(57)【要約】【課題】複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較することによって遺伝子発現を解析する方法に用いる正規化係数を安定化させることを課題とする。【解決手段】複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較することによって遺伝子発現を解析する方法において、細胞抽出物に核酸標準物質を含む水溶液を加え測定試料を調製し、当該測定試料からRNAを抽出しトランスクリプトームデータを取得した後、データ中に含まれる核酸標準物質由来の定量データを用いて正規化係数を算出しデータの正規化を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較することによって遺伝子発現を解析する方法であって、下記の工程、
（１）生体試料を細胞質抽出液により溶解させ細胞抽出物を作製する工程、
（２）前記細胞抽出物に核酸標準物質を含む水溶液を加え測定試料を調製する工程、
（３）前記測定試料からRNAを抽出し、トランスクリプトームデータを取得する工程
および
（４）トランスクリプトームデータ中に含まれる核酸標準物質由来の定量データを用いて正規化係数を算出し、トランスクリプトームデータの正規化を行う工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（１）において、生体試料中の細胞数および細胞サイズを測定することをさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（２）において、核酸標準物質を含む水溶液の希釈率および液重量を測定することをさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程（４）において、正規化係数の算出が式（Ｉ）および式（ＩＩ）により算出することを特徴とする請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。 
【数１】
2018042515.tif 000010
【数２】
2018042515.tif 000011
（式（ＩI）中、Ｍは正規化係数を示し、Ｘ１、Ｘ２は、各標準化物質により決定される生体試料における正規化係数算出用データを示し、Ｓ１、Ｓ２は各生体試料におけるトランスクリプトームの総和を示す。）
【請求項５】
請求項1〜４のいずれか1項に記載の遺伝子発現を解析する方法を実行するためのプログラム。
【請求項６】
請求項５記載のプログラムを記録したことを特徴とする情報記録媒体。
【請求項７】
請求項６記載の情報記録媒体により実行される希釈率計算手段、理想希釈率変換手段および正規化係数算出手段を含む正規化係数の算出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較することによって遺伝子発現を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスクリプトームとは、特定の状況下において細胞中に存在する全ての一時転写産物の総体を指す呼称である。原則として、細胞に存在するゲノム(DNAの全塩基配列)は同一個体内の全ての細胞で同一であり、特定の個体から採取された細胞であれば、環境に変化が生じてもゲノムは一定である（例えば、非特許文献１参照）。一方、トランスクリプトームは、各遺伝子の発現状況（頻度）が反映された結果であるため、同一個体の細胞であっても各細胞の存在環境に呼応した固有の構成を取るため、例えば異なる組織の細胞間では全く異なる態様を示す。
【０００３】
高速シークエンサーの登場により、トランスクリプトームの測定（細胞の遺伝子発現量総体の測定）の精度が飛躍的に向上した、しかしながら、トランスクリプトームの測定結果として得られるデータは膨大な量であるため、得られたトランスクリプトームデータが如何なる意味を持つのか、直接的に人間が理解することは難しい。
【０００４】
得られたトランスクリプトームデータが如何なる意味を持つのかについて、統計処理を行って解析することが行われている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
複数のトランスクリプトームの差異(=各遺伝子の発現頻度の差異の総体)を解析するにあたっては、例えば、発現変動遺伝子（DEG）抽出という手法が一般的に取られる。
【０００６】
高速シークエンサーを用いて取得することのできるトランスクリプトームデータは、生体試料に含まれるトランスクリプトームの一部を抽出して分析することによって得られるデータであり、任意のトランスクリプトームデータの総和は、該当のトランスクリプトームデータの由来となった生体試料に含まれていたトランスクリプトームの量と独立であって、トランスクリプトームデータによってトランスクリプトームデータの総和は異なる。
【０００７】
複数のトランスクリプトームデータを比較することにより遺伝子の発現を解析する目的で、複数のトランスクリプトームデータ間での総和の差異の正規化が実施されている。
【０００８】
すべての生体試料に含まれているトランスクリプトームの量が同一であることを仮定した正規化方法として、RPM値及びRPKM値の算出が実施されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００９】
