(57)【要約】【課題】抗ＨＢｃ定量的検出方法、並びに慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行の監視及び管理並びに治療効果の予測におけるその使用の提供。【解決手段】  Ｂ型肝炎コアタンパク質に対する抗体（抗ＨＢｃ）の定量的検出方法、並びに慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行の監視及び管理並びに治療効果の予測におけるその使用が本発明において開示される。抗ＨＢｃが定量的に検出され、その結果、慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行が監視及び管理され、抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）治療中（特に、インターフェロンに基づく治療中、及びヌクレオシド類似体又はヌクレオチド類似体に基づく抗ＨＢＶ薬による治療中）である慢性Ｂ型肝炎患者に対する治療効果が効果的に予測され、それによって、薬を合理的に選択するように患者を導く。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視し、且つ／又は慢性Ｂ型肝炎患者がＢ型肝炎ウイルスに対する治療を受ける前に治療効果を効果的に予測するための診断剤を製造する際の、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルを定量的に検出するための試薬の使用。
【請求項２】
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の定量的検出が、次の方法：酵素結合免疫吸着アッセイ、化学発光免疫検出法、時間分解蛍光検出法、免疫比濁法、免疫クロマトグラフィー法、免疫ろ過法のうちの１つ又は複数によって実施される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルの１回の検出の直線ダイナミックレンジが１．５桁以上である、すなわち、１回の検出に対する正確な定量の上限値が、正確な定量の下限値より３２倍以上大きい、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の定量的検出が、以下のステップ：
ａ）Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合できるＢ型肝炎ウイルスタンパク質を提供するステップであって、前記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の完全長のアミノ酸配列（１番目のアミノ酸から１８３番目のアミノ酸まで）を含んでよく、又はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列のみ（例えば、１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸まで）を含んでよく、前記タンパク質が、固体支持体上に固定され、固相抗原として作用し、血清試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体を捕捉するのに使用される、上記ステップ；
ｂ）固相抗原上で捕捉されるＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合できる標識抗原を提供するステップであって、標識抗原が、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の完全長のアミノ酸配列（１番目のアミノ酸から１８３番目のアミノ酸まで）を含んでよく、又はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列のみ（例えば、１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸まで）を含んでよく、標識抗原上のシグナル発生物質が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はアクリジニウムエステルであり得る、上記ステップ；
ｃ）様々な濃度のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体を含有する、通常３〜６個の試料からなる、定量検量線を描くための濃度が公知の定量標準試料を提供するステップであって、濃度の単位が、ＩＵ／ｍｌ、ＰＥＩＵ／ｍｌ、又は起源を追跡することができる濃度若しくは力価の他の単位であり得る、上記ステップ；
ｄ）試料（試験される試料又は定量標準試料）を固相抗原と接触させ、その結果、前記試料中に存在する場合には、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体が捕捉されて、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の複合体を形成する、ステップ；
ｅ）標識抗原を、ステップｄ）の生成物、すなわち、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の複合体と接触させて、その結果、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体−標識抗原の複合体を形成させる、ステップ；
ｆ）シグナル発生を活性化できる基質又は溶液を、ステップｅ）で形成された固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体−標識抗原の複合体と接触させて、その結果、測定可能なシグナルを発生させ、対応する測定機器を用いて、発生したシグナルの強度を測定する、ステップ；
ｇ）定量標準試料（通常、３〜６個の試料）の測定されたシグナルの線形回帰フィッティングをそれらの対応する濃度を用いて実施して、測定シグナルから試料濃度を算出するための数式を得るステップ；
ｈ）試験される試料の測定されたシグナルをステップｇ）の式に導入し、試験される試料中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度を算出するステップ；
ｉ）ステップｈ）で算出されたＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度が、検出方法の正確な定量の上限値より高い場合、測定された濃度が対応する検出方法の正確な定量の上限値から下限値の間の範囲に入るまで、試験される試料を希釈し、ステップａ）〜ｈ）を繰り返すステップであって、試験される試料中に含有されるＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度が、希釈後に測定された値に希釈率を掛ける計算によって得られる、上記ステップ
を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
診断剤が、様々な治療用薬物を与えられる慢性Ｂ型肝炎患者において使用され、前記薬物が、長時間作用性インターフェロン（ペグ化インターフェロン、ペグインターフェロン）、通常のインターフェロン（インターフェロン）、ラミブジン（ＬＭＶ）、アデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン（ＬｄＴ）、テノホビル、又は慢性Ｂ型肝炎の治療において有用な他の薬物を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
治療の前に患者における治療の治療効果を予測するための一般的な基準が、治療前の患者血清中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルがより高い患者において得られる治療効果（奏効率）が、治療前の患者血清中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルがより低い患者のものより優れていることであり；治療効果の基準が、Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原セロコンバージョン（すなわち、治療を受ける慢性Ｂ型肝炎患者におけるＨＢｅＡｇ（＋）／抗ＨＢｅ（−）からＨＢｅＡｇ（−）／抗ＨＢｅ（＋）への変換）であってもよく、又はウイルス学的応答（すなわち、慢性Ｂ型肝炎患者において血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量が１０００コピー／ｍｌ以下まで減少する）又は疾患状態の寛解若しくは良好な予後を示唆し得る他の臨床的指標であってもよい、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視するための一般的な基準が、患者の肝臓炎症の発生及びＢ型肝炎ウイルスに特異的な宿主免疫応答の活性化を示唆する、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルの異常な上昇である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
アデホビルジピボキシル及びペグ化インターフェロンによる治療を受ける慢性Ｂ型肝炎患者の応答を評価するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用。
【請求項９】
慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用。
【請求項１０】
Ｂ型肝炎患者の病期を予測するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の検出及びＢ型ウイルス性肝炎の臨床診断に関し、より詳細には、患者の慢性Ｂ型肝炎の疾患進行を監視し、Ｂ型肝炎ウイルスに対する治療（特に、インターフェロンに基づく治療及びヌクレオシド／ヌクレオチド類似体抗ＨＢＶ薬物に基づく治療）を受ける慢性Ｂ型肝炎患者における治療効果を効果的に予測し、かくして、薬物を合理的に選択するように患者を導くために、Ｂ型肝炎コアタンパク質に対する抗体（抗ＨＢｃ）の定量的検出を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルスの感染、特にＢ型肝炎ウイルスの慢性感染は、世界で最も重要な公衆衛生問題のうちの１つである。現在、全世界で、Ｂ型肝炎ウイルスに慢性感染した患者は３億５千万人を超えている。Ｂ型肝炎ウイルスの慢性感染は、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、肝硬変（ＬＣ）、及び原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）などの肝疾患をもたらす場合があり、全世界で毎年、１００万人を超える人が、Ｂ型肝炎ウイルスの慢性感染及びそれによって引き起こされる関連疾患が原因で死亡している［１］。
【０００３】
現在のところ、Ｂ型肝炎ウイルスの慢性感染を治療するための薬物は、２つのグループ、すなわちインターフェロン（ＩＦＮ）及びヌクレオシド／ヌクレオチド類似体（ＮＡ）に主に分類されている。前者には、通常のインターフェロン（ＩＦＮ）及びペグインターフェロン（Ｐｅｇ−ＩＦＮ、長時間作用性インターフェロンとも呼ばれる）が含まれ、これらは、主に患者の免疫能を総体的に増強することによってＨＢＶを阻害しＣＨＢを治療する効果をもたらす。一方、後者には、５種類の薬物、すなわちラミブジン（ＬＭＶ）、アデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン（ＬｄＴ）、及びテノホビルが主に含まれ、これらは、ＨＢＶのポリメラーゼ活性を直接阻害することによってＨＢＶ複製を阻害する。Ｂ型肝炎ウイルスの慢性感染の場合、慢性Ｂ型肝炎を治療するために上記の薬物を使用する最終目的は、患者においてＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に関する血清学的陰性又はセロコンバージョン（ＨＢｓＡｇ消失又はＨＢｓＡｇセロコンバージョン）を起こすことである。しかし、上記の既存の薬物がＨＢｓＡｇ消失又はＨＢｓＡｇセロコンバージョンを実現する効力は限られており、通常、数年間の連続的治療が必要とされる。さらに、Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原セロコンバージョン（ＨＢｅＡｇセロコンバージョン）は、Ｂ型肝炎ウイルスの慢性感染の処置中に起こる別の重要な事象であり、通常、臨床的肝炎の寛解及び良好な予後を伴う。したがって、臨床医及び研究者は、「治療後、ＨＢｅＡｇセロコンバージョンが患者において起こるかどうか」を、治療が有効であるか否かを判定するための第１の指標として一般に使用する。ＨＢｅＡｇセロコンバージョンに加えて、ウイルス学的著効（ＳＶＲ）もまた、Ｂ型肝炎の臨床的治療の治療効果を判定するための第２の指標として使用されている［２、３］。
【０００４】
