(57)【要約】【課題】  非天然型16SリボソーマルRNAおよびその製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】  非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、5’ドメイン、セントラルドメイン、3’メジャードメイン、または、3’マイナードメインに対応する４つの部分配列を含み、部分配列が、少なくとも２つ以上の異なる微生物由来の部分配列である、遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
前記遺伝子は、5’ドメイン、セントラルドメイン、3’メジャードメイン、または、3’マイナードメインに対応する４つの部分配列を含み、
前記部分配列が、少なくとも２つ以上の異なる微生物由来の部分配列である、遺伝子。
【請求項２】
請求項１記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
前記微生物由来の部分配列の少なくとも一つが大腸菌由来であり、残りの部分配列が単離された微生物のゲノムに由来する、遺伝子。
【請求項３】
請求項１記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
前記微生物由来の部分配列の少なくとも一つが大腸菌由来であり、残りの部分配列が環境ゲノムに由来する、遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
（ｉ）5’ドメインに対応する部分配列が、大腸菌、または、ガンマプロテオバクテリア綱由来の部分配列であり、
（ｉｉ）セントラルドメインに対応する部分配列が、大腸菌、アシドバクテリア門、または、プロテオバクテリア門由来の部分配列であり、
（ｉｉｉ）3’メジャードメインに対応する部分配列が、大腸菌、バクテロイデテス門、ジェマティモナス門、ニトロスピラ門、アシドバクテリア門、プロテオバクテリア門、または、アシディチオバチリア門由来の部分配列であり、かつ、
（ｉｖ）3’マイナードメインに対応する部分配列が、大腸菌、ジェマティモナス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、または、ファーミキューテス門由来の部分配列である、遺伝子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、下記(ｉ’)〜(ｉｖ’)の少なくとも一つの特徴を有する、遺伝子：
（ｉ’）5’ドメインに対応する部分配列が、配列番号11〜49のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における5’ドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、5’ドメインの機能を担保する塩基配列であるか、
（ｉｉ’）セントラルドメインに対応する部分配列が、配列番号50〜88のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子におけるセントラルドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、セントラルドメインの機能を担保する塩基配列であるか、
（ｉｉｉ’）3’メジャードメインに対応する部分配列が、配列番号89〜129のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における3’メジャードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、3’メジャードメインの機能を担保する塩基配列であるか、または、
（ｉｖ’）3’マイナードメインに対応する部分配列が、配列番号130〜175のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における3’マイナードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、3’マイナードメインの機能を担保する塩基配列である。
【請求項６】
請求項５に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
前記部分配列のうち３つが大腸菌由来16SリボソーマルRNA遺伝子の部分配列であり、残り１つの部分配列が(ｉ’)〜(ｉｖ’)のいずれかの部分配列である、遺伝子。
【請求項７】
配列番号176〜187、212〜226のいずれかに示される塩基配列からなる非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
下記(ｉ’’)〜(ｉｖ’’)の部分配列を有する、遺伝子：
（ｉ’’）5’ドメインに対応する部分配列が、配列番号194,195,または、196のいずれかに示されるガンマプロバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子の5’ドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、5’ドメインの機能を担保する塩基配列であり、
（ｉｉ’’）セントラルドメインに対応する部分配列が、配列番号191、192、もしくは、195のいずれかに示されるガンマプロテオバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子、または、配列番号200、201、もしくは、204のいずれかに示されるベータプロテオバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子のセントラルドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、セントラルドメインの機能を担保する塩基配列であり、
（ｉｉｉ’’）3’メジャードメインに対応する部分配列が、配列番号191、194、または、195のいずれかに示されるガンマプロバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子の3’メジャードメイン領域の塩基、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、3’メジャードメインの機能を担保する塩基配列であり、かつ、
（ｉｖ’’）3’マイナードメインに対応する部分配列が、配列番号194、195、もしくは、196のいずれかに示されるガンマプロバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子、または、配列番号204に示されるベータプロテオバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子の3’マイナードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、3’マイナードメインの機能を担保する塩基配列である。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、翻訳機能を有する遺伝子。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のうち、アンチシャインダルガーノ配列を改変した直交型翻訳系においても翻訳機能を有する16SリボソーマルRNA遺伝子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の作製方法であって、
16SリボソーマルRNA遺伝子における5’ドメイン、セントラルドメイン、3’メジャードメイン、または、3’マイナードメインに対応する４つの部分配列を連結させる工程であって、少なくとも２つ以上の異なる微生物由来の部分配列を連結する工程、
を含む作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子によりコードされる非天然型16SリボソーマルRNA。
【請求項１３】
請求項１２に記載の非天然型16SリボソーマルRNAを含むリボソーム30Sサブユニット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のリボソーム30Sサブユニットを含む70Sリボソーム。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
請求項１６に記載の形質転換体を用いて、タンパク質を発現させる工程を含む、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子及びその作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボソームはあらゆる生物の生体内において翻訳の機能を担っている重要な分子である。リボソームは、リボソーマルRNAとリボソーマル蛋白質とが複雑に相互作用した構造をとっているため(非特許文献１)、リボソーマルRNAとその周辺の蛋白質は共進化してきたと考えられてきた(非特許文献２)。すなわち、リボソームを構成する成分は、種に固有で、生物種間を超えて遺伝子の伝達が起きない、すなわち水平伝播しない分子と考えられており、16SリボソーマルRNA遺伝子の配列は、生物の進化系統解析の分子マーカーとして利用されてきた(非特許文献３)。このように機能を維持する上で、水平伝播のような大規模な変異を受け付けないと考えられてきたリボソームであるが、最近、大腸菌の16SリボソーマルRNA遺伝子の全長配列を、他の微生物由来のものに置換することが可能なことが報告されている(特許文献１及び非特許文献４)。さらには、特許文献１及び非特許文献４記載の方法によれば、16SリボソーマルRNA遺伝子の種類によっては、異種生物のものと置換することにより、リボソームの翻訳機能が向上する可能性があることも示されている。一方、翻訳活性を向上させる方法などは多様で、合理的な方法は確立されていない。そのため、翻訳活性の高いリボソームの創成には、大規模な変異リボソームライブラリーを創成し、その中から求める機能に適した変異リボソームを選択する方法が適している。リボソームの改変手段としては、リボソームを構成する各成分(RNAあるいは蛋白質)の配列を変えることにより達成されるが、リボソームの成分は数十に登るため、改変手段も無数に存在する。そうした中、簡便な方法で多様な機能を生み出すには、リボソームの骨格分子である16SリボソーマルRNAや23SリボソーマルRNAなどを改変するのが有効である。16SリボソーマルRNAや23SリボソーマルRNAの改変方法としては、点突然変異を導入する方法も考えられるが、これらのRNAは二次構造を豊富に含むため点突然変異に対しては機能低下を招きやすい(非特許文献５)。一方、遺伝子を丸ごと別の生物のものに置き換える方法によれば、比較的機能を維持できることも最近明らかとなっている。しかし、遺伝子全体の置換の方法により機能性の16SリボソーマルRNAを取得できる効率は著しく低く、宿主の系統に比較的近縁な生物由来のものは受容されるものの、その範囲は限定的である(非特許文献４)。また、外来16SリボソーマルRNA遺伝子の由来も天然に存在するものを活用することに限定されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５９８４０８４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Steitz TA (2008) A structural understanding of the dynamic ribosome machine. Nature Rev Mol Cell Biol (9):242-253
【非特許文献２】Jain R, Rivera MC, Lake JA (1999) Horizontal gene transfer among genomes: The complexity hypothesis. Proc Natl Acad Sci USA 96(7):3801-3806.
【非特許文献３】Woese CR (1987) Bacterial evolution. Microbiol Rev 51(2):221‐271.
【非特許文献４】Kitahara K, Yasutake Y, Miyazaki K (2012) Mutational robustness of 16S ribosomal RNA, shown by experimental horizontal gene transfer in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 109(47):19220-19225.
【非特許文献５】O'Connor M, Goringer HU, Dahlberg AE (1992) A ribosomal ambiguity mutation in the 530 loop of E. coli 16S rRNA. Nucleic Acids Res (16):4221-4227.
【非特許文献６】Kaihang W, Heinz N, Sew YP, Jason WC (2007) Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nature Biotechnol (25):770‐777.
