(57)【要約】【課題】アンペロプシンと脂溶性ビタミンを含む、抗酸化能が増強した組成物を提供することを課題とする。【解決手段】アンペロプシンと脂溶性ビタミンを含有する組成物。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンペロプシンと脂溶性ビタミンを含有する組成物。
【請求項２】
アンペロプシンが藤茶抽出物由来である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
脂溶性ビタミンがビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＡ、コエンザイムＱ１０から選択される１以上の物質である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
脂溶性ビタミン１モル当たりに対しモル比で、アンペロプシン０．０２〜０．６４モル当量を含有する請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性ビタミンとアンペロプシンを含有した組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂溶性ビタミンには光、熱または酸化に対して不安定なものが多い。特に、脂溶性ビタミンを含有する液状飲食品中での脂溶性ビタミンの安定化には問題が多い。このため、様々な提案がなされている。
脂溶性ビタミンを安定化させる方法としては、カロテノイドを脂溶性ビタミンと均一に混和することによる脂溶性ビタミンの安定化方法（特許文献１）、黄色および赤色の着色剤から選ばれる１種以上の物質を配合することによる光に不安定な脂溶性薬物の安定化方法（特許文献２）等が知られている。また、リボフラビンもしくはその誘導体またはこれらの塩、カロテノイド色素、コチニール色素およびベニバナ色素からなる群より選ばれる色素または乳濁液、および抗酸化剤を配合する方法（特許文献３）、脂溶性ビタミンと炭酸カリウムとを混合する方法（特許文献４）、脂溶性ビタミンを含有する液状飲食品にリボフラビンとピリドキシンもしくはその誘導体を配合する方法（特許文献５）、ビタミンＡ類とロウ類、炭化水素類、エステル油及び植物油等、脂溶性抗酸化剤、非イオン界面活性剤を混合する方法（特許文献６）など様々な提案がなされている。しかし脂溶性ビタミンを安定化するための普遍的な方法は見いだされておらず、脂溶性ビタミンを含有する組成物に応じて様々な試行錯誤が行われているのが現状である。
【０００３】
一方、本発明者らは、藤茶と呼ばれる植物の生理活性を研究している。この藤茶に含有される成分であるアンペロプシンというフラボノイドに、高血圧に関与する酵素キマーゼ阻害作用があることを見いだし、すでに特許出願（特願２０１７−０５３１４６）を行っている。藤茶（学名：Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ（Ｈａｎｄ．−Ｍａｚｚ．）Ｗ．Ｔ．Ｗａｎｇ、またはＡｍｐｅｌｏｐｓｉｓ ｃａｎｔｏｎｉｅｎｓｉｓ（Ｈｏｏｋ．ｅｔ Ａｒｎ.）Ｐａｎｃｈ.）は、ブドウ科に属し、中国の中部〜南部および台湾にわたる広い地域で自生している多年生のつる性植物である。藤茶の葉部は飲料として利用されている他、藤茶の根部又は全草は、黄疸性肝炎、風邪、のどの痛み、急性結膜炎症等の治療のための民間薬として利用されており、安全性の高い植物である。
この藤茶の抽出物等に多く含まれるアンペロプシンは、色素の退色防止効果（特許文献７）、香料の劣化防止効果、美白作用、抗老化作用等を有することが知られているが、まだ研究の途上にある物質である。
本発明者らは、藤茶抽出物を健康食品として利用するため、種々の成分と混合して組成物を調製する過程で、藤茶抽出物やアンペロプシンにビタミンの抗酸化能を増強させる作用が存在することを見いだし、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平４−２６６７０号公報
【特許文献２】特開２０００−００７５８３号公報
【特許文献３】国際公開第２００３／０８４３５２号
【特許文献４】国際公開第２０１１／０４０１４１号
【特許文献５】特開２００４−１９１号公報
【特許文献６】特開２０１６−２１６５０９号公報
【特許文献７】特開２００２−６５２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上記のような背景技術をもとに研究を行い、藤茶抽出物が強いキマーゼ阻害作用を有していることを利用した健康食品やサプリメント類についてさらに研究を進めた。その結果、キマーゼ阻害作用を示すアンペロプシンが特異的に脂溶性ビタミンの抗酸化能を増強することを見いだし、本発明をなした。
【０００６】
本発明の課題は、アンペロプシン又は藤茶抽出物と脂溶性ビタミンを含む、脂溶性ビタミン組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は以下のとおりである。
（１）アンペロプシンと脂溶性ビタミンを含有する組成物。
（２）アンペロプシンが藤茶抽出物由来である（１）に記載の組成物。
（３）脂溶性ビタミンがビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＡ、コエンザイムＱ１０から選択される１以上の物質である（１）または（２）に記載の組成物。
（４）脂溶性ビタミン１モル当たりに対しモル比で、アンペロプシン０．０２〜０．６４モル当量を含有する（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によりアンペロプシン又は藤茶抽出物と脂溶性ビタミンを含む脂溶性ビタミン組成物が提供される。
本発明の組成物は、キマーゼ阻害作用を有するため、気管支喘息、じん麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、鼻炎、関節リューマチ、マストサイトーシス、強皮症、心不全、心肥大、うっ血性心疾患、高血圧、アテローム動脈硬化、心筋虚血、心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術後再狭窄、バイパスグラフト術後再狭窄、虚血性末梢循環障害、高アルドステロン症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、腎炎、糸球体硬化症、腎不全、乾癬、固形腫瘍、手術後癒着、緑内障および高眼圧症などの予防治療剤及びこれらの疾患の改善用飲食品組成物及び脂溶性ビタミン供給用飲食品とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＯＲＡＣ法による抗酸化物質非存在化の測定の模式図である。
【図２】ＯＲＡＣ法によるＴｒｏｌｏｘまたは抗酸化物質の測定の模式図である。
【図３】ＯＲＡＣ法による抗酸化効果のＮｅｔ  ＡＵＣ値を得る場合の模式図である。
【図４】Ｔｒｏｌｏｘ標準液の濃度、Ｎｅｔ  ＡＵＣについてグラフ化し、検量線を作成した。各試料の抗酸化能は、そのＮｅｔ  ＡＵＣに相当するＴｒｏｌｏｘ標準液の濃度を求め、Ｔｒｏｌｏｘ当量（ＴＥ）として示す。
【図５】α−トコフェロールに対するアンペロプシン併用による抗酸化効果増強を示すグラフである。上段はα−トコフェロール５００μＭ、下段はα−トコフェロール１０００μＭの場合を示す。
【図６】コレカルシフェノールに対するアンペロプシン併用による抗酸化効果増強を示すグラフである。上からコレカルシフェノール  ６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭの濃度に対する効果を示す。
【図７】レチナールに対するアンペロプシン併用による抗酸化効果増強を示すグラフである。
【図８】レチノールに対するアンペロプシン併用による抗酸化効果増強を示すグラフである。
【図９】レチノイン酸に対するアンペロプシン併用による抗酸化効果増強を示すグラフである。上からレチノイン酸  ３１．２５μＭ、６２．５μＭの濃度に対する効果を示す。
【図１０】コエンザイムＱ１０に対するアンペロプシン併用による抗酸化効果増強を示すグラフである。上段はコエンザイムＱ１０  １００μＭ、下段はコエンザイムＱ１０  ２００μＭの場合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、アンペロプシンと脂溶性ビタミンを含有する組成物に係る発明である。
藤茶は、ブドウ科蛇葡萄属の植物であり、中国名を顕歯蛇葡萄という。学名は、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａである。主には中国の広西、広東、雲南、貴州、湖南、湖北、江西、福建などの省並びに自治区に分布している。中国の広西、湖南などの省や自治区の壮族や瑶族の人々がこの茎および葉から作った飲料を常用しており、風邪、のどの痛みなどにも利用されている。アンペロプシンは、藤茶の示す肝臓疾患の治療作用や抗菌作用の活性本体として特定されている。
【００１１】
アンペロプシンは、下記の式で表される。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
アンペロプシンは、例えば、藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）、大叶蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ）、広東蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｔｏｎｉｅｎｓｉｓ）、ケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）、オノエヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）、ヨレハマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ及びカツラ（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）から選ばれる植物の抽出物から単離精製することができる。これらの中でも、藤茶が好ましい。
【００１４】
具体的には、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ属植物である藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）から、下記のようにしてアンペロプシンを得ることができる。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、８０容量％含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、さらに精製することができる。精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。
【００１５】
本発明は、上記のアンペロプシンを１０質量％以上含有するものであれば使用可能である。このような組成物を藤茶から得るためには以下のような操作を行う。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で、任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。
【００１６】
抽出に用いる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。
また、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることもできる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、親水性有機溶媒が低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３０〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１０〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００１７】
抽出溶媒を満たした処理槽に、藤茶の乾燥・粉砕物を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、この抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜１５倍量（質量比）であることが好ましく、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いる場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００１８】
得られた抽出液から抽出溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られる。さらに乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。本発明においては、アンペロプシンの含有量が１０質量％以上、好ましくは２０質量％以上であれば、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても良い。これらは、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液―液向流分配などの方法により精製してから用いても構わない。
したがって、上記の藤茶から抽出しアンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。
【００１９】
組成物中のアンペロプシンの含有量は、ＨＰＬＣなど公知の分析方法で分析することができる。定量方法の概略は次のとおりである。
・試料溶液の調製
試料（抽出物）約２０ｍｇを精秤し、蒸留水を加えて超音波処理して溶解し、正確に５０ｍＬとする。この溶液２ｍＬを５０ｍＬに正確に希釈し、試料溶液とする。  
・標準溶液の調製と検量線作成  
標準品（Ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）２．００ｍｇを精秤し、１００％アセトニトリルを適量加えて超音波処理して溶解し、さらにアセトニトリルを加えて正確に２５ｍＬとし、アンペロプシン標準原液８０μｇ／ｍＬを調製する。この標準原液を蒸留水にて正確に５倍希釈して、１６μｇ／ｍＬアンペロプシン標準溶液を調製する。ＨＰＬＣへの注入量を１０、２０、４０μＬとし、アンペロプシンのピークに基づいて検量線を作成する。
