(57)【要約】      （修正有）【課題】抗腫瘍効果と安全性面に優れる抗腫瘍薬の提供。【解決手段】下記式で示される抗腫瘍性化合物と抗体とを、次式：-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-で示される構造のリンカーを介して結合させたことを特徴とする抗体−薬物コンジュゲート（抗体はL１の末端において結合し、抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を結合部位として、Lｃの末端において結合する）。2018188455.tif 000152【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式のいずれかで示されるリンカー及び薬物と、抗体と、が結合した抗体−薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
及び
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
（式中、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化１】
2018188455.tif 000147
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(NH-DX)は次式：
【化２】
2018188455.tif 000148
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。）
【請求項２】
抗体が、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、又は抗ＣＤ７０抗体である請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３】
抗体が、抗Ｂ７−Ｈ３抗体である請求項２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４】
抗Ｂ７−Ｈ３抗体が、
重鎖における相補性決定領域として配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに
軽鎖における相補性決定領域として配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する、
請求項３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５】
抗Ｂ７−Ｈ３抗体が、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１５においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１７においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１９においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１５においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、並びに
配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域からなる群から選択される重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を有する、
請求項４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６】
抗Ｂ７−Ｈ３抗体が、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１７においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１９においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、並びに
配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる群から選択される重鎖及び軽鎖からなる、
請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項７】
抗Ｂ７−Ｈ３抗体の重鎖が、配列番号９又は１２に記載のアミノ酸配列においてカルボキシル末端のアミノ酸が欠失している重鎖である、請求項６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項８】
薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個の範囲である請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項９】
薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個の範囲である請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート又はその塩を含有する医薬。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート又はその塩を含有する抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
【請求項１２】
肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、又は食道癌に適用するための請求項１１に記載の抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート又はその塩を活性成分とし、薬学的に許容される製剤成分とを含有する医薬組成物。
【請求項１４】
次式のいずれかで示される化合物：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
及び
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
（式中、(maleimid-N-yl)-は、次式：
【化３】
2018188455.tif 000149
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
-(NH-DX)は、次式：
【化４】
2018188455.tif 000150
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。）
【請求項１５】
リンカーを介して薬物と抗体とが結合された抗体−薬物コンジュゲートを得るための、次式のいずれかで示されるリンカー。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、
及び
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
（式中、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化５】
2018188455.tif 000151
で示される構造であり、このものの３位で前記抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー内のメチレン基と結合する。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞を標的にできる抗体と抗腫瘍性薬物とをリンカー構造部分を介して
結合させた、抗腫瘍薬として有用な抗体−薬物コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞表面に発現し、かつ細胞に内在化できる抗原に結合する抗体に、細胞毒性のある
薬物を結合させた抗体−薬物コンジュゲート（Antibody-Drug Conjugate；ADC）は、癌細
胞に選択的に薬物を送達できることによって、癌細胞内に薬物を蓄積させ、癌細胞を死滅
させることが期待できる（非特許文献１〜３参照）。ADCとして例えば、抗CD33抗体にカ
リチアマイシンを結合させたMylotarg（ゲムツズマブオゾガマイシン）は急性骨髄性白血
病の治療薬として認可されている。また、抗CD30抗体にオーリスタチンＥを結合させたAd
cetris（ブレンツキシマブベドティン）はホジキンリンパ腫と未分化大細胞リンパ腫の治
療薬として最近認可された（非特許文献４参照）。これまでに認可されたADCに含有され
る薬物は、DNA、又はチューブリンを標的としている。
【０００３】
抗腫瘍性の低分子化合物としてトポイソメラーゼＩを阻害して抗腫瘍作用を発現する化
合物であるカンプトテシン誘導体が知られている。その中で下式
【０００４】
【化１】
2018188455.tif 000002
【０００５】
で示される抗腫瘍性化合物（エキサテカン、化学名：(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-フル
オロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ［de］ピラノ［3’,4’:6,7］
インドリジノ［1,2-b］キノリン-10,13（9H,15H）-ジオン）は、水溶性のカンプトテシン
誘導体である（特許文献１、２）。現在臨床で用いられているイリノテカンとは異なり、
酵素による活性化が不要である。また、イリノテカンの薬効本体であるSN-38や、同じく
臨床で用いられているトポテカンよりもトポイソメラーゼＩ阻害活性が強く、in vitroで
種々の癌細胞に対して、より強い殺細胞活性を有している。特にP-glycoproteinの発現に
よってSN-38等に耐性を示す癌細胞に対しても効果を示した。また、マウスのヒト腫瘍皮
下移植モデルでも強い抗腫瘍効果を示し、臨床試験が行われたが上市には至っていない（
非特許文献５〜１０参照）。エキサテカンがADCとして有効に作用するかについては明ら
かではなかった。
【０００６】
DE-310は、生分解性のカルボキシメチルデキストランポリアルコールポリマーにエキサ
テカンをGGFGペプチドスペーサーを介して結合させた複合体である（特許文献３）。エキ
サテカンを高分子プロドラッグ化することによって、高い血中滞留性を保持させ、さらに
腫瘍新生血管の透過性の亢進と腫瘍組織滞留性を利用して、受動的に腫瘍部位への指向性
を高めたものである。DE-310は、酵素によるペプチドスペーサーの切断によって、活性本
体であるエキサテカン、およびグリシンがアミノ基に結合しているエキサテカンが持続的
に遊離される。その結果、薬物動態が改善され、非臨床試験における種々の腫瘍の評価モ
デルにおいて、DE-310はエキサテカンの投与量がエキサテカン単剤の投与時よりも減少し
ているのにも拘らず、エキサテカン単剤の投与時よりもより高い有効性を示した。DE-310
に関しては臨床試験が実施され、ヒトにおいて有効例が確認され、活性本体が正常組織よ
りも腫瘍に集積することが確認されたという報告がある一方で、ヒトにおける腫瘍へのDE
-310及び活性本体の集積は正常組織への集積と大差なく、ヒトでは受動的なターゲティン
グは見られなかったとの報告もある（非特許文献１１〜１４参照）。結果としてDE-310も
上市には至らず、エキサテカンがこのようなターゲティングを指向した薬物として有効に
機能するかについては明らかではなかった。
DE-310の関連化合物として、-NH(CH2)4C(=O)-で示される構造部分を-GGFG-スペーサー
とエキサテカンの間に挿入し、-GGFG-NH(CH2)4C(=O)-をスペーサー構造とする複合体も知
られているが（特許文献４）、同複合体の抗腫瘍効果については全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−５９０６１号公報
【特許文献２】特開平８−３３７５８４号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ１９９７/４６２６０パンフレット
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０００/２５８２５パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ducry,  L.,  et  al.  Bioconjugate  Chem.  (2010)  21,  5-13.;  Antibody-Drug  Conjugates:  Linking  cytotoxic  payloads  to  monoclonal  antibodies.
【非特許文献２】Alley,  S.  C.,  et  al.  Current  Opinion  in  Chemical  Biology  (2010)  14,  529-537.;  Antibody-drug  conjugates:  targeted  drug  delivery  for  cancer.
【非特許文献３】Damle  N.K.  Expert  Opin.  Biol.  Ther.  (2004)  4,  1445-1452.;  Tumour-targeted  chemotherapy  with  immunoconjugates  of  calicheamicin.
【非特許文献４】Senter  P.  D.,  et  al.  Nature  Biotechnology  (2012)  30,  631-637.;  The  discovery  and  development  of  brentuximab  vedotin  for  use  in  relapsed  Hodgkin  lymphoma  and  systemic  anaplastic  large  cell  lymphoma.
【非特許文献５】Kumazawa,  E.,  Tohgo,  A.,  Exp.  Opin.  Invest.  Drugs  (1998)  7,  625-632.;  Antitumour  activity  of  DX-8951f:  a  new  camptothecin  derivative.
【非特許文献６】Mitsui,  I.,  Kumazawa,  E.,  Hirota,  Y.,  et  al.  Jpn  J.  Cancer  Res.  (1995)  86,  776-786.;  A  new  water-soluble  camptothecin  derivative,  DX-8951f,  exhibits  potent  antitumor  activity  against  human  tumors  in  vitro  and  in  vivo.
【非特許文献７】Takiguchi,  S.,  Tohgo,  A.,  et  al.  Jpn  J.  Cancer  Res.  (1997)  88,  760-769.;  Antitumor  effect  of  DX-8951,  a  novel  camptothecin  analog,  on  human  pancreatic  tumor  cells  and  their  CPT-11-resistant  variants  cultured  in  vitro  and  xenografted  into  nude  mice.
【非特許文献８】Joto,  N.  et  al.  Int  J  Cancer  (1997)  72,  680-686.;  DX-8951f,  a  water-soluble  camptothecin  analog,  exhibits  potent  antitumor  activity  against  a  human  lung  cancer  cell  line  and  its  SN-38-resistant  variant.
【非特許文献９】Kumazawa,  E.  et  al.  Cancer  Chemother.  Pharmacol.  (1998)  42,  210-220.;  Potent  and  broad  antitumor  effects  of  DX-8951f,  a  water-soluble  camptothecin  derivative,  against  various  human  tumors  xenografted  in  nude  mice.
【非特許文献１０】De  Jager,  R.,  et  al.  Ann  N  Y  Acad  Sci  (2000）  922,  260-273.;  DX-8951f:  summary  of  phase  I  clinical  trials.
【非特許文献１１】Inoue,  K.  et  al.  Polymer  Drugs  in  the  Clinical  Stage,  Edited  by  Maeda  et  al.  (2003),  145-153.;  CM-dextran-polyalcohol-camptothecin  conjugate,  DE-310  with  a  novel  carrier  system  and  its  preclinical  data.
【非特許文献１２】Kumazawa,  E.  et  al.  Cancer  Sci  (2004）  95,  168-175.;  DE-310,  a  novel  macromolecular  carrier  system  for  the  camptothecin  analog  DX-8951f:  Potent  antitumor  activities  in  various  murine  tumor  models.
【非特許文献１３】Soepenberg,  O.  et  al.  Clinical  Cancer  Research,  (2005)  11,  703-711.;  Phase  I  and  pharmacokinetic  study  of  DE-310  in  Patients  with  Advanced  Solid  Tumors.
【非特許文献１４】Wente  M.  N.  et  al.  Investigational  New  Drugs  (2005)  23,  339-347.;  DE-310,  a  macromolecular  prodrug  of  the  topoisomerase-I-inhibitor  exatecan  (DX-8951),  in  patients  with  operable  solid  tumors.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
抗体による腫瘍の治療においては、抗体が抗原を認識して腫瘍細胞に結合しても抗腫瘍
効果が十分でない場合が観察されることもあり、より効果の高い抗腫瘍抗体が必要とされ
る場合がある。また、抗腫瘍性の低分子化合物においては、抗腫瘍効果に優れていても副
作用や毒性面等、安全性上の問題を有するものが多く、低分子抗腫瘍化合物については、
安全性をより高めてより優れた治療効果を獲得することも課題である。すなわち本発明は
、抗腫瘍効果と安全性面に優れる、優れた治療効果を有する抗腫瘍薬を獲得して提供する
ことが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは抗腫瘍性化合物であるエキサテカンを、リンカー構造部分を介して、腫瘍
細胞を標的にできる抗体、すなわち、腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる
特性、腫瘍細胞に内在化できる特性、あるいは腫瘍細胞に細胞障害性を有する特性のいず
れか一又はそれ以上の特性を備えた抗体、に結合させた化合物である抗体−薬物コンジュ
ゲートに変換することによって、腫瘍細胞に細胞障害性を有する抗体であればその細胞障
害性の増強が達成できること、さらに抗腫瘍性化合物を腫瘍細胞により確実に移動させて
当該化合物の抗腫瘍効果を腫瘍細胞で特異的に発揮させることができること、したがって
抗腫瘍効果の確実な発揮とともに抗腫瘍性化合物の投与量が当該化合物の単体投与時より
も減少させることができるのでより高い安全性を達成できること、が可能と考えた。
このために本発明者らは特定の構造のリンカーを創出し、このリンカーを介して抗体と
エキサテカンとを結合させた抗体−薬物コンジュゲートを獲得することに成功し、そして
この化合物が優れた抗腫瘍効果を発揮することを見出して本発明を完成させたのである。
【００１１】
すなわち本願発明は、
［１］次式
【化２】
2018188455.tif 000003
で示される抗腫瘍性化合物と抗体とを次式：
-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-
で示される構造のリンカーを介して結合させたことを特徴とする抗体−薬物コンジュゲー
トに関するものである。
【００１２】
ここで、抗体はL１の末端において結合し、抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素
原子を結合部位として、Lｃの末端において結合し、
式中、
n１は、０から６の整数を示し、
L１は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n２-C(=O)-、-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n３-C(=O)-、-C(=
O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-、又は-C(=O)-(CH2)n４-C(=O)-を示し、
ここで、n２は、２から８の整数を示し、n３は、１から８の整数を示し、n４は、１か
ら８の整数を示し、
L２は、-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-、-S-(CH2)n６-C(=O)-、又は単結合を示し、
ここで、n５は、１から６の整数を示し、n６は、１から６の整数を示し、
LＰは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
Lａは、-C(=O)-NH-、-NR１-(CH2)n７-、-O-、又は単結合を示し、
ここで、n７は、１から６の整数を示し、R１は、水素原子、炭素数１から６のアルキル
基、-(CH2)n８-COOH、又は-(CH2)n９-OHを示すが、n８は、整数の１から４を示し、n９は
、１から６の整数を示し、
Lｂは、-CR２(-R３)-、-O-、-NR４-、又は単結合を示し、
ここで、R２及びR３は、各々独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、-(CH2)
nａ-NH2、-(CH2)nｂ-COOH、又は-(CH2)nｃ-OHを示し、R４は、水素原子又は炭素数１から
６のアルキル基を示し、nａは、０から６の整数を示し、nｂは、整数の１から４を示し、
nｃは、整数の１から４を示すが、nａが０であるときは、R２及びR３は同一とはならず、
Lｃは、-CH2-又は-C(=O)-を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化３】
2018188455.tif 000004
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含む
リンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(N-ly-3-diminiccuS)-は次式：
【化４】
2018188455.tif 000005
で示される構造であり、このものの３位でL２と結合し、１位の窒素原子上でこの構造を
含むリンカー構造内のメチレン基と結合し、
cyc.Hex(1,4)は１，４-シクロへキシレン基を示し、
L２が-S-(CH2)n６-C(=O)-のとき、L１は-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-
となる。
【００１３】
さらに本願発明は以下の各々に関するものでもある。
［２］Lｃが、-C(=O)-である［１］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［３］抗体とL１との結合が、
抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分において形成させたチオエーテル結合、
抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分において形成させたジスルフィド結合、
又は
抗体を構成するアミノ酸の側鎖上に存在するアミノ基または末端のアミノ基において形成
させたアミド結合、
である［１］又は［２］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［４］LＰのペプチド残基が、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリ
ン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸からなるアミノ酸残基
である［１］から［３］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［５］LＰが、４個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である［１］から［３］のいず
れか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［６］LＰが、-GGFG-である［１］から［３］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジ
ュゲート。
【００１４】
［７］次式
【化５】
2018188455.tif 000006
で示される抗腫瘍性化合物と抗体とを次式：
-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-
で示される構造のリンカーを介して結合させたことを特徴とする抗体−薬物コンジュゲー
ト。
【００１５】
ここで、抗体はL１の末端において結合し、抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素
原子を結合部位として、Lｃの末端において結合し、
式中、
n１は、０から６の整数を示し、
L１は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n２-C(=O)-、-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n３-C(=O)-、-C(=
O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-、又は-C(=O)-(CH2)n４-C(=O)-を示し、
ここで、n２は、２から８の整数を示し、n３は、１から８の整数を示し、n４は、１か
ら８の整数を示し、
L２は、-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-、-S-(CH2)n６-C(=O)-、又は単結合を示し、
ここで、n５は、１から６の整数を示し、n６は、１から６の整数を示し、
LＰは、GGFGのテトラペプチド残基を示し、
Lａは、-O-又は単結合を示し、
Lｂは、-CR２(-R３)-又は単結合を示し、
ここで、R２及びR３は水素原子を示し、
Lｃは-C(=O)-を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化６】
2018188455.tif 000007
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含む
リンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(N-ly-3-diminiccuS)-は次式：
【化７】
2018188455.tif 000008
で示される構造であり、このものの３位でL２と結合し、１位の窒素原子上でこの構造を
含むリンカー構造内のメチレン基と結合し、
cyc.Hex(1,4)は１，４-シクロへキシレン基を示し、
L２が-S-(CH2)n６-C(=O)-のとき、L１は-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-
となる。
【００１６】
［８］L１が、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n２-C(=O)-又は-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n３-C(=O
)-である［１］から［７］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［９］L１が、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n２-C(=O)-である［１］から［７］のいずれ
か一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１０］L１が、-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-又は-C(=O)-(CH2)n４-C
(=O)-である［１］から［７］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１１］n２が、２から５の整数であって、L２が、単結合である［１］から［９］のいず
れか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１２］n２が、２から５の整数であって、L２が、-NH-(CH2CH2O)n５-CH2-CH2-C(=O)-で
あり、n５が、２又は４である［１］から［９］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コン
ジュゲート。
［１３］-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-が、４から７原子の鎖長を有する部分構造である［
１］から［１２］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１４］-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-が、５又は６原子の鎖長を有する部分構造である［
１］から［１２］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［１５］-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-が、
-NH-(CH2)3-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は
-NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-
である［１］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【００１７】
［１６］薬物−リンカー構造部分が、次の薬物−リンカー構造の群から選ばれる１種の薬
物−リンカー構造である［１］から[１５]のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲ
ート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=
O)-(NH-DX)
【００１８】
ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化８】
2018188455.tif 000009
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含む
リンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(N-ly-3-diminiccuS)-は次式：
【化９】
2018188455.tif 000010
で示される構造であり、このものの３位でL２と結合し、１位の窒素原子上でこの構造を
含むリンカー構造内のメチレン基と結合し、
cyc.Hex(1,4)は１，４-シクロへキシレン基を示し、
-(NH-DX)は次式：
【化１０】
2018188455.tif 000011
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示し、
-GGFG-は、-Gly-Gly-Phe-Gly-のペプチド残基を示す。
【００１９】
［１７］-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-に薬物を結合させた薬物−リンカー構
造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物−リンカー構造である［１］から[９]および[
１１]から[１４]のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)。
【００２０】
ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化１１】
2018188455.tif 000012
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含む
リンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(NH-DX)は次式：
【化１２】
2018188455.tif 000013
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
【００２１】
［１８］次式
【化１３】
2018188455.tif 000014
で示される抗腫瘍性化合物と抗体とを次式：
-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-
で示される構造のリンカーを介して結合させたことを特徴とする抗体−薬物コンジュゲー
ト。
ここで、抗体はL１の末端において結合し、抗腫瘍性化合物はLｃの末端において結合し
、
式中、
n１は、０から６の整数を示し、
L１は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n２-C(=O)-を示し、抗体のヒンジ部に存在するジス
ルフィド結合部分において形成させたチオエーテル結合を介して抗体に結合するが、
ここで、n２は、２から８の整数を示し、
L２は、-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-又は単結合を示し、
ここで、n５は、１から６の整数を示し、
LＰは、GGFGのテトラペプチド残基を示し、
Lａは、-O-又は単結合を示し、
Lｂは、-CR２(-R３)-又は単結合を示し、
ここで、R２及びR３は水素原子を示し、
Lｃは-C(=O)-を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化１４】
2018188455.tif 000015
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含む
リンカー構造内のメチレン基と結合する。
【００２２】
［１９］n２が２であり、L２が-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-であって、n５が２で
あり、n１が３であり、LａおよびLｂがいずれも単結合であるか、
n２が５であり、L２が単結合であり、n１が１であり、Lａが-O-であり、  Lｂが-CR２(-R
３)-であるか、または
n２が５であり、L２が単結合であり、n１が２であり、Lａが-O-であり、  Lｂが-CR２(-R
３)-である、［１８］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２０］n２が、２から５の整数であって、L２が、単結合である［１８］又は［１９］の
いずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２１］n２が、２から５の整数であって、L２が、-NH-(CH2CH2O)n５-CH2-CH2-C(=O)-で
あり、n５が、２又は４である［１８］又は［１９］に記載の抗体−薬物コンジュゲート
。
［２２］-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-が、
-NH-(CH2)3-C(=O)-、
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は
-NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-
である［１８］から［２１］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【００２３】
［２３］薬物−リンカー構造部分が、次の薬物−リンカー構造の群から選ばれる１種の薬
物−リンカー構造である［１８］から[２２]のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュ
ゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化１５】
2018188455.tif 000016
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含む
リンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(NH-DX)は次式：
【化１６】
2018188455.tif 000017
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
【００２４】
［２４］-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-に薬物を結合させた薬物−リンカー構
造部分が、次の群から選ばれる１種の薬物−リンカー構造である［２３］に記載の抗体−
薬物コンジュゲート：
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)。
ここで、-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化１７】
2018188455.tif 000018
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含む
リンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(NH-DX)は次式：
【化１８】
2018188455.tif 000019
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基を示す。
【００２５】
［２５］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０
個の範囲である［１］から［２４］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２６］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個
の範囲である［１］から［２４］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２７］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個
の範囲である［１］から［２４］のいずれか一に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２８］抗体が、標的細胞を認識できる特性、標的細胞に結合できる特性、標的細胞に内
在化できる特性、標的細胞を傷害する特性の一又はそれ以上の特性を備えた抗体である［
１］から［２７］にいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［２９］抗体−薬物コンジュゲートが標的とする細胞が腫瘍細胞である［１］から[２７]
のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［３０］抗体が、抗Ａ３３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ２０抗体
、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体
、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１
抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗体ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃ
ｉｎ−Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、又は抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体である［１］か
ら[２７]のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［３１］抗体が、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、又は抗ＣＤ７０
抗体である［１］から[２７]のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［３２］抗体が、抗Ｂ７−Ｈ３抗体である［１］から[２７]のいずれか一項に記載の抗体
−薬物コンジュゲート。
【００２６】
［３３］［１］から［３２］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩
、又はそれらの水和物を含有する医薬。
［３４］［１］から［３２］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩
、又はそれらの水和物を含有する抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
［３５］肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、
乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、又は食道癌に適用するための［３４］に記載の
抗腫瘍薬及び/又は抗癌薬。
［３６］［１］から［３２］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩
、又はそれらの水和物を活性成分とし、薬学的に許容される製剤成分とを含有する医薬組
成物。
［３７］肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、
乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、又は食道癌に適用するための［３６］に記載の
医薬組成物。
［３８］［１］から［３２］のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、その塩
、又はそれらの水和物を投与することを特徴とする腫瘍及び/又は癌の治療方法。
【００２７】
［３９］次式で示される薬物−リンカー中間体化合物：
Q-(CH2)nＱ-C(=O)-L２ａ-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-(NH-DX)
【００２８】
式中、Ｑは、(maleimid-N-yl)-、HS-、X-CH2-C(=O)-NH-、又は(Pyrrolidine-2,5-dione-N
-yl)-O-C(=O)-を示し、
Ｘは、臭素原子又はヨウ素原子を示し、
nＱは、整数の２から８を示し、
L２ａは、-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-、又は単結合を示し、
ここで、n５は、１から６の整数を示し、
LＰは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸から選ばれる２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示
し、
n１は、０から６の整数を示し、
Lａは、-C(=O)-NH-、-NR１-(CH2)n７-、-O-、又は単結合を示し、
ここで、n７は、１から６の整数を示し、R１は、水素原子、炭素数１から６のアルキル
基、-(CH2)n８-COOH、又は-(CH2)n９-OHを示すが、n８は、整数の１から４を示し、n９は
、１から６の整数を示し、
Lｂは、-CR２(-R３)-、-O-、-NR４-、又は単結合を示し、
ここで、R２及びR３は、各々独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、-(CH2)
nａ-NH2、-(CH2)nｂ-COOH、又は-(CH2)nｃ-OHを示し、R４は、水素原子又は炭素数１から
６のアルキル基を示し、nａは、０から６の整数を示し、nｂは、整数の１から４を示し、
nｃは、整数の１から４を示すが、nａが０であるときは、R２及びR３は同一とはならず、
Lｃは、-CH2-又は-C(=O)-を示し、
(maleimid-N-yl)-は、次式
【化１９】
2018188455.tif 000020
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)は、次式
【化２０】
2018188455.tif 000021
で示される窒素原子が結合部位である基であり、
-(NH-DX)は、次式
【化２１】
2018188455.tif 000022
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００２９】
［４０］Lｃが-C(=O)-である［３９］に記載の薬物−リンカー中間体化合物。
［４１］LＰが、４個のアミノ酸から構成されたペプチド残基である［３９］または［４
０］に記載の薬物−リンカー中間体化合物。
［４２］LＰが、-GGFG-である［３９］から［４１］のいずれか一項に記載の薬物−リン
カー中間体化合物。
［４３］-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、
-NH-CH2CH2-、
-NH-CH2CH2CH2-、
-NH-CH2CH2CH2CH2-、
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、
-NH-CH2-O-CH2-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-である［３９］から［４２］のいずれか一項に記載の薬物−リンカー
中間体化合物。
［４４］-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、
-NH-CH2CH2CH2-、
-NH-CH2-O-CH2-、又は
-NH-(CH2)2-O-CH2-である［３９］から［４２］のいずれか一項に記載の薬物−リンカー
中間体化合物。
［４５］nＱが、整数の２から６である、［３９］から［４４］のいずれか一項に記載の
薬物−リンカー中間体化合物。
［４６］Ｑが、(maleimid-N-yl)-であり、
nＱが、整数の２から５であり、
L２ａが単結合である［４３］に記載の薬物−リンカー中間体化合物。
［４７］Ｑが、(maleimid-N-yl)-であり、
nＱが、整数の２から５であり、
L２ａが単結合である［４４］に記載の薬物−リンカー中間体化合物。
［４８］Ｑが、(maleimid-N-yl)-であり、
nＱが、整数の２から５であり、
L２ａが-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-であり、
n５が、整数の２から４であり、
-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、
-NH-CH2CH2-、
-NH-CH2CH2CH2-、
-NH-CH2CH2CH2CH2-、
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、
-NH-CH2-O-CH2-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-である［３９］から［４２］のいずれか一項に記載の薬物−リンカー
中間体化合物。
［４９］n５が、整数の２又は４であり、
-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、
-NH-CH2CH2CH2-、
-NH-CH2-O-CH2-、又は
-NH-CH2CH2-O-CH2-である［４８］に記載の薬物−リンカー中間体化合物。
【００３０】
［５０］次の化合物：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O
)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C
(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C
(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)
-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(
=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(
=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2
-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH
-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C
(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH
2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX
)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH
-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=
O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX
)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH
-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=
O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-
C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX
)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH
-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=
O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-
C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH
-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=
O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-
C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C
H2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、又は
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
【００３１】
ここで，(maleimid-N-yl)-は、次式
【化２２】
2018188455.tif 000023
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
Ｘはハロゲン原子を示し、
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-は、次式
【化２３】
2018188455.tif 000024
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
-(NH-DX)は、次式
【化２４】
2018188455.tif 000025
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００３２】
［５１］次の化合物：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O
)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C
(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C
(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
【００３３】
ここで，(maleimid-N-yl)-は、次式
【化２５】
2018188455.tif 000026
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
-(NH-DX)は、次式
【化２６】
2018188455.tif 000027
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００３４】
［５２］次の化合物：(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)
-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
【００３５】
ここで，(maleimid-N-yl)-は、次式
【化２７】
2018188455.tif 000028
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
-(NH-DX)は、次式
【化２８】
2018188455.tif 000029
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００３６】
［５３］次の群から選ばれる化合物：
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、及び
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX)
式中、-(NH-DX)は、次式
【化２９】
2018188455.tif 000030
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００３７】
［５４］次式
【化３０】
2018188455.tif 000031
で示される化合物。
【００３８】
［５５］次式：
【化３１】
2018188455.tif 000032
で示される化合物。
【００３９】
［５６］次式
【化３２】
2018188455.tif 000033
で示される化合物。
【００４０】
［５７］次式で示される化合物：
Q-(CH2)nＱ-C(=O)-L２ａ-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-(NH-DX)
を抗体又はその反応性誘導体と反応させ、
抗体のヒンジ部に存在するジスルフィド結合部分においてチオエーテル結合を形成させる
方法、又は
抗体を構成するアミノ酸の側鎖上に存在するアミノ基または末端のアミノ基においてアミ
ド結合を形成させる方法
によって薬物−リンカー部分を抗体に結合させることを特徴とする抗体−薬物コンジュゲ
ートの製造方法。
【００４１】
式中、Ｑは、(maleimid-N-yl)-、HS-、X-CH2-C(=O)-NH-、又は
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-を示し、
Ｘは、臭素原子又はヨウ素原子を示し、
nＱは、整数の２から８を示し、
L２ａは、-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-、又は単結合を示し、
ここで、n５は、１から６の整数を示し、
LＰは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、シトルリン、セリン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸から選ばれる２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示
し、
n１は、０から６の整数を示し、
Lａは、-C(=O)-NH-、-NR１-(CH2)n７-、-O-、又は単結合を示し、
ここで、n７は、１から６の整数を示し、R１は、水素原子、炭素数１から６のアルキル
基、-(CH2)n８-COOH、又は-(CH2)n９-OHを示すが、n８は、整数の１から４を示し、n９は
、１から６の整数を示し、
Lｂは、-CR２(-R３)-、-O-、-NR４-、又は単結合を示し、
ここで、R２及びR３は、各々独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、-(CH2)
nａ-NH2、-(CH2)nｂ-COOH、又は-(CH2)nｃ-OHを示し、R４は、水素原子又は炭素数１から
６のアルキル基を示し、nａは、０から６の整数を示し、nｂは、整数の１から４を示し、
nｃは、整数の１から４を示すが、nａが０であるときは、R２及びR３は同一とはならず、
Lｃは、-CH2-又は-C(=O)-を示し、
(maleimid-N-yl)-は、次式
【化３３】
2018188455.tif 000034
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)は、次式
【化３４】
2018188455.tif 000035
で示される窒素原子が結合部位である基であり、
-(NH-DX)は、次式
【化３５】
2018188455.tif 000036
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００４２】
［５８］薬物−リンカー部分を抗体に結合させる方法が、
抗体を還元処理した後に、Ｑが、マレイミジル基又はX-CH2-C(=O)-NH-である化合物を反
応させてチオエーテル結合を形成させる方法、
抗体に、Ｑが、(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-である化合物を反応させてアミ
ド結合を形成させる方法、又は
抗体に式Ｑ１-Ｌ１ａ-Ｑ２
［式中、Ｑ１は、(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-、(3-Sulfo-pyrrolidine-2,5-
dione-N-yl)-O-C(=O)-、RＱ-O-C(=N)-、又はO=C=N-を示し、
Ｌ１ａ-は、-cyc.Hex(1,4)-CH2-、炭素数１から１０のアルキレン基、フェニレン基、-(C
H2)n４-C(=O)-、-(CH2)n４a-NH-C(=O)-(CH2)n４ｂ-、又は-(CH2)n４a-NH-C(=O)-cyc.Hex(
1,4)-CH2-を示し、
Ｑ２は、(maleimid-N-yl)、ハロゲン原子、又は-S-S-(2-Pyridyl)を示し、
RＱは、炭素数１から６のアルキル基、n４は、１から８の整数を示し、
n４aは０から６の整数、n４ｂは１から６の整数を示し、
(3-Sulfo-pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-は、次式
【００４３】
【化３６】
2018188455.tif 000037
【００４４】
で示される窒素原子が結合部位である基であり、このスルホン酸はリチウム塩、ナトリウ
ム塩、カリウム塩を形成でき、
cyc.Hex(1,4)は１，４-シクロへキシレン基を示し、
(2-Pyridyl)は、２−ピリジル基を示す。］
で示される化合物を反応させた後に、Ｑが、ＳＨである化合物を反応させてアミド結合に
よって薬物−リンカー構造を形成させる方法、
のいずれかである［５７］に記載の製造方法。
【００４５】
［５９］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０
個の範囲である［５７］又は［５８］に記載の製造方法。
［６０］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個
の範囲である［５７］又は［５８］に記載の製造方法。
［６１］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個
の範囲である［５７］又は［５８］に記載の製造方法。
［６２］抗体−薬物コンジュゲートが標的とする細胞が腫瘍細胞である［５７］から[６
１]のいずれか一項に記載の製造方法。
［６３］抗体が、抗Ａ３３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ２０抗体
、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体
、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１
抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗体ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃ
ｉｎ−Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、又は抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体である［５７］
から[６１]のいずれか一項に記載の製造方法。
［６４］抗体が、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、又は抗ＣＤ７０
抗体である［５７］から[６１]のいずれか一項に記載の製造方法。
［６５］抗体が、抗Ｂ７−Ｈ３抗体である［５７］から[６１]のいずれか一項に記載の製
造方法。
［６６］［５７］から［６５］のいずれかの製造方法によって得られる抗体−薬物コンジ
ュゲート。
【００４６】
［６７］抗体を還元条件で処理した後に以下の化合物群から選ばれる化合物を反応させる
ことを特徴とする、抗体のヒンジ部のスルフィド結合部分においてチオエーテル結合を形
成させて得られる抗体−薬物コンジュゲート：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O
)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C
(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C
(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
【００４７】
ここで，(maleimid-N-yl)-は、次式
【化３７】
2018188455.tif 000038
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
-(NH-DX)は、次式
【化３８】
2018188455.tif 000039
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００４８】
［６８］抗体を還元条件で処理した後に以下の化合物群から選ばれる化合物を反応させる
ことを特徴とする、抗体のヒンジ部のスルフィド結合部分においてチオエーテル結合を形
成させて得られる抗体−薬物コンジュゲート：
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C
(=O)-(NH-DX)、
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、又は
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
ここで，(maleimid-N-yl)-は、次式
【化３９】
2018188455.tif 000040
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
-(NH-DX)は、次式
【化４０】
2018188455.tif 000041
で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基である。
【００４９】
［６９］選択された１種の薬物−リンカー構造をの１抗体あたりの平均結合数が１から１
０個の範囲である［６７］又は［６８］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［７０］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個
の範囲である［６７］又は［６８］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［７１］選択された１種の薬物−リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個
の範囲である［６７］又は［６８］に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［７２］抗体−薬物コンジュゲートが標的とする細胞が腫瘍細胞である［６７］から[７
１]のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［７３］抗体が、抗Ａ３３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ２０抗体
、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体
、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１
抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗体ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃ
ｉｎ−Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、又は抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体である［６７］
から[７１]のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［７４］抗体が、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、又は抗ＣＤ７０
抗体である［６７］から[７１]のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
［７５］抗体が、抗Ｂ７−Ｈ３抗体である［６７］から[７１]のいずれか一項に記載の抗
体−薬物コンジュゲート。
【００５０】
［７６］リンカーを介して薬物と抗体とが結合された抗体−薬物コンジュゲートを得るた
めの次式で示されるリンカー。
-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-
ここで、L１は抗体への結合部位であり、Lｃは抗腫瘍性化合物への結合部位であり、
式中、
n１は、０から６の整数を示し、
L１は、-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n２-C(=O)-、-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n３-C(=O)-、-C(=
O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-、又は-C(=O)-(CH2)n４-C(=O)-を示し、
ここで、n２は、２から８の整数を示し、n３は、１から８の整数を示し、n４は、１か
ら８の整数を示し、
L２は、-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-、-S-(CH2)n６-C(=O)-、又は単結合を示し、
ここで、n５は、１から６の整数を示し、n６は、１から６の整数を示し、
LＰは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
Lａは、-C(=O)-NH-、-NR１-(CH2)n７-、-O-、又は単結合を示し、
ここで、n７は、１から６の整数を示し、R１は、水素原子、炭素数１から６のアルキル
基、-(CH2)n８-COOH、又は-(CH2)n９-OHを示すが、n８は、整数の１から４を示し、n９は
、１から６の整数を示し、
Lｂは、-CR２(-R３)-、-O-、-NR４-、又は単結合を示し、
ここで、R２及びR３は、各々独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、-(CH2)
nａ-NH2、-(CH2)nｂ-COOH、又は-(CH2)nｃ-OHを示し、R４は、水素原子又は炭素数１から
６のアルキル基を示し、nａは、０から６の整数を示し、nｂは、整数の１から４を示し、
nｃは、整数の１から４を示すが、nａが０であるときは、R２及びR３は同一とはならず、
Lｃは、-CH2-又は-C(=O)-を示し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は次式：
【化４１】
2018188455.tif 000042
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含む
リンカー構造内のメチレン基と結合し、
-(N-ly-3-diminiccuS)-は次式：
【化４２】
2018188455.tif 000043
で示される構造であり、このものの３位でL２と結合し、１位の窒素原子上でこの構造を
含むリンカー構造内のメチレン基と結合し、
cyc.Hex(1,4)は１，４-シクロへキシレン基を示し、
L２が-S-(CH2)n６-C(=O)-のとき、L１は-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-
となる。
【００５１】
［７７］次の群から選ばれる［７６］に記載のリンカー、ただし左端が抗体との結合部位
であり、右端が抗腫瘍性化合物との結合部位である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-N
H-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-N
H-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-
CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-N
H-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-N
H-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C
(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH
2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH
2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
CH2-O-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=
O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O
-CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(
=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=
O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-
C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-C
H2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=
O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-
C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C
H2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C
H2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-C
H2CH2CH2-C(=O)-
［７８］次の群から選ばれる［７６］に記載のリンカー、ただし左端が抗体との結合部位
であり、右端が抗腫瘍性化合物との結合部位である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-N
H-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
［７９］次の群から選ばれる［７６］に記載のリンカー、ただし左端が抗体との結合部位
であり、右端が抗腫瘍性化合物との結合部位である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
［８０］次の群から選ばれる［７６］に記載のリンカーリンカー、ただし左端が抗体との
結合部位であり、右端が抗腫瘍性化合物との結合部位である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-
【発明の効果】
【００５２】
特定の構造のリンカーを介して抗腫瘍性化合物エキサテカンを結合させた抗体−薬物コ
ンジュゲートによって優れた抗腫瘍効果及び安全性を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、Ｂ７−Ｈ３バリアント１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、Ｂ７−Ｈ３バリアント２のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、Ｍ３０−Ｈ１タイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図４】図４は、Ｍ３０−Ｈ２タイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図５】図５は、Ｍ３０−Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図６】図６は、Ｍ３０−Ｈ４タイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図７】図７は、Ｍ３０−Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【図８】図８は、Ｍ３０−Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図９】図９は、Ｍ３０−Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
【図１０】図１０は、Ｍ３０−Ｌ４タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１１】図１１は、Ｍ３０−Ｌ５タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。
【図１２】図１２は、Ｍ３０−Ｌ６タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図１３】図１３は、Ｍ３０−Ｌ７タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図１４】図１４は、Ｍ３０抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図１５】図１５は、Ｍ３０抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
【図１６】図１６は、Ｂ７−Ｈ３バリアント１のヌクレオチド配列（配列番号２６）を示す。
【図１７】図１７は、皮下移植したヒトメラノーマ株Ａ３７５細胞への抗体−薬物コンジュゲート（２）の効果を示す。図中の白ひし形線は無処置の腫瘍、白三角線はＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体、白丸線は抗体−薬物コンジュゲート（２）の効果を示す。
【図１８】図１８は、皮下移植したヒトメラノーマ株Ａ３７５細胞への抗体−薬物コンジュゲート（２）の効果を示す。白ひし形線は無処置の腫瘍、黒四角線は抗体−薬物コンジュゲート（２）０．１ｍｇ／ｋｇ投与時、線−Ｘ−は０．３ｍｇ／ｋｇ投与時、黒三角線は１ｍｇ／ｋｇ投与時、白丸線は３ｍｇ／ｋｇ投与時の効果を示す。
【図１９】図１９は、皮下移植したヒト非小細胞肺癌株Ｃａｌｕ−６細胞への抗体−薬物コンジュゲート（２）の効果を示す。白ひし形線は無処置の腫瘍、白三角線はＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体、白丸線は抗体−薬物コンジュゲート（２）の効果を示す。
【図２０】図２０は、皮下移植したヒトメラノーマ株Ａ３７５細胞胞への抗体−薬物コンジュゲート（１）、（１３）、（４１）、（５５）の効果を示す。図中の白ひし形線は無処置の腫瘍、白丸線は抗体−薬物コンジュゲート（１）、白三角線は抗体−薬物コンジュゲート（１３）、線−X−は抗体−薬物コンジュゲート（４１）、白四角線は抗体−薬物コンジュゲート（５５）の効果を示す。
【図２１】図２１は、皮下移植したヒト非小細胞肺癌株Ｃａｌｕ−６細胞への抗体−薬物コンジュゲート（１３）、（４１）、（５５）の効果を示す。白ひし形線は無処置の腫瘍、白丸線はDE-310、白三角線は抗体−薬物コンジュゲート（１３）、線−Ｘ−は抗体−薬物コンジュゲート（４１）、白四角線は抗体−薬物コンジュゲート（５５）の効果を示す。
【図２２】図２２は、皮下移植したヒトメラノーマ株Ａ３７５細胞への抗体−薬物コンジュゲート（１７）、（１８）、（１９）、（５９）、（６０）、（６１）の効果を示す。図黒ひし形線は無処置の腫瘍、黒四角線は抗体−薬物コンジュゲート（１７）、白四角線は抗体−薬物コンジュゲート（１８）、白丸線は抗体−薬物コンジュゲート（１９）、黒三角線は抗体−薬物コンジュゲート（５９）、白三角線は抗体−薬物コンジュゲート（６０）、線−Ｘ−は抗体−薬物コンジュゲート（６１）の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、抗腫瘍性抗体に、リンカー構造部分を介して抗
腫瘍性化合物を結合させた抗腫瘍性薬物であり、以下に詳細に説明する。
【００５５】
［抗体］
本発明の抗体−薬物コンジュゲートに使用される抗体は、免疫グロブリンを意味し、抗
原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子である。本発明の抗体として、Ig
G、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgYのいずれのクラスでもよいが、IgGが好ましい。また、サ
ブクラスとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2のいずれであってもよいがIgG1
及びIgG2が好ましい。抗体は、いずれの種に由来してもよいが、好ましくは、ヒト、ラッ
ト、マウス及びウサギを例示できる。ヒト以外の種に由来する場合は、周知の技術を用い
て、キメラ化又はヒト化することが好ましい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であ
っても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明の抗体は腫瘍細胞を標的にできる抗体であればよい。すなわち抗腫瘍活性を有す
る薬物をリンカーを介して結合させることから、抗体としては、腫瘍細胞を認識できる特
性、腫瘍細胞に結合できる特性、腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性、さらには腫
瘍細胞を障害する特性の一又はそれ以上の特性を備えていることが好ましい。
抗体の腫瘍細胞への結合性は、フローサイトメトリーを用いて確認できる。腫瘍細胞内
への抗体の取り込みは、（１）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内
に取り込まれた抗体を蛍光顕微鏡で可視化するアッセイ（Cell  Death  and  Differenti
ation  (2008)  15,  751-761）、（２）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用
いて細胞内に取り込まれた蛍光量を測定するアッセイ（Molecular  Biology  of  the  C
ell  Vol.  15,  5268-5282,  December  2004）又は（３）治療抗体に結合するイムノト
キシンを用いて、細胞内に取り込まれると毒素が放出されて細胞増殖が抑制されるという
Mab-ZAPアッセイ（BioTechniques  28:162-165  ,January  2000)を用いて確認できる。
抗体の抗腫瘍活性は、腫瘍細胞への細胞障害活性、殺細胞効果をいうが、ｉｎ  ｖｉｔ
ｒｏでは、細胞の増殖の抑制活性で測定することで確認できる。例えば、抗体の標的蛋白
質を過剰発現している癌細胞株を培養し、培養系に種々の濃度で抗体を添加し、フォーカ
ス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。
Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、例えば、標的蛋白質を高発現している腫瘍細胞株を移植したヌード
マウスに抗体を投与し、癌細胞の変化を測定することによって、抗腫瘍活性を確認できる
。なお、抗体−薬物コンジュゲートは抗腫瘍効果を発揮する薬物を結合させてあるので、
抗体自体に抗腫瘍効果があることは必須ではないが抗腫瘍効果を有することがより好まし
い。抗腫瘍効果の発揮の点からは抗体が内在化して腫瘍細胞内に移行する性質のあること
が、薬物によって腫瘍細胞を特異的・選択的に障害を与える点で重要であり、好ましい。
このような抗体として、抗Ａ３３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ
２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ
７０抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗
ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗体ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅ
ｎａｓｃｉｎ−Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を例示でき
るがこれに限らない。
本発明の抗体として、好ましくは、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ７０抗体
及び抗Ｂ７−Ｈ３抗体であり、さらに好ましくは抗Ｂ７−Ｈ３抗体である。
【００５６】
本発明の抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを
動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる
。抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を
動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト
抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
また、公知の方法（例えば、Kohler  and  Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Ken
net,R.ed.,Monoclonal  Antibodies,p.365-367,Plenum  Press,N.Y.(1980)）に従って、
抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって
ハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
なお、抗原は抗原蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させ
ることによって得ることができる。具体的には、抗原遺伝子を発現可能なベクターを作製
し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現した抗原を精製すればよい。
抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ７０抗体は、それぞれ、ＷＯ２００２／０４
３６６１、米国特許第５，７７３，００１号、ＷＯ２００６／１１３９０９に基づき、公
知の手段によって取得することができる。
【００５７】
本発明において使用されるＢ７−Ｈ３抗体としては、以下の特性を有する抗体が望まし
い。
（１）以下の特性を有することを特徴とする抗体；
（ａ）Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合する
（ｂ）抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）活性を有する
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する
（２）Ｂ７−Ｈ３が配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなる分子である上記（１
）に記載の抗体又は当該抗体。
（３）重鎖における相補性決定領域として配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤ
ＲＨ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号５に記載のア
ミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに軽鎖における相補性決定領域として配列番号６に
記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤ
ＲＬ２及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する上記（１）又は
（２）に記載の抗体。
（４）定常領域がヒト由来定常領域である上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体
。
（５）ヒト化されている上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）（ａ）配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列、（
ｂ）配列番号１０においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列、（ｃ）配
列番号１１においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号
１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列、（ｅ）（ａ）乃至（ｄ
）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（ｆ）（ａ
）乃至（ｄ）の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸
配列からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、並びに（ｇ）配列
番号１３においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列、（ｈ）配列番号１
４においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列、（ｉ）配列番号１５にお
いてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列、（ｊ）配列番号１６においてア
ミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列、（ｋ）配列番号１７においてアミノ酸
番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列、（ｌ）配列番号１８においてアミノ酸番号２
１乃至１２８に記載のアミノ酸配列、（ｍ）配列番号１９においてアミノ酸番号２１乃至
１２８に記載のアミノ酸配列、（ｎ）（ｇ）乃至（ｍ）の配列に対して少なくとも９５％
以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（ｏ）（ｇ）乃至（ｍ）の配列において1又は
数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されたアミ
ノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、を有する上記（５）に記載の抗体。
（７）配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖の可変領域及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配
列からなる軽鎖の可変領域、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のア
ミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至１２
８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号９においてアミノ酸番号２０
乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１５においてアミ
ノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号９にお
いてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列
番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変
領域、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖の可変領域及び配列番号１７においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配
列からなる軽鎖の可変領域、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のア
ミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２
８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号９においてアミノ酸番号２０
乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１９においてアミ
ノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１２に
おいてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配
列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可
変領域、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からな
る重鎖の可変領域及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ
酸配列からなる軽鎖の可変領域、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記
載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１５においてアミノ酸番号２１乃
至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、並びに配列番号１２においてア
ミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１
６においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域か
らなる群から選択される重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を有する上記（６）に記載の
抗体。
（８）配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる
軽鎖、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる
軽鎖、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖及び配列番号１５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる
軽鎖、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる
軽鎖、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖及び配列番号１７においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる
軽鎖、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる
軽鎖、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖及び配列番号１９においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる
軽鎖、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる
重鎖及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からな
る軽鎖、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からな
る重鎖及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列から
なる軽鎖、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列から
なる重鎖及び配列番号１５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列か
らなる軽鎖、並びに配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸
配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ
酸配列からなる軽鎖からなる群から選択される重鎖及び軽鎖からなる上記（６）又は（７
）に記載の抗体。
（９）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１３に記載のアミノ酸
配列からなる軽鎖、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１４に記
載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列
番号１５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる
重鎖及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号９に記載のアミノ酸
配列からなる重鎖及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号９に記
載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配
列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列から
なる軽鎖、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１３に記載のア
ミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号
１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重
鎖及び配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、並びに配列番号１２に記載のア
ミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる群
から選択される重鎖及び軽鎖からなる上記（１４）乃至（１６）のいずれかに記載の抗体
。
（１０）重鎖が配列番号９又は１２に記載のアミノ酸配列においてカルボキシル末端のア
ミノ酸が欠失している重鎖である上記（８）又は（９）に記載の抗体。
（１１）上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド
を含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で
得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られ
る抗体。
（１２）抗体依存性細胞傷害活性を増強させるために糖鎖修飾が調節されている上記（１
）乃至（１１）のいずれかに記載の抗体。
【００５８】
以下に、本発明において使用されるＢ７−Ｈ３抗体について説明する。
本明細書中において、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれる。
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれる。
本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書中において、「Ｂ７−Ｈ３」は、Ｂ７−Ｈ３蛋白質と同じ意味で用いており、
また、Ｂ７−Ｈ３バリアント１及び／又はＢ７−Ｈ３バリアント２を意味する。
本明細書における「ＣＤＲ」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒ
ｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｒｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を意味する。抗体分子の重鎖及び軽鎖には
それぞれ３箇所のＣＤＲがあることが知られている。ＣＤＲは、超可変領域（ｈｙｐｅｒ
ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあっ
て、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造
上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体のＣＤＲにつ
いて、重鎖のＣＤＲを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、Ｃ
ＤＲＨ３と表記し、軽鎖のＣＤＲを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、Ｃ
ＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合す
る抗原に対する特異性を決定している。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハ
イブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを
固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼ
ーションを行った後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ  
ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することによ
って同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００５９】
１．Ｂ７−Ｈ３
Ｂ７−Ｈ３は、抗原提示細胞に補助刺激分子として発現するＢ７ファミリーのひとつで
あり、Ｔ細胞上のレセプターに作用して免疫作用を促進又は抑制すると考えられている。
Ｂ７−Ｈ３は１回膜貫通構造を有する蛋白質であるが、Ｂ７−Ｈ３のＮ末端側の細胞外
領域には２つのバリアントが存在する。Ｂ７−Ｈ３バリアント１（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３）
には各２ヶ所のＶ又はＣ様Ｉｇドメインが存在し、Ｂ７−Ｈ３バリアント２（２Ｉｇ−Ｂ
７−Ｈ３）には各１ヶ所のＶ又はＣ様Ｉｇドメインが存在する。
本発明で用いるＢ７−Ｈ３は、ヒト、非ヒト哺乳動物（ラット、マウス等）のＢ７−Ｈ
３発現細胞から直接精製して使用するか、あるいは当該細胞の細胞膜画分を調製して使用
することができ、また、Ｂ７−Ｈ３をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操
作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体
的には、Ｂ７−Ｈ３  ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要
な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は
真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＢ７−Ｈ３を発現させることによって
、該蛋白質を得ることが出来る。
ヒトＢ７−Ｈ３バリアント１遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のアミ
ノ酸配列は配列表の配列番号１に記載されている。また、配列番号１の配列は図１に記載
されている。
ヒトＢ７−Ｈ３バリアント２遺伝子のＯＲＦのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に記
載されている。また、配列番号２の配列は図２に記載されている。
また、上記各Ｂ７−Ｈ３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失
及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、当該蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白
質もＢ７−Ｈ３に含まれる。
シグナル配列が除かれた成熟ヒトＢ７−Ｈ３バリアント１は、配列番号１に示されるア
ミノ酸配列の２７番目から５３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。
また、シグナル配列が除かれた成熟ヒトＢ７−Ｈ３バリアント２は、配列番号２に示され
るアミノ酸配列の２７番目から３１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当す
る。
【００６０】
２．抗Ｂ７−Ｈ３抗体の製造
本発明のＢ７−Ｈ３に対する抗体は、常法を用いて、Ｂ７−Ｈ３又はＢ７−Ｈ３のアミ
ノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を
採取、精製することによって得ることができる。抗原となるＢ７−Ｈ３の生物種はヒトに
限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＢ７−Ｈ３を動物に免疫する
こともできる。この場合には、取得された異種Ｂ７−Ｈ３に結合する抗体とヒトＢ７−Ｈ
３との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ
（１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５−３６７，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．
Ｙ．（１９８０））に従って、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得
ることもできる。
なお、抗原となるＢ７−Ｈ３はＢ７−Ｈ３遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に発現
させることによって得ることができる。
具体的には、Ｂ７−Ｈ３遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入
して該遺伝子を発現させ、発現したＢ７−Ｈ３を精製すればよい。以下、具体的にＢ７−
Ｈ３に対する抗体の取得方法を説明する。
【００６１】
（１）  抗原の調製
抗Ｂ７−Ｈ３抗体を作製するための抗原としては、Ｂ７−Ｈ３又はその少なくとも６個
の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配
列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
Ｂ７−Ｈ３は、ヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ
、また、Ｂ７−Ｈ３をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作によって宿主
細胞に産生させることによって得ることができる。
遺伝子操作では、具体的には、Ｂ７−Ｈ３のｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込ん
だ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、ある
いは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＢ７−Ｈ３を
発現させることによって、抗原を得ることができる。
また、膜蛋白質であるＢ７−Ｈ３の細胞外領域と抗体の定常領域とを連結した融合蛋白
質を適切な宿主・ベクター系において発現させることによって、分泌蛋白質として抗原を
得ることも可能である。
Ｂ７−Ｈ３のｃＤＮＡは例えば、Ｂ７−Ｈ３のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブ
ラリーを鋳型として、Ｂ７−Ｈ３  ｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐ．４８７−４８９  参照）を行なう、いわゆるＰＣ
Ｒ法によって取得することができる。
ポリペプチドのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成としては、例えばロシュ・ダイ
アグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）を挙げること
ができるが、これに限定されない。
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を挙げることができる。目的の遺伝子を
これらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわ
ち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。
また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することが
できる配列を有するものが好ましい。
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞とし
ては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１
）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ
３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（Ｃ
ＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ
．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（
１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定さ
れない。
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養によ
って細胞内、又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを
適宜選択でき、大腸菌であれば、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗
生物質やＩＰＭＧを添加して用いることができる。
上記培養によって、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋
白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法によって分離・精製
することができる。
該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子
ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、透析
法、これらの組合せ等を例示できる。
また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンタグを繋げることによって
、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。あるいは、発現させ
る組換え蛋白質にＩｇＧのＦｃ領域を繋げることによって、プロテインＡカラムで効率的
に精製することができる。
上記方法を組合せることによって容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大
量に製造できる。
【００６２】
（２）  抗Ｂ７−Ｈ３モノクローナル抗体の製造
Ｂ７−Ｈ３と特異的に結合する抗体の例として、Ｂ７−Ｈ３と特異的に結合するモノク
ローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。
すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することによって免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定し
て脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培
養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の
検討、あるいは標識試薬としての特性の検定
等である。
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法は
これに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもで
きる。
【００６３】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したＢ７−Ｈ３又はその一部を使用すること
ができる。
また、Ｂ７−Ｈ３発現組換え体細胞よって調製した膜画分、又はＢ７−Ｈ３発現組換え
体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分
ペプチドを抗原として使用することもできる。
【００６４】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミ
ョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知の
ハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、
例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、
摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又
はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
また、実際に使用するマウス及びラットの系統には特に制限はなく、マウスの場合には
、例えば各系統Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ
５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ
ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、例えば、Ｗｉｓ
ｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｇｕｅ、Ｄａｗｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃ
ｈｅｒ等を用いることができる。
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ−ルスリバー、等実験動物飼
育販売業者より入手することができる。
このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／
ｃ系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。
また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下さ
せたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに好
ましくは６〜８週齢である。
Ｂ７−Ｈ３又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ
．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏ
ｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ
．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｃ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ
（１９６４）等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。
これらの免疫法のうち、本発明において好適な方法を具体的に示せば、例えば以下のと
おりである。
すなわち、まず、抗原である膜蛋白質画分、もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮
内又は腹腔内に投与する。
ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後
半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。
抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等によって異なるが、一般には
、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましく、投与回数３〜４回、投与間隔
２〜４週間がさらに好ましい。
また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等によって異なるが、一般には０．０５〜
５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ程度とする。
追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１〜６週間後、好ましくは２〜４週間後、さらに
好ましくは２〜３週間後に行う。
なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等によって異なるが、一
般に、例えばマウスの場合には０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ、さら
に好ましくは０．１〜０．２ｍｇ程度とする。
上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後
に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。その際
に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば
、以後の操作の効率を高めることができる。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法を挙げ
ることができるがこれらの方法に制限されない。
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような
手順によって行うことができる。
まず、精製又は部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着さ
せ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アル
ブミン（以下「ＢＳＡ」という）によって覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希
釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させる。
さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結
合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定
することによって、抗体価を算出する。
被免疫動物の脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば
、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５，；Ｋｏ
ｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１，
；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０，
；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５）に従って行うことがで
きる。例えば、脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過し
た後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法
を採用することができる。
【００６５】
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜選択し
て用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考
慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎ
ｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが
好ましい。
すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、
Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、
ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ
）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１
．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴ
Ｇ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２
）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例
えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣ
Ｃ）等から入手することができる。
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培
地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下
「ＦＢＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダル
ベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕ
ｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培
養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％  ＦＣＳを含むＡＳＦ１
０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確
保しておく。
【００６６】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ
．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，
Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ  Ｔｈｏ
ｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）
等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができ
る。
そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体
産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等
を用いることができる。このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである
。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量
１５００〜６０００、好ましくは２０００〜４０００のポリエチレングリコール溶液中で
、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１
〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。
【００６７】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合によって得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ
．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。
この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用い
てハイブリドーマを得る場合に有効である。
すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することによって、アミ
ノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増
殖させることができる。
【００６８】
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース
法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる（例えばＢａｒｂａｒａ，  Ｂ．Ｍ
．ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎ
ｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）。これらの方法のうち、特にメチル
セルロース法等の三次元培養法が好適である。例えば、細胞融合によって形成されたハイ
ブリドーマ群をＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｄ（Ｓ
ｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＃０３８０４）等のメチルセルロース
培地に懸濁して培養し、形成されたハイブリドーマコロニーを回収することでモノクロー
ンハイブリドーマの取得が可能である。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、
得られたハイブリドーマ培養上清中に安定して抗体価の認められたものをＢ７−Ｈ３モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００６９】
このようにして樹立されたハイブリドーマ株の例としては、Ｂ７−Ｈ３ハイブリドーマ
Ｍ３０を挙げることができる。なお、本明細書中においては、Ｂ７−Ｈ３ハイブリドーマ
Ｍ３０が産生する抗体を、「Ｍ３０抗体」又は単に「Ｍ３０」と記載する。
Ｍ３０抗体の重鎖は、配列表の配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する。また、
Ｍ３０抗体の軽鎖は、配列表の配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する。なお、配
列表の配列番号２０に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基か
らなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４１番目のアミノ酸残基からなる
アミノ酸配列は可変領域であり、１４２乃至４７１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸
配列は定常領域である。また、配列表の配列番号２１に示される軽鎖アミノ酸配列中で、
１乃至２２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２３乃至１
３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１３１乃至２３５番目
のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。
【００７０】
（ｇ）ハイブリドーマの培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することによって、モノクロ
ーナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
本発明における抗体価の測定は、例えば上記（ｂ）の項目で説明したＥＬＩＳＡ法によ
って行うことができる。
以上の方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は−８０℃以下の冷凍庫中に
凍結状態で保存することができる。
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養
される。
大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大
量培養における上清から、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することによっ
て、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの
腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることによって、本発明
のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ
）（プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。
例えば、ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞
を不活性化した後、２０日後に１０６〜１０７個のハイブリドーマ・クローン細胞を、血
清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹
水がたまったところでマウスより腹水を採取する。この方法によって、培養液中に比べて
約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
上記方法によって得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．：Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，
ＩＩＩ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘ
ｆｏｒｄ（１９７８）に記載されている方法で精製することができる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、Ｂ７−Ｈ３に対して高い抗原特異性を有する
。
【００７１】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のよ
うに行うことができる。
まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、
又はＲＩＡ法を挙げることができる。
オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操
作が必要である。
一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と
反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対
応する抗体を用いることによって、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同
定することが可能である。
また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキッ
ト；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１
．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法によって行うこ
とができる。
さらに、（２）の（ａ）乃至（ｈ）の工程を再度実施して別途に独立してモノクローナ
ル抗体を取得した場合においても、Ｍ３０抗体と同等の細胞傷害活性を有する抗体を取得
することが可能である。このような抗体の一例として、Ｍ３０抗体と同一のエピトープに
結合する抗体を挙げることができる。Ｍ３０はＢ７−Ｈ３の細胞外領域中のドメインであ
るＩｇＣ１ドメイン又はＩｇＣ２ドメインにおけるエピトープを認識して、ＩｇＣ１ドメ
イン若しくはＩｇＣ２ドメイン又は両者に結合するので、特に当該エピトープとしてはＢ
７−Ｈ３のＩｇＣ１ドメイン又はＩｇＣ２ドメインに存在するエピトープを挙げることが
できる。新たに作製されたモノクローナル抗体が、Ｍ３０抗体の結合する部分ペプチド又
は部分立体構造に結合すれば、該モノクローナル抗体がＭ３０抗体と同一のエピトープに
結合すると判定することができる。また、Ｍ３０抗体のＢ７−Ｈ３に対する結合に対して
該モノクローナル抗体が競合する（即ち、該モノクローナル抗体が、Ｍ３０抗体とＢ７−
Ｈ３の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造
が決定されていなくても、該モノクローナル抗体がＭ３０抗体と同一のエピトープに結合
すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該モノク
ローナル抗体がＭ３０抗体と同等の細胞傷害活性を有していることが強く期待される。
【００７２】
（３）  その他の抗体
本発明の抗体には、上記Ｂ７−Ｈ３に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する
異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例え
ば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体等
も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウ
ス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げるこ
とができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−
６８５５，（１９８４）参照）。
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲ
の配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開
パンフレットＷＯ９０／０７８６１）を挙げることができる。
但し、Ｍ３０抗体由来のヒト化抗体としては、Ｍ３０抗体の６種全てのＣＤＲ配列を保
持し、抗腫瘍活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されない。なお、Ｍ３０抗体の
重鎖可変領域は、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＮＹ
ＶＭＨ）、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＹＩＮＰＹＮＤＤＶ
ＫＹＮＥＫＦＫＧ）、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＷＧ
ＹＹＧＳＰＬＹＹＦＤＹ）を保有している。また、Ｍ３０抗体の軽鎖可変領域は、配列表
の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＲＡＳＳＲＬＩＹＭＨ）、配
列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ）、及び配列番号
８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＷＮＳＮＰＰＴ）を保有している。
【００７３】
マウス抗体Ｍ３０のヒト化抗体の実例としては、（１）配列表の配列番号９、１０、１
１又は１２の２０乃至１４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（２）上記（１
）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（
３）上記（１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加され
たアミノ酸配列のいずれか一つからなる重鎖可変領域を含む重鎖、並びに（４）配列番号
１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基から
なるアミノ酸配列、（５）上記（４）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相
同性を有するアミノ酸配列、及び（６）上記（４）のアミノ酸配列において１又は数個の
アミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる軽鎖可変領域
を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
なお、本明細書中における「数個」とは、１乃至１０個、１乃至９個、１乃至８個、１
乃至７個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、又は１若しくは２個を意
味する。
【００７４】
また、本明細書中におけるアミノ酸の置換としては保存的アミノ酸置換が好ましい。保
存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換であ
る。好適なアミノ酸グループは、以下のとおりである：酸性グループ＝アスパギン酸、グ
ルタミン酸；塩基性グループ＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、ト
リプトファン；及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、シス
テイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりであ
る：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラ
ギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；
並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかるアミノ
酸置換は元のアミノ酸配列を有する物質の特性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
上記重鎖及び軽鎖の好適な組合せの抗体としては、配列番号９においてアミノ酸番号２
０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１３
においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有す
る軽鎖からなる抗体、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸
配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至
１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号
９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有
する重鎖及び配列番号１５においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列か
らなる軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃
至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１６にお
いてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽
鎖からなる抗体、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列
からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１７においてアミノ酸番号２１乃至１２
８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号９に
おいてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する
重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からな
る軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至１
４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１９において
アミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖か
らなる抗体、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列か
らなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至１２８
に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１２に
おいてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する
重鎖及び配列番号１４においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からな
る軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至
１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１５におい
てアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖
からなる抗体、並びに配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ
酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃
至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体を挙げる
ことができる。
【００７５】
さらに好適な組合せの抗体としては、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１
に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１３においてアミノ酸番号２１乃至２３
３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号９においてアミノ酸番号２
０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１４においてアミノ酸番号
２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号９においてア
ミノ酸番号２０乃至４７１に記載目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１５におい
てアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番
号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番
号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる
抗体、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載目のアミノ酸配列からなる
重鎖及び配列番号１７においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からな
