(57)【要約】【課題】本発明は、細胞浸潤性に優れることにより、組織再生性に優れた多孔質組織再生基材及び人工血管を提供する。また、本発明は、これらを容易に製造することができる製造方法を提供する。【解決手段】生体吸収性材料からなる少なくとも２層の積層体である多孔質組織再生基材であって、  少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、  前記極細繊維不織布層の表面に、平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する、ことを特徴とする多孔質組織再生基材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性材料からなる少なくとも２層の積層体である多孔質組織再生基材であって、
少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、
前記極細繊維不織布層の表面に、平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する、
ことを特徴とする多孔質組織再生基材。
【請求項２】
前記極細繊維不織布層は、平均繊維径が０．１μｍ〜１０μｍの極細繊維からなる、請求項１に記載の多孔質組織再生基材。
【請求項３】
前記極細繊維不織布層は、生体吸収性の異なる２種以上の生体吸収性高分子からなる、請求項１又は２に記載の多孔質組織再生基材。
【請求項４】
生体吸収性材料からなる少なくとも２層の多孔質組織再生基材の製造方法であって、
（１）高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成して積層体を得る工程１、
（２）前記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、前記高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒を用いて、前記積層体の前記高分子層を膨潤させる工程２、
（３）前記積層体の膨潤させた前記高分子層と前記極細繊維不織布層とを圧着させ、乾燥させる工程３、
（４）生体吸収性高分子と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い溶媒１と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高く、且つ、前記生体吸収性高分子に対する溶解度よりも前記極細繊維不織布層に対する溶解度が低く前記溶媒１と相溶しない溶媒２と、前記溶媒１及び前記溶媒２と相溶する共溶媒３とを用いて、前記生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する工程４、
（５）前記均一溶液を、前記積層体の前記極細繊維不織布層の表面に塗工する工程５、
（６）前記積層体の表面の前記均一溶液を冷却して、前記積層体の前記極細繊維不織布層の表面に前記生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出させて複合体を形成する工程６、
（７）前記複合体の前記高分子層を、前記高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ前記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒を用いて溶解させ、前記高分子層を前記複合体から取り除き、前記極細繊維不織布層及び前記多孔質層からなる複合多孔体を得る工程７、
（８）前記複合多孔体を凍結乾燥して多孔質組織再生基材を得る工程８、
を有することを特徴とする多孔質組織再生基材の製造方法。
【請求項５】
前記共溶媒３を２種以上用い、前記２種以上の共溶媒３の配合比を調整することにより、得られる多孔質層の平均孔径を制御する、請求項４に記載の多孔質組織再生基材の製造方法。
【請求項６】
生体吸収性材料からなる少なくとも２層のチューブ状の人工血管であって、
最内層に少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、
前記極細繊維不織布層の外側の表面に平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する、
ことを特徴とする人工血管。
【請求項７】
前記極細繊維不織布層は、平均繊維径が０．１μｍ〜１０μｍの極細繊維からなる、請求項６に記載の人工血管。
【請求項８】
前記極細繊維不織布層は、生体吸収性の異なる２種以上の生体吸収性高分子からなる、請求項６又は７に記載の人工血管。
【請求項９】
生体吸収性材料からなる少なくとも２層のチューブ状の人工血管の製造方法であって、
（１−１）棒状体上に高分子層を形成する工程１−１、
（１−２）前記高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成して棒状積層体を得る工程１−２、
（２）前記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、前記高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒を用いて、前記棒状積層体の前記高分子層を膨潤させる工程２、
（３）膨潤させた前記高分子層と前記極細繊維不織布層とを圧着させ、乾燥させる工程３、
（４）生体吸収性高分子と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い溶媒１と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高く、且つ、前記生体吸収性高分子に対する溶解度よりも前記極細繊維不織布層に対する溶解度が低く前記溶媒１と相溶しない溶媒２と、前記溶媒１及び前記溶媒２と相溶する共溶媒３とを用いて、前記生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する工程４、
（５）前記均一溶液を、前記棒状積層体の前記極細繊維不織布層の表面に塗工する工程５、
（６）前記棒状積層体の表面の前記均一溶液を冷却して、前記棒状積層体の前記極細繊維不織布層の表面に前記生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出させて棒状複合体を形成する工程６、
（７）前記棒状複合体の前記高分子層を、前記高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ前記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒を用いて溶解させ、前記棒状体及び前記高分子層を前記棒状複合体から取り除き、前記極細繊維不織布層及び前記多孔質層からなるチューブ状の複合多孔体を得る工程７、
（８）前記チューブ状の複合多孔体を凍結乾燥してチューブ状の人工血管を得る工程８、
を有することを特徴とする人工血管の製造方法。
【請求項１０】
前記棒状体は、金属からなる、請求項９に記載の人工血管の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質組織再生基材、人工血管、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療の分野において、ヒト細胞等の動物細胞の培養が行われており、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官等を再生する、再生医療が行われている。
【０００３】
上述の再生医療では、組織再生基材を患者の体内に埋め込み、当該再生基材中に細胞を侵入させて増殖分化させ、組織又は器官が再生される。
【０００４】
上述のような組織再生基材として、生体吸収性高分子からなる多孔質組織再生基材が用いられている。多孔質組織再生基材を体内に埋め込むことにより、孔に細胞が侵入して増殖分化し、早期に組織が再生される。また、多孔質組織再生基材を生体吸収性高分子により形成することで、組織再生後に手術により取り出さなくても、多孔質組織再生基材が分解されて体内に吸収される。
【０００５】
このような生体吸収性高分子からなる多孔質基材として、例えば血管組織を構成している細胞外基質の構造を模倣できるエレクトロスピニング技術（以下、「ＥＳＤ」という）を使用したナノファイバーチューブ（ＥＳＤチューブ）が注目されており、ナノファイバーの平滑性が優れていることから、血栓が付き難いことが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
しかしながら、上述のようなナノファイバーチューブのポアサイズは小さいため、細胞浸潤性に劣り、組織再生に時間がかかるという問題がある（非特許文献２参照）。
【０００７】
上記問題を解決するために、予め細胞特異的接着ペプチドや繊維芽細胞増殖因子等の細胞成長因子を導入し、組織再生を早めることが試みられている。しかしながら、これらの細胞成長因子が血流の条件の中ナノファイバーチューブに留まっているかが明確ではなく、また、過剰な細胞成長因子が周辺組織の増殖を促すことによる悪影響が懸念されるという問題がある。また、細胞成長因子が存在しなくなった場合に細胞浸潤性が改善されず、組織再生性に劣るという問題がある（特許文献１及び２参照）。
【０００８】
