(57)【要約】【課題】混合容器を用いることなく検体と反応試薬とを十分に混合することができる検体と反応試薬との混合方法を提供する。【解決手段】マイクロ流路２で検体１００と反応試薬２００とを混合する混合方法であって、検体１００及び反応試薬２００の一方である第一投入物を予め秤量して導入口３からマイクロ流路２に導入する第一工程と、第一工程の後、導入口３を気密封止する第二工程と、第二工程の後、導入口３を気密封止にした状態で、検体１００及び反応試薬２００の他方である第二投入物を予め秤量して導入口３からマイクロ流路２に導入する第三工程と、第三工程の後、導入口３を気密封止にした状態で、導入口３を介して検体１００と反応試薬２００とをマイクロ流路２の内外に出し入れして攪拌することで混合する第四工程と、を含む。【選択図】図３
2018119813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路で検体と反応試薬とを混合する混合方法であって、
検体及び反応試薬の一方である第一投入物を予め秤量して導入口から前記マイクロ流路に導入する第一工程と、
前記第一工程の後、前記導入口を気密封止する第二工程と、
前記第二工程の後、前記導入口を気密封止にした状態で、前記検体及び前記反応試薬の他方である第二投入物を予め秤量して前記導入口から前記マイクロ流路に導入する第三工程と、
前記第三工程の後、前記導入口を気密封止にした状態で、前記導入口を介して前記検体と前記反応試薬とを前記マイクロ流路の内外に出し入れして攪拌することで混合する第四工程と、を含む、
マイクロ流路での検体と反応試薬との混合方法。
【請求項２】
前記マイクロ流路の前記導入口付近に前記第一投入物を保持する保持部が設けられており、
前記第一工程では、導入した前記第一投入物を前記保持部に保持させる、
請求項１記載のマイクロ流路での検体と反応試薬との混合方法。
【請求項３】
前記第二工程、前記第三工程および前記第四工程では、前記導入口に設けられた気密封止部材により前記導入口を気密封止する、
請求項１又は２記載のマイクロ流路での検体と反応試薬との混合方法。
【請求項４】
前記第二工程、前記第三工程および前記第四工程では、前記第二投入物が収容された容器に設けられた気密封止部材により前記導入口を気密封止する、
請求項１又は２記載のマイクロ流路での検体と反応試薬との混合方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流路で検体と反応試薬とを混合する混合方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲料又は食品等に含まれる細菌等の微生物の検査においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用したＰＣＲ検査法が知られている。ＰＣＲ検査法は、培養法と比べて大幅に検査工程を高速化及び簡略化することができる利点がある。
【０００３】
ＰＣＲ検査は、例えばマイクロ流路を有するマイクロ流路チップを用いて行われる。具体的には、検査対象となる微生物を含む検体（検体原液）と反応試薬とを含む反応溶液をマイクロ流路チップのマイクロ流路に流すことで、検体に含まれる標的核酸と反応試薬とを反応させている。
【０００４】
この種のＰＣＲ検査法が特許文献１に開示されている。特許文献１には、高温領域と低温領域とに温度制御されたマイクロ流路チップ内に反応溶液として検体とＰＣＲ試薬との混合溶液を導入してマイクロ流路に混合溶液を送液して混合溶液に温度サイクルを与えることが開示されている。これにより、検体に含まれる標的核酸を高速に増幅することができ、迅速に検体の検査を行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−６１３２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のようなＰＣＲ検査を行う場合、温度サイクルを与える前に、検体とＰＣＲ試薬とを十分に混合しておく必要がある。このため、従来は、検体とＰＣＲ試薬とをマイクロ流路チップに導入する前に混合させている。
【０００７】
