(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒアルロン酸の産生を促進し、肌表面のキメを整え、肌表面の立体的な構造を支え肌にハリや艶を保ち、老化に伴う皮膚の保水力の減少を防ぎ、さらには関節リウマチ、化膿性関節炎や通風性関節炎、熱傷の初期の治療薬に有効な製剤の提供。【解決手段】ウスベニアオイの抽出物、アマチャの葉の抽出物、クチナシの果実の抽出物、イラクサ属植物の抽出物より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分とするヒアルロン酸合成促進剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウスベニアオイの抽出物、アマチャの葉の抽出物、クチナシの果実の抽出物、イラクサ属植物の抽出物より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸の産生を促進し、皮膚を健全に保つ製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、N-アセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖単位が連結した構造をした高分子であり、皮膚細胞には広く分布し、皮膚の水分保持や粘弾性に深く関与し、肌表面のキメを整え、肌表面の立体的な構造を支え肌にハリや艶を保っている、皮膚の重要な成分の１つである。
ヒアルロン酸は高分子化合物であるため、皮膚の外側から表皮に供給することは困難であり、生体内で低分子の原料物質からヒアルロン酸合成酵素によって産生されているから、表皮細胞間にヒアルロン酸を供給するためにはヒアルロン酸合成酵素の発現が重要である。
表皮でヒアルロン酸の合成促進に関与するヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）の発現を促進することで、肌表面のキメを整え、肌表面の立体的な構造を支え肌にハリや艶を保つことが可能となる。
【０００３】
また、このヒアルロン酸は加齢と共に減少する事が報告されており、これにより老化に伴う皮膚の保水力の減少を引き起こし、乾燥肌などの原因となると考えられている。また関節リウマチ患者の場合、関節中のヒアルロン酸が減少することが明らかとなっている。
リウマチ以外にも化膿性関節炎や通風性関節炎などでも関節リウマチ同様ヒアルロン酸含量の低下が起こることが知られている。（非特許文献１〜３）
さらには熱傷の初期の治療薬としても利用できる。（非特許文献４）
関節炎の治療法としては、例えば患部にヒアルロン酸を注入する方法もとられているが、医療行為のため病院で処置が必要となるうえに、ヒアルロン酸の代謝と共に改善効果が薄れ、また一回あたりの費用がかかるため、患者に対して多くの心身的、経済的な負担となっている。（非特許文献５）
【０００４】
ヒアルロン酸合成酵素の発現を促進する化合物としては、ホスフェート誘導体、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含有糖ベンジル誘導体が知られている。（特許文献１〜２）
【０００５】
ウスベニアオイ（学名: Malva sylvestris、又はMalva mauritiana L.）は、アオイ科ゼニアオイ属の多年草で、マロウとも呼ばれている。
若葉と花はサラダやハーブティに、葉と根は茹でて、野菜としても利用できる。民間薬として、咳や胃炎に効果があるとされている。
また、保湿性化粧料、抗男性ホルモン剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、メイラード反応阻害剤、及び該メイラード反応阻害剤等の用途が知られ、（特許文献３〜６参照）化粧料の原料として抽出物が市販されている。
【０００６】
アマチャ（学名 Hydrangea macrophylla var. thunbergii）は、ユキノシタ科の落葉低木ガクアジサイの変種である。
その若い葉を蒸して揉み、乾燥させたものを煎じたものを飲料とし、広く飲まれている。
また、抗アレルギー剤、メラニン取込抑制剤、リパーゼ活性賦活剤、痩身用皮膚外用剤、セラミド産生促進剤としても知られている。（特許文献７〜１０）
【０００７】
クチナシ(Gardenia jasminoides）はアカネ科クチナシ属の常緑低木である。果実は山梔子或いは梔子と称され生薬として、消炎、止血、解熱、鎮静薬として利用されている。
また、セラミド産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、髪質改善剤、トリプシン阻害剤等の用途も知られている。（特許文献１１〜１４）
【０００８】
イラクサ属の植物は、イラクサ（Urtica thunbergiana）、セイヨウイラクサ (Urtica dioica)がよく知られ、食用や入浴に用いられるがされるが、疼痛等にも用いられる。
ヨーロッパでは、薬草として用いられていて、血糖値降下作用があり、糖尿病に健康茶として広く親しまれています。 
さらにメラニン取込抑制、 ＳＣＦｍＲＮＡ発現促進剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進、クローディン産生促剤、及びオクルディン産生促進、セラミド合成促進等の用途が知られている。（特許文献１５〜１９）
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−３６３０８１号公報
【特許文献２】特開２００４−５１５７９号公報
【特許文献３】特開昭６０−２５８１０４号公報
【特許文献４】特開平０５−０７０３６０号公報
【特許文献５】特開２０１１−００１３２８号公報
【特許文献６】特開２０１２−０６７０６１号公報
【特許文献７】特開平０６−１３５８４４号公報
【特許文献８】特開２０１１−１０５６４４号公報
【特許文献９】特開２００２−３５６４３４号公報
【特許文献１０】特開２００２−３７０９９８号公報
【特許文献１１】特開２０００−１６９３５９号公報
【特許文献１２】特開２０００−３１９１５５号公報
【特許文献１３】特開２００１−２７０８１１号公報
【特許文献１４】特開２００６−１８２７３２号公報
【特許文献１５】特開２０１１−１０５６４４７号公報
