(57)【要約】【課題】細胞培養中の細胞の成長状態を測定する連続測定装置における細胞密度の連続測定で得た測定値の可視化において、過去及び現在の測定値の全て、もしくは選択された過去、現在の測定値を、時系列変化が明確に区別でき、細胞の成長度合いや細胞サイズの同一性の確認も可能とする測定値の可視化プログラム及び可視化方法を提供する。【解決手段】細胞培養中の細胞の成長状態を測定する連続測定装置を、信号印加手段、計測手段、計算手段、記憶手段を経て得られた測定値が、細胞の成長が進む場合には、散布図のｘ・ｙ座標系の右側に移動し、細胞の大きさの同一性が高くなる場合にはｘ・ｙ座標系の上方に移動するように、ｘ・ｙ座標系におけるｘ軸を周波数の逆数ｆＣ−１とし、ｙ軸を「周波数−誘電率曲線」の傾きの最大値αとする「ｆＣ−１・α」座標系とする可視化手段として機能させるための細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラム。【選択図】図６
2018042506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養中の細胞の成長状態を測定する連続測定装置を、
前記細胞に周波数ｆ０からｆＥ間のＮ個の周波数ｆｍＪを測定周波数とする交流信号を順次与えるマルチ周波数スキャンを、培養開始から時間間隔ΔｔI（Ｉはマルチ周波数スキャン番号で、Ｉ＝０、１、２、・・・、Ｍ）毎に、ΣＭＩ＝０ΔｔＩ＝ｔＩ（Δｔ０＝０、Ｍはマルチ周波数スキャンの測定回数））で示される経過時間迄実施する信号印加手段、
前記信号印加手段の実施により細胞内で生じる配向分極による誘電率を測定する計測手段、
前記マルチ周波数スキャンで得られる前記交流信号の周波数と前記周波数に対応して得られた誘電率を用いて、「周波数−誘電率曲線」の傾きの最大値αと前記傾きの最大値αを示す周波数ｆＣを求める操作を、実施したＩ回のマルチ周波数スキャンに対して行い、時間間隔Δｔとマルチ周波数スキャン番号Ｉから求められる経過時間ｔＩと前記ｔＩに対応する傾きの最大値αＩと周波数ｆＣＩとからなるデータ群（αＩ、ｆＣＩ、ｔＩ）を算出する計算手段、
前記信号印加手段、計測手段、及び計算手段で用いた測定条件、測定した計測値、前記測定条件及び計測値を用いて得た計算値を記録する記憶手段、
前記データ群（αＩ、ｆＣＩ、ｔＩ）を用い、傾きの最大値α及び周波数ｆＣを項目とし、経過時間ｔＩをデータとする散布図を構成、描画し、
前記散布図における前記データの座標位置を示すマークの位置が、細胞の成長が進む場合には、前記散布図のｘ・ｙ座標系の右側に移動し、前記細胞の大きさの同一性が高くなる場合には前記ｘ・ｙ座標系の上方に移動するように、
前記ｘ・ｙ座標系におけるｘ軸を周波数の逆数ｆＣ−１とし、ｙ軸を「周波数−誘電率曲線」の傾きの最大値αとする「ｆＣ−１・α」座標系とする可視化手段、
として機能させるための細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラム。
【請求項２】
前記測定周波数ｆｍＪが、ｆｍＪ＝１０（ａ−ｂ＊Ｎ）（Ｎは１回のマルチ周波数スキャンにおける周波数の数）で生成されるＮ個の周波数であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラム。
【請求項３】
前記測定周波数ｆｍＪが、ｆｍＪ＝１０（４−０．０９５３＊Ｎ）（Ｎは１回のマルチ周波数スキャンにおける周波数の数）で生成されるＮ個の周波数であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラム。
【請求項４】
前記散布図における前記データの経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎の細胞成長状態が前記散布図上で見分けられるように、
前記区切り時間範囲κ毎に前記マークの色種類（色相）が変わり、
前記区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、前記初期値におけるマークの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、前記区切り領域κ内での経過時間がΔｔ増す毎に、段階的に前記マークの色の階調が強くなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラム。
【請求項５】
前記散布図において、前記データのマークが閉じた境界線と前記境界線で囲まれた領域τを有する図形で、
前記境界線は線幅、色種類（色相）、色の階調（彩度）を属性に持ち、
前記領域τは色種類（色相）と色の階調（彩度）を属性として有し、
前記データの経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎に、前記境界線及び領域τの色種類（色相）が変わり、
前記区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、前記初期値における領域τの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、前記区切り領域τ内での経過時間がΔｔ増す毎に、段階的に前記マークの色の階調が強くなることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラム。
