(57)【要約】【課題】本発明の課題は、新規なαＭＳＨ（１−８）発現抑制剤を提供することであり、前記薬剤を含有する、医薬品組成物、食品組成物、美白用食品組成物を提供することである。【解決手段】本発明者らは前記課題を解決するため、多数の植物抽出物に対してαＭＳＨ（１−８）発現抑制試験を行い、有効性を確認した。その結果、クロガネモチに含まれるロツゲニン酸に高いαＭＳＨ（１−８）発現抑制効果を見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロツゲニン酸またはその塩を有効成分とするαＭＳＨ（１−８）発現抑制剤。
【請求項２】
ロツゲニン酸またはその塩を配合した医薬品組成物。
【請求項３】
ロツゲニン酸またはその塩を配合した食品組成物。
【請求項４】
ロツゲニン酸またはその塩を配合した美白用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線やストレスによって産生されるセリン、チロシン、セリン、メチオニン、グルタミン酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニンの配列順で構成される８つのアミノ酸から成るペプチド（以下、αＭＳＨ（１−８）と記載）発現抑制剤、経口投与組成物、及び美白用経口投与組成物への利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロオピオメラノコルチン（Pro-opiomelanocortin、以下POMCと記載）は、２４１個のアミノ酸残基からなるポリペプチド前駆体である。２８５アミノ酸残基長のポリペプチド前駆体であるプレプロオピオメラノコルチン（pre-POMC）から、翻訳後プロセッシングにて４４アミノ酸残基長のシグナルペプチド配列が切除されプPOMCとなる。POMCは主に下垂体の前葉と中葉で産生されるが、皮膚組織等からも産生されており、紫外線などの刺激によってPOMCの産生量が増加することも知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
また、POMC内には、プロセッシングによって切断可能な箇所があり、組織や変換酵素によって次に示す最大１０の活性ペプチドが産生される。その１０の活性ペプチドとしては、Ｎ−ターミナル ペプチド プロオピオメラノコルチン（Terminal Peptide of Proopiomelanocortin，NPP or pro-γ-MSH） 、γ-メラノサイト細胞刺激ホルモン（γ-melanocyte-stimulating hormone，γ-MSH）、副腎皮質刺激ホルモン（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、α−メラノサイト細胞刺激ホルモン（α‐melanocyte stimulating hormone，α-MSH）、コルチコトロピン様中葉ペプチド（Corticotropin-like Intermediate Peptide，CLIP）、β−リポトロピン（β‐lipotropic hormone，β-LPH）、γ-リポトロピン（γ‐lipotropic hormone，γ-LPH）、β−メラノサイト細胞刺激ホルモン（β-melanocyte stimulating hormone，β-MSH）、β−エンドルフィン（β-Endorphin）メチオニン−エンケファリン（methionine-enkephalin）である。
【０００４】
また、副腎皮質刺激ホルモンがさらにプロセッシングを受けて産生されるα−メラノサイト細胞刺激ホルモンは、メラニン産生を誘導するホルモンとして広く知られている。ストレス応答に関わる副腎皮質刺激ホルモンから誘導されるホルモンであるが、一般的な皮膚科学としては紫外線によって誘導されるメラニン合成ホルモンとして認知されている。一方、角化細胞が分泌するα−ＭＳＨは低濃度であり、多くは細胞内プロセッシングを受けていないPOMCの状態で高濃度に分泌していることが報告されている。
【０００５】
我々は、マウスの皮膚に紫外線を照射するとPOMCだけでなく、トリプシン様酵素によりPOMCからαＭＳＨ（１−８）が細胞外プロセッシングにより生成することを見出した（非特許文献２参照）。また、このペプチドは、文献によってはＡＣＴＨ（１−８）と表記される場合もあるが同一のペプチドである。
【０００６】
従来から知られているPOMCプロセッシング活性ペプチドは、ケラチノサイトの中でプロセッシングされたものが、個々に活性ペプチドとしてケラチノサイトから分泌されている。一方、αＭＳＨ（１−８）は、POMCとしてケラチノサイト外に分泌された後に、細胞外プロセッシングによって生成される。このことから、αＭＳＨ（１−８）は既存のシステムとは全く異なる合成経路によって生成される新規の活性ペプチドであるといえる。さらに、POMCからαＭＳＨ（１−８）をプロセッシングする因子として、セリンプロテアーゼの１種であるトリプターゼが特定されている（非特許文献３、非特許文献４参照）。
【０００７】
また、このαＭＳＨ（１−８）がメラノサイトのＭＣ１レセプターに結合し、メラニン産生を誘導することを明らかとしており（非特許文献３参照）、我々はヒメフウロ抽出物に優れたαＭＳＨ（１−８）産生抑制効果、メラニン生成阻害効果を既に見出している（特許文献１参照）。
【０００８】
このように、αＭＳＨ（１−８）がメラニン産生経路に深く関わることは明かであるが、このペプチドの存在は生化学的にも新しい知見であり、現在も様々な研究がなされている状況である。例えば、このペプチドは紫外線によって誘導されることから、紫外線に始まる、体内のあらゆる反応のセンサーとして機能している可能性が高い。すなわち、免疫機能の調整や、しわやたるみ乾燥による皮膚老化の因子としての作用が考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
（非特許文献１）Aline Primot,Elena Sviderskaya,et al：THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.279,No.49,:pp.51226-51233(2004)
（非特許文献２）山根、山本ら：日本薬学会  第１３０年会  ２８ＳＪ−ｐｍ１５  要旨集３−１０１頁
（非特許文献３）大石、山本ら：日本薬学会  第１３１年会  ３０Ｐ―００７０  要旨集３−１１８頁
（非特許文献４）Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ：Ｓｃｉ  Ｒｅｐ、２０１５  Ｓｅｐ  ２９；５：１４５７９
【特許文献】
【００１０】
