(57)【要約】【課題】新生児マススクリーニング検査における先天性代謝異常症６疾患（ファブリー病、ポンぺ病、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症II型、低ホスファターゼ症）責任酵素活性測定を、大規模な測定機器や専用装置を必要とせず、実用的に簡便・迅速かつ安価に実施する方法を提供する。【解決手段】１枚の乾燥血液ろ紙から抽出した試料を用いて、ファブリー病責任酵素、ポンぺ病責任酵素、ゴーシェ病責任酵素、ムコ多糖症Ｉ型責任酵素、ムコ多糖症II型責任酵素、低ホスファターゼ症責任酵素の酵素活性測定を同時測定することにより、これらの疾患のスクリーニング検査を簡便、迅速、効率的に実施できる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
1枚の乾燥血液ろ紙から複数の先天性代謝異常症の責任酵素活性を迅速に測定する、先天性代謝異常症の迅速マススクリーニング検査方法であって、該責任酵素が、
（A群）α-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）、酸性β-glucosidase（GBA）
（B群）α-L-Iduronidase（IDU）、Iduronate-2-sulfatase（IDS）及び
（C群）組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNSALP)
の少なくとも２つの群より選ばれる、各群１又はそれ以上の酵素であり、以下の工程を含む方法：
（１）乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、
（２）抽出した血液試料に合成基質を含む基質液を添加して酵素反応を行わせる工程、
（３）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程。
【請求項２】
前記共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記共通抽出液に界面活性剤が含まれる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤がTritonX-100であり、0.05％〜0.5％で含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記共通抽出液に、0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウム及び0.05％〜0.5％のウシ血清アルブミン（BSA）が含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質液が、A群の責任酵素の場合は、（i）N-アセチルガラクトサミン及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液、（ii）アカルボース及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液、並びに（iii）4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液の組み合わせであり、B群の責任酵素の場合は、（iv）塩化カリウム及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液、並びに（v）Iduronidase及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液の組み合わせであり、C群の責任酵素の場合は、（vi）L-フェニルアラニン及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（i）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-α-D-galactopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記（i）における基質液のpHが4.0〜5.0である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記（i）における基質液が、0.1ｍM〜1.0ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれるクエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ii）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-α-D-glucopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれ、アカルボースが1μM〜10μMで含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ii）における基質液のpHが3.5〜4.5である、請求項６又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ii）における基質液が、0.1ｍM〜1.0ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれるクエン酸-リン酸カリウム緩衝液である、請求項６、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記（iii）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-β-D-glucopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記（iii）における基質液のpHが4.5〜5.5である、請求項６又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記（iii）における基質液が、クエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、請求項６、１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記（iii）における基質液に、タウロデオキシコール酸ナトリウムが類似酵素阻害剤として含まれる、請求項６、１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記（iii）における基質液に、0.1ｍM〜1ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれる、請求項６、１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記（iv）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferyl α-L-Idopyranosiduronic Acid, Sodium Saltであり、0.1ｍM〜3ｍMで含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記（iv）における基質液のpHが3〜4である、請求項６又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記（iv）における基質液の緩衝液が還元作用を有する、請求項６、１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記緩衝液が、ギ酸ナトリウム緩衝液である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記（iv）における基質液に、0.1ｍM〜1ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれる、請求項６、１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記（iv）における基質液に、0.01％〜0.1％のPolyoxyethyleneglycol Dodecyl Ether（Brij-35）が含まれる、請求項６、１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記（iv）における基質液に、1μg/mL〜20μg/mLのD-Saccharic acid 1,4-lactoneが類似酵素阻害剤として含まれる、請求項６、１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記（v）におけるIduronidaseが、遺伝子組換え技術により作製したIduronidaseであり、0.1μg/mL〜2μg/mLで含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
前記（v）における４-methylumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferyl-a-L-Idopyranosiduronic Acid-2-Sulfate, Sodium Saltであり、0.1ｍM〜3ｍMで含まれる、請求項６又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記（v）における基質液のpHが4〜5である、請求項６、２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記（v）における基質液の緩衝液が、酢酸ナトリウム緩衝液である請求項６、２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記（v）における基質液に10mM〜30mMの酢酸鉛又は2〜20mMの酢酸セリウムが含まれる、請求項６、２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記（vi）における4-methylumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferylphosphateであり、0.05ｍM〜2ｍMで含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項３１】
前記（vi）における基質液のpHが9〜11である、請求項６又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記（vi）における基質液の緩衝液が、トリス緩衝液である請求項６、３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記（vi）における基質液に、1mM〜30mMのL‐フェニルアラニンが含まれる、請求項６、３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記（vi）における基質液に、0.5mM〜2mMのMgCl２が酵素活性増強剤として含まれる、請求項６、３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記（vi）における基質液に、1mM〜30mMのコハク酸ナトリウムが基質自己分解抑制剤として含まれる、請求項６、３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
工程（２）において、酵素反応の停止を、酵素反応溶液にグリシン及びEDTAを含む共通反応停止液を添加することにより行う、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記共通反応停止液のpHが10〜11である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記酵素反応を、25〜45℃の温度で行った後、前記共通反応停止液を添加する、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記酵素反応を1〜4時間で行う、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記蛍光測定の測定波長が、励起波長365〜375nm、検出波長460〜470nmである、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
1枚の乾燥血液ろ紙から複数の先天性代謝異常症の責任酵素を同時に抽出する方法であって、共通抽出液を用いることを含み、該責任酵素が、
（A群）α-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）、酸性β-glucosidase（GBA）
（B群）α-L-Iduronidase（IDU）、Iduronate-2-sulfatase（IDS）及び
（C群）組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNSALP)
の少なくとも２つの群より選ばれる、各群１又はそれ以上の酵素である、方法。
【請求項４２】
