(57)【要約】      （修正有）【課題】発毛促進及び／又は脱毛の改善並びに治療のための生体植立用インプラントの提供。【解決手段】発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を含む、生体植立用インプラント。前記幹細胞は、低酸素条件下で培養された幹細胞、特に、羊水由来幹細胞（好ましくは逆分化羊水幹細胞）又は胎児由来間葉系幹細胞であることが好ましい。前記発毛機能性のサイトカインは、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＧＦ及びＷｎｔ７ａで構成される群から選択される。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を含む、生体植立用インプラント。
【請求項２】
脱毛の治療または改善のための、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項３】
発毛促進のための、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項４】
前記発毛機能性のサイトカインはｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＧＦ及びＷｎｔ７ａで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項５】
前記幹細胞は、低酸素条件下で培養された幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項６】
前記幹細胞は、羊水由来幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項７】
前記幹細胞は、逆分化羊水幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項８】
前記幹細胞は、胎児由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項９】
前記生体植立用インプラントは、前記幹細胞を１．０×１０3ないし１．０×１０10個含むことを特徴とする、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項１０】
頭皮下に植立されることを特徴とする、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項１１】
前記生体植立用インプラントは、老化による脱毛の治療または改善のためのものである、請求項１に記載の生体植立用インプラント。
【請求項１２】
発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を生体植立用インプラント内に注入する段階を含む、
脱毛改善のための生体植立用インプラントの製造方法。
【請求項１３】
発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を生体植立用インプラント内に注入する段階を含む、
脱毛治療のための生体植立用インプラントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発毛促進用インプラントに関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪は、頭の保護、外見の影響、頭の温度維持など、人の体において様々な働きを担っており、生命維持に大切な器官ではないが、健康状態の尺度であり外見を決定する身体の重要な一部分である。脱毛は、老化現象のひとつに認識されてきたが、最近、色んな遺伝的要因とともにストレス、西洋型食生活、栄養の不均衡、社会活動の変化など、多様な原因によって脱毛が進むことが明らになっている。
【０００３】
毛髪は、頭皮の基底部にある基質細胞の継続的増殖により、肌が陥入している構造である毛包で生成されて、多様な成長段階を含む毛周期を有する。毛髪は、正常毛髪の９０％を占める成長期（ａｎａｇｅｎ、ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｈａｓｅ）、生長停止と毛根が萎縮する退行期（ｃａｔａｇｅｎ、ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｐｈａｓｅ）、毛球が乾いて棍毛になる休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ、ｒｅｓｔｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）、それから脱落期（ｅｘｏｇｅｎ）という、４段階の成長周期に従って成長および脱毛を繰り返す。
【０００４】
脱毛の原因は、遺伝的要因とストレス及び老化などがあるが、その代表的なひとつは、男性ホルモンであるｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（Ｔ）が５α−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＲＤ）によりｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＴ）に転換されて、頭皮の毛包を萎縮させて脱毛を誘発することである。年をとると、ＤＨＴが増加して毛包細胞のタンパク質合成が遅延され、これにより休止期の毛包の割合が増えながら脱毛が早く進むと言える。また、老化が進むと、毛包の乳頭部でケラチンを分泌する幹細胞が破壊されて、幹細胞の供給が減る。これによって、脱毛が促進される。
【０００５】