る軽鎖からなる抗体、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸
配列からなる重鎖及び配列番号１８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ
酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記
載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１９においてアミノ酸番号２１乃至２３３に
記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１２においてアミノ酸番号２０
乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１３においてアミノ酸番号２
１乃至２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１２においてアミ
ノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１４においてア
ミノ酸番号２１乃至２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１２
においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１
５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体
、並びに配列番号１２においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からな
る重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列から
なる軽鎖からなる抗体。
【００７６】
また、別の好適な組合せとしては、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び
配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号９に記載のアミ
ノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体
、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１５に記載のアミノ酸配列
からなる軽鎖からなる抗体、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号
１６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号９に記載のアミノ酸配列
からなる重鎖及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番
号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる
軽鎖からなる抗体、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１９に記
載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からな
る重鎖及び配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号１２
に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
からなる抗体、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１５に記載
のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、並びに配列番号１２に記載のアミノ酸配列か
らなる重鎖及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げるこ
とができる。
【００７７】
上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い相同性を示す配列を組み合わせる
ことによって、上記の各抗体と同等の細胞傷害性活性を有する抗体を選択することが可能
である。このような相同性は、一般的には８０％以上の相同性であり、好ましくは９０％
以上の相同性であり、より好ましくは９５％以上の相同性であり、最も好ましくは９９％
以上の相同性である。また、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が
置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と
同等の細胞傷害性活性を有する抗体を選択することが可能である。
【００７８】
二種類のアミノ酸配列間の相同性は、Ｂｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｖｅｒｓｉｏ
ｎ  ２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａ
ｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ，  Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ
，  Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．
Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ
：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅ
ａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９
−３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。
Ｂｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、インターネットでwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastにア
クセスすることによっても使用することができる。
【００７９】
なお、配列表の配列番号９、１０、１１又は１２に示される重鎖アミノ酸配列中で、１
乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４
１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４２乃至４７１番目の
アミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号９の配列は図３に、配列
番号１０の配列は図４に、配列番号１１の配列は図５に、配列番号１２の配列は図６に各
々記載されている。
また、配列表の配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９に示される軽鎖
アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列
であり、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１
２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号１
３の配列は図７に、配列番号１４の配列は図８に、配列番号１５の配列は図９に、配列番
号１６の配列は図１０に、配列番号１７の配列は図１１に、配列番号１８の配列は図１２
に、配列番号１９の配列は図１３に各々記載されている。
【００８０】
本発明の抗体としては、さらに、Ｍ３０抗体と同一のエピトープに結合する、ヒト抗体
を挙げることができる。抗Ｂ７−Ｈ３ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列
のみを有するヒト抗体を意味する。抗Ｂ７−Ｈ３ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺
伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ
，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−
１４３，；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９
９８）２６，ｐ．３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａ
ｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅ
ｃｔｓ  ｖｏｌ．１０，ｐ．６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ
．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７等を参照。）によっ
て取得することができる。
【００８１】
このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の
遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクター等を介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺
伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動
物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることによって作り出すことができる。
また、遺伝子組換え技術によって、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコード
するｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターによって真核細胞を形質転換し、遺
伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することによって、こ
の抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ
等の哺乳動物細胞を用いることができる。
【００８２】
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得
する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏ
ｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７
），ｐ．２３０１−２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  
ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２０
０２），１（２），ｐ．１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７−４３１等参照。）
も知られている。
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させ
て、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）を用いる
ことができる。
抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結
合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクタ
ーを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによってヒト抗体を取得することがで
きる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３
／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３−４５５、Ｎａｔｕｒ
ｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１１６）。
新たに作製されたヒト抗体が、Ｍ３０抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に
結合すれば、該ヒト抗体がＭ３０抗体と同一のエピトープに結合すると判定することがで
きる。また、Ｍ３０抗体のＢ７−Ｈ３に対する結合に対して該ヒト抗体が競合する（すな
わち、該ヒト抗体が、Ｍ３０抗体とＢ７−Ｈ３の結合を妨げる）ことを確認することによ
って、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該ヒト抗体がＭ３０
抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であるこ
とが確認された場合、該ヒト抗体がＭ３０抗体と同等の細胞傷害活性を有していることが
強く期待される。
以上の方法によって得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体は、公知の方法等
によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。
【００８３】
抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができ
る。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性のよい指標となる熱
変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる装置である。ＤＳＣを用い
てＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することがで
きる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており
（Ｌｏｒｉ  Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５−２７３）
、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指
標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いこ
とを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限ら
ないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗
体を選抜する必要がある。
【００８４】
本発明の抗体には抗体の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明の抗体に化学的又
は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格へ
の化学部分の結合、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学
的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ−結合又はＯ−結合への糖鎖付加、Ｎ末又はＣ
末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）された
もの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによってＮ末にメチオニン残基が付加し
たもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標
識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の
意味に含まれる。このような本発明の抗体の修飾物は、元の本発明の抗体の安定性及び血
中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
【００８５】
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコー
ス化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修
飾の調節技術としては、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１
１４０等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体には当該糖
鎖修飾を調節された抗体も含まれる。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な
宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては
、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする
遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖
配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり
、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることが
できる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇ
ｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ
−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）や
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ
葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）
を挙げることができる。
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換によって導入し、形質転換された細胞
をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによって抗体が得られる。当該培養においては抗体の
配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に
医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には
、上記形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的
の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造
方法によって得られる抗体も含まれる。
【００８６】
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失
することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，
７０５：１２９−１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン
、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基が
アミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，３６０：７５−８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗
体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用等）には
影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の機能性断片
も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及び
アミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化さ
れた重鎖）等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれて
いる限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定され
ない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群か
ら選択される重鎖のいずれか一種であってもよいし、いずれか二種を組み合わせたもので
あってもよい。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び
培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカ
ルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
【００８７】
本発明の抗体のアイソタイプとしては、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３
、ＩｇＧ４）等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２を挙げること
ができる。
【００８８】
抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活
性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び補体依存性細胞傷害（ＣＤ
Ｃ）活性を挙げることができるが、本発明に係る抗体が有する機能は、Ｂ７−Ｈ３に対す
る結合活性であり、好ましくは抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）活性であり、より
好ましくは腫瘍細胞に対するＡＤＣＰ活性を介した細胞傷害活性（抗腫瘍活性）である。
更に、本発明の抗体は、ＡＤＣＰ活性に加えて、ＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性を併
せ持っていてもよい。
【００８９】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質
で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、
フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電
点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒ
ａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ
，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉ
ｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８
８））が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用
いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プ
ロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとし
て、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を
挙げることができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも
可能である。
【００９０】
［抗腫瘍性化合物］
本発明の抗体−薬物コンジュゲートに結合される抗腫瘍性化合物について述べる。抗腫
瘍性化合物としては、抗腫瘍効果を有する化合物であって、リンカー構造に結合できる置
換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗腫瘍性化合物は、リンカーの一
部又は全部が腫瘍細胞内で切断されて抗腫瘍性化合物部分が遊離されて抗腫瘍効果が発現
される。リンカーが薬物との結合部分で切断されれば抗腫瘍性化合物が本来の構造で遊離
され、その本来の抗腫瘍効果が発揮される。
抗腫瘍性化合物としては、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン
Ｃ、ブレオマイシン、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセ
ート、白金系抗腫瘍剤（シスプラチン若しくはその誘導体）、タキソール若しくはその誘
導体、カンプトテシン若しくはその誘導体（特開平6-87746号公報に記載された抗腫瘍剤
）等を挙げることができる。本発明の抗体−薬物コンジュゲートにおいては、カンプトテ
シン誘導体であるエキサテカン（(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-
9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノ
リン-10,13(9H,15H)-ジオン；次式：）
【００９１】
【化４３】
2018188455.tif 000044
【００９２】
を好適に使用することができる。このエキサテカンは、優れた抗腫瘍活性を有しているも
のの、抗腫瘍薬として市販されるには至っていない。同化合物は、公知の方法で容易に取
得でき、１位のアミノ基をリンカー構造への結合部位として好適に使用することができる
。また、エキサテカンはリンカーの一部が結合した状態で腫瘍細胞内で遊離される場合も
あるが、この様な状態でも優れた抗腫瘍効果が発揮される優れた化合物である。
抗体−薬物コンジュゲートにおいて、抗体１分子への薬物の結合数は、その有効性、安
全性に影響する重要因子である。抗体−薬物コンジュゲートの製造は、薬物の結合数が一
定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが
、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られる
のが通常である。抗体１分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数とし
て特定され、表記される。本発明でも原則として断りのない限り、すなわち、異なる薬物
結合数をもつ抗体−薬物コンジュゲート混合物に含まれる特定の薬物結合数をもつ抗体−
薬物コンジュゲートを示す場合を除き、薬物の結合数は平均値を意味する。抗体分子への
エキサテカンの結合数はコントロール可能であり、１抗体あたりの薬物平均結合数として
、１から１０個程度のエキサテカンを結合させることができるが、好ましくは２から８個
であり、より好ましくは３から８個である。なお、当業者であれば本願の実施例の記載か
ら抗体に必要な数の薬物を結合させる反応を設計することができ、エキサテカンの結合数
をコントロールした抗体を取得することができる。
エキサテカンはカンプトテシン構造を有するので、酸性水性媒体中（例えばpH3程度）
ではラクトン環が形成された構造（閉環体）に平衡が偏り、一方、塩基性水性媒体中（例
えばpH10程度）ではラクトン環が開環した構造（開環体）に平衡が偏ることが知られてい
る。このような閉環構造及び開環構造に対応するエキサテカン残基を導入した薬物コンジ
ュゲートであっても同等の抗腫瘍効果が期待され、いずれのものも本発明の範囲に包含さ
れることはいうまでもない。
【００９３】
［リンカー構造］
本発明の抗体−薬物コンジュゲートにおいて抗腫瘍性薬物を抗体に結合するリンカー構
造について述べる。当該リンカーは、次式：
-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-
の構造を有しており、抗体はL１の末端、L２が結合するのとは反対側の末端、で結合し、
抗腫瘍性薬物はLｃの末端、Lｂが結合するのとは反対側の末端で結合する。
n１は、０から６の整数を示すが、好ましくは１から５の整数であり、より好ましくは
１から３である。
【００９４】
１．L１
L１は、
-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n2-C(=O)-、
-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-、
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-、又は
-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-
の各構造で示される構造のリンカーである。ここで、n２は、２から８の整数であり、n３
は、１から８の整数であり、n４は、１から８の整数である。
【００９５】
リンカーL１のうちの-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n２-C(=O)-で示される構造のリンカ
ーにおいて、『-(Succinimid-3-yl-N)-』は、次式
【００９６】
【化４４】
2018188455.tif 000045
【００９７】
で示される構造を有する。この部分構造における３位が抗体への結合部位である。さらに
この３位での抗体との結合は、チオエーテルを形成して結合することが特徴である。一方
、この構造部分の１位の窒素原子は、この構造が含まれるリンカー内に存在するメチレン
の炭素原子と結合する。すなわち-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n2-C(=O)-L2-は次式で示さ
れる構造である（ここで、「抗体−Ｓ−」は抗体由来である。）。
【００９８】
【化４５】
2018188455.tif 000046
【００９９】
式中、n２は、２から８の整数であるが、好ましくは２から５である。
【０１００】
L１のうちの-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n３-C(=O)-で示される構造のリンカーにおいて、n３
は１から８の整数であるが、好ましくは２から６である。このリンカーは、抗体とは末端
のメチレンの炭素原子上で結合するが、先と同様にチオエーテルを形成して結合する次の
構造を有する（ここで、「抗体−Ｓ−」は抗体由来である。）：
抗体-S-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n３-C(=O)-L２-。
【０１０１】
L１のうちの-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-で示される構造のリンカ
ーであるが、ここで『-(N-ly-3-diminiccuS)-』は次式：
【０１０２】
【化４６】
2018188455.tif 000047
【０１０３】
で示される構造を有する。この構造部分において、１位の窒素原子は同構造を含むリンカ
ー内に存在するメチレン炭素原子と結合する。３位の炭素原子は、リンカーL2のうちの-S
-(CH2)n６-C(=O)-と、その末端の硫黄原子において結合する。なお、このL2のリンカーで
ある-S-(CH2)n６-C(=O)-は、L１リンカーのうちの-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-dim
iniccuS)-とのみ組み合わされたリンカー構造を形成する。ここで、リンカーに含まれる
『-cyc.Hex(1,4)-』は、１，４−シクロヘキサレン基を示す。リンカー-C(=O)-cyc.Hex(1
,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-は抗体とは末端のカルボニル炭素でアミド結合を形成して
結合する（次式；ここで、「抗体−ＮＨ−」は抗体由来である。）。
【０１０４】
【化４７】
2018188455.tif 000048
【０１０５】
このアミド結合を形成する抗体のアミノ基としては抗体のリシン残基の側鎖の末端のア
ミノ基、あるいは抗体Ｎ末端のアミノ基であればよい。なお、当該構造のリンカーはアミ
ド結合のほか、抗体のアミノ酸の水酸基とエステル結合を形成して結合することもできる
。
また、当該リンカーに含まれる『-cyc.Hex(1,4)-』構造部分であるが、１，４−シクロ
ヘキサレン基の他、これ以外の２価の飽和環状アルキレン基である、シクロブチレン基、
シクロペンチレン基、シクロヘプタレン基、シクロオクタレン基等の２価の環状飽和炭化
水素基であってもよく、フェニレン基、ナフチレン基等の、２価の芳香族炭化水素基であ
ってもよく、また、５員環、６員環の飽和、部分飽和、あるいは芳香族である、１又は２
の複素原子を含む２価の複素環基であってもよい。さらには、炭素数１から４の２価のア
ルキレン基であってもよい。なお、２価基への結合は、隣接した位置であっても離れた位
置であってもいずれでもよい。
【０１０６】
リンカーL１のうちの-C(=O)-(CH2)n４-C(=O)-で示される構造のリンカーにおいて、n４
は１から８の整数であるが、好ましくは２から６である。このリンカーも、上記のリンカ
ーと同様に、末端のカルボニル基において抗体のアミノ基とアミド結合を形成して結合す
る（次式；当該構造において「抗体−ＮＨ−」は抗体由来である。）。
抗体-NH-C(=O)-(CH2)n４-C(=O)-L２-。
【０１０７】
リンカーL１の具体例としては、
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2C(=O)NH-CH2-C(=O)-、
-CH2C(=O)NH-CH2CH2-C(=O)-
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-
-C(=O)-Aryl-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-
-C(=O)-cyc.Het-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
等を挙げることができる（Arylは２価の芳香族炭化水素基、cyc.Hetは２価の環状複素環
基を示す。）。
【０１０８】
２．L２
リンカーL２は、
-NH-(CH2CH2O)n５-CH2-CH2-C(=O)-、又は
-S-(CH2)n６-C(=O)-、
で示される構造のリンカーであるが、リンカーL２は存在しなくともよく、この場合L２は
単結合となる。また、n５は、１から６の整数であり、n６は、１から６の整数である。
【０１０９】
リンカーL２のうちの、-NH-(CH2CH2O)n５-CH2-CH2-C(=O)-で示される構造のリンカーに
おいて、n５は、１から６の整数であるが、好ましくは２から４である。当該リンカーは
末端のアミノ基でリンカーL１に結合し、反対の末端のカルボニル基でリンカーLＰと結合
する。
【０１１０】
リンカーL２のうちの、-S-(CH2)n６-C(=O)-において、n６は、１から６の整数であるが
、好ましくは２から４である。
【０１１１】
リンカーL２の具体例としては、
-NH-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-、
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-、
等を挙げることができる。
【０１１２】
さらにリンカーL２が-S-(CH2)n６-C(=O)-の場合、組み合わさるリンカーL１は、-C(=O)
-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-であるので、-L１-L２-リンカーの具体例とし
ては、
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
等を挙げることができる。
【０１１３】
３．LＰ
リンカーLＰは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である。すなわち、
２から６個のアミノ酸がペプチド結合したオリゴペプチドの残基によって構成される。リ