【特許文献１６】特開２０１１−０７４０２２号公報
【特許文献１７】特開２００９−２９８７２３号公報
【特許文献１８】特開２００９−２５６２４４号公報
【特許文献１９】特開２００９−１０７９６５号公報
【非特許文献１】Ｌｏｎｇａｓ ＭＯ ｅｔａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ． １５９（１） １２７−３６ １９８７
【非特許文献２】「Ａｒｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ」、１９６７年、第１０巻、ｐ３５７．
【非特許文献３】「結合組織」、１９８４年、金原出版、ｐ４８１
【非特許文献４】「結合組織と疾患」、講談社、１５３頁、１９８０年
【非特許文献５】「炎症」、１９９１年、第１１巻、ｐ１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的はヒアルロン酸の産生を促進し、肌表面のキメを整え、肌表面の立体的な構造を支え肌にハリや艶を保ち、老化に伴う皮膚の保水力の減少を防ぎ、さらには関節リウマチ、化膿性関節炎や通風性関節炎、熱傷の初期の治療薬に有効な製剤を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らが鋭意検討した結果、  ウスベニアオイの抽出物、アマチャの葉の抽出物、クチナシの果実の抽出物、イラクサ属植物の抽出物が上記目的を達することがわかった。
ここで利用するウスベニアオイの抽出物、アマチャの葉の抽出物、クチナシの果実の抽出物、イラクサ属植物の抽出物について説明する。
ウスベニアオイの抽出物、アマチャの葉の抽出物、クチナシの果実の抽出物、イラクサ属植物の抽出物は、乾燥した後、抽出効率を考えると、細切，乾燥，粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
【００１２】
本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
【００１３】
また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
【００１４】
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。
【００１５】
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。
【００１６】
本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
【００１７】
本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができる。
これらの抽出物の製剤への配合量は固形分として、０．０００００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００００１〜３．０重量％、さらに好ましくは０．００００５〜１．０重量％である。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するがこれに限定されることはない。
【００１９】
実施例１（ウスベニアオイ抽出物）
ウスベニアオイ（部位＝花、ルーマニア産、乾燥品）１０ｇに、３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、撹拌しつつ５日間抽出した。
これをエバポレートしたのち、凍結乾燥した。
【００２０】
実施例２
アマチャの葉（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
【００２１】
実施例３
クチナシの果実（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
【００２２】
実施例４
セイヨウイラクサ (Urtica dioica)の葉（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
【００２３】
確認試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
【００２４】
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
【００２５】
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
【００２６】
＜使用プライマー＞
ＨＡＳ３：フォワードプライマーがＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＡＧＴＧＣＴＧ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号４）の塩基配列とのセット
【００２７】
確認試験の結果を図１に示す。
実施例１〜４いずれもＨＡＳ３の遺伝子の発現量をコントロールに比較して大幅に促進することがわかった。
【００２８】
また、実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、ヒアルロン酸合成を促進する結果、肌のハリが増し、シワが減少することがわかった。
また、関節リウマチ、化膿性関節炎や通風性関節炎にも有効であった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１（作用濃度0.2％）、実施例２（作用濃度0.05％）、実施例３（作用濃度0.1％）、実施例４（作用濃度0.1％）はコントロールに比較して２〜３倍ＨＡＳ３の遺伝子の発現量が増加した。
【図１】
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【配列表】
2018188446000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月31日(2018.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クチナシの果実の抽出物より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤。