(57)【要約】【課題】新たな抗原を標的とする新規キメラ抗原受容体を提供する。【解決手段】ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、膜貫通ドメインと、活性化シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、膜貫通ドメインと、活性化シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
細胞外ヒンジドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記活性化シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζの活性化シグナルドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記膜貫通ドメインが、ＮＫｐ４４、ＣＤ８α、及びＣＤ２８からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記細胞外ヒンジドメインが、ＮＫｐ４４、ＣＤ８α、及びＣＤ２８からなる群より選択されるタンパク質の細胞外ヒンジドメインを含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２２〜３２９番目のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
【請求項１１】
Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項８に記載のポリヌクレオチド又は請求項９に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
【請求項１３】
前記細胞がＴ細胞又はナチュラルキラー細胞である、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１０又は１１に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１０又は１１に記載の細胞を含む、腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、キメラ抗原受容体を発現する細胞、及び前記細胞を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんに対する治療方法として、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）遺伝子を導入したＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を用いる養子免疫療法が注目されている。ＣＡＲは、単鎖抗体などを抗原結合部位とする人工受容体であり、１９９３年に、イスラエルのＥｓｈｈａｒらが初めてＣＡＲのコンセプトを確立した（非特許文献１）。ＣＡＲは、リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、活性化シグナル伝達ドメインとを有し、リガンド結合ドメインにリガンドが結合することにより、活性化シグナルがＴ細胞内に伝達される。
【０００３】
ＣＡＲの臨床効果としては、リガンド結合ドメインに、ＣＤ１９に結合する一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｓｃＦｖ）を使用したＣＡＲを導入したＴ細胞（特許文献１、非特許文献２）が、難治性・再発性Ｂ細胞性白血病に対して劇的な効果を示したことが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、ＣＤ１９はＢ細胞のみに発現する抗原であり、固形腫瘍等には適用できない。また、他の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲの研究も進められているが、十分な臨床効果が得られていないのが現状である。
【０００４】
固形腫瘍を含む悪性腫瘍に対して臨床効果を示すＣＡＲを開発するためには、抗原の選択が重要である。ＣＡＲが標的とする抗原は、腫瘍細胞表面に存在する抗原である必要があり、かつ正常細胞では発現していないか極めて低発現の抗原である、若しくは喪失しても生体の生存に影響のない細胞に発現が限定されている抗原である必要がある。ＣＡＲ−Ｔは、標的抗原を細胞表面上に有する細胞に対して、極めて高い細胞傷害活性を示す。そのため、抗体薬では問題とならなかったような正常細胞における低レベルの発現であっても、ＣＡＲ−Ｔ療法においては、重篤な副作用を引き起こす恐れがある。したがって、既に抗体医薬の標的として実用化されている抗原であっても、ＣＡＲ−Ｔ療法の標的抗原として使用できるもの限られている。このような標的抗原の少なさが、ＣＡＲ−Ｔ療法の臨床応用における大きな障壁となっている。
【０００５】
また、従来、ＣＡＲのリガンド結合ドメインには、標的抗原に結合するｓｃＦｖが使用されてきた。そのため、新たな抗原を標的とするＣＡＲを作成しようとする場合には、まず当該抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を取得し、さらに当該モノクローナル抗体の可変領域からｓｃＦｖを作成する必要があった。
【０００６】
一方、リガンド結合ドメインにｓｃＦｖを使用せず、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞傷害性受容体（ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＮＣＲ）の１種であるＮＫｐ３０のリガンド結合ドメインを、ＣＡＲのリガンド結合ドメインとして使用する方法が報告されている（特許文献２）。ＮＣＲは、ＮＫｐ３０のほかにＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６が知られており、ＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害性に重要な役割を果たしている。これらのＮＣＲにリガンドが結合すると、ＮＫ細胞内に活性化シグナルが伝達されて、ＮＫ細胞が活性化され細胞傷害性顆粒の放出やサイトカイン産生が起こる。ＮＫｐ３０のリガンド結合ドメインを使用した場合、ＣＡＲの作成にあたってｓｃＦｖを取得しなくてもよいという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第８３９９６４５号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１３／０３３６２６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Eshhar Z, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1993, 90(2): 720-4.
【非特許文献２】Imai C, et al. Leukemia 2004, 18(4): 676-84.
【非特許文献３】Maude SL, et al. N Engl J Med. 2004, 371(16): 1507-17.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ療法では、現在までのところ、ＣＤ１９以外に臨床的に有効な標的抗原が見出されていない。さらに、腫瘍は、その種類によって発現する抗原が異なっているため、ある腫瘍に有効な標的抗原が見出されても、他の腫瘍に対しては有効ではないことが多い。そのため、ＣＡＲ−Ｔ療法を幅広い腫瘍に応用するためには、標的抗原の探索が重要な課題となっている。
【００１０】
特許文献２には、ＮＫｐ３０のリガンド結合ドメインを使用したＣＡＲが記載されているが、臨床効果や適用範囲は未知数である。したがって、異なる抗原を標的とする新規ＣＡＲの開発は、ＣＡＲ−Ｔ療法の臨床応用を進めていくうえで、極めて重要である。
【００１１】
そこで、本発明は、新たな抗原を標的とする新規ＣＡＲ、及び当該ＣＡＲを発現し、かつ腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示すＣＡＲ発現細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下の通りである。
（１）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、膜貫通ドメインと、活性化シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体。
（２）細胞外ヒンジドメインをさらに含む、（１）に記載のキメラ抗原受容体。
（３）共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、（１）又は（２）に記載のキメラ抗原受容体。
（４）前記活性化シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζの活性化シグナルドメインを含む、（１）〜（３）のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
（５）前記膜貫通ドメインが、ＮＫｐ４４、ＣＤ８α、及びＣＤ２８からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
（６）前記細胞外ヒンジドメインが、ＮＫｐ４４、ＣＤ８α、及びＣＤ２８からなる群より選択されるタンパク質の細胞外ヒンジドメインを含む、（２）〜（５）のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
（７）配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２２〜３２９番目のアミノ酸配列を含む、（１）に記載のキメラ抗原受容体。
（８）（１）〜（７）のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
（９）（８）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１０）（１）〜（７）のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
（１１）Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞である、（１０）に記載の細胞。
（１２）（８）に記載のポリヌクレオチド又は（９）に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
（１３）前記細胞がＴ細胞又はナチュラルキラー細胞である、（１２）に記載の製造方法。
（１４）（１０）又は（１１）に記載の細胞を含む、医薬組成物。