例えば、検体とＰＣＲ試薬とを各々予め秤量しておき、図１１（ａ）に示すように、検体とＰＣＲ試薬とを混合容器１０００に導入して攪拌混合することで反応溶液（混合溶液）２０００を作製している。その後、ＰＣＲ検査をするにあたり、図１１（ｂ）に示すように、混合容器１０００からピペット等で反応溶液２０００を吸い上げて、図１２（ａ）に示すように、マイクロ流路２Ｘを有するマイクロ流路チップ１Ｘの導入口３Ｘから反応溶液２０００を導入する。反応溶液２０００は、図１２（ｂ）に示すように、マイクロ流路２Ｘに導入されると送液が開始する。
【０００８】
しかしながら、図１１（ａ）に示すように、検体とＰＣＲ試薬とを混合容器１０００で混合すると、混合容器１０００が別途必要になるだけではなく、マイクロ流路チップに導入する前に反応溶液２０００（混合溶液）にコンタミが生じるリスクがある。また、検体とＰＣＲ試薬とを混合容器１０００で混合すると、混合した後に混合容器１０００から反応溶液２０００を取り出す必要があるが、混合容器１０００から反応溶液２０００を取り出す際に、反応溶液２０００が混合容器１０００に残留する等して反応溶液２０００のロスも発生して、検査精度が低下する。
【０００９】
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、混合容器を用いることなく検体と反応試薬とを十分に混合することができる検体と反応試薬との混合方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明に係る混合方法の一態様は、マイクロ流路で検体と反応試薬とを混合する混合方法であって、検体及び反応試薬の一方である第一投入物を予め秤量して導入口から前記マイクロ流路に導入する第一工程と、前記第一工程の後、前記導入口を気密封止する第二工程と、前記第二工程の後、前記導入口を気密封止にした状態で、前記検体及び前記反応試薬の他方である第二投入物を予め秤量して前記導入口から前記マイクロ流路に導入する第三工程と、前記第三工程の後、前記導入口を気密封止にした状態で、前記導入口を介して前記検体と前記反応試薬とを前記マイクロ流路の内外に出し入れして攪拌することで混合する第四工程と、を含む。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、混合容器を用いることなく検体と反応試薬とを十分に混合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施の形態に係るマイクロ流路チップの構成を示す斜視図である。
【図２】実施の形態に係るマイクロ流路チップのマイクロ流路を模式的に示す断面図である。
【図３】実施の形態に係る検体と反応試薬との混合方法を説明するための図である。
【図４】実施の形態に係るマイクロ流路チップにおける温度サイクルを説明するための図である。
【図５】変形例１に係る検体と反応試薬との混合方法を説明するための図である。
【図６】変形例２に係る検体と反応試薬との混合方法を説明するための図である。
【図７】変形例３に係る検体と反応試薬との混合方法を説明するための図である。
【図８】変形例４に係る検体と反応試薬との混合方法を説明するための図である。
【図９】変形例５に係る検体と反応試薬との混合方法を説明するための図である。
【図１０】変形例６に係る検体と反応試薬との混合方法を説明するための図である。
【図１１】検体と反応試薬とを混合する従来の方法を説明するための図である。
【図１２】従来のマイクロ流路チップに検体と反応試薬との混合溶液を導入する様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本発明の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ（工程）及びステップの順序などは、一例であって本発明を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００１４】
なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。
【００１５】
（実施の形態）
［マイクロ流路チップの構成］
まず、実施の形態に係るマイクロ流路チップ１の構成について、図１及び図２を用いて説明する。図１は、実施の形態に係るマイクロ流路チップ１の構成を示す斜視図である。図２は、同マイクロ流路チップ１のマイクロ流路２を模式的に示す断面図である。
