(57)【要約】【課題】免疫磁気組成物を提供する。【解決手段】コア層１１０と、フコイダン、酸化デキストラン及び超常磁性酸化鉄ナノ粒子が疎水性相互作用によって結合される複合物からなり、コア層１１０を覆うシェル層１２０と、少なくとも１つの抗体１３１を含む外層１３０と、を備え、前記抗体１３１は、シェル層１２０の外にグラフトされ外層１３０を構成する免疫磁気組成物１００。これによって、前記免疫磁気組成物１００は、抗癌剤の調製に用いられることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア層と、
フコイダン、酸化デキストラン及び複数の超常磁性酸化鉄ナノ粒子が疎水性相互作用によって結合される複合物からなり、前記コア層を覆うシェル層と、
免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤である少なくとも１つの抗体を含む外層と、
を備え、
前記抗体は、前記シェル層の外にグラフトされ前記外層を構成する免疫磁気組成物。
【請求項２】
前記免疫磁気組成物は、粒径が８０ｎｍ〜３５０ｎｍにある球体である請求項１に記載の免疫磁気組成物。
【請求項３】
前記フコイダンは、ウンデリア・ピンナチフィダ、洋ナシの形嚢大型藻類又はフーカスベシクロサスから抽出される請求項１に記載の免疫磁気組成物。
【請求項４】
前記酸化デキストランは、アルデヒド基を有する請求項１に記載の免疫磁気組成物。
【請求項５】
前記酸化デキストランは、分子量が５ｋＤａ〜２７０ｋＤａにあるデキストランによって調製される請求項４に記載の免疫磁気組成物。
【請求項６】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体及びＴＩＭ−３抗体からなる群から選ばれる請求項１に記載の免疫磁気組成物。
【請求項７】
前記キラーＴ細胞増殖剤は、ＣＤ３抗体、ＣＤ２８抗体及び４−１ＢＢ抗体からなる群から選ばれる請求項１に記載の免疫磁気組成物。
【請求項８】
前記コア層には活性物質を別に含む請求項１に記載の免疫磁気組成物。
【請求項９】
フコイダン及び酸化デキストランを含む水相溶液を提供する工程と、
有機溶媒及び超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む油相溶液を提供する工程と、
前記水相溶液及び前記油相溶液を混合し乳濁液を形成するエマルジョン反応を行う工程と、
前記乳濁液における前記有機溶媒を除去して、磁気フコイダン担体を形成する工程と、
前記磁気フコイダン担体と免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤である少なくとも１つの抗体を混合して、免疫磁気組成物を形成するグラフトを行う工程と、
を備える免疫磁気組成物の調製方法。
【請求項１０】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体及びＴＩＭ−３抗体からなる群から選ばれる請求項９に記載の免疫磁気組成物の調製方法。
【請求項１１】
前記キラーＴ細胞増殖剤は、ＣＤ３抗体、ＣＤ２８抗体及び４−１ＢＢ抗体からなる群から選ばれる請求項９に記載の免疫磁気組成物の調製方法。
【請求項１２】
前記フコイダンと前記酸化デキストランとの重量比は、１：０．１〜１：４である請求項９に記載の免疫磁気組成物の調製方法。
【請求項１３】
前記酸化デキストランは、アルデヒド基を有する請求項９に記載の免疫磁気組成物の調製方法。
【請求項１４】
前記酸化デキストランは、分子量が５ｋＤａ〜２７０ｋＤａにあるデキストランによって調製される請求項９に記載の免疫磁気組成物の調製方法。
【請求項１５】
前記有機溶媒は、メタン、ジクロロメタン又はクロロホルムである請求項９に記載の免疫磁気組成物の調製方法。
【請求項１６】
抗癌剤の調製に用いられる請求項１〜８の何れか１項に記載の免疫磁気組成物の使用方法。
【請求項１７】
前記抗癌剤は、癌細胞の増殖を阻害する薬物である請求項１６に記載の免疫磁気組成物の使用方法。
【請求項１８】
前記抗癌剤は、癌転移を阻害する薬物である請求項１６に記載の免疫磁気組成物の使用方法。
【請求項１９】
前記抗癌剤は、腫瘍の免疫応答を引き起こす薬物である請求項１６に記載の免疫磁気組成物の使用方法。
【請求項２０】
請求項１〜８の何れか１項に記載の免疫磁気組成物と、
磁場発生装置と、
を含む癌治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物及びその調製方法に関し、特に、特殊の物理形態を特徴とする医薬組成物及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、悪性腫瘍とも言われ、細胞が異常に増殖する状態であり、これらの増殖性細胞が体の他の部分に侵入する可能性があり、細胞分裂や増殖に対する制御機能の異常による疾患である。全世界に渡って、癌に罹患する人がますます増加しており、癌が台湾人の死亡原由の上位１０位にランクインし、２７年連続で死亡原因のトップ１０になっている。
【０００３】
癌に対する常規の治療手段としては、手術治療、放射線療法及び化学療法などが含まれる。免疫療法は、上記の治療法以外の癌治療法であり、患者自身の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞又は腫瘍抗原物質によって体の特異的細胞免疫及び体液性免疫応答を誘導して、体の抗癌能力を高め、腫瘍の生長、拡散及び再発を阻止することで、腫瘍の摘出又は制御の目的を達成する。免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）は、幾つかの免疫療法の中で最も重視されるものであり、２０１５年以来、免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）による５０以上の複合療法が臨床で試験されるようになる。しかしながら、免疫チェックポイント阻害剤は、ヒト免疫系のフィードバック機能をオフにし、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８+  Ｔ細胞）により、癌細胞が攻撃されるほか、皮膚及び胃潰瘍の潰瘍形成等の自己免疫反応も引き起こすことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
体内の腫瘍に対する特異的な免疫細胞の添加も、癌の治療において非常に有望なリンクであると考えられている。従来の技術の大部分は、患者から腫瘍における免疫細胞を取ってインビトロ培養して、マイクロディメンションのミクロ構造（例えば、マイクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄ））によって抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ；ＡＰＣｓ）を模倣して、Ｔ細胞の増殖や訓練を行い、最後、患者の体に戻って癌細胞を殺す。しかしながら、そのような方法では、時間がかかり、材料をかなり消費し、且つ患者の体内の癌細胞が変異しやすく、再導入された免疫細胞が元々の効果を失う。一方、増殖用のマイクロビーズが大きすぎるため、人の血液循環によって目的領域に入ることができず、インビトロ培養しかで使用できない。また、このような担体は、表面移植抗体又は被覆された活性成分に加えて、通常、担体を形成する材料が賦形剤であり、治療にあまり役立たず、適用時の用量を制限するため、このような素材の固有欠陥となる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
これに鑑みて、本発明の一態様は、コア層と、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、酸化デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）及び超常磁性酸化鉄ナノ粒子が疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって結合される複合物からなり、コア層を覆うシェル層と、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤である少なくとも１つの抗体を含む外層と、を備え、前記抗体は、シェル層の外にグラフトされ外層を構成する免疫磁気組成物を提供する。
【０００６】
前記の免疫磁気組成物によれば、前記免疫磁気組成物は、粒径が８０ｎｍ〜３５０ｎｍにある球体であってもよい。
【０００７】
前記の免疫磁気組成物によれば、前記フコイダンは、ウンデリア・ピンナチフィダ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、洋ナシの形嚢大型藻類（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ）又はフーカスベシクロサス（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）から抽出されてもよい。
【０００８】
前記の免疫磁気組成物によれば、前記酸化デキストランは、アルデヒド基を有してもよい。前記酸化デキストランは、分子量が５ｋＤａ〜２７０ｋＤａにあるデキストランによって調製されてもよい。
【０００９】
前記の免疫磁気組成物によれば、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体及びＴＩＭ−３抗体からなる群から選ばれてもよい。前記キラーＴ細胞増殖剤は、ＣＤ３抗体、ＣＤ２８抗体及び４−１ＢＢ抗体からなる群から選ばれてもよい。
【００１０】
前記の免疫磁気組成物によれば、前記コア層は、活性物質を別に含んでもよい。
【００１１】
これによって、本発明の免疫磁気組成物は、抗癌活性を有するフコイダン、酸化デキストラン及び超常磁性酸化鉄ナノ粒子を担体として構成され、更に外層が抗体を有し且つコア層で活性物質を覆うナノスケール構造を形成してもよく、そのサイズ及び表面電荷は適切であり、体循環時間を増加させ、腫瘍に浸透し、腫瘍に対するフコイダンの役割を強める。外層の抗体は、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤であってもよく、これによって本発明の免疫磁気組成物が自体材料の抗癌作用に加えて、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤の両方であってもよく、腫瘍微小環境が大幅に改善され、且つ本発明の免疫磁気組成物は、単独の同じ抗体による免疫療法の抗癌効果を大幅に改善し、より少ない抗体用量でより良好な腫瘍抑制能力を達成することができる。また、製造された免疫磁気組成物は、凍結乾燥して粉末状の結晶を形成し、無菌条件下で長時間保存することができ、必要に応じて溶媒で再溶解して用いることができ、簡便で安定した特性を示す。
【００１２】
本発明の別の態様は、フコイダン及び酸化デキストランを含む水相溶液を提供する工程と、有機溶媒及び超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む油相溶液を提供する工程と、水相溶液と油相溶液を混合し乳濁液を形成するエマルジョン反応を行う工程と、乳濁液における有機溶媒を除去して、磁気フコイダン担体を形成する工程と、磁気フコイダン担体と免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤である少なくとも１つの抗体を混合して、免疫磁気組成物を形成するグラフトを行う工程と、を備える免疫磁気組成物の調製方法を提供することにある。
【００１３】
前記の免疫磁気組成物の調製方法によれば、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体及びＴＩＭ−３抗体からなる群から選ばれてもよく、前記キラーＴ細胞増殖剤は、ＣＤ３抗体、ＣＤ２８抗体及び４−１ＢＢ抗体からなる群から選ばれてもよい。
【００１４】
前記の免疫磁気組成物の調製方法によれば、フコイダンと酸化デキストランとの重量比は、１：０．１〜１：４であってもよい。
【００１５】
前記の免疫磁気組成物の調製方法によれば、前記酸化デキストランは、アルデヒド基を有してもよく、前記酸化デキストランは、分子量が５ｋＤａ〜２７０ｋＤａにあるデキストランによって調製されてもよい。
【００１６】
前記の免疫磁気組成物の調製方法によれば、前記有機溶媒は、メタン（ｍｅｔｈａｎｅ）、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）又はクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）であってもよい。
【００１７】
これによって、本発明の免疫磁気組成物の調製方法は、他のターゲット担体の複雑な製造プロセスと異なり、構造を安定させるために余分な界面活性剤を使用する必要がなく、材料の入手と生産も非常に簡単である。
【００１８】
本発明の更に１つの態様は、抗癌剤の調製に用いられる前記のような免疫磁気組成物の使用方法を提供することにある。
【００１９】
前記の免疫磁気組成物の使用方法によれば、前記抗癌剤は、癌細胞の増殖を阻害する薬物、癌転移を阻害する薬物又は腫瘍の免疫応答を引き起こす薬物であってもよい。
【００２０】
本発明のまた１つの態様は、前記のような免疫磁気組成物及び磁場発生装置を含む癌治療用キットを提供することにある。
【００２１】
これによって、本発明の癌治療用キットは、本発明の免疫磁気組成物及び磁場発生装置を含み、磁場発生装置を磁気誘導の補助工具とすることによって、本発明の免疫磁気組成物を患部に蓄積して、局所的な拡大処置の効果を達成し、全身の免疫応答を回避する。本発明の癌治療用キットは、物理的及び生物学的両方の目的の役割を有し、従来の純粋な粋な抗体用量の１％だけを使用するが、より優れた腫瘍抑制能力を示し、半減期を２倍以上高めることができる。
【００２２】
本発明の説明は、読者に本開示内容を基本的に理解させるように、本開示内容の簡略化された概要を提供する。この発明の内容は、本開示内容の完全な記述ではなく、また本発明実施例の重要な又は肝心な素子を指摘し、或いは本発明の範囲を限定するものではない。
下記の添付図面の説明は、本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするためのものである。また、添付ファイル１〜５は、本明細書とは別に、物件提出書にて提出される。
本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするために、添付図面の説明は下記の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の免疫磁気組成物を示す構造模式図である。
【図２】本発明の免疫磁気組成物の調製方法を示す工程フロー図である。
【図３Ａ】磁気フコイダン担体を示す構造分析図である。
【図３Ｂ】磁気フコイダン担体を示す構造分析図である。
【図３Ｃ】磁気フコイダン担体を示す構造分析図である。
【図３Ｄ】磁気フコイダン担体を示す構造分析図である。
【図３Ｅ】磁気フコイダン担体を示す構造分析図である。
【図３Ｆ】磁気フコイダン担体を示す構造分析図である。
【図４Ａ】磁気担体ＩＯ＠Ｆｕを示す構造分析図である。
【図４Ｂ】磁気担体ＩＯ＠Ｆｕを示す構造分析図である。
【図４Ｃ】磁気担体ＩＯ＠Ｆｕを示す構造分析図である。
【図５Ａ】磁気担体ＩＯ＠Ｄｅｘを示す構造分析図である。
【図５Ｂ】磁気担体ＩＯ＠Ｄｅｘを示す構造分析図である。
【図６Ａ】磁気フコイダン担体の安定性を示す分析結果図である。
【図６Ｂ】磁気フコイダン担体の安定性を示す分析結果図である。
【図６Ｃ】磁気フコイダン担体の安定性を示す分析結果図である。
【図７Ａ】磁気フコイダン担体の凍結乾燥する前後の透過電子顕微鏡写真図である。
【図７Ｂ】磁気フコイダン担体の凍結乾燥する前後の透過電子顕微鏡写真図である。
【図８】本発明の免疫磁気組成物の一実施形態を示す構造分析図である。
【図９】本発明の免疫磁気組成物の一実施形態のＸ線光電子分光法（Ｘ−ｒａｙ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＸＰＳ）を示す分析結果図である。
【図１０Ａ】本発明の免疫磁気組成物の別の実施形態を示す構造分析図である。
【図１０Ｂ】本発明の免疫磁気組成物の別の実施形態を示す構造分析図である。
【図１１Ａ】本発明の免疫磁気組成物の目的能力と細胞結合能力の分析結果図である。
【図１１Ｂ】本発明の免疫磁気組成物の目的能力と細胞結合能力の分析結果図である。
【図１１Ｃ】本発明の免疫磁気組成物の目的能力と細胞結合能力の分析結果図である。
【図１１Ｄ】本発明の免疫磁気組成物の目的能力と細胞結合能力の分析結果図である。
【図１１Ｅ】本発明の免疫磁気組成物の目的能力と細胞結合能力の分析結果図である。
【図１１Ｆ】本発明の免疫磁気組成物の目的能力と細胞結合能力の分析結果図である。
【図１２Ａ】本発明の免疫磁気組成物の細胞結合能力の分析結果図である。
【図１２Ｂ】本発明の免疫磁気組成物の細胞結合能力の分析結果図である。
【図１２Ｃ】本発明の免疫磁気組成物の細胞結合能力の分析結果図である。
【図１２Ｄ】本発明の免疫磁気組成物の細胞結合能力の分析結果図である。
【図１３Ａ】本発明の癌治療用のキットが集中的に腫瘍に蓄積することを示す分析結果図である。
【図１３Ｂ】本発明の癌治療用のキットが集中的に腫瘍に蓄積することを示す分析結果図である。
【図１３Ｃ】本発明の癌治療用のキットが集中的に腫瘍に蓄積することを示す分析結果図である。
【図１３Ｄ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットによる治療効果のヘマトキシリン−エオシン染色がプロシアンブルー染色に合わせる結果図である。
【図１４Ａ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが乳癌肺転移マウスモデルで癌細胞増殖と癌転移を阻害することの分析結果図である。
【図１４Ｂ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが乳癌肺転移マウスモデルで癌細胞増殖と癌転移を阻害することの分析結果図である。
【図１４Ｃ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが乳癌肺転移マウスモデルで癌細胞増殖と癌転移を阻害することの分析結果図である。
【図１４Ｄ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが乳癌肺転移マウスモデルで癌細胞増殖と癌転移を阻害することの分析結果図である。
【図１４Ｅ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが乳癌肺転移マウスモデルで癌細胞増殖と癌転移を阻害することの分析結果図である。
【図１５Ａ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが大腸癌マウスモデルで癌細胞増殖を阻害することの分析結果図である。
【図１５Ｂ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが大腸癌マウスモデルで癌細胞増殖を阻害することの分析結果図である。
【図１５Ｃ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが大腸癌マウスモデルで癌細胞増殖を阻害することの分析結果図である。
【図１６Ａ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１６Ｂ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１６Ｃ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１６Ｄ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１６Ｅ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１６Ｆ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１６Ｇ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１６Ｈ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１６Ｉ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
【図１７Ａ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットの反応部位の分析結果図である。
