(57)【要約】【課題】抗原特異的Ｔ細胞を高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物及びその簡便な製造方法を提供すること。【解決手段】ＣＤ１３７陽性細胞を５００ＩＵ／ｍＬ以上の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養する細胞増殖工程を含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物の製造方法、及び全Ｔ細胞数に対する抗原特異的Ｔ細胞の細胞数の割合が、１５％以上である抗原特異的Ｔ細胞含有組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１３７陽性細胞を５００ＩＵ／ｍＬ以上の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養する細胞増殖工程を含むことを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞含有組成物の製造方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−２の終濃度が１，０００ＩＵ／ｍＬ以上である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記細胞増殖工程の培地が、更に、抗ＣＤ３抗体を含む請求項１から２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４】
前記ＣＤ１３７陽性細胞が、
単核球を調製する単核球調製処理、
前記単核球からＣＤ１３７陽性細胞を誘導するＣＤ１３７陽性細胞誘導処理、及び
前記ＣＤ１３７陽性細胞を分離するＣＤ１３７陽性細胞分離処理を含む工程により得られる請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物であって、
前記組成物における、全Ｔ細胞数に対する抗原特異的Ｔ細胞の細胞数の割合が１５％以上であることを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞含有組成物。
【請求項６】
前記組成物における、前記抗原特異的Ｔ細胞の細胞数が、５×１０３個／ｍＬ以上である請求項５に記載の抗原特異的Ｔ細胞含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞含有組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のがん治療方法である、外科療法（手術）、化学療法（抗がん剤）、放射線療法の３つに加えて、近年、第４のがん治療方法として注目されているのが免疫療法である。
前記免疫療法には、免疫細胞療法、サイトカイン療法、抗体療法などがあるが、これらは、抗がん剤と比較して副作用が少ないと考えられており、その開発が期待されている。
【０００３】
前記免疫細胞療法は、腫瘍免疫などにおける免疫機能を、目的とする方向へ誘導する治療方法であり、患者のがん細胞の周辺に浸潤するリンパ球を採取し、培養後に患者の体内へ戻す治療法である、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、患者からリンパ球を採取し、ＩＬ−２の存在下での培養後に患者の体内へ戻す治療法である、活性化リンパ球（ＬＡＫ）療法、及び患者からＴ細胞と樹状細胞を採取し、細胞傷害性Ｔ細胞へと分化させた後に患者の体内へ戻す治療法である、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法などがある。
【０００４】
前記腫瘍免疫において、抗腫瘍に働く多くのＴ細胞は、がん細胞の持つ突然変異を認識していると考えられており、前記ＴＩＬ療法においても、Ｔ細胞はがん細胞の持つ突然変異を認識していることが予想される（非特許文献１）。したがって、最適な抗原エピトープを選択し、それを認識する抗原特異的Ｔ細胞を適切に簡便に増殖させることが治療効果の向上に極めて重要である。
【０００５】
これまでに、最適な抗原情報がない場合における、抗原特異的Ｔ細胞の選択に適した分子として、ＣＤ１３７が報告されている。しかしながら、従来の方法は、成熟樹状細胞と共培養して得られるＣＤ１３７陽性細胞を、低濃度（５０ＩＵ／ｍＬ）のインターロイキン２（ＩＬ−２）を含む培地で培養するものであり、抗原特異的Ｔ細胞を高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物を簡便に得ることは困難であった（非特許文献２）。
【０００６】
前記ＬＡＫ療法は、本邦において広く実施されている免疫細胞療法であるが、上記のとおり、抗原特異的Ｔ細胞を高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物を簡便に得ることは困難であったことより、その効果は限定的であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８：６２−６８（２０１５）