【請求項６】
細胞培養における細胞成長状態の可視化方法であって、
前記細胞に周波数ｆ０からｆＥ間のＮ個の周波数を測定周波数ｆｍＪ（Ｊは1回のマルチ周波数スキャンにおけるスキャン番号で、Ｊ＝０、１、２、・・・、Ｎ）とする交流信号を順次加えるマルチ周波数スキャンを、培養開始から時間間隔ΔｔＩ毎にΣＩ＝０ＭΔｔＩ＝ｔＩ（Δｔ０＝０、Ｍはマルチ周波数スキャンの測定回数、Ｉはマルチ周波数スキャンの測定番号）で示す経過時間迄、）迄、実施する信号印加手段、
前記細胞内で生じる測定周波数ｆｍＪの交流信号により形成される配向分極による誘電率εｍＩＪを測定する計測手段、
前記交流信号の周波数ｆｍＪと誘電率εｍＩＪを用いて、周波数−誘電率曲線の傾きＡＩＪを求めて、前記傾きＡＩＪの最大値αＩと前記αＩを示す周波数ｆＣＩを得る計算手段、
前記信号印加手段、計測手段、及び計算手段で用いた測定条件、測定した計測値、求めた計算値であるデータ群（Ｉ，Ｊ，Ｍ，Ｎ，ｔＩ，ΔｔＩ，ｆｍＪ，αＩ，ｆＣＩ，εｍＩＪ）を記録する記憶手段、
前記αＩ、周波数の逆数（ｆＣＩ）−１を項目とし、経過時間ｔＩをデータとする散布図を構成、描画する可視手段を備え、
前記散布図における前記データのマークの位置が、細胞の成長が進む場合には、前記散布図のｘｙ座標系の右側に移動し、前記細胞の大きさの同一性が高くなる場合には前記ｘｙ座標系の上方に移動するように、
前記ｘ・ｙ座標系におけるｘ軸を周波数の逆数ｆＣ−１とし、ｙ軸を「周波数−誘電率曲線」の傾きの最大値αとする「ｆＣ−１・α」座標系とすることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化方法。
【請求項７】
前記測定周波数ｆｍＪが、ｆｍＪ＝１０（ａ−ｂ＊Ｎ）（Ｎは１回のマルチ周波数スキャンにおける周波数の数）で生成されるＮ個の周波数であることを特徴とする請求項６記載の細胞培養における細胞成長状態の可視化方法。
【請求項８】
前記測定周波数ｆｍＪが、ｆｍＪ＝１０（４−０．０９５３＊Ｎ）（Ｎは１回のマルチ周波数スキャンにおける周波数の数）で生成されるＮ個の周波数であることを特徴とする請求項６記載の細胞培養における細胞成長状態の可視化方法。
【請求項９】
前記散布図における前記データの経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎の細胞成長状態が前記散布図上で見分けられるように、
前記区切り時間範囲κ毎に、前記マークの色種類（色相）が変わり、
前記区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、前記初期値におけるマークの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、前記区切り領域κ内での経過時間がΔｔ増す毎に、段階的に前記マークの色の階調が強くなることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の細胞培養における細胞成長状態の可視化方法。
【請求項１０】
前記散布図において、前記データのマークが閉じた境界線と前記境界線で囲まれた領域τを有する図形で、
前記境界線は線幅、色種類（色相）、色の階調（彩度）を属性に持ち、
前記領域τは色種類（色相）と色の階調（彩度）を属性として有し、
前記データの経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎に、前記境界線及び領域τの色種類（色相）が変わり、
前記区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、前記初期値における領域τの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、前記区切り領域κ内での経過時間がΔｔ増す毎に、段階的に前記マークの色の階調が強くなることを特徴とする請求項９に記載の細胞培養における細胞成長状態の可視化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の成長状態を測定する測定装置において、得られた計測値の可視化技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジープロセスやアッセイにおいて、細胞培養を進めるに際して、培養中の増殖に適した環境を維持管理するために、その指標として、ｐＨそして溶存酸素量を制御するためのオンライン測定機器が、広く用いられている。
一方、その測定されたｐＨや溶存酸素量が指し示す環境が、細胞の増殖に最適な環境であるかを判断するには、実際の増殖の状態を知る必要がある。
【０００３】
従来、その細胞の増殖状態を知見する方法としては、細胞のサンプリングを行って判断が成されていたが、サンプリングという外乱要因が付加されることにより、増殖中の「その瞬間」の状態を知り得なかった。そのため、細胞増殖過程へのフィードバックは時間的には遅くなり、定量性に欠けるものとなっている。
