(57)【要約】【課題】均質な接着性細胞を大量に培養し回収すること。【解決手段】細胞処理装置１は、固定治具Ｇと、加振ユニット１０と、コントローラ４０とを備えている。固定治具Ｇは、接着性細胞が培養された培養容器を支持する。加振ユニット１０は、固定治具Ｇを加振する。コントローラ４０は、加振ユニット１０における加振振動数を培養容器が有する固有振動数を含む範囲でスイープする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着性細胞が培養された培養容器を支持する支持手段と、
前記支持手段を加振する加振手段と、
前記加振手段における加振振動数を前記培養容器が有する固有振動数を含む範囲でスイープする制御手段と、
を備えることを特徴とする細胞処理装置。
【請求項２】
前記培養容器内の培養液の温度を制御する温度制御手段をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項３】
前記培養容器に発生する振動を検出する検出手段をさらに備え、
前記制御手段は、前記検出手段の検出結果に基づいて、前記培養容器の振動状態の報知及び前記加振手段における加振へのフィードバック制御の少なくともいずれかを実行することを特徴とする請求項１または２に記載の細胞処理装置。
【請求項４】
前記培養容器は、積層されたスタックプレートによって構成され、
前記制御手段は、前記加振手段における加振振動数を、各段の前記スタックプレートに固有振動を発生させる加振振動数の範囲でスイープすることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項５】
前記培養容器は、細胞を培養するローラボトルによって構成され、
前記支持手段は、前記ローラボトルを回転可能に支持し、
前記加振手段は、回転されている前記ローラボトルを支持する前記支持手段を加振することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項６】
前記培養容器は、細胞の培養バッグによって構成され、
前記支持手段は、前記培養バッグの少なくとも両端を支持し、
前記加振手段は、前記培養バッグの少なくとも前記両端を支持する前記支持手段を加振することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項７】
接着性細胞が培養された培養容器を支持する支持手段を備える細胞処理装置が実行する細胞処理方法であって、
前記支持手段を加振する加振ステップと、
前記加振ステップにおける加振振動数を前記培養容器が有する固有振動数を含む範囲でスイープする制御ステップと、
を含むことを特徴とする細胞処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞処理装置及び細胞処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞の樹立等に伴って、再生医療への期待が高まっている。再生医療においては、細胞の大量培養が必要であり、大量かつ安定的な細胞の供給を可能とする細胞培養法の確立が望まれている。
また、細胞は浮遊性細胞と接着性細胞に大別できるが、生体組織は接着性細胞によって構成されていることから、とりわけ接着性細胞の大量培養法を確立することが望まれている。
通常、接着性細胞は培養フラスコや培養ディッシュの培養面に接着させて培養される。
一方、こうした手法は空間的な培養効率が低いため、近年は浮遊培養を用いた３次元培養が広く行われている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】“Quantum細胞増殖システム”、［online］、テルモＢＣＴ株式会社、［平成２８年１２月２０日検索］、インターネット＜URL:https://www.terumobct.com/location/japan/products-and-services/Pages/Quantum.aspx＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、接着性細胞を浮遊培養した場合、いくつかの細胞が互いに接着して細胞塊を形成して増殖するものの、細胞塊の大きさを制御することが困難である。細胞塊の大きさが不均一となった場合、細胞は周囲環境によって性質が変化することから、回収した細胞の品質にばらつきが生じることとなる。
このように、従来の技術においては、均質な接着性細胞を大量に培養し回収することが困難であった。
【０００５】
本発明は、均質な接着性細胞を大量に培養し回収することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明の一態様の細胞処理装置は、
接着性細胞が培養された培養容器を支持する支持手段と、
前記支持手段を加振する加振手段と、
前記加振手段における加振振動数を前記培養容器が有する固有振動数を含む範囲でスイープする制御手段と、