【非特許文献２】Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｗｏｌｆｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  １１０：２０１−２１０  （２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞を高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物及びその簡便な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＣＤ１３７陽性細胞を、５００ＩＵ／ｍＬ以上の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養することにより、抗原特異的Ｔ細胞を高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物が簡便に得られることを確認した。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＣＤ１３７陽性細胞を５００ＩＵ／ｍＬ以上の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養する細胞増殖工程を含むことを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞の製造方法である。
＜２＞  前記ＩＬ−２の終濃度が１，０００ＩＵ／ｍＬ以上である＜１＞に記載の抗原特異的Ｔ細胞の製造方法である。
＜３＞  前記細胞増殖工程の培地が、更に、抗ＣＤ３抗体を含む＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞の製造方法である。
＜４＞  前記ＣＤ１３７陽性細胞が、単核球を調製する単核球調製処理、前記単核球からＣＤ１３７陽性細胞を誘導するＣＤ１３７陽性細胞誘導処理、及び前記ＣＤ１３７陽性細胞を分離するＣＤ１３７陽性細胞分離処理を含む工程により得られる＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞の製造方法である。
＜５＞  抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物であって、前記組成物における、全Ｔ細胞数に対する抗原特異的Ｔ細胞の細胞数の割合が、１５％以上であることを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞含有組成物である。
＜６＞  前記組成物における、前記抗原特異的Ｔ細胞の細胞数が、５×１０３個／ｍＬ以上である＜５＞に記載の抗原特異的Ｔ細胞含有組成物である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、抗原特異的Ｔ細胞を高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物及びその簡便な製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、比較例１で得られた組成物の細胞内サイトカイン染色結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例１〜５及び比較例２で得られた組成物の細胞増殖率を示す図である。
【図３】図３は、実施例１〜５及び比較例２で得られた組成物の抗原特異的Ｔ細胞の割合を示す図である。
【図４】図４は、実施例１〜５及び比較例２で得られた組成物の抗原特異的Ｔ細胞数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の抗原特異的Ｔ細胞含有組成物の製造方法は、ＣＤ１３７陽性細胞を５００ＩＵ／ｍＬ以上の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養する細胞増殖工程を含む。また、本発明の抗原特異的Ｔ細胞含有組成物は、本発明の抗原特異的Ｔ細胞含有組成物の製造方法により好適に製造することができる。
【００１４】
（抗原特異的Ｔ細胞含有組成物の製造方法）
本発明の抗原特異的Ｔ細胞含有組成物の製造方法は、細胞増殖工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含むことができる。
【００１５】
＜細胞増殖工程＞
前記細胞増殖工程は、ＣＤ１３７陽性細胞を５００ＩＵ／ｍＬ以上の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養する工程である。
【００１６】
＜＜培地＞＞
−ＩＬ−２−
前記ＩＬ−２としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安全性の点から組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）が好ましい。前記ＩＬ−２としては、市販品であってもよく、従来公知の手法に基づき合成したものであってもよい。前記市販品としては、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（ノバルティス社製）、イムネース（塩野義製薬株式会社製）、セロイク（武田薬品工業株式会社製）などが挙げられる。
【００１７】
前記ＩＬ−２の終濃度の下限値としては、５００ＩＵ／ｍＬ以上であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１，０００ＩＵ／ｍＬ以上がより好ましく、３，０００ＩＵ／ｍＬ以上が更に好ましく、６，０００ＩＵ／ｍＬ以上が特に好ましい。前記ＩＬ−２の終濃度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５０，０００ＩＵ／ｍＬ以下などが挙げられる。前記好ましい範囲とすることで、抗原特異的Ｔ細胞をより高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物が得られる点で有利である。
