(57)【要約】【課題】遠心力を利用して、より効率的に組織を作製可能な方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る組織の作製方法は、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面１ａを有する培養容器１に、細胞２及び細胞接着性微粒子３を含有する培養液４を加える細胞添加工程と、培養容器１に加えられた細胞２に対し内底面１ａ方向への遠心力Ｇを作用させながら細胞培養を行い、細胞２間を接着させてシート状細胞組織体５を形成する細胞培養工程と、得られたシート状細胞組織体５を内底面１ａから剥離し回収する剥離工程とを含むことを特徴とする。【選択図】図１
2018042572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養
容器に、細胞及び細胞接着性微粒子を含有する培養液を加える細胞添加工程と、
前記培養容器に加えられた前記細胞に対し前記内底面方向への遠心力を作用させながら
細胞培養を行い、前記細胞間を接着させて組織を形成する細胞培養工程と、
得られた前記組織を前記内底面から剥離し回収する剥離工程と
を含む、組織の作製方法。
【請求項２】
前記細胞接着性微粒子の平均粒径が、５００ｎｍ〜１０μｍである、請求項１に記載の
組織の作製方法。
【請求項３】
前記培養容器に加えられる前記細胞接着性微粒子の量が、前記細胞一個当たり０．０２
ｎｇ〜２０ｎｇである、請求項１又は２に記載の組織の作製方法。
【請求項４】
前記細胞接着性微粒子が、ゲル化したコラーゲンの微粒子である、請求項１〜３のいず
れかに記載の組織の作製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により作製されるシート状細胞組織体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法に用いられる細胞培養キットであって、
細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養
容器と、
細胞接着性微粒子と
を含む、前記細胞培養キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織の作製方法に関する。特に、厚さ方向に複数の細胞が積層されたシート
状細胞組織体の製造に適した方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン等の培養担体上で細胞を培養させて製造される生体組織は、細胞密度が低い
ため、医療目的の移植用組織として適したものではない。移植に適した、細胞密度が高い
細胞シート等の組織を製造する技術は、ティッシュエンジニアリングの分野において重要
である。しかしながら、従来の高細胞密度の生体組織の作製方法にはいくつかの問題点が
存在する。
【０００３】
細胞を培養支持体上に播種し、細胞シートを形成することは一般に広く行われている。
細胞シートの剥離を容易にする目的で、細胞接着面に温度応答性ポリマーの層を設け、細
胞の剥離を促進させる技術も開発されており、異物をほとんど含まない細胞シートの回収
が可能である。しかしながら、この方法により形成される細胞シートは、単層又は３層以
下の細胞層から構成されることが通常であり、多層化を行うには、細胞シートを複数重ね
合わせることが必要である。細胞シートは極めて薄く、取扱いが困難であるため、複数重
ね合わせることは容易でなく手間がかかる。
【０００４】
これに対し、細胞培養において細胞に遠心力を作用させる方法が提案されている。例え
ば、（特許文献１）には、細胞を基材上に播種する工程と、細胞を基材に対して遠心力に
より加圧する工程と、細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程と、形成され
た培養物を基材から遊離させる工程とを含む、遊離したシート状細胞培養物の製造方法が
開示されている。
【０００５】
また、本発明者らは、（特許文献２）において、細胞非接着性であるか、細胞非接着性
に変化することが可能である内底面を有する培養容器に、細胞及び細胞外マトリクス成分
を含有する培養液を加える細胞添加工程と、培養容器に加えられた細胞に内底面方向への
遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接
着させて組織を形成する細胞培養工程と、細胞培養工程において得られた組織を前記内底
面から剥離し回収する剥離工程とを含む、組織の作製方法を提案している。この技術では
、細胞外マトリクス成分として、培養される細胞と同一の個体に由来する細胞から調製さ
れた成分を別途添加することによって、最終的に製造される組織の生体成分が全て同一個
体由来となり、組織を移植する上での安全性が高まるとともに、細胞外マトリックスを培
養細胞から分泌させて細胞同士を接着させる場合に比べると細胞間接着が加速されるとい
う利点を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２２６９６２号公報（請求項１及び４）
【特許文献２】特開２０１０−１６１９５２号公報（請求項１、３及び４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記（特許文献２）の技術では、細胞外マトリックスを別途添加した場合であ
