(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質の発現効率を向上させる手段を提供すること。【解決手段】（ａ）特定の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する領域、及び／又は、他の特定配列の塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ、或いは（ｂ）特定の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列を有する領域、及び／又は他の特定の配列塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する領域、及び／又は、配列番号２の塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ、或いは
（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列を有する領域、及び／又は配列番号２塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
からなるエンハンサー。
【請求項２】
クリプトコッカス属由来のプロモーター用である、請求項１に記載のエンハンサー。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のエンハンサーが組み込まれたプロモーター。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のエンハンサーが複数個組み込まれたプロモーター。
【請求項５】
クリプトコッカス属由来である、請求項３又は４に記載のプロモーター。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載のプロモーターを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項８】
クリプトコッカス属に属する、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の微生物を用いたタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現に関するエンハンサー、前記エンハンサーを導入したプロモーター、前記プロモーターを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された微生物、及び前記微生物を用いたタンパク質の製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による組み換えタンパク質の工業的生産は、診断薬原料、医薬品原料、化粧品原料、あるいは各種化成品原料に至るまで、幅広い分野で行われている。例えば、担子酵母の一種であるクリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株は、独立行政法人酒類総合研究所において単離された酵母であり、αアミラーゼ、酸性キシラナーゼ、クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）などの酵素を大量に生産することが確認されている。
【０００３】
微生物による有用物質の工業的生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つである。その手法として、特許文献１並びに非特許文献１及び２には遺伝子工学技術により微生物のプロモーターを改変して生産性を向上させる方法が報告されている。さらに、前記担子酵母を組み換え宿主として使用した組み換えタンパク質の製造方法が特許文献２及び３、並びに非特許文献３などに報告されている。更に、前記組み換え宿主で利用可能なプロモーターが特許文献３や非特許文献３に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３３４３５６７号
【特許文献２】特許第５２４５０６０号
【特許文献３】特許第５２７７４８２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ.  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００５）６９：２０６−２０８
【非特許文献２】Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. （２００６）７２：１０４８−１０５３
【非特許文献３】Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. （２０１２） ９３：１６２７-１６３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質の発現効率を向上させる手段を提供することを１つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、クリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株由来のクチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーターの一部がエンハンサーとしても機能することを見出した。また、該エンハンサーのＤＮＡ配列をプロモーターに導入した改良プロモーターを使用することで、タンパク質の発現効率が改善されることを見出した。斯かる知見に基づき、更なる検討を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。
【０００８】
項１．
（ａ）配列番号１の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する領域、及び／又は、配列番号２の塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ、或いは
（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列を有する領域、及び／又は配列番号２塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
からなるエンハンサー。
項２．
クリプトコッカス属由来のプロモーター用である、項１に記載のエンハンサー。
項３．
項１又は２に記載のエンハンサーが組み込まれた、プロモーター。
項４．
項１又は２に記載のエンハンサーが複数個組み込まれた、プロモーター。
項５．
クリプトコッカス属由来である、項３に記載のプロモーター。
項６．
項３〜５のいずれかに記載のプロモーターを含む発現ベクター。
項７．
項６に記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
項８．
クリプトコッカス属に属する、項７に記載の微生物。
項９．
項７又は８に記載の微生物を用いたタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
タンパク質の生産効率を向上させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】プラスミド（ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ）の構造を示す。
【図２】ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１〜Ｄ９におけるプロモーター領域の模式図を示す。