前記共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記共通抽出液に界面活性剤が含まれる、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記界面活性剤がTronX-100であり、0.05％〜0.5％で含まれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記共通抽出液に、0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウム及び0.05％〜0.5％のウシ血清アルブミン（BSA）が含まれる、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
下記を含む、請求項１に記載の検査方法に使用するためのキット：
（１）乾燥血液ろ紙、
（２）共通抽出液、
（３）合成基質を含む基質液、
（４）共通反応停止液、及び
（５）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。
【請求項４７】
前記共通抽出液が、0.1％BSA、0.1％TrtionX-100及び0.05％アジ化ナトリウムを含む精製水である、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記合成基質を含む基質液が、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液、ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液、ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液、ムコ多糖症I型（MPSI）を検出するためのIDU酵素活性測定用のMPSI基質液、ムコ多糖症II（MPSII）を検出するためのIDS酵素活性測定用のMPSII基質液及び低ホスファターゼ症を検出するためのTNSALP基質液との組み合わせであり、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液が、3.0mM 4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside及び100mM N-アセチル-D-ガラクトサミン、0.5mM DTTを含むpH4.4の100mMクエン酸-200mMリン酸ナトリウム緩衝液；ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液が、2.0mM 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside及び4.5μMアカルボース、0.5mM DTTを含むpH4.0の250mMクエン酸-250mMリン酸カリウム緩衝液；ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液が、3.0mM 4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside、0.5mM DTT及び0.3％タウロデオキシコール酸ナトリウムを含むpH5.0の100mMクエン酸-100mMリン酸ナトリウム緩衝液；MPSI基質液が、0.6mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid，sodium salt、5μg/mL D-Saccharic acid 1,4-lactone、0.05％Birij-35、50mM KCl及び0.25mM DTTを含むpH3〜4の100mMギ酸ナトリウム緩衝液；MPSII基質液が、0.13mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic Acid -2-sulfate, Sodium Salt (4MU-IDS)、1μg/mL遺伝子組換えIduronidase及び20ｍM酢酸鉛又は2〜20mMの酢酸セリウムを含むpH4.5の50mM酢酸ナトリウム緩衝液；TNSALP基質液が、0.2mM 4-methylumbelliferyl-phosphate、0.05％TritonX-100、10mMコハク酸ナトリウム、10mM L-フェニルアラニン、1mM MgCl2を含むpH9〜11の100mMトリス緩衝液である請求項４６又は４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記共通反応停止液が、10mM EDTAを含む300mMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、先天性代謝異常症であるライソゾーム病５疾患（ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病、ムコ多糖症I型（MPSI）、ムコ多糖症II（MPSII））及び低ホスファターゼ症の責任酵素を同時にスクリーニングする検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性代謝異常症は、代謝に関係する酵素の遺伝子が先天的に欠損又は変異しているため代謝に必要な酵素の活性が発現されず発症する疾患であり、欠損する酵素により臨床状況も多岐に渡る疾患群である。
【０００３】
先天性代謝異常症の一つであるライソゾーム病は、細胞内小器官の一つであるライソゾーム（lysosome；「リソゾーム」、「リソソーム」とも呼ばれる。）に存在する加水分解酵素が欠損又は低下しているため、細胞内に分解すべき基質が蓄積されることにより引き起こされる疾患であるため、ライソゾーム蓄積症とも呼ばれている。
【０００４】
ライソゾームは、細胞の中で糖質や糖脂質の分解を行っており、これには約60種類の加水分解酵素が関与している。それらの責任酵素の欠損・異常によって、ライソゾームの分解機能が発揮されなくなると、本来分解されるべき物質が老廃物として体内に蓄積してしまう。このようにして生じる先天性代謝異常症の総称がライソゾーム病である。欠損している酵素によって症状が異なり、ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病、ムコ多糖症など、約30種類の病名で知られる。
【０００５】
低ホスファターゼ症も先天性代謝異常症の一つであり、組織非特異型アルカリホスファターゼ（Tissue-Nonspecific Alkaline Phosphatase；以下、「TNSALP」という。）の遺伝子変異による骨系統疾患である。TNSALPの欠損が原因であり、発症時期及び症状の広がりに基づいて、胎内で発病する「周産期型」、生後半年以内に発病する「乳児型」、小児期に発病し乳歯の早期脱落を伴う「小児型」、成人期に発病する「成人型」、症状が歯に限局する「歯限局型」の5つの病型に分類され、四肢短縮、内反膝、骨折、骨変形、低身長、痙攣、乳歯早期脱落などの症状を呈する。低ホスファターゼ症は致死率が高く、周産期型の1年死亡率はほぼ100％、乳児型の1年死亡率は約50％と言われている。
【０００６】
ライソゾーム病や低ホスファターゼ症は、別の先天性代謝異常症であるフェニルケトン尿症のように、摂取制限で治療できるような必須アミノ酸代謝異常とは異なり、それらの責任酵素は生体内で合成されることから、根治には遺伝子治療が必要である。現在は、酵素補充療法のための薬剤が市販され、多くの場合、酵素補充療法の早期治療開始により、患者のQOL向上や発症の予防など臨床的改善がもたらされる。このため、これらの疾患が新生児マススクリーニング検査によって早期に発見されることが望まれている。
【０００７】
ライソゾーム病の新生児マススクリーニング検査では、血液を染み込ませて乾燥させたろ紙（以下、「乾燥血液ろ紙」という。）を用い、合成基質法による酵素活性を測定する方法が用いられる。他には、タンデム分析装置を用いた酵素活性測定法、専用装置を必要とするものの迅速に測定できるマイクロ流路測定キットなどを用いたパイロットスタディなどが実施されており、新生児マススクリーニング検査の有用性が示されている。
【０００８】
一方、低ホスファターゼ症は、既存の測定方法では、TNSALPの酵素活性を特異的に測定することができないため、乾燥血液ろ紙を用いたスクリーニング検査は実施されていない。
【０００９】
生体中のアルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatase：以下、「ALP」という。）は、小腸粘膜、胎盤、乳腺、腎臓、骨、肺、肝臓、脾臓の順に多く、骨格筋や結合組織には少ない。血清中のALP酵素活性は、これらの組織で産生されたALPに由来する。ALPは、遺伝子の違いにより、臓器非特異型である骨型、肝臓型、及び腎臓型と臓器特異的な小腸型、胎盤型、胚細胞型ALPに大別される。血清中ALPには、６種類のALPのアイソザイムが存在し、それらトータルのALP酵素活性として計測される。
【００１０】
特に近年、骨形成マーカーとして骨型アルカリホスファターゼ（BAP；Bone Specific Alkaline Phosphatase）が注目され、血清中のBAPを特異的に測定するためにBAP特異抗体を用いた酵素免疫測定法(ELISA法)や化学発光酵素免疫測定法(CLEIA法)などが開発され測定キットとして市販されている。しかしながら、これらの測定キットは高価であり、かつ専用の自動分析装置が必要となるため、マススクリーニング検査には適さない。
【００１１】
低ホスファターゼ症は、TNSALP遺伝子の異常により、TNSALPの酵素活性が低下することによって引き起こされる。このため、血清中の総ALP酵素活性が低下していることを測定で確かめることによって容易に判別することができる。
【００１２】
血清中のALPの酵素活性は、パラニトロフェニルリン酸（p-NPP)を基質とした測定方法が一般的に利用され、生化学分析装置を用いて測定されている。しかしながら、ヘモグロビンなどの血色素の影響を受けやすく、全血検体又は溶血した検体での測定には適さない。また、より高感度な基質として、蛍光基質を用いた酵素活性法もある。合成基質である4-Methylumbelliferyl phosphate（以下、「4MU-Phos」という。）」を基質として用いる方法は、微生物が産生するALP酵素活性や酵素免疫測定法などの基質として広く利用されているものの、4MU-Pは、鉄（II）イオン（Fｅ２＋）のような２価の金属イオンにより自己分解を引き起こすため、ヘモグロビンが共存するような試料を測定することはできない。
【００１３】
ALPの酵素活性の発現には、マグネシウムイオン（Mg2+）が必須であり、ALP測定時にはMg2+の共存が必須となるため、ヘモグロビンなどFe２＋を多く含む試料を測定する場合には、Mg２＋の作用を妨害せず、Fe２＋など基質の自己分解に作用する金属イオンをマスクするような添加剤の共存が必要である。
【００１４】
特許文献１には、乾燥体液及び細胞組織試料中に存在するライソゾーム酵素の活性をアッセイするための方法及びキットが記載されている。特許文献１に記載の方法及びキットは、各種ライソゾーム蓄積障害を疾患ごとに個別にアッセイするものである。
【００１５】
特許文献２には、MPSI及びMPSIIを含むリソソーム蓄積症（LDS）の多重スクリーニングが記載されている。特許文献２は、複数の標的酵素及びタンパク質を同定並びに定量するための化合物、試薬及び方法に関するものであるが、標的抗原への結合能のある捕捉抗体及びその捕捉抗体が結合されている微粒子を含む多重化ビーズ技術に基づくものである。
【００１６】
特許文献３には、α-L-Iduronidase（IDU）酵素活性を検定する方法及びMPSIにつき新生児をスクリーニングするための方法が記載されている。特許文献３に記載の方法は、IDU産物とIDU内部標準とを含む有機相を提供するために、IDU、IDU産物及びIDU内部標準を含む水性酵素反応混合物を有機溶媒により抽出するステップと、IDU産物の量を決定するステップとを含む。特許文献３ではIDU酵素のみが単独でアッセイの対象となっている。
【００１７】
特許文献４には、ムコ多糖症I型、II型、III型又はVII型に罹患している可能性のある動物由来の血液検体中におけるヘパラン硫酸を測定し、その測定結果とムコ多糖症I型、II型、III型又はVII型とを関連づけるステップを少なくとも含む、ムコ多糖症I型、II型、III型又はVII型の検出方法が記載されている。特許文献４に記載の方法は、検体中の単一種類のグリコサミノグリカン（GAG）を測定し、その測定結果とリソソーム病とを関連づけるステップを少なくとも含む、リソソーム病の検出方法である。
【００１８】
Iduronate-2-sulfatase（IDS）酵素活性の高感度な測定法として、蛍光基質を用いた酵素活性法が一般的に利用されており、合成基質である4-Methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic Acid-2-Sulfate, Sodium Salt（以下、「4MU-IDS」と略す。）を基質として用い、Iduronidaseを添加した２段階酵素反応で測定する方法が知られている。しかしながら、この合成酵素は非常に高価であり、かつ測定時間が48時間以上必要であるため、新生児マススクリーニング検査で使用するためには、より安価で、簡便迅速な測定が求められている。
【００１９】
特許文献５には、低ホスファターゼ症の検査法として、TNSALP遺伝子を１２対のプライマーを用いて、特定部位の遺伝子増幅断面の融解曲線分析により遺伝子変異の有無を調べることにより、低ホスファターゼ症の診断を行う方法が記載されている。
