(57)【要約】【課題】ケイ酸イオン存在下であっても、ε−ポリリジンの抗菌作用が低下するのを抑制する方法を提供する。【解決手段】クエン酸及び／又はクエン酸塩からなる、抗菌作用低下抑制剤。ε−ポリリジン及び／又はε−ポリリジンの塩と、クエン酸及び／又はクエン酸塩とを含有する、抗菌用組成物。ケイ酸イオンを含有する対象に、ε−ポリリジン及び／又はε−ポリリジンの塩とクエン酸及び／又はクエン酸塩とを添加することを含む、抗菌作用低下抑制方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ε−ポリリジン及び／又はε−ポリリジンの塩と、クエン酸及び／又はクエン酸塩とを含有する、抗菌用組成物。
【請求項２】
ケイ酸イオン存在下で使用される、請求項１に記載の抗菌用組成物。
【請求項３】
ケイ酸イオンを含有する対象に、ε−ポリリジン及び／又はε−ポリリジンの塩とクエン酸及び／又はクエン酸塩とを添加することを含む、抗菌作用低下抑制方法。
【請求項４】
クエン酸及び／又はクエン酸塩を、対象中のケイ酸イオンの１／２等モル濃度以上になるように添加する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クエン酸及び／又はクエン酸塩からなる、抗菌作用低下抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケイ酸イオン存在下でのε−ポリリジンの抗菌作用の低下現象を抑制することができる抗菌作用低下抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ε−ポリリジン（「ＥＰＬ」とも記す）は抗菌作用を有することが知られており、その安全性の高さから食品、化粧品、トイレタリー製品等の添加物として広く使用されている。ＥＰＬはカチオン性化合物であるため、マイナス電荷を帯びている微生物の外膜にＥＰＬが吸着することにより、微生物の外膜が破壊され、抗菌効果が得られる（非特許文献１）。
【０００３】
ＥＰＬの抗菌作用は、アニオン、界面活性剤、タンパク質等の存在により阻害され得ることが知られている。
水道水においても溶存シリカがアニオン（ケイ酸イオン）として存在しており（非特許文献２）、水中でカチオンとして存在するＥＰＬを吸着し、その抗菌作用を低下させる。そのため、水を主成分とする製品や水道水など、水系の対象に対してＥＰＬを適用するときに、十分な抗菌効果が得られない場合があるという問題点があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】平木  純 (1995) ε−ポリリジンの基礎と応用  防菌防黴誌  Vol. 23, No. 6, pp 349-354
【非特許文献２】公益社団法人  日本水道協会. (2011) 上水試験方法2011年度版
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
かかる状況において、本発明は、ケイ酸イオン存在下であっても、ＥＰＬの抗菌作用が低下するのを抑制する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＥＰＬとクエン酸及び／又はクエン酸塩とを併用することにより、ケイ酸イオン存在下であっても、ＥＰＬの抗菌作用が低下するのを抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ε−ポリリジン及び／又はε−ポリリジンの塩と、クエン酸及び／又はクエン酸塩とを含有する、抗菌用組成物。
［２］ケイ酸イオン存在下で使用される、［１］に記載の抗菌用組成物。
［３］ケイ酸イオンを含有する対象に、ε−ポリリジン及び／又はε−ポリリジンの塩とクエン酸及び／又はクエン酸塩とを添加することを含む、抗菌作用低下抑制方法。
［４］クエン酸及び／又はクエン酸塩を、対象中のケイ酸イオンの１／２等モル濃度以上になるように添加する、［３］に記載の方法。
［５］クエン酸及び／又はクエン酸塩からなる、抗菌作用低下抑制剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ケイ酸イオン存在下であっても、ＥＰＬの抗菌作用が低下するのを抑制することができる。ＥＰＬ及び／又はＥＰＬの塩と、クエン酸及び／又はクエン酸塩とい
う、既に安全性が確立されている成分どうしの組み合わせであるため、飲食品において十分な抗菌効果を得られる抗菌用組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】E.coliの菌数の経時変化を表すグラフである。
【図２】E.coliの菌数の経時変化を表すグラフである。