【図３】ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１〜Ｄ９のいずれかで形質転換したクリプトコッカスを培養した培養上清中のＧＤＨ活性を示す。
【図４】ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１０〜Ｄ１２のいずれかで形質転換したクリプトコッカスを培養した培養上清中のＧＤＨ活性を示す。
【図５】改良型プラスミド（ｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ９）‐ＣｓＡｏＧＬＤ）の構造を示す。
【図６】ｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ４）‐ＣｓＡｏＧＬＤ、又はｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ９）‐ＣｓＡｏＧＬＤで形質転換したクリプトコッカスを培養した培養上清中のＧＤＨ活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（エンハンサー）
一実施形態において、下記のエンハンサーが提供される：
（ａ）配列番号１の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する領域、及び／又は、配列番号２の塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ、或いは
（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列を有する領域、及び／又は配列番号２塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
からなるエンハンサー。
【００１２】
配列番号１の塩基配列は３４塩基で構成される。配列番号２の塩基配列は４１塩基で構成される。上記（ａ）に関し、配列番号１の塩基配列に対する同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることが好ましい。配列番号２の塩基配列に対する同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることが好ましい。
【００１３】
同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。例えば、具体的には、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
【００１４】
上記（ｂ）に関し、「数個」とは、エンハンサーとしての機能が維持される限り特に制限されない。一実施形態において、数個とは、２個、３個、又は４個であることが好ましい。
【００１５】
上記（ａ）及び（ｂ）に関し、「遺伝子の発現効率を高める機能を有する」とは、任意の遺伝子の転写効率を高める機能を有することを意味する。この機能を有するか否かは、任意の手法で確認することができる。例えば、任意のプロモーター及びレポーター遺伝子を有する発現ベクターに被験ＤＮＡ配列を導入し、それを当該発現ベクターに適した宿主細胞に導入して当該レポーター遺伝子の発現レベルが被験ＤＮＡ配列の導入によって増大するか否かを調べることによって確認することができる。
【００１６】
一実施形態において、エンハンサーは、配列番号１の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する領域、及び、配列番号２の塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡであることが好ましい。配列番号１の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する領域と配列番号２の塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する領域とは、直接的に連続していても良く、他の１個以上の塩基を介して連続していても良い。これらの領域が１個以上の塩基を介して連続している場合、「１個以上」とは、例えば、５個以上、１０個以上、１５個以上、又は２０個以上であり、５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、又は３０個以下であり得る。好適な一実施形態において、「１個以上の塩基」とは、ｇａｃｔｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃｇｃｔｔａａｃａｇｃ（配列番号２８）から成る塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列であり得る。９０％以上とは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であり得る。
【００１７】
好適な一実施形態において、エンハンサーは、配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列が配列番号２８の塩基配列を介して連結した配列番号２９の塩基配列又はそれと９０％以上の同一性を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有することが好ましい。ここで、同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である。
【００１８】
エンハンサーは、遺伝子の発現効率を向上することができる限り、上記（ａ）及び（ｂ）で規定する領域以外の任意の領域を５’末端側及び／又は３’末端側に有することができる。そのような任意の領域としては、例えば、配列番号１の塩基配列が本来存在するゲノムＤＮＡ配列において、配列番号１よりも上流５００ｂｐ以内（好ましくは４００ｂｐ以内、より好ましくは３００ｂｐ以内、より好ましくは２００ｂｐ以内、より好ましくは１００ｂｐ以内、より好ましくは５０ｂｐ以内、最も好ましくは３０ｂｐ以内）に存在する任意の領域を挙げることができる。
【００１９】
エンハンサーの塩基長は特に制限されない。一実施形態において、エンハンサーは、３５個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、７５個以上、８０個以上、９０個以上、９５個以上、１００個以上、１１０個以上、１２０個以上、１３０個以上、１４０個以上、１５０個以上、１６０個以上、１７０個以上、１８０個以上、１９０個以上、又は２００個以上の塩基で構成され得、５００個以下、４５０個以下、４００個以下、３５０個以下、３００個以下、２５０個以下、２００個以下、又は１５０個以下の塩基で構成され得る。
【００２０】
（プロモーター）
エンハンサーは、プロモーターと組み合わせることによって、それが発現を制御する遺伝子の発現効率を向上させることができる。エンハンサーと組み合わせるプロモーターの種類及び組み合わせ方は、遺伝子の発現効率を向上させることができる限り、特に制限されない。例えば、プロモーターが存在する発現ベクター上の任意の場所にエンハンサーを導入することができる。一実施形態において、エンハンサーは、プロモーター内に導入されていることが好ましい。
【００２１】
