(57)【要約】【課題】ＸＴＥＮおよびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子タンパク質を有する第ＶＩＩＩ因子の複合体、および、その使用を提供すること。【解決手段】本発明は、ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦタンパク質、１以上のＸＴＥＮ配列、およびＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質を提示するものであり、ここで、当該ＶＷＦ断片、当該ＸＴＥＮ配列、または当該ＦＶＩＩＩタンパク質は、互いに連結または関連付けられている。当該キメラタンパク質はさらに、１以上のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）を含有してもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
血友病Ａは、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする遺伝子の異常により発生する出血性疾患であり、１０，０００人の出生男児のうち１〜２人が発症する。Grawet al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005)。血友病Ａに罹患した患者は、精製ＦＶＩＩＩまたは組換え生産されたＦＶＩＩＩの投与により治療することができる。しかしながら、市販されているすべてのＦＶＩＩＩ製品は、約８〜１２時間の半減期であることが知られており、頻繁に患者に静脈内投与しなければならない。WeinerM.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee,M.T., 12. Disorders ofCoagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap,D. Thromb. Res. 122Suppl 4:S2-8 (2008)を参照のこと。さらに、ＦＶＩＩＩの半減期を延長させるため、多くの方法が試されている。凝固因子の半減期を延長させるために開発中の方法としては、たとえば、ペグ化、糖ペグ化およびアルブミンとの結合が挙げられる。Dumontet al., Blood. 119(13): 3024-3030(Published online Jan. 13,2012)を参照のこと。しかしながら、どのタンパク質組換え法を用いているかに関わらず、現在、開発中の長期作用型ＦＶＩＩＩ製品は、わずかな半減期（前臨床動物モデルにおいて、約１．５〜２時間）しかないことが報告されている。上記文献を参照のこと。ヒトでも結果は同じであり、たとえば、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、血友病Ａ患者において約１．７倍の半減期延長の改善が報告されている。上記文献を参照のこと。それゆえ、細かな改良にかかわらず、半減期の延長には、他のＴ１／２制限因子が存在することが示唆される。Liu,T. et al., 2007 ISTH meeting, abstract #P-M-035; Henrik,A. et al., 2011 ISTHmeeting, abstract #P=MO-181; Liu, T. et al.,2011 ISTH meeting abstract#P-WE-131を参照のこと。
【背景技術】
【０００２】
血漿ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｒｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）の半減期はおよそ１２時間である（９〜１５時間の範囲）。http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm（最終確認は２０１１年１０月２２日）。ＶＷＦの半減期は、多くの因子（グリコシル化のパターン、ＡＤＡＭＴＳ−１３（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆ−１３）およびＶＷＦ中の様々な変異）により影響を受け得る。
【０００３】
血漿中では、９５〜９８％のＦＶＩＩＩが、全長ＶＷＦとの強固な非共有結合性の複合体の状態で循環している。この複合体の組成は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適切な血漿ＦＶＩＩＩの維持に重要である。Lentinget al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lentingetal., J. Thromb. Haemost. 5(7):1353-60 (2007)。全長の野生型ＦＶＩＩＩは、そのほとんどが、重鎖（ＭＷ  ２００ｋＤ）および軽鎖（ＭＷ  ７３ｋＤ）を有するヘテロ二量体として存在している。ＦＶＩＩＩが、重鎖の３７２位および７４０位、ならびに軽鎖の１６８９位でのタンパク質分解により活性化された場合、ＦＶＩＩＩに結合するＶＷＦは、活性化ＦＶＩＩＩから除去される。活性化第ＩＸ因子、カルシウムおよびリン脂質とともに活性化されたＦＶＩＩＩ（テナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）複合体）は、第Ｘ因子の活性化を誘導し、多量のトロンビンを産生させる。次いで、トロンビンがフィブリノーゲンを開裂し、可溶性のフィブリン単量体を形成し、次いで、それらが自発的に多量体化し、可溶性のフィブリンポリマーを形成する。トロンビンはまた第ＸＩＩＩ因子を活性化し、それらは、カルシウムと共に、可溶性フィブリンポリマーを架橋および安定化させ、架橋フィブリン（不溶性）を形成する。活性化ＦＶＩＩＩは、タンパク質分解により循環系から速やかに除去される。
【０００４】
頻繁な投与および投与スケジュールから生じる不便さのために、より少ない頻度の投与で済むＦＶＩＩＩ製品、すなわち、半減期限界の１．５〜２倍長い半減期を有するＦＶＩＩＩ製品の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lenting et al., Blood.(1998)92(11):3983-96
【非特許文献２】Lenting et al., J. Thromb. Haemost.(2007)5(7):1353-60
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｒｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質を目的としており、ここで、当該ＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ配列は、任意のリンカーにより連結されており、および、ここで、ＶＷＦ断片またはＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結、または関連付けられている。キメラタンパク質は、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列およびＦＶＩＩＩタンパク質を含有する単一なポリペプチド鎖を含有していてもよく、または、２つのポリペプチド鎖（１つ目の鎖はＶＷＦ断片を含有し、２つ目の鎖はＦＶＩＩＩタンパク質を含有する）を含有していてもよく、ここで、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質のいずれかに連結されている。
【０００７】
１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、
（ａ）Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩ、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ−Ｘ−Ｖ、
（ｃ）Ｖ−Ｘ：ＦＶＩＩＩ、
（ｄ）Ｘ−Ｖ：ＦＶＩＩＩ、
（ｅ）ＦＶＩＩＩ：Ｖ−Ｘ、または、
（ｆ）ＦＶＩＩＩ：Ｘ−Ｖ
を含有する式を含有し、ここで、
ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、および、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有する。ハイフン（−）は、ペプチド結合またはリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）であっても良く、コロン（：）は、ポリペプチドの間の化学的関連または物理的関連（たとえば、共有結合または非共有結合）を表す。
【０００８】
他の実施態様において、キメラタンパク質はさらに、（ｉｖ）ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、ＦＶＩＩＩタンパク質またはそれらの任意の組み合わせに連結されたイムノグロブリン（Ｉｇ）定常領域またはその一部（Ｆ１もしくは第一のＩｇ定常領域またはその一部としても示される）を含有する。他の実施態様において、キメラタンパク質はさらに、追加のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２もしくは第二のＩｇ定常領域またはその一部としても示される）を含有する。第一のＩｇ定常領域またはその一部は、ＶＷＦ断片またはＸＴＥＮ配列に連結されていてもよく、および、第二のＩｇ定常領域は、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されていてもよい。第一のＩｇ定常領域、第二のＩｇ定常領域、またはその一部、または両方は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長してもよい。
【０００９】
一部の実施態様において、第二のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２）は、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）によりＶＷＦ断片に連結されている。他の実施態様において、第二のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２）は、（第一の）Ｉｇ定常領域またはその一部（Ｆ１）に関連している。第二のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２）および、第一のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ１）は同一であっても、異なっていても良い。第二のＩｇ定常領域またはその一部は、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）によりＩｇ定常領域またはその一部に関連していてもよい。第一のＩｇ定常領域またはその一部に連結されたＶＷＦ断片はまた、非共有結合により第二のＦｃ領域に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質と関連していてもよい。ある実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結されている１以上の追加のＸＴＥＮ配列、またはＦＶＩＩＩタンパク質中の１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入されている（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）１以上の追加のＸＴＥＮ配列を含有しても良い。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質を比較して、延長されている。
【００１０】
一部の実施態様において、キメラタンパク質は、
（ｇ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１：ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２、
（ｈ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ、
（ｉ）Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ：ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２、
（ｊ）Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ：Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ、
（ｋ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２、
（ｌ）Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ−Ｌ４−Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ、
（ｍ）ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２−Ｌ４−Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１、および、
（ｎ）Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ、
を含有する式を含有し、ここで、
ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３のぞれぞれは任意のリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）を含有し、
Ｌ４は任意のリンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）であり、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１は任意の第一のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は任意の第二のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、および、
（：）は共有結合または非共有結合である。
【００１１】
また、本発明は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）、ＸＴＥＮ配列、および（ｉｉｉ）Ｉｇ定常領域またはその一部を含有するキメラタンパク質を目的とし、ここで、ＸＴＥＮ配列は、任意のリンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（１以上の挿入部位）に挿入されており、および、ここで、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列に連結、または関連している。１つの実施態様において、本キメラタンパク質に有用なＩｇ定常領域またはその一部は、第一のＦｃ領域を含有する。他の実施態様において、本キメラタンパク質はさらに、追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する。本発明に有用な追加のＩｇ定常領域またはその一部は、第二のＦｃ領域（第一のＦｃ領域に、たとえば共有結合により、連結されている、または関連している）を含有している。他の実施態様において、第一のＦｃ領域は、たとえばプロセッシング可能なリンカー等のリンカーにより、第二のＦｃ領域に連結されている。
【００１２】
他の態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＶＷＦ断片、および、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部（ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する）、を含有し、ここで、ＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端で任意のリンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質中の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上の挿入部位）に挿入されており、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列に連結、または関連しており、および、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、ＶＷＦ断片またはそれらの任意の組み合わせに連結されている。キメラタンパク質の非限定的な例として、以下：
（１）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１：Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２、
（２）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
（３）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）：Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２、
（４）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）；Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
（５）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２、
（６）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
（７）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ４−  Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２、または、
（８）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ４−  Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
を含有する式を含有しても良く、ここで、
ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）は、ＦＶＩＩＩタンパク質および１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、ここで、１以上のＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結され、またはＦＶＩＩＩタンパク質中の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入されており、
Ｌ１、Ｌ２またはＬ３のそれぞれは、たとえば開裂可能なリンカー等の任意のリンカーを含有しており、
Ｌ４は、リンカー（プロセッシング可能なリンカー）であり、
Ｘ２は、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１はＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は任意の追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、および、
ＶはＶＷＦ断片を含有し、
（−）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり、および、
（：）は共有結合または非共有結合を含有する。
【００１３】
本発明の１つの態様において、本キメラタンパク質に有用なＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用を妨害または抑制するＶＷＦクリアランス受容体に結合しない。ゆえに、当該ＶＷＦ断片を含有するキメラタンパク質は、ＶＷＦクリアランス経路を介しては除去されない。本発明の他の態様において、ＶＷＦ断片は、１以上のプロテアーゼ開裂からＦＶＩＩＩタンパク質を防御することができ、活性化からＦＶＩＩＩタンパク質を防御することができ、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖を安定化させることができ、または、１以上のスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩタンパク質のクリアランスを妨害することができる。
【００１４】
ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの間の相互作用を妨害または抑制することができるため、当該ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質と比較し、延長される。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、延長される。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
【００１５】
本キメラタンパク質に有用な、Ｉｇ定常領域またはその一部は、任意のリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）により、ＶＷＦ断片に連結されている第一のＦｃ領域を含有する。キメラタンパク質はさらに、任意のリンカーにより、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列、Ｉｇ定常領域もしくはその一部、ＶＷＦ断片、またはそれらの任意の組み合わせに連結されている、追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有しても良い。１つの実施態様において、追加のＩｇ定常領域またはその一部は、任意のリンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている。追加のＩｇ定常領域またはその一部は、第二のＦｃ領域を含有してもよい。
【００１６】
本発明に有用なＩｇ定常領域またはその一部、および、本発明に有用な追加のＩｇ定常領域またはその一部は、同一、または異なっている。
【００１７】
一部の態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端でＸＴＥＮ配列に連結され、または、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩ中の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上の挿入部位）に挿入され、または、それらの任意の組み合わせである。ＦＶＩＩＩタンパク質中の１以上の挿入部位は、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメインの内に位置しても良く、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメインの間に位置しても良く、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメインの間に位置しても良い。
【００１８】
１つの実施態様において、１以上の挿入部位は、表７、８、９、１０、１１またはそれらの任意の組み合わせ中のアミノ酸残基からなる群から選択される成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩ（たとえば、配列番号４[成熟型ＦＶＩＩＩ配列全長]）中の１以上のアミノ酸のすぐ下流に位置する。
【００１９】
他の実施態様において、１以上の挿入部位は、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩの許容ループ内に位置する。他の実施態様において、１以上の挿入部位は、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩのａ３領域内に位置する。たとえば、ＸＴＥＮ配列は、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１６５６位のすぐ下流に挿入されてもよい。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも２つのＸＴＥＮ配列（ａ３領域内に挿入された第一のＸＴＥＮ配列およびＦＶＩＩＩタンパク質の許容ループ内に挿入された第二のＸＴＥＮ配列）に連結されている（たとえば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、または、Ａ３−２）。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも３つのＸＴＥＮ配列（ａ３領域内に挿入されたＸＴＥＮ配列、ならびに、ＦＶＩＩＩタンパク質内の１または２の許容ループ内に挿入された第二のＸＴＥＮ配列および第三のＸＴＥＮ配列）に連結されている（たとえば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、または、Ａ３−２）。
【００２０】
ある実施態様において、１以上のＸＴＥＮ挿入のための１以上の挿入部位は、以下：
（１）  アミノ酸３、（２）アミノ酸１８、
（３）  アミノ酸２２、（４）  アミノ酸２６、
（５）  アミノ酸３２、（６）  アミノ酸４０、
（７）  アミノ酸６０、（８）  アミノ酸６５、
（９）  アミノ酸８１、（１０）  アミノ酸１１６、
（１１）  アミノ酸１１９、（１２）  アミノ酸１３０、
（１３）  アミノ酸１８８、（１４）  アミノ酸２１１、
（１５）  アミノ酸２１６、（１６）  アミノ酸２２０、
（１７）  アミノ酸２２４、（１８）  アミノ酸２３０、
（１９）  アミノ酸３３３、（２０）  アミノ酸３３６、
（２１）  アミノ酸３３９、（２２）  アミノ酸３７５、
（２３）  アミノ酸３９９、（２４）  アミノ酸４０３、
（２５）  アミノ酸４０９、（２６）  アミノ酸４１６、
（２６）  アミノ酸４４２、（２８）  アミノ酸４８７、
（２９）  アミノ酸４９０、（３０）  アミノ酸４９４、
（３１）  アミノ酸５００、（３２）  アミノ酸５１８、
（３３）  アミノ酸５９９、（３４）  アミノ酸６０３、
（３５）  アミノ酸７１３、（３６）  アミノ酸７４５、
（３７）  アミノ酸１６５６、（３８）  アミノ酸１７１１、
（３９）  アミノ酸１７２０、（４０）  アミノ酸１７２５、
（４１）  アミノ酸１７４９、（４２）  アミノ酸１７９６、
（４３）  アミノ酸１８０２、（４４）  アミノ酸１８２７、
（４５）  アミノ酸１８６１、（４６）  アミノ酸１８９６、
（４７）  アミノ酸１９００、（４８）  アミノ酸１９０４、
（４９）  アミノ酸１９０５、（５０）  アミノ酸１９１０、
（５１）  アミノ酸１９３７、（５２）  アミノ酸２０１９、
（５３）  アミノ酸２０６８、（５４）  アミノ酸２１１１、
（５５）  アミノ酸２１２０、（５６）  アミノ酸２１７１、
（５７）  アミノ酸２１８８、（５８）  アミノ酸２２２７、
（５９）  アミノ酸２２７７、および、（６０）それらの２以上の組み合わせ
からなる群から選択される１以上のアミノ酸のすぐ下流である。
【００２１】
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質中に１つのＸＴＥＮが挿入されている。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質中に２つのＸＴＥＮが挿入されている。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質中に３つのＸＴＥＮが挿入されている。
【００２２】
特定の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）に対応するアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。他の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。一部の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。他の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されており、および、第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、および第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。ある実施態様において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）に対応するアミノ酸２６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されており、および、第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入されている。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されており、第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されており、および、第四のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入されている。他の例において、ＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入されている。さらなる例において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されており、および第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入されている。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されており、および第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入されている。他の例において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入されており、および、第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入されている。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入されており、および、第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入されている。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１８のすぐ下流に挿入されており、および、第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入されている。
【００２３】
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、二本鎖のＦＶＩＩＩアイソフォームである。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は一本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである。
【００２４】
一部の実施態様において、挿入されるＸＴＥＮは、配列番号３９（ＡＥ２８８）である。一部の例において、挿入されるＸＴＥＮは、配列番号３８および３７（ＡＧ１４４およびＡＥ１４４）である。一部の例において、挿入されるＸＴＥＮは、配列番号３７、３８および３７（ＡＥ１４４、ＡＧ１４４およびＡＥ１４４）である。一部の実施態様において、挿入されるＸＴＥＮは、配列番号３７および４０（ＡＥ１４４およびＡＥ２８８）である。一部の実施態様において、挿入されるＸＴＥＮは、ＡＥ４２（配列番号３６）、ＡＥ７２（配列番号１２７）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号１２８）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号１２９）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号１３０）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号１３１）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３２）、ＡＥ１４４＿Ａ（配列番号１３３）、ＡＥ１４４＿Ｂ（配列番号１３４）、ＡＥ１４４＿Ｃ（配列番号１３５）、ＡＥ１４４＿Ｆ（配列番号１３６）、ＡＥ８６４（配列番号４３）、ＡＥ５７６（配列番号４１）、ＡＥ２８８（配列番号３９）、ＡＥ２８８＿２（配列番号１３７）、ＡＥ１４４（配列番号３７）、ＡＧ８６４（配列番号４４）、ＡＧ５７６（配列番号４２）、ＡＧ２８８（配列番号４０）、ＡＧ１４４（配列番号３８）、およびそれらの任意の組み合わせである。
【００２５】
本発明において有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂドメインまたはその一部（たとえば、ＳＱ  Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ）を含有してもよい。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、一本鎖ＦＶＩＩＩを含有する。他の実施態様において、一本鎖ＦＶＩＩＩは、全長成熟型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号４）の１６４８残基、１６４５残基またはその両方に相当する残基の位置で、または、ＳＱ  ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（配列番号６）の７５４残基、７５１残基またはその両方の位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する。他の実施態様において、アミノ酸置換は、アルギニン以外のアミノ酸である。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩの重鎖およびＦＶＩＩＩの軽鎖を含有し、ここで、当該重鎖および当該軽鎖は、金属結合により互いに関連している。
【００２６】
ＦＶＩＩＩタンパク質は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に対し、低いアフィニティを有するか、または結合しなくともよい（たとえば、ＬＲＰに対するアフィニティを下げる、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有することにより、または、ＬＲＰに対する結合を除去する、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有することにより）。そのような少なくとも１つのアミノ酸置換は、全長成熟型ＦＶＩＩＩの、４７１残基、４８４残基、４８７残基、４９０残基、４９７残基、２０９２残基、２０９３残基またはそれらの２以上の組み合わせの残基の位置であってもよい。特定の実施態様において、４７１、４８４または４９７残基でのアミノ酸置換は、アルギニン以外のアミノ酸であり、４８７残基でのアミノ酸置換は、チロシン以外のアミノ酸であり、２０９２残基でのアミノ酸置換はリシン以外アミノ酸であり、または、２０９３残基でのアミノ酸置換は、フェニルアラニン以外のアミノ酸である。
【００２７】
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、それにより、置換を有しないＦＶＩＩＩタンパク質よりも、当該ＦＶＩＩＩタンパク質はより安定となる。そのような置換は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ２ドメインとＡ３ドメインに位置しても良い（たとえば、全長成熟型ＦＶＩＩＩの、６６４残基、１８２６残基、６６２残基、１８２８残基、またはそれらの２以上の組み合わせに対応する残基の位置）。
【００２８】
本発明に有用なＶＷＦ断片は、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有し、それらは共に、ＦＶＩＩＩに結合することができる。ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜８６６に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であるＤ´ドメインのアミノ酸配列、および／または、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であるＤ３ドメインのアミノ酸配列を含有しても良い。１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は単量体である。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、少なくとも２つのＶＷＦ断片、少なくとも３つのＶＷＦ断片、少なくとも４つのＶＷＦ断片、少なくとも５つのＶＷＦ断片、または、少なくとも６つのＶＷＦ断片を含有する。ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であるアミノ酸を含有してもよい。ＶＷＦ断片は、本質的に配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０からなる、または、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０からなることができる。ある実施態様において、ＶＷＦ断片は、配列番号２の１０９９残基、１１４２残基または、１０９９と１１４２残基の両方に相当する残基の位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有しても良い。他の実施態様において、ＶＷＦ断片はさらに、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、またはＤ１とＤ２ドメインを含有する。
【００２９】
ＶＷＦ断片はさらに、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１以上の断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＶＷＦドメインを含有しても良い。たとえば、ＶＷＦ断片は、（１）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、または、（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´、Ｄ３およびＡ１ドメイン、もしくはそれらの断片、本質的にからなる、または、からなることができる。一部の実施態様において、ＶＷＦ断片はさらに、ＶＷＦ断片に作動可能に連結されているＶＷＦまたはＦＶＩＩＩのシグナルペプチドを含有する。
【００３０】
本発明に有用なリンカーのうち１つ以上は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００アミノ酸の長さを有する。一部の実施態様において、リンカーのうちの１つ以上は、約１〜約２００アミノ酸の長さを有する。１つの実施態様において、リンカーのうちの１つ以上は、少なくとも約２０、３５、４２、４８、７３、７５、９５、９８、１４４、２８８、３２４、３３３、５７６、または、８６４アミノ酸の長さを有している。他の実施態様において、リンカーのうちの１つ以上は、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチド、ＸＴＥＮ配列またはそれら両方を含有する。ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドの例としては、限定されないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３９）、または、Ｓ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１４０）の式が挙げられ、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される正の整数である。たとえば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６３）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１３８）であってもよい。１つの実施態様において、リンカーは、当該リンカーのＮ末端に少なくとも１つの第一の開裂部位を含有し、当該リンカーのＣ末端に少なくとも１つの第二の開裂部位を含有し、またはそれら両方を含有する。他の実施態様において、リンカーは２０アミノ酸、３５アミノ酸、４８アミノ酸、７３アミノ酸、または９５アミノ酸のトロンビン開裂可能なリンカーを含有する。開裂可能なリンカーは、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ２、グランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ）Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）Ａ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、およびＭＭＰ−２０（たとえば、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号８））からなる群から選択されるプロテアーゼによる１つ以上の開裂部位を含有しても良い。当該１以上の開裂部位の非限定的な例としては、ＲＲＲＲ（配列番号９）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０）、ＲＲＲＲＳ（配列番号１１）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１２）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号１３）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号１４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号１５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号１７）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号１８）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号１９）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号２０）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号２１）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号２２）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号２３）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号２４）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２５）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ  （配列番号２６）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号２７）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号���８）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号２９）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号３０）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号３１）、ＥＮＬＹＦＱＧ  （配列番号３２）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号３３）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号３４）、および、ＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号３５）からなる群から選択されるアミノ酸配列が挙げられる。一部の実施態様において、第一の開裂部位および第二の開裂部位は同一または異なっている。
【００３１】
本発明に有用なＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２（配列番号３６）、ＡＥ１４４（配列番号３７）、ＡＧ１４４（配列番号３８）、ＡＥ２８８（配列番号３９）、ＡＧ２８８（配列番号４０）、ＡＥ５７６（配列番号４１）、ＡＧ５７６（配列番号４２）、ＡＥ８６４（配列番号４３）、ＡＥ７２（配列番号１２７）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号１２８）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号１２９）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号１３０）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号１３１）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号１３３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号１３４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号１３５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号１３６）、ＡＥ２８８＿２（配列番号１３７）、または、ＡＧ８６４（配列番号４４）からなる群から選択されても良い。特定の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＧ２８８およびＡＧ２８８を含有する。
【００３２】
本発明のキメラタンパク質は、ポリシアル化、ペグ化、またはヘシル化（ｈｅｓｙｌａｔｅｄ）されていても良い。
【００３３】
本発明はまた、当該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドのセットを目的とする。当該ポリヌクレオチドはさらに、ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖を含有しても良い。本発明はまた、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット、および、当該ポリヌクレオチドのセットに作動可能に連結された１以上のプロモーターを含有するベクターを目的とする。当該ベクターはさらに、追加のベクター（ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖を含有する）を含有しても良い。本発明はまた、当該ポリヌクレオチドまたは当該ベクターを含有する宿主細胞を見出したものである。当該宿主細胞は、哺乳類細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、またはＢＨＫ細胞）であっても良い。一部の実施態様において、宿主細胞のＰＣ５またはＰＣ７は、ＶＷＦのＤ１Ｄ２ドメインを開裂する。
【００３４】
本発明はまた、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞、および、薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物を目的とする。本発明の組成物は、ゆえに、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、半減期が延長されている。ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、延長される。第ＦＶＩＩＩ因子の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
【００３５】
本発明の組成物は、局所投与、眼球内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、または経口投与からなる群から選択される経路により投与されても良い。１つの実施態様において、組成物は、非経口投与（たとえば、静脈内または皮下投与）を介して投与される。本発明の組成物は、その必要のある患者における出血性疾患または状態を処置するのに有用である。出血性疾患または状態は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。１つの実施態様において、本キメラタンパク質で処置される対象は、外科手術を受ける予定である。他の実施態様において、処置は、予防的に、または要求に応じて行われる。
【００３６】
本発明はまた、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の結合を妨害または抑制する方法を目的としており、本キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または組成物の有効量を、その必要のある対象に投与することを含み、ここで、ＶＷＦ断片がＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、それゆえに、内因性ＶＷＦの結合が妨害または抑制されることとなる。本発明はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長または増加させる方法を目的とし、ここで、当該方法には、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物の有効量を、その必要のある対象に投与することが含まれ、ここで、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、それゆえに、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が延長または増加される。本方法はまた、細胞からＦＶＩＩＩタンパク質が除去されることを妨害または抑制する方法を提示し、ここで、当該方法には、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物の有効量を、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する細胞に添加することが含まれ、ここで、ＶＷＦ活性を有するタンパク質が、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合する。本発明の方法が有用な対象は、動物（たとえば、ヒト（たとえば、血友病Ａに罹患している患者））である。
【００３７】
本発明はまた、その必要のある対象における出血性疾患または状態を処置する方法を提示し、当該方法には、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または組成物の有効量を投与することが含まれ、ここで、当該出血性疾患または状態は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、からなる群から選択される。治療は、予防的または要求に応じて行うものであっても良い。１つの実施態様において、有効量は、０．１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇである。
【００３８】
本発明にはまた、ポリヌクレオチドまたはベクターと１つ以上の宿主細胞をトランスフェクトすること、および、当該宿主細胞中で当該キメラタンパク質を発現させること、を含む、当該キメラタンパク質の製造方法が含まれる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
（ｉ）ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）のＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記ＶＷＦ断片および上記ＸＴＥＮ配列は、任意選択的なリンカーで連結されており、ここで、上記ＶＷＦ断片または上記ＸＴＥＮ配列は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に連結または関連付けられている、キメラタンパク質。
（項目２）
（ａ）Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩ、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ−Ｘ−Ｖ、
（ｃ）Ｖ−Ｘ：ＦＶＩＩＩ、
（ｄ）Ｘ−Ｖ  ：ＦＶＩＩＩ、
（ｅ）ＦＶＩＩＩ：Ｖ−Ｘ、または、
（ｆ）ＦＶＩＩＩ：Ｘ−Ｖ、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、
Ｖは、ＶＷＦ断片を含有し、
Ｘは、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し；
（−）は、ペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；
（：）は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
（項目３）
上記ＸＴＥＮ配列が、リンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている、項目１または２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４）
上記リンカーが、開裂可能なリンカーである、項目３に記載のキメラタンパク質。
（項目５）
上記ＶＷＦ断片、上記ＸＴＥＮ配列、および上記ＦＶＩＩＩタンパク質を含有する、一本鎖ポリペプチドを含有する、項目１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６）
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖がＦＶＩＩＩを含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＶＷＦ断片および上記ＸＴＥＮ配列を含有する、項目１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７）
（ｉｖ）上記ＶＷＦ断片、上記ＸＴＥＮ配列、もしくは上記ＦＶＩＩＩタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかに連結されたＩｇ定常領域またはその一部をさらに含有する、項目１〜６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８）
（ｇ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１：ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２；
（ｈ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ；
（ｉ）Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ：ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２；
（ｊ）Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ：Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ；
（ｋ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２；
（ｌ）Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ−Ｌ４−Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ；
（ｍ）ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２−Ｌ４−Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１；および、
（ｎ）Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、
Ｖは、ＶＷＦ断片を含有し、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し、
Ｌ４は、任意選択的なリンカーであり、
ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、
Ｘは、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１は、任意選択的なＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は、任意選択的な追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
（−）は、ペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；
（：）は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
（項目９）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＶＷＦ断片の半減期を延長させる、項目７または８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＸＴＥＮ配列または上記ＶＷＦ断片に連結されている第一のＦｃ領域を含有する、項目７〜９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１１）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、リンカーにより上記ＸＴＥＮ配列に連結されている、項目１０に記載のキメラタンパク質。
（項目１２）
上記リンカーは、開裂可能なリンカーを含有する、項目１２に記載のキメラタンパク質。
（項目１３）
追加のＩｇ定常領域またはその一部をさらに含有する、項目７〜１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１４）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、追加のＦｃ領域を含有する、項目１３に記載のキメラタンパク質。
（項目１５）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長させる、項目１４に記載のキメラタンパク質。
（項目１６）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている、項目１３〜１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１７）
上記第二のＦｃ領域はさらに、リンカーにより上記ＶＷＦ断片に連結されている、項目１６に記載のキメラタンパク質。
（項目１８）
上記リンカーは、プロセッシング可能なリンカーである、項目１７に記載のキメラタンパク質。
（項目１９）
Ｌ４は、プロセッシング可能なリンカーである、項目８〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２０）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、、上記Ｉｇ定常領域またはその一部と関連付けられている、項目７〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２１）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、共有結合により、上記Ｉｇ定常領域またはその一部と関連付けられている、項目２０に記載のキメラタンパク質。
（項目２２）
上記共有結合は、ジスルフィド結合である、項目２１に記載のキメラタンパク質。
（項目２３）
上記ＶＷＦ断片は、非共有結合により上記ＦＶＩＩＩタンパク質と関連付けられている、項目１〜２２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２４）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、上記ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質、または野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、延長されている、項目１〜２３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２５）
上記ＦＶＩＩＩの半減期が、上記ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質よりも、または野生型ＦＶＩＩＩと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長されている、項目２４に記載のキメラタンパク質。
（項目２６）
上記第ＶＩＩＩ因子の半減期が、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である、項目２４に記載のキメラタンパク質。
（項目２７）
（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）Ｉｇ定常領域またはその一部を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記ＸＴＥＮ配列は、任意選択的なリンカーにより上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端で上記ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されており、または、上記ＦＶＩＩＩタンパク質中の少なくとも１以上の挿入部位の２アミノ酸の間に挿入されており、および、ここで、上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質または上記ＸＴＥＮ配列に連結され、または関連付けられている、キメラタンパク質。
（項目２８）
上記ＸＴＥＮ配列および上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する、項目２７に記載のキメラタンパク質。
（項目２９）
上記ＶＷＦ結合部位は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメイン、またはＣ２ドメイン、または上記Ａ３ドメインおよび上記Ｃ２ドメインの両方に位置づけられている、項目２７および２８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目３０）
上記ＶＷＦ結合部位は、配列番号４のアミノ酸１６６９〜１６８９およびアミノ酸２３０３〜２３３２に相当するアミノ酸配列を含有する、項目２９に記載のキメラタンパク質。
（項目３１）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、上記Ｉｇ定常領域またはその一部を有していないＦＶＩＩＩタンパク質、または、上記ＸＴＥＮ配列を有していないＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、延長されている、項目２７〜３０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目３２）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、上記Ｉｇ定常領域またはその一部を有していないＦＶＩＩＩタンパク質、または、上記ＸＴＥＮ配列を有していないＦＶＩＩＩタンパク質、または、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長されている、項目３１に記載のキメラタンパク質。
（項目３３）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。項目３１に記載のキメラタンパク質。
（項目３４）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部が、第一のＦｃ領域を含有している、項目２７〜３３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目３５）
追加のＩｇ定常領域またはその一部をさらに含有する、項目２７〜３４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目３６）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部が、上記第一のＦｃ領域に連結または関連付けられている、第二のＦｃ領域を含有する、項目３５に記載のキメラタンパク質。
（項目３７）
上記第二のＦｃ領域が、共有結合により上記第一のＦｃ領域に関連付けられている、項目３６に記載のキメラタンパク質。
（項目３８）
上記第一のＦｃ領域が、リンカーにより上記第二のＦｃ領域に連結されている、項目３６に記載のキメラタンパク質。
（項目３９）
上記リンカーが、プロセッシング可能なリンカーである、項目３８に記載のキメラタンパク質。
（項目４０）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、および上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する、項目２７〜３４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４１）
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が、上記ＦＶＩＩＩの重鎖を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖およびＸＴＥＮ配列ならびに、上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有する、項目２７〜３４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４２）
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、および上記Ｉｇ定常領域を含有し、および、上記第二のポリペプチド鎖が上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目３５〜３９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４３）
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および上記ＸＴＥＮ配列を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖および上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目３５〜３９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４４）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、上記Ｉｇ定常領域またはその一部、および、上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する、項目３５〜３９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４５）
ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＶＷＦ断片、および（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記ＸＴＥＮ配列は、任意選択的なリンカーにより、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端で上記ＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、または、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の挿入部位のすぐ下流で挿入されており、上記ＶＷＦ断片は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質または上記ＸＴＥＮ配列に連結または関連付けられており、および、上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、上記ＶＷＦ断片、またはそれらの任意の組み合わせに連結されている、キメラタンパク質。
（項目４６）
（１）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１：Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２；
（２）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ；
（３）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）：Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２；
（４）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）；Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ；
（５）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２；
（６）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ；
（７）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ４−Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２；または、（８）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）は、ＦＶＩＩＩタンパク質およびＸＴＥＮ配列を含有し、ここで、上記ＸＴＥＮ配列は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結され、または、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸（「１以上の挿入部位」）のすぐ下流に挿入されており；
Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し；
Ｌ４は、リンカーであり、
Ｘ２は、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１は、Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は、任意選択的な追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、および、
Ｖは、ＶＷＦ断片を含有し、
（−）は、ペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；ならびに、
（：）は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
（項目４７）
上記ＶＷＦ断片は、ＶＷＦクリアランス受容体に結合しない、項目４５または４６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４８）
上記ＶＷＦ断片は、１以上のプロテアーゼによる開裂から上記ＦＶＩＩＩタンパク質を保護することができる、活性化から上記ＦＶＩＩＩタンパク質を保護することができる、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖を安定化することができる、または、１以上のスカベンジャー受容体による上記ＦＶＩＩＩタンパク質の除去を妨害することができる、項目４５〜４７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４９）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位を遮蔽または妨害することにより、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に内因性ＶＷＦが結合することを抑制または妨害する、項目４５〜４８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５０）
上記ＶＷＦ結合部位は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメイン、またはＣ２ドメイン、または、上記Ａ３ドメインおよび上記Ｃ２ドメインの両方に位置づけられている、項目４９に記載のキメラタンパク質。
（項目５１）