複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較しようとする場合に、比較のあり方としては、１細胞あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較するべきである場合と、同質量の生体試料あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較すべきである場合と、同細胞膜面積あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較すべきである場合がある。
【００１０】
複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較しようとする場合に用いる有用な方法として、TMM正規化方法が開発されてきた。TMM正規化方法では、生体試料間のトータルRNAの量の比を推定することによって正規化係数を算出することができる（例えば、非特許文献３参照）。
【００１１】
同様の課題解決を目指した手法として例えば、非特許文献５に記載された方法が挙げられるが、該文献においては細胞より抽出したRNAに対して指標となるRNAを加えており、RNAの抽出効率が実験毎に変動するために正規化手法として不十分であり、利用されてこなかった。
【００１２】
非特許文献５に記載された方法ではRNAの標準化物質が用いられるが、RNA定量装置のバリデーションの目的で、配列及び濃度が高精度に定まっている国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センター認証標準物質NMIJ CRM 6204-a 定量解析用リボ核酸（RNA）水溶液（以下、核酸標準物質 と呼称する。）が存在する（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開2014-103851号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】ベントレー  ディ  アール（Bentley DR）、 バラスブラマニアン  エス（Balasubramanian S）、スワードロウ  エイチ  ピー（Swerdlow HP）、スミス  ジーピー（Smith GP）、ミルトン  ジェイ（Milton J）, et al. 「アキュレート  フォール  ヒューマン  ゲノム  シークエンシング  ユージング  リバーシブル  ターミネーター  ケミストリー（Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry）」、 ネーチャー（Nature）、2008年、 456巻: ｐ53-59.
【非特許文献２】モルタザヴィ  エー（Mortazavi A）、ウイリアムス  ビーエー（Williams BA）、マッキュー  ケイ（ McCue K）、シェーファー  エル（Schaeffer L）、ウオルド  ビー（ Wold B）、「マッピング  アンド  クアンティファィング  マーマリアン  トランスクリプトームス  バイ  アールエヌエイ  セク（Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.）」、ネーチャー  メソズ （Nature methods）、2008年、5巻、ｐ621-628.
【非特許文献３】ロビンソン  エム  ディー（Robinson MD）、オシュラック  エィ（ Oshlack A ）、「ア  スケーリング  ノーマリゼーションメソッド  フォー  ディファレンシャル  エクスプレッション  アナリーシス  オブ  アール  エヌ  エー  セク  データ（A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data）、 ゲノムバイオロジー（Genome biology）、2010年、11巻、R25
【非特許文献４】国立研究開発法人  産業技術総合研究所、「計量標準総合センター  標準物質認証書、認証標準物質  NMIJ  CRM  6204-b」[平成28年7月29日検索]、インターネット（URL:https://www.nmij.jp/service/C/crm/42/6204b_J.pdf）
【非特許文献５】ヤコブ  ローベン（Jakob Loven）、デービッド  エィ  オルランド（David A.Orlando）、アラ  エィ  シゴバ（Alla A. Sigova）、チャールス  ワイ  リン（Charles Y. Lin）、ピーター  ビー  ラール （Peter B. Rahl）、クリストファー  ビー  ブルヅェ（Christopher B Burge）、デイビッド  エル  レベンス（David L. Levens）、トン  イン  リー（Tong Ihn Lee）、リチャード  エー  ヤング（Richard A. Young）、「リビジティング グローバル  ジーン  エクスプレッション  アナリーシス（Revisiting Global Gene Expression Analysis）」、セル（Cell）、 2012年、151巻、ｐ476-482
