(57)【要約】      （修正有）【課題】酸素治療薬（ＯＴＡｓ）として有用なポリニトロキシル化されたヘムタンパク質の提供。【解決手段】構造（ＶＩ）を有するニトロキシル化されたタンパク質。2018150335.tif 000045[式中、Ｚは、タンパク質を表し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり；Ｘは、酸素であり；Ｙは、ＣＨ２であり；ｍは、０または１であり；ｐは、タンパク質に抱合されたニトロキシル基の平均数であり；Ｎは、タンパク質の窒素であり、；及びタンパク質はヘモグロビン四量体を含む]【選択図】図８
2018150335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造（ＶＩ）を有するニトロキシル化されたタンパク質：
【化１】
2018150335.tif 000041
[式中、
Ｚは、タンパク質を表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｘは、酸素であり；
Ｙは、ＣＨ２であり；
ｍは、０または１であり；
ｐは、タンパク質に抱合されたニトロキシル基の平均数であり； 
Ｎは、タンパク質の窒素であり、；および
タンパク質はヘモグロビン四量体を含む]。
【請求項２】
ニトロキシル化されたタンパク質を製造するための方法であって、式（Ｉ）のニトロキシル化薬とタンパク質を反応することを含む方法：
【化２】
2018150335.tif 000042
[式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｘは、酸素であり；
Ｙは、ＣＨ２であり；
ｍは、０または１であり；および
タンパク質はヘモグロビン四量体を含む]。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３であり；および／または
ｍは、１である、
請求項１に記載のニトロキシル化されたタンパク質または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質のＮ末端アミノ基はニトロキシル化されているか、または、少なくとも１つのリジン残基のイプシロン（ε）−アミノ基はニトロキシル化されており；および／または
ｐは、１〜２５である、
請求項１または３に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項５】
前記ヘモグロビン四量体はヒトヘモグロビンα−サブユニット、ヒトヘモグロビンβ−サブユニット、またはヒトヘモグロビンα−サブユニットおよびβ−サブユニットの両方を含み；
前記ヘモグロビン四量体は、架橋されたαα二量体または架橋されたββ二量体を含み；および／または
前記ヘモグロビン四量体は、１７のニトロキシル化されたアミノ基を含む、
請求項１、３、および４のいずれか１項に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項６】
前記ヘモグロビン四量体は、架橋されたαα二量体または架橋されたββ二量体を含み；
前記ヘモグロビン四量体はヒトヘモグロビンα−サブユニットを含み、前記ヒトヘモグロビンα−サブユニットは、Ｎ末端バリン残基のα−アミノ基にて、および／またはリジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるリジン残基のε−アミノ基にてニトロキシル化され；および
前記ヘモグロビン四量体は、所望により、ヒトヘモグロビンβ−サブユニットをさらに含み、前記ヒトヘモグロビンβ−サブユニットは、前記Ｎ末端バリン残基の前記α−アミノ基にて、および／またはリジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるリジン残基の前記ε−アミノ基にてニトロキシル化される、
請求項５に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項７】
前記ニトロキシル化されたタンパク質は、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）に抱合されており、前記ＰＡＯは、所望により、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり：
前記ＰＥＧは、所望により、２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有し；
前記ＰＥＧは、所望により、マレイミド−ＰＥＧであり、前記マレイミドは、所望により、アルキレンまたはフェニレンリンカーを介してＰＥＧに連結され、前記アルキレンリンカーは、所望により、エチレンリンカーであり；および／または
前記ＰＥＧは、所望により、スクシンイミジルバレラートＰＥＧ（ＳＶＡ−ＰＥＧ）である、
請求項１、および３〜６のいずれか１項に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載のニトロキシル化されたタンパク質であって、前記マレイミド−ＰＥＧは、前記タンパク質のシステイン残基の固有のチオール部分、前記タンパク質のチオール化されたリジン残基のチオール部分およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のチオール部分に抱合されており、前記マレイミド−ＰＥＧは、所望により、構造（ＶＩＩＩ）を有する、ニトロキシル化されたタンパク質：
【化３】
2018150335.tif 000043
[式中、
Ｚは、前記タンパク質を表し、
Ｓは、前記タンパク質のチオールであり、
Ｒ３は、アルキレンまたはフェニレン基であり、
Ｘは、末端基であり、
ｍは、前記タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、および
ｎは、２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数を表す]。
【請求項９】
Ｒ３は、エチレンであり；
ｍは、約６〜約１０であり；
Ｘは、メトキシ（−ＯＣＨ３）またはカルボキシレート（−ＣＯＯＨ）であり；
前記マレイミド−ＰＥＧは、ヘモグロビンβ−サブユニットのシステイン−９３残基のチオール部分に抱合されており；および／または
前記マレイミド−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットのチオール化されたリジン残基のチオール部分に抱合され、前記チオール化されたリジン残基は、所望により、リジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンα−サブユニットのチオール化されたリジン残基、またはリジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンβ−サブユニットのチオール化されたリジン残基である、
請求項８に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項１０】
前記ＰＥＧは、スクシンイミジルバレラートＰＥＧ（ＳＶＡ−ＰＥＧ）であり、前記ＳＶＡ−ＰＥＧは、前記タンパク質のリジン残基のε−アミノ部分、前記タンパク質の末端バリン残基のα−アミノ部分またはこれらの組み合わせから選択されるタンパク質のアミノ部分に抱合されており、前記ＳＶＡ−ＰＥＧは、所望により、構造（ＩＸ）を有する、請求項７に記載のニトロキシル化されたタンパク質：
【化４】
2018150335.tif 000044
[式中、
Ｚは、前記タンパク質であり、
Ｎは、前記タンパク質のアミノ基であり、
Ｘは、末端基であり、
ｍは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の数であり、および
ｎは、２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数である]。
【請求項１１】
Ｘは、メトキシ（−ＯＣＨ３）またはカルボキシレート（−ＣＯＯＨ）であり；
ｍは、平均で四量体あたり６〜１０ＰＡＯ分子であり；
前記ＳＶＡ−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットのリジン残基のε−アミノ部分に抱合され、前記リジン残基は、所望により、リジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンα−サブユニットのリジン残基、またはリジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンβ−サブユニットのリジン残基であり；および／または
前記ＳＶＡ−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットの末端バリン残基のα−アミノ部分に抱合されている、
請求項１０に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれか１項に記載のニトロキシル化されたタンパク質であって、
前記ヘモグロビンは、平均で四量体あたり５〜１０ＰＡＯ分子に抱合されており；および／または
前記ヘモグロビンは、酸素化される、脱酸素化される、またはＣＯ、ＮＯまたはＣＯおよびＮＯの混合物とリガンド結合している、
ニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項１３】
請求項１および３〜１２のいずれか１項に記載のニトロキシル化されたタンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
前記組成物は、血液で正常腫脹性であるか、または血液と比較して過剰腫脹性であり；
前記薬学的に許容される担体は、水性希釈剤を含み；
前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水、生理食塩水−グルコース混合物、Ｒｉｎｇｅｒ液、乳酸Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｌｏｃｋｅ−Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｈａｒｔｍａｎｎの平衡生理食塩水、ヘパリン処置したクエン酸ナトリウム−クエン酸−デキストロース溶液、アセテート溶液、複数の電解質溶液、ラクトビオナート溶液および重合体の代用血漿またはこれらの組み合わせを含み；および／または
前記薬学的に許容される担体は、充填剤、塩、生理緩衝液、炭水化物、アルコール、ポリアルコール、抗酸化剤、抗バクテリア薬剤、コロイド浸透圧薬剤、還元薬剤またはこれらの組み合わせを含む、
医薬組成物。
【請求項１４】
前記水性希釈剤は、コロイドの水性溶液または非酸素運搬成分の水性溶液を含み；
前記水性希釈剤は、水性無細胞溶液（所望によりアルブミンの水性無細胞溶液）を含み；
前記水性希釈剤は、タンパク質の水性溶液、糖タンパク質の水性溶液、多糖の水性溶液またはこれらの組み合わせを含み；
前記重合体の代用血漿は、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、エチレンオキシド−プロピレングリコール凝縮物またはこれらの組み合わせを含み；および／または
前記還元剤は、アスコルビン酸、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステインまたはこれらの組み合わせを含む、
請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
急性肝不全、ベータ地中海貧血症、火傷、慢性重篤な肢虚血、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鬱血性心不全、低酸素症、マラリア、器官虚血（所望により急性腸虚血（捻転）、急性腸虚血（塞栓症）、心臓性ショック、急性血管器官虚血、脳卒中、心筋梗塞または重篤な心虚血を含む）、末梢血管疾患、ポルフィリン症、妊娠における子癇前症、敗血症、鎌状赤血球症、網膜疾患、内部眼球条件、睾丸捻転、外傷、ショック、外傷脳損傷、潰瘍、血管攣縮またはこれらの組み合わせの治療における使用のための；
非外傷性出血ショック、入院前の環境の外傷、外傷性出血ショック、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、外傷性脳損傷、脳卒中、固形腫瘍癌、器官分解（エキソビボで）、器官分解（レシピエントにおいて）、重篤な敗血症、敗血症性ショック、心筋梗塞、心虚血、心臓性ショック、急性心不全、肺動脈塞栓症またはこれらの組み合わせの治療における使用のための；
血管形成術に対する補助として、形成手術のための補助剤として、または補助人工心臓を植設する際の補助剤として；代用血液、心臓保護剤、凍結保存剤、血液透析補助剤、腫瘍学的薬剤、器官保存剤、性能増強剤、外科手術補助剤または創傷治癒薬剤として；イメージングにおいて；肺機能を改善するため；またはこれらの組み合わせとしての使用のための；または
傷害、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染、第ＩＶ因子断片化、過剰脾臓化および巨脾、家禽における出血症候群、形成不全性貧血、無形成性貧血、特発性免疫溶血性状態、鉄欠損症、イソ免疫性溶血性貧血、細血管障害性溶血性貧血、寄生または外科的麻酔で誘導される脳外傷による血液の喪失の獣医学的治療における使用のための、
請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、スクシンイミド活性化されたニトロキシル化合物およびスクシンイミド活性化されたニトロキシル化合物の合成のための方法に関する。また、本発明は、ニトロキシル化されたタンパク質、たとえばニトロキシル化されたヘムタンパク質（たとえば、ニトロキシル化されたヘモグロビンおよびニトロキシル化されたミオグロビン）を製造するためのスクシンイミド活性化されたニトロキシル化合物の使用に関する。また、ニトロキシル化されたタンパク質を、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に任意に抱合する。ポリニトロキシル化されたヘムタンパク質は、酸素治療薬（ＯＴＡｓ）として有用であり、分子酸素、一酸化炭素、一酸化窒素およびそれらの混合物を送達することができる。したがって、さらに、本発明は、ニトロキシル化されたタンパク質の医薬組成物および種々の状態の治療におけるニトロキシル化されたタンパク質の使用のための方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンに基づいた酸素担体（「ＨＢＯＣ」）は、ヘムによる一酸化窒素（ＮＯ）掃気に起因していた血管収縮と長く関連していた。酸素担体は、安定化ヘモグロビン（Ｈｂ）などの、酸素治療（時には「酸素運搬血漿増補液」といわれる）として有用であり、これらが一酸化窒素を掃気するので、血管収縮および高血圧を生じさせ、有効性を制限することが示されている。これらの酸素運搬溶液が血管収縮を生じさせる性向は、動物および男性において高血圧として顕在化され得る。ＨＢＯＣの血管収縮の効果の基礎をなす機構は、あまり理解されないが、ヘム鉄が、迅速に、および不可逆的に、強力な血管拡張薬の内因性ＮＯと結合し、これにより血管収縮を生じさせ得ることを示唆した。
【０００３】
一部において、これらの血管収縮効果のため、修飾された無細胞Ｈｂを含む製品は、最も有望だったが、酸素担体は、現在まで酸素治療薬（ＯＴＡ）として完全に良好だったわけではない。ビス−ジブロモサリチル−フマラート（ααＨｂ）とα−鎖との間で架橋されたヒトＨｂは、モデル赤血球代替として米軍によって開発されたが、それが肺および全身の血管耐性において重篤な増大を示した後に断念された（Ｈｅｓｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ  ７８：３５６Ａ）。また、この製品の市販のバージョンは、期待外れの第３相臨床試験の後、断念された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，２０００，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ７９：１−２０）。
【０００４】
２つの分子アプローチが、ＨｂのＮＯ結合活性を克服する試みにおいて進められた。第１のアプローチは、減少したＮＯ結合親和性をもつ組換えヘモグロビンを作製する試みにおいて、遠位ヘムポケットの部位特異的突然変異を使用した（Ｅｉｃｈ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：６９７６-８３）。第２のアプローチは、血管スペースから間質腔へのＨｂの管外遊出を減少させる、またはおそらく完全に阻害する試みにおいてオリゴマー形成を介してＨｂのサイズを増強させる化学的修飾アプローチを使用した（Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４：１７６９−７８；Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２８：５７９−８３；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｖ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：５６５−７５；Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ，Ｒ．，１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１７５−９７；およびＫｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：１５５−６２）。
