(57)【要約】【課題】本発明は、骨格筋の萎縮を阻害することが可能な組成物、又は、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することが可能な組成物を提供する。【解決手段】本発明は、水溶性ウコン抽出物又はビサクロンを有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物に関する。本発明はまた、水溶性ウコン抽出物又はビサクロンを有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物。
【請求項２】
ビサクロンを０．１重量％以上含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
クルクミンを含まない又はクルクミンの含有量が０．５重量％以下である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
ビサクロンを有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物。
【請求項５】
飲食品である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物。
【請求項７】
ビサクロンを０．１重量％以上含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
クルクミンを含まない又はクルクミンの含有量が０．５重量％以下である、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
ビサクロンを有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物。
【請求項１０】
飲食品である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮を阻害するための組成物に関する。
本発明はまた、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会が進行している我が国では、加齢による筋萎縮であるサルコペニアや寝たきりによる筋萎縮である廃用性筋萎縮の患者が増加すると考えられる。こうした筋萎縮は入院を要することが考えられ、それによる医療費の増大や病床の占有率も問題となる。
【０００３】
サルコペニアや廃用性筋萎縮の治療は困難であり、その予防や治療法の開発が研究されている。一方で、運動は筋萎縮を抑えるための有効な手段として知られているが、高齢者や寝たきり状態の患者は日常的に運動することが困難である。従って骨格筋萎縮対策として食品からのアプローチが注目されている。食品は日常生活に取り入れやすいことから、骨格筋萎縮抑制効果を有する食品への期待は大きい。
【０００４】
骨格筋萎縮対策に有用な食品に関する発明は、例えば以下の文献に開示されている。
特許文献１には、ウコン抽出物を有効成分とする剤により、筋芽細胞を活性化し、筋肉を増強させることで、筋肉萎縮を回復できることが記載されている。また、ウコン抽出物にはセスキテルペン類が含まれていることが記載されている。
【０００５】
特許文献２には、ウコン抽出物とその他１成分とを含む組成物により、ＡＴＰ、一酸化窒素、ｅ．Ｎｏｓ、ＭＡＯ、ＡＣＨＥ、筋肉タンパク質、ミオゲニンから選択されるバイオマーカーを改善し、筋細胞増殖を増強する方法が記載されている。
【０００６】
非特許文献１では、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与糖尿病モデルマウス（Ｔ１ＤＭ）の下肢骨格筋萎縮がクルクミン投与により軽減されたこと、クルクミン投与により大腿直筋，腓腹筋において萎縮が有意に抑制されたことが記載されている。また、非特許文献１では、ＳＴＺ群で増加したＭｕＲＦ１，Ａｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘのｍＲＮＡ発現は、クルクミン投与でいずれも有意に減少したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１５６２９４号公報
【特許文献２】特表２０１６−５０５６１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】小野太祐，「クルクミンはタンパク質分解亢進を抑制して糖尿病に伴う下肢骨格筋の萎縮を軽減する」，北海道大学博士論文，甲第９８０９号，平成２３年３月２４日学位授与
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１及び２には、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することで筋萎縮を阻害することについて記載されていない。
【００１０】
非特許文献１では、クルクミン以外のウコン成分による筋萎縮原因遺伝子に対する作用に関する記載は無い。
【００１１】
本発明は、骨格筋の萎縮を阻害することが可能な組成物、又は、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することが可能な組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物。
（２）ビサクロンを０．１重量％以上含む、（１）に記載の組成物。
（３）クルクミンを含まない又はクルクミンの含有量が０．５重量％以下である、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）ビサクロンを有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物。
（５）飲食品である、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物。
（７）ビサクロンを０．１重量％以上含む、（６）に記載の組成物。
（８）クルクミンを含まない又はクルクミンの含有量が０．５重量％以下である、（６）又は（７）に記載の組成物。
（９）ビサクロンを有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物。
（１０）飲食品である、（６）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、骨格筋の萎縮を阻害することが可能な組成物、及び、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することが可能な組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、試料Ｎｏ．１〜５の細胞障害率の測定結果を示す。
【図２】図２Ａは、試料Ｎｏ．１〜５により処理した骨格筋細胞におけるＤＥＸ誘導性Ｍａｆｂｘ遺伝子の発現量を示す。図２Ｂは、試料Ｎｏ．１〜５により処理した骨格筋細胞におけるＤＥＸ誘導性Ｍｕｒｆ１遺伝子の発現量を示す。図２Ａ及び図２Ｂでは、ＤＥＸ添加,試料未添加群（ｃｏｎｔｒｏｌ／ＤＥＸ＋）での各遺伝子の発現量に対する割合（％）で示す。
【図３】図３上段は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））で、対照群（ＣＯＮ）、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）又はＩＧＦ−１添加群（ＩＧＦ−１）のマウス骨格筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液を試料とした実験２に記載のウェスタンブロッティングで得られたＰＶＤＦ膜上のＭＡＦｂｘ及びβ−ａｃｔｉｎ（内部標準）のバンドを示す。図３下段は、実験２に記載のウェスタンブロッティングで求められた、各条件で培養したＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液中での、β−ａｃｔｉｎのタンパク質量に対する、ＭＡＦｂｘのタンパク質量を示す。