一実施形態において、エンハンサーと組み合わせる好ましいプロモーターとして、例えば、クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーター、キシラナーゼプロモーター、トランスレーションエロンゲーションファクター１αプロモーター、アミラーゼプロモーター、及びアクチンプロモーターなどが挙げられる。好ましくはクチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーター、最も好ましくは配列番号３記載のクリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株由来のクチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーターへの導入が挙げられる。一実施形態において、エンハンサーと組み合わせる好ましいプロモーターは、クリプトコッカス属由来のプロモーター又は後述する宿主由来のプロモーターであることが好ましい。好適な一実施形態において、エンハンサーと組み合わせる好ましいプロモーターは、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ，  又はＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓに由来するプロモーターであることが好ましい。 
【００２２】
エンハンサーを導入するプロモーター上の部位及びエンハンサーの方向は、発現効率が向上する限りにおいて特に限定されない。例えば、導入するプロモーターのデリーション解析によりエンハンサーの導入に適した条件（部位及び方向性等）を決定することができる。一実施形態において、好ましくは、配列番号３のクリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株由来のクチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーターにおける転写開始点より上流３００〜１００３ｂｐの間の任意の箇所、より好ましくは、配列番号３のクリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株由来のクチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーターにおける転写開始点より上流３００〜５００ｂｐの間の任意の箇所、最も好ましくは、配列番号３のクリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株由来のクチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーターにおける転写開始点より上流４３８ｂｐの位置への挿入が挙げられる。
【００２３】
エンハンサーの導入数は遺伝子の発現効率を向上できる限り特に限定されない。例えば、エンハンサーの導入数は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上であり得、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下であり得る。複数のエンハンサーが導入される場合は、それらは連続して存在しても良く、各エンハンサー間に他の塩基配列が介在してもよい。一実施形態において、複数のエンハンサーは連続して存在することが好ましい。
【００２４】
（発現ベクター）
一実施形態において、エンハンサーは発現ベクターにおいて、プロモーターと組み合わせられる。そのような発現ベクターとしては、所望の宿主細胞において、目的の遺伝子の発現効率を向上させることができる限り、特に限定されず、従来公知の発現ベクターから適宜選択することができる。一実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクターであることが好ましい。また、発現ベクターの由来は、後述する宿主内で機能する限り特に制限されないが、例えば大腸菌のベクターであることが好ましい。大腸菌のベクターとしては、具体的にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＴＡ２、ｐＥＴなどが挙げられる。一実施形態において、発現ベクターは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、発現プロモーターＤＮＡ配列、及び発現ターミネーターＤＮＡ配列を含む。好適な一実施形態において、発現ベクターは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来のｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、及びクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来のターミネーターを含む。
【００２５】
上述のエンハンサー及びプロモーターによってその発現が調節される遺伝子の種類は特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができる。一実施形態において好ましい遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子である。タンパク質としては、例えば、クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、及びグルコースデヒドロゲナーゼなどから成る群より選択される一種以上が挙げられる。
【００２６】
（宿主微生物）
上記発現ベクターを導入する宿主は、目的の遺伝子の発現効率を向上させることができる微生物であれば特に制限されない。例えば、担子菌門に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、Ｂａｎｎｏａ属，Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属，Ｂｕｌｌｅｒａ属，Ｂｕｌｌｅｒｏｍｕｃｅｓ属，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属，Ｃｕｒｖｉｂａｓｉｄｉｕｍ属，Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，Ｄｉｏｓｚｅｇｉａ属，Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ属，Ｆｉｂｕｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ属，Ｇｕｅｈｏｍｙｃｅｓ属，Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ属，Ｋｏｎｄｏａ属，Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属，Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属，Ｍａｓｔｉｇｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，Ｍｒａｋｉａ属，Ｏｃｃｕｌｔｉｆｕｒ属，Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ属，Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属，Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ属，Ｓｉｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，Ｓｐｏｒｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属，Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ属，Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，Ｓｙｍｐｏｄｉｍｙｃｏｐｓｉｓ属，Ｔａｕｓｏｎｉａ属，Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ属，Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属，Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属，Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ属，Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ属，Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｕｃｅｓ属などに属する微生物を挙げることができる。