【０００５】
実際に、ＮＯに対する会合結合速度が減少された組換えＨｂは、産生されず、天井荷重ラット実験において高血圧が少ない（Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｈ．ｅｔｇ  ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：６７２−６７６  ａｎｄ  Ｌｅｍｏｎ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４：３７８）。しかし、研究は、ＮＯ結合がＨｂの血管作用についての唯一の解釈ではないであろうことを示唆する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたものなどの一定の大きなＨｂ分子は、これらのＮＯ会合速度が、極度に高血圧性のααＨｂのものと同一であったにもかかわらず、血管収縮が実質的になかったことが分かった（Ｒｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２１２８−１２１３４）。さらにまた、ＰＥＧ−Ｈｂは、出血前に交換輸血として与えたときに、出血の結果を阻止するのに非常に有効だったことが判明した（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：９９３−１００３）。
【０００６】
ＨｂへのＰＥＧの抱合は、その抗原性を減少させ、その循環半減期を延長する。しかし、ＰＥＧ抱合反応は、αβ−二量体サブユニットへのＨｂ四量体の解離を生じて４０，０００ダルトン（「Ｄａ」）より下のＨｂ単量体ユニットのＰＥＧ抱合体を受ける交換輸血されたラットにおいて、ひどいヘモグロビン尿症を生じることが報告されている（Ｉｗａｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ａｊｉｓａｋａ  Ｏｒｇａｎ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄｉｃｉｅｓ  Ｍｅｃｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８１，Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ  ｐｇｓ  ９７−１０１）。８４，０００ダルトンより大きい分子量を有するポリアルキレンオキシド（「ＰＡＯ」）抱合されたＨｂは、Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．によって製造され（米国特許第５，６５０，３８８号）、そのαおよびε−アミノ基にてＨｂに連結された約１０コピーのＰＥＧ−５，０００鎖を有する。この置換度は、哺乳動物におけるヘモグロビン尿症と関連する臨床的に有意な腎毒性を回避することと記述された。しかし、抱合反応は、不均一な抱合集団を生じ、およびその他の望ましくない反応物を含み、カラムクロマトグラフィーによって除去されなければならなかった。
【０００７】
ＰＥＧ抱合は、典型的には、生体分子の表面上に官能基と活性化されたＰＥＧ部分の反応を介して実施される。最も一般的な官能基は、リジンのアミノ基、ヒスチジン残基のイミダゾール基およびタンパク質のＮ末端、システイン残基のチオール基、およびセリン、スレオニンおよびチロシン残基のヒドロキシル基、並びにタンパク質のＣ末端である。通常、ＰＥＧは、穏やかな水性環境においてヒドロキシル末端をこれらの官能基と反応することができる反応性部分に変換することによって活性化される。治療的バイオ医薬品の抱合のために使用される最も一般的な単官能性ＰＥＧの１つは、メトキシ−ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ−ＯＨ」）であり、これは１つのみの官能基（すなわちヒドロキシル）を有し、したがって、二官能性ＰＥＧと関連する架橋および凝集問題を最小限にする。しかし、ｍＰＥＧ−ＯＨには、たいてい高分子量二官能性ＰＥＧ（すなわち「ＰＥＧジオール」）が混入され、その製造工程に起因して１０〜１５％程度の高い範囲であり得る（Ｄｕｓｔ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ２３：３７４２−３７４６）。この二官能性ＰＥＧジオールは、所望の単官能ＰＥＧのおよそ２倍のサイズを有する。さらに、混入問題は、ＰＥＧの分子量が増大するにつれて悪化する。ＦＤＡは、高いレベルの製造工程における再現性および最終薬物製品の品質を要求するため、ｍＰＥＧ−ＯＨの純度は、特にペグ化されたバイオ治療薬の産生のために重要である。
【０００８】
ＰＡＯに対するＨｂの抱合は、酸素化された、および脱酸素化された状態の両方において行われてきた。米国特許第６，８４４，３１７号は、結果として得られたＰＥＧ−Ｈｂ抱合体の酸素親和性を増強するために、抱合の前に空気でＨｂを平衡化することによって酸素化された、または「Ｒ」状態でＨｂを抱合することを記述する。その他は、酸素親和性を減少させ、および構造的な安定性を増大させて、Ｈｂが化学的修飾、ダイアフィルトレーションおよび／または無菌濾過および低温殺菌の物理的なストレスに耐えることを可能にするための、抱合の前の脱酸素工程を記述する（米国特許第５，２３４，９０３号）。Ｈｂの分子内架橋については、架橋試薬にα−鎖のリジン９９を曝露するために、修飾の前にＨｂを脱酸素化するを必要とし得ることを示唆する（米国特許第５，２３４，９０３号）。
【０００９】
ＰＥＧとの抱合前の２−イミノチオランでのＨｂチオール化の動態は、Ａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．によって調査された（米国特許第７，５０１，４９９号）。四量体あたり５つの外部チオールの平均を導入する１０倍から３０倍までイミノチオランの濃度を増加させると、Ｈｂ上の外部チオールの数がほとんど２倍になったことが観察された。しかし、ＰＥＧ抱合後に見られたサイズ増強は、周辺だけでなく、さらにチオールの数を２倍にした。これは、抱合反応は、２０倍のモル過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００の存在下で、より反応性でないチオールでＨｂの表面をカバーし、より反応性のチオールでのＨｂのさらなる修飾に抵抗する立体障害を生じたことを示唆した。結果的に、所望の程度の修飾Ｈｂの抱合を達成するために（すなわちＨｂ分子あたり６±１  ＰＥＧ）、Ａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．は、８〜１５モル過剰のイミノチオランでＨｂをチオール化し、および次いで、１６〜３０倍モル過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００でチオール化されたＨｂを反応させた。しかし、大規模生産におけるこれらの高モル過剰反応物質濃度は、ＨＢＯＣを製造するためのコストを有意に上昇させ、最終製品の不均一性を増加させる。その上、マレイミジルＰＥＧ−５０００のこのような高モル過剰は、また、より不均一な産物を生じ、多数の望まれない副反応物の産生を伴う。
【００１０】
以前の研究において、修飾されたヘモグロビンの表面の分子サイズは、腎臓によって除去されることを回避するのに、および所望の循環半減期を達成するのに十分大きくあるべきことが観察された。Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．は、これを８４，０００ダルトン（「Ｄａ」）の分子量またはそれより上にて達成することができると決定した“Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｘｐａｎｄｅｒｓ，”Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅｓ  ２０５−２１２（１９７８））。その研究において、著者は、Ｈｂに異なる分子量のデキストランを抱合した。彼らは、Ｈｂの抱合体（６４，０００Ｄａの分子量をもつ）およびデキストラン（２０，０００Ｄａの分子量を有する）は、「循環から、およびごくわずかに腎臓を介してゆっくり除去された」ことを報告した。さらに、８４，０００Ｄａを上回る分子量を増加させると、これらの除去曲線を有意に変化させなかったことを観察した。腎臓によって早期に排出される二量体の形成を防止するために、分子内架橋により、四量体ヘモグロビンユニットのサブユニットを共に化学的に結合する（たとえば、米国特許第５，２９６，４６５号を参照されたい）。
【００１１】
窒素酸化物は、炎症性疾患の動物モデルにおける酸化損傷を減弱し、および生物が利用可能なＮＯ気体を保存する低毒性の十分に確立された抗酸化剤化合物である。これらは、主にＳＯＤ擬態またはラジカルスカベンジャーとして作用することによって保護効果を及ぼすと考えられる。したがって、ポリニトロキシル化された化合物は、抗酸化剤および抗炎症特性を有する。これは、一酸化窒素（ＮＯ）ドナー分子とＨＢＯＣを結合することと混乱すべきでなく、これは、血管の緩和を増強することが報告されている。たとえば、米国特許出願公開第２０１０／０３１１６５７号を参照されたい。しかし、ＳＯＤ擬態の窒素酸化物は、これらの小さなサイズのため、短い血漿半減期を有し、およびしたがって、インビボでこれらの分子の抗酸化剤有効性を維持することは困難である。
【００１２】
前述の観点では、当該技術分野において血管収縮および高血圧を生じさせず、および抗酸化剤および抗炎症特性を有する酸素治療薬に対する需要がある。
【００１３】
その上、ニトロキシル化薬としての使用のための窒素酸化物を活性化するための現在の方法は、多段階の、および高価なプロセスである。したがって、当該技術分野においてニトロキシル化薬としての使用のための活性化された窒素酸化物化合物を作製するための単純な、および安価な方法のための方法に対する需要がある。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の一つの側面は、式（Ｉ）のニトロキシル化薬に関する：
【化１】
2018150335.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素であり；Ｙは、ＣＨ２であり；ｎは、０または１であり；およびｍは、０または１である。
【００１５】
本発明のもう一つの側面は、式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法であって：
【化２】
2018150335.tif 000004
式（ＩＩＩ）を有する化合物を、
【化３】
2018150335.tif 000005
有機塩基の存在下でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）と反応することを含む方法に関し；式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素であり；Ｙは、ＣＨ２であり；およびｍは、０または１である。
【００１６】
また、本発明のもう一つの側面は、式（ＩＶ）のニトロキシル化薬を製造するための方法であって：
【化４】
2018150335.tif 000006
式（Ｖ）を有する化合物を
【化５】
2018150335.tif 000007
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応することを含む方法に向けられ；式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｙは、ＣＨ２であり；およびｍは、０または１である。
【００１７】
さらなる側面は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むニトロキシル化されたタンパク質であり、およびニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩ）を有することができる：
【化６】
2018150335.tif 000008
式中Ｚは、タンパク質を表し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素であり；Ｙは、ＣＨ２であり；ｍは、０または１であり；ｎは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、−ＮＨ−基は、タンパク質のアミン基であり、およびＮは、タンパク質の窒素である。
【００１８】
さらにもう一つの側面または本発明は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むことができるニトロキシル化されたタンパク質であり、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩＩ）を有し：
【化７】
2018150335.tif 000009
式中Ｚは、タンパク質を表し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｙは、ＣＨ２であり；ｍは、０または１であり；ｎは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり；−ＮＨ−基は、タンパク質のアミン基であり；およびＮは、タンパク質の窒素である。
【００１９】
もう一つの側面は、マレイミド−ＰＥＧである抱合されたＰＥＧを有するニトロキシル化されたタンパク質であり、システイン残基の固有のチオール部分に抱合された、またはチオール化されたリジン残基のチオール部分に抱合されたマレイミド−ＰＥＧは、構造（ＶＩＩＩ）を有し
【化８】
2018150335.tif 000010
式中Ｚはタンパク質を表し、Ｓは、タンパク質のチオール基であり、Ｒ３は、アルキレンまたはフェニレン基であり、Ｘは末端基であり、ｍは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、およびｎは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数を表す。
【００２０】
さらなる側面は、マレイミド−ＰＥＧである抱合されたＰＥＧを有するニトロキシル化されたタンパク質であり、システイン残基の固有のチオール部分に抱合された、またはチオール化されたリジン残基のチオール部分に抱合されたマレイミド−ＰＥＧは、構造（ＶＩＩＩ）を有し、
【化９】
2018150335.tif 000011
式中Ｚは、タンパク質を表し、Ｓは、タンパク質のチオール基であり、Ｒ３は、アルキレンまたはフェニレン基であり、Ｘは、末端基であり、ｍは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、およびｎは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数を表す。
【００２１】
本発明のもう一つの側面は、式（ＩＶ）のニトロキシル化薬とタンパク質を反応させることを含む、ニトロキシル化されたタンパク質を製造するための方法である：
【化１０】
2018150335.tif 000012
式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｙは、ＣＨ２であり；およびｍは、０または１である。式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して−ＣＨ３である請求項Ｇ２の方法。
【００２２】
さらなる側面は、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法であり、システイン残基の固有のチオール部分に抱合されたマレイミド−ＰＥＧは、構造（ＶＩＩＩ）を有し、
【化１１】
2018150335.tif 000013
式中Ｚは、タンパク質を表し、Ｒ３は、アルキレンまたはフェニレン基であり、Ｓは、タンパク質のチオール基であり、ｍは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、およびｎは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数を表す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）のＥＳＩ−ＴＯＦ高精度質量分析の結果を示す。
【図２】４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）の分子構造を確認するＥＳＩ−ＴＯＦ高精度質量分析の結果を示す。
【図３】ＴＥＭＰＯＬ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）、６時間の時点のＴＥＭＰＯＬおよびＤＳＣの反応からの反応産物、および最終４−ＳＴＣ反応産物において行われた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）結果を示す。
【図４】ＴＥＭＰＯＬおよびペグ化ヘモグロビン（ＭＰ４）のポリニトロキシル化前および後（ＰＮ−ＭＰ４）両方の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを示す。
【図５】ペグ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ）およびポリニトロキシル化ペグ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ−ＰＮ）のサイズ排除解析プロフィールを示す。
【図６】ポリニトロキシル化ペグ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ−ＰＮ）の特徴的な紫外可視スペクトルを示す。
【図７】ラットへのＰＥＧ−Ｈｂ−ＰＮ投与後の、血漿ヘモグロビンの紫外可視スペクトルを示す。
【図８】ペグ化ヘモグロビンに対して１：５から１：１００のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）を使用して、ペグ化ヘモグロビンをニトロキシル化した実験の代表的結果を示す。
【図９】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１０】ＨＳＡに対して１：５〜１：１００のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートを使用して、ポリニトロキシル化されたＨＳＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１１】ＨＳＡに対して１：５〜１：１００のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートを使用して、ポリニトロキシル化されたＨＳＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１２】ＨＳＡに対して１：５〜１：１００のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートを使用して、ポリニトロキシル化されたＨＳＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１３】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１４】ＨＳＡに対して１：５〜１：１００のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートを使用して、ポリニトロキシル化されたＨＳＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１５】ＨＳＡに対して１：５〜１：１００のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートを使用して、ポリニトロキシル化されたＨＳＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１６】ＨＳＡに対して１：５〜１：１００のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートを使用して、ポリニトロキシル化されたＨＳＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１７】ＨＡＳに対して１：５〜１：１００のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）を使用して、ＨＳＡをニトロキシル化した実験の代表的結果を示す。
【００２４】
定義
用語「１つの」、「ある」または「ある」が、この開示において使用されるとき、特に明記しない限り、これらは「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。
【００２５】
本明細書に使用される「活性化されたポリアルキレンオキシド」または「活性化されたＰＡＯ」は、少なくとも１つの官能基を有するＰＡＯ分子をいう。官能基は、ＰＡＯと抱合された分子上の遊離アミン、スルフヒドリルまたはカルボキシル基と相互作用する反応性部分である。たとえば、遊離スルフヒドリルと反応する１つのこのような官能基は、マレイミド基である。遊離アミンと反応する官能基は、スクシンイミド基である。
【００２６】
「デオキシヘモグロビン」または「リガンド非結合ヘモグロビン」は、外来性リガンドがヘムに結合していない任意のヘモグロビンを意味する。
【００２７】
一般に、「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」は、酸素を輸送するヘムタンパク質をいう。ヒトにおいて、それぞれのＨｂの分子は４サブユニット、２α−鎖サブユニットおよび２β−鎖サブユニットを有し、四量体構造で配置される。また、それぞれのサブユニットは、１つのヘム基を含み、第一鉄（Ｆｅ２＋）においてリガンドＯ２、ＮＯまたはＣＯを結合する鉄を含む中心である。したがって、それぞれのＨｂ分子は、４つまでのリガンド分子まで結合することができ、それぞれＨｂＯ２、ＨｂＮＯまたはＨｂＣＯリガンドの化合物を生成する。加えて、ヘモグロビンは、Ｏ２  、ＮＯまたはＣＯの混合物とリガンド結合し得る。
【００２８】
「ヘモグロビンに基づいた酸素担体」（ＨＢＯＣ）は、酸素を運搬するヘモグロビンをいうが、また、一酸化炭素および酸化窒素などのその他の分子気体を運搬するためにも有用である。
【００２９】
「高酸素親和性」は、ストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）のものより大きい酸素親和性を示すように修飾されたヘモグロビンをいう。したがって、「高酸素親和性」Ｈｂは、ＳＦＨのものより少ないＰ５０を有し、３７℃およびｐＨ７．４にて測定したときに、１５ｍｍＨｇのＰ５０を有する。
【００３０】
「リガンド結合ヘモグロビン」は、外来性リガンドがヘムに結合しているヘモグロビンを意味する。共通の好ましいリガンドは、酸素、一酸化炭素および一酸化窒素を含む。
【００３１】
「ＭａｌＰＥＧ」は、マレイミジルポリエチレングリコールをいい、およびリンカーを介してポリエチレングリコールに付着されたマレイミジル部分を含む。
【００３２】
「ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ」は、マレイミジル活性化されたＰＥＧが抱合されたＨｂをいう。抱合は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ形成するために、Ｈｂ上のチオール基（およびより小さい範囲で、アミノ基）とＭａｌＰＥＧを反応させることによって行われる。チオール基は、βＣｙｓ  ９３にて２つの固有のチオールなどのＨｂのアミノ酸配列において存在するシステイン残基において見いだされ、およびまた、チオール基を含むように表面アミノ基を修飾することによって導入することができる。ＭＰ４（Ｓａｎｇａｒｔ、Ｉｎｃ．）として公知の例示的なＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、以下の式を有する：
【化１２】
2018150335.tif 000014
式中Ｈｂは、ヘモグロビンであり；Ｓは、ヘモグロビン上のチオール基であり；ｎは、５，０００ダルトンポリアルキレンオキシド重合体のオキシエチレンユニットの数であり；およびｍは、ヘモグロビンに抱合されたマレイミジル活性化されたポリアルキレンオキシド重合体の平均数であり、および７〜８である。
【００３３】
「メトヘモグロビン」または「ｍｅｔＨｂ」は、第二鉄の状態で鉄を含むＨｂの酸化型をいう。ＭｅｔＨｂは、酸素またはＣＯ担体として機能しない。本明細書に使用される用語「メトヘモグロビン％」は、酸化ヘモグロビン対総Ｈｂの割合をいう。
【００３４】
「メトキシ−ＰＥＧ」または「ｍＰＥＧ−ＯＨ」は、ヒドロキシル末端の水素がメチル（−ＣＨ３）基で置換されたＰＥＧをいう。
【００３５】
「修飾ヘモグロビン」または「修飾Ｈｂ」は、重合、抱合および／または組換え技術などの、化学反応、分子内および分子間架橋によって変化され、その結果Ｈｂは、その「天然の」状態にもはやないＨｂをいう。本明細書に使用される用語「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」は、特に明記しない限り、天然の修飾されていないＨｂおよび修飾されたＨｂの両方をいう。
【００３６】
「亜硝酸レダクターゼ活性」または「ＮＲＡ」は、ヘモグロビンまたはヘモグロビンに基づいたタンパク質が亜硝酸塩を一酸化窒素に還元させる能力である。「最大亜硝酸レダクターゼ活性」は、ヘモグロビンまたはヘモグロビンに基づいたタンパク質が亜硝酸塩を一酸化窒素に還元させることができる最大割合である。「最初の亜硝酸レダクターゼ活性」は、亜硝酸塩が完全に脱酸素化されたタンパク質に添加されたときに、ヘモグロビンまたはヘモグロビンに基づいたタンパク質が亜硝酸塩を一酸化窒素に還元させる初速度である。
【００３７】
用語「非酸素化された」は、ヘムタンパク質またはヘモグロビンが、リガンド非結合の、脱酸素された状態であるか、またはＮＯまたはＣＯなどのＯ２以外の気体とリガンド結合していることを意味する。
【００３８】
「酸素親和性」は、Ｈｂなどの酸素担体が分子酸素と結合する結合活性をいう。この特徴は、酸素平衡曲線によって定義され、酸素でのＨｂ分子の飽和度（Ｙ軸）を酸素の分圧（Ｘ軸）と相関される。この曲線の位置を「Ｐ５０」値によって表示し、酸素担体は、酸素と半分飽和する酸素分圧であり、および酸素親和性に逆に相関される。それ故、Ｐ５０が低いほど、酸素親和性はより高い。全血（および、赤血球およびＨｂなどの全血の成分）の酸素親和性は、当該技術分野において公知の種々の方法によって測定することができる。（たとえば、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２：２３３１−３７を参照されたい）。また、酸素親和性は、市販のＨＥＭＯＸ（商標）アナライザー（ＴＣＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ，ＰＡ）を使用して決定してもよい。（たとえば、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ  ａｎｄ  Ｓｈｒａｇｅｒ  ｉｎ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ｅｖｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．）２３２：４６０（１９９４））、および  Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６（１）：１０７−１１６（１９９８）を参照されたい）。
【００３９】
本明細書に使用される用語「酸素治療薬」は、分子酸素に結合すること、およびその必要のある細胞／組織／器官へ運搬することができるヘムタンパク質をいう。ＣＯ−またはＮＯ−リガンド結合ヘムタンパク質の形態で投与されるとき、一旦ＣＯまたはＮＯがヘム部分から放出されると、ヘム基は自由に分子酸素と結合すること、および運搬することができる。
【００４０】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨの重合体をいい、「ｎ」は、４以上、好ましくは約４５〜約５００、より好ましくは約７０〜約２５０および最も好ましくは約９０〜約１４０、または約１１５である。重合体は、置換である、または非置換であることができ、および末端ヒドロキシ基は、メトキシまたはカルボキシなどの異なる通常の末端基で置換することができる。ＰＥＧは、多くの供与源から市販されている（たとえば、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ），Ｐｏｌｙ−Ｇ（登録商標）（Ａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）およびＳｏｌｂａｓｅ）。
【００４１】
「ポリエチレングリコール抱合されたヘモグロビン」、「ＰＥＧ−Ｈｂ抱合体」または「ＰＥＧ−Ｈｂ」は、少なくとも１つのＰＥＧが共有結合されているＨｂをいう。
【００４２】
「溶液」は、液体の混合物をいい、および用語「水性溶液」は、いくらかの水を含み、およびまた、多成分溶液を形成するように水と１つまたは複数のその他の液体の物質を含み得る溶液をいう。
【００４３】
「ストローマフリーヘモグロビン」または「ＳＦＨ」は、赤血球膜が取り除かれたＨｂをいう。
【００４４】
「表面修飾ヘモグロビン」は、デキストランまたはポリアルキレンオキシドなどの、化学的群、通常は重合体が付着したヘモグロビンをいう。用語「表面修飾酸素化ヘモグロビン」は、表面修飾されたときに、「Ｒ」状態であるＨｂをいう。
【００４５】
「末端活性」は、ヘムタンパク質またはヘモグロビンの反応基と反応することができる部分で官能性をもたせたＰＡＯの割合の指標である。「１００％の末端活性」は、全てのＰＡＯがヘムタンパク質またはヘモグロビンの反応基と反応することができる部分を有することに基づいて、抱合反応において使用されるモル過剰のＰＡＯが表されることを示す。たとえば、利用できるＭａｌ−ＰＥＧが、８０％の末端活性を有し、その結果、ＰＥＧの８０％は、Ｍａｌで官能性をもたせられ、およびＭａｌ−ＰＥＧは、ヘモグロビンに対して２０倍のモル過剰において使用されル場合、このモル比は、１００％の末端活性に基づいてヘモグロビンに対して１６倍のモル過剰のＭａｌ−ＰＥＧとして表すことができる。
【００４６】
「チオール化」は、分子上のスルフヒドリル基の数を増加させるプロセスをいう。たとえば、２−イミノチオラン（「２−ＩＴ」）とタンパク質を反応させることは、タンパク質の表面上の遊離アミンをスルフヒドリル基に変換することである。次いで、これらのスルフヒドリル基は、マレイミドなどのチオール反応性の部分との反応に利用できる。
【００４７】
「リガンド非結合ヘモグロビン」は、酸素、一酸化炭素または一酸化窒素などの分子気体にリガンド結合していない少なくとも１つのヘム部分を含む任意のヘモグロビンをいう。従って、ヘモグロビンは、ヘム部分の１つのみが分子気体にリガンド結合していない場合、「リガンド非結合」とみなされる。
【００４８】
本明細書に使用される用語「ヘムタンパク質」は、酸素、一酸化窒素または一酸化炭素などの気体を結合するヘム部分を有する任意の単一または複数の鎖タンパク質である。
【００４９】
本明細書に使用される用語「窒素酸化物」は、安定な窒素酸化物遊離基、これらの前駆体およびその誘導体をいう。この用語は、一酸化窒素ドナー分子と混同してはならない。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明の記述
本発明は、一般に、タンパク質をニトロキシル化するために使用することができるスクシンイミド活性化されたニトロキシル化合物に関する。たとえば、このようなニトロキシル化合物は、ヘモグロビンなどのヘムタンパク質をニトロキシル化するために使用することができる。スクシンイミド活性化されたニトロキシル化合物でのヘムタンパク質のニトロキシル化は、スーパーオキシドおよび過酸化水素などの酸化性物質によるＮＯおよびその他の生体分子の酸化に対抗する。本発明のポリニトロキシル化されたヘムタンパク質は、分子酸素、一酸化炭素、一酸化窒素およびそれらの混合物を送達することができる（ＯＴＡｓ）として、有用である。
【００５１】
スクシンイミジル窒素酸化物試薬
本発明は、タンパク質のアミノ基をニトロキシル化するために使用することができるスクシンイミジル窒素酸化物試薬に関する。一般に、スクシンイミジル窒素酸化物試薬は、窒素酸化物基、たとえばＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル）窒素酸化物基、に連結されたスクシンイミドを含む。たとえば、スクシンイミドと窒素酸化物間の結合は、カルボキシ結合またはカルボナート結合であることができる。このような試薬、たとえばニトロキシルスクシンイミジルカルボナートは、高度に反応性であり、タンパク質のアミンとスクシンイミドとの間の共役を高度に効率的にする。
【００５２】
たとえば、本発明は、式（Ｉ）のニトロキシル化薬に関する：
【化１３】
2018150335.tif 000015
式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素であり；Ｙは、ＣＨ２であり；ｎは、０または１であり；およびｍは、０または１である。
【００５３】
式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、Ｘ、Ｙ、ｎおよびｍが上記の通りの構造を有することができ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３である。
【００５４】
また、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙ、ｎおよびｍが上記の通りの構造を有することができ、およびＸは、酸素または硫黄である。
【００５５】
さらに、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙ、ｎおよびｍが上記の通りの構造を有することができ、およびＸは、酸素である。
【００５６】
また、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、Ｙ、ｎおよびｍが上記の通りの構造を有することができ、Ｘは酸素であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３である。
【００５７】
加えて、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよびｍが上記の通りの構造を有することができ、およびｎは、０である。
【００５８】