さらに、オンライン測定器を含めた細胞の増殖にかかわるプロセス機器に生じる不具合による増殖中の細胞に及ぼす影響は把握することも困難である。
【０００４】
そこで、非特許文献１、２に開示されるオンライン細胞密度モニターである細胞密度連続測定装置が開発されている。
この装置は、従来の遠赤外方式の全細胞により生じる濁度の測定と異なり、生細胞のみを検知し、生細胞膜の示す誘電率の変化を計測して生細胞の増殖による密度の変化を把握するものである。
【０００５】
この測定装置の特徴は、細胞密度の測定において２種類の機能を有し、その第一は特定範囲の細胞（以下、特定細胞と称す。この特定細胞とは一定サイズの細胞を意味する。）の密度変化を測定する機能、その第二は全細胞の変化を測定する機能である。これら二つを同時監視することによって、サンプリングによる従来法では困難であった特定細胞密度の変化の連続測定、及び細胞全体における成長状態の連続測定を行うことが可能である。
【０００６】
先ず、第一の特徴である特定細胞の密度変化の測定は、電極間に発生する特定周波数が特定の大きさの細胞膜内の陽イオン・陰イオンの移動に作用し、双極化という現象を発生させ、この現象から測定される細胞誘電率が、細胞の体積当たりの数量と比例関係を持つことから細胞密度の連続測定を行う。
【０００７】
一方、細胞全体における成長状態の連続測定は、多様なサイズの細胞を含め、その成長の傾向を見るために、細胞培地に複数の周波数による電圧もしくは電流を加え、その走査結果から得られる分散曲線（β分散：ベータ分散）における曲線の傾きが最大化する点の周波数ｆＣ、その点の傾きαが求められる。
その求めた傾きαは、細胞の存在する状態、即ち大きさの分布を表し、数値が高い程同一サイズの細胞の占める割合が多くなる傾向を示す。
また、ｆＣは最大密度を有する細胞の大きさの変化を示し、周波数が低くなるほど、細胞が大きくなる傾向を示す。
【０００８】
この細胞全体の成長状態における連続測定で、曲線の傾きが最大化する点の周波数ｆＣ、その点の傾きαの測定値は、時々刻々とそれらは変化し、その値は培地の養分の変化、温度、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）などの環境の変化が加わることで、複雑な成長を表すことになる。
そこで、このような複雑な成長過程を分析するためには、周波数ｆＣと傾きαの過去の値を知り、その値の前後の変化の方向性或いは傾向を知る必要があり、変化前後の値を即座に知る必要がある。
【０００９】
しかしながら、現状では図４に示すように、周波数ｆＣ、傾きα共に時系列的な変化を記録、表示するものとなっている。そのため、細胞の変化は頻雑で、その動きは黒矢印に示すように、その動きは帯状のグラフになってしまい、細かな動きと、その時間経過を把握できない問題を抱え、周波数ｆＣと傾きαの値の動きからの細胞状態の理解に不明瞭さを加える結果となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔ＆ＣＴｅｃｈｎｉｃａｌ、「Ｈａｍｉｌｔｏｎ社製細胞密度連続測定装置Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ」紹介カタログ、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成２８年３月１５日、［平成２８年７月２５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｃｔｅｃ．ｊｐ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｄｌ／ＰＣ  ＬａｕｎｃｈＢｏｘ  Ｃｅｌｌ  ＤＥＮＳＩＴＹ  １６０３１５．ｐｄｆ＞．
【非特許文献２】Ｔ＆ＣＴｅｃｈｎｉｃａｌ、「Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、製細胞密度連続測定装置」、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成２８年７月５日、［平成２８年７月２５日検索］、インターネット、＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｔａｃｔｅｃ.ｊｐ／ＰＣ＿ｔｙｐｅ＿Ｃｅｌｌ＿ＤＥＮＳＩＴＹ.ｈｔｍｌ＞．