慢性Ｂ型肝炎患者がＨＢｅＡｇセロコンバージョンを達成するという治療法のエンドポイントの点から見ると、ＩＦＮとＮＡの間には、治療効果及び薬物コンプライアンスの点で有意差がある。ＩＦＮ（主に、Ｐｅｇ−ＩＦＮ又は長時間作用性インターフェロンを指す）の方がＮＡより優れた治療効果を有し、前者を用いた治療から１年（５２週）後に、ＨＢｅＡｇ陽性患者の３０〜５０％がＨＢｅＡｇセロコンバージョンを達成できたのに対し、後者を用いた治療では、ＨＢｅＡｇセロコンバージョンを達成することができたのはＨＢｅＡｇ陽性患者の１０〜３０％に過ぎなかった。しかし、ＩＦＮ治療法の副作用の方がＮＡの副作用よりも通常は重く、通常、対象は、発熱、頭痛、衰弱、脱毛、白血球減少などの有害反応を伴い、一部の患者はこれらの副作用に耐えることができなかった。一方、ＮＡの経口薬の方が副作用は少なく、コンプライアンスが良好である。価格の面では、ＩＦＮ（主に、Ｐｅｇ−ＩＦＮ又は長時間作用性インターフェロンを指す）を用いて１年間治療した場合の薬物費用は約１５，０００ＲＭＢであるのに対し、ＮＡを用いた治療の薬物費用は、通常、１０，０００ＲＭＢ未満である。２種類の薬物グループには上記の差異があるため、患者を治療する前に効果的な評価及び予測を実施し、次いで、慢性Ｂ型肝炎の治療に最適化された薬物を選択することが基本的に重要である。
【０００５】
患者におけるＨＢｅＡｇセロコンバージョンの実現は、患者その人自体がＨＢＶに対する十分な特異的免疫能を有しているかどうか、又は患者が薬物療法によってＨＢＶに対する十分な特異的免疫能を獲得し得るかどうかに主に依存する。したがって、慢性Ｂ型肝炎患者のＨＢＶに対する特異的免疫能の定量的アッセイは、治療すべき慢性Ｂ型肝炎患者においてＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こる確率を予測するのに使用され得る。長い間、慢性Ｂ型肝炎患者の血清ＡＬＴレベルが、ＨＢＶに対する宿主免疫能を評価するための間接的な代用マーカーとして使用されている。これは、慢性Ｂ型肝炎患者の血清ＡＬＴレベルが、患者の肝細胞の炎症／壊死レベルを反映するためである。一方でＨＢＶは免疫の原因となるウイルスであり、抗ＨＢＶ  Ｔ細胞によって媒介される免疫学的応答が原因で肝臓炎症又は肝細胞壊死を誘発し、したがって、血清ＡＬＴレベルと宿主の抗ＨＢＶ免疫能の間には一定の相関関係が存在する。一般に、血清ＡＬＴレベルが正常値上限（ＵＬＮ）より２倍大きい患者は、肝炎反応のない患者、すなわち血清ＡＬＴレベルが正常値上限より低い慢性Ｂ型肝炎患者よりも、抗ＨＢＶ治療の治療効果（治療によって実現するＨＢｅＡｇセロコンバージョンの確率を指す）が通常は優れており、血清ＡＬＴレベルが正常値上限（ＵＬＮ）より５倍大きい患者は、肝炎反応があるがＡＬＴレベルが比較的低い患者よりも、抗ＨＢＶ治療の治療効果が通常は優れていると考えられている。それでもやはり、血清ＡＬＴレベルは、肝臓炎症の程度を主に表し、ＡＬＴレベルはＨＢＶ固有の指標ではなく、他の因子（合併した自己免疫性肝炎、アルコール性肝疾患、ＨＣＶ又は他の肝炎ウイルスの感染など）の影響を容易に受ける場合があり、半減期は短いため、慢性Ｂ型肝炎の治療の治療効果を予測するのにＡＬＴレベルを使用することはあまり信頼性が高くない。血清ＡＬＴに加えて、ＨＢＶに特異的なＴ細胞の免疫学的応答に関するアッセイ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激サイトカイン放出試験）もまた、慢性Ｂ型肝炎の治療の治療効果を予測するために使用され得るが、その作業は比較的複雑であり、臨床的な実践及び推進は非常に困難であり、試験試料に対する要件が高く（新鮮な全血試料が必要とされる）、したがって、その応用の可能性は非常に限られている。要約すれば、治療の前に治療効果を評価する有効な方法が当技術分野では未だにない。
【０００６】
Ｂ型肝炎コアタンパク質に対する抗体（抗ＨＢｃ）は、ＨＢＶ感染の最も典型的な血清学的指標のうちの１つであり、抗ＨＢｃの定性的検出（抗ＨＢｃが陽性であるかどうかを判定する）が、Ｂ型肝炎ウイルス感染の臨床診断において、３５年を超えて使用され続けている。血清抗ＨＢｃ陽性の結果から、その対象がＨＢＶに感染していたか、又は感染していることが示唆され、通常、この抗体は、ＨＢＶ感染者の血清中に継続的に一生存在する。現在のところ、抗ＨＢｃ抗体の検出のために開発された方法は、競合的又は抑制的な免疫検出のメカニズムに主として基づいており、これらの方法は、抗ＨＢｃの定性的検出のために効果的に使用され得る。しかし、技術的メカニズムに制限があるため、それらの直線検出ダイナミックレンジは通常狭く（一般に、１桁の範囲内）、それらの検出安定性は乏しく、抗ＨＢｃの定量的検出に満足のいくように応用することはできない。関連する再調査に基づくと、本発明の発表以前に抗ＨＢｃの定量的検出のための有効な方法及び試薬はなく、抗ＨＢｃの定量的検出の臨床的価値及び対応する使用は、これまで不明である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質は非常に強力な免疫原性を有しているため、その血清抗体レベルは、宿主個体におけるＨＢＶを特異的に対象とする体液性免疫応答（Ｂ細胞免疫応答）の能力を示し、ＨＢＶに対する宿主の全体的な免疫学的能力を反映する。このために、本発明の発明者らは、慢性Ｂ型肝炎患者の血清抗ＨＢｃレベルを正確に検出すれば、患者におけるＨＢＶに対する特異的免疫応答の能力を示唆でき、患者が受ける薬物（インターフェロン薬物、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体を含む）治療の最終的治療効果を予測することができると考えている。本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した患者の血清／血漿中の抗ＨＢｃ抗体レベルを正確に定量的に検出するための方法、並びに患者において慢性Ｂ型肝炎の進行を監視する際、及び慢性Ｂ型肝炎患者における治療の治療効果を予測する際の、抗ＨＢｃの定量的検出の使用に関する。
【０００８】
詳細には、本発明は、血清抗ＨＢｃレベルを正確に定量的に検出するための免疫学的検出方法であって、酵素結合免疫吸着アッセイ又は化学発光検出法によって実行することができる、上記方法に関する。
【０００９】
この方法には、１回の検出の直線ダイナミックレンジが１．５桁以上である、すなわち、１回の検出に対する正確な定量の上限値が、正確な定量の下限値より少なくとも３２倍大きいという利点がある。この特徴は、血清抗ＨＢｃレベルの正確な定量的検出の基本原理であり、本発明より前の先行技術における抗ＨＢｃ検出方法はこの特徴を有していない。
【００１０】
Ｂ型肝炎ウイルスに慢性感染した様々な時期の患者の試料、及び患者の疾患過程の自然な進行中の一連の試料にこの方法を適用することによって得られた結果から、血清抗ＨＢｃの定量的レベルと患者の肝炎活動性及び宿主免疫状態とには高い相関関係があり、抗ＨＢｃの定量的測定値を用いて、患者が免疫活性化又は肝炎活動性の時期にあるかどうかを効果的に見分けられることが示された。このことから、本発明によって開示される抗ＨＢｃの定量的検出のための方法又はその等価な方法の臨床的使用は、慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視及び判定する助けとなることが示唆される。
【００１１】
アデホビルジピボキシル及び長時間作用性インターフェロンによる治療を受ける慢性肝炎患者のコホート試料にこの方法を適用することによって得られた結果から、抗ＨＢｃ基本レベルが治療奏効率と正の相関関係にあることが示された。このことから、本発明によって開示される抗ＨＢｃの定量的検出のための方法又はその等価な方法の臨床的使用は、アデホビルジピボキシル、長時間作用性インターフェロン、又は類似したメカニズムを有するものなどの薬物による治療を慢性Ｂ型肝炎患者が受ける前に治療効果を評価及び予測することを可能にし、治療用薬物及び治療時間の選択を手引きし、それによって治療効率を改善する助けとなることが示唆される。
【００１２】
その一方で、本発明は、慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視し、且つ／又は慢性Ｂ型肝炎患者がＢ型肝炎ウイルスに対する治療を受ける前に治療効果を効果的に予測するための診断剤を製造する際の、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルを定量的に検出するための試薬の使用に関する。
【００１３】
特定の一実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の定量的検出は、次の方法：酵素結合免疫吸着アッセイ、化学発光免疫検出法、時間分解蛍光検出法、免疫比濁法、免疫クロマトグラフィー法、免疫ろ過（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ）法のうちの１つ又は複数によって実施される。
【００１４】
特定の一実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体レベルの１回の検出の直線ダイナミックレンジは１．５桁以上である、すなわち、１回の検出に対する正確な定量の上限値は、正確な定量の下限値より３２倍以上大きい。
【００１５】
特定の一実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の定量的検出は、以下のステップを含む：
ａ）Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合できるＢ型肝炎ウイルスタンパク質を提供するステップであって、前記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の完全長のアミノ酸配列（１番目のアミノ酸から１８３番目のアミノ酸まで）を含んでよく、又はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列のみ（例えば、１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸まで）を含んでよく、前記タンパク質が、固体支持体上に固定され、固相抗原として作用し、血清試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体を捕捉するのに使用される、上記ステップ；
ｂ）固相抗原上で捕捉されるＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合できる標識抗原を提供するステップであって、標識抗原が、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の完全長のアミノ酸配列（１番目のアミノ酸から１８３番目のアミノ酸まで）を含んでよく、又はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列のみ（例えば、１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸まで）を含んでよく、標識抗原上のシグナル発生物質が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はアクリジニウムエステルであり得る、上記ステップ；
ｃ）様々な濃度のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体を含有する、通常３〜６個の試料からなる、定量検量線を描くための濃度が公知の定量標準試料を提供するステップであって、濃度の単位が、ＩＵ／ｍｌ、ＰＥＩＵ／ｍｌ、又は起源を追跡することができる（ｓｏｕｒｃｅ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔｒａｃｅｄ）濃度若しくは力価の他の単位であり得る、上記ステップ；
ｄ）試料（試験される試料又は定量標準試料）を固相抗原と接触させ、その結果、前記試料中に存在する場合には、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体が捕捉されて、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の複合体を形成する、ステップ；
ｅ）標識抗原を、ステップｄ）の生成物、すなわち、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の複合体と接触させて、その結果、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体−標識抗原の複合体を形成させる、ステップ；
ｆ）シグナル発生を活性化できる基質又は溶液を、ステップｅ）で形成された固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体−標識抗原の複合体と接触させて、その結果、測定可能なシグナルを発生させ、対応する測定機器を用いて、発生したシグナルの強度を測定する、ステップ；
ｇ）定量標準試料（通常、３〜６個の試料）の測定されたシグナルの線形回帰フィッティングをそれらの対応する濃度を用いて実施して、測定シグナルから試料濃度を算出するための数式を得るステップ；
ｈ）試験される試料の測定されたシグナルをステップｇ）の式に導入し、試験される試料中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度を算出するステップ；
ｉ）ステップｈ）で算出されたＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度が、検出方法の正確な定量の上限値より高い場合、測定された濃度が対応する検出方法の正確な定量の上限値から下限値の間の範囲に入るまで、試験される試料を希釈し、ステップａ）〜ｈ）を繰り返すステップであって、試験される試料中に含有されるＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度が、希釈後に測定された値に希釈率を掛ける計算によって得られる、上記ステップ。
