(57)【要約】【課題】  高価な試薬および高価な装置を使用せずに、基材に対するタンパク質吸着性の高精度評価を可能とする方法の提供。【解決手段】  タンパク質と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、混合試料溶液を調製し、基材に混合試料溶液を接触させた後、接触後の混合試料溶液に含まれるタンパク質および非タンパク質構成アミノ酸を加水分解する。また、アミノ酸混合標準液と非タンパク質構成アミノ酸とを含む校正用溶液を加水分解する。加水分解処理後の混合試料溶液および校正溶液中に蛍光試薬を添加して、混合溶液中のタンパク質由来のアミノ酸量を定量する。このとき、校正用溶液は、アミノ酸の定量結果の校正に用いる。得られた定量結果より、基材へのタンパク質吸着量を算出する。【選択図】図２
2018036146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法であって、
前記タンパク質と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、混合試料溶液を調製する工程と、
前記タンパク質に対応するアミノ酸混合標準液と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、校正用溶液を調製する工程と、
前記混合試料溶液を基材と接触させる工程と、
基材と接触させた前記混合試料溶液、および、前記校正用溶液を加水分解する工程と、
加水分解処理後の前記混合試料溶液および前記校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、混合試料溶液中の前記タンパク質由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸と、前記校正用溶液中の前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸を蛍光標識する工程と、
前記混合試料溶液および前記校正用溶液中の蛍光標識したアミノ酸を定量することにより、基材の接触によるタンパク質吸着量を算出する工程であって、前記タンパク質由来のアミノ酸の定量値を、前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸の定量値で校正し、かつ非タンパク質構成アミノ酸の定量値で補正する工程と、
を含む、前記基材のタンパク質の吸着量を測定する方法。
【請求項２】
前記非タンパク質構成アミノ酸が、前記基材に実質的に吸着性を示さないものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の測定方法であって、
前記混合溶液中の蛍光標識したアミノ酸の定量の測定が、高速液体クロマトグラフ-紫外線吸光検出器、または、高速液体クロマトグラフ-蛍光検出器による行われる、測定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法であって、
前記基材が、プラスチック材料、ガラス材料、金属材料からなる群より選択される少なくとも一つの基材である、測定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定方法であって、
前記非タンパク質構成アミノ酸が、ホスホセリン(P-Ser)、タウリン(Tau)、ホスホエタノールアミン(PEA)、尿素(Urea)、ハイドロキシプロリン(HyPro)、サルコシン(Sar)、α-アミノアジピン酸(α-AAA)、シトルリン(Cit)、α-アミノ-ｎ-酪酸(α-ABA)、シスタチオニン(Cysthi)、β-アラニン(β-Ala)、β-アミノイソ酪酸(β-AiBA)、γ-アミノ-ｎ-酪酸(γ-ABA)、エタノールアミン(EtOHNH2)、ハイドロキシリジン(Hylys)、オルニチン(Orn)、１-メチルヒスチジン(1MeHis)、ヒスチジン(His)、３-メチルヒスチジン(3MeHIS)、アンセリン(Ans)、カルノシン(Car)、からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸である、測定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法であって、
前記タンパク質が、高純度であり、かつ、そのアミノ酸配列が既知なものである、測定方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定方法であって、
前記蛍光試薬が、AQC(6-aminoquinolyl-Nhydroxylsuccinimidyl carbamate)、ninhydrin, OPA(o-phthalaldehyde)、NBD-F(4-fluoro-7-nitro-2,1,2-benzoxadiazole)、FMOC-Cl (9-fluorenylmethyl chloroformate)からなる群より選択される少なくとも一つの蛍光試薬である、測定方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の測定方法であって、
