(57)【要約】【課題】抗体のインビボ半減期の決定が可能な、アフィニティークロマトグラフィー用担体を提供する。【解決手段】アフィニティークロマトグラフィー用のリガンドとして、新生児型Ｆｃ受容体(ＦｃＲｎ)とβ-２-ミクログロブリン(ｂ２ｍ)との非共有結合性複合体を用いる。新生児型Ｆｃ受容体(ＦｃＲｎ)とβ-２-ミクログロブリン(ｂ２ｍ)は、互いとは無関係に、ヒト由来、マウス由来、カニクイザル由来、ラット由来、ウサギ由来のいずれかである。抗体と参照抗体の保持時間の比から、抗体のインビボ半減期が決定される。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正の直線pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおける、固定化された、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との非共有結合性複合体の、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての使用。
【請求項２】
正の直線pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおいて、少なくとも1つのFc領域を含む抗体または融合ポリペプチドを分離するためであることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、互いとは無関係に、ヒト由来、またはマウス由来、またはカニクイザル由来、またはラット由来、またはウサギ由来であることを特徴とする、請求項1または2に記載の使用。
【請求項４】
前記β-2-ミクログロブリンが前記新生児型Fc受容体と同じ種に由来することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、それぞれ互いとは無関係に0〜10個のアミノ酸残基修飾を有するヒト野生型新生児型Fc受容体およびヒト野生型β-2-ミクログロブリンであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との前記非共有結合性複合体が固相に結合していることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記固相がクロマトグラフィー材料であることを特徴とする、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との前記非共有結合性複合体がビオチン標識され、かつ前記固相がストレプトアビジンで誘導体化されていることを特徴とする、請求項6または7に記載の使用。
【請求項９】
前記pH勾配が、第1のpH値から第2のpH値までであり、該第1のpH値がpH約3.5〜pH約7.5であり、かつ該第2のpH値がpH約6.0〜pH約9.5であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記第1のpH値がpH約5.5であり、かつ前記第2のpH値がpH約8.8であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
抗体と参照抗体の保持時間の比を決定することによって該抗体のインビボ半減期を決定するためであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
抗体のメチオニン酸化を測定するためであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
抗体のオリゴマー化レベルを測定するためであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
親抗体または親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している該親抗体または該親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドについて、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含むこれらの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするためであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含み前記新生児型Fc受容体に対する結合の変化を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するためであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
IgG調製物から半抗体を除去するためであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
IgG調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するためであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記抗体が、単一特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または二重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または三重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または四重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片であることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
負の直線pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおける、固定化された、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との非共有結合性複合体の、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての使用。
【請求項２０】
負の直線pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおいて、少なくとも1つのFc領域を含む抗体または融合ポリペプチドを分離するためであることを特徴とする、請求項19に記載の使用。
【請求項２１】
前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、互いとは無関係に、ヒト由来、またはマウス由来、またはカニクイザル由来、またはラット由来、またはウサギ由来であることを特徴とする、請求項19または20に記載の使用。
【請求項２２】
前記β-2-ミクログロブリンが前記新生児型Fc受容体と同じ種に由来することを特徴とする、請求項19〜21のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、それぞれ互いとは無関係に0〜10個のアミノ酸残基修飾を有するヒト野生型新生児型Fc受容体およびヒト野生型β-2-ミクログロブリンであることを特徴とする、請求項19〜22のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との前記非共有結合性複合体が固相に結合していることを特徴とする、請求項19〜23のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記固相がクロマトグラフィー材料であることを特徴とする、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との前記非共有結合性複合体がビオチン標識され、かつ前記固相がストレプトアビジンで誘導体化されていることを特徴とする、請求項24または25に記載の使用。
【請求項２７】
前記pH勾配が、第1のpH値から第2のpH値までであり、該第1のpH値がpH約7.0〜pH約8.5であり、かつ該第2のpH値がpH約5.5〜pH約6.9であることを特徴とする、請求項19〜26のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記第1のpH値がpH約7.4であり、かつ前記第2のpH値がpH約6.0であることを特徴とする、請求項19〜27のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
抗体と参照抗体の保持時間の比を決定することによって該抗体のインビボ半減期を決定するためであることを特徴とする、請求項19〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
抗体のメチオニン酸化を測定するためであることを特徴とする、請求項19〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
抗体のオリゴマー化レベルを測定するためであることを特徴とする、請求項19〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
親抗体または親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している該親抗体または該親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドについて、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含むこれらの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするためであることを特徴とする、請求項19〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含み前記新生児型Fc受容体に対する結合の変化を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するためであることを特徴とする、請求項19〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
IgG調製物から半抗体を除去するためであることを特徴とする、請求項19〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
IgG調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するためであることを特徴とする、請求項19〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記抗体が、単一特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または二重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または三重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または四重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片であることを特徴とする、請求項19〜35のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
252位のアミノ酸がメチオニンからヒスチジンに変更され、かつ、428位のアミノ酸がメチオニンからグルタミン酸に変更されている、ヒトIgG1アイソタイプのFc領域変種。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、固定化されたヒト新生児型Fc受容体をアフィニティーリガンドとして含むアフィニティークロマトグラフィーカラムの使用およびその使用を報告する。
【背景技術】
【０００２】
背景
一般に、免疫グロブリンは、いわゆる軽鎖ポリペプチド(軽鎖)2つおよびいわゆる重鎖ポリペプチド(重鎖)2つを含む。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドはそれぞれ、抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン(可変領域)(一般に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分)を含む。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドはそれぞれ、定常領域(一般にカルボキシル末端部分)を含む。重鎖の定常領域は、抗体の(i)Fcγ受容体(FcγR)を有する細胞、例えば食細胞への、または(ii)ブランベル(Brambell)受容体としても公知の新生児型Fc受容体(FcRn)を有する細胞への結合を媒介する。それはまた、成分(C1q)のような古典的補体系の因子を含むいくつかの因子への結合も媒介する。
【０００３】
新生児型Fc受容体(FcRn)は、MHCクラスIに関連した受容体としても公知である(概要については、Ward, E.S. and Ober, R.J., Advances in Immunology 103 (2009) 77-115を参照されたい)。この受容体は、成人時期の全体を通してIgGのレベルおよび分布を調節する働きをしていることだけでなく(Ghetie, V., et al., Nat. Biotechnol. 15 (1997) 637-640; Israel, E.J., Immunology 89 (1996) 573-578; Junghans, R.P. and Anderson, C.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 5512-5516)、様々な細胞型および組織において多数の他の役割を有していることも(例えば、Akilesh, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 967-972; Dickinson, B.L., et al., J. Clin. Invest. 104 (1999) 903-911; Kim, H., et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (2008) 2025-2029; Spiekermann, G.M., et al., J. Exp. Med. 196 (2002) 303-310; Zhu, X., et al., J. Immunol. 166 (2001) 3266-3276を参照されたい)、研究によって示されている。マウス、ラット、ヒト、ヒツジ、雌ウシ、オポッサム(possum)、ブタ、およびラクダを含む多くの種からFcRnオルソログが単離されている(Adamski, F.M., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 435-444; Ahouse, J.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 6076-6088; Kacskovics, I., et al., J. Immunol. 164 (2000) 1889-1897; Kacskovics, I., et al., Dev. Comp. Immunol. 30 (2006) 1203-1215; Kandil, E., et al., J. Immunol. 154 (1995) 5907-5918; Mayer, B., et al., Immunology 107 (2002) 288-296; Schnulle, P.M. and Hurley, W.L., Vet. Immunol. Immunopathol. 91 (2003) 227-231; Simister, N.E. and Mostov, K.E., Nature 337 (1989) 184-187; Story, C.M., et al., J. Exp. Med. 180 (1994) 2377-2381)ことから、この受容体がほぼすべての哺乳動物種において存在することが示唆されている。FcRnの多数の機能は、細胞内でのリソソーム分解を回避するように(away from)IgGを選別し、細胞膜におけるエキソサイトーシス事象の間に、結合された物質(cargo)を放出する能力に依存している(Ober, R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 11076-11081; Ober, R.J., et al., J. Immunol. 172 (2004) 2021-2029; Prabhat, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007) 5889-5894)。さらに、インビボでIgGのトラフィッキング経路および挙動を調節する潜在能力を考慮して、マウスにおける半減期を延長するための抗体操作に関する以前の報告(Ghetie et al., 前記)は、バイオ医薬品業界において強い関心を持たれる分野に発展した(Dall'Acqua, W.F., et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524; Hinton, P.R., et al., J. Biol. Chem. 279 (2004) 6213-6216; Hinton, P.R., et al., J. Immunol. 176 (2006) 346-356; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。
【０００４】
WO2005/047327では、新生児型Fc受容体(FcRn)に結合するポリペプチド変種、二量体Fc結合タンパク質、およびそれらに関する方法が報告されている。エフェクター機能が改変されたポリペプチド変種が、WO2006/031370において報告されている。WO2009/041643では、CDR中のアミノ酸を置換することによって抗体の等電点を改変する方法が報告されている。WO2010/048313では、Fcを含む融合タンパク質を精製するための組換えFcRnおよびその変種が報告されている。Magistrelli, G.らは、IgG結合研究用に方向を定めた固定化を可能にする、哺乳動物細胞における活発な組換えFcRn作製を報告している(J. Immunol. Meth. 印刷中、2011年9月12日にオンラインで入手可能(in press, available online 12.09.2011))。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書において報告される1つの局面は、固定化された、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との非共有結合性複合体を、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用することである。
【０００６】
本明細書において報告される方法/使用によって、密接に関連した抗体種、すなわち単一または限定された数のアミノ酸残基が異なる抗体種を、分離し、単離し、かつインビボでの特性に関して特徴決定することが現在可能であることが判明している。
【０００７】
したがって、本明細書において報告される方法を用いて単離された、異なる抗体種、すなわち1つのアミノ酸残基が異なるものを用いて、FcRnに関連し半減期に影響を与えるアミノ酸位置を特徴決定/同定することができる。
【０００８】
したがって、本明細書において報告される方法を用いて、1つの親抗体の異なる変種を分離すること、およびこれらの変種間の個々の比率を決定することが可能である。個々の比率を決定することは、現在公知の方法では不可能である。これらの方法は、個々の種ではなく修飾体(modifications)の合計を与えるにすぎないことがその理由である(すなわち、親ならびに変種1および変種2および変種1/2の混合物の場合、質量分析法は、変種1を含む分子、すなわち単一の変異を含む変種(1)およびまた第2の変異も含むもの(1/2)の合計を与える)。
【０００９】
これは、(i)組換えによって作製したヒトβ2ミクログロブリンと組み合わせて、組換えによって作製したヒトFcRnをクロマトグラフィー担体上に固定化すること、および(ii)直線pH勾配を組み合わせることによって、実現することができる。
【００１０】
所与の条件の場合、野生型IgG1抗体の保持時間は約42〜49分であることが判明している。1つの態様において、IgG1サブクラスの野生型Fc領域を含む抗体またはFc融合タンパク質の保持時間は約45分である。
【００１１】
FcRn結合を減少した修飾Fc領域を有する抗体の保持時間はより短いのに対し、FcRn結合を増強した修飾Fc領域を有する抗体の保持時間はより長い。1つの態様において、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との非共有結合性複合体は、固相に結合している。1つの態様において、固相はクロマトグラフィー材料である。1つの態様において、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との非共有結合性複合体はビオチン標識され、かつ、固相はストレプトアビジンで誘導体化されている。
【００１２】
1つの態様において、使用は、pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおいてである。1つの態様において、pH勾配は第1のpH値から第2のpH値までであり、第1のpH値はpH約3.5〜pH約7.5であり、かつ第2のpH値はpH約6.0〜pH約9.5である。1つの態様において、pH勾配は、pH値が上昇する勾配またはpH値が低下する勾配である。1つの態様において、第1のpH値がpH約5.5であり第2のpH値がpH約8.8であるか、または第1のpH値がpH約7.4であり第2のpH値がpH約6.0である。
【００１３】
1つの態様において、β-2-ミクログロブリンは、FcRnと同じ種に由来する。
【００１４】
1つの態様において、使用は、抗体と参照抗体の保持時間の比を決定することによって抗体のインビボ半減期を決定するためである。
【００１５】
1つの態様において、使用は、少なくとも1つのFc領域を含む抗体または融合ポリペプチドを分離するためである。
【００１６】
1つの態様において、使用は、抗体のメチオニン酸化を測定するためである。
【００１７】
1つの態様において、使用は、抗体のオリゴマー化レベルを測定するためである。
【００１８】
1つの態様において、使用は、親抗体または親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している該親抗体または該親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドについて、Fc領域の少なくとも1つのFcRn結合部分を含むこれらの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするためである。
【００１９】
1つの態様において、使用は、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含み新生児型Fc受容体に対する結合の変化を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するためである。
【００２０】
1つの態様において、抗体は、単一特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または二重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または三重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または四重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片である。
【００２１】
1つの態様において、使用は、IgG調製物から半抗体(half antibodies)を除去するためである。
【００２２】
1つの態様において、使用は、IgG調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するためである。
【００２３】
本明細書において報告される1つの局面は、252位のアミノ酸がメチオニンからヒスチジンに変更され、かつ、428位のアミノ酸がメチオニンからグルタミン酸に変更されている、ヒトIgG1アイソタイプのFc領域変種である。
【００２４】
