(57)【要約】【課題】ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ及びその断片を含むタンパク質、それをコードする核酸、並びにＭＲＳＡ感染を予防する及び治療するための組成物及びそれらの使用の提供。【解決手段】ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は少なくとも２４５のアミノ酸を含むその断片をコードする核酸分子が開示される。該核酸分子を含む組成物が開示される。ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は少なくとも２４５のアミノ酸を含むその断片を含む新規のタンパク質が開示される。ＭＲＳＡに罹っていると診断されている個体を治療する方法及び個体のＭＲＳＡ感染を予防する方法として、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対する免疫応答を誘導する方法が開示される。【選択図】図１
2018102319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンセンサス抗原性ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質及びその断片及びそれらをコードする核酸；そのようなタンパク質及び／又は核酸分子を含む改善されたＭＲＳＡワクチン；並びに免疫応答を誘導し、ＭＲＳＡ感染を防ぐ及び／又はＭＲＳＡに感染した個体を治療するために該ワクチンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の抗生剤感受性株すべてを指す。従って、ＭＳＳＡは、ほとんどの黄色ブドウ球菌感染の原因となり、ペニシリン型の抗生剤で治療することができる黄色ブドウ球菌の一般的な種類を指す。それに対してメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）はメチシリンを含む様々なペニシリン抗生剤に耐性である黄色ブドウ球菌の亜群を指す。ＭＲＳＡは抗生剤メチシリンの導入の直後、１９６１年に最初に出現した。ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡは双方とも細胞表面への接着及び免疫回避／殺傷を可能にする毒性／病原性の因子を持つ。ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡの病原性を比較して行った研究は若干矛盾するデータを生じている。しかしながら、明らかなことは、ＭＳＳＡとＭＲＳＡの間の最も意味のある差異は恐らくＭＲＳＡのメチシリンへの耐性であるということである。ＭＲＳＡの耐性は、細菌の表面上のペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）タンパク質の存在から生じる。ＰＢＰ２ａタンパク質はｍｅｃＡ遺伝子にコードされている。
【０００３】
ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）を含む黄色ブドウ球菌の感染は、病院及び、たとえば、老人ホームや透析センターのような他の医療施設における人々の間で最も頻繁に発生する。これらの医療に関連するブドウ球菌感染には、とりわけ、手術傷の感染、尿路感染、血流感染及び肺炎が挙げられる。ＭＲＳＡは、吹き出物又は腫れ物のように見え得る、赤く、腫脹した、疼痛を伴い得る、又は膿又は他の排膿を有する皮膚感染を引き起こすことができる。さらに深刻な感染は肺炎、血流感染又は手術傷の感染を引き起こし得る。深刻なＭＲＳＡ感染（すなわち、侵襲性の）を発症した人の数の一番最近の概算は約９４，３６０人である。深刻なＭＲＳＡ感染の結果としておよそ１８，６５０人が病院に入院中に死亡した（約２０％の死亡率）。
【０００４】
ＰＢＰ２ａ又はその断片をコードする核酸配列を伴ったプラスミドを用いてＭＲＳＡに対するＤＮＡワクチンを開発する試みが報告されている。Ｏｈｗａｄａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｃＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｖｏｋｅｓ  ａｎ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｌｌｓ
ａｕｒｅｌｌｓ，Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９９  Ｄｅｃ；４４（６）：７６７−７４（非特許文献１）は、Ｎ３１５ＭＲＳＡ単離物からクローニングされたＰＢＰ２ａタンパク質をコードするｍｅｃＡ遺伝子を含むＤＮＡプラスミドの筋肉内注射を記載している。Ｒｏｔｈ  ＤＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｔｉ−ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｇｅｎｅｔ  Ｍｏｌ  Ｒｅｓ．２００６  Ａｕｇ  ３１；５（３）：５０３−１２（非特許文献２）及びＳｅｎｎａ  ＪＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００３  Ｊｕｎ  ２；２１（１９−２０）：２６６１−６（非特許文献３）は、筋肉内注射を使用して、ＨＳＰ−０３臨床ＭＲＳＡ単離物からクローニングされたｍｅｃＡ遺伝子の２４９塩基対断片のみを含むＤＮＡプラスミドを送達したことを報告している。
ＭＲＳＡ感染を防ぐ又は治療するのに有用なワクチンに対するニーズが残っている。ＰＢＰ２ａを発現するＭＲＳＡ黄色ブドウ球菌に対する有効な免疫応答を誘導し、それによって感染した個体における治療効果又はＭＲＳＡ感染に対する長期の予防を提供するように、ワクチンに組み入れられると高いレベルで発現することができるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ又はその断片をコードするヌクレオチド配列に対するニーズが残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｏｈｗａｄａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｃＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｖｏｋｅｓ  ａｎ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｌｌｓ  ａｕｒｅｌｌｓ，Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９９  Ｄｅｃ；４４（６）：７６７−７４
【非特許文献２】Ｒｏｔｈ  ＤＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｔｉ−ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｇｅｎｅｔ  Ｍｏｌ  Ｒｅｓ．２００６  Ａｕｇ  ３１；５（３）：５０３−１２
【非特許文献３】Ｓｅｎｎａ  ＪＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００３  Ｊｕｎ  ２；２１（１９−２０）：２６６１−６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は少なくとも２４５のアミノ酸を含むその断片を含むタンパク質をコードする核酸配列が提供される。一部の実施形態では、タンパク質はＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又はその断片に連結されるシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドはＩｇＥのシグナルペプチドである。
【０００７】
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列の断片を含む核酸分子が提供される。断片は、配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質の免疫原性断片をコードし、少なくとも２４５アミノ酸、たとえば、２４５アミノ酸を有する配列番号２の免疫原性断片を含む。一部の実施形態では、断片は配列番号１の断片、たとえば、配列番号３又は配列番号５を含む。一部の実施形態において断片はＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの膜貫通ドメインをコードするコーディング配列を含まない。一部の実施形態における断片は、たとえば、ＩｇＥのシグナルペプチド配列、配列番号１３のようなシグナルペプチド配列をコードするコーディング配列に操作可能に連結される。配列番号９又は配列番号１１を含む一部の実施形態における断片。
【０００８】
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質、たとえば、配列番号２を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。一部の実施形態では、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質の合成コーディング配列である配列番号１を含む核酸分子が提供される。一部の実施形態における核酸コーディング配列は、たとえば、ＩｇＥのシグナルペプチド配列、配列番号１３のようなシグナルペプチド配列をコードするコーディング配列に操作可能に連結される。配列番号７を含む一部の実施形態における核酸分子。
【０００９】
上述されたようなＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は少なくとも２４５のアミノ酸を含むその断片をコードする核酸配列を含む核酸分子はプラスミドであってもよく、核酸分子はウイルス粒子又は他の発現ベクターに組み入れられる。
【００１０】
電気穿孔法を用いて個体に送達するために製剤化されるプラスミド又は他の核酸分子を含む組成物が提供される。
【００１１】
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２８から成る群から選択される１以上のタンパク質をコードする核酸配列を含む組成物が提供される。
【００１２】
タンパク質が提供される。配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であり、少なくとも２４５のアミノ酸を含むタンパク質の免疫原性断片を含むタンパク質であるように、配列番号２を含むタンパク質に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質が提供される。一部の実施形態では、タンパク質は配列番号４又は配列番号６を含む。
【００１３】
ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対して免疫応答を誘導する方法が提供される。一部の方法は、個体にて免疫応答を誘導するのに有効な量にて、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は少なくとも２４５のアミノ酸を含むその断片をコードする核酸分子を個体に投与することを含む。一部の方法は、個体にて免疫応答を誘導するのに有効な量にて個体にタンパク質を投与することを含む。
【００１４】
ＭＲＳＡに罹っていると診断されている個体を治療する方法が提供される。一部の方法は、治療上の量にてＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は少なくとも２４５のアミノ酸を含むその断片をコードする核酸分子を個体に投与することを含む。一部の方法は、治療上有効な量のタンパク質を個体に投与することを含む。
【００１５】
個体にてＭＲＳＡ感染を予防する方法が提供される。一部の方法は、予防上の量にてＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は少なくとも２４５のアミノ酸を含むその断片をコードする核酸分子を個体に投与することを含む。一部の方法は、予防上有効な量のタンパク質を個体に投与することを含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は少なくとも２４５のアミノ酸を含むその断片をコードする核酸分子であって、
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列、又は
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列の断片を含み、
前記断片が、少なくとも２４５のアミノ酸を含む配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質の免疫原性断片をコードする、核酸分子。
（項目２）
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列の断片を含み、前記断片が、少なくとも２４５のアミノ酸を含む配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質の免疫原性断片をコードする、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列の断片を含み、前記断片が、少なくとも２４５のアミノ酸を有する配列番号２の免疫原性断片をコードする、項目２に記載の核酸分子。
（項目４）
前記断片が配列番号１の断片である、項目２に記載の核酸分子。
（項目５）
配列番号５を含む項目２に記載の核酸分子。
（項目６）
配列番号３を含む項目２に記載の核酸分子。
（項目７）
配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質の免疫原性断片が、少なくとも２４５のアミノ酸を含み、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの膜貫通ドメインをコードするコーディング配列を含まない、項目２に記載の核酸分子。
（項目８）
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列の断片に操作可能に連結されるシグナルペプチド配列をコードするコーディング配列を含む、項目２に記載の核酸分子。
（項目９）
前記シグナルペプチド配列が、ＩｇＥのシグナルペプチド配列、配列番号１３である、項目８に記載の核酸分子。
（項目１０）
配列、配列番号１１を含む項目９に記載の核酸分子。
（項目１１）
配列、配列番号９を含む項目９に記載の核酸分子。
（項目１２）
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列を含む、項目に記載の核酸分子。
（項目１３）
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２をコードする核酸配列を含む、項目１２に記載の核酸分子。
（項目１４）
配列番号１を含む項目１２に記載の核酸分子。
（項目１５）
配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結されるシグナルペプチド配列をコードするコーディング配列を含む、項目１２に記載の核酸分子。
（項目１６）
シグナルペプチド配列が、ＩｇＥのシグナルペプチド配列、配列番号１３である、項目１５に記載の核酸分子。
（項目１７）
配列番号７を含む項目１６に記載の核酸分子。
（項目１８）
前記核酸分子がプラスミドである、項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
（項目１９）
前記核酸分子が発現ベクターであり、前記１以上のタンパク質をコードする配列が調節要素に操作可能に連結される、項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
（項目２０）
前記核酸分子がウイルス粒子に組み入れられる、項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
（項目２１）
