(57)【要約】      （修正有）【課題】カニクイザルなどのマカク属やマウス，ラットといった対象動物において移植等したヒト細胞を検出する方法の提供。【解決手段】フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットであって，前記フォワードプライマーは，特定な配列の塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドであり，前記リバースプライマーは，特定な配列の塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである，検出キット。【選択図】図１２
2018102252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットであって，
前記フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドであり，
前記リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである，
検出キット。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
【請求項２】
請求項１に記載の検出キットであって，
前記フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり，
前記リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである，
検出キット。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の検出キットであって，
配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドであるプローブを，更に有する
検出キット。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【請求項４】
請求項３に記載の検出キットであって，
前記プローブは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有する検出キット。
５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の検出キットを用いたヒト以外の対象動物におけるヒト細胞の検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の検出方法であって，前記対象動物は，ヒトの幹細胞を移植されたヒト以外の動物である，方法。
【請求項７】
請求項５に記載の検出方法であって，前記対象動物は，ヒトの幹細胞を移植されたマカク属に分類される動物である，方法。
【請求項８】
請求項５に記載の検出方法であって，移植されたヒト細胞の前記対象動物における分布を検出する，方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，検出キット，及び検出方法に関する。より詳しく説明すると，本発明は，ヒト以外の実験動物において移植等したヒト細胞がどのように分布しているかを検出するための生体分布の検出キットや，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物におけるヒト細胞の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開ＷＯ２０１３−０６９６６１号パンフレットには，ｉＰＳ細胞を用いた細胞シートが開示されている。このようにｉＰＳ細胞など幹細胞を移植する試みがなされている。この場合，移植片の安全性を評価する必要が生ずる。このため，人体実験に先立って，動物実験が行われる。その場合，移植した細胞が，実験動物の生体内においてどのように分布したか評価することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１３−０６９６６１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の技術では，ｉＰＳ細胞などヒト由来の移植片に由来する細胞が，ヒト由来のものであるか実験動物由来のものであるかを判別することが困難であった。特に，マカク属に細胞を移植した場合，移植片に由来する細胞が，ヒト由来のものであるか実験動物由来のものであるか判別することが困難であった。
【０００５】
そこで，本発明は，ヒト細胞をヒト以外の実験動物において移植等させた場合に，ヒト細胞を検出するための検出キットや，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物におけるヒト細胞の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の側面は，フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットに関する。
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
一方，リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
【０００７】
フォワードプライマーは，好ましくは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
リバースプライマーは，好ましくは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０００８】
この検出キットは，更にプローブを有していてもよい。プローブの例は，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
プローブは，好ましくは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【０００９】
プローブは，下記の配列を有するものが好ましい。
５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’
