(57)【要約】【課題】  植物性原料に生育しやすい非ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌とその増殖方法、ならびに、単位質量あたりの乳酸菌の菌数が多いにもかかわらず酸味が強すぎない豆味噌およびその製造方法を提供する。【解決手段】  図示のような一般的な豆味噌の製造工程の特に蒸煮後仕込みに至るまでの工程において、非ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌を培養することを含む豆味噌の製造方法である。非ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌は、最少培地にシュクロースまたはガラクトースから選択される糖源を添加した培地上で初発生菌数を１０７ｃｆｕ／ｍｌ〜３×１０７ｃｆｕ／ｍｌの範囲に設定して３０℃で培養したときに、６．５時間後の増殖速度がヒト由来の基準菌株（エンテロコッカス・フェカリスＭＡＦＦ４００５０５）と比較して１．４倍以上増加している。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
最少培地にシュクロースまたはガラクトースから選択される糖源を添加した培地上で初発生菌数を１０７ｃｆｕ／ｍｌ〜３×１０７ｃｆｕ／ｍｌの範囲に設定して３０℃で培養したときに、６．５時間後の増殖速度がヒト由来の基準菌株（エンテロコッカス・フェカリスＭＡＦＦ４００５０５）と比較して１．４倍以上増加しているエンテロコッカス属乳酸菌。
【請求項２】
前記糖源がシュクロースである場合の増殖速度が基準菌株の４倍以上増加する請求項１に記載のエンテロコッカス属乳酸菌。
【請求項３】
エンテロコッカス・フェカリス菌である請求項１または請求項２に記載のエンテロコッカス属乳酸菌。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３３６。
【請求項５】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１６。
【請求項６】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１７。
【請求項７】
乳酸菌および／またはその死菌体を１ｇあたり２×１０９個以上含む豆味噌。
【請求項８】
前記乳酸菌が、標準寒天培地で生育したコロニーを無作為に選択した場合に、エンテロコッカス属乳酸菌を８０％以上含む請求項７に記載の豆味噌。
【請求項９】
前記乳酸菌および／またはその死菌体が、エンテロコッカス属に属しない乳酸菌を含む請求項７または請求項８に記載の豆味噌。
【請求項１０】
喫食時の乳酸量が０．０５５ｗ／ｗ％以下である請求項７ないし請求項９のいずれか一項に記載の豆味噌。
【請求項１１】
製造工程において、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の非ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌を培養することを含む豆味噌の製造方法。
【請求項１２】
さらに、エンテロコッカス属に属しない乳酸菌を培養する工程を含む請求項１１に記載の豆味噌の製造方法。
【請求項１３】
エンテロコッカス属乳酸菌を大豆由来培地上で培養して、培地１ｇあたり２×１０９個以上に達するまで増殖させる方法。
【請求項１４】
エンテロコッカス属乳酸菌が、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の非ヒト由来エンテロコッカス属乳酸菌である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載のエンテロコッカス属乳酸菌を含む乳酸菌群および／またはその死菌体を１ｇあたり２×１０９個以上含む培養物。
【請求項１６】
前記乳酸菌群が、アミノ酸分解能を有する乳酸菌および／またはこれらの死菌体を含む請求項１５に記載の培養物。
【請求項１７】
請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載のエンテロコッカス属乳酸菌および／またはその死菌体を含む食品組成物。
【請求項１８】