【００１６】
図１及び図２に示すように、マイクロ流路チップ１は、マイクロ流体である反応溶液が流れるマイクロ流路２を備えるマイクロ流体デバイスであり、第一開口である導入口３と、第二開口である排出口４とを備える。
【００１７】
反応溶液は、例えば、標的核酸を含む検体と、標的核酸に反応する反応試薬とを含む水溶液である。検体は、例えば、検査対象となる微生物（細菌、ウイルス又は組織細胞等）から核酸抽出試薬により予め抽出された標的核酸を含む検体原液である。反応試薬は、例えば、蛍光物質を含むＰＣＲ試薬等の反応試薬溶液である。マイクロ流路２を流れる反応溶液は、標的核酸を含む検体と反応試薬との混合溶液である。本実施の形態において、標的核酸を含む検体と反応試薬とは別々のタイミングでマイクロ流路２に導入され、マイクロ流路２内で混合されて混合溶液となる。
【００１８】
マイクロ流路チップ１は、下基板である第一基板１０と上基板である第二基板２０とによって構成されている。第一基板１０及び第二基板２０としては、例えば、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）、アクリル等の樹脂基板、ガラス基板、又は、シリコン基板等を用いることができる。
【００１９】
マイクロ流路２は、流路幅がマイクロオーダの微細流路である。マイクロ流路２は１本で構成されており、マイクロ流路２には反応溶液が一方通行的に流れる。具体的には、反応溶液は、マイクロ流路２内を導入口３から排出口４に向かう方向に流れる。本実施の形態では、反応溶液は、マイクロ流路２内を毛管力（キャピラリ力）により送液される。例えばマイクロ流路２の内面を界面活性剤等でコーティングして親水性表面とすることによって反応溶液を毛管力によって送液することができる。
【００２０】
マイクロ流路２は、例えば第二基板２０の内面側に形成された溝である。なお、マイクロ流路２は、第一基板１０に形成されていてもよい。マイクロ流路２を構成する溝は、例えば、断面形状が矩形状であって、流路幅（溝幅）及び深さが一定である。一例として、マイクロ流路２を構成する溝は、流路幅が２０〜３００μｍで、深さが５０〜１５０μｍである。
【００２１】
マイクロ流路２は、第一ヒータブロック３１により温度制御された高温領域と第二ヒータブロック３２により温度制御された低温領域とを交互に複数回繰り返して通過するように構成されている。具体的には、マイクロ流路２は、蛇行するように形成された蛇行流路であり、第一ヒータブロック３１の上（高温領域）と第二ヒータブロック３２の上（低温領域）とを往復するように複数サイクルで折り返されて形成されている。
【００２２】
なお、蛇行流路の折り返し回数は、例えば２０〜７０サイクル程度であるが、図１では、１０サイクル程度しか図示されていない。また、低温領域に対応する第一ヒータブロック３１の設定温度は、例えば５０℃〜７５℃であり、本実施の形態では、アニール・伸長反応温度である約６０℃としている。一方、高温領域に対応する第二ヒータブロック３２の設定温度は、例えば９３℃〜９８℃であり、本実施の形態では、核酸増幅反応の変性反応温度である約９５℃としている。
【００２３】
導入口３は、マイクロ流路２の一方の端部に設けられており、マイクロ流路２の始点になっている。導入口３には検体及び反応試薬が導入される。つまり、検体及び反応試薬は、導入口３を介してマイクロ流路２に導入される。導入口３は、第二基板２０に形成された貫通孔である。導入口３は、例えば円形の貫通孔であるが、これに限らない。
【００２４】
図２に示すように、マイクロ流路２の導入口３付近には、第一投入物として投入された検体又は反応試薬を保持する保持部５が設けられている。保持部５は、例えば、導入口３の下方において第一基板１０に設けられた凹部である。つまり、保持部５は、マイクロ流路チップ１に投入した第一投入物がマイクロ流路２に流れ出していかないように一段低くした構造である。このように、保持部５を設けることで、導入口３から投入された検体又は反応試薬を保持部５で一時的に保持することができる。
【００２５】
