(57)【要約】      （修正有）【課題】生理活性ポリペプチドの生体内活性を維持しながら血中半減期を延長させるために、生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体の製造方法を提供する。【解決手段】生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体の製造方法であって、(1)有機溶媒を含有する反応溶液において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと反応させ、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと連結させる工程、及び、(2)前記ステップ(1)の反応混合物から非ペプチド性ポリマーが共有結合した生理活性ポリペプチドの結合体を分離および精製する工程、を含む方法を提供する。【選択図】図１
2018150332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体の製造方法であって、
(1)有機溶媒を含有する反応溶液において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと反応させ、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと連結させる工程、及び、
(2)前記ステップ(1)の反応混合物から非ペプチド性ポリマーが共有結合した生理活性ポリペプチドの結合体を分離および精製する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記有機溶媒が、1〜10の炭素原子を有するアルコールである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アルコールが、イソプロパノール、エタノールおよびメタノールからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記反応溶液が、反応溶液の総体積に基づき、体積で10〜60％の量で有機溶媒を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記反応溶液が4.5〜7.0のpHを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記生理活性ポリペプチドが、二つ以上のN末端を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記生理活性ポリペプチドが、インスリン、黄体刺激ホルモン(LTH)、濾胞刺激ホルモン(FSH)、血液凝固第VIII因子、血液凝固第VII因子、アディポネクチン、抗体、抗体断片scFv、Fab、Fab'、F(ab')2およびリラクシンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記インスリンが、天然型インスリン、変異体、天然インスリンの一つ以上のアミノ酸における置換、付加、欠失、修飾のいずれか一つ若しくはそれらの組み合わせにより製造される誘導体、またはそれらの断片である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記インスリンのβ鎖のN末端に前記非ペプチド性ポリマーが結合する、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記インスリンまたはインスリン誘導体のアミン基またはチオール基に前記非ペプチド性ポリマーが結合する、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ペプチド性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコールコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ペプチド性ポリマーが、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオールおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される反応基を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ペプチド性ポリマーが、両末端または3末端に反応基を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ペプチド性ポリマーが、両末端に反応基としてアルデヒド基を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離および精製が、イオン交換クロマトグラフィーによって行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
生理活性ポリペプチド複合体の製造方法であって、
(1)請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法により、生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体を製造する工程、及び
(2)前記結合体の非ペプチド性ポリマーに兔疫グロブリンFc領域、抗体、アルブミンおよびトランスフェリンからなる群から選択されるキャリアを共有結合で連結し、非ペプチド性ポリマーの末端がそれぞれ前記生理活性ポリペプチドおよび前記キャリアと結合したペプチド複合体を生成する工程、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記兔疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群から選択される1個〜4個のドメインからなる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記兔疫グロブリンFc領域が、ヒンジ領域をさらに含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
前記兔疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgMに由来するFc領域である、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
前記兔疫グロブリンFc領域が、IgG4Fc領域である、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
前記兔疫グロブリンFc領域が、ヒト非糖鎖化IgG4Fc領域である、請求項17に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性ポリペプチドの生体内持続性および安定性を向上させるため、有機溶媒を用いて生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーが共有結合により連結された生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体を製造する方法、並びに前記結合体にキャリアが結合した生理活性ポリペプチド複合体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、生理活性ポリペプチドは安定性が低く容易に変性され、血液内タンパク質加水分解酵素により分解され、腎臓や肝臓を通じて容易に除去される。したがって、薬理成分として生理活性ポリペプチドを含むタンパク質性医薬品の血中濃度および力価を維持するためには、タンパク質性医薬品を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、大部分注射剤の形態で患者に投与されるタンパク質性医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射を打つことが患者に極度の苦痛をもたらす。このような問題点を解決するために、タンパク質性医薬品の血中安定性を増大させて血中薬物濃度を長時間高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このようなタンパク質性医薬品の持続性製剤は、タンパク質性医薬品の安定性を高めるとともに薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発してはならない。