上記ＶＷＦ結合部位は、配列番号４のアミノ酸１６６９〜１６８９およびアミノ酸２３０３〜２３３２に相当するアミノ酸配列を含有する、項目４９または５０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５２）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、上記ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、延長されている、項目４５〜５１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５３）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長されている、項目５２に記載のキメラタンパク質。
（項目５４）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である、項目５２に記載のキメラタンパク質。
（項目５５）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、上記ＶＷＦ断片、および上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する、項目４５〜５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５６）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、第一のＦｃ領域を含有する、項目４５〜５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５７）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーにより上記ＶＷＦ断片に連結されている、項目４５〜５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５８）
上記リンカーは、開裂可能なリンカーを含有する、項目５７に記載のキメラタンパク質。
（項目５９）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記Ｉｇ定常領域またはその一部、上記ＶＷＦ断片、またはそれらの任意の組み合わせに、任意選択的なリンカーにより連結されている、追加のＩｇ定常領域またはその一部をさらに含有する、項目４５〜５０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６０）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーにより上記ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている、項目５９に記載のキメラタンパク質。
（項目６１）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、第二のＦｃ領域である。項目５９または６０に記載のキメラタンパク質。
（項目６２）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部、および、上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、同一であるか、または異なっている、項目８〜２６、４２〜４４、および４６〜６１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６３）
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、および上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、および、上記第二のポリペプチド鎖が、上記ＶＷＦ断片および上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目４６〜６２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６４）
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および上記ＸＴＥＮ配列を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖および上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記ＶＷＦ断片および上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目４６〜６２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６５）
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖、上記ＸＴＥＮ配列および上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記ＶＷＦ断片および上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目４６〜６２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６６）
第一のポリペプチド鎖、および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および上記ＸＴＥＮ配列を含有し、および、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖、上記Ｉｇ定常領域またはその一部、上記ＶＷＦ断片、および上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目４６〜６２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６７）
上記ＶＷＦ断片または上記追加のＩｇ定常領域もしくはその一部に連結された追加のＸＴＥＮ配列をさらに含有する、項目６３〜６６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６８）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端でＸＴＥＮ配列に連結されている、または、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流で挿入されている、またはそれらの任意の組み合わせである、項目１〜２６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６９）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、少なくとも２つのＸＴＥＮ配列、少なくとも３つのＸＴＥＮ配列、少なくとも４つのＸＴＥＮ配列、少なくとも５つのＸＴＥＮ配列、または、少なくとも６つのＸＴＥＮ配列に連結されている、項目２７〜６８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７０）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ｂドメイン、Ａ３ドメイン、ａ３酸性領域、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、それらの１以上の断片、および、それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦＶＩＩＩの１以上のドメインを含有する、項目１〜６９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７１）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の上記１以上の挿入部位が、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメインの内に位置付けられる、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメインの間に位置付けられる、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記ＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメインの間に位置づけられる、項目２７〜７０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７２）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の挿入部位が、表７、表８、表９、および表１０のアミノ酸残基からなる群から選択される１以上のアミノ酸である、項目２７〜７１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７３）
配列番号４のアミノ酸３Ｒに相当する挿入部位で挿入された上記ＸＴＥＮ配列が、ＡＴＲのアミノ酸配列をさらに含有する、項目７２に記載のキメラタンパク質。
（項目７４）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の挿入部位が、
（１）  アミノ酸３、（２）アミノ酸１８、
（３）  アミノ酸２２、（４）  アミノ酸２６、
（５）  アミノ酸３２、（６）  アミノ酸４０、
（７）  アミノ酸６０、（８）  アミノ酸６５、
（９）  アミノ酸８１、（１０）  アミノ酸１１６、
（１１）  アミノ酸１１９、（１２）  アミノ酸１３０、
（１３）  アミノ酸１８８、（１４）  アミノ酸２１１、
（１５）  アミノ酸２１６、（１６）  アミノ酸２２０、
（１７）  アミノ酸２２４、（１８）  アミノ酸２３０、
（１９）  アミノ酸３３３、（２０）  アミノ酸３３６、
（２１）  アミノ酸３３９、（２２）  アミノ酸３７５、
（２３）  アミノ酸３９９、（２４）  アミノ酸４０３、
（２５）  アミノ酸４０９、（２６）  アミノ酸４１６、
（２６）  アミノ酸４４２、（２８）  アミノ酸４８７、
（２９）  アミノ酸４９０、（３０）  アミノ酸４９４、
（３１）  アミノ酸５００、（３２）  アミノ酸５１８、
（３３）  アミノ酸５９９、（３４）  アミノ酸６０３、
（３５）  アミノ酸７１３、（３６）  アミノ酸７４５、
（３７）  アミノ酸１６５６、（３８）  アミノ酸１７１１、
（３９）  アミノ酸１７２０、（４０）  アミノ酸１７２５、
（４１）  アミノ酸１７４９、（４２）  アミノ酸１７９６、
（４３）  アミノ酸１８０２、（４４）  アミノ酸１８２７、
（４５）  アミノ酸１８６１、（４６）  アミノ酸１８９６、
（４７）  アミノ酸１９００、（４８）  アミノ酸１９０４、
（４９）  アミノ酸１９０５、（５０）  アミノ酸１９１０、
（５１）  アミノ酸１９３７、（５２）  アミノ酸２０１９、
（５３）  アミノ酸２０６８、（５４）  アミノ酸２１１１、
（５５）  アミノ酸２１２０、（５６）  アミノ酸２１７１、
（５７）  アミノ酸２１８８、（５８）  アミノ酸２２２７、
（５９）  アミノ酸２２７７、および、（６０）それらの２以上の組み合わせ、
からなる群から選択される１以上のアミノ酸のすぐ下流に位置づけられる、項目２７〜７１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７５）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ｂドメインまたはその一部を含有する、項目１〜７４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７６）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＳＱ  Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩである、項目７５に記載のキメラタンパク質。
（項目７７）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、一本鎖ＦＶＩＩＩを含有する、項目１〜７６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７８）
上記一本鎖ＦＶＩＩＩが、全長成熟型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号４）の、１６４８残基、１６４５残基、もしくはその両方に相当する残基で、または、ＳＱ  ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（配列番号６）の７５４残基、７５１残基、もしくはその両方に相当する残基で、少なくとも１以上のアミノ酸置換を含有する、項目７７に記載のキメラタンパク質。
（項目７９）
上記アミノ酸置換が、アルギニン以外のアミノ酸である、項目７８に記載のキメラタンパク質。
（項目８０）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＦＶＩＩＩの重鎖および第ＶＩＩＩ因子の軽鎖を含有し、ここで、上記重鎖および軽鎖は、金属結合により互いに関連付けられている、項目１〜７６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８１）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に対し、低いアフィニティを有するか、または結合しない、項目１〜８０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８２）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、上記ＬＲＰに対するアフィニティを減少させる、または、上記ＬＲＰに対する結合を消失させる、アミノ酸置換を少なくとも１つ含有する、項目８１に記載のキメラタンパク質。
（項目８３）
上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、全長成熟型ＦＶＩＩＩの、４７１残基、４８４残基、４８７残基、４９０残基、４９７残基、２０９２残基、２０９３残基またはそれらの２以上の組み合わせに相当する残基の位置である、項目８２に記載のキメラタンパク質。
（項目８４）
４７１、４８４または４９７残基でのアミノ酸置換は、アルギニン以外のアミノ酸であり、４８７残基でのアミノ酸置換は、チロシン以外のアミノ酸であり、２０９２残基でのアミノ酸置換はリシン以外のアミノ酸であり、または、２０９３残基でのアミノ酸置換は、フェニルアラニン以外のアミノ酸である、項目８３に記載のキメラタンパク質。
（項目８５）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、上記置換を有していないＦＶＩＩＩタンパク質よりも、上記ＦＶＩＩＩタンパク質をより安定化させるアミノ酸置換を少なくとも１つ含有する、項目１〜８４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８６）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の上記Ａ２ドメインおよびＡ３ドメインが、共有結合により互いに関連付けられている、項目８５に記載のキメラタンパク質。
（項目８７）
上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、全長成熟型ＦＶＩＩＩの６６４残基、１８２６残基、６６２残基、１８２８残基、またはそれらの２以上の組み合わせに相当する残基の位置である、項目８５または８６に記載のキメラタンパク質。
（項目８８）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、（ａ）全長成熟型ＦＶＩＩＩの６６４残基に相当する残基でシステイン、および全長成熟型ＦＶＩＩＩの１８２６残基に相当する残基でシステイン、または、（ｂ）全長成熟型ＦＶＩＩＩの６６２残基に相当する残基でシステイン、および全長成熟型ＦＶＩＩＩの１８２８残基に相当する残基でシステイン、を含有する、項目８７に記載のキメラタンパク質。
（項目８９）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４ではない、項目１〜２６および４５〜８８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９０）
上記Ｄ´ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸７６４〜８６６に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一である、項目１〜２６および４５〜８９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９１）
上記Ｄ３ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一である、項目１〜２６および４５〜９０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９２）
上記ＶＷＦ断片が、単量体である、項目１〜２６および４５〜９１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９３）
上記ＶＷＦ断片が、少なくとも２つのＶＷＦ断片、少なくとも３つのＶＷＦ断片、少なくとも４つのＶＷＦ断片、少なくとも５つのＶＷＦ断片、または、少なくとも６つのＶＷＦ断片を含有する、項目１〜２６および４５〜９１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９４）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であるアミノ酸を含有する、項目１〜２６および４５〜９３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９５）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から本質的になる、または、からなる、項目９４に記載のキメラタンパク質。
（項目９６）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２の１０９９残基、１１４２残基または、１０９９残基および１１４２残基の両方に相当する残基で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する、項目１〜２６および４５〜９５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９７）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２の１０９９残基、１１４２残基または、１０９９残基および１１４２残基の両方に相当する残基に対して置換された、システイン以外のアミノ酸を含有する、項目９６に記載のキメラタンパク質。
（項目９８）
上記ＶＷＦ断片がさらに、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメインまたは、Ｄ１およびＤ２ドメインを含有する、項目１〜２６および４５〜９７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９９）
上記ＶＷＦ断片がさらに、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１以上の断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＶＷＦドメインを含有する、項目１〜２７および４５〜９８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１００）
上記ＶＷＦ断片が：（１）ＶＷＦのＤ´およびＤ３ドメイン、またはその断片；（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ´およびＤ３ドメインまたはその断片；（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ´およびＤ３ドメインまたはその断片；（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´およびＤ３ドメインまたはその断片；または、（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´、Ｄ３およびＡ１ドメインまたはその断片から本質的になる、または、からなる、項目１〜２７および４５〜９９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０１）
上記ＶＷＦ断片が、上記ＶＷＦ断片に作動可能に連結されているＶＷＦまたはＦＶＩＩＩのシグナルペプチドをさらに含有する、項目１〜２７および４５〜１００いずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０２）
上記リンカーのうちの１以上が、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００アミノ酸の長さを有する、項目１〜１０１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。（項目１０３）
上記リンカーのうちの１以上が、約１〜約２０００アミノ酸の長さを有する、項目１〜１０１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０４）
上記リンカーのうちの１以上が、少なくとも約２０、３５、４２、４８、７３、７５、９５、９８、１４４、２８８、３２４、３３３、５７６、または８６４アミノ酸の長さを有する、項目１０３に記載のキメラタンパク質。
（項目１０５）
上記リンカーのうちの１以上が、Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドを含有する、項目１〜１０４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０６）
上記Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３９）、または、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１４０）の式を有し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される正の整数である、項目１０５に記載のキメラタンパク質。
（項目１０７）
上記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６３）または、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１３８）である、項目１０６に記載のキメラタンパク質。
（項目１０８）
上記ＸＴＥＮ配列が、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、およびＡＧ１４４からなる群から選択される、項目１〜１０７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０９）
上記ＸＴＥＮ配列が、配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３、配列番号４４および、配列番号１２７からなる群から選択される、項目１０８に記載のキメラタンパク質。
（項目１１０）
上記ＸＴＥＮ配列が、ＡＥ２８８またはＡＧ２８８である、項目１０９に記載のキメラタンパク質。
（項目１１１）
上記リンカーが、上記リンカーのＮ末端で少なくとも１つの第一の開裂部位を含有し、上記リンカーのＣ末端で少なくとも１つの第二の開裂部位を含有し、または、その両方である、項目１〜１１０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１１２）
上記リンカーが、２０アミノ酸、３５アミノ酸、４８アミノ酸、７３アミノ酸、または９５アミノ酸を含有する、項目１〜１１１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１１３）
上記リンカーが、４８アミノ酸のトロンビン開裂リンカーである、項目１１２に記載のキメラタンパク質。
（項目１１４）
上記リンカーが、３５アミノ酸のトロンビン開裂リンカーである、項目１１２に記載のキメラタンパク質。
（項目１１５）
上記開裂部位の１以上が、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号８）である、項目１１１に記載のキメラタンパク質。
（項目１１６）
上記開裂部位の１以上が、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ２、グランザイム−Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群から選択されるプロテアーゼにより開裂される、項目１１１に記載のキメラタンパク質。
（項目１１７）
上記開裂部位の１以上が、ＲＲＲＲ（配列番号９）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０）、ＲＲＲＲＳ（配列番号１１）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１２）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号１３）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号１４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号１５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号１７）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号１８）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号１９）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号２０）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号２１）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号２２）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号２３）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号２４）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２５）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号２６）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号２７）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号２８）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号２９）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号３０）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号３１）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号３２）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号３３）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号３４）、およびＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号３５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、項目１１１または１１６のいずれかに記載のキメラタンパク質。
（項目１１８）
上記第一の開裂部位および上記第二の開裂部位が、同一、または異なっている、項目１１１〜１１７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１１９）
ポリシアル化、ペグ化、またはヘシル化されている、項目１〜１１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１２０）
項目１〜１２０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、ポリヌクレオチドのセット。
（項目１２１）
ＰＣ５または、ＰＣ７をコードする、ポリヌクレオチド鎖をさらに含有する、項目１２０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１２２）
項目１２０または１２１に記載のポリヌクレオチド、および上記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットに作動可能に連結されている１以上のプロモーターを含有する、ベクター。
（項目１２３）
ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖を含有する、追加のベクターをさらに含有する、項目１２２に記載のベクター。
（項目１２４）
項目１２０または１２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベクターを含有する、宿主細胞。
（項目１２５）
哺乳類細胞である、項目１２４に記載の宿主細胞。
（項目１２６）
上記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、およびＢＨＫ細胞からなる群から選択される、項目１２５に記載の宿主細胞。
（項目１２７）
項目１〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２０または１２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベクター、または、項目１２４〜１２５のいずれか１項に記載の宿主細胞、および、薬学的に受容可能な担体を含有する、医薬組成物。
（項目１２８）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、半減期が延長されている、項目１２７に記載の組成物。
（項目１２９）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長されている、項目１２７または１２８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３０）
上記第ＶＩＩＩ因子の半減期が、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約  ２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である、項目１２８または１２９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３１）
局所投与、眼球内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および経口投与からなる群から選択される経路により投与される、項目１２７〜１３０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３２）
上記非経口投与が、静脈内投与または皮下投与である、項目１３１に記載の組成物。
（項目１３３）
その必要のある対象における、出血性疾患または状態を処置するために用いられる、項目１２７〜１３２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３４）
上記出血性疾患または状態が、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１３３に記載の組成物。
（項目１３５）
上記対象が、外科手術を受ける予定である、項目１３３または１３４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３６）
上記処置が、予防的に、または、要求に応じて行われるものである、項目１３３〜１３５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３７）
項目１〜２６および４５〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベクター、項目１２４〜１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または、項目１２７〜１３６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に添加することを含む、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の結合を妨害または抑制する方法であって、ここで、上記ＶＷＦ断片は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、それによって、内因性ＶＷＦの結合を妨害または抑制する、方法。
（項目１３８）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長または増加させる方法であって、ここで、上記方法は、項目１〜２６および４５〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベクター、項目１２４〜１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または、項目１２７〜１３６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に添加することを含み、ここで、上記ＶＷＦ断片は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、それによって、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長または増加させる、方法。
（項目１３９）
細胞からのＦＶＩＩＩタンパク質の除去を妨害または抑制する方法であって、ここで、上記方法は、項目１〜２６および４５〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベクター、項目１２４〜１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または、項目１２７〜１３６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、ＦＶＩＩＩタンパク質または上記ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する細胞に添加することを含み、ここで、上記ＶＷＦ活性を有するタンパク質は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に結合する、方法。
（項目１４０）
上記対象が、動物である、項目１３７〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４１）
上記動物が、ヒトである、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
上記対象が、血友病Ａに罹患している、項目１４０に記載の方法。
（項目１４３）
項目１〜２６および４５〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベクター、項目１２４〜１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または、項目１２７〜１３６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、それを必要とする対象に、出血性疾患または障害を処置する方法であって、ここで、上記出血性疾患または障害は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血からなる群から選択される、方法。
（項目１４４）
上記処置が、予防的または要求に応じて行われる、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
上記有効量が、０．１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇである、項目１４３または１４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４６）
項目１〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベクター、項目１２４〜１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または、項目１２７〜１３６のいずれか１項に記載の組成物が、局所投与、眼球内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および経口投与からなる群から選択される経路により投与される、項目１４３〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４７）
上記非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、および皮内投与からなる群から選択される、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベクターで、宿主細胞の１以上をトランスフェクトすること、および、上記キメラタンパク質を上記宿主細胞内で発現させること、を含有する、キメラタンパク質を作製する方法。
（項目１４９）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、成熟型ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号４）の７４５残基のすぐ下流である、項目２７〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５０）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１６５６残基および１９００残基のすぐ下流である、項目２７〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５１）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の２６残基、１６５６残基および１９００残基のすぐ下流である、項目２７〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５２）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の４０３残基および７４５残基のすぐ下流である、項目２７〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５３）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の７４５残基および１９００残基のすぐ下流である、項目２７〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５４）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１８残基および７４５残基のすぐ下流である、項目２７〜１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５５）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、二本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである、項目１４９〜１５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５６）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、一本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである、項目１４９〜１５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５７）
１つのＸＴＥＮを含有する、項目１４９〜１５６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５８）
２つのＸＴＥＮを含有する、項目１４９〜１５６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５９）
挿入されている３つのＸＴＥＮを含有する、項目１４９〜１５６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６０）
上記ＸＴＥＮが、配列番号３９（ＡＥ２８８）である、項目１４９〜１５７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６１）
上記ＸＴＥＮが、配列番号３８および３７（ＡＧ１４４およびＡＥ１４４）である、項目１４９〜１５６および１５８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６２）
上記ＸＴＥＮが、配列番号３７、３８および３７（ＡＥ１４４、ＡＧ１４４、およびＡＥ１４４）である、項目１４９〜１５６および１５９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６３）
上記ＸＴＥＮが、配列番号３８および３９（ＡＥ１４４およびＡＥ２８８）である、項目１４９〜１５６および１５７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６４）
上記ＰＣ５またはＰＣ７が、ＶＷＦの上記Ｄ１Ｄ２ドメインを開裂する、項目１２４に記載の宿主細胞。
（項目１６５）
少なくとも２つのＸＴＥＮ、少なくとも３つのＸＴＥＮ、少なくとも４つのＸＴＥＮ、少なくとも５つのＸＴＥＮ、または少なくとも６つのＸＴＥＮを含有する、項目１〜２７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】ＶＷＦ断片の概略図である。図１Ａは、本発明に有用な、３つの例示的なＶＷＦ断片（ＶＷＦ−００２、ＶＷＦ−０１０、および、ＶＷＦ−０１３）を示す。ＶＷＦ−００２は、配列番号１２４（配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０）のアミノ酸１〜４７７を含有し、プレ／プロペプチド配列無しで合成される。ＶＷＦ−０１０は、Ｄ´Ｄ３ドメインに加え、Ｄ１Ｄ２ドメインを含有する。ＶＷＦ−０１３は、配列番号１２３の３３６残基および３７９残基で、システインを置換するアラニン残基に加え、Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメインを含有する。図１Ｂは、開裂可能なリンカー（たとえば、４８アミノ酸トロンビン開裂可能なリンカー）によってＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）に、融合されたＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメインを含有するＶＷＦ−０３１を示す。図１Ｃは、ｐＬＩＶＥベクター中に含まれるＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメインをコードするヌクレオチド配列であるＶＷＦ−０２５、および、ｐＬＩＶＥベクター中の、Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａの２つのアミノ酸置換を有するＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメインをコードするヌクレオチド配列であるＶＷＦ−０２９を示す。
【図１−２】図１Ｄは、プロペプチド（Ｄ１およびＤ２ドメイン）および、成熟型サブユニット（Ｄ´、Ｄ３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｂ１−３、Ｃ１−２ドメイン）を含有する全長ＶＷＦ断片を示す。ＶＷＦ断片は約２５０ｋＤａタンパク質であり、ジスルフィド結合により多量体（＞２０ＭＤａ）を形成する。ＶＷＦ断片は、非共有結合性の複合体中のＦＶＩＩＩ（９５〜９８％）と関連し、次いで、プロテアーゼ開裂／活性化からＦＶＩＩＩを保護すること、重鎖および軽鎖を安定化させること、ならびに、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩの除去を妨害すること、によりＦＶＩＩＩの半減期を延長させる。また、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦ受容体を介してＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ複合体を除去すること、ならびに、ｒＦＶＩＩＩＦｃのピノサイトーシスおよびリサイクルを妨害すること、によりＦＶＩＩＩの半減期を制限することもできる。
【図２】ＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３発現マウス、または、ＦＶＩＩＩとＶＷＦのダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスにおける、ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ（ｒＦＶＩＩＩ−ＡＥ２８８、または、ｒＦＶＩＩＩ−２８８ＡＥ）の薬物動態プロファイルである。図２Ａは、プラスミドＤＮＡ（ＶＷＦ−０２５）をコードするＤ´Ｄ３ドメインの水圧注入（５日前）、ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ＡＥ２８８の静脈内投与（０日）、およびＰＫ試料採取（５日目）のタイムラインを示す。図２Ｂは、Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３マウスにおけるｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ２８８のＩＶ投与（逆三角）およびＤＫＯマウスにおけるｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ２８８（ひし形）のＩＶ投与後のＦＶＩＩＩ発色アッセイにより測定されたＦＶＩＩＩ活性を示す。図２Ｃは、ＶＷＦ−０２５の投与後のＤ´Ｄ３の血漿レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。Ｘ軸は、時間単位での、時間を表す。
【図３】例示的なＶＷＦ：ＦＶＩＩＩヘテロ二量体構築物の概略図。構築物は、式ＦＶＩＩＩ−Ｆ１−Ｌ１−Ｖ−Ｘ−Ｌ２−Ｆ２で表される共通構造を有しているが、異なる可変リンカーの例を含有している。示されている構築物（ＦＶＩＩＩ−１６１）は、ＶＷＦ断片（ＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦのＤ´およびＤ３ドメイン（すなわち、Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａのアミノ酸置換を有する、配列番号２のアミノ酸１〜４７７）である）および第一のＦｃ領域に連結されたヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ（重鎖と軽鎖は金属結合により関連）を含有し、それらはさらに、開裂可能なリンカーおよび第二のＦｃ領域に連結されている。ＦＶＩＩＩ−１６１に含まれるＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮ  ＡＥ２８８配列であり、リンカーはトロンビン開裂可能なリンカー（３５アミノ酸を有する）である。ＦＶＩＩＩ−１６１において、第一のＦｃ領域に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、プロセッシング可能なリンカーによりＶＷＦ断片に連結されている。発現すると、プロセッシング可能なリンカーは、細胞内プロセッシング酵素により開裂されることができ、それにより、３つのポリペプチド鎖が互いに関連する構築物が作製される。
【図４】ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロ二量体または単量体の例の概略図である。ＦＶＩＩＩ−１６８、ＦＶＩＩＩ−１７５、ＦＶＩＩＩ−１７２、ＦＶＩＩＩ−１７４、および、ＦＶＩＩＩ１７０。構築物ＦＶＩＩＩ−１６８は、トロンビン開裂可能なリンカー（４８アミノ酸を有する）により第二のＦｃ領域に連結されているＶＷＦ断片に融合されている、第一のＦｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩ配列（１６４５残基と１６４８残基で、アルギニン残基がアラニン残基に置換されている）を含有する。ＡＥ２８８  ＸＴＥＮは、一本鎖ＦＶＩＩＩ配列のＢドメインに挿入されている。第一のＦｃ領域とＶＷＦ断片の間の連結には、細胞内プロセッシング酵素により開裂することができるリンカー（すなわち、プロセッシング可能なリンカー）が含有されている。構築物ＦＶＩＩＩ−１７５は、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮおよび第一のＦｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩ（１６４５残基と１６４８残基で、アルギニン残基がアラニン残基に置換されている）を含有しており、それは、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）により第二のＦｃ領域に連結されている。ＡＥ２８８  ＸＴＥＮは、一本鎖ＦＶＩＩＩ配列のＢドメインに挿入されている。ＦＶＩＩＩ−１７２構築物は、２つのポリペプチド鎖を含有しており、第一の鎖は、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮに融合された重鎖ＦＶＩＩＩ配列を含有し、第二の鎖は、軽鎖ＦＶＩＩＩ配列、第一のＦｃ領域、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）、ＶＷＦ断片、トロンビン開裂可能なリンカー（たとえば、４８アミノ酸）および第二のＦｃ領域を含有している。ＦＶＩＩＩ−１７４構築物は、２つのポリペプチド鎖を含有し、第一の鎖は、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮに融合された重鎖ＦＶＩＩＩ配列を含有し、第二の鎖は、軽鎖ＦＶＩＩＩ、第一のＦｃ領域、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）、および第二のＦｃ領域を含有している。ＦＶＩＩＩ−１７０構築物は、ＶＷＦ断片、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ、リンカー（たとえば、３５アミノ酸の長さのトロンビン開裂可能なリンカー）および一本鎖ＦＶＩＩＩ配列を含有する。
【図５】Ｆｃ領域と結合されたＸＴＥＮ配列を含有するＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ二量体の薬物動態プロファイルである。ＦＶＩＩＩ−１６１、ＦＶＩＩＩ−１６８およびＦＶＩＩＩ−１７２構築物を、水圧注入（ＨＤＩ）により、１００ｕｇ／マウスの用量で、ＦＶＩＩＩ：ＶＷＦのダブルノックアウト（ＤＫＯ）に投与した。ＦＶＩＩＩ−１７０構築物は、ＨＤＩにより、５０μｇ／マウスの用量で、ＦＶＩＩＩ：ＶＷＦのＤＫＯマウスに投与された。ＨＤＩ後の血漿ＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより、ＨＤＩ後の２４時間、分析した。ＸＴＥＮ配列およびＦｃドメインを含有するＦＶＩＩＩ：ＶＷＦヘテロ二量体のＦＶＩＩＩ活性を、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列およびＦｃドメインの無いＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ活性と比較した。
【図６】ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロ二量体例の共トランスフェクションシステムの概略図である。図６Ａ。ＦＶＩＩＩ−１６９構築物は、Ｆｃ領域に連結されている全長ＦＶＩＩＩ配列（１６４５残基および１６４８残基の位置でアルギニンがアラニン残基で置換されており、一本鎖ＦＶＩＩＩ配列中にＸＴＥＮ配列が挿入されている）を含有する。ＶＷＦ−０３１は、４８トロンビン開裂可能なリンカーで、他のＦｃ領域に連結されているＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３断片（３３６位および３７９位で、システイン残基がアラニン残基で置換されている）を含有する。細胞内プロセッシングの後、ＦＶＩＩＩ−１６９構築物は、１つのＦｃ断片とＸＴＥＮ配列に融合されている全長一本鎖ＦＶＩＩＩ（ＳＣＦＶＩＩＩ）を産生し、ＶＷＦ−０３１構築物は、他のＦｃ断片に連結されている４７７アミノ酸のＤ´Ｄ３断片を産生する。ＳＣ  ＦＶＩＩＩまたはＤ´Ｄ３断片に連結されているＦｃ断片の間に２つの共有結合が形成され、それにより、ＦＶＩＩＩとＤ´Ｄ３の非共有結合性の関連が可能となってもよい。図６Ｂ。ＦＶＩＩＩ−１７３構築物は、ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ配列、ＸＴＥＮ配列に連結された重鎖ＦＶＩＩＩ配列、およびＦｃ領域に連結された軽鎖ＦＶＩＩＩ配列を含有する。ＶＷＦ−０３１は上述されている。細胞内プロセッシングの後、ＦＶＩＩＩ−１７３構築物は、ヘテロ二量体タンパク質、ＸＴＥＮ配列に融合された重鎖ＦＶＩＩＩ、１つのＦｃ断片に融合された軽鎖ＦＶＩＩＩを産生し、およびＶＷＦ−０３１構築物は、他のＦｃ断片に連結された４７７アミノ酸のＤ´Ｄ３断片を産生する。軽鎖ＦＶＩＩＩまたはＤ´Ｄ３断片に連結されたＦｃ断片の間に２つの共有結合が形成され、これにより、ＦＶＩＩＩとＤ´Ｄ３の非共有結合性の関連が可能となっても良い。
【図７】Ｏｃｔｅｔ分析における、固定ｈＶＷＦに対する、ＸＴＥＮ配列およびＦｃドメインを含有する例示的なＦＶＩＩＩ：ＶＷＦの結合アフィニティ。固定されたｈＶＷＦに対する、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１およびＦＶＩＩＩ−０５７（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）の結合アフィニティを、バイオ層（ｂｉｏｌａｙｅｒ）干渉分光法を基にした測定（Ｏｃｔｅｔ分析）を用いて検証した。図７Ａにおいて、固定されたｈＶＷＦに対する、ＦＶＩＩＩ１６９およびＦＶＩＩＩＦｃ医薬成分（陽性対照）のナノモル単位での結合応答を示す。図７Ｂにおいて、固定されたヒトＶＷＦに対する、ヒトＩｇＧ１（陰性対照）の結合応答を示す。
【図８Ａ】ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ：ＶＷＦのダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスにおける、ＦＶＩＩＩ−１６９の薬物動態（ＰＫ）プロファイルである。図８Ａにおいて、ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１およびＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを示す。ＨｅｍＡマウスを、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１を２００ＩＵ／ｋｇにて単回静脈内投与で処置した。マウスから採取した血漿試料を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより検証した。ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１の半減期を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて算出した。
【図８Ｂ】図８Ｂにおいて、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＦｃおよびＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを示す。
【図９Ａ】Ｄ´Ｄ３発現ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおけるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体のＰＫプロファイルである。図９Ａにおいて、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体（１つのＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ、２つのＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ、および３つのＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ）のＰＫプロファイルの比較を示す。１、２または３つのＸＴＥＮを、Ｃ末端およびＢドメインを含むＦＶＩＩＩの様々な位置に挿入した。ＣＴは、ＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのＣ末端に連結されていることを示す。挿入部位Ｂ／ＣＴは、１つのＸＴＥＮが、ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基７４５とアミノ酸残基７４６の間に挿入され、他のＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端に連結されていることを示している。アミノ酸残基のナンバリングは、ＳＱ  ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質配列に対応している。挿入部位１９００／Ｂ／ＣＴは、第一のＸＴＥＮが、ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基１９００とアミノ酸残基１９０１の間に挿入され、第二のＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４５とアミノ酸残基７４６の間に挿入され、そして第三のＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのＣ末端に連結されていることを示す。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体の投与に用いられたマウスの系統は、Ｄ´Ｄ３ドメインを発現するＤＫＯマウス系統である。
【図９Ｂ】図９Ｂに、３つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮのＰＫプロファイルを示す。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ（１９００／Ｂ／ＣＴ）変異体は、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスまたはＨｅｍＡマウスのいずれかに投与された。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ（１９００／Ｂ／ＣＴ）の半減期が比較されている。
【図１０】発色アッセイにより計測された、ＤＫＯマウス血漿中のＦＶＩＩＩＦｃ（白三角）、ＦＶＩＩＩ１６９：Ｆｃ（黒丸）、およびＦＶＩＩＩ１６９：ＶＷＦ３１（白三角）のＦＶＩＩＩ活性である。ＦＶＩＩＩ：Ｆｃは、Ｆｃ二量体に融合された二本鎖ＦＶＩＩＩ（重鎖および軽鎖）を含有する（すなわち、単量体−二量体のハイブリッド）。ＦＶＩＩＩ１６９は、上述である（成熟型ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸７４５のすぐ下流、ＢドメインにＡＥ２８８を含有する）。ＦＶＩＩＩ１６９：Ｆｃは、Ｆｃ二量体に融合されたＦＶＩＩＩ１６９を含有する。ＦＶＩＩＩ１６９：ＶＷＦ３１は、Ｆｃ二量体に加えてＶＷＦ３１を含有し、ＦＶＩＩＩ１６９は第一のＦｃ領域に融合され、そしてＶＷＦ３１は第二のＦｃ領域に融合され、ここで、第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は共有結合を形成する（たとえば、１以上のジスルフィド結合）。
【図１１】ＦＶＩＩＩ半減期延長に対する、Ｆｃ、ＸＴＥＮ、およびＶＷＦ−Ｄ´Ｄ３の効果。ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標））（四角）、ＦＶＩＩＦｃ（丸）、ＦＶＩＩＩ１６９／Ｆｃ（三角）、およびＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１（逆三角）を、ＦＶＩＩＩとＶＷＦのダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスへと投与した。ＦＶＩＩＩ活性は、発色アッセイにより測定され、半減期を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ−Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて算出した。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸はｍＵ／ｍＬ単位での血漿ＦＶＩＩＩ活性を示す。
【図１２Ａ】ＨｅｍＡマウスにおける、ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／ＶＷＦヘテロ二量体中の異なるＸＴＥＮの効果。図１２Ａは、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基のすぐ下流にＸＴＥＮを含有するＦＶＩＩＩ−１６９と比較した、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１９００残基と１６５６残基のすぐ下流に挿入された２つのＸＴＥＮの、５分値に対して標準化された、ＦＶＩＩＩの血漿活性を示す（％）（すなわち、ＦＶＩＩＩ−１９５（二本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォーム）およびＦＶＩＩＩ−１９９（一本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォーム））。ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１（黒丸）、ＦＶＩＩＩ−１９９／ＶＷＦ−０３１（黒四角）、およびＦＶＩＩＩ−１９５／ＶＷＦ０３１（白四角）を、ＨｅｍＡマウスに投与し、ＦＶＩＩＩの血漿活性を測定した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＦＶＩＩＩ−１６９（ＢドメインにのみＸＴＥＮの挿入を有する）と比較した、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の残基４０３（Ａ２ドメイン）および残基７４５（Ｂドメイン）（すなわち、ＦＶＩＩＩ−２０３）、ならびに、残基７４５（Ｂドメイン）および残基１９００（Ａ３ドメイン）（ＦＶＩＩＩ−２０４）のすぐ下流に第二のＸＴＥＮを挿入することによる、半減期延長の効果を示す。ＦＶＩＩＩ−２０４／ＶＷＦ０３１（黒三角）、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１(黒丸)、ＦＶＩＩＩ−２０３／ＶＷＦ−０３１（黒四角）、およびｓｃＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（白ひし形）を、ＨｅｍＡマウスに投与した。Ｘ軸は、５分値に対して標準化したＦＶＩＩＩの血漿活性（％）を示し、Ｙ軸は、時間単位での時間を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＦＶＩＩＩ−１６９（Ｂドメインに１つのＸＴＥＮ挿入を有する）、および、一本鎖ＦＶＩＩＩ（いずれのＦｃ領域またはＸＴＥＮも無い（すなわち、ＦＶＩＩＩ−２０７））と比較した、残基１８（Ａ１ドメイン）と残基７４５（Ｂドメイン）のすぐ下流に２つのＸＴＥＮを挿入した（すなわち、ＦＶＩＩＩ−２０５）ことによる半減期延長の効果を示す。図１２Ｃにおいてさらに、ＦＶＩＩＩ−１６９（残基７４５のすぐ下流に１つのＸＴＥＮ挿入を有する）と比較した、残基２６（Ａ１ドメイン）、１６５６（Ａ３ドメイン）および１９００（Ａ３ドメイン）のすぐ下流に組み込まれた３つのＸＴＥＮ挿入（すなわち、ＦＶＩＩＩ−２０１）の半減期延長の効果を示す。ＦＶＩＩＩ−２０５／ＶＷＦ−０３１（黒四角）、ＦＶＩＩＩ−２０１／ＶＷＦ−０３１（逆三角）、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１（黒丸）、および、ＦＶＩＩＩ−２０７（白ひし形）を、ＨｅｍＡマウスに投与した。５分値に対して標準化したＦＶＩＩＩの血漿活性（％）（Ｘ軸）を、経時的に時間単位で測定した（Ｙ軸）。
【図１３】ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける、ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／ＶＷＦ−ＸＴＥＮヘテロ二量体のＦＶＩＩＩ活性。血漿試料中のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、時間関数（Ｙ軸）としてのＦＶＩＩＩ血漿活性（Ｘ軸）の回帰曲線をプロットした。ＦＶＩＩＩ−１５５（いずれのＸＴＥＮも有さないｓｃＦＶＩＩＩＦｃ）を、ＶＷＦ−０３４（ＡＥ２８８  ＸＴＥＮを有するＶＷＦ−Ｆｃに、３５残基のトロンビン開裂可能なリンカーを足したもの）と共発現させた。ＦＶＩＩＩ−１５５／ＶＷＦ−０３４の半減期を、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１（ＦＶＩＩＩのＢドメイン接合部分（成熟型ＦＶＩＩＩポリペプチドの７４５残基のすぐ下流）内に挿入されたＡＥ２８８ＸＴＥＮを有する）と比較した。
【図１４】様々なｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／ＶＷＦ構築物の概略図。これらの構築物は、本明細書の他の項においても記述されている。図１４Ａは、一本鎖Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩタンパク質を示す（本明細書において、場合により、ｓｃＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと示される）。ｓｃＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ構築物は、１６４５残基と１６４８残基で、２つの置換（ＡｒｇからＡｌａへ）を含有する。図１４Ｂは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３１）を示し、第一のポリペプチド鎖は、いずれのＸＴＥＮも有さないＦｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩを含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３断片を含有する。この構築物を対照として用いた。図１４Ｃにおいて、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ１９９／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１９００残基のすぐ下流に第一のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１６５６残基のすぐ下流に第二のＸＴＥＮが挿入されている、Ｆｃ領域に連結されている一本鎖ＦＶＩＩＩを含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されているＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３断片を含有している）。図１４Ｄにおいて、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ２０１／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の２６残基のすぐ下流に第一のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１６５６残基のすぐ下流に第二のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１９００残基のすぐ下流に第三のＸＴＥＮが挿入されている、Ｆｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３断片を含有する）。図１４Ｅは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基のすぐ下流（Ｂと示される）にＸＴＥＮが挿入されている、Ｆｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３断片を含有する）。図１４Ｆは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ２０３／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基（Ｂ）で第一のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１９００残基で第二のＸＴＥＮが挿入されている、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ    Ｄ´Ｄ３断片を含有する）。図１４Ｇは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ２０４／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の４０３残基のすぐ下流で第一のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基のすぐ下流（Ｂ）で第二のＸＴＥＮが挿入されている、Ｆｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３を含有する）。図１４Ｈは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１８残基のすぐ下流で第一のＸＴＥが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基のすぐ下流（Ｂ）で第二のＸＴＥＮが挿入されている、一本鎖ＦＶＩＩＩを含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３を含有する）。
【図１５】ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける、ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／ＶＷＦおよびＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ活性。血漿試料中のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、時間関数（Ｙ軸）としてのＦＶＩＩＩ血漿活性（Ｘ軸）の回帰曲線をプロットした。ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／ＶＷＦ（ＦＶＩＩＩ−２０５／ＶＷＦ−０３１）の半減期を、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩＦｃと比較した。
【図１６】尾切断出血モデルを用いた、ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体の有効性。ＨｅｍＡマウスの尾切断出血モデルを用いて、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１、および、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの有効性を比較した。２００ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、および、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１に対する、ｍｌ単位での失血量のメジアンを、２００ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、６５ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、２０ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩおよびビヒクルと比較した。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義
「一つの」（「ａ」または「ａｎ」）という用語の実体は、その実体の１以上を指すことに注意されたい。たとえば、「一つのヌクレオチド配列」とは、１以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。同様に、「一つの」、「一つ以上の」および「少なくとも一つの」という用語は、本明細書において、相互交換可能に用いることができる。
