(57)【要約】【課題】多糖にヒドロキシアリール基が導入された変性多糖において、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングの効率が上がり、ゲル化できる変性多糖を提供する。【解決手段】多糖に、炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）、およびヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）が導入された変性多糖。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖に、
炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）、および
ヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）
が導入された変性多糖。
【請求項２】
前記多糖が、ヒアルロン酸またはその誘導体である請求項１の変性多糖。
【請求項３】
前記ヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）が、下記式（２）に示す基である請求項１または２に記載の変性多糖。
【化１】
2018188561.tif 000008
［式（２）中、＊は、多糖中の水酸基残基との結合手であり、Ｒ1は、炭素数１〜２０のアルカンジイル基または−（ＣＨ2）n−Ｏ−（ＣＨ2）m−で示される２価の基であり、ｎおよびｍは、それぞれ独立に１〜１０の整数を示し；Ｒ2〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、アルコキシ基、または置換基を有してもよいアルキル基であり、ただしＲ2〜Ｒ6のうち少なくとも１つは水酸基である。］
【請求項４】
前記炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）が、（メタ）アクリロイル基である請求項１〜３のいずれか１項に記載の変性多糖。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の変性多糖と、酵素と、水とを含有する組成物。
【請求項６】
過酸化物をさらに含有する請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の変性多糖に含まれるヒドロキシアリール基の酸化カップリングによる架橋構造を有するゲル。
【請求項８】
水分を５０〜９９．９質量％含有するハイドロゲルである請求項７に記載のゲル。
【請求項９】
請求項７または８に記載のゲルを５０質量％以上含有する成形体。
【請求項１０】
請求項９に記載の成形体を有する医療用器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性多糖およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨および骨等の生体組織の一部が損なわれた場合、その損なわれた箇所の、ハイドロゲルを用いた人工の医療用器具への置き換えが行われている。このようなハイドロゲルとしては、以下の高分子ネットワーク（ゲル）が知られている。すなわち、多糖にヒドロキシフェニル基が導入された変性多糖を、西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素および過酸化水素を触媒系として用いて、前記ヒドロキシフェニル基において酸化カップリングさせることで形成される高分子ネットワーク（ゲル）である（特許文献１〜４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第８２８７９０６号公報
【特許文献２】米国特許第６９８２２９８号公報
【特許文献３】米国公開特許第２０１２／３０１４４１号公報
【特許文献４】米国特許第９１３２２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者の検討によれば、多糖にヒドロキシアリール基が導入された変性多糖では、ヒドロキシアリール基の多糖への導入箇所や、多糖の種類によっては、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングの効率が悪く、ゲル化できないことが明らかになった。
【０００５】
本発明の課題は、多糖にヒドロキシアリール基が導入された変性多糖において、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングの効率が上がり、ゲル化できる変性多糖を提供することにあり、また、前記変性多糖を含有する組成物、前記変性多糖から得られるゲル、前記ゲルから形成される成形体、および前記成形体を有する医療用器具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は前記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、以下の構成を有する変性多糖が前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、例えば以下の［１］〜［１０］である。
【０００７】
［１］多糖に、炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）、およびヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）が導入された変性多糖。
［２］前記多糖が、ヒアルロン酸またはその誘導体である前記［１］の変性多糖。
［３］前記ヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）が、下記式（２）に示す基である前記［１］または［２］に記載の変性多糖。
【０００８】
【化１】
2018188561.tif 000002
