(57)【要約】【課題】細胞培養に際して行われる細胞の分画、ろ過、洗浄などの種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うために、容器本体の内部をフィルタ部材によって区画するにあたり、フィルタ部材とのシール強度が高められたフィルタ付き細胞用バッグ、及びその製造方法を提供する。【解決手段】少なくともポリエチレン層２０ａを含む可撓性フィルム２０の間に、ポリエチレン層２０ａを対向させて、目開き２０〜３００μｍのポリエステル製又はポリアミド製のメインメッシュ４ａと、その表裏両面に配された目開き１００〜４０００μｍのポリエチレン製のサブメッシュ４ｂとからなるフィルタ部材４を挟んで周縁部を熱融着して容器本体２を形成し、容器本体２の周縁部に形成される熱融着部５において、サブメッシュ４ｂが溶融して、メインメッシュ４ａの空隙部に侵入しつつ互いに融着されているともに、可撓性フィルム２０のポリエチレン層２０ａと融着させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器本体と注入出用ポートとを備え、
前記容器本体の内部が、フィルタ部材によって区画されて、少なくとも一つの区画に注入出用ポートが設けられており、
前記フィルタ部材が、目開き２０〜３００μｍのポリエステル製又はポリアミド製のメインメッシュと、その表裏両面に配された目開き１００〜４０００μｍのポリエチレン製のサブメッシュとからなり、
前記容器本体が、少なくともポリエチレン層を含む可撓性フィルムの間に、前記ポリエチレン層を対向させて、前記フィルタ部材を挟んで周縁部を熱融着してなり、
前記容器本体の周縁部に形成される熱融着部において、前記ポリエチレン製のサブメッシュが溶融して、前記メインメッシュの空隙部に侵入しつつ互いに融着されているともに、前記可撓性フィルムの前記ポリエチレン層と融着していることを特徴とするフィルタ付き細胞用バッグ。
【請求項２】
前記熱融着部において、前記メインメッシュの端縁が、前記サブメッシュの端縁よりも容器内方に位置し、前記熱融着部の最外縁部では、前記可撓性フィルムの前記ポリエチレン層どうしが直接、又は前記サブメッシュを介して、これらが溶融して融着している請求項１に記載のフィルタ付き細胞用バッグ。
【請求項３】
容器本体と注入出用ポートとを備え、前記容器本体の内部が、フィルタ部材によって区画されて、少なくとも一つの区画に注入出用ポートが設けられたフィルタ付き細胞用バッグの製造方法であって、
目開き２０〜３００μｍのポリエステル製又はポリアミド製のメインメッシュの表裏両面に、目開き１００〜４０００μｍのポリエチレン製のサブメッシュを配して前記フィルタ部材を用意し、
少なくともポリエチレン層を含む可撓性フィルムの間に、前記ポリエチレン層を対向させて、前記フィルタ部材を挟み、
これらの周縁部を熱融着することを特徴とするフィルタ付き細胞用バッグの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養に際して行われる細胞や培地の分画、ろ過、洗浄などの種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うためのフィルタ付き細胞用バッグ、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの医薬学・生化学分野において、細胞（組織、微生物、ウイルスなどを含む）を人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
【０００３】
このような要求に応えるべく、本出願人は、閉鎖系の環境を構築してコンタミネーションのリスクを低減しつつ、効率的に細胞培養を行うことができる細胞培養システムについて検討を重ねてきた。
【０００４】