【００１０】
プローブの上記とは別の例は，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドである。５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’。（配列番号３）
好ましいプローブの例は，以下のものである。
５’  −  ＦＡＭ  −  ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ  −  ＮＦＱ  −  ＭＧＢ  −  ３’。
【００１１】
本発明の第２の側面は，上記したいずれかに記載の検出キットを用いたヒト以外の対象動物におけるヒト細胞の検出方法に関する。
【００１２】
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたヒト以外の動物である。
【００１３】
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたマカク属に分類される動物である。
【００１４】
好ましい他の対象動物は，マウス及びラットである。より好ましい対象動物は，マウスである。
【００１５】
この発現検出方法は，好ましくは，移植されたヒト細胞の対象動物における分布を検出する方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は，ヒト細胞をヒト以外の実験動物において移植等させた場合に，ヒト細胞を検出するための検出キットを提供できる。
また，本発明は，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物におけるヒト細胞の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図２】図２は，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図３】図３は，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは，実施例１におけるヒトゲノムDNAを用いた場合の検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図８】図８は，比較例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは，比較例２における１０ｎｇ  マウスｇＤＮＡ存在下でＡｌｕ−１を用いたｑＰＣＲの増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは，比較例２における１０ｎｇ マウスｇＤＮＡ存在下でＡｌｕ−２を用いたｑＰＣＲの増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは，比較例３における１μｇ  マウスｇＤＮＡ存在下でＡｌｕ−２を用いたｑＰＣＲの増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは，比較例３における１００ｎｇ マウスｇＤＮＡ存在下でＡｌｕ−２を用いたｑＰＣＲの増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは，比較例３における１０ｎｇ マウスｇＤＮＡ存在下でＡｌｕ−２を用いたｑＰＣＲの増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図１２】図１２は，実施例２における１μｇ マウスｇＤＮＡ存在下で本発明を用いたｑＰＣＲの増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図１３】図１３は，実施例２における１μｇマウスｇＤＮＡ存在下で本発明を用いた１００ｃｏｐｙ／ｒｘｎ のｑＰＣＲ増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の第１の側面は，フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットに関する。この検出キットは，ヒト細胞が存在するか否か，すなわちヒト細胞の分布を検出することに好ましく用いることができる。また，後述する実施例により実証されたとおり，本発明の検出キットは，マカク属に属するヒト以外の動物において，ヒト細胞を移植等した際に，ヒト細胞の分布を適切に評価できる。本発明の検出キットは，プライマーを含むため，例えば，ＰＣＲなど公知の核酸増幅法を用いて分析できる。ＰＣＲ自体やＰＣＲを行うための装置は，公知であるから，公知のＰＣＲ法などの核酸増幅法において，本発明の検出キットを用いることができる。
【００１９】
各プライマーセットを用いた増幅反応の結果を確認するには，公知の様々な検出方法を利用することができる。増幅反応を確認する方法の例は，アガロースゲル電気泳動法，ポリアクリルアミド電気泳動法，フラグメント解析法及び蛍光物質による検出方法である。
【００２０】
核酸増幅方法の例は，ＰＣＲの他，ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻，第９１頁（１９９１）），ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報，及び特開平２−２９３４号公報），ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２０巻，第１６９１頁（１９９２）），ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報），ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  第３１巻，第３２７０頁（１９９３））である。
【００２１】
