(57)【要約】      （修正有）【課題】一つ又は複数の抗原の発現を上方制御することができる放射免疫結合体。【解決手段】上方制御される該抗原は、該放射免疫結合体によって標的とされる抗原、又は同じ細胞上に発現している異なる抗原であることができる。又、該発現が増強された抗原を用いることによって、癌ならびに免疫系の疾患及び障害を処置する方法。【選択図】図６
2018150323.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
- モノクローナル抗体、
- 任意のリンカー、
- 放射性核種
を含む、一つまたは複数の抗原に関する抗原発現の上方制御における使用のための放射免疫結合体。
【請求項２】
一つまたは複数の上方制御される前記抗原が、B細胞癌細胞の表面上に発現している、請求項1に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項３】
前記上方制御が、癌を患っている患者において免疫療法または免疫結合体療法の前に行われる、請求項1または2に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項４】
前記患者が、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病からなる群より選択されるB細胞悪性腫瘍を患っている、請求項3に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項５】
放射標識モノクローナル抗体がHH1である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項６】
前記リンカーが、p-SCN-bn-DOTA、DOTA-NHS-エステル、p-SCN-Bn-DTPA、およびCHX-A"-DTPAからなる群より選択されるキレートリンカーである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項７】
前記放射性核種が、47Sc、67Cu、90Y、105Rh、117mSn、131I、149Tb、153Sm、161Tb、165Dy、177Lu、186Re、188Re、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、224Ra、225Ac、および227Thからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項８】
上方制御される前記抗原が、CD37、CD19、CD20、CD21、CD22、HLA-DR、CD23、CD39、CD52、CDw75、およびCD80からなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項９】
上方制御される前記抗原がCD37である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項１０】
上方制御される前記抗原がCD20である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項１１】
上方制御される前記抗原がCD22である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項１２】
薬学的組成物として製剤化される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項１３】
前記薬学的組成物が、一つまたは複数の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項１４】
前記使用が、放射免疫結合体の後に、抗体療法、免疫結合体療法、またはそれらの組み合わせを用いる同時処置または後処置が続く併用療法のためである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項１５】
上方制御される前記抗原がCD20であり、かつ、該上方制御の後に、単回投与におけるまたは繰り返し投与パターンにおけるリツキシマブを用いる抗CD20抗体療法が続く、請求項1〜14のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項１６】
前記同時処置または前記後処置が、前記放射免疫結合体とは異なる抗原を標的とする、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用のための放射免疫結合体。
【請求項１７】
上方制御される抗原発現が有利であると考えられる人への放射免疫結合体の投与を含む、抗原発現を上方制御する方法。
【請求項１８】
前記人が、B細胞悪性腫瘍または免疫系の疾患もしくは障害を患っている、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記放射免疫結合体の後に、抗体療法、免疫結合体療法、またはそれらの組み合わせを用いる同時処置または後処置が続く併用療法である、請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
リツキシマブ、オビヌツズマブ、または同様のCD20抗体がその後に続く、B細胞悪性腫瘍の処置における使用のための177Lu標識HH1抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、一つまたは複数の抗原の発現を上方制御することができる放射免疫結合体に関する。上方制御される抗原は、放射免疫結合体によって標的とされる抗原、または同じ細胞上に発現している異なる抗原であることができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
モノクローナル抗体療法（MAT）の使用は、非常に興味深い領域であり、大きな研究努力がなされてきている。有効であるために、MATは、抗原が結合することができる細胞1個につき、応答の誘発に十分な数の抗原に、依存する（Sugimoto et al., 2009、Czuczman et al., 2008）。
【０００３】
放射免疫療法（RIT）の使用は、癌治療における治療上の選択肢として認可されている（Stevens et al., 2012）。今日、放射免疫療法は、主に、化学療法および／またはMATから再発を経験した患者において用いられる（Stevens et al., 2012）。
【０００４】
高線量率の外部ビーム照射が、B細胞におけるCD20の増加を引き起こし得ること、およびこの応答が、アスコルビン酸、PEG-カタラーゼなどのような抗酸化物質によって阻害され、H2O2およびブチオニンスルフォキシミンのような酸化剤によって増強されたことが、文献から公知である（Kunala et al., 2001；Gupta et al., 2008）。効果は、外部ビーム曝露後の約48時間のみ続いたことが、注目に値する。
【０００５】
しかしながら、低線量率の放射免疫療法が抗原発現を上方制御することができるか否かは、知られていなかった。実際に、Elgstrom et al, (2012)は、実験的放射免疫療法後に抗原発現の低減を見出した。
【０００６】
また、モノクローナル抗体療法は、腫瘍細胞上の抗原の発現の低減を引き起こし得（Musto et al., 2011）、化学療法と組み合わせた抗体も同様である（Hiraga et al., 2009）。
【０００７】
このように、外部ビームの高線量率照射は、抗原発現の増大を引き起こし得ること、ならびに、放射免疫療法およびモノクローナル抗体療法は、癌細胞において抗原発現の低減を引き起こし得ることが、当分野において公知である。
【０００８】
現在の標準は、低減処置としての放射免疫療法の施与であり、例えばリツキシマブ（抗体）が、Zevalin（放射免疫結合体）の前の調整処置として与えられる。
【０００９】
このアプローチに伴う問題は、実験的作業および臨床データによって、低い抗原発現を有し処置抵抗性になる細胞に対する選択圧となる抗原ドリフトを抗体療法が引き起こし得ると示されていることである（Musto and D'Auria, 2011）。これはまた、実験的RITにおいても示されている（Elgstrom et al, 2012）。
【００１０】
従って、反対のことを引き起こすこと、すなわち、処置細胞上の抗原の増加を引き起こすことができる標的化された治療上の選択肢は、非常に価値のある治療手段であると考えられる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、一つまたは複数の抗原の発現を上方制御することができる放射免疫結合体に関する。上方制御される抗原は、放射免疫結合体によって標的とされる抗原、同じ細胞上に発現している異なる抗原、または組み合わせであることができる。
【００１２】
この発現によって癌細胞および免疫系の細胞の標的化および特異的阻害が可能になる。
【００１３】
従って、本発明の一つの局面は、モノクローナル抗体、任意のリンカー、および放射性核種を含む、一つまたは複数の抗原に関する抗原発現の上方制御における使用のための放射免疫結合体に関する。
【００１４】
本発明の一つの態様において、一つまたは複数の上方制御される抗原は、B細胞癌細胞の表面上に発現している。
【００１５】