【図４】図４は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））の対照群（ＣＯＮ）又は秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）のＣ２Ｃ１２でのＦｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量（ＰｐｉａのｍＲＮＡ発現量に対する相対値）を示す。
【図５】図５上段は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））で、対照群（ＣＯＮ）、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）又はＩＧＦ−１添加群（ＩＧＦ−１）のＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液を試料とした実験４に記載のウェスタンブロッティングで得られたＰＶＤＦ膜上のリン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ）及びリン酸化されていないｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のバンドを示す。図５下段は、実験４に記載のウェスタンブロッティングで求められた、各条件で培養したＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液中での、リン酸化されていないｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のタンパク質量に対する、リン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ）のタンパク質量を示す。
【図６】図６Ａは、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））の、対照群（ＣＯＮ）又は秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）で培養したＣ２Ｃ１２の筋管直径の平均値（μｍ）と標準偏差を示す。図６Ｂは、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））、対照群（ＣＯＮ）又はビサクロン添加群（ＢＣ）で培養したＣ２Ｃ１２の筋管直径の平均値（μｍ）と標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜ウコン＞
本発明においてウコンとは、ショウガ科ウコン属の植物であるＣｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａを指す。Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａは「秋ウコン」と呼ばれる場合もある。
【００１６】
＜水溶性ウコン抽出物＞
水溶性ウコン抽出物は、ウコン植物原料の、後述する親水性抽出溶媒による抽出物（ウコンエキス）をいい、必要に応じてさらに加熱及び／又は減圧等により抽出溶媒を揮発し、乾燥させたものであってもよい。これらの加熱、減圧、乾燥の方法は特に限定されず、例えば従来公知の方法を使用することができる。
【００１７】
ウコン植物原料としては、ウコンの根茎が挙げられる。ウコンの根茎は土中から採取し洗浄したものをそのまま使用してもよいし、根茎の適当な部位を原型のまま、あるいは適当な寸法又は形状にカットしたもの、あるいは粉砕物の形態にしたものを使用することができる。ウコン植物原料は乾燥されたものであってよい。
【００１８】
植物原料からのウコン抽出物の抽出方法は特に限定されず、従来公知の方法を使用することができる。
【００１９】
親水性抽出溶媒としては、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、水、親水性有機溶媒、又は、水と親水性有機溶媒の混合溶媒がより好ましく、水、又は、水と親水性有機溶媒の混合溶媒が特に好ましい。親水性有機溶媒は複数種の親水性有機溶媒の混合溶媒であってもよい。「水」とは熱水も包含する。親水性有機溶媒としては少なくとも１種のアルコール（複数種のアルコールの混合溶媒であってもよい）が挙げられ、アルコールとしては、特に限定されないが、エタノールが好ましい。
【００２０】
親水性抽出溶媒として親水性有機溶媒と水との混合溶媒を用いる場合、両者の混合比は特に限定されないが、例えば親水性有機溶媒：水の重量比は１０：９０〜９０：１０の範囲が好ましく、２０：８０〜５０：５０の範囲がより好ましい。抽出する際の温度は、特に限定されない。
【００２１】
親水性抽出溶媒を用いて抽出された水溶性ウコン抽出物は、抽出溶媒として酢酸エチル等の疎水性有機溶媒を用いて抽出された非水溶性ウコン抽出物と比較して、水溶性のより高い化合物を含有する。従って、水溶性ウコン抽出物と非水溶性ウコン抽出物とは、含有される成分が互いに異なる。
【００２２】
本発明において、水溶性ウコン抽出物としては、上述のようにして得られたウコン根茎の親水性抽出溶媒による抽出物をそのまま使用することができるし、該ウコン根茎の親水性抽出溶媒による抽出物を、さらに、希釈、濃縮、乾燥等の処理を施したものを使用することもできる。希釈、濃縮、乾燥等の方法は、従来公知の方法を使用することができる。
【００２３】
本発明に用いる水溶性ウコン抽出物は、好ましくは、ビサクロンを含むことを特徴とする。ビサクロンは、水溶性ウコン抽出物全量に対して好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．１５重量％以上、特に好ましくは０．２重量％以上含有される。水溶性ウコン抽出物中のビサクロンの量は、水溶性ウコン抽出物を酢酸エチルと混合し、遠心分離して得られた上澄み液から酢酸エチルを減圧留去後、アセトニトリルに溶解した液を分析サンプルとして、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付すことにより求めることができる。
【００２４】
本発明に用いる水溶性ウコン抽出物は、好ましくは、クルクミンを含まない、又はクルクミンを含んでいたとしても０．５重量％以下である。本発明に用いる水溶性ウコン抽出物は、更に好ましくは、クルクミノイド（クルクミン及びその類縁物質の総称）を含まない、又はクルクミノイドを含んでいたとしても合計で０．５重量％以下である。
【００２５】
クルクミン及びクルクミノイドの量は、水溶性ウコン抽出物を５０％アセトニトリルで溶解させ、遠心分離した上清液を高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）により測定することができる。
【００２６】
＜ビサクロン＞
本発明においてビサクロンとは、ビサボラン型セスキテルペン類に分類される化合物であり、下記の平面構造式を有する化合物又はその塩を意味する。ビサクロンは平面構造式中＊印で示した位置に不斉炭素を有し、そのため数種の光学異性体が存在するが、本明細書におけるビサクロンとはそのいずれの光学異性体も包含する概念である。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
本発明の一実施形態に係る、ビサクロンを含む組成物は、上記の、ビサクロンを含む水溶性ウコン抽出物を含む組成物であることが好ましいが、これには限定されず、他の起源からのビサクロンを含む組成物であってもよい。他の起源からのビサクロンとしては、人為的に合成されたビサクロンや、ショウガ科ウコン属の植物（秋ウコンに限らない）から抽出され精製されたビサクロンが使用できる。
【００２９】
＜水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物、及び、その用途＞
本発明の一実施形態は、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物に関する。