本明細書において報告される1つの局面は、所定のインビボ半減期を有する抗体を選択するための方法であり、クロマトグラフィーが実施され、かつ保持時間が野生型IgG1と比べて所与の保持時間ウィンドウ内である抗体が選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本明細書において報告されるFcRnカラムを用いたクロマトグラフィーの適用された抗体と曲線下面積の直線性。
【図２】本明細書において報告されるFcRnカラムによる、抗IGF-1R抗体の野生型およびYTE変異体のクロマトグラム。
【図３】CE-SDS解析(A/B/C下の列)において確認することができるように様々な量の半抗体を含む様々な抗体調製物のFcRnクロマトグラフィー(A/B/C上の列(top row))。
【図４】様々な量の抗体単量体および抗体凝集物を含む様々な抗体調製物のFcRnクロマトグラフィー。
【図５】クロマトグラフィーにかけた分子中のFc領域の数による、FcRnクロマトグラフィーにおける保持時間の影響。
【図６】FcRnクロマトグラフィー保持時間に対する抗体酸化の影響。
【図７】本明細書において報告されるFcRnカラムを用いた抗Aβ抗体の野生型およびHE変異体のクロマトグラム。
【図８】FcRn相互作用に対するMet252酸化およびMet428酸化の影響。40℃で2ヶ月間保管したIgG1抗体の試料(曲線2)をFcRnカラムに適用すると、酸化IgG1抗体を示唆する二重ピークを有する種が早くに溶出するのに対し、25℃(曲線1)および-80℃(曲線3)で2ヶ月間保管したIgG1抗体の試料をFcRnカラムに適用すると、もっと後に溶出し、実質的に重なったピークが生じる。クロマトグラフィー条件:緩衝液A(20mM MES、150mM NaCl、pH5.5)、緩衝液B(20mM HEPES、150mM NaCl、pH8.2)、流量0.5ml/分、緩衝液Aから緩衝液Bへの勾配:60分(標準)。
【図９】ストレスを加えられたIgG1抗体の表面プラズモン共鳴(SPR)解析。40℃で2ヶ月間保管したIgG1抗体の試料をSPR解析用のBIAcoreに適用すると、野生型IgG1抗体種とMet252およびMet428が酸化されたIgG1抗体種とで異なるセンサーグラムが示される。
【図１０】FcRn相互作用に対する抗体凝集物の影響。元の試料、その単離された単量体、および単離された凝集物中の抗IL13Rα抗体のFcRnクロマトグラフィー解析。クロマトグラフィー条件:緩衝液A(20mM MES、150mM NaCl、pH5.5)、緩衝液B(20mM Tris/HCl、150mM NaCl、pH8.8)、流量0.5ml/分、緩衝液Aから緩衝液Bへの勾配:50分(標準)。
【図１１】抗IL13Rα抗体凝集物のSPR解析。参照標準としての抗IL13Rα抗体(曲線1)、元の試料中の抗IL13Rα抗体(3)、単離された抗IL13Rα抗体単量体(曲線2)、および単離された抗IL13Rα抗体凝集物(曲線4)のセンサーグラム。
【図１２】FcRnトランスジェニックマウスにおける薬物動態に対するFc変異の影響。野生型抗体またはその三重変異体YTEが、1グループ当たり8匹の動物への10mg/kgの静脈内ボーラス注射1回として与えられた。結果を平均値±標準偏差(SD)、野生型抗体と比べた有意性のANOVA解析(+++、p<0.001)として提示する。A:時間0から672時間までの血清濃度-時間曲線下面積(AUC(0〜672))。B:終末半減期。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の態様の詳細な説明
新生児型Fc受容体(FcRn)は、インビボでのIgG抗体の代謝の最終結果にとって重要である。
【００２７】
FcRnアフィニティークロマトグラフィーにより、ピーク領域および保持時間のプロファイルに基づいてIgG 試料を区別することができる。これにより、インビトロでFcRnとIgGの相互作用を解析することが可能になり、インビボでの薬物動態に関する治療的IgGの構造的および機能的な完全性に対する見識が与えられ得る。
【００２８】
したがって、変異体IgGおよび野生型IgGのFcRnアフィニティークロマトグラフィーは、インビボでの薬物動態の半定量的予測(predictive)として使用され得る。さらに、FcRnアフィニティークロマトグラフィーは、例えば、IgGバッチの特徴決定または類似性(comparability)の研究のためにFcRn-IgG相互作用をモニターするのにも使用され得る。
【００２９】
標準化されたpH勾配のFcRnアフィニティー液体クロマトグラフィー法は、インビボでのIgGとFcRnの相互作用のメカニズムによく似ている条件を用いて見出された。ヒトFcRnがアフィニティーリガンドとしてカラムに固定化され、例えばpH5.5から8.8への直線pH勾配が適用された。
【００３０】
例えば、解析的FcRnアフィニティークロマトグラフィーにより、ピークパターンおよび保持時間のプロファイルに基づいてIgG試料および変種の同定および特徴決定をすることが可能になる。この方法により、(1)Fab断片が異なる同じIgG、(2)酸化IgG型と非酸化IgG型、(3)凝集物と単量体、および(4)Fc領域に変異を有する抗体を区別することができる。
【００３１】
野生型IgGと比べた変種IgG(Fc領域変種)のFcRnアフィニティークロマトグラフィープロファイルの変化は、インビボでの薬物動態プロファイルの予測に役立つことが判明している。これらの結果から、FcRnアフィニティークロマトグラフィーが、FcRn-IgG相互作用、IgG完全性、および最大では(at most)IgGそれ自体を特徴決定するための有用な新規方法であることが実証される。
【００３２】
I.定義
「約」という用語は、その後に続く数値の+/-20％の範囲を意味する。1つの態様において、約という用語は、その後に続く数値の+/-10％の範囲を意味する。1つの態様において、約という用語は、その後に続く数値の+/-5％の範囲を意味する。
【００３３】
「改変」という用語は、修飾された抗体または融合ポリペプチドを得るための、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含む親抗体または融合ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を意味する。
【００３４】
「アミノ酸置換」という用語は、少なくとも1つの既存のアミノ酸残基を別の異なるアミノ酸残基(置換アミノ酸残基)で置換することを意味する。置換アミノ酸残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」であってよく、アラニン(3文字記号:ala、1文字記号:A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、トレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、およびバリン(val、V)からなる群より選択されてよい。
【００３５】
「アミノ酸挿入」という用語は、アミノ酸配列中の所定の位置に少なくとも1つのアミノ酸残基を組み入れることを意味する。1つの態様において、挿入は、1つまたは2つのアミノ酸残基の挿入である。挿入されるアミノ酸残基は、任意の天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基であることができる。
【００３６】
「アミノ酸欠失」という用語は、アミノ酸配列中の所定の位置において少なくとも1つのアミノ酸残基を取り除くことを意味する。
【００３７】
「抗体」という用語は、最も広い意味で本明細書において使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、およびFcRn結合特性を示す限りにおいて抗体断片を含む、様々な抗体構造体を包含する。
【００３８】
「緩衝物質」という用語は、溶液中に存在する場合、例えば、酸性物質または塩基性物質の添加または放出によって溶液のpH値のレベルを変更できる物質を意味する。
【００３９】
「CH2ドメイン」という用語は、おおよそEU位置231番からEU位置340番(KabatによるEU番号付与システム)まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。1つの態様において、CH2ドメインは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列：
2018188442.tif 000003
を有する。
【００４０】
「CH3ドメイン」という用語は、おおよそEU位置341番からEU位置446番まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。1つの態様において、CH3ドメインは、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列：
2018188442.tif 000004
を有する。
【００４１】
抗体の「クラス」という用語は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを意味する。抗体には5つの主要なクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらの内のいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ、およびμとそれぞれ呼ばれる。
【００４２】
「ヒト由来のFc領域」という用語は、ヒンジ領域についての少なくとも1つの部分、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む、ヒト由来の免疫グロブリン重鎖のC末端領域を意味する。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端まで伸びる。1つの態様において、Fc領域は、SEQ ID NO: 10のアミノ酸配列を有する。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在する場合もあれば存在しない場合もある。本明細書において別段の指定が無い限り、Fc領域中または定常領域中のアミノ酸残基の番号付与は、EU指標とも呼ばれるEU番号付与システムに従い、これは、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242において説明されている。
【００４３】
「FcRn」という用語は、ヒト新生児型Fc受容体を意味する。FcRnは、リソソーム分解経路からIgGを救助する機能を果たし、その結果、クリアランスを減らし、半減期を長くする。FcRnは、2つのポリペプチド:50kDaのクラスI主要組織適合性複合体様タンパク質(α-FcRn)および15kDaのβ2-ミクログロブリン(β2m)からなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、IgGのFcドメインのCH2-CH3部分に高い親和性で結合する。IgGとFcRnの相互作用は、pHに厳密に依存しており、1:2の化学量論比で起こり、1つのIgGが、2つの重鎖を介して2つのFcRn分子に結合する(Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083)。酸性pH(pH<6.5)ではFcRn結合がエンドソーム中で起こり、中性の細胞表面(pH約7.4)ではIgGは遊離する。相互作用のpH感受性の性質のおかげで、エンドソームの酸性環境内での受容体への結合によって、細胞中へ飲作用されるIgGを細胞内分解からFcRnを介して保護することが容易になる。次いで、FcRnは、FcRn-IgG複合体が細胞外の中性pH環境に曝露された際に、細胞表面にIgGを再循環させ、続いて血流中に放出するのを促進する。
【００４４】
「Fc領域のFcRn結合部分」という用語は、おおよそEU位置243番からEU位置261番、ならびにおおよそEU位置275番からEU位置293番、ならびにおおよそEU位置302番からEU位置319番、ならびにおおよそEU位置336番からEU位置348番、ならびにおおよそEU位置367番からEU位置393番およびEU位置408番、ならびにおおよそEU位置424番からEU位置440番まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。1つの態様において、KabatのEU番号付与による次のアミノ酸残基の内の1つまたは複数が改変される:
2018188442.tif 000005
。
【００４５】
「完全長抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に同様の構造を有するか、または本明細書において定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体を意味する。
【００４６】
「ヒンジ領域」という用語は、CH1ドメインとCH2ドメインを連結する、例えばKabatのEU番号システムによれば216位あたりから230位あたりまでの、抗体重鎖ポリペプチド部分を意味する。通常、ヒンジ領域は、アミノ酸配列が同一である2つのポリペプチドからなる二量体分子である。一般に、ヒンジ領域は約25個のアミノ酸残基を含み、可撓性であるため、抗原結合領域が独立に動くことが可能である。ヒンジ領域は、3つのドメイン:上部ヒンジドメイン、中央部ヒンジドメイン、下部ヒンジドメインに細分することができる(Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083)。
【００４７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は同義的に使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて意味する。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫が継代の回数に関わらず含まれる。子孫の核酸内容は親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫は、本明細書に含まれる。
【００４８】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト超可変領域(HVR)に由来するアミノ酸残基およびフレームワーク領域(FR)に由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。特定の態様において、ヒト化抗体は、HVR(例えばCDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに相当し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに相当する、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域についての少なくとも1つの部分を任意で含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を意味する。
【００４９】
本明細書において使用される「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が超可変性であり、かつ/または特徴的な構造の(structurally defined)ループ(「超可変ループ」)を形成する、抗体可変ドメインの各領域を意味する。一般に、ネイティブ4鎖抗体は6個のHVRを含む。3個はVH中にあり(H1、H2、H3)、3個はVL中にある(L1、L2、L3)。一般に、HVRは、超可変ループおよび/または「相補性決定領域」(CDR)に由来するアミノ酸残基を含み、後者は、配列の可変性が最も高く、かつ/または抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に存在する(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)。例示的なCDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2のアミノ酸残基50〜56、L3のアミノ酸残基89〜97、H1のアミノ酸残基31〜35B、H2のアミノ酸残基50〜65、およびH3のアミノ酸残基95〜102に存在する(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242)。VH中のCDR1は例外として、一般に、CDRは、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。また、CDRは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」も含む。SDRは、短縮CDRまたはa-CDRと呼ばれるCDR領域内に含まれる。例示的なa-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、およびa-CDR-H3)は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2のアミノ酸残基50〜55、L3のアミノ酸残基89〜96、H1のアミノ酸残基31〜35B、H2のアミノ酸残基50〜58、およびH3のアミノ酸残基95〜102に存在する(Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照されたい)。別段の定めが無い限り、本明細書において、可変ドメイン中のHVR残基および他の残基(例えばFR残基)は上記のKabat et al.に従って番号を付与する。
【００５０】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、飼い慣らされた動物(例えば、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ)、霊長類(例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、およびげっ歯動物(例えば、マウス、ハムスター、およびラット)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。特定の態様において、個体または対象はヒトである。
【００５１】
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を意味する。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、存在し得る変種抗体を除いて、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。例えば、天然に存在する変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物を作製する間に発生するこのような変種は通常、少量で存在する。様々な決定基(エピトープ)を対象とする様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の作製を必要とするとして構成されるべきではない。例えば、本発明に従って使用するためのモノクローナル抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含むトランスジェニック動物を使用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法は、本明細書において説明される。
【００５２】
「ネイティブ抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合されている2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)とそれに続く3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有する。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)とそれに続く軽鎖定常(CL)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つのタイプの内の1つに割り当てることができる。
【００５３】
「天然に存在しないアミノ酸残基」という用語は、ポリペプチド鎖中の隣接したアミノ酸残基に共有結合することができる、上記に挙げた天然に存在するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を意味する。天然に存在しないアミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンである。さらなる例は、Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336に挙げられている。天然に存在しないアミノ酸残基を合成するための例示的な方法は、例えば、Noren, et al., Science 244 (1989) 182およびEllman et al.(前記)において報告されている。
【００５４】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント(％)」とは、配列を整列させ、かつ必要な場合にはギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを実現した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部分とみなさない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の技能の範囲内である様々な方法において、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなど公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、実現することができる。当業者は、比較される配列の全長に渡って最大限のアライメントを実現するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のためには、配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を用いて、アミノ酸配列同一性％の値を得る。配列比較コンピュータープログラムALIGN-2は、Genentech, Inc.の著作物であり、ソースコードはユーザー向け文書と共にU.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559に提出され、米国著作権登録番号(U.S. Copyright Registration No.)TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティング・システムにおける使用向けにコンパイルされるべきである。配列比較パラメーターはすべて、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
【００５５】
ALIGN-2がアミノ酸配列比較のために使用される状況において、所与のアミノ酸配列Bに対する、との、または比較しての(to, with, or against)所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性％(あるいは、所与のアミノ酸配列Bに対する、との、または比較してある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Aと表現することもできる)は、次のとおりに算出される。
100×比X/Y
上式で、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、そのプログラムによるAおよびBのアラインメントにおいて同一のマッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さに等しくない場合、Bに対するAのアミノ酸配列同一性％は、Aに対するBのアミノ酸配列同一性％と等しくならないが認識されると考えられる。別段の記載が特に無い限り、本明細書において使用されるアミノ酸配列同一性％の値はすべて、すぐ前の節で説明したようにして、ALIGN-2コンピュータープログラムを用いて得られる。
【００５６】
「薬学的製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態で存在し、かつその製剤が投与されると思われる対象に対して許容されないほど毒性である追加成分を含まない、調製物を意味する。
