(57)【要約】【課題】本願は、ループス腎炎の処置、予防または診断に寄与する組成物または方法を提供することを目的とする。【解決手段】ＲＡＧＥアプタマーを含む、ループス腎炎を処置または予防するための医薬組成物を提供する。対象から採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定することを含む、ループス腎炎の診断方法、および、ＲＡＧＥを検出するための試薬を含む、ループス腎炎を診断するための組成物またはキットを提供する。ループス腎炎のバイオマーカーとしてのＲＡＧＥの使用を提供する。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＧＥアプタマーを含む、ループス腎炎を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項２】
ＲＡＧＥアプタマーが以下からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物：
（１）配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、一本鎖ＤＮＡ；
（２）配列番号１〜１０のいずれかの配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ；および、
（３）配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ。
【請求項３】
ＲＡＧＥアプタマーが、配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ＲＡＧＥアプタマーが、配列番号１〜１０のいずれかの配列からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
全身性エリテマトーデスの患者に投与するための、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
ループス腎炎を処置するための、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
ループス腎炎を予防するための、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
全身性エリテマトーデスの患者に投与するための、ＲＡＧＥアプタマーを含む医薬組成物。
【請求項９】
対象から採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定することを含む、ループス腎炎の診断方法。
【請求項１０】
対象が全身性エリテマトーデスの患者である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＡＧＥを検出するための試薬を含む、ループス腎炎を診断するための組成物。
【請求項１２】
ＲＡＧＥを検出するための試薬が、抗ＲＡＧＥ抗体、ＲＡＧＥアプタマーまたはＲＡＧＥリガンドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＲＡＧＥを検出するための試薬が抗ＲＡＧＥ抗体である、請求項１１または請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１１ないし請求項１３のいずれかに記載の組成物を含む、ループス腎炎を診断するためのキット。
【請求項１５】
ループス腎炎のバイオマーカーとしてのＲＡＧＥの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ループス腎炎を処置または予防するためのＲＡＧＥアプタマーを含む医薬組成物、並びに、ループス腎炎の診断方法、そのための組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は自己免疫疾患である。成人ＳＬＥ患者の約６０％はループス腎炎を発症し、ループス腎炎症例の約２５％が発症後１０年以内に末期腎不全に至る（非特許文献１および２）。ループス腎炎は主にステロイドを用いて処置されるが、ステロイド抵抗性ループス腎炎が存在し、また、長期ステロイド内服は重篤な副作用をもたらす。このように、ループス腎炎は、ＳＬＥ患者の生存率およびクオリティ・オブ・ライフ（ＱＯＬ）を規定する重要な要因である（非特許文献３）。ループス腎炎に対して、グルココルチコイドおよびミコフェノール酸モフェチルなどの免疫抑制剤も用いられる。しかしながら、免疫抑制剤はループス腎炎の末期腎不全への進行を完全に阻止することはできず、日和見感染の原因となり得る。さらに、ほとんどの免疫抑制剤は高額であり、患者と社会の経済的負担が大きい。また、グルココルチコイドには高血糖・肥満・ざ瘡などの副作用が認められ、それらの副作用は患者の日常生活動作（ＡＤＬ）の低下に直結している。従って、新規薬剤の開発は急務である。
【０００３】
本発明者らは、糖尿病性腎症における終末糖化産物（Advanced glycation endproducts；ＡＧＥｓ）とその受容体ＲＡＧＥ（Receptor for AGEs）系の病態生理学的な役割について研究を進めてきた。ＡＧＥｓ−ＲＡＧＥ系をターゲットとした創薬にも着手している。例えば、細胞毒性が強いグリセルアルデヒド由来ＡＧＥに対する核酸アプタマーを作成し、自然発症２型糖尿病マウスＫＫＡｙ／Ｔａマウスに持続投与したところ、糖尿病性腎症の発症進展を著明に抑制したことを報告した（特許文献１、非特許文献４）。しかしながら、ＡＧＥｓには多種多様な化合物が含まれ、一種のＡＧＥをブロックできたとしても、その他のＡＧＥによる細胞障害が惹起される。この問題を解決するために、本発明者らは、殆どのＡＧＥｓが結合するＲＡＧＥに着目し、ＲＡＧＥ表面に結合するＲＡＧＥアプタマーを作成した（特許文献２）。ＲＡＧＥアプタマーは、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥ、Human Morbidity Group Box-1（ＨＭＧＢ−１）とＲＡＧＥの結合を有意に抑制した。
【０００４】
ヒトループス腎炎の腎組織におけるＲＡＧＥの過剰発現が報告され（非特許文献５）、ループス腎炎の発症進展とＲＡＧＥの関連性が注目を集めている。ＨＭＧＢ−１と結合したＤＮＡ含有免疫複合体がＲＡＧＥを介して形質細胞様樹状細胞やＢ細胞の活性化を誘導し、自己免疫異常を惹起することが報告された（非特許文献６）。また、ＳＬＥおよびループス腎炎への易罹患性ＲＡＧＥ遺伝子多型がループス腎炎の発症や尿蛋白量に強く関連することが知られている（非特許文献７）。しかしながら、ＲＡＧＥ阻害剤によるＳＬＥ発症およびループス腎炎進展に対する抑制効果については、一定の見解は得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１２／０７０６２１号公報
【特許文献２】特開２０１６−７９１８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Buhaescu et al.Semin Arthritis Rheum. 2007;36(4):224-37
【非特許文献２】Maroz N et al. Am J Med Sci. 2013; 346(4): 319-23
【非特許文献３】Houssiau FA, Arthritis Res Ther. 2012 31; 14(1): 202
【非特許文献４】Kaida et al. Diabetes 2013 62(9):3241-50
【非特許文献５】Tanji et al. JASN 2000; 11:1656-1666
【非特許文献６】Tian J et al. Nat Immunol. 2007; 8(5): 487-96
【非特許文献７】Martens HA et al. Lupus. 2012; 21(9): 959-68
【非特許文献８】J Exp Med. 2013 21;210(11):2447-63
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願は、ループス腎炎の処置、予防または診断に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ループス腎炎に罹患している対象の腎臓において、ＲＡＧＥ発現が増加し、病態進展に伴って増加すること、並びに、ＲＡＧＥアプタマーの投与により、ループス腎炎の発症を防止し、進行を抑制し、腎機能を保護し得ることを見出した。
【０００９】
従って、ある態様では、本願は、ＲＡＧＥアプタマーを含む、ループス腎炎を処置または予防するための医薬組成物を提供する。
別の態様では、本願は、全身性エリテマトーデスの患者に投与するための、ＲＡＧＥアプタマーを含む組成物を提供する。
【００１０】
ある態様では、本願は、対象から採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定することを含む、ループス腎炎の診断方法を提供する。
別の態様では、本願は、ＲＡＧＥを検出するための試薬を含む、ループス腎炎を診断するための組成物を提供する。
さらなる態様では、本願は、当該組成物を含む、ループス腎炎を診断するためのキットを提供する。