水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、水溶性ウコン抽出物からなる組成物（即ち水溶性ウコン抽出物自体）であってもよいし、水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを含む組成物であってもよい。該組成物が、水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを含む場合、水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを混合した組成物であってもよいし、水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを適当な手段で製剤化した組成物であってもよいし、水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分との製剤化した組成物を、更に他の成分と混合した組成物であってもよい。本発明における、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物の形状は、特に限定されず、例えば、液体状、流動状、ゲル状、半固形状、又は固形状などの何れの形状であってもよい。
【００３０】
前記の、少なくとも１種の他の成分としては、特に限定されないが、好ましくは、飲食品、医薬品等の最終的な形態において許容される成分であって、経口摂取可能な成分が例示できる。
【００３１】
このような他の成分としては例えば、甘味料、酸味料、ビタミン類、ミネラル類、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、水等が挙げられる。また、必要により、色素、香料、保存料、防腐剤、防かび剤、更なる生理活性物質等を添加してもよい。
【００３２】
甘味料としては、ブドウ糖、果糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、パラチノース、トレハロース、キシロース等の単糖や二糖、異性化糖（ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、砂糖混合異性化糖等）、糖アルコール（エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、パラチニット、ソルビトール、還元水飴等）、はちみつ、高甘味度甘味料（スクラロース、アセスルファムカリウム、ソーマチン、ステビア、アスパルテーム等）等が挙げられる。
【００３３】
酸味料としては、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、又はこれらの塩等があり、これらのうちの１種又は２種以上を利用することができる。
【００３４】
ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＥ、ナイアシン、イノシトール等が挙げられる。
ミネラル類としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等が挙げられる。
【００３５】
増粘剤としては、カラギーナン、ジェランガム、キサンタンガム、アラビアガム、タマリンドガム、グアーガム、ローカストビーンガム、カラヤガム、寒天、ゼラチン、ペクチン、大豆多糖類、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等が挙げられる。
【００３６】
乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン、植物性ステロール、サポニン等が挙げられる。
【００３７】
酸化防止剤としては、ビタミンＣ、トコフェロール（ビタミンＥ）、酵素処理ルチン、カテキン等が挙げられる。
【００３８】
前記他の成分は、それぞれ当業者が飲食品、医薬品等の組成物に通常採用する範囲内の量で適宜配合することができる。
【００３９】
水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを適当な手段で製剤化した組成物の形態は、カプセル剤、錠剤（糖衣錠等のコーティング錠又は多層錠、口中崩壊剤、チュアブル錠等を含む）、散剤もしくは顆粒剤等の固形組成物の形態であってもよいし、液体組成物の形態であってもよい。
【００４０】
本発明における、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、それ自体が飲食品又は医薬品であることが好ましく、飲食品であることがより好ましい。ここで飲食品とは食品添加物や、他の食品素材と組み合わせて飲食品の製造に用いられる飲食品原料の形態も包含する。水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物が飲食品である場合、或いは、他の食品素材と組み合わせて飲食品の製造に用いられる飲食品原料である場合において、「飲食品」は、好ましくは機能性表示食品、特定保健用食品、栄養補給のためのサプリメント等であり、その形態は特に限定されないが、例えば、菓子類（例えば、ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック菓子、ゼリー、グミ、錠菓等）、麺類（例えば、そば、うどん、ラーメン等）、乳製品（例えば、ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、調味料（例えば、味噌、醤油等）、スープ類、飲料（例えば、ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）等が挙げられ、好ましくは飲料である。
【００４１】
水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、好ましくは、ビサクロンを、組成物全量に対して好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．１５重量％以上、特に好ましくは０．２重量％以上含有する。前記組成物中のビサクロンの量は、前記組成物を酢酸エチルと混合し、遠心分離して得られた上澄み液から酢酸エチルを減圧留去後、アセトニトリルに溶解した液を分析サンプルとして、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付すことにより求めることができる。
【００４２】
水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、好ましくは、クルクミンを含まない、又はクルクミンを含んでいたとしても組成物全量に対し０．５重量％以下である。前記組成物は、更に好ましくは、クルクミノイドを含まない、又はクルクミノイドを含んでいたとしても合計で組成物全量に対し０．５重量％以下である。クルクミン及びクルクミノイドの量は、前記組成物を５０％アセトニトリルで溶解させ、遠心分離した上清液を高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）により測定することができる。
【００４３】
水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、本発明の一実施形態において、筋萎縮を阻害するための組成物である。ここで「筋萎縮を阻害する」とは、ヒト又は非ヒト動物、好ましくはヒト、において、サルコペニア、廃用性筋萎縮等の筋肉の萎縮を予防、軽減又は治療することを指す。本発明の一実施形態に係る、筋萎縮を阻害するための組成物は、加齢により衰える筋肉もしくは筋力を維持又は改善するため、又は、加齢により衰える歩行能力を維持又は改善するために摂取することができる。
【００４４】