【００１８】
−ＩＬ−２以外の添加物−
前記培地には、必要に応じて、ＩＬ−２に加えてＴ細胞受容体刺激を惹起する成分を組み合わせて添加することもできる。また、その他の添加物を培地に加えてもよい。
【００１９】
−−Ｔ細胞受容体刺激を惹起する成分−−
前記Ｔ細胞受容体刺激を惹起する成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、非特異的Ｔ細胞受容体刺激を惹起する成分、特異的Ｔ細胞受容体刺激を惹起する成分などが挙げられる。これらの中でも、治療対象者を拡大する点及び簡便である点から非特異的Ｔ細胞受容体刺激を惹起する成分が好ましい。
【００２０】
前記非特異的Ｔ細胞受容体刺激を惹起する成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗ＣＤ３抗体などが挙げられる。前記抗ＣＤ３抗体としては、市販品であってもよく、従来公知の手法に基づき合成したものであってもよい。前記市販品としては、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＣＤ３  ｐｕｒｅ（ミルテニーバイオテク株式会社製）、Ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｍＡｂ  ＧＭＰ  ｇｒａｄｅ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。
【００２１】
前記抗ＣＤ３抗体の終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１μｇ／ｍＬ以上が好ましく、１．０μｇ／ｍＬ以上がより好ましく、３．０μｇ／ｍＬ以上が更に好ましく、５．０μｇ／ｍＬ以上が特に好ましい。前記好ましい範囲とすることで、抗原特異的Ｔ細胞をより高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物が得られる点で有利である。
【００２２】
−−その他の添加物−−
前記培地に含まれる、前記その他の添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＬ−２以外のサイトカイン、血清、抗生物質、アミノ酸などが挙げられる。これらの添加物は、細胞増殖工程の全期間において添加してもよく、一部期間において添加してもよい。
【００２３】
前記ＩＬ−２以外のサイトカインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インターロイキン７、インターロイキン１５、又はこれらの組合せなどが挙げられる。
【００２４】
前記血清としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウシ胎仔血清、ヒトＡＢ型血清、又は献血ヒト血清アルブミンなどが挙げられるが、ヒトＡＢ型血清が好ましい。
【００２５】
−基本培地−
前記細胞増殖工程における基本培地としては、ＣＤ１３７陽性細胞を培養できるものであれば特に制限はなく、例えば、ＩＭＤＭ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、ＡＩＭ  Ｖ培地、又はこれらの組合せなどが挙げられる。
【００２６】
＜＜培養＞＞
前記細胞増殖工程における培養期間の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５日間以上が好ましく、７日間以上がより好ましく、１１日間以上が更に好ましく、１４日間以上が特に好ましい。また、前記細胞増殖工程における培養期間の上限値としては、２８日間以下が好ましく、２１日間以下がより好ましく、１８日間以下が更に好ましく、１５日間以下が特に好ましい。前記好ましい範囲とすることで、抗原特異的Ｔ細胞をより高い割合で含む抗原特異的Ｔ細胞含有組成物が得られる点で有利である。
【００２７】
前記細胞増殖工程における培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５％から２０％のＣＯ２存在下において３７℃で培養する条件などが挙げられる。
【００２８】
＜＜ＣＤ１３７陽性細胞＞＞
前記ＣＤ１３７陽性細胞の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単核球を調製する単核球調製処理、前記単核球からＣＤ１３７陽性細胞を誘導するＣＤ１３７陽性細胞誘導処理、及び前記ＣＤ１３７陽性細胞を分離するＣＤ１３７陽性細胞分離処理を含む工程により好適に得ることができる。
【００２９】
−単核球調製処理−
前記単核球調製処理における原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血液、骨髄、リンパ節、臍帯血、及び造血幹細胞などが挙げられる。前記造血幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などから生成される。これらの中でも、侵襲性が低い点から血液が好ましい。被採取者の負担が低い点から成分採血により得られる産物（アフェレーシス産物）であってもよい。また、これらの細胞を凍結保存しておいた細胞であってもよい。
【００３０】
前記単核球の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィコール比重遠心法、マイクロビーズを用いる方法、フローサイトメトリーを用いる方法、又はこれらの組合せなどが挙げられる。これらの中でも、分離効率の点及び簡便である点からフィコール比重遠心法が好ましい。
