(57)【要約】【課題】重症の血友病患者の血液検体と、凝固因子に対する抗体が出現している血友病患者の血液検体とを、高精度で判定可能な、血友病の重症度の判定方法を提供することを課題とする。【解決手段】血液検体を凝固させて凝固波形を取得する工程、前記凝固波形から、凝固速度の平均変化率を取得する工程、および、前記凝固速度の平均変化率に基づいて、前記血液検体の血友病の重症度を判定する工程を含む、血友病の重症度の判定方法によって上記の課題を解決する。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液検体を凝固させて凝固波形を取得する工程、
前記凝固波形から、凝固速度の平均変化率を取得する工程、および、
前記凝固速度の平均変化率に基づいて、前記血液検体の血友病の重症度を判定する工程を含む、血友病の重症度の判定方法。
【請求項２】
前記凝固速度の平均変化率は、前記凝固波形を微分して得られた速度の波形に基づいて算出される、請求項１に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項３】
前記凝固速度の平均変化率は、前記速度の波形上の２点を結んだ直線の傾きの大きさである、請求項２に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項４】
前記凝固速度の平均変化率は、最大凝固速度(|min1|)および凝固速度が最大となるまでの時間(time to |min1|)を用いて算出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項５】
前記凝固速度の平均変化率は、凝固加速度が最大となるまでの時間(time to |min2|)をさらに用いて算出される、請求項４に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項６】
前記凝固速度の平均変化率は、以下の式１により算出される、請求項５に記載の血友病の重症度の判定方法。
(1/2×|min1|)/(time to |min1| - time to |min2|)・・・  式１
【請求項７】
前記凝固加速度が最大となるまでの時間は、凝固速度が最大となる前であって最大凝固速度の1/2となるまでの時間である、請求項５又は６に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項８】
前記凝固速度の平均変化率が基準値以下である場合に、前記血液検体には凝固因子に対する抗体が出現している虞が高いと判定する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項９】
前記血液検体は、VS-HA患者の疑いのある患者由来の血液検体であり、
前記凝固速度の平均変化率が基準値以下である場合に、前記血液検体には凝固因子に対する抗体が出現している虞が高いと判定し、前記凝固速度の平均変化率が基準値を超える場合に、前記血液検体はVS-HA患者の虞が高くないと判定する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項１０】
前記血友病の重症度は、血友病Ａの重症度である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項１１】
前記凝固波形は、前記血液検体に凝固時間測定用試薬を接触させて測定試料を調製し、前記測定試料に光を照射して得られる光学的情報に基づいて取得される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項１２】
前記凝固時間測定用試薬は、活性化部分トロンボプラスチン時間を測定するための試薬である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項１３】
前記光学的情報は、光の透過度、散乱光量又は吸光度である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の血友病の重症度の判定方法。
【請求項１４】
血液検体と凝固時間測定用試薬とを含む測定試料を調製する測定試料調製部と、
調製された測定試料から凝固波形を取得する情報取得部と、
制御部と
を備え、
前記制御部が、
血液検体と、凝固時間測定用試薬とから測定試料を調製するように前記測定試料調製部を制御し、
前記凝固波形に基づいて、凝固速度の平均変化率を取得し、
前記凝固速度の平均変化率に基づいて、血友病の重症度に関する情報を出力する、血液検体分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血友病の重症度の判定方法及び血液検体分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、凝固第VIII因子(FVIII)又は凝固第IX因子(FIX)の先天的欠損又は機能不全に起因する出血性疾患である。FVIIIが原因である場合は血友病Ａと呼ばれ、FIXが原因である場合は血友病Ｂと呼ばれる。血友病患者においては、関節内、筋肉内などの深部組織に出血症状が見られ、重篤な例では頭蓋内出血も生じる。
【０００３】
血友病の重症度は、血液中のFVIII活性又はFIX活性に基づいて分類される。具体的には、健常者のFVIII活性又はFIX活性を100％として、活性が１％未満の患者を重症に、活性が１％以上５％未満の患者を中等症に、活性が５％以上40％未満の患者を軽症に分類する。重症血友病患者は、中等症及び軽症の患者に比べて顕著に高い頻度で出血症状を呈するが、近年、重症血友病患者の中でも特にFVIII活性が低い患者(0.2％未満；Very-Severe Haemophilia A；VS-HA)と、そうでない患者(0.2％以上１％未満；Modestly-Severe Haemophilia A；MS-HA)では、臨床的な重症度や後述するインヒビターの発生確率に差があることが分かってきている。
【０００４】
重症血友病患者の出血症状を予防するために、患者に凝固因子製剤を投与する補充療法が有用である。しかしながら、血友病Ａ患者の10〜15％、血友病Ｂ患者の１〜３％に、このような凝固因子に対する抗体(インヒビター)が発生することがある。インヒビター値が5 BU (ベセスダ単位)未満の患者では、インヒビターが一過性で消失することもあるが、インヒビター値が5 BU以上の患者では、インヒビターが血中に存在し続ける傾向がある。このような患者に対しては、凝固因子製剤での止血管理が困難となるため、免疫寛容療法やバイパス製剤投与に切り替えるなど、治療方針の変更を余儀なくされる。さらに、インヒビターが発生した患者はVS-HA患者よりも重症となりうる。したがって、適切な治療方針を選択するという観点から、インヒビターの出現を早期に、高精度で検出することが重要である。
【０００５】