（特許文献１）特開２０１５−１３７２６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、新規なαＭＳＨ（１−８）発現抑制剤、経口投与組成物、及び美白用経口投与組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは前記課題を解決するため、多数の植物抽出物に対してαＭＳＨ（１−８）発現抑制試験を行い、有効性を確認した。その結果、クロガネモチに含まれるロツゲニン酸に高いαＭＳＨ（１−８）発現抑制効果を見出した。
【発明の効果】
【００１３】
ロツゲニン酸は、紫外線やストレスを受けることによって体内中で産生されるαＭＳＨ（１−８）の産生を抑制する。αＭＳＨ（１−８）は、メラノサイトのＭＣ１レセプターに結合しメラニン産生を誘導することから、αＭＳＨ（１−８）発現抑制作用を示したロツゲニン酸は特に皮膚の美白、しみ・そばかすの予防、改善を目的とする医薬品組成物、食品組成物、美白用食品組成物に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ロツゲニン酸のαＭＳＨ（１−８）発現抑制作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
尚、本発明で使用する「クロガネモチ」とは、モチノキ科（Aquifoliaceae）、モチノキ属（Ilex）、の植物：クロガネモチ（Ilex rotunda）を用いる。
【００１６】
本発明で用いる次の化学構造式（化１）で示されるロツゲニン酸及び／又は薬学的に許容される塩の形の化合物は植物、動物、菌体等から抽出、合成等から得ることが出来、クロガネモチがロツゲニン酸を多く含むため、そこからカラム等を用いて精製を用いてもよい。また、通常医薬、化粧料で用いられているアルカリと反応させて塩と為すことも出来る。この様な塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリエチルアミン塩等の有機アミン塩類、リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩等が好ましく例示できる。
【化１】
2018150268.tif 000002
【００１７】
本発明のαＭＳＨ（１−８）発現抑制剤、食品組成物、美白用食品組成物を製造する上で、使用するロツゲニン酸の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状等いずれの形状でも良く、本発明を実施する上で最適な形状を任意に選択することができる。また、αＭＳＨ（１−８）とは「Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg」の８つのアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１８】
本発明の各種組成物におけるロツゲニン酸の含有量としては、αＭＳＨ（１−８）産生を抑制することが確認できる範囲であれば特に制限はないが、一般的には０．０００１〜１０重量％であることが好ましく、０．００１〜１重量％であることが最も好ましい。
【００１９】
本発明のαＭＳＨ（１−８）発現抑制剤の利用に関しては、医薬品組成物、飲食品組成物、美白用食品組成物へ利用できる。αＭＳＨ（１−８）の発現を抑制できる形態であれば、固体、液体を問わず使用することが出来る。
【００２０】
また、本発明による医薬品組成物、食品組成物（美容や健康志向の飲食品を含む）、美白用食品組成物の具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子類；カニ、サケ、アサリ、マグロ、イワシ、エビ、カツオ、サバ、クジラ、カキ、サンマ、イカ、アカガイ、ホタテ、アワビ、ウニ、イクラ、トコブシ等の水産物；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；カレー、シチュー、親子丼、お粥、雑炊、中華丼、かつ丼、天丼、うな丼、ハヤシライス、おでん、マーボドーフ、牛丼、ミートソース、玉子スープ、オムライス、餃子、シューマイ、ハンバーグ、ミートボール等のレトルトパウチ食品；種々の形態の健康食品や栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等の医薬品、医薬部外品が上げられる。
【００２１】
本発明の医薬品組成物、食品組成物、美白用食品組成物には、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤などを目的に応じて適宜配合することができる。
【実施例】
【００２２】
本発明で用いるロツゲニン酸抽出物中の製造例を以下に詳述するが、本発明のクロガネモチ抽出物は以下の製造例に限定されない。
【００２３】
（製造例）ロツゲニン酸の製造
特願2017-41854号と同様、既報（Phytochemistry 28(5) 1479-1482(1989)、）に従い、クロガネモチ果実2 kgに対して4 Lのメタノールで3回抽出、その後500 mLまで濃縮し、さらに水を500 mL加えた後、ジエチルエーテルを500 mL加え、エーテル層を抽出し濃縮。固形分15.2 ｇを得た。さらに、固形分15.2 gをメタノール、ジクロロメタン混液（メタノール：ジクロロメタン＝2:98）に溶かしカラム精製を行い固形分384 mgを得た。その後、水とメタノール混液でカラム精製を行いロツゲニン酸を24.5 mg得た。
【００２４】
（試験１）ロツゲニン酸の確認
前記製造例により得たロツゲニン酸13.0 mｇをＣ５Ｄ５Ｎ（600 μL）に溶かし、１３Ｃ−ＮＭＲ測定を行った。さらに上記ロツゲニン酸溶液をＣ５Ｄ５Ｎ６倍に薄め１Ｈ−ＮＭＲ測定も行った。
【００２５】
（試験結果）
結果は表１に示した化学シフトの値を示し、＊既報（Phytochemistry 28(5) 1479-1482(1989)）に記載された値とほぼ一致したことから、ロツゲニン酸であることを確認した。
ロツゲニン酸の１３ＣＮＭＲ物性値
【表１】
2018150268.tif 000003
【００２６】
（試験２）ロツゲニン酸の塩の調整
前記製造例により得たロツゲニン酸を常法により、ロツゲニン酸のナトリウム塩、カルシウム塩、を調整した。
【００２７】
（試験３）ロツゲニン酸のαＭＳＨ（１−８）の発現抑制評価試験
正常ヒト皮膚角化細胞（クラボウ社製）と正常ヒト皮膚メラノサイト（クラボウ社製）を１０：１の割合で培養する。細胞に２ｍＪの紫外線（ＵＶ−Ｂ）を照射後、被験サンプル（ロツゲニン酸の対照としてロスマリン酸を使用）含有無血清培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）にて培養する。２４時間後、培養上清を回収し、リコンビナントトリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｒｈＳｋｉｎ，β−ｔｒｙｐｔａｓｅ）を添加して反応させ、トリフルオロ酢酸を添加して反応を停止する、その後既報（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ：Ｓｃｉ  Ｒｅｐ、２０１５  Ｓｅｐ  ２９；５：１４５７９）に従い、ゲルろ過クロマトグラフィーで粗精製したのち、逆相ＨＰＬＣで分離、検出し濃度を測定した。以下が分析条件である。