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、このような状況の中、本発明は細胞培養中の細胞の成長状態を測定する連続測定装置における細胞全体においての成長状態での細胞密度の連続測定で得られる測定値の可視化において、過去及び現在の測定値の全て、もしくは選択された過去、現在の測定値を、時系列変化が明確に区別でき、細胞の成長度合いや細胞サイズの同一性の確認も可能とする測定値の可視化プログラム及び可視化方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような状況に鑑み、本発明の第１の発明は、細胞培養中の細胞の成長状態を測定する連続測定装置を、前記細胞に周波数ｆ０からｆＥ間のＮ個の周波数ｆｍＪを測定周波数とする交流信号を順次与えるマルチ周波数スキャンを、培養開始から時間間隔ΔｔI（Ｉはマルチ周波数スキャン番号で、Ｉ＝０、１、２、・・・、Ｍ）毎に、ΣＭＩ＝０ΔｔＩ＝ｔＩ（Δｔ０＝０、Ｍはマルチ周波数スキャンの測定回数）で示される経過時間迄実施する信号印加手段、前記信号印加手段の実施により細胞内で生じる配向分極による誘電率を測定する計測手段、前記マルチ周波数スキャンで得られる前記交流信号の周波数と前記周波数に対応して得られた誘電率を用いて、「周波数−誘電率曲線」の傾きの最大値αと前記傾きの最大値αを示す周波数ｆＣを求める操作を、実施したＩ回のマルチ周波数スキャンに対して行い、時間間隔Δｔとマルチ周波数スキャン番号Ｉから求められる経過時間ｔＩと前記ｔＩに対応する傾きの最大値αＩと周波数ｆＣＩとからなるデータ群（αＩ、ｆＣＩ、ｔＩ）を算出する計算手段、前記信号印加手段、計測手段、及び計算手段で用いた測定条件、測定した計測値、前記測定条件及び計測値を用いて得た計算値を記録する記憶手段、前記データ群（αＩ、ｆＣＩ、ｔＩ）を用い、傾きの最大値α及び周波数ｆＣを項目とし、経過時間ｔＩをデータとする散布図を構成、描画し、前記散布図における前記データの座標位置を示すマークの位置が、細胞の成長が進む場合には、前記散布図のｘ・ｙ座標系の右側に移動し、前記細胞の大きさの同一性が高くなる場合には前記ｘ・ｙ座標系の上方に移動するように、前記ｘ・ｙ座標系におけるｘ軸を周波数の逆数ｆＣ−１とし、ｙ軸を「周波数−誘電率曲線」の傾きの最大値αとする「ｆＣ−１・α」座標系とする可視化手段として機能させるための細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラムである。
【００１３】
本発明の第２の発明は、第１の発明における測定周波数ｆｍＪが、ｆｍＪ＝１０（ａ−ｂ＊Ｎ）（Ｎは１回のマルチ周波数スキャンにおける周波数の数）で生成されるＮ個の周波数であることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラムである。
【００１４】
本発明の第３の発明は、第１の発明における測定周波数ｆｍＪが、ｆｍＪ＝１０（４−０．０９５３＊Ｎ）（Ｎは１回のマルチ周波数スキャンにおける周波数の数）で生成されるＮ個の周波数であることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラムである。
【００１５】
本発明の第４の発明は、第１〜３の発明の散布図における前記データの経過時間ｔＩの
範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎の細胞成長状態が前記散布図上で見分けられるように、前記区切り時間範囲κ毎に前記マークの色種類（色相）が変わり、前記区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、前記初期値におけるマークの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、前記区切り領域κ内での経過時間がΔｔ増す毎に、段階的に前記マークの色の階調が強くなることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラムである。
【００１６】
本発明の第５の発明は、第４の発明における散布図において、前記データのマークが閉じた境界線と前記境界線で囲まれた領域τを有する図形で、前記境界線は線幅、色種類（色相）、色の階調（彩度）を属性に持ち、前記領域τは色種類（色相）と色の階調（彩度）を属性として有し、前記データの経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎に、前記境界線及び領域τの色種類（色相）が変わり、前記区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、前記初期値における領域τの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、前記区切り領域τ内での経過時間がΔｔ増す毎に、段階的に前記マークの色の階調が強くなることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化プログラムである。
【００１７】
本発明の第６の発明は、細胞培養における細胞成長状態の可視化方法であって、前記細胞に周波数ｆ０からｆＥ間のＮ個の周波数を測定周波数ｆｍＪ（Ｊは１回のマルチ周波数スキャンにおけるスキャン番号で、Ｊ＝０、１、２、・・・、Ｎ）とする交流信号を順次加えるマルチ周波数スキャンを、培養開始から時間間隔ΔｔＩ毎にΣＩ＝０ＭΔｔＩ＝ｔＩ（Δｔ０＝０、Ｍはマルチ周波数スキャンの測定回数、Ｉはマルチ周波数スキャンの測定番号）で示す経過時間迄、）迄、実施する信号印加手段、前記細胞内で生じる測定周波数ｆｍＪの交流信号により形成される配向分極による誘電率εｍＩＪを測定する計測手段、前記交流信号の周波数ｆｍＪと誘電率εｍＩＪを用いて、周波数−誘電率曲線の傾きＡＩＪを求めて、前記傾きＡＩＪの最大値αＩと前記αＩを示す周波数ｆＣＩを得る計算手段、前記信号印加手段、計測手段、及び計算手段で用いた測定条件、測定した計測値、求めた計算値であるデータ群（Ｉ，Ｊ，Ｍ，Ｎ，ｔＩ，ΔｔＩ，ｆｍＪ，αＩ，ｆＣＩ，εｍＩＪ）を記録する記憶手段、前記αＩ、周波数の逆数（ｆＣＩ）−１を項目とし、経過時間ｔＩをデータとする散布図を構成、描画する可視手段を備え、