本発明の別の態様において、上方制御は、癌を患っている患者において免疫療法または免疫結合体療法の前に行われる。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、患者は、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病からなる群より選択されるB細胞悪性腫瘍を患っている。
【００１７】
本発明のまた別の態様において、放射標識モノクローナル抗体はHH1である。
【００１８】
本発明の一つの態様において、リンカーは、p-SCN-bn-DOTA、DOTA-NHS-エステル、p-SCN-Bn-DTPA、およびCHX-A"-DTPAからなる群より選択されるキレートリンカーである。
【００１９】
本発明の別の態様において、放射性核種は、47Sc、67Cu、90Y、105Rh、117mSn、131I、149Tb、153Sm、161Tb、165Dy、177Lu、186Re、188Re、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、224Ra、225Ac、および227Thからなる群より選択される。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、上方制御される抗原は、CD37、CD19、CD20、CD21、CD22、HLA-DR、CD23、CD39、CD52、CDw75、およびCD80からなる群より選択される。
【００２１】
本発明のまた別の態様において、放射免疫結合体は薬学的組成物として製剤化される。
【００２２】
本発明の別の態様において、薬学的組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様において、使用は、放射免疫結合体の後に、抗体療法、免疫結合体療法、またはそれらの組み合わせを用いる同時処置または後処置が続く併用療法のためである。
【００２４】
本発明の別の態様において、上方制御される抗原はCD20であり、かつ、上方制御の後に、単回投与におけるまたは繰り返し投与パターンにおけるリツキシマブを用いる抗CD20抗体療法が続く。
【００２５】
本発明のまた別の態様において、同時処置または後処置は、放射免疫結合体とは異なる抗原を標的としている。
【００２６】
本発明の別の局面は、上方制御される抗原発現が有利であると考えられる人への放射免疫結合体の投与を含む、抗原発現を上方制御する方法に関する。
【００２７】
本発明の一つの態様において、人は、B細胞悪性腫瘍を患っている。
【００２８】
本発明の別の態様において、使用は、放射免疫結合体の後に、抗体療法、免疫結合体療法、またはそれらの組み合わせを用いる同時処置または後処置が続く併用療法である。
【００２９】
別の態様において、放射免疫療法および免疫療法または免疫結合体療法は、数サイクル繰り返される。
【００３０】
別の態様において、放射免疫療法は、単独で腫瘍において低い細胞殺傷効果を有するが、有意な抗原上方制御を有する低線量として与えられる。
[本発明1001]
- モノクローナル抗体、
- 任意のリンカー、
- 放射性核種
を含む、一つまたは複数の抗原に関する抗原発現の上方制御における使用のための放射免疫結合体。
[本発明1002]
一つまたは複数の上方制御される前記抗原が、B細胞癌細胞の表面上に発現している、本発明1001の使用のための放射免疫結合体。
[本発明1003]
前記上方制御が、癌を患っている患者において免疫療法または免疫結合体療法の前に行われる、本発明1001または1002の使用のための放射免疫結合体。
[本発明1004]
前記患者が、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病からなる群より選択されるB細胞悪性腫瘍を患っている、本発明1003の使用のための放射免疫結合体。
[本発明1005]
放射標識モノクローナル抗体がHH1である、本発明1001〜1004のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1006]
前記リンカーが、p-SCN-bn-DOTA、DOTA-NHS-エステル、p-SCN-Bn-DTPA、およびCHX-A"-DTPAからなる群より選択されるキレートリンカーである、本発明1001〜1005のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1007]
前記放射性核種が、47Sc、67Cu、90Y、105Rh、117mSn、131I、149Tb、153Sm、161Tb、165Dy、177Lu、186Re、188Re、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、224Ra、225Ac、および227Thからなる群より選択される、本発明1001〜1006のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1008]
上方制御される前記抗原が、CD37、CD19、CD20、CD21、CD22、HLA-DR、CD23、CD39、CD52、CDw75、およびCD80からなる群より選択される、本発明1001〜1007のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1009]
上方制御される前記抗原がCD37である、本発明1001〜1008のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1010]
上方制御される前記抗原がCD20である、本発明1001〜1009のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1011]
上方制御される前記抗原がCD22である、本発明1001〜1010のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1012]
薬学的組成物として製剤化される、本発明1001〜1011のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1013]
前記薬学的組成物が、一つまたは複数の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む、本発明1001〜1012のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1014]
前記使用が、放射免疫結合体の後に、抗体療法、免疫結合体療法、またはそれらの組み合わせを用いる同時処置または後処置が続く併用療法のためである、本発明1001〜1013のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1015]
上方制御される前記抗原がCD20であり、かつ、該上方制御の後に、単回投与におけるまたは繰り返し投与パターンにおけるリツキシマブを用いる抗CD20抗体療法が続く、本発明1001〜1014のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1016]
前記同時処置または前記後処置が、前記放射免疫結合体とは異なる抗原を標的とする、本発明1001〜1015のいずれかの使用のための放射免疫結合体。
[本発明1017]
上方制御される抗原発現が有利であると考えられる人への放射免疫結合体の投与を含む、抗原発現を上方制御する方法。
[本発明1018]
前記人が、B細胞悪性腫瘍または免疫系の疾患もしくは障害を患っている、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記放射免疫結合体の後に、抗体療法、免疫結合体療法、またはそれらの組み合わせを用いる同時処置または後処置が続く併用療法である、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
リツキシマブ、オビヌツズマブ、または同様のCD20抗体がその後に続く、B細胞悪性腫瘍の処置における使用のための177Lu標識HH1抗体。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】フローサイトメトリーによって測定した際の、Betalutinとの24時間インキュベーション後（Betalutinの除去後に新鮮培地を添加してt＝0）の、Daudi細胞についてのCD20およびCD37発現の増大を示す。
【図２】フローサイトメトリーによって測定した際の、177Lu-テツロマブ（tetulomab）（Betalutin）と1時間および24時間インキュベーションしたDaudi細胞についての、CD37およびCD20の上方制御を示す。
【図３】（表1）フローサイトメトリーによって測定した際の、177Lu-テツロマブ（Betalutin）との1時間のインキュベーション後の抗原発現増大を示す。
【図４】（表2）フローサイトメトリーによって測定した際の、177Lu-リツキシマブ（Betalutin）で処置した細胞についてのCD20およびCD37の上方制御を示す。
【図５】（表3）細胞結合アッセイ法によって測定した際の、Betalutinまたは対照を添加した4日／8日／11日／15日後の放射免疫療法対対照の、腫瘍細胞に対する125I-リツキシマブの結合の増大％を示す。