【非特許文献７】Sambrook JF, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Volume2, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、機能を有する変異リボソームを大規模に発生させる方法を開発することであり、そのために機能を有する16SリボソーマルRNA遺伝子の配列を拡張する技術を開発する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、発明者は、様々な生物種から16SリボソーマルRNA遺伝子を大規模に獲得し、それらをランダムに組換える方法、すなわちキメラ遺伝子を生成する方法を検討した。より具体的には、16SリボソーマルRNAのドメイン構造(5’ドメイン、セントラルドメイン、3’メジャードメイン、3’マイナードメイン、大腸菌16SリボソーマルRNAの塩基番号では、それぞれ1〜562塩基、563〜917塩基、918〜1394塩基、1395〜1542塩基に相当)に着目し、種々の生物由来のドメインを、並び順はそのままに、起源の異なる遺伝子断片をランダムに組換えることで天然には存在しない人工的なキメラ型16SリボソーマルRNA遺伝子を生成することを検討した。
【０００７】
そのために、分離された微生物のゲノムや環境ゲノムを鋳型にPCR法により16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片を取得し、それらをインビトロで連結した。こうして得られた非天然型のキメラ型16SリボソーマルRNA遺伝子を大腸菌に導入し、大腸菌宿主の生育相補試験により機能を有しているものを選抜し、生育相補株に含まれる16SリボソーマルRNA遺伝子の配列を確認することにより、非天然型のキメラ配列により生育を相補されていることを確認した。また、生育相補性以外のリボソーム機能の評価方法として、非特許文献６記載の直交型翻訳系を活用し、直交型翻訳系により特異的に翻訳されるレポーター遺伝子に由来する翻訳産物(蛋白質)の有無を指標に、非天然型のキメラ型16SリボソーマルRNAの翻訳機能を確認した。
【０００８】
すなわち本発明は以下の発明を包含する。
本発明の一態様は、
〔１〕非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
前記遺伝子は、5’ドメイン、セントラルドメイン、3’メジャードメイン、または、3’マイナードメインに対応する４つの部分配列を含み、
前記部分配列が、少なくとも２つ以上の異なる微生物由来の部分配列である、遺伝子に関する。
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
前記微生物由来の部分配列の少なくとも一つが大腸菌由来であり、残りの部分配列が単離された微生物のゲノムに由来することを特徴とする。
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
前記微生物由来の部分配列の少なくとも一つが大腸菌由来であり、残りの部分配列が環境ゲノムに由来することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
（ｉ）5’ドメインに対応する部分配列が、大腸菌、または、ガンマプロテオバクテリア綱由来の部分配列であり、
（ｉｉ）セントラルドメインに対応する部分配列が、大腸菌、アシドバクテリア門、または、プロテオバクテリア門由来の部分配列であり、
（ｉｉｉ）3’メジャードメインに対応する部分配列が、大腸菌、バクテロイデテス門、ジェマティモナス門、ニトロスピラ門、アシドバクテリア門、プロテオバクテリア門、または、アシディチオバチリア門由来の部分配列であり、かつ、
（ｉｖ）3’マイナードメインに対応する部分配列が、大腸菌、ジェマティモナス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、または、ファーミキューテス門由来の部分配列である、ことを特徴とする。
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、下記(ｉ’)〜(ｉｖ’)の少なくとも一つの特徴を有することを特徴とする：
（ｉ’）5’ドメインに対応する部分配列が、配列番号11〜49のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における5’ドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、5’ドメインの機能を担保する塩基配列であるか、
（ｉｉ’）セントラルドメインに対応する部分配列が、配列番号50〜88のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子におけるセントラルドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、セントラルドメインの機能を担保する塩基配列であるか、
（ｉｉｉ’）3’メジャードメインに対応する部分配列が、配列番号89〜129のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における3’メジャードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、3’メジャードメインの機能を担保する塩基配列であるか、または、
（ｉｖ’）3’マイナードメインに対応する部分配列が、配列番号130〜175のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における3’マイナードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、3’マイナードメインの機能を担保する塩基配列である。
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔５〕に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、
前記部分配列のうち３つが大腸菌由来16SリボソーマルRNA遺伝子の部分配列であり、残り１つの部分配列が(ｉ’)〜(ｉｖ’)のいずれかの部分配列である、ことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔７〕配列番号176〜187、212〜226のいずれかに示される塩基配列からなる非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子、であることを特徴とする。
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、下記(ｉ’’)〜(ｉｖ’’)の部分配列を有することを特徴とする：
（ｉ’’）5’ドメインに対応する部分配列が、配列番号194,195,または、196のいずれかに示されるガンマプロバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子の5’ドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、5’ドメインの機能を担保する塩基配列であり、
（ｉｉ’’）セントラルドメインに対応する部分配列が、配列番号191、192、もしくは、195のいずれかに示されるガンマプロテオバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子、または、配列番号200、201、もしくは、204のいずれかに示されるベータプロテオバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子のセントラルドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上の同一性を有する塩基配列であって、セントラルドメインの機能を担保する塩基配列であり、
（ｉｉｉ’’）3’メジャードメインに対応する部分配列が、配列番号191、194、または、195のいずれかに示されるガンマプロバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子の3’メジャードメイン領域の塩基、または、それらの塩基配列のいずれかと８５％以上の同一性を有する塩基配列であって、3’メジャードメインの機能を担保する塩基配列配列であり、かつ、
（ｉｖ’’）3’マイナードメインに対応する部分配列が、配列番号194、195、もしくは、196のいずれかに示されるガンマプロバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子、または、配列番号204に示されるベータプロテオバクテリア由来16SリボソーマルRNA遺伝子の3’マイナードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと８５％以上の同一性を有する塩基配列であって、3’マイナードメインの機能を担保する塩基配列である。
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子であって、翻訳機能を有することを特徴とする。
また、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、
〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕に記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のうち、アンチシャインダルガーノ配列を改変した直交型翻訳系においても翻訳機能を有することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明は、別の態様において、
〔１１〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の作製方法であって、
16SリボソーマルRNA遺伝子における5’ドメイン、セントラルドメイン、3’メジャードメイン、または、3’マイナードメインに対応する４つの部分配列を連結させる工程であって、少なくとも２つ以上の異なる微生物由来の部分配列を連結する工程
を含む作製方法に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１２〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子によりコードされる非天然型16SリボソーマルRNAに関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１３〕上記〔１２〕に記載の非天然型16SリボソーマルRNAを含むリボソーム30Sサブユニットに関する。
【００１２】
また、本発明は、別の態様において、
〔１４〕上記〔１３〕に記載のリボソーム30Sサブユニットを含む70Sリボソームに関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１５〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を含む、ベクターに関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１６〕上記〔１５〕に記載のベクターにより形質転換された形質転換体に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１７〕上記〔１６〕に記載の形質転換体を用いて、異種タンパク質を発現させる工程を含む、異種タンパク質の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明で開発された非天然型の16SリボソーマルRNA遺伝子を用いることにより、新規機能の大腸菌株を取得することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205のベクターマップ。
【図２】大腸菌16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY201のベクターマップ。
【図３】大腸菌16SリボソーマルRNAの４つのドメインのうち、5’ドメインを置換することにより生成される非天然型(キメラ型)16SリボソーマルRNA。生育が確認された16SリボソーマルRNAに含まれる異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を棒グラフで示している。縦軸が配列数を示し、横軸が系統起源を示している。