【００３１】
−ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理−
前記ＣＤ１３７陽性細胞の誘導方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記単核球調製処理により得られた単核球に抗原刺激を与える方法、抗原刺激により分化させた成熟樹状細胞との共培養を行う方法などが挙げられる。これらの中でも、簡便である点から前記単核球調製処理で得られた単核球に抗原刺激を与える方法が好ましい。
【００３２】
前記抗原としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、ＢＫウイルス等のウイルス、又はこれらウイルス由来のペプチド、ＷＴ１、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＡＧＥ−Ａ４等のがん細胞由来のペプチドなどが挙げられる。前記ペプチドとしては、市販品であってもよく、従来公知の手法に基づき合成したものであってもよい。前記市販品としては、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ  ＣＭＶ  ｐｐ６５（ミルテニーバイオテク株式会社製）、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ  ＥＢＶ  ＬＭＰ２Ａ（ミルテニーバイオテク株式会社製）、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ  ＷＴ１（ミルテニーバイオテク株式会社製）などが挙げられる。
【００３３】
前記ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理における基本培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＭＤＭ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、ＡＩＭ  Ｖ培地、又はこれらの組合せなどが挙げられる。
【００３４】
前記ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理における基本培地に添加する添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血清、抗生物質、アミノ酸などが挙げられる。これらの添加物は、前記ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理の全期間において添加してもよく、一部期間において添加してもよい。
【００３５】
前記血清としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウシ胎仔血清、ヒトＡＢ型血清、献血ヒト血清アルブミンなどが挙げられるが、ヒトＡＢ型血清が好ましい。
【００３６】
前記ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理における培養期間の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、誘導効率の点から１２時間以上が好ましく、１８時間以上が更に好ましく、２０時間以上が特に好ましい。また、前記ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理における培養期間の上限値としては、３日間以下が好ましく、２日間以下が特に好ましい。
【００３７】
前記ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理における培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５％から２０％のＣＯ２存在下において３７℃で培養する条件などが挙げられる。
【００３８】
−ＣＤ１３７陽性細胞分離処理−
前記ＣＤ１３７陽性細胞の分離方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロビーズを用いた方法、フローサイトメトリーを用いた方法、又はこれらの組合せなどが挙げられる。これらの中でも、分離効率の点及び簡便である点などからマイクロビーズを用いた方法が好ましい。
【００３９】
前記マイクロビーズを用いた方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、分離効率の点から抗ＣＤ１３７が結合したマイクロビーズを用いたポジティブ選択による分離が好ましい。前記抗ＣＤ１３７が結合したマイクロビーズとしては、市販品であってもよく、従来公知の手法に基づき合成したものであってもよい。前記市販品としては、ＣＤ１３７  マイクロビーズキット、ヒト（ミルテニーバイオテク株式会社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７（ライフテクノロジーズ社製）などが挙げられる。
【００４０】
＜その他の工程＞
前記抗原特異的Ｔ細胞含有組成物の製造方法における、前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗原特異性を確認する抗原特異性確認工程、品質を検査する品質検査工程などが挙げられる。
【００４１】
＜＜抗原特異性確認工程＞＞