【図６】125I-リツキシマブの注射の3日後の、125I-リツキシマブの生体内分布を示す。マウスには、5日前に、350 MBq/kgのBetalutin（処置）またはコールドHH1（対照）のいずれかを注射していた。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明をここでより詳細に以下に説明する。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明者らは、B細胞関連抗原CD37に対する、低線量率のβ放射する177Lu標識HH1抗体（177Lu-テツロマブまたはBetalutinとも命名されている）を用いる実験を行った際に、これで処置した細胞が、CD37と、別のB細胞関連抗原であるCD20の両方の発現を上方制御することを、驚いたことに見出した。
【００３４】
従って、177Lu-HH1を用いる治療は、癌および自己免疫疾患のようなB細胞疾患においてMATのための条件を改善する可能性があることが示されている。
【００３５】
CD37抗原陽性細胞に対する177Lu-HH-1を用いた低線量率放射免疫療法が、癌細胞における抗原発現の増大を引き起こしただけでなく、外部ビーム曝露についての発表されているデータと比較して延長された効果も引き起こしたこともまた、予想外の知見であった。
【００３６】
放射免疫療法処置は、CD37抗原およびCD20抗原の両方の発現の増大を引き起こした。抗体療法は抗原の良好な発現に大きく依存するため、これは、例えば、177Lu-HH-1を用いる放射免疫療法を、抗体療法への誘導処置として使用できることを意味すると考えられる。
【００３７】
別の注目に値する知見は、上方制御される抗原発現が、外部ビーム曝露後には約2日間しか続かないのに対して、放射免疫療法への曝露後には1〜2週間続き得ることであった。
【００３８】
標的化抗体療法を用いる新規の方法、すなわち、増大した抗原発現を活用するための、その後の数日および数週間に抗体または抗体結合体療法が続く放射免疫療法による誘導療法を、構想することができる。
【００３９】
従って、本発明は、一つまたは複数の抗原の発現を上方制御することができる放射免疫結合体に関する。上方制御される抗原は、放射免疫結合体によって標的とされる抗原、同じ細胞上に発現している異なる抗原、または組み合わせであることができる。
【００４０】
この発現によって癌細胞および免疫系の細胞の標的化および特異的阻害が可能になる。
【００４１】
放射免疫結合体の使用
従って、本発明の一つの局面は、モノクローナル抗体、任意のリンカー、および放射性核種を含む、一つまたは複数の抗原に関する抗原発現の上方制御における使用のための放射免疫結合体に関する。
【００４２】
本発明の一つの態様において、一つまたは複数の上方制御される抗原は、B細胞癌細胞の表面上に発現している。
【００４３】
本発明の別の態様において、本発明の放射免疫結合体は、免疫系の細胞を下方制御することになる。
【００４４】
そのような免疫系の細胞は、例えば自己免疫疾患において罹患していてもよい。
【００４５】
本発明の別の態様において、上方制御は、癌または疾患を患っている患者において免疫療法または免疫結合体療法の前に行われる。
【００４６】
本発明のさらなる態様において、患者は、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ球性白血病からなる群より選択されるB細胞悪性腫瘍を患っている。
【００４７】
本発明の一つの態様において、患者は、非ホジキンリンパ腫であるB細胞悪性腫瘍を患っている。
【００４８】
本発明の一つの態様において、患者は、急性リンパ芽球性白血病であるB細胞悪性腫瘍を患っている。
【００４９】
本発明の一つの態様において、患者は、慢性リンパ球性白血病であるB細胞悪性腫瘍を患っている。
【００５０】
別の態様において、放射免疫療法は、単独で腫瘍に対して低い細胞殺傷効果を有するが、有意な抗原上方制御を有する低線量として与えられる。
【００５１】
本文脈において、上方制御されるという用語は、タンパク質レベルまたはmRNAレベルでの抗原の有意により高い発現として定義される。
【００５２】
本発明は、驚くべきことに、177Lu-標識HH1抗体を用いたB細胞悪性腫瘍の前処置が、リツキシマブの標的であるCD20を上方制御できることを、示している。
【００５３】
従って、本発明の一つの局面は、リツキシマブがその後に続く177Lu-標識HH1抗体を用いたB細胞悪性腫瘍の併用処置の使用に関する。
【００５４】
本発明の好ましい態様は、リツキシマブがその後に続く、B細胞悪性腫瘍の処置における使用のための177Lu-標識HH1抗体に関する。
【００５５】
177Lu-標識HH1抗体の投与とリツキシマブの投与との間のこのウィンドウは、CD20に対して最大の上方制御を生じるように最適化することができる。ウィンドウは、典型的に、少なくとも1日、3〜5日、または3〜10日である。
【００５６】
ウィンドウはまた、放射免疫療法を施与後の0〜30日、より好ましくは3〜15日であってもよい。長時間循環する抗体の場合には、抗原の上方制御が起こる時に抗体が血液中に実質的な濃度で存在する限り、同時処置または前処置でさえ考えられてもよい。
【００５７】
CD37または血液癌と関連する他の抗原に対する他の放射標識抗体、例えば、イブリツモマブ、トシツモマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、およびオクレリズマブを含む放射標識抗CD20抗体、または、ブリナツモマブおよびエプラツズマブを含む放射標識CD19、CD21、CD22、HLA-DR、CD23、CD39、CD52、CDw75、またはCD80抗体を用いる放射免疫療法の使用は、本発明の範囲内である。
【００５８】
使用される放射性核種の例は、47Sc、67Cu、90Y、105Rh、117mSn、131I、149Tb、153Sm、161Tb、165Dy、177Lu、186Re、188Re、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、224Ra、225Ac、および227Thであり、キレートリンカーで抗体に、または、求電子反応もしくは求核反応によってタンパク質中の基と結合させることができる。
【００５９】
放射免疫結合体
放射免疫結合体は、関心対象の抗原に結合することができるか、または標的とすることができる任意のものであり得る。
【００６０】
放射免疫結合体は、Zevalin、Bexxar、およびBetalutinを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
本文脈において、Betalutinはまた、177Lu-HH1、177Lu-HH-1、177Lu-テツロマブ、または177Lu-テトラキセタン-テツロマブとも呼ばれる。
【００６２】
本発明の別の態様において、一つまたは複数の抗体または放射免疫結合体は、CD20を標的とすることになる。
【００６３】
抗体は、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Reditux、およびイブリツモマブを含むが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明の別の態様において、一つまたは複数の抗体または放射免疫結合体は、CD37を標的とすることになる。
【００６５】
本発明の好ましい態様において、CD37放射免疫結合体はBetalutinである。
【００６６】
抗体
本発明の抗体は、下記に議論されている抗原のいずれかを標的とすることができる任意のモノクローナル抗体であり得る。
【００６７】
抗体は、リツキシマブ、エプラツズマブ、L19、F8、F16、ガリキシマブ、トラリズマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Reditux、イブリツモマブ、K7153A、37.1、およびHH1を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明の一つの態様において、モノクローナル抗体はHH1（すなわち、テツロマブ）である。
【００６９】
本発明の一つの態様において、モノクローナル抗体はリツキシマブである。
【００７０】
HH1の具体的なバリアントは、参照により本明細書に組み入れられるPCT/IB2012/057230およびPCT/EP2011/051231に開示され、本発明に含まれる具体的な態様として開示される。
【００７１】
従って、上述の開示に基づいて、本発明の放射免疫結合体に含まれるHH1のバリアントを調整することが可能であると考えられる。
【００７２】
そのようなバリアントは、キメラバリアント、またはHH1の鎖とある特定の配列同一性を有するバリアントを含む。
【００７３】
本発明の好ましい態様において、バリアントは、キメラHH1またはヒト化HH1である。
【００７４】
本発明の別の態様において、HH1のキメラバリアントは、キメラHH1アイソタイプIgG1であるchHH1.1、またはR435H変異を有するキメラHH1アイソタイプIgG3であるchHH1.3Hである。
【００７５】
本発明の別の態様において、モノクローナル抗体はリツキシマブである。
【００７６】
リンカー
放射性核種は、任意のリンカーによって抗体に付加されてもよい。
【００７７】
例えば、ヨウ素を有する放射免疫結合体は、リンカーを必要としない。これは、125I-HH1がリンカーを含む必要がないことを意味する。
【００７８】
放射性核種は、最初に二官能性キレート剤、例えば、p-SCN-bn-DOTA（Macrocyclics, Tx, USA）を抗体と反応させ、それに続く、結合していないキレート剤を除去するための精製、およびその次の、キレート剤抗体結合体の放射性核種との反応、それに続く、いかなる結合していない放射性核種も除去するための精製によって、抗体に付加されてもよい。