（１５）（１０）又は（１１）に記載の細胞を含む、腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＮＫｐ４４リガンドを標的とする新規ＣＡＲ、及び当該ＣＡＲを発現し、かつ腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示すＣＡＲ発現細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態にかかる各種ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲコンストラクトの模式図である。図中、ＳＰはシグナルペプチド、Ｉｇは免疫グロブリンドメイン、ＥＨは細胞外ヒンジドメイン、ＴＭは膜貫通ドメイン、ＣＳは共刺激分子伝達ドメイン、ＡＳは活性化シグナル伝達ドメインを示す。
【図２】ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲ遺伝子を導入したＴ細胞及びＮＫ細胞におけるＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。
【図３】ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲ遺伝子（ＥＨ（ｐ４４）−ＴＭ（ＣＤ２８）−ＡＳ（ＣＤ３ζ））を導入したＴ細胞（ＮＫｐ４４−ＣＡＲＴ）の細胞傷害性評価試験の結果を示す。（Ａ）は骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、（Ｂ）はＢ細胞性白血病（Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、（Ｃ）はＴ細胞性白血病（Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）の各細胞株をそれぞれ標的細胞として使用した。各グラフの右上に、標的細胞に使用した細胞株名を示した。（Ｄ）は自己の活性化Ｔ細胞（Ａｕｔｏ−Ｔ  ｃｅｌｌ）又は他家非活性化Ｔ細胞（Ａｌｌｏ−Ｔ  ｃｅｌｌ）を標的細胞として使用した。
【図４】骨髄性白血病株（Ｋ５６２）と共培養したＮＫｐ４４−ＣＡＲＴのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［キメラ抗原受容体］
１実施形態において、本発明は、ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、膜貫通ドメインと、活性化シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体を提供する。
【００１６】
本明細書において、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、少なくとも１つのリガンド結合ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの活性化シグナル伝達ドメインとを含む、キメラタンパク質を意味する。なお、キメラタンパク質とは、少なくとも２種以上の異種タンパク質由来の領域を含むタンパク質を意味する。本明細書において、ＣＡＲは、上記３つのドメインのみを含むものに限定されず、他のドメインを含むものを包含する。一般的に、細胞内ドメインとして、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）・ＣＤ３複合体の活性化シグナル伝達ドメインのみを有するものを第１世代ＣＡＲ、活性化シグナル伝達ドメインに加えて共刺激分子由来の共刺激シグナル伝達ドメインを有するものを第２世代ＣＡＲ、活性化シグナル伝達ドメインに加えて複数の共刺激シグナル伝達ドメインを有するものを第３世代ＣＡＲと呼ぶが、本明細書におけるＣＡＲは、これら全てを包含する。
【００１７】
＜ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメイン＞
本実施形態のＣＡＲは、リガンド結合ドメインとして、ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインを含む。
【００１８】
ＮＫｐ４４は、ＮＫ細胞のＮＣＲの１種であり、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性に重要な役割を果たしている。ＮＫｐ４４にリガンドが結合すると、ＮＫ細胞内に活性化シグナルが伝達されて、ＮＫ細胞が活性化され、細胞傷害性顆粒の放出やサイトカイン産生が起こる。ＮＫｐ４４のリガンドは、造血器腫瘍を含む幅広い腫瘍細胞において発現していると報告されており、ＮＫｐ４４へのリガンドの結合を介して、これらのＮＫｐ４４リガンド発現腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性が発現される。なお、ＮＫｐ４４のリガンドとしては、現在までに、ＭＬＬ５（Baycheiler F, et al. Blood 2013, 122(17): 2935-42）、及びＰＣＮＡ（Rosental B, et al. J Immunol 2011, 187: 5693-5702）が報告されている。ヒトＭＬＬ５のアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＮＰ＿０６１１５２（塩基配列：ＮＭ＿０１８６８２．３）及びＮＰ＿８９１８４７．１（塩基配列：ＮＭ＿１８２９３１．２）を挙げることができ、ヒトＰＣＮＡのアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＮＰ＿００２５８３．１（塩基配列：ＮＭ＿００２５９２．２）及びＮＰ＿８７２５９０．１（塩基配列：ＮＭ＿１８２６４９．１）を挙げることができるが、これらに限定されない。ＮＫｐ４４は、非活性化ＮＫ細胞では発現しておらず、活性化ＮＫ細胞で発現する。本明細書において、「ＮＫｐ４４」とは、上記のような性質を有する全てのタンパク質を包含する。
【００１９】
本実施形態のＣＡＲにおいて、ＮＫｐ４４の由来する生物は特に限定されず、ヒト由来のＮＫｐ４４、並びにマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳動物のＮＫｐ４４であることができるが、ヒトＮＫｐ４４であることが好ましい。ヒトＮＫｐ４４のアミノ酸配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＮＰ＿００４８１９．２（アイソフォーム１）、ＮＰ＿００１１８６４３８．１（アイソフォーム２）及びＮＰ＿００１１８６４３９．１（アイソフォーム３）等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらのアミノ酸配列からなるヒトＮＫｐ４４は、ヒトＮＫｐ４４のバリアントであり、いずれも上記のようなＮＫｐ４４の特徴を有する。ただし、ＮＫｐ４４は、これらのアミノ酸配列を有するものに限定されず、これらの変異体及び種間相同体を包含する。また、上記アイソフォーム１〜３の他に、ＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等の配列データベースに登録されている他のアミノ酸配列を有するものであってもよく、それらの変異体であってもよい。
【００２０】
なお、上記のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列としては、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿００４８２８．３（アイソフォーム１）、ＮＭ＿００１１９９５０９．１(アイソフォーム)２、及びＮＭ＿００１１９９５１０．１（アイソフォーム３）が登録されている。ヒトＮＫｐ４４のアミノ酸配列の典型例として、アイソフォーム１の塩基配列及びアミノ酸配列（ＮＭ＿００４８２８．３，ＮＰ＿００４８１９．２）をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
【００２１】
前記ヒトＮＫｐ４４の変異体の例としては、例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列と比較して、１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、又は１〜１０個程度の変異を有し、かつ上記したＮＫｐ４４の機能を保持するタンパク質等が挙げられる。なお、変異は、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。あるいは、前記ヒトＮＫｐ４４の変異体の他の例としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつ上記したＮＫｐ４４機能を保持するタンパク質等が挙げられる。なお、アミノ酸配列同士の配列同一性は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。
【００２２】
ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインは、ＮＫｐ４４のリガンド結合ドメインとして機能し、ＮＫｐ４４リガンドに結合する機能を有する。ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインは、ＮＫｐ４４の細胞外領域に位置し、免疫グロブリン類似構造を有する。ヒトＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインのアミノ酸配列としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２２〜１３０番目のアミノ酸配列を有するもの等を挙げることができる。ただし、ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインは、上記アミノ酸配列を含むものに限定されず、ＮＫｐ４４リガンドに対する結合能を有するポリペプチド全てを包含する。
【００２３】
ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインの例としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかに記載のポリペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉ）配列番号４のＮ末端から２２〜１３０番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と比較して、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、又は１〜５個、又は１〜３個程度の変異を有し、かつＮＫｐ４４リガンドに対する結合能を有するポリペプチド（前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい）；
（ｉｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を含み、かつＮＫｐ４４リガンドに対する結合能を有するポリペプチド；並びに