従って、細胞浸潤性に優れることにより、組織再生性に優れた多孔質組織再生基材及び人工血管の開発が望まれており、これらを製造することができる製造方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４４１７９０９号公報
【特許文献２】特許第５７９２４４２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Acta Biomaterialia,8(2012),4349-4356
【非特許文献２】Biomaterials,33(2012)38-47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、細胞浸潤性に優れることにより、組織再生性に優れた多孔質組織再生基材及び人工血管を提供することを目的とする。また、本発明は、これらを容易に製造することができる製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、生体吸収性材料からなる少なくとも２層の積層体である多孔質組織再生基材において、少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、当該極細繊維不織布層の表面に、平均孔径が特定の範囲の少なくとも１層の多孔質層を有する構成、又は、生体吸収性材料からなる少なくとも２層のチューブ状の人工血管において、最内層に少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、当該極細繊維不織布層の外側の表面に平均孔径が特定の範囲の少なくとも１層の多孔質層を有する構成とすることにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は下記の多孔質組織再生基材、人工血管、及びそれらの製造方法を提供する。
１．生体吸収性材料からなる少なくとも２層の積層体である多孔質組織再生基材であって、
少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、
前記極細繊維不織布層の表面に、平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する、
ことを特徴とする多孔質組織再生基材。
２．前記極細繊維不織布層は、平均繊維径が０．１μｍ〜１０μｍの極細繊維からなる、項１に記載の多孔質組織再生基材。
３．前記極細繊維不織布層は、生体吸収性の異なる２種以上の生体吸収性高分子からなる、項１又は２に記載の多孔質組織再生基材。
４．生体吸収性材料からなる少なくとも２層の多孔質組織再生基材の製造方法であって、
（１）高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成して積層体を得る工程１、
（２）前記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、前記高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒を用いて、前記積層体の前記高分子層を膨潤させる工程２、
（３）前記積層体の膨潤させた前記高分子層と前記極細繊維不織布層とを圧着させ、乾燥させる工程３、
（４）生体吸収性高分子と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い溶媒１と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高く、且つ、前記生体吸収性高分子に対する溶解度よりも前記極細繊維不織布層に対する溶解度が低く前記溶媒１と相溶しない溶媒２と、前記溶媒１及び前記溶媒２と相溶する共溶媒３とを用いて、前記生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する工程４、
（５）前記均一溶液を、前記積層体の前記極細繊維不織布層の表面に塗工する工程５、
（６）前記積層体の表面の前記均一溶液を冷却して、前記積層体の前記極細繊維不織布層の表面に前記生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出させて複合体を形成する工程６、
（７）前記複合体の前記高分子層を、前記高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ前記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒を用いて溶解させ、前記高分子層を前記複合体から取り除き、前記極細繊維不織布層及び前記多孔質層からなる複合多孔体を得る工程７、
（８）前記複合多孔体を凍結乾燥して多孔質組織再生基材を得る工程８、
を有することを特徴とする多孔質組織再生基材の製造方法。
５．前記共溶媒３を２種以上用い、前記２種以上の共溶媒３の配合比を調整することにより、得られる多孔質層の平均孔径を制御する、項４に記載の多孔質組織再生基材の製造方法。
６．生体吸収性材料からなる少なくとも２層のチューブ状の人工血管であって、
最内層に少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、
前記極細繊維不織布層の外側の表面に平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する、
ことを特徴とする人工血管。
７．前記極細繊維不織布層は、平均繊維径が０．１μｍ〜１０μｍの極細繊維からなる、項６に記載の人工血管。
８．前記極細繊維不織布層は、生体吸収性の異なる２種以上の生体吸収性高分子からなる、項６又は７に記載の人工血管。
９．生体吸収性材料からなる少なくとも２層のチューブ状の人工血管の製造方法であって、
（１−１）棒状体上に高分子層を形成する工程１−１、
（１−２）前記高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成して棒状積層体を得る工程１−２、
（２）前記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、前記高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒を用いて、前記棒状積層体の前記高分子層を膨潤させる工程２、
（３）膨潤させた前記高分子層と前記極細繊維不織布層とを圧着させ、乾燥させる工程３、
（４）生体吸収性高分子と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い溶媒１と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高く、且つ、前記生体吸収性高分子に対する溶解度よりも前記極細繊維不織布層に対する溶解度が低く前記溶媒１と相溶しない溶媒２と、前記溶媒１及び前記溶媒２と相溶する共溶媒３とを用いて、前記生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する工程４、
（５）前記均一溶液を、前記棒状積層体の前記極細繊維不織布層の表面に塗工する工程５、
（６）前記棒状積層体の表面の前記均一溶液を冷却して、前記棒状積層体の前記極細繊維不織布層の表面に前記生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出させて棒状複合体を形成する工程６、
（７）前記棒状複合体の前記高分子層を、前記高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ前記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒を用いて溶解させ、前記棒状体及び前記高分子層を前記棒状複合体から取り除き、前記極細繊維不織布層及び前記多孔質層からなるチューブ状の複合多孔体を得る工程７、
（８）前記チューブ状の複合多孔体を凍結乾燥してチューブ状の人工血管を得る工程８、
を有することを特徴とする人工血管の製造方法。
１０．前記棒状体は、金属からなる、項９に記載の人工血管の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の多孔質組織再生基材及び人工血管は、細胞浸潤性に優れており、優れた組織再生性を示すことができる。また、本発明の多孔質組織再生基材の製造方法及び人工血管の製造方法によれば、上記多孔質再生基材及び人工血管を容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の人工血管の製造方法において、工程１−１を電界紡糸法により行う場合を示す模式図である。
【図２】本発明の人工血管の製造方法において、工程１−１により、棒状体上に高分子層が形成された状態を示す図である。
【図３】本発明の人工血管の製造方法における工程１−２を示す模式図である。
【図４】本発明の人工血管の製造方法の工程１−２により得られる棒状積層体を示す図である。
【図５】本発明の人工血管の製造方法において、工程３により、膨潤させた高分子層と極細繊維不織布層とを圧着させる状態を示す断面模式図である。
【図６】本発明の人工血管の製造方法において、工程５により、均一溶液を、棒状積層体の極細繊維不織布層の表面に塗工する状態を示す図である。
【図７】本発明の人工血管の製造方法において、工程６により得られた棒状複合体を示す図である。