また、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよびｍが上記の通りの構造を有することができ、およびｎは、１である。
【００５９】
さらに、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよびｎが上記の通りの構造を有することができ、およびｍは、０である。
【００６０】
また、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよびｎが上記の通りの構造を有することができ、およびｍは、１である。
【００６１】
たとえば、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）、３−スクシンイミジル−ＰＲＯＸＹＬ−カルボナート（３−ＳＰＣ）、４−スクシンイミジル−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ（４−ＳＣＴ）および３−スクシンイミジル−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ（３−ＳＣＰ）から選択することができる。これらの化合物のそれぞれの構造を下に示す：
【化１４】
2018150335.tif 000016
４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ；１−（（（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）−４−オキシカルボニル）オキシ）−２，５−ピロリジンジオン）
【化１５】
2018150335.tif 000017
３−スクシンイミジル−ＰＲＯＸＹＬ−カルボナート（３−ＳＰＣ；１−（（（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）−３−オキシカルボニル）オキシ）−２，５−ピロリジンジオン）
【化１６】
2018150335.tif 000018
４−スクシンイミジル−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ（４−ＳＣＴ；１−（（（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）−４−カルボニル）オキシ）−２，５−ピロリジンジオン）
【化１７】
2018150335.tif 000019
３−スクシンイミジル−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ（３−ＳＣＰ；１−（（（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）−３−カルボニル）オキシ−２，５−ピロリジンジオン）。
【００６２】
たとえば、式（Ｉ）のニトロキシル化薬は、以下の構造を有することができる：
【化１８】
2018150335.tif 000020
【００６３】
スクシンイミジル窒素酸化物試薬の合成のための方法
スクシンイミジル窒素酸化物試薬は、容易に入手できる試薬を使用して単純な一段階活性化化学を使用して合成することができる。さらにまた、活性化反応は、穏やかな条件下で行うことができる。
【００６４】
したがって、本発明は、さらに式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法であって：
【化１９】
2018150335.tif 000021
式（ＩＩＩ）を有する化合物を
【化２０】
2018150335.tif 000022
有機塩基の存在下でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）と反応することを含む方法に関し；式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素であり；Ｙは、ＣＨ２であり；およびｍは、０または１である。
【００６５】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｘ、Ｙおよびｍは、上記の通りであり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３である。
【００６６】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、Ｙおよびｍは、上記の通りであり、およびＸは、酸素または硫黄である。
【００６７】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、Ｙおよびｍは、上記の通りであり、およびＸは、酸素である。
【００６８】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｙおよびｍは、上記の通りであり、Ｘは、酸素であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３である。
【００６９】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、ＸおよびＹは、上記の通りであり、およびｍは、０である。
【００７０】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、ＸおよびＹは上記の通りであり、およびｍは、１である。
【００７１】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、Ｘ、Ｙおよびｍは上記の通りであり、および式中有機塩基は、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、ピリジン、Ｎ−メチルピペリジンまたはこれらの組み合わせを含む。
【００７２】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、Ｘ、Ｙおよびｍは、上記の通りであり、および式中有機塩基は、トリエチルアミンを含む。
【００７３】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、Ｘ、Ｙおよびｍは、上記の通りであり、式中有機塩基は、トリエチルアミンを含み、および式中、式（ＩＩＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナートおよびトリエチルアミンの化合物は、約１：２：３の比で存在する。
【００７４】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための上記の方法のいずれかにおいて、反応を、約２℃〜約３０℃；約１５℃〜約２５℃；約４℃；または約２０℃の温度にて、実施することができる。
【００７５】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための上記の方法のいずれかにおいて、反応を、約３〜約６時間、進行可能にすることができる(can be allowed to proceed)。
【００７６】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬を製造するための上記の方法のいずれかにおいて、反応は、極性の非プロトン性溶媒中で実施することができる。極性の非プロトン性溶媒は、アセトニトリル（ＡＣＮ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）、アセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらの組み合わせを含むことができる。たとえば、極性の非プロトン性溶媒は、アセトニトリルを含むことができる。
【００７７】
４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートの製造のための反応スキームを下に示す。
【化２１】
2018150335.tif 000023
【００７８】
上に示したように、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル）を、一段階活性化化学を使用して、４−スクシンイミジル（ｓｕｃｃｉｎｍｉｄｙｌ）−ＴＥＭＰＯ−カルボナートを製造するために使用する。４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートに対するＴＥＭＰＯＬの活性化は、トリエチルアミンの存在下でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナートとＴＥＭＰＯＬの反応によって達成する。有機塩基（上の反応スキームにおけるＴＥＡ）は、ヒドロキシル窒素酸化物（上の反応スキームにおけるＴＥＭＰＯＬ）の−ＯＨ基を脱プロトン化する触媒として使用され、これをより反応性にして、その結果これは求核試薬として作用することができ、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）の求電子性のカルボニルを攻撃する。
【００７９】
また、本発明は、式（ＩＶ）のニトロキシル化薬を製造するための方法であって：
【化２２】
2018150335.tif 000024
式（Ｖ）を有する化合物を
【化２３】
2018150335.tif 000025
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応することを含む方法に向けられ；式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｙは、ＣＨ２であり；およびｍは、０または１である。
【００８０】
式（ＩＶ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＶ）および（Ｖ）の構造を使用することができ、式中Ｙおよびｍは、上記の通り、式（ＩＶ）および（Ｖ）と関連し、および式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して−ＣＨ３である。
【００８１】
式（ＩＶ）のニトロキシル化薬を製造するための方法において、式（ＩＶ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの化合物は、約１：１．１：１．１のモル比で反応混合物において存在することができる。
【００８２】
式（ＩＶ）のニトロキシル化薬を製造するための方法は、式（ＩＶ）および（Ｖ）の構造を使用することができ、式中ＹおよびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記の通り、式（ＩＶ）および（Ｖ）と関連し、およびｍは、０である。また、本方法は、ｍが１である構造を使用することができる。
【００８３】
式（ＩＶ）のニトロキシル化薬を製造するための上記の方法のいずれかにおいて、反応は、約２℃〜約３０℃；約１５℃〜約２５℃；約４℃；または約２０℃の温度にて実施される。
【００８４】
式（ＩＶ）のニトロキシル化薬を製造するための上記の方法のいずれかにおいて、反応は、約６〜約２４時間の間進行可能にすることができる。
【００８５】
式（ＩＶ）のニトロキシル化薬を製造するための上記の方法のいずれかにおいて、反応は、約７．２〜約７．６のｐＨにて；または約７．４のｐＨにて実施することができる。
【００８６】
ニトロキシル化されたタンパク質およびニトロキシル化されたＰＡＯ修飾タンパク質
また、本発明は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を有するニトロキシル化されたタンパク質に関する。また、ニトロキシル化されたタンパク質は、１つまたは複数のポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）分子、たとえば１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に任意に抱合される。
【００８７】
タンパク質を抱合する際の使用のためのポリエチレンオキシドは、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドおよびポリエチレン／ポリプロピレンオキシドコポリマーを含むが、限定されない。ＰＡＯは、約２，０００〜約２０，０００ダルトン、好ましくは約３，０００〜約１０，０００ダルトン、より好ましくは４，０００〜約６，０００ダルトンおよび最も好ましくは約５，０００ダルトンの分子量を有する。現在、タンパク質の表面を修飾するために使用される最も一般的なＰＡＯは、その医薬品許容性および市販に入手可能なため、ＰＥＧである。ＰＥＧは、タンパク質に抱合されたＰＥＧ分子の数およびサイズに基づいて所望の分子量を達成するように、分子内のエチレンオキシド（すなわち−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）のサブユニットを繰り返す数に基づいて様々な分子量で入手可能である。
【００８８】
ＰＡＯ重合体の末端基の１つまたは両方は、反応性の官能基（「活性化された」）に変換される。たとえば、ＰＥＧ−ＯＨを、ＰＥＧ−ハライド、メシラートまたはトシラートを製造するために使用されており、次いで、水性アンモニア（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，９８３，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７−１１８３）、アジ化ナトリウムまたはカリウムフタルイミドと求核置換反応を行うことによってＰＥＧ−アミン（「ＰＥＧ−ＮＨ２」）に変換される。次いで、活性化されたＰＥＧを、タンパク質のカルボキシル基（「−ＣＯＯＨ」）とＰＥＧアミン基（−「ＮＨ２」）の相互作用を介してタンパク質に抱合することができる。
【００８９】
アミン基でＰＥＧに官能性をもたせ、およびマレイミド基にそれを変換することに加えて、それとともに活性化されるＰＥＧは、当該技術分野において使用されることが公知である。たとえば、少し例を挙げれば、ＰＥＧは、ｐ−ニトロフェニルカルボナート、アルデヒド、アミノプロピル、アミノエチル、チオール、アミノキシ、ヒドラジドおよびヨードアセトアミドで活性化してもよい。このような官能性ＰＥＧを、公知の方法を使用してタンパク質の表面アミノ酸側鎖に抱合することができる。
【００９０】
さらに、ＰＥＧ−ＮＨ２は、カルボキシル以外の基で抱合体に官能性をもたせることができる。たとえば、米国特許第６，８２８，４０１号は、ｍＰＥＧ−マレイミドを形成するために、マレイミドとＰＥＧ−ＮＨ２の反応を開示する。この反応において、ｍＰＥＧ−ＯＨを、ｍＰＥＧ−トシラートを生成するためにトシル化試薬（ｐ−トルエンスルホニルクロライド）および有機溶媒（ジクロロメタン）の存在下で塩基触媒（トリエチレンアミン）と反応させる。次いで、ｍＰＥＧ−トシラートを、マレアミン酸化合物を生成するために、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド（「ＤＭＡｃ」）およびＮ−シクロヘキシルピロリジノン（「ＣＨＰ」）の有機溶媒混合物中で２８％アンモニア水および無水マレイン酸と反応させる。次いで、この化合物を、ｍＰＥＧ−マレイミドを生成するために、ジクロロメタンの存在下でペンタフルオロフェニルトリフルオロアセタートと反応させる。
【００９１】
あるいは、ｍＰＥＧ−マレイミドは、ｍＰＥＧ−トシラートを生成するために、トシル化試薬（ｐ−トルエンスルホニルクロライド）および有機溶媒（ジクロロメタン）の存在下で、塩基触媒（トリエチレンアミン）とｍＰＥＧ−ＯＨを反応させることによって作製することができる。次いで、ｍＰＥＧ−トシラートを、ｍＰＥＧ−ＮＨ２を製造するために２８％アンモニアと反応させる。次いで、ｍＰＥＧ−ＮＨ２を、ｍＰＥＧ−マレイミドを生成するために飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）の存在下で、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド（ＭＣＭ）と反応させる。
【００９２】
ＰＡＯとの抱合のためのアミン反応性の化学を使用して、修飾することができるヒトＨｂのアミノ酸残基側鎖の非限定的な例を下の表１に示す：
【００９３】
【表１】
2018150335.tif 000026
【００９４】
Ｈｂ上の利用できる抱合部位の数を増加させる一つの方法は、スルフヒドリル基を導入することであり（また、チオール化としても知られる）、遊離アミンよりもＭａｌＰＥＧとより反応性の傾向がある。様々な方法がタンパク質チオール化について公知である。一つの方法において、無タンパク質アミンを、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートと反応させ、続いてジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）で還元する。この反応は、２−ピリジンチオン発色団を放出し、チオール化の程度を決定するために用いることができる。また、アミンは、スクシンイミジルアセチルチオアセタート、続いて、５０ｍＭヒドロキシルアミンまたは中性付近のｐＨにおけるヒドラジンとの反応によってによって間接的にチオール化することができる。
【００９５】