【図４】大腸菌16SリボソーマルRNAの４つのドメインのうち、セントラルドメインを置換することにより生成される非天然型(キメラ型)16SリボソーマルRNA。生育が確認された16SリボソーマルRNAに含まれる異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を棒グラフで示している。縦軸が配列数を示し、横軸が系統起源を示している。
【図５】大腸菌16SリボソーマルRNAの４つのドメインのうち、3’メジャードメインを置換することにより生成される非天然型(キメラ型)16SリボソーマルRNA。生育が確認された16SリボソーマルRNAに含まれる異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を棒グラフで示している。縦軸が配列数を示し、横軸が系統起源を示している。
【図６】大腸菌16SリボソーマルRNAの４つのドメインのうち、3’マイナードメインを置換することにより生成される非天然型(キメラ型)16SリボソーマルRNA。生育が確認された16SリボソーマルRNAに含まれる異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を棒グラフで示している。縦軸が配列数を示し、横軸が系統起源を示している。
【図７】＜実施例２＞で作製した非天然型(キメラ型)16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメインの供給源となった16SリボソーマルRNA遺伝子の表。左の列はサンプル名を表している。最も類似する菌株名の配列と配列相同性及び遺伝子の取得源を記載している。機能相補株とあるものは、16SリボソーマルRNA遺伝子の全長機能相補実験によって得られた配列、研究室保有株は研究室で保存していた配列、NITEは製品評価技術基盤機構より入手した配列である。
【図８】直交型変異16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMS205A4*のベクターマップ。
【図９】シャインダルガーノ配列が改変された緑色蛍光蛋白質の発現プラスミドpJ29b*A4(アンピシリン耐性、ColE1 ori)のベクターマップ。
【図１０】７種類のベータプロテオバクテリアと８種類のガンマプロテオバクテリアの各ドメインを元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の全長の系統樹(近隣接合法により作成)。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図１１】７種類のベータプロテオバクテリアと８種類のガンマプロテオバクテリア由来の16SリボソーマルRNA遺伝子から調製したドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のドメインの帰属表。
【図１２】７種類のベータプロテオバクテリアと８種類のガンマプロテオバクテリア由来の16SリボソーマルRNA遺伝子から調製したドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の5’ドメインの系統樹(近隣接合法により作成)。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図１３】７種類のベータプロテオバクテリアと８種類のガンマプロテオバクテリア由来の16SリボソーマルRNA遺伝子から調製したドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のセントラルドメインの系統樹(近隣接合法により作成)。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図１４】７種類のベータプロテオバクテリアと８種類のガンマプロテオバクテリア由来の16SリボソーマルRNA遺伝子から調製したドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の3’メジャードメインの系統樹(近隣接合法により作成)。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図１５】７種類のベータプロテオバクテリアと８種類のガンマプロテオバクテリア由来の16SリボソーマルRNA遺伝子から調製したドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の3’マイナードメインの系統樹(近隣接合法により作成)。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図１６】本実験の概要［１］。環境ゲノムから得られた16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン断片を元に非天然型16SリボソーマルRNAを作製する手法。
【図１７】本実験の概要［２］。16SリボソーマルRNA遺伝子のドメイン置換実験で相補が確認された16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン断片を元に非天然型16SリボソーマルRNAを作製する手法。
【図１８】生育が確認された非天然型16SリボソーマルRNAに含まれる5’ドメインにおける異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を棒グラフで示している。縦軸が配列数を示し、横軸が系統起源を示している。
【図１９】生育が確認された非天然型16SリボソーマルRNAに含まれるセントラルドメインにおける異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を棒グラフで示している。縦軸が配列数を示し、横軸が系統起源を示している。
【図２０】生育が確認された非天然型16SリボソーマルRNAに含まれる3’メジャードメインにおける異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を棒グラフで示している。縦軸が配列数を示し、横軸が系統起源を示している。
【図２１】生育が確認された非天然型16SリボソーマルRNAに含まれる3’マイナードメインにおける異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を棒グラフで示している。縦軸が配列数を示し、横軸が系統起源を示している。
【図２２】得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の全長の配列に最も類似する菌株名の配列と類似率の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図２３】得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の5’ドメインの配列に最も類似する菌株名の配列と同一性の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図２４】得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のセントラルドメインの配列に最も類似する菌株名の配列と同一性の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図２５】得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の3’メジャードメインの配列に最も類似する配列の菌株名と同一性の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図２６】得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の3’マイナードメインの配列に最も類似する配列の菌株名と同一性の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図２７】機能相補が確認された各ドメイン断片及びメタゲノムから直接増幅した各ドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の全長における近隣接合法により作成した系統樹。MGが＜実施例３＞［１］を元に作成したもので、AUが＜実施例３＞［２］を元に作成したものである。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図２８】機能相補が確認された各ドメイン断片及びメタゲノムから直接増幅した各ドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の5’ドメインの系統樹(近隣接合法により作成)。MGが＜実施例３＞［１］を元に作成したもので、AUが＜実施例３＞［２］を元に作成したものである。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図２９】元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のセントラルドメインの系統樹(近隣接合法により作成)。MGが＜実施例３＞［１］を元に作成したもので、AUが＜実施例３＞［２］を元に作成したものである。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図３０】機能相補が確認された各ドメイン断片及びメタゲノムから直接増幅した各ドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の3’メジャードメインの系統樹(近隣接合法により作成)。MGが＜実施例３＞［１］を元に作成したもので、AUが＜実施例３＞［２］を元に作成したものである。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図３１】機能相補が確認された各ドメイン断片及びメタゲノムから直接増幅した各ドメイン断片を元に作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の3’マイナードメインの系統樹(近隣接合法により作成)。MGが＜実施例３＞［１］を元に作成したもので、AUが＜実施例３＞［２］を元に作成したものである。外群にはT.thermophilusの16SリボソーマルRNA遺伝子配列を用いている。
【図３２】各種の遺伝子における各蛍光蛋白質の蛍光強度。縦軸は相対蛍光強度。横軸はGFPの遺伝子配列のタイプ。
【図３３】各形質転換体におけるGFP/Sceに対する蛍光強度。縦軸は相対蛍光強度。横軸はクローン名。Sce_Mac1〜6が＜実施例１＞(１)の培養した菌体から抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子で、Sce_MG1〜5が＜実施例１＞(１)の土壌から直接抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子である。また、コントロールとなる大腸菌16SリボソーマルRNAを保持するクローンを単にCと表記した。
【図３４】各形質転換体におけるGFP/Bsuに対する蛍光強度。縦軸は相対蛍光強度。横軸はクローン名。 Bsu_Mac1〜6が＜実施例１＞(１)の培養した菌体から抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子で、Bsu_MG1〜5が＜実施例１＞(１)の土壌から直接抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子である。また、コントロールとなる大腸菌16SリボソーマルRNAを保持するクローンを単にCと表記した。
【図３５】各形質転換体におけるGFP/Hsaに対する蛍光強度。縦軸は相対蛍光強度。横軸はクローン名。 Hsa_Mac1〜6が＜実施例１＞(１)の培養した菌体から抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子で、Hsa_MG1〜5が＜実施例１＞(１)の土壌から直接抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子である。また、コントロールとなる大腸菌16SリボソーマルRNAを保持するクローンを単にCと表記した。
