(57)【要約】【課題】ヒト血清アルブミン及び体内に潜在的に有害な因子含まないことから、ウィルスによる感染のリスクがなく、インスリン結合体に対して優れた貯蔵安定性を示す液状製剤を提供する。【解決手段】本発明は、生理活性ペプチドであるインスリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型インスリン結合体；及びアルブミン-非含有の安定化剤を含み、前記安定化剤が、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含む持続型インスリン結合体の製剤に関する。複数回使用する際に、微生物による汚染を防止するために、製剤に保存剤を添加することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ペプチドであるインスリン(ｉｎｓｕｌｉｎ)と免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型インスリン結合体；及びアルブミン-非含有の安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含み、前記緩衝溶液のｐＨの範囲が、５〜７である、持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２】
前記緩衝溶液が、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液又はリン酸緩衝溶液である請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項３】
前記インスリンが、天然型インスリンと同様のアミノ酸配列を持つ請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項４】
前記インスリンが、天然型インスリンのアミノ酸の置換、除去又は挿入などによって生成されたインスリン誘導体又は天然型インスリンと同様の活性を示すペプチドの類似体である請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭから由来するＦｃ領域である請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群より選択される免疫グロブリンから由来する異なる起源のドメインのハイブリットである請求項５に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、同様の起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンから構成される２量体又は多量体である請求項５に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項７に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項９】
前記結合体が、非ペプチド性重合体又は組み換え技術を用いて結合された請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１０】
前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコールである請求項９に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１１】
前記非ペプチド性重合体が、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(ＰＬＡ)及びポリ乳酸-グリコール酸共重合体(ＰＬＧＡ)などの生分解性高分子；脂質重合体；キチン類；ヒアルロン酸；及びそれらの組み合わせからなる請求項９に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１２】
前記薬理学的有効量の持続型インスリン結合体が、１０mg/ml〜２００mg/mlの濃度である請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１３】
前記糖アルコールが、マンニトール、スクロース及びソルビトールからなる群より選択される１つ以上である請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１４】
前記糖アルコールの濃度が、全体溶液に対して１％(ｗ/ｖ)〜１５％(ｗ/ｖ)である請求項１３に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１５】
前記緩衝溶液が、酢酸緩衝溶液である請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１６】
前記緩衝溶液の濃度が、５〜５０ｍＭである請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１７】
前記等張化剤が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムからなる群より選択される請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１８】
前記等張化剤が、塩化ナトリウムである請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項１９】
前記等張化剤の濃度が、０．５mg/ml〜２０mg/mlである請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２０】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマー(ｐｏｌｏｘａｍｅｒ)である請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２１】
前記非イオン性界面活性剤が、０．００１％(ｗ/ｖ)〜０．０２％(ｗ/ｖ)の濃度である請求項２０に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２２】
前記安定化剤が、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群より選択される１つ以上の成分をさらに含む請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２３】
インスリンと免疫グロブリンＦｃ領域が、ポリエチレングリコールによって結合した持続型インスリン結合体；及びアルブミン-非含有の安定化剤を含み、前記安定化剤が、酢酸緩衝溶液、マンニトール、ポリソルベート２０及び塩化ナトリウムを含む持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２４】
前記安定化剤が、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、１０〜２０mg/mlの塩化ナトリウム及び０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０を含み、ｐＨが６．０である請求項２３に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２５】
前記安定化剤が、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、２％〜５％(ｗ/ｖ)のマンニトール、１〜６mg/mlの塩化ナトリウム及び０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０を含み、ｐＨが６．０である請求項２３に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２６】
ｍ−クレゾール、フェノール及びベンジルアルコールからなる群より選択される１つ以上の保存剤をさらに含む請求項１に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２７】
前記保存剤の濃度が、全体溶液に比べ、０．００１％〜１％(ｗ/ｖ)である請求項２６に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２８】
前記保存剤が、ｍ−クレゾールである請求項２６に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項２９】
複数回投与用である請求項２６に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
【請求項３０】
ａ）持続型インスリン結合体を製造する段階；及び
ｂ）ａ）段階で製造した持続型インスリン結合体と、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤として塩化ナトリウムを含む安定化剤を混合する段階を含み、前記緩衝溶液のｐＨの範囲が、５〜７である請求項１〜２５のいずれかに記載の持続型インスリン結合体の液状製剤の製造方法。
【請求項３１】
ａ）持続型インスリン結合体を製造する段階；及び
ｂ）ａ）段階で製造された持続型インスリン結合体と、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤として塩化ナトリウムを含む安定化剤及び保存剤を混合する段階を含み、前記緩衝溶液のｐＨの範囲が、５〜７である請求項２６〜２９のいずれかに記載の持続型インスリン結合体の液状製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性ペプチドであるインスリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型インスリン結合体及びアルブミン-非含有の安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含む持続型インスリン結合体の液状製剤及び前記製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、約５８００Ｄａの分子量を持つ５１個のアミノ酸から構成されるペプチドである。インスリンは、ヒト膵臓のβ細胞から分泌され、体内の血糖値を調節する重要な役割をする。インスリンの分泌量が不足したり、分泌されたインスリンが体内で正常に機能しない場合、血糖値が上昇し、糖尿病という代謝疾患を引き起こす。インスリンが正常に分泌されなかったり、体内で正常に機能しない場合、体内の血糖値は調節されないが、このタイプの糖尿病を２型糖尿病という。１型糖尿病は、膵臓が血糖値の増加を調節するインスリンの分泌を十分に生産できない場合に起こる。２型糖尿病は、主に化学物質で構成される経口血糖降下剤で治療し、場合によっては、インスリンを使用して治療する。一方、１型糖尿病は、インスリンの投与が必要とされる。
【０００３】
