(57)【要約】【課題】糞便中の化学物質を簡便かつ迅速に抽出することができる方法、及び係る方法に用いられるキットを提供する。【解決手段】糞便中の化学物質の抽出方法であって、糞便を、微粒子と、親水性溶媒及び疎水性溶媒からなる抽出溶媒と、を備えたマイクロチューブに添加する工程１と、前記糞便及び前記微粒子を含む抽出溶媒を攪拌し、前記糞便を前記微粒子との接触により溶解し、機械的に衝撃破砕して糞便の破砕液を得る工程２と、遠心分離により、前記粉砕液を、疎水性画分と、親水性画分と、糞塊画分と、に分画する工程３と、所望の画分から所望の化学物質を分析又は回収する工程４と、を有することを特徴とする抽出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便中の化学物質の抽出方法であって、
糞便を、微粒子と、親水性溶媒及び疎水性溶媒からなる抽出溶媒と、を備えたマイクロチューブに添加する工程１と、
前記糞便及び前記微粒子を含む抽出溶媒を攪拌し、前記糞便を前記微粒子との接触により溶解し、機械的に衝撃破砕して糞便の破砕液を得る工程２と、
遠心分離により、前記粉砕液を、疎水性画分と、親水性画分と、糞塊画分と、に分画する工程３と、
所望の画分から所望の化学物質を分析又は回収する工程４と、
を有することを特徴とする抽出方法。
【請求項２】
前記化学物質は、胆汁酸である請求項１に記載の抽出方法。
【請求項３】
前記抽出溶媒は、水と、酢酸エチル又はクロロホルムと、からなる請求項１又は２に記載の抽出方法。
【請求項４】
糞便中の化学物質を抽出するためのキットであって、
微粒子と、親水性溶媒及び疎水性溶媒からなる抽出溶媒と、マイクロチューブと、を備えたことを特徴とするキット。
【請求項５】
前記化学物質は、胆汁酸である請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記抽出溶媒は、水と、酢酸エチル又はクロロホルムと、からなる請求項４又は５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便中の化学物質の抽出方法、及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
胆汁酸は、両親媒性であり、生体内において脂質とミセルを形成し、脂質吸収を促進する物質である。胆汁酸は、肝臓でコレステロールから合成されると胆汁に含まれる形で十二指腸に分泌され、回腸下部に到達すると門脈を通り肝臓に帰還し、再び分泌される。しかし、一部の胆汁酸は、回収されずに大腸に流入し、腸内細菌によって構造変換を受け、糞便とともに排出される。
【０００３】
近年、胆汁酸は、炎症性大腸炎や大腸癌等の様々な疾病に関与していると報告されている。しかし、胆汁酸と疾病との正確な因果関係等は未だ明確でないため、糞便中の胆汁酸を正確に測定することで大腸内の胆汁酸環境を把握する必要がある。
【０００４】
例えば非特許文献１には、２４時間分の糞を回収し、凍結乾燥による水分除去、破砕を行った後、抽出、精製を行う胆汁酸の抽出方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hagio M., et al., Improved analysis of bile acids in tissues and intestinal contents of rats using LC/ESI-MS., J. Lipid Res., 50(1):173-80., 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、係る抽出方法では、抽出前処理と抽出処理合せて５〜７日間と、比較的時間を要していた。
そこで、本発明は、胆汁酸をはじめとする糞便中の化学物質を簡便かつ迅速に抽出することができる方法、及び係る方法に用いられるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］糞便中の化学物質の抽出方法であって  糞便を、微粒子と、親水性溶媒及び疎水性溶媒からなる抽出溶媒と、を備えたマイクロチューブに添加する工程１と、前記糞便及び前記微粒子を含む抽出溶媒を攪拌し、前記糞便を前記微粒子との接触により溶解し、機械的に衝撃破砕して糞便の破砕液を得る工程２と、遠心分離により、前記粉砕液を、疎水性画分と、親水性画分と、糞塊画分と、に分画する工程３と、所望の画分から所望の化学物質を分析又は回収する工程４と、を有することを特徴とする抽出方法。
