(57)【要約】【課題】タンパク質を精製しつつウイルス不活化処理を行うことのできるタンパク質精製方法及びタンパク質精製装置を提供する。【解決手段】本発明に係るタンパク質精製方法は、内設されたフィルタ１３３によって容積の小さい小容積室１３２と、容積の大きい大容積室１３１と、に分けられた晶析容器１３０を用いたタンパク質精製方法であり、前記晶析容器１３０内にタンパク質を含む溶液を充填する充填工程Ｓ１と、加圧用溶液を前記小容積室１３２に導入して前記タンパク質が析出する圧力を印加する印加工程Ｓ２と、前記圧力を維持しつつ、前記大容積室１３１に前記加圧用溶液を送液し、前記タンパク質を精製する精製工程Ｓ３と、前記小容積室１３２又は前記大容積室１３１に前記加圧用溶液を送液し、前記精製したタンパク質を回収する回収工程Ｓ４と、を含む。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内設されたフィルタによって容積の小さい小容積室と、容積の大きい大容積室と、に分けられた晶析容器を用いたタンパク質精製方法であり、
前記晶析容器内にタンパク質を含む溶液を充填する充填工程と、
加圧用溶液を前記小容積室に導入して前記タンパク質が析出する圧力を印加する印加工程と、
前記圧力を維持しつつ、前記大容積室に前記加圧用溶液を送液し、前記タンパク質を精製する精製工程と、
前記小容積室又は前記大容積室に前記加圧用溶液を送液し、前記精製したタンパク質を回収する回収工程と、
を含むことを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記印加工程における前記圧力が１００ＭＰａ以上であることを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項３】
請求項１において、
前記印加工程における前記圧力の保持時間が５分以上であることを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項４】
請求項１において、
前記精製工程における前記加圧用溶液の圧力が１００ＭＰａ以上であることを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項５】
請求項１において、
前記精製工程は、吸光度に基づいて送液ラインを切り替え、精製した前記タンパク質を多く含む画分と、そうでない画分と、を分けることを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項６】
請求項１において、
前記印加工程は、前記小容積室及び前記大容積室のうちの少なくとも一方に設置された吸光度計で前記タンパク質の吸光度を測定して前記タンパク質の析出を検知することを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項７】
請求項１において、
前記タンパク質を含む溶液が、フィルタでろ過されていることを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項８】
請求項１において、
前記回収工程後、再度、前記充填工程から前記回収工程までをこの順で順次繰り返すことを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項９】
請求項１において、
前記大容積室の容積が、前記小容積室の容積の９倍以上であることを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項１０】
内設されたフィルタによって容積の小さい小容積室と容積の大きい大容積室とに分けられた晶析容器と、
前記晶析容器内にタンパク質を含む溶液を充填する充填用配管と、
前記小容積室及び前記大容積室のそれぞれに加圧用溶液を導入する加圧用配管と、
前記加圧用配管と接続された加圧手段と、
前記小容積室及び前記大容積室のうちの少なくとも一方と接続され、精製された前記タンパク質を回収する回収用配管と、
を備えることを特徴とするタンパク質精製装置。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記大容積室の容積が、前記小容積室の容積の９倍以上であることを特徴とするタンパク質精製装置。
【請求項１２】
請求項１０において、
前記フィルタが交換可能であることを特徴とするタンパク質精製装置。
【請求項１３】
請求項１０において、
前記回収用配管が、吸光度計と、当該吸光度計の吸光度に基づいて送液ラインを切り替えるバルブと、を有することを特徴とするタンパク質精製装置。
【請求項１４】
請求項１０において、
前記小容積室及び前記大容積室のうちの少なくとも一方に吸光度計が設置されていることを特徴とするタンパク質精製装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製方法及びタンパク質精製装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品や飲料品、食料品の製造工程において、微生物、細胞、菌類等の生体細胞を培養する培養法が用いられている。特に、生体細胞を用いて生産される抗体医薬、酵素をはじめとするタンパク質はその需要が増大している。一般的に、これらのタンパク質は、アフィニティーをはじめとするカラムにより精製されるが、カラム充填剤が高価であるため、製造コスト増大の要因となっている。
【０００３】
バイオ医薬品を製造する際や、抗体を精製する際は、これに加えて次のような処理が行われる。
すなわち、バイオ医薬品を製造する際は、培養に用いた生体細胞に内在するウイルスや製造工程における偶然の混入によるウイルスのほか、生体細胞の培養に使用する培地成分に由来するウイルスの混入等のリスクがある。そのため、細胞を培養した培養液から抗体タンパク質等の培養生産物を回収する精製工程においては、培養生産物の安全性を確保するために、培養液に混入する可能性のある細菌を確実に低減する滅菌処理及びウイルス不活化処理が必要とされる。ここで、ウイルス不活化処理とは、ウイルスの感染力を失わせる処理を意味する。
【０００４】
抗体を精製する際は、中性条件下でプロテインＡに抗体を吸着させて、非吸着成分を洗浄、除去する。次いで、ｐＨ３以下の酸性条件下で吸着させた抗体をプロテインＡから溶離させて回収する。このような低ｐＨ条件は、ウイルスの不活化処理も兼用できるため、一般的には、酸性の溶離液を低ｐＨ条件で数時間保持することによってウイルス不活化処理（本明細書において「低ｐＨ処理」という。）を行っている。
【０００５】