電気穿孔法を用いて個体に送達するように製剤化される、項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子を含む組成物。
（項目２２）
さらに、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２８から成る群から選択される１以上のタンパク質をコードする核酸配列を含む、項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子を含む組成物。
（項目２３）
電気穿孔法を用いて個体に送達するように製剤化され、さらに、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２８から成る群から選択される１以上のタンパク質をコードする核酸配列を含む、項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子を含む組成物。
（項目２４）
ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対する免疫応答を誘導する方法であって、個体にて免疫応答を誘導するのに有効な量で項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子を前記個体に投与することを含む、方法。
（項目２５）
ＭＲＳＡに罹っていると診断されている個体を治療する方法であって、治療上有効な量の項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子を個体に投与することを含む、方法。
（項目２６）
個体のＭＲＳＡ感染を予防する方法であって、予防上有効な量の項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子を個体に投与することを含む、方法。
（項目２７）
タンパク質であって、
配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるアミノ酸配列を含み、さらにシグナルペプチドを含むタンパク質、又は
配列番号２に対して少なくとも９８％相同であり、且つ少なくとも２４５のアミノ酸であるアミノ酸配列を含み、さらにシグナルペプチドを含むタンパク質の免疫原性断片であるタンパク質
から成る群から選択される、タンパク質。
（項目２８）
配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２を含む項目２６に記載のタンパク質。
（項目２９）
ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対して免疫応答を誘導する方法であって、個体にて免疫応答を誘導するのに有効な量で項目２７に記載のタンパク質を含む組成物を前記個体に投与す
ることを含む、方法。
（項目３０）
ＭＲＳＡに罹っていると診断されている個体を治療する方法であって、治療上有効な量の項目２７に記載のタンパク質を含む組成物を個体に投与することを含む、方法。
（項目３１）
個体のＭＲＳＡ感染を予防する方法であって、予防上有効な量の項目２７に記載のタンパク質を含む組成物を個体に投与することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】黄色ブドウ球菌の表面上で見い出されるようにＰＢＰ２ａタンパク質を描写した図である。タンパク質は、細胞膜に位置する「膜貫通ドメイン」によって細胞膜に係留され、「Ｎ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン」及び「トランスペプチダーゼドメイン」は双方とも細胞外空間にて細胞の外側に露出される。図１はまた、本明細書で開示される核酸分子によってコードされるタンパク質に含まれるＰＢＰ２ａタンパク質配列の例であるＰＢＰ２ａタンパク質の２つの型も示す。「完全」と指定される型は、「膜貫通ドメイン」、「Ｎ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン」及び「トランスペプチダーゼドメイン」を含む完全長のＰＢＰ２ａタンパク質を含む。「係留なし」と指定される型は、「Ｎ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン」及び「トランスペプチダーゼドメイン」を含む完全長のＰＢＰ２ａタンパク質の断片である。
【図２】「係留なし型」のＰＢＰ２ａタンパク質断片をコードするＤＮＡワクチンで免疫したマウスにおけるＰＢＰ２ａ特異的な抗体と比べた「短い型」のＰＢＰ２ａタンパク質断片をコードするＤＮＡワクチンで免疫したマウスにおけるＰＢＰ２ａ特異的な抗体の力価のデータを示す図である。
【図３】ＣＭＶプロモータとＢＧＨポリＡ部位に操作可能に連結されるようにクローニングしたＰＢＰ２ａコーディング配列の挿入を伴った骨格プラスミドｐＶａｘ１を示す模式図である。
【図４】ｐＶａｘを対照として用い、ＰＢＰ２ａタンパク質の完全型及び係留なし型をコードする構築物を用いてタンパク質の発現レベルを比較する発現実験の結果を示す図である。
【図５】未感作／対照マウス又は０日目と１４日目に完全型又は係留なし型のワクチンでワクチン接種したマウスからの０日目、１４日目及び２８日目における抗ＰＢＰ２ａ  ＩｇＧ力価の複合データを示す図である。
【図６】未感作／対照マウス（左）又は０日目と１４日目に係留なし型のワクチン（中央）又は完全型のワクチン（右）でワクチン接種したマウスからの０日目、１４日目及び２８日目における抗ＰＢＰ２ａ  ＩｇＧ力価の個体データを示す図である。
【図７】血清希釈におけるＩｇＧの力価のデータの点間グラフ（左）及び最良適合（中央）及び相互希釈の終点力価（右）を用いた未感作／対照マウス又は完全型若しくは係留なし型ワクチンでワクチン接種したマウスからのデータの比較を示す図である。
【図８】未感作／対照マウス又は０日目と１４日目に完全型のワクチン又は係留なし型のワクチンでワクチン接種したマウスからの０日目及び２８日目のＩｇＧ１（左）及びＩｇＧ２ａ（右）の別々の力価を示す図である。
【図９】完全型又は係留なし型の変異体で皮内（ＩＤ）免疫したモルモットから採取したＩｇＧ力価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
コンセンサスＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ又はその免疫原性断片を含むタンパク質をコードするコーディング配列が提供される。コーディング配列は、以下：転写を高めるための低ＧＣ含量のリーダー配列；ｍＲＮＡの安定性及びコドンの最適化；可能な限りのシス作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の除去の１以上を有することを含む、改善された転写及び翻訳を提供する。一部の実施形態では、コンセンサスＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ又はその免疫原性断片を含むタンパク質をコードするコーディング配列は、たとえば、ＩｇＥのシグナルペプチドのようなシグナルペプチドをコードするコーディング配列に操作可能に連結される。たとえば、ＩｇＥのシグナルペプチドのようなシグナルペプチドをコードするコーディング配列に連結されるコンセンサスＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ又はその免疫原性断片を含むタンパク質が提供される。個体の細胞におけるコーディング配列の発現又はタンパク質の投与は、黄色ブドウ球菌の細胞表面上におけるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質を含むＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質を認識する免疫応答を誘導する。
【００１８】
本発明の一部の態様では、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対する免疫応答は、細菌の複数の株に対する広い免疫応答を提供する。一部の実施形態では、タンパク質は完全長のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ配列を含み、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質をコードする核酸分子は完全長のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ配列をコードするコーディング配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質はＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ配列の断片を含み、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質をコードする核酸分子はＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ配列の断片をコードするコーディング配列を含む。ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質の配列は複数の供給源、株、亜型、亜種等に由来するＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ配列から生成され得る。一部の実施形態では、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ配列は複数のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ配列のコンセンサス配列であるコンピュータで生成された配列であり、コンセンサス配列は各位置にて最も共通して存在するアミノ酸を利用する。一部の実施形態では、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａは株間での交差反応性が高い免疫応答を提供する。
１．定義
【００１９】
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であって、限定することを意図するものではない。明細書及び添付のクレームで使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に示さない限り、複数参照を含む。
【００２０】
本明細書での数範囲の引用については、同程度の精度でその間に介在する各数が明白に企図される。たとえば、６〜９の範囲については、６及び９に加えて数７及び８が企図され、６．０〜７．０の範囲については、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明白に企図される。
【００２１】
（ａ）アジュバント
「アジュバント」は本明細書で使用されるとき、本明細書で記載されるＤＮＡプラスミドワクチンに添加してＤＮＡプラスミド及び以下で記載される核酸配列によってコードされるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対する免疫応答を高める任意の分子を意味し得る。
【００２２】
ｂ）抗体
「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及び単鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二官能性抗体及びそれらの誘導体を含むクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥの抗体又はその断片又は誘導体を意味し得る。抗体は、所望のエピトープ又は由来する配列への十分な結合特異性を示す、哺乳類の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製した抗体又はそれらの混合物であり得る。
【００２３】
（ｃ）コーディング配列
「コーディング配列」又は「コードする核酸」は本明細書で使用されるとき、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を意味し得、それを指す。コーディング配列はさらに、核酸が投与される個体又は哺乳類の細胞にて発現を指示することが可能であるプロモータ及びポリアデニル化シグナルを含む調節性要素に操作可能に連結される開始シグナル及び終結シグナルを含み得る。
【００２４】
（ｄ）相補体
「相補体」又は「相補性」は本明細書で使用されるとき、核酸が核酸分子のヌクレオチド間又はヌクレオチド類似体間でワトソン／クリック（たとえば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）又はフーグスティーンの塩基対形成を意味し得ることを意味し得る。
【００２５】
（ｅ）コンセンサス又はコンセンサス配列
「コンセンサス」又は「コンセンサス配列」は本明細書で使用されるとき、複数のＭＲＳＡ配列に基づいたＰＢＰ２ａ配列の配列比較の解析に基づいて構築される合成の核酸配列又は対応するポリペプチド配列を意味し得る。配列番号２にて開示されるＰＢＰ２ａ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ７４３７６．１、ＡＤＣ３６２５３．１、ＣＡＨ１７５９４．１、ＣＡＬ２２８９１．１、ＡＡＦ８５６４５．１及びＡＢＭ６６４４３．１における配列に基づく。これらの配列を並べ、最終決定される抗原で使用するために各点で最も共通するアミノ酸を選択した。ワクチンに組み込むと、タンパク質又はタンパク質をコードする遺伝子を用いて複数のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ変異体に対する広い免疫応答を誘導することができる。コンセンサスＭＲＳＡのＰＢＰ２ａはそのようなタンパク質をコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を含み得る。
【００２６】
（ｆ）定電流
「定電流」は、組織又は組織を規定する細胞が、同じ組織に送達される電気パルスの持続時間にわたって受け取る又は感じる電流を規定するように本明細書で使用される。電気パルスは本明細書で記載される電気穿孔装置から送達される。この電流は、本明細書で提供される電気穿孔装置がフィードバック要素を有する、好ましくは瞬時のフィードバックを有するので、電気パルスの寿命の間にわたって当該組織にて一定のアンペア数のままである。フィードバック要素はパルスの持続時間全体にわたって組織（または細胞）の抵抗を測定することができ、電気穿孔装置がその電気的エネルギーの出力を変える（たとえば、電圧を上げる）ようにすることができるので、同一組織における電流は電気パルス全体にわたって及びパルスからパルスにて一定のままである（約数マイクロ秒）。一部の実施形態では、フィードバック要素は制御要素を含む。
【００２７】
（ｇ）電流フィードバック又はフィードバック
「電流フィードバック」又は「フィードバック」は本明細書で使用されるとき、相互交換可能に使用されてもよく、提供される電気穿孔装置の有効な応答を意味し得、これは、それに応じて電流を一定レベルに維持するために電極間の組織における電流を測定し、ＥＰ装置によって送達されるエネルギー出力を変えることを含む。この一定レベルはパルス列又は電気処理の開始に先立ってユーザーによって予め設定される。フィードバックは電気穿孔法の構成部分、たとえば、電気穿孔装置の制御要素によって達成され得、これは、その中の電気回路が電極間の組織における電流を連続してモニターすることができ、予め設定した電流とそのモニターした電流（又は組織内の電流）を比較し、連続的にエネルギー出力を調整してモニターした電流を予め設定したレベルに維持することができるためである。フィードバックループは、それがアナログ閉ループのフィードバックなので瞬時であり得る。
【００２８】
（ｈ）分散化させた電流
「分散化させた電流」は本明細書で使用されるとき、本明細書で記載される電気穿孔装置の種々の針状電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、パターンは、電気穿孔法を受ける組織の任意の領域にて電気穿孔法に関連する熱ストレスの発生を出来るだけ抑える、又は好ましくは排除する。
【００２９】
（ｉ）電気穿孔法