前記混合試料溶液を基材と接触させる工程が、前記混合試料溶液の一部を基材と接触させ、残りの一部を基材と接触させない工程であり、
前記加水分解の工程が、基材と接触させた前記混合試料溶液と、基材と接触させていない前記混合試料溶液と、前記校正用溶液とを加水分解する工程であり、
前記蛍光標識する工程が、加水分解処理後の前記各混合試料溶液と前記校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、前記各混合試料溶液および前記校正溶液中のアミノ酸を蛍光標識する工程であり、
前記タンパク質吸着量を算出する工程が、前記各混合試料溶液のそれぞれに含まれるアミノ酸量を、前記校正用溶液中のアミノ酸量に基づいてそれぞれ定量し、定量した値の差によりタンパク質の吸着量を算出する工程である、方法。
【請求項９】
基材に対するタンパク質の吸着量を測定するためのキットであって、
非タンパク質構成アミノ酸、アミノ酸認証標準物質、および、蛍光試薬を含むキット。
【請求項１０】
タンパク質の低吸着性の基材をスクリーニングする方法であって、
前記タンパク質と前記非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、混合試料溶液を調製する工程と、
前記タンパク質に対応するアミノ酸混合標準液と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、校正用溶液を調製する工程と、
前記混合試料溶液を基材と接触させる工程と、
基材と接触させた前記混合試料溶液、および、前記校正用溶液を加水分解する工程と
加水分解処理後の前記混合試料溶液および前記校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、混合試料溶液中の前記タンパク質由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸と、前記校正用溶液中の前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸を蛍光標識する工程と、
前記混合試料溶液および前記校正用溶液中の蛍光標識したアミノ酸を定量することにより、基材の接触によるタンパク質吸着量を算出する工程であって、前記タンパク質由来のアミノ酸の定量値を、前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸の定量値で校正し、かつ非タンパク質構成アミノ酸の定量値で補正する工程とを含み、
得られたタンパク質吸着量により基材のタンパク質の吸着性を評価する、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸着タンパク質の高精度絶対定量法に関する。特に、部品、器具、容器等のプラスチック材料や、各種製造装置材料、分析機器材料等へ吸着するタンパク質を絶体定量する方法に関し、当該材料の吸着性の評価に用いることができるものである。
【背景技術】
【０００２】
固相表面へのタンパク質の吸着評価に関し、たとえば、特許文献１には、蛍光ラベル化タンパク質を、対象となる材料に接触させた後、当該材料の蛍光を測定することにより、タンパク質の吸着を評価する方法が提案されている。
また、特許文献２では、タンパク質に放射性物質や蛍光体などでラベル化することなく、測定を行う方法として、タンパク質を添加した塩の水溶液を接触させる前後の被験物層の厚みを、反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置により測定し、その増加量から、被験物のタンパク質吸着性を評価する方法が提案されている。
また、本発明者らは過去、複数の学会発表において、被験物を安定同位体標識アミノ酸を含むタンパク質溶液に接触させ、操作前後のタンパク質溶液中のタンパク濃度を、加水分解処理後のアミノ酸分析により定量し、その定量結果から、被験物へ吸着したタンパク質の絶対量を換算する方法(同位体希釈アミノ酸分析)を開示している。上記の方法においては、内部標準物質として安定同位体標識したアミノ酸を用いるため、特許文献１や特許文献２に示すような技術と比較して、さらに高精度な定量を可能とするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−２１７８４８号公報
