(57)【要約】      （修正有）【課題】分子量の制御や物性の制御が可能なα−１，３−グルカンの新規合成方法、及びα−１，３−グルカンのエステル誘導体を用いたフィルム材料等の提供。【解決手段】スクロースを原料として用いるα−１，３−グルカンの製造方法であって、３０℃以下の温度条件下で、スクロースとα−１，３−グルカン合成酵素とを反応させる反応工程を含み、反応工程により生成するα−１，３−グルカンが、α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合した構造を有し、２０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロースを原料として用いるα−１，３−グルカンの製造方法であって、
３０℃以下の温度条件下で、スクロースとα−１，３−グルカン合成酵素とを反応させる反応工程を含み、
前記反応工程により生成するα−１，３−グルカンが、α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合した構造を有し、２０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、該製造方法。
【請求項２】
前記α−１，３−グルカン合成酵素が、虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）由来の酵素である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記α−１，３−グルカン合成酵素が、虫歯菌のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子をクローニングして得られた組み換え酵素である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記組み換え酵素が、ヒスチジンタグを有する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記反応工程が、５℃〜２０℃の温度条件下で行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記反応工程が、ｐＨ５．０以上、６．０未満の条件で行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記反応工程が、界面活性剤の存在下で行われる請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記α−１，３−グルカンの重量平均分子量（Ｍｗ）が、７０×１０４以上である、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記α−１，３−グルカンの多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０〜２．５の範囲である、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法により得られたα−１，３−グルカンにおけるＯＨ基をエステル化する工程を含む、α−１，３−グルカンエステル誘導体の製造方法。
【請求項１２】
α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合した構造を有し、２０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有するα−１，３−グルカン。
【請求項１３】
７０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１２に記載のα−１，３−グルカン。
【請求項１４】
１．０〜２．５の範囲の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を有する、請求項１２又は１３に記載のα−１，３−グルカン。
【請求項１５】
グルコース単位がα−１，３−グリコシド結合のみにより重合しており、かつグルコース及び他の糖による分岐を有しない、請求項１２〜１４のいずれかに記載のα−１，３−グルカン。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれかに記載のα−１，３−グルカンにおけるＯＨ基をエステル基（ＯＲ基）に置換した構造を有する、α−１，３−グルカンエステル誘導体。
【請求項１７】
前記Ｒが、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基よりなる群から選択される、請求項１６に記載のα−１，３−グルカンエステル誘導体。
【請求項１８】
融点が２８０〜３４０℃であり、かつ、ガラス転移温度が１００〜２００℃の範囲である、請求項１６又は１７に記載のα−１，３−グルカンエステル誘導体。
【請求項１９】
請求項１６〜１８に記載のα−１，３−グルカンエステル誘導体を含む構造体。
【請求項２０】
前記構造体が、射出成形、圧縮成形、ブロー成形、インフレーション成形エンゲル成形、押出成形、押出ラミネート成形、回転成形、カレンダー成形、真空成型、スタンピング成形、スプレーアップ成形、積層成形、注形法、注入成形、手積み成形、低圧成形、トランスファー成形、発泡成形、ブロー成形、又はTダイ法により成形されてなる、請求項１９に記載の構造体。
【請求項２１】
前記構造体がフィルムである、請求項１９に記載の構造体。
【請求項２２】
３５ＭＰａ以上の破壊強度を有する、請求項１９〜２１のいずれかに記載の構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子量を有するα−１，３−グルカンの酵素を用いた合成方法に関する。また、当該α−１，３−グルカンのエステル誘導体を用いた構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、二酸化炭素排出や環境問題等により、石油由来に替わり、再生産可能な植物バイオマスを原料とした高強度で耐熱性に優れたバイオベースプラスチックの開発が求められています。とりわけ、天然高分子の一つである多糖類を原料とするバイオベースプラスチックが注目されおり、これまで利用されてきた天然多糖類としてはセルロース（β−１，４−グルカン）、デンプン（α−１，４−グルカン）、キシラン（β−１，４−キシラン）等の植物由来のものや、カードラン（β−１，３−グルカン）やデキストラン（α−１，６−グルカン）等の微生物が生産するものがある。かかる天然多糖類由来の高分子は、由来の糖ユニットの種類、結合部位、アノマーの違いにより、高分子としての物性が大きく異なる。
