(57)【要約】【課題】桂皮酸、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸などの桂皮酸類の幾何異性体混合物から、各幾何異性体を大量かつ安価に分離精製する方法を提供する。また、分離精製された桂皮酸類のcis体のみを含む抗ウイルス剤などを提供する。【解決手段】本発明の分離精製法は、幾何異性体混合物から液体クロマトグラフィーによって幾何異性体を分離精製する際に、固定相にセルロース類を使用する。なお、移動相には、酸性水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒を使用してもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
桂皮酸類の幾何異性体混合物から液体クロマトグラフィーによって幾何異性体を分離精製する分離精製法であって、固定相にセルロース類を使用する分離精製法。
【請求項２】
移動相に酸性水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒を使用する請求項１に記載の分離精製法。
【請求項３】
桂皮酸類の幾何異性体のうち、cis体のみを有効成分として含む抗ウイルス剤。
【請求項４】
cis-p-クマル酸のみを有効成分として含む請求項３に記載の抗ウイルス剤。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載の抗ウイルス剤の何れかを含む抗ウイルス用医薬品。
【請求項６】
請求項３又は請求項４に記載の抗ウイルス剤の何れかを含む抗ウイルス用医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、桂皮酸類幾何異性体の分離精製法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
桂皮酸、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸などの桂皮酸類は、フェノール性化合物の一種であり、これら有機酸と糖とが主にエステル結合した状態で、植物や微生物の二次代謝産物として広く分布している。
【０００３】
例えば、コーヒーやサツマイモなどに存在するクロロゲン酸は、カフェ酸とキナ酸がエステル結合したものである。また、米糠や麦わらにはフェルラ酸が多糖類と結合して大量に存在している。
【０００４】
なお、これらの桂皮酸類は、抗酸化作用や降圧作用などの作用を有し、食品の酸化防止や紫外線防止の化粧品や血圧対策のための特定保健用食品などとして広く利用されている。また、p-クマル酸は、植物フェノール化合物の生合成の制御やアレロパシーに関与したり、紅色光合成細菌のPhotoactive Yellow Protein（Hh-PYP）の発色団としての役割も報告されているため、生物学的研究の対照としても重要である。
【０００５】
桂皮酸類は、trans体とcis体の幾何異性体を含んでいる。このうち、桂皮酸類のtrans体は、化学合成や植物材料などから容易に入手できるものの、cis体の入手は容易ではなかった。例えば、p-クマル酸の場合、trans体は化学合成により容易に入手できるが、充分な量のcis体を化学合成によって入手することは従来極めて困難であった。
【０００６】
従来、桂皮酸類のcis体は、（１）桂皮酸類のtrans体を紫外線処理してtrans体からcis体が生成させ、一定時間後にtrans体とcis体とを化学量的に平衡状態にする、（２）平衡状態にあるtrans体とcis体とを分離する方法により入手されている。なお、（２）では、イオン液体を使用する異性体分離法でtrans体とcis体とを分離したのち、異性体の溶解度の差を使用して各幾何異性体を精製している（非特許文献１を参照。）。
【０００７】
このように、従来からある製造方法では、非常に高価なイオン液体を使用しなければならず、製造規模に応じてイオン液体の使用量を増加させなければならないため、桂皮酸類のcis体を大量、かつ安価に入手することは困難であった。そのため、例えばp-クマル酸のcis体は、非常に高価（100mgで12万円）であり、例えば、抗ウイルス剤などの実用的な用途に使用することはできなかった。
【０００８】
一方、ビタミンK2に含まれる幾何異性体のうちのtrans体を、臨界流体クロマトグラフィーを使用して工業的、すなわち大量かつ安価に分離精製する方法が、既に知られている（特許文献１を参照。）。また、6,10,14-トリメチルペンタデカ-5,9,13−トリエン-2-オンの幾何異性体混合物を、液体クロマトグラフィーにより幾何異性体混合ごとに分離する方法が、既に知られている（特許文献２を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特公平６−５３７０２号公報