［式（２）中、＊は、多糖中の水酸基残基との結合手であり、Ｒ1は、炭素数１〜２０のアルカンジイル基または−（ＣＨ2）n−Ｏ−（ＣＨ2）m−で示される２価の基であり、ｎおよびｍは、それぞれ独立に１〜１０の整数を示し；Ｒ2〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、アルコキシ基、または置換基を有してもよいアルキル基であり、ただしＲ2〜Ｒ6のうち少なくとも１つは水酸基である。］
【０００９】
［４］前記炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）が、（メタ）アクリロイル基である前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の変性多糖。
［５］前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の変性多糖と、酵素と、水とを含有する組成物。
［６］過酸化物をさらに含有する前記［５］に記載の組成物。
［７］前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の変性多糖に含まれるヒドロキシアリール基の酸化カップリングによる架橋構造を有するゲル。
［８］水分を５０〜９９．９質量％含有するハイドロゲルである前記［７］に記載のゲル。
［９］前記［７］または［８］に記載のゲルを５０質量％以上含有する成形体。
［１０］前記［９］に記載の成形体を有する医療用器具。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、多糖にヒドロキシアリール基が導入された変性多糖において、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングの効率が上がり、ゲル化できる変性多糖を提供することができ、また、前記変性多糖を含有する組成物、前記変性多糖から得られるゲル、前記ゲルから形成される成形体、および前記成形体を有する医療用器具を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、合成例１で得た変性多糖の1Ｈ  ＮＭＲのチャートである。
【図２】図２は、実施例１で得た変性多糖の1Ｈ  ＮＭＲのチャートである。
【図３】図３は、実施例２で得た変性多糖の1Ｈ  ＮＭＲのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について好適態様も含めて説明する。
［変性多糖］
本発明の変性多糖は、多糖に、炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）、およびヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）が導入されたものである。前記変性多糖は、ヒドロキシアリール基のみが導入された従来の変性多糖に比べて、ヒドロキシアリール基の酸化カップリングがより効率的に進むため、前記変性多糖のゲルを得ることができる。
【００１３】
後述するように、多糖が有する、アルコール性水酸基、カルボキシ基およびアミノ基等の官能基に、前記官能基と反応しうる基と炭素−炭素不飽和二重結合またはヒドロキシアリール基とを有する化合物を反応させることで、多糖に前記基（ａ１）および（ａ２）を導入することができる。
【００１４】
＜多糖＞
変性前、すなわち前記基（ａ１）および（ａ２）導入前の多糖としては、例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、セルロース、グアーガム、プルラン、デキストラン、フルクタン、マンナン、カラギーナン、キチン、キトサン、ペクチン、デンプン、グリコーゲン、デキストリン、およびゲランガム等の天然多糖；ならびに前記天然多糖の誘導体が挙げられる。
【００１５】
天然多糖の誘導体としては、例えば、前記例示の多糖が、炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）およびヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）以外の基、例えば、メチル基、エチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシエチルメチル基、ヒドロキシプロピルメチル基、カルボキシメチル基、アセチル基、ステアロキシ基、グリセロール、プロピレングリコール等の置換基を有する誘導体が挙げられる。誘導体は、前記置換基を単独で又は複数の組合せで有してもよい。
【００１６】
置換基を有する多糖としては、具体的には、アセチル化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアロキシヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルグアーガム、エチルグアーガム、ヒドロキシエチルグアーガム、ヒドロキシプロピルグアーガム、ヒドロキシエチルメチルグアーガム、ヒドロキシプロピルメチルグアーガムが挙げられる。
【００１７】
多糖は、塩であってもよく、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の周期表第２族金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。具体的には、カルボキシ基を有する多糖の金属塩が挙げられる。
【００１８】
多糖の中でも、多糖にヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）を容易に導入しやすいことから、ヒアルロン酸、デキストランおよびプルラン、ならびにこれらの誘導体が好ましく、ヒアルロン酸およびその誘導体がより好ましい。ヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）のみが導入された変性ヒアルロン酸およびその誘導体では、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ／過酸化水素の触媒系では増粘はするもののゲル化ができなかったが、さらに炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）が導入された変性ヒアルロン酸およびその誘導体であれば、前記触媒系によりゲル化させることができる。