【０００３】
従来より開発されているバイオベースプラスチックは、デンプンやセルロースをグルコースにまでいったん単糖化した後、微生物の発酵合成によりプラスチックの基本構成単位となるモノマーを生合成し、そのモノマーを金属触媒によりポリマー化する方法がとられている。しかし、このような方法では、自然が作りだした精緻で特徴的な結合や構造を破壊しており、バイオマスの特徴を活かした新規なバイオベースプラスチックを創製することはできない。また、デンプンやセルロースに代表される高分子多糖類は熱をかけると分解し着色することから、熱により形を自在に変えられる熱可塑性と呼ばれるプラスチックとしての重要な性質を有することは困難である。
【０００４】
一方で、自然界にはこれらの他にも様々な構造の多糖類が知られており、新規な物性が期待されているが、原料生産のシステムが構築できていないため新規材料の研究開発が遅れている。
【０００５】
例えば、虫歯菌のバイオフィルムやある種の糸状菌の細胞壁に含まれている粘着性のムタンは、グルコースがα−１，３−グリコシド結合により重合結合した高分子（α−１，３−グルカン）である（非特許文献１）。天然に存在するムタンは、α−１，３−グリコシド結合を主成分とするものの、他に複雑な分岐構造を有する複合体として知られている。虫歯菌由来のムタンは、菌体が細胞外へ分泌するグルコシルトランスフェラーゼ（Ｇｔｆ）の中のＧｔｆＪと呼ばれる合成酵素により、スクロースを基質として菌体外で合成される。通常、虫歯菌はＧｔｆJ以外にも複数種のＧｔｆを同時に分泌するので、複雑な分岐構造を有するグルカンが合成される。かかるムタンを原料としてバイオプラスチックを作成する場合、精製には複雑な工程を必要とし、精製物の純度や分子量について品質の制御は困難であるという問題があった。
【０００６】
したがって、分子量の制御や物性の制御が可能なα−１，３−グルカンの合成方法の構築が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｏｅｓｃｈｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５０、３５３−３８０、１９８６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、分子量の制御や物性の制御が可能なα−１，３−グルカンの新規合成方法を提供すること、及びかかるα−１，３−グルカンのエステル誘導体を用いたフィルム材料等の構造物を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、虫歯菌由来の組み換え酵素を用いて、天然のスクロースを原料とし、水系・ワンポット合成により、グルコースがα−１，３−グリコシド結合のみで重合した分岐のない完全直鎖状で高分子量を有するα−１，３−グルカンを大量合成することができ、かつ、種々の合成条件を調整することでその分子量や物性を制御可能であることを新たに見出した。さらに、かかる合成方法により得られるα−１，３−グルカンのエステル誘導体から成型したフィルムが、高い耐熱性と優れた機械的性質を併せ持ち、エンジニアリングプラスチックとして好適であることを見出した。これらの新たな知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞スクロースを原料として用いるα−１，３−グルカンの製造方法であって、３０℃以下の温度条件下で、スクロースとα−１，３−グルカン合成酵素とを反応させる反応工程を含み、前記反応工程により生成するα−１，３−グルカンが、α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合した構造を有し、２０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、該製造方法；
＜２＞前記α−１，３−グルカン合成酵素が、虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）由来の酵素である、上記＜１＞に記載の製造方法；
＜３＞前記α−１，３−グルカン合成酵素が、虫歯菌のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子をクローニングして得られた組み換え酵素である、上記＜１＞に記載の製造方法；
＜４＞前記組み換え酵素が、ヒスチジンタグを有する、上記＜３＞に記載の製造方法；
＜５＞前記反応工程が、５℃〜２０℃の温度条件下で行われる、上記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の製造方法；
＜６＞前記反応工程が、ｐＨ５．０以上、６．０未満の条件で行われる、上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の製造方法；
＜７＞前記反応工程が、界面活性剤の存在下で行われる上記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の製造方法；
＜８＞前記界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）である、上記＜７＞に記載の製造方法；
＜９＞前記α−１，３−グルカンの重量平均分子量（Ｍｗ）が、７０×１０４以上である、上記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の製造方法； 