「電気穿孔法」、「エレクトロ透過化」又は「電気動力学的増強（「ＥＰ」）」は本明細書で相互交換可能に使用されるとき、生体膜にて微細な経路（孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を指し得、それらの存在によって、たとえば、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン及び水のような生体分子が細胞膜の一方から他方へ通過するのが可能になる。
【００３０】
（ｊ）フィードバック機構
「フィードバック機構」は本明細書で使用されるとき、過程が、所望の組織のインピーダンス（エネルギーのパルスの送達前、途中、及び／又は後での）を受取り、現在の値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーのパルスを調整して予め設定された値を達成するソフトウエア又はハードウエア（又はファームウエア）のいずれかによって実施される過程を指し得る。フィードバック機構はアナログ閉ループ回路によって実施され得る。
【００３１】
（ｋ）断片
「断片」は、哺乳類にてＰＢＰ２ａに対して免疫応答を引き出すことが可能であるＰＢＰ２ａのポリペプチド断片を意味し得る。断片は配列番号２の断片を含み得る。断片は配列番号６、又はたとえば、配列番号４のような配列番号２の他の断片を含み得る。一部の実施形態では、断片は配列番号６を含む。一部の実施形態では、断片は配列番号４を含む。配列番号１２は配列番号６を含む。配列番号１０は配列番号４を含む。断片はまた配列番号２に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片も指す。断片はまた配列番号２に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片も指す。断片は、配列番号６に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片又は配列番号４に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片のような配列番号２に対して９８％以上相同であるポリペプチドの他の断片を含み得る。一部の実施形態では、断片は配列番号６に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片を含む。一部の実施形態では、断片は配列番号４に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片を含む。断片は、配列番号６に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片又は配列番号４に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片のような配列番号２に対して９９％以上相同であるポリペプチドの他の断片を含み得る。一部の実施形態では、断片は配列番号６に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片を含む。一部の実施形態では、断片は配列番号４に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片を含む。
【００３２】
その断片は、長さ２４５以上のアミノ酸、長さ２５０以上、２６０以上、２７５以上、２９０以上、３２０以上、３５０以上、３８０以上、４１０以上、４４０以上、４７０以上、５００以上、５４０以上、５６０以上、５８０以上、６４０以上又は長さ６６０以上であり得る。ポリペプチド断片は、長さ２５０未満のアミノ酸、長さ２５５未満、２６７未満、２８３未満、３０５未満、３３５未満、３６５未満、３９５未満、４３５未満、４５５未満、４８５未満、５２０未満、５５０未満、５７０未満、６００未満、６５０未満、又は６６５未満のアミノ酸であり得る。断片は好ましくは膜貫通ドメインを含まない。断片は好ましくは分子のＣ末端部分に対応する触媒ドメイン又はトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部を包含する。断片は好ましくはＮ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン／二量体領域のすべて又は一部を包含する。断片は好ましくは分子のＣ末端部分に対応する触媒ドメイン又はトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部、さらにＮ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン／二量体領域のすべて又は一部を包含する。
【００３３】
断片はさらに、たとえば、免疫グロブリンのシグナルペプチド、たとえば、ＩｇＥ又はＩｇＧのシグナルペプチドのようなシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列（６６８のアミノ酸マイナスＮ末端Ｍｅｔ）又はそのさらに小さな断片に連結され得る。シグナルペプチドは、６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列（６６８のアミノ酸マイナスＮ末端Ｍｅｔ）に対して９８％相同であるポリペプチド又は６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列に対して９８％相同であるポリペプチドのさらに小さな断片に連結され得る。シグナルペプチドは、６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列（６６８アミノ酸マイナスＮ末端Ｍｅｔ）に対して９９％相同であるポリペプチド又は６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列に対して９９％相同であるポリペプチドのさらに小さな断片に連結され得る。配列番号２又はその断片に対するポリペプチドが有する相同性の程度の算出では、どんなシグナルペプチドもそのような算出には含められない。シグナルペプチドの配列は相同性の決定には使用されない。従って、たとえば、配列番号１２はシグナルペプチドに操作可能に連結された配列番号６を含むけれども、配列番号１２は配列番号２の断片を含み、すなわち、配列番号６には存在しないシグナルペプチドにもかかわらず、配列番号１２は配列番号２の断片に対して１００％相同であるポリペプチドを含む。従って、配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるポリペプチドの断片を含むタンパク質は、少なくとも２４５のアミノ酸であり、任意で、たとえば、シグナルペプチドに連結され得る配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるポリペプチドの断片であるタンパク質を指すように意図される。
【００３４】
「断片」は、配列番号２の断片をコードする核酸断片及び配列番号２に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片を含む上述のＰＢＰ２ａ断片をコードする核酸断片も意味し得る。断片は、配列番号２の断片を含むタンパク質をコードする核酸断片も意味し得る。断片は、配列番号６又はたとえば、配列番号４のような配列番号２の断片を含む配列番号２の断片を含むタンパク質をコードする核酸断片を意味し得る。一部の実施形態では、断片は配列番号１２のような配列番号６を含むタンパク質をコードする核酸断片である。一部の実施形態では、断片は配列番号１０のような配列番号４を含むタンパク質をコードする核酸断片である。断片はまた、配列番号２に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片をコードする核酸断片も指す。断片はまた、配列番号２に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片をコードする核酸断片も指す。断片は、配列番号６に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片、又は配列番号４に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片のような配列番号２に対して９８％以上相同であるポリペプチドの他の断片をコードする核酸断片を含み得る。一部の実施形態では、断片は、配列番号６に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片をコードする核酸断片を含む。一部の実施形態では、断片は、配列番号４に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片をコードする核酸断片を含む。断片は、配列番号６に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片、又は配列番号４に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片のような配列番号２に対して９９％以上相同であるポリペプチドの他の断片をコードする核酸断片を含み得る。一部の実施形態では、断片は、配列番号６に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片をコードする核酸断片を含む。一部の実施形態では、断片は、配列番号４に対して９９％以上相同であるポリペプチドの断片をコードする核酸断片を含む。「断片」は本明細書で使用されるとき、哺乳類にて抗ＰＢＰ２ａ免疫応答を引き出すことが可能であるポリペプチドをコードする部分又は核酸を意味し得る。
【００３５】
配列番号２の断片及び配列番号２に対して９８％以上相同であるポリペプチドの断片をコードする核酸断片を含む上述されたＰＢＰ２ａ断片をコードする核酸断片は、配列番号１の断片に対して９８％以上相同である。核酸断片は好ましくは配列番号１の断片に対して９９％以上相同である。核酸断片は好ましくは配列番号１の断片である。従って核酸分子断片は配列番号１の断片に対して９８％以上相同であり、配列番号２の断片に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする。従って核酸分子断片は好ましくは配列番号１の断片に対して９９％以上相同である。核酸分子断片は好ましくは配列番号２の断片に対して９９％以上相同であるタンパク質をコードする。従って、核酸分子断片は、配列番号１の断片に対して９９％以上相同であり、且つ配列番号２の断片に対して９９％以上相同であるタンパク質をコードする。核酸分子断片は好ましくは配列番号２の断片に対して９９％以上相同であるタンパク質をコードする。核酸分子断片は好ましくは配列番号２の断片をコードする。核酸分子断片は好ましくは、配列番号６を含む配列番号２の断片をコードする。核酸分子断片は配列番号６を含む配列番号２の断片をコードし得る。核酸分子断片は配列番号４を含む配列番号２の断片をコードし得る。核酸分子断片は配列番号５を含み得る。核酸分子は配列番号３を含み得る。
【００３６】
核酸分子断片は、長さ２４５以上のアミノ酸、２５０以上、２６０以上、２７５以上、２９０以上、３２０以上、３５０以上、３８０以上、４１０以上、４４０以上、４７０以上、５００以上、５４０以上、５６０以上、５８０以上、６４０以上又は長さ６６０以上のアミノ酸であるＰＢＰ２ａの断片をコードする。その断片は、配列番号９のような配列番号５を含み得る。その断片は、配列番号１１のような配列番号７を含み得る。配列番号１の断片又は配列番号２の断片をコードする配列番号１の断片に対して少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列の断片又は配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるポリペプチドの断片は、長さ２４５以上のアミノ酸、２５０以上、２６０以上、２７５以上、２９０以上、３２０以上、３５０以上、３８０以上、４１０以上、４４０以上、４７０以上、５００以上、５４０以上、５６０以上、５８０以上、６４０以上又は長さ６６０以上のアミノ酸であるＰＢＰ２ａの断片をコードし得る。配列番号１の断片又は配列番号２の断片をコードする配列番号１の断片に対して少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列の断片又は配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるポリペプチドの断片は、長さ２５０未満のアミノ酸、２５５未満、２６７未満、２８３未満、３０５未満、３３５未満、３６５未満、３９５未満、４３５未満、４５５未満、４８５未満、５２０未満、５５０未満、５７０未満、６００未満、６５０未満、又は６６５未満のアミノ酸である。配列番号１の断片又は配列番号２の断片をコードする配列番号１の断片に対して少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列の断片又は配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるポリペプチドの断片は、長さ７３５以上のヌクレオチド、７５０以上、７８０以上、８２５以上、８７０以上、９６０以上、１０５０以上、１１４０以上、１２３０以上、１３２０以上、１４１０以上、１５００以上、１６２０以上、１６８０以上、１７４０以上、１９２０以上又は１９８０以上のヌクレオチドであり得る。配列番号１の断片又は配列番号２の断片をコードする配列番号１の断片に対して少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列の断片又は配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同であるポリペプチドの断片は、長さ７５０未満のヌクレオチド、７６５未満、８００未満、８５０未満、９１５未満、１０００未満、１１００未満、１２００未満、１３００未満、１３５０未満、１５５０未満、１６００未満、１６５０未満、１７００未満、１８００未満、１９５０未満又は１９９５未満のヌクレオチドであり得る。断片は好ましくは膜貫通ドメインをコードしない。断片は好ましくはタンパク質のＣ末端部分に対応する触媒ドメイン又はトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部をコードする。断片は好ましくは、タンパク質のＣ末端部分に対応する触媒ドメイン又はトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部、且つさらにＮ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン／二量体領域のすべて又は一部をコードする。
【００３７】
ＤＮＡ断片は、免疫グロブリンのシグナルペプチド、たとえば、ＩｇＥ又はＩｇＧのシグナルペプチドのようなシグナルペプチドをコードするコーディング配列を含み得る。シグナルペプチドをコードするコーディング配列は、６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列（６６８のアミノ酸マイナスＮ末端Ｍｅｔ）又はそのさらに小さな断片に連結され得る。シグナルペプチドをコードするコーディング配列は、６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列（６６８のアミノ酸マイナスＮ末端Ｍｅｔ）に対して少なくとも９８％相同であるポリペプチド又は６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列に対して少なくとも９８％相同であるポリペプチドのさらに小さな断片をコードするコーディング配列に連結され得る。シグナルペプチドをコードするコーディング配列は、６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列（６６８のアミノ酸マイナスＮ末端Ｍｅｔ）に対して少なくとも９９％相同であるポリペプチド又は６６７のアミノ酸のＰＢＰ２ａ配列に対して少なくとも９９％相同であるポリペプチドのさらに小さな断片をコードするコーディング配列に連結され得る。コーディング配列は、配列番号１の断片に対して少なくとも９８％相同であり、好ましくは配列番号１の断片に対して少なくとも９９％以上相同である。コーディング配列は好ましくは、配列番号１の断片に対して１００％相同であり、すなわち、それらは配列番号１の断片である。ペプチド配列について配列番号２又はその断片に対する相同性の程度を算出する記載にて上記で言及したように、コーディング配列についての相同性の程度の算出は、そのような算出にはシグナルペプチドをコードするコーディング配列を含まない。シグナルペプチドの配列は、配列番号１のコーディング配列と断片との間での相同性の程度の決定には使用されない。従って、たとえば、配列番号１１はシグナルペプチドに操作可能に連結された配列番号５を含むけれども、配列番号１１は配列番号１の断片を含み、すなわち、配列番号１１は、シグナルペプチドをコードする配列番号１１のコーディング配列が配列番号１に含まれないという事実にもかかわらず、配列番号１の断片に対して１００％相同であるヌクレオチド配列を含む。従って、配列番号１の断片に対して少なくとも９８％相同である核酸配列の断片を含む核酸分子は、配列番号１の断片に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２の断片に対して少なくとも９８％相同である少なくとも２４５のアミノ酸をコードし、任意で、たとえば、シグナルペプチドのコーディング配列に操作可能に連結され得る核酸配列の断片を含む核酸分子を指すように意図される。