【００４１】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意味され、単離された核酸分子または構築物（たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））を指す。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合または非従来的な結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において存在する、アミド結合）を含有する。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１以上の核酸セグメント（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片）を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡが意図される。たとえば、ベクター中に含有される第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的に対し、単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または、溶液中の他のポリヌクレオチドから（部分的に、または実質的に）精製された組換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明に従う、単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としては、合成して製造された分子も含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸に、たとえばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、または転写終止シグナル等の制御因子が含まれても良い。
【００４２】
本明細書において、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸へと翻訳されるコドンからなるポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は通常、アミノ酸へと翻訳されないが、コドン領域の一部であるとみなされても良く、しかし、たとえばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等の隣接する配列はいずれも、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は通常、５´末端の開始コドン（得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする）、および３´末端にある翻訳終止コドン（得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする）により決定される。本発明の２以上のコード領域が、１つのポリペプチド構築物中（たとえば、１つのベクター）に、または別々のポリヌクレオチド構築物（たとえば別々の（異なる）ベクター）に、存在してもよい。そして、１つのベクターは、ただ１つのコード領域を含有してもよく、または、２以上のコード領域を含有しても良い（たとえば、１つのベクターは、以下に記述されるように、結合ドメインＡと結合ドメインＢを別々にコードしてもよい）。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の結合ドメインをコードする核酸に融合された、または融合されていない、異種のコード領域をコードしてもよい。異種のコード領域としては、限定されないが、たとえば分泌シグナルペプチド、または異種の機能性ドメイン等の、特殊化した因子またはモチーフが挙げられる。
【００４３】
哺乳類細胞から分泌される、あるタンパク質は、分泌シグナルぺプチド（発達途上のタンパク質鎖が粗面小胞体を超えて輸送されると成熟型タンパク質から開裂される）と結合している。当業者であれば、シグナルペプチドは多くの場合、ポリペプチドのＮ末端に融合されており、そして、完全ポリペプチド、または「全長」ポリペプチドから切り離され、当該ポリペプチドの分泌型または「成熟」型が産生されることを認識している。ある実施態様において、天然型のシグナルペプチドまたは、作動可能に結合されているポリペプチドの分泌を誘導することができる能力を保持している、その配列の機能性誘導体。あるいは、異種哺乳類シグナルペプチド（たとえば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化物質（ＴＰＡ）またはマウスβグルクロニダーゼシグナルペプチド）、またはその機能性誘導体が用いられても良い。
【００４４】
「下流」という用語は、基準となるヌクレオチド配列に対して３´に位置づけられるヌクレオチド配列を指す。ある実施態様において、下流のヌクレオチド配列とは、転写の開始地点の後に続く配列のことである。たとえば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部分の下流に位置づけられている。
【００４５】
「上流」という用語は、基準となるヌクレオチド配列に対して５´に位置づけられるヌクレオチド配列を指す。ある実施態様において、上流のヌクレオチド配列とは、コード領域の５´側、または、転写の開始部分に位置づけられている。たとえば、ほとんどのプロモーターは、転写の開始部分の上流に位置づけられている。
【００４６】
本明細書において、「制御領域」という用語は、コード領域の上流（５´非コード配列）、コード領域内、またはコード領域の下流（３´非コード配列）に位置づけられているヌクレオチド配列を指し、関連コード領域の転写、ＲＮＡプロセッシング、安定性、または翻訳に影響を与える。制御領域には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が含まれても良い。もしコード領域が、真核細胞中の発現を目的とするものである場合、通常、当該コード配列の３´にポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列が位置づけられている。
【００４７】
遺伝子産物（たとえば、ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、１以上のコード領域に作動可能に関連づけられているプロモーターおよび／または他の転写制御因子または翻訳制御因子を含有してもよい。操作可能な関連付けにおいて、遺伝子産物（たとえば、ポリペプチド）に対するコード領域は、制御領域（複数含む）の影響の下、または制御の下で、遺伝子産物の発現を設定するような方法で、１以上の制御領域に関連付けられている。たとえば、プロモーター機能を誘導することにより、コード領域によりコードされている遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が発生する場合、および、プロモーターとコード領域の間の連携の本来のありようでは、遺伝子産物の発現を誘導するプロモーターの能力に干渉することがない、または転写されるＤＮＡ鋳型の能力に干渉することがない場合、コード領域およびプロモーターは、「作動可能に関連づけられている」。他のプロモーターのそばにある転写制御因子（たとえば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終止シグナル）もまた、遺伝子産物の発現を誘導するために、コード領域に作動可能に関連づけられていてもよい。
【００４８】
様々な転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域（たとえば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメント（イントロンＡと連結した前初期プロモーター）、シミアン・ウイルス４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）のプロモーターおよびエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、および、レトロウイルス（たとえば、ラウス肉腫ウイルス）のプロモーターおよびエンハンサーセグメント）が含まれる。他の転写制御領域としては、たとえば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロビン等の脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに、真核細胞において遺伝子発現を制御することが出来る他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびに、リンホカイン誘導プロモーター（たとえば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【００４９】
同様に、様々な翻訳制御因子が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび終止コドン、ならびに、ピコルナウイルス由来の因子（特に、配列内リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列ともまた呼称される）が挙げられる。
【００５０】
本明細書において、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物（たとえば、ＲＮＡまたはポリヌクレオチド）を産生するプロセスを指す。限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への、ポリヌクレオチドの転写、および、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発現により、「遺伝子産物」が産生される。本明細書において、遺伝子産物とは、核酸（たとえば、遺伝子の転写により産生されたメッセンジャーＲＮＡ）または転写物から翻訳されたポリペプチドのいずれかであっても良い。本明細書において遺伝子産物とは、さらに、転写後修飾（たとえば、ポリアデニル化またはスプライシング）された核酸、または翻訳後修飾（たとえば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの関連、またはタンパク分解性の開裂等）されたポリペプチドが含まれる。
【００５１】
「ベクター」とは、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または移送のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、他の核酸セグメントが付随し、当該付随セグメントの複製も発生しうる、レプリコンであっても良い。「レプリコン」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製の自律的単位として機能する（すなわち、自身の制御の下で複製することができる）任意の遺伝子因子（たとえば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞へ核酸を導入するための、ウイルス性のビヒクルおよび非ウイルス性のビヒクルの両方が含まれる。たとえば、プラスミド、改変真核細胞ウイルス、または改変細菌性ウイルス等を含む、多くのベクターが当分野に公知であり、使用されている。適切なベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、適切なポリヌクレオチド断片を、相補的な付着末端を有する選択ベクターへとライゲーションすることにより行うことができる。
【００５２】
ベクターを操作して、ベクターが組み込まれている細胞の選択または同定を行う選択マーカーまたはレポーターをコードさせてもよい。選択マーカーまたはレポーターの発現により、ベクターに含まれている他のコード領域を組み込み、発現する宿主細胞の同定および／または選択が可能となる。当分野に公知であり、使用されている選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤（ｂｉａｌａｐｈｏｓ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ）、スルホンアミド等に対する抵抗性をもたらす遺伝子、および、表現型マーカーとしても用いられる遺伝子（すなわち、アントシアニン制御遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等）が挙げられる。当分野に公知であり、使用されているレポーターの例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が挙げられる。
【００５３】
「プラスミド」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではないが、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子を多くの場合に保有する染色体外因子を指す。そのような因子は、任意の源由来の、自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、直線状、環状、もしくは超らせん状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、その中で、多くのヌクレオチド配列が、適切な３´非翻訳配列と共に、選択遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を、細胞へと導入することができる独特の構造体へと連結または組換えられる。
【００５４】
用いることができる真核細胞性ウイルスベクターとしては、限定されないが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびポックスウイルス（たとえば、ワクシニアウイルスベクター）、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターが挙げられる。非ウイルス性ベクターとしては、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎｓ））、ＤＮＡ−タンパク質複合体およびバイオポリマーが挙げられる。
【００５５】
「クローニングベクター」とは、連続して複製する核酸の単位長さであり、たとえばプラスミド、ファージまたはコスミド等の複製起源を含有する、「レプリコン」を指し、他の核酸セグメントが付随され、当該付随セグメントの複製が開始されてもよい。あるクローニングベクターは、１つの細胞型（たとえば、細菌）で複製され、そしてそれ以外（たとえば、真核細胞）で発現されることができる。クローニングベクターは通常、ベクターを含有する細胞の選別に用いることができる１以上の配列を含有し、および／または、対象の核酸配列の挿入のための複数のクローニング部位を含有する。
【００５６】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞への挿入後、挿入された核酸配列を発現することができるように設計されたビヒクルを指す。挿入核酸配列は、上述の制御領域と作動可能に関連づけられた状態で挿入される。
【００５７】
ベクターは、当分野公知の方法（たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーター）により宿主細胞へと導入される。
【００５８】
本明細書において、「培養」、「培養すること」および「培養する」とは、細胞増殖もしくは分裂が可能となるｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で細胞をインキュベートすること、または、細胞を生きている状態に維持すること、を意味する。本明細書において、「培養された細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖された細胞を意味する。
【００５９】
本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、および、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２以上のアミノ酸の任意の鎖（複数含む）を指すが、特定の長さの産物は意図されない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２以上のアミノ酸の鎖（複数含む）を呼称するために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちの任意のものの代わりに、または相互交換可能に用いることができる。「ポリペプチド」という用語はまた、発現後にポリペプチドを改変した産物を指すことも意図され、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基による誘導体化、タンパク質分解性の開裂、または非天然型アミノ酸での置換等が挙げられる。ポリペプチドは、天然の生物源から誘導されてもよく、または、組み換え技術により製造されてもよいが、指定された核酸配列から翻訳される必要がある。化学合成によるものを含む、任意の方法で作製されてもよい。
【００６０】
「単離された」ペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、自然環境中には無いポリペプチドを指す。特定レベルの精製は必要ない。たとえば、単離されたポリペプチドは、その自然の状態であってもよく、または自然環境から単に取り出されたものであってもよい。組み換え技術により製造されたポリペプチドおよび宿主細胞で発現されたタンパク質は、任意の適切な技術により分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的に精製された天然型ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様、本発明の目的に対し、単離されたとみなされる。
【００６１】
本発明にはまた、ポリペプチドの断片または変異体、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。本発明のポリペプチド結合ドメインまたはポリペプチド結合分子を呼称する際の「断片」または「変異体」という用語には、基準となるポリペプチドの少なくとも一部の特性（たとえば、ＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃ変異体については、ＦｃＲｎ結合アフィニティ、ＦＶＩＩＩ変異体については、凝固活性、または、ＶＷＦ断片についてはＦＶＩＩＩ結合活性等）を保持している任意のポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの断片には、タンパク質分解断片、ならびに、欠損断片、さらに本明細書の別項に解説される特定の抗体断片が含まれるが、天然型の全長ポリペプチド（または成熟型ポリペプチド）は含まれない。本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子の変異体には、上述の断片が含まれ、および、アミノ酸置換、欠失または挿入による改変アミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。変異体は、天然型であっても、非天然型であっても良い。非天然型の変異型は、公知の突然変異誘導技術を用いて製造されてもよい。変異型ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸の置換、欠失または付加を含んでも良い。
【００６２】
本明細書において用いられる「ＶＷＦ断片」（複数含む）という用語は、ＦＶＩＩＩと相互作用する任意のＶＷＦ断片を意味し、正常であれば全長ＶＷＦによってＦＶＩＩＩにもたらされる少なくとも１以上の特性（たとえば、ＦＶＩＩＩａに対する時期尚早の活性化を防ぐ、時期尚早のタンパク質分解を防ぐ、時期尚早のクリアランスをもたらすリン脂質メンバーとの結合を防ぐ、裸のＦＶＩＩＩとは結合できるが、ＶＷＦ結合ＦＶＩＩＩとは結合できないＦＶＩＩＩクリアランス受容体への結合を防ぐ、および／または、ＦＶＩＩＩ重鎖と軽鎖の相互作用を安定化させる、等）を保持する任意のＶＷＦ断片を意味する。
【００６３】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されており、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。ゆえに、ポリペプチド中のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸と置換される場合、その置換は保存的であるとみなされる。他の実施態様において、アミノ酸の列は、側鎖ファミリーメンバの系列および／または組成が異なる構造的に類似のストリングで保存的に置換されてもよい。
【００６４】
当分野において、２つのポリペプチド間の「配列同一性」とは、１つのポリペプチドのアミノ酸配列と、第二のポリペプチドの配列とを比較することにより決定されると認識されている。本明細書において検討される場合、任意の特定のポリペプチドが、他のポリペプチドに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または、１００％の同一であるかどうかは、当分野公知の方法およびコンピュータープログラム／ソフトウェア（限定されないが、たとえば、ＢＥＳＴＦＩＴ
ｐｒｏｇｒａｍ  （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１１））を用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、Smithand Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の部分的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良い相同性セグメントが見出される。特定の配列が、本発明に従う基準配列と、たとえば、９５％の同一であるかどうかを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを用いる場合、パラメーターは、同一性のパーセントが基準ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、基準配列中のアミノ酸の総数のうちの５％までの相同性ギャップが許可されるよう、セットされる。
【００６５】
本明細書において、ＶＷＦ配列またはＦＶＩＩＩタンパク質配列における、「〜に対応するアミノ酸」または「同等のアミノ酸」は、第一のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列と、第二のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列の間の同一性または類似性を最大化するアライメントにより特定される。第二のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列中の同等のアミノ酸を特定するために用いられる数は、第一のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列中の対応するアミノ酸を特定するために用いられた数に基づいている。
【００６６】
本明細書において、「挿入部位」という用語は、異種部分が挿入されうる位置のすぐ上流の、ＦＶＩＩＩポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体中の位置を指す。「挿入部位」は、番号として特定され、その番号は、挿入位置に対してすぐＮ末端側にある、挿入部位に相当する、成熟型天然ＦＶＩＩＩ（配列番号４）中のアミノ酸の番号である。たとえば、「ａ３は、配列番号４のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位にＸＴＥＮを有する」という表現は、当該異種部分が、配列番号４のアミノ酸１６５６とアミノ酸１６５７に対応する２つのアミノ酸の間に位置することを指す。
【００６７】
本明細書において、「アミノ酸のすぐ下流」という表現は、アミノ酸の末端カルボキシ基側の方のすぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸のすぐ上流」という表現は、アミノ酸の末端アミノ基側の方のすぐ隣の位置を指す。それゆえ、本明細書において、「挿入部位の２つのアミノ酸の間」という表現は、ＸＴＥＮまたは他の任意のポリペプチドが、２つの隣接するアミノ酸の間に挿入される位置を指す。ゆえに、「アミノ酸のすぐ下流に挿入される」および「挿入部位の２つのアミノ酸の間に挿入される」という表現は、「挿入部位で挿入される」と同義で用いられる。
【００６８】
本明細書において、「挿入された」、「挿入される」、「〜へ挿入される」またはそれらと文法的に関連した用語は、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩ中の類似の位置と比較した、キメラポリペプチド中のＸＴＥＮの位置を指す。本明細書において、その用語は、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩと比較した、組換えＦＶＩＩＩポリペプチドの特徴を指すが、キメラポリペプチドが作製された任意の方法またはプロセスを示唆、暗示または推察させるものではない。たとえば、本明細書に提示されるキメラポリペプチドに関連して、「ＸＴＥＮが、ＦＶＩＩＩポリペプチドの７４５残基のすぐ下流へと挿入される」という表現は、キメラポリペプチドが、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩの７４５アミノ酸に対応するアミノ酸のすぐ下流にＸＴＥＮを含有する（たとえば、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩの７４５と７４６アミノ酸に対応するアミノ酸で囲まれている）ということを意味する。
【００６９】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、自然界では、本来、連結されていない第二のアミノ酸配列に連結されている第一のアミノ酸配列を含有する。通常は別々のタンパク質中に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド中に集めても良く、または、通常は同じタンパク質中に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド中に新たな配置で設置しても良い（たとえば、Ｉｇ  Ｆｃドメインと本発明の第ＶＩＩＩ因子ドメインの融合）。融合タンパク質は、たとえば、化学合成により、または所望される関係性でペプチド領域がコードされているポリペプチドを作製および翻訳することにより、作製される。キメラタンパク質はさらに、共有結合、非ペプチド結合、または非共有結合により第一のアミノ酸配列と関連する第二のアミノ酸配列を含有してもよい。
【００７０】
本明細書において、「半減期」という用語は、特定のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半分が、動物内の循環系および／または他の組織から除去されるために必要とされる時間と表されても良い。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間関数として描かれる場合、その曲線は通常、急峻なα相と、より長いβ相の二相性となる。α相は多くの場合、投与されたキメラポリペプチドの、血管内腔と血管外腔の間の平衡を表し、ポリペプチドのサイズによりある程度は決定される。β相は多くの場合、血管内腔におけるポリペプチドの異化を表す。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩとＦＶＩＩＩを含有するキメラタンパク質は単相性であり、α相を有せず、β相のみを有する。それゆえ、ある実施態様において、本明細書に用いられる半減期という用語は、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおける、ヒト抗体の典型的なβ相半減期は２１日である。
【００７１】
本明細書において、「連結された」という用語は、第二のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に共有結合、または非共有結合された、それぞれ、第一のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第一のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、第二のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に直接結合または並置されてもよく、あるいは、介在配列が、第一の配列を第二の配列に共有結合させてもよい。「連結された」という用語は、Ｃ末端またはＮ末端での、第一のアミノ酸配列の第二のアミノ酸配列への融合のみならず、第二のアミノ酸配列中の任意の２つのアミノ酸へ、第一のアミノ酸配列のすべてを挿入すること（または、第一のアミノ酸配列中の任意の二つのアミノ酸へ、第二のアミノ酸配列のすべてを挿入すること）を含むことが意図される。１つの実施態様において、第一のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーにより、第二のアミノ酸配列に連結されてもよい。第一のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーにより、第二のヌクレオチド配列に連結されてもよい。リンカーは、（ポリペプチド鎖に対しては）ペプチドもしくはポリペプチド、または、（ヌクレオチド鎖に対しては）ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖、または、（ポリペプチド鎖およびポリヌクレオチド鎖の両方に対しては）任意の化学結合であってもよい。「連結された」という用語はまた、ハイフン（−）により示される。
【００７２】
本明細書において、「関連した」という用語は、第一のアミノ酸鎖と第二のアミノ酸鎖の間に形成された共有結合または非共有結合を指す。１つの実施態様において、「関連した」という用語は、共有結合的な非ペプチド結合、または非共有結合を意味する。この関連は、コロン（すなわち、（：））により示されても良い。他の実施態様において、それは、ペプチド結合を除く共有結合を意味する。たとえば、アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することが出来るチオール基、または第二のシステイン残基上のチオール基と架橋することができるチオール基を含有する。ほとんどの天然型ＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合により関連づけられ、２つの重鎖は２３９および２４２に相当する位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用（ＥＵナンバリングシステムにおける２２６または２２９位））の２つのジスルフィド結合により関連づけられる。共有結合の例としては、限定されないが、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、π背面結合（ｂａｃｋｂｏｎｄ）、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、超共役、芳香族性、ハプト数または反結合が挙げられる。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（たとえば、カチオン−π結合または塩結合）、金属結合、水素結合（たとえば、二水素結合、二水素複合体、低障壁水素結合、または対称性水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、エントロピー力、または化学的極性が挙げられる。
【００７３】
本明細書において、「単量体−二量体ハイブリッド」という用語は、ジスルフィド結合により互いに関連している、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質を指し、ここで、第一の鎖は凝固因子（たとえば、第ＶＩＩＩ因子）および第一のＦｃ領域を含有し、第二の鎖は、凝固因子の無い第二のＦｃ領域を含有し、凝固因子の無い第二のＦｃ領域から本質的になり、または、からなる。ゆえに、単量体−二量体ハイブリッド構築物は、ただ１つの凝固因子のみを有する単量体の特徴と、２つのＦｃ領域を有する二量体の特徴を含有するハイブリッドである。
【００７４】
本明細書において、「開裂部位」または「酵素開裂部位」という用語は、酵素により認識される部位を指す。ある酵素開裂部位は、細胞内プロセッシング部位を含有する。１つの実施態様において、ポリペプチドは、凝固カスケードの間に活性化される酵素により開裂される酵素開裂部位を有し、そのような部位の開裂は凝固形成部位で生じる。そのような部位の例としては、たとえば、トロンビン、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子により認識されるものが挙げられる。例示的なＦＸＩａ開裂部位としては、たとえば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号４５）および、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号４６）が挙げられる。例示的なトロンビン開裂部位としては、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４７）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号４８）、ＬＶＰＲＧ（配列番号４９）および、ＡＬＲＰＲ（配列番号５０のアミノ酸１〜５）が挙げられる。他の酵素開裂部位も当分野に公知である。
【００７５】
本明細書において、「プロセッシング部位」または「細胞内プロセッシング部位」という用語は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素の標的である、ポリペプチド中の酵素開裂部位のタイプを指す。１つの実施態様において、そのような酵素は、ゴルジ内腔からトランス−ゴルジ部分への輸送の間に機能する。細胞内プロセッシング酵素は、細胞からタンパク質が分泌される前に、ポリペプチドを開裂する。そのようなプロセッシング部位の例としては、たとえば、エンドぺプチダーゼファミリーのＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ（ＰＡＣＥは、Ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ（塩基性アミノ酸開裂酵素対）の頭字語である）により標的とされるものが挙げられる。これらの酵素はゴルジ膜に位置し、Ａｒｇ−［任意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ａｒｇ配列モチーフのカルボキシ末端側上でタンパク質を開裂する。本明細書において、酵素の「ｆｕｒｉｎ」ファミリーとしては、たとえば、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ３（ｆｕｒｉｎまたはＰＡＣＥとしてもまた知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５またはＰＣ６としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としてもまた知られる）、または、ＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７としてもまた知られる）が挙げられる。他のプロセッシング部位も当分野に公知である。
【００７６】
２以上のプロセッシング部位または開裂部位を含む構築物において、そのような部位は同じであっても、異なっていても良いことが理解される。
【００７７】
「Ｆｕｒｉｎ」という用語は、ＥＣ第３．４．２１．７５に対応する酵素を指す。Ｆｕｒｉｎは、サブチリシン様前駆タンパク質転換酵素であり、ＰＡＣＥ（Ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）としてもまた知られている。Ｆｕｒｉｎは、生物学的に活性なタンパク質へと転換させるために、前駆タンパク質の不活性な部分を削除する。細胞内輸送の間に、Ｆｕｒｉｎ酵素によりＶＷＦのプロペプチドが成熟型ＶＷＦ分子から開裂されてもよい。一部の実施態様において、Ｆｕｒｉｎは、ＶＷＦのＤ´Ｄ３からＤ１Ｄ２を開裂する。他の実施態様において、ＦｕｒｉｎによりＤ１Ｄ２ドメインが細胞内で切り離されるように、Ｆｕｒｉｎをコードするヌクレオチド配列がＶＷＦ断片をコードするヌクレオチドとともに発現されてもよい。
【００７８】
２以上のプロセッシング部位または開裂部位を含有する構築物において、そのような部位は同じであっても異なっていても良いことを理解されたい。
【００７９】
本明細書において、「プロセッシング可能なリンカー」とは、本明細書の他項に記述される、細胞内プロセッシング部位を少なくとも１つ含有するリンカーを指す。
【００８０】
本明細書において、止血障害とは、フィブリン塊形成の能力が無い、または能力が損なわれたことによる、自然発生的な、または外傷の結果としての、大量出血の傾向により特徴付けられる遺伝性または後天的な状態を意味する。そのような障害の例としては、血友病が挙げられる。血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ欠損または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ欠損、軽度な出血傾向）が３つの主な形態である。他の止血障害としては、たとえば、Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ症、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常、Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群（ＧＰＩｂの異常または欠損である）が挙げられる。ＶＷＦの受容体であるＧＰＩｂが不完全である可能性もあり、一次血栓形成（一次止血）の欠落をもたらし、出血傾向を増加させ、Ｇｌａｎｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｎａｅｇｅｌｉの血小板無力症（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ血小板無力症）をもたらす。肝不全（急性および慢性状態）においては、肝臓による凝固因子の産生が不十分であり、これによって出血リスクが高まりうる。
【００８１】
本発明のキメラ分子は、予防的に用いられても良い。本明細書において、「予防的処置」という用語は、出血症状の前に分子を投与することを指す。１つの実施態様において、全般的な止血剤の必要性がある対象は、外科手術を受けている、または外科手術を受けようとしているものである。本発明のキメラタンパク質は、予防剤として、外科手術の前、または後に投与されても良い。本発明のキメラタンパク質は、深刻な出血症状を制御するために、外科手術の間、または外科手術の後に投与されても良い。外科手術には、限定されないが、肝臓移植、肝切除、歯科処置または幹細胞移植が挙げられる。
【００８２】
本発明のキメラタンパク質はまた、要求に応じた処置に用いられても良い。「要求に応じた処置」という用語は、出血症状の兆候に応じてキメラ分子を投与すること、または、出血をもたらしうる活動の前にキメラタンパク分子を投与することを指す。１つの態様において、要求に応じた処置は、出血が始まるとき（たとえば外傷の後）、または出血が予期されるとき（たとえば外科手術の前）に、対象に施されても良い。他の態様において、要求に応じた処置は、たとえば接触のあるスポーツ等の出血リスクが増大する活動の前に施されても良い。
【００８３】
本明細書において、「深刻な出血」という用語は、背景事情に関わらず、出血症状を指す。たとえば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血性疾患（たとえば、第ＶＩＩ因子欠損）、血小板疾患、または凝固因子に対する抗体の発現による抵抗性を有していても良い。
【００８４】
本明細書において、処置する、処置、処置することとは、疾患または状態の重篤度を下げること；疾患経過の持続期間を短くすること；疾患または状態に関連した１以上の症状を改善すること；疾患または状態を有する対象に対して、有益な効果を提供すること、または、当該疾患または状態を処置する必要がない対象に対して、疾患または状態に関連した１以上の症状の予防法を提供すること、を指す。１つの実施態様において、「処置すること」または「処置」という用語は、本発明のキメラタンパク質またはＶＷＦ断片を投与することにより、対象におけるＦＶＩＩＩのトラフレベルを、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または、２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する。他の実施態様において、処置すること、または処置とは、ＦＶＩＩＩのトラフレベルを、約１〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約２〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約３〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約４〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約５〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約６〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約７〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約８〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約９〜約２０ＩＵ／ｄＬ、または、約１０〜約２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する。疾患もしくは状態の処置または処置することには、非血友病の対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または、２０％に相当するレベルに、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を維持することも含まれる。処置に必要とされる最小のトラフレベルは、１以上の公知の方法により測定することができ、各人物に対して調整する（増加させる、または減少させる）ことができる。
【００８５】
キメラタンパク質
本発明は、ＶＷＦ断片とＸＴＥＮ配列を用いて、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子（すなわち、内因性ＶＷＦ）が、ＦＶＩＩＩタンパク質と関連することを妨害または抑制することにより、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の半減期を延長させることを目的とする。内因性ＶＷＦは、非共有結合性複合体のＦＶＩＩＩの約９５〜９８％と関連する。内因性ＶＷＦはＦＶＩＩＩの半減期制限因子であり、また、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質への結合は、様々な方法でＦＶＩＩＩを保護することが知られている。たとえば、全長ＶＷＦ（約２５０ｋＤａを有する多量体）は、プロテアーゼ開裂およびＦＶＩＩＩ活性化からＦＶＩＩＩを保護することができ、ＦＶＩＩＩの重鎖および／または軽鎖を安定化させ、ならびに、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩのクリアランスを妨害することができる。しかし、同時に、内因性ＶＷＦは、ピノサイトーシスを妨害し、そして、ＶＷＦクリアランス経路を介し、身体からＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ複合体を除去することにより、ＦＶＩＩＩの半減期を制限する。学説に縛られることは望まないが、内因性ＶＷＦは半減期制限因子であり、これによって、半減期延長物質に融合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの約２倍より長くはならないと考えられている。それゆえ、本発明は、ＶＷＦ断片を用いて内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の間の相互作用を妨害または抑制し、それにより、ＸＴＥＮ配列のみを用いて、または、Ｉｇ定常領域もしくはその一部との組み合わせでＸＴＥＮ配列を用いることにより、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長させることを目的とする。ＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＶＷＦ断片に連結されてもよい。それにより、ＶＷＦ断片と関連したＦＶＩＩＩタンパク質は、１以上のＶＷＦクリアランス受容体により、さらにゆっくりと循環系から除去され、ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩと比較して、ＸＴＥＮ配列またはＩｇ定常領域と組み合わせたＸＴＥＮ配列による完全な半減期延長が得られる。
【００８６】
１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は、共有結合または非共有結合により、ＦＶＩＩＩタンパク質と関連（または連結）する。しかしながら、一部の例において、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の間の物理的封鎖または化学的関連（たとえば、非共有結合性の結合）は、内因性ＶＷＦの存在下では、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦ断片を含有する複合体を安定化させるほどには強くない可能性がある。たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質と非共有結合を形成している（他の結合は何もない）ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦの存在下では、ｉｎ  ｖｉｖｏで容易にＦＶＩＩＩタンパク質から解離し、内因性ＶＷＦとＶＷＦ断片（たとえば、組換えＶＷＦ、すなわち、ｒＶＷＦ）が置き換わってしまう可能性がある。それゆえ、内因性ＶＷＦと非共有結合しているＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦクリアランス経路を経て、身体から容易に除去されてしまう。ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の解離を防ぐために、一部の実施態様においては、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の関連または連結は、共有結合（たとえば、ペプチド結合、１以上のアミノ酸、またはジスルフィド結合）である。ある実施態様において、付属部分とＦＶＩＩＩタンパク質の間の関連（すなわち、連結）は、ペプチド結合、またはＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間のリンカー（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦリンカー）である。リンカーの非限定的な例は、本明細書の他項に記述する。一部の実施態様において、ＶＷＦ断片は、少なくとも約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、または、４０００アミノ酸を含有する、本質的にからなる、または、からなるポリペプチドである。ＶＷＦ断片の非限定的な例は、本明細書の別項に記述する。
【００８７】
ある実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のＶＷＦ結合部位に化学的（たとえば、非共有結合的）に結合、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のＶＷＦ結合部位を物理的に封鎖する。ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメイン内に位置する。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位は、Ａ３ドメインおよびＣ２ドメイン内に位置する。たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位は、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１６６９〜１６８９および／または２３０３〜２３３２に対応する。
【００８８】
本発明はまた、１以上のＸＴＥＮ配列をさらに含有するキメラタンパク質（ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片を含有する）を提示し、それにより、さらなる半減期延長の特性がもたらされる。１以上のＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＶＷＦ断片の内に挿入されてもよく、または、ＦＶＩＩＩタンパク質もしくはＶＷＦ断片のＮ末端またはＣ末端に連結されてもよい。本発明にはまた、ＸＴＥＮ配列（第一の半減期延長部分）に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質および、Ｉｇ定常領域またはその一部（第二の半減期延長部分）を含み、それにより、その２つの半減期延長部分が、２つの異なるメカニズムを介して、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する。
【００８９】
一部の実施態様において、キメラタンパク質は、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃＲｎ結合パートナー）に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質、第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃＲｎ結合パートナー）に連結されたＶＷＦ断片、および、ＦＶＩＩＩタンパク質もしくはＶＷＦ断片に挿入された、または連結された１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、ここで、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子（たとえば、内因性ＶＷＦ）がＦＶＩＩＩタンパク質に結合することを妨害し、ここで、第一および第二のＩｇ定常領域またはその一部は、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）を形成し、および、１以上のＸＴＥＮ配列が、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する。
【００９０】
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、任意選択的なリンカー（すなわち、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦリンカー）によりＶＷＦ断片に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質、および、ＦＶＩＩＩタンパク質もしくはＶＷＦ断片に挿入された、または連結された１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、ここで、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子（たとえば、内因性ＶＷＦ）がＦＶＩＩＩタンパク質に結合することを妨害し、および、１以上のＸＴＥＮ配列が、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する。１つの態様において、任意選択的なリンカー（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦリンカー）は、ソルターゼ認識モチーフを含有する。他の態様において、任意選択的なリンカー（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦリンカー）は、開裂可能な部位を含有する。開裂リンカー（すなわち、１以上の開裂部位を含有するリンカー）の例は、本明細書の別項に記述する。
【００９１】
本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、以下を含有する：
（１）Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、およびＦＶＩＩＩであり、ここで、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦ断片に連結されている、
（２）ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、およびＩｇ定常領域またはその一部であり、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質はＸＴＥＮ配列およびＩｇ定常領域またはその一部に連結されており、または、
（３）ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、およびＶＷＦ断片であり、ここで、ＸＴＥＮ配列は、Ｃ末端またはＮ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結されているか、または、ＦＶＩＩＩの１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入されており、および、ＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質は互いに関連している。
【００９２】
（１）ＸＴＥＮに連結されたＶｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）断片およびＦＶＩＩＩ
本発明は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質を目的とするものであり、ここで、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、互いに連結または関連している。本発明のキメラタンパク質の一部として、ＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦは、ＦＶＩＩＩタンパク質を関連し、それによって、内因性ＶＷＦとそのＦＶＩＩＩタンパク質の間の相互作用を妨害または抑制する。ある実施態様において、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の結合を妨害または抑制することができるＶＷＦ断片は、同時に、少なくとも１つのＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性を有することができる。ＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性の例としては、限定されないが、プロテアーゼ開裂およびＦＶＩＩＩ活性化からＦＶＩＩＩを保護すること、ならびに、ＦＶＩＩＩ重鎖および／または軽鎖を安定化させること、ならびに、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩの除去を妨害することが挙げられる。その結果として、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦクリアランス経路を介したＦＶＩＩＩタンパク質の除去を阻害し、それによって、身体からのＦＶＩＩＩの除去を減少させる。一部の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質と結合または関連し、および／または、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位を物理的にもしくは化学的に封鎖する。ＶＷＦ断片に関連したＦＶＩＩＩタンパク質は、そのようにして、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ断片と関連していないＦＶＩＩＩと比較して、循環系からさらにゆっくりと除去される。
【００９３】
１つの実施態様において、本発明は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質を目的とするものであり、ここで、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦ断片に連結されており（たとえば、（ａ１）Ｖ−Ｘまたは（ａ２）Ｘ−Ｖであり、ここで、ＶはＶＷＦ断片を含有し、ＸはＸＴＥＮ配列を含有する）、および、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に連結または関連している。他の実施態様において、ＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ配列は、リンカーまたはペプチド結合により連結されている（たとえば、（ａ３）Ｖ−Ｌ−Ｘまたは（ａ４）Ｘ−Ｌ−Ｖ）。リンカーは、凝固部位で開裂されることができる開裂可能なリンカー（たとえばトロンビン開裂可能なリンカー）であっても良い。他の実施態様において、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、およびＦＶＩＩＩタンパク質は、単一のポリペプチド鎖に配置される。さらに他の実施態様において、キメラタンパク質は２つのポリペプチド鎖を含有し、ここで第一の鎖はＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ配列を含有し、第二の鎖はＦＶＩＩＩタンパク質を含有する。さらに他の実施態様において、キメラタンパク質は３つのポリペプチド鎖を含有し、ここで第一の鎖はＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ配列を含有し、第二の鎖はＦＶＩＩＩの軽鎖を含有し、ならびに、第三の鎖はＦＶＩＩＩの重鎖を含有し、ここで、第一の鎖および第二の鎖は互いに関連づけられ（たとえば、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合））、第二の鎖と第三の鎖は互いに関連付けられている（たとえば、金属結合）。さらに他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦ断片のＮ末端またはＣ末端に連結されていても良く、または、ＶＷＦ断片の１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入されていても良い。
【００９４】
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、以下を含有する式を含有する：（ａ）Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩ、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ−Ｘ−Ｖ、
（ｃ）Ｖ−Ｘ：ＦＶＩＩＩ、
（ｄ）Ｘ−Ｖ：ＦＶＩＩＩ、
（ｅ）ＦＶＩＩＩ：Ｖ−Ｘ、
（ｆ）ＦＶＩＩＩ：Ｘ−Ｖ、または、
（ａ５）Ｘ−Ｖ−ＦＶＩＩＩ、
であり、ここで、ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し；
（−）はペプチド結合または１以上のアミノ酸を表し；および、
（：）は化学的関連または物理的関連である。１つの実施態様において、（：）は、化学的関連（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、（：）は２つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、Ｎ末端（左側）からＣ末端（右側）へと列記されている。たとえば、式Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩは、式ＮＨ２−Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩ−ＣＯＯＨを意味する。１つの実施態様において、本明細書に記述される式は、２つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。たとえば、式Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩはさらに、他で特定されない限り、ＶとＸの間のＶのＮ末端で、ＸとＦＶＩＩＩの間で、または、ＦＶＩＩＩのＣ末端で、任意の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン（−）はペプチド結合を示す。
【００９５】
他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、以下を含有する式を含有する：（ａ）Ｖ（Ｘ１）−Ｘ２−ＦＶＩＩＩ、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ−Ｘ２−Ｖ（Ｘ１）、
（ｃ）Ｖ（Ｘ１）：ＦＶＩＩＩ、
（ｄ）ＦＶＩＩＩ：Ｖ（Ｘ１）、または、
（ａ５）Ｘ２−Ｖ（Ｘ１）−ＦＶＩＩＩ、
であり、ここで、Ｖ（Ｘ１）はＶＷＦ断片および第一のＸＴＥＮ配列（Ｘ１）を含有し、ここで、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦ断片の１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入され、Ｘ２は１以上の任意選択的なＸＴＥＮ配列を含有し、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、
（−）はペプチド結合または１以上のアミノ酸を表し；および、
（：）は化学的関連または物理的関連である。
【００９６】
一部の実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｖ）第一の任意選択的なリンカー、および（ｖ）第二の任意選択的なリンカー、を含有するキメラタンパク質を目的とするものであり、ここで、ＸＴＥＮ配列は、リンカーにより、ＶＷＦ断片および／またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている。ある実施態様において、キメラタンパク質は、以下の式を含有する：
（ｂ１）Ｖ−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−ＦＶＩＩＩ、
（ｂ２）ＦＶＩＩＩ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｖ、
（ｂ３）Ｖ−Ｌ１−Ｘ：ＦＶＩＩＩ、
（ｂ４）Ｘ−Ｌ１−Ｖ：ＦＶＩＩＩ、
（ｂ５）ＦＶＩＩＩ：Ｖ−Ｌ１−Ｘ、
（ｂ６）ＦＶＩＩＩ：Ｘ−Ｌ１−Ｖ、
（ｂ７）Ｘ−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−ＦＶＩＩＩ、または、
（ｂ８）ＦＶＩＩＩ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｘ、
であり、ここで、ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し；
Ｌ１は第一の任意選択的なリンカー（たとえば、第一の開裂可能なリンカー）を含有し、Ｌ２は第二の任意選択的なリンカー（たとえば、第二の開裂可能なリンカー、または任意選択的なプロセッシング可能なリンカー）を含有し、
（−）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；および、
（：）は化学的関連または物理的関連である。１つの実施態様において、（：）は、化学的関連（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、（：）は２つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、Ｎ末端（左側）からＣ末端（右側）へと列記されている。たとえば、式（ｂ１）Ｖ−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−ＦＶＩＩＩは、式ＮＨ２−Ｖ−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−ＦＶＩＩＩ−ＣＯＯＨを意味する。１つの実施態様において、本明細書に記述される式は、２つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン（−）はペプチド結合を示す。
【００９７】
本発明の他の態様において、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子（たとえば、内因性ＶＷＦ）と相互作用しないＦＶＩＩＩキメラタンパク質が提示され、同時に、第二の半減期延長物質または、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の共有結合をもたらす部分（たとえば、Ｉｇ定常領域またはその一部）と組み合わせたＸＴＥＮ配列を用いた、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期の最大化が提示される。１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、および、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部（本明細書において、Ｆとも呼称される）、を含有し、ここで、（１）ＶＷＦ断片は、任意選択的なリンカー（たとえば開裂可能なリンカー）によりＸＴＥＮ配列に連結され、（２）ＶＷＦ断片は、追加の任意選択的なリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）によりＦＶＩＩＩタンパク質と関連、または連結されており、および、（３）Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部（Ｆ１または第一のＩｇ定常領域）、および、（ｖ）追加のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２または第二のＩｇ定常領域）を含有し、ここで、（１）ＶＷＦ断片は、任意選択的なリンカー（たとえば開裂可能なリンカー）によりＸＴＥＮ配列に連結され、（２）ＸＴＥＮ配列またはＶＷＦ断片は、Ｉｇ定常領域またはその一部に連結されており、（３）ＦＶＩＩＩは追加のＩｇ定常領域またはその一部に連結されており、および、（４）Ｉｇ定常領域またはその一部は、追加のＩｇ定常領域またはその一部と関連、または連結している。１つの実施態様において、２つのＩｇ定常領域またはその一部の間の関連または連結は、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）である。他の実施態様において、２つのＩｇ定常領域またはその一部の間の関連または連結は、プロセッシング可能なリンカーであり、ここで、当該プロセッシング可能なリンカーは、細胞内でプロテアーゼによってプロセッシングされる。たとえば、キメラタンパク質は、以下の式を含有する：
（ｇ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１：ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２；
（ｈ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ；
（ｉ）Ｆ−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ：ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２；
（ｊ）Ｆ−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ：Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ；
（ｋ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−ＦＶＩＩＩ−Ｌ３−Ｆ２；
（ｌ）Ｆ２−Ｌ３−ＦＶＩＩＩ−Ｌ４−Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ；
（ｍ）ＦＶＩＩＩ−Ｌ２−Ｆ２−Ｌ４−Ｖ−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−Ｆ１；または、
（ｎ）Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ２−ＦＶＩＩＩ、
であり、ここで、ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｌ１およびＬ３のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し、
Ｌ２は、任意選択的なリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）を含有し、
Ｌ４は、任意選択的なリンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）であり、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１は任意選択的なＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は任意選択的な追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
（−）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；および、
（：）は化学的関連または物理的関連である。
【００９８】
一部の実施態様において、本明細書に開示される任意の構築物または式中のＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＸＴＥＮ配列を含有し、ＸＴＥＮ配列のそれぞれは、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結される。ＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な例は、本明細書の別項に記述される。
【００９９】
１つの実施態様において、（：）は、化学的関連（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、（：）は２つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、Ｎ末端（左側）からＣ末端（右側）へと列記されている。たとえば、式（ｎ）Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ２−ＦＶＩＩＩは、式ＮＨ２−Ｆ１−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ２−ＦＶＩＩＩ−ＣＯＯＨを意味する。１つの実施態様において、本明細書に記述される式は、２つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン（−）はペプチド結合を示す。
【０１００】
１つの実施態様において、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結される、Ｉｇ定常領域またはその一部（場合によって、本明細書において、「Ｆ」または「Ｆ１」と示される）および追加のＩｇ定常領域またはその一部（場合によって、本明細書において、「Ｆ２」と示される）のいずれかまたは両方は、ＶＷＦ断片、ＦＶＩＩＩタンパク質またはその両方の半減期を延長させてもよい。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部（場合によって、本明細書において、「Ｆ」または「Ｆ１」と示される）および追加のＩｇ定常領域またはその一部（場合によって、本明細書において、「Ｆ２」と示される）のペアは、各々、ＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の非共有結合よりも強い結合をもたらし（すなわち、共有結合（たとえばジスルフィド結合）をもたらし）、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで、内因性ＶＷＦとＶＷＦ断片が置き換わることを防ぐ。Ｆ１またはＦ２は、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有してもよい。他の実施態様において、ＶＷＦ断片および／またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたＦ１およびＦ２のいずれか、または両方は、Ｆ１とＦ２の愛さに共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）を形成し、それによって、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を非常に近接させ、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の相互作用を抑制する。一部の実施態様において、Ｆ１とＦ２は同一であるか、または異なっている。Ｆ１およびＦ２の非限定的な例は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ヒンジドメイン、それらの任意の機能性断片、誘導体、またはアナログ、およびそれらの２以上の組み合わせからなる群から選択されてもよい。１つの実施態様において、Ｆ１、Ｆ２またはその両方は、少なくとも１つのＣＨ１ドメイン、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、少なくとも１つのＣＨ４ドメイン、またはその機能性断片、誘導体もしくはアナログを含有する。他の実施態様において、Ｆ１、Ｆ２またはその両方は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部、および、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部（たとえば、ヒンジ−ＣＨ２の方向で）を含む。他の実施態様において、Ｆ１、Ｆ２またはその両方は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部、および、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部（たとえば、ＣＨ２−ＣＨ３の方向で）を含む。その組み合わせの例としては、限定されないが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジドメイン（それらは、Ｆｃ領域（またはＦｃドメイン）としても知られる）（たとえば、Ｆ１に対する第一のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー、および、Ｆ２に対する第二のＦｃ領域または第二のＦｃＲｎ結合パートナー）が挙げられる。他の実施態様において、Ｆ１は、リンカーによりＶＷＦ断片に連結されており、および／または、Ｆ２はリンカーによりＦＶＩＩＩに連結されている。一部の実施態様において、Ｆ１および／またはＦ２は、ヒンジ領域を含有する、本質的にからなる、または、からなる。Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーの非限定的な追���例は、本明細書の別項に記述する。