（ゲルろ過クロマトグラフィー）
カラム：Sephadex G-75 fine column（1.0×100cm）
溶媒：１M酢酸
デキストラン換算で１．１ｋＤａ付近のフラクションを回収し、ＨＰＬＣにインジェクトした。
（ＨＰＬＣ）
分析機器：SLC-6B（島津社製）
検出器：SPD-7A
カラム：ODSカラム（4.6×150mm、Myfhtsil RP-GP 5μm、関東化学社製）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶媒：Ａ液：アセトニトリル、Ｂ液：０．０１Ｍ塩酸
グラジエント；
０ｍｉｎ；％Ａ液／％Ｂ液  ＝  １００／０  →  ３０ｍｉｎ；％Ａ液、％Ｂ液  ＝  ４０／６０
【００２８】
（試験結果）
図１は試験３の結果である。ロスマリン酸にはαＭＳＨ（１−８）の発現抑制効果がみられなかったが、ロツゲニン酸にはαＭＳＨ（１−８）の発現抑制効果がみられた。また、試験２により得たロツゲニン酸のナトリウム塩、カルシウム塩についても、試験３を行ったところ同様な効果が得られた。
【００２９】
（処方例）
ロツゲニン酸に対して以下処方例を記載するが、本発明の配合に限定したものではない。
【００３０】
（処方例１）タブレット型菓子                                                重量％
１．乳糖                                                                      ２
２．ビタミンＣ                                                                ３
３．クエン酸                                                              １．５
４．ゼラチン１％水溶液                                                        ４
５．ロツゲニン酸                                                      ０．００１
６．ショ糖脂肪酸エステル                                                      １
７．粉末イチゴ香料                                                        ０．５
８．粉糖                                                      全量で１００にする
【００３１】
（処方例２）タブレット                                                      重量％
１．微結晶セルロース                                                        ３０
２．カルボキシメチルセルロースカルシウム                                    ２４
３．ポリビニルピロリドン                                                    １０
４．ロツゲニン酸                                                      ０．００１
５．タルク                                                                    ５
６．コーンスターチ                                            全量で１００にする
【００３２】
（処方例３）タブレット型健康食品                                            重量％
１．プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物                                      ４
（一丸ファルコス社製，プロテオグリカンＦ）
２．コンドロイチン硫酸                                                        ２
３．ヒアルロン酸                                                          ０．５
４．Ｎ−アセチルグルコサミン                                                ４０
５．コラーゲンエキスパウダー                                              ７．５
６．ロツゲニン酸                                                      ０．００１
７．結晶セルロース                                                            ９
８．ショ糖脂肪酸エステル                                                      ３
９．微粒酸化ケイ素                                                            ２
１０．マルチトール                                              全量で１００にする
【００３３】
（処方例４）クッキー菓子                                                    重量％
１．薄力粉                                                                  ３５
２．全卵                                                                    １０
３．ロツゲニン酸                                                      ０．００１
４．バター                                                                  ２０
