(57)【要約】【課題】簡便に低コストでこれらのイミダゾールジペプチドを提供することを課題として、カルノシン、アンセリン及びバレニン等のイミダゾールジペプチドを高効率で生産するタンパク質、及びこれらを使用する製造方法等を提供する。【解決手段】  配列番号１で表されるＬ−アミノ酸α−リガーゼ：ＹｗｆＥのアミノ酸配列の少なくとも１〜３個のアミノ酸残基の置換を含む変異タンパク質であり、  Ｎ末端より１０８位のアスパラギン（Ｎ）残基がアラニン（Ａ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基に置換され、又は、さらに、  １１２位のイソロイシン（Ｉ）残基がバリン（Ｖ）残基に置換され、及び／又は、３７８位のヒスチジン（Ｈ）残基がリジン（Ｋ）残基又はアルギニン（Ｒ）残基に置換されている、変異タンパク質。【選択図】図１
2018102287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるＬ−アミノ酸α−リガーゼ：ＹｗｆＥのアミノ酸配列の少なくとも１〜３個のアミノ酸残基の置換を含む変異タンパク質であり、
Ｎ末端より１０８位のアスパラギン（Ｎ）残基がアラニン（Ａ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基に置換され、又は、さらに、
１１２位のイソロイシン（Ｉ）残基がバリン（Ｖ）残基に置換され、及び／又は、３７８位のヒスチジン（Ｈ）残基がリジン（Ｋ）残基又はアルギニン（Ｒ）残基に置換されていることを特徴とする、変異タンパク質。
【請求項２】
前記変異タンパク質が、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項３】
前記変異タンパク質が、
（ｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質、
であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の変異タンパク質。
【請求項４】
前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性が、カルノシン合成活性、アンセリン合成活性及び／又はバレニン合成活性から選択されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の変異タンパク質。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性が、カルノシン合成活性の場合に、前記変異タンパク質が、
（ｉ）配列番号２〜４、６、７、９、１０、１２〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２〜４、６、７、９、１０、１２〜１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、カルノシン合成活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２〜４、６、７、９、１０、１２〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルノシン合成活性を有するタンパク質、
であることを特徴とする、請求項４に記載の変異タンパク質。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性が、アンセリン合成活性の場合に、前記変異タンパク質が、
（ｉ）配列番号２、３、５、６、８〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２、３、５、６、８〜１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、アンセリン合成活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２、３、５、６、８〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アンセリン合成活性を有するタンパク質、
であることを特徴とする、請求項４に記載の変異タンパク質。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性が、バレニン合成活性の場合に、前記変異タンパク質が、
（ｉ）配列番号６、７、１１、１４〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号６、７、１１、１４〜１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、バレニン合成活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号６、７、１１、１４〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、バレニン合成活性を有するタンパク質、
であることを特徴とする、請求項４に記載の変異タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含むポリヌクレオチドを挿入したことを特徴とする、ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異タンパク質を使用することを特徴とする、ジペプチドの製造方法。
【請求項１２】
ペプチダーゼの活性阻害剤とともに、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質を使用することを特徴とする、ジペプチドの製造方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の宿主細胞を使用することを特徴とする、ジペプチドの製造方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、ペプチダーゼの欠損細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項１５】
前記ペプチダーゼがペプチダーゼＤであることを特徴とする、請求項１２又は１４に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項１６】
前記ジペプチドが、イミダゾールジペプチドであることを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項１７】
前記イミダゾールジペプチドが、カルノシン、アンセリン及び／又はバレニンであることを特徴とする、請求項１６に記載のジペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルノシン、アンセリン及びバレニン等のイミダゾールジペプチドに対して合成活性を有するタンパク質及びイミダゾールジペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イミダゾールジペプチドは、イミダゾール基を含むアミノ酸残基が結合したペプチドの総称であり、カルノシン（ｃａｒｎｏｓｉｎｅ：β−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アンセリン（ａｎｓｅｒｉｎｅ：β−ａｌａｎｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）及びバレニン（ｂａｌｅｎｉｎｅ：Ｎα−β−ａｌａｎｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）等のヒスチジン残基又はその誘導体を含むジペプチドが含まれる。これらのジペプチドは、長距離を飛行する鳥類の胸肉、マグロやカツオ、鯨等の長距離を回遊する海洋生物の筋肉に多く含有されており、抗疲労効果、活性酸素消去能、血圧降下作用、抗炎症作用及び尿酸値効果作用等が知られ、ニワトリ等の家畜の筋肉から抽出されたこれらのイミダゾールジペプチドがサプリメントとして利用されている（非特許文献１〜３）。しかし、カルノシン、アンセリン及びバレニンに対する簡便かつ低コストな製造方法は、まだ確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｓｏｎｇ  Ｂ．ら、Ｎｕｔｒ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．２０１４，８：３−１０
【非特許文献２】Ｂｅｌｌｉａ  Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１４，１９：２２９９−２３２９