米国特許第５，５８５，４８４号において記述されたもう一つの方法は、抱合後、Ｈｂのアミノ（α−またはε−）基の正電荷を維持する。この方法は、タンパク質上にスルフヒドリル基を導入するために、２−ＩＴによって、Ｈｂのε−アミノ基のアミジン化を含む。このアプローチは、以前に使用されたスクシンイミジル化学に対して少なくとも２つのさらなる利点を有する：１）スルフヒドリル基とのマレイミド基の高い反応性および選択性は、チオールのきわどい定量的修飾を容易にし、試薬の過剰が制限される、および２）２−ＩＴのチオール基は、潜在的であり、およびタンパク質アミノ基と試薬の反応の結果として、インサイチューでのみ生成される。これらの利点は、１つのさらなる利益を提供し、これらは、表面装飾のためのチオール化およびペグ化試薬の両方とＨｂの同時のインキュベーションを可能にする。
【００９６】
たとえば、ＭａｌＰＥＧを、Ｈｂのアミンをチオール化することによってＨｂに抱合してＨｂの表面上にチオール基を導入することができる。反応に利用できるＨｂの２つの固有のチオール基は、βＣｙｓ９３にあり、およびＨｂの表面上に付加されたチオール基は、マレイミジルＰＡＯのマレイミドと反応してペグ化Ｈｂ抱合体を形成することができる。
【００９７】
マレイミド−ＰＥＧは、ＰＥＧにマレイミドを付着するためのリンカーを含む。リンカーは、エチレン、プロピレンまたはイソプロピレン、フェニレン、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）またはフェニルカルバメート（たとえば、−Ｐｈ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−））などのアルキレンを含むが、限定されない。
【００９８】
チオール反応性化学を使用して修飾することができるアミノ酸残基側鎖の非限定的な例を、下の表２に示す：
【００９９】
【表２】
2018150335.tif 000027
【０１００】
ＰＡＯ−Ｈｂの分子量は、抱合反応によって調節することができる。従来の考えは、反応物のモル比を増加させることがＨｂに結合するＰＥＧ分子の数を増加させるだろうことを示唆した。これは、Ｈｂのチオール化プロセス（すなわち、Ｈｂ対チオール化する薬剤のモル比を増加させること）および抱合プロセス（すなわち、チオール活性化されたＰＥＧ対チオール化Ｈｂのモル比をに増加させること）の両方を含んだ。しかし、これらの過剰なモル比は、Ｈｂあたり６±１ＰＥＧ分子のみの結合を生じた（米国特許第７，５０１，４９９号を参照されたい）。
【０１０１】
近年、より多数のＰＡＯ分子を、反応物のより低いモル比を使用してＨｂに結合することができることが決定された。Ｈｂ上の利用できるチオール基の数を、チオール化前および後、並びに抱合後にジチオピリジン比色アッセイを使用して決定した（Ａｍｐｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３２：１６３−１６９）。ヒトＨｂは、β９３システイン残基にて２つの固有の反応性のチオール基を含み、これはジチオピリジン反応によって確認された。２−ＩＴでのＳＦＨのチオール化後、反応性チオール基の数は、２〜７以上まで増加した。この例において、平均８  ＰＥＧ分子が、Ｈｂに結合した。これを、チオール化反応において、ＳＦＨに対して７．５倍のモル過剰の２−ＩＴおよび抱合反応において、チオール化Ｈｂに対して１２倍のモル過剰のＭａｌＰＥＧを使用して達成した。
【０１０２】
ヘモグロビンは、Ｈｂ−ＰＡＯ抱合体の酸素親和性が増加するように酸素化した状態にあるとき、ポリアルキレンオキシドと抱合する。
【０１０３】
ニトロキシル化されたタンパク質
ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を有する。ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含み、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩ）を有することができる：
【化２４】
2018150335.tif 000028
式中Ｚは、タンパク質を表し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素であり；Ｙは、ＣＨ２であり；ｍは、０または１であり；ｎは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、−ＮＨ−基は、タンパク質のアミン基であり、およびＮは、タンパク質の窒素である。
【０１０４】
ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むことができ、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩ）を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙ、ｍ、ｎおよびＺは、上記の通り、式（ＶＩ）と関連し、Ｘは、酸素または硫黄である。
【０１０５】
ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むことができ、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩ）を有することができ、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙ、ｍ、ｎおよびＺは、上記の通り、式（ＶＩ）と関連し、Ｘは、酸素である。
【０１０６】
ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むことができ、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩ）を有することができ、式中Ｙ、ｍ、ｎおよびＺは、上記の通り、式（ＶＩ）と関連し、Ｘは、酸素であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３である。
【０１０７】
ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むことができる、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩＩ）を有する：
【０１０８】
【化２５】
2018150335.tif 000029
式中Ｚは、タンパク質を表し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｙは、ＣＨ２であり；ｍは、０または１であり；ｎは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり；−ＮＨ−基は、タンパク質のアミン基であり；およびＮは、タンパク質の窒素である。
【０１０９】
ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むことができ、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩ）または（ＶＩＩ）を有することができ、式中Ｘ、Ｙ、ｍ、ｎおよびＺは、定義したように、式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）と関連し、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３である。
【０１１０】
ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むことができ、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩ）または（ＶＩＩ）を有し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、Ｙ、Ｍ、ｎおよびＺは、式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）に関してと同様に定義され、およびｍは、０である。
【０１１１】
ニトロキシル化されたタンパク質は、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基を含むことができ、ニトロキシル化されたタンパク質は、構造（ＶＩ）または（ＶＩＩ）を有し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、Ｙ、Ｍ、ｎおよびＺは、式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）に関してと同様に定義され、および式中ｍは、１である。
【０１１２】
上のニトロキシル化されたタンパク質のいずれかにおいて、少なくとも１つのニトロキシル化されたアミノ基は、タンパク質のＮ末端アミノ基またはリジン残基のイプシロン（ε）アミノ基であることができる。
【０１１３】
ニトロキシル化されたタンパク質は、適切にポリニトロキシル化されたタンパク質であることができる。たとえば、式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の構造を有するニトロキシル化されたタンパク質については、ｎは、約１〜約２５であり；ｎは、少なくとも約２であり；ｎは、少なくとも約５であり；ｎは、少なくとも約１０であり；またはｎは、約１５〜約２０である。
【０１１４】
ポリニトロキシル化されたタンパク質は、ポリニトロキシル化されたヘムタンパク質であることができる。
【０１１５】
ヘムタンパク質は、本発明の実施において有用である。四量体ヘモグロビン（Ｈｂ）に加えて、これは、ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１：１３において記述されたものなどの、単鎖（単量体）天然または組換えヘムタンパク質を含み、それは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｐｄｆ／１４７２−６８０７−１１−１３．ｐｄｆにてアクセス可能である。ヘムタンパク質のその他の例は、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１：１０８５−１０９８（１９９８）において見ることができる。
【０１１６】
多様なＨｂを本発明で利用してもよい。Ｈｂは、ヒト、ウシ、豚または馬のヘモグロビンなどの動物供与源から得てもよい。ヒトＨｂが好ましい。Ｈｂは、天然供与源から得ることができ、または公知の組換え方法によって産生することができる。
【０１１７】
本発明のヘモグロビンは、ストローマフリーヘモグロビンのものより大きい高酸素親和性を有する。これは、ヘモグロビンが、３７℃およびｐＨ７．４にて測定されたときに、１５ｍｍＨｇ未満、好ましくは約２〜約１０ｍｍＨｇおよび最も好ましくは約２〜約８ｍｍＨｇまたは約２〜約５ｍｍＨｇのＰ５０を有するだろうことを意味する。
【０１１８】
たとえば、ニトロキシル化されたタンパク質は、ヘモグロビンα−サブユニット、ヘモグロビンβ−サブユニット、ヘモグロビン四量体またはミオグロビンを含むことができる。
【０１１９】
ニトロキシル化されたタンパク質は、ヘモグロビンα−サブユニット、ヘモグロビンβ−サブユニット、ヘモグロビン四量体、ミオグロビンまたはアルブミンを含むことができる。
【０１２０】
ニトロキシル化されたタンパク質がアルブミンである場合、ニトロキシル化されたタンパク質は、血清アルブミンを含むことができる。血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むことができる。ＨＳＡは、５８５のアミノ酸を有する単一のポリペプチドである。ＢＳＡは、６０のリジン、１７対のジスルフィド架橋および１つの遊離システインを含み、およびおよそ〜６７ｋＤの分子量を有する。
【０１２１】
ニトロキシル化されたタンパク質は、ヘモグロビンα−サブユニットまたはヘモグロビンβ−サブユニットもしくはヘモグロビン四量体を含むことができる。ニトロキシル化されたタンパク質は、動物ヘモグロビンα−サブユニット、動物ヘモグロビンβ−サブユニットまたは動物ヘモグロビンα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含むヘモグロビン四量体を含むことができる。
【０１２２】
ニトロキシル化されたタンパク質は、ヒトヘモグロビンα−サブユニット、ヒトヘモグロビンβ−サブユニットまたはヒトヘモグロビンα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含むヘモグロビン四量体を含むことができる。
【０１２３】
ニトロキシル化されたタンパク質がヘモグロビン四量体である場合、ヘモグロビンは、分子内で架橋することができる。分子内架橋ヘモグロビンは、二量体への解離および腎臓によって除去されることを回避することを妨げ、循環半減期を延ばす。様々な方法は、Ｈｂを分子内に架橋するための当該技術分野において公知である。化学的架橋試薬は、グルタルアルデヒド（米国特許第７，００５，４１４号）、ポリアルデヒド（米国特許第４，８５７，６３６号）、ジアスピリン（米国特許第４，５２９，７１９号）、ピリドキシル−５’−ホスフェート（米国特許第４，５２９，７１９号）トリメソイルトリス（メチルホスフェート）（米国特許第５，２５０，６６５号）、ジアルキン（アジドリンカーを有するヘモグロビンとの反応のため。Ｆｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００９，７３１５−７３１７、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０，４６：７５５７−７５５９を参照されたい）を含み、およびヘモグロビンは、組換え方法論を介して架橋することができる。
【０１２４】
たとえば、ヘモグロビン四量体は、架橋されたαα二量体または架橋されたββ二量体を含むことができる。
【０１２５】
上の表１に示したように、ヒトヘモグロビンＮ末端基バリン残基のα−およびβ−サブユニットは、Ｎ末端アミノ基上で、ニトロキシル化することができる。加えて、ヒトヘモグロビンのα−およびβ−サブユニットは、ε−アミノ基にてニトロキシル化することができる多数のリジン基を含む。
【０１２６】
加えて、ニトロキシル化されたタンパク質は、ヒトヘモグロビンα−サブユニットを含むことができる。ヒトヘモグロビンα−サブユニットは、Ｎ末端バリン残基のα−アミノ基にてニトロキシル化することができる。さらに、ヒトヘモグロビンα−サブユニットは、リジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９およびこれらの組み合わせからなる群より選択されたリジン残基のε−アミノ基にてニトロキシル化することができる。
【０１２７】
また、ニトロキシル化されたタンパク質は、ヒトヘモグロビンβ−サブユニットを含むことができる。ヒトヘモグロビンβ−サブユニットは、Ｎ末端バリン残基のα−アミノ基にてニトロキシル化することができる。また、ヒトヘモグロビンβ−サブユニットは、リジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されたリジン残基のε−アミノ基にてニトロキシル化することができる。
【０１２８】
さらに、ニトロキシル化されたタンパク質は、ヘモグロビン四量体を含むことができ、およびヘモグロビン四量体は、約１７のニトロキシル化されたアミノ基を含むことができる。
【０１２９】
ニトロキシル化およびＰＡＯ抱合されたタンパク質
また、ニトロキシル化されたタンパク質は、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）に抱合することができる。ＰＡＯは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることができる。
【０１３０】
ＰＥＧは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有することができる；約３，０００〜約１０，０００ダルトン；約４，０００〜約６，０００ダルトン；または約５，０００ダルトン。
【０１３１】
また、ニトロキシル化されたタンパク質は、マレイミド−ＰＥＧであるＰＥＧに抱合することができる。マレイミドは、アルキレンまたはフェニレンリンカーを介して、ＰＥＧに連結することができる。アルキレンリンカーは、エチレンリンカーであることができる。
【０１３２】
また、ニトロキシル化されたタンパク質は、タンパク質のシステイン残基の固有のチオール部分、タンパク質のチオール化されたリジン残基のチオール部分およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のチオール部分に抱合されたマレイミド−ＰＥＧである抱合されたＰＥＧを有することができる。
【０１３３】
ニトロキシル化されたタンパク質は、マレイミド−ＰＥＧである抱合されたＰＥＧを有することができ、システイン残基の固有のチオール部分に抱合された、またはチオール化されたリジン残基のチオール部分に抱合されたマレイミド−ＰＥＧは、構造（ＶＩＩＩ）を有する
【化２６】
2018150335.tif 000030
式中Ｚは、タンパク質を表し、Ｓは、タンパク質のチオール基であり、Ｒ３は、アルキレンまたはフェニレン基であり、Ｘは、末端基であり、ｍは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、およびｎは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数を表す。
【０１３４】
ニトロキシル化されたタンパク質は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｒ３は、エチレンである。
【０１３５】
ニトロキシル化されたタンパク質は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有することができ、式中ｍは、約６〜約１０である。
