(57)【要約】      （修正有）【課題】耐性腫瘍、および、治療すべき組織への不十分または低下した分布により高分子薬またはプロドラッグを用いる治療的処置の効果があまりない患者、を識別するために、高分子薬の有効な送達を可能にする条件が治療すべき病的組織に存在することを、非侵襲性に確認することができる、改良された造影剤および診断方法の提供。【解決手段】DCE-MRI技術の使用による病的身体領域、部位、または組織における、目的とする高分子溶質の輸送のin vivo非侵襲評価に用いるための、85％またはそれ以上のヒト血清アルブミンHSAとの非共有結合性タンパク質結合を示す、分子量800〜5,000Daの常磁性造影剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
DCE-MRI技術の使用による病的身体領域、部位、または組織における目的とする高分子溶質の輸送のin vivo非侵襲評価に用いるための85％またはそれ以上のヒト血清アルブミンHSAとの非共有結合性タンパク質結合を示す、分子量800〜5,000Daの常磁性造影剤。
【請求項２】
ヒト血液循環中の終末相半減期が少なくとも4時間である、分子量800〜3,000Daの請求項１記載の常磁性造影剤。
【請求項３】
該評価が、目的とする病的身体領域、部位、または組織内の造影剤により示される薬物動態に関連するパラメーターのin vivo DCE-MRI推定値を得ることを含む請求項１または２記載の常磁性造影剤。
【請求項４】
測定するパラメーターが、fPV、Ktrans、AVGENH、AUC、AUCE、IAUCT、IAUCET、EARLYAUCRATIO、およびLATEAUCRATIOからなる群から選ばれる、請求項３記載の常磁性造影剤。
【請求項５】
測定するパラメーターが、Ktrans、AVGENH、AUC、およびAUCE、またはその組み合わせから選ばれる請求項４記載の常磁性造影剤。
【請求項６】
該パラメーターが、目的とする病的領域(ROI)、および独立して、全病的領域をサンプリングするDCE-MRI画像収集物の基準健康領域において定時的に測定される、請求項３〜５のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項７】
該非侵襲性評価が、基準領域において測定したパラメーターのそれぞれについて閾値を計算し、次いで収集したDCE-MRI画像のそれぞれにおいて、決定した閾値を超える該パラメーター値を示すピクセルを区別することにより行われる、請求項３〜６のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項８】
目的とする高分子溶質の輸送の評価が、該閾値を超えるパラメーター値を示すピクセルの分画Dから計算される請求項７記載の常磁性造影剤。
【請求項９】
病的身体領域、部位、または組織が、腫瘍、または癌状塊、または慢性炎症領域である、請求項１〜８のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項１０】
目的とする高分子溶質が、分子量50kDaまたはそれ以上の高分子薬もしくはプロドラッグである、請求項１〜９のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項１１】
該高分子薬もしくはプロドラッグが高分子抗癌薬もしくはプロドラッグである請求項１０記載の常磁性造影剤。
【請求項１２】
該高分子抗癌薬もしくはプロドラッグが、抗体もしくは抗体断片ベースの抗癌剤である請求項１１記載の常磁性造影剤。
【請求項１３】
該高分子抗癌剤が、Campath（登録商標)、Avastin（登録商標)、 Adcetris（登録商標)、Erbitux（登録商標)、Mylotarg（登録商標)、Yervoy（登録商標)、Vectibix（登録商標)、Herceptin（登録商標)、Bexxar（登録商標)、およびRituxan（登録商標)からなる群から選ばれる請求項１２記載の常磁性造影剤。
【請求項１４】
高分子薬またはプロドラッグを用いる薬学的処置に対する浸透抵抗性を示す病的組織もしくは部位、または腫瘍塊を区別するのに用いるための、該区別が測定したD値に基づいて行われ、0.5より高いD値をもたらす病的領域または腫瘍部位を、高分子媒質に対する適切な浸透を示すとみなす、請求項１〜１３のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項１５】
浸透抵抗性腫瘍、すなわち、高分子溶質に対する乏しいもしくは減少した透過性を示す病的組織の同定に用いるための請求項１４に記載の常磁性造影剤。
【請求項１６】
治療する病的部位または腫瘍塊への不十分もしくは減少した浸透により高分子薬またはプロドラッグを用いる抗癌療法に対して抵抗性の患者を同定することにより、癌患者を層別化するためのプロトコールまたは予測方法に用いるための先の請求項のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項１７】
高分子薬またはプロドラッグを単独もしくは高分子薬の取り込みを増強するのに用いるあらゆる物質もしくは薬剤を含む他の相乗的薬剤と組み合わせて用いる抗癌戦略を選択、管理、または最適化し、該取り込みを増強する物質または薬剤、治療法もしくはそれらの一つを含む組み合わせ療法の有効性をモニターするための請求項１記載の常磁性造影剤。
【請求項１８】
90％以上のヒト血清アルブミンとの非共有結合性タンパク質結合を示す請求項１記載の常磁性造影剤。
【請求項１９】
ガドコレチン酸、MS325のガドリニウム錯体、およびAAZTA-デオキシコール酸のガドリニウム錯体から選ばれる常磁性キレート錯体の生理学的に許容される塩から選ばれる先の請求項のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項２０】
治療する病的領域の不十分または減少した浸透により高分子薬またはプロドラッグによる抗癌療法に抵抗性の患者を非侵襲的に同定するための85％またはそれ以上のヒト血清アルブミンとin vivo非共有結合性タンパク質結合を示す、分子量800〜5,000Daの常磁性造影剤を用いることを含む癌患者の層別化のためのDCE-MRIに基づく診断プロトコール。
【請求項２１】
i)少なくとも85％、好ましくは90％のヒト血清アルブミンとの非共有結合を示す、分子量800〜5000Daの常磁性造影剤の有効量を、患者、または患者の器官または他の身体部位もしくは組織に投与し、
ii)DCE-MRI技術を用いることにより得られる病的領域、部位、組織、または塊における造影剤により示される薬物動態に関する１またはそれ以上のパラメーターの推定値から該送達のin vivo評価を得ることを含む、
病的身体領域、部位、組織、腫瘍、または癌状塊への高分子溶質の送達の非侵襲性評価のためのDCE-MRI法。
【請求項２２】
常磁性造影剤が、少なくとも4時間のヒト血液循環中の終末相半減期を有し、800〜3,000Daの分子量を有する、請求項21記載のDCE-MRI法。
【請求項２３】
a)目的とする病的身体領域または部位内に該造影剤が通過中に得られるMRI画像の収集物を得、得られたMRI画像から該造影剤の濃度−時間プロフィール（または濃度−時間曲線（本明細書では互換性に用いる））を計算し、
b)該計算した濃度−時間プロフィールから、病的組織内の該造影剤により示される薬物動態に関連する多くのパラメーターを得、
c)該パラメーター計算値から関連組織内の予測高分子輸送を評価する、
ことを含む請求項２１または２２記載のDCE-MRI法。
【請求項２４】
推定パラメーターが、fPV、Ktrans、AVGENH、AUC、AUCE、IAUCT、IAUCET、EARLYAUCRATIO、およびLATEAUCRATIOからなる群から選ばれる請求項２１〜２３のいずれかに記載のDCE-MRI法。
【請求項２５】
推定パラメーターが、Ktrans、AVGENH、AUC、およびAUCE、またはその組み合わせから選ばれる請求項２４記載のDCE-MRI法。
【請求項２６】
a)関連病的身体領域、組織、部位、または塊内を該造影剤が通過中のDCE-MRI画像の収集物、および所望により、良好な解剖学的解像度のさらなるMRI画像を得、次いで、目的領域、典型的には腫瘍部位、基準部位、および所望により、収集したDCE-MRI画像内の血管部位を同定し、
b)所望により、造影剤投与からMRI取得終了間のあらゆる連続的または不連続的時間ウインドウでAVGENHおよび/またはAUCEの値を測定し、
c)工程a)で得られたMRIシグナル強度値を造影剤濃度値に変換して濃度−時間曲線を描き、
d)所望により、造影剤投与からMRI取得終了間のあらゆる連続的または不連続的時間ウインドウでAUC値を測定し、
e)該得られた濃度曲線を薬物動態モデルに適合させてKtransの推定値を得、
f)得られたKtrans、AVGENH、AUC、および/またはAUCEパラメーターの推定値から目的とする高分子媒質の送達を評価する、
ことを含む請求億１８〜２２のいずれかに記載のDCE-MRI法。
【請求項２７】
該パラメーター値を、工程a)で収集したDCE-MRI画像それぞれの基準健康部位および病的目的部位(ROI)において定時的に測定し、全病的領域または腫瘍容積をサンプリングする、請求項２６記載のDCE-MRI法。
【請求項２８】
さらに、測定したDCE-MRIパラメーターそれぞれの閾値を、そのそれぞれについて、収集したDCE-MRI画像の基準部位中の定時的に測定した値の平均（μ）および標準偏差（σ）を決定することにより計算することを含む請求項27記載のDCE-MRI法。
【請求項２９】
評価が、工程a)で収集したDCE-MRI画像それぞれにおいて、決定した閾値を超える関連パラメーター値を示す病的ROIのそれらのピクセルを区別し、次いで、目的とする全腫瘍容量または病的領域をサンプリングするすべてのDCE-MRI画像の病的または腫瘍ROIから該閾値を超えるパラメーター値を有するピクセルの分画Dを計算することにより決定される請求項26記載のDCE-MRI法。
【請求項３０】
さらに、高分子溶質の浸出および拡散をもたらす送達条件が、逆に、得られるD値に基づく高分子抗癌剤による薬理学的処置に抵抗性を示す悪性新生物に適切に適合し、高分子溶質に対する適切な浸透を示す病的領域または腫瘍領域が少なくとも0.5に等しいD値をもたらす病的領域または腫瘍を区別することを含む、請求項29記載のDCE-MRI法。
【請求項３１】
さらに、工程a)の前に、必要とする患者、または該患者の器官または他の身体部位もしくは組織に有効量の常磁性造影剤を投与することに関する工程1a)を含む、請求項２６記載のDCE-MRI法。
【請求項３２】
適切な量の常磁性造影剤で予め処置した患者から得たMRI画像の収集物、または有効量の常磁性造影剤で適切に処置した患者から得たMRI画像の収集物からシグナル強度曲線を得、次いで、断層撮影コンソールメモリーまたはローカルもしくはリモートデジタルデータ記憶装置にデジタルで記憶することを含む、請求項２６記載のDCE-MRI法。
【請求項３３】
目的とする高分子溶質が高分子薬またはプロドラッグである、請求項２１〜３２のいずれかに記載のDCE-MRI法。
【請求項３４】
常磁性造影剤が、ガドコレチン酸、MS325のガドリニウム錯体、およびAAZTA-デオキシコール酸のガドリニウム錯体から選ばれる常磁性キレート錯体の生理学的に許容される塩から選ばれる、請求項２１〜３３のいずれかに記載のDCE-MRI法。
【請求項３５】
得られたD値に基づいて処置する腫瘍領域に対する不十分または減少した浸透により高分子薬またはプロドラッグを用いる抗癌療法に抵抗性の患者を同定することを含む請求項30記載のDCE-MRI法。
【請求項３６】
高分子薬またはプロドラッグを単独または高分子薬の取り込みの増強をもたらすあらゆる物質または薬剤を含む他の相乗的薬剤と組み合わせて用いる抗癌戦略を選択、管理、および最適化し、該取り込みを増強する物質または薬剤、またはそれらの一つを含む療法もしくは併用療法の有効性をモニターするための請求項３５記載のDCE-MRI法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、病的組織内への高分子輸送を評価するためのダイナミック造影（dynamic contrast enhanced）ＭＲＩ法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、病的組織、特に癌状部位および固形癌内への高分子薬またはプロドラッグの送達を非侵襲評価し、抗癌療法を選択および最適化するための造影剤およびDCE-MRI法に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、依然として先進国の主要な死亡原因であり、癌のリスクは、人工の高齢化に伴って増加する。特に小悪性腫瘍または限られた領域に限定した外科的除去、および通常小分子薬を用いる常套的化学療法は、依然として最も普通に用いられる抗癌療法である。治療する部位および病状に対する選択性がなく、常套的化学療法剤による重度の副作用のため、薬物毒性を著しく減少させ、常套的化学療法によりもたらされる治療効果を改善することができる最適な標的化能を有する生物活性剤に対する興味が高まっている。
【０００４】
適切な例には、腫瘍に対する治療的活性部分に選択的に向かわせるための標的化剤、すなわち構造中に選択的腫瘍標的化単位、典型的にはペプチドまたはペプチド模倣部分を含む薬剤が含まれる。しかしながら、このタイプの薬剤は、常に有効であると証明されているわけではなく、場合により重篤な副作用も生じている。
【０００５】
近年、ますます興味を集めている異なる戦略は、高分子またはナノサイズの薬剤、すなわち、分子量40KDa以上の治療的化合物の開発、または前臨床および臨床環境において優れた治療効果があり副作用が最小限である、サイズが2〜400nmの範囲の粒子に基づく。高分子薬またはプロドラッグは、実際に、悪性腫瘍組織、特に固形腫瘍内に、その構造、特にその脈管構造を特徴とする解剖学的および病態生理学的異常の結果として、時間とともに事前に選択的に集まると考えられている。
【０００６】
この点で、大部分の病的組織および固形癌において、血管新生は、典型的には他の機能的異常と共に高分子化合物の血管外腫瘍組織への広範な漏出をもたらす透過性の顕著な亢進を示す無秩序で上方調節された血管形成をもたらすことを覚えておく価値がある。
【０００７】
同時に、細網内皮系および/またはリンパ管のクリアランスの部分的不足あるいは欠如は、該高分子化合物が腫瘍組織内に長く保持されるのを保証し、高分子薬の場合は持続局所治療的活性をもたらす（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95、1998、4607-4612；R.K. Jain、Transport of molecules、particles and cells in solid tumors、Annu. Rev. Biomed. Eng.、1、1999、241-263参照)。
【０００８】
例として、抗癌剤、例えばSMANCS（分子量40KDa以上の、ネオカルジノスタチンとスチレン−マレイン酸共重合体が結合したポリマー）の腫瘍組織内への自発的蓄積は、正常組織および器官で見られるものより最大200倍も高いことが解っている（例えば、Maeda et al.、Cancer Res. 1986；46、6387-6392；Maeda et al.、Adv. Drug Deliv. Rev. 2001；46、169-185参照)。
【０００９】
これは、最近１０年のポリマーまたはナノサイズの薬剤を用いる治療戦略に対する関心の高まりを説明し、そのいくつかは実際に速やかに臨床使用が承認されて、すでに市販されているが、多くの他のものももうすぐだと予期される。
【００１０】
しかしながら、数ヶ月間の治療の失敗や限られた効果、および薬剤抵抗性の症例が、特にナノサイズの薬剤においてみられている（例えば、Northfelt、D. W. et al. Pegylated-liposomal doxorubicin versus doxorubicin、bleomycin、and vincristine in the treatment of AIDS-related Kaposi’s sarcoma：results of a randomized phase III clinical trial. J. Clin. Oncol. 16、1998、2445？2451；O’Brien、M. E. et al. Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX/Doxil) versus conventional doxorubicin for first line treatment of metastatic breast cancer. Ann. Oncol. 15、2004、440？449）。
【００１１】
これらの失敗の最も考えられる説明として、種々の癌性組織が示す特有の構造と病態生理がある。この点で、実際に、病的組織に治療作用を効果的に発揮するために薬剤は、血管から浸出し、組織の血管外細胞外腔に深く拡散し、血液循環系から意図する組織に達することができなければならないことは明らかである。
【００１２】
それどころか、臨床診療では、基本的に、治療する病的領域または組織内への不適切な送達により高分子抗癌剤による薬理学的治療に対する抵抗性を示す、多くのほとんど分散しないかもしくは不均一に分散した腫瘍に遭遇する。
【００１３】
そのなかには、例えば、しばしば、典型的にはより高密度の高浸透性の微小血管新生を示す外層、および通常、ほとんど血管新生しない高分子治療薬が浸透しにくい壊死領域を含む内部コアを含む、より大きいかまたは後期の固形腫瘍がある。
【００１４】
高分子溶質の腫瘍塊内への送達および蓄積を促進するすべてのパラメーターを考慮し、説明する現象は、Maedaら(Maeda et al.、Cancer Res. 1986；46、6387-6392参照)が最初に報告し、考察した血管透過性・滞留性亢進(EPR)効果である。より具体的には、EPR効果は、悪性腫瘍組織の特定の構造および病態生理学に関連する複雑な分子量依存性現象であり、その定量はその中の高分子溶質の浸透および蓄積の妥当な信頼できる推定値に変換される(特に、Adv. Drug Deliv. Rev. 2011；63、136-151、および引用文献参照)。実際問題として、観察されるEPR効果がより高いと、腫瘍内の高分子薬またはプロドラッグの期待送達量も大きくなる。反対に、観察されるEPR効果が低すぎると、悪性腫瘍への薬剤の浸透はごく限られるかまたは阻害されると予期され、いわゆる腫瘍の薬剤抵抗性が生じる。
【００１５】
したがって、EPR効果は、今日、腫瘍塊への薬剤送達を評価し、高分子薬またはプロドラッグを用いる薬理学的治療の利用可能性に対する制限または阻害を示す患者を同定するための重要な因子として科学界で受け入れられており、抗癌剤設計および高分子薬剤を用いる治療戦略における「黄金基準」になる。
【００１６】
しかしながら、この現象（例えば先に記載の文献、特にAdv. Drug Deliv. Rev. 2011、63、136-151(この内容は本明細書の一部を構成する)）の実際の原因となり、影響を及ぼすパラメーターの数と複雑さのため、臨床的関連画像化技術を用いるEPR効果の非侵襲性in vivo定量方法として利用できる確立されたものはまだない。実際に、蛍光顕微鏡検査に基づく組織学的方法は、血流を定量し、血管外腔への目的化合物の浸出を顕微鏡レベルで特徴づけるための有用な手段として示唆された。
【００１７】
この方法に用いるのに適した物質は蛍光化合物であり、蛍光自体またはフルオロフォア基と結合しているため、顕微鏡画像を増強する蛍光強度によりその濃度を測定することができる。
【００１８】
この組織学的方法により計算することができる重要なパラメーターは、血管面積、すなわち、血管が占める顕微鏡的断片のパーセンテージである。この点で、このパラメーター値が高いと、腫瘍への浸潤が良好であり、溶質の組織への輸送が改善される。血管面積は目的化合物の組織への浸透によるEPR効果を確証する重要なパラメーターであるが、蛍光顕微鏡検査で得られる最も興味深い情報は、直近の環流血管からの距離に応じて化合物濃度の減衰（低下）を表す曲線である。この曲線は、直近の環流血管からの距離に応じて多くの顕微鏡画像から測定した蛍光強度Ｉを表現することにより、I=f(x)として得ることができる（例えば、F. Tannock et al.、2005. Clin Cancer Res、11、8782-8788 and Tong、R. T. et al.、2004 Cancer Res、64、3731-3736参照)。
【００１９】
あるいはまた、静脈内注射後にある種の腫瘍部位に蓄積し、正常組織には蓄積しない青色色素であるエバンスブルーの使用も関連文献に開示されている。