・ＨＰＬＣ測定条件
下記表１の条件に設定する。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
本発明の組成物を調製する場合は、抽出物をそのまま、あるいは各種賦形剤を添加して脂溶性ビタミン類を配合して、脂溶性ビタミンと藤茶抽出物を含む組成物を調製し、これを製剤化する。製剤としては顆粒剤、錠剤、カプセル剤を例示することができる。
また組成物をそのまま、あるいは粉末剤などの形態に製剤化したものを飲食品に添加して用いることもできる。
なお藤茶抽出物と脂溶性ビタミンを含む組成物の製剤化に当たっては、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル、水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、風味調整剤や香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウムなどの呈味料、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、アスパルテームなどの低カロリー甘味料、着色剤などである。
なお本発明の組成物には、アンペロプシンを１０〜５００ｍｇ、好ましくは５０〜３００ｍｇ、特に好ましくは１００〜２００ｍｇを含有するように調製する。
【００２２】
本発明に配合する脂溶性ビタミンは、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、ビタミンＫ、脂溶性ビタミン類としてコエンザイムＱ１０（ユビキノン）などやこれらの誘導体が挙げられる。脂溶性ビタミンの具体例としては、例えば、レチノール、３−デヒドロレチノール、レチナール、３−デヒドロレチナール、レチノイン酸、３−デヒドロレチノイン酸およびこれらの酢酸エステルまたはパルミチン酸エステルなどの誘導体などのビタミンＡ類；エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロールおよびこれらの硫酸エステルなどの誘導体などのビタミンＤ類；α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノールおよびこれらの酢酸エステルまたはニコチン酸エステルもしくはリン酸エステルなどの誘導体などのビタミンＥ類；フィロキノン、メナキノン、メナジオンなどのビタミンＫ類；ユビキノンの有するイソプレン残基数が１〜１２のユビキノン；などをそれぞれ挙げることができる。これらの脂溶性ビタミンは、一種または二種以上を組み合わせることができる。そして脂溶性ビタミンの配合量は、アンペロプシンが上記含有量であれば、その１０倍量配合しても安定化しているので、配合量にはヒトの脂溶性ビタミン必要量を考慮して自由に設計することができる。
【００２３】
本発明で用いられる脂溶性ビタミンは、天然物より公知の方法で抽出精製して得たもの、また、公知の方法で化学合成して得たもの、さらには、微生物などを用いる発酵法によって得たいずれのものであってもよい。
【００２４】
本発明で用いられる脂溶性ビタミンは、脂溶性ビタミンの濃度を調整するために食用油脂を加えたものであっても良い。前記食用油脂としては、食用可能な油脂であれば特に限定はないが、例えば、サフラワー油、ぶどう油、大豆油、ひまわり油、小麦胚芽油、とうもろこし油、綿実油、ごま油、なたね油、こめ油、落花生油、オリーブ油、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）、パーム油、パーム核油、やし油などの植物油脂や、牛脂、ラード、乳脂及び魚油などの動物油脂、さらにこれらの動植物油脂を水素添加あるいはエステル交換した油脂などが挙げられる。上記食用油脂は、一種または二種以上を組み合わせることができる。
また、脂溶性ビタミンが天然物より抽出精製して得たものである場合、抽出原料由来の食用油脂を含むものであっても良い。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明の組成物の製造例及びこの組成物を用いた試験例を示し、本発明をさらに説明する。
＜藤茶抽出物の製造例１＞
乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、その後ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍＬを−４０℃で凍結し、さらに凍結乾燥装置で乾燥し、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物８５ｇをキマーゼ阻害用組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は６５．８質量％であった。