【図８】本発明の人工血管の製造方法において、工程７により得られたチューブ状の複合多孔体を示す図である。
【図９】実施例１で得られた人工血管の電子顕微鏡写真である。
【図１０】比較例１で得られた人工血管の電子顕微鏡写真である。
【図１１】実施例１において得られた人工血管の術後８週目の埋稙部分を摘出して得られた標本をＨＥ染色して撮影した顕微鏡写真である。
【図１２】比較例１において得られた人工血管の術後８週目の埋稙部分を摘出して得られた標本をＨＥ染色して撮影した顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の多孔質組織再生基材は、生体吸収性材料からなる少なくとも２層の積層体である多孔質組織再生基材であって、少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、上記極細繊維不織布層の表面に、平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する多孔質組織再生基材である。また、本発明の人工血管は、生体吸収性材料からなる少なくとも２層のチューブ状の人工血管であって、最内層に少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、上記極細繊維不織布層の外側の表面に平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する人工血管である。本発明の多孔質組織再生基材及び人工血管は、上記構成を備えているので、多孔質層の空隙部分に細胞が侵入して増殖し易くなっており、早期に組織が再生される。特に、本発明の多孔質組織再生基材をチューブ状にして、最内層に少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、極細繊維不織布層の外側の表面に平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する構成とした本発明の人工血管では、最内層の極細繊維不織布層の表面が平滑性に優れていることから、血栓等が付着し難く、血管の詰まりが抑制されるので、人工血管として好適に用いることができる。
【００１７】
また、本発明の多孔質組織再生基材の製造方法、及び人工血管の製造方法によれば、上記多孔質組織再生基材及び人工血管を容易に製造することができる。
【００１８】
以下、本発明の多孔質組織再生基材、人工血管、及びそれらの製造方法について詳細に説明する。
【００１９】
１．多孔質組織再生基材
本発明の多孔質組織再生基材は、生体吸収性材料からなる少なくとも２層の積層体である多孔質組織再生基材であって、少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、上記極細繊維不織布層の表面に、平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する。上記多孔質組織再生基材の層構成は、上記少なくとも２層の積層体であり、後述する極細繊維不織布層及び多孔質層を少なくともそれぞれ１層ずつ有していれば特に限定されない。
【００２０】
多孔質組織再生基材の形状は特に限定されず、平面状、チューブ状等の種々の形状であってもよい。多孔質組織再生基材を平面状に形成した場合、皮膚等の比較的平面性を要求される組織の多孔質組織再生基材として好適に用いることができる。
【００２１】
本発明の多孔質組織再生基材を、極細繊維不織布層が最内層となるようにチューブ状に形成した場合、本発明の人工血管となる。
【００２２】
（極細繊維不織布層）
極細繊維不織布層は、生体吸収性材料からなる、極細繊維により形成される不織布層である。特に、多孔質組織再生基材において、極細繊維不織布層を血液に接触する層とした場合、血栓形成を抑制し、且つ、血液中からの細胞浸潤を容易にすることができる。また、極細繊維不織布層を設けることにより多孔質組織再生基材の強度を向上させることができる。
【００２３】
極細繊維不織布層を構成する生体吸収性材料としては生体吸収性を有していれば特に限定されず、例えば、生体吸収性高分子を好適に用いることができる。生体吸収性高分子としては、ポリグリコール酸、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ−ε−カプロラクトン、ラクチド−グリコール酸共重合体、グリコリド−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサンノン、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリグリコールセバスチン酸等の合成高分子；デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類；ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。
【００２４】
上記生体吸収性材料は１種単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。特に、生体吸収性の異なる２種以上の生体吸収性高分子を組み合わせて用いることが好ましい。生体吸収性の異なる２種以上の生体吸収性高分子を組み合わせて極細繊維不織布層を構成することにより、極細繊維不織布層への細胞の侵入をより一層容易にすることができ、血管再生の遅延や、石灰化の原因となることをより一層抑制することができる。例えば、相対的に生体吸収性の高いポリグリコリドと、相対的に生体吸収性の低いポリラクチドとを組み合わせて極細繊維不織布層を構成するとする。この場合、特に強度が求められる移植直後の比較的初期においては、２種の生体吸収性高分子のいずれもが分解せずに存在することから、高い強度向上効果を発揮できる。その後、徐々に生体吸収性の高いポリグリコリドが分解され吸収されていくに従って、極細繊維不織布層に空隙が生成する。この空隙により細胞の侵入がより一層容易となり、血管再生がより一層促進され、石灰化をより一層抑制することができる。
【００２５】
極細繊維不織布層を形成する繊維の繊維径は０．１μｍ〜１０μｍが好ましい。上記繊維系を０．１μｍ以上とすることで、繊維間と繊維間の距離が適度に広くなり細胞浸潤性がより一層優れ、１０μｍ以下とすることで、極細繊維不織布層の表面の平滑性がより一層向上して、血栓形成の一因である血小板の付着をより一層抑制することができる。上記繊維径は０．３μｍ〜８．０μｍがより好ましく、０．３μｍ〜５．０μｍが更に好ましい。
【００２６】
本明細書において、上記極細繊維不織布層を形成する繊維の平均繊維径は、多孔質組織再生基材をその表面とは垂直方向に切断し、得られた電子顕微鏡像の任意の１０点の繊維の直径を測定し、その平均値を算出することにより測定される。同様に、本発明の多孔質組織再生基材が人工血管である場合は、チューブ状の人工血管を長手方向と直交する方向で切断し、人工血管の壁面の断面の中央付近を電子顕微鏡を用いて電子顕微鏡像を撮影し、得られた電子顕微鏡像の任意の１０点の繊維の直径を測定し、その平均値を算出することにより測定される。
【００２７】
極細繊維不織布層の厚みは１０〜１０００μｍが好ましい。極細繊維不織布層の厚みが上記範囲内であると、より一層強度向上効果を発揮することができる。
【００２８】
極細繊維不織布層は、少なくとも１層形成されていればよく、複数層形成されていてもよい。
【００２９】
（多孔質層）
多孔質層は、組織再生を早めるため、極細繊維不織布層の表面に配置される層である。多孔質層は、極細繊維不織布層の少なくとも片面の表面に形成されていればよく、両面の表面に形成されていてもよいが、通常は片面の表面にのみ形成される。
【００３０】
多孔質層の平均孔径は、０．１〜８００μｍである。平均孔径が０．１μｍより小さいと細胞浸潤性が劣り、８００μｍより大きいと侵入してきた細胞を補足することが困難となる。多孔質層の平均孔径は、１．０〜７００μｍが好ましく、１０〜６００μｍがより好ましい。
【００３１】
本明細書において、上記多孔質層の平均孔径は、多孔質組織再生基材をその表面とは垂直方向に切断し、多孔質組織再生基材の断面の中央付近を電子顕微鏡を用いて電子顕微鏡像を撮影し、得られた電子顕微鏡像の多孔質層の任意の１０点の孔の直径（長径）を測定して、その平均値を算出することにより測定される。同様に、本発明の多孔質組織再生基材が人工血管である場合は、チューブ状の人工血管を長手方向と直交する方向で切断し、人工血管の壁面の断面の中央付近を電子顕微鏡を用いて電子顕微鏡像を撮影し、得られた電子顕微鏡像の多孔質層の任意の１０点の孔の直径（長径）を測定して、その平均値を算出することにより測定される。
【００３２】
多孔質層は、生体吸収性高分子により形成されていることが好ましい。多孔質層を形成する生体吸収性高分子としては特に限定されず、上述した極細繊維不織布層を構成する生体吸収性高分子と同様の生体吸収性高分子を用いることができる。
【００３３】
多孔質層の厚みは、上記極細繊維不織布層の厚みとのバランス、所望の形状、及び人工血管である場合は所望の口径を勘案して設定すればよい。多孔質層の厚みは特に限定されず、１０〜１０００μｍが好ましく、５０〜６００μｍがより好ましい。
【００３４】
多孔質層は、少なくとも１層形成されていればよく、複数層形成されていてもよい。
【００３５】
本発明の多孔質組織再生基材は、各層に、ヘパリン等の血栓の形成を防止する剤や、ｂＦＧＦ等の血管の再生を促進する成長因子等を含有してもよい。更に、移植に先立って、間葉系幹細胞等の細胞が播種されていてもよい。