【００１６】
特定の一実施形態において、本発明の診断剤は、様々な治療用薬物を与えられる慢性Ｂ型肝炎患者において使用され、前記薬物は、長時間作用性インターフェロン（ペグ化インターフェロン、ペグインターフェロン）、通常のインターフェロン（インターフェロン）、ラミブジン（ＬＭＶ）、アデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン（ＬｄＴ）、テノホビル、又は慢性Ｂ型肝炎の治療において有用な他の薬物を含む。
【００１７】
特定の一実施形態において、治療の前に患者における治療の治療効果を予測するための一般的な基準は、治療前の患者血清中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルがより高い患者において得られる治療効果（奏効率）が、治療前の患者血清中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルがより低い患者のものより優れていることであり；治療効果の基準は、Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原セロコンバージョン（すなわち、治療を受ける慢性Ｂ型肝炎患者におけるＨＢｅＡｇ（＋）／抗ＨＢｅ（−）からＨＢｅＡｇ（−）／抗ＨＢｅ（＋）への変換）であってもよく、又はウイルス学的応答（ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（すなわち、慢性Ｂ型肝炎患者において血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量が１０００コピー／ｍｌ以下まで減少する）又は疾患状態の寛解若しくは良好な予後を示唆し得る他の臨床的指標であってもよい。
【００１８】
特定の一実施形態において、慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視するための一般的な基準は、患者の肝臓炎症の発生及びＢ型肝炎ウイルスに特異的な宿主免疫応答の活性化を示唆する、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルの異常な上昇である。
【００１９】
特定の一実施形態において、本発明は、アデホビルジピボキシル及びペグ化インターフェロンによる治療を受ける慢性Ｂ型肝炎患者の応答を評価するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用に関する。
【００２０】
特定の一実施形態において、本発明は、慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用に関する。
【００２１】
特定の一実施形態において、本発明は、Ｂ型肝炎患者の病期を予測するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】抗ＨＢｃ  ＥＬＩＳＡ定量法の直線ダイナミック（ｄｙｎａｍｉｔｉｃ）レンジを示すグラフである。
【図２】抗ＨＢｃ  ＥＬＩＳＡ定量法の実験内（Ａ）及び実験間（Ｂ）の正確性を示すグラフである。
【図３】１０４個の試料の抗ＨＢｃ  ＥＬＩＳＡ定量検出の結果の一貫性を示すグラフである。
【図４】抗ＨＢｃ  ＣＬＥＩＡ定量法の直線ダイナミック（ｄｙｎａｍｉｔｉｃ）レンジを示すグラフである。
【図５】抗ＨＢｃ  ＣＬＩＡ定量法の直線ダイナミック（ｄｙｎａｍｉｔｉｃ）レンジを示すグラフである。
【図６】様々な時期のＨＢＶ感染患者の血清抗ＨＢｃレベルの分布を示すグラフである：（Ａ）様々な時期のＨＢＶ感染患者の血清抗ＨＢｃレベル及びＡＬＴレベル；（Ｂ）様々な時期のＨＢＶ感染患者の血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベル及びＨＢｓＡｇレベル；（Ｃ）血清抗ＨＢｃレベルに基づいて対象の免疫活性化状態を判定するためのＲＯＣ曲線解析；（Ｄ）ＡＬＴに基づいて層別化した様々な患者の平均抗ＨＢｃレベル；（Ｅ）血清抗ＨＢｃレベル及びＡＬＴレベルの相関解析。頭字語に関する注釈：ＰＢＩ、感染前の患者；ＩＴ、免疫寛容期にある患者；ＩＣ、免疫クリアランス期にある患者；ＬＲ、低複製期にある患者；ＥＮＨ、ＨＢｅＡｇ陰性肝炎；ＬＣ、肝硬変の患者；ＨＣＣ、原発性肝臓癌の患者。
【図７】慢性Ｂ型肝炎ウイルス保有者の自然な進行期間中の血清抗ＨＢｃ、ＡＬＴ、ＨＢＶ  ＤＮＡ、及びＨＢｓＡｇのレベルの動態変化を示すグラフである。
【図８】治療前の慢性Ｂ型肝炎患者の血清抗ＨＢｃレベルを用いて予測された、治療後のＨＢｅＡｇセロコンバージョン率を示す図である。（Ａ）治療前の抗ＨＢｃレベルを用いて、アデホビルジピボキシルによる治療を受けた後の慢性Ｂ型肝炎患者のＨＢｅＡｇセロコンバージョンを予測；（Ｂ）治療前の抗ＨＢｃレベルを用いて、ペグ化インターフェロンによる治療を受けた後の慢性Ｂ型肝炎患者のＨＢｅＡｇセロコンバージョンを予測；（Ｃ）血清抗ＨＢｃレベルを用いて、アデホビルジピボキシルによる治療を受けた後の患者におけるＨＢｅＡｇセロコンバージョン発生率を予測；（Ｄ）血清抗ＨＢｃレベルを用いて、ペグ化インターフェロンによる治療を受けた後の患者におけるＨＢｅＡｇセロコンバージョン発生率を予測；（Ｅ）治療前の抗ＨＢｃレベルを用いて、ベースラインＡＬＴレベルが異なる層別化された患者におけるＨＢｅＡｇセロコンバージョン率を予測；
【図９】アデホビルジピボキシル及びペグ化インターフェロンによる治療を受けた後の、ベースライン抗ＨＢｃレベルが異なる層別化された患者におけるＨＢｅＡｇセロコンバージョン発生率を示す図である。
【図１０】アデホビルジピボキシルによる治療中及び治療後の患者において定量した血清マーカーレベルの動態変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
別段の定めがない限り、本発明の本文で使用される技術用語又は科学用語はすべて、本発明に関連する分野の当業者に公知である共通の意味を有する。
【００２４】
本発明の例１において、抗ＨＢｃ  ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ、マイクロウェルプレート法）定量的検出方法が確立された。この方法により、血清試料中の抗ＨＢｃの含有量を正確に測定することができ、１回の検出の正確な定量のための直線ダイナミックレンジは、最大で１．８桁（０．０４〜２．５ＩＵ／ｍｌ）であった。このような特徴は、抗ＨＢｃを検出するための公知の方法は有していなかった［４、５］。
【００２５】
例２において、抗ＨＢｃ  ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素結合免疫アッセイ、マイクロウェルプレート法）定量的検出方法が確立された。この方法により、血清試料中の抗ＨＢｃの含有量を正確に測定することができ、１回の検出の正確な定量のための直線ダイナミックレンジは、最大で２．７桁（０．０４〜２０ＩＵ／ｍｌ）であった。この方法の直線ダイナミックレンジは、例１で説明した抗ＨＢｃ  ＥＬＩＳＡ定量的検出方法のものより広く、その結果、抗ＨＢｃの多い試料を検出するのに必要とされる希釈回数は著しく減少し、効率は改善した。
【００２６】
例３において、抗ＨＢｃ  ＣＬＩＡ（直接的化学発光免疫アッセイ、微粒子法）定量的検出方法が確立された。この方法により、血清試料中の抗ＨＢｃの含有量を正確に測定することができ、１回の検出の正確な定量のための直線ダイナミックレンジは、最大で３．０２桁（０．０２〜２０．８ＩＵ／ｍｌ）であった。この方法により、例１で説明した抗ＨＢｃ  ＥＬＩＳＡ定量的検出方法と比べて、１回の検出の直線ダイナミックレンジは有意に広がり、その結果、抗ＨＢｃの多い試料を検出するのに必要とされる希釈回数は著しく減少し、効率は改善した。この方法は、検出用に単一の試験管が使用されるという点で、例２で説明した抗ＨＢｃ  ＣＬＥＩＡ定量的検出方法とは異なり、全自動機器が装備された場合、診療所において任意の時点におけるピックアップ検出（ｐｉｃｋ−ｕｐ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）のために使用され得る。
【００２７】
例４において、上記の抗ＨＢｃ定量的検出方法は、様々な段階のＨＢＶ感染者の血清抗ＨＢｃレベル分布を評価するために適用された。評価結果から、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染者において、血清抗ＨＢｃレベルは感染者の肝炎活動性及び宿主免疫状態に関連していることが示された。したがって、抗ＨＢｃレベルは、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染者が免疫活性化状態であるか、又は肝炎活動的状態であるかを判定するために使用され得、診断精度（ＡＵＲＯＣ）は０．９１８（９５％ＣＩ：０．８８８〜０．９４８）であり、測定の閾値は７４００ＩＵ／ｍｌであった。これらの結果から、本発明において開示される抗ＨＢｃ定量的検出方法によって得られる検出結果は、臨床医が患者の疾患段階を判定するのに寄与できることが示された。
【００２８】
例５において、上記の抗ＨＢｃ定量的検出方法は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染者の自然な進行期間中の抗ＨＢｃレベルの動態変化及び他の指標との関係を評価するために適用された。評価結果から、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染者の肝臓炎症が活動性である場合、抗ＨＢｃ及びＡＬＴはほぼ同時に増加し、抗ＨＢｃピーク値はＡＬＴピーク値から３〜８週間後に通常現われるが、時として、ＡＬＴピークの出現の前又は同時に現われる場合もあり；肝炎の回復期の間、ＡＬＴは直ちに正常に戻ったのに対し、抗ＨＢｃは１２〜２０週後にベースラインレベルに戻った。この結果から、本発明の定量的検出方法によって測定される、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染者の抗ＨＢｃレベルは、ＡＬＴ測定の補完的指標として使用され得、患者が肝炎活動期にあるのか、又は過去３〜４ヶ月以内に肝炎活動性を経験しているかどうかを臨床医が判定するのに寄与できることがさらに示唆される。
【００２９】
例６において、抗ＨＢｃ定量的検出方法は、アデホビルジピボキシル及びペグ化（ｐｅｇｌｙａｔｅｄ）インターフェロンによる治療を受ける慢性Ｂ型肝炎患者の応答を評価するために適用された。結果から、慢性Ｂ型肝炎患者の治療前の抗ＨＢｃレベルは、治療後のＨＢｅＡｇセロコンバージョン率と正の相関関係にあることが示された。すなわち、治療前の抗ＨＢｃレベルが高い（この例においては≧２９０００ＩＵ／ｍｌ）患者では、安価で副作用が少ないが治療効果が十分ではないアデホビルジピボキシルでさえ、所望の効果を達成することができたが、一方、治療前の抗ＨＢｃのレベルが中程度（この例においては９０００〜２９０００ＩＵ／ｍｌ）又はレベルが低い（この例においては＜９０００ＩＵ／ｍｌ）患者の場合、アデホビルジピボキシルの治療効果は、高価で副作用が多いが、より強力である長時間作用性インターフェロンに著しく劣っていた。治療前の抗ＨＢｃレベルが高い（この例においては≧２９０００ＩＵ／ｍｌ）患者では、ウイルス複製に対するアデホビルジピボキシルの阻害効果が、治療前の抗ＨＢｃレベルが低い（＜２９０００ＩＵ／ｍｌ）患者における阻害効果よりも著しく優れていた。この結果から、本発明の定量的検出方法を使用して、治療を受ける前の慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染者の抗ＨＢｃレベルを測定することにより、アデホビルジピボキシル、長時間作用性インターフェロン、又は同様のメカニズムを有する他の薬物による治療を受けた後に予想される治療効果を予測でき、このことは、治療用薬物及び治療時間の選択を手引きし、それによって治療効率を改善する助けとなることが示唆された。
【００３０】
以下の実施例は、本発明をさらに説明し、例示する。これらの実施例は、本発明を例示すると意図され、実施例におけるすべての試薬、化学物質又は生物学的活性材料の濃度、使用される患者、及び他の変量（ｖａｒｉａｎｔ）は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明の用途を例示するにすぎない。
【実施例】
【００３１】
１．二重抗原サンドイッチアッセイ抗ＨＢｃ定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方法
【００３２】
１．１  固定化抗原及び標識抗原の調製
この方法において、使用される固定化抗原及び標識抗原は、試料中の抗ＨＢｃ抗体に特異的に結合できるＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）であり、抗原は、ＨＢｃＡｇの完全長アミノ酸配列（Ｃｐ１８３）を含んでもよく、又はＨＢｃＡｇの主要な免疫優性領域のアミノ酸配列（Ｃｐ１４９）を含むだけでもよかった。本発明で使用するＨＢｃＡｇは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いた組換え発現及び精製によって得た。Ｃｐ１４９組換え抗原の発現方法及び精製方法については、Ａｄａｍ  Ｚｌｏｔｎｉｃｋら［６］によって開示されている方法を参照することができ、一方、Ｃｐ１８３組換え抗原の発現方法及び精製方法については、Ａｎ  Ｌｉら［５］によって開示されている方法を参照することができる。本発明において、通常、Ｃｐ１４９組換え抗原を固定化抗原として使用し、Ｃｐ１８３組換え抗原を標識抗原として使用した。