毛髪の形成は、周期的に循環するパターンを有する。すなわち、正常毛髪の９０％を占める成長期（ａｎａｇｅｎ、ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｈａｓｅ）、生長停止と毛根が萎縮する退行期（ｃａｔａｇｅｎ、ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｐｈａｓｅ）、毛球が乾いて棍毛になる休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ、ｒｅｓｔｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）、それから脱落期（ｅｘｏｇｅｎ）など、４段階の毛周期（ｈａｉｒ ｃｙｃｌｅ）を踏みながら毛髪は成長および脱毛を繰り返えす。特に、退行期の間、多くの毛包は、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が進行され、休止期に入りながら毛包の大きさが小さくなる。
【０００６】
このような脱毛症状を改善・治療するために開発された方法では、発毛を促進する物質（合成物質、天然物、細胞培養液、またはその抽出物など）を塗る方法、毛髪を移植する方法、自分の幹細胞を注射する方法などがある。例えば、脱毛治療剤としては、ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）塗布剤が広く使用されており、韓国登録特許１０−１４９８２０１号では、サキブトミル抽出物を有効成分として含む脱毛防止または発毛改善用組成物が記載されており、韓国登録特許１０−１４８４０３３号では、ピーナッツ種皮の抽出物を含む脱毛防止または発毛促進用組成物について記載されている。
【０００７】
また最近は、幹細胞培養液を利用した治療に対する関心が高まっているが、これは、毛髪の成長を促進する成長因子が間葉系幹細胞を利用した培養液に豊かに含まれていることに基づく。
【０００８】
しかし、このような方法は、毛根がなくなり、毛包を改めて形成する必要がある場合にはその効果が制限的であるか、繰り返して塗るか注射しなければならず、困難である。また、毛髪が改めて形成されるためには、関連成長因子の持続的な供給が重要であるが、注射や塗る方法は、一回性に過ぎないため持続的な供給が難しくて、間葉系幹細胞も持続的な成長に限界がある。
【０００９】
ここで、本発明者たちは、毛髪の成長に必要な成長因子を生体内で持続的に供給する方法を研究するうち、特定条件下で培養した幹細胞を生体植立用インプラントを利用して植立する場合、ｂＦＧＦのような幹細胞の成長促進因子を体内に持続的に供給して、毛包の乳頭部で幹細胞の成長を誘導することで、幹細胞が長期間にかつ効果的に作用することを確認したうえで本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、発毛促進及び／または脱毛の改善及び治療のための生体植立用インプラントを提供することである。
【課題を解決しようとする手段】
【００１１】
上記目的のため本発明は、発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を含む生体植立用インプラントを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のインプラントは、生体に植立して発毛機能性を有する成分を分泌することで、長期間の発毛促進及び脱毛の改善／治療を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＡＦ−Ｎを付着細胞培養を利用して培養する方法（図１Ａ）及びＡＦ−Ｎをテラサイトに注入して培養する方法（図１Ｂ）を示す。
【図２】培養方法による調整培地内のｂＦＧＦ濃度を示す（１：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、２：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、３：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個、４：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、５：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、６：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個）
【図３】培養方法による調整培地内のｂＦＧＦ濃度を示す（１：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、２：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、３：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個、４：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、５：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、６：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個）。
【図４】培養方法による調整培地内のＰＤＧＦ−ＡＡ濃度を示す（１：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、２：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、３：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個、４：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、５：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、６：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個）。
