(57)【要約】【課題】アルツハイマー病を含むアミロイド沈着物の存在に関連する疾病を治療及び／又は予防する方法を提供すること。【解決手段】本発明はアルツハイマー病を治療するための薬剤を調製するために使用される抗体に関するものである。より詳しくは、本発明はアルツハイマー病を予防及び／又は治療するのに用いる薬剤を調製するためにアミロイドベータペプチド、Ａβ４０及びＡβ４２の優性変異体のいずれか１つをとくに認識する抗体を使用する使用方法に関するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の脳中のアミロイド沈殿物の蓄積によって特徴付けられる疾病を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するためにペプチドベータアミロイドＡβ４０及びＡβ４２の優性遺伝子変異体をとくに認識することができる抗体を製造するための免疫原として作用するタンパク質に結合されたペプチドを使用するペプチドの使用方法。
【請求項２】
前記疾病がアルツハイマー病であることを特徴とする請求項１に記載のペプチドの使用方法。
【請求項３】
前記タンパク質がキーホールリンペットタンパク質（ＫＬＨ）であることを特徴とする請求項１に記載のペプチドの使用方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のペプチド，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のペプチド，ＳＥＱ  
ＩＤ  Ｎｏ．３のペプチド，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物の除去によるショートニング（短縮）から生じるペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のいずれかのペプチドにタンパク質を結合するのに適するアミノ酸残留物の添加によるレングスニング（伸張）から生じるペプチド；
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のペプチドの使用方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物の除去によるショートニングから生じるペプチド；
・タンパク質結合に必要なアミノ酸残留物の添加によるレングスニングから生じるペプチド；
からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のペプチドの使用方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物の除去によるショートニングから生じるペプチド；
・タンパク質結合に必要なアミノ酸残留物の添加によるレングスニングから生じるペプチド；
からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のペプチドの使用方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物の除去によるショートニングから生じるペプチド；
・タンパク質結合に必要なアミノ酸残留物の添加によるレングスニングからして生じるペプチド；
からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のペプチドの使用方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物の除去によるショートニングから生じるペプチド；
・タンパク質結合に必要なアミノ酸残留物の添加によるレングスニングから生じるペプチド；
からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のペプチドの使用方法。
【請求項９】
患者の脳中のアミロイド沈殿物の蓄積によって特徴付けられる疾病を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するためにベータアミロイドペプチドＡβ４０及びＡβ４２の優性遺伝子変異体のいずれかをとくに認めることができる抗体又は活性断片又は抗体の誘導体を使用するペプチドの使用方法。
【請求項１０】
前記疾病がアルツハイマー病であることを特徴とする請求項９に記載のペプチドの使用方法。
【請求項１１】
ペプチドＡβの優性遺伝子変異体のいずれかをとくに認めることができる抗体又は活性断片又は抗体の誘導体がＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物の除去によって任意にショートニングされかつタンパク質結合に適切なアミノ酸残留物の添加により任意にレングスニングされたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４からなる群から選択されたペプチドから得られることを特徴とする請求項９乃至１０のいずれか１項に記載のペプチドの使用方法。
【請求項１２】
前記抗体又は活性断片又は抗体の誘導体が、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物を除去することから生じるペプチド；
・タンパク質結合に必要なアミノ酸残留物を前記配列のいずれかに添加させることから生じるペプチド；
からなる群から選択されるペプチドを有する哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られることを特徴とする請求項９に記載のペプチドの使用方法。
【請求項１３】
前記抗体又は活性断片又は抗体の誘導体が、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物を除去することから生じるペプチド；
・タンパク質結合に必要なアミノ酸残留物を前記配列のいずれかに添加させることから生じるペプチド；
からなる群から選択されるペプチドを有する哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られることを特徴とする請求項９に記載のペプチドの使用方法。
【請求項１４】
前記抗体又は活性断片又は抗体の誘導体が、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸を残留物の除去することから生じるペプチド；
・タンパク質結合に必要なアミノ酸残留物を前記配列のいずれかに添加させることから生じるペプチド；
からなる群から選択されるペプチドを有する哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られることを特徴とする請求項９に記載のペプチドの使用方法。
【請求項１５】
前記抗体又は活性断片又は抗体の誘導体が、
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のペプチド；
・ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残留物を除去することから生じるペプチド；
・タンパク質結合に必要なアミノ酸残留物を前記配列のいずれかに添加させることから生じるペプチド；
からなる群から選択されるペプチドを有する哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られることを特徴とする請求項９に記載のペプチドの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルツハイマー病を含むアミロイド沈着物の存在に関連する疾病を治療及び／又は予防する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）の存在と関連する生化学現象及び新陳代謝現象についての幾つかの要因が知られている。ＡＤを有する者の脳に観察される２つの構造的かつ組織病理学的変化は神経原繊維の絡み合い（ＮＦＴ）及びアミロイド沈着物である。神経内（ｉｎｔｒａｎｅｕｒｏｎａｌ）の神経原繊維の絡み合いは他の神経変性疾病においても存在するが、神経内空間（神経プラーク）内及び微小血管系（血管プラーク）に近接するアミロイド沈着物の存在はＡＤの特徴であると思われている。これらについて、神経プラークは最も共通であると思われている（プライス・ディー・エル氏及び同僚著の医薬開発研究、１９８５年、第５巻、第５９頁乃至第６８頁「Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８５）５：５９−６８」）。
【０００３】
これらのアミロイドプラークの主成分はアミロイドペプチドＡβ４と呼ばれている４０−４２アミノ酸のペプチドである。
【０００４】
アミロイドペプチドＡβ４はアミロイドペプチドＡβ４先駆体タンパク質（βＡＰＰ）と呼ばれている細胞膜糖タンパク質からのタンパク質分解から生じるポリペプチドである。アミロイドペプチドのこれらのタンパク質先駆体は６９５乃至７７０のアミノ酸からなっており、それらのすべては同じ遺伝子によってコード化されている。
【０００５】
アミロイドペプチドＡβ４の２つの主要な変異体が確認されており、それらはそれぞれ４０及び４２のアミノ酸を含有しているペプチドＡβ４０及びペプチドＡβ４２であり、生理学的及び病理学的状態において異なる組織分布を有している。４２のアミノ酸の変異体はＡＤを有する患者の脳内に位置しているアミロイドプラークの優性形質である。
【０００６】
現在までＡＤに対する可能なワクチンを提供するために種々の考え得る解決案が提案されている。
【０００７】
ヨーロッパ特許第ＥＰ５２６５１１号明細書において、予め設けたＡＤを有する患者に対してＡβの同種治療の投薬が提案されている。しかしながら、使用される投薬により、血漿（プラズマ）内で循環する内因性Ａβのレベルは非常に変化するので、治療的な利点は期待されない。
【０００８】
シェンク氏等著、ネイチャー、１９９９年、第４００巻、第１７３頁乃至第１７７頁「Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９９；４００：１７３−１７７」は、ヒト突然変異体ＡＰＰを過剰に発現させ、かくしてアミロイドプラーク、神経ジストロフィ及びアストログリオシスの形成を予防するＡβ４２を有する遺伝子導入マウスＰＤＡＰＰの免疫処置を記載している。
【０００９】
国際特許出願公開第ＷＯ９９２７９４４号（シェンク・ディー氏「Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ」）明細書に、Ａβ４２の患者に対する投与によるＡＤの治療が記載されている。
【００１０】