現在用いられているインスリン治療は、食事前後のインスリン注射である。しかし、このようなインスリン注射は、１日に３回持続的に使用しなければならないため、患者に激痛と不快感を与える。このような問題を解決するために多くの試みがなされてきた。その中の１つとして、ペプチド薬物の生体膜透過度を増加させて口腔又は鼻口を通じてペプチド薬物を体内に輸送することである。しかし、このような方法は、注射剤に比べ、ペプチドの体内輸送の効率が著しく低下するため、ペプチド薬物の体内活性を要求するレベルに維持するには、依然として困難がある。
【０００４】
一方、薬物を輸送するための他の方法は、薬物を過剰量皮下に投与した後、薬物の吸収を遅らせることで、１日に１回の投与だけで血中に持続的に薬物濃度を維持するようにすることである。一部の薬品(ランタス、サノフィ・アベンティス社)は、薬物として許可され、現在患者に投与されている。さらに、インスリンを脂肪酸で修飾することによって、インスリン結合体の結合を強化し、また、投与部位及び血中のアルブミンと結合させるなどの、生体内の持続時間を延長させる研究がなされ、薬品として許可されたレベミル(ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ)の開発に繋がった。しかし、このような方法は、投与部位に痛み発生の副作用があり、毎日の注射は、依然として患者に大きな負担である。
【０００５】
一方、ペプチド薬物を体内に吸収した後、血中のそれらの安定性を高め、また、 長期間血中に薬物の濃度を高く維持させるなど、ペプチド薬物の治療効果を最大化するための努力が続けられてきた。前記ペプチド薬物の持続型製剤は、患者に免疫反応を誘発させることなく、向上したペプチド薬物の安定性を促進し、また、薬物自体の十分に高い力価を維持しなければならない。ペプチド薬物の持続型製剤の製造のために、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの高溶解性を持つ重合体が、ペプチド薬物の表面を化学的に修飾するために使用された。
【０００６】
ＰＥＧは、標的ペプチドの特異的部位又は様々な部位に非特異的に結合してペプチドの分子量を増加させ、副作用を起こすことなく、腎臓におけるペプチドの損失及びペプチドの加水分解を防ぐ。例えば、特許文献１では、ＮＰＲ−Ａに結合してｃＧＭＰの生産を活性化して動脈内の血圧を下げ、また、うっ血性心不全(ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ)の治療剤として効果的なＢ型ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)にＰＥＧを取り付けることで、ＢＮＰの生理活性が維持できることについて記述している。同様に、特許文献２では、エキセンジン-４のリジン残基にＰＥＧを取り付けることによってエキセンジン-４の生体内の持続性を向上させる方法を記述している。しかし、これらの方法は、ＰＥＧの分子量を増加させることによって、ペプチド薬物の生体内の持続性を延長させることができるが、ＰＥＧの分子量が増加すれば、ペプチド薬物の力価は減少する。
【０００７】
生理活性タンパク質の生体内の安定性を高めるための他の方法として、融合タンパク質を製造する方法が開発された。この方法では、高い血中安定性を持つタンパク質の遺伝子と生理活性タンパク質の遺伝子を、遺伝子組み換えによって連結し、前記組み換え遺伝子に形質転換された動物細胞を培養して融合タンパク質を生産した。例えば、融合タンパク質は、タンパク質の安定性を高めるのに非常に効果的であるアルブミン又はその断片を、遺伝子組み換えを通じて所望の生理活性タンパク質と連結することによって製造できると報告されている(特許文献３、４、５)。
【０００８】
特許文献６では、ＧＬＰ-１、エキセンジン-４又はその類似体と、ヒト血清アルブミン又は免疫グロブリン断片(Ｆｃ)を、遺伝子組み換えを通じて連結することによって製造した融合タンパク質について記述している。特許文献７では、副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)又はその類似体と、免疫グロブリン断片(Ｆｃ)を連結することによって製造した融合タンパク質について記述している。これらの方法は、低いペグ化(ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ)収率の問題と非特異性を克服できるが、ペプチドの血中半減期の増加は著しくない。場合によっては、力価が低いという制限を依然として持つ。血中半減期を増加させる効果を最大化するために、様々な種類のペプチドリンカーが使用されたが、それらは、免疫反応を誘発させる可能性がある。さらに、BNPなどのジスルフィド結合を持つペプチドを使用する場合、ミスフォールディングの可能性が高く、ペプチドリンカーに天然に存在しないアミノ酸残基がある場合は、遺伝子組み換えによって生産することができない。
【０００９】
近年、活性減少の最小化及び安定性の向上を促進できる持続型タンパク質の薬物製剤として、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及び生理活性ポリペプチドを結合させて製造した結合体が、特許文献８(生体内の持続性が増加した生理活性ポリペプチド結合体)及び特許文献９(免疫グロブリン断片を用いたタンパク質結合体及びその製造方法)に記載されている。
【００１０】
さらに、特許文献１０(免疫グロブリン断片を用いたインスリン誘導体の薬物結合体)では、共有結合を通じて、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及びＰＥＧ修飾されたインスリン類似体を部位特異的に連結することによって製造したインスリン結合体が、血中半減期を改善し、また、体内の低血糖値のリスクを減少させることをと記述している。前記方法で、インスリンは、持続型インスリン結合体を製造するための生理活性ポリペプチドとして適用可能であり得る。持続型インスリン結合体を含む薬物を製造するためには、体内の効力を維持しながら、貯蔵及び輸送過程の間、光、熱又は添加剤内の不純物によって発生する熱誘導性変性、凝集、吸着又は加水分解などの物理化学的な変化を防ぐことが必須である。前記持続型インスリン結合体は、インスリンのペプチド自体に比べ、体積及び分子量が増加したため、安定化させるのが難しい。
【００１１】
異なるタンパク質は、それらの化学的な違いによって、貯蔵の間、異なる条件下で異なる比率で段階的に非活性化され得る。つまり、安定化剤による貯蔵期間の延長は、異なるタンパク質で同じではない。これらの理由から、タンパク質の貯蔵安定性を向上させるために用いられる安定化剤の適切な比率、濃度及び種類は、標的タンパク質の物理化学的な特性によって多様である。さらに、異なる安定化剤を一緒に使用する場合、競争的な相互作用及び副作用によって、それらの目的とは異なる逆効果を誘発し得る。また、貯蔵の間、貯蔵したタンパク質の本質又はそれらの濃度が変化するため、異なる効果が発生し得る。従って、溶液中のタンパク質を安定化させるための多くの努力と注意が必要である。特に、生体内の持続性及び安定性を高めた持続型インスリン結合体は、生理活性ペプチドであるインスリンと、免疫グロブリンＦｃ領域が結合した形態であるため、分子量及びそれらの体積が、普通のインスリンと著しく異なる。従って、タンパク質を安定化させるための特異的な組成が要求される。
【００１２】
また、生理活性ペプチドであるインスリン及び免疫グロブリンＦｃ領域は、物理化学的に異なるペプチド又はタンパク質であるため、同時に安定化させなければならない。しかし、前述のとおり、異なるペプチド又はタンパク質は、それらの物理化学的な違いによって、貯蔵の間、異なる条件下で異なる比率で段階的に非活性化され得る。また、それぞれのペプチド又はタンパク質に適した安定化剤が一緒に使用される場合、競争的な相互作用及び副作用によって、所望の効果とは異なる逆効果を誘発し得る。従って、持続型インスリン結合体において、生理活性ペプチドであるインスリンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化できる安定化剤の組成を探すのは非常に難しい。
【００１３】
近年、患者の便宜のために、繰り返して使用可能なタンパク質及びペプチドの製剤が開発された。しかし、この複数回使用の製剤は、繰り返し投与後、捨てる前まで、微生物による汚染を防ぐために、必ず保存剤を含まなければならない。保存剤を含む複数回使用の製剤は、単回使用の製剤に比べて、いくつか長点がある。例えば、単回使用の製剤では、投与量の違いによって多量の薬物が無駄になる。しかし、複数回使用の製剤を使用する場合、無駄になる製品の量を減らすことができる。さらに、複数回使用の製剤は、一定期間微生物の成長に対する心配なく、数回使用できる。また、１つの容器で使用することができるため、包装を最小化でき、よって、経済的に利益になる。
【００１４】
しかし、保存剤の使用は、タンパク質の安定性に影響を与えることがある。保存剤の使用において、最もよく知られている問題は、沈澱の発生である。タンパク質の沈澱は、薬物の効果を下げ、また、体内に投与する場合、予期せぬ免疫反応を誘発し得る。従って、微生物による汚染を防ぐために、タンパク質の安定性に影響を及ぼすことなく、安定性を維持する適切な濃度及び種類の保存剤を選択することが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第WO2006/076471号明細書
【特許文献２】米国特許第6924264号明細書
【特許文献３】国際公開第WO93/15199号明細書
【特許文献４】国際公開第WO93/15200号明細書
【特許文献５】欧州特許第EP413,622号明細書
【特許文献６】国際公開第WO02/46227号明細書
【特許文献７】米国特許第6756480号明細書
【特許文献８】韓国特許公告第10-0567902号明細書
【特許文献９】韓国特許公告第10-0725315号明細書
【特許文献１０】韓国特許公告第10-2011-0134210号明細書
【特許文献１１】韓国特許公告第10-2011-0134209号明細書
【特許文献１２】韓国特許公告第10-2011-0111267号明細書
【特許文献１３】国際公開第WO97/34631号明細書
【特許文献１４】国際公開第WO96/32478号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979
【非特許文献２】J. of ＰＨarmaceutical Sciences, Vol. 94, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このような背景から、持続型インスリン結合体に対してウィルスによる汚染のリスクなしに、長期間貯蔵できる持続型インスリン結合体の安定的な液状製剤を提供するために努力した結果、本発明者らは、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含む安定化剤を使用することで、持続型インスリン結合体の安定性を向上させることができ、また、保存剤を添加する場合、複数回使用が可能であり、さらに、経済的かつ安定的な液状製剤を製造できることを確認した液状製剤を開発し、本発明を完成した。