便通改善、整腸作用、免疫調節作用、または生活習慣病予防作用がある旨の表示が付された請求項１７に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物性原料に生育しやすいエンテロコッカス属乳酸菌及びその増殖方法、ならびに、それを使用した豆味噌の製造方法および豆味噌に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、古くから整腸効果などが知られており、飲食品や医薬品として広く利用されている。しかしながら、スーパー等に出回る普及品に利用されている乳酸菌の多くがラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属及びストレプトコッカス（Streptococcus）属に属し、そのほとんどは発酵乳（ヨーグルト）や乳酸菌飲料などの生菌を含む発酵物である（特許文献１、特許文献２）。発酵乳製品には、０．１億〜６億個／ｍｌの乳酸菌が含まれている。
【０００３】
また近年、乳酸菌の死菌体に免疫調節機能などが発見され、他工程を汚染しないといったハンドリングの良さもあって、乳酸菌死菌体の活用が広がっている。一般的に、乳酸菌死菌体に効果を期待するには、上述の生菌の場合と比較して、よりたくさんの菌体を摂取する必要があると言われている。例えば、現在最も利用が進んでいるエンテロコッカス・フェカリス菌の場合、1日に少なくとも１０００億個程度必要とされている。したがって、乳酸菌を安価に大量増殖させる技術が望まれている。
【０００４】
プロバイオティクス素材としてあまり注目されていないが、味噌にもヨーグルトに匹敵する乳酸菌が数億個／ｇレベルで含まれている。例えば、上述した属の乳酸菌を蒸煮大豆、蒸し米、豆麹または米麹に添加して培養したものや最終製品に添加したものが挙げられるが（特許文献３、特許文献４）、これらは最終製品において喫食１回あたり１００億個（１ｇ当たりたかだか数億〜１０億個）程度の乳酸菌を含むに過ぎない。また味噌においては、製造工程で乳酸菌を大量に増殖させようとすると、最終製品の酸味がどうしても強くなり最終製品として適さなくなるという発酵乳製品にない制約も存在している。
【０００５】
エンテロコッカス属乳酸菌は、味噌玉を使った従来の豆味噌の製麹過程において、味噌玉内部で１×１０８〜１０９個／ｇ程度まで増殖し、ｐＨを下げることで雑菌の混入抑制に寄与することが知られている（非特許文献１）。しかしながら、味噌業界において、エンテロコッカス属乳酸菌は、通常、ヒトの糞便や腸内に生息するものと認識されているため、工場の衛生管理の観点から衛生指標菌として取り扱われ（非特許文献２）、検出されれば、洗浄・殺菌して工程から排除してきた。従って、その特性についてはこれまで詳細に検討されておらず、活用しようとは考えてこなかった。
【０００６】
これまでエンテロコッカス属乳酸菌の培養技術としては、単独で液体培養する方法（特許文献５）、ＭＲＳ培地にアルカリ剤を添加してｐＨ調整しながら中和培養する方法（特許文献６）、米麹に混ぜて１２℃で発酵させて得る方法（特許文献７）、麹菌を用いて大豆を発酵させた培養物から分離して得る方法（特許文献８）等が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２６９７３７号公報
【特許文献２】特開２０１５−１１２０３５号公報
【特許文献３】特開２０１５−０３３３４６号公報
【特許文献４】特開２００１−２２４３５９号公報
【特許文献５】特開２００３−１１３１１４号公報
【特許文献６】特開２０１４−１３１５０４号公報、段落００１７
【特許文献７】特開２０１３−１９３９９６号公報、表１、段落００６９
【特許文献８】特開２００６−０６７８８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】東和男著、「発酵と醸造［Ｉ］」、１０６頁、２００２年３月、株式会社光琳発行
【非特許文献２】公益社団法人日本食品衛生協会、「食品衛生検査指針  ２０１５  微生物編」、１８９頁〜２００頁、２０１５年
【非特許文献３】端ら著、「糖資化性を利用したマウス消化管内lactobacillus属乳酸菌の簡単な同定方法の構築」、酪農学園大学紀要  別刷  第３１巻  第１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献５や特許文献６で培養増殖されているエンテロコッカス属乳酸菌は、腸球菌といわれる消化管内常在菌のことであり、ヒトの糞便や腸内に棲息する、いわゆる動物性フェカリス菌である。このような動物性フェカリス菌の利用にあたっては、高価な培地上で培養する必要があるうえ、濃縮・水洗後に添加するか、もしくは適宜乾燥した粉末を添加する工程を含むことが一般的であり、安価で簡便な増殖法とはいえない。
【００１０】
特許文献７で利用されているエンテロコッカス属乳酸菌は、いか麹漬けから分離されたものであるが、その由来は必ずしも明らかではなく、その大豆または豆麹における増殖性や糖資化性、乳酸濃度についての言及はない。特許文献８で利用されているエンテロコッカス属乳酸菌は、発酵大豆由来であるとされるが、その発酵大豆における増殖性や糖資化性、乳酸濃度について記載や示唆はない。