例えば、特許文献１において、細胞を培養するための培養容器と、培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器と、細胞を注入するための細胞注入容器と、培養後の細胞懸濁液を回収する細胞回収容器とを導管によって連結し、閉鎖系の環境を構築してなる細胞培養用キットを提案している。このような細胞培養用キットによれば、細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までをキット内で閉鎖系を維持しながら行うことが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１３／１１４８４５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、特許文献１には、培養された細胞を回収するにあたり、培養容器を静置して細胞懸濁液中の細胞を沈降させた後に、細胞懸濁液の上澄みを排出し、液量を低減させてから、濃縮された細胞懸濁液を培養容器から細胞回収容器に移送する例が示されている。
【０００７】
また、細胞の培養には、通常、数日〜数週間の期間を要するため、培地成分の枯渇や細胞の代謝物の蓄積によって細胞の成長が阻害されてしまわないように、培養期間中に、必要に応じて培地交換を行うことがある。培地交換を行うに際しては、細胞懸濁液の上澄みを排出することによって古い培地を取り除くとともに、それに代えて新しい培地を追加することが考えられる。
【０００８】
しかしながら、このようにして細胞の回収や培地交換を行うには、細胞懸濁液の上澄みを排出するに先立って、培養容器を静置して細胞懸濁液中の細胞を沈降させておかなければならず、細胞を沈降させるまでに時間を要してしまう。一方、十分な時間をかけて細胞懸濁液中の細胞を沈降させても、排出操作によって上澄みに細胞が混入し、上澄みと一緒に細胞が排出されてしまう虞もある。特に、培地交換を行うにあたっては、古い培地ができるだけ多く取り除かれるようにして、新しい培地がより多く追加されるようにすることが望まれるが、上澄みの排出量が多くなるほど、細胞の混入が避けられなくなってしまう。
【０００９】
また、培地交換を行う際に、古い培地と一緒に細胞が排出されてしまうのを防ぐには、培養容器に設けられたポートの流路にフィルタを取り付けることも考えられる。
しかしながら、ポートの流路径は、通常、１〜１０ｍｍ程度であり、フィルタの面積も比較的小さくなるため、捕捉された細胞によってフィルタに目詰まりが生じ易く、古い培地の排出を妨げてしまう虞がある。さらに、フィルタに捕捉された細胞が培養容器内に戻らずに、フィルタに捕捉されたまま死滅してしまう虞もある。
【００１０】
このような背景技術に鑑みて、本出願人は、容器本体の内部をフィルタ部材によって区画することで、例えば、培地交換を行う際には、培養中の細胞を一方の区画に留まらせておいて、他方の区画から古い培地のみを排出させることができると考え、これを実現するために種々の検討を重ねてきた。
【００１１】
しかしながら、フィルタ部材として用いるには、細胞の通過を許容しない程度にメッシュサイズの小さいものが容易に入手できるポリエステル製又はポリアミド製のメッシュが好適であるところ、このようなメッシュを、特許文献１の培養容器ように、ポリエチレン系樹脂を材料とする可撓性素材を用いて形成した容器に取り付けるには、シール強度が弱いという問題があった。
そこで、かかる問題点に着眼して、本出願人が、さらなる鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、細胞培養に際して行われる細胞や培地の分画、ろ過、洗浄などの種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うために、容器本体の内部をフィルタ部材によって区画するにあたり、フィルタ部材とのシール強度が高められたフィルタ付き細胞用バッグ、及びその製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係るフィルタ付き細胞用バッグは、容器本体と注入出用ポートとを備え、前記容器本体の内部が、フィルタ部材によって区画されて、少なくとも一つの区画に注入出用ポートが設けられており、前記フィルタ部材が、目開き２０〜３００μｍのポリエステル製又はポリアミド製のメインメッシュと、その表裏両面に配された目開き１００〜４０００μｍのポリエチレン製のサブメッシュとからなり、前記容器本体が、少なくともポリエチレン層を含む可撓性フィルムの間に、前記ポリエチレン層を対向させて、前記フィルタ部材を挟んで周縁部を熱融着してなり、前記容器本体の周縁部に形成される熱融着部において、前記ポリエチレン製のサブメッシュが溶融して、前記メインメッシュの空隙部に侵入しつつ互いに融着されているともに、前記可撓性フィルムの前記ポリエチレン層と融着している構成としてある。