【００１８】
本発明の一つの目的は、生理活性ペプチドであるインスリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型インスリン結合体；及びアルブミン-非含有の安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含む持続型インスリン結合体の液状製剤を提供することである。
【００１９】
本発明の他の一つの目的は、複数回投与のために、前記持続型インスリン結合体及びアルブミン-非含有の安定化剤に加えて保存剤を含む持続型インスリン結合体の液状製剤を提供することである。
【００２０】
本発明の他の一つの目的は、前記液状製剤を製造する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の他の一つの目的は、生理活性ペプチドであるインスリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した持続型インスリン結合体を含む糖尿病を予防又は治療するための薬学的組成物を提供することである。
【００２２】
本発明の他の一つの目的は、前記組成物を糖尿病を患う個体に投与することを含む糖尿病を治療する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の持続型インスリン結合体の液状製剤は、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含有する安定化剤を含むが、ヒト血清アルブミン及び体内に潜在的な他の危険要素は含まないため、ウィルスによる汚染のリスクがない。また、インスリン及び免疫グロブリンＦｃ領域から構成される持続型インスリン結合体に対する優れた貯蔵安定性を提供できるため、天然型のタンパク質に比べ、より高い分子量と生体内で増大した生理活性の持続期間を持つ。さらに、保存剤を製剤に添加する場合、液状製剤を複数回安定的に使用できる。特に、本発明は、持続型インスリン結合体の優秀かつ安定的な液状製剤を提供する。このような本発明の液状製剤は、単回製剤に優れた貯蔵安定性を提供することができ、また、他の安定化剤及び凍結乾燥剤に比べ、より経済的な薬剤を提供することができる。また、本製剤は、従来のインスリン製剤に比べ、長期間体内でタンパク質活性を維持させることができるため、効果的な薬剤製剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】表７の組成物で持続型インスリン結合体の沈澱阻害の持続期間を４０℃で４週間肉眼で確認した結果を示す。沈澱阻害の持続期間は、結合体を貯蔵した後、タンパク質の沈澱が発生しない期間を示す。
【図２】４０℃の持続型インスリン結合体の液状製剤の不安定過酷試験のグラフを示す。対照群は、実施例１〜４(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)マンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)ポリソルベート２０)で確認された液状製剤である。これを基に、第一の試験群は(＃１)、液状製剤の中に高濃度の界面活性剤として０．２％(ｗ/ｖ)ポリソルベート２０を加えて製造し、第二の試験群(＃２)は、高濃度の等張化剤として２０mg/mlの塩化ナトリウムを加えて製造し、第三の試験群(＃３)は、０．２％(ｗ/ｖ)ポリソルベート２０及び２０mg/mlの塩化ナトリウムを両方加えて製造した。その結果、ｐＨ６．０の酢酸ナトリウム、濃度が２０mg/mlに増加された塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート２０を含む液状製剤の試験群＃２では、対照群(１０mg/mlの塩化ナトリウム)より高い安定性を維持した。しかし、ポリソルベート２０の濃度が、０．２％(ｗ/ｖ)(試験群＃１)に増加した場合、タンパク質の沈澱は、製剤を貯蔵した後の３週間後に発生した。塩化ナトリウム及びポリソルベート２０の濃度をそれぞれ２０mg/ml及び０．２％(ｗ/ｖ)に両方増加した場合、製剤を貯蔵した後の１週間後に液状製剤(＃３)にタンパク質の沈澱が発生した。
【００２５】
前記目的を達成するための一態様として、本発明は、生理活性ペプチドであるインスリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型インスリン結合体；及びアルブミン-非含有の安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含む持続型インスリン結合体の液状製剤を提供する。また、本発明は、製剤に保存剤を含む複数回使用可能な製剤を提供する。
【００２６】
また、本発明は、前記持続型インスリン結合体及びアルブミン-非含有の安定化剤に加えて保存剤を含む複数回投与のための持続型インスリン結合体の液状製剤を提供する。
【００２７】
本発明における「持続型インスリン結合体」とは、誘導体、変異体、前駆体及びその断片を含む生理活性インスリンと、免疫グロブリンＦｃ領域が結合した結合体を意味し、天然型インスリンに比べて、生体内における生理活性の持続期間が増大した結合体を意味する。本発明における、持続型インスリン結合体とは、インスリンが、非ペプチド性リンカー又は、ペプチド性リンカーを通じて免疫グロブリンＦｃ領域と結合したことを意味する。
【００２８】
本発明における「持続型」とは、天然型に比べ、生理活性の持続期間が増大したことを意味し、前記用語「結合体」とは、インスリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した形態を意味する。
【００２９】
持続型インスリン結合体は、天然型に比べ、活性効力の持続性が増大している。前記持続型インスリン結合体の種類は、天然型インスリンのアミノ酸の修飾、置換、追加又は除去によって製造されたインスリンの形態、インスリンがＰＥＧなどの生分解性重合体と結合した結合体、インスリンがアルブミン又は免疫グロブリンなどの持続性が高いタンパク質と結合した結合体、インスリンが体内のアルブミンとの結合親和力を持つ脂肪酸と結合した結合体又は生分解性ナノ粒子に封入されたインスリンの形態を含むが、それらに制限されるものではない。
【００３０】
本発明で使用される持続型インスリン結合体は、合成されたインスリンと免疫グロブリンＦｃ領域を結合させて製造する。前記２つを結合させる方法は、インスリンと免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチド性重合体を用いて架橋結合、又は遺伝子組み換え技術でインスリンと免疫グロブリンＦｃ領域を結合させた融合タンパク質を製造することであり得る。
【００３１】
本発明における「インスリン」とは、血中糖濃度の増加に反応して、膵臓から分泌されて、肝臓、筋肉又は脂肪組織で糖を取り込んで、グリコーゲンに変えることで、エネルギー源として脂肪の使用を止めて血糖値を調節する機能を持つペプチドを意味する。このようなペプチドは、天然型インスリン、基礎インスリン(basal insulin)及びそのアゴニスト、前駆体、誘導体、断片及びそれらの変異体を含む。
【００３２】
本発明における「天然型インスリン」とは、膵臓から分泌されるホルモンで、糖の吸収を促進し、脂肪の分解を抑制することで、体内の血糖値を調節する役割をする。インスリンは、血糖値を調節する機能を持たないプロインスリンというそれの前駆体のプロセッシングにより生成される。インスリンのアミノ酸配列は以下のようである。
α鎖：
Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｔｙｒ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-Ａｓｎ (配列番号１)
β鎖：
Ｐｈｅ-Ｖａｌ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ｔｙｒ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ (配列番号２)
【００３３】
本発明における「基礎インスリン(basal insulin)」とは、正常な毎日の血糖値の変動を調節するペプチドを意味し、このようなペプチドの例として、レベミル(levemir)、グラルギン(glargine)及びデグルデク(deglude)が含まれる。本発明における「インスリンアゴニスト」とは、インスリンの構造的な違いとは関係なく、インスリンと同様の生物学的活性を示しながら生体内のインスリン受容体に結合する物質を意味する。本発明における「インスリン変異体」とは、天然型インスリンとアミノ酸配列が１つ以上異なるペプチドを意味し、体内で血糖値を調節する機能を持つペプチドを意味する。インスリン誘導体は、天然型インスリンの一部のアミノ酸が、置換、追加、除去及び修飾の１つ又はそれらの組み合わせによって製造され得る。本発明における「インスリン誘導体」とは、天然型インスリンとアミノ酸配列の相同性が少なくとも８０％であり、アミノ酸残基の一部が、化学的に置換(例；α-メチル化、α-ヒドロキシル化)、除去(例；脱アミノ反応)、又は修飾(例；α-メチル化)され、体内で血糖値を調節する機能を持つペプチドを意味する。本発明における「インスリン断片」とは、天然型インスリンのＮ-末端又はＣ-末端に１つ以上のアミノ酸が、追加又は削除された断片を意味し、天然に存在しないアミノ酸(例；Ｄ型アミノ酸)にも付加され得る。前記インスリン断片は、体内で血糖値を調節する機能を持つ。
【００３４】
インスリンのアゴニスト、誘導体、断片及び変異体のそれぞれの製造方法は、単独で又は同時に適用可能である。例えば、本発明の範囲は、体内の血糖値を調節する機能を持ちながらそれらの天然型ペプチドとアミノ酸配列が１つ以上異なり、Ｎ-末端のアミノ酸残基が脱アミド化されたペプチドを含む。本発明で使用されるインスリンは、組み換え技術による生産又は固相合成法によって合成する方法によっても製造することができる。また、本発明で使用されるインスリンのβ鎖のアミノ末端に非ペプチド性重合体が結合され得る。このような非ペプチド性重合体は、本発明でリンカーとして利用され得る。リンカーとして前記非ペプチド性重合体をインスリンと結合させることで、その活性を維持しながら、インスリンの安定性を向上させることができる。
【００３５】
本発明における「非ペプチド性重合体」とは、１つ以上の繰り返し単位と結合した生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を通じて互いに連結される。本発明における前記「非ペプチド性重合体」は、「非ペプチド性リンカー」と混用して使用され得る。
【００３６】
本発明で使用される非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール及びプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチレン
ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(ＰＬＡ)及びポリ乳酸-グリコール酸共重合体(ＰＬＧＡ)などの生分解性高分子；脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択され得、好ましくは、ポリエチレングリコールが非ペプチド性重合体として用いられるが、それらに制限されるものではない。本発明の範囲は、当分野に公知のそれらの誘導体を含み、当分野で利用可能な技術を用いて容易に製造することができる。
【００３７】
従来のインフレーム融合方法によって製造される融合タンパク質を用いたペプチド性リンカーは、体内でタンパク質分解酵素で容易に切断され得る。従って、担体を用いる場合、活性薬物の血中半減期を十分に増大させることができない。しかし、タンパク質分解酵素に対して抵抗性のある重合体を用いる場合、ペプチドの血中半減期を、担体を用いた場合と同様に維持させることができる。従って、任意の非ペプチド性重合体は、前述の機能、すなわち、タンパク質分解酵素に対する抵抗性、を持つものであれば、制限なく用いることができる。前記非ペプチド性重合体は、１〜１００ＫＤａの分子量であり、好ましくは、１〜２０ＫＤａである。また、本発明の非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域と結合し、１種類の重合体又は異なる種類の重合体の組み合わせであり得る。
【００３８】
前記非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域及びタンパク質薬物と結合できる反応基を有してもよい。前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群より選択されるのが好ましい。前記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオン酸、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートであり得る。特に、前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応アルデヒド基を持つ場合、非特異的結合を最小化でき、各末端で非ペプチド性重合体と、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンを効果的に連結することができる。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成される最終産物は、アミド結合によって結合したものより遥かに安定的である。アルデヒド反応基は、低いｐＨでＮ-末端に選択的に結合し、例えば、ｐＨ９．０という高いｐＨでリジン残基と共有結合を形成する。前記非ペプチド性重合体の２つの末端の反応基は、同じか又は異なることがある。例えば、非ペプチド性重合体は、一方の末端にマレイミド基を、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端にヒドロキシ基を持つポリエチレングリコールを、非ペプチド性重合体として用いる場合、前記ヒドロキシ基が、公知の化学反応による多様な反応基で活性化されたり、又は商業的に利用可能な修飾された反応基を持つポリエチレングリコールが、本発明の持続型インスリン結合体を製造するために利用され得る。
【００３９】
好ましくは、前記非ペプチド性重合体が、インスリンのβ鎖Ｎ-末端に結合され得る。
【００４０】
本発明のインスリンは、非ペプチド性重合体で修飾され得る。
【００４１】
免疫グロブリン断片を用いて持続型インスリン結合体を開発する場合、生理活性ポリペプチドが、低血糖を示すことなく、薬物の持続時間を増大させるために、ＰＥＧによって修飾されると、その力価が低下され得る。しかし、その働きは、持続型インスリン結合体の長点になる。従って、ＰＥＧによって修飾されたインスリンは、非ペプチド性重合体を通じて免疫グロブリンＦｃ領域と結合し得る。変形インスリンに使用され得る非ペプチド性重合体の種類は、前述のとおりであり、好ましくは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)である。前記ＰＥＧ修飾されたインスリンにおいて、ＰＥＧは、インスリンのα鎖Ｎ-末端又はβ鎖の特異的なリジン残基に選択的に結合する。前記インスリンを修飾するＰＥＧは、好ましくは、末端にアルデヒド基又はスクシニル基を含むが、より好ましくはスクシニル基を含む。
【００４２】
本発明の持続的インスリン結合体の製造方法及び効果は、特許文献１０，１１，１２に開示されている。当業者らは、これらの文献の説明によって本発明で使用される持続型インスリン結合体を製造することができる。また、本発明者らは、以前に、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ-末端をモノペグ化し、また、インスリンβ鎖の１番位置のフェニルアラニンに同様に修飾して持続型インスリン結合体を製造する方法を提供した。
【００４３】
本発明で使用されるインスリンは、リンカーとして非ペプチド性重合体を通じて担体と結合する。本発明で使用可能な前記担体は、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、トランスフェリン及びＰＥＧからなる群より選択され得るが、好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域であり得る。
【００４４】
本発明の持続型インスリン結合体は、非ペプチド性リンカーを通じて免疫グロブリンＦｃと結合するインスリンを含み、持続性及び安定性を持つ。本発明において、免疫グロブリンＦｃは、免疫グロブリン断片と混用して使用することができる。
【００４５】
さらに、免疫グロブリンＦｃ領域は、全体免疫グロブリン分子に比べて、比較的に低分子量であるため、それらを使用することで、高収率を得られるだけでなく、結合体を製造及び精製する上で有益であり得る。さらに、免疫グロブリンＦｃ領域は、抗体のサブクラスによってアミノ酸配列が異なるため、高い非均一性を持つＦｃ断片は含まない。従って、免疫グロブリンＦｃ領域の同質性が増加し、抗原性は少ないことが期待できる。
【００４６】
本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域、重鎖不変領域１(ＣＨ１)及び軽鎖不変領域(ＣＬ１)を除いた、免疫グロブリンの重鎖不変領域２(ＣＨ２)及び重鎖不変領域３(ＣＨ３)を含むペプチドを意味する。さらに、重鎖不変領域にヒンジ領域を含んでもよい。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型タンパク質より実質的に同程度又はよりよい生理機能を持つ限り、重鎖と軽鎖可変領域を除いて、重鎖不変領域１(ＣＨ１)及び/又は軽鎖不変領域１(ＣＬ１)を含むＦｃ領域の一部又は全体を含んでもよい。また、ＣＨ２及び/又はＣＨ３の比較的に長い部分のアミノ酸配列の欠失を持つ断片であり得る。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つ以上のドメインと免疫グロブリンのヒンジ領域との組み合わせ(又はヒンジ領域の一部)、及び６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の２量体を含んでもよい。
【００４７】
さらに、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列及びそれらの配列誘導体(ｍｕｔａｎｔ)を含む。アミノ酸配列の誘導体は、１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はそれらの組み合わせによって、天然アミノ酸配列とは異なる配列を持つ。例えば、ＩｇＧ Ｆｃにおいて、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番位置のアミノ酸残基が、修飾に適した標的として利用され得る。
【００４８】
さらに、ジスルフィド結合を形成可能な領域の除去、天然型Ｆｃ形態のＮ-末端の数個のアミノ酸残基の欠失、又は天然型Ｆｃ形態のＮ-末端のメチオニン残基の付加を持つ誘導体を含む、他の様々な誘導体が可能である。さらに、エフェクター機能を除去するために、Ｃ１ｑ結合部位及び抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)部位などの補体結合部位が除去され得る。免疫グロブリンＦｃ領域のこのような配列の誘導体を製造する技術は、特許文献１３、１４などに記載されている。
【００４９】
分子の活性を全体的に変えないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸の交換は、当分野で知られている(非特許文献１)。最も通常に起きる交換は、アミノ酸残基 Ａｌａ/Ｓｅｒ、Ｖａｌ/Ｉｌｅ、Ａｓｐ/Ｇｌｕ、Ｔｈｒ/Ｓｅｒ、Ａｌａ/Ｇｌｙ、Ａｌａ/Ｔｈｒ、Ｓｅｒ/Ａｓｎ、Ａｌａ/Ｖａｌ、Ｓｅｒ/Ｇｌｙ、Ｔｈｙ/ＰＨｅ、Ａｌａ/Ｐｒｏ、Ｌｙｓ/Ａｒｇ、Ａｓｐ/Ａｓｎ、Ｌｅｕ/Ｉｌｅ、Ｌｅｕ/Ｖａｌ、Ａｌａ/Ｇｌｕ及びＡｓｐ/Ｇｌｙ)間の交換である。前記Ｆｃ領域は、場合によっては、リン酸化、硫酸化、アクリル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化及びアミド化などに修飾され得る。
【００５０】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同様の生物活性を持ち、又は、例えば、熱、ｐＨなどに対する構造的な安定性を増大させた誘導体である。
【００５１】
さらに、このようなＦｃ領域は、ヒト及び牛、羊、豚、マウス、ラビット、ハムスター、ラット又はモルモットを含む他の動物から分離した天然型から得てもよく、又は形質転換された動物細胞或いは微生物から得られた組み換え型又はそれらの誘導体であり得る。ここで、全体免疫グロブリンをヒト又は動物から分離及びタンパク質分解酵素で処理することによって、天然型の免疫グロブリンから得ることができる。パパインは、天然型の免疫グロブリンをＦａｂ及びＦｃ領域に切断し、ペプシン処理で、ｐＦ'ｃ及びＦ(ａｂ)２断片が生成される。これらの断片を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーに供し、Ｆｃ又はｐＦ'ｃに分離することができる。好ましくは、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から取得した組み換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００５２】