【００３６】
２．人工血管
本発明の人工血管は、生体吸収性材料からなる少なくとも２層のチューブ状の人工血管であって、最内層に少なくとも１層の極細繊維不織布層を有し、上記極細繊維不織布層の外側の表面に平均孔径が０．１〜８００μｍである少なくとも１層の多孔質層を有する。上記多孔質組織再生基材を、極細繊維不織布層が最内層となるようにチューブ状に形成した場合、本発明の人工血管となる。
【００３７】
本発明の人工血管において、上記極細繊維不織布層は最内層の直接血液に接触する層であり、血栓形成を抑制し、且つ、血液中からの細胞浸潤を容易にする層である。また、極細繊維不織布層を設けることにより人工血管の強度を向上させることができる。
【００３８】
本発明の人工血管において、上記多孔質層は、極細繊維不織布層の外側の表面に形成される。上記構成とすることで、最内層の直接血液に接触する層が極細繊維不織布層となり、血栓形成を抑制し、且つ、血液中からの細胞浸潤を容易にすることができる。
【００３９】
人工血管の内径は特に限定されず、一般的な血管の内径から、好ましい下限は０．５ｍｍ、好ましい上限は８．０ｍｍ程度である。また、上記人工血管の外径は特に限定されず、一般的な血管の外径から、好ましい下限は１．０ｍｍ、好ましい上限は１０．０ｍｍ程度である。とりわけ内径が２．０〜５．０ｍｍ程度の抹消血管の再生にも利用可能な人工血管は、従来の方法では製造が困難であったが、後述する本発明の人工血管の製造方法によれば容易に製造することができる。
【００４０】
本発明の人工血管の上記以外の構成については、上記多孔質組織再生基材と同一である。
【００４１】
本発明の人工血管は、人工血管以外にも神経再生に用いることができる。また、本発明のチューブ状の人工血管を長手方向と平行方向に切開し、血管欠損部の組織再生を促すパッチ等の組織再生基材として用いることができる。
【００４２】
３．多孔質組織再生基材の製造方法
本発明の多孔質組織再生基材の製造方法は、生体吸収性材料からなる少なくとも２層の多孔質組織再生基材の製造方法であって、
（１）高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成して積層体を得る工程１、
（２）上記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、上記高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒を用いて、上記積層体の前記高分子層を膨潤させる工程２、
（３）上記積層体の膨潤させた上記高分子層と上記極細繊維不織布層とを圧着させ、乾燥させる工程３、
（４）生体吸収性高分子と、前記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い溶媒１と、上記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高く、且つ、前記生体吸収性高分子に対する溶解度よりも前記極細繊維不織布層に対する溶解度が低く上記溶媒１と相溶しない溶媒２と、上記溶媒１及び上記溶媒２と相溶する共溶媒３とを用いて、上記生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する工程４、
（５）上記均一溶液を、上記積層体の上記極細繊維不織布層の表面に塗工する工程５、
（６）上記積層体の表面の上記均一溶液を冷却して、上記積層体の上記極細繊維不織布層の表面に上記生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出させて複合体を形成する工程６、
（７）上記複合体の上記高分子層を、上記高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ上記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒を用いて溶解させ、上記高分子層を上記複合体から取り除き、上記極細繊維不織布層及び上記多孔質層からなる複合多孔体を得る工程７、
（８）上記複合多孔体を凍結乾燥して多孔質組織再生基材を得る工程８、
を有する製造方法である。
【００４３】
本発明の多孔質組織再生基材の製造方法により製造される多孔質組織再生基材の形状がチューブ状である場合、本発明の人工血管となる。このため、後述するように、本発明の多孔質組織再生基材の製造方法において、棒状体上に高分子層、極細繊維不織布層及び多孔質層を形成し、棒状体及び高分子層を取り除く工程を有する製造方法とすることにより、本発明の人工血管の製造方法となる。先ず、以下に本発明の多孔質組織再生基材の製造方法について説明する。
【００４４】
（工程１）
工程１は、高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成して積層体を得る工程である。
【００４５】
高分子層は、後述する多孔質層を形成するための生体吸収性高分子の均一溶液が、極細繊維不織布層の高分子層を形成する側の表面へ侵入することを抑制する層であり、最終的に取り除かれる層である。
【００４６】
高分子層を形成する高分子としては、多孔質層を形成するための生体吸収性高分子の均一溶液の極細繊維不織布層への侵入を抑制でき、形成された高分子層を容易に取り除くことができれば特に限定されない。このような高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、ＨＥＭＡ、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリグルタミン酸、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、でんぷん、キサンタンガム、ゼラチン等が挙げられる。これらの中でも、生体吸収性高分子の均一溶液の極細繊維不織布層への侵入をより一層抑制することができ、且つ、形成された高分子層を容易に取り除くことができる点で、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムが好ましい。
【００４７】
上記高分子は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４８】
高分子層の形態は特に限定されず、高分子フィルム等の平面状の層であってもよいし、ナノファイバー等の繊維状の高分子の不織布層であってもよい。中でも、高分子のナノファイバーの不織布層であることが好ましい。高分子層を高分子のナノファイバーの不織布層とすることにより、高分子層を均一な厚みに形成し易く、且つ、後工程で極細繊維不織布層を電界紡糸法により形成する場合、高分子層の密度が０．３〜０．８ｇ／ｃｍ３程度に調整することができるため電圧がかかり易くなり、極細繊維不織布層をより一層形成し易くなる。
【００４９】
高分子層の厚みは、後工程での電界紡糸法等の方法による極細繊維不織布層の形成を阻害しなければ特に限定されず、１０〜８００μｍが好ましく、３０〜５００μｍがより好ましい。
【００５０】
高分子層の形成方法としては特に限定されず、例えば、高分子層を形成する高分子を適当な溶媒に溶解させ、平面状体、棒状体等の基材上にディプコーティング、スプレーコーティング、電界紡糸法（エレクトロスピニング）等の方法により形成する方法が挙げられる。高分子層を形成後、後工程で電界紡糸法により極細繊維不織布層を積層するため、生産性の観点から同様な装置で均一な高分子層を形成させることが望ましく、上記方法の中でも、電界紡糸法が好適である。
【００５１】
高分子層の形成を電界紡糸法で行う場合、電界紡糸の条件は特に限定されず、電圧−５〜−２５ｋＶ、ノズル径１８〜３２Ｇの条件で行うことが好ましい。
【００５２】
上記基材として平面状体を用いれば、製造される多孔質組織再生基材が平面状となり、皮膚等の比較的平面性を要求される組織に好適に用いられる多孔質組織再生基材を製造することができる。また、上記基材として棒状体を用いれば、製造される多孔質組織再生基材がチューブ状となり、本発明の人工血管を製造することができる。
【００５３】
工程１では、上記高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成する。電界紡糸法は、ノズルとコレクタ電極との間に高電圧をかけた状態で、ノズルから生体吸収性高分子を溶解した溶液をターゲットに向けて吐出する方法である。ノズルから発射された溶液は、電気力線に沿って極細繊維状となり、ターゲット上に付着する。
【００５４】
極細繊維不織布層の形成を電界紡糸法で行う場合、電界紡糸の条件は特に限定されず、電圧−５〜−２５ｋＶ、ノズル径１８〜３２Ｇの条件で行うことが好ましい。
【００５５】