ンカーLＰは、Ｎ末端においてリンカーL２に結合し、Ｃ末端においてリンカーの-NH-(CH2
)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-部分のアミノ基に結合する。リンカーLＰを構成するアミノ酸は特に限
定されることはないが、例えば、L-又はD-アミノ酸であり、好ましくはL-アミノ酸である
。また、α−アミノ酸の他、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸、γ−アミノ酪酸等の
構造のアミノ酸であってもよく，さらには例えばＮ−メチル化されたアミノ酸等の非天然
型のアミノ酸であってもよい。
【０１１４】
リンカーLＰのアミノ酸配列は、特に限定されないが、構成するアミノ酸として、フェ
ニルアラニン（Phe；F）、チロシン（Tyr；Y）、ロイシン（Leu；L），グリシン（Gly；G
）、アラニン（Ala；A）、バリン（Val；V）、リシン（Lys；K）、シトルリン（Cit）、
セリン（Ser；S）、グルタミン酸（Glu；E）、アスパラギン酸（Asp；D）等を挙げること
ができる。これ等のうちで好ましくは、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、
シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸を挙げることができる。アミノ酸の
種類によって、薬物遊離のパターンをコントロールすることができる。アミノ酸の数は、
２から７個でよい。
【０１１５】
リンカーLＰの具体例として、
-GGF-
-DGGF-
-(D-)D-GGF-
-EGGF-
-GGFG-
-SGGF-
-KGGF-
-DGGFG-
-GGFGG-
-DDGGFG-
-KDGGFG-
-GGFGGGF-
を挙げることができる［上記の『(D-)D』はＤ−アスパラギン酸を意味する］。本発明抗
体−薬物コンジュゲートの特に好ましいリンカーLＰとして、-GGFG-を挙げることができ
る。
【０１１６】
リンカーの-NH-(CH2)n１-で示される構造部分であるが、n１は、０から６の整数である
が、好ましくは１から５の整数であり、より好ましくは１から３である。この部分のアミ
ノ基部分がリンカーLＰのＣ末端に結合する。
【０１１７】
４．Lａ
リンカーのLａは、-C(=O)-NH-、-NR１-(CH2)n７-、-O-の各構造のいずれかであるか、
又は単結合であるが、n７は、１から６の整数であり、R１は、水素原子、炭素数１から６
のアルキル基、-(CH2)n８-COOH、又は-(CH2)n９-OHであり、n８は、整数の１から４であ
り、n９は、１から６の整数である。
リンカーのLａのうちのアミド構造である-C(=O)-NH-は、窒素原子側がLｂに結合する。
リンカーのLａのうちの-NR１-(CH2)n７-である構造部分において、n７は、１から６の整
数であり、好ましくは１から３である。当該部分はメチレン側がLｂに結合する。R１は、
水素原子又は炭素数１から６のアルキル基であるが、炭素数１から６のアルキル基の場合
は、直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル
基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基
、ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロ
ピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、
２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３,３−ジメチルブチル基、２,２−ジメ
チルブチル基、１,１−ジメチルブチル基、１,２−ジメチルブチル基、１,３−ジメチル
ブチル基、２,３−ジメチルブチル基及び２−エチルブチル基等を挙げることができる。
これ等のうちで好ましくは、メチル基又はエチル基である。R１が、-(CH2)n８-COOHで示
される構造のとき、n８は、整数の１から４であるが、好ましくは１又は２である。R１が
、-(CH2)n９-OHで示される構造のとき、n９は、１から６の整数であるが、好ましくは１
又は２である。R１としては、水素原子、メチル基、エチル基、-CH2COOH、-CH2CH2-COOH
、又は-CH2CH2-OHが好ましく、より好ましくは、水素原子、メチル基、-CH2COOHである。
さらに好ましくは水素原子である。なお、リンカーのLａ部分は-O-、又は単結合であって
もよい。
【０１１８】
５．Lｂ
リンカーのLｂは、-CR２(-R３)-、-O-、-NR４-の各構造のいずれかであるか、又は単結
合であり、R２及びR３は、各々独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、-(CH2)
nａ-NH2、-(CH2)nｂ-COOH、又は-(CH2)nｃ-OHであり、R４は、水素原子又は炭素数１から
６のアルキル基であり、nａは、０から６の整数であり、nｂは、整数の１から４であり、
nｃは、整数の０から４であるが、nａ又はnｃが０であるときは、R２及びR３は同一とは
ならない。
R２及びR３がアルキル基であるとき、このアルキル基はR１におけるアルキル基と同様
に解釈されるアルキル基である。R２及びR３が-(CH2)nａ-NH2の構造であるとき、nａは、
０から６の整数であるが、好ましくは０であるか、あるいは３から５である。なお、nａ
が０であるときはR２及びR３は同一にはならない。R２及びR３が-(CH2)nｂ-COOHの構造で
あるとき、nｂは、整数の１から４であるが、好ましくは１又は２である。R２及びR３が-
(CH2)nｃ-OHの構造であるとき、nｃは、整数の０から４であるが、好ましくは１又は２で
ある。
R２及びR３として好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基、-NH2、-CH2CH2CH2NH2
、-CH2CH2CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2、-CH2COOH、-CH2CH2-COOH、-CH2OH、又は
-CH2CH2-OHが好ましく、より好ましくは、水素原子、メチル基、-NH2、-CH2CH2CH2CH2NH2
、-CH2COOH、-CH2CH2-COOH、-CH2OH、又は-CH2CH2-OHである。さらに好ましくは水素原子
である。
R４が、炭素数１から６のアルキル基であり、このアルキル基はR１におけるアルキル基
と同様に解釈されるアルキル基である。R４としては水素原子又はメチル基が好ましく、
より好ましくは水素原子である。
【０１１９】
リンカーの-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-で示される構造の具体例として、
-NH-CH2-
-NH-CH(-Me)-
-NH-C(-Me)2-
-NH-CH2-CHMe-
-NH-CH(-CH2OH)-
-NH-CH(-CH2COOH)-
-NH-CH(-CH2CH2COOH)-
-NH-CH(-CH2CH2CH2CH2NH2)-
-NH-CH2CH2-
-NH-CH2-O-CH2-
-NH-CH2CH2-O-
-NH-CH2CH2-O-CH2-
-NH-CH2CH2C(-Me)2-
-NH-CH2CH2NH-
-NH-CH2CH2NH-CH2-
-NH-CH2CH2NMe-CH2-
-NH-CH2CH2NH-CH2CH2-
-NH-CH2CH2NMe-CH2CH2-
-NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2-
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2-
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2OH)-
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)-
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2CH2CH2CH2NH2)-
-NH-CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2CH(NH2)-
等を挙げることができる。
【０１２０】
これ等のうち好ましくは、
-NH-CH2-
-NH-CH2-CH(Me)-
-NH-CH(-CH2OH)-
-NH-CH(-CH2CH2COOH)-
-NH-CH2CH2-
-NH-CH2-O-CH2-
-NH-CH2CH2-O-
-NH-CH2CH2-O-CH2-
-NH-CH2CH2C(-Me)2-
-NH-CH2CH2NH-
-NH-CH2CH2NH-CH2-
-NH-CH2CH2NMe-CH2-
-NH-CH2CH2NMe-CH2CH2-
-NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2-
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2-
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2OH)-
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)-
-NH-CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-
等を挙げることができる。
【０１２１】
より好ましくは、
-NH-CH2-
-NH-CH2CH2-
-NH-CH2-O-CH2-
-NH-CH2CH2-O-
-NH-CH2CH2-O-CH2-
-NH-CH2CH2NH-
-NH-CH2CH2NH-CH2-
-NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2-
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)-
-NH-CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2-
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-
を挙げることができる。
【０１２２】
さらに好ましくは、
-NH-(CH2)3-、
-NH-CH2-O-CH2-、
-NH-(CH2)2-O-CH2-
である。
【０１２３】
６．Lｃ
リンカーのLｃは、-CH2-又は-C(=O)-である。当該リンカーにおいて抗腫瘍性化合物と
結合する。リンカーのLｃとしては、-C(=O)-がより好ましい。
【０１２４】
リンカーの-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃは、鎖長として４から７原子の鎖長であるものが
好ましいが、さらに好ましくは５又は６原子の鎖長を有するものである。
【０１２５】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍細胞内に移動した後にはリンカー部分が切
断され、NH2-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-(NH-DX)で示される構造の薬物誘導体が遊離して抗腫
瘍作用を発現する。本発明の抗体−薬物コンジュゲートから遊離され抗腫瘍効果を発現す
る抗腫瘍性誘導体としては、先に挙げたリンカーの-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-で示される構
造にLｃを結合させ、末端がアミノ基となった構造部分を有する抗腫瘍性誘導体を挙げる
ことができるが、特に好ましいものは次のものである：
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
なお、NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)の場合は同分子内にあるアミナール構造が不安定
であるため、さらに自己分解して
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX)
が遊離されることが確認された。これらの化合物は本発明の抗体−薬物コンジュゲートの
製造中間体としても好適に用いることができる。
【０１２６】
薬物をエキサテカンとする本発明の抗体−薬物コンジュゲートにおいては、下記の構造
の薬物−リンカー構造部分［-L１-L２-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-(NH-DX)］を抗体に
結合させたものが好ましい。これらの薬物−リンカー構造部分は、１抗体あたりの平均結
合数として、１から１０を結合させればよいが、好ましくは２から８であり、より好まし
くは３から８である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=
O)-(NH-DX)
これ等のうちでより好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=
O)-(NH-DX)。
さらに、好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-(NH-DX)。
【０１２７】
本願の抗体−薬物コンジュゲートにおいて、抗体と薬物とを結合するリンカー構造は、
これまで述べたリンカー各部において示した好ましい構造のものを結合することで好まし
いリンカーを構築することができる。この様なリンカ−構造として以下の構造のものを好
適に使用することができる。なお構造の左端が抗体との結合部位であり、右端が薬物との
結合部位である。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=
O)-
これ等のうちでより好ましくは、次のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=
O)-。
さらに、好ましくは、次のものを挙げることができる。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2
CH2-C(=O)-。
【０１２８】
［製造方法］
次に、本発明の抗体−薬物コンジュゲートあるいはその製造中間体の代表的な製造方法
について説明する。なお、以下において、化合物を示すために、各反応式中に示される化
合物の番号を用いる。すなわち、『式（１）の化合物』、『化合物（１）』等と称する。
またこれ以外の番号の化合物についても同様に記載する。
【０１２９】
１．製造方法１
式（１）で示される抗体−薬物コンジュゲートのうち、チオエーテルを介して抗体とリ
ンカー構造が結合しているものは例えば下記の方法によって製造することができる。
【０１３０】
【化４８】
2018188455.tif 000049
【０１３１】
［式中、ＡＢは、スルフヒドリル基を有する抗体を示し、L１’は、L１で示されるリンカ
ー構造において、リンカー末端がマレイミジル基（次式）
【０１３２】
【化４９】
2018188455.tif 000050
【０１３３】
となった構造であるか（ここで、窒素原子が結合部位である。）、又は末端がハロゲンと
なった構造のリンカーを示すが、L１のうちの-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n2-C(=O)-にお
いて-(Succinimid-3-yl-N)-部分がマレイミジル基となった基、又はL１における-CH2C(=O
)NH-(CH2)n3-C(=O)-の末端のメチレンがハロゲン化されてハロアセトアミドとなった、Ha
logen-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)-基を示す。また、-(NH-DX)は次式：
【０１３４】
【化５０】
2018188455.tif 000051
【０１３５】
で示される構造であり、エキサテカンの１位のアミノ基の水素原子１個が除かれて生成す
る基を示す。また、上記の反応式において式（１）の化合物では、薬物からリンカー末端
までの構造部分１個が１の抗体に対して結合した構造として記載されているが、これは説
明のための便宜的な記載であって、実際には当該構造部分が抗体分子に対して複数個が結
合している場合が多い。この状況は以下の製造方法の説明においても同様である。］
【０１３６】
すなわち、後述する方法によって入手しうる化合物（２）と、スルフヒドリル基を有す
る抗体（３a）を反応させることによって、抗体−薬物コンジュゲート（１）を製造する
ことができる。
スルフヒドリル基を有する抗体（３a）は、当業者周知の方法で得ることができる（Ｈ
ｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．
５６−１３６、ｐｐ．４５６−４９３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。
例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬を抗体のアミノ基に作用させる；Ｎ−サクシンイミジルＳ−
アセチルチオアルカノエート類を抗体のアミノ基に作用させた後、ヒドロキシルアミンを
作用させる；Ｎ−サクシンイミジル３−（ピリジルジチオ）プロピオネートを作用させた
後、還元剤を作用させる；ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、トリス（２
−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ)等の還元剤を抗体に作用させて抗体
内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元しスルフヒドリル基を生成させる；等等の方法を挙
げることができるがこれらに限定されることはない。
具体的には、還元剤としてＴＣＥＰを、抗体内ヒンジ部ジスルフィド一個当たりに対し
て０．３乃至３モル当量用い、キレート剤を含む緩衝液中で、抗体と反応させることで、
抗体内ヒンジ部ジスルフィドが部分的もしくは完全に還元された抗体を得ることができる
。キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やジエチレントリア
ミン５酢酸（ＤＴＰＡ）等を挙げることができる。これ等を１ｍＭ乃至２０ｍＭの濃度で
用いればよい。緩衝液としては、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム
溶液等を用いることができる。具体的な例において、抗体は４℃乃至３７℃にて１乃至４
時間ＴＣＥＰと反応させることで部分的もしくは完全に還元されたスルフヒドリル基を有
する抗体（３a）を得ることが出来る。
なお、ここでスルフヒドリル基を薬物−リンカー部分に付加させる反応を実施させるこ
とでチオエーテル結合によって薬物−リンカー部分を結合させることができる。
次に、スルフヒドリル基を有する抗体（３a）一個あたり、２乃至２０モル当量の化合
物（２）を使用して、抗体１個当たり２個乃至８個の薬物が結合した抗体―薬物コンジュ
ゲート（１）を製造することができる。具体的には、スルフヒドリル基を有する抗体（３
a）を含む緩衝液に、化合物（２）を溶解させた溶液を加えて反応させればよい。ここで
、緩衝液としては、酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム、等を用
いればよい。反応時のｐＨは５乃至９であり、より好適にはｐＨ７付近で反応させればよ
い。化合物（２）を溶解させる溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピリ
ドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒を用いることができる。化合物（２）を溶解させた有機溶媒
溶液を、スルフヒドリル基を有する抗体（３a）を含む緩衝液に１乃至２０％ｖ／ｖを加
えて反応させればよい。反応温度は、０乃至３７℃、より好適には１０乃至２５℃であり
、反応時間は、０．５乃至２時間である。反応は、未反応の化合物（２）の反応性をチオ
ール含有試薬によって失活させることによって終了できる。チオール含有試薬は例えば、
システインまたはＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）である。より具体的には、Ｎ
ＡＣを、用いた化合物（２）に対して、１乃至２モル当量加え、室温で１０乃至３０分イ
ンキュベートすることにより反応を終了できる。
製造した抗体−薬物コンジュゲート（１）は、以下の共通操作によって濃縮、バッファ
ー交換、精製、抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定を行い、抗体−薬
物コンジュゲート（１）の同定を行うことができる。
【０１３７】
共通操作Ａ：抗体もしくは抗体−薬物コンジュゲート水溶液の濃縮
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（５０，０００  ＭＷＣＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）の容器内に抗体もしくは抗体−薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機
（Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いた
遠心操作（２０００Ｇ乃至３８００Ｇにて５乃至２０分間遠心）にて、抗体もしくは抗体
−薬物コンジュゲート溶液を濃縮した。
共通操作Ｂ：抗体の濃度測定
ＵＶ測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った
。その際に、抗体ごとに異なる２８０ｎｍ吸光係数（１．３ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１乃至１
．８ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１）を用いた。
共通操作Ｃ−１：抗体のバッファー交換
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５担体を使用したＮＡＰ−２５カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７
−０８５２−０２，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）を、メーカー説明書の方法に従い、塩化ナトリウム（１３７ｍＭ）及びエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ，５ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ６．０）（本明細書
でＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡと称する。）にて平衡化させた。このＮＡＰ−２５カラム一本
につき、抗体水溶液２．５ｍＬをのせたのち、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ３．５ｍＬで溶出
させた画分（３．５ｍＬ）を分取した。この画分を共通操作Ａによって濃縮し、共通操作
Ｂを用いて抗体濃度の測定を行ったのちに、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡを用いて１０ｍｇ／
ｍＬに抗体濃度を調整した。
共通操作Ｃ−２：抗体のバッファー交換
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５担体を使用したＮＡＰ−２５カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７
−０８５２−０２，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）を、メーカー規定の方法に従い、塩化ナトリウム（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（２ｍＭ）
を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．５）（本明細書でＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡと称
する。）にて平衡化させた。このＮＡＰ−２５カラム一本につき、抗体水溶液２．５ｍＬ
をのせたのち、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡ３．５ｍＬで溶出させた画分（３．５ｍＬ）を分
取した。この画分を共通操作Ａによって濃縮し、共通操作Ｂを用いて抗体濃度の測定を行
ったのちに、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡを用いて２０ｍｇ／ｍＬに抗体濃度を調整した。
共通操作Ｄ−１：抗体−薬物コンジュゲートの精製
市販のリン酸緩衝液（ＰＢＳ７．４，Ｃａｔ．Ｎｏ．１００１０−０２３，Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）、塩化ナトリウム（１３７ｍＭ）を含むリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ
，ｐＨ６．０；本明細書でＰＢＳ６．０と称する。）もしくはＳｏｒｂｉｔｏｌ（５％）
を含む酢酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ５．５；本明細書でＡＢＳと称する。）のいずれかの
緩衝液でＮＡＰ−２５カラムを平衡化させた。このＮＡＰ−２５カラムに、抗体−薬物コ
ンジュゲート反応水溶液（約１．５ｍＬ）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させ
ることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びＮＡＰ−２５カラムにのせ緩衝液で
溶出させるゲルろ過精製操作を計２乃至３回繰り返すことで、未結合の薬物リンカーや低
分子化合物（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ），Ｎ−アセ
チル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ），ジメチルスルホキシド）を除いた抗体−薬物コンジュ
ゲートを得た。
共通操作Ｅ：抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平
均結合数の測定
抗体−薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、抗体−薬物コンジュゲート水溶液
の２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの二波長におけるＵＶ吸光度を測定したのちに下記の計算を
行うことで、算出することができる。
ある波長における全吸光度は系内に存在する全ての吸収化学種の吸光度の和に等しい［
吸光度の加成性］ことから、抗体と薬物のコンジュゲーション前後において、抗体及び薬
物のモル吸光係数に変化がないと仮定すると、抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体濃
度及び薬物濃度は、下記の関係式で示される。
Ａ２８０＝ＡＤ，２８０＋ＡＡ，２８０＝εＤ，２８０ＣＤ＋εＡ，２８０ＣＡ    式（
１）
Ａ３７０＝ＡＤ，３７０＋ＡＡ，３７０＝εＤ，３７０ＣＤ＋εＡ，３７０ＣＡ    式（
２）
ここで、Ａ２８０は２８０ｎｍにおける抗体−薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示
し、Ａ３７０は３７０ｎｍにおける抗体−薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、Ａ
Ａ，２８０は２８０ｎｍにおける抗体の吸光度を示し、ＡＡ，３７０は３７０ｎｍにおけ
る抗体の吸光度を示し、ＡＤ，２８０は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光
度を示し、ＡＤ，３７０は３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、ε
Ａ，２８０は２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数を示し、εＡ，３７０は３７０ｎｍ
における抗体のモル吸光係数を示し、εＤ，２８０は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート
前駆体のモル吸光係数を示し、εＤ，３７０は３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体
のモル吸光係数を示し、ＣＡは抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体濃度を示し、ＣＤ
は抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物濃度を示す。
ここで、εＡ，２８０、εＡ，３７０、εＤ，２８０、εＤ，３７０は、事前に用意し
た値（計算推定値もしくは化合物のＵＶ測定から得られた実測値）が用いられる。例えば
、εＡ，２８０は、抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Protein  Science,  199
5,  vol.4,  2411-2423）によって推定することが出来る。εＡ，３７０は、通常、ゼロ
である。εＤ，２８０及びεＤ，３７０は、用いるコンジュゲート前駆体をあるモル濃度
に溶解させた溶液の吸光度を測定することで、ランベルト・ベールの法則（吸光度＝  モ
ル濃度×モル吸光係数×  セル光路長）によって、得ることができる。抗体−薬物コンジ
ュゲート水溶液のＡ２８０及びＡ３７０を測定し、これらの値を式（１）及び（２）に代
入して連立方程式を解くことによって、ＣＡ及びＣＤを求めることができる。さらにＣＤ
をＣＡで除することで１抗体あたりの薬物平均結合数が求めることができる。
【０１３８】
製造方法１における式（２）で示される化合物であるが、次式のいずれかである。
【０１３９】
【化５１】
2018188455.tif 000052
【０１４０】
上記式中、n１、n２、n３、L２、LＰ、Lａ、Lｂ及びLｃは、既に定義したとおりであり
、Lｃは薬物との結合部位となる。
【０１４１】
このような本発明化合物の製造に有用な中間体として好ましいものは、ｎ２としては、
整数の２から５であり、L２は-NH-(CH2CH2O)n５-CH2CH2-C(=O)-であるか単結合であり、n
５は、２から４であり、LＰはGGFGであり、-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-は、-NH-CH2CH2-C
(=O)-、NH-CH2CH2CH2-C(=O)-、-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-の
部分構造が好ましい。またHalogenとしては臭素又はヨウ素が好ましい。これ等の化合物
について具体的には以下のものを例示することができる［ここで，(maleimid-N-yl)は、
マレイミジル基（2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl基）を意味する］。
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C
(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2
CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
ここで，式中のＸは、臭素原子又はヨウ素原子を示す。これらの臭素化合物及びヨウ素
化合物はいずれも製造中間体として好適に使用することができる。
なお、コンジュゲートの量を確保するために、同様な条件で作製して得られた平均薬物
数が同程度の複数のコンジュゲート（例えば±１程度）を混合して新たなロットにするこ
とができる。その場合、平均薬物数は混合前の平均薬物数の間に収まる。
【０１４２】
２．製造方法２
式（１）で示される抗体−薬物コンジュゲートのうち、抗体との結合がアミド基であっ
て、チオエーテル結合をリンカー内に有するリンカーである、具体的には-L１-L２-が-C(
=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-diminiccuS)-S-(CH2)n６-C(=O)-の構造であるものは、下
記の方法によっても製造することができる。
【０１４３】
【化５２】
2018188455.tif 000053
【０１４４】
［式中、AB-Ｌ１’は、抗体とリンカーＬ１が結合し、さらにＬ１の末端がＮ−マレイミ
ジル基に変換された基を示すが、具体的にはAB-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH2-(N-ly-3-dimini
ccuS)-において、-(N-ly-3-diminiccuS)-がマレイミジル基に変換された構造である。Ｌ
２’は末端がメルカプト基となったHS-(CH2)n６-C(=O)-基を示し、ＡＢは抗体を示す。］
【０１４５】
すなわち、後述する方法によって入手しうる化合物（２ａ）と、マレイミジル基を有す
るリンカーを結合させた抗体（３b）を反応させることによって、抗体−薬物コンジュゲ
ート（１）を製造することができる。
マレイミジル基を有する抗体（３b）も当業者周知の方法で得ることができる（Ｈｅｒ
ｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．５６
−１３６、ｐｐ．４５６−４９３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。例え
ばアミノ基、ヒドロキシル基との結合性を有しマレイミジル基を有するサクシンイミジル
-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（ＳＭＣＣ）等の二官能性
リンカーをリガンドのアミノ基に作用させマレイミジル基を導入する等の方法を挙げるこ
とができるが、これらに限定されない。
例えば、アミノ基への反応性部分と、チオール基への反応性部分をリンカーで結合した
化合物であれば好適に使用することができる。ここでアミノ基への反応性部分は、活性エ
ステル、イミドエステル等であればよく、またチオール反応性部分は、マレイミジル、ハ
ロゲン化アセチル、ハロゲン化アルキル、さらにはジチオピリジル等であればよい。
抗体を構成するアミノ酸のアミノ基又は水酸基、特にアミノ基においてアミド結合を介
してリンカーを構築させるための方法として，先ず抗体に反応させる化合物は、次式：
Ｑ１-Ｌ１ａ-Ｑ２
［式中、Ｑ１は、(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-、(3-Sulfo-pyrrolidine-2,5-
dione-N-yl)-O-C(=O)-、RＱ-O-C(=N)-、又はO=C=N-を示し、
Ｌ１ａ-は、-cyc.Hex(1,4)-CH2-、炭素数１から１０のアルキレン基、フェニレン基、-(C
H2)n４-C(=O)-、-(CH2)n４a-NH-C(=O)-(CH2)n４ｂ-、又は-(CH2)n４a-NH-C(=O)-cyc.Hex(
1,4)-CH2-を示し、
Ｑ２は(maleimid-N-yl)、ハロゲン原子、又は-S-S-(2-Pyridyl)を示すが、
RＱは、炭素数１から６のアルキル基、n４は、１から８の整数を示し、n４aは０から６の
整数、n４ｂは１から６の整数を示す。］
で示される化合物であればよい。
ここで、RＱは、炭素数１から６のアルキル基であればよいが、より好ましくはメチル
基またはエチル基である。
Ｌ１ａにおけるアルキレン基としては、炭素数１から１０のものであればよい。フェニ
レン基としては、オルト、メタ、パラいずれのものでもよいが、パラ、またはメタのもの
がより好ましい。
Ｌ１ａとして好ましいものは、-cyc.Hex(1,4)-CH2-、-(CH2)5-NH-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-