【特許文献２】特開２０１６−０２４１４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者が既有する上記の同位体希釈アミノ酸分析の技術は、高精度な定量を可能とする一方、高価な試薬および高価な装置(具体的には、内部標準物質として利用する安定同位体標識アミノ酸、および測定装置として用いる高速液体クロマトグラフ-質量分析計(LC/MS))を必要とするため、汎用性が低いという課題を有していた。加えて、同位体希釈アミノ酸分析の技術においては、測定のダイナミックレンジが狭く、測定できるサンプルの濃度が非常に限定されてしまうという課題も有していた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明者らは、内部標準物質として、安定同位体標識アミノ酸の代わりに、非タンパク質構成アミノ酸を用いることで、測定の精度は維持しつつ、かつ、高価な試薬および高価な装置(具体的には、例えば、内部標準物質として利用する安定同位体標識アミノ酸とその測定装置としての高速液体クロマトグラフ-質量分析計(LC/MS))を不要とし、技術の汎用性を大幅に向上することが可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
【０００６】
本発明は、一態様において、
〔１〕基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法であって、
前記タンパク質と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、混合試料溶液を調製する工程と、
前記タンパク質に対応するアミノ酸混合標準液と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、校正用溶液を調製する工程と、
前記混合試料溶液を基材と接触させる工程と、
基材と接触させた前記混合試料溶液、および、前記校正用溶液を加水分解する工程と、
加水分解処理後の前記混合試料溶液および前記校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、混合試料溶液中の前記タンパク質由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸と、前記校正用溶液中の前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸を蛍光標識する工程と、
前記混合試料溶液および前記校正用溶液中の蛍光標識したアミノ酸を定量することにより、基材の接触によるタンパク質吸着量を算出する工程であって、前記タンパク質由来のアミノ酸の定量値を、前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸の定量値で校正し、かつ非タンパク質構成アミノ酸の定量値で補正する工程と、
を含む、方法に関する。
ここで、本発明の基材に対するタンパク質の吸着性を評価する方法は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の測定方法であって、
前記タンパク質非構成アミノ酸が、前記基材に実質的に吸着性を示さないものであることを特徴とする。
また、本発明の基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の測定方法であって、
各混合溶液中の蛍光標識したアミノ酸の定量の測定が、高速液体クロマトグラフ-紫外線吸光検出器、または、高速液体クロマトグラフ-蛍光検出器による行われることを特徴とする。
また、本発明の基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の測定方法であって、前記基材が、プラスチック材料、ガラス材料、金属材料からなる群より選択される少なくとも一つの基材であることを特徴とする。
また、本発明の基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の測定方法であって、
前記タンパク質非構成アミノ酸が、ホスホセリン(P-Ser)、タウリン(Tau)、ホスホエタノールアミン(PEA)、尿素(Urea)、ハイドロキシプロリン(HyPro)、サルコシン(Sar)、α-アミノアジピン酸(α-AAA)、シトルリン(Cit)、α-アミノ-ｎ-酪酸(α-ABA)、シスタチオニン(Cysthi)、β-アラニン(β-Ala)、β-アミノイソ酪酸(β-AiBA)、γ-アミノ-ｎ-酪酸(γ-ABA)、エタノールアミン(EｔOHNH２)、ハイドロキシリジン(Hylys)、オルニチン(Orn)、１-メチルヒスチジン(1MeHis)、ヒスチジン(His)、３-メチルヒスチジン(3Mehis)、アンセリン(Ans)、カルノシン(Car)、からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸であることを特徴とする。
また、本発明の基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の測定方法であって、
前記タンパク質が、高純度であり、かつ、そのアミノ酸配列が既知なものであることを特徴とする。
また、本発明の基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の測定方法であって、
前記蛍光試薬が、AQC(6-aminoquinolyl-Nhydroxylsuccinimidyl carbamate)、ninhydrin, OPA(o-phthalaldehyde), NBD-F(4-fluoro-7-nitro-2,1,2-benzoxadiazole)、FMOC-Cl (9-fluorenylmethyl chloroformate)からなる群より選択される少なくとも一つの蛍光試薬であることを特徴とする。