５．砂糖                                                                    １２
６．食塩                                                                    １０
７．ベーキングパウダー                                                    ０．３
８．水                                                        全量で１００にする
【００３４】
（処方例５）カプセル錠                                                      重量％
１．ラクトース                                                              ４９
２．ロツゲニン酸                                                      ０．００１
３．ステアリン酸マグネシウム                                                  １
４．コーンスターチ                                            全量で１００にする
【００３５】
（処方例６）チューインガム                                                  重量％
１．ロツゲニン酸                                                      ０．００１
２．砂糖                                                                ５３．０
３．ガムベース                                                          ２０．０
４．水飴                                                                １６．０
５．香料                                                                  ０．５
６．グルコース                                                全量で１００にする
【００３６】
（処方例７）グミ                                                            重量％
１．ロツゲニン酸                                                      ０．００１
２．還元水飴                                                            ４０．０
３．グラニュー糖                                                        ２０．０
４．ブドウ糖                                                            ２０．０
５．ゼラチン                                                              ４．７
６．ウメ果汁                                                              ４．０
７．ウメフレーバー                                                        ０．６
８．色素                                                                ０．０２
９．水                                                        全量で１００にする
【００３７】
（処方例８）清涼飲料                                                        重量％
１．果糖ブドウ糖液                                                      ２０．０
２．液状ヨーグルト                                                      ３０．０
３．乳化剤                                                                ０．５
４．ヒアルロン酸ナトリウム（分子量５万〜１５万）                          ０．１
５．ロツゲニン酸                                                      ０．００１
６．香料                                                                    適量
７．精製水                                                    全量で１００にする
【００３８】
（試験４）単回投与毒性試験
ロツゲニン酸、ロツゲニン酸ナトリウム塩を、一匹につき6ｇ／ｋｇ(体重)量を、試験前、１６時間絶食させたｄｄｙ系マウス（雄性及び雌性、１群５匹、５週齢）に経口投与し、毒性症状の発現、程度等を経時的に観察した。その結果、全てのマウスにおいて１４日間、何等異常を認めず、解剖の結果、異常がないことを確認した。
【００３９】
（試験５）使用効果試験
本発明の処方例８をもとに、下記表２の通りの処方Ａ、処方Ｂ２種の清涼飲料水を作製した。成人男女１０名に対して、作製した清涼飲料水を１日５００ｍｌ飲み、１ヶ月間の使用試験を行った。なお、被験者は５人づつにわけ、シミや色素沈着について使用前に比べて評価した。
【表２】
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【００４０】
（試験結果）
結果は下記表３の通り、ロツゲニン酸を配合した処方Ｂは処方しない処方Ａよりも、効果が高いことが認められた。
有    効  ：使用前よりもシミや色素沈着が改善された。
やや有効  ：使用前よりもシミや色素沈着がやや改善された。
無    効  ：使用前と変化なし。
【表３】
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【図１】
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