ＰＣＲ法は，試料核酸，４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸，一対のオリゴヌクレオチド，及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で，変性，アニーリング，伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより，上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。変性工程で試料の核酸を変性し，続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと，それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ，続く伸長工程で，各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ，二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより，１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って，このサイクルをｎ回繰り返せば，理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので，電気泳動等の方法により容易に検出できる。
【００２２】
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
一方，リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
【００２３】
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１８〜２１塩基（１９〜２１塩基又は２０〜２１塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。フォワードプライマーは，好ましくは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１９〜２２塩基（２０〜２２塩基又は２１〜２２塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。リバースプライマーは，好ましくは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
本発明のフォワードプライマー及びリバースプライマーは，ヒト由来のあるＤＮＡと特異的にハイブリダイズするものと考えられる。「特異的にハイブリダイズする」とは，通常のハイブリダイゼーション条件下，好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば，サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ，  第２版，１９８９に記載の条件）において，他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。
【００２６】
この検出キットは，上記のフォワードプライマー及びリバースプライマーに加え，ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むものであってもよい。
【００２７】
この検出キットは，更にプローブを有していてもよい。プローブは，配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドである。プローブは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に標識が付加されてもよい。配列番号３で示される塩基配列中の連続する１２〜１５塩基（１３〜１５塩基又は１４〜１５塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。プローブは，好ましくは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【００２８】
標識の例は，蛍光化学物質による蛍光標識，発光団，酵素，蛍光蛋白質，発光蛋白質，磁性体，導電性物質，ビオチン，ハプテン，抗原及び抗体である。蛍光化学物質の例は，ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド，Ｃｙ３，及びＣｙ５である。発光団の例は，ルテニウムである。酵素の例は，アルカリフォスファターゼ及びペルオキシダーゼである。プローブのみならず，上記したフォワードプライマー及びリバースプライマーにも適宜標識が付されていてもよい。
【００２９】
プローブは，下記の配列を有するものが好ましい。
５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’
５’末端及び３’末端のＦＡＭ及びＴＡＭＲＡは蛍光標識である。
【００３０】
プローブの上記とは別の例は，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドである。５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’。（配列番号３）
好ましいプローブの例は，以下のものである。
５’  −  ＦＡＭ  −  ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ  −  ＮＦＱ  −  ＭＧＢ  −  ３’。このプローブは，特にヒトＤＵＦ１２２０ドメインをターゲットとする場合に好ましく用いられる。本発明においてプローブやプライマーには蛍光色素の他，クエンチャー，及びエンハンサー（シグナル増強試薬）といった配列に付加されるものが適宜付加されていても構わない。ＮＦＱは，ｎｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ（クエンチャー）でありＭＧＢは，Ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒである。 
【００３１】