【０１０１】
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、第一のポリペプチド鎖（Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）およびＶＷＦ断片とＸＴＥＮ配列の間の任意選択的なリンカーを含有するＶＷＦ断片、またはＸＴＥＮ配列または第一のＩｇ定常領域もしくはその一部を含有する、本質的にからなる、または、からなる）および、第二のポリペプチド鎖（ＦＶＩＩＩタンパク質および第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有する、本質的にからなる、または、からなる）の、２つのポリペプチド鎖を含有する。ＶＷＦ断片と第一のＩｇ定常領域もしくはその一部の間のリンカーは、凝固部位で開裂されることができる、開裂可能なリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）であっても良い。一部の実施態様において、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、互いに関連している。第一の鎖と第二の鎖の間の関連により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、内因性ＶＷＦと、ＶＷＦ断片を含有する第一の鎖の置換が妨げられる。１つの実施態様において、第一の鎖と第二の鎖の間の関連は、共有結合であってもよい。特定の実施態様において、共有結合はジスルフィド結合である。一部の実施態様において、第二の鎖のＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結された１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、本明細書に開示される少なくとも１つの挿入部位）に挿入される。本発明の非限定的な例は、本明細書の別項に記述される。
【０１０２】
他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、３つのポリペプチド鎖を含有し、ここで、第一のポリペプチド鎖は、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖を含有し、本質的にからなり、または、からなり、第二のポリペプチド鎖は第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖を含有し、本質的にからなり、または、からなり、および、第三のポリペプチド鎖は、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）およびＸＴＥＮ配列と第二のＩｇ定常領域もしくはその一部の間の任意選択的なリンカーまたはＶＷＦ断片とＸＴＥＮ配列の間の任意選択的なリンカーを含有し、本質的にからなり、または、からなる。第三の鎖のリンカーは、凝固部位（たとえば、トロンビン開裂部位）で開裂される開裂可能なリンカーであっても良い。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩの重鎖またはＦＶＩＩＩの軽鎖は、Ｎ末端またはＣ末端に連結されることができる、または、ＦＶＩＩＩ配列内の１以上の挿入部位内に挿入されることができる、１以上のＸＴＥＮ配列に連結されている。挿入部位の非限定的な例は、本明細書の別項に記述される。
【０１０３】
さらに他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、第一の鎖（ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖を含有する、本質的にからなる、または、からなる）および第二の鎖（ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）、第一のリンカー（たとえば、１以上の細胞内プロセッシング部位を含有する１以上のプロテアーゼ開裂部位を含有する、プロセッシング可能なリンカー）、ＶＷＦ断片、第二のリンカー（たとえば、トロンビン開裂可能なリンカー）、ＸＴＥＮ配列、および第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有する、本質的にからなる、または、からなる）を含有し、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖は、第一のＩｇ定常領域またはその一部に連結され、それはさらに第一のリンカーによりＶＷＦ断片に連結され、および、ここで、ＶＷＦ断片はＸＴＥＮ配列に連結され、それはさらに、第二のリンカーにより第二の定常領域またはその一部に連結されている。ある実施態様において、第一のリンカーはプロセッシング可能なリンカーであり、第二のリンカーは開裂可能なリンカーである。発現することで、キメラタンパク質は、プロセッシング可能なリンカーを開裂する細胞内プロセッシング酵素により開裂されることができ、それによって、キメラタンパク質は、３つのポリペプチド鎖を含有する、本質的にからなる、またはからなることができる。さらに、ＶＷＦ断片は、開裂可能なリンカーによって、凝固部位で開裂されることができる。
【０１０４】
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）、第一のリンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、第二のリンカー（たとえば、トロンビン開裂可能なリンカー）、および第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有する、１つのポリペプチド鎖を含有し、ここで、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質は、第一のＩｇ定常領域またはその一部に連結され、それはさらに、第一のリンカーによりＶＷＦ断片に連結され、そして、ＶＷＦ断片はＸＴＥＮ配列に連結され、それはさらに、第二のＩｇ定常領域またはその一部に連結されている。１つの実施態様において、ＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ配列は、第二のリンカーにより連結されている。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列および第二のＩｇ定常領域またはその一部は、第二のリンカーにより連結されている。他の実施態様において、第二の鎖はさらに第三のリンカーを含有する。それにより、一本鎖ポリペプチドは、第二のリンカーによりＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦ断片、および第三のリンカーにより第二のＩｇ定常領域またはその一部に連結されたＸＴＥＮを含有する。第二のリンカーおよび第三のリンカーは同じであっても異なっていても良い。１つの実施態様において、第一のリンカーはプロセッシング可能なリンカーである。他の実施態様において、第二のリンカーまたは第三のリンカーは、１または２の開裂可能な部位を含有する開裂可能なリンカーである。特定の実施態様において、第二のリンカーは、トロンビン開裂可能なリンカーである。本発明に有用なリンカーは、本明細書の別項に記述する。
【０１０５】
（２）ＦＶＩＩＩ、ＸＴＥＮおよびＦｃ
本発明のキメラタンパク質はまた、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列（第一の半減期伸長物質）、および、（ｉｉｉ）Ｉｇ定常領域またはその一部（第二の半減期伸長物質）を含有し、その中で、ＸＴＥＮ配列は任意選択的なリンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、追加の任意選択的なリンカーによりＩｇ定常領域またはその一部に連結されている。ＸＴＥＮ配列およびＩｇ定常領域またはその一部を共に用いて、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することができる。１つの実施態様において、キメラタンパク質は単量体である。他の実施態様において、キメラタンパク質は二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体）である。
【０１０６】
本発明はまた、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）Ｉｇ定常領域またはその一部（すなわち、第一のＩｇ定常領域またはその一部（ＦまたはＦ１））および、（ｉｖ）追加のＩｇ定常領域またはその一部（すなわち、第二のＩｇ定常領域またはその一部、Ｆ２）を含有するキメラタンパク質を目的とする。１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、Ｎ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結されているか、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入されており、ＦＶＩＩＩタンパク質は、第一のＩｇ定常領域またはその一部に連結されており、ならびに、第一のＩｇ定常領域またはその一部、および第二の定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーにより互いに関連、または連結されている。ある態様において、キメラタンパク質は、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含有する単量体−二量体ハイブリッドであり、ここで、第一のポリペプチド鎖は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、および第一のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、ならびに、第二のポリペプチド鎖は、ＦＶＩＩＩタンパク質の無い第二のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、本質的にからなり、またはからなり、ならびに、ここで、第一の鎖と第二の鎖は、互いに関連している。Ｉｇ定常領域またはその一部（たとえば第一のＦｃ領域）と、追加のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）の間の関連は、化学的関連または物理的関連である。ある実施態様において、化学的関連は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連は、非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）である。他の実施態様において、関連は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、関連はペプチド結合である。
【０１０７】
他の態様において、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、第一の定常領域またはその一部、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）および第二の定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドであり、ここで、一本鎖ポリペプチドは、細胞内酵素により、発現の後でプロセッシングされ、２つのポリペプチド鎖となる。
【０１０８】
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたＩｇ定常領域またはその一部（場合によって、「Ｆ」または「Ｆ１」と示される）は、ＸＴＥＮ配列と共に、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することができる。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部（ＦまたはＦ１）は、本明細書の別項に記述されるＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーである。
【０１０９】
他の実施態様において、第一のＩｇ定常領域もしくはその一部と関連または連結される、追加のＩｇ定常領域もしくはその一部（場合によって、Ｆ２または第二のＩｇ定常領域またはその一部と本明細書において示される）もまた、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することができる。他の実施態様において、第二のＩｇ定常領域またはその一部は（Ｆ２）は、第一のＩｇ定常領域またはその一部およびＸＴＥＮ配列と共に、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することができる。追加のＩｇ定常領域またはその一部は、本明細書の別項に記述されるＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーであってもよい。
【０１１０】
ある実施態様において、第一のＩｇ定常領域またはその一部と連結された、第二のＩｇ定常領域またはその一部はさらに、本明細書の別項に記述されるＶＷＦ断片および任意選択的なＸＴＥＮ配列に連結される。
【０１１１】
一部の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部（ＦもしくはＦ１または第一のＩｇ定常領域もしくはその一部）および、追加のＩｇ定常領域またはその一部（すなわち、第二のＩｇ定常領域もしくはその一部またはＦ２）のいずれか、または両方（本段落においては、Ｉｇ定常領域またはその一部として示される）としては、限定されないが、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ヒンジドメイン、それらの任意の機能性断片、誘導体、もしくはアナログ、またはそれらの２以上の組み合わせ、が挙げられる。１つの実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、少なくとも１つのＣＨ１ドメイン、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、少なくとも１つのＣＨ４ドメイン、またはその機能性断片、誘導体もしくはアナログを含有する。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部、および、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部（たとえば、ヒンジ−ＣＨ２の方向で）を含む。他の実施態様において、Ｉｇ定常ドメインまたはその一部は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部、および、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部（たとえば、ＣＨ２−ＣＨ３の方向で）を含む。
その組み合わせの例としては、限定されないが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジドメイン（それらは、Ｆｃ領域（またはＦｃドメイン）としても知られる）が挙げられる（たとえば、第一のＦｃ領域）。Ｉｇ定常領域またはその一部の追加例は、本明細書の別項に記述する。
【０１１２】
本発明のキメラタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩと比較し延長された半減期のＦＶＩＩＩタンパク質を有してもよい。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、野生型ＦＶＩＩＩよりも長く、延長されている。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
【０１１３】
（３）ＦＶＩＩＩ、ＸＴＥＮおよびＶＷＦ
１つの態様において、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、を含有し、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列に連結され、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦ断片と関連し、または連結されている。１つの実施態様において、本明細書に記述されるキメラタンパク質のＶＷＦ断片は、ＶＷＦクリアランス受容体に結合することができない。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質を１以上のプロテアーゼ開裂から保護すること、ＦＶＩＩＩタンパク質を活性化から保護すること、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖を安定化させること、または、１以上のスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩタンパク質の除去を妨げること、ができる。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦが、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位へと結合することを、妨害または抑制する。ＶＷＦ結合部位は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメインに位置していてもよく、または、Ａ３ドメインおよびＣ２ドメインの両方に位置していても良い。特定の実施態様において、ＶＷＦ結合部位は、配列番号２の、アミノ酸１６６９〜１６８９および／または２３０３〜２３３２に対応するアミノ酸配列を含有する。
【０１１４】
他の態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、および、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部、を含有し、ここで、ＸＴＥＮ配列はＣ末端またはＮ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、本明細書に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入され、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列に連結または関連し、および、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、ＶＷＦ断片、またはそれらの任意の組み合わせに連結される。本発明のキメラタンパク質に有用なＩｇ定常領域またはその一部は、本明細書の別項に記述される。１つの実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長させることができる。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、第一のＦｃ領域または第一のＦｃＲｎ結合パートナーを含有する。さらに他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質に連結される。さらに他の実施態様において、リンカーは、開裂可能なリンカーを含有する。キメラタンパク質は、一本鎖ポリペプチド、すなわち、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含有する単量体（すなわち、一本鎖）であってもよく、または、（ｉ）および（ｉｉ）を含有する第一の鎖と、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含有する第二の鎖を含有する、二本鎖ポリペプチドであっても良い。他の態様において、キメラタンパク質は、二量体（たとえば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）であある。１つの実施態様において、キメラタンパク質は、それぞれが（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含有する２つの鎖を含有する。
【０１１５】
ある実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部（場合によって、「Ｆ」、「第一のＩｇ定常領域またはその一部」または「Ｆ２」とも示される）、および、（ｖ）追加のＩｇ定常領域またはその一部（場合によって、「Ｆ２」または「第二のＩｇ定常領域またはその一部」とも示される）を含有し、ここで、（１）ＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端でＸＴＥＮ配列に連結、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、本明細書に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位）で挿入され、（２）ＸＴＥＮ配列またはＦＶＩＩＩタンパク質のいずれかは、Ｉｇ定常領域またはその一部に連結され、（３）ＶＷＦ断片は、第二のＩｇ定常領域またはその一部に連結され、および、（４）Ｉｇ定常領域またはその一部は、第二のＩｇ定常領域またはその一部と関連する。１つの実施態様において、ＦＶＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列に連結されたＩｇ定常領域またはその一部はさらに、リンカー（プロセッシング可能なリンカー）によりＶＷＦ断片に連結される。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質に有用な追加のＩｇ定常領域またはその一部はさらに、任意選択的なリンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）によりＦＶＩＩＩタンパク質またはＩｇ定常領域またはその一部に連結されてもよい。一部の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部、および追加のＩｇ定常領域またはその一部のペアは、それぞれがＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の非共有結合よりも強い結合（すなわち、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合））をもたらし、それによって、内因性ＶＷＦが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＶＷＦ断片と置き換わることを妨げる。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部、および、追加のＩｇ定常領域またはその一部のいずれか、または両方は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＶＷＦ断片の半減期を延長することができる。他の実施態様において、追加のＩｇ定常領域またはその一部は、第二のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する。キメラタンパク質中のＩｇ定常領域またはその一部、および、追加のＩｇ定常領域またはその一部は、同一または異なっている。
【０１１６】
ある実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部、および、追加のＩｇ定常領域またはその一部は、化学的関連または物理的関連により関連している。１つの実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は、少なくとも１つの非ペプチド結合である。ある実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は、共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、（：）は２つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害される。一部の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部、および、追加のＩｇ定常領域またはその一部の間の関連は、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）であっても良く、それにより、ＶＷＦ断片または、ＶＷＦ断片を含有するポリペプチドが、内因性ＶＷＦと置き換わることが妨げられる。すなわち、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの間の相互作用を妨げることにより、ＦＶＩＩＩタンパク質に対する半減期制限因子が取り除かれ、それによって、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、ＶＷＦタンパク質を有しないＦＶＩＩＩタンパク質、または野生型ＦＶＩＩＩと比較して、延長される。
【０１１７】
他の態様において、キメラタンパク質は、下記を含有する式を含有する：
（１）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１：Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２、
（２）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
（３）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）：Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２、
（４）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）；Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
（５）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２、
（６）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
（７）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ４−Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｆ２、または、（８）Ｆ１−Ｌ１−ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）−Ｌ４−Ｆ２−Ｌ３−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、
であり、ここで、ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）は、ＦＶＩＩＩタンパク質および１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、ここで、１以上のＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、本明細書に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入され、
Ｌ１、Ｌ２またはＬ３のそれぞれは、任意のリンカー（たとえば開裂可能なリンカー）を含有し、
Ｌ４は、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）であり、
Ｘ２は、１以上の任意選択的なＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１はＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は任意選択的な追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、および、
ＶはＶＷＦ断片を含有し、
（−）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり、および、
（：）は共有結合または非共有結合を含有する。１つの実施態様において、（：）は、化学的関連（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は、共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、（：）は２つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、Ｎ末端（左側）からＣ末端（右側）へと列記されている。たとえば、式Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩは、式ＮＨ２−Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩ−ＣＯＯＨを意味する。１つの実施態様において、本明細書に記述される式は、２つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。たとえば、式Ｖ−Ｘ−ＦＶＩＩＩはさらに、他で特定されない限り、ＶとＸの間のＶのＮ末端で、ＸとＦＶＩＩＩの間で、または、ＦＶＩＩＩのＣ末端で、任意の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン（−）はペプチド結合を示す。
【０１１８】
１つの態様において、キメラタンパク質は、２つのポリペプチド鎖、つまり、（Ａ）（ｉ）一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する第一の鎖であり、ここで、ＸＴＥＮ配列はＮ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、本明細書に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入され、および、ＸＴＥＮ配列がＣ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結される場合には、第一のＩｇ定常領域またはその一部はＸＴＥＮ配列に連結され、および、ＸＴＥＮ配列がＦＶＩＩＩタンパク質内に挿入される場合には、第一のＩｇ定常領域またはその一部はＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、ならびに、（Ｂ）（ｉｖ）Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｖ）リンカー、および、（ｖｉ）第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域または第二のＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する第二の鎖であり、ここで、ＶＷＦ断片はリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）に連結され、それはさらに第二のＩｇ定常領域またはその一部に連結され、ならびに、ここで、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖は、互いに関連（たとえば、ジスルフィド結合等の共有結合）する、を含有する。１つの実施態様において、リンカーは、本明細書の別項に記述される開裂可能なリンカーである（たとえば、トロンビン開裂可能なリンカー）。一部の実施態様において、第二の鎖は、（ｉｖ）および（ｖ）、または、（ｖ）および（ｖｉ）の間に１以上のＸＴＥＮ配列を含有する。
【０１１９】
キメラタンパク質は、（ｉ）一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域または第一のＦｃＲｎ結合パートナー）、（ｉｖ）第一のリンカー、（ｖ）Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｖｉ）第二のリンカー、（ｖｉｉ）第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域または第二のＦｃＲｎ結合パートナー）、を含有する１つのポリペプチド鎖を含有し、ここで、（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、その順で、または任意の順で、連結されている。１つの実施態様において、第一のリンカーは、発現後に細胞内でプロセッシングされ、または、開裂され、そして一本鎖ポリペプチドを２つのポリペプチド鎖にすることができる、プロセッシング可能なリンカーである。他の実施態様において、第二のリンカーは、本明細書に記述される開裂可能なリンカー（たとえば、トロンビン開裂可能なリンカー）である。本明細書において用いられるＸＴＥＮ配列は、任意選択的なリンカーにより、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結されてもよく、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）で挿入されても良い。
【０１２０】
ある態様において、キメラタンパク質は、（Ａ）互いに連結されている、（ｉ）ＦＶＩＩＩの重鎖および（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、を含有する第一のポリペプチド鎖、ならびに、（Ｂ）互いに連結されている、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖および（ｉｖ）第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域または第一のＦｃＲｎ結合パートナー）、を含有する第二のポリペプチド鎖、ならびに、（Ｃ）（ｖ）Ｄ´ドメインとＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｖｉ）リンカー、および、（ｖｉｉ）第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域または第二のＦｃＲｎ結合パートナー）、を含有する第三のポリペプチド鎖、の３つのポリペプチド鎖を含有し、ここで、第二の鎖は、第一の鎖と第三の鎖に関連している。１つの実施態様において、第一の鎖と第二の鎖の間の関連は、化学的関連または物理的関連である。たとえば、第一の鎖と第二の鎖の間の関連は、金属結合であっても良い。他の実施態様において、第二の鎖と第三の鎖の間の関連もまた、化学的関連または物理的関連（たとえば、共有結合または非共有結合等）である。ある実施態様において、第二の鎖と第三の間の関連は、２つのＩｇ定常領域またはその一部を介しており、および、ジスルフィド結合である。第二の鎖と第三の鎖の間の結合により、ＦＶＩＩＩタンパク質が内因性ＶＷＦと結合することが妨害または抑制され、それによって、ＶＷＦクリアランス経路によりＦＶＩＩＩタンパク質が除去されることを防ぐ。一部の実施態様において、リンカーは、宿主細胞における発現の後で、細胞内で開裂される、プロセッシング可能なリンカーである。本明細書で用いられるＸＴＥＮ配列は、任意選択的なリンカーにより、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入される。
【０１２１】
ある実施態様において、ＶＷＦ断片は、ペプチド結合またはリンカーにより、１以上のＸＴＥＮを含有するＦＶＩＩＩタンパク質に直接、連結される。ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質（１以上のＸＴＥＮが挿入され、または、直接連結（たとえば、ペプチド結合）またはリンカーを介して連結されている）の連結方法の１つとして、酵素的ライゲーション（たとえば、ソルターゼ）を用いても良い。たとえば、ソルターゼとは、カルボキシ末端選別シグナルを認識および開裂することにより、表面タンパク質を改変する、原核細胞の酵素の群を指す。ソルターゼ酵素の基質のほとんどに対し、認識シグナルは、ＬＰＸＴＧ（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−ａｎｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（配列番号５１）モチーフ、次いで、高度に疎水性の膜貫通型配列、次いで、塩基性残基（たとえば、アルギニン）のクラスターからなる。Ｔｈｒ残基を介した、ライゲーションパートナーのＣｙｓ残基活性部位への一過性の付着で、ＴｈｒとＧｌｙの間に開裂が発生し、次いで、細胞壁へタンパク質を共有結合的に付着させるペプチド転移が発生する。一部の実施態様において、ライゲーションパートナーは、Ｇｌｙ（ｎ）を含有する。他の実施態様において、キメラタンパク質はさらに、ソルターゼ認識モチーフを含有する。一部の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ソルターゼ介在ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質ライゲーションを用いて、挿入された、または連結された１以上のＸＴＥＮを含有するＦＶＩＩＩに付着する。
【０１２２】
１つの実施態様において、任意選択的なリンカーにより、ソルターゼ認識モチーフに連結されたＶＷＦ断片は、ソルターゼによりＧｌｙ（ｎ）に連結されたＦＶＩＩＩに融合されていてもよく、ここで、ｎは、任意の整数であってもよく、および、ここで、１以上のＸＴＥＮが、ＦＶＩＩＩタンパク質内に挿入または連結されていてもよい。ライゲーション構築物は、ＶＷＦ断片（構築物のＮ末端部分）および、１以上のＸＴＥＮが挿入または連結されているＦＶＩＩＩタンパク質（構築物のＣ末端部分）を含有し、ここで、ソルターゼ認識モチーフは、その間に挿入されている。他のライゲーション構築物は、ＶＷＦ断片（構築物のＮ末端部分）、リンカー、ソルターゼ認識モチーフ、および、１以上のＸＴＥＮが挿入または連結されているＦＶＩＩＩタンパク質（構築物のＣ末端部分）を含有する。他の実施態様において、任意選択的なリンカーによりソルターゼ認識モチーフに連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ソルターゼによりＧｌｙ（ｎ）に連結されたＶＷＦ断片に融合されていてもよく、ここで、ｎは、任意の整数である。得られたライゲーション構築物は、１以上のＸＴＥＮが挿入または連結されているＦＶＩＩＩタンパク質（構築物のＮ末端部分）、および、ＶＷＦ断片（構築物のＣ末端部分）を含有し、ここで、ソルターゼ認識モチーフは、その間に挿入されている。他の得られたライゲーション構築物は、１以上のＸＴＥＮが挿入または連結されているＦＶＩＩＩタンパク質（構築物のＮ末端部分）、リンカー、ソルターゼ認識モチーフ、およびＶＷＦ断片（構築物のＣ末端部分）を含有する。他の実施態様において、第一の任意選択的なリンカーによりソルターゼ認識モチーフに連結されたＶＷＦ断片は、第二の任意選択的なリンカーによりトロンビン開裂部位に連結された異種部分（たとえば、イムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ領域））に融合されていてもよい。得られた構築物は、ＶＷＦ断片（Ｎ末端部分）、第一のリンカー、ソルターゼ認識モチーフ、プロテアーゼ開裂部位、第二の任意選択的なリンカー、および異種部分を含有してもよい。
【０１２３】
一部の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質に関連している。ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の間の関連は、化学的関連または物理的関連であってもよい。化学的関連は、非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）であってもよい。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の関連は、２つの配列の間の物理的関連（たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質を有する配列と、ＶＷＦ断片を有する配列の間のさらなる関連によるもの）であり、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害される。
【０１２４】
内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質との相互作用をＶＷＦ断片が妨害または抑制することにより、本明細書に記述されるキメラタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ断片の無い対照キメラタンパク質と比較して、半減期が延長される。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片の無いＦＶＩＩＩタンパク質よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、延長される。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。特定の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＨｅｍＡマウスにおいて、少なくとも１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、延長される。
【０１２５】
Ａ）Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）断片
ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしてもまた知られる）は、血漿中に存在する大きな多量体糖タンパク質であり、内皮（バイベル・パラーデ（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）小体）、巨核球（血小板のα顆粒）および内皮下結合組織において、構造的に産生される。基礎となるＶＷＦ単量体は、２８１３アミノ酸のタンパク質である。すべての単量体には、Ｄ´／Ｄ３ドメイン（第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂ受容体、ヘパリン、および／または、おそらくコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（活性化された際に、その中のＲＧＤドメインが血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合する）、およびタンパク質のＣ末端の「システインノット」ドメイン（ＶＷＦが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、およびβヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）等の特定の機能を有する多くの特定ドメインが含有される。
【０１２６】
本明細書において「ＶＷＦ断片」という用語には、限定されないが、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を抑制することができる、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する機能性ＶＷＦ断片が含まれる。１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合する。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質状のＶＷＦ結合部位を妨害し、それにより、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦとの相互作用を抑制する。ＶＷＦ断片には、ＶＷＦのこれらの活性を保持する、誘導体、変異体、突然変異体、またはアナログが含まれる。
【０１２７】
ヒトＶＷＦの２８１３単量体アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０００５４３．２として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０００５５２．３として報告されている。ヒトＶＷＦのヌクレオチド配列は、配列番号１として指定されている。配列番号２は、配列番号１にコードされるアミノ酸配列である。ＶＷＦの各ドメインは、表１にリストアップされる。
【表１−１】
2018102323.tif 000002
【表１−２】
2018102323.tif 000003
【表１−３】
2018102323.tif 000004
【表１−４】
2018102323.tif 000005
【表１−５】
2018102323.tif 000006
【表１−６】
2018102323.tif 000007
【表１−７】
2018102323.tif 000008
【表１−８】
2018102323.tif 000009
【表１−９】
2018102323.tif 000010
【表１−１０】
2018102323.tif 000011
【表１−１１】
2018102323.tif 000012
【表１−１２】
2018102323.tif 000013
【表１−１３】
2018102323.tif 000014
【表１−１４】
2018102323.tif 000015
【０１２８】
本明細書において、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片であってもよく、ここで、ＶＷＦ断片は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合し、内因性ＶＷＦ（全長ＶＷＦ）のＦＶＩＩＩへの結合を抑制する。Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片はさらに、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１以上の断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＶＷＦドメインを含有しても良い。１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は、（１）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、または、（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´、Ｄ３およびＡ１ドメイン、もしくはそれらの断片、を含有する、本質的にからなる、または、からなる。本明細書に記述されるＶＷＦ断片は、ＶＷＦクリアランス受容体に結合する部位を含有しない。他の実施態様において、本明細書に記述されるＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４ではない。本発明のＶＷＦ断片は、ＶＷＦ断片に連結された、または融合された、任意の他の配列を含有しても良い。たとえば、本明細書に記述されるＶＷＦ断片は、シグナルペプチドをさらに含有してもよい。
【０１２９】
１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合、または関連する。ＦＶＩＩＩタンパク質に結合、または関連することにより、本発明のＶＷＦ断片は、プロテアーゼ開裂およびＦＶＩＩＩ活性化からＦＶＩＩＩを保護し、ＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖を安定化させ、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩの除去を妨害する。他の実施態様において、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩに結合または関連し、ＦＶＩＩＩがリン脂質および活性化されたプロテインＣに結合することを妨害または防ぐ。ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性の全長ＶＷＦとの結合を妨害または抑制することによって、本発明のＶＷＦ断片は、ＶＷＦクリアランス受容体によるＦＶＩＩＩの除去を減少させ、それによって、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長させる。ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期の延長は、ＶＦＶＩＩＩタンパク質に対するＷＦクリアランス受容体結合部位が欠落しているＶＷＦ断片の結合または関連によるものであり、および、ＶＷＦ断片によって、ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＶＷＦクリアランス受容体結合部位を含有する内因性ＶＷＦから隠蔽される、または保護されることによるものである。全長ＶＷＦ分子に含有されるＶＷＦクリアランス経路受容体結合部位を除去することにより、本発明の、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ二量体は、ＶＷＦクリアランス経路から隠蔽され、さらにＦＶＩＩＩの半減期が延長される。
【０１３０】
１つの実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有し、ここで、Ｄ´ドメインは、配列番号２のアミノ酸７６４〜８６６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であり、ここで、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩに結合することを妨害する。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有し、ここで、Ｄ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であり、ここで、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩに結合することを妨害する。一部の実施態様において、本明細書に記述されるＶＷＦ断片は、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一である、ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する、本質的にからなる、または、からなり、ここで、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩに結合することを妨害する。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸２３〜１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一である、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ´およびＤ３ドメインを含有する、本質的にからなる、または、からなり、ここで、ＷＦ断片は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩに結合することを妨害する。さらに他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦ断片に作動可能に連結されたシグナルペプチドをさらに含有する。
【０１３１】
一部の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、（１）Ｄ´Ｄ３ドメイン、Ｄ１Ｄ´Ｄ３ドメイン、Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメイン、または、Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメイン、および、（２）約１０アミノ酸までの追加のＶＷＦ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２５０由来の任意の配列）、約１５アミノ酸までの追加のＶＷＦ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２５５由来の任意の配列）、約２０アミノ酸までの追加のＶＷＦ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６０由来の任意の配列）、約２５アミノ酸までの追加のＶＷＦ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６５由来の任意の配列）、約３０アミノ酸までの追加のＶＷＦ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６０由来の任意の配列）から本質的になる、または、からなる。特定の実施態様において、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する、または本質的にからなる、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４ではなく、また、全長成熟型ＶＷＦでもない。一部の実施態様において、Ｄ１Ｄ２ドメインは、Ｄ´Ｄ３ドメインと、ｔｒａｎｓの状態で発現される。一部の実施態様において、Ｄ１Ｄ２ドメインは、Ｄ´Ｄ３ドメインとｃｉｓの状態で発現される。
【０１３２】
他の実施態様において、Ｄ１Ｄ２ドメインに連結されているＤ´Ｄ３ドメインを含有するＶＷＦ断片は、細胞内開裂部位（たとえば、ＰＡＣＥ（ｆｕｒｉｎ）またはＰＣ５による開裂部位）をさらに含有し、それにより、発現の際に、Ｄ´Ｄ３ドメインからＤ１Ｄ２ドメインが開裂される。細胞内開裂部位の非限定的な例は、本明細書の別項に記述される。
【０１３３】
さらに他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するが、（１）配列番号２のアミノ酸１２４１〜２８１３、（２）配列番号２のアミノ酸１２７０〜２８１３、（３）配列番号２のアミノ酸１２７１〜２８１３、（４）配列番号２のアミノ酸１２７２〜２８１３、（５）配列番号２のアミノ酸１２７３〜２８１３、（６）配列番号２のアミノ酸１２７４〜２８１３、および、それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含有しない。
【０１３４】
さらに他の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、Ｄ´ドメイン、Ｄ３ドメイン、およびＡ１ドメインに対応するアミノ酸配列を含有する、本質的にからなる、または、からなり、ここで、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１４７９と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であり、ここで、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩに結合することを妨害する。特定の実施態様において、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４ではない。
【０１３５】
一部の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するが、（１）Ａ１ドメイン、（２）Ａ２ドメイン、（３）Ａ３ドメイン、（４）Ｄ４ドメイン、（５）Ｂ１ドメイン、（６）Ｂ２ドメイン、（７）Ｂ３ドメイン、（８）Ｃ１ドメイン、（９）Ｃ２ドメイン、（１０）ＣＫドメイン、（１１）ＣＫ  ドメイン、および、Ｃ２ドメイン、（１２）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、および、Ｃ１ドメイン、（１３）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、（１４）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、（１５）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、および、Ｂ１ドメイン、（１６）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、および、Ｄ４ドメイン、（１７）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、および、Ａ３ドメイン、（１８）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ａ３ドメイン、および、Ａ２ドメイン、（１９）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ａ３ドメイン、Ａ２ドメイン、および、Ａ１ドメイン、および、（２０）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのＶＷＦドメインを含有しない。
【０１３６】
さらに他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、Ｄ´Ｄ３ドメインおよび１以上のドメインまたは分子を含有する。そのようなドメインまたは分子の例としては、限定されないが、Zhouret al., Blood published online April 6, 2012: DOI10.1182/blood-2012-01-405134に開示されているドメインおよび分子が挙げられる。たとえば、ＶＷＦ断片は、Ｄ
´Ｄ３ドメインおよび、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４Ｎモジュール、ＶＷＤ４モジュール、Ｃ８−４モジュール、ＴＩＬ−４モジュール、Ｃ１モジュール、Ｃ２モジュール、Ｃ３モジュール、Ｃ４モジュール、Ｃ５モジュール、Ｃ５モジュール、Ｃ６モジュールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１以上のドメインまたはモジュールを含有しても良い。
【０１３７】
さらに他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、異種部分に連結され、ここで、異種部分は、ＶＷＦ断片のＮ末端またはＣ末端に連結され、または、ＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入される。たとえば、ＶＷＦ断片の異種部分の挿入部位は、Ｄ´ドメイン、Ｄ３ドメインまたはその両方の中であってもよい。異種部分は、半減期延長物質であっても良い。
【０１３８】
ある実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は多量体（たとえば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体またはそれより高次の多量体）を形成する。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、１つのＶＷＦ断片のみを有する単量体である。一部の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、１以上のアミノ酸置換、欠失、付加または改変を有しても良い。１つの実施態様においてＶＷＦ断片は、そのＶＷＦ断片がジスルフィド結合を形成することができない、または二量体または多量体を形成することができないよう、アミノ酸置換、欠失、付加または改変を含有しても良い。他の実施態様において、アミノ酸置換は、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメイン内にある。特定の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、配列番号２の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と残基１１４２の両方に対応する残基で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する。少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型ＶＷＦにおいて天然には発生しない任意のアミノ酸であってもよい。たとえば、アミノ酸置換は、システイン以外の任意のアミノ酸（たとえば、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニン、またはヒスチジン）であっても良い。他の例において、アミノ酸置換は、ＶＷＦ断片が多量体を形成することを妨害または抑制する１以上のアミノ酸を有する。
【０１３９】
ある実施態様において、本発明に有用なＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩとの相互作用を改善するために（たとえば、ＦＶＩＩＩに対する結合アフィニティを改善するために）さらに改変されていても良い。非限定的な例として、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４に対応する残基でセリン残基を含有し、配列番号２のアミノ酸７７３に対応する残基でリシン残基を含有する。残基７６４および／または残基７７３は、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦ断片の結合アフィニティに寄与することができる。他の実施態様において、本発明に有用なＶＷＦ断片は、他の改変（たとえば、タンパク質は、ペグ化、グリコシル化、ヘシル化、またはポリシアル化）を有しても良い。
【０１４０】
Ｂ）ＸＴＥＮ配列
本明細書において、「ＸＴＥＮ配列」とは、主に小さな親水性アミノ酸から構成される、天然には存在せず、実質的に非反復性の配列を有し、生理学的条件下で低次構造を有する、または二次構造もしくは三次構造を有さない配列を有する、伸長された長さのポリペプチドを指す。キメラタンパク質のパートナーとして、ＸＴＥＮは、キメラタンパク質の作製のために本発明のＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩ配列に連結された際、ある所望の薬物動態特性、物理化学特性、および薬剤特性をもたらす、担体としての役割を果たすことができる。そのような所望の特性としては、限定されないが、薬物動態パラメーターおよび可溶性の特徴の増強が挙げられる。本明細書において、「ＸＴＥＮ」は、たとえば、抗体、または、一本鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のＦｃ断片等の抗体断片を具体的に除外する。
【０１４１】
一部の実施態様において、本発明のＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００アミノ酸残基よりも大きいアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある実施態様において、ＸＴＥＮは、約２０〜約３０００アミノ酸残基、約３０〜約２５００アミノ酸残基、約４０〜約２０００アミノ酸残基、約５０〜約１５００アミノ酸残基、約６０〜約１０００アミノ酸残基、約７０〜約９００アミノ酸残基、約８０〜約８００アミノ酸残基、約９０〜約７００アミノ酸残基、約１００〜約６００アミノ酸残基、約１１０〜約５００アミノ酸残基、または約１２０〜約４００アミノ酸残基、よりも大きいアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドである。
【０１４２】
本発明のＸＴＥＮ配列は、９〜１４アミノ酸残基のモチーフ配列、または、配列モチーフに対して少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％同一であるアミノ酸配列を１つ以上、含有してもよく、ここで、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択されるアミノ酸のうち４〜６のタイプを含有する、本質的にからなる、またはからなる（ＵＳ２０１０−０２３９５５４  Ａ１を参照のこと）。
【０１４３】
一部の実施態様において、ＸＴＥＮは、配列の約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％が、ファミリー配列となる、表２Ａから選択される単一モチーフファミリーから選択される、非反復配列の複数の単位からなる、非反復配列モチーフを含有する。本明細書において、「ファミリー」という用語は、ＸＴＥＮが、表２Ａからの単一モチーフカテゴリーからのみ選択されるモチーフ（すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、または、ＢＤ  ＸＴＥＮ）を有すること、および、ファミリーモチーフ由来ではない、ＸＴＥＮ中の他の任意のアミノ酸は、必要とされる特性（たとえば、コードヌクレオチドによる制限酵素部位の組み込み、開裂配列の組み込みを可能とするため、または、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦへの連結をより良いものとするため）を得るために選択されること、を意味する。ＸＴＥＮファミリーの一部の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの非反復配列モチーフの複数の単位を含有し、得られたＸＴＥＮ配列は、上述の相同性の範囲を示す。他の実施態様において、ＸＴＥＮは、表２Ａのモチーフファミリーのうちの２以上由来のモチーフ配列の複数の単位を含有する。これらの配列は、所望される物理的／化学的特性（正味荷電、親水性、二次構造の欠落、または、モチーフのアミノ酸組成による反復性の欠落等の特性を含む）を得るために選択されても良い（下記により詳細に記述される）。本段落の上述の実施態様において、ＸＴＥＮに組み込まれるモチーフは、約３６〜約３０００アミノ酸残基のＸＴＥＮを得るために本明細書に記述される方法を用いて選択およびアセンブリされてもよい。
【表２−１】
2018102323.tif 000016
【表２−２】
2018102323.tif 000017
【０１４４】
ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦへの挿入または連結のために、様々な長さを有しても良い。１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列（複数含む）の長さは、融合タンパク質中で得られる特性または機能に基づいて選択される。意図される特性または機能に基づいて、ＸＴＥＮは、短い、もしくは中間の長さの配列、または、担体として役に立ち得るより長い配列であってもよい。ある実施態様において、ＸＴＥＮは、約６〜約９９アミノ酸残基の短いセグメント、約１００〜約３９９アミノ酸残基の中間の長さのセグメント、および約４００〜１０００および約３０００アミノ酸残基までの、より長いセグメントを含有してもよい。ゆえに、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩに連結された、または挿入されたＸＴＥＮは、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約１４４、約２８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約８６４、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００の長さ、または、約３０００までの長さのアミノ酸残基を有しても良い。他の実施態様において、ＸＴＥＮは、約６〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、約４００〜約５００、約５００〜約９００、約９００〜１５００、約１５００〜２０００、または、約２０００〜約３０００のアミノ酸残基の長さである。ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦに連結された、または挿入されたＸＴＥＮの正確な長さは、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦの活性に悪い影響を与えることなく、変化することができる。１つの実施態様において、本明細書に用いられる１つ以上のＸＴＥＮは、３６アミノ酸、４２アミノ酸、７２アミノ酸、１４４アミノ酸、２８８アミノ酸、５７６アミノ酸、または８６４アミノ酸の長さを有し、ＸＴＥＮファミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、または、ＢＤのうちの１つ以上から選択されてもよい。
【０１４５】
一部の実施態様において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、  ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、およびＡＧ２００４からなる群から選択される配列に対し、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である（ＵＳ  ２０１０−０２３９５５４  Ａ１を参照のこと）。
【０１４６】
１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２（配列番号３６）、ＡＥ７２（配列番号１２７）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号１２８）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号１２９）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号１３０）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号１３１）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号１３３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号１３４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号１３５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号１３６）、ＡＥ８６４（配列番号４３）、ＡＥ５７６（配列番号４１）、ＡＥ２８８（配列番号３９）、ＡＥ２８８＿２（配列番号１３７）、ＡＥ１４４（配列番号３７）、ＡＧ８６４（配列番号４４）、ＡＧ５７６（配列番号４２）、ＡＧ２８８（配列番号４０）、ＡＧ１４４（配列番号３８）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列に対し、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２（配列番号３６）、ＡＥ７２（配列番号１２７）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号１２８）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号１２９）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号１３０）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号１３１）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号１３３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号１３４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号１３５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号１３６）、ＡＥ８６４（配列番号４３）、ＡＥ５７６（配列番号４１）、ＡＥ２８８（配列番号３９）、ＡＥ２８８＿２（配列番号１３７）、ＡＥ１４４（配列番号３７）、ＡＧ８６４（配列番号４４）、ＡＧ５７６（配列番号４２）、ＡＧ２８８（配列番号４０）、ＡＧ１４４（配列番号３８）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ２８８である。本発明の任意のＸＴＥＮ配列に対するアミノ酸配列を、表２Ｂに示す。
【表２−３】
2018102323.tif 000018
【表２−４】
2018102323.tif 000019
【表２−５】
2018102323.tif 000020
【表２−６】
2018102323.tif 000021
【表２−７】
2018102323.tif 000022
【０１４７】
さらなる実施態様において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、本発明のキメラタンパク質の物理的特性または化学的特性（たとえば、薬物動態的な）に影響を与える。本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、以下の有益な特性のうちの１以上を示しうる：配座柔軟性、水溶解度の増強、高度なプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳類受容体に対する低結合性、または、流体力学的（またはストークス（Ｓｔｏｋｅｓ））半径の増加。特定の実施態様において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたＸＴＥＮ配列は、たとえば半減期の延長または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加等の薬物動態的特性を増加させ、それにより、本明細書に記述されるキメラタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩと比較して、長い期間、ｉｎ  ｖｉｖｏに留まることとなる。さらなる実施態様において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、たとえば半減期の延長または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加等の薬物動態的特性を増加させ、それにより、ＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩと比較して、長い期間、ｉｎ  ｖｉｖｏに留まることとなる。