前記抗原特異性の確認方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞内サイトカインの定量、培養上清サイトカインの定量などが挙げられる。
前記細胞内サイトカインの定量としては、例えば、フローサイトメトリーを用いた細胞内染色、ウェスタンブロット法などが挙げられる。
前記培養上清サイトカインの定量としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法などが挙げられる。
【００４２】
＜＜品質検査工程＞＞
前記品質の検査としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ否定試験、フローサイトメトリー試験などが挙げられる。
【００４３】
＜抗原特異的Ｔ細胞含有組成物＞
以上の工程により本発明の抗原特異的Ｔ細胞含有組成物が製造される。
前記抗原特異的Ｔ細胞含有組成物は、少なくとも、抗原特異的Ｔ細胞を含み、更に必要に応じて、その他の成分を含む。
【００４４】
＜＜抗原特異的Ｔ細胞＞＞
前記抗原特異的Ｔ細胞含有組成物における、全Ｔ細胞数に対する抗原特異的Ｔ細胞の細胞数の割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５％以上が好ましく、１８％以上がより好ましく、２０％以上が更に好ましく、２５％以上が特に好ましい。
本発明において、全Ｔ細胞数に対する抗原特異的Ｔ細胞の細胞数の割合は、前記抗原による再刺激後において、ＣＤ４及びＣＤ８の少なくともいずれかが陽性の細胞数に対する、ＣＤ４及びＣＤ８の少なくともいずれかが陽性であって、かつ細胞内ＩＦＮ−γが陽性の細胞数の割合（％）をいう。
前記組成物における、前記抗原特異的Ｔ細胞の細胞数としては、５×１０３個／ｍＬ以上が好ましく、１×１０４個／ｍＬ以上がより好ましく、２×１０４個／ｍＬ以上が更に好ましく、５×１０４個／ｍＬ以上が特に好ましい。
本発明において、抗原特異的Ｔ細胞の細胞数は、前記抗原による再刺激後において、ＣＤ４及びＣＤ８の少なくともいずれかが陽性であって、かつ細胞内ＩＦＮ−γが陽性の細胞の数をいう。
【００４５】
＜＜その他の成分＞＞
前記抗原特異的Ｔ細胞含有組成物に含まれる、前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗原特異的Ｔ細胞以外の細胞、ＩＬ−２、ＩＬ−２以外のサイトカイン、抗ＣＤ３抗体等の抗体、培地由来の成分などが挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４７】
（比較例１）従来方法を用いたＴ細胞含有組成物の製造
健常人よりヘパリンを用いて採血を行い、３０ｍＬの血液を採取した。採血した血液細胞に、終濃度５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体、終濃度５０ＩＵ／ｍＬとなるようリコンビナントヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、ノバルティス社製）を添加し、５％のＣＯ２存在下において３７℃で１４日間培養した。
【００４８】
−−細胞内サイトカイン染色−−
前記従来方法による培養により得られた細胞を、１０％ヒトＡＢ型血清（ヒト血清ＡＢ、Ｇｅｍｉｎｉｂｉｏ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に５×１０５個／ｍＬとなるように懸濁し、９６ウェル培養プレート（９６ウェル組織培養プレート、サーモフィッシャー社製）に２００μＬ／ウェルで播種した。抗原（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ  ＣＭＶ  ｐｐ６５、ミルテニーバイオテク株式会社製）を１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、５％のＣＯ２存在下において３７℃で２時間培養した。終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ、ＳＩＧＭＡ社製）を加え、５％のＣＯ２存在下において３７℃で４時間培養した。２％ＦＢＳ（Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ハイクローン社製）を含むＰＢＳ（染色バッファー）を用いて細胞を２回洗浄し、抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ抗体（抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ抗体、バイオレジェンド社製）及び抗ＣＤ８  ＡＰＣ抗体（抗ＣＤ８  ＡＰＣ抗体、バイオレジェンド社製）を用いて細胞表面を染色した。染色バッファーで２回洗浄後、細胞内染色キット（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（登録商標）  Ｋｉｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｏｅｎｃｅｓ社製）を用いて細胞内ＩＦＮ−γを染色した。染色バッファーに細胞を懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔ−ＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｏｅｎｃｅｓ社製）で細胞を解析し、解析結果を図１に示した。
