(57)【要約】      （修正有）【課題】多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムの性能の特徴付けおよび／または構成のためのシステムおよび方法を提供する。【解決手段】指定された試料の光学特性から独立しつつ多数の異なる蛍光試料と共に使用するためにＭＳＩシステムを装備し、ＭＳＩシステムに統合システム・レベル検査を行う手段を設ける。システムおよび方法は、更に、標準化単位に関してＭＳＩシステムの動作パラメータの振る舞いを評価および表現するように、および／またはＭＳＩシステムの容認可能な検出範囲を決定するように構成される。【選択図】図５Ｆ
2018119968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムの性能の較正システムであって、
実質的に固定動作特性で動作するように構成され、較正された光標準のスペクトルに対応する透過スペクトルを有する光学フィルタを含む少なくとも１つの光源であって、前記動作特性が少なくとも温度と電気動作特性とを含み、前記光源が、それぞれの対応する中心波長を中心とする多数のスペクトル帯域を含むスペクトルを有する光出力を生成するように構成される、光源と、
空間周期的な反射の分布によって特徴付けられる幾何標準と、
前記少なくとも１つの光源から前記光出力を受け、前記受けた光出力からの光を前記幾何標準に伝達し、前記幾何標準と相互作用した光を前記ＭＳＩシステムに再送出するように構成された光学システムと、
を含む、システム。
【請求項２】
請求項１記載のシステムにおいて、前記光学システムが、前記幾何標準から反射した前記光源からの光を再送出するように構成される、システム。
【請求項３】
請求項１または２記載のシステムにおいて、前記光源から前記幾何標準に伝達された光パワーが、前記透過スペクトルの変動とは独立して可変である、システム。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載のシステムにおいて、前記光源が、第１光のスペクトル帯域および第２光のスペクトル帯域が実質的に重複するように、前記幾何標準に、前記幾何標準を透過する前記第１光と、前記幾何標準から反射する前記第２光とを伝達するように構成される、システム。
【請求項５】
請求項３記載のシステムであって、前記多数のスペクトル帯域からの所与のスペクトル帯域において、前記スペクトルのスペクトル内容に実質的に影響を及ぼすことなく、前記ＭＳＩシステムに再送出される光パワーの調節を可能にするように、構成される、システム。
【請求項６】
請求項３記載のシステムであって、前記多数のスペクトル帯域からの第１スペクトル帯域において、前記多数のスペクトル帯域からの第２スペクトル帯域における光パワーの測定とは実質的に独立して、前記ＭＳＩシステムに再送出される光パワーの測定を可能にするように構成される、システム。
【請求項７】
撮像分光計（５０２）のスペクトル精度および分解能を判定する方法（１３００）であって、
スペクトルを出力するために、既知のスペクトル特徴を有するスペクトル・ソースを作動させるステップ（１３０２）と、
カメラによってキャプチャされたエリアを均等に覆うように分布された照明を使用する前記撮像分光計の標準化された露出時間および標準化された照明のレベルを使用して、標準物体のスペクトル画像を取得するステップ（１３０３）と、
スペクトル・プロパティが均質であることがわかっているエリアについて、前記取得された画像のスペクトル情報の平均を取るステップ（１３０４）と、
前記取得されたスペクトル画像の強度値を波長の関数としてプロットし、該プロットからスペクトル・ピークの位置を特定するステップ（１３０５）と、
既知の物体のスペクトル・ピークを前記標準物体のスペクトル・ピークの予期される組と比較して、前記撮像分光計が、前記標準物体の前記スペクトル・ピークに対応すると知られている波長における前記ピークの位置を認識するかどうかを判定するステップと、
前記ピークが前記スペクトル・ピークの予期される組の位置からずれる場合に、前記撮像分光計が調整または修理を必要とすると判定するステップと
を含む、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法であって、
前記ピークがスペクトル・ピークの前記予期される組の位置からずれる場合、スペクトル画像処理および分析ソフトウェアにおいて使用される定数を変更することによって、記録されている強度値に対する波長のマッピングを調節するステップをさらに含む、方法。
【請求項９】
請求項７または８記載の方法であって、
前記プロットされたスペクトル・ピークの内少なくとも１つの半値幅を特定するステップであって、前記ピークが波長に対応する、ステップと、
波長についての前記撮像分光計の分解能を、前記少なくとも１つのピークの前記特定された幅として決定するステップと
をさらに含む、方法。
【請求項１０】
画像取得システム（５０２）の空間精度および正確度を判定する方法であって、
前記画像取得システムのスペクトル検出範囲をカバーする波長において照明を生成するスペクトル・ソースを作動させ、関心のある複数の波長において等しく見ることができる反射パターンを有するスペクトルを標準物体に対して出力する、ステップ（１５０２）と、
前記標準物体のスペクトル画像を取得するステップ（１５０３）と、
前記スペクトル画像内のそれぞれの単一の波長または帯域についての画素の１つ以上の行または選択からの強度データを空間位置の関数としてプロットする（１５０４）ことによってプロット（９０６）を生成するステップであって、関心のあるすべての波長の強度データが同じグラフにプロットされる、ステップと、
前記プロット（９０６）に関して、
ａ）関心のある波長の内の１つの波長において前記標準物体の複数の空間位置にわたって撮像された周期的な空間特徴を、関心のある波長の内の別の波長の同じ周期的な特徴と比較するステップ、
ｂ）関心のある波長の内の１つの波長において前記標準物体の複数の空間位置にわたって撮像された周期的な変化を、前記標準物体の予期される振る舞いと比較するステップ、または
ｃ）所与の波長に対する最高の強度値の焦点位置を発見し、それによって、異なる波長において生ずる軸方向色焦点ずれがあるか否か判定するために、波長の内の所与の１つの波長において平均強度値を取ること、前記画像取得システムの物理焦点を調節すること、および多数の焦点位置において画素強度値を再評価することによって、複数の波長における画素強度を反復的に評価するステップ
のうちの１つを実行するステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法であって、
反射性標準品（９１０）は、電子顕微鏡において従来使用されている炭素膜レプリカ標準品である、方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載の方法であって、
前記標準物体が前記画像取得システムの光学システム（４３６）の理想的な焦点から逸脱して配置されるかどうかを判定するために、前記波長の内、基準波長として使用される１つの波長（λ３）における前記プロットの強度変化の割合を評価するステップであって、前記プロットから取得される画像コントラストの減少が、前記撮像システムの空間分解能に誤差が生じていることを示す、ステップ
をさらに含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法であって、
前記１つの（λ３）基準波長において判定された前記空間分解能と比較して、前記標準物体の前記反射パターンの前記周期的特徴のエッジにおける分解能の低下率を決定することによって、前記理想的な焦点からの前記標準物体（９１０）の位置付けの近似のパーセント偏差を決定するステップと、
前記プロットにおける最大の半分の点および前記プロットにおける最大強度の点の相対位置を測定し、これらの点に対応する波長を比較することによって、前記画像取得システムの横方向分解能を決定するステップと
をさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、撮像デバイスの較正システムおよび方法に関するものである。更に特定すれば、本発明は、多重スペクトル撮像システムおよび／またはそのコンポーネントを較正することに関係する。また、本発明は、撮像システムの動作パラメータを設定する(configure)ことにも関係するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明の実施形態は、撮像の動作を管理するようにプログラミングされたプロセッサを含む多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムの品質を評価する方法を提供する。また、本発明の実施形態は、ＭＳＩを較正し、特徴付け、構成するコンピュータ実装方法も含む。このような方法は、ＭＳＩシステムのスペクトル範囲の少なくとも一部にわたって、ＭＩＳシステムの検出器の出力において、前記検出器を周囲光に露出することなく、選択された波長における前記検出器の出力を表す第１組のスペクトル・データを形成するように、ＭＳＩシステムの第１スペクトル・スキャンの間にデータを収集するステップを含む。加えて、この方法は、前記取得したスペクトル・データの部分集合同士を比較することによって、ＭＳＩシステムにおける迷光の存在を判定するステップと、迷光の存在が陽性に判定されたときに任意に撮像システムを調節するステップを含む。
【０００３】
ＭＳＩシステムのスペクトル範囲の前記少なくとも一部にわたるＭＳＩシステムの第２スペクトル・スキャンの間、検出器において、標準化された出力パワーと較正された光標準のスペクトルを有する第１光源からの光を受け、選択された波長における検出器の出力を表す第２組のスペクトル・データを形成する。更に、この方法は、検出器においてそしてＭＳＩシステムの第３スペクトル・スキャンの間、ＭＳＩシステムのスペクトル範囲の前記少なくとも一部にわたって、第１光源からの光を受け、選択された波長における検出器の出力を表す第２組のスペクトル・データを形成する。
【０００４】
あるいは、またはこれに加えて、この方法は、標準化された単位に関して、ＭＳＩシステムの動作特性を判定するステップも含む(involve)。このような判定は、１つ以上の波
長または狭い帯域幅において上記画像の強度分散に対する、ＭＳＩシステムによって取得された画像のモード強度を表す曲線の勾配を判定するステップ、ＭＳＩシステムによるデータ取得に関連付けられた雑音指数を計算するステップ、および既知のスペクトル・マーカの放出波長に対応する波長を中心とする実質的に等しい幅の多数のスペクトル帯域幅を含むスペクトルを有する入射光の使用によって、ＭＳＩの波長依存応答を判定するステップの内１つ以上を含むことができる。既知のスペクトル・マーカは、任意に、選択された検体および量子ドットの内少なくとも１つを含む。
【０００５】
更に、本発明の実施形態は、多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムの性能を較正および判定するシステムも提供する。一実施態様では、このようなシステムは、（ｉ）実質的に固定動作特性で動作するように構成され、較正された光標準のスペクトルに対応する透過スペクトルを有する光学フィルタを含む少なくとも１つの光源と、（ｉｉ）空間周期的な反射の分布によって特徴付けられる幾何標準を含む。光源の動作特性は、少なくとも温度と電気動作特性を含み、この光源は、それぞれの対応する中心波長を中心とする多数のスペクトル帯域を含むスペクトルを有する光出力を生成するように構成される(adapted)
。加えて、ＭＳＩシステムは、（ａ）使用された光源またはアクティブな光源から光出力を受け、（ｂ）該受けた光出力からの光を幾何標準に伝達し、（ｃ）幾何標準と相互作用
した光をＭＳＩシステムに再送出するように構成された光学システムも含む。この光学システムは、任意に、幾何標準から反射した光を再送出するように構成される。任意に、光源から幾何標準に伝達された光パワーは、透過スペクトルの変動とは独立して可変にすることもできる。更に、一実施形態では、光源は、第１光に関連付けられたスペクトル帯域および第２光に関連付けられたスペクトル帯域が実質的に重複するように、幾何標準を透過する第１光と、この幾何標準から反射する第２光を、この幾何標準に伝達するように構成される。
【０００６】
一実施形態では、較正システムは、 多数のスペクトル帯域から選択された所与のスペ
クトル帯域において、他のスペクトル帯域のスペクトル内容に実質的に影響を及ぼすことなく、ＭＳＩシステムに送出される光パワーの調節を可能にするように構成される。更に、この較正システムは、多数のスペクトル帯域から選択された第１スペクトル帯域において、多数のスペクトル帯域から選択された第２スペクトル帯域における光パワーの測定とは実質的に独立して、光パワーの測定を可能にするように構成される。
【０００７】
加えて、本発明の実施形態は、物体面および視野（ＦＯＶ）を有する多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムの性能の較正システムも提供する。このような較正システムは、多数の帯域の１つ以上における光の量が、残りの帯域の１つ以上に実質的に影響を及ぼすことなく、調節可能となるように、多数の帯域があるスペクトルを有する光出力を生成するように構成された(adapted)少なくとも１つの光源であって、多数の帯域の各々が対応す
る中心波長を中心として位置付けられる、光源を含む。更に、この較正システムは、物体面の照明のために多数の光路を定め、物体面からの光をＭＳＩシステムに伝達するように構成された光学システムも含む。このような較正システムは、 多数のスペクトル帯域か
ら選択された第２スペクトル帯域における光パワーの判定とは実質的に独立して、多数のスペクトル帯域から選択された第１スペクトル帯域において光パワーの判定を可能にするように構成される。一実施形態では、このシステムの光学システムは、反射および透過双方において幾何標準と相互作用した光を収集するように構成される。
【０００８】
特定の実施形態では、較正システムは、更に、物体面に置かれると、ＦＯＶにわたるＭＳＩシステムの光学性能の空間較正を可能にするために、空間帯域に依存して光を空間的に分けるように構成された基準サンプルを含む。更に、この較正システムは、 多数のス
ペクトル帯域の各々によって搬送される光の量を表す１組のデータを形成するようにプログラミングされたプロセッサと、このプロセッサに動作可能に接続されこのような１組のデータを格納するように構成された有形非一時的コンピュータ読み取り可能媒体を含む。
【０００９】
また、本発明の実施形態は、多重スペクトル（ＭＳ）画像のスペクトル分離のための計算アルゴリズムについて精度および正確度を判定する方法も提供する。この方法は、（ｉ）検出器によって、多数のスペクトル帯域があるスペクトル出力を有する光源からの光によって均等に照明されたまたは実質的に均等に照明された基準サンプルの画像を取得するステップと、（ｉｉ）取得した画像の画素値の基準線強度オフセット、即ち、「バイアス」を補正し、補正ＭＳ画像を形成するステップと、（ｉｉｉ）バイアス補正取得画像に対応する平均強度プロファイルに基づいて、積分強度値を判定するステップと、
を含む。
【００１０】
一実施態様では、積分強度値を判定するステップは、平均強度プロファイルを形成するように、検出器の選択された画素にわたって、バイアス補正ＭＳ画像の強度のスペクトル・プロファイルを平均するステップを含む。あるいは、または加えて、光源からの光によって照明された基準サンプルの画像を取得するステップを含んでもよく、光源は、取得するステップは、較正された光標準のスペクトルに対応する透過スペクトルを有する光学フィルタを含む。あるいはまたは加えて、取得するステップは、（ａ）検出器によって、基
準サンプルを透過した第１光と、基準サンプルから反射した第２光を受けるステップであって、第１および第２光の各々が対応する多帯域スペクトルを有する、ステップと、（ｂ）第１ビーム光の第１スペクトル帯域における光の、検出器によって受けた光に対する寄与を判定するステップであって、このような判定が、第２光ビームの第２スペクトル帯域における光の対応する寄与とは独立して実行される、ステップを含んでもよい。
【００１１】
特定の実施態様では、本方法は、検出器によって取得した画像に対する、異なるスペクトル帯域からの光の相対的な寄与を変化させるステップを含み、このような変化させるプロセスは、検出器によって受けた光のスペクトル内容を実質的に変化させることなく実行される。加えて、この方法は、 較正された光源の出力の異なるスペクトル帯域からの光