一実施形態において好ましい宿主は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の微生物であり、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓなどが挙げられ、最も適するのはクリプトコッカス  ｓｐ．Ｓ−２である。他の実施形態において好ましい宿主としては、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｃａｐｉｔａｔｕｍ，Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｆｌｏｒｉｆｏｒｍｅ，Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．，Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ，Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ，Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ，Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｌｕｄｉｇｅｎｕｍ，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ，Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ，Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ，Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｕｃｏｉｄｅｓなどの担子菌門に属する微生物を挙げることができる。他の実施形態においては、例えば、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ，Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓｐ．，Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ，Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ，Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｐ���ｂｅｓｃｅｎｓ，Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓｐ．Ｃ３０，Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓｐ．  ４２０，Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓｐ．  ＡＨ２８−２，Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ，Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓｐ．Ｉ−６２，Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ，Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｈｉｒｓｕｔｅ，及びＴｒａｍｅｔｅｓ  ｏｃｈｒａｃｅａなどの真核微生物を挙げることができる。
【００２７】
クリプトコッカス  ｓｐ．Ｓ−２は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１として国際寄託されている菌株であり、所定の手続きを経ることで分譲を受けることができる。
【００２８】
宿主微生物の細胞に発現ベクターを導入する方法としては、特に限定するものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト―ポリエチレングリコール法、及びパーティクルガン法などの方法が挙げられる。
【００２９】
宿主に発現ベクターを導入することによって得られる微生物（形質転換体）の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３０】
培養に用いる窒素源は、特定のアミノ酸成分に欠失があるなど特殊なＮ源を除いて、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であればどんなものでも良い。これらは主として有機窒素源であり、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、ゼラチン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。特に、酵母エキスやゼラチン加水分解物が好ましいが、これに限定されるものではなく、カゼインポリペプトン、発酵麹エキス、麦芽抽出物などを用いることによっても、形質転換体を培養することができる。
【００３１】
その他の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、キシロース、などの資化可能な糖類や、オリーブオイル、アマニ油、大豆油、米油、トリオレイン、トリリノレンなどの資化可能な油脂が使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３２】
培養温度は、菌が発育してタンパク質を生産する範囲で適宜選択し得る。例えば、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２の場合、通常は２０〜２５℃程度である。培養時間は、条件によって異なるが、タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は４８〜１６８時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育して目的とするタンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、通常はｐＨ３．０〜９．０程度である。
【００３３】
上述の発現ベクターが導入された形質転換体を適切な条件で培養することによって、ベクターがコードする任意のタンパク質をより効率的に製造することができる。
【００３４】
ＤＮＡ配列は、宿主細胞内にて転写翻訳される限りにおいて特に限定されず、コドンユーセージが最適化されていてもよい。コドンユーセージの最適化は、例えば、かずさＤＮＡ研究所にて公開されているコドンユーセージデータベースｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から提供される情報を用いて行うことができる。