【図５】培養方法による調整培地内のＩＧＦ濃度を示す（１：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、２：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、３：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個、４：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、５：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、６：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個）。
【図６】培養方法による調整培地内のＷｎｔ７ａ濃度を示す（１：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、２：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、３：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個、４：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、５：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、６：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個）。
【図７】実施例１ないし４の幹細胞をテラサイトに注入するとき、細胞の生存率を示す。
【図８】マウスを利用した幹細胞が注入されたテラサイトの生体機能性を確認する過程を示す模式図である。
【図９】１次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後、テラサイトを植立して発毛誘導効果を確認した写真である。
【図１０】２次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後、テラサイトを植立して発毛誘導効果を確認した写真である。このとき、発毛の効果が確認された低酸素培養幹細胞のみを比較した。
【図１１】３次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後、テラサイトを植立して発毛誘導効果を確認した写真である。このとき、発毛効果が確認された低酸素培養幹細胞のみを比較した。
【図１２】対照群を追加して１次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後、テラサイトを植立して発毛誘導効果を確認した写真である。
【図１３】老化マウスモデルで１次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後、テラサイトを植立して毛髪の成長期誘導を比較した写真である。
【図１４】老化マウスモデルで２次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後、テラサイトを植立して毛髪の成長期誘導を比較した写真である。
【図１５】組織内に植立して９日後、テラサイトの内部の逆分化羊水幹細胞の形態を見せる。
【図１６】各グループ当たり肌組織の毛包形成差を分析した結果である。
【図１７】各グループの肌組織のＡＰ染色によるＨＦＤＰ細胞の活性度を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を含む生体植立用インプラントに関する。
【００１５】
また本発明は、発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を生体植立用インプラント内に注入する段階を含む、脱毛改善のための生体植立用インプラントの製造方法に関する。
【００１６】
また本発明は、発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を生体植立用インプラント内に注入する段階を含む、脱毛治療のための生体植立用インプラントの製造方法に関する。
【００１７】
また本発明は、発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を生体植立用インプラント内に注入する段階を含む、発毛促進のための生体植立用インプラントの製造方法に関する。
【００１８】
また本発明は、本発明のインプラントを生体に植立する段階を含む脱毛改善方法に関する。
【００１９】
また本発明は、本発明のインプラントを生体に植立する段階を含む脱毛治療方法に関する。
【００２０】
また本発明は、本発明のインプラントを生体に植立する段階を含む発毛促進方法に関する。
【００２１】
また本発明は、脱毛治療、脱毛改善または発毛促進のための発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を含む生体植立用インプラントの用途に関する。
【００２２】
以下、本発明について詳説する。
【００２３】
発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞
【００２４】
本発明の発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞は、羊水由来幹細胞であることが望ましい。これは、羊水内の細胞が成長ホルモンを分泌するからである。また、本発明の発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞は、逆分化羊水幹細胞であることが望ましい。また、本発明の発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞は、胎児由来間葉系幹細胞であることが望ましい。さらに望ましくは、本発明の発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞は、胎児由来逆分化間葉系幹細胞である。
【００２５】