っても、シート状の細胞組織体を得るために数時間を要することがあり、細胞へのダメー
ジを低減する観点からより短時間での組織作製が望まれていた。特に近年では、例えば人
工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）において力学的な刺激を加えることにより分化が始まる可
能性が報告されており、そのため効率的な組織作製を行うことによって未分化の状態を維
持することが望まれていた。
【０００８】
そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、遠心力を利用して、より効率的に組織を作製
可能な方法を提供することを目的とする。また、その方法により得られるシート状の細胞
組織体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意研究を行った結果、培養液に対し、細胞とともに細胞接着性微粒子を
添加することによって上記課題を解決できることを見出し、発明を完成した。すなわち、
本発明の要旨は以下の通りである。
【００１０】
（１）細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する
培養容器に、細胞及び細胞接着性微粒子を含有する培養液を加える細胞添加工程と、
前記培養容器に加えられた前記細胞に対し前記内底面方向への遠心力を作用させながら
細胞培養を行い、前記細胞間を接着させて組織を形成する細胞培養工程と、
得られた前記組織を前記内底面から剥離し回収する剥離工程と
を含む、組織の作製方法。
（２）前記細胞接着性微粒子の平均粒径が、５００ｎｍ〜１０μｍである、上記（１）に
記載の組織の作製方法。
（３）前記培養容器に加えられる前記細胞接着性微粒子の量が、前記細胞一個当たり０．
０２ｎｇ〜２０ｎｇである、上記（１）又は（２）に記載の組織の作製方法。
（４）前記細胞接着性微粒子が、ゲル化したコラーゲンの微粒子である、上記（１）〜（
３）のいずれかに記載の組織の作製方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により作製されるシート状細胞組織体
。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法に用いられる細胞培養キットであって
、
細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養
容器と、
細胞接着性微粒子と
を含む、前記細胞培養キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、シート状細胞組織体等の、細胞密度の高い生体組織をより効率的に作
製することができる。作製した組織は、移植等の治療用途に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る組織の作製方法の各工程を説明するための図である。
【図２】実施例１において作製されたシート状細胞組織体を示す写真である。
【図３】実施例１において作製されたシート状細胞組織体を拡大した顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．細胞添加工程
細胞添加工程は、容器部分の内表面のうち少なくとも内底面が細胞非接着性であるか、
細胞非接着性に変化することが可能である培養容器に、細胞及び細胞接着性微粒子を含有
する培養液を加える工程である。
【００１４】
本発明で使用する培養容器は、培養液を収容する容器部分の内表面のうち少なくとも内
底面が細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であれば良い。特に、
培養液を収容する容器部分の内表面のうち、細胞と接触する表面の全て（例えば容器の内
底面及び内側面）が細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であるこ
とが好ましい。
【００１５】
本発明において、細胞非接着性である表面としては、親水性の表面、具体的には２０℃
における静的水接触角が４５°以下である表面が挙げられる。このような表面は、例えば
、炭素酸素結合を有する有機化合物の被膜を基材の表面上に形成することにより得ること
ができる。あるいは、親水性を有する材料で基材自体を構成しても良い。
【００１６】
表面上に親水性被膜を形成するための基材の材料は特に限定されず、具体的には、金属
、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、
ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ
樹脂、ポリアミド樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタ
ン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニ
ル樹脂等）に代表される有機材料等を挙げることができる。
【００１７】
細胞非接着性の表面は、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される、静的水接
触角が４５°以下である親水性被膜により形成することができる。ここで、炭素酸素結合
とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であっても
良い。炭素酸素結合としては、Ｃ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合等が挙げら
れる。
【００１８】
親水性被膜の主原料としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性低分子化合物
、界面活性物質、両親媒性物質等の親水性有機化合物が挙げられる。これらが場合により
相互に物理的又は化学的に架橋し、基材と物理的又は化学的に結合することによって親水
性被膜となる。
【００１９】
具体的な水溶性高分子としては、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリアク
リル酸及びその誘導体、ポリメタクリル酸及びその誘導体、ポリアクリルアミド及びその
誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類等を挙げる
ことができる。分子形状は、直鎖状、分岐状、デンドリマー等を挙げることができる。よ
り具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリ
コールとの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉ
ｃ（登録商標）Ｆ１２７、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニル
−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロ
イルオキシエチルフォスフォリルコリン）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリル
コリンとアクリルモノマーとの共重合体、デキストラン及びヘパリン等が挙げられるがこ
れらには限定されない。
【００２０】
具体的な水溶性オリゴマーや水溶性低分子化合物としては、アルキレングリコールオリ
ゴマー及びその誘導体、アクリル酸オリゴマー及びその誘導体、メタクリル酸オリゴマー
及びその誘導体、アクリルアミドオリゴマー及びその誘導体、酢酸ビニルオリゴマーのケ
ン化物及びその誘導体、双性イオンモノマーからなるオリゴマー及びその誘導体、アクリ
ル酸及びその誘導体、メタクリル酸及びその誘導体、アクリルアミド及びその誘導体、双
性イオン化合物、水溶性シランカップリング剤、水溶性チオール化合物等を挙げることが
できる。より具体的には、エチレングリコールオリゴマー、（Ｎ−イソプロピルアクリル
アミド）オリゴマー、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンオリゴマー、低
分子量デキストラン、低分子量ヘパリン、オリゴエチレングリコールチオール、エチレン
グリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコー
ル、２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）−プロピル］トリメトキシシラン及びトリエ
チレングリコール−ターミネーティッド−チオール等が挙げられるがこれらには限定され
ない。
【００２１】
親水性被膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μ
ｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがさらに好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ま
しい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、基材表面の親水性被膜で覆われていない領域
の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティン
グが比較的容易である。
【００２２】
基材表面への親水性被膜の形成方法としては、基材へ親水性有機化合物を直接吸着させ
る方法、基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材へ親水性有機化合物
をコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材への密着性を高めるために多段階式に
親水性被膜を形成させる方法、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、
次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、基材表面に重合開始点を形成し、次い
で親水性ポリマーブラシを重合する方法等を挙げることができる。
【００２３】
上記の被膜形成方法のうち特に好ましい方法としては、多段階式に親水性被膜を形成さ
せる方法、並びに、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水
性有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。これらの方法を用いると、
基材に対する親水性有機化合物の密着性を高めることが容易であるためである。以下、「