しかし、低ｐＨ処理を行うと、抗体の高次構造が変化し、抗体が失活したり、凝集体を生成したりして、抗体の品質が低下するおそれがあることが知られている。近年では、低ｐＨ処理による抗体の失活や凝集体の生成を回避するため、温度によって吸脱着特性が異なる温度応答性のアフィニティークロマトグラフなどの機能性担体の開発も進められている。しかしながら、このような機能性担体を用いる場合、低ｐＨ処理に代わるウイルス不活化処理が必要となる。
【０００６】
低ｐＨ処理に代わるウイルス不活化処理として期待できそうな技術として、例えば、特許文献１及び非特許文献１に記載されているように、圧力を印加することが挙げられる。
【０００７】
具体的に、特許文献１には、２成分以上からなる流動相状混合物を加圧下に置くことによって特定成分の結晶を生成・増加せしめる圧力晶析方法が記載されている。この圧力晶析方法は、生成した特定成分結晶から分離・排出されてくる母液圧力が所定圧力に到達した時点で母液の分離を停止し、高圧容器内に残留する特定成分結晶に加えられた圧力を低下させて、結晶の一部を溶解せしめ、特定成分をスラリー状にして高圧容器外へ回収するというものである。
【０００８】
また、非特許文献１には、水よりも比重が大きく且つ水と混合しないフッ素系の溶媒とタンパク質溶液とをセル内に充填し、タンパク質溶液に対してフッ素系の溶媒を介して圧力を印加する旨と、これに用いられる圧力晶析装置が記載されている。
【０００９】
タンパク質を精製する際に特許文献１や非特許文献１に記載の技術を適用することが考えられる。特許文献１及び非特許文献１のいずれも高い圧力の印加が可能であるため、タンパク質を結晶化させて純度を高めつつ（精製しつつ）、印加する圧力によってはウイルス不活化処理を同時に行うことができると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭６３−２１８２０５号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】杉山成監修、「タンパク質結晶の最前線」、株式会社シーエムシー出版、２０１３年１２月２５日発行、ｐ．７０、７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、特許文献１に記載されている技術では、タンパク質などの特定成分を高圧容器外へ回収する際に当該特定成分を外気に晒すことになる。このような場合、特定成分の回収はクリーンルームやクリーンベンチなどで行われることが多いが、雑菌やウイルスなどが混入する可能性は否定できない。
また、非特許文献１に記載されている圧力晶析装置は、非開放系の装置であり、雑菌やウイルスなどが混入するおそれはないが、結晶を観察するためのものであるため、析出させた結晶を取り出すこと、すなわち精製した特定成分を得ることはできない。
【００１３】
本発明は前記状況に鑑みてなされたものであり、タンパク質を精製しつつウイルス不活化処理を行うことのできるタンパク質精製方法及びタンパク質精製装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決した本発明に係るタンパク質精製方法は、内設されたフィルタによって容積の小さい小容積室と、容積の大きい大容積室と、に分けられた晶析容器を用いたタンパク質精製方法であり、前記晶析容器内にタンパク質を含む溶液を充填する充填工程と、加圧用溶液を前記小容積室に導入して前記タンパク質が析出する圧力を印加する印加工程と、前記圧力を維持しつつ、前記大容積室に前記加圧用溶液を送液し、前記タンパク質を精製する精製工程と、前記小容積室又は前記大容積室に前記加圧用溶液を送液し、前記精製したタンパク質を回収する回収工程と、を含む。
【００１５】
本発明に係るタンパク質精製装置は、内設されたフィルタによって容積の小さい小容積室と容積の大きい大容積室とに分けられた晶析容器と、前記晶析容器内にタンパク質を含む溶液を充填する充填用配管と、前記小容積室及び前記大容積室のそれぞれに加圧用溶液を導入する加圧用配管と、前記加圧用配管と接続された加圧手段と、前記小容積室及び前記大容積室のうちの少なくとも一方と接続され、精製された前記タンパク質を回収する回収用配管と、を備える。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係るタンパク質精製方法及びタンパク質精製装置は、タンパク質を精製しつつウイルス不活化処理を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施形態に係るタンパク質精製装置の構成を説明する概略構成図である。
【図２】物質に及ぼす圧力（ＭＰａ）の影響を示す説明図である。
【図３】圧力（ＭＰａ）と単位質量当たりの水の体積（ｃｍ３／ｇ）の関係を示す状態図である。
【図４】培養槽との間にフィルタ装置を設けた様子を示す概略構成図である。
【図５】本実施形態に係るタンパク質精製方法の内容を説明するフローチャートである。
【図６】充填工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。
【図７】印加工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。
【図８】精製工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。
【図９】回収工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。
【図１０】他の態様に係るタンパク質精製装置の構成を説明する概略構成図である。
【図１１】充填工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。
【図１２】印加工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。
【図１３】精製工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。
【図１４】回収工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。
【図１５】晶析容器の一変形例を説明する概略断面図である。
【図１６】本実施形態に係るタンパク質精製装置の変形例を説明する概略構成図である。
【図１７】他の態様に係るタンパク質精製装置の変形例を説明する概略構成図である。
【図１８】他の態様の変形例に係る晶析容器を説明する概略構成図である。
【図１９】他の態様の変形例に係る晶析容器を用いた場合における充填工程の動作の一例を説明する説明図である。
【図２０】他の態様の変形例に係る晶析容器を用いた場合における印加工程の動作の一例を説明する説明図である。
【図２１】他の態様の変形例に係る晶析容器を用いた場合における精製工程の動作の一例を説明する説明図である。