前記逆分化幹細胞は、従来に知られた逆分化方法を利用して作ればよいし、特に制限されるものではない。例えば、本発明の逆分化幹細胞は、逆分化因子を間葉系幹細胞に導入して作ることができる。かかる逆分化因子も特に制限されないが、検証されたものを利用するほうが安全性かつ効率上好ましい。例えば、本発明の逆分化幹細胞は、逆分化因子としてＯｃｔ４、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｓｏｘ、Ｎａｎｏｇなどを利用して製造することができ、望ましくは、本発明の逆分化幹細胞は、Ｎａｎｇｏ遺伝子を利用して作ることができる。本発明の逆分化幹細胞は、逆分化されない幹細胞に比べて成長期間が増加して、成長分裂回数が増え、成長因子分泌が促進されたという特徴がある。
【００２６】
前記発毛機能性のサイトカインは、発毛促進効能、脱毛治療効能、脱毛抑制効能、脱毛改善効能を有するサイトカインを指す。前記サイトカインはｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＧＦ及びＷｎｔ７ａで構成される群から選択される。
【００２７】
前記幹細胞は、低酸素条件下で培養された幹細胞であることが望ましい。このとき、低酸素条件とは、大気圧下の酸素濃度より低い酸素条件を意味し、望ましくは酸素濃度が０．０１％ないし８％である条件、さらに望ましくは０．０５％ないし５％である条件、さらに望ましくは０．１０％ないし３％である条件を指す。
【００２８】
このとき、培養は、生体植立用インプラント内の培養であり、一般的な付着細胞培養で、望ましくは一般的な付着細胞培養である。
【００２９】
生体植立用インプラント
【００３０】
本発明の生体植立（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）用インプラントは、生体適合性メンブレンで製造される薄膜ポリマーチャンバーである。前記生体植立用インプラントは、生体内移植のための容器、すなわち生体移植容器であって、幹細胞を注入できる空間があり、薄膜を通して幹細胞が作り出した物質、特にサイトカインをインプラントの外に分泌する。前記インプラントは、幹細胞を植立された対象が拒否することから保護して、皮下に移植されるとき、メンブレンに近い毛細血管の形成を誘導する血管新生機能を有することが望ましい。前記血管新生機能によりインプラントは、薄膜内の幹細胞に栄養及び血液を提供する。前記インプラントは、生体親和的な、すなわち免疫反応を誘発しない素材で製造することが望ましい。かかる素材は、既に広く知られており、例えばポリウレタンなどである。前記インプラントは、微細な穴が複数表面に位置する多孔性表面を有することが望ましいが、このとき、穴は、細胞のような大きい物質は通過できないもののタンパク質や栄養素は出入り可能な大きさであることが望ましい。したがって、前記穴を通してインプラント内に注入された幹細胞がインプラントの外に出ることができず、幹細胞による癌誘発を防止する一方、幹細胞の分泌物である成長促進因子は、血液に放出されて周りに血管が形成され、酸素及び栄養素がインプラント内に供給される。これにより、幹細胞の生存期間が意味ありに増加することになる。前記インプラントはまた、植立後、長い時間が経過した後にも除去しやすい。前記インプラントは、前記条件を満たす市販の製品を購入して使用するか製作して使用すればよい。例えば、前記インプラントは、テラサイト（ＴｈｅｒａＣｙｔｅTM）であることが望ましい。
【００３１】
本発明の生体植立用インプラントは、脱毛の治療または改善のためのものである。また、本発明の生体植立用インプラントは、発毛促進のためのものである。このとき、本発明の生体植立用インプラントは、老化による脱毛を治療または改善するためのものである。また、本発明の生体植立用インプラントは、老化による脱毛に苦しむ患者において発毛促進のためのものである。
【００３２】
本発明の生体植立用インプラントは、本発明の幹細胞を１．０×１０3ないし１．０×１０10個含み、このとき、培養した幹細胞自体をインプラント内に注入する。しかし、本発明は、幹細胞自体が生体内で長期間作動するものであり、幹細胞の培養液をインプラント内に注入するものではない。本発明の幹細胞は、透過性膜を有するインプラント内に注入されて植立されるところ、生存に必要な酸素及び栄養を植立された対象の血液を通して供給されるからである。また、インプラント内に培養液を注入するよりは、その分幹細胞をさらに注入することが発毛促進及び脱毛の防止／改善／治療に一層効率的であるからである。
【００３３】
本発明は、本発明の生体植立用インプラントに本発明の幹細胞を注入して植えることで、免疫拒否反応や癌細胞が発生するリスクなしに毛髪の形成を増進させることができる。
【００３４】
本発明の生体植立用インプラントは、生体、望ましくは頭皮下（皮下）に植立されることが望ましい。このとき、本発明の生体植立用インプラントを移植される対象は、人を含む動物であり、特に脱毛に苦しむ人である。
【００３５】
発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を生体植立用インプラント内に注入する段階
【００３６】
本発明は、発毛機能性のサイトカイン分泌能を有する幹細胞を生体植立用インプラント内に注入する段階を含む、発毛促進／脱毛治療／脱毛改善／脱毛抑制のための生体植立用インプラントの製造方法に関する。前記注入方法自体は、従来のインプラント内の細胞注入方法を用いればよいし、特に制限されるものではない。
【００３７】
本発明の利点及び特徴、それにそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下に開示される実施例に限定されるものではなく、様々な異なる形態に具現されるものであり、但し、本実施例は、本発明の開示を完全なものにして、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであって、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【００３８】
＜材料及び方法＞
【００３９】
実験動物
【００４０】