さらに、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖又は天然型に比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であり得る。前記免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増加、減少又は除去は、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を利用した遺伝工学的方法などの当分野で通常の方法により達成され得る。Ｆｃ領域からの糖鎖の除去は、補体(Ｃ１ｑ)との結合親和力の著しい低下及び抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞障害の減少又は喪失をもたらすことから、生体内に不要な免疫反応を誘発しない。このような点で、糖鎖が除去されたり非糖化された形態の免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物の担体としての本来の目的により適切であり得る。
【００５３】
本発明における「糖鎖の除去(ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ)」とは、酵素でＦｃ領域から糖の部分を除去することを意味し、「非糖鎖化(ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ)」とは、原核動物、好ましくは、大腸菌によって糖鎖化されてない形態で製造されるＦｃ領域を意味する。
【００５４】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト又は牛、羊、豚、マウス、ラビット、ハムスター、ラット及びモルモットなどの動物から由来され得るが、好ましくは、ヒト由来であり得る。
【００５５】
さらに、免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭから由来し、又はそれらの組み合わせ或いはそれらのハイブリットによって製造したものである。好ましくは、ヒトの血液に最も豊富なタンパク質の中のＩｇＧ又はＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来である。
【００５６】
本発明における「組み合わせ」とは、同様の起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが、異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合して２量体又は多量体を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなる群より選択される２つ以上の断片から２量体又は多量体が形成され得る。
【００５７】
本発明における「ハイブリット」とは、２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ領域をコードする配列が、単鎖免疫グロブリンＦｃ領域内に存在することを意味する。本発明において、様々な形態のハイブリットが可能である。すなわち、ドメインのハイブリットは、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群より選択される１つ〜４つのドメインを含んでもよく、ヒンジ領域を含んでもよい。
【００５８】
一方で、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明では、組み合わせ又はそれらのハイブリットを含む。好ましくは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のサブクラスであり、最も好ましくは、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)などのエフェクター機能をほとんど持たないＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【００５９】
本発明の薬物担体として、最も好ましい免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖化Ｆｃ領域である。前記ヒト由来のＦｃ領域は、非ヒト由来のＦｃ領域より好ましく、ヒトの体内で抗原として作用して、抗原に対する新しい抗体の生成などの好ましくない免疫反応を起こし得る。
【００６０】
本発明の持続型インスリン結合体の液状製剤は、治療学的な有効量の持続型インスリン結合体を含む。本発明で使用される持続型インスリン結合体の濃度は、０．１mg/ml〜２００mg/mlであり、好ましくは、１０mg/ml〜２００mg/mlである。本発明の持続型インスリン結合体の液状製剤は、インスリン結合体が低濃度で存在する場合だけでなく、高濃度で存在する場合でも、沈澱させることなく安定的に貯蔵することができることから、体内に高濃度のインスリンを安定的に提供することができる。
【００６１】
本発明における「安定化剤」とは、持続型インスリン結合体を安定的に貯蔵できるようにする物質を意味する。前記用語「安定化」とは、一定時間、特定の貯蔵条件下で活性成分の損失が特定量未満、一般的に１０％未満であることを意味する。製剤は、５±３℃で２年、２５±２℃で６ヶ月又は４０±２℃で１〜２週間貯蔵した後、持続型インスリン結合体の残存率が９０％以上で、より好ましくは９２〜９５％である場合に安定的な製剤として見なされる。持続型インスリン結合体のようなタンパク質において、それらの貯蔵安定性は、持続型インスリン結合体に対する抗原性物質の潜在的な形成を抑制するためだけでなく、正確な投与量を提供するために重要である。貯蔵の間、組成物内の凝集体又は断片を形成して抗原性化合物の形成を生成しない限り、持続型インスリン結合体の１０％の損失は、実際の投与時に許容される。
【００６２】
本発明の前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、等張化剤として塩化ナトリウム及び持続型インスリン結合体を安定化させる非イオン性界面活性剤を含むのが好ましい。
【００６３】
緩衝溶液は、急激なｐＨ変化を防ぐために溶液のｐＨを維持して持続型インスリン結合体を安定化させる働きをする。緩衝溶液は、アルカリ塩(ナトリウム又はリン酸カリウム又はこれらの水素又は二水素塩)、クエン酸ナトリウム/クエン酸、酢酸ナトリウム/酢酸及び当業者に公知の任意の他の薬学的に許容可能なｐＨ緩衝溶液、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。このような緩衝溶液の好ましい例は、酢酸ナトリウム緩衝溶液(Ｎａ-酢酸塩緩衝溶液)である。酢酸ナトリウム緩衝溶液を構成する酢酸の濃度は、好ましくは５ｍＭ〜１００ｍＭであり、より好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭである。緩衝溶液のｐＨは、好ましくは４．０〜８．０であり、より好ましくは４．０〜７．０であり、さらに好ましくは５．０〜７である。
【００６４】
糖アルコールは、持続型インスリン結合体の安定性を向上させる役割をする。本発明において、糖アルコールは、好ましくは製剤の全体量に対して１〜２０％(ｗ/ｖ)の量、より好ましくは２〜１５％(ｗ/ｖ)の量で使用することである。本発明の糖アルコールの有用な例としては、マンニトール及びソルビトールを含むが、好ましくはマンニトールである。
【００６５】
等張化剤は、インスリン結合体の溶液を体内に投与する場合、適切な浸透圧を維持させる効果を持ち、同様に溶液内の持続型インスリン結合体をより安定化させる。等張化剤は、一般的に、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムを含む水溶性無機塩であるが、好ましくは塩化ナトリウムである。等張化剤の含量は、全ての混合物が含まれた液状製剤が等張液になるように、製剤に含まれた成分の種類と量によって適切に調節され得る。例えば、等張化剤は、１mg/ml〜２０mg/mlの濃度で使用され得る。
【００６６】
非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を下げることで疎水性表面上のタンパク質の吸収又は凝集を防止する。本発明における非イオン性界面活性剤の有用な例としては、ポリソルベート系、ポロキサマー系及びそれらの組み合わせを含むが、その中でポリソルベート系が好ましい。ポリソルベート系の非イオン性界面活性剤の中には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０があり、最も好ましい非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０である。
【００６７】
非イオン性界面活性剤を液状製剤の中で高濃度で使用することは、不適切であり、それは、高濃度の非イオン性界面活性剤が、ＵＶ-分光法又は等電焦点法などの分析法でタンパク質の濃度を測定及びタンパク質の安定性を評価するとき、干渉効果を誘導するためであり、従って、正確にタンパク質の安定性を評価する上で困難が生じる。従って、本発明の液状製剤は、好ましくは０．２％(ｗ/ｖ)以下の低濃度で前記非イオン性界面活性剤を含むが、より好ましくは０．００１％〜０．０２％(ｗ/ｖ)である。
【００６８】
本発明の一実施例によると、緩衝溶液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤の存在下で、等張化剤として塩化ナトリウムを添加する場合、持続型インスリン結合体の貯蔵安定性が著しく増加した。特に、持続型インスリン結合体は、ｐＨ６．０で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０〜２０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)マンニトール及び０．０２％(ｗ/ｖ)ポリソルベート２０を含む製剤で著しく高い安定性を示した。また、持続型インスリン結合体の安定性は、等浸透圧を発生させるため、ｐＨ６．０で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１．２〜５．９mg/mlの塩化ナトリウム、２〜５％(ｗ/ｖ)マンニトール及び０．０２％(ｗ/ｖ)ポリソルベート２０を含む製剤で著しく高かった。これらは、等張化剤として塩化ナトリウムを緩衝溶液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤と一緒に用いる場合、シナジー効果をもたらすことで、持続型インスリン結合体の安定性が向上された。
【００６９】
本発明の前記安定化剤は、アルブミンを含有しないのが好ましい。タンパク質の安定化剤として利用可能なヒト血清アルブミンは、ヒトの血清から製造するため、ヒト由来の病原性ウィルスに汚染される可能性が常にある。ゼラチン又はウシ血清アルブミンは、疾患を起こしたり又は一部患者に、アレルギー反応を誘発しやすい。本発明の前記安定化剤は、ヒト又は動物由来の血清アルブミン又は精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないため、ウィルスによる汚染を起こす可能性がない。