【図３６】各形質転換体におけるGFP/Treに対する蛍光強度。縦軸は相対蛍光強度。横軸はクローン名。 Tre_Mac1〜6が＜実施例１＞(１)の培養した菌体から抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子で、Tre_MG1〜5が＜実施例１＞(１)の土壌から直接抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子である。また、コントロールとなる大腸菌16SリボソーマルRNAを保持するクローンを単にCと表記した。
【図３７】各形質転換体におけるGFP/Abiに対する蛍光強度。縦軸は相対蛍光強度。横軸はクローン名。 Abi_Mac1〜6が＜実施例１＞(１)の培養した菌体から抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子で、Abi_MG1〜5が＜実施例１＞(１)の土壌から直接抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子である。また、コントロールとなる大腸菌16SリボソーマルRNAを保持するクローンを単にCと表記した。
【図３８】各形質転換体におけるGFP/Scoに対する蛍光強度。縦軸は相対蛍光強度。横軸はクローン名。 Sco_Mac1〜6が＜実施例１＞(１)の培養した菌体から抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子で、Sco_MG1〜5が＜実施例１＞(１)の土壌から直接抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子である。また、コントロールとなる大腸菌16SリボソーマルRNAを保持するクローンを単にCと表記した。
【図３９】各形質転換体におけるGFP/Ecoに対する蛍光強度。縦軸は相対蛍光強度。横軸はクローン名。 Eco_Mac1〜6が＜実施例１＞(１)の培養した菌体から抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子で、Eco_MG1〜5が＜実施例１＞(１)の土壌から直接抽出したメタゲノムに由来する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子である。また、コントロールとなる大腸菌16SリボソーマルRNAを保持するクローンを単にCと表記した。
【図４０】下記＜実施例４＞において得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の全長の配列に最も類似する菌株名の配列と同一性の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図４１】下記＜実施例４＞において得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の5’ドメインの配列に最も類似する菌株名の配列と同一性の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図４２】下記＜実施例４＞において得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のセントラルドメインの配列に最も類似する配列の菌株名と同一性の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図４３】下記＜実施例４＞において得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の3’メジャードメインの配列に最も類似する菌株名の配列と同一性の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【図４４】下記＜実施例４＞において得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の3’マイナードメインの配列に最も類似する菌株名の配列と類似率の表。左の列の数字は配列番号を表している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
異種生物由来の16SリボソーマルRNA遺伝子とは、大腸菌以外の細菌に由来する16SリボソーマルRNA遺伝子を意味する。単離された微生物より得たゲノム由来の16SリボソーマルRNA遺伝子あるいは微生物培養を介さずに、環境試料より直接微生物ゲノムを調製し、環境試料より得たゲノム由来の16SリボソーマルRNA遺伝子である。
【００１６】
異種生物由来の16SリボソーマルRNA遺伝子の部分配列断片は、例えば、各ドメインに対応する、配列番号1〜8のプライマー対を用いてPCRを行うことにより得ることができる。配列番号1、2のプライマー対で5’ドメインを、配列番号3、4のプライマー対でセントラルドメインを、配列番号5、6のプライマー対で3’メジャードメインを、配列番号7、8のプライマー対で3’マイナードメインをそれぞれ増幅することができる。あるいは、異種生物由来のゲノムDNAから大腸菌由来の16SリボソーマルRNA遺伝子をプローブにしたハイブリダイゼーションにより得ることもできる。
【００１７】
上記のようにして得られた部分配列の断片を連結させることにより、本発明の非天然１６SリボソーマルRNA遺伝子を作製することができる。各部分配列を連結させる方法は、公知の方法により実施することができる。各部分配列を連結して構築し、非天然16SリボソーマルRNA遺伝子の機能を評価するために例えば、大腸菌株を用いることができる。本発明に用いることのできる大腸菌株としては、大腸菌自身の16SリボソーマルRNA遺伝子が欠損し、その代わりに異種生物由来の16SリボソーマルRNA遺伝子に導入されているものが好ましい。
16SリボソーマルRNA遺伝子はもともと大腸菌には７コピー存在するが、外来の16SリボソーマルRNAの機能評価を行う際には、自身の16SリボソーマルRNA遺伝子を欠損した大腸菌を用い、生育相補性から判断することが可能である。その際、自身(大腸菌)の16SリボソーマルRNA遺伝子を含むプラスミドなどで生育を補うと同時に、該プラスミドにカウンターセレクションマーカーを含ませておき、外来性の16SリボソーマルRNA遺伝子で機能相補させる際に、同時に脱落せしめればよい。カウンターセレクションマーカーとしては、例えば、sacB遺伝子などを用い、ショ糖を含む培地で培養することによりsacB遺伝子とともに大腸菌由来の16SリボソーマルRNA遺伝子を含むベクターを脱落させることができる。
【００１８】
選択された変異株において導入された16SリボソーマルRNA遺伝子の配列を決定することにより、各ドメインにおいてどの微生物種の16SリボソーマルRNA遺伝子断片が機能的であるかを知ることができる。
あるいは、16SリボソーマルRNA遺伝子の欠損株を用いずに、大腸菌自身の16SリボソーマルRNA遺伝子を保持したまま、人工キメラ16SリボソーマルRNAの翻訳機能を検出できる直交型翻訳系を用いてもよい。より具体的には、非特許文献５にある通り、16SリボソーマルRNA遺伝子の3’末端に位置するアンチシャインダルガーノ配列をピリミジン(シトシン及びチミン)に富んだ配列からプリン(アデニン及びグアニン)に富んだ配列へと変更し、一方蛋白質をコードするメッセンジャーRNAのシャインダルガーノ配列をプリン(アデニン及びグアニン)に富んだ配列からピリミジン(シトシン及びチミン)に富んだ配列へと変更することにより、大腸菌の本来の蛋白質をコードするメッセンジャーRNAと干渉することなく、直交型のメッセンジャーRNAと直交型の16SリボソーマルRNA遺伝子との間の特異的な相互作用のもと翻訳反応を行わせしめることができる。
【００１９】
本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、大腸菌由来の16SリボソーマルRNA遺伝子をベースとして、当該16SリボソーマルRNA遺伝子に含まれる４つの部分配列のうち、１つ、２つ、３つ、４つを大腸菌以外の生物由来の16SリボソーマルRNA遺伝子の部分配列と置換することができる。
【００２０】
5’ドメインを置換可能な生物としては、例えば、ガンマプロテオバクテリア綱に帰属される細菌を挙げることができる。
セントラルドメインを置換可能な生物としては、例えば、アシドバクテリア門、プロテオバクテリア門(例えば、アルファプロテオバクテリア綱、ベータプロテオバクテリア綱、ガンマプロテオバクテリア綱、デルタプロテオバクテリア綱)に帰属される細菌を挙げることができる。好ましい実施の形態としては、ベータプロテオバクテリア綱、ガンマプロテオバクテリア綱に属する細菌を挙げることができる。
3’メジャードメインを置換可能な生物としては、例えば、バクテロイデテス門、ジェマティモナス門、ニトロスピラ門、アシドバクテリア門、プロテオバクテリア門(例えば、アルファプロテオバクテリア綱、ベータプロテオバクテリア綱、ガンマプロテオバクテリア綱、デルタプロテオバクテリア綱)、アシディチオバチリア門に帰属される細菌を挙げることができる。好ましい実施の形態としては、ガンマプロテオバクテリア綱に属する細菌を挙げることができる。
3’マイナードメインを置換可能な生物としては、例えば、ジェマティモナス門、プロテオバクテリア門(例えば、アルファプロテオバクテリア綱、ベータプロテオバクテリア綱、ガンマプロテオバクテリア綱、デルタプロテオバクテリア綱)、アクチノバクテリア門、ファーミキューテス門に帰属される細菌を挙げることができる。好ましい実施の形態としては、ベータプロテオバクテリア綱、ガンマプロテオバクテリア綱に属する細菌を挙げることができる。
【００２１】
本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の各部分配列は、例えば、下記のように記載することもできる：
（ｉ’）5’ドメインに対応する部分配列が、配列番号11〜49のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における5’ドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと８５％以上(好ましくは、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)の同一性を有する塩基配列であって、5’ドメインの機能を担保する塩基配列である、
（ｉｉ’）セントラルドメインに対応する部分配列が、配列番号50〜88のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子におけるセントラルドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上(好ましくは、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)の同一性を有する塩基配列であって、セントラルドメインの機能を担保する塩基配列である、
（ｉｉｉ’）3’メジャードメインに対応する部分配列が、配列番号89〜129のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における3’メジャードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上(好ましくは、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)の同一性を有する塩基配列であって、3’メジャードメインの機能を担保する塩基配列である、または、
（ｉｖ’）3’マイナードメインに対応する部分配列が、配列番号130〜175のいずれかに示される16SリボソーマルRNA遺伝子における3’マイナードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上(好ましくは、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)の同一性を有する塩基配列であって、3’マイナードメインの機能を担保する塩基配列である。
すなわち、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の各部分配列の少なくとも一つを、上記(ｉ’)〜(ｉｖ’)で示すことができる。
【００２２】