【００１９】
＜炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）＞
本発明の変性多糖は、炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）を含む。
炭素−炭素不飽和二重結合は、好ましくはラジカル重合可能な二重結合であり、例えば、（メタ）アクリロイル基、ビニル基等として変性多糖に含まれていればよく、（メタ）アクリロイル基が好ましく、アクリロイル基がより好ましい。本発明においてゲル形成が良好に進行する理由は定かではないが、ラジカル重合可能であり且つ立体的な障害の小さい（メタ）アクリロイル基、ビニル基等で多糖を一部変性すれば、変性多糖において先に不飽和二重結合が架橋してヒドロキシアリール基同士を近寄せることができ、したがってヒドロキシアリール基の酸化カップリングをより効率的に進行させることができると推測される。
【００２０】
前記基（ａ１）は、下記式（１）に示す基（（メタ）アクリロイル基）であることが好ましい。例えば、本発明の変性多糖は、多糖中の水酸基残基に結合している式（１）に示す基を含む。
【００２１】
【化２】
2018188561.tif 000003
式（１）中、ＲAは水素原子またはメチル基を示す。
＊は、多糖中の水酸基残基（−Ｏ−）との結合手である。例えば、ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチルグルコサミン単位中のヒドロキシメチル基における水酸基残基と、式（１）に示す基とが結合していることが好ましい。
【００２２】
多糖に炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）を導入する方法としては、例えば、アミノ基、アルコール性水酸基およびカルボキシ基等の官能基を有する多糖と、前記官能基と反応しうる官能基（例：カルボキシ基、その酸ハロゲン化物、アミノ基、アルコール性水酸基、エポキシ基、オキセタニル基）および炭素−炭素不飽和二重結合を有する化合物（以下「二重結合含有化合物（１１）」ともいう）とを、反応させる方法が挙げられる。
【００２３】
二重結合含有化合物（１１）としては、多糖が多く有するアルコール性水酸基と反応しうるカルボキシ基またはその酸ハロゲン化物（−ＣＯＸ（Ｘは塩素原子等のハロゲン原子）で表される基）を有する化合物が好ましく、例えば、（メタ）アクリル酸、クロトン酸等の不飽和モノカルボン酸；マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、イタコン酸等の不飽和ジカルボン酸；前記不飽和ジカルボン酸の無水物；コハク酸モノ〔２−（メタ）アクリロイルオキシエチル〕、フタル酸モノ〔２−（メタ）アクリロイルオキシエチル〕等の多価カルボン酸のモノ〔（メタ）アクリロイルオキシアルキル〕エステル；およびこれらの酸ハロゲン化物、例えば（メタ）アクリル酸クロライドが挙げられる。
【００２４】
二重結合含有化合物（１１）としては、その他、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸２−メチルグリシジル、（メタ）アクリル酸３，４−エポキシブチル、（メタ）アクリル酸６，７−エポキシヘプチル、（メタ）アクリル酸３，４−エポキシシクロへキシルメチル等のエポキシ基含有（メタ）アクリレート；ｏ，ｍ又はｐ−ビニルフェニルグリシジルエーテル、ｏ，ｍ又はｐ−イソプロペニルフェニルグリシジルエーテル、ｏ，ｍ又はｐ−ビニルベンジルグリシジルエーテル、ｏ，ｍ又はｐ−イソプロペニルベンジルグリシジルエーテル等のエポキシ基含有ビニル化合物；３−（（メタ）アクリロイルオキシメチル）オキセタン、３−（（メタ）アクリロイルオキシメチル）−２−メチルオキセタン、３−（（メタ）アクリロイルオキシメチル）−３−エチルオキセタン、３−（（メタ）アクリロイルオキシメチル）−２−フェニルオキセタン等のオキセタニル基含有（メタ）アクリレート；３−（ｐ−ビニルフェニルオキシメチル）−３−メチルオキセタン、３−（ｐ−イソプロペニルフェニルオキシメチル）−３−メチルオキセタン等のオキセタニル基含有ビニル化合物；（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸３−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸４−ヒドロキシブチル等の（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルが挙げられる。
【００２５】
例えば、塩基性化合物の存在下又は非存在下に、多糖と二重結合含有化合物（１１）とを、あるいはヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）を含む変性多糖と二重結合含有化合物（１１）とを反応させる。前記反応の反応温度は、通常は−１０〜５０℃、好ましくは−５〜３０℃であり、反応時間は、通常は１〜４８時間である。
【００２６】
塩基性化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、ピペリジンが挙げられる。
前記反応において、二重結合含有化合物（１１）は、多糖１００質量部、またはヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）を含む変性多糖１００質量部に対して、通常は０．１〜５０質量部、好ましくは０．３〜２０質量部、より好ましくは０．５〜１０質量部の量で用いることができる。
【００２７】
前記反応は、溶媒中で行うことが好ましい。溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミドが挙げられる。前記反応は、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で行ってもよい。
【００２８】