【００３３】
１．２  反応プレートの準備
（１．２．１）Ｃｐ１４９抗原を、５０ｍＭ  ＣＢ緩衝液（ｐＨ９．６）（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨ値は９．６であった）で希釈した。最終濃度は３μｇ／ｍｌであった。
（１．２．２）１００μｌのコーティング溶液を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、２〜８℃で１６〜２４時間コーティングし、次いで、３７℃で２時間コーティングした。
（１．２．３）ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、洗浄を１回行った。次いで、ブロッキング溶液（ｐＨ７．４、２０％のウシ胎児血清及び１％のカゼインを含有する２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液）２００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で２時間ブロッキングし、ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥させた後、プレートをアルミニウムホイルの袋に入れ、予備用途用に（ｆｏｒ  ｓｔａｎｄｂｙ  ｕｓｅ）２〜８℃で保管した。
【００３４】
１．３  Ｃｐ１８３抗原のＨＲＰ標識
改良した過ヨウ素酸ナトリウム法を使用した。Ｃｐ１８３組換え抗原１０ｍｇを標識する例は次のとおりであった。
（１．３．１）濃度２ｍｇ／ｌのＣｐ１８３組換え抗原（５ｍｌ）を透析袋に入れ、５０ｍＭ  ＣＢ緩衝液を用いて４℃で４時間透析した。透析中、２時間に１回、透析緩衝液を交換した。
（１．３．２）ＨＲＰ  ４０ｍｇを正確に計量し、ｄｄＨ２Ｏ  ２ｍｌ中に溶解し、溶解後、２０ｍｇ／ｍｌ  ＮａＩＯ４溶液２ｍｌを添加し、室温で３０分間反応させた。次いで、エチレングリコール４０ｕｌを添加し、４℃で３０分間反応させて、ＨＲＰ活性化溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、４ｍｌ）を得た。
（１．３．３）ステップ１．３．２で得られたＨＲＰ活性化溶液を、Ｃｐ１８３組換え抗原を入れた透析袋に添加し、均一に混合し、次いで、暗条件下、４℃で６〜８時間、５０ｍＭ  ＣＢ緩衝液を用いて透析した。透析中、２時間に１回、透析緩衝液を交換した。
（１．３．４）ＮａＢＨ４溶液（５ｍｇ／ｍｌ）０．４ｍｌを調製し、ステップ１．３．３で得られた標識反応溶液に添加し、均一に混合し、暗条件下、４℃で２時間、反応させた。
（１．３．５）ステップ１．３．４を完了した後、標識反応溶液を新しい透析袋に入れ、４℃で４時間、ＰＢＳ緩衝液を用いて透析した。
（１．３．６）ステップ１．３．５を完了した後、Ｃｐ１８３−ＨＲＰ標識を分離するために、ＧＥ  Ｃｏｍｐａｎｙ製のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲクロマトグラフィーカラムを用いて精製を行った。
（１．３．７）ステップ１．３．６で分離及び精製されたＣｐ１８３−ＨＲＰ標識を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次いで、グリセロールを体積比１：１で加え、均一に混合し、予備用途用に−２０℃で保管した。
（１．３．８）ステップ１．３．７で得られたＣｐ１８３−ＨＲＰ標識を、体積比１／４０００で酵素標識希釈緩衝液（ｐＨ７．４、２０％のウシ胎児血清、１％のカゼイン、１０％のショ糖、０．０５％のアミノピリンを含有する２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液）を用いて希釈して、酵素標識反応溶液を得、これを均一に混合し、予備用途用に２〜８℃で保管した。
【００３５】
１．４  定量用標準試料
抗ＨＢｃ定量的検出のための定量用標準試料は、様々な濃度のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質抗体の系列試料からなっていた。濃度の単位は、ＩＵ／ｍｌ、ＰＥＩＵ／ｍｌであり得、又は起源を追跡することができる（ｓｏｕｒｃｅ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔｒａｃｅｄ）濃度若しくは力価の他の任意の単位であり得た。本発明では、一般的な国際単位（ＩＵ／ｍｌ）を抗ＨＢｃ定量のための単位として使用し、ＮＩＢＳＣ［７］によって公開されている抗ＨＢｃ  ＷＨＯ標準試料（コード：９５／５２２、５０ＩＵ／アンプル）を、４０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ、５ＩＵ／ｍＬ、２．５ＩＵ／ｍＬ、１．２５ＩＵ／ｍＬ、０．６２５ＩＵ／ｍＬ、０．３１２５ＩＵ／ｍＬ、０．１５６ＩＵ／ｍＬ、０．０７８ＩＵ／ｍＬ、０．０３９ＩＵ／ｍＬ、０．０２ＩＵ／ｍＬ、０．０１ＩＵ／ｍＬ、すなわち合計で１３種の異なる濃度に達するように、段階的に希釈した。標準試料を希釈するのに使用される基質溶液は、抗ＨＢｃ陰性の健康な血液ドナーに由来する血漿若しくは血清であり得、又は２０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ溶液であり得た。
【００３６】
１．５  ＥＬＩＳＡによる抗ＨＢｃの定量的検出
慢性Ｂ型肝炎患者の血清試料１つ（Ｐ１番）を用意し、以下のステップに従って、抗ＨＢｃ定量的検出を実施した。通常、慢性Ｂ型肝炎患者は抗ＨＢｃのレベルが比較的高いという事実を考慮して、２０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ溶液を用いて、４種の希釈率、すなわち１：５００、１：２５００、１：１２５００、１：６２５００に達するように試料を希釈し、次いで、定量的ＥＬＩＳＡ検出のために使用した。
（１．５．１）試料の反応：コーティングされたＥＬＩＳＡプレート１枚を用意し、試料希釈溶液９０μｌを各ウェルに添加し、試料又は標準試料１０μｌも各ウェルに添加し、振盪及び混合し、次いで、３７℃で３０分間、インキュベートし反応させた。
（１．５．２）酵素標識反応：ステップ１．５．１を完了した後、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてＥＬＩＳＡプレートを５回洗浄し、ステップ１．３．８で得られた酵素標識反応溶液１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で３０分間、インキュベートし反応させた。
（１．５．３）発色反応：ステップ１．５．２を完了した後、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてＥＬＩＳＡプレートを５回洗浄し、ＴＭＢ発色剤（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって提供される）５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１５分間、インキュベートし反応させた。
（１．５．４）反応の停止及び値の読み取り：ステップ１．５．３を完了した後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに停止液（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって提供される）５０μｌを添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルのＯＤ４５０／６３０値を検出した。
（１．５．５）定量用検量線を描く：ステップ１．５．４を完了した後、１３種の定量用標準試料の測定値及び対応するその濃度を線形回帰に供し、図１の定量用検量線を描いた。図１によれば、抗ＨＢｃ  ＥＬＩＳＡ法の正確な定量のための上限値は２．５ＩＵ／ｍｌであり、下限値は０．０４ＩＵ／ｍｌであり、その直線ダイナミックレンジは１．８桁であった。ＯＤ４５０／６３０測定値から抗ＨＢｃ濃度を算出するための式は、次のとおりであった：抗ＨＢｃ濃度（ＩＵ／ｍＬ）＝１．２１０４×ＯＤ４５０／６３０−０．０１１。
（１．５．６）試験される試料の抗ＨＢｃ濃度の取得：Ｐ１血清の段階的に希釈した試料をステップ１．５．１〜１．５．５に供した。その際、希釈率１：５００の場合のＯＤ４５０／６３０測定値は３．８９９であり、希釈率１：２５００の場合のＯＤ４５０／６３０測定値は３．８０１であり、希釈率１：１２５００の場合のＯＤ４５０／６３０測定値は２．９８８であり、希釈率１：６２５００の場合のＯＤ４５０／６３０測定値は０．３０１であった。上記の測定値を、ステップ１．５．５で得られた抗ＨＢｃ濃度算出用の式に導入したところ、希釈率１：５００の場合の濃度の値は４．７１ＩＵ／ｍｌであり、希釈率１：２５００の場合の濃度の値は４．５９ＩＵ／ｍｌであり、希釈率１：１２５００の場合の濃度の値は３．６１ＩＵ／ｍｌであり、希釈率１：６２５００の場合の濃度の値は０．３５ＩＵ／ｍｌであった。希釈率１：６２５００の場合の濃度測定値は、ＥＬＩＳＡ法の正確な定量のための直線ダイナミックレンジ（０．０４〜２．５ＩＵ／ｍｌ）の範囲内であった。したがって、試料の元の抗ＨＢｃ濃度は、０．３５×６２５００＝２２０８３ＩＵ／ｍｌであった。
（１．５．７）検出方法のアッセイ内の正確性の評価：濃度が公知の６種の試料を用意した。これらは、抗ＨＢｃの定量した値が５ＩＵ／ｍｌ、２．５ＩＵ／ｍｌ、１．２５ＩＵ／ｍｌ、０．６２５ＩＵ／ｍｌ、０．３１２５ＩＵ／ｍｌ、０．１５６ＩＵ／ｍｌであった。同じ試験において、各試料をステップ１．５．１〜１．５．４に従い１６個のウェル中で繰り返し検出し、各試料のＯＤ４５０／６３０測定値のアッセイ内変動係数（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を検出後に別々に算出し、図２Ａに示した。図２Ａにおいて、６種の試料のアッセイ内変動係数が２．８％から１０．１％の間であることが示された。
（１．５．８）検出方法のアッセイ間の正確性の評価：濃度が公知の６種の試料を用意した。これらは、抗ＨＢｃの定量した値が５ＩＵ／ｍｌ、２．５ＩＵ／ｍｌ、１．２５ＩＵ／ｍｌ、０．６２５ＩＵ／ｍｌ、０．３１２５ＩＵ／ｍｌ、０．１５６ＩＵ／ｍｌであった。上記の６種の試料を、ステップ１．５．１〜１．５．４に従う１６回の独立した検出試験に供した。すべての試験を完了した後、各試料のＯＤ４５０／６３０測定値のアッセイ間変動係数を別々に算出し、図２Ｂに示した。図２Ｂにおいて、６種の試料のアッセイ間変動係数が４．４％から１０．５％の間であることが示された。
（１．５．９）抗ＨＢｃ定量的検出の再現性の評価：慢性Ｂ型肝炎患者の血清試料１０４個（抗ＨＢｃレベルが２．２３ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌから５．３７ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌの間であった）を無作為に選択し、ステップ１．５．１〜１．５．６に従う抗ＨＢｃ定量的検出に供した。検出は、独立に２回繰り返し、２回の検出試験の結果を回帰分析に供し、図３に示した。図３において、２回の検出試験の結果の一貫性が高い（Ｒ２＝０．９８８）ことが示された。
【００３７】
２．二重抗原サンドイッチアッセイ抗ＨＢｃ定量的化学発光酵素結合免疫アッセイ（ＣＬＥＩＡ）法
【００３８】
２．１  固定化抗原及び標識抗原の調製
本発明の例１のセクション１．１の方法を用いて、調製を行った。
【００３９】
２．２  化学発光反応プレートの準備
化学発光反応プレートを抗原用の固体支持体として使用したことを除いて、本発明の例１のセクション１．２の方法を用いた。
【００４０】
２．３  Ｃｐ１８３抗原のＨＲＰ標識
本発明の例１のセクション１．３の方法及びステップを用いた。
【００４１】
２．４  定量標準試料
定量用標準試料は、本発明の例１のセクション１．４のものと同じであった。
【００４２】
２．５  ＣＬＥＩＡによる抗ＨＢｃの定量的検出
慢性Ｂ型肝炎患者の血清試料１つ（Ｐ１番）を用意し、以下のステップに従って、抗ＨＢｃ定量的検出を実施した。通常、慢性Ｂ型肝炎患者は抗ＨＢｃのレベルが比較的高いという事実を考慮して、２０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ溶液を用いて、３種の希釈率、すなわち１：５００、１：２５００、１：１２５００に達するように試料を希釈し、次いで、定量的ＣＬＥＩＡ検出のために使用した。
（２．５．１）試料の反応：コーティングされた化学発光反応プレート１枚を用意し、試料希釈溶液９０μｌを各ウェルに添加し、次いで、試料又は標準試料１０μｌを各壁（ｗａｌｌ）に添加し、振盪し均一に混合し、次いで、３７℃で３０分間、インキュベートし反応させた。