【図３】E.coliの菌数の経時変化を表すグラフである。
【図４】P.aeruginosaの菌数の経時変化を表すグラフである。
【図５】C.albicansの菌数の経時変化を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の１つの態様である抗菌作用低下抑制剤は、クエン酸及び／又はクエン酸塩からなる。クエン酸塩としては、金属塩、アンモニウム塩など特に限定されないが、食品添加物としての安全性が確立していてｐＨ調整剤等として汎用されているナトリウム塩がより好ましい。
本発明の抗菌作用低下抑制剤は、遊離のクエン酸が、ケイ酸イオンとＥＰＬとの結合を阻害することにより、ケイ酸イオンを含有する対象へのＥＰＬの抗菌作用が低下するのを抑制することができる。すなわち、本発明の抗菌作用低下抑制剤は、通常はケイ酸イオンを含有する水系の対象に対してＥＰＬとともに適用され、後述の抗菌作用低下抑制方法に好適に用いることができる。
【００１１】
本発明の抗菌作用低下抑制剤、すなわちクエン酸及び／又はクエン酸塩は、ＥＰＬ及び／又はＥＰＬの塩と組み合わせて、本発明の別の態様である抗菌用の組成物とすることができる（「本発明の組成物」という）。本発明の組成物は、アニオンによってＥＰＬが捕捉されることなく、ＥＰＬの抗菌効果が発揮される。そのため、ケイ酸イオン存在下で好ましく使用することができ、例えば水道水等のケイ酸イオンを含有する水系の対象に対して適用しうる。
なお、本明細書においてケイ酸イオンは、特に限定されず、メタケイ酸イオンやオルトケイ酸イオンの他、ピロケイ酸イオン等の縮合ケイ酸イオン、また環状ケイ酸イオン等をいう。
【００１２】
本明細書においてＥＰＬは、通常はε−ポリ−Ｌ−リジンを指す。ＥＰＬの重合度は特に限定はしないが、１０００〜５０００が好ましい。
ＥＰＬは、例えば特開昭５９−２０３５９号公報に記載のＥＰＬ生産菌であるストレプトマイセス属に属するＥＰＬ生産菌であるストレプトマイセス・アルブラスサブスピーシーズ・リジノポリメラスを培地に培養し、得られた培養物からＥＰＬを分離・採取することによって得られる。
また、ＥＰＬは遊離の形で用いることができるが、塩酸、硫酸、リン酸および臭化水素酸から選ばれた少なくとも１種の無機酸、または酢酸、プロピオン酸、フマル酸、リンゴ酸およびクエン酸から選ばれた少なくとも１種の有機酸の塩の形で用いることもできる。ＥＰＬの抗菌剤としての効果は、遊離の形でも、塩の形でも本質的に差異はない。
ＥＰＬ塩は常法により製造される。例えば含水メタノール溶液に前記ＥＰＬを溶解させ、これに前記酸を加え、溶液が中和点を過ぎたところで、冷アセトンを加えて沈澱した塩を乾燥させることによって得られる。
また、ＥＰＬの使用時の濃度は、十分な抗菌効果を得る観点から、菌種ごとのＭＩＣにもよるが通常は５ｐｐｍ以上が好ましく、１０ｐｐｍ以上が好ましく、１５ｐｐｍ以上がさらに好ましい。また、該濃度の上限は、特に限定されないが、１００ｐｐｍ以下が好ましく、５０ｐｐｍがより好ましい。かかる濃度範囲において、例えば大腸菌及びサルモネラ菌を各１０７個／ｍＬ以上含む水に対して、それらの菌を飲用に許容できる１０2個／ｍＬ以下にまで不活化できる。前記組成物を添加して、１時間後、好ましくは２時間後に
上記効果を得ることができる。
【００１３】
本発明の別の態様は、ケイ酸イオンを含有する対象に、ＥＰＬ及び／又はＥＰＬの塩とクエン酸及び／又はクエン酸塩とを添加することを含む、抗菌作用低下抑制方法である（「本発明の方法」とも記す）。本発明の方法は、ＥＰＬ及び／又はＥＰＬの塩を用いる抗菌方法において、対象がケイ酸イオンを含有する場合に、好ましく適用できる。
ここで、ＥＰＬ及び／又はＥＰＬの塩と本発明の抗菌作用低下抑制剤に係るクエン酸及び／又はクエン酸塩とを、ケイ酸イオンを含有する対象に添加する順番は特に問わないが、通常は本発明の抗菌作用低下抑制剤をＥＰＬ及び／又はＥＰＬの塩より先に添加することが好ましい。
これは、対象中に予め存在するケイ酸イオンにＥＰＬが捕捉されるのを、クエン酸が阻害しやすくするためである。
【００１４】
本明細書において、対象とは、抗菌作用を発揮させる対象物をいう。対象としては、特に限定されないが、通常は水系の物、すなわち水又は水を含む物であり、具体的には水道水、飲料水、冷却水、飲料、食品等が挙げられる。特に、クーリングタワー等の循環型冷却水においては、抗菌の需要がある一方でシリカが濃縮しやすい環境にあるため、本発明の方法を好ましく適用できる。
本発明の方法を好ましく適用し得る対象は、ケイ酸イオンを好ましくは０．５ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上、さらに好ましくは２ｍＭ以上含有するものである。また、該濃度の上限は、特に限定されないが、通常は１０ｍＭ以下である。