【０１３６】
ニトロキシル化されたタンパク質は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有することができ、式中Ｘは、メトキシ（−ＯＣＨ３）またはカルボキシラート（−ＣＯＯＨ）である。
【０１３７】
ニトロキシル化されたタンパク質は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有することができ、式中マレイミド−ＰＥＧは、ヘモグロビンβ−サブユニットのシステイン−９３残基のチオール部分に抱合される。
【０１３８】
ニトロキシル化されたタンパク質は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中マレイミド−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットのチオール化されたリジン残基のチオール部分に抱合される。ニトロキシル化されたタンパク質は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中チオール化されたリジン残基は、リジン−７リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９およびこれらの組み合わせからなる群より選択されたヒトヘモグロビンα−サブユニットのチオール化されたリジン残基である。式（ＶＩＩＩ）のニトロキシル化されたタンパク質、式中チオール化されたリジン残基は、リジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されたヒトヘモグロビンβ−サブユニットのチオール化されたリジン残基である。
【０１３９】
ニトロキシル化ヘモグロビン四量体
ニトロキシル化されたヘモグロビンの任意の１つの少なくとも１つのα−サブユニットまたは少なくとも１つのβ−サブユニットを含むヘモグロビン四量体を、本明細書において記述した。
【０１４０】
これらのヘモグロビン四量体は、本明細書において記述したニトロキシル化されたヘモグロビンの任意の１つの少なくとも１つのα−サブユニットおよび少なくとも１つのβ−サブユニットを有することができる。
【０１４１】
ヘモグロビン四量体は、本明細書において記述したニトロキシル化されたヘモグロビンの任意の１つの２つのα−サブユニットおよび２つのβ−サブユニットを含むことができる。
【０１４２】
本明細書において記述したヘモグロビン四量体は、ヘモグロビンは、四量体あたり平均５〜１０ＰＡＯ分子において抱合され、ヘモグロビンは、四量体あたり平均７．１〜８．９ＰＡＯ分子において抱合される。
【０１４３】
ヘモグロビンが酸素化されているヘモグロビン四量体。
【０１４４】
ヘモグロビンが脱酸素化されているヘモグロビン四量体。
【０１４５】
ヘモグロビンがＣＯ、ＮＯまたはＣＯおよびＮＯの混合物とリガンド結合しているヘモグロビン四量体。
【０１４６】
本発明のヘモグロビン抱合体は、酸素化したまたは脱酸素化された形であることができ、ＣＯまたはＮＯにリガンド結合することができ、またはこれらの４つの形の２つ以上を含む混合物であることができる。ＨｂＯ２は、空気、純Ｏ２気体またはＯ２／窒素ガス混合物で非酸素化したヘモグロビンを平衡化することによって製造される。
【０１４７】
脱酸素は、当該技術分野において公知の任意の方法によって行うことができる。１つの単純な方法は、窒素、アルゴンまたはヘリウムなどの不活性気体にヘモグロビン溶液を曝露することである。脱酸素が相対的に均一であることを保証するために、Ｈｂ溶液をこのプロセスにおいて循環させる。所望のレベルを達成するための脱酸素モニタリングは、Ｃｏ−ｏｘｉｍｅｔｅｒ  ６８２（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用することによって行ってもよい。部分的な再酸素負荷が所望である場合、脱酸素化されたＨｂを、酸素にまたは空気などの酸素を含む気体混合物に曝露してもよい。
【０１４８】
分子酸素を別の気体で置換するガス交換は、ポリプロピレンまたは酢酸セルロース膜などのガス透過性膜を介して達成してもよい。たとえば、公開された米国特許出願第２００６／０２３４９１５号を参照されたい。これらの膜を利用する市販の気体−交換装置は、Ｃｅｌｇａｒｄ（商標）ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ  （Ｄａｌｌａｓ，  ＴＸ）またはｔｈｅ  Ｃｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ（商標）  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ  ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｅａｓｔ  Ｌｙｍｅ，  ＣＴ）を含む。Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃｅｌｇａｒｄ（商標）装置において、酸素化したＨｂを、システムが５〜２０ｐｓｉにて窒素で除去されると共に１０〜１００ｍｌ／分／ｆｔ２にてポリプロピレン微小孔構造中空フィルターを介して水性Ｈｂ溶液を通過させることによって脱酸素化する。一般に、Ｈｂを約５〜３０分間循環させて、デオキシＨｂの所望の割合を達成する。脱酸素化されたＨｂを産生するためのもう一つの方法は、アスコルビン酸ナトリウム、ナトリウムジチオン酸塩および亜硫酸水素ナトリウムなどの化学的還元薬剤にヘモグロビン溶液を曝露することを含む。Ｈｂは、還元薬剤濃度、反応時間および温度を調整することによって部分的に脱酸素化される。あるいは、実質的に、還元薬剤を使用してＨｂを脱酸素化してもよく、および次いで、酸素を部分的に再導入して脱酸素化された産物を形成してもよい。たとえば、Ｈｂを、抗酸化剤を添加する前に約１時間１００ｍＭ濃度の亜硫酸水素ナトリウムに曝露することができる。
【０１４９】
Ｈｂは、単にＣＯをＯ２に置換することによって、オキシヘモグロビンを形成するための任意の公知の方法を使用して、ＣＯにリガンド結合することができる。これは、一般にヘモグロビンがＯ２の代わりにＣＯとリガンド結合されるように、ヘモグロビンの溶液へＣＯの供与源を導入することを含む（Ｋ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８２：１８３−１８９（２００４））。ヘモグロビンは、酸素に対してよりも高い親和性をＣＯに対して有するので、最初に、ヘモグロビンを脱酸素化することは必要でない。したがって、ＣＯ−Ｈｂ複合体を形成する最も便利な方法は、１００％のガス状ＣＯをヘモグロビンの溶液に導入することである。
【０１５０】
ＨｂＮＯを、一酸化窒素気体で脱酸素化されたヘモグロビンを反応させることによって、またはＮＯがＣＯに交換するようにＮＯ気体にＣＯ−Ｈｂを曝露することによって製造することができる。また、ＨｂＮＯは、ＰＲＯＬＩ  ＮＯＮＯａｔｅ（商標）（すなわち、１−（ヒドロキシ−ＮＮＯ−アゾキシ）−Ｌ−プロリン、ジナトリウム塩；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）のように小さなＮＯドナー分子と脱酸素化されたヘモグロビンを反応させることによって作製することができる。
【０１５１】
遊離基ＮＯがグロビン鎖におけるアミノ酸側鎖群に結合されるヘモグロビンは、本明細書において定義したＮＯＨｂ複合体ではないことを留意するべきであり、このような化合物は、酸素の代わりにヘムポケットにおいてリガンドとして２価（非イオン性）ＮＯを含まないためである。たとえば、ニトロシルヘモグロビンは、遊離スルフヒドリル基に対する結合を生じさせる条件下で天然のヘモグロビンがＮＯドナーに曝露させたときに形成される（米国特許第６，６２７，７３８号）。まだ、このようなニトロシルヘモグロビンは、酸素運搬するが、一方、本発明のＮＯ-Ｈｂ複合体はしない。さらにまた、修飾ヘモグロビンが上記などのスルフヒドリル部分に向けられた反応によって形成されるとき、これらの部分は、ＮＯ結合にもはや利用できない。
【０１５２】
タンパク質およびＰＡＯ修飾タンパク質のニトロキシル化のための方法
また、本発明は、ＰＡＯ修飾タンパク質を含むタンパク質のニトロキシル化のための方法に関する。本発明の方法は、部位特異的なニトロキシル化を提供し、および好ましい反応条件下で行うことができる。これらの方法を使用して産生されるニトロキシル化ペグ化ヘモグロビンは、増強された循環時間およびタンパク質安定性、並びに高酸素親和性を有する。
【０１５３】
ニトロキシル化されたタンパク質は、式（ＩＩ）のニトロキシル化薬でタンパク質を反応することによって、製造することができる
【化２７】
2018150335.tif 000031
式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり；Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素であり；Ｙは、ＣＨ２であり；およびｍは、０または１である。
【０１５４】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬は、式（ＩＩ）に関して定義された通りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよびｍを有し、およびＸは、酸素または硫黄である、ニトロキシル化されたタンパク質を作製する方法。
【０１５５】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬は、式（ＩＩ）に関して定義された通りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｙおよびｍを有し、、およびＸは、酸素である、ニトロキシル化されたタンパク質を作製することで方法。
【０１５６】
式（ＩＩ）のニトロキシル化薬は、式（ＩＩ）に関して定義された通りのＹおよびｍを有し、、Ｘは、酸素であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３である、ニトロキシル化されたタンパク質を作製する方法。
【０１５７】
式（ＩＶ）のニトロキシル化薬とタンパク質を反応させることを含むニトロキシル化されたタンパク質を製造するための方法：
【化２８】
2018150335.tif 000032
式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり；Ｙは、ＣＨ２であり；およびｍは、０または１である。請求項Ｇ２の方法、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して−ＣＨ３である。
【０１５８】
式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬は、式（ＩＩ）または（ＩＶ）に関して定義された通りのＸ、Ｙおよびｍを有し、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３である、ニトロキシル化されたタンパク質を作製する方法。
【０１５９】
式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬は、式（ＩＩ）または（ＩＶ）に関して定義された通りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＸおよびＹを有し、およびｍは、０である、ニトロキシル化されたタンパク質を作製する方法。
【０１６０】
式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬は、式（ＩＩ）または（ＩＶ）に関して定義された通りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＸおよびＹを有し、およびｍは、１である、ニトロキシル化されたタンパク質を作製する方法。
【０１６１】
式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬の比は、タンパク質に対して約５〜約１００倍のモル過剰にて存在する、ニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１６２】
タンパク質は、ヘモグロビン四量体のα−またはβ−サブユニットを含む、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。タンパク質は、ヘモグロビン四量体を含む方法。ヘモグロビン四量体は、非酸素化したヘモグロビン四量体である方法。非酸素化したヘモグロビン四量体は、ＣＯリガンド結合したヘモグロビン四量体である方法。ヘモグロビン四量体は、脱酸素化されたヘモグロビン四量体である方法。
【０１６３】
反応は、約２℃〜約３０℃；約１５℃〜約２５℃；約２℃〜約８℃；約４℃；または約２０℃の温度にて実施される、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１６４】
反応は、約３〜約２０時間；約３〜約６時間；または約１６時間の間進行可能にすることができる、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１６５】
反応は、水性溶媒中で実施される、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法
【０１６６】
反応は、約６．５〜約８．５のｐＨ；約７．５のｐＨ；または約７．２のｐＨにて実施される、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１６７】
タンパク質は、ヘモグロビン四量体を含み、反応は、約７．２のｐＨおよび約２℃〜約８℃の温度にて実施され、および約１６時間の間進行可能にすることができ、および方法は、約１７のニトロキシル化されたアミノ基を有するニトロキシル化されたヘモグロビン四量体を生じる、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１６８】
タンパク質は、ヘモグロビン四量体を含み、およびニトロキシル化薬は、ヘモグロビン四量体に対して約１０〜約１００倍のモル過剰にて存在する、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１６９】
反応の産物は、式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）のニトロキシル化されたタンパク質または本明細書において記述したヘモグロビン四量体である、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用するニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１７０】
ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）にタンパク質を抱合することをさらに含む、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１７１】
水性希釈剤中でタンパク質にスクシンイミジルバレラートＰＡＯを添加してタンパク質を抱合したＰＡＯ−バレラートを形成することをさらに含む、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。水性希釈剤中で２−イミノチオラン（２−ＩＴ）とタンパク質を混合してチオール化されたタンパク質を形成すること；および水性希釈剤中でチオール化されたタンパク質にＰＡＯ−マレイミドを添加してタンパク質を抱合したＰＡＯ−マレイミドを形成することをさらに含む方法。ＰＡＯがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である方法。
【０１７２】
ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）にタンパク質を抱合することをさらに含み、およびＰＡＯは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、ＰＥＧは、約２，０００〜約２０，０００ダルトン；約３，０００〜約１０，０００ダルトン；約２，０００〜約６，０００ダルトン；または約５，０００ダルトンの平均分子量を有する、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１７３】
ＰＥＧは、マレイミド−ＰＥＧである、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。マレイミドをアルキレンまたはフェニレンリンカーを介してＰＥＧに連結する方法。アルキレンリンカーは、エチレンリンカーである方法。マレイミド−ＰＥＧは、タンパク質のシステイン残基の固有のチオール部分、タンパク質のチオール化されたリジン残基のチオール部分およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のチオール部分に抱合される方法。
【０１７４】
システイン残基の固有のチオール部分に抱合されたマレイミド−ＰＥＧは、構造（ＶＩＩＩ）を有する、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法、
【化２９】
2018150335.tif 000033