（２．５．２）酵素標識反応：ステップ２．５．１を完了した後、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて化学発光反応プレートを５回洗浄し、ステップ１．３．８で調製した酵素標識反応溶液１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で３０分間、インキュベートし反応させた。
（２．５．３）発光反応及び測定：ステップ２．５．２を完了した後、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて化学発光反応プレートを５回洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ製のＰＩＣＯ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  １００μｌを各ウェルに添加し、Ｏｒｉｎ  ＩＩ化学発光検出器を用いて、各反応ウェルのルミネセンス値（ＲＬＵ）を直ちに読み取った。
（２．５．４）定量用検量線を描く：ステップ２．５．３を完了した後、１３種の定量用標準試料の測定値及び対応するその濃度を線形回帰に供し、図４の定量用検量線を描いた。図４によれば、抗ＨＢｃ  ＣＬＥＩＡ法の正確な定量のための上限値は２０ＩＵ／ｍｌであり、下限値は０．０４ＩＵ／ｍｌであり、その直線ダイナミックレンジは２．７桁であった。ＲＬＵ測定値から抗ＨＢｃ濃度を算出するための式は、次のとおりであった：抗ＨＢｃ濃度（ＩＵ／ｍＬ）＝１０（Ｌｏｇ１０（ＲＬＵ）×０．９３３７−５．３００６）。
（２．５．５）試験される試料の抗ＨＢｃ濃度の取得：Ｐ１血清の段階的に希釈した試料をステップ２．５．１〜２．５．４の測定に供した。希釈率１：５００の場合のＲＬＵ測定値は１２１１５１００であり、希釈率１：２５００の場合のＲＬＵ測定値は５０６７８９０であり、希釈率１：１２５００の場合のＲＬＵ測定値は８８９６１０であり、上記の測定値を、ステップ２．５．４で得られた抗ＨＢｃ濃度算出用の式に導入したところ、希釈率１：５００の場合の濃度の値は２０．５６ＩＵ／ｍｌであり、希釈率１：２５００の場合の濃度の値は９．１１４ＩＵ／ｍｌであり、希釈率１：１２５００の場合の濃度の値は１．７９５ＩＵ／ｍｌであった。ここで、希釈率１：２５００及び１：１２５００の場合の測定値は、本発明のＣＬＥＩＡ法の正確な定量のための直線ダイナミックレンジ（０．０４〜２０ＩＵ／ｍｌ）の範囲内であった。したがって、希釈率１：２５００の場合の測定値を計算に使用した場合、試料の元の抗ＨＢｃ濃度は、９．１１４×２５００＝２２７８４ＩＵ／ｍｌであった。一方、希釈率１：１２５００の場合の測定値を計算に使用した場合、試料の元の抗ＨＢｃ濃度は、１．７９５×１２５００＝２２４４２ＩＵ／ｍｌであった。２つの測定値の平均濃度は２２６１３ＩＵ／ｍｌであり、この濃度の値とＥＬＩＳＡ法によって測定した試料の濃度の値２２０８３ＩＵ／ｍｌとには、通常の変動範囲内である２．４％の誤差があった。
【００４３】
３．二重抗原サンドイッチアッセイ抗ＨＢｃ定量的管状微粒子化学発光免疫アッセイ（ＣＬＩＡ）法
【００４４】
３．１  固定化抗原及び標識抗原の調製
本発明の例１のセクション１．１の方法を用いて、調製を行った。
【００４５】
３．２  化学発光反応プレートの準備
（３．２．１）磁性ビーズ１ｍｇを用意し、活性化緩衝液系（５０ｍＭ  ＭＥＳ５．０）１ｍｌで２回洗浄し、上清を廃棄した。ＥＤＣ  １ｍｇ及びＮＨＳ剤１ｍｇ（それぞれ、１０ｍｇ／ｍｌに達するように５０ｍＭ  ＭＥＳ５．０を用いて調製した）を添加し、均一に混合し、室温で振盪して２０分間活性化させた。
（３．２．２）活性化された磁性ビーズを活性化緩衝液系（５０ｍＭ  ＭＥＳ５．０）１ｍｌで２回洗浄し、上清を廃棄した。Ｃｐ１４９抗原２５μｇを添加し、均一に混合し、室温で振盪して３時間反応させた。
（３．２．３）ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、洗浄を３回行った。次いで、保存溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、０．１％ＢＳＡ、１００ｍＭ  Ｇｌｙ、０．０５％ＴＷ−２０、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ）２５００μｌを各ウェルに添加し、予備用途用に２〜８℃で保管した。
【００４６】
３．３  Ｃｐ１８３抗原のアクリジニウムエステル標識
（３．３．１）タンパク質Ｃｐ１８３  ５０μｇを用意し、標識緩衝液系（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０）３００μｌに添加し、アクリジニウムエステル（５ｍＭ  ＮＨＳ−ＳＡＥ）８μｌを添加し、暗条件下、室温で３０分間、反応させた。
（３．３．２）ステップ（３．３．１）で反応させた混合物に、停止緩衝液（１００ｍＭグリシンを含有するリン酸緩衝液、ｐＨ８．０）１００μｌを添加し、暗条件下、室温で３０分間、反応させた。
（３．３．３）ステップ（３．３．２）で得られた標識されたタンパク質を透析袋に入れ、透析緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて暗条件下、４℃で６〜８時間透析した。その際、２時間に１回、透析緩衝液を交換した。
（３．３．４）ステップ（３．３．３）で得られた標識されたタンパク質を保存用試験管に移し、２％ＢＳＡ及び５０％グリセロールを加え、予備用途用に−２０℃で保管した。
（３．３．５）ステップ３．３．４で得られたＣｐ１８３−ＳＡＥ標識を、体積比１／５００でアクリジニウムエステル標識希釈緩衝液（２０％のウシ胎児血清、１％のカゼイン、１０％のショ糖、０．０５％のアミノピリンを含有する２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて希釈して、発光標識反応溶液を形成させた。これを均一に混合し、予備用途用に２〜８℃で保管する。
【００４７】
３．４  定量用標準試料
抗ＨＢｃの濃度が公知である試料Ｐ１（抗ＨＢｃ＝２２０８３ＩＵ／ｍｌ）を用意し、２０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ溶液を用いて段階的に希釈した。これらは、ＣＬＩＡ法の定量用標準試料として４０００ＩＵ／ｍＬ、１３３３ＩＵ／ｍＬ、３３３ＩＵ／ｍＬ、８３．３ＩＵ／ｍＬ、２０．８ＩＵ／ｍＬ、５．２１ＩＵ／ｍＬ、１．３０ＩＵ／ｍＬ、０．３３ＩＵ／ｍＬ、０．０８ＩＵ／ｍＬ、０．０２ＩＵ／ｍＬ、０．００５ＩＵ／ｍＬに達するように、別々に希釈した。
【００４８】
３．５  ＣＬＩＡによる抗ＨＢｃの定量的検出
慢性Ｂ型肝炎患者の血清試料１つ（Ｐ２番）を用意し、以下のステップに従って、抗ＨＢｃ定量的検出を実施した。通常、慢性Ｂ型肝炎患者は抗ＨＢｃのレベルが比較的高いという事実を考慮して、２０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ溶液を用いて、２種の希釈率、すなわち１：５００、１：２５００に達するように試料を希釈し、次いで、定量的ＣＬＩＡ検出のために使用した。Ｐ２試料を例１の抗ＨＢｃ  ＥＬＩＳＡ定量的検出方法に供し、その抗ＨＢｃ濃度を８０６９ＩＵ／ｍｌと決定した。
（３．５．１）試料の反応：磁性ビーズ５０μｌを用意し、反応試験管に加え、次いで、試料又は標準試料１０μｌを各ウェルに添加し、振盪し均一に混合し、３７℃で１５分間、インキュベートし反応させた。
（３．５．２）発光標識反応：ステップ３．５．１を完了した後、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて化学発光反応プレートを５回洗浄し、ステップ３．３．５で調製した発光標識反応溶液５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１０分間、インキュベートし反応させた。
（３．５．３）発光反応及び測定：ステップ３．５．２を完了した後、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて化学発光反応プレートを５回洗浄し、Ｓｉｒｉｕｓ−Ｌシングルチューブ化学発光検出器を用いて励起溶液をその場所に（ｉｎ−ｓｉｔｕ）注入し、光強度を同時に検出した。
（３．５．４）定量用検量線を描く：ステップ３．５．３を完了した後、１１種の定量用標準試料の測定値及び対応するその濃度を線形回帰に供し、図５の定量用検量線を描いた。図５によれば、抗ＨＢｃ微粒子化学発光検出（ＣＬＩＡ）法の正確な定量のための上限値は２０．８ＩＵ／ｍｌであり、下限値は０．０２ＩＵ／ｍｌであり、その直線ダイナミックレンジは３．０２桁であった。ＲＬＵ測定値から抗ＨＢｃ濃度を算出するための式は、次のとおりであった：抗ＨＢｃ濃度（ＩＵ／ｍＬ）＝１０（Ｌｏｇ１０（ＲＬＵ）×１．１４０９−５．８６１）。
（３．５．５）試験される試料の抗ＨＢｃ濃度の取得：Ｐ２血清の段階的に希釈した試料をステップ３．５．１〜３．５．４の測定に供した。希釈率１：５００の場合のＲＬＵ測定値は１５７１４００であり、希釈率１：２５００の場合のＲＬＵ測定値は３８０５６０であり、上記の測定値を、ステップ３．５．４で得られた抗ＨＢｃ濃度算出用の式に導入したところ、希釈率１：５００の場合の濃度の値は１６．１６ＩＵ／ｍｌであり、希釈率１：２５００の場合の濃度の値は３．２０４ＩＵ／ｍｌであり、両方とも、ＣＬＩＡ法の正確な定量のための直線ダイナミックレンジ（０．０２〜２０．８ＩＵ／ｍｌ）の範囲に入った。したがって、希釈率１：５００の場合の測定値を計算に使用した場合、試料の元の抗ＨＢｃ濃度は、１６．１６×５００＝８０７８ＩＵ／ｍｌであった。一方、希釈率１：２５００の場合の測定値を計算に使用した場合、試料の元の抗ＨＢｃ濃度は、３．２０４×２５００＝８０１０ＩＵ／ｍｌであった。２つの測定値の平均濃度は８０４４ＩＵ／ｍｌであり、この濃度の値とＥＬＩＳＡ法によって測定した試料の濃度の値８０６９ＩＵ／ｍｌとには、通常の変動範囲内である３．１％の誤差があった。
【００４９】
４．様々な段階のＨＢＶ感染者の血清抗ＨＢｃレベルの分布
【００５０】
４．１  代表的な患者血清試料の選択
本発明において、様々な段階のＨＢＶ感染者の血清抗ＨＢｃレベルの分布を研究するために、過去にＨＢＶに感染し、治癒した健常者の血清試料３５０個及び慢性Ｂ型肝炎患者の血清試料４８８個を採取した。血清試料はすべて、血清を分離した後に−８０℃で保管した。患者４８８名の内、患者１０９名は、原発性肝臓癌の患者であり、患者６３名は肝硬変の患者であり、残りの患者３１６名は、単純な慢性Ｂ型肝炎の患者であった。患者はすべて、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に同時に感染している可能性を排除するように、且つ自己免疫性又は代謝性の肝臓疾患に同時に罹患しているという臨床的医学的証拠がないように、選択した。
【００５１】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒの慢性Ｂ型肝炎の臨床的管理のための手引書（ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）（２００９）に基づいて、単純な慢性Ｂ型肝炎の患者３１６名を異なる感染期に分けた。患者５２名は、免疫寛容期（ＩＴ）にあり、年齢が３５歳未満であり、ＨＢｅＡｇ陽性であり、血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量が５×１０７コピー／ｍｌより多く、過去１２ヶ月の間に測定されたＡＬＴレベルが常に正常値の上限（ＵＬＮ、すなわち、本発明においては４０Ｕ／Ｌ）より低いことを特徴としていた。患者１０４名は、免疫クリアランス期（ＩＣ）にあり、ＨＢｅＡｇ陽性であり、血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量が１×１０４コピー／ｍｌより多く、ＡＬＴレベルがＵＬＮの２倍より高いことを特徴としていた。患者７５名は、低複製期（ＬＲ）にあり、ＨＢｅＡｇ陰性であり、血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量が１×１０４コピー／ｍｌより少なく、過去１２ヶ月の間に測定されたＡＬＴレベルが常にＵＬＮより低いことを特徴としていた。患者８５名は、ＨＢｅＡｇ陰性肝炎期にあり、ＨＢｅＡｇ陰性であり、血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量が２×１０４コピー／ｍｌより多く、ＡＬＴレベルがＵＬＮの２倍より高いことを特徴としていた。
【００５２】
４．２  臨床検査方法
試料採取後２４時間目に、患者の血清ＡＬＴレベル及び肝臓機能の他の生化学的指標を測定した。先行技術文献で報告されている方法を用いて、血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量及びＨＢＶ遺伝子型検出を行った。ＨＢｓＡｇ定量は、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．のＨＢｓＡｇ化学発光定量キットを用いることによって実施した。ＨＢｅＡｇ及び抗ＨＢｅは、米国のＡｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＡｒｃｈｉｔｅｃｔ化学発光自動検出システムを用いて測定した。
【００５３】
４．３  患者の血清試料の抗ＨＢｃ定量
これは、本発明の例１、例２、又は例３の方法を用いて実施した。
【００５４】
４．４  統計学的方法