【００２０】
しかしながら、関連技術の感受性が高くないので、色素は、屠殺動物から得た試料について行うex vivo検査、または外科手術で観察可能になる腫瘍について行うin vivo試験のみに有効に用いることができる。
【００２１】
放射性標識物質も、PET技術の使用により腫瘍内への高分子化合物の蓄積のin vivo推定値を得るのに用いられる。しかしながら、この後者は、患者の危険な放射線への暴露を必要とするのに加え、空間的解像度が低く、MRIで得られるものより値が１オーダー低く、小さな腫瘍に利用するのは難しい。
【００２２】
油状の造影媒質（すなわちLipiodol）を用いるCTベースの方法も、特に、抗癌剤を溶解し、選択的に送達するための有用な媒質として開示されている（例えば、Cancer、August 15、1985参照)。B22956/1 (ガドコレチン酸三ナトリウム塩)を用いて得られたKtransの測定値によるDCE-MRI技術を用いる血管透過性の評価は、例えばUS2007/0059246特許出願に開示されている。内皮透過性 (DCE-MRI技術により、透過性-表面面積の積の係数、KPSとして測定される)とベバシズマブ(Avastin（アバスチン）（登録商標）)による血管新生阻害を受ける実験的異種移植腫瘍における化学療法剤 Vinorelbine（ビノレルビン）の組織学的に決定した濃度との相関をBrasch et al. Fortschr. Rontgenstr 2010；182：133-139により分析した。
【００２３】
特に、該文献は、免疫応答を生じる(Brasch R. et al.、JMRI 1997；7：331-338)ため臨床使用が認可されていない高分子造影増強剤であるアルブミン(Gd-DTPA)30 (m.w. @ 92KDa)を用いて腫瘍の縁で得られるKPS値と、試験した腫瘍領域内の化学療法剤の、まだ任意に血管コンパートメント内にあるかまたは該当する腫瘍領域の血管外−細胞外腔内に拡散した薬剤を区別することなく計算されるHPLCで決定した総濃度の間に見られる相関について考察している。対照的に、この種の測定は、実質的に未到達かまたは非均質的に環流した腫瘍領域の同定を全く実行不能にする。
【００２４】
その代わりに、高分子抗癌剤またはプロドラッグによる治療が有効な腫瘍患者を同定するために、実際の可能性を評価することができる必要があり、後者は、極めて重要な工程として、浸出量（血管からの）および病的領域の血管外腔への拡散の深さと均一性を決定することにより治療すべき疾患領域に浸透および均一に浸透しなければならない(Freeman et al. Molecular Cancer 2012；11：47)。
【００２５】
この点で、実際に、腫瘍領域へのモノクローナル抗体(mAbs)ベースの抗癌剤の不十分および/または非不均一（heterogeneous）な分布が、mAbs由来薬剤を用いる治療の失敗の主原因の一つとして科学界に現在承認されていることに留意すべきである。顕微鏡スケールでの薬剤の空間的分布、特に、mAbを全身投与したときに血液プールから除去される前に環流血管から達することができる距離は、実際にmAbsの治療効果の決定因子である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、依然として、耐性腫瘍、および、したがって、治療すべき組織への不十分または低下した分布により高分子薬またはプロドラッグを用いる治療的処置の効果があまりない患者、を識別するために高分子薬の有効な送達を可能にする条件が治療すべき病的組織に存在することを非侵襲性に確認することができる改良された造影剤および診断方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の要約）
本発明は、MRI技術を用いることにより目的とする高分子化合物の病的組織への透過性の非侵襲性in vivo評価を可能にする常磁性造影剤および診断法に関する。より具体的には、本発明は、目的とする高分子溶質の浸出および拡散の基本的条件を非侵襲性評価し、ならびに領域、部位、組織、腫瘍、または病的身体領域、または癌状塊、より一般的には炎症領域への送達を該薬剤が該領域内で示す薬物動態に基づいて定量的に評価するためのあるクラスの常磁性造影剤およびMRI法に関する。
【００２８】
この点で、あるクラスの常磁性造影剤は、妥当な低分子量であるにも関わらず、適切な時間（すなわち、in vivoのMRI診断画像化時間ときわめて同等な時間）、分子量約67KDaの血液高分子溶質であるヒト血清アルブミン(HSA)と同じ薬物動態的結果を示すことがわかった。
【００２９】
特に、分子量5,000ダルトン以下の、in vivoで少なくとも85％のHSAと非共有結合する常磁性造影剤は、ヒト血漿中で、適切な時間、すなわち、MRI画像化ときわめて同等の時間、ヒト血清アルブミンの薬物動態と厳密に同等の薬物動態を示し、MRI-画像化技術を用いて評価すると、この後者の送達と、該関連領域または組織で示される薬物動態に基づく目的とする病的身体領域または組織中の分散の確実な推定値をもたらすことができることがわかった。
【００３０】
さらに、興味深いことに、目的とする高分子溶質の典型例であると好都合に考えられるHSAの局所送達のin vivo定量（quantization）により、これら造影剤は、目的とする高分子溶質、例えば薬剤またはプロドラッグの浸出および拡散をもたらす条件の確実な評価、より興味深いことには、病的身体領域または組織、特に腫瘍または癌状塊への送達の定量的評価をもたらすことができることがわかった。
【００３１】
従って、ある態様において、本発明は、MRI画像化技術による、目的とする高分子溶質の病的身体領域、組織、または塊への送達、および局所高分子輸送の程度の非侵襲性in vivo評価のためのこのクラスの非共有HSA結合造影剤の使用に関する。別の態様において、本発明は、目的とする高分子溶質の病的身体領域、部位、組織、または固体塊への送達のin vivo評価を、該病的組織、部位、または塊において適切な常磁性造影剤により示される薬物動態から、より具体的には、該身体領域または塊におけるこの薬剤の薬物動態的表示に関連するパラメーターのDCE-MRI推定値から、非侵襲性に得ることを含むDCE-MRI法に関する。
【００３２】
異なる態様において、本発明は、高分子抗癌剤またはプロドラッグによる治療の効果がほとんどない浸透抵抗腫瘍、すなわち、高分子溶質の透過性が乏しいかまたは低下した病的組織を同定するための本発明の常磁性物質およびDCE-MRI法の使用に関する。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、治療すべき腫瘍領域の不十分または低下した浸透性により高分子薬またはプロドラッグを使用する抗癌療法に抵抗性の患者を同定および区別するための本発明の物質およびDCE-MRI法を用いる腫瘍患者を層別化するための診断プロトコールに関する。
【００３４】
さらに、本発明は、高分子抗癌剤またはプロドラッグの単独、または高分子薬、例えばEPR増強剤の取り込みを増強するあらゆる物質を含む他の相乗的物質と組み合わせて使用する抗癌戦略の選択、管理、および最適化するための、ならびにEPR増強療法または抗癌剤およびEPR増強剤を含む組み合わせ療法の有効性をモニターするか、または目的とする病的組織への新規抗癌剤またはプロドラッグの最適な送達について効果を試験するための、本発明の物質およびDCE-MRI法の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】マウスにおいてガドコレチン酸ナトリウム塩を用いる実施例３のin vivo試験のタイミング。
【図２】顕微鏡画像サンプリングスキーム。
【図３】顕微鏡画像中の血管（１および２）、および蛍光強度を計算する顕微鏡画像のピクセルごとの直近の血管からの距離を示す等距離線を同定する実験的試験に用いる組織学的方法の模式図。例えば、このスキームにおいて、A点は、血管１から20〜30μm離れており、B点は血管２から10〜20μm離れている。C点は、血管２から40〜50μm離れているが、血管１から30〜40μm離れているので、その距離は、直近の血管（血管１）から30〜40μmである。
【図４】血管壁からの特定距離（ｘ）の各ピクセルについて計算した蛍光強度値から得た蛍光強度減衰曲線。蛍光強度減衰曲線下面積は、選択した間隔、すなわち、血管壁から蛍光がバックグラウンド値に近づく距離で数値的に積分して該強度減衰曲線を計算する。
【図５】実施例３のin vivo試験において、各動物について腫瘍縁において計算したFITC-アルブミン減衰AUC(1〜200μm) (平均値)の組織学的推定値と回帰線でプロットしたktrans mL＼(min x g) x 100の対応値の相関。
【図６】実施例３のin vivo試験において、各動物について腫瘍コアにおいて計算したFITC-アルブミン減衰AUC(1〜200μm) (平均値)の組織学的推定値と回帰線でプロットしたktrans mL＼(min x g) x 100の対応値の相関。
【図７】PTX処理腫瘍のそれぞれコアおよび縁における実施例４にてin vivoでB22956/1について測定した分画血漿容量fPVおよび移動係数KtransのDCE-MRI値の増加のグラフ表示（ボックス−プロット）。
【図８】PTX (左画像)およびビークル(右画像)で処置後24時間の病的組織(異種移植腫瘍)で記録された解剖学的MRI画像と重ね合わせた（overimposed）ピクセルに基づくDCE-MRI測定Ktrans値を報告する実施例４のin vivo試験から得た比較パラメトリック画像。該画像は、PTXで処理した異種移植腫瘍におけるアルブミンの空間的分布の増加を示す。
【図９】実施例５のin vivo試験から得た組織学的画像。パネルA：FITC-アルブミン染色組織学的画像；パネルB：閾値血管領域；パネルC：直近血管からの距離のマップ；パネルD：Cy5-CTX染色組織学的画像。
【図１０】対応する解剖学的MRI画像と重ね合わせたピクセルに基づくDCE-MRI測定Ktrans、fPV、初期AUC比、後期AUC比、平均増強(Avg. Enh.)値を示す実施例５のin vivo試験から得た比較パラメトリック画像。パネルは、筋肉およびAIF (動脈血)部位も示す。該パラメトリック画像において、重ね合わせたピクセルの明度を該パラメーター値の測定値として用い、測定パラメーターの値が高ければ、該画像のピクセルはより明るい。
【図１１】左パネルは、マウスの腹部部位のMRI断面図(矢印は、A431異種移植腫瘍塊を示す)を示し、右パネルは、画像中の白色部位として示されるAVGENH＞57 (57は測定した閾値である)の腫瘍のピクセルと重ね合わせた同じ断面図を示す。図から、腫瘍部位内の「好ましい」または「陽性」ピクセルの量および分布を速やかに理解することができる。
【図１２】PTXまたはビークルで前処置した皮下A431ヒト扁平上皮（hepidermoid）癌異種移植片を有するヌードマウスNCRにCy5-CTXを用いることによる実施例５のin vivo試験において計算した平均蛍光減衰曲線。約20μmの範囲に分割した２つの曲線間の統計的有意差をプロット下の線で示す。
【図１３】DCE-MRIの結果と組織学的推定値に対応する実施例５の比較試験のグラフ表示。さらにスキームは、「好ましい」(すなわち「浸透性」)腫瘍を「好ましくない」(すなわち「非浸透性」)腫瘍とDCE-MRIに基づいて区別した結果、および区別するために用いた選択基準を示す。図において、AVGENH＞57のピクセルの分画 (各腫瘍ROIのすべてのピクセルから計算した)は、fAUC350.550の値との統計的に有意な相関を示した (斜めの線はp値＜0.01、Parson Corr. Test（ピアソン相関検定）)。実際に、「好ましい」腫瘍(白色ドットは、0.5を超えるAVGENH＞57のピクセルの分画であった。)は、「好ましくない」より高いfAUC値を示した（縦線は、カットオフ値を示す）。（発明の詳細な説明）
【００３６】
本発明は、高分子溶質の浸透および拡散に関連する条件の非侵襲性に得られる推定値、すなわち、病的組織または塊内への高分子溶質の（その）輸送、および該関連病的領域または組織中の適切なクラスの常磁性造影剤により示される薬物動態に基づく高分子溶質の（その）局所送達の定量的評価、のためのDCE-MRI法の一般的適用性に関する。したがって、提唱する方法は、高分子溶質の浸出および拡散をもたらす送達条件が適切に当てはまる腫瘍および患者を、治療すべき病的組織におけるその不適切な送達により高分子抗癌剤による薬理学的処置に抵抗性を示す患者と非侵襲性に区別するのを可能にする。特に、本発明の目的は、該関連病的領域または組織における適切なクラスの常磁性造影剤により示される薬物動態、またはより具体的には該物質が該関連組織、領域、または塊において示す薬物動態に関連するパラメーターのDCE-MRI推定値から目的とする高分子溶質の局所送達のin vivo推定値を得ることを含む病的身体領域、組織、または塊への高分子の輸送を非侵襲性に評価するためのDCE-MRI法である。
【００３７】
この点で、ダイナミック造影（Dynamic Contrast Enhanced）MRI技術(DCE-MRI)は、現在、種々の組織における薬物動態パラメーターを定量し、特に血管形成薬を用いる癌治療に対する反応の経過を評価するのに最適と考えられている画像診断画像化技術である(例えば、Preda et al. JMRI 2004；20：865-873；Haacke E.M.、Magnetic Resonance Imaging 1999；Physical Principles and Sequence Design Wiley-Liss；and Fortschr. Roentgenstr 2009；181：536-542参照)。その選択は、MRI技術分野で知られた種々のシーケンスセットまたは画像化プロトコールの代替的使用を制限または排除するものではないが、本発明の方法を実施するための、すなわち、関連病的組織または腫瘍塊内の関連造影剤により示される薬物動態に関連するパラメーターの推定値を得るためのDCE-MRI技術の使用が好ましいと考えられる。
【００３８】
特記しないかぎり、関連病的身体部位、組織、または腫瘍塊内への高分子溶質の用語「送達」（または本明細書において互換性に用いる「分布」または「浸透」）は、該関連組織または塊の間質腔内へのその分布（典型的には、血管内腔からの浸出およびその局所的（すなわち間質への)拡散を含む）を表すものとする。高分子溶質の関連身体領域、部位、組織、または腫瘍塊への用語「輸送」は、むしろ、典型的には局所的血管新生による該関連領域または塊へのその浸透、および該関連組織または塊の間質へのその拡散の程度を表すものとする。
【００３９】
「送達条件」は、高分子溶質の血液循環からの浸出および病的組織の間質内への拡散をもたらす病態生理学的条件および機能的パラメーターを表し、例えば、上記文献によりよく詳述されている(特に、Adv. Drug Deliv. Rev. 2011、63、136-151参照(この内容は本明細書の一部を構成する))。
【００４０】
「病的」または「罹患」組織、領域、身体部位、または固体塊は、高分子薬またはプロドラッグによる、例えば、好ましくは、癌または腫瘍の身体領域、組織、または部位、または腫瘍塊、より一般的には慢性的炎症領域、例えば関節炎領域または身体部位などの治療からの利益があり得る病状に罹患した領域をあらわす。
【００４１】
「患者」は、ある疾患、例えば慢性的炎症状態、癌、または腫瘍など、より一般的には高分子薬またはプロドラッグによる治療的処置からの利益がありうる病状に罹患している哺乳動物患者、好ましくはヒトを表す。
【００４２】
特記しない限り、本発明の範囲内の高分子溶質は、アルブミンと同等かまたはそれより大きいサイズを有する、すなわち、少なくとも約50KDaの分子量を有する化合物、または血漿タンパク質または血液成分との非共有結合により静脈注射するとその範囲になる抗癌剤などの薬剤である。
【００４３】
本発明の特に興味がもたれる高分子溶液は、典型的には、モノクローナル抗体もしくは抗体断片、またはタンパク質コンジュゲート、または治療的分子のポリマー誘導体を含む、高分子薬剤またはプロドラッグ、特に抗癌剤またはプロドラッグである。
【００４４】
例えば、適切な例には、例えば以下のタンパク質のポリマーコンジュゲートが含まれる：SMANCS、PEG-アスパラギナーゼおよびPEG化抗VEGFR2、低分子薬剤と合成ポリマーのコンジュゲート、例えば、SMA(スチレン−マレイン酸/無水物コポリマー)、HPMA(N-2-ヒドロキシプロピル)-メタクリルアミドコポリマー)、DIVEMA (ジビニルエーテル-マレイン酸コンジュゲート)、PVA (ポリビニルアルコール)、PEG (ポリエチレングリコール)、スクシニルゼラチン、OXD (酸化デキストラン70)、例えば以下のものを含む：SOD-SMA (ここで、SODはスーパーオキシドジスムターゼを表す)、SOD-ジVEMA、DIVEMA-NCS (ここで、NCSは、ネオカルジノスタチンを表す)、Pyran-NCS、SOD-PVA、SOD-suc-ゼラチン、PEGビリルビンオキシダーゼ、DOX-HPMA (ここで、DOXはドキソルビシンを表す)、OXD-DOX、PEG-ドセタキセル(NKTR-105)、PEG-イリノテカン(NKTR-102)、PEG-ナロキソン(NKTR-118)、HPMAコポリマーパラチネート(ProLindac)、およびポリマー-シクロデキストリンナノ粒子-カンプトテシン(IT-101)、または低分子薬剤とタンパク質、例えばIgGまたはアルブミンのコンジュゲート、または、さらに例えばCritical Review in Oncology Hematology 2005；54 11-29および引用文献に記載のモノクローナル抗体または抗体断片ベースの薬剤、および血漿成分（特にアルブミン）とin vivo非共有結合を示す薬剤。モノクローナル抗体/抗体断片に基づく好ましい高分子薬剤には、例えば以下のものが含まれる：Campath（登録商標)(抗体：アレムツヅマブ；標的：CD52)、Avastin（登録商標) (抗体：ベバシズマブ；標的：血管内皮成長因子、VEGFR)、Adcetris（登録商標） (ブレンツキシマブベドチン；標的：CD30)、Erbitux（登録商標) (抗体：セツキシマブ；標的：上皮成長因子レセプター)、Mylotarg（登録商標) (抗体：ゲムツヅマブ；標的 CD33)、Yervoy（登録商標) (イピリムマブまたはMDX-101；標的：CTLA-4を阻害する)、Vectibix（登録商標）(抗体：パニツムマブ；標的：上皮性著言う因子レセプター)、Herceptin（登録商標) (抗体：トラスツズマブ；標的：HER2/neu)、Bexxar（登録商標) (抗体：トシツモマブ；標的：CD20)、Rituxan（登録商標) (抗体：リツキシマブ；標的 CD20)。
【００４５】
本発明の方法において、目的とする病的身体領域または組織への高分子輸送の評価は、本質的に、用いた造影剤により局所的に示される薬物動態に厳密に関連する、該関連組織または領域における該造影剤の浸出および拡散をもたらすそれらの特有の解剖学的および病態生理学的病状に関連し、反応する、パラメーターの１またはそれ以上のDCE-MRI技術を用いて行う定量的評価により得られる。
【００４６】
この点で、多くは、DCE-MRI実験データ、および一般的にほとんどの臨床および前臨床試験から得られるデータから計算することができるパラメーターであり、さらに、それを計算するのに用いた薬物動態 (PK)アプローチが異なる。これらの方法および量のあるものは、例えば、Tofts P.S. et al、JMRI、1999；10、223-232に記載されており、その評価に関するアプローチは、例えばYankeelov TE et al. Magn. Reson. Imaging 2005；23、519-29に記載されている。
【００４７】
本発明の適切な薬物動態パラメーター（一般的にはｐで表す）の非限定的リストには以下のものが含まれる：
・Ktrans(min-1)：血漿と血管外細胞外腔(EES)の間の容量移動定数（volume transfer constant）である。血管から血管外-細胞外(EES)腔への該物質の浸出に関するものである。
・fPV（分画血漿容量）：血液の容量および局所（腫瘍）血管新生の指標をもたらす。
・Kep (min-1)：EESと血漿（より正確にはEESから血液、したがって溶質の除去）の速度定数である。
・AUCt1,t2 (曲線下面積、min x mol/L)：造影剤濃度時間プロフィールの積分値である。例えば、AUC20.30およびAUC10.20は、造影剤注射後20〜30分間および10〜20分間のAUC計算値である。
・AUCEt1,t2 (シグナル増強曲線下面積、min)：MRIシグナル増強時間プロフィールの積分値である。例えば、AUCE20.30およびAUCE10.20は、造影剤注射後20〜30分間および10〜20分間のAUCE計算値である。