ヨーロッパの４カ国の国及びアメリカ合衆国においてＡＤを抑えるための媒体により診断された３６０人の患者にアミロイドペプチドＡβ４２が抗原として使用された第３期（ｐｈａｓｅＩＩＩ）の臨床実験は何人かの患者に脳炎が発生されたことが報告されたので中断された（スクリプ・デイリー・オンライン、２００２年２月２５日、Ｓ００７４５５３２０、ザ・サイエンティスト第１６［７］巻、第２２号、２００２年４月１日「Ｓｃｒｉｐ  Ｄａｉｌｙ  Ｏｎｌｉｎｅ，２５  Ｆｅｂ  ２００２，Ｓ００７４５５３２０，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １６［７］：２２，Ａｐｒｉｌ  １，２００２」）。
【００１１】
ワクチン（又は予防接種されている動物に自然に存在するタンパク質）として内因性タンパク質を使用する問題はペプチドＡβ４２の場合であり、生体はＡβ４２に対してかついままでのところでは未知の生理学的機能を有する小さい断片に対して抗原を作ることによって応答し、我々が記載できる考え得る問題の幾つかのうちには、内因性のタンパク質に対する抗体の発生による考え得る自己免疫病の発育、内因性の抗原を認識するための免疫系の欠陥による免疫応答の発生の困難、及び急性の炎症性応答の考え得る発育がある。
【発明の概要】
【００１２】
本発明はタンパク質と結合されているＡβのＣ−末端部のペプチドの投与によるアルツハイマー病及び他のアミロイド疾病を治療することを目的とするものであり、本発明の好適な実施の形態において、前記タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）である。
【００１３】
本発明はアルツハイマー病及び他の関連のアミロイド疾病の予防及び／又は治療用のワクチンに関するものである。
【００１４】
本発明の好適な実施の形態によれば、ワクチンはペプチド、タンパク質又は内因性免疫原を使用することに関連する不都合を克服するアルツハイマー病及び他のアミロイド疾病の予防及び／又は治療のために提供することにある。
【００１５】
アミロイド沈着物によって特徴付けられる他の疾病の例は島状遺伝性症候群、多発性骨髄種、及びクロイツフェルト−ヤコブ病を含む海綿状脳炎である。
【００１６】
免疫応答の導入は患者のＡβと反応する抗体を誘起するように免疫原が投与される時のように活性にすることができるか、又は患者のＡβとそれ自体で反応するように抗体が投与される時のように非活性にすることができる。
【００１７】
本発明の目的に関して以下の用語は以下のごとく定義されものとする。
【００１８】
用語「関連のアミロイド疾病」は１つの器官、局在的アミロイドシス、全体的に拡がった幾つかの器官、系統的アミロイドシスに制限され得るアミロイドの蓄積に関連する疾病を含んでいる。第２アミロイドシスは、慢性感染（例えば、結核のような）又は慢性炎（例えば、慢性間接リウマチ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）及び血液透析の長期間の治療において患者に見出される他の型の系統的アミロイドシスと関連され得る。局在形状のアミロイドシスはタイプＩＩの糖尿病及びそれに関連する他のあらゆる疾病、即ちスクラピーを有する神経変性疾病、ウシ型海綿状脳炎、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルツハイマー病、大脳アミロイド血管症を包含するが、それらに限定するものではない。
【００１９】
用語「非活性の免疫処置」は個人についての免疫を付与する意図によりその個人に抗体又はその断片を投与することに関連して使用される。
【００２０】
第１実施態様において、本発明はアミロイド沈着物の蓄積によって特徴付けられる疾病を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するために免疫原として又は抗体として作用するペプチドを使用するペプチドの使用方法を提供する。その使用方法は患者に存在するアミロイド沈着物のペプチド成分に対する免疫応答の誘導から成っている。前記誘導は免疫原の投与によって活性にするか、又は抗体又は抗体の活性断片若しくは誘導体の投与により非活性にすることができる。
【００２１】
本発明の好適な実施例において、疾病はアルツハイマー病である。
【００２２】
得られる薬剤は疾病の症状を示す者又は無症候性の患者の双方に使用することができる。
【００２３】
本発明により、アミロイドプラークの幾つかの成分に向けられる免疫応答を引き起こすことができる組成物はアミロイド沈着物に関連付けられる疾病の治療又は予防に有効である。特に、本発明の態様によれば、ペプチド又はそれから得られた抗体の免疫賦活量が患者に投与される時、個人のアミロイドの進行を防止し、アミロイドの症状を減少し及び／又は沈殿過程を減少することができる。
【００２４】
本発明の態様によれば、抗体は免疫原としてタンパク質に結合されるペプチドの使用により哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られる。
【００２５】
本発明の好適な実施例によれば、免疫処置に使用される哺乳動物は反芻動物、ウマ科の動物、ウサギ、肉食動物、霊長類、又は抗体のために抽出されるような適量の血清を有する他のあらゆる動物にすることができる。免疫処置に使用される鳥類の中で、我々は、とくに、ガリフォームズ（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）、アンセリフォームズ（Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）、及びコロンビフォームズ（Ｃｏｌｕｍｂｉｆｏｒｍｅｓ）を記載することができるが、それらに限定するものではない。