対応のないｔ検定又はクラスカル・ワリスＡＮＯＶＡを用いて、群間の連続変数の比較を行った。マンテル・ヘンツェルのχ２検定又はフィッシャーの正確検定を用いて、群間の分類変数（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ  ｖａｒｉａｂｌｅ）の比較を行った。また、ピアソン検定を相関分析のために使用した。受信者動作特性（ＲＯＣ）を用いて診断精度の分析を行い、診断効率を算出した（ＲＯＣ曲線下面積、ＡＵＲＯＣ）。０．０５未満のｐ値は、有意な統計学的差を有しているとみなした。
【００５５】
４．４  患者コホートの基本的特徴
セクション４．１において説明したＨＢＶに過去に感染した者及び慢性ＨＢＶ保有者の人口統計学的特性（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）、臨床的ウイルス学的検査、及び血液生化学的検査に関するバックグラウンドデータを表１に示す。
【表１】
2018036268.tif 000002
【００５６】
４．５  様々な段階のＨＢＶ感染者の血清抗ＨＢｃレベル
図６Ａ／Ｂにおいて、様々な疾患段階の代表的な患者の血清抗ＨＢｃレベル、ＡＬＴレベル、ＨＢｓＡｇレベル、及びＨＢＶ  ＤＮＡ量の分布状況を示した。過去に感染した者の血清抗ＨＢｃレベルは、慢性ＨＢＶ保有者のものより有意に低かった（中央値：０．４ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ対４．１ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ、ｐ＜０．００１、１０００分の１より低い）。感染期の異なる単純な慢性Ｂ型肝炎患者間で、血清抗ＨＢｃレベルは有意に異なっていた。免疫寛容期にある患者の血清抗ＨＢｃレベルの中央値は３．４ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌであり、免疫クリアランス期にある患者の血清抗ＨＢｃレベルの中央値は４．４ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌであり、低複製期にある患者の血清抗ＨＢｃレベルの中央値は３．３ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌであり、ＨＢｅＡｇ陰性肝炎期にある患者の血清抗ＨＢｃレベルの中央値は４．４ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌであった。上記データの解析により、免疫クリアランス期及びＨＢｅＡｇ陰性肝炎期にある患者の血清抗ＨＢｃレベルは、免疫寛容期及び低複製期にある患者のものより有意に高く（ｐ＜０．００１）、免疫クリアランス期及びＨＢｅＡｇ陰性肝炎期にある患者の血清抗ＨＢｃレベルには統計学的差はなく（ｐ＞０．０５）、免疫寛容期及び低複製期にある患者の血清抗ＨＢｃレベルにも統計学的差はない（ｐ＞０．０５）ことが示される。上記の結果から、慢性Ｂ型肝炎患者の血清抗ＨＢｃレベルは、宿主の免疫状態と強く相関していることが示される。高レベルの抗ＨＢｃは、患者が抗ＨＢＶ免疫活性状態にあることを示し、対象個体が免疫活性状態にある（免疫クリアランス期又はＨＢｅＡｇ陰性肝炎期）にあるかどうかを判定するのに抗ＨＢｃレベルを使用する場合、ＲＯＣ曲線解析による診断効率（ＡＵＲＯＣ、曲線下面積）は０．９１８（９５％信頼区間：０．８８８〜０．９４８）である（図６Ｃを参照されたい）。ＲＯＣ曲線を用いて算出した７４００ＩＵ／ｍｌという最適化カットオフ値を閾値として使用する場合、診断感度は８７．３％であり、診断特異度は８３．５％であった。
【００５７】
Ｂ型肝炎肝硬変患者及びＢ型肝炎原発性肝臓癌患者の血清抗ＨＢｃレベルを解析した。その結果を図６Ａ／Ｂに示す。Ｂ型肝炎肝硬変患者間で、ＡＬＴ≧ＵＬＮである患者３９名（ＬＣ−ｂ群）の血清抗ＨＢｃレベルは、ＡＬＴ＜ＵＬＮである患者２４名（ＬＣ−ａ群）のものより有意に高かった（中央値は、４．２ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ対３．８ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌであった。ｐ＝０．０１６）。一方、Ｂ型肝炎原発性肝臓癌患者間で、ＡＬＴ≧ＵＬＮである患者８０名（ＨＣＣ−ｂ群）の血清抗ＨＢｃレベルは、ＡＬＴ＜ＵＬＮである患者２９名（ＨＣＣ−ａ群）のものより有意に高かった（中央値は、４．１ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ対３．８ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌであった。ｐ＝０．００６）。上記の結果から、慢性肝炎ウイルス感染者の血清抗ＨＢｃレベルがＡＬＴレベル及び宿主の免疫状態と有意に相関していることがさらに裏付けられる。
【００５８】
４．６  慢性Ｂ型肝炎ウイルス保有者の抗ＨＢｃレベル及びＡＬＴレベルの相関関係
慢性Ｂ型肝炎ウイルス保有者４８８名全員（単純な慢性Ｂ型肝炎患者、Ｂ型肝炎肝硬変患者、及びＢ型肝炎原発性肝臓癌患者を含む、ｎ＝４８８）をＡＬＴに基づいて層別化した様々な患者の血清抗ＨＢｃレベルを解析した。この結果を図６Ｄに示す。ＡＬＴ≦５×ＵＬＮである患者において、患者の平均抗ＨＢｃレベルはＡＬＴレベルの上昇と共に上昇した（ｐ傾向＜０．００１）。一方、ＡＬＴが５×ＵＬＮに達した場合、血清抗ＨＢｃレベルは最高値に達し、それ以上上昇しなかった（ｐ傾向＝０．６３）。相関分析により、ＡＬＴ≦５×ＵＬＮである患者（ｎ＝３２８）において、平均血清抗ＨＢｃレベルはＡＬＴレベルと正の相関関係にある（単因子分析：ｒ＝０．５２、ｐ＜０．００１；多因子分析：Ｒ＝０．５３、ｐ＜０．００１）が、ＨＢＶ  ＤＮＡレベル（ｐ＝０．２５）ともＨＢｓＡｇレベル（ｐ＝０．３３）とも相関関係がないこと（図６Ｅ）が示されている。ＡＬＴ≦５×ＵＬＮである患者において、抗ＨＢｃレベルとＡＬＴレベルの間の定量的相関は、男性患者（ｒ＝０．５３、ｐ＜０．００１）又は女性患者（ｒ＝０．４３、ｐ＜０．００１）のどちらでも、ＨＢＶ遺伝子型Ｂに感染した患者（ｒ＝０．４９、ｐ＜０．００１）又はＨＢＶ遺伝子型Ｃに感染した患者（ｒ＝０．５３、ｐ＜０．００１）のどちらでも、ＨＢｅＡｇ陽性患者（ｒ＝０．５７、ｐ＜０．００１）又はＨＢｅＡｇ陰性患者（ｒ＝０．５０、ｐ＜０．００１）のどちらでも、常に存在する。ＡＬＴ＞５×ＵＬＮ（ｎ＝１６０）である場合、抗ＨＢｃレベルは、ＡＬＴレベルとは統計学的に有意な相関関係はなく（ｐ＝０．４３）、またＨＢＶ  ＤＮＡレベル（ｐ＝０．６３）ともＨＢｓＡｇレベル（ｐ＝０．４３）とも相関関係がない。
【００５９】
５．  慢性Ｂ型肝炎ウイルス保有者の自然な進行期間中の血清抗ＨＢｃレベルの動態変化及び他の指標とのその関係
【００６０】
５．１  患者コホート
本実施例において、抗ＨＢＶ治療を受けなかった合計９名の患者から得た自然な進行を縦断的に観察（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）するための血清系列試料を研究した。平均観察期間は１０３±３８週（５７〜１６８週）であり、追跡時の来院を５〜１７回実施し、血清試料７７個を使用した。
【００６１】
５．２  臨床的検出方法
これは、例４のセクション４．２において説明した方法に従って実施した。
【００６２】
５．３  患者の血清試料の抗ＨＢｃ定量
これは、例４のセクション４．３において説明した方法に従って実施した。
【００６３】
５．４  統計学的方法
一般化推定方程式（ＧＥＥ）を用いて縦断的データ解析を行い、例４において説明したものに従って、他の統計学的方法を実施した。
【００６４】
５．５  慢性Ｂ型肝炎ウイルス保有者の自然な進行期間中の血清マーカーの動態変化及びそれらの関係
追跡観察期間中の患者９名（Ａ〜Ｇ）の抗ＨＢｃレベル、ＡＬＴレベル、ＨＢｓＡｇレベル、及び血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量の動態変化を図７に示した。患者Ａは、追跡観察期間中、免疫寛容期にあり、その血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量及びＨＢｓＡｇは常に極めて高レベルであったが、ＡＬＴレベル及び抗ＨＢｃレベルは常に極めて低レベルであった。患者Ａを除いて、他の患者（Ｂ〜Ｇ）は全員、１回又は複数回の肝炎活性化を経験していた。これらの患者を観察することにより、抗ＨＢｃレベルの上昇は常にＡＬＴレベルの上昇を伴う、すなわち、肝炎の発病を伴うことが判明した。大半の状況において、肝炎の急性発病が起こった場合、患者の血清抗ＨＢｃレベルは通常、ＡＬＴレベルより３〜８週遅れてピーク値に達した（図７、例えば、患者Ｃ、患者Ｄの第１の期間、患者Ｆの第１の期間、並びに患者Ｇ及び患者Ｉの状況）。場合によっては、患者の血清抗ＨＢｃレベルは、ＡＬＴレベルと比べて先に又は同時にピーク値に達することができた（図７、例えば、患者Ｂ、患者Ｄ、患者Ｆの第２の期間、並びに患者Ｈ及び患者Ｅの状況）。肝炎の回復期中、抗ＨＢｃの減少はＡＬＴより遅く、通常、ＡＬＴが正常に戻ってから１２〜２０週間後に、抗ＨＢｃはベースラインレベルに戻った。
【００６５】
一般に、多因子縦断的データ解析により、血清抗ＨＢｃレベルはＡＬＴレベルと独立に相関している（β＝０．６５、ｐ＜０．００１）が、血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量（β＝−０．００６、ｐ＝０．９８）及びＨＢｓＡｇレベル（β＝−０．０３４、ｐ＝０．４５）との間に統計学的に有意な相関関係はないことが示される。
【００６６】
６．抗ＨＢｃレベルを用いて、慢性Ｂ型肝炎患者における抗ウイルス治療法の治療効果を予測することができる。
【００６７】
６．１  患者コホート
患者コホートＡ：ＨＢｅＡｇ陽性患者４９名。患者は全員、アデホビルジピボキシル（１０ｍｇ／日）による治療を合計９６週間受け、治療を中止してから１２週間、追跡来院した。
【００６８】
患者コホートＢ：ＨＢｅＡｇ陽性患者４８名。患者は全員、ペグインターフェロンα−２ａ（長時間作用性インターフェロンα−２ａ、１８０μｇ／週）による治療を合計２４週間受け、治療を中止してから２４週間、追跡来院した。
【００６９】
治療前の上記の患者はすべて、ＡＰＡＳＬの慢性Ｂ型肝炎の臨床的管理のための手引書（ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ）によって推奨されている治療法に適応できる疾患基準を満たしていた。すなわち、ＨＢｓＡｇが継続的に１年以上陽性であり、ＨＢｅＡｇが陽性であり抗ＨＢｅが陰性であり、血清ＡＬＴレベルはＵＬＮの２倍より高かった。患者は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に同時に感染している可能性を排除するように、且つ自己免疫性又は代謝性の肝臓疾患に同時に罹患しているという臨床的医学的証拠がないように、選択した。
【００７０】
６．２  臨床的検出方法
これは、例４のセクション４．２において説明した方法に従って実施した。
【００７１】
６．３  患者の血清試料の抗ＨＢｃ定量
これは、例４のセクション４．３において説明した方法に従って実施した。
【００７２】
６．４  治療終了の定義
主要な治療終了は、追跡来院の終了時にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こった場合と定義した。
【００７３】
６．５  統計学的方法
統計学的方法はすべて、例４において説明した方法に従って実施した。
【００７４】
６．６  患者コホートの基本的特徴
表２に示したとおりである。
【表２】
2018036268.tif 000003
【００７５】
６．７  ベースライン抗ＨＢｃレベルは、治療後のＨＢｅＡｇセロコンバージョンの発生率と相関関係がある。
【００７６】
治療及び追跡観察後、コホートＡ（アデホビルジピボキシルによる治療を受けている）の患者４９名中９名は、追跡来院の終了時にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こっており、治療有効率は１８．４％（９５％ＣＩ：８．８〜３２．０％）であった。一方、コホートＢ（長時間作用性インターフェロンによる治療を受けている）の患者４８名中２３名は、追跡来院の終了時にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こっており、治療有効率は４７．９％（９５％ＣＩ：３３．３〜６２．８％）であった。
【００７７】