【０１４８】
様々な方法およびアッセイを用いて、ＸＴＥＮ配列を含有するタンパク質の物理的／化学的特性を測定することができる。そのような方法としては、限定されないが、分析的遠心、ＥＰＲ、ＨＰＬＣイオン交換、ＨＰＬＣサイズ排除、ＨＰＬＣ逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、屈折率測定、およびＵＶ／可視光分光法が挙げられる。さらなる方法は、Amauet al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006)に開示されている。
【０１４９】
本発明に従い用いることができるＸＴＥＮ配列のさらなる例は、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４  Ａ１号、第２０１０／０３２３９５６  Ａ１号、第２０１１／００４６０６０  Ａ１号、第２０１１／００４６０６１  Ａ１号、第２０１１／００７７１９９  Ａ１号、もしくは、第２０１１／０１７２１４６  Ａ１号、または、国際特許出願公開ＷＯ２０１００９１１２２  Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２  Ａ２、ＷＯ２０１０１４４５０８  Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２８  Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９  Ａ１、または、ＷＯ２０１１０２８３４４  Ａ２に開示されている。
【０１５０】
Ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質
本明細書に用いられる「ＦＶＩＩＩタンパク質」とは、他で特定されない限り、凝固系におけるその通常の役割において、機能的であるＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。ＦＶＩＩＩタンパク質という用語には、凝固系における全長の野生型第ＶＩＩＩ因子の機能を保持する、その機能性断片、変異体、アナログまたは誘導体が含まれる。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、ＦＶＩＩＩポリペプチド（またはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと相互交換可能に用いられる。ＦＶＩＩＩ機能の例としては、限定されないが、凝固系を活性化する能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、または、Ｃａ２＋およびリン脂質の存在下で第ＩＸ因子とテナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）複合体を形成し、それによって第Ｘ因子を活性化形態第Ｘａ因子へと転換させる能力、が挙げられる。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスＦＶＩＩＩタンパク質であっても良い。さらに、ヒトのＦＶＩＩＩと他種のＦＶＩＩＩを比較することにより、その機能のために必要とされる可能性がある、保存残基が特定されている（Cameronet al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US6,251,632）。
【０１５１】
凝固システムの機能を評価するための多くの検証が利用可能である：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）テスト、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）テスト（ＩＮＲを測定するためにも用いられる）、フィブリノーゲン検証（多くの場合、Ｃｌａｕｓｓ法による）、血小板計数、血小板機能検証（多くの場合、ＰＦＡ−１００）、ＴＣＴ、出血時間、混合テスト（元となる血漿が正常な血漿と混合された場合には、異常性が補正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ−二量体、遺伝的テスト（たとえば、第Ｘ因子Ｌｅｉｄｅｎ、プロトロンビン変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセルヘビ毒時間（ｄｉｌｕｔｅ  Ｒｕｓｓｅｌｌ‘ｓ  ｖｉｐｅｒ
ｖｅｎｏｍ  ｔｉｍｅ、ｄＲＶＶＴ）、混合血小板機能テスト、トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、たとえば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、または真性グロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。
【０１５２】
ａＰＴＴテストは、「内因性」凝固経路（接触活性化経路とも呼称される）および共通凝固経路の両方の有効性を測定する、性能の指標である。このテストは、市販の遺伝子組み換え凝固因子（たとえば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ）の凝固活性を測定するために普遍的に用いられている。これを、外因経路を測定する、プロトロンビン時間（ＰＴ）と組み合わせて用いる。
【０１５３】
ＲＯＴＥＭ分析により、全体的な止血動態に関する情報が得られる：凝固時間、凝固形成、凝固安定性および溶解。トロンボエラストメトリーにおける異なるパラメーターは、血漿凝固システム、血小板機能、線維素溶解、またはこれらの相互作用に影響を与える多くの因子の活性に依存している。このアッセイにより、二次止血の全体的な概観が得られる。
【０１５４】
ＦＶＩＩＩポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列は公知であり、多くの機能性断片、変異体および改変体が存在する。ヒトＦＶＩＩＩ配列（全長）の例を以下に示す。
【表３−１】
2018102323.tif 000023
【表３−２】
2018102323.tif 000024
【０１５５】
【表４−１】
2018102323.tif 000025
【表４−２】
2018102323.tif 000026
【表４−３】
2018102323.tif 000027
【表４−４】
2018102323.tif 000028
【表４−５】
2018102323.tif 000029
【０１５６】
ＦＶＩＩＩポリペプチドには、全長ＦＶＩＩＩ、全長ＦＶＩＩＩからＮ末端のＭｅｔを引いたもの、成熟型ＦＶＩＩＩ（シグナルペプチドを引いたもの）、Ｎ末端にＭｅｔを付加した成熟型ＦＶＩＩＩ、および／または、Ｂドメインのすべて、または部分的に欠損したＢドメインを有するＦＶＩＩＩが含まれる。ある実施態様において、ＦＶＩＩＩ変異体には、Ｂドメイン欠損（部分的または全ての欠損のいずれか）が含まれる。
【０１５７】
天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩの配列は、配列番号４として示されている。天然型ＦＶＩＩＩタンパク質は、以下の式を有する：Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２、ここで、Ａ１、Ａ２およびＡ３は構造的に関連した「Ａドメイン」であり、Ｂは、「Ｂドメイン」であり、Ｃ１およびＣ２は、構造的に関連した「Ｃドメイン」であり、ならびに、ａ１、ａ２およびａ３は、酸性スペーサー領域である。配列番号４の一次アミノ酸配列の位置に関して、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１ドメインは、Ａｌａ１から、およそＡｒｇ３３６にわたり、ａ１スペーサー領域は、およそＭｅｔ３３７から、およそＶａｌ３７４にわたり、Ａ２ドメインは、およそＡｌａ３７５から、およそＴｙｒ７１９にわたり、ａ２スペーサー領域は、およそＧｌｕ７２０から、およそＡｒｇ７４０にわたり、Ｂドメインは、およそＳｅｒ７４１から、およそＡｒｇ１６４８にわたり、ａ３スペーサー領域は、およそＧｌｕ１６４９から、およそＡｒｇ１６８９にわたり、Ａ３ドメインは、およそＳｅｒ１６９０から、およそＬｅｕ２０２５にわたり、Ｃ１ドメインは、およそＧｌｙ２０２６から、およそＡｓｎ２０７２にわたり、そして、Ｃ２ドメインは、およそＳｅｒ２０７３から、およそＴｙｒ２３３２にわたる。特定のタンパク質溶解性の開裂部位以外の、ＦＶＩＩＩのドメインおよび領域の間の境界の位置の指定は、参照文献ごとに変化しうる。本明細書に記述される境界は、それゆえ、「およそ」という用語を用いることにより、近似値として指定されている。
【０１５８】
ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子は単離され、哺乳類細胞中で発現されている（Toole, J. J., et
al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier,J., et al., Nature 312:326-330(1984); Wood, W. I., et al., Nature312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al.,Nature 312:337-342 (1984)；ＷＯ８７／０４１８７；ＷＯ８８／０８０３５；ＷＯ８８／０３５５８；および、米国特許第４，７５７，００６号）。ＦＶＩＩＩアミノ酸配列は、米国特許第４，９６５，１９９号において示されるように、ｃＤＮＡから推定されている。さらに、部分的Ｂドメイン欠損、または完全Ｂドメイン欠損したＦＶＩＩＩは、米国特許第４，９９４，３７１号および第４，８６８，１１２号において示されている。一部の実施態様において、ヒトＦＶＩＩＩ  Ｂドメインは、ヒト第Ｖ因子のＢドメインと置換されている（米国特許第５，００４，８０３号）。ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、米国特許出願公開第２００５／０１００９９０号の配列番号４および５に示されている。
【０１５９】
ブタＦＶＩＩＩの配列は、Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:5939-5942(1986)、に公開されている。さらに、ブタ脾臓ｃＤＮＡライブラリ由来のＦＶＩ
ＩＩ配列のＰＣＲ増幅から得られた、完全ブタｃＤＮＡ配列は、Healey, J. F., et al.,
Blood 88:4209-4214 (1996)、に報告されている。すべてのドメイン、すべてのサブユニット、および特定のアミノ酸配列の置換を有するハイブリッドのヒト／ブタＦＶＩＩＩは、LollarおよびRungeによる米国特許第５，３６４，７７１号およびＷＯ９３／２００９
３に開示されている。さらに最近になって、ブタＦＶＩＩＩのＡ１ドメインおよびＡ２ドメインのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列、および、ブタＡ１および／またはＡ２ドメインが、対応するヒトのドメインで置換されたキメラＦＶＩＩＩが、ＷＯ９４／１１５０３に報告されている。米国特許第５，８５９，２０４号（Ｌｏｌｌａr,J. S.）もまた、ブタｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を開示している。米国特許第６，４５８，５６３号は、Ｂドメイン欠損ブタＦＶＩＩＩを開示している。
【０１６０】
米国特許第５，８５９，２０４号（Lollar, J. S.）は、抗原性および免疫反応性が減
少したＦＶＩＩＩの機能的変異体を報告している。米国特許第６，３７６，４６３号（Lollar, J. S.）もまた、免疫反応性が減少したＦＶＩＩＩの変異体を報告している。米国
特許出願公開第２００５／０１００９９０号（Saenko et al.）は、ＦＶＩＩＩのＡ２ド
メインにおける機能性変異を報告している。
【０１６１】
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩ（または、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分）は、配列番号６のアミノ酸１〜１４３８、または、配列番号４のアミノ酸１〜２３３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配列は伴わない）に対して、または、配列番号３のアミノ酸１〜１９および配列番号６のアミノ酸１〜１４３８のＦＶＩＩＩアミノ酸配列に対して、または、配列番号３のアミノ酸１〜１９および配列番号４のアミノ酸１〜２３３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配列を伴う）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であってもよく、ここで、ＦＶＩＩＩは、凝固活性（たとえば、補因子として第ＩＸ因子を活性化し、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子へと転換させる）を有している。ＦＶＩＩＩ（または、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分）は、配列番号６のアミノ酸１〜１４３８、または、配列番号４のアミノ酸１〜２３３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配列を伴わない）と同一であってもよい。ＦＶＩＩＩはさらに、シグナル配列を含有してもよい。
【０１６２】
本明細書において、ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は、内部アミノ酸配列の同一性およびタンパク質溶解性開裂の部位（たとえば、全長ヒトＦＶＩＩＩのＳｅｒ７４１−Ａｒｇ１６４８残基）により定義づけられる、当分野公知のＢドメインと同一である。他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、以下のアミノ酸残基により定義づけられる：Ａ１、残基Ａｌａ１−Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３−Ａｒｇ７４０；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０−Ａｓｎ２０１９；Ｃ１、残基Ｌｙｓ２０２０−Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列には、残基Ｓｅｒ１６９０−Ｔｙｒ２３３２が含有される。残りの配列、つまり、残基Ｇｌｕ１６４９−Ａｒｇ１６８９は、通常、ａ３酸性領域と呼ばれる。ブタ、マウスおよびイヌＦＶＩＩＩに対する、Ｂドメインを含む、全てのドメインに対する境界の位置は、当分野に公知である。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩのＢドメインは欠損している（Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子、または、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）であり、表５の配列の第ＶＩＩＩ部分と同じ配列を有している（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの重鎖は、二重下線。Ｂドメインはイタリック体。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ軽鎖は標準文字で表されている）。表５（配列番号７）をコードするヌクレオチド配列は、表６に示す。
【表５−１】
2018102323.tif 000030
【表５−２】
2018102323.tif 000031
【０１６３】
【表６−１】
2018102323.tif 000032
【表６−２】
2018102323.tif 000033
【表６−３】
2018102323.tif 000034
【０１６４】
「Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ」は、米国特許第６，３１６，２２６号、第６，３４６，５１３号、第７，０４１，６３５号、第５，７８９，２０３号、第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、第６，２２８，６２０号、第５，９７２，８８５号、第６，０４８，７２０号、第５，５４３，５０２号、第５，６１０，２７８号、第５，１７１，８４４号、第５，１１２，９５０号、第４，８６８，１１２号、および、第６，４５８，５６３号に開示されている、全欠損または部分欠損を有していても良い。一部の実施態様において、本発明のＢドメイン欠損ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６，３１６，２２６号（または米国特許第６，３４６，５１３号）の４段落目、４行目〜５段落目、２８行目および実施例１〜５に開示されている欠損のうちの任意の１つを含有する。他の実施態様において、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子は、Ｓ７４３／Ｑ１６３８  Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子（ＳＱ  ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）（たとえば、配列番号４の、アミノ酸７４４〜１６３７の欠損を有する第ＶＩＩＩ因子、たとえば、アミノ酸１〜７４３およびアミノ酸１６３８〜２３３２を有する第ＶＩＩＩ因子、すなわち、配列番号６）である。一部の実施態様において、本発明のＢドメイン欠損ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，２０３号、（または、米国特許第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、および、第６，２２８，６２０号）の２段落目、２６〜５１行目および実施例５〜８に開示されている欠損を有する。一部の実施態様において、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２，８８５号の１段落目、２５行目〜２段落目、４０行目に開示される欠損；米国特許第６，０４８，７２０号の６段落目、１−２２行目および実施例１に開示される欠損；米国特許第５，５４３，５０２号の２段落目、１７−４６行目に開示される欠損；米国特許第５，１７１，８４４号の４段落目、２２行目〜５段落目、３６行目に開示される欠損；米国特許第５，１１２，９５０号の２段落目、５５−６８行目、図２および実施例１に開示される欠損；米国特許第４，８６８，１１２号の２段落目、２行目〜１９段落目、２１行目および表２に開示される欠損；米国特許第７，０４１，６３５号の２段落目、１行目〜３段落目、１９行目、３段落目、４０行目〜４段落目、６７行目、７段落目、４３行目〜８段落目、２６行目、および、１１段落目、５行目〜１３段落目、３９行目に開示される欠損；または、米国特許第６，４５８，５６３号の４段落目、２５−５３行目に開示される欠損を有する。一部の実施態様において、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのほとんどを欠損するが、ＷＯ９１／０９１２２に開示されるように、一次翻訳産物の２つのポリペプチド鎖への、ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質溶解性プロセッシングにとって必須である、Ｂドメインのアミノ末端配列を含有する。一部の実施態様において、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩは、アミノ酸７４７〜１６３８の欠損（すなわち、実質的にＢドメインの完全な欠損）を伴って、構成される。HoebenR.C., et al. J. Biol. Chem. 265
(13): 7318-7323 (1990)。Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子はまた、ＦＶＩＩＩのアミノ
酸７７１−１６６６または、アミノ酸８６８−１５６２の欠損を含有しても良い。Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4):301-6 (1988)。本発明の一部である、さらなるＢド
メインの欠損としては、以下が挙げられる：アミノ酸９８２〜１５６２、または、７６０〜１６３９の欠損 (Toole et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83,5939-5942))、７９７〜１５６２の欠損(Eaton, et al.Biochemistry(1986) 25:8343-8347))、７
４１〜１６４６の欠損(Kaufman (ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８７／０４１８７））、７４７〜１５６０の欠損(Sarver, et al., DNA(1987) 6:553-564))、７４１〜１６４８の
欠損（Pasek（ＰＣＴ国際特許出願８８／００８３１))、または、８１６〜１５９８、も
しくは、７４１〜１６４８の欠損 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988)、欧州特許第２９５５９７号))。他の実施態様において、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩとしては、１以上のＮ結合型グリコシル化部位（たとえば、残基７５７、７８４、８２８、９００、９６３、または、任意選択的に、９４３（全長ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸配列に対応している））の１つ以上を保持するＢドメインの断片を含有するＦＶＩＩＩポリペプチドが挙げられる。Ｂドメイン断片の例としては、Miao,H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda,A, et al., J. Thromb.Haemost. 6: 1352-1359 (2008)、および、Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9:2235-2242 (2011)に開示されている、Ｂドメインの２２６アミノ酸または１６３アミノ酸が挙げられる（すなわち、Ｂドメインの最初の２２６アミノ酸、または１６３アミノ酸が保持されている）。さらに他の実施態様において、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩはさらに、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を改善するために、残基３０９の位置で点変異（ＰｈｅからＳｅｒへの）を含有する。Miao,H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)を参照のこと。さらに他の実施態様において、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩには、Ｂドメインの一部を含有するが、１以上のｆｕｒｉｎ開裂部位（たとえば、Ａｒｇ１３１３およびＡｒｇ１６４８）を含有しないＦＶＩＩＩポリペプチドが含まれる。Pipe,S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)を参照のこと。前述の各
欠損は、任意のＦＶＩＩＩ配列において作製されうる。
【０１６５】
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩは、部分的なＢドメインを有する。一部の実施態様において、部分的なＢドメインを有するＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩ１９８（配列番号８９）である。ＦＶＩＩＩ１９８は、一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ分子−２２６Ｎ６を含有する部分的Ｂドメインである。２２６は、ＦＶＩＩＩ  ＢドメインのＮ末端２２６アミノ酸を表し、Ｎ６は、Ｂドメインの６つのＮグリコシル化部位を表す。
【０１６６】
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩは、（全長第ＶＩＩＩ因子、または配列番号４の）アミノ酸１６４８のアルギニンのすぐ後で、（Ｓ７４３／Ｑ１６３８  Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子または配列番号６の）アミノ酸７５４のアルギニンのすぐ後で、または、（他の変異体の）対応するアルギニン残基のすぐ後で、開裂され、それによって、重鎖および軽鎖が得られる。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩは、金属イオン介在非共有結合により連結、または関連している、重鎖および軽鎖を含有する。
【０１６７】
他の実施態様において、ＦＶＩＩＩは、（全長第ＦＶＩＩＩ因子、または配列番号４の）アミノ酸１６４８のアルギニンのすぐ後で、（Ｓ７４３／Ｑ１６３８  Ｂドメイン欠損第ＦＶＩＩＩ因子または配列番号６の）アミノ酸７５４のアルギニンのすぐ後で、または、（他の変異体の）対応するアルギニン残基のすぐ後で、開裂されていない、一本鎖ＦＶＩＩＩである。一本鎖ＦＶＩＩＩは、１以上のアミノ酸置換を含有してもよい。１つの実施態様において、アミノ酸置換は、全長成熟型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号４）の残基１６４８、残基１６４５、もしくはその両方に対応する残基、または、ＳＱ  ＢＤＤ  第ＶＩＩＩ因子（配列番号６）の残基７５４、残基７５１、またはその両方に対応する残基にある。アミノ酸置換は、アルギニン以外の任意のアミノ酸（たとえば、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、オルニチン、ピロリシン、またはタウリン）であっても良い。
【０１６８】
ＦＶＩＩＩはさらに、トロンビンにより開裂され、その後、ＦＶＩＩＩａとして活性化され、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の補因子としての役割を果たしてもよい。活性化ＦＶＩＩＩと活性化ＦＩＸは共に、Ｘａｓｅ複合体を形成し、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）へと転換する。活性化に対し、ＦＶＩＩＩは、３つのアルギニン残基（アミノ酸３７２、７４０および１６８９（Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸３７２、７４０、および７９５に相当））の後でトロンビンにより開裂され、その開裂により、５０ｋＤａのＡ１、４３ｋＤａのＡ２、および７３ｋＤａのＡ３−Ｃ１−Ｃ２鎖を有するＦＶＩＩＩａが産生される。１つの実施態様において、本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、非活性のＦＶＩＩＩである。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、活性化ＦＶＩＩＩである。
【０１６９】
ＶＷＦ断片に連結された、または関連するＦＶＩＩＩポリペプチドを有するタンパク質は、配列番号４または６に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一である配列を含有しても良く、ここで、その配列は、ＦＶＩＩＩ凝固活性（たとえば、補因子として第ＩＸ因子を活性化し、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）へと転換させる）を有する。
【０１７０】
「ハイブリッド」または「キメラ」ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書において、第一のポリペプチド鎖（たとえば、第一のＩｇ定常領域またはその一部に任意選択的に融合されたＶＷＦ断片）と、第二のポリペプチド鎖（たとえば、第二のＩｇ定常領域またはその一部に任意選択的に融合されたＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩであり、それによって、ヘテロ二量体を形成する）の組み合わせを含む。１つの実施態様において、ハイブリッド中の第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、タンパク質−タンパク質の相互作用（たとえば、電荷−電荷、または疎水性相互作用等）を介して互いに関連している。他の実施態様において、ハイブリッド中の第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、ジスルフィド結合または他の共有結合（複数含む）を介して互いに関連している。ハイブリッドは、たとえば、米国特許出願第２００４／１０１７４０号および米国特許出願第２００６／０７４１９９号に記述されている。第二のポリペプチドは、第一のポリペプチドの同一の複製物または非同一なポリペプチドであっても良い。１つの実施態様において、第一のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質（Ｘ）−Ｆｃ融合タンパク質であり、第二のポリペプチドは、Ｆｃ領域を含有する、本質的にからなる、またはからなる、ポリペプチドであり、ここで、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは互いに関連している。他の実施態様において、第一のポリペプチドは、ＶＷＦ断片−ＸＴＥＮ−Ｆｃ融合タンパク質を含有し、第二のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含有し、それによって、ハイブリッドはヘテロ二量体となる。他の実施態様において、第一のポリペプチドは、ＶＷＦ断片−Ｆｃ融合タンパク質を含有し、第二のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）−Ｆｃ融合タンパク質を含有し、それによって、ハイブリッドはヘテロ二量体となる。さらに他の実施態様において、第一のポリペプチドは、ＶＷＦ断片−ＸＴＥＮ−Ｆｃ融合タンパク質を含有し、第二のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）−Ｆｃ融合タンパク質を含有する。第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域の間の共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）を介して互いに関連してもよい。第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドはさらに、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の間の結合により互いに関連してもよい。
【０１７１】
本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの凝固活性に影響を与えない１以上の追加のＸＴＥＮ配列を有するＦＶＩＩＩを含有してもよい。そのようなＸＴＥＮ配列を、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に融合してもよく、または、挿入によってＦＶＩＩＩの凝固活性もしくはＦＶＩＩＩの機能に影響を与えることなく、ＦＶＩＩＩタンパク質の２つのアミノ酸残基のうちの１以上の間に挿入されてもよい。１つの実施態様において、挿入により、ＦＶＩＩＩタンパク質の薬物動態特性（たとえば、半減期）が改善される。他の実施態様において、挿入は、複数の挿入（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の挿入）であってもよい。挿入部位の例としては、限定されないが、表７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５にリストアップされる部位、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１７２】
１以上のＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）、ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）、ＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）−Ｘ−ＦＶＩＩＩ（ｃ→ｄ）と表されても良く、ここで、ＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）は、アミノ酸残基「ａ」からアミノ酸残基「ｂ」のＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分を含有し、本質的にからなり、または、からなり；ＸまたはＸ１は、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、本質的にからなり、または、からなり、ＦＶＩＩＩ（ｃ→ｄ）は、アミノ酸残基「ｃ」からアミノ酸残基「ｄ」のＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分を含有し、本質的にからなり、または、からなり；
ａは、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分のＮ末端アミノ酸残基であり、
ｂは、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分のＣ末端アミノ酸残基であり、ＸＴＥＮ配列が挿入されている挿入部位の２アミノ酸のＮ末端アミノ酸残基でもあり、
ｃは、ＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分のＮ末端アミノ酸残基であり、ＸＴＥＮ配列が挿入されている挿入部位の２アミノ酸のＣ末端アミノ酸残基でもあり、
ｄは、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端アミノ酸残基であり、
ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分およびＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は、互いに同一ではなく、および、併せて、ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＦＶＩＩＩ凝固活性を有するのに十分な長さのものである。
【０１７３】
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分およびＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ配列）の断片、または配列番号６（Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ）の断片である（たとえば、それぞれ、Ｎ末端部分およびＣ末端部分）。ある実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ１ドメインおよびＡ２ドメインを含有する。ＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、および、任意選択的にＣ２ドメインを含有する。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分は、Ａ１ドメインおよびＡ２ドメインを含有し、ならびに、ＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は、Ｂドメイン、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、および任意選択的にＣ２ドメインを含有する。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ１ドメイン、Ａ２ドメインおよびＢドメインの一部を含有し、ならびに、ＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、および任意選択的にＣ２ドメインを含有する。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ１ドメイン、Ａ２ドメインおよびＢドメインの第一の部分を含有する。ＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は、Ｂドメインの第二の部分、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、および任意選択的にＣ２ドメインを含有する。一部の実施態様において、２つのアミノ酸（「ｂ」および「ｃ」）は、任意の１つ以上の、表７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示されるアミノ酸残基挿入部位であってもよい。たとえば、「ｂ」は、１以上のＸＴＥＮ配列が挿入または連結される部位のすぐ上流のアミノ酸残基であってもよく、および、「ｃ」は、１以上のＸＴＥＮ配列が挿入または連結される部位のすぐ下流のアミノ酸残基であってもよい。一部の実施態様において、「ａ」は、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の成熟型アミノ酸配列であり、および、「ｄ」は、ＦＶＩＩＩタンパク質の最後のアミノ酸配列である。たとえば、ＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）は、配列番号６（Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩアミノ酸配列）または、配列番号４（全長ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１〜７４５に対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であるアミノ酸配列であってもよく、および、ＦＶＩＩＩ（ｃ→ｄ）は、それぞれ、配列番号６のアミノ酸７４６〜１４３８、または、配列番号４のアミノ酸１６４１〜２３３２であっても良い。
【０１７４】
一部の態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の挿入部位は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ末端、またはそれらの任意の組み合わせである、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメイン内に位置づけられても良く、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせである、ＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメインの間に位置づけられても良い。たとえば、ＸＴＥＮ配列が挿入されうる挿入部位は、Ｎ末端とＡ１ドメイン、Ｎ末端とＡ２ドメイン、Ｎ末端とＡ３ドメイン、Ｎ末端とＢドメイン、Ｎ末端とＣ１ドメイン、Ｎ末端とＣ２ドメイン、Ｎ末端とＣ末端、Ａ１およびＡ２ドメイン、Ａ１およびＡ３ドメイン、Ａ１およびＢドメイン、Ａ１およびＣ１ドメイン、Ａ１およびＣ２ドメイン、Ａ１ドメインおよびＣ末端、Ａ２およびＡ３ドメイン、Ａ２およびＢドメイン、Ａ２およびＣ１ドメイン、Ａ２およびＣ２ドメイン、Ａ２ドメインおよびＣ末端、Ａ３およびＢドメイン、Ａ３およびＣ１ドメイン、Ａ３およびＣ２ドメイン、Ａ３ドメインおよびＣ末端、ＢおよびＣ１ドメイン、ＢおよびＣ２ドメイン、ＢドメインおよびＣ末端、Ｃ１およびＣ２ドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ末端、Ｃ２ドメインおよびＣ末端、ならびにそれらの２以上の組み合わせからなる群から選択される。挿入部位の非限定的な例は、表７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示される。
【０１７５】
ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）にＸＴＥＮ配列が挿入されるＦＶＩＩＩタンパク質、または、ＸＴＥＮ配列がＣ末端もしくはＮ末端で連結されるＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列への連結後、またはＸＴＥＮ配列の挿入後、ＦＶＩＩＩ活性を保持している。ＸＴＥＮ配列は、挿入によってＦＶＩＩＩ活性が影響を受けないように（すなわち、ＦＶＩＩＩタンパク質は凝固特性をまた維持している）、１度、または２度以上、３度以上、４度以上、５度以上、６度以上、または７度以上、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入されてもよい。
【０１７６】
本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に任意選択的なリンカーにより１以上のＸＴＥＮポリペプチドを連結されてもよく、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に、１以上の任意選択的なリンカーにより、挿入されてもよい。１つの実施態様において、ＸＴＥＮが挿入される２つのアミノ酸残基、またはＸＴＥＮ配列が連結されるアミノ酸残基は、表７、表８、表９、および表１０ならびにそれらの任意の組み合わせの中にある残基からなる群から選択される、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）の２以上のアミノ酸残基に相当する
【０１７７】
他の実施態様において、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が、本明細書に開示される任意の１以上のＸＴＥＮ挿入部位、またはそれらの任意の組み合わせの中に挿入される。１つの態様において、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列は、表７に開示される１以上のアミノ酸に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位に挿入される。
【表７−１】
2018102323.tif 000035
【表７−２】
2018102323.tif 000036
【表７−３】
2018102323.tif 000037
【表７−４】
2018102323.tif 000038
【表７−５】
2018102323.tif 000039
【表７−６】
2018102323.tif 000040
【０１７８】
一部の実施態様において、１以上のＸＴＥＮ配列が、アミノ酸３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５、もしくは１９１０（配列番号４に対応）、またはそれらの任意の組み合わせから、およそ６アミノ酸、上流または下流の内に挿入される。
【表８】
2018102323.tif 000041
【０１７９】
他の実施態様において、１以上のＸＴＥＮ配列が、表９の１以上の挿入部位からなる群から選択される、全長成熟型ヒトＦＶＩＩＩに対応する１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入される。
【表９】
2018102323.tif 000042
【０１８０】
さらに他の実施態様において、１以上のＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのＢドメインに挿入される。１つの例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４０と１６４０の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４０と１６４０の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４１と１６9０の
間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４０と１６9０の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意
選択的に、存在しない。他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４１と１６４８の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４１と１６４８の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４３と１６３８の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４３と１６３８の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４５と１６５６の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４５と１６５６の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４５と１６５７の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４５と１６５７の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４５と１６６７の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４５と１６６７の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４５と１６８６の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４５と１６８６の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。一部の他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４７と１６４２の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４７と１６４２の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７５１と１６６７の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７５１と１６６７の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。
【０１８１】
一部の実施態様において、１以上のＸＴＥＮが、表１０のアミノ酸残基からなる群から選択される挿入部位のアミノ酸のすぐ下流の１以上のアミノ酸に挿入されている。
【表１０−１】
2018102323.tif 000043
【表１０−２】
2018102323.tif 000044
【表１０−３】
2018102323.tif 000045
【表１０−４】
2018102323.tif 000046
【０１８２】
１つの実施態様において、１以上のＸＴＥＮ挿入部位が、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の、表面に露出した、可塑性のあるループ構造（たとえば、許容ループ（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｌｏｏｐ））の内に位置づけられている。たとえば、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が、少なくとも２つの「許容ループ」を含有する各ＦＶＩＩＩの「Ａ」ドメイン内に挿入されており、組換えタンパク質の凝固促進活性、または、宿主細胞でｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現される組換えタンパク質の活性をを損なうことなく、少なくとも１つのＸＴＥＮポリペプチドが、そのループに挿入されることができる。許容ループは、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が挿入でき、そして他の性質の中でもとりわけ、高い表面の露出または溶媒への曝露、および高い配座柔軟性を可能とする領域である。Ａ１ドメインは、許容ループ１（Ａ１−１）領域および許容ループ２（Ａ１−２）領域を含有し、Ａ２ドメインは、許容ループ１（Ａ２−１）領域および許容ループ２（Ａ２−２）領域を含有し、Ａ３ドメインは、許容ループ１（Ａ３−１）領域および許容ループ２（Ａ３−２）領域を含有する。
【０１８３】
１つの態様において、ＦＶＩＩＩ  Ａ１ドメインの第一の許容ループ（Ａ１−１）は、βストランド１とβストランド２の間に位置づけられ、および、ＦＶＩＩＩ  Ａ２ドメインの第二の許容ループ（Ａ１−２）は、βストランド１１とβストランド１２の間に位置づけられる。ＦＶＩＩＩ  Ａ２ドメインの第一の許容ループ（Ａ２−１）は、βストランド２２とβストランド２３の間に位置づけられ、および、ＦＶＩＩＩ  Ａ２ドメインの第二の許容ループ（Ａ２−２）は、βストランド３２とβストランド３３の間に位置づけられる。ＦＶＩＩＩ  Ａ３ドメインの第一の許容ループ（Ａ３−１）は、βストランド３８とβストランド３９の間に位置づけられ、および、ＦＶＩＩＩ  Ａ３ドメインの第二の許容ループ（Ａ３−２）は、βストランド４５とβストランド４６の間に位置づけられる。ある態様において、Ａ１−１を含有する、表面が露出された、可塑性ループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸１５〜およそアミノ酸４５の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸１８〜およそアミノ酸４１）に相当する。他の態様において、Ａ１−２を含有する、表面が露出された、可塑性のループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸２０１〜およそアミノ酸２３２の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸２１８〜およそアミノ酸２２９）に相当する。さらに他の態様において、Ａ２−１を含有する、表面が露出された、可塑性のループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸３９５〜およそアミノ酸４２１の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸３９７〜およそアミノ酸４１８）に相当する。さらに他の実施態様において、Ａ２−２を含有する、表面が露出された、可塑性のループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸５７７〜およそアミノ酸６３５の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸５９５〜およそアミノ酸６０７）に相当する。ある態様において、Ａ３−１を含有する、表面が露出された、可塑性のループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸１７０５〜およそアミノ酸１７３２の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸１７１１〜およそアミノ酸１７２５）に相当する。さらに他の態様において、Ａ３−２を含有する、表面が露出された、可塑性のループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸１８８４〜およそアミノ酸１９１７の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸１８９９〜およそアミノ酸１９１１）に相当する。
【０１８４】
他の実施態様において、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が挿入される、１以上のアミノ酸は、ａ３ドメイン（たとえば、全長成熟型ＦＶＩＩＩポリペプチドに対応するアミノ酸１６４９〜１６８９）内に位置づけられる。特定の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１６５６〜１６５７の間に挿入される。特定の実施態様において、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されたＸＴＥＮ配列を含有するＦＶＩＩＩはさらに、配列番号４のアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６の欠損を含有する。
【０１８５】
一部の実施態様において、１以上のＸＴＥＮ挿入に対する１以上の挿入部位は、
（１）アミノ酸３、（２）アミノ酸１８、（３）アミノ酸２２、
（４）  アミノ酸２６、（５）アミノ酸３２、（６）アミノ酸４０、
（７）アミノ酸６０、（８）アミノ酸６５、（９）アミノ酸８１、
（１０）アミノ酸１１６、（１１）アミノ酸１１９、（１２）アミノ酸１３０、
（１３）アミノ酸１８８、（１４）アミノ酸２１１、（１５）アミノ酸２１６、
（１６）アミノ酸２２０、（１７）アミノ酸２２４、（１８）アミノ酸２３０、
（１９）アミノ酸３３３、（２０）アミノ酸３３６、（２１）アミノ酸３３９、
（２２）アミノ酸３７５、（２３）アミノ酸３９９、（２４）アミノ酸４０３、
（２５）アミノ酸４０９、（２６）アミノ酸４１６、（２６）アミノ酸４４２、
（２８）アミノ酸４８７、（２９）アミノ酸４９０、（３０）アミノ酸４９４、
（３１）アミノ酸５００、（３２）アミノ酸５１８、（３３）アミノ酸５９９、
（３４）アミノ酸６０３、（３５）  アミノ酸７１３、（３６）アミノ酸７４５、
（３７）アミノ酸１６５６、（３８）アミノ酸１７１１、（３９）アミノ酸１７２０、
（４０）アミノ酸１７２５、（４１）アミノ酸１７４９、（４２）アミノ酸１７９６、
（４３）アミノ酸１８０２、（４４）アミノ酸１８２７、（４５）アミノ酸１８６１、
（４６）アミノ酸１８９６、（４７）アミノ酸１９００、（４８）アミノ酸１９０４、
（４９）アミノ酸１９０５、（５０）アミノ酸１９１０、（５１）アミノ酸１９３７、
（５２）アミノ酸２０１９、（５３）アミノ酸２０６８、（５４）アミノ酸２１１１、
（５５）アミノ酸２１２０、（５６）アミノ酸２１７１、（５７）アミノ酸２１８８、
（５８）アミノ酸２２２７、（５９）アミノ酸２２７７、および、
（６０）それらの２以上の組み合わせ、
からなる群から選択される１以上のアミノ酸のすぐ下流である。
【０１８６】
１つの実施態様において、本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、２つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第一のＸＴＥＮ配列、第二のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第二のＸＴＥＮ）を含有する。第一のＸＴＥＮ挿入部位および第二のＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な例を表１１にリストアップする。
【表１１−１】
2018102323.tif 000047
【表１１−２】
2018102323.tif 000048
【表１１−３】
2018102323.tif 000049
【０１８７】
ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された、または連結された２つのＸＴＥＮは、同一であっても、異なっていても良い。一部の実施態様において、本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された２つのＸＴＥＮ配列（配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入された第一のＸＴＥＮ配列、および、配列番号４のアミノ酸２３３２（Ｃ末端）のすぐ下流に挿入された第二のＸＴＥＮ配列）を含有する。他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、４０、１６５６、または１７２０のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、または４０のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸５９９のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、４０、３９９、４０３、１７２５、１７２０、１９００、１９０５、または２３３２のすぐ下流に挿入される。ある実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６または４０のすぐ下流に挿入される。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６または４０のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸３９９のすぐ下流に挿入される。他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、または４０のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８のすぐ下流に挿入される。特定の実施態様において、２つのＸＴＥＮ配列（配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入された第一のＸＴＥＮ、および、配列番号４のアミノ酸２３３２のすぐ下流に挿入された第二のＸＴＥＮ）を含有するＦＶＩＩＩタンパク質であって、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、配列番号４のアミノ酸７４５から配列番号４のアミノ酸１６８５の欠損を有し、配列番号４のアミノ酸１６８０で変異または置換（たとえば、Ｙ１６８０Ｆ）を有し、配列番号４のアミノ酸１６４８で変異または置換（Ｒ１６４８Ａ）を有し、または、配列番号４のアミノ酸１６４８、および、配列番号４のアミノ酸１６８０で、少なくとも２つの変異または置換（たとえば、Ｒ１６４８Ａ、Ｙ１６８０Ｆ）を有する。特定の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、２つのＸＴＥＮ配列（配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入された第一のＸＴＥＮ、および、配列番号４のアミノ酸２３３２のすぐ下流に挿入された第二のＸＴＥＮ）を含有し、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、配列番号４のアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６の欠損を有する。
【０１８８】
ある実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、３つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第一のＸＴＥＮ配列、第二のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第二のＸＴＥＮ配列、および、第三のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第三のＸＴＥＮ配列）を含有する。第一、第二、または、第三のＸＴＥＮ配列は、同一であっても、または、異なっていても良い。第一、第二、および、第三の挿入部位は、本明細書に開示される挿入部位のうちの任意の１つの群から選択されてもよい。一部の実施態様において、３つのＸＴＥＮ配列を含有するＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、変異または置換（たとえば、配列番号４のアミノ酸１６４８で、たとえば、Ｒ１６４８Ａ）を含有しても良い。たとえば、第一、第二、および第三のＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な例を、表１２にリストアップする。
【表１２−１】
2018102323.tif 000050
【表１２−２】
2018102323.tif 000051
【０１８９】
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、３つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１６５６、１７２０または１９００のすぐ下流に挿入される）を含有する。他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０または１９００のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０または１９００のすぐ下流に挿入される。他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸４０３または１６５６のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入される。他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、４０、３９９、４０３、１７１１、１７２０、１７２５、１９００、１９０５、または、１９１０のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０または２３３２のすぐ下流に挿入される。
【０１９０】
他の実施態様において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は４つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴＥＮ配列は第一の挿入部位に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は第二の挿入部位に挿入され、第三のＸＴＥＮ配列は第三の挿入部位に挿入され、および、第四のＸＴＥＮ配列は第四の挿入部位に挿入される）を含有する。第一、第二、第三、および第四のＸＴＥＮ配列は、同一であっても、異なっていても、またはそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施態様において、４つのＸＴＥＮ配列を含有するＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、変異または置換（たとえば、配列番号４のアミノ酸１６４８（たとえば、Ｒ１６４８Ａ））を含有してもよい。第一、第二、第三、および第四のＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な例を表１３にリストアップする。
【表１３−１】
2018102323.tif 000052
【表１３−２】
2018102323.tif 000053
【表１３−３】
2018102323.tif 000054
【表１３−４】
2018102323.tif 000055
【０１９１】
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、５つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴＥＮ配列は第一の挿入部位に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は第二の挿入部位に挿入され、第三のＸＴＥＮ配列は第三の挿入部位に挿入され、第四のＸＴＥＮ配列は第四の挿入部位に挿入され、および、第五のＸＴＥＮ配列は第五の挿入部位に挿入される）を含有する。第一、第二、第三、第四および第五のＸＴＥＮ配列は、同一であっても、異なっていても、またはそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施態様において、第一、第二、第三、第四および第五のＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な例を表１４にリストアップする。
【表１４】
2018102323.tif 000056
【０１９２】
ある実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、６つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴＥＮ配列は第一の挿入部位に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は第二の挿入部位に挿入され、第三のＸＴＥＮ配列は第三の挿入部位に挿入され、第四のＸＴＥＮ配列は第四の挿入部位に挿入され、第五のＸＴＥＮ配列は第五の挿入部位に挿入され、および、第六のＸＴＥＮ配列は第六の挿入部位に挿入される）を含有する。第一、第二、第三、第四、第五および第六のＸＴＥＮ配列は、同一であっても、異なっていても、またはそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施態様において、６つのＸＴＥＮ挿入部位の例は、限定されないが、表１５にリストアップされる挿入部位が挙げられる。
【表１５】
2018102323.tif 000057
【０１９３】
特定の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６と２７の間に挿入され、および、第二のＸＴＥＮは、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。他の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、および、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。一部の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、および、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。他の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、および、第三のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、および、第三のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、および、第三のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。ある実施態様において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入され、および、第三のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１９００と１９０１の間に挿入される。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、第三のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入され、および、第四のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１９００と１９０１の間に挿入される。
【０１９４】
特定の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、全長第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７４５と７４６の間に挿入され、または、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子の対応する挿入部位に挿入される。
【０１９５】
一部の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、２つのポリペプチド配列を含有し、第一のポリペプチド配列は、ＦＶＩＩＩ−１６１（配列番号１０１）、ＦＶＩＩＩ−１６９（配列番号１０３）、ＦＶＩＩＩ−１７０（配列番号１０２）、ＦＶＩＩＩ−１７３（配列番号１０４）；ＦＶＩＩＩ−１９５  （配列番号１０５）；ＦＶＩＩＩ−１９６（配列番号１０６）、ＦＶＩＩＩ１９９  （配列番号１０７）、ＦＶＩＩＩ−２０１（配列番号１０８）；ＦＶＩＩＩ−２０３（配列番号１０９）、ＦＶＩＩＩ−２０４（配列番号１１０）、ＦＶＩＩＩ−２０５（配列番号１１１）、ＦＶＩＩＩ−２６６（配列番号１１２）、ＦＶＩＩＩ−２６７（配列番号１１３）、ＦＶＩＩＩ−２６８（配列番号１１４）、ＦＶＩＩＩ−２６９（配列番号１１５）、ＦＶＩＩＩ−２７１（配列番号１１６）、または、ＦＶＩＩＩ−２７２（配列番号１１７）から選択される配列に対し、少なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有し、および、第二のポリペプチド配列は、ＶＷＦ０３１（配列番号１１８）、ＶＷＦ０３４（配列番号１１９）、または、ＶＷＦ−０３６（配列番号１２０）から選択される配列に対し、少なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有する。
【０１９６】
Ｄ）  Ｉｇ定常領域またはその一部
本発明のＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、Ｉｇ定常領域またはその一部を含有してもよい。Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＸＴＥＮ配列を組み合わされたＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質の薬物動態特性または薬力学特性を改善してもよい。ある実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、Ｉｇ定常領域またはその一部と融合された分子の半減期を延長する。
【０１９７】
Ｉｇ定常領域は、ＣＨ（定常重鎖）ドメインと示されるドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２等）から構成される。アイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたは、ＩｇＥ）によって、定常領域は、３つ、または４つのＣＨドメインから構成されてもよい。一部のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ）の定常領域はまた、ヒンジ領域を含有する。Janewayet al. 2001, Immunobiology, GarlandPublishing, N.Y., N.Yを参照のこと。
【０１９８】
本発明のキメラタンパク質の製造のための、Ｉｇ定常領域またはその一部は、多くの異なる源から入手されてもよい。一部の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ヒトＩｇから誘導される。しかしながら、Ｉｇ定常領域またはその一部は、他の哺乳類種（たとえば、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等）、または非ヒト霊長類種（たとえば、チンパンジー、マカク）を含む）のＩｇから誘導されても良いことを理解されたい。さらに、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む任意のＩｇクラス、および、任意のＩｇアイソタイプ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）から誘導されても良い。１つの実施態様において、ヒトのアイソタイプのＩｇＧ１が用いられる。
【０１９９】
様々なＩｇ定常領域の遺伝子配列（たとえば、ヒト定常領域遺伝子配列）が、第三者利用なデポジットの形態で入手可能である。特定のエフェクター機能を有する（または、特定のエフェクター機能を欠損している）定常領域ドメインの配列、または、免疫原性を減少させるために特定の改変が為されている定常領域ドメインの配列を、選択することができる。多くの抗体の配列、および抗体をコードする遺伝子の配列が公開されており、当分野公知の技術を用いて、これらの配列から、適切なＩｇ定常領域の配列（たとえば、ヒンジ、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３配列、またはその一部）を得ることができる。次いで、前述の任意の方法を用いて得られた遺伝的材料を改変、または合成して、本発明のポリペプチドを得ても良い。さらに、本発明の範囲には、定常領域のＤＮＡ配列の対立遺伝子、変異体、および突然変異を包含することを認識されたい。
【０２００】
Ｉｇ定常領域またはその一部の配列は、たとえば、ポリメラーゼ鎖反応および対象のドメインを増幅するために選択されたプライマーを用いて、クローニングされてもよい。抗体からＩｇ定常領域またはその一部の配列をクローニングするために、ｍＲＮＡをハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離し、ＤＮＡへ逆転写し、および、抗体遺伝子をＰＣＲにより増幅してもよい。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第４，９６５，１８８号、および、たとえば、"PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications"Innis et al. eds., AcademicPress, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989.Gene 77:51; Horton et al. 