【図１７Ｂ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットの反応部位の分析結果図である。
【図１７Ｃ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットのＴＵＮＥＬテスト結果図である。
【図１７Ｄ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットのＴＵＮＥＬテスト結果図である。
【図１８Ａ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウスＣＤ４+  Ｔ細胞とＣＤ８+  Ｔ細胞の浸潤程度の分析図である。
【図１８Ｂ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウスＣＤ４+  Ｔ細胞とＣＤ８+  Ｔ細胞の浸潤程度の分析図である。
【図１８Ｃ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウスＣＤ４+  Ｔ細胞とＣＤ８+  Ｔ細胞の浸潤程度の分析図である。
【図１８Ｄ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウスＣＤ４+  Ｔ細胞とＣＤ８+  Ｔ細胞の浸潤程度の分析図である。
【図１８Ｅ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウスＣＤ４+  Ｔ細胞とＣＤ８+  Ｔ細胞の浸潤程度の分析図である。
【図１９Ａ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウス血液生化学分析の結果図である。
【図１９Ｂ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウス血液生化学分析の結果図である。
【図１９Ｃ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウス血液生化学分析の結果図である。
【図１９Ｄ】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウス血液生化学分析の結果図である。
【図２０】本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウスの病理学的切片の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書の開示内容は、フコイダン及び酸化デキストランを疎水性相互作用によって超常磁性酸化鉄ナノ粒子と結合した後で、また抗体をグラフトしてなる新規の免疫磁気組成物を提出する。製造された免疫磁気組成物は、単独の同じ抗体による免疫療法の抗癌効果を大幅に改善し、より少ない抗体でより良好な腫瘍抑制能力を達成することができる。また、本明細書は、また、本案の免疫磁気組成物及び磁場発生装置を含み、更に本発明の免疫磁気組成物の抗癌効果を向上させることができる新規の癌治療用のキットを開示する。明細書において、乳癌肺転移及び大腸癌のマウス動物モデルによって、本案の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットの免疫療法における有効性及びメカニズムを確認する。
【００２５】
以下、本明細書に用いられる特定用語の説明である。
【００２６】
明細書における前記の「フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）」とは、茶色の海藻の表面における独特のスティックスリップ成分から抽出された水溶性食物繊維である。フコイダンは、フコースが豊富であり、高い生物安全性、抗酸化、抗凝固、抗血栓、抗ウイルス及び抗癌活性を有する天然多糖類である。
【００２７】
明細書における前記の「デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）」とは、３Ｄａ〜２０００ｋＤａの範囲の分子量を構成する、複雑で分岐したデキストラン（多くのグルコース分子からなる多糖類）である。デキストランの直鎖部分は、α−１，６グリコシド結合によって互いに連結されたグルコース分子からなり、一方、分枝はα−１，３グリコシド結合に由来する。明細書における前記の「酸化デキストラン（ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ）」は、デキストランに対して表面改質を行い、デキストランにおけるヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化して、抗体を更にグラフトすることができる酸化デキストランを得る。
【００２８】
図１を参照すると、本発明の免疫磁気組成物１００を示す模式図である。免疫磁気組成物１００は、コア層１１０と、シェル層１２０と、外層１３０と、を含む。
【００２９】
コア層１１０は、サイトカイン又は抗癌薬物のような活性物質を含んでもよい。
【００３０】
シェル層１２０は、フコイダン、酸化デキストラン及び超常磁性酸化鉄ナノ粒子が疎水性相互作用によって結合される複合物からなり、コア層１１０を覆う。更に、シェル層１２０を構成する複合物に用いられるフコイダンは、ウンデリア・ピンナチフィダ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、洋ナシの形嚢大型藻類（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ）又はフーカスベシクロサス（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）から抽出されてもよく、用いられる酸化デキストランがアルデヒド基を有してもよく、且つ分子量が５ｋＤａ〜２７０ｋＤａにあるデキストランによって調製されてもよい。フコイダン、酸化デキストラン及び超常磁性酸化鉄ナノ粒子の間の疎水性相互作用は、乳化作用又はナノ沈殿法等のような方法によって形成されてもよいが、本発明はこれらに限定されない。
【００３１】
外層１３０は、少なくとも１つの抗体１３１を含み、且つ抗体１３１がシェル層１２０外にグラフトされて外層１３０を構成する。抗体１３１は、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤であってもよい。免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体及びＴＩＭ−３抗体からなる群から選ばれてもよく、キラーＴ細胞増殖剤は、ＣＤ３抗体、ＣＤ２８抗体及び４−１ＢＢ抗体からなる群から選ばれてもよい。
【００３２】
更に、前記免疫磁気組成物１００は、粒径が８０ｎｍ〜３５０ｎｍにある球体であってもよい。また、前記免疫磁気組成物は、中空形状になる。
【００３３】
図２を参照すると、本発明の免疫磁気組成物の調製方法３００を示す工程フロー図である。図２において、免疫磁気組成物の調製方法３００は、工程３１０、工程３２０、工程３３０、工程３４０と工程３５０を含む。
【００３４】
工程３１０は、フコイダン及び酸化デキストランを含む水相溶液を提供する。用いられるフコイダンは、ウンデリア・ピンナチフィダ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、洋ナシの形嚢大型藻類（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ）又はフーカスベシクロサス（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）から抽出されてもよく、用いられる酸化デキストランがアルデヒド基を有してもよく、分子量が５ｋＤａ〜２７０ｋＤａにあるデキストランによって調製されてもよい。フコイダンと酸化デキストランとは、１：０．１〜１：４の重量比で混合される。
【００３５】
工程３２０は、有機溶媒及び超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む油相溶液を提供する。有機溶媒は、メタン（ｍｅｔｈａｎｅ）、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）又はクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）であってもよい。
【００３６】
工程３３０は、工程３１０に提供される水相溶液と工程３２０に提供される油相溶液を混合して乳濁液を形成するエマルジョン反応を行う。
【００３７】
工程３４０において、エマルジョンにおける有機溶媒は、減圧蒸発等の方法によって乳濁液における有機溶媒を除去して、磁気フコイダン担体を形成することができる。
【００３８】
工程３５０は、磁気フコイダン担体と少なくとも１つの抗体をグラフトして、免疫磁気組成物を形成する抗体のグラフトを行う。用いられる抗体は、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤であってもよい。免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体及びＴＩＭ−３抗体からなる群から選ばれてもよく、キラーＴ細胞増殖剤は、ＣＤ３抗体、ＣＤ２８抗体及び４−１ＢＢ抗体からなる群から選ばれてもよい。
【００３９】
これによって、前記の方法で調製された免疫磁気組成物は、後で抗癌剤、例えば、癌細胞増殖抑制剤、癌転移抑制剤、腫瘍免疫反応誘導剤等として使用することができる。上記の方法で調製された免疫磁気組成物は中空形状になり、免疫物質組成物の抗腫瘍効果を高めるためにコア層に活性物質を更に覆ってもよい。
【００４０】
また、前記の方法で調製された免疫磁気組成物は、磁石、三次元磁場磁石又は磁気共鳴スキャナー等の磁場発生装置と組み合わせて、癌を治療するためのキットを構成してもよく、磁場発生装置が発生させた磁場を磁気誘導用の補助工具として使用することによって、本発明の免疫磁気組成物を患部に蓄積させ、局所的な拡大処置の効果を得ることができ、本発明の癌治療用のキットは、従来の純粋な粋な抗体の投与量の１％しか必要としないが、より優れた腫瘍抑制能力を示し、２倍以上の半減期を増加させることができる。
【００４１】
本発明は、本発明の当業者が過度に解読せずに、容易に実施できるように、以下の特定の試験例によって更に説明するが、これらの試験例は本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の材料や方法の実施方法を説明するためのものである。