【０００３】
タンパク質を安定化させ、タンパク質加水分解酵素との接触および腎臓の消失を抑制するための方法として、従来ポリエチレングリコール(以下「PEG」と略す)のように溶解度の高い高分子をタンパク質性医薬品の表面に化学的に付加させる方法が用いられてきた。PEGは、目的タンパク質の特定部位または様々な部位に非特異的に結合して溶解度を高めることによりタンパク質を安定化させ、タンパク質の加水分解を防止するのに効果があり、特別な副作用も起こさないことが知られている(非特許文献１)。しかし、PEGの結合によりタンパク質の安定性は増大させうるが、生理活性タンパク質の力価が顕著に低くなり、PEGの分子量が増加するほどタンパク質との反応性が低くなって収率が減少するという問題がある。よって、本発明者らは生理活性ポリペプチドとキャリアが非ペプチド性ポリマーが連結された結合体を提供している。しかし、依然として前記結合体の高い収率と純度での製造方法に対するニーズが高まっており、従来の方法であるキャリアに非ペプチド性ポリマーを先に結合する方法の場合、高コストであるという欠点があった。
【０００４】
一方、インスリンは、ヒトの膵腸のベータ細胞から分泌するペプチドであり、体内の血糖を調節するのに非常に重要な役割を担当する物質である。このようなインスリンが十分に分泌しなかったり、分泌したインスリンが体内で十分に作用できない場合、体内の血糖が調節されないため上昇するが、このような状態を糖尿病と言う。先に言及した場合を第2型糖尿病と言い、膵腸からインスリンを分泌することができずに血糖が上昇する場合を第1型糖尿病と言う。
【０００５】
第2型糖尿病の場合、化学物質を主成分とする経口用血糖降下剤を用いて治療が行われ、一部の患者にはインスリンを用いた治療が行われることもある。一方、第1型糖尿病の場合には、インスリンの投与が必須となる。
【０００６】
現在行われているインスリン治療法の多くは、食前、食後に注射によってインスリンを投与する方法である。しかし、このようなインスリン療法は、１日3回ずつの持続的な注射が必要とされるので、患者に多くの苦痛と不便さを生じさせる。このような問題点を克服するために様々な試みがなされてきた。その中の一つとしてペプチドの薬物の生体膜透過度を増加させ、口腔または鼻腔を通じた吸入によりペプチドの薬物を体内に伝達する試みがなされた。しかし、このような方法は、注射剤に比べてペプチドの体内伝達効率が顕著に低いのでペプチド薬物の体内活性を、要求される条件において維持するのに依然として困難が多い。
【０００７】
また、過量の薬物を皮下に投与した後、吸収を遅らせる方法が試みられた。これによって１日に１日の投与で持続的な血中濃度を維持する方法が提示された。その中の一部は医薬品(例えば、ランタス、サノフィ・アベンテイス社)として許可を受け、現在患者に投与されている。また、インスリンに脂肪酸を修飾してインスリンポリマーの結合を強くし、投与部位および血中のアルブミンと結合して持続時間を延長する研究が進められ、医薬品(レベミル、ノボノルデイスク社)として許可を受けた。しかし、このような方法は、投与部位で痛みが生じるという副作用があり１日に１日の注射による投与間隔で依然として患者にとっては大きな負担であると言わざるを得ない。
【０００８】
また、ペプチド薬物が体内に吸収された後、ペプチド薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物の濃度を長時間高く持続させることによって薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このようなペプチド薬物の持続型製剤は、ペプチド薬物の安定性を高めるとともに、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならず、且つ患者に免疫反応を誘発してはならない。このようなペプチド薬物の持続型製剤としては、ポリエチレングリコール(PEG)といった溶解度の高い高分子物質をペプチドの表面に化学的に付加させる方法が用いられてきた。
【０００９】
PEGは、標的ペプチドの特定部位または様々な部位に非特異的に結合してペプチドの分子量を増加させ、腎臓による消失を抑制し、加水分解を防止するのに効果があり、特別な副作用も起こさない。例えば、特許文献１は、NPR-Aに結合してcGMPの生産を活性化して動脈内血圧を低下させ、それによって鬱血性心不全症(Congestive heart failure)の治療剤として用いられるB型ナトリウム利尿ペプチド(B-type natriuretic peptide、BNP)にPEGを結合して生理活性を持続させることについて記述している。特許文献２では、エキセンディン-4のリシン残基にPEGを結合させて生体内持続時間を増加させる方法について記述している。しかし、このような方法は、PEGの分子量を増加させてペプチド薬物の生体内持続時間を延ばすことができる反面、分子量が増加するほどペプチド薬物の力価が顕著に低くなり、また、ペプチドとの反応性が低くなって収率が減少するという問題がある。
【００１０】
特許文献３には、組み換え遺伝子技術を用いたGLP-1およびエキセンディン-4 またはその類似体とヒト血清アルブミンまたは免疫グロブリン断片(Fc)との融合タンパク質について記述されており、特許文献４には副甲状線ホルモン(PTH)およびその類似体とFc融合タンパク質について記述されている。このような方法は、低いペグ化(pegylation)収率の問題と非特異性を克服できる反面、血中半減期の延長効果が予想より画期的なものではなく、場合によっては力価が低いという問題点を有している。血中半減期の延長効果を極大化するために、様々な種類のペプチドリンカーが用いられることもあるが、免疫反応を誘発する可能性がある。また、BNPのようにジスルフィド結合(disulfide bond)を有しているペプチドを用いる場合、ミスフォールディング(misfolding)の確率が高く、適用が困難であるという問題点と、天然に存在しないアミノ酸残基がある場合、遺伝子組み換えの形態で生産が不可能であるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO 2006/076471
【特許文献２】米国特許第6924264号
【特許文献３】WO 02/46227
【特許文献４】米国特許第6756480号
【特許文献５】国際特許公開第97/34631号
【特許文献６】国際特許公開第96/32478号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Sada et al.、J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139、1991
【非特許文献２】H.Neurath、R. L. Hill、The Proteins、Academic Press、New York,197 9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、インスリンを含む生理活性ポリペプチドの血中半減期の延長および生体内活性の維持を同時に極大化できる方法を見出すために努力を重ねた結果、有機溶媒を含有する反応溶液で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーを先に連結する場合、製造費用が節減され、高い収率と純度で生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体を製造することができることを見出し、そのような結合体を用いた生理活性ポリペプチド複合体を製造する場合、生体内活性が高く維持され、公知のインフレーム・フュージョン(inframe fusion)方法よりはるかに改善した血中半減期の延長効果を示すことを明らかにすることにより本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一つの目的は、生理活性ポリペプチドの生体内活性を維持しながら血中半減期を延長させるために、生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体の製造方法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体にキャリアを共有結合で連結した生理活性ポリペプチド複合体の製造方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の製造方法により高い純度と収率で生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体を製造することができ、これを用いて製造した生理活性ポリペプチド複合体は製造費用が節減され、生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が顕著に延長し、患者の服薬コンプライアンスを高める生理活性ポリペプチドの持続型製剤の開発に有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、インスリン-PEG結合体がβ鎖に修飾されたことを確認するために、SEC HPLCを用いて分析した結果を示す。A: インスリン還元条件、B: PEG-インスリン還元条件。