【００２０】
特許文献６には、１枚の乾燥血液ろ紙からIDU及びIDSの酵素活性を迅速に測定するライソゾーム病責任酵素の迅速マススクリーニング検査方法で、（１）乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、（２）抽出した血液試料に合成基質を含む基質液を添加して酵素反応を行わせる工程、（３）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程、を含む方法が記載されている。
【００２１】
特許文献７には、１枚の乾燥血液ろ紙からα-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）、及び酸性β-glucosidase（GBA）を迅速に測定するライソゾーム病責任酵素の迅速マススクリーニング検査方法で、（１）乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、（２）抽出した血液試料に合成基質を含む基質液を添加して酵素反応を行わせる工程、（３）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程、を含む方法が記載されている。
【００２２】
非特許文献１には、乾燥血液ろ紙を用いたファブリー病責任酵素であるGALの活性測定が、新生児のファブリー病スクリーニングに有効であったことが記載されている。非特許文献１ではGAL酵素のみが単独で測定の対象となっている。
【００２３】
非特許文献２には、乾燥血液ろ紙及び繊維芽細胞中のポンペ病責任酵素であるGAAの活性測定が、新生児のポンペ病スクリーニングに有効であること、また試料中のヘモグロビンの影響を回避する方法として水酸化バリウムと硫酸亜鉛を用いる沈殿除去法が有用であったことが記載されている。非特許文献２では、GAA酵素のみが単独で測定の対象となっている。
【００２４】
非特許文献３には、デジタルマイクロ流路測定装置と専用キットを用いたファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病を含むリソソーム蓄積症（LDS）の多重スクリーニングが、新生児マススクリーニングのパイロットスタディで使用されていることが記載されている。
【００２５】
非特許文献４には、MPSIの責任酵素であるIDUのアッセイが新生児のMPSIスクリーニングに有効であったことが記載されている。非特許文献４ではIDU酵素のみが単独でアッセイの対象となっている。
【００２６】
非特許文献５には、MPSIIの責任酵素であるIDSの酵素活性を白血球中で測定したことが記載されている。非特許文献５ではIDSのみが単独でアッセイの対象となっている。
【００２７】
非特許文献６には、低ホスファターゼ症の責任酵素であるTNSALP酵素をELISA法で測定したことが記載されている。非特許文献５では、低ホスファターゼ症患者血清中では、酵素活性、抗原量共に正常人より低いことが示されている。
【００２８】
非特許文献７には、低ホスファターゼ症患者の血清中アルカリホスファターゼ（総アルカリホスファターゼ）活性が、小児の正常値（血清中）の1/5以下であったことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】米国特許第７５６３５９１号
【特許文献２】特表２００６−５２３３００
【特許文献３】特表２０１０−５３６３４７
【特許文献４】特開２０１３−１１６２１
【特許文献５】特開２０１１−５０２８３
【特許文献６】特開２０１７−１６９５２８
【特許文献７】特開２０１７−１６９５２９
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Journal of Human Genetics (2013) 58, 548-552
【非特許文献２】Molecular Genetics and Metabolism 103 (2011) 12-17
【非特許文献３】Dried Blood Spots: Application and Techniques, 2014,325-331
【非特許文献４】Orphanet Journal of Rare Disease, 8, 147, 2013
【非特許文献５】Clinical Biochemistry, 47, 1297-1299, 2014
【非特許文献６】Jpn.J Clin Chem 23, 203-208,1994
【非特許文献７】口病誌 58(3), 613-623 , 1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明は、新生児マススクリーニング検査における先天性代謝異常症であるライソゾーム病５疾患（ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症II）及び低ホスファターゼ症の責任酵素活性測定を、大規模な測定機器や専用装置を必要とせず、簡便・迅速かつ安価に実施する方法を提供することを目的とする。
【００３２】
新生児マススクリーニング検査は、乾燥血液ろ紙から抽出した試料を測定検体として用いる。従来の測定方法では、検査対象となる責任酵素毎に抽出液組成が異なり、１枚の乾燥血液ろ紙からは１種類の酵素活性しか測定できず、複数の酵素を測定するには、複数枚の乾燥血液ろ紙が必要であった。また、乾燥血液ろ紙から抽出した試料の酵素活性を測定するためには、測定対象とする酵素毎に反応時間が異なり、一度に複数の酵素活性を同一の検体より測定することは煩雑な作業を要していた。
【００３３】
さらに、従来の測定方法では、測定対象の責任酵素により、測定波長、操作手順、反応時間、抽出液組成、及び反応停止液組成が異なるため、多数の検体を同時に測定するためには、責任酵素毎に分析者が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ファブリー病責任酵素、ポンペ病責任酵素、ゴーシェ病責任酵素、ムコ多糖症Ｉ型責任酵素、ムコ多糖症II型責任酵素、及び低ホスファターゼ症責任酵素の抽出時の酵素活性の低下や酵素活性測定時のpHに影響を及ぼさず、共通で使用できる抽出液（以下、「共通抽出液」という。）の組成を見出した。さらに、当該抽出試料が高感度に測定でき、かつ各基質液組成と共通で使用できる反応停止液（以下、「共通反応停止液」という。）の組成を見出した。
【００３５】
また、酵素活性の測定波長をシフトさせることで、乾燥血液ろ紙からの抽出試料中の蛍光物質や蛍光阻害物質の影響が少なくなることを見出し、それまで測定前に必要であった検体の遠心操作を不要とした。
【００３６】
さらに、各酵素の単位時間当たりの酵素活性は、酵素反応時間が長いほど低下する事実を見出した。さらに、酵素反応時間を６つの酵素活性で共通に使用できる反応時間に設定することで、測定操作の煩雑性を解消し、ライソゾーム酵素活性測定では、従来より短時間にしても十分に測定可能な共通の条件（試料液量、基質液量、反応停止液量、酵素反応時間）を見出したことで、１人の分析者でも複数項目の同時測定を可能とした。
【００３７】
これらの知見に基づいて、１枚の乾燥血液ろ紙から抽出した試料より、ファブリー病責任酵素、ポンペ病責任酵素、ゴーシェ病責任酵素、ムコ多糖症Ｉ型責任酵素、ムコ多糖症II型責任酵素、及び低ホスファターゼ症責任酵素の酵素活性測定を、同時、高感度、簡便、迅速、効率的かつ安価に検出する方法を見出し、本発明を完成した。
【００３８】
すなわち本発明は、１枚の乾燥血液ろ紙から抽出した試料を６種類の基質液を用いて酵素活性を測定することで、同時に６種の先天性代謝異常症を検出する方法、及び当該検査方法に使用するためのキットを提供する。ここで、本発明における先天性代謝異常症とはとは、ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症II型、低ホスファターゼ症の６疾患である。
【００３９】
したがって、本発明は以下を含む。
[１]1枚の乾燥血液ろ紙から複数の先天性代謝異常症の責任酵素活性を迅速に測定する、先天性代謝異常症の迅速マススクリーニング検査方法であって、該責任酵素が、
（A群）α-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）、酸性β-glucosidase（GBA）
（B群）α-L-Iduronidase（IDU）、Iduronate-2-sulfatase（IDS）及び
（C群）組織非特異型アルカリホスファターゼ（TNSALP）
の少なくとも２つの群より選ばれる、各群１又はそれ以上の酵素であり、以下の工程を含む方法：
（１）乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、
（２）抽出した血液試料に合成基質を含む基質液を添加して酵素反応を行わせる工程、
（３）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程。
[２]前記共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液である、[１]に記載の方法。
[３]前記共通抽出液に界面活性剤が含まれる、[１]又は[２]に記載の方法。
[４]前記界面活性剤がTritonX-100であり、0.05％〜0.5％で含まれる、[３]に記載の方法。
[５]前記共通抽出液に、0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウム及び0.05％〜0.5％のウシ血清アルブミン（BSA）が含まれる、[１]から[４]のいずれか一項に記載の方法。
[６]前記基質液が、A群の責任酵素の場合は、（i）N-アセチルガラクトサミン及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液、（ii）アカルボース及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液、並びに（iii）4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液の組み合わせであり、B群の責任酵素の場合は、（iv）塩化カリウム及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液、並びに（v）Iduronidase及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液の組み合わせであり、C群の責任酵素の場合は、（vi）L-フェニルアラニン及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液である、[１]から[５]のいずれか一項に記載の方法。
[７]前記（i）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-α-D-galactopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれる、[６]に記載の方法。
[８]前記（i）における基質液のpHが4.0〜5.0である、[６]又は[７]に記載の方法。
[９]前記（i）における基質液が、0.1ｍM〜1.0ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれるクエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、[６]から[８]のいずれか一項に記載の方法。
[１０]前記（ii）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-α-D-glucopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれ、アカルボースが1μM〜10μMで含まれる、[６]に記載の方法。
[１１]前記（ii）における基質液のpHが3.5〜4.5である、[６]又は[１０]に記載の方法。
[１２]前記（ii）における基質液が、0.1ｍM〜1.0ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれるクエン酸-リン酸カリウム緩衝液である、[６]、[１０]又は[１１]に記載の方法。
[１３]前記（iii）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-β-D-glucopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれる、[６]に記載の方法。
[１４]前記（iii）における基質液のpHが4.5〜5.5である、[６]又は[１３]に記載の方法。
[１５]前記（iii）における基質液が、クエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、[６]、[１３]又は[１４]に記載の方法。
[１６]前記（iii）における基質液に、タウロデオキシコール酸ナトリウムが類似酵素阻害剤として含まれる、[６]及び[１３]から[１５]のいずれか一項に記載の方法。
[１７]前記（iii）における基質液に、0.1ｍM〜1ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれる、[６]及び[１３]から[１６]のいずれか一項に記載の方法。