【特許文献２】特開２００５−３３７９４６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Salum ML and Erra-Balselis R., Environmental Control in Biology, 51巻, 1-10頁,2013年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、桂皮酸、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸などの桂皮酸類の幾何異性体混合物から、各幾何異性体を大量かつ安価に分離精製する方法を提供することを課題とする。また、分離精製した桂皮酸類のcis体のみを含む抗ウイルス剤などを提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは、鋭意検討の結果、セルロースカラムを使用する液体クロマトグラフィーによって、桂皮酸類幾何異性体の混合物をcis体とtrans体に分離精製できることを見出し、本発明を完成させた。また、分離精製した桂皮酸類のcis体が抗ウイルス性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、桂皮酸類の幾何異性体混合物から液体クロマトグラフィーによって幾何異性体を分離精製する分離精製法であって、固定相にセルロース類を使用する方法である。
【００１４】
また、本発明は、固定相にセルロース類を使用するとともに、移動相に酸性水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒を使用する分離精製法である。
【００１５】
さらに、本発明は、桂皮酸類、中でもp-クマル酸の幾何異性体のうちcis体のみを有効成分として含む抗ウイルス剤である。加えて、本発明は前記抗ウイルス剤を含む医薬品又は医薬部外品である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の桂皮酸類幾何異性体の分離精製法は、生化学分野では一般的な液体クロマトグラフィーを使用して桂皮酸類を幾何異性体ごとに分離精製するので、桂皮酸類のcis体のみを大量かつ安価に入手できる。
【００１７】
また、本発明の抗ウイルス剤は、桂皮酸類のcis体のみを有効成分として含んでいるため、優れた抗ウイルス効果を有している。本発明の医薬品又は医薬部外品は、本発明の抗ウイルス剤を含んでいるため、優れた抗ウイルス効果を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、p-クマル酸（cis体とtrans体との混合物）の液体クロマトグラフィーのチャートである。
【図２】図２は、セルロースカラムで分離したピークと標品とをTLCで比較した結果を示す写真である。
【図３】図３は、セルロースカラムで分離したピークと標品のHPLCで測定した結果を示すチャートである。
【図４】図４は、セルロースカラムで分離したピークと標品とをNMRで測定した結果を示すチャートである
【図５】図５は、カフェ酸（cis体とtrans体との混合物）の液体クロマトグラフィーのチャートである。
【図６】図６は、フェルラ酸（cis体とtrans体との混合物）の液体クロマトグラフィーのチャートである。
【図７】図７は、cis-p-クマル酸とtrans-p-クマル酸の抗ウイルス活性を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の桂皮酸類の分離精製法は、桂皮酸類の幾何異性体混合物から液体クロマトグラフィーによって幾何異性体を分離精製する分離精製法であって、固定相にセルロース類を使用する方法である。そこで、本発明について以下に詳説する。
【００２０】
（１）桂皮酸類
本発明で分離精製する桂皮酸類とは、桂皮酸及びその誘導体、具体的には、ヒドロキシ桂皮酸であるp-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸が挙げられる。
【００２１】
（２）液体クロマトグラフィー
本発明の分離精製法における液体クロマトグラフィーは、公知の液体クロマトグラフィー方法であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、高速液体クロマトグラフィー法（HPLC）、中圧液体クロマトグラフィー法、低圧液体クロマトグラフィーが使用できる。なお、これらのクロマトグラフィー法において、単カラム法はもちろん、多段カラム法、擬似移動床法及び改良型擬似移動床法等を使用してもよい。