【００２６】
＜藤茶抽出物の製造例２＞
乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して５０％エタノール水溶液を１５倍量加え、還流冷却機を付して加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に同様に５０％エタノール水溶液を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出しろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍＬを−４０℃で凍結し、さらに凍結乾燥装置で乾燥し、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物７８．１ｇをキマーゼ阻害用組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は５２．９質量％であった。
【００２７】
＜藤茶抽出物の製造例３＞  
製造例１と同様に、乾燥藤茶１重量部に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出しろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍＬを得た。さらにグアガム分解物を、濃縮液あたりを７８ｇ添加し、−４０℃で凍結し、さらに凍結乾燥装置で乾燥し、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物１６３．１ｇを得た。この組成物中のアンペロプシン含有量は２４．７質量％であった。
【００２８】
＜藤茶抽出物の製造例４＞  
製造例１と同様に、乾燥藤茶１重量部に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出しろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍＬを得た。さらにγシクロデキストリンを、濃縮液中に７８ｇ添加し、−４０℃で凍結し、さらに凍結乾燥装置で乾燥し、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物１５１．４ｇを得た。この組成物中のアンペロプシン含有量は  ４５．２質量％であった。
【００２９】
・キマーゼ阻害試験
（１）試験試料
製造例１〜４の組成物、市販の藤茶抽出物（市販品１）、及びアンペロプシン精製物（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いて試験をおこなった。
【００３０】
（２）試験方法
１）試験試料調製方法
各試料のアンペロプシン含有量がそれぞれ所定の濃度（ｍＭ）になるように、各試験試
料を水で溶解した。各試験試料濃度の詳細は以下の表２に示す。
【００３１】
【表２】
2018188371.tif 000005
【００３２】
２）キマーゼ活性阻害試験方法
キマーゼ活性阻害の評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）は、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６８（２２），ｐｐ５８８５−５８９３（２００１）に記載された方法に変更を加えた以下の方法で行った。
この評価方法では、ヒトキマーゼの基質となるアンジオテンシンＩをＤｎｐ／Ｎｍａ修飾した基質を用い、キマーゼがこの基質を切断し、アンジオテンシンＩＩを産生すると蛍光発色することを利用する簡易的な方法である。以下に当該評価方法の概要を記述する。
インキュベーションバッファーは１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝液で総インキュベーション溶液量は１００μＬである。まず、サンプルを５μＬ加え、そこへ標準ヒトキマーゼ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）が０．００１２単位含まれるように調整し、室温で前インキュベーションを３０分間施行後、基質であるＤｎｐ／Ｎｍａ修飾アンジオテンシンＩを最終濃度が２００μＭになるように加え、３７℃で３０分インキュベーションする。０．５Ｍ  ＮａＯＨを２５μＬ加えてインキュベーションを終了した。産生されたＤｎｐアンジオテンシンＩＩの発光蛍光（４６０ｎｍ）を測定し、標準ＤｎｐアンジオテンシンＩＩによって作成した標準曲線から産生量を計算した。試験試料を加えないコントロールを対照として、検定サンプルのヒトキマーゼ活性阻害及び阻害率を求めた。