[１８]前記（iv）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferyl α-L-Idopyranosiduronic Acid, Sodium Saltであり、0.1ｍM〜3ｍMで含まれる、[６]に記載の方法。
[１９]前記（iv）における基質液のpHが3〜4である、[６]又は[１８]に記載の方法。
[２０]前記（iv）における基質液の緩衝液が還元作用を有する、[１８]から[１９]のいずれか一項に記載の方法。
[２１]前記緩衝液が、ギ酸ナトリウム緩衝液である、[２０]に記載の方法。
[２２]前記（iv）における基質液に、0.1ｍM〜1ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれる、[６]から[２２]のいずれか一項に記載の方法。
[２３]前記（iv）における基質液に、0.01％〜0.1％のPolyoxyethyleneglycol Dodecyl Ether（Brij-35）が含まれる、[６]から[１１]のいずれか一項に記載の方法。
[２４]前記（iv）における基質液に、1μg/mL〜20μg/mLのD-Saccharic acid 1,4-lactoneが類似酵素阻害剤として含まれる、[６]から[２４]のいずれか一項に記載の方法。
[２５]前記（v）におけるIduronidaseが、遺伝子組換え技術により作製したIduronidaseであり、0.1μg/mL〜2μg/mLで含まれる、[６]に記載の方法。
[２６]前記（v）における４-methylumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferyl-a-L-Idopyranosiduronic Acid-2-Sulfate, Sodium Saltであり、0.1ｍM〜3ｍMで含まれる、[６]又は[２５]に記載の方法。
[２７]前記（v）における基質液のpHが4〜5である、[６]、[２５]又は[２６]に記載の方法。
[２８]前記（v）における基質液の緩衝液が、酢酸ナトリウム緩衝液である[６]又は[２５]から[２７]のいずれか一項に記載の方法。
[２９]前記（v）における基質液に10mM〜30mMの酢酸鉛又は2〜20mMの酢酸セリウムが含まれる、[６]又は[２５]から[２８]のいずれか一項に記載の方法。
［３０］前記（vi）における４-methylumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferylphosphateであり、0.05ｍM〜2ｍMで含まれる、[６]又は[２９]に記載の方法。
[３１]前記（vi）における基質液のpHが9〜11である、[６]、[２９]又は[３０]に記載の方法。
[３２]前記（vi）における基質液の緩衝液が、トリス緩衝液である[６]又は[２９]から[３１]のいずれか一項に記載の方法。
[３３]前記（vi）における基質液に、1ｍM〜30ｍMのL‐フェニルアラニンが含まれる、[６]又は［３０］から[３２]のいずれか一項に記載の方法。
[３４]前記（vi）における基質液に、0.5ｍM〜2ｍMのMgCl２が酵素活性増強剤として含まれる、[６]又は［３０］から[３３]のいずれか一項に記載の方法。
[３５]前記（vi）における基質液に、1ｍM〜30ｍMのコハク酸ナトリウムが基質自己分解抑制剤として含まれる、[６]又は［３０］から[３４]のいずれか一項に記載の方法。
[３６]工程（２）において、酵素反応の停止を、酵素反応溶液にグリシン及びEDTAを含む共通反応停止液を添加することにより行う、[１]から[３５]のいずれか一項に記載の方法。
[３７]前記共通反応停止液のpHが10〜11である、[３６]に記載の方法。
[３８]前記酵素反応を、25〜45℃の温度で行った後、前記共通反応停止液を添加する、[３６]又は[３７]に記載の方法。
[３９]前記酵素反応を1〜4時間で行う、[１]から[３９]のいずれか一項に記載の方法。
[４０]前記蛍光測定の測定波長が、励起波長365〜375nm、検出波長460〜470nmである、[１]から[３９]のいずれか一項に記載の方法。
[４１]1枚の乾燥血液ろ紙から複数の先天性代謝異常症の責任酵素を同時に抽出する方法であって、共通抽出液を用いることを含み、該責任酵素が、
（A群）α-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）、酸性β-glucosidase（GBA）
（B群）α-L-Iduronidase（IDU）、Iduronate-2-sulfatase（IDS）及び
（C群）組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNSALP)
の少なくとも２つの群より選ばれる、各群１又はそれ以上の酵素である、方法。
[４２]前記共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液である、[４１]に記載の方法。
[４３]前記共通抽出液に界面活性剤が含まれる、[４１]又は[４２]に記載の方法。
[４４]前記界面活性剤がTronX-100であり、0.05％〜0.5％で含まれる、[４３]に記載の方法。
[４５]前記共通抽出液に、0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウム及び0.05％〜0.5％のウシ血清アルブミン（BSA）が含まれる、[４１]から[４４]のいずれか一項に記載の方法。
[４６]下記を含む、[１]に記載の検査方法に使用するためのキット：
（１）乾燥血液ろ紙、
（２）共通抽出液、
（３）合成基質を含む基質液、
（４）共通反応停止液、及び
（５）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。
[４７]前記共通抽出液が、0.1％BSA、0.1％TrtionX-100及び0.05％アジ化ナトリウムを含む精製水である、[４６]に記載のキット。
[４８]前記合成基質を含む基質液が、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液、ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液、ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液、ムコ多糖症I型（MPSI）を検出するためのIDU酵素活性測定用のMPSI基質液、ムコ多糖症II（MPSII）を検出するためのIDS酵素活性測定用のMPSII基質液及び低ホスファターゼ症を検出するためのTNSALP基質液との組み合わせであり、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液が、3.0mM 4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside及び100mM N-アセチル-D-ガラクトサミン、0.5mM DTTを含むpH4.4の100mMクエン酸-200mMリン酸ナトリウム緩衝液；ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液が、2.0mM 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside及び4.5μMアカルボース、0.5mM DTTを含むpH4.0の250mMクエン酸-250mMリン酸カリウム緩衝液；ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液が、3.0mM 4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside、0.5mM DTT及び0.3％タウロデオキシコール酸ナトリウムを含むpH5.0の100mMクエン酸-100mMリン酸ナトリウム緩衝液；MPS I基質液が、0.6mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid，sodium salt、5μg/mL D-Saccharic acid 1,4-lactone、0.05％Birij-35、50mM KCl及び0.25mM DTTを含むpH3〜4の100mMギ酸ナトリウム緩衝液；MPSII基質液が、0.13mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic Acid -2-sulfate, Sodium Salt (4MU-IDS)、1μg/mL遺伝子組換えIduronidase及び20ｍM酢酸鉛又は2〜20mMの酢酸セリウムを含むpH4.5の50mM酢酸ナトリウム緩衝液；TNSALP基質液が、0.2mM 4-methylumbelliferyl-phosphate、0.05％TritonX-100、10mMコハク酸ナトリウム、10mM L-フェニルアラニン、1mM MgCl2を含むpH9〜11の100mMトリス緩衝液である請求項４６又は４７に記載のキット。
[４９]前記共通反応停止液が、10mM EDTAを含む300mMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）である、[４６]から[４８]のいずれか一項に記載のキット。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、乾燥血液ろ紙の枚数が制限される新生児マススクリーニング検査において、１枚の乾燥血液ろ紙からの、先天性代謝異常症６疾患（ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症II型、低ホスファターゼ症）の酵素活性の同時測定を可能とした。
【００４１】
本発明は、測定条件を共通化させたことで、多数の検体を一度に測定可能とし、検査に要する時間を大幅に短縮させると共に、複数項目の同時検査が可能となった。
【００４２】
本発明により、検体としての血液が採取しにくい新生児について、既存の新生児代謝異常で使用した乾燥血液ろ紙をそのまま使用することができるようになった。すべての新生児について、６種の新規な先天性代謝異常症の可能性が検出できれば、未だ臨床症状が現れていない出生後の早期の段階で、酵素補充療法、遺伝子治療、骨髄移植等が実施でき、精神発達の遅れ等をくい止めることができる可能性が高くなる。
【００４３】
さらに本発明は、新生児のマススクリーニング検査での先天性代謝異常疾患の検出のみならず、病状の把握、治療方針の決定、治療効果の確認、経過観察、モニタリング、医薬品開発の評価等へも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】励起波長(300〜400nm)と検出感度（S/N比）の関係を示す。
【図２】検出波長(400〜500nm)と検出感度（S/N比）の関係を示す。
【図３】複数の測定波長の組み合わせでGLAを測定した場合のS/N比を示す。
【図４】複数の測定波長の組み合わせでGAAを測定した場合のS/N比を示す。
【図５】複数の測定波長の組み合わせでGBAを測定した場合のS/N比を示す。
【図６】アカルボース有無による患者検体と正常人検体の酵素活性値比較結果を示す。
【図７】GLA、GAA、GBA酵素活性のDTT有無による比較結果を示す。
【図８】基質液に4MU合成基質を入れないで蛍光測定した結果（DTT有無）を示す。
【図９】本発明による検査法と先行技術文献による検査法（個別測定条件)でのS/N比を示す。
【図１０】IDU酵素活性に及ぼす添加剤の比較結果を示す。
【図１１】IDU酵素活性に及ぼす基質液KCl濃度の比較結果を示す。
【図１２】IDU酵素活性に及ぼす基質液の緩衝液（ギ酸緩衝液と酢酸緩衝液）の比較結果を示す。
【図１３】IDS酵素活性と抽出緩衝液の組み合わせの影響を示す。
【図１４】IDS酵素活性と基質液ｐHの関係を示す。
【図１５】IDS酵素活性と酢酸セリウム及び酢酸鉛の添加効果を示す。
【図１６】TNSALP酵素活性の金属キレート剤比較結果を示す。
【図１７】TNSALP酵素活性とクエン酸Na、コハク酸Na濃度の比較結果を示す。
【図１８】TNSALP酵素活性とL-フェニルアラニン濃度の比較結果を示す。
【図１９】GLA、GAA、GBA、MPSＩ、MPSII酵素活性と酵素反応時間の関係を示す。
【図２０】TNSALP酵素活性と酵素反応時間の関係を示す。
【図２１】本発明での酵素活性測定法を例示したフローチャートである。
【図２２】新生児の乾燥血液ろ紙中のGLA酵素活性分布図を示す。矢印は、ファブリー病患者の乾燥血液ろ紙中のGLA酵素活性を示す。
【図２３】新生児の乾燥血液ろ紙中のGAA酵素活性分布図を示す。矢印は、ポンペ病患者の乾燥血液ろ紙中のGAA酵素活性を示す。
【図２４】新生児の乾燥血液ろ紙中のGBA酵素活性分布図を示す。矢印は、ゴーシェ病患者の乾燥血液ろ紙中のGBA酵素活性を示す。
【図２５】新生児の乾燥血液ろ紙中のIDU酵素活性分布図を示す。矢印は、MPSI病患者の乾燥血液ろ紙中のIDU酵素活性を示す。
【図２６】新生児の乾燥血液ろ紙中のIDS酵素活性分布図を示す。矢印は、MPSII患者の乾燥血液ろ紙中のIDS酵素活性を示す。
【図２７】新生児の乾燥血液ろ紙中のTNSALP酵素活性分布図を示す。矢印は、低ホスファターゼ症患者の乾燥血液ろ紙中のIDS酵素活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（発明の詳細な説明）