水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、本発明の他の一実施形態において、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物である。ここで「筋萎縮原因遺伝子」とは、代表的には、ヒトにおけるＭａｆｂｘ遺伝子及びＭｕｒｆ１遺伝子のうち一種以上である。これらの筋萎縮原因遺伝子は、筋萎縮患者において発現が亢進し、筋萎縮の原因となることが知られている。「筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制する」とは、筋萎縮の予防が求められるヒト等の対象において筋萎縮原因遺伝子の発現の亢進を未然に予防すること、及び、筋萎縮の症状を有するヒト等の対象において筋萎縮原因遺伝子の発現の亢進を軽減することを指す。本発明の一実施形態に係る、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物もまた、加齢により衰える筋肉を維持又は改善するため、或いは、加齢により衰える歩行能力を維持又は改善するために摂取することができる。筋萎縮原因遺伝子の発現が抑制されていることは、本発明の組成物を摂取した対象から細胞、好ましくは筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞等）を採取し、細胞中のＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡを鋳型とし、筋萎縮原因遺伝子を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅産物量を検出することで確認することができる。Ｍａｆｂｘ遺伝子を増幅するためのプライマーセットは配列番号１に示す塩基配列を含むプライマーと、配列番号２に示す塩基配列を含むプライマーとのセットが例示できる。Ｍｕｒｆ１遺伝子を増幅するためのプライマーセットは配列番号３に示す塩基配列を含むプライマーと、配列番号４に示す塩基配列を含むプライマーとのセットが例示できる。
【００４５】
筋萎縮原因遺伝子の発現が抑制されていることは、本発明の組成物を摂取した対象から細胞、好ましくは筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞等）を採取し、細胞中の、筋萎縮原因遺伝子に由来するタンパク質を検出することで確認することもできる。例えば、Ｍａｆｂｘ遺伝子に由来するタンパク質であるＭＡＦｂｘ、Ｍｕｒｆ１遺伝子に由来するタンパク質であるＭｕＲＦ１等の、筋萎縮原因遺伝子に由来するタンパク質の量が細胞中で低減している場合に、筋萎縮原因遺伝子の発現が抑制されていることが確認できる。
【００４６】
骨格筋の筋萎縮は、ユビキチン・プロテアソーム分解経路を含むタンパク質分解系によるタンパク質分解が、タンパク質合成系によるタンパク質合成を上回る場合に生じると推定される。
【００４７】
タンパク質分解系を構成するユビキチン・プロテアソーム分解経路は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、及び、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の酵素群からなるユビキチン化システム（分解すべきタンパク質にポリユビキチンを連結する）と、ポリユビキチンを認識して分解するプロテアソームの二つの系からなる。筋萎縮原因遺伝子に由来するタンパク質であるＭＡＦｂｘ及びＭｕＲＦ１は、ユビキチンリガーゼの一例である。低栄養、飢餓等のストレス環境下では、ホルモンであるグルココルチコイドが、細胞膜上のグルココルチコイド受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を経て、筋萎縮原因遺伝子の発現が促進される。細胞内シグナル伝達に含まれ、筋萎縮原因遺伝子の発現を促進するタンパク質として、フォークヘッド型転写因子（ＦＯＸＯ）サブファミリーが知られている。ＦＯＸＯサブファミリーの１つにＦＯＸＯ３がある。本発明の組成物は、グルココルチコイドにより誘導される、Ｆｏｘｏ３遺伝子の発現を抑制することができ（実験３参照）、それにより筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４８】
タンパク質合成系の１つに、内分泌物質であるインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦ−１）が、細胞膜上のＩＧＦ−１受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を経て、Ｓ６リボソームタンパク質がリン酸化され、タンパク質合成が促進される経路が知られている。Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化に関与するタンパク質が、ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）である。ｐ７０Ｓ６Ｋは、リン酸化されることで活性化され、Ｓ６リボソームタンパク質をリン酸化する。本発明の組成物は、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を促進することができ（実験４参照）、それによりタンパク質合成系を促進することができる。
【００４９】
＜ビサクロンを有効成分として含む組成物、及び、その用途＞
本発明の一実施形態は、ビサクロンを有効成分として含む組成物に関する。
ビサクロンを有効成分として含む組成物は、ビサクロンからなる組成物（即ちビサクロン自体）であってもよいし、ビサクロンと、少なくとも１種の他の成分とを含む組成物であってもよい。該組成物が、ビサクロンと、少なくとも１種の他の成分とを含む場合、ビサクロンと、少なくとも１種の他の成分とを混合した組成物であってもよいし、ビサクロンと、少なくとも１種の他の成分とを適当な手段で製剤化した組成物であってもよいし、ビサクロンと、少なくとも１種の他の成分との製剤化した組成物を、更に他の成分と混合した組成物であってもよい。本発明における、ビサクロンを有効成分として含む組成物の形状は、特に限定されず、例えば、液体状、流動状、ゲル状、半固形状、又は固形状などの何れの形状であってもよい。
【００５０】
前記の、少なくとも１種の他の成分としては、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物に関して記載したものと同じものが使用できる。
【００５１】
ビサクロンを有効成分として含む組成物の好適な形態は、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物に関して説明した好適な形態と同様である。
【００５２】
ビサクロンを有効成分として含む組成物は、好ましくは、ビサクロンを、組成物全量に対して好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．１５重量％以上、特に好ましくは０．２重量％以上含有する。前記組成物中のビサクロンの量は、前記組成物を酢酸エチルと混合し、遠心分離して得られた上澄み液から酢酸エチルを減圧留去後、アセトニトリルに溶解した液を分析サンプルとして、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付すことにより求めることができる。
【００５３】
ビサクロンを有効成分として含む組成物は、好ましくは、クルクミンを含まない、又はクルクミンを含んでいたとしても組成物全量に対し０．５重量％以下である。前記組成物は、更に好ましくは、クルクミノイドを含まない、又はクルクミノイドを含んでいたとしても合計で組成物全量に対し０．５重量％以下である。クルクミン及びクルクミノイドの量は、前記組成物を５０％アセトニトリルで溶解させ、遠心分離した上清液を高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）により測定することができる。
【００５４】
ビサクロンを有効成分として含む組成物は、本発明の一実施形態において、筋萎縮を阻害するための組成物である。「筋萎縮を阻害するための組成物」の具体的な態様は、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物に関して説明した態様と同様である。
【００５５】