工程１で用いられる極細繊維不織布層を形成する生体吸収性材料としては、上述の本発明の多孔質組織再生基材の極細繊維不織布層の説明において説明した生体吸収性高分子を好適に用いることができる。工程１で好適に用いられる生体吸収性高分子は、後述する工程４において用いられる良溶媒（溶媒２）及び共溶媒３に溶解しないことが好ましく、例えば、工程４において良溶媒としてメチルエチルケトン（ＭＥＫ）、共溶媒としてアセトンを用いる場合、これらの溶媒の溶解度パラメーター（ｓｐ値）がそれぞれ９．３及び１０であることから、それらよりも溶解度パラメーターが高いことが好ましい。このような生体吸収性高分子としては、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ラクチド−グリコール酸共重合体、グリコリド−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサンノン、コラーゲン等が挙げられる。これらの中でも、ポリラクチド、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体が好ましい。ポリラクチドの中でも、ポリ−Ｌ−ラクチド（ＰＬＬＡ）は溶解度パラメーターが１９であるので好適に用いることができ、ポリ−Ｄ,Ｌ−ラクチド（ＰＤＬＬＡ）は、Ｄ−ラクチドとＬラクチドとの混合比を適宜調整することにより溶解度パラメーターを調整することができ、好適に用いることができる。また、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体は、ラクチドとε−カプロラクトンとの共重合比ＬＡ／ＣＬを７５／２５〜１００／０の範囲とすることにより結晶性が高くなり、好適に用いることができる。
【００５６】
工程１において生体性高分子は、後述する工程４で用いられる良溶媒（溶媒２）及び共溶媒３に溶解しないよう耐溶剤性を向上させてもよく、熱処理（アニーリング）されていてもよい。
【００５７】
以上説明した工程１により、高分子層上に極細繊維不織布層が形成された積層体を得ることができる。
【００５８】
（工程２）
工程２は、極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒を用いて、積層体の高分子層を膨潤させる工程である。上記工程１により得られた積層体では、高分子層と極細繊維不織布層とは界面で密着しておらず、当該界面に、後工程により多孔質層を形成する生体吸収性高分子を溶解させた均一溶液（高分子溶液）が侵入し、極細繊維不織布の高分子層が形成される側の表面にも高分子層が形成されてしまう。本発明では、上記工程２において、積層体の高分子層を溶解させない程度に膨潤させることにより、高分子層と極細繊維不織布層とを密着させることができ、これらの界面への高分子溶液の侵入を抑制することができる。
【００５９】
上記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒とは、高分子層よりも極細繊維不織布層を溶解しにくい性質を有する溶媒であることを意味する。このような溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等が挙げられる。上記溶媒は１種単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００６０】
上記溶媒を用いて高分子層を膨潤させる方法としては特に限定されず、例えば、工程１により得られた積層体を上記溶媒に浸漬する方法が挙げられる。浸漬時間は特に限定されず、１〜６０分が好ましく、５〜３０分がより好ましい。浸漬の際の溶媒の温度は上記溶媒の沸点を超えない程度であればよく、５〜６０℃が好ましく、１０〜５０℃がより好ましい。
【００６１】
以上説明した工程２により、上記積層体の高分子層が膨潤される。
【００６２】
（工程３）
工程３は、積層体の膨潤させた高分子層と極細繊維不織布層とを圧着させ、乾燥させる工程である。上述のように、工程１により得られた積層体では、高分子層と極細繊維不織布層との界面は密着しておらず、当該界面に、後工程により多孔質層を形成する生体吸収性高分子を溶解させた高分子溶液が侵入し、極細繊維不織布の高分子層が形成される側の表面にも多孔質層が形成されてしまう。このため、上記工程２により積層体の高分子層を膨潤させた後、工程３により高分子層と極細繊維不織布層とを密着させる。
【００６３】
積層体の膨潤させた高分子層と極細繊維不織布層とを圧着させる圧着方法としては特に限定されず、従来公知の方法により圧着させればよい。このような方法としては、例えば、上記工程２により高分子層を膨潤させた積層体全体を、シリコン板等で均一にロールプレスする方法が挙げられる。また、工程３においては、超音波溶着により極細繊維不織布層を損傷させない程度に、高分子層だけを溶融させて圧着してもよい。
【００６４】
上記圧着方法として、シリコン板等で均一にロールプレスする方法を採用する場合、ロールプレスの際の圧力は、０．０１〜１０ＭＰａが好ましく、０．２〜５．０ＭＰａがより好ましい。
【００６５】
工程３では、積層体の高分子層と極細繊維不織布層とを圧着させた後、積層体を乾燥させる。積層体を乾燥させることにより、後工程で極細繊維不織布層の表面に多孔質層を好適に形成することができる。上記乾燥方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、積層体を２０〜１００℃程度の乾燥オーブンに１〜６０分間程度入れて乾燥させる方法が挙げられる。また、極細繊維不織布層の表面をキムワイプ等で拭きとる方法により乾燥させてもよい。
【００６６】
以上説明した工程３により、積層体の膨潤させた高分子層と極細繊維不織布層とが圧着され、乾燥される。
【００６７】
（工程４）
工程４は、生体吸収性高分子と、生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い溶媒１と、生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高く、且つ、前記生体吸収性高分子に対する溶解度よりも前記極細繊維不織布層に対する溶解度が低く溶媒１と相溶しない溶媒２と、溶媒１及び溶媒２と相溶する共溶媒３とを用いて、生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する工程である。
【００６８】
工程４において用いられる生体吸収性高分子は、上記均一溶液を調製できるものであれば特に限定されず、例えば、上述の本発明の多孔質組織再生基材を構成する極細繊維不織布層の説明において説明した生体吸収性高分子の中から適宜選択して用いることができる。これらの中でも、ポリε−カプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリグリコールセバシン酸等のグリコール酸共重合体、グリコリド−ε−カプロラクトン共重合体、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)共重合体、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体等を好適に用いることができる。特に、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体は、ラクチドとε−カプロラクトンとの共重合比ＬＡ／ＣＬを７５／２５〜０／１００の範囲とすることにより上記均一溶液をより一層容易に調製することができ、より好適に用いることができる。
【００６９】
溶媒１は、上記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い、いわゆる貧溶媒である。ここで、「生体吸収性高分子に対し相対的に溶解度が低い」とは、上記溶媒２よりも上記生体吸収性高分子を溶解しにくい性質を有することを意味する。
【００７０】
溶媒１としては、生体吸収性高分子が合成高分子である場合には、例えば、水、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等を用いることができる。なかでも、取り扱い性に優れることから、水が好適である。
【００７１】
溶媒２は、上記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高いいわゆる良溶媒であって、且つ、生体吸収性高分子に対する溶解度よりも極細繊維不織布層に対する溶解度が低い溶媒である。ここで、「生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高い」とは、上記溶媒１よりも上記生体吸収性高分子を溶解しやすい性質を有することを意味する。
【００７２】
溶媒２は、溶媒１と相溶しないものである。ここで相溶しないとは、２５℃の室温下で混合、撹拌しても相分離することを意味する。
【００７３】
溶媒２としては、工程４で用いられる生体吸収性高分子が合成高分子であって、溶媒１として水を選択した場合には、例えば、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルアミノケトン、シクロヘサノン、酢酸エチル等の有機溶媒を用いることができる。なかでも、安価で比較的取扱い容易なメチルエチルケトンが好適である。
【００７４】
共溶媒３は、溶媒１と溶媒２とのいずれとも相溶する。このような共溶媒３を組み合わせることにより、溶媒１と溶媒２とが非相溶であっても相分離法による多孔質層を製造することが可能となり、溶媒１と溶媒２との組み合わせの選択肢が飛躍的に広がる。ここで相溶するとは、２５℃の室温下で混合、撹拌しても相分離しないことを意味する。
【００７５】
得られる多孔質層の孔径は、溶媒１と溶媒２との配合比を調整することにより制御することができる。具体的には、溶媒１の比率を高くすると得られる多孔質層の孔径が大きくなり、溶媒２の比率を高くすると得られる多孔質層の孔径が小さくなる。溶媒１と溶媒２との配合比は特に限定されず、溶媒１と溶媒２とが重量比で１：１〜１：１００の範囲内であることが好ましい。この範囲内であると、均一な多孔質層を製造することができる。より好ましくは、１：１０〜１：５０の範囲内である。
