(57)【要約】【課題】高濃度の脂肪酸の存在下でも、脂肪酸の分解が可能な脂肪酸分解菌、それを含む脂肪酸分解菌製剤及びそれらを用いた脂肪酸の分解方法を提供する。【解決手段】Candida  orthopsilosis  HFA40-c（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１２）等の、カンジダ・オルトプローシス（Candida  orthopsilosis）属に属し、オレイン酸等の脂肪酸含有培地で生育でき、該脂肪酸を分解できる脂肪酸分解菌、それを含む脂肪酸分解菌製剤及びそれらを用いた脂肪酸の分解方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ・オルトプローシス（Candida  orthopsilosis）属に属し、油脂含有培地及び脂肪酸含有培地で生育でき、該脂肪酸を分解できることを特徴とする脂肪酸分解菌。
【請求項２】
前記脂肪酸がオレイン酸であることを特徴とする請求項１に記載の脂肪酸分解菌。
【請求項３】
Candida  orthopsilosis  HFA40-c（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１２）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の脂肪酸分解菌。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項記載の脂肪酸分解菌の１又は複数を含むことを特徴とする脂肪酸分解菌製剤。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の脂肪酸分解菌又は請求項４に記載の脂肪酸分解菌製剤を用いて、油脂含有廃水に含まれ、又は油脂含有廃水から分離した固形状の脂肪酸を分解させる工程を有することを特徴とする脂肪酸の分解方法。
【請求項６】
油脂分解剤を、前記脂肪酸分解菌又は前記脂肪酸分解菌製剤と併用することを特徴とする請求項５に記載の脂肪酸の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な脂肪酸分解菌、それを含む脂肪酸分解菌製剤及びそれらを用いた脂肪酸の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食用油脂を多用する食品工場、食肉加工場、飲食店等において、廃水に含まれる油脂が大量に下水に流入すると、固化して配管の閉塞を引き起こす。そこで、レストランやホテル、食堂、給食センターなどの全ての業務用厨房から排出される汚水を公共の下水に直接排水することは禁止されており、廃水中の油脂を堰き止めるグリーストラップ（阻集器）等で浄化してから排出することが法律で義務づけられている（水質汚濁防止法第１４条の６、下水道法第１２条等）。
【０００３】
飲食店や食肉加工場等のグリーストラップに堰き止められ、蓄積した油脂は、その機能を著しく低下させるだけでなく、悪臭や、害虫の発生など食品を扱う事業所にとっては深刻な問題を発生させる。また、過剰蓄積により下水に流出した油脂は配管の閉塞のみならず、流れ着いた先において腐敗や水質汚濁を引き起こしており、環境問題の観点からも問題となっている。
【０００４】
そこで、グリーストラップに蓄積された油脂を分解及び／又は除去するための種々の処理方法が提案されてきた。例えば、特許文献１には、グリーストラップ内に溜まった汚水中の油分を除去することができる油分乳化剤と、消臭剤と、バクテリア等及び酵素とを混合したことを特徴とするグリーストラップ内消臭洗浄剤が開示されている。
【０００５】
また、種々の微生物の働きにより油脂の分解を図る技術が知られている。例えば、特許文献２には、ロドトルラ・パシフィカ（Rhodotrula  pacifica）等を含み、グリーストラップ内の温度変化にも対応可能な混合微生物が開示されている。また、特許文献３及び特許文献４には、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia  cepacia）菌を油脂分解菌として使用することが開示されている。
【０００６】
特許文献１記載のグリーストラップ内消臭洗浄剤中の油分乳化剤による油脂の可溶化は一時的なものであるため、やはり、油脂が下水道管内で凝集及び固化し、配管の閉塞を引き起こすおそれがある。また、グリーストラップ内の廃水のｐＨは酸性側に傾きがちであるが、特許文献２〜４記載のものを含め、これまで廃食用油の分解処理に用いられている微生物の多くは、酸性の使用環境下での油脂の分解能力が十分でない上に、現場の環境に適応することができずに増殖まで至らない。
【０００７】