【図２２】他の態様の変形例に係る晶析容器を用いた場合における回収工程の動作の一例を説明する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、適宜図面を参照して本発明に係るタンパク質精製方法及びタンパク質精製装置を実施するための形態（実施形態）について詳細に説明する。
説明の便宜上、はじめに、本発明に係るタンパク質精製装置の一実施形態について説明する。
【００１９】
［タンパク質精製装置］
図１は、本実施形態に係るタンパク質精製装置の構成を説明する概略構成図である。
本実施形態に係るタンパク質精製装置１００は、タンパク質を含む溶液からタンパク質を精製するために用いられる。また、このタンパク質精製装置１００は、このタンパク質の精製と同時にウイルス不活化処理を行うものである。
精製対象物となるタンパク質としては、例えば、抗体、成長ホルモン、甲状腺ホルモンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質を含む溶液は、前記精製対象物となるタンパク質を含んでいる溶液であればどのようなものでもよい。タンパク質を含む溶液としては、培養液や当該培養液をろ過したろ過液などを挙げることができる。
【００２０】
図１に示すように、本実施形態に係るタンパク質精製装置１００は、晶析容器１３０と、充填用配管１０１と、加圧用配管１０２と、加圧手段１１１と、回収用配管１０３と、を備えている。また、充填用配管１０１、加圧用配管１０２、回収用配管１０３、及びベント配管１０４は、それぞれの配管上の適宜の位置にバルブ１２１〜１２５が設けられており、これらのバルブ１２１〜１２５の開閉によって各種溶液の通流が制御されている。バルブ１２１〜１２５の開閉についてはタンパク質精製方法で説明する。
【００２１】
このタンパク質精製装置１００には、タンパク質を精製するにあたって、溶液中でタンパク質が析出する圧力が印加される。そのため、前記した各構成要素は、当該圧力に耐えることができるステンレスなどの金属製の素材で形成するのが好ましい。なお、これらの各構成要素をステンレス製とすると、タンパク質を含む溶液などによる腐食を受け難いので好適である。
【００２２】
ここで、図２及び図３を参照して前記圧力によるウイルス不活化処理について説明する。なお、図２は、物質に及ぼす圧力の影響を示す説明図である。図３は、圧力と単位質量当たりの水の体積の関係を示す状態図である。
ウイルスには、核酸が脂質二重膜で構成されるエンベロープで覆われているものと、タンパク質のサブユニットが複数集合して構成されるカプシドで覆われているものとがある。
図２に示すように、圧力が約１００ＭＰａになると、脂質相転移に伴って脂質二重膜が破壊される。これは、圧力が印加された際に、脂質二重膜がより体積を小さくして、系のエネルギーを低下させる方向に平衡が移動するルシャトリエの原理による。そのため、エンベロープで覆われているウイルスは、圧力を１００ＭＰａとすることによって、不活化できる。
また、図３に示すように、静水圧が２５０ＭＰａを超えると水の体積変化が１０％を超えるため、カプシドが破壊される。そのため、カプシドで覆われているウイルスは圧力を２５０ＭＰａ以上とすることによって、不活化できる。
【００２３】
よって、前記圧力としては、例えば、１００ＭＰａ以上とするのが好ましく、２５０ＭＰａ以上とするのがより好ましい。より確実なウイルス不活性処理を望む場合は、３００ＭＰａ以上とするのがさらに好ましい。その一方で、図２に示すように、圧力が４００ＭＰａ付近になると精製対象物であるタンパク質が変性し始める。そのため、圧力は４００ＭＰａ以下とするのが好ましい。より好ましくは３９０ＭＰａ以下である。なお、ウイルス不活化処理時の好ましい温度は０〜３０℃である。
そして、前記したように、本実施形態では、圧力を印加することによってタンパク質を精製できる。これについては、以下の晶析容器で説明する。
【００２４】
（晶析容器）
図１に戻って説明を続ける。図１に示すように、晶析容器１３０は、内設されたフィルタ１３３によって容積Ｖ２の小さい小容積室１３２と容積Ｖ１の大きい大容積室１３１とに分けられている。晶析容器１３０は、フィルタ１３３を内設できればどのような形状であってもよいが、例えば、有底円管状とすることができる。
この晶析容器１３０に内設されるフィルタ１３３も前記圧力に耐えることができ、且つ、タンパク質を含む溶液などによって腐食し難い素材で形成されている。このような観点から、フィルタ１３３は、例えば、ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３０４Ｌ、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ、ＳＵＳ６３０などで形成するのが好ましい。このフィルタ１３３の孔径は、例えば、１μｍとすることができるがこれに限定されない。
【００２５】
大容積室１３１の容積Ｖ１は、小容積室１３２の容積Ｖ２の９倍以上（Ｖ１≧９×Ｖ２）であるのが好ましい。このようにすると、前記したように１００ＭＰａ以上の圧力を印加した場合に、晶析容器１３０内のタンパク質を含む溶液の体積を約１割圧縮できる。すなわち、タンパク質を含む溶液の体積を約９／１０に圧縮できる。そのため、晶析容器１３０内にタンパク質を含む溶液を充填した後、小容積室１３２に加圧用溶液を導入して前記圧力を印加することにより、タンパク質を含む溶液のほぼ全量を大容積室１３１に押し込み、小容積室１３２のほぼ全容積を加圧用溶液で満たすことができる。
【００２６】
そして、前記した圧力が印加されて体積が圧縮され、大容積室１３１に押し込められたタンパク質を含む溶液には、次のような現象が生じる。当該現象の説明にあたり、表１を参照する。表１は、タンパク質の水和状態の圧力依存性を示している。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
表１に示すように、低圧の場合は、タンパク質に水が水和した方が、体積が小さくなり安定である。また、水がタンパク質に水和することでタンパク質の溶解度が増加する。その一方で、高圧の場合は、タンパク質に水和した水が脱離した方が、タンパク質の体積が低下し、安定になる。しかし、このようにして水和水が脱離するとタンパク質の溶解度が低下するため、タンパク質が析出・結晶化する。なお、本発明者らは本発明の検討にあたり、例えば、リゾチームは１００ＭＰａ以上×５分以上保持すると析出すること、グルコースイソメラーゼは３００ＭＰａ以上×５分以上保持すると析出することなどを見出している。従って、本実施形態における圧力の印加時間は５分以上とするのが好ましい。
【００２９】