血液検査によって、このようなインヒビターの有無を調べる方法が知られている。例えば、非特許文献１には、中等症の血友病Ａ患者の血漿検体（Moderate type HA、2.1±0.9IU/dl）と、抗体が出現している血友病Ａ患者の血漿検体（Type 2）とを、凝固曲線の一次微分曲線の最小値min1 (|min1|：最大絶対値)を用いて識別することが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Matsumoto et al., A putative inhibitory mechanism in the tenase complex responsible for loss of coagulation function in acquired haemophilia A patients with anti-C2 autoantibodies, Thorombosis and Haemostasis 107.2/2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、VS-HA患者の血液検体などの重症の血友病患者の血液検体と、VS-HA患者より重症となる凝固因子に対する抗体が出現している血友病患者の血液検体とを、高精度で判定可能な、血友病の重症度の判定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、血液検体を凝固させて凝固波形を取得する工程、前記凝固波形から、凝固速度の平均変化率を取得する工程、および、前記凝固速度の平均変化率に基づいて、前記血液検体の血友病の重症度に関する情報を取得する工程を含む、血友病の重症度の判定方法が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、血液検体と凝固時間測定用試薬とを含む測定試料を調製する測定試料調製部と、調製された測定試料から凝固波形を取得する情報取得部と、制御部とを備え、前記制御部が、血液検体と、凝固時間測定用試薬とから測定試料を調製するように前記測定試料調製部を制御し、前記凝固波形に基づいて、凝固速度の平均変化率を取得し、前記凝固速度の平均変化率に基づいて、血友病の重症度に関する情報を出力する、血液検体分析装置が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
重症の血友病患者、特にVS-HA患者の血液検体と、VS-HA患者より重症となる凝固因子に対する抗体が出現している血友病患者の血液検体とを、高精度で判定可能な、血友病の重症度の判定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】正常血漿検体についての透過度を測定して得られる凝固波形の一例である。
【図１Ｂ】図１Ａの凝固波形を１次微分して得られる速度の波形の一例である。
【図２】凝固波形を２次微分して得られる凝固加速度の波形の一例である。
【図３】本実施形態の方法で可能な近似の一例である。
【図４】血液検体分析装置の外観の構成を示す斜視図である。
【図５】血液検体分析装置の測定部の内部を上側から見た場合の平面図である。
【図６】血液検体分析装置の測定部の構成を示す図である。
【図７】測定装置が備えるランプユニットの構成を示す図である。
【図８Ａ】測定装置が備える検出部の構成を示す図である。
【図８Ｂ】測定装置が備える検出部の構成を示す図である。
【図８Ｃ】測定装置が備える検出部の構成を示す図である。
【図８Ｄ】測定装置が備える検出部の構成を示す図である。
【図９】血液検体分析装置の制御装置の機能構成を示す図である。
【図１０】血液検体分析装置の制御装置のハードウェア構成を示す図である。
【図１１】血液検体分析装置による血液検体の測定処理を示すフローチャートである。
【図１２】血液検体分析装置による血液検体の分析処理を示すフローチャートである。
【図１３】血液検体分析装置による分析結果を表示する画面の一例を示す図である。
【図１４】本実施形態のパラメータを用いる鑑別の結果を示す図である。
【図１５】従来のパラメータを用いる鑑別の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
血友病の重症度の判定方法は、血液検体を凝固させて凝固波形を取得する工程を含む。
血液検体としては全血及び血漿が挙げられるが、好ましくは血漿である。血液検体は、VS-HA患者の疑いのある患者由来の血液検体であることが好ましい。血液検体には、凝固検査に通常用いられる公知の抗凝固剤が添加されていてもよい。そのような抗凝固剤としては、例えばクエン酸３ナトリウムが挙げられる。測定試料の調製前に、あらかじめ血液検体を凝固反応に適した温度(例えば36℃以上38℃以下)まで加温してもよい。
【００１３】
血液検体の凝固方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、血液検体に凝固時間測定用試薬を接触させて測定試料を調製し、前記測定試料中で血液検体を凝固させることによって行うことができる。
【００１４】
凝固時間測定用試薬は、当該技術において公知の測定原理に基づく凝固時間を測定するための試薬であればよい。例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間、希釈プロトロンビン時間、希釈活性化部分トロンボプラスチン時間、カオリン凝固時間、希釈ラッセル蛇毒時間、トロンビン時間、及び希釈トロンビン時間の少なくとも１種を測定するための試薬が挙げられる。凝固時間測定用試薬は、好ましくは、活性化部分トロンボプラスチン時間を測定するための試薬である。市販の凝固時間測定用試薬及び試薬キットを用いてもよい。
【００１５】
凝固時間測定用試薬は、凝固系の活性化剤を含むことが好ましい。凝固系の活性化剤は、凝固系に関与するいずれかの凝固因子を活性化する物質であればよい。凝固系の活性化剤としては、例えば、エラグ酸、シリカ、カオリン、セライト、組織因子、トロンビン及び蛇毒などが挙げられる。エラグ酸は、金属イオンとキレートを形成した状態にあってもよい。組織因子は、ウサギ脳又はヒト胎盤由来の組織因子であってもよいし、組み換え型組織因子であってもよい。蛇毒としては、ラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒などが挙げられる。これらの凝固系の活性化剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。通常、市販の凝固時間測定用試薬及び試薬キットには、測定する凝固時間の種類に応じて、いずれかの凝固系の活性化剤が含まれている。
【００１６】
測定試料中の凝固系の活性化剤の終濃度は、凝固系の活性化剤の種類に応じて適宜決定できる。凝固系の活性化剤がエラグ酸である場合、測定試料中のエラグ酸の終濃度は、通常3.5μM以上150μM以下、好ましくは10μM以上50μM以下である。凝固系の活性化剤が組織因子である場合、測定試料中の組織因子の終濃度は、通常0.4μg/mL以上0.7μg/mL以下、好ましくは0.5μg/mL以上0.6μg/mL以下である。
【００１７】
リン脂質は凝固反応を促進するので、凝固時間測定用試薬はリン脂質をさらに含んでいてもよい。リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリン(PC)及びホスファチジルセリン(PS)が挙げられる。本実施形態では、凝固時間測定用試薬に、PE、PC及びPSから選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは全種のリン脂質を添加できる。リン脂質は、天然由来リン脂質であってもよいし、合成リン脂質であってもよい。それらの中でも、合成リン脂質又は純度99％以上に精製された天然由来リン脂質が好ましい。PE、PC及びPSの脂肪酸側鎖は特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸などが挙げられる。それらの中でもオレイン酸が好ましい。本実施形態では、リン脂質は、適切な溶媒に溶解された液体の形態にあることが好ましい。
【００１８】