【００２２】
（３）固定相
液体クロマトグラフィーで使用する固定相は、セルロース類である。ここで、セルロース類とは、セルロース又はその誘導体のことであり、液体クロマトグラフィーで使用されている公知のセルロース又はその誘導体であれば特に限定することなく使用できる。なお、セルロース誘導体としては、水酸基の水素原子がカルボニル基、ビニル基により置換されたセルロース誘導体が例示できる。
【００２３】
（４）移動相
液体クロマトグラフィーで使用する移動相は、酸性水性溶媒と親水性の有機溶媒の混合溶媒である。酸性に保つことで桂皮酸類の溶解度を増し、安定性を強める。また親水性の有機溶媒を含むことにより、桂皮酸の溶解度を増強することができる。なお、移動相は、この他に必要に応じて、酸化防止剤などを含んでいてもよい。
【００２４】
１）酸性水性溶媒
酸性水性溶媒は、桂皮酸類を可溶な公知のギ酸、酢酸、プロピオンなどの有機酸又はリン酸、塩酸などの無機酸を含む酸性水性溶媒であれば限定することなく使用できる。なお、酸性水性溶媒は、一種類の有機酸又は無機酸だけを含んでいてもよく、複数種の有機酸又は無機酸を含んでいてもよい
【００２５】
２）有機溶媒
有機溶媒としては、桂皮酸類を可溶で水性溶媒と混合可能な公知の有機溶媒であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n-プロパノールなどの低級アルコールや、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。なお、これら有機溶媒は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。
【００２６】
このように、本発明の分離精製法は、液体クロマトグラフィーの固定相として生化学分野において一般なセルロース類を使用し、移動相に生化学分野において一般な水性溶媒と有機溶媒の混合溶媒を使用する。そのため、従来方法とは異なり、大量かつ安価に桂皮酸類の幾何異性体を分離精製できる。
【００２７】
２．抗ウイルス剤
本発明の抗ウイルス剤は、本発明の分離精製法によって大量かつ安価に得られるようになった桂皮酸類のcis体のみを有効成分として含むものである。
【００２８】
３．抗ウイルス用医薬品及び抗ウイルス用医薬部外品
本発明の医薬品又は医薬部外品は、本発明の抗ウイルス剤を含むものである。なお、医薬品及び医薬部外品における抗ウイルス剤の含有量は、使用する抗ウイルス剤の抗ウイルス力やその用途等を勘案して自由に設定することができる。
【００２９】
（１）医薬品
医薬品とは、薬事法に規定されているものであって、医療用医薬品及び一般用医薬品（OTC）の何れをも含む。また、その対象となる疾患は従来からある抗ウイルス剤を含む医薬品、例えば風邪薬、整腸剤、含嗽薬などであれば、特に限定することなく使用できる。さらに、その形態については、例えば、丸薬剤、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル錠剤、トローチ剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、懸濁液、エマルジョン剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤、坐剤、外用液剤、軟膏等の塗布剤等の非経口剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
なお、本発明の医薬品を経口剤として製造する場合には、公知の賦型剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤等とともに、公知の製造方法により製造すればよい。
【００３１】
また、本発明の医薬品を非経口剤として製造する場合には、注射用蒸留水、生理食塩水希釈剤、ブドウ糖水溶液等の希釈剤、公知の殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤とともに、公知の方法によって製造すればよい。
【００３２】
（２）医薬部外品
医薬部外品とは、薬事法に規定されているものであって、例えば、含嗽剤、脱臭剤（デオドラント剤）、育毛剤、薬用化粧品類、栄養補給薬（サプリメント）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
以下、本発明について実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明の特許請求の範囲は、以下の実施例によって如何なる意味においても制限されない。
【実施例１】
【００３４】
本発明の分離精製法に従って、桂皮酸類幾何異性体の混合物をcis体とtrans体に分離精製し、その分離能力を評価した。以下に詳説する。