式中Ｚは、タンパク質を表し、Ｒ３は、アルキレンまたはフェニレン基であり、Ｓは、タンパク質のチオール基であり、ｍは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、およびｎは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数を表す。
【０１７５】
システイン残基の固有のチオール部分に抱合されたマレイミド−ＰＥＧは、Ｒ３がエチレンである構造（ＶＩＩＩ）を有する方法。タンパク質は、ヘモグロビンα−サブユニット、ヘモグロビンβ−サブユニット、ヘモグロビン四量体、ミオグロビンまたはアルブミン含む方法。タンパク質は、血清アルブミンを含む方法。血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む方法。タンパク質は、ヘモグロビン四量体を含む方法。
【０１７６】
ヘモグロビン四量体は、架橋されたαα二量体または架橋されたββ二量体を含む方法。マレイミド−ＰＥＧは、ヘモグロビンβ−サブユニットのシステイン−９３残基のチオール部分に抱合される方法。マレイミド−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットのチオール化されたリジン残基のチオール部分に抱合される方法。チオール化されたリジン残基は、リジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンα−サブユニットのチオール化されたリジン残基である方法。チオール化されたリジン残基は、リジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンβ−サブユニットのチオール化されたリジン残基である方法。
【０１７７】
２−イミノチオラン（ｉｍｉｎｉｔｈｉｏｌａｎｅ）は、タンパク質濃度に対して約７〜約１５倍モル過剰の間；タンパク質濃度に対して約７〜約８倍のモル過剰の間；またはタンパク質濃度に対して約７．５倍のモル過剰の濃度にて存在する、式（ＩＩ）のまたは（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１７８】
ＰＡＯ−マレイミドは、タンパク質濃度に対して約９〜約２０倍のモル過剰の間；タンパク質濃度に対して約９〜約１５倍のモル過剰の間；またはタンパク質濃度に対して約１２倍のモル過剰の濃度にて存在する、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１７９】
チオール化工程は、約７〜約９の間のｐＨ；または約８．５のｐＨにて実施される、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１８０】
チオール化されたタンパク質にＰＡＯ−マレイミドを添加してＰＡＯ−マレイミド抱合されたタンパク質を形成するする工程は、約６．５〜約８．５の間のｐＨにて；または約７．５のｐＨにて実施される、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。
【０１８１】
ＰＥＧは、ＳＶＡ−ＰＥＧである、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。スクシンイミドは、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）４−を介して、ＰＥＧに連結される方法。ＳＶＡ−ＰＥＧは、タンパク質のリジン残基のε−アミノ部分、タンパク質の末端バリン残基のα−アミノ部分またはこれらの組み合わせから選択されるタンパク質のアミノ部分に抱合することができる。また、ＳＶＡ−ＰＥＧは、タンパク質のリジン残基のε−アミノ部分に抱合することができ、またはタンパク質の末端バリン残基のα−アミノ部分は、構造（ＩＸ）を有する
【化３０】
2018150335.tif 000034
式中Ｚは、タンパク質であり、Ｎは、タンパク質の窒素であり、Ｘは、末端基であり、ｍは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の数であり、およびｎは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数である。
【０１８２】
Ｘは、ＰＡＯの末端基であり、およびヒドロキシ、ベンジルオキシなどのアリールオキシまたはＣ１〜Ｃ２０アルコキシ、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０アルコキシ基およびさらにより好ましくはメトキシまたはエトキシなどのＣ１〜Ｃ５アルコキシ基であることができる。
【０１８３】
式ＩＸについて、ｍは、四量体あたり平均約６〜約１０  ＰＡＯ分子である、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。ＳＶＡ−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットのリジン残基のε−アミノ部分に抱合される。ＳＶＡ−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットの末端バリン残基のα−アミノ部分に抱合される。
【０１８４】
式ＩＸについて、リジン残基は、リジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンα−サブユニットのリジン残基である、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。リジン残基は、リジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンβ−サブユニットのリジン残基である。
【０１８５】
タンパク質は、タンパク質のニトロキシル化の前にＰＡＯに抱合される、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のニトロキシル化薬を使用してニトロキシル化されたタンパク質を作製するための方法。、チオール化されたタンパク質にＰＡＯ−マレイミドを添加してＰＡＯ−マレイミド抱合されたタンパク質を形成する工程は、タンパク質のニトロキシル化と並行して行うことができる。タンパク質にスクシンイミジルバレラートＰＡＯを添加してＰＡＯ−バレラート抱合されたタンパク質を形成する工程は、タンパク質のニトロキシル化と並行して行われる。
【０１８６】
上の方法のいずれかにおいて、ニトロキシル置換の程度は、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して評価および定量化することができる
【０１８７】
医薬組成物
本発明のＰＡＯ−Ｈｂ抱合体は、水性希釈剤などの非経口投与のための薬学的に許容される担体中にＰＡＯ−Ｈｂ抱合体を含む医薬組成物として製剤化することができる。担体におけるＰＡＯ−Ｈｂ抱合体の濃度は、適用に従って変えることができる。好ましくは、ＰＡＯ−Ｈｂ抱合体の濃度は、約０．１ｇ／ｄｌ〜約１０ｇ／ｄｌ、より好ましくは約２．０ｇ／ｄｌ〜約８．０ｇ／ｄｌおよび最も好ましくは約４．０〜約６．０ｇ／ｄｌの範囲である。ヘモグロビンの適切な濃度の選択は、最終ヘモグロビン産物のコロイド性浸透圧（腫脹の）特性に依存する。好ましくは、本発明の組成物は、全血と比較して、正常腫脹性(normooncotic)または血漿と比較して高張性(hyperoncotic)である。ヘモグロビン濃度は、それぞれの指標について所望のコロイド浸透圧を得るように調整することができる。
【０１８８】
組成物が非経口として製剤化されるとき、一般に、溶液は、全血と等張の生理的に適合性の電解質担体を含み、およびヘモグロビンの可逆的な酸素−、ＣＯ−またはＮＯ−運搬および送達特性を維持する。
【０１８９】
薬学的に許容される担体は、水性希釈剤であることができる。水性希釈剤は、コロイドの水性溶液または成分を運搬する非酸素の水性溶液、アルブミンなどのタンパク質の水性溶液、糖タンパク質の水性溶液、多糖の水性溶液またはこれらの組み合わせなどを含むことができる。水性希釈剤は、水性無細胞溶液を含むことができる。
【０１９０】
適切な水性希釈剤は、生理食塩水、生理食塩水−グルコース混合物、Ｒｉｎｇｅｒ液、乳酸Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｌｏｃｋｅ−Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｈａｒｔｍａｎｎの平衡生理食塩水、ヘパリン処置したクエン酸ナトリウム−クエン酸−デキストロース溶液、アセテート溶液、複数の電解質溶液（たとえば、Ｐｌａｓｍａ  Ｌｙｔｅ（登録商標）  ｏｒ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌｙｔｅ−Ａ（登録商標）ｆｒｏｍ  Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ラクトビオナート溶液および重合体の代用血漿、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、エチレンオキシド−プロピレングリコール凝縮物またはこれらの組み合わせなどを含むが、限定されない。
【０１９１】
加えて、組成物は、当該技術分野において周知の薬学的に許容される充填剤、塩およびその他の材料を含むことができ、その選択は、投薬形態、治療されている条件、当業者の決定に従って達成される特定の目的およびこのような添加剤の特性に依存する。たとえば、組成物は、生理緩衝液、炭水化物（たとえば、グルコース、マンニトールまたはソルビトール）、アルコールまたはポリアルコール、薬学的に許容される塩（たとえば、ナトリウムまたは塩化カリウム）、表面活性物質（たとえば、ポリソルベート８０）、抗酸化剤、抗バクテリア薬剤、コロイド浸透圧薬剤（たとえば、アルブミンまたはポリエチレングリコール）または還元薬剤（たとえば、アスコルビン酸、グルタチオンまたはＮ−アセチルシステイン）を含むことができる。
【０１９２】
医薬組成物は、少なくとも約２センチポアズ（ｃｐ）の粘性を有する。より具体的には、粘性は、約２〜約５ｃｐおよび特に約２．５〜約４．５ｃｐの範囲である。
【０１９３】
投与における合併症を回避するために、医薬組成物は、高純度のもの、すなわち間質およびリン脂質および発熱物質がなく、ＬＡＬ（カブトガニアメーバ様細胞溶解物）試験によって測定したとき、わずか０．２５Ｅｕ／ｍｌのエンドトキシンレベルを有し、および８％未満のメトヘモグロビンを有する。
【０１９４】
医薬組成物は、皮下、静脈内または筋肉内注射によってなど非経口的に、または大きな容積非経口液として投与することができる。また、組成物は、経管栄養によって投与することができる。
【０１９５】
治療薬としてのヘモグロビン抱合体の典型的な用量は、患者の体重量キログラムあたり約１〜約１５，０００ミリグラムのヘモグロビンであることができる。たとえば、酸素治療剤として使用されるときに、投薬量は、患者の体重量の１００〜７５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは体重量の５００〜５０００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは体重量の７００〜３０００ｍｇ／ｋｇの間の範囲だろう。したがって、ヒト患者のための典型的な用量は、１グラム〜１０００グラム以上であるかもしれない。、それぞれの投薬量形態の個々の用量に含まれない活性成分のユニット含量は、必要な有効な量を多数の個々の用量の投与によって到達することができるので、それ自体において有効量を構成する必要がないことが認識されるであろう。投薬量の選択は、利用される投薬形態、治療される状態および当業者の決定に従って達成される特定の目的に依存する。
【０１９６】
治療の方法
ＰＡＯ−Ｈｂ抱合体および医薬組成物は、酸素、ＣＯおよび／またはＮＯを被験体に送達するために使用することができる。組織に酸素、一酸化窒素、一酸化炭素またはそれらの混合物を送達し、および亜硝酸塩を還元して微小血管系においてさらに内因性一酸化窒素（ＮＯ）を産生する方法は、その必要のある被験体にヘモグロビン抱合体または組成物を投与することを含み、投与後に、ヘモグロビンは、リガンド非結合になり、微小血管系において亜硝酸を一酸化窒素に変換する。
【０１９７】
本発明のヘモグロビン抱合体およびその組成物は：急性肝不全、ベータ地中海貧血症、火傷、慢性重篤な肢虚血、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（たとえば、急性悪化）、鬱血性心不全（たとえば、急性心不全、慢性心不全）、低酸素症（たとえば、肺水腫を含む高高度用途、減圧症）、マラリア（たとえば、大脳マラリア（熱帯熱閉塞性のイベント）、器官虚血（たとえば、急性腸虚血（ねじれ）、急性腸虚血（塞栓症）、心臓性ショック、急性血管器官虚血、脳卒中（ＣＡＴスキャン前）、脳卒中（ＣＡＴスキャン後）、心筋梗塞／重篤な心虚血）、末梢血管疾患、ポルフィリン症、妊娠における子癇前症、敗血症、鎌状赤血球症（たとえば、脳卒中／一過性脳虚血発作、脾臓血球貯留、肝臓血球貯留、持続勃起症）、網膜疾患／内部眼球条件（たとえば、網膜中心動脈閉塞、中心静脈閉塞）、睾丸捻転、外傷／ショック（たとえば、外傷性出血性ショック、非外傷性出血ショック、病院前／現場使用（軍事的／緊急）、外傷脳損傷／芽球）、潰瘍または血管攣縮；血管形成術に対する補助剤として、形成手術のための補助剤として（皮膚弁）（たとえば、急性治療、慢性治療）、または補助人工心臓を植設する際の補助剤として；代用血液として（たとえば、急性失血、エホバの証人、患者とクロスマッチさせることが困難、珍しい血液型、鎌骨髄無形成発症、鎌状赤血球性貧血術中管理、急性溶血性貧血（自己免疫性）、急性溶血性貧血（毒素）またはその他の不応性の貧血、心臓保護剤、凍結保存剤、血液透析補助剤、腫瘍学薬剤（たとえば、放射線療法または化学療法に対する補助、固形腫瘍）、器官保存剤（たとえば、エキソビボで、ドナーにおいて、レシピエントにおいて）、性能増強剤（たとえば、一般人の／スポーツの、軍事的な）、外科手術補助（たとえば、人工心肺（主な）、人工心肺（調整）、肺虚血、プレ外科手術調節、破裂性大動脈瘤、胸部大動脈の置換（解剖または動脈瘤））または創傷治癒薬剤；イメージングにおいて（Ｘ線または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ））；肺機能を改善する（たとえば、急性肺傷害、慢性肺傷害、一過性ウイルス性肺炎、新生児窮迫症候群）；またはこれらの組み合わせを治療するために使用することができる。このような用途は、その必要のある被験体への抱合体または組成物の投与を含む。
【０１９８】
さらに、本発明のヘモグロビンおよび組成物は、非外傷性出血ショック、病院前状況の外傷、外傷性出血ショック、急性肺傷害、成人呼吸不全症候群、外傷性脳損傷、脳卒中、固形腫瘍癌、器官分解(organ degradation)（エキソビボで）、器官分解（レシピエントにおいて）、重篤な敗血症／敗血症性ショック、心筋梗塞／心虚血、心臓性ショック、急性心不全、肺動脈塞栓症、外科手術による種々の状態（たとえば、血管形成術に対する補助剤、胸部大動脈修復に対する補助剤、人工心肺に対する補助剤、人工心肺のためのプライミング溶液）またはこれらの組み合わせを治療するために使用することができる。
【０１９９】
本発明のヘモグロビンおよび組成物が有用である多数の臨床的状況は、以下を含む：
【０２００】
外傷。全血の急性喪失は、皮膚および腸を含む低い優先度の器官から離れた血液を短絡すると共に、血液の失われた容積を置換するために、組織内および細胞内スペースから液体移動を生じ得る。器官から離れている血液を短絡するには、これらの器官におけるＯ２レベルを減少させ、時には除去し、および進行性の組織死を生じる。一次目標は、影響を受けた組織に酸素を与えることである。この外傷は、病院前状況であることができ、または外傷性出血ショックまたは外傷性脳損傷を生じることができる。
【０２０１】
虚血。また、抱合体およびその組成物は、赤血球または多くのその他の酸素治療が貫通することができない領域に酸素、ＣＯおよび／またはＮＯを送達するために使用することができる。これらの領域は、血栓の下流の領域、鎌形赤血球閉塞、動脈の閉塞、血管形成バルーン、外科的な計測手段などの赤血球フローの閉塞の下流に位置する任意の組織領域を含むことができ、および任意の組織は、酸素飢餓に罹患する、または低酸素である。たとえば、全てのタイプの組織虚血は、脳卒中、新進の脳卒中、一過性虚血発作、心筋気絶および休止状態、急性または不安定狭心症、新進の狭心症、梗塞および同様のものを含み、治療することができる。特に、虚血を生じる状態は、急性心不全、心臓性ショック、心筋梗塞／心虚血、脳卒中、肺動脈塞栓症、非外傷性出血ショックまたは脳血管外傷を含む。
【０２０２】
血液希釈。この適用において、治療薬は、取り出された自己の血液のＯ２レベルを交換する（または置換する）ために投与される。これは、外科手術の間と後に、必要な輸液のために取り出された自己の血液を使用することを可能にする。手術前血液除去を必要とするこのような１つの外科手術は、人工心肺手順である。
【０２０３】
敗血症／敗血症性ショック。敗血症において、何人かの患者は、大量の液体療法および血管収縮薬での治療にもかかわらず、高血圧性になるかもしれない。この例において、一酸化窒素（ＮＯ）の生産過剰は、降下された血圧を生じる。したがって、ヘモグロビンは、高結合活性化されたを伴うＮＯをヘモグロビンが結合するので、これらの患者の治療のための望ましい薬剤である。
【０２０４】
低酸素血症。患者が肺炎または膵臓炎のいずれかによって生じる急性肺傷害を有するとき、低酸素血症を観察することができ、および影響を受けた組織に酸素を与えるために、本発明のヘモグロビンまたは組成物を提供することによって緩和することができる。