ヒトキマーゼによるアンジオテンシン生産能の抑制率試験の試験操作手順は以下のとおりである。
【００３３】
＜１＞試験試料を水で溶解および段階希釈により、テスト用ストック（アンジオテンシンＩ添加時に目的濃度となる濃度（２０倍濃い濃度にすることが好ましい））を作成する。
＜２＞９６ｗｅｌｌプレートに、キマーゼ標準品１．２ｍＵ／ｗｅｌｌ、ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ、テストサンプルを混入し、２５℃下で３０分間振盪しながら、プレインキュベーションする。
＜３＞アンジオテンシンＩを反応濃度２００μＭで添加し、３７℃で３０分間振盪しつつ反応させる。
＜４＞３０分経過後ただちにＮａＯＨを添加し反応を止める（３０分のカウントはｗｅｌｌごとに管理）。
＜５＞蛍光プレートリーダーにて測定を行う。励起波長：３５５ｎｍ、測定波長：４６０ｎｍ。
試験後、以下の計算式を用いて、ヒトキマーゼによるアンジオテンシン生産能の抑制率を求める。
※試験試料を添加しないｗｅｌｌの結果を抑制率０％として、各サンプルの抑制率を算出する。
（計算方法）  抑制率＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
Ａ：各サンプル値
Ｂ：テスト品を使用しないｗｅｌｌの結果値
【００３４】
３）濃度設定試験方法
アンペロプシン及び製造例１〜４のそれぞれについてアンペロプシン量を基に、最終試験に用いる試料濃度を調整した。これを用いてヒトキマーゼによるアンジオテンシン生産能の抑制率試験を実施した。
【００３５】
（３）試験結果
ヒトキマーゼによるアンジオテンシン生産能抑制率試験の結果を下記表３に示す。また、各試験試料のヒトキマーゼ産生能の抑制から、各試料のヒトキマーゼ生産能の抑制率５０％を示す値（ＩＣ５０値）を表４に示す。ＩＣ５０は下記式による。
【００３６】
［式１］
2018188371.tif 000006
Ａ：５０％を挟む高い濃度
Ｂ：５０％を挟む低い濃度
Ｃ：Ｂでの阻害率
Ｄ：Ａでの阻害率
【００３７】
【表３】
2018188371.tif 000007
【００３８】
【表４】
2018188371.tif 000008
【００３９】
以上の試験結果、アンペロプシンは、最終濃度２００μＭでヒトキマーゼを完全に抑制できることがわかった。またＩＣ５０は、アンペロプシンの含有量と逆相関していた。
【００４０】
・ビタミン類の抗酸化効果測定
ＯＲＡＣ法によって脂溶性ビタミンの抗酸化効果を確認する。ＯＲＡＣは、１９９２年、米国立老化研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ）によって開発された評価手法である。
ＯＲＡＣは、蛍光物質であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを蛍光プローブとして使用し、ラジカル発生剤である２，２’−アゾビズ（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）の存在下、これにより分解されるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を経時的に測定し、その変化を指標として抗酸化力を測定する方法である。この反応系に抗酸化物質が共存するとＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の減少速度が遅延するため、標準物質存在下のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの減少速度の遅延度合いと比較して、標準物質に換算した試料の抗酸化力を算出することができる。したがってこのＯＲＡＣ試験で高い値を示す場合、酸化に対する安定性が高いということができる。
なお、ＯＲＡＣは食品の生体内の抗酸化能を評価する指標として有用であるといわれている。
【００４１】
１．抗酸化効果測定方法
ＯＲＡＣの測定原理は、上記したように蛍光物質であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを蛍光プローブとして使用し、ラジカル発生剤であるＡＡＰＨにより分解されるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を経時的に測定し、その変化を指標として抗酸化力を測定する方法である。図１に示すように、蛍光強度の変化曲線を作成し、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出する。このＡＵＣの違いを標準物質であるＴｒｏｌｏｘを用いて相対的に評価する。具体的には、抗酸化物質非存在下の蛍光強度（ＲＦＵ）を測定して蛍光強度の変化曲線（Ｂｌａｎｋ）を作成し、ついで図２に示すＴｒｏｌｏｘ標準液または試料存在下の蛍光強度変化曲線（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）を作成し、それぞれの曲線のＡＵＣを計算する。Ｔｒｏｌｏｘ標準液または試料存在下のＡＵＣ値から抗酸化物質非存在下のＡＵＣ値を減じたＡＵＣをＮｅｔ  ＡＵＣ（図３）とする。Ｔｒｏｌｏｘ標準液の測定から作成した検量線を元に、試料のＮｅｔ  ＡＵＣからＴｒｏｌｏｘに換算した時の値、Ｔｒｏｌｏｘ当量（ＴＥ）を算出し（図４）、この値をもって抗酸化能を評価した。