【図２】図2は、インスリン-PEG結合体がβ鎖の1番のフェニルアラニン(B1F)に95％以上修飾されたことを確認するために、ペプチドマッピング(peptide mapping)を用いて分析した結果を示す。A: インスリンのペプチドマッピングの結果、B: PEG-インスリンのペプチドマッピングの結果、C: PEG-インスリン配列および ペプチドマッピング時の予想切断位置(赤色線)。
【図３】図3は、インスリン-PEG結合体のそれぞれの緩衝液条件に対するRP-HPLC、SE-HPLC分析結果を示す。実線の矢印はモノペグ化(Mono-PEGylated)したインスリンピークを示し、点線の矢印はブリッジ構造のペグ化不純物ピークを示す。それぞれの緩衝液の条件は、次の通りである。  A: (a)100mM リン酸カリウム(pH6.0)緩衝液; (b)100mM リン酸カリウム(pH6.0)、30％イソプロパノール緩衝液; (c)100mM リン酸カリウム(pH6.0)、45％イソプロパノール緩衝液; (d)100mM リン酸カリウム(pH6.0)、55％イソプロパノール緩衝液  B: (a)50mM クエン酸ナトリウム(pH6.0)、45％イソプロパノール緩衝液; (b)50mM クエン酸ナトリウム(pH6.0)、55％イソプロパノール緩衝液;  C: (a)50mM 酢酸ナトリウム (pH4.0)緩衝液; (b)50mM 酢酸ナトリウム (pH4.0)、10％イソプロパノール緩衝液; (c)50mM 酢酸ナトリウム (pH4.0)、20％イソプロパノール緩衝液; (d)50mM 酢酸ナトリウム (pH4.0)、30％イソプロパノール緩衝液; (e)50mM 酢酸ナトリウム (pH4.0)、40％イソプロパノール緩衝液; (f)50mM 酢酸ナトリウム (pH4.0)、45％イソプロパノール緩衝液; (g)50mM 酢酸ナトリウム (pH4.0)、50％イソプロパノール緩衝液。
【図４】図4は、インスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体の RP HPLC 分析結果(A)、SE HPLC 分析結果(B)を示す。
【図５】図5は、インスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体のSDS-PAGE分析結果を示す。M: サイズマーカー、1: インスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体還元条件、2: インスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体非還元条件。
【図６】図6は、インスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体の生体内持続性を確認するための薬物動態確認試験結果を示す。iv: 静脈投与、sc: 皮下投与。
【図７】図7は、インスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体のin vivo効力試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記目的を達成するための一つの態様として、本発明は、(1)有機溶媒を含有する反応溶液において、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーを反応させ、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーを連結させるステップと、(2)前記ステップ(1)の反応混合物から非ペプチド性ポリマーが共有結合した生理活性ポリペプチドの結合体を分離および精製するステップを含む、生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明において、前記有機溶媒は固体、気体、液体を溶かしうる液体有機化合物を意味し、本発明の目的上、非ペプチド性ポリマーが生理活性ポリペプチドのN末端に高い収率と純度で共有結合し得るように、反応溶液に含まれてもよい。
【００２０】
前記有機溶媒は、当業界において通常用いられる有機溶媒を全て用いることができる。前記有機溶媒は、これに制限されないが、好ましくは、1次、2次、3次アルコールを全て用いることができる。また、炭素数1〜10のアルコールを用いることができる。より好ましくは、前記アルコールは、イソプロパノール、エタノールまたはメタノールであってもよい。前記有機溶媒は、生理活性ポリペプチドの種類に応じて適合した有機溶媒を自由に選択することができる。
【００２１】
前記有機溶媒は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマー間の連結のための反応溶液に含まれるものであり、これに制限されないが、好ましくは、反応溶液の総量基準で10〜60％、より好ましくは、30〜55％、さらに好ましくは45〜55％で含まれてもよい。また、前記反応溶液のpHは、これに制限されないが、好ましくは4.5〜7.0であってもよく、より好ましくは5.5〜6.5であってもよい。この時、前記弱酸性のpHを有する反応溶液で生理活性ポリペプチドは一般に溶解度が低下する現象があるが、本発明の有機溶媒を用いる場合、前記溶解度の問題を改善し、反応を円滑に行わせるという長所がある。
【００２２】
本発明の一実施態様では、インスリンのβ鎖のN末端に選択的にPEGを結合させるために、有機溶媒としてイソプロパノールを反応溶液に含めて様々なpH上でインスリンのペグ化反応を行った。そして、有機溶媒を反応溶液に含める場合、数種類の不純物を効率よく減少させ、高い純度と収率で生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体を製造することができることを確認し(表1)、これを用いて最終的に均質且つ高純度の生理活性ポリペプチドの複合体を製造することができる。本発明の実施態様において、イソプロパノールの含量および反応溶液のpHが不純物の含量とモノペグ化したインスリンの比率を変化させることができる。特に、pH 6.0でイソプロパノールが反応溶液の総量を基準としてで45〜55％の場合、モノペグ化したインスリンの含量が最大になることを確認した(表1)。
【００２３】
本発明における用語「生理活性ポリペプチド」とは、生体内で、ある生理作用を有するポリペプチドを総称する概念であり、ポリペプチド構造を有するという共通点を有し、様々な生理活性を有する。前記生理活性は、遺伝表現と生理機能を調整して生体内で機能調節に関与する物質の欠乏や過度な分泌により異常な病態を示す時、これを正す役割を果たす。前記生理活性ポリペプチドは、一般のタンパク質治療剤を含むことができる。
【００２４】
本発明において、前記生理活性ポリペプチドは、生体内で生理活性を有するものであれば、制限なく含まれ、その例としてインスリン、黄体刺激ホルモン(LTH)、濾胞刺激ホルモン(FSH)、血液凝固第VIII(8)因子(Factor VIII)、血液凝固 第VII(7)因子(Factor VII)、アディポネクチン(Adiponectin)、抗体、抗体断片 scFv、Fab、Fab'、F(ab')2 またはリラクシン(Relaxin)等があり、好ましくはインスリンであってもよい。前記生理活性ポリペプチドは、二つ以上のN末端(アミノ末端)を有することができる。