そこで、酸性条件下で生育が可能であり、かつ高い油脂分解能を有する油脂分解菌として、バークホルデリア・エスピー（Burkholderia  sp.）  ＡｃＬ３−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９５２）及びバークホルデリア・エスピー（Burkholderia  sp.）  ＡｃＬ１３−２（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９５３）が見出されている（特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−２９７９２号公報
【特許文献２】特開２００８−１４２０４２号公報
【特許文献３】特開２００４−２４２５５３号公報
【特許文献４】特開２００２−１２５６５９号公報
【特許文献５】特許第５７９０９８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
微生物を用いた廃油脂の処理の根幹をなすのは、リパーゼに触媒されるトリグリセリドの加水分解反応である。これにより、脂肪酸とグリセリンが生成するが、生成物の１つである中鎖又は長鎖脂肪酸も、水への溶解度が低いため、油脂と同様の問題を引き起こす場合が多い。よって、廃水中の油脂を処理するには、分解産物である脂肪酸も同時に分解して水と二酸化炭素にする必要がある。
【００１０】
特許文献５記載の油脂分解菌を使用して油脂分解を行った場合、油脂濃度１０ｇ／Ｌ位までは、油脂をほぼ完全に水及び二酸化炭素に分解することが可能であることが分かっているが、さらに濃度が高くなると、徐々に脂肪酸が蓄積し、油脂の加水分解反応が停滞することが分かっている。一般的に、油脂の分解反応生成物である脂肪酸は、油脂の分解反応の化学平衡を逆反応側にシフトさせる上、微生物に対して殺菌効果を示すおそれがある。
【００１１】
油脂が蓄積したグリーストラップ等の実際の使用環境下では、処理対象は、必然的に高濃度の油脂である。したがって、高濃度の油脂を処理するには、油脂の分解産物である高濃度の脂肪酸も積極的に分解する必要がある。しかしながら、特許文献２〜５に記載の油脂分解能を有する微生物は、いずれも、脂肪酸濃度が高くなるにつれて脂肪酸分解能が低下する。
【００１２】
本発明はかかる状況に鑑みてなされたものであり、高濃度の脂肪酸の存在下でも、脂肪酸の分解が可能な脂肪酸分解菌、それを含む脂肪酸分解菌製剤及びそれらを用いた脂肪酸の分解方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、カンジダ・オルトプローシス（Candida  orthopsilosis）属に属し、油脂含有培地及び脂肪酸含有培地で生育でき、該脂肪酸を分解できる脂肪酸分解菌を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１４】
本発明の第１の態様に係る脂肪酸分解菌において、前記脂肪酸がオレイン酸であってもよい。
【００１５】
本発明の第１の態様に係る脂肪酸分解菌のうち、好ましいものの１つは、Candida  orthopsilosis  HFA40-c（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１２）である。
【００１６】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に係る脂肪酸分解菌の１又は複数を含む脂肪酸分解菌製剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１７】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に係る脂肪酸分解菌又は本発明の第２の態様に係る脂肪酸分解菌製剤を用いて、油脂含有廃水に含まれ、又は油脂含有廃水から分離した固形状の脂肪酸を分解させる工程を有する脂肪酸の分解方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１８】
本発明の第３の態様に係る脂肪酸の分解方法において、油脂分解剤を、前記脂肪酸分解菌又は前記脂肪酸分解菌製剤と併用することが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の脂肪酸分解菌は、高濃度の脂肪酸の存在下でも、脂肪酸の分解が可能であるため、既存の油脂分解剤と併用することにより、食品工場、食肉加工場、飲食店等の排水設備に備えられたグリーストラップ等に高濃度に蓄積された油脂及び脂肪酸を、水と二酸化炭素に分解できる。油脂分解剤として、油脂分解能を有する微生物を組み合わせて用いる場合には、本発明の脂肪酸分解菌が脂肪酸を分解するため、油脂分解能を有する微生物が、脂肪酸によるｐＨの低下や殺菌作用により失活することを回避することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】オレイン酸分解試験の結果を示すガスクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
【００２２】