【非特許文献３】Ｂｏｌｄｙｒｅｖ  Ａ．Ａ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．２０１３，９３：１８０３−４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、簡便に、かつ、低コストでこれらのイミダゾールジペプチドを提供することを目的に、カルノシン及びアンセリン及びバレニンのイミダゾールジペプチドを高効率で生産可能なタンパク質、及び、該タンパク質をコードする遺伝子を導入した宿主細胞、並びに前記タンパク質を使用した前記イミダゾールペプチドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼが、ＡＴＰの加水分解反応と共役し、無保護のアミノ酸を基質としてαペプチド結合を形成することによりペプチド合成を触媒する酵素であることに着目し、バチルス属由来でＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質ＹｗｆＥの部位特異的変異を導入した変異型酵素を作製し、そのイミダゾールジペプチド合成活性を評価し、特定の部位を特定のアミノ酸残基に置換した変異型酵素が、強いイミダゾールペプチド合成活性、特に、カルノシン合成活性、アンセリン合成活性及び／又はバレニン合成活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
具体的には、本発明は、配列番号１で表されるＬ−アミノ酸α−リガーゼ：ＹｗｆＥのアミノ酸配列の少なくとも１〜３個のアミノ酸残基の置換を含む変異タンパク質であり、
Ｎ末端より１０８位のアスパラギン（Ｎ）残基がアラニン（Ａ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基に置換され、又は、さらに、
１１２位のイソロイシン（Ｉ）残基がバリン（Ｖ）残基に置換され、及び／又は、３７８位のヒスチジン（Ｈ）残基がリジン（Ｋ）残基又はアルギニン（Ｒ）残基に置換されていることを特徴とする、変異タンパク質を提供する。
【０００７】
本発明の前記変異タンパク質が、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有する場合がある。
【０００８】
本発明の前記変異タンパク質が、
（ｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質の場合がある。
【０００９】
本発明において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性が、カルノシン合成活性、アンセリン合成活性及び／又はバレニン合成活性から選択される場合がある。
【００１０】
本発明において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性が、カルノシン合成活性の場合に、前記変異タンパク質が、
（ｉ）配列番号２〜４、６、７、９、１０、１２〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２〜４、６、７、９、１０、１２〜１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、カルノシン合成活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２〜４、６、７、９、１０、１２〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルノシン合成活性を有するタンパク質の場合がある。
【００１１】
本発明において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性が、アンセリン合成活性の場合に、前記変異タンパク質が、
（ｉ）配列番号２、３、５、６、８〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２、３、５、６、８〜１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、アンセリン合成活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２、３、５、６、８〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アンセリン合成活性を有するタンパク質、
であることを特徴とする、請求項４に記載の変異タンパク質。
【００１２】
本発明において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性が、バレニン合成活性の場合に、前記変異タンパク質が、
（ｉ）配列番号６、７、１１、１４〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号６、７、１１、１４〜１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、バレニン合成活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号６、７、１１、１４〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、バレニン合成活性を有するタンパク質の場合がある。
【００１３】
本発明は、本発明の変異タンパク質をコードする、核酸を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明の核酸を含むポリヌクレオチドを挿入した、ベクターを提供する。
【００１５】
本発明は、本発明のベクターを少なくとも１種以上を含む、宿主細胞を提供する。
【００１６】
本発明は、本発明の変異タンパク質を使用する、ジペプチドの製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の製造方法において、ペプチダーゼの活性阻害剤とともに、本発明のタンパク質を使用する場合がある。
【００１８】
本発明の製造方法において、本発明の宿主細胞を使用する場合がある。
【００１９】
本発明の製造方法において、前記宿主細胞が、ペプチダーゼの欠損細胞である場合がある。
【００２０】
本発明の製造方法において、前記ペプチダーゼがペプチダーゼＤである場合がある。
【００２１】
本発明の製造方法において、前記欠損細胞が、ＪＷ０２２７株である場合がある。
【００２２】
本発明の製造方法において、前記ジペプチドが、イミダゾールジペプチドである場合がある。
【００２３】
本発明の製造方法において、前記イミダゾールジペプチドが、カルノシン、アンセリン及び／又はバレニンである場合がある。
【発明の効果】
【００２４】
イミダゾールジペプチドを高効率で生産するタンパク質、及び、該タンパク質を含有する宿主細胞を提供することにより、簡便に低コストでこれらのカルノシン、アンセリン及びバレニンを含むイミダゾールジペプチドを提供できる。また宿主細胞として、ペプチダーゼ欠損細胞を用いることで、イミダゾールジペプチド、特にカルノシンを高効率で製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】野生型ＹｗｆＥ及び部位特異的変異型ＹｗｆＥを含む変異型酵素のカルノシン合成活性を評価した結果を表す図。  図中、＊は、ｐ値が０．０５未満であることを示し、＊＊は、ｐ値が０．０１未満であることを示し、＊＊＊は、ｐ値が０．００１未満であることを示す。
【図２】野生型ＹｗｆＥ及び部位特異的変異型ＹｗｆＥを含む変異型酵素のアンセリン合成活性を評価した結果を表す図。  図中、＊は、ｐ値が０．０５未満であることを示し、＊＊は、ｐ値が０．０１未満であることを示し、＊＊＊は、ｐ値が０．００１未満であることを示す。
【図３】野生型ＹｗｆＥ及び部位特異的変異型ＹｗｆＥを含む変異型酵素のバレニン合成活性を評価した結果を表す図。  図中、＊は、ｐ値が０．０５未満であることを示し、＊＊は、ｐ値が０．０１未満であることを示し、＊＊＊は、ｐ値が０．００１未満であることを示す。
【図４】カルノシン合成におけるペプチダーゼの影響を評価した結果を表す図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１．本発明のタンパク質
本発明の実施態様の１つは、バチルス属細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来でＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質ＹｗｆＥの変異型酵素である。
【００２７】
本明細書において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性は、イミダゾールジペプチド合成活性であり、イミダゾールジペプチドとしては、カルノシン、アンセリン及びバレニンが挙げられる。
【００２８】
前記変異型酵素は、野生型ＹｗｆＥのＮ末端より１０８位のアスパラギン（Ｎ）残基がアラニン（Ａ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基に置換され、又は、さらに、１１２位のイソロイシン（Ｉ）残基がバリン（Ｖ）残基に置換され、及び／又は、３７８位のヒスチジン（Ｈ）残基がリジン（Ｋ）残基又はアルギニン（Ｒ）残基に置換させることにより、Ｎ末端側基質がβ−アラニンで、Ｃ末端側基質がヒスチジン又はその誘導体であるアミノ酸に対するリガーゼ活性が向上した酵素である。
【００２９】
なお、本明細書において、タンパク質の配列は、当業者に周知慣用のアミノ酸の３文字又は１文字による表記法で記述される。本明細書においてアミノ酸は、特に記載のない限りＬ体である。また、変異型タンパク質を表す場合、当業者に周知慣用の方法である野生型タンパク質の変異が導入されるアミノ酸の１文字表記、変異位置を表す数字、及び、変異されたアミノ酸の１文字表記が使用される。また、本明細書において、特段の説明がない場合には、アミノ酸はＬ−体を表す。