ビサクロンを有効成分として含む組成物は、本発明の他の一実施形態において、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物である。「筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物」の具体的な態様は、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物に関して説明した態様と同様である。
【実施例】
【００５６】
＜実験１：秋ウコン抽出物及びビサクロンのユビキチンリガーゼ遺伝子発現への影響評価（ｍＲＮＡレベル）＞
[試料]
下記表に示す試料を用いた。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
各試料の詳細は以下の通りである。
＜Ｎｏ．１  ビサクロン高濃度品（実施例）＞
ビサクロンは、精製された（≧９９％（ＨＰＬＣ））ビサクロン試薬を長良サイエンス株式会社から入手して、メタノールで適時希釈して使用した。
【００５９】
＜Ｎｏ．２  水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽出物）（実施例）＞
水溶性ウコン抽出物は、秋ウコンと通称される学名Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａの根茎の親水性抽出溶媒による抽出物を指す。ウコンの根茎部分を水等の抽出溶媒を用いて抽出し、加熱及び／又は減圧して抽出溶媒を揮発させたものを使用した。
【００６０】
実験に用いた水溶性ウコン抽出物は、ビサクロンを０．１５重量％以上含有し、クルクミノイドを０．１重量％以下含有するものであった。
【００６１】
＜Ｎｏ．３  ウコン色素（比較例）＞
ウコン色素は、Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａの根茎部分より、アルコールやヘキサン、アセトン等の有機溶媒で抽出したものを使用した。このようにして得られたウコン色素は主にクルクミン等のクルクミノイドを含む。
使用したウコン色素は、クルクミンを６０重量％以上含有するものであった。
【００６２】
＜Ｎｏ．４  ガジュツ水抽出物（比較例）＞
ガジュツは、ショウガ科ウコン属の１種の、紫ウコンと通称される学名Ｃｕｒｃｕｍａ  ｚｅｄｏａｒｉａを指し、秋ウコンとは別種である。ガジュツは秋ウコンに比べてビサクロンの含有量が少ない。ガジュツの根茎部分を、水を用いて抽出し、加熱及び／又は減圧して抽出溶媒を揮発させたものを、試料Ｎｏ．４として使用した。
【００６３】
＜Ｎｏ．５  ガジュツアルコール抽出物（比較例）＞
ガジュツの根茎部分を、エタノールを用いて抽出し、加熱及び／又は減圧して抽出溶媒を揮発させたものを、試料Ｎｏ．５として使用した。
【００６４】
［実験方法］
細胞障害率の測定
マウス骨格筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）添加ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にて３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ２条件下で培養した。培養に使用したＤＭＥＭ培地は１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とフィルター滅菌した１０％ＦＢＳを添加した。細胞継代の際は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、トリプシン溶液で細胞を剥がした。ＰＢＳはＰＢＳ１０×，ｐＨ７．４（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、東京）をｄＨ２Ｏで１０倍希釈し、オートクレーブ滅菌した。トリプシン溶液は０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（１×）（ｇｉｂｃｏ）を用いた。２日に一度培地交換を行い、細胞が４０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったところでＢｉｏｃｏａｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ｃｅｌｌ  ｗａｒｅ  ２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＣＯＲＮＩＮＧ）に播種した。細胞が９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったところで、４％ウマ血清（ＨＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）添加ＤＭＥＭに培地交換することにより分化誘導をかけた。培地交換は２日に一度行った。
【００６５】
細胞障害率の測定にはＬＤＨ−細胞毒性キット（Ｗａｋｏ）を使用した。分化誘導６日目にＰＢＳで洗浄後、無血清ＤＭＥＭで１２時間培養した。培地を除去しＰＢＳで洗浄後、各ｗｅｌｌに、前記試料Ｎｏ．１〜５のいずれか１つを２００μｇ／ｍＬまでになるように添加したＤＭＥＭを１ｍＬ加えて１２時間培養した。その後、培地上清を全量回収した。また、上清を除いた各ｗｅｌｌに１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＤＭＥＭを５００μＬずつ添加し、３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ２条件下で１０分間インキュベート後、ピペッティングにより細胞を回収した。回収した上清及び細胞懸濁液を遠心（３０００ｇ、５分、２５℃）後、各上清を９６ｗｅｌｌプレートに５０μＬ分注した。これにキット付属の反応開始薬を５０μＬずつ添加し、室温で５分間放置後、同じくキット付属の反応停止液の２倍希釈液を１００μＬ添加し、９０分以内にマイクロプレートリーダーにより５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６６】
（ＬＤＨ放出率）
＝１００×（培地上清の吸光度）／（培地上清の吸光度＋細胞懸濁液の吸光度）
という式によりＬＤＨ放出率を算出し、各試料未添加群に対するＬＤＨ放出率の割合（％）を細胞障害率とした。細胞障害率が１５０％以下となる最大濃度を、次に示す、ユビキチンリガーゼ遺伝子発現への影響評価時の試料の添加濃度とした。
【００６７】
各試料のユビキチンリガーゼ遺伝子発現への影響評価（ｍＲＮＡレベル）
試料Ｎｏ．１〜５のデキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導性ユビキチンリガーゼ発現に対する評価を行った。マウス骨格筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２を２４ｗｅｌｌプレートに播種し、９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったところで、４％ＨＳ添加ＤＭＥＭに培地交換することにより分化誘導をかけた。培地交換は２日に一度行った。分化誘導６日目にＰＢＳで洗浄後、無血清ＤＭＥＭで１２時間培養した。培地を除去しＰＢＳで洗浄後、各ｗｅｌｌに１００ｎＭとなるようにＤＥＸ（Ｓｉｇｍａ）を、細胞障害率の測定で決定された濃度となるように各試料を添加した無血清ＤＭＥＭを１ｍＬ加えて１２時間培養した。ＤＥＸはＥｔＯＨ（関東化学株式会社、東京）にて１００μＭとなるように溶解し、−２０℃にて保存した。その後、上清を除去し、ＰＢＳ  １ｍＬにて洗浄し、ＴＲＩｚｏｌＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、東京）１ｍＬによって細胞を回収し、−８０℃で保存またはそのまま次の操作に用いた。凍結保存した場合はＴＲＩｚｏｌＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔを融解した後、クロロホルム（関東化学株式会社、東京）２００μＬを添加・撹拌し、室温で３分間放置後、４℃で１５分間遠心（１６，０００ｇ）した。その後、上層の水層部を４００μＬ取り出し、２−プロパノール（関東化学株式会社、東京）５００μＬを添加・撹拌し、室温で１０分間放置後、４℃で１０分間遠心（１２，０００ｇ）した。