の相対的な寄与を定めるステップと、多数のスペクトル帯域にそれぞれ対応する正規化された個々の基準スペクトルを定めるために、これら多数のスペクトル帯域に対応する平均強度プロファイルを個々に正規化するステップを含んでもよい。また、任意に、この方法は、計算スペクトル分離アルゴリズムの結果と、定められた光の相対的な寄与との間の差の判定のステップも含む。
【００１２】
あるいは、本発明の実施形態は、多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムの動作の波長依存性を判定する方法を提供する。この方法は、（ｉ）ＭＳＩシステムの検出器によって、多数のスペクトル帯域がある出力スペクトルを有する光源からの光の第１波長または狭い帯域幅によって照明された物体の画像を表す第１画像データを取得するステップと、（ｉｉ）第１および第２光が、多数のスペクトル帯域の内異なる第１および第２スペクトル帯域に対応し、それぞれ、対応する第１および第２パワーを有するように、光源からの第２波長または狭い帯域幅によって照明された物体の画像を表す第２画像データを、検出器によって取得するステップと（ｉｉｉ）検出器に対する、異なる波長における正規化量子効率を判定するステップを含む。更に、この方法は、（ｉｖ）第３光が多数のスペクトル帯域の内第３スペクトル帯域に対応し、第３スペクトル帯域が第１スペクトル帯域とは異なるように、判定された正規化量子効率の使用によって、光源からの第３波長または狭い帯域幅によって照明された物体の画像を表す第３画像を収集するステップを含む。
【００１３】
また、本発明の実施形態は、多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムのスペクトル・カメラを較正する方法も含む。この方法は、最初に第１所定強度レベルおよび／またはパワーの光源で基板を照明するステップと、ＭＳＩシステムのセンサによって、基板の第１組のスペクトル画像データを収集するステップと、２回目に、第１所定強度レベルで光源によって基板を照明するステップと、ＭＳＩシステムのセンサによって、第１所定強度レベルで基板の第２組のスペクトル画像データを収集するステップと、第２組のスペクトル画像データから第１組のスペクトル画像データを減算または調節し、第１差画像データを生成するステップと、第２所定強度レベルで第３組のスペクトル撮像データを収集し、第２所定強度レベルで第４組のスペクトル撮像データを収集するステップと、第４組のスペクトル画像データから第３組のスペクトル画像データを減算し、第２差画像データを生成するステップと、第１差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つを計算するステップと、第１差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つに基づいて、第１差画像データの各波長において、第１差画像データの画素値の分散および標準偏差の内少なくとも１つを判定し、第１最終画像データ(resulting image data)を生成するステップと、第２差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つを計算するステップと、第２差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つに基づいて、第２差画像データの各波長において、第２差画像データの画素値の分散および標準偏差の内少なくとも１つを判定し、第２最終画像データを生成するステップと、第１最終画像データ、第２最終画像データ、第１差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つ、ならびに第２差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つに基づいて、波長毎に、変換値を生成するステップであって、この変換値が、グレー・レベル毎の各画素において記録された電子の近似
数を表す、ステップを含む。上記変換値は、（１）第１差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つの関数として第１最終画像データに対応する１組のデータと、（２）第２差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つの関数として第２最終画像データに対応する１組のデータとの間における勾配または近似勾配を生成することによって、決定される。波長毎の変換値は、波長毎の他の変換値と比較され、これらの値の間の差が、ＭＳＩシステムを較正するために利用される。
【００１４】
また、本発明の実施形態は、多重スペクトル撮像システムのために補正画像を生成する方法も含む。多重スペクトル撮像システムのために補正画像を生成する方法は、このシステムの第１スペクトル・ソースの露出時間がゼロであるときにセンサによって第１スペクトル画像を取得し、複数の波長において第１スペクトル画像データを生成するステップと、第１スペクトル画像の複数の波長の各波長に対してモード画素強度値を判定するステップであって、第１スペクトル画像の複数の波長の各波長におけるモード画素強度値が、第１スペクトル画像の複数の波長の各波長における画素強度オフセット値に対応する、ステップと、第１スペクトル・ソースによって第２スペクトル画像を取得するステップであって、第１スペクトル・ソースの露出時間がゼロよりも長く、複数の波長の第２スペクトル画像データを生成するステップと、第１スペクトル画像の複数の波長の各波長における画素強度オフセット値を、第２スペクトル画像データの対応する各波長における複数の画素の各々の値から減算するステップを含む。
【００１５】
本発明の実施形態例では、平均値がモード値と、または他の適した値と置換されてもよい。
また、本発明の実施形態は、多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムのスペクトル・カメラを較正する方法も含むことができる。本方法は、最初に第１所定強度レベルの光源で基板を照明するステップと、ＭＳＩシステムのセンサおよびスペクトル・カメラの内少なくとも１つによって、基板の第１組のスペクトル画像データを収集するステップと、２回目に第１所定強度レベルで光源によって基板を照明するステップと、ＭＳＩシステムのセンサおよびスペクトル・カメラの内少なくとも１つによって、基板の第２組のスペクトル画像データを収集するステップと、第１組のスペクトル画像データを第２組のスペクトル画像データから減算し、第１差画像データを生成するステップと、ＭＳＩシステムのセンサおよびスペクトル・カメラの内少なくとも１つによって、第２所定強度値で第３組のスペクトル撮像データを収集するステップと、第２所定強度レベルで第４組のスペクトル撮像データを収集するステップと、第３組のスペクトル撮像データを第４組のスペクトル撮像データから減算し、第２差画像データを生成するステップと、第１差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つを計算するステップと、第１差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つに基づいて、第１差画像データのあらゆる波長において第１差画像データの画素値の分散および標準偏差の内少なくとも１つを判定し、第１最終画像データを生成するステップと、第２差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つを計算するステップと、第２差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つに基づいて、第２差画像データのあらゆる波長において第２差画像データの画素値の分散および標準偏差の内少なくとも１つを判定し、第２最終画像データを生成するステップと、第１最終画像データ、第２最終画像データ、第１差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つ、ならびに第２差画像データのモードおよび平均の内少なくとも１つに基づいて、第２差画像データの波長毎に、変換値を生成するステップであって、この変換値が、第１、第２、第３、および第４スペクトル画像データの内少なくとも１つにおけるグレー・レベル毎に各画素において記録された電子の近似数を表す、ステップを含む。
【００１６】
本発明の実施形態例では、光源は、他のスペクトル・ソースと置換されてもよく、光またはスペクトル・ソースは、 例えば、２組のスペクトル画像データが同じ所定の強度レ
ベルまたはパワーでキャプチャされるときに、基板が一度に照明されるように、したがっ
て基板を２回照明する必要がないように、作動されたまま、即ち、オンに留まることもできる。
【００１７】
また、本発明の実施形態は、コンピュータ・プログラム製品も含み、非一時的な有形コンピュータ読み取り可能媒体および任意にプログラム可能な媒体上にロードされると、以上で説明した方法および以上で説明したシステムの動作を含む、開示した発明のステップを実行するように、コンピュータ・プロセッサをプログラミングするように構成される。
【００１８】
本発明は、詳細な説明を図面と共に参照することによって、一層深く理解されよう。図面は、全体を通して同じ拡縮率で描かれているのではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、典型的な多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システムによって取得された多重スペクトル画像の一例である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、典型的なＭＳＩシステムの模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、典型的なＭＳＩシステムの模式図である。
【図２−１】図２−１は、線形分離(unmixing) の原理を示すブロック模式図である。
【図２−２】図２−２は、線形分離(unmixing) の原理を示すブロック模式図である。
【図２−３】図２−３は、線形分離(unmixing) の原理を示すブロック模式図である。
【図３】図３は、定量的多重化のためのマーカとして量子ドットおよび化学蛍光体を使用するときの利点および欠点の比較を示すグラフによる概略図である。
【図４Ａ】図４Ａは、較正されたエミッタと較正光フィルタを含む第１較正光源を内蔵するＭＳＩシステムの照明チャネルの一実施形態の模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａの第１較正光源の強度のスペクトル分布を表すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明による撮像システムの一実施形態例のブロック図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明にしたがって、撮像システム内の場所に伝えられた光の強度を測定する方法の一実施形態を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、スペクトル画像オフセット補正データおよび／または画像を決定する方法を表すフロー・チャートである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、本発明の一実施形態にしたがって、スペクトル画像を強度オフセットについて補正する方法を示すフロー・チャートである。
【図５Ｅ】図５Ｅは、任意のグレー・スケール単位から標準化強度単位（ｅ−）へのスペクトル画像の標準化変換（平均／分散計算）を決定する方法６００を示すフロー・チャートである。
【図５Ｆ】図５Ｆは、標準化強度単位に関して、スペクトル・データ取得に付随する電子ノイズを判定する方法７００を示すフロー・チャートである。
【図５Ｇ】図５Ｇは、スペクトル撮像センサのダイナミック・レンジを評価する方法８００を示すフロー・チャートである。
【図６Ａ】図６Ａは、照明の線形増加に対するスペクトル撮像装置の線形応答を判定する方法１２００を示すフロー・チャートである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、４つの光レベルで取得された較正照明源の空間的に平均された撮像スペクトル・データ(spectral data imaged)を表すプロットである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図６の方法の実施形態にしたがって、データ集合から１つのスペクトル波長において決定されたＭＳＩシステムの利得および線形特性を表すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、図４Ａの光源の較正されたエミッタによって生成された光の強度のスペクトル分布であり、スペクトルにおけるＨｇエレメントのピーク位置を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、異なるスペクトル分解能で取得された図７Ａの正規化スペクトル分布のトレースを示すグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、物体に関連付けられた１組の既知のスペクトル特徴に対して、画像または画像データのスペクトル特徴を特徴付ける、本発明の一実施形態による方法である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、本発明の一実施形態にしたがって、スペクトル分解能を変化させる方法１４００である。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の一実施形態にしたがって、スペクトル−空間座標精度を評価するために利用される方法１５００である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＭＳＩシステムによって得られる撮像の空間精度および正確度を判定するために、本発明の一実施形態と共に使用されるサンプル精密標準品(sample precision standard)の強度プロファイルおよび画像である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、それぞれ、ＭＳＩシステムによって得られる撮像の空間精度および正確度を判定するために、本発明の一実施形態と共に使用されるサンプル精密標準品(の強度プロファイルおよび画像である。
【図９Ａ】図９Ａは、本発明にしたがって、スペクトル検出の量子効率を判定する方法例である。
【図１０】図１０は、較正済み光源から出力された光の多数のスペクトル・ピークからの相対的寄与のスペクトル分離のプロセスの検証方法を表すフロー・チャートである。
【図１１】図１１は、図１０の方法の実施形態を示すスペクトル・グラフである。
【図１２】図１２は、図１０の方法の実施形態を示すスペクトル・グラフである。
【図１３】図１３は、図４Ｂのスペクトルの個々のスペクトル帯域の正規化基準スペクトルを示す。
【図１４】図１４は、図１３の正規化基準スペクトルを使用して実行された線形分離検査の結果を示す棒グラフ(bar-chard)である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、第１および第２較正光源を内蔵した２照明チャネルＭＳＩシステムの一実施形態の模式図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、図１５Ａの第１および第２光源の正規化スペクトルを比較して示すスペクトル・グラフである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、図１５Ａの第１および第２光源の正規化スペクトルを比較して示すスペクトル・グラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、本発明の一実施形態にしたがって、多数の較正済み光源から出力された光の多数のスペクトル・ピークからの相対的な寄与のスペクトル分離のプロセスの検証方法を示すスペクトル・グラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、本発明の一実施形態にしたがって、多数の較正済み光源から出力された光の多数のスペクトル・ピークからの相対的な寄与のスペクトル分離のプロセスの検証方法を示すスペクトル・グラフである。
【図１７】図１７は、図１５Ｂ、図１５Ｃの第１および第２光源のスペクトルの個々のスペクトル帯域について、正規化基準スペクトルを示す。
【図１８】図１８は、２つの較正／基準光標準を採用した本発明の光学取得システムの検出器によって登録されたスペクトル・トレースを表すプロットである。