ここで、大腸菌の16SrRNA遺伝子の塩基配列において、5’ドメイン領域は、以下の範囲に限定されないが、例えば、1〜561位塩基配列で特定することができる。本明細書において、「5’ドメインに対応する部分配列」または「5’ドメイン領域の塩基配列」というとき、大腸菌の16SrRNA遺伝子における5’ドメインを担保する塩基配列、または、他の微生物の16SrRNA遺伝子において当該領域に相当する塩基配列をいう。
また、以下の範囲に限定されないが、例えば、大腸菌の16SrRNA遺伝子の塩基配列において、セントラルドメイン領域は562-917位の塩基配列で特定され、3’メジャードメインは918〜1394位の塩基配列で特定され、3’マイナードメインは1395〜1542位の塩基配列で特定することができる。本明細書において「セントラルドメインに対応する部分配列」、「3’メジャードメインに対応する部分配列」、「3’マイナードメインに対応する部分配列」、「セントラルドメイン領域の塩基配列」、「3’メジャードメイン領域の塩基配列」、または、「3’マイナードメイン領域の塩基配列」というとき、「5’ドメイン領域の塩基配列」と同様に、大腸菌16SrRNAにおいて各ドメインを担保する領域の塩基配列、または、他の微生物の16SrRNAにおいて当該領域に相当する塩基配列、と理解することができる。
上述のように、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、部分配列の３つが大腸菌由来であり、残りの１つを大腸菌以外の生物由来の部分配列と置換したものを含む。このような、非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子としては、好ましい一実施の形態において、配列番号176〜187、212〜226のいずれかに示される塩基配列により特定される遺伝子である。
また、本明細書において、「5’ドメインの機能を担保する塩基配列」とは、他の生物由来のセントラルドメイン、3’メジャードメイン、3’マイナードメインとの組み合わせにおいて、16SリボソーマルRNAの機能、すなわち、他のリボソームサブユニットとリボソームを構成した際に、mRNAからタンパク質を翻訳する機能を発揮できるものをいう。「セントラルドメインの機能を担保する塩基配列」、「3’メジャードメインの機能を担保する塩基配列」、「3’マイナードメインの機能を担保する塩基配列」も他の生物由来の各ドメインとの組み合わせにおいて同様の機能を発揮できることをいう。
【００２３】
上述のように、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子は、一実施の形態において、部分配列すべてが大腸菌以外の生物由来の部分配列である。
部分配列のすべてが、大腸菌以外の生物由来である非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の好ましい一実施の形態として、例えば、下記(ｉ’’)〜(ｉｖ’’)の部分配列を含む非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を挙げることができる：
（ｉ’’）5’ドメインに対応する部分配列が、配列番号194,195,または、196のいずれかに示されるガンマプロバクテリア(Gamma_5,6,7)由来16SリボソーマルRNA遺伝子の5’ドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上(好ましくは、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)の同一性を有する塩基配列であって、5’ドメインの機能を担保する塩基配列であり、
（ｉｉ’’）セントラルドメインに対応する部分配列が、配列番号191、192、もしくは、195のいずれかに示されるガンマプロテオバクテリア(Gamma_2,3,6)由来16SリボソーマルRNA遺伝子、または、配列番号200、201、もしくは、204のいずれかに示されるベータプロテオバクテリア(Beta_3,4,7)由来16SリボソーマルRNA遺伝子のセントラルドメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上(好ましくは、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)の同一性を有する塩基配列であって、セントラルドメインの機能を担保する塩基配列であり、
（ｉｉｉ’’）3’メジャードメインに対応する部分配列が、配列番号191、194、または、195のいずれかに示されるガンマプロバクテリア(Gamma_2,5,6)由来16SリボソーマルRNA遺伝子の3’メジャードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上(好ましくは、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)の同一性を有する塩基配列であって、3’メジャードメインの機能を担保する塩基配列であり、かつ、
（ｉｖ’’）3’マイナードメインに対応する部分配列が、配列番号194、195、もしくは、196のいずれかに示されるガンマプロバクテリア(Gamma_5,6,7)由来16SリボソーマルRNA遺伝子、または、配列番号204に示されるベータプロテオバクテリア(Beta_7)由来16SリボソーマルRNA遺伝子の3’マイナードメイン領域の塩基配列、または、それらの塩基配列のいずれかと85％以上(好ましくは、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％以上)の同一性を有する塩基配列であって、3’マイナードメインの機能を担保する塩基配列である。
【００２４】
本発明の非天然16SリボソーマルRNA遺伝子は、下記実施例に示される生育相補性や直交翻訳系によりその機能を評価することができる。なお、非天然16SリボソーマルRNA遺伝子と大腸菌16SリボソーマルRNAとを置き換えることを目的とする場合には、生育相補性で機能を評価することが好ましい。また、形質転換体(例えば、大腸菌)の生育については自身の16SリボソーマルRNAで担保しつつ、新たな翻訳系をゲノム由来の遺伝子と干渉しない形で組み込むことを目標とする場合には、直交翻訳系により評価することが好ましい。
【００２５】
本発明は、別の態様において、上記の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子によりコードされる非天然型16SリボソーマルRNAを提供する。当該非天然型16SリボソーマルRNAは、本発明の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子をコードする塩基配列を用いることで、公知の方法により合成することができる。例えば、当該非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の塩基配列を含むベクターを用いて大腸菌を形質転換することにより、当該大腸菌内において非天然型16SリボソーマルRNAを合成することができる。
ここで、当業者であれば、非天然型16SリボソーマルRNAを含むリボソーム30Sサブユニットや、当該リボソーム30Sサブユニットを含む70Sリボソームも提供できることが理解される。
【００２６】
また、本発明は、非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を含むベクターにより形質転換された形質転換体において、タンパク質(好ましくは、形質転換体に対する異種タンパク質)を発現させることができる。好ましい実施の形態においては、非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を用いることにより、向上した翻訳の効率でタンパク質の発現、製造を行うことができる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明の実施例を説明するが、ここで挙げる実施例は単なる具体的例示に過ぎず、本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。
実施例は＜実施例１＞〜＜実施例４＞まで示しており、＜実施例１＞は大腸菌16SリボソーマルRNA遺伝子中の４つのドメインのうちの一つのドメインを置換して得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のうち、生育機能を相補する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の取得について記載してある。また、＜実施例２＞は一度全長配列として分離された16SリボソーマルRNA遺伝子を複数用意し、それらをドメインに分割し、再度ランダムに連結することよって復元される非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子に関する。機能の評価方法としては、直交型翻訳系を用いている。＜実施例３＞は一度全長の16SリボソーマルRNA遺伝子を調製せずに、環境ゲノムから直接各ドメインを取得し、それらをランダムに連結することにより得た非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のうち、生育機能を相補する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子について記載してある。＜実施例４＞は配列供給源を環境ゲノムから取得した16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン以外に、環境試料をマッコンキープレートに播種し、該選択培地上に生育した菌体から取得した16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメインを用い、ランダムに連結することよって復元される非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の直交型翻訳系を用いた翻訳活性の定量的な評価についてである。
【００２８】
＜実施例１＞大腸菌16SリボソーマルRNA遺伝子中の四つのドメインのうちの一つのドメインを置換して得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の創成：生育機能相補性に基づく機能性非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のスクリーニング
（１）環境試料からのメタゲノム由来16SリボソーマルRNA遺伝子の調製
茨城県つくば市国立研究開発法人産業技術総合研究所敷地内にて採取した土壌より環境ゲノムDNAを調製した。ゲノム抽出の際には、土壌試料約2gよりExtrap Soil DNA Plus ver.2(日鉄住金環境株式会社製)を使用し、キットマニュアルに従いゲノムDNA約8mg(100μL)を取得した。
16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメインの増幅には、配列番号1〜8のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。各微生物由来の染色体DNAを鋳型として使用し、配列番号1、2のプライマー対で5’ドメインを、配列番号3、4のプライマー対でセントラルドメインを、配列番号5、6のプライマー対で3’メジャードメインを、配列番号7、8のプライマー対で3’マイナードメインをそれぞれPCR法により増幅した。反応溶液(総量25μL)は、終濃度1x PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡社製)、各0.2mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP(以上、東洋紡社製)、各25pmolプライマー、1μLゲノムDNA(約80ng)、0.5ユニット KOD FX Neo(東洋紡社製)を含む。本溶液を94℃ 2分間の保温後、98℃ 10秒、48℃ 30秒、68℃ 1分の温度サイクルを30回繰り返し、最後に68℃で5分間保温した。得られたPCR産物を定法に従いアガロースゲル電気泳動により分離し、日本ジェネティクス社製のDNA精製キット(FastGene Gel/PCR Extraction Kit)を用いてマニュアルに従って精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００２９】