またさらなる態様では、本願は、ループス腎炎のバイオマーカーとしてのＲＡＧＥの使用を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本願の開示に従い、対象のループス腎炎を処置、予防または診断し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの糸球体、近位尿細管および遠位尿細管の過ヨウ素酸シッフ試薬染色を示す。
【図２Ａ】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの糸球体におけるＲＡＧＥ発現量を示す。
【図２Ｂ】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの尿細管間質におけるＲＡＧＥ発現量を示す。
【図３】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの尿細管におけるＲＡＧＥの免疫染色の結果を示す。
【図４】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの遠位尿細管におけるＲＡＧＥの細胞内局在を示す。
【図５】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの糸球体におけるＲＡＧＥの局在を示す。
【図６】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの尿中ＲＡＧＥ排泄量および尿蛋白量を示す。
【図７】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける尿中ＲＡＧＥ排泄量と尿中ＮＡＧ排泄量の相関を示す。
【図８】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスのループス腎炎に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図９】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの腎臓におけるＲＡＧＥ発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１０】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの腎臓におけるＨＭＧＢ１沈着に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１１】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるＩＬ−６の発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１２】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるＴＮＦαの発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１３】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの腎臓におけるＭＣＰ−１の発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１４】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるＫｉｍ１の発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１５】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの糸球体における半月体形成に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１６】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの糸球体におけるワイヤーループ病変の形成に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１７】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの糸球体におけるマクロファージの浸潤に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１４】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。
【００１５】
「ＲＡＧＥ」は、膜貫通型の細胞表面タンパク質であり、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の受容体として機能する。ＲＡＧＥのリガンドとしては、Ｎεカルボキシメチルリジン、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥ−２を含む各種ＡＧＥの他、ＨＭＧＢ−１およびＬＰＳなどが知られている。
【００１６】
「アプタマー」は、特異的に標的物質に結合する能力を持った一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり、種々の立体構造をとりタンパク質や化合物に結合して抗体のような機能を発揮する。本明細書において「ＲＡＧＥアプタマー」とは、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００１７】
ＲＡＧＥアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）法によって調製することができる。一本鎖ＤＮＡをライブラリー源とするＳＥＬＥＸ法の概要を以下に説明する。まず、任意の２つのプライマー配列で挟まれた適当な長さのランダム配列を含むテンプレートＤＮＡを合成する。ランダム配列の長さは、３５塩基〜１２０塩基が適切である。このテンプレートＤＮＡをＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して、ランダムＤＮＡアプタマープールを得る。次いで、このランダムＤＮＡアプタマープールを標的物質と会合させ、結合しなかったＤＮＡを除去し、そして結合したＤＮＡアプタマーを抽出する。得られたＤＮＡアプタマーを、上記プライマー配列を用いるＰＣＲによって増幅する。このとき、５〜８ｍＭのＭｇ２＋存在下でＰＣＲを行って、複製の正確性を低下させて変異を導入しやすくすることにより、標的物質との会合前のＤＮＡアプタマープールに存在しない新たなＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡアプタマープールが得られる。新たなＤＮＡアプタマーは、結合力がより強い可能性があり、すなわち、ＤＮＡアプタマーが進化する可能性が生じる。この進化したＤＮＡアプタマープールについて、上記の一連の操作を５〜１５ラウンド繰り返すことによって、標的物質に結合するＤＮＡアプタマーが得られる。最終ラウンドの後、得られたＤＮＡアプタマープールは、当業者が通常行う操作によってクローニングされ、次いで配列決定される。このＳＥＬＥＸ法における、テンプレートＤＮＡの合成、ＰＣＲなどの操作、ならびにクローニングおよび配列決定は、当業者が通常用いる方法によって行われる。ＲＡＧＥアプタマーは、このようにして決定された配列に基づいて、当業者が通常用いる方法によって化学合成することができる。
【００１８】
ＲＡＧＥアプタマーは、その安定性を増加させるため、修飾ヌクレオチドにより構成されていてもよい。例えば、ＲＡＧＥアプタマーは、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたホスホロチオエート（Ｓ化）オリゴヌクレオチドであってよい。
【００１９】
ＲＡＧＥアプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれであってもよいが、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。ＲＡＧＥアプタマーは、少なくとも３５塩基からなり、好ましくは約３５塩基〜約１２０塩基、より好ましくは約３５塩基〜約７０塩基、さらにより好ましくは約３５塩基〜約５０塩基である。
【００２０】
ある態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、以下の配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む一本鎖ＤＮＡである。
CCTGATATGGTGTCACCGCCGCCTTAGTATTGGTGTCTAC  （配列番号１）
TCTGTTCAGGTTGGTACGGTGGAAGGTGTGATTCACGAGG  （配列番号２）
CTTGGGTTGTTTATGTCGACCGCCAGTTTTGTGTTCAGCA  （配列番号３）
CATTCTTAGATTTTTGTCTCACTTAGGTGTAGATGGTGAT  （配列番号４）
TTGGTTCTCTTGCCCTCTTCTATTTTGTACGATGTTTCCT  （配列番号５）
TTCCACTGAGTGCCGCGGACTGTTGTTGGGAGGTGGTGTG  （配列番号６）
ATGGGGAGGAGGGGTGTCGTGGGGGGTGGGGGAGTGGGGA  （配列番号７）