【図１９】図１９は、図１８の集計スペクトル・トレースの下のエリアの使用を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、予め較正済みであることを想定した測定システムのシステム・レベル検査の図を示す。
【図２０Ｂ】図２０ＢＣは、予め較正済みであることを想定した測定システムのシステム・レベル検査の図を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、予め較正済みであることを想定した測定システムのシステム・レベル検査の図を示す。
【図２１Ａ−１】図２１Ａ−１は、９個のスペクトル特徴のスペクトル分離を示すプロットおよび関連データを示す(provide)。
【図２１Ａ−２】図２１Ａ−２は、９個のスペクトル特徴のスペクトル分離を示すプロットおよび関連データを示す。
【図２１Ａ−３】図２１Ａ−３は、９個のスペクトル特徴のスペクトル分離を示すプロットおよび関連データを示す。
【図２１Ｂ−１】図２１Ｂ−１は、９個のスペクトル特徴のスペクトル分離を示すプロットおよび関連データを示す。
【図２１Ｂ−２】図２１Ｂ−２は、９個のスペクトル特徴のスペクトル分離を示すプロットおよび関連データを示す。
【図２１Ｂ−３】図２１Ｂ−３は、９個のスペクトル特徴のスペクトル分離を示すプロットおよび関連データを示す。
【図２２】図２２は、本発明の関連実施形態の動作結果を示す。
【図２３】図２３は、説明する実施形態を実現することができる計算システム例のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施形態は、多重スペクトル撮像（ＭＳＩ）システム（例えば、撮像分光計、蛍光顕微鏡システム、病理学撮像システム）のような、撮像システムと共に採用することができる。ＭＳＩシステムは、一般に、組織サンプルを含む、病理学試料の分析を容易にする。ＭＳＩシステムは、通例、例えば、コンピュータ化された顕微鏡をベースとした撮像システムを含む。この撮像システムは、分光計、分光器、分光写真機(spectrograph)、スペクトル・カメラ、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、光センサ、光検出器、および／または撮像分光器等が装備される。ＭＳＩシステムおよび／またはデバイスは、画素レベルで画像のスペクトル分布を取得することができ、二次元（２Ｄ）空間視野を表す多重スペクトル・データを、光検出器によって記録された画像の各画素における波長の関数として光強度を表すデータ集合と共に取得する能力を提供する。
【００２１】
種々の多重スペクトル撮像システムがあるが、全てのＭＳＩシステムに共通である動作の一面は、例えば、図１Ａに模式的に示されるような、多重スペクトル画像を形成できることである。多重スペクトル画像とは、電磁スペクトルにわたって特定の波長または特定のスペクトル帯域幅で取得された画像データを含む画像である。これらの波長は、光フィルタによって、あるいは、例えば、赤外線（ＩＲ）のような、可視光範囲(range of visible light range)を超えた波長における電磁放射光線を含む、所定のスペクトル成分を選択することができる他の計器の使用によって、選別する(single out)ことができる。
【００２２】
試料の画像の取得を容易にするＭＳＩシステムの２つの一般的なタイプを、図１Ｂおよび図１Ｃに模式的および全体的に示す。図１Ｂは、撮像システム１０４、例えば、光学撮像システムを含むシステム１００を示し、撮像システムの一部１０８は、所定数Ｎの離散光帯域を定めるように調整可能なスペクトル選択システムを内蔵する。撮像システム１０４は、広帯域光源または他の放射光線源のような、スペクトル・ソース１１２からの照明を透過、吸収、または反射する物体、例えば、組織サンプル１１０を、検出器１１６（例えば、光検出器、光センサ、画像センサ、ＣＣＤ、光検出器(photodetector)、光センサ(photosensor)、スペクトル・カメラ等）上で撮像するように構成される(adapted to)。一実施形態例では、検出器１１６は撮像システム１０４に含まれる。図示のように、図１Ｂにおいて、撮像システム１０４は、一実施形態では、例えば、撮像システム１０４の光出力１２２と全体的に空間的に整列された１本の光軸１２０を有する顕微鏡のような、拡大システムを含んでもよい。撮像システム１０４は、異なる離散スペクトル帯域において画像が取得されることを確保するため等で、スペクトル選択システム１０８が調節または調
整される（例えば、コンピュータ・プロセッサ１２６によって）に連れて、物体１１０の画像、例えば、物体１１０の一連の画像を形成する。加えて、システム１００は、一連の取得された画像から組織の少なくとも１つの視覚的に知覚できる画像が現れるディスプレイ１２２も内蔵する。あるいは、ディスプレイ１２２はタッチ・スクリーン・ディスプレイである。スペクトル選択システム１０８は、回折格子のような光学的散乱エレメント、薄膜干渉フィルタのような光学フィルタの集合体、あるいはユーザ入力またはプロセッサのコマンド１２６（予めプログラミングされたプロセッサでもよい）に応答して、スペクトル・ソース１１２から物体１１０を通過して検出器１１６に向けて伝えられたスペクトルからの特定の通過帯域を選択するように構成された任意の他のシステムを含むことができる。
【００２３】
様々なスペクトル帯域において多数のスペクトル離散光学画像を同時に撮影するように構成されたシステムの代替実施態様１５０を図１Ｃに示す。ここでは、スペクトル選択システム１５４は、Ｎ個の離散スペクトル帯域に対応する様々な光出力を定める。システム１５４は、撮像システム１５８（例えば、光学システム）から透過光出力(transmitted light output)１５６を取り入れ(intake)、識別されたスペクトル帯域に対応する光路に沿って、この識別されたスペクトル帯域内にあるサンプル１１０を検出システム１６６上に撮像するように、この光出力の少なくとも一部を、Ｎ個の空間的に異なる光路１６２−１〜１６２−Ｎに沿って空間的に方向転換する(redirect)。尚、他の代替実施形態（図示せず）が実施形態１００および１５０の特徴を組み合わせてもよいことは認められよう。このようなスペクトル撮像デバイスの蛍光顕微鏡のための使用は、多重化核酸およびタンパク質マーカのような蛍光体を使用する種々のサンプル（例えば、生物学的組織）の価値が高い診断(high-value diagnostics)を可能にする。
【００２４】
図２に模式的に示すように、このような計器(instrumentation)によって生成されるスペクトル・データは、取得された全体的な放出スペクトルに対する、サンプルと共に使用された異なる検体または蛍光体２１４の相対的な寄与を表す、異なる取得部分または「検体チャネル」(analyte channel)２１０に分解することができる。図２は、線形分離（と
きとして「スペクトル・ディコンボリューション」"spectral deconvolution"または「スペクトル分解」(spectral decomposition"とも呼ばれる)の原理に対する例示を示す。こ
の原理によれば、図１Ａのそれのような、元のスペクトル・データ・キューブのスペクトル・データが、例えば、特定の検体の既知の基準スペクトルに計算的に比較され、次いで、既知のスペクトル成分を、各画素における各検体の強度寄与（例えば、正味の強度）を表す「チャネル」に分けるために、線形分離アルゴリズムが使用される。このような検体特定情報は、例えば、相対的検体濃度を質問するために有用であり、特定の疾病またはそのステータスの、外科医による診断および／または予知のために、新たな深度の情報を提供することができる。質問の有用な結果は、背景および／またはノイズ蛍光（例えば、蛍光代謝副生物から）および後方散乱光のような背景光によって生じたものから、分子および／または対象のマーカを表すスペクトル・データを分離することから得られる。したがって、高分解能のスペクトル画像データを取得し、異なる光源によって生じたこのようなデータに対する混合スペクトル寄与を分離する、即ち、ディコンボリュートする能力も、恒常的自己蛍光(constitutive autofluorescence)の寄与を除去するために重要である。
スペクトル撮像によってもたらされる信号対ノイズ比の向上によって、空間における光源または対象スペクトルの位置確認（信号位置確認と呼ぶ）の高精度な判定を、一層良く行うことができる(better enable)。この判定は、手元にある組織の詳細分析(anatomy)の判定に関係する。
【００２５】
量子ドットスペクトル・マーカの使用は、多重検定技術に多数の利点をもたらす（図３）。量子ドットの放出スペクトルは、実質的に対称的な強度プロファイルを有する狭いスペクトル分布で正しく近似される。このプロパティは、放出プローブまたはマーカとして
使用される他の光源からの量子ドットのスペクトル分布の処理を容易にする。可視スペクトルにわたる異なるスペクトル範囲において放出する多数の量子ドット種(quantum dot species)の選択は、多重化組織診断に使用することができる。所与の量子ドット種の放出
スペクトルは、通例、量子ドットの物理サイズによって定められる。放出スペクトルは量子ドットの物理サイズによって決定されるので、放出スペクトルは、例えば、量子ドットが関連付けられる組織における化学的環境または溶媒環境における変化による波長ずれが起こりにくい。量子ドットの励起スペクトルは、むしろ、多数の量子ドット放出種にとっては広域であり、ＵＶ範囲にも十分に達する。その結果、多数の量子ドット種が、重複する励起スペクトルを有することになる。例えば、狭帯域光（同じ量子ドット種の放出スペクトルからは十分に分離可能な実質的に１つの波長）との重複励起スペクトルの領域内における放射光線によって、結果的に多数の量子ドット種の励起の可能性が生ずることは、量子ドット励起手順の簡単な制御を可能にするので、有利である。具体的には、これは、実質的に同じ量の量子光が全てサンプルの検体に伝達されることを保証することを可能にする。量子ドットは、実質的に光安定種(photostable species)としても知られる。
【００２６】
前述の量子ドットの励起特性は、化学蛍光体のそれとは異なる。量子ドットとは対照的に、異なる波長において放出する異なる化学蛍光体は、通例、可視スペクトルの異なる波長における励起を必要とする。この理由のために、化学蛍光体をマーカとして生物学的組織と共に使用すると、励起プロセスが複雑になる可能性がある。具体的には、組織と関連付けられた多数の化学蛍光体をマーカとして使用すると、多重波長励起方式が必要となる。加えて、異なる多数の化学蛍光体の全体的な多重化放出スペクトルに対する寄与が、組織と共にスペクトル・マーカとして使用される化学蛍光体の相対濃度を精度高く反映することを保証するのは、容易でなくなる。
【００２７】
量子ドットおよび化学蛍光体／染料を伴うスペクトル検出の具体的な特性の概略的な比較を図３に示す。広い放出帯域、狭い吸収スペクトル、および光脱色の感受性(susceptibility)というような化学染料のスペクトル・プロパティは、量子ドットのそれらとは徹底的に異なる。量子ドットは、狭い放出帯域、広い吸収スペクトル、および光脱色に対する強い耐性を有する。その結果、量子ドット量子ドットに基づく撮像のために設計された画像取得計器の較正方法は、同じ機器を使用する、化学染料蛍光標準に基づく画像取得には十分に適応され難い。実際には、測定の精度の確認を行うのが困難である。何故なら、このような精度は、１）既知の濃度であり、２）光安定であり、および／または３）実験サンプルと一貫するプロパティを有する検体とのサンプルの使用に依存するからである。
【００２８】
画像取得機器の較正のための市販の蛍光標準は、通例、フロー・サイトメトリーと共に使用するように設計されたビーズと関連付けられ、および／またはこのビーズに吸収される。例えば、画像取得システムと共に使用される光学フィルタのシステムに依存して、このような化学マーカの使用によって得られた放出スペクトルのスペクトル分離分析の結果は、このシステムの標準較正仕様とは全く調和しないことが多くなる。ビーズの使用は、場合によっては、フィールド当たり大きなサンプル・サイズを得ることが複雑になり得る（一方、大きなサンプル・サイズが得られれば、測定値における信号対ノイズ比ＳＮＲが高くなる）。大きなビーズは、その湾曲した外形のために、レンズのような効果を生じること、および／または異なる物体面からの同じ画像に寄与することがあり得る。
【００２９】
したがって、多検体分光分析において標準を正確にそして信頼性高く使用するために、更に組織試料から一貫性があり高精度なデータ取得を確保するため、そして検体の放出データ全体に対する相対的寄与の高精度な評価を可能にするために、多検体ＭＳＩシステムのシステム・レベルにおけるこのような較正が求められるが、現在では提供されていない。この要望が満たされないのは、部分的に、適した較正標準がないためである。加えて、このようなＭＳＩシステムによって取得された画像データを処理するために使用される計
算スペクトル・ディコンボリューションまたは分離アルゴリズムのパラメータも適正に設定され(configure)、実際のスペクトル分布を反映する結果を生成することが確認されな
ければならない。このため、測定システムおよび染色検定（１つまたは複数）双方の開発のために、例えば、ダイナミック・レンジを指定することが重要である。
【００３０】
また、これは、スペクトル分離画像−データ処理の結果の信頼性高い検証方法の開発も必要とする。本願が取り組んでいる未解決の問題は、したがって、少なくとも四重である。（ｉ）このような撮像システムの性能(performance)の特徴付けおよび／または較正シ
ステム（１つまたは複数）ならびに方法（１つまたは複数）であって、このようなシステムを多数の異なる蛍光試料と共に使用することを可能にするものを開発する（即ち、撮像システムの性能を、指定された試料の使用に連携されることから切断するため）。（ｉｉ）ＭＳＩシステム全体のスペクトル性能の検査（統合システム・レベル検査）を提供する。（ｉｉｉ）標準化された単位(unit)に関してＭＳＩシステムの動作パラメータの振る舞い(performance)を評価し表現する。（ｉｖ）仕様にしたがって性能を確保するために満
たさなければならない、容認可能な染色検出範囲を決定する。
【００３１】
統合システム・レベル検査は、例えば、１）アルゴリズム、例えば、画像分析アルゴリズムおよび／または多重化量子ドット・レポーターを伴うシステムの分離性能の有効性を判断するときに重要であり、ならびに２）可視スペクトルにわたりそしてＩＲ範囲にも入る複数の（例えば、６、７、８以上）検体に対する量子ドット放出波長を反映するように特別に製作することができる。以下で提案するシステムおよび方法は，任意の単位として相対的強度を表現する従来の検査方法とは異なり、標準化された強度単位（ＳＩＵ）に関する検体チャネルおよび生データ強度情報の解釈をし易くし、したがって異なる計器からの強度データの有意な比較を可能にする。標準化された単位に関して信号およびノイズ双方（または他の動作特性）を表現することが可能であると、標準化された条件の下で異なるＭＳＩシステムの使用によって取得される撮像データのＳＮＲの有意な指定および比較が可能になり、異なる計器の動作性能の比較が可能になる。この前進は、例えば、計器の性能の定められた尺度においてダイナミック・レンジの制限を定め、計器のダイナミック・レンジを蛍光シグナリング技術のダイナミック・レンジから隔離する能力を提供する。
【００３２】
本発明による画像取得システム４００の一実施形態例のコンポーネントを図４Ａに示す。画像取得システム例４００は、スペクトル・ソース４１０、例えば、光源を含む。本発明の一実施形態例では、スペクトル・ソース４１０は、スペクトル・エミッタを含むように構成される。スペクトル・エミッタは、明確なスペクトル・プロパティを有する（例えば、Ｈｇ−ランプ、キセノンまたは他のアーク・ランプ、レーザ・ライン、発光放射性標準品(luminescent radioactive standards)、化学発光標準品、燐光体、および／または
ＬＥＤ）。スペクトル・ソース４１０のパワーおよび温度は、閉ループ電子回路および／またはマルチ・バンドパス・フィルタ４１０ａによって、安定化され、監視されるとよい。マルチ・バンドパス・フィルタ４１０ａは、ｎ個の既定の通過帯域を有し、スペクトル・ソース４１０の前に位置付けられる。本発明の実施形態例では、スペクトル取得システム４２２、例えば、顕微鏡ベースの光取得デバイスは、スペクトル・カメラ４４３を含むか、またはこれに結合される。スペクトル取得デバイス４４２は、走査プラットフォーム４４５を含む。走査プラットフォーム４４５は、軸、例えば、ｘおよび／またはｙ軸に沿って動き、物体の画像をキャプチャする(capture)ことができるように、スライドおよび