【非特許文献６】緒方  エヌ（Ogata N）、小崎  ティー（Kozaki T）、横山  ティー（Yokoyama T）、秦  ティー（Hata T）、岩淵  ケィ（Iwabuchi K）、コンプレッション  ビツーン  ザ  アマウント  オブ  エンバイロメンタル  チェンジ  アンド  ザ  アマウント  オブ  タンスクリプトーム  チェンジ（Comparison between the Amount of Environmental Change and the Amount of Transcriptome Change）、2015年、ピーエルオーエス  ワン（PLoS ONE）、10巻、12号、 e0144822
【非特許文献７】ジャンキャン  サン（Jianqiang Sun）、西山智明（Tomoaki Nishiyama), 清水謙多郎(Kentaro Shimizu) アンド  門田幸二(Koji Kadota)、ティーシーシー:アン  アール  パッケージ  フォー  コンペアリング  タグ  カウント  データ  ウィズ  ロブスト  ノーマリゼーション  ストラテジース(TCC: an R package for comparing tag count data with robust normalization strategies)、2013年、ビーエムシー  バイオインフォマティックス（BMC Bioinformatics）、14巻、p219
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従来からある正規化方法を用いた正規化を実施した場合でも、（i）１細胞あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較することのできる正規化係数としての確からしさを実測値との比較により評価する技術、(ii)同質量の生体試料あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較することのできる正規化係数としての確からしさを実測値との比較により評価する技術、(iii)推定された正規化係数の、生体試料の同細胞膜表面積あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較することのできる技術が存在しなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は上記事情を鑑み、鋭意検討を行った結果、従来は混合溶媒の影響で試料に添加しにくいとされていた核酸標準物質を、RNA抽出前の試料に添加することにより正規化係数の測定が安定化することを見出し、この手法により複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較しようとする場合に、(i)１細胞あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較したい場合でも、用いる正規化係数の確からしさを実測値との比較により評価する技術、(ii)同質量の生体試料あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較したい場合でも、用いる正規化係数の確からしさを実測値との比較により評価する技術、(iii)生体試料の同細胞膜表面積あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較したい場合でも、用いる正規化係数の確からしさを実測値との比較により評価する技術を提供しようとしたものである。
【００１７】
本発明は以下の特徴を有する。
〔I〕、複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較することによって遺伝子発現を解析する方法であって、下記の工程、
（１）生体試料を細胞質抽出液により溶解させ細胞抽出物を作製する工程、
（２）前記細胞抽出物に核酸標準物質を含む水溶液を加え測定試料を調製する工程、
（３）前記測定試料からRNAを抽出し、トランスクリプトームデータを取得する工程
および
（４）トランスクリプトームデータ中に含まれる核酸標準物質由来の定量データを用いて正規化係数を算出し、トランスクリプトームデータの正規化を行う工程を含むことを特徴とする方法。
〔II〕、工程（１）において、生体試料中の細胞数および細胞サイズを測定することをさらに含むことを特徴とする〔I〕記載の方法。
〔III〕、工程（２）において、核酸標準物質を含む水溶液の希釈率および液重量を測定することをさらに含むことを特徴とする〔I〕または〔II〕記載の方法。
【００１８】
〔IV〕、工程（４）において、正規化係数の算出が式（Ｉ）および式（ＩＩ）により算出することを特徴とする〔I〕〜〔III〕いずれかに記載の方法。 
【数１】
2018042515.tif 000002
【数２】
2018042515.tif 000003
（式（ＩI）中、Ｍは正規化係数を示し、Ｘ１、Ｘ２は、各標準化物質により決定される生体試料における正規化係数算出用データを示し、Ｓ１、Ｓ２は各生体試料におけるトランスクリプトームの総和を示す。）
【００１９】
〔V〕、〔I〕〜〔IV〕のいずれかに記載の遺伝子発現を解析する方法を実行するためのプログラム。
〔VI〕、〔V〕記載のプログラムを記録したことを特徴とする情報記録媒体。