【００３０】
具体的には、本発明のタンパク質である前記変異型酵素は、配列番号１で表されるＬ−アミノ酸α−リガーゼ：ＹｗｆＥのアミノ酸配列の少なくとも１〜３個のアミノ酸残基の置換を含む変異タンパク質であり、
Ｎ末端より１０８位のアスパラギン（Ｎ）残基がアラニン（Ａ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基に置換され、又は、さらに、
１１２位のイソロイシン（Ｉ）残基がバリン（Ｖ）残基に置換され、及び／又は、３７８位のヒスチジン（Ｈ）残基がリジン（Ｋ）残基又はアルギニン（Ｒ）残基に置換されていることを特徴とする、変異タンパク質を提供する。
【００３１】
すなわち、本発明のタンパク質は、
（ｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３２】
また、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性は、好ましくはジペプチド合成活性であり、より好ましくは、カルノシン（Ｌ−Ｃａｒｎｏｓｉｎｅ）合成活性、アンセリン（Ｌ−Ａｎｓｅｒｉｎｅ）合成活性及び／又はバレニン（Ｌ−Ｂａｌｅｎｉｎｅ）合成活性である。
【００３３】
【化１】
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【００３４】
【化２】
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【００３５】
【化３】
2018102287.tif 000005
【００３６】
本明細書において、前記の「Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有する限り」とは、野生型ＹｗｆＥのＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性と同等又はより向上した活性をいい、野生型ＹｗｆＥと本発明のタンパク質の活性とを被験タンパク質の相違以外は同一条件で比較した場合に、野生型ＹｗｆＥのＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性と比較して、向上したＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性を示すタンパク質をいう。
【００３７】
本明細書において、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性、特に、ジペプチド合成活性の評価は、例えば、被験タンパク質、基質であるアミノ酸、ＡＴＰを含む例えばｐＨ５〜１１の緩衝水溶液中で、例えば２０〜５０℃の所定の温度で、例えば２〜１５０時間の所定の時間インキュベーションし、インキュベーションによって産生するジペプチドの量若しくは濃度の増加、基質であるアミノ酸の量若しくは濃度の減少、ＡＴＰの量若しくは濃度の減少、ＡＤＰの量若しくは濃度の増加、又は無機リン酸の量若しくは濃度の増加の中の少なくとも１つを指標として、例えば、高速液体クロマトグラフィー等を用いて測定し、被験タンパク質以外の条件が同一条件で測定する野生型ＹｗｆＥのジペプチド合成活性と比較することにより、実施できる。
【００３８】
また、本明細書において、「配列番号ＸのＮ末端からＹ番目のＺ１残基（Ｚ１）に相当するアミノ酸残基をＺ２残基（Ｚ２）に置換したタンパク質」（「Ｘ」及び「Ｙ」は、１以上の整数を、「Ｚ１」及び「Ｚ２」は任意のアミノ酸を表し、「（Ｚ１）」及び「（Ｚ２）」は、それぞれのアミノ酸を１文字表記したものである）とは、前記タンパク質のアミノ酸配列と、配列番号Ｘとを最も高い相同性スコアを与えるようにアライメントしたときに、配列番号Ｘのアミノ酸配列のＮ末端からＹ番目の位置に相当するＺ１残基がＺ２残基に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
【００３９】
以下に、本発明のタンパク質の特性を詳細に説明する。
【００４０】
バチルス属由来でＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質ＹｗｆＥの野生型タンパク質自体は、Ｃ末端がＬ−ヒスチジンであるジペプチドの合成活性を有するものの（Ｔａｂａｔａ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００５，１８７：５１９５-５２０２）、Ｎ末端がβ−アラニンでＣ末端がヒスチジンのジペプチドであるカルノシン並びにその誘導体であるアンセリン及びバレニンの産生に対して、強いα−リガーゼ活性を保有しない（図２参照）。すなわち、強いカルノシン合成活性、強いアンセリン合成活性及びバレニン合成活性は、ＹｗｆＥの野生型タンパク質に対して変異体とすることにより、もたらされる。
【００４１】
本発明のタンパク質のＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性の発現において、Ｎ末端基質としてＡｌａ及びＧｌｙを、Ｃ末端基質としてＨｉｓを使用する場合と比較し、Ｎ末端基質としてβ−Ａｌａを、Ｃ末端基質としてＨｉｓを使用する場合には、より強い活性を示し、本発明のタンパク質は、特に、カルノシン又はその誘導体であるアンセリン若しくはバレニンの合成に対して選択的な強い活性を有する。カルノシン又はその誘導体であるアンセリン若しくはバレニンの合成に対する至適な変異型酵素は必ずしも一致しない。
【００４２】
そして、本発明の１アミノ酸変異型タンパク質から得られた特性に基づき、本発明は２個又は３個のアミノ酸残基を置換した変異型酵素が設計され、二重変異型酵素又は三重変異型酵素であるタンパク質が本発明によって提供される。
【００４３】
Ｎ１０８Ａ、Ｎ１０８Ｅ又はＮ１０８Ｑの変異、Ｉ１１２Ｖの変異、Ｈ３７８Ｋ又はＨ３７８Ｒの変異、並びに、これらの変異の組み合わせによる二重変異型酵素又は三重変異型酵素の多くにおいて、カルノシン合成活性と、アンセリン合成活性と、バレニン合成活性とは野生型ＹｗｆＥの各活性よりも活性が向上するが、必ずしも全ての活性が同様に向上するとは限らない。
【００４４】
すなわち、本発明の前記タンパク質の前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性の例がカルノシン合成活性である場合、該タンパク質は、配列番号１のＮ末端から１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基の、アラニン（Ａ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基から選択されるアミノ酸残基への置換；配列番号１のＮ末端から１１２位のイソロイシン（Ｉ）残基の、バリン（Ｖ）残基への置換；及び／又は、配列番号１の３７８番目のヒスチジン（Ｈ）残基の、リジン（Ｋ）残基又はアルギニン（Ｒ）残基への置換を含むことが好ましい。
【００４５】
また、本発明の前記タンパク質の前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性の例がアンセリン合成活性である場合、該タンパク質は、配列番号１のＮ末端から１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基の、アラニン（Ａ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基から選択されるアミノ酸残基への置換；配列番号１のＮ末端から１１２位のイソロイシン（Ｉ）残基の、バリン（Ｖ）残基への置換；及び／又は、配列番号１の３７８番目のヒスチジン（Ｈ）残基の、リジン（Ｋ）残基又はアルギニン（Ｒ）残基への置換を含むことが好ましい。
【００４６】
さらに、本発明の前記タンパク質の前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性の例がバレニン合成活性である場合、該タンパク質は、配列番号１のＮ末端から１０８番目のアスパラギン（Ｎ）の、アラニン（Ａ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基から選択されるアミノ酸残基への置換；配列番号１のＮ末端から１１２位のイソロイシン（Ｉ）残基の、バリン（Ｖ）残基への置換；及び／又は、配列番号１の３７８番目のヒスチジン（Ｈ）残基の、リジン（Ｋ）残基又はアルギニン（Ｒ）残基への置換を含むことが好ましい。
【００４７】
前記ＹｗｆＥの変異タンパク質は、例えば、配列番号１７で表されるＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３３〜４４に示される核酸配列を有するプライマーを用い、当業者に周知慣用のＰＣＲにより部位特異的変異導入を行い、下記に記載の本発明の配列番号２〜１６のタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを挿入したベクター（以下、「核酸挿入ベクター」と記載）、さらに該核酸挿入ベクターを導入した下記の本発明の核酸挿入ベクターを含む宿主細胞（以下、「形質転換細胞」と記載する場合がある）を作製し、該形質転換細胞を含む宿主細胞を適切な培地で培養し、該形質転換体により製造されたタンパク質を塩沈法、ゲルクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法等の通常の酵素の単離精製法を用いることにより、単離精製し、１変異型酵素を製造することができる。