（ｉｖ）（ｉ）のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＫｐ４４リガンドに対する結合能を有するポリペプチド（前記複数個とは、２〜３０個であり、好ましくは２〜２０個であり、より好ましくは２〜１０個であり、さらに好ましくは２〜５個である）。
【００２４】
＜膜貫通ドメイン＞
本実施形態のＣＡＲは、少なくとも１つの膜貫通ドメインを有する。本実施形態のＣＡＲに使用可能な膜貫通ドメインは、細胞膜を貫通する機能を有するポリペプチドであれば特に限定されない。膜貫通ドメインは、天然タンパク質に由来するものであってもよく、人為的に設計したものであってもよい。天然タンパク質に由来する膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質から取得することができる。本実施形態のＣＡＲにおいて、膜貫通ドメインは、ＮＫｐ４４免疫グロブリンドメインに対するリガンドの結合に対応して、活性化シグナル伝達ドメインに活性化シグナルを伝達し得る。
【００２５】
本実施形態のＣＡＲに使用可能な膜貫通ドメインが由来するタンパク質としては、例えば、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６等を挙げることができる。また、好ましい例としては、ＣＤ２８、ＣＤ８α、ＮＫｐ４４等を挙げることができ、より好ましい例としては、ＣＤ２８を挙げることができる。本実施形態のＣＡＲが含む膜貫通ドメインは、これらのタンパク質の膜貫通ドメインを含むものであることができ、これらのタンパク質の膜貫通ドメインからなるものであることができる。
【００２６】
ＣＤ２８、ＣＤ８α及びＮＫｐ４４の膜貫通ドメインのアミノ酸配列の例としては、それぞれ配列番号８に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１５３〜１７９番目のアミノ酸配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１８２〜２０６番目のアミノ酸配列、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１９１〜２１３番目のアミノ酸配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２７】
また、膜貫通ドメインは、上記のような天然タンパク質由来の膜貫通ドメインの変異体であってもよい。天然タンパク質由来の膜貫通ドメインの変異体の例としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のポリペプチド等が挙げられる。
（ｉ）天然タンパク質由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と比較して、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、又は１〜５個、又は１〜３個程度の変異を有し、かつ膜貫通能を有するポリペプチド（前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい）；
（ｉｉ）天然タンパク質由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を含み、かつ膜貫通能を有するポリペプチド；並びに
（ｉｉｉ）天然タンパク質由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通能を有するポリペプチド（前記複数個とは、２〜３０個であり、好ましくは２〜２０個であり、より好ましくは２〜１０個であり、さらに好ましくは２〜５個である）。
【００２８】
＜活性化シグナル伝達ドメイン＞
本実施形態のＣＡＲは、少なくとも１つの活性化シグナル伝達ドメインを含む。Ｔ細胞は、ＴＣＲにＭＨＣ・ペプチド複合体が結合すると、ＴＣＲ・ＣＤ３複合体を介して細胞内にシグナルが伝達され、様々なリン酸化シグナルが惹起される（一次シグナル伝達）。本明細書において、「活性化シグナル伝達ドメイン」とは、上記のようなＴＣＲに対する抗原ペプチドの結合によって誘導される一次シグナル伝達に関与するタンパク質の、当該シグナル伝達に関与するドメインを意味する。
【００２９】
本実施形態のＣＡＲに使用可能な活性化シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達に関与するタンパク質の活性化シグナル伝達ドメインであれば、特に限定されない。一次シグナル伝達には、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）が関与することが知られている。そのため、ＩＴＡＭを有するタンパク質は、活性化シグナル伝達ドメインが由来するタンパク質の好適な例である。ＩＴＡＭを有するタンパク質の例としては、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ等を挙げることができる。これらのタンパク質のＩＴＡＭを含む活性化シグナル伝達ドメインは、本実施形態のＣＡＲに使用する活性化シグナル伝達ドメインの好ましい例である。本実施形態のＣＡＲが含む活性化シグナル伝達ドメインは、これらのタンパク質の活性化シグナル伝達ドメインを含むものであることができ、これらのタンパク質の活性化シグナル伝達ドメインからなるものであることができる。
【００３０】
上記の中でも、より好ましい例としては、ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む活性化シグナル伝達ドメインが挙げられる。ＣＤ３ζの活性化シグナルドメインのアミノ酸配列の例としては、配列番号１２に記載のアミノ酸配列のＮ末端から５２〜１６３番目のアミノ酸配列を挙げることができるが、これに限定されない。
【００３１】
また、活性化シグナル伝達ドメインは、上記のような天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインの変異体であってもよい。天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインの変異体の例としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のポリペプチド等が挙げられる。
（ｉ）天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列と比較して、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、又は１〜５個、又は１〜３個程度の変異を有し、かつ一次シグナル伝達能を有するポリペプチド（前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい）；
（ｉｉ）天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を含み、かつ一次シグナル伝達能を有するポリペプチド；並びに
（ｉｉｉ）天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一次シグナル伝達能を有するポリペプチド（前記複数個とは、２〜３０個であり、好ましくは２〜２０個であり、より好ましくは２〜１０個であり、さらに好ましくは２〜５個である）。
【００３２】
また、活性化シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭ、又は天然ＩＴＡＭから改変された改変ＩＴＡＭを１つ又は複数含むように、人為的に設計されたものであってもよい。一次シグナル伝達能を有する限りＩＴＡＭの数は特に限定されないが、例えば、１〜５個程度、又は１〜３個程度とすることができる。
【００３３】
また、本実施形態のＣＡＲが含む活性化シグナル伝達ドメインの数は、１つに限定されず、複数の活性化シグナル伝達ドメインを含むこともできる。この場合、ＣＡＲが含む複数の活性化シグナル伝達ドメインは、同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。例えば、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインに加えて、他のタンパク質由来の活性化シグナル伝達ドメインを含むようにしてもよい。本実施形態のＣＡＲは、活性化シグナル伝達ドメインを、例えば、１〜５個、１〜３個、又は１個若しくは２個含むことができる。
【００３４】
＜その他のドメイン＞
本実施形態のＣＡＲは、ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び活性化シグナル伝達ドメインに加えて、他のドメインを含むこともできる。他のドメインの例としては、細胞外ヒンジドメイン、共刺激伝達ドメイン、シグナルペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
（細胞外ヒンジドメイン）
本実施形態のＣＡＲは、好ましい態様において、細胞外ヒンジドメインを含み得る。本明細書において、「細胞外ヒンジドメイン」とは、細胞外のリガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結するドメインを意味する。細胞外ヒンジドメインは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインを連結できるものであれば特に限定されない。天然タンパク質に由来するものであってもよく、人為的に設計されたものであってもよい。細胞外ヒンジドメインは、例えば、１０〜３００個程度のアミノ酸、好ましくは２０〜１００個程度のアミノ酸で構成することができる。細胞外ヒンジドメインは、ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインのリガンド結合能を妨げず、かつ活性化シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達を妨げないものであることが好ましい。
【００３６】
本実施形態のＣＡＲに使用可能な細胞外ヒンジドメインとしては、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６の細胞外ヒンジドメイン等が挙げられる。また、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ４等）のヒンジ領域を使用してもよい。好ましい例としては、ＣＤ８α、ＣＤ２８及びＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインが挙げることができ、より好ましい例としてはＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインを挙げることができる。
【００３７】