を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、均質な接着性細胞を大量に培養し回収することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】スタックプレートに発生する固有振動モードの解析結果例を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る細胞処理装置１の全体構成を示す模式図である。
【図３】固定治具Ｇに固定されたスタックプレートＰの構成例を示す模式図であり、図３（Ａ）は斜視図、図３（Ｂ）は上面図を示す図である。
【図４】スタックプレートＰの数が１段である場合の振動状態を示すグラフであり、図４（Ａ）は振動数に対する培養面及び固定治具Ｇ上の振幅、図４（Ｂ）は振動数に対する振幅増幅率（培養面の振幅／固定治具Ｇの振幅）を表す図である。
【図５】スタックプレートＰの数が１段である場合の振動状態を示すグラフであり、図５（Ａ）は加振振動数が９４［Ｈｚ］（１次振動モード）における位置に対する振幅、図５（Ｂ）は加振振動数が２０６［Ｈｚ］（３次振動モード）における位置に対する振幅を表す図である。
【図６】第１段〜第５段のスタックプレートＰにおける振動数に対する振幅増幅率（培養面の振幅／固定治具Ｇの振幅）を示すグラフである。
【図７】スタックプレートＰの数が５段である場合の振動状態を示すグラフであり、図７（Ａ）は１次振動モードにおける位置に対する振幅、図７（Ｂ）は３次振動モードにおける位置に対する振幅を表す図である。
【図８】細胞処理装置１による場合と手作業による場合の細胞剥離率の差異を示すグラフであり、図８（Ａ）はスタックプレートＰが１段の場合、図８（Ｂ）はスタックプレートＰが５段の場合を示す図である。
【図９】細胞処理装置１による場合と手作業による場合のｈＭＳＣの剥離率及び死亡率の差異を示すグラフであり、図９（Ａ）は細胞の剥離率、図９（Ｂ）は細胞の死亡率を示している。
【図１０】細胞処理装置１による場合と手作業による場合のｈＭＳＣの細胞増殖性の差異を示すグラフであり、図１０（Ａ）は剥離細胞を０．８×１０５個播種し、３日間培養した場合、図１０（Ｂ）は剥離細胞を１．６×１０５個播種し、３日間培養した場合を示している。
【図１１】フローサイトメトリー解析による細胞の未分化状態の検証結果を示すグラフであり、図１１（Ａ）は手作業で細胞を剥離した場合のアイソタイプコントロール（Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）の陽性率、図１１（Ｂ）は細胞処理装置１を用いた場合のアイソタイプコントロールの陽性率を示している。
【図１２】フローサイトメトリー解析による細胞の未分化状態の検証結果を示すグラフであり、図１２（Ａ）は手作業で細胞を剥離した場合のタンパク質ＣＤ７３の陽性率、図１２（Ｂ）は細胞処理装置１を用いた場合のタンパク質ＣＤ７３の陽性率を示している。
【図１３】フローサイトメトリー解析による細胞の未分化状態の検証結果を示すグラフであり、図１３（Ａ）は手作業で細胞を剥離した場合のタンパク質ＣＤ９０の陽性率、図１３（Ｂ）は細胞処理装置１を用いた場合のタンパク質ＣＤ９０の陽性率を示している。
【図１４】温度管理を行った場合と細胞剥離酵素（トリプシン）を用いた場合との剥離細胞の数の一例を示すグラフであり、図９（Ａ）は、加振の振幅を一定（２［μｍ］）とし、培養液の温度を１０［℃］、２０［℃］とした場合及び細胞剥離酵素を用いた場合の剥離細胞の数、図９（Ｂ）は、培養液の温度を１０［℃］とし、加振の振幅を１［μｍ］、２［μｍ］とした場合及び細胞剥離酵素を用いた場合の剥離細胞の数を示す図である。
【図１５】温度制御装置Ｔを備えた細胞処理装置１の構成例を示す模式図である。
【図１６】培養容器に発生している振動を検出するセンサを備えた細胞処理装置１の構成例を示す模式図である。
【図１７】細胞処理装置１において培養容器にローラボトルＲを用いた状態を示す模式図であり、図１２（Ａ）は固定治具Ｇに回転可能に支持されたローラボトルＲの斜視図、図１２（Ｂ）は固定治具Ｇに回転可能に支持されたローラボトルＲの側面図である。
【図１８】細胞処理装置１において培養容器に培養バッグＢを用いた状態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。
［本発明の基本的概念］
本発明は、スタックプレート等の接着性細胞を大量に培養可能な培養容器において、培養容器に加振して固有振動を発生させることにより、効率的に細胞の剥離を促し、均質な細胞を大量に回収するものである。
また、本発明においては、培養容器に加振する際に、培養容器が有する固有振動数の範囲をカバーするように加振振動数をスイープする。
これにより、培養容器内の状態や培養容器の構造（積層数等）によって変化する固有振動数で確実に加振を行うことができる。
そのため、均質な接着性細胞が大量に培養された培養容器から、効率的に接着性細胞を剥離・回収することが可能となる。
以下、本発明の実施に関する具体的な手順について説明する。なお、以下の説明では、培養容器として、スタックプレートを用いる場合を例に挙げて説明する。