【００１４】
また、本発明に係るフィルタ付き細胞用バッグの製造方法は、容器本体と注入出用ポートとを備え、前記容器本体の内部が、フィルタ部材によって区画されて、少なくとも一つの区画に注入出用ポートが設けられたフィルタ付き細胞用バッグの製造方法であって、目開き２０〜３００μｍのポリエステル製又はポリアミド製のメインメッシュの表裏両面に、目開き１００〜４０００μｍのポリエチレン製のサブメッシュを配して前記フィルタ部材を用意し、少なくともポリエチレン層を含む可撓性フィルムの間に、前記ポリエチレン層を対向させて、前記フィルタ部材を挟み、これらの周縁部を熱融着する方法としてある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、容器本体を形成する可撓性フィルムとフィルタ部材とのシール強度が高められ、破袋強度が向上したフィルタ付き細胞用バッグを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態に係るフィルタ付き細胞用バッグの一例を示す説明図である。
【図２】本発明の実施形態に係るフィルタ付き細胞用バッグの製造例を模式的に示す説明図である。
【図３】熱融着部における可撓性フィルム、メインメッシュ、サブメッシュのそれぞれの端縁の位置関係を示す説明図である。
【図４】本発明の実施形態に係るフィルタ付き細胞用バッグの一使用例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
なお、図１は、本実施形態に係るフィルタ付き細胞用バッグの一例を示す説明図であり、図１(ａ)は、フィルタ付き細胞用バッグ１の平面図、図１（ｂ）は、フィルタ付き細胞用バッグ１の側面図、図１（ｃ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ断面図である。
【００１８】
本実施形態の一例として図１に示すフィルタ付き細胞用バッグ１は、容器本体２と注入出用ポート３ａ，３ｂとを備えている。そして、容器本体２の内部は、フィルタ部材４によって二室に区画されており、それぞれの区画（第一区画１ｓｔ及び第二区画２ｎｄ）に注入出用ポート３ａ，３ｂが設けられている。
【００１９】
注入出用ポート３ａ，３ｂは、培地や細胞を注入、排出などする際の出入り口となる部位であり、例えば、培地や細胞などが流通可能な管状の部材を容器本体２に取り付けることによって設けることができる。注入出用ポート３ａ，３ｂを形成する管状の部材は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹脂を用いて、射出成形、押出成形などにより、所定の形状に成形することができる。
【００２０】
フィルタ部材４は、メッシュサイズが異なる二種類のメッシュを用いて構成され、メッシュサイズが相対的に小さいメインメッシュ４ａと、その表裏両面に配されたメッシュサイズが相対的に大きいサブメッシュ４ｂとからなっている。
メインメッシュ４ａには、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系樹脂繊維を織製したポリエステル製メッシュ、又はナイロン等のポリアミド系樹脂繊維を織製してなるポリアミド製メッシュが用いられる。サブメッシュ４ｂには、ポリエチレン系樹脂繊維を織製してなるポリエチレン製メッシュが用いられる。
なお、サブメッシュ４ｂを形成するポリエチレン系樹脂繊維は、後述する可撓性フィルム２０のポリエチレン層２０ａと同種のポリエチレン系樹脂からなるのが好ましい。
【００２１】
これらのメッシュ４ａ，４ｂのメッシュサイズは、フィルタ付き細胞用バッグ１の使用態様に応じて適宜選定することができるが、メインメッシュ４ａについては目開き２０〜３００μｍの範囲で、サブメッシュ４ｂについては目開き１００〜４０００μｍの範囲で、これらのメッシュサイズを選定する。このとき、サブメッシュ４ｂの目開きが、メインメッシュ４ａの目開きに対して２〜１０倍の大きさとなるように、上記範囲から選定するのが好ましい。
なお、フィルタ付き細胞用バッグ１の使用例については後述する。
【００２２】
容器本体２は、可撓性フィルム２０をバッグ状に製袋することによって形成される。