結合層」という用語を用いて説明する。結合層とは、多段階式に親水性被膜を形成する場
合には最表面の親水性被膜層と基材との間に存在する層を意味し、基材表面に下地層を設
け当該下地層の上に親水性有機化合物をコーティングする場合には当該下地層を意味する
。結合層は、結合部分（リンカー）を有する材料を含む層であることが好ましい。リンカ
ーとリンカーに結合させる材料の末端の官能基の組み合わせとしては、エポキシ基と水酸
基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ヒドロキシスクシイミド、カルボキ
シル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組
み合わせにおいて、いずれがリンカー側の官能基であっても良い。これらの方法において
は、親水性有機化合物をコーティングする前に、基材上にリンカーを有する材料による結
合層を形成する。結合層における前記材料の密度は、結合力を規定する重要な因子である
。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができ
る。例えば、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）の場合
には、エポキシシランを付加した基材表面の水接触角が典型的には４５°以上、望ましく
は４７°以上であれば、次に酸触媒存在下でエチレングリコール系材料等を付加すること
によって十分な細胞非接着性を有する表面を得ることができる。
【００２４】
本発明で用いられる培養容器の内底面をはじめとする内表面の細胞接触領域は、細胞非
接着性であることが、組織の剥離の容易性という観点から好ましいが、細胞培養時には細
胞接着性であるが剥離の際に細胞非接着性に変化することが可能である表面であっても良
い。このような表面は、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリ
マーからなる群から選択される少なくとも１種の刺激応答性高分子を、基材の表面に固定
化することによって形成することができる。刺激応答性高分子としては特に温度応答性ポ
リマーが好ましいがこれには限定されない。
【００２５】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは、細胞培養温度下（通常、３７℃程度
）においては疎水性を示し、培養した細胞組織体の回収時の温度下において親水性を示す
ものである。なお、温度応答性ポリマーが、疎水性から親水性に変化する温度（水に対す
る臨界溶解温度（Ｔ））としては、特に限定されないが、培養後の細胞組織体の回収の容
易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度
応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場（細胞接着面）が
充分に確保されるため細胞培養を効率良く行うことができる。その一方、培養後の細胞組
織体の回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、培養された細胞組織体を細胞
培養基材から分離させることで、細胞組織体の回収をより一層容易にすることができる。
特に、所定の臨界溶解温度未満の温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎水性を示す
温度応答性ポリマーが好ましい。このような温度応答性ポリマーにおける臨界溶解温度を
特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。
【００２６】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは、具体的には、下限臨界溶解温度Ｔが
０℃〜８０℃、好ましくは０℃〜５０℃であるポリマーが好ましい。Ｔが８０℃を超える
と細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低いと、一般に細胞
増殖速度が極度に低下するか、又は細胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような
好適なポリマーとしては、アクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。
好適なポリマーとしては、具体的には、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３
２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピ
ルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約
３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−
Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が挙げられる。その他のポリマーとしては、例えば
、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−
Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ
−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニル
エーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のア
ルキル置換セルロース誘導体や、ポリポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイ
ドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、
ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体等が挙げられる。
【００２７】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、例えば、モノマーの単独重合体
がＴ＝０℃〜８０℃を有するようなモノマーであって、放射線照射によって重合し得るモ
ノマーが挙げられる。モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−
（もしくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（
メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以
上を使用することができる。一種類のモノマーが単独で使用された場合、基材上に形成さ
れるポリマーはホモポリマーとなり、複数種のモノマーが一緒に使用された場合、基材上
に形成されるポリマーはコポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。また
、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合等には、上記以外の他のモノマー
類をさらに加えて共重合して良い。さらに、本発明に使用する上記ポリマーとその他のポ
リマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは上記ポリマーと他のポリマーとの混
合物を用いても良い。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可
能である。
【００２８】
ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーは、作製しようとする細胞組織体に適し
たものを適宜選択することができる。
【００２９】
本発明に用いられる細胞としては接着性細胞であれば特に限定されない。そのような細
胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜
内皮細胞等の内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細
胞等の表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の
上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲ
ルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞等の神経細胞、軟骨細胞、骨細胞等が挙げら
れる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、あるいは、それ
らを何代か継代させたものでも良い。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性肝細胞
、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞
等の単能性幹細胞、分化が終了した細胞のいずれであっても良い。また、細胞は単一種を
培養しても良いし二種以上の細胞を共培養しても良い。
【００３０】
これらの細胞は、予め通常の方法で培養させ、培養物をトリプシン処理等で処理し、培
養液中に懸濁させた状態で培養容器に収容される。培養液としては、当技術分野において
通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用い
る細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ
培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰ
ＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編  組織培養の技術第三版」５８
１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（
ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えても良い。また、Ｇｉｂ
ｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。
最終的に得られる細胞組織体の臨床応用を考えると動物由来成分を含まない培地を使用す
ることが好ましい。
【００３１】
そして本発明は、培養液に、細胞に加えて細胞接着性微粒子を含有させることを特徴と
する。細胞接着性微粒子は、細胞とともに遠心力により沈殿し、細胞間を接着させて組織
を形成する機能を有する微粒子である。好ましくは１４４０Ｇの遠心力を付与した場合に