前記した現象により、タンパク質を含む溶液は、大容積室１３１内でタンパク質が析出・結晶化する（以下、析出・結晶化したタンパク質を「タンパク質Ｐ」と表すことがある（図８等参照）。）。ここで、表２は、培養液中に含まれる主な成分の分子量とサイズを示している。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
表２に示すように、タンパク質が抗体である場合、析出・結晶化する前は０．００５μｍ程度であるが、析出・結晶化すると１０μｍ以上の大きさとなる。その一方で、ウイルスの大きさは、圧力が印加されて破壊（不活化）される前でも０．１μｍ程度のものが多い（殆どのウイルスは０．０３〜０．３μｍ程度である）。そのため、後述するようにして加圧用溶液の導入とバルブの制御を適切に行い、フィルタ１３３でろ過することにより、析出・結晶化したタンパク質Ｐを晶析容器１３０内に残しつつ（精製しつつ）、不活化したウイルスを含む不要物を晶析容器１３０外に排出する（除去する）ことができる。なお、析出・結晶化したタンパク質Ｐは、圧力が下がると溶液に再溶解する。
【００３２】
晶析容器１３０は、所定の温度に調節する温度調節器を外壁面に設けていてもよい（図示せず）。このようにすると、タンパク質を含む溶液の温度を適切な範囲に制御できるので、例えば、タンパク質の変性や失活を防ぐことができる。
【００３３】
（充填用配管）
充填用配管１０１は、開端部１０１ａからタンパク質を含む溶液を導入し、当該タンパク質を含む溶液を晶析容器１３０内に充填する。図１に示すように、本実施形態における充填用配管１０１は、経路Ａで晶析容器１３０内にタンパク質を含む溶液を導入する。
経路Ａに係る充填用配管１０１は、任意の位置１０１ｂで配管１０１ｃが接続されており、いわゆるＴ字管となっている。そして、配管１０１ｃの端部１０１ｄが晶析容器１３０の小容積室１３２と接続されている。また、充填用配管１０１は、開端部１０１ａから配管１０１ｃが接続されている任意の位置１０１ｂまでの間にバルブ１２１が設けられている。
すなわち、この充填用配管１０１は、開端部１０１ａ、バルブ１２１、任意の位置１０１ｂ、配管１０１ｃ、及び端部１０１ｄを順に経由して、タンパク質を含む溶液を晶析容器１３０内に導入する。充填用配管１０１は、晶析容器１３０に至るまでの任意の箇所に、タンパク質を含む溶液を所定の温度に調節する温度調節器Ｈが設けられていてもよい。このようにすると、タンパク質を含む溶液の温度を適切な範囲に制御できるので、例えば、タンパク質の変性や失活を防ぐことができる。
【００３４】
ここで、図４は、培養槽との間にフィルタ装置を設けた様子を示す概略構成図である。
図４に示すように、充填用配管１０１は、図４において図示しない培養槽との間に１つ以上のフィルタ装置が設けられていてもよい。具体的には、充填用配管１０１の上流に孔径が０．２２μｍである第２フィルタ１６４を備えた第２フィルタ装置１６０が設けられていてもよく、さらにその上流に孔径が３μｍである第１フィルタ１５６を備えた第１フィルタ装置１５０が設けられていてもよい。このようにすると、特に第２フィルタ１６４の目詰まりを防止することができる。
【００３５】
フィルタ装置について説明を続ける。第１フィルタ装置１５０は、バルブ１５１が設けられた開端部１０５ａを有する配管１０５によって図示しない培養槽と接続されている。培養液は、開端部１０５ａ、配管１０５及びバルブ１５１を順に経由して第１フィルタ装置１５０内に導入される。第１フィルタ装置１５０内に導入された培養液は、第１フィルタ１５６でろ過される。第１フィルタ装置１５０は、バルブ１６１が設けられた配管１５７によって第２フィルタ装置１６０と接続されている。第１フィルタ装置１５０でろ過されたろ過液は当該配管１５７及びバルブ１６１を順に経由して第２フィルタ装置１６０内に導入される。
第２フィルタ装置１６０は、内部に導入されたろ過液を第２フィルタ１６４でさらにろ過する。
このようにして第１フィルタ装置１５０及び第２フィルタ装置１６０でろ過されたろ過液は、細胞由来の構造タンパク質や脂質などの不要物の多くが取り除かれたものとなる。そして、このようにして得られたろ過液は、前記したように、充填用配管１０１、開端部１０１ａ、バルブ１２１などを経由して晶析容器１３０に導入される。
【００３６】
なお、ろ過が終了したら、バルブ１５１、１２１を“閉”とし、バルブ１５２、１５４、１５５、１６１〜１６３を“開”とする。そして、この状態でバルブ１５２から空気を圧送し、バルブ１５４、１５５を介して第１フィルタ装置１５０内に残存する溶液を排出すると共に、バルブ１６２、１６３を介して第２フィルタ装置１６０内に残存する溶液を排出する。
【００３７】
（加圧用配管・加圧手段）
図１に示すように、加圧用配管１０２は、加圧手段１１１と接続されており、小容積室１３２及び大容積室１３１のそれぞれに加圧手段１１１で加圧された加圧用溶液を導入する。加圧用溶液は、例えば、水、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水などの中から、精製対象物であるタンパク質に応じて適宜選択して用いることができる。
加圧手段１１１は、加圧用溶液に１００ＭＰａ以上、好ましくは２５０ＭＰａ以上、より好ましくは３００ＭＰａ以上の圧力を印加できるものであればどのようなものも用いることができる。なお、加圧手段１１１で印加する圧力は、４００ＭＰａ以下であるのが好ましく、３９０ＭＰａ以下であるのがより好ましい。このような加圧手段１１１としては、例えば、加圧ポンプなどを用いることができるが、これに限定されない。
【００３８】
図１に示すように、本実施形態における加圧用配管１０２は、小容積室１３２と接続する経路Ｂ、及び大容積室１３１と接続する経路Ｃとを備えている。
経路Ｂに係る加圧用配管１０２は、開端部１０２ａから加圧手段１１１を経由して、当該加圧手段１１１とバルブ１２３との間の任意の位置１０２ｂで配管１０２ｃが接続されており、Ｔ字管となっている。そして、この配管１０２ｃは、その経路上にバルブ１２２が設けられており、他の端部が前記した配管１０１ｃの任意の位置１０１ｅで接続されている。
すなわち、経路Ｂに係る加圧用配管１０２は、開端部１０２ａから加圧手段１１１、任意の位置１０２ｂ、バルブ１２２が設けられている配管１０２ｃ、任意の位置１０１ｅで接続された配管１０１ｃ、及び端部１０１ｄを順に経由して、小容積室１３２に加圧用溶液を導入する。
【００３９】
経路Ｃに係る加圧用配管１０２は、開端部１０２ａから加圧手段１１１及び任意の位置１０２ｂを順に経由し、さらにバルブ１２３が設けられている配管１０２ｄを備えている。この配管１０２ｄは、任意の位置１０２ｅで配管１０２ｆが接続されており、当該任意の位置１０２ｅでもＴ字管となっている。そして、配管１０２ｆの先端１０２ｈが晶析容器１３０の大容積室１３１と接続されている。