【００３５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
＜実施例１＞
クリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株由来クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーターのデリーション解析
非特許文献３記載のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーターの機能をデリーションにより解析した。ｐＵＣ１８プラスミドに非特許文献３記載のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来のｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子を含有するＤＮＡ配列、クチナーゼ様酵素プロモーターのＤＮＡ配列（配列番号３）、クチナーゼ様酵素に由来する分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）、特許文献３に配列番号１として記載される麹菌由来ＦＡＤ‐ＧＬＤをコードするＤＮＡ配列、非特許文献３に記載のキシラナーゼターミネーターのＤＮＡ配列を図１に記載の構成で導入したプラスミドを作成した。以下、本プラスミドをｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤと呼ぶ。なお、クリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株のクチナーゼ様酵素に由来する分泌シグナルは、公知のクリプトコッカス  ｓｐ．  Ｓ２株クチナーゼ様酵素のアミノ酸配列より、ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）を用いて予測した。
【００３７】
ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤを鋳型として、配列番号６と配列番号７〜１５記載の各ＤＮＡ配列をプライマーとして用い、ＫＯＤ‐ｐｌｕｓ‐Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ(東洋紡社)を用い、プロトコルに沿って操作をすることで、クチナーゼ様酵素プロモーターのデリーションプロモーターを有する発現プラスミドｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１〜Ｄ９を構築した。各プラスミドとプロモーター領域の対比を図２に示す。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１では、転写開始点から−１００３〜−９００の塩基配列が除去されている。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ２では、転写開始点から−１００３〜−８００の塩基配列が除去されている。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ３では、転写開始点から−１００３〜−７００の塩基配列が除去されている。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ４では、転写開始点から−１００３〜−６００の塩基配列が除去されている。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ５では、転写開始点から−１００３〜−５００の塩基配列が除去されている。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ６では、転写開始点から−１００３〜−４００の塩基配列が除去されている。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ７では、転写開始点から−１００３〜−３００の塩基配列が除去されている。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ８では、転写開始点から−１００３〜−２００の塩基配列が除去されている。ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ９では、転写開始点から−１００３〜−１００の塩基配列が除去されている。
【００３８】
ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤおよびｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１〜Ｄ９のそれぞれを用いてクリプトコッカスｓｐ．ＤＡ２５株を形質転換した。形質転換は、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９２  Ｍａｒ；６０（３）：１１０１−８．（Ｖａｒｍａら）に記載の方法で実施した。クリプトコッカスｓｐ．ＤＡ２５株を２０ｍｌＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定したところ、２．９６Ａｂｓであった。次に、この培養液６．７５ｍｌを２００ｍｌ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）に植菌し、２５℃、１８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定したところ、０．９４Ａｂｓであった。次に、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｕｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）で菌体を２回洗浄し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）に吸光度ＯＤ６６０＝５０Ａｂｓとなるように懸濁した。得られた懸濁液１００μｌに、予めＳｂｆＩによって制限酵素処理し、直鎖化したプラスミド１０μｇ（〜５μｌ）を添加し、エレクトロポレーション用のキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて通電した。通電条件は、Ｃ＝２５μＦ；  Ｖ＝０．４７ｋＶであった。通電後の液中に６００μｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）を加え、選択プレート上に塗り広げた。選択プレートはＹＮＢ−ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、０．０７８％  −ｕｒａ  ＤＯ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％グルコース、１％寒天粉末）を用いた。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。
【００３９】
形質転換で得られた形質転換体については、配列番号１６及び配列番号１７を用いてＫＯＤ−Ｆｘ（東洋紡社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより遺伝子の導入を確認し、ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤおよびｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１〜Ｄ９のいずれかが導入された形質転換体を取得した。
【００４０】