【００７９】
あるいは、キレート剤および放射性核種を、最初に組み合わせ、その後、抗体に結合させることができる。
【００８０】
例えば、p-SCN-bn-DOTAのようなキレートリンカーを、177Luについて記載したものと同様の様式において、他の金属放射性核種をHH1に結合させるために用いることができる。
【００８１】
タンパク質またはペプチドへの直接的または間接的な結合を可能にする、十分な錯化能および官能基を有する任意のタイプのリンカーを、用いることができる。そのようなリンカーの例は、文献（例えば、Brechbiel, 2008；Liu, 2008）に記載されている。いくつかの有用な例は、p-SCN-bn-DOTA、DOTA-NHS-エステルのような二官能性環状キレート剤；p-SCN-Bn-DTPAおよびCHX-A"-DTPAのような二官能性直鎖状キレート剤である。
【００８２】
本発明における放射性核種は、好ましくは、二官能性キレート剤を用いることによって標的分子に結合されることになる。
【００８３】
これらは、環状、直鎖状、または分岐状キレート剤であり得る。バックボーンの窒素に付加された酸性（例えば、カルボキシアルキル）基を有する直鎖状、環状、または分岐状のポリアザアルカンバックボーンを含むポリアミノポリ酸キレート剤に、特定の言及がなされ得る。
【００８４】
適したキレート剤の例は、p-イソチオシアナトベンジル-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸（p-SCN-Bz-DOTA）などのDOTA誘導体、およびp-イソチオシアナトベンジル-ジエチレントリアミンペンタ酢酸（p-SCN-Bz-DTPA）などのDTPA誘導体を含み、最初のものは環状キレート剤、後者は直鎖状キレート剤である。
【００８５】
錯化部分の金属化は、錯化部分の標的部分への結合の前または後に行われてもよい。
【００８６】
放射標識手法は、概して、放射標識を行う前にキレート剤を抗体に結合させると、用いられる時間などの観点においてより便利であると考えられる。
【００８７】
抗体に付加されたキレート剤を用いて放射標識結合体を調製する原理は、例えば、Liu, 2008により広く記載されている。
【００８８】
従って、HH1を、放射特性および有効半減期における違いを有する放射免疫結合体を調製するために用いることができる。
【００８９】
従って、本発明の一つの態様において、リンカーは、p-SCN-bn-DOTA、DOTA-NHS-エステル、p-SCN-Bn-DTPA、およびCHX-A"-DTPAからなる群より選択されるキレートリンカーである。
【００９０】
金属特性を有するβ放射および／またはα放射の放射性核種は、Bn-TCMC、DOTA、Bn-DOTA、Bn-NOTA、Bn-オキソ-DO3A、DTPA、CHX-A-DTPA、Bn-DTPA、Bn-PCTA、ならびにカリックスアレーン、クリプタート、およびクリプタンドなどの類由来の分子によって例証される以下由来であるがこれらに限定されない、二官能性キレートリンカーに対する錯化を可能にする。
【００９１】
従って、リンカーは、二官能性キレートリンカーであってもよい。
【００９２】
本発明の一つの態様において、リンカーはキレートリンカーである。
【００９３】
放射性核種
上述のように、異なる放射特性および有効半減期を有する放射免疫結合体を構築することが可能である。
【００９４】
そのような放射免疫結合体を構築する固有の部分は、放射性核種の選択である。
【００９５】
本発明の好ましい態様において、放射性核種は金属性放射性核種である。
【００９６】
本発明のさらなる態様において、放射性核種はα放射体である。
【００９７】
α放射体は、212Bi、213Bi、225Ac、227Thからなる群より選択されてもよい。
【００９８】
本発明のさらなる態様において、放射性核種はβ放射体である。
【００９９】
β放射体は、90Y、153Sm、161Tb、177Luからなる群より選択されてもよい。
【０１００】
本発明の別の態様において、放射性核種は、47Sc、67Cu、90Y、105Rh、117mSn、131I、149Tb、153Sm、161Tb、165Dy、177Lu、186Re、188Re、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、224Ra、225Ac、および227Thからなる群より選択される。
【０１０１】
本発明のまた別の態様において、放射性核種の半減期は24時間より短く、放射性核種は、211At、212Pb、212Bi、213Biからなる群より選択される。
【０１０２】
本発明の別の態様において、放射性核種の半減期は24時間より長く、放射性核種は、47Sc、67Cu、90Y、105Rh、117mSn、131I、149Tb、153Sm、161Tb、165Dy、177Lu、186Re、188Re、223Ra、224Ra、225Ac、および227Thからなる群より選択される。
【０１０３】
抗原
本発明の抗原は、本発明の放射免疫結合体によって上方制御され得る抗原である。
【０１０４】
この上方制御はまた、抗原の発現の増大または誘導としても見ることができる。上方制御または増大は、ウェスタンブロッティングおよびFACSを含む当業者により公知である従来の技術によって測定することができる。
【０１０５】
上方制御されるのは単一の抗原であってもよいが、いくつかであることもできる。
【０１０６】
例えば、本発明の放射免疫結合体によって、CD20およびCD37の両方を上方制御することが可能である。
【０１０７】
従って、本発明の一つの態様において、上方制御される抗原は、CD37、CD19、CD20、CD21、CD22、HLA-DR、CD23、CD39、CD52、CDw75、およびCD80からなる群より選択される。
【０１０８】
本発明のさらなる態様において、上方制御される抗原はCD37である。
【０１０９】
本発明のまたさらなる態様において、上方制御される抗原はCD20である。
【０１１０】
本発明の別の態様において、上方制御される抗原はCD22である。
【０１１１】
放射免疫療法によって上方制御されるかまたは潜在的に上方制御され得るB細胞抗原は、CD19、CD20、CD22、CD37、およびCD52を含む。
【０１１２】
従って、本発明のさらなる態様において、抗原は、CD19、CD20、CD22、CD37、およびCD52からなるリストより選択される。
【０１１３】
本発明のまた別の態様において、B細胞特異的抗原は、CD19、CD20、CD22、CD37からなる群より選択される。
【０１１４】
本発明のさらなる態様において、CD20およびCD37の両方が、本発明の放射免疫結合体によって上方制御される。
【０１１５】
本発明の別の態様において、CD22およびCD37の両方が、本発明の放射免疫結合体によって上方制御される。
【０１１６】
本発明のまた別の態様において、CD52およびCD37の両方が、本発明の放射免疫結合体によって上方制御される。
【０１１７】
本発明の別の態様において、CD19およびCD37の両方が、本発明の放射免疫結合体によって上方制御される。
【０１１８】
抗原はまた、自己免疫疾患または障害に特異的な抗原であってもよい。
【０１１９】
抗原が自己免疫疾患に特異的である場合、抗原は下方制御され、従って例えば炎症を処置する可能性を有する。
【０１２０】
そのような抗原の例は、TNF-α、IL-2、または免疫グロブリンEである。
【０１２１】
本発明の別の態様において、疾患は多発性骨髄腫であり、抗原は、CD38、CD138、BCMA、CD317、CS1、CD40、BLyS、CD56、CD52、KMA、GRP78、BAFF、CXCR4、およびLMAからなる群より選択される。
【０１２２】
多発性骨髄腫の処置に関与するか、または多発性骨髄腫の処置のために開発中である抗体は、デノスマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、ミラツズマブ、ルカツムマブ、MDX-1097、PAT-SM6、タバルマブ、ウロクプルマブ、およびMDX-1458からなる群より選択することができる。
【０１２３】
多発性骨髄腫の処置のための抗体薬物結合体は、BT062、ミラツズマブ-DOX、ロルボツズマブ-メルタンシンからなる群より選択することができる。
【０１２４】
多発性骨髄腫患者における溶骨性骨疾患に関与する抗体は、骨を形成する骨芽細胞の活性を促進する抗DKK-1抗体BHQ-880からなる群より選択することができる。
【０１２５】
抗RANKL抗体であるデノスマブは、骨組織を分解する破骨細胞の活性を低減させる。
【０１２６】
従って、本発明の一つの態様において、抗体はデノスマブであり、疾患は骨粗鬆症である。
【０１２７】
血管新生抗原であるVEGFは、癌細胞における新たな血管成長を阻止する抗VEGF抗体ベバシズマブであることができる。
【０１２８】
従って、本発明の一つの態様において、癌細胞における血管新生が標的とされ、抗原はVEGFであり、抗体はベバシズマブである。
【０１２９】
抗原の上方制御を誘導するための、上述の骨髄腫抗原のうちの一つに対する放射標識抗体の使用は、本発明の範囲内である。
【０１３０】
薬学的組成物
薬学的組成物において製剤化された抗体を、通常、疾患の処置に適用する。
【０１３１】