すなわち、経路Ｃに係る加圧用配管１０２は、開端部１０２ａから加圧手段１１１、任意の位置１０２ｂ、バルブ１２３が設けられている配管１０２ｄ、任意の位置１０２ｅ、配管１０２ｆ、及び先端１０２ｈを順に経由して、大容積室１３１に加圧用溶液を導入する。
【００４０】
（回収用配管）
回収用配管１０３は、小容積室１３２及び大容積室１３１のうちの少なくとも一方と接続され、精製されたタンパク質を回収する。ここで、本実施形態における回収用配管１０３は、小容積室１３２及び大容積室１３１と接続され得るものであるが、説明の便宜上、はじめに、回収用配管１０３が小容積室１３２と接続されている態様について説明する。なお、この態様に係る回収用配管１０３を、図１、図４、図６〜図９に示す。なお、この回収用配管１０３は、後述する精製工程Ｓ３（図５参照）においては、晶析容器１３０内の溶液を排出する配管として兼用される（図８参照）。
【００４１】
（回収用配管の一態様）
図１に示すように、回収用配管１０３は、経路Ｄで図示しない回収容器内にタンパク質を回収する。
図１に示すように、経路Ｄに係る回収用配管１０３は、配管１０１ｃと、任意の位置１０１ｂで接続されている配管１０３ｂとを有する。配管１０３ｂは、その経路上にバルブ１２４が設けられている。配管１０３ｂは、開端部１０３ａから、図示しない回収容器に精製したタンパク質を回収する。
すなわち、この態様の回収用配管１０３は、配管１０１ｃ、任意の位置１０１ｂ、バルブ１２４が設けられている配管１０３ｂ、及び開端部１０３ａを順に経由して、回収容器内にタンパク質を回収する。なお、回収容器に回収されたタンパク質は、−２０〜４℃で保存される。
【００４２】
（ベント配管）
ベント配管１０４は、必要に応じて晶析容器１３０内に残存する溶液又は気体を排出する。ベント配管１０４は、配管１０２ｆと、任意の位置１０２ｅで接続されている配管１０４ｂとを有する経路Ｅで構成されている。配管１０４ｂは、その経路上にバルブ１２５が設けられている。配管１０４ｂは、開端部１０４ａから、前記したように晶析容器１３０内に残存する溶液又は気体を排出する。
【００４３】
［タンパク質精製方法］
次に、以上に説明した態様のタンパク質精製装置を用いたタンパク質精製方法を説明する。すなわち、回収用配管１０３が小容積室１３２と接続されている態様のタンパク質精製方法について説明する。
ここで、図５は、本実施形態に係るタンパク質精製方法の内容を説明するフローチャートである。
この態様のタンパク質精製方法は、図１に示すように、内設されたフィルタ１３３によって容積Ｖ２の小さい小容積室１３２と、容積Ｖ１の大きい大容積室１３１と、に分けられた晶析容器１３０を用いる方法である。図５に示すように、この態様のタンパク質精製方法は、充填工程Ｓ１と、印加工程Ｓ２と、精製工程Ｓ３と、回収工程Ｓ４と、を含み、これらの工程をこの順に行う。
以下、これらの工程の内容を図５と、適宜図１及び図６〜図９とを参照して、バルブ１２１〜１２５の開閉操作などと共に説明する。なお、図６〜図９は、前記した各工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。図６〜図９において、“閉”状態のバルブは黒色で表し、“開”状態のバルブは白色で表し、“半開”状態のバルブはドットで表している。なお、「半開」と記載しているが、開度は適宜調整されるものであり、５０％に限定されない。
【００４４】
（充填工程）
充填工程Ｓ１は、晶析容器１３０内にタンパク質を含む溶液を充填する工程である。充填工程Ｓ１は、図１、図６に示す経路Ａでタンパク質を含む溶液を晶析容器１３０内に導入する。
図６を参照して説明すると、充填工程Ｓ１は、バルブ１２２〜１２４を“閉”とし、バルブ１２１、１２５を“開”とする。この状態で開端部１０１ａからタンパク質を含む溶液を充填用配管１０１に導入すると、晶析容器１３０内の溶液又は気体を経路Ｅ（ベント配管１０４の開端部１０４ａ）で排出しつつ、タンパク質を含む溶液をバルブ１２１、任意の位置１０１ｂ、配管１０１ｃ、及び端部１０１ｄを順に経由して晶析容器１３０内に導入できる。タンパク質を含む溶液が晶析容器１３０を満たしたら、次の印加工程Ｓ２を行う。
なお、この充填工程Ｓ１を行う際に、タンパク質を含む溶液に結晶化助剤を添加することもできる。結晶化助剤としては、例えば、ポリエチレングリコールが挙げられるが、一般的に用いられているものを適宜選択して用いることができる。
【００４５】
（印加工程）
印加工程Ｓ２は、加圧用溶液を小容積室１３２に導入してタンパク質が析出する圧力を印加する工程である。印加工程Ｓ２は、図１、図７に示す経路Ｂで加圧用溶液を晶析容器１３０内に導入し、晶析容器１３０内のタンパク質を含む溶液に圧力を印加する。
【００４６】
図７を参照して説明すると、印加工程Ｓ２は、バルブ１２１、１２３〜１２５を“閉”とし、バルブ１２２を“開”とする。この状態で開端部１０２ａから加圧用溶液を導入し、加圧手段１１１で加圧する。加圧手段１１１で加圧された加圧用溶液は、任意の位置１０２ｂ、バルブ１２２が設けられている配管１０２ｃ、任意の位置１０１ｅで接続された配管１０１ｃ、及び端部１０１ｄを順に経由して晶析容器１３０の小容積室１３２に導入される。
【００４７】
印加工程Ｓ２における圧力は、図２及び図３を参照して説明したように、１００ＭＰａ以上とするのが好ましく、２５０ＭＰａ以上とするのがより好ましく、３００ＭＰａ以上とするのがさらに好ましい。また、圧力は４００ＭＰａ以下とするのが好ましい。さらに、前述したように、圧力の保持時間は５分以上とするのが好ましい。
【００４８】
印加工程Ｓ２を行うと、前述したように、晶析容器１３０内のタンパク質を含む溶液の体積を約１割圧縮できる（すなわち、タンパク質を含む溶液の体積を約９／１０に圧縮できる）。そのため、好適な態様として説明したように、大容積室１３１の容積Ｖ１を小容積室１３２の容積Ｖ２の９倍以上としておくと、晶析容器１３０内に充填したタンパク質を含む溶液のほぼ全量を大容積室１３１に押し込むことができ、小容積室１３２のほぼ全容積を加圧用溶液で満たすことができる。そして、これにより、前述したように、大容積室１３１内でタンパク質Ｐが析出・結晶化し、また、印加した圧力でウイルス不活化処理が行われる。
印加工程Ｓ２によるこのような処理が終わったら、次の精製工程Ｓ３を行う。
【００４９】
（精製工程）
精製工程Ｓ３は、印加工程Ｓ２で印加した圧力を維持しつつ、大容積室１３１に加圧用溶液を送液し、タンパク質を精製する工程である。つまり、精製工程Ｓ３における加圧用溶液の圧力は１００ＭＰａ以上とするのが好ましい。精製工程Ｓ３は、図１、図８に示す経路Ｃで加圧用溶液を晶析容器１３０内に導入して晶析容器１３０内のタンパク質Ｐを精製し、経路Ｄで晶析容器１３０内の溶液を排出する。