【０００８】
［２］前記化学物質は、胆汁酸である［１］に記載の抽出方法。
［３］前記抽出溶媒は、水と、酢酸エチル又はクロロホルムと、からなる［１］又は［２］に記載の抽出方法。
［４］糞便中の化学物質を抽出するためのキットであって、微粒子と、親水性溶媒及び疎水性溶媒からなる抽出溶媒と、マイクロチューブと、を備えたことを特徴とするキット。
［５］前記化学物質は、胆汁酸である［４］に記載のキット。
［６］前記抽出溶媒は、水と、酢酸エチル又はクロロホルムと、からなる［４］又は［５］に記載のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、糞便中の化学物質を簡便かつ迅速に抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各有機溶媒における胆汁酸の回収率を示す図である。
【図２】水と有機溶媒（クロロホルム又は酢酸エチル）を用いて抽出した胆汁酸を定量した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［糞便中の化学物質の抽出方法］
本発明の糞便中の化学物質の抽出方法は、糞便を、微粒子と、親水性溶媒及び疎水性溶媒からなる抽出溶媒と、を備えたマイクロチューブに添加する工程１と、前記糞便及び前記微粒子を含む抽出溶媒を攪拌し、前記糞便を前記微粒子との接触によりに溶解し、機械的に衝撃破砕して糞便の破砕液を得る工程２と、遠心分離により、前記粉砕液を、疎水性画分と、親水性画分と、糞塊画分と、に分画する工程３と、所望の画分から所望の化学物質を分析又は回収する工程４と、を有する方法である。
以下、各工程について詳細に説明する。
【００１２】
＜工程１＞
工程１は、糞便を、微粒子と、親水性溶媒及び疎水性溶媒からなる抽出溶媒と、を備えたマイクロチューブに添加する工程である。
糞便としては、ヒトの便；ラット、マウス、牛、山羊、羊などの糞が挙げられ、疾患に関連する化学物質を簡便かつ迅速に抽出できる観点から、ヒトの便が好ましい。
【００１３】
微粒子としては、糞便を機械的に衝撃破砕するものであれば特に限定されず、ジルコニア製微粒子、ガラス製微粒子、シリカ製微粒子、金属製微粒子、これらの混合物等が挙げられ、ジルコニアビーズが好ましい。
微粒子の大きさは、破砕したい糞便の大きさ、硬さ等によって適宜調節すればよく、例えば、一粒の粒子の場合には、直径１．０〜１０．０ｍｍのものが好ましく、２．０〜６．０ｍｍのものがより好ましい。複数粒の粒子の場合には、直径０．５〜５．０ｍｍのものが好ましく、１．０〜３．０ｍｍのものがより好ましい。
また、糞便が硬い場合、糞便を抽出溶媒につけたまましばらく放置し、糞便をふやかせることが好ましい。例えば、インキュベーターに３０℃、３０分静置することで糞便を破砕しやすくなる。また、抽出溶媒がクロロホルムと水の組み合わせの場合、糞便がふやける速度が酢酸エチルと水の組み合わせの場合に比べると格段に速い。
【００１４】
抽出に用いる親水性溶媒としては、水；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸バリウム水溶液、炭酸セシウム水溶液等のアルカリ溶液等が挙げられる。糞便中の有機酸、中でも短鎖脂肪酸を抽出する場合には、水酸化ナトリウム水溶液等の強アルカリ溶液が好ましい。強アルカリ溶液は、揮発性物質を塩化させることにより、揮発させることなく回収できる点で優れている。
従来の抽出方法においては、回収した糞便を凍結乾燥することにより糞便中の水分を除去していたが、本発明においては、糞便を親水性溶媒と接触させることにより、糞便中の水分を親水性溶媒に移行させ、除去する。これにより、抽出に要する時間を大幅に短縮することができる。