【００５７】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性である、薬学的製剤中の有効成分以外の成分を意味する。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５８】
「正の直線pH勾配」という用語は、低い(すなわち、酸性の強い)pH値から始まって、高い(すなわち、酸性が弱い、中性、またはアルカリ性の)pH値で終わるpH勾配を意味する。1つの態様において、正の直線pH勾配は、約5.5のpH値から始まり、約8.8のpH値で終わる。
【００５９】
「負の直線pH勾配」という用語は、高い(すなわち、中性またはアルカリ性の)pH値から始まって、低い(すなわち、中性または酸性の)pH値で終わるpH勾配を意味する。1つの態様において、負の直線pH勾配は、約7.4のpH値から始まり、約6.0のpH値で終わる。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「治療(treatment)」(およびその文法的変形、例えば「治療する(treat)」または「治療すること(treating)」)とは、治療される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を意味し、予防のため、または臨床的病状の過程のいずれかに実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な任意の病理学的転帰の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるため、または疾患の進行を遅くするために使用される。
【００６１】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体が抗原に結合するのに関与している抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを意味する。一般に、ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖(それぞれVHおよびVL)の可変ドメインは、4つの保存されているフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を各ドメインが含む、類似した構造を有する。(例えば、Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照されたい)。1つのVHドメインまたはVLドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを用いて、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングして、単離することができる。(例えば、Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい。)
【００６２】
「変種」、「修飾抗体」、および「修飾融合ポリペプチド」という用語は、親分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する分子を意味する。典型的には、このような分子は、1つまたは複数の改変、挿入、または欠失を有する。1つの態様において、修飾抗体または修飾融合ポリペプチドは、天然に存在しないFc領域についての少なくとも1つの部分を含むアミノ酸配列を含む。このような分子の、親抗体または親融合ポリペプチドとの配列同一性は、100％未満である。1つの態様において、変種抗体または変種融合ポリペプチドは、親抗体または親融合ポリペプチドのアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性が約75％〜100％未満、特に約80％〜100％未満、特に約85％〜100％未満、特に約90％〜100％未満、および特に約95％〜100％未満であるアミノ酸配列を有する。1つの態様において、親抗体または親融合ポリペプチドと変種抗体または変種融合ポリペプチドとは、1つの(単一の)、2つの、または3つのアミノ酸残基が異なる。
【００６３】
II.組成物および方法
ヒト新生児型Fc受容体(FcRn)は、IgG異化作用において重要な役割を果たしている。IgGのインビトロでのFcRn結合特性/特徴は、インビボでのその薬物動態学的特性を示唆している。このようなインビトロの方法は、度重なるインビボ研究を回避することができる(動物実験、時間、およびコストの削減)ため、抗体を開発する間、大変貴重であると思われる。これまで、このような解析は通常、プラズモン表面共鳴(plasmon surface resonance)(SPR)アッセイ法を用いて実施されてきた(Wang, W., et al., Drug Metab. Disp. 39 (2011) 1469-1477; Datta-Mannan, A., et al., Drug Metab. Disp. 40 (2012) 1545-1555; Vaughn, D.E. and Bjorkman, P.J., Biochemistry 36 (1997) 9374-9380; Raghavan, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 11200-11204; Martin, W.L. and Bjorkman, P.J., Biochemistry 38 (1999) 12639-12647)。熱量測定方法および非対称流フィールドフロー分画法もまた、FcRnへのIgG結合親和性の評価に関して説明されている(Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083; Pollastrini, J., et al., Anal. Biochem. 414 (2011) 88-98)。複雑なアッセイ法であることに加えて、SPRによって測定したインビトロでのFcRn結合パラメーターとインビボでの抗体の血清半減期との相互関係を調査するいくつかの研究は、結合反応条件を改善し適切なモデル化を行ったにも関わらず、そのような相互関係を実証することがこれまでできなかった(Gurbaxani, B., et al., Mol. Immunol. 43 (2006) 1462-1473; Gurbaxani, B.M. and Morrison, S.L., Mol. Immunol. 43 (2006) 1379-1389; Gurbaxani, B., Clin. Immunol. 122 (2007) 121-124)。IgG1のFc領域を操作して、SPR技術によって測定されるpH6および中性pHでのFcRnに対するIgG1の親和性を改善しても、カニクイザルにおける薬物動態は改善しなかった(Yeung, Y.A., et al., J. Immunol. 182 (2009) 7663-7671)。しかしながら、pH7.4ではFcRnへの顕著な結合を伴わないN434A IgG1変種のpH6でのFcRn親和性がわずかに増大していることにより、霊長類における薬物動態が改善したことから、pH7.4でのFcRn遊離の重要性が実証された(Yeung, Y.A.、前記を参照されたい)。
【００６４】
公知の方法を組み合わせることによって、FcRnアフィニティークロマトグラフィーの結果に匹敵する解析結果が得られるが、複雑さおよび労力の増大という犠牲を払うと考えられる。
【００６５】
現在の標準的な方法は、エンドソーム結合のためには酸性pHを要するが、細胞表面でのIgG放出には中性pHを要するFcRn結合特徴の生理的pH依存性を適切に反映しない。pH環境は、FcRn分子の自己会合特性に影響を与える。現在の方法は、1種類の所与のpHにおいて標準的条件下で機能し、したがって、複雑なFcRn-IgG相互作用の概略を見つけるにすぎず、IgG-FcRn相互作用のしっかりした(robust)動力学的評価を妨げる。このことはまた、いくつかの研究で判明しているインビトロFcRn解析とインビボ薬物動態との間のFcRn親和性の相互関係欠如を説明する理由の一つであり得る(上記を参照されたい)。
【００６６】
IgG-FcRn相互作用のSPR解析から、ある試料の予想されたまたは異常な結合特性を示唆する定性的結果が提供されるが、異常な結合の原因に関する手がかりも、異常な結合をする抗体の量の定量的推定も与えられない。質量分析法もまた、IgG分子の乱された完全性の定性的情報を与えるにすぎない。一方、FcRnアフィニティークロマトグラフィーによって、適切な生理的条件下で、1:2、1:1、および2:2の化学量論比を含む混ざった化学量論比(a mixture of stoichiometries)において2:1の化学量論比を主とし、かつ試料中に存在する様々なピークの分離を微調整するために調整することができるpH勾配を用いて、試料を解析することが可能になる。様々なピークは、個々の曲線下面積に基づいて定量することができ、各ピークに対応する溶出物は、例えば、官能性の決定、再クロマトグラフィー、または質量分析解析のための二次的解析を受けることができる。
【００６７】
さらに、現在公知の様々な疾患およびまた今後明らかになると考えられる疾患を治療するための治療プログラムを提供するために、目的に合わせて作製された(tailor made)抗体ならびにFc部分を含むポリペプチドが必要とされている。
【００６８】
抗体またはFc部分を含む融合ポリペプチドのFcRn結合特徴を目的に合わせるには、Fc部分を介したエフェクター機能に関与する残基を修飾し、結果として生じる修飾された抗体および融合ポリペプチドを試験しなければならない。必要とされる特徴を実現していない場合、同じ工程が再び実施される。
【００６９】
1つの態様において、Fc部分は、FcRnへの結合を媒介するFc領域の部分である。
【００７０】
したがって、単純なクロマトグラフィー法に基づいて修飾抗体の特徴的な特性の変化を予測し、修飾抗体の特徴の変化を解析するのにインビボ研究を必要としない方法を提供することは有利であると思われる。
【００７１】
一部の場合において、半減期が延長された抗体が望まれる。例えば、治療を必要とする患者の血液循環中での半減期が延長された薬物は、必要とする投薬回数(dosing)が減るか、または必要とする投薬期間が長くなる。また、このような抗体は、疾患部位、例えば腫瘍への曝露が増大するという利点を有している。
【００７２】
本明細書において報告される1つの局面は、固定化された、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体を、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用することである。
【００７３】
固定化された、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体を、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして含む、アフィニティークロマトグラフィーカラムは、予想外の安定性を有することが判明している。これは、性能(選択性および/または結合能力)を損なうことなく、少なくとも100回を超えるクロマトグラフィーサイクル、かつ最高で約200回のクロマトグラフィーサイクル(平衡化-分離-再生)に使用することができる。
【００７４】
また、マトリックスに結合されたクロマトグラフィー用の官能基が、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体を含むことを特徴とする、マトリックスおよびマトリックスに結合されたクロマトグラフィー用の官能基を含むアフィニティークロマトグラフィーカラムも報告されている。
【００７５】
本明細書において報告される1つの局面は、抗体と参照抗体の保持時間の比を決定することによって抗体のインビボ半減期を決定するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。1つの態様において、参照抗体は、完全長ヒトIgG1抗体である。
【００７６】
また、本明細書において報告されるFcRnアフィニティーカラムを用いて測定した抗体および参照抗体の保持時間の比を決定することによって、参照抗体と比較して(in relation to)抗体のインビボ半減期を決定するための方法も、本明細書において報告される。
【００７７】
本明細書において報告される1つの局面は、少なくとも1つのFc部分を含む抗体または融合ポリペプチドを分離するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【００７８】
また、少なくとも1つのFc部分を含む抗体または融合ポリペプチドを分離するための方法も、本明細書において報告される。
【００７９】
1つの態様において、分離は、精製、作製、および解析より選択される。
【００８０】
本明細書において報告される1つの局面は、IgG1サブクラスの抗体をIgG3サブクラスの抗体から分離するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【００８１】
本明細書において報告される1つの局面は、抗体のメチオニン酸化を測定するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【００８２】
本明細書において報告されるアフィニティークロマトグラフィー法を用いて、抗体のFc部分中のFcRn結合酸化メチオニン残基に対する、抗体のFc部分中のFcRn結合の影響を明らかにするための方法が、本明細書において報告される。
【００８３】
本明細書において報告される1つの局面は、抗体のオリゴマー化レベルを測定するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【００８４】
本明細書において報告されるアフィニティークロマトグラフィー法を用いて、抗体のオリゴマー化レベルを測定するための方法が、本明細書において報告される。
【００８５】
一般に、本明細書において報告される方法の開始点は、FcRnへの結合を特徴とする親抗体または親融合ポリペプチドである。
【００８６】
本明細書において報告される1つの局面は、親抗体または親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している該親抗体または該親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドについて、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含むこれらの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【００８７】
親抗体または親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している該親抗体または該親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドについて、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含むこれらの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするための方法が本明細書において報告され、該方法が、以下の段階を含む:
(a)本明細書において報告されるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムに、該ライブラリーの個々のメンバーおよび該親抗体または該親融合ポリペプチドを適用する段階;
(b)pH勾配を用いて、ライブラリーの個々のメンバーを回収し、個々の保持時間を測定する段階;ならびに
(c)該親抗体または該親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している抗体または融合ポリペプチドを選択する段階。
【００８８】
Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含む抗体または融合ポリペプチドを、ポリペプチドの混合物から精製するための方法が本明細書において報告され、該方法が、本明細書において報告されるFcRnアフィニティーカラムに混合物を適用する段階、およびFc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含む抗体または融合ポリペプチドをpH勾配を用いて溶出させ、それによって、抗体または融合ポリペプチドを精製する段階を含む。1つの態様において、Fc領域のFcRn部分は、ヒトFc領域のもの、またはマウスFc領域のもの、またはカニクイザルFc領域のもの、またはウサギFc領域のもの、またはハムスターFc領域のものである。
【００８９】
「1つの(a)」および「1つの(an)」という用語は、1つまたは2つもしくは3つもしくは4つもしくは5つもしくは6つ、および最大109個を意味する。
【００９０】
1つの態様において、反応/作製混合物または粗製もしくはある程度精製した培養上清が、第1のpH値でFcRnアフィニティーカラムに適用され、抗体または融合ポリペプチドが、第2のpH値でFcRnアフィニティーカラムから回収される。
【００９１】
1つの態様において、第1のpH値は、pH約3.5〜pH約7.5である。1つの態様において、第1のpH値は、pH約4〜pH約7である。1つの態様において、第1のpH値は、pH約4.5〜pH約6.5である。1つの態様において、第1のpH値は、pH約5〜pH約6である。1つの態様において、第1のpH値は、pH約5またはpH約5.5またはpH約6である。
【００９２】
1つの態様において、第1のpH値は、pH約3.5、pH約3.6、pH約3.7、pH約3.8、pH約3.9、pH約4.0、pH約4.1、pH約4.2、pH約4.3、pH約4.4、pH約4.5、pH約4.6、pH約4.7、pH約4.8、pH約4.9、pH約5.0、pH約5.1、pH約5.2、pH約5.3、pH約5.4、pH約5.5、pH約5.6、pH約5.7、pH約5.8、pH約5.9、pH約6.0、pH約6.1、pH約6.2、pH約6.3、pH約6.4、pH約6.5、pH約6.6、pH約6.7、pH約6.8、pH約6.9、pH約7.0、pH約7.1、pH約7.2、pH約7.3、pH約7.4、およびpH約7.5より選択される。
【００９３】
1つの態様において、第2のpH値は、pH約8〜pH約9.5である。1つの態様において、第2のpH値は、pH約8.5〜pH約9である。1つの態様において、第2のpH値は、pH約8.8である。
【００９４】
1つの態様において、第2のpH値は、pH約8.0、pH約8.1、pH約8.2、pH約8.3、pH約8.4、pH約8.5、pH約8.6、pH約8.7、pH約8.8、pH約8.9、pH約9.0、pH約9.1、pH約9.2、pH約9.3、pH約9.4、およびpH約9.5より選択される。
【００９５】
1つの態様において、pH約3.5、pH約3.6、pH約3.7、pH約3.8、pH約3.9、pH約4.0、pH約4.1、pH約4.2、pH約4.3、pH約4.4、pH約4.5、pH約4.6、pH約4.7、pH約4.8、pH約4.9、pH約5.0、pH約5.1、pH約5.2、pH約5.3、pH約5.4、pH約5.5、pH約5.6、pH約5.7、pH約5.8、pH約5.9、pH約6.0、pH約6.1、pH約6.2、pH約6.3、pH約6.4、pH約6.5、pH約6.6、pH約6.7、pH約6.8、pH約6.9、pH約7.0、pH約7.1、pH約7.2、pH約7.3、pH約7.4、およびpH約7.5という所与の第1のpH値のそれぞれは、pH約8.0、pH約8.1、pH約8.2、pH約8.3、pH約8.4、pH約8.5、pH約8.6、pH約8.7、pH約8.8、pH約8.9、pH約9.0、pH約9.1、pH約9.2、pH約9.3、pH約9.4、およびpH約9.5という所与の第2のpH値のそれぞれと組み合わせられる。
【００９６】
本明細書において報告される1つの局面は、Fc領域のFcRn結合部分(例えば、IgG1のような免疫グロブリンの定常ドメイン)の少なくとも1つを含み新生児型Fc受容体(FcRn)に対する結合の変化を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【００９７】
Fc領域のFcRn結合部分(例えば、IgG1のような免疫グロブリンの定常ドメイン)の少なくとも1つを含み新生児型Fc受容体(FcRn)に対する結合の変化を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するための方法が、本明細書において提供される。
【００９８】
このような修飾された抗体または融合ポリペプチドは、親抗体もしくは親融合ポリペプチドと比べるか、または参照抗体もしくは参照融合タンパク質と比べた場合、FcRnに対する結合の増大または減少のいずれかを示し、したがって、それぞれ、血清中半減期が延長されるか、または短縮されている。
【００９９】
FcRnに対する親和性が増大しているFc領域変種(すなわち、親抗体または参照抗体と比べて、本明細書において報告されるようにFcRnカラムにおける保持時間が長くなっているが、それでもなお、pH7.4のpH値より前に溶出する)は、FcRnに対する親和性が低下しているものと比べて、より長い血清半減期を有することが予測される。FcRnに対する親和性が増大しているFc領域変種は、慢性の疾患または障害の治療などにおいて投与される抗体または融合ポリペプチドの半減期が長いことが望まれる場合、哺乳動物、特にヒトを治療する方法に応用される。FcRnに対する親和性が低下しているFc領域変種は、インビボの画像診断などにおいて投与される抗体または融合ポリペプチドの半減期が短いことが望まれる場合、哺乳動物、特にヒトを処置する方法に応用される。
【０１００】
FcRn結合親和性が低下しているFc領域変種は、胎盤を通過することができ、したがって、妊婦における、特に生まれる前の子供の疾患または障害の治療に使用できる可能性が非常に高い。さらに、低下したFcRn結合親和性は、脳、腎臓、および/または肝臓への適用/輸送向けである薬物にとって望ましい場合がある。
【０１０１】
本明細書において報告される1つの局面は、血管系からの腎糸球体上皮を通過する輸送の減少を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【０１０２】
1つの態様において、本明細書において報告される修飾Fc領域を含む抗体または融合ポリペプチドは、血管系からの腎糸球体上皮を通過する輸送の減少を示す。
【０１０３】
本明細書において報告される1つの局面は、脳から血管腔中への血液脳関門を通過する輸送の減少を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【０１０４】
1つの態様において、本明細書において報告されるヒト由来の修飾Fc領域を含む抗体または融合ポリペプチドは、脳から血管腔中への血液脳関門(BBB)を通過する輸送の減少を示す。
【０１０５】
Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含むこのような修飾された抗体および融合ポリペプチドを作製する方法、ならびにこのような修飾された抗体および融合ポリペプチドを使用する方法が、本明細書において報告される。
【０１０６】
1つの態様において、本明細書において報告される抗体または融合ポリペプチドは、少なくとも1つの結合部位(例えば、少なくとも1つの抗原結合部位、または少なくとも1つの受容体結合部位、または少なくとも1つのリガンド結合部位)を含む。1つの態様において、本明細書において報告される抗体または融合ポリペプチドは、少なくとも2つの結合部位(例えば、少なくとも2つの抗原結合部位、もしくは少なくとも2つの受容体結合部位、もしくは少なくとも2つのリガンド結合部位、または少なくとも1つの抗原結合部位および少なくとも1つの受容体結合部位、もしくは少なくとも1つの抗原結合部位および少なくとも1つのリガンド結合部位、もしくは少なくとも1つの受容体結合部位および少なくとも1つのリガンド結合部位)を含む。1つの態様において、本明細書において報告される抗体または融合ポリペプチドは、3つの結合部位(例えば、少なくとも3つの抗原結合部位、もしくは少なくとも3つの受容体結合部位、もしくは少なくとも3つのリガンド結合部位、または前述の(of the before)少なくとも3種の結合部位の任意の組合せ)を含む。1つの態様において、本明細書において報告される抗体または融合ポリペプチドは、4つの結合部位を含む。
【０１０７】
本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、Fc領域の少なくとも1つの部分は、ヒト由来のFc領域についての少なくとも1つの部分である。本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、FcRnは、ヒトFcRn、カニクイザルFcRn、マウスFcRn、ラットFcRn、ヒツジFcRn、イヌFcRn、およびウサギFcRnより選択される。