【００１０】
［培養容器の構造解析］
本発明においては、培養容器が有する固有振動数の振動を印加することにより、接着性細胞の効率的な剥離を実現する。培養容器が有する固有振動数は、例えば、有限要素法等を用いた構造解析を行うことで、推定することができる。
図１は、スタックプレートに発生する固有振動モードの解析結果例を示す模式図である。
なお、図１においては、スタックプレートの培養面の振動状態を濃度分布によって模式的に示しており、濃度が最も高い部分が最大振幅の部分を表している。
【００１１】
図１に示すように、１段のスタックプレートの場合には、加振振動数が１１２［Ｈｚ］で１次振動モードが発生し、加振振動数を増加させると、１６２［Ｈｚ］で２次振動モード、２５０［Ｈｚ］で３次振動モードが発生している。
一方、図１に示すように、５段のスタックプレートの場合、９５［Ｈｚ］で最上段（第５段）のスタックプレートに１次振動モードが発生し、第１段のスタックプレートは１１４［Ｈｚ］で１次振動モードが発生している。
【００１２】
そして、さらに加振振動数を増加させると、２３４［Ｈｚ］で第５段及び第４段のスタックプレートに３次振動モードが発生し、第１段のスタックプレートは２５６［Ｈｚ］で３次振動モードが発生している。
このように、１段のスタックプレートの場合、加振振動数の増加に伴って、１次振動モードから順に、スタックプレートに複数次の固有振動モードが発生する。
【００１３】
また、複数段のスタックプレートが積層されている場合、加振振動数の増加に伴って、１次振動モードから順に、各段のスタックプレートに複数次の固有振動モードが発生し、これらの固有振動モードは、各段のスタックプレート毎に異なる振動数で発生する。
即ち、スタックプレートに発生する固有振動モードは、積層されるスタックプレートの数によって異なると共に、各段のスタックプレート毎に異なることがわかる。
【００１４】
［固有振動数のスイープ制御］
本発明においては、上述の構造解析によって推定される固有振動数の範囲に基づいて、培養容器が有する固有振動数の範囲をカバーするように加振振動数をスイープする。
図１に示す例では、１段のスタックプレートの場合、約１１２［Ｈｚ］〜約２５０［Ｈｚ］の範囲で加振振動数をスイープしながら加振を行うことで、１次〜３次の固有振動モードを発生させることができる。
【００１５】
また、５段のスタックプレートの場合、約９５［Ｈｚ］〜約２５６［Ｈｚ］の範囲で加振振動数をスイープしながら加振を行うことで、各段のスタックプレートに１次〜３次の固有振動モードを発生させることができる。
ここで、本発明においては、上述の構造解析によって推定された固有振動数を選択的に切り替えて培養容器に印加するのではなく、推定された固有振動数の範囲をスイープする制御を行っている。
【００１６】
本発明の発明者らによる研究によれば、培養容器に発生する固有振動数は、スタックプレート内の状態（培養液の流れ等）や、スタックプレートの構造（積層数や設置構造等）等によって、変動することがわかっている。
これに対し、上述のように、培養容器が有する固有振動数の範囲をカバーするように加振振動数をスイープすることで、種々の要因で発生する固有振動数の変化に対応して、より確実に固有振動を発生させることができる。
以下、本発明の具体的な実施形態について説明する。
【００１７】
［実施形態］
［構成］
図２は、本発明の一実施形態に係る細胞処理装置１の全体構成を示す模式図である。
図２に示すように、細胞処理装置１は、加振ユニット１０と、ステージ２０と、本体３０と、コントローラ４０とを備え、ステージ２０には、固定治具Ｇに固定されたスタックプレートＰがねじ止め等により固定して設置されている。
図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、固定治具Ｇに固定されたスタックプレートＰの構成例を示す模式図であり、図３（Ａ）は斜視図、図３（Ｂ）は上面図である。
【００１８】
図３（Ａ）に示すように、細胞処理装置１には、複数のスタックプレートＰを積層して設置することが可能であり、ここでは、５段のスタックプレートＰが積層して設置された例を示している。
また、スタックプレートＰは、上面視において方形を有し、底面には細胞を培養するための培地が形成されている。なお、スタックプレートＰには、上面視において、図３（Ｂ）に示すような座標を設定するものとする。
【００１９】
加振ユニット１０は、コントローラ４０の指示信号に従って、ステージ２０を振動させる加振力を発生させる。具体的には、加振ユニット１０は、内部にボイスコイルモータ及びドライバ（不図示）を備え、コントローラ４０から入力される指示信号が示す固有振動数に従って、ステージ２０を振動させる。
ステージ２０は、加振ユニット１０の出力軸に固定され、加振ユニット１０が発生した振動を、固定治具Ｇを介してスタックプレートＰに伝達する。
【００２０】
本体３０は、衝撃吸収用の弾性部材（ゴム部材等）を介して加振ユニット１０を支持する筐体である。