【００４２】
２．試験試料 
測定対象としたビタミン類は表５に記載の製品から調整した。すべてＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社より購入した。
【００４３】
【表５】
2018188371.tif 000009
【００４４】
試験に使用した試薬物質の内、Ｔｒｏｌｏｘ（（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）はＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社から、ＡＡＰＨは東京化成工業株式会社から、メチル−β−シクロデキストリンは純正化学株式会社から購入した。また、りん酸水素二カリウム、りん酸二水素カリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、アセトンは和光純薬工業株式会社より購入した。
また、実験機器はマイクロプレートリーダー（ＩＮＦＩＮＩＴ ２００ ＰＲＯ、ＴＥＣＡＮジャパン株式会社）、９６  ｗｅｌｌ  プレート（３８８１−０９６、ＩＷＡＫＩ）プレートシール（ＦＧ−ＢＣ１００ＰＣＲ、日本ジェネティクス株式会社）を使用した。
【００４５】
３．プロトコル
水溶性ビタミンはＨ−ＯＡＲＣ法、脂溶性ビタミンはＬ−ＯＡＲＣ法で測定した。すなわち、試料をＤＭＳＯに溶解後、Ｈ−ＯＡＲＣ法ではリン酸Ｂｕｆｆｅｒ（７５ｍＭリン酸水素二カリウム溶液５００ｍＬと７５ｍＭリン酸二水素カリウム溶液１５５ｍＬを混合、７５ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ）で、Ｌ−ＯＲＡＣ法では７％メチル−β−シクロデキストリン含有５０％アセトン水溶液（ＲＭＣＤ溶液、アセトン５０％水溶液で７％メチル−β−シクロデキストリンを溶解）で適宜希釈した。その他に、反応液濃度や測定範囲が若干異なる。詳細は以降に記載する。また、ＴｒｏｌｏｘとアンペロプシンはＤＭＳＯを用いてそれぞれ、５０ｍＭ、１０ｍＭに希釈後、エッペンに分けて−２０℃にて保管した（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。
水溶性ビタミンの測定では、Ｔｒｏｌｏｘ、ビタミン、アンペロプシンＤＭＳＯ溶液の溶解にリン酸Ｂｕｆｆｅｒを使用した。すなわち、５０ｍＭ  Ｔｒｏｌｏｘ溶液をＤＭＳＯ濃度が１％となるように、リン酸Ｂｕｆｆｅｒを用いて５０μＭから２倍希釈系列にて６．２５μＭまでＴｒｏｌｏｘ標準液を調整し、水溶性ビタミンはＤＭＳＯで１００ｍＭに希釈した後、ＤＭＳＯ濃度が１％となるように、リン酸Ｂｕｆｆｅｒを用いて適宜希釈した。また、１０ｍＭアンペロプシン溶液をＤＭＳＯ濃度が１％となるようにリン酸Ｂｕｆｆｅｒを用いて５μＭに希釈した。ビタミンとアンペロプシンの希釈濃度は、Ｔｒｏｌｏｘ当量６．２５−５０μＭの範囲内となるように決定した。各ｗｅｌｌの液量、ＤＭＳＯ濃度が等しくなるように、表６のとおりサンプルを分注した。なお、水溶性ビタミンの内、リボフラビン、ナイアシン、シアノコバラミン、ビオチン、パントテン酸は１ｍＭから１０μＭまで１０倍希釈系列を作成し、濃度依存的な活性が認められなかったため、相乗効果検討の対象から除外した。
【００４６】
【表６】
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【００４７】
フルオレセイン溶液（１１０．７ｎＭ／７５ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を１１５μＬ添加後、プレートシールを貼り、マイクロプレートリーダーにてＥｘ  ４８５ｎｍ、Ｅｍ  ５３８ｎｍの蛍光強度を測定した。３７℃で１０分間インキュベート後、ＡＡＰＨ溶液（３１．７ｍＭ／７５ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を４０μＭ加えて振とうし、再びプレートシールを貼った。３７℃にて２分間毎に１２０分間、Ｅｘ  ４８５ｎｍ、Ｅｍ  ５３８ｎｍを測定した。