〔VII〕、〔VI〕記載の情報記録媒体により実行される希釈率計算手段、理想希釈率変換手段および正規化係数算出手段を含む正規化係数の算出装置。
【００２０】
本明細書において、「複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較することによって遺伝子発現を解析する方法」とは、異なる表現型を持つ2個体間で発現量の差がある遺伝子群をトランスクリプトーム解析により網羅的に同定し解析する手法を示し、トランスクリプトーム解析としては、マイクロアレイ等を用いた遺伝子発現解析、または高速シークエンサーを用いた全転写量解析等が挙げられるが、高速シークエンサーを用いた全転写量解析を用いることが好ましい（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献５）。
【００２１】
本明細書において、「生体試料を細胞抽出液により溶解させ細胞抽出物を作製する工程」とは、細胞等の生体試料を通常、細胞質抽出又は細胞溶解に用いる細胞抽出液により細胞質成分を溶出させる工程を示し、細胞抽出液としては例えばCHAPS、非イオン性界面活性剤、Triton-X等の膜タンパク質可溶化剤を緩衝液に加えたものを用いる。この際、必要に応じて、生体試料中の細胞数および細胞サイズを測定する。細胞数および細胞サイズを測定する方法は、トリパンブルーや蛍光色素で染色した細胞を顕微鏡を用いて目視で計測する方法、顕微鏡像から画像解析装置で計測する方法、フローサイトメトリー等により自動的に計測する方法等通常用いられている方法で良い。
【００２２】
本明細書において、「前記細胞抽出物に核酸標準物質を含む水溶液を加え測定試料を調製する工程」とは生体試料を細胞抽出液により溶解させた細胞抽出物に対して核酸標準物質を加えてトランスクリプトーム測定用の試料を調製する工程を示す。本発明においては核酸標準物質の添加により正規化係数の算出を行うが、核酸標準物質とは定量解析用標準物質としてはDNAマイクロアレイ用に異なる装置間の測定結果の互換性向上や解析技術の精度管理のために規格化されたものを示す。本発明に用いる核酸標準物質としては分子量と塩基配列が明確な定量用、構造解析用の核酸、とりわけRNAならどのようなものでも良いが、認証標準物質NMIJ CRM 6204-a 定量解析用リボ核酸（RNA）水溶液（国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センター製）を用いることが好ましい。なお正規化係数算出のために核酸標準物質を含む水溶液の希釈率および液重量を測定し、記録することが好ましい。
【００２３】
このようにして調製した「測定試料からRNAを抽出し、トランスクリプトームデータを取得する工程」とは、測定試料の水溶液に対してクロロホルム、フェノール等の無極性溶媒を加えることによりDNAやタンパク質等が無極性な有機層へ分離し、水層に留まったRNAに対してアルコール沈殿等により得られた精製RNA水溶液を用いてトランスクリプトーム解析に付す工程を示す。トランスクリプトーム解析に関しては、マイクロアレイを用いる方法でも良いが、高速シークエンサーを用いる場合は、total RNAやmRNAからライブラリーを作製し、塩基配列解析データを取得し、得られたデータを参照配列にマッピングし、遺伝子発現量を推定することにより行う。
【００２４】
「トランスクリプトームデータ中に含まれる核酸標準物質由来の定量データを用いて正規化係数を算出し、トランスクリプトームデータの正規化を行う工程」において、正規化係数とは、測定系に加わる生物学的要素以外のノイズ、具体的には蛍光色素による影響、スライドグラス位置によるシグナルの強度変化、ハイブリダイゼーション効率、スキャナー感度特性、RNA含量の相違による個体差に由来するノイズを、統計的に相互比較するよう補正するための係数を示す。本発明における正規化手法とは、Internal Controlの利用、Quantile法、Lowess法等が挙げられるが、本発明においては濃度が定められた核酸標準物質を用いる。本発明における正規化係数の算出は以下の数式によって行われる。
【００２５】
正規化係数算出用データ（Ｘ）は以下の数式（I）により得ることができる。
【数３】
2018042515.tif 000004
【００２６】
正規化係数Mは、得られた正規化係数算出用データとトランスクリプトームの総和から以下の数式(II)により得ることができる。
【数４】
2018042515.tif 000005
【００２７】
上記の正規化係数の計算方法は、ヒトが手計算を行って求めても良いし、コンピュータを用いて自動的に行っても良い。すなわち、本発明は、上記した方法を実行するためのコンピュータや、コンピュータを上記した方法を実現するようにするためのプログラム、及びそのようなプログラムを記憶したコンピュータが読み取り可能な情報記録媒体をも提供する。
【００２８】
本発明の第２の側面は、コンピュータを含む正規化係数の算出装置に関する。コンピュータは、前記情報媒体により実行される図１の希釈率計算手段（１１）と、理想希釈率変換手段（１２）と、正規化係数算出手段（１３）を含む。このコンピュータは、入出力部，記憶部，制御部、及び演算部が存在し、情報の授受を行うことができるように各要素が接続されている。そして、制御部は、記憶部に記憶した制御プログラムからの指令を受け、記憶部に記憶された各種情報を読み出して、演算部に所定の演算を行わせ、演算結果を記憶部に記憶し、適宜入出力部から出力する。