【０２０５】
癌。固形腫瘍腫瘤の低酸素コアへのＯ２の送達は、放射線療法および化学療法に対するその感受性を増加させる。腫瘍の微小血管系が、その他の組織のそれとは異なるので、Ｏ２レベルを増加させることを介する感作は、Ｏ２が低酸素コアの中で降ろされることを必要とする。言い換えれば、Ｐ５０は、Ｏ２の早めの荷卸しを予防するために非常に低いべきであり、その後の放射線および化学療法治療に腫瘍の最適の感作を保証するために、Ｏ２レベルを増加させる。
【０２０６】
外科手術。本発明のヘモグロビンおよび組成物は、種々の外科的手順の間に使用することができる。たとえば、これらは、人工心肺手順の間、血管形成術、胸部の大動脈修復に対する補助剤として、または心肺プライミング溶液として使用することができる。
【０２０７】
器官灌流。器官がエキソビボで維持される、または臓器提供レシピエント内にあるとき、Ｏ２含量を維持することは、構造的なおよび細胞の統合性を保存するのを補助し、および梗塞形成を最小限にする。ヘモグロビンおよび組成物は、このような器官のために酸素需要量を持続することができる。
【０２０８】
また、ヘモグロビンおよびその組成物は、家畜などの非ヒトにおいて、使用することができる（たとえば、家畜およびイヌ、ネコ、ウマ、トリ、爬虫類などのコンパニオン・アニマル）。本発明は、傷害、溶血性貧血などのために血液の喪失で苦しんでいる飼育されたおよび野生の動物の応急処置における有用性を見いだすと考えられる。獣医学的用途は、傷害、溶血性貧血、馬伝染性貧血、ネコの感染性貧血、細菌感染、第ＩＶ因子断片化、過剰脾臓化および巨脾、家禽における出血症候群、形成不全性貧血、無形成性貧血、特発性免疫溶血性状態、鉄欠乏症、イソ免疫性溶血性貧血、細血管障害性溶血性貧血、寄生または外科的麻酔誘導された脳外傷のための血液の喪失の治療を含む。
【実施例】
【０２０９】
実施例１．４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ；１−（（（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）−４−オキシカルボニル）オキシ）−２，５−ピロリジンジオン）の合成
４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）１グラムを無水アセトニトリル２０ｍｌに溶解し、室温にて５分間混合した。一旦、ＴＥＭＰＯＬが溶解したら、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）（２ｅｑ）２．９７５ｇおよびトリエチルアミン（３．０ｅｑ）２．４２５ｍｌを反応に添加した。反応は、室温にて嫌気性条件下で６〜８時間行った。反応完了後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をエチルアセテートに溶解し、および飽和ＣｕＳＯ４水溶液で洗浄した。有機相を分離し、ＴＥＭＰＯＬ１グラムにつきＮａ２ＳＯ４  ０．５ｇを有機相に添加した。溶液を室温にて１５分間混合し、続いて濾過した。濾過した溶液を減圧下で蒸発させた。生成物、４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートを、ｎ−ヘプタンを添加することによって沈殿させ、濾過し、室温にて真空下で乾燥した。
【０２１０】
４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートの製造のための反応スキームを下に示してある：
【化３１】
2018150335.tif 000035
【０２１１】
実施例２．４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）の解析
ＥＳＩ−ＴＯＦ高精度質量分析を出発材料ＴＥＭＰＯＬおよび最終生成物４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）において行ってＴＥＭＰＯＬの４−ＳＴＣへの変換を確認した（図１および２）。
【０２１２】
加えて、図３に示したように、薄層クロマトグラフィーを、出発材料ＴＥＭＰＯＬ（レーン１）およびＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ、レーン３）、並びに６時間における反応生成物（レーン４）および沈殿後の最終生成物４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（レーン５）で行った。レーン２には、反応の間にＤＳＣから放出される反応副生成物、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）を充填した。図３から分かるように、最終生成物は、出発材料または副生成物のいずれも含まない。
【０２１３】
実施例３．３−スクシンイミジル−ＰＲＯＸＹＬ−カルボナート（３−ＳＰＣ；１−（（（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）−３−オキシカルボニル）オキシ）−２，５−ピロリジンジオン）の合成
３−スクシンイミジル−ＰＲＯＸＹＬ−カルボナートは、出発材料としてＴＥＭＰＯＬの代わりに３−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシルを用いて、４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナートについての実施例１における上記のものと類似の方法を使用して製造することができる。
【０２１４】
実施例４．４−スクシンイミジル−カルボキシ−ＴＥＭＰＯ（４−ＳＣＴ；１−（（（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）−４−カルボニル）オキシ）−２，５−ピロリジンジオン）の合成
４−カルボキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（４−カルボキシＴＥＭＰＯ）１グラムをテトラヒドロフラン７５ｍｌに溶解し、および室温にて５分間混合した。一旦、４−カルボキシＴＥＭＰＯを溶解したら、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．６３２ｇ（１．１ｅｑ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド１．１５ｇ（１．１ｅｑ）を反応に添加した。反応を２４時間、嫌気性条件下で室温にて行った。反応完了後、溶液を濾過し、減圧下で蒸発させた。残基をエチルアセテートに溶解し、水で洗浄した。有機相を分離し、４−カルボキシＴＥＭＰＯ  １グラムにつきＮａ２ＳＯ４  ０．５ｇを有機相に添加した。溶液を室温にて１５分間混合し、続いて濾過した。濾過した溶液を減圧下で蒸発させた。生成物、４−スクシンイミジル−カルボキシ−ＴＥＭＰＯをｎ−ヘプタンを添加することによって沈殿し、濾過し、室温にて真空下で乾燥した。
【０２１５】
４−スクシンイミジル−カルボキシ−ＴＥＭＰＯの製造のための反応スキームを以下に示してある：
【化３２】
2018150335.tif 000036
【０２１６】
実施例５．３−スクシンイミジル−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬ（３−ＳＣＰ；１−（（（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）−３−カルボニル）オキシ−２，５−ピロリジンジオン）の合成
３−スクシンイミジル−カルボキシプロキシルは、出発材料として４−カルボキシＴＥＭＰＯの代わりに３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル（３−カルボキシＰＲＯＸＹＬ）を使用して、４−スクシンイミジル−カルボキシ−ＴＥＭＰＯについての実施例３における上記の通りの化学を使用して合成することができる。
【０２１７】
実施例６．ポリニトロキシル化ペグ化ヘモグロビン（ＰＮ−ＰＥＧ−Ｈｂ）の製造
ポリニトロキシル化ヘモグロビンは、２工程プロセス：ａ）ＰＥＧ複合ヘモグロビンの製造およびｂ）ＰＥＧ−Ｈｂのポリニトロキシル化で製造した。
【０２１８】
ＰＥＧを、ストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）に、ＳＦＨを９倍のモル過剰の２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と２．５時間および１６倍のモル過剰のマレイミドＰＥＧ  ５０００（ＭａｌＰＥＧ５０００）と２時間反応させることによって抱合した。チオール化およびペグ化反応は、ｐＨ７．４にてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で行った。下の反応スキームに示したように、２−イミノチオランは、リジン残基をチオール化し、およびＭａｌＰＥＧ５０００は、β−Ｃｙｓ９３残基の固有のチオールと反応し、およびリジン残基をチオール化した：
【化３３】
2018150335.tif 000037
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、ヘモグロビン主鎖の残部を表し、Ｒ４は、エチレンであり、およびｎは、５，０００ダルトンのＰＥＧ鎖におけるオキシエチレンユニットの数を表す。上の反応スキームは、チオール化およびペグ化を分離した工程として示すが、反応は、単一の反応の混合に含まれたＳＦＨ、２−ＩＴおよびＭａｌＰＥＧ  ５０００との「ワンポット」反応として行われる。
【０２１９】
ＰＥＧ−Ｈｂのポリニトロキシル化を、カルボキシ−ＰＥＧ−Ｈｂを使用して行った。反応を室温にて、または冷蔵された状態においてＣＯの雰囲気下で、ヘモグロビンに対して３０倍のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）を使用して行った。ヘモグロビン分子あたりのニトロキシル基の数は、ヘモグロビンに対する４−ＳＴＣのモル過剰、反応が実施される温度および／または反応時間を変化させることによって変動し得る。ポリニトロキシル化ヘモグロビンを、７０ｋＤａの接線流濾過を使用して精製し、および最終生成物を無菌濾過し、およびＣＯの雰囲気下で貯蔵した。ＰＥＧ−ＨｂからのＰＮ−ＰＥＧ−Ｈｂの製造のための反応スキームを以下に示してある。
【化３４】
2018150335.tif 000038
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、ヘモグロビン主鎖の残部を表す。
【０２２０】
実施例７．ポリニトロキシル化ペグ化ヘモグロビン（ＰＮ−ＰＥＧ−Ｈｂ）の特性
図４は、ＴＥＭＰＯＬ（上方パネル）の非電子対、並びにポリニトロキシル化（ＰＮ-ＭＰ４）の前（中間パネル）および後（下方パネル）のペグ化ヘモグロビン（ＭＰ４）の両方についての電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを示す。
【０２２１】
図５は、ペグ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ；上方パネル）およびポリニトロキシル化ペグ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ−ＰＮ；下方パネル）のサイズ排除解析プロフィールを示す。サイズ排除解析を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムを使用して行い、およびタンパク質を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して溶出した。
【０２２２】
図６は、ポリニトロキシル化ペグ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ−ＰＮ）の特徴的な紫外可視スペクトルを示す。
【０２２３】
ＰＥＧ−Ｈｂ−ＰＮの安定性を、ラットにおいて１０％の天井負荷を施すことによってインビボで試験した。図７は、注入終了時にておよび注入後１時間にての血漿ヘモグロビンの紫外可視スペクトルを示す。
【０２２４】
図８は、ペグ化ヘモグロビン（ＭＰ４）を５、１０、２０、３０、５０または１００倍のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）を使用してニトロキシル化した実験の結果を示す。ニトロキシル化の程度は、４−ＳＴＣのモル過剰が５倍から３０倍に増加するにつれ、用量依存的な様式で増加した。ニトロキシル化の程度は、３０倍、５０倍または１００倍のモル過剰の４−ＳＴＣを使用したとき、およそ同じであった。
【０２２５】
実施例８．ポリニトロキシル化アルブミン（ＰＮ−Ａｌｂ）の製造
アルブミンのポリニトロキシル化を、２５％ヒト血清アルブミン溶液を使用して行った。アルブミン分子あたりのニトロキシル基の数は、アルブミンに対する４−ＳＴＣのモル過剰を変化させることによって変動した。反応を室温にて、または冷蔵された状態において、１７〜２４時間ｐＨ７．４にてアルブミンに対して５、１０、２０、３０、５０または１００倍のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）を使用して行った。ポリニトロキシル化アルブミンをゲル濾過によって精製し、アルブミン分子あたりのニトロキシル基の数を同定するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって解析した。４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）を使用するアルブミンからのＰＮ−アルブミンの製造のための反応スキームを以下に示してある：
【化３５】
2018150335.tif 000039
Ｒ１およびＲ２は、アルブミン主鎖の残部を表す。
【０２２６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、図９および１３（非ニトロキシル化ＨＳＡ）および１０〜１２および１４〜１６（それぞれ、ＨＳＡを、５、１０、２０、３０、５０または１００倍のモル過剰の４−ＳＴＣを使用してニトロキシル化した）に示した。図１７は、これらのデータのグラフ図を提供し、およびニトロキシル化の程度は、４−ＳＴＣのモル過剰が５倍から１００倍に増加するにつれ、用量依存的な様式で増加したことを示す。
【０２２７】
実施例９．ポリニトロキシル化ペグ化アルブミン（ＰＮ−ＰＥＧ−Ａｌｂ）の製造。
ポリニトロキシル化ペグ化アルブミンは、２工程プロセス：ａ）ＰＥＧ複合アルブミンの製造およびｂ）ＰＥＧ−Ａｌｂのポリニトロキシル化で製造した。
【０２２８】
ＰＥＧを、９倍のモル過剰の２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と２．５時間および１６倍のモル過剰のマレイミドＰＥＧ  ５０００（ＭａｌＰＥＧ５０００）と２時間アルブミンを反応させることによってアルブミンに抱合した。チオール化およびペグ化反応は、ｐＨ  ７．４にてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で行った。ペグ化の２時間後に、ＰＥＧ−アルブミン抱合体を、７０ｋＤａの接線流濾過を通過させて、反応していない試薬を除去し、および製剤緩衝液中で製剤化した。ポリニトロキシル化を室温にて、または冷蔵された状態においてアルブミンに対して１００倍のモル過剰の４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）を使用して４−スクシンイミジル−ＴＥＭＰＯ−カルボナート（４−ＳＴＣ）とＰＥＧ−アルブミンを反応させることによって行った。アルブミン分子あたりのニトロキシル基の数は、アルブミンに対する４−ＳＴＣのモル過剰、反応を実施する温度および／または反応時間を変化させることによって変動し得る。ポリニトロキシル化アルブミンを、７０ｋＤａの接線流濾過を使用して精製した。ＰＥＧ−ＡｌｂからＰＮ−ＰＥＧ−Ａｌｂの製造のための反応スキームを以下に示してある：
【化３６】
2018150335.tif 000040
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、アルブミン主鎖の残部を表し、Ｒ４はエチレンであり、およびｎは５，０００ダルトンＰＥＧ鎖におけるオキシエチレンユニットの数を表す。
【図１】
2018150335.tif 000046
【図２】
2018150335.tif 000047
【図３】
2018150335.tif 000048
【図４】
2018150335.tif 000049
【図５】
2018150335.tif 000050
【図６】
2018150335.tif 000051
【図７】
2018150335.tif 000052
【図８】
2018150335.tif 000053
【図９】
2018150335.tif 000054
【図１０】
2018150335.tif 000055
【図１１】
2018150335.tif 000056
【図１２】
2018150335.tif 000057
【図１３】
2018150335.tif 000058
【図１４】
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【図１５】
2018150335.tif 000060
【図１６】
2018150335.tif 000061
【図１７】
2018150335.tif 000062