＜ヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）＞
本発明の変性多糖は、ヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）を含む。
ヒドロキシアリール基としては、例えば、ヒドロキシフェニル基、ヒドロキシナフチル基等の炭素数６〜１４のヒドロキシアリール基が挙げられる。ヒドロキシアリール基における水酸基数は通常は１〜３、好ましくは１である。また、ヒドロキシアリール基は、水酸基の他に、アルコキシ基、置換基を有してもよいアルキル基等を有してもよい。
【００２９】
前記基（ａ２）は、下記式（２）に示す基であることが好ましい。例えば、本発明の変性多糖は、多糖中の水酸基残基に結合している式（２）に示す基を含む。
【００３０】
【化３】
2018188561.tif 000004
式（２）中の各記号について以下に説明する。
＊は、多糖中の水酸基残基（−Ｏ−）との結合手である。例えば、ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチルグルコサミン単位中のヒドロキシメチル基における水酸基残基と、式（２）に示す基とが結合していることが好ましい。
【００３１】
Ｒ1は、炭素数１〜２０のアルカンジイル基または−（ＣＨ2）n−Ｏ−（ＣＨ2）m−で示される２価の基であり、ｎおよびｍは、それぞれ独立に１〜１０の整数を示す。
アルカンジイル基としては、例えば、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基が挙げられる。アルカンジイル基の炭素数は、好ましくは１〜１０、より好ましくは２〜５である。
【００３２】
Ｒ2〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、アルコキシ基、または置換基を有してもよいアルキル基であり、ただしＲ2〜Ｒ6のうち少なくとも１つは水酸基である。後述するゲル化において酸化カップリングが優位に進み、機械的強度により優れたゲルが得られることから、Ｒ2〜Ｒ6のうち、Ｒ4のみが水酸基であることが好ましい。水酸基に対して少なくとも１つのオルト位置の炭素原子には水素原子が結合していることが好ましい。
【００３３】
アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基が挙げられる。
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等の炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。アルキル基における１以上の水素原子は置換されていてもよく、置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子、フェニル基、水酸基、アセトキシ基、アルコキシ基、カルボキシ基、シアノ基、ニトロ基が挙げられる。
【００３４】
Ｒ2〜Ｒ6のうち水酸基以外の残りの基は、水素原子またはアルコキシ基であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。
多糖にヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）を導入する方法としては、例えば、アミノ基、アルコール性水酸基およびカルボキシ基等の官能基を有する多糖と、前記官能基と反応しうる官能基（例：カルボキシ基、その酸ハロゲン化物、アミノ基、アルコール性水酸基、エポキシ基、オキセタニル基）およびヒドロキシアリール基を有する化合物とを、反応させる方法が挙げられる。例えば、多糖中の水酸基と、下記式（２１）に示す化合物（以下「化合物（２１）」ともいう）中の−ＣＯＸとを反応させることで、化合物（２１）由来のヒドロキシフェニル基を、エステル結合を介して多糖に導入することができる。
【００３５】
【化４】
2018188561.tif 000005
式（２１）中、Ｒ1〜Ｒ6は式（２）中の同一記号と同義である。Ｘは、−ＯＨまたはハロゲン原子である。ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられ、塩素原子が好ましい。
【００３６】
化合物（２１）としては、例えば、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、４−ヒドロキシフェニルブタン酸、２−（２，５−ジヒドロキシフェニル）酢酸、およびこれらの酸ハロゲン化物が挙げられる。
【００３７】
例えば、多糖と化合物（２１）とを、あるいは炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）を含む変性多糖と化合物（２１）とを反応させる。例えば、前記多糖または前記基（ａ１）を含む変性多糖と化合物（２１）とを含む溶液から溶媒を留去し、次いで、残渣を加熱脱水縮合させる。溶媒留去は、例えば、減圧下、通常は０〜１５０℃、好ましくは２０〜８０℃で行う。加熱脱水縮合は、溶媒留去後の残渣を減圧下加温して行い、ここでの加熱温度は、通常は５０〜１５０℃、好ましくは８０〜１３０℃であり、反応時間は、通常は１〜９２時間、好ましくは２〜４８時間である。減圧条件は、例えば７６０ｍｍＨｇ未満、好ましくは１〜５００ｍｍＨｇである。加熱脱水縮合後の生成物を水に溶解させて、エタノール、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン等の貧溶媒で再沈殿により精製してもよい。
【００３８】
前記反応において、化合物（２１）は、多糖１００質量部、または炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）を含む変性多糖１００質量部に対して、通常は１〜１００質量部、好ましくは５〜８０質量部、より好ましくは１０〜６０質量部の量で用いることができる。
【００３９】
前記反応は、溶媒中で行うことが好ましい。溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミドが挙げられる。前記反応は、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で行ってもよい。