脂溶性ビタミンの測定では、Ｔｒｏｌｏｘ、ビタミンＤＭＳＯ溶液の溶解にＲＭＣＤ溶液を、アンペロプシンＤＭＳＯ溶液の溶解にリン酸Ｂｕｆｆｅｒを用いた。すなわち、５０ｍＭ  Ｔｒｏｌｏｘ溶液をＤＭＳＯ濃度が１０％となるように、ＲＭＣＤ溶液を用いて３２０μＭから２倍希釈系列にて２０μＭまでＴｒｏｌｏｘ標準液を調整し、脂溶性ビタミンはＤＭＳＯで１００ｍＭに希釈した後、ＤＭＳＯ濃度が１０％となるように、ＲＭＣＤ溶液を用いて適宜希釈した。また、１０ｍＭアンペロプシン溶液をＤＭＳＯ濃度が１０％となるようにリン酸Ｂｕｆｆｅｒを用いて２０μＭに希釈した。ビタミンとアンペロプシンの希釈濃度は１０００μＭから２倍希釈系列を作成し、Ｔｒｏｌｏｘ当量２０−３２０μＭの範囲内となるように決定した。各ｗｅｌｌの液量、ＤＭＳＯ、ＲＭＣＤ濃度が等しくなるように、表７のとおりサンプルを分注した。
【００４８】
【表７】
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【００４９】
フルオレセイン溶液（７７．５ｎＭ／７５ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を１１５μＬ添加後、プレートシールを貼り、マイクロプレートリーダーにてＥｘ  ４８５ｎｍ、Ｅｍ  ５３８ｎｍの蛍光強度を測定した。３７℃で１０分間インキュベート後、ＡＡＰＨ溶液（８２．４ｍＭ／７５ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＭ加えて振とうし、再びプレートシールを貼った。３７℃にて２分間毎に１２０分間、Ｅｘ  ４８５ｎｍ、Ｅｍ  ５３８ｎｍを測定した。
コエンザイムＱ１０は脂溶性物質であるがＤＭＳＯに不溶のため、エタノールに溶解した。エタノール濃度が１０％になるようにＲＭＣＤ溶液を用いて適宜希釈した。Ｔｒｏｌｏｘ、アンペロプシンＤＭＳＯ溶液の溶解にＲＭＣＤ溶液を用いた。すなわち、５０ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ溶液をＤＭＳＯ濃度が１０％となるように、ＲＭＣＤ溶液を用いて８０μＭから２倍希釈系列にて１０μＭまでＴｒｏｌｏｘ標準液を調整した。コエンザイムＱ１０とアンペロプシンの希釈濃度は、Ｔｒｏｌｏｘ当量１０−８０μＭの範囲内となるように決定した。各ｗｅｌｌの液量、ＤＭＳＯ、エタノール、ＲＭＣＤ溶液濃度が等しくなるように、表８のとおりサンプルを分注した。
【００５０】
【表８】
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【００５１】
フルオレセイン溶液（７７．５ｎＭ／７５ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を１１５μＬ添加後、プレートシールを貼り、マイクロプレートリーダーにてＥｘ  ４８５ｎｍ、Ｅｍ  ５３８ｎｍの蛍光強度を測定した。３７℃で１０分間インキュベート後、ＡＡＰＨ溶液（８２．４ｍＭ／７５ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＭ加えて振とうし、再びプレートシールを貼った。３７℃にて２分間毎に１２０分間、Ｅｘ  ４８５ｎｍ、Ｅｍ  ５３８ｎｍを測定した。 
【００５２】
４．アンペロプシンによるビタミン類の抗酸化効果の評価結果
表９にアンペロプシンによるビタミン類の抗酸化効果の総合評価結果を示す。なお。アンペロプシンとビタミン類の併用による抗酸化相乗効果については以下の基準で判定した。
・相乗効果＝（実測値／理論値）＊１００
実測値＝アンペロプシンとビタミン類を混合した反応液の測定値
理論値＝アンペロプシンの測定値＋ビタミン類の測定値
・相乗効果については以下の方法で判断した
×：８０％以下、相乗効果なし（相殺効果）
△：８０〜１２０％、相乗効果なし（測定誤差範囲）
○：１２０％以上、相乗効果あり
【００５３】
【表９】
2018188371.tif 000013
【００５４】
また、図５〜図１０に特に強い抗酸化効果を示した脂溶性ビタミン類の抗酸化測定結果を示す。
図５はα−トコフェロール、図６はコレカルシフェノール、図７はレチナール、図８はレチノール、図９はレチノイン酸、図１０はコエンザイムＱ１０のそれぞれの測定結果である。いずれの脂溶性ビタミンもアンペロプシンと組み合わせると、抗酸化効果が相加以上、つまり相乗的に上昇することから、アンペロプシンは、脂溶性ビタミンの抗酸化能を増強するものと考えられた。
一方、水溶性ビタミンとアンペロプシンでは、抗酸化効果は相加的な効果しか認められなかったことから、水溶性ビタミンに対するアンペロプシンの抗酸化増強効果は小さいものと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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