また、本発明の基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の測定方法であって、
前記混合試料溶液を基材と接触させる工程が、前記混合試料溶液の一部を基材と接触させ、残りの一部を基材と接触させない工程であり、
前記加水分解の工程が、基材と接触させた前記混合試料溶液と、基材と接触させていない前記混合試料溶液と、前記校正用溶液とを加水分解する工程であり、
前記蛍光標識する工程が、加水分解処理後の前記各混合試料溶液と前記校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、前記各混合試料溶液および前記校正溶液中のアミノ酸を蛍光標識する工程であり、
前記タンパク質吸着量を算出する工程が、前記各混合試料溶液のそれぞれに含まれるアミノ酸量を、前記校正用溶液中のアミノ酸量に基づいてそれぞれ定量し、定量した値の差によりタンパク質の吸着量を算出する工程であることを特徴とする。
また、本発明は、別の態様において、
〔９〕基材に対するタンパク質の吸着量を測定するためのキットであって、
非タンパク質構成アミノ酸、アミノ酸認証標準物質、および、蛍光試薬を含むキットに関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１０〕タンパク質の低吸着性の基材をスクリーニングする方法であって、
前記タンパク質とタンパク質非構成アミノ酸とを混合して、混合試料溶液を調製する工程と、
前記タンパク質に対応するアミノ酸混合標準液と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、校正用溶液を調製する工程と、
前記混合試料溶液を基材と接触させる工程と、
前記混合試料溶液に含まれる前記タンパク質および前記非タンパク質構成アミノ酸を加水分解する工程と、
加水分解処理後の前記混合試料溶液および前記校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、混合試料溶液中の前記タンパク質由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸と、前記校正用溶液中の前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸を蛍光標識する工程と、
混合溶液中の蛍光標識したアミノ酸を定量することにより、基材の接触によるタンパク質吸着量を算出する工程であって、前記タンパク質由来のアミノ酸の定量値を、前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸の定量値で校正し、かつタンパク質非構成アミノ酸の定量値で補正する工程とを含み、
得られたタンパク質吸着量により基材のタンパク質の吸着性を評価する、スクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の基材のタンパク質吸着量を測定方法によれば、高価な試薬および高価な装置を必要とせずに、従来の安定同位体標識したアミノ酸を内部標準として用いる評価方法と同様の高い測定精度を維持しつつ、タンパク質の吸着性を評価することができる。
また、本発明の方法によれば、従来の同位体希釈アミノ酸分析と比較してダイナミックレンジが広く、幅広いサンプル濃度を対象とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、同位体希釈アミノ酸分析による吸着タンパク質の評価方法のフローを示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の一実施の形態である、蛍光アミノ酸分析による吸着タンパク質の評価方法のフローを示す概略図である。
【図３】図３は、非タンパク構成アミノ酸を含むアミノ酸クロマトグラムの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
図１に示すように、本発明者の既有技術である「同位体希釈アミノ酸分析」においては、被験体である、プラスチック容器またはガラス容器に、高度に精製された単一のタンパク溶液とそれを構成するアミノ酸の安定同位体標識体の混合液を用いて、吸着反応を行った後、吸着せずに溶液中に残存するタンパク質を回収、アミノ酸に分解し、高速液体クロマトグラフ-質量分析計(LC/MS)により定量する。
一方、図２に示すように、本発明においては、同様の被験体に対し、高度に精製された単一のタンパク溶液と非タンパク質構成アミノ酸(たとえばγ-アミノ酪酸やノルバリンなど)の混合液を用いて、基材に対する吸着反応を行った後、溶液中に残存するタンパク質をアミノ酸に分解し、蛍光試薬で誘導体化後、例えば、高速液体クロマトグラフ-蛍光検出器(LC/FL)により定量する。以上を「蛍光アミノ酸分析」による基材に対するタンパク質の吸着評価と呼ぶ。