実験動物としては、６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた。一方、老化モデル試験のためには１３週齢以上の老化したＣ５７ＢＬ６マウスモデルを用いた。
【００４１】
Ｎａｎｏｇ導入の羊水由来逆分化再活力間葉系幹細胞
【００４２】
Ｎａｎｏｇ遺伝子を導入して確立した羊水由来逆分化再活力間葉系幹細胞（Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｗｉｔｈ ｎａｎｏｇ；以下、ＡＦ−Ｎ）は、羊水由来胎児間葉系幹細胞にレトロウイルスベクターを利用してＮａｎｏｇ遺伝子を導入し、Ｎａｎｏｇ遺伝子の過発現を誘導して製作した。以下、前記Ｎａｎｏｇ遺伝子を導入して確立した羊水由来逆分化再活力間葉系幹細胞を「ＡＦ−Ｎ」と称する。
【００４３】
幹細胞の培養
【００４４】
羊水幹細胞は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌ ｓｅｌｅｎｉｕｍ、５０ｕｇ／ｍｌ ｖｉｔａｍｉｎＣの培地で培養した。
【００４５】
羊水幹細胞のテラサイト内注入
【００４６】
１００ｍｍ細胞培養皿において、それぞれの羊水幹細胞群を付着培養容器の表面を７０〜８０％覆うまで培養した後、細胞数を数えて１．０×１０7個の細胞を２０ｕｌ  ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭに懸濁させて、２２Ｇ  ｎｅｅｄｌｅを利用してテラサイト内に注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）する。この後、強力接着剤で入口を密封する。
【００４７】
テラサイト植立（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）
【００４８】
マウスを痲酔した後、背中の右側に１０ｍｍほど穴を作り、その内部にテラサイトを挿入する。その後、縫合用シルク糸で縫うかｗｏｕｎｄ  ｃｌｉｐを用いて怪我を縫合する。
【００４９】
ＣＣＫ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ）
【００５０】
実験群に含まれたマウスを犠牲させて、植立されたテラサイトを分離した後、外部をＰＢＳできれいに洗滌する。その後、ＡＦ成長培地とＣＣＫ１００ｕｌを一緒にｍｉｘした後に３０分間培養する。培養された培地を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）した後、４５０ｎｍの波長ａｂｓｏｒｂａｎｃｅを測定する。
【００５１】
＜実施例１＞
【００５２】
Ｎａｎｏｇ遺伝子が導入されていない羊水幹細胞を普通の酸素条件（Ｎｏｒｍｏｘｉａ）下で培養して、羊水幹細胞を得た。
【００５３】
＜実施例２＞
【００５４】
ＡＦ−Ｎ（Ｎａｎｏｇ遺伝子を導入して確立した逆分化羊水幹細胞）を普通の酸素条件（Ｎｏｒｍｏｘｉａ）下で培養して、羊水幹細胞を得た。
【００５５】
＜実施例３＞
【００５６】
Ｎａｎｏｇ遺伝子が導入されていない羊水幹細胞を１％酸素濃度のＨｙｐｏｘｉａ（低酸素）条件で培養して、羊水幹細胞を得た。
【００５７】
＜実施例４＞
【００５８】
ＡＦ−Ｎ（Ｎａｎｏｇ遺伝子を導入して確立した逆分化羊水幹細胞）を１％酸素濃度のＨｙｐｏｘｉａ（低酸素）条件で培養して、羊水幹細胞を得た。
【００５９】
＜実験例１＞テラサイトに注入したＡＦ−ＮのサイトカインｂＦＧＦの分泌確認
【００６０】
ＡＦ−Ｎの培養方法に従って得られた調整培地内の発毛機能性のサイトカインｂＦＧＦ濃度差を評価した。具体的には、それぞれ１．０×１０5個、４×１０5個、１．０×１０6個であり、ＡＦ−Ｎ幹細胞数を異にして、これらを一般的な幹細胞培養方法である付着細胞培養を利用して培養した場合（図１Ａ）とＡＦ−Ｎをテラサイトに注入して培養した場合（図１Ｂ）、それぞれ調整培地内のｂＦＧＦ濃度をＥＬＩＳＡ分析方法を利用して測定した。
【００６１】
その結果、付着細胞培養（ａｔｔａｃｈｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を利用して培養した場合、細胞数の増加によってｂＦＧＦ濃度が増加したが、ＡＦ−Ｎをテラサイトに注入して培養した場合、注入した細胞数の増加によってｂＦＧＦの分泌量が増加しておらず、調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）内のｂＦＧＦ濃度が一定に維持された（図２）。
【００６２】
これは、ＡＦ−Ｎをテラサイトに注入して培養する場合も、付着細胞培養を利用して一般的に細胞培養することと同様、テラサイトの内部に注入された幹細胞から分泌された発毛機能性のサイトカインが、テラサイト膜を通過してテラサイトの外部に分泌されることを意味する。したがって、テラサイトが発毛機能性を制限せず、発毛剤の伝達手段として活用されることが確認された。
【００６３】
一方、ＡＦ−Ｎをテラサイトに注入して培養する場合、ｂＦＧＦの分泌量が大きな変化なしに一定に維持される理由としては、１）テラサイトの内部という制限した空間内で幹細胞が生長するため、細胞の物質代謝が付着細胞培養の場合と差異が出るためであるか、または２）テラサイトは、空間的に制限されているだけでなく、サイトカインが排出される通路も制限されているため、通路のボトルネック現象により、決まった時間内に通過できる量が制限されたという、二つの理由が提示された。
【００６４】
したがって、ＡＦ−Ｎをテラサイトに注入して培養する場合、ｂＦＧＦの調整培地内の濃度が一定である理由は、サイトカインがテラサイト膜を通して通過可能な量が飽和されたからであるか否かについて追加実験を通じて確認した。
【００６５】
＜実験例２＞テラサイトに注入したＡＦ−Ｎの発毛機能性のサイトカイン分泌の確認
【００６６】