図１の結果から、従来方法により製造されたＴ細胞含有組成物は、抗原特異的Ｔ細胞を非常に低い割合（０．２％程度）で含むことが分かる。
【００４９】
（実施例１）抗原特異的Ｔ細胞含有組成物の製造
＜ＣＤ１３７陽性細胞調整工程＞
−単核球調製処理−
健常人よりヘパリンを用いて採血を行い、３０ｍＬの血液を採取した。採血した血液を遠心管に移し、等量のＰＢＳで希釈した。希釈した血液を、等量のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケア社製）に重層した後、５００Ｇにて３０分間室温で遠心した。血漿層を除去し、単核球層を回収後、ＰＢＳで懸濁し、５００Ｇにて５分間４℃で遠心した。この遠心洗浄を合計２回行った。
【００５０】
−ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理−
前記単核球調製処理により得られた細胞の細胞数を、０．４％トリパンブルー液を用いて計測し、５％ヒトＡＢ型血清（ヒト血清ＡＢ、Ｇｅｍｉｎｉｂｉｏ社製）及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、１×１０７個／ｍＬとなるように懸濁した。２４ウェル培養プレート（２４ウェル組織培養プレート、サーモフィッシャー社製）に、細胞懸濁液を１ｍＬ／ウェルで播種した。細胞懸濁液に、抗原（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ  ＣＭＶ  ｐｐ６５、ミルテニーバイオテク株式会社製）を１０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、５％のＣＯ２存在下において３７℃で２０時間培養した。
【００５１】
−ＣＤ１３７陽性細胞分離処理−
前記ＣＤ１３７陽性細胞誘導処理において培養した細胞を回収し、ＰＢＳで懸濁し、５００Ｇにて５分間４℃で遠心した。この遠心洗浄を合計２回行った。得られた細胞の細胞数を、０．４％トリパンブルー液を用いて計測し、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ヒトアルブミンを含むＰＢＳ（分離バッファー）に懸濁し、５００Ｇにて５分間４℃で遠心した。上清を破棄し、１×１０７個の細胞に対して４０μＬの分離バッファーで懸濁し、１０μＬの抗ＣＤ１３７−ＰＥ抗体（ＣＤ１３７  マイクロビーズキット、ヒト、ミルテニーバイオテク株式会社製）を添加し、１０分間４℃で反応させた。１ｍＬの分離バッファーを加え、３００Ｇにて１０分間４℃で遠心した。上清を破棄し、１×１０７個の細胞に対して８０μＬの分離バッファーで懸濁し、２０μＬの抗ＰＥマイクロビーズ（ＣＤ１３７  マイクロビーズキット、ヒト、ミルテニーバイオテク株式会社製）を添加し、１５分間４℃で反応させた。１ｍＬの分離バッファーを添加し、３００Ｇにて１０分間４℃で遠心した。上清を破棄し、５００μＬの分離バッファーに懸濁し、磁気分離装置（ミルテニーバイオテク株式会社製）を用いてＣＤ１３７陽性細胞を分離した。
【００５２】
＜細胞増殖工程＞
前記ＣＤ１３７陽性細胞分離処理により得られた細胞を、分離バッファーで懸濁し、得られた細胞の細胞数を、０．４％トリパンブルー液を用いて計測した。５００Ｇにて５分間、４℃で遠心し、１０％ヒトＡＢ型血清（ヒト血清ＡＢ、Ｇｅｍｉｎｉｂｉｏ社製）及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地とＡＩＭ−Ｖ培地を等量で混合した培地に５×１０５個／ｍＬとなるように懸濁した。９６ウェル培養プレート（９６ウェル組織培養プレート、サーモフィッシャー社製）に、細胞懸濁液を２００μＬ／ウェルで播種した。終濃度５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体、及び終濃度５００ＩＵ／ｍＬのリコンビナントヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、ノバルティス社製）を添加し、５％のＣＯ２存在下において３７℃で５日間培養した。培養上清を１００μＬ破棄し、終濃度５００ＩＵ／ｍＬとなるようにｒｈＩＬ−２を添加した、１０％ヒトＡＢ型血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地とＡＩＭ−Ｖ培地を等量で混合した培地を１００μＬ加え、５％のＣＯ２存在下において３７℃で２日間培養した。細胞を懸濁し、９６ウェル培養プレートの新しいウェルに分注した。終濃度５００ＩＵ／ｍＬとなるようにｒｈＩＬ−２を添加した、５％ヒトＡＢ型血清、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含むＡＩＭ−Ｖ培地で２００μＬに培地量を調整し、５％のＣＯ２存在下において３７℃で４日間培養した。培養上清を１００μＬ破棄し、終濃度５００ＩＵ／ｍＬとなるようにｒｈＩＬ−２を添加した、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含むＡＩＭ−Ｖ培地を１００μＬ加え、５％のＣＯ２存在下において３７℃で３日間培養した。細胞を回収し、０．４％トリパンブルー液を用いて、３０ｍＬの血液から得られた細胞数を計測し、培養開始前の細胞数に対する細胞増殖率（倍）を図２に示した。
【００５３】
−−細胞内サイトカイン染色−−