なお、保持部５の形状は、特に限定されるものではないが、保持部５は、検体１００（第一投入物）の全量を保持できるだけの容積（容量）を有するとよい。ただし、保持部５の容積が大きすぎると、反応試薬２００（第二投入物）との混合効率が低下するおそれがあるとともに、混合後にマイクロ流路２内に混合溶液を送液する際に保持部５に混合溶液が残留して混合溶液のロスも大きくなるおそれがある。このため、保持部５の容積は、必要以上に大きくしないことが望ましく、投入する検体１００（第一投入物）の容量と同じであるか、それよりもわずかに大きいとよい。
【００２６】
また、マイクロ流路２の導入口３付近には、検体及び反応試薬を混合する領域として混合部６が設けられている。混合部６は、導入口３に連続するようにして第二基板２０の内面に設けられた凹部である。
【００２７】
保持部５及び混合部６は、マイクロ流路２の一部を構成している。保持部５及び混合部６は、マイクロ流路２の始点位置において、互いに対向する位置に設けられている。保持部５と混合部６とによって囲まれる空間領域で、検体と反応試薬とが攪拌されて混合される。
【００２８】
排出口４は、マイクロ流路２の他方の端部に設けられており、マイクロ流路２の終点になっている。つまり、排出口４は、反応溶液の送液の終点となる。なお、マイクロ流路２を流れる反応溶液の一部又は全部は、排出口４から排出可能であるが、排出口４から排出されなくてもよい。
【００２９】
［検体と反応試薬との混合方法］
次に、実施の形態に係る検体と反応試薬との混合方法について、図３を用いて説明する。図３は、実施の形態に係る検体と反応試薬との混合方法を説明するための図である。本実施の形態では、マイクロ流路チップ１のマイクロ流路２で検体と反応試薬とを混合する。
【００３０】
まず、図３（ａ）に示すように、検体及び反応試薬の一方である第一投入物を予め秤量してマイクロ流路２の導入口３からマイクロ流路２に導入する（第一工程）。本実施の形態では、第一投入物として、まず検体１００をマイクロ流路２に導入している。例えば、ピペット１１０を用いて予め秤量済みの検体１００を導入口３からマイクロ流路２に導入する。
【００３１】
このとき、第一投入物として導入した検体１００を保持部５に保持させる。具体的には、導入口３に挿入したピペット１１０から検体１００を滴下することで、導入口３の下方に設けられた保持部５である凹部に検体１００を滞留させる。
【００３２】
次に、図３（ｂ）に示すように、第一投入物をマイクロ流路２に導入した後（第一工程の後）、導入口３を気密封止する（第二工程）。本実施の形態では、第二投入物である反応試薬２００が収容された加圧導入容器２１０に設けられた気密封止部材２２０により導入口３を気密封止している。この場合、加圧導入容器２１０の気密封止部材２２０を導入口３の周辺部の第二基板２０に押し当てることで導入口３を気密封止する。
【００３３】
気密封止部材２２０は、加圧導入容器２１０の容器本体２１１と注入口２１２との段差部に取り付けられた枠状のパッキンである。気密封止部材２２０の形状及び材質は特に限定されないが、気密封止部材２２０はゴム弾性を有するゴムパッキンであることが望ましく、気密封止部材２２０の材質は、シリコーンゴム、フッ素ゴム又はニトリルゴム等が挙げられる。
【００３４】
また、加圧導入容器２１０の種類は特に限定されないが、加圧導入容器２１０としては、例えば、シリンジ又はベローズ構造を有するスポイトを用いることができる。
【００３５】
次に、図３（ｃ）に示すように、導入口３を気密封止した後（第二工程の後）、導入口３を気密封止にした状態で、第二投入物である反応試薬２００を予め秤量して導入口３からマイクロ流路２に導入する（第三工程）。
【００３６】
具体的には、予め秤量済みの反応試薬２００が収容された加圧導入容器２１０の気密封止部材２２０を第二基板２０に押し当てた状態を維持したままで、加圧導入容器２１０を加圧する。これにより、導入口３を気密封止にした状態で、加圧導入容器２１０の注入口２１２から、予め秤量済みの反応試薬２００を導入口３を介して加圧導入容器２１０からマイクロ流路２に導入することができる。
【００３７】
このとき、導入口３が気密封止されているので、反応溶液３００がマイクロ流路２に導入されたとしても、反応試薬２００は、マイクロ流路２内を進行せずに、保持部５と混合部６とによって囲まれる空間領域で滞留する。
【００３８】
次に、図３（ｄ）に示すように、反応試薬２００をマイクロ流路２に導入した後（第三工程の後）、導入口３を気密封止にした状態で、導入口３を介して検体１００と反応試薬２００とをマイクロ流路２の内外に出し入れして攪拌することで混合する（第四工程）。