【００１０】
本明細書において、「基材」とは、特に限定されず、部品、器具、容器等のプラスチック材料や各種性状装置材料、分析機器材料などとして用いられる材料を広く含む。特に、当該基材を含む製品の使用の際に、溶液中のタンパク質の接触および吸着が想定される基材をいう。本発明の一実施の形態において、基材は、プラスチック材料、ガラス材料、金属材料からなる群より選択される少なくとも一つの基材である。本発明の一態様は、このような基材に対するタンパク質の吸着性を評価する方法である。
【００１１】
本明細書において「タンパク質」というとき、タンパク質を構成する天然のアミノ酸からなるタンパク質をいう。また、本発明の方法におけるアミノ酸分析は、タンパク質やペプチド、アミノ酸等の夾雑物を併せて測定するものであるため、タンパク質試料は十分に精製されている必要がある。すなわち、本発明の吸着の評価方法に用いられる「タンパク質」は、タンパク質としての純度(単一性)が高く、かつ、そのアミノ酸配列が既知なものを用いることができる。純度としては、例えば、99％以上のものが好ましい。本発明の吸着の評価方法に用いることのできるタンパク質の具体例としては、以下に限定されないが、遺伝子組み換え型ヒトCRPをはじめとした様々な遺伝子組み換え型タンパク質や、ヒト血清アルブミン精製品などの高純度精製タンパク質などを挙げることができる。これらは市販のものを用いることができる。
【００１２】
また、本明細書において、「非タンパク質構成アミノ酸」とは、天然のタンパク質内に存在しないアミノ酸を意味する。本発明に用いることのできる「非タンパク質構成アミノ酸」としては、天然アミノ酸との性質の違いによりクロマトグラフなどの技術を用いて天然アミノ酸と分離可能なアミノ酸である。また、好ましい一実施の形態においては、「非タンパク質構成アミノ酸」は、基材に対して実質的に吸着性を示さないものである。「基材に実質的に吸着性を示さない」とは、特定の基材に対して吸着性を示さないか、または、たとえ僅かに吸着性を示したとしても、試料混合溶液と校正用溶液の双方に内部標準物質として非タンパク質構成アミノ酸が含まれており、同様に振る舞うため、検量線の作成により校正可能であり、考慮する必要がないことを意味する。このような「非タンパク質構成アミノ酸」の具体例としては、以下に限定されないが、例えば、ホスホセリン(P-Ser)、タウリン(Tau)、ホスホエタノールアミン(PEA)、尿素(Urea)、ハイドロキシプロリン(HyPro)、サルコシン(Sar)、α-アミノアジピン酸(α-AAA)、シトルリン(Cit)、α-アミノ-ｎ-酪酸(α-ABA)、シスタチオニン(Cysthi)、β-アラニン(β-Ala)、β-アミノイソ酪酸(β-AiBA)、γ-アミノ-ｎ-酪酸(γ-ABA)、エタノールアミン(EtOHNH2)、ハイドロキシリジン(Hylys)、オルニチン(Orn)、１-メチルヒスチジン(1MeHis)、ヒスチジン(His)、３-メチルヒスチジン(3MeHis)、アンセリン(Ans)、カルノシン(Car)、などを挙げることができる。
【００１３】
本発明は、一態様において、基材におけるタンパク質の吸着量を測定する方法を提供する(なお、「基材におけるタンパク質の吸着量を測定する方法」は、「基材におけるタンパク質の吸着性を評価する方法」と置き換えることができる)。当該方法は、「タンパク質と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、混合試料溶液を調製する工程」を含む。
ここで、混合試料溶液を調製するために用いる溶媒は、タンパク質が凝集あるいは分解してしまう溶媒でない限り、いずれの溶媒でも用いることができる。具体的には、以下に限定されないが、トリスバッファーやリン酸バッファーを使用することができる。また、混合試料溶液中に含まれるタンパク質は、0.001〜10mg/ml、より好ましくは0.01〜1mg/mLの濃度とすることができる。また、混合試料溶液の調製において、タンパク質と非タンパク質構成アミノ酸との混合は、質量比混合法により、混合することができる。
【００１４】
また、本発明に係る基材におけるタンパク質の吸着量を測定する方法は、「タンパク質に対応するアミノ酸混合標準液と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、校正用溶液を調製する工程」を含む。
ここで、「アミノ酸混合標準液」とは、基材に吸着させるタンパク質の代わりに、校正用溶液中に含むことのできるアミノ酸であり、当該タンパク質を構成するアミノ酸の組成と同様のアミノ酸組成からなるアミノ酸混合標準液である。このようなアミノ酸混合標準液の調製においては、公知のアミノ酸認証標準物質を用いることができる。
なお、「アミノ酸混合標準液」を用いる際には、公知のアミノ酸認証標準物質を基に、質量比混合法により当該タンパク質を構成するアミノ酸の組成と同様のアミノ酸組成からなるアミノ酸混合標準物質を調製することができる。当業者であれば、対象となるタンパク質の情報を基に、適宜アミノ酸混合標準液の調製を行うことができる。