（試験例）
一、本発明の免疫磁気組成物及びその調製方法
１．１  磁気フコイダン担体の構造及び安定性の分析
【００４２】
本試験例において、抗体がグラフトされていない磁気フコイダン担体を調製して、試験の最適な調製条件で、走査型電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＭ）及び透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＥＭ）によって磁気フコイダン担体の形態を観察した。ナノ粒径及び界面電位アナライザー（Ｄｅｌｓａ  Ｎａｎｏ  Ｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ，ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）によって磁気フコイダン担体のゼータ電位（ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、粒径及び磁気フコイダン担体が二次蒸留（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ；ＤＤＷ）及びリン酸緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）における安定性を分析した。
【００４３】
磁気フコイダン担体を調製する前に、まず超常磁性酸化鉄ナノ粒子及び酸化デキストランを別々に調製し、後の抗体のグラフトに寄与するように、本試験例においてアルデヒド基を有する酸化デキストランを使用した。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（以下、「ＩＯ」で示す）の設計合成は、２００４?~のＳｈｏｕｈｅｎｇ  Ｓｕｎチームによって発表される文献（Ｓｈｏｕｈｅｎｇ  Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ＭＦｅ２Ｏ４（Ｍ＝Ｆｅ，Ｃｏ，Ｍｎ）  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００４，１２６（１）：２７３−２７９）を参照し、調製条件として、２ｍｍｏｌのＦｅ（ａｃａｃ）３、１０ｍｍｏｌの１，２−ヘキサデカンジオール、６ｍｍｏｌのオレイン酸及び６ｍｍｏｌのアセトアミドを２０ｍｌのベンジルエーテル２０ｍｌで混合した後で、窒素雰囲気下、１００℃で３０分間還流させた。更に、前記反応物を２００℃で１時間加熱した後で、また２８５℃まで３０分間加熱してＩＯの核形成及び生長を完成した。反応物を室温に冷却した後で、６０００ｒｐｍで遠心分離してＩＯを１０分間回収し、エタノールで３回精製して、ＩＯの調製を完成した。
【００４４】
アルデヒド基を有する酸化デキストラン（以下「Ｄｅｘ」で示す）の調製方法としては、下記の通りである。デキストラン（分子量：５ｋＤａ〜２７０ｋＤａ）を室温で光を避けて過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍＭ）を含む水性酸化バッファー（０．５−１０ｍｇｍｌ−１、ｐＨ＝５．５）に溶解して３０分間酸化した。Ａｍｉｃｏｎ（分子量：３ｋＤａ）によって修飾したＤｅｘを透析して過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。凍結乾燥機（ＦｒｅｅＺｏｎｅ  １Ｌ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａｂｃｏｎｃｏ，ｋａｎｓａｓ）によって前記Ｄｅｘを再散在し、凍結乾燥した。製造されたＤｅｘについては、核磁気共鳴（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ｎｍＲ）によって構造を分析し、比色アルデヒドベースのアッセイキット（ＭＡＫ１４０，ｓｉｇｍａ）を用いてその修飾度を分析した。
【００４５】
本試験例において、磁気フコイダン担体の調製条件としては、下記の通りである。０．５ｍｇ／ｍｌのフコイダン（フーカスベシクロサスから抽出）と０．５ｍｇ／ｍｌのＤｅｘを混合して水相溶液とした。２ｍｇのＩＯを０．２ｍｌのジクロロメタンに溶解して油相溶液とした。前記水相溶液及び油相溶液を混合した後で、ホモジナイザー（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｃｏ，Ｌｔｄ）で１２０Ｗのパワーで５０秒乳化して、乳濁液を得た。ロータリーエバポレーターでジクロロメタンを除去した後で、磁気分離装置（ＭａｇｎｉＳｏｒｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって製造された磁気フコイダン担体（以下、「ＩＯ＠ＦｕＤｅｘ」で示す）を精製し、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘをＤＤＷ又は０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝６）で再懸濁して更に抗体のグラフトを行った。
また、本試験例において、別にそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌのフコイダン又は０．５ｍｇ／ｍｌのＤｅｘを水相溶液として、ジクロロメタンに溶解するＩＯを油相溶液として、同じ調製方法によって磁気担体ＩＯ＠Ｆｕ（水相溶液：フコイダン）又はＩＯ＠Ｄｅｘ（水相溶液：アルデヒド基を有する酸化デキストラン）を調製した。調製されたＩＯ＠ＦｕＤｅｘ、ＩＯ＠Ｆｕ及びＩＯ＠Ｄｅｘに対しては、走査型電子顕微鏡及び透過型電子顕微鏡によって形態を分析し、ナノ粒径及び界面電位アナライザーによってゼータ電位と粒径を分析し、超伝導量子干渉磁力計によって磁気分析を分析した。
【００４６】
図３Ａ〜図６Ｃを参照すると、図３Ａ〜図３Ｆは、磁気フコイダン担体を示す構造分析図である。図３Ａは、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの走査電子顕微鏡写真図である。図３Ｂ〜図３Ｆは、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの透過電子顕微鏡写真図である。
図４Ａ〜図４Ｃは、磁気担体ＩＯ＠Ｆｕを示す構造分析図である。図４Ａと図４Ｂは、ＩＯ＠Ｆｕの走査電子顕微鏡写真図である。図４Ｃは、ＩＯ＠Ｆｕの透過電子顕微鏡写真図である。
図５Ａと図５Ｂは、磁気担体ＩＯ＠Ｄｅｘを示す構造分析図である。図５Ａは、ＩＯ＠Ｄｅｘの走査電子顕微鏡写真図である。図５Ｂは、ＩＯ＠Ｄｅｘの透過電子顕微鏡写真図である。
図６Ａ〜図６Ｃは、磁気フコイダン担体の安定性を示す分析結果図である。図６Ａは、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘ、ＩＯ＠ＦｕとＩＯ＠Ｄｅｘの流体力学的サイズ分布図である。図６Ｂは、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘ、ＩＯ＠ＦｕとＩＯ＠Ｄｅｘのゼータ電位分析図である。図６Ｃは、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘとＩＯの磁気分析図である。
【００４７】
図３Ａの結果から、走査型電子顕微鏡の観察によって、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘが球状構造であることが分かり、電子顕微鏡の中空環境によって崩壊の現象があり、それは中空構造であることを示す。
図３Ｂの結果から分かるように、透過型電子顕微鏡によってＩＯ＠ＦｕＤｅｘが崩壊で重なるシェル層による暗いコントラストが観察された。図３Ｃは、シェル層を拡大する透過電子顕微鏡写真図である。数多くのサイズが約５ｎｍの超常磁性酸化鉄ナノ粒子が見られ、それはシェル層の組成の構造であることが証明される。図３Ｄの暗視野観察及び図３Ｅと図３Ｆの要素分布の検出で、再び明らかな中空構造及び酸化鉄が担体に散在している状況が見られる。
【００４８】
図４Ａ〜図５Ｂの結果から分かるように、ＩＯ＠ＦｕとＩＯ＠ＦｕＤｅｘは同様に均一な構造を有し、ＩＯ＠Ｄｅｘが安定ではなく、蒸発プロセスで凝集しやすくて、広い範囲の粒径分布及びランダムな形態学的外観が観察された。
【００４９】
図６Ａと図６Ｂの結果から分かるように、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘは流体中に均一な粒径が現れ、粒径サイズが８０ｎｍ〜３５０ｎｍにあり、且つ平均粒径が１４１．５ｎｍであり、ＩＯ＠Ｆｕの平均粒径（２４１ｎｍ）より小さい。ＩＯ＠ＦｕＤｅｘとＩＯ＠Ｆｕは主体がフコイダンからなり、その中に含まれる硫酸塩によってＩＯ＠ＦｕＤｅｘとＩＯ＠Ｆｕに強い負ゼータ電位を持たせるが、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの主体に別にＤｅｘを有するので、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの負ゼータ電位（−３２．８ｍＶ）がＩＯ＠Ｆｕの負ゼータ電位（−５８．４ｍＶ）よりも低くなるため、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの間の強い反発力がコロイドの安定性と良好な散在性を維持することができる。
図６Ｃの結果から分かるように、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＩＯ）がかなり高い単位重量あたりの飽和磁化強度があり、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘは、超常磁性酸化鉄ナノ粒子、フコイダン及び酸化デキストランを含むので、その数値がやや低減するが、やはり５７．５ｅｍｕ  ｇ−１の高数値を保有し、その磁気の強度が複合担体構造の形成によって低減しなく、磁気分離装置によって磁気精製を行うことに寄与して、高収率のＩＯ＠ＦｕＤｅｘを得た。
【００５０】
本試験例において、別に異なる分子量の酸化デキストランで磁気フコイダン担体を調製し、それは、図２の工程３１０のように提供される水相溶液に、分子量が５ｋＤａ〜２７０ｋＤａであるデキストランによって酸化デキストランを調製し、また酸化デキストランとフコイダンとを１：０．２の重量比で混合した。残りの工程３２０〜工程３４０の細部については、試験例１．１に記載のものとほぼ同じであるので、ここで説明しない。更に製造された磁気フコイダン担体の粒径サイズをナノ粒径及び界面電位アナライザーによって分析して、その結果を下記の表１に示す。