本発明の第１の実施の形態に係る脂肪酸分解菌は、カンジダ・オルトプローシス（Candida  orthopsilosis）属に属し、油脂含有培地及び脂肪酸含有培地で生育でき、該脂肪酸を分解できる。
【００２３】
脂肪酸分解菌の探索は、例えば次のようにして行われる。まず、グリーストラップ廃水や各地の土壌等を採取し、オレイン酸等の脂肪酸を含む最少培地に適量添加し培養する。最少培地中で油脂を炭素源として利用できる微生物がサンプル中に存在する場合は、菌体の増殖により、培養液が白濁する。白濁したサンプルについて植え継ぎを繰り返し、集積培養を行った後、培養液を脂肪酸含有寒天培地上に塗布し、脂肪酸分解菌を選抜する。その後、選抜した候補菌を栄養培地上で単離する。
【００２４】
上記方法によって単離される脂肪酸分解菌の分類、同定は、任意の公知の方法を用いて行うことができる。分類、同定方法の具体例としては、光学顕微鏡による微細形態の観察、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼ−ションによるＤＮＡ類似度の判定等が挙げられるが、リボソームＲＮＡ及びリボソームＤＮＡの部分塩基配列から分類、同定を行う方法が好ましく用いられる。リボソームＲＮＡ及びリボソームＤＮＡの部分塩基配列の決定には、ＰＣＲ法等の任意の公知の方法を用いることができる。ＰＣＲ法を用いる場合、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ等のリボソームＲＮＡを適宜選択して用いてもよいが、近年、酵母等の同定に広く用いられている、２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２リボソームＤＮＡの部分塩基配列を用いてもよい。プライマーとしては任意のものを適宜選択して用いることができる。また、部分塩基配列の相同性の決定には、ＢＬＡＳＴ等の任意の公知のソフトウェアを用いることができる。
【００２５】
このようにして、高濃度の脂肪酸存在下で脂肪酸を効率よく分解する数株の脂肪酸分解菌を取得した。上述の手順により得られる脂肪酸分解菌のうち、本実施の形態に係る脂肪酸分解菌として用いられるものは、カンジダ・オルトプローシス（Candida  orthopsilosis）属に属するものである。増殖可能な初発ｐＨ範囲は、例えば、２．５〜１０．０であり、高濃度の脂肪酸存在下においても、脂肪酸の殺菌作用を受けることなく増殖可能であり、油脂や脂肪酸を分解することができる。
【００２６】
これらの菌株の同定のために、２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の部分塩基配列を決定した結果、特に高い脂肪酸分解活性を示す菌株が、カンジダ・オルトプローシス（Candida  orthopsilosis）属に属する新規微生物であることが判明し、Candida  orthopsilosis  HFA40-c（詳細については後述する。）と命名した。本菌株は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１２で、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されている。
【００２７】
本発明の脂肪酸分解菌を用いた油脂処理剤は、例えば、液体栄養培地に脂肪酸分解菌を適量添加し、２５〜３０℃で、１日間好気条件下で培養することで作製することができる。必要に応じて、他の微生物と混合培養してもよい。
【００２８】
本発明の第２の実施の形態に係る脂肪酸分解菌製剤は、本発明の第１の実施の形態に係る１又は複数の脂肪酸分解菌を含んでいる。製剤は、グリーストラップ及びそれに類似する浄化槽等に使用される微生物製剤と同様の任意の形態を取ることができる。油脂分解を促進させるために、脂肪酸分解菌製剤に、油脂の表面積を広げるための界面活性剤やリパーゼ活性を促進させるミネラル等を添加することも可能である。更に、脂肪酸分解菌製剤は、油脂分解剤を含んでいてもよい。油脂分解剤としては、リパーゼ等の酵素製剤、油脂分解能を有する微生物等が挙げられる。後者の好ましい例としては、バークホルデリア・エスピー（Burkholderia  sp.）  ＡｃＬ３−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９５２）及びバークホルデリア・エスピー（Burkholderia  sp.）  ＡｃＬ１３−２（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９５３）等が挙げられる。これらの微生物は、酸性ｐＨ下でも高い脂質分解能を示すため、脂肪酸濃度が高い油脂含有廃水やグリーストラップ上で好適に用いることができ、脂肪酸分解菌と組み合わせることにより、脂肪酸の蓄積に伴う活性の低下を回避しつつ、油脂及び脂肪酸を効率よく分解除去することができる。
【００２９】