・IAUCT (時間-濃度曲線下初期面積、min x mol/L)：造影剤注射後に得られる最初の時点および最終時点Tにわたり計算した造影剤濃度曲線の分析値である。
・IAUCET (時間-シグナル増強曲線下初期面積(min))：
・AVGENH (平均シグナル増強またはAve. Enh.（本明細書では互換性に用いる）：注射後に得られるすべての時点で計算した平均シグナル増強値である。
・EARLYAUCRATIO(または初期AUC比（本明細書では互換性に用いる）：目的とするROI(例えば腫瘍または筋肉)のIAUC1を(造影剤後最初の１分間に計算した)血液のIAUC1で割って計算する。本発明の造影剤のように、注射後最初の１分間の浸出（血管からの）がわずかである造影剤では、EARLYAUCRATIOの値は、腫瘍分画血漿容量に関連する。
・LATEAUCRATIO (後期AUC比、本明細書では互換性に用いる)：注射後20〜30分間(AUC20,30)を血液において測定したIAUC1で割った目的とする部位の増強曲線下面積として計算する。この量は、浸出した造影剤の量、すなわち、直接ktransおよびkepの値に関連する。
・後期および初期ENHANCEMENT（増強）は、後期および初期AUCRATIO（AUC比）と操作上異なるが実質的に等価である。
【００４８】
しかしながら、上記特定したDCE-MRI薬物動態パラメーターから誘導するか、それとある程度関連する各薬物動態パラメーターは本発明内であると考えなければならない。
【００４９】
一般用語において、本発明のDCE-MRI法の主要工程には以下のものが含まれる：
ａ）目的とする病的身体領域または部位内の適切な造影剤の移行中に得られるMRI画像を得、得られたMRI画像から造影剤濃度-時間プロフィール（または濃度-時間曲線（本明細書では互換性に用いる）を計算し；
ｂ）計算した濃度-時間プロフィールから病的組織内の造影剤で示された薬物動態に関連する数値ディスクリプタを抽出し；
ｃ）計算したパラメーター値から該組織内の高分子輸送の評価を得る。
【００５０】
上記方法の要点は、各収集DCEMRI画像内の目的とする部位の同定を含む。目的とする部位またはROI（本明細書では互換性に用いる）は、該診断法を適用する身体部位（または組織またはその部分）、すなわち組織レベルで高分子の分布に関連する生理学的特性を観察する特定部位を意味する。典型的には、記録した画像における目的とする部位(ROI)は、該病的部位(典型的には、腫瘍部位または腫瘍ROI（本明細書では互換性に用いる）)により示されるが、目的とする高分子溶質の浸出が実質的にないかまたは少なくともわずかである健康な筋肉により示される基準部位、所望により血管領域（または血液部位）も、通常、計算および/または比較のため同定する。
【００５１】
好ましい態様によれば、本発明のDCE-MRI法は、本質的にDCE-MRI実験で得られたシグナル時間曲線の薬物動態モデリングを利用し、主要工程として以下のものを含む：
i)観察下で病的領域、組織、または塊内への適切な常磁性造影剤の通過により得られるDCE-MRI画像からシグナル強度曲線、所望により基準部位 および/または血管部位から同等の曲線を得、MRIシグナル強度を造影剤濃度に変換して濃度曲線を得、
ii)薬物動態モデルによる濃度曲線を適合させて、該組織、領域、または塊への造影剤の輸送に関連する薬物動態パラメーターpiの推定値を得、
iii)得られた薬物動態パラメーター値から観察下で該組織または領域内の目的とする高分子溶質の送達を評価する。
【００５２】
好ましくは、上記DCE-MRI法は、さらに、例えば、観察下で病的身体領域または部位の形態学的MRI画像を得、次いでダイナミック画像化法を開始し、目的とするROI、典型的には記録したDCE-MRI画像内の腫瘍部位、基準部位、所望により血液部位の良好な解剖学的解像度での同定を可能にする。
【００５３】
該方法の工程ｉ）のDCE-MRI画像の収集物は、典型的には1〜30分間の範囲、好ましくは1〜20分間、より好ましくは1〜15分間の造影剤投与後からMRI取得終点Tまでの全取得時間ウィンドウ（T）、あるいはまた造影剤投与からMRI取得終了までを含むあらゆる連続的、または非連続的時間ウィンドウについて適切に得ることができる。該方法の工程ii)で得ることができる薬物動態パラメーターの適切な例には、移動係数Ktrans、速度係数Kep、および分画血漿容量fPVが含まれる。
【００５４】
しかしながら、それらの選択は、いかなる異なるパラメーターを限定または排除するものではないが、上記方法の好ましい実施には、KtransおよびfPV、より好ましくはKtransのDCE-MRIベースの推定値を得ることが含まれ、これらは、工程ｉ）で得られる濃度曲線に適合させることにより、典型的には、当該分野で知られた、例えばBrasch R. C. et al.、1998、AJR 171、941-949、およびTofts P.S. et al、JMRI、1999 ,10、223-232に記載の２つのコンパートメント薬物動態モデルを用いることにより計算される。
【００５５】
この点で、DCE-MRI由来Ktrans値と同じ画像化組織内への高分子溶質の観察される実質的線形相関は、前者のDCE-MRI推定値から後者の評価を可能にする。実際問題として、測定したKtransがより高いと、実験下の病的組織内の高分子薬またはプロドラッグの送達はより大きくおよび/またはより均質であるが、反対により低いKtrans推定値は、該組織内への高分子溶質の乏しいまたは低下した浸出および拡散を示唆する。
【００５６】
本発明のDCE-MRI法の別の同等に好ましい実施は、本明細書にモデルフリーアプローチとして示す。
【００５７】
このアプローチは、腫瘍血管に関するその生理学的パラメーターの決定に基づくものではなく、目的とする組織への造影剤の到着に関連し、血流、血管透過性、および間質腔の分画を反映するパラメーターに基づく(Geoffrey J.M. Parker et al. Comparative Study into the Robustness of Compartmental Modeling and Model-Free Analysis in DCE-MRI Studies. JMRI 2006、23：554-563)。
【００５８】
本質的に、この実施は、例えば、造影剤注射後の最初の時点およびDCE-MRI取得の終了前の種々の時点Ｔ（分）により限定される種々の時間ウィンドウについて計算した時間-濃度曲線下初期面積(IAUCT)および/または時間-シグナル増強曲線下初期面積IAUCET、および/または注射後の得られたすべての時点で計算した平均シグナル増強を含む、例えば造影剤注射後の種々の時間ウィンドウで計算したAUCおよび/またはAUCE値などの数値ディスクリプターの抽出（DCE-MRI実験で得たMRIデータから）に依存する。
【００５９】
より詳細には、この別の実施は主要工程として以下のものを含む：
例えば、典型的には先に記載のごとく得られる30分間以下、好ましくは1〜20分間の全取得時間ウィンドウ、あるいは、例えば注射後20〜30分間のt1〜t2時間ウィンドウ、または造影剤投与およびMRI取得終了を含むあらゆる連続または非連続時間ウィンドウに及ぶ、目的とする領域または組織内への造影剤の移行により得られるMRI画像のセットから造影剤注射後の最初のＴ分間に及ぶ造影剤濃度(および/またはシグナル増強)曲線、ならびに/または取得時間ウィンドウのすべての注射後時点で計算される平均シグナル増強を計算する。
【００６０】
該造影剤投与から該時間Ｔに及ぶ造影剤濃度（またはシグナル増強）曲線の積分は、例えば以下の台形積分公式などの当該分野で知られた数値積分法を用いて決定することができる：
2018188448.tif 000002
［式中、IAUCTは、注射後最初のＴ時間で計算したIAUCである。F(i)は、ダイナミック時点ｉにおける造影剤の組織濃度（またはAUCEについてはシグナル増強）である。tiは、時点ｉの時間である。Ｎはti＝T前の最終時点である。］、または
2018188448.tif 000003
［式中、AUCは、t1〜t2時間ウィンドウで計算される（すなわち、より正確には、t1〜t2の時間間隔で得られたすべてのDCE-MRI画像を用いることによる）。F(i)は、時点ｉで測定した造影剤の組織濃度(またはAUCEについてはシグナル増強)である。］。
【００６１】
AVEGHは、例えば下記式を用いて決定することができる：
2018188448.tif 000004
［式中、Enh(i)は、ダイナミック時点ｉにおけるシグナル増強である。Ｎは最後に得られる時点である。］。
【００６２】
一般的には、各上記DCE-MRIディスクリプターのAVGENH、AUC、AUCE、 IAUCT IAUCET、およびそれらおよびそれらのあらゆる操作可能な組み合わせから操作的に誘導することができるあらゆる他の数値ディスクリプター（例えばLATEAUCRATIOおよびEARLYAUCRATIOを含む）は、本発明のこの他の実施手順を用いて記録したDCE-MRI画像から適切に抽出することができる。しかしながら、その選択は、あらゆる異なるパラメーターの評価を制限または排除するものではないが、上記方法の好ましい実施には、AVGENH、AUC、および/またはAUCE、またはIAUCTおよび/またはIAUCETの少なくとも１のDCE-MRIに基づく推定値を得ることが含まれ、これらの最後には、上記のごとく、先の特定の実施があり、より好ましくは、該方法は、そのロバスト性（robustness）および決定しやすさのため、AVGENHの収集したDCE-MRI画像数値推定値から抽出することを含む。
【００６３】
先に記載の２つの実施法、すなわち、薬物動態モデル化アプローチおよびモデルなしアプローチは、そのそれぞれが結果として、それぞれ、病的組織内への造影剤の輸送に関連し、それに対応して、該組織への目的とする高分子溶質の送達の推定をもたらすことができる少なくとも１の薬物動態パラメーター、例えば、Ktransおよび/またはfPV (薬物動態モデル化アプローチを用いる)、およびAVEGH、IAUCT IAUCET、AUC、AUCE、LATEAUCRATIO、および/またはEARLYAUCRATIO (モデルなしアプローチを用いる)の決定をもたらすので、互いに代替的であると考えることができる。
【００６４】
しかしながら、２以上のパラメーターの決定は、必要な制限であると考えるべきではないが、本発明のDCE-MRI法の好ましい実施には、上記薬物動態パラメーターpの２またはそれ以上またはすべてを測定し、次いで得られた結果を比較し、観察下で該身体領域または組織への高分子の送達のより正確で信頼できる推定をもたらすことが含まれる。
【００６５】
したがって、特に好ましい態様において、本発明は、適切な常磁性造影剤を、病的身体領域、部位、組織、または固体塊への目的とする高分子溶質の送達のin vivo推定値を得るために用いる、主要工程として以下の工程を含むDCE-MRI法に関する：
a)関連病的身体領域、組織、部位、または塊内への造影剤の移行によるDCE-MRI画像、所望により、良好な解剖学的解像度のさらなるMRI画像のコレクションを得、目的とする部位、典型的には、収集したDCE-MRI画像内の腫瘍部位、基準部位、所望により血管部位を同定し、同定した部位内のシグナル強度曲線を得、
b)所望により、造影剤投与およびMRI取得終了を含むあらゆる連続的または非連続的時間ウィンドウにおけるAVGENHおよび/またはAUCE値を決定し、
c)工程a)で得られたMRIシグナル強度値を造影剤濃度値に変換して濃度-時間曲線を得、
d)所望により、造影剤投与およびMRI取得終了を含むあらゆる連続的または非連続的時間ウィンドウにおけるAUG値を決定し、
e)薬物動態モデルによる該得られた濃度曲線を適合させてKtransの推定値を得、
f)評価したパラメーターの得られた推定値から目的とする高分子溶質の送達を評価する。
【００６６】
この点で、上記方法は、所望によりさらに、工程a)の前に、有効量の選択した常磁性造影剤を必要とする患者または該患者の器官もしくは他の身体部位または組織に投与する工程1a)を含みうる（ことにworth noting）。別の態様において、上記方法は、適切な量の常磁性造影剤で前処置した患者で得られたMRI画像のコレクションからシグナル強度曲線を得ることを含み得るか、または有効量の常磁性造影剤で適切に処置した患者により適切な時間で得、次いで断層撮影コンソールメモリーまたはローカルもしくはリモートデジタルデータ記憶装置にデジタル保存したMRI画像のコレクションからシグナル強度曲線（および上記DCE-MRIベースのパラメーターの少なくとも１の推定値）を得ることを含み得る。
【００６７】
本明細書で用いる「有効量」または「適切な量」は、意図する診断目的、すなわち、例えば関連病的身体領域、組織、部位、または塊内への造影剤の移行時のMRI画像のコレクションを得、得られた画像からシグナル強度曲線を得ることを満たすのに充分な本発明の造影剤またはその医薬組成物のあらゆる用量または量を表す。
【００６８】
上記方法の好ましい態様において、高分子送達の評価は定時的に行われる。
【００６９】
この点で、例えば、Ktrans、fPV、AVEGNH、IAUCT IAUCET、AUC、AUCE、LATEAUCRATIOおよび/またはEARLYAUCRATIO、好ましくは、Ktrans、AVEGNH、AUC、およびAUCEを含む各上記DCE-MRI由来薬物動態パラメーターpは、すべての病的領域または腫瘍容積をサンプリングする収集した各DCE-MRI画像の病的(腫瘍)部位および基準部位のそれぞれにおいてピクセル的に（またはボクセル的に（該画像または身体容積が２次元か３次元かに応じて））決定される。
【００７０】
本発明の方法で決定し、対応する解剖学的MRI画像と重ね合わせたKtrans、fPV、EARLYAUCRATIO、LATEAUCRATIO、平均増強(AVEGNH)のピクセル的DCE-MRI測定値を示す実施例５のin vivo試験から得られた比較パラメトリック画像を、例えば図１０に示す。パネルは基準（筋肉）およびAIF (動脈血) 部位も示す。該図のパラメトリック画像において、重ね合わせたピクセルの輝度をパラメーター値の尺度として用い、測定したパラメーター値がより高いと、画像中のピクセルはより明るい。
【００７１】
したがって、２セットのパラメトリック値は、評価した各パラメーター：目的とするROI（すなわち病的部位）由来のものと基準部位由来のものについて定時的に得られる。
【００７２】
次に、高分子送達の評価は、評価したパラメーター、目的とする病的組織または部位中の各ピクセル（またはボクセル）で測定した推定値を基準健康部位で得られた対応する値と比較し、非病的(健康)部位の推定値より統計的に有意に高い値を有するピクセル/ボクセル (病的部位内の)の分画を評価することにより行う。
【００７３】
この点で、基準(非病的)部位内で決定した薬物動態パラメーター値を用いて、平均(μ)および標準偏差(σ)で特徴づけた基準統計的分布を定義する。次に、各推定薬物動態パラメーターについて、病的ROIからピクセルについて得た値と基準ROI由来の対応基準統計的分布の比較試験を行い、各記録したDCE-MRI画像の各腫瘍ROIについてμ＋3σ (すなわち、ピクセル/ボクセル（ここで、pi＞μ＋3σ）（ここで、piは、該薬物動態パラメーター(病的ROIの各ピクセル/ボクセル中)の測定値である。μおよびσは、それぞれ対応する基準統計的分布の平均および標準偏差である。）より大きいパラメーター値をもたらすピクセルの分画を同定し、計算する。
【００７４】
この点で、上記要求にかなうpi値（すなわちμ＋3σ）は、本発明では「好ましい」、すなわち、非病的ROI、および高分子溶質に対して「浸透性」(P)と分類される上記条件が確認されるピクセル/ボクセルに見られるものと有意に異なる透過性を示すとみなされる。反対に、比較試験がμ＋3σより低いpi値をもたらす（すなわち、該試験が間違った報告をもたらす）場合は、該ピクセル/ボクセルは、高分子溶質に対して「好ましくない」または「非浸透性」（NP）（本明細書では互換性に用いる）と分類される。次に、高分子溶質が病的組織に適切に送達される可能性は、病的身体部位または腫瘍容量すべてについてサンプリングした収集したすべてのDCE-MRI画像から計算した下記比：D＝P / (P＋NP)で表す。この点で、病的組織への有効な高分子溶質送達に対する最適D値は、好ましくは0.5以上であり、実際的に、定時的に考えて組織または部位それ自体の50％以上が、ごくわずかな血管新生で特徴づけられる非病的、基準領域に見られるものより高い透過性を有する身体組織または部位に対応する。
【００７５】
この点で、興味深いことに、病的領域内の「浸透性」と分類されたピクセル/ボクセルの対応する形態学的MRI画像（例えば、図8および11の場合のように）への適切な重ね合わせは、高分子溶質の病的領域への即時の確実に有効な図を好都合に得ることを可能にし、測定した送達の程度、および適切な比較により、病的組織内部の高分子輸送を改善する適切な薬剤で該病状を適切に処置することから生じるこの後者の増加または減少を可視化する。
【００７６】
前記から、上記方法の好ましい実施は、罹患領域に効果的に達することができない高分子薬またはプロドラッグの使用に依存する治療からほとんど利益が得られない0.5以下のD値を生じる病状および患者から、高分子溶質への適切な浸透を示し、高分子薬またはプロドラッグによる治療とかなり適合する、0.5またはそれ以上の、好ましくは0.5〜0.6のD値をもたらす病状（および患者）を区別し選択することを含むことは明らかである。
【００７７】
より図式的には、工程ｆは、好ましくは以下により実施する：
1. 好ましくは、Ktrans、AVGENH、fPV、AUCE、AUC、EARLYAUCRATIO、およびLATEAUCRATIO、工程a)で収集した各DCE-MRI画像の基準部位においてピクセルベースで決定した値の平均（μ）および標準偏差（σ）から選ばれるパラメーターを含む、該DCE-MRIパラメーター pそれぞれを計算し、
2. 該DCE-MRIパラメーターそれぞれについてμ＋3σ閾値を計算し、
3. 回収したDCE-MRI画像それぞれについて該パラメーター値 pi＞μ＋3σを示す病的または腫瘍ROI中の該ピクセルを同定し、
4. 全病的領域または腫瘍容量をサンプリングするすべてのDCE-MRI画像の腫瘍ROIから閾値(μ＋3σ)を超えるパラメーター値を示すピクセルの分画Dを計算し、
5. カットオフ値、例えば0.5を決め、D＞0.5の「浸透性」または「好ましい」病的身体部位または腫瘍を定義する。
【００７８】
上記DCE-MRI法に用いるための適切な造影剤には、典型的には、目的とする高分子溶質と同様かまたはそれに近い生理化学的特性を有する常磁性造影剤が含まれる。
【００７９】
この場合は、実際に、観察下で身体領域において該造影剤で示される薬物動態は、目的とする高分子溶質、例えば好ましくは高分子薬またはプロドラッグが局所的に示す薬物動態挙動と同等、すなわち反応する、ことを前提とすることができ、したがって、該薬剤が該身体部位または組織において示す薬物動態に関連するそれらパラメーターの測定は、高分子溶質の局所輸送に同様に関連し、反応し、該身体領域または部位へのその送達の確実な推定値を得るのに好都合に用いられると当然に考えることができる。
【００８０】
本発明の造影剤は、典型的には、高分子溶質のプロトタイプとして当該分野において一般に用いられる、目的とする高分子薬剤またはプロドラッグ（例えばアルブミン(Gd-DTPA)30 (m.w. 約92KDa)）と類似しているかまたは近いサイズおよび表面荷電を有する高分子薬剤が含まれる。
【００８１】
反対に、市販の低分子造影剤(SMCM)、例えば、Magnevist（登録商標）またはMultiHance（登録商標）は、一般的にそれらより少なくとも50〜100倍大きい流体力学半径を有する高分子薬剤またはプロドラッグの輸送および送達と関連すると妥当に予期することはできない。
【００８２】
興味深いことに、本発明者らは、本明細書に記載のあるクラスの常磁性造影剤は、当該分野の高分子薬剤に影響を及ぼす欠点を克服するのに妥当な低分子量を有するにも関わらず、in vivoで適切な時間、高分子溶質（すなわち血清アルブミン）の薬物動態的運命に従うことが好都合に証明されていることをみいだした。
【００８３】
実際に、HSAの少なくとも85％とin vivoで非共有結合を示す常磁性造影剤(平衡条件で)は、興味深いことに、ヒト血漿中で適切な時間（すなわち、MRI診断画像化の時間ときわめて適合する）、分子量約65KDaの血液成分である血清アルブミンと厳密に同等な薬物動態を示すことがわかった。
【００８４】
先に開示した本発明のDEC-MRI法のこのクラスのin vivo アルブミン結合造影剤の使用は、本発明の特に好ましい態様と考えるべきである。