ＣＤ８α、ＣＤ２８及びＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインのアミノ酸配列の例としては、それぞれ配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１２８〜１８２番目のアミノ酸配列、配列番号８に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１５３〜１７９番目のアミノ酸配列、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１３１〜１９０番目のアミノ酸配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３８】
また、細胞外ヒンジドメインは、上記のような天然タンパク質由来の細胞外ヒンジドメインの変異体であってもよい。天然タンパク質由来の細胞外ヒンジドメインの変異体の例としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のポリペプチド等が挙げられる。
（ｉ）天然タンパク質由来の細胞外ヒンジドメインのアミノ酸配列と比較して、１〜２０個、１〜１０個、又は１〜５個、又は１〜３個程度の変異を有し、かつＮＫｐ４４免疫グロブリンドメインと膜貫通ドメインとを連結可能なポリペプチド（前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい）；
（ｉｉ）天然タンパク質由来の細胞外ヒンジドメインのアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を含み、かつＮＫｐ４４免疫グロブリンドメインと膜貫通ドメインとを連結可能なポリペプチド；並びに
（ｉｉｉ）天然タンパク質由来の細胞外ヒンジドメインのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＫｐ４４免疫グロブリンドメインと膜貫通ドメインとを連結可能なポリペプチド（前記複数個とは、２〜３０個であり、好ましくは２〜２０個であり、より好ましくは２〜１０個であり、さらに好ましくは２〜５個である）。
【００３９】
（共刺激シグナル伝達ドメイン）
本実施形態のＣＡＲは、一態様において、共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。Ｔ細胞上に発現する共刺激分子は、抗原提示細胞上に発現する各共刺激分子に特異的なリガンドとの結合により、細胞内に共刺激シグナルを伝達し、Ｔ細胞の活性化を補助することが知られている（二次シグナル伝達）。本明細書において、「共刺激シグナル伝達ドメイン」とは、上記のような共刺激分子の共刺激シグナル伝達に関与する細胞内ドメインを意味する。
【００４０】
本実施形態のＣＡＲに使用可能な共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の共刺激シグナル伝達に関与する細胞内ドメインであれば、特に限定されない。共刺激分子の例としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＯＸＯ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ，ＣＤ１５４等を挙げることができる。本実施形態のＣＡＲは、これらの共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができ、これらの共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインからなるものであることができる。本実施形態のＣＡＲが含む共刺激シグナル伝達ドメインの好ましい例としては、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、及びＯＸＯ４０の共御刺激シグナル伝達ドメインを挙げることができ、より好ましい例としては４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインを挙げることができる。４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列の例としては、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２１４〜２５５番目のアミノ酸配列を挙げることができるが、これに限定されない。
【００４１】
また、共刺激シグナル伝達ドメインは、上記のような天然タンパク質由来の共刺激シグナル伝達ドメインの変異体であってもよい。天然タンパク質由来の共刺激シグナル伝達ドメインの変異体の例としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のポリペプチド等が挙げられる。
（ｉ）天然タンパク質由来の共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列と比較して、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、又は１〜５個、又は１〜３個程度の変異を有し、かつ共刺激シグナル伝達能を有するポリペプチド（前記変異は欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい）；
（ｉｉ）天然タンパク質由来の共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を含み、かつ共刺激シグナル伝達能を有するポリペプチド；並びに
（ｉｉｉ）天然タンパク質由来の共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ共刺激シグナル伝達能を有するポリペプチド（前記複数個とは、２〜３０個であり、好ましくは２〜２０個であり、より好ましくは２〜１０個であり、さらに好ましくは２〜５個である）。
【００４２】
本実施形態のＣＡＲが含み得る共刺激シグナル伝達ドメインの数は、１つに限定されず、複数であってもよい。本実施形態のＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインを、例えば、１〜５個、１〜３個、又は１個若しくは２個含むことができる。本実施形態のＣＡＲが複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む場合、複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。例えば、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインに加えて、他の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインを含むようにしてもよい。
【００４３】
（シグナルペプチド）
本実施形態のＣＡＲは、一態様において、シグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、膜タンパク質や分泌タンパク質の局在化を指示するペプチドである。シグナルペプチドは、一般的に、膜タンパク質のＮ末端に存在する５〜６０個程度のアミノ酸からなるペプチドであり、局在化の完了した成熟タンパク質では除去されている。
【００４４】
本実施形態のＣＡＲで使用可能なシグナルペプチドは、細胞膜への局在化を指示するシグナルペプチドであることが好ましく、膜タンパク質のシグナルペプチドであることが好ましい。シグナルペプチドの例としては、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６等のシグナルペプチドを挙げることができる。好ましい例としては、ＮＫｐ４４のシグナルペプチドを挙げることができる。ＮＫｐ４４のシグナルペプチドのアミノ酸配列の例としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１〜２１番目のアミノ酸配列を挙げることができるが、これに限定されない。
【００４５】
＜ＣＡＲの全体構造＞
本実施形態のＣＡＲにおいて、ＮＫｐ４４免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び活性化シグナル伝達ドメインは、前記の順番でＮ末端側から配置される。これらの各ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、他のドメインやスペーサー配列等を介して連結されていてもよい。
【００４６】
本実施形態のＣＡＲが細胞外ヒンジドメインを含む場合、細胞外ヒンジドメインは、ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと膜貫通ドメインとの間に配置される。また、本実施形態のＣＡＲがシグナルペプチドを含む場合、シグナルペプチドは、ＣＡＲのＮ末端に配置される。
【００４７】
また、本実施形態のＣＡＲが共刺激シグナル伝達ドメインを含む場合、共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと活性化シグナル伝達ドメインとの間か、活性化シグナル伝達ドメインのＣ末端側に配置される。なお、本実施形態のＣＡＲが活性化シグナルドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインのいずれか又は両方を複数個含む場合、それらのドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端側において、任意の順番で配置することができる。好ましくは、共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと活性化シグナル伝達ドメインとの間に配置される。
【００４８】
本実施形態のＣＡＲの好ましい例としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｊ）のいずれかに記載の構造が挙げられるが、これらに限定されない。なお、（ａ）〜（ｊ）における各ドメインの記載順序は、各ドメインのＮ末端側からの配置順序に対応する。