【００４０】
＜好適態様＞
本発明の変性多糖としては、多糖に（メタ）アクリロイル基およびヒドロキシフェニル基が導入された変性多糖が好ましく、ヒアルロン酸、デキストランおよびプルラン、ならびにこれらの誘導体に前記基が導入された変性多糖がより好ましく、ヒアルロン酸およびその誘導体に前記基が導入された変性多糖が特に好ましい。
【００４１】
本発明の変性多糖は、多糖に炭素−炭素不飽和二重結合を有する基（ａ１）が導入されている。変性多糖における前記基（ａ１）による置換度（ＤＳD）、好ましくは前記式（１）に示す基（（メタ）アクリロイル基）による置換度（ＤＳA）は、通常は０．０１〜３０であり、好ましくは０．１〜１５、より好ましくは０．５〜１０である。
【００４２】
本発明の変性多糖は、多糖にヒドロキシアリール基を有する基（ａ２）が導入されている。変性多糖における前記基（ａ２）による置換度（ＤＳAr）、好ましくは前記式（２）に示す基による置換度（ＤＳP）は、通常は０．１〜４０であり、好ましくは０．５〜２０、より好ましくは１〜１５である。
【００４３】
また、置換度（ＤＳAr）と置換度（ＤＳD）との比（ＤＳAr／ＤＳD）は、好ましくは０．１〜２０であり、より好ましくは０．５〜１０である。
これらの置換度は、1Ｈ  ＮＭＲより求めることができる。変性多糖の置換度とは、変性多糖の構成単糖１００単位あたりに導入されている基（例：前記基（ａ１）または（ａ２））の平均数を示す。変性多糖はこのような置換度を有することにより、変性多糖のゲル化速度が向上する。
【００４４】
変性多糖の前記置換度は、例えば、前述した反応の反応時間、反応温度、各反応成分の濃度を変えることによって制御することができる。例えば、反応時間を短くする、反応温度を下げる、各反応成分の濃度を低くすることで、前記置換度を低くすることができる。
【００４５】
本発明の変性多糖の絶対分子量測定による数平均分子量は、通常は１，０００〜１０，０００，０００、好ましくは３，０００〜１，０００，０００、より好ましくは５，０００〜５００，０００である。
【００４６】
［組成物］
本発明の組成物は、上述した変性多糖と、酵素と、水とを含有し、好ましくはさらに過酸化物を含有する。前記組成物の一実施態様は、変性多糖を含み、過酸化物および酵素のいずれかを含むが両方は含まない第１の溶液と、前述の過酸化物および酵素のうち第１の溶液中で含まれない方を含む第２の溶液とを有する。
【００４７】
本発明の組成物は、上述した変性多糖を含有する。前記組成物において、前記変性多糖の含有量は、通常は０．０５〜４０質量％、好ましくは０．２〜３０質量％である。変性多糖は単独で又は２種以上用いることができる。
【００４８】
本発明の組成物は、好ましくは過酸化物を含有する。過酸化物としては、例えば、過酸化水素が挙げられる。前記組成物において、過酸化物の量は、前記変性多糖中のフェノール性水酸基１モルに対して、通常は０．０１〜１０００モル、好ましくは０．１〜５００モル、より好ましくは０．５〜２００モルである。前記フェノール性水酸基は、例えば、前記基（ａ２）におけるヒドロキシアリール基に含まれるフェノール性水酸基である。
【００４９】
本発明の組成物は、酵素を含有する。酵素としては、例えば、ラッカーゼ、チロシナーゼ等のフェノールオキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼが挙げられる。ラッカーゼおよびチロシナーゼは、ゲルの構成要素とならない他の薬品を一切加える必要がないので、ゲル化の際に機能発現物質が変性するおそれが全くない点で優れる。ペルオキシダーゼは、過酸化水素等の過酸化物と併用することで瞬時にゲル化させることができる。ラッカーゼ、チロシナーゼ等の銅酵素類の起源は、例えばウルシ、キノコ（ツチカブリ、マッシュルーム）、カビ（Polyporus vericolor）が挙げられる。カタラーゼ、ペルオキシダーゼの起源は、例えば、ウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、M. lysodeikticus、西洋ワサビ（ホースラディッシュ）、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Caldariomyces fumago、Steptococcus faecalisが挙げられる。これらの中でも、チロシナーゼとしてはマッシュルーム由来、ペルオキシダーゼとしては西洋ワサビ由来のものが好ましい。
【００５０】
本発明では、変性多糖に含まれる炭素−炭素不飽和二重結合の架橋反応も進める観点から、過酸化物を用い、酵素としてペルオキシダーゼおよびカタラーゼから選ばれる１種以上を少なくとも用いることが好ましく、ペルオキシダーゼを少なくとも用いることがより好ましい。
酵素は単独で又は２種以上用いることができる。
【００５１】
本発明の組成物において、酵素の量は、０．０１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、１Ｕ／ｍＬ以上がより好ましく；１，０００Ｕ／ｍＬ以下が好ましく、５００Ｕ／ｍＬ以下がより好ましい。なお、Ｕとは酵素活性の単位を示し、至適条件下で、温度３０℃で毎分１マイクロモルの基質を変化させることができる酵素量である。
【００５２】
本発明の組成物は、水を含有する。また、本発明の組成物は、さらに塩化ナトリウムを含有してもよい。このように本発明の組成物は、生理食塩水のような塩化ナトリウム水溶液を含有してもよい。
【００５３】
本発明の組成物の水の含有量は、通常は５０〜９９．９質量％、好ましくは６０〜９９質量％、より好ましくは７０〜９８質量％である。このような態様であると、得られるゲルの機械的強度が優れる傾向にある。
【００５４】
本発明の組成物は、前記変性多糖以外の多糖をさらに含有してもよい。この多糖としては、例えば、［変性多糖］の欄に記載した多糖が挙げられる。多糖は単独で又は２種以上用いることができる。
【００５５】