コントローラ４０は、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）あるいはＰＬＣ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）等の制御装置によって構成される。コントローラ４０には、固定治具Ｇに固定されたスタックプレートＰに対して印加する加振振動数の範囲が設定されている。この加振振動数の範囲は、培養容器が有する固有振動数の範囲をカバーするように設定されている。そして、コントローラ４０は、加振ユニット１０に対して指示信号を出力し、設定された加振振動数の範囲を所定時間でスイープさせる。
【００２１】
［動作］
次に、細胞処理装置１の動作を説明する。
細胞処理装置１の駆動に先立ち、ステージ２０には、固定治具Ｇに固定されたスタックプレートＰがねじ止め等により固定される。このスタックプレートＰには、接着性細胞が培養されている。
また、コントローラ４０には、加振振動数のスイープ範囲が設定される。
そして、コントローラ４０が加振ユニット１０に加振の指示信号を出力することにより、加振ユニット１０がステージ２０及びスタックプレートＰの加振を開始する。
【００２２】
加振ユニット１０によってステージ２０及びスタックプレートＰの加振が開始されると、コントローラ４０は、設定されている加振振動数の範囲を所定時間でスイープさせる。例えば、コントローラ４０は、９５［Ｈｚ］〜２５６［Ｈｚ］の範囲を低周波側から１往復スイープさせる。
このとき、図１に示すように、９５［Ｈｚ］で最上段（第５段）のスタックプレートＰに１次振動モードが発生し、さらに加振振動数を増加させると、第１段のスタックプレートＰに２５６［Ｈｚ］で３次振動モードが発生する。この間、第１段から最上段のスタックプレートＰには、１次振動モード、２次振動モード及び３次振動モードが順に発生し、各段のスタックプレートＰにおいて、１次〜３次の固有振動モードが発生する。
【００２３】
即ち、コントローラ４０に設定された加振振動数の範囲をスイープさせることで、細胞処理装置１に設置されたスタックプレートＰの全てに固有振動が発生し、接着性細胞が剥離された状態となる。
このように、細胞処理装置１によれば、培養容器側の条件に相違がある場合であっても、加振振動数をスイープすることで、これらの条件を吸収して、確実に培養容器に培養された細胞を剥離することができる。
即ち、細胞処理装置１によれば、均質な接着性細胞を大量に培養し回収することができる。
【００２４】
［効果］
次に、細胞処理装置１によって実現される効果を説明する。
上述のように、細胞処理装置１にスタックプレートＰを設置した場合、１段のスタックプレートＰにおいて、１段のスタックプレートＰの構造に応じた加振振動数の範囲で、１次以上の固有振動モードを発生させることができる。また、任意の数のスタックプレートＰを積層すると、積層されたスタックプレートＰの構造に応じた加振振動数の範囲で、１次以上の固有振動モードを発生させることができる。
以下、スタックプレートＰの数が１段である場合及びスタックプレートＰの数が５段である場合のそれぞれについて、実験によって検証された効果を説明する。
【００２５】
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、スタックプレートＰの数が１段である場合の振動状態を示すグラフであり、図４（Ａ）は振動数に対する培養面及び固定治具Ｇ上の振幅、図４（Ｂ）は振動数に対する振幅増幅率（培養面の振幅／固定治具Ｇの振幅）を表す図である。なお、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、スタックプレートＰの中央位置で振幅を計測した結果を示している。
【００２６】
図４（Ａ）において、固定治具Ｇの振幅は、加振ユニット１０の出力によって固定治具Ｇが実際に振動した振幅を表している。一方、培養面の振幅は、固定治具Ｇの振幅に追従するものであるが、加振振動数が２００［Ｈｚ］をやや超えた位置で、振幅が大きく上昇していることがわかる。この振幅の上昇は、固有振動によって励起されたものである。
また、図４（Ｂ）を参照すると、加振振動数が２００［Ｈｚ］の位置に加え、１００［Ｈｚ］付近においても、増幅率にピークが表れていることがわかる。
即ち、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）を参照すると、スタックプレートＰが１段である場合、加振振動数が１００［Ｈｚ］付近で１次振動モード、加振振動数が２００［Ｈｚ］付近で３次振動モードが発生していることがわかる。なお、２次振動モードの場合、スタックプレートＰの中央位置は振動の節となるため、固有振動に基づく振幅の上昇が観察されていない。
【００２７】
図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、スタックプレートＰの数が１段である場合の振動状態を示すグラフであり、図５（Ａ）は加振振動数が９４［Ｈｚ］（１次振動モード）における位置に対する振幅、図５（Ｂ）は加振振動数が２０６［Ｈｚ］（３次振動モード）における位置に対する振幅を表す図である。なお、図５（Ａ）及び図５（Ｂ）においては、図３（Ｂ）に示すＸ座標上の振幅であって、最大値を基準に正規化した値を示している。