【００７０】
さらに、本発明の前記安定化剤は、糖類、多価アルコール又は中性アミノ酸をさらに含んでもよい。持続型インスリン結合体の貯蔵安定性を向上させるためにさらに添加してもよい糖類の好ましい例としては、マンノース、グルコース、フコース及びキシロースなどの単糖類と、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース及びデキストランなどの多糖類を含む。多価アルコールの好ましい例としては、プロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量のポリプロピレングリコール及びそれらの組み合わせを含む。
【００７１】
一方、本発明の持続型インスリン結合体の液状製剤は、複数回使用の製剤の微生物による汚染を防ぐ目的で、前述した結合体、緩衝溶液、等張化剤、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤の他に、保存剤をさらに含んでもよい。
【００７２】
本発明における「保存剤」とは、抗菌剤として作用するために医薬製剤に添加される化合物を意味する。保存剤の例としては、ベンゼトニウム、クロルヘキシジン フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、o−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、 塩化ベンザルコニウム、硝酸フェニール水銀、チメロサール及び 安息香酸を含むが、それらに制限されるものではない。保存剤は、１種類を単独で使用したり、又は ２つ以上の種類の保存剤を任意に組み合わせて使用してもよい。好ましくは、本発明の液状製剤は、保存剤として、ｍ−クレゾール、フェノール及びベンジルアルコール中１つ以上を含んでもよい。本発明の液状製剤は、０．００１％〜１％(ｗ/ｖ)の保存剤、好ましくは０．００１％〜０．５％(ｗ/ｖ)の保存剤及びより好ましくは０．００１％〜０．２５％(ｗ/ｖ)の保存剤を含んでもよい。
【００７３】
本発明の一実施例において、０．２７％(ｗ/ｖ)のｍ−クレゾールを保存剤として本発明の液状製剤に添加し、インスリン結合体の安定性におけるクレゾールの効果を評価した。その結果、結合体は、沈澱することなく、保存剤を添加した製剤の中で安定性を維持することが確認された。従って、安定化剤を加えた保存剤を含む本発明のインスリン結合体の液状製剤は、複数回投与に使用され得る。
【００７４】
本発明の液状製剤は、前述した緩衝溶液、等張化剤、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤の他に、本発明の効果が影響されない限り、当分野に公知のその他の成分又は物質を選択的にさらに含んでもよい。
【００７５】
持続型インスリン結合体に安定性を提供する本発明による持続型インスリン複合体のアルブミン-非含有の液状製剤は、ウィルスによる汚染のリスクがないだけでなく、簡単な製剤で、優れた貯蔵安定性を提供することから、本製剤は、他の安定化剤又は凍結乾燥製剤に比べ、より経済的に提供され得る。
【００７６】
また、本発明の液状製剤は、天然型に比べ、生理活性の持続期間が増大した持続型インスリン結合体を含むため、通常のインスリン製剤に比べ、体内でタンパク質活性を長期間維持させる効率的な薬物製剤として利用され得る。また、本液状製剤は、高濃度だけでなく、低濃度の持続型インスリン結合体の貯蔵に対しても優れた安定性を提供する。
【００７７】
他の態様として、本発明は、本発明の液状製剤を製造する方法を提供する。
【００７８】
本発明の液状製剤は、持続型インスリン結合体の生成と、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含む安定化剤と持続型インスリン結合体生成物の混合によって製造され得る。また、複数回使用のための持続型インスリン結合体の安定的な液状製剤は、前記安定化剤に加えて保存剤を添加して製造され得る。
【００７９】
他の様態として、本発明は、前記インスリン結合体を含む、糖尿病を予防又は治療するための組成物を提供する。
【００８０】
前記インスリン結合体は、液状製剤であり得、前述したとおりである。
【００８１】
本発明における「糖尿病」とは、インスリンの分泌が不足したり、又はインスリンが正常に機能できない代謝疾患を意味する。本発明の組成物を個体に同時投与することによって、血糖値を調節し、糖尿病を治療することができる。
【００８２】
本発明における「治療」とは、本発明の組成物を投与することで糖尿病の症状を緩和又は有益に変化できる全ての行為を意味し、前記用語、「予防」とは、組成物を投与することで糖尿病の発病を抑制又は遅延させる全ての行為を意味する。症状を緩和又は有益に変化させる糖尿病の治療は、糖尿病を発生し得るどんな動物にも適用され得る。そのような動物の例としては、ヒト及び霊長類だけでなく、牛、豚、羊、馬、犬及び猫などの家畜も制限なく含むが、好ましくはヒトであり得る。
【００８３】
本発明における「投与」とは、任意の適した方法で患者に所定量の物質を導入することを意味し、前記組成物は、薬物が標的組織に到達できるものであれば、任意の一般経路を通じて投与され得る。前記投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与を含むが、それらに制限されるものではない。しかし、ペプチドは、経口投与で消化されるため、経口投与する組成物の活性成分を、胃による分解から保護するためにコーティングしたり、製剤化する必要がある。好ましくは、結合体は、注射剤の形態で投与され得る。さらに、前記組成物は、活性物質を標的細胞に輸送できる任意の装置を用いて投与してもよい。
【００８４】
さらに、本発明の薬学的組成物は、薬物の活性組成物の種類だけでなく、治療する疾患の種類、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、並びに疾患の重症度を含む様々な要因によって決定され得る。
【００８５】
さらに、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。本発明における「薬学的に許容可能な担体」とは、個体を刺激することなく、投与される物質の生物活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。経口投与の場合、薬学的に許容可能な担体は、結合剤、滑澤剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、色素及び香料を含んでもよい。注射用製剤の場合、薬学的に許容可能な担体は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤及び安定化剤を含んでもよい。局所投与用製剤の場合、薬学的に許容可能は担体は、基剤、賦形剤、潤滑剤及び保存剤を含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を添加することで様々な形態に製剤され得る。例えば、経口投与の場合、薬学的組成物は、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー、懸濁液、シロップ又はウエハースに製剤され得る。注射剤の場合、薬学的組成物は、単回投与アンプル又は複数回投与の形態として製剤され得る。薬学的組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル及び徐放性製剤に製剤され得る。
【００８６】
本発明の持続型インスリン結合体の液状製剤は、薬学的有効量の持続型インスリン結合体を含む。一般的に、例として、ランタス(Ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｌａｒｇｉｎｅ;Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ)の治療有効量は、１日当たり約０．０７ｍｇ〜３．７ｍｇである。一方で、本発明のインスリンの最大の許容可能な容量は、頻繁な投与の必要がなく、数週間に１回だけ投与が必要で、１日当たり最大で約０．５ｍｇ〜２５．９ｍｇである。
【００８７】
他の態様として、本発明は、前記持続型インスリン結合体を含む組成物を糖尿病を患う個体に投与することを含む、糖尿病を予防又は治療する方法を提供する。
【００８８】
前記持続型インスリン結合体を含む本発明の組成物は、体重増加の副作用を起こすことなく、週１回の単一投与でも、血糖値を効果的に下げるため、糖尿病を予防又は治療するために効果的に使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下、本発明は、実施例を参考してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、単に例示するためのものであり、本発明は、これらの実施例によって制限されることを意図しない。
【００９０】
実施例１：持続型インスリン結合体の液状製剤の安定性を決定する因子の確認
体内の低血糖値を起こすことなく、血中半減期を増大させる前記持続型インスリン結合体を開発した。前記インスリン結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及びインスリンを、共有結合を通じて部位特異的に結合させており、これらは、血中半減期は増大し、低血糖値のリスクは著しく減少させる。
【００９１】
前記持続型インスリン結合体の液状製剤の安定性を確認するために、前記製剤を表１の組成で製造し、４０℃で２週間貯蔵した後、それらの安定性をイオン交換クロマトグラフィー(ＩＥ-ＨＰＬＣ)で分析した。
【００９２】
この際、結合体の安定性におけるそれらの効果を決定するために比較した主要な因子は、ｐＨ、緩衝溶液の種類及び濃度、等張化剤の種類、マンニトールからなる糖アルコールの濃度、界面活性剤の種類、ポリソルベート２０からなる界面活性剤の濃度、その他の添加剤の存在及びメチオニンと塩化ナトリウムの同時添加である。
【００９３】
表１のＩＥ-ＨＰＬＣ(％)の結果は、初期結果と比較した持続型インスリン結合体の残存率を示す(Ａｒｅａ％/Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％)の値で表す。
【００９４】
【表１】
2018119005.tif 000003
【００９５】
【表２】
2018119005.tif 000004
【００９６】
分析の結果、持続型インスリン結合体の液状製剤は、表２に示すように、ｐＨ５．６〜６で、酢酸ナトリウムを含む緩衝溶液、塩化ナトリウムからなる等張化剤、マンニトールからなる糖アルコール、ポリソルベート２０からなる界面活性剤を含有するときに最も安定的であった。
【００９７】