前記細胞増殖工程で得られた細胞を、１０％ヒトＡＢ型血清（ヒト血清ＡＢ、Ｇｅｍｉｎｉｂｉｏ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に５×１０５個／ｍＬとなるように懸濁し、９６ウェル培養プレート（９６ウェル組織培養プレート、サーモフィッシャー社製）に２００μＬ／ウェルで播種した。抗原（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ  ＣＭＶ  ｐｐ６５、ミルテニーバイオテク株式会社製）を１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、５％のＣＯ２存在下において３７℃で２時間培養した。終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ、ＳＩＧＭＡ社製）を加え、５％のＣＯ２存在下において３７℃で４時間培養した。２％ＦＢＳ（Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ハイクローン社製）を含むＰＢＳ（染色バッファー）を用いて細胞を２回洗浄し、抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ抗体（抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ抗体、バイオレジェンド社製）及び抗ＣＤ８  ＡＰＣ抗体（抗ＣＤ８  ＡＰＣ抗体、バイオレジェンド社製）を用いて細胞表面を染色した。染色バッファーで２回洗浄後、細胞内染色キット（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（登録商標）  Ｋｉｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｏｅｎｃｅｓ社製）を用いて細胞内ＩＦＮ−γを染色した。染色バッファーに細胞を懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔ−ＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｏｅｎｃｅｓ社製）で細胞を解析した。ＣＤ４及びＣＤ８の少なくともいずれかが陽性の細胞数に対する、ＣＤ４及びＣＤ８の少なくともいずれかが陽性であって、かつ細胞内ＩＦＮ−γが陽性の細胞数の割合（％）を図３に示した。前記細胞増殖工程で計測した、３０ｍＬの血液から得られた細胞数、及び、図３に示した割合を用いて、３０ｍＬの血液から得られた抗原特異的Ｔ細胞数を算出し、図４に示した。
【００５４】
（実施例２）
実施例１の細胞増殖工程において、ｒｈＩＬ−２の終濃度を１，０００ＩＵ／ｍＬに変えた以外は、実施例１と同様の方法で抗原特異的Ｔ細胞含有組成物を製造した。実施例１に記載の方法で、細胞数の計測、細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図２〜図４に示した。
【００５５】
（実施例３）
実施例１の細胞増殖工程において、ｒｈＩＬ−２の終濃度を３，０００ＩＵ／ｍＬに変えた以外は、実施例１と同様の方法で抗原特異的Ｔ細胞含有組成物を製造した。実施例１に記載の方法で、細胞数の計測、細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図２〜図４に示した。
【００５６】
（実施例４）
実施例１の細胞増殖工程において、ｒｈＩＬ−２の終濃度を６，０００ＩＵ／ｍＬに変えた以外は、実施例１と同様の方法で抗原特異的Ｔ細胞含有組成物を製造した。実施例１に記載の方法で、細胞数の計測、細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図２〜図４に示した。
【００５７】
（実施例５）
実施例１の細胞増殖工程において、ｒｈＩＬ−２の終濃度を９，０００ＩＵ／ｍＬに変えた以外は、実施例１と同様の方法で抗原特異的Ｔ細胞含有組成物を製造した。実施例１に記載の方法で、細胞数の計測、細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図２〜図４に示した。
【００５８】
（比較例２）
実施例１の細胞増殖工程において、ｒｈＩＬ−２の終濃度を１００ＩＵ／ｍＬに変えた以外は、実施例１と同様の方法で抗原特異的Ｔ細胞含有組成物を製造した。実施例１に記載の方法で、細胞数の計測、細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図２〜図４に示した。
【００５９】
図２〜図４の結果から、実施例１から５に記載の、ＣＤ１３７陽性細胞を５００ＩＵ／ｍＬ以上の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養する細胞増殖工程を含む抗原特異的Ｔ細胞の製造方法により製造した抗原特異的Ｔ細胞含有組成物は、抗原特異的Ｔ細胞を高い割合で含むことが分かる。これに対して、比較例２に記載の、ＣＤ１３７陽性細胞を５００ＩＵ／ｍＬ未満の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養する細胞増殖工程を含む抗原特異的Ｔ細胞の製造方法により製造した抗原特異的Ｔ細胞含有組成物は、抗原特異的Ｔ細胞を低い割合で含むことが分かる。したがって、本発明の、ＣＤ１３７陽性細胞を５００ＩＵ／ｍＬ以上の終濃度のＩＬ−２を含む培地で培養する細胞増殖工程を含む抗原特異的Ｔ細胞の製造方法、及び抗原特異的Ｔ細胞含有組成物は、格別顕著な効果を奏するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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