【００２６】
本発明の好適な実施例によれば、これは患者の脳内のアミロイド沈着物の蓄積によって特徴付けられる疾病の予防及び／又は治療用の薬剤を調製するためにペプチドベータアミロイドＡβ４０及びＡβ４２の優性遺伝子変異体のいずれかを特異的に認識することができる抗体を生成するために免疫原として作用するタンパク質に結合されたペプチドを使用するペプチドの使用方法を提供する。
【００２７】
本発明の最も好適な実施例によれば、ペプチドと結合して使用されるタンパク質はキーホールリンペットタンパク質（ＫＬＨ）である。
【００２８】
本発明の同様に好適な実施例において、ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のペプチド，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のペプチド，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のペプチド，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のペプチド，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のＮ末端及び／又はＣ末端からアミノ酸残基を除去することによって切断することから生じるペプチド、及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のいずれかのペプチドに該残基を添加することによる伸張（ｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ）から生じるペプチドからなる群から選択されている。
【００２９】
他の好適な実施例によれば、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１からＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸の残基の除去から生じる配列を有するペプチド、及び前述の配列にタンパク質結合に必要なアミノ酸残基を添加することから生じるペプチドからなる群から選択されている。
【００３０】
本発明の他の好適な実施例において、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２からのＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸の残基の除去から生じる配列によるペプチド、及び前記配列のいずれかにタンパク質結合に必要なアミノ酸残基を添加することから生じるペプチドからなる群から選択されている。
【００３１】
本発明の他の好適な実施例において、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３からＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残基の除去から生じる配列を有するペプチド、及び前記配列のいずれかにタンパク質結合に必要なアミノ酸残基を添加することから生じるペプチドからなる群から選択されている。
【００３２】
本発明の他の好適な実施例において、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４からＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸の残基の除去から生じる配列を有するペプチド、及び前記配列のいずれかにタンパク質結合に必要なアミノ酸残基を添加することから生じるペプチドからなる群から選択されている。
【００３３】
本発明の他の実施例によれば、これは患者の脳内のアミロイド沈着物の蓄積によって特徴付けられる疾病の予防及び／又は治療用の薬剤を調製するために、ベータアミロイドペプチドＡβ４０及びＡβ４２の優性遺伝子変異体のいずれかを特異的に認識する抗体又は抗体の活性断片若しくは誘導体を使用する使用方法を提供することにある。
【００３４】
本発明の他の好適な実施例によれば、ペプチドＡβの優性遺伝子変異体のいずれかを特異的に認識することができる抗体又はその活性断片若しくは誘導体はＮ末端及び／又はＣ末端からアミノ酸残基の除去によって任意にショートニング（ｓｈｏｔｅｎｅｄ）され、かつタンパク質結合に適切なアミノ酸残基の添加により任意にレングスニング（ｌｅｎｇｔｈｅｎｅｇ）されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４からなる群から選択されたペプチドから得られる。
【００３５】
他のより好適な実施例において、抗体又はその活性断片若しくは誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸残基の除去から生じる配列を有するペプチド、及び前記配列のいずれかにタンパク質結合に必要なアミノ酸残基を添加することから生じるペプチドからなる群の中から選択されるペプチドを用いた哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られる。
