懸濁液を、「プルロニックＦ６８含有エクソソーム懸濁液Ｆ」と称する。
（比較例８）
比較例７と同様の操作を行い、懸濁液を得た。この懸濁液を、「プルロニックＦ６８非含有エクソソーム懸濁液Ｇ」と称する。
次いで、懸濁液Ｆ、Ｇ各７５質量部に、４×Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｃａｔ  ｎｏ．  ＮＰ０００７）をそれぞれ２５質量部加え、９５℃で５分間加熱処理した。この液１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、銀染色（コスモバイオ社製  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．  ４２３３９０）を行った。結果を図６に示す（懸濁液Ｆ：添加剤（＋）、懸濁液Ｇ：添加剤（−））。
図６に示すとおり、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールを添加することによって、未添加と比較して、蛋白質総量でみた収量増加が確認された。
【００７６】
〔試験例７  ウェスタンブロッティング法による評価〕
懸濁液Ｆ、Ｇ各７５質量部に、４×Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｃａｔ  ｎｏ．  ＮＰ０００７）をそれぞれ２５質量部加え、９５℃で５分間加熱処理した。この液１０μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。次に、トランスブロット  Ｔｕｒｂｏブロッティングシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、分離ゲルをＰＶＤＦ膜（トランスブロットＴｕｒｂｏ転写パックＰＶＤＦ（ミディ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製））に転写し、転写後の膜を、５０％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）に３７℃で約２時間浸した。これに、一次抗体Ａｎｔｉ−ＣＤ９  ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００１−３）、Ａｎｔｉ−ＣＤ６３（ＬＡＭＰ−３）ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００２−３）、Ａｎｔｉ−ＣＤ８１（ＴＡＰＡ１）ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００３−３）、または抗ＥｐＣＡＭ抗体を、１μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で約１時間浸した。これを洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）にて３回洗浄した後、標識抗体として１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＴｒｕｅＢｌｏｔ  ＵＬＴＲＡ：  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  １８−８８１７−３３）をそれぞれ２５℃で１時間反応させた。これを洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）にて５回洗浄した後、発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃３４０９５）を反応させ、発光測定機（ＬＡＳ−５００、ＧＥヘルスケア社製）にてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ像を確認した。結果を図７に示す（懸濁液Ｆ：添加剤（＋）、懸濁液Ｇ：添加剤（−））。
図７に示すとおり、エクソソーム表面マーカーである、ＣＤ９、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ８１、ＣＤ６３全てにおいて、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールを添加して超遠心したことによるエクソソーム収量の増加が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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