乾燥血液ろ紙を検体とした先天性代謝異常症の酵素活性測定は、乾燥血液ろ紙と基質液を直接混合して酵素反応を行わせる方法や、乾燥血液ろ紙に少量のバッファーを添加した後、基質液を添加して反応させる方法、乾燥血液ろ紙から血液を抽出して、抽出した血液試料に基質液を添加して酵素反応を行わせる方法などがある。
【００４６】
本発明は、１枚の乾燥血液ろ紙から、ファブリー病責任酵素（GLA)、ポンペ病責任酵素（GAA）、ゴーシェ病責任酵素（GBA）、ムコ多糖症Ｉ型（MPSＩ）責任酵素（IDU）、ムコ多糖症II型（MPSII）責任酵素（IDS）、低ホスファターゼ症責任酵素（TNSALP）を含む血液を抽出し、抽出した血液試料を利用して、乾燥血液ろ紙中の６種の酵素活性を測定する方法である。
【００４７】
本発明方法による測定は、（１）乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、（２）抽出した血液試料に合成基質を含む基質液を添加して酵素反応を行わせる工程、（３）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程、の３ステップにより完了する。
【００４８】
血液試料の酵素活性測定では、抽出した血液試料と基質液を混合した場合に酵素活性測定に適するpHになるように抽出液と基質液のどちらか一方で、又は両方で最適pHの緩衝能を持つ組成にする必要があり、既知の測定方法では、測定する酵素毎に抽出液が異なっていた。このため、測定する酵素毎に別々の乾燥血液ろ紙が必要であり、複数の項目を測定するには、複数の乾燥血液ろ紙が必要であった。
【００４９】
本発明では、６種類酵素の酵素活性測定を妨害せず、かつ乾燥血液ろ紙から効果的に各酵素を同時に抽出することができる共通抽出液組成を見出し、１枚の乾燥血液ろ紙から複数の酵素を同時に測定することを可能とした。
【００５０】
本発明方法による共通抽出液は、各基質液と混合したときに酵素反応の最適pHを阻害しない低緩衝能の緩衝液が好ましく、より好ましくは、スルファターゼ酵素やホスファターゼ酵素の反応を妨害するリン酸イオンやクエン酸イオンを含まない緩衝液である。
【００５１】
本発明方法による共通抽出液は、GLA、GAA、GBA、IDU、IDS及びTNSALPの酵素反応を妨害するイオンを含まず、抽出した酵素の安定化を図るために、ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」という。）などの希薄な蛋白質を共存させpH緩衝能を持たせることが好ましい。また、測定するライソゾーム酵素は、白血球などの血液細胞中のライソゾーム中に存在するため、細胞を破砕し、抽出液中に酵素を遊離させる作用を持つ界面活性剤（TritonX-100など）を共存させることがより好ましい。一方で、TNSALPは、血液中の細胞表面や血清中に存在するため、抽出液中に均一に酵素を遊離させるためにも界面活性剤を共存させることが好ましい。
【００５２】
本発明による共通抽出液は、測定対象の酵素活性の抑制には働かず、酵素を抽出する過程で目的以外の酵素活性による非特異反応を抑制する作用を持つ添加物を共存させ、かつ乾燥血液ろ紙からの抽出を促進させる界面活性剤を共存させることが好ましい。界面活性剤は、一般的に作用させる濃度では酵素反応を抑制したり、増強させたりすることがあるため、酵素活性を阻害しない濃度で添加する必要がある。
【００５３】
本発明の共通抽出液は、0.05％〜0.5％のBSA、0.05％〜0.5％のTrtionX-100及び0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウムを含む。本発明の一実施形態の共通抽出液の組成は、「0.1％BSA、0.1％TrtionX-100及び0.05％アジ化ナトリウムを含む精製水」である。共通抽出液中のBSAは、共通抽出液に弱いpH緩衝能を持たせると共に、IDU酵素活性の増強と各酵素の安定化に作用する。界面活性剤であるTritonX-100は、乾燥血液ろ紙からの血液成分の溶出と血球破砕による酵素の溶出を促進し、抽出時間の短縮のために添加する。アジ化ナトリウムは、血液中に存在するペルオキシダーゼ類による非特異反応を防止すると共に、共通抽出液の防腐抑制のために添加する。各添加剤の濃度は、互いの酵素活性を抑制しない濃度として設定することが好ましい。
【００５４】
本発明による基質液は、それぞれの酵素活性測定に適したpH域で緩衝能を持つ緩衝液を使用することにより、共通抽出液で抽出した血液試料を用いて各酵素の測定が可能となる。
【００５５】
基質液に使用する合成基質は、測定対象酵素の特異基質となる構造を有する基質であることが必要である。そのような合成基質を使用することにより、測定対象酵素との反応特異性を向上させることができる。しかしながら、抽出された血液試料中には、類似反応をする酵素が無数に存在するため、さらに特異性を高める目的で、類似酵素阻害剤を共存させることが好ましい。
【００５６】
ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定に使用する基質液（以下、「GLA基質液」という。）は、1mM〜10mMの4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside（以下、「4MU-α-GAL」と略す。）及び10mM〜200mMのN-アセチル-D-ガラクトサミン（以下、「GalNAc」と略す。）を含む。GLA基質液の一実施形態における組成は、「3.0ｍM 4MU-α-GAL及び100ｍM GaLNAc、0.5ｍM DTTを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸Na緩衝液」である。pHは、4.0〜5.0であっても良い。
【００５７】
ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定に使用する基質液（以下、「GAA基質液」という。）は、1mM〜10mMの4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside（以下、「4MU-α-Glu」と略す。）及び1μM〜10μMのアカルボースを含む。GAA基質液の一実施形態における組成は、「2.0ｍM 4MU-α-Glu、4.5μMアカルボース、0.5ｍM DTTを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液」である。pHは、3.5〜4.5であっても良い。アカルボースは、血液試料中に含まれるGAA以外のα-glucosidaseの作用を阻害させるために添加する。
【００５８】
GAAの測定ではα-glucosidase阻害剤（アカルボース）の添加により、血液中のGAA以外のα-glucosidaseを阻害してGAA酵素活性測定の特異性を向上させることが必要である。しかしながら、アカルボースを高濃度で使用するとGAA酵素の活性にも影響する。このため、本発明においては、ポンペ患者の乾燥血液ろ紙と正常人の乾燥血液ろ紙を用いて、アカルボースの有無の基質液で比較検証を行い、アカルボースの濃度を決定している。
【００５９】
ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定に使用する基質液（以下、「GBA基質液」という。）は、1mM〜10mMの4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside（以下、「4MU-β-Glu」と略す。）及び0.1％〜1％のタウロデオキシコール酸ナトリウム（以下、「TAUDA」と略す。）を含む。GBA基質液の一実施形態における組成は、「3.0ｍM 4MU-β-Glu、0.3％TAUDA、0.5ｍM DTTを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸Na緩衝液」である。pHは、4.5〜5.5であっても良い。
【００６０】
ゴーシェ病用基質液に添加される類似酵素阻害剤は、タウロコール酸ナトリウム（以下、「TAUA」と略す。）が一般的に使用されているが、TAUAよりもGBA酵素活性増強に効果があるTAUDAを使用することで、低濃度の試料のGBA酵素活性が測定可能となる。GBA酵素はライソゾームの膜上に多く存在していることから、膜蛋白の可溶化に効果が高いデオキシコール酸類似のTAUDAに変更することでGBA酵素活性測定の増強に効果が得られるものである。
【００６１】
MPSIを検出するためのIDU酵素活性測定に使用する基質液（以下、「MPSI基質液」という。）は、0.1ｍM〜3ｍMの4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid，sodium salt（以下、「4MU-IDUA」と略す。）、1μg/mL〜20μg/mLのD-Saccharic acid 1,4-lactone（以下、「D-Sac」と略す。）、0.01％〜0.1％のBirij-35（Polyoxyethyleneglycol Dodecyl Ether）、10ｍM〜100ｍMのKCl（塩化カリウム）及び0.1ｍM〜1.0ｍMのDTT（Dithiothreitol）を含む。MPSI基質液の一実施形態における組成は、「0.6ｍM 4MU-IDUA、5μg/mL D-Sac、0.05％Birij-35、50ｍM KCl及び0.25ｍM DTTを含むpH3〜4の100ｍMギ酸Na緩衝液」である。
【００６２】
上記組成におけるMPSI基質液は、IDU酵素活性の増強効果のためにKCl、界面活性剤としてBrij-35、さらに、DTTの添加剤が最適濃度で添加されている。また、合成基質である4MU-IDUAは、ナトリウム塩（sodium salt）を用いることでIDUとの反応性が向上し、高感度の測定が可能となっている。
【００６３】
MPSI基質液に添加される類似酵素阻害剤の一例はD-Sacである。類似酵素阻害剤は、IDU以外の類似作用を持つ各種酵素類を阻害し、IDU酵素活性測定の特異性の強化に作用する。その濃度は1μg/mL以上であれば良く、5μg/mL〜10μg/mLであれば類似酵素による非特異的酵素反応を完全に阻害することができる。
【００６４】
MPSI基質液のBase緩衝液は、pH3〜4の酸性側で酵素反応を起こさせるため、還元作用のあるギ酸緩衝液が好ましく、より好ましくは、pH3.5のギ酸Na緩衝液である。
【００６５】
一方、MPSIIを検出するためのIDS酵素活性測定に使用する基質液（以下、「MPSII基質液」という。）は、0.1ｍM〜3ｍMの4MU-IDS、0.1μg/mL〜2μg/mLの遺伝子組換えIduronidase（以下、「r-IDU」と略す。）及び10mM〜30mMの酢酸鉛又は2〜20ｍMの酢酸セリウムを含む。MPSII基質液の一実施形態における組成は、「0.125ｍM 4MU-IDS、0.7μg/mL r-IDU及び5ｍM酢酸セリウムを含むpH4.5の50ｍM酢酸Na緩衝液」である。緩衝液のpHは、4〜5であっても良い。
【００６６】
上記組成におけるMPSII基質液は、これまで２段階を要していた酵素反応を１段階で可能にする組成として考案した。既知の4MU-IDS基質を用いたIDS酵素反応では、第一酵素反応として、IDSと4MU-IDSを反応させて、Iduronidaseの基質となる4MU-IDUAを生成する。その後、リン酸緩衝食塩液などを添加してIDS酵素反応を停止させた後、Iduronidaseを添加して4MU-IDUAの分解を行い蛍光物質である4-methylumbelliferone（以下、「4MU」と略す。）を遊離させるための２段目の酵素反応を行わせる必要がある。本発明におけるMPSII基質液は、２回の酵素反応を行わせることなく、１回の酵素反応で4MUの遊離が可能な組成となっている。
【００６７】
上記組成におけるMPSII基質液中の酢酸鉛又は酢酸セリウムは、鉛イオン又はセリウムイオンが血液試料中の硫酸イオン、リン酸イオン、クエン酸イオンなどのIDS酵素反応阻害物質をマスクして、血液試料のIDS酵素活性の検出を可能にする目的で添加されている。しかしながら、鉛イオン又はセリウムイオンはIduronidaseの妨害金属イオンでもあるため、IDS酵素活性を適切に測定するためには、その添加濃度は多すぎても少なすぎても良くなく、適切な濃度設定が求められる。本発明では、１段階の酵素反応に適する濃度として酢酸鉛濃度又は酢酸セリウム濃度を設定しており、酢酸鉛を用いる場合は、好ましくは、10〜30mMであり、より好ましくは20mMである。一方、酢酸セリウムを用いる場合は、好ましくは、2〜20mMであり、より好ましくは5ｍMである。
【００６８】
上記組成におけるMPSII基質液のpHは、IDS及びIDUの両方が反応できるpHを設定した。IDSの最適pHは5〜6であり、一般に使用される動物由来(ウサギ)IDUの最適pHは2〜3である。このため、IDS酵素反応とIDU酵素反応を同時に行わせることは難しい。そこで、添加するIduronidaseを、IDS酵素活性の至適pHに近いpH4〜5でも反応させることが可能な、r-IDUとすることで、同一pH条件での酵素反応を可能とし、１段階酵素反応でのIDS酵素活性測定を実現した。
【００６９】