【０１０８】
本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、β-2-ミクログロブリンは、FcRnと同じ種に由来する。
【０１０９】
本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、β-2-ミクログロブリンは、FcRnとは異なる種に由来する。
【０１１０】
1つの態様において、Fc領域またはFc領域のFcRn結合部分は、任意のアイソタイプの重鎖に由来する。
【０１１１】
1つの態様において、Fc領域についての少なくとも1つの部分は、ヒト由来のCH2ドメインの少なくともアミノ酸残基282〜340を含む(SEQ ID NO: 01、Kabatによる番号付与)。1つの態様において、Fc領域についての少なくとも1つの部分は、CH2ドメイン全体(KabatのEU番号付与によれば、ヒト由来抗体重鎖ポリペプチドFc領域のアミノ酸残基231〜340あたり)を含む。1つの態様において、Fc領域についての少なくとも1つの部分は、少なくとも1つのCH2ドメイン、およびヒンジ領域(EU番号付与によれば、ヒト由来抗体重鎖ポリペプチドFc領域のアミノ酸残基216〜230あたり)またはCH3ドメイン(EU番号付与によれば、ヒト由来抗体重鎖ポリペプチドFc領域のアミノ酸残基341〜446あたり)の内の少なくとも1つを含む。1つの態様において、Fc領域についての少なくとも1つの部分は、ヒト由来の抗体重鎖のCH2およびCH3ドメインを含む。1つの態様において、Fc領域についての少なくとも1つの部分は、ヒト由来の抗体重鎖Fc領域のヒンジ、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む。ヒト由来のFc領域またはヒト由来部分(portion)のFc領域のFcRn結合部分は、IgG1(SEQ ID NO: 03)、IgG2(SEQ ID NO: 04)、IgG3(SEQ ID NO: 05)、およびIgG4(SEQ ID NO: 06)など任意のアイソタイプの重鎖に由来してよい。1つの態様において、ヒトアイソタイプはIgG1である。
【０１１２】
親抗体のFc領域または親融合ポリペプチドに含まれるFc領域は、異なる免疫グロブリン分子および/または異なる免疫グロブリンアイソタイプに由来することができる。例えば、親抗体または親融合ポリペプチドは、IgG1アイソタイプ免疫グロブリンに由来するCH2ドメインおよびIgG3アイソタイプ免疫グロブリンに由来するヒンジ領域を含んでよい。また、例えば、親抗体または親融合ポリペプチドは、IgG1免疫グロブリンサブタイプに一部が由来しIgG3免疫グロブリンサブタイプに一部が由来するヒンジ領域を、これらがヒト由来である限りにおいて、含むこともできる。例えば、親抗体または親融合ポリペプチドは、IgG1免疫グロブリンアイソタイプに一部が由来しIgG4免疫グロブリンアイソタイプに一部が由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。
【０１１３】
本明細書において報告される親抗体または親融合ポリペプチドは、少なくとも1つのFc領域またはその1つのFcRn結合部分を含む。1つの態様において、親抗体または親ポリペプチドは、少なくとも1つの結合ドメイン(1つの態様において、抗原結合ドメイン、受容体結合ドメイン、またはリガンド結合ドメインより選択される)をさらに含む。1つの態様において、親抗体または親融合ポリペプチドは、少なくとも1つの結合ドメインおよび少なくとも1つのFc領域または1つのそのFcRn結合部分を含む。1つの態様において、親抗体または親融合ポリペプチドは、2つの結合ドメインおよび2つのFc領域または2つのそのFcRn結合部分を含む。
【０１１４】
1つの態様において、本明細書において報告される親抗体または親融合ポリペプチドは、生物学的効果をもたらす標的(1つの態様において、細胞表面受容体に結合できるリガンドまたはリガンドに結合できる細胞表面受容体)に特異的に結合し、少なくとも1つのFc領域またはそのFcRn結合部分と共に細胞への負または正のシグナルの伝達を媒介する、少なくとも1つの結合ドメインを含む。1つの態様において、生物学的効果の媒介は、pH約7.4のpH値で起こる。1つの態様において、親抗体または親融合ポリペプチドは、減少または除去の標的とされる抗原(1つの態様において、細胞表面抗原または可溶性抗原)に特異的な少なくとも1つの結合ドメインおよび少なくとも1つのFc領域または1つのそのFcRn結合部分を含む。
【０１１５】
標的に特異的に結合する抗体は、適切な抗原(例えば 、精製された抗原、そのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物、またはそのような抗原をコードするDNA)および任意でアジュバントを皮下または腹腔内に複数回注射することによって、哺乳動物において産生させることができる。
【０１１６】
1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１１７】
1つの態様において、本明細書において報告される融合ポリペプチドは、FcRn結合部分に機能的に連結された抗体断片(例えば、scFv分子、ミニボディ、四価のミニボディ、またはダイアボディ)を含む。1つの態様において、FcRn結合部分は、完全抗体重鎖Fc領域である。
【０１１８】
1つの態様において、親抗体は二重特異性抗体であるか、または親融合ポリペプチドは、二重特異性抗体または二重特異性抗体断片を含む。
【０１１９】
1つの態様において、親抗体はキメラ抗体である。
【０１２０】
1つの態様において、親融合ポリペプチドは、Fc領域についての少なくとも1つのFcRn結合部分を含む。1つの態様において、本明細書において報告される親融合ポリペプチドは、1つまたは複数の結合ドメインを含み、さらにはこれらのドメインは1つの結合部位をそれぞれ含む。親融合ポリペプチドは、二重特異性(1つの結合部位が第1の標的に特異的に結合し、第2の結合部位が第2の標的に特異的に結合する)または多価(2つの結合部位が同じ標的に特異的に結合する)であることができる。
【０１２１】
すべての先の局面の1つの態様において、pHは、pH約5.5からpH約8.8までの勾配である。
【０１２２】
1つの態様において、pHは、pH約5からpH6まで、またはpH約6からpH約7まで、またはpH約7からpH約8までの勾配である。
【０１２３】
一般に、結合ドメインは、Fc領域についての少なくとも1つのFcRn結合部分のC末端またはN末端に融合される。
【０１２４】
本明細書において報告される1つの局面は、インビボで(同時)ターゲティングするために、pH7.4のpH値でFcRnに結合する抗体を選択するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。1つの態様において、同時ターゲティングは、内在化である。
【０１２５】
したがって、1つの態様において、第1のpH値は、pH約7.4である。1つの態様において、第2のpH値は、pH約6.0である。
【０１２６】
通常、C末端にHis-Aviタグ(SEQ ID NO: 08)を有するFcRnの可溶性細胞外ドメイン(ヒトFcRnの場合SEQ ID NO: 07)が、哺乳動物細胞においてβ2-ミクログロブリン(ヒトβ-2-ミクログロブリンの場合SEQ ID NO: 09)と同時発現させられた。FcRn-ミクログロブリン非共有結合性複合体がビオチン標識され、ストレプトアビジン誘導体化セファロース上に載せられた。
【０１２７】
本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体は、固相に結合している。
【０１２８】
「固相」とは、非流動性物質を意味し、ポリマー、金属(常磁性粒子、強磁性粒子)、ガラス、およびセラミックなどの材料から作製された粒子(微粒子およびビーズを含む);シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルなどのゲル物質;ポリマー、金属、ガラス、および/またはセラミック製であり得るキャピラリー;ゼオライトおよび他の多孔性物質;電極;マイクロタイタープレート;ソリッドストリップ(solid strip);ならびにキュベット、チューブ、または他の分光計用試料容器が含まれる。「固相」が、ある分子と化学的に相互作用すると意図される少なくとも1つの部分をその表面に含むという点で、アッセイ法の固相構成要素は、不活性な固体表面と区別される。固相は、チップ、チューブ、ストリップ、キュベット、もしくはマイクロタイタープレートなどの静止構成要素であってよく、またはビーズおよび微粒子などの非静止構成要素であってよい。微粒子もまた、ホモジニアスなアッセイ形式のための固体支持体として使用され得る。タンパク質および他の物質の非共有結合または共有結合の両方を可能にする様々な微粒子が、使用され得る。このような粒子には、ポリスチレンおよびポリ(メチルメタクリラート)などのポリマー粒子;金ナノ粒子および金コロイドなどの金粒子;ならびにシリカ、ガラス、および金属酸化物粒子などのセラミック粒子が含まれる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるMartin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1 (1998) 322A-327Aを参照されたい。1つの態様において、固体支持体はセファロースである。
【０１２９】
1つの態様において、固相への非共有結合性複合体のコンジュゲーションは、抗体のアミノ酸骨格のN末端基および/もしくはε-アミノ基(リジン)、異なるリシンのε-アミノ基、カルボキシ官能基、スルフヒドリル官能基、ヒドロキシル官能基、および/もしくはフェノール官能基、ならびに/または抗体の炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学的結合によって実施される。
【０１３０】
1つの態様において、非共有結合性複合体は、特異的結合対を介して固相にコンジュゲートされている。1つの態様において、非共有結合性複合体はビオチンにコンジュゲートされ、固体支持体に固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して、固体支持体への固定化が行われる。
【０１３１】
1つの態様において、特異的結合対(第1の構成要素/第2の構成要素)は、ストレプトアビジンまたはアビジン/ビオチン、抗体/抗原(例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)を参照されたい)、レクチン/多糖、ステロイド/ステロイド結合タンパク質、ホルモン/ホルモン受容体、酵素/基質、IgG/プロテインAおよび/またはプロテインGなどより選択される。
【０１３２】
本明細書において報告される使用および方法における、本明細書において報告されるFcRnアフィニティーカラムに結合した抗体の回収は、直線勾配溶離による。1つの態様において、直線勾配は、pH勾配または導電率勾配である。
【０１３３】
原則的には、本明細書において報告される方法において、任意の緩衝物質を使用することができる。
【０１３４】
マウスFcとマウスFcRnの相互作用に決定的に重要なFc残基は、部位特異的変異誘発によって同定されている(例えば、Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180を参照されたい)。残基I253、H310、H433、N434、およびH435(KabatによるEU番号付与)が、相互作用に関与している(Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。残基I253、H310、およびH435が、ヒト FcとマウスFcRnの相互作用に決定的に重要であることが判明した(Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819)。タンパク質間の相互作用研究によってFcRn結合を改良するために、残基M252Y、S254T、T256EがDall'Acquaらによって説明されている(Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。ヒトFc-ヒトFcRn複合体の研究により、残基I253、S254、H435、およびY436が相互作用に決定的に重要であることが示された(Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)において、残基248〜259番および301〜317番および376〜382番および424〜437番の様々な変異体が報告され検査されている。
【０１３５】
異なる溶出緩衝液を用いて得られる、異なる抗体の保持時間を以下の表に示す。
【０１３６】
（表）
2018188442.tif 000006
YTE変異体という用語は、三重変異体M252Y/S254T/T256Eを意味する。
【０１３７】
1つの態様において、例えば、リン酸またはその塩、酢酸またはその塩、クエン酸またはその塩、モルホリン、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)またはその塩、ヒスチジンまたはその塩、グリシンまたはその塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)またはその塩、(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)またはその塩などの薬学的に許容される緩衝物質が使用される。
【０１３８】
1つの態様において、緩衝物質は、リン酸もしくはその塩、または酢酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩、またはヒスチジンもしくはその塩より選択される。
【０１３９】
1つの態様において、緩衝物質の濃度は、10mM〜500mMである。1つの態様において、緩衝物質の濃度は、10mM〜300mMである。1つの態様において、緩衝物質の濃度は、10mM〜250mMである。1つの態様において、緩衝物質の濃度は、10mM〜100mMである。1つの態様において、緩衝物質の濃度は、15mM〜50mMである。1つの態様において、緩衝物質の濃度は、約20mMである。
【０１４０】
1つの態様において、第1の溶液中の緩衝物質および第2の溶液中の緩衝物質は、同じ緩衝物質である。
【０１４１】
1つの態様において、第1の溶液中の緩衝物質および第2の溶液中の緩衝物質は、異なる緩衝物質である。
【０１４２】
1つの態様において、第1の溶液のpH値は、pH約3.5〜pH約7.5である。1つの態様において、第1の溶液のpH値は、pH約5〜pH約6である。1つの態様において、第1の溶液のpH値は、pH約5.5である。
【０１４３】
1つの態様において、第2の溶液のpH値は、pH約7.0〜pH約9.5である。1つの態様において、第2の溶液のpH値は、pH約8〜pH約9である。1つの態様において、第2の溶液のpH値は、pH約8.2〜pH約8.8である。
【０１４４】
例示的な第1の溶液は、pH5.5に調整された20mM MESおよび150mM NaClを含む。
【０１４５】
例示的な第2の溶液は、pH8.8に調整された20mM TRISおよび150mM NaClを含む。
【０１４６】
例示的な第2の溶液は、pH8.6に調整された20mM HEPESを含む。
【０１４７】
例示的な第2の溶液は、pH8.2に調整された20mM TRISを含む。
【０１４８】
1つの態様において、緩衝液は、その他の塩を含む。1つの態様において、その他の塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、またはクエン酸カリウムより選択される。1つの態様において、緩衝液は、50mM〜1000mMのその他の塩を含む。1つの態様において、緩衝液は、50mM〜750mMのその他の塩を含む。1つの態様において、緩衝液は、50mM〜500mMのその他の塩を含む。1つの態様において、緩衝液は、50mM〜750mMのその他の塩を含む。1つの態様において、緩衝液は、約50mM〜約300mMのその他の塩を含む。
【０１４９】
1つの態様において、第1および/または第2の溶液は、塩化ナトリウムを含む。1つの態様において、第1および/または第2の溶液は、約50mM〜約300mMの塩化ナトリウムを含む。
【０１５０】
塩および緩衝物質の種類が保持時間および分解能に影響することが判明している。FcRnへの抗体の結合に関して最適な塩濃度は、決定され得る(150mM NaCl)。塩濃度が高い場合(300mM)、FcRnへの結合が減少し/より短い保持時間が得られる。低い塩濃度(50mM)の場合も、同じことが当てはまる。20mM HEPES pH8.6を用いた場合、試験した抗体すべての保持時間が長くなった。
【０１５１】
図1から理解できるとおり、適用された抗体の量は、溶出ピークの曲線下面積に対して直線的相関を示す。
【０１５２】
8種類の抗体が、完全抗体としておよび酵素IDESを用いて切断した後に、解析された。切断は、SDS pageおよび解析的SECによって管理された。抗体のFc部分およびFab部分は、分離用SECによって分離された。下記の表において、完全抗体、Fab部分、およびFc部分の保持時間を示す。
【０１５３】
（表）
2018188442.tif 000007
YTE変異体という用語は、三重変異体M252Y/S254T/T256Eを意味する。
【０１５４】
一般に、野生型Fc部分を有する抗体(IgG1またはIgG2またはIgG4)の保持時間は、45分〜49分の間を変動する(36種の抗原に対して35種の治療的抗体を用いて試験。データ不掲載)。
【０１５５】
下記の表において、カラム材料1グラム当たりの固定化されたFcRn受容体の量に関して、保持時間を示している。
【０１５６】
（表）
2018188442.tif 000008
YTE変異体という用語は、三重変異体M252Y/S254T/T256Eを意味する。
【０１５７】
抗Aβ抗体FAB断片は、グリコシル化部位を含む。
【０１５８】
したがって、本明細書において報告される1つの局面は、FAB修飾を検出するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。1つの態様において、修飾は、グリコシル化または電荷分布である。
【０１５９】
通常、本明細書において報告される方法および使用における保持時間は、pH勾配の険しさおよび使用される塩濃度に依存している。野生型抗体が参照として使用され、弱い結合は、短い保持時間(=早い溶出)によって示され、一方、強い結合は、長い保持時間(=遅い溶出)によって示され、ただし、それでもなお、pH7.4のpH値より前である。
【０１６０】
IgGのFc部分の異なる変異体は、FcRnカラム上での挙動が異なり、変化した保持時間を示すことが判明している。
【０１６１】
例えば、抗Aβ抗体変異体YTEは、長くなった保持時間を示す。抗Aβ抗体YTE変異体の第2のピークは、Fab部分に導入された付加的なグリコシル化部位に起因する。
【０１６２】
例えば、抗IGF-1R抗体変異体YTEは、長くなった保持時間を示す(図2を参照されたい)。
【０１６３】
（表）
2018188442.tif 000009
YTE変異体という用語は、三重変異体M252Y/S254T/T256Eを意味する。
【０１６４】
本明細書において報告されるFcRnカラムを用いて、FcRn結合に関連するアミノ酸を同定すること、および修飾されていない野生型抗体と比較して変異体を格付けすることが可能であることが判明している。
【０１６５】
本明細書において報告される局面は、FcRn結合に関連するアミノ酸を同定するため、および修飾されていない野生型抗体と比較して変異体を格付けするための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【０１６６】
抗Her2抗体を用いて得られた結果が、下記の表に提示される(例えば、例示的な参照文献としてWO2006/031370を参照されたい)。
【０１６７】
（表）
2018188442.tif 000010
【０１６８】
FcRnカラムからの遅い溶出を示した、すなわち、FcRnカラムにおける保持時間がより長かった抗体の方が、インビボでの半減期が長かったことが判明している。インビボのデータは、下記の表に示される。
【０１６９】
（表）
2018188442.tif 000011
YTE変異体という用語は、三重変異体M252Y/S254T/T256Eを意味する。
【０１７０】
本明細書において報告される1つの局面は、抗体のインビボ半減期を測定するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【０１７１】
野生型IgGおよびFc部分にYTE変異を有するIgG変種を用いて実施した一組のインビトロ実験およびインビボ実験により、FcRnアフィニティークロマトグラフィーの調査結果とヒトFcRnに関してトランスジェニックなマウスを用いたインビボの薬物動態学的研究の調査結果との半定量的相関を示すことができた(Spiekerman, G.M., et al. J. Exp. Med. 196 (2002) 303-310; Dall'Acqua, W.F., et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。YTE変異により、半減期が有意に延長され、血漿クリアランスが遅くなる。長いインビボ半減期は、FcRnクロマトグラフィーにおける長い保持時間に対応していた。半減期の長くなった、Fcを操作されたトラスツズマブ変種は、フローサイトメトリーによって測定されるFcRnに対するインビトロでの結合が増大していることが、最近示された(Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769)。FcRn親和性が11倍向上した抗VEGF IgG1抗体ベバシズマブ変種は、ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて5倍長い半減期を有し、カニクイザルにおいて3倍長い半減期を有することが示された(Zalevsky, J., et al., Nat. Biotechnol. 28 (2010) 157-159)。
【０１７２】
IgG調製物中の半抗体の解析および除去は、本明細書において報告されるFcRnカラムを用いて実現できることが判明している。例示的なFcRnカラムクロマトグラフィーが、図3に示される。
【０１７３】
本明細書において報告される1つの局面は、IgG調製物から半抗体を除去するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【０１７４】
オリゴマーおよび凝集物は、本明細書において報告されるFcRnクロマトグラフィーによって分離できることが判明している(図4を参照されたい)。
【０１７５】
本明細書において報告される1つの局面は、IgG調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するための、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
【０１７６】
保持時間は、分析物分子中に含まれるFc部分の数の影響を受けることが判明している。これは、1つまたは2つのFc部分を含む構築物を用いることによって示された(図5を参照されたい)。
【０１７７】
酸化が、FcRn結合に強い影響を与えたこと、およびFcRnカラム上で示すことができたことが判明している(図6を参照されたい)。
【０１７８】
抗体の形態はFcRnカラムへの結合に強い影響を与えなかったことが示されている。このことは、ノブイントゥーホール(knob-into-hole)形態について、およびいくつかの二重特異性抗体の形態について示された。したがって、FcRnカラムは、新規の抗体形態の評価に使用され得る。
【０１７９】
1つの態様において、複合体は、モノビオチン化されている。
【０１８０】
1つの態様において、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、本明細書において報告される方法および使用において少なくとも100サイクルという安定性を有する。サイクルは、各方法または使用の第1のpH値から第2のpH値までのpH勾配であり、材料を再生するために、方法または使用の最終条件に加えて条件をさらに変更する必要はない。したがって、1つの態様において、サイクルは、およそのpH値pH5.5からおよそのpH値pH8.8までのpH勾配である。
【０１８１】
428位のMからEへのアミノ酸交換と組み合わせて252位のMからHへのアミノ酸交換が起こると、保持時間が短くなることが判明している(図7を参照されたい)。