【００２９】
希釈率計算手段（１１）は、重量法を用いて希釈した標準RNA溶液の希釈率を算出する手段である。RNA溶液を希釈する際に、例えば1/2に希釈しようと考えた時、実際の希釈操作では厳密な1/2からずれるので実際の希釈率は1/2と異なるが、本発明ではこのような場合、1/2を理想希釈率と定義する。理想希釈率変換手段（１２）は，実際の希釈率と実際の標準RNAカウントデータをもとにRNA溶液を理想希釈率で希釈することでできる概念上の液である理想希釈液でのカウントデータを算出する手段である。正規化係数算出手段（１３）は，理想希釈液を用いたことを想定した場合に算出された標準RNA溶液のデータを元に、細胞間の正規化に用いる係数を算出する手段である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較しようとする場合に、(i)１細胞あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較したい場合でも、用いる正規化係数の確からしさを実測値との比較により評価する技術、(ii)同質量の生体試料あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較したい場合でも、用いる正規化係数の確からしさを実測値との比較により評価する技術、(iii)生体試料の同細胞膜表面積あたりの各メッセンジャーRNAの存在量として比較したい場合でも、用いる正規化係数の確からしさを実測値との比較により評価する技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】コンピュータを含む正規化係数の算出装置。
【図２】TMM正規化法を用いて求めた正規化係数による正規化原点を縦軸上に0として示し、本発明にかかる正規化法を用いて求めた正規化係数による正規化原点を縦軸上に通る水平直線として示したMAプロット。図中色の濃い黒いプロットは発現変動遺伝子ではないと考えられる遺伝子（FDR>0.05）、色の薄い灰色のプロットは発現変動遺伝子（FDR<0.05）を示す。
【図３】TCC正規化法を用いて求めた正規化係数による正規化原点を縦軸上に0として示し、本発明にかかる正規化法を用いて求めた正規化係数による正規化原点を縦軸上に通る水平直線として示したMAプロット。図中色の濃い黒いプロットは発現変動遺伝子ではないと考えられる遺伝子（FDR>0.05）、色の薄い灰色のプロットは発現変動遺伝子（FDR<0.05）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
細胞数、または細胞数と細胞サイズを測定した生体試料に希釈率と液重量を測定した核酸標準物質を加える工程では、トランスクリプトームを分析しようとする生体試料について、以下のような測定および操作を行なうことができる。
（１）生体試料中の細胞数、生体試料中の細胞の大きさを測定する。これらの測定方法としては細胞を顕微鏡下で観察し、細胞数を測定するとともに細胞の大きさを測定する他、例えばVicell(商品名  ベックマン  カルター  ライフサイエンス社製)等生死細胞オートアナライザーの使用が挙げられる。
（２）核酸標準物質には通常複数個の標品RNAが含まれているが、それぞれ異なる濃度、具体的には1/10〜1/100000となるように希釈する。希釈液としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等を用いることができる。
（３）希釈した各標品RNAの希釈液を生体試料に加え混合液を調製する。その際、加えた希釈液の重量を記録する。
（４）前記混合液を25℃〜28℃の温度で、5分〜10分インキュベートする。
【００３３】
生体試料に核酸標準物質を加えた試料からRNAを抽出し、トランスクリプトームデータを取得する工程は以下の操作手順で行う。
（１）TRIzol（登録商標）LS（サーモフィッシャー  サイエンティフィック社製）などの細胞溶解液に浸漬した混合液をホモジナイズし、静置した後クロロホルムを加え、十分に混合する。
（２）クロロホルム処理液を静置した後、遠心分離を行い、RNAを含む水層を分取し、イソプロピルアルコールを加え良く混和した後に、再び遠心分離を行い洗浄し、RNAの水溶液とする。
（３）total RNA からmRNAを精製する。精製したmRNAを断片化し、cDNAに逆転写しPCRを行って増幅させる。増幅させたサンプルに関して、75サイクルのシーケンス反応を行い配列を決定する。得られた配列はCHO細胞トランスクリプトームリファレンスデータにマッピングし、トランスクリプトームデータを取得する。上記の操作については非特許文献６参照することができる。
【００３４】
トランスクリプトームデータ中に含まれる核酸標準物質由来の定量データを用いて正規化係数を算出する工程では以下のような操作を行うことができる。
（１）核酸標準物質 を添加した生体試料よりRNAを抽出し、高速シークエンサーを用いたシークエンス分析を実施するためのシークエンスライブラリ調製を行なう。
（２）核酸標準物質 を添加した生体試料由来のシークエンスライブラリを高速シークエンサーを用いてシークエンスし、得られたシークエンスデータを処理してトランスクリプトームデータを取得する。