【００４８】
前記テンプレートとして使用するＤＮＡは、例えば、配列番号１７のポリヌクレオチド配列の部分配列より設計されるプローブを用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８等のＹｗｆＥタンパク質又はその類縁タンパク質をコードする微生物の染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法等により全長の配列番号１７のポリヌクレオチドを取得できる。
【００４９】
また、二重変異型酵素は、前記１変異型酵素の製造で使用した１変異型の部位特異的変異を導入した核酸挿入ベクターをテンプレートとして、さらに、配列番号３３〜４４に示される核酸配列を有するプライマーを用い、当業者に周知慣用のＰＣＲにより部位特異的変異導入を行い、１変異型酵素の製造と同様に、二重変異を導入した核酸ベクターを含む宿主細胞を適切な培地で培養後、二重変異型酵素を単離精製することにより製造できる。
【００５０】
さらに、三重変異型酵素は、前記２変異型酵素の製造で使用した２変異型の部位特異的変異を導入した核酸挿入ベクターをテンプレートとして、さらに、配列番号３３〜４４に示される核酸配列を有するプライマーを用い、当業者に周知慣用のＰＣＲにより部位特異的変異導入を行い、２変異型酵素の製造と同様に、三重変異を導入した核酸ベクターを含む宿主細胞を適切な培地で培養後、三重変異型酵素を単離精製することにより製造できる。
【００５１】
そして、本発明のタンパク質は、カルノシン、アンセリン又はバレニンを製造するための酵素として使用され、さらに、該タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を導入した形質転換細胞を作製し、該形質転換細胞の細胞培養によりカルノシン、アンセリン及び／又はバレニンの製造に利用される。
【００５２】
２．本発明の核酸
本発明のもう１つの実施態様は核酸であり、
（ｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２〜１６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を挙げることができる。
【００５３】
前記核酸は、例えば、配列番号１７のポリヌクレオチド配列より設計されるプライマーを用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８等のＹｗｆＥタンパク質又はその類縁タンパク質をコードする微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とした部位特異的変異法を用いて部位特異的変異の導入によって取得される。
【００５４】
鋳型遺伝子への目的の変異導入は、より具体的には、基本的には配列番号１７のポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、ＰＣＲ法やアニーリング法等（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社、米国）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アジレント  テクノロジー社、米国）等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００５５】
ＹｗｆＥ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、ＹｗｆＥタンパク質を産生する細菌から、常法により、ゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって調製することができる。ＹｗｆＥタンパク質を産生する細菌は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属細菌、クロストリジウム属細菌、アシドサーマス属細菌を含む細菌の他、植物や動物でも報告されているが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属細菌が好ましく、当業者であれば容易に入手することができる。例えば、バチルス・エスピーのＫＳＭ−Ｓ２３７株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）、ＫＳＭ−６３５株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４８５）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ併記した受託番号に基づいて寄託されている。
【００５６】
これらバチルス属細菌からのゲノムＤＮＡの調製は、例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，８：ｐ．１５１−１５６に記載の方法等を用いて行うことができる。ＹｗｆＥ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、調製したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから切り出したＹｗｆＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を任意のベクター中に挿入した形で調製してもよい。
【００５７】
ＹｗｆＥ遺伝子への部位特異的変異の導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、ＹｗｆＥ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有する塩基配列を含むように設計すればよい。
【００５８】
これらの方法で取得された核酸を用い、下記の本発明のタンパク質を宿主細胞で発現させるためのベクターの調製、該ベクターを導入した宿主細胞、すなわち、形質転換細胞の作製、さらに、前記の本発明のタンパク質の製造に使用できる。
【００５９】
３．本発明のタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを挿入したベクター（核酸挿入ベクター）
本発明のもう１つの実施態様は、前記の本発明のタンパク質をコードする遺伝子及び適切な発現配列を含む核酸挿入ベクターである。これらの組換えＤＮＡを作製するための発現ベクターは、商業的に利用可能である。これらのベクターを入手し、利用することにより本発明の核酸挿入ベクターを作製し、下記の本核酸挿入ベクターを含む宿主細胞、すなわち形質転換細胞の作製に使用することができる。
【００６０】
ベクターとしては、例えば、宿主細胞にエシェリヒア・コリを用いる場合、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、等を挙げることができる。
【００６１】
前記ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルス・サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等も用いることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００６２】
本発明のタンパク質を生成する目的において、ベクターを利用する場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でタンパク質を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればｐＢＥＳＴベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればｐＥＴベクター（インビトロジェン社製）、培養細胞であればｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）、生物個体であればｐＭＥ１８Ｓベクター（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２（１９８８））等が好ましい。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４−１１．１１）。
【００６３】
４．本発明の宿主細胞
本発明のもう１つの実施態様は、前記核酸挿入ベクターを宿主細胞に導入し、本発明の前記タンパク質を発現する形質転換された宿主細胞である。核酸挿入ベクターを宿主細胞に導入するための試薬は、各種の試薬が商業的に利用可能であり、これらを入手して形質転換細胞の作製に使用できる。
【００６４】
宿主細胞は酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、植物細胞及び古細菌細胞から選択され、好ましくは、細菌細胞である。細菌細胞の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。イミダゾールジペプチド生成物（例えば、カルノシン、アンセリン、バレニン）を高効率に製造する観点から、前記宿主細胞は、イミダゾールジペプチドの分解酵素、具体的にはペプチダーゼＤの欠損細胞であることが好ましい。