／または生物学的試料のような物体（プラットフォーム上に置かれるとよい）を走査するために利用される。
【００３３】
図４Ａに示す本発明の一実施形態によれば、画像取得システム４００は、第１スペクトル・ソース４１０を含む。第１スペクトル・ソース４１０は、スペクトル・ソース４１０によって定められたスペクトル特性を有するスペクトル、例えば、励起光を供給するよう
に構成される。本発明の実施形態例では、スペクトル・ソース４１０は、蛍光撮像用途に使用される広帯域光源（例えば、３５０−ｎｍおよび７００−ｎｍの間の放出スペクトルを有する）である。本発明の一実施形態例では、スペクトル・ソース４１０は、自己較正光源であり、光源のパワーおよび温度は、閉ループ電子フィードバック回路によって、安定化され監視される。
【００３４】
また、画像取得システム４００は、スペクトル選択システム４１０ａも含む（例えば、ｎ個の既定の通過帯域を有し、スペクトル・ソース４１０の前に位置付けられたマルチ・バンドパス・フィルタ４１０ａ）。一実施形態では、スペクトル選択システム４１０は、その隣接する通過帯域の内任意の２つの間における光の透過が実質的に遮断される（例えば、フィルタの最も高い透過レベルと比較して少なくとも３桁低減させられる）ことを保証するように構成される。その結果、ソース４１０によって生成された光４１４は、色中立メカニズム(chromatically neutral mechanism)４１６、例えば、スペクトル・ソース
４１０の絞り４１６を通過して、ビームスプリッタ４１８（例えば、５０／５０ビームスプリッタ等）に入射することができ、図４Ｂに示すように、所定の較正スペクトル４２２を有する。例えば、スペクトル選択システム４１０ａを利用することによって、サンプル４３０上に入射するスペクトル４１４の強度および波長のような、スペクトル（例えば、光）４１４のスペクトル・プロパティおよびパワーは、サンプル／物体４３０が放射光線または照明の経路に置かれる前に、判定することができる。本発明の実施形態例では、絞り４１６は、瞳面に配置され、種々の度合いで開閉され、スペクトル・ソース４１０からのスペクトル４１４出力を変化させる。
【００３５】
光４１４の一部は、光学システム４３６（少なくとも１枚のレンズを有するレンズ・システム等）を通過し、入射ビーム４２６を形成する。光学システム４３６を通過した後、入射ビーム４２６は、次いで、物体４３０、例えば、顕微鏡スライドのような部分的に反射性で部分的に透過性の（即ち、半透過性）基板の第１側面４４７に達する。
【００３６】
物体４３０から反射された光４４０は、中立密度フィルタのようなフィルタ４４４を通過した後、ＭＳＩシステムのコンポーネント（例えば、スペクトル・カメラ４４３）によって受光および検出される。本発明の一実施形態例では、このフィルタはＮＤ３フィルタであり、部品番号XB27/25Rで識別されVermontのOmega Optical社によって製造される。フィルタ４４４は、被測定光の強度を減衰させ、蛍光サンプルと一貫する強度レベルに比肩するレベルにそれを低下させるために利用される。関連する実施形態では、画像取得システム４００は物体４３０の反対側に、第２スペクトル・ソース４４８、例えば、透過光源を有してもよい。この透過光源は、それ自体のスペクトルを有するビーム４４６を生成し、ビーム４４６は、第２スペクトル・ソース４４８からのスペクトルが物体／サンプル４３０を通過してスペクトル取得デバイス４４２に向かうように、物体／サンプル４３０の第２側面４４９上に入射する。第２スペクトル・ソース４４８は、スペクトル・ソース４１０の代用でもよく、または追加のスペクトル・ソースとして設けられてもよい。
【００３７】
図５Ａに示すのは、本発明による撮像システム５００の他の実施形態例のブロック図である。本発明の一実施形態例では、撮像システム５００は、光を受けるセンサ５０４を有するスペクトル・カメラのような、画像取得装置５０２を含む、スペクトル撮像システムである。本発明の一実施形態例では、画像取得装置５０２はスキャナ５０６に含まれる。システム５００は、画像取得装置５０２に結合された画像形成装置５０８を含む。システム５００の実施形態例では、画像形成装置５０８は、例えば、（１）少なくとも１つのレンズ５１０を含み、（２）光学縦列(optical train)であり、および／または（３）顕微
鏡である。物体位置決め装置５１２が、画像形成装置５０８に結合される。本発明の実施形態例では、物体位置決め装置５１２は、単一画像または走査画像を得るために、物体、例えば、スライドを位置決めするために利用される。本発明の一実施形態例では、物体位
置決め装置５１２は、例えば、顕微鏡の一部である顕微鏡ステージである。本発明の実施形態例では、物体位置決め装置５１０は、ｘ−方向、ｙ−方向、ｚ−方向、回転方向、および角方向の内少なくとも１つに移動することができる。
【００３８】
システム５００および／またはこのシステムのコンポーネントの各々（例えば、画像取得装置５０２、画像形成装置５０８、および物体位置決め装置５１２）は、１つのＣＰＵ５１４によって制御することができる。尚、ＣＰＵ５１６、５１８、５２０が、代わりにまたは加えて、それぞれ、画像取得装置５０２、画像形成装置５０８、および／または物体位置決め装置５１２のコンポーネントの内任意の１つに含まれてもまたは結合されてもよいことは、当業者には理解されてしかるべきである。
【００３９】
第１スペクトル・ソース５２２は、システム５００に、光のようなスペクトルを供給し、本発明の一実施形態例では、スペクトルを物体位置決め装置５１２の平面５２４に伝達する。本発明の一実施形態例では、スペクトル・ソース５２２は、制御ユニット５２６を含むことができる。制御ユニット５２６は、スペクトル・ソース５２２の所望のスペクトル出力波長または波長範囲を制御し、選択し、または入射させるために利用される。本発明の一実施形態例では、第１スペクトル・ソース５２２は、部品番号P010-00201Rで識別
され、ＣＡ（都市および州）、OntarioのLumen Dynamics社によって製造される自己較正
光源のような、自己較正光源（即ち、スペクトル出力を監視し調整するのを助けるそれ自体のセンサを有する光源）である。本発明の一実施形態例では、スペクトル・ソース５２０は画像取得装置５０２に結合される。本発明の一実施形態例では、スペクトル選択システム５２８のようなスペクトル選択システムは、スペクトル・ソース５２２の経路内に配置されるとよい。また、システム５００は、第２スペクトル・ソース５３０、例えば、透過光源も含むことができる。第２スペクトル・ソース５３０は、物体位置決め装置５１２上に置かれた物体の側面を、第１スペクトル・ソース５２２からの入射スペクトルを受光するこの物体の側とは逆側において照明する。本発明の一実施形態例では、スペクトル選択システム５２８のようなスペクトル選択システムが、スペクトル・ソース５３０の経路内におかれてもよい。本発明の一実施形態例では、第２スペクトル・ソース５３０が制御ユニット５３２を含んでもよい。制御ユニット５３２は、スペクトル・ソース５３０の所望のスペクトル出力波長または波長範囲を制御する、選択する、または入射させるために利用される。本発明の一実施形態では、スペクトル制御ユニット５２６、５３２は、スペクトル・ソース４１０の出力を規制する(regulate)任意のデバイスまたは方法であり、フィルタを含んでもよい。本発明の一実施形態例では、スペクトル選択システム５２８はスペクトル・ソース５２２、５３０の外部にあってもよい。本発明の一実施形態例では、スペクトル制御ユニット５２６、５３２がメータまたはセンサを含む。本発明の一実施形態例では、スペクトル制御ユニット５２６、５３２は、スペクトル・ソース５２２、５３０からのスペクトルが撮像システム５００またはそのコンポーネント（画像形成装置５０８（例えば、光学列））等）を横断する(traverse)前に、その出力を規制する。センサまたはメータ５３４は、システム５００における任意の地点において、第１および／または第２スペクトル・ソース５２６、５３０によってシステム５００に供給されるスペクトルを検知、測定、および／または特徴化するために利用される。本発明の一実施形態例では、このセンサまたはメータは、任意のコンピュータ、またはシステム５００の内部または外部にある、ＣＰＵ、例えば、ＣＰＵ５１４、５１６、５１８、および５２０に結合されてもよい。
【００４０】
入力デバイス５３６がＣＰＵ５１２に結合される。本発明の一実施形態例では、入力デバイス５３６は、キーボード、マウス、タッチ・パッド、または他の入力デバイスである。本発明の実施形態例では、ＣＰＵ５１４、５１６、５１８、５２０の内任意のものまたは全てがネットワーク５３８に接続されてもよい。１つ以上のサーバ５４０、５４２および／または記憶デバイス５４４、５４６が、ネットワーク５３８および／またはＣＰＵ５
１４、５１６、５１８、５２０の内任意の１つ以上に接続されてもよい。システム５００のデバイス、装置、および／またはコンポーネントは、システム５００の一部として説明したが、システム５００のこれらの装置、デバイス、および／またはコンポーネントは単独で存在すること、あるいはワイヤラインまたはワイヤレス接続によってシステム５００に結合されることも可能である。
【００４１】
これより図５Ａおよび図５Ｂを参照して、本発明によるシステム、例えば、撮像システム５００および／またはシステム５００のコンポーネントの較正方法についてこれより説明する。システム５００の較正は、例えば、システム５００における任意の地点において、スペクトル強度の量を測定すること、例えば、物体面５２４においてまたはその付近において照明を測定することを伴うのでもよい。スペクトル・ソース５２２、５３０によって出力されたスペクトルの強度は、例えば、物体面５２４において入射するスペクトルの量と一致しないこともあり得る。物体面５２３に入射するスペクトルの量を確認することによって、同じ量のスペクトル（例えば、光）を物体面５２４（例えば、スライド上の組織サンプルの部位）に繰り返し伝達することができる。このように、物体面５２３に達する照明の量を識別することによって、システム５００の操作者は物体位置決め装置５１２においてまたはその付近において配置される、生物学的試料のような１つ以上の物体に伝達されるスペクトル、例えば、光の量を標準化することができる。
【００４２】
図５Ｂは、システム５００内部の複数の場所においてスペクトルの強度を識別する方法の一実施形態５５０を示す。この方法は、所望のスペクトル出力毎に、例えば、スペクトル・ソース５２２による励起光波長出力範囲について実行することができる。方法５５０は、ステップ５５２から開始し、ここでスペクトルがスペクトル・ソース５２２から出力されるように、スペクトル・ソース５２２をオンにする。ステップ５５４において、スペクトル出力が特定の波長または帯域と相互に関係するように、スペクトル出力をフィルタリングおよび／または調節することができ（例えば、スペクトル選択システム５２８または制御ユニット５２６によって）、フィルタリングおよび／または調節したスペクトル出力を生成する。
【００４３】
ステップ５５４からステップ５６０までは、スペクトル・ソース５２２によって生成される第２のおよび／または異なる波長または帯域のスペクトルの特性を測定するために、繰り返すことができる。本発明の他の実施形態では、ステップ５５４からステップ５６０までは、第２スペクトル・ソース５３０から生成される第２波長または帯域のスペクトルの特性を測定するために繰り返すこともできる。第２スペクトル・ソースのスペクトル波長または帯域は、第１スペクトル・ソース５２２について調節またはフィルタリングされたのと同じまたは異なる波長あるいは帯域に調節またはフィルタリングすることもできる。方法５５０のステップは、種々の波長のスペクトル出力について、連続的に繰り返すことができる。このように、例えば、システム５００内のある場所における１つ以上の波長に帰するスペクトルの強度が識別され、システム５００を既知のまたは期待されるレベルの性能に標準化または較正するために使用することができる。
【００４４】
本発明の一実施形態例では、スペクトル選択システム５２８は、スペクトル・ソース５２２内部に置かれるか、またはスペクトル・ソース５２２の経路内に置かれ、スペクトル・ソースおよび／またはスペクトル選択システム５２８の出力においてあるいはその付近において、スペクトル量が測定され、スペクトルが、例えば、画像形成装置５０８に達する前に、スペクトル・ソースまたはシステム５００の他のコンポーネントの性能を判定する。このように、例えば、スペクトルの強度またはパワーが、物体面５２４において予期されるものではない場合、システム５００内の特定の位置において伝達されたスペクトルが予期されない強度になった原因になっているかもしれないコンポーネントを、一層容易に特定することができる（たとえば、画像形成装置のレンズが、その期待される性能標準
を満たしていないこともあり得る。
【００４５】
また、図５Ａに示すシステム５００の較正は、ダイナミック・レンジ、即ち、画像取得装置５０２、例えば、スペクトル・カメラ、スキャナ、またはカメラのセンサのようなそのコンポーネントの検知能力の近似最小値および近似最大値を判定することを伴ってもよい。本発明の一実施形態例では、ダイナミック・レンジの最小値は、識別された全ノイズよりも上で測定可能な、カメラによって検知される最少スペクトル信号である。
【００４６】
ダイナミック・レンジは、最初に、第１または第２スペクトル・ソースからの入力がない状態で、強度オフセット補正画像および／または画素オフセット補正画像データ（ときとしてバイアス画像および／またはバイアス画像データと呼ばれる）を確認することによって判定され、較正の後に撮られるあらゆる画像を較正するために使用される。図５Ｃは、カメラの電子回路による強度値のオフセットを補正するために、全ての画像データに適用されるオフセット値を決定する方法５６０を表すフロー・チャートである。ステップ５６２において、光が画像センサに伝わるのを阻止するように、本システムを構成する。ステップ５６３において、オフセット値を決定する間に迷光が蓄積されないことを保証するために、ゼロ露出時間で画像を取得するように、本システムのセンサまたはカメラを設定する(set)。ステップ５６４において、これらの設定でスペクトル画像を取得する（これ
は、事実上、「無」の画像であり、したがって、目立つ強度はいずれも、カメラの電子回路によるものになる）。ステップ５６４において取得した画像から、０よりも大きな画素値のオフセットを確認するために、各波長画像において、モード画素値(modal pixel value)を計算する。この情報は、各波長において、後続の画像における全ての画素からこの
オフセットを減算するために使用することができる。その最終結果は、光を受けない画素は０の値に設定されることである。スペクトル・ソースからの入力がない状態でキャプチャされた画像のモード画素強度値は、画素オフセット画像、データ、および／または値であるので、ときとして、バイアス画像、バイアス画像データ、バイアス・オフセット画像、画素オフセット画像、画素オフセット値、または画素オフセット画像データと呼ばれる。本発明の実施形態例では、オフセット補正値は、例えば、グレー・スケール値、または電子（ｅ−）、またはクーロン（Ｃ）の単位で表現することができる。オフセット値は、システム５００を使用して照明されたフィールドまたは物体（例えば、スライド上にある生物学的試料）から画像が後に撮られるときに、画像（例えば、スペクトル画像）またはスペクトル画像データ（例えば、多重スペクトル画像データ）に適用される。
【００４７】
図５Ｄは、画素オフセット補正データおよび／または画像に基づいて、補正画像および／または補正画像データを決定する方法５７０を表すフロー・チャートである。ステップ５７２において、スペクトル・ソースを作動させる(activated)。ステップ５７３におい
て、スペクトル・ソースを特定の波長または帯域幅にフィルタリングまたは調節する。ステップ５７４において、スペクトル・ソースを、画像取得に適した標準化パワー出力に調節する。ステップ５７６において、カメラ露出時間を、カメラに達する光の強度レベルに適した値に調節する。ステップ５７７において、画像取得装置５０２によって、均等に照明されたフィールドの第１画像をキャプチャする。ステップ５７８において、各波長に対するオフセット値（先に概略を説明した方法５６０において既に導かれている）を、取得したスペクトル画像の、対応する各波長における、各画素から減算する。ステップ５７３からステップ５７７までは、同じ設定値を使用して、画素間強度分散を計算することができる１対の画像を得るために繰り返すことができ、このプロセスは、種々の波長、波長帯域、および／または露出時間毎に繰り返すことができる。