本発明の組成物は、ゲルの用途に応じた機能発現物質を含有してもよい。これにより、得られるゲル中に機能発現物質を含ませることができる。機能発現物質としては、例えば、薬剤、細胞が挙げられる。機能発現物質を含有するゲルは、医療用器具等の幅広い分野で用いることができる。
【００５６】
本発明の組成物は、以下に説明するゲルの原料組成物として好適に用いることができる。また、本発明の組成物は、例えば、変形性関節症の治療に用いられる関節腔内の潤滑剤や、損傷被覆材として用いることができる。変形性関節症は膝、肩、股、腰、足首、手首、指などの体の各関節に発生しうるが、本発明の組成物はいずれの関節にも適用しうる。
【００５７】
［ゲル］
本発明のゲルは、上述した変性多糖に含まれるヒドロキシアリール基の酸化カップリングによる架橋構造を有し、すなわち前記変性多糖の架橋体を含有する。酸化カップリングの詳細は、後述する。また、本発明のゲルは、一実施態様において、上述した変性多糖に含まれる炭素−炭素不飽和二重結合の付加重合による架橋構造も有していることが好ましい。
【００５８】
一実施態様において、前記ゲルは、水分を通常は５０〜９９．９質量％、好ましくは６０〜９９質量％、より好ましくは７０〜９８質量％含有するハイドロゲルである。前記ハイドロゲルは、前記変性多糖の架橋体を通常は５０〜０．１質量％、好ましくは４０〜１質量％、より好ましくは３０〜２質量％含有する。前記ハイドロゲルは、機械的強度および柔軟性に優れる。
【００５９】
本発明のハイドロゲルは、後述するように変性多糖と酵素とを水中で混合して、変性多糖を架橋することにより得ることができる。また、前記ハイドロゲルを適宜乾燥するなどして水分を除去することにより、キセロゲルを得ることができる。あるいは、本発明のゲルは、例えば、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１５）２６２４−２６３０に記載のように、変性多糖とともにエオシンＹ、メチレンブルー、ローズベンガル等の光増感剤を用い、光照射を行うことでゲル化させて得ることもできる。
【００６０】
本発明の組成物を用いることにより、ゲルを形成することができる。例えば、一実施態様において、変性多糖と過酸化水素等の過酸化物と酵素とを水中で混合して、変性多糖を架橋して、ハイドロゲルを形成する。ここでは、変性多糖中の炭素−炭素不飽和二重結合の付加重合が進行し、さらに、ヒドロキシアリール基が酸化され、前記基同士の酸化カップリング（架橋）が起こり、ゲル化が進行すると推測される。酸化カップリングについてさらに詳述すると、例えば、変性多糖のヒドロキシアリール基を酵素の存在下で過酸化物と反応させると、フェノール性水酸基において水素原子が引き抜かれてフリーラジカル種となり、これが異性化してオルト位置の炭素上に不対電子が存在するフリーラジカル種となり、次に２つのフリーラジカル種が結合して、続いてエノール化することにより、架橋構造が形成されるものと考えられる。
【００６１】
本発明のハイドロゲルの製造方法の一態様は、例えば、変性多糖と、酵素と、必要な場合は過酸化物とを水中で混合して、変性多糖を架橋させて、ハイドロゲルを製造する。変性多糖、酵素および過酸化物は、それぞれの水溶液として用いてもよい。
【００６２】
本発明のハイドロゲルの製造方法の別の一態様は、例えば、（１）変性多糖を含み、過酸化物および酵素のいずれかを含むが両方は含まない第１の溶液を用意し、（２）前述の過酸化物および酵素のうち第１の溶液中で含まれない方を含む第２の溶液を用意し、（３）第１の溶液と第２の溶液とを混合して変性多糖を架橋させて、ハイドロゲルを製造する。具体的には、変性多糖、酵素および水を含む第１の溶液と、過酸化物および水を含む第２の溶液とを混合して、変性多糖を架橋させる。ここで、例えば、所望の形状のキャビティーを有する金型を用意し、第１の溶液と第２の溶液とを前記キャビティー中で混合して反応させることにより、前記形状を有するハイドロゲルを形成することができる。
【００６３】
ハイドロゲル形成時の水溶液温度（重合・架橋温度）は、通常は４〜５０℃、好ましくは１０〜４５℃、より好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間は、通常は１分〜２０時間、好ましくは５分〜１０時間である。ハイドロゲル形成は、加圧下、常圧（大気圧）下および減圧下のいずれで行ってもよいが、常圧下が好ましい。本発明の組成物を用いることにより、室温程度の温和な条件で、ハイドロゲルを形成することができる。
本発明のゲルおよびハイドロゲルは、例えば、軟骨および骨等の生体組織の一部が損なわれた場合の、人工軟骨および人口骨等として好適に用いることができる。
【００６４】
［成形体および医療用器具］
本発明の成形体は、上述したゲルを含有する。例えば、本発明のゲルが、所望の形状に成形された成形体である。前記成形体において、ゲルの量は、通常は５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、さらに好ましくは７０質量％以上である。
【００６５】
本発明の医療用器具は、前記成形体を有する。前記医療用器具は、機械的強度および柔軟性に優れる前記成形体を有することから、医療用器具の中でも特にインプラント材料に好適に用いることができる。インプラント材料としては、例えば、軟骨および骨等の生体組織の一部が損なわれた場合に用いられるインプラント材料が挙げられる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。以下の実施例等の記載において、特に言及しない限り、「部」は「質量部」を示す。
【００６７】
［合成例１］ヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（Ａ１）の合成