図５（Ａ）を参照すると、加振振動数が９４［Ｈｚ］の場合、スタックプレートＰの中央位置（原点）を腹として固有振動（１次振動モード）が発生していることがわかる。
【００２８】
また、図５（Ｂ）を参照すると、加振振動数が２０６［Ｈｚ］の場合、スタックプレートＰの中央位置（原点）及び±７［ｃｍ］程度の位置を腹として固有振動（３次振動モード）が発生していることがわかる。
【００２９】
次に、スタックプレートＰが５段の場合にも、同様の効果を確認することができる。
図６は、第１段〜第５段のスタックプレートＰにおける振動数に対する振幅増幅率（培養面の振幅／固定治具Ｇの振幅）を示すグラフである。なお、図６においては、スタックプレートＰの中央位置で振幅を計測した結果を示している。
図６を参照すると、スタックプレートＰが５段の場合にも、各段のスタックプレートＰにおいて、１次振動モード及び３次振動モードがそれぞれ発生していることがわかる。
【００３０】
図７（Ａ）及び図７（Ｂ）は、スタックプレートＰの数が５段である場合の振動状態を示すグラフであり、図７（Ａ）は１次振動モードにおける位置に対する振幅、図７（Ｂ）は３次振動モードにおける位置に対する振幅を表す図である。なお、図７（Ａ）及び図７（Ｂ）においては、図３（Ｂ）に示すＸ座標上の振幅であって、最大値を基準に正規化した値を示している。
【００３１】
図７（Ａ）を参照すると、１次振動モードの場合、各段のスタックプレートＰにおいて、中央（原点）を腹として固有振動（１次振動モード）が発生していることがわかる。
また、図７（Ｂ）を参照すると、３次振動モードの場合、各段のスタックプレートＰにおいて、中央（原点）及び±１０［ｃｍ］程度の位置を腹として固有振動（３次振動モード）が発生していることがわかる。
【００３２】
［効率性の比較］
本発明に係る細胞処理装置１によって細胞を剥離した場合、手作業によってスタックプレートＰの剥離作業を行う場合に比べ、剥離効率が高いことが確認されている。なお、本実験においては、Ｃ２Ｃ１２（マウスの横紋筋細胞（接着性細胞））を用いて検証を行った。
図８（Ａ）及び図８（Ｂ）は、細胞処理装置１による場合と手作業による場合の細胞剥離率の差異を示すグラフであり、図８（Ａ）はスタックプレートＰが１段の場合、図８（Ｂ）はスタックプレートＰが５段の場合を示す図である。なお、手作業によってスタックプレートＰの剥離作業を行う場合、細胞処理装置１が固有振動数を加振することによってスタックプレートＰから細胞を剥離する工程に代えて、人手によってスタックプレートＰを揺動させて細胞を剥離した。図８（Ａ）及び図８（Ｂ）において、その他の条件は同一である。
【００３３】
図８（Ａ）を参照すると、スタックプレートＰが１段の場合、手作業で細胞を剥離したときと、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときとの間に有意差が認められる。
また、図８（Ｂ）を参照すると、スタックプレートＰが５段の場合も、手作業で細胞を剥離したときと、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときとの間に有意差が認められる。
なお、検証の結果、手作業で細胞を剥離したときと、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときとの間に、細胞の死亡率及び増殖率に関して有意差は認められなかった。
即ち、細胞処理装置１によって細胞を剥離することで、効率的に高品質な細胞を剥離・回収することが可能であることがわかる。
【００３４】
［幹細胞に関する検証］
上述のように、Ｃ２Ｃ１２（マウスの横紋筋細胞（接着性細胞））に関して、本発明の細胞処理装置１を用いることの効果が実証された。
これに対し、分化率が重要なパラメータとなるｈＭＳＣ（ヒト骨髄より分離された間葉系幹細胞）の剥離・回収に細胞処理装置１を用いた場合にも、効率的に高品質な細胞を剥離・回収することが可能であることが確認されている。
【００３５】
図９（Ａ）及び図９（Ｂ）は、細胞処理装置１による場合と手作業による場合のｈＭＳＣの剥離率及び死亡率の差異を示すグラフであり、図９（Ａ）は細胞の剥離率、図９（Ｂ）は細胞の死亡率を示している。
本実験においては、手作業によってスタックプレートＰの剥離作業を行う場合と、本発明に係る細胞処理装置１によって細胞を剥離する場合とで、剥離した細胞数及び残存した細胞数を測定した。その後、剥離細胞から一定数（ここでは８．０×１０４個および１．６×１０５個）をディッシュに播種し、一定期間（ここでは３日）培養後の細胞数を測定した。そして、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析によって、細胞の未分化状態を確認した。なお、図９（Ａ）及び図９（Ｂ）は、スタックプレートＰが１段の場合について実験を行った結果を示しており、細胞処理装置１の加振条件は、図８（Ａ）の場合と同一である。