前記散布図における前記データのマークの位置が、細胞の成長が進む場合には、前記散布図のｘｙ座標系の右側に移動し、前記細胞の大きさの同一性が高くなる場合には前記ｘｙ座標系の上方に移動するように、前記ｘ・ｙ座標系におけるｘ軸を周波数の逆数ｆＣ−１とし、ｙ軸を「周波数−誘電率曲線」の傾きの最大値αとする「ｆＣ−１・α」座標系とすることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化方法である。
【００１８】
本発明の第７の発明は、第６の発明における測定周波数ｆｍＪが、ｆｍＪ＝１０（ａ−ｂ＊Ｎ）（Ｎは１回のマルチ周波数スキャンにおける周波数の数）で生成されるＮ個の周波数であることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化方法である。
【００１９】
本発明の第８の発明は、第６の発明における測定周波数ｆｍＪが、ｆｍＪ＝１０（４−０．０９５３＊Ｎ）（Ｎは１回のマルチ周波数スキャンにおける周波数の数）で生成されるＮ個の周波数であることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化方法である。
【００２０】
本発明の第９の発明は、第６〜８の発明の散布図における前記データの経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎の細胞成長状態が前記散布図上で見分けられるように、前記区切り時間範囲κ毎に、前記マークの色種類（色相）が変わり、前記区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、前記初期値におけるマークの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、前記区切り領域κ内での経過時間がΔｔ増す毎に、段階的に前記マークの色の階調が強くなることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化方法である。
【００２１】
本発明の第１０の発明は、第９の発明における散布図において、前記データのマークが閉じた境界線と前記境界線で囲まれた領域τを有する図形で、前記境界線は線幅、色種類（色相）、色の階調（彩度）を属性に持ち、前記領域τは色種類（色相）と色の階調（彩度）を属性として有し、前記データの経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎に、前記境界線及び領域τの色種類（色相）が変わり、前記区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、前記初期値における領域τの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、前記区切り領域κ内での経過時間がΔｔ増す毎に、段階的に前記マークの色の階調が強くなることを特徴とする細胞培養における細胞成長状態の可視化方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、細胞培養中の細胞の成長状態を測定する連続測定装置における細胞の成長状態を視覚的に把握できるように、測定値の表示に色の変化を導入することで、細胞の成長過程を明瞭に出来、細胞培養を最適化することが可能となり、また応答周波数による細胞の分傾向を把握できるため、特定細胞集団の密度測定を行う場合の測定周波数の設定を正確且つ容易にする効果を奏している。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】細胞の成長状態測定における周波数と誘電率で示される細胞の大きさとの関係を説明する図である。
【図２】マルチ周波数スキャンの概要を示し、（ａ）は１回のマルチ周波数スキャンによる結果、（ｂ）は細胞培養の時間経過に沿って行われたマルチ周波数スキャンから得られる結果を示す図である。
【図３】マルチ周波数スキャンから得られた結果を示す図である。
【図４】従来の可視化方法による測定結果を表示する図で、（ａ）は「経過時間・α」座標系、（ｂ）は「経過時間・周波数」座標系、（ｃ）は「経過時間・誘電率」座標系の図である。
【図５】本発明に係る可視化プログラムのフロー図である。
【図６】本発明に係る可視化表示の散布図例である。
【図７】本発明に係る可視化表示に使用するデータのマークを説明する図で、（ａ）は形状の説明図で、（ｂ）は属性の説明図である。
【図８−ａ】本発明の実施形態の可視化表示で、培養から２０時間４６分経過時における散布図である。
【図８−ｂ】本発明の実施形態の可視化表示で、培養から４４時間経過時における散布図である。