CTGGGGATGACTCGGATAGGATGTACGAGTTTGATGTGTA  （配列番号８）
TTTGATCGAGCTGCGCCCTCCTCGCCGTAGAAGAGTGTGT  （配列番号９）
TTTGGGGTGGAGTTAGGGGTGGATCAAGCGGGATTGTGTA  （配列番号１０）
【００２１】
ある態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、上記の配列番号１〜１０のいずれかの配列を含み、下表に示す位置でホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドである。
【表１】
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【００２２】
ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらにより好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡであってよい。また、ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００２３】
「配列同一性」とは、２つのオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
【００２４】
ＲＡＧＥアプタマーがＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害するか否かは、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＱＣＭ（quartz crystal microbalance）法により調べることができる。ＥＬＩＳＡの場合、ＡＧＥと結合するＲＡＧＥのＶドメイン（ｖ−ＲＡＧＥ）とＲＡＧＥアプタマーとを前反応させ、この反応混合物をＲＡＧＥのリガンド（例えばＡＧＥまたはＨＭＧＢ１）を固定化したＥＬＩＳＡプレートに添加して、プレート中のリガンドに結合したＲＡＧＥを抗ＲＡＧＥ抗体で検出する。あるいは、ｖ−ＲＡＧＥをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ＲＡＧＥアプタマーとそのリガンドとを添加して、ｖ−ＲＡＧＥに結合したリガンドを抗体により検出してもよい。ＱＣＭ法では、ＱＣＭセンサープレートにｖ−ＲＡＧＥを固定化し、ＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下にＲＡＧＥのリガンドを添加して、ｖ−ＲＡＧＥに対するリガンドの結合をモニタリングすればよい。
【００２５】
好ましい態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む一本鎖ＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号１〜１０のいずれかの配列からなる一本鎖ＤＮＡである。別の好ましい態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、CATTCTTAGATTTTTGTCTCACTTAGGTGTAGATGGTGAT（配列番号４）の配列を含む一本鎖ＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号４の配列からなる一本鎖ＤＮＡである。
【００２６】
ＲＡＧＥアプタマーは、ＲＡＧＥとそのリガントとの結合を阻害することにより、ループス腎炎を処置または予防することができる。「ループス腎炎」とは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に伴う腎障害を意味する。ＳＬＥは、全身が侵され得る自己免疫疾患であり、免疫複合体の形成と補体による組織障害をもたらす。組織障害の発生場所は個々の症例によって異なり、腎臓、皮膚、肺、脳など多様な臓器に障害が発生し得る。ＳＬＥの診断基準として、例えば、Updating the American College of Rheumatology revised criteria (1997)、および、The systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus (2012) が知られている。
【００２７】
ループス腎炎では、主に糸球体腎炎が生じるが、血管炎や間質性腎炎なども生じ得る。ループス腎炎には、微小メサンギウムループス腎炎、メサンギウム増殖性ループス腎炎、巣状ループス腎炎、びまん性ループス腎炎、膜性ループス腎炎および進行した硬化性ループス腎炎、特にびまん性ループス腎炎が含まれる。ループス腎炎の症状には、例えば、蛋白尿およびむくみが含まれる。ループス腎炎が進行すると腎機能が低下し、腎不全に至る場合がある。ループス腎炎の診断または分類は、例えば、国際腎臓学会（ＩＳＮ）によるループス腎炎の２００３年分類、または、ループス腎炎のＡＣＲ（米国リウマチ学会）診療ガイドライン（２０１２）を基準とし得る。
【００２８】
ループス腎炎の「処置」には、ループス腎炎またはその症状の改善および寛解、並びにループス腎炎またはその症状の進展または進行の抑制が含まれる。また、ループス腎炎の「予防」には、ループス腎炎またはその症状の発症の抑制および遅延が含まれる。ループス腎炎の処置または予防の対象は、ＳＬＥの患者であり得る。ループス腎炎の処置の対象は、ループス腎炎に罹患している対象、例えば、ループス腎炎に罹患しているＳＬＥの患者であり得る。ループス腎炎の予防の対象は、ループス腎炎を発症するリスクのある対象、例えば、ループス腎炎を発症していないＳＬＥの患者、または、ＳＬＥを発症するリスクのある対象であり得る。対象は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物であり得る。
【００２９】
ループス腎炎の処置または予防には、腎機能の悪化の抑制または保護、および腎組織の保護が含まれる。腎機能の指標の非限定的な例としては、尿中アルブミン排出量、尿中アルブミン／クレアチニン比、クレアチニンクリアランス、血中尿素窒素量、血中クレアチニン量が挙げられる。また、ループス腎炎の処置または予防には、メサンギウム基質の増加、糸球体基底膜の肥厚、糸球体の線維化（硬化）、および／または腎肥大（腎臓／体重比の増加）の抑制、尿細管間質の線維化および／または萎縮の抑制、および酸化ストレスの抑制が含まれる。酸化ストレスの指標としては、尿中８ＯＨｄＧ（8-Hydroxydeoxyguanosine）排出量が挙げられる。
【００３０】
上記医薬組成物は、ＲＡＧＥアプタマーを医薬上許容される担体と配合し、固形製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など）、または液状製剤（例えば、シロップ剤、注射剤など）として製造することができる。医薬上許容される担体としては、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
上記医薬組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、上記医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、または皮下投与により投与することができるが、皮下投与または静脈内投与によることが好ましい。上記医薬組成物の投与量もまた、投与方法、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、成人１日当たり、ＲＡＧＥアプタマーの量として０．０１μｇ〜１００ｇ、例えば、０．０１μｇ〜１ｍｇを投与することができるが、これに限定されない。
【００３２】
ある態様では、本願は、ループス腎炎を処置または予防する方法であって、それを必要とする患者にＲＡＧＥアプタマーを投与することを含む方法、ループス腎炎を処置または予防するためのＲＡＧＥアプタマーの使用、および、ループス腎炎を処置または予防するための医薬の製造のための、ＲＡＧＥアプタマーの使用を提供する。
【００３３】
ある態様では、本願は、ＳＬＥの患者に投与するためのＲＡＧＥアプタマーを含む組成物を提供する。この組成物は、上記のループス腎炎を処置または予防するための医薬組成物と同様に製造し、ＳＬＥの患者に投与し得る。
【００３４】
下記の実施例に記載する通り、本発明者らは、ＳＬＥマウスにおいて尿中ＲＡＧＥ排泄が増加すること、および、尿細管障害マーカーである尿中ＮＡＧ排泄量と、尿中ＲＡＧＥ排泄量に強い正の相関関係があることを見出した。従って、ＲＡＧＥをループス腎炎のバイオマーカーとして使用して、ループス腎炎を診断することができる。
【００３５】
例えば、対象から採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定することを含む、ループス腎炎の診断方法が提供される。この方法を、ループス腎炎の診断を補助する方法としてもよい。例えば、診断は下記を目的とし得るが、診断の目的はこれらに限定されない。
（Ａ）対象がループス腎炎に罹患しているか否かを判定する。
（Ｂ）ループス腎炎発症のリスクを判定する。
（Ｃ）対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防の効果を予測する。
（Ｄ）対象のループス腎炎をモニタリングする。