【００４８】
ダイナミック・レンジを決定する際、撮像システム５００またはそのコンポーネント（例えば、スペクトル・カメラのセンサ）のノイズ（平均および分散多重スペクトル・カメラを判定することを含み）、この値は電子ノイズ画像データを表現するために、後に使用
される）によって報告されるグレー・スケール値に加算して標準強度単位変換を決定するために、図５Ｅに示す方法６００を必要とする場合もある。ステップ６０２において、スペクトル・ソース５２２を作動させる。本発明の一実施形態例では、システム５００は、撮像取得装置５０２が受ける照明が均等または実質的に均等になるように（例えば、スペクトル・カメラの複数のセンサにわたって照明が均等になる）構成される。強度レベルは、照明レベルを測定し所与の波長において所望の出力に調節するために物体面に一時的に置かれたサンプル面センサを使用して、続いて行われるデータ取得毎に、強度レベルを較正する。ステップ６０２において、１つ以上のスペクトル・ソース（例えば、広帯域光源または複数の光源）をオンにしている間に、画像取得装置５０２を使用して、第１画像（例えば、スペクトル／多重スペクトル画像）をキャプチャする。ステップ６０２において、画像取得装置５０２によって、第２画像をキャプチャする。ステップ６０２において、前述の方法５７０によって識別されたオフセット補正値、画像、および／またはデータを、第１および第２画像および／または第１および第２画像データの各々からのゼロ露出画像の各波長における画素値から減算して、第１補正画像および／または第１補正画像データ（例えば、キャプチャしたｘ、ｙ、λ毎のスペクトル強度値のような、データの画像キューブ）、ならびに第２補正画像および／または第２補正画像データ（例えば、データの画像キューブ）を生成する。
【００４９】
ステップ６０３において、第１および第２画像の対応するオフセット補正スペクトル強度値および／または第１および第２組の補正画像データをそれぞれ減算することから、最終的な(resultant)示差画像データを生成する。ステップ６０４において、スペクトル特
性、例えば、最終的な補正画像データにおける波長／帯域毎の画素強度値の標準偏差が、更に、各波長または帯域における画素強度値に関連付けられた分散値を決定するときに使用される。ステップ６０４において、最終的な示差画像データの波長／帯域毎に、分散を決定する（例えば、多重スペクトル標準偏差画像データを２で除算することによるというように、標準偏差に基づいて）。尚、分散は、標準偏差が決定される前に決定されてもよいことは当業者には認められてしかるべきである。以上の方法は、例えば、標準偏差、分散、および平均を決定することによって説明されるが、前述のこと（標準偏差、分散、および平均）は関係があり、したがって本発明の方法のステップにおいて、１つを他の代わりとして決定するおよび／または置き換えるには十分であり得ることは当業者には理解されてしかるべきである。更に、例えば、標準偏差、分散、および平均を決定することを伴う本発明のステップは、本発明の方法において説明された順序で必ずしも実行する必要はない場合もある。
【００５０】
ステップ６０５において、第１および第２補正画像データの内少なくとも１つの各波長においてモード画素強度値を生成し、決定し、または受け取り、最終的な補正画像の対応する波長／帯域毎にステップ６０４において決定された分散に分割して、波長毎に変換値を生成する。得られた変換値は、例えば、グレー・レベル毎にスペクトル・カメラにおけるＣＣＤセンサによって各画素において記録された電子の数または近似数を表す。その結果、例えば、画像（例えば、スペクトル画像）の明るさのレベルが、標準化測定単位（ＳＩＵ）、例えば、電子（ｅ−）に反映される。ＳＩＵへの変換は、標準化単位（標準化条件の結果として）に関してカメラのＳＮＲおよびダイナミック・レンジの表現をし易くし、更に異なる分析および撮像システム間における測定値および／または測定結果の客観的比較(objective comparison)もやり易くする。標準化条件とは、できるだけ高い度合いまで、測定条件を容易に再現および／またはモデル化できるように、測定に影響を及ぼし得る要因を制御し報告する条件である。
【００５１】
本発明の一実施形態例では、データ取得システムのセンサ電子回路に関連付けられるノイズは、一般に、ＣＣＤ技術を採用するＭＳＩシステムのダイナミック・レンジを制限する主要な要因となる。本発明の一実施形態によれば、画像取得ノイズの判定は、方法７０
０（図５Ｆ）において示される以下のステップを伴う。
【００５２】
−ステップ７０２において、ステップ５６２からステップ５６４まで（図５Ｃ）において同様に実行されるように、システムの照明を全く作動させずに、第１および第２スペクトル・オフセット（またはバイアス）画像を取得する。
【００５３】
−ステップ７０３において、第１オフセット画像を第２オフセット画像から減算することによって、示差画像を生成する。この示差画像は、データ取得の間におけるセンサ電子回路から分離されたノイズを表す。
【００５４】
−ステップ７０４において、示差画像の標準偏差を計算する。
−ステップ７０５において、標準偏差の調節された値（２つの画像を減算したことによる可変性の増大に対して）を２の平方根で除算し、結果値(resulting value)を生成する
ことによって、この調節された値を補正または調節する。
【００５５】
−ステップ７０６において、結果値と、図５Ｅのステップ６０６において決定された変換係数とを乗算することによって、結果値を標準化強度単位に変換する。結果値および変換された結果値は、撮像システムの取得ノイズの判定された尺度に対応し、ノイズの詳細(noise specification)を明らかにするために利用することができる。
【００５６】
ダイナミック・レンジは、撮像取得装置が、例えば、ディジタル化する（即ち、アナログ信号を検知し、ディジタル信号に変換する）ことができる最大および最少光強度値の比として、ときとして表現されることもある。本発明の一実施形態例では、範囲の最大限度は、特定のビット深度（例えば、８ビットの深度を有する画像は、２５５の最も高いグレースケール・レベルを有する）に対する最も高いグレー・レベルを変換値と乗算することによって決定される。最小値は、ノイズ・フロアまたはその付近となり、またはほぼ変換値（例えば、電子変換値）を、計算したノイズに加算した値となる。図５Ｇは、標準的な照明および露出設定値において、スペクトル撮像システムに対して波長毎にダイナミック・レンジを決定するフローを示す。
【００５７】
システムを較正するとき、センサ応答の線形性も判定することができる。図６Ａに示すのは、システム５００、またはそのコンポーネントの線形性（例えば、ディジタル・カメラ、スペクトル・カメラ、またはカメラのスペクトル（例えば、光）に対するセンサというような撮像装置取得装置５０２の応答の線形性）を判定する方法１２００である。線形性は、例えば、撮像取得装置５０２からの信号出力が、受けるスペクトル（例えば、光）の量に比例するか否か確認するために判定される。本発明の一実施形態例では、撮像取得装置５０２は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）センサを有するディジタル・カメラまたはスペクトル・カメラである。ＣＣＤセンサの機能の１つは、画像情報を搬送する光子（即ち、アナログ信号）を電子信号（即ち、ディジタル信号）に変換することである。理想的には、撮像装置および／またはそのコンポーネントから出力される信号は、センサ上に入射する光の量に線形に比例するはずである。本発明の一実施形態例では、センサ上に入射する光の量は、スペクトル（例えば、光）に対する露出時間量に関係する。
【００５８】
図６Ａは、撮像装置および／またはそのコンポーネント（例えば、スペクトル・カメラおよび／またはカメラのセンサ）の線形性を判定する方法１２００を示す。本発明の一実施形態例では、多数の波長（図６Ｂに示すように、ｎ＝４）およびシステム５００のダイナミック・レンジの大部分にわたってしかるべく分布された所定の光レベル（例えば、１０ｍＷ、４０ｍＷ、７０ｍＷ、１００ｍＷ）で、所定の露出時間（例えば、２０ｍｓ）を使用して、図６Ｂに示すように、異なるレベルの入射光に対応するスペクトル・データ・キューブを得るために、各画像が取得される。スペクトル・データは、一般に、選択され
たマーカの蛍光の波長を模擬するように選択された波長において得られる。図６Ａのステップ１２０２において、均等に照明されたフィールド（例えば、部分的に反射性であるスライドのような基板）の第１組の画像データを、方法６００を使用してキャプチャし、第１組の画像データの画素強度値のモードおよび分散を判定する。撮像取得装置５０２によってキャプチャされる光レベルは、設定された露出時間において、センサのダイナミック・レンジの最大値またはその付近に設定されなければならない。ステップ１２０３において、ダイナミック・レンジの最小値またはその付近で、物体（例えば、部分的に反射性であるスライドのような基板）の第２画像および／または第２組の画像データをキャプチャし、第２画像または第２組の画像データの画素強度値の平均および分散を判定する。ステップ１２０４において、撮像取得装置５０２によって、ダイナミック・レンジの最小値と最大値との間のある値において、物体（例えば、部分的に反射性であるスライドのような基板）の第３画像および／または第３組の画像データをキャプチャし、第３画像および／または第３組の画像データの画素強度値のモードおよび分散を判定する。ステップ１２０５において、３つ（または任意にそれよりも多く）の点の各々に対して、グラフの横軸に分散値をプロットし、モード値を縦軸にプロットする。これらの点に当てはめられた直線の勾配は、変換値を表し、理想的には、方法５８０において（評価対象になっている所与の波長において）計算した値と一致しなければならない。直線のデータ点に対する「当てはまりの良さ」の尺度は、センサの応答の線形性（この所与の波長における）の尺度となる。
【００５９】
ステップ１２０７において、所与の波長における第１、第２、および第３画像、および／または第１、第２、および第３組のデータに関連付けられた複数組の平均および分散データの各々について、線形回帰を判定する。本発明の一実施形態例では、第１、第２、および第３画像、および／または第１、第２、および第３組のデータに関連付けられた平均および分散データをグラフ上にプロットしてもよい。本発明の一実施形態例では、線形回帰は、次の最少二乗計算によって判定することができる。
【００６０】
【数１】
2018119968.tif 000003
【００６１】
ここで、ｉは所与の光レベルを表し、variancenoiseは、オフセット画像（光なし）につ
いて計算した分散を表し、slopeiは、所与の光レベルに対する分散／モードデータ点における勾配を表す。上の式は、オフセット画像（光なし）について計算した分散の値において発する線の勾配を得る。
【００６２】
【数２】
2018119968.tif 000004
【００６３】
ステップ１２０７において、Ｒ２値を判定または識別する。
【００６４】
【数３】
2018119968.tif 000005
【００６５】
ここで、variancepredictedは、所与の光レベルにおいて線の方程式によって予測される
分散値であり、異なる光レベルにおいて収集された分散値の平均値である。SSerrは、「
残差平方和」であり、SStotal は、計算されたデータ点を通過する線に対するデータ点の「当てはまりの良さ」を評価するための「全平方和」を表す。
【００６６】
Ｒ２値は、画像取得装置５０２、またはそのコンポーネント（例えば、スペクトル・カメラのセンサ）の線形性を示す。例えば、Ｒ２値が１に等しい場合、本システムは、非常に線形性が高く量子化に理想的であると見なすことができる。ステップ１２０６において、第１、第２、および第３画像の各々および／またはデータ集合に関連付けられた平均および分散データに当てはめられた線の方程式から、勾配を判定する。この当てはめ線の勾配は、波長毎に大きく変動しないのが理想的である。ステップ１２０４からステップ１２２２までは、データ集合における種々の波長／帯域幅毎に繰り返される。図６Ｃは、実施形態６００を使用して評価された、ほぼ完全な線形性の平均強度対変動依存性の関係を示す。単位グレー・レベル毎の標準化強度単位の値は、波長λｋに対して勾配が約３．３ｅであることから決定される。この依存性から取得された点を通る線形回帰当てはめ曲線が、選択された波長λｋに対するＲ２値を生成する。Ｒ２値は、ＭＳＩシステムの（分光計の）応答の線形性の度合いを反映し、Ｒ２＝１のときに理想的な線形性を示す。
【００６７】
撮像システムの標準単位変換、ダイナミック・レンジ、およびその性能の線形性の判定から、取得された画像の強度情報を、ｅ−の標準化単位、計器が記録することができる検出可能な値の範囲、および強度値とサンプルの強度との間の関係に関して解釈するための較正の基礎が得られる。スペクトル撮像計器に対するこれら基本的なメトリックの使用により、異なる計器によって得られた強度データの有意な比較が可能になる。
【００６８】
スペクトル精度および分解能
本発明の一実施形態によれば、取得された画像のスペクトル特徴を解明する本システムの能力の評価が、スペクトル分離アルゴリズムの使用に先立って、確定されてしかるべきである。このような評価のための方法は、所定のカットオフを有する長波長通過フィルタ（例えば、約４０９ｎｍおよび９００ｎｍの間の光の収集のために約４０９ｎｍにカットオフを有するフィルタ）を使用する。好ましくは、スペクトル精度および分解能の判定は、温度制御された光源を使用して行われる。何故なら、温度変動は基本的なスペクトル線のスペクトル位置に影響を及ぼす可能性があるからである。
【００６９】
例えば、２Ｄカメラ・アレイによってキャプチャされたエリアを均等に覆うように分布された照明を使用する撮像分光計の高（スペクトル）分解能設定値における標準化露出時間および照明のレベルを使用して、スペクトル・データ集合（図１Ａと同様の多重スペクトル画像キューブ）が取得される。このような照明は、閉ループ安定化Ｈｇメタル・ハライド・ランプから供給され、選択された表面からの反射（例えば、図４Ａと同様のセット
アップの使用により）によって得ることができる。このようなＨｇ−ドープ・メタル・ハライド・ランプ技術から取得されたスペクトルの一例を図７Ａに示す。Ｈｇ−ランプの基本スペクトル・ピークのスペクトル位置は、分かっている（４３６ｎｍ、５４６ｎｍ、および５７８ｎｍ）。
【００７０】
図７Ｃに示す、本発明の方法１３００によれば、画像データ集合のスペクトル特徴が、既知の物体、例えば、部分的に反射性であるスライドの画像データ集合について予測される１組のスペクトル特徴と比較される。この特徴付け方法は、既知の標準のスペクトル・ピークを採用して、撮像分光計が、これらの基本スペクトル・ピークに対応することが分かっている波長において、ピーク位置を認識または検出するか否か判断する。使用される基本スペクトル・ピークは非常に狭い（基本的発光プロパティのために）ことが知られており、したがって、近似的にスペクトル的に別個であるまたは離散すると見なすことができるので、これらのピークを使用すると、選択された分解能判断基準に基づいて、近接するピークを解明する測定機器の能力を判定することができる。（このような判定は、基本ピークのような標準は、使用される分光計の分解能よりも遙かに狭いスペクトル特徴を有するという仮定に基づく。）したがって、撮像分光計によって生成されるピーク形状は、検査の条件下における分光計の分解パワーの限界を表す。
【００７１】
ステップ１３０２において、既知のスペクトル特徴を有するスペクトル・ソース、例えば、光源を作動させて、スペクトルを出力する（例えば、照明）。ステップ１３０３において、物体の画像を取得する。ステップ１３０４において、測定されるスペクトルに対するノイズの影響を最少に抑えるために、スペクトル・プロパティが均質であることがわかっているエリアについて、スペクトル情報（トレース）の平均を取る。ステップ１３０５において、スペクトル・ピークに位置を、強度のプロットから、波長の関数として識別および／または測定し、スペクトル特徴（例えば、照明標準の基本プロパティ）の知識に基づいて、これらのピークが現れるべきところの既知の値と比較する。ピークが期待される位置からずれる場合、例えば、システム５００に関連付けられたハードウェアおよび／またはソフトウェアを調節することによって、計器は調節またはサービスが必要になることもある。本発明の一実施形態では、ずれたスペクトル・ピークに応答してのシステム５００の調節は、スペクトル画像処理および分析ソフトウェアにおいて使用される定数を変更することによって、記録されている強度値に対する波長のマッピングの調節を必要とする。