【００１１】
本発明者らは、従来の豆味噌製造において製麹中に検出されるエンテロコッカス属乳酸菌の混入経路を調査してみたところ、ヒト由来の感染ではなく、豆味噌製造工程に古くから定着している菌であることを見いだした。この乳酸菌は、シュクロース、ガラクトースなど大豆由来の糖に対する資化性がヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌とは明らかに異なることから、非ヒト由来と考えられる。更に、本発明の非ヒト由来のエンテロコッカス・フェカリス菌は、豆麹中の菌数が高いにもかかわらず、ヒト由来エンテロコッカス属や他の乳酸菌種と比較して豆麹中の乳酸生成が少ないことが分かった。
【００１２】
本発明の目的は、上記知見に基づき、植物性原料に生育しやすい非ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌とその増殖方法、ならびに、単位質量あたりの乳酸菌の菌数が多いにもかかわらず酸味が強すぎない豆味噌およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するためになされた本発明の１つの側面は、最少培地にシュクロースまたはガラクトースから選択される糖源を添加した培地上で初発生菌数を１０７ｃｆｕ／ｍｌ〜３×１０７ｃｆｕ／ｍｌの範囲に設定して３０℃で培養したときに、６．５時間後の増殖速度がヒト由来の基準菌株（エンテロコッカス・フェカリスＭＡＦＦ４００５０５）と比較して１．４倍以上増加したエンテロコッカス属乳酸菌である。
【００１４】
上記エンテロコッカス属乳酸菌は、シュクロースでの増殖速度が４倍以上増加したものであることが好ましい。
【００１５】
上記エンテロコッカス属乳酸菌は、エンテロコッカス・フェカリス菌であることが好ましい。
【００１６】
上記目的を達成するためになされた本発明の別の側面は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３３６、エンテロコッカス・フェカリスＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１６、および／または、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１７である。これらの菌は、大豆由来培地での生育に適しており、特に豆味噌の製造工程において、豆麹中の菌数が高いにもかかわらず、ヒト由来のエンテロコッカス属や他の乳酸菌種と比較して乳酸生成が少ないものである。
【００１７】
上記目的を達成するためになされた本発明の別の側面は、製造工程において、非ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌を培養することを含む豆味噌の製造方法である。豆味噌の製麹工程を培養に利用することで、高価な培地を要することなく、乳酸菌の大量生産が可能になる。
【００１８】
上記製造方法において、さらに、エンテロコッカス属に属しない乳酸菌を培養する工程を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の別の側面は、乳酸菌および／またはその死菌体を１ｇあたり２×１０９個以上含む豆味噌である。
【００２０】
上記豆味噌において乳酸菌は、標準寒天培地から分離される細菌の中に、エンテロコッカス属乳酸菌を８０％以上含むものであることが好ましい。本発明のエンテロコッカス属乳酸菌は豆味噌の製造工程での増殖性に優れ、単位質量あたりの菌数も多くなりうるからである。
【００２１】
上記豆味噌において乳酸菌および／またはその死菌体は、エンテロコッカス属に属しない乳酸菌を含むものであってもよい。
【００２２】
上記豆味噌は、さらに喫食時の乳酸量が０．０５５ｗ／ｗ％以下であることが好ましい。喫食時の乳酸量が上記範囲内であると、従来の豆味噌に比較するものがないほど乳酸菌量が多いにも関わらず食味も酸っぱくなりすぎないため、便通改善効果や免疫調節作用を高める効果が期待できる一方、クセがなく飽きない豆味噌になる。
【００２３】
本発明の別の側面は、エンテロコッカス属乳酸菌を大豆由来培地上で培養して、培地１ｇあたり２×１０９個以上に達するまで増殖させる方法である。
【００２４】
上記増殖方法において、エンテロコッカス属乳酸菌は非ヒト由来であり、シュクロースでの増殖速度が基準菌株と比較して著しく速いことが好ましい。このようなエンテロコッカス属乳酸菌であれば、菌数が高いにもかかわらず、酸味が少ないので得られる培養物に対して濃縮・水洗・乾燥等の工程は不要になる。