【００３６】
上記方法に用いられる尿は、常法に従って採取したものであり得る。採取した尿は、すぐにＲＡＧＥ濃度の測定に用いてもよく、測定時まで低温で、例えば冷蔵または冷凍して、例えば４℃以下、０℃以下または−２０℃以下で、保存してもよい。希釈または濃縮した尿を用いてもよい。
【００３７】
尿中ＲＡＧＥ濃度は、ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体を用いる免疫学的手法により測定し得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法）、ウェスタンブロッティングなどを例示できる。
【００３８】
尿中ＲＡＧＥ濃度の測定に使用される抗体は、ＲＡＧＥに結合する抗体（抗ＲＡＧＥ抗体）、即ち、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドからなる群から選択され得る。抗体は、任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含み、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒトおよび他の抗体、並びに複数の種に由来する配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質または当該タンパク質の抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、動物を抗原で免疫化することにより産生し得、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生し得る。あるいは、市販の抗体を使用してもよい。
【００３９】
抗ＲＡＧＥ抗体は、ＲＡＧＥと選択的に相互作用できるものであれば、その断片および誘導体であってもよい。抗体の断片および誘導体には、例えば、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からなるＦａｂ断片；２個の可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖ断片；可動性ペプチドリンカーにより連結された２個のＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；ラクダ科の重鎖二量体および単一可変領域、および、テンジクザメの新規抗原受容体などの単一ドメイン骨格および、可変重鎖ドメインに基づくミニボディー（minibody）が含まれる。
【００４０】
尿中ＲＡＧＥ濃度の測定のために、抗ＲＡＧＥ抗体と同様に、ＲＡＧＥアプタマーを使用することもできる。このために、上記のＲＡＧＥアプタマーを使用し得る。
【００４１】
尿中ＲＡＧＥ濃度の測定に使用される抗ＲＡＧＥ抗体またはＲＡＧＥアプタマーは、標識されていてもよい。標識は、当業者が適宜選択し得る。標識の例には、蛍光染料または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色団の染料（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）、粒子（例えば、金などの金属粒子）、蛍光性半導体ナノ結晶（量子ドット）が含まれる。各種標識を、当業者に周知の様々な化学反応を使用して、所望の抗体またはアプタマーに結合させることができる。あるいは、尿中ＲＡＧＥ濃度の測定に使用される抗体またはアプタマーは、標識されていなくてもよい。この場合は、抗ＲＡＧＥ抗体またはＲＡＧＥアプタマーを認識する、標識された二次抗体または核酸プローブをさらに使用し得る。
【００４２】
あるいは、ＲＡＧＥに結合するリガンドの量を測定することにより、尿中ＲＡＧＥ濃度を測定することができる。例えば、蛍光標識リガンド、放射性標識リガンド等の標識リガンドを用いるリガンド結合アッセイにより、ＲＡＧＥの濃度を測定し得る。この目的で、いかなるＲＡＧＥリガンドも使用できる。例えば、ＲＡＧＥリガンドとして、Ｎεカルボキシメチルリジン、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥ−２を含む各種ＡＧＥ、ＨＭＧＢ−１およびＬＰＳなどを使用し得る。
【００４３】
抗ＲＡＧＥ抗体、ＲＡＧＥアプタマーまたはＲＡＧＥリガンドは、適切な支持体に結合していてもよい。当該分野で通常用いられている支持体を使用できる。支持体は、どのような形状や材質のものであっても良く、例えば、ナイロン膜などのメンブレン、プレート、マルチウェルプレート、ビーズ、ガラス、プラスチックおよび金属などであり得る。
【００４４】
尿中ＲＡＧＥ濃度は採尿時の水分代謝の状態によって変化するため、測定した尿中ＲＡＧＥ濃度を尿中クレアチニンの値で補正すること（クレアチニン補正）が好ましい。クレアチニン補正の方法は、当業者に周知である。
【００４５】
上記（Ａ）に関して、対象から採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定することを含む、対象がループス腎炎に罹患しているか否かを判定する方法（方法（Ａ））が提供される。方法（Ａ）では、ループス腎炎罹患のバイオマーカーとしてＲＡＧＥを使用する。
【００４６】
方法（Ａ）における対象は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物であり得、いかなる健康状態であってもよい。例えば、対象は、ＳＬＥの患者、または、ＳＬＥまたはループス腎炎の発症が疑われる対象であり得る。対象は、ＳＬＥまたはループス腎炎の処置を受けていても、いなくてもよい。
【００４７】
ある実施態様では、測定した尿中ＲＡＧＥ濃度を指標値と比較することにより、対象がループス腎炎に罹患しているか否かを判定する。指標値は、対象と同種の動物群（対照群）において尿中ＲＡＧＥ濃度を測定して得られる値であり得る。指標値は、被験対象の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に、対照群について決定した値であってもよく、各被験動物種について予め定めた値であってもよい。
【００４８】
ある実施態様では、指標値は、ＳＬＥに罹患しているが、ループス腎炎に罹患していない動物群（対照群）について得られた値であり得る。この場合、対象の尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値よりも高い場合に、対象がループス腎炎に罹患していると判定し得、指標値よりも低い場合に、対象がループス腎炎に罹患していないと判定し得る。別の実施態様では、指標値は、ループス腎炎に罹患している動物群（対照群）について得られた値であり得る。この場合、対象の尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値よりも高い場合に、対象がループス腎炎に罹患していると判定し得、指標値よりも低い場合に、対象がループス腎炎に罹患していないと判定し得る。また、指標値に対する被験値の高低の程度に基づいて、ループス腎炎の重症度をさらに知ることができる。
【００４９】
また、尿中ＲＡＧＥ濃度のカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定値とカットオフ値とを比較してもよい。例えば、対象の尿中ＲＡＧＥ濃度がカットオフ値より高い場合に、対象はループス腎炎に罹患していると判定し得、カットオフ値よりも低い場合に、対象がループス腎炎に罹患していないと判定し得る。
【００５０】
「カットオフ値」とは、閾値ともいい、その値を基準としてループス腎炎を診断し得る値をいう。好ましくは、カットオフ値は、高い診断感度および高い診断特異度の両方を示す。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。例えば、ループス腎炎の患者で高い陽性率を示し、かつ、ループス腎炎に罹患していない対象で高い陰性率を示す尿中ＲＡＧＥ濃度をカットオフ値として設定し得る。複数のカットオフ値を設定することもできる。
【００５１】
カットオフ値の設定は、種々の統計解析手法を用いて、自体公知の方法により実施できる。一般的には、ループス腎炎の患者の尿中ＲＡＧＥ濃度と、ループス腎炎に罹患していない対象の尿中ＲＡＧＥ濃度を、統計解析的に処理することにより、カットオフ値を設定できる。
【００５２】
例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析（receiver opera ting characteristic analysis）により、カットオフ値の設定を行うことができる。ＲＯＣ解析では、閾値を変化させていった場合に、それぞれの閾値における感度（Sensitivity）を縦軸に、ＦＰＦ（False Positive Fraction、偽陽性率：１−特異度（Specificity））を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線では、全く診断能のない検査は、対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、対角線が左上方に弧を描くような曲線となり、診断能１００％の検査は、左辺−上辺上を通る曲線となる。カットオフ値の設定としては、例えば、感度と特異度の優れた独立変数のＲＯＣ曲線は、左上隅に近づいていくという事実から、この左上隅との距離が最小となる点をカットオフ値にする方法がある。また、ＲＯＣ曲線における曲線下面積（area under the curve、ＡＵＣと略称される）が０．５００となる斜点線から最も離れたポイントをカットオフ値にする方法、つまり、（感度＋特異度−１）を計算して、その最大値となるポイントであるヨーデン指標（Youden index）をカットオフ値に設定することもできる。