【００７６】
溶媒１及び溶媒２の合計と共溶媒３との配合比は特に限定されないが、溶媒１及び溶媒２の合計と共溶媒３とが重量比で１：０．０１〜１：０．５の範囲内であることが好ましい。この範囲内であると、より一層均一な多孔質層を製造することができる。より好ましくは、１：０．０２〜１：０．３の範囲内である。
【００７７】
工程４で用いられる生体吸収性高分子として合成高分子を用い、溶媒１として極細繊維不織布層に対して溶解度が低い溶媒である水を選択し、上記溶媒２として有機溶媒を選択した場合には、共溶媒３としては、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、テトラヒドロフラン等を用いることができる。
【００７８】
工程４では、共溶媒３を２種以上組み合わせて用いることが好ましい（以下、共溶媒３に含まれる２種以上の溶媒を「共溶媒３−１」、「共溶媒３−２」、・・・ともいう。）。上記共溶媒３を２種以上組み合わせて、例えば、共溶媒３−１と共溶媒３−２の配合比を調整することにより、得られる多孔質層の平均孔径を制御することができる。即ち、溶媒１と溶媒２と共溶媒３の配合比を一定としたまま、共溶媒３に含まれる共溶媒３−１と共溶媒３−２との配合比を調整することにより、得られる多孔質層の平均孔径を制御することができる。これは、得られる多孔質層のかさ密度をほぼ一定として、孔径のみを調整可能なことを意味する。このような本発明の多孔質組織再生基材の製造方法によれば、任意の孔径とかさ密度を有する多孔質層を製造することがより一層容易になる。
【００７９】
極細繊維不織布層、工程４で用いられる生体吸収性高分子、及び各溶媒の組み合わせとしては特に限定されず、各溶媒が極細繊維不織布層に対して溶解度が低く生体吸収性高分子に対して溶解度が高い溶媒の組み合わせとすればよい。例えば、極細繊維不織布層がポリラクチドからなり、工程４で用いられる生体吸収性高分子としてのラクチド−ε−カプロラクトン共重合体に対して、溶媒１が水、溶媒２がメチルエチルケトンである組み合わせ；極細繊維不織布層がポリグリコライドからなり、生体吸収性高分子としてのポリラクチドに対して、溶媒１が水、溶媒２がクロロホルムである組み合わせ；極細繊維不織布層がポリグリコライドからなり、工程４で用いられる生体吸収性高分子としてのポリラクチドに対して、共溶媒３−１がテトラヒドロフラン、共溶媒３−２がエタノールである組み合わせ；極細繊維不織布層がポリグリコライドからなり、工程４で用いられる生体吸収性高分子としてのポリラクチドに対して、溶媒１が水、溶媒２がクロロホルム、共溶媒３−１がアセトン、共溶媒３−２がエタノールである組み合わせ等が挙げられる。
【００８０】
工程４においては、生体吸収性高分子と溶媒１と溶媒２と共溶媒３とを用いて、生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する。より具体的に上記均一溶液を調製する方法としては、例えば、生体吸収性高分子と、上記溶媒１、溶媒２及び共溶媒３を含む混合溶媒（以下、単に「混合溶媒」ともいう。）を混合した後、加熱する方法が挙げられる。また、より容易に均一溶液を調製する方法として、例えば、上記混合溶媒を予め加熱し、該加熱した混合溶媒に生体吸収性高分子を加える方法や、生体吸収性高分子をいったん溶媒２に溶解した後、加熱しながら溶媒１及び共溶媒３を加える方法等も挙げられる。混合方法は特に限定されず、例えば、スターラチップ、撹拌棒等を用いた公知の混合方法を用いることができる。
【００８１】
工程４における上記加熱の温度としては、生体吸収性高分子が均一に溶解する温度であれば特に限定されず、溶媒１、溶媒２及び共溶媒３のいずれの沸点よりも低い温度が好ましい。加熱温度をこのような温度とすることにより、加熱温度を沸点以上の温度とすることによる各溶媒の配合比の変動を抑制することができ、得られる多孔質組織再生基材の孔径、かさ密度をより一層制御し易くなる。
【００８２】
以上説明した工程４により、均一溶液が調製される。
【００８３】
（工程５）
工程５は、上記均一溶液を、積層体の極細繊維不織布層の表面に塗工する工程である。上記均一溶液を極細繊維不織布層の表面に塗工する方法としては特に限定されず、例えば、極細繊維不織布層が形成された積層体を均一溶液中に１回又は複数回ディップする方法等が挙げられる。
【００８４】
以上説明した工程５により、上記均一溶液が、積層体の極細繊維不織布層の表面に塗工される。
【００８５】
（工程６）
工程６は、積層体の表面の均一溶液を冷却して、積層体の極細繊維不織布層の表面に生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出させて複合体を形成する工程である。積層体を冷却することにより、不溶となった生体吸収性高分子からなる多孔質層が析出する。これは、いわゆる一般的な熱融起相分離の冷却による多孔質高分子の析出であるが、析出された多孔質層は細胞浸潤性にとって望ましい連通孔となっている。これは、生体吸収性高分子が結晶化され析出する前に、生体吸収性高分子が結晶化する温度以上で、液体状態の生体吸収性高分子と各溶媒とがまず熱力学的不安定性により相分離（液−液相分離）するためと考えられる。
【００８６】
工程６における冷却の温度としては、生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出できる温度であれば特に限定されないが、４℃以下であることが好ましく、−２４℃以下であることがより好ましい。なお、得られる多孔質組織再生基材の孔径は冷却速度にも影響される。具体的には、冷却速度が早いと孔径が小さくなり、冷却速度が遅いと孔径が大きくなる傾向がある。従って、特に孔径の小さい多孔質組織再生基材を得る場合には、冷却温度を低く設定して急速に冷却することが考えられる。また、冷却温度の下限は特に限定されず、−４０℃が好ましく、−７０℃がより好ましい。
【００８７】
工程６における冷却時間としては特に限定されず、５〜４８０分が好ましく、１０〜１２０分がより好ましい。
【００８８】
冷却方法としては特に限定されず、従来公知の冷却方法により冷却すればよい。このような冷却方法としては、例えば、積層体を冷凍庫に保管する方法が挙げられる。
【００８９】
以上説明した工程６により、積層体の極細繊維不織布層の表面に生体吸収性高分子からなる多孔質層が析出して複合体が形成される。
【００９０】
（工程７）
工程７は、複合体の高分子層を高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒を用いて溶解させ、高分子層を複合体から取り除き、極細繊維不織布層及び多孔質層からなる複合多孔体を得る工程である。
【００９１】
高分子層に対し相対的に溶解度が高く且つ極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔ―ブチルアルコール等が挙げられる。ここで、高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低いとは、高分子層よりも極細繊維不織布層を溶解しにくい性質を有することを意味する。
【００９２】
高分子層を上記溶媒を用いて溶解させる方法としては特に限定されず、上記溶媒に複合体を浸漬する方法等が挙げられる。このような方法により高分子層を溶解させる場合、浸漬時間は、１分〜２４時間であることが好ましい。
【００９３】
工程７における溶媒の温度は、５〜６０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。
【００９４】
工程７では、より具体的には、上記高分子層を形成する高分子としてポリビニルアルコールを用いた場合、溶媒として水を用いることが好ましく、例えば、複合体を３７℃の水に約２０〜６０分間浸漬させ、これを数回繰り返すことで、複合体から高分子層を容易に取り除くことができる。
【００９５】
以上説明した工程７により、高分子層を複合体から取り除き、極細繊維不織布層及び多孔質層からなる複合多孔体を得ることができる。
【００９６】
（工程８）
工程８は、複合多孔体を凍結乾燥して多孔質組織再生基材を得る工程である。凍結乾燥の条件としては特に限定されず、従来公知の条件で行うことができる。
【００９７】
凍結乾燥の凍結温度としては特に限定されず、−１００℃〜−１０℃が好ましく、−５０℃〜−３０℃がより好ましい。
【００９８】
凍結乾燥の際の圧力としては特に限定されず、１〜４００Ｐａが好ましく、５〜１００Ｐａがより好ましい。
【００９９】
凍結乾燥の乾燥時間としては特に限定されず、１２〜９６時間が好ましく、２４〜５２時間がより好ましい。
【０１００】
以上説明した工程８により、複合多孔体が凍結乾燥されて、多孔質組織再生基材を得ることができる。
【０１０１】
本発明の多孔質組織再生基材の極細繊維不織布層を複数層形成する場合は、上記工程１において、電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成する工程を複数回繰り返して行い、極細繊維不織布層を所望の層数で形成すればよい。
【０１０２】
本発明の多孔質組織再生基材の多孔質層を複数層形成する場合は、上記工程４及び５を複数回繰り返して行い、多孔質層を所望の層数で形成すればよい。
【０１０３】