そのような組成物は、生理学的許容度および保存寿命などのパラメータについて最適化される。
【０１３２】
従って、本発明の一つの態様において、放射免疫結合体は、薬学的組成物として製剤化される。
【０１３３】
本発明の一つの態様は、一つまたは複数の追加の治療剤をさらに含む、上述のような薬学的組成物に関する。
【０１３４】
本発明の別の態様において、前記一つまたは複数の追加の治療剤は、アポトーシスを誘導する作用物質から選択される。
【０１３５】
通常、薬学的組成物の重要な要素は、放射免疫結合体の化学的完全性を実質的な程度まで維持し、かつ患者への注入のために生理学的に許容されている緩衝溶液である。
【０１３６】
本発明の一つの態様において、薬学的組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを含む。
【０１３７】
許容される薬学的担体は、非毒性緩衝液、充填剤、等張溶液などを含むが、これらに限定されない。より具体的には、薬学的担体は、生理食塩水（0.9％）、2分の1生理食塩水、乳酸リンガー液、5％デキストロース、3.3％デキストロース/0.3％食塩水であることができるが、これらに限定されない。生理学的に許容される担体は、保存および輸送中に放射性薬剤の完全性を保護する放射線分解安定剤、例えば、アスコルビン酸を含有することができる。
【０１３８】
本発明の一つの態様は、本発明の薬学的組成物および一つまたは複数の追加の抗体または放射免疫結合体を含む。
【０１３９】
処置の方法
本発明による放射免疫結合体の治療的使用は、B細胞非ホジキンリンパ腫、B細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、および多発性骨髄腫からなる群より選択されるB細胞悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載されているような抗原を発現している悪性細胞に対する処置のためであってもよい。
【０１４０】
他の使用は、自己免疫疾患の処置および移植に関連する影響の処置であることができる。
【０１４１】
従って、本発明の一つの局面は、上方制御される抗原発現が有利であると考えられる人への放射免疫結合体の投与を含む、抗原発現を上方制御する方法に関する。
【０１４２】
本発明の一つの態様は、CD20が標的であり、放射免疫結合体がCD20抗原発現を上方制御することができる、B細胞悪性腫瘍または免疫系の疾患もしくは障害の処置の方法に関する。
【０１４３】
本発明の好ましい態様において、CD20抗原発現を上方制御することができる放射免疫結合体はbetalutinであり、CD20がリツキシマブまたはそのバリアントによって標的とされる。
【０１４４】
本発明の一つの局面は、betalutinとその後に続くリツキシマブ、オビヌツズマブ、または同様のCD20治療用抗体を用いる、B細胞悪性腫瘍または免疫系の疾患もしくは障害の併用処置に関する。
【０１４５】
本発明の一つの態様において、人は、B細胞悪性腫瘍または免疫系の疾患もしくは障害を患っている。
【０１４６】
本発明の別の態様において、使用は、放射免疫結合体の後に、抗体療法、免疫結合体療法、またはそれらの組み合わせを用いる同時処置または後処置が続く併用療法である。
【０１４７】
療法は、単独療法として、または他の療法、好ましくは標準的処置との組み合わせのいずれかで施与することができる。そのような他の療法は、前処置、手術、化学療法（ドキソルビシン、ビンブラスチン、およびゲムシタビンを含む）、免疫療法、抗体療法、光力学療法、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブを含む）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ボリノスタットおよびスベロイルアニリドヒドロキサム酸を含む）、ビタミンD3およびビタミンD3類似体、細胞周期チェックポイント阻害剤（UCN-01および2-(4-(4-クロロフェノキシ)フェニル)-1H-ベンズイミダゾール-5-カルボキサミドを含む）、低酸素細胞放射線増感剤（メトロニダゾールおよびミソニダゾールを含む）、アポトーシス誘導剤（ウィタフェリンAを含む）放射線増感剤、放射免疫療法、または、これらのうちの二つまたはそれ以上の組み合わせであってもよい。
【０１４８】
静脈内注入または静脈内注射は、投与されるを意味する。より具体的には、本発明の放射免疫結合体を、空気塞栓症を予防し、かつ患者への流量の推定を可能にするドリップチャンバーに接続された末梢カニューレによって静脈に直接投与することができる。
【０１４９】
一つの態様において、放射免疫結合体は、繰り返し様式で投与することができる。
【０１５０】
別の態様において、放射免疫結合体とその後に続くモノクローナル抗体（または免疫結合体）は両方とも、繰り返し様式で投与することができる。
【０１５１】
本発明の別の態様において、放射免疫結合体は、繰り返し様式であるが異なる放射性核種と共に投与することができ、例えば、β-放射免疫療法の後にα-放射免疫療法が続くことができ、または逆も可能である。
【０１５２】
本発明の一つの局面は、B細胞悪性腫瘍の処置のための本発明の放射免疫結合体の使用に関する。
【０１５３】
本発明の一つの態様は、他の療法と組み合わせてまたは他の療法に加えて投与される、本発明の放射免疫結合体の使用に関する。
【０１５４】
本発明の一つの態様において、他の療法は、前処置、化学療法、モノクローナル抗体療法、手術、放射線療法、および／または光力学療法から選択される。
【０１５５】
本発明の別の態様において、他の療法は、骨髄移植、または幹細胞移植および／もしくは療法である。
【０１５６】
本発明の一つの態様において、抗体投薬量は、患者当たり1〜1000 mg、より好ましくは患者当たり5〜50 mgであり、177Luは、1〜200 MBq/体重kg、より好ましくは10〜100 MBq/体重kgになる。
【０１５７】
併用療法
上述のように、放射免疫結合体を、他のタイプの療法と組み合わせて使用することができる。
【０１５８】
従って、本発明のさらなる態様において、使用は、放射免疫結合体の後に、抗体療法、免疫結合体療法、またはそれらの組み合わせを用いる同時処置または後処置が続く併用療法のためである。
【０１５９】
本発明の別の態様において、上方制御される抗原はCD20であり、かつ、上方制御の後に、単回投与におけるまたは繰り返し投与パターンにおけるリツキシマブを用いる抗CD20抗体療法が続く。
【０１６０】
従って、本放射免疫結合体を、放射免疫結合体が標的とする抗原以外の抗原を上方制御するために用いることが可能である。
【０１６１】
従って、本発明のまた別の態様において、同時処置または後処置は、放射免疫結合体とは異なる抗原を標的としている。
【０１６２】
投与パターンは、放射免疫結合体が一つまたは複数の抗原の発現を上方制御する単回投与であることができ、それらの抗原がその後、抗原特異的療法の単一用量または数用量によって標的とされる。
【０１６３】
そのような療法は、焦点を合わせる抗原に依存する、リツキシマブまたはHH1などのモノクローナル抗体であってもよい。
【０１６４】
療法は、放射免疫結合体およびモノクローナル抗体の投与を、1回、2回、または数回繰り返すサイクルパターンにおいて、繰り返すことができる。
【０１６５】
そのような投与の利点は、標的細胞を、各サイクルにおいて同じ抗体または異なる抗体によって処置することができ、最高の発現を有する抗原に焦点を合わせることを確実にすることである。
【０１６６】
いくつかの抗原に焦点を合わせる戦略は、標的細胞の表面上に発現している抗原の発現変動の危険性を限定する。
【０１６７】
本発明の局面のうちの一つの文脈において記載されている態様および特徴はまた、本発明の他の局面にも当てはまることが、注目されるべきである。
【０１６８】
本出願において引用されているすべての特許および非特許参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６９】
本発明をここで以下の非限定的な実施例においてさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１７０】
実施例1−Batalutin（177Lu-テトラキセタン-テツロマブ、または177Lu-HH1）を用いる処置および抗原発現に対する効果
材料および方法：
抗体の標識化
抗体HH-1のp-SCN-Bn-DOTAおよび177Luでの標識化を、Dahle et al. (2013)およびRepetto-Llamazares et al. (2013)に記載されている標準的手法に従って行った。放射免疫結合体（RIC）の放射化学的純度（RCP）を、インスタント薄層クロマトグラフィーを用いて評価した。RCPが95％より下であった場合は、結合体を、Econo-Pac 10 DGカラム（Bio-rad Laboratories, California, USA）を用いて精製した。実験に使用したすべてのRICについて、RCPは97％よりも高かった。Betalutinの比活性は、178μg/mlの抗体濃度で92 MBq/kgであった。RICの免疫反応画分（IRF）を、RamosおよびDaudiリンパ腫細胞ならびにワンポイントアッセイ法を用いて推定した。細胞7500万個/mlの細胞濃度を、用いた。コールドのテツロマブとインキュベーションした細胞を用いて、非特異的結合を査定した。ブロッキングした細胞およびブロッキングしていない細胞を、1.5時間、40 ng/mlの放射免疫結合体とインキュベーションした。添加した活性を、較正したγ線検出器（Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA）を用いて測定した。細胞をその後、0.5％ BSAを含むPBSで3回洗浄し、結合した活性をガンマカウンターで測定した。IRFを、ブロッキングした試料を用いて測定した非特異的結合をブロッキングしていない試料の結合活性から引くことによって、推定した。IRFは、Daudi細胞において52 +/- 3、およびRamos細胞において75 +/- 1であった。