測定試料中のリン脂質の終濃度は、リン脂質の種類に応じて適宜決定できる。リン脂質がPEである場合、測定試料中のリン脂質の終濃度は、通常１μg/mL以上150μg/mL以下、好ましくは５μg/mL以上50μg/mL以下である。リン脂質がPCである場合、測定試料中のリン脂質の終濃度は、通常１μg/mL以上100μg/mL以下、好ましくは５μg/mL以上80μg/mL以下である。リン脂質がPSである場合、測定試料中のリン脂質の終濃度は、通常0.1μg/mL以上50μg/mL以下、好ましくは１μg/mL以上10μg/mL以下である。２種類以上のリン脂質を用いる場合は、測定試料における各リン脂質の濃度の合計が、通常５μg/mL以上400μg/mL以下、好ましくは20μg/mL以上100μg/mL以下であればよい。
【００１９】
凝固時間測定用試薬は、好ましくは、リン脂質及び凝固系の活性化剤を含む。リン脂質及び凝固系の活性化剤を含む凝固時間測定用試薬としては、例えば活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)測定用試薬が挙げられる。この場合、凝固系の活性化剤は、内因系凝固経路の接触因子を活性化する物質が好ましく、例えば、エラグ酸、シリカ、カオリン及びセライトが挙げられる。
【００２０】
カルシウムイオンは、測定試料中で血液凝固を開始させるために必要となる。本実施形態では、カルシウムイオンを含む水溶液を測定試料の調製に用いることにより、測定試料にカルシウムイオンが提供される。カルシウムイオンを含む水溶液としては、カルシウム塩の水溶液が好ましく、例えば、塩化カルシウム水溶液、乳酸カルシウム水溶液などが挙げられる。測定試料中のカルシウムイオン含有量は、凝固を生じさせるのに十分な量であればよく、例えば、塩化カルシウムの濃度で表して、通常２mM以上20 mM以下、好ましくは４mM以上10 mM以下である。以下、カルシウムイオンを含む水溶液を「カルシウム溶液」とも呼ぶ。
【００２１】
カルシウム溶液を添加すると凝固が開始するので、測定試料の調製においては、カルシウム溶液は最後に添加することが好ましい。測定試料の調製手順は、次のとおりである。まず、血液検体と凝固時間測定用試薬とを混合し、次に、得られた混合物とカルシウム溶液とを混合することにより調製できる。あるいは、まず、血液検体と凝固時間測定用試薬とを混合し、次に、得られた混合物とカルシウム溶液とを混合することにより、測定試料を調製してもよい。市販のプロトロンビン時間(PT)測定用試薬を用いる場合、該試薬は組織因子及びカルシウムイオンを含むので、血液検体とPT測定用試薬とを混合することにより測定試料を調製できる。いずれの手順により測定試料を調製するかは、用いる凝固時間測定用試薬に応じて決定すればよい。
【００２２】
本実施形態では、カルシウム溶液の添加前に、上記の混合物を凝固反応に適した条件下でインキュベートしてもよい。例えば、35℃以上40℃以下の温度にて２分以上５分以下の時間でインキュベートする条件が挙げられる。測定試料の調製は、用手法で行ってもよいし、全自動測定装置により行ってもよい。そのような装置としては、例えば、全自動血液凝固測定装置のCSシリーズ(シスメックス株式会社)などが挙げられる。
【００２３】
リン脂質及び凝固系の活性化剤を含む凝固時間測定用試薬を用いる場合は、次のようにして、測定試料を調製することが好ましい。まず、血液検体と、リン脂質及び凝固系の活性化剤を含む凝固時間測定用試薬とを混合する。次に、得られた混合物と、カルシウム溶液とを混合する。
【００２４】
本実施形態の方法では、凝固波形は、上記のようにして調製した測定試料を用いて取得する。凝固波形とは、血液検体の凝固の進行に伴って生じる該血液検体の光学的特性等の経時的変化を表す波形である。本実施形態において、凝固波形は、光学的測定法により取得してもよい。光学的測定法としては、例えば、測定試料に光を照射して透過度などの光学的情報を取得する方法が挙げられる。測定は、全自動測定装置により行ってもよい。例えば、全自動血液凝固測定装置のCSシリーズ(シスメックス株式会社)は透過度などの光学的情報を測定できる。
【００２５】
光学的情報の取得は、始点から凝固の完了時までの間、連続的又は断続的に行う。凝固の過程において連続的又は断続的に測定された光学的情報に基づけば、該過程の任意の時点又は時間において、後述の凝固波形の微分に関するパラメータを取得することが可能となる。ここで、始点とは、後述する凝固速度の平均変化率を取得するために、凝固波形を構成する各プロットのデータを取得し始める時点をいう。始点は、凝固速度の平均変化率の取得に支障がない限り特に限定されないが、凝固速度が最大となる時点より前に設定されることが好ましい。例えば、始点は、凝固時間の測定開始点(図１Ａ及びＢにおけるａ点)若しくは凝固の開始点(図１Ａ及びＢにおけるｂ点)又はその時点を示す数値に任意の係数を加算又は減算することにより得られる数値が示す時点に設定され、好ましくは凝固時間の測定開始点に設定される。
【００２６】
測定時間は、通常５秒以上１８００秒以下、好ましくは１０秒以上６００秒以下の範囲から決定すればよい。なお、本実施形態の方法では、正常血漿(健常者から得た血漿)を血液検体として用いた場合、通常、測定試料の調製時から３０秒以内に凝固が完了する。
【００２７】
凝固波形は、測定試料に光を照射して得られる光学的情報から取得されることが好ましい。そのような光学的情報としては、例えば、連続的又は断続的に測定された散乱光量、透過度及び吸光度などが挙げられる。この場合、凝固波形は、散乱光量、透過度又は吸光度の経時的変化を表す波形である。測定試料に照射する光は、凝固時間の測定に通常用いられる光であればよく、例えば、波長が660 nm近傍、好ましくは660 nmの光が挙げられる。光源は特に限定されないが、例えば、発光ダイオード、ハロゲンランプなどが挙げられる。また、本実施形態で取得される凝固波形には、凝固波形の曲線自体、および凝固波形を構成する各プロットのデータが含まれる。凝固波形を構成する各プロットのデータとしては、始点からの時間及びその時点における測定試料の光学的特定の測定値が挙げられる。
【００２８】
ここで、図１Ａを参照して、本実施形態の方法で得られる凝固波形の一例について説明する。図１Ａに示される凝固波形において、ａ点は凝固時間の測定開始点であり、ｂ点はフィブリン析出点(凝固の開始点)であり、ｃ点は凝固の終点である。一般的な凝固時間測定法では、フィブリンが析出するまでの時間を凝固時間としている。図１Ａでは、ａ-ｂ間の時間が凝固時間を表す。凝固時間測定用試薬の作用により凝固が進行するので、図１Ａのａからｃに示されるように、測定試料の透過度は低下する。
【００２９】
血友病の重症度の判定方法は、凝固波形から、凝固速度の平均変化率を取得する工程を含む。
凝固速度の平均変化率は、始点からの時間に対する凝固速度の平均変化率を反映すれば特に制限されない。例えば、凝固速度の平均変化率は、凝固速度の平均変化率を反映する近似値であってもよい。本実施形態では、凝固波形の微分によって得られる曲線や微分に関するパラメータ等を取得し、それらを用いて、凝固速度の平均変化率を取得する。
【００３０】
凝固波形の微分によって得られる曲線は、凝固波形を１次微分することによって得られる１次微分曲線(速度の波形)であることが好ましい。ここで、図１Ｂを参照して、速度の波形について説明する。図１Ａの凝固波形を１次微分すると、図１Ｂに示される凝固の速度を示す波形が得られる。図１Ｂでは、凝固速度(ａ-ｃ間の速度)が正の値となるように波形が表示されているが、凝固の速度が負の値となるように表示してもよい。すなわち、縦軸の正負が図１Ｂとは反転した波形を取得してもよい。図１Ｂのａ点〜ｃ点はそれぞれ図１Ａのａ点〜ｃ点に対応する。図１Ｂにおいて、凝固の終点であるｃ点は、上昇した速度が０となる点である。
【００３１】