【００２５】
本発明の別の側面は、エンテロコッカス属乳酸菌を含む乳酸菌群および／またはその死菌体を１ｇあたり２×１０９個以上含む培養物である。斯かる培養物は、単位質量あたりの菌量が多いことから、その形態によっては、乳酸菌含有量を増やしたい飲食品に対して食味に影響を与えることなくそのまま添加することも可能である。
【００２６】
上記培養物は、乳酸菌群がさらにアミノ酸分解能を有する乳酸菌および／またはその死菌体を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明の別の側面は、上記エンテロコッカス属乳酸菌および／またはその死菌体を含む食品組成物である。上記エンテロコッカス属乳酸菌および／またはその死菌体は、便通改善作用、免疫調節作用、生活習慣病予防を謳う食品組成物にも利用可能である。
【００２８】
上記食品組成物は、便通改善、免疫調節作用、整腸作用または生活習慣病予防効果がある旨の表示が付されたものであってもよい。上記エンテロコッカス属乳酸菌および／またはその死菌体は、上記表示を付した特定保健用食品や機能性表示食品での利用に好適である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、乳酸菌含有量をこれまでに比べて安価かつ飛躍的に増やしつつも酸味が強くなりすぎず、従来の乳酸菌添加豆味噌の欠点を改善した豆味噌が得られる。また、培養物に対して濃縮・水洗・乾燥等の工程は不要であり、乳酸菌含有量を増やしたい飲食品に対して培養物をそのまま添加することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】一般的な豆味噌の製造工程を示す工程図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に本発明の実施態様を説明する。
本発明の１つは、定法に従って、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定し、既知の塩基配列と比較して、９９％以上の相同性を示すため、エンテロコッカス属乳酸菌に分類される、シュクロースおよび／またはガラクトースでの増殖速度が速い乳酸菌株である。その取得方法としては、市販菌株、または、蔵もしくは工程に定着している菌株に対するスクリーニング、物理的な紫外線（ＵＶ）照射や化学的な変異剤の使用等の変異作出手段の作用が挙げられる。なかでも簡便性の観点から、蔵または工程に定着している菌株に対するスクリーニングやＵＶ照射が好ましい。具体的には、例えば、乳酸菌株にＵＶ照射を施した後、シュクロースおよび／またはガラクトースを含む糖液を添加したプレート上で培養し、シュクロースおよび／またはガラクトースでの増殖速度が速い変異株を選抜することによって本発明のシュクロースおよび／またはガラクトース高資化性の変異株が得られる。
【００３２】
上記方法で新規に分離した乳酸菌の３株は、後述する遺伝子解析によってエンテロコッカス属に属することが判明したものであるが、シュクロースおよび／またはガラクトースに対する資化性が著しく高くなっていることから、その変異株と同定し、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＩＣＫ−１と命名、表示し、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にＮＩＴＥ  Ｐ−０２３３６として寄託され、さらにもう１株は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＩＣＫ−２と命名、表示し、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１６として寄託され、さらにもう１株は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＡＰ１８と命名、表示し、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１７として寄託されている。
【００３３】
乳酸菌の選抜、同定および特性評価の方法及び結果、遺伝子解析の方法及び結果ならびに糖資化性試験の方法及び結果については後述する。
【００３４】
本発明の１つは、豆味噌の常法に従った製造工程において、エンテロコッカス属乳酸菌を培養することを含む豆味噌の製造方法である。