【００６５】
具体的には、本発明のベクターを導入する宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、例えば、大腸菌、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、デバリヨミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属酵母、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属酵母、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属酵母、キサントフィロミセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）属酵母、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属糸状菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属糸状菌、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属等に属する微生物を好適に用いることができる。好ましくは、宿主細胞は大腸菌、放線菌、シュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス属に属する酵母である。
【００６６】
本発明の宿主細胞は、より具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セラチア・マーセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、デバリヨミセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、クリプトコッカス・カバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇａｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、モルティエレラ・バイニエリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｂａｉｎｉｅｒｉ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）カニンガメラ・エレガンス（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、シゾキトリウム・リマシアム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｕｍ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）等を用いることができる。
【００６７】
宿主細胞への前記核酸挿入ベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）、接合、天然の形質転換、エレクトロポレーション及び当業者に公知のその他の方法を含む様々な方法によって実施できる。また、商業的に利用可能なトランスフェクション試薬を入手し、これらを利用することにより、宿主細胞への前記発現ベクターの導入を実施できる。［参考文献：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  ３  ｖｏｌｓ．  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．］
【００６８】
５．本発明のジペプチドの製造方法
前記の本発明のタンパク質又は形質転換細胞を用い、本発明のタンパク質の基質となる製造原料であるアミノ酸をＡＴＰの共存下、緩衝液中でインキュベーションする又は細胞培養用培地中で細胞培養することにより産生される所望とするジペプチドを緩衝液又は培地から単離することにより、これらのジペプチドを製造できる。原料とするアミノ酸としては、Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−Ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ、Ｌ−３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ、Ｌ−Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ、Ｌ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ、Ｌ−６−Ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ、グリシン（Ｇｌｙ）及びβ−アラニン（β−Ａｌａ）からなる群より選ばれる１種又は２種のアミノ酸の組み合わせを挙げることができる。
【００６９】
緩衝液としては、例えば、当業者に慣用のリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液及びトリス塩酸緩衝液等が挙げられる。
【００７０】
細胞培養培地に含まれる成分として、炭素源としては、宿主細胞及び形質転換細胞が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００７１】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、及びその消化物等を用いることができる。
【００７２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
【００７３】
培養は、通常、通気撹拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、宿主細胞又は形質転換細胞の生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても宿主細胞又は形質転換細胞が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸又はアルカリを添加して行うことができる。
【００７４】
上記培養において、ペプチダーゼによるイミダゾールジペプチド生成物（例えば、カルノシン、アンセリン、バレニン）の分解を妨げるために、本発明のタンパク質を使用する場合にペプチダーゼ、特にペプチダーゼＤの活性阻害剤を用いる、又は、宿主細胞を用いる場合に宿主細胞としてペプチダーゼの欠損細胞、特にＪＷ０２２７株を用いることにより、カルノシン、アンセリン及び／又はバレニンを高効率で製造することができる。
【００７５】
培養物からの所望とする酵素の採取は、所望とする酵素の活性を指標として公知の採取方法により行うことができる。所望とする酵素は必ずしも均一にまで精製される必要はなく、用途に応じた精製度まで精製すればよい。
【００７６】
以下に、ジペプチドがカルシノン、アンセリン及びバレニンの場合について、より具体的に説明する。
【００７７】
（１）本発明のタンパク質を基質であるアミノ酸を含む緩衝液中でインキュベーションすることによるカルノシンの製造方法
カルノシンは、β−アラニンとＬ−ヒスチジンとを基質として、本発明のタンパク質が触媒として縮合反応することにより産生される。したがって、β−アラニン及びＬ−ヒスチジンを含む緩衝液に本発明のタンパク質を添加し所定の時間インキュベーション後、産生されるカルノシンを単離精製することにより、所望とするカルノシンを製造できる。
【００７８】
前記製造法において、本発明のタンパク質は、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ添加する。前記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、０．１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜４０ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発又は反応途中に添加する。前記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、０．５〜１ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いる。
【００７９】
インキュベーションによる生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜７２時間、好ましくは６〜３６時間行う。
【００８０】
緩衝液中に生成、蓄積したカルノシンの単離・精製は、当業者に慣用の活性炭やイオン交換樹脂等を用いる方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００８１】
（２）本発明を使用するカルノシンの製造方法
カルノシンは、β−アラニンとＬ−ヒスチジンとを基質として、本発明のタンパク質が触媒として縮合反応することにより生成される。したがって、β−アラニン及びＬ−ヒスチジンを含む細胞培養用培地で本発明の形質転換細胞を培養後、産生されるカルノシンを単離精製することにより、所望とするカルノシンを製造し、取得できる。