本発明の第３の実施の形態に係る油脂又は脂肪酸の分解方法は、本発明の第１の実施の形態に係る脂肪酸分解菌又は本発明の第２の実施の形態に係る脂肪酸分解菌製剤を用いて、油脂含有廃水、固形状の油脂又は脂肪酸を処理し、該廃水油脂含有廃水、固形状の油脂又は脂肪酸の油脂及び／又は脂肪酸を分解させる工程を有している。処理に際しては、グリーストラップ中に滞留している油脂含有排水に製剤を投入すればよく、増殖した脂肪酸分解菌により、油脂含有廃水中に含まれ、或いは、固体状又は液滴状の形態で浮遊している脂肪酸が分解される。上述の脂肪酸分解菌又は脂肪酸分解菌製剤を、油脂分解剤と併用してもよい。油脂分解剤については、上で説明した通りであるため、ここでは詳細な説明を省略する。
【実施例】
【００３０】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：高濃度オレイン酸を分解する微生物のスクリーニング
植物油脂と動物油脂の種類を問わず、油脂を構成する主な脂肪酸としてオレイン酸が挙げられる。そこで、高濃度オレイン酸を含む酸性条件下で生育可能で、オレイン酸の殺菌作用の影響を受けず、かつオレイン酸を効率的に分解する微生物のスクリーニングを行った。
【００３１】
まず、各地の土壌やグリーストラップ廃水をサンプリングし、各々下記に示す組成を有する培地１及び培地２に適宜添加し、２８℃で３日間培養した。培養したサンプルのうち、白濁したものについて、培養液を３回植え継ぐ集積培養を行った。オレイン酸分解菌が集積された培養液を寒天培地上で単離し、オレイン酸分解試験に供した。
【００３２】
培地１の組成
リン酸二水素カリウム      ０．６ｇ
リン酸水素二カリウム      １．６ｇ
硝酸アンモニウム          １．０ｇ
硫酸マグネシウム七水和物  ０．２ｇ
硫酸亜鉛七水和物          ０．０１ｇ
塩化鉄六水和物            ０．０１ｇ
硫酸マンガン五水和物      ０．０１ｇ
塩化カルシウム            ０．０１ｇ
オレイン酸                ５０．０ｇ
蒸留水                    １Ｌ
【００３３】
培地２の組成
培地１に、下記濃度になるよう成分を添加した。
ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ  酵母エキス  １．０ｇ
日本製薬ハイポリペプトン      ０．５ｇ
オレイン酸                    ５０．０ｇ
蒸留水                        １Ｌ
【００３４】
オレイン酸分解試験
スクリーニング時に使用した培地を試験管に用意し、前培養した単離株を植菌した。２８℃で３日間振盪した後、Bligh-Dyer法により油脂類の抽出を行った。抽出したサンプルを薄層クロマトグラフィーに供し、オレイン酸残量の少ないものを候補株とした。上記のような方法で候補株の選抜を繰り返した結果、福岡県内のツバキの木の下の土壌より、５０ｇ／Ｌのオレイン酸を効率的に分解する酵母１株を取得し、Candida  orthopsilosis  HFA40-c（以下、「HFA40-c株」と略称する場合がある。）と命名した。本菌株は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１２で、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託済みである。
【００３５】
同定試験（簡易形態観察、生理性状試験）
HFA40-c株を寒天培地に植菌して、以下の条件で培養した。
培地：Difco  YM  Broth＋寒天培地（YM  agar）
培養温度：２５℃
培養期間：１週間
【００３６】
培養後の簡易形態観察の結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2018042514.tif 000003
【００３８】
生理性状試験の結果を表２に示す。
【００３９】
記号の説明
「＋」：陽性反応
「−」：陰性反応
「Ｄ」：試験開始後１週間以上の時間をかけて徐々に陽性反応が認められた
「Ｌ」：試験開始２週間以降に急速に陽性反応が認められた
【００４０】
【表２】
2018042514.tif 000004
【００４１】
２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列解析
抽出したHFA40-c株のＤＮＡをＰＣＲにより増幅させた。その後、サイクルシークエンス法により２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列を決定した（下記参照）。得られた配列について国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎＢａｎｋ）に対するＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、子嚢菌系酵母の一種であるCandida  orthopsilosisに高い相同性を示した。
【００４２】