（２）異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205の調製
異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターであるpMY205(図１)(トリメトプリム耐性、pACYC ori、大腸菌リボソーマルRNA[rrnB]オペロン、tRNA遺伝子を含む)の増幅には、配列番号2〜7、9及び10のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。大腸菌rrnBオペロン含有環状pMY205を鋳型として、配列番号9、3のプライマー対で5’ドメインを除く領域を、配列番号2、5のプライマー対でセントラルドメインを除く領域を、配列番号4、7のプライマー対で3’メジャードメインを除く領域を、配列番号6、10のプライマー対で3’マイナードメインを除く領域をそれぞれPCR法により増幅した。
PCR条件は以下の通りである。反応溶液(総量25μL)は、終濃度1x PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡社製)、各0.2mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP(以上、東洋紡社製)、各25pmolプライマー、1μLゲノムDNA(約80ng)、0.5ユニットKOD FX Neo(東洋紡社製)を含む。本溶液を94℃ 2分間の保温後、98℃ 10秒、68℃ 5分の温度サイクルを30回繰り返し、最後に68℃で3分間保温した。各反応後溶液に制限酵素Dpn I(NEB社製)を0.5μL加え、37℃で終夜保温した。その後、得られたPCR産物を定法に従いアガロースゲル電気泳動により分離し、日本ジェネティクス社製のDNA精製キット(FastGene Gel/PCR Extraction Kit)を用いてマニュアルに従って精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００３０】
（３）異種16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメインのクローニング
上記(１)及び(２)で得られた16SリボソーマルRNA断片と異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205をNEB社製のクローニングキット(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)を用いて連結した。反応溶液(総量20μL)は10μLの2x NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix、2μLの16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン断片、2μLの16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205、6μLの蒸留水を含む。本溶液を50℃で60分間保温した。その溶液の全量を大腸菌JM109株に形質転換により導入し、寒天培地上に生育してきたコロニー約4000個をかき集め、RBC Bioscience社製のプラスミド抽出キット(HiYield Plasmid Mini Kit)を用いて、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。その溶液の一部を分取し、大腸菌Δ7株(大腸菌の染色体上の７つのrrnオペロンを全て欠失し、大腸菌rrnBオペロンを発現するpMY201(図２)(アンピシリン耐性、pACYC ori)を保持する株)を形質転換した。pMY201にはBacillus subtilis由来のsacB遺伝子がコードされており、ショ糖含有培地で選択することでプラスミドを脱落させることが可能である。
【００３１】
（４）異種由来16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメインを含む宿主株の創成〈異種16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメインを含むプラスミドpMY205を含む変異株の創成〉
まず、形質転換体を、10μg/mLトリメトプリム(和光純薬社製)を含むLB Lennox寒天培地((1％ トリプトン、0.5％ 酵母エキス、0.5％ 塩化ナトリウム)LB培地、寒天ともにメルク社製)上に播種した。次に、寒天培地上に生育してきたコロニー約4000個をかき集め、2mL LB培地に懸濁後、その一部を10μg/mLトリメトプリム及び5％ショ糖(和光純薬社製)を含むLB寒天培地上に再度播種した。37℃で一晩培養し、生育してきたコロニーを選抜した。各コロニーからプラスミドを精製し、16SリボソーマルRNAの置換ドメイン領域をシーケンス解析した結果、5’ドメインにおいて配列番号11〜49の配列を、セントラルドメインにおいて配列番号50〜88の配列を、3’メジャードメインにおいて配列番号89〜129の配列を、3’マイナードメインにおいては配列番号130〜175の配列を含む大腸菌変異株について生育が確認された。
なお、配列番号11〜175の塩基配列は、16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメインの増幅プライマーで挟まれた領域の遺伝子配列に対し、増幅プライマーを含む、増幅領域外側の配列は大腸菌由来の16SリボソーマルRNAの相同領域と組み合わせて表記してある。
【００３２】
16SリボソーマルRNAの４つのドメイン中の１つのドメインを置換することにより生成されるキメラ型16SリボソーマルRNAのうち、生育が確認された16SリボソーマルRNAに含まれる異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を(図３)〜(図６)に棒グラフで示している。
各ドメインの配列の起源生物は、5’ドメインではガンマプロテオバクテリア由来の16SリボソーマルRNAのみ相補が確認できた。一方、他のドメインでは全長16SリボソーマルRNAを置換したときには相補が確認されていない微生物由来であって、大腸菌に対してより遠縁かつ多様な微生物に由来する16SリボソーマルRNA遺伝子のドメインであっても大腸菌変異株の生育機能を相補できることが明らかとなった。特に3’メジャードメイン及び3’マイナードメインではこの傾向が顕著であった。
【００３３】
＜実施例２＞全長の16SリボソーマルRNA遺伝子を複数用意し、それらをドメインに分割し、再度ランダムに連結することよって復元される非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のうち、直交型翻訳系において機能を有する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の取得
上記＜実施例１＞では、大腸菌16SリボソーマルRNA遺伝子の四つのドメインのうち一つのみを異種生物由来の16SリボソーマルRNA遺伝子由来のドメインで置換した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を創成したが、本実施例では、一度全長配列として分離された複数の16SリボソーマルRNA遺伝子をドメインに分割し、ランダムに連結することよって復元される非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の創成方法に関する。また機能選択には、上記＜実施例１＞に記載の大腸菌の生育相補性ではなく、直交型翻訳系を用いた蛍光蛋白質をレポーター遺伝子にした蛋白質合成活性を指標とした。
【００３４】
（１）非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の作製
16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片の供給源は配列番号190〜204に示す環境ゲノムや製品評価技術基盤機構より入手した様々な微生物ゲノム由来の16SリボソーマルRNA遺伝子を用いた。これらの配列に最も類似する微生物名及び配列の入手源を(図７)に示した。なお、製品評価技術基盤機構から入手したゲノムに関してはカタログ番号も併記している。また、系統関係を配列番号190〜204(図１０)に示している。配列番号190〜197がガンマプロテオバクテア、配列番号198〜204がベータプロテオバクテリアに由来する16SリボソーマルRNA遺伝子であり、それぞれ順にgamma_1〜gamma_8、beta_1〜beta_7と名付けた。
【００３５】
16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメインの増幅には、配列番号1〜8のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。配列番号198〜204の配列を鋳型として使用し、配列番号1、2のプライマー対で5’ドメインを、配列番号3、4のプライマー対でセントラルドメインを、配列番号5、6のプライマー対で3’メジャードメインを、配列番号7、8のプライマー対で3’マイナードメインをそれぞれPCR法により増幅した。反応溶液(総量25μL)は、終濃度1x PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡社製)、各0.2mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP(以上、東洋紡社製)、各25pmolプライマー、1μLゲノムDNA(約80ng)、0.5ユニット KOD FX Neo(東洋紡社製)を含む。本溶液を94℃ 2分間の保温後、98℃ 10秒、48℃ 30秒、68℃ 1分の温度サイクルを30回繰り返し、最後に68℃で5分間保温した。得られたPCR産物を定法に従いアガロースゲル電気泳動により分離し、日本ジェネティクス社製のDNA精製キット(FastGene Gel/PCR Extraction Kit)を用いてマニュアルに従って精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００３６】
（２）異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205の調製
異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターであるpMY205(トリメトプリム耐性、pACYC ori、大腸菌リボソーマルRNA[rrnB]オペロン、tRNA遺伝子を含む)の増幅には、配列番号9、10のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。大腸菌rrnBオペロン含有環状pMY205を鋳型として、配列番号9、10のプライマー対で16SリボソーマルRNA遺伝子の全長を除く領域をPCR法により増幅した。
PCR条件は以下の通りである。反応溶液(総量25μL)は、終濃度1x PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡社製)、各0.2mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP(以上、東洋紡社製)、各25pmolプライマー、1μLゲノムDNA(約80ng)、0.5ユニットKOD FX Neo(東洋紡社製)を含む。本溶液を94℃ 2分間の保温後、98℃ 10秒、68℃ 5分の温度サイクルを30回繰り返し、最後に68℃で3分間保温した。各反応後溶液に制限酵素Dpn I(NEB社製)を0.5μL加え、37℃で終夜保温した。その後、得られたPCR 産物を定法に従いアガロースゲル電気泳動により分離し、日本ジェネティクス社製のDNA精製キット(FastGene Gel/PCR Extraction Kit)を用いてマニュアルに従って精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００３７】
（３）アンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の作製