【００５１】
【表１】
2018188435.tif 000003
【００５２】
また、本試験例において、異なるフコイダンと酸化デキストランとの混合比例で磁気フコイダン担体を調製して、図２の工程３１０のように提供された水相溶液に、フコイダンとデキストランとを１：０．１〜１：４の重量比で混合した。残りの工程３２０〜工程３４０の細部については、試験例１．１に記載のものとほぼ同じであるので、ここで説明しない。更に製造された磁気フコイダン担体の粒径サイズをナノ粒径及び界面電位アナライザーによって分析して、その結果を下記の表２に示す。
【００５３】
【表２】
2018188435.tif 000004
【００５４】
凍結乾燥されて再溶解した後のＩＯ＠ＦｕＤｅｘが同じ構造を有するかをテストするために、本試験例では、更に調製されたＩＯ＠ＦｕＤｅｘを凍結乾燥機によって凍結乾燥して粉末状の結晶を形成し、また凍結乾燥された結晶を水溶液に再溶解し、透過型電子顕微鏡によってＩＯ＠ＦｕＤｅｘの凍結乾燥前と凍結乾燥された構造を観察した。
【００５５】
図７Ａと図７Ｂを参照すると、図７Ａは、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの凍結乾燥前の透過電子顕微鏡写真図である。図７Ｂは、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘが凍結乾燥されて再溶解した後の透過電子顕微鏡写真図である。結果から分かるように、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの凍結乾燥前の構造は、中空の球状であり、サイズが約８０ｎｍ〜３５０ｎｍにある。凍結乾燥された結晶は、快速に水溶液に再溶解でき、且つ再溶解のＩＯ＠ＦｕＤｅｘ構造が透過型電子顕微鏡で、やはり中空であり、且つサイズが凍結乾燥前の担体と合致する球体となるように保持する。ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの安定性が非常に優れたと示す。
【００５６】
（１．２  実施例１−３の調製）
前記最適なＩＯ＠ＦｕＤｅｘの調製条件で、更に本発明の免疫磁気組成物を調製した。調製されたＩＯ＠ＦｕＤｅｘをそれぞれ異なる抗体を含み且つシアノ水素化ホウ素ナトリウム（５μＭ）を含む緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ＝６）と４℃で抗体のグラフトを４〜６時間行い、Ｄｅｘにおけるアルデヒド基が抗体上の第一級アミンとシッフ塩基を形成し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによって還元アミノ化を行った後で、抗体のグラフトを化学的に安定な状態にした。最後に、製造された免疫磁気組成物を磁気分離装置によって精製した。表３を参照すると、本発明の実施例１−３に用いられる抗体であり、実施例１に用いられる抗体がＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体であり、実施例２に用いられる抗体がＰＤ−Ｌ１抗体であり、実施例３に用いられる抗体がＰＤ−Ｌ１抗体、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体であった。
【００５７】
【表３】
2018188435.tif 000005
【００５８】
調製された実施例は、透過型電子顕微鏡分析の形態、元素分析、及びＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって実施例３における元素構成を測定した。
【００５９】
図８を参照すると、実施例３の構造分析図である。結果から分かるように、実施例３の構造は、サイズが約８０〜３５０ｎｍの球状の中空構造であった。そして、電子顕微鏡の元素分析によって、実施例３の外層が抗体の存在のため、均一に明らかな窒素信号（Ｎ）が見られた。抗体がグラフトされる前に、担体成分として糖及び酸化鉄だけがあり、窒素を有する材料がないが、抗体がグラフトされた後で、抗体がアミノ基及びペプチド結合を有するので、多量の窒素を有して、本発明の免疫磁性組成物は抗体を有することが実証された。
【００６０】
また図９を参照すると、本発明の実施例３のＸ線光電子分光法分析結果図である。結果から分かるように、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘに対して実施例３は結合エネルギーが３９９ｅＶに位置する１本の信号があり、この信号が窒素信号であり、これは実施例３において抗体が担体にうまくグラフトされていることを示す。
【００６１】
（１．３  実施例５の調製及び構造確認）
本発明の免疫磁気組成物は、中空形状になるので、更にコア層でサイトカイン又は抗癌薬物等のような活性物質を覆うことができた。本試験例における活性物質は、インターロイキン−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，ＩＬ−２）を例として、更にＩＬ−２を覆う実施例５を調製した。
【００６２】
本試験例において、実施例５の調製条件は下記の通りである。０．５ｍｇ／ｍｌのフコイダン、０．５ｍｇ／ｍｌのＤｅｘ及び５０μｇのＩＬ−２を混合して水相溶液とした。２ｍｇのＩＯを０．２ｍｌのジクロロメタンに溶解して油相溶液とした。前記水相溶液と油相溶液を混合した後で、ホモジナイザーで１２０Ｗのパワーで５０秒乳化して、乳濁液を得た。ロータリーエバポレーターでジクロロメタンを除去した後で、製造された実施例５を磁気分離装置によって精製した。調製された実施例については、走査型電子顕微鏡によって形態を分析し、ナノ粒径及び界面電位アナライザーによってその粒径を分析した。
【００６３】
図１０Ａと図１０Ｂを参照すると、実施例５を示す構造分析図である。
図１０Ａは、実施例５の走査電子顕微鏡写真図である。図１０Ｂは、実施例５の流体力学的サイズ分布図である。結果から分かるように、実施例５のＩＬ−２のカバー率は９９．９３％まで達する。ＩＬ−２がコア層を満たして、実施例５の平均粒径サイズが純粋な担体の１６１．２ｎｍから３５６．２ｎｍに増加し、本発明の免疫磁気組成物が更にコア層で活性物質を覆うことが証明され、例えばドキソルビシン薬物（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドセタキセル薬物（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ又はＰａｃｌｉｔａｘｅｌ）及びアスタキサンチン（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ；ＡＳＴＸ）等の活性物質も、同じ方式によって本発明の免疫磁気組成物に覆われることができる。
【００６４】
（１．４  本発明の免疫磁気組成物の目的能力の分析）
本試験例において、本発明の免疫磁気組成物がＴ細胞免疫力の低下を逆転してマウスの腫瘍退縮を促進することができるかを検証するために、調製された実施例１−３に対して目的能力分析及び細胞結合能力分析を行った。試験的に、実験モデルとして、転移能力、浸潤性及びＰＤ−Ｌ１発現を有するトリ陰性乳癌細胞株（４Ｔ１）を選択した。蛍光顕微鏡下での観察を容易にするために、蛍光顕微鏡分析群の実施例１−３でそれぞれ量子ドットに接続した。
【００６５】
目的効率を評価するために、試験的に、実施例１−３及び４Ｔ１細胞株（４×１０５）を、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）を基礎とする培養液の中で、４℃で３０分間培養し、次いでフローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ；ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。細胞結合能力を評価するために、量子ドットに接続したＩＯ＠ＦｕＤｅｘ及び実施例２をそれぞれ４Ｔ１細胞株と１、４、１２と２４時間培養し、またフローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ；Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ）によって分析した。
【００６６】
図１１Ａ〜図１１Ｆを参照すると、本発明の免疫磁気組成物の目的能力と細胞結合能力の分析結果図である。
図１１Ａは、グラフト濃度が１．４μｇ／ｍｌ（低濃度；Ｌ）、７μｇ／ｍｌ（中濃度；Ｍ）と３５μｇ／ｍｌ（高濃度；Ｈ）であるＰＤ−Ｌ１抗体の実施例２の体外の目的能力のテスト結果である。図１１Ｂは、実施例２とＩｇＧがグラフトされたＩＯ＠ＦｕＤｅｘの体外の目的能力のテスト結果である。図１１Ｃは、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘが第１、４、１２と２４時間に４Ｔ１細胞株との結合能力の分析結果図である。図１１Ｄは、実施例２が第１、４、１２と２４時間に４Ｔ１細胞株との結合能力の分析結果図である。図１１Ｅは、グラフト濃度が１．４μｇ／ｍｌ（低濃度；Ｌ）、７μｇ／ｍｌ（中濃度；Ｍ）と３５μｇ／ｍｌ（高濃度；Ｈ）であるＣＤ３抗体／ＣＤ２８抗体の実施例３の体外の目的能力のテスト結果である。図１１Ｆは、実施例２と実施例３が第１と２４時間に４Ｔ１細胞株との結合能力の分析結果図である。
【００６７】
図１１Ａの結果から分かるように、１時間培養した後で、実施例２（Ｈ）の群が一番高い平均蛍光強度（ｍｅｄｉａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ；ＭＤＩ）を有し実施例２が４Ｔ１細胞株（ＰＤ−Ｌ１を発見する）と結合する量がその表面抗体密度と緊密な関係があるので、後の試験実施例２にグラフトされるＰＤ−Ｌ１濃度が高濃度（３５μｇ／ｍｌ）であった。
図１１Ｂの結果から分かるように、ＩｇＧが接続されるＩＯ＠ＦｕＤｅｘにＭＤＩ変位が観察されなく、実施例２が４Ｔ１細胞株に対する親和性はＩＯ＠ＦｕＤｅｘとの非特異的相互作用ではなく、ＰＤ−Ｌ１抗体に由来することを示す。
【００６８】