【００１５】
また、本発明に係る基材におけるタンパク質の吸着量を測定する方法は、「混合試料溶液を基材と接触させる工程と」を含む。この工程により、混合試料溶液中に含まれるタンパク質を基材に吸着させる。混合試料溶液を基材と接触させる工程は、タンパク質が基材に吸着するのに十分である限り、特に方法や条件は制限されず、用いる基材やタンパク質等により当業者は適宜設定することができる。例えば、室温で約2〜4時間、または、4℃において一晩おくことでタンパク質を基材に吸着させることができる。
一方で、「校正用溶液」は、基材に接触させる工程を経ることなく、以降の工程において、タンパク質の吸着量を求める際の検量線作成のために使用される。
【００１６】
基材にタンパク質を接触させた後、本発明は、「基材と接触させた混合試料溶液に含まれるタンパク質、および、校正用溶液を加水分解する工程」を含む。
加水分解処理は、混合試料溶液中に含まれるタンパク質をアミノ酸にまで完全に分解することができる限りにおいて、公知の方法を採用することができる。例えば、市販の加水分解用バキュームバイアルなどへ混合試料溶液および校正用溶液をそれぞれ移し入れ、試料を蒸発乾固させた後、6mol/L 塩酸, 1％フェノールを加えて、110℃〜170℃、6〜48時間気相で加水分解処理を行うことができる。
【００１７】
本発明に係る基材におけるタンパク質の吸着量を測定する方法は、「加水分解処理後の前記混合試料溶液および前記校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、混合試料溶液中の前記タンパク質由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸と、前記校正用溶液中の前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸および前記非タンパク質構成アミノ酸を蛍光標識する工程」を含む。
この工程により、溶液中に存在するアミノ酸が蛍光標識され、後の工程によりアミノ酸の定量を行うことを可能とする。
なお、蛍光標識の方法は、混合試料溶液および校正用溶液中に含まれるアミノ酸の定量が可能である限り特に制限されず、公知の方法、化合物により標識することができる。具体的には、一実施の形態として、6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate. (AQC)を用いたアミノ酸の誘導体化により蛍光標識する方法を挙げることができる。その他、本発明に用いることのできる蛍光試薬としては、例えば、ninhydrin, OPA(o-phthalaldehyde), NBD-F(4-fluoro-7-nitro-2,1,2-benzoxadiazole)、FMOC-Cl (9-fluorenylmethyl chloroformate)からなる群より選択される少なくとも一つの蛍光試薬である、溶液中のアミノ酸を蛍光標識するための条件は、当業者であれば、適宜公知の方法に従って行うことができる。
【００１８】
本発明に係る基材におけるタンパク質の吸着量を測定する方法は、「混合試料溶液および校正用溶液中の蛍光標識したアミノ酸を定量することにより、基材の接触によるタンパク質吸着量を算出する工程であって、タンパク質由来のアミノ酸の定量値を、前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸の定量値で校正し、かつ非タンパク質構成アミノ酸の定量値で補正する工程」を含む。
ここで、蛍光標識したアミノ酸の定量方法は、液体クロマトグラフィおよび蛍光検出器からなるLC/FLなどの公知の方法を用いて測定することができる。また、一実施の形態において、蛍光検出器は、高速液体クロマトグラフ-紫外線吸光検出器、または、高速液体クロマトグラフ-蛍光検出器である。
【００１９】
また、「タンパク質由来のアミノ酸の定量値を、アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸の定量値で校正し、かつ非タンパク質構成アミノ酸の定量値で補正する」方法は、以下の方法に限定されないが、例えば、一点検量線法、２点検量線法、多点検量線法の採用によりアミノ酸量を定量することができる。一点検量線法としては、下記実施例で採用するように、下記式Ｉおよび式IIに基づき、加水分解後の混合試料溶液中に含まれるタンパク質由来のアミノ酸量を算出する方法である。
【表１】
2018036146.tif 000003
【表２】
2018036146.tif 000004
上記式IIにより得られたアミノ酸ごとの定量値(Cω)を比較し、それぞれの不確かさが十分小さく(例えば、相対不確かさが1〜3％である場合に、不確かさが十分小さいと判断することができる)、かつ拡張不確かさの範囲で一致することを確認の上、それらの平均値を、タンパク質試料の濃度とすることができる。なお、「それぞれの不確かさが十分小さく、かつ拡張不確かさの範囲で一致することを確認」するのは、加水分解がきちんと行われていることを確認する上で重要であるため、アミノ酸は複数種において定量値を算出し、相互比較することが好ましい。より好ましくは、全種のアミノ酸について、定量値の不確かさ、および、拡張不確かさを確認する形態である。