【図８−ｃ】本発明の実施形態の可視化表示で、培養から６８時間経過時における散布図である。
【図８−ｄ】本発明の実施形態の可視化表示で、培養から１４０時間経過時における散布図である。
【図８−ｅ】本発明の実施形態の可視化表示で、培養から１４６時間経過時における散布図である。
【図８−ｆ】本発明の実施形態の可視化表示で、［図８−ｅ］とほぼ同経過時におけるｘ軸のスケールを変えた散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
先ず、特定細胞の密度変化の測定について概略を説明する。
細胞密度を測定する際に、細胞の種類と周波数には、電極間に発生する特定周波数が特定の大きさの細胞膜内の陽イオン・陰イオンの移動に作用し、双極化という現象を発生させ、この現象から測定される細胞誘電率が、細胞の体積当たりの数量と比例関係を持つことが知られているため、その測定する細胞、被測定細胞の種類に適した測定周波数ｆｍを選択して細胞の誘電率εｍを計測する。
同時に細胞を増殖させる培地（バックグランド）が示す誘電率も把握するため、測定周波数ｆｍよりも高い周波数のバックグラウンド周波数ｆＧを用いて培地（バックグラウンド）の誘電率εＧを計測する。
ここでは、測定周波数ｆｍとバックグラウンド周波数ｆＧの２つの周波数の計測を常時行う。
【００２５】
図１の実線で示すようなβ分散を行う細胞増殖において、細胞密度の測定における測定周波数ｆｍと測定誘電率εｍ、バックグラウンド周波数ｆＧと誘電率εＧの関係を図１に合わせて示す。なお、β分散とは低い周波数で安定した誘電率が、高い周波数に行くに従い低下し、安定した誘電率へと至る領域である。
したがって、図１からも被測定細胞の誘電率εＣは、計測した細胞の測定誘電率εｍとバックグラウンドの誘電率εＧの差、「εＣ＝εｍ−εＧ」より求められる。
細胞密度は、細胞の誘電率が細胞の大きさに依存することから、測定周波数ｆｍを基準に、発生する被測定細胞の測定誘電率εｍとバックグラウンドの誘電率εＧとの誘電率差Δε（＝「εＣ＝εｍ−εＧ」）を計測し、細胞密度を計算する。
【００２６】
次に、細胞全体における成長状態の細胞密度の連続測定の概略を説明する。
先ず、細胞全体における成長状態の細胞密度を知るためには、これまでに説明してきた特定細胞密度の測定において、単一の周波数から求めた誘電率を用いて細胞密度を測定していたが、細胞全体の場合では、β分散が図２（ａ）の実線（白抜矢印）のような細胞増殖状態を採る場合、周波数ｆ０からｆE間（例えば、図２にではｆ０＝０．３ＭＨｚ、ｆＥ＝１０ＭＨｚ）において、マルチ周波数スキャンによる交流信号の印加を行い、図２（ｂ）に示すような「測定周波数ｆｍと被測定細胞の誘電率εｍ」の関係をスキャンした周波数の数分（Ｊ＝Ｎ）計測する。このように、培養時間の経過（ｔＩ：経過時間）に沿って、測定周波数を変化（ｆｍＪ：測定周波数）させ、その影響による誘電率を計測することによって、細胞の大きさ、その分布状況の把握が可能となっている。さらに、図３に示す情報が得られる。
なお、この図３に示す情報は、任意の経過時間における単一の結果である。
【００２７】
また図３は、マルチ周波数スキャンから得られた結果を示すもので、Ａは周波数−誘電率曲線の傾き、αはβ分散領域における曲線の傾きＡの最大値を表し、ｆＣは傾きＡが最大値αを採る点の周波数、ΔεＭＡＸは最大誘電率で全細胞が有する誘電率、εＧはバックグランド（培地）が示す誘電率である。
【００２８】
次に、細胞の成長状態を知るためには、細胞の培養開始からの経過時間ｔIに、周波数ｆ０からｆE間で、ｆｍＪ＝１０（ａ−ｂ＊Ｎ）（Ｎは１回の周波数スキャンにおける測定周波数の数）の周波数式に沿って得られる測定周波数ｆｍＪの交流信号を印加する上記マルチ周波数スキャンによる測定を行い、周波数ｆｍＪに対する誘電率εｍＩＪを計測し、それらの計測値からΔεＭＡＸ、ｆＣ、αを求めて経過時間ｔＩと共に記録し、１回の周波数スキャン測定により得られる組データ（ｔＩ，ΔεＭＡＸ，ｆＣ，α）として記録される。なお、測定周波数の数は、周波数ｆ０〜ｆＥ間の幅の大きさで調整されるＮにより定まる。
【００２９】
実際には、このマルチ周波数スキャンを、経過時間（ｔＩ＝０からΣＭＩ＝０ΔｔＩ、ΔｔＩ：時間間隔、Ｉはマルチ周波数スキャンの回数）に沿って行い、データ群Ｄ（Ｉ、ΔｔＩ、ｔＩ，ΔεＭＡＸＩ，ｆＣＩ，αＩ）を得る。ここで、Ｉはマルチ周波数スキャン番号を示す。また、通常測定は一定間隔（ΔｔＩ＝Δｔ）毎に行うものとし、その経過時間は、Ｉ×Δｔで示される。
即ち、測定毎に組データ（マルチ周波数スキャンの回数、時間間隔、経過時間、全細胞が有する誘電率，αが最大になる周波数、β分散領域における誘電率曲線の傾きの最大値）を記録するものである。
【００３０】
測定終了後、データ群Ｄの可視化が行われる。従来の可視化は、図４（ａ）〜（ｃ）に見られるようなｘ軸を「経過時間ｔ」とし、ｙ軸を各々「β分散領域における誘電率曲線の傾きの最大値α」、「αが最大になる周波数ｆＣ」、「全細胞が有する誘電率ΔεＭＡＸ」とするグラフによる可視化が成されている。