低ホスファターゼ症を検出するための基質液(以下、「TNSALP基質液」という。)は、ALP酵素活性測定に適したpH域で緩衝能を持つ緩衝液を使用することにより、共通抽出液で抽出した血液試料を用いて各酵素の測定が可能となる。
【００７０】
TNSALP基質液に使用する合成基質は、測定対象酵素の特異基質となる構造を有する基質であることが必要である。この合成基質を使用することにより対象の酵素との反応特異性を向上させることができる。しかしながら、抽出された血液試料中には、無数の類似反応をする酵素やALPアイソザイムが存在するため、更に特異性を高めるための、類似酵素阻害剤の共存が好ましい。
【００７１】
TNSALP基質液の一実施形態は、「0.2ｍM 4-Methylumbelliferyl phosphate（以下、「4MU-Phos」と略す。）、0.05％TritonX-100、10ｍMコハク酸ナトリウム、10ｍM L-フェニルアラニン（以下、「L-Phe」と略す。）、1.0ｍM MgCl２、を含むpH9〜11の100ｍMトリス緩衝液」の組成からなる。
【００７２】
TNSALP基質液に添加される類似酵素阻害剤（L-Phe）は、TNSALP以外のALPアイソザイム（小腸型ALP、胎盤型ALP、生殖細胞型ALP）を阻害し、TNSALP酵素活性測定の特異性の強化に作用する。その作用は1ｍM以上であれば良く、5〜30ｍMであればALPアイソザイム類による酵素反応を完全に阻害することができる。
【００７３】
ALP測定の場合には、通常pH9〜11のアルカリ性側で酵素反応を起こさせるため、エタノールアミン類の緩衝液が一般に利用されているが、乾燥血液ろ紙抽出試料中のALP濃度は、血清試料を用いた場合に比べて低濃度での活性測定となるため、より高感度に測定することができるトリスヒドロキシメタン緩衝液が良く、好ましくは、pH10.0のトリス-NaOH緩衝液である。
【００７４】
TNSALP基質液に添加される基質安定剤（コハク酸ナトリウム）は、ALPの活性発現に必要なMg２＋の作用を妨害せず、血液試料やその他の試薬から混入するFｅ２＋など基質自己分解を促進する2価の金属イオンを阻害するために添加する。その作用は2ｍM以上であれば良く、好ましくは、5〜30ｍMが良い。
【００７５】
TNSALP基質液に添加されるALP活性増強剤（MgCl2）は、ALPの活性発現に必要なMg２＋を基質液に供給する。その作用は0.1ｍM以上であれば良く、好ましくは、0.5〜3ｍMが良い。
【００７６】
各酵素反応により生成する共通の反応生成物は、アルカリ域に強い蛍光を発する4MUであり、この4MUの蛍光強度を測定する。4MUは、pH9〜11のアルカリ域で最も強い蛍光を発するため、共通反応停止液を添加した後の反応液のpHをアルカリ側にシフトさせることが望ましい。しかしながら、各酵素反応においてpHが異なること、及び基質液はアルカリ域に強い緩衝能を持つことから、共通反応停止液はそれらの影響を受けないよう、高濃度のアルカリ緩衝液とすることがより好ましい。
【００７７】
本発明における共通反応停止液は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの強力な金属キレート剤を含む100ｍM〜500ｍMのグリシン-NaOH緩衝液（pH9〜11）である。この組成の共通反応停止液組成を使用することにより、酵素反応を停止させると共に反応生成物（4MU）の蛍光を増強させて測定することができる。4MUは、pH8を超えるアルカリ域では、360nm付近の紫外線を吸収して、450nm付近に最大蛍光強度を持つ蛍光を発する。よって、共通反応停止液のpHは、8以上が好ましく、より好ましくは9以上であり、10〜11がさらに好ましい。本発明の一実施形態で使用可能な共通反応停止液の組成は、最も好ましくは「10ｍM EDTAを含む300ｍMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）」である。
【００７８】
乾燥血液ろ紙抽出物には、ヘモグロビンなどの4MU蛍光測定を妨害する色素蛋白や紫外線を吸収して4MU励起効率を阻害する核酸成分などが含まれる。本発明では、血液成分を含む反応液での測定で、血液成分の阻害を少なくして4MUを測定するために、測定の波長を4MUの最大励起と最大蛍光波長を意図的にシフトさせて測定する。
【００７９】
４MUのみの最大励起波長は360nm、最大検出波長は450nmであるが、血液試料が混入した状態で蛍光測定する場合、血液成分の影響で蛍光の減衰や非特異的蛍光発生などが混在した状態で実施することになる。このため本発明では、励起波長と検出波長のスキャンニングを行い、より高感度に検出できる波長の組み合わせを見出したものである。この励起波長と測定波長のシフトにより、これまで、血液成分の影響で測定ができなかた低濃度の酵素活性を効率よく測定することができるようになり、高感度な測定が可能となった。
【００８０】
本発明での一実施形態での蛍光測定の波長は、励起波長365〜375nmと検出波長460〜470nmの組合せであり、より好ましくは、励起波長370nｍと検出波長465nmの組み合わせである。この測定波長の組み合わせを各酵素測定に共通で使用することにより、１台の蛍光オートリーダーで各酵素活性を同一マイクロプレート上に配置した場合でも測定可能となった。
【００８１】
酵素活性は、乾燥血液ろ紙１枚当たりの単位時間に得られる4MU産生量として計算する。4MU産生量は、4MU標準品の蛍光強度と抽出試料の蛍光強度を比較して算出する。また、酵素活性の計算式は、以下の式により算出する。
酵素活性（pmol/hr/disk）＝抽出試料の4MU量(μM)×抽出試料量（μL）÷酵素反応時間（hr）×（乾燥血液ろ紙１枚当たりの抽出液量（μL）÷抽出試料量（μL））
【００８２】
本発明での一実施形態での測定操作は、乾燥血液ろ紙１枚をマイクロプレートのウェル内に入れ、100〜200μLの共通抽出液を添加して、1時間の抽出反応を行わせる。抽出された血液試料は、10〜20μLずつ別のマイクロプレートにwell to wellで移注し、そこに各基質液を20〜40μL添加して、25〜45℃で2〜24時間反応させる。
【００８３】
各酵素反応に最適な酵素反応温度は、６種の責任酵素で異なり、IDSやTNSALP以外は、37℃付近が最も活性が高い。よって、共通で使用する温度条件としては、25〜45℃が好ましく、より好ましくは37℃付近である。
【００８４】
酵素反応時間は、ライソゾーム酵素活性の場合は、一般的に24〜48時間であり、ALP酵素活性の場合は、5分〜30分程度であるが、測定条件により挙動が異なるため、本測定系の場合1〜4時間での酵素活性が、24時間反応させた場合より高活性を示すように設定した。よって、共通で使用する条件としては1〜4時間が好ましい。酵素反応終了後、各反応液には、共通反応停止液を200μL添加して酵素反応を停止させる。蛍光オートリーダーを用いて、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光を測定し、4MU標準品の蛍光強度と比較して酵素活性を算出する。
【００８５】
本発明はまた、本発明の検査方法に使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、以下の構成を含む：
（１）乾燥血液ろ紙、
（２）共通抽出液、
（３）合成基質を含む基質液、
（４）共通反応停止液、及び
（５）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。
【００８６】
本発明のキットに含まれる前記共通抽出液は、最も好ましくは、0.1％BSA、0.1％TritonX-100及び0.05％アジ化ナトリウムを含む。
【００８７】
本発明のキットに含まれる前記合成基質を含む基質液は、GLA基質液、GAA基質液及びGBA基質液、MPSI基質液とMPSII基質液、TNSALP基質液との組み合わせであり、最も好ましくはGLA基質液が、「3.0ｍM 4MU-α-GAL及び100ｍM GaLNAc、0.5ｍM DTTを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸Na緩衝液」であり、GAA基質液が、「2.0ｍM 4MU-α-Glu及び4.5μMアカルボース、0.5mM DTTを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液」であり、GBA基質液が、「3.0ｍM 4MU-β-Glu、0.3％ TAUDA及び0.5ｍM DTTを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸Na緩衝液」であり、MPSI基質液が、「0.6ｍM 4MU-IDUA、5μg/mL D-Sac、0.05％Birij-35、50ｍM KCl及び0.5ｍM DTTを含むpH3〜4の100ｍMギ酸Na緩衝液」であり、MPSII基質液が、「0.13ｍM 4MU-IDS、1μg/mL r-IDU及び20ｍM酢酸鉛又は5ｍM酢酸セリウムを含むpH4.5の50ｍM酢酸Na緩衝液」であり、TNSALP基質液が、「0.2ｍM 4MU-Phos、0.05％TritonX-100、10ｍMコハク酸Na、10ｍM L-Phe、1.0ｍM MgCl２、を含むpH10.0の100ｍMトリス緩衝液」である。
【００８８】
本発明のキットに含まれる前記共通反応停止液は、最も好ましくは、10ｍM EDTAを含む300ｍMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）である。
【００８９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００９０】
検体、試薬等
実施例において用いた検体、試薬等は以下のとおりである。
［検体及び標準品］
・検体：乾燥血液ろ紙（φ3mmに切り出して使用)
・4MU標準品：SIGMA-ALDRICH社製、Product No.M1381
【００９１】
［合成基質］
・4-MU-IDUA：トロントリサーチケミカル（TRC)社製、Product No. M334701
・4MU-IDS：トロントリサーチケミカル(TRC)社製、Product No. M334715
・4MU-α-GAL：SIGMA-ALDRICH社製、Product No. M7633
・4MU-α-Glu：SIGMA-ALDRICH社製、Product No. M9766
・4MU-β-Glu：SIGMA-ALDRICH社製、Product No. M3633
・４MU-Phos：SIGMA-ALDRICH社製、Product No.M8883
【００９２】
［類似酵素阻害剤］
・D-Sac：SIGMA-ALDRICH社製、Product No. S0375
・GaLNAc：和光純薬社製、Product No. 013-1282
・アカルボース：和光純薬社製、Product No. 019-22671
・TAUDA：SIGMA-ALDRICH社製、Product No. T0557P
・TAUA：SIGMA-ALDRICH社製、Product No. T4009
・L-Phe：和光純薬社製、試薬特級
【００９３】
［添加酵素］
・r-IDU（組換えIDU酵素）：R＆D systems社製、試薬カタログコード番号4119-GH-010
【００９４】
・共通抽出液：0.1％ BSA、0.1％TrtionX-100及び0.05％アジ化ナトリウムを含む精製水
・共通反応停止液：10ｍM EDTA、300ｍMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）
【００９５】
〔測定機器/器具〕
・マイクロプレート：96well透明マイクロプレート（GREINER社製）
・Blackマイクロプレート：蛍光測定用96well Blackマイクロプレート（NUNC社製）
・蛍光オートリーダー：Infinite M200PRO（TECAN製）
【００９６】
「S/N比」とは検出感度のことであり、得られた試料の蛍光強度をそれぞれのBlank試料蛍光強度で除した値である。また、励起波長をEx、検出波長をEmと記載することがある。
【実施例１】
【００９７】
測定波長（励起波長・検出波長）と検出感度比較
蛍光測定における励起波長と検出波長のスキャンニングを行い、高感度に検出できる波長の組み合わせを検討した。
【００９８】
（１）試薬、試液
・GBA基質液：3.0ｍM 4MU-β-Glu及び0.3％TAUDA、0.5ｍM DTTを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸Na緩衝液
・4MU標準液：4MU標準品を最終濃度20μMになるように共通抽出液で溶解
【００９９】
（２）実験方法
2枚の乾燥血液ろ紙に100μLの共通抽出液を加え2時間抽出した。抽出試料10μL（Blankの場合は、共通抽出液のみを10μL）、20μM 4MU標準液10μL、GBA基質液40μL、共通反応停止液200μLをマイクロプレートのウェルに添加し、(i)検出波長を450nmと460nmに固定して、励起波長300nm〜400nmを5nm毎にスキャンニングした。また、(ii)励起波長を360nmと365nmに固定して、検出波長400nm〜500nmを5nm毎にスキャンニングした。その後、S/N比を算出し検出感度を比較した。
【０１００】
（３）結果