本発明の検出キットを用いた検出方法は，標識の種類に応じて選択されればよい。例えば，プライマーとプローブが異なる蛍光化学物質で標識されている場合は，蛍光検出器，又はフローサイトメーターを用いることにより目的とする増幅核酸を検出することができる。さらに，ＦＲＥＴを利用することで，目的とする増幅核酸を検出してもよい。例えば，一方がビオチン，他方が蛍光化学物質や発光団により標識されている場合は，例えば，ビオチン標識を利用してハイブリッドの捕捉を行い，捕捉されたハイブリッドの標識を測定する方法などが考えられる。またビオチンと抗原等の両方が捕捉可能な物質の場合は，例えばアビジンを固定した通液フィルターでハイブリッドを捕捉し，次に酵素標識抗体を反応させ，当該酵素による発色もしくは発光基質を添加することによる発光を利用して検出することができる。
【００３２】
本発明の第２の側面は，上記したいずれかに記載の検出キットを用いたヒト以外の対象動物におけるヒト細胞の検出方法に関する。ヒト細胞を検出するためには，上記において説明した各種の方法を適宜用いればよい。
【００３３】
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたヒト以外の動物である。ヒトの幹細胞の例は，ヒトのｉＰＳ細胞であり，ヒトのｉＰＳ細胞シートであってもよい。対象動物は，形質転換されたヒト以外の動物であってもよい。さらに，対象動物は，ヒト細胞が投与されたヒト以外の動物であってもよい。
【００３４】
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたマカク属に分類される動物である。マカク属に分類される動物の例は，カニクイザルである。
【００３５】
好ましい他の対象動物は，マウス及びラットである。特に，本発明は，ヒト細胞をマウスに移植した場合に，感度良くヒト細胞を検出できる。このため，前臨床実験などにおいて，本発明を好ましく利用できる。特に，本発明は，ヒトＤＵＦ１２２０遺伝子をターゲットとした場合に好ましく利用できる。本発明は，ヒトＤＵＦ１２２０遺伝子を特異的に検出でき，しかもＤＵＦ１２２０は，バックグラウンドが低いか検出されないドメインであるから，極めて感度良くヒト細胞を検出できる。
【００３６】
この検出方法は，好ましくは，移植されたヒト細胞の対象動物における分布を検出する方法である。この場合，対象動物の各部位から細胞を取り出して，本発明の検出キットを用いて，各部位においてヒト細胞が存在しているかを分析（例えば定量分析）すればよい。具体的に説明すると，移植片が移植された部位のみならず，その周辺や各種の器官から細胞を採取し，ヒト細胞が分布しているか否か分析すればよい。
【００３７】
以下実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は，上記した説明や，実施例に限定されるものではなく，当業者に公知な方法や条件を適宜採用することができる。
【実施例１】
【００３８】
カニクイザルまたはラットのゲノムＤＮＡ由来の増幅は起こらず，ヒトのゲノムＤＮＡを特異的に増幅できることを確認するため，ヒト，カニクイザル及びラットそれぞれのゲノムＤＮＡを５〜５００００コピー（１６．５ｐｇ〜１６５ｎｇ，ゲノムＤＮＡ  １コピー  ＝  ３．３ｐｇ換算）含む希釈系列を作製し，これらを鋳型としてｑＰＣＲ定量を行った。
この際，フォワードプライマー及びリバースプライマーとして，それぞれ，配列番号１及び配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
また，プローブとして，５’−ＦＡＭ−（配列番号３）−ＴＡＭＲＡ−３’で示されるものを用いた。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【００３９】
ｑＰＣＲは，公知の装置を用いて行った。ｑＰＣＲ条件は，５０℃２分／９５℃１０分／（９５℃１５秒及び６０℃１分）を１サイクルとし，４０サイクル行うことを基本とした。
【００４０】
ラット及びカニクイザルのゲノムＤＮＡに市販のヒトゲノムＤＮＡを規定量（５〜５００００コピー）添加した希釈系列を作成し，これらを鋳型としてｑＰＣＲ定量を行うことで，ヒトゲノムＤＮＡを特異的に検出できるか否かを評価した。バックグラウンド試料として，代表的な臓器である肝臓を使用した。具体的には，ラットやカニクイザルのゲノムＤＮＡをそれらの肝臓から抽出し，ｑＰＣＲ定量のバックグラウンド試料として用いた。
検量線を作成する際には，バックグラウンド試料を含まないヒトゲノムＤＮＡを使用し，ＰＣＲ増幅に対する影響の有無を確認した。その結果を図１〜図６に示す。
【００４１】
図１Ａは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図１Ｂは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図２は，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図３は，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図４Ａは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図４Ｂは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図５Ａは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す。
図５Ｂは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す。
図６Ａは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す。
図６Ｂは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す。
【００４２】
増幅曲線において，縦軸（Ｄｅｌｔａ  Ｒｎ）は，反応生産物量を示す。数値は蛍光量の対数で記載されたものである。理論上，（テンプレートの初期濃度×２のｎ乗）で増幅する。増幅曲線において，横軸（Ｃｙｃｌｅ  Ｎｕｍｂｅｒ）は，ＰＣＲ反応のサイクル数を示す。増幅曲線において，補助線（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ（図中の横線））は，指数関数的に増幅されている領域に引かれたベースラインである。補助線は，ユーザーが任意の場所に変更できるものである。増幅曲線において，Ｃｔ値は，補助線と増幅曲線との交点のサイクル数を示す。Ｃｔ値は，検量線作成や，サンプルの濃度推定に使用する数値である。