２つのコホート中の治療法が有効であった患者及び治療法が無効であった患者の、治療を受ける前の臨床的指標を解析し、その結果を表３に示した。アデホビルジピボキシルで治療した患者又は長時間作用性インターフェロンで治療した患者のいずれにおいても、年齢、性別比、ＡＬＴレベル、血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量、ＨＢｓＡｇレベル、及び抗ＨＢｃ−ＩｇＭレベルの観点からは、治療法が有効であった患者と治療法が無効であった患者の間に統計的有意差はなかった。しかし、治療法が有効であった患者のベースライン抗ＨＢｃレベルは、治療法が無効であった患者のものより有意に高かった。コホートＡでは４．５８±０．２８ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ対４．１５±０．４２ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ、ｐ＝０．００５、コホートＢでは４．３２±０．６６ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ対３．８１±０．６８ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ、ｐ＝０．０１１。この結果から、治療前の抗ＨＢｃレベルによって患者の予想される治療効果を予測できることが示唆される。ＲＯＣ解析により、ベースライン抗ＨＢｃレベルを用いて追跡来院の終了時のＨＢｅＡｇセロコンバージョンを予測するためのＡＵＲＯＣ値がコホートＡにおいて０．８１０であったこと（９５％、ＣＩ：０．６７５〜０．９４８、ｐ＝０．００４、図８Ａを参照されたい。）、最良のカットオフ値は２９０００ＩＵ／ｍｌであり、診断感度は７７．８％であり、診断特異度は７７．５％であったこと、コホートＢにおいてはＡＵＲＯＣ値が０．７１０であったこと（９５％ＣＩ：０．５６４〜０．８５５、ｐ＝０．０１３、図８Ｂを参照されたい。）、最良のカットオフ値は９０００ＩＵ／ｍｌであり、診断感度は６９．６％であり、診断特異度は６０．０％であったことが示されている。
【表３】
2018036268.tif 000004
【００７８】
６．８  ベースライン抗ＨＢｃレベルを用いた、治療後のＨＢｅＡｇセロコンバージョンの発生率の予測
【００７９】
セクション６．７で算出されたカットオフ値を治療の前に用いて、患者が治療を受けた後のＨＢｅＡｇセロコンバージョンの発生率を予測し得る。コホートＡでは、図８Ｃで示したように、ベースライン抗ＨＢｃレベルが２９０００ＩＵ／ｍｌより高い患者１６名中７名は、追跡来院の終了時にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが発生していた（有効率：４３．８％）。一方、ベースライン抗ＨＢｃレベルが２９０００ＩＵ／ｍｌより低い患者３３名中２名のみで、追跡来院の終了時にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが発生していた（有効率：６．１％）。高抗ＨＢｃ群と低抗ＨＢｃ群とのＨＢｅＡｇセロコンバージョンの発生率の比（リスク比、ＲＲ）は７．２２であった（９５％ＣＩ：１．６９〜３０．９、ｐ＝０．００６）。コホートＢでは、図８Ｄで示したように、ベースライン抗ＨＢｃレベルが９０００ＩＵ／ｍｌより高い患者２５名中１６名は、追跡来院の終了時にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが発生していた（有効率：６４．０％）。一方、ベースライン抗ＨＢｃレベルが９０００ＩＵ／ｍｌより低い患者２３名中７名のみで、追跡来院の終了時にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが発生していた（有効率：３０．４％）。高抗ＨＢｃ群と低抗ＨＢｃ群とのＨＢｅＡｇセロコンバージョンの発生率の比（リスク比、ＲＲ）は２．１０であった（９５％ＣＩ：１．０６〜４．１７、ｐ＝０．００６）。
【００８０】
様々なＡＬＴレベルの患者における治療後のＨＢｅＡｇセロコンバージョンを予測するためのベースライン抗ＨＢｃの効果をさらに解析し、結果を図８Ｅに示した。２つのコホートにおいて、ベースラインＡＬＴレベルが５×ＵＬＮ以下であるか、又は５×ＵＬＮを上回る患者の下位集団に関して、抗ＨＢｃレベルが低い患者と比べて、抗ＨＢｃレベルが高い患者ほど、治療後のセロコンバージョンの発生率が高かった。アデホビルジピボキシル及び長時間作用性インターフェロンによる治療を受けた患者を解析のために一緒にし、患者全員を３つの群、すなわち高抗ＨＢｃレベル（≧２９０００ＩＵ／ｍｌ）、中抗ＨＢｃレベル（９０００〜２９０００ＩＵ／ｍｌ）、及び低抗ＨＢｃレベル（＜９０００ＩＵ／ｍｌ）に分け、３群の患者の治療後のＨＢｅＡｇセロコンバージョン率を解析し、その結果を図９に示した。ベースライン抗ＨＢｃレベルが２９０００ＩＵ／ｍｌ以上である患者のうちで、アデホビルジピボキシルによる治療を受けた患者１６名中９名は、治療後にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こり、奏効率は４３．８％であったのに対し、長時間作用性インターフェロンによる治療を受けた患者１５名におけるこの比率は６６．７％（１０／１５）であり、これらの間に統計的有意差はなかった（ｐ＝０．８２）。ベースライン抗ＨＢｃレベルが９０００〜２９０００ＩＵ／ｍｌである患者の場合、アデホビルジピボキシルによる治療を受けた患者１９名中２名のみで、治療後にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こり、奏効率は１０．５％であったのに対し、長時間作用性インターフェロンによる治療を受けた患者１０名におけるこの比率は６０．０％（６／１０）であり、これらの間に統計的有意差があった（ｐ＝０．０１８）。ベースライン抗ＨＢｃレベルが９０００ＩＵ／ｍｌ未満である患者の場合、アデホビルジピボキシルによる治療を受けた患者１６名の内で、治療後にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こった者はいなかったのに対し、長時間作用性インターフェロンによる治療を受けた患者２３名中７名でＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こり（３０．４％）、これらの間には統計的有意差があった（ｐ＜０．００１）。
【００８１】
６．９  アデホビルジピボキシルによる治療中及び治療後の患者の抗ＨＢｃレベルの動態変化
【００８２】
アデホビルジピボキシルによる治療中及び治療後の患者の抗ＨＢｃレベルの動態変化（図１０Ａを参照されたい）に基づくと、治療及び観察の期間全体を３つの段階に分けることができた：（１）ベースライン〜治療開始後６０週目。この段階では、患者の平均血清抗ＨＢｃレベルは、治療の継続に伴って直線的低下を示し（ｒ＝０．９９、ｐ＜０．００１）、１２週当たり０．２０±０．０５ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ低下した；（２）治療開始後６０週目〜治療の終了（９６週目）まで。患者の平均血清抗ＨＢｃレベルは一定値に達し（ｒｅａｃｈｅｄ  ａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）、治療の継続に伴って低下しなかった（ｐ＝０．８７）；（３）薬物治療後（１０８週目）。患者の平均血清抗ＨＢｃレベルは、治療終了時（９６週目）の値と比べて著しい急上昇を示し、平均して０．２９ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ上昇した（ｐ＜０．００１）。通常、治療処置中、抗ＨＢｃレベルは、ＡＬＴレベル、ＨＢＶ  ＤＮＡレベル、及びＨＢｓＡｇレベルよりゆっくりと低下した。前者は治療開始後６０週目に一定値の段階に達したのに対し、後者の３つの指標は、治療開始後２４週目に一定値の段階に達した。多因子縦断解析により、抗ＨＢｃレベルは、ＡＬＴレベルとは独立に相関している（β＝０．８３０、ｐ＜０．００１）が、ＨＢＶ  ＤＮＡレベル（β＝０．００３、ｐ＝０．９４）ともＨＢｓＡｇレベル（β＝−０．０６１、ｐ＝０．５２）とも統計学的に有意な相関関係はないことが示された。
【００８３】
本実施例のセクション６．７で決定された臨床的カットオフ値に基づいて、アデホビルジピボキシルによる治療を受けた患者全員を２９０００ＩＵ／ｍｌ以上（ｎ＝１６、高ＨＢｃ）及び２９０００ＩＵ／ｍｌ未満（ｎ＝３３、低ＨＢｃ）の２群に分けた。これらの２群の間で、治療中及び治療後の血清抗ＨＢｃ、ＨＢＶ  ＤＮＡ、ＡＬＴ、及びＨＢｓＡｇのレベルの動態変化を比較し、その結果を図１０Ｂに示した。ＨＢＶ  ＤＮＡレベル（７．６１±１．１５ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ対７．５０±１．２２ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ、ｐ＝０．７７）及びＨＢｓＡｇレベル（４．３４±０．３１ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ対４．３８±０．６９ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ、ｐ＝０．８３）の点で、高ＨＢｃ群と低ＨＢｃ群の間に統計学的差はなかった。一方、高ＨＢｃ群のベースラインＡＬＴレベルは低ＨＢｃ群のものより高かったが、統計学的差はなかった。治療中、２つの群のＡＬＴレベル及び抗ＨＢｃレベルの減少曲線は、各監視点の解析においても縦断解析においても統計学的差を示さなかった。しかし、薬物治療後、低ＨＢｃ群の抗ＨＢｃは、高ＨＢｃ群の抗ＨＢｃと比べて注目すべき急上昇を示し（ｐ＝０．０３９）、ＡＬＴも同様の状況にあったが、統計的有意性はなかった（ｐ＝０．０９）。ＨＢＶ  ＤＮＡレベルの場合、高ＨＢｃ群の患者の血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルは、治療中又は治療後いずれも（ベースラインを除く）、低ＨＢｃ群のものと比べて有意に低かった（ｐ＜０．０５）。追跡終了時に、高ＨＢｃ群の患者の平均ＨＢＶ  ＤＮＡレベルは、治療前のレベルと比べて３．４８±２．２４ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ低下していたのに対し、低ＨＢｃ群の患者の平均ＨＢＶ  ＤＮＡレベルは、治療前のレベルと比べて１．６９±２．０５ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ低下していた（ｐ＝０．００８）。これら２群のＨＢｓＡｇレベルの変化は、有意な差を示さなかった。
【００８４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月26日(2017.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む方法を介して、慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視するための、試料中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体のレベルを定量的に検出するための試薬を含む診断剤（但し該薬物はヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体である）：
（１）診断剤を使用して慢性Ｂ型肝炎患者から血清試料中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体のレベルを定量的に検出するステップ、及び
（２）検出されたＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体のレベルが７４００ＩＵ／ｍｌより高い場合、慢性Ｂ型肝炎ウイルスが免疫活性化状態又は肝炎活動的状態であると決定するステップ；
或いは、
以下のステップを含む方法を介して、慢性Ｂ型肝炎患者が薬物を受ける前にＢ型肝炎ウイルスに対する薬物の治療効果を予測するための、試料中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体のレベルを定量的に検出するための試薬を含む診断剤（但し該薬物はヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体である）：
（ｉ）診断剤を使用して慢性Ｂ型肝炎患者から血清試料中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体のレベルを定量的に検出するステップ、及び
（ｉｉ）検出されたＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体のレベルが２９０００ＩＵ／ｍｌより高い場合、薬物が慢性Ｂ型肝炎ウイルス患者に対して有効であると決定するステップ。
【請求項２】
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体レベルの定量的検出が、次の方法：酵素結合免疫吸着アッセイ、化学発光免疫検出法、時間分解蛍光検出法、免疫比濁法、免疫クロマトグラフィー法、及び免疫ろ過法のうちの１つ又は複数によって実施される、請求項１に記載の診断剤。
【請求項３】
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体のレベルの１回の検出の直線ダイナミックレンジが１．５桁以上である、すなわち、１回の検出に対する正確な定量の上限値が、正確な定量の下限値より３２倍以上大きい、請求項１に記載の診断剤。
【請求項４】
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体レベルの定量的検出が、以下のステップ：