２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列は、下記のとおりであった。
AAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGCCTCTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGGGCGGTAGGACAATTGCAAAGAAATGTGGCACTGCCTCGGTAGTGTGTTATAGTCTTTGTCGATACTGCCAGCCTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGC
【００４３】
以上の簡易形態観察、生理性状試験及び２６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列解析の結果から、HFA40-c株はCandida  orthopsilosisであると同定された。
【００４４】
実施例２：脂肪酸分解試験
YM液体培地にHFA40-c株と対象菌株２種（Candida  orthopsilosis  NBRC0585、Candida  parapsilosis  NBRC  1396、Candida  lipolytica  NBRC  1548）をそれぞれ植菌し、２４時間振盪培養し、前培養液とした。オレイン酸分解試験用液体培地にオレイン酸５０ｇ／Ｌ添加し、前培養液を１％植菌することでオレイン酸分解試験を開始した。２８℃で７２時間振盪した後、Bligh-Dyer法により油脂類の抽出を行った。抽出したサンプルを、ガスクロマトグラフィーに供し、オレイン酸の残量を分析した。
【００４５】
ＹＭ液体培地組成
グルコース                  １０ｇ
日本製薬ハイポリペプトン    ５ｇ
ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ酵母エキス  ３ｇ
麦芽エキス                  ３ｇ
蒸留水                      １Ｌ
ｐＨ                        無調整
【００４６】
オレイン酸分解試験用液体培地
Ｄｉｆｃｏ酵母ニトロゲンベース（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含）
ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ酵母エキス                          ５．０ｇ
日本製薬ハイポリペプトン                            ２．５ｇ
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート  ５．０ｇ
蒸留水                                              １Ｌ
【００４７】
ガスクロマトグラフィー条件
システム：ＧＣ／ＦＩＤ
カラム：InertCap  FFAP  ０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｍ  ｄｆ＝０．２５μｍ
カラム温度：６０℃（２分保持）−１０℃／分−２４０℃（１０分保持）
キャリアガス：Ｈｅ  １００ｋＰａ
【００４８】
表３及び図１に、ガスクロマトグラフィーによる分析結果を示す。菌を添加していないものを１００％としてオレイン酸の残存量を算出した。対照として使用した他のカンジダ属を用いた実験では、オレイン酸が残存したのに対して、HFA40-c株はオレイン酸を１％にまで減少させることができた。
【００４９】
【表３】
2018042514.tif 000005
【００５０】
実施例３：増殖可能な初発ｐＨ範囲の確認
ＹＭ液体培地にHFA40-c株を植菌し、２８℃で２４時間培養し、前培養液とした。ＹＭ液体培地に塩酸及び水酸化ナトリウムを添加してｐＨ２．５から１１．０の培地を０．５区切りで作成し、試験管に各々分注した。前培養液を１％植菌して、２８℃で２４時間振盪培養した。その後、分光光度計で６００ｎｍの吸光度を測定し、各初発ｐＨにおける増殖可能範囲と至適初発ｐＨを見出した。
【００５１】
実験の結果、本菌株は初発ｐＨ２．５〜１０．０の範囲で増殖可能で、至適初発ｐＨは３．０〜８．５であった。
【００５２】
実施例４：増殖限界温度の確認
YM寒天培地にHFA40-c株を画線し、各温度で４８時間培養した。コロニーが明らかに形成されたものを陽性とした。
【００５３】
その結果、４０℃で陽性、４２℃で陰性であった。つまり、ＹＭ寒天培地における増殖限界温度が４０℃と４２℃の間にあるということが明らかになった。
【受託番号】
【００５４】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３１２
【図１】
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【配列表】
2018042514000001.app