検量線において，縦軸（Ｃｔ値）はサイクル数を示す。Ｃｔ値は，増幅曲線のＣｔ値が使用される。検量線において，横軸（Ｌｏｇ  Ｃ０）は，検量（濃度）を対数表記したものである。既知濃度サンプルを検量線試料とすることで，未知のサンプル濃度を推定できる。
【００４３】
検量線試料より，５００００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝１６．３±０．０６であり，５０００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝１９．３±０．０７であり，５００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝２２．７±０．０６であり，５０コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝２６．４±０．１４であり，５コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝３０．１±０．１１であった。バックグラウンド試料中の各コピー数に応じたサイクル数は，カニクイザルでは，Ｃｔ＝１６．３±０．０２，１９．３±０．１３，２２．８±０．１０，及び３０．１±０．１１であった。ラットでは，Ｃｔ＝１６．３±０．０４，１９．４±０．０８，２２．８±０．１６，及び３０．２±０．１７であった。この結果，バックグラウンド試料存在下でもＰＣＲ増幅に影響なく，ヒトゲノムＤＮＡを定量できることが明らかとなった。
【００４４】
［比較例１］
フォワードプライマー及びリバースプライマーとして，それぞれ，配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これは，ヒトではマルチに存在し，マカク属には１００％一致する配列が存在しない領域であるＱ８ＩＸ６２＿１７−８３を選択的に増幅するプライマーセットである。この領域は，ヒト特異的な配列であり，ＤＵＦ１２２０配列とよばれるものである。また，プローブとして，５’末端及び３’末端がそれぞれＶＩＣ，及びＴＡＭＲＡで蛍光修飾された配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ｑＰＣＲの条件は，実施例１と同様とした。その結果を図７〜図９に示す。
【００４５】
配列番号４：５’−ＧＣＴＧＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣ−３’
配列番号５：５’−ＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡ−３’
配列番号６：５’−ＴＧＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴＣＡＡＣＴＣＣ−３’
【００４６】
図７Ａは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図７Ｂは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図８は，比較例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図９Ａは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図９Ｂは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
【００４７】
図７から，ヒトＤＮＡを鋳型として用いた場合，全ての希釈系で指数関数的増幅を示すことが確認された。
図８から，ラットＤＮＡを鋳型として用いた場合，全ての希釈系で増幅がみられないことが分かった。
図９から，カニクイザルＤＮＡを鋳型として用いた場合には，５００００コピー（１６５ｎｇ）の濃度において，２８サイクル目（Ｃｔ＝２７．７±０．０５）から，増幅が検出された。ヒトＤＮＡを鋳型として用いた場合には，Ｃｔ＝１７．７±０．０４であり，これと比べると２×１０２の差が生じているものの，ヒトＤＮＡと同様に指数関数的な増幅が確認でき，定量分析を行うことができることがわかる。比較例では，ヒト及びカニクイザルといった霊長類特異性を確認することができたものの，ヒト特異的ではなく，マカク属を対象動物とした移植片等の分布評価には，適していないことがわかった。
【実施例２】
【００４８】
［比較例２及び３］
Ａｌｕ配列をターゲットにしたｑＰＣＲ
実施例２との比較をするため，一般的にヒト遺伝子検出に使用されているＡｌｕ配列をターゲットにしたプライマー／プローブセットを用いてｑＰＣＲを行った。以前に論文にて報告のあったＡｌｕ−１（参考文献１及び２）と新規に設計したＡｌｕ−２のセットのいずれを用いても，遺伝子の存在しない試薬のみであるＮｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ （ＮＴＣ）と，マウスＤＮＡ存在下のＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ （ＮＣ）の両方においてヒト遺伝子の存在を示すはずのシグナルが見られた（図１０Ａ，図１０Ｂ）。バックグラウンドとなるこのノイズシグナルを抑えるために，各反応に添加するｇＤＮＡ量を計１０ｎｇ，１００ｎｇ，１μｇと変化させてｑＰＣＲを実施した。その結果を図１１Ａ〜図１１Ｃに示す。図１１Ａ〜図１１Ｃに示される通り，全ての濃度に関してノイズシグナルが見られた。ただし，ｇＤＮＡ量が１μｇの条件ではＮＣがＮＴＣに比べて低いＣｔ値を示すことから，鋳型ＤＮＡが過剰な条件ではＡｌｕプライマーがマウス遺伝子に非特異的に反応する可能性が示唆されたため，最適条件はＮＣとＮＴＣのＣｔ値に差の無いｇＤＮＡ添加量１０ｎｇと考えられる。
【００４９】
合成遺伝子断片を陽性対照として用いて希釈系列を作成し，Ａｌｕ−１とＡｌｕ−２のｑＰＣＲを１０ｎｇのｇＤＮＡ存在下で行った場合の各アッセイの検量線の成績は以下のようであった。