＜１０＞前記α−１，３−グルカンの多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０〜２．５の範囲である、上記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の製造方法；及び
＜１１＞上記＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の製造方法により得られたα−１，３−グルカンにおけるＯＨ基をエステル化する工程を含む、α−１，３−グルカンエステル誘導体の製造方法
を提供するものである。
【００１１】
別の態様において、本発明は、
＜１２＞α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合した構造を有し、２０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する直鎖状α−１，３−グルカン；
＜１３＞７０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、上記＜１２＞に記載の直鎖状α−１，３−グルカン；
＜１４＞１．０〜２．５の範囲の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を有する、上記＜１２＞又は＜１３＞に記載の直鎖状α−１，３−グルカン；及び
＜１５＞グルコース単位がα−１，３−グリコシド結合のみにより重合しており、かつグルコース及び他の糖による分岐を有しない、上記＜１２＞〜＜１４＞のいずれかに記載の直鎖状α−１，３−グルカン
を提供するものである。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、
＜１６＞上記＜１２＞〜＜１５＞のいずれかに記載の直鎖状α−１，３−グルカンにおけるＯＨ基をエステル基（ＯＲ基）に置換した構造を有する、α−１，３−グルカンエステル誘導体；
＜１７＞前記Ｒが、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基等よりなる群から選択される、上記＜１６＞に記載のα−１，３−グルカンエステル誘導体；
＜１８＞融点が２８０〜３４０℃であり、かつ、ガラス転移温度が１００〜２００℃の範囲である、上記＜１６＞又は＜１７＞に記載のα−１，３−グルカンエステル誘導体；
＜１９＞上記＜１６＞〜＜１８＞に記載のα−１，３−グルカンエステル誘導体を含む構造体；
＜２０＞前記構造体が、射出成形、圧縮成形、ブロー成形、インフレーション成形エンゲル成形、押出成形、押出ラミネート成形、回転成形、カレンダー成形、真空成型、スタンピング成形、スプレーアップ成形、積層成形、注形法、注入成形、手積み成形、低圧成形、トランスファー成形、発泡成形、ブロー成形、Tダイ法により成形されてなる、上記＜１９＞に記載の構造体；
＜２１＞前記構造体がフィルムである、上記＜１９＞に記載の構造体；及び
＜２２＞３５ＭＰａ以上の破壊強度を有する、上記＜１９＞〜＜２１＞のいずれかに記載の構造体を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、天然のスクロースを原料とし、水系・ワンポット合成によって、分岐のない完全直鎖状の構造を有し、かつ重量平均分子量（Ｍｗ）が２０×１０４以上のα−１，３−グルカンを大量合成することができる。また、種々の合成条件を調整することにより、α−１，３−グルカンの分子量や物性を簡便に制御可能である。特に、反応温度を低温とすることや界面活性剤を添加することで、より大きな分子量を有する完全直鎖状のα−１，３−グルカンを合成することができる。
【００１４】
さらに、かかるα−１，３−グルカンの分子構造中に存在する水酸基（ＯＨ基）をエステル基に置換することで、完全直鎖状のα−１，３−グルカンの構造を保持したまま、熱可塑性を有するエステル誘導体を得ることができる。かかるα−１，３−グルカンのエステル誘導体を用いてフィルム等の構造体を形成することで、高い耐熱性と優れた機械的性質を併せ持つ、バイオベースプラスチック製フィルム等の材料を提供することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、グルコシルトランフェラーゼ（ＧｔｆＪ）によるα−１，３−グルカンの合成反応を示した模式図である。
【図２】図２は、ＧｔｆＪを用いて試験管内合成したα−１，３−グルカンのＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は、α−１，３−グルカンの試験管内合成の反応温度の違いにおける分子量と多分散度への影響を示すグラフである。ここで、反応条件は、スクロース濃度１．０ Ｍ、ＧｔｆＪ量０．０１ Ｕ／ｍＬとした。
【図４】図４は、α−１，３−グルカンの試験管内合成の反応時間における分子量と多分散度への影響を示すグラフである。反応条件は、スクロース濃度１．０ Ｍ、ＧｔｆＪ量０．０１ Ｕ／ｍＬ、反応温度３０℃とした。
【図５】図５は、α−１，３−グルカン合成反応における界面活性剤添加の効果を示すグラフである。反応条件は、スクロース濃度１．０ Ｍ、ＧｔｆＪ量０．０１ Ｕ／ｍＬ、反応温度３０℃とした。
【図６】図６は、試験管内合成したα−１，３−グルカンのエステル化物の耐熱性を他のプラスチックと比較したグラフである。
【図７】図７は、α−１，３−グルカンエステル誘導体から調製したフィルムの写真である。
【図８】図８は、α−１，３−グルカンエステル誘導体から調製したキャストフィルムの機械特性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１７】
１．α−１，３−グルカンの製造
本発明の製造方法は、スクロースを原料とする酵素反応により、α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合した構造を有するα−１，３−グルカンを合成する方法である。当該合成の反応は、水を溶媒として用い、スクロースとα−１，３−グルカン合成酵素とを反応させる反応工程によるワンポット合成で行うことができる。当該反応工程のスキームを図１に示す（図中の「ＧｔｆＪ」が、α−１，３−グルカン合成酵素である）。