前記実験例１においてＡＦ−Ｎをテラサイトに注入して培養する場合、ｂＦＧＦの調整培地内の濃度が一定である理由は、サイトカインがテラサイト膜を通して通過可能な量が飽和されたからであるか否かを確認して、マウスに植立するとき、テラサイトに注入する幹細胞数を決定するために、前記実験例１と同様な方法でＡＦ−Ｎを培養して、得られた調整培地内の発毛機能性のサイトカイン濃度を測定した。このとき、測定したサイトカインはｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＧ及びＷｎｔ７ａであり、これらは発毛を促進する成長因子として知られている。
【００６７】
その結果、ｂＦＧＦの場合と同様、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＷｎｔ７ａの場合も、付着細胞培養の場合には、注入する細胞数が増加するにつれて排出されるサイトカイン量が増加したが、テラサイト内で培養した場合には、サイトカイン量が増加することは観察されたものの、付着細胞培養と比較したとき、増加幅は比較的小さかったことが確認された。
【００６８】
一方、ＩＧＦの場合は、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、Ｗｎｔ７ａとは違って、付着細胞培養条件では、注入する細胞数の増加に関係なく濃度が一定してから減少することを観察することができ、テラサイト内で培養される条件では、注入する細胞数の増加によって調整培地内のＩＧＦ濃度が持続的に増加することを確認した（図３：ｂＦＧＦ、図４：ＰＤＧＦ−ＡＡ、図５：ＩＧＦ、図６：Ｗｎｔ７ａ）（１：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、２：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、３：付着細胞培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個、４：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０5個、５：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ４×１０5個、６：テラサイトに注入して培養したＡＦ−Ｎ１．０×１０6個）。
【００６９】
こういうことから、テラサイト内でサイトカインが排出される通路が飽和状態に到逹していないと判断された。したがって、調整培地内のサイトカイン濃度がテラサイトに注入した細胞数の増加につれて増加しない理由は結局、テラサイトという空間的制限が幹細胞の代謝に影響を及ぼすからであると考えられた。
【００７０】
上記結果を総合してみると、体外環境条件でテラサイトに注入する細胞数が増加するにつれて、一部の毛髪機能性のサイトカインの測定値が増加しており、またイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）状態では、血清がテラサイト膜を通過して幹細胞に供給されて、幹細胞の代謝を活性化させ、さらに多くのサイトカインが排出される可能性があるため、テラサイトに注入する細胞数を勧める量のうち一番多い１．０×１０7個に設定し、追って実験した。すなわち、この後のｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、１．０×１０7個の幹細胞をテラサイトに注入した後、マウスに植立して試験した。
【００７１】
＜実験例３＞テラサイト内の細胞生存能評価
【００７２】
実施例１ないし４の幹細胞をテラサイトにそれぞれ１．０×１０7個ずつ注入した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルの肌に植立した。そして、植立して１４日後、植立されたテラサイトを回収してＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔを利用して注入した個別幹細胞を評価した。
【００７３】
Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（ＣＣＫ）は、高い水溶性を示すｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ塩（ＷＳＴ−８）がＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅにより還元されながら放出するｆｏｒｍａｚａｎ ｄｙｅのせいで色が変化することを通じて、細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙを敏感に測定することができる。
【００７４】
また、（１）テラサイト（生体移植容器）で測定した場合（テラサイトに表示）及び（２）テラサイトに羊水由来間葉系幹細胞（ＡＦ）を１．０×１０7個入れてすぐに測定した場合（陽性対照群であり、Ｐｏｓｉｔｉｖｅに表示）を使用して比較した。前記（１）は、ＡＦをテラサイトに入れてマウスに植えず、ＡＦをテラサイトに入れてすぐに幹細胞の生存能を測定したものであり、前記（２）は、Ｎａｎｏｇ遺伝子を導入せず、普通の酸素条件下で培養した羊水幹細胞をテラサイトに入れたものである。すなわち、前記（１）及び（２）は、マウスに植えていない群である。
【００７５】
その結果、実施例１ないし４の羊水幹細胞は、いずれも細胞の注入なしにテラサイトだけで測定した場合より高い細胞生存能の測定値を見せており、これは、植立して１４日後も幹細胞が生存していることを意味する。またこれは、注入された幹細胞がテラサイト膜により保護されて、免疫拒否反応の影響を受けなかったことを意味する。
【００７６】
一方、実施例１ないし４の結果をそれぞれ比較してみると、逆分化羊水幹細胞が羊水幹細胞より高い生存能をみせて、普通の酸素濃度よりは低濃度の酸素条件で育てた幹細胞がさらに高い生存能を見せた。
【００７７】
実施例３の羊水幹細胞の場合、植立して１４日後に測定したにもかかわらず、普通の酸素濃度で育てた実施例１と大きな差異はなかった。したがって、低酸素条件で培養した逆分化羊水幹細胞が脱毛治療剤として開発するに一番好適であると判断された（図７）。
【００７８】
＜実験例４＞
【００７９】