【０１７１】
リツキシマブのAlexa 647での標識化は、対応するAlexa Fluor Protein Labeling Kit（Molecular Probes, Life Technologies）を用い、製造業者によって提供される手法に従って行った。
【０１７２】
細胞の処置
0日目に、Daudi細胞を、10％ FBSを補給したRPMI 1640を用いて細胞100万個/mlに希釈した。細胞を次に、各々が6 mlを含有している2個の細胞培養フラスコに分注した。フラスコのうちの1個は、約4.6 MBqの177Lu-テトラキセタン-テツロマブ（10μg/ml）を受けたが、もう1個はいかなる処置も受けなかった。両方のフラスコを、24時間インキュベーションし、洗浄して、細胞50万個/mlの濃度になるように新鮮培地に再懸濁した。処置細胞の培地に吸収された放射線量は、約1.1 Gyであった。処置細胞および対照細胞の両方を次に、測定する各時点に対応した細胞培養フラスコに分注した。各細胞フラスコは、約5 mlの細胞懸濁液を含有した。処置の72時間後の実験の終わりまで、細胞に新鮮培地を与えなかった。
【０１７３】
フローサイトメトリー測定
各時点で、対照細胞を、0,4μg/mlのDNA染色Hoechst33342（H33342）で20分間、37℃で染色した。その後、対照細胞および処置細胞を、洗浄して混合した。すべてのCD37部位を飽和させるために、細胞を20分間コールドのテツロマブとインキュベーションした。その後、細胞をPBSで洗浄し、Alexa647に結合した抗CD20抗体リツキシマブおよびウサギ抗マウス二次抗体（フィコエリスリン（PE）に結合（DakoCytomation））を溶液に添加した。氷中で30分間のインキュベーション後、試料を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて測定した。抗原発現（CD37またはCD20）の増大を、対照細胞と処置細胞との間の強度測定値における差（％）として算出した。対照細胞と処置細胞とは、対照細胞のDNAにおけるH3342染色由来の青色蛍光にゲーティングすることによって識別した。CD20の上方制御を、0、18、24、48、および72時間について評価した。CD37は、24および48時間で評価した。ウサギ抗マウスAbがCD20測定値に影響を及ぼさないことを確認するために、抗マウスAbを含む染色および抗マウスAbを含まない染色を、24時間および48時間で行った。
【０１７４】
結果：
ほとんどの時点について、無処置対照に対して約130％のCD20発現の増大があった（図1）。約60％の、CD37発現の増大があった（図1）。ウサギ抗体を含む試料およびウサギ抗体を含まない試料におけるCD20発現の増大は同様であったため、リツキシマブとウサギ抗マウス抗体との間に相互作用はなかった。
【０１７５】
結論：
細胞を177Lu-テトラキセタン-テツロマブで処置した後に、CD20およびCD37抗原が上方制御された。増大は、CD20について、すべての時点でおおよそ一定で約130％であり、CD37については処置後48〜72時間の間で30から60％へ増大した。
【０１７６】
実施例2
序論
177Lu-テツロマブ由来の効果が、細胞特異的放射によるものか否かを評価するために、Daudi細胞をBetalutinと共に1時間インキュベーションした。
【０１７７】
材料および方法
抗体の標識化
抗体を標識するため、およびIRFを算出するために用いた手法は、実施例1において以前に議論している。177Lu-テツロマブの比活性は212 MBq/mgであり、Ab濃度は0.5 mg/mlであった。IRFは、72 +/-2％であり、Ramos細胞において測定した。
【０１７８】
細胞の処置
細胞を処置するために従った手法は、実施例1に記載したものと同様であった。二つの異なる処置を、この実施例において評価した。一つの処置は、実施例1において行ったものと同様に、24時間の細胞のインキュベーションを含んだ。もう一つの処置は、1時間の細胞のインキュベーションを含んだ。対照細胞を、実施例1に記載したように処置の各々について調製した。同じ量の活性を、両方の処置に添加した（4.6 MBq、実施例1において与えたものと同じ活性）。細胞濃度が希釈後に細胞50万〜100万個/mlであるように、2〜5日毎に細胞を分割して、新鮮培地を添加した。
【０１７９】
フローサイトメトリー測定
細胞の染色および対照細胞と比較した処置細胞における抗原上方制御の測定を、実施例1に記載したものと同じ手法を用いて行った。測定は、0〜14日の時点で行った。
【０１８０】
結果
1時間インキュベーションした細胞の培地に対する線量は約0.05 Gyであり、他方、24時間インキュベーションした細胞に対する線量は約1.1 Gyであった。1時間インキュベーションした細胞は、曝露の48時間後に、CD20が45.5％増大して、CD37が3.8％増大し、曝露の144時間後には、それぞれ48.8％および15.1％増大し、放射免疫結合体からの細胞特異的放射が、特にCD20抗原について効果に重要な構成要素であることを示した（図2）。抗原の上方制御は、14日後に、0に向かって減少するようである。
【０１８１】
実施例3
序論
抗原の上方制御が、細胞株特異的効果ではなくリンパ腫の一般的特徴であるか否かを研究するために、Daudi細胞を、3種の他のリンパ腫細胞株、Raji、Ramos、およびRec-1と共に試験した。
【０１８２】
材料および方法
抗体の標識化
抗体を標識するため、およびIRFを算出するために用いた手法は、実施例1において以前に議論している。177Lu-テツロマブの比活性は212 MBq/mgであり、Ab濃度は0.5 mg/mlであった。IRFは、72 +/-2％であり、Ramos細胞において測定した。
【０１８３】
細胞の処置
細胞を処置するために従った手法は、実施例1に記載したものと同様であった。細胞を、1時間インキュベーションした。対照細胞を、実施例1に記載したように細胞株の各々について調製した。同じ量の活性を、細胞株に添加した（4.6 MBq、実施例1において与えたものと同じ活性）。細胞の培地に対する線量は、約0.05 Gyであった。細胞濃度が希釈後に細胞50万〜100万個/mlであるように、2〜5日毎に細胞を分割して、新鮮培地を添加した。
【０１８４】
フローサイトメトリー測定
細胞の染色および対照細胞と比較した処置細胞における抗原上方制御の測定を、実施例1に記載したものと同じ手法を用いて行った。測定は、0〜7日の時点で行った。
【０１８５】
結果
抗原の上方制御は、非ホジキンリンパ腫細胞について一般的であると考えられる。CD20の増大は、すべての細胞株上で観察されたが、CD37発現の増大は、4種の細胞株のうちの3種上で観察された（表1）。結論として、177Lu-テツロマブ放射免疫結合体への曝露は、CD20およびCD37の増大を引き起こし、これは、B細胞リンパ腫の一般的特徴であると考えられる。
【０１８６】
実施例4．177Lu-リツキシマブでCD20を標的化することによる抗原発現に対する効果
序論
効果が、Betalutin（すなわち、177Lu-HH-1または177Lu-テツロマブ）の特異的効果ではなく放射免疫結合体の一般的特徴であるか否かを研究するために、DaudiおよびRaji細胞を、177Lu-リツキシマブで処置した。
【０１８７】
材料および方法
抗体の標識化
リツキシマブを標識するため、およびIRFを算出するために用いた手法は、実施例1において以前に議論している。177Lu-リツキシマブの比活性は165 MBq/mgであり、Ab濃度は0.2 mg/mlであった。IRFは、60 +/-2％であり、Ramos細胞において測定した。
【０１８８】
テツロマブのAlexa 488での標識化は、対応するAlexa Fluor Protein Labeling Kit（Molecular Probes, Life Technologies）を用い、製造業者によって提供される手法に従って行った。
【０１８９】
細胞の処置
細胞を処置するために従った手法は、実施例1に記載したものと同様であった。細胞を、1時間または24時間インキュベーションした。DaudiおよびRajiリンパ腫細胞を、用いた。対照細胞を、実施例1に記載したように細胞株の各々について調製した。同じ量の活性を、細胞株に添加した（4.6 MBq、実施例1において与えたものと同じ活性）。細胞の培地に対する線量は、約0.05 Gyであった。細胞濃度が希釈後に細胞50万〜100万個/mlであるように、2〜5日毎に細胞を分割して、新鮮培地を添加した。
【０１９０】
フローサイトメトリー測定
細胞の染色および対照細胞と比較した処置細胞における抗原上方制御の測定を、実施例1に記載したものと同じ手法を用いて行った。測定は、0〜7日の時点で行った。177Lu-リツキシマブがCD20に結合すること、および同じ抗体を蛍光の強度を測定するために用いたことを考慮すると、見出された結果は、CD20の上方制御について最小値を与える。CD37の上方制御は、二次（ウサギ抗マウス）Abおよび直接Ab（Alexa488に結合したテツロマブ）の両方を用いることによって評価した。