【００３５】
１.試薬及び実験装置等
（１）試薬
trans-p-クマル酸（SIGMA-ALDRICH）
cis-p-クマル酸（Tronto Research Chemicals）
カフェ酸（SIGMA-ALDRICH）
フェルラ酸（築野食品工業株式会社）
【００３６】
（２）実験装置及び測定条件
１）紫外線ランプ（Sankyo G15F8E、三共電気株式会社）
２）液体クロマトグラフィー
カラム    ガラスカラム（直径50 mm×長さ300 mm、株式会社旭製作所）
固定相    微結晶セルロース（Merck社）
移動相    1容量%酢酸水溶液：メタノール(=90:10,v/v)の混合溶媒
検出      吸光度（測定波長：280nm）
３）HPLC
HPLC装置        Prominence HPLC system （株式会社島津製作所）
分離用カラム    Hydrosphere C18 250 mm×4.6 mm I.D. （5μm、株式会社ワイエムシィ）
ガードカラム    InertSustain C18 カートリッジガードカラムE 10 mm×4.0 mm I.D. （5μm、ジーエルサイエンス株式会社）
カラム温度      30 ℃
セル部温調温度  40 ℃
移動相A         0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液
移動相B        メタノール
流速            1.0 mL/ min 
検出            吸光度（測定波長：280 nm）
グラジエント条件
時間（min.）            移動相Bの濃度（容量％）
0                      20
10                      20
80                      75
80.01-90.00                100
90.01-105.00                20
４）薄層クロマトグラフィー（TLC）
TLCセルロースプレート(メルク株式会社、カタログ番号 105716)
展開溶媒  10容量%メタノール+1容量％酢酸水溶液
５）NMR
NMR装置   JNM-ECA 400 FT NMR(株式会社 JEOL RESONANCE)
溶媒       DMSO-d6
【００３７】
２．実験方法と実験結果
（１）混合物の調製
trans-p-クマル酸を100%メタノールに溶解し（1000μg/mL）、ガラスバイアル（20.3×40.0×75mm）に入れた。ガラスバイアルの外から、0.75 mW/cm2±10％の強度の紫外線を72時間照射した。HPLC及びTLCによって、cis体が生成し、cis体とtrans体の混合物となっていることを確認した（データは示さない。）。
【００３８】
（２）液体クロマトグラフィーによる分離
混合物のメタノール溶液を、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固させた。乾固物をもとの5分の1のメタノールに溶解して、分離用試料とした。セルロースカラムに試料を5mL注ぎ、移動相である酢酸とメタノールの混合溶媒で溶出し、溶出液を5mLずつ分取した。なお、分取する際に各画分の吸光度を測定し、画分ごとの吸光度の測定結果をチャートにした。その結果を図１に示す。
【００３９】
図１に示すように、チャートには前側と後側の２つのピークがある、すなわち、混合物がcis体とtrans体の２つの幾何異性体の混合物であることが分かった。そこで、各ピークが含む物質を同定するため、前側ピークの画分を集め、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。
【００４０】
（３）分取したピークの物質同定
前側ピークの蒸発乾固物と、cis-p-クマル酸とtrans-p-クマル酸の標品とをTLCで展開した。その結果を図２に示す。図２に示すように、標品との比較から、前側のピークがcis-p-クマル酸であることが分かった。反対に、後側のピークがtrans-p-クマル酸であることも分かった。
【００４１】
また、HPLCを使用して、前側ピークの蒸発乾固物と、cis-p-クマル酸とtrans-p-クマル酸の標品の保持時間（Retention time）を測定した。その結果を図３に示す。標品との比較から、前側のピークがcis-p-クマル酸に近い保持時間を有することが分かった。すなわち、前側のピークがcis-p-クマル酸であることが分かった。反対に、後側のピークがtrans-p-クマル酸であることも分かった。
【００４２】