図１１Ｃ図と図１１Ｄの結果から分かるように、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘと細胞結合の量が時間依存性を有し、培養後の第１２時間後に明らかな細胞取り込みがあった。対照的に、実施例２において培養後の第１時間に細胞結合の現象があり、その後、ＭＤＩが緩い変位になり、培養時間の増加につれて、実施例２が細胞との結合量が向上することを示し、この結果から分かるように、ＰＤ−Ｌ１抗体をＩＯ＠ＦｕＤｅｘにグラフトした後で、元のＩＯ＠ＦｕＤｅｘ及び４Ｔ１細胞株の結合能力が変わった。
【００６９】
本発明の免疫磁気組成物を同時に免疫チェックポイント阻害剤とキラーＴ細胞増殖剤にするために、実施例３は、同時にＰＤ−Ｌ１抗体、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体をＩＯ＠ＦｕＤｅｘにグラフトしてなる免疫磁気組成物であった。図１１Ｅを参照すると、異なる濃度のＣＤ３抗体／ＣＤ２８抗体をグラフトする実施例３の目的能力分析であった。
図１１Ｅの結果から分かるように、１時間のインビトロ培養後、実施例３（Ｈ）の群が一番高いＭＤＩを有し、実施例３（Ｈ）群がＣＤ８+  Ｔ細胞に対して強い親和性を有することを示す。図１１Ｆの結果から分かるように、実施例３が４Ｔ１細胞株との間に実施例２と類似する結合力を有し、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘに複数の抗体がグラフトされては４Ｔ１細胞株に対する親和性を影響しないことを示す。
【００７０】
図１２Ａ〜図１２Ｄを参照すると、実施例３がＣＤ８+  Ｔ細胞との結合能力の分析結果図である。試験的に、量子ドットが接続される実施例３をＣＤ８+  Ｔ細胞と３０分間培養し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ＰｈａｌｌｏｉｄｉｎとＤＡＰＩによってＣＤ８+  Ｔ細胞に対して固定染色を行い、共役焦点顕微鏡によって実施例３がＣＤ８+  Ｔ細胞の細胞内部位に位置することを確認した。
図１２Ａは、細胞核の位置を示し、図１２Ｂは、実施例３の位置を示し、図１２Ｃは、明視野下の顕微鏡写真図である。図１２Ｄは、合併後の顕微鏡写真図であり、スケールバーは、５μＭの長さを示す。結果から分かるように、ＣＤ８+  Ｔ細胞で複数の実施例３が見られ、実施例３が確実にＣＤ８+  Ｔ細胞と結合できることが証明された。
【００７１】
（二、免疫磁気組成物の用途）
（２．１  本発明の免疫磁気組成物による癌治療の治療効果）
本試験例は、乳癌肺転移及び大腸癌のマウスモデルで更に本発明の免疫磁気組成物が癌治療の効能を有するか、そして磁気誘導によって患部に蓄積されるかをテストした。
【００７２】
（２．１．１  本発明の免疫磁気組成物による乳癌肺転移の治療効果）
本試験例は、生物発光酵素を安定に発現するｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を持つ４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスを乳癌肺転移の動物モデル（中国医薬大学付属病院分子医療センターによって提供される）として、マーカー１２５Ｉを含む実施例１−３の製剤を右大腿静脈を介して４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに投与し、試験的に、別に実施例４（本発明の癌治療用のキット）があり、実施例４においてマーカー１２５Ｉを含む実施例３の製剤を投与し、円状表面の磁石（直径０．５ｃｍ，０．５Ｔｅｓｌａ）を合わせて磁気誘導を行った。続いて、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＳＰＥＣＴ）によって実施例３及び実施例４の腫瘍組織における動的蓄積をモニターした。
【００７３】
図１３Ａ〜図１３Ｃを参照すると、本発明の癌治療用のキットが集中的に腫瘍に蓄積する分析結果図である。
図１３Ａは、１２５Ｉが標識される実施例３又は実施例４が４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスで第０、４、６、１２と２４時間にある時間活性曲線であり、ｎ＝４である。図１３Ｂは、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスが１２５Ｉが標識される実施例３又は実施例４が投与された後の第２４時間の全身単一光子放出コンピュータ断層撮影法図である。図１３Ｃは、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスが１２５Ｉが標識される実施例３又は実施例４が投与された後の、第２４時間の生体分布定量図であり、ｎ＝４であり、＊は統計的に明らかな差を示す（ｐ＜０．０５）。
【００７４】
図１３Ａの結果から分かるように、実施例３の腫瘍における蓄積は、投与後の第６時間に組織１ｇあたりに注射される用量の最大濃度（５．０８％ＩＤ／ｇ）に達した。対照的に、実施例４は、磁気誘導によって腫瘍の用量投与の領域性を促進し、実施例４が２４時間内に腫瘍で持続に蓄積することが見られ、第２４時間に、実施例４が腫瘍における蓄積量は実施例３の３．６倍となった。
図１３Ｂの結果から分かるように、実施例３又は実施例４を投与した後の２４時間後に、実施例３及び実施例４の間の放射性同位体は異なる生体分布パターンを有した。
図１３Ｃの生体分布定量図から分かるように、実施例３及び実施例４において、主に腫瘍、肝臓、脾臓及び膀胱に蓄積するが、筋肉、脳、心臓、肺、胃、腎臓、結腸と血液に蓄積されにくい（５％ＩＤ／ｇよりも小さい）。実施例３は実施例４と比べて、実施例４が腫瘍における蓄積を向上させることだけでなく、著しく肝臓と脾臓におけるその全身蓄積を低減して、実施例４が効果的に作用部位に集中し得ることを示す。
【００７５】
本試験例は、更にそれぞれ右大腿静脈を介してＩｇＧ（対照組）、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘ、実施例１−４を４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに投与し、投与形態として腫瘍接種の８日後、４日ごとに連続して３回（ｑ４ｄｘ３）投与した。図１３Ｄ及び添付ファイル１を参照すると、添付ファイル１は、図１３Ｄのカラー図面である。４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに実施例１−４を投与した後の４週のヘマトキシリン−エオシン染色がプロシアンブルー染色に合わせる結果図である。スケールバーは５０μＭの長さを示す。図１３Ｄの結果から分かるように、他の群と比べて、実施例４は腫瘍組織において散在したプロシアンブルー染色結果が観察された。
【００７６】
本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに対して治療効果を有することを確認するために、本試験例では、更に右大腿静脈からＩｇＧ（対照組）、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘ、実施例１−４を４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに投与し、投与形態として腫瘍接種の８日後、４日ごとに連続して３回（ｑ４ｄｘ３）投与した。腫瘍体積をデジタルキャリパー（ｍｉｔｕｔｏｙｏ）を用いて２〜３日ごとにモニターし、腫瘍体積を以下の式Ｉに基づいて計算した。
【００７７】
【数１】
2018188435.tif 000006
【００７８】
非侵襲的生体内分子イメージングシステム（Ｎｏｎ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＩＶＩＳ；Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって生物発光評価を行った。４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの生存率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって分析した。
【００７９】
図１４Ａ〜図１４Ｅ及び添付ファイル２を参照すると、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが乳癌肺転移マウスモデルで癌細胞増殖と癌転移を阻害する分析結果図である。
図１４Ａは、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに実施例１−４が投与された後の２４時間の非侵襲的生体内分子イメージングシステムスキャン結果図である。添付ファイル２は、図１４Ａのカラー図面である。図１４Ｂは、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに実施例１−４が投与された後の腫瘍体積統計図である。図１４Ｃは、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに実施例１−４が投与された後の生存曲線である。図１４Ｄは、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに実施例１−４が投与された後の腫瘍と肺臓の写真図である。図１４Ｅは、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスに実施例１−４が投与された後の肺転移の統計図である。
【００８０】
図１４Ａと図１４Ｂの結果から分かるように、対照組と比べて、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘは、腫瘍生長を阻害できるが、統計的に明らかな差異がなかった。実施例１−４は、抗腫瘍効果を有する以外、且つ統計的に明らかな差異があり（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す）、特に、実施例４は、３０日以内に腫瘍の増殖をほとんど阻害した。