【０１９１】
結果
CD20およびCD37の上方制御は、細胞を177Lu-リツキシマブで処置した際にも観察された（表2）。従って、抗原の上方制御は、177Lu-テツロマブの特異的効果ではない。
【０１９２】
実施例5．
序論
放射免疫療法が、異なるアッセイ法において細胞への抗体結合を増大させることを確認するために、2種の細胞株Daudi（非ホジキンリンパ腫）およびJMV-3（B細胞白血病）を、177Lu-HH-1（抗CD37）で処置し、その後、125I-標識リツキシマブ（抗CD20）の結合を測定した。
【０１９３】
方法：
125I-リツキシマブを、iodogen tubes（Pierce）を用いて調製した。iodogen tubeを、1 mlトリス緩衝液で洗浄し、その後、100μlトリス緩衝液（pH 7.5）を添加し、125Iヨウ素を添加した。溶液を、6分間の間に数回チューブ中で穏やかに旋回させ、その後、125I溶液のうちのいくらかまたは全部を、典型的には50〜200μgのOI-3抗体を含む100μlトリスを有するバイアルに添加した。
【０１９４】
バイアルの時折の旋回を用いて、反応を7分間継続した。その後、50μlのトリス中のl-チロシン（飽和）を添加し、溶液をSephadex G-25 PD-10（GE Health）ゲル濾過カラムを用いて精製する前に、少なくとも5分間反応させた。
【０１９５】
約70％の活性が高分子量画分に溶出されることになり、回収して、細胞結合実験に用いた。
【０１９６】
抗体HH-1を、最初に、0.005M HCl中に溶解したp-SCN-Bn-DOTAで標識した。抗体に対するp-SCN-Bn-DOTAのモル比は、6：1であった。反応物を、炭酸緩衝液を用いて8.5 ± 0.2にpH調整した。37℃での45分のインキュベーション後に、Ab 1mg当たり50μlの0.2 Mグリシン溶液の添加によって、反応を停止させた。遊離のキレート剤を除去するために、結合した抗体を、抗体結合体を0.9％ NaClで1：10に希釈すること、およびAMICON-30遠心チューブ（Millipore, Cork, Ireland）での遠心分離による濃縮によって洗浄した。手法を、4〜5回繰り返した。1mgの抗体結合体の220 MBq 177Lu（Perkin Elmer, Boston, Ma, USA）での標識化の前に、pHを、0.25 M酢酸アンモニウム緩衝液を用いて5.3 ± 0.3に調整した。反応物を、15分間37℃でインキュベーションした。
【０１９７】
放射免疫結合体（RIC）の放射化学的純度（RCP）を、インスタント薄層クロマトグラフィー（ITLC）を用いて評価した。RCPは、95.5％であった。RICの免疫反応画分（IRF）を、Ramos（177Lu-HH1）またはDaudi（125I-リツキシマブ）リンパ腫細胞およびワンポイントアッセイ法を用いて測定した。およそ細胞5000万個/mlの細胞濃度を、用いた。2本のチューブはブロッキングせず、2本のチューブを10μg HH-1で前処置して、その後、それらに2 ngの177Lu-HH1を添加し、1.5時間振盪した。その後、チューブをガンマカウンターでカウントして、適用された活性を決定し、細胞結合活性についてチューブをカウントする前に、0.5 ml DPBS/BSAで3回、洗浄して遠心分離した。細胞結合活性を、ブロッキングしたチューブ由来のカウントを引くことによって、非特異的結合について補正した。IRF、すなわち適用した全体に対する特異的結合は、78％（177Lu-HH1）および71％（125I-リツキシマブ）であった。5 mlの10％ FBSを補給したRPMI 1640を含有し、ml当たり100万細胞を有する細胞培養フラスコ（25 cm2, Corning）に、2.5 MBq 177Lu-Bn-DOTA-HH-1（177Lu-HH-1）、Bn-DOTA-HH-1（DOTA-HH-1、対照群1）、または製剤化緩衝液、すなわち、RICまたは抗体結合体以外は二つの他の処置と同じ溶液（対照群2）のいずれかを、16.7マイクロリットルにおいて添加した。1日後、2 mlを抜き取って3 mlの新鮮培地を添加し（1.7倍希釈）、3日後、3 mlの培地を添加し（1.5倍希釈）、5日後、4 mlを抜き取って3 mlの新鮮培地を添加し（1.8倍希釈）、8日目に、6 mlを抜き取って5 mlの新鮮培地を添加し（2.7倍希釈）、11日目に、7 mlを抜き取って4 mlの新鮮培地を添加した（5倍希釈）。これは、増殖培地を再供給するため、およびインビボにおいてRICで見られる時間に伴う濃度の低減をシミュレートするために行った。
【０１９８】
3.5日後、細胞懸濁液を抜き取って、Countess自動セルカウンター（Invitrogen）を用いて細胞濃度および生存率を測定し、0.5 mlを反応チューブに添加して遠心分離し、細胞ペレットを0.5％ BSA（VWR）を含む200μl DPBS（Gibco）に再懸濁した。177Lu-HH-1群の2本のチューブに、10μl DPBS/BSA中の0.8μg、すなわち、およそ1.6 μg/mlの125I-リツキシマブを添加し、2本のチューブには、（125Iウィンドウにおける177Luからのカウント干渉について補正するために）DPBSのみを添加した。対照群1および2の2本のチューブに、10μl DPBS/BSA中の0.8μg、すなわち、およそ1.6 μg/mlの125I-リツキシマブおよび10μl DPBS/BSA緩衝液を添加した。チューブを1.5時間インキュベーションし、その後、Cobra II Autogamma（Packard）ガンマカウンターの125Iウィンドウにおいてカウントする前に、2回洗浄して遠心分離した。177Lu-HH-1群におけるカウントを、125I-リツキシマブを添加していない2本のチューブ由来の測定値を用いることによって、125Iウィンドウにおける177Luからのクロスオーバーカウントについて補正した。
【０１９９】
結果
細胞結合活性を、細胞数および125Iウィンドウにおける177Lu干渉について調整し、RIC処置および無処置の対照1（177Lu以外の抗体結合体）および2（RICの緩衝溶液）の間の比較を、表3に示す。RICで処置した細胞は、177Lu-HH1を用いる療法を開始した15日後までおよびそれを含むすべての時点で、125I-リツキシマブの結合が増大していたことが示されている。
【０２００】
結論
表3に示されるように、b細胞リンパ腫およびb細胞白血病細胞は両方とも、177Lu-HH1曝露後に125I-リツキシマブの結合の増大を示した。これによって、放射免疫療法は、モノクローナル抗体療法、例えば、リンパ腫および白血病に対するリツキシマブ処置を受ける患者において誘導療法として有益であり得ることが示される。
【０２０１】
実施例6．非特異的結合の評価
背景：
放射免疫療法に曝露された細胞に対する抗原特異的抗体の結合の増大が、細胞に対する非特異的結合の増大によって引き起こされてはいないことを検証するために、抗原ブロッキングを用いた実験を行った。
【０２０２】
実験：
25cm2培養フラスコ中のml当たりおよそ100万のDaudi細胞を、標識されていないHH1抗体（対照1）、製剤化緩衝液（対照）、または0.1 MBq/mlもしくは0.5 MBq/mlの177Lu-HH-1のいずれかに3日間曝露した。1日後、新鮮培地を添加することによって、濃度を50％に低減させた。3日目に、細胞懸濁液を抜き取って、結合アッセイ法のために使用し、3群由来の二連のチューブが125I-リツキシマブを受けて、実施例4におけるように処置した。さらに、二連の各群を、CD20抗原をブロッキングするために、半時間、標識されていないリツキシマブ（100μg/ml）で処置した。125Iウィンドウにおける177Luについて補正するために、2種の放射性群由来の二連を、125I-リツキシマブを添加せずに使用し、125I-リツキシマブを有する試験チューブと同じように処置および洗浄した。125I-リツキシマブの添加後、試験チューブを2時間インキュベーションし、適用された活性についてカウントした。Cobra II自動ガンマカウンター（Packard Instruments Company Inc, Downers Grove, IL, USA）を用いた。その後、試験チューブをDPBS/0.5％ BSAで2回洗浄し、2回遠心分離して、細胞結合活性についてカウントした。データを、処置細胞における177Luからの125Iウィンドウ中へのガンマ漏出について補正した。
【０２０３】
結果：
ブロッキングしたチューブ対ブロッキングしていないチューブにおける細胞当たりの正味のカウントを比較すると、結果は、以下の通りであった：0.1および0.5 MBq/ml群、0.8％および1.1％の非特異的結合；対照1および対照2、1.3％および1.1％の非特異的結合。
【０２０４】
結論：
抗原ブロッキングは、処置細胞および無処置細胞に対して同等に有効であった。従って、放射免疫結合体処置細胞への結合の増大は、非特異的結合によって引き起こされたわけではなく、ゆえに抗原発現の増大によって引き起こされるに相違ない。
【０２０５】
実施例7：インビボのBetalutin（177Lu-テトラキセタン-テツロマブ、または177Lu-HH1）を用いる処置およびCD20抗原発現に対する効果