【００８２】
前記製造法において、本発明のタンパク質は、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ添加する。前記製造法において、添加するβ−アラニンとＬ−ヒスチジンの量は、各々通常０．５〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは２〜５０ｇ／Ｌである。これらのアミノ酸を含む細胞培地において、本発明の形質転換細胞を、当業者に周知慣用の方法に従って培養する。
【００８３】
培養は、通常振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００８４】
緩衝液中に生成、蓄積したカルノシンの単離・精製は、当業者に慣用の活性炭やイオン交換樹脂等を用いる方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００８５】
（３）本発明のタンパク質を基質であるアミノ酸を含む緩衝液中でインキュベーションすることによるアンセリンの製造方法
アンセリンは、β−アラニンと３−メチル−Ｌ−ヒスチジンとがペプチド結合したジペプチドである。したがって、本発明のタンパク質を利用してアンセリンを製造する場合には、前記の「（１）本発明のタンパク質を基質であるアミノ酸を含む緩衝液中でインキュベーションすることによるカルノシンの製造方法」に記載において、基質の１つであるＬ−ヒスチジンの代わりに３−メチル−Ｌ−ヒスチジンを使用する以外は、該「（１）カルノシンの製造方法」と同様の条件でインキュベーションし、単離・精製することにより、アンセリンを製造し、取得できる。
【００８６】
（４）本発明の形質転換細胞を使用するアンセリンの製造方法
アンセリンは、β−アラニンと３−メチル−Ｌ−ヒスチジンとがペプチド結合したジペプチドである。したがって、本発明のタンパク質を利用してアンセリンを製造する場合には、前記の「（２）本発明の形質転換細胞を使用するカルノシンの製造方法」に記載において、基質の１つであるＬ−ヒスチジンの代わりに３−メチル−Ｌ−ヒスチジンを使用する以外は、「（２）本発明の形質転換細胞を使用するカルノシンの製造方法」と同様の条件で、実施することにより、アンセリンを製造し、取得できる。
【００８７】
（５）本発明のタンパク質を基質であるアミノ酸を含む緩衝液中でインキュベーションすることによるバレニンの製造方法
アンセリンは、β−アラニンと１−メチル−Ｌ−ヒスチジンとがペプチド結合したジペプチドである。したがって、本発明のタンパク質を利用してバレニンを製造する場合には、前記の「（１）本発明のタンパク質を基質であるアミノ酸を含む緩衝液中でインキュベーションすることによるカルノシンの製造方法」に記載において、基質の１つであるＬ−ヒスチジンの代わりに１−メチル−Ｌ−ヒスチジンを使用する以外は、該「（１）カルノシンの製造方法」と同様の条件でインキュベーションし、単離・精製することにより、バレニンを製造し、取得できる。
【００８８】
（６）本発明の形質転換細胞を使用するバレニンの製造方法
バレニンは、β−アラニンと１−メチル−Ｌ−ヒスチジンとがペプチド結合したジペプチドである。したがって、本発明のタンパク質を利用してバレニンを製造する場合には、前記の「（２）本発明の形質転換細胞を使用するカルノシンの製造方法」に記載において、基質の１つであるＬ−ヒスチジンの代わりに１−メチル−Ｌ−ヒスチジンを使用する以外は、「（２）本発明の形質転換細胞を使用するカルノシンの製造方法」と同様の条件で、実施することにより、バレニンを製造し、取得できる。
【００８９】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００９０】
以下の実施例において、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）の調製、ＰＣＲ、塩基配列決定、形質転換、タンパク質の発現、タンパク質の精製、ＨＰＬＣ分析等は、当業者に周知慣用の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２０１２）等を参照せよ。
【００９１】
ＹｗｆＥへの部位特異的変異の導入
ＹｗｆＥ遺伝子（配列番号１１）を組み込んだｐＥＴベクターを鋳型として、製造者の指示に従ってＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、米国）を用いて目的の変異を導入した。ＰＣＲ反応は、表１（組成）及び表２（ＰＣＲサイクル）に示す反応条件で実施した。ＰＣＲ反応では、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．、大阪）を用いた。プライマー（配列番号３３〜４４）を使用し、Ｎ１     
０８Ａ、Ｎ１０８Ｅ又はＮ１０８Ｑの部位特異的変異を導入したベクターを得た。なお、Ｎ１０８Ａに対するベクターはＹｗｆＥタンパク質のＮ末端から１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基をアラニン（Ａ）残基に置換したＹｗｆＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）を、Ｎ１０８Ｅに対するベクターはＹｗｆＥタンパク質の１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基をグルタミン酸（Ｅ）残基に置換したＹｗｆＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１９）を、Ｎ１０８Ｑに対するベクターはＹｗｆＥタンパク質の１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基をグルタミン（Ｑ）残基に置換したＹｗｆＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）を表す。
【００９２】
【表１】
2018102287.tif 000006
【００９３】
【表２】
2018102287.tif 000007
【００９４】
ＰＣＲ反応後、得られたＰＣＲ産物について、ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社、東京）で解析し、部位特異的変異が導入されたかを確認した。
【００９５】
大腸菌から抽出されたベクターは、Ｄａｍメチラーゼにより、Ｄｐｎ  Ｉサイトがメチル化されている一方、ＰＣＲ産物は、Ｄｐｎ  Ｉサイトがメチル化されていないため、これを利用することにより、鋳型ベクターと、ＰＣＲ産物とを区別できる。簡潔には、ＰＣＲ後の反応液に含まれる鋳型ベクターを除去するために、精製したＰＣＲ産物をＤｐｎ  Ｉで３７℃、２時間処理した。制限酵素反応は、表３に示した反応条件で実施した。
【００９６】
【表３】
2018102287.tif 000008
【００９７】
Ｄｐｎ  Ｉでの消化後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿によって精製した部位特異的変異導入ベクターを、ＴＥ緩衝液ｐＨ８．０に溶解した。
【００９８】
部位特異的変異導入ベクターによる大腸菌ＪＭ１０９の形質転換
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルと、部位特異的変異導入ベクターとをともに、４２℃で熱処理した。その後ＳＯＣ培地を加えて培養し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で終夜培養した。
【００９９】
生育したコロニーから１つのコロニーを選択し、カナマイシン含有ＬＢ培地３ｍＬに懸濁し、３７℃で５時間培養した。培養後、アルカリＳＤＳ法により形質転換細胞から部位特異的変異導入ベクターを抽出した。抽出した部位特異的変異導入ベクターをフェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。
【０１００】
精製酵素の調製
部位特異的変異導入ベクターによる大腸菌ＢＬ２１の形質転換
精製した部位特異的変異導入ベクターを用いて、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１の形質転換を行った。大腸菌ＢＬ２１のコンピテントセルと部位特異的変異導入ベクターとをともに、４２℃で熱処理した。その後ＳＯＣ培地を加えて培養し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で終夜培養した。ここでコロニーを形成した大腸菌を、ＹｗｆＥ発現形質転換細胞とした。
【０１０１】
ＩＰＴＧによる発現誘導
生育したＹｗｆＥ発現形質転換細胞のコロニーから１つのコロニーを選択し、試験管中でカナマイシン含有ＬＢ培地３ｍＬに懸濁して、３７℃で５時間、前培養を行った。次に、５００ｍＬバッフル付エルレンマイヤーフラスコ中のカナマイシン含有ＬＢ培地２００ｍＬに前培養液２ｍＬを添加した。３７℃、１２０ｒｐｍで２時間本培養した後、１００ｍＭ  ＩＰＴＧ  ２００μＬを添加した。ＩＰＴＧ添加後の培養液を２５℃、１２０ｒｐｍで終夜培養した。
【０１０２】