１００ｍｌナス型フラスコに、ヒアルロン酸（キューピー株式会社製、商品名「ＨＡ−ＬＦ５−Ａ」）７．５８ｇを入れ、蒸留水８０ｇを加え溶解させ、ここに、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸３．３２ｇを加え撹拌し、均一液とした。この液を６０℃で加温しながら減圧留去し、残渣を得た。ついで、この残渣の入ったナス型フラスコを４００ｍｍＨｇで減圧しつつ１２０℃で２４時間加温した。反応終了後、反応液に蒸留水８０ｇを加え溶解させ、この水溶液をエタノール２００ｍｌ、酢酸エチル１００ｍｌ、およびｎ−ヘキサン５０ｍｌ混合液中で再沈殿した。沈殿物を吸引濾過し、得られた沈殿物を６０℃で加温しながら減圧して溶媒分を留去し、ヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（Ａ１）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ１）」）を得た。
【００６８】
変性ヒアルロン酸（Ａ１）の、ヒドロキシフェニル基置換度（ＤＳP）を1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、１０．８であった。1Ｈ  ＮＭＲのチャートを図１に示す。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、装置名「ＪＮＭ−ＥＣＸ４００Ｐ」（日本電子製、重溶媒は重水）を用いて測定した。
【００６９】
［実施例１］ヒドロキシフェニル基およびアクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ１１）の合成
５０ｍｌナス型フラスコに、変性ヒアルロン酸（Ａ１）５１５ｍｇを入れ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｇを加え、窒素雰囲気下、１００℃で加熱し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液とした。次いで、室温で、この溶液にトリエチルアミン１８９ｍｇおよびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン１．５ｍｇを加え撹拌した。次いで、氷冷下攪拌しながら、アクリル酸クロライド４５ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０質量％溶液を滴下した。滴下終了後、室温で２４時間撹拌した。次いで、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール１ｍｇを加え、減圧下６５℃でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを留去した。留去後得られた残渣を蒸留水２ｇに溶解し、この溶液をイソプロピルアルコールで再沈殿し、沈殿物を吸引濾過し、４５℃で１２時間真空乾燥し、ヒドロキシフェニル基およびアクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ１１）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ１１）」）を得た。
【００７０】
変性ヒアルロン酸（Ａ１１）のＤＳPおよびアクリロイル基置換度（ＤＳA）を1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、それぞれ１０および５であった。1Ｈ  ＮＭＲのチャートを図２に示す。
【００７１】
［実施例２］ヒドロキシフェニル基およびアクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ１２）の合成
実施例１の変性ヒアルロン酸（Ａ１１）の合成において、アクリル酸クロライドを２２．５ｍｇ用いた以外は同様の操作を行い、ヒドロキシフェニル基およびアクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ１２）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ１２）」）を得た。変性ヒアルロン酸（Ａ１２）のＤＳPおよびＤＳAを1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、それぞれ９．５および１．９であった。1Ｈ  ＮＭＲのチャートを図３に示す。
【００７２】
［合成例２］ヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（Ａ２）の合成
合成例１の変性ヒアルロン酸（Ａ１）の合成において、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸を１．６６ｇ用い、エタノールで再沈殿した以外は同様の操作を行い、ヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（Ａ２）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ２）」）を得た。変性ヒアルロン酸（Ａ２）のＤＳPを1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、７であった。
【００７３】
［実施例３］ヒドロキシフェニル基およびアクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ２１）の合成
実施例１の変性ヒアルロン酸（Ａ１１）の合成において、変性ヒアルロン酸（Ａ１）の変わりに、変性ヒアルロン酸（Ａ２）を４９８ｍｇ用いた以外は同様の操作を行い、ヒドロキシフェニル基およびアクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ２１）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ２１）」）を得た。変性ヒアルロン酸（Ａ２１）のＤＳPおよびＤＳAを1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、それぞれ３．９および４であった。
【００７４】
［実施例４］ヒドロキシフェニル基およびアクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ２２）の合成