【００５０】
図８を参照して説明すると、精製工程Ｓ３は、バルブ１２１、１２２、１２５を“閉”とし、バルブ１２３を“開”とし、バルブ１２４は開度を適宜調整して“半開”とする。この状態で開端部１０２ａから加圧用溶液を導入し、加圧手段１１１で加圧する。なお、バルブ１２４が半開となっているため圧力が低下することから、前記した圧力を維持するため必要に応じて加圧手段１１１の出力を高めるなどして、晶析容器１３０内の圧力を維持するのが好ましい。
【００５１】
加圧手段１１１で加圧された加圧用溶液は、任意の位置１０２ｂ、バルブ１２３が設けられている配管１０２ｄ、及び任意の位置１０２ｅで接続された配管１０２ｆを順に経由して晶析容器１３０の大容積室１３１に導入される。大容積室１３１に導入された加圧用溶液は、それまで大容積室１３１に押し込まれていた溶液を小容積室１３２に向けて押し込む。そして、小容積室１３２に向けて押し込まれた溶液はさらに、端部１０１ｄから配管１０１ｃ、任意の位置１０１ｅ、任意の位置１０１ｂ、バルブ１２４が設けられている配管１０３ｂ、及び開端部１０３ａを順に経由して排出される。
【００５２】
精製工程Ｓ３は、印加工程Ｓ２で印加した圧力が維持されているので、溶液に含まれているタンパク質Ｐは析出・結晶化されたままである。従って、当該タンパク質Ｐはフィルタ１３３でトラップされ、大容積室１３１に残存するが、ウイルスはフィルタ１３３を透過し、小容積室１３２を経て晶析容器１３０外に排出される。所定時間この処理を行うことでタンパク質Ｐが洗浄され、純度を上げることができる（精製される）。
【００５３】
精製工程Ｓ３における加圧用溶液の流量（流速）は、晶析容器１３０内の流れ場が層流になるようにすることが好ましい。このようにすると、発生する渦によりタンパク質Ｐが乱流拡散し、フィルタ１３３で回収率が低下するのを抑制することができる。
晶析容器１３０内の流れ場を層流とするには、
ＵＤ／ν≦２０００      ・・・式（１）
を満たすように加圧用溶液の流量を制御するとよい。
なお、前記式（１）において、
Ｕ：単位秒当たりの溶液の移動距離［ｍ／ｓ］
Ｄ：晶析容器直径（内径）［ｍ］
ν：動粘度［ｍ２／ｓ］
である。
【００５４】
また、νは、次式（２）で表される。
ν＝μ／ρ      ・・・式（２）
なお、前記式（２）において、
μ：粘度［Ｐａ・Ｓ］
ρ：密度［ｋｇ／ｍ３］
である。
【００５５】
（回収工程）
回収工程Ｓ４は、精製したタンパク質Ｐを回収する工程である。図１及び図９を参照して説明すると、この態様における回収工程Ｓ４は、図１、図９に示す経路Ｃで加圧用溶液を晶析容器１３０内に導入して晶析容器１３０内のタンパク質を精製し、経路Ｄで晶析容器１３０内の溶液を排出する。これは、精製工程Ｓ３と同様である。回収工程Ｓ４と精製工程Ｓ３との違いは、晶析容器１３０に印加する圧力の高低である。
【００５６】
図９を参照して説明すると、回収工程Ｓ４は、精製工程Ｓ３と同様、バルブ１２１、１２２、１２５を“閉”とし、バルブ１２３を“開”とする。そして、バルブ１２４を精製工程Ｓ３の“半開”から“開”とする。この状態で開端部１０２ａから加圧用溶液を導入し、加圧手段１１１を使用して晶析容器１３０の大容積室１３１に導入する。バルブ１２４を“開”としたので、圧力が低下する。そのため、析出・結晶化したタンパク質Ｐは溶液に再溶解する。
【００５７】
溶液に再溶解したタンパク質は、大きさがフィルタ１３３の孔径よりも小さくなるので、溶液と共にフィルタ１３３を通過し、小容積室１３２に移動する。小容積室１３２に移動したタンパク質は、端部１０１ｄから配管１０１ｃ、任意の位置１０１ｅ、任意の位置１０１ｂ、バルブ１２４が設けられている配管１０３ｂ、及び開端部１０３ａを順に経由して、図９で図示しない回収容器に回収される。回収容器に回収されたタンパク質は、−２０〜４℃で保存される。
この回収工程Ｓ４を行った後、再度、前記した充填工程Ｓ１から回収工程Ｓ４までをこの順で順次繰り返す。このようにすると、連続してタンパク質の精製を行うことができる。
【００５８】
（他の態様に係る回収用配管）
ここまで、回収用配管１０３の一態様として、回収用配管１０３が小容積室１３２と接続されている場合について説明した。
次に、他の態様に係る回収用配管１０３として、回収用配管１０３が大容積室１３１と接続されている場合について説明する。なお、この態様に係る回収用配管を、図１０に示すように、「回収用配管１０６」と呼称する。なお、図１０は、他の態様に係るタンパク質精製装置の構成を説明する概略構成図である。
【００５９】
図１０に示すように、回収用配管１０６は、経路Ｆで図示しない回収容器内にタンパク質を回収する。
経路Ｆに係る回収用配管１０６は、配管１０２ｆを有している。配管１０２ｆは、先端１０２ｈが大容積室１３１と接続されており、他端が任意の位置１０２ｅで配管１０２ｄ及び配管１０４ｂと接続されている。また、この態様においては、任意の位置１０２ｅに配管１０６ｂが接続されている。この配管１０６ｂは、開端部１０６ａに至るまでの間にバルブ１２６が設けられている。
すなわち、この回収用配管１０６は、先端１０２ｈ、配管１０２ｆ、任意の位置１０２ｅ、バルブ１２６が設けられた配管１０６ｂ、及び開端部１０６ａを順に経由して、図示しない回収容器内にタンパク質を回収する。
【００６０】
当該他の態様を採用するタンパク質精製装置２００におけるその他の構成要素はタンパク質精製装置１００と同様であるため、タンパク質精製装置１００と同一の構成要素については同一の符号を付し、その説明を省略する。
【００６１】
（他の態様に係る回収用配管を採用した場合におけるタンパク質精製方法）
次に、他の態様に係る回収用配管１０６を採用した場合におけるタンパク質精製方法について説明する。
この態様に係るタンパク質精製方法も前述したタンパク質精製方法と同様、図５に示す充填工程Ｓ１と、印加工程Ｓ２と、精製工程Ｓ３と、回収工程Ｓ４と、を含み、これらの工程をこの順に行う。
但し、これらの工程におけるバルブの開閉操作が前述したものと異なるので、図１１〜図１４を参照して以下に説明する。なお、図１１〜図１４は、前記した各工程におけるバルブの開閉操作と、溶液が通流する経路の一例を説明する説明図である。図１１〜図１４において、“閉”状態のバルブは黒色で表し、“開”状態のバルブは白色で表し、“半開”状態のバルブはドットで表している。なお、「半開」と記載しているが、開度は適宜調整されるものであり、５０％に限定されない。
【００６２】
（充填工程）