【００１８】
図１に示すように、スクロースは、α−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−フルクトースがα−１，２−グリコシド結合によって結合した構造を有する非還元二糖類である。当該スクロースとα−１，３−グルカン合成酵素の反応により、スクロースがグルコースとフルクトースに分解され、グルコース単位がα−１，３−グリコシド結合により直鎖状に重合したポリマーであるα−１，３−グルカンが生成する。一方、フルクトースは反応の副産物として放出される。
【００１９】
スクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程は、スクロース水溶液にα−１，３−グルカン合成酵素を含む水溶液を添加する等の方法により行うことができる。水溶液中のスクロース濃度は、好ましくは０．０１Ｍ〜１．０Ｍを用いることができる。スクロースを低濃度とすることでより分子量の大きなα−１，３−グルカンを得ることができるため、より好ましくは、スクロース濃度は、０．０５Ｍ〜０．５Ｍであることができる。原料となるスクロースは、市販の食品用途及びその他用途のものを用いることができる。
【００２０】
本発明の製造方法で用いられるα−１，３−グルカン合成酵素は、スクロースを分解しながらグルコースをα−１，３−グリコシド結合で重合させることができる酵素であり、一般に、グルカンスクラーゼまたはグルコシルトランスフェラーゼ（「Ｇｔｆ」又は「ＧｔｆＪ」）とも呼ばれる。当該α−１，３−グルカン合成酵素は、虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）由来の酵素であることが好ましい。例えば、当該酵素は、虫歯菌のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子をクローニングし、大腸菌等のプラスミドベクターに組み込み、これを宿主として発現させることで得られる組み換え酵素である。かかる手法により、α−１，３−グルカン合成酵素を大量生産することができる。当該組み換え酵素の作成に用いられる遺伝子は、典型的には、本願の実施例で用いられているＧｔｆＪ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２６８９６）であることができる。後述のように、本発明の製造方法の目的物である直鎖状で、かつ大きな分子量を有するα−１，３−グルカンを得るためには、かかる特定のＧｔｆＪ遺伝子を用いて発現させた組み換え酵素が重要である可能性があるが、必ずしも当該遺伝子の使用に限定されるものではない。
【００２１】
α−１，３−グルカン合成酵素は、その活性を奏するアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。その活性が維持される限り、Ｎ末端および／またはＣ末端上に、１〜３００個の残基をさらに含むものであってもよく、そのような追加的な残基は、例えば、α−１，３−グルカン合成酵素に対応する野性型配列に由来するものであってもよく、または（ＮまたはＣ末端のいずれかにおける）エピトープタグなどの別の配列であってもよく、または（Ｎ末端の）異種シグナルペプチドであってもよい。
【００２２】
また、当該組み換え酵素は、ヒスチジンタグを有することができる。かかるヒスチジンタグを付加することにより、精製が可能となり、宿主由来の阻害物質（スクロースや合成物の代謝に影響するような他の酵素）の影響を抑制することができる。
【００２３】
スクロース水溶液に添加されるα−１，３−グルカン合成酵素は、スクロース濃度に応じて適宜調整することができるが、好ましくは、０．００５〜０．１０Ｕ／ｍＬの濃度であることができ、より好ましくは、０．０１〜０．０６Ｕ／ｍＬの濃度である。
【００２４】
本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程は、より大きな分子量を有するα−１，３−グルカンを得るという観点から低温で行われることが好ましい。典型的には、当該反応工程は３０℃以下の温度条件下で行われる。より好ましくは２０℃以下、さらに好ましくは１５℃以下の温度条件下で行われる。温度範囲として表すと、当該反応工程は、好ましくは５〜２０℃、より好ましくは５〜１５℃の温度範囲で行われる。必ずしも理論に拘束されるものではないが、２０℃以下の温度条件下で行うことで、７０×１０４程度或いはそれ以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有するα−１，３−グルカンを得ることができることを見出した。さらに、１５℃以下の温度条件下で行うこと場合には、１００×１０４程度或いはそれ以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有するα−１，３−グルカンを得ることができる。
【００２５】
また、本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程は、好ましくは、反応溶液にｐＨが５．０以上、６．０未満の条件で行われる。より好ましくは、ｐＨ５．２以上、５．９未満、さらに好ましくは、ｐＨ５．３〜５．８の範囲である。かかるｐＨ条件とするために、当該技術分野において公知の緩衝剤（バッファー）を用いることができる。特に、ｐＨ５．５近傍が好ましく、その場合、クエン酸バッファーを用いることが好ましい。
【００２６】
本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程のける反応時間は、目的とする分子量や多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）によって適宜変更可能であるが、好ましくは１日〜３０日であり、より好ましくは１日〜５日であることができる。反応初期に生成するα−１，３−グルカンほど分子量が大きい傾向となり、かつ多分散度が小さい傾向となる。
【００２７】