【００２５】
本発明において、前記インスリンは、体内の血糖が高い時、膵腸から分泌し、肝臓、筋肉、脂肪組職で糖を吸収してグリコーゲンとして貯蔵し、脂肪を分解してエネルギー源として用いられることを抑制して血糖を調節する機能を持つペプチドである。このようなペプチドは、インスリンアゴニスト、前駆物質、誘導体、断片(fragments)、変異体(variants)等を含み、好ましくは、天然型インスリン、速効性インスリン、持続型インスリン等である。
【００２６】
天然型インスリンは膵腸から分泌するホルモンであり、一般に細胞内のグルコース吸収を促進し、脂肪の分解を抑制して体内の血糖を調節する役割を果たす。インスリンは、血糖調節機能がないプロインスリン(Proinsulin)前駆体の形態でプロセッシングを経て血糖調節機能を有するインスリンになる。インスリンアミノ酸配列は、下記の通りである。
【００２７】
α鎖 :
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(配列番号1)
β鎖 :
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(配列番号2)
【００２８】
インスリンアゴニストは、インスリンの構造と関係なく、インスリンの生体内受容体に結合してインスリンと同一の生物学的活性を示す物質を意味する。
【００２９】
インスリン誘導体は、天然型インスリンと比較した時、少なくとも80％以上のアミノ酸配列で相同性を示し、アミノ酸残基の一部の基が化学的に置換(例：アルファ−メチル化、アルファ−ヒドロキシル化)、欠失(例：脱アミノ化)または修飾(例： N-メチル化、グリコシル化、脂肪酸)した形態であってもよく、体内で血糖を調節する機能を有するペプチドを意味する。
【００３０】
インスリン断片は、インスリンのアミノ末端またはカルボキシ末端に一つまたはそれ以上のアミノ酸が追加または欠失した形態を意味し、追加されたアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸(例; D型アミノ酸)も可能である。このようなインスリン断片は、体内で血糖調節機能を有する。
【００３１】
インスリン変異体はインスリンとアミノ酸配列が一つ以上異なるペプチドであり、体内で血糖調節機能を有するペプチドを意味する。
【００３２】
インスリンアゴニスト、誘導体、断片および変異体においてそれぞれ用いられた製造方法は、独立して用いられてもよく、組み合わせてもよい。例えば、アミノ酸配列が一つ以上異なり、N末端アミノ酸残基に脱アミノ化された体内で血糖調節機能を有するペプチドも含まれる。
【００３３】
具体的な一態様として本発明で用いたインスリンは、組み換え法での生産が可能であり、固相(Solid phase)合成法による生産も可能である。
【００３４】
また、本発明で用いられたインスリンは、β鎖のN末端(アミノ末端)に非ペプチド性ポリマーが結合したことを特徴とする。インスリンの場合、α鎖修飾時に活性が減少し、および安定性が低下するため、本発明ではインスリンのβ鎖のN末端に非ペプチド性ポリマーを連結することにより、インスリンの活性を維持させながら安定性を向上させた。
【００３５】
本発明における用語、「血液凝固因子」とは、傷による出血時に血液凝固によって身体を保護する作用をする血液凝固関連タンパク質を意味する。血液凝固は、このような血液凝固因子に含まれる12個の因子が関与して起こる一連の反応である。このうち、血液凝固第VIII(8)因子は抗血友病因子とも呼ばれ、遺伝的欠乏が起きる場合に血友病を起こす因子であり、血液凝固第VII(7)因子はプロコンバーチン(Proconvertin)とも呼ばれ、活性化させて血液を凝固させる血液凝固剤として用いられる因子である。
【００３６】
本発明における用語、「アディポネクチン(Adiponectin)」とは、脂肪細胞から分泌するタンパク質を意味し、脂肪と糖代謝に関与する物質である。アディポネクチンは成人期で心臓病と糖尿病の発病の危険性を減らし、筋肉をして脂肪をエネルギーに転換させ、食欲を抑制する機能を有することで知られているタンパク質である。また、用語 「リラクシン(Relaxin)」は卵巣黄体から分泌して恥骨結合を弛緩させ、出産を促進するホルモンを意味する。リラクシンは、全身の骨と関節を柔らかく弛緩させる役割を果たすホルモンである。
【００３７】
本発明において「非ペプチド性ポリマー」は繰り返し単位が 2個以上結合した生体適合性ポリマーを意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合ではない任意の共有結合によって相互に連結される。
【００３８】
本発明に使用可能な非ペプチド性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLA(ポリ乳酸)およびPLGA(ポリ乳酸-グリコール酸)といった生分解性高分子、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせで構成された群から選択されてもよく、好ましくは、ポリエチレングリコールである。当該分野において既に知られているこれらの誘導体および当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
従来のインフレーム・フュージョン(inframe fusion)方法により製造された融合タンパク質において用いられたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の延長効果を期待した程得ることができないということである。しかし、本発明では、タンパク質分解酵素に抵抗性のあるポリマーを用いてキャリアと類似したペプチドの血中半減期を維持することができる。そのため、本発明で用いられる非ペプチド性ポリマーは、前記のような役割、すなわち、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のあるポリマーであれば、制限なく用いられる。非ペプチド性ポリマーは、分子量が1〜100 kDaの範囲、好ましくは1〜20 kDaの範囲であってもよい。また、前記生理活性ポリペプチドと結合される本発明の非ペプチド性ポリマーは一種類のポリマーだけではなく、異なる種類のポリマーを組み合わせて用いることもできる。
【００４０】
本発明で用いられる非ペプチド性ポリマーは、生理活性ポリペプチドおよびキャリアと結合される両末端または3末端の官能基を有することができる。
【００４１】
前記非ペプチド性ポリマーの官能基は、これに制限されないが、好ましくは、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド(maleimide)基、オルトピリジルジスルフィド、チオールまたはスクシンイミド(succinimide)誘導体であってもよい。前記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートを用いてもよい。特に、前記非ペプチド性ポリマーの末端に反応アルデヒド基の官能基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、ポリマーの末端で生理活性ポリペプチドおよびキャリアとそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキルファにより生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものより遥かに安定的である。アルデヒド官能基は、低いpHでアミノ末端に選択的に反応し、高いpH、例えば、pH9.0の条件ではリシン残基と共有結合を形成し得る。
【００４２】
前記非ペプチド性ポリマーの両末端または３末端の官能基は、互いに同一でもよく、または異っていてもよい。例えば、一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基を有することができる。両方の末端にヒドロキシ官能基を有するポリ(エチレングリコール)を非ペプチド性ポリマーとして用いる場合には、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前記様々な官能基で活性化したり、商業的に入手可能な修飾された官能基を有するポリ(エチレングリコール)を用いて本発明のタンパク質結合体を製造することができる。