上記(１)で増幅した16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片と上記(２)で得られた異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205をNEB社製のクローニングキット(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)を用いて連結した。反応溶液(総量25μL)は15μLの2x NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix、2μLずつの16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン断片、2μLの16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205を含む。本溶液を50℃で60分間保温した。反応液の全量を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、37℃で一晩培養後に10μg/mlのトリメトプリムを含むLB寒天培地上に生育してきたコロニー約8000個をかき集め、RBC Bioscience社製のプラスミド抽出キット(HiYield Plasmid Mini Kit)を用いてプラスミドを精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
直交型翻訳系で機能させるためには、通常の翻訳系におけるメッセンジャーRNAのシャインダルガーノ配列と16SリボソーマルRNAのアンチシャインダルガーノ配列を入れ替得ることにより行う(非特許文献５)。この目的で、直交型翻訳系で機能する16SリボソーマルRNA遺伝子の増幅には、配列番号1、188のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。鋳型としては、上記(１)で作製した16SリボソーマルRNAライブラリーを使用した。反応溶液(総量25μL)は、終濃度1x PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡社製)、各0.2mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP(以上、東洋紡社製)、各25pmolプライマー1μL、上記で作製した16SリボソーマルRNAライブラリーDNA(約350ng)、0.5ユニットKOD FX Neo(東洋紡社製)を含む。本溶液を94℃ 2分間の保温後、98℃ 10秒、48℃ 30秒、68℃ 1分の温度サイクルを30回繰り返し、最後に68℃で5分間保温した。得られたPCR産物を定法に従いアガロースゲル電気泳動により分離し、日本ジェネティクス社製のDNA精製キット(FastGene Gel/PCR Extraction Kit)を用いてマニュアルに従って精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００３８】
（４）直交型16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMS205*A4の調製
直交型異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターであるpMS205*A4(図８)の増幅には、配列番号9、189のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。大腸菌rrnBオペロン含有環状pMS205*A4を鋳型として、配列番号9、189のプライマー対で16SリボソーマルRNA遺伝子の全長を除く領域をPCR法により増幅した。
【００３９】
（５）アンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子ライブラリーの作製
(３)で得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子と(４)で得られたアンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMS205*A4をNEB社製のクローニングキット(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)を用いて連結した。反応溶液(総量20μL)は10μLの2x NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix、2μLの非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子、2 Lの16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMS205*A4、6μLの蒸留水を含む。本溶液を50℃ 60分間保温した。反応液の全量を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、37℃で一晩培養後に10μg/mlのトリメトプリムを含むLB寒天培地上に生育してきたコロニー約8000個をかき集め、RBC Bioscience社製のプラスミド抽出キット(HiYield Plasmid Mini Kit)を用いてプラスミドを精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００４０】
（６）アンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子と蛍光蛋白質遺伝子を含む宿主株の創成
(５)で作製したライブラリーと蛍光蛋白質を発現するプラスミドによりJM109株を形質転換した。蛍光蛋白質を発現するプラスミドは緑色蛍光蛋白質を発現するプラスミドを用いた。緑色蛍光蛋白質の該発現プラスミドはDNA 2.0社製プラスミドpJ404を改変したpJ29b*A4(図９)(アンピシリン耐性、ColE1 ori、配列番号227)にシャインダルガーノ配列が改変された緑色蛍光蛋白質をコードする遺伝子をクローニングしたものである。
【００４１】
（７）アンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を含む宿主株による蛋白質発現
(６)で得た緑色蛍光蛋白質遺伝子の形質転換体のうち、蛍光を有するコロニー９個 (BG_1〜BG_9)、有さないコロニー各９個(BG_10〜BG_18)の16SリボソーマルRNA遺伝子の配列を調べ、各ドメインがどの配列に由来するかを調べた。その結果を(図１１)に記載し、全長の系統樹を(図１０)、5’ドメインの系統樹を(図１２)、セントラルドメインの系統樹を(図１３)、3’メジャードメインの系統樹を(図１４)、3’マイナードメインの系統樹を(図１５)に示した。なおこれらの系統樹は全て近隣接合法で作製した。その結果、蛍光を与えたクローン、すなわち活性型リボソームにおける16SリボソーマルRNAのドメインの組み合わせにおいて、16SリボソーマルRNAの起源との間には特定のパターンが観察されなかった。このことは、16SリボソーマルRNAの機能が特定の生物種や系統群由来のドメインの組み合わせによって規定されるのではなく、様々な組み合わせがありうることを意味している。なお、蛍光性ではない、機能を失った16SリボソーマルRNAにおいても特定のパターンは観察されなかった。
【００４２】
＜実施例３＞各ドメインがランダムに連結された非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のうち、生育機能を相補する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子
上記＜実施例１＞では16SリボソーマルRNA遺伝子中の一つのドメインを置換して得られた生育機能を相補する非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子についての例を示し、＜実施例２＞では直交型翻訳系を持つ非天然型16SリボソーマルRNAの作製であったが、本実施例では各ドメインがランダムに連結され、かつ生育機能を相補する非天然型16SリボソーマルRNAの作製を示している。
16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片の供給源は［１］上記＜実施例１＞(１)で得られた16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン断片(図１６)及び［２］上記＜実施例１＞(４)で相補が確認された16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン断片(図１７)の２種類を元に行った。上記２種類の16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片ライブラリーと＜実施例１＞(２)で得られた異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205をNEB社製のクローニングキット(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)を用いて連結した。反応溶液(総量25μL)は15μLの2x NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix、2μLずつの16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン断片、2μLの16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205を含む。本溶液を50℃で60分間保温した。その溶液の全量を用いて非特許文献７に従い作成した大腸菌JM109株を形質転換した後に、37℃で一晩培養後に10μg/mlのトリメトプリムを含むLB寒天培地上に生育してきたコロニー約2000個をかき集め、RBC Bioscience社製のプラスミド抽出キット(HiYield Plasmid Mini Kit)を用いて、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。その溶液の一部を分取し、大腸菌Δ７株(大腸菌の染色体上の７つのrrnオペロンを全て欠失し、rrnBオペロンを含有するpMY201を保持する株)を形質転換した。
【００４３】
以降、上記＜実施例１＞(４)と同様の実験手順を行い、非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を含むプラスミドpMY205を含む変異株の創成を行った。この結果、［１］の16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片を供給源とした方では配列番号176〜182の配列を、［２］の16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片を供給源とした方では配列番号183〜187の配列を含む大腸菌変異株について生育が確認された。これらの配列をデータベースに登録されている菌種との相同性検索を行い、生育が確認された非天然型16SリボソーマルRNAに含まれる全長及び各ドメインにおける異種16SリボソーマルRNA遺伝子の系統起源の配列数を(図１８)〜(図２１)に棒グラフで示し、その詳細を全長から順に(図２２)〜(図２６)に示している。全長の系統樹を(図２７)、5’ドメインの系統樹を(図２８)、セントラルドメインの系統樹を(図２９)、3’メジャードメインの系統樹を(図３０)、3’マイナードメインの系統樹を(図３１)に示した。なおこれらの系統樹は全て近隣接合法で作製した。図３０において、MGが［１］を元に作成したもので、AUが［２］を元に作成したものである。この表、系統樹から、すべてのドメインはそれぞれ異なる生物種に由来しており、大腸菌の16SリボソーマルRNA遺伝子欠損株を非天然型16SリボソーマルRNAによって生育機能を相補させることが可能であることが明らかとなった。本実験においても活性型リボソームにおける16SリボソーマルRNAのドメインの組み合わせにおいて、16SリボソーマルRNAの起源生物との間には特定のパターンが観察されなかったため、機能を有する16SリボソーマルRNAには様々な配列の組み合わせがありうると考えられる。
【００４４】
＜実施例４＞アンチシャインダルガーノ配列が改変されている非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を含むリボソームによる緑色蛍光タンパク質の翻訳活性