本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程は、生成物であるα−１，３−グルカンの分子量を制御するために界面活性剤の存在下で行うことができる。かかる界面活性剤を用いることにより、１００×１０４程度或いはそれ以上、又は１２０×１０４程度或いはそれ以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有するα−１，３−グルカンを得ることができる。そのような界面活性剤は、好ましくは陽イオン性界面活性剤であり、特に好ましくは臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）である。必ずしも理論に拘束されないが、ＣＡＴＢ等の陽イオン性界面活性剤を用いることによって、より大きな分子量のα−１，３−グルカンが得られるのは、グルコース単位間の水素結合を阻害する可能性や合成酵素に何らかの作用をもたらしている可能性が考えられる。添加する界面活性剤の濃度は、原料となるスクロース及びα−１，３−グルカン合成酵素の濃度等にも依存するが、好ましくは０．５〜１．０ｇ／Ｌの範囲内である。
【００２８】
本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程では、その他の添加剤として、ＮａＮ３、６〜８％のエタノール等の ＧｔｆＪ酵素の働きを阻害しない抗菌剤を添加することもできる。一方、本発明の製造方法では、α−１，３−グルカン合成酵素による反応を開始するための開始剤（プライマー）を添加せずとも、グルカン伸長反応が進行する。
【００２９】
本発明の製造方法により得られるα−１，３−グルカンは、上述のように、グルコース単位がα−１，３−グリコシド結合によって直鎖状に重合した構造を有することを特徴とする。好ましくは、α−１，３−グルカンは、完全直鎖状の構造を有する。ここで、「完全直鎖状」とは、α−１，３−グルカンを構成するグルコース単位がα−１，３−グリコシド結合以外の分岐（グルコース及び他の糖による分岐）を有しないことを意味する。
【００３０】
また、本発明の製造方法により得られるα−１，３−グルカンは、従来のα−１，３−グルカン合成手法では得られなかった大きな分子量を有することを特徴とする。具体的には、本発明の製造方法により得られるα−１，３−グルカンは、２０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。好ましくは、７０×１０４以上、より好ましくは１００×１０４以上、さらに好ましくは１２０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有することができる。上述のとおり、かかる分子量の制御は、主として、合成酵素の種類、反応温度、反応時間、界面活性剤の使用等によって行うことができる。
【００３１】
また、本発明の製造方法により得られるα−１，３−グルカンは、分子量のばらつきが少ないという利点を有する。具体的には、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比Ｍｗ／Ｍｎである多分散度（ＰＤＩ；又は分子量分布ともいう）が、好ましくは１．０〜２．５の範囲であり、より好ましくは１．０〜２．０の範囲であり、さらに好ましくは１．０〜１．７の範囲である。
【００３２】
重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ）の測定には、当該技術分野における公知の手法を用いることができ、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、またはゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などの手段を用いることができる。
【００３３】
２．α−１，３−グルカンエステル誘導体
本発明は、また上記で説明したα−１，３−グルカンにおけるＯＨ基をエステル基（ＯＲ基）に置換した化合物である、α−１，３−グルカンエステル誘導体にも関する。
【００３４】
ＯＨ基を有するα−１，３−グルカン（未エステル化α−１，３−グルカン）自体は熱可塑性を有しないが、かかるエステル化を行うことにより、直鎖状のα−１，３−グルカンの構造を残したままで、熱可塑性を発現させることができる。そのため、当該エステル誘導体を用いることで、熱により形を自在に変えられる熱可塑性のエンジニアリングプラスチック材料として用いることが可能となる。
【００３５】
エステル基を構成するＲは、好ましくは、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基等よりなる群から選択されるアシル基である。より好ましくは、Ｒは、アセチル基又はプロピオニル基である。後述のように、当該Ｒのアルキル鎖長を変更することにより、エステル誘導体の融点、及び破壊強度やひずみ（引張伸長）等の物性を制御することができる。
【００３６】
なお、α−１，３−グルカンの各グルコース単位内に存在する３つのＯＨ基（末端のグルコース単位では４つのＯＨ基）を置換して得られるエステル基は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。すなわち、各グルコース単位内のエステル基において、各Ｒは同一または異なるアシル基であることができる。例えば、Ｒがランダムに異なるエステル基とすることができ、或いは、エステル化の手法を制御することによって異なる複数のエステル基を２：１の比率で得ることもできる。
【００３７】
本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体は、好ましくは、融点が２８０〜３４０℃であることができ、当該融点は、広く用いられている石油由来のプラスチックの代表であるポリエチレン（融点＝１２０℃）、ポリプロピレン（融点＝１７５℃）、ナイロン-６（融点＝２２５℃）、ポリエチレンテレフタレート（融点＝２７０℃）よりも高く、本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体はこれらよりも耐熱性に優れている。当該Ｒのアルキル鎖長を短くすることで、よる高い融点が得られる傾向にある。
【００３８】