【００３８】
（ｌ）同一の
「同一の」又は「同一性」は、２以上の核酸又はポリペプチドの配列の文脈にて本明細書で使用されるとき、配列が特定される領域にわたって同一である特定される比率の残基を有することを意味し得る。比率は、２つの配列を最適に並べ、特定される領域にわたって２つの配列を比較し、双方の配列で同一の残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得、特定される領域における位置の総数で一致した位置の数を割り、結果に１００を乗じて配列同一性の比率を得ることによって算出され得る。２つの配列の長さが異なる場合、又は整列が１以上の互い違いの末端を生じ、比較の特定される領域が単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等であると見なされ得る。同一性は、手動で、又はＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０のようなコンピュータ配列アルゴリズムを用いて実施され得る。
【００３９】
（ｍ）インピーダンス
「インピーダンス」は本明細書で使用されるとき、フィードバック機構を考察する際に使用されてもよく、オームの法則に従って電流値に変換することができるので、予め設定される電流との比較を可能にする。
【００４０】
（ｎ）免疫応答
「免疫応答」は本明細書で使用されるとき、提供されるＤＮＡプラスミドワクチンを介してＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質の導入に応答する宿主の免疫系、たとえば、哺乳類の免疫系の活性化を意味し得る。免疫応答は細胞性の応答又は液性の応答のいずれか、又はその双方の形態であることができる。
【００４１】
（ｏ）核酸
「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の表現は相補性の鎖の配列も規定する。従って、核酸は表現される一本鎖の相補性の鎖も包含する。核酸の多数の変異体が所与の核酸として同一目的に使用され得る。従って、核酸は実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で標的配列とハイブリッド形成し得るプローブを提供する。従って、核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。
【００４２】
核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、二本鎖配列及び一本鎖配列双方の一部を含有してもよい。核酸はＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの双方、ＲＮＡ又はハイブリッドであってもよく、その際、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有してもよい。核酸は化学合成法又は組換え法によって得られ得る。
【００４３】
（ｐ）操作可能に連結される
「操作可能に連結される」は本明細書で使用されるとき、遺伝子の発現が空間的に接続されるプロモータの制御下にあることを意味し得る。プロモータはその制御下の遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に位置し得る。プロモータと遺伝子の間の距離は、プロモータが由来する遺伝子にてそれが制御する遺伝子とプロモータの間の距離とほぼ同一であり得る。当該技術で知られるように、この距離の変動はプロモータの機能を喪失することなく調整され得る。
【００４４】
（ｑ）プロモータ
「プロモータ」は本明細書で使用されるとき、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する又は向上させることが可能である合成の又は天然に存在する分子を意味し得る。プロモータは１以上の特異的な転写調節配列を含んで発現をさらに向上させ、及び／又はその空間的発現及び／又は一過性の発現を変化させ得る。プロモータはまた遠位のエンハンサ要素又はリプレッサ要素を含んでもよく、それは転写開始部位から数千塩基対ほどの位置にあり得る。プロモータは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモータは、発現が生じる細胞、組織又は臓器に関して、発現が生じる発生段階に関して、又はたとえば、生理的ストレス、病原体、金属イオン又は誘導剤のような外部刺激に応答して構成的に又は差次的に遺伝子成分の発現を調節し得る。プロモータの代表例には、バクテリオファージＴ７プロモータ、バクテリオファージＴ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ｌａｃオペレータ／プロモータ、ｔａｃプロモータ、ＳＶ４０後期プロモータ、ＳＶ４０早期プロモータ、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、ＣＭＶ  ＩＥプロモータ、ＳＶ４０早期プロモータ又はＳＶ４０後期プロモータ、及びＣＭＶ  ＩＥプロモータが挙げられる。
【００４５】
（ｒ）シグナルペプチド
「シグナルペプチド」は、それが組み入れられるタンパク質の輸送を指示する通常、長さ５０未満のアミノ酸の短いペプチド配列を指す。シグナルペプチドは通常、Ｎ末端でタンパク質に連結され、シグナルペプチドをコードするコーディング配列は開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンをコードする開始コドンを含むことが多い。シグナルペプチドは、細胞内での輸送に関してタンパク質を標的とし、タンパク質が細胞によって分泌されるように、又はそうでなければ、細胞による細胞外環境への放出についてタンパク質が標的とされるように、タンパク質におけるシグナルペプチドの存在が分泌経路を介した輸送についてタンパク質を標的とする分泌経路に関与する。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、たとえば、ＩｇＧ又はＩｇＥのシグナルペプチドのような免疫グロブリンのシグナルペプチドである。タンパク質のコーディング配列へのシグナルペプチドのコーディング配列の付加は一般に、タンパク質のコーディング配列の開始コドンの代わりに開始コドンを含むシグナルペプチドのコーディング配列を挿入することを指す。すなわち、タンパク質のコーディング配列へのシグナルペプチドのコーディング配列の付加には、タンパク質のコーディング配列の開始コドンの除去及び開始コドンを含むシグナルペプチドのコーディング配列の挿入を伴う。従って、シグナルペプチドとそれによってコードされたタンパク質では、元々のタンパク質配列のアミノ酸配列の１位でのメチオニンが、１位でメチオニンを有するシグナルペプチドのアミノ酸配列によって置き換えられる。
【００４６】
（ｓ）ストリンジェントなハイブリッド形成条件
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は本明細書で使用されるとき、たとえば、核酸の複雑な混合物にて第１の核酸配列（たとえば、プローブ）が第２の核酸配列（たとえば、標的）とハイブリッド形成する条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況にて異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨにて特定の配列について融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択され得る。Ｔｍは、標的に相補性のプローブの５０％が標的配列と平衡（標的配列はＴｍにて過剰に存在するので、プローブの５０％は平衡で占有される）でハイブリッド形成する温度（定義されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度のもとでの）であり得る。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３にて塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、たとえば、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、温度が、短いプローブ（たとえば、約１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（約５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件はまた、たとえば、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的な又は特異的なハイブリッド形成については、陽性のシグナルは背景ハイブリッド形成の少なくとも２〜１０倍であり得る。例となるストリンジェントなハイブリッド形成条件には、以下：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％のＳＤＳにて４２℃でのインキュベート、又は５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳにて６５℃でのインキュベート、と共に０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳで６５℃での洗浄が挙げられる。
【００４７】
（ｔ）実質的に相補性の
「実質的に相補性の」は本明細書で使用されるとき、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のヌクレオチド又はアミノ酸の範囲にわたって第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であること、又はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で２つの配列がハイブリッド形成することを意味し得る。
【００４８】
（ｕ）実質的に同一の
「実質的に同一の」は本明細書で使用されるとき、第１と第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のヌクレオチド又はアミノ酸の範囲にわたって、又は第１の配列が第２の配列の相補体に対して実質的に相補性であれば、核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であることを意味し得る。
【００４９】
（ｖ）変異体
核酸に関して本明細書で使用される「変異体」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部又は断片；（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列の相補体又はその一部；（ｉｉｉ）参照されるヌクレオチド配列又はその相補体と実質的に同一である核酸；又は（ｉｖ）参照される核酸配列、その相補体又はそれと実質的に同一の配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸を意味し得る。
【００５０】
アミノ酸の挿入、欠失又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持するペプチド又はポリペプチドに関する「変異体」。変異体はまた、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を持つ参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を持つタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、類似の特性（たとえば、親水性、荷電された領域の程度と分布）の異なるアミノ酸でアミノ酸を置き換えることは、通常軽微な変化を伴うものとして当該技術で認識されている。これらの軽微な変化は、当該技術で理解されるように、アミノ酸のハイドロパシー指標を検討することによって部分的に特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指標は、疎水性及び電荷の検討に基づく。類似のハイドロパシー指標のアミノ酸を置換することができ、それはタンパク質の機能をそのまま保持できることが当該技術で知られている。１態様では、±２のハイドロパシー指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物活性を保持するタンパク質を生じる置換を示すこともできる。ペプチドの文脈でのアミノ酸の親水性の検討によって、そのペプチドの最大局所平均親水性を計算することができ、それは、抗原性及び免疫原性と良く相関することが報告されている有用な測定である。米国特許第４，５５４，１０１号（参照によって完全に本明細書に組み込まれる）。当該技術で理解されるように、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物活性、たとえば、免疫原性を保持するペプチドを結果的に生じることができる。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で置換が実施され得る。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値は双方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その所見に一致して、生物機能で適合するアミノ酸の置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の特性によって示されるように、アミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解されている。
【００５１】
（ｗ）ベクター
「ベクター」は本明細書で使用されるとき、複製開始点を含有する核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌性人工染色体又は酵母の人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡベクター又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは自己複製する染色体外のベクター又は宿主ゲノムに統合するベクターであり得る。
２．ＰＢＰ２ａタンパク質
【００５２】