【００４３】
一方、本発明の前記 (2)ステップでN末端に非ペプチド性ポリマーが共有結合した生理活性ポリペプチドを含む結合体を分離および精製する過程は、当業界に公知となった方法を制限なく用いることができ、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。
【００４４】
他の一つの態様として、本発明は(1)前記方法により生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体を製造するステップ、および (2)前記結合体の非ペプチド性ポリマーに兔疫グロブリンFc領域、抗体、アルブミンおよびトランスフェリンで構成された群から選択されるキャリアを共有結合により連結して非ペプチド性ポリマーの末端がそれぞれ生理活性ポリペプチドおよびキャリアと結合したペプチド複合体を生成するステップを含む、生理活性ポリペプチド複合体の製造方法を提供する。
【００４５】
本発明において、「複合体(complex)」とは、一つ以上の生理活性ポリペプチド、一つ以上の非ペプチド性ポリマーおよび一つ以上のキャリアを含み、これら構成要素が共有結合により相互に連結されている構造を意味する。また、前記 「複合体」と区別するために、「結合体(conjugate) 」は生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーのみが共有結合により相互に連結されている構造を示す。
【００４６】
本発明において、「キャリア」とは、薬物に結合する物質を意味し、一般に、薬物に結合して薬物の生理活性を増減させたり除去する物質である。本発明の目的上、前記キャリアに結合する薬物は、好ましくは生理活性ポリペプチドであり、非ペプチド性ポリマーにより結合され得、結合する生理活性ポリペプチドの生体内活性の減少を最小限に抑えながら同時に薬物の生体内安定性を増加させるためのものである。前記キャリアは、これに制限されないが、好ましくは、兔疫グロブリンFc領域、抗体、アルブミンまたはトランスフェリンであってもよい。
【００４７】
兔疫グロブリンFc領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして用いるのに安全である。また、兔疫グロブリンFc領域は、兔疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製および収率の面で有利である。また、アミノ酸配列が抗体ごとに異なるため、高い非均質性を示すFab 部分を除去することにより、物質の同質性が大幅に増加して血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待できる。
【００４８】
本発明において、「兔疫グロブリンFc領域」は、兔疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域1(CH1)と軽鎖不変領域(CL1)を除いた、重鎖不変領域2(CH2)および重鎖不変領域3(CH3)の部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ(hinge)部分を含むこともある。また、本発明の兔疫グロブリンFc領域は、天然型と実質的に同等または向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体の重鎖不変領域1(CH1)および/または軽鎖不変領域1(CL1)を含む拡張されたFc領域であってもよい。また、CH2および/またはCH3に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の兔疫グロブリンFc領域は、(1)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメインおよび CH4ドメイン、(2)CH1ドメインおよび CH2ドメイン、(3)CH1ドメインおよび CH3ドメイン、(4)CH2ドメインおよび CH3ドメイン、(5)1個または2個以上のドメインと兔疫グロブリンヒンジ領域(またはヒンジ領域の一部)との組合わせ、(6)重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
【００４９】
また、本発明の兔疫グロブリンFc領域は、天然型アミノ酸配列だけではなく、この配列変異体(mutant)を含む。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、あるいはこれらの組合わせにより異なる配列を有することを意味する。例えば、IgG Fcの場合、結合の際に重要であると知られている214〜238、297〜299、318〜322または327〜331番のアミノ酸残基が修飾のために適切な部位として利用されうる。また、ジスルフィド結合を形成できる部位が除去されたり、天然型 FcでN末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、または天然型FcのN末端にメチオニン残基が付加されうる等、様々な種類の変異体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えば、C1q結合部位が除去されてもよく、ADCC部位が除去されてもよい。このような兔疫グロブリンFc領域の配列変異体を製造する技術は、特許文献５、特許文献６等に開示されている。
【００５０】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知となっている(非特許文献２)。最も通常的に起きる交換は、アミノ酸残基 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly間の交換である。
【００５１】
場合によっては、リン酸化(phosphorylation)、硫化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミル化(amidation)等で修飾(modification)されることも可能である。
【００５２】
前述したFc変異体は、本発明のFc領域と同一の生物学的活性を示すが、Fc 領域の熱、pH 等に対する構造的安定性を増大させた変異体である。
【００５３】
また、このようなFc領域は、ヒトおよび牛、山羊、豚、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモット等の動物の生体内から分離した天然型から得ることもでき、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはこの誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体兔疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合には、FabおよびFcに切断し、ペプシンを処理する場合には pF'cおよびF(ab)2に切断する。これをサイズ排除クロマトグラフィー(size-exclusion chromatography)等を用いてFcまたはpF'cを分離することができる。
【００５４】
好ましくは、ヒト来由のFc領域を微生物から得た組み換え型兔疫グロブリンFc領域である。
【００５５】
また、兔疫グロブリンFc領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が欠失した形態であってもよい。このような兔疫グロブリンFc糖鎖の増減または欠失は、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法を用いることができる。ここで、Fcから糖鎖が欠失した兔疫グロブリンFc領域は、補体(c1q)の結合力が顕著に低下し、抗体-依存性細胞障害(antibody-dependent cytotoxicity)または補-依存性細胞障害(complement dependent cytotoxicity、 CDC)が減少または除去されるため、生体内で不必要な免疫反応を誘発しない。このような点において、薬物のキャリアとしての本来の目的により適切な形態は、糖鎖が除去され（deglycosylate）または非糖鎖化された（aglycosylate）兔疫グロブリンFc領域であると言える。