凝固波形の微分によって得られる曲線は、凝固波形を２回微分することによって得られる２次微分曲線でないことが好ましい。なぜなら、２次微分曲線にはノイズが入りやすく、不均一な波形を示し得るため(例えば図２)、凝固因子の微量定量において、正確な情報が得られないことがあるからである。凝固波形を３回以上微分することによって得られる曲線についても同様に、ノイズが入りやすくなると推測される。したがって、凝固波形の微分によって得られる曲線は、１次微分曲線であることが特に好ましい。
【００３２】
凝固波形の微分に関するパラメータは、凝固波形を少なくとも１回微分することによって得られる、凝固速度などの少なくとも１つを示す値であれば、特に限定されない。凝固波形の微分に関するパラメータとしては、例えば、凝固速度(凝固波形の傾き)、最大凝固速度(凝固波形の傾きの最大値)(|min1|)、凝固速度が最大となるまでの時間(time to |min1|)、凝固速度が最大のa倍(ここで、0<a<1)となるまでの時間(time to a×|min1|)、凝固波形の平均変化率、凝固加速度(速度の波形の傾き)が最大となるまでの時間(time to |min2|)、凝固加速度が最大のa倍(ここで、0<a<1)となるまでの時間(time to a×|min2|)又はそれらの近似値等が挙げられる。凝固波形の微分に関するパラメータの数は１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。また、凝固波形の微分に関するパラメータは、２つ以上のパラメータを組み合わせて得られる値であってもよく、例えば、上記で例示したパラメータの少なくとも２つの和、差、積、比などが挙げられる。
【００３３】
凝固速度の平均変化率は、凝固波形を微分して得られた速度の波形に基づいて算出される。凝固速度の平均変化率としては、例えば、速度の波形上の２点を結んだ直線の傾きの大きさが挙げられる。速度の波形上の２点は、速度の波形上の任意の点及びそれに近い周辺の点から選択される。この２点は、いずれも、速度の波形上の任意の点を(時間, 凝固速度)＝(x, f(x))で表して、(0, f(0))〜(time to |min1|, |min1|)の範囲内から選択されることが好ましい。ここで、時間x = 0は、始点である。凝固速度の平均変化率は、より好ましくは、点(time to |min1|, |min1|)と、点(time to |min2|, f(time to |min2|))とを結んだ直線の傾きの大きさが挙げられる。なお、time to |min1|、f(time to |min1|)、time to |min2|、およびf(time to |min2|)はそれぞれ、それらの近似値を用いることができる。ここで、f(time to |min2|)は、1/2×|min1|と近似することができるため、f(time to |min2|)として、1/2×|min1|を用いることができる。また、凝固速度が1/2×|min1|となるまでの時間(time to 1/2×|min1|)は、time to |min2|と近似することができる。そのため、点(time to |min2|, f(time to |min2|))としては、例えば、点（time to |min2|, 1/2×|min1|）、点（time to 1/2×|min1|, 1/2×|min1|）等を用いることができる。
【００３４】
ここで、図３を参照して、本実施形態の方法で可能な近似の一例について詳しく説明する。図３左下図の波形は、健常人の血液検体に由来する速度の波形であり、図３右上図は、血友病Ａ患者に由来する速度の波形である。これらの図において、ａの破線は点(time to |min1|, 0)を通る縦軸に平行な直線を表し、その直線と速度の波形との交点が、点(time to |min1|, |min1|)に相当する。一方、ｂの破線は点(time to |min2|, 0)を通る縦軸に平行な直線を表し、その直線と速度の波形との交点が、点(time to |min2|, f(time to |min2|))に相当する。ここで、f(time to |min2|)は1/2×|min1|で近似できるため、凝固速度の平均変化率は、点(time to |min1|, |min1|)と点(time to |min2|, 1/2×|min1|)との２点を結んだ直線の傾きの大きさとして算出される。図３に示された三角形は、このような近似の概念図である。
図３に示されていないが、重症血友病患者、特にMS-HA患者及びVS-HA患者並びに抗体が出現している血友病患者(HA-inh)についても同様、上記の近似が可能である。
【００３５】
別の観点では、凝固速度の平均変化率は、好ましくは、最大凝固速度(|min1|)および凝固速度が最大となるまでの時間(time to |min1|)を用いて算出され、より好ましくは、凝固加速度が最大となるまでの時間(time to |min2|)をさらに用いて算出される。
【００３６】
特に好ましい実施形態では、凝固速度の平均変化率は、以下の式１により算出される。
［数１］
(1/2×|min1|)/(time to |min1| - time to |min2|)・・・  式１
【００３７】
上記の式１を用いれば、微分に関するパラメータのうち簡便に取得できるものだけを用いて、凝固速度の平均変化率を算出できる。これは、重症血友病患者、抗体が出現している血友病患者及び健常人の血液検体を用いて取得した、凝固速度の平均変化率を算出する際に、凝固速度が1/2×|min1|となるまでの時間(time to 1/2×|min1|)を、time to |min2|で近似できることを本発明者らが経験的に見出したことに基づく。このような観点でみれば、本実施形態の方法では、凝固加速度が最大となるまでの時間は、凝固速度が最大となる前であって最大凝固速度の1/2となるまでの時間であるともいえる。
【００３８】
血友病の重症度の判定方法は、凝固速度の平均変化率に基づいて、血液検体の血友病の重症度を判定する工程を含む。
血友病は、血友病Ａ又は血友病Ｂのいずれであってもよいが、好ましくは血友病Ａである。
【００３９】
本実施形態では、凝固速度の平均変化率が基準値以下である場合に、血液検体には凝固因子に対する抗体が出現している虞が高いと判定し、基準値を超える場合には、血液検体には凝固因子に対する抗体が出現している虞が高くないと判定する。ここで、「抗体が出現している」とは、少なくとも検出可能なレベルで血中に抗体が存在していることを意味するが、血中抗体レベルが5 BU以上となっている状態のことを意味していてもよい。このような判定結果は、血友病患者の血中にインヒビターが出現していると医師が診断することを補助するデータとなり得る。このように抗体が出現している場合、VS-HA患者より血友病が重症であると考えることができる。これに対し、凝固速度の平均変化率が基準値を超える場合には、血友病患者の血中にインヒビターは出現していないが、重症であると医師が診断することを補助するデータとなり得る。
【００４０】
重症血友病、特に第VIII因子活性<0.2IU/dlのVS-HAと、抗体が出現している血友病において、APTT検査ではともに凝固時間は著しく延長し、凝固因子定量検査においてはともに定量限界以下となるため、そのような一般的な検査で簡便にインヒビターを検出することは困難である。一方で、血友病患者において、インヒビターが発生した場合には、補充療法で一般的に使用される第VIII因子製剤では止血管理が困難となるため、免疫寛容療法やバイパス製剤の投与を考慮する必要があり、治療法の選択においてインヒビター発現を早期に、高い特異度かつ信頼度で検出することが重要である。本実施形態の方法によれば、上記のとおり、第VIII因子活性<0.2IU/dlのVS-HAと、抗体が出現している血友病とを鑑別できるため、それぞれの患者に適した治療方針を選択することができるようになる。このことは、先行技術からは予測し得ない成果である。なお、血友病Ｂの場合も、第VIII因子が第IX因子に置き換わるだけで同様である。