【００５３】
具体的には、ループス腎炎の患者の群（反応例）およびループス腎炎に罹患していない対象の群（無反応例）から採取した尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定し、測定された値における診断感度および診断特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ曲線を作成する。そして、診断感度と診断特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とし得る。また、例えば、検出された値における診断効率（即ち、ループス腎炎の患者を正しく診断した症例と、ループス腎炎に罹患していない対象を正しく診断した症例との合計数の全症例数に対する割合）を求め、最も高い診断効率が算出される値をカットオフ値とし得る。
【００５４】
カットオフ値は、適宜変更することができる。即ち、尿中ＲＡＧＥ濃度の測定方法および比較方法、臨床上の使用目的、所望の感度および特異度などの条件に応じて、カットオフ値を設定することができる。
【００５５】
ある実施態様では、対象がループス腎炎に罹患しているか否かを判定する方法であって、
（１）対象から尿を採取する工程、および、
（２）当該尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定する工程、
を含む方法が提供される。
【００５６】
この方法はさらに、
（３）測定された尿中ＲＡＧＥ濃度を指標値またはカットオフ値と比較する工程、
（４）測定された尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値またはカットオフ値よりも高い場合に、対象がループス腎炎に罹患していると判定し、測定された尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値またはカットオフ値よりも低い場合に、対象がループス腎炎に罹患していないと判定する工程、
を含み得る。
【００５７】
さらなる実施態様では、対象がループス腎炎に罹患していると判定された場合に、対象にＲＡＧＥアプタマーを投与することを決定する。さらなる実施態様では、対象がループス腎炎に罹患していると判定された場合に、対象にＲＡＧＥアプタマーを投与する。
【００５８】
上記（Ｂ）に関して、対象から採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定することを含む、ループス腎炎発症のリスクを判定する方法（方法（Ｂ））が提供される。方法（Ｂ）では、ループス腎炎を発症するリスクのバイオマーカーとしてＲＡＧＥを使用する。
【００５９】
方法（Ｂ）における対象は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物であり得、いかなる健康状態であってもよい。例えば、対象は、健康な対象、ＳＬＥの患者、または、ＳＬＥまたはループス腎炎の発症が疑われる対象であり得る。対象は、ＳＬＥの処置を受けていても、いなくてもよい。
【００６０】
ある実施態様では、測定した尿中ＲＡＧＥ濃度を指標値と比較することにより、対象のループス腎炎発症のリスクを判定する。指標値は、対象と同種の動物群（対照群）において尿中ＲＡＧＥ濃度を測定して得られる値であり得る。指標値は、被験対象の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に、対照群について決定した値であってもよく、各被験動物種について予め定めた値であってもよい。
【００６１】
ある実施態様では、指標値は、ＳＬＥに罹患していない動物群（対照群）について得られた値であり得る。この場合、対象の尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値よりも高い場合に、対象がループス腎炎を発症するリスクが高いと判定し得、指標値よりも低い場合に、対象がループス腎炎を発症するリスクが低いと判定し得る。別の実施態様では、指標値は、ＳＬＥに罹患しているが、ループス腎炎を発症していない動物群について得られた値であり得る。この場合、対象の尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値よりも高い場合に、対象がループス腎炎を発症するリスクが高いと判定し得、指標値よりも低い場合に、対象がループス腎炎を発症するリスクが低いと判定し得る。また、指標値に対する被験値の高低の程度に基づいて、ループス腎炎を発症するリスクの大きさをさらに知ることができる。
【００６２】
また、尿中ＲＡＧＥ濃度のカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定値とカットオフ値とを比較してもよい。例えば、尿中ＲＡＧＥ濃度がカットオフ値より高い場合に、対象がループス腎炎を発症するリスクが高いと判定し得、カットオフ値より低い場合に、対象がループス腎炎を発症するリスクが高いと判定し得る。カットオフ値は、上記の方法（Ａ）に準じて、適切な対照群の測定値に基づき、設定できる。
【００６３】
ある実施態様では、対象のループス腎炎発症のリスクを判定する方法であって、
（１）対象から尿を採取する工程、および、
（２）当該尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定する工程、
を含む方法が提供される。
【００６４】
この方法はさらに、
（３）測定された尿中ＲＡＧＥ濃度を指標値またはカットオフ値と比較する工程、
（４）測定された尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値またはカットオフ値よりも高い場合に、対象がループス腎炎を発症するリスクが高いと判定し、測定された尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値またはカットオフ値よりも低い場合に、対象がループス腎炎を発症するリスクが低いと判定する工程、
を含み得る。
【００６５】
さらなる実施態様では、対象がループス腎炎を発症するリスクが高いと判定された場合に、対象にＲＡＧＥアプタマーを投与することを決定する。さらなる実施態様では、対象がループス腎炎を発症するリスクが高いと判定された場合に、対象にＲＡＧＥアプタマーを投与する。
【００６６】
上記（Ｃ）に関して、対象から採取された尿における尿中ＲＡＧＥ濃度を測定することを含む、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防の効果を予測する方法（方法（Ｃ））が提供される。上記の通り、ＲＡＧＥアプタマーをループス腎炎の処置または予防に使用でき、そして、ＳＬＥ患者の尿にＲＡＧＥが排出され、ループス腎炎の進展に伴って増加する。このことから、尿中にＲＡＧＥが検出される対象にはＲＡＧＥアプタマーによるループス腎炎の処置または予防が有効であると予測することができる。このような方法は、一般的にコンパニオン診断と呼ばれる。
【００６７】
方法（Ｃ）において、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置の効果を予測する場合、方法（Ａ）に準じて対象がループス腎炎に罹患しているか否かを判定し、対象がループス腎炎に罹患していると診断される場合に、ＲＡＧＥアプタマーによるループス腎炎の処置が有効であると予測する。
【００６８】
方法（Ｃ）において、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる予防の効果を予測する場合、方法（Ｂ）に準じて対象がループス腎炎に罹患するリスクを判定し、リスクが高いと判定される場合に、ＲＡＧＥアプタマーによるループス腎炎の予防が有効であると予測する。
【００６９】
方法（Ｃ）は、ＲＡＧＥアプタマーによるループス腎炎の処置または予防の前、最中、または後に実施することができる。ある実施態様では、ＲＡＧＥアプタマーによるループス腎炎の処置または予防を受けていない対象に、方法（Ｃ）を実施する。ＲＡＧＥアプタマーによるループス腎炎の処置または予防を受けていない対象には、当該処置または予防を受けたことのない対象、および、当該処置または予防を受けたことがあるが、方法（Ｃ）を実施する時点では受けていない対象が含まれる。別の実施態様では、ＲＡＧＥアプタマーによるループス腎炎の処置または予防を受けている対象に、方法（Ｃ）を実施し、処置または予防を継続するか否かを決定する。
【００７０】