【００５６】
本発明において、「 糖鎖の除去(Deglycosylation)」とは、酵素から糖を除去したFc領域を意味し、「非糖鎖化(Aglycosylation) 」とは原核動物、好ましくは、大腸菌で生産し、糖鎖化されないFc領域を意味する。
【００５７】
また、兔疫グロブリンFc領域は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM来由またはこれらの組み合わせ、もしくはこれらの混成 (hybrid)によるFc領域であってもよい。好ましくは、ヒトの血液に最も豊富なIgGまたはIgM来由であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったIgG来由である。
【００５８】
一方、本発明において「組み合わせ(combination)」とは、二量体または多量体を形成する際、同一起源の単鎖兔疫グロブリンFc領域をコードするポリペプチドが、異なる起源の単鎖ポリペプチドとの結合を形成することを意味する。すなわち、IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgDFcおよびIgEのFc断片からなる群れから選択された2個以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【００５９】
本発明において「ハイブリッド(hybrid)」とは、単鎖の兔疫グロブリンFc領域内に2個以上の異なる起源の兔疫グロブリンFc断片に該当する配列が存在することを意味する。本発明の場合、様々なの形態のハイブリッドが可能である。すなわち、IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE FならびにIgD Fcの CH1、CH2、CH3 および CH4で構成された群から1個〜4個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
【００６０】
さらに、IgGも IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリダイゼーションも可能である。好ましくはIgG2およびIgG4サブクラスであり、最も好ましくは補体−依存的毒性のようなエフェクター機能(effector function)がほとんどないIgG4のFc領域である。
【００６１】
すなわち、最も好ましい本発明の薬物のキャリア用兔疫グロブリンFc領域は、ヒトIgG4来由の非糖鎖化されたFc領域である。ヒト由来のFc領域は、ヒトの生体で抗原として作用し、これに対する新たな抗体を生成する等の好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のFc領域に比べて好ましい。
【００６２】
本発明の方法により製造された生理活性ポリペプチド複合体は、高い純度と収率での製造が可能であり、生体内持続性および安定性が向上して生理活性ポリペプチドを用いた治療時に、服薬コンプライアンス(compliance)を著しく改善することができる。本発明の一実施例では、本発明の方法により製造されたインスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体を用いて生体内消失半減期を確認した。その結果、静脈投与時には15.73時間、皮下投与時には16.98時間と、約0.5時間を示す天然型インスリンに比べて30倍以上長い持続性を示すことを確認した(図6)。また、in vivo 効力試験を行った結果、血糖降下効力が約4日間持続することを確認した(図7)。
【００６３】
また、本発明では、前記生理活性ポリペプチド複合体を含む生理活性ポリペプチド持続性製剤を提供することができる。
【００６４】
本発明において「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記複合体の投与経路は、薬物が目的組職に到逹できる限り、如何なる一般の経路を通じて投与されてもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与等が挙げられるが、これに制限されない。しかし、経口投与時に、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり胃腸での分解から保護されるように製剤化することが好ましい。好ましくは、注射剤の形態で投与されてもよい。また、持続性製剤は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置により投与されうる。
【００６５】
本発明の複合体を含む持続性製剤は、薬剤学的に許容可能なキャリアを含むことができる。薬剤学的に許容されるキャリアは、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料等を用いることができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤等を混合して用いることができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤等を用いることができる。本発明の持続性製剤の剤形は、上述したような薬剤学的に許容されるキャリアと混合して多様に製造されることができる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー、サスペンション、シロップ、ウエハ等の形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤等に製剤化することができる。
【００６６】
一方、製剤化に適したキャリア、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルジネート、ゼラチン、カルシウムフォスフェート、カルシウムシルリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油等が用いられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤等をさらに含むことができる。
【００６７】
本発明の持続性製剤は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別および体重および疾患の重症度等の様々な関連因子とともに、活性成分である薬物の種類に応じて決定される。本発明の持続性製剤は、生体内持続性および力価に優れているため、本発明の薬剤学的製剤の投与回数および頻度を著しく減らすことができる。また、前記持続性製剤は、生理活性ポリペプチドの生体内持続性および安定性を非常に高く維持させるため、これを用いた疾病治療に効果的である。
【００６８】
以下、下記実施例により本発明をさらに詳しく説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例 1: インスリンのペグ化(PEGylation)反応およびモノペグ化(Mono-PEGylated)したインスリンの精製
インスリン粉末を10mM HClに溶解させた後、3.4K プロピオン-ALD2 PEG (プロピオンアルデヒド基を2個有しているPEG、IDB、韓国)をインスリンβ鎖のN末端にペグ化させるために、インスリン : PEGのモル比を 1 : 2〜4、インスリン濃度を3〜5 mg/mlにし、4〜8℃で約2時間反応させた。この時、反応は50mM クエン酸ナトリウムpH6.0、45％イソプロパノールで行われ、4〜20mM NaCNBH3還元剤を添加して反応させた。反応液はクエン酸ナトリウム(pH3.0)、45％EtOHが含まれたバッファとKCl濃度勾配を用いたSP-HP(GE ヘルスケア社)カラムを用いて精製した。
【００７０】
製造されたモノペグ化したインスリンは、SE-HPLCと ペプチドマッピング分析法を用いてβ鎖の1番のフェニルアラニン(B1F)に 98％以上ペグ化したことを確認した(図1および2)。
【００７１】