さらに、前側ピークの蒸発乾固物とtrans-p-クマル酸の標品をNMRで測定した。その結果を図４に示す。標品との比較から、前側のピークがtrans-p-クマル酸とは異なる分子構造を有することが分かった。すなわち、前側のピークは、trans-p-クマル酸ではなく、cis-p-クマル酸であることが分かった。反対に、後側のピークがtrans-p-クマル酸であることも分かった。
【００４３】
以上のように、cis-p-クマル酸とtrans-p-クマル酸の混合物は、液体クロマトグラフィーによって高い分解能で前後２つのピークに分離でき、そのうちの前側ピークがcis-p-クマル酸に該当することがTLC、HPLC、NMRによって確認できた。
【００４４】
３．他の桂皮酸類について
p-クマル酸と同様の方法で、カフェ酸及びフェルラ酸についても液体クロマトグラフィーで分離精製した。カフェ酸についての液体クロマトグラフィーのチャートを図５に示す。また、フェルラ酸についての液体クロマトグラフィーのチャートを図６に示す。
【００４５】
図５及び図６に示すように、p-クマル酸と同様に、カフェ酸及びフェルラ酸でもcis体とtrans体を示す２つのピークを確認できた。すなわち、本発明の分離精製法は、カフェ酸及びフェルラ酸でも有効であった。
【実施例２】
【００４６】
分離精製した桂皮酸類のcis体のみを含む抗ウイルス剤と、trans体のみを含む抗ウイルス剤の効果を調べて比較した。以下に詳説する。
【００４７】
１．実験材料
（１）ウイルス
A型インフルエンザウイルスAichi株（IAV/Aichi）を使用した。
【００４８】
（２）細胞及び細胞培養用培地
A型インフルエンザウイルスAichi株の感染価の測定には、イヌ腎由来のMDCK細胞を使用した。なお、細胞培養には、5%ウシ胎児血清（以下、FBSと省略する。) を含むイーグル最低必須培地（以下、MEMと省略する。）を使用した。
【００４９】
２．実験方法
（３）ウイルスの定量
ウイルスはプラーク法で定量した。具体的には以下のようにして定量した。まず、ウイルスの定量に使用する細胞が50mm‐ディッシュの底部全体を覆うようになるまで単層培養した。つぎに、ウイルス試料をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で10倍階段希釈し、その0.5mlをディッシュに接種したのち、室温で１時間ゆっくりと機械的に振盪して、ウイルスを吸着させた。なお、ウイルスの非特異的な不活化を抑えるために、希釈液には0.1％ウシ血清アルブミン（以下、BSAと省略する。）を加えた。
【００５０】
（４）A型インフルエンザウイルスAichi株（IAV/Aichi）に対する不活化
cis-p-クマル酸とtrans-p-クマル酸をエタノールに溶かし0.5 M溶液を調製した。この溶液を使用して、種々の濃度（5.0 mM, 7.5 mM, 10.0 mM）のcis-p-クマル酸又はtrans-p-クマル酸を含む10ｍMクエン酸緩衝液（pH 5.2, pH 5.5, pH 6.0)を調製した。緩衝液をプラスチック製のチューブ（Assist tube）に一定量ずつ加え氷冷した。
【００５１】
各チューブ内容量の1/19量になるように、A型インフルエンザウイルスAichi株（IAV/Aichi）を含むウイルス液を添加し、30℃で10分間保温した。なお、クマル酸を含む10ｍMクエン酸緩衝液の代わりに、PBSに同じウイルス液を添加し、同様に保温して、実験対照とした。
【００５２】
保温後、BSAを加えた冷たいウイルス希釈液で直ちに各チューブ内の内容物を10倍階段希釈し、ウイルスの非特異的な不活化を抑えた。クマル酸を含むチューブの残存感染性ウイルス量と、実験対照のチューブの感染性ウイルス量とを測定した。両者の比を残存感染性ウイルス量とし、これをグラフにした。その結果を図７に示す。
【００５３】
ここで、cis-p-クマル酸は白シンボル（○、△、□）、trans-p-クマル酸は黒シンボル（●、▲、■）で示している。また、処理溶液のpHに応じて四角、丸、三角のシンボルをpH 5.2 (□、■), pH 5.5 (○、●),  pH 6.0 (△、▲)のように使用している。
【００５４】
３．実験結果
図７から、cis-p-クマル酸及びtrans-p-クマル酸の存在下では、その濃度に依存したウイルス不活化が見られ、かつ、不活化は酸性側でより顕著であった。また、何れのpHにおいても、顕著な不活化が見られる条件下では、cis-p-クマル酸がtrans-p-クマル酸よりも明らかに強いウイルス不活化活性を示していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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