毛髪機能性を確認するに主に利用されるＣ５７ＢＬ／６マウスは、色素を作るメラニン細胞が表皮には存在せず毛包にのみ存在するため、毛包のメラニン色素量により肌色が決まる特性を有している。毛包におけるメラニン色素の合成は、成長期にのみ成されるため、成長期には肌色が黒色になり、メラニン色素の合成が成されない退行期及び休止期には、肌色が桃色になるため、肌の組織検査なしに肌色を通じて毛周期を確認できるという特長がある。
【００８０】
本発明では、実施例１ないし４の羊水幹細胞を１．０×１０7個ずつテラサイトに注入して、１次毛引き抜き（ｐｌｕｃｋｉｎｇ）後、二番目の毛髪成長期（ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅ）が始まるＣ５７ＢＬ／６マウスにこれを植立して、発毛機能性を評価した。このとき、何ら試料を処理していないマウス（無処理群）を対照群として毛髪の成長様態を観察した。図８は、かかるマウス体内の機能性を確認する過程の模式図である。
【００８１】
その結果、実施例３及び実施例４の羊水幹細胞をテラサイトに注入して植立した場合が、他の実験群（実施例１及び２、対照群である無処理群）に比べて発毛機能性効果が高いと表れた（図９）。
【００８２】
これは、低酸素条件でサイトカインの分泌量が増加することが、発毛機能性に組み合わせて影響を及ぼすためであると解釈できる。一方、テラサイトの植立により動物モデルに大きい怪我をしており、これは発毛機能性に影響を及ぼす部分であるため、怪我が治ってからｐｌｕｃｋｉｎｇした後、改めて発毛機能性を評価した。
【００８３】
先に決めたとおり怪我が治った後、ｐｌｕｃｋｉｎｇ後に観察した結果、２次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後、７日目から実施例３及び実施例４の羊水幹細胞をテラサイトに注入して植立した場合、１次ｐｌｕｃｋｉｎｇした場合と同様、対照群に比べてａｎａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎが明確に表れたことを確認した（図１０）。
【００８４】
また、３次ｐｌｕｃｋｉｎｇして毛髪の誘導効果を観測したが、１次及び２次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後に観察した結果に類似する結果が出た。すなわち、実施例３及び実施例４をテラサイトに注入して植立した場合、植立して８日目から対照群に比べてａｎａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎの差異が出て、１２日後はさらに明確になった。また、１次及び２次ｐｌｕｃｋｉｎｇ後に植立した場合に比べて、ａｎａｇｅｎが進むａｒｅａの大きさが広くなったことが観察されたが、特に、実施例３より実施例４の逆分化羊水幹細胞を注入した場合がａｎａｇｅｎ  ａｒｅａがさらに大きく増加したことを確認した（図１１）。
【００８５】
かかる結果を総合してみると、幹細胞をテラサイトに注入して植立すれば、発毛機能性効果を持続的に維持できることを確認した。特に、実施例４の低酸素条件下で培養した逆分化羊水幹細胞を注入した場合が、発毛機能性の効果が一番良いことを確認した。
【００８６】
＜実験例５＞
【００８７】
前記実験例４の実験群に幾つの対照群を追加して同様に実験した。具体的には、Ｔｈｅｒａｃｙｔｅの植立により発生する怪我が発毛機能性に及ぼす影響を確認するように、幹細胞の注入なしにＴｈｅｒａｃｙｔｅのみを植立した場合を追加陰性対照群に設定した（Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ ｏｎｌｙ）。また、毎日、逆分化羊水幹細胞培養液（幹細胞数：１．０×１０7個）をマウスの肌に塗抹した場合を対照群に用いた（塗抹）。また、大きい怪我の縫合に好適なｗｏｕｎｄ  ｃｌｉｐを利用して、効率的な怪我の縫合が成されるようにした。その他は、前記実験例５と同様な条件及び方法で実験した。実施例１ないし４の幹細胞も実験例４と同様、Ｔｈｅｒａｃｙｔｅに注入する細胞数は、約１．０×１０7個になるように計算して行った。前記植立は、１次毛引き抜き（ｐｌｕｃｋｉｎｇ）後、二番目の毛髪成長期（ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅ）が始まるＣ５７ＢＬ／６マウスに行った。
【００８８】
その結果、実験例４と同様、テラサイトを利用するとき、幹細胞の発毛機能性効果を持続的に維持することができ、特に、実施例４の逆分化羊水幹細胞をテラサイトに注入して植立した場合、発毛効果が一番優れていることが確認された（図１２）。
【００８９】
＜実験例６＞
【００９０】
前記実験結果によって、テラサイトに注入された逆分化羊水幹細胞が発毛機能性があることを確認した。したがって、実際に脱毛が多く進む高齢者の脱毛患者と類似する特性を有する老化したマウス脱毛モデルを利用して発毛能を評価した。
【００９１】
このため、１３週齢以上の老化したＣ５７ＢＬ６マウスモデルを用意した。前記マウスモデルは、別途処理しなくても自発して脱毛が進む特徴を有しながら、毛髪成長周期及び判定が容易であり、同実験に好適であると判断した。（ＭｃＭａｈｏｎ  ＷＭ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  ＪＰ．Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｏｏｌｓ，ｅｄ．Ｓｕｎｂｅｒｇ ＪＰ，ｐｐ．４９３−４９７．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４．）。
【００９２】