図１４Ｃの結果から分かるように、対照組、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘ、実施例１、実施例２、実施例３及び実施例４を投与した４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの生存期間の中央値は、それぞれ２４日、３４日、３４日、４３天と４４日であった。実施例４を投与した４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの生存期間の中央値は、著しく６３日まで延長した。実施例４におけるＰＤ−Ｌ１抗体の投与量は、普通の純粋な抗体投与量の１％しかないが、より優れた腫瘍抑制能力を示して、半減期が２倍以上に増加した。
また、図１４Ｄの結果から分かるように、実施例１−４は何れも抗腫瘍転移能力を有した。図１４Ｄにおいて、他の群と比べて、実施例３及び実施例４の投与は著しく肺腫瘍転移を阻害できる。
別に図１４Ｅの結果から分かるように、対照組の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの肺に２０の結節を超える肺転移を有し、実施例４が投与される４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの肺に平均して５つの結節未満の肺転移が発見された。従って、上記の結果から分かるように、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットは、明らかな阻害腫瘍と抗腫瘍転移作用を有した。対照組と比べて、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘは、腫瘍の転移を著しく減少させなかった。本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットの有する抗腫瘍転移作用は、フコイダンの阻害作用に加え、腫瘍微小環境の動的応答に関連することを推測した。
【００８１】
（２．１．２  本発明の免疫磁気組成物による大腸癌の治療効果）
本試験例は、生物発光酵素を安定に発現するｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を持つＣＴ−２６細胞株を大腸癌の動物モデル（中国医薬大学付属病院分子医療センターによって提供される）として、ＩｇＧ（対照組）、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘ及び実施例３を右大腿静脈を介してＣＴ−２６腫瘍マウスに投与し、試験的に、別に実施例３が投与され円状表面の磁石（直径０．５ｃｍ，０．５Ｔｅｓｌａ）を合わせて磁気誘導を行う実施例４（本発明の癌治療用のキット）、及びＩＯ＠ＦｕＤｅｘが投与され円状表面の磁石を合わせて磁気誘導を行う比較例１があった。投与形態として、腫瘍接種の８日後、４日ごとに連続して３回（ｑ４ｄｘ３）投与した。腫瘍体積をデジタルキャリパーを用いて２〜３日ごとにモニターし、腫瘍体積を前記の式Ｉに基づいて計算し、非侵襲的生体内分子イメージングシステムによって生物発光評価を行った。ＣＴ−２６腫瘍マウスの生存率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって分析した。
【００８２】
図１５Ａ〜図１５Ｃ及び添付ファイル３を参照すると、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットが大腸癌マウスモデルで癌細胞増殖を阻害する分析結果図である。
図１５Ａは、ＣＴ−２６腫瘍マウスに実施例３−４が投与された後の２４時間の非侵襲的生体内分子イメージングシステムスキャン結果図である。添付ファイル３は、図１５Ａのカラー図面であり。図１５Ｂは、ＣＴ−２６腫瘍マウスに実施例３−４が投与された後の腫瘍体積統計図である。図１５Ｃは、ＣＴ−２６腫瘍マウスに実施例３−４が投与された後の生存曲線である。
【００８３】
図１５Ａと図１５Ｂの結果から分かるように、対照組と比べて、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘは、腫瘍生長を阻害できるが、統計的に明らかな差異がなかった。ＩＯ＠ＦｕＤｅｘを投与し磁気誘導を合わせる比較例１は、ＩＯ＠ＦｕＤｅｘの治療効果を向上させることができた。本発明の実施例３−４は、抗腫瘍効果を有する以外、且つ統計的に明らかな差異があり（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す）、特に、実施例４は、３０日以内に腫瘍の増殖をほとんど阻害した。
図１５Ｃの結果から分かるように、実施例３及び実施例４を投与すると、著しくマウスの生存時間を延長して、本発明の免疫磁気組成物が腫瘍生長と転移を阻害する効果があることが再び証明された。
【００８４】
（２．２  本発明の免疫磁気組成物を投与した後の免疫作用の分析）
本試験例は、更に４Ｔ１腫瘍モデルで、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットの腫瘍内の微環境における免疫作用を検討した。初期腫瘍（１０日）から晩期（３０日）の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの腫瘍、血液、腹水及び脾臓におけるリンパ球の数の変化を実験的にモニターした。
【００８５】
図１６Ａ〜図１６Ｉを参照すると、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後の腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球数変化とサイトカイン含有量変化の分析結果図である。
図１６Ａと図１６Ｂの結果から分かるように、実施例１−４が投与される群、特に、実施例４が投与される群（ｐ＜０．０１）は、著しく抗腫瘍リンパ球細胞、例えば、ＣＤ８+  Ｔ細胞とＣＤ４+  Ｔ細胞の数を向上させることができた。
図１６Ｃと図１６Ｄの結果から分かるように、実施例１−４が投与される群は、著しく前腫瘍抗腫瘍リンパ球細胞、例えばＣＤ４+ＣＤ２２５+Ｆｏｘｐ３+Ｔｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）とＣＤ１１ｂ+ＣＤ２０６+Ｆ４／８０+ＴＡＭ（腫瘍関連マクロファージ）の数を低減させることができ、特に、実施例４が投与される群は、大幅に調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）数（ｐ＜０．０１）を低減させることができた。
図１６Ｅ〜図１６Ｇにおいて、異なる群の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウス血清を回収し、ＴＡＭによって分泌されたＴＮＦ−α、ＶＥＧＦとＴＧＦ−βの含有量を分析し、実施例１−４が投与される群、特に、実施例４が投与される群（ｐ＜０．０１）は、著しくＴＮＦ−α、ＶＥＧＦとＴＧＦ−β等の前炎症性サイトカインの含有量を低減させることができた。
図１６Ｈと図１６Ｉにおいて、細胞内グランザイムＢ（ＧｒＢ+）とＫｉ６７の発現レベルによってＣＤ８+  Ｔ細胞の活性化程度を評価して、実施例１−４が投与される群、特に、実施例４が投与される群（ｐ＜０．０１）は、ＣＤ８+腫瘍浸潤リンパ球細胞の機能を効果的に活性化することができた。
【００８６】
前記試験例で本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与すると腫瘍微小環境を変えることができると確認した後で、本試験例で更に本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットの腫瘍に対する特異的免疫応答と全身作用の変化を検討した。試験的に、異なる群の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの腫瘍、血清、脾臓を回収し、ＩＮＦ−γ+ＣＤ４４+  Ｔ細胞とＣＤ８+ＣＤ３+  Ｔ細胞の変化をモニターして、ＴＵＮＥＬテストによって異なる群の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの皮膚組織のアポトーシス状況を観察した。
【００８７】
図１７Ａと図１７Ｂを参照すると、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットの反応部位の分析結果図である。図１７Ａは、異なる群の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスのＩＮＦ−γ+ＣＤ４４+  Ｔ細胞の変化結果図である。図１７Ｂは、異なる群の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスのＣＤ８+ＣＤ３+  Ｔ細胞の変化結果図である。
【００８８】
図１７Ａの結果から分かるように、ＩＮＦ−γ+ＣＤ４４+  Ｔ細胞は実施例１−４が投与された後で増殖の数が向上し、特に、実施例４が投与される群は高く増殖した。図１７Ｂの結果から分かるように、実施例１−３が投与された後で、ＣＤ８+ＣＤ３+  Ｔ細胞が血清と脾臓で何れも増殖するが、実施例４が投与される群と実施例３が投与される群と比べて、磁気誘導によってＣＤ８+ＣＤ３+  Ｔ細胞が血清と脾臓における増殖を低減させた。
【００８９】
皮膚の毒性によるかゆみや白斑が免疫チェックポイント阻害剤治療における副作用の一つであり、免疫関連の有害事象がしばしば長期間の場合に起こるので、本試験例では、腫瘍が接種された4週間後で、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの皮膚組織に対してＴＵＮＥＬテストを行って、浸潤しているＴ細胞が免疫応答を誘発し皮膚組織損傷を引き起こすかを評価した。
【００９０】
添付ファイル４、図１７Ｃと図１７Ｄを参照すると、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットのＴＵＮＥＬテスト結果図である。図１７Ｃは、ＴＵＮＥＬテストによる異なる群の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの皮膚組織アポトーシス指数の統計結果図である。アポトーシス指数は、ＴＵＮＥＬ+アポトーシス核の比例を細胞核総数（ランダムに選択された微小範囲）で割ったものとして、２因子の変動性の分析とＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後比較試験を用いて異なる群の間の差異を評価した。図１７Ｄは、ＴＵＮＥＬテストによる異なる群の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍マウスの蛍光顕微鏡写真図であり、スケールバーは、５０μＭの長さを示す。添付ファイル４は、図１７Ｄのカラー図面である。