幾つかのアミノ酸配列のＰＢＰ２ａタンパク質が、ＧｅｎＢａｎｋ、たとえば、受託番号：ＮＰ＿３７０５６５．１、ＺＰ＿０６７９１４８０．１、ＢＡＧ０６２００．１、ＡＡＸ１４３９７．１、ＹＰ＿１８４９４４．１、ＢＡＫ５３１４５．１、ＡＤＣ５３３３２．１、ＢＡＥ７５８８４．１、ＺＰ＿０７３６２７３９．１、ＡＤＣ５３３１４．１、ＣＡＬ２２８９１．１、ＣＢＩ４７９５７．１、ＣＡＨ１７５９４．１、ＣＡＡ７４３７６．１、ＡＤＣ３６２５３．１、ＡＤＶ６８９８０．１、ＡＤＶ６８９６８．１、ＡＡＦ８５６４５．１、及びＡＢＭ６６４４３．１．ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質を有するものにて開示されている。様々に報告された配列はわずかな変異を有するが、様々な株や単離物の中で若干の差異が存在するものの、タンパク質の長さは一般に６６７のアミノ酸である。本明細書で使用されるとき、便宜上、ＰＢＰ２ａタンパク質は、開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンを含めて６６８のアミノ酸のタンパク質と呼ばれる。本明細書で示される様々なドメインの番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ７４３７６．１、ＡＤＣ３６２５３．１、ＣＡＨ１７５９４．１、ＣＡＬ２２８９１．１、ＡＡＦ８５６４５．１、及びＡＢＭ６６４４３．１における配列に基づくコンセンサス配列と上記で呼ばれた完全長のＰＢＰ２ａ配列である配列番号２のアミノ酸配列を参照する。
【００５３】
完全長のＰＢＰ２ａタンパク質は、図１に示される３つのドメインを有する細胞表面タンパク質である。図１の左側は、細胞膜内で「膜貫通ドメイン」によって細胞膜に係留され、「Ｎ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン」及び「トランスペプチダーゼドメイン」の双方が細胞外空間にて細胞の外に露出されるＰＢＰ２ａタンパク質の描写を示す。図１の右側は、本明細書の構築物によってコードされるタンパク質の「完全型」と「係留なし型」の描写を示す。「完全型」は「膜貫通ドメイン」、「Ｎ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン」及び「トランスペプチダーゼドメイン」を含む一方で、「係留なし型」は「Ｎ末端伸長及び非ペニシリン結合ドメイン」及び「トランスペプチダーゼドメイン」を含む。タンパク質のＮ末端にあり、細胞膜にてタンパク質を係留する膜貫通ドメインはアミノ酸１〜２３に相当する。アミノ酸２７〜３２６は非ペニシリン結合ドメインと呼ばれ、Ｎ末端伸長と呼ばれるアミノ酸２７〜１３８を含む。アミノ酸３２７〜６６８はトランスペプチダーゼドメイン又は触媒ドメインと呼ばれる。アミノ酸２４〜１４０はまたＭｅｃＡ＿Ｎ領域又は「ＮＴＦ２様Ｎ末端トランスペプチダーゼドメイン」とも呼ばれる。アミノ酸１３６〜６６７はまた、ＦｔｓＩ領域とも呼ばれ、ＰＢＰ二量体領域又は「ペニシリン結合タンパク質二量体化ドメイン」とも呼ばれるアミノ酸１４７〜３１０及びトランスペプチダーゼ領域又は「トランスペプチダーゼドメイン」とも呼ばれるアミノ酸３４５〜６５８を含む。
【００５４】
本明細書で提供されるのは、哺乳類にてＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対して免疫応答を引き出すことが可能であるコンセンサスＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質である。一部の実施形態では、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質は、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ完全長（配列番号２）、又は少なくとも２４５のアミノ酸を含む配列番号２で示される完全長配列ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの断片から成る群から選択される１以上のタンパク質であり得る。さらに、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質は、配列番号２に対して９８％相同であり得る、又は配列番号２の断片に対して９８％相同であるタンパク質の断片であり得る。配列番号２は６６８のコンセンサス配列のうち６６７を開示している。開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンは配列番号２では示されない。しかしながら、一部の実施形態であれば、シグナルペプチドを含まないことが企図される。従って、配列番号１のコーディング配列には開始コドンが提供され、それによってポリペプチド配列はＮ末端メチオニンを伴った配列番号２を含むであろう。従って、本開示の目的では、Ｎ末端メチオニンと共に配列番号２を含むポリペプチドが意図されるように、開始コドン（ＡＴＧ）と共に配列番号１を含む核酸分子が開示されることが意図される。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列において開始コドン（ＡＴＧ）及びＮ末端メチオニンを有する断片及びその相同性変異体も本明細書で記載されることも意図される。従って、たとえば、配列番号３及び配列番号５のような配列番号１の断片又は配列番号１に対して少なくとも９８％相同である核酸配列の断片は、開始コドン（ＡＴＧ）をさらに含むように開示されることが意図される。同様に、配列番号４及び配列番号６のような配列番号２の断片又は配列番号２に対して少なくとも８％相同である断片は、Ｎ末端メチオニンをさらに含むように開示されることが意図される。同様に、配列番号４及び配列番号６のような配列番号２の断片又は配列番号２に対して少なくとも９８％相同である断片は、Ｎ末端メチオニンをさらに含むように開示されることが意図される。
【００５５】
一部の実施形態では、抗原はシグナルペプチド配列のペプチドを含み得る。一部の実施形態では、抗原は配列番号１３で示されるようなＩｇＥのシグナルペプチド配列を含み得る。一部の実施形態では、抗原は、Ｎ末端にてＩｇＥのシグナルペプチド配列（配列番号１３）を連結している完全長のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ（配列番号２）で構成される「完全型」配列番号８を含み得る。
【００５６】
配列番号２で示されるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの完全長配列の断片は少なくとも２４５のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本明細書で示される断片はシグナルペプチド配列を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で示される断片は配列番号１３で示されるようなＩｇＥのシグナルペプチド配列を含み得る。一部の実施形態では、抗原は、Ｎ末端にてＩｇＥのシグナルペプチド配列（配列番号１３）を連結している配列番号４を有するＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの断片で構成される「係留なし型」の配列番号１０を含み得る。一部の実施形態では、抗原は、Ｎ末端にてＩｇＥのシグナルペプチド配列（配列番号１３）を連結している配列番号６を有するＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの断片で構成される「短い型」の配列番号１２を含み得る。
【００５７】
一部の実施形態では、断片は、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの膜貫通ドメイン（アミノ酸１〜２３）を含まない。一部の実施形態では、断片は、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸３２７〜６６８）のすべて若しくは一部、又はこの領域に由来する少なくとも２４５のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、断片は、アミノ酸３４５〜６５８を含むトランスペプチダーゼドメインのすべて若しくは一部、又はこの領域に由来する少なくとも２４５のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、断片は、完全長配列の最もＣ末端領域の少なくとも２４５のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、断片は、完全長配列（すなわち、アミノ酸３９３〜６３８からアミノ酸４２３〜６６８に及ぶ及びその間の断片すべて）の２７５の最もＣ末端領域（アミノ酸３９３〜６６８）の少なくとも２４５のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、断片は、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸３２７〜６６８）のすべて若しくは一部、又はこの領域に由来する少なくとも３００のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、断片は、アミノ酸３４５〜６５８を含むＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメインのすべて若しくは一部、又はこの領域に由来する少なくとも３００のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、断片は、完全長配列の最もＣ末端領域の少なくとも３４０のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、断片は、完全長配列（すなわち、アミノ酸２６８〜６０８からアミノ酸３２８〜６６８に及ぶ及びこの間の断片すべて）の最もＣ末端領域（アミノ酸２６８〜６６８）の４００のうちの少なくとも３４０のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で示される断片はシグナルペプチド配列を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で示される断片は配列番号１３で示されるようなＩｇＥのシグナルペプチド配列を含み得る。
【００５８】
一部の実施形態では、断片は、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸３２７〜６６８）のすべて又は一部、及び非ペニシリン結合ドメイン（アミノ酸２７〜３２６）のすべて又は一部を含む。一部の実施形態では、断片は、アミノ酸を含むＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部及び非ペニシリン結合ドメインのすべて又は一部を含む少なくとも４００のアミノ酸の配列を含み、一部の実施形態では、さらに膜貫通ドメイン（アミノ酸１〜２３のほとんど又はすべて）を含まない。一部の実施形態では、断片は、アミノ酸を含むＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部及び非ペニシリン結合ドメインのすべて又は一部を含む少なくとも４５０のアミノ酸の配列を含み、一部の実施形態では、さらに膜貫通ドメイン（アミノ酸１〜２３のほとんど又はすべて）を含まない。一部の実施形態では、断片は、アミノ酸を含むＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部及び非ペニシリン結合ドメインのすべて又は一部を含む少なくとも５００のアミノ酸の配列を含み、一部の実施形態では、さらに膜貫通ドメイン（アミノ酸１〜２３のほとんど又はすべて）を含まない。一部の実施形態では、断片は、アミノ酸を含むＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部及び非ペニシリン結合ドメインのすべて又は一部を含む少なくとも５５０のアミノ酸の配列を含み、一部の実施形態では、さらに膜貫通ドメイン（アミノ酸１〜２３のほとんど又はすべて）を含まない。一部の実施形態では、断片は、アミノ酸を含むＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部及び非ペニシリン結合ドメインのすべて又は一部を含む少なくとも６００のアミノ酸の配列を含み、一部の実施形態では、さらに膜貫通ドメイン（アミノ酸１〜２３のほとんど又はすべて）を含まない。一部の実施形態では、断片は、アミノ酸を含むＭＲＳＡのＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼドメインのすべて又は一部及び非ペニシリン結合ドメインのすべて又は一部を含む少なくとも６４０のアミノ酸の配列を含み、一部の実施形態では、さらに膜貫通ドメイン（アミノ酸１〜２３のほとんど又はすべて）を含まない。一部の実施形態では、本明細書で示される断片はシグナルペプチド配列を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で示される断片は配列番号１３で示されるようなＩｇＥのシグナルペプチド配列を含み得る。
【００５９】
断片は好ましくはトランスペプチダーゼドメインの多く又はすべてを含む。４００以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。４２５以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。４５０以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。４７５以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。５００以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。５２５以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。５５０以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。５７５以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。６００以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。６３０以上のアミノ酸を含む配列番号２の断片は好ましくは、ＰＢＰ２ａのＣ末端からのより多くのアミノ酸６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７又は６６８の１つで成り立つ。一部の実施形態では、本明細書で示される断片はシグナルペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書で示される断片は配列番号１３で示されるようなＩｇＥのシグナルペプチド配列を含み得る。
【００６０】
一部の実施形態では、断片は係留なしの／膜貫通ドメインなしのＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ（配列番号４）であり得る。一部の実施形態では、断片は係留なしの／膜貫通ドメインなしのＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ（配列番号４）にＩｇＥのシグナルペプチド（配列番号１３）を加えた「係留なし型」（配列番号１０）であり得る。一部の実施形態では、断片はＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの短い型／触媒ドメインのみ（すなわち、触媒ドメインのみ）（配列番号６）にＩｇＥのシグナルペプチド（配列番号１３）を加えたＰＢＰ２ａの「短い型」（配列番号１２）であり得る。
【００６１】
配列番号２に加えて、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質は配列番号２に対して９８％の相同性を持つアミノ酸配列を有してもよく、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質の断片には、本明細書で開示されるもののような断片及び配列番号２に対して９８％の相同性を持つアミノ酸配列を有するＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質の相当する断片が含まれる。シグナルペプチドは相同性の決定には含められないが、配列番号２に対して９８％の相同性を持つアミノ酸配列を有してもよいＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質は、たとえば、配列番号１３で示されるようなＩｇＥのシグナルペプチド配列のようなシグナルペプチド配列もさらに含み得る。同様に、シグナルペプチドは相同性の決定には含められないが、配列番号２に対して９８％の相同性を持つアミノ酸配列を有するＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質の断片を含む本明細書で開示される断片は、たとえば、配列番号１３で示されるようなＩｇＥのシグナルペプチド配列のようなシグナルペプチド配列をさらに含み得る。