豆味噌の常法に従った製造工程は、典型例としては、図１に示すように、原料大豆への撒水、浸漬、蒸煮を経て、味噌玉を成形し、ここに種麹と香煎との混合物を種付けし製麹、食塩および食塩水を加えて仕込み、熟成へと続く一連の工程のことである。培養は、最終的な乳酸菌数が所望の範囲に達するのであれば、上記工程のいずれの段階でなされてもよいが、なかでも、仕込み時の食塩添加で乳酸菌が増殖しないかもしくは死滅することから、蒸煮後仕込みに至るまでの工程でなされることが好ましく、蒸煮後出麹までの工程でなされることがより好ましい。
【００３５】
味噌玉を作る際の蒸煮大豆の温度としては、麹菌の破精込みより乳酸菌の増殖を優先する観点では味噌玉が若干固い方が好ましいため、比較的高温にすることが好ましく、例えば、５０℃〜６５℃で行うことができるが、これより低温（３０℃〜５０℃）にすることも許容される。
【００３６】
味噌玉の大きさとしては、乳酸菌培養の観点からは、直径３０〜６５ｍｍが好適であるが、これに限定されず、直径１５ｍｍ〜３０ｍｍの一般的な味噌玉であってもよく、直径１５ｍｍ〜６５ｍｍの範囲内で小径玉と大径玉との混合物としてもよい。
【００３７】
培養するエンテロコッカス属乳酸菌は、少なくとも非ヒト由来であり、好ましくは植物性と判別されるものである。「非ヒト由来」であることは、ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌に比べてシュクロースおよびガラクトースの資化性が異なることによって判別しうる。また「植物性」とは、非ヒト由来であって、植物や植物由来原料中でヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌に比べて有意に多く増殖しうることを意味し、典型的には大豆の主要糖分であるシュクロースを資化できる。
【００３８】
エンテロコッカス属乳酸菌としては、エンテロコッカス属に分類されるものであれば特に限定されず、例えば、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム等が含まれる。
【００３９】
培養するエンテロコッカス属乳酸菌としては、蔵または工程に定着している菌を活用してもよいし、外部から添加してもよい。外部から添加する場合の添加量としては、味噌玉１ｇ当たり、１０５ＣＦＵ未満、具体的には１０３〜１０４ＣＦＵに設定することができる。外部から添加する場合は、後述する大豆由来培地上で培養して得られた培養物を添加してもよい。
【００４０】
培養するエンテロコッカス属乳酸菌は、最少培地にシュクロース又はガラクトースから選択される糖源を添加した培地での増殖速度が基準菌株と比較して１．４倍以上、２倍以上、４倍以上、８倍以上増加したものであることが好ましい。本明細書において、増殖速度の増加割合は、最少培地に各種糖源を添加した培地上で初発生菌数を１０７ｃｆｕ／ｍｌ〜３×１０７ｃｆｕ／ｍｌの範囲に設定して３０℃で培養した時の、培養開始６．５時間後における対象となるエンテロコッカス属乳酸菌株の総菌数を初発菌数で除した値と培養開始６．５時間後における基準菌株（エンテロコッカス・フェカリスＭＡＦＦ４００５０５）の総菌数を初発菌数で除した値との比率によって評価している。総菌数は、培養液を適宜希釈した後、トーマ血球計を用いて顕微鏡下で乳酸菌をカウントして得られた値である。
【００４１】
エンテロコッカス属乳酸菌を培養する際に、エンテロコッカス属に属しない乳酸菌と共に乳酸菌叢として培養し、また結果として培養されることになってもよい。エンテロコッカス属に属しない乳酸菌としては特に限定されず、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ペディオコッカス(Pediococcus)属、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ワイセラ（Weissella）属等が挙げられる。
【００４２】
エンテロコッカス属に属しない乳酸菌は、アミノ酸分解能を有する乳酸菌であってもよい。斯かる乳酸菌としては、従来公知のものを使用することができ、テトラジェノコッカスハロフィラスＤＡ−３５３株（イチビキ社）等のアルギニンをオルニチンに変換する乳酸菌；ラクトバチルス・プランタラムＩＦＯ３０７０（特開2011-004723号公報）等のグルタミン酸をＧＡＢＡに変換する乳酸菌；テトラジェノコッカスハロフィラスＳ−２株（キッコーマン社、特開2003-079363号公報）等のアスパラギン酸をβ−アラニンに変換する乳酸菌等が挙げられる。
【００４３】
培養温度としては、ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌の至適生育温度（３０〜３７℃）よりやや低めに設定するのが通常であり、例えば、１５℃〜３３℃、より好ましくは１５℃〜３０℃、さらに好ましくは１５℃〜２５℃に管理する。