【００８５】
本発明の好ましいアルブミン結合剤には、さらに、例えば、Invest.Radiol. 2006、41：279-291；Whitlam JB、Brown KF. Ultrafiltration in serum protein binding determinations. J.Pharm.Sci. 1981；70：146-150、および実験の項の実施例２に記載の方法に従って、37℃でインキュベーションしたSeronorm（登録商標)中の該薬剤の0.5 mM溶液から遠心限外ろ過(Centrifree（登録商標))で測定した血清アルブミンの非共有結合している該薬剤量％で表した85％またはそれ以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上のヒト血清アルブミン(またはHSAもしくはアルブミン（本明細書では互換性に用いる）)とのin vivo非共有結合タンパク質結合を示す、分子量5,000 Da以下、好ましくは3,000 Da以下、より好ましくは800〜3,000 Daの常磁性造影剤が含まれる。
【００８６】
それらのうち、血液系において好ましい持続性を示すアルブミン結合剤が特に好ましく、最終ヒト血漿半減期（すなわち、血漿濃度を偽平衡に達した後２で割るのに必要な時間、すなわち終末期の半減期後、J. vet. Pharmacol. Therap. 2004；27：427-439)は、該薬剤の投与から少なくとも4時間、好ましくは4〜15時間、より好ましくは最高20時間であるが、投与した薬剤はすべて投与から２カ月以内、好ましくは２週間以内に適切に排泄される。
【００８７】
この選択したクラスの非共有結合アルブミン結合造影剤は、興味深いことに、in vivoで適切な時間、ヒトアルブミンと同じ薬物動態を示し、病的身体領域または組織内のそれらの輸送に関連するパラメーターのDCE-MR画像化由来測定値をもたらすことが示され、予期しないことに、該組織または領域中のこの高分子溶質の送達と線形的に相関することがわかり、組織学的に観察された病的組織の血管外腔への血管新生からのアルブミン浸出およびその局所的分散の量と線形的に相関することがかわった。
【００８８】
したがって、該組織または領域に有効に送達されたアルブミンの量の確実なin vivo推定値の提供により、本発明により同定された選択したクラスの非共有結合アルブミン結合常磁性造影剤は、病的組織または塊内の高分子輸送の確実なDCE-MRIに基づく推定値を非侵襲性に得、高分子抗癌剤による薬理学的処置に浸透抵抗性を示す病状を、高分子薬またはプロドラッグを使用する治療的処置と互換性の適切な浸透を示す病状と区別するのを可能にする。すなわち、それらは、該処置に抵抗性と思われる患者から高分子薬剤による処置に適した患者を区別するためのプロトコールまたは予測方法において好都合な適用を見いだすことができる。
【００８９】
病的身体領域、部位、組織、または固体塊への高分子溶質の送達のin vivo推定値を非侵襲性に得るための本発明のDCE-MRI法におけるこの特定クラスのアルブミン結合造影剤の使用は、いかなる他の適切な常磁性造影剤の使用も何ら制限または排除するものではないが、本発明において特に好ましいと考えるべきである。
【００９０】
したがって、本発明の特に好ましい態様は、病的身体領域、部位、組織、または固体塊への目的とする高分子溶質の送達のin vivo推定値を非侵襲性に得るための本発明のin vivo アルブミン結合常磁性造影剤の使用を含むDCE-MRI法に関連する。
【００９１】
少なくとも4時間のヒト血液循環中最終半減期を示すアルブミン結合造影剤が上記範囲で特に好ましい。
【００９２】
本発明のアルブミン結合常磁性造影剤の適切な例には、HSAの少なくとも85％ (平衡状態で)とのin vivo非共有結合を示す、分子量5,000 Da未満の血液プール造影剤が含まれる。好ましくは、該造影剤は、その構造中に少なくとも１の常磁性複合体単位を含み、これは、好ましくは、生理的pHで１またはそれ以上の陰性残基荷電、および少なくとも１の、所望により２（またはそれ以上）の、該造影剤とHSAとの結合を促進する脂溶性部分を示す。所望により、該造影剤は、形成される水素結合数を増加し、造影剤の血液保持を持続させる、親水性部分、例えば、所望により陰性に荷電した基、例えばリン酸基（例えば１または２エステルリン酸基）、カルボキシル基、またはスルホン酸基、またはヘテロ原子、例えば酸素原子、窒素原子、または硫黄原子も含みうる。造影剤分子の上記脂溶性部分、所望により親水性部分、およびキレート化複合体単位は、互いに直接、または単結合、適切なリンカーもしくは結合基により結合することができる。この点で、該親水性部分は、好都合には、脂溶性部分または所望により不可欠な部分でありうる連結基と共有結合することができる。
【００９３】
該造影剤の脂溶性部分は、好ましくは、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸残基からなる群から選ばれる胆汁酸の誘導体により示され、１もしくは２または２より大きい（例えば３）芳香族環または脂環式環（例えば、好ましくは、フェニル、ビフェニル、シクロヘキシル、シクロヘキシルフェニル、またはシクロヘキシルビフェニル残基）を含む部分である。
【００９４】
それらのうち、下記式（I）を有する造影剤が特に好ましい：
X-L-Y (I) 
［式中、Xは、ジエチレントリアミノペンタ酢酸 (DTPA)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸 (DOTA)、4-カルボキシ-5,8,11-トリ(カルボキシメチル)-1-フェニル-2-オキサ-5,8,11-トリアザトリデカン-13-酸(BOPTA)、または多座AAZTAキレートリガンド（WO03/008390またはEP 1904460に記載されている）からなる群から選ばれるキレートリガンドの常磁性キレート錯体である。Yは、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸から選ばれる胆汁酸の残基であるか、または１、２、または３個の芳香族および/または脂環式環を含む環式残基または多環式残基である。Lは連結基である。］。
【００９５】
本発明では、例えばEP 0806968に記載の造影剤が好ましく、GadofosvesetまたはMS-325（Ablavar（登録商標）として市販されている）で示されるガドリニウム錯体の３ナトリウム塩が特に好ましく、これは、ヒト血清アルブミンの約90％と非共有結合性タンパク質結合を示すことがわかっている(Invest. Radiol. 2006；41(3)：229-43)。本発明の常磁性造影剤の別の好ましい群には、例えばWO 00/38738またはUS 2007/0059246に記載の胆汁酸のコンジュゲートが含まれる。
【００９６】
それらのうち、[3β(S),5β,12α]-3-[[4ビス-[ビス[2-(カルボキシメチル)アミノ]エチル]アミノ]-4-カルボキシ-1-オキソブチル]アミノ]-12-ヒドロキシコラン-24-酸と常磁性金属イオンのキレート錯体およびその生理学的に適合する塩が特に好ましい。
この点で、本発明の範囲内にある適切な常磁性金属イオンは以下から選ばれる：Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Ni(2+)、Rh(2+)、Co(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、Tb(3+)、Pm(3+)、Nd(3+)、Tm(3+)、Ce(3+)、Y(3+)、Ho(3+)、Er(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(3+)、Mn(2+)。より好ましくは、該常磁性金属イオンはGd(3+)である。
【００９７】
薬理学的に許容される塩は、例えば、以下から適切に選ばれる：カリウム、ナトリウム、カルシウム、またはマグネシウム塩；エタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、N-メチルグルカミン、およびN,N-ジメチルグルカミン塩；クロリド、ブロミド、ヨージド、サルフェート、アセテート、スクシネート、シトレート、フマレート、マレエート、オキサレート塩；およびアミノ酸（例えば、タウリン、グリシン、リジン、アルギニン、オルニチン、またはアスパラギン酸およびグルタミン酸）のカチオンおよびアニオンを有する塩。
【００９８】
ヒト血清アルブミン約95％とin vivo結合し(例えば、de Haen C. et al、Invest Radiol 2006；41(3)：279-91、および下記実施例２参照)、血管腔で良好に保持される(例えば、WO 00/38738に)ことがわかっている該[3β(S),5β,12α]-3-[[4ビス-[ビス[2-(カルボキシメチル)アミノ]エチル]アミノ]-4-カルボキシ-1-オキソブチル]アミノ]-12-ヒドロキシコラン-24-oic acid キレートリガンドとのガドリニウム錯体のナトリウム塩（本明細書では、ガドコレチン酸３ナトリウム塩またはB22956/1ともいう）は、本発明の特に好ましい造影剤と考えられる。
【００９９】
本発明の特に好ましい上記式(I)の常磁性造影剤の別の例は、式：
2018188448.tif 000005
で示されるAAZTA-デオキシコール酸のガドリニウム錯体ジナトリウム塩（以後、Gd AAZTA-デオキシコール酸（deoxycholic）であり、これは、ヒト血清アルブミンと90％を超える結合親和性を示すことがわかっている。
【０１００】
したがって、本発明の目的は、病的身体領域、組織、部位、または癌状塊への高分子輸送をDCE-MRI技術を用いて非侵襲性in vivo評価するための、少なくとも85％、好ましくは85％より高いヒト血清アルブミンとin vivo非共有結合を示し、86、87、88、89、90、91、92、93、94、または95％の、より好ましくは95％を超えるHSAとの非共有結合に対応する分子量5,000 Da未満の、好ましくは800〜5,000 Da、より好ましくは800〜3,000 Daの常磁性造影剤の使用に関する。
【０１０１】
ガドコレチン酸３ナトリウム塩、Gd AAZTA-デオキシコール酸ジナトリウム塩およびGadofosvesetからなる群から選ばれる常磁性造影剤、またはそれらの１つを含む医薬組成物の単独、またはあらゆる他の薬剤またはプロドラッグ、適切な添加剤、および/またはビークルと組み合わせた本発明の使用が特に好ましい。
【０１０２】
本発明のさらなる目的は、目的とする高分子溶質の病的身体領域、部位、組織、または固体塊、詳細には腫瘍または癌状塊への送達のin vivo推定値を得るための、少なくとも85％、好ましくは90％を超える、より好ましくは95％を超えるヒト血清アルブミンとin vivoで非共有結合する分子量5,000 Da未満の非共有結合常磁性造影剤の使用を含むDCE-MRI法に関する。
【０１０３】
この点で、それらのうち、さらにヒトの血液循環中の終末相半減期値が少なくとも4時間である分子量800〜5,000、より好ましくは800〜3,000 Daの造影剤が特に好ましい。
【０１０４】
好ましくは、該DCE-MRI法は、主要工程として、先に詳述した処理工程を含み、より好ましくは、ガドコレチン酸３ナトリウム塩、Gadofosveset ３ナトリウム塩、およびGd AAZTA-デオキシコール酸ジナトリウム塩からなる群から選ばれる造影剤を使用する。
【０１０５】
前記すべてから、本発明の方法は、DCE-MRI技術を使用して行うアルブミン送達の測定により目的とする高分子溶質の送達の評価を得ることを可能にするので、予測的（prognostic）方法と考えることができる。
【０１０６】
したがって、本発明のさらなる目的は、病的身体領域、部位、組織、または固体塊への目的とする高分子溶質の、具体的には、腫瘍、癌性組織、または慢性炎症領域、例えば、DCE-MRI技術の使用による関節炎領域または身体部位など内への高分子治療薬の送達を非侵襲性にin vivo評価するための、少なくとも85％、好ましくは90％より高いヒト血清アルブミンに対する非共有結合を示す分子量800〜5,000 Daの常磁性造影剤を用いることを含む予防的方法である。
【０１０７】
さらなる態様において、本発明は、高分子溶質の浸出および拡散に内在する送達条件が適切に当てはまる病状および患者を、逆に、治療すべき病的組織への不適切な送達により高分子抗癌剤またはプロドラッグによる薬理学的処置に対する抵抗性を示す悪性腫瘍または患者から非侵襲性に区別するための本発明の選択したクラスのアルブミン結合造影剤およびDCE-MRI法の使用に関する。
【０１０８】
該区別は、例えば、関連病的領域内で測定したD値に対する基準を作ることにより、スクリーニング下の患者が罹患している病状への高分子溶質の送達の定量に基づいて好都合に用いるすることができ、記載したように、好ましくは0.5以上の、例えば0.5〜0.6のD値は、高分子薬またはプロドラッグを用いる治療的処置と適合する適切な送達を示すと考えることができるが、反対に、0.5より低いD値は、高分子薬による治療を損なう乏しいまたは低下した浸透および送達を示す。
【０１０９】
したがって、本発明のさらなる態様は、治療すべき病的領域への不十分または減少した浸透により高分子薬またはプロドラッグを使用する抗癌療法に抵抗性の患者を非侵襲性に同定するための、85％またはそれ以上の、好ましくは90％以上のヒト血清アルブミンとin vivoで非共有結合する分子量800〜5,000 Daの常磁性造影剤を用いることを含む癌患者の層別化または分類のためのプロトコールに関する。
【０１１０】
好ましくは、上記プロトコールは、モノクローナル抗体、またはペプチドまたはポリマー誘導体抗癌剤またはプロドラッグの使用に基づく抗癌療法に抵抗性の患者を同定し、階層化し、および/またはその使用に基づく抗癌療法を最適化するために適用される。
【０１１１】
さらに、本発明は、高分子薬またはプロドラッグを単独、または高分子薬の取り込みを増強するあらゆる物質または薬剤、例えばEPR増強物質を含む他の相乗作用剤、例えば該取り込み促進物質または薬と組み合わせて用いる抗癌戦略を選択、管理、または最適化するための、該取り込み促進物質もしくは薬剤またはそれらの一つを含む療法もしくは組み合わせ療法の有効性をモニターするための、および新規抗癌薬またはプロドラッグの病的組織内への最適な分布における有効性を試験するための、本発明の物質およびDCE-MRI法の使用を指向する。
【０１１２】
したがって、本発明は、さらに、高分子抗癌剤またはプロドラッグを単独でまたは高分子溶質および高分子薬またはプロドラッグの目的とする病的身体領域、部位、組織、または固体塊内への取り込みを増強するための物質と組み合わせて使用する抗癌戦略を選択、管理、および最適化するための、または該組み合わせ療法がもたらす効果をモニターするための、および高分子溶質の取り込みを増強するための物質がもたらす効果をモニターするための本発明のDCE-MRI法および物質を用いるプロトコールを含む。
【０１１３】
この点で、高分子化合物の薬物動態的運命を追跡し、目的とする病的身体領域内へのその輸送の確実な評価をもたらすための本発明の選択したクラスの非共有結合アルブミン結合物質の可能性を、最初に、マウスの実験的前立腺癌モデルに対するin vivoダイナミック造影増強MRI試験により試験した。
【０１１４】
この点、B22956/1を、本発明の非制限的典型的造影剤として用い、蛍光標識ウシ血清アルブミン(BSA、m.w.約65KDa)を、マウスに注射すると、同等の生理化学的特性を有する高分子薬の挙動を模倣することができるプロトタイプ的大分子として用いた。
【０１１５】
比較試験は、タイミングを例えば図1に記載したプロトコールにより（腫瘍血管透過性を調節するための）VEGFR阻害剤であるAxitinib（登録商標)で処置したPC-3細胞（ヒト前立腺癌系）移植NCR無胸腺ヌードマウスを用いて行った。該試験の範囲は、B22956/1を造影剤として注射した後の本発明の方法により得られた時系列のMRI画像（空間的解像度約110μm）の分析から抽出したヒト腫瘍モデルにおけるアルブミン分布、およびミクロンスケールで蛍光顕微鏡画像から組織学的に測定した血管の内側および外側のFITC-BSA（蛍光イソチオシアネートウシ血清アルブミン）アルブミンの分布の画像に基づく分析を比較することであった。
【０１１６】
特に、経内皮透過性(KTrans)および分画血漿容量(fPV)は、２コンパートメント（bi-compartmental）薬物動態モデルの適用によるダイナミックMRI画像データから計算し、曲線下初期面積(IAUCT)は、典型的には造影剤投与からMRI取得終了までの種々の時間ウィンドウで計算した。次に、腫瘍の高分子浸透性を最終MRIセッション後の尾静脈から投与した蛍光標識ウシ血清アルブミンにより検討した。顕微鏡画像を用い、自動閾値化法により血管密度の尺度として腫瘍中の蛍光アルブミンによる染色領域のパーセンテージを定量した。腫瘍の血管外腔におけるアルブミン浸出を、例えば図２に示す様に腫瘍の縁とコアから得た組織資料から血管外にみられる蛍光に基づいて評価した。特に、アルブミン蛍光を、直近の血管から一定の距離にあるすべてのピクセルについて平均化し、例えば図３に記載の最適化した方法を用いて血管壁からの距離に応じて保存することにより、該腫瘍の血管外腔におけるアルブミンの利用可能性、すなわち浸出したFITC-アルブミンの量の定量と、直近の血管から距離ｘのその濃度、すなわち、細胞外腔内のその実際の分布および希釈の低下(例えば図４に示す)を得る。
【０１１７】
特に、例えば、実験の項の表AおよびBに示すように顕微蛍光とMRIデータの間に統計的に有意な相関がみられた。
【０１１８】
特に、統計的に有意な一貫性が測定したDCE-MRIパラメーターと抗血管新生処置により促進される効果から証明され、処置群とコントロール群の動物間の有意差が図７に示すように測定したKtrans、IAUCET、およびIAUCTにみられたが、MRI画像化時間は造影剤注射後少なくとも5分間続き、これは、乏血管性腫瘍におけるVEGFR阻害剤の治療効果をモニターするための提供した方法と物質の能力を確認した。
【０１１９】
さらに、最も関連することは、
本発明のDCE-MRI法で非侵襲性に測定したKtrans、IAUCET、およびIAUCTの測定値（実験の項の表AおよびBに要約している）は、腫瘍縁および腫瘍コアの両方で、本明細書で提唱した蛍光顕微鏡法により得られた減衰曲線下面積により組織学的に定量した血管(FITC-BSA)から浸出したアルブミンと統計的に有意な線形相関を示した。この点で、各測定パラメータに対応する各データカラムについて得られたピアソン係数および統計的有意差を該表に示し、試験した動物の腫瘍コアおよび腫瘍縁両方の回帰線を用いてプロットしたKtransの対応値に対するFITC-BSAの得られた組織学的推定値間の相関を図５および６に示す。
【０１２０】
特に、血管透過性の組織学的分析は、VEGFR阻害剤による処置が血管付近だけでなく、それより遠い距離（100〜200μm)でもアルブミン濃度の変化をもたらした。これらの結果に完全に一致して、Axitinib（登録商標）で処置後にB22956/1で測定したktrans値は、処置した腫瘍の縁で低く、処置腫瘍では経時的なIAUCET/IAUCTパラメーター値の低下もみられたが、MRI取得は造影剤注射後少なくとも５分間持続した。
【０１２１】
これに対し、表CおよびDに示すように、基準低分子非アルブミン結合造影剤として用いたMultiHance（登録商標)では有意な相関はみられなかった。
【０１２２】
上記は、本発明にしたがって選択した非共有結合タンパク質結合剤のクラスは、高分子溶質（例えばアルブミン）と同様のin vivo挙動、および適切な時間、同じかまたは良く似た薬物動態を示し、目的とする病的身体領域または組織内へのその送達を非侵襲性に測定するために好都合に用いることができることを証明する。したがって、同様に（記載したように、アルブミンを想定される目的とする高分子薬剤とみなすことにより）、それらを該組織または領域への目的とする高分子媒質の送達を非侵襲性に評価し、より一般的には、目的とする高分子薬剤によるその浸透性および局所環流の可能性に基づき病的領域を階層化するために好都合に用いることができる。
【０１２３】
確かに好都合であるのに加え、高分子溶質の有効なin vivoプロトタイプとして適度な低分子量を示すこれら物質を用いる可能性は実際に予期し得ないことである。
【０１２４】