【００１５】
本発明の方法においてクエン酸及び／又はクエン酸塩の添加量は、対象中のケイ酸イオンの好ましくは１／２等モル濃度以上、より好ましくは等モル濃度以上になる量である。かかる終濃度とすることにより、ケイ酸イオンのＥＰＬへの結合を阻害しやすくなり、ＥＰＬの抗菌作用の低下をより効果的に抑制することができる。
また、本発明の方法においてクエン酸及び／又はクエン酸塩の添加量は、前述の通り対象中のケイ酸イオン濃度によるが、通常は、０．２５ｍＭ以上になる量が好ましく、０．５ｍＭ以上がより好ましく、２ｍＭ以上がさらに好ましい。また、該濃度の上限は、特に限定されないが、１０ｍＭ以下が好ましく、５ｍＭ以下がより好ましい。
【００１６】
本明細書において「抗菌」とは、細菌を殺す殺菌、細菌数を減らす減菌、及び細菌の繁殖・生育の防止又は抑制、のいずれの意味をも指すものとする。
また、本明細書において「抗菌作用低下」とは、ＥＰＬによる抗菌作用が、ケイ酸イオン非存在下に比べて低下すること、より具体的には細菌数の低減がケイ酸イオン非存在下に比べて小さくなること、さらに具体的には細菌数の低減がケイ酸イオン非存在下に比べて１０００分の１以下になることをいう。
また、本明細書において「抗菌作用低下抑制」とは、ケイ酸イオン存在下でのＥＰＬによる抗菌作用が、クエン酸及び／又はクエン酸塩を添加しないときに比べて増加すること、より具体的には細菌数の低減がクエン酸及び／又はクエン酸塩を添加しないときに比べて大きくなること、さらに具体的には細菌数の低減がクエン酸及び／又はクエン酸塩を添加しないときに比べて１０００倍以上になることをいう。
【００１７】
本明細書において抗菌の対象となる細菌は、通常ＥＰＬが抗菌作用を呈すると知られている細菌であり、具体的には、大腸菌、サルモネラ菌、緑膿菌、肺炎桿菌等のグラム陰性菌、ブドウ球菌、枯草菌、セレウス菌、リステリア菌等のグラム陽性菌等が挙げられる。
【００１８】
また、本発明の方法は任意のｐＨの水に対して適用できるが、特に６〜９、好ましくは６．５〜８で用いる。
また、本発明の方法は任意の温度の水に対して適用できるが、特に加温・冷却をしなく
ても室温・常温であれば十分に処理を行うことができる。
【実施例】
【００１９】
以下、具体的な実験例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の態様にのみ限定されない。
【００２０】
＜実施例１＞
（１）モデル水の作製
メタケイ酸ナトリウム・９水和物（Na2SiO3・9H2O）９４６ ｍｇを蒸留水９５０ｍＬに溶解したものに、緩衝剤として炭酸水素ナトリウム３３６ ｍｇを添加してｐＨを８に調整した後、１．０Ｌにメスアップしたものを、対象（モデル水）とした。
なお、上記モデル水におけるケイ酸イオン濃度（３．３ｍＭ）は、循環型冷却水を模したもので、水道水基準の約２倍である。
【００２１】
（２）試験区の作製
モデル水を１００ｍＬずつフタ付きの滅菌フラスコに無菌的に分注した。
各モデル水に、以下の(1)〜(9)の何れかを添加し溶解し、９つの試験区とした。
(1)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）
(2)クエン酸三ナトリウム０．１ｇ（終濃度３．９ｍＭ）
(3)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）及びクエン酸三ナトリウム０．０１ｇ（終濃度０．３９ｍＭ）
(4)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）及びクエン酸三ナトリウム０．０２５ｇ（終濃度０．９７ｍＭ）
(5)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）及びクエン酸三ナトリウム０．０５ｇ（終濃度１．９３ｍＭ）
(6)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）及びクエン酸三ナトリウム０．０７５ｇ（終濃度２．９１ｍＭ）
(7)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）及びクエン酸三ナトリウム０．１ｇ（終濃度３．９ｍＭ）
(8)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）及びクエン酸三ナトリウム０．２ｇ（終濃度７．８ｍＭ）
(9)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）及びクエン酸三ナトリウム０．３ｇ（終濃度１１．６ｍＭ）