その後、上清を除去し、７５％ＥｔＯＨ（関東化学株式会社、東京）ｉｎ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを７５０μＬ添加し、４℃で５分間遠心（７，６００ｇ）した。再び上清を除去し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ５０μＬ、１００％ＥｔＯＨ  １２５μＬ、３Ｍ酢酸ナトリウム１０μＬを添加し、−２０℃で一晩または２時間静置した。その後、４℃で１５分間遠心（１６，０００ｇ）し、上清を除去後、７５％ＥｔＯＨ  ｉｎ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  １ｍＬを添加し４℃で５分間遠心（１６，０００ｇ）した。再び上清を除去し、９０％ＥｔＯＨ  ｉｎ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  １ｍＬを添加し４℃で５分間遠心（１６，０００ｇ）した。その後上清を除去し、残存ＥｔＯＨを揮発させて得られたＲＮＡを２０μＬのＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解した。ＲＮＡの濃度はＮａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定を行った。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５００ｎｇからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ）を使用してｃＤＮＡを合成した。調製したｃＤＮＡは−２０℃で保存した。その後リアルタイムＰＣＲによってＭａｆｂｘ、Ｍｕｒｆ１及び内部標準遺伝子としてＰｐｉａの発現レベルを検討した。リアルタイムＰＣＲにはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＴＰ８００（ＴａＫａＲａ）を用いた。ＰＣＲ反応溶液の組成は、１サンプルにつきＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（Ｔｌｉ  ＲｎａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）６．２５μＬ、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ４．２５μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．５μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．５μＬ、ｃＤＮＡ  １μＬとした。ＰＣＲ反応条件は、初期変性を９５℃１０秒間で行い、その後９５℃５秒間→６０℃３０秒間（４０サイクル）→９５℃１５秒間→６０℃３０秒間→９５℃１５秒間とした。各プライマーはウェブアプリケーションＰＲＩＭＥＲ３  ＩＮＰＵＴにより設計し、合成をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃに依頼した。プライマー配列は以下に示した。
【００６８】
【表２】
2018188428.tif 000005
実験結果の統計処理には、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔを用いた。
【００６９】
［結果］
細胞障害率の測定
試料Ｎｏ．１〜５の細胞障害率の測定結果を図１に示す。細胞障害率が１５０％以下となる最大濃度から添加濃度をＮｏ．１は２０ｎｇ／ｍＬ、Ｎｏ．２，４〜５は２００μＬ／ｍＬ、Ｎｏ．３は５０μｇ／ｍＬとした。
【００７０】
試料のユビキチンリガーゼ遺伝子発現への影響評価（ｍＲＮＡレベル）
骨格筋細胞におけるＤＥＸ誘導性Ｍａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１発現に及ぼす、試料Ｎｏ．１〜５の影響を見るために、分化させたＣ２Ｃ１２にＤＥＸ処理をし、各試料により１２時間処理した。
【００７１】
結果を図２に示す。ＤＥＸ添加,試料未添加群（ｃｏｎｔｒｏｌ／ＤＥＸ＋）に対する割合（％）で示した。図２ＡではＭａｆｂｘの、図２ＢではＭｕｒｆ１の結果を示した。
【００７２】
Ｎｏ．１，Ｎｏ．３〜５にはＭａｆｂｘ発現低下作用が見られなかったが、Ｎｏ．２（ウコン抽出物）はＤＥＸ誘導性Ｍａｆｂｘ発現レベルを有意に低下させた（図２Ａ）。
【００７３】
また、Ｎｏ．４及び５にはＭｕｔｆ１発現低下作用が見られなかったが、Ｎｏ．１（ビサクロンとＮｏ．２（ウコン抽出物）はＤＥＸ誘導性Ｍｕｒｆ１発現レベルを有意に低下させた（図２Ｂ）。一方、Ｎｏ．３は、ＤＥＸ誘導性Ｍｕｒｆ１発現レベルを有意に亢進した（図２Ｂ）。
【００７４】
［考察］
ウコン抽出物は、ＤＥＸ誘導性のＭａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１のｍＲＮＡ発現低下作用を示した。また、ビサクロンはＤＥＸ誘導性のＭｕｒｆ１のｍＲＮＡ発現低下作用を示した。
【００７５】
Ｍａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１は種々の骨格筋萎縮時に発現が亢進することが知られており、骨格筋のタンパク質分解機構に関わるため、以上の結果からウコン抽出物及びビサクロンは骨格筋萎縮を抑制することができる。
【００７６】
＜実験２：秋ウコン抽出物（ＡＥ）のＭＡＦｂｘタンパク質発現への影響評価＞
［実験材料及び実験方法］
秋ウコン抽出物（ＡＥ）として、実験１で調製した「水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽出物）」を用いた。
【００７７】
６ｗｅｌｌプレートで培養した分化６日目のＣ２Ｃ１２を無血清培地で１２〜１６時間のｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った後、１００ｎＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）有無の条件下で、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地に交換し、１２時間培養した。培養終了後、各ウェルの上清を除去し、細胞を氷冷したＰＢＳ  １ｍＬで２回洗浄した後、液体窒素によりプレートごと凍結し、−８０℃で保存した。凍結保存した細胞を融解させ、各ウェルにＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ添加し、５分程静置した。その後、セルスクレーパーで細胞をプレートから剥がして得られた細胞溶解液を４℃で１時間ローテート（３０ｒｐｍ）し、ソニケーション（５秒、５回）を行った。これを２℃で３０分間遠心（１６，０００ｇ）し、上清を回収してタンパク質抽出液を得た。抽出液のタンパク質濃度測定はＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎを基準としたＢｒａｄｆｏｒｄ法により行い、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて波長６００ｎｍの吸光度を測定した。抽出した細胞内タンパク質を用いてウェスタンブロッティングによりＭＡＦｂｘのタンパク質量を測定した。ポジティブコントロールとして、１０ｎＭ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１（ＩＧＦ−１）を用いた。対照（ＣＯＮ）として、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地の代わりに、同量のＰＢＳを添加した培地を用いた以外は同様の手順でＣ２Ｃ１２を培養し、そのタンパク質抽出液中のＭＡＦｂｘのタンパク質量を測定した。ウェスタンブロッティングの方法は以下に示した。
【００７８】