この点で、実際に、適度な分子量を有する物質、例えば、B22956/1 (MW 1056.17)、MS-325 (MW 975.88)、およびGd AAZTA-デオキシコール酸ジナトリウム塩 (MW 1019.22)（非結合分画に対応するそのパーセンテージは、血液循環からきわめて急速に排泄される）が、血流中で顕著に異なる大きさ、構造、および持続性を有する高分子化合物、例えばアルブミン、もしくは少ないが高分子ペプチドまたは抗体誘導薬剤またはプロドラッグの送達と適切に相関する薬物動態パラメーターを提供しうることは予期し得ないことであった。この結果は、特に、血管コンパートメントに長時間止まり、次いで拡散性、抗原密度、抗原結合動力学、血管透過性、および用量などのパラメーターに強く依存する血管外腫瘍組織における分布を示すことが知られているこれらの後者に当てはまる(G.M. Thurber et al. ADV DRUG DELIVER REV 2008、60：1421？1434)。
【０１２５】
実際に、例えばEPR増強剤、すなわち腫瘍領域に同時投与した高分子薬剤の取り込みを増強する物質などの治療薬により促進される効果のin vivoの適切な推定値を提供するための本発明の非共有結合タンパク質結合造影剤の可能性を、ビークルまたはPaclitaxel(PTX)で処置したヌードマウスのメラノーマ癌モデル異種移植片に対する本発明の典型的物質として用いたB22956/1によるin vivoダイナミック造影増強MRI試験により検討した。この化合物は、実際に、適切なリンパ系の局所的欠如により生じる局所間質液圧（IFP)を減少させ、過剰な間質液圧により顕著に妨げられる腫瘍の高分子輸送の主なドライバーであると認識されている対流輸送を修復することにより固体腫瘍における薬剤送達を増強することができることが示されている(例えば、Paclitaxel Decreases the interstitial fluid Pressure and Improves Oxygenation in Breast Cancers in Patients Treated With Neoadjuvant Chemotherapy：Clinical Implications.  Simon N. Powell et al. J Clin Oncol 23：1951-1961；Delivering nanomedicine to solid tumors. Jain、R. K. & Stylianopoulos、T. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2010、7：653？664参照)。
【０１２６】
興味深いことに、PTXで前処置したマウス（皮下WM1552/5メラノーマを有する）を用いて行った腫瘍血管機能性のDCE-MRI評価は、PTX処置動物の腫瘍コアおよび腫瘍縁の両方でコントロールに比べて薬物動態および造影剤分布の有意な修飾を示した。
【０１２７】
特に、Paclitaxel（登録商標）で前処置した腫瘍で、ビークルのみを投与した腫瘍で測定された値より分画血漿容量fPVの％(％)およびKtrans値の統計的に有意な増加がみられ、これは、PTX処置により促進されることが知られている腫瘍環流および透過性の増加と完全に一致する。この点で、PTX処置後24時間の腫瘍縁およびコアで得られたf PV (％)およびKtransのDCE-MRI推定値のボックスプロットを図７に示す。実際に、PTX処置により促進される腫瘍環流の変化と完全に一致して、図7のプロットは、薬物動態パラメーター fPVおよびKtranの中央値がコアと縁の両方ともビークル群で低かったが、このEPR増強剤で促進された腫瘍環流の変化（該環流の増加）と一致してPTX前処置動物で増加が見られたことを示す。
【０１２８】
この点で、上記DCE-MRI法により計算した薬物動態パラメーター値を、カラースケールパラメトリック画像により、例えば図8に示す(対応するグレースケールとして)観察下の病的組織のMRI解剖学的基準画像と好都合に重ね合わせることができ、PTX前処置により促進された透過性の増加の空間的拡大、または同様に目的とする高分子溶質の送達の程度および深さの容易な可視化を可能にすることに注目すべきである。
【０１２９】
一方からのこの試験結果は、本発明の物質が可能にするKtrans推定値（病的組織内の）、および高分子溶質の送達および希釈の増加をもたらす物質により促進される効果から存在する顕著な一貫性を指示および確認し、これは、後者の推定値は前者の測定により得ることができることを示唆する。
【０１３０】
上記結果は、アルブミン送達の確実な推定値をもたらし、高分子送達に対するEPR増強剤による促進効果と一致することが示された本発明の非共有結合剤により示される薬物動態パラメーター、すなわちfPV、特にKtrans (および、さらに先に記載のIAUCTおよびIAUCET)が、例えば、目的とする高分子ペプチド、蛍光抗体、より一般的には抗体由来抗癌剤を含む、異なるクラスの高分子溶質の送達および拡散にも関連しうることを示唆する。
【０１３１】
次に、病的腫瘍領域内の抗体由来抗癌剤の分布の確実な推定値を得、組織の血管壁からの種々の距離におけるその蓄積を修飾するのに用いる物質による促進効果を評価するための、本発明の非共有結合（登録商標）結合造影剤の可能性を検討および証明するために実験の項の実施例５に詳述するさらなる実験を行った。該実験は、例えば、ビークルまたはPaclitaxel (PTX)で処置したNCR無胸腺ヌードマウス（各マウスのそれぞれ左および右脇腹に２移植片）に移植したヒト扁平上皮癌(A431)の腫瘍異種移植モデルに対し、Cetuximab（登録商標）を用いて行った。
【０１３２】
このために、Cetuximab（登録商標）(CTX)を抗体由来高分子薬剤の非限定的例として用い、蛍光顕微鏡による検出および定量を可能にする蛍光シアニン部分Cy5で標識し、B22956/1を本発明の造影剤の非限定的例として用いた。蛍光顕微鏡技術を、顕微鏡規模でCTXの分布を決定する感度と能力によりモノクローナル抗体 (mAb)送達を評価するための基準のゴールドスタンダードとして選択した。行った実験を例示および詳述する組織学的画像を図９に示す。
【０１３３】
B22956/1の動力学および分布に対するPTX処置の促進効果を、最初に本発明の方法により測定した。特に、Ktrans、fPV、EARLYAUCRATIO、LATEAUCRATIO、およびAVGENH値を、PTXおよびビークル処置後24時間でピクセル的に評価した。PTX処置マウスからピクセル的に測定し、対応する解剖学的MRI画像と重ね合わせた上記パラメーター値を示すパラメトリック画像を図10に示す（より明るいシグナルはより高いパラメーター値を示す）。結果の統計的評価に用いる筋肉およびAIF（動脈血）領域（ROI)を示すパネルも該図に示す。PTX処置およびコントロールマウスから得た上記薬物動態パラメーターの数値推定値を、実施例の表Gにまとめ、比較しているが、これらは、物質が促進することが知られている組織的（tissutal）拡散性に対する効果と一致する(PTX効果に対する上記引用文献を参照のこと)、Ktrans、LATEAUCRATIO、AUC20-30、およびAVGENHなどのパラメーターの統計的に有意な増加がPTX処置腫瘍で観察されたことを示す。
【０１３４】
より興味深いことに、上記結果は、蛍光顕微鏡により組織学的に測定したA431腫瘍異種移植片における標識Cetuximab（登録商標）(すなわちCy5-CTX)の浸出、特に分布と一致する。この点で、CTXの浸透および分布に対するPTXの促進効果を、シアニンCy5で適切に標識したCetuximab（登録商標）を用いて蛍光顕微鏡により評価した。顕微鏡画像を用いて、標識mAbにより染色された領域の量、および直近の血管壁からの染色領域の距離を定量した。
【０１３５】
特に、PTXおよびビークル注射後24時間の腫瘍中に蓄積する蛍光標識抗体Cy5-CTXの量を、蛍光組織学により血管壁からの距離に応じて測定した。得られた結果を図12に示す。図から解るように、PTX処置マウスにおいてコントロールに比べて、投与した蛍光標識抗体のより良いより均一な分布がみられ、コントロールでは血管周囲腔により大きなCTXの蓄積がみられた。
【０１３６】
したがって、非共有結合造影剤を用いて測定したDCEMRIパラメーターの増加と本発明の方法の間に実質的な一貫性がみられ、mAb由来CTXのより良好な分布がPTX処置腫瘍異種移植で組織学的にみられた。他方、実質的な一貫性は、腫瘍組織（tissutal）拡散率に対するPTXによる促進効果に関する関連文献がもたらす知見（例えば、F. Marcucci et al.、Advanced Drug Delivery Review 2011、64、53-68)と本発明の薬剤と方法を用いて測定した腫瘍生理学の修飾の間にも証明された。結論として、片側から得られた結果は、EPR増強剤による促進効果および抗癌剤、ならびに治療する腫瘍内へのその送達を促すEPR増強剤と組み合わせて使用する抗癌プロトコールの有効性を支持する。他方、該結果は、さらに興味深いことに、分子量の顕著な違い（したがって、身体系からの全身的クリアランス
の顕著な違い）にも関わらず、本発明により選ばれた非共有結合造影剤は、モノクローナル抗体由来抗癌剤の輸送と実質的に一致した数値DCE-MRIパラメーター、したがって、浸透抵抗腫瘍の非侵襲評価のための好都合な使用の実行可能性を提供することができることを示唆する。この後者の仮説をさらに裏付けるために、本発明によるDCE-MRI推定値を用いて、CTX標識薬剤に対する不十分または低下した浸透性を示す「好ましくない」すなわち「非浸透性」腫瘍(およびマウス)を、「好ましい」すなわち「浸透性」腫瘍と区別し、得られた結果を組織学的推定値と比較した。
【０１３７】
この点で、AVGENHを、そのロバスト性および試験しやすさから、本発明の薬物動態パラメーターの非限定的例として選んだ。その値を、全腫瘍容量をサンプリングするMRI画像のそれぞれで得た腫瘍ROIにおいてピクセル的に測定した。AVGENH＞57のピクセル（ここで、後者の値が記録したMRI画像の基準(筋肉)部位から決定した該パラメーターの閾値である）を「好ましい」または「浸透性」として同定した。AVGENH＞57の腫瘍のピクセルと重ね合わせた解剖学的画像を図11に示す。これは、腫瘍ROI内の「好ましい」ピクセルの量と分布の正しい評価に同意する。
【０１３８】
次に、投与したmAbの輸送を、AVGENH値＞57のすべてのピクセルの分画として該分析した腫瘍において評価した。特に、カットオフ値を0.5に固定して（該閾値を超えるピクセルの数が少なくとも総腫瘍ピクセルの50％と等しい腫瘍に対応する）、0.5より高い「浸透性」ピクセルの分画を有する腫瘍を「好ましい」または「浸透性」と同定し、より低い分画をもたらす腫瘍を「好ましくない」または「非浸透性」と定義する。得られた結果を図13に図示する。ここでは、閾値を超えるピクセル（試験した各腫瘍の）分画を蛍光顕微鏡により測定した対応する腫瘍中の抗体の量（fAUC）を比較している。図が示すように、統計的に有意な相関が、AVGENH＞57およびfAUC350.550の測定値 (傾斜線、p値＜0.01、Parson相関検定)のピクセルの分画、したがって組織学的に測定した浸出したCTXの分布を有するピクセルの分画にみられた。実際に、「好ましい」腫瘍(白色ドットは、AVGENH＞57の0.5を超えるピクセルの分画であった)は、「好ましくない」もの(垂直線はカットオフ値を示す)に対してfAUC350.500のより高い値を示した。
【０１３９】
これらの結果は、提案する造影剤、および「好ましい」または「浸透性」腫瘍を、処置する腫瘍部位における不十分または低下した浸透により抗体由来薬剤の処置に抵抗性を示す「好ましくない」腫瘍と区別する方法を用いる実行可能性と一致する。
【０１４０】
に対し、PTX処置マウスおよびコントロールマウスともに記録したシグナルが（おそらく検出可能な領域の状況により）かなりの強度であったことにより、ビークル処置腫瘍またはPTX処置腫瘍を区別するin vivo光学的画像化技術の使用、および腫瘍部位内のCy5-CTX 分布に対するこの後者の効果の評価は、いかなる有意な結果ももたらさなかった。
【０１４１】
上記のすべてから、本発明により確認された非共有結合性アルブミン結合造影剤のクラスは、比較的低分子量であるが、目的とする腫瘍領域、部位組織、または塊内への特に抗癌剤またはプロドラッグなどの高分子溶質の送達の評価への使用を示唆することができる。
【０１４２】
さらに、得られた結果は、さらに、高分子薬剤、例えばモノクローナル抗体もしくは抗体断片に基づく薬剤またはプロドラッグを用いる抗癌療法の有効性をモニターし、および抗癌剤を、処置する腫瘍内へのその送達に有利に作用するEPR増強剤と組み合わせて用いる抗癌プロトコールの有効性を評価するための本発明のアルブミン結合造影剤およびDCE-MRI法の有効性を示唆する。
【０１４３】
さらに、本発明の薬剤およびDCE-MRI法は、例えば、カットオフ線の左側のマウスにより図13のスキーム内に示された、浸透抵抗病状、特に固体腫瘍、および高分子抗癌剤またはプロドラッグ、および特に抗体由来薬剤による治療からの利益がほとんどない患者を、例えば、カットオフ線の右側のマウスにより図13のスキーム内に示す治療する腫瘍の間質におけるこの後者の浸出および深い拡散の基礎となる該病状の存在により、高分子抗癌剤による処置に適合する患者から同定および層別化するための使用を示唆することができる。
【０１４４】
したがって、本発明のさらなる目的には、DCE-MRI技術の使用により目的とする病的身体領域、部位、組織、または固体塊へのモノクローナル抗体または抗体断片に基づく抗癌剤、またはプロドラッグの送達の非侵襲性in vivo評価のための、85％またはそれ以上、好ましくは90％以上のヒト血清アルブミンとのin-vivo非共有結合を示す分子量800〜5,000 Daの常磁性造影剤の使用が含まれる。
【０１４５】
さらに、さらなる態様によれば、本発明は、さらに、その工程のいずれか、例えば臨床または治療試験において、高分子薬剤またはプロドラッグを用いる治療計画、または「陽性」または「応答性患者」を「陰性」または「非応答者」患者から区別し、または抗癌剤またはプロドラッグの効果もしくはアジュバント薬剤の相乗効果、または腫瘍組織中の高分子分布のプロセスに関連するあらゆる他の標的生物学的エンドポイント（TBE）を評価するための、本発明の造影剤およびDCE-MRI法の使用を含む、予測的、前臨床もしくは臨床、または治療プロトコールに関する。
【０１４６】
本発明の非共有結合性アルブミン結合常磁性造影剤およびその生物学的に許容される塩は当該分野で知られており、既知の合成法を用いて当業者が製造することができる。それらは、その医薬的に許容される組成物に適用される。
【０１４７】
非限定的例として、AAZTA-デオキシコール酸のガドリニウム錯体の製造を実施例１に示す。
【０１４８】
本発明の造影剤は、好ましくは、0.001〜1.0 M、より好ましくは0.01〜0.5 Mの濃度で、pH6.0〜8.5の無菌水性溶液として製剤化された、本発明の常磁性造影剤またはその生理学的に許容される塩を生理学的に許容される担体と共に含む注射可能な医薬組成物の形で必要とする患者に適切に投与することができる。これら組成物は、例えば非経口投与、最も好ましくは静脈内投与もしくは動脈内投与できる状態に製剤化される。あるいはまた、これら製剤を凍結乾燥し、使用前に再構成することができる。
【０１４９】
一般的および具体的には、投与が静脈内または動脈内である場合は、医薬組成物は、ボーラスで、または時間内に分離した２用量またはそれ以上で、または一定もしくは非線形流注入として供給することができる。
【０１５０】
本発明のDCE-MRI法および実施に関するさらなる詳細は、単に本発明をよりよく例示するために以下の実験の項に記載するが、それに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１５１】
[[6-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-6-[5-[[(3β,5β,12α)-23-カルボキシ-7-ヒドロキシ-24-コラン-3-イル]アミノ]5-オキソペンタ-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4-(5H)-ジアセテート(5-)]ガドリネート(2-)]２ナトリウム (Gd AAZTA-デオキシコール酸２ナトリウム塩)の製造
Gd AAZTA-デオキシコール酸塩の製造を、下記スキーム１に記載の合成方法を用いて行った。
【０１５２】
スキーム1
2018188448.tif 000006
（deoxycholic（デオキシコール酸））
【０１５３】
スキーム１は主要工程として以下のものを含む：
a) 6-[ビス[2-[(1,1ジメチル)エトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-6-[5-[[(3β,5β,12α))-23-(メトキシカルボニル)-7-ヒドロキシ-24-コラン-3-イル]アミノ]5-オキソペンタ-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4-(5H)-ジ酢酸ビス[(1,1-ジメチル)エチル]エステル (3)
(3β,5β,12α))-3-アミノ-12-ヒドロキシコラン-24-酸メチルエステル 1 (7.3 g、18.0 mmol；WO95/32741に記載のごとく製造した)、2 (11.0 g、16.4 mmol、WO2008/071679に記載のごとく製造した)、およびN-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt) (2.21 g、16.4 mmol、Product Aldrich、art. 157260)を、CH2Cl2 (105 ml)に溶解し、0〜5℃に冷却し、次いで、CH2Cl2 (60 ml)中のN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)の溶液 (3.71 g、18.0 mmol；Product  Merck、art. 802954)を40分間かけて加えた。0〜5℃で２時間および室温で22時間後、サスペンジョンを濾過し、容量を半分に濃縮し、次いでsat.NaHCO3 (3 x 30 ml)およびH2O (2 x 30 ml)で洗浄した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、濾過し、次いで蒸発させた。粗物質(17.1 g)をフラッシュクロマトグラフィ (Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) (Merck KGaA art. 109385)カラム h = 20 cm、φ = 10 cm；溶離剤 97 ：3 CHCl3/MeOH ) で精製して目的とする化合物3 (13.36 g；12.6 mmol)を固体として得た。収率77％
分析データ 
Mr：1059.49 (C59H102N4O12)
HPLC：90.8 ％ (面積％) 
1H-NMRおよび13C-NMR(CDCl3)は予期した構造と一致する。
b) 6-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-6-[5-[[(3β,5β,12α))-23-カルボキシ-7-ヒドロキシ-24-コラン-3-イル]アミノ]5-オキソペンタ-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4-(5H)-ジ酢酸 (AAZTA-デオキシコール酸)の製造
【０１５４】
2M NaOH (74.5 ml、149 mmol)をi-PrOH (30 ml)中の化合物3 (12.6 g、11.9 mmol)の溶液に加え、該溶液を室温で24時間、次いで55℃で30時間攪拌した。溶液のpHを、37％HClを加えて7.7に調整し、次いで該溶液を蒸発させて残渣を得、次いでH2O (50 mL)に溶解した。粗リガンドを37％ HClを加えてpH3で沈殿させ、ろ過し、次いでH2Oで洗浄した（洗浄物のpHが中性になるまで）。得られた粗酸(8.1 g)を1N NaOHを加えてpH 6.9としたH2O (30 mL)に溶解し、次いでクロマトグラフィで精製した(Amberchrome CG161樹脂、溶離剤：勾配H2O/CH3CN。目的とする生成物を3：2 H2O/CH3CNで回収した。)。該生成物を含む分画を回収し、濃縮してCANを除去し、次いでHCl 37％でpH 3に酸性化した。沈殿物をろ過し、H2O (洗浄物のpHが中性になるまで)で洗浄し、次いで乾燥して(30℃および15 mbar)白色固体の目的とする酸を得た(4.78 g；5.8 mmol)。収率49％。
分析データ 
Mr：821.02 (C42H68N4O12)
HPLC：89.1 ％ (面積％) 
1H-NMRおよび13C-NMR：(D2O/KOD)は予期した構造と一致する。
錯滴定価：(0.01 M CuSO4)：93,4 ％
KF：5.17 ％.