【００３６】
図９（Ａ）を参照すると、手作業で細胞を剥離したときの細胞剥離率と、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときの細胞剥離率との間に有意差が認められる。また、図８（Ａ）に示す場合と比べて、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときの細胞剥離率が高いものとなっており、細胞処理装置１を用いることの効果がより高いことがわかる。
なお、図９（Ｂ）を参照すると、手作業で細胞を剥離したときの細胞死亡率と、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときの細胞死亡率との間には有意差は認められない。即ち、細胞処理装置１を用いた場合であっても、手作業で細胞を剥離した場合に対して、細胞死亡率に影響がないことがわかる。
【００３７】
図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）は、細胞処理装置１による場合と手作業による場合のｈＭＳＣの細胞増殖性の差異を示すグラフであり、図１０（Ａ）は剥離細胞を０．８×１０５個播種し、３日間培養した場合、図１０（Ｂ）は剥離細胞を１．６×１０５個播種し、３日間培養した場合を示している。
【００３８】
図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）を参照すると、手作業で細胞を剥離したときと、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときとの間に有意差は認められなかった。即ち、細胞処理装置１を用いた場合であっても、手作業で細胞を剥離した場合に対して、細胞の増殖性に影響がないことがわかる。
【００３９】
図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）〜図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）は、フローサイトメトリー解析による細胞の未分化状態の検証結果を示すグラフである。なお、図１１（Ａ）は手作業で細胞を剥離した場合のアイソタイプコントロール（Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）の陽性率、図１１（Ｂ）は細胞処理装置１を用いた場合のアイソタイプコントロールの陽性率を示している。また、図１２（Ａ）は手作業で細胞を剥離した場合のタンパク質ＣＤ７３の陽性率、図１２（Ｂ）は細胞処理装置１を用いた場合のタンパク質ＣＤ７３の陽性率を示している。さらに、図１３（Ａ）は手作業で細胞を剥離した場合のタンパク質ＣＤ９０の陽性率、図１３（Ｂ）は細胞処理装置１を用いた場合のタンパク質ＣＤ９０の陽性率を示している。なお、アイソタイプコントロールとは、反応させる抗体がターゲットタンパク質と特異的に結合していること（非特異的な結合が存在しないこと）を確認するための抗体である。
【００４０】
本検証では、未分化状態のｈＭＳＣに発現する代表的なタンパク質（ＣＤ７３及びＣＤ９０）の局在を確認するためにフローサイトメトリー解析を用いている。具体的には、ターゲットとなるタンパク質と結合する蛍光標識された抗体を細胞と反応させ、各細胞から励起される蛍光を測定する。そして、この測定結果から、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞の個数を取ったヒストグラムを作成すると、蛍光されている細胞の割合を算出することによって、ターゲットとなるタンパク質が局在する細胞の割合を知ることができる。
【００４１】
なお、図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）〜図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）において、横軸方向に記載された線分は、各抗体が陽性であると判別される蛍光強度の領域を表し、この線分に付された数値は、線分が示す範囲内に存在する細胞の割合（陽性率）を示している。
【００４２】
図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）を参照すると、アイソタイプコントロールに関して、手作業で細胞を剥離したときと、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときとの両手法において、剥離・培養後の細胞に非特異的な抗体反応は存在せず、タンパク質ＣＤ７３及びＣＤ９０の抗体がターゲットとなるタンパク質と特異的に結合することが確認できる。即ち、図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）により、フローサイトメトリー解析の結果が妥当であることが示されている。
【００４３】