具体的な実験方法は、前記実験例４び５と同様に行われた。本実験では、テラサイトの植立により発生する怪我が発毛機能性に及ぼす影響を確認するように、幹細胞の注入なしにテラサイトのみを植立した場合を追加陰性対照群に設定した（Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ  ｏｎｌｙ）。また、実施例４の幹細胞培養液（幹細胞数：１．０×１０7個）をマウスの肌に塗抹した場合を対照群に用いた（実施例４−塗抹）。そして、実施例２及び４の幹細胞を実験例４と同様、テラサイトに注入する細胞数は、約１．０×１０7個になるように計算して行った。前記植立は、１次毛引き抜き（ｐｌｕｃｋｉｎｇ）後、二番目の毛髪成長期（ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅ）が始まるＣ５７ＢＬ／６マウスに行った。
【００９３】
その結果、前の実験例の結果と同様、ｔｈｅｒａｃｙｔｅ  ｏｎｌｙ及び実施例４を塗抹したグループより、テラサイトに注入された実施例２及び４の場合が成長期誘導（ａｎａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）が早く起こることが確認された（図１３）。これは、羊水幹細胞よりは逆分化羊水幹細胞の発毛機能性が高いことを意味する。
【００９４】
＜実験例７＞
【００９５】
前記実験例６の結果、老化モデルにおいても本発明の逆分化羊水幹細胞を含むテラサイトが効果的であることを確認した。したがって、さらに老化したモデルにおけるａｎａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎの機能性の差異を調べるために、前記実験例６の実験が行われた老化モデルを６週過ぎた１９週齢（既存の１３週齢のモデル実験後、ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅが改めて始まる６週後の１９週齢）マウスモデルを利用して２次ｐｌｕｃｋｉｎｇ実験を行った。
【００９６】
その結果、実験例６の場合よりさらに明らかな結果が表れたが、これはマウスモデルの老化により、対照群グループの場合、脱毛が進みながらａｎａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎの部分的な遅延現象が表れることに比べて、テラサイトを植えたグループの場合、発毛サイトカインの持続的な分泌及び機能性の発現のため、時間が経つにつれて大きな差異が表れたからであると判断された。これは結局、コンディション培地を肌に塗るより、テラサイトの内部に存在する細胞のｓｅｃｒｅｔｏｍｅ効果がさらに高いことを示唆する。このような発毛効果は、実験例６における結果と同様、実施例３（テラサイト）及び実施例４（テラサイト）のグループが一番効果が良く、その次が実施例４−塗抹グループであり、Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ  ｏｎｌｙグループは一番効果が落ちた（図１４）。
【００９７】
＜実験例８＞
【００９８】
先に、羊水幹細胞群の生存確認をＣＣＫ（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ）により確認したことがある。これをもう一度確認するために、テラサイトの内部に羊水幹細胞群がどのような形態に生存しているかを確認する試験を行った。このとき、テラサイトサンプルは、実験例７において７日目のサンプルを用いており、テラサイトの内部を切開（ｓｅｃｔｉｏｎ）してＨ＆Ｅ染色した。
【００９９】
その結果、テラサイトのみを植立した組織では（ｔｈｅｒａｃｙｔｅ  ｏｎｌｙ）、内部に何も存在しないことが分かった。一方、実施例２及び実施例４の幹細胞を注入したテラサイトの内部では、幹細胞が組織化して形成されていることが確認された（図１５）。これにより、細胞が約６週齢以上成長及び生存して持続的に機能性を発揮していたことが立証された。
【０１００】
＜実験例９＞
【０１０１】
実験例６及び７において、老化マウスモデルの外的部分によるａｎａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎが立証された。したがって、組織分析により実際に毛包が形成されたことを確認した。このため、実験例７を試験して５日目に老化マウスモデルの肌組織をサンプリングして分析した。
【０１０２】
その結果、テラサイトグループ（実施例２及び実施例４）の肌組織内で多量の毛包組織を確認しており、ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅも前期ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅの形態より後期ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅの毛包形態が多く分布されていることを確認した。一方、実施例４塗抹グループは、毛包になる余地のあるＨＦＤＰ細胞群は複数存在するが、ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅ上に比較的に前期にあり、機能的にテラサイトグループに比べて、多少劣ると判断された（図１６）。
【０１０３】
＜実験例１０＞
【０１０４】
前記実験例９の結果をもう一度確認するために、各組織をＡＰ染色してＨＦＤＰ細胞の活性度を測定した。この試験では、毛髪形成に対する活性度が高いほどＡＰ染色に対して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）である部分が大きくかつ明確に表れる。
【０１０５】
その結果、実施例２及び実施例４の幹細胞を注入したテラサイトグループのＨＦＤＰ細胞の活性度がｔｈｅｒａｃｙｔｅ  ｏｎｌｙグループ、実施例４の幹細胞を塗抹したグループよりさらに優れたことを肉眼確認した（図１７）。
【０１０６】
したがって、テラサイトは、幹細胞を免疫反応から自由にしてくれると共にｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔを通じてその機能性を増加させることを確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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