【０１５５】
c)[[6-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-6-[5-[[(3β,5β,7α)-23-カルボキシ-7-ヒドロキシ-24-コラン-3-イル]アミノ]5-オキソペンタ-1-イル]-テトラヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン-1,4-(5H)-ジアセテート(5-)]ガドリネート(2-)]２ナトリウム塩 (Gd AAZTA-デオキシコール酸)の製造。
【０１５６】
AAZTA-デオキシコール酸 (2.0 g；2.31 mmol)をH2O (pH 3.8)に懸濁し、1N NaOHを加えてpH 4.1で溶解し(2.7 ml；2.7 mmol)；Gd(acac)3 (1.05 g；2.31 mmol；Alfa ？Aesar art.013204より供給)を分けて加え、錯体化をHPLC-ELSD (別表1参照)およびキシレノールオレンジアッセイでモニターした。2,4-ペンタンジオンをCH2Cl2 (3 x 150 ml)で抽出し、水性相を濃縮し、0.1 N NaOH (19.2 ml；1.92 mmol)を加えてpH 6.5に調整し(総NaOH 4.62 mmol、2当量)、次いで凍結乾燥して白色固体の目的とする錯体２ナトリウム塩を得た(2.3 g；2.26 mmol)。収率98 ％。
分析データ 
Mr：1019.21 (C42H63GdN4Na2O12)
HPLC-ELSD：99.7 ％ (領域 ％) (下記参照)
MS：提唱した構造と一致。
C42H63GdN4Na2O12に対する元素分析(％)
2018188448.tif 000007
クロマトグラフィ法 リン脂質RXSIL
固定相：Zorbax RX-SIL、4.6 mm ID x 250 mm (5μm)
温度：40 ℃
移動相：勾配溶出
A： CH2Cl2/CH3CN/CH3OH/25％ NH4OH        237：237：25：1 (v/v)
B： CH2Cl2/CH3CN/CH3OH/H2O/25％ NH4OH    150：150：125：70：5 (v/v)
流速：1.2 mL/min
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【実施例２】
【０１５７】
常磁性錯体とヒト血清アルブミンとの結合の測定（結合パーセント(％)として）
結合(％)をWhitlam JB、Brown KF Ultrafiltration in serum protein binding determination. J. Pharm Sci. 1981；70：146-150； Bowers WF、Fulton S、thompson J. Ultrafiltration vs equilibrium dialysis for determination of free fraction. Clin Pharmacokinet. 1984；9：49-60に記載の遠心限外ろ過法により測定した。
【０１５８】
材料と方法
B22956/1 (Bracco Imaging S.p.A.,例えばWO00/37738に記載のごとく製造)
Gd AAZTA-デオキシコール酸２ナトリウム塩 (Bracco Imaging S .p.A.)
Seronorm（登録商標）Human (Nycomed Phama)
【０１５９】
一般的手順
アルブミン血清タンパク質結合を、ヒト血清溶液中で分析した(Seronorm Human、Nycomed Phama)。各錯体を0.5 mMのGd(III)イオン濃度で加えた。該溶液を、Innova 4230インキュベーターシェーカー(New Brunswick Scientific、Edison NJ USA)中で37℃に維持した限外ろ過再生セルロース膜(30KDa MWCO)を装着したAmicon超遠心分離器中でインキュベーションした。37℃で10分間、試料をインキュベーションし、次いで、限外ろ過を行った。Gd(III)-錯体結合のパーセント(％B)を下記式により決定した：
％B=[(Ct-Cf)/Ct]*100
［式中、Ctは、インキュベーションした溶液中の総Gd(III)量である。Cfは、浸透溶液中に見られる遊離Gd(III)錯体である。平均結合分画をトリプリケートで行った限外ろ過実験から評価した。各Gd(III)-錯体と限外ろ過膜の非特異的相互作用を各錯体の水性溶液を用いて行った回収実験から排除した。
【０１６０】
実施例Ａ．血清タンパク質に結合したB22956/1のパーセント(％B)。
B22956/1の溶液を、31.8 mgの錯体をmilliQ水(1 mL)に溶解して調製し、次いで、電子レンジ (25.07±0.41 mM)中で硝酸中で試料を消化した後、Gd(III)の量をICP-MS分光計(Elan 6000、Perkin Elmer)で定量した。
上記溶液(0.300 mL)を15 mLの再構成ヒト血清に加えた。限外ろ過前に、Gd(III)量 (Ct)を誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)で測定するために該溶液(0.5 mL)を回収した(0.460 mM±0.015)。調製した溶液(4.5 mL)を混合し、インキュベーター振盪器中で37℃に加熱し、37℃で10分間インキュベーションした後、再生セルロース膜(30KDa MWCO)を用いて限界ろ過した。タンパク質不含浸透溶液(0.4 mL)を回収し、CfをICP-MS分析により測定した。限外ろ過手順をトリプリケートで反復した。
【０１６１】
2018188448.tif 000009
【０１６２】
2018188448.tif 000010
【０１６３】
実施例Ｂ．血清タンパク質に結合したGd AAZTA-デオキシコール酸２ナトリウム塩パーセント(％B)。
Gd-AAZTAデオキシコール酸ナトリウム塩の溶液を20.8 mgの錯体をmilliQ水(0.63 mL)に溶解して調製した。ICP-MSにより測定したGd(III)の量は、26.06mM (S.D.：1.13 mM)であった。該溶液(0.290 mL)を15 mLの再構成ヒト血清に加え、0.5 mLを限外ろ過前に回収し、総Gd(III)を評価した(Ct=0.464 mM、SD：0.014 mM)。
AAZTAベースのGd錯体の血清タンパク質との結合相互作用を先の実施例に記載のごとく測定した。
【０１６４】
2018188448.tif 000011
【実施例３】
【０１６５】
非共有結合性タンパク質結合造影剤およびDCE-MRI画像化技術を用いる腫瘍中の高分子輸送の定量
動物
Harlan Laboratories S.r.l.、S. Pietro al Natisone (UD)、Italyから購入した20 NCR無胸腺ヌードマウスを用いて実験を行った。
動物を用いるすべての手順は、実験動物の管理と使用に関する指針、および国内法および国際法 (L.D. 116/92；承認n.19/2008-A（Italian Ministry of Healthにより2008年3月6日に発行）；EEC Council Directive 86/609CEE、およびEEC Council Directive 2010/63/EU)に従って行った。
【０１６６】
腫瘍細胞培養および移植片の調製
ヒト前立腺アデノカルチノーマ細胞(PC-3)をATCC (American Type Culture Collection)から得、10％ウシ胎児血清、2 mMグルタミン、100 IU/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン添加Hams F-12培地(すべてLonza、Verviers、Belgiumから購入)で増殖させた。次に、PC-3細胞を回収し、PBSで2回洗浄し、5ｘ106個の細胞を0.1 mLリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再浮遊させ、5週齢の雄マウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍の発達を、実験終了まで2〜3日毎に触診し、キャリパーで測定した。腫瘍体積を、式：(π/6) x (L x W)3/2［式中、LおよびWは腫瘍の最大長および最大幅である。］で測定した。平均腫瘍体積が400〜600mm3に達し、最初の薬剤処置をする比にマウスを２群（処置およびコントロール）に無作為に割り振った。
【０１６７】
Axitinibによる抗血管新生処置
Axitinib（登録商標）(LC Laboratoires、Woburn、MA、USA)をポリエチレングリコール400に5mg/mLで懸濁し、室温で10〜20分間超音波処理して微細なサスペンジョンを得た。該サスペンジョンのpHを0.1 N HClで2〜3に調整し、次いで２回目の超音波処理を行った。酸性水(pH 2〜3)を加えて、ポリエチレングリコール400：H2Oの最終比を3：7 (v/v)とした。注射できる状態の溶液を4〜5日間毎に新たに調製し、暗所に4℃で保存した。Axitinibを25mg/kgの用量（5 mL/kgの投与容量に対応する）で腫瘍保持マウスに腹腔内注射により毎日投与した。コントロールマウスには、被験物と同じ投与容量のビークル溶液 (30％ ポリエチレングリコール 400：70％酸性水、pH 2〜3)を毎日腹腔内注射した。
動物を連続７日間処置した。
【０１６８】
実験プロトコール
造影剤および薬剤処置を下記表１に示す用量および容量で行った。
Axitinibによる６日間の処置期間の開始時および終了時に、コントロール群および処置群の各動物を、MultiHance（登録商標)（非アルブミン結合化合物、基準として使用）で最初に、24時間後にB22956/1でMRI画像化した。
実験タイミングのスキームを図1に示す。すなわち、第0日は、Axitinibによる処置開始日であり、第6日は処置最終日であり、Axitinib（登録商標)処置開始前日、すなわち、第-1日は、MultiHance（登録商標)による画像化日であり、第7日は、組織学的検査用に腫瘍を摘出した日である。
【０１６９】
2018188448.tif 000012
【０１７０】
DCE-MRI実験
MR画像化実験中は、動物を33％O2および66％N2Oを混合したイソフルオランガス（約1％）で麻酔した。該実験中は、呼吸数に応じてガスレベルを調整し、麻酔を維持した。
造影剤を、動物の尾静脈に取り付けたカテーテルから約1 mL/minの注射速度で静脈内注射した。
【０１７１】
DCE-MRI画像化プロトコール
MR実験は、BGA12S2勾配コイル(内径12cm)を装着した小動物実験専用の3Tで操作するBioSpec-Bruker分光計を用いて行った。
冠状および軸方向Rare T2強調画像を、腫瘍塊を検出するための良好なコントラストの高い解像度を得るために最適化したパラメーターを用いて得た。
プレコントラスト局所縦緩和時間(T1)を、以下のパラメーター：マトリクス256x128x8、スライス厚1.875 mm、FOV 3x3 cmを用い、造影剤注射前に、種々のフリップ角θ (FA=5〜90°)で3D FLASH MR画像 (Fast Low Angle Shot、TR約6〜7ミリ秒)を得ることにより測定した。２つの飽和バンドをフローアーティファクトを避けるために測定したスライスの直上および直下においた。
【０１７２】
T1値を下記式の曲線フィッティングにより決定した。
2018188448.tif 000013
［式中、TRは、繰り返し時間、T1は縦緩和時間である。S(θ)はフリップ角θで得られるシグナルである。kは、プロトン密度およびレシーバーゲインを考慮した比例コントラストである。
5初期プレコントラストおよび約315ダイナミックポストコントラスト画像からなるダイナミック3D FLASH (FA=20°、TR約6〜7ミリ秒、取得時間約7.5s)を造影剤 B22956/1注射時に得た(スキャン時間45 min)。5初期プレコントラストおよび約235ダイナミックポストコントラスト画像を造影剤MultiHance（登録商標）注射時に得た（スキャン時間30min)。
２つの飽和バンドをフローアーティファクトを避けるために測定したスライスの直上および直下においた。
【０１７３】
組織学的プロトコール
最後のMRI取得時に、蛍光色素溶液(FITC-アルブミン、10 mg/mL、Sigma-Aldrich)を、100 mg/kgの用量 (投与容量：10 mL/kg)で尾静脈に注射した。注射して20分後にマウスを頸椎脱臼により屠殺した。切除した腫瘍を頭/尾方向に３片にカットした。
試料を4％ホルマリンで一夜固定し、次いで、30％蔗糖生理食塩水溶液で一夜インキュベーションした。最後に、試料をOCT (最適切断温度)化合物中に包埋した。全部の組織ブロックを液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結した。
約1600の5μm厚凍結切片(選択した組織学的切片)をOCTブロックから得た。5隣接切片(25μm)を、MR画像に用いたものとほぼ並行な面で腫瘍塊の中心片から100μm毎にカットした。
アルブミン-FITC可視化のために、切片を2％中性緩衝ホルマリンで10分間固定し、0.1 Mグリシンを加えたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で20分間洗浄し、次いでマウント用媒質にマウントした。
各動物から、10倍の倍率で約70画像を、例えば図2に示すように腫瘍の縁およびコア部位の選択した組織切片からサンプリングした。縁を、腫瘍切片の1mm周辺端部と定義した。コアは、腫瘍切片の中心部分に対応する。
組織学的画像を、Leica蛍光顕微鏡DM2500およびBiology LaboratoriesのLASソフトウエアを用いて捕捉した。
【０１７４】
DCE-MRIデータ分析
目的部位(ROI)を取り出し、シグナル強度を、血液(下大静脈または腹大動脈の)、および腫瘍縁(腫瘍の1mm周辺端部)、腫瘍コア(腫瘍の中心部分)、および全腫瘍部位について記録した。次に、２種類の分析を、本発明のDCE-MRI法が提供する２つの異なる実施手順に従って実施した。
1. 腫瘍中の時間に応じたシグナル増強および造影剤濃度のモデルフリー分析。
2. ２コンパートメント薬物動態モデルに基づく時間に応じた（３切片）縦緩和時間分散（変動）の薬物動態（モデル化）分析。
最終分析結果は、例えば表ＡおよびＢに示す腫瘍から得た各ＭＲＩスライスについてモデルフリーおよび薬物動態パラメーターの両方を含むデータセットであった。
画像を、WindowsコンピューターでパブリックドメインNIH画像Jプログラム(U.S. National Institutes of Healthが開発し、例えばインターネットのhttp：//rsb.info.nih.gov/nih-image/から利用可能)を用いて分析した。収集した画像データをPhyton scriptにより加工した。統計分析は、SPSS (SPSS、Inc.、Chicago IL)を用いて行った。
【０１７５】
造影剤濃度の推定
腫瘍部位および血液のプレコントラストR1値を、変動フリップ角FLASH画像から測定した。該方法は、θに応じたS(θ,i,j)の測定値の線形型のピクセルについての最小二乗フィッティングからなった（ここで、S(θ,i,j)は、θに等しいフリップ角でピクセル (i,j)で測定したシグナルである。）。
腫瘍ROIおよび血液のポストコントラストR1値は、下記式を用いて造影剤投与の前および後に得られたダイナミック3D画像の平均プレコントラストR1値および平均シグナル強度からROIについて計算した。
2018188448.tif 000014
2018188448.tif 000015
［式中、R1(ROI,t)は、ROI ROIについて時間ｔで計算した平均R1である。S(ROI,t)は、ROI ROIについて時間ｔで計算した平均シグナル強度である。Spre(ROI)は、プレコントラスト注射画像からROI ROIにおいて測定した平均シグナルである。R1プレおよびポストコントラストを評価したら、時間に応じた平均CA組織濃度を周知の関係により計算する。
2018188448.tif 000016
［式中、r1,CAはCA緩和能である。CCA(ROI,t)は、時間ｔでROI ROIについて測定した造影剤濃度である。］
【０１７６】
モデルフリー時間分析
時間濃度曲線下初期面積(IAUCT)を用いて、腫瘍微小血管系を特徴づけた。IAUCTを、造影剤注射後最初の1、5、10、15、20、および30分間の造影剤濃度とシグナル増強の台形積分を用いて種々の時点で計算した。
2018188448.tif 000017
［式中、IAUCTは、注射後最初のT分間で計算したIAUCである。F(i)は、ダイナミック時点ｉにおける造影剤の組織濃度またはシグナル増強である。tiは、時点ｉの時間である。Ｎは、ti＝T前の最終時点である。t0は最初の注射後時点と定義した。］
以下において、IAUCTは、注射後最初のＴ分間で計算した造影剤濃度曲線下初期面積を表し、IAUCETは、シグナル増強曲線に基づくが同じ計算値を表す。
【０１７７】
薬物動態モデル
2つのコンパートメント薬物動態モデル(Daldrup H、et al.、1998 Correlation of Dynamic Contrast Enhanced MR Imaging with Histologic Tumor Grade：Comparison of Macromeleuclar and Small-Molecular Contrast Media. AJR；171：941-949；Tofts P.S. et al、1999、Estimating Kinetic Parameters From Dynamic Contrast-Enhanced T1-Weighted MRI of diffusible Tracer：Standardized Quantities and Symbols. JMRI；10：223-232(これらの内容は本明細書の一部を構成する))を用い、腫瘍組織中の造影剤媒質の動力学的挙動を説明し、腫瘍中の血管外細胞外腔(EES)と血漿の間の交換の動力学を正確に説明した。
【０１７８】
血管終末を含む場合の目的とする組織中のCAの動力学的挙動を説明する微分方程式を以下に示す。
2018188448.tif 000018
(1)
３つのパラメーターを解析する微分方程式を以下に示す。
2018188448.tif 000019
［式中、Ctis(t)およびCP(t)は、それぞれ腫瘍組織および血漿中の時間に応じたガドリニウム濃度である。Ktransは移動定数である。Kepは速度定数である。fPVは分画血漿容量である。］
Ktrans、Kep、およびfPV値は、常套的線形最小二乗包を用いてDCE-MRIデータから推定することができる(例えば、Kenya Murase、2004、MRM；51：858-862、および上記文献参照)。
この点で、特記しない限り、Ktransは本明細書ではkTranまたはkTrans mL＼(min x g) x 100ともいう（後者は単位測定を表す場合である）。また、fPVは本明細書ではfPVまたはfPV(％)ともいう。
【０１７９】
組織学的画像分析
血管密度は、下記の閾値に基づく分割法を用いる目的とする組織中のアルブミンで染色された面積のパーセンテージとして定量し、さらに、FITC-アルブミンの溶出分画による蛍光を局所微小血管の透過性を特徴付けるために定量した。
【０１８０】
セグメンテーション法
RGSヒストグラムを、画像コントラストを増加させるために伸張し、次いでRGBピクセル強度を下記輝度式を用いて8ビットグレースケールに変換した。
輝度値＝0.3赤色＋0.59緑色＋0.11青色
血管に対応するピクセル（血管ピクセル)をOtsu閾値アルゴリズムにより分割した。外分割結果は、我々組織学者により内部的に実証された。
血管領域を、血管ピクセルが占める視野のパーセンテージとして計算した(FITC−アルブミン陽性領域％)。
【０１８１】
浸出定量
腫瘍組織中のFITC-アルブミン分布を分析するために、FITC-アルブミン蛍光を、各画像について直近の血管に対して一定の距離にあるすべてのピクセルについて平均化し、該直近の血管からの距離に応じて保存した(蛍光減衰曲線)(Daldrup H、et al.、1998 Correlation of Dynamic Contrast Enhanced MR Imaging with Histologic Tumor Grade：Comparison of Macromolecular and Small-Molecular Contrast Media. AJR；171：941-949)。浸出FITC-アルブミンの総量を1〜200μm蛍光減衰曲線下面積により定量した(FITC−Alb. 減衰AUC(1-200μm))。
統計分析
DCE-MRI推定値と組織学的パラメーターの間に存在する相関を評価するために、ピアソン相関を、MRIパラメーター：kTrans、fPV、IAUCE1、IAUCE5、IAUCE10、および組織学的：FITC−アルブミン陽性領域％、FITC-Alb.減衰AUC(1-200μm)のそれぞれについて計算した。p-値＜0.05を統計的に有意とみなした。
結果
腫瘍縁およびコアにおいてガドコレチン酸３ナトリウム塩を用いて得られた蛍光顕微鏡画像およびMRI画像化に基づく結果から得られたアルブミン分布の組織学的推定値、およびピアソン相関をそれぞれ下記表AおよびBにまとめる。表Eは、表AおよびBのラベル定義を示し、組織学的およびMRI誘導推定値からコアおよび縁の両方に存在する統計的線形相関を確認する。表CおよびDは、造影剤MultiHance（登録商標)を用いて得られたデータを示し、この造影剤を用いてDCE-MRIと組織学的データの間に相関はみられなかった。
【０１８２】
特に、この４つの表は、試験した動物のそれぞれについて腫瘍縁(表AおよびC)およびコア(表BおよびD)における造影剤投与後5、10、20、および30分間の本発明のDCE-MRI法により推定したパラメーター値を報告および比較し、浸出したアルブミンを、FITC-BSAを用いて蛍光顕微鏡により同じ動物において組織学的に定量した。B22956/1を用いて測定したMRIに基づくパラメーターと浸出アルブミンの量の間の相関のグラフを図５および６に示す（各腫瘍について腫瘍縁およびコアで測定したFITC-Alb.減衰AUC(1-200μm)の値をkTransに対してプロットした）。