容器本体２を形成する可撓性フィルム２０としては、少なくともポリエチレン層２０ａを含む可撓性フィルム２０が用いられる。かかる可撓性フィルム２０は、ポリエチレン層２０ａを単層で含むポリエチレン系樹脂フィルムの他、例えば、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリエステル、ポリアミド、シリコーン系エラストマー、ポリスチレン系エラストマー、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）などの熱可塑性樹脂からなる一種又は二種以上の層に、ポリエチレン層２０ａが表層に位置するように積層された積層フィルムであってもよい。
なお、容器本体２を形成する可撓性フィルム２０は、細胞培養の進行状況や内部の細胞の状態又は培地の色などを確認できる程度の透明性を有しているのが好ましい。
【００２３】
容器本体２は、例えば、所望のサイズに裁断された二枚の可撓性フィルム２０を揃えて重ね合せ、その際、二枚の可撓性フィルム２０の間に、そのポリエチレン層２０ａを対向させて、フィルタ部材４を挟み込んだ状態で、これらの周縁部を熱融着することによって形成することができる。
このとき、フィルタ部材４によって区画された、それぞれの区画１ｓｔ，２ｎｄに注入出用ポート３ａ，３ｂを設けるには、容器本体２の周縁部を熱融着する際に、容器本体２の周縁部における可撓性フィルム２０とフィルタ部材４との間の所定の位置に、注入出用ポート３ａ，３ｂを形成する管状の部材を挟んで熱融着するようにすればよい。
また、熱融着に際しては、その温度は、サブメッシュ４ｂに用いたポリエチレン系樹脂の融点以上、メインメッシュ４ａに用いたポリエステル系樹脂又はポリアミド系樹脂の融点未満の温度とする。
なお、図２は、フィルタ付き細胞用バッグ１の製造例を模式的に示す説明図であり、可撓性フィルム２０、フィルタ部材４、注入出用ポート３ａ，３ｂの配置を示している。
【００２４】
このようにして形成された容器本体２にあっては、その周縁部に形成される熱融着部５において、メインメッシュ４ａの表裏両面に配されたサブメッシュ４ｂ（具体的には、サブメッシュ４ｂを形成するポリエチレン系樹脂繊維）が溶融して、メインメッシュ４ａの空隙部に侵入しつつ互いに融着されているとともに、可撓性フィルム２０のポリエチレン層２０ａと融着している。その結果、容器本体２を形成する可撓性フィルム２０とフィルタ部材４とのシール強度が高まり、フィルタ付き細胞用バッグ１の破袋強度が向上する。
【００２５】
可撓性フィルム２０の間にフィルタ部材４を挟み込んだ状態で、これらの周縁部を熱融着して容器本体２を製袋するにあたり、フィルタ部材４についても所望のサイズに裁断するが、熱融着部５において、メインメッシュ４ａの端縁が、サブメッシュ４ｂの端縁よりも容器内方に位置するように切り揃えておくことが好ましい。さらに、サブメッシュ４ｂの端縁が、容器本体２を形成する可撓性フィルム２０の端縁よりも容器内方に位置するように切り揃えておくのがより好ましい。
なお、図３は、図１（ａ）のＢ−Ｂ断面に相当し、熱融着部５における可撓性フィルム２０、メインメッシュ４ａ、サブメッシュ４ｂのそれぞれの端縁の位置関係を示し、可撓性フィルム２０の端縁を一点鎖線αで示し、メインメッシュ４ａの端縁を一点鎖線βで示し、サブメッシュ４ｂの端縁を一点鎖線γで示している。
【００２６】
このようにすることで、熱融着部５の最外縁部では、可撓性フィルム２０のポリエチレン層２０ａどうしが直接、又はサブメッシュ４ｂを介して、これらが溶融して融着するようになる。その結果、容器本体２の最外縁部がより強固に熱融着されて、フィルタ付き細胞用バッグ１の破袋強度がより一層向上する。
【００２７】
次に、本実施形態の一例として図１に示すフィルタ付き細胞用バッグ１の使用例について説明する。
図４は、図１に示すフィルタ付き細胞用バッグ１を、培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養バッグとして使用する例を示している。
【００２８】
本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、第二区画２ｎｄに設けた注入出用ポート３ｂから、培養対象の細胞Ｃを注入して培養を行う。このとき、培養対象の細胞Ｃの大きさを考慮して、フィルタ部材４のメインメッシュ４ａとして、かかる細胞Ｃの通過を許容しないメッシュサイズのものを選択する。これにより、培養中の細胞Ｃは、第二区画２ｎｄに留まり、第一区画１ｓｔには移動しないようにすることができる（図４（ａ）参照）。