【００９１】
図１７Ｃと図１７Ｄの結果から分かるように、実施例１−３が投与された後で、ＴＵＮＥＬで標識される（緑色）アポトーシス細胞が増加し、対照群と比べて実施例３が投与される群のアポトーシス指数が３．３倍増加した。しかしながら、実施例４が投与される群は実施例３が投与される群と比べて、磁気誘導は効果的に皮膚組織におけるアポトーシス細胞の数を低減させることができた。
【００９２】
（２．３  本発明の免疫磁気組成物の免疫関連の有害事象試験）
本試験例において更に本発明の免疫磁気組成物又は癌治療用のキットを投与した４Ｔ１腫瘍モデルで、試験的に実施例３又は実施例４を４Ｔ１腫瘍マウスに投与し、腫瘍が接種された４週後、４Ｔ１腫瘍マウスに対して免疫関連有害事象（Ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ；ｉｒＡＥｓ）をテストして、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットの安全性を分析した。
【００９３】
本試験例は、実施例３及び実施例４によって治療された４週後のマウスのＣＤ４+  Ｔ細胞及びＣＤ８+  Ｔ細胞の主要臓器への浸潤程度を観察して副作用の影響を判断した。図１８Ａ〜図１８Ｅを参照すると、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウスＣＤ４+  Ｔ細胞とＣＤ８+  Ｔ細胞の浸潤程度の分析図である。
図１８Ａは、肝臓の分析結果図である。図１８Ｂは、肺臓の分析結果図である。図１８Ｃは、脾臓の分析結果図である。図１８Ｄは、腎臓の分析結果図である。図１８Ｅは、大腸の分析結果図である。結果から分かるように、実施例３は肝臓、肺臓、脾臓、腎臓と大腸へのＴ細胞浸潤程度が対照組よりも低く、実施例４は磁石の吸引作用によって、更に周りへの蓄積（肝臓、肺臓、脾臓、腎臓と大腸）を著しく低減させることができ、更にＴ細胞の浸潤を低減させた。
【００９４】
本試験例において更に血液生化分析によって、肝機能指標（ＡＳＴとＡＬＴ）、腎機能指標（クレアチニン）及び血糖値を分析して副作用の影響を判断する。図１９Ａ〜図１９Ｄを参照すると、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットを投与した後のマウス血液生化学分析の結果図である。
図１９Ａは、ＡＳＴ値分析図である。図１９Ｂは、ＡＬＴ値分析図である。図１９Ｃは、クレアチニン値分析図である。図１９Ｄは、血糖値分析図である。図面から分かるように、実施例３又は実施例４を投与した治療群と対照組の生化値がやはり正常値の範囲に保持され、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットはある程度の安全性を有することを示す。
【００９５】
また、腫瘍が接種された４週後のマウスに対して病理学的切片の分析を行い、図２０及添付ファイル５を参照すると、実施例３及び実施例４を投与した後のマウスの病理学的切片の画像である。添付ファイル５は、図５Ａのカラー図面である。結果から分かるように、対照組と比べて、実施例３又は実施例４を投与した治療群は、肝臓、肺臓、脾臓、腎臓及び大腸において明らかな組織損傷がなく、本発明の免疫磁気組成物及び癌治療用のキットはある程度の安全性を有することを示す。
【００９６】
要するに、本発明の免疫磁気組成物は、調製方法の製造プロセスが簡単であり、抗癌活性を有するフコイダンを担体の構成として、超常磁性酸化鉄ナノ粒子を組み合わせて、外層が抗体をグラフトすることができ活性物質をコア層に覆うことができる免疫磁気組成物を形成して、調製された免疫磁気組成物は、ナノスケール構造であり、そのサイズが適切で腫瘍に浸透して、腫瘍に対するフコイダンの役割を強めることができた。外層の抗体は、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤であってもよく、これによって本発明の免疫磁気組成物が自体材料の抗癌作用に加えて、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はキラーＴ細胞増殖剤の両方であってもよく、腫瘍微小環境が大幅に改善され、且つ本発明の免疫磁気組成物は、単独の同じ抗体による免疫療法の抗癌効果を大幅に改善し、より少ない抗体用量でより良好な腫瘍抑制能力を達成することができた。また、製造された免疫磁気組成物は、凍結乾燥して粉末状の結晶を形成し、無菌条件下で長時間保存することができ、必要に応じて溶媒で再溶解して用いることができ、簡便で安定した特性を示す。
【００９７】
本発明の癌治療用キットは、本発明の免疫磁気組成物及び磁場発生装置を含み、磁場発生装置によって磁場を発生させ、磁気誘導の補助工具として、本発明の免疫磁気組成物を患部に蓄積して、腫瘍で免疫細胞の増殖が強く、且つ全身の免疫応答を低下させることができ、本発明の免疫磁気組成物の抗癌効果を更に高めることができる。前記試験のデータから確認されるように、局所に対する治療能力を有し、本発明の癌治療用キットは、同時に物理的及び生物学的目的作用を有するので、免疫療法及び化学療法の組み合わせ、又は免疫療法の化合物治療に寄与し、過剰な免疫反応による重篤な副作用を避ける。
【００９８】
本発明の実施形態を前述の通りに開示したが、これは、本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、多様の変更や修飾を加えてもよく、したがって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とするものである。
【符号の説明】
【００９９】
１００                                  免疫磁気組成物
１１０                                  コア層
１２０                                  シェル層
１３０                                  外層
１３１                                  抗体
３００                                  免疫磁気組成物の調製方法
３１０、３２０、３３０、３４０、３５０  工程
【図１】
2018188435.tif 000007
【図２】
2018188435.tif 000008
【図３Ａ】
2018188435.tif 000009
【図３Ｂ】
2018188435.tif 000010
【図３Ｃ】
2018188435.tif 000011
【図３Ｄ】
2018188435.tif 000012
【図３Ｅ】
2018188435.tif 000013
【図３Ｆ】
2018188435.tif 000014
【図４Ａ】
2018188435.tif 000015
【図４Ｂ】
2018188435.tif 000016
【図４Ｃ】
2018188435.tif 000017
【図５Ａ】
2018188435.tif 000018
【図５Ｂ】
2018188435.tif 000019
【図６Ａ】
2018188435.tif 000020
【図６Ｂ】
2018188435.tif 000021
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2018188435.tif 000024
【図８】
2018188435.tif 000025
【図９】
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【図１０Ａ】
2018188435.tif 000027
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
2018188435.tif 000029
【図１１Ｂ】
2018188435.tif 000030
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2018188435.tif 000038
【図１３Ａ】
2018188435.tif 000039
【図１３Ｂ】
2018188435.tif 000040
【図１３Ｃ】
2018188435.tif 000041
【図１３Ｄ】
2018188435.tif 000042
【図１４Ａ】
2018188435.tif 000043
【図１４Ｂ】
2018188435.tif 000044
【図１４Ｃ】
2018188435.tif 000045
【図１４Ｄ】
2018188435.tif 000046
【図１４Ｅ】
2018188435.tif 000047
【図１５Ａ】
2018188435.tif 000048
【図１５Ｂ】
2018188435.tif 000049
【図１５Ｃ】
2018188435.tif 000050
【図１６Ａ】
2018188435.tif 000051
【図１６Ｂ】
2018188435.tif 000052
【図１６Ｃ】
2018188435.tif 000053
【図１６Ｄ】
2018188435.tif 000054
【図１６Ｅ】
2018188435.tif 000055
【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
2018188435.tif 000057
【図１６Ｈ】
2018188435.tif 000058
【図１６Ｉ】
2018188435.tif 000059
【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
2018188435.tif 000063
【図１８Ａ】
2018188435.tif 000064
【図１８Ｂ】
2018188435.tif 000065
【図１８Ｃ】
2018188435.tif 000066
【図１８Ｄ】
2018188435.tif 000067
【図１８Ｅ】
2018188435.tif 000068
【図１９Ａ】
2018188435.tif 000069
【図１９Ｂ】
2018188435.tif 000070
【図１９Ｃ】
2018188435.tif 000071
【図１９Ｄ】
2018188435.tif 000072
【図２０】
2018188435.tif 000073