３．ＰＢＰ２ａのコーディング配列
【００６２】
ＧｅｎＢａｎｋは黄色ブドウ球菌の単離物の完全なゲノムの配列を収容している。たとえば、受託番号ＦＲ８２３２９４．１、ＥＦ１９０３３５．１、ＡＢ２２１１２１．１、ＡＢ２２１１２２．１、ＡＢ２２１１２４．１、ＡＢ２２１１２０．１、ＡＢ２２１１１９．１、Ｅ０９７７１．１、ＡＢ２３６８８８．１、ＡＢ２２１１２３．１、ＡＢ０６３４８１．１及びＸ５２５９３．１を有するもののようなｍｅｃＡのコーディング配列の幾つかのヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋで開示されている。
【００６３】
本明細書で提供されるのは、哺乳類にてＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対する免疫応答を引き出すことが可能であるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質をコードするコーディング配列である。一部の実施形態では、コーディング配列は、完全長のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ（配列番号２）又は少なくとも２４５のアミノ酸を含む配列番号２で示される完全長のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの断片から成る群から選択されるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質をコードする。さらに、コーディング配列は、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又は配列番号２の断片に対して９８％相同であるタンパク質の断片をコードし得る。
【００６４】
一部の実施形態では、コーディング配列は、配列番号１、少なくとも２４５のアミノ酸をコードする配列番号２の断片、配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードするコーディング配列、及び配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードするコーディング配列の断片から成る群から選択され、そのような断片は少なくとも２４５のアミノ酸を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、コーディング配列はさらに、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａコーディング配列に操作可能に連結されるシグナルペプチド配列のコーディング配列を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチド配列のコーディング配列は配列番号１３で示されるようなＩｇＥのシグナルペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、コーディング配列は、発現された場合、ＩｇＥのシグナルペプチドがタンパク質のＮ末端であるようにＩｇＥのシグナルペプチド配列（配列番号１３）のコーディング配列に連結される完全長のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ（配列番号２）のコーディング配列、配列番号１で構成される配列番号７（「完全型」）を含み得る。
【００６６】
一部の実施形態では、コーディング配列は、配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、配列番号２に対して少なくとも９８％相同であるタンパク質をコードする核酸配列の断片を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は、配列番号１に対して少なくとも９８％相同であり、少なくとも２４５のアミノ酸である配列番号２の断片をコードする核酸配列の断片を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は、少なくとも２４５のアミノ酸をコードする配列番号１の断片を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は、シグナルペプチド配列、好ましくはＩｇＥのシグナルペプチド（配列番号１３）のコーディング配列に操作可能に連結される少なくとも２４５のアミノ酸をコードする配列番号１の断片を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は配列番号３を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は配列番号３を含み、さらに、シグナルペプチド配列、好ましくはＩｇＥのシグナルペプチドをコードする操作可能に連結されたコーディング配列を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は配列番号９を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は配列番号５を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は配列番号５を含み、さらに、シグナルペプチド配列、好ましくはＩｇＥのシグナルペプチドをコードする操作可能に連結されたコーディング配列を含む。一部の実施形態では、コーディング配列は配列番号１１を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、配列番号２の断片に対して９８％相同であるタンパク質の免疫原性断片をコードする配列番号１に対して少なくとも９８％相同である核酸配列の断片を含むコーディング配列は、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの膜貫通ドメインをコードしない。一部の実施形態では、配列番号２の免疫原性断片をコードする配列番号１に対して少なくとも９８％相同である核酸配列の断片を含むコーディング配列は、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの膜貫通ドメインをコードしない。一部の実施形態では、配列番号１の断片を含むコーディング配列は、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａの膜貫通ドメインをコードしない。そのようなコーディング配列は好ましくは、シグナルペプチド配列、好ましくはＩｇＥのシグナルペプチドのコーディング配列を含む。
【００６８】
一部の実施形態では、コーディング配列は、第２節として数え、「ＰＢＰ２ａタンパク質」と題する前節にて示した断片をコードする。一部の実施形態では、第２節として数え、「ＰＢＰ２ａタンパク質」と題する前節にて示した断片をコードするコーディング配列は、配列番号１の断片であり、好ましくはさらにシグナルペプチド配列、好ましくはＩｇＥのシグナルペプチドのコーディング配列を含み得る。一部の実施形態では、第２節として数え、「ＰＢＰ２ａタンパク質」と題する前節にて示した断片をコードするコーディング配列は、配列番号１に対して９８％相同であるコーディング配列の断片であり、好ましくはさらにシグナルペプチド配列、好ましくはＩｇＥのシグナルペプチドのコーディング配列を含み得る。一部の実施形態では、第２節として数え、「ＰＢＰ２ａタンパク質」と題する前節にて示した断片をコードするコーディング配列は、配列番号１に対して９８％相同であり、配列番号２の免疫原性断片をコードするコーディング配列の断片であり、好ましくはさらにシグナルペプチド配列、好ましくはＩｇＥのシグナルペプチドのコーディング配列を含み得る。
４．プラスミド
【００６９】
本明細書で提供されるのは、哺乳類における免疫応答を引き出すのに有効な量で哺乳類の細胞にてＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又はその断片を発現させることが可能であるベクターである。ベクターはＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又はその断片をコードする非相同の核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであってもよい。プラスミドはＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又はその断片をコードする核酸によって細胞に形質移入するのに有用であり得、形質転換された宿主細胞は培養され、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又はその断片の発現が生じる条件下で維持される。
【００７０】
プラスミドは、そのＮ末端でＩｇシグナルペプチド配列に連結されるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又はその断片を含むタンパク質をコードする核酸を含み得る。プラスミドはさらに、コーディング配列の上流にあり得る開始コドン及びコーディング配列の下流にあり得る停止コドンを含み得る。開始コドン及び停止コドンはコーディング配列と共にインフレームにあってもよい。
【００７１】
プラスミドはまた、コーディング配列に操作可能に連結されるプロモータも含み得る。コーディング配列に操作可能に連結されるプロモータは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、たとえば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモータのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモータ、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、たとえば、ＣＭＶ前初期プロモータ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータであり得る。プロモータはまた、たとえば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインのようなヒトの遺伝子に由来するプロモータであってもよい。プロモータはまた、天然の又は合成の組織特異的なプロモータ、たとえば、筋肉又は皮膚に特異的なプロモータであってもよい。そのようなプロモータの例は、その内容はその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載されている。
【００７２】
プラスミドはまた、コーディング配列の下流にあり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル、ＬＴＲのポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のポリアデニル化シグナル、又はヒトβ−グロビンのポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（カリフォルニア州、サンディエゴのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のポリアデニル化シグナルであり得る。
【００７３】
プラスミドはまたコーディング配列の上流でエンハンサを含み得る。エンハンサは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はウイルスのエンハンサ、たとえば、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ又はＥＢＶに由来するものであってもよい。ポリヌクレオチドの機能エンハンサは、それぞれその内容が参照によって本明細書に完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号及び国際公開第９４／０１６７３７号に記載されている。
【００７４】
プラスミドはまた、プラスミドを染色体外で維持し、細胞にてプラスミドの多重コピーを産生するために哺乳類の複製開始点も含み得る。プラスミドは、エプステイン・バーウイルスの複製開始点と核抗原ＥＢＮＡ−１コーディング領域を含み得る、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、サンディエゴ）製のｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４又はｐＲＥＰ４であってもよく、それらは、統合することなく高コピーエピソーム複製を生じ得る。プラスミドの骨格はｐＡＶ０２４２であってもよい。プラスミドは複製欠損のアデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであってもよい。
【００７５】
プラスミドはまた、プラスミドが投与される細胞での遺伝子発現によく適合し得る調節配列も含み得る。コーディング配列は宿主細胞にてコーディング配列のさらに効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。
【００７６】
コーディング配列はまたＩｇシグナルペプチド配列も含み得る。シグナルペプチド配列のコーディング配列はコーディング配列の５’にあり得る。この配列によってコードされるコンセンサス抗原はＮ末端Ｉｇシグナルペプチドと、それに続くコンセンサス抗原タンパク質を含み得る。Ｎ末端ＩｇシグナルペプチドはＩｇＥ又はＩｇＧであり得る。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，７３３，９９４号は、最適化されたＲＮＡ配列とＩｇＥのシグナルペプチド配列を含む構築物を開示している。双方とも参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号及び対応する米国特許出願第１０／５６０，６５０号もＩｇＥのシグナルペプチド配列を含む構築物を開示している。
【００７７】
プラスミドは、大腸菌におけるタンパク質産生に使用され得るｐＳＥ４２０（カリフォルニア州、サンディエゴのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であってもよい。プラスミドはまた、酵母のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株におけるタンパク質産生に使用され得るｐＹＥＳ２（カリフォルニア州、サンディエゴのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であってもよい。プラスミドはまた、昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得るＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（カリフォルニア州、サンディエゴのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のものであってもよい。プラスミドはまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得るｐｃＤＮＡ１又はｐｃＤＮＡ３（カリフォルニア州、サンディエゴのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であってもよい。
５．ワクチン
【００７８】
本明細書で提供されるのは、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対する免疫応答を哺乳類にて生成することが可能であるワクチンである。ワクチンは上記で考察したようなプラスミドを含み得る。ワクチンは複数のプラスミド又はそれらの組み合わせを含み得る。ワクチンを提供してＭＲＳＡに対する治療上の又は予防的な免疫応答を誘導し得る。