Ａｌｕ−１：傾き−３．６，Ｒ２＝０．９９９，増幅効率＝８９．６％。
Ａｌｕ−２：傾き−３．５，Ｒ２＝０．９９８，増幅効率＝９３．８％。
［実施例２］
【００５０】
ＤＵＦ１２２０ドメインをターゲット遺伝子としたＰＣＲ
フォワードプライマー及びリバースプライマーとして，それぞれ，配列番号１及び配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い，上記Ａｌｕ配列と同様に，ノイズシグナルの有無を確認するためにｑＰＣＲを実施したが，ｇＤＮＡ量が１μｇでもノイズシグナルは検出されなかった（図１２）。合成遺伝子断片を陽性対照として用いて希釈系列を作成し，ｑＰＣＲを行って検量線を作成した結果，成績は以下のようであった。
傾き-３．３，Ｒ２＝０．９９８，増幅効率＝１０１％であった。
また，図１３に示されるように，１００ ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎもシグナルとして検出することができた。
【００５１】
検出限界の有利性
表１に実施例２と比較例２及び３との比較を示す。
【００５２】
【表１】
2018102252.tif 000003
【００５３】
Ａｌｕを使用したｑＰＣＲでは，ノイズシグナルが１０３〜１０２ ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎの間に出てくるため，信頼できる検出／定量下限は１０３ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎに留まる。しかし，本発明にノイズシグナルが検出されないため，バリデーション可能な定量下限は１００ ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎ，検出限界は５ ｃｏｐｙ／ｒｘｎである。これらを添加ｇＤＮＡ １０ｎｇ中の細胞数として算出すると，Ａｌｕ−１の定量下限/検出限界は０．００８細胞／１０ｎｇ ｇＤＮＡ，Ａｌｕ−２の定量下限/検出限界は０．０２細胞／１０ｎｇ ｇＤＮＡ，本発明の定量下限は０．００２細胞／１０ｎｇ ｇＤＮＡ，検出限界は８．０Ｘ１０−５細胞／１０ｎｇ ｇＤＮＡとなり，本発明はＡｌｕと比較して約１００倍の優れた検出限界を保持する。
【００５４】
ヒト細胞の生体内分布検出結果比較
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＮＯＧマウスに尾静脈投与後２４時間におけるｈＭＳＣのマウス生体内分布を上記３セットのプライマー/プローブで検出したところ，表２の結果が得られた。
【００５５】
【表２】
2018102252.tif 000004
【００５６】
表２に示される通り，非特異的な反応，もしくはコンタミネーションを表す陰性対照投与群におけるシグナルがＡｌｕ−１の系では多く見られたが，Ａｌｕ−２と実施例２では１サンプルずつでしか見られなかった。また，実際にヒト細胞の分布の可能性のある組織においては，実施例２がＡｌｕ−１とＡｌｕ−２に比べて最も多くのサンプルからヒト遺伝子を検出することができた。この結果より，実施例２は既存のＡｌｕ配列を標的としたアッセイ系と比較して，Ｓ／Ｎ比が高く，高感度を有していると考えられる。
【００５７】
次に，実施例２及び比較例２〜３の実験系について説明する。
プライマー／プローブ，陽性対照，ｑＰＣＲ  Ａｌｕ−１のプライマーは参考文献１, ２で使用されている配列を使用し，プローブには以下の蛍光とクエンチャーを含む配列を使用した。
具体的には，フォワードプライマー及びリバースプライマーとして，それぞれ，配列番号７及び配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号７：ＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡ
配列番号８：ＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＡＧ
プローブとして，以下の配列を有するものを用いた。
５’−５６−ＦＡＭ／ＡＴＴＡＧＣＣＧＧ／ＺＥＮ／ＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧ／３ＩＡＢｋＦＱ−３’ 
これは（配列番号９：ＡＴＴＡＧＣＣＧＧ／ＺＥＮ／ＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧ）の末端に，５６−ＦＡＭ及び３ＩＡＢｋＦＱが付加し，９番目のＧと１０番目のＧの間にクエンチャーであるＺＥＮが挿入された配列である。
参考文献１：Toupet K, Maumus M, Peyrafitte JA, Bourin P, van Lent PL, Ferreira R, Ordetti B, Pirot N, Casteilla L, Jorgensen C, and Noel D. (2013) Long-term detection of human adipose-derived mesenchymal stem cells after intraarticular injection in SCID mice. Arthritis & Rheumatology. 65 (7): 1786-94.
参考文献２：Lee RH, Pulin AA, Seo MJ, Kota DJ, Ylostalo J, Larson BL, Semprun-Prieto L, Delafontaine P, and Prockop DJ. (2009) Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1) 54-63.
【００５８】
Ａｌｕ−２はＰｒｉｍｅｒ３（参考文献３，４）を用いてＡｌｕＹａ５サブファミリーを検出ターゲットとしてデザインした。
【００５９】
参考文献３：Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, and Rozen SG. (2012) Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15): e115.