それぞれ測定したパラメーターに対応するDCE-MRIデータ欄のそれぞれについて得られたピアソン係数は示した表に含まれ、B22956/1を用いて得られたDCE-MRIに基づく値と組織学的データの間に存在する統計的線形相関を確認する（これは、さらにp値が常に0.05未満であることにより確認された）。造影剤 MultiHance（登録商標)を用いて統計的に有意な相関はみられなかった。
【０１８３】
2018188448.tif 000020
【０１８４】
2018188448.tif 000021
【０１８５】
2018188448.tif 000022
【０１８６】
表Ｄ．造影剤MultiHance（登録商標）を用いて腫瘍コアで測定した組織学的およびＭＲＩ生データ。
2018188448.tif 000023
【実施例４】
【０１８７】
皮下にWM1552/5を有するヌードマウスにおけるPaclitaxel（登録商標）による前処置効果を評価するための本発明の非共有結合性タンパク質結合造影剤の使用
細胞株
患者のメラノーマ由来ATCC WM15 (Silini A、et al. Regulator of G-protein signalling 5 (RGS5) protein：a novel marker of cancer vasculature elicited and sustained by the tumor's proangiogenic microenvironment. Cell Mol Life Sci. 2011 DOI 10.1007/s00018-011-0862-8)メラノーマ細胞株を、10％加熱不活化ウシ胎児血清(Sigma、St. Louis、MO、USA)および1％ L-グルタミン(Gibco)添加RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640)(Gibco、Paisley、UK)中で培養し、37℃で5％CO2の加湿雰囲気下で維持した。対数増殖期の細胞を回収し、繰り返し洗浄し、注射前に無血清培地に再浮遊させた。
【０１８８】
マウスおよび異種移植腫瘍モデル
Harlan (Correzzana、Italy)から得た6〜8週齢の雌NCr-nu/nuマウスを、特定病原体未感染条件下で維持し、全試験を通して無菌操作した。動物を含む手順およびその管理は、実験動物の管理と使用に関する基準に関する上記国内法および国際法および指針に従って行った。WM1552/5細胞(2x106個)を腫瘍が約100〜150mgに達した時に処置のために無作為化したヌードマウスの右脇腹に皮下注射した(N＝10〜12／群)。
【０１８９】
薬剤
PTX (Indena S.p.A.、Milan、Italy)を50％ Cremophor EL (Sigma)および50％エタノールに溶解し、使用直前にさらに生理食塩水で希釈した。PTXを20mg/kgの用量で静脈内(i.v.)注射した。
【０１９０】
MRI画像化
試薬
B22956/1 (Bracco Imaging S.p.A、WO 00/38738に記載のごとく得た)をMRI造影剤として使用した。
【０１９１】
In vivo DCE-MRI画像化
PTXおよびビークル処置したWM1552/5メラノーマ異種移植保持ヌードマウス(N=4、マウス／群)をPTX投与後24時間にDCE-MRIで分析した。環流および透過性が病変のサイズの影響を受けるのを避けるため、PTXおよびビークル処置腫瘍の体重を一致させた(それぞれ、平均＝603 mgおよび503 mg)。磁気共鳴画像化スキャンを、7 Tesla/30cm磁石および35mmバードケージRFコイルを装着した、小齧歯類専用のBioSpec AVIIIシステム(Bruker BioSpin)を用いて行った。スキャンの継続時間を通して、動物を麻酔制御下においた(約30％ O2、70％ N2、および0.8〜1％イソフルラン)。腫瘍の血管新生を、本発明の造影剤の非限定的例としてB22956/1 (Bracco Imaging SpA) 0.1 mmol/kgを注射した後に得られた、以下のパラメーターを用いる74トランスバーサルFLASH (Fast Low Angle SHot) 2次元(2D) T1強調スキャンを含むダイナミックコントラスト増強(DCE)系により観察した：TR/ TE 100/3.5 ms、フリップ角(FA) 90°、マトリックスサイズ128 x 256、視野2.5 x 2.5 cm2 (面内解像度約200 x 100 mm2に相当する)、6スライス、2 mm厚、取得時間59秒/画像。同じパラメーターを用いる１スキャンをCA注射前に行った。腫瘍中のプレコントラストT1値を、多スライス可変フリップ角FLASHを用いて測定した。すべてのMRI実験の画像2D再構築を、スキャナーソフトウエアParaVisionを用いて行った。画像後処理およびデータ分析は、画像J下で操作する社内開発手順により行った(Abramoff、M.D.、Magalhaes、P.J.、Ram、S.J. 「Image Processing with ImageJ」. Bio光子ics International、volume 11、issue 7、pp. 36-42、2004)。得られた推定値を図7にボックスプロットで示す。図７は、PTX処置腫瘍のコアおよび縁の両方におけるDCE-MRI-推定B22956/1分画血漿容量fPVおよび移動係数の増加を示す。
【０１９２】
統計分析
造影剤(DCE-MRI)の分布の動力学的差をMann Whitney U検定で分析した。
【実施例５】
【０１９３】
ビークル処置またはPaclitaxel前処置した皮下A431保持ヌードマウスにおける抗体由来抗癌剤の輸送を評価するための本発明の非共有結合性タンパク質結合造影剤の使用
動物
8匹の雌NCR無胸腺ヌードマウス（Harlan Laboratories S.r.l.、S. Pietro al Natisone (UD)、Italyから購入）を用いて実験を行った。動物を含むすべての手順とその管理は、実験動物の管理と使用に関する上記国内法および国際法および指針に適合する企業指針に基づいて実施した。
【０１９４】
腫瘍細胞培養および腫瘍移植片
ヒト扁平上皮癌細胞株(A431)(ATCCより供給)を、10％加熱不活化ウシ胎児血清(Lonza、Verviers、Belgium)、2mM グルタミン(Lonza、Verviers、Belgium)、100 IU/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン(Lonza、Verviers、Belgium)を添加したDMEM (Dulbecco改良Eagle培地)高グルコース培地(4.5g/Lグルコース)中で培養し、37℃、5％CO2の加湿雰囲気下で維持した。対数増殖期の細胞を回収し、PBSで2回洗浄した。2×106個のA431細胞を0.1 mL PBSに再浮遊させ、6週齢の各雌マウスの右および左脇腹に皮下注射した。腫瘍の発達を、接種後毎日、最初は触診で、腫瘍塊が確認されたらキャリパーで屠殺の日まで追跡した。マウスを、キャリパーで測定した腫瘍直径が7〜8mmに達した最初の薬剤処置日に無作為に2群（処置およびコントロール）に振り分けた。
【０１９５】
薬剤
Paclitaxel（登録商標）(PTX)(Indena S.p.A.、Milan、Italy)：PTX溶液を、実施例4に記載のごとく50％Cremophor ELおよび50％エタノールを用いて調製し、さらに使用直前に生理食塩水で最終濃度2mg/mLに希釈した。PTXを、20 mg/kgの用量で静脈内投与した（i.v.、単回投与）。
コントロールマウスを、試験薬に用いたのと同様の投与容量のビークル溶液(50％Cremophor ELおよび50％エタノール（生理食塩水で希釈）)で腹腔内処置した。
【０１９６】
実験計画およびプロトコール
ヒト扁平上皮癌(A431)の腫瘍モデルにおける抗体Cetuximab（登録商標）(CTX)の蓄積および分布に対するPTXによりもたらされる効果を測定し、得られた結果をB22956/1を用いて得られたDCE-MRIデータと比較するために実験を設計した。
【０１９７】
この点で、8匹のマウスを2群に分け、得られた2群の各2匹をPTXで、2匹をビークル(CTRL)で処置した。キャリパーで測定した腫瘍の直径が7〜8mmに達した腫瘍移植後14日に処置を開始した。腫瘍移植から第14日に動物をPTXまたはCTRLで処置した（第1日とする）。PTXまたはCTRL処置後24時間(第2日)で、各動物にB22956/1(本発明の造影剤の非限定的例として用いた)を注射し、DCE-MRIで画像化した。MRI画像化は、プレコントラスト、および造影剤投与後の種々の時点で行った。MRI実験後、蛍光標識Cetuximab（登録商標）(Cy5-CTX)を腹腔内注射した。第3日にすべてのマウスを、in vivoで光学的画像化(OI)により画像化し、次いでFITC-アルブミン(10mg/mL)を注射し、5分後に動物を屠殺した。腫瘍を切除し、ex vivoで第2の光学的画像取得を行った。最後に組織学的検査用に腫瘍を調製した。
【０１９８】
DCE-MRI実験
MR実験を、BGA12S2勾配コイル(内径12cm)を装着した小動物試験専用の3Tで操作するBioSpec-Bruker分光計を用いて行った。
試薬
B22956/1(Bracco Imaging S.p.A、上記のごとく得た)をMRI造影剤(CA)として用いた。B22956/1は、100μmol/kgの用量（投与容量4mL/kg）で静脈内注射した。
【０１９９】
DCE-MRI画像化プロトコールおよび結果
PTXまたはCTRL処置後24時間で、各動物にCA(B22956/1)を注射し、DCE-MRIで画像化した。造影剤を、動物の尾静脈に取り付けたカテーテルから約1 mL/minの注射速度で静脈内注射した。MR画像化実験用に、動物を、33％ O2および66％ N2Oの混合物中のイソフルランガス（約1％）で前麻酔し、次いで、呼吸速度に応じてガスレベルを調整して麻酔を維持した。MRI画像化を、造影剤投与後の種々の時点で行った。特に、プレコントラスト冠状および軸方向Rare T2強調解剖学的画像を、良好なコントラストの高解像度を得るために最適化したパラメーターで得、腫瘍塊を検出した。可変フリップ角θ (FA=5〜90°)の3D FLASH画像(Fast Low Angle Shot；TR約6〜7ミリ秒)を造影剤注射前に得、マトリックス128x128x8、スライス厚〜1.5 mm、FOV〜3.0x3.0cmを用いて腫瘍および筋肉縦緩和時間を推定した。次に、同じ結果(FA=20°、TR約6〜7ミリ秒)を得、CA i.v.注射後の腫瘍および血管のCAダイナミックを追跡した。測定したスライスの直上および直下に２つの厚い飽和バンドを置くことによりフローアーティファクトを避けた。
【０２００】
光学的画像化実験およびプロトコール
光学的画像化(OI)実験をPearl Impulse、LiCor、USAを用いて行った。組織学的検査をCRB/Z laboratoriesのScanScope FL Aperio (USA)を用いて行う。
試薬
ERBITUX (Cetuximab（登録商標）溶液；MW〜152 kDa)：(100 mM塩化ナトリウム、100 mMグリシン、0.01％ポリソルベート80、および10 mMクエン酸からなる緩衝溶液（pH 5.5)中のImClone LCC、5 mg/mL (0.033mM)）。
シアニンCy5：(Cy5、NHSエステル、GE Healthcare、MW 792、10mg/mL)。
Cy5-CTX：蛍光標識モノクローナル抗体 (mAb)は、モノクローナル抗体 (3.51mg/mL、シトレート？TEA緩衝液中。該mAbの市販のグリシン溶液から緩衝液交換により得た)と市販の蛍光シアニンCy5-NHSエステルを、当該分野で知られた典型的な充分に経験のある手順を用いて結合させることにより社内で製造した。結合産物中の色素/mAbモル比＝2。
アルブミン-フルオレセインイソチオシアネート：(アルブミン-FITC（Sigma-Aldrich）、10 mg/mL溶液)。
【０２０１】
光学的画像化プロトコール
該標識抗体を、用量1mgモノクローナル抗体 (mAb)/マウス（約7nmolの蛍光色素/マウスに相当する）で、PTXまたはビークル投与後24時間に腹腔内注射した。
光学的画像化実験を行う前に、動物を98％ O2中のイソフルランガス(2％)で前麻酔し、取得中、麻酔を、呼吸数に応じてガスレベルを調整して維持した。OI期間中、動物を37℃に維持した。
【０２０２】
Cy5結合Cetuximab（登録商標）注射後24時間で、マウスを、蛍光強度を検出することができる上記光学的画像化システムで分析した。該装置は、波長650 nmの励起レーザー、およびバンドパス波長770 nmのロングパスフィルターを装備した。典型的励起出力は100μWであった。全胸部部位（解像度1mm）のin vivo蛍光画像の取得は約10min持続した。蛍光強度を取得部位の各位置における光子カウント数として測定した。in vivo OI実験終了後、FITC-アルブミンの蛍光溶液 (10 mg/mL、Sigma-Aldrich)を、用量100 mg/kg (投与容量：10 mL/kg)で尾静脈内に注射した。注射後5分間で動物を頸椎脱臼により屠殺し、腫瘍を切除した。細胞外腔中に浸出したアルブミン分画による血管体積の過大評価を避けるため、注射と屠殺の5分間の短い遅延時間を選択した。除去した腫瘍に対するex vivo OI実験も行った。
【０２０３】
組織学的実験およびプロトコール
切除した腫瘍をOCT(Optimum Cutting Temperature)コンパウンドに包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結した。次に、10μm厚凍結切片をOCTブロックから得た。特に、6切片を、MR画像に用いたものとほぼ平行面で各腫瘍から500μm毎に切り出した（3切片／ガラススライド、ガラススライド２枚）。アルブミン-FITCおよびその他の蛍光シグナルの可視化のために、切片を10％中性緩衝ホルマリンで10分間固定し、PBS＋0.1Mグリシンで20min分間洗浄し、次いで、DAPIを含む封入剤で封入した。
【０２０４】
データ分析
組織学的画像分析
顕微鏡スケールでのDCE-MRIデータ、腫瘍微小環境に対するPTXの効果、および腫瘍中のCTXの分布の関係を分析するため、蛍光顕微鏡検査を、高感度および高空間的解像度により基準方法として選択した。実際に、CTXとして膜抗原に対する高い特異性を示すmAbに基づく薬剤は、薬剤の治療活性を阻害しうる著しく不均一な空間的分布を生じうる。蛍光顕微鏡検査により、CTXの分布を空間的に解像する、すなわち、顕微鏡スケールでmAbの量を定量し、組織中に送達されるCTXの全体量およびそれが分布する時は均一性に対するPTXの効果を検討することができた。
【０２０５】
方法
約3切片/腫瘍に対応する45の組織学的画像を得た。各画像は、色素シアニン5(Cy5)およびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)から得られた蛍光シグナルに対応する多量の２チャンネルからなった。Cy5をmAb Cetuximab（登録商標）を結合させ、これを用いてCy5-CTX画像を得(図9パネルD)、アルブミンと結合させた色素FITCを用いてFITC-Alb画像を得た(図9パネルA)。
【０２０６】
FITC-アルブミン画像からの環流血管の同定
各切片内部の環流血管を、各FITC-Alb画像において、特定した閾値以上のシグナル強度を有するすべてのピクセルを選択することにより同定した(図9パネルB)。該閾値を選択し、熟練組織学者による目視検査により立証した。
【０２０７】
CTXシグナル減衰曲線
Cy5-CTX染色の空間分布を、各ピクセルについて、FITC-Alb画像を用いて直近の血管壁からの距離を計算して分析した(距離マップ。図9パネルc)。次に、対応するCy5-CTX画像において、Cy5-CTXシグナルを、血管壁からのピクセル距離に応じて表現した(CTX 減衰曲線)(採用したプロトコールに関する限り、例えば、F.Tannock et al.、2005. Clin Cancer Res、11、8782-8788、およびTong、R. T. et al.、2004 Cancer Res、64、3731？3736参照)。この方法により得られた空間分布データは、直近の血管壁から0〜約700μmに及ぶ。
【０２０８】
DCE-MRI画像分析
全画像分析を画像Jソフトウエアを用いて実施し、収集したデータはＲ統計分析環境内で構成された(R Development Core Team (2011). R：A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing、Vienna、Austria. ISBN 3-900051-07-0、URL. http：/www.R-projact.org/. （本明細書の一部を構成する)）。
【０２０９】
造影剤濃度の推定
腫瘍、筋肉、および血液に対するプレコントラストＲ１値を可変フリップ角FLASH画像から決定した。該方法は、θに応じてS(θ)の値を最小二乗適合することである（ここで、S(θ)は、θに等しいフリップ角で得られた画像から測定したシグナルである）。ポストコントラストR1値を、下記式を用い、プレコントラストR1値、および造影剤投与前および後に得られたダイナミック3D画像のシグナル強度を用いて計算した。
2018188448.tif 000024
2018188448.tif 000025
［式中、R1(t)は時間ｔに計算したR1である。S(t)は、時間ｔで計算したシグナル強度である。Spreは、造影剤注射前画像から測定した平均シグナルである。］造影剤投与前および後のR1を評価したら、時間に応じた平均CA組織濃度を下記式により計算した。
2018188448.tif 000026
［式中、r1,CAはCA緩和能である。CCA(t)は時間ｔで測定した造影剤濃度である。］
１基準R1pre値を、各動物の腫瘍、筋肉、および血液についてroiに基づいて計算し、平均1/T1値を、RF場不均一性による誤差を最小化するために、RFコイルの中心付近のスライスの可変フリップ角 FLASH画像から計算した。
【０２１０】
薬物動態分析
例えば上記実施例３および引用文献に記載の２コンパートメント薬物動態モデルを、腫瘍組織の造影剤の動力学的挙動を説明するため、より正確には腫瘍中の血漿と血管外細胞外腔(EES)の間の交換の動力学を説明するために同様に用いた。同じ微分方程式を、血管終末が含まれる場合に目的とする組織中のCAの動力学的挙動を説明するために用いた。
2018188448.tif 000027
同様にして下記式：
2018188448.tif 000028
を示す［式中、Ctis(t)およびCP(t)は、それぞれ腫瘍組織および血漿における時間に応じたガドリニウム濃度である。Ktransは移動定数である。Kepは速度定数である。fPVは、分画血漿容量である。］。次に、Ktrans、Kep、およびfPVの値を、例えば常套的線形最小二乗法を用いてDCE-MRIデータから推定した(これについては上記引用文献参照)。
【０２１１】
動脈流入機能(AIF)、すなわち、時間に応じて表した注射した造影剤B22956/1の濃度を、さらに、血液roiに基づいてMRIシグナルを分析することにより計算した。薬物動態分析に用いるAIFを各動物について測定したAIFを平均して得た(プールAIFまたはポピュレーションに基づくAIF)。
ピクセルに基づく分析を、右および左脇腹に接種した腫瘍に対応する目的とする部位ならびに筋肉について行った。
【０２１２】
モデルフリー分析
このアプローチは、簡単、計算が速やか（特に、数千のピクセルにおよびピクセルに基づく分析に適用する場合に有益である）、およびロバスト性（最小二乗適合手順に依存しないため）により好都合である。
実際に、時間濃度曲線下面積(AUC)を、造影剤濃度またはシグナル増強曲線を数値的に統合した種々の時間ウィンドウについて計算した。AUC値を下記式により定義する。
2018188448.tif 000029
［式中、AUCはt1〜t2の時間ウィンドウで計算する。F(i)は、時点ｉで測定した造影剤の組織濃度またはシグナル増強である。］
AUCを注射後の最初の時点から出発して計算する場合は、該パラメーターを、濃度曲線下初期面積(IAUCT)（ここで、Tは時間ウィンドウの上限を示す。）という。この実験において、AUC10,20、AUC20,30、およびIAUC1を計算した。すなわち、該曲線下面積を、それぞれ注射後10〜20分、20〜30分、および最初の時点〜第１分の時間ウィンドウで計算した。次に、２つのさらなるパラメーターを、腫瘍と血液で計算したAUC値を組み合わせて計算して得た。特に、EARLYAUCRATIOを、目的とするROIおよび基準部位(腫瘍および筋肉)におけるIAUC1を血液について測定したIAUC1で割って得た。この点で、B22956/1(試験に用いた)の場合のように、注射後最初の１分間以内の造影剤の浸出がごくわずかであるときは、EARLYAUCRATIO値は腫瘍分画血漿容量(fPV)に対応することに注目すべきである。
【０２１３】
さらに、記載したようにこの実験においてプールしたAIFを用いたので(したがって、一定値とみなされる)、EARLYAUCRATIO値(上記比により得られた)はIAUC1と直接相関する。第2は、血液について測定したIAUC1により注射後20〜30分間の腫瘍の該増強曲線下面積(AUC20,30)として定義したLATEAUCRATIOである。この量は、浸出した造影剤の量、すなわち、間接的にktransおよびkep値と関連する。さらに、この実験において、上記理由でプールしたAIFを用いたので、LATEAUCRATIO値はAUC20,30に直接関連する。
【０２１４】
また、パラメーターAVGENHを、下記式に従って得られた全時点について計算した平均増強として計算した。
2018188448.tif 000030
［式中、Enh(i)は、ダイナミック時点ｉでのシグナル増強である。Nは、得られた最終時点である。］。このパラメーターは、きわめて計算しやすくロバスト性のため試験した。