【００４４】
仕込み時の塩分濃度は、通常の仕込み時の塩分濃度（１０．０〜１３．０％）であってもよいが、適宜塩化カリウム、グルコン酸塩、塩基性アミノ酸、オルニチル−β−アラニン等の塩味増強剤と併用することにより、例えば、６．０％〜１０．０％となるように調整することができる。塩分濃度は、培養菌の乳酸産生の状態（速度、収率）やアミノ酸分解の状態を確認したうえで調整することができる。
【００４５】
上記豆味噌製造の工程を経て得られた豆味噌は、乳酸菌および／またはその死菌体を好ましくは１ｇあたり２×１０９個以上、より好ましくは、３×１０９個以上、５×１０９個以上、８×１０９個以上、１×１０１０個以上含んだものとすることができる。豆味噌中の乳酸菌数は、最終製品中の乳酸菌数と死菌体数との合計であり、顕微鏡法、リアルタイムＰＣＲ法により測定された値である。ここで死菌体には、デブリ、遺伝子断片等も含まれる。
【００４６】
豆味噌は、同属もしくは異なる属に属する２種以上の乳酸菌を含むものであってよく、その場合、豆麹を適宜希釈し、標準寒天培地に塗沫し、生育したコロニーから無作為に２０株釣菌し、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定し、既知の塩基配列と比較して菌種を特定したとき、エンテロコッカス属乳酸菌を８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上含むものであることが好ましい。
【００４７】
豆味噌に含まれる乳酸菌および／またはその死菌体は、アミノ酸分解能を有する乳酸菌および／またはその死菌体を含むものであってもよい。アミノ酸分解能を有する乳酸菌は、製法において上述の通りである。
【００４８】
豆味噌は、喫食時の乳酸量が０．０５５ｗ／ｗ％以下、０．０４５ｗ／ｗ％以下、０．０３５ｗ／ｗ％以下、０．０２５ｗ／ｗ％以下または０．０１５ｗ／ｗ％以下である。本明細書において、「喫食時」とは、食品包装等で指示された標準的な方法に従って味噌を熱湯で溶いて（具材が別形態で同一包装内に添付されているかまたは味噌と混合されている場合は、味噌を溶きかつ具材を戻して）食する状態とした時点を意味する。乳酸の濃度は、喫食時の試料をイオン排除モードのＨＰＬＣ（移動相：4mM過塩素酸、カラム：shodex RSpak KC-LG+KC-811）にかけて検出、定量した値である。
【００４９】
エンテロコッカス属乳酸菌を大豆由来培地上で培養して、培地１ｇあたり２×１０９個以上に達するまで増殖させる方法もまた本発明に包含される。ここでの大豆由来培地には、おから、きなこ、豆腐、豆乳、納豆、軟化大豆、大豆麹等が含まれる。また軟化大豆は、含水処理により軟化したものであれば足り、味噌玉のような成型培地に限定されず、非成型培地も含まれる。エンテロコッカス属乳酸菌の性質および量は、豆味噌の製造方法において上述した通りであり、温度条件は、豆味噌の製造方法において上述した範囲を採用しうる。
【００５０】
エンテロコッカス属乳酸菌、好ましくは非ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌を含む乳酸菌群および／またはその死菌体を１ｇあたり２×１０９個以上含む培養物もまた、本発明の１つである。培養物の形態としては、特に限定されないが、例えば、ペトリフィルム等の専用培地上で培養された形態、米麹、豆麹、またはこれらを利用した食品（伝統発酵食品）の形態、乾燥体、フリーズドライ、液体培養物、懸濁培養物等を挙げることができる。これらの製造方法は常法によればよい。なお、培養物は、乳酸菌のみを分離抽出したものであっても、培地に乳酸菌や他の成分を含んだものであってもよい。エンテロコッカス属乳酸菌の性質および量、ならびに、エンテロコッカス属乳酸菌以外に含み得る乳酸菌の種類、性質および量は、豆味噌の製造方法において上述した通りである。ここでの乳酸菌数も、最終製品中の乳酸菌数と死菌体数との合計であり、トーマ血球計を用いた顕微鏡法により測定された値である。
【実施例】
【００５１】
実施例１  豆味噌製造工程からの乳酸菌の選抜、同定及び特性評価
イチビキの製造工程（蔵・室・桶に定着した乳酸菌群や豆麹など）から常法に従って乳酸菌を分離採取し、最少培地にシュクロースのみを含む糖液を添加したプレート上で培養し、シュクロースに対する増殖速度が速い菌株を選抜した。得られたエンテロコッカス属乳酸菌ＩＣＫ−１、ＩＣＫ−２、ＡＰ１８に対して以下の手順で遺伝子解析を行った。
（１）染色体ＤＮＡの取得