【０１８２】
酸化産物Met252およびMet428を含む抗体試料は、SPR技術とFcRnアフィニティークロマトグラフィーとの差異を例示する。試料のSPR解析により、参照標準と比べて試料の結合に約20％の相対的差異が検出されたものの、SPR解析ではこの試料の不均質性に対する見識は与えられなかった。一方、同じ試料のFcRnアフィニティークロマトグラフィーにより、2つの異なるピーク、すなわち参照標準の保持時間の箇所の1つおよび左に顕著にシフトした第2のピークが示されたことから、ストレスを加えられた試料中の抗体とFcRnカラム材料との相互作用が低いpHでは弱まっていることが示唆された。
【０１８３】
本明細書において報告される新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、抗体断片の単離/分離のために使用され得、したがって、従来のプロテインAアフィニティークロマトグラフィーの代替手段を提供する。さらに、本明細書において報告されるクロマトグラフィー材料を用いることによって、従来のプロテインAアフィニティークロマトグラフィーと比べて、より生理的な条件、例えばpH値で分離が実施され得る。
【０１８４】
新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、修飾、例えば、酸化、電荷変種(charge variants)、グリコシル化、および脱アミドなどを含む抗体種の測定/分離/濃縮のために使用され得る。新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、特定の抗体種を濃縮するために、選択されたpH勾配(開始/終了pH値)に応じて使用され得る。
【０１８５】
新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、分子量の変化/差異に基づいた抗体種の単離/濃縮のために使用され得る。
【０１８６】
新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、分子中のFcRn結合部位の数に基づいた抗体の単離/濃縮のために使用され得る。
【０１８７】
新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、アミノ酸修飾物の単離のために使用され得る。新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリンとの非共有結合性複合体をリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、ホール-ホール二量体および半抗体などの二重特異性抗体誤対合物の単離/分離のために使用され得る。
【０１８８】
具体的な態様
1. 正の直線pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおける、固定化された、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との非共有結合性複合体の、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての使用。
2. 正の直線pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおいて、少なくとも1つのFc領域を含む抗体または融合ポリペプチドを分離するためであることを特徴とする、項1に記載の使用。
3. 前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、互いとは無関係に、ヒト由来、またはマウス由来、またはカニクイザル由来、またはラット由来、またはウサギ由来であることを特徴とする、項1または2に記載の使用。
4. 前記β-2-ミクログロブリンが前記新生児型Fc受容体と同じ種に由来することを特徴とする、項1〜3のいずれかに記載の使用。
5. 前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、それぞれ互いとは無関係に0〜10個のアミノ酸残基修飾を有するヒト野生型新生児型Fc受容体およびヒト野生型β-2-ミクログロブリンであることを特徴とする、項1〜4のいずれかに記載の使用。
6. 新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との前記非共有結合性複合体が固相に結合していることを特徴とする、項1〜5のいずれかに記載の使用。
7. 前記固相がクロマトグラフィー材料であることを特徴とする、項6に記載の使用。
8. 新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との前記非共有結合性複合体がビオチン標識され、かつ前記固相がストレプトアビジンで誘導体化されていることを特徴とする、項6または7に記載の使用。
9. 前記pH勾配が、第1のpH値から第2のpH値までであり、該第1のpH値がpH約3.5〜pH約7.5であり、かつ該第2のpH値がpH約6.0〜pH約9.5であることを特徴とする、項1〜8のいずれかに記載の使用。
10. 前記第1のpH値がpH約5.5であり、かつ前記第2のpH値がpH約8.8であることを特徴とする、項1〜9のいずれかに記載の使用。
11. 抗体と参照抗体の保持時間の比を決定することによって該抗体のインビボ半減期を決定するためであることを特徴とする、項1〜10のいずれかに記載の使用。
12. 抗体のメチオニン酸化を測定するためであることを特徴とする、項1〜10のいずれかに記載の使用。
13. 抗体のオリゴマー化レベルを測定するためであることを特徴とする、項1〜10のいずれかに記載の使用。
14. 親抗体または親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している該親抗体または該親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドについて、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含むこれらの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするためであることを特徴とする、項1〜10のいずれかに記載の使用。
15. Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含み前記新生児型Fc受容体に対する結合の変化を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するためであることを特徴とする、項1〜10のいずれかに記載の使用。
16. IgG調製物から半抗体を除去するためであることを特徴とする、項1〜10のいずれかに記載の使用。
17. IgG調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するためであることを特徴とする、項1〜10のいずれかに記載の使用。
18. 前記抗体が、単一特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または二重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または三重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または四重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片であることを特徴とする、項1〜17のいずれかに記載の使用。
19. 負の直線pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおける、固定化された、新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との非共有結合性複合体の、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての使用。
20. 負の直線pH勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおいて、少なくとも1つのFc領域を含む抗体または融合ポリペプチドを分離するためであることを特徴とする、項19に記載の使用。
21. 前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、互いとは無関係に、ヒト由来、またはマウス由来、またはカニクイザル由来、またはラット由来、またはウサギ由来であることを特徴とする、項19または20に記載の使用。
22. 前記β-2-ミクログロブリンが前記新生児型Fc受容体と同じ種に由来することを特徴とする、項19〜21のいずれかに記載の使用。
23. 前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、それぞれ互いとは無関係に0〜10個のアミノ酸残基修飾を有するヒト野生型新生児型Fc受容体およびヒト野生型β-2-ミクログロブリンであることを特徴とする、項19〜22のいずれかに記載の使用。
24. 新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との前記非共有結合性複合体が固相に結合していることを特徴とする、項19〜23のいずれかに記載の使用。
25. 前記固相がクロマトグラフィー材料であることを特徴とする、項24に記載の使用。
26. 新生児型Fc受容体(FcRn)とβ-2-ミクログロブリン(b2m)との前記非共有結合性複合体がビオチン標識され、かつ前記固相がストレプトアビジンで誘導体化されていることを特徴とする、項24または25に記載の使用。
27. 前記pH勾配が、第1のpH値から第2のpH値までであり、該第1のpH値がpH約7.0〜pH約8.5であり、かつ該第2のpH値がpH約5.5〜pH約6.9であることを特徴とする、項19〜26のいずれかに記載の使用。
28. 前記第1のpH値がpH約7.4であり、かつ前記第2のpH値がpH約6.0であることを特徴とする、項19〜27のいずれかに記載の使用。
29. 抗体と参照抗体の保持時間の比を決定することによって該抗体のインビボ半減期を決定するためであることを特徴とする、項19〜28のいずれかに記載の使用。
30. 抗体のメチオニン酸化を測定するためであることを特徴とする、項19〜28のいずれかに記載の使用。
31. 抗体のオリゴマー化レベルを測定するためであることを特徴とする、項19〜28のいずれかに記載の使用。
32. 親抗体または親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している該親抗体または該親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドについて、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含むこれらの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするためであることを特徴とする、項19〜28のいずれかに記載の使用。
33. Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含み前記新生児型Fc受容体に対する結合の変化を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するためであることを特徴とする、項19〜28のいずれかに記載の使用。
34. IgG調製物から半抗体を除去するためであることを特徴とする、項19〜28のいずれかに記載の使用。
35. IgG調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するためであることを特徴とする、項19〜28のいずれかに記載の使用。
36. 前記抗体が、単一特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または二重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または三重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または四重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片であることを特徴とする、項19〜35のいずれかに記載の使用。
37. IgG3サブクラスからIgG1サブクラスの抗体を分離するためである、項1〜10、18、19〜28、および35のいずれかに記載の使用。
38. 252位のアミノ酸がメチオニンからヒスチジンに変更され、かつ、428位のアミノ酸がメチオニンからグルタミン酸に変更されている、ヒトIgG1アイソタイプのFc領域変種。
【０１８９】
1.抗体断片
特定の態様において、本明細書において提供される融合ポリペプチドは抗体断片を含む。抗体断片には、Fab断片、Fab'断片、Fab'-SH断片、F(ab')2断片、Fv断片、およびscFv断片、ならびに後述する他の断片が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１９０】
いくつかの抗体断片の概要については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。scFv断片の概要については、例えば、Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照されたい。また、WO93/16185ならびにUS5,571,894およびUS5,587,458も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が長くなっているFab断片およびF(ab')2断片の考察については、US5,869,046を参照されたい。
【０１９１】
ダイアボディとは、二価または二重特異性であり得る、2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP0404097;WO1993/01161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134;およびHolliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもまた、Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134)において説明されている。
【０１９２】
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である。特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA;例えば、米国特許第6,248,516 B1号を参照されたい)。
【０１９３】
抗体断片は、本明細書において説明するように、インタクト抗体のタンパク質分解消化ならびに組換え宿主細胞(例えば、大腸菌(E. coli)またはファージ)による作製を非限定的に含む様々な技術によって作製することができる。
【０１９４】
2.キメラ抗体およびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体が、例えば、US4,816,567;およびMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855において説明されている。1つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはヒト以外の霊長類、例えばサルに由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。別の例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０１９５】
特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低下させる。
【０１９６】
通常、ヒト化抗体は、HVR、例えばCDR(またはその一部分)が非ヒト抗体に由来し、FR(またはその一部分)がヒト抗体配列に由来する、1つまたは複数の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は、ヒト定常領域についての少なくとも1つの部分も任意で含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるか、または向上させるために、非ヒト抗体(例えば、HVR残基の由来元である抗体)に由来する対応する残基で置換されている。
【０１９７】
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633において概説されており、例えば、Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US5,821,337、US7,527,791、US6,982,321、およびUS7,087,409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34(SDR(a-CDR)グラフティングを説明); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498(「リサーフェシング」を説明); Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60(「FRシャッフリング」を説明);ならびにOsbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68およびKlimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260(「FRシャッフリング」に取り組む「導かれた選択」アプローチを説明)においてさらに説明されている。
【０１９８】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法(例えば、Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照されたい)を用いて選択されたフレームワーク領域;特定のサブグループの軽鎖可変領域または重鎖可変領域のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;およびPresta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照されたい);ヒト成熟(体細胞性に変異した)フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照されたい);およびFRライブラリーをスクリーニングして得られたフレームワーク領域(例えば、Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684およびRosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618を参照されたい)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１９９】
3.ヒト抗体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374およびLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において一般的に説明されている。
【０２００】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって、調製することができる。典型的には、このような動物は、内在性の免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含む。このようなトランスジェニックマウスにおいて、通常、内在性の免疫グロブリン遺伝子座は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照されたい。また、例えば、XENOMOUSE(商標)技術を説明するUS6,075,181およびUS6,150,584;HUMAB(登録商標)技術を説明するUS5,770,429;K-M MOUSE(登録商標)技術を説明するUS7,041,870、ならびにVELOCIMOUSE(登録商標)技術を説明するUS2007/0061900も参照されたい。このような動物によって産生されるインタクト抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と結合させることによって、さらに修飾することができる。
【０２０１】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株は説明されている。(例えば、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63;およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照されたい)。また、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって作製したヒト抗体が、Li, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562において説明されている。その他の方法には、例えば、US7,189,826(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の作製を説明)およびNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268(ヒト-ヒトハイブリドーマを説明)において説明されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937およびVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191においても説明されている。
【０２０２】
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製することもできる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと結合させてよい。
【０２０３】
抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。
【０２０４】
4.ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の1種または複数種の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37において概説されており、例えば、McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S., et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;およびLee, C.V., et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132においてさらに説明されている。
【０２０５】
いくつかのファージディスプレイ法では、VH遺伝子のレパートリーおよびVL遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいて無作為に組み換え、次いで、Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455で説明されているようにして、抗原結合ファージについてそれらをスクリーニングすることができる。典型的には、ファージは、単鎖Fv(scFv)断片またはFab断片のいずれかとして抗体断片を提示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734によって説明されているように、未処置のレパートリーを(例えばヒトから)クローニングして、まったく免疫化せずに、広範な非自己抗原およびまた自己抗原に対する単一の抗体供給源を提供することもできる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388によって説明されているように、幹細胞由来の再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、かつランダム配列を含むPCRプライマーを用いて可変性に富むCDR3領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することによって、未処置のライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを説明している特許公報には、例えば、US5,750,373、US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936、およびUS2009/0002360が含まれる。