上記多孔質組織再生基材の製造方法により製造される多孔質組織再生基材の形状は特に限定されず、平面状、チューブ状等の種々の形状であってもよい。上記工程１において、高分子層の形状を所望の形状にすることにより、多孔質組織再生基材の形状を所望の形状にすることができる。上記多孔質再生基材の製造方法により、多孔質組織再生基材を極細繊維不織布層が最内層となるようにチューブ状に製造した場合、後述する本発明の人工血管の製造方法となる。
【０１０４】
なお、本発明の多孔質組織再生基材は、後述する本発明の人工血管の製造方法において、製造されたチューブ状の人工血管を長手方向と平行方向に切開することによっても製造することができる。このようにして製造された本発明の多孔質組織再生基材は、血管欠損部の組織再生を促すパッチ等として用いることができる。
【０１０５】
４．人工血管の製造方法
本発明の人工血管の製造方法は、生体吸収性材料からなる少なくとも２層のチューブ状の人工血管の製造方法であって、
（１−１）棒状体上に高分子層を形成する工程１−１、
（１−２）上記高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成して棒状積層体を得る工程１−２、
（２）上記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、上記高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒を用いて、上記棒状積層体の上記高分子層を膨潤させる工程２、
（３）膨潤させた上記高分子層と上記極細繊維不織布層とを圧着させ、乾燥させる工程３、
（４）生体吸収性高分子と、上記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い溶媒１と、上記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高く、且つ、上記生体吸収性高分子に対する溶解度よりも上記極細繊維不織布層に対する溶解度が低く上記溶媒１と相溶しない溶媒２と、上記溶媒１及び上記溶媒２と相溶する共溶媒３とを用いて、上記生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する工程４、
（５）上記均一溶液を、上記棒状積層体の前記極細繊維不織布層の表面に塗工する工程５、
（６）上記棒状積層体の表面の前記均一溶液を冷却して、上記棒状積層体の上記極細繊維不織布層の表面に上記生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出させて棒状複合体を形成する工程６、
（７）上記棒状複合体の上記高分子層を、上記高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ上記極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒を用いて溶解させ、上記棒状体及び上記高分子層を上記棒状複合体から取り除き、上記極細繊維不織布層及び上記多孔質層からなるチューブ状の複合多孔体を得る工程７、
（８）上記チューブ状の複合多孔体を凍結乾燥してチューブ状の人工血管を得る工程８、
を有することを特徴とする製造方法である。
【０１０６】
本発明の人工血管の製造方法は、上記多孔質組織再生基材の製造方法において、多孔質組織再生基材をチューブ状に製造する製造方法である。このため、本発明の人工血管の製造方法では、上記多孔質組織再生基材の製造方法の工程１において棒状体を用い、棒状体上に高分子層を形成した後、当該高分子層上に順次極細繊維不織布層及び多孔質層を形成して、工程７において棒状体及び高分子層を取り除くこととなる。
【０１０７】
以下、本発明の人工血管の製造方法について、上記多孔質組織再生基材の製造方法との相違点を中心に、図を用いて説明する。以下の本発明の人工血管の製造方法の説明において、記載のない事項は、上記多孔質組織再生基材の製造方法と同一である。
【０１０８】
（工程１−１）
工程１−１は、棒状体上に高分子層を形成する工程である。棒状体上に高分子層を形成する方法としては特に限定されず、高分子層を含有する樹脂組成物を塗布し、乾燥させる方法や、電界紡糸法等が挙げられる。中でも、後述する棒状体を用いて効率よく高分子層を形成することができる点で、電界紡糸法により形成することが好ましい。
【０１０９】
（棒状体）
棒状体は、高分子層をチューブ状に成形するための部材である。棒状体としては特に限定されず、従来公知の棒状の部材を用いることがでる。棒状体としては、例えば、ステンレスや樹脂被覆ステンレス等の金属からなる棒状体が挙げられる。棒状体として金属からなる導電性の棒状体を用いることにより、電界紡糸法において棒状体をコレクタ電極として、高分子層及び極細繊維不織布層を効率よく形成することができる。
【０１１０】
棒状体の直径は、０．４〜５０ｍｍが好ましく、０．５〜４０ｍｍがより好ましい。棒状体の直径を上記範囲とすることで、人工血管の内径を、体内の所望の部位に好適に用いることができる。また、棒状体の長さは、製造する血管の長さに合わせて適宜設定すればよい。
【０１１１】
図１は、工程１−１を電界紡糸法により行う場合を示す模式図である。図１では、棒状体１をコレクタ電極として、棒状体１を回転させて、ノズル２を往復させながら高分子層を形成する高分子を吐出している。工程１−１により、図２に示すように、棒状体１上に高分子層３が形成される。
【０１１２】
（工程１−２）
工程１−２は、高分子層上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維を吐出して、極細繊維不織布層を形成して棒状積層体を得る工程である。図３は、工程１−２を示す模式図である。図３では、工程１で形成された高分子層３上に電界紡糸法により生体吸収性材料からなる繊維が吐出されている。工程１−２により、図４に示すように、高分子層３上に極細繊維不織布層４が形成され、棒状積層体５が得られる。
【０１１３】
（工程２）
工程２は、極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低く、且つ、高分子層に対して相対的に溶解度が高い溶媒を用いて、棒状積層体の高分子層を膨潤させる工程である。工程２については、上記多孔質組織再生基材の製造方法と同一である。
【０１１４】
（工程３）
工程３は、工程２により膨潤させた高分子層と極細繊維不織布層とを圧着させ、乾燥させる工程である。図５は、工程３において、膨潤させた高分子層と極細繊維不織布層とを圧着させる状態を示す断面模式図である。図５において、棒状積層体５は、シリコン板６によりロールプレスされており、これにより、高分子層３と極細繊維不織布層４とが界面７において密着する。当該密着により、界面７に、後工程により多孔質層を形成する生体吸収性高分子を溶解させた高分子溶液が侵入することを抑制して、極細繊維不織布の高分子層が形成されている側の表面への多孔質層の形成を抑制することができる。
【０１１５】
（工程４）
工程４は、生体吸収性高分子と、上記生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が低い溶媒１と、生体吸収性高分子に対して相対的に溶解度が高く、且つ、生体吸収性高分子に対する溶解度よりも極細繊維不織布層に対する溶解度が低く溶媒１と相溶しない溶媒２と、溶媒１及び溶媒２と相溶する共溶媒３とを用いて、生体吸収性高分子を溶解した均一溶液を調製する工程である。工程４については、上記多孔質組織再生基材の製造方法と同一である。
【０１１６】
（工程５）
工程５は、工程４により調製した均一溶液を、棒状積層体の極細繊維不織布層の表面に塗工する工程である。図６は、工程５において、均一溶液を、棒状積層体の極細繊維不織布層の表面に塗工する状態を示す図である。図６において、棒状積層体５は、当該棒状積層体５の内径よりも内径が大きい筒状体８であるガラス管の中に配置され、棒状積層体５と筒状体８との隙間に工程４により調製した均一溶液９が流し込まれ、充填されている。
【０１１７】
筒状体を形成する素材としては特に限定されず、ガラス管、ステンレス管、アルミニウム管等を用いることができる。中でも、多孔質層の形成過程を確認できる点で、ガラス管が好ましい。
【０１１８】
筒状体の内径は、棒状積層体の直径に応じて適宜設定すればよい。棒状積層体と筒状体との隙間は、０．０１〜１０ｍｍが好ましく、０．１〜８．０ｍｍがより好ましい。
【０１１９】
後述する工程６において、棒状積層体５の極細繊維不織布層の表面に析出する多孔質層は、若干収縮することから、筒状体の抜き取りは容易であるが、より一層筒状体の抜き取りを容易にするために、予め筒状体の内側の表面にコーティング等の滑り加工を施しておいてもよい。
【０１２０】
（工程６）
工程６は、棒状積層体の表面の均一溶液を冷却して、棒状積層体の極細繊維不織布層の表面に生体吸収性高分子からなる多孔質層を析出させて棒状複合体を形成する工程である。図７は、工程６により得られた棒状複合体を示す模式図である。図７において、棒状複合体１０は、棒状積層体５の極細繊維不織布層４の表面に多孔質層９が形成されている。
【０１２１】
（工程７）