また、図１２（Ａ）及び図１２（Ｂ）、図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）を参照すると、タンパク質ＣＤ７３及びＣＤ９０に関して、手作業で細胞を剥離したときと、細胞処理装置１によって細胞を剥離したときとの両手法において、剥離した細胞の９０％以上の細胞にタンパク質ＣＤ７３及びＣＤ９０が局在していることが確認できる。これにより、９０％以上のｈＭＳＣが未分化状態を保持し、手作業で細胞を剥離した場合に比べ、細胞処理装置１によって細胞を剥離した場合における分化状態に影響がないことが確認できる。
以上の検証により、本発明の細胞処理装置１を用いた剥離手法が、分化率が重要なパラメータとなる幹細胞の培養へも適用可能であることがわかる。
【００４４】
［変形例１］
上述の発明の基本的概念に加えて、本発明においては、低温に管理された培養液を培養容器に導入しつつ、加振を行うことも可能である。
この場合には、トリプシン等の細胞剥離酵素の使用量を低減または細胞剥離酵素を使用しない細胞剥離技術を実現することができる。
図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）は、温度管理を行った場合と細胞剥離酵素（トリプシン）を用いた場合との剥離細胞の数の一例を示すグラフである。なお、図１４（Ａ）は、加振の振幅を一定（２［μｍ］）とし、培養液の温度を１０［℃］、２０［℃］、３０［℃］とした場合及び細胞剥離酵素を用いた場合の剥離細胞の数を示している。また、図１４（Ｂ）は、培養液の温度を１０［℃］とし、加振の振幅を１［μｍ］、２［μｍ］とした場合及び細胞剥離酵素を用いた場合の剥離細胞の数を示している。
【００４５】
図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）を参照すると、培養液の温度を１０［℃］以下とすることで、細胞剥離酵素の使用量を低減して、または細胞剥離酵素を使用することなく、スタックプレートＰから細胞を有効に剥離可能であることがわかる。
なお、細胞処理装置１において、培養液の温度を管理する手段としては、液温を予め調整した培養液を使用したり、スタックプレートＰに導入する前段またはスタックプレートＰ内における培養液の温度を制御するための温度制御装置（ペルチェ素子等）を備えたりすることができる。
図１５は、温度制御装置Ｔを備えた細胞処理装置１の構成例を示す模式図である。
図１５に示す例では、スタックプレートＰが設置されるステージ２０上の空間を覆うケース２０ａが設置され、ケース２０ａの所定箇所に温度制御装置Ｔとしてのペルチェ素子が設置されている。なお、この場合、細胞処理装置１には、図示しない温度センサ等の温度管理に必要な機能が適宜設置される。
【００４６】
［変形例２］
上述の実施形態において、培養容器に発生している振動を検出し、検出結果を報知したり、フィードバック制御に用いたりすることが可能である。
この場合、培養容器に適切な固有振動が発生していないことを報知したり、培養容器に印加する加振振動数をより適切な値に自動的に変更したりすることが可能となる。
図１６は、培養容器に発生している振動を検出するセンサを備えた細胞処理装置１の構成例を示す模式図である。
図１６において、培養容器に発生している振動を検出するセンサとして、加速度センサＤが用いられ、最下段のスタックプレートＰ及び最上段のスタックプレートＰに加速度センサＤが設置されている。
【００４７】
スタックプレートＰの固有振動は、上述のように、低周波側から加振振動数をスイープした場合、初めに、最下段のスタックプレートＰで１次振動モードが発生し、高次の振動モードが最上段のスタックプレートＰに最後に表れる。
そのため、加速度センサＤは、最下段のスタックプレートＰ及び最上段のスタックプレートＰに設置しておくことで、積層されたスタックプレートＰそれぞれに固有振動が発生したことを推定することができる。
また、加速度センサＤによって検出された振動の状態に基づいて、より適切な加振振動数のスイープ範囲を決定することで、さらに効率的に細胞を剥離することが可能となる。
【００４８】
［変形例３］
上述の実施形態において、スタックプレートＰに接着性細胞を培養する場合を例に挙げて説明したが、スタックプレートＰ以外にも、接着性細胞を大量に培養可能な種々の培養容器を用いることも可能である。
図１７（Ａ）及び図１７（Ｂ）は、細胞処理装置１において培養容器にローラボトルＲを用いた状態を示す模式図であり、図１７（Ａ）は固定治具Ｇに回転可能に支持されたローラボトルＲの斜視図、図１７（Ｂ）は固定治具Ｇに回転可能に支持されたローラボトルＲの側面図である。
図１７（Ａ）及び図１７（Ｂ）に示すように、ローラボトルＲを培養容器として用いる場合、ローラボトルＲを細胞の培養時と同様に回転させながら、回転軸を加振ユニット１０で加振し、加振振動数をスイープすることで、ローラボトルＲに固有振動を発生させることができる。
これにより、ローラボトルＲの内周面に培養された細胞を適切に剥離することができる。
【００４９】
また、図１８は、細胞処理装置１において培養容器に培養バッグＢを用いた状態を示す模式図である。