参考文献４：Koressaar T and Remm M. (2007) Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23(10): 1289-91
【００６０】
各配列を以下に示す。
フォワードプライマー配列：５’− ＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴ −３’（配列番号１０）
リバースプライマー配列：５’− ＡＣＴＡＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴ −３’，（配列番号１１）
プローブ配列：Ｐ−５６−ＦＡＭ／ＴＣＡＧＧＡＧＡＴ／ＺＥＮ／ＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣＴ／３ＩＡＢｋＦＱ。
（これは配列番号１２：ＴＣＡＧＧＡＧＡＴ／ＺＥＮ／ＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣＴの末端にＰ−５６−ＦＡＭ及び３ＩＡＢｋＦＱが付加し，９番目のＴと１０番目のＣの間にクエンチャーであるＺＥＮが挿入されたものである）
実施例２として，配列番号１及び２の配列を有するものを用い，プローブは以下のクエンチャーとエンハンサーが付加されたものを使用した。
５’  −  ＦＡＭ  −  ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ  −  ＮＦＱ  −  ＭＧＢ  −  ３’。（これは配列番号３の末端にＦＡＭ及びＮＦＱ  −  ＭＧＢが付加したものである）
【００６１】
すべてのｑＰＣＲ反応は以下の条件で７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｔｈeｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ.）を用いて行われた。計３０μＬの反応液を調製し，９５℃３分を１サイクル，９５℃１５秒に続く６０℃１分を４０サイクルで反応させた。Ａｌｕ１，Ａｌｕ２，本発明の各陽性対照は，これらのプライマーによって増幅される領域を含む遺伝子配列をＩＤＴ社（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ, Ｉｏｗａ）において遺伝子合成されたものを使用した。
【００６２】
各ｑＰＣＲ反応に添加したマウスｇＤＮＡは，ｇＤＮＡの最適添加量を検討する実験ではＣ５７ＢＬ／６マウスの各臓器から抽出したｇＤＮＡの混合液を用い，それ以外の実験ではＩＣＲマウスの脾臓由来ｇＤＮＡを用いた。これらのｇＤＮＡはＱｉａｇｅｎ社のＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔを用いて添付プロトコールに従って抽出した。
【００６３】
マウスへのｈＭＳＣ投与
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は継代数２のものをＬｏｎｚａから購入し，ＣＯ２濃度５％，３７度に設定したＣＯ２インキュベータで，下記の組成の培地を用いて加湿下にて培養した。培地：１０％ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２％ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，０．１％ ＧＡ−１０００を含むｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ。継代数５に達した上記細胞を２．０Ｘ１０７ ｃｅｌｌｓ／ｋｇ となるように３匹の８週齢ＮＯＤ.Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／Ｊｉｃ （ＮＯＧ）マウスに尾静脈注射して投与した。１匹の８週齢陰性対照投与群にはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅを５ｍＬ／ｋｇの割合で投与した。
投与後２４時間の時点で陰性対照投与動物１匹とｈＭＳＣ投与動物3匹を安楽死させ，血液，肺，肝臓，心臓，腎臓，脳，脾臓，投与部位（尾）を切り出してｇＤＮＡを前述と同様に抽出した。抽出されたｇＤＮＡの濃度はＱｕｂｉｔを用いて測定し，Ａｌｕ配列検出系については１０ｎｇ／ｒｘｎ, 本発明については１μｇ／ｒｘｎとなるよう希釈し，ｑＰＣＲ反応に供した。
【００６４】
本発明の検出キットを用いることで，ヒトＤＮＡのみを測定することができた。バックグラウンドに動物ＤＮＡが存在してもその特異性は変化することなく安定して測定することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は，製薬産業，医療機器産業，及び医療診断産業において利用されうる。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プローブ
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プローブ
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プローブ
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プローブ
【図１Ａ】
2018102252.tif 000005
【図１Ｂ】
2018102252.tif 000006
【図２】
2018102252.tif 000007
【図３】
2018102252.tif 000008
【図４Ａ】
2018102252.tif 000009
【図４Ｂ】
2018102252.tif 000010
【図５Ａ】
2018102252.tif 000011
【図５Ｂ】
2018102252.tif 000012
【図６Ａ】
2018102252.tif 000013
【図６Ｂ】
2018102252.tif 000014
【図７Ａ】
2018102252.tif 000015
【図７Ｂ】
2018102252.tif 000016
【図８】
2018102252.tif 000017
【図９Ａ】
2018102252.tif 000018
【図９Ｂ】
2018102252.tif 000019
【図１０Ａ】
2018102252.tif 000020
【図１０Ｂ】
2018102252.tif 000021
【図１１Ａ】
2018102252.tif 000022
【図１１Ｂ】
2018102252.tif 000023
【図１１Ｃ】
2018102252.tif 000024
【図１２】
2018102252.tif 000025
【図１３】
2018102252.tif 000026
【配列表】
2018102252000001.app