【００３６】
他のより好適な実施例において、抗体又はその活性断片若しくは誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残基の除去から生じる配列を有するペプチド、及び前記配列のいずれかにタンパク質結合に必要なアミノ酸残基に添加することから生じるペプチドからなる群から選択されるペプチドを用いた哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られる。
【００３７】
他のより好適な実施例において、抗体又はその活性断片若しくは誘導体はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残基の除去から生じるペプチド、及び前記配列のいずれかにタンパク質結合に必要なアミノ酸残基を添加することから生じるペプチドからなる群から選択されるペプチドを用いた哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られる。
【００３８】
他のより好適な実施例において、抗体又はその活性断片若しくは誘導体はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の残基の除去から生じるペプチド、及び前記配列のいずれかにタンパク質結合に必要なアミノ酸残基を添加することから生じるペプチドからなる群から選択されるペプチドを用いた哺乳動物又は鳥類の免疫処置によって得られる。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明において、アミノ酸はこの分野において認められている単文字コードを使用して以下に指示したように略記されている。
【００４０】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン
Ｙ＝Ｔｙｒ＝トリオシン
【００４１】
本発明において前述されかつＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４として確認された配列は以下のアミノ酸配列に対応する。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１      ＬＶＦＦＡＥＤＶ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２      ＧＬＭＶＧＧＶＶ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３      ＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４      ＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ
【００４２】
前述のペプチドから得られる抗体は以下に示されているコードに対応するコードＳＡＲ−１，ＳＡＲ−２，ＳＡＲ−３及びＳＡＲ−４が付与されている。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１      ＳＡＲ−２
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２      ＳＡＲ−３
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３      ＳＡＲ−４
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４      ＳＡＲ−１
【００４３】
コンピュータ読み取り可能なフォーマット中に本明細書を添付する本発明に記載されたペプチド配列の確認に関する情報は本明細書とともに提出される配列のリストに指示されている。
【実施例】
【００４４】
本発明は以下の実施例によって例示されている。
例１      多クーロン抗体の発生
免疫原として使用されたＫＬＨと結合された４つのペプチドに対して４つの多クーロン抗体がニュージーランド産白ウサギにおける免疫処置によって発生された。
【００４５】
各免疫原は各ウサギに５回の注入により２匹のウサギに注入された。すなわち、ＰＢＳに結合の完全なフロイントのアジュバント中に乳化されたペプチド−ＫＬＨの最初の皮内注射及び１４日、２８日、４９日及び８０日でのブースター投与量として、ＰＢＳに結合の同じペプチド−ＫＬＨであるが、しかし今回は抗体の存在を検出するために９０日放置させた血液で不完全なフロイントのアジュバント中に乳化させたペプチド−ＫＬＨの４回の皮内注射が行なわれた。
【００４６】
採血後、血清は分離されかつ脱塩により予備純化され、次いで抗体は５ｍｇの対応するペプチドが添加されている１．５ｍｌのＥＭＤ−Ｅｐｏｘｙ（エポキシ）活性化材料（Ｍｅｒｃｋ）を含んでいるマトリクス中で親和性により純化された。純化された断片は０．１％ＢＳＡ（シグマ）にパックされかつ４℃で保管され、そしてグリセロール２０−５０％がクリオプロテクタ（抗凍結剤）として添加され得る。
【００４７】
例２      Ａβ用のウエスタン−ブロット
１．電気泳動