1993. Methods Enzymol. 217:270)に詳述されている。コンセンサス定常領域プライマーにより、または、公開されている重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づいた、より特異的なプライマーにより、ＰＣＲが開始されてもよい。上述のように、ＰＣＲを用いて抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡクローンを単離してもよい。この場合において、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（たとえばマウス定常領域プローブ）によりスクリーニングされてもよい。抗体遺伝子の増幅に適切な多くのプライマーセットが当分野に公知である（たとえば、精製抗体のＮ末端配列に基づいた５´プライマー（Benharand Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509）；ｃＤＮＡ末端の急速増幅（Ruberti, F. et al.1994. J.Immunol. Methods 173:33)）；抗体リーダー配列（Larrick et al. 1989 Biochem.Biophys. Res. Commun. 160:1250）等）。抗体配列のクローニングは、Ｎｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０
号（１９９５年１月２５日出願、参照により本明細書に援用される）にさらに詳述されている。
【０２０１】
本明細書に用いられているＩｇ定常領域は、すべてのドメインおよびヒンジ領域、またはそれらの一部を含むことができる。１つの実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域（すなわち、ＦｃドメインまたはＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する。
【０２０２】
本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、天然型イムノグロブリンのＦｃ領域に相当するポリペプチド部分、すなわち、その２つの重鎖の各Ｆｃドメインの二量体性の関連付けにより形成される部分と定義づけられる。天然型Ｆｃ領域は他のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。対照的に、「遺伝的に融合されたＦｃ領域」または「一本鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）という用語は、本明細書において、一本鎖ポリペプチド（すなわち、単一の連続的な遺伝子配列にコードされたもの）内で遺伝的に連結されたＦｃドメインから構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。
【０２０３】
１つの実施態様において、「Ｆｃ領域」とは、パパイン開裂部位のちょうど上流にあるヒンジ領域（すなわち、１１４である重鎖定常領域の最初の残基を取り、ＩｇＧ中の残基２１６）から始まり、抗体のＣ末端で終わる、単一Ｉｇ重鎖部分を指す。従って、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する。
【０２０４】
Ｉｇ定常領域のＦｃ領域は、Ｉｇアイソタイプに依存して、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびにヒンジ領域を含有しても良い。キメラタンパク質がＩｇのＦｃ領域を含有することによって、安定性の増加、血清半減期の増加（seeCapon et al., 1989, Nature 337:525を参照のこと）、ならびに、たとえば胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）等のＦｃ受容体への結合の増加を含む、いくつかの所望の特性がキメラタンパク質にもたらされる（米国特許第６，０８６，８７５号、第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１、それらは、参照によりその全体で本明細書に援用される）。
【０２０５】
Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦｃＲｎ結合パートナーであってもよい。ＦｃＲｎは、成人の上皮組織で活性であり、腸管腔、気道、鼻腔面、膣表面、結腸表面および直腸表面で発現される（米国特許第６，４８５，７２６号）。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎに結合するＩｇの部分である。
【０２０６】
ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含む、いくつかの哺乳類種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスのＦｃＲｎの配列が公知である（Storyet al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377）。ＦｃＲｎ受容体は、比較的低いｐＨでＩｇＧに結合し（たとえば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ等の他のＩｇクラスには結合しない）、内腔内でＩｇＧを漿膜方向に経細胞的に能動輸送し、次いで、腸管液中の比較的高いｐＨでＩｇＧを放出する。肺および腸管上皮（Israelet al. 1997, Immunology 92:69）、近位尿細管上皮細胞（Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol.Renal Physiol. 282:F358）、ならびに鼻腔上皮、膣表面および胆管表面を含む、成人の上皮組織（米国特許第６，０８６，８７５号、第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１）で発現されている。
【０２０７】
本発明に有用なＦｃＲｎ結合パートナーには、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、および、ＦｃＲｎ受容体の完全な結合領域を含む他の断片を含む、ＦｃＲｎ受容体により特異的に結合されることができる分子が包含される。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づき、記述されている（Burmeisteret al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃＲｎとのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２とＣＨ３ドメインの接合点の近くである。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触はすべて、単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーには、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、および、ＦｃＲｎの完全な結合領域を含むＩｇＧの他の断片が含まれる。主な接触部位としては、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０−２５７、２７２、２８５、２８８、２９０−２９１、３０８−３１１および３１４、ならびに、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５−３８７、４２８および４３３−４３６が含まれる。ＩｇまたはＩｇ断片のアミノ酸のナンバリングに作成された基準はすべて、Kabatet al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S. Department ofPublic Health, Bethesda, Mdに基づいている。
【０２０８】
ＦｃＲｎに結合されたＦｃ領域、またはＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎによって、効率的に上皮バリアを超えて行き来することができるため、それにより、所望の治療分子を全身投与するための非侵襲的な手段が得られる。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現している細胞により、エンドサイト―シスされる。しかし、分解されるかわりに、これらの融合タンパク質は、循環系へと再びリサイクルされ、それによって、これらのタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は延長される。ある実施態様において、Ｉｇ定常領域の一部は、多くの場合、ジスルフィド結合および他の非特定の相互作用を介して他のＦｃ領域または他のＦｃＲｎ結合パートナーと関連し、二量体および高次の多量体を形成する、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーである。
【０２０９】
２つのＦｃＲｎ受容体は、１つのＦｃ分子と結合することができる。結晶構造解析のデータから、各ＦｃＲｎ分子は、Ｆｃホモ二量体の１つのポリペプチドに結合することが示唆されている。１つの実施態様において、ＦｃＲｎ結合パートナー（たとえば、ＩｇＧのＦｃ断片）の、生物学的に活性な分子への連結は、経口、口腔、舌下、経直腸、経腟、経鼻もしくは肺経路を介するエアロゾル投与、または、眼内経路を介する、生物学的に活性な分子を送達する手段となる。他の実施態様において、キメラタンパク質は侵襲的に投与（たとえば、皮下投与、静脈内投与）されてもよい。
【０２１０】
ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、ＦｃＲｎ受容体により特異的に結合され、その結果、Ｆｃ領域のＦｃ受容体により能動輸送されることができる、分子またはその一部である。特異的な結合とは、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成する２つの分子を指す。特定の結合は、高いアフィニティおよび低〜中程度の容量（キャパシティ）により特徴付けられ、非特異的結合（通常、低いアフィニティおよび中〜高度の容量を有する）から明確に区別される。典型的には、アフィニティ定数ＫＡが、１０６Ｍ−１、または１０８Ｍ−１よりも高い場合に、その結合は特異的であるとみなされる。もし必要であれば、結合条件を変えることにより、特異的結合に実質的な影響を与えることなく、非特異的結合を減少させることができる。適切な結合条件（たとえば、分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（たとえば、血清アルブミン、ミルクカゼイン等）の濃度等）は、通常の技術を用いて当業者により最適化されてもよい。
【０２１１】
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）のＦｃ領域に対する結合特性をもたらすには十分な、断片化Ｆｃ領域を１以上含有する。たとえば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＥＵナンバリングでＩｇＧ１のおよそアミノ酸２８２〜４３８を含有する（ＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０−２５７、２７２、２８５、２８８、２９０−２９１、３０８−３１１、および３１４、ならびに、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５−３８７、４２８および、４３３−４３６である主要接触部位を有する）。ゆえに本発明のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含有してもよい、または、からなるものであってもよい。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプの重鎖から誘導されてもよい。１つの実施態様において、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が用いられる。他の実施態様において、ヒトのアイソタイプＩｇＧ４の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が用いられる。
【０２１２】
他の実施態様において、「Ｆｃ領域」には、Ｆｃドメインのアミノ酸配列、またはＦｃドメイン由来のアミノ酸配列が含まれる。ある実施態様において、Ｆｃ領域は、ヒンジ（たとえば、上部ヒンジ領域、中部ヒンジ領域、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン（ＥＵナンバリングで、抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸２１６〜２３０）、ＣＨ２ドメイン（ＥＵナンバリングで、抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸２３１〜３４０）、ＣＨ３ドメイン（ＥＵナンバリングで、抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸３４１〜４３８）、ＣＨ４ドメイン、またはそれらの変異体、部分もしくは断片の内の少なくとも１つを含有する。他の実施態様において、Ｆｃ領域は、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含有する。一部の実施態様において、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部）、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部）、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその一部）、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）の両方に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含有する、本質的にからなる、または、からなる。さらに他の実施態様において、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部を欠損する（たとえば、ＣＨ２ドメインの一部またはすべて）。特定の実施態様において、Ｆｃ領域は、ＥＵナンバリングで２２１〜４４７に相当するアミノ酸を含有する、または、からなる。
【０２１３】
Ｆ、Ｆ１、またはＦ２と本明細書に表記されるＦｃ領域は、多くの異なる源から得られても良い。１つの実施態様において、ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトＩｇから誘導される。しかしながら、Ｆｃ領域は、他の哺乳類種（たとえば、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）または非ヒト霊長類種（たとえば、チンパンジー、マカク）を含む）のＩｇから誘導されても良いことを理解されたい。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部のポリペプチドは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む任意のＩｇクラス、および、任意のＩｇアイソタイプ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）から誘導されても良い。他の実施態様において、ヒトのアイソタイプのＩｇＧ１が用いられる。
【０２１４】
ある実施態様において、前記野生型Ｆｃドメインを含有するＦｃ領域によりもたらされるエフェクター機能の少なくとも１つに対し、Ｆｃ変異体は、変化をもたらす（たとえば、Ｆｃ受容体（たとえば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、または、ＦｃγＲＩＩＩ）または補体タンパク質（たとえば、Ｃ１ｑ）に結合するＦｃ領域の活性における改善または減少、または、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシスもしくは補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣＣ）を引き起こすＦｃ領域の活性における改善または減少等）。他の実施態様において、Ｆｃ変異体は、遺伝子操作されたシステイン残基をもたらす。
【０２１５】
本発明のＦｃ領域に、エフェクター機能および／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎ結合に変化をもたらすことが知られている、当分野公知のＦｃ変異体を用いても良い。具体的には、本発明の結合分子は、たとえば、国際特許出願ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２、およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許公開ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３７７６５、ＵＳ２００７／０２３７７６６、ＵＳ２００７／０２３７７６７、ＵＳ２００７／０２４３１８８、ＵＳ２００７０２４８６０３、ＵＳ２００７０２８６８５９、ＵＳ２００８００５７０５６；または、米国特許第５，６４８，２６０号；第５，７３９，２７７号；第５，８３４，２５０号；第５，８６９，０４６号；第６，０９６，８７１号；第６，１２１，０２２号；第６，１９４，５５１号；第６，２４２，１９５号；第６，２７７，３７５号；第６，５２８，６２４号；第６，５３８，１２４号；第６，７３７，０５６号；第６，８２１，５０５号；第６，９９８，２５３号；第７，０８３，７８４号；第７，４０４，９５６、および、７，３１７，０９１号（それら各々は、参照により本明細書に援用される）に開示されるアミノ酸の位置のうちの１つ以上で、たとえば変化（たとえば、置換）を含有してもよい。１つの実施態様において、開示されたアミノ酸の位置の１つ以上で、特定の変化（たとえば、当分野公知の１以上のアミノ酸の特定の置換）があっても良い。他の実施態様において、開示されたアミノ酸の位置の１つ以上で、異なる変化（たとえば、当分野公知の１以上のアミノ酸の位置の異なる置換）があっても良い。
【０２１６】
ＩｇＧのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを、たとえば、良く知られた方法（たとえば、特定部位の突然変異誘導等）により改変し、ＦｃＲｎにより結合される、改変ＩｇＧまたはＦｃ断片もしくはその一部を得ても良い。そのような改変として、ＦｃＲｎ接触部位から離れた部位にある改変、ならびに、ＦｃＲｎに対する結合を失わない、または、あまつさえ増強する、接触部位内の改変が挙げられる。たとえば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｆｃ  γ１）の以下の１アミノ酸残基は、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合アフィニティを著しく損ねることなく、置換することができる：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、およびＫ４４７Ａ（ここで、たとえば、Ｐ２３８Ａとは、野生型プロリンが、２３８番の位置でアラニンに置換されることを表す）。例として、特定の実施態様において、Ｎ２９７Ａ変異を組込み、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去している。アラニンに加え、他のアミノ酸で、上記特定の部位で野生型アミノ酸を置換してもよい。変異を個々にＦｃに導入し、天然型Ｆｃとは異なる２００以上のＦｃ領域を生じさせてもよい。さらに、２、３またはそれ以上のこれら個々の変異の組み合わせを共に導入して、数百以上のＦｃ領域を生じさせてもよい。さらに、本発明の構築物のＦｃ領域のうちの１つが変異され、当該構築物の他のＦｃ領域はまったく変異を受けなくても良く、または、それら両方ともが異なる変異で、変異されていてもよい。
【０２１７】
上述の変異のうちのいくつかは、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーに新たな機能性をもたらしうる。たとえば、１つの実施態様において、Ｎ２９７Ａを導入し、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去する。この変異の効果は、免疫原性を減少させることであり、これにより、Ｆｃ領域の循環半減期が延長され、および、ＦｃＲｎに対するアフィニティを損ねることなく、Ｆｃ領域はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡに結合することができなくなる（Routledgeet al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999,Transplantation68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。上述の変異から生じる新たな機能性のさらなる例として
、一部の例においては、ＦｃＲｎに対するアフィニティが、野生型のそれを超えて増加しうることが挙げられる。このアフィニティの増加は、「オン」の比率の増加、「オフ」の比率の減少、または、「オン」の比率増加と「オフ」の比率減少の両方を反映している可能性がある。ＦｃＲｎに対するアフィニティ増加をもたらすと考えられている変異の例として、限定されないが、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、および、Ｎ４３４Ａが挙げられる（Shieldset al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。
【０２１８】
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃγ受容体が、下部ヒンジ領域（通常は、アミノ酸２３４〜２３７）の内で、ＩｇＧ上の結合部位を認識すると考えられている。それゆえ、他の新たな機能性の例、および、免疫原性の減少の可能性は、たとえばヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３〜２３６（ＥＬＬＧ）を、ＩｇＧ２の対応する配列（ＰＶＡ）（１アミノ酸の欠失を伴う）へと置換する等、この領域の変異によりもたらされる可能性がある。様々なエフェクター機能を調節する、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、そのような変異が導入された場合、ＩｇＧ１に結合しなくなることが示されている。Wardand
Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77、および、Armour et al. 1999, Eur. J.Immunol. 29:2613。
【０２１９】
１つの実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）は、配列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号５２）を含むポリペプチドおよび、任意選択的に、ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号５３）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号５４）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号５５）、または、ＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号５６）（米国特許第５，７３９，２７７号）から選択される配列をさらに含むポリペプチドである。
【０２２０】
他の実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部は、１以上のジスルフィド結合を他のイムノグロブリン定常領域またはその一部と形成する、ヒンジ領域またはその一部のアミノ酸配列を含有する。イムノグロブリン定常領域またはその一部によるジスルフィド結合は、ＦＶＩＩＩを含有する第一のポリペプチドおよび、ＶＷＦ断片を含有する第二のポリペプチド共に位置し、それにより、内因性ＶＷＦは、ＶＷＦ断片を置換せず、および、ＦＶＩＩＩに結合しない。それゆえ、第一のイムノグロブリン定常領域またはその一部と、第二のイムノグロブリン定常領域またはその一部の間のジスルフィド結合は、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の間の相互作用を阻害する。この、ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の間の相互作用の阻害により、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、２倍という限界を超える。ヒンジ領域またはその一部はさらに、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、その断片およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上のドメインに連結されていてもよい。特定の実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部ヒンジ領域およびＣＨ２である。
【０２２１】
ある実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、半グリコシル化されている。たとえば、２つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有するキメラタンパク質は、第一の、グリコシル化されたＦｃ領域（たとえば、グリコシル化ＣＨ２領域）またはＦｃＲｎ結合パートナー、および、第二の、グリコシル化されていないＦｃ領域（たとえば、グリコシル化されていないＣＨ２領域）またはＦｃＲｎ結合パートナー、を含有してもよい。１つの実施態様において、リンカーは、グリコシル化されたＦｃ領域と、グリコシル化されていないＦｃ領域の間に置かれても良い。他の実施態様において、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、完全にグリコシル化されている（すなわち、Ｆｃ領域のすべては、グリコシル化されている）。他の実施態様において、Ｆｃ領域は、グリコシル化されていなくても良い（すなわち、Ｆｃ部分は１つもグリコシル化されていない）。
【０２２２】
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、Ｉｇ定常領域またはその一部に対するアミノ酸置換を含有し（たとえば、Ｆｃ変異体）、それにより、Ｉｇ定常領域の抗原非依存性エフェクター機能が変化する（特に、タンパク質の循環半減期）。
【０２２３】
そのようなタンパク質は、置換の無いタンパク質と比較し、ＦｃＲｎに対する結合の増加、または減少のいずれかを示し、それにより、それぞれ、血清中の半減期が増加、または減少する。ＦｃＲｎに対するアフィニティが改善されたＦｃ変異体は、血清半減期が延長することが予期され、そのような分子は、長い半減期の投与ポリペプチドが所望される場合（たとえば、慢性疾患または障害）の哺乳類の治療方法における応用に有用である（たとえば、米国特許第７，３４８，００４号、第７，４０４，９５６号、および、第７，８６２，８２０号を参照のこと）。対照的に、ＦｃＲｎ結合アフィニティが減少したＦｃ変異体は、短い半減期を有することが予期され、そのような分子はまた、たとえば、短時間の循環が有利である場合（たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断イメージング、または、開始ポリペプチドが長い期間、循環系に存在すると、毒性のある副作用がある場合）の哺乳類への投与に有用である。ＦｃＲｎ結合アフィニティが減少したＦｃ変異体はまた、胎盤を通過する可能性が少なく、ゆえに、妊娠した女性における疾患または障害の処置に有用である。さらに、ＦｃＲｎ結合アフィニティの減少が望ましい他の応用として、脳、腎臓、および／または肝臓への局在が望まれるアプリケーションが挙げられる。１つの例示的な実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、脈管系から腎臓糸球体上皮を超える輸送の減少を示す。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、脳から血管腔内への、血液脳関門（ＢＢＢ）を超える輸送の減少を示す。１つの実施態様において、ＦｃＲｎ結合が変換したタンパク質は、Ｉｇ定常領域の「ＦｃＲｎ結合ループ」内に、１以上のアミノ酸置換を有する、少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー（たとえば、１または２のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型、全長Ｆｃ領域のアミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵナンバリングに従う）から構成されている。他の実施態様において、改変されたＦｃＲｎ結合アフィニティを有する本発明のキメラタンパク質のＩｇ定常領域またはその一部は、１５ÅのＦｃＲｎ「接触域」内に、１以上のアミノ酸置換を有する、少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する。本明細書において、１５ÅのＦｃＲｎ「接触域」という用語には、野生型、全長Ｆｃ部分の以下の位置の残基を含む：２４３−２６１、２７５−２８０、２８２−２９３、３０２−３１９、３３６−３４８、３６７、３６９、３７２−３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５−４４０（ＥＵナンバリングに従う）。他の実施態様において、改変されたＦｃＲｎ結合アフィニティを有する本発明のＩｇ定常領域またはその一部は、以下のＥＵ位のうちの任意の１つに相当するアミノ酸の位置で、１以上のアミノ酸置換を有するＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを少なくとも１つ含有する：２５６、２７７−２８１、２８３−２８８、３０３−３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（たとえば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）、および４３８。ＦｃＲｎ結合活性を変化させる例示的なアミノ酸置換は、国際���許出願公開ＷＯ０５／０４７３２７（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。
【０２２４】
本発明に用いられるＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーはまた、キメラタンパク質のグリコシル化を変える、当分野公知のアミノ酸置換を含有してもよい。たとえば、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたキメラタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、グリコシル化（たとえば、Ｎ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化）の減少をもたらす変異を含有してもよく、または、野生型Ｆｃ部分の改変糖型を含有しても良い（たとえば、低フコース、またはフコースのないグリカン）。
【０２２５】
１つの実施態様において、本発明のプロセッシングを受けていないキメラタンパク質は、本明細書に記述されるＩｇ定常領域またはその一部から独立して選択される、その構成Ｉｇ定常領域またはその一部を２つ以上有する、遺伝子融合されたＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）を含有してもよい。１つの実施態様において、二量体Ｆｃ領域のＦｃ領域は、同一である。他の実施態様において、Ｆｃ領域のうちの少なくとも２つは、異なっている。たとえば、本発明のタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、同数のアミノ酸残基を含有し、または、それらは、１以上のアミノ酸残基により長さが異なっていても良い（たとえば、約５アミノ酸残基（たとえば、１、２、３、４または５アミノ酸残基）、約１０残基、約１５残基、約２０残基、約３０残基、約４０残基、または約５０残基により）。さらに他の実施態様において、本発明のタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、１以上のアミノ酸の位置で、配列が異なっていても良い。たとえば、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーのうちの少なくとも２つは、約５アミノ酸の位置（たとえば、１、２、３、４または５アミノ酸の位置）、約１０の位置、約１５の位置、約２０の位置、約３０の位置、約４０の位置、または約５０の位置で、異なっていても良い。
【０２２６】
Ｅ）  リンカー
本発明のキメラタンパク質はさらに、１以上のリンカーを含有する。リンカーのうちの１つのタイプは、対象にｉｎ  ｖｉｖｏで投与された際に、様々なプロテアーゼにより、（たとえば、凝固部位で）、開裂されることができる、開裂可能なリンカーである。１つの実施態様において、開裂可能なリンカーにより、凝固カスケードが発生している部位での、キメラタンパク質からの部分（たとえば、ＶＷＦ断片）の開裂が可能となり、それによって、活性化されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）が、そのＦＶＩＩＩａ活性を有するようになる。他のタイプのリンカーは、細胞内開裂部位を含有するプロセッシング可能なリンカーであり、それにより、宿主細胞内の細胞内プロセッシング酵素により開裂されることができ、ポリペプチドの簡便な発現およびキメラタンパク質の形成が可能となる。
【０２２７】
１以上のリンカーが、キメラタンパク質中の任意の２つのタンパク質の間に存在してもよい。１つの実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、ここで、ＶＷＦ断片は、リンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）によりＸＴＥＮ配列に連結されており、および、ＸＴＥＮ配列はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている（すなわち、Ｖ−Ｌ−Ｘ−ＦＶＩＩＩ）。他の実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、ここで、ＶＷＦ断片はＸＴＥＮ配列に連結されており、および、ＸＴＥＮ配列は、リンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）によりＦＶＩＩＩに連結されている（すなわち、Ｖ−Ｘ−Ｌ−ＦＶＩＩＩ）。
【０２２８】
ある実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）、（ｉｖ）ＦＶＩＩＩタンパク質、および、（ｖ）第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有し、ここで、ＶＷＦ断片は任意選択的なリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）によりＸＴＥＮ配列に連結されている。ＸＴＥＮ配列はさらに、リンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）により第一のＩｇ定常領域またはその一部に連結されていてもよい。ＦＶＩＩＩタンパク質（ＸＴＥＮ配列を含む、または含まない）もまた、任意選択的なリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）により、第二のＩｇ定常領域またはその一部に連結されていてもよい。ある実施態様において、キメラタンパク質はさらに、１以上のリンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）を、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば第一のＦｃ領域）と、第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば第二のＦｃ領域）の間、ＶＷＦ断片と第二のＩｇ定常領域またはその一部の間、または、ＦＶＩＩＩタンパク質と第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）の間に、含有する。
【０２２９】
一部の実施態様において、本発明は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）、および、（ｉｖ）第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有し、ここで、第一のＩｇ定常領域またはその一部、および第二のＩｇ定常領域またはその一部は、プロセッシング可能なリンカーにより連結されている。
【０２３０】
本発明に有用なリンカーは、任意の有機分子を含有してもよい。１つの実施態様において、リンカーは、ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））または、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含有する。他の実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列を含有する。リンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または、２０００アミノ酸を含有してもよい。リンカーは、１〜５アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１０〜５０アミノ酸、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、または、９００〜１０００アミノ酸を含有してもよい。１つの実施態様において、リンカーは、ＸＴＥＮ配列を含有する。追加例のＸＴＥＮを本発明に従い用いても良く、米国特許出願公開２０１０／０２３９５５４  Ａ１、２０１０／０３２３９５６  Ａ１、２０１１／００４６０６０  Ａ１、２０１１／００４６０６１  Ａ１、２０１１／００７７１９９  Ａ１、もしくは、２０１１／０１７２１４６  Ａ１、または、国際特許出願公開ＷＯ２０１００９１１２２
Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２  Ａ２、ＷＯ２０１０１４４５０８  Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２８  Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９  Ａ１、もしくは、ＷＯ２０１１０２８３４４  Ａ２に開示されている。他の実施態様において、リンカーは、ＰＡＳ配列である。
【０２３１】
本発明に有用なリンカーは、任意の有機分子を含有してもよい。１つの実施態様において、リンカーは、ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））または、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。他の実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列である。リンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または、２０００アミノ酸を含有してもよい。リンカーは、１〜５アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１０〜５０アミノ酸、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、または、９００〜１０００アミノ酸を含有してもよい。
【０２３２】
リンカーの例は、当分野に公知である。１つの実施態様において、リンカーは、配列Ｇｎを含有する。リンカーは、配列（ＧＡ）ｎを含有してもよい。リンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎを含有してもよい。他の実施態様において、リンカーは、配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５７）を含有する。さらに他の実施態様において、リンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５８）を含有する。これらの例において、ｎは、１〜１００の整数であってもよい。他の例において、ｎは、１〜２０の整数、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であっても良い。リンカーの例としては、限定されないが、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号６２）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６３）が挙げられる。リンカーは、ＶＷＦ断片の活性または第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を消去または減少させない。任意選択的に、リンカーは、たとえば、立体障害の影響をさらに減少させ、ＶＷＦ断片または第ＶＩＩＩ因子タンパク質を、その標的結合部位へより接近しやすくさせることにより、ＶＷＦ断片の活性または第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性を増強する。
【０２３３】
１つの実施態様において、キメラタンパク質に有用なリンカーは、１５〜２５アミノ酸の長さである。他の実施態様において、キメラタンパク質に有用なリンカーは、１５〜２０アミノ酸の長さである。一部の実施態様において、キメラタンパク質のリンカーは、１０〜２５アミノ酸の長さである。他の実施態様において、キメラタンパク質のリンカーは、１５アミノ酸の長さである。さらに他の実施態様において、キメラタンパク質のリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６４）であり、ここでＧは、グリシンを表し、Ｓはセリンを表し、そしてｎは、１〜２０の整数である。
【０２３４】
Ｆ）開裂部位
リンカーはまた、他分子から１分子を放出させるために、化学的に（たとえば、エステル結合の加水分解等）、酵素的に（すなわち、プロテアーゼ開裂配列の組み込み）、または光分解（たとえば、３−アミノ−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ））のいずれかで開裂することができる部分を組み込んでもよい。
【０２３５】
１つの実施態様において、リンカーは、開裂可能なリンカーである。開裂可能なリンカーは、Ｎ末端もしくはＣ末端またはその両方で、１以上開裂部位を含有してもよい。他の実施態様において、開裂可能なリンカーは、１以上の開裂可能な部位から本質的になる、または、からなる。他の実施態様において、開裂可能なリンカーは、本明細書に記述される異種アミノ酸リンカー配列、または、ポリマー、および１以上の開裂可能な部位を含有する。
【０２３６】
ある実施態様において、開裂可能なリンカーは、宿主細胞中で開裂することができる１以上の開裂部位（すなわち、細胞内プロセッシング部位）を芽乳する。開裂部位の非限定的な例として、ＲＲＲＲ（配列番号９）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０）、およびＲＲＲＲＳ（配列番号１１）が挙げられる。
【０２３７】
他の実施態様において、開裂可能なリンカーは、当該開裂可能なリンカーを含有するキメラタンパク質が対象に投与された後にプロテアーゼにより開裂される、１以上の開裂部位を含有する。１つの実施態様において、開裂部位は、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群から選択されるプロテアーゼにより開裂される。他の実施態様において、開裂部位は、ＸＩａ開裂部位（たとえば、ＫＬＴＲ↓ＡＥＴ（配列番号６５））、ＦＸＩａ開裂部位（たとえば、ＤＦＴＲ↓ＶＶＧ（配列番号６６））、ＦＸＩＩａ開裂部位（たとえば、ＴＭＴＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号６７））、カリクレイン開裂部位（たとえば、ＳＰＦＲ↓ＳＴＧＧ（配列番号６８））、ＦＶＩＩａ開裂部位（たとえば、ＬＱＶＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号６９））、ＦＩＸａ開裂部位（たとえば、ＰＬＧＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号７０））、ＦＸａ開裂部位（たとえば、ＩＥＧＲ↓ＴＶＧＧ（配列番号７１））、ＦＩＩａ（トロンビン）開裂部位（たとえば、ＬＴＰＲ↓ＳＬＬＶ（配列番号７２））、エラスターゼ−２開裂部位（たとえば、ＬＧＰＶ↓ＳＧＶＰ（配列番号７３））、グランザイム−Ｂ開裂（たとえば、ＶＡＧＤ↓ＳＬＥＥ（配列番号７４））、ＭＭＰ−１２開裂部位（たとえば、ＧＰＡＧ↓ＬＧＧＡ（配列番号７５））、ＭＭＰ−１３開裂部位（たとえば、ＧＰＡＧ↓ＬＲＧＡ（配列番号７６））、ＭＭＰ−１７開裂部位（たとえば、ＡＰＬＧ↓ＬＲＬＲ（配列番号７７））、ＭＭＰ−２０開裂部位（たとえば、ＰＡＬＰ↓ＬＶＡＱ（配列番号７８））、ＴＥＶ開裂部位（たとえば、ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ（配列番号７９））、エンテロキナーゼ開裂部位（たとえば、ＤＤＤＫ↓ＩＶＧＧ（配列番号８０））、プロテアーゼ３Ｃ（ＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ（登録商標））開裂部位（たとえば、ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ（配列番号８１））、およびソルターゼＡ開裂部位（たとえば、ＬＰＫＴ↓ＧＳＥＳ）（配列番号８２）からなる群から選択される。ある実施態様において、ＦＸＩａ開裂部位としては、限定されないが、たとえば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号８３）およびＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号８４）が挙げられる。トロンビン開裂部位の非限定的な例としては、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号８５）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号８６）、またはＬＶＰＲＧ（配列番号８７）、および、ＡＬＲＰＲ（配列番号１７）、（たとえば、ＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡ（配列番号８８））を含有する、本質的にからなる、または、からなる配列が挙げられる。
【０２３８】
特定の実施態様において、開裂部位は、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号８）である。
【０２３９】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明において、本明細書に記述される、（ａ）ＸＴＥＮ配列およびＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたＶＷＦ断片、（ｂ）ＸＴＥＮ配列およびＦｃに連結されたＦＶＩＩＩタンパク質、または、（ｃ）ＸＴＥＮ配列およびＶＷＦ断片に連結されるＦＶＩＩＩタンパク質、もまた開示される。キメラタンパク質が一本鎖ポリペプチドである場合（たとえば、Ｆ２−Ｌ２−Ｘ−Ｖ−Ｌ１−Ｆ１−ＦＶＩＩＩであり、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、Ｆ１は第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）を含有し、Ｌ１は第一のリンカーを含有し、ＶはＶＷＦ断片を含有し、ＸはＸＴＥＮ配列を含有し、Ｌ２は第二のリンカーを含有し、および、Ｆ２は第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有する）、本発明は、一本鎖ポリペプチドをコードする一本鎖ポリヌクレオチドを含有する。キメラタンパク質が第一および第二のポリペプチド鎖を含有する場合（Ｆ２−Ｌ２−Ｘ−Ｖ：ＦＶＩＩＩ−Ｆ１）、第一のポリペプチド鎖はＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦ断片を含有し、それはさらに、開裂可能なリンカーにより第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）に連結され（たとえば、Ｆ２−Ｌ２−Ｘ−Ｖ）、および、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩタンパク質および第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有し（たとえば、ＦＶＩＩＩ−Ｆ１）、ここで、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は互いに関連し、ポリヌクレオチドは第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列を含有してもよい。１つの実施態様において、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、一本鎖ポリヌクレオチドによりコードされてもよい。他の実施態様において、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、２つの異なるポリヌクレオチド（すなわち、第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列）によりコードされる。他の実施態様において、第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列は、２つの異なるポリヌクレオチド上にある（たとえば、異なるベクター）。ある実施態様において、本発明は、第一のヌクレオチド鎖および第二のヌクレオチド鎖を含有するポリヌクレオチドのセットを目的とするものであり、ここで、第一のヌクレオチド鎖は、キメラタンパク質のＶＷＦ断片をコードし、および、第二のヌクレオチド鎖は、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする。一部の実施態様において、２つのポリペプチド鎖または３つのポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質は、一本鎖ポリヌクレオチドによりコードされ、次いで、２または３（またはそれ以上）のポリペプチド鎖にプロセッシングされてもよい。さらに他の実施態様において、これらのポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質は、２または３のポリヌクレオチド鎖によりコードされてもよい。
【０２４０】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドのセットはさらに、タンパク質転換酵素をコードする、追加のヌクレオチド鎖（たとえば、キメラポリペプチドが一本鎖ポリヌクレオチドによりコードされる場合の第二のヌクレオチド鎖、または、キメラタンパク質が２つのポリヌクレオチド鎖によりコードされる場合の、第三のヌクレオチド鎖）を含有する。タンパク質転換酵素は、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）／５型ケキシン（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／７型ケキシン（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋｅｘ２、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／３型ケキシン（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）、およびそれらの２以上の組み合わせからなる群から選択されてもよい。一部の実施態様において、タンパク質転換酵素は、ＰＡＣＥ、ＰＣ５、またはＰＣ７である。特定の実施態様において、タンパク質転換酵素は、ＰＣ５またはＰＣ７である。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６８を参照のこと。
【０２４１】
本明細書において、発現ベクターとは、適切な宿主細胞へと導入された際に、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有する任意の核酸構築物を指し、ＲＮＡウイルスベクターの場合には、適切な宿主細胞へと導入された際に、複製および翻訳にとって必要な要素を含有する任意の核酸構築物を指す。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスおよびその誘導体が含まれる。
【０２４２】
本発明の発現ベクターは、本明細書に記述されるキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。１つの実施態様において、ＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ、ＦＶＩＩＩタンパク質およびＸＴＥＮ、またはその両方に対するコード配列のうちの１つ以上が、発現制御配列に作動可能に連結されている。本明細書において、各構成核酸配列がその機能性を保持するように共有結合的に連結されている場合、２つの核酸配列が作動可能に連結されている。遺伝子発現制御配列の影響の下、または制御の下で、コード配列の発現または転写および／もしくは翻訳が発生するように共有結合的に連結されている場合、コード配列および遺伝子発現制御配列は作動可能に連結されているとみなされる。もし、５´遺伝子発現配列のプロモーターの誘導によってコード配列の転写が生じ、および、２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質によって、（１）フレームシフト変異の導入がもたらされない、（２）コード配列の転写を誘導するプロモーター領域の活性が妨げられない、または、（３）タンパク質へと翻訳される、対応するＲＮＡ転写物の活性が妨げられない、場合に、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されているとみなされる。ゆえに、もし、遺伝子発現配列が、コード核酸配列の転写を生じさせることができ、それによって、得られた転写物が所望されるタンパク質またはポリペプチドへと翻訳される場合には、その遺伝子発現配列は、コード核酸配列に作動可能に連結されている。
【０２４３】
本明細書において、遺伝子発現制御配列は、たとえば、プロモーター配列または、プロモーター−エンハンサーの組み合わせ等の、任意の制御性ヌクレオチド配列であり、それらが作動可能に連結されているコード核酸の効率的な転写および翻訳を促進する。遺伝子発現制御配列は、たとえば、哺乳類またはウイルスプロモーター（たとえば、構造性プロモーターまたは誘導性プロモーター）であってもよい。構造性哺乳類プロモーターとしては、限定ｓあれないが、以下の遺伝子に対するプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、βアクチンプロモーター、および他の構造性プロモーター。真核細胞において構造的に機能するウイルスプロモーターの例としては、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（たとえば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルス由来のプロモーター、および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構造性プロモーターも、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとしてはまた、誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。たとえば、メタロチオネインプロモーターは、ある金属イオンの存在下で、転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターも、当業者に公知である。
【０２４４】
一般的に、遺伝子発現制御配列として、必要に応じて、転写および翻訳の開始に関与する、それぞれ、５´非転写配列および５´非翻訳配列（たとえば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等）が含まれる。特に、そのような５´非転写配列は、作動可能に接続されたコード核酸の転写制御に対するプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含有する。遺伝子発現配列は、任意選択的に、エンハンサー配列、または、所望される上流の活性化配列を含有する。
【０２４５】
ウイルスベクターとしては、限定されないが、以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられる：たとえば、モロニーマウス白血病ウイルス、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；および、たとえばレトロウイルス等のＲＮＡウイルス。当分野公知の他のベクターも容易に使用することができる。あるウイルスベクターは、非必須遺伝子が、対象の遺伝子と置換されている、非細胞変性の真核生物ウイルスに基づいている。非細胞変性ウイルスとしては、レトロウイルスが挙げられ、そのライフサイクルには、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、次いで、宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス融合が含まれている。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療の治験が承認されている。最も有用なレトロウイルスは、複製欠損しているレトロウイルス（すなわち、所望されるタンパク質の合成を誘導することはできるが、感染性粒子の製造を行うことはできない）である。そのような遺伝子改変されたレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて高効率で遺伝子を形質導入するという様々な実用性を有する。複製欠損レトロウイルス製造の標準的なプロトコール（外来性遺伝子物質のプラスミドへの組み込み、プラスミドを有するパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、および標的細胞へのウイルス粒子の感染、の工程を含む）は、Kriegler,M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual,W.H. Freeman Co., NewYork (1990)、および、Murry, E. J.,Methods in Molecular Biology, Vol.
7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)に提示されている。
【０２４６】
１つの実施態様において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは遺伝子操作して、複製欠損とすることができ、そして、広範囲の細胞型および種に感染することができる。さらに、たとえば熱安定性および油性溶媒安定性；多様な系統の細胞（造血系細胞を含む）における、高い形質導入頻度；重複感染阻害の欠落により、複数種の形質導入が可能、等の利点を有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的な様式でヒト細胞ＤＮＡへ組み込むことができ、それにより、挿入による突然変異の可能性および、レトロウイルス感染による、挿入遺伝子発現の特性の変動の可能性を最小限とすることができる。さらに野生型のアデノ随伴ウイルスの感染は、選択圧力無しで、１００回超の組織培養継代において観察されていることから、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定な事象であることが暗示される。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の環境でも機能することができる。
【０２４７】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当分野で広範囲に評価され、当業者に公知である。たとえば、Sambrook etal., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989を参照のこと。ここ数年において、プラスミドベクターは宿主ゲノム内を置換す
ることができず、および宿主ゲノム内に組み込まれることができないことから、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞へと遺伝子を送達する場合において特に有利であることが判明している。しかしながら、宿主細胞と同等のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。市販されている、普遍的に用いられているプラスミドのいくつかを挙げると、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、様々なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、様々なｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０、および、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔがある。具体的なプラスミドの追加例としては、ｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６３２０；および、ｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ．）より入手）が挙げられる。他のプラスミドも、当業者に公知である。さらに、標準的な分子生物学的技法を用いてプラスミドのカスタム設計を行い、特定のＤＮＡ断片を除去および／または付加してもよい。
【０２４８】
本発明のタンパク質を産生するために用いられうる、１つの昆虫発現システムにおいて、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、外来性遺伝子を発現する。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で成長する。コード配列は、ウイルスの非必須領域（たとえば、多角体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）遺伝子）へとクローニングされ、ＡＣＮＰＶプロモーター（たとえば、多角体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター）の制御下に置かれても良い。コード配列が成功裏に挿入されると、多角体遺伝子の不活化および非閉塞ウイルスの産生（すなわち、多角体遺伝子によりコードされるタンパク質性のコートを欠損するウイルス）がもたらされる。次いで、これらの組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させる。（たとえば、Smithet al. (1983) J Virol 46:584；米国特許第４，２１５，０５１号を参照のこと）。この発現システムのさらなる例は、Ausubel etal., eds. (1989) Current Protocols in MolecularBiology, Vol. 2, Greene Publish.Assoc. & Wiley Interscienceに見出すことができる。
【０２４９】
本発明のタンパク質を発現するために用いることができる他のシステムは、グルタミン合成酵素遺伝子発現システム（「ＧＳ発現システム」とも呼称される（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ，  Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ  ＵＫ））である。この発現システムは、米国特許第５，９８１，２１６号に詳述されている。
【０２５０】
哺乳類宿主細胞においては、多くのウイルスベースの発現システムを用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（たとえば、後期プロモーターおよび三連リーダー配列）へとライゲートされてもよい。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子組み換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入により、感染宿主内で生存することができ、およびペプチドを発現することができる、組換えウイルスが得られる。たとえば、Logan& Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655)を参照のこと。あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを用いてもよい。たとえば、Mackettet al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415;Mackett et al. (1984) J Virol49:857; Panicali et al.(1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927を参照のこと。
【０２５１】
産生効率を上げるために、酵素開裂部位により分離された、本発明のタンパク質の複数のユニットをコードするようにポリヌクレオチドを設計してもよい。得られたポリペプチドを開裂して（たとえば、適切な酵素で処理することにより）、ポリペプチド単位で回収することができる。これにより、１つのプロモーターにより為されるポリペプチドの産生量を増加させることができる。適切なウイルス発現システムを用いた場合、ｍＲＮＡによりコードされる各ポリペプチドの翻訳は、転写物の内部で指示される（たとえば、内部リボソーム侵入部位、ＩＲＥＳ）。従って、ポリシストロニックな構築物は、単一の、大きなポリシストロニックのｍＲＮＡの転写を指示し、同様に、複数の、個々のポリペプチドの翻訳を指示する。この方法により、ポリプロテインの産生および酵素処理が省略され、１つのプロモーターによりなされるポリペプチドの産生量が著しく増加しうる。
【０２５２】
形質転換に用いられるベクターは通常、形質転換体を特定するために用いられる選択マーカーを含有する。昆虫システムにおいては、たとえばアンピシリンまたはカナマイシン等の抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。培養哺乳類細胞に用いるための選択マーカーとしては、薬物（たとえば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート等）に対する抵抗性を寄与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであっても良い。１つの増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子である。SimonsenC C et al. (1983) Proc Natl Acad SciUSA 80:2495-9。選択マーカーは、Thilly (1986)Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers,Stoneham, Mass.により、概説されており、選択マーカーの選択は、当業者レベルの範囲内
である。
【０２５３】
選択マーカーは、対象の遺伝子と同時に、別々のプラスミド上で、細胞内へと導入されてもよく、または、同じプラスミド上で導入されてもよい。もし同じプラスミド上にある場合、選択マーカーおよび対象遺伝子は、異なるプロモーターの制御下にあっても、同一のプロモーターの制御下にあってもよく、後者の配置の場合には、ジシストロニックなメッセンジャーが産生される。このタイプの構築物は当業者公知である（たとえば、米国特許第４，７１３，３３９号）。
【０２５４】
発現ベクターは、遺伝子組み換え的に産生されたタンパク質の精製を容易にするためのタグをコードしてもよい。例としては、限定されないが、発現されるタンパク質のコード配列が、ｌａｃＺコード領域と共にインフレームでベクターへとライゲートされ、それによりタグ化された融合タンパク質が産生される、ｐＵＲ２７８が挙げられ（Rutheret al. (1983) EMBO J 2:1791）；ｐＧＥＸベクターを用いて、本発明のタンパク質を、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグと共に発現してもよい。これらのタンパク質は通常可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへ吸着させ、次いで、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、細胞から容易に精製することができる。当該ベクターは、精製後にタグを容易に除去するために、開裂部位（トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ、またはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｅａｐａｃｋ，  Ｎ．Ｊ．））を含有する。
【０２５５】
次いで、発現ベクター（複数含む）を、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞へとトランスフェクト、または共トランスフェクトする。当分野公知のトランスフェクション法としては、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿（Wigleret al. (1978) Cell 14:725）、エレクトロポレーション（Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841）、および、リポソームベースの試薬が挙げられる。原核細胞および真核細胞の両方を含む、様々な宿主−発現ベクターシステムを用いて、本明細書に記述されるタンパク質を発現させてもよい。これらとしては、限定されないが、たとえば、適切なコード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（たとえば、大腸菌）等の微生物；適切なコード配列を含有する、組換え酵母発現ベクターまたは組換え真菌発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌；適切なコード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞システム；適切なコード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）で感染させた、または、組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞システム；または、哺乳類細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ、ＨＫＢ１１、およびＢＨＫ細胞）を含む、動物細胞システムが挙げられる。
【０２５６】
１つの実施態様において、宿主細胞は、真核細胞である。本明細書において、真核細胞とは、限定的な核を有する任意の動物細胞または植物細胞を指す。動物の真核細胞としては、脊椎動物（たとえば、哺乳類）の細胞、および無脊椎動物（たとえば、昆虫）の細胞が挙げられる。植物の真核細胞では特に、限定されないが、酵母細胞を含むことができる。真核細胞は原核細胞（たとえば、細菌）とは明確に異なる。
【０２５７】
ある実施態様において、真核細胞は、哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、哺乳類由来の任意の細胞である。哺乳類細胞として特に、限定されないが、哺乳類細胞株が挙げられる。１つの実施態様において、哺乳類細胞は、ヒトの細胞である。他の実施態様において、哺乳類細胞は、ヒトの胎児腎細胞株である、ＨＥＫ２９３細胞である。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＲＬ−１５３３として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡから入手可能であり、または、２９３−Ｈ細胞として、カタログ番号１１６３１−０１７で、または、２９３−Ｆ細胞として、カタログ番号１１６２５−０１９として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。一部の実施態様において、哺乳類細胞は、網膜由来のヒト細胞株である、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）である。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、Ｃｒｕｃｅｌｌ（Ｌｅｉｄｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である。他の実施態様において、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ．（たとえば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＣＣＬ−６１）から入手可能である。さらに他の実施態様において、哺乳類細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。ＢＨＫ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ．（たとえば、ＣＲＬ−１６３２）から入手可能である。一部の実施態様において、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞とヒトＢ細胞株のハイブリッド細胞株である、ＨＫＢ１１細胞である。Meiet al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006)。
【０２５８】
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）融合コード配列、ＶＷＦ断片−Ｌ−Ｆｃ融合コード配列、またはそれら両方、および、選択マーカー（たとえば、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）抵抗性）を含有するプラスミドが、キメラタンパク質産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトされる。
【０２５９】
他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合コード配列、ＶＷＦ断片−ＸＴＥＮ−Ｌ−Ｆｃ融合コード配列、またはその両方、および選択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗性）を含有するプラスミドを、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトする。
【０２６０】
他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）−Ｆｃ融合コード配列、Ｆｃコード配列、またはその両方、および選択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗性）を含有するプラスミドを、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトする。
【０２６１】
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）−融合コード配列および第一の選択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗性遺伝子）を含有する第一のプラスミド、ならびに、Ｆｃコード配列またはＶＷＦ断片−Ｌ−Ｆｃコード配列および第二の選択マーカー（たとえば、ネオマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第二のプラスミド、ならびに、タンパク質転換酵素コード配列および第三の選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第三のプラスミド、を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトする。第一および第二のプラスミドは、等量（すなわち、１：１のモル比）で導入されてもよく、または、非等量で導入されてもよい。
【０２６２】
さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合コード配列および第一の選択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗性遺伝子）を含有する第一のプラスミド、ならびに、ＶＷＦ断片−ＸＴＥＮ−Ｌ−Ｆｃコード配列および第二の選択マーカー（たとえば、ネオマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第二のプラスミド、ならびに、タンパク質転換酵素コード配列および第三の選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第三のプラスミド、を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトする。第一および第二のプラスミドは、等量（すなわち、１：１のモル比）で導入されてもよく、または、非等量で導入されてもよい。
【０２６３】
さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）−Ｆｃ融合コード配列および第一の選択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗性遺伝子）を含有する第一のプラスミド、ならびに、ＶＷＦ断片−ＸＴＥＮ−Ｌ−Ｆｃコード配列および第二の選択マーカー（たとえば、ネオマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第二のプラスミド、ならびに、タンパク質転換酵素コード配列および第三の選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第三のプラスミド、を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトする。第一および第二のプラスミドは、等量（すなわち、１：１のモル比）で導入されてもよく、または、非等量で導入されてもよい。
【０２６４】
ある実施態様において、ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮを伴う、または伴わない）−Ｆ１−Ｌ１−Ｖ−ＸＴＥＮ−Ｌ２−Ｆ２コード配列および第一の選択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗性遺伝子）を含有する第一のプラスミド、ならびに、タンパク質転換酵素コード配列および第二の選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第二のプラスミド、を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトする。ＦＶＩＩＩ（Ｘ）−Ｆｃコード配列およびＶＷＦ−ＸＴＥＮ−Ｆｃコード配列に対するプロモーターは、異なっていてもよく、または、同一であっても良い。
【０２６５】
さらに他の実施態様において、トランスフェクト細胞は、安定的にトランスフェクトされている。当業者公知の標準的な技術を用いてこれらの細胞を選択し、安定細胞株として維持してもよい。
【０２６６】
タンパク質のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞を、適切な増殖培地中で増殖させる。本明細書において、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖に必要とされる栄養素を含有する培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養素は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、および増殖因子を含有してもよい。任意選択的に、培地は、１以上の選択因子を含有してもよい。任意選択的に、培地は、仔牛血清またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有しても良い。１つの実施態様において、培地は、実質的にＩｇＧを含有しない。増殖培地は一般的に、たとえば、薬剤選択または必須栄養素の欠損（ＤＮＡ構築物上の選択マーカーにより補完される、またはＤＮＡ構築物とともに共トランスフェクトされる）等により、ＤＮＡ構築物を含有する細胞に対して選択される。培養哺乳類細胞は通常、市販の血清含有培地、または無血清培地（たとえば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等）で増殖する。１つの実施態様において、培地は、ＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ．）である。他の実施態様において、培地は、ＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ．）である。使用する特定の細胞株に対して適切な培地の選択は、当業者レベルの範囲内にある。
【０２６７】
キメラタンパク質の２つのポリペプチド鎖を共発現させるために、宿主細胞を、両鎖の発現が可能となるような条件下で培養する。本明細書において、培養する、とは、少なくとも所定の時間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生きている細胞を維持することを指す。維持とは、生細胞群を必ずしも増殖させなくともよい。たとえば、培養で維持されている細胞は、数に変化がなくてもよいが、生きており、所望の産物（たとえば、組換えタンパク質または組換え融合タンパク質）を産生することができる。真核細胞培養のための適切な条件は当分野で公知であり、培養培地の適切な選択、培地の補完、温度、ｐＨ、酸素飽和度等が含まれる。商業目的に関しては、攪拌フラスコ、ローラーボトル、中空糸バイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクターエアリフトバイオリアクター、ウェーブバイオリアクター等を含む、様々なタイプの任意のスケールアップシステムの使用を培養に含んでも良い。
【０２６８】
また、細胞培養条件は、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の関連が可能となるように選択される。ＶＷＦ断片および／またはＦＶＩＩＩタンパク質の発現が可能となる条件には、ビタミンＫ源の存在が含まれうる。たとえば、１つの実施態様において、安定的トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、４ｍＭのグルタミンを補完されたＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ．）またはＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ．）中で培養される。
【０２６９】
１つの態様において、本発明は、ａ）キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞をトランスフェクトすること、および、ｂ）キメラタンパク質を発現するために適した条件の下で培養培地中の宿主細胞を培養することであって、ここで、当該キメラタンパク質は発現されている、ことを含む、本発明のキメラタンパク質を発現、作製または製造する方法を目的とする。
【０２７０】
さらなる実施態様において、ＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦ断片、または、ＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質を含有するタンパク質産物は、培地中に分泌される。培地を、細胞から分離し、濃縮し、ろ過し、次いで、２、または３のアフィニティカラム（たとえば、プロテインＡ）および１または２の陰イオン交換カラムに通す。
【０２７１】
ある態様において、本発明は、本明細書に記述される方法により製造されたキメラタンパク質に関する。
【０２７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産により、本発明の所望される改変ポリペプチドを大量に得るためのスケールアップが可能となる。組織培養条件下での、哺乳類細胞培養の技法は当分野公知であり、同種浮遊培養（たとえば、エアリフトバイオリアクター、または連続攪拌リアクター等にて）、または、固定細胞培養またはエントラップ細胞培養（たとえば、中空糸にて、マイクロカプセルにて、アガロースマイクロビーズ上で、またはセラミックカートリッジ上で）が挙げられる。もし必要であれば、および／または、所望の場合には、ポリペプチドの溶液を、通常のクロマトグラフィ法（たとえば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥ−セルロースを通すクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等）により精製してもよい。
【０２７３】
医薬組成物
本発明のキメラタンパク質を含有する組成物は、適切な薬学的に受容可能な担体を含有してもよい。たとえば、活性化合物が、作用部位への送達のために設計された調製物へプロセッシングされることを促進する、賦形剤および／または補助剤を含有してもよい。
【０２７４】
医薬組成物は、ボーラス注入による非経口投与（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内）のために処方されてもよい。注入のための剤型は、単位投与量の形態（たとえば、アンプル、または防腐剤が添加された複数投与用容器）であってもよい。組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または、乳濁液等の形態であってもよく、たとえば、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤等の処方剤を含有してもよい。あるいは、活性成分は、適切なビヒクル（たとえば、発熱物質の無い水）との構成のための、粉末形態であってもよい。
【０２７５】
また、非経口投与のための適切な剤型としては、水溶性の形態（たとえば、水溶性の塩）の活性化合物の水性溶液が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液として、活性化合物の懸濁液が投与されてもよい。適切な脂溶性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（たとえば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（たとえば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる物質（たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストラン等）を含有してもよい。任意選択的に、懸濁液はまた、安定化剤を含有しても良い。また、リポソームを使用して、細胞または間質空間への送達のために、本発明の分子をカプセル化してもよい。薬学的に受容可能な担体の例は、生理学的適合性を有する溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。一部の実施態様において、組成物は、等張剤（たとえば、糖類、ポリアルコール類（たとえば、マンニトール、ソルビトール）、または塩化ナトリウム）を含有する。他の実施態様において、組成物は、たとえば湿潤剤等の薬学的に受容可能な物質、または少量の補助物質（たとえば、湿潤剤または乳化剤）、保存剤または緩衝剤を含有し、それにより、活性成分の有効期間または有効性が増強される。
【０２７６】
本発明の組成物は、たとえば、液体（たとえば、注射用溶液および不溶解性溶液等）、分散液、懸濁液、半固体および固体の剤型等を含む、様々な形態であってもよい。好ましい形態は投与方法および治療アプリケーションに依存する。
【０２７７】
組成物は、溶液、微乳濁液、分散液、リポソーム、または他の高薬剤濃度に適した規則構造として製剤化されてもよい。滅菌注射可能溶液は、適切な溶媒に溶解した必要量の活性成分と、必要に応じて、上述の成分の１つ、または組み合わせと組み合わせ、ろ過滅菌を行うことにより、調製されてもよい。一般的に、分散剤は、活性成分を、基礎分散培地および上述の必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルへと組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液の調製のための、滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、前もって滅菌ろ過された溶液から、所望される任意の追加成分と活性成分の粉末を得る。溶液の適切な流動性は、たとえば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および、界面活性剤の使用により、維持されてもよい。たとえば、モノステアリン酸塩およびゼラチン等の吸収を遅延させる剤を組成物中に含有させることにより、注射組成物の吸収を遅延させてもよい。
【０２７８】
活性成分は、制御放出された剤型またはデバイスで、製剤化されてもよい。そのような剤型またはデバイスの例としては、インプラント、経皮貼布、およびマイクロカプセル化デリバリーシステムが挙げられる。生分解性で、生物適合性のあるポリマー（たとえば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等）を用いても良い。そのような製剤およびデバイスの調製方法は当分野公知である。たとえば、Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems, J.