【００２０】
また、本発明の基材に対するタンパク質の吸着量を測定する方法の一実施の形態において、混合試料溶液を基材と接触させる工程が、混合試料溶液の一部を基材と接触させ、残りの一部を基材と接触させない工程であり、
加水分解の工程が、基材と接触させた混合試料溶液と、基材と接触させていない混合試料溶液と、校正用溶液とを加水分解する工程であり、
蛍光標識する工程が、加水分解処理後の各混合試料溶液と校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、各混合試料溶液および校正溶液中のアミノ酸を蛍光標識する工程であり、
タンパク質吸着量を算出する工程が、各混合試料溶液のそれぞれに含まれるアミノ酸量を、校正用溶液中のアミノ酸量に基づき定量し、定量した値の差によりタンパク質の吸着量を算出する工程とすることができる。
すなわち、(ｉ)基材に対して吸着反応させたタンパク質試料溶液と(ｉｉ)基材に対して吸着反応させていないタンパク質試料溶液を調製・加水分解し、それぞれについて、(ｉｉｉ)校正用溶液の加水分解物を用いてアミノ酸量を算出することにより、当該タンパク質由来のアミノ酸量をそれぞれ定量することができる。次いで、(ｉ)と(ｉｉ)とのアミノ酸の定量値の差をもとに、基材に対する吸着の絶対量の算出を可能とする。
【００２１】
また、本発明は、基材のタンパク質吸着量を測定するためのキットも提供する。
本発明に係る当該キットは、非タンパク質構成アミノ酸、アミノ酸認証標準物質を含むことを特徴とする。
本発明のキットは、その他、基材に対するタンパク質の吸着の評価において使用される試薬(非タンパク質構成アミノ酸、アミノ酸認証標準物質、加水分解用試薬(塩酸、フェノール)、蛍光試薬など)、溶媒(トリスバッファー、リン酸バッファー)や器具(蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフィなど)をさらに含むことができる。
【００２２】
また、本発明は、タンパク質の低吸着性の基材をスクリーニングする方法を提供する。
当該方法は、
前記タンパク質と前記非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、混合試料溶液を調製する工程と、
前記タンパク質に対応するアミノ酸混合標準液と非タンパク質構成アミノ酸とを混合して、校正用溶液を調製する工程と、
前記混合試料溶液を基材と接触させる工程と、
前記混合試料溶液に含まれる前記タンパク質および前記非タンパク質構成アミノ酸を加水分解する工程と、
加水分解処理後の前記混合試料溶液、および、前記校正用溶液中に蛍光試薬を添加して、前記混合溶液中の前記タンパク質由来のアミノ酸と前記校正用溶液中の前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸、および、前記非タンパク質構成アミノ酸とを蛍光標識する工程と、
混合溶液中の蛍光標識したアミノ酸を定量することにより、基材の接触によるタンパク質吸着量を算出する工程であって、前記タンパク質由来のアミノ酸の定量値を、前記アミノ酸混合標準液由来のアミノ酸の定量値で校正し、かつ非タンパク質構成アミノ酸の定量値で補正する工程とを含み、
得られたタンパク質吸着量により基材のタンパク質の吸着性を評価する、スクリーニング方法に関する。
【実施例】
【００２３】
（１.タンパク質試料）
下記試験においては、オリエンタル酵母工業(株)が製造している大腸菌を利用して発現した遺伝子組換え型ヒトＣ反応性蛋白(C-reactive protein, CRP)の緩衝溶液を使用した。本タンパク質溶液は、20mM Tris-HCl (pH7.5)、0.14M NaCl、2mM CaCl2、0.05% NaN3を含む緩衝液に溶解した状態で、約1mg/mLとなるように調製されている。
【００２４】
（２.試薬）
校正用のアミノ酸混合標準液は、すべてタンパク質を構成する17種類のアミノ酸認証標準物質(国立研究開発法人  産業技術総合研究所  計量標準総合センタ-より入手)をもとに作製した。各アミノ酸の0.1N塩酸溶液を用い、タンパク質試料(CRP)中の各アミノ酸の分子比とほぼ一致するような混合液を質量比混合法により調製した。アミノ酸混合標準液中の各アミノ酸の濃度は、おおよそ240〜840nmol g-1である。
【００２５】
内部標準として使用する、非タンパク質構成アミノ酸は、図３に示されるように(図３に開示されるクロマトグラム中、文字の背景が強調されていないアミノ酸が非タンパク質性アミノ酸)、蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフィ(LC/FL)の系において、タンパク質構成アミノ酸と分離可能なアミノ酸であれば、使用できる。本試験においては、非タンパク質構成アミノ酸として、α-アミノ酪酸(α-Amino butyric acid, AABA)またはノルロイシン(Norleucine, Nle)を用いた。内部標準液は、α-アミノ酪酸またはノルロイシン(いずれも和光純薬工業(株)社製)と0.1N塩酸を用いて、質量比混合法により適当濃度の溶液調製を個別に行った。それぞれの内部標準液の濃度は、おおよそ500nmol g-1である。