本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体は、好ましくは、ガラス転移温度が１００〜２００℃の範囲である。より好ましくは、融点が２８０〜３４０℃であり、かつ、ガラス転移温度が１００〜２００℃の範囲である。
【００３９】
機械的特性について、本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体は、１０ＭＰａ以上、好ましくは３５ＭＰａ以上の破壊強度を有することができ、より好ましくは４０ＭＰａの破壊強度を有することができる。
【００４０】
本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体は、当該技術分野において公知のエステル化手法を用いてエステル化することができる。例えば、塩基の存在下で所望のアルキル鎖長を有する酸無水物と反応させることにより、α−１，３−グルカンのＯＨ基をエステル基に変換することができる。または、酸触媒の存在下で、所望のアルキル鎖長を有する有機酸及び酸無水物と反応させることにより、α−１，３−グルカンのＯＨ基をエステル基に変換することもできる。
【００４１】
３．構造体の成形
本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体は、高い耐熱性と優れた機械的性質を併せ持つため、これを用いてフィルム等の構造体を好適に作成することができる。
【００４２】
本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体を含む構造体は、当該技術分野において公知の手法を用いて成形することができ、例えば、射出成形、圧縮成形、ブロー成形、インフレーション成形エンゲル成形、押出成形、押出ラミネート成形、回転成形、カレンダー成形、真空成型、スタンピング成形、スプレーアップ成形、積層成形、注形法、注入成形、手積み成形、低圧成形、トランスファー成形、発泡成形、ブロー成形、又はTダイ法等の手法により成形することができる。
【００４３】
好ましくは、本発明の構造体は、フィルムである。α−１，３−グルカンエステル誘導体からフィルムを作成する手法としては、当該技術分野において公知の手法を用いることができるが、例えば、当該エステル誘導体を適切な有機溶媒に溶解させた溶液を塗布し、溶媒を除去することにより、所望の厚さのフィルムを得ることができる。当該有機溶媒としては、例えば、塩化メチレン（ジクロロメタン）、メタノール、クロロホルム、テトラクロロエタン、ギ酸、酢酸、ブロモホルム、ピリジン、ジオキサン、エタノール、アセトン、アルコール類、及びトルエンなどの芳香族化合物、酢酸エチル及び酢酸プロピルなどのエステル、テトラヒドロフラン、メチルセロソルブ、及びエチレングリコールモノメチルエーテルなどのエーテル、又はこれらの組み合わせを用いることができる。また、スピンコートや噴霧等の方法を用いてフィルムを成形することもできる。
【００４４】
本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体により形成した構造体は、１０ＭＰａ以上、好ましくは３５ＭＰａ以上の破壊強度を有することができ、より好ましくは４０ＭＰａの破壊強度を有することができる。エステル部位のＲのアルキル鎖長を短くすることで、よる高い破壊強度を得ることができる。一方、Ｒのアルキル鎖長を長くすることで、引張伸長性を高くすることもできる。これらの物性は、当該技術分野において公知の手法によって測定することができる。
【００４５】
また、本発明のα−１，３−グルカンエステル誘導体は、上述のように高い耐熱性と優れた機械的性質を併せ持つため、かかる特性が求められる材料であればフィルム以外の種々のプラスチック材料に応用することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
１．α−１，３−グルカン及びそのエステル誘導体の合成
【００４８】
ａ）α−１，３−グルカン合成酵素（ＧｔｆＪ）の調製
ＧｔｆＪ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ: ＡＡＡ２６８９６）を虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ；ＡＴＣＣ２５９７５）からクローニングし、プラスミドベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に組み込み、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ;ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３））（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）とともに、１ＬのＬＢ培地で成長させた。当該ＬＢ培地は、抗生物質として１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（和光純薬工業）、及びタンパク質誘導剤として０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、和光純薬工業）を添加したものを用いた。
【００４９】
細胞を遠心分離により収集し、次いで４０ｍＬの細胞破砕用緩衝液（５ｍＭイミダゾール、２０ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０，３００ｍｌ ＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１ｍＭジチオスレイトール、１錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、ＥＤＴＡを含まない））(Ｒｏｃｈｅ スイス)中に懸濁させた。続いて、細胞を１０分間超音波処理した。破砕されていない細胞および細胞破片を遠心分離によって除去した。遠心分離の上清からのＧｔｆＪタンパク質の精製は、ニッケルを包摂したニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）をアガロースビーズに固定した担体を充填したカラム（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ（商標）、Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いた固定化金属親和性クロマトグラフィー技術を用いて行った。溶出は、２００ｍＭイミダゾール緩衝液（２００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭトリス - 塩酸緩衝液ｐＨ８．０および３００ｍＭ ＮａＣｌ）を流速１ｍＬ ／分でカラムへ添加し、連続的に溶出液を５ｍｌずつ分画した。