【００４１】
基準値は、特に限定されず、当業者が予め適宜設定することができる。例えば、重症血友病Ａ患者群及び抗体が出現している血友病患者群からの血液検体を用いて予め凝固波形を取得し、それに基づいて上記の式１の値を得て、重症血友病患者群、特にVS-HA患者群と、抗体が出現している血友病患者群とを最も精度良く分類できる値に設定することができる。
【００４２】
[２．血液検体分析装置]
以下に、血液検体分析装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態はこの例のみに限定されない。図４に示されるように、血液検体分析装置１０は、測定試料の調製及び測定を行う測定装置５０と、測定装置５０により取得された測定データを分析すると共に測定装置５０に指示を与える制御装置４０とを備える。測定装置５０は、測定試料からの光学的情報を取得する測定部２０と、測定部２０の前方に配置された検体搬送部３０とを備える。
【００４３】
測定部２０には、蓋２０ａ及び２０ｂと、カバー２０ｃと、電源ボタン２０ｄが設けられている。ユーザは、蓋２０ａを開けて、試薬テーブル１１及び１２(図５参照)に設置されている試薬容器１０３を新たな試薬容器１０３と交換したり、また、別の試薬容器１０３を新たに追加したりすることができる。試薬容器１０３には、収容する試薬の種類と、試薬に付与されたシリアルナンバーからなる試薬ＩＤとを含むバーコードが印刷されたバーコードラベル１０３ａが貼付されている。
【００４４】
ユーザは、蓋２０ｂを開けて、ランプユニット２７(図５参照)を交換できる。また、ユーザは、カバー２０ｃを開けて、ピアサ１７ａ(図５参照)を交換できる。検体搬送部３０は、検体ラック１０２に支持された検体容器１０１を、ピアサ１７ａによる吸引位置まで搬送する。検体容器１０１は、ゴム製の蓋１０１ａにより密封されている。
【００４５】
血液検体分析装置１０を使用する場合、ユーザは、まず、測定部２０の電源ボタン２０ｄを押して測定部２０を起動させ、制御装置４０の電源ボタン４３９を押して制御装置４０を起動させる。制御装置４０が起動すると、表示部４１にログオン画面が表示される。ユーザは、ログオン画面にユーザ名及びパスワードを入力して制御装置４０にログオンし、血液検体分析装置１０の使用を開始する。
【００４６】
(測定装置の構成)
測定装置５０の構成について、以下に説明する。測定部２０は、図５に示されるように、試薬テーブル１１及び１２と、キュベットテーブル１３と、バーコードリーダ１４と、キュベット供給部１５と、キャッチャ１６と、検体分注アーム１７と、試薬分注アーム１８と、緊急検体セット部１９と、光ファイバ２１と、検出部２２と、キュベット移送部２３と、加温部２４と、廃棄口２５と、流体部２６と、ランプユニット２７とを備えている。
【００４７】
(測定試料調製部)
測定試料調製部は、試薬テーブル１１及び１２、キュベットテーブル１３、バーコードリーダ１４、キュベット供給部１５、キャッチャ１６、検体分注アーム１７、試薬分注アーム１８、緊急検体セット部１９、キュベット移送部２３、加温部２４、廃棄口２５、流体部２６、及び検体搬送部３０から構成される。試薬テーブル１１及び１２とキュベットテーブル１３は、それぞれ、円環形状を有し、回転可能に構成されている。試薬テーブル１１及び１２は試薬収納部に相当し、ここには試薬容器１０３が載せ置かれる。試薬テーブル１１及び１２に載せ置かれた試薬容器１０３のバーコードは、バーコードリーダ１４により読み取られる。バーコードから読み取られた情報(試薬の種類、試薬ＩＤ)は、制御装置４０に入力され、ハードディスク４３４(図９参照)に格納される。
【００４８】
本実施形態の血液検体分析装置では、試薬テーブル１１及び／又は１２には、凝固時間測定用試薬、カルシウム溶液などがそれぞれ収容された試薬容器１０３が載せ置かれる。また、試薬テーブル１１及び／又は１２に、対照検体として正常血漿が収容された試薬容器１０３が載せ置かれてもよい。
【００４９】
キュベットテーブル１３には、キュベット１０４を支持可能な複数の孔からなる支持部１３ａが形成されている。ユーザによってキュベット供給部１５に投入された新しいキュベット１０４は、キュベット供給部１５により順次移送され、キャッチャ１６によりキュベットテーブル１３の支持部１３ａに設置される。
【００５０】
検体分注アーム１７と試薬分注アーム１８には、それぞれ、上下移動及び回転移動できるようステッピングモータが接続されている。検体分注アーム１７の先端には、検体容器１０１の蓋１０１ａを穿刺できるよう先端が鋭利に形成されたピアサ１７ａが設置されている。試薬分注アーム１８の先端にはピペット１８ａが設置されている。ピペット１８ａの先端は、ピアサ１７ａと異なり平坦に形成されている。また、ピペット１８ａには、静電容量式の液面検知センサ２１３(図６参照)が接続されている。
【００５１】
検体搬送部３０(図４参照)によって検体容器１０１が所定位置に搬送されると、ピアサ１７ａが、検体分注アーム１７の回転移動により検体容器１０１の真上に位置付けられる。そして、検体分注アーム１７が下方向に移動され、ピアサ１７ａが検体容器１０１の蓋１０１ａを貫通し、検体容器１０１に収容されている血液検体が、ピアサ１７ａにより吸引される。緊急を要する血液検体が緊急検体セット部１９にセットされている場合、ピアサ１７ａは、検体搬送部３から供給される検体に割り込んで、緊急を要する血液検体を吸引する。ピアサ１７ａにより吸引された血液検体は、キュベットテーブル１３上の空のキュベット１０４に吐出される。
【００５２】
血液検体が吐出されたキュベット１０４は、キュベット移送部２３のキャッチャ２３ａにより、キュベットテーブル１３の支持部１３ａから、加温部２４の支持部２４ａに移送される。加温部２４は、支持部２４ａに設置されたキュベット１０４に収容されている血液検体を、所定の温度(例えば36〜38℃)で一定時間加温する。加温部２４による血液検体の加温が終了すると、このキュベット１０４は、キャッチャ２３ａによって再び把持される。そして、このキュベット１０４は、キャッチャ２３ａにより把持されたまま所定位置に位置付けられ、この状態で、ピペット１８ａにより吸引された試薬がキュベット１０４内に吐出される。
【００５３】
ピペット１８ａによる試薬の分注では、まず、試薬テーブル１１及び１２が回転され、測定項目に対応する試薬を収容する試薬容器１０３が、ピペット１８ａによる吸引位置に搬送される。そして、原点位置を検知するためのセンサに基づいて、ピペット１８ａの上下方向の位置が原点位置に位置付けられた後、液面検知センサ２１３によりピペット１８ａの下端が試薬の液面に接触するまで、ピペット１８ａが下降される。ピペット１８ａの下端が試薬の液面に接触すると、必要な量の試薬を吸引できる程度に、さらにピペット１８ａが下降される。そして、ピペット１８ａの下降が停止され、ピペット１８ａにより試薬が吸引される。ピペット１８ａにより吸引された試薬は、キャッチャ２３ａによって把持されたキュベット１０４に吐出される。そして、キャッチャ２３ａの振動機能により、キュベット１０４内の血液検体と試薬が攪拌される。これにより、測定試料の調製が行われる。その後、測定試料を収容するキュベット１０４は、キャッチャ２３ａにより、検出部２２の支持部２２ａに移送される。
【００５４】
(情報取得部)
情報取得部は、光ファイバ２１、検出部２２及びランプユニット２７から構成される。ランプユニット２７は、検出部２２による光学的信号の検出に用いられる複数種類の波長の光を供給する。図７を参照して、ランプユニット２７の構成の一例を説明する。ランプユニット２７は光源に相当し、ハロゲンランプ２７ａと、ランプケース２７ｂと、集光レンズ２７ｃ〜２７ｅと、円盤形状のフィルター部２７ｆと、モータ２７ｇと、光透過型のセンサ２７ｈと、光ファイバカプラ２７ｉとを備える。