【００３９】
具体的には、加圧導入容器２１０の気密封止部材２２０を第二基板２０に押し当てた状態を維持したままで、加圧導入容器２１０による加圧と減圧とを繰り返す。こうすることで、保持部５と混合部６とによって囲まれる空間領域に滞留する検体１００及び反応試薬２００を、加圧導入容器２１０内とマイクロ流路２内とを行き来させることができる。これにより、検体１００と反応試薬２００とを攪拌して混合することができ、検体１００と反応試薬２００との混合溶液である反応溶液３００を生成することができる。
【００４０】
なお、この際、エアーが反応溶液３００に混入しないように、加圧導入容器２１０内とマイクロ流路２内との液の出し入れ量をあまり多くしすぎないようにするとともに、加圧導入容器２１０の注入口２１２の先端をできるだけ保持部５の底面近くにセットすることが望ましい。
【００４１】
次に、図３（ｅ）に示すように、検体１００と反応試薬２００とを混合した後（第四工程の後）、検体１００と反応試薬２００とを加圧導入容器２１０から全てマイクロ流路２に押し出す（第五工程）。その後、加圧導入容器２１０（注入口２１２）を導入口３から抜き取る。これにより、導入口３の気密封止の状態が解除されて、検体１００と反応試薬２００との混合溶液である反応溶液３００は、毛管力によってマイクロ流路２内を自走する。
【００４２】
反応溶液３００を自走によって送液させることで、送液用のアクチュエーターを用いる必要がないので、簡便な構成で反応溶液３００を送液させることができる。したがって、複数のマイクロ流路チップ１を用いて反応溶液３００の送液を同時に行う場合には、反応溶液３００を自走によって送液するとよい。
【００４３】
その後、反応溶液３００が送液されてマイクロ流路２を進むと、蛇行流路によって反応溶液３００が高温領域と低温領域とを通過し、これにより、反応溶液３００に周期的な温度変化（温度サイクル）を与えることができる。
【００４４】
具体的には、図４に示すように、反応溶液３００は、第一ヒータブロック３１上と第二ヒータブロック３２上とを繰り返して往復するようにマイクロ流路２を通ることになる。つまり、反応溶液３００は、高温領域（第一ヒータブロック３１）と低温領域（第二ヒータブロック３２）との２つの温度領域を交互に繰り返して通過するように送液されるので、反応溶液３００には、加熱と冷却とが交互に繰り返して付与されることになる。これにより、反応溶液３００に対してヒートサイクルを付与することができるので、反応溶液３００に含まれる標的核酸は、高温領域での変性反応と低温領域でのアニール・伸長反応との繰り返しにより増幅する。
【００４５】
このように、送液しながら反応溶液３００を昇降温させることができるので、非常に高速なフローＰＣＲを実現することができる。したがって、反応溶液３００に含まれる標的核酸を高速に増幅させることができる。
【００４６】
反応溶液３００がマイクロ流路２の全域に行き渡った後は、光学検出装置を用いて、反応溶液３００に含まれる標的核酸の増幅量を検出する。例えば、マイクロ流路２に交差する方向にレーザ光（励起光）をスキャンしながら反射光（蛍光）を受光し、受光した反射光量（蛍光量）に基づいて、蛇行流路のサイクル毎（温度サイクル毎）の核酸の増幅量を増幅曲線として検出する。具体的には、ＰＣＲサイクルの増加に従って核酸の増幅量が増加する増幅曲線が得られる。これにより、反応溶液３００に含まれる標的核酸の増幅量を算出することができる。
【００４７】
［まとめ］
以上、本実施の形態では、検体１００と反応試薬２００とを混合するにあたり、第一投入物である検体１００を予め秤量してマイクロ流路２の導入口３からマイクロ流路２に導入し（第一工程）、その後、導入口３を気密封止している（第二工程）。その後、導入口３を気密封止にした状態で、第二投入物である反応試薬２００を予め秤量して導入口３からマイクロ流路２に導入し（第三工程）、その後、導入口３を気密封止にした状態で、導入口３を介して検体１００と反応試薬２００とをマイクロ流路２の内外に出し入れして攪拌することで混合している（第四工程）。
【００４８】
このように、本実施の形態では、導入口３を気密封止した状態でマイクロ流路２の導入口３近傍で検体１００と反応試薬２００とを混合している。これにより、混合容器を用いることなく、また、反応溶液３００にコンタミが生じるリスクを低減しつつ、検体１００と反応試薬２００とを十分に混合することができる。