実施例 2: 反応溶液のpHと有機溶媒の濃度によるモノPEG-インスリンの収率と不純物含量の比率の変化
インスリンとのPEG反応時、反応溶液にイソプロパノール等の有機溶媒を用いる場合、モノPEG-インスリンの反応収率と製造中に不純物が生成されるか否かを比較するために、インスリンと3.4K プロピオン-ALD2 PEGのモル比を1:2、インスリンの濃度を3 mg/mLにし、4℃で4時間反応させた。この時、反応溶液は、それぞれ50mM クエン酸ナトリウムpH6.0、45％イソプロパノール緩衝液; 50mM クエン酸ナトリウムpH6.0、55％イソプロパノール緩衝液; 100mM リン酸カリウムpH6.0 緩衝液; 100mM リン酸カリウムpH6.0、30％イソプロパノール緩衝液; 100mM リン酸カリウムpH6.0、45％イソプロパノール緩衝液; 100mM リン酸カリウムpH6.0、55％イソプロパノール緩衝液; 50mM 酢酸ナトリウム pH4.0 緩衝液; 50mM 酢酸ナトリウム pH4.0、10％イソプロパノール緩衝液; 50mM 酢酸ナトリウム pH4.0、20％イソプロパノール緩衝液; 50mM 酢酸ナトリウム pH4.0、30％イソプロパノール緩衝液; 50mM 酢酸ナトリウム pH4.0、40％イソプロパノール緩衝液; 酢酸ナトリウム pH4.0、45％イソプロパノール緩衝液; および 50mM 酢酸ナトリウム pH4.0、50％イソプロパノール緩衝液を用い、これに還元剤である20 mM NaCNBH3を添加した。各反応液を実施例 1と同様の方法で精製した後、精製プロファイルを図3に示した。インスリンのα鎖およびβ鎖のN末端が同時にブリッジ構造のPEGが反応する場合には、モノペグ化したインスリンと免疫グロブリンFcとのカップリング反応が不可能な形態になる。したがって、このような不純物の比率を表1に示した。表1で見られるように、反応液に含まれたイソプロパノールの含量とPhの条件に応じてモノペグ化したインスリンの比率が変化し、pH6.0でイソプロパノールの含量が約45〜55％である場合、モノペグ化したインスリンの含量が最大になることを確認した。pHが低い条件では、ブリッジ構造のペグ化不純物の含量が、イソプロパノールの含量が高くなるほど増加し、これによりモノペグ化したインスリンの収率が減少した。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
実施例 3: モノペグ化したインスリンと兔疫グロブリンFc複合体の製造
インスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体を製造するために、実施例 1の方法を用いて得たモノペグ化したインスリンと兔疫グロブリンFcのモルビが1:1になるようにし、全体のタンパク質濃度を20〜50 mg/mlにし、25℃で15〜17時間反応させた。この時、反応液は100mM HEPES、22 mM リン酸カリウム、10 ％エタノール、pH8.2であり、さらに還元剤である20mM NaCNBH3を添加した。
【００７４】
反応が終結した後、反応液はSource 15Q(GE ヘルスケア)カラムを用いた1次精製によって、残留した兔疫グロブリンFcおよびモノペグ化したインスリンを除去した。この時、Tris-HCl (pH7.5)バッファとNaCl濃度勾配を用いて溶出した。
【００７５】
その後、Source 15ISO (GE ヘルスケア)を2次カラムとして用い、残留した兔疫グロブリンFcおよびマルチペグ化したインスリン複合体を除去してインスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体を得た。この時、Tris-HCl (pH7.5)が含まれた硫酸アンモニウム の濃度勾配を用いて溶出した。
【００７６】
溶出したインスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体は、RP-HPLC、SE-HPLC、そしてSDS PAGEを用いて分析し、98％以上の高純度で製造されたことを確認した(図4 および 5)。
【００７７】
実施例 4: 持続型インスリン複合体の生体内消失半減期の測定
実施例3で製造したインスリン-PEG-兔疫グロブリンFc複合体形態の持続型インスリン結合体の生体内持続性を確認するため、正常な雄ラット(Normal SD rat)を用いて静脈投与および皮下投与により薬物動態を確認した。正常な雄ラットに持続型インスリン複合体を0.1mg/kg (インスリン基準)で単回静脈および皮下投与した後、インスリンELISAキットを用いて経時的な血中濃度の変化を測定し、測定された値で WinNonlin 5.2を用いて薬物動態パラメータ値を算出した。持続型インスリン結合体の生体内消失半減期は、静脈投与時に15.73時間、皮下投与時に16.98時間で約0.5時間の天然型インスリンに比べて30倍以上長い持続性を示すことを確認し、皮下投与時の生物学的利用能は54％程度になることを確認した(図6)。
【００７８】
実施例 5: インスリン複合体のin vivo 効力試験
インスリン複合体のin vivo 効力を比較するために、ストレプトゾトシン(Streptozotocin)で糖尿病が誘発されたラットにおける血糖降下効力比較試験を行った。16時間絶食した正常のラットに10 mMのクエン酸緩衝溶液(pH4.5)に溶かしたストレプトゾトシンを60mg/kgのレベルで腹腔投与した後、糖尿を誘発させた。その後、血糖が 500mg/dL以上高くなったラットにインスリン複合体を0.5 mg/kgの用量で単回皮下投与し、その後血糖降下効力を比較したところ、インスリン結合体の血糖降下は、投与後、約 4日間持続し、5日目に血糖がビヒクル(vehicle)の水準まで上昇することを確認した(図7)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月15日(2018.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体の製造方法であって、
(1)有機溶媒を含有する反応溶液において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと反応させ、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと連結させる工程、及び、
(2)前記ステップ(1)の反応混合物から非ペプチド性ポリマーが共有結合した生理活性ポリペプチドの結合体を分離および精製する工程、
を含み、
前記有機溶媒が、1〜10の炭素原子を有するアルコールであり、
前記反応溶液が、反応溶液の総体積に基づき、体積で30〜55％の量で有機溶媒を含み、
前記反応溶液が、4.5〜6.5のpHを有し、
前記非ペプチド性ポリマーが、２つ又は３つの反応性末端基を有し、
前記生理活性ポリペプチドが、２つ以上のN末端を有する、
方法。
【請求項２】
前記有機溶媒が、イソプロパノール、エタノールおよびメタノールからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記反応溶液が、反応溶液の総体積に基づき、体積で45〜55％の量で有機溶媒を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記生理活性ポリペプチドが、黄体刺激ホルモン(LTH)、濾胞刺激ホルモン(FSH)、血液凝固第VIII因子、血液凝固第VII因子、アディポネクチン、抗体、抗体断片scFv、Fab、Fab'、F(ab')2およびリラクシンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記非ペプチド性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコールコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記非ペプチド性ポリマーの前記反応性末端基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオールおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記非ペプチド性ポリマーが、２つのアルデヒド末端基を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記分離および精製が、イオン交換クロマトグラフィーによって行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応溶液が、クエン酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ペプチド性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコールコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルエチルエーテルおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記生理活性ポリペプチドのアミン基またはチオール基に前記非ペプチド性ポリマーが結合する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