また、メタケイ酸ナトリウム・９水和物を添加しない他はモデル水と同様に調製した「対象水（ケイ酸イオンなし）」に、以下の(10)を添加し溶解した試験区も設けた。
(10)ＥＰＬ（終濃度５ｐｐｍ）
なお、ＥＰＬは、「ポリリジン25％溶液（２５重量％）  重合度４５００（ＪＮＣ株式会社製）」を用いた。
【００２２】
（３）菌株の供試
Escherichia coli NBRC 3972をトリプトソイ寒天培地で３５℃、２４時間、前培養したものを供試菌株とした。該菌株を、滅菌綿棒を用いて、マクファーランド比濁＃１相当（約３．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）になるように滅菌生理食塩水に懸濁し、その１ｍＬを各試験区に接種した。すなわち、初発菌数は約１０６ＣＦＵ／ｍＬとした。各試験区を３０℃にて静置し、菌接種後０、１、３、６、２４、及び４８時間後に１ｍＬずつを抜き取り、菌数の計測に供した。抜き取ったサンプルは、ＥＰＬの作用を抑えるため５ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ８０加滅菌リン酸緩衝液で１０倍段階希釈し、定法に従い標準寒天培地（栄研化学製）による混釈培養を、３５℃、２４時間、二重測定にて行った。培養後に菌数を計測し、各サンプリング時における試験区の菌数を算出した。サンプリング時間に対する菌数の平均値の対数を、表１及び図１〜２に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
表１及び図１に示される通り、ケイ酸イオンが存在しない場合、通常は５ｐｐｍのＥＰＬで約１０６ＣＦＵ／ｍＬを１時間後までに検出限界以下にまで静菌することができる（試験区(10)）。一方、ケイ酸イオンが存在する場合は、５ｐｐｍのＥＰＬを添加した場合（試験区(1)）は菌数の低減効果が緩く、また６時間後以降に菌数の増加が見られた。これは、ケイ酸イオンにＥＰＬが吸着されたために、安定的な抗菌効果が得られなかったと考えられる。
また、表１及び図２に示される通り、クエン酸三ナトリウムのみを添加した場合（試験区(2)）では、菌数の低減は認められなかった。
一方、ＥＰＬとクエン酸三ナトリウムとを併用した場合（試験区(3)〜(9)）は、ＥＰＬの抗菌効果の低下が抑制された。特に、ケイ酸イオンの１／２等モル濃度以上のクエン酸三ナトリウムを添加した場合（試験区(5)〜(9)）は、３時間後に菌数が検出限界以下となり、かつ４８時間後以降もそれが維持された。
【００２５】
＜実施例２＞
（１）モデル水及び試験区の作製
モデル水は実施例１と同様に作製した。
モデル水を１００ｍＬずつフタ付きの滅菌フラスコに無菌的に分注した。
各モデル水に、以下の(1)〜(3)の何れかを添加し溶解して３つの試験区としたものを、３セット用意した。
(1)添加なし
(2)ＥＰＬ（終濃度１０ｐｐｍ）
(3)ＥＰＬ（終濃度１０ｐｐｍ）及びクエン酸三ナトリウム０．０１ｇ（終濃度３．９ｍＭ）
また、実施例１と同様に作製した「対象水（ケイ酸イオンなし）」に、以下の(4)を添加し溶解した試験区も設けた。
(4)ＥＰＬ（終濃度１０ｐｐｍ）
なお、ＥＰＬは、「ポリリジン25％溶液（２５重量％）、重合度４５００（ＪＮＣ株式会社製）」を用いた。
【００２６】
（２）菌株の供試
Escherichia coli NBRC 3972、Pseudomonas aeruginosa NBRC 13275、及びCandida albicans NBRC 1594をそれぞれトリプトソイ寒天培地で３５℃、２４時間、前培養したものを供試菌株とし、実施例１と同様に各試験区への接種及び菌数の計測を行った。菌株ごとの結果を図３〜５に示す。
【００２７】
図３〜５にそれぞれ示される通り、ケイ酸イオンが存在しない場合は速やかに検出限界以下まで静菌されるのに対し（試験区(4)）、モデル水のみの試験区(1)では、いずれの供試菌株も４８時間後まで接種した初発の菌数が維持された。また、１０ｐｐｍのＥＰＬを添加した試験区(2)では、菌数の低減効果が緩く、検出限界以下にまで低下することはなかった。ＥＰＬとクエン酸三ナトリウムとを併用した試験区(3)では、ＥＰＬの抗菌効果の低下が抑制され、菌数が検出限界以下にまで低減し、かつ４８時間後以降もそれが維持された。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、ＥＰＬをケイ酸イオン存在下で使用する際であっても、その抗菌作用が低下するのを抑制することができ、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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