【００５５】
図５を参照して、ランプユニット２７からの光は、光ファイバ２１を介して、検出部２２に供給される。検出部２２には、穴状の支持部２２ａが複数設けられており、各支持部２２ａには、キュベット１０４が挿入可能となっている。各支持部２２ａには、それぞれ、光ファイバ２１の端部が装着され、支持部２２ａに支持されたキュベット１０４に光ファイバ２１からの光が照射可能となっている。検出部２２は、光ファイバ２１を介して、ランプユニット２７から供給される光をキュベット１０４に照射し、キュベット１０４を透過する光(又はキュベット１０４からの散乱光)の光量を検出する。
【００５６】
図８Ａ〜Ｄを参照して、検出部２２に配された複数の支持部２２ａのうちの一つの構成の例を示すが、他の支持部２２ａも同様の構成を有する。図８Ａを参照して、検出部２２には、光ファイバ２１の先端が挿入される円形の穴２２ｂが形成される。さらに、検出部２２には、穴２２ｂを支持部２２ａに連通させる円形の連通孔２２ｃが形成されている。穴２２ｂの径は、連通孔２２ｃの径よりも大きい。穴２２ｂの端部には、光ファイバ２１からの光を集光するレンズ２２ｄが配置されている。さらに、支持部２２ａ内壁面には、連通孔２２ｃに対向する位置に孔２２ｆが形成される。この孔２２ｆの奥に、光検出器２２ｇが配置されている。光検出器２２ｇは受光部に相当し、受光光量に応じた電気信号を出力する。レンズ２２ｄを透過した光は、連通孔２２ｃ、支持部２２ａ及び孔２２ｆを介して、光検出器２２ｇの受光面に集光される。光ファイバ２１は、端部が穴２２ｂに挿入された状態で、板ばね２２ｅによって抜け止めされる。
【００５７】
図８Ｂを参照して、支持部２２ａにキュベット１０４が支持されると、レンズ２２ｄによって集光された光は、キュベット１０４およびキュベット１０４に収容された試料を透過して、光検出器２２ｇに入射する。試料において血液凝固反応が進むと、試料の濁度が上昇する。これに伴い、試料を透過する光の光量(透過光量)が減少し、光検出器２２ｇの検出信号のレベルが低下する。
【００５８】
図８Ｃを参照して、散乱光を用いる場合の検出部２２の構成を説明する。支持部２２ａの内側面において、連通孔２２ｃと同じ高さの位置に、孔２２ｈが設けられる。この孔２２ｈの奥に、光検出器２２ｉが配置される。支持部２２ａにキュベット１０４が挿入され、光ファイバ２１から光が出射されると、キュベット１０４内の測定試料によって散乱された光が、孔２２ｈを介して光検出器２２ｉに照射される。この例では、光検出器２２ｉからの検出信号は、測定試料による散乱光の強度を示す。また、図８Ｄに示されるように、測定試料を透過する透過光と、測定試料により散乱される散乱光との両方を検出できるようにしてもよい。
【００５９】
上記のように、検出部２２は、ランプユニット２７から供給される光をキュベット１０４に照射し、測定試料からの光学的情報を取得する。取得された光学的情報は、制御装置４０に送信される。制御装置４０は、光学的情報に基づいて分析を行い、分析結果を表示部４１に表示する。
【００６０】
測定終了後、不要となったキュベット１０４は、キュベットテーブル１３により搬送され、キャッチャ１６により廃棄口２５に廃棄される。なお、測定動作の際に、ピアサ１７ａとピペット１８ａは、流体部２６から供給される洗浄液などの液体により、適宜洗浄される。
【００６１】
測定装置のハードウェア構成について、以下に説明する。図６に示されるように、測定部２０は、制御部２００と、ステッピングモータ部２１１と、ロータリーエンコーダ部２１２と、液面検知センサ２１３と、センサ部２１４と、機構部２１５と、光学的情報取得部２１６と、バーコードリーダ１４とを含む。
【００６２】
図６を参照して、制御部２００は、ＣＰＵ２０１と、メモリ２０２と、通信インターフェース２０３と、Ｉ／Ｏインターフェース２０４を含んでいる。ＣＰＵ２０１は、メモリ２０２に記憶されているコンピュータプログラムを実行する。メモリ２０２は、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスクなどからなる。また、ＣＰＵ２０１は、通信インターフェース２０３を介して、検体搬送部３０を駆動させると共に、制御装置４０との間で指示信号及びデータの送受信を行う。また、ＣＰＵ２０１は、Ｉ／Ｏインターフェース２０４を介して、測定部２０内の各部を制御すると共に、各部から出力された信号を受信する。
【００６３】
ステッピングモータ部２１１は、試薬テーブル１１及び１２と、キュベットテーブル１３と、キャッチャ１６と、検体分注アーム１７と、試薬分注アーム１８と、キュベット移送部２３を、それぞれ駆動するためのステッピングモータを含んでいる。ロータリーエンコーダ部２１２は、ステッピングモータ部２１１に含まれる各ステッピングモータの回転変位量に応じたパルス信号を出力するロータリーエンコーダを含んでいる。
【００６４】
液面検知センサ２１３は、試薬分注アーム１８の先端に設置されたピペット１８ａに接続されており、ピペット１８ａの下端が試薬の液面に接触したことを検知する。センサ部２１４は、ピペット１８ａの上下方向の位置が原点位置に位置付けられたことを検知するセンサと、電源ボタン２０ｄが押されたことを検知するセンサを含んでいる。機構部２１５は、キュベット供給部１５と、緊急検体セット部１９と、加温部２４と、流体部２６を駆動するための機構と、ピアサ１７ａとピペット１８ａによる分注動作が可能となるようピアサ１７ａとピペット１８ａに圧力を供給する空圧源を含んでいる。光学的情報取得部２１６は、図５を参照して、少なくとも、ランプユニット２７と、光ファイバ２１と、検出部２２とを含む。
【００６５】
(制御部)
制御装置４０(制御部)の構成について、以下に説明する。図４に示されるように、制御装置４０は、表示部４１と、入力部４２と、コンピュータ本体４３とから構成されている。ユーザが、入力部４２を介して血液検体の測定開始指示を入力すると、制御装置４０は、測定開始指示を測定部２０に送信して測定を開始させる。制御装置４０は、測定部２０から光学的情報を受信する。そして、制御装置４０のプロセッサは、光学的情報に基づいて、凝固波形の１次微分曲線や微分に関するパラメータ等を算出する。また、制御装置４０のプロセッサは、光学的情報に基づいて凝固時間を算出してもよい。そして、制御装置４０のプロセッサは、血液検体の分析のためのコンピュータプログラムを実行する。よって、制御装置４０は、血液検体の分析のためのコンピュータシステムとしても機能する。
【００６６】
制御装置４０の機能構成について、図９に示されるように、制御装置４０は、取得部４０１と、記憶部４０２と、算出部４０３と、判定部４０４と、出力部４０５とを備える。取得部４０１は、測定部２０と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。出力部４０４は、表示部４１と通信可能に接続されている。
【００６７】
取得部４０１は、測定部２０から送信された光学的情報を取得する。記憶部４０２は、凝固波形の微分に関する各種パラメータの値を算出するための式、各種パラメータに対応する正常範囲又は所定の基準値などを記憶する。また、記憶部４０２は、凝固時間を算出するための式を記憶していてもよい。算出部４０３は、取得部４０１で取得された情報を用いて、記憶部４０２に記憶された式に従って各種パラメータの値を算出する。判定部４０４は、算出部４０３によって算出されたパラメータの値が、記憶部４０２に記憶された該パラメータに対応する正常範囲から外れるか否かを判定する。出力部４０５は、算出部４０３によって算出されたパラメータの値を、血液検体についての参考情報として出力する。