図１に示した通り、励起波長370〜380nm、検出波長は450nmよりも長波長である460nmがより高いS/N比が得られた。また図２に示した通り、励起波長は、360nmより長波長側の365nmで、検出波長は450nmより長波長側の460〜480nmで高いS/N比が得られた。これらの結果を総合すると、血液成分が入ったサンプルでは、励起波長370〜380nm、検出波長460〜480nmで最もS/N比が高い結果が得られることが分かった。
【実施例２】
【０１０１】
測定波長シフトによる高感度化確認
実施例１による波長のシフトが、実検体を測定した場合にも有効であるかどうかを一般的な条件（Ex365/Em450、Ex360/Eｍ460）で測定した場合と長波長側への波長シフトの組み合わせで測定した場合とで比較した。
【０１０２】
（１）試薬・試液
・基質液：
(i)GLA基質液：3.0ｍM 4MU-α-GAL及び100ｍM GaLNAc、0.5ｍM DTTを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸Na緩衝液
(ii)GAA基質液：2.0ｍM 4MU-α-Glu及び4.5μMアカルボース、0.5ｍM DTTを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液
(iii)GBA基質液：3.0ｍM 4MU-β-Glu及び0.3％ TAUDA、0.5ｍM DTTを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸Na緩衝液
【０１０３】
（２）実験方法
乾燥血液ろ紙検体をマイクロプレートの各ウェルに切り出し、各ウェルに100μLの共通抽出液を添加して、室温で振とうしながら1時間の抽出操作を行った。抽出された血液試料を20μLずつBlackマイクロプレートにwell to wellで移注した。検体の入ったウェルにそれぞれの基質液を40μL添加し、37℃恒温槽内に4時間静置して酵素反応を行わせた。酵素反応終了後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、蛍光オートリーダーを用いて、各励起波長・検出波長の組み合わせで蛍光強度を測定し、S/N比を算出した。
【０１０４】
（３）結果
乾燥血液ろ紙（N＝3／Sample 1〜3）を各測定波長の組み合わせでGLA、GAA、GBAを測定した場合のS/N比をそれぞれ図３〜５に示す。GLA、GAA、GBA共に、一般的な条件である励起波長365nm・検出波長450nmで測定した場合より、長波長側にシフトさせた波長の組み合わせが高いS/N比を示し、高感度に検体を測定することができることが実際の乾燥血液ろ紙を用いた測定でも示された。
【実施例３】
【０１０５】
GAA基質液におけるアカルボース添加効果の検証
GAA基質液におけるアカルボース添加効果を、ポンペ患者の乾燥血液ろ紙と正常人（正常新生児）の乾燥血液ろ紙を用いて比較した。
【０１０６】
（１）試薬・試液
・GAA基質液：2.0ｍM 4MU-α-Gluを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液
上記基質液に、4.5μMアカルボースの添加有り、無しの2種を作製。
（２）実験方法
乾燥血液ろ紙として正常人（新生児）から採取したもの（N=74）とポンぺ患者から採取したもの（N=1）を使用し、実施例２「（２）実験方法」と同様の方法で、抽出からGAA酵素反応までを行った。その後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、4MU標準液の蛍光強度と比較して各乾燥血液ろ紙1枚当たりのGAA酵素活性を求めた。
【０１０７】
（３）結果
結果を図６に示す。アカルボースを4.5μMで添加した基質液を用いるとGAA酵素以外のα-glucosidaseによる基質分解が抑制され、患者と正常人の区別ができるようになることが示された。
【実施例４】
【０１０８】
GBA酵素活性測定での添加剤（TAUAとTAUDA）の比較
GBA基質液の添加剤をTAUAからTAUDAに変更することで、GBA酵素活性測定の増強に効果があるかどうか検討した。
【０１０９】
（１）試薬・試液
・(i)GBA基質液：3.0ｍM 4MU-β-Glu、0.5ｍM DTTを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸Na緩衝液
上記基質液に、(ii)0.2％TAUDAを添加したもの、(iii)0.2％TAUAを添加したもの、の3種を作製した。
【０１１０】
（２）実験方法
実施例２「（２）実験方法」と同様の方法で、抽出からGBA酵素反応までを行った。その後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、S/N比を算出し検出感度を比較した。
【０１１１】
（３）結果
結果を表１に示す。Sample 1〜3のすべてにおいて、TAUAよりもTAUDAを使用した方がS/N比が高く、より高感度に測定することができることが分かった。
【表１】
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【実施例５】
【０１１２】
DTT有無による酵素活性増強効果
DTTを含む基質液と含まない基質液を用い、乾燥血液ろ紙より抽出した試料のGLA、GAA、GBA酵素活性を同時に測定し、DTTの酵素活性増強効果を確認した。
【０１１３】
（１）試薬・試液
・基質液
(i)GLA基質液：3.0ｍM 4MU-α-GAL、100ｍM GaLNAcを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸Na緩衝液
(ii)GAA基質液：2.0ｍM 4MU-α-Glu、4.5μMアカルボースを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液
(iii)GBA基質液：3.0ｍM 4MU-β-Glu、0.3％ TAUDAを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸Na緩衝液
(i)〜(iii)のそれぞれについて、0.5ｍM DTT有無の２種類の基質液を作製した。
【０１１４】
（２）実験方法
室温で1時間静置、1時間振とうにより抽出を行ったこと以外は、実施例２「（２）実験方法」に記載した方法と同様の方法で酵素反応までを行った。その後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、DTTを含まない基質液で測定した試料の蛍光強度を100％とした場合のDTTを含む基質液で測定した試料の蛍光強度の割合（％）を比較した。
【０１１５】
（３）結果
結果を図７に示す。0.5mMのDTT濃度では、GLA、GAAの酵素活性には影響せず、GBAのみが増強されることが確認された。
【実施例６】
【０１１６】
DTT添加有無による血液非特異蛍光の増強
基質液にDTTを入れることで、GBA酵素活性は増強する一方で、DTTが高濃度になるとサンプル中の血液成分とDTTが反応して特異蛍光が増強する。この現象を検証するために、4MU合成基質を入れない基質液（以下、「基質ブランク液」）を調製して、DTT添加の有無により非特異蛍光の増強がどの程度発生するのかを確認した。
【０１１７】
（１）試薬・試液
・基質ブランク液：0.3％TAUDAを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸Na緩衝液
上記基質ブランク液に、5ｍM DTT有無による2種類を作製した。
【０１１８】
（２）実験方法
室温で1時間静置、1時間振とうで抽出を行ったこと、抽出された血液試料を2枚のマイクロプレートに移注したこと以外は、実施例２「（２）実験方法」に記載した方法と同様の方法で酵素反応から移注までを行った。その後、検体の入ったウェルに基質ブランク液（DTT有・無）をそれぞれ40μL添加し、37℃恒温槽内に4時間静置して反応を行わせた。反応終了後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、基質ブランク液（DTT有・無）の蛍光強度を比較した。
【０１１９】
（３）結果
結果を図８に示す。Sample１〜４のすべてにおいて、5mM濃度でDTTを添加した基質ブランク液を用いると血液抽出液の成分とDTTが反応して非特異的な蛍光が増強することが確認された。このため、基質液のDTT濃度は低く抑えることが良いことが分かった。
【実施例７】
【０１２０】
先行技術文献に記載の方法との比較
先行技術文献（非特許文献１、２）に記載の個別酵素測定法での測定方法と本発明による測定方法で、同一乾燥ろ紙血液を用いて測定した場合の測定感度を蛍光強度のS/N比で比較した。
【０１２１】
［先行技術文献に記載の測定方法］
(i)GLA：非特許文献１に記載の測定条件に従い測定
乾燥血液ろ紙1枚に抽出液(McIlvan Buffer)40μLを添加して2時間抽出。抽出試料30μLと基質液100μLを混合して、37℃24時間反応させた後、150μLの反応停止液を加え、Ex365nm、Em450nmで4MU蛍光強度を測定した。
(ii)GAA：非特許文献２に記載の測定条件に従い測定
乾燥血液ろ紙1枚に抽出液(イオン交換水)100μLを添加して、2時間抽出。抽出試料20μLと基質液40μLを混合して37℃24時間反応させた後、190μLの反応停止液を加え、Ex360nm, Em450nmで4MU蛍光強度を測定した。
(iii)GBA：非特許文献１に記載の測定条件を一部改編し測定
乾燥血液ろ紙1枚に抽出液(McIlvan Buffer) 40μLを添加して2時間抽出。抽出試料30μLと基質液100μLを混合して、37℃24時間反応させた後、150μLの反応停止液を加え、Ex365nm、Em450nmで4MU蛍光強度を測定した。
※基質液：10ｍM 4MU-β-Glu、0.2％TAUAを含むph5.0の100ｍMクエン酸-リン酸緩衝液
【０１２２】
［本発明による測定方法］
（１）試薬・試液
・基質液：GLA基質液、GAA基質液、GBA基質液、それぞれすべて実施例２「（１）試薬・試液」に記載の組成のものを使用。
【０１２３】
（２）測定方法
実施例２「（２）測定方法」と同様の方法で抽出から酵素反応までを行った。その後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、S/N比を計算して各条件で比較した。
【０１２４】
（３）結果
結果を図９に示す。同一乾燥血液ろ紙を検体として、先行技術文献に記載の測定方法で測定した場合と本発明による測定方法で測定した結果、本発明による測定方法では、3種全ての測定項目でS/N比が高くなり、先行技術文献に記載の測定条件より高感度でかつ、短時間で測定できることが示された。
【実施例８】
【０１２５】
IDU酵素活性の増強確認
IDU酵素活性の増強を図るため、各種添加剤を基質液に添加して測定した。
（１）検体、試薬等
・検体：r-IDU
・MPSI基質液：0.6ｍM 4MU-IDUAを含むpH3.5の100ｍMギ酸Na緩衝液
【０１２６】
（２）測定方法
r-IDUを共通抽出液で8ng/mLに調整し、この希釈標準酵素を検体として、20μLずつBlackマイクロプレートに移注した。検体の入ったウェルにそれぞれの添加剤を添加した基質液を20μL添加し、37℃恒温槽内に4時間静置して酵素反応を行わせた。酵素反応終了後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定した。
【０１２７】
（３）結果
結果を図１０に示す。GBAで増強効果のあるTAUDAやIDS測定に必須添加の酢酸鉛は、IDU酵素活性を阻害した。Birji-35及びKClの添加はIDU酵素活性の増強を示した。
【実施例９】
【０１２８】
IDU酵素活性増強のためのKCl添加濃度検討
IDU酵素活性増強のためにKClの基質液添加濃度について調べた。
【０１２９】
（１）検体、試薬等
・検体：r-IDU
・MPSI基質液：0.6ｍM 4MU-IDUA、5μg/mL D-Sac、0.05％Birij-35及び0.25ｍM DTTを含むpH3.5の100ｍMギ酸Na緩衝液
上記基質液について、(i)KClなし、(ii)30mM KCl添加、(iii)60mM KCl添加、(iv)120mM KCl添加、の4種類を作製した。
【０１３０】
（２）測定方法
実施例８「（２）測定方法」に記載した方法と同様の方法で測定を行った。
【０１３１】
（３）結果
結果を図１１に示す。30ｍM〜120ｍMの範囲でKClを添加することで、無添加の場合と比較して30％以上の酵素活性増強効果を示した。
【実施例１０】
【０１３２】
酢酸緩衝液とギ酸緩衝液の比較検討
IDU酵素活性測定に最適な基質緩衝液を酢酸緩衝液（pH3.0）とギ酸緩衝液（pH3.0）で比較した。
（１）検体、試薬等
・検体：正常人ヒト乾燥血液ろ紙（新生児74名の乾燥血液ろ紙）
・MPSI基質液：
(i)0.6ｍM 4MU-IDUA、5μg/mL D-Sac、0.05％Birij-35、50ｍM KClを含むpH3.0の100ｍMギ酸Na緩衝液
(ii)0.6ｍM 4MU-IDUA、5μg/mL D-Sac、0.05％Birij-35、50ｍM KClを含むpH3.0の100ｍM酢酸Na緩衝液
【０１３３】
（２）測定方法