小さいペプチドの分離を改善することにより変更された１９９８年、ニューヨーク、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ著の、分子バイオロジにける現行のプロトコルに記載されたレムリ方法「Ｔｈｅ  Ｌａｅｍｍｌｉ  ｍｅｔｈｏｄ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８，ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」が使用された。
【００４８】
使用された装置はＢｉｏ−Ｒａｄからのミニプロテアン（Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ）３であった。
【００４９】
以下の成分と混合された、１５％アクリルアミドゲルが使用された。
貯蔵液                            分離ゲル（１５％）          堆積ゲル
４０％アクリルアミド                ３．７５ｍｌ            ５００μｌ
トリス３Ｍ，ｐＨ＝８．４５          ３．３ｍｌ              ２５０μｌ
グリセロール                        １．０５ｍｌ                −
水                                  １．９ｍｌ              ４．２μｌ
ＳＤＳ２０％                        ５０μｌ              １８．６μｌ
ＡＰＳ１０％                        ５０μｌ                  ２５μｌ
ＴＥＭＥＤ                          １０μｌ                    ５μｌ
【００５０】
１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡβ４０及び４２の最初の貯蔵液が使用された（ＰＢＳ中に溶解された）。必要な容量はサンプルの各々に関してこれらの液から採られかつＳＢＬＴ（ＳＢＬ＋トリスベース２Ｍ）で２０μｌまで作られた。サンプルは次いでペプチドを変性させかつ考え得るプロテアーゼを除去するために５分間沸騰された。
【００５１】
キュベットの中心はカソードバッファでかつ外側はアノードバッファで充填され、これらのバッファの組成は以下の通りである。
【００５２】
アノードバッファ
２４．２ｇトリスベース（０．２Ｍ最終濃度）
Ｈ２ Ｏにより１リットルに希釈
濃縮された塩酸によりｐＨ８．９の調整
１ヶ月まで４℃で貯蔵
【００５３】
カソードバッファ
１２．１１ｇトリスベース（０．１Ｍ最終濃度）
１２．９２ｇトリシン（０．１Ｍ最終濃度）
１ｇＳＤＳ（０．１％最終濃度）
Ｈ２ Ｏにより１リットルに希釈
ｐＨ調整しない
１ヶ月まで４℃で貯蔵
【００５４】
最後に、サンプルは容器、すなわち、２０μｌ／容器に負荷された。マーカとしてＢｉｏ−Ｒａｄからのポリペプチド標準カレイドスコープを使用して、移動が低電圧（３０Ｖ）で開始され、かつ次いで電圧は、およそ１時間の電気泳動後、１００Ｖに上昇させられた。
【００５５】
２．膜転移（ＭＥＭＢＲＡＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ）
ゲル中に分離されたタンパク質は電子吸着（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）によりＰＶＤＦ膜に転移された。移転小冊子において、以下が配置された。
【００５６】
ブラック側−スポンジ−３ホワットマンペーパ（又はフィルタペーパ）−ゲル−膜−３ホワットマンペーパ−スポンジ−透明側。
【００５７】
キュベットは次いで電子吸着バッファにより充填された。
グリシン３８ｎＭ
トリスベース５０ｍＭ
メタノール４０％
【００５８】
転移は２００ｍＡで２時間行なわれた。転移中に、バッファは磁気攪拌器により攪拌し続けられた。
【００５９】
３．抗体による培養
抗体及び粉末ミルクがＰＢＳ−ｔ（ＰＢＳ＋０．５％トィーン２０）内に溶解され、またＰＢＳ−Ｔによる洗浄をも実施している。
【００６０】
転移後、膜の表面は攪拌しながら室温（ＲＴ）で１時間粉末ミルクの５％溶液によりブロックされた。
【００６１】
この後、膜はＲＴで２×５分洗浄された。
【００６２】
その後、その膜はＰＢＳ−Ｔにおいて１：５００に少なくとも希釈されたＲＴで１時間最初の抗体（ＳＡＲ−１，ＳＡＲ−２，ＳＡＲ−３又はＳＡＲ−４）により培養された。
【００６３】
膜はＲＴで３×１０分洗浄された。次いで、それは第２抗体、すなわちヤギアンチウサギＨＲＰによりＲＴで１時間（すべての場合に、１：１０，０００）培養された。
【００６４】
膜の洗浄は、再度ＲＴで３×１０分繰り返された。
【００６５】
４．発育
最後の洗浄後、その膜はファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのＥＣＬキット＋Ｐｌｕｓを使用して、化学ルミネセンス（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キットの溶液により培養された。
【００６６】
膜はセロファンで包まれそして２重エマルジョンフィルム（アメルシャムからのハイパーフィルムＭＰ）に３０秒と２分の間の異なる時間で露出された。
【００６７】