（ａ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインと、ＮＫｐ４４の膜貫通ドメインと、ＮＫｐ４４の活性化シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｂ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインと、ＮＫｐ４４の膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｃ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ８αの膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｄ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＣＤ８αの細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ８αの膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｅ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ２８の膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｆ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＣＤ２８の細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ２８の膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｇ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ８αの膜貫通ドメインと、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｈ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＣＤ８αの細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ８αの膜貫通ドメインと、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｉ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＮＫｐ４４の細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ２８の膜貫通ドメインと、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
（ｊ）ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインと、ＣＤ２８の細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ２８の膜貫通ドメインと、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲ。
【００４９】
上記（ａ）〜（ｊ）の中でも、好ましいものとしては（ｃ）〜（ｊ）を挙げることができ、より好ましいものとしては（ｅ）を挙げることができる。（ｅ）のＣＡＲのアミノ酸配列の例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＡＲは、本実施形態のＣＡＲの好適な例である。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＣＡＲは、本実施形態のＣＡＲのより好適な例である。なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１〜２１番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドであり、細胞膜への局在化の過程で除去される。したがって、本実施形態のＣＡＲは、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２２〜３２９番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドであることもでき、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２２〜３２９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることもできる。
【００５０】
［キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド］
１実施形態において、本発明は、上記実施形態のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５１】
本実施形態のポリヌクレオチドは、ＮＫｐ４４免疫グロブリンドメインをコードする塩基配列と、膜貫通ドメインをコードする塩基配列と、活性化シグナル伝達ドメインをコードする塩基配列とを含む。また、これらの塩基配列に加えて、任意に、細胞外ヒンジドメインをコードする塩基配列、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする塩基配列、及びシグナルペプチドをコードする塩基配列等を含むことができる。
【００５２】
上記各ドメインの由来するタンパク質は、上記［キメラ抗原受容体］の項で記載したとおりであり、これらのドメインのアミノ酸配列は、公知のものを特に制限なく利用することができる。また、上記各ドメインのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ等の配列データベースから取得することもできる。そして、上記各ドメインをコードする塩基配列も、公知のものを利用することができ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ等の配列データベースに登録されているものを利用することができる。
【００５３】
また、上記各ドメインをコードする塩基配列は、公知のものに限定されず、上記各ドメインをコードする塩基配列であれば、使用可能である。遺伝子コードの縮重により、１つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は多数存在する。本実施形態のポリヌクレオチドの塩基配列は、上記実施形態のＣＡＲをコードする限り、遺伝子コードの縮重によって生じる複数の塩基配列のいずれであってもよい。
【００５４】
本実施形態のポリヌクレオチドにおいて、ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインをコードする塩基配列としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２２〜１３０番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
また、膜貫通ドメインとして、ＮＫｐ４４、ＣＤ８α、及びＣＤ２８のいずれかの膜貫通ドメインを用いる場合、これらのドメインをコードする塩基配列としては、それぞれ、配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１９１〜２１３番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１８１〜２０６番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１５３〜１７９番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
また、活性化シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ζの活性化シグナル伝達ドメインを用いる場合、当該ドメインをコードする塩基配列としては、配列番号１２に記載のアミノ酸配列のＮ末端から５２〜１６３番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
【００５５】
また、本実施形態のポリヌクレオチドが、細胞外ヒンジドメインをコードする塩基配列を含み、当該ドメインにＮＫｐ４４、ＣＤ８α、及びＣＤ２８のいずれかの細胞外ヒンジドメインを用いる場合、これらのドメインをコードする塩基配列としては、それぞれ、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１３１〜１９０番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１２８〜１８２番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１１３〜１５２番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
また、本実施形態のポリヌクレオチドが、共刺激シグナル伝達ドメインを含み、当該ドメインに４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインを用いる場合、当該ドメインをコードする塩基配列としては、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２１４〜２５５番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
また、本実施形態のポリヌクレオチドが、シグナルペプチドを含み、当該シグナルペプチドにＮＫｐ４４のシグナルペプチドを用いる場合、当該シグナルペプチドをコードする塩基配列としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１〜２１番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示することができる。
【００５６】
なお、上記各ドメインをコードするポリヌクレオチドのうち、ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＮＫ細胞から抽出したＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いて増幅することにより得ることができる。あるいは、ＮＫ細胞から抽出したＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いて増幅することにより得ることもできる。
【００５７】
また、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、又は活性化シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞から抽出したＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いて増幅することにより得ることができる。あるいは、Ｔ細胞から抽出したＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いて増幅することにより得ることもできる。
【００５８】
細胞外ヒンジドメインをコードするポリヌクレオチド、又は共刺激シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドもまた、Ｔ細胞から抽出したＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いて増幅することにより得ることができる。あるいは、Ｔ細胞から抽出したＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法等を用いて増幅することにより得ることもできる。
【００５９】
シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、ＮＫ細胞又はＴ細胞等から抽出したＤＮＡ又はＲＮＡから得ることができる。また、シグナルペプチドに長さが短いものを使用する場合には、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成法により合成してもよい。