充填工程Ｓ１は、図１１に示すように、バルブ１２２〜１２４、１２６を“閉”とし、バルブ１２１、１２５を“開”とする。この状態で開端部１０１ａからタンパク質を含む溶液を充填用配管１０１に導入すると、晶析容器１３０内の溶液又は気体を経路Ｅで排出しつつ、タンパク質を含む溶液をバルブ１２１、任意の位置１０１ｂ、配管１０１ｃ、及び端部１０１ｄを順に経由する経路Ａで晶析容器１３０内に導入できる。タンパク質を含む溶液が晶析容器１３０を満たしたら、次の印加工程Ｓ２を行う。
【００６３】
（印加工程）
印加工程Ｓ２は、図１２に示すように、バルブ１２１、１２３〜１２６を“閉”とし、バルブ１２２を“開”とする。この状態で開端部１０２ａから加圧用溶液を導入し、加圧手段１１１で加圧する。加圧手段１１１で加圧された加圧用溶液は、任意の位置１０２ｂ、バルブ１２２が設けられている配管１０２ｃ、任意の位置１０１ｅで接続された配管１０１ｃ、及び端部１０１ｄを順に経由する経路Ｂで晶析容器１３０の小容積室１３２に導入される。このようにすると、前述同様、大容積室１３１内でタンパク質Ｐを析出・結晶化させつつ、ウイルス不活化処理を行うことができる。
【００６４】
この印加工程Ｓ２における圧力は、前述同様、１００ＭＰａ以上とするのが好ましく、２５０ＭＰａ以上とするのがより好ましく、３００ＭＰａ以上とするのがさらに好ましい。また、圧力は４００ＭＰａ以下とするのが好ましい。さらに、前述したように、圧力の保持時間は５分以上とするのが好ましい。
【００６５】
（精製工程）
精製工程Ｓ３は、図１３に示すように、バルブ１２１、１２２、１２５、１２６を“閉”とし、バルブ１２３を“開”とし、バルブ１２４は開度を適宜調整して“半開”とする。この状態で開端部１０２ａから加圧用溶液を導入し、加圧手段１１１で加圧する。加圧手段１１１で加圧された加圧用溶液は、任意の位置１０２ｂ、バルブ１２３が設けられている配管１０２ｄ、任意の位置１０２ｅで接続された配管１０２ｆ、及び先端１０２ｈを順に経由する経路Ｃで晶析容器１３０の大容積室１３１に導入される。
【００６６】
前述した精製工程Ｓ３と同様、この精製工程Ｓ３は、印加工程Ｓ２で印加した圧力が維持されているので、溶液に含まれているタンパク質Ｐは析出・結晶化されたままである。従って、当該タンパク質Ｐはフィルタ１３３でトラップされて大容積室１３１に残存するが、ウイルスはフィルタ１３３を透過し、小容積室１３２を経てバルブ１２４が設けられている配管１０３ｂの開端部１０３ａから排出される。所定時間この処理を行うことでタンパク質Ｐが洗浄され、純度を上げることができる（精製される）。
【００６７】
（回収工程）
そして、この態様における回収工程Ｓ４は、図１４に示すように、バルブ１２１、１２３〜１２５を“閉”とし、バルブ１２２、１２６を“開”とする。この状態で開端部１０２ａから加圧用溶液を導入し、加圧手段１１１を使用して晶析容器１３０の小容積室１３２に導入する。大容積室１３１内にあるタンパク質Ｐは析出・結晶化した状態、及び一部が再溶解した状態で先端１０２ｈ、配管１０２ｆ、任意の位置１０２ｅ、バルブ１２６が設けられた配管１０６ｂ、及び開端部１０６ａを順に経由する経路Ｆで図示しない回収容器内にタンパク質を回収する。
【００６８】
この態様の回収工程Ｓ４は、精製したタンパク質Ｐの再溶解速度が遅い場合に好適である。つまり、精製したタンパク質Ｐを析出・結晶化した状態のまま一旦回収し、その後、時間をかけてゆっくり再溶解させることができる。
また、この態様の回収工程Ｓ４は、タンパク質Ｐを含む溶液を晶析容器１３０内に導入する経路と、精製したタンパク質Ｐを回収する経路とが異なっている。そのため、精製前のタンパク質を含む溶液にウイルスが含まれている場合であっても、精製後のタンパク質Ｐにウイルスがコンタミし難い点で好適である。
なお、この場合も加圧用溶液の流量は、晶析容器１３０内の流れ場が層流になるようにすることが好ましい。
【００６９】
以上に説明した本実施形態に係るタンパク質精製方法及びタンパク質精製装置は、内設されたフィルタ１３３によって容積Ｖ２の小さい小容積室１３２と、容積Ｖ１の大きい大容積室１３１と、に分けられた晶析容器１３０を用い、当該晶析容器１３０で所定の圧力を印加するので、タンパク質を精製しつつウイルス不活化処理を行うことができる。
【００７０】
（他の実施形態・変形例など）
以下に適宜図面を参照して、本発明に係るタンパク質精製方法及びタンパク質精製装置の他の実施形態・変形例などについてさらに説明する。
図１５は、晶析容器の一変形例を説明する概略断面図である。図１５に示すように、当該変形例に係る晶析容器１３０Ａは、フィルタ１３３が内設されている箇所の近傍にボルト及びナットのような着脱自在な固定具１３４、１３５が設けられている。すなわち、この固定具１３４、１３５を緩めたり、外したりすることで、フィルタ１３３の着脱が行えるようになっている。このようにすると、フィルタ１３３が目詰まり等した場合に交換することができる。
【００７１】
また、図１５に示すように、晶析容器１３０Ａは、小容積室１３２及び大容積室１３１のうちの少なくとも一方に、並行に対向させた２つの光透過部１３６、１３６を設けることができる。なお、図１５は、大容積室１３１に光透過部１３６、１３６を設けた様子を図示している。そして、この光透過部１３６、１３６に向けて光を照射する光照射部１３７と、この光照射部１３７から照射され、光透過部１３６、１３６を透過した光を受光する受光部１３８と、を設けることができる。なお、光照射部１３７と受光部１３８は、所謂吸光度計である。このようにすると、晶析容器１３０Ａでタンパク質の析出・結晶化を検知することができる。なお、光は、タンパク質の析出・結晶化を検知する観点から、濁度を検出に使用される可視光の波長帯が好ましく、波長は６００ｎｍ程度の可視光であることがより好ましい。
【００７２】
図１６は、本実施形態に係るタンパク質精製装置の変形例を説明する概略構成図である。また、図１７は、他の態様に係るタンパク質精製装置の変形例を説明する概略構成図である。
図１６に示すように、変形例に係るタンパク質精製装置１００Ａは、バルブ１２４の下流に吸光度計（ＵＶセンサ１４０）を設けたものである。タンパク質精製装置１００Ａは、このＵＶセンサ１４０でタンパク質の吸光度を測定することによって、溶液に含まれているタンパク質の濃度を検出できる。ここで、回収用配管１０３内を通流する溶液量や溶液の通流速度はバルブ１２４の開度や加圧手段１１１の圧力などから算出できる。従って、タンパク質が含まれている画分がＵＶセンサ１４０を通過した後、適宜のタイミングでバルブ１４１を“開”とし、バルブ１４２を“閉”とする（送液ラインを切り替える）ことで、タンパク質が含まれている画分を回収用の開端部１０３ａに送液できる。これとは反対に、タンパク質が含まれていない画分がＵＶセンサ１４０を通過した後、適宜のタイミングでこれとは逆の操作を行う（送液ラインを切り替える）ことで、タンパク質を含まない画分を廃棄用の開端部１０７に送液できる。従って、前記した変形例によれば、精製したタンパク質をより高濃度に得ることができる。