例３  ヒト脳の組織中のＳＡＲ−１，ＳＡＲ−２，ＳＡＲ−３及びＳＡＲ−４抗体による免疫組織化学
組織の部分は以下の工程に続いてパラフィン中に固定された。
ａ）１０％での中性ホルマリン内に固定
ｂ）増大するアルコール濃度において連続する工程による脱水
ｃ）キシロール及びパラフィンを通過その工程は６０−６２℃におけるオーブン中で
ｄ）４ミクロンに切断されかつスライド内に取り付けられるパラフィンブロックの実施
【００６８】
上記組織部分は次いで以下の溶液を通すことにより脱パラフィン化された。
キシロール      １００％      １０分
キシロール      １００％      １０分
エタノール      １００％        ５分
エタノール      １００％        ５分
エタノール      ９６％          ５分
エタノール      ９０％          ５分
エタノール      ７０％          ５分
ＰＢＳ                          ５分×３回
【００６９】
その後、それらは以下の方法において処理された。
ａ）換気装置内でかつ攪拌しながら３分間９６％蟻酸
ｂ）水での急速洗浄
ｃ）ＰＢＳ２×５分における洗浄
ｄ）７０ｍｌのＰＢＳ，３０ｍｌｋエタノール及び１ｍｌのＨ２Ｏ２ から作られた溶液
中で１５分間の内因性ペルオキシダーゼのブロック
ｅ）ＰＢＳ３×５分における洗浄
ｆ）ＰＢＳ／Ｔ（ＰＢＳ中０．５％でのトリトン又はトィーン−２０）３×５分における洗浄
ｇ）２時間ＰＢＳ／Ｔにおける１０：１００に希釈されたヤギ血清（ノーマルヤギ血清）
による非特定結合のブロック
ｈ）水蒸気室中で４°Ｃにおいて夜間中最初の抗体の培養
ＳＡＲ−１・・・ＰＢＳ中の希釈１：１５０
ＳＡＲ−２・・・ＰＢＳ中の希釈１：１５００
ＳＡＲ−３・・・ＰＢＳ中の希釈１：１５００
ＳＡＲ−４・・・ＰＢＳ中の希釈１：２０００
ｉ）ＰＢＳ／Ｔ３×５分における洗浄
ｊ）４５分の間中のＰＢＳ中で１：２００に希釈された第２抗体（アンチウサギヤギ）中での培養
ｋ）ＰＢＳ４×５分における洗浄
ｌ）発育が完了するまでこれらの条件を維持して、暗闇で４５分間ＰＢＳ／Ｔ中で１：１００の希釈においてベクトル・ラブスのＡＢＣ（アビディン−ビオチン複合体）の培養
ｍ）ＰＢＳ３×５分における洗浄
ｎ）ジアミンベンジディン（ＤＡＢ）中の発育
【００７０】
時間は立体顕微鏡により経験的に制御された。このため、先ず、洗浄が揺動させながら１０分間トリス−ＨＣｌ０．５Ｍの溶液中で行なわれ、次いでトリス−ＨＣｌ０．０５Ｍ中に希釈されかつ４℃で０．５ｌ／ｍｌＨ２ Ｏ２が添加されているジアミンベンジディン基板（ＤＡＢ）による培養で継続する。反応がいったん完了すると、３回の洗浄が各回５分４°ＣにおいてＰＢＳ中で行なわれ、かつ次いでエタノール中での脱水が４分間キシロールを通して、各回２分間７０％，９０％及び１００％で行なわれ、そしてそれらが顕微鏡による観察のためにユーキット（Ｅｕｋｉｔｔ）により取り付けられるまで、２分間さらにキシロールを通した。
【００７１】
配列のリスト
配列の数：４
配列１についての情報：
配列の特徴：
長さ：８
タイプ：アミノ酸
分子のタイプ：ペプチド
起源：化学合成
配列記載
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１
ＬｅｕＶａｌＰｈｅＰｈｅＡｌａＧｌｕＡｓｐＶａｌ
１            ５
配列２についての情報：
配列の特徴：
長さ：８
タイプ：アミノ酸
分子のタイプ：ペプチド
起源：化学合成
配列記載
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１
ＧｌｙＬｅｕＭｅｔＶａｌＧｌｙＧｌｙＶａｌＶａｌ
１            ５
配列３についての情報：
配列の特徴：
長さ：１０
タイプ：アミノ酸
分子のタイプ：ペプチド
起源：化学合成
配列記載
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１
ＧｌｙＬｅｕＭｅｔＶａｌＧｌｙＧｌｙＶａｌＶａｌＩｌｅＡｌａ
１            ５                    １０
配列４についての情報：
配列の特徴：
長さ：１２
タイプ：アミノ酸
分子のタイプ：ペプチド
起源：化学合成
配列記載
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４
ＡｒｇＨｉｓＡｓｐＳｅｒＧｌｙＴｙｒＧｌｕＶａｌＨｉｓＨｉｓＧｌｎＬｙｓ
１            ５                    １０
【配列表】
2018119011000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月11日(2018.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病を治療するための、ペプチドベータアミロイドＡβ４０を特異的に認識することができる抗体を製造するための免疫原として作用するキーホールリンペットタンパク質（ＫＬＨ）に結合されたペプチドであって、当該ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のペプチドである、ＫＬＨに結合されたペプチド。
【外国語明細書】
2018119011000001.pdf