これまでの実施例では作製した非天然型16SリボソーマルRNAについて、翻訳機能の有無または生育機能の相補といった定性的な指標で説明してきたが、本実施例では直交型翻訳系を用いることで、作製した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の翻訳活性を定量的な値で示した。
【００４５】
（１）環境資料をマッコンキー寒天培地上で培養した菌体からメタゲノム由来16SリボソーマルRNA遺伝子の調製
茨城県つくば市国立研究開発法人産業技術総合研究所敷地内にて採取した土壌の懸濁液を大腸菌近縁種の選択培地植菌し、培養した菌体より、環境ゲノムDNAを調製した。採取した土2gを滅菌水10mlに懸濁したのちに、懸濁液100μLをパールコアマッコンキー寒天培地(栄研化学株式会社製)に植菌し、一晩培養した菌体よりExtrap Soil DNA Plus ver. 2(日鉄住金環境株式会社製)を使用し、キットマニュアルに従いゲノムDNA約8mg(100μL)を取得した。
16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメインの増幅には、配列番号1〜8のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。各微生物由来の染色体DNAを鋳型として使用し、配列番号1、2のプライマー対で5’ドメインを、配列番号3、4のプライマー対でセントラルドメインを、配列番号5、6のプライマー対で3’メジャードメインを、配列番号7、8のプライマー対で3’マイナードメインをそれぞれPCR法により増幅した。反応溶液(総量25μL)は、終濃度1x PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡社製)、各0.2mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP(以上、東洋紡社製)、各25pmolプライマー、1μLゲノムDNA(約80ng)、0.5ユニット KOD FX Neo(東洋紡社製)を含む。本溶液を94℃ 2分間の保温後、98℃ 10秒、48℃30秒、68℃ 1分の温度サイクルを30回繰り返し、最後に68℃で5分間保温した。得られたPCR産物を定法に従いアガロースゲル電気泳動により分離し、日本ジェネティクス社製のDNA精製キット(FastGene Gel/PCR Extraction Kit)を用いてマニュアルに従って精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００４６】
（２）アンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子の作製
16SリボソーマルRNA遺伝子の増幅には、配列番号1、188のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片の供給源は、＜実施例１＞(１)で得られた各ドメイン断片(MG)と上記(１)で得られた各ドメイン断片(Mac)の２種類を元に行った。16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片と＜実施例２＞(２)で得られた異種16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205をNEB社製のクローニングキット(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)を用いて結合した。反応溶液(総量25μL)は15μLの2x NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix、2μLずつの16SリボソーマルRNA遺伝子の各ドメイン断片、2μLの16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMY205を含む。本溶液を50℃で60分間保温した。続いてアンチシャインダルガーノ配列を改変した16SリボソーマルRNA遺伝子を増幅した。アンチシャインダルガーノ配列を改変した16SリボソーマルRNA遺伝子の増幅には、配列番号1、188のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用し、本項目で作製した16SリボソーマルRNAライブラリーを鋳型として使用した。反応溶液(総量25μL)は、終濃度1x PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡社製)、各0.2 mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP(以上、東洋紡社製)、各25pmolプライマー、1μL本項目で作製した16SリボソーマルRNAライブラリーDNA(約350ng)、0.5ユニットKOD FX Neo(東洋紡社製)を含む。本溶液を94℃ 2分間の保温後、98℃ 10秒、48℃ 30秒 、68℃ 1分の温度サイクルを30回繰り返し、最後に68℃で5分間保温した。得られたPCR 産物を定法に従いアガロースゲル電気泳動により分離し、日本ジェネティクス社製のDNA精製キット(FastGene Gel/PCR Extraction Kit)を用いてマニュアルに従って精製し、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００４７】
（３）アンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子ライブラリーの作製
(２)で得られた２種類の非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子各ドメイン断片と＜実施例２＞(４)で得られた非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMS205*A4をNEB社製のクローニングキット(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)を用いて結合した。反応溶液(総量20μL)は10μLの2x NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix、2μLの非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子、2μLの16SリボソーマルRNA遺伝子発現ベクターpMS205*A4、6μLの蒸留水を含む。本溶液を50℃で60分間保温した。その溶液の全量を大腸菌JM109株に形質転換した後に、37℃で一晩培養後に10μg/mlのトリメトプリムを含むLB寒天培地上に生育してきたコロニー約4000個をかき集め、RBC Bioscience社製のプラスミド抽出キット(HiYield Plasmid Mini Kit)を用いて、20μLの10mM Tris-HCl(pH8.5)に溶出した。
【００４８】
（４）アンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子と７種類の配列を持つ緑色蛍光蛋白質遺伝子を含む宿主株の創成
(３)で作製したライブラリーと蛍光蛋白質を発現するプラスミドによりJM109株を形質転換した。蛍光蛋白質を発現するプラスミドは緑色蛍光蛋白質を発現するプラスミドを用いた。緑色蛍光蛋白質の該発現プラスミドはDNA 2.0社製プラスミドpJ404を改変したpJ29b*A4(アンピシリン耐性マーカーを含む)にシャインダルガーノ配列が改変された緑色蛍光蛋白質をコードする遺伝子をクローニングしたものである。クローニングされた緑色蛍光蛋白質は、アミノ酸配列は同一であるが、塩基配列が異なる。緑色蛍光蛋白質はオワンクラゲ由来の蛋白質であるが、上記7種の合成遺伝子は、系統的に異なる7種の生物種、すなわちアガリクス ビスポラス(Agaricus bisporus)、枯草菌(Bacillus subtilis)、大腸菌(Escherichia coli)、ヒト(Homo sapiens)、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ストレプトマイセス セリカラー(Streptomyces coelicolor)、トリコデルマ リーセイ(Trichoderma reesei)の遺伝子特性に合わせ設計された。遺伝子の合成アルゴリズムはDNA2.0社の方法によるものである。以下、これらの緑色蛍光蛋白質をGFP/Abi、GFP/Bsu、GFP/Eco、GFP/Hsa、GFP/Sce、GFP/Sco、GFP/Treと略記する。配列番号205〜211は、それぞれの蛍光蛋白質に対する塩基配列を示す。
【００４９】
（５）アンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子を含む宿主株による蛍光蛋白質発現
(４)で得た緑色蛍光蛋白質遺伝子の形質転換体を100μg/mLアンピシリン、10μg/mLトリメトプリムを含むLB培地1mL中、37℃で一晩培養した。培養器はグライナー社製96穴深型プレートを、振盪培養器としてはタイテック社製M・BR-024を用いた。一晩培養された菌体5μLを、100μg/mLアンピシリン、10μg/mLトリメトプリム、0.1mM イソプロピル‐β-チオガラクトシドを含むLB培地1mLに移し、37℃で20時間培養した。培養液の一部(100μL)を分取し、Sigma-Aldrich社製ブラックボトムの浅型96穴マイクロプレートで菌体の蛍光を緑色蛍光蛋白質では励起波長488nm、蛍光波長530nmにて測定した。測定にはMolecular Devices社製プレートリーダーSpectraMax M2を用いた。(図３２)では、本実験のコントロール菌株であるJM109/Controlに対する相対的な各蛍光蛋白質の蛍光強度を示している。ここから、遺伝子特性が異なる遺伝子に対する発現の特異性があることが分かった。(図３３)〜(図３９)は、寒天培地上で高い蛍光を示した株を分離し、JM109/Controlと共に蛍光値を測定し、比較したグラフである。図中、JM109/Controlを単にCと表記した。
【００５０】
その結果、(図３３)〜(図３９)に示すように、変異株によって、各種蛍光蛋白質の発現に大きく差があることが判明した。これらの変異株の内、コントロールとなるJM109/Controlよりも高蛍光性であるJM109/Sce_Mac3、JM109/Sce_MG1、JM109/Hsa_Mac1、JM109/Hsa_Mac2、JM109/Hsa_Mac3、JM109/Hsa_Mac5、JM109/Hsa_Mac6、JM109/Hsa_MG1、JM109/Abi_Mac1、JM109/Abi_Mac5、JM109/Sco_MG1、JM109/Sco_MG3、JM109/Eco_Mac1、JM109/Eco_Mac4、JM109/Eco_MG3を抜粋して、培養液からプラスミドを精製し、各株に含まれるアンチシャインダルガーノ配列を改変した非天然型16SリボソーマルRNA遺伝子のシーケンス解析を行った。シーケンス解析の結果、得られた配列を配列番号212〜226に示した。また、16SリボソーマルRNA遺伝子の配列の全長及び各ドメインをデータベースに登録されて居る菌種と相同性検索を行った結果を全長から順に(図４０)〜(図４４)に示した。この結果は、(４)で示す方法により創成される16SリボソーマルRNA変異型の大腸菌変異株が、発現対象となる遺伝子に対して固有の発現特性を示すことを意味している。変異体ライブラリーの構築により、野生型で発現しにくい遺伝子を効率的に発現させうる。
以上、様々な16SリボソーマルRNAを用いてハイブリッドリボソームを構築することで、大腸菌野生株を使用した際に比べて高い発現レべルを達成できる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明に基づく非天然型の16SリボソーマルRNA遺伝子創成技術によれば、機能を有する16SリボソーマルRNA遺伝子の種類を天然配列に限定することなく大規模に拡張することができる。また野生型リボソームよりも高機能を示す例も示され、蛋白質の効率的生産に有用なリボソーム工学の有力な手段となりうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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