ＭＲＳ培地（メルク社製）２００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、Enterococcus faecalis  ＩＣＫ−１、Enterococcus faecalis  ＩＣＫ−２、Enterococcus faecalis  ＡＰ１８をそれぞれ別のフラスコに植菌した。３０℃で２４時間培養した後、ろ過・遠心分離して菌体を回収した。液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕し、ＤＮＡ抽出用緩衝液（５．０％ＳＤＳ、０．１Ｍ、ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１５ｍｌを加えゆっくり振盪して溶解した。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、６ｍｉｎ、ｒｔ．）により上清を得、フェノール／クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を２回行い、エーテルを蒸発させた後、３Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、エタノール２５ｍｌを加え、−３０℃で３０分放置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により染色体ＤＮＡを回収し、７０％エタノールにて洗浄した後、ＴＥ４００μｌに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ１０μｌ（０．１３２Ｕ）を加え、３７℃で１時間ＲＮａｓｅ処理した後、プロテイナーゼＫを５μｌ（０．６Ｕ）加え、５０℃で１時間処理した。フェノール／クロロホルム抽出（２回）、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出（１回）を行った後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。７０％エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、ＴＥ２００μｌに溶解した。
（２）１６ＳｒＤＮＡ遺伝子断片の増幅
Ｐ１    ５‘−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’
Ｐ２    ５‘−ｇｇｔｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’
前述の方法で得られた染色体ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰ１プライマーとＰ２プライマーの組み合わせでＰＣＲ反応を２５サイクル行った。その後、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、既知の塩基配列データーベースと比較したところ、いずれもEnterococcus faecalis標準菌株ＪＣＭ５８０３の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と９９％以上の相同性を示したため（ＩＣＫ−１、ＩＣＫ−２、ＡＰ１８に対してそれぞれ配列番号１〜３）、本菌株をEnterococcus faecalisと同定した。
【００５２】
特性評価：糖資化性試験
上記選抜手法によって得られたエンテロコッカス属乳酸菌およびヒト由来の基準菌株であるエンテロコッカス・フェカリスＭＡＦＦ４００５０５に対して、非特許文献３で提案された手順を参考に下記表１に示す手順で糖資化性試験を行った。その結果、各種糖類に対して下記表２のような資化性を示した。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
【表２】
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【００５５】
表２から、エンテロコッカス属乳酸菌ＩＣＫ−１、ＩＣＫ−２、ＡＰ１８はいずれも、シュクロースまたはガラクトースを糖源とする場合の増殖速度がヒト由来のエンテロコッカス・フェカリス菌であるＭＡＦＦ４００５０５に比べて著しく高いことがわかった。このことから大豆由来原料中に主に含まれる糖源であるシュクロースまたはガラクトースを利用でき、ヒト由来のエンテロコッカス属乳酸菌に比べて有意に多く増殖することから、植物性でもあることがわかった。
【００５６】
実施例３  エンテロコッカス乳酸菌高含有豆味噌の製造