取得した形質転換体を、５％酵母エキス、５％オリーブオイルからなる培地に稙菌し、２５℃にて６４時間培養し、上清中のＧＤＨ活性を比較した。本書においてＧＤＨ活性測定法は特に指定のない限り、以下の方法で実施している。
【００４１】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
１．３００ｍＭ  Ｄ−グルコースを含む１００ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ６．５（０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２．１．６ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
上記Ｄ−グルコースを含むリン酸緩衝液２０ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液１０ｍＬ、を混合して反応試薬とする。
【００４２】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録する。反応時間をＸ軸、吸光度をＹ軸として測定結果をプロットし、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度１ＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量である。
【００４３】
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛０．８５×０．１×１．０｝
【００４４】
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、０．８５は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００４５】
結果を図３に示す。比較の結果、ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ６による形質転換体で上清中のＧＤＨ活性の著しい低下を確認し、ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ７〜Ｄ９による形質転換体で取得した全ての形質転換体で、上清中にＧＤＨ活性を確認できなかった。
【００４６】
この結果より、転写開始点より上流３００〜５００ｂｐの領域に、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーターにとって重要な領域が存在すると推測した。
【００４７】
＜実施例２＞
プロモーター機能に強く寄与する領域の絞り込み
転写開始点より上流３００〜５００ｂｐの領域から、プロモーター機能に強く寄与する領域の絞り込みを行った。
【００４８】
ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２６９（１９９４），  ＮＯ．１２，Ｐ９１９５−９２０４には、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ由来のクチナーゼプロモーターのモチーフ解析についての報告がある。文献記載のＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ由来のクチナーゼはクチンを基質とする酵素であり、脂質を基質とするクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）とはタンパク質の機能を異にするものであり、それらに関与するプロモーター領域も、相同性は４５％であり決して相同性は高くはない。
該文献に報告のある、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ由来のクチナーゼプロモーターのモチーフ配列であるＧＣＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＴＣＧＡを配列番号３記載のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来クチナーゼ様酵素プロモーターに対しＢＬＡＳＴ検索したところ、完全に一致するものは見つからなかったものの、１０〜１５ｂｐ程度の長さで類似性が期待できる領域が、転写開始点より上流９７１〜９８１ｂｐの領域、４０４〜４１３ｂｐの領域、３６８〜３８０ｂｐの領域、１６０〜１７４ｂｐの領域の４か所見つかった。
【００４９】
４か所のうち、転写開始点より上流９７１〜９８１ｂｐの領域に関しては、実施例１での解析によりプロモーター機能に寄与しないことが判明しており、必ずしも見つかった領域が文献同様プロモーター機能に寄与する確証はなかった。しかし、実施例１において推測した転写開始点より上流３００〜５００ｂｐの領域中に２か所を含むこともあり、残りの３か所の効果をデリーションにより確認した。
【００５０】
ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤを鋳型として、ＫＯＤ‐ｐｌｕｓ‐  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ(東洋紡社)を用い、配列番号１８、及び配列番号１９記載のＤＮＡ配列を有するプライマーを用い、プロトコルに沿って操作をすることで、転写開始点より上流４０４〜４１３ｂｐの領域を含むＣＡＣＴＴＣＧＣＧＣＧＧＴＡＣＴＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＧＴＡＧＴＣＴＧ（配列番号１）を欠失したｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１０を作製した。同様に、配列番号２０、及び配列番号２１記載のＤＮＡ配列を有するプライマーを用い、プロトコルに沿って操作をすることで、転写開始点より上流３６８〜３８０ｂｐの領域を含むＡＡＣＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＣＧＴＧＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＡ（配列番号２）を欠失したｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１１を作製した。同様に、配列番号２２、及び配列番号２３記載のＤＮＡ配列を有するプライマーを用い、プロトコルに沿って操作をすることで、転写開始点より上流１６０〜１７４ｂｐの領域を含むＧＴＧＡＴＴＧＧＧＡＣＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＧＡＣＴＡＧＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴ（配列番号５）を欠失したｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１２を作製した。
【００５１】
ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１０〜Ｄ１２を用いてクリプトコッカスｓｐ．ＤＡ２５株を形質転換し形質転換体を取得した。形質転換は、実施例１記載の方法で実施した。得られた形質転換体については、実施例１記載の方法で遺伝子の導入を確認した。
【００５２】
取得した形質転換体を、５％酵母エキス、５％オリーブオイルからなる培地に稙菌し、２５℃にて６４時間培養し、上清中のＧＤＨ活性を測定した。結果を図４に示す。
【００５３】
＜比較例１＞
比較例として、実施例１で取得したｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤを実施例２と同条件で同時に培養したものを用意し、上清中のＧＤＨ活性を測定した。結果を図４に示す。