実施例２：等張化剤及び界面活性剤の濃度による持続型インスリン結合体の安定性の評価  実施例１(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)で確認された液状製剤を基に、等張化剤及び界面活性剤の濃度による持続型インスリン結合体の安定性を測定した。この際、等張化剤及び界面活性剤の濃度は、商業的に利用可能な製剤及び許可機関で勧告する最大に許容可能な範囲内に設定した。
【００９８】
持続型インスリン結合体の液状製剤は、表３の組成で製造し、４０℃で４週間貯蔵した後、ＩＥ-ＨＰＬＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥ-ＨＰＬＣ)で前記安定性を測定した。
【００９９】
表４のＩＥ-ＨＰＬＣ(％)及びＳＥ-ＨＰＬＣ(％)の結果を、初期結果と比較した持続型インスリン結合体の残存率を示すＡｒｅａ％/Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％の値で表す。
【０１００】
【表３】
2018119005.tif 000005
【０１０１】
【表４】
2018119005.tif 000006
N/A:凝集による沈澱でデータの利用不可
【０１０２】
前記に示すように、実施例２(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)で確認された液状製剤の塩化ナトリウムの濃度を２０mg/ml(＃２)になるように増加した場合、結合体の安定性が最も高かった。一方で、ポリソルベート２０の濃度を０．２％(ｗ/ｖ)(＃１)になるように増加した場合、製剤を貯蔵した３週間後にタンパク質の沈澱が発生し、貯蔵の４週間後に沈澱量が増加した(表４)。
【０１０３】
実施例３：糖アルコールの種類による持続型インスリン結合体の安定性の評価
持続型インスリン結合体の貯蔵安定性を向上させるために製剤に添加できる糖アルコールの例としては、マンノース、グルコース、フコース及びキシロースなどの単糖類；及びラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース及びデキストランなどの多糖類を含む。それらの中で、スクロースは、脱アミド化減少効果が確認されたため(非特許文献２)、スクロースによる持続型インスリン結合体の安定性の効果を測定した。この際、スクロースの濃度は、商業的に利用可能な製剤及び機関の許可で勧告される最大に許容可能な範囲内であった。
【０１０４】
持続型インスリン結合体の液状製剤は、表５の組成で製造し、４０℃で４週間貯蔵した後、それらの安定性をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣを用いて安定性試験を行うことで評価した。表６のＩＥ-ＨＰＬＣ(％)及びＳＥ-ＨＰＬＣ(％)は、初期結果と比べた持続型インスリン結合体の残存率を示すＡｒｅａ％/Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％の値で表す。
【０１０５】
【表５】
2018119005.tif 000007
【０１０６】
【表６】
2018119005.tif 000008
【０１０７】
前記で示すように、持続型インスリン結合体(＃１)の貯蔵安定性を向上させるために添加できる糖アルコールであるスクロースをマンニトールの代わりに添加した場合、製剤の安定性が、液状製剤の対照群(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)と同程度であった。また、スクロース(＃３)を含む液状製剤の塩化ナトリウムの濃度を２０mg/mlになるように増加した場合、液状製剤の安定性は、液状製剤の対照群と同程度であった。さらに、ポリソルベート２０の濃度が、０．２％(ｗ/ｖ)(＃２)になるように増加した場合、液状製剤の安定性は、ポリソルベート２０の濃度を増加してない群に比べて減少しており、貯蔵の３週間後に、タンパク質の沈澱が発生した。＃２の場合、沈澱を除去した後に純度を測定し、＃２の安定性が他の製剤に比べて低下したことを確認した(表６)。
【０１０８】
実施例４：様々なｐＨにおける持続型インスリン結合体の安定性の評価
緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート２０からなる液状製剤を基に、様々なｐＨ下で持続性インスリン結合体の安定性を測定した。
【０１０９】
持続型インスリン結合体の液状製剤は、表７の組成で製造し、４０℃で４週間貯蔵した後、肉眼によってタンパク質の沈澱を調査し製剤の安定性を測定した。
【０１１０】
【表７】
2018119005.tif 000009
【０１１１】
図１で、タンパク質の沈澱(週)阻害の持続期間は、４０℃で製剤を貯蔵した後、タンパク質の沈澱が発生しない期間を表す。前記に示すように、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２(＃１、＃４及び＃７)の場合、４０℃で貯蔵の1週間以内に、タンパク質の沈澱が発生した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６(＃２、＃５及び＃)の場合、４０℃で貯蔵の２週間以内に、タンパク質の沈澱が発生した。これらの中で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０(＃３、＃６及び＃９)の場合、４０℃で貯蔵の３週まで、タンパク質の沈澱が発生しなかった。これらの中で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で、塩化ナトリウムの濃度が２０mg/mlになるように増加した場合(＃６)、結合体の安定性が最も高かった(図１)。
【０１１２】
実施例５：高濃度の等張化剤及び界面活性剤の単独に又は組み合わせによる持続型インスリン結合体の安定性の評価
実施例１〜４(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)で確認された液状製剤を基に、高濃度の等張化剤として２０mg/mlの塩化ナトリウム、高濃度の界面活性剤として０．２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０を単独又は同時に添加した。その後、製剤の安定性を比較した。
【０１１３】
持続型インスリン結合体の液状製剤は、表８の組成で製造し、４０℃で４週間貯蔵した後、それらの安定性をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣを用いた安定性試験により測定した。
【０１１４】
表９のＩＥ-ＨＰＬＣ(％)及びＳＥ-ＨＰＬＣ(％)は、初期結果と比べた持続型インスリン結合体の残存率を示すＡｒｅａ％/Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％の値で表す。
【０１１５】
【表８】
2018119005.tif 000010
【０１１６】
【表９】
2018119005.tif 000011
【０１１７】
前記に示すように、対照群の液状製剤(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)に比べて、塩化ナトリウムの濃度が、２０mg/mlになるように増加した場合、結合体の安定性が最も高かった。一方で、ポリソルベート２０の濃度が０．２％(ｗ/ｖ)(＃１)になるように増加した場合、タンパク質の沈殿は、貯蔵の３週間後、タンパク質の沈殿が発生し、貯蔵の４週間後には増加した。また、高濃度の等張化剤として２０mg/mlの塩化ナトリウム及び高濃度の界面活性剤として０．２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０を同時に添加する場合(＃３)、タンパク質の沈殿は、４０℃で貯蔵の２週間以内に発生した(表９又は図２)。
【０１１８】
実施例６：低濃度の等張化剤及び低濃度の糖アルコールの添加による持続型インスリン結合体の安定性の評価
実施例１〜４(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)で確認された液状製剤を基に、低濃度の等張化剤として１．２〜５．９mg/mlの塩化ナトリウム及び低濃度の糖アルコールとして２〜５％の(ｗ/ｖ)のマンニトールの組み合わせを含む液状製剤を製造して前記持続型インスリン結合体の安定性を測定した。
【０１１９】
持続型インスリン結合体の液状製剤は、表１０の組成で製造し、２５℃で４週間貯蔵した後、結合体の安定性をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣを用いた安定性試験により測定した。
【０１２０】
表１１のＩＥ-ＨＰＬＣ(％)及びＳＥ-ＨＰＬＣ(％)は、初期結果と比べた持続型インスリン結合体の残存率を示すＡｒｅａ％/Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％の値で表す。
【０１２１】
【表１０】
2018119005.tif 000012
【０１２２】
【表１１】
2018119005.tif 000013
【０１２３】
前記に示すように、等張化剤として１．２〜５．９mg/mlの塩化ナトリウム及び糖アルコールとして２〜５％(ｗ/ｖ)のマンニトール(＃１、＃２)を含む液状製剤は、実施例１〜４(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)で確認された液状製剤と同程度の安定性を示した。
【０１２４】
実施例７：保存剤の添加による持続型インスリン結合体の安定性の評価
実施例１〜４で確認された液状製剤(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)と実施例６(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１．２〜５．９mg/mlの塩化ナトリウム、２〜５％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)で確認された等浸透圧の生成のための液状製剤における保存剤の添加による結合型インスリン結合体の安定性を比較した。
【０１２５】
持続型インスリン結合体の液状製剤は、表１２の組成で製造し、２５℃で４週間貯蔵した後、結合体の安定性をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣを用いた安定性試験により測定した。
【０１２６】
表１３のＩＥ-ＨＰＬＣ(％)及びＳＥ-ＨＰＬＣ(％)は、初期結果と比べた持続型インスリン結合体の残存率を示すＡｒｅａ％/Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％の値で表す。
【０１２７】
【表１２】
2018119005.tif 000014
【０１２８】
【表１３】
2018119005.tif 000015