工程７は、棒状複合体の高分子層を、高分子層に対して相対的に溶解度が高く且つ極細繊維不織布層に対して相対的に溶解度が低い溶媒を用いて溶解させ、棒状体及び前記高分子層を棒状複合体から取り除き、極細繊維不織布層及び多孔質層からなるチューブ状の複合多孔体を得る工程である。図８は、工程７により得られたチューブ状の複合多孔体を示す模式図である。図８において、複合多孔体１１は、図７で示される棒状複合体の中心に存在していた棒状体及び高分子層３が取り除かれて空洞１２となっており、極細繊維不織布層の表面に多孔質層が積層された、チューブ状の複合多孔体となっている。
【０１２２】
以下の本発明の人工血管の製造方法の説明において、記載のない事項は、上記多孔質組織再生基材の製造方法と同一である。以上説明した人工血管の製造方法により、細胞浸潤性に優れており、優れた組織再生性を示すことができる本発明の人工血管を、容易に製造することができる。
【実施例】
【０１２３】
以下に、本発明を、実施例及び比較例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【０１２４】
実施例１
（工程１−１）
ポリビニルアルコール（和光純薬工業株式会社製、平均重合度１５００〜１８００）を水に溶解させて、ポリビニルアルコール濃度が１０質量％のポリビニルアルコール水溶液を調製した。棒状体としてφ０．７ｍｍのステンレス棒を用意してコレクタ電極とし、電界紡糸装置を用いて、棒状体の表面にポリビニルアルコール水溶液を吐出させた。この際、棒状体を回転させて、調製されたポリビニルアルコール水溶液をノズルに充填して複数回往復させながら吐出することにより塗布し、高分子層を形成した。なお、電界紡糸の条件は、電圧−２０ｋＶ、ノズル径２５Ｇであった。これにより、棒状体上に外径約９００μｍ、厚み１００μｍの高分子層を形成した。
【０１２５】
（工程１−２）
ポリラクチドをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解させて、ポリラクチド濃度が１０質量％のヘキサフルオロイソプロパノール溶液を調製した。工程１−１により調製された、高分子層が形成された棒状体をコレクタ電極として、電界紡糸装置を用いて、棒状体の表面にヘキサフルオロイソプロパノール溶液を吐出させた。この際、棒状体を回転させて、調製されたヘキサフルオロイソプロパノール溶液をノズルに充填して複数回往復させながら吐出することにより塗布し、高分子層上に極細繊維不織布層を形成して、棒状積層体を得た。なお、電界紡糸の条件は、電圧−１５ｋＶ、ノズル径２６Ｇであった。棒状積層体の外径は約１０００μｍであった。
【０１２６】
（工程２）
工程１−２により調製された棒状積層体を３７℃の水に５分間浸漬させて、高分子層を膨潤させた。
【０１２７】
（工程３）
高分子層が膨潤した棒状積層体をシリコン板で０．１ＭＰａの条件で軽くロールプレスして、高分子層と極細繊維不織布層を圧着した。次いで、６０℃のオーブンで約５分間乾燥させて、極細繊維不織布層の表面の水分を除去した。
【０１２８】
（工程４）
生体吸収性高分子として、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）を用意した。２５℃の室温下で、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体０．２５ｇ、溶媒１として水０．３ｍＬ、溶媒２としてメチルエチルケトン２．０ｍＬ、共溶媒３としてアセトン（共溶媒３−１）とエタノール（共溶媒３−２）との混合物１．０ｍＬを混合した。次いで、６０℃に加熱したところ、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体が溶解した均一溶液が得られた。
【０１２９】
（工程５）
工程３により得られた、圧着、乾燥後の棒状積層体を、内径１．１ｍｍのガラス管の中に配置し、棒状積層体とガラス管との隙間に、工程４により得られた均一溶液を流し込んだ。
【０１３０】
（工程６）
工程５により、棒状積層体とガラス管との隙間に工程４により得られた均一溶液を流し込んだ状態で、冷凍庫内に入れて−３０℃で１２０分間冷却したところ、棒状積層体の表面にＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体からなる多孔質層が析出して、棒状複合体が得られた。
【０１３１】
（工程７）
得られた棒状複合体を、５０ｍＬのエタノール槽中に−３０℃、１２時間浸漬した。次いで、５０ｍＬの水槽中に３７℃、３０分の条件で２回浸漬し、高分子層を取り除くと同時に棒状体を取り除いた。次いで、５０ｍＬの水槽中に３７℃、３０分の条件で２回浸漬した後、洗浄を行った。
【０１３２】
（工程８）
最後に、−４０℃の条件で凍結乾燥を行い、最内層に極細繊維不織布層を有するチューブ状の人工血管を製造した。得られた人工血管の極細繊維不織布層の厚みは約５０μｍであり、多孔質層の厚みは約２５０μｍであった。
【０１３３】
比較例１
ポリラクチドをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解して、ポリラクチド濃度が１０重量％のヘキサフルオロイソプロパノール溶液を調製した。φ０．６ｍｍのステンレスの棒状体をコレクタ電極として、電界紡糸装置を用いて、棒状体の表面に該ヘキサフルオロイソプロパノール溶液を吐出させた。このとき、棒状体を回転させ、調製されたヘキサフルオロイソプロパノール溶液をノズルに充填して複数回往復させながら吐出することにより塗布し、棒状体上に極細繊維不織布層を形成した。なお、電界紡糸の条件は、電圧−１５ｋＶ、ノズル径２６Ｇであった。
【０１３４】
最後に、棒状体を引き抜いて、外径約９００μｍ、内径約６００μｍのチューブ状の人工血管を製造した。
【０１３５】
上述のようにして調製された実施例及び比較例の人工血管を用いて、以下の測定及び評価を行った。
【０１３６】
＜平均孔径の測定＞
チューブ状の人工血管を長手方向と直交する方向で切断し、人工血管の壁面の断面の中央付近を倍率１０００倍又は８０００倍の電子顕微鏡を用いて電子顕微鏡像を撮影した。得られた電子顕微鏡像の多孔質層の任意の１０点の孔の直径（長径）を測定し、その平均値を平均孔径とした。
【０１３７】
＜平均繊維径の測定＞
チューブ状の人工血管を長手方向と直交する方向で切断し、人工血管の壁面の断面の中央付近を倍率８０００倍の電子顕微鏡用いて電子顕微鏡像を撮影した。得られた電子顕微鏡像の任意の１０点の繊維の直径を測定し、その平均値を平均繊維径とした。なお、実施例１においては極細繊維不織布層の断面の箇所の繊維の直径を測定した。
【０１３８】
＜血管組織再生性の評価＞
マウスの腹部大動脈の一部を切除し、実施例及び比較例の人工血管に置換した。術後８週間でマウスが生存しているか否かを確認した。評価は、合計１０検体で行った。また、実施例及び比較例において、術後８週目に、ペントバルビタール過剰量の腹腔内投与によりマウスを安楽死させ、埋稙部分を摘出して標本を得た。得られた標本をヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ染色）して顕微鏡写真を撮影した。
【０１３９】
（結果）
図９に実施例１で得られた人工血管の電子顕微鏡写真を示し、図１０に比較例１で得られた人工血管の電子顕微鏡写真を示す。図９の結果から、実施例１の人工血管は、最内層に極細繊維不織布層を有しており、極細繊維不織布層の外側の表面に相対的に孔径が大きな多孔質層を有しており、２層構造であることが確認できた。また、極細繊維不織布層の平均繊維径は０．５μｍであり、多孔質層の平均孔径は２３．２μｍであった。また、図１０から、比較例１の人工血管は、極細繊維不織布層のみ形成されており、多孔質層が形成されていない構成であることが確認できた。
【０１４０】
実施例１及び比較例１において、術後８週間の時点で１０検体全てが生存しており、血管の閉塞は全く認められなかった。
【０１４１】
図１１に、実施例１において得られた人工血管の術後８週目の埋稙部分を摘出して得られた標本をＨＥ染色して撮影した顕微鏡写真を示す。また、図１２に、比較例１において得られた人工血管の術後８週目の埋稙部分を摘出して得られた標本をＨＥ染色して撮影した顕微鏡写真を示す。図１１及び図１２の結果から、実施例１の人工血管では比較例１の人工血管よりも明らかに細胞が浸潤していることが分かる。これにより、実施例１の人工血管は組織再生速度が速く、組成記載生成に優れていることが分かった。
【符号の説明】
【０１４２】
１…棒状体
２…ノズル
３…高分子層
４…極細繊維不織布層
５…棒状積層体
６…シリコン板
７…高分子層と極細繊維不織布層との界面
８…ガラス管
９…均一溶液
１０…棒状複合体
１１…複合多孔体
１２…空洞
【図１】
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【図２】
2018102652.tif 000003
【図３】
2018102652.tif 000004
【図４】
2018102652.tif 000005
【図５】
2018102652.tif 000006
【図６】
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【図７】
2018102652.tif 000008
【図８】
2018102652.tif 000009
【図９】
2018102652.tif 000010
【図１０】
2018102652.tif 000011
【図１１】
2018102652.tif 000012
【図１２】
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