【００７９】
ワクチンはさらに薬学上許容可能な賦形剤を含み得る。薬学上許容可能な賦形剤は、媒体、アジュバント、キャリア又は希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学上許容可能な賦形剤は、形質移入促進剤であってもよく、それには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンのような小胞及びスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、又はナノ粒子、又は他の既知の形質移入促進剤が挙げられ得る。
【００８０】
形質移入促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、又は脂質である。形質移入促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩であり、さらに好ましくはポリ−Ｌ−グルタミン酸塩は６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在する。形質移入促進剤には、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンのような小胞及びスクアレンが挙げられ得、ヒアルロン酸は遺伝子構築物と併用して使用され、投与され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた、脂質、レシチンリポソーム又はＤＮＡリポソーム混合物（たとえば、国際公開第９３２４６４０号を参照）のような当該技術で既知の他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、又はナノ粒子のような形質移入促進剤、又は他の既知の形質移入促進剤も含み得る。好ましくは、形質移入促進剤はポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、又は脂質である。ワクチンにおける形質移入剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、又は０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００８１】
薬学上許容可能な賦形剤は１以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、同一の若しくは代わりのプラスミドから発現される他の遺伝子であってもよく、又はワクチンにて上記プラスミドと併用してタンパク質として送達される。１以上のアジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞−誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、シグナル配列又は欠失したシグナル配列をコードするコーディング配列を有し、任意でＩｇＥからのもののような異なるシグナルペプチド又は任意でＩｇＥからのもののような異なるシグナルペプチドをコードするコーディング配列を含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びその機能的断片、又はそれらの組み合わせから成る群から選択されるタンパク質及び／又はタンパク質をコードする核酸分子であり得る。一部の実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ又はＲＡＮＴＥＳから成る群から選択される１以上のタンパク質及び／又はタンパク質をコードする核酸分子であり得る。ＩＬ−１２の構築物及び配列の例は、それぞれその全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号及び対応する米国特許出願第０８／９５６，８６５号、２０１１年１２月１２日に出願され、「改善されたＩＬ−１２遺伝子構築物を含む組成物、及びそれを用いたワクチン、免疫治療剤及び方法」と題された米国仮特許出願第６１／５６９，６００号、及び指定された代理人整理番号１３３１７２.０４１００（Ｘ５��１５）、並びに共に出願された出願として同日出願された米国仮特許出願第６１／５６９，６００号に対して優先権を主張する国際ＰＣＴ出願にて開示されている。ＩＬ−１５の構築物及び配列の例は、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号及び対応する米国特許出願番号第１０／５６０，６５０号、及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号及び対応する米国特許出願第１２／１６０，７６６号及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４８８２７号にて開示されている。ＩＬ−２８の構築物及び配列の例は、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号及び対応する米国特許出願第１２／９３６，１９２号にて開示されている。ＲＡＮＴＥＳ及び他の構築物及び配列の例は、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号及び対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号にて開示されている。ＲＡＮＴＥＳの構築物及び配列の他の例は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号にて開示されている。ＲＡＮＴＥＳ及び他の構築物及び配列の例は、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号及び対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号にて開示されている。ＲＡＮＴＥＳの構築物及び配列の他の例は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号にて開示されている。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ及びＭＥＣの構築物及び配列の例は、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号及び対応する米国特許出願第１１／７１９，６４６号にて開示されている。ＯＸ４０及び他の免疫調節剤の例は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第１０／５６０，６５３号にて開示されている。ＤＲ５及び他の免疫調節剤の例は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第０９／６２２，４５２号にて開示されている。
【００８２】
ワクチンはさらに、その全体が参照によって完全に組み込まれる１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されたような遺伝子ワクチン促進剤を含み得る。
【００８３】
ワクチンは、約１ナノグラム〜１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；又は好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；又はさらに好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量でコンセンサス抗原及びプラスミドを含み得る。一部の好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含有する。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムのコンセンサス抗原又はそのプラスミドを含有する。
【００８４】
ワクチンは使用される投与の方式に従って製剤化され得る。注射用のワクチン医薬組成物は、無菌であり得、発熱物質を含まないことが可能であり、粒子状物質を含まないことが可能である。等張の製剤又は溶液が使用され得る。等張性の添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが挙げられ得る。ワクチンは血管収縮剤を含み得る。等張溶液にはリン酸緩衝化生理食塩水が挙げられ得る。ワクチンはさらにゼラチン及びアルブミンを含む安定剤を含み得る。ワクチン製剤に対するＬＧＳ又はポリカチオン又はポリアニオンのような安定化剤は、製剤を長い間、室温又は常温で安定にすることが可能であり得る。
【００８５】
ＤＮＡワクチンのような遺伝子ワクチンを使用することに加えて、コーディング配列及び／又はタンパク質は、弱毒化生ワクチン、組換えワクチン又はサブユニットワクチンに組み入れられ得る。外来抗原を送達するための弱毒化生ワクチン及び組換えベクターを用いたものの例は、それぞれが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，７２２，８４８号；同第５，０１７，４８７号；同第５，０７７，０４４号；同第５，１１０，５８７号；同第５，１１２，７４９号；同第５，１７４，９９３号；同第５，２２３，４２４号；同第５，２２５，３３６号；同第５，２４０，７０３号；同第５，２４２，８２９号；同第５，２９４，４４１号；同第５，２９４，５４８号；同第５，３１０，６６８号；同第５，３８７，７４４号；同第５，３８９，３６８号；同第５，４２４，０６５号；同第５，４５１，４９９号；同第５，４５３，３６４号；同第５，４６２，７３４号；同第５，４７０，７３４号；及び同第５，４８２，７１３に記載されている。
６．ワクチンの送達方法
【００８６】
本明細書で提供されるのは、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質をコードする遺伝子構築物を提供するワクチンを送達する方法であって、該ＰＢＰ２ａタンパク質に対して免疫応答を誘導することができる、方法である。ワクチンを送達する方法又はワクチン接種の方法を提供して治療上及び予防上の免疫応答を誘導し得る。ワクチン接種の過程は哺乳類にてＭＲＳＡに対する免疫応答を生成し得る。ワクチンの送達には、細胞にて高レベルの発現を生じるＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質をコードするコーディング配列を含む核酸分子の形質移入が含まれる。ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質又はそのペプチドは細胞の表面に送達されて、及び／又は免疫系が認識した際、それによって分泌されて、細胞性の、液性の、又は細胞性と液性の応答を誘導する。ワクチンの送達は、上記で考察したようなワクチンを哺乳類に投与することによってＭＲＳＡに対する免疫応答を哺乳類で誘導する又は引き出すための使用であり得る。
【００８７】
哺乳類の細胞へワクチン及びプラスミドが送達されると、形質移入された細胞はコーディング配列を発現し、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質を分泌するであろう。タンパク質は免疫系によって異物として認識され、それに対する抗体が作られるであろう。これらの抗体は免疫系によって維持され、進行中のＭＲＳＡ感染及びそれに続くＭＲＳＡ感染に対する有効な応答を可能にするであろう。
【００８８】
ワクチンを哺乳類に投与して哺乳類にて免疫応答を引き出し得る。哺乳類は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、乳牛、ウシ、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、及びニワトリであり得る。
【００８９】
ａ．併用治療
ワクチンは、他のタンパク質との併用で、及び／又はα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞−誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺−発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連の上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、欠失したシグナル配列を有し、ＩｇＥシグナルペプチドのような異なるシグナルペプチドを任意で含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−２８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びそれらの機能的断片、又はそれらの組み合わせをコードする遺伝子との併用で投与され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、以下の核酸分子及び／又はタンパク質：ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ及びＲＡＮＴＥＳ又はその機能的な断片の１以上をコードするコーディング配列を含む核酸分子から成る群から選択される核酸分子、並びにＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−２８タンパク質、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質及びＲＡＮＴＥＳタンパク質又はその機能的な断片から成る群から選択されるタンパク質の１以上との併用で投与される。
【００９０】
ワクチンは、経口で、非経口で、舌下に、経皮で、直腸内に、経粘膜で、吸入を介して、頬内投与を介して、胸膜内に、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮下に、筋肉内に、鼻内に、クモ膜下に及び関節内に、又はそれらの組み合わせでの投与を含む様々な経路によって投与され得る。獣医用途については、組成物は、平常の獣医学診療に従って好適な許容可能な製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適する投与計画及び投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、従来のシリンジ、無針注射装置、「微量推進衝撃遺伝子銃」、又はたとえば、電気穿孔法（「ＥＰ」）、「流体力学法」又は超音波のような他の物理的方法によって投与され得る。
【００９１】
ワクチンのプラスミドは、生体内の電気穿孔法を伴う及び伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも言う）、リポソーム介在性の、ナノ粒子が促進する組換えベクター、たとえば、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルスが関連するウイルス及び組換えワクシニアを含む幾つかの既知の技術によって哺乳類に送達され得る。コンセンサス抗原は生体内の電気穿孔法と共にＤＮＡ注入によって送達され得る。
【００９２】
ｂ．電気穿孔法
ワクチンのプラスミドの電気穿孔法を介したワクチンの投与は、細胞膜にて可逆的な孔を形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳類の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成されてもよく、好ましくは、エネルギーのパルスはユーザーによって予め設定された電流出力に類似する定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔法構成部分及び電極の集合体又はハンドル集合体を含み得る。電気穿孔法構成部分には、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスター、波形ロガー、入力要素、状況報告要素、伝達ポート、記憶構成部分、電源、及び電力スイッチを含む電気穿孔装置の種々の要素の１以上が含まれ、組み入れられ得る。電気穿孔法は、生体内電気穿孔装置、たとえば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ  ＥＰシステム（ペンシルベニア州、ブルーベルのＩｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）又はＥｌｇｅｎエレクトロポレータ（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）を用いてプラスミドによる細胞の形質移入を円滑にすることによって達成され得る。