しかしながら、本発明では図４の可視化では細胞の成長状態を定量的に明瞭には見出せない問題を解消すべく以下に示す、細胞培養における細胞成長状態を定量的に明瞭に表示する可視化方法と、その細胞成長状態を測定する連続測定装置に細胞の成長状態を定量的に明瞭に表示する可視化プログラムを発明した。
【００３１】
以下、具体的に本発明に係る細胞培養における細胞成長状態を定量的に明瞭な可視化方法、及び、細胞成長状態を測定する連続測定装置に、その細胞成長状態を表示させる機能の可視化プログラムを説明する。
【００３２】
１．可視化プログラム
細胞成長状態の連続測定装置において、その細胞培養における細胞成長状態を表示させる機能を有する本発明に係る可視化プログラムは、連続測定装置を、信号印加手段、計測手段、計算手段、記憶手段、可視化手段で示される５つの手段として機能させるものである。そのフロー図を図５に示す。
【００３３】
２．可視化方法
本発明に係る細胞培養における細胞成長状態の可視化方法は、細胞培養において、細胞成長状態を観察、測定した結果を定量的に明瞭に、且つ時系列を考慮して表示可能な可視化方法で、信号印加手段により生じた細胞の成長に伴う変化を、計測手段により測定し、得られた計測値を、計算手段により可視化手段で利用する特性値を求め、記憶手段で計測値と共に記録すると同時に、その特性値を本発明に係る可視化手段に用いて可視化するものである。
【００３４】
以下に、可視化プログラム及び可視化方法の各手段を説明する。
なお、信号印加手段、及び計測手段の概要は、上記段落［００２６］〜［００２８］に記載しているが、さらに詳細に説明する。
【００３５】
［信号印加手段］
細胞に周波数を、測定周波数式「ｆｍＪ＝１０（ａ−ｂ＊Ｎ）、ａ、ｂは係数、Ｎは測定周波数の数」で求めた測定周波数の交流信号を与えるマルチ周波数スキャンを、培養開始から時間間隔ΔｔＩ（Ｉは培養開始からのマルチ周波数スキャン番号で、Ｉ＝０、１、２、・・・Ｍ）毎に、ｔｆ＝ΣＭＩ＝０ΔｔＩ（Δｔ０＝０）で示される経過時間迄、実施するものである。
実際には、細胞に測定周波数ｆｍＪ＝ｆ０からｆＥまで、測定周波数式「ｆｍＪ＝１０（ａ−ｂ＊Ｎ）、ａ＝４、ｂ＝０．０９５３、Ｎ＝０〜１６までの１７段階」で求めた測定周波数の交流信号を加えるマルチ周波数スキャンを、培養開始から時間間隔ΔｔＩ毎に、経過時間ｔＩ＝ΣＭＩ＝０ΔｔＩ（Δｔ０＝０）迄、実施する。
【００３６】
［計測手段］
信号印加手段の実施により細胞内で生じる配向分極による誘電率を測定するもので、実際には、細胞内で生じる周波数ｆｍＪの交流信号により形成される配向分極による誘電率εｍＩＪを測定する。
【００３７】
［計算手段］
マルチ周波数スキャンで得られる交流信号の測定周波数ｆｍＪと、その周波数に対応して得られた誘電率εｍＩＪを用いて、「周波数−誘電率曲線」の傾きの最大値αと、その傾きの最大値αを示す周波数ｆＣを求める操作を、実施したＩ回のマルチ周波数スキャンに対して行う。
この計算手段で、Ｉ個の傾きの最大値αＩと周波数ｆＣＩと、時間間隔ΔｔＩとマルチ周波数スキャン番号Ｉから求められる経過時間ｔＩからなるデータ群（αＩ、ｆＣＩ、ｔＩ）を算出される。
具体的には、交流信号の周波数ｆｍＪと誘電率εｍＩＪを用いて、周波数−誘電率曲線の傾きＡＩを求めて、その傾きＡＩの最大値αＩと、そのαＩを示す周波数ｆＣＩを得るものである。
【００３８】
［記憶手段」
これまでの信号印加手段、計測手段、及び計算手段で用いた測定条件、測定した計測値、前記測定条件及び計測値を用いて得た計算値を記録するもので、測定、計算の流れに沿って、適宜記録された値の入出が行われる。
【００３９】
［可視化手段］
本発明において特徴を成し、計算手段で得られたデータ群（αＩ、ｆＣＩ、ｔＩ）を用い、傾きの最大値α及び周波数ｆＣを項目とし、経過時間ｔＩをデータとする散布図を構成、描画するものである。
この散布図におけるデータのマーク位置は、細胞の成長が進んでいる場合、成長初期のデータは、散布図の「ｘ・ｙ」座標系の右側に移動し、その隣り合う左側に時間が経過しているデータマークが表示され、データ細胞の大きさの同一性が高くなる場合には「ｘ・ｙ」座標系の上方に移動するように、「ｘ・ｙ」座標系におけるｘ軸を「周波数の逆数ｆＣ−１」とし、ｙ軸を「周波数−誘電率曲線」の「傾きの最大値α」とする「ｆＣ−１・α」座標系とするもので、以下にさらに詳細に説明する。
【００４０】
［本発明に係る可視化方法の詳細］
本発明に係る可視化方法の基本形は、ｘ軸をαが最大になる周波数ｆＣの逆数「ｆＣ−１」とし、ｙ軸をβ分散領域における誘電率曲線の傾きの最大値「α」とする「ｆＣ−１・α」座標系散布図で表すものである。
このようにｘ軸、ｙ軸を採用した「ｆＣ−１・α座標系」とすることで、マルチ周波数スキャン測定による測定値は、図６に示すように細胞の成長が進むにつれ、新しい測定値は過去の測定値の左側に表示される。即ち測定値はグラフの右側方向（ｘ軸＋方向、白抜き矢印方向）に移動していき、細胞のサイズの同一性が高くなるにつれ、グラフの上方（ｙ軸＋方向、黒塗り矢印方向）に移動していくように表示されることになる。
【００４１】
散布図のｘ・ｙ座標の点上で表されるデータの値は、経過時間を示すものとなる。