終夜培養後、５０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行って集菌し、菌体ペレットを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁して洗菌した。この操作を２回繰り返して培地成分を除去した。洗菌後、菌体ペレットを−８０℃で凍結保存した。
【０１０３】
酵素精製
解凍した菌体ペレットに、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、メルクＫＧａＡ社、独国）とリゾチームとを添加し、タンパク質を抽出した。菌体破砕液は遠心分離によって、沈殿（不溶性画分）と上清（無細胞抽出液）とに分離した。無細胞抽出液をＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ（ＧＥヘルスケア社、米国）を用いて製造者の指示に従って適用した。溶出した溶液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて、製造者の指示書に従って脱塩した。精製した酵素を、以下の実験で使用されるまで、−８０℃で保存した。
【０１０４】
精製酵素の濃度測定
精製した酵素の濃度を、クマシーブリリアントブルーを用いた呈色反応後、マイクロプレートリーダーＭＯＤＥＬ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）により測定した。検量線法により５９５ｎｍの吸光度の測定値から精製した酵素濃度を決定した。
【０１０５】
二重変異型酵素
Ｎ１０８Ａ、Ｎ１０８Ｅ又はＮ１０８Ｑの変異と、Ｉ１１２Ｖ、Ｈ３７８Ｋ又はＨ３７８Ｒの変異とを組み合わせた二重変異型酵素Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号５）、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号６）、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号７）、Ｎ１０８Ｅ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号８）、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号９）、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１０）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号１１）、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号１２）及びＮ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１３）を作製し、カルノシン合成活性を評価した。簡潔には、上記の部位特異的変異の導入と同様に、Ｎ１０８Ａ、Ｎ１０８Ｅ又はＮ１０８Ｑの部位特異的変異を有するベクターを鋳型にして、Ｉ１１２Ｖのプライマー（配列番号３９及び４０）、Ｈ３７８Ｋのプライマー（配列番号４１及び４２）又はＨ３７８Ｒのプライマー（配列番号４３及び４４）を用いて部位特異的変異（Ｉ１１２Ｖ、Ｈ３７８Ｋ又はＨ３７８Ｒ）をさらに導入し、二重部位特異的変異を有するベクターを得た。その後、上記と同様に、精製した二重部位特異的変異型ＹｗｆＥ（配列番号５〜１３）を得た。
【０１０６】
三重変異型酵素
Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖの変異と、Ｈ３７８Ｋ、Ｈ３７８Ｒの変異とを組み合わせた三重変異型酵素Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１４）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号１５）及びＮ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１６）を作製し、カルノシン合成活性を評価した。簡潔には、上記の部位特異的変異の導入と同様に、Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖの部位特異的変異を有するベクターを鋳型にして、Ｈ３７８Ｋのプライマー（配列番号４１及び４２）又はＨ３７８Ｒのプライマー（配列番号４３及び４４）を用いて部位特異的変異（Ｈ３７８Ｋ又はＨ３７８Ｒ）をさらに導入し、三重部位特異的変異を有するベクターを得た。その後、上記と同様に、精製した三重部位特異的変異型ＹｗｆＥ（配列番号１４〜１６）を得た。
【０１０７】
カルノシン合成活性評価（ＨＰＬＣ分析） 
カルノシンの標品は、市販のカルノシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を使用した。ペプチドの合成量について、Ｎα−（５−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）誘導体化法を用いたＨＰＬＣ分析を実施し、検量線法により定量した。該ＨＰＬＣ分析は表４（溶離液組成）及び表５（グラジエントプログラム）に示した条件で定法に従って実施された。
＜分析条件＞
使用機器：ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−７０００  シリーズ（株式会社日立製作所、東京）
使用カラム：ＷＨ−Ｃ１８Ａ（４×１５０ｍｍ）（株式会社日立ハイテクノロジーズ、東京）
サンプル注入量：１０μＬ
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＵＶ検出波長：３４０ｎｍ
【０１０８】
【表４】
2018102287.tif 000009
【０１０９】
【表５】
2018102287.tif 000010
【０１１０】
カルノシン合成は、表６に示す組成の反応液中で、３０℃で２０時間実施された。酵素として、野生型酵素（配列番号１）と、単変異型酵素Ｎ１０８Ａ（配列番号２）、Ｎ１０８Ｅ（配列番号３）、Ｎ１０８Ｑ（配列番号４）と、二重変異型酵素Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号５）、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号６）、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号７）、Ｎ１０８Ｅ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号８）、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号９）、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１０）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号１１）、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号１２）、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１３）と、三重変異型酵素Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１４）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号１５）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１６）とを用いた。反応終了後、カルノシン合成の評価するために上記と同様の方法でＨＰＬＣによって分析した。
【０１１１】
統計学的検定は、統計検定ソフト：ＥＺＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｉｃｈｉ．ａｃ．ｊｐ／ｓａｉｔａｍａ−ｓｃｔ／ＳａｉｔａｍａＨＰ．ｆｉｌｅｓ／ｓｔａｔｍｅｄ．ｈｔｍ）を用い、野生型酵素によって生成されるカルノシンの濃度を対照群として、各変異型酵素によって生成されるカルノシンの濃度に対して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＤｕｎｎｅｔｔの検定法により、ｐ値０．０５を有意水準としてｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析した（各群ｎ＝３）。また、下記のアンセリン合成活性評価、及び、バレニン合成活性評価の統計学的解析も同様に実施した。
【０１１２】
【表６】
2018102287.tif 000011
【０１１３】
結果