ある実施態様では、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防が有効であると予測された場合に、対象にＲＡＧＥアプタマーを投与することを決定する。ある実施態様では、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防が有効であると予測された場合に、対象にＲＡＧＥアプタマーを投与する。ある実施態様では、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防が有効ではないと予測された場合に、対象にＲＡＧＥアプタマーを投与しないことを決定する。ある実施態様では、ＲＡＧＥアプタマーによるループス腎炎の処置または予防を受けている対象において、当該処置または予防が有効ではないと予測された場合に、当該処置または予防を中断、延期または中止する。
【００７１】
ある実施態様では、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防の効果を予測する方法であって、
（１）対象から尿を採取する工程、および、
（２）当該尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定する工程、
を含む方法が提供される。
【００７２】
この方法はさらに、
（３）測定された尿中ＲＡＧＥ濃度を指標値またはカットオフ値と比較する工程、
（４）測定された尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値またはカットオフ値よりも高い場合に、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防は有効であると予測し、測定された尿中ＲＡＧＥ濃度が指標値またはカットオフ値よりも低い場合に、対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防は有効ではないと予測する工程、
を含み得る。
【００７３】
上記（Ｄ）に関して、対象から少なくとも２つの時点で採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定し、比較することを含む、対象のループス腎炎をモニタリングする方法（方法（Ｄ））が提供される。方法（Ｄ）では、ループス腎炎の病態進展のバイオマーカーとしてＲＡＧＥを使用する。
【００７４】
方法（Ｄ）における対象は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物であり得、いかなる健康状態であってもよい。例えば、対象は、健康な対象、ＳＬＥまたはループス腎炎の患者、または、ＳＬＥまたはループス腎炎の発症が疑われる対象であり得る。また、上記少なくとも２つの時点で、対象のＳＬＥまたはループス腎炎の状態は同じであっても異なっていてもよい。対象は、ＳＬＥまたはループス腎炎の処置を受けていても、いなくてもよい。
【００７５】
方法（Ｄ）では、２つの時点またはそれ以上の時点で採取された尿を用い得る。採取時点の間隔は、一定であっても異なっていてもよい。例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、１０日に１回、１週、２週、３週、４週に１回、１月、２月、３月、４月に１回、半年に１回、１年に１回等の頻度で採取した尿を用い得る。
【００７６】
ある実施態様では、少なくとも２つの時点で採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を比較した結果、対象の尿中ＲＡＧＥ濃度が増加した場合に、ループス腎炎が進行したと判定し得、対象の尿中ＲＡＧＥ濃度が減少した場合に、ループス腎炎が改善されたと判定し得る。従って、この方法により、例えば、ループス腎炎の病態進展を観察すること、または、ループス腎炎の処置の効果を確認することができる。
【００７７】
ある実施態様では、対象のループス腎炎をモニタリングする方法であって、
（１）対象から少なくとも２つの時点で尿を採取する工程、
（２）当該尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定する工程、および、
（３）測定された尿中ＲＡＧＥ濃度を比較する工程、
を含む方法が提供される。
【００７８】
この方法はさらに、
（４）対象の尿中ＲＡＧＥ濃度が増加した場合に、ループス腎炎が進行したと判定し、対象の尿中ＲＡＧＥ濃度が減少した場合に、ループス腎炎が改善されたと判定する工程、
を含み得る。
【００７９】
ある態様では、本願は、ＲＡＧＥを検出するための少なくとも１種の試薬を含む、ループス腎炎を診断するための組成物を提供する。ＲＡＧＥを検出するための試薬は、尿中ＲＡＧＥ濃度を測定し得るものであり、例えば、上記の抗ＲＡＧＥ抗体、ＲＡＧＥアプタマーまたはＲＡＧＥリガンド、特に抗ＲＡＧＥ抗体であり得る。ＲＡＧＥを検出するための試薬は、水または適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で提供され得る。当該組成物は、例えば、上記方法（Ａ）ないし（Ｄ）のいずれかにおいて使用し得る。
【００８０】
ある態様では、本願は、ＲＡＧＥを検出するための少なくとも１種の試薬または上記のループス腎炎を診断するための組成物を含む、ループス腎炎を診断するためキットを提供する。キットは、尿中ＲＡＧＥ濃度の測定に必要な他の成分や試薬、例えば、標識二次抗体、標識プローブ、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、希釈剤、ＥＬＩＳＡプレート、ブロッティング膜などをさらに含み得る。キットは、ＲＡＧＥ陽性または陰性の対照試料または対照試薬を含み得る。さらに、使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の構成要素を含み得る。
【００８１】
キットに含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水または適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、試験管、プレート、マルチウェルプレート、メンブレン等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチック、金属などの多様な材料から形成されていてよい。容器は、ラベルを有していてもよい。キットは、例えば、上記方法（Ａ）ないし（Ｄ）のいずれかにおいて使用し得る。
【００８２】
ある態様では、本願は、対象のループス腎炎を診断するための、ＲＡＧＥを検出するための試薬の使用を提供する。あるいは、本願は、対象のループス腎炎を診断するための医薬を製造するための、ＲＡＧＥを検出するための試薬の使用を提供する。ＲＡＧＥを検出するための試薬は、上記の抗ＲＡＧＥ抗体、ＲＡＧＥアプタマーまたはＲＡＧＥリガンド、特に抗ＲＡＧＥ抗体であり得る。
【００８３】
本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］ＲＡＧＥアプタマーを含む、ループス腎炎を処置または予防するための医薬組成物。
［２］ＲＡＧＥアプタマーが以下からなる群から選択される、第１項に記載の組成物：
（１）配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、一本鎖ＤＮＡ；
（２）配列番号１〜１０のいずれかの配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ；および、
（３）配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ。
［３］ＲＡＧＥアプタマーが、配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、第１項または第２項に記載の組成物。
［４］ＲＡＧＥアプタマーが、配列番号１〜１０のいずれかの配列からなる、第１項〜第３項のいずれかに記載の組成物。
［５］全身性エリテマトーデスの患者に投与するための、第１項〜第４項のいずれかに記載の組成物。
［６］ループス腎炎を処置するための、第１項〜第５項のいずれかに記載の組成物。
［７］ループス腎炎を予防するための、第１項〜第５項のいずれかに記載の組成物。
［８］全身性エリテマトーデスの患者に投与するための、ＲＡＧＥアプタマーを含む医薬組成物。
［９］対象から採取された尿におけるＲＡＧＥ濃度を測定することを含む、ループス腎炎の診断方法。
［１０］対象がループス腎炎に罹患しているか否かを判定するための、第９項に記載の方法。
［１１］ループス腎炎発症のリスクを判定するための、第９項に記載の方法。
［１２］対象のループス腎炎のＲＡＧＥアプタマーによる処置または予防の効果を予測するための、第９項に記載の方法。
［１３］対象のループス腎炎をモニタリングするための、第９項に記載の方法。
［１４］対象が全身性エリテマトーデスの患者である、第９項ないし第１３項のいずれかに記載の方法。
［１５］ＲＡＧＥを検出するための試薬を含む、ループス腎炎を診断するための組成物。
［１６］ＲＡＧＥを検出するための試薬が、抗ＲＡＧＥ抗体、ＲＡＧＥアプタマーまたはＲＡＧＥリガンドである、第１５項に記載の組成物。
［１７］ＲＡＧＥを検出するための試薬が抗ＲＡＧＥ抗体である、第１５項または第１６項に記載の組成物。
［１８］第１５項ないし第１７項のいずれかに記載の組成物を含む、ループス腎炎を診断するためのキット。
［１９］ループス腎炎のバイオマーカーとしてのＲＡＧＥの使用。
【００８４】