（３）トランスクリプトームデータ中の核酸標準物質由来のデータについて、標品RNAを生体試料に添加するときに想定していた理想的な標品RNA存在量を掛け、測定した添加希釈液重量で割って商を求め、正規化算出用データとする。
（４）任意の複数のサンプル間において、正規化係数算出用データxnとトランスクリプトーム総和Snを用い、比較が２つのサンプル間の場合には前記数式（I）および（II）に基づいて正規化係数Mを算出する。
【００３５】
なお、下記実施例１及び実施例２においては以下に示す共通のCHO細胞、高速シークエンサー、及び国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センター認証標準物質NMIJ CRM 6204-a 定量解析用リボ核酸（RNA）水溶液を用いて、トランスクリプトームデータを取得した。
【００３６】
〈CHO細胞〉
各実験に用いる細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣由来樹立細胞系のひとつであるSC20細胞及びSC39細胞を用いた。
【００３７】
〈高速シークエンサー〉
トランスクリプトームシークエンスデータは、Illumina社製  NextSeq500を用いて取得した。
【００３８】
〈国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センター認証標準物質NMIJ CRM 6204-a 定量解析用リボ核酸（RNA）水溶液〉。
国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センター認証標準物質NMIJ CRM 6204-a 定量解析用リボ核酸（RNA）を水溶液として用いた（非特許文献４）。
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は当該発明に限定されないものとする。
【実施例１】
【００３９】
国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センターから購入した認証標準物質NMIJ CRM 6204の中のRNA500-A〔Synthetic construct RNA, spike-in microarray control RNA CRM 6204-a, clone: 6204-a-500-1 RNA500-A〕を水で希釈した。水91.7mgにRNA500-A 9.7mgを加え、RNA500-A-1とした。水90.7mgにRNA500-A-1 9.3mgを加え、RNA500-A-2とした。水90.1mgにRNA500-A-2 9.4mgを加え、RNA500-A-3とした。
【００４０】
国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センターから購入した認証標準物質NMIJ CRM 6204の中のRNA500-B〔Synthetic construct RNA, spike-in microarray control RNA CRM 6204-a, clone: 6204-a-500-2 RNA500-B〕を水で希釈した。水89.7mgにRNA500-B 9.6mgを加えRNA500-B-1とした。水89.8mgにRNA500-B-1 9.5mgを加え、RNA500-B-2とした。水89.9mgにRNA500-B-2 9.6mgを加え、RNA500-B-3とした。水90.1mgにRNA500-B-3 9.6mgを加え、RNA500-B-4とした。
【００４１】
国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センターから購入した認証標準物質NMIJ CRM 6204の中のRNA500-C〔Synthetic construct RNA, spike-in microarray control RNA CRM 6204-a, clone: 6204-a-500-4 RNA500-C〕を水で希釈した。水89.8mgにRNA500-C 9.6mgを加え、RNA500-C-1とした。水89.8mgにRNA500-C-1 9.2mgを加え、RNA500-C-2とした。水89.6mgにRNA500-C-2 9.5mgを加え、RNA500-C-3とした。水89.9mgにRNA500-C-3 9.5mgを加え、RNA500-C-4とした。水89.8mgにRNA500-C-4 9.6mgを加え、RNA500-C-5とした。
【００４２】
国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センターから購入した認証標準物質NMIJ CRM 6204の中のRNA1000-A〔Synthetic construct RNA, spike-in microarray control RNA CRM 6204-a, clone: 6204-a-1000-3 RNA1000-A〕を水で希釈した。水90.0mgにRNA1000-A 9.9mgを加え、RNA1000-A-1とした。水90.0mgにRNA1000-A-1 10.0mgを加え、RNA1000-A-2とした。水90.6mgにRNA1000-A-2 9.9mgを加え、RNA1000-A-3とした。水90.0mgにRNA1000-A-3 10.0mgを加え、RNA1000-A-4とした。水89.5mgにRNA1000-A-4 10.0mgを加え、RNA1000-A-5とした。