【０２１５】
この点で、以下に、この実施例の試験の実験DCE-MRIデータから計算したDCE-MRIパラメーター値を対ピアソン相関とともに含む相関表Fを示す。１に等しいかまたはそれに近い相関係数は、２つのパラメーターが実質的に同じ情報を表すことを示す。特別な例として、EARLYAUCRATIOおよびLATEAUCRATIOは、それぞれ１に等しいIAUC1およびAUC20.30とのピアソン相関を示すが、これは、ポピュレーションに基づく(プールした)AIFを用い、その結果、それがEARLYAUCRATIOおよびLATEAUCRATIO（該パラメーターは倍数因子のみ異なる）の定義から得られるためである。
【０２１６】
この表は、実質的に、それらの計算のために行った操作に関わらず、これらすべてのパラメーターは、最終的に同じ基礎となる物理現象、すなわち投与した造影剤の薬物動態に関連し、それらはある程度互いに関連するので本発明の方法とすべて妥当に利用可能であることを確認する。例外は、EESから血液への速度定数を表し、（腫瘍）組織内の血管外細胞外腔の分画ならびに血液からEESへの浸出ではなく高分子溶質の除去に関連するKepにより表されかもしれない。
【０２１７】
2018188448.tif 000031
*プールしたAIFを用いるので相関は１に等しい。EARLYおよびLATEAUCRATIOの定義から得られる。
【０２１８】
閾値を超えるピクセル
上記DCE-MRIパラメーター値を、DCE-MRI画像から目的とする病的部位（本実施例では腫瘍部位）でピクセルに基づいて計算した。対応する解剖画像と重ね合わせた評価したパラメーターのそれぞれに対するピクセルに基づくDCE-MRI分析の結果を示すパラメトリック画像を、例えば図10に示す。
次に、閾値を、未処置マウスの健康筋肉において該パラメーターについてピクセルに基づき測定した値の平均（μ）および標準偏差(σ)を考慮することにより、目的とするパラメーター（p）についてピクセルに基づき計算した（典型的には閾値μ＋3σとみなす）。
【０２１９】
例えば、AVGENHを、本明細書において、測定しやすさおよびロバスト性により本発明の非限定的DCE-MRIパラメーターと見なす関連DCE-MRI パラメーターとみなすと、得られた値は閾値57を示す。
2018188448.tif 000032
【０２２０】
次に、評価した閾値を超えるパラメーター値を有する各ROIについてピクセル数を確認する。例えば図11に示す対応する解剖学的画像に対するAVGENH＞57の腫瘍部位のピクセルの重ね合わせは、ROIにおける「浸透性」または「好ましい」ピクセルの量と分布の両方の正しい評価を可能にする。投与したmAbの腫瘍組織における輸送を、分析した腫瘍において、基準組織において計算した対応値と統計学的に異なる測定したDCE-MRIパラメーター値(本実施例ではAVGENH)（すなわち、AVGENH＞57）により特徴付けられる総ピクセル(記録したMRI画像の腫瘍ROIの（すべての腫瘍容量をサンプリング)）に応じて評価する。次に、カットオフ値を0.5に固定することにより（該閾値を超えるピクセルの数が総腫瘍ピクセルの少なくとも50％に等しい腫瘍に対応する）、0.5より高い総腫瘍ピクセルに対するAVGENH＞57のピクセルの比を有する腫瘍を「好ましい」または「浸透性」と同定し、それより低い比を生じる腫瘍を「好ましくない」または「非浸透性」と定義する。
【０２２１】
光学的画像分析
全胸部部位の蛍光画像を、PTX処置およびコントロールマウスにおいて1mm解像度で約10min得た。
処置およびコントロール動物の両方でより高い強度のシグナル領域が記録された。
【０２２２】
結果および結論
DCE-MRI パラメーターに対するPTX効果の分析
統計分析は、DCE-MRIデータを用いて行い、PTX処置後24時間の処置および非処置腫瘍を比較した。各腫瘍について、ピクセルに基づいて計算したDCE-MRI パラメーターの平均値、次いで２処置群の平均の分布を比較した。統計的有意差は、Mann Whitney U検定を用いて試験した。p値＜0.05(5％)を統計的有意差とみなした。
得られた結果を表Gに示す（DCE-MRI パラメーターを得るために用いたCTRLおよびPTX腫瘍の平均、標準偏差、および数を示す）。Mann-Whitney U検定の結果も示す。
【０２２３】
表Ｇ
2018188448.tif 000033
【０２２４】
得られた結果は、コントロールに対するPTX処置マウスにおける造影剤 B22956/1の血液環流の増加および浸出の増強と一致する。特に、PTX処置は、DCE-MRI パラメーター、例えばCA浸出に関連するtrans、AUC20-30、LATEAUCRATIOに対する統計的視点から特に有意である効果を誘導することがわかった。
【０２２５】
PTXは、mAbsと組み合わせて投与すると促進効果を示すことが知られており(F. Marcucci and A. Corti、Advanced Drug Delivery Reviews 2011、64：53？68)、これは、おそらく、PTXの、間質液圧を減少させ、腫瘍における高分子の環流（convection）介在輸送を増強する能力による(A. Broenstad、A. Berg、and R. K. Reed. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004、287：H963？H968)。腫瘍における高分子の分布を変化させることができる薬剤（PTXとして）の効果を評価するための提唱されたDCE-MRI法の有効性を試験した。片側から得られた結果は、腫瘍の病状のPTXがもたらす修飾を提唱したDCE-MRI法で測定することができることを確認する。他方、得られた結果は、さらに本発明の薬剤およびDCE-MRI法を、抗癌剤を、治療する腫瘍内への抗癌剤の送達に好都合なEPR増強剤と組み合わせて用いる抗癌プロトコールの効果を評価するために有利に用いることができることを支持および示唆する。
【０２２６】
光学的画像化によるPTX効果の分析
行った実験において、PTX処置およびコントロールマウスの両方において記録されたかなりのシグナル強度（おそらく、検出可能な領域の飽和による）により、投与したmAbに対するPTXの効果を推定することができなかった。実際に、高用量（例えば1 mg/マウス）のmAb Cetuximab（登録商標）は、A431腫瘍異種移植の血管壁から最初の100μmの腫瘍組織を飽和しうるが、腫瘍の中心部分に位置する低酸素部分における薬剤の浸透は最小限のままであったことが知られている(Lee and Tannock BMC Cancer 2010、10：255)。OIは、mAbがPTX処置および非処置腫瘍の両方に蓄積したことを確認した。腫瘍の良く環流した表面部分より下部から得られる蛍光シグナルを観察する技術の限界により、腫瘍の中心下環流領域におけるPTXの顕著な効果はみられなかった。
【０２２７】
CTX分布に対するPTX効果の分析
蛍光CTX減衰曲線を、直近の血管壁から0〜約700μmの範囲の距離にわたり蛍光顕微鏡により得られた各腫瘍切片について測定した。処置腫瘍と非処置腫瘍にほぼ等しく分けた45の蛍光減衰曲線を分析した。0〜700μmの距離範囲を、約20μm幅のビンに分け、各区間について蛍光シグナルの曲線下面積(fAUC)の値を計算した。fAUCの値の分布をMann-Whitney U検定で比較し、処置腫瘍と非処置腫瘍の差が有意か否かを評価した。得られた結果を図12に示す。各距離ビンについて計算したPTXおよびCTRL群におけるfAUCの中央値をMann-Whitney U検定から得られた対応するp値と共に報告する。図から明らかなように、非処置腫瘍は、直近の血管壁から0〜約200μmでより大きなCTXの蓄積を示した。処置腫瘍は、直近の血管壁から400〜約700μmでより高い蛍光を示した。0〜700μmの全試験範囲にわたり計算したfAUC値の分布を分析したところ、処置腫瘍と非処置腫瘍の間に差はみられなかった。しかしながら、得られた結果（例えば図12に示す）から、PTX処置マウスにおいて投与した蛍光標識抗体の分布がコントロールマウスに比べてより均一で改善されていることが明確にわかる。
【０２２８】
これらの結果は、PTXによる腫瘍部位におけるmAbの全分布に対する促進効果に関するいくつかの知見、特に、mAbを高飽和用量で投与した時に、腫瘍内部のmAbの分布容量を増加させ、組織に蓄積するmAbの総量に対する影響は限られるとの知見を裏付ける(F. Marcucci and A. Corti、Advanced Drug delivery Reviews 2011、64  53？68；Lee and Tannock BMC Cancer 2010、10：255；A. Broenstad、A. Berg、and R. K. Reed. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004、287：H963？H968；G.M. Thurber et al. Advanced Drug Delivery Reviews 2008、60：1421？1434)。これは、高分子薬剤の治療効果を改善するための重要な前提条件である。
【０２２９】
さらに、注目すべきことに、腫瘍領域内のmAb分布の組織学的推定値により得られた図12の挙動は、PTX処置によりもたらされたmAbのより良好でより均一な分布を裏付け、本発明のDCE-MRI法を用いてPTX処置腫瘍において測定した薬物動態パラメーター、例えば特に、Ktrans、fPV、AUC20-30、およびLATEAUCRATIOの増加と一致する。
【０２３０】
DCE-MRIと組織学的データの相関および腫瘍の区別
本発明の方法により得られたDCE-MRIパラメーターと組織学的データの間の関連の存在を分析した。基準となる観察結果は、PTX処置および非処置腫瘍についての蛍光が測定される血管からの距離に応じた特異的CTX蓄積を示す組織学的結果であった。本発明の方法の特定の例を、抗体CTXの好都合な浸出により特徴付けられる腫瘍を限られたmAbの浸出を示す腫瘍から区別するための本発明のDCE-MRI法の実現可能性を証明するために利用可能なデータに適用した。この点で、CTXの浸出を350〜550μmで計算したfAUC(fAUC350.550)として定量した。
【０２３１】
適用した手順は、実質的に以下の工程を含んだ。
１．ROI (下記実施例では皮下移植腫瘍)における造影剤濃度時間プロフィールおよび/またはシグナル増強時間プロフィールを計算するためにMRIシグナル強度時間プロフィールをピクセルに基づき分析する。
２．目的とするDCE-MRIパラメーター値をピクセルに基づき計算する。下記実施例において、パラメーターAVGENHを、上記理由により本発明の典型的非限定的DCE-MRIパラメーターとして用いた。
３．基準部位 (下記実施例では背部筋肉)におけるAVGENH値の平均（μAVGENH)および標準偏差(σAVGENH)を計算する。
４．AVGENH＞(μAVGENH＋3σAVGENH)を示すROI (腫瘍)においてピクセル (DAVGENH)の分画を同定する。
５．DAVGENH＞0.5を示す各腫瘍を「好ましい」群に割り当て、その他を「好ましくない」群に割り当てる。
【０２３２】
実際に、基準閾値57を、DCE-MRIパラメーター AVGENHについて先に記載のごとく筋肉から定義した。したがって、AVGENH＞57のピクセルを、CTX浸出について好ましい生理学を有する腫瘍ROIのピクセルとして同定した。すなわち、DAVGENHは、腫瘍 ROIの少なくとも部分を示すすべての利用可能なMRIスライスを分析することにより測定した腫瘍容積に属する「好ましい」ピクセルの分画を示す。DAVGENHをfAUC350.550に対してプロットし、 fAUC350.550とDAVGENHのピアソン相関を計算した。得られた結果を図13に示す。
【０２３３】
特に、図13から明らかなように、DAVGENHは、fAUC350.550 (傾斜線 p値＜0.01、ピアソン相関検定)、したがって、直近の血管から350〜550μmの組織部位において組織学的に測定したCTXの量と統計学的に有意な相関を示した。次に、DAVGENHについて0.5のカットオフ値を選択した。これは、ROIの内側の全てのピクセルの50％が「好ましい」生理学を示す仮定の腫瘍に対応する。DAVGENH＞0.5の腫瘍を「好ましい」または「浸透性」として同定し、比がそれより低い腫瘍を「好ましくない」または「非浸透性」を定義した。
【０２３４】
実際に、図13のグラフから明らかなように、「好ましい」腫瘍 (白色ドット、DAVGENH＞0.5)は「好ましくない」より高い fAUC350.550値を示した(垂直線は、カットオフ値を示すために置く)。
この関連する知見は、提唱した方法の信頼性の目安をもたらし、癌患者を区別するために用いるときの有効性を示唆する。
【図１】
2018188448.tif 000034
【図２】
2018188448.tif 000035
【図３】
2018188448.tif 000036
【図４】
2018188448.tif 000037
【図５】
2018188448.tif 000038
【図６】
2018188448.tif 000039
【図７】
2018188448.tif 000040
【図８】
2018188448.tif 000041
【図９】
2018188448.tif 000042
【図１０】
2018188448.tif 000043
【図１１】
2018188448.tif 000044
【図１２】
2018188448.tif 000045
【図１３】
2018188448.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月3日(2018.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書または図面に記載された発明。
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月25日(2018.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子薬物またはプロドラッグによる処置に適した癌患者を、そのような処置に抵抗性と思われる患者から区別するための予測方法において使用するための、少なくとも１の常磁性複合体単位と、胆汁酸の残基または環式残基若しくは多環式残基から選択される少なくとも１の脂溶性部分を含んでなり、分子量が800〜3,000Daの、85％またはそれ以上のヒト血清アルブミンHSAとの非共有結合性タンパク質結合を示す常磁性造影剤であって、
該予測方法において、病的な身体領域、部位、組織、または塊への該高分子薬物またはプロドラッグの予測される送達のin vivo非侵襲性の定量的な予測が、DCE-MRI技術を使用するHSAの局所送達のin vivo定量により得られ、該定量的な予測が、
ａ）病的な身体領域、部位、組織、または塊内を該造影剤が通過中に得られるDCE-MRI画像を収集し、収集されたDCE-MRI画像内で少なくとも１つの関心領域と参照領域を同定し、同定された領域内のシグナル強度曲線を得、得られたシグナル強度値を造影剤濃度値に変換して濃度−時間曲線を描き、
ｂ）該濃度−時間曲線から、収集されたDCE-MRI画像の少なくとも１つの関心領域と参照領域における、該造影剤により示される薬物動態に関連するパラメーターの数値をピクセル単位で求め、
ｃ）評価パラメーターの各々について、関心領域および参照領域における各ピクセルで測定された数値を比較することにより、得られたパラメーターの数値から、目的とする高分子薬物またはプロドラッグの期待される輸送を予測する、
ことを含んでなる、
常磁性造影剤。
【請求項２】
ヒト血液循環中の終末相半減期が少なくとも４時間である、請求項１記載の常磁性造影剤。
【請求項３】
評価パラメーターが、fPV、Ktrans、AVGENH、AUC、AUCE、IAUCT、IAUCET、EARLYAUCRATIO、およびLATEAUCRATIOからなる群から選ばれる、請求項１または２に記載の常磁性造影剤。
【請求項４】
評価パラメーターが、Ktrans、AVGENH、AUC、AUCE、またはそれらの組合せから選ばれる、請求項３に記載の常磁性造影剤。
【請求項５】
定量的な予測が、
a)病的な身体領域、組織、部位、または塊内を前記造影剤が通過中のDCE-MRI画像を収集し、および所望により、良好な解剖学的解像度のさらなるMRI画像を得、次いで、収集したDCE-MRI画像において関心領域、参照領域、および所望により血管領域を同定し、および同定した領域内のシグナル強度曲線を得；
b)所望により、造影剤投与からMRI取得終了までの連続的または不連続的な時間ウインドウでのAVGENHおよび/またはAUCEの値を測定し、
c)工程a)で得られたMRIシグナル強度値を造影剤濃度値に変換して濃度−時間曲線を描き、
d)所望により、造影剤投与からMRI取得終了までの連続的または不連続的な時間ウインドウでのAUCの値を測定し、
e)該得られた濃度曲線を薬物動態モデルに適合させてKtransの推定値を得、
f)得られた評価パラメーターの推定値から目的とする高分子薬物またはプロドラッグの期待される送達を、参照領域において測定したパラメーターの各々について閾値を計算し、次いで、収集した各DCE-MRI画像において、決定した閾値を超えるパラメーター値を示す病的領域におけるピクセルを区別することにより予測する、
ことを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項６】
工程ｆ）において、目的とする高分子薬物またはプロドラッグの送達の予測が、前記閾値を超えるパラメーター値を示すピクセルの分画Dから計算される、請求項５記載の常磁性造影剤。
【請求項７】
病的な身体領域、部位、または組織が、腫瘍、または癌状塊、または慢性炎症領域である、請求項１〜６のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項８】
高分子薬物またはプロドラッグの分子量が50kDaまたはそれ以上である、請求項１〜７のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項９】
高分子薬またはプロドラッグが高分子抗癌剤またはプロドラッグである、請求項８記載の常磁性造影剤。
【請求項１０】
高分子抗癌剤またはプロドラッグが抗体または抗体断片ベースの抗癌剤である、請求項９記載の常磁性造影剤。
【請求項１１】
高分子抗癌剤が、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブレントキシマブ、ベンドチン、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イピリムマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ、トシツモマブおよびリツキシマブからなる群から選ばれる請求項９記載の常磁性造影剤。
【請求項１２】
測定されたD値に基づき、高分子薬物またはプロドラッグの浸出および拡散をもたらす送達条件を適切に満している病的組織もしくは領域または腫瘍塊を、高分子薬もしくはプロドラッグを用いる薬理学的処置に浸透抵抗性を示す悪性新生物から区別することをさらに含んでなり、0.5を超えるD値をもたらす病的領域または腫瘍部位が高分子薬に対する適切な浸透を示すとみなされる、請求項６〜１１のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項１３】
治療する病的領域または腫瘍塊への不十分もしくは減少した浸透により高分子薬またはプロドラッグを用いる抗癌療法に対して抵抗性を示す癌患者を層別化するためのプロトコールまたは予測方法に用いるための請求項１〜１２のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項１４】
90％より高いヒト血清アルブミンとの非共有結合性タンパク質結合を示す請求項１記載の常磁性造影剤。
【請求項１５】
ガドコレチン酸、MS325のガドリニウム錯体、およびAAZTA-デオキシコール酸のガドリニウム錯体から選ばれる常磁性キレート錯体の生理学的に許容される塩から選ばれる請求項１〜１４のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【請求項１６】
高分子薬物またはプロドラッグによる処置に適した癌患者を、該高分子薬物またはプロドラッグによる抗癌療法に対して抵抗性を示す患者と区別する方法であって、
ａ）請求項１に記載の造影剤が病的身体部位、領域、組織、または固体塊内を通過中に得られるDCE-MRI画像を収集し、収集したDCE-MRI画像において少なくとも１つの関心領域と参照領域を同定し、同定された領域内のシグナル強度曲線を得、
ｂ）工程ａ）で得られたシグナル強度値を造影剤濃度値に変換して濃度−時間曲線を描き、
ｃ）薬物動態モデルにより該濃度−時間曲線を適合させ、
ｄ）収集したDCE-MRI画像の関心領域と参照領域について、ピクセル単位で、該造影剤により示される薬物動態に関連するパラメーターの数値を求め、
ｅ）評価パラメーターの各々について、関心領域および参照領域における各ピクセルで測定された数値を比較することにより、得られたパラメーターの数値から目的とする高分子薬物またはプロドラッグの送達を予測し、
ｆ）予測した期待される送達に基づき、高分子薬物またはプロドラッグによる処置に適した癌患者を、治療する病的領域への不十分もしくは減少した浸透により高分子薬またはプロドラッグを用いる抗癌療法に対して抵抗性を示す癌患者と区別する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１７】
病的領域における測定された高分子薬物またはプロドラッグの送達の程度、および適切な比較により、病的組織内の高分子輸送を改善する薬物による該病状の処置により生じる後者の増加または減少の程度を示す像が、決定した閾値を超える目的のパラメーター値を示す病的領域内のピクセルを、対応する形態学的MRI画像と重ね合わせることにより得られる、請求項５〜１２のいずれかに記載の常磁性造影剤。
【外国語明細書】
2018188448000001.pdf