図１は、野生型酵素（配列番号１）と、単変異型酵素Ｎ１０８Ａ（配列番号２）、Ｎ１０８Ｅ（配列番号３）、Ｎ１０８Ｑ（配列番号４）と、二重変異型酵素Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号５）、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号６）、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号７）、Ｎ１０８Ｅ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号８）、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号９）、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１０）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号１１）、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号１２）、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１３）と、三重変異型酵素Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１４）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号１５）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１６）のカルノシン合成によるカルノシン濃度を示す。Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号５）、Ｎ１０８Ｅ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号８）及びＮ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ（配列番号１１）を除いて、いずれの変異型酵素においても、野生型と比較して統計学的有意なカルシノン合成活性の上昇を認めた。また、カルシノン合成活性は、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号９）が最も高く、収率は９１．４％であった。
【実施例２】
【０１１４】
アンセリン合成活性の評価
実施例１のカルノシン合成活性の評価と同様に、１５種類の変異型酵素（Ｎ１０８Ａ、Ｎ１０８Ｅ、Ｎ１０８Ｑ、Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｋ、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ｅ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｋ、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ及びＮ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ）のアンセリン合成活性を、野生型の活性と比較し評価した。簡潔には、アンセリン合成は、表７に示す組成の反応液中で、３０℃で２０時間実施された。反応終了後、アンセリン濃度を実施例１と同様にＨＰＬＣで定量することにより各変異型酵素のアンセリン合成活性を評価した。アンセリンの標品は、市販のアンセリン（和光純薬工業株式会社、大阪）を使用した。
【０１１５】
【表７】
2018102287.tif 000012
【０１１６】
結果
図２に測定結果を示した。Ｎ１０８Ｑ（配列番号４）及びＮ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号７）を除いて、いずれの変異型酵素においても、野生型と比較して統計学的有意なアンセリン合成活性の上昇を認めた。また、アンセリン合成活性は、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号１５）が最も高く、収率は９４．７％であった。
【実施例３】
【０１１７】
バレニン合成活性の評価
実施例１のカルノシン合成活性の評価と同様に、１５種類の変異型酵素（Ｎ１０８Ａ、Ｎ１０８Ｅ、Ｎ１０８Ｑ、Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｋ、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ｅ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ、Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｋ、Ｎ１０８Ｑ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ及びＮ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ）のバレニン合成活性を、野生型の活性と比較し評価した。簡潔には、バレニン合成は、表８に示す組成の反応液中で、３０℃で２０時間実施された。反応終了後、バレニン濃度を実施例１と同様にＨＰＬＣで定量することにより各変異型酵素のバレニン合成活性を評価した。バレニンの標品は、市販のバレニン（浜理薬品工業株式会社、大阪）を使用した。
【表８】
2018102287.tif 000013
【０１１８】
結果
図３に測定結果を示した。６種類の変異型酵素（Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｋ、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ、Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ及びＮ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ）において、野生型と比較して統計学的有意なバレニン合成活性の上昇を認めた。また、バレニン合成活性は、Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号６）が最も高く、収率は３８．８％であった。
【０１１９】
以上の結果から、４種類の変異型酵素（Ｎ１０８Ａ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号６）、Ｎ１０８Ａ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１４）、Ｎ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号１５）及びＮ１０８Ｑ／Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｒ（配列番号１６））については、野生型と比較して統計学的有意なカルノシン合成活性、アンセリン合成活性及びバレニン合成活性の上昇を認めた。
【実施例４】
【０１２０】
カルノシン合成におけるペプチダーゼの影響評価
ペプチダーゼＤ（ｐｅｐＤ）は、Ｎ末端側の任意のアミノ酸（Ｘａａ）と、Ｃ末端側のヒスチジン（Ｈｉｓ）とからなるジペプチド（Ｘａａ−Ｈｉｓ）を認識し、これを分解する（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７２，２３３７−２３４３（１９８６））。そのため、細胞を用いる製造方法では、ｐｅｐＤを欠損する菌体を使用することでカルノシンの分解を抑制できると考えられた。
そこで、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０１株及びＪＷ０２２７株を使用して、カルノシンの分解活性を比較評価した。ＪＷ０２２７株はＪＭ１０１株からペプチダーゼの一種であるｐｅｐＤの遺伝子を欠損させたものである。表９にＪＭ１０１株のＧｅｎｏｔｙｐｅを示す。
【表９】
2018102287.tif 000014
【０１２１】
菌体反応によるカルノシン分解は、表１０に示す組成の反応液中で、３０℃で０又は２０時間実施された。反応終了後の溶液について９０℃で１０分間処理し、反応を停止させた。２０分間の遠心分離後、上清をＨＰＬＣにより分析を行った。０時間のカルノシン濃度を１００％としたときの２０時間反応後のカルノシン残存率を算出した。
【表１０】
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【０１２２】
結果
図４は、宿主細胞としてＪＭ１０１株、ＪＷ０２２７株それぞれを使用した際のカルノシン残存率を示す。カルノシン残存率はＪＭ１０１株では６４．２％であり、ＪＷ０２２７株では７４．７％であった。このことから、ペプチダーゼの欠損株を用いることにより、生成されたカルノシンの分解を抑制し、カルノシンを高効率で製造できることが明らかとなった。また、アンセリン及びバレニンもペプチダーゼの欠損株を用いることにより、高効率で製造できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
イミダゾールジペプチド、特にカルノシン、アンセリン及び／又はバレニンを高効率で生産するタンパク質、該タンパク質をコードする核酸を含むベクター、及び、該タンパク質を含有する宿主細胞を提供することにより、簡便に低コストでこれらのイミダゾールジペプチドを提供することができる。また宿主細胞として、ペプチダーゼ欠損細胞を用いることで、イミダゾールジペプチド、特にカルノシンを高効率で製造できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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