【００４３】
国立研究開発法人産業技術総合研究所計量標準総合センターから購入した認証標準物質NMIJ CRM 6204の中のRNA1000-B〔Synthetic construct RNA, spike-in microarray  control RNA CRM 6204-a, clone: 6204-a-1000-4 RNA1000-B〕を水で希釈した。水89.7mgにRNA1000-B 10.0mgを加え、RNA1000-B-1とした。水89.9mgにRNA1000-B-1 10.0mgを加え、RNA1000-B-2とした。水90.0mgにRNA1000-B-2 10.0mgを加え、RNA1000-B-3とした。水90.7mgにRNA1000-B-3 9.9mgを加え、RNA1000-B-4とした。水90.3mgにRNA1000-B-4 10.0mgを加え、RNA1000-B-5とした。
【００４４】
SC20細胞1.0484×106個をTrizol150μLに溶解させ、RNA500-A-1を10.1mg、RNA500-B-2を10.1mg、RNA500-C-3を10.3mg、RNA1000-A-4を9.9mg、RNA1000-B-5を10.1mg加え、SC20-1とした。
【００４５】
SC20細胞0.9523×106個をTrizol150μLに溶解させ、RNA500-A-1を10.1mg、RNA500-B-2を10.0mg、RNA500-A-3を9.9mg、RNA500-B-4を9.8mg、RNA500-C-5を9.9mg加え、SC20-2とした。
【００４６】
SC20細胞0.9735×106個をTrizol150μLに溶解させ、RNA500-C-1を10.0mg、RNA500-A-2を9.8mg、RNA500-B-3を9.5mg、RNA1000-B-4を9.8mg、RNA1000-A-5を9.5mg加え、SC20-3とした。
【００４７】
SC39細胞0.8841×106個をTrizol150μLに溶解させ、RNA500-A-1を10.0mg、RNA500-B-2を9.9mg、RNA500-C-3を10.1mg、RNA1000-A-4を9.9mg、RNA1000-B-5を10.0mg加え、SC39-1とした。
【００４８】
SC39細胞0.8338×106個をTrizol150μLに溶解させ、RNA1000-A-1を10.0mg、RNA1000-B-2を10.0mg、RNA500-A-3を10.0mg、RNA500-B-4を9.9mg、RNA500-C-5を10.1mg加え、SC39-2とした。
【００４９】
SC39細胞0.9769×106個をTrizol150μLに溶解させ、RNA500-C-1を10.0mg、RNA500-C-2を10.0mg、RNA500-B-3を10.0mg、RNA1000-B-4を10.4mg、RNA1000-A-5を10.0mg加え、SC39-3とした。
【００５０】
Total RNAはTRIzol（登録商標）LS （商品名、サーモフィッシャー  サイエンティフィック社製）のマニュアルに従い以下のように抽出した。TRIzol LS に浸漬したSC20-1、SC20-2、SC20-3、SC39-1、SC39-2、SC39-3をホモジナイズした後、25℃下で5分間静置した。その後60μL のクロロホルムを処理し、15秒間力強く振った。25℃下で15分間静置した後に12,000 × g 、4℃下で15分間遠心分離した。RNAを含む水層を新しいチューブに移し、水層と等量のイソプロピルアルコールを加え良く混和した後に12,000 × g 、4℃下で１５分間遠心分離した。RNAのペレットは75%エタノールで洗浄した後に30μlの水に溶かした。最終的に,各サンプル6.9μg以上のtotal RNA が得られた。ナノドロップを用いて測定したA260/280 比は1.98と2.03であった。また、TapeStationを用いてeRIN値を求め、取得したtotal RNAの品質が充分であることを確認した。
【００５１】
全てのサンプル調製はmRNA-seq Sample Preparation Kit (商品名 Illumina社製, San Diego, CA, USA) を用い、キット添付のマニュアルに従い次のように行った。
【００５２】
poly-T磁気ビーズを用いて,10μg のtotal RNA からmRNAを精製した。精製したmRNAを断片化し、cDNAに逆転写した。核酸標準物資として用いた各RNAの逆転写体の塩基配列を、RNA500Aを配列番号1、RNA500Bを配列番号2、RNA500Cを配列番号3、RNA1000Aを配列番号4、RNA1000Cを配列番号5に示した。
【００５３】
最終的にアダプターがcDNA断片にライゲーションされる前に、終末を修正し、アデニン塩基を付加した。15サイクルのPCRを行って増幅させた。増幅させたサンプルはAgilent 2100 Bioanalyzer を用いて品質確認を行った。それぞれのサンプルは10nM に調製し、その後の実験まで-40℃下で保存した。クラスター生成及びシーケンス反応をNextSeq500 (Illumina)を用いて行い,75サイクルのシーケンス行った。シーケンス反応で得られた配列（リード）の品質確認はFast QC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) を用いて行った。