【００５０】
ＧｔｆＪタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定した。ブロモフェノールブルーを含む電気泳動試料緩衝液１５μＬと各分画1５μＬを混合し、次いで９５℃で５分間加熱した。調製したサンプルを分離ゲル上に注入し、３０mＡで９０分間、電気泳動を実施した。ゲル電気泳動でＧｔｆＪタンパク質を含む画分を確認後、ＧｔｆＪを含有する溶出画分へ７０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えてタンパク質を沈殿させ、続いて遠心分離した。沈殿した酵素は５ｍＬの５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で再懸濁し、最後にＰＤ−１０脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５、ＧＥヘルスケア）を用いて脱塩を行った。
【００５１】
ＧｔｆＪ活性は、スクロースの加水分解から生成するフルクトース量を定量することにより測定した。当該測定は酵素キット（Ｄ−グルコース/ Ｄ−フルクトースＵＶ試験、Ｒ-Ｂｉｏｐｈａｒｍ ＡＧ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、３４０ｎｍの紫外可視分光光度計を用いて行った。ＧｔｆＪの1単位（Ｕｎｉｔ, Ｕ）は、反応の初期状態（最初の３０分間）で1分間に1μＭのフルクトースをスクロースから遊離させることができる酵素の量として定義される。反応は以下の条件下で行った。５０ｍＭスクロース溶液、１００ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ ５．５）、および総反応液容量の１／１０量の希釈した酵素液。酵素活性に対するｐＨの影響の研究のために、１００ｍＭクエン酸緩衝液のｐＨを３〜９に変化させた。
【００５２】
ｂ）α−１，３−グルカンの合成
０．１％ＮａＮ３および１００ｍＭクエン酸緩衝液を含む１Ｍのショ糖溶液（ｐＨ５．５）を調製し、それぞれ１Ｌずつ４つに分けた。 ０．０１Ｕ /ｍＬのＧｔｆＪ酵素を添加した後、４つサンプルを３０℃、２５℃、２０℃及び１５℃で２週間インキュベートした（フルクトースが産生されなくなるまで行った）。得られた不溶性物質を遠心分離により集め、脱イオン水で再懸濁することを５回繰り返した。 最後に、得られたサンプルを一晩真空凍結乾燥した。
【００５３】
ｃ）α−１，３−グルカンエステル誘導体の合成
２．０ｘ１０５の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する乾燥させたα−１,３−グルカン（０．５ｇ）、乾燥ＬｉＣｌ（０．４５ｇ）およびジメチルアセトアミド（１０ｍＬ）を混合し、７０℃で1時間（溶液が透明になるまで）撹拌した。 温度を６０℃に下げた後、２ｍＬのピリジンを加え、続いて２ｍＬの酸無水物（和光純薬工業）を滴下した。 次いで、溶液を６０℃で４８時間（無水酢酸）および７２時間（無水プロピオン酸）、連続的に撹拌した。反応後、溶液を室温まで冷却し、メタノール中で沈殿させた。沈殿物を濾過し、メタノールおよび脱イオン水で洗浄し、真空中で乾燥させた。
【００５４】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを用いて、ヒドロキシル基に対するカルボキシル基の置換度（ＤＳ）を算出した。α−１,３−グルカンエステルのグルコース単位中のプロトン（[ｒｉｎｇ−Ｈ]）に対するカルボキシル基中のメチルプロトン（[ＣＨ３]）のピーク面積の比から、ＤＳ＝（[ＣＨ３] / ３）/（[ｒｉｎｇ−Ｈ] / ７）となった。
【００５５】
α−１,３−グルカンの酢酸エステルについて
1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ , ppm): 2.10 (-CH3), 4.07 (H-3, H-5, H-6), 4.65 (H-2), 5.05(H-4), 5.20 (H-1).
【００５６】
α−１,３−グルカンのプロピオン酸エステルについて
1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ , ppm): 1.10 (-CH3), 2.36 (-CH2-), 4.05 (H-3, H-5, H-6),4.59 (H-2), 5.02 (H-4), 5.20 (H-1).
【００５７】
酢酸エステル及びプロピオン酸エステル以外のα−１,３−グルカンエステルについても、アシル基がブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基のものを同様に合成を行った。
【実施例２】
【００５８】
２．α−１,３−グルカンの一次構造の解析
各種ＮＭＲ測定（１次元の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲ；２次元の１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ）及び１Ｈ−１３Ｃ ＮＭＲ（ＨＳＱＣ））を用いて、実施例１で得られたα−１,３−グルカンの構造を解析した。ＮＭＲ測定用の各試料の溶液をＤＭＳＯ−ｄ６中で調製した。
【００５９】