以下、実施例により本願の開示をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８５】
モデル動物
全身性エリテマトーデスのモデルであり、ループス腎炎を自然発症するＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ（ＭＲＬ／ｌｐｒ）マウスを使用した（The Jackson Laboratoryより購入）。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、通常、約１６週齢で免疫複合体による糸球体腎炎を発症し、２０週程度で約５０％が腎不全死へ至る（Arthritis Rheum. 2006 Jan;54(1):325-35）。対照として、Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスまたはＭＲＬ／ＭＰＪマウスを使用した。ＭＲＬ／ＭＰＪマウスは、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスとバックグラウンドが同じマウスであり、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの対照として汎用されている。
【００８６】
実験１：腎臓の過ヨウ素酸シッフ試薬染色
８、１２、１６および１８週齢の雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスから腎組織を採取し、糸球体、近位尿細管および遠位尿細管を、組織中の多糖類を染色する過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色した。結果を図１に示す。
【００８７】
実験２：糸球体および尿細管間質におけるＲＡＧＥ発現
８、１２、１６および１８週齢の雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスおよびＭＲＬ／ＭＰＪマウスから腎組織を採取し、糸球体および尿細管間質を蛍光抗体法にて染色した。１次抗体として抗ＲＡＧＥ抗体（金沢大学山本靖彦先生より供与）を、２次抗体としてAlexa Fluor 488 標識抗マウス抗体を使用した。蛍光強度を共焦点顕微鏡により測定し、ＲＡＧＥ陽性面積を測定し、対照の測定値を１として各測定値の相対値を算出した。結果を図２に示す。糸球体では時間依存的にＲＡＧＥ発現が増加した（図２Ａ）。尿細管では早期にＲＡＧＥ発現が増加し、それが維持された（図２Ｂ）。
【００８８】
実験３：尿細管におけるＲＡＧＥの局在
ＭＲＬ／ｌｐｒマウス尿細管のどの細胞でＲＡＧＥ発現が増加しているかを調べるために、８週齢雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスおよびＭＲＬ／ＭＰＪマウスの尿細管を抗ＲＡＧＥ抗体で免疫染色した。結果を図３に示す。また、ＲＡＧＥとＮＣＸ（遠位尿細管マーカー）を蛍光抗体法で二重染色した。１次抗体として抗ＲＡＧＥ抗体および抗ＮＣＸ抗体を、２次抗体として各々Alexa Fluor488およびAlexa Fluor標識抗体を使用した。ＲＡＧＥとＮＣＸは有意に共染色された。これは、ループス腎炎の早期に遠位尿細管でＲＡＧＥ発現が増加することを示す。
【００８９】
実験４：遠位尿細管におけるＲＡＧＥの細胞内局在
定常状態ではＲＡＧＥは主に細胞膜に局在するが、図３において、遠位尿細管のＲＡＧＥは細胞内で粒状に局在した。このＲＡＧＥの細胞内局在を調べた。蛍光抗体法によりＲＡＧＥと各種マーカーを共染色し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。ＲＡＧＥは晩期エンドサイトーシス膜表面蛋白であるＲａｂ７（上段）およびライソゾーム酵素であるカテプシンＤ（中段）と共染色された。しかしながら、オートファジー関連蛋白であるＬＣ３とは全く共染色されなかった（下段）。これらの結果は、ＲＡＧＥはオートファジーに関与せず、エンドサイトーシスおよびライソゾームでの蛋白分解に関与することを示唆する。
【００９０】
実験５：糸球体におけるＲＡＧＥの局在
ＭＲＬ／ｌｐｒマウス糸球体におけるＲＡＧＥの過剰発現の部位を調べた。１８週齢雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの糸球体において、蛍光抗体法によりＲＡＧＥと各種マーカーを共染色し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。ＲＡＥＧは血管内皮細胞マーカーであるＣＤ３４と共染色された（上段）。ポドサイト（糸球体上皮細胞）のマーカーであり、細胞質に局在するＷＴ１とは共染色されず、その周囲にＲＡＧＥが見られた（下段）。ポドサイトではＲＡＧＥが主に細胞膜に局在する（定常状態である）ことが示された。
【００９１】
実験６：尿中ＲＡＧＥ排泄量
８、１２、１４、１６および１８週齢雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ｎ＝５）および９週齢ＭＲＬ／ＭＰＪマウス（ｎ＝５）（対照）の尿を採取し、尿中ＲＡＧＥ排泄量をＥＬＩＳＡにより測定した。対照の尿中ＲＡＧＥ排泄量を１として、尿中ＲＡＧＥ排泄量を相対的に比較した。尿蛋白量を尿中クレアチニン補正により測定した。結果を図６に示す。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスでは８週齢から尿中ＲＡＧＥ排泄量が増加していた（図６上）。尿蛋白量には全研究期間内で有意差はなかった（図６下）。これらの結果は、ＳＬＥマウスでは尿中ＲＡＧＥ濃度が高いことを示す。
【００９２】
実験７：尿中ＲＡＧＥ排泄量と尿中ＮＡＧ排泄量の相関
実験６と同じサンプルを用いて、尿中ＲＡＧＥ排泄量と、尿細管障害マーカーである尿中ＮＡＧ（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ）排泄量との関連性を調べた。尿中ＮＡＧ排泄量の測定は株式会社ＳＲＬに委託し、ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡ法にて実施した。結果を図７に示す。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの尿中ＮＡＧ排泄量は１８週齢で増加した（図７上）。すべての週齢のサンプルについて、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの尿中ＮＡＧ排泄量（ＮＡＧ／Ｃｒｅ比）を横軸に、尿中ＲＡＧＥ排泄量（ＲＡＧＥ／Ｃｒｅ比）を縦軸にプロットすると、強い正の相関関係が見られた（図７下）。これらの結果は、腎炎の進行に伴って、尿中ＲＡＧＥ排泄量が増加することを示す。
【００９３】
ＲＡＧＥアプタマーの投与とサンプル採取
下記のＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ−ａｐｔ）およびコントロールアプタマー（Ｃｔｒ−ａｐｔ）を使用した。
【表２】
2018150272.tif 000004
８週齢雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスを２群に分け、ＲＡＧＥアプタマー（ｎ＝６）またはコントロールアプタマー（ｎ＝９）を、浸透圧ポンプを用いて皮下持続投与した（２.０×１０−４μｇ／日）。８、１２、１６および１８週齢で尿と血液を採取した。１８週齢で屠殺し、腎臓、肝臓、脾臓および肺を採取した。以下の実験では、これらのサンプルを使用した。
【００９４】
実験８：ループス腎炎に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
１８週齢のサンプルの血中尿素窒素（ＢＵＮ）をＵＶ法にて測定した。腎組織のマッソントリクローム染色（免疫複合体の沈着が赤く染まる染色）を行い、糸球体における染色陽性の面積を測定した。１８週齢サンプルの血中の抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体をＥＬＩＳＡ法（レビス）により測定した。１８週齢サンプルの血中ＩｇＧ濃度をＣＬＥＩＡにより測定した。１８週齢サンプルの血中Ｃ３濃度を免疫比濁法により測定した。１８週齢サンプルの血中Ｎａ濃度を電極法により測定した。１８週齢のサンプルの尿アルブミン排泄量を免疫比濁法により測定した。結果を図８および下表に示す。
【００９５】
【表３】
2018150272.tif 000005
データは平均±ＳＥＭである。
*は、P < 0.05 vs. MRL/MPJを示す。#は、P < 0.05 vs. MRL/lpr + Ctrl-aptを示す。
**は、P=0.051 vs. MRL/MPJを示す。##は、P=0.055 vs. MRL/lpr + Ctrl-aptを示す。
略号；
ＢＰ：血圧、ＨＲ：心拍数、ＫＷ：腎臓重量、ＢＷ：体重、ＢＵＮ：血中尿素窒素、ＵＡＥ：尿アルブミン排泄量
【００９６】
ＲＡＧＥアプタマー投与群では、ＢＵＮが低かった。これは、ＲＡＧＥアプタマーの投与により腎機能低下が抑制されたことを示す。腎組織のマッソントリクローム染色は、ＲＡＧＥアプタマー投与により糸球体における免疫複合体の沈着が抑制されたことを示す（図８、上段）。また、ＲＡＧＥアプタマーを投与されたマウスでは、Ｂ細胞から産生される免疫グロブリンの中で最も自己免疫性疾患に関与するＩｇＧの濃度が低かった。さらに、ＲＡＧＥアプタマー投与群では、血中Ｃ３濃度が高かった。ループス腎炎活動期には低下する補体成分Ｃ３がＲＡＧＥアプタマー投与にて改善することから、炎症が軽減したことによりＣ３の消費が抑えられループス腎炎の活動性が抑制されたことを示唆する結果である。