細胞内タンパク質を１５−１００μｇを含むタンパク質抽出液に２×あるいは３×Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて５分間煮沸処理したものを２０μＬ／ｌａｎｅアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは８〜１２％ポリアクリルアミドゲルを用い２０ｍＡ／ｇｅｌで１時間半程度行った。泳動槽はＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。泳動終了後、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）への転写を、セミドライブロッター（アテナック）を用いたセミドライ式（１ｍＡ／ＰＶＤＦ膜１ｃｍ２、４５〜６０分）あるいはＭｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いたウェット式（１００Ｖ、１００分）で行った。転写終了後メンブレンをＴｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄後、ＰＶＤＦ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）  （ＴＯＹＯＢＯ）に浸し、室温で１時間あるいは４℃で一晩ブロッキングした。ブロッキング終了後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、一次抗体溶液に浸して４℃で一晩振盪した。その後ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、二次抗体溶液に浸して室温で１時間振盪した。再度ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により１分間化学発光させた。Ｅｚ−Ｃａｐｔｕｒｅ  ＭＧ（ＡＴＴＯ）を用いて検出し、ＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３．０（ＡＴＴＯ）を用いてデンシトメトリー解析を行った。
【００７９】
用いた抗体及び希釈倍率を以下に示す。一次抗体はＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（ＴＯＹＯＢＯ）、二次抗体はＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した。タンパク質発現の内部標準にはβ−ａｃｔｉｎを用いた。
【００８０】
〈一次抗体〉
ａｎｔｉ−ＭＡＦｂｘ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂｃａｍ，ａｂ１６８３７２）
希釈倍率：１０００倍
ａｎｔｉ−β−Ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３７００）
希釈倍率：２０００倍
〈二次抗体〉
ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＡ９３４）
ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＡ９３１）
【００８１】
［結果］
図３上段は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））で、対照群（ＣＯＮ）、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）又はＩＧＦ−１添加群（ＩＧＦ−１）のＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液を試料とした上記のウェスタンブロッティングで得られたＰＶＤＦ膜上のＭＡＦｂｘ及びβ−ａｃｔｉｎ（内部標準）のバンドを示す。
【００８２】
図３下段は、上記のウェスタンブロッティングで求められた、各条件で培養したＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液中での、β−ａｃｔｉｎのタンパク質量に対する、ＭＡＦｂｘのタンパク質量を示す。
【００８３】
ＭＡＦｂｘのタンパク質量はＩＧＦ−１添加群を除き、Ｄｅｘ（＋）群でＤｅｘ（−）群と比較して有意に増加した。一方、ＡＥ／Ｄｅｘ（＋）群及びＩＧＦ−１／Ｄｅｘ（＋）群はＣＯＮ／Ｄｅｘ（＋）群と比較して有意に減少した（図３下段）。
【００８４】
＜実験３：秋ウコン抽出物（ＡＥ）のユビキチンリガーゼ上流転写因子のｍＲＮＡ発現への影響評価＞
［実験材料及び実験方法］
秋ウコン抽出物（ＡＥ）として、実験１で調製した「水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽出物）」を用いた。
【００８５】
実験１においてＭａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１のｍＲＮＡ発現亢進抑制効果が認められた秋ウコン抽出物（ＡＥ）に関して、ユビキチンリガーゼ上流転写因子のｍＲＮＡ発現に対する影響評価を行った。２４ｗｅｌｌプレートで培養した分化６日目のＣ２Ｃ１２を無血清培地で１２〜１６時間のｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った後、１００ｎＭ  Ｄｅｘ有無の条件下で、終濃度２００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地に交換し、１２時間培養した。培養終了後の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、ユビキチンリガーゼ上流転写因子の１つであるＦｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量を測定した。プライマー配列は以下に示した。遺伝子発現の内部標準にはＰｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ａ（Ｐｐｉａ）を用いた。対照群（ＣＯＮ）として、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地の代わりに、同量のＰＢＳを添加した培地を用いた以外は同様の手順でＣ２Ｃ１２を培養しＦｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量を測定した。
【００８６】
Ｆｏｘｏ３
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＧＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＧＣＧＴ−３’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴ−３’（配列番号８）
Ｐｐｉａ
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＡＣ−３’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴ−３’（配列番号６）
【００８７】
［結果］
図４は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））の対照群（ＣＯＮ）又は秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）のＣ２Ｃ１２でのＦｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量（ＰｐｉａのｍＲＮＡ発現量に対する相対値）を示す。
【００８８】
Ｆｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量は対照群（ＣＯＮ）において、Ｄｅｘ（＋）群でＤｅｘ（−）群と比較して有意に増加したが、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）においては有意な増加が認められなかった。ＣＯＮ／Ｄｅｘ（＋）群とＡＥ／Ｄｅｘ（＋）群間においても有意な差は認められなかった。