【００５４】
比較の結果、ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１０及びＤ１１による形質転換体では取得した全ての形質転換体で、上清中にＧＤＨ活性を確認できなかった。一方、ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤ‐Ｄ１２による形質転換体では上清中にＧＤＨ活性を確認した。
【００５５】
この結果より、配列番号１及び２を含む領域がプロモーター機能に強く寄与する可能性が推測された。配列番号１及び２は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）データベースに対するＢＬＡＳＴ検索で、解析に供したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来のクチナーゼ様酵素のプロモーター領域以外で相同性を有するＤＮＡ配列は確認できなかった。
【００５６】
＜実施例３＞
エンハンサー配列を連結導入したベクターの構築
配列番号１及び２は２５ｂｐの領域を含んで隣接し、配列番号３記載のプロモーター内に含まれる。さらに、配列番号３において配列番号１記載の配列の上流近傍に制限酵素ＳｐｅＩの認識サイトがあることに着目し、配列番号１及び２を含むＤＮＡ断片のプロモーター内への追加導入を行った。
【００５７】
ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤを鋳型として、配列番号２４、及び配列番号２５記載のＤＮＡ配列をプライマーとして用い、ＫＯＤ‐ｐｌｕｓ‐  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ(東洋紡社)を用い、プロトコルに沿って操作することで、ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤのクチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーター内に存在するＳｐｅＩ認識配列の隣にＨｉｎｄIII認識配列を導入したプラスミドを作成した。以下、本プラスミドをｐＣｓＵＣ（ＨｉｎｄIII）‐ＣｓＡｏＧＬＤと呼ぶ。
【００５８】
ｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤを鋳型として、配列番号２６（ＨｉｎｄIII認識配列を５’ 末端に付加）、及び配列番号２７（ＸｂａＩ認識配列を５’ 末端に付加）記載のＤＮＡ配列を有するプライマーを用い、ＫＯＤ‐ｐｌｕｓ‐(東洋紡社)を用い、プロトコルに沿って配列番号１及び２の両方を有するＤＮＡ断片を増幅した。配配列番号３における配列番号１記載の配列の近傍に存在するＳｐｅＩ認識配列を含む形でＰＣＲ増幅を実施しているため、本断片は、配列番号１及び２の両方を有し、５’ 末端にＨｉｎｄIIIによる認識配列、ＳｐｅＩによる認識配列の順で制限酵素認識配列を持ち、３’ 末端にＸｂａＩによる認識配列を有する。
【００５９】
増幅したエンハンサー配列を含むＤＮＡ断片をＨｉｎｄIII（東洋紡社、以下全て同社製を使用）、及びＸｂａＩ（タカラバイオ社、以下全て同社製を使用）で３７℃１６時間処理した後、ｐＣｓＵＣ（ＨｉｎｄIII）‐ＣｓＡｏＧＬＤをＨｉｎｄIII、ＳｐｅＩ（東洋紡社、以下全て同社製を使用）で３７℃１６時間処理した後、Ｅ.ｃｏｌｉ ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（東洋紡社）を用いて脱リン酸化したＤＮＡと適量混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社）を等量加え、１６℃１時間反応させた。
その後、反応液を用いてＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５α（東洋紡社）を形質転換した。取得した形質転換体よりプラスミドを抽出し、ＡＢＩ３７３０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｙｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて配列の確認を行い、エンハンサー配列が追加で導入されたプラスミドを取得した。以下、本プラスミドをｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ１）‐ＣｓＡｏＦＡＤ−ＧＬＤと呼ぶ。
【００６０】
ｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ１）‐ＣｓＡｏＧＬＤを用いて上記操作をさらに３回繰り返すことで、エンハンサーを配列を含むＤＮＡ断片を追加で４個導入したｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ４）‐ＣｓＡｏＧＬＤを取得した。さらに、ｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ４）‐ＣｓＡｏＦＡＤ−ＧＬＤを用い、上記操作をさらに５回繰り返すことで、エンハンサーを配列を含むＤＮＡ断片を追加で９個導入したｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ９）‐ＣｓＡｏＦＡＤ−ＧＬＤを取得した。代表としてｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ９）‐ＣｓＡｏＦＡＤ−ＧＬＤの構造を図５に示す。
【００６１】
＜実施例４＞
エンハンサー配列導入効果の確認
構築したｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ４）‐ＣｓＡｏＧＬＤ、ｐＣｓＵＣ（＋ＥＨＣ９）‐ＣｓＡｏＧＬＤを用いてクリプトコッカスｓｐ．ＤＡ２５株を形質転換し形質転換体を取得した。形質転換は、実施例１記載の方法で実施した。得られた形質転換体については、実施例１記載の方法で遺伝子の導入を確認した。
【００６２】
取得した形質転換体を、２％酵母エキス、１％ラクトース、２％トリオレイン、１％リン酸二水素カリウム、０．１％硫酸マグネシウムからなる培地に稙菌し、２５℃にて６４時間培養し、上清中のＧＤＨ活性を測定した。結果を図６に示す。
【００６３】
＜比較例２＞
比較例として、実施例１で取得したｐＣｓＵＣ‐ＣｓＡｏＧＬＤによる形質転換体を実施例４と同条件で同時に培養したものを用意し、上清中のＧＤＨ活性を比較した。結果を図６に示す。
【００６４】
各プラスミドによる形質転換体の比較の結果、エンハンサー配列の導入により上清中のＧＤＨ活性が優位に増加することを確認した。また、導入個数が増えるほど、上清中のＧＤＨ活性が優位に増加することを確認した。      
【００６５】
この結果より、配列番号１及び２を含む領域のプロモーターへの追加導入で、物質生産性を向上させる可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明により、産業上有用なエンハンサー、前記エンハンサーを導入したプロモーター、前記プロモーターを含む発現用プラスミド等の提供及び、該プロモーターを用いた組み換えタンパク質の生産方法が提供可能となる。該プロモーターの利用により、組み換えタンパク質の生産性を飛躍的に向上させることが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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