【０２０６】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
【０２０７】
5.多重特異性抗体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様において、二重特異性抗体は、同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。また、二重特異性抗体は、抗原を発現する細胞に細胞障害性物質を局在させるのにも使用され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０２０８】
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組み換え同時発現(Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、WO93/08829、およびTraunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照されたい)および「ノブインホール(knob-in-hole)」操作(例えばUS5,731,168を参照されたい)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための静電気的操縦(electrostatic steering)効果を操作すること(WO2009/089004);2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること(例えば、US4,676,980およびBrennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83を参照されたい);二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーを用いること(例えば、Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照されたい);二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を用いること(例えば、Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい);および単鎖Fv(sFv)二量体を用いること(例えば、Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照されたい);ならびに例えばTutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69で説明されているようにして、三重特異性抗体を調製することによって、多重特異性抗体を作製することもできる。
【０２０９】
「オクトパス抗体(Octopus antibodies)」を含む、3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる(例えば、US2006/0025576を参照されたい)。
【０２１０】
また、本明細書の抗体または断片には、異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab」または「DAF」が含まれる(例えば、US2008/0069820を参照されたい)。
【０２１１】
本明細書の抗体または断片にはまた、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、およびWO2010/145793において説明されている多重特異性抗体も含まれる。
【０２１２】
6.抗体変種
特定の態様において、本明細書において提供される抗体のアミノ酸配列変種が企図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変種は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製することができる。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、ならびに/または残基中への挿入、および/もしくは残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を示すことを条件として、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行って、最終構築物を得てもよい。
【０２１３】
(a)置換変種、挿入変種、および欠失変種
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変種が、提供される。対象となる置換変異誘発部位には、HVRおよびFRが含まれる。例示的な変更は、表1の「例示的置換」という項目の下に提供し、アミノ酸側鎖のクラスに関してさらに後述する。保存的置換は、表1の「好ましい置換」という項目の下に示す。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、その作製物を所望の活性、例えば、保持された/向上した抗原結合、低下した免疫原性、または改善したADCCもしくはCDCについてスクリーニングすることができる。
【０２１４】
（表）
2018188442.tif 000012
【０２１５】
アミノ酸は、側鎖の共通特性に基づいてグループ分けされ得る:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性で親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の向きに影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
【０２１６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０２１７】
置換変種の1つのタイプは、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1つまたは複数の超可変領域(HVR)残基の置換を含む。一般に、その後の研究のために選択される得られた変種は、親抗体を基準としていくつかの生物学的特性の変化(例えば改善)(例えば、増大した親和性、低下した免疫原性)を有し、かつ/または親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変種は、例えば、本明細書において説明するもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作製することができる、親和性成熟抗体である。簡単に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、変種抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングする。
【０２１８】
例えば、抗体親和性を向上させるために、HVR中に改変(例えば置換)がなされてよい。このような改変は、HVR「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異を経験するコドンにコードされる残基(例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照されたい)、および/またはSDR(a-CDR)中になされてよく、得られた変種VHまたは変種VLを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R., et al., in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37において説明されている。親和性成熟のいくつかの態様において、様々な方法(例えば、誤りがちなPCR、チェーンシャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指定変異誘発)のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変種を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのHVR残基(例えば、同時に4〜6個の残基)がランダム化される、HVRを対象とするアプローチを伴う。抗原結合に関与しているHVR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的とされる。
【０２１９】
特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、このような改変によって、抗体が抗原に結合する能力が実質的に低下しない限り、1つまたは複数のHVR内に存在してよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変(例えば、本明細書において提供される保存的置換)がHVR中になされてよい。このような改変は、HVR「ホットスポット」またはSDRの外側でもよい。上記で提供した変種VH配列および変種VL配列の特定の態様において、各HVRは、未改変であるか、または1個、2個、もしくは3個以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
【０２２０】
変異誘発の標的とされ得る抗体の残基または領域を同定するために有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085によって説明されている。この方法では、残基または標的残基群(例えば、arg、asp、his、lys、およびgluなどの荷電残基)を同定し、中性アミノ酸または負電荷を持つアミノ酸(例えば、アラニンまたはポリアラニン)によって置換して、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうか判定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらに置換を導入してよい。あるいはまたはさらに、抗原-抗体複合体の結晶構造から、抗体と抗原の接触点を特定する。このような接触残基および隣接残基を、置換の候補として標的とするか、または除去してよい。変種をスクリーニングして、それらが所望の特性を有するかどうかを判定してよい。
【０２２１】
アミノ酸配列挿入には、長さが残基1個から100個またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶアミノ末端融合および/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変種には、(例えばADEPTのための)酵素または抗体の血清半減期を長くするポリペプチドへの、抗体のN末端またはC末端への融合が含まれる。
【０２２２】
(b)グリコシル化変種
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を大きくするか、または小さくするように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作製されるかまたは取り除かれるようにアミノ酸配列を改変することによって、簡便に達成することができる。
【０２２３】
抗体がFc領域を含む場合、それに結合する炭水化物を改変してよい。典型的には、哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって通常結合している分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「軸(stem)」中のGlcNAcに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様において、いくつかの特性が改善した抗体変種を作製するために、本発明の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えてよい。
【０２２４】
1つの態様において、Fc領域に(直接的にまたは間接的に)結合されたフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変種が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％、または20％〜40％であってよい。フコースの量は、例えばWO2008/077546において説明されているように、MALDI-TOF質量分析法によって測定して、Asn297に結合した糖構造物(glycostructure)すべて(例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物、および高マンノース構造物)の合計に対するAsn297における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Asn297は、Fc領域中の297位あたり(Fc領域残基のEU番号付与)に位置するアスパラギン残基を意味する;しかしながら、Asn297は、抗体の軽微な配列変異が原因で、297位からアミノ酸±約3個だけ上流または下流に、すなわち、294位と300位の間に位置してもよい。このようなフコシル化変種は、ADCC機能が向上している場合がある。例えば、US2003/0157108; US2004/0093621を参照されたい。「脱フコシル化された」または「フコースを欠く」抗体変種に関連した刊行物の例には、US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249;Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠陥があるLec13 CHO細胞(Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545;US2003/0157108;およびWO2004/056312、特に実施例11)およびノックアウト細胞株、例えば、α-1,6-フコシル基転移酵素遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞(例えば、Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688;およびWO2003/085107を参照されたい)が含まれる。
【０２２５】
抗体変種は、分岐したオリゴ糖と共にさらに提供され、例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐型オリゴ糖は、GlcNAcによって分岐している。このような抗体変種は、フコシル化が減少し、かつ/またはADCC機能が向上している場合がある。このような抗体変種の例は、例えば、WO2003/011878;US6,602,684;およびUS2005/0123546において説明されている。Fc領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変種もまた、提供される。このような抗体変種は、CDC機能が向上している場合がある。このような抗体変種は、例えば、WO1997/30087;WO1998/58964;およびWO1999/22764において説明されている。
【０２２６】
(c)Fc領域変種
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸修飾を本明細書において提供される抗体のFc領域中に導入し、それによってFc領域変種を作製することができる。Fc領域変種は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域)を含み得る。
【０２２７】
特定の態様において、本発明は、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変種を企図する。このことにより、その抗体は、インビボでの抗体の半減期が重要ではあるが、ある種のエフェクター機能(補体およびADCCなど)が不必要または有害である用途に対する望ましい候補となる。インビトロおよび/またはインビボの細胞障害性アッセイ法を行って、CDC活性および/またはADCC活性の減少/消失(depletion)を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイ法を行って、抗体はFcγR結合を欠く(したがって、ADCC活性を欠く可能性が高い)がFcRn結合能を保持していることを確実にすることができる。ADCCを媒介する主な細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロのアッセイ法の非限定的な例は、US5,500,362(例えば、Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063;およびHellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照されたい);US5,821,337(Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照されたい)において説明されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい(例えば、フローサイトメトリー用のACTI(商標)非放射性細胞障害性アッセイ法(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA);およびCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞障害性アッセイ法(Promega, Madison, WI)を参照されたい)。このようなアッセイ法に有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656で開示されているもののような動物モデルにおいて評価してもよい。また、C1q結合アッセイ法を実施して、抗体はC1qに結合することができず、したがって、CDC活性を欠くことを確認することもできる。例えば、WO2006/029879およびWO2005/100402におけるC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ法を実施してもよい(例えば、Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052;およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照されたい)。FcRn結合およびインビボのクリアランス/半減期の測定はまた、当技術分野において公知の方法を用いて実施することもできる(例えば、Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照されたい)。
【０２２８】
エフェクター機能が低下している抗体には、Fc領域残基238番、265番、269番、270番、297番、327番、および329番の内の1つまたは複数が置換されたものが含まれる(US6,737,056)。このようなFc変異体には、残基265番および297番がアラニンに置換された、いわゆる「DANA」Fc変異体を含む、アミノ酸265位、269位、270位、297位、および327位の内の2つまたはそれ以上における置換を有するFc変異体が含まれる(US7,332,581)。
【０２２９】
FcRへの結合が改善されているか、または減弱しているいくつかの抗体変種が説明されている。(例えば、US6,737,056;WO2004/056312、およびShields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照されたい)。
【０２３０】
特定の態様において、抗体変種は、ADCCを向上させる1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の298位、333位、および/または334位(残基のEU番号付与)の位置における置換を有するFc領域を含む。
【０２３１】
例えば、US6,194,551、WO99/51642、およびIdusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184において説明されているように、いくつかの態様において、C1q結合および/または補体依存性細胞障害性(CDC)の変化(すなわち、向上または減弱のいずれか)をもたらす改変が、Fc領域中に施される。
【０２３２】
胎児への母親のIgGの移行に関与する、半減期が長くなり新生児型Fc受容体(FcRn)への結合が向上した抗体(Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593およびKim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)は、US2005/0014934において説明されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を向上させる1つまたは複数の置換をその中に有するFc領域を含む。このようなFc変種には、Fc領域残基:238番、252番、253番、254番、256番、265番、272番、286番、303番、305番、307番、311番、312番、317番、340番、356番、360番、362番、376番、378番、380番、382番、413番、424番、または434番の内の1つまたは複数における置換、例えば、Fc領域残基434番の置換を有するものが含まれる(US7,371,826)。
【０２３３】
Fc領域変種の他の例に関しては、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740;US5,648,260;US5,624,821;およびWO94/29351も参照されたい。
【０２３４】
(d)システインで操作された抗体変種
特定の態様において、システインで操作された抗体、例えば、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb」を作製することが望ましい場合がある。特定の態様において、置換される残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、その結果、抗体の接近可能な部位に位置づけられ、本明細書においてさらに説明するように、薬物部分またはリンカー-薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートさせて免疫コンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の態様において、次の残基の任意の1つまたは複数をシステインで置換してよい:軽鎖のV205(Kabatの番号付与);重鎖のA118(EU番号付与);および重鎖Fc領域のS400(EU番号付与)。システインで操作された抗体は、例えば、US7,521,541において説明されているようにして作製することができる。
【０２３５】
(e)抗体誘導体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、当技術分野において公知であり、容易に入手可能である付加的な非タンパク性部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるがそれに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレン(prolylpropylene)オキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造の際に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものでよく、分枝状または非分枝状でよい。抗体に結合されるポリマーの数は変動してよく、複数のポリマーが結合される場合、それらは同じ分子または異なる分子でよい。通常、誘導体化のために使用されるポリマーの数および/またはタイプは、限定されるわけではないが、改善しようとする抗体の特定の特性または機能、その抗体誘導体が所定の条件下で治療法において使用されるかどうかなどを含む考慮すべき事柄に基づいて決定することができる。
【０２３６】