原料大豆１０ｋｇを重量が１．５〜１．６倍になるまで浸漬し、水切り後、蒸し釜に入れ、０．７〜１．０ｋｇ／ｃｍ２で９０分間蒸し、蒸し大豆を得た。次いで冷却後、１種または２種の乳酸菌を蒸し大豆に対して１０４ＣＦＵ／ｇとなるように添加して、直径３０ｍｍの味噌玉を作成した。これに香煎及び種麹を常法に従い適量まぶし、これを２５〜３５°Ｃの品温で約４８時間かけて豆麹を製造した。この豆麹を生理食塩水で適宜希釈し、標準寒天培地（ニッスイ社製）に塗抹し、３０℃で２日間培養した。培地に生育したコロニーを、無作為に２０個選択し、実施例１と同様に染色体ＤＮＡを取得し、ＰＣＲ反応を行った。その後、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、添加した乳酸菌（Enterococcus faecalis）の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と９９％以上の相同性を示すコロニーの割合を算出した。その結果、ＩＣＫ−１を添加した豆麹は８５％、ＩＣＫ−２を添加した豆麹は９０％、ＡＰ１８を添加した豆麹は９５％が、添加した乳酸菌の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と９９％以上の相同性を示した。このように用意した豆麹１０ｋｇを圧潰し、塩化ナトリウム１．４３ｋｇと種水２．０３ｋｇと共に仕込み容器内に仕込んだ。これに上蓋と重石を載せて２５〜３５°Ｃの範囲で発酵・熟成を開始し、最終的に得られた豆味噌中１ｇあたりの乳酸菌および／またはその死菌体数を顕微鏡下でトーマ血球計（サンリード硝子有限会社製）により測定した。また得られた豆味噌を希釈率１０倍（豆味噌２０ｇを２００ｍｌの熱湯で希釈）に希釈して、乳酸濃度をイオン排除モードのＨＰＬＣ（移動相：4mM過塩素酸、カラム：shodex RSpak KC-LG+KC-811）で乳酸量を測定した。クエン酸濃度および酢酸濃度も乳酸濃度と同様の方法で測定した。またそれぞれの豆味噌２０ｇを２００ｍｌの熱湯で希釈してよく溶かし、官能試験を行った。結果を表３に示す。なお、表３の乳酸濃度、クエン酸濃度および酢酸濃度は、味噌そのものの値に換算した値である。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
表３から、本発明のエンテロコッカス属乳酸菌を添加した豆味噌は、乳酸菌数が顕著に高いにもかかわらず、乳酸量が低く、官能検査でも酸味、酸臭がなく、通常の味噌と遜色ないことが分かった。また、本発明のエンテロコッカス属乳酸菌とアルギニンをオルニチンに変換する乳酸菌ＤＡ−３５３株（イチビキ社）とを混ぜて添加した場合、乳酸発酵が過度に進行しｐＨが著しく低下したものの、充分な総菌数が得られ、高菌量の培養物を得るための大豆由来培地としては適していることがわかった。
【００５９】
実施例４  本発明のエンテロコッカス・フェカリス菌等の豆味噌以外の大豆由来培地における培養
１２１℃で１５分間オートクレーブ処理したＭＲＳ培地（メルク社製）に各種菌を接種し、３０℃で２４時間前培養し、無菌的に滅菌水で２回洗浄した菌液を本培養のスターターとした。次いで無調整豆乳（キッコーマン社製）に対して、各スターター１％を接種して、３０℃、２４時間培養し、ｐＨ、生菌数、乳酸量を測定した。なお、ｐＨ測定は、ガラス電極ｐＨメータ（東亜ＤＫＫ株式会社、HM-25R）で行い、生菌数測定は、培養物の菌数測定と同様の方法で行った。乳酸濃度はイオン排除モードのＨＰＬＣ（移動相：4mM過塩素酸、カラム：shodex RSpak KC-LG+KC-811）で測定した。クエン酸濃度および酢酸濃度も乳酸濃度と同様の方法で測定した。結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
表４に示すように、本発明のエンテロコッカス属乳酸菌を使用することで、豆乳特有のオフフレーバーが抑えられ、１ｇあたり２×１０９個以上の高菌量の乳酸菌を含みながら酸っぱすぎない発酵豆乳が得られた。
【００６２】
以上、本発明の実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲内においてさらに種々の形態で実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の増殖方法は、乳酸発酵（減塩）豆味噌の製造、豆味噌以外の食品用途または医薬用途のための乳酸菌の培養に特に好適に利用することができる。
【図１】
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【配列表】
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