【００５４】
リードはCHO細胞トランスクリプトームリファレンスデータにマッピングし、トランスクリプトームデータを取得した。
【００５５】
取得したトランスクリプトームデータ中の核酸標準物質由来のデータ（表１）について、標品RNAを生体試料に添加するときに想定していた理想的な標品RNA存在量（表２）を掛け、測定した添加希釈液重量で割って商を求め、正規化算出用データとし表３に示す。
【００５６】
【表１】
2018042515.tif 000006
【００５７】
【表２】
2018042515.tif 000007
【００５８】
【表３】
2018042515.tif 000008
【００５９】
SC20細胞とSC39細胞の比較において、正規化係数算出用データxnとトランスクリプトーム総和Snを用い、式Iに基づいて正規化係数Mを算出し、図２に示した。
【００６０】
TMM正規化法（非特許文献３）を用いて求めた正規化係数による正規化原点を図２の縦軸上に0として示す。本発明にかかる正規化法を用いて求めた正規化係数による正規化原点を縦軸上に通る水平直線を示した。縦軸の0点を通る横軸の下方に前述の水平直線が示されたため、図２からTMM正規化法を用いて求めた正規化原点と本発明にかかる正規化法を用いて求めた正規化原点が異なっていることが示された。
【００６１】
TMM正規化法を用いて求めた正規化原点は推定値であるのに対し、本発明にかかる正規化法を用いて求めた正規化原点は標品を用いた実測値である。本発明は、mRNAに関するトランスクリクリプトーム比較のための、正規化原点の実測値の算出を実現させ、正規化原点推定値の評価を実現させる。
【実施例２】
【００６２】
実施例２では、実施例１と異なり、mRNAを抽出せずにtotal RNAの分析を実施した。total RNAは実施例１と同様の方法で取得し、実験に用いた。
【００６３】
全てのサンプル調製はmRNA-seq Sample Preparation Kit (Illumina社製, San Diego, CA, USA) を用い、マニュアルを一部改変して次のように行った。
【００６４】
Total RNAを断片化し、cDNAに逆転写した。最終的にアダプターがcDNA断片にライゲーションされる前に、終末を修正し、アデニン塩基を付加した。
【００６５】
15サイクルのPCRを行って増幅させた。増幅させたサンプルはAgilent 2100 Bioanalyzer を用いて品質確認を行った。それぞれのサンプルは10nM に調製し、その後の実験まで-40℃下で保存した。クラスター生成及びシーケンス反応はNextSeq500 (Illumina)を用いて行い、75サイクルのシーケンスを行った。
【００６６】
シーケンス反応で得られた配列（リード）の品質確認はFast QC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) を用いて行った。
【００６７】
リードはCHO細胞トランスクリプトームリファレンスデータにマッピングし、トランスクリプトームデータを取得した。取得したトランスクリプトームデータ中の核酸標準物質由来のデータについて、標品RNAを生体試料に添加するときに想定していた理想的な標品RNA存在量をかけ、測定した添加希釈液重量で割って商を求め、正規化算出用データとし表４に示した。
【００６８】
【表４】
2018042515.tif 000009
【００６９】
SC20細胞とSC39細胞の比較において、正規化係数算出用データxnとトランスクリプトーム総和Snを用い、式Iに基づいて正規化係数Mを算出し、図３に示した。
【００７０】
TCC正規化法（非特許文献７）を用いて求めた正規化係数による正規化原点を図３の縦軸上に0として示した。本発明にかかる正規化法を用いて求めた正規化係数による正規化原点を縦軸上に通る水平直線を示した。縦軸の0点を通る横軸の下方に前述の水平直線が示されたため、図３からTCC正規化法を用いて求めた正規化原点と本発明にかかる正規化法を用いて求めた正規化原点が異なっていることが示された。
【００７１】
TCC正規化法を用いて求めた正規化原点は推定値であるのに対し、本発明にかかる正規化法を用いて求めた正規化原点は標品を用いた実測値である。本発明は、すべてのRNAに関するトランスクリプトーム比較のための正規化原点の実測値の算出を実現させ、正規化原点推定値の評価を実現させる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、簡便な方法により正確な正規化係数が得られる。この正規化係数を用いることにより、複数の生体試料についてトランスクリプトームデータを比較することによって遺伝子発現を解析する方法、当該方法を実行するためのプログラム、当該プログラムを組み込んだ情報媒体、正規化係数の算出装置が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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