【００９３】
電気穿孔法構成部分は、電気穿孔装置の要素の１つとして機能し得、他の要素（又は構成部分）は電気穿孔法構成部分と連通した別の要素である。電気穿孔法構成部分は、電気穿孔装置の１を超える要素として機能してもよく、それは、電気穿孔法構成部分とは別の電気穿孔装置の他の要素と連通し得る。１つの電気機械的な又は機械的な装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、要素が１つの装置として又は互いに連通する別の要素として機能することができるので、限定され得ない。電気穿孔法構成部分は、所望の組織で定電流を生じるエネルギーのパルスを送達することが可能であってもよく、フィードバック機構を含む。電極集合体は、空間配置にて複数の電極を有する電極アレイを含んでもよく、その際、電極集合体は、電気穿孔法構成部分からエネルギーのパルスを受け取り、電極を介してそれを所望の組織に送達する。複数の電極の少なくとも１つはエネルギーのパルスの送達の間、中性であり、所望の組織でインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔法構成部分に伝達する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取ってもよく、電気穿孔法構成部分によって送達されたエネルギーのパルスを調整して定電流を維持することができる。
【００９４】
複数の電極は分散化されたパターンでエネルギーのパルスを送達し得る。複数の電極は、プログラムされた順序のもとで電極の制御を介して分散化されたパターンでエネルギーのパルスを送達してもよく、プログラムされた順序はユーザーによって電気穿孔法構成部分に入力される。プログラムされた順序は順に送達される複数のパルスを含んでもよく、その際、複数のパルスの各パルスは、一方がインピーダンスを測定する中性の電極である少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスのその次のパルスは一方がインピーダンスを測定する中性の電極である少なくとも２つの活性電極の異なる一方によって送達される。
【００９５】
フィードバック機構はハードウエア又はソフトウエアのいずれかによって実施され得る。フィードバック機構はアナログの閉ループ回路によって実施され得る。フィードバックは、５０μｓ毎、２０μｓ毎、１０μｓ毎、又は１μｓ毎に発生するが、好ましくはリアルタイムフィードバック又は瞬時である（すなわち、応答時間を測定するのに利用可能な技法によって測定したとき実質的に瞬時）。中性の電極は所望の組織にてインピーダンスを測定してもよく、インピーダンスをフィードバック機構に伝達し、フィードバック機構はインピーダンスに応答し、エネルギーのパルスを調整して予め設定された電流に類似する値で定電流を維持する。フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達の間、定電流を連続して及び瞬時に維持し得る。
【００９６】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を円滑にし得る電気穿孔装置及び電気穿孔法の例には、その内容が全体として参照によって本明細書に組み込まれるＤｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許公開２００５／００５２６３０号に記載されたものが挙げられる。ＤＮＡワクチンの送達を円滑にするために使用され得る他の電気穿孔装置及び電気穿孔法には、すべてその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００６年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／８５２，１４９号と、２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号とに対して米国特許法第１１９条（ｅ）のもとで利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属で共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号にて提供されたものが挙げられる。
【００９７】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、生体又は植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を円滑にするためのモジュール式の電極システム及びその使用を記載している。モジュール式の電極システムは、複数の針状電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針状電極への導電性連結を提供する電気接続器；及び電源を含み得る。操作者は、支持構造に搭載される複数の針状電極を握り、生体又は植物の選択された組織の中へそれをしっかりと挿入することができる。次いで皮下注射針を介して選択された組織の中に生体分子を送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器が活性化され、複数の針状電極に定電流の電気パルスが適用される。適用された定電流の電気パルスは複数の電極間で細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９８】
Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、生体又は植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を円滑にするために使用され得る電気穿孔装置を記載している。電気穿孔装置は、その操作がソフトウエア又はファームウエアによって特定される電気動的装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザーの制御及びパルスパラメータの入力に基づくアレイにて電極間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生じ、電流波形データの保存及び獲得を可能にする。電気穿孔装置はまた、針状電極のアレイを有する置き換え可能な電極ディスク、注入針用の中央注入経路、及び取り外し可能なガイドディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９９】
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイ及び方法は、筋肉のような組織だけでなく、他の組織又は臓器の中への深い浸透に適合させ得る。電極アレイの構造のために、（選択した生体分子を送達するための）注入針も標的臓器に完全に挿入され、注入は、電極によって事前に描かれる領域にて標的組織に垂直に行われる。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは長さ２０ｍｍで２１ゲージである。
【０１００】
さらに、電気穿孔装置及びその使用を組み入れる一部の実施形態に企図されるものには、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号及び２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、及び２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号にて記載されたものである電気穿孔装置がある。さらに、いずれの種々の装置を用いたＤＮＡの送達に関係する、２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、及びＤＮＡを注入する方法についての、２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号において提供された主題を網羅する特許が本明細書で企図される。上記特許はそれらの全体が参照によって組み込まれる。
【０１０１】
ｃ．ＤＮＡプラスミドを調製する方法
本明細書で提供されるのは、本明細書で考察されるＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドを調製する方法である。ＤＮＡプラスミドは、哺乳類の発現プラスミドへの最終的なサブクローニング工程の後、当該技術で既知の方法を用いて大規模発酵槽における細胞培養物に植菌するのに使用することができる。
【０１０２】
本発明のＥＰ装置とともに使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置と技法の組み合わせを用いて製剤化する又は製造することができるが、好ましくは、それらは、２００７年５月２３日に出願された認可された同時係属米国仮特許出願第６０／９３９，７９２号に記載されている最適化されたプラスミドの製造法を用いて製造される。一部の実施形態では、これらの試験で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で製剤化することができる。製造法はまた、認可された特許、２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号にて記載されたものを含む、米国特許出願第６０／９３９７９２にて記載されたものに加えて、当業者に一般的に既知である種々の装置及びプロトコールを含む又は組み入れる。上記で参照された出願及び特許、米国特許出願第６０／９３９，７９２号及び米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
実施例
【０１０３】
以下の実施例にて本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で説明のためにのみ提供されることが理解されるべきである。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合するように本発明の種々の変更及び改変を行うことができる。従って、本明細書で示され、記載されるものに加えた本発明の種々の改変は、前述の記載から当業者に明らかであろう。そのような改変は添付のクレームの範囲内に入るように意図される。
【実施例１】
【０１０４】
ＭＲＳＡ感染が増えているという事実と関連した高い死亡率は、ＭＲＳＡ特異的なＰＢＰ２ａタンパク質に対する免疫を誘導することが可能であるワクチンを生成する尽力を促した。その目的で、２種類のＰＢＰ２ａＤＮＡワクチン抗原：ＩｇＥのシグナルペプチド配列に連結されたＰＢＰ２ａの触媒ドメインのみから成るもの（配列番号１２、以下、配列番号１１によってコードされる「短い型」と呼ぶ）及びＩｇＥのシグナルペプチド配列に連結された、膜貫通ドメインを除くＰＢＰ２ａタンパク質全体から成るもの（配列番号１０、以下、配列番号９によってコードされる「係留なし型」と呼ぶ）を最初に構築した。ＩｇＥのシグナルペプチド配列を含めることは、効率の高いシグナルペプチド配列を提供する。コーディング配列は、発現レベルをさらに高めるようにコドン最適化及びＲＮＡ最適化された。
【０１０５】
大腿四頭筋の筋肉にて２５μｇの「短い型」又は「係留なし型」のウイルス変異体のいずれかによってマウスを免疫し、その後、Ｉｎｏｖｉｏ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌのＣｅｌｌｅｃｔｒａ装置によって電気穿孔法を行った。単回免疫の２週間後、マウスから採血し、ＰＢＰ２ａ特異的な抗体について血清を調べた。「短い型」の変異体を投与された動物の群はこの群の免疫前の血清と比べて抗体力価の３倍を超える上昇を示したが、「係留なし型」のワクチン変異体を投与された動物は６倍を超える上昇を示した（図２）。これらのデータは、これらのプラスミド抗原が単回免疫の２週間後、生体内でのＰＢＰ２ａ特異的な抗体反応を引き出すことができることを示している。これらのデータは、この重要な感染性疾患に対する治療法としてのそのような免疫原の設計の使用を支持している。
【実施例２】
【０１０６】
膜貫通ドメインを含むＰＢＰ２ａタンパク質の完全長変異体を含む構築物を作製した。ＩｇＥのシグナルペプチド配列（配列番号１３）に連結された完全長ＰＢＰ２ａタンパク質（配列番号２）のコーディング配列を含む完全長のＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質のＤＮＡワクチン構築物は以下、配列番号７によってコードされる「完全型」と呼ばれ、アミノ酸配列、配列番号８を有する。図３は、ＣＭＶプロモータ及びＢＧＨポリＡ部位に操作可能に連結されるようにクローニングしたＰＢＰ２ａコーディング配列の挿入を伴った骨格プラスミドｐＶａｘ１の模式図を示す。
【実施例３】
【０１０７】
図４は、ｐＶａｘを対照として用い、ＰＢＰ２ａタンパク質の完全型及び係留なし型をコードする構築物を含むプラスミドを用いてタンパク質の発現レベルを比較する発現実験の結果を示す。
【０１０８】
ＰＢＰ２ａタンパク質の完全型及び係留なし型をコードする構築物を含むプラスミドによって生成される免疫応答を比較した。０日目にマウスから採血し、大腿四頭筋の筋肉にて２５μｇのｐＶａｘ、完全型（配列番号７）又は係留なし型（配列番号９）ワクチン変異体のいずれかによってマウスを免疫し、その後、Ｉｎｏｖｉｏ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌのＣｅｌｌｅｃｔｒａ装置によって電気穿孔法を行った。２週間後、マウスから採血し、２回目の免疫を行った。２８日目にマウスから採血し、ＥＬＩＳＡ、血清殺菌アッセイ及びオプソニン化貪食作用及び殺傷アッセイによって解析した。
【０１０９】
未感作／対照のマウス又は０日目と１４日目に完全型若しくは係留なし型のワクチンでワクチン接種したマウスから０日目、１４日目及び２８日目に採取した血清におけるＰＢＰ２ａ特異的なＩｇＧ抗体の力価を比較した。合わせた結果を図５に示す。図６は、未感作／対照のマウス（左）又は０日目と１４日目に係留なし型（中央）若しくは完全型（右）のワクチンでワクチン接種したマウスからの０日目、１４日目及び２８日目における抗ＰＢＰ２ａ  ＩｇＧの力価の個体のデータを示す。
【０１１０】
未感作／対照のマウス又は完全型若しくは係留なし型でワクチン接種したマウスの希釈した血清におけるＰＢＰ２ａ特異的なＩｇＧ抗体の力価を測定し、点間グラフ（左）及び最良適合グラフ（中央）を用いてデータをプロットした図７にてデータを示す。相互希釈の終点力価も図７（右）にて示す。
【０１１１】
未感作／対照のマウス又は０日目と１４日目に完全型若しくは係留なし型でワクチン接種したマウスから０日目及び２８日目に採取した血清におけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａについての別々の力価。ＩｇＧ１の力価を示す結果を図８の左に示し、ＩｇＧ２ａの力価を示す結果を図８の右に示す。
【実施例４】
【０１１２】
モルモットを皮内にて（ＩＤ）１００μｇで免疫する追加試験を行った。免疫の完了後、３週及び６週で、動物から採血し、ＰＢＰ２ａ特異的な抗体について血清を調べた。免疫の３週間後、完全型及び係留なし型の変異体は双方とも強固な終点力価を生じ、これは、完全型変異体については１０６に近づき、係留なし変異体については１０４に近づいた。免疫の６週間後、力価の大部分が一貫したままだったということは応答の持続性を示唆している。
【０１１３】
図９は、完全型又は係留なし型の変異体で皮内（ＩＤ）にて免疫したモルモットから得られたＩｇＧの力価を示す。３週間間隔にて３回、皮膚内で動物を免疫した。最終免疫の３週間後（左のグラフ）及び６週間後（右のグラフ）、動物から採血し、ＰＢＰ２ａ抗原に特異的な力価を測定した。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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