【００６０】
上記各ドメインをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーは、各ドメインの公知の遺伝子配列から設計することができる。プライマーの例としては、例えば、本明細書の実施例に記載のもの等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本実施形態のポリヌクレオチドに、上記以外のドメインをコードする塩基配列を含ませる場合には、目的のドメインを発現する細胞からＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、適切なプライマーを設計してＰＣＲ法等を用いて増幅することにより、目的のドメインをコードするポリヌクレオチドを取得すればよい。上記のようにして得られた各ドメインをコードするポリヌクレオチドは、翻訳後の各ドメインの機能が失われない範囲内で、置換、欠失、付加等の改変を行ってもよい。
【００６２】
本実施形態のポリヌクレオチドは、上記のようにして得られた各ドメインをコードするポリヌクレオチドを、直接又はスペーサー介して連結することにより、得ることができる。なお、各ドメインをコードするポリヌクレオチドは、スペーサー等の介在配列を介さず、直接連結されていることが好ましい。各ドメインをコードするポリヌクレオチドの連結は、例えば、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法等の公知の方法を用いて行うことができる。
【００６３】
本実施形態のポリヌクレオチドの好適な例としては、配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができ、より好ましくは配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００６４】
本実施形態のポリヌクレオチドは、上記実施形態のＣＡＲをコードする塩基配列の他に、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル等の制御配列や、他のタンパク質をコードする塩基配列等を含んでいてもよい。
【００６５】
［キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター］
１実施形態において、本発明は、上記実施形態のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００６６】
本実施形態において、ベクターの種類は特に限定されず、一般的に使用される発現ベクター等を使用することができる。ベクターの例としては、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター等を挙げることができる。
【００６７】
ウイルスベクターとしては、例えば、センダイウイルスベクター、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等が挙げられる。
【００６８】
プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。
【００６９】
エピソーマルベクターは、染色体外で自律複製可能なベクターである。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、公知である（Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)）。エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、ＥＢＶにあっては複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ−１遺伝子、ＳＶ４０にあっては複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ＬＴ遺伝子が挙げられる。
【００７０】
人工染色体ベクターとしては、例えば、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等が挙げられる。
【００７１】
本実施形態のベクターは、上記実施形態のＣＡＲをコードする塩基配列の他に、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル等の制御配列、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする塩基配列、他のタンパク質をコードする塩基配列などを含んでいてもよい。
【００７２】
上記実施形態のＣＡＲをコードする塩基配列は、適切なプロモーターの制御下で発現されるように、ベクター内に配置されることが好ましい。プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。一例としては、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターとβ−グロビン遺伝子のポリＡシグナル部位を含む）等を挙げることができる。
【００７３】
また、他のタンパク質をコードする塩基配列としては、例えば、蛍光タンパク質遺伝子、レポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子、サイトカイン等のＴ細胞活性化に関与する分子をコードする遺伝子等を挙げることができる。また、他のタンパク質をコードする塩基配列は、ＣＡＲ発現細胞を投与したがん患者等の体内で、投与したＣＡＲ発現細胞のアポトーシスを適宜誘導するために、チミジンキナーゼ等の自殺遺伝子をコードする塩基配列であってもよい。
【００７４】
本実施形態のベクターは、プロモーター等の適切な塩基配列を有するベクターに、上記実施形態のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、得ることができる。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター配列の３’末端側に挿入されることが好ましい。本実施形態のベクターの作成には、市販の発現ベクター等を用いてもよい。
【００７５】
［キメラ抗原受容体を発現する細胞］
１実施形態において、本発明は、上記実施形態のＣＡＲを発現する細胞を提供する。
【００７６】
本実施形態の細胞は、上記実施形態のポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することにより得ることができる。したがって、一態様において、本発明は、上記実施形態のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入する工程を含む、ＣＡＲを発現する細胞の製造方法を提供する。
【００７７】
本実施形態において、細胞は、哺乳動物由来の細胞であることが好ましく、例えば、ヒト由来の細胞、又はマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳動物由来の細胞を用いることができる。細胞の種類は、特に限定されず、血液、骨髄液等の体液や、脾臓、胸腺、リンパ節などの組織、腫瘍やがん性腹水等から採取された細胞等を使用することができる。好ましい例としては、免疫細胞を挙げることができ、末梢血から分離された末梢血単核球等を好適に用いることができる。末梢血単核球に含まれる細胞の中でも、特に好ましい細胞としては、Ｔ細胞及びＮＫ細胞並びにこれらの前駆細胞を挙げることができる。Ｔ細胞の種類は、特に限定されず、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞等のいずれのＴ細胞であってもよい。
【００７８】
上記実施形態のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入する方法としては、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を挙げることができる。
【００７９】
また、例えば上記実施形態のベクターがレトロウイルスベクターである場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製してもよい。パッケージング細胞としては、例えば、ＰＧ１３、ＰＡ３１７、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ等を例示することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞をパッケージング細胞として用いることもできる。各種レトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、広く市販されているためこれらの市販品を用いてもよい。
【００８０】
上記実施形態のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入する際には、導入効率を向上させる機能性物質を用いることもできる。そのような機能性物質の例としては、フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメント等のウイルスベクターに結合する活性を有する物質が挙げられる。例えば、レトロウイルスベクターを導入する際には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメントであるレトロネクチン（登録商標）を好適に用いることができる。これらの機能性物質は適切な固相（例えば、プレート、シャーレ、コニカルチューブ、マイクロチューブ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用することができる。
【００８１】
上記実施形態のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入した後、当該細胞のＣＡＲの発現は、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫染色等の公知の方法により確認することができる。
【００８２】
本実施形態の細胞は、上記実施形態のＣＡＲを細胞膜上に発現している。前記ＣＡＲのＮＫｐ４４免疫グロブリンドメインにＮＫｐ４４リガンドが結合すると、本実施形態の細胞が活性化されて、細胞傷害性顆粒の放出やサイトカイン産生が起こる。これら細胞傷害性顆粒やサイトカインにより、ＮＫｐ４４リガンド発現細胞が破壊される。
【００８３】
［キメラ抗原受容体発現細胞を含む医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【００８４】