、通常の細胞培養時間（３０分未満〜数時間）内に培養容器の内底面に沈殿するものが望
ましく、このような細胞接着性微粒子として、コラーゲン、フィブリン等の細胞外マトリ
ックス分子の集合体、ゼラチン等の細胞接着性分子からなる微粒子、それら細胞接着性分
子により表面を被覆もしくは修飾した有機もしくは無機材料からなる微粒子等を挙げるこ
とができる。例えば、各種のタンパク質もしくは多糖類をゲル化させた微粒子等が好まし
く用いられる。
【００３２】
好適な細胞接着性微粒子の具体例として、ゲル化させたコラーゲンの微粒子やゼラチン
微粒子等を挙げることができる。コラーゲンは、長さ３００ｎｍ、太さ１．５ｎｍ程度の
棒状の塩基性タンパク質であるが、このコラーゲンをそのまま培養液に添加しても、より
効率的に組織作製を行う観点からは十分でない場合がある。本発明者らは、コラーゲンを
ゲル化させ、得られたコラーゲンゲルを微粒子化することによって細胞同士を強固に密着
させ、細胞密度の高い組織を効率的に得ることができることを見出した。このようなコラ
ーゲンゲルの微粒子を製造するには、例えば、まず塩基性タンパク質であるコラーゲンを
酸性下で可溶化してコラーゲン溶液を作製し、このコラーゲン溶液を生理的条件下（中性
、温度３７℃程度）におくことにより、多数のコラーゲン分子を会合させてゲル化させる
。コラーゲンが十分にゲル化するか、好ましくは５％〜９５％のゲル化度が得られた段階
で、ピペッティング、超音波処理等によってコラーゲンゲルに剪断力を加え、ゲルを粉砕
して微粒子化することにより得ることができる。
【００３３】
細胞接着性微粒子の大きさは、小さ過ぎると遠心力により沈殿し難くなり、逆に大き過
ぎると作製する組織の細胞密度が低下するため、これらのバランスを考慮して適宜設定さ
れる。培養する細胞よりは十分に小さいことが好ましい。具体的には、細胞の種類等によ
っても異なるが、平均粒径が５００ｎｍ〜１０μｍであり、なかでも１μｍ〜３μｍであ
ることが好ましい。なお、細胞接着性微粒子の平均粒径は、例えば上記のようにゲルを粉
砕して微粒子化する場合には、その粉砕条件（超音波による処理時間等）を適宜変化させ
ることにより所望の範囲内になるよう制御することができる。あるいは、微粒子化した後
、ふるい分けにより平均粒径を調整しても良い。ここで平均粒径は、顕微鏡観察による平
均粒径である。顕微鏡観察による平均粒径は、例えば、顕微鏡観察を行い、画像処理ソフ
ト等により任意の微粒子の粒径を１００個測定して個数平均することにより得られる。な
お、粒径とは微粒子の長軸径と短軸径の平均値を指す。また、細胞接着性微粒子の比重は
、遠心力を加えた場合に、細胞間に細胞接着性微粒子が均一に位置し、作製される組織内
において微粒子の偏りができるだけ生じないような比重とする。具体的には、細胞の種類
によっても異なるが、細胞の比重の±２０％以内であり、なかでも±１０％以内とするこ
とが好ましい。
【００３４】
培養容器に加えられる細胞接着性微粒子の量は、組織が形成可能であれば、より少ない
方が組織内の細胞密度が高くなるため好ましい。具体的には、細胞接着性微粒子の平均粒
径等によっても異なるが、細胞接着性微粒子の量を、細胞一個当たり０．００２ｎｇ〜２
００ｎｇとすることが好ましく、０．０２ｎｇ〜２０ｎｇとすることが特に好ましい。一
例として、マウス線維芽細胞からなる組織を作製する場合、１×１０７個の細胞に対する
平均粒径３μｍ前後のコラーゲンゲルの微粒子の好適な量は、０．３ｍｇ（細胞一個当た
り０．０３ｎｇ）程度である。
【００３５】
２．細胞培養工程
細胞培養工程を図１に基づき説明する。細胞培養工程は、培養容器１に収容された、細
胞２及び細胞接着性微粒子３を含有する培養液４に対し、内底面１ａ方向への遠心力Ｇを
作用させながら細胞培養を行い、細胞２間を接着させて組織を形成する工程である。図１
のＡ及びＢがこの工程に対応する。本工程では、遠心力Ｇにより細胞２が内底面１ａの形
状に対応して内底面１ａに密着し、その状態で細胞２同士が細胞接着性微粒子３を介して
接着し、所望の形状の組織が形成される。
【００３６】
遠心力Ｇの大きさは、細胞２の機能に悪影響を与えることなく組織の形成が可能な範囲
で適宜選択することができる。例えば、２Ｇ〜１４４０Ｇが好ましく、２Ｇ〜７２０Ｇが
より好ましい。細胞２及び細胞接着性微粒子３を含有する培養液４を収容した培養容器１
を遠心器に設置し、遠心操作を行うことで遠心力Ｇを付与することができる。
【００３７】
細胞培養は、細胞間接着が形成される条件下で行う。ここで「細胞間接着が形成される
条件」とは、細胞が活動して細胞同士が接着できる条件を指す。培養する細胞の種類に応
じて変動するが、例えば温度条件は２０℃〜４０℃が好ましく、雰囲気ガス条件としては
二酸化炭素濃度が３％〜５％であることが好ましく、培養時間としては０．５〜２４時間
が好ましい。本発明では、比較的大粒径の細胞接着性微粒子３を含有させることにより、
細胞間の接着がより加速化され、組織を効率的に得ることができる。
【００３８】
細胞培養の際には、培養容器を所望の雰囲気ガス（例えば、二酸化炭素濃度５％）で満
たされたインキュベータ内で数分間放置した後、雰囲気ガスが変化しないように培養容器
に蓋をして加重培養を行うことができる。あるいは、これには限定されず、例えば雰囲気
ガス及び温度が制御されたインキュベータ内であれば培養容器を開放した状態で加重培養