【００４９】
しかも、従来のように検体と反応試薬とを混合した後に混合容器から反応溶液を取り出す必要がないため、反応溶液３００のロスを少なくすることができる。これにより、検体１００の検査精度の低下を抑制し、高精度で検体１００の検査を行うことができる。
【００５０】
また、本実施の形態では、マイクロ流路２の導入口３付近に検体１００を保持する保持部５が設けられており、検体１００をマイクロ流路２に導入する工程（第一工程）では、導入した検体１００を保持部５に保持させている。
【００５１】
これにより、検体１００（第一投入物）を投入しても、反応試薬２００（第二投入物）を投入するまで検体１００を保持部５で保持させておくことができる。これにより、検体１００と反応試薬２００とを導入口３付近で効率よく混合してから、マイクロ流路２に送液することができる。
【００５２】
また、本実施の形態では、第二工程、第三工程および第四工程では、反応試薬２００が収容された加圧導入容器２１０に設けられた気密封止部材２２０により導入口３を気密封止している。
【００５３】
これにより、マイクロ流路チップ１に気密封止構造を形成する必要がないので、マイクロ流路チップ１の構造を簡素化することができる。
【００５４】
（変形例）
以上、本発明について、実施の形態に基づいて説明したが、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではない。
【００５５】
例えば、上記実施の形態では、図３（ｄ）の第四工程（検体１００と反応試薬２００とを混合する工程）の後、図３（ｅ）に示すように、加圧導入容器２１０を導入口３から抜き取ることで導入口３の気密封止の状態を解除し、検体１００と反応試薬２００との混合溶液である反応溶液３００を毛管力によって自走で送液を開始したが、これに限らない。
【００５６】
この場合、図５（ａ）に示すように、図３（ｄ）と同様の第四工程（検体１００と反応試薬２００とを混合する工程）を行った後、図３（ｅ）に示す第五工程に代えて、図５（ｂ）に示す第五工程を行ってもよい。具体的には、図５（ｂ）に示すように、加圧導入容器２１０を導入口３に挿入したまま、導入口３の気密封止を確保した状態で、検体１００及び反応試薬２００の混合溶液である反応溶液３００の全てを加圧導入容器２１０からマイクロ流路２に押し出す。つまり、加圧導入容器２１０の加圧によって反応溶液３００の送液を開始する。これにより、加圧導入容器２１０のストロークの駆動を直動アクチュエーター等によって行うことができるので、反応溶液３００の送液速度をコントロールできるとともに安定した送液が可能となる。
【００５７】
なお、このように加圧導入容器２１０の加圧によって反応溶液３００をマイクロ流路２に押し出して送液させる場合、加圧導入容器２１０のシリンジ又はベローズのストロークを第四工程の攪拌混合時のストロークに加えて、さらに最終的に反応溶液３００を送液させるためのストロークを残しておくとよい。
【００５８】
また、上記実施の形態では、加圧導入容器２１０に設けられた気密封止部材２２０によって導入口３を気密封止したが、これに限らない。例えば、図６に示すように、導入口３に設けられた気密封止部材７により導入口３を気密封止してもよい。気密封止部材７は、例えば、導入口３を囲むように第二基板２０の導入口３の表面近傍に配置されたリング状のゴムパッキンである。
【００５９】
この場合、図６に示すように、導入口３を気密封止する工程（第二工程）では、反応試薬２００が収容された加圧導入容器２１０の容器本体２１１と注入口２１２との段差部を気密封止部材７に押し当てることで導入口３を気密封止することができる。その後、この気密封止の状態を保ったまま、第三工程（反応試薬２００を導入口３からマイクロ流路２に導入する工程）と、第四工程（検体１００と反応試薬２００とを混合する工程）とを行う。
【００６０】
このように、マイクロ流路チップ１に気密封止部材７を設けることによって加圧導入容器２１０に気密封止部材２２０を設ける必要がなくなるので、加圧導入容器２１０の構造を簡素化することができる。
【００６１】