【０１２９】
前記に示すように、実施例１〜４で確認された液状製剤(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０mg/mlの塩化ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)及び実施例６で確認された等張性浸透圧のための液状製剤(１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１．２〜５．９mg/mlの塩化ナトリウム、２〜５％(ｗ/ｖ)のマンニトール、０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０)に保存剤として０．２７％(ｗ/ｖ)のｍ−クレゾールを添加して確認した結果、保存剤として０．２７％(ｗ/ｖ)ｍ-クレゾールを含む液状製剤(＃１、＃３、＃５)が、保存剤を含まない液状製剤(＃２、＃４)と同程度の安定性を示した。
【０１３０】
これらの結果は、本発明の液状製剤は、組成に保存剤をさらに添加する場合でも、持続型インスリン結合体は高い安定性を維持できることを証明する。
【０１３１】
以上の説明を基に、本発明が属する分野の当業者は、本発明の範囲と思想から逸脱することなく、様々な修正及び変更が可能であろう。従って、前記具体例は、制限的ではないが、全ての態様において例示的なものであると理解されるべきである。本発明の範囲は、それらに先行している説明より、添付した特許請求の範囲によって定義される。従って、請求範囲の意味と範囲又はそのような意味と範囲の等価概念を含む全ての変更と修正は、本発明の範囲に含まれることを意図している。
【０１３２】
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕生理活性ペプチドであるインスリン(ｉｎｓｕｌｉｎ)と免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型インスリン結合体；及びアルブミン-非含有の安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤を含む、持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２〕前記緩衝溶液が、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液又はリン酸緩衝溶液である前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔３〕前記インスリンが、天然型インスリンと同様のアミノ酸配列を持つ前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔４〕前記インスリンが、天然型インスリンのアミノ酸の置換、除去又は挿入などによって生成されたインスリン誘導体又は天然型インスリンと同様の活性を示すペプチドの類似体である前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔５〕前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭから由来するＦｃ領域である前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔６〕前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群より選択される免疫グロブリンから由来する異なる起源のドメインのハイブリットである前記〔５〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔７〕前記免疫グロブリンＦｃ領域が、同様の起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンから構成される２量体又は多量体である前記〔５〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔８〕前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である前記〔７〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔９〕前記結合体が、非ペプチド性重合体又は組み換え技術を用いて結合された前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１０〕前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコールである前記〔９〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１１〕前記非ペプチド性重合体が、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(ＰＬＡ)及びポリ乳酸-グリコール酸共重合体(ＰＬＧＡ)などの生分解性高分子；脂質重合体；キチン類；ヒアルロン酸；及びそれらの組み合わせからなる前記〔９〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１２〕前記薬理学的有効量の持続型インスリン結合体が、１０mg/ml〜２００mg/mlの濃度である前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１３〕前記糖アルコールが、マンニトール、スクロース及びソルビトールからなる群より選択される１つ以上である前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１４〕前記糖アルコールの濃度が、全体溶液に対して１％(ｗ/ｖ)〜１５％(ｗ/ｖ)である前記〔１３〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１５〕前記緩衝溶液が、酢酸緩衝溶液である前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１６〕前記緩衝溶液の濃度が、５〜５０ｍＭである前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１７〕前記緩衝溶液のｐＨの範囲が、５〜７である前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１８〕前記等張化剤が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムからなる群より選択される前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔１９〕前記等張化剤が、塩化ナトリウムである前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２０〕前記等張化剤の濃度が、０．５mg/ml〜２０mg/mlである前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２１〕前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマー(ｐｏｌｏｘａｍｅｒ)である前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２２〕前記非イオン性界面活性剤が、０．００１％(ｗ/ｖ)〜０．０２％(ｗ/ｖ)の濃度である前記〔２１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２３〕前記安定化剤が、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群より選択される１つ以上の成分をさらに含む前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２４〕インスリンと免疫グロブリンＦｃ領域が、ポリエチレングリコールによって結合した持続型インスリン結合体；及びアルブミン-非含有の安定化剤を含み、前記安定化剤が、酢酸緩衝溶液、マンニトール、ポリソルベート２０及び塩化ナトリウムを含む持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２５〕前記安定化剤が、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０％(ｗ/ｖ)のマンニトール、１０〜２０mg/mlの塩化ナトリウム及び０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０を含み、ｐＨが６．０である前記〔２４〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２６〕前記安定化剤が、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、２％〜５％(ｗ/ｖ)のマンニトール、１〜６mg/mlの塩化ナトリウム及び０．０２％(ｗ/ｖ)のポリソルベート２０を含み、ｐＨが６．０である前記〔２４〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２７〕 ｍ−クレゾール、フェノール及びベンジルアルコールからなる群より選択される１つ以上の保存剤をさらに含む前記〔１〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２８〕前記保存剤の濃度が、全体溶液に比べ、０．００１％〜１％(ｗ/ｖ)である前記〔２７〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔２９〕前記保存剤が、ｍ−クレゾールである前記〔２７〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔３０〕複数回投与用である前記〔２７〕に記載の持続型インスリン結合体の液状製剤。
〔３１〕ａ）持続型インスリン結合体を製造する段階；及び
ｂ）ａ）段階で製造した持続型インスリン結合体と、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤として塩化ナトリウムを含む安定化剤を混合する段階を含む前記〔１〕〜〔２６〕のいずれかに記載の持続型インスリン結合体の液状製剤の製造方法。
〔３２〕ａ）持続型インスリン結合体を製造する段階；及び
ｂ）ａ）段階で製造された持続型インスリン結合体と、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤として塩化ナトリウムを含む安定化剤及び保存剤を混合する段階を含む前記〔２７〕〜〔３０〕のいずれかに記載の持続型インスリン結合体の液状製剤の製造方法。
【図１】
2018119005.tif 000016
【図２】
2018119005.tif 000017
【配列表】
2018119005000001.app