上記実施形態の細胞は、ＮＫｐ４４リガンド発現細胞に対して、特異的な細胞傷害性を示す。そのため、上記実施形態の細胞は、ＮＫｐ４４リガンド発現細胞が関与する疾患を治療又は予防するために使用することができる。ＮＫｐ４４リガンドは、造血器腫瘍を含む幅広い腫瘍細胞に発現していることから、上記実施形態の細胞を含む医薬組成物は、腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物として提供することができる。より具体的には、本実施形態の医薬組成物は、ＮＫｐ４４リガンドを発現する腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物として好適である。例えば、肺がん、悪性黒色腫、子宮頸がん、大腸がん、Ｂ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞性白血病、すい臓がん、乳がん、神経芽細胞腫、肝細胞がんを含む肝臓がん、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病等は、ＮＫｐ４４リガンドを発現することが報告されている（Byrd A, et al. Plos One 2007, 2(12): e1339; Baychelier F, et al. Blood 2013, 122(17): 2935-2942）。したがって、本実施形態の医薬組成物は、これらの腫瘍を治療又は予防するために好適に用いることができる。なお、本実施形態の医薬組成物は、前述した腫瘍に限定されず、ＮＫｐ４４リガンドを発現する腫瘍であれば、適用可能である。腫瘍がＮＫｐ４４リガンドを発現しているか否かは、抗ＮＫｐ４４リガンド抗体や、ＮＫｐ４４のリガンド結合領域と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質等を使用して、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫染色等の公知の方法を行うことにより確認することができる。
【００８５】
本実施形態の医薬組成物は、上記実施形態の細胞に加えて、薬学的に許容される担体等の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、薬学的に許容される担体のほか、サイトカイン等のＴ細胞活性化因子、免疫賦活剤、免疫チェックポイント阻害剤、他のＣＡＲを発現する細胞、抗炎症剤等を挙げることができるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体としては、細胞培養培地、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液を挙げることができる。
【００８６】
本実施形態の医薬組成物は、好ましくは、注射又は輸注により、患者に投与することができる。投与経路としては、静脈内投与が好ましいが、これに限定されず、腫瘍内への注入等により投与してもよい。
【００８７】
本実施形態の医薬組成物は、上記実施形態の細胞を治療的有効量含むことができる。投与量及び投与間隔は、投与対象の年齢、性別及び体重等、疾患の種類、進行度及び症状等、並びに投与方法等により、適宜選択することができる。投与量としては、治療的有効量を投与することができ、例えば、１回の投与において、投与細胞の個数でとして、１ｘ１０３〜１ｘ１０１０個／ｋｇ（体重）、好ましくは１ｘ１０４〜１ｘ１０９個／ｋｇ（体重）、より好ましくは１ｘ１０５〜１ｘ１０８個／ｋｇ（体重）とすることができる。
【００８８】
本実施形態の医薬組成物の投与間隔としては、例えば、１週毎、１０〜３０日毎、１月毎、３〜６月毎、１年毎等とすることができる。また、上記実施形態の細胞は、投与対象の体内で自律的に増殖できるため、１回きりの投与とすることもできる。また、投与後に体内のＣＡＲ発現細胞の数をモニタリングし、その結果に応じて投与時期を決定するようにしてもよい。
【００８９】
また、他の態様において、本発明は、腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、上記実施形態の細胞の使用を提供する。
また、他の態様において、本発明は、上記実施形態の細胞を対象に投与することを含む、腫瘍を治療又は予防する方法を提供する。
また、他の態様において、本発明は、腫瘍を治療又は予防するための上記実施形態の細胞を提供する。
【実施例】
【００９０】
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００９１】
［実験例１］ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲ遺伝子の作成
（ＮＫｐ４４遺伝子のクローニング）
実施例で作成した全てのＣＡＲにおいて、抗原認識部位には、ＮＫｐ４４のリガンド結合部位である免疫グロブリンドメインを使用した。なお、以下では、抗原認識部位にＮＫｐ４４のリガンド結合部位を用いたＣＡＲを、「ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲ」という。ＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインのクローニングは以下の手順で行った。
健常ドナーから同意のもとで末梢血を１０ｍＬ採取し、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法にて単核球を分離した。分離した単核球をフィーダー細胞（Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）と１週間共培養し、ナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞を増幅した。増幅したＮＫ細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴＭ  ＲＮＡ（ＴａＫａＲａ)を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  III  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写反応により相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。このｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を酵素に用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）法にて、野生型ＮＫｐ４４遺伝子アイソフォーム１（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：タンパク質：ＮＰ＿００４８１９．２（配列番号４），ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００４８２８．３（配列番号３））をクローニングした。なお、ＮＫｐ４４には、３種のアイソフォームが知られているが、他のアイソフォームのＩＤは以下の通りである；アイソフォーム２：ＮＰ＿００１１８６４３８．１，ＮＭ＿００１１９９５０９．１；アイソフォーム３：ＮＰ＿００１１８６４３９．１，ＮＭ＿００１１９９５１０．１。
【００９２】
（抗原認識部位以外のＣＡＲの各要素配列のクローニング）
ＣＡＲを構成する要素には、抗原認識ドメインの他に、細胞外ヒンジドメイン（ＥＨ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳ）、及び活性化シグナル伝達ドメイン（ＡＳ）がある。細胞外ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインには、ＣＤ８α及びＣＤ２８由来の要素を使用し、共刺激シグナル伝達ドメインには４−１ＢＢ由来の要素を使用した。活性化シグナル伝達ドメインにはＣＤ３ζ由来の要素を使用した。これらの配列のクローニングは以下の手順で行った。
フィトヘムアグルチニンで刺激したヒト末梢血Ｔ細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＣＤ８α（ＮＰ＿００１７５９．３：配列番号６，ＮＭ＿００１７６８．６：配列番号５）の細胞外ヒンジドメインの配列及び膜貫通ドメインの配列をＰＣＲ法でクローニングした。同様に、４−１ＢＢ（ＮＰ＿００１５５２．２：配列番号１０，ＮＭ＿００１５６１．５：配列番号９）、及びＣＤ３ζ（ＮＰ＿０００７２５．１：配列番号１２，ＮＭ＿０００７３４．３：配列番号１１）の活性化シグナル伝達ドメインの配列をクローニングした。ＣＤ２８(ＮＰ＿００６１３０．１：配列番号８，ＮＭ＿００６１３９．３：配列番号９)の細胞外ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインの配列は、Ｔ細胞性白血病細胞株ＪｕｒｋａｔからＲＮＡを抽出し、逆転写反応により得たｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法でクローニングした。なお、ＲＮＡの抽出、逆転写反応、及びＰＣＲ法は、上記「（ＮＫｐ４４遺伝子のクローニング）」で記載した方法と同様の方法で行った。
各要素のクローニングに使用したプライマーの配列を表１に示す。また、クローニングした各要素の全長アミノ酸配列における位置を、表２に示す。
【００９３】
【表１】
2018042531.tif 000002
【００９４】
【表２】
2018042531.tif 000003
【００９５】
（ＣＡＲ遺伝子コンストラクトの構築）
Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−ＰＣＲ法を用いて、ＣＡＲの各要素間に余分なヌクレオチドを挟むことなく、繋ぎ合わせることにより、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び活性化シグナル伝達ドメインの組合せの異なる複数種類のＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲ遺伝子を作成した。各要素の配列は、配列間に余分なヌクレオチドを挟んでいないため、作成されたＣＡＲ遺伝子から合成されるＣＡＲは、各要素間に余分なアミノ酸は含まない。
【００９６】
共刺激シグナル伝達ドメインを有さないＣＡＲは第一世代ＣＡＲと呼ばれ、共刺激シグナル伝達ドメインと活性化シグナル伝達ドメインとを有するものは第二世代ＣＡＲと呼ばれる。ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲ遺伝子として、第一世代ＣＡＲをまず作成し、次いで第二世代ＣＡＲを作成した。また、抗原認識ドメインにＮＫｐ４４の免疫グロブリンドメインを有するが、活性化シグナル伝達ドメインを有さないＣＡＲ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＣＡＲ）をコントロールとして作成した。作成したＣＡＲコンストラクトの模式図を図１に示す。
【００９７】
（ＣＡＲ遺伝子形質転換用ベクターの作成）