R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
【０２７９】
注射用デポ製剤は、たとえば、ポリラクチド‐ポリグリコリド等の生分解性ポリマーに、マイクロカプセル化した薬物基質を形成することにより作製されてもよい。ポリマーに対する薬物の比率、および用いられるポリマーの性質に依存して、薬物の放出率を制御することができる。他の例示的な生分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリ無水物である。また、注射用デポ製剤は、薬物をリポソームまたは微乳濁液中に封入することにより調製してもよい。
【０２８０】
補充用活性化合物を、組成物へと組み込んでも良い。１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、他の凝固因子、またはその変異体、断片、アナログ、もしくは誘導体と製剤化される。たとえば、凝固因子としては、限定されないが、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子もしくは組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）または、前述の任意のものの活性化形態が挙げられる。また、止血剤の凝固因子に、抗線維素溶解剤（たとえば、イプシロン−アミノ−カプロン酸、トラネキサム酸等）を含有してもよい。
【０２８１】
投与レジメンは、最適な所望の応答が得られるように調節されてもよい。たとえば、１回の急速投与を行っても良く、時間をかけて数回に分割された投与を行っても良く、または、処置状況の緊急性により示されるように、投与量を比例的に減少または増加させてもよい。投薬量単位の形態で非経口組成物を製剤化すると、投与の簡便さ、そして投与量の均一性の点で有利である。たとえば、Remington'sPharmaceutical Sciences (Mack Pub.
Co., Easton, Pa.1980)を参照のこと。
【０２８２】
液体の投薬形態は、活性化合物に加え、不活性成分（たとえば、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル等）を含有してもよい。
【０２８３】
適切な薬学的担体の非限定的な例はまた、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin.に記述されている。賦形剤のいくつかの例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物はまた、ｐＨ緩衝試薬および湿潤剤もしくは乳化剤を含有してもよい。
【０２８４】
経口投与に対しては、医薬組成物は、標準的な手段で調製された錠剤またはカプセルの形態であってもよい。組成物はまた、たとえばシロップまたは懸濁液等の液体として調製されてもよい。液体には、懸濁化剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂等）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（たとえば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画化植物油）、および保存剤（たとえば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）が含まれても良い。調製物はまた、香味剤、着色剤および甘味剤を含有してもよい。あるいは、組成物は、水または他の適切なビヒクルとの構成のための乾燥製品であってもよい。
【０２８５】
口腔投与に対しては、組成物は、標準的なプロトコールに従った、錠剤またはトローチ剤の形態であってもよい。
【０２８６】
吸入による投与に対しては、本発明に従う使用のための化合物は、賦形剤を伴う、または伴わないネブライザー用エアロゾルの形態で、または、任意選択的に、高圧ガス（たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）とともに、加圧パックもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で、簡便に送達される。加圧されたエアロゾルの場合には、投薬量の単位は、測定された量を送達するようにバルブを規定することで、決定されてもよい。吸入具または吸入器における使用のために、たとえば、ゲラチン等のカプセルおよびカートリッジは、化合物と、適切な粉末ベース（たとえば、ラクトースまたはデンプン等）の粉末混合物を含有して処方されてもよい。
【０２８７】
医薬組成物はまた、座薬または停留浣腸として（たとえば、ココアバターまたは他のグリセリド等の、標準的な座薬ベースを含有して）、直腸投与用に製剤化されてもよい。
【０２８８】
１つの実施態様において、医薬組成物は、キメラタンパク質、当該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含有するベクター、または当該ベクターを含有する宿主細胞と、薬学的に受容可能な担体を含有する。キメラタンパク質中のＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質または、ＶＷＦ断片の無い対照ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、半減期が延長されている。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍、野生型ＦＶＩＩＩよりも長い。他の実施態様において、第ＶＩＩＩ因子の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
【０２８９】
一部の実施態様において、組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および経口投与からなる群から選択される経路により投与される。非経口投与は、静脈内投与または皮下投与であってもよい。
【０２９０】
他の実施態様において、組成物は、その必要のある対象における出血性疾患または状態を処置するために用いられる。出血性疾患または状態は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。さらに他の実施態様において、対象は、外科手術を受ける予定である。さらに他の実施態様において、処置は、予防的に、または要求に応じて行われる。
【０２９１】
遺伝子治療
本発明のキメラタンパク質は、治療的に有益であろう、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋鞘の出血からなる群から選択される出血性疾患または障害の治療に対する遺伝子治療法を用いて、哺乳類（たとえば、ヒト患者）において、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生されてもよい。１つの実施態様において、出血性疾患または障害は、血友病である。他の実施態様において、出血性疾患または障害は、血友病Ａである。これには、適切な発現制御配列に作動可能に連結された、適切なキメラタンパク質をコードする核酸の投与が含まれる。ある実施態様において、これらの配列は、ウイルスベクターへと組み込まれている。そのような遺伝子治療に適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。他の実施態様において、アデノウイルスベクターは、そのＥ１遺伝子およびＥ３遺伝子を欠損している。アデノウイルスベクターを用いる場合、哺乳動物は、選択マーカー遺伝子をコードする核酸に曝露されなくともよい。他の実施態様において、配列は、当業者公知の非ウイルス性ベクターへと組み込まれる。
【０２９２】
キメラタンパク質を使用する方法
本発明は、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質への結合を妨害または抑制するために、本明細書に記述されるキメラタンパク質を使用する方法を目的とする。本発明はまた、ＸＴＥＮおよびＩｇ定常領域またはその一部に連結されたＦＶＩＩＩを有するキメラタンパク質を使用する方法を目的とする。
【０２９３】
本発明の１つの態様は、ＦＶＩＩＩ上のＶＷＦ結合部位を妨害または隠蔽することにより、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩの相互作用を妨害または抑制し、同時に、Ｉｇ定常領域またはその一部（それらはまた、半減期伸長物質であってもよい）と組み合わせて、ＸＴＥＮ配列を用いてＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することを目的とする。１つの実施態様において、本発明は、野生型ＦＶＩＩＩよりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩタンパク質を構築する方法を目的とする。１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、キメラタンパク質中のＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用を抑制または妨害する。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用を抑制または妨害する。本方法に有用なキメラタンパク質は、本明細書に記述される任意の１以上のキメラタンパク質が挙げられる。
【０２９４】
本発明の他の態様において、野生型ＦＶＩＩＩよりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質を、その必要のある対象に投与する方法が含まれ、ここで、当該方法は、本明細書に記述されるキメラタンパク質を当該対象に投与することを含む。
【０２９５】
１つの実施態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用を妨害または抑制するためのＶＷＦ断片、ならびに、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長するためのＸＴＥＮ配列およびＩｇ定常領域またはその一部、を用いる方法を目的とする。ＸＴＥＮ配列に連結され、次いで、ＶＷＦ断片に結合または関連したＦＶＩＩＩタンパク質（たとえば、ＦＶＩＩＩ（Ｘ））は、ＶＷＦのクリアランス経路から遮蔽または保護され、それによって、ＶＷＦ断片に結合されていないＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、除去されることが減少する。ゆえに、遮蔽されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列およびＶＷＦ断片に結合または関連していないＦＶＩＩＩタンパク質と比較し、半減期が最大限延長されている。ある実施態様において、ＶＷＦ断片と関連またはＶＷＦ断片により保護され、および、ＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦクリアランス受容体により除去されない。他の実施態様において、ＶＷＦ断片と関連またはＶＷＦ断片により保護され、ＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦ断片と関連または保護されていないが、ＸＴＥＮ配列に連結されている、ＦＶＩＩＩタンパク質よりもゆっくりと身体から除去される。
【０２９６】
１つの態様において、ＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質、または、ＸＴＥＮに連結されたＶＷＦ断片に結合もしくは関連したＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質は、当該ＶＷＦ断片がＶＷＦクリアランス受容体結合部位を含有していないため、循環系からの除去が減少する。ＶＷＦ断片は、当該ＶＷＦ断片に結合または関連したＦＶＩＩＩの、ＶＷＦクリアランス経路を介した身体からの除去を妨害または抑制する。本発明に有用なＶＷＦ断片はまた、内因性ＶＷＦによりもたらされる、ＶＷＦ様のＦＶＩＩＩ保護特性の少なくとも１つ以上をもたらし得る。ある実施態様において、ＶＷＦ断片またはＸＴＥＮ配列はまた、１以上のＦＶＩＩＩクリアランス受容体結合部位を隠すことができ、それによって、それ自身のクリアランス経路による、ＦＶＩＩＩの除去を妨害することができる。
【０２９７】
一部の実施態様において、ＶＷＦ断片またはＸＴＥＮ配列による、内因性ＶＷＦへのＦＶＩＩＩタンパク質の結合の妨害または抑制は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。
【０２９８】
また、本明細書に記述されるキメラタンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を増加させる方法が提示される。全長ＶＷＦに結合または関連した、非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は、血漿中で約１２〜１４時間である。３型ＶＷＤにおいて（ここで、循環系にはほとんどＶＷＦは存在しない）、ＦＶＩＩＩの半減期は、およそ６時間のみであり、これにより、ＦＶＩＩＩの濃度減少に起因する、そのような患者における軽度〜中度の血友病Ａの症状がもたらされる。本発明のＶＷＦ断片またはＸＴＥＮ配列に連結または関連したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、全長ＶＷＦに結合または関連した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期よりも、少なくとも約１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．６倍、２．７．倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、または４．０倍、長く延長されてもよい。
【０２９９】
１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列を含有するキメラタンパク質中で、ＶＷＦ断片に連結または関連したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期、または、Ｉｇ定常領域またはその一部に連結したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、全長ＶＷＦに結合または関連した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期よりも、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍、長く延長される。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列を含有するキメラタンパク質中で、ＶＷＦ断片またはＩｇ定常領域もしくはその一部に連結または関連したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、全長ＶＷＦまたは野生型ＦＶＩＩＩに結合または関連した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期よりも、約２〜約５倍、約３〜約１０倍、約５〜約１５倍、約１０〜約２０倍、約１５〜約２５倍、約２０〜約３０倍、約２５〜約３５倍、約３０〜約４０倍、約３５〜約４５倍、長く延長される。特定の実施態様において、ＸＴＥＮ配列を含有するキメラタンパク質中で、ＶＷＦ断片に連結または関連したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期、またはＩｇ定常領域に連結したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＦＶＩＩＩとＶＷＦのダブルノックアウトマウス中の野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、少なくとも約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０倍長く延長される。
【０３００】
一部の実施態様において、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）およびＸＴＥＮ配列に融合されたＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列および第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質、を含有するキメラタンパク質の半減期は、内因性ＶＷＦに関連したＦＶＩＩＩの半減期よりも長い。他の実施態様において、キメラタンパク質の半減期は、内因性ＶＷＦと関連したＦＶＩＩＩタンパク質、または野生型ＦＶＩＩＩの半減期の少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．５倍、または５．０倍である。
【０３０１】
一部の実施態様において、本発明の結果として、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩと比較して、延長されている。本発明のキメラタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍、長い。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、約１．５倍〜約２０倍、約１．５倍〜約１５倍、または、約１．５倍〜約１０倍、長い。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩの半減期は、ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩと比較して、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約２倍〜約３倍、約２．５倍〜約１０倍、約２．５倍〜約９倍、約２．５倍〜約８倍、約２．５倍〜約７倍、約２．５倍〜約６倍、約２．５倍〜約５倍、約２．５倍〜約４倍、約２．５倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約６  ｆｏｌｄ，  約５倍〜約７倍、または、約６倍〜約８倍、延長されている。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約  ２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。さらに他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質の半減期は、約１５  時間〜約２週間、約１６時間〜約１週間、約１７時間〜約１週間、約１８時間〜約１週間、約１９時間〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約２１時間〜約１週間、約２２時間〜約１週間、約２３時間〜約１週間、約２４時間〜約１週間、約３６時間〜約１週間、約４８時間〜約１週間、約６０時間〜約１週間、約２４時間〜約６日、約２４時間〜約５日、約２４時間〜約４日、約２４時間〜約３日、または、約２４時間〜約２日である。
【０３０２】
一部の実施態様において、本発明のキメラタンパク質の対象ごとの平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日）、約８４時間、約９６時間（４日）、約１０８時間、約１２０時間（５日）、約６日、約７日（１週）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、または約１４日である。
【０３０３】
さらに、本発明は、キメラタンパク質の有効量を投与することを含む、出血性疾患または障害を処置または予防する方法を提示する。１つの実施態様において、出血性疾患または障害は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血からなる群から選択される。特定の実施態様において、出血性疾患または障害は、血友病Ａである。
【０３０４】
本明細書に記述される、ＶＷＦ断片（本発明により調製された、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の相互作用を妨害または抑制する）と組み合わせた、ＸＴＥＮ配列およびＩｇ定常領域またはその一部を含有するキメラタンパク質には多くの用途があることが当業者に認識され、限定されないが、止血障害を有する対象を処置する方法および全般的な止血剤を必要としている対象を処置する方法が含まれる。１つの実施態様において、本発明は、キメラタンパク質の治療有効量を投与することを含む、止血障害を有する対象を処置する方法に関する。
【０３０５】
キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質部分は、陰性荷電されたリン脂質表面上で第ＩＸ因子に対する補因子として供され、それによって、Ｘａｓｅ複合体を形成することにより、止血障害を処置または予防する。リン脂質表面への活性化凝固因子の結合により、血管損傷部位にこのプロセスは限局する。リン脂質表面上で、第ＶＩＩＩａ因子は、第ＩＸａ因子による第Ｘ因子活性化の最大速度を、およそ２００，０００倍まで増加させ、それにより、トロンビン生成の大きな第二バーストがもたらされる。
【０３０６】
本発明のキメラタンパク質を用いて、任意の止血障害を処置してもよい。本発明のキメラタンパク質の投与により処置されうる止血障害としては、限定されないが、血友病Ａ、ならびに、第ＶＩＩＩ因子に関連する欠損症または構造異常が挙げられる。１つの実施態様において、止血障害は、血友病Ａである。
【０３０７】
本発明のキメラタンパク質を予防的に用いて、止血障害を有する対象を処置してもよい。本発明のキメラタンパク質を用いて、止血障害を有する対象における、深刻な出血症状を処置してもよい。他の実施態様において、止血障害は、不完全な凝固因子（たとえば、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の結果によるものであってもよい。１つの実施態様において、止血障害は、遺伝性障害である。他の実施態様において、止血障害は、後天性な障害である。後天性な障害は、潜在的な二次疾患または障害に起因するものであってもよい。関係のない状態は、たとえば、限定されないが、癌、自己免疫疾患、または妊娠であっても良い。後天性障害は、老齢に起因してもよく、または、潜在的な二次障害を処置するための医薬（たとえば、癌化学療法）に起因してもよい。
【０３０８】
本発明はまた、先天的な止血障害を有していない、止血障害の獲得をもたらす二次疾患または状態を有する（たとえば、抗ＦＶＩＩＩ抗体の発現または外科手術に起因する）、対象を処置する方法に関する。本発明は、本方法により調製されたキメラタンパク質の治療有効量を投与することを含む、全般的な止血剤の必要性がある対象を処置する方法に関する。
【０３０９】
本発明はまた、本明細書に記述されるキメラタンパク質の有効量、または、本明細書に記述されるキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、ＦＶＩＩＩの免疫原性を減少させる方法、または、ＦＶＩＩＩに対し、より少ない免疫原性を誘導する方法に関する。
【０３１０】
１つの実施態様において、全般的な止血剤の必要性のある対象は、外科手術を受けている、または外科手術を受けようとしているものである。本発明のキメラタンパク質は、予防的レジメンとして、外科手術の前、外科手術の間、または後に投与されても良い。本発明のキメラタンパク質は、深刻な出血症状を制御するために、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後に投与されても良い。
【０３１１】
本発明のキメラタンパク質を用いて、止血障害を有していない、深刻な出血症状を有する対象を処置してもよい。深刻な出血症状は、重篤な外傷（たとえば、外科手術、交通事故、創傷、銃による裂傷、または、制御できない出血をもたらす他の任意の外傷性の事象）に起因するものであってもよい。出血症状の非限定的な例としては、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３１２】
予防的応用においては、本発明のキメラタンパク質、またはそれらのカクテルを含有する１以上の組成物を、疾患または障害に関連する症状を減少するために、または患者の抵抗性を増加させるために、疾患状態にはまだない患者に投与する。その量は、「予防的有効量」であると定義される。治療的応用においては、疾患の進行が遅くなる、または止まるまで、および、患者が疾患症状の部分的改善または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で、比較的高い投与量（たとえば、投与１回につき、約１〜４００ｍｇ／ｋｇのポリペプチド。放射免疫測定用の接合体に対し、普遍的に用いられるのは５〜２５ｍｇの投与量、および、細胞毒性薬剤改変ポリペプチドに対してはより高い投与量）が求められることもある。患者は、予防的レジメンを投与されてもよい。
【０３１３】
一部の実施態様において、本発明のキメラタンパク質または組成物は、要求に応じた処置（出血症状、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血に対する処置を含む）のために用いられる。対象は、外科的予防、周術期管理、または外科手術に対する処置の必要があっても良い。そのような外科手術としては、たとえば、小手術、大手術、抜歯、扁桃切除、鼡径ヘルニア術、滑膜切除術、全膝置換、開頭、骨接合、外傷手術、脳内手術、腹膜内手術、胸腔内手術、または関節置換手術が挙げられる。
【０３１４】
１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内、または任意の粘膜表面（たとえば、経口、舌下、口腔内、舌下、経鼻、直腸内、経腟またはは肺経路）を介して、投与される。本発明のＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質は、キメラタンパク質を出血部位へゆっくりと放出させるバイオポリマー固形支持体内に移植または連結されてもよく、または、包帯／包帯剤へと移植されてもよい。キメラタンパク質の投与は、対象、および用いられる特定の投与経路によって変化する。投与量は、０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。１つの実施態様において、投与量の範囲は、０．１〜１，０００μｇ／ｋｇである。他の実施態様において、投与量の範囲は０．１〜５００μｇ／ｋｇである。タンパク質は、継続的に投与されてもよく、または、特定の時間間隔で投与されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、最適な投与範囲および／または投与スケジュールを決定してもよい。凝固因子の活性を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは当分野に公知である（たとえば、ＳＴＡ−ＣＬＯＴ  ＶＩＩａ−ｒＴＦ凝固アッセイまたはＲＯＴＥＭ凝固アッセイ）。さらに、有効投与量は、動物モデル（たとえば、血友病のイヌ）から得られた用量応答曲線から外挿されてもよい（Mountet al. 2002, Blood 99(8):2670）。
【０３１５】
本発明について詳細に記述したが、同内容は、以下の実施例を参照することにより、さらに明確に理解されうるであろう。以下の実施例は、解説の目的のみ、本明細書に添付され、本発明の限定を表すものではない。本明細書に言及される全ての特許、公表文献および論文は、参照により、明示的に、および具体的に本明細書に援用される。
【実施例】
【０３１６】
実施例全体を通して、他で特定されない限り、以下の材料および方法が用いられた。
【０３１７】
材料と方法
概して、本発明の実施には、他に示されない限り、標準的な化学的技術、生物物理学的技術、分子生物学的技術、組み換えＤＮＡ技術、免疫学的技術（特に、たとえば、抗体の技術）および、電気泳動の標準的な技術（たとえば、Sambrook,Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989); Antibody Engineering Protocols (Methods inMolecular Biology), 510,Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: APractical Approach(Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr(1996); Antibodies: ALaboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press,Pub. (1999);および、CurrentProtocols in Molecular Biology,eds. Ausubel et
al., John Wiley & Sons (1992)を参照のこと）を採用している。
【０３１８】
実施例１：異なるＶＷＦドメインのクローニング（図１）
（ａ）ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００２のクローニング
ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００２は、配列番号１００のアミノ酸１〜４７７である。［ＶＷＦ−Ｄ´Ｄ３タンパク質配列］アミノ酸番号は、プロぺプチドを有していない成熟型ＶＷＦ配列に相当し、および、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０に相当する。ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００２構築物は、Ｎ末端に、合成されたタンパク質を適切に分泌させるＦＶＩＩＩシグナルペプチドを有しており、続いて、タンパク質の精製のために用いられる、Ｃ末端の６ｘＨｉｓタグを有している。以下のプライマーの組み合わせを用いて、合成された。
ＶＩＩＩシグナルおよびＢｓｉＷ１部位を有する、ＥＳＣ４８−Ｆｗｄ−ＶＷＦ−Ｄ´Ｄ３
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG  （配列番号９０）
６ＨｉｓおよびＮｏｔ１部位を有する、ＥＳＣ５１−Ｒｅｖ−ＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３（１−４７７アミノ酸）
TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAGGTTGACAAC  （配列番号９１）
【０３１９】
５０μｌのＰＣＲ反応を、ＥＳＣ  ４８／ＥＳＣ  ５１のプライマーの組み合わせ、および、鋳型として全長ＶＷＦプラスミドを用いて、２ステップのＰＣＲ増幅サイクル（９４℃、２分；２１サイクルの（９６℃  ３０秒、６８℃  ２分））で、実施した。１４６０ｂｐのバンドを、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲル精製し、ｐｃＤＮＡ４のＢｓｉＷＩおよびＮｏｔ１部位へクローニングし、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ  ００２を作製した。
【０３２０】
（ｂ）ｐＳＹＮ−ＶＷＦ  ０１０および０１３のクローニング
ｐＳＹＮ−ＶＷＦ  ０１０は、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００８およびｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００２を用いて構築した。ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００８は、ｐｃＤＮＡ  ３．１中に全長ＶＷＦ配列を含有し（配列番号２のアミノ酸１−２８１３）、その中には、７６３アミノ酸のプロペプチド（すなわち、Ｄ１Ｄ２ドメイン）が含まれ、その後に成熟型ＶＷＦの残りの２０５０アミノ酸配列が続く。ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００２のＦＶＩＩＩシグナルペプチドは、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００８由来のＤ１Ｄ２ドメインと置換され、得られた構築物が、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１０である。ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００８は、Ａｒｇ９０７で、ＢａｍＨ１部位を有し、コード領域の末端（ストップコドンの後）でＮｏｔ１部位を有する。ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００８および００２を、ＢａｍＨ１およびＮｏｔ１制限酵素で消化した。ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００２由来の挿入物（１０２６ｂｐ）を、ｂａｍＨ１／Ｎｏｔ１で消化したｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００８（８２４２ｂｐ）へとライゲートし、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１０（Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３：配列番号２のアミノ酸１−１２４０）を得て、６ｘＨｉｓタグもまた、Ｃ末端に付加された。形質転換された細胞において、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１０はプロペプチドとともに合成されるが、細胞内プロセッシングにより、分泌された産物にプロペプチド（Ｄ１Ｄ２）は含有されない。ＶＷＦ−０１０由来のタンパク質は、二量体として存在する。
【０３２１】
ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１０を用いて、配列番号１００のＣ３３６ＡおよびＣ３７９Ａ（アミノ酸番号は、Ｄ１Ｄ２ドメイン−ＶＷＦ配列２を有していない成熟型ＶＷＦ配列に相当する）で２つの点変異を有するｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１３を作製した。これらの変異は、ＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３ドメインの二量体化を阻害すると予測されている。
【０３２２】
（ｃ）ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０２５およびｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０２９のクローニング
ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０２５は、ｐＬＩＶＥベクターにおいて、全長ＶＷＦの野生型Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３配列を含有し、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０２９は、Ｃ３３６ＡおよびＣ３７９Ａの変異を伴うＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３配列を含有する。ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０２５のクローニングに対し、以下のプライマーの組み合わせを用いた：
Ｎｈｅ１部位を有する、ＥＳＣ８９−ｆｗｄ＝
CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG  （配列番号９２）
Ｓａｌ１を有する、ＥＳＣ９１−ｒｅｖ＝
CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG  （配列番号９３）
【０３２３】
５０μｌのＰＣＲ反応を、ＥＳＣ  ８９／ＥＳＣ９１のプライマーの組み合わせおよび、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ  ０１０（ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０２５に対して）または、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ  ０１３（ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０２９に対して）のいずれかのプラスミドを鋳型として用いて、３ステップのＰＣＲ増幅サイクル（９４℃、２分；２１サイクルの（９６℃
３０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ４分））で、実施した。予測されたサイズのバンド（約３８００ｂｐ）を、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲル精製し、ｐＬＩＶＥ−Ｍｉｒｕｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆ．）のＮｈｅ１およびＳａｌ１制限酵素部位へとクローニングして、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ  ０２５および０２９を作製した。
【０３２４】
（ｄ）ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０３１のクローニング
ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０３１は、４８アミノ酸の長さのトロンビン開裂可能なリンカー（８ｘＧＧＧＧＳ（配列番号９４）＋トロンビン部位）をＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３（Ｃ３３６Ａ／Ｃ３７９Ａ）とＦｃ配列の間に有する、Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３（Ｃ３３６Ａ／Ｃ３７９Ａ）−Ｆｃ構築物である。この構築物を作製するために、ＶＷＦ−Ｆｃ領域を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０６４構築物（以下、ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ構築物と呼称）から増幅した。ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦをＸｂａ１およびＮｈｅ１で消化した。得られた４１６５ｂｐの挿入領域（ＶＷＦ断片およびＦｃ領域を含有）を、ＶＷＦおよびＦｃ領域のＬＷ２２／ＬＷ２３のプライマーの組み合わせによる増幅のための鋳型として用いた。
ＦＶＩＩＩシグナル配列およびＢｓｉＷ１部位を有するＬＷ２２−ＦＷＤ−ＶＷＦ−Ｄ´Ｄ３
GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG（配列番号９５）
ストップコドンおよびＮｏｔ１部位を有するＬＷ２３−Ｒｅｖ−Ｆｃ
TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC（配列番号９６）
【０３２５】
ＬＷ２２／ＬＷ２３増幅から得られたＰＣＲ産物（約２３００ｂｐ）を、ＢｓｉＷ１／Ｎｏｔ１で消化したｐＳＹＮ−ＶＷＦ−００２へとクローニングして、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１４中間体を得た。ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１４はＦＶＩＩＩシグナルペプチド−Ｄ´Ｄ３−２０アミノ酸トロンビン開裂可能なリンカー（Ｆｃ領域が後に続く）を含有する。
【０３２６】
Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３−Ｆｃ構築物を作製するために、ＬＷ２４／ＬＷ２７のプライマーの組み合わせを用いて、標準的なＰＣＲ法により、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１３からＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３領域を増幅した。
ＢｓｉＷ１部位を有するＬＷ２４−Ｆｗｄ−ＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３クローニングオリゴ
GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG（配列番号９７）
ＥｃｏＲＶを有する、ＬＷ２７−Ｒｅｖ−ＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３オリゴ
CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG（配列番号９８）
【０３２７】
ＬＷ２２／ＬＷ２３増幅から得られたＰＣＲ産物（約３７５０ｂｐ）を、ＢｓｉＷ１／ＥｃｏＲＶで消化したｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１４にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０１５中間体を得た。ＶＷＦ断片とＦｃ領域の間のリンカーの長さを変化させて、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０３１を得た。
ＶＷＦ−Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３タンパク質配列１（配列番号９９）
【化１】
2018102323.tif 000058
【化２】
2018102323.tif 000059
ＶＷＦ−Ｄ´Ｄ３タンパク質配列２（配列番号１００）
【化３】
2018102323.tif 000060
【０３２８】
実施例２：ＦＶＩＩＩ半減期の延長に対する、Ｄ´Ｄ３およびＸＴＥＮ融合の効果
ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質の、Ｄ´Ｄ３  ＦＶＩＩＩ半減期延長の可能性を評価するために、ＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３二量体を、その対応するＤＮＡ構築物ＶＷＦ−０２５（実施例１）の水圧注入により、ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスへと導入した。Ｄ´Ｄ３が安定して発現される状態になった後（注入後５日目）、ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの単回投与を、２００ＩＵ／ｋｇの投与量で、ＩＶ注射により投与した。ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ投与後の１２０時間まで、血液試料を採取した。血漿ＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析した。Ｄ´Ｄ３発現レベルを、ＶＷＦ  ＥＬＩＳＡにより測定し、ｒＦＶＩＩＩＦｃ  ＰＫプロファイルを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて解析した。
【０３２９】
実験結果を図２に示し、Ｄ´Ｄ３を伴う／伴わない、ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの循環系中のＰＫパラメーターを、表１６に示す。Ｄ´Ｄ３二量体はさらに、ｒＦＩＩＩ−ＸＴＥＮのｔ１／２を、３．４時間から１７．８時間へと、５倍増で延長させた。半減期に加え、ＭＲＴに対して５倍の増加、ＡＵＣに対して３．６倍の増加、クリアランスに対して３．８倍の増加が観察された。
【０３３０】
Ｄ´Ｄ３断片とＸＴＥＮの技術の相乗的な効果が観察されたことから、血友病のモデルにおいて、一連のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ／ＸＴＥＮ構築物のＦＶＩＩＩ半減期延長の可能性に対して評価する。
【表１６】
2018102323.tif 000061
【０３３１】
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮのタンパク質精製
ＡＥ２８８  ＸＴＥＮを、本実験のために、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのＣ末端に挿入した。このタンパク質を精製するために、接線流ろ過（ＴＦＦ）工程を最初に用いて、馴化培地をバッファー交換した。次いで、ろ過物中の産物を、強陰イオン交換クロマトグラフィを用いて捕捉し、次いで、アフィニティクロマトグラフィを用いてさらに精製した。分子の純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによる許容範囲にあり、ウェスタンブロッティングによりさらに確認された。分子の比活性は、ａＰＴＴアッセイおよびＥＬＩＳＡによる測定で、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩと同等であった。
【０３３２】
ＦＶＩＩＩ発色アッセイ
ＦＶＩＩＩ活性は、ＤｉａＰｈａｒｍａ（ｌｏｔ＃  Ｎ０８９０１９）から入手したＣＯＡＴＥＳＴ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットを用いて測定し、すべてのインキュベーションは、３７℃のプレートヒーター上で振とうさせながら行った。
【０３３３】
ｒＦＶＩＩＩ標準の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬである。プールされた正常ヒト血漿アッセイ対照および血漿試料（１ＸのＣｏａｔｅｓｔ緩衝液で希釈した）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ  ９６ウェルプレートに、二重で添加した（２５μＬ／ウェル）。調製したばかりのＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を、連続して各ウェルに添加した（各添加の間に、５分間インキュベーションを行った）。基質とインキュベーションした後、２５μＬの２０％酢酸を添加し、発色反応を停止させ、ＯＤ４０５の吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）装置で測定した。データは、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン５．２）で分析した。最低定量値（ＬＬＯＱ）は、７．８ｍＩＵ／ｍＬである。
【０３３４】
ＶＷＦ  ＥＬＩＳＡ：
ヤギ抗ヒトＶＷＦ抗体（アフィニティ精製、ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡＶＷＦ−ＡＰ）を捕捉抗体として、０．５ｕｇ／ウェルで用いて、ＶＷＦ−ＥＩＡ−Ｄ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＶＷＦ−ＥＩＡ−Ｄ、１：１００希釈）をＶＷＦ  ＥＬＩＳＡに対する検出抗体として用いた。ＥＬＩＳＡアッセイを、以下の標準的なＥＬＩＳＡの手順に従い実施し、ＴＭＢをＨＲＰ基質として用いて、ＰＢＳＴ／１．５％  ＢＳＡ／０．５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液をブロッキングおよび結合緩衝液として用いた。アッセイの標準範囲は、１００ｎｇ〜０．７８ｎｇであり、アッセイの定量下限（ＬＬＱＱ）は、７．８ｎｇ／ｍＬである。
【０３３５】
実施例３：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ構築物を含有する、ＸＴＥＮのプラスミド構築
（ａ）ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６１のクローニング（図３）
ＦＶＩＩＩ−１６１プラスミドは、細胞での合成の間にプロセッシングされる酵素開裂部位を有する、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）スキャホールドを含有する。構築物は、全長ＶＷＦ（Ｄ´Ｄ３）のＦＶＩＩＩ結合ドメインを有する。
【０３３６】
プラスミド（ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６１）は、ＦＶＩＩＩ−ＦｃおよびＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体の発現のために設計され、Ｄ´Ｄ３ドメインはＦＶＩＩＩに結合し、リン脂質と活性化プロテインＣのＦＶＩＩＩ相互作用を妨害する。ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６１からのタンパク質は、ＦＶＩＩＩ−ＦｃサブユニットのＣ末端が６ｘ（ＧＧＧＧＳ）ポリペプチドリンカー（配列番号６４）によりＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３−ＦｃサブユニットのＮ末端に連結されている単一ポリペプチドとして細胞内で発現される。さらに、各配列の最後のＡｒｇの後に、前駆タンパク質転換酵素による細胞内開裂のために、ＲＲＲＲＳ（配列番号１１）およびＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０）の配列が、それぞれ、当該ポリペプチドリンカーの５´末端と３´末端に挿入された。ゆえに、細胞は、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ鎖がＣ末端でＲＲＲＲＳ配列（配列番号１１）を有しているが、リンカー配列の残りは除去されている、二重鎖ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ／Ｄ´Ｄ３−Ｆｃヘテロ二量体を発現してもよい。ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロ二量体タンパク質がトロンビンにより活性化され、ＦＶＩＩＩと他の凝固因子の相互作用が可能になった時に、ＦＶＩＩＩからのＶＷＦ断片の放出が促進されるよう、トロンビン開裂部位を含有するＩＳ｛５Ｘ（ＧＧＧＧＳ）｝ＬＶＰＲＧＳＧＧ（配列番号１２２）ポリペプチドがすぐ後に続く、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ断片が、ＶＷＦドメインとＦｃ領域の間に挿入されている。
【０３３７】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６１（配列番号１０１）タンパク質配列（ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸の位置  １〜１４５７）；下線領域はＦｃ領域を表し、波下線は第一のＦｃとＶＷＦ断片の間にある開裂可能なリンカーを表し、二重下線領域はＶＷＦ断片を表し、太字の領域はＶＷＦ断片とＦｃの間にある開裂可能なリンカーを表す。
【化４】
2018102323.tif 000062
【化５】
2018102323.tif 000063
【化６】
2018102323.tif 000064
【０３３８】
（ｂ）ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６８、１７５、１７２および１７４のクローニング（図４Ａ−４Ｄ）
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６８、１７２、１７４および１７５は、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６１の誘導体である。Ｒ１６４５Ａ／Ｒ１６４８Ａ変異をｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６１に導入して、ＳＣ−ＦＶＩＩＩアイソフォームを産生するｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６８を形成し、さらなる半減期延長のために、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮをＦＶＩＩＩ−ＨＣのＣ末端に直接融合した。ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＦｃおよびＸＴＥＮ技術の効果を評価するために、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７５を構築するために、Ｄ´Ｄ３コドン配列をｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６８から除去した。
【０３３９】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７２を構築するために、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ断片を、さらなる半減期延長のためにＦＶＩＩＩ−ＨＣのＣ末端へと直接融合した。そして、Ｄ´Ｄ３コドン配列を、ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＦｃおよびＸＴＥＮ技術の効果を評価するための、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７４を形成するために、Ｄ´Ｄ３コドン配列をｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７２から除去した。
【０３４０】
（ｃ）ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７０のクローニング（図４Ｅ）
ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＸＴＥＮおよびＤ´Ｄ３断片の効果を評価するために、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７０を構築した。コドン配列ＶＷＦ−Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３断片およびＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを、発現キャスケットの５´および３´末端へと導入し、３５ａａトロンビン開裂可能なリンカーがすぐ後に続くＡＥ２８８  ＸＴＥＮコドン配列を用いて、ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩ分子を接続した。細胞内プロセッシングの後、分泌されたタンパク質は、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ／３５ａａトロンビン開裂可能なリンカーにより成熟型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのＮ末端に連結されている成熟型ＶＷＦ分子のＤ´Ｄ３断片を含有する、ポリペプチドを含有する。
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７０タンパク質配列（配列番号１０２）
【化７】
2018102323.tif 000065
【化８】
2018102323.tif 000066
【０３４１】
実施例４：ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦ欠損マウスにおける、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ構築物を含有する、ＸＴＥＮの水圧注入
図３および４のＤＮＡ構築物を含有するＸＴＥＮはともに、２〜３の半減期延長因子と組み合わされている。それらのＦＶＩＩＩ半減期延長の可能性を評価するために、図３および図４のＤＮＡ構築物の選択群を、水圧注入（ＨＤＩ）により、１００ｕｇ／マウスの投与量で、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスへと導入した。次いで、眼窩腔血液採取により、血液試料を、ＨＤＩ後２４時間で採取した。ＨＤＩ後の血漿ＦＶＩＩＩの活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析され、結果は、表１７および図５に示す。野生型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して、ＤＮＡ構築物を含有するすべてのＸＴＥＮは、ＨＤＩ後２４時間で、有意に高いＦＶＩＩＩ血漿活性を有していたことから、対応する分子は、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩよりも有意に長い循環タンパク質半減期を有していたことが示唆される。それら半減期延長因子の組み合わせ応用を、血友病動物においてさらに評価した。