【００６８】
図１０に示されるように、制御装置４０のコンピュータ本体４３は、ＣＰＵ４３１と、ＲＯＭ４３２と、ＲＡＭ４３３と、ハードディスク４３４と、読出装置４３５と、入出力インターフェース４３６と、通信インターフェース４３７と、画像出力インターフェース４３８と、電源ボタン４３９とを備える。ＣＰＵ４３１、ＲＯＭ４３２、ＲＡＭ４３３、ハードディスク４３４、読出装置４３５、入出力インターフェース４３６、通信インターフェース４３７、画像出力インターフェース４３８及び電源ボタン４３９は、バス４４０によって通信可能に接続されている。
【００６９】
ＣＰＵ４３１は、ＲＯＭ４３２に記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ４３３にロードされたコンピュータプログラムを実行する。ＣＰＵ４３１がアプリケーションプログラムを実行することにより、上述した各機能ブロックが実現される。これにより、コンピュータシステムが、血液検体分析装置の端末として機能する。
【００７０】
ＲＯＭ４３２は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ４３２には、ＣＰＵ４３１によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
【００７１】
ＲＡＭ４３３は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ４３３は、ＲＯＭ４３２及びハードディスク４３４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ４３３は、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ４３１の作業領域としても利用される。
【００７２】
ハードディスク４３４は、オペレーティングシステム、ＣＰＵ４３１に実行させるためのアプリケーションプログラム(血液検体の分析のためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム、当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータ、及び制御装置４０の設定内容がインストールされている。
【００７３】
読出装置４３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置４３５は、ＣＤ、ＤＶＤなどの可搬型記録媒体４４１に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
【００７４】
入出力インターフェース４３６は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェース４３６には、キーボード、マウスなどの入力部４２が接続されている。ユーザは入力部４２を介して指示を入力し、入出力インターフェース４３６は、入力部４２を介して入力された信号を受け付ける。
【００７５】
通信インターフェース４３７は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェースなどである。制御装置４０は、通信インターフェース４３７により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。通信インターフェース４３７は測定部２０に接続されており、ＣＰＵ４３１は、通信インターフェース４３７を介して、測定部２０との間で指示信号及びデータの送受信を行う。
【００７６】
画像出力インターフェース４３８は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部４１に接続されている。画像出力インターフェース４３８は、画像データに応じた映像信号を表示部４１に出力し、表示部４１は、画像出力インターフェース４３８から出力された映像信号に基づいて画像を表示する。
【００７７】
図６を参照して、測定動作の際、測定部２０のＣＰＵ２０１は、検出部２２(図５参照)から出力された検出信号をデジタル化したデータ(光学的情報)を、メモリ２０２に一時格納する。メモリ２０２の記憶領域は、支持部２２ａ毎にエリア分割される。各エリアには、対応する支持部２２ａに支持されたキュベット１０４に対して所定波長の光を照射したときに取得されるデータ(光学的情報)が、順次格納される。こうして、所定の測定時間にわたって順次、データがメモリ２０２に格納される。測定時間が経過すると、ＣＰＵ２０１は、メモリ２０２に対するデータの格納を中止し、格納したデータを、通信インターフェース２０３を介して制御装置４０に送信する。制御装置４０は、受信したデータを処理して解析を行い、解析結果を表示部４１に表示する。
【００７８】
(血液検体分析装置の処理手順)
測定部２０における処理は、主として測定部２０のＣＰＵ２０１の制御の下で行われ、制御装置４０における処理は、主として制御装置４０のＣＰＵ４３１の制御の下で行われる。ユーザにより入力された測定開始指示を制御装置４０から受信すると、測定部２０は測定処理を開始する。図１１を参照して、測定処理が開始されると、測定部２０は、検体搬送部により搬送された検体容器１０１から所定量の血液検体を吸引し、これを、キュベットテーブル１３上の空のキュベット１０４に分注する。なお、対照検体として正常血漿も測定する場合、測定部２０は、試薬収容部に収容された正常血漿が入った試薬容器１０３から所定量の正常血漿を吸引し、これを空のキュベット１０４に分注する。測定部２０は、検体が分注されたキュベット１０４を加温部２４に移送して、キュベット１０４内の血漿を所定温度(例えば37℃)に加温する。その後、測定部２０は、キュベット１０４に凝固時間測定用試薬及びカルシウム溶液を添加して、測定試料を調製する(ステップＳ１１)。
【００７９】
測定部２０は、各種試薬が添加されたキュベット１０４を検出部２２に移送し、キュベット１０４に光を照射して測定試料を測定する(ステップＳ１２)。測定部２０は、始点からの時間、好ましくはキュベット１０４にカルシウム溶液を添加した時点から時間の計測を開始する。この測定では、波長660 nmの光に基づくデータ(散乱光量又は透過光量)が、測定時間の間、順次、メモリ２０２に格納される。このとき、データは、始点からの経過時間、好ましくはカルシウム溶液の添加時点からの経過時間に対応付けられた状態でメモリ２０２に格納される。そして、測定時間が経過すると、測定部２０は、測定を中止し、メモリ２０２に格納された測定結果(データ)を制御装置４０に送信する(ステップＳ１３)。これにより、制御装置４０が測定部２０から測定結果(データ)を受信すると(ステップＳ２１：ＹＥＳ）、制御装置４０は、受信した測定結果に対して分析処理を実行する(ステップＳ２２)。すなわち、制御装置４０は、測定試料について、凝固波形から、凝固波形の微分に関するパラメータを算出する。なお、制御装置４０は、測定試料の凝固時間、凝固波形及び速度の波形などを算出してもよい。分析処理を行った後、制御装置４０は、分析結果の表示処理を実行する(ステップＳ２３)。
【００８０】
(凝固速度の平均変化率の取得の処理手順及び血友病の重症度に関する情報の出力)
図１２を参照して、凝固速度の平均変化率の取得の処理のフローの一例を説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００８１】