【００１５】
抽出に用いる疎水性溶媒としては、水層との分離が可能な溶媒であれば特に限定はないが、具体的には、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、トルエン、クロロホルム、テトラクロロメタン、ジクロロメタン、酢酸エチル、ベンゼン等が挙げられる。
【００１６】
マイクロチューブとしては、２ｍｌ又は１．５ｍｌ容量のポリプロピレン製のものが好ましく用いられる。
２ｍｌ容量のマイクロチューブを用いる場合、糞便の破砕に用いる微粒子の量は、例えば、０．５ｇ〜３．０ｇ重量のもの、０．２ｍｌ〜０．４ｍｌ容積のものが挙げられる。微粒子は、予め破砕用のマイクロチューブ等の容器に充填しておいてもよく、糞便や抽出溶媒等と同時またはその後に添加してもよい。
【００１７】
用いる糞便の量としては、抽出対象の化学物質の糞便中の量に依存するが、例えば０．０１ｇ〜０．２ｇが挙げられる。
用いる抽出溶媒の量としては、例えば０．１ｍＬ〜１ｍＬが挙げられる。抽出溶媒中の親水性溶媒及び疎水性溶媒の比率としては、体積換算で０．１：１〜１：０．１が好ましく、ほぼ１：１が好ましい。
【００１８】
＜工程２＞
工程２は、前記糞便及び前記微粒子を含む抽出溶媒を攪拌し、前記糞便を前記微粒子との接触により溶解し、機械的に衝撃破砕して糞便の破砕液を得る工程である。
工程２において、糞便を微粒子と共に激しく攪拌して、糞便を溶解・破砕することが好ましい。
糞便の破砕液を得る方法としては、例えばビーズ式破砕機によるものが挙げられる。  攪拌条件は用いる破砕機により異なるが、１，５００ｒｐｍ〜５，０００ｒｐｍ、３０秒〜３０分の条件が挙げられる。
【００１９】
＜工程３＞
工程３は、遠心分離により、前記粉砕液を、疎水性画分と、親水性画分と、糞塊画分と、に分画する工程である。遠心分離の条件としては、９，０００〜３０，０００×ｇの条件が挙げられる。
遠心分離により、疎水性画分及び親水性画分の内、どちらが上層に分画されるかは、用いる親水性溶媒と疎水性溶媒の組み合わせに依存する。抽出対象の化学物質が、疎水性画分及び親水性画分の内、どちらの画分に分画されるかに応じて、親水性溶媒と疎水性溶媒の組み合わせを選択することが好ましく、抽出対象の化学物質が上層の画分に分画されるように選択することがより好ましい。
実施例で後述するように、糞便中の胆汁酸を抽出する場合、抽出溶媒の組み合わせとしては、水とクロロホルム、又は、水と酢酸エチルの組み合わせが好ましい。
【００２０】
＜工程４＞
工程４は、所望の画分から所望の化学物質を分析又は回収する工程である。所望の化学物質としては、特に限定されず、酸、糖、脂質、タンパク質等が挙げられる。酸としては、胆汁酸が挙げられる。胆汁酸としては、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸等が挙げられる。
分析方法としては、特に限定されず、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ等を用いた分析方法が挙げられる。
回収方法としては、ＨＰＬＣ等を用いた回収方法が挙げられる。
【００２１】
［糞便中の化学物質抽出キット］
本発明のキットは、微粒子と、親水性溶媒及び疎水性溶媒からなる抽出溶媒と、マイクロチューブと、を備えたものであり、糞便中の化学物質を抽出するために用いられる。キットの詳細については、上述した［糞便中の化学物質の抽出方法］に記載の構成と同様である。
【００２２】
本発明によれば、糞便中の化学物質を簡便かつ迅速に抽出することができる。また、抽出に用いる糞便の量が微量であるため、本発明によれば、一定時間おきにサンプリングした糞便中の化学物質の日内変動等の分析を容易に行なうことができる。また、本発明において、抽出に必要なサンプル量と、ヒト便のような大量のサンプル量とではスケールに大きな差がある。しかしながら、糞便全体から偏りなくランダムに複数ポイントの試料を回収し、測定値を平均化すれば、前処理時に試料を均一化してから測定した場合の値に近づけることが出来る。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［抽出溶媒の選択］