【００７２】
図７Ｂを参照すると、各スペクトル・ピークの位置が、基準線上の最大の半分において、上昇する強度値と下降する強度値との間の中間にある波長値として記述することができる。このスペクトル・ピーク位置判定の慣例は、スペクトル・キャプチャ範囲にわたるスペクトル強度サンプル点の位置によって混入するエリアシング誤差のために、ピーク位置を間違える潜在的可能性を低減するために使用される。
【００７３】
本発明の一実施形態例では、例えば、プロットによって、結果的に得られるスペクトル・データ（波長の関数として記録される強度）が識別され、プロットによってスペクトル・ピークの幅が特定および／または測定される。一実施形態例では、この測定は、ピークの基準線と各ピークの頂点(top)との間のほぼ中間で行われる。通例、選択された較正標
準（例えば、Ｈｇ基本ピーク）のスペクトル特徴は、スペクトル撮像デバイスの制限された分解能よりはるかに狭い。したがって、スペクトル・ピークの記録された幅が識別され、このような幅は、波長範囲の特定の部分に対するスペクトル分解能に対応する。図７Ｄに、特定の計器の仕様にしたがって各波長においてスペクトル分解能を検証する方法１４００を示す。ステップ１４０２において、離散する特徴または狭いピークを有するスペクトル・ソースを作動させ（例えば、基本ピークを有する光源）、物体（例えば、半反射性スライド）上にスペクトルを出力する。図７Ｂは、３つの分解能設定値により、方法１４
００のステップ１４０４〜１４０６を使用して取得されたスペクトルを描画する。使用した較正済みのスペクトル・ソース（この場合、Ｈｐ−ランプ）のスペクトル・ピークの少なくとも一部の半値全幅（ＦＷＨＭ）は、計器の分解能よりも狭いことが分かっているので、取得されたスペクトルは、分解能設定値がピークの既知のＦＷＨＭとどのように拮抗するかを示す。例えば、約５４６ｎｍおよび５７８ｎｍを中心とするピークに対して対応するＦＷＨＭ値を考慮することができる。
【００７４】
更に図７Ｂを参照すると、３０ｎｍ分解能のスペクトル（トレースＣ）において、５４６−ｎｍおよび５７８−ｎｍにおけるＨｇ−ランプのスペクトル・ピークは解明されず、ピーク強度が平均される。１５ｎｍ分解能のスペクトル（トレースＢ）では、ピークは解明されるが、むしろ粗く(bluntly)定められる。１０ｎｍ分解能のスペクトル（トレース
Ａ）では、ピークは十分に解明され、ピークの各々のスペクトル全体に対する相対的な寄与は、スペクトルの直接調査によって、一層容易に認められる。この例は、スペクトル分解能の設定(setting)が、データにおけるサンプルの表現に対して及ぼす可能性がある影
響を例示し、この方法を使用して、スペクトル分解能を測定し、計器(instrumentation)
に対して指定することができる。
【００７５】
空間精度および正確度／光学素子の横方向および軸方向色収差検査
図８Ａに示すのは、広いスペクトル範囲にわたって撮られたスペクトル画像の空間座標の撮像、例えば、位置(location)および焦点品質(focus quality)を評価するために利用
される方法１５００である。ステップ１５０２において、スペクトル・ソースを作動させ、物体、例えば、一種の幾何学的格子を有するスライド（規則的な繰り返しパターンを有する較正スライド等）にスペクトルを出力する。本発明の一実施形態例では、スペクトル・ソースは広帯域スペクトル・ソースであり、またはスペクトル検出範囲をカバーする波長において照明を生成する任意の光源である。本発明の一実施形態によれば、画像取得システム５０２、例えば、スペクトル顕微鏡またはスライド・ディジタル化計器の空間精度および正確度は、この目的のために懸命に設計された精密標準品(precision standard)を使用して評価される。例えば、検査パターンが所与の用途（多重組織撮像の用途等）全ての波長において等しく見えることを条件に、反射パターン標準品を使用することができる。標準品は、撮像システムが異なる波長において混入させたかもしれない横方向歪みおよび焦点ずれを明らかにする１組の規則的な画像の特徴を生成するように構成される(adapt)。ステップ１５０３において、画像取得デバイス５０２を利用して、スライドまたは物
体の画像および／または画像データ（例えば、スペクトル画像および／またはスペクトル画像データ）を取得する。ステップ１５０４において、画素の１つ以上の行または選択(selection)からの強度データを、データ集合における波長または帯域幅１つずつについて
識別する。本発明の一実施形態例では、１つの波長、例えば、青において画像を横切る１つの画素行または画素列からの強度が、空間位置の関数としてプロットされ、次の他の波長、例えば、緑が同じグラフ上にプロットされる。このプロセスは、対象の波長全てが比較のためにプロットされるまで続く。ステップ１５０４は、複数の空間領域に対して繰り返すことができる。１つの波長において視野にわたって撮像された周期的な空間特徴を、異なる波長における同じ周期的特徴と比較することができる。あるいは、周期的な変化を、物体の予期される振る舞い（例えば、較正スライドの耐久性）と比較するのでもよい。あるいは、所与の照明波長において平均強度値を取り、計器の物理焦点を調節し、多数の焦点位置において平均強度値を再評価することによって、複数の波長における画素強度を軸方向（ｚ）軸において反復的に評価してもよい。この手順は、所与の波長に対する最高の強度値の焦点位置を発見することによって（所与の波長に対する焦点、および波長間の焦点位置の相違を示す）、異なる波長において生ずる軸方向色焦点ずれ(axial chromatic
focal shift)があるか否か判定するために使用することもできる。 
【００７６】
図８Ｂは、λ３において取得された一次元（１Ｄ）プロット９０６であり、強度分布の
図８Ｂの反射性標準品９１０にわたる位置の関係を示す。図８Ｂ、図８Ｃの例では、反射性標準品９１０は、電子顕微鏡において従来より使用されていた炭素膜レプリカ標準品(carbon film replica standard )であった。標準品９１０によって生成される反射性パタ
ーンの周期的特徴のエッジに対応する強度値は、スペクトル・データ集合からの１つの波長における合焦特徴(in-focus feature)に対する撮像システムの横方向空間分解能を表す。
【００７７】
反射性標準品９１０が、光学システム４３６の「理想的な」焦点から逸脱して置かれる場合、結果的に得られるこのような標準品の画像は、画像コントラストが減少し（プロット９０６から取得される）、定められた判断基準（例えば、強度変化の割合）にしたがってこのような画像コントラストを拠り所にして判定された撮像システムの空間分解能には誤差が生ずる。他の波長における理想的な焦点からの反射性標準品９１０の位置付けの乖離率は、選択された基準波長、例えば、λ３において判定された空間分解能と比較して、反射性標準品のパターンの周期的特徴のエッジにおける分解能の低下率によって近似することができる。更に、ＭＳＩシステム（この例では、分光計またはスペクトル・カメラ）の横方向分解能は、曲線上の最大半量点および曲線における最大強度点の相対的位置を測定し、これらの点に対応する波長を比較することによって、判定される。視野にわたるプロット９０６における画像縞の空間規則性のような、記述的メトリックは、しかるべき画像データ処理によって判定することができる。
【００７８】
撮像視野内における歪み（例えば、横方向色歪み等）も判定することができる。空間較正パターンの波長帯域画像の擬似カラー・オーバーレイ(pseudo-color overlay)は、全ての波長成分に対する正しい(good)整列を明らかにするはずであり、規則的な特徴間の空間は、視野にわたって一定でなければならない。このような空間／スペクトル評価は、検定の用途のための撮像システムの波長依存性能を特徴付けおよび最適化するために必要である。例えば、ある波長において横方向空間歪みがあることが明らかになった場合、その根源を特定し、必要であれば、補正処置を実施することができる。歪みの状況が分析および／または特徴付けされない場合、診断用途のための空間位置確認の結果が、分光画像において記録される異なる波長毎に異なる可能性があり、これは、分子マーカ位置確認に起こり得る誤差または誤解釈の根源になる。
【００７９】
量子効率、波長依存応答
画像取得装置５０２（例えば、光感応デバイス、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、またはスペクトル・カメラ）の量子効率（ＱＥ）も判定することができる。相対的な量子効率は、画像取得装置５０２の異なる波長における光に対する感度を測定する。量子効率とは、電子に変換される入射光子の量を言い、率（例えば、ＩＰＣＥ率）で表すことができる。ＩＰＣＥ率は、電荷担体を生成する画像取得デバイス５０２の光反応面に当たる光子の百分率に相互に関係がある。量子効率に相関があるＩＰＣＥ率は、光子当たりの電子またはワット当たりのアンペアの単位で測定される。量子効率は、各波長において画像取得装置５０２の相対的な効率を特徴化するために、ある範囲の異なる波長にわたって測定するとよい。本発明の一実施形態例では、異なる検出波長において装置に伝達される全ての光子の内、実際に記録する（即ち、検知される）光子の割合を較正するために、量子効率を判定する。つまり、ユーザは、計器またはセンサ間の差を調和できるように、量子効率に基づいてデータに対する相関付けを行うことができる。一実施形態では、異なる光学素子を使用してＱＥの差を補正するために、スペクトル・キューブにおける強度値の計算による拡縮(scaling)によって、調節を行ってもよい。他の実施形態では、ＱＥの差を補償する
ために、異なる波長レンジのキャプチャのための露出時間を変更することができる。他の実施形態では、照明レベルを増減してＱＥの差を補償するために、ＱＥ情報を使用することができる。
【００８０】
本発明の一実施形態によれば、撮像システム５００の波長依存応答を判定するために、様々な照明（発光）フィルタ、例えば、染料検体（例えば、ＤＡＰＩ）および／または量子ドット放出波長のような、例えば、染色(stain)または標識に対応する、実質的に等し
い帯域幅を有するフィルタ（例えば、約４６０ｎｍを中心とする約２０ｎｍの通過帯域を有するフィルタ。これは、簡略化のために２０／４６０のように明記される。あるいは、２０／５２５フィルタ、または２０／５６５フィルタ、あるいは２０／５８５、２０／６０５、２０／６２５、２０／６５５、２０／７１０フィルタの内少なくとも１つ）が選択される。例えば、システム５００の波長範囲全体をカバーするために等しいまたは実質的に等しい帯域幅を有する放出フィルタ（１つまたは複数）が、図４Ａに示す撮像経路内に個々に置かれる。測定対象の各波長または帯域において標準化された量の照明を出力するためにスペクトル出力を標準化できるように、物体面、例えば、物体／サンプルの表面に位置付けられた電力計またはセンサが、スペクトル・ソース（例えば、光源）を較正するために使用される。その結果、スペクトル（例えば、光）の量および／またはパワーをシステム５００またはそのコンポーネントにあるいはその内部に伝達することができ、このようなスペクトルの量および／またはパワーは、物体および／またはサンプル面の表面において再現または実質的に再現され、等しい量の光が撮像光学素子によって集光され、対象の各波長帯域においてセンサに導かれることを保証することができる。部分的に反射性のサンプル（例えば、図４Ａ、図４Ｂを参照して論じたガラス・スライド４３６）が、反射性表面を設けるために使用されてもよく、代わりに、出力を注意深く調節することができ、あらゆる反射面が対象の全ての波長に対して等しく反射するのであれば、透過スペクトル・ソース５３０（例えば、光源）を使用してもよい。画像取得装置５０２（例えば、スペクトル・カメラ、分光計等）は、量子効率画像の全ての取得の間、例えば、標準化されたスペクトル分解能設定（例えば、５ｎｍ）および標準化された露出時間（例えば、３０ｍｓ）で使用される。一般に、標準化露出時間は、濾波帯域(filtered band)から光を
受ける検出器の飽和レベルの約８０％に達するように決定され、これが最大の検出効率を有する。取得され分析される全てのデータと同様に、画像はバイアス補正され、ピーク波長画像毎に、平均値が判定される。
【００８１】
図９Ａに示すのは、量子効率を判定する方法例１６００である。ステップ１６０２において、スペクトル・ソース５２２（例えば、広帯域光源）を作動させ、スペクトル（例えば、照明）を出力し、標準化された単位（例えば、ワット）で測定可能にする。ステップ１６０３において、計器の検出波長範囲をカバーする標準化された１組の等しい帯域幅フィルタから、狭帯域フィルタを選択する。ステップ１６０４において、選択したフィルタを光が通過した後にパワーを測定し、物体面に標準化されたレベルの光を供給するように、光源を調節する。ステップ１６０５において、スペクトル撮像デバイスによって、均等に照明されたサンプル面を撮像する。ステップ１６０６において、オフセットを減算することによってスペクトル画像を補正し、画像全体に対する画素強度を合計し、スペクトル画像において収集された全光量を測定する。ステップ１６０７において、全てのスペクトル画像を収集した後（フィルタ毎に１つ）、各画素強度合計値を最大和で除算して、全ての合計を、最大値の小数に正規化する。最大和の値は、最高量子効率の波長を表し、他の値は、この最高量子効率の分数になる。ステップ１６０８において、波長範囲にわたる量子化効率曲線を可視化するために、これらの値をプロットしてもよい。あるいは、これらの値は、スペクトル画像を調節して異なる波長における撮像システムの異なるＱＥを否定するために使用される較正曲線を生成するために使用することができる。本発明の一実施形態例では、生成した相対的量子化効率は、所与の設定値で取得された異なる波長に対して、記録された波長値を補正するために利用される。本発明の一実施形態例では、量子化効率曲線を生成し、未補正のデータ集合をこの量子化効率曲線で除算して、記録された強度値の、異なる波長における相対的検出効率の差を調節する。このプロセスは、各波長における数値強度値を補正する。本発明の一実施形態例では、このような補正されたデータは、異なる波長依存透過プロパティを有する、異なるレンズ・システムを使用して取得さ
れたデータを比較するために利用される。このように、撮像システムは、スペクトル、例えば、異なる波長／帯域における光の既知量を測定して、スペクトルにわたる異なる波長における相対的検出効率百分率を判定する。このような測定は、光学素子の透過およびセンサの量子効率の双方を含む、システム・レベルの波長依存効率測定値を生成する。例えば、システムが、波長５００−ｎｍにおいてピーク検出効率を有し、波長４００−ｎｍにおいてピーク効率の３０％、そして波長６００−ｎｍにおいて３０％の効率を有することがあり得る。これらの検出効率の値が分かっている場合、異なる波長において取得された検体強度（例えば、量子ドット５６５の光の強度、および量子ドット６５５のそれ）の測定値を補正し、計器によるこの異なる検出効率を考慮に入れることができる。この特徴付け方法によって、較正は、異なる波長において取得された測定値、および異なる透過効率の異なるコンポーネントを使用して取得されたデータ集合の比較を可能にすることができる。
【００８２】
異なる波長において測定された値の差の百分率は、計器間でまたは光学構成間で比較して、標準化された入力を想定して（この手法を使用すると、波長応答の大きな格差が、デバイス間で明白になるはずである）、計器の波長に対する応答の比較を行うことができる。異なる波長における量子効率の差を補正する能力により、所与の計器の波長効率による検体濃度の誤解釈の潜在的な可能性なく、サンプルの高精度な解釈が可能になる。
【００８３】
説明した本発明の方法およびアルゴリズムの実施形態によるＭＳＩの較正は、実質的な動作分離(isolation)における高精度な撮像結果、および撮像計器の性能の蛍光サンプル
の可変性からの切断を保証し、しかもなおシステム・レベルの性能統合が達成される(provide)。これらの実施形態によれば、較正済みの光源および耐久性がある物理標準品を撮
像システムに組み込み、ソフトウェア・ツールと組み合わせることができ、機械的で、任意に、自動化された、チェックおよび自己較正手順ならびにトラブルシューティング手順を実行することを可能にする。
【００８４】