を行うこともできる。
【００３９】
細胞培養工程では細胞間接着が形成されれば十分であり、細胞数を増殖により増やすこ
とは必須ではない。培養液中における細胞数を適宜調節することにより、作製される組織
の厚さ（すなわち、組織の厚さ方向の細胞積層数）を制御することができる。細胞培養工
程において細胞の増殖を行う必要がないため、比較的短時間で組織を得ることができる。
また、組織の厚さ、形状を自在に調節することができる。
【００４０】
また、本発明の方法によれば、細胞が高密度化された組織を得ることが可能となる。細
胞が高密度化された組織は移植用途に好ましく用いられる。
【００４１】
３．剥離工程
剥離工程は、遠心操作終了後に、得られた組織を培養容器１の内底面１ａから剥離し回
収する工程である。図１のＣがこの工程に対応する。例えば、ピペッティング操作等の物
理的な操作によって細胞を剥離することができる。培養容器１の内底面１ａが細胞非接着
性の表面であればこの操作は容易であり、短時間の培養で組織の作製及び剥離回収が可能
である。図１に示すように、内底面１ａの平坦形状に沿って、組織としてのシート状細胞
組織体５を得ることができる。培養容器１の内底面１ａが、刺激応答性高分子等の、細胞
非接着性に変化する表面である場合には、細胞非接着性となるような環境（例えば、下限
臨界温度以下の温度）において剥離操作を行う。
【００４２】
組織の形状を維持したまま剥離を行う方法の一例としては、まず、細胞非接着性の内底
面上に形成された組織の表面上にゼラチンを流してゲル化し、さらにＰＥＴフィルム等の
保持基材によりゼラチンゲルを保持し、次いで細胞非接着性の内底面からゼラチンゲルと
ともに組織を剥離して回収することができる。こうして剥離回収された組織は、さらに、
移植対象に密着させ、３７℃でゼラチンを溶解させることにより所望の対象に移植するこ
とができる。
【００４３】
また、本発明は、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内
底面を有する培養容器と、上記の細胞接着性微粒子とを含む細胞培養キットを提供するも
のである。このキットを利用して、上述のような細胞培養を行うことにより、シート状細
胞組織体のような所望の組織を効率的に得ることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これに限定されるものではない
。
【００４５】
（実施例１）
底面の直径が２ｃｍのガラスの容器の内底面の表面全体にポリエチレングリコールを化
学的に付与することで内底面の全体を細胞非接着性にしておき、１０％ウシ胎児血清入り
ＤＭＥＭ培地で懸濁したマウス線維芽細胞４×１０６個、及びアテロコラーゲン（低抗原
性コラーゲン）ゲルの微粒子（平均粒径３μｍ、細胞一個当たりの微粒子の量は０．０３
ｎｇ）を含む培養液２ｍｌを培養容器に播種し、遠心器により内底面方向に７２０Ｇの遠
心力を作用させながら３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で０．５時間培養を行った。培養
後に、遠心器を止めて、内底面に水流による物理的な力を加えることにより組織構造を壊
すことなくシート状細胞組織体を内底面から容易且つ速やかに剥離回収することができた
（図２）。
【００４６】
回収したシート状細胞組織体の顕微鏡観察を行ったところ、細胞同士が密着し、高い細
胞密度の組織が形成されていることが確認された（図３）。また、得られた組織における
細胞生存の有無を調べるために、シート状細胞組織体をトリプシン及びＥＤＴＡで処理す
ることで細胞を分散させ、その後に細胞生死アッセイキット（製品名：細胞二重染色キッ
ト、メーカー：同仁化学、製品番号：ＣＳ０１）により細胞生存率を測定したところ、遠
心力を作用させる前の細胞生存率は９０％であったのに対し、得られたシート状細胞組織
体の細胞生存率も９０％であった。この結果から、本発明の方法により細胞が死ぬことは
ほとんどないことが明らかとなった。
【００４７】
（比較例１）
培養液にアテロコラーゲンゲルの微粒子を含有させない以外は上記実施例１と同様にし
て細胞培養を行った。培養後に遠心器を止めて内底面に水流による物理的な力を加えたと
ころ、組織構造が崩壊し、シート状細胞組織体は得られなかった。
【符号の説明】
【００４８】
１    培養容器
１ａ  内底面
２    細胞
３    細胞接着性微粒子
４    培養液
５    シート状細胞組織体
Ｇ    遠心力
【図１】
2018042572.tif 000003
【図２】
2018042572.tif 000004
【図３】
2018042572.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月17日(2018.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と、ゲル化したタンパク質又は多糖類からなる細胞接着性微粒子とを含有するシート状細胞組織体。
【請求項２】
前記細胞接着性微粒子の平均粒径が、５００ｎｍ〜１０μｍである請求項１に記載のシート状細胞組織体。
【請求項３】
前記細胞接着性微粒子の量が、前記細胞一個当たり０．０２ｎｇ〜２０ｎｇである請求項１又は２に記載のシート状細胞組織体。
【請求項４】
前記細胞接着性微粒子が、ゲル化したコラーゲンの微粒子である請求項１〜３のいずれか一項に記載のシート状細胞組織体。