【００９７】
実験９：ＲＡＧＥ発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
腎組織に存在するＲＡＧＥの量をウェスタンブロッティング法にて解析した。また、腎組織からｍＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて腎組織におけるＲＡＧＥ発現量を測定した。結果を図９に示す。ウェスタンブロッティング法では、ＲＡＧＥアプタマー投与群と対照群で、ＲＡＧＥの量に有意差は見られなかった（上段）。一方、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定したＲＡＧＥ発現量は、ＲＡＧＥアプタマー投与群で有意に低かった（下段）。この結果は、ＲＡＧＥアプタマー投与群において腎臓におけるＲＡＧＥの発現が抑制されたことを示す。ウェスタンブロッティング法では、血流由来のＲＡＧＥもサンプルに含まれるため、有意差が見られなかったと考えられる。
【００９８】
実験１０：ＲＡＧＥアプタマーによるＨＭＧＢ１沈着の抑制
ＨＭＧＢ１は、ＳＬＥに関連するＲＡＧＥリガンドの代表格である。腎組織におけるＨＭＧＢ１の沈着の程度を、免疫染色にて解析した。腎組織全体のＨＭＧＢ１含有量をウェスタンブロッティング法にて解析した。血漿中ＨＭＧＢ１量をＥＬＩＳＡにて測定した。結果を図１０に示す。ＲＡＧＥアプタマー投与群と対照群で、腎組織全体（９割は尿細管）のＨＭＧＢ１含有量（上段、右）および血漿中ＨＭＧＢ１量（下段）に有意差は見られなかったものの、糸球体においてＨＭＧＢ１の沈着が抑制された（上段、左）。つまりＲＡＧＥリガンドであるＨＭＧＢ１を細胞内へ取り込む役割を担っていると考えられるＲＡＧＥを阻害することで組織への沈着は抑制されるが、流血中や尿中へ存在するＨＭＧＢ１の量は変わらないために腎臓および血中のＨＭＧＢ１濃度は変わらなかったと考えられる。
【００９９】
実験１１：炎症性サイトカインの発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
腎臓、肝臓、脾臓および肺組織からｍＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて炎症性サイトカインであるＩＬ−６およびＴＮＦαの発現量を測定した。また、炎症性サイトカインであるＭＣＰ−１について、腎臓における発現量を測定した。結果を図１１〜１３に示す。興味深いことに、ＲＡＧＥアプタマー投与群のＩＬ−６およびＴＮＦａのｍＲＮＡ量は、腎臓のみで約１／１０まで低下し、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡ量は、腎臓で有意に低下していた。この結果から、ＲＡＧＥが腎臓において特有の役割を有すること、および、ＲＡＧＥの阻害により炎症が抑制され、腎保護効果がもたらされることが示唆される。
【０１００】
実験１２：Ｋｉｍ１の発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
急性腎障害マーカーでありアポトーシスに関与するＫｉｍ１の発現を、腎皮質免疫染色により解析した。結果を図１４に示す。ＲＡＧＥアプタマー投与群では、対照群と比較して、明らかにＫｉｍ１発現が低かった。一般的に、炎症プロセスでアポトーシスへ誘導された腎臓の細胞（血管内皮細胞、尿細管細胞）はＫｉｍ１を発現し、Ｔ細胞による貪食を受ける。上記のＲＡＧＥアプタマーの投与による腎組織における炎症性サイトカイン発現の低下を考慮すると、ＲＡＧＥアプタマーにより炎症プロセスが抑制され、Ｋｉｍ１の発現も抑制されたと考えられる。
【０１０１】
実験１３：糸球体病変に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
糸球体病変に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を調べた。糸球体における半月体の形成を、ＰＡＳ染色にて観察した。糸球体におけるワイヤーループ病変の形成を、マッソントリクローム染色にて観察した。マクロファージマーカーである抗ＣＤ６８抗体および抗ＲＡＧＥ抗体を用いる蛍光抗体法により、糸球体におけるマクロファージの浸潤を観察した。結果を図１５〜１７に示す。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて、ＲＡＧＥアプタマーの投与は、半月体形成および糸球体内皮細胞の腫大を抑制し（図１５）、ワイヤーループ病変の形成を減少させた（図１６）。また、コントロールアプタマーを投与したマウスの糸球体では、マクロファージの浸潤が見られ、ＲＡＧＥと共局在していたが、ＲＡＧＥアプタマーを投与されたマウスの糸球体ではマクロファージの浸潤は有意に少なく、ＲＡＧＥとの共局在は見られなかった（図１７）。このことは、ＲＡＧＥアプタマーにより、糸球体内へのマクロファージの浸潤が抑制されたことを示唆する。
【０１０２】
考察
自然発症ＳＬＥのモデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、生後２４週前後で約５０％が腎炎に起因する腎不全で死亡することが報告されている。上記の実験により、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの腎組織において、週齢を追ってＲＡＧＥの発現が増加することが明らかとなった。また尿中のＲＡＧＥも、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスで対照マウスと比較して有意に増加し、尿中の尿細管障害マーカーであるＮＡＧ／Ｃｒｅ比とＲＡＧＥ／Ｃｒｅ比に強い相関関係が認められた。
【０１０３】
以上の結果から、ＳＬＥマウスにおいて、比較的早期からＲＡＧＥ発現が増加し、ループス腎炎の病態進展に伴って増加することが判明した。従って、尿中のＲＡＧＥをループス腎炎の病態進展のバイオマーカーとして使用できる。
【０１０４】
また、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにＲＡＧＥアプタマーを投与したところ、腎機能の増悪が抑制されただけでなく、半月体形成および糸球体内皮細胞の腫大が抑制され、ワイヤーループ病変の形成が減少した。ワイヤーループ病変や半月体形成は、特にびまん性ループス腎炎で見られる現象である。また糸球体内へのマクロファージの浸潤が抑制されたことから、糸球体内の細胞に２本鎖ＤＮＡやＲＮＡなど抗原抗体反応を惹起させる分子が取り込まれておらず、糸球体における免疫細胞の活性化が抑制されていると考えられる。また腎組織における炎症性サイトカインＩＬ−６、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１ｍＲＮＡレベルが１／１０程度まで抑制されたことから、ＲＡＧＥアプタマーにより腎臓において炎症および免疫惹起因子が抑制され、それにより腎機能が保持されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
アプタマーは核酸を本体とする次世代分子標的薬であり、一般的に免疫原性が低い。上記ＲＡＧＥアプタマーのＲＡＧＥに対する親和性は高いため、少ない投与量で効力を発揮し得る。また、大量生産が可能であり、ロット間の差異が少ないので、生産コストが低い。従って、上記ＲＡＧＥアプタマーは、医薬として好適に製造および使用し得る。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号１：アプタマー
配列番号２：アプタマー
配列番号３：アプタマー
配列番号４：アプタマー
配列番号５：アプタマー
配列番号６：アプタマー
配列番号７：アプタマー
配列番号８：アプタマー
配列番号９：アプタマー
配列番号１０：アプタマー
配列番号１１：アプタマー
【図１】
2018150272.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2018150272.tif 000008
【図３】
2018150272.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018150272.tif 000014
【図９】
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【図１０】
2018150272.tif 000016
【図１１】
2018150272.tif 000017
【図１２】
2018150272.tif 000018
【図１３】
2018150272.tif 000019
【図１４】
2018150272.tif 000020
【図１５】
2018150272.tif 000021
【図１６】
2018150272.tif 000022
【図１７】
2018150272.tif 000023
【配列表】
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