【００２６】
（３.校正用アミノ酸混合標準液と内部標準液の校正用溶液の調製）
校正用溶液については、アミノ酸混合標準液と内部標準液の混合比が0.5：1〜2：1となるような５系列を、質量比混合法により調製した。
【００２７】
（４.被験体への吸着反応）
タンパク質試料溶液と内部標準液は、順次、被験体の容器中に質量混合法により採取を行い、ガラスバイアル(基材)タンパク質を吸着させた。容器に蓋をして、軽く混合した後、4℃にて一晩放置し、吸着反応を行った。
【００２８】
（５.タンパク質のアミノ酸への加水分解）
加水分解用のガラス製サンプルチューブ(5mm × 50mm Pyrex)に吸着反応後のタンパク試料溶液を適量移し取り、加水分解用バキュームバイアル(Waters社製)に入れた。吸着反応前のタンパク質試料については、試料溶液と内部標準液を、ガラス製サンプルチューブに順に秤量してから、同様に加水分解用バキュームバイアル(Waters社製)に入れた。校正用溶液に関しては、上記３.に示した方法で、予め質量比混合法により別途調製しておいたものを、加水分解用ガラスチューブに適量移し取り、同様に加水分解用バキュームバイアル(Waters社製)に入れた。加水分解用バキュームバイアルをPico-Tag Workstation(Waters社製)にセットし、直ちに試料を蒸発乾固させた後、6mol/L 塩酸, 1％フェノールを加えて、130℃、24時間気相で加水分解を行った。
【００２９】
（６.蛍光法のための前処理）
加水分解後のサンプルを乾固後、20mmol/L HClを加えて溶解させ、市販キットによりAQC(6-aminoquinolyl-N- hydroxysuccinimidyl carbamate)で誘導体化して測定用サンプルとした。
【００３０】
（７.高速液体クロマトグラフィによるアミノ酸の測定）
LC/FLの使用装置は高速液体クロマトグラフ(島津製)、逆相モードカラム(AccQ-Tag Column(日本ウォーターズ製))、および蛍光検出器(日本ウォーターズ製 2475)をPEEKチューブで接続して用いた。LC/FLの測定条件は、下記表３に示す条件とした。
【表３】
2018036146.tif 000005
【００３１】
（８.吸着タンパク質の絶対量の算出）
上記３.〜５.に記載の質量比混合法調製時に得られた各溶液の質量と、７.に記載の測定により得られた各ピーク面積をもとに試料由来のアミノ酸濃度をアミノ酸ごとに求めた。一例として一点検量線法により定量した場合の計算式を下記に示す。
【表４】
2018036146.tif 000006
【００３２】
上記で得た試料由来のアミノ酸濃度(Cx)をもとにタンパク質としての濃度(Cω)をアミノ酸ごとに換算した。計算式を下記に示す。
【表５】
2018036146.tif 000007
【００３３】
アミノ酸ごとに得られた定量値(Cω)を比較し、それぞれの不確かさが十分小さく、かつ拡張不確かさの範囲で一致することを確認の上、それらの平均値を、タンパク質試料の濃度とした。
【００３４】
吸着反応前、吸着反応後のタンパク試料それぞれについて、上記８.に記載の手順に従い、試料濃度を求めた。また、それらの差分を被験体容器への吸着絶対量とした。なお、本実施例の方法において、約1mg/mLのタンパク質試料を用いてガラスバイアルに対して吸着反応を行った際、約2.5μg/cm2の吸着絶対量の値を算出することができた。
【００３５】
（９．蛍光アミノ酸分析によるアミノ酸の定量の精度について）
参考文献(Kato, M et al., “Application of amino acid analysis using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with isotope dilution mass spectrometry for peptide and protein quantification”, Journal of Chromatography B  877, 3059-3064 (2009))の表２に示されるように、同一のペプチド溶液(アンジオテンシンＩ認証標準物質)の加水分解物を同位体希釈アミノ酸分析(IDMS法)と蛍光アミノ酸分析(AQC法)のそれぞれでアミノ酸の定量値を比較した結果、ほぼ同等の定量結果が得られている。この結果は、本発明の「蛍光アミノ酸分析」の方法が、従来の「同位体標識アミノ酸分析」と同等の精度でタンパク質加水分解後のアミノ酸の定量を実施可能であることを支持している。
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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