乾燥血液ろ紙検体をマイクロプレートの各ウェルに切り出し、各ウェルに200μLの共通抽出液を添加して、室温で振とうしながら1時間の抽出操作を行った。抽出された血液試料を20μLずつ2枚のBlackマイクロプレートにwell to wellで移注した。4MU標準品は、2.5μMより2倍段階希釈した希釈標準液を血液試料と同様に20μLずつBlackマイクロプレートに移注した。検体及び4MU標準液の入ったウェルにそれぞれの合成基質を20μL添加し、37℃の恒温槽内に4時間静置して酵素反応を行わせた。酵素反応終了後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、4MU標準液の蛍光強度と比較して各乾燥血液ろ紙1枚当たりの酵素活性を求めた。
【０１３４】
（３）結果
結果を図１２に示す。どちらもpH3.0の緩衝液であるが、ギ酸緩衝液を用いることで高めの酵素活性測定結果となることが確認された。これは、ギ酸緩衝液の還元作用によるものと考えられる。
【実施例１１】
【０１３５】
抽出液の緩衝液検討（IDS酵素活性測定）
抽出液の緩衝液として、リン酸-クエン酸緩衝液と0.1％BSA-H2O緩衝液を用いIDS酵素活性を比較した。
（１）検体、試薬等
・検体：遺伝子組換えIduronate 2-sulfatase（以下「r-IDS」と略す）
R＆D systems社製、試薬カタログコード番号2449-SU-020r-IDS
・抽出液：
(i)0.1％BSA、0.1％TrtionX-100及び0.05％アジ化ナトリウムを含む精製水
(ii)0.1％TrtionX-100、0.05％アジ化ナトリウムを含むpH6.0の25ｍMクエン酸-25ｍMリン酸カリウム緩衝液
・MPSII基質液：0.13ｍM 4MU-IDS、1μg/mL r-IDU及び5ｍM酢酸セリウムを含むpH4.5の50ｍM酢酸Na緩衝液
【０１３６】
（２）測定方法
r-IDSを各抽出液で125〜1000ng/mLに調整し、この希釈標準酵素を検体として、20μLずつBlackマイクロプレートに移注した。検体の入ったウェルにそれぞれの添加剤を添加した基質液20μL添加し、37℃恒温槽内に4時間静置して酵素反応を行わせた。酵素反応終了後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定した。
【０１３７】
（３）結果
結果を図１３に示す。リン酸-クエン酸緩衝液を用いた場合、IDS酵素活性を測定することはできなかった。
【実施例１２】
【０１３８】
MPSII基質液の最適pH検討
MPSII基質液pHを変えて測定を行い最適pHを検討した。
（１）検体、試薬等
・検体：r-IDS
・基質液：0.13ｍM 4MU-IDS、1μg/mL r-IDU及び5ｍM酢酸セリウムを含む50ｍM酢酸Na緩衝液
上記基質液について、(i)pH4.0、(ii)pH4.5、(iii)pH5.0の3種類を作製した。
【０１３９】
（２）測定方法
r-IDSを共通抽出液で500ng/mLに調整したこと以外は、実施例１１（２）測定方法に記載の方法と同様の方法で酵素反応から蛍光強度測定までを行った。
【０１４０】
（３）結果
結果を図１４に示す。pH4.5付近で酵素活性が最大となることから、MPSII基質液の最適pHは4.5付近であることが分かった。
【実施例１３】
【０１４１】
酢酸セリウムの添加効果検討
血液抽出試料中のIDS酵素活性を測定するために、血液試料中の硫酸イオン、リン酸イオン、クエン酸イオンなどのIDS酵素反応阻害物質をマスクするための添加剤として酢酸鉛や酢酸セリウムを基質液に添加する。一般には酢酸鉛が多く使用されているが、測定後の廃液処理の煩雑さを解消するために別の添加剤として酢酸セリウムの添加効果を調べた。
(１)検体、試薬等
・検体：正常人乾燥血液ろ紙
・MPSII基質液：
(i)0.13ｍM 4MU-IDS、1μg/mL r-IDUを含むpH4.5の50ｍM酢酸Na緩衝液
(ii)0.13ｍM 4MU-IDS、1μg/mL r-IDU及び酢酸セリウムを含むpH4.5の50ｍM酢酸Na緩衝液（酢酸セリウム濃度が、5mM、10mM、20mM、30mMのものを作製）
(iii)0.13ｍM 4MU-IDS、1μg/mL r-IDU及び20ｍM酢酸鉛を含むpH4.5の50ｍM酢酸Na緩衝液
【０１４２】
（２）測定方法
実施例２「（２）実験方法」と同様の方法で、抽出から酵素反応までを行った。その後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、S/N比を算出し検出感度を比較した。
【０１４３】
（３）結果
結果を図１５に示す。酢酸セリウムは、酢酸鉛より低濃度で使用することが可能であることが分かった。酢酸セリウムは重金属化合物ではなく、測定終了後の廃液処理が容易となることからも有効な添加剤といえる。
【実施例１４】
【０１４４】
金属キレート剤（EDTA、クエン酸、コハク酸）の基質液への添加効果
ALPの酵素活性発現にはMg2+イオンなど2価金属イオンの共存が必要であるが、一方で全血液中にはヘモグロビン由来のFe2+など多量の2価金属イオンが存在している。Mg2+以外の2価金属イオンが多量に存在すると合成基質の自己分解が促進されるため、Mg２＋イオンの効果を阻害しない金属キレート剤（EDTA、クエン酸、コハク酸）の基質液への添加効果について調べた。
【０１４５】
(１)検体、試薬等
・検体：正常人乾燥血液ろ紙
・TNSALP基質液：(i)0.2ｍM 4MU-Phos、0.05％TritonX-100、10ｍM L-Phe、1.0ｍM MgCl２、を含むpH10.0の100ｍMトリス緩衝液
上記基質液をベースに、(ii)4ｍM EDTA・4Na、(iii)4ｍMクエン酸Na、(iv)4ｍMコハク酸Na、をそれぞれ含む基質液も作製した。
【０１４６】
（２）測定方法
実施例１３「（２）測定方法」と同様の方法で抽出、酵素反応、蛍光強度を測定した。
【０１４７】
（３）結果
結果を図１６に示す。EDTA（キレート定数16.5）、クエン酸（キレート定数11）、コハク酸（キレート定数13）では、キレート効果の弱いクエン酸又はコハク酸の添加はALP測定を阻害しないことが分かった。
【実施例１５】
【０１４８】
クエン酸Na、コハク酸Naの添加濃度検討
乾燥血液ろ紙を検体として、TNSAPL酵素活性を基質液のクエン酸Na又はコハクNa酸の添加濃度を変えて測定を行った。
【０１４９】
(１)検体、試薬等
・検体：正常人乾燥血液ろ紙
・TMSALP基質液：0.2ｍM 4MU-Phos、0.05％TritonX-100、10ｍM L-Phe、1.0ｍM MgCl２、を含むpH10.0の100ｍMトリス緩衝液
上記基質液をベースに、(i)0〜8ｍMクエン酸Na、(ii)0〜8ｍMコハク酸Na、を含む基質液をそれぞれ作製した。
【０１５０】
（２）測定方法
実施例１３（２）測定方法に記載した方法と同様の方法で、抽出、酵素反応、測定を実施した。
【０１５１】
（３）結果
結果を図１７に示す。クエン酸は4ｍM以上で酵素活性低下が認められるが、コハク酸は酵素活性測定には影響を及ぼさないことが分かった。
【実施例１６】
【０１５２】
TNSALP基質液へのL-Phe濃度検討
TNSALP基質液に添加するL-Pheの最適濃度を検討した。
【０１５３】
(１)検体、試薬等
・検体：正常人乾燥血液ろ紙（sample 1〜3）
・TNSALP基質液：0.2ｍM 4MU-Phos、0.05％TritonX-100、10ｍMコハク酸Na、0〜8ｍM L-Phe、1.0ｍM MgCl２、を含むpH10.0の100ｍMトリス緩衝液
【０１５４】
（２）測定方法
実施例１３「（２）測定方法」に記載した方法と同様の方法で、抽出、酵素反応、測定を実施した。
【０１５５】
（３）結果
結果を図１８に示す。L-PheはALPの阻害剤であるが、各アイソザイムに対する感受性が異なり、TNSALPの50％阻害濃度は31mM、小腸型は0.8ｍM、胎盤型は1.1ｍM、生殖細胞型は0.8ｍMである。本測定では、TNSALPの50％阻害濃度より低く、かつTNSALP以外のALPの50％阻害濃度の2倍より高い濃度の範囲内で設定することが望ましい。従って、2ｍM以上の使用濃度で使用すれば本測定系で測定できるALPはTNSALPの酵素活性を反映することができることが分かった。
【実施例１７】
【０１５６】
6種同時測定（酵素活性）
乾燥血液ろ紙を検体として、酵素反応時間を2〜24時間と変化させ6種の酵素活性を同時に測定した。
（１）検体、試薬等
・正常人乾燥血液ろ紙（新生児74名の乾燥血液ろ紙）
・GLA基質液、GAA基質液、GBA基質液：実施例２「（１）試薬・試液」に記載の組成のものを使用
・MPSI基質液：0.6ｍM 4MU-IDUA、5μg/mL D-Sac、0.05％Birij-35、50ｍM KCl及び0.25ｍM DTTを含むpH3.5の100ｍMギ酸Na緩衝液
・MPSII基質液：0.13ｍM 4MU-IDS、1μg/mL r-IDU及び5ｍM酢酸セリウムを含むpH4.5の50ｍM酢酸Na緩衝液
・TNSALP基質液：0.2ｍM 4MU-Phos、0.05％TritonX-100、10ｍMコハク酸Na、10ｍM L-Phe、1.0ｍM MgCl２、を含むpH10.0の100ｍMトリス緩衝液
【０１５７】
（２）測定操作
乾燥血液ろ紙検体をマイクロプレートの各ウェルに切り出し、各ウェルに150μLの共通抽出液を添加して、室温で振とうしながら1時間の抽出操作を行った。抽出された血液試料を20μLずつ6枚のBlackマイクロプレートにwell to wellで移注した。4MU標準品は、TNSALP以外は、2.5μMより2倍段階希釈、TNSALPの場合は、20μMより2倍段階希釈した希釈標準液を血液試料と同様に20μLずつBlackマイクロプレートに移注した。検体及び4MU標準液の入ったウェルにそれぞれの合成基質を30μL添加し、37℃の恒温槽内に2〜24時間静置して酵素反応を行わせた。酵素反応終了後、共通反応停止液を各ウェル200μL添加して、軽く混合した後、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、4MU標準液の蛍光強度と比較して各乾燥血液ろ紙1枚当たりの酵素活性を求めた。
【０１５８】
（３）結果
結果を図１９、図２０に示す。各酵素により挙動が異なるが、多くの酵素では24時間反応させると活性値は低下する。従って本測定法で使用する場合の反応時間は4時間以内に設定するのが望ましいことが分かった。
【実施例１８】
【０１５９】
6種同時測定（正常人検体）
乾燥血液ろ紙を検体として、6種の酵素活性を同時に測定した。検体としては正常人乾燥血液ろ紙（新生児1000名の乾燥血液ろ紙）を用いた。その方法は、酵素反応時間を3時間とした以外は、実施例１７に示した方法と同様である。
【実施例１９】
【０１６０】
6種同時測定（患者検体）
乾燥血液ろ紙を検体としてファブリー病患者、ポンぺ病患者、ゴーシェ病患者、MPSI病患者、MPSII病患者、低ホスファターゼ症患者の乾燥血液ろ紙を検体として測定した。その方法は、実施例１８に示した方法と同様である。
【０１６１】
本実施例１８及び１９で使用した検体は、正常人（新生児乾燥血液ろ紙）1157例、ファブリー病患者1例、ポンぺ病患者1例、ゴーシェ病患者1例、MPSI病患者1例、MPSII病患者1例、低ホスファターゼ症患者1例である。
【０１６２】
正常人の各酵素活性の分布と各疾患患者の酵素活性を図２２〜図２７及び表２に示した。各疾患患者の酵素活性は、明らかに正常人の酵素活性分布より低い結果となった。
【表２】
2018102295.tif 000003
【０１６３】
従って、本発明の測定により、1枚の乾燥血液ろ紙を用いて、6種類の酵素活性を同時に測定することにより、迅速な6疾患のマススクリーニング検査が可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本発明による測定方法は、新生児マススクリーニング検査等において利用可能である。
【図１】
2018102295.tif 000004
【図２】
2018102295.tif 000005
【図３】
2018102295.tif 000006
【図４】
2018102295.tif 000007
【図５】
2018102295.tif 000008
【図６】
2018102295.tif 000009
【図７】
2018102295.tif 000010
【図８】
2018102295.tif 000011
【図９】
2018102295.tif 000012
【図１０】
2018102295.tif 000013
【図１１】
2018102295.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
2018102295.tif 000016
【図１４】
2018102295.tif 000017
【図１５】
2018102295.tif 000018
【図１６】
2018102295.tif 000019
【図１７】
2018102295.tif 000020
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2018102295.tif 000024
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2018102295.tif 000028
【図２６】
2018102295.tif 000029
【図２７】
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