また、上記実施の形態及び変形例では、気密封止部材２２０及び７によって導入口３を気密封止したが、これに限らない。例えば、図７に示すように、気密封止部材を別途用いることなく、導入口３の内面と加圧導入容器２１０の容器本体２１１又は注入口２１２の外面とを密閉嵌合させることで導入口３を気密封止してもよい。例えば、導入口３の内面をテーパ面にするとともに、加圧導入容器２１０の注入口２１２（又は容器本体２１１）の外面をテーパ面にすることで、導入口３の内面と注入口２１２（又は容器本体２１１）の外面とを密閉嵌合させることができる。
【００６２】
また、上記実施の形態において、マイクロ流路２に第一投入物として投入された検体１００を保持する保持部５は、第一基板１０に形成された凹部としたが、これに限らない。例えば、図８に示すように、第一投入物を保持する保持部５Ａは、枠状の突起であってもよい。つまり、保持部５Ａは、マイクロ流路２に設置された流れ止めであり、マイクロ流路チップ１に投入した第一投入物がマイクロ流路２に流れ出していかないようにマイクロ流路２の底面から一段高くした構造となっている。この場合も、導入口３から投入された第一投入物を保持部５Ａで一時的に保持することができる。
【００６３】
また、図９に示すように、保持部５の底面に凹凸構造５ａを形成してもよい。これにより、検体１００と反応試薬２００とを混合する工程（第四工程）において、検体１００と反応試薬２００との攪拌効率を高めることができるので、検体１００と反応試薬２００とを効率よく混合させて反応溶液３００を得ることができる。
【００６４】
また、上記実施の形態において、検体１００は、液体としたが、これに限らない。例えば、図１０に示すように、固形状の検体１００Ａを用いてもよい。検体１００Ａが固形状である場合、検体１００Ａは、後で導入する反応試薬２００の投入によって容易に溶解するとよい。
【００６５】
また、上記実施の形態では、図３（ｄ）に示すように、加圧導入容器２１０内の加圧と減圧とを繰り返すことによって、検体１００及び反応試薬２００を、加圧導入容器２１０内とマイクロ流路２内との間を行き来させて（つまりマイクロ流路２の内外に出し入れして）攪拌混合したが、これに限らない。例えば、加圧導入容器２１０の気密封止部材２２０を第二基板２０に押し当てた状態を維持したまま、マイクロ流路チップ１の全体を揺動したりマイクロ流路チップ１に超音波振動を与えたりすることによって、検体１００及び反応試薬２００をマイクロ流路２の内外に出し入れして攪拌混合してもよい。
【００６６】
また、上記実施の形態及び変形例では、マイクロ流路２への第一投入物を検体１００とし、マイクロ流路２への第二投入物を反応試薬２００としたが、これに限らない。つまり、マイクロ流路２への第一投入物を反応試薬２００とし、マイクロ流路２への第二投入物を検体１００としてもよい。
【００６７】
また、上記実施の形態では、マイクロ流路２を蛇行流路として反応溶液３００に温度変化を繰り返し与えるフローＰＣＲとしたが、これに限らない。つまり、フローＰＣＲとせずに、反応溶液３００に温度変化を繰り返し与えるようなＰＣＲであってもよい。ただし、上記実施の形態のようにフローとした方が効率良くＰＣＲを実施することができる。
【００６８】
その他、各実施の形態及び変形例に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本発明に含まれる。
【符号の説明】
【００６９】
１  マイクロ流路チップ
２  マイクロ流路
３  導入口
４  排出口
５、５Ａ  保持部
７、２２０  気密封止部材
１００、１００Ａ  検体
１１０  ピペット
２００  反応試薬
３００  反応溶液
【図１】
2018119813.tif 000003
【図２】
2018119813.tif 000004
【図３】
2018119813.tif 000005
【図４】
2018119813.tif 000006
【図５】
2018119813.tif 000007
【図６】
2018119813.tif 000008
【図７】
2018119813.tif 000009
【図８】
2018119813.tif 000010
【図９】
2018119813.tif 000011
【図１０】
2018119813.tif 000012
【図１１】
2018119813.tif 000013
【図１２】
2018119813.tif 000014