各種ＮＭＲ測定の解析結果を図２に示す。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ｂ）では、シャープな６本のピークのみが観測されたので、合成されたグルカンが分岐構造を有さない直鎖状であることが分かった。そして、二次元ＮＭＲスペクトルＨＳＱＣ（ｃ）とＤＱＦ-ＣＯＳＹ（ｄ）から、合成されたグルカンがα−１，３−グリコシド結合のみからなることが分かった。
【実施例３】
【００６０】
３．α−１,３−グルカンの反応温度依存性
実施例１で合成したα−１,３−グルカンの重量平均分子量（Ｍｗ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）について、１５〜３０℃の反応温度依存性を検討した。分子量の測定は、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて行った。ここで、反応条件は、スクロース濃度１．０ Ｍ、酵素（ＧｔｆＪ）量０．０１ Ｕ／ｍＬとした。図３に示す結果から、反応温度を変化させることで合成されるα−１,３−グルカンの分子量と多分散度を制御できることが分かった。反応温度３０℃では分子量２０×１０４程度のα−１,３−グルカンが合成されるが、反応温度を下げてゆくと分子量が増加し、多分散度の値が小さいα−１,３−グルカンが合成できることが分かった。多分散度（ＰＤＩ）に関しても反応温度に影響され、ＰＤＩは反応温度を高くすると値が大きくなることが分かった。そして、１５℃の反応温度では、７０×１０４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）、及び約１．９の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を有するα−１,３−グルカンが得られた。
【実施例４】
【００６１】
４．α−１,３−グルカンの反応時間依存性
次に、実施例１で合成したα−１,３−グルカンについて、反応時間（生成時間）に依存した重量平均分子量（Ｍｗ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）の変化について検討した。反応温度は、３０℃、スクロースは１．０Ｍ、酵素（ＧｔｆＪ）量は０．０１Ｕ／ｍＬを用いた。
図４に示すように、反応初期には高い分子量のα−１,３−グルカン（Ｍｗ=７０×１０４以上）が合成されるが、時間を追うごとに合成されるα−１,３−グルカンの分子量が低下することが分かった。２週間目以降に合成されるα−１,３−グルカンの分子量は２０×１０４程度に落ち着いた。多分散度（ＰＤＩ）も反応時間に伴って変化し、反応初期には１．２程度だった値は、反応時間が長くなると２．５程度に変化することが分かった。
【実施例５】
【００６２】
５．界面活性剤の添加により影響
反応溶液に種々の界面活性剤を添加した点以外は、実施例１に記載と同様の条件を用いてα−１,３−グルカンを合成した。反応温度は、３０℃、スクロースは１．０Ｍ、酵素（ＧｔｆＪ）量は０．０１Ｕ／ｍＬを用いた。界面活性剤として非イオン性、両性、陽イオン性の界面活性剤を臨界ミセル濃度以上で添加した。それぞれについて得られたα−１,３−グルカンの分子量を図５に示す。ＧｔｆＪ酵素は非イオン性、両性界面活性剤の存在下の反応において、活性低下は起こらなかった。合成されるα−１,３−グルカンの生産量と分子量も非イオン性、両性界面活性剤存在下で変化しなかった。一方、陽イオン性界面活性剤である臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）を添加した場合は、生産量が減少するものの、１２０×１０４を超える重量平均分子量（Ｍｗ）を有するα−１,３−グルカンが得られた。
【実施例６】
【００６３】
６．α−１,３−グルカンエステル誘導体の熱的特性
次に、実施例１で得られたα−１,３−グルカンエステル誘導体の融点（Ｔｍ）及びガラス転移温度（Ｔｇ）を測定した。α−１,３−グルカンアセテートでは、Ｔｍ：３３９℃、Ｔｇ：１７７であり、α−１,３−グルカンプロピオネートでは、Ｔｍ：２９９℃、Ｔｇ：１１９であった。既存の各種高分子との比較を図６に示す。図中、既存の石油由来プラスチック（黒丸）、既存のバイオプラスチック（青丸）、実施例で得られたα−１,３−グルカンエステル誘導体（赤丸）。その結果、実施例で得られたα−１,３−グルカンエステル誘導体は、既存のポリエチレンテレフタレートやナイロンよりも高い耐熱性を有していることが分かった。
【実施例７】
【００６４】
７．α−１,３−グルカンエステル誘導体から成形したフィルムの物性
実施例１で得られたα−１,３−グルカンエステル誘導体によりフィルムを作成した。当該フィルムは、α−１,３−グルカンエステル誘導体をクロロホルムに溶解させ、テフロンディッシュ上で溶媒を蒸発させることで除去することによって作成した（キャスト法）。図７に示すように、得られたフィルムとして、可視光域全般において透明性が高いものを調製できた。
同様に、エステル部位のアルキル鎖長を変化させたα−１,３−グルカンエステル誘導体を用いて各種フィルムの物性を測定した結果を図８に示す。図中、「α−１,３−ｇｌｕｃａｎＡｃ」は、α−１,３−グルカンアセテート；「α−１,３−ｇｌｕｃａｎＰｒ」は、α−１,３−グルカンプロピオネート；「「α−１,３−ｇｌｕｃａｎＢｕ」は、α−１,３−グルカンブチレート」；「α−１,３−ｇｌｕｃａｎＶａ」は、α−１,３−グルカンバレレート；「α−１,３−ｇｌｕｃａｎＨｅ」は、α−１,３−グルカンヘキサネート；及び「α−１,３−ｇｌｕｃａｎＯｃ」は、α−１,３−グルカンオクタネートを示す。その結果、α−１,３−グルカンアセテート及びα−１,３−グルカンプロピオネートでは、３５ＭＰａを超える破壊強度を有することが分かった。また付加するエステルの種類を変えることで、２００%以上の伸び率を有する伸展性の高い材料も調製できることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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