なお、フィルタ部材４のサブメッシュ４ｂのメッシュサイズは、メインメッシュ４ａのメッシュサイズよりも大きければよく、培養対象の細胞Ｃの大きさによらずに適宜選択できる。
【００２９】
培養期間中に培地交換を行う際には、第一区画１ｓｔに設けた注入出用ポート３ａから、古い培地を排出する（図４（ｂ）参照）。このとき、培養中の細胞Ｃを第二区画２ｎｄに留まらせることができるため、古い培地と一緒に排出されないようにすることができ、古い培地をより多く排出させることが可能になる。古い培地を排出した後は、それと同量の新しい培地を第一区画１ｓｔに設けた注入出用ポート３ａから注入し（図４（ｃ）参照）、培養を継続する。
【００３０】
このように、本使用例にあっては、培養期間中の培地交換、特に、古い培地の排出操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００３１】
また、本使用例におけるフィルタ付き細胞用バッグ１は、第二区画２ｎｄに細胞Ｃを留まらせた状態で、第一区画１ｓｔに設けた注入出用ポート３ａから、容器内の内容液を排出することができるため、例えば、特許文献１の細胞培養用キットの培養容器として使用すれば、特許文献１が例示する細胞の回収操作も、細胞の沈降に時間をかけずに、簡便、かつ、効率良く行うことができる。さらに、特許文献１の細胞培養用キットの細胞回収容器として使用し、培養容器から回収された細胞懸濁液を第二区画２ｎｄに移送して、第一区画１ｓｔに設けた注入出用ポート３ａから、洗浄液の注入、排出を繰り替えして細胞の洗浄操作が行われるようにすることで、特許文献１の細胞培養用キットに洗浄回収機構を導入することができる。
【００３２】
このように、本使用例では、フィルタ部材４のメインメッシュ４ａとして、培養対象の細胞Ｃの通過を許容しないメッシュサイズのものを選択して、フィルタ部材４によって区画された一方の区画２ｎｄに細胞Ｃを注入して培養を行うことで、当該区画２ｎｄに細胞Ｃを留まらせた状態で、フィルタ部材４によって区画された他方の区画１ｓｔに設けた注入出用ポート３ａから、培地や洗浄液などを注入出することができる。
【００３３】
本使用例は、本実施形態に係るフィルタ付き細胞用バッグ１の一使用例であり、本実施形態に係るフィルタ付き細胞用バッグ１を細胞培養の用途に供することで、細胞培養に際して行われる細胞の分画、ろ過、洗浄、又は培地のろ過などの種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００３４】
以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることはいうまでもない。
【００３５】
例えば、前述した実施形態では、容器本体２の内部を二室に区画した例を示したが、同様のフィルタ部材４を複数用いて、三室以上に区画することもできる。また、それぞれの区画に、注入出用ポート３ａ，３ｂを一つずつ設けた例を示したが、必要に応じて、二以上の注出入用ポートを設けてもよい。また、注出入用ポートは、少なくとも一つの区画に設けられていればよく、注出入用ポートが設けられていない区画があってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、医薬学・生化学分野において、細胞を効率良く培養する技術として利用できる。
【符号の説明】
【００３７】
１          フィルタ付き細胞用バッグ
２          容器本体
２０          可撓性フィルム
２０ａ          ポリエチレン層
３ａ，３ｂ          注入出用ポート
４          フィルタ部材
４ａ          メインメッシュ
４ｂ          サブメッシュ
５          熱融着部
１ｓｔ          第一区画
２ｎｄ          第二区画
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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