生理活性ポリペプチド複合体の製造方法であって、
(1)請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法により、生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体を製造する工程、及び
(2)前記結合体の非ペプチド性ポリマーに兔疫グロブリンFc領域、抗体、アルブミンおよびトランスフェリンからなる群から選択されるキャリアを共有結合で連結し、非ペプチド性ポリマーの末端がそれぞれ前記生理活性ポリペプチドおよび前記キャリアと結合したペプチド複合体を生成する工程、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記兔疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群から選択される1個〜4個のドメインからなる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記兔疫グロブリンFc領域が、ヒンジ領域をさらに含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記兔疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgMに由来するFc領域である、請求項13に記載の方法。
【請求項１７】
前記兔疫グロブリンFc領域が、IgG4Fc領域である、請求項13に記載の方法。
【請求項１８】
前記兔疫グロブリンFc領域が、ヒト非糖鎖化IgG4Fc領域である、請求項13に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
実施例 5: インスリン複合体のin vivo 効力試験
インスリン複合体のin vivo 効力を比較するために、ストレプトゾトシン(Streptozotocin)で糖尿病が誘発されたラットにおける血糖降下効力比較試験を行った。16時間絶食した正常のラットに10 mMのクエン酸緩衝溶液(pH4.5)に溶かしたストレプトゾトシンを60mg/kgのレベルで腹腔投与した後、糖尿を誘発させた。その後、血糖が 500mg/dL以上高くなったラットにインスリン複合体を0.5 mg/kgの用量で単回皮下投与し、その後血糖降下効力を比較したところ、インスリン結合体の血糖降下は、投与後、約 4日間持続し、5日目に血糖がビヒクル(vehicle)の水準まで上昇することを確認した(図7)。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体の製造方法であって、
(1)有機溶媒を含有する反応溶液において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと反応させ、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと連結させる工程、及び、
(2)前記ステップ(1)の反応混合物から非ペプチド性ポリマーが共有結合した生理活性ポリペプチドの結合体を分離および精製する工程、
を含む、方法。
〔２〕前記有機溶媒が、1〜10の炭素原子を有するアルコールである、前記〔1〕に記載の方法。
〔３〕前記アルコールが、イソプロパノール、エタノールおよびメタノールからなる群から選択される、前記〔2〕に記載の方法。
〔４〕前記反応溶液が、反応溶液の総体積に基づき、体積で10〜60％の量で有機溶媒を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔５〕前記反応溶液が4.5〜7.0のpHを有する、前記〔1〕に記載の方法。
〔６〕前記生理活性ポリペプチドが、二つ以上のN末端を有する、前記〔1〕に記載の方法。
〔７〕前記生理活性ポリペプチドが、インスリン、黄体刺激ホルモン(LTH)、濾胞刺激ホルモン(FSH)、血液凝固第VIII因子、血液凝固第VII因子、アディポネクチン、抗体、抗体断片scFv、Fab、Fab'、F(ab')2およびリラクシンからなる群から選択される、前記〔1〕に記載の方法。
〔８〕前記インスリンが、天然型インスリン、変異体、天然インスリンの一つ以上のアミノ酸における置換、付加、欠失、修飾のいずれか一つ若しくはそれらの組み合わせにより製造される誘導体、またはそれらの断片である、前記〔7〕に記載の方法。
〔９〕前記インスリンのβ鎖のN末端に前記非ペプチド性ポリマーが結合する、前記〔7〕に記載の方法。
〔１０〕前記インスリンまたはインスリン誘導体のアミン基またはチオール基に前記非ペプチド性ポリマーが結合する、前記〔8〕に記載の方法。
〔１１〕前記非ペプチド性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコールコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、前記〔1〕に記載の方法。
〔１２〕前記非ペプチド性ポリマーが、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオールおよびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される反応基を有する、前記〔1〕に記載の方法。
〔１３〕前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである、前記〔12〕に記載の方法。
〔１４〕前記非ペプチド性ポリマーが、両末端または3末端に反応基を有する、前記〔1〕に記載の方法。
〔１５〕前記非ペプチド性ポリマーが、両末端に反応基としてアルデヒド基を有する、前記〔1〕に記載の方法。
〔１６〕前記分離および精製が、イオン交換クロマトグラフィーによって行われる、前記〔1〕に記載の方法。
〔１７〕生理活性ポリペプチド複合体の製造方法であって、
(1)前記〔1〕〜〔16〕のいずれか一項に記載の方法により、生理活性ポリペプチドおよび非ペプチド性ポリマーの結合体を製造する工程、及び
(2)前記結合体の非ペプチド性ポリマーに兔疫グロブリンFc領域、抗体、アルブミンおよびトランスフェリンからなる群から選択されるキャリアを共有結合で連結し、非ペプチド性ポリマーの末端がそれぞれ前記生理活性ポリペプチドおよび前記キャリアと結合したペプチド複合体を生成する工程、
を含む、方法。
〔１８〕前記兔疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群から選択される1個〜4個のドメインからなる、前記〔17〕に記載の方法。
〔１９〕前記兔疫グロブリンFc領域が、ヒンジ領域をさらに含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔２０〕前記兔疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgMに由来するFc領域である、前記〔17〕に記載の方法。
〔２１〕前記兔疫グロブリンFc領域が、IgG4Fc領域である、前記〔17〕に記載の方法。
〔２２〕前記兔疫グロブリンFc領域が、ヒト非糖鎖化IgG4Fc領域である、前記〔17〕に記載の方法。
【外国語明細書】
2018150332000001.pdf