一旦ＭＳＩおよび光学取得システムが以上で説明した方法（または他の関連方法）にしたがって較正されたなら、このような撮像システムのユーザは、ＭＳＩ取得（例えば、スペクトル分離データ処理を具体化するアルゴリズム、例えば、ピーク正規化、ベクトル正規化、エリア正規化というようなデータ正規化選択肢に関係するアルゴリズム等）と併せて使用されるコンピュータ・プログラム製品を検査して、データ処理の忠実性を高めることが可能になる。少なくとも同じ理由で、蛍光標準品とは独立して較正されたＭＳＩシステムは、分離されたスペクトル・データが多数の蛍光試料の寄与を正しく表すか否かについて、サンプルに独立した検証を可能にするように構成される。実際、最初に計器の性能および較正の有効性を判断することによって、ユーザはサンプル調合および／またはソフトウェア処理アルゴリズムに関係するかもしれない誤差の他の発生源を隔離し特定することができる。データ処理アルゴリズムが、特定の蛍光標準品とは独立して較正および／または検証され、物理的に高精度な結果を送り出すことを示したならば、多重スペクトル画像のスペクトル分離の結果が、物理的に高精度であるものから逸脱する場合、ＭＳＩシステム自体の動作性能の変化または逸脱を示す。
【００８５】
このようなサンプル独立撮像データ検証を可能にする方法の実施形態について、以下で論ずる。
定量的多重スペクトル分離の検証
濃度が分かっている蛍光色素の湿式マウント、または蛍光ポリスチレン・ビーズのような蛍光体標準品(fluorophore standard)では、検体の相対的信号寄与は、異なる波長におけるスペクトル・ソース、例えば、光源の相対的出力、ならびに画像形成装置５０８および／または画像取得装置５０２（例えば、顕微鏡）の光学プロパティに依存する。しかしながら、これは広く認められていない。この理由のために、１つの計器を使用して有効性
を判断された蛍光体標準品が、異なる計器では基準としては全く役に立たないこともあり得る。更に、蛍光体標準品は、量子ドットのような他のレポーターが使用されるときには、スペクトル計器の較正には有用でない。何故なら、使用される励起波長およびフィルタが完全に異なるからである。本明細書において説明する新規な方法では、サンプル・プロパティの影響が殆ど存在せず、計器は再現可能な照明に対して測定される。同一の標準に合わせて装備される計器は、同等に動作することが予期され、異なるコンポーネントに変更したことの、予期される成果に対する影響を測定することができる。
【００８６】
本発明の一実施形態によれば、スペクトル分離の方法の検証は、総合的に、多数の波長／帯域（多数の波長において種々の強度ピークを有する）においてスペクトル（例えば、照明）を伝達するように構成された二重ビーム・スペクトル・ソースおよび／または照明幾何(illumination geometry)（例えば、図５Ａに示したような、スペクトル・ソース５
２２および５３０）を利用する。本発明の一実施形態例では、例えば、図５Ａに示したような、スペクトル選択システム５２８が、スペクトル・ソース５２２および５３０の各々からのスペクトル出力の経路内に置かれるとよい。本発明の一実施形態例では、各スペクトル選択システム５２８は異なる帯域通過仕様を有する。その結果、２本の光ビームが生成され、各々、それ自体のスペクトル特徴、例えば、それら自体の別個のスペクトル特徴（波長、強度等のような）を有する。
【００８７】
２本のビームは、撮像取得装置５０２が合焦される平面または表面において、例えば、物体面５２４において混合する。物体面５２４は、基板、材料、または物質、例えば、透明なガラス・スライド、あるいはステージ、例えば、顕微鏡ステージの平面に対応する。本発明の一実施形態例では、ガラス・スライドは、部分的に反射性、そして部分的に透過性である。つまり、入射光の一部は、ガラス・スライドの部分的に反射性である表面から反射され、透過ビームの一部は、ガラス・スライドを通過して、光の反射された部分と混合される。入力光の量を注意深く制御し標準化することによって、２組のスペクトル特徴を制御し、正確な仕様に保持する(hold)ことができる。
【００８８】
異なるピーク透過スペクトル（例えば、サンプル平面から反射した光信号のピーク、および透過スペクトル（例えば、光）のスペクトル信号（例えば、光信号）のピーク）からの相対的な寄与を変調することができ、したがって、例えば、撮像システムおよび／または計器の重複スペクトルを分離する能力を検査するために、２組のピークをコンボリュート／混合することができる。２つのスペクトル・ソースの各々、ならびにそれらの出力量、強度、および／または波長（例えば、光源）は、独立して制御することができるので、コンボリュートされた信号に対する相対的なピーク寄与は、明確に判定すること、または２つのスペクトル・ソースからのスペクトルを混合する前に予め決定しておくことができる。
【００８９】
また、２つのスペクトル・ソース（例えば、光源）の各々を独立して制御することができるので、特定の帯域幅に帰するピークの寄与する積分強度(integrated intensity)は、撮像システム５００および／または画像取得装置５０２、あるいはそのコンポーネント（例えば、センサ、検出器、または検出システム）のダイナミック・レンジ全体のコンテキストにおいて分離を検査するために、減衰させる、および／または増大させる、および／または減少させることができる。制御されるスペクトル（例えば、照明）およびセンサ・システムの仕様のために、分離結果における差（即ち、スペクトル・ソースからのスペクトルの寄与と撮像システムの分離アルゴリズムからの分離結果との間）は、ＭＳＩシステムまたはそのコンポーネントの１つ以上のプロパティに対する変化を示すこともできる。計器性能に対する許容範囲は、このように、サンプル（例えば、生物学的試料および／または組織スライド）から隔離され、いずれの計器の許容範囲も明確な仕様に調節することができる。
【００９０】
このようなシステムの一例が、図４Ａに示されている。一般に、２つの入射ビーム４２６、４４６は、物体の部位、例えば、透明な半反射性ガラス・スライド４３０によって設けられるサンプル面において重複する。これらのビームによって供給される照明（例えば、照射量(irradiance)の相対的なレベルは、一般に、機械的に変化させることができ、したがって、システム５００またはそのコンポーネント、例えば、画像取得システム５０２の光検出器のダイナミック・レンジ全体（既に図５〜図９を参照して論じた本発明の実施形態の内１つ以上にしたがって較正されている）にわたるこれら重複スペクトルを分離する能力を検査するために、ビーム４２６、４４６のスペクトルを混合することができる。２つのスペクトル・ソース、例えば、光源（光源４１０および光４４８の光源）の各々を独立して制御することができるので、ビーム４２６、４４６の信号、例えば、画像取得システムによって受光される光信号に対する相対的な寄与も、ビーム４２６、４４６のスペクトルが混合される前に、明確に判定することができる。
【００９１】
実施形態の照明幾何は、均等なフィールドの照明を確保するので、検出器（例えば、画像取得装置５０２、またはそのセンサ）のアパーチャ全体にわたる検出応答を検証し、検出器の異なる画素からの応答の逸脱、あるいは画像取得デバイスの予期される性能または性能仕様からの応答の逸脱を判定することもできる。関連実施形態では、物体、例えば、反射および／または透過の非均一な空間分布を有するサンプルをガラス・スライド４３０の代わりに使用して、１回の画像および／またはデータ取得サイクルの間において画像取得装置５０２によって検出される画像の異なる空間座標に対する、異なる比率のスペクトル・ピークの寄与を確保することができる。
【００９２】
スペクトルの１つのビーム、例えば、光照明ビーム（例えば、入射光４２６。これのスペクトルを図４Ｂに示す）について、スペクトル分離手順を検査する目的では、ｎ個のスペクトル・ピークの各々は、１つの蛍光マーカ（例えば、量子ドット）のスペクトルに類似する。
【００９３】
ｎ個のスペクトル・ピークは、バンドパス・フィルタのような、選択されたスペクトル選択システム４１０ａの物理プロパティによって定められるので、これらのピークのスペクトル位置は、フィルタ４１０ａの整列が変化させられなければ、不変のままであることが予期される。（尚、同じ仕様で作られたバンドパス・フィルタ４１０ａの異なる単位の透過ピークのスペクトル位置には、測定可能な許容範囲誤差が生ずることが認められる。）
一実施形態では、光学取得装置は、光源４１０または光源４１０および光４４６の光源（即ち、スペクトル・ソース４４８）の双方がオンに切り替えられるときに、このシステムの検出器が飽和レベル未満であることを保証するように、しかるべく構成される。このような照明の制限は、例えば、サンプル面において既知の単位（例えば、ｍＷ）に関して照明を信頼性高く再現する（例えば、Ｅ％＝１％誤差以内）ように較正された安定化光源（１つまたは複数）を使用することによって、可能とされる。
【００９４】
図１０を参照すると、較正された光入力の多数のスペクトル・ピークからの相対寄与のスペクトル分離のプロセスの検証方法の一実施形態１７００は、画像取得システム５０２および／または画像形成装置５０８の１つまたは複数の検出器によって受光されたスペクトル・パワー（例えば、光パワー）全体の判定を含む。全体的なスペクトル・パワー、例えば、光パワーは、スペクトル曲線４２２の下側にあるエリア、即ち、スペクトル的に統合された光源４１０の強度に比例する。ステップ１０１０において、積分強度を判定するために、画像取得システム５０２および／または画像形成装置、例えば、顕微鏡を最初にスライド４３０の反射面上に合焦させ、１つの光路（この場合、反射における光路）を使用して、スライド４３０の均等にまたは実質的に均等に照明されたフィールドの多重スペ
クトル画像を取得する。
【００９５】
ステップ１０２０において、ゼロの基準線強度値からの信号のオフセットを考慮に入れるために、得られた多重スペクトル画像を補正する。このオフセット補正手順は、図４Ａを参照して説明したのと同様に実行され、実質的に、ａ）同じ取得条件下であるが、検出器に伝達されるスペクトル・ソース４００および／または４４８、例えば、光源（１つ以上）からの光を入れずに、ゼロ露出時間で、多重スペクトル画像を収集するステップと、（ｂ）信号レベルをモード強度として判定するステップと、（ｃ）信号オフセットおよび／または所定の定数を表す、判定された信号レベルを、画像取得において使用されたあらゆる波長における多重スペクトル・データ集合全体から減算するステップとを含む。このデータ集合は、以前に取得された多重スペクトル画像に画素毎に対応する。
【００９６】
モード強度は、スペクトル・データ集合におけるあらゆる波長において得られ、所与の設定の下で取得された全てのデータを処理するときに使用するために、一次元行列（スペクトル・トレース）として保存することができる。図１０および図１１のステップ１７０５を参照すると、スペクトル・トレース・エンベロープ１１１０の下にあるエリア１１０６に対応する積分強度を更に判定する。積分強度は、光源４１０によって生成されスライド４３０から反射されたスペクトル（例えば、光）ビームの全てのスペクトル帯域によって伝達される（画像の）波長積分強度の総和を表し、多重帯域照明に対して記録された光の総量を表す量を導くために利用される。
【００９７】
図１２および図１０のステップ１７０６を参照すると、スペクトル帯域Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４の各々の信号全体に対する相対的な寄与を判定するために、帯域の各々内においてトレース１１１０の下にあるエリアを計算し、全エリア１１０６の百分率として表す。（ステップ１７０６において実行されるデータ処理は、様々な別個の蛍光体または量子ドットの個々の強度寄与を測定することに類似する。）信号全体に対する異なる相対的な強度寄与は、スペクトル分離性能を検査するための、再現可能で（較正された光源によって策定されるようなＥ％誤差以内で）特徴がはっきりした標準を提供する。したがって、一旦多重帯域較正光源および／またはスペクトル・ソース４１０の個々のスペクトル帯域の相対的な寄与がステップ１７０６において確定されたなら、この情報は、これらの設定値を使用して後続のスペクトル取得から、測定された強度を再現するアルゴリズムの能力を検査するために使用することができる。このような標準の光学特性は、先に論じたように、直接測定可能であるので、分かっている。
【００９８】
更に図１０を参照し、更にここで図１３を参照すると、多バンド較正および／またはスペクトル・ソース４１０の帯域Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４の各々に対する正規化基準スペクトルを形成するために、ステップ１７０６において、スペクトル・トレース１１１０を表すデータを任意に処理することができる。このために、所与の帯域に対応するスペクトル・トレース１１１０の一部を表すデータ集合の一部を、残りのデータ（例えば、隣接するスペクトル・ピーク間の中間点）から分け(separate)、または「切り取り」(clip)、次いで、ステップ１７０７において、分けた帯域に対応する部分を正規化する。通例、選択された正規化の形態で、分けられた各帯域の曲線の下にある積分エリアは、信号全体に対する最大の寄与を表すスペクトル・ピークの曲線の下にあるエリアと同じとなる。個々の帯域Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４から結果的に得られた個々の参照スペクトルＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４（実施形態によっては等価されることもある）は、ここで、異なる通過帯域のスペクトル寄与を分けるための線形分離データ処理において使用することができる。これらのスペクトルＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４（例えば、等価されたスペクトル）を、通過帯域の既知の組み合わせからのスペクトル（例えば、光）のスペクトル分離の間参照スペクトルとして使用すると、各通過帯域の相対的な寄与の計算がし易くなる。この同じ原理は、強度寄与の比率が基礎になるタンパク質または遺伝子発現につい
て重要な情報を保持するとき、蛍光検体で標識された組織が、例えば、強度値の定量化において撮像されるときに採用することができる。
【００９９】
１本の光路についての定量化分離アルゴリズムの検証
先に論じたように、較正光源４１０の別個の帯域Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４の、画像取得装置５０２によって受光されるスペクトル（例えば、光）入力全体に対する相対的な強度寄与（図１２の示す）は、直接測定されたので、ここでは、線形分離アルゴリズムに誤りがないことを確認するために、図１３の正規化された基準スペクトルＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４を線形分離に使用することができる。（関連実施形態では、提案する方法(methodology)は、非線形分離にも同様に適用可能である）。具体的には、線形分離ア
ルゴリズムが誤差のないデータを処理している場合、分離アルゴリズムの使用によって判定された所与の帯域の相対的な強度寄与は、図１２の対応する直接測定強度寄与と一貫する。例えば、この方法の適用(application)についての表１は、２つのソフトウェア実現
アルゴリズム、SpectraView および Specounter（双方共、 Applied Spectral Imaging, Inc.の商標である）によって実行されたスペクトル分離の結果間の比較を提示する。これらは、同じ標準化撮像計器ハードウェア、および図１２の直接測定較正データ（Actualと呼ぶ）を使用する多重組織診断への応用について評価された。図示のように、この分離アルゴリズムは、合計強度値の１００％全体の約５％内という計算の非常に高い精度を保証する。図１４は、棒グラフを含む対応する図を示す。理想的な場合では、物体／スライド４３０からの反射におけるスペクトルおよび／または較正光源４１０のようなスペクトル（例えば、光）の光源からのスペクトル（例えば、光）のスペクトル分布は、異なるスペクトル（例えば、光）レベルにおけるスペクトル（例えば、光）出力のパワー・レベルに関係なく不変のままであるはずである。何故なら、光源４１０からのスペクトル（例えば、光）出力は、例えば、色中立メカニズム４１６によって変化させられるが、光源４１０への電力供給を一定に保つからである。同様に、取得されたスペクトル（例えば、光）のスペクトル分布も、取得時間（即ち、露出時間）に依存しない。
【０１００】
【表１】
2018119968.tif 000006
【０１０１】
多数の光路についての定量化分離アルゴリズムの検証