別の態様において、抗体と放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク性部分とのコンジュゲートが提供される。1つの態様において、非タンパク性部分はカーボンナノチューブである(Kam, N.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。放射線は、任意の波長のものでよく、普通の細胞には害を与えないが、抗体-非タンパク性部分の近位にある細胞が死滅する温度まで非タンパク性部分を加熱する波長が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０２３７】
III.組換え法および組換え組成物
モノクローナル抗体を作製するための方法は、KohlerおよびMilstein(Nature 256 (1975) 495-497)によって最初に報告されている。その後、抗体をコードする核酸(DNA)を安定に導入することによる、骨髄腫細胞を用いた組換え抗体の作製が報告されている(Oi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 6351-6355を参照されたい)。
【０２３８】
抗体のコード核酸(完全抗体または可変ドメインいずれかについて)は、従来の手順を用いて抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。単離後、コード核酸を1つまたは複数の発現ベクター中に配置することができる。可変ドメインのコード核酸のみが単離されている場合、発現ベクターは、重鎖定常領域および/または軽鎖定常領域をそれぞれコードする核酸も含む(例えば、US5,658,570を参照されたい)。発現ベクターは、さもなければ抗体を分泌しない原核宿主細胞(大腸菌)または真核宿主細胞(CHO、HEK、BHK、SP2/0)中にトランスフェクトされ得る。
【０２３９】
コード核酸が、ファージディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、または一般に細胞表面ディスプレイライブラリーなどのディスプレイライブラリーに由来する場合、発現ベクター中にそれを直接クローニングすることができる。
【０２４０】
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号において説明されているようにして、組換え法および組換え組成物を用いて作製することができる。1つの態様において、本明細書において説明する抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードし得る。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのこのような態様において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらで形質転換されている)。1つの態様において、宿主細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp20細胞)である。1つの態様において、本明細書において報告される抗体を作製する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階、および任意で、宿主細胞(または宿主細胞培地)から抗体を回収する段階を含む。
【０２４１】
本明細書において報告される抗体を組換え作製する場合、例えば前述したような抗体をコードする核酸は、単離され、宿主細胞におけるその後のクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクター中に挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、容易に単離および配列決定され得る。
【０２４２】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書において説明する原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合には特に、細菌において産生させることができる。細菌における抗体断片および抗体ポリペプチドの発現については、例えば、US5,648,237、US5,789,199、およびUS5,840,523を参照されたい。(大腸菌における抗体断片の発現を説明するCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254)も参照されたい)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。
【０２４３】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的または全面的にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株および酵母株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414;およびLi, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい。
【０２４４】
グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０２４５】
植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。例えば、US5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978、およびUS6,417,429(トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのPLANTIBODIES(商標)技術を説明している)を参照されたい。
【０２４６】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように順応させた哺乳動物細胞株が、有用である場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7);ヒト胚性腎臓株(例えばGraham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74で説明されている293または293細胞);仔ハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252で説明されているTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸部癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(HepG2);マウス乳房腫瘍(MMT060562);例えば、Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68で説明されている、TRI細胞;MRC5細胞;およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR- CHO細胞(Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。
【０２４７】
III.免疫コンジュゲート
本発明はまた、1種または複数種の細胞障害性物質、例えば、化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖抑制剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来するタンパク毒素、酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片)、または放射性同位元素にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体を含む、免疫コンジュゲートも提供する。
【０２４８】
1つの態様において、免疫コンジュゲートは、抗体が1種または複数種の薬物にコンジュゲートされている抗体-薬物コンジュゲート(ADC)である。これらの薬物には、マイタンシノイド(US5,208,020、US5,416,064、およびEP0425235 B1を参照されたい);アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDF(MMAEおよびMMAF)(US5,635,483、US5,780,588、およびUS7,498,298を参照されたい);ドラスタチン;カリケアミシンまたはその誘導体(US5,712,374、US5,714,586、US5,739,116、US5,767,285、US5,770,701、US5,770,710、US5,773,001、およびUS5,877,296;Hinman, L.M., et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342;ならびにLode, H.N., et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照されたい);アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシンまたはドキソルビシン(Kratz, F., et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523;Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721;Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834;Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532;King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343;および米国特許第6,630,579号を参照されたい);メトトレキサート;ビンデシン;タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル;トリコテセン;ならびにCC1065が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２４９】
別の態様において、免疫コンジュゲートは、限定されるわけではないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ツルレイシ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス(Saponaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む、酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書において説明する抗体を含む。
【０２５０】
別の態様において、免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成した、本明細書において説明する抗体を含む。様々な放射性同位元素が、放射性コンジュゲートの作製のために利用可能である。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位元素が含まれる。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー調査のための放射性原子、例えば、TC99mもしくはI123、または核磁気共鳴(NMR)画像法(磁気共鳴画像法、MRIとしても公知)のためのスピン標識、例えば、やはりヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含んでよい。
【０２５１】
抗体および細胞障害性物質のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質結合剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えばアジプイミド酸ジメチルHCl)、活性エステル(例えばスベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えばビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えばトルエン2,6-ジイソシアナート)、および置換基が2つの活性なフッ素化合物(例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を用いて作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104で説明されているようにして調製することができる。炭素14で標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、抗体に放射性ヌクレオチドを結合させるための例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞障害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性のリンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィドを含むリンカーが使用され得る(Chari, R.V., et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131;US5,208,020)。
【０２５２】
本明細書における免疫コンジュゲートまたはADCは、(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから)市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB(スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾアート)を非限定的に含む架橋剤試薬を用いて調製されたこのようなコンジュゲートを明確に企図するが、それらに限定されるわけではない。
【０２５３】
IV.診断および検出のための方法および組成物
特定の態様において、本明細書において提供される抗体のいずれかは、生物試料においてその抗原の存在を検出するのに有用である。本明細書において使用される「検出する」という用語は、定量的検出または定性的検出を包含する。特定の態様において、生物試料は、細胞または組織を含む。
【０２５４】
1つの態様において、診断または検出の方法において使用するための本明細書において報告される抗体が提供される。さらなる局面において、抗原の存在を生物試料において検出する方法が提供される。特定の態様において、この方法は、抗体がその抗原に結合するのを許容する条件下で、生物試料を本明細書において説明する抗体と接触させる段階、および抗体と抗原の間で複合体が形成されるかどうかを検出する段階を含む。このような方法は、インビトロの方法またはインビボの方法であってよい。
【０２５５】
特定の態様において、本明細書において報告される標識された抗体が提供される。標識には、直接的に検出される標識または部分(例えば、蛍光性標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識)、ならびに例えば酵素反応または分子相互作用を通じて間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的な標識には、ラジオアイソトープ32P、14C、125I、3H、および131I、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどの蛍光体、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ(US4,737,456)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、過酸化水素を使用して色素前駆体を酸化する酵素、例えば、HRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼと併用される、糖類酸化酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環酸化酵素、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、ならびに安定なフリーラジカルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２５６】
V.薬学的製剤
本明細書において説明する抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するそのような抗体を1種または複数種の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で調製される。通常、薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度において受容者に非毒性であり、限定されるわけではないが、次のものが含まれる:リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリ(ビニルピロリドン)のような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムのような塩を形成する対イオン;金属複合体(例えばZn-タンパク質複合体);ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン系界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)のような侵入型(interstitial)薬物分散剤、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)のようなヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。rhuPH20を含む、いくつかの例示的なsHASEGPおよび使用方法は、米国特許出願公開公報第2005/0260186号および同第2006/0104968号において説明されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1種または複数種の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２５７】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が、US6,267,958において説明されている。水性抗体製剤には、US6,171,586およびWO2006/044908において説明されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。
【０２５８】
本明細書における製剤はまた、治療される個々の適応症に対する必要に応じて複数の有効成分、好ましくは、補完的な活性を有し、互いに悪影響を及ぼさないものも含んでよい。このような有効成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせられて存在するのが適切である。
【０２５９】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリラート)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込めることができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)で開示されている。
【０２６０】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは造形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
【０２６１】
通常、インビボ投与のために使用される製剤は、滅菌済みである。無菌状態は、例えば、滅菌ろ過膜に通してろ過することによって、容易に実現することができる。
【０２６２】
VI.製造品
本発明の別の局面において、前述の障害の治療、予防、および/または診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器、および容器の上または容器に伴うラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料から形成されてよい。容器は、単独であるか、または病態を治療、予防、および/もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられた組成物を収容し、無菌取出口を有してよい(例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができる栓を有する静注液バッグまたはバイアルでよい)。組成物中の少なくとも1種の活性物質は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が、選ばれた病態を治療するのに使用されることを示す。さらに、製造品は、(a)本発明の抗体を含む組成物がその中に含まれる第1の容器;および(b)別の細胞障害性物質またはそうでなければ治療物質を含む組成物がその中に含まれる第2の容器を含んでよい。本発明のこの態様の製造品は、それらの組成物を用いて特定の病態を治療できることを示す添付文書をさらに含んでよい。あるいはまたはさらに、製造品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の(または第3の)容器をさらに含んでよい。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含んでよい。
【０２６３】
上記の製造品のいずれかは、本明細書において報告される抗体の代わりにまたは抗体に加えて、本発明の免疫コンジュゲートを含んでよいことが理解される。
【０２６４】
以下の実施例、図面、および配列は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱することなく、説明される手順に改変を加え得ることが理解される。
【実施例】
【０２６５】
方法
エレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)
N-グリカナーゼplus(Roche)0.5μLおよびリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.1)を添加することによってタンパク質アリコート(50μg)を脱グリコシル化して、最終試料体積115μLを得た。この混合物を37℃で18時間インキュベートした。その後、還元および変性のために、4M塩酸グアニジン(Pierce)に溶かした0.5M TCEP(Pierce)60μLおよび8M塩酸グアニジン50μLを添加した。この混合物を37℃で30分間インキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィー(セファロースG-25、無勾配、2％ギ酸を含む40％アセトニトリル)によって試料を脱塩した。ナノESI供給源(TriVersa NanoMate、Advion)を装備されたQ-TOF機器(maXis、Bruker)を用いて、ESI質量スペクトル(+ve)を記録した。MSパラメーター設定は次のとおりであった:移動:ファンネルRF、400Vpp;ISCIDエネルギー、0eV;多重極RF、400Vpp;四重極:イオンエネルギー、4.0eV;低質量、600m/z;供給源:乾燥ガス、8L/分;乾燥ガスの温度、160℃;コリジョンセル:衝突エネルギー、10eV;衝突RF:2000Vpp;イオンクーラー:イオンクーラーRF、300Vpp;移動時間:120μ秒;プレパルス蓄積、10μ秒;スキャン範囲m/z600〜2000。データを評価するために、施設内で開発したソフトウェア(MassAnalyzer)を使用した。
【０２６６】
FcRn表面プラズモン共鳴(SPR)解析