作成したＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲのＤＮＡは全て、５’側に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を、３’側にＸｈｏＩの認識部位を有している。ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩでＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲのＤＮＡを切断した後、Ｍｕｒｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターとライゲーションを行った。ライゲーション産物を用いて、コンピテントセルを形質転換した。ＬＢ培地上に形成された大腸菌コロニーを採取し、シークエンス解析により配列を確認した上で、採取した大腸菌を大容量のＬＢ液体培地で培養し、高濃度のＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲプラスミドを得た。得られたＣＡＲプラスミド、ウイルス構造蛋白プラスミド（ｐＥＱ−ＰＡＭ３−Ｅ）、及びエンベローププラスミド（ＲＤＦ）をリポフェクション法により２９３Ｔ細胞に一過性に感染させた（３プラスミドシステム）。２〜４日後に上清を採取し、ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲのレトロウイルス液を作成した。レトロウイルス液の力価は、ポリブレンの存在下でＨｅｌａ細胞への感染効率を測定することで決定した。
【００９８】
［実験例２］ヒトＴ細胞及びヒトｐｒｉｍａｒｙ  ＮＫ細胞へのＣＡＲ遺伝子の導入
（ヒトＴ細胞へのＣＡＲ遺伝子の導入）
健常ドナーの末梢血からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法にて単核球を分離した。分離した単核球から、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  （ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＣＤ３陽性細胞を単離した。Ｔ細胞活性化・増殖刺激用ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８，  ｇｉｂｃｏ）及びｒＩＬ−２を用いて、Ｔ細胞を４８〜７２時間刺激した。一方、レトロネクチン（登録商標）（ＴａＫａＲａ）を吸着させた１５ｍＬラウンドボトムチューブに、力価を測定したＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲレトロウイルス液を加え、３２℃、１２００〜１３００ｇで１２０分間遠心し、レトロウイルスをコニカルチューブに吸着させた（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｖｉｒｕｓ感染法）。このようにして作成したレトロネクチンコートチューブに、０．５〜２ｘ１０５個のＴ細胞、及び１０％の最終濃度でウシ血清（ＦＢＳ）を加えた培地（ＲＰＭＩ１６４０，  ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を２〜３ｍＬ加え、３７℃、５％  ＣＯ２の条件でインキュベーター内にて培養することで、Ｔ細胞へのＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲ遺伝子の導入を行った。ＣＡＲ遺伝子導入後、２〜３日毎に２００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ−２を添加した。
【００９９】
（ヒトＮＫ細胞へのＣＡＲ遺伝子の導入）
健常ドナーの末梢血から分離した単核球を、ｒＩＬ−２投与下でフィーダー細胞  Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）と共培養し、ＮＫ細胞を増幅した。１週後、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）  ＣＤ３  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  （ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＴ細胞を除去した後に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｖｉｒｕｓ感染法により、ＮＫ細胞へＣＡＲ遺伝子の導入を行った。遺伝子導入を行ったＮＫ細胞は、１０％の最終濃度でＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、２〜３日毎に１００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ−２を添加した。
【０１００】
（導入したＣＡＲ遺伝子の発現評価）
本試験で使用したＭＳＣＶレトロウイルスベクターには、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列の下流に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子が組み込まれている。Ｔ細胞へのＣＡＲ遺伝子導入の効率は、フローサイトメトリーを用い、ＧＦＰの蛍光波長の検出域であるＦＬ１のシグナル強度の測定により決定した（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ，  ＢＤ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
ＣＡＲ遺伝子導入１週後に、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の細胞表面に存在するＮＫｐ４４をモノクローナル抗体（ＮＫｐ４４−ＰＥ，  ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）で染色し、フローサイトメトリーで測定することにより、ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲの発現量を比較した。フローサイトメトリーでの解析結果を図２に示す。
ヒトＴ細胞においては、ＧＦＰ発現を元に算出された遺伝子導入効率は９３．５％（ｎ＝１７、６２．４〜９７．１％）であった。ヒトＮＫ細胞における遺伝子導入効率は４２．３％（ｎ＝８、２４．０〜４９．２％）であった。ＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲの発現は、ＧＦＰ発現量を基準として評価した。Ｔ細胞及びＮＫ細胞のいずれにおいても、最も良好な細胞表面のＮＫｐ４４−ｂａｓｅｄ  ＣＡＲの発現を認めた遺伝子コンストラクトは、細胞外ヒンジドメイン（ＥＨ）にＮＫｐ４４、膜貫通ドメイン（ＴＭ）にＣＤ２８、活性化シグナル伝達ドメイン（ＡＳ）にＣＤ３ζを用いたコンストラクトである、「ＥＨ（ｐ４４）−ＴＭ（ＣＤ２８）−ＡＳ（ＣＤ３ζ）」だった。そのため、後述する細胞傷害性評価試験では、当該コンストラクトを導入したヒトＴ細胞を使用した。なお、ＥＨ（ｐ４４）−ＴＭ（ＣＤ２８）−ＡＳ（ＣＤ３ζ）の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。
【０１０１】
［実験例３］ＣＡＲ導入Ｔ細胞の細胞傷害性評価
細胞傷害性評価試験では、ＮＫｐ４４リガンドの表面発現が確認されているＴ細胞性白血病細胞株（ＭＯＬＴ４，Ｊｕｒｋａｔ）、骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２，ＴＨＰ−１）、Ｂ細胞性白血病細胞株（ＯＰ−１）を標的細胞として用いた。これらの標的細胞に対し、ＥＨ（ｐ４４）−ＴＭ（ＣＤ２８）−ＡＳ（ＣＤ３ζ）遺伝子を導入したＴ細胞（ＮＫｐ４４−ＣＡＲＴ）の細胞傷害性の評価を、遺伝子導入後１週以降に行った。標的細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭ  Ｃａｌｃｅｉｎ  Ｒｅｄ−Ｏｒａｎｇｅ，  ＡＭ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて染色した後に、ＮＫｐ４４−ＣＡＲＴと標的細胞とを様々なｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｒａｔｉｏ（Ｅ：Ｔ比）で、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下でインキュベーター内にて、９６ウェルＵ底プレートを用いて６時間共培養した。標的細胞のみを含むウェルを所定時間培養し、コントロールとした。比較対象として、空ベクター（ｍｏｃｋ）を遺伝子導入したＴ細胞（ｍｏｃｋ−Ｔ）を用いた。また、自己および他者の正常細胞ヘの攻撃の可能性を確認するため、ｒＩＬ−２投与下で培養し刺激・増殖させた自己の活性化Ｔ細胞（Ａｕｔｏ−Ｔ  ｃｅｌｌ）を細胞傷害性試験の対象細胞に用いた。同様に、Ｔ細胞の提供者とは別の健常ドナーの末梢Ｔ細胞を分離し対象細胞として用いた（Ａｌｌｏ−Ｔ  ｃｅｌｌ）。
細胞傷害性評価試験の結果を図３に示す。ＮＫｐ４４−ＣＡＲＴは、ｍｏｃｋ−Ｔと比べ、Ｋ５６２、ＴＨＰ−１、ＯＰ−１、ＭＯＬＴ４及びＪｕｒｋａｔの各細胞株に対する細胞傷害性の著しい増強が認められた。一方で、ＮＫｐ４４−ＣＡＲＴは、ｍｏｃｋ−Ｔと同様に、Ａｕｔｏ−Ｔ細胞及びＡｌｌｏ−Ｔ細胞に対する細胞傷害性は全く認められなかった。
【０１０２】
［実験例４］インターフェロンγアッセイ
標的細胞（Ｋ５６２）とＮＫｐ４４−ＣＡＲＴとを、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、インキュベーター内にて９６ウェル丸底プレートを用いて共培養した。共培養に用いたＮＫｐ４４−ＣＡＲＴの細胞数は１ｘ１０５個とし、Ｅ：Ｔ比は１：１とした。２００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ−２を添加し、１０％の最終濃度のＦＢＳを加えた２００μＬのＲＰＭＩ１６４０を培養培地として用いた。共培養開始２４時間後に上清を採取し、上清中のインターフェロンγをＥＩＡ法により測定した。陰性コントロールとして、１ｘ１０５個のｍｏｃｋ−Ｔを同条件でＫ５６２と２４時間共培養した。
インターフェロンγアッセイの結果を図４に示す。ＮＫｐ４４−ＣＡＲＴでは、ｍｏｃｋ−Ｔと比較して、インターフェロンγ産生量が顕著に増加した。
【０１０３】
以上の結果より、ＮＫｐ４４−ＣＡＲＴは、腫瘍細胞特異的に細胞傷害性を示すことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明によれば、ＮＫｐ４４リガンドを標的とする新規ＣＡＲ、及び当該ＣＡＲを発現し、かつ腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示すＣＡＲ発現細胞が提供される。
【図１】
2018042531.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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