尚、スペクトル・データ分離アルゴリズムの精度の検証は、スペクトル、例えば、光が画像取得装置５０２に向けて多数の経路に沿って伝達されるときにも、同様に実行することができる。したがって、多経路検証手順は、異なる経路において異なる較正光源の使用を必要とする。図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃを参照すると、例えば、物体／スライド４３０と相互作用した２つの光部分が、光取得システムによって受光される。ビーム４４０は、スライド４３０によって反射されたビーム４２６の一部であり、ビーム１５１０は、第２スペクトル１５１４によって生成されスライド４３０を透過したビーム４４６の一部である。第２のスペクトル／較正光源１５１４は、安定化された較正スペクトル（例えば、光）エミッタ、較正多帯域通過フィルタ１５１４ａ、および光源４１０の出力において絞り（図示せず）を内蔵し、視野を均等にまたは実質的に均等に照明するという点で、光源４１０と同様に構成される。スペクトル（例えば、光）４４６のスペクトル分布は、全体的に、図１５Ａに示すスペクトル（例えば、光）４１４のそれとは異なる。図１５Ｂに示す、スペクトル（例えば、光）４４６のスペクトル分布１５２０の一例は、３つの帯域、即ち、それぞれ対応する波長λ５、λ６、およびλ７を中心とするＢ５、Ｂ６、およびＢ７を含む。
【０１０２】
帯域Ｂ５、Ｂ６、およびＢ７の各々において受けた光パワーの相対的な寄与（透過ビーム４４６の全スペクトル（例えば、光）パワーと比較した場合）は、光源１５１４のみをオンにして光源４１０をオフにしたときに、直接測定することができる。したがって、透過スペクトル（例えば、光）に対する基準スペクトルは、図１３に関して論じた方法にしたがって定められる。
【０１０３】
また、反射ビーム４４０（スペクトル帯域Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４を有する）および透過ビーム１５１０（スペクトル帯域Ｂ５、Ｂ６、およびＢ７を有する）は、実質的に干渉せず、画像取得システム５０２の１つまたは複数の検出器（例えば、センサ）において線形に重複することも認められる。したがって、両スペクトル（例えば、光）ソース４１０、１５１４をオンにしたとき、画像取得システム５０２に伝達されるスペクトル・パワー（例えば、光パワー）は、前述の帯域の各々において、直接、そして反射または透過スペクトル（例えば、光）経路のいずれにおいても他の帯域におけるそれとは独立して測定することができ、これによって受けられる全スペクトル（例えば、光）パワーに対する、検出器において登録されたスペクトル帯域の各々におけるスペクトル（例えば、光）パワーの寄与の直接測定が可能になる。図１５Ｂおよび図１５Ｃは、それぞれ、スペクトル（例えば、光）ビーム４１４および４４０のスペクトル１５２０および１５３０を、比較のために、そして、例えば、最も強いピークＢ７、λ７の下にあるエリアに対して示す。ここでは、ハロゲン・ランプが光源１５１４として使用され、フィルタ１５１４ａが近ＩＲにおいて透過する光学フィルタを含んだ。
【０１０４】
図１６Ａ、図１６Ｂを参照すると、個々の光路（即ち、反射および透過）のいずれからも検出器によって受けられるスペクトル、例えば、光のスペクトル特性は、更に、先に論じたように直接測定され、スペクトル分離システムおよびアルゴリズムの較正／検証のために、基準スペクトル較正標準（図１３のそれらと同様）を構築するために使用される。反射および透過経路（例えば、光路）双方にそのように考案された較正標準の正規化されたスペクトルを一緒に図１７にプロットし、スペクトルの可視部分における透過および反射経路の較正光源１５１４、４１０のスペクトルの実質的な重複を示す。
【０１０５】
図１８の「集計」正規化スペクトル・トレース１８１０は、個々の較正／基準光標準４１０および１５１４がオンに切り替えられたときに画像取得システムの検出器によって登録されたスペクトル・トレースを表す。スペクトル・トレース・エンベロープ１８１０の下にあるエリア１９１６が、図１９に示すように、更に判定され、図１６Ａおよび図１６Ｂの個々のスペクトル・トレースの下にあるエリアの和と比較され、個々のコンポーネントのスペクトル・トレースと合計との間の一致を判定することができる。光学取得システムは先に正規化較正スペクトル１５２０、１５３０を基準にした(referenced)ので、光学列全体（フィルタ、レンズ、および光取得システム自体を含む）が、例えば、再整列や置換のような変更を全く受けなければ、積分強度１９１６は、個々のスペクトル（例えば、光）標準４１０、４１４の強度の和に実質的に等しいままである。このような均衡からの著しい逸脱は、動作光源４１０、４１４を個々に使用した較正の時点以降に、ＭＳＩシステムの光学列が変化したことを示す。
【０１０６】
図２０は、予め較正済みであると想定した測定システムのシステム・レベルの検査の図を示す。測定システムの検出器コンポーネントにおいて受けられた光は、各々スペクトル標準を表す、６つの少なくとも部分的に重複するスペクトル帯域の混合を表す。（スペクトル標準の帯域は、スペクトル特性が分かっている２つのスペクトル・フィルタを、本発明の測定システムの各アームに１つずつ使用することによってエミュレートされる。）したがって、スペクトル帯域および／または波長の各々において混合内に存在するスペクトル（例えば、光）信号の量は、前もって分かっている。図２０のインセット(inset)Ａか
ら見ることができるように、異なるスペクトル帯域／チャネルが異なる比率で重複し、非線形効果が、検出器上に入射するスペクトル、例えば、光のスペクトル混合に影響を及ぼすという仮定が行われる。スペクトル分離アルゴリズムの一実施形態が、計算によって、各スペクトル帯域（インセットＢおよびＣを参照のこと）におけるスペクトル、例えば、光の量を表す値を決定するために使用される。既知の実際の値および計算値との間の比較から、使用されたスペクトル分離アルゴリズムが補正を必要とするか否か、そしてどの程度必要かが示される。
【０１０７】
図２１Ａおよび図２１Ｂは、以上で説明した方法にしたがって、５％以内の精度で、既知の標準の個々のスペクトル・ピークに対する既知の寄与に関して測定された、９つのスペクトル特徴のスペクトル分離を例示するプロットおよび関連データを示す。
【０１０８】
図２２および表２における関連データは、入射および透過ビームにおいて４帯域標準フィルタ（例えば、光学フィルタ）を採用したスペクトル分離に使用された本発明の一実施形態の動作の効率を示す。表２は、８つのスペクトル・ピークに対する相対的な強度寄与に対応する値を、データのハイパースペクトル・キューブを形成するプロセスにおいて本システムによって受けられる光の総合強度の百分率として提示する。「差」の列が示すように、本発明のアルゴリズムの一実施形態によって得られた線形分離の結果は、直接測定された値と十分に一致する。
【０１０９】
【表２】
2018119968.tif 000007
【０１１０】
図２３は、様々な説明した革新を実現することができる、適した計算システムの一般化した例を示す。この計算システムは、使用範囲や機能に関して限定を示唆する意図は全くない。何故なら、本革新は多様な汎用または特殊目的計算システムにおいても実現できるからである。
【０１１１】
図２３を参照すると、この計算システムは、１つ以上の処理ユニットおよびメモリ２３２０、２３２５を含む。処理ユニット２３１５は、コンピュータ実行可能命令を実行する。処理ユニットは、汎用中央演算装置（ＣＰＵ）、特定用途集積回路（ＡＳＩＣ）内にあるプロセッサ、または任意の他のタイプのプロセッサとすることができる。マルチ処理システムでは、処理パワーを高めるために、多数の処理ユニットがコンピュータ実行可能命令を実行する。例えば、図２３は、中央処理ユニット２３１０およびグラフィクス処理ユニットまたは共処理ユニット２３１５を示す。有形メモリ２３２０、２３２５は、揮発性メモリ（例えば、レジスタ、キャッシュ、ＲＡＭ）、不揮発性メモリ（例えば、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュ・メモリ等）、または処理ユニット（１つまたは複数）によってアクセス可能な、これら２つの何らかの組み合わせであってもよい。メモリ２３２０、
２３２５は、処理ユニット（１つまたは複数）による実行に適しており、コンピュータ実行可能命令の形態とした、本明細書において説明した１つ以上の革新を実現するソフトウェア２３８０を格納する。
【０１１２】
計算システムは、追加の機構を有してもよい。例えば、計算システムは、ストレージ２３４０、１つ以上の入力デバイス２３５０、１つ以上の出力デバイス２３６０、および１つ以上の通信接続２３７０を含む。バス、コントローラ、またはネットワークのような相互接続メカニズム（図示せず）は、計算システムのコンポーネントを相互接続する。通例、オペレーティング・システム・ソフトウェア（図示せず）は、計算システムにおいて実行する他のソフトウェアのために動作環境を提供し、計算システムのコンポーネントの動作(activity)を調整する。
【０１１３】
有形ストレージ２３４０は、リムーバブルまたは非リムーバブルでもよく、磁気ディスク、磁気テープまたはカセット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、あるいは情報を一時的でない方法で格納するために使用することができ、更に計算システム内でアクセスすることができる任意の他の媒体を含む。ストレージ２３４０は、本明細書において説明した１つ以上の革新を実現するソフトウェア２３８０の命令を格納する。
【０１１４】
入力デバイス（１つまたは複数）２３５０は、キーボード、マウス、ペン、またはトラックボールのようなタッチ入力デバイス、音声入力デバイス、走査デバイス、あるいは入力を計算システムに供給する他のデバイスであってもよい。ビデオ・エンコーディング用には、入力デバイス（１つまたは複数）５０は、カメラ、ビデオ・カード、ＴＶチューナ・カード、あるいはアナログまたはディジタル形態でビデオ入力を受け入れる同様のデバイス、あるいはビデオ・サンプルを計算システムに読み込むＣＤ−ＲＯＭまたはＣＤ−ＲＷであってもよい。出力デバイス（１つまたは複数）２３６０は、ディスプレイ、プリンタ、スピーカ、ＣＤ−ライタ、または計算システムからの出力を供給する他のデバイスであってもよい。
【０１１５】
通信接続（１つまたは複数）２３７０は、通信媒体または他の計算エンティティを通じた通信を可能にする。通信媒体は、コンピュータ実行可能命令、オーディオまたはビデオ入力または出力、あるいは変調データ信号における他のデータというような情報を伝える。変調データ信号とは、当該信号において情報をエンコードするように、その特性の内１つ以上が設定されたまたは変化させられた信号である。一例として、そして限定ではなく、通信媒体は、電気、光、ＲＦ、または他の搬送波を使用することができる。
【０１１６】
本革新は、コンピュータ読み取り可能媒体という一般的なコンテキストで説明することができる。コンピュータ読み取り可能媒体は、計算環境内部でアクセスすることができる任意の入手可能な有形媒体である。一例として、そして限定ではなく、計算システムでは、コンピュータ読み取り可能媒体は、メモリ２２３０、２３２５、ストレージ２３４０、および以上の内任意のものの組み合わせを含む。
【０１１７】
本革新は、計算システムにおけるターゲットの実プロセッサまたは仮想プロセッサ上で実行されるプログラム・モジュールに含まれるような、コンピュータ実行可能命令という一般的なコンテキストで説明することができる。一般に、プログラム・モジュールは、ルーチン、プログラム、ライブラリ、オブジェクト、クラス、コンポーネント、データ構造等を含み、特定のタスクを実行するか、または特定の抽象データ型を実装する。プログラム・モジュールの機能は、種々の実施形態において所望通りに、プログラム・モジュール間で組み合わせてもまたは分割してもよい。プログラム・モジュールのコンピュータ実行可能命令は、ローカルまたは分散型計算システム内部で実行することもできる。
【０１１８】
本明細書では、「システム」および「デバイス」という用語は相互交換可能に使用される。そうでないことを文脈が明らかに示すのではなければ、いずれの用語も、計算システムまたは計算デバイスのタイプに対して何の限定も強制しない。一般に、計算システムまたは計算デバイスは、ローカルまたは分散型であることができ、特殊目的ハードウェアおよび／または汎用ハードウェアと、本明細書において説明した機能を実現するソフトウェアとの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１１９】
紹介のために、詳細な説明では、計算システムにおけるコンピュータ動作を記述するために「判定する」および「使用する」というような用語を使用した。これらの用語は、コンピュータによって実行される動作の上位抽象化であり、人間によって行われる行為と混同すべきでない。これらの用語に対応する実際のコンピュータ動作は、実施態様に応じて異なる。
【０１２０】
本明細書におけるコンピュータ読み取り可能媒体はいずれも、非一時的（例えば、メモリ、磁気ストレージ、光ストレージ等）とすることができる。
本明細書において説明した格納動作(storing action)はいずれも、１つ以上のコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、コンピュータ読み取り可能記憶媒体または他の有形媒体）に格納することによって実現することができる。
【０１２１】
格納されると説明したものはいずれも、１つ以上のコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、コンピュータ読み取り可能記憶媒体または他の有形媒体）に格納することができる。
【０１２２】
本明細書において説明した方法はいずれも、１つ以上のコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、コンピュータ読み取り可能記憶媒体または他の有形媒体）における（例えば、エンコードされた）コンピュータ実行可能命令によって実現することができる。このような命令は、コンピュータに本方法を実行させることができる。本明細書において説明した技術は、種々のプログラミング言語で実現することができる。
【０１２３】
本明細書において説明した方法はいずれも、１つ以上のコンピュータ読み取り可能記憶デバイス（例えば、メモリ、磁気ストレージ、光ストレージ等）に格納されたコンピュータ実行可能命令によって実現することができる。このような命令は、コンピュータに本方法を実行させることができる。
【０１２４】
以上で説明した実施形態の例を通じて本発明について説明したが、例示した実施形態に対する変更、およびその変形も、本明細書において開示した発明の概念から逸脱することなく、行えることは当業者には理解されよう。例えば、実施形態の一部の態様は、フロー・チャートを参照して説明したが、フロー・チャートの各ブロックの全部または一部の機能、動作、判断等、あるいはブロックの組み合わせを組み合わせてもよく、別々の動作に分けてもよく、または他の順序で実行してもよいことは、当業者には容易に認められよう。更に、種々の例示的なデータ構造に関連付けて実施形態について説明したが、本システムは種々のデータ構造を使用して具体化できることを、当業者は認めよう。更にまた、開示した態様、またはこれらの態様の一部は、以上で列挙しなかった方法で組み合わせてもよい。本願において説明したアルゴリズムの実施形態のステップを実行するためにシステムのプログラマブル・プロセッサを実施する(effectuate)コンピュータ・プログラム製品も、本発明の範囲内に該当する。したがって、本発明は、開示した実施形態（１つまたは複数）には限定されないと見なされてしかるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ−１】
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【図２１Ａ−２】
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【図２１Ａ−３】
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【図２１Ｂ−１】
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【図２１Ｂ−２】
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【図２１Ｂ−３】
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【図２２】
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【図２３】
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