【００７３】
図１７に示すように、変形例に係るタンパク質精製装置２００Ａも前記と同様である。つまり、タンパク質精製装置２００Ａは、バルブ１２６の下流にＵＶセンサ１４０を設けたものである。従って、タンパク質精製装置２００Ａは、前記同様、タンパク質が含まれている画分がＵＶセンサ１４０を通過した後、適宜のタイミングでバルブ１４１を“開”とし、バルブ１４２を“閉”とする（送液ラインを切り替える）ことで、タンパク質が含まれている画分を回収用の開端部１０３ａに送液できる。これとは反対に、タンパク質が含まれていない画分がＵＶセンサ１４０を通過した後、適宜のタイミングでこれとは逆の操作を行う（送液ラインを切り替える）ことで、タンパク質を含まない画分を廃棄用の開端部１０７に送液できる。従って、前記した変形例によっても、精製したタンパク質をより高濃度に得ることができる。
【００７４】
また、図１８は、他の態様の変形例に係る晶析容器を説明する概略構成図である。図１９〜図２２は、他の態様の変形例に係る晶析容器を用いた場合における各工程の動作の一例を説明する説明図である。
図１８に示すように、他の態様の変形例に係るタンパク質精製装置３００の晶析容器１３０Ｂは、有底円管状の容器（晶析容器１３０（図１等参照））に替えて、プランジャを適用したものである。この晶析容器１３０Ｂは、内設されたフィルタ１３３によって容積Ｖ２の小さい小容積室１３２と、容積Ｖ１の大きい大容積室１３１と、に分けられている。
【００７５】
大容積室１３１には、ピストン１３０Ｐを介してバルブ１２３と加圧手段１１１が設けられた、開端部１０２ａを有する加圧用配管１０２が接続されている。
また、大容積室１３１には、ピストン１３０Ｐを介してバルブ１２５が設けられた開端部１０４ａを有するベント配管１０４が接続されている。
【００７６】
そして、小容積室１３２には、シリンダ１３０Ｓの底面にバルブ１２１が設けられた開端部１０１ａを有する充填用配管１０１が接続されている。
また、小容積室１３２には、シリンダ１３０Ｓの底面にバルブ１２７が設けられた開端部１０８ａを有する廃棄用配管１０８が接続されている。
さらに、小容積室１３２には、シリンダ１３０Ｓの底面にバルブ１２４が設けられた開端部１０３ａを有する回収用配管１０３が接続されている。
そして、タンパク質精製装置３００は、バルブ１２３と加圧手段１１１との間の任意の位置、及びシリンダ１３０Ｓの底面とバルブ１２１との間の任意の位置で接続された、バルブ１２２が設けられた配管１０２ｃを有している。
【００７７】
この変形例では、図１９に示すように、バルブ１２２〜１２４、１２７を“閉”とし、バルブ１２１、１２５を“開”とする。この状態で開端部１０１ａからタンパク質を含む溶液を導入することで、晶析容器１３０Ｂ内にタンパク質を含む溶液を充填できる（図５の充填工程Ｓ１に相当）。
【００７８】
この後、タンパク質を含む溶液の導入量が大容積室１３１とほぼ同量になったら、小容積室１３２を加圧用溶液で満たすため、下記の操作を行う。
すなわち、前記した状態から、バルブ１２１を“閉”とし、バルブ１２２を“開”とし（これらの状態については図示せず）、このバルブ１２２を経由して適宜の圧力を印加しつつ加圧用溶液を小容積室１３２に導入する。
【００７９】
加圧用溶液を小容積室１３２に導入し終えたら、図２０に示すように、全てのバルブ１２１〜１２５、１２７を“閉”とし、この状態でピストン１３０Ｐを押し込み、タンパク質を含む溶液に圧力を印加する（図５の印加工程Ｓ２に相当）。これにより、タンパク質を析出・結晶化しつつ、ウイルス不活化処理を行うことができる。なお、このときの圧力は、前記同様、１００ＭＰａ以上とする。また、圧力の印加時間は５分以上とするのが好ましい。
【００８０】
次いで、図２１に示すように、バルブ１２１、１２２、１２４、１２５を“閉”とし、バルブ１２３、１２７を“開”とする。この状態で開端部１０２ａから加圧用溶液を導入し、加圧手段１１１で圧力を印加して前記圧力を維持しつつ、加圧用溶液を大容積室１３１に導入する（図５の精製工程Ｓ３に相当）。この処理では、前記したように圧力が維持されているので、溶液に含まれているタンパク質は析出・結晶化されたままである。従って、当該タンパク質はフィルタ１３３でトラップされ、大容積室１３１に残存する。所定時間この処理を行うことでタンパク質が洗浄され、純度を上げることができる。なお、このときの加圧用溶液の流量は、前述したように、晶析容器１３０Ｂ内の流れ場が層流になるようにすることが好ましい。
【００８１】
所定時間、前記処理を行ったら、図２２に示すように、バルブ１２１、１２２、１２５、１２７を“閉”とし、バルブ１２３、１２４を“開”とする。この状態で開端部１０２ａから加圧用溶液を導入し、加圧手段１１１を使用して晶析容器１３０Ｂの大容積室１３１に導入する。この場合の圧力は、析出・結晶化したタンパク質が再溶解する程度に低くすればよく、任意に調整できる。溶液に再溶解したタンパク質は、溶液と共にフィルタ１３３を通過し、小容積室１３２に移動する。小容積室１３２に移動したタンパク質は、バルブ１２４が設けられている回収用配管１０３、及び開端部１０３ａを順に経由して、図２２において図示しない回収容器に回収される。
【００８２】
このような変形例においても、内設されたフィルタ１３３によって容積Ｖ２の小さい小容積室１３２と、容積Ｖ１の大きい大容積室１３１と、に分けられた晶析容器１３０Ｂを用い、当該晶析容器１３０Ｂで所定の圧力を印加するので、タンパク質を精製しつつウイルス不活化処理を行うことができる。
【００８３】
以上、本発明に係るタンパク質精製方法及びタンパク質精製装置について、実施形態及び実施例により説明したが、これらは本発明を分かり易く説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００８４】
１００、１００Ａ、２００、２００Ａ  タンパク質精製装置
１０１  充填用配管
１０２  加圧用配管
１０３、１０６  回収用配管
１０４  ベント配管
１０８  廃棄用配管
１１１  加圧手段
１２１〜１２７  バルブ
１３０、１３０Ａ、１３０Ｂ  晶析容器
１３０Ｐ  ピストン
１３０Ｓ  シリンダ
１３１  大容積室
１３２  小容積室
１３３  フィルタ
１４０  ＵＶセンサ（吸光度計）
Ｓ１    充填工程
Ｓ２    印加工程
Ｓ３    精製工程
Ｓ４    回収工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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