ステップＳ１０１において、制御装置４０の取得部４０１は、測定部２０から受信したデータ(散乱光量又は透過光量)に基づいて、光学的情報(散乱光強度、又は透過度もしくは吸光度)を取得する。ステップＳ１０２において、算出部４０３は、取得部４０１が取得した光学的情報から凝固波形を取得し、記憶部４０２に記憶された式に従って凝固波形の微分に関するパラメータを算出する。算出部４０３は、取得部４０１が取得した光学的情報から凝固時間、凝固波形及び速度の波形などをさらに算出してもよい。そして、算出部４０３は、これらの算出結果等に基づいて、記憶部４０２に記憶された上記式１に従って、式１の値を算出する。
【００８２】
ステップＳ１０３において、判定部４０４は、算出部４０３で算出された式１の値が、記憶部４０２に記憶された基準値を超えるか否かを判定する。ここで、式１の値が基準値を超えるとき、処理はステップＳ１０４に進行する。ステップＳ１０４において、判定部４０４は、血液検体には、凝固因子に対する抗体が出現している虞が高くないとの判定結果を出力部４０５に送信する。一方、式１の値が基準値以下のとき、処理はステップＳ１０５に進行する。ステップＳ１０５において、判定部４０４は、血液検体には、凝固因子に対する抗体が出現している虞が高いとの判定結果を出力部４０５に送信する。
【００８３】
ステップＳ１０６において、出力部４０５は、判定結果を出力し、表示部４１に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。あるいは、音声で出力してもよい。これにより、判定結果を、血液検体についての参考情報としてユーザに提供できる。
【００８４】
分析結果を表示する画面の一例として、図１３を参照して、APTT測定用試薬及びカルシウム溶液を用いて血液検体の凝固の過程を分析した結果を表示する画面について説明する。画面Ｄ１は、検体番号を表示する領域Ｄ１１と、測定項目名を表示する領域Ｄ１２と、詳細画面を表示させるためのボタンＤ１３と、測定日時を表示するための領域Ｄ１４と、測定結果を表示する領域Ｄ１５と、分析情報を表示する領域Ｄ１６と、凝固波形及びその一次微分曲線を表示する領域Ｄ１７を含む。
【００８５】
領域Ｄ１５には、測定項目と測定値が表示される。領域Ｄ１５において、「APTT sec」は、活性化部分トロンボプラスチン時間である。領域Ｄ１５には、式１の値、|min1|などの凝固波形の微分に関するパラメータの値が表示されてもよい。
【００８６】
領域Ｄ１６には、分析項目と参考情報が表示される。領域Ｄ１６において、「Index」は、判定に用いた凝固波形の微分に関するパラメータの値である。「基準値(参考)」は、判定に用いたパラメータ値に対応する基準値である。「判定(参考)」は、血液検体分析装置による判定結果である。図１３では、血液検体に凝固因子に対する抗体が出現している虞が高いことを示す。なお、患者が凝固因子に対する抗体が出現しているか否かの診断は、この判定結果だけでなく、他の検査結果などの情報も考慮して行われることが望ましい。よって、本実施形態に係る血液検体分析装置による判定結果及び基準値が参考情報であることを示すために、「(参考)」と表示している。図１３では、判定結果を「抗体出現の虞」という文字で表示しているが、フラグなどの記号や図形標識で表示してもよい。あるいは、判定結果を音声で出力してもよい。
【００８７】
以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００８８】
実施例：凝固速度の平均変化率による鑑別
(１)試薬
市販のAPTT測定試薬として、トロンボチェックAPTT-SLA(シスメックス株式会社)及びアクチンFS(シーメンスヘルスケアダイアグノスチックス社)を用いた。カルシウムイオンを含む凝固開始試薬として、20 mM塩化カルシウム液(シスメックス株式会社)を用いた。
【００８９】
(２)血液検体
・重症血友病Ａ血漿検体  １０検体(Severe Haemophilia A; 第VIII因子活性 <1.0 IU/dl)：
VS-HA検体  ５検体(第VIII因子活性 <0.2 IU/dl)
MS-HA検体  ５検体(第VIII因子活性 0.2 IU/dl〜1.0 IU/dl)
・抗体が出現している血友病Ａ検体  １０検体：
HA-inh  １０検体(第VIII因子活性 <0.2 IU/dl)
【００９０】
(３)測定試料の調製及び測定
測定試料の調製及び測定には、全自動血液凝固測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)を用いた。血漿検体(50μL)に血液凝固分析用試薬(50μL)を添加して、37℃で３分間インキュベーションした。そして、20 mM塩化カルシウム液(50μL)を添加して測定試料を調製した。測定試料の透過度を、塩化カルシウム液の添加時から420秒間連続的に測定した。なお、血漿検体は以下のものを用いた。
【００９１】
(４)解析結果
透過度の経時的変化をプロットして凝固波形を得た。また、凝固波形のデータを１次微分して、速度の波形データを得た。さらに、凝固時間と、凝固波形の微分に関するパラメータとしてtime to |min1|、|min1|及びtime to |min2|を算出した。これらのパラメータを以下の式１にあてはめて、凝固速度の平均変化率を算出した。結果を図１４に示す。
［数２］
(1/2×|min1|)/(time to |min1| - time to |min2|)・・・  式１
【００９２】
図１４から明らかなように、上記式１で算出した凝固速度の平均変化率を比較することによって、抗体が出現している検体(HA-inh)と、重症血友病Ａ検体(VS-HA、MS-HA)とを非常に高精度(p<0.01)で識別可能であった。後述する比較例において示すように、既知のパラメータでは、これらをp<0.05で識別する。上記の結果は、既知のパラメータよりも高精度で抗体が出現している検体(HA-inh)と重症血友病Ａ検体(VS-HA、MS-HA)とを識別できる点で優れている。上記式１で算出されるパラメータによる鑑別によれば、偽陽性及び偽陰性の確率を抑えることができる。これにより、第VIII因子活性<0.2IU/dlのVS-HAと、抗体が出現している血友病とを従来よりも高精度で鑑別できるため、それぞれの患者に適した治療方針を選択することができるようになる。
【００９３】
比較例：最大凝固速度|min1|による鑑別
抗体が出現している検体(HA-inh)及び重症血友病Ａ検体(VS-HA、MS-HA)について、上記の実施例の凝固波形解析において取得した微分に関するパラメータ|min1| (最大凝固速度)を比較した。結果を図１５に示す。
【００９４】
図１５から明らかなように、最大凝固速度を比較することによって、抗体が出現している検体(HA-inh)と、重症血友病Ａ検体(VS-HA、MS-HA)とを識別可能であった(p<0.05)。しかしながら、p<0.01で識別はできなかった。すなわち、最大凝固速度による鑑別は、式１で算出されるパラメータによる鑑別結果ほど高精度ではない。最大凝固速度による鑑別では、式１で算出されるパラメータによる鑑別ほど、偽陽性及び偽陰性の確率を抑えることができない。
【符号の説明】
【００９５】
１０    血液検体分析装置
１１、１２    試薬テーブル(試薬収容部)
２０    測定部
２２ｇ、２２ｉ    光検出器(受光部)
２７    ランプユニット(光源)
３０    検体搬送部
４０    制御装置(制御部)
４１    表示部
４２    入力部
４３    コンピュータ本体
５０    測定装置(測定試料調製部及び情報取得部)
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2018017619.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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