ａ）Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合できるＢ型肝炎ウイルスタンパク質を提供するステップであって、前記タンパク質が、１番目のアミノ酸から１８３番目のアミノ酸までのＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の完全長のアミノ酸配列を含み、又はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列のみを含み、前記タンパク質が、固体支持体上に固定され、固相抗原として作用し、血清試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体を捕捉するのに使用される、上記ステップ；
ｂ）固相抗原上で捕捉されるＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合できる標識抗原を提供するステップであって、標識抗原が、１番目のアミノ酸から１８３番目のアミノ酸までのＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の完全長のアミノ酸配列を含み、又はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列のみを含み、標識抗原が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びアクリジニウムエステルからなる群から選択されるシグナル発生物質を含む、上記ステップ；
ｃ）様々な濃度のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体を含有する、３〜６個の試料からなる、定量検量線を描くための濃度が公知の定量標準試料を提供するステップ；
ｄ）試験される試料又は定量標準試料を固相抗原と接触させ、その結果、前記試料中に存在する場合には、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体が捕捉されて、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の複合体を形成するステップ；
ｅ）標識抗原を、ステップｄ）の生成物、すなわち、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の複合体と接触させて、その結果、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体−標識抗原の複合体を形成させるステップ；
ｆ）シグナル発生を活性化できる基質又は溶液を、ステップｅ）で形成された固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体−標識抗原の複合体と接触させて、その結果、測定可能なシグナルを発生させ、対応する測定機器を用いて、発生したシグナルの強度を測定するステップ；
ｇ）定量標準試料の測定されたシグナルの線形回帰フィッティングをそれらの対応する濃度を用いて実施して、測定シグナルから試料濃度を算出するための数式を得るステップ；
ｈ）試験される試料の測定されたシグナルをステップｇ）の式に導入し、試験される試料中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体の濃度を算出するステップ；
ｉ）ステップｈ）で算出されたＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体の濃度が、検出方法の正確な定量の上限値より高い場合、測定された濃度が対応する検出方法の正確な定量の上限値から下限値の間の範囲に入るまで、試験される試料を希釈し、ステップａ）〜ｈ）を繰り返すステップを含む、
請求項１に記載の診断剤。
【請求項５】
前記Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸までである、請求項４に記載の診断剤。
【請求項６】
前記ステップ（ｃ）における濃度の単位が、ＩＵ／ｍｌである、請求項４に記載の診断剤。
【請求項７】
前記ステップ（ｇ）における定量標準試料が、３〜６個の試料である、請求項４に記載の診断剤。
【請求項８】
前記ステップ（ｉ）において、試験される試料中に含有されるＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する総抗体の濃度が、希釈後に測定された値に希釈率を掛ける計算によって得られる、請求項４に記載の診断剤。
【請求項９】
前記薬物が、ラミブジン（ＬＭＶ）、アデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン（ＬｄＴ）、及びテノホビルからなる群から選択される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の診断剤。
【請求項１０】
前記薬物がアデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）である、請求項９に記載の診断剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
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本発明の好ましい態様には以下が含まれる。
（１）慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視し、且つ／又は慢性Ｂ型肝炎患者がＢ型肝炎ウイルスに対する治療を受ける前に治療効果を効果的に予測するための診断剤を製造する際の、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルを定量的に検出するための試薬の使用。
（２）Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の定量的検出が、次の方法：酵素結合免疫吸着アッセイ、化学発光免疫検出法、時間分解蛍光検出法、免疫比濁法、免疫クロマトグラフィー法、免疫ろ過法のうちの１つ又は複数によって実施される、（１）に記載の使用。
（３）Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルの１回の検出の直線ダイナミックレンジが１．５桁以上である、すなわち、１回の検出に対する正確な定量の上限値が、正確な定量の下限値より３２倍以上大きい、（１）に記載の使用。
（４）Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の定量的検出が、以下のステップ：
ａ）Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合できるＢ型肝炎ウイルスタンパク質を提供するステップであって、前記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の完全長のアミノ酸配列（１番目のアミノ酸から１８３番目のアミノ酸まで）を含んでよく、又はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列のみ（例えば、１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸まで）を含んでよく、前記タンパク質が、固体支持体上に固定され、固相抗原として作用し、血清試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体を捕捉するのに使用される、上記ステップ；
ｂ）固相抗原上で捕捉されるＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合できる標識抗原を提供するステップであって、標識抗原が、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質の完全長のアミノ酸配列（１番目のアミノ酸から１８３番目のアミノ酸まで）を含んでよく、又はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質の主要な免疫優性領域のアミノ酸配列のみ（例えば、１番目のアミノ酸から１４９番目のアミノ酸まで）を含んでよく、標識抗原上のシグナル発生物質が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はアクリジニウムエステルであり得る、上記ステップ；
ｃ）様々な濃度のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体を含有する、通常３〜６個の試料からなる、定量検量線を描くための濃度が公知の定量標準試料を提供するステップであって、濃度の単位が、ＩＵ／ｍｌ、ＰＥＩＵ／ｍｌ、又は起源を追跡することができる濃度若しくは力価の他の単位であり得る、上記ステップ；
ｄ）試料（試験される試料又は定量標準試料）を固相抗原と接触させ、その結果、前記試料中に存在する場合には、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体が捕捉されて、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の複合体を形成する、ステップ；
ｅ）標識抗原を、ステップｄ）の生成物、すなわち、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の複合体と接触させて、その結果、固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体−標識抗原の複合体を形成させる、ステップ；
ｆ）シグナル発生を活性化できる基質又は溶液を、ステップｅ）で形成された固相抗原−Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体−標識抗原の複合体と接触させて、その結果、測定可能なシグナルを発生させ、対応する測定機器を用いて、発生したシグナルの強度を測定する、ステップ；
ｇ）定量標準試料（通常、３〜６個の試料）の測定されたシグナルの線形回帰フィッティングをそれらの対応する濃度を用いて実施して、測定シグナルから試料濃度を算出するための数式を得るステップ；
ｈ）試験される試料の測定されたシグナルをステップｇ）の式に導入し、試験される試料中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度を算出するステップ；
ｉ）ステップｈ）で算出されたＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度が、検出方法の正確な定量の上限値より高い場合、測定された濃度が対応する検出方法の正確な定量の上限値から下限値の間の範囲に入るまで、試験される試料を希釈し、ステップａ）〜ｈ）を繰り返すステップであって、試験される試料中に含有されるＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体の濃度が、希釈後に測定された値に希釈率を掛ける計算によって得られる、上記ステップ
を含む、（１）に記載の使用。
（５）診断剤が、様々な治療用薬物を与えられる慢性Ｂ型肝炎患者において使用され、前記薬物が、長時間作用性インターフェロン（ペグ化インターフェロン、ペグインターフェロン）、通常のインターフェロン（インターフェロン）、ラミブジン（ＬＭＶ）、アデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン（ＬｄＴ）、テノホビル、又は慢性Ｂ型肝炎の治療において有用な他の薬物を含む、（１）から（４）までのいずれかに記載の使用。
（６）治療の前に患者における治療の治療効果を予測するための一般的な基準が、治療前の患者血清中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルがより高い患者において得られる治療効果（奏効率）が、治療前の患者血清中のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルがより低い患者のものより優れていることであり；治療効果の基準が、Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原セロコンバージョン（すなわち、治療を受ける慢性Ｂ型肝炎患者におけるＨＢｅＡｇ（＋）／抗ＨＢｅ（−）からＨＢｅＡｇ（−）／抗ＨＢｅ（＋）への変換）であってもよく、又はウイルス学的応答（すなわち、慢性Ｂ型肝炎患者において血清ＨＢＶ  ＤＮＡ量が１０００コピー／ｍｌ以下まで減少する）又は疾患状態の寛解若しくは良好な予後を示唆し得る他の臨床的指標であってもよい、（１）から（４）までのいずれかに記載の使用。
（７）慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視するための一般的な基準が、患者の肝臓炎症の発生及びＢ型肝炎ウイルスに特異的な宿主免疫応答の活性化を示唆する、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質に対する抗体のレベルの異常な上昇である、（１）から（４）までのいずれかに記載の使用。
（８）アデホビルジピボキシル及びペグ化インターフェロンによる治療を受ける慢性Ｂ型肝炎患者の応答を評価するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用。
（９）慢性Ｂ型肝炎患者の疾患進行を監視するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用。
（１０）Ｂ型肝炎患者の病期を予測するためのキットを製造する際の抗ＨＢｃの使用。