FcRnに対する野生型抗体および変異体の結合特性を、BIAcore T100機器(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって解析した。この方式は、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。これにより、リガンド/分析物結合を連続的にリアルタイムでモニタリングし、したがって、様々なアッセイ法設定において動態パラメーターを測定することが可能になる。SPR技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面近くでの屈折率の測定に基づいている。屈折率の変化から、固定化されたリガンドと溶液中に注入された分析物の相互作用によって引き起こされる表面の質量変化が示唆される。分子が、表面の固定化されたリガンドに結合する場合、質量は増加し、解離する場合は質量が減少する。本(current)アッセイ法においては、400応答単位(RU)のレベルまで、アミンカップリングによってFcRn受容体をBIAcore CM5バイオセンサーチップ(GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden)上に固定化した。アッセイ法は、PBS、0.05％ Tween20 pH6.0(GE Healthcare Bioscience)をランニング緩衝液および希釈用緩衝液として用いて室温で実施した。200nMのネイティブ抗体試料または酸化抗体試料を室温、流速50μL/分で注入した。結合時間は180秒であった。解離相は360秒に及んだ。HBS-P、pH8.0を短時間注入することにより、チップ表面の再生を達成した(reached)。注入後180秒および注入後300秒における生物学的応答シグナルの高さを比較することによって、SPRデータの評価を行った。対応するパラメーターは、RU最大レベル(注入後180秒)および後期の安定性(注入終了後300秒)である。
【０２６７】
実施例1
FcRnアフィニティーカラムの調製
HEK293細胞におけるFcRnの発現
FcRnおよびβ-2-ミクログロブリンのコード配列を含む2つのプラスミドを用いてHEK293細胞をトランスフェクションすることによって、FcRnを一過性に発現させた。トランスフェクトされた細胞を、36.5℃、120rpm(振盪機の振幅5cm)、80％湿度、および7％CO2で、振盪フラスコ中で培養した。2〜3日毎に、細胞を3〜4×105細胞/mlの密度に希釈した。
【０２６８】
一過性発現のために、14l容のステンレス鋼バイオリアクターを、培養体積8l、36.5℃、pH7.0±0.2、pO2 35％(N2および空気をガス供給、合計ガス流量200ml/分)、および撹拌速度100〜400rpmの条件で開始した。細胞密度が20×105細胞/mlに達した場合、プラスミドDNA 10mg(両方のプラスミドの等モル量)をOpti-MEM(Invitrogen)400ml中で希釈した。293フェクチン(Invitrogen)20mlをこの混合物に添加し、次いで、室温で15分間インキュベートし、続いて、発酵槽に移した。翌日以降、これらの細胞に連続的に栄養素を供給した:供給溶液を500ml/日の速度で添加し、2g/lを上回るレベルを維持するように必要に応じてグルコースを加えた。トランスフェクション後7日目に、1l容バケツ付きスイングヘッド遠心分離機を4000rpmで90分間用いて、上清を回収した。Sartobran Pフィルター(0.45μm+0.2μm、Sartorius)によって上清(13L)を清澄化し、FcRnβ-2-ミクログロブリン複合体をそれから精製した。
【０２６９】
新生児型Fc受容体のビオチン標識
HEK293細胞においてβ2-ミクログロブリンと同時発現された、His-Aviタグを有するFcRnの可溶性細胞外ドメインを、精製後、次のようにしてビオチン標識した。
【０２７０】
150mM KCl、PBS 250μl、およびCompleteプロテアーゼインヒビター(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)1錠を含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5.5 5mlに溶かした1.2mg〜12mgの間のFcRn/β2-ミクログロブリンを、製造業者の取扱い説明書に従ってAvidity社のビオチン標識キット(Bulk BIRA)を用いて、ビオチン標識した。ビオチン標識反応は、室温で一晩、実施した。150mM NaClを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5に対して、修飾タンパク質を4℃で一晩透析して、過剰なビオチンを除去した。
【０２７１】
ストレプトアビジンセファロースへの結合
ストレプトアビジンセファロース(GE Healthcare)1gを、ビオチン標識し透析した受容体(1.2〜12mgの間のFcRn/β2-ミクログロブリン、標準的な分析用途の場合、3mgを選択した)に添加し、振盪しながら2時間インキュベートした。受容体で誘導体化したセファロースを、1ml容XKカラム(GE Healthcare)に詰めた。
【０２７２】
実施例2
FcRnアフィニティーカラムを用いるクロマトグラフィー
受容体で誘導体化したセファロースを、1ml容XKカラム(GE Healthcare)に詰め、次いで、150mM NaClを含む20mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)緩衝液、pH5.5を用いてFcRnカラムを平衡化した。
【０２７３】
条件:
カラム寸法:50mm×5mm
カラム床の高さ:5cm
添加量:試料50μg
平衡化緩衝液:pH5.5に調整された、150mM NaClを含む20mM MES
溶出緩衝液:pH8.8に調整された、150mM NaClを含む20mM Tris/HCl
溶出:7.5カラム体積(CV)の平衡化緩衝液、30カラム体積をかけて100％溶出緩衝液とし、10カラム体積の溶出緩衝液
【０２７４】
タンパク質50〜100μgを含む抗体試料または融合タンパク質試料をpH5.5に調整し、AKTA explorer 10 XTまたはDionex Summit(Dionex, Idstein, Germany)を用いて、FcRnカラムに適用した。次いで、カラム床の高さが5cmのカラムを、5〜10カラム体積の平衡緩衝液である20mM MES、150mM NaCl、pH5.5で洗浄した。親和性によって結合されたFcを含むタンパク質を、30カラム体積をかけて、20mM Tris/HCl、150mM NaCl、pH8.8へのpH勾配を用いて溶出させた。修飾抗体を完全に溶出させるために、最高pH8.8までの勾配で、pHを上昇させた。実験は室温で実施した。280nmにおける吸光度を連続的に測定することによって、溶出プロファイルを得た。試料注入後に分析物のピークが検出器に到達するのにかかる時間Xを保持時間と呼んだ。
【０２７５】
実施例3
FcRnカラムにおける保持時間とインビボ半減期との相互関係
10mg/kgを1回静脈内投与した後、ヒトFcRnトランスジェニックC57BL/6Jマウスにおいてインビボ半減期を測定し(n=8)、FcRnカラムにおける保持時間と比較した(表を参照されたい)。FcRnカラムから遅くに溶出する抗体の方が、FcRnトランスジェニックマウスにおいて長い半減期を有することが判明した。
【０２７６】
（表）
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【０２７７】
実施例4
ヒトFcRn、マウスFcRn、およびカニクイザルFcRnの精製
ヘキサヒスチジン(hexahis)でタグ化されたタンパク質を含む清澄化された上清を、4℃でNi-NTAアフィニティークロマトグラフィー樹脂(Qiagen, Hanbrechtikon, Switzerland)に載せた。500mM NaClを含み、かつ20mMイミダゾールおよび100mMイミダゾールをそれぞれ含むpH7.4の20mMリン酸ナトリウム緩衝液を用いた洗浄段階の後、AKTA Primeクロマトグラフィーシステム(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いて、300mMイミダゾールを含む同じ緩衝液によるバッチ溶出を用いて流速2ml/分でタンパク質を溶出させた。画分を集め、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex(商標)200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland)を用いて、500mM NaClを含むリン酸ナトリウム緩衝液中でさらに精製した。Nanodrop分光光度計(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE)を用いて、精製したタンパク質を定量し、変性かつ還元条件下でMES緩衝液においてNuPAGE 4〜12％ Bis-Trisゲルを用いたSDS PAGEによって解析した。
【０２７８】
実施例5
マウスFcRnアフィニティーカラムクロマトグラフィーおよびカニクイザルFcRnアフィニティーカラムクロマトグラフィー
次の表において、カニクイザル由来のFcRnを含むアフィニティーカラムにおける例示的なヒト抗体の保持時間を示す。データは、次の条件を用いて得た:溶出緩衝液:20mM TRIS/HCl、150mM NaCl、pH8.5。さらなる説明は、実施例2を参照されたい。YTE変異体という用語は、三重変異体M252Y/S254T/T256Eを意味する。
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【０２７９】
次の表において、マウスFcRnにおける例示的なヒト抗体の保持時間を示す。データは、次の条件を用いて得た:セファロース1mlに結合させた受容体1.2mg。溶出緩衝液:20mM TRIS/HCl、150mM NaCl、pH8.5。さらなる説明は、実施例2を参照されたい。YTE変異体は、溶出緩衝液のpHを9.5に調整しなければ溶出させることができなかったため、この表に含めていない。
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【０２８０】
カニクイザルFcRnアフィニティーカラムは、ヒト化抗体の結合に関して、ヒトFcRnアフィニティーカラムと同様の挙動を示す。これに対して、マウスFcRnカラムへのヒト化抗体の結合は、より遅くまで保持されることから理解できるように、ヒトFcRnアフィニティーカラムよりも強い。
【０２８１】
実施例6
抗体断片の作製
抗体50μg当たり1μgのIdeSシステインプロテアーゼを添加し、37℃で2時間インキュベーションすることにより、100mM Tris、pH8.0で1:1希釈した完全長抗体を切断することによって、F(ab')2断片およびFc領域断片を調製した。得られた切断産物F(ab')2およびFcを、AKTA Explorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)を用いてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(Superdex 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland)によって分離し、ピーク画分を集めた。同じカラム上の分子量標準物質が、保持時間に基づいてこれら2種の切断産物を同定するのに役立った。
【０２８２】
完全長抗体の保持時間は、著しく異なった。一方、試験したすべての抗体の各Fc部分の保持時間は、実質的に相互に差がなかった(<1％)。
【０２８３】
完全長抗体の切断にプラスミンを使用した場合、同じ調査結果が得られた(データ不掲載)。
【０２８４】
実施例7
FcRnカラムにおける保持時間と酸化状態との相互関係
FcRnアフィニティークロマトグラフィーの保持時間に抗体酸化が与える影響を研究した。抗体を40℃で2ヶ月間保管することによって、IgG1抗体(1mg/ml)の酸化を観察した。未修飾抗体試料および酸化抗体試料を、FcRnアフィニティークロマトグラフィーおよびFcRn表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって解析した。ペプチドマッピングおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって、抗体酸化の特徴を明らかにした。
【０２８５】
ESI-MSのデータにより、40℃で2ヶ月間、促進条件下で緩衝液(20mM His/His*HCl、240mMトレハロース、0.02％ポリソルベート20)中で保管すると、IgG1抗体の重鎖の約50％において、溶媒にさらされたMet252残基およびMet428残基が酸化されることが明らかになった。酸化抗体を含む40℃でストレスを加えられた試料ならびに-80℃および25℃で保管された試料を、あらかじめFcRnを固定化したアフィニティーカラムに適用した場合、2つの主要ピークを分離することができた(図8)。ほとんど重なっている2つの曲線からなる、図8の保持時間のより長い第2のピークは、25℃および-80℃で保管された試料中の未修飾抗体の溶出時間に対応していたのに対し、より早い時期の溶出ピークは、Met252およびMet428が酸化された抗体に相当していた。酸化されたMet252およびMet428の存在は、ESI-MSにより、ストレスを加えられた試料において検出された16Daの質量シフトによって裏付けられた。BIAcoreのSPRによって、ストレスを加えられた(40℃)抗体試料を解析したところ、2種の異なる抗体種、すなわち野生型抗体ならびにMet252およびMet428が酸化された抗体を用いたFcRnクロマトグラフィーと同じセンサーグラムの応答パターンを示した(図9)。
【０２８６】
実施例8
FcRnカラムにおける保持時間と凝集物形成との相互関係
アフィニティークロマトグラフィーにおいて抗体凝集物形成がFcRn相互作用に与える影響を、抗IL13Rα 抗体について評価した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行い、各ピークを集めることによって、抗体単量体画分および凝集物画分を単離した。アフィニティークロマトグラフィーおよびSPR技術によって、これらの画分のFcRn相互作用を解析した。
【０２８７】
FcRnカラムクロマトグラフィーのために、抗IL13Rα抗体の単量体および多量体凝集物を含む3種の抗IL13Rα抗体画分をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて単離した。クロマトグラムのピーク領域に基づくと、FcRnアフィニティークロマトグラフィーに使用された抗IL13Rα抗体の試料は、抗IL13Rα抗体の単量体57％および凝集物43％を含んだ。FcRnアフィニティークロマトグラフィーにおいて未分画試料を解析したところ、保持時間の異なる2つの主要なピークが明らかになった(図10)。保持時間のより長い小さい方のピークは、凝集物画分のピークに相当し、速く溶出したピークの大部分は単量体画分に相当した。
【０２８８】
表面プラズモン共鳴(SPR)解析において、抗IL13Rα抗体の参照標準を、2つの異なるプール画分(凝集物を濃縮したもの(プール1)および単量体を濃縮したもの(プール2))ならびに天然のプールと比較した。天然バッチおよびプール画分の正確な組成を下記の表において説明する。
【０２８９】
（表）抗IL13Rα抗体の天然画分および濃縮したプール画分の組成
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【０２９０】
単量体を濃縮したプール2試料のセンサーグラムが、抗IL13Rα抗体の参照標準のものに最も似ており、続いて、凝集物の少ない試料のセンサーグラムであった。一方、凝集物を濃縮したプール1は、SPR解析によって、FcRnへの結合が2倍近く強いという特徴が示された(図11)。
【０２９１】
実施例9
ヒトFcRnマウスにおける薬物動態試験
手順はすべて、実験動物管理評価認定協会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)の指針(www.aaalac.org)に従って実施した。試験は、ドイツ、オーバーバイエルンの州議会(Regional Council of Oberbayern, Germany)によって認可された。
【０２９２】
雄および雌のC57BL/6Jマウス(遺伝背景(background));マウスFcRnを欠損しているがヒトFcRnに関してヘミ接合性トランスジェニックであるもの(huFcRn(276)-/tg(30、31)を、薬物動態試験の間、一貫して使用した。
【０２９３】
投与時の動物の体重は、17〜25gの間であった。尾静脈を介した1回の静脈内ボーラス注入として、各抗体を与えた。マウスの血液量は限られているため、9回の試料採取時点、すなわち動物1匹当たり3回の試料採取時点をカバーするために、それぞれ雄動物4匹および雌動物4匹からなる3つのグループが必要とされた。投与後、グループ1では5分、24時間、および336時間の時点で、グループ2では2時間、168時間、および504時間の時点で、グループ3では8時間、48時間、および672時間の時点で、血液試料を採取した。眼球後穿刺によって約100μLの血液試料を得、室温で60分間保管して、凝固させた。4℃、9,300×gで3分間の遠心分離によって、少なくとも40μLの血清試料を得、直ちに凍結し、分析するまで-20℃で保管した。
【０２９４】
マウス血清中のヒト治療的抗体の血清濃度を、投与された抗体およびその変種の抗原結合領域(Fab)に特異的な抗原捕捉酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって測定した。すべての試薬または試料を、400rpmの振盪機上、室温でインキュベートした。各洗浄段階は3サイクルを含んだ。簡単に説明すると、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートを、アッセイ用緩衝液中で希釈したビオチン標識抗体で被覆した。リン酸緩衝化生理食塩水-ポリソルベート20(Tween20)を用いて洗浄した後、様々な希釈率の血清試料を添加し、1時間インキュベートした。洗浄後、マウスIgGと交差反応しない、ジゴキシゲニンとコンジュゲートされたヒトFcγ特異的モノクローナル抗体Fab断片と続いてインキュベーションすることによって、結合したヒト治療的抗体を検出した。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を添加し、1時間インキュベートした。洗浄後、ABTS(2,2'Azino-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate; Roche Diagnostics, Germany)をHRP基質として添加して、有色の反応生成物を形成させた。得られた反応生成物の吸光度を、参照波長を490nmとして405nmで読み取った。血清試料および陽性対照試料または陰性対照試料はすべて、反復して解析し、参照標準に対して補正した。
【０２９５】
薬物動態パラメーターは、薬物動態評価プログラムWinNonlin(商標)(Pharsight, St. Louis, MO, USA)、バージョン5.2.1を用いて非コンパートメント解析によって算出した。簡単に説明すると、濃度/時間曲線下面積AUC(0〜672)を、時間0から無限大までの線形台形公式(一次補間を用いる)によって算出した。見かけの終末半減期(T1/2)は、式:T1/2=ln2/λzから導き出した。全身クリアランス(CL)を用量/AUCとして算出した。野生型抗体とその変種との薬物動態パラメーターの統計的有意差をANOVA解析によって決定した。
【０２９６】
マウスFcRnを欠損しているがヒトFcRnに関してヘミ接合性トランスジェニックであるC57BL/6Jマウス(huFcRn(276)-/tg)における薬物動態試験により、YTE変異により抗体の薬物動態が向上することが示された(図12)。統計的有意性のレベルで、YTE変異体は、野生型抗体と比べてAUC(0〜672)は1.74倍の大きさであり、クリアランスは遅く1.95分の1であり、終末半減期は2.2倍の長さであった(表)。
【０２９７】
（表）ヒトFcRnトランスジェニックマウスに10mg/kgの1回の静脈内ボーラス注射の後にELISAによって測定した血清濃度の非コンパートメント解析によって得た、野生型抗体およびその三重変異体YTEの薬物動態パラメーター。平均値±SD、1グループ当たりn=8、野生型抗体と比べた有意性のANOVA解析(+++、p<0.001)。AUC(0〜672)、時間0から672時間までの血清濃度-時間曲線下面積。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月4日(2018.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含む抗体または融合ポリペプチドを、ポリペプチドの混合物から作製するための方法：
-  固定化された、新生児型Fc受容体（FcRn）とβ-2-ミクログロブリン（b2m）との非共有結合性複合体をアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用したFcRnアフィニティーカラムに、混合物を適用する段階、および
-  Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含む抗体または融合ポリペプチドをpH勾配を用いて溶出させ、それによって、抗体または融合ポリペプチドを精製する段階、
ここで、新生児型Fc受容体とβ-2-ミクログロブリンとの前記非共有結合性複合体がクロマトグラフィー材料に結合しており、前記非共有結合性複合体が特異的結合対を介して固相にコンジュゲートされており、
前記pH勾配が、第1のpH値から第2のpH値までであり、該第1のpH値がpH3.5〜pH6.4であり、かつ該第2のpH値がpH7.4〜pH9.5であり、および
新生児型Fc受容体とβ-2-ミクログロブリンとの前記非共有結合性複合体がモノビオチン化されており、かつ前記固相がストレプトアビジンで誘導体化されている、方法。
【請求項２】
前記新生児型Fc受容体および前記β-2-ミクログロブリンが、それぞれ互いとは無関係に0〜10個のアミノ酸残基修飾を有するヒト野生型新生児型Fc受容体およびヒト野生型β-2-ミクログロブリンであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記pH勾配が、第1のpH値から第2のpH値までであり、該第1のpH値がpH5.5であり、かつ該第2のpH値がpH8.8であることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
抗体と参照抗体の保持時間の比を決定することによって該抗体のインビボ半減期を決定するためであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗体のメチオニン酸化を測定するためであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
抗体のオリゴマー化レベルを測定するためであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
親抗体または親融合ポリペプチドと比べてFcRnに対する結合親和性が変化している該親抗体または該親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドについて、Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含むこれらの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするためであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Fc領域のFcRn結合部分の少なくとも1つを含み前記新生児型Fc受容体に対する結合の変化を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するためであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
IgG調製物から半抗体を除去するためであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
IgG調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するためであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、単一特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または二重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または三重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または四重特異性の抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。