【００８９】
＜実験４：秋ウコン抽出物（ＡＥ）のｐ７０Ｓ６Ｋ（７０  ｋＤａ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化への影響評価＞
［実験材料及び実験方法］
秋ウコン抽出物（ＡＥ）として、実験１で調製した「水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽出物）」を用いた。
【００９０】
６ｗｅｌｌプレートで培養した分化６日目のＣ２Ｃ１２を無血清培地で１２〜１６時間のｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った後、１００ｎＭ  Ｄｅｘ有無の条件下で、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した秋ウコン抽出物（ＡＥ）を添加した培地に交換し、６時間培養した。培養終了後の細胞からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングによりｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を測定した。ポジティブコントロールとして１０ｎＭ  ＩＧＦ−１を用いた。ウェスタンブロッティングは実験２に記載の手順で行った。対照群（ＣＯＮ）として、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地の代わりに、同量のＰＢＳを添加した培地を用いた以外は同様の手順でＣ２Ｃ１２を培養しタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングによりｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を測定した。
【００９１】
［結果］
図５上段は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））で、対照群（ＣＯＮ）、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）又はＩＧＦ−１添加群（ＩＧＦ−１）のＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液を試料としたウェスタンブロッティングで得られたＰＶＤＦ膜上のリン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ）及びリン酸化されていないｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のバンドを示す。
【００９２】
図５下段は、上記のウェスタンブロッティングで求められた、各条件で培養したＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液中での、リン酸化されていないｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のタンパク質量に対する、リン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ）のタンパク質量を示す。
【００９３】
ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は６時間刺激後のＣ２Ｃ１２において、ＡＥ／Ｄｅｘ（−）群及びＩＧＦ−１／Ｄｅｘ（−）群はＣＯＮ／Ｄｅｘ（−）群と比較して有意に増加した。また、ＡＥ／Ｄｅｘ（＋）群はＣＯＮ／Ｄｅｘ（＋）群と比較して増加する傾向が認められ（ｐ＝０．０９０８）、ＩＧＦ−１／Ｄｅｘ（＋）群は有意に増加した（図５下段）。
【００９４】
＜実験５：秋ウコン抽出物（ＡＥ）とビサクロン（ＢＣ）の筋管直径への影響評価＞
［実験材料及び実験方法］
秋ウコン抽出物（ＡＥ）として、実験１で調製した「水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽出物）」を用いた。
【００９５】
ビサクロン（ＢＣ）として、実験１と同様に、精製された（≧９９％（ＨＰＬＣ））ビサクロン試薬を長良サイエンス株式会社から入手して用いた。
【００９６】
６ｗｅｌｌプレートで培養した分化６日目のＣ２Ｃ１２を無血清培地で１２〜１６時間のｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った後、１００ｎＭ  Ｄｅｘ有無の条件下で、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥまたは終濃度１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈したＢＣを添加した培地に交換し、１２時間培養した。培養終了後の細胞から各群４枚の画像を取得し、それぞれの画像から３０本の筋管直径を画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊを用いて測定し、各画像の上位１０本から平均と標準偏差を算出した。尚、１本の筋管直径は３ヶ所の測定結果の平均とした。対照群（ＣＯＮ）として、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地の代わりに、同量のＰＢＳを添加した培地を用いた以外は同様の手順でＣ２Ｃ１２を培養し筋管直径を測定した。
【００９７】
［結果］
図６Ａは、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））、対照群（ＣＯＮ）又は秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）で培養したＣ２Ｃ１２の筋管直径の平均値（μｍ）と標準偏差を示す。
【００９８】
図６Ｂは、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（−））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））、対照群（ＣＯＮ）又はビサクロン添加群（ＢＣ）で培養したＣ２Ｃ１２の筋管直径の平均値（μｍ）と標準偏差を示す。
Ｄｅｘ誘導性の筋管直径の減少をＡＥ（図６Ａ）、ＢＣ（図６Ｂ）がともに抑制した。
【００９９】
＜実験２〜５の考察＞
秋ウコン抽出物（ＡＥ）はＤｅｘ誘導性のＭＡＦｂｘタンパク質発現量の増加を有意に減少させた（実験２）。このことは、実験１で確認されたｍＲＮＡ発現の結果に加え、ＡＥがＤｅｘ誘導性骨格筋萎縮抑制効果を持つことを裏付ける。さらに、ＡＥ添加によりＦｏｘｏ３の有意なｍＲＮＡ発現亢進が認められなかった（実験３）。このことから、ＡＥ添加は、Ｆｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現亢進を減弱させ、ユビキチンリガーゼの発現を促進する転写因子の発現量自体を減少させることで、Ｍａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１のｍＲＮＡ発現亢進抑制及びＭＡＦｂｘタンパク質発現亢進抑制を行うことが示唆された。さらに、ＡＥ添加は、Ｄｅｘ誘導性のｐ７０Ｓ６Ｋの脱リン酸化を阻害する傾向も認められた（実験４）。このｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化の促進はＤｅｘ未添加群においても認められたことから、ＡＥはタンパク質合成経路へも影響を及ぼし、タンパク質合成を促進する可能性も示唆された。また、ＡＥ及びその成分であるビサクロン（ＢＣ）は筋管直径の萎縮を抑制したことから（実験５）、表現型における効果も示された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明に係る、筋萎縮を阻害するための組成物は、飲食品及び医薬品の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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