発明者は、水と有機溶媒を含むマイクロチューブ内で糞便を破砕し、水層を除去することで糞中の水分を効率的に除くことができると考えた。そこで、糞便中に水分除去と糞便の破砕を同時に行うため、水と混和しない有機溶媒を探索した。
また、有機溶媒と水を混ぜ、分離させた後、水層に対して有機溶媒層が上層・下層のどちらに位置するかを調べた。混和しなかった有機溶媒を〇、混和した有機溶媒を×で示す。有機溶媒の揮発性の評価とともに、結果を表１に示す。
尚、揮発性の評価は、空のマイクロチューブの重量を測定後、このマイクロチューブに有機溶媒を１ｍＬ入れ、有機溶媒入りマイクロチューブの重量を測定した後、マイクロチューブの蓋を開けて２４時間放置後、再び有機溶媒入りマイクロチューブの重量を測定し、揮発割合を算出することにより行った。揮発割合７０〜１００％を揮発性大、揮発割合３０〜６９％を揮発性中、揮発割合０〜２９％を揮発性小と評価した。
【００２５】
【表１】
2018119859.tif 000002
【００２６】
表１に示すように、試した有機溶媒１２種類のうち、８種類の有機溶媒が水と混和せず、層を形成した。
【００２７】
［胆汁酸抽出溶媒の選択］
選択した８種類の有機溶媒に対して、上記５種胆汁酸の中で最も親水性の高い胆汁酸であるウルソデオキシコール酸（以下、ＵＤＣＡ）と、最も親油性の高い胆汁酸であるリトコール酸（以下、ＬＣＡ）の標品をそれぞれ添加し、各胆汁酸が有機溶媒層から検出されるかどうかを検討した。胆汁酸の検出には、ＵＰＬＣ／ＳｙｎａｐｔＧ２（Ｗａｔｅｒｓ）の組み合わせによるＬＣ／ＭＳを用いた。詳細には、５０μＭ ＵＤＣＡ及び５０μＭ ＬＣＡの標品をそれぞれ１０μＬマイクロチューブに添加し、遠心濃縮器で３０分濃縮し、乾固した後、ジルコニアビーズと、水及び有機溶媒をそれぞれ５００μＬ入れ、ＢｕｇＣｒａｓｈｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社製）で３０秒混和した。６０００×ｇ、１分の遠心分離を行い、上層を回収又は除去し、遠心濃縮器で回収層から有機溶媒を除去した後、メタノール５００μＬに溶解し、上記ＬＣ／ＭＳで検出した。
これら８種類の有機溶媒の中で、標品のＵＤＣＡとＬＣＡを高効率に回収できた有機溶媒は、クロロホルムと酢酸エチルの２種類であった。結果を図１に示す。クロロホルムの回収率は、ＵＤＣＡ＝７９．４±０．５％；ＬＣＡ＝７３．６±１．６％（ｎ＝４）であった。酢酸エチルの回収率は、ＵＤＣＡ＝８０．４±１．２％；ＬＣＡ＝７９．０±０．９％（ｎ＝４）であった。
【００２８】
［糞便から胆汁酸の抽出］
水と有機溶媒（クロロホルム又は酢酸エチル）とをジルコニアビーズ入りのマイクロチューブに添加した後、マウスの糞便２粒（約０．０５ ｇ）をマイクロチューブに添加した。
次いで、ＢｕｇＣｒａｓｈｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いてマイクロチューブ中の糞便を破砕した後、９，５００×ｇ、５分間遠心分離を行った。
有機溶媒層を回収し、ＣＶＥ−２１００（ＥＹＥＬＡ社製）を用いて遠心濃縮後、残った糞塊からの本抽出画分と合わせ、ＵＰＬＣ／ＳｙｎａｐｔＧ２（Ｗａｔｅｒｓ）の組み合わせによるＬＣ／ＭＳを用いて胆汁酸を検出した。クロロホルムを用いて抽出したサンプルをＳａｍｐｌｅ Ａとし、酢酸エチルを用いて抽出したサンプルをＳａｍｐｌｅ Ｂとした。結果を図２に示す。図中、ＣＡは、コール酸を表し、ＣＤＣＡは、ケノデオキシコール酸を表し、ＤＣＡは、デオキシコール酸を表す。
図２に示されるように、両有機溶媒を用いても胆汁酸を抽出可能であることが確認された。サンプルＡとサンプルＢの胆汁酸組成（バランス）及び各胆汁酸量がほぼ同じであることから、本発明の抽出方法によれば、標的化学物質のロスを最大限抑制できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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