【表１７】
2018102323.tif 000067
【０３４２】
水圧注入
水圧注入は、小動物（たとえばマウスおよびラット）の肝臓へ、効果的および安全に非ウイルス遺伝子を送達する方法である。元々は、約５〜７秒で、動物の体重の１０分の１量の裸のプラスミドＤＮＡ／生理食塩水溶液（エンドトキシンフリー）を急速に注入するものとして特徴付けられていた。裸のプラスミドＤＮＡに対象の遺伝子が含有され、肝臓において、動物の体重の１０分の１量で産生された。標的タンパク質は、注入されたＤＮＡから肝臓において産生され、注入後２４時間以内で検出することができる。次いで、血漿試料を採取し、発現されたタンパク質の治療性を検討する。
【０３４３】
本明細書において実施されたすべての水圧注入について、０．９％の滅菌生理食塩水溶液に溶解したプラスミドＤＮＡを２ｍｌ、尾静脈注射を介して、約４〜７秒で２０〜３５グラムのマウスに送達させた。マウスは、正常な動作が戻るまで、最初の２〜３時間、厳密にモニターされた。眼窩腔血液採取を介して血液試料を採取した後、次いで、血漿試料を得て、さらなる分析を行うまで−８０℃で保存した。
【０３４４】
実施例５：ＸＴＥＮ挿入を含有するＦＶＩＩＩＦｃ−ＶＷＦヘテロ二量体に対する共トランスフェクションシステムのプラスミド構築（図６）
タンパク質産生量を増加させるために、タンパク質産生のための２つの共トランスフェクションシステム（３つのＤＮＡ構築物を含有する）を作成した。第一のＤＮＡ構築物は、ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ断片がＦＶＩＩＩ重鎖のＣ末端に直接融合され、その後に野生型ＦＶＩＩＩ軽鎖断片（ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７３、図６Ｂ）または、Ｒ１６４５Ａ／Ｒ１６４８Ａ変異を有するＦＶＩＩＩ軽鎖断片（ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６９、図６Ａ）のいずれかが続き、次いで、ＦＶＩＩＩ軽鎖は単一Ｆｃ断片に直接融合されている、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質をコードした。第二のＤＮＡ構築物は、Ｄ´Ｄ３−Ｆｃ融合タンパク質をコードしているｐＳＹＮ−ＶＷＦ−０３１（実施例１）である。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、第三のプラスミド（ＰＣ５）と共に２つのプラスミドが８０：１５：５の比率でトランスフェクトされた。合成されたタンパク質は、ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮ）Ｆｃ／Ｄ´Ｄ３Ｆｃヘテロ二量体およびＤ´Ｄ３Ｆｃ二量体として分泌され、そして、ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮ）Ｆｃ／Ｄ´Ｄ３Ｆｃヘテロ二量体は、タンパク質精製によりＤ´Ｄ３Ｆｃ二量体から分離された。
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１６９成熟型タンパク質配列（配列番号１０３）
【化９】
2018102323.tif 000068
【化１０】
2018102323.tif 000069
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１７３成熟型タンパク質配列（配列番号１０４）
【化１１】
2018102323.tif 000070
【化１２】
2018102323.tif 000071
【０３４５】
実施例６．ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１およびＦＶＩＩＩ−１７３／ＶＷＦ−０３１のタンパク質精製
接線流ろ過（ＴＦＦ）工程を用いて、澄まされた馴化培地を緩衝液交換した。次いで、２工程クロマトグラフィプロセスを用いて、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１またはＦＶＩＩＩ−１７３／ＶＷＦ−０３１を精製した。弱い陰イオン交換樹脂を用いて、アフィニティクロマトグラフィを行った。最終精製産物は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣの許容範囲の純度であった。比活性は、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩと同等であった（ＦＶＩＩＩ発色アッセイおよびＡ２８０濃度で測定）。純度および本分子の各部分の存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより確認された。
【０３４６】
実施例７．Ｏｃｔｅｔアッセイによる、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１の、ＶＷＦ結合能の評価
ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１の、ＶＷＦ結合能は、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）を基にした測定（Ｏｃｔｅｔ  ａｓｓａｙ）により、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ３８４で、Ｔｒｉｓ結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）を用いて、２５℃で得られた。ＦＶＩＩＩ結合を測定するためのＯｃｔｅｔアッセイは、ＡＰＳ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ上へのヒトｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号ＨＣＶＷＦ−０１９１）の疎水性固定化後の１．０％ウシ血清アルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号００１−０００−１６１）の結合に基づいた。簡潔に述べると、ｈｖＷＦ（２０  μｇ／ｍＬ）をＴｒｉｓ緩衝液中で希釈し、６００秒間、ＡＰＳ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ全体にわたってロードし、反応プローブ上でおよそ３．０〜３．５ｎｍの結合を得た。対照ＡＰＳプローブは、基準差し引きのために、ｈｖＷＦの非存在下で、１．０％ＢＳＡと共にロードした。ロードの後、すべてのプローブを、３００秒間、Ｔｒｉｓ緩衝液中でインキュベートし、新たな基準線を確立した。続いて、バイオセンサープローブを、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  １６９または、ＦＶＩＩＩＦｃ  Ｄｒｕｇ基質（０、０．６、２、６、２０、６０、２００、６００ＩＵ／ｍＬ）の溶液中で、５分間、室温でインキュベートし、次いで、５分間の解離工程を行った。Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアを用いて、結合応答（ｎｍ）を、差し引きデータ（反応プローブから基準プローブを差し引いた）から導いた。ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１（図７）に対しては、固定化ＶＷＦへの結合が検出されなかったことから、Ｄ´Ｄ３断片による、全長ＶＷＦ分子からのＦＶＩＩＩの遮蔽が完全であったことが示された。
【０３４７】
実施例８．ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１のＰＫ
ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１のＰＫプロファイルを、ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて検証し、内因性ＶＷＦからＦＶＩＩＩ部分を遮蔽するＤ´Ｄ３断片の能力を評価した。ＨｅｍＡマウスまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスを、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１の単回静脈内投与（２００ＩＵ／ｋｇ）で処置して、次いで、血漿試料を、投与後、５分、８時間、２４時間、４８時間および７２時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより検証し、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１の半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて算出した。
【０３４８】
ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１に対し、固定化ＶＷＦへの構築物結合の完全な阻害が、バイオレイヤー干渉法により示された（図７）。このことから、分子中のＤ´Ｄ３断片は、天然型ＶＷＦ分子へのＦＶＩＩＩの結合を成功裏に妨害し、それにより、２つの異なるマウス系統において、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１は類似の半減期を有することが予測された。図８Ａおよび表１８に示されるように、予測通り、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１は、ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスの両方において、類似のＰＫプロファイルを有していた（ＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロ二量体の半減期は、内因性ＶＷＦの半減期とは無関係であることが示されている）。ＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロ二量体の半減期と内因性ＶＷＦの半減期が異なることにより、ＦＶＩＩＩが上限を超えて延長され、内因性ＶＷＦによって課せられていた半減期の限界の２倍を超えて、ＦＶＩＩＩの半減期をさらに延長することが出来る可能性が生じる。
【０３４９】
【表１８】
2018102323.tif 000072
【０３５０】
ＸＴＥＮ挿入とＤ´Ｄ３断片の、ＦＶＩＩＩ防御活性を、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいてＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１の半減期と、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＦｃおよびＦＶＩＩＩＦｃの半減期を比較することにより評価した。単回ＩＶ投与の後、血液試料を、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１に対しては、５分、８時間、２４時間、４８時間および７２時間で採取し、ＦＶＩＩＩ−１６９／Ｆｃに対しては５分、８時間、２４時間、３２時間、４８時間で採取し、ＦＶＩＩＩＦｃに対しては、５分、１、２、４、６および８時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性はＦＶＩＩＩ発色アッセイにより検証し、ＦＶＩＩＩ−１５５／ＶＷＦ−０３１の半減期はＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて算出した。
【０３５１】
実験結果を、図８Ｂおよび表１９に要約した。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＶＷＦ保護の消失により、ＤＫＯマウス中で、半減期は１．６時間であった。ＸＴＥＮ挿入がＦＶＩＩＩＦｃ分子内へ導入された場合には、得られたＦＶＩＩＩ‐１６９／Ｆｃ分子は、ＸＴＥＮ挿入により、半減期が４倍延長された（７時間の半減期）。最後に、Ｄ´Ｄ３断片が、分子内に組み込まれ、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１が形成された場合には、１７時間の半減期が観察され、Ｄ´Ｄ３断片によって、さらに２．５倍、半減期が延長された。半減期の改善に加え、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（Ｃｌ）およびＡＵＣの改善もまた観察された（表１９に示す）。
【０３５２】
ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１は、ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスの両方において、１７〜１８時間のｔ１／２が得られた（ＶＷＦクリアランスにより課せられていた、ｔ１／２の延長限界の上限値）。さらなるｔ１／２延長因子をこの分子内に組み込んでもよい（たとえば、第二のＸＴＥＮをＦＶＩＩＩ内に挿入）。Ｄ´Ｄ３断片とＸＴＥＮ挿入の相乗効果により、クリアランス経路からＦＶＩＩＩを完全に防御することができる可能性があり、そして、ＦＶＩＩＩＦｃ／ＸＴＥＮ／ＶＷＦ変異体により、最終的には、２倍のＦＶＩＩＩｔ１／２延長限界を超えることができるであろう。
【表１９】
2018102323.tif 000073
【０３５３】
実施例９：ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体細胞培地は、Ｄ´Ｄ３発現ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおけるＰＫを増強する
Ｄ´Ｄ３断片の、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮのｔ１／２を延長する能力を、Ｄ´Ｄ３発現ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスモデル（実施例２に記述）において評価した。この実験においては、循環中にＤ´Ｄ３二量体を導入するためにＶＷＦ−０２５を用いる代わりに、ＶＷＦ−０２９構築物を用いて、循環中にＤ´Ｄ３単量体を導入した。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体タンパク質を調製するために、小スケール（５０〜１００ｍＬ）の一過性トランスフェクション培養培地を、トランスフェクション後４日目で調製し、細胞培養物を回収し、ＰＫ実験に適したＦＶＩＩＩ活性の範囲（１０〜２０ＩＵ／ｍＬ）になるまで濃縮した。次いで、濃縮された細胞培地を、循環中にＤ´Ｄ３を有する、または有しないＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける標準的なＰＫ実験に用いた。
【０３５４】
１〜３のＸＴＥＮ挿入を含有する、総数で６つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体を、システムにおいて検証し、それらのｔ１／２を表２０にまとめた、代表的な変異体のデータを図９Ａにプロットした。
【０３５５】
Ｄ´Ｄ３断片が循環中に存在するすべてのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体に対して半減期の延長が観察され（表２０）、ＦＶＩＩＩ‐ＸＴＥＮがそのクリアランス経路からＤ´Ｄ３により保護されたことが示された。さらに、ＨｅｍＡマウスにおける１４時間の半減期と比較して、Ｄ´Ｄ３発現ＤＫＯマウスにおいて、ＬＳＤ００５５．０２１は２０．４時間のｔ１／２を有していたことから（図９Ｂ、表２０）、ＦＶＩＩＩ分子が、２倍の半減期延長という限界を最終的に突破したことが示される。ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮ）／ＶＷＦ分子のさらなる改変によって、さらに長いｔ１／２のＦＶＩＩＩが得られる可能性があり、１週間に１度、またはそれよりも低い頻度での投与レジメンで済む、ＦＶＩＩＩタンパク質をＨｅｍＡ患者にもたらすことが出来る可能性がある。
【表２０−１】
2018102323.tif 000074
【表２０−２】
2018102323.tif 000075
【０３５６】
実施例１０：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）の血漿中の、ＶＷＦおよびＸＴＥＮ含有ＦＶＩＩＩ変異体の安定性
ｒＦＶＩＩＩＦｃタンパク質変異体の血漿安定性を、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）の血漿において検証した。安定性アッセイのために、ＨＥＫ２９３細胞を、ｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＦＶＩＩＩ−１６９（Ｂドメイン接合部分で挿入された、２８８ＡＥ  ＸＴＥＮを有するｒＦＶＩＩＩＦｃ）を発現するプラスミド、およびＩｇＧ−ＦｃまたはＶＷＦ−０３１（ＩｇＧ−Ｆｃに融合されたＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３領域）のいずれかを発現するプラスミドと共トランスフェクションした。トランスフェクション後４日目で、細胞培養培地を回収し、ＦＶＩＩＩ発色活性に基づき、３０ＩＵ／ｍＬまで濃縮した。濃縮された細胞培養培地を、次いで、５ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性をもたらすためにＤＫＯマウス血漿に添加し、３７℃でインキュベートした。発色アッセイによる活性測定のために、異なる時点でアリコートを回収した。各時点での活性を二重で測定し、平均活性を時間関数としてプロットした。ＦＶＩＩＩＦｃ（重鎖と軽鎖が非共有結合的相互作用により共に保持されている二本鎖（ｄｃ）ＦＶＩＩＩ分子）の活性は、ＤＫＯマウス血漿中で、時間と共に減少した（図１０）。ＦＶＩＩＩ−１６９：Ｆｃ（Ｂドメイン接合部分で２８８ＡＥ  ＸＴＥＮの挿入を含有する）の活性は、ｒＦＶＩＩＩＦｃと比較して、ゆっくりと低下したことから、ＸＴＥＮの挿入により安定性の増強がもたらされたことが示された。ｉｎ  ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩの安定性を増強するためにＶＷＦを導入したとして、ＦＶＩＩＩ−１６９：ＶＷＦ−０３１の血漿安定性を評価した。このヘテロ二量体（ＦＶＩＩＩ因子とＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３因子がＦｃの各ドメインの一部に融合されている）は、ＦＶＩＩＩ−１６９：Ｆｃと比較して、さらなる血漿安定性を示したことから、ＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３ドメインおよびＸＴＥＮは、ｒＦＶＩＩＩＦｃの血漿安定性に対し相乗効果を有することが示された。
【０３５７】
実施例１１：Ｆｃ融合物、ＸＴＥＮ挿入およびＶＷＦのＤ´Ｄ３断片のＦＶＩＩＩ半減期に対する効果
Ｆｃ融合物、ＸＴＥＮ挿入およびＶＷＦのＤ´Ｄ３断片のＦＶＩＩＩ半減期に対する効果を評価するために、Ｂドメイン欠損組換えＦＶＩＩＩ（ｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＦＶＩＩＩ−１６９：ＦｃおよびＦＶＩＩＩ−１６９：ＶＷＦ−０３１の薬物動態特性を、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）において評価した。
【０３５８】
ＤＫＯマウスを、ＦＶＩＩＩタンパク質の単回静脈内投与（２００ＩＵ／ｋｇ）で処置し、血漿試料を、図１１に示される指定時点で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、半減期をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ−Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて算出した。検証分子の薬物動態パラメーターを、表２１に示す。各ＦＶＩＩＩ変異体に対する血漿ＦＶＩＩＩ活性の時間回帰曲線を図１１にプロットした。
【０３５９】
改変していないＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの半減期は、ＤＫＯマウスにおいて、０．２３時間であり、ＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ：ＦｃＲｎ相互作用を介したＦＶＩＩＩＦｃタンパク質のリサイクルによって、ＤＫＯマウスにおける半減期は１．６６時間に延長された。ＡＥＸＴＥＮポリペプチドの２８８残基が、ＦＶＩＩＩＦｃ分子内のＦＶＩＩＩのＢドメイン領域へと組み込まれ、得られたＦＶＩＩＩ１６９／Ｆｃタンパク質の半減期は、ＤＫＯマウスにおいて、さらに７．４１時間に延長されていた。最終的に、ＶＷＦのＤ´Ｄ３ドメインの付加により、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１ヘテロ二量体の半減期は、ＤＫＯマウスにおいて、１７．９時間にまで延長された（図１１、表２１）。半減期に加え、すべての他のＰＫパラメーターも、各因子の付加に比例して改善されていた（表２１）。ＦＶＩＩＩは複数の半減期延長因子に対して耐容性であり、３つの因子のＦＶＩＩＩ半減期延長に対する相乗効果により、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ＶＷＦヘテロ二量体の半減期をさらに改善することができる。
【表２１−１】
2018102323.tif 000076
【表２１−２】
2018102323.tif 000077
【０３６０】
実施例１２：異なるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＶＷＦヘテロ二量体の薬物動態特性
ＦＶＩＩＩ半減期に対する、ＶＷＦ−Ｄ´Ｄ３断片とＸＴＥＮ挿入の組み合わせの効果を評価するために、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体の薬物動態特性を、ＨｅｍＡマウスにおいて検証し、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの一本鎖アイソフォーム（ｓｃＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）およびＦＶＩＩＩ−１６９：ＶＷＦ−０３１（実施例１０）と比較した。７つの新たなＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ構築物を作製した（タンパク質配列は表２４に示す）。これら構築物の概略図は、図１４Ａ〜Ｈに示す。ＦＶＩＩＩ−１９５およびＦＶＩＩＩ−１９９はそれぞれ、ＦＶＩＩＩ二本鎖および一本鎖アイソフォームであり、各々、１９００位と１６５６位に２つのＸＴＥＮ挿入を含有する。ＦＶＩＩＩ−１９６およびＦＶＩＩＩ−２０１は、それぞれ、ＦＶＩＩＩ二本鎖および一本鎖アイソフォームであり、各々、２６位、１９００位と１６５６位に３つのＸＴＥＮ挿入を含有する。ＦＶＩＩＩ−２０３、２０４および２０５は、Ｂドメインの接合部分および、１９００位、４０３位、または１８位にそれぞれ、２つのＸＴＥＮ挿入を有するｓｃ−ＦＶＩＩＩＦｃ分子である。各ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ構築物を、ＨＥＫ２９３細胞においてＶＷＦ−０３１と共に共発現させ、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ／ＶＷＦヘテロ二量体タンパク質を産生させた。トランスフェクション後４日目、細胞培養培地を回収し、ＦＶＩＩＩ発色活性に基づき、２０ＩＵ／ｍＬまで濃縮（ＦＶＩＩＩ−１９５：ＶＷＦ−０３１、ＦＶＩＩＩ−１９６：ＶＷＦ−０３１、ＦＶＩＩＩ−１９９：ＶＷＦ−０３１、ＦＶＩＩＩ−２０３：ＶＷＦ−０３１およびＦＶＩＩＩ−２０４：ＶＷＦ−０３１）、または、精製（ｓｃＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ−１６９：ＶＷＦ−０３１、ＦＶＩＩＩ−２０１：ＶＷＦ−０３１  ａｎｄ  ＦＶＩＩＩ−２０５：ＶＷＦ−０３１）のいずれかを行った。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体（ＦＶＩＩＩ−１６９：ＶＷＦ−０３１、実施例５）において、Ｄ´Ｄ３断片によって内因性ＶＷＦからＦＶＩＩＩ分子は完全に分子間遮蔽されたことが示されているため、ＨｅｍＡマウスをＰＫ評価に選択した。精製タンパク質または濃縮細胞培養培地を、８〜１２週齢のＨｅｍＡマウスに、静脈内投与によって、２００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇの投与量で投与した。血漿試料は、投与後、５分、８時間、１６時間、２４時間、３２時間、４８時間、７２時間、または９６時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ−Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて算出した。検証分子の薬物動態パラメーターは、表２２に示す。選択時点での、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ／ＶＷＦ−Ｆｃ変異体に対する血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図１２Ａ〜Ｃにプロットした。
【０３６１】
ＸＴＥＮが１９００位および１６５６位に挿入された場合（ＦＶＩＩＩ−１９５およびＦＶＩＩＩ−１９９）、ＦＶＩＩＩ−１６９：ＶＷＦ−０３１と比較して、中程度の半減期改善がｓｃＦＶＩＩＩアイソフォーム（ＦＶＩＩＩ−１９９：ＶＷＦ−０３１）に対して観察された。しかしながら、ｄｃＦＶＩＩＩアイソフォームは、ＦＶＩＩＩ−１６９：ＶＷＦ−０３１よりも短い半減期を示したことから、一本鎖アイソフォームは、対応する二本鎖アイソフォームよりも有意に安定性が高いことが示唆された（表２２および図１２Ａ）。第三のＸＴＥＮが２６位でＦＶＩＩＩ−１９９に組み込まれた場合、得られた分子（ＦＶＩＩＩ−２０１：ＶＷＦ−０３１）の半減期は２４．６時間であり、ｓｃＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して３倍超長い半減期の改善を示した（表２２および図１２Ｃ）。４０３位（Ａ２ドメイン）、１９００位（Ａ３ドメイン）、および１８位（Ａ１ドメイン）での、第二のＸＴＥＮ挿入の半減期延長効果も検証した（それぞれ、ＢドメインＸＴＥＮ挿入と組み合わせている）。Ａ２またはＡ３のＸＴＥＮ挿入の追加によって、さらなる半減期延長は得られなかったが（表２２、図１２ｂ）、Ａ１挿入の追加により、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体の半減期はさらに２９．４時間まで延長された（表２２、図１２Ｃ）（ｓｃＢＤＤ−ＦＶＩＩＩよりも３倍超長い）。
【０３６２】
ＸＴＥＮがＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロ二量体構築物に組み込まれた場合、得られた分子の半減期改善の程度は様々であり、半減期と、ＸＴＥＮ挿入の部位またはＸＴＥＮ挿入数のいずれの間にも、明らかな相関は認められなかったことから、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ／ＶＷＦヘテロ二量体の半減期は、ＸＴＥＮ挿入の数、またはＸＴＥＮ挿入の位置よりもむしろ、分子全体の完全性により決定されることが示唆される。
【０３６３】
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体に対して観察された２４．６時間および２９．４時間の半減期は、ＦＶＩＩＩ半減期延長の限界を１．６〜２倍明らかに超えていた。もしこの発見がＨｅｍＡ患者にも適用できるのであれば、ＦＶＩＩＩ予防のための投与を、１週間に１度、またはより少ない頻度とすることができる。
【表２２−１】
2018102323.tif 000078
【表２２−２】
2018102323.tif 000079
【０３６４】
ＦＶＩＩＩ分子へのＸＴＥＮの組み込みに加え、Ｄ´Ｄ３とＦｃ断片の間にリンカーとしてＸＴＥＮを組み込むことにより半減期延長の利点の可能性についても評価した。ＦＶＩＩＩ−１５５（ｓｃＦＶＩＩＩＦｃ）を、ＨＥＫ２９３細胞において、ＶＷＦ−０３４（ＡＥ２８８  ＸＴＥＮと３５残基のトロンビン開裂可能なリンカーを有するＶＷＦ−Ｆｃ）と共発現させた。トランスフェクション後４日目に、細胞培養培地を回収し、ＦＶＩＩＩ活性のアッセイに基づき、２０ＩＵ／ｍＬまで濃縮した。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスに、濃縮した細胞培養培地を２００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇで、単回静脈内投与で投与した。血漿試料を、投与後５分、８時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、血漿ＦＶＩＩＩ活性の回帰曲線を時間関数としてプロットした（図１３）。ＦＶＩＩＩ−１５５／ＶＷＦ−０３４（ＦＶＩＩＩのＢドメイン接合部分にＡＥ２８８  ＸＴＥＮが挿入されている）は、２つの分子に対する、重複する回帰曲線により図示されるように、ＦＶＩＩＩ−１６９／ＶＷＦ−０３１と同程度の半減期改善を示した（図１３）。ＶＷＦ−ＦｃポリぺプチドへのＸＴＥＮ挿入により、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＢドメイン接合部分でのＸＴＥＮ挿入によりもたらされるものと同程度の半減期改善が得られたことから、ＦＶＩＩＩポリペプチドの分子内ＸＴＥＮ挿入と、ＶＷＦ−ＦｃポリペプチドのＶＷＦとＦｃ因子の間の、ドメイン間ＸＴＥＮ挿入とが組み合わされた、ヘテロ二量体分子において、さらに半減期を改善することが可能となる可能性が示唆される。
【０３６５】
実施例１３Ａ：表２２に示されるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ＶＷＦヘテロ二量体に加え、異なるＸＴＥＮ挿入、一本鎖ＦＶＩＩＩ、および二本鎖ＦＶＩＩＩの組成を含有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ＶＷＦヘテロ二量体（表２３Ａ）を、薬物動態特性に関し、ＨｅｍＡにおいて検証する。様々なＦＶＩＩＩ構築物（表２３Ｂ）およびＶＷＦ構築物（表２３Ｃ）も、以下に開示する。ＨｅｍＡマウスを、ヘテロ二量体を２００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇで、単回静脈内投与で処置する。次いで、血漿試料は、投与後、５分、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間で採取する。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ−Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて算出する。リストにあるヘテロ二量体のタンパク質配列は、表２５に示す。
【表２３−１】
2018102323.tif 000080
【表２３−２】
2018102323.tif 000081
【表２３−３】
2018102323.tif 000082
【表２３−４】
2018102323.tif 000083
【表２３−５】
2018102323.tif 000084
【０３６６】
実施例１３Ｂ：追加のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＶＷＦヘテロ二量体の薬物動態特性
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＶＷＦヘテロ二量体を、薬物動態特性に関し、ＨｅｍＡマウスにおいて検証した。検証したヘテロ二量体は、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３４、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３６およびＦＶＩＩＩ２６６／ＶＷＦ０３１である。ＨｅｍＡマウスに、２００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇで、様々なヘテロ二量体タンパク質を単回静脈内投与した。血漿試料を、投与後５分、２４、４８、７２、９６および１２０時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ−Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて算出した。ＰＫの結果を、以下の表２４に示す。
【表２４】
2018102323.tif 000085
【０３６７】
ｐＳＹＮＦＶＩＩＩ  ０１０ヌクレオチド配列−（二本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１２５）
【化１３】
2018102323.tif 000086
【化１４】
2018102323.tif 000087
【化１５】
2018102323.tif 000088
【化１６】
2018102323.tif 000089
【０３６８】
ｐＳＹＮＦＶＩＩＩ  ０１０タンパク質配列−（二本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１２６）
【化１７】
2018102323.tif 000090
【化１８】
2018102323.tif 000091
【０３６９】
実施例１４：血友病Ａマウスにおいて、３倍超の半減期延長を伴う、第ＶＩＩＩ凝固因子の新規分子
ＦＶＩＩＩの新規分子は、２つのポリペプチド（１つは、ＦＶＩＩＩ配列内の１以上の位置で挿入ＸＴＥＮを有する一本鎖Ｂドメイン欠損（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩからなり、もう１つは、ＶＷＦのＤ´Ｄ３領域から構成される）を含有するように設計された。各ポリペプチドはまた、ＩｇＧ１のＦｃ領域に遺伝子組み換えにより融合され、Ｄ´Ｄ３領域がＦＶＩＩＩ部分に結合するように正確に位置づけられた。得られたＦＶＩＩＩ変異体を、一過性トランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞において発現させ、馴化培地から精製した。ＦＶＩＩＩ活性はＦＶＩＩＩ発色アッセイにより評価し、薬物動態特性は、ＦＶＩＩＩノックアウト（ＨｅｍＡマウス）マウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスの両方において評価した。
【０３７０】
ＸＴＥＮおよびＶＷＦのＤ´Ｄ３領域をｒＦＶＩＩＩへと組み込むことによって、融合タンパク質は内因性ＶＷＦにより除去されず、循環半減期が延長された。この融合構造中のＦＶＩＩＩは、ＶＷＦとの相互作用から完全に遮蔽されている（バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）分析により測定）。これと一致して、ＨｅｍＡマウスおよびＤＫＯマウスにおける薬物動態特性は同一であることが判明し、このことから、マウスにおける除去率は、効果的にＶＷＦから離れたことによることが示唆される。ＸＴＥＮの長さ、およびＸＴＥＮ挿入の位置の最適化により、ＶＷＦの限界（１６時間）を超えるタンパク質のサブセットを特定し、ＨｅｍＡマウスにおける循環半減期を３０時間まで増加させ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを超える４倍の改善となった。重要なことは、これらのタンパク質は、その機能性を維持していたことである（ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより判定）。
【０３７１】
ＶＷＦの従属が、治療用ＦＶＩＩＩの半減期の根本的な限界を設定している。ＶＷＦのＤ´Ｄ３領域とＸＴＥＮの融合により半減期を延長させながら、ＦＶＩＩＩをＶＷＦクリアランス経路から離すことにより、４倍の半減期延長を伴う、ＦＶＩＩＩ新規分子が作製された。これは、持続的効果のあるＦＶＩＩＩの開発における産業界全体の試みの中で、半減期限界を超えた遺伝子組み換えＦＶＩＩＩの初の報告であり、血友病Ａの予防的処置における、重大な進展となる可能性がある。
表２５：ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−ＦｃおよびＶＷＦ−Ｆｃ構築物のタンパク質配列
ＦＶＩＩＩ１９５タンパク質配列（アミノ酸１６５６および１９００で、２つの１４４  ＡＥ  ＸＴＥＮを有する、二本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１０５）
【化１９】
2018102323.tif 000092
【化２０】
2018102323.tif 000093
【０３７２】
ＦＶＩＩＩ１９６タンパク質配列（アミノ酸２６、１６５６および１９００で、３つの１４４  ＡＥ  ＸＴＥＮを有する、二本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１０６）
【化２１】
2018102323.tif 000094
【化２２】
2018102323.tif 000095
【０３７３】
ＦＶＩＩＩ１９９タンパク質配列（アミノ酸１６５６および１９００で、３つの１４４  ＡＥ  ＸＴＥＮを有する、一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１０７）
【化２３】
2018102323.tif 000096
【化２４】
2018102323.tif 000097
【０３７４】
ＦＶＩＩＩ２０１タンパク質配列（アミノ酸２６、１６５６および１９００で、３つの１４４  ＡＥ  ＸＴＥＮを有する、一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１０８）
【化２５】
2018102323.tif 000098
【化２６】
2018102323.tif 000099
【０３７５】
ＦＶＩＩＩ２０３タンパク質配列（２つのＡＥ  ＸＴＥＮを有する一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ；Ｂドメインで１つの２８８ＡＥ  ＸＴＥＮを有し、アミノ酸１９００で、１つの１４４
ＡＥ  ＸＴＥＮを有する）（配列番号１０９）
【化２７】
2018102323.tif 000100
【化２８】
2018102323.tif 000101
【０３７６】
ＦＶＩＩＩ２０４タンパク質配列（２つのＡＥ  ＸＴＥＮを有する一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ；Ｂドメインで１つの２８８ＡＥ  ＸＴＥＮを有し、アミノ酸４０３で、１つの１４４  ＡＥ  ＸＴＥＮを有する）（配列番号１１０）
【化２９】
2018102323.tif 000102
【化３０】
2018102323.tif 000103
【化３１】
2018102323.tif 000104
【０３７７】
ＦＶＩＩＩ２０５タンパク質配列（２つのＡＥ  ＸＴＥＮを有する一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ；Ｂドメインで１つの２８８ＡＥ  ＸＴＥＮを有し、アミノ酸１８で、１つの１４４  ＡＥ  ＸＴＥＮを有する）（配列番号１１１）
【化３２】
2018102323.tif 000105
【化３３】
2018102323.tif 000106
【０３７８】
ｐＳＹＮ  ＦＶＩＩＩ２６６タンパク質配列（Ｂドメインで２８８ＡＥ  ＸＴＥＮ、および、アミノ酸１８で４２ＡＥ  ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ  Ｆｃ）（配列番号１１２）
【化３４】
2018102323.tif 000107
【化３５】
2018102323.tif 000108
【０３７９】
ｐＳＹＮ  ＦＶＩＩＩ２６７タンパク質配列（Ｂドメインで２８８ＡＥ  ＸＴＥＮ、および、アミノ酸１８で７２ＡＥ  ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ  Ｆｃ）（配列番号１１３）
【化３６】
2018102323.tif 000109
【化３７】
2018102323.tif 000110
【０３８０】
ｐＳＹＮ  ＦＶＩＩＩ２６８タンパク質配列（アミノ酸１８で１４４ＡＥ-ＸＴＥＮを有
するＦＶＩＩＩ  Ｆｃ）（配列番号１１４）
【化３８】
2018102323.tif 000111
【化３９】
2018102323.tif 000112
【０３８１】
ｐＳＹＮ  ＦＶＩＩＩ２６９タンパク質配列（アミノ酸１８で７２ＡＥ  ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ  Ｆｃ）（配列番号１１５）
【化４０】
2018102323.tif 000113
【化４１】
2018102323.tif 000114
【０３８２】
ｐＳＹＮ  ＦＶＩＩＩ２７１タンパク質配列（アミノ酸１８で４２ＡＥ  ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ  Ｆｃ）（配列番号１１６）
【化４２】
2018102323.tif 000115
【化４３】
2018102323.tif 000116
【０３８３】
ｐＳＹＮ  ＦＶＩＩＩ２７２タンパク質配列（アミノ酸１８で１４４ＡＥ  ＸＴＥＮを有し、Ｂドメインで２４４ＡＥ  ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ（Ｆｃは無し））（配列番号１１７）
【化４４】
2018102323.tif 000117
【化４５】
2018102323.tif 000118
【０３８４】
ｐＳＹＮ  ＶＷＦ０３１タンパク質配列（ＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３−４８ａａの長さのトロンビン開裂可能ＧＳリンカー−Ｆｃ）（配列番号１１８）
【化４６】
2018102323.tif 000119
【化４７】
2018102323.tif 000120
【０３８５】
ｐＳＹＮ  ＶＷＦ０３４タンパク質配列（ＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３−２８８ＡＥ  ＸＴＥＮ−３５ａａの長さのトロンビン開裂可能ＧＳリンカー−Ｆｃ）（配列番号１１９）
【化４８】
2018102323.tif 000121
【化４９】
2018102323.tif 000122
【０３８６】
ｐＳＹＮ  ＶＷＦ０３６タンパク質配列（ＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ−９８ａａの長さのトロンビン開裂可能ＧＳリンカー−Ｆｃ）（配列番号１２０）
【化５０】
2018102323.tif 000123
【化５１】
2018102323.tif 000124
【０３８７】
ｐＳＹＮ  Ｆｃ-０１５タンパク質配列（ＩｇＧ−Ｆｃドメイン）（配列番号１２１）
【化５２】
2018102323.tif 000125
【０３８８】
実施例１５：ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体は、野生型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して、正常なＦＶＩＩＩ特異的活性を維持している
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体のＦＶＩＩＩ特異的活性を測定した。ヘテロ二量体は、２ステップのクロマトグラフィプロセスを用いて精製した。弱陰イオン交換樹脂を用いて、アフィニティクロマトグラフィを行った。最終精製産物は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣに受容可能な純度であった。特異的活性を、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩい（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）と比較した（ＦＶＩＩＩ発色アッセイおよびＡ２８０濃度により測定）。データを表２６に示す。すべての検証分子は、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと同等のＦＶＩＩＩ特異的活性を示した。分子の純度および各部分の存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより確認した。
【表２６】
2018102323.tif 000126
【０３８９】
ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／Ｄ´Ｄ３およびＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの半減期を、ＨｅｍＡマウスにおいて比較した（図１５、表２７）。図１５に示されるように、ｒＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／Ｄ´Ｄ３は、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩにより得られた半減期よりも、４倍長い半減期を示した。
【表２７】
2018102323.tif 000127
【０３９０】
実施例１６：止血における、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体の有効性（ＦＶＩＩＩ活性）（ワンステージａＰＴＴアッセイにより測定）
止血におけるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体の有効性を、ＦＶＩＩＩ特異的ａＰＴＴ活性により評価した（表２８にまとめる）。表２８に示されるように、ＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３断片の付加およびＦＶＩＩＩのドメイン内へのＸＴＥＮ挿入により、ヘテロ二量体のＦＶＩＩＩ特異的ａＰＴＴ活性が減少する一方（ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３１データおよびＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１データにより示される）で、ＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン領域のＸＴＥＮ挿入またはＶＷＦ  Ｄ´Ｄ３断片のＣ末端のＸＴＥＮ挿入は、ＦＶＩＩＩ特異的ａＰＴＴ活性に悪影響を与えなかった（ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１データおよびＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４データにより示される）。二本鎖ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ｄｃＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）と比較して、ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３１、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４およびＶＷＦ２０５／ＶＷＦ０３１は、それぞれ、２．５倍、２．８倍、２．６倍および、
５．５倍の特異的ａＰＴＴ活性の減少を示した。
【表２８】
2018102323.tif 000128
【０３９１】
ＦＶＩＩＩ特異的ａＰＴＴアッセイ
ＦＶＩＩＩ変異体を、ａＰＴＴ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）を用いて線形アッセイ範囲（２００〜１．６ｍＵ／ｍＬ）で希釈した。その後に、５０μＬの希釈試料または標準物を、５０μＬの３７℃、天然型ヒトＨｅｍＡのプールされた血漿、５０μＬの３７℃、ａＰＴＴ試薬（ＡＣＴＩＮ（登録商標）ＦＳＬ活性化セファロプラスチン試薬、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、参照番号Ｂ４２１９−２）と混合し、３７℃、４分間、インキュベートした。次いで、５０μｌの２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ［参照番号ＯＲＦＯ３７］）を試薬混合物に添加して、凝固反応を開始させた。各試料の凝固時間（ＣａＣｌ２の添加から、血塊形成開始までの時間の長さ）を用いて、ａＰＴＴ活性を、標準物（第８版  国際標準ＦＶＩＩＩ濃縮物で作製された）に対して、算出した。特異的ａＰＴＴ活性は、ＯＤ２８０により測定された各分子のタンパク質濃度に対して算出された。
【０３９２】
実施例１７：ＨｅｍＡマウスおよび尾切断出血モデルにおける、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ：ＶＷＦ−Ｆｃヘテロ二量体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ヘテロ二量体の止血有効性をさらに評価するために、ＨｅｍＡマウスおよび尾切断出血モデルにおける、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４および、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１の急性有効性を、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩとの比較で評価した。ＨｅｍＡマウスを、２００、６５、および２０ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ単回ＩＶ注射で処置し、尾切断損傷後の失血対照レベルを作成した。２００ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４またはＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１で処置されたマウスからの失血を、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩで処置された対照群と比較して、止血における有効性を推定した。ビヒクル処置動物を用いて、当該モデルの失血ベースラインを作成した。図１６に示されるように、ビヒクル処置動物と比較して、失血の有意な減少が、すべてのＦＶＩＩＩ処置群で観察された（ｐ＜０．０５）。ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４および、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１の両方が、ＨｅｍＡマウス尾切断モデルにおいて有効であった。ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４については約３倍低い有効性が観察された（６５ＩＵ／ｋｇ  ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩおよび２００ＩＵ／ｋｇ  ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４は、同様の失血減少であった）。ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３４に対しては、１０倍の有効性減少が観察された（２０ＩＵ／ｋｇ  ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩおよび２００ＩＵ／ｋｇ  ＦＶＩＩＩ205／ＶＷＦ０３1は、同様の失血減少であった）。
【０３９３】
ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４および、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１は、ｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して同様の特異的ＦＶＩＩＩ発色活性を有しているが、ＦＶＩＩＩのａＰＴＴ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の両方は、分子改変により減少していた。これらのデータから、ＦＶＩＩＩ発色活性よりも、止血に対するｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を予測するには、ＦＶＩＩＩ分子のａＰＴＴ活性のほうが、より正確な測定法であることが示唆される。
【０３９４】
ＨｅｍＡマウス尾切断出血マウス
８〜１０週齢のオスのＨｅｍＡマウスを実験に用いた。尾切断の前に、マウスを、５０ｍｇ／ｋｇのケタミン、０．５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジンのカクテルで麻酔し、３７℃のヒートパッド上に乗せ、体温を維持させた。次いで、マウスの尾を３７℃の水の中に１０分間浸し、側血管脈を拡張させた。血管を拡張させた後、ｒＦＶＩＩＩまたはビヒクル溶液を、尾静脈から注射し、５分後、尾の末梢１ｃｍを、＃１１のストレージエッジの外科用メスを用いて切断した。流出した値を、１３ｍｌの３７℃に温めた生理食塩水へ３０分間採取し、次いで、マウスを、麻酔下で両側開胸により安楽死させた。血液採取前後の血液採取管の重量変化による重量測定で、失血量をグラム単位で定量し、それを失血量ミリリットル（ｍＬ）へと変換した（１ｇの重量変化＝１ｍＬの失血）。
【０３９５】
特定の実施態様に関する上記の記述は、当業者レベルの知識を用いることにより、本発明の概念から逸脱することなく、および、他者が容易に実験を行うことなく、そのような特定の実施態様の様々な応用を適用および／または改変することができるように、本発明の一般的性質を全体的に明らかにするものである。それゆえ、本明細書に提示される教示および指示に基づく、そのような応用および改変も、本開示の実施態様の均等の範囲および意図の範囲内にある。本明細書の表現または専門用語は、限定ではなく、記述の目的のためであり、本明細書の表現または専門用語は、当業者により本教示および本指定を踏まえて解釈されるものである。
【０３９６】
本発明の他の実施態様は、本明細書に開示される本発明の実施および明細書の事項から、当業者には明らかである。明細書および実施例は、例示の目的のみえあり、本発明の真の範囲および主旨は、以下の請求項により示されている。
【０３９７】
本明細書に引用されている全ての特許および公表文献は、参照により、その全体で本明細書に援用される。
【図１−１】
2018102323.tif 000129
【図１−２】
2018102323.tif 000130
【図２】
2018102323.tif 000131
【図３】
2018102323.tif 000132
【図４】
2018102323.tif 000133
【図５】
2018102323.tif 000134
【図６】
2018102323.tif 000135
【図７】
2018102323.tif 000136
【図８Ａ】
2018102323.tif 000137
【図８Ｂ】
2018102323.tif 000138
【図９Ａ】
2018102323.tif 000139
【図９Ｂ】
2018102323.tif 000140
【図１０】
2018102323.tif 000141
【図１１】
2018102323.tif 000142
【図１２Ａ】
2018102323.tif 000143
【図１２Ｂ】
2018102323.tif 000144
【図１２Ｃ】
2018102323.tif 000145
【図１３】
2018102323.tif 000146
【図１４】
2018102323.tif 000147
【図１５】
2018102323.tif 000148
【図１６】
2018102323.tif 000149
【配列表】
2018102323000001.app
【外国語明細書】
2018102323000001.pdf