図１８に示すように、培養バッグＢを培養容器として用いる場合、培養バッグＢの両端をクリップ機構を有する固定治具Ｇで保持すると共に、固定治具Ｇをステージ２０を介して加振ユニット１０で振動し、加振振動数をスイープすることで、培養バッグＢに固有振動を発生させることができる。
このとき、培養バッグＢに所定の張力（弛みが生じない程度）が加わるよう両端を保持部材で保持することにより、培養バッグＢに固有振動がより発生し易くなる。
このように、培養バッグＢのような剛性が低い培養容器であっても、培養された細胞を適切に剥離することができる。
また、培養バッグＢ内の培養液及び空気の比率や流動状態等、条件に相違がある場合であっても、加振振動数をスイープすることで、これらの条件を吸収して、確実に培養容器に培養された細胞を剥離することができる。
【００５０】
なお、本発明は、本発明の効果を奏する範囲で変形、改良等を適宜行うことができ、上述の実施形態に限定されない。
例えば、上述の実施形態において用いられる細胞処理装置１は、培養容器に固有振動を発生させることができれば、種々の構成のものを用いることができ、加振力を発生させる駆動源についても、ボイスコイルモータの他、種々のアクチュエータを用いることが可能である。
【００５１】
また、上述の各実施形態及び各変形例を適宜組み合わせて、本発明を実施することが可能である。
上述の実施形態における制御のための処理は、ハードウェア及びソフトウェアのいずれにより実行させることも可能である。
即ち、上述の処理を実行できる機能が細胞処理装置１に備えられていればよく、この機能を実現するためにどのような機能構成及びハードウェア構成とするかは上述の例に限定されない。
【００５２】
なお、上記実施形態は、本発明を適用した一例を示しており、本発明の技術的範囲を限定するものではない。即ち、本発明は、本発明の要旨を逸脱しない範囲で、省略や置換等種々の変更を行うことができ、上記実施形態以外の各種実施形態を取ることが可能である。本発明が取ることができる各種実施形態及びその変形は、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【００５３】
以上のように構成される細胞処理装置１は、固定治具Ｇと、加振ユニット１０と、コントローラ４０とを備えている。
固定治具Ｇは、接着性細胞が培養された培養容器を支持する。
加振ユニット１０は、固定治具Ｇを加振する。
コントローラ４０は、加振ユニット１０における加振振動数を培養容器が有する固有振動数を含む範囲でスイープする。
これにより、培養容器に確実に固有振動が発生し、接着性細胞が剥離された状態となる。
したがって、本発明によれば、均質な接着性細胞を大量に培養し回収することができる。
【００５４】
また、細胞処理装置１は、温度制御装置Ｔをさらに備える。
温度制御装置Ｔは、培養容器内の培養液の温度を制御する。
これにより、細胞剥離酵素の使用量を低減または細胞剥離酵素を使用しない細胞剥離技術を実現することができる。
【００５５】
また、細胞処理装置１は、加速度センサＤをさらに備える。
加速度センサＤは、培養容器に発生する振動を検出する。
コントローラ４０は、加速度センサＤの検出結果に基づいて、培養容器の振動状態の報知及び加振ユニット１０における加振へのフィードバック制御の少なくともいずれかを実行する。
これにより、培養容器に適切な固有振動が発生していないことを報知したり、培養容器に印加する加振振動数の範囲をより適切な値に自動的に変更したりすることが可能となる。
【００５６】
培養容器は、積層されたスタックプレートによって構成される。
コントローラ４０は、加振ユニット１０における加振振動数を、各段のスタックプレートに固有振動を発生させる加振振動数の範囲でスイープする。
これにより、設置されたスタックプレートの全てに固有振動を発生させることができ、細胞をより確実に剥離することができる。
【００５７】
培養容器は、細胞を培養するローラボトルによって構成される。
固定治具Ｇは、ローラボトルを回転可能に支持する。
加振ユニット１０は、回転されているローラボトルを支持する固定治具Ｇを加振する。
これにより、ローラボトルの内周面に培養された細胞を適切に剥離することができる。
【００５８】
培養容器は、細胞の培養バッグによって構成される。
固定治具Ｇは、培養バッグの少なくとも両端を支持する。
加振ユニット１０は、培養バッグの少なくとも両端を支持する固定治具Ｇを加振する。
これにより、培養容器の剛性が低い場合であっても、培養容器に培養された細胞を適切に剥離することができる。
【符号の説明】
【００５９】
１  細胞処理装置、１０  加振ユニット、２０  ステージ、２０ａ  ケース、３０  本体、４０  コントローラ、Ｇ  固定治具、Ｐ  スタックプレート、Ｔ  温度制御装置、Ｄ  加速度センサ、Ｒ  ローラボトル、Ｂ  培養バッグ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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