この実施例は、177Lu-HH1由来の抗原上方制御効果がインビボでも観察されることを検証する。皮下Ramos異種移植片を有するヌードマウスにおける生体内分布および腫瘍取り込みを、BetalutinまたはコールドHH1の対照注射を用いる処置の3日後に測定した。
【０２０６】
方法：
177Luでのテツロマブの標識化
キレート剤p-SCN-Bn-DOTA（DOTA）を0.005 M HCl中に溶解し、6：1の比で抗体に添加して、炭酸緩衝液を用いておよそ8.5にpH調整した。37℃での45分のインキュベーション後に、Abのmg当たり50μlの0.2 Mグリシン溶液の添加によって、反応を停止させた。遊離のDOTAを除去するために、結合した抗体を、AMICON-30遠心チューブ（Millipore, Cork, Ireland）を用いて4〜5回、NaCl 0.9％で洗浄した。177Luでの標識化の前に、pHを、0.25 M酢酸アンモニウム緩衝液を用いて5.3 ± 0.3に調整した。約150 MBqの177Lu（Perkin Elmer, Boston, Ma, USA）を0.5 mgのDOTA-Abに添加して、20分間37℃でインキュベーションした。比活性は、250 MBq/mgであった。結合体の放射化学的純度（RCP）を、インスタント薄層クロマトグラフィーを用いて評価した。RCPが95％より下であった場合は、結合体を、Econo-Pac 10 DGカラム（Bio-rad Laboratories, California, USA）を用いて精製した。
【０２０７】
125Iでのリツキシマブの標識化
リツキシマブを、IODOGEN pre-coated iodination tubes（Pierce, Rockford,IL）を用いて製造業者の説明に従い、間接ヨウ素化を通して125Iで標識した。L-チロシンで反応を終結させた後、低分子量化合物を除去するために、反応混合物をSephadex G-25 PD-10カラムを通して溶出させた。最終産物の比活性は、12 MBq/mgであった。
【０２０８】
177Lu-HH1および125I-リツキシマブの免疫反応画分
Ramosリンパ腫細胞の単細胞懸濁液を、10％の熱非働化FCS（PAA, Linz, Austria）、1％ L-グルタミン（PAA）、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（PAA）を補給したRPMI 1640培地（PAA）において、95％空気/5％ CO2を含む湿った環境中で増殖させた。放射免疫結合体の免疫反応性を、ワンポイント改変Lindmo法を用いて測定した。用いた細胞濃度は、細胞7500万個/mlであった。結合体の免疫反応性は、60％〜82％の間であった。
【０２０９】
動物
実験の開始時に約8〜9週齢であり、約22 gの体重を有する、施設内で繁殖させた雌の無胸腺ヌードFoxn1nuマウスを用いた。動物は、病原体がない条件下で維持し、食物と水を制約なしに供給した。本研究における動物に関わるすべての手法および実験は、National Animal Research Authorityによって認可され、European Convention for the Protection of Vertebrates Used for Scientific Purposesに従って実施した。マウスの両方の側腹部の皮下に、つぶした腫瘍溶液の各mlについて約300μl NaClでわずかに希釈したRamosリンパ腫腫瘍組織のつぶした溶液の50μlを注射した。
【０２１０】
生体内分布取り込み実験
125I-リツキシマブおよび177Lu-HH1の生体内分布を、研究の開始時に直径が5〜14 mmのRamos異種移植片を有するヌードFoxn1nuマウスにおいて測定した。調製物を、100μl溶液の尾静脈注射によって各動物に投与した。2,3 mg/kgのタンパク質投与量に相当する、約350 MBq/kgのBetalutinの投与量（177Lu-HH-1は使用前に保存されていたため、比活性が低減していた）を、5匹のマウスに投与した（処置マウス）。対照群は、処置マウスと同じタンパク質投与量のコールドHH1（2.3 mg/kg）を注射した7匹のマウスにあった。BetalutinまたはコールドHH1の注射の2日後に、すべてのマウスに3 mg/kgの125I-リツキシマブを注射した。125I-リツキシマブの注射の3日後に、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させ、解剖を行った。各組織試料の重量を測定し、177Luおよび125Iの量を、較正したγ線検出器（Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA）によって測定した。注射物の試料を、測定手法における参照として用いた。グラム組織当たりの注射した線量の減衰補正したパーセンテージ（ID％/g）を、各時点について算出した。器官における活性を、二ウィンドウ設定を用いることによって測定し、177Luおよび125Iの活性を同時に測定した。177Luまたは125Iのいずれかのみを有するブランクチューブを用いて、ウィンドウからのクロスオーバーを査定した。125Iウィンドウから177Luウィンドウへのクロスオーバーは、約0,006％であり、無視可能と考えられた。他方で、177Luウィンドウから125Iウィンドウへのクロスオーバーは、約10％であり、すべてのデータをそれに応じて補正した。さらに、補正の有効性を実証するために、試料を、10週間（177Lu半減期の約10倍）置いて減衰させ、再びカウントした。
【０２１１】
結果：
図6は、125I-リツキシマブの注射の3日後の、125I-リツキシマブの生体内分布を示す。マウスには、5日前に、350 MBq/kg Betalutin（処置）またはコールドHH1（対照）のいずれかを注射していた。正常器官における取り込みは、両方の群において同様であった（p＞0,05）が、腫瘍における取り込みは、処置マウスにおいて約3倍高かった（p＝3,19 10-10）。対照マウス中の腫瘍における平均ID％/gは、1.3 +/- 0.2であったが、処置マウスにおいては3.6 +/- 0.7であった。
【０２１２】
結論：
Betalutinを用いる処置は、コールドHH1で処置したマウスと比較した際に、腫瘍取り込みを3倍増大させたが、正常器官における取り込みは一定に保っていた。これらの結果は、前の実施例において示されているデータと共に、Betalutinを用いる処置が、インビボでCD20抗原を上方制御し、これが腫瘍取り込みの実質的な増大に変わることを示している。
【図１】
2018150323.tif 000003
【図２】
2018150323.tif 000004
【図３】
2018150323.tif 000005
【図４】
2018150323.tif 000006
【図５】
2018150323.tif 000007
【図６】
2018150323.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月17日(2018.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)以下を含む放射免疫結合体：
- CD37を標的とするモノクローナル抗体HH1、
- 任意のリンカー、
- 177Lu放射性核種、および
(b)抗CD20抗体
の組み合わせを含み、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ球性白血病からなる群より選択されるB細胞悪性腫瘍を治療するための医薬であって、
該放射免疫結合体が、B細胞癌細胞の表面上に発現されたCD20抗原の発現を上方制御し、かつ
該放射免疫結合体が、抗CD20抗体の前の前処置として使用される、前記医薬。
【請求項２】
前記抗CD20抗体の投与が、放射免疫結合体投与の3日後〜15日後などの、放射免疫結合体投与の少なくとも1日後〜15日後である、請求項1に記載の医薬。
【請求項３】
前記投与が、静脈内注入または静脈内注射を介して行われる、請求項1または2に記載の医薬。
【請求項４】
投薬量が10〜100 MBq/体重kgである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項５】
前記放射標識モノクローナル抗体が、HH1、キメラHH1、ヒト化HH1、chHH1.1、またはchHH1.3からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
前記リンカーが、p-SCN-bn-DOTA、DOTA-NHS-エステル、p-SCN-Bn-DTPA、およびCHX-A"-DTPAからなる群より選択されるキレートリンカーである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
前記抗CD20抗体が、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Reditux、およびイブリツモマブからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項８】
薬学的組成物として製剤化される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項９】
前記薬学的組成物が、一つまたは複数の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む、請求項8に記載の医薬。