実施例１の変性ヒアルロン酸（Ａ１１）の合成において、変性ヒアルロン酸（Ａ１）の変わりに、変性ヒアルロン酸（Ａ２）を４９８ｍｇ用い、アクリル酸クロライドを２２．５ｍｇ用い、エタノールで再沈殿した以外は同様の操作を行い、ヒドロキシフェニル基およびアクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ２２）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ２２）」）を得た。変性ヒアルロン酸（Ａ２２）のＤＳPおよびＤＳAを1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、それぞれ６および１であった。
【００７５】
［合成例３］ヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（Ａ３）の合成
合成例１の変性ヒアルロン酸（Ａ１）の合成において、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸を０．８２ｇ用い、イソプロピルアルコールで再沈殿した以外は同様の操作を行い、ヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（Ａ３）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ３）」）を得た。変性ヒアルロン酸（Ａ３）のＤＳPを1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、３．５であった。
【００７６】
［合成例４］アクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ４）
５０ｍｌナス型フラスコに、ヒアルロン酸（キューピー株式会社製、商品名「ＨＡ−ＬＦ５−Ａ」）２．０６ｇを入れ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５０ｇを加え、窒素雰囲気下、１００℃で加熱し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液とした。次いで、室温で、この溶液にトリエチルアミン８２３ｍｇおよびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン７ｍｇを加え撹拌した。次いで、氷冷下攪拌しながら、アクリル酸クロライド３．９５ｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０質量％溶液を滴下した。滴下終了後、室温で２４時間撹拌した。次いで、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール３ｍｇを加え、減圧下６５℃でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを留去した。留去後得られた残渣を蒸留水２０ｇに溶解し、この溶液をイソプロピルアルコール２００ｍｌおよび酢酸エチル１００ｍｌの混合液中で再沈殿し、沈殿物を吸引濾過し、４５℃で１２時間真空乾燥し、アクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ４）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ４）」）を得た。
変性ヒアルロン酸（Ａ４）のアクリロイル基置換度（ＤＳA）を1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、９であった。
【００７７】
［合成例５］アクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ５）
合成例４の変性ヒアルロン酸（Ａ４）の合成において、アクリル酸クロライドを２．４７ｇ用いた以外は同様の操作を行い、アクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ５）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ５）」）を得た。変性ヒアルロン酸（Ａ５）のＤＳAを1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、７であった。
【００７８】
［合成例６］アクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ６）
合成例４の変性ヒアルロン酸（Ａ４）の合成において、アクリル酸クロライドを０．９９ｇ用い、イソプロピルアルコールで再沈殿した以外は同様の操作を行い、アクリロイル基変性ヒアルロン酸（Ａ６）（以下「変性ヒアルロン酸（Ａ６）」）を得た。変性ヒアルロン酸（Ａ６）のＤＳAを1Ｈ  ＮＭＲで算出したところ、１．９であった。
合成例１〜６、実施例１〜４で合成した変性ヒアルロン酸のＤＳPおよびＤＳAを下記表１に示す。
【００７９】
【表１】
2018188561.tif 000006
【００８０】
［実施例５〜８、比較例１〜６］組成物およびゲルの製造、ならびにその評価
実施例１〜４および合成例１〜６の変性ヒアルロン酸の１０質量％水溶液と、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（和光純薬製、商品コード「１６９−１０７９１」、ＨＲＰと略す）水溶液（濃度：１５０Ｕ／ｍｌ）と、過酸化水素水（０．３質量％）とを、この順で、下記表２に示す種類および量を混合し、組成物を製造した。
混合後、２３℃で１０分間経過後、ゲル化の有無を評価した。ゲル化の有無を以下の基準にて評価した。結果を下記表２に示す。
Ｘ：組成物の流動性がなくなったもの
Ｙ：組成物に流動性があり液体としての挙動を示すもの。
【００８１】
【表２】
2018188561.tif 000007
【００８２】
実施例では組成物をゲル化させることができた。一方比較例では、ＨＲＰおよび過酸化水素の量を実施例に対して増加させているにもかかわらず、ゲル化させることができなかった。
【図１】
2018188561.tif 000009
【図２】
2018188561.tif 000010
【図３】
2018188561.tif 000011