そこで、経過時間は時系列な数値データであるために、判断のし易さを考慮して経過時間により色の階調が表現可能に変化する記号表記（例えば、丸印「○」等）とし、経過時間ｔ＝０の時の階調を０％（「○」：白抜き丸又は透明丸）に設定し、経過時間に比例して段階的に強くなっていくように設定する。さらに、例えば経過時間の区切り時間範囲が２４時間、即ち１日終了直前の測定では階調が１００％（「●」：塗りつぶし丸）が設定され、１日ごとに、色を変える「色分け」を導入するとさらに可視化を容易にする。なお、経過時間の区切り時間範囲は、１日に限らず適宜設定できる。
【００４２】
図６は、細胞培養における７日間の細胞成長状態を、区切り時間範囲を１日として可視化したもので、上記カラー表示をすることで上記効果が明瞭に得られる。即ち、可視化当日の「実線範囲ｄ０」、１日前の「破線範囲ｄ１」、２〜４日前の「１点鎖線範囲ｄ２からｄ４」、５日前の「破線範囲ｄ５」、６日前の「実線範囲ｄ６」の評価結果を示され、細胞成長状態の様子が時系列的に把握可能となっている。
【００４３】
さらに、図７（ａ）に示すように、このデータのマーク１は、閉じた境界線Ｌと、その境界線Ｌで囲まれた領域τを有する図形で、その境界線Ｌは線幅、色種類（色相）、色の階調（彩度）を属性に持ち、領域τは色種類（色相）と色の階調（彩度）を属性として有している。
また、このマーク１は、図７（ｂ）に示すように、その経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲κ毎に、前記境界線及び領域τの色種類（色相）が変わり、区切り時間範囲κ内における経過時間ｔＩの最小経過時間を初期値とし、その初期値における領域τの色の階調（彩度）を０％の白色又は透明とし、区切り領域κ内でのマルチ周波数スキャン回数が増す毎に、段階的にマークの色の階調が強くなる特徴も有している。
【００４４】
図８に、その実施形態を示す。
図８−ａにおいては、培養から２０時間４６分経過時、図８−ｂにおいては培養から４４時間経過時、図８−ｃにおいては培養から６８時間経過時、図８−ｄにおいては培養から１４０時間経過時、図８−ｅにおいては培養から１４６時間経過時の細胞の成長状態を示している。
図８の各図から、培養開始前の初期状態の細胞状態（図８−ａ）の実線範囲ｄ１で囲まれた群（培養開始時））が、時間の経過と共に、経過時間に依存していると見られる特定の周波数範囲内に細胞の成長状態が集約されて大きさの同一性も進んでいることが判る。
【００４５】
即ち、図８−ａでは、「範囲ｄ１→ｄ０」、図８−ｂでは、「ｄ２→ｄ１→ｄ０」、図８−ｃでは「ｄ２→ｄ１→ｄ０」、図８−ｄでは「ｄ５→ｄ４→（ｄ１〜ｄ３）→ｄ０」、図８−ｅ、図８−ｆでは「ｄ６→ｄ５→（ｄ２〜ｄ４）→ｄ１→ｄ０」で示す方向に細胞成長が進行、集約され、広がりを持った分布が特定周波数範囲内で大きさの同一性を有する周波数に対して先鋭化された分布状態を示していることが判る。
また、経過時間が長くなるにつれ、細胞の成長状態が集約される周波数が高い周波数側、グラフでは左側に移動していく様子が、各図から見て取れる。同時にグラフの上方に向かっていくことから細胞の大きさの同一性が上がってきていることも判る。
【００４６】
さらに、明瞭に分析するために、ｘ軸の「ｆＣ−１」のスケールを変更した図を、図８−ｆに示す。図８−ｆは図８−ｅと同等の経過時間時の測定値をプロットしたものである。
細胞の成長状態の傾向は、図８−ｅと図８−ｆでは変わらず同じであるが、より詳細なデータ（α、ｆＣ）を得られることが示されている。
【符号の説明】
【００４７】
１    データのマーク
Ｌ    マークの境界線
τ    マークの閉じた境界線が作る領域
Ａ、ＡＩＪ    周波数−誘電率曲線の傾き
α、αＩ    周波数−誘電率曲線の傾きの最大値
ｆＣ、ｆＣＩ  傾きの最大値αを示す周波数
ｔＩ    細胞培養開始からの経過時間
κ    経過時間ｔＩの範囲内において設定される区切り時間範囲
ｆｍＪ  マルチ周波数スキャンの交流信号の測定周波数
εｍＩＪ  マルチ周波数スキャンの測定誘電率
εｍ    測定誘電率
εＧ    培地（バックグラウンド）の誘電率
εＣ    被測定細胞の誘電率：εｍ
ΔεＭＡＸ  最大誘電率
ΔｔＩ  マルチ周波数スキャン測定の時間間隔
Δｆ    周波数間隔
Ｉ    培養開始からのマルチ周波数スキャン番号（Ｉ＝０、１、２、・・・Ｍ）
Ｍ    培養開始から測定終了までのマルチ周波数スキャンの回数
Ｊ    １回のマルチ周波数スキャンにおけるスキャン番号（Ｊ＝１、２、・・・Ｎ）
Ｎ    １回のマルチ周波数スキャンにおける測定周波数の数
【図１】
2018042506.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−ａ】
2018042506.tif 000010
【図８−ｂ】
2018042506.tif 000011
【図８−ｃ】
2018042506.tif 000012
【図８−ｄ】
2018042506.tif 000013
【図８−ｅ】
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【図８−ｆ】
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