CH2-、-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-、-(CH2)5-NH-C(=O)-(CH2)2-、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-
、-(CH2)5-、-(CH2)10-、-(para-Ph)-、-(meta-Ph)-、-(para-Ph)-CH(-CH3)-、-(CH2)3-(
meta-Ph)-、又は-(meta-Ph)-NH-C(=O)-CH2-を挙げることができる。
Ｑ１として好ましくは(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-であり、Ｑ２は、(male
imid-N-yl)が好ましいが、ジスルフィド結合を形成させようとするときは-S-S-(2-Pyridy
l)を使用すればよい。
ここで，(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-は、次式
【０１４６】
【化５３】
2018188455.tif 000054
【０１４７】
で示される窒素原子が結合部位である基であり、(3-Sulfo-pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)
-は、次式
【０１４８】
【化５４】
2018188455.tif 000055
【０１４９】
で示される窒素原子が結合部位である基であり、このスルホン酸はリチウム塩、ナトリウ
ム塩、カリウム塩を形成でき、好ましくはナトリウム塩であり、cyc.Hex(1,4)は１，４-
シクロへキシレン基を示し、
(maleimid-N-yl)は、次式
【０１５０】
【化５５】
2018188455.tif 000056
【０１５１】
で示される、窒素原子が結合部位である基であり、
(2-Pyridyl)は、２−ピリジル基を示し、(para-Ph)はパラフェニレン基を示し、(meta-Ph
)は、メタフェニレン基を示す。
この様な化合物として例えば、スルフォスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミジルメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（sulfo-SMCC）、Ｎ−スクシンイミジル−
４−（Ｎ−マレイミジルメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプ
ロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミジルウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエ
ステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミジル酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）
、ε−マレイミジルカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ
−マレイミジルベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（
α−マレイミジルアセトキシ）−スクシンイミドエステル(ＡＭＡＳ)、スクシンイミジル
−６−（β−マレイミジルプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシ
ンイミジル４−（ｐ−マレイミジルフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（ｐ−マ
レイミジルフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨー
ドアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテー
ト（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）Ｎ−スクシンイミジル
３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−
（２−ピリドジチオ）プロピオネート（SPDP）、及びスクシンイミジルオキシカルボニル
−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（SMPT）等の化合物である。
具体的には、例えば、抗体（３）に対して、２乃至６当量のＳＭＣＣを、ｐＨ６乃至７
のリン酸緩衝液中で、室温かつ１乃至６時間反応させることで、ＳＭＣＣの活性エステル
が抗体と反応しマレイミジル基を有する抗体（３b）を得ることが出来る。得られた抗体
（３b）は下記の共通操作Ｄ−２によって精製し、次の化合物（２a）との反応に用いるこ
とができる。
共通操作Ｄ−２：サクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミジルメチル）−シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）誘導体化抗体の精製
ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡでＮＡＰ−２５カラムを平衡化させた。このＮＡＰ−２５カラ
ムに、サクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミジルメチル）−シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（本明細書でＳＭＣＣと称する。）誘導体化抗体を含む反応液（約０．５ｍＬ
）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取し、精製を行
った。
リンカーとの結合に供される抗体のアミノ基は、Ｎ末端アミノ基及び／又はリシン残基
が有するアミノ基であればよいがこれ等に限定されることはない。さらにセリン残基が有
する水酸基を利用してエステル結合を形成させてリンカーと結合させることもできる。
化合物（２ａ）と、マレイミジル基を有するリンカーを結合させた抗体（３b）の反応
は、製造方法１で述べた、化合物（２）と、スルフヒドリル基を有する抗体（３a）の反
応方法の場合と同様にして行うことができる。
製造した抗体−薬物コンジュゲート（１）における、濃縮、バッファー交換、精製、抗
体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定による抗体−薬物コンジュゲート（
１）の同定は製造方法１と同様に行うことが出来る。
製造方法２において式（３b）で示される化合物は次の構造を有する（次式；当該構造
において「抗体−ＮＨ−」は抗体由来である。）。
【０１５２】
【化５６】
2018188455.tif 000057
【０１５３】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートを製造するための中間体であって上記の構造を有す
る化合物は次の通りである（式中、ｎは、１から１０の整数であるが、好ましくは２から
８であり、より好ましくは３から８である。）。
【０１５４】
【化５７】
2018188455.tif 000058
【０１５５】
さらに末端がメルカプト基となった本発明の化合物としては以下のものを挙げることが
できる。
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH
2-C(=O)-(NH-DX)
【０１５６】
３．製造方法３
式（１）で示される抗体−薬物コンジュゲートであって、アミド結合を介して薬物リン
カー部分と抗体が結合したものは、以下の方法で製造することができる。例えばＬ１が-C
(=O)-(CH2)n４-C（＝O）-であり、これが活性エステルとなったＬ１’、例えば(Pyrrolid
ine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-(CH2)n４-C(=O)-を好適に使用することができる。さらに
Ｌ２が単結合である場合は、例えば下記の方法によって製造することができる。
【０１５７】
【化５８】
2018188455.tif 000059
【０１５８】
すなわち、後述する方法によって入手しうる化合物（２ｂ）と、抗体（３）を反応させ
ることによって、抗体−薬物コンジュゲート（１）を製造することができる。
化合物（２ｂ）は抗体のアミノ基、ヒドロキシル基との結合性を有する。抗体のアミノ
基、ヒドロキシル基は、製造方法２で記したように、それぞれ例えば抗体の有するＮ末端
アミノ基及び／又はリシン残基が有するアミノ基、セリン残基が有する水酸基を示すが、
これらに限定されない。
化合物（２ｂ）はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基から成る活性エステルで
あるが、他の活性エステル、例えばスルホスクシンイミジルエステル基、Ｎ−ヒドロキシ
フタルイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホフタルイミジルエステル、オルト−ニト
ロフェニルエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステ
ル、３−スルホニル−４−ニトロフェニルエステル、３−カルボキシ−４−ニトロフェニ
ルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル等も使用することができる。
化合物（２ｂ）と、抗体（３）の反応は、抗体（３）一個あたり、２乃至２０モル当量
の化合物（２ｂ）を使用して、抗体１個当たり１個乃至１０個の薬物が結合した抗体―薬
物コンジュゲート（１）を製造することができる。具体的には、抗体（３）を含む緩衝液
に、化合物（２ｂ）を溶解させた溶液を加えて反応させることにより、抗体−薬物コンジ
ュゲート（１）を製造することができる。ここで、緩衝液として、酢酸ナトリウム溶液、
リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム等を用いることができる。反応時のｐＨは５乃至９
であればよく、より好適にはｐＨ７付近で反応させればよい。化合物（２ｂ）を溶解させ
る溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒
を用いることができる。化合物（２ｂ）を溶解させた有機溶媒溶液を、抗体（３）を含む
緩衝液に１乃至２０％ｖ／ｖを加えて反応させればよい。反応温度は、０乃至３７℃、よ
り好適には１０乃至２５℃であり、反応時間は、０．５乃至２０時間である。
製造した抗体−薬物コンジュゲート（１）における、濃縮、バッファー交換、精製、抗
体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定による抗体−薬物コンジュゲート（
１）の同定は製造方法１と同様に行うことが出来る。
製造方法３において(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-(CH2)n４-C(=O)-は次の構
造を有する。
【０１５９】
【化５９】
2018188455.tif 000060
【０１６０】
上記の部分構造を有する本発明の化合物としては以下のものを挙げることができる。
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX
)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH
-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-
(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=
O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX
)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH
-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=
O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-
C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX
)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH
-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=
O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-
C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH
-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=
O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-
C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C
H2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O
)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2
CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
【０１６１】
４．製造方法４
先の製造方法で使用した中間体である式（２）又は（２ｂ）で示される化合物及びそれ
らの薬理上許容される塩は例えば下記の方法によって製造することができる。
【０１６２】
【化６０】
2018188455.tif 000061
【０１６３】
［式中、Ｌｃは-C(=O)-であって-(NH-DX)との結合はアミド結合を形成し、Ｌ１’は末端
マレイミジル基、又は末端ハロアセチル基、又は(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)
-(CH2)n４-C(=O)-に変換された構造のL1を示し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は保護基を示す。］
【０１６４】
カルボン酸（５）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩
基存在下、ＮＨ２−ＤＸ［エキサテカンを示す；化学名：(1S,9S)-1-アミノ-9-エチル-5-
フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1H,12H-ベンゾ［de］ピラノ［3',4':6,7
］インドリジノ［1,2-b］キノリン-10,13（9H,15H）-ジオン］（４）またはその薬理上許
容される塩と反応させることによって化合物（６）を製造することができる。
この反応は、ペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよい。活性エステ
ルには各種のものがあるが、例えばｐ−ニトロフェノール等のフェノール類、Ｎ−ヒドロ
キシベンゾトリアゾールあるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド等とカルボン酸（５）を
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドあるいは１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩等の縮合剤を用いて反応させれば製造できる。ま
た、活性エステルは、カルボン酸（５）とペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテー
ト等との反応；カルボン酸（５）と１−ベンゾトリアゾリルオキシトリピロリジノホスホ
ニウムヘキサフルオロホスファイトとの反応；カルボン酸（５）とシアノホスホン酸ジエ
チルとの反応（塩入法）；カルボン酸（５）とトリフェニルホスフィン及び２，２’−ジ
ピリジルジスルフィドとの反応（向山法）；カルボン酸（５）と４−（４，６−ジメトキ
シ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭ
ＴＭＭ）のようなトリアジン誘導体との反応；等によっても製造することができる。また
、カルボン酸（５）を塩基存在下に塩化チオニル、オキザリルクロリド等の酸ハロゲン化
物で処理することによって製造できる酸ハライド法等によって反応を行うこともできる。
上記のように得たカルボン酸（５）の活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物
を化合物（４）と適当な塩基存在下に不活性な溶媒中で−７８℃〜１５０℃で反応させる
ことによって化合物（６）を製造することができる（なお、「不活性な溶媒」とはその溶
媒が採用された反応において実施される反応を阻害することのない溶媒を意味する。）。
【０１６５】
上記の各工程に用いる具体的な塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム
、ナトリウムエトキシド、カリウムブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水
素化ナトリウム、水素化カリウムのような、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の炭
酸塩、アルカリ金属アルコキシド、アルカリ金属水酸化物もしくは水素化物、又はｎ−ブ
チルリチウムのようなアルキルリチウム、リチウムジイソプロピルアミドのようなジアル
キルアミノリチウムに代表される有機金属塩基；リチウムビス（トリメチルシリル）アミ
ドのようなビスシリルアミンの有機金属塩基；又はピリジン、２，６−ルチジン、コリジ
ン、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジイソプ
ロピルエチルアミン、ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）のよ
うな有機塩基等を挙げることができる。
【０１６６】
本反応に用いる不活性な溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等
のハロゲン化炭化水素系溶媒；テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキ
サン等のエーテル系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジン−２−オン等
のアミド系溶媒；を挙げることができ、これらに加えて場合によってはジメチルスルホキ
シド、スルホラン等のスルホキシド系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系
溶媒；等を使用することも可能である。
【０１６７】
化合物（６）のＬａ及びＬｂは、後述するように、その水酸基、カルボキシ基、アミノ
基等が有機化合物の合成に通常用いられる保護基で保護されていてよい。具体的には水酸
基の保護基としては、メトキシメチル基等のアルコキシメチル基；ベンジル基、４−メト
キシベンジル基、トリフェニルメチル基等のアリールメチル基；アセチル基等のアルカノ
イル基；ベンゾイル基等のアロイル基；ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル
基；等を挙げることができる。カルボキシ基は、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル
基等のアルキル基、アリル基、又はベンジル基等のアリールメチル基とのエステル等とし
て保護することができる。アミノ基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基、メトキシ
カルボニル基、エトキシカルボニル基等のアルキルオキシカルボニル基；アリルオキシカ
ルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、
パラメトキシベンジルオキシカルボニル基、パラ（又はオルト）ニトロベンジルオキシカ
ルボニル基等のアリールメチル基；のほか、アセチル基等のアルカノイル基；ベンジル基
、トリフェニルメチル基等のアリールメチル基；ベンゾイル基等のアロイル基；又は２，
４−ジニトロベンゼンスルホニル基、オルトニトロベンゼンスルホニル基等のアリールス
ルホニル基；等、ペプチド合成に通常用いられているアミノ基の保護基によって保護する
ことができる。上記の保護基の着脱は、通常実施される方法に従って行えばよい。
【０１６８】
化合物（６）の末端アミノ基の保護基Ｐ１としては、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニ
ル基や９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等、ペ
プチド合成に通常用いられているアミノ基の保護基を用いることができる。他のアミノ基
の保護基としては、アセチル基等のアルカノイル基；メトキシカルボニル基、エトキシカ
ルボニル基等のアルコキシカルボニル基；パラメトキシベンジルオキシカルボニル基、パ
ラ（又はオルト）ニトロベンジルオキシカルボニル基等のアリールメトキシカルボニル基
；ベンジル基、トリフェニルメチル基等のアリールメチル基；ベンゾイル基等のアロイル
基；又は２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、オルトニトロベンゼンスルホニル基等
のアリールスルホニル基；を挙げることができる。保護基Ｐ１は、アミノ基を保護する化
合物の性質等に応じて取捨選択すればよい。
得られた化合物（６）の末端アミノ基の保護基Ｐ１を脱保護させることによって化合物
（７）を製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
Ｎ末端をＰ２で保護したペプチドカルボン酸（８）を活性エステル、混合酸無水物等に
誘導し、得られた化合物（７）に反応させることによって、化合物（９）を製造すること
ができる。ペプチドカルボン酸（８）と化合物（７）のペプチド結合を形成する反応条件
や試薬、及び塩基、不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して
使用すればよい。保護基Ｐ２は、化合物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使
用すればよく、アミノ基を保護する化合物の性質等に応じて取捨選択すればよい。また、
ペプチド合成に通常用いられているように、ペプチドカルボン酸（８）を構成するアミノ
酸又はペプチドを順次反応と脱保護を繰り返し、伸長させて化合物（９）を製造すること
もできる。
得られた化合物（９）のアミノ基の保護基Ｐ２を脱保護させることによって化合物（１
０）を製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
カルボン酸（１１）及び（１１ｂ）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化
物等に誘導し、得られた化合物（１０）に反応させることによって、化合物（２）又は（
２ｂ）を製造することができる。カルボン酸（１１）又は（１１ｂ）と化合物（１０）の
ペプチド結合を形成する反応条件や試薬、及び塩基、不活性溶媒は、化合物（６）の合成
で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
【０１６９】
化合物（９）は例えば下記の方法でも製造することができる。
Ｎ末端をＰ２で保護したペプチドカルボン酸（８）を活性エステル、混合酸無水物等に
誘導し、塩基存在下、カルボキシ基をＰ３で保護したアミン化合物（１２）と反応させる
ことによって化合物（１３）を製造することができる。ペプチドカルボン酸（８）と化合
物（１２）のペプチド結合を形成する反応条件や試薬、及び塩基、不活性な溶媒は、化合
物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。化合物（１３）のアミノ
基の保護基Ｐ２は化合物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
カルボキシ基の保護基Ｐ３としては、有機合成化学、中でもペプチド合成においてカルボ
キシ基の保護基として通常用いられている保護基を使用すればよく、具体的にはメチル基
、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル等のアルキルエステル、アリルエステル、ベンジルエステ
ル等、化合物（６）の保護基で述べたものから適宜選択して使用すればよい。この場合に
、アミノ基の保護基とカルボキシ基の保護基が異なる方法又は条件で除去できる必要があ
る。例えばＰ２がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基であり、Ｐ３がベンジル基である
組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。それらの保護基はアミノ基とカ
ルボキシ基を保護する化合物の性質等に応じて上述したものから取捨選択すればよく、そ
れらの保護基の切断に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
得られた化合物（１３）のカルボキシ基の保護基Ｐ３を脱保護させることによって化合
物（１４）を製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
得られた化合物（１４）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導
し、塩基存在下、化合物（４）と反応させることによって化合物（９）を製造することが
できる。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条
件や試薬、及び塩基や不活性な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して
使用すればよい。
【０１７０】
化合物（２）又は（２ｂ）は例えば下記の方法でも製造することができる。
化合物（１３）のアミノ基の保護基Ｐ２を脱保護させることによって化合物（１５）を
製造することができる。その保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
カルボン酸誘導体（１１）又は（１１ｂ）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロ
ゲン化物等に誘導し、塩基存在下、得られた化合物（１５）と反応させることによって化
合物（１６）又は（１６ｂ）を製造することができる。ペプチドカルボン酸（１１）又は
（１１ｂ）と化合物（１５）のアミド結合を形成する反応条件や試薬、及び塩基、不活性
な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
得られた化合物（１６）又は（１６ｂ）のカルボキシ基の保護基を脱保護させることに
よって化合物（１７）又は（１７ｂ）を製造することができる。化合物（１４）の製造に
おけるカルボキシ基の脱保護と同様に行うことができる。
化合物（１７）又は（１７ｂ）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等
に誘導し、塩基存在下、化合物（４）と反応させることによって化合物（２）又は（２ｂ
）を製造することができる。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用
すればよく、反応条件や試薬、及び塩基や不活性な溶媒は化合物（６）の合成で述べたも
のから適宜選択して使用すればよい。
【０１７１】
５．製造方法５
中間体の式（２）で示される化合物は下記の方法によっても製造することもできる。
【０１７２】
【化６１】
2018188455.tif 000062
【０１７３】
［式中、Ｌ１’は末端がマレイミジル基、又はハロアセチル基に変換された構造のL1であ
り、Ｐ４は保護基を示す。］
【０１７４】
化合物（１１）を活性エステル、混合酸無水物等に誘導し、塩基存在下、Ｃ末端をＰ４
で保護したペプチドカルボン酸（１８）と反応させることによって化合物（１９）を製造
することができる。ペプチドカルボン酸（１８）と化合物（１１）のペプチド結合を形成
する反応条件や試薬、及び塩基、不活性な溶媒は、化合物（６）の合成で述べたものから
適宜選択して使用すればよい。化合物（１８）のカルボキシ基の保護基Ｐ４は化合物（６
）の保護基で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
得られた化合物（１９）のカルボキシ基の保護基を脱保護させることによって化合物（
２０）を製造することができる。化合物（１４）の製造におけるカルボキシ基の脱保護と
同様に行うことができる。
得られた化合物（２０）を活性エステル、又は混合酸無水物等に誘導し、化合物（７）
に反応させることによって、化合物（２）を製造することができる。この反応はペプチド
合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試薬、及び塩基や不活性
な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用すればよい。
【０１７５】
６．製造方法６
製造方法２に記載の製造中間体（２ａ）であって、Ｌ２’が末端メルカプトアルカノイ
ル基に変換された構造のＬ２である化合物は、下記の方法によって製造することができる
。
【０１７６】
【化６２】
2018188455.tif 000063
【０１７７】
末端メルカプト基を有するカルボン酸（２１）を活性エステル、又は混合酸無水物等に
誘導し、化合物（１０）に反応させることによって、化合物（２ａ）を製造することがで
きる。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件
や試薬、及び塩基や不活性な溶媒は化合物（４）の合成で述べたものから適宜選択して使
用すればよい。
また、化合物（２１）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し
、化合物（１５）と反応させ、得られる化合物（２２）のカルボキシ基の保護基を脱保護
することによって、化合物（２３）を製造することができる。
化合物（２３）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、塩基
存在下、化合物（４）と反応させることによって化合物（２ａ）を製造することができる
。この反応はペプチド合成に通常用いる反応試薬や条件を準用すればよく、反応条件や試
薬、及び塩基や不活性な溶媒は化合物（６）の合成で述べたものから適宜選択して使用す
ればよい。
【０１７８】
７．製造方法７
以下に、製造方法４に記載の製造中間体（１０）のうち、n１=1、Ｌａ=O、及びLｂ=CR
２(-R３)の化合物（１０ｃ）の製造方法について詳述する。式（１０ｃ）で示される化合
物、その塩又はそれらの溶媒和物、例えば下記の方法で製造することができる。
【０１７９】
【化６３】
2018188455.tif 000064
【０１８０】
［式中、ＬＰ、Ｒ２、及びＲ３は前記と同じものを示し、Ｌはアセチル基又は水素原子等
を、Ｘ及びＹは１から３個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを、Ｐ５及びＰ７はアミノ
基の保護基を、Ｐ６はカルボキシ基の保護基を示す。］
【０１８１】
式（２４）で示される化合物は、特開２００２−６０３５１号公報に記載される手法や
文献（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５１巻，３１９６頁，１９８６年）記載の方法、もしく
はその方法を応用し、必要に応じて保護基の除去や官能基変換を行うことによって、製造
することができる。又は、末端アミノ基が保護されたアミノ酸又はアミノ基が保護された
オリゴペプチドの酸アミドをアルデヒド又はケトンと処理することによって得ることがで
きる。
化合物（２４）を、不活性な溶媒中、酸または塩基存在下に冷却下〜室温下で水酸基を
有する化合物（２５）と反応させることによって、化合物（２６）を製造することができ
る。用いる酸としては例えば、フッ化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無
機酸、酢酸、クエン酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等の有機酸、テトラ
フルオロボレート、塩化亜鉛、塩化スズ、塩化アルミニウム、塩化鉄等のルイス酸等を挙
げることができる。特にパラトルエンスルホン酸が好ましい。用いる塩基としては、前記
の塩基の中から適宜選択して使用すればよく、特にカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等のア
ルカリ金属アルコキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物
、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物、リチウムジイソプロピ
ルアミド等のジアルキルアミノリチウムに代表される有機金属塩基、リチウムビス（トリ
メチルシリル）アミド等のビスシリルアミンの有機金属塩基等が好ましい。反応に用いる
溶媒としては、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル系溶媒；ベンゼン
、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；等が用いられる。上記の溶媒は水との混合物とし
てもよい。また、Ｐ５に例示されるアミノ基の保護基としては、通常、アミノ基の保護に
用いられる基であれば特に制限はなく、代表的なものとして製造方法４で記載したアミノ
基の保護基を挙げることができるが、本反応中においてＰ５に例示されるアミノ基の保護
基が切断される場合がある。その場合には、必要に応じて適当なアミノ基の保護試薬と反
応させる必要がある。
化合物（２７）は、化合物（２６）の保護基Ｐ６を除去することによって製造すること
ができる。ここで、Ｐ６として例示されるカルボキシ基の保護基としては、代表的なもの
を製造方法４に記載したが、この場合にはアミノ基の保護基Ｐ５とカルボキシ基の保護基
Ｐ６が異なる方法又は条件で除去できる保護基であることが望ましい。例えば、Ｐ５が９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル基であり、Ｐ６がベンジル基である組み合わせ等
を代表的なものとして挙げることができる。それらの保護基は、アミノ基及びカルボキシ
基を保護する化合物の性質等に応じて取捨選択すればよく、それらの保護基の除去に際し
てもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
カルボン酸（２７）を活性エステル、混合酸無水物、又は酸ハロゲン化物等に誘導し、
塩基存在下、化合物（４）及びそれらの薬理上許容される塩と反応させることによって化
合物（２８）を製造し、得られた化合物（２８）の保護基Ｐ５を除去することによって化
合物（２９）を製造することができる。化合物（４）とカルボン酸（２７）との反応及び
保護基Ｐ６を除去する反応では、製造方法４で述べた試薬や反応条件と同様なものを用い
ればよい。
化合物（２９）と末端アミノ基が保護されたアミノ酸又はアミノ基が保護されたオリゴ
ペプチド（３０）を反応させることによって化合物（９ｃ）を製造し、得られた化合物（
９ｃ）の保護基Ｐ７を除去することによって化合物（１０ｃ）を製造することができる。
Ｐ７に例示されるアミノ基の保護基としては、通常、アミノ基の保護に用いられる基であ
れば特に制限はなく、代表的なものとして製造方法４で記載したアミノ基の保護基を挙げ
ることができ、その保護基の除去に際しても保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい
。化合物（２９）と化合物（３０）との反応では、ペプチド合成に通常使用される反応試
薬や条件を準用すればよい。上記の方法で製造した化合物（１０ｃ）は、上述の製造方法
に従って本発明化合物（１）に導くことができる。
【０１８２】
８．製造方法８
以下に、製造方法４に記載の製造中間体（２）のうち、n１=1、Lａ=O、及びLｂ=CR２(-
R３)の化合物（２ｃ）の製造方法について詳述する。式（２ｃ）で示される化合物、その
塩又はそれらの溶媒和物は、例えば下記の方法で製造することができる。
【０１８３】
【化６４】
2018188455.tif 000065
【０１８４】
［式中、Ｌ１’、Ｌ２、ＬＰ、Ｒ２、及びＲ３は前記と同じものを示し、Ｚは１から３個
のアミノ酸からなるオリゴペプチドを、Ｐ８はアミノ基の保護基を、Ｐ９はカルボキシ基
の保護基を示す。］
【０１８５】
末端アミノ基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸又はオリゴペプチド（３１）の保
護基Ｐ８を除去することによって化合物（３２）を製造し、得られたアミン体（３２）と
化合物（１１）を反応させることによって化合物（３３）を製造できる。Ｐ８に例示され
るアミノ基の保護基としては、通常、アミノ基の保護に用いられる基であれば特に制限は
なく、代表的なものとして製造方法４で記載したアミノ基の保護基を挙げることができる
。また、保護基Ｐ８の除去に際してもその保護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。
化合物（３２）とカルボン酸（１１）との反応では、製造方法４で述べた試薬や反応条件
と同様なものを用いればよい。
化合物（３３）の保護基Ｐ９を除去することによって化合物（３４）を製造し、得られ
たカルボン酸（３４）と化合物（２９）を反応させることによって製造中間体（２ｃ）を
製造した。Ｐ８として例示されるカルボキシ基の保護基としては、代表的なものを製造方
法４に記載したが、その脱保護反応では製造方法４で述べた試薬や反応条件と同様なもの
を用いればよい。また、化合物（２９）とカルボン酸（３４）との反応では、ペプチド合
成に通常使用される反応試薬や条件を準用すればよい。上記の方法で製造した化合物（２
ｃ）は、上述の製造方法に従って本発明化合物（１）に導くことができる。
【０１８６】
９．製造方法９
以下に、製造方法４に記載の製造中間体（１７）のうち、n１=1、Lａ=O、及びLｂ=CR２
(-R３)の化合物（１７ｃ）の製造方法について詳述する。式（１７ｃ）で示される化合物
、その塩又はそれらの溶媒和物は、例えば下記の方法によっても製造することができる。
【０１８７】
【化６５】
2018188455.tif 000066
【０１８８】
［式中、Ｌ１’、Ｌ２、ＬＰ、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｙ、Ｐ５、Ｐ６、及びＰ７は前記と同じ
ものを示す。］
【０１８９】
末端アミノ基及び末端カルボキシ基が保護された化合物（２６）のアミノ基の保護基Ｐ
５を脱保護することによって化合物（３５）を製造し、得られたアミン体（３５）と末端
アミノ基又はアミノ基が保護されたオリゴペプチド（３０）を反応させることによって化
合物（３６）を製造できる。Ｐ５に例示されるアミノ基の保護基としては、通常、アミノ
基の保護に用いられる基であれば特に制限はなく、代表的なものとして製造方法４で記載
したアミノ基の保護基を挙げることができる。また、保護基Ｐ５の除去に際してもその保
護基に応じた試薬や条件を選択すればよい。ここで、Ｐ６に例示されるカルボキシ基の保
護基およびＰ７に例示されるアミノ基の保護基としては、代表的なものとして製造方法４
で記載したカルボキシ基およびアミノ基の保護基を挙げることができるが、カルボキシ基
の保護基Ｐ６とアミノ基の保護基Ｐ７が同じ方法または条件で除去できる保護基が望まし
い。例えばＰ６がベンジルエステル基であり、Ｐ７がベンジルオキシカルボニル基である
組み合わせ等を代表的なものとして挙げることができる。
化合物（３７）は化合物（３６）のカルボキシ基の保護基Ｐ６とアミノ基の保護基Ｐ７
を除去することによって製造することができる。カルボキシ基の保護基Ｐ６とアミノ基の
保護基Ｐ７それぞれを順次除去することによっても化合物（３７）を製造することができ
るし、Ｐ６とＰ７が同じ方法または条件で除去できる保護基であれば、両者を一工程で除
去して化合物（３７）を製造することができる。
得られた化合物（３７）と化合物（１１）を反応させることによって化合物（１７ｃ）
を製造できる。化合物（３７）と化合物（１１）との反応では、製造方法４で述べた試薬
や反応条件と同様なものを用いればよい。
【０１９０】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートの製造において有用な製造中間体として次式：
【０１９１】
【化６６】
2018188455.tif 000067
【０１９２】
で示される化合物を先に説明したが、さらに次式：
Q-(CH2)nＱ-C(=O)-L２ａ-LＰ-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-Lｃ-(NH-DX)
で示される一群の化合物も本発明の抗体−薬物コンジュゲートの製造において有用な製造
中間体となる化合物である。
すなわち、上記式において，Ｑは、(maleimid-N-yl)-、HS-、X-CH2-C(=O)-NH-、又は(P
yrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-であり、
Ｘは、臭素原子又はヨウ素原子であり、
nＱは、整数の２から８であり、
L２ａは、-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-、又は単結合を示し、
ここで、n５は、１から６の整数を示し、
LＰは、２から７個のアミノ酸で構成されるペプチド残基を示し、
n１は、０から６の整数を示し、
Lａは、-C(=O)-NH-、-NR１-(CH2)n７-、-O-、又は単結合を示し、
ここで、n７は、１から６の整数を示し、R１は、水素原子、炭素数１から６のアルキル
基、-(CH2)n８-COOH、又は-(CH2)n９-OHを示すが、n８は、整数の１から４を示し、n９は
、１から６の整数を示し、
Lｂは、-CR２(-R３)-、-O-、-NR４-、又は単結合を示し、
ここで、R２及びR３は、各々独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、-(CH2)
nａ-NH2、-(CH2)nｂ-COOH、又は-(CH2)nｃ-OHを示し、R４は、水素原子又は炭素数１から
６のアルキル基を示し、nａは、０から６の整数を示し、nｂは、整数の１から４を示し、
nｃは、整数の１から４を示すが、nａが０であるときは、R２及びR３は同一とはならず、
Lｃは、-CH2-又は-C(=O)-を示し、
(maleimid-N-yl)-は、次式
【０１９３】
【化６７】
2018188455.tif 000068
【０１９４】
で示される構造の基（窒素原子が結合部位）であり、(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-は
、次式
【０１９５】
【化６８】
2018188455.tif 000069
【０１９６】
で示される構造の基（窒素原子が結合部位）であり、-(NH-DX)は、次式
【０１９７】
【化６９】
2018188455.tif 000070
【０１９８】
で示される構造の基（１位のアミノ基の窒素原子が結合部位）である。
【０１９９】
製造中間体としては、Lｃが-C(=O)-である化合物が好ましい。
また、LＰのペプチド残基としては、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リシン、
シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸からなるアミ
ノ酸残基である化合物が製造中間体として好ましい。このようなペプチド残基のうち、L
Ｐが４個のアミノ酸で構成されるペプチド残基である化合物が製造中間体として好ましい
。より具体的には、LＰが-GGFG-である化合物が製造中間体として好ましい。
さらに、-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-としては、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2
CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が製
造中間体として好ましく、より好ましくは、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-
(CH2)2-O-CH2-C(=O)-である化合物である。
nＱとしては、整数の２から６である化合物が製造中間体として好ましい。
L２ａは、単結合であるか、n５が整数の２から４の化合物が製造中間体として好ましい
。
【０２００】
また、Ｑが、(maleimid-N-yl)-である場合、nＱが、整数の２から５であり、L２ａが単
結合であり、-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2C
H2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が製
造中間体として好ましい。より好ましくは、-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、-NH-CH2CH2-、-N
H-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物である。さらに、n
Ｑが、整数の２又は５である化合物が好ましい。
【０２０１】
さらに、Ｑが、(maleimid-N-yl)-である場合、nＱが、整数の２から５であり、L２ａが
-NH-(CH2-CH2-O)n５-CH2-CH2-C(=O)-であって、n５が整数の２から４であり、-NH-(CH2)n
１-Lａ-Lｂ-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2C
H2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が製造中間体として好ましい
。より好ましくは、n５が整数の２又は４の化合物である。さらに、-NH-(CH2)n１-Lａ-L
ｂ-が、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が好まし
い。
【０２０２】
Ｑが、HS-である場合、nＱが、整数の２から５であり、L２ａが単結合であり、-NH-(CH
2)n１-Lａ-Lｂ-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2C
H2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が製造中間体として好ま
しい。より好ましくは、-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、
又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物である。
【０２０３】
Ｑが、X-CH2-C(=O)-NH-である場合、Ｘとしては臭素原子である化合物が製造中間体と
して好ましい化合物である。nＱは、整数の２から８である化合物が好ましく、L２ａが単
結合である化合物が好ましく、-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-C
H2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物が製造中間体として好ましい。
【０２０４】
Ｑが、(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-である場合、nＱが、整数の２から５で
あり、L２ａが単結合であり、-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が、-NH-CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2-
、-NH-CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-
である化合物が製造中間体として好ましい。より好ましくは、-NH-(CH2)n１-Lａ-Lｂ-が
、-NH-CH2CH2CH2-、-NH-CH2-O-CH2-、又は-NH-CH2CH2-O-CH2-である化合物である。
【０２０５】
より具体的には以下のものが製造中間体として好ましい化合物である。
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C
(=O)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O
)-(NH-DX)
(maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGF
G-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
Br-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
(Pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-
C(=O)-(NH-DX)
【０２０６】
なお、本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、大気中に放置したり、又は再結晶するこ
とにより、水分を吸収し、吸着水がついたり、水和物になる場合が有り、そのような水を
含む化合物及び塩も本発明に包含される。
また、本発明には、種々の放射性または非放射性同位体でラベルされた化合物も包含さ
れる。本発明の抗体−薬物コンジュゲートを構成する原子の１以上に、原子同位体の非天
然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、重水素（2Ｈ）、トリチウム（3Ｈ）
、ヨウ素−125（125Ｉ）または炭素−14（14Ｃ）等を挙げることができる。また、本発明
化合物は、例えば、トリチウム（3Ｈ）、ヨウ素−125（125Ｉ）または炭素−14（14Ｃ）
のような放射性同位体で放射性標識され得る。放射性標識された化合物は、治療または予
防剤、研究試薬、例えば、アッセイ試薬、及び診断剤、例えば、インビボ画像診断剤とし
て有用である。本発明の抗体−薬物コンジュゲートの全ての同位体変異種は、放射性であ
ると否とを問わず、本発明の範囲に包含される。
【０２０７】
＜医薬＞
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、癌細胞に対して細胞傷害活性を示すことから、
医薬として、特に癌に対する治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。
【０２０８】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートが適用される癌の種類としては、肺癌、腎癌、尿路
上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、
膀胱癌、胃癌、食道癌等を挙げることができるが、治療対象となる癌細胞において抗体−
薬物コンジュゲート中の抗体が認識できるタンパクを発現しているがん細胞であればこれ
らには限定されることはない。
【０２０９】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、哺乳動物に対して好適に投与することができる
が、より好ましくはヒトである。
【０２１０】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートが含まれる医薬組成物において使用される物質とし
ては、投与量や投与濃度において、この分野において通常使用される製剤添加物その他か
ら適宜選択して適用することができる。
【０２１１】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、１種以上の薬学的に適合性の成分を含む薬学的
組成物として投与され得る。例えば、上記薬学的組成物は、代表的には、１種以上の薬学
的キャリア（例えば、滅菌した液体（例えば、水および油（石油、動物、植物、または合
成起源の油（例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ごま油など）を含む））を含む。水
は、上記薬学的組成物が静脈内投与される場合に、より代表的なキャリアである。食塩水
溶液、ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、液体キャリアと
して、特に、注射用溶液のために使用され得る。適切な薬学的賦形剤は、当該分野で公知
である。上記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩
衝化剤を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
その処方は、投与の態様に対応する。
【０２１２】
種々の送達システムが公知であり、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与するため
に使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下の経路
が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、例えば、注入またはボーラス注射によ
るものであり得る。特定の好ましい実施形態において、上記リガンド薬物結合体の投与は
、注入によるものである。非経口的投与は、好ましい投与経路である。
【０２１３】
代表的実施形態において、上記薬学的組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合したた薬学
的組成物として、常習的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投与のための組成
物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合、上記医薬はまた、可
溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を
含み得る。一般に、上記成分は、（例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなど
の密封してシールされた容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水の濃縮物として、別個に、
または単位剤形中で一緒に混合して、のいずれかで供給される。上記医薬が注入によって
投与される予定である場合、それは、例えば、滅菌の製薬グレードの水または食塩水を含
む注入ボトルで投薬され得る。上記医薬が注射によって投与される場合、注射用滅菌水ま
たは食塩水のアンプルは、例えば、上記成分が投与前に混合され得るように、提供され得
る。
【０２１４】
本発明の医薬組成物には本願の抗体−薬物コンジュゲートのみを含む医薬組成物であっ
てもよいし、抗体−薬物コンジュゲート及び少なくとも一つのこれ以外の癌治療剤を含む
医薬組成物であってもよい。本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、他の癌治療剤と共に
投与することもでき、これによって抗癌効果を増強させることができる。このような目的
で使用される他の抗癌剤は、抗体−薬物コンジュゲートと同時に、別々に、あるいは連続
して個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このよう
な癌治療剤として、ａｂｒａｘａｎｅ、ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、
ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（ＣＰＴ−１１）、ｐａｃｌｉｔａｘｅ
ｌ、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ、ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ又は国際公開第
ＷＯ２００３／０３８０４３号パンフレットに記載の薬剤、更にＬＨ−ＲＨアナログ（リ
ュープロレリン、ゴセレリン等）、エストラムスチン・フォスフェイト、エストロジェン
拮抗薬（タモキシフェン、ラロキシフェン等）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール
、レトロゾール、エキセメスタン等）等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬
剤であれば限定されることはない。
【０２１５】
このような医薬組成物は、選択された組成と必要な純度を持つ製剤として、凍結乾燥製
剤あるいは液状製剤として製剤化すればよい。凍結乾燥製剤として製剤化する際には、こ
の分野において使用される適当な製剤添加物が含まれる製剤であってもよい。また液剤に
おいても同様にして、この分野において使用される各種の製剤添加物を含む液状製剤とし
て製剤化することができる。
【０２１６】
医薬組成物の組成及び濃度は投与方法によっても変化するが、本発明の医薬組成物に含
まれる抗体−薬物コンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲートの抗原に対する親和性、
すなわち、抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）の点において、親和性が高い（Ｋｄ値が低い
）ほど、少量の投与量であっても薬効を発揮させことができる。したがって、抗体−薬物
コンジュゲートの投与量の決定に当たっては、抗体−薬物コンジュゲートと抗原との親和
性の状況に基づいて投与量を設定することもできる。本発明の抗体−薬物コンジュゲート
をヒトに対して投与する際には、例えば、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇを１回あるい
は１〜１８０日間に１回の間隔で複数回投与すればよい。
【実施例】
【０２１７】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。また、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されるものではない
。また、本明細書において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源か
ら容易に入手可能である。
【０２１８】
参考例１  Ｍ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体
抗Ｂ７−Ｈ３抗体のヒト化抗体のうち、配列番号９においてアミノ酸番号２０乃至４７
１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２
３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を公知の方法によって製造し、得ら
れたヒト化抗Ｂ７−Ｈ３抗体をＭ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体（又は単に「Ｍ３０−Ｈ１−Ｌ４
」と記載）とした。
【０２１９】
参考例２  Ｍ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体
上記で得られたＭ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体に結合している糖鎖修飾を公知の方法によって
脱フコース化して調節し、得られた糖鎖修飾が調節されている抗体をＭ３０−Ｈ１−Ｌ４
Ｐ抗体（又は単に「Ｍ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ」と記載）とした。
【０２２０】
参考例３  抗ＣＤ３０抗体
抗ＣＤ３０抗体は特表２００５−５０６０３５を参照して作製した。その配列を配列番
号２７、２８に示した。
【０２２１】
参考例４  抗ＣＤ３３抗体
抗ＣＤ３３抗体は特開平８−４８６３７号を参照して作製した。その配列を配列番号２
９，３０示した。
【０２２２】
参考例５  抗ＣＤ７０抗体
抗ＣＤ７０抗体は特表２００８−５３８２９２を参照して作製した。その配列を配列番
号３１，３２に示した。
【０２２３】
実施例１  ４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロ
キシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒド
ロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２
−ｂ］キノリン−１−イル］ブタンアミド
【０２２４】
【化７０】
2018188455.tif 000071
【０２２５】
工程１：ｔｅｒｔ−ブチル（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−
ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキ
サヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［
１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）カーバメート
４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸（０．２３７ｇ、１．１３ｍｍ
ｏＬ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１
３０ｇ、１．１３ｍｍｏＬ）及び、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩（０．２１６ｇ、１．１３ｍｍｏＬ）を加え１時間撹拌した。その反
応溶液を化合物（４）のメシル酸塩（０．５００ｇ、０．９４ｍｍｏＬ）及び、トリエチ
ルアミン（０．１５７ｍＬ、１．１３ｍｍｏＬ）を加えたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
溶液（１０ｍＬ）に滴下し、室温にて一日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノ−ル＝
８：２（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．５９５ｇ、定量的）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈ
ｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．６６（２Ｈ
，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．８２−１．８９（２Ｈ，ｍ），２．１２−２．２１（３Ｈ
，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．１７（２
Ｈ，ｓ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．
８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５９−５．５５（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，
ｓ），６．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．７９（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：６２１（Ｍ＋Ｈ）＋
【０２２６】
工程２：４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキ
シ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ
−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−
ｂ］キノリン−１−イル］ブタンアミド
上記工程１で得た化合物（０．３８８ｇ、０．６１ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（９ｍ
Ｌ）に溶解した。トリフルオロ酢酸（９ｍＬ）を加え４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し
、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム
：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製し、標記化合物の
トリフルオロ酢酸塩（０．３４３ｇ、定量的）を得た。抗体−薬物コンジュゲート（１３
）、（１４）を担癌マウスに投与した際に、この化合物が腫瘍中で確認された。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈ
ｚ），１．７９−１．９２（４Ｈ，ｍ），２．１０−２．１７（２Ｈ，ｍ），２．２７（
２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．８０−２．８６（２Ｈ，ｍ）
，３．１５−３．２０（２Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２
６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５４−５．６１（１Ｈ
，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．７２（３Ｈ，ｂｒｓ），７
．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：５２１（Ｍ＋Ｈ）＋
【０２２７】
実施例２  抗体−薬物コンジュゲート（１）
【０２２８】
【化７１】
2018188455.tif 000072
【０２２９】
工程１：Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニ
ル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−
メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，
１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノ
リン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）グリシンアミド
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニルグリ
シン（０．０８１ｇ、０．１９ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（０．０２１ｇ、０．１９ｍｍｏＬ）及び、１−エチル−３−（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．０３６ｇ、０．１９ｍｍｏＬ
）を加え３．５時間撹拌した。その反応溶液を実施例１の化合物（０．０８０ｇ、０．１
５ｍｍｏＬ）を加えたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１．５ｍＬ）に滴下し、室温
にて４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノ−ル＝８：２（ｖ／ｖ）］にて精製し、
標記化合物（０．１０６ｇ、７３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．３６（９Ｈ，ｓ），１．７１（２Ｈ，ｍ），１．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８
Ｈｚ），２．１５−２．１９（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７７（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝１２．７，８．８Ｈｚ），３．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．１，４．７Ｈｚ）
，３．０８−３．１１（２Ｈ，ｍ），３．１６−３．１９（２Ｈ，ｍ），３．５４（２Ｈ
，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．５７−３．７７（４Ｈ，ｍ），４．４６−４．４８（１Ｈ
，ｍ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８
Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５５−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ
），７．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．１７−７．２６（５Ｈ，ｍ），７．３
１（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
１．０Ｈｚ），７．９２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．
２Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈ
ｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：９３９（Ｍ＋Ｈ）＋
【０２３０】
工程２：グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９
−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３
，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，
４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソ
ブチル）グリシンアミドトリフルオロ酢酸塩
上記工程１で得た化合物（１．９７ｇ、２．１０ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（７ｍＬ
）に溶解した。トリフルオロ酢酸（７ｍＬ）を加え１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、
トルエンを加えて共沸し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロ
ロホルム〜クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］に
て精製し、標記化合物（１．９７ｇ、９９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．７１−１．７３（２Ｈ，ｍ），１．８２−１．９０（２Ｈ，ｍ），２．１２−
２．２０（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，
９．４Ｈｚ），３．０３−３．０９（３Ｈ，ｍ），３．１８−３．１９（２Ｈ，ｍ），３
．５８−３．６０（２Ｈ，ｍ），３．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．６９（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，
ｄｄ，Ｊ＝１６．８，５．９Ｈｚ），４．５０−４．５６（１Ｈ，ｍ），５．１６（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ
，ｓ），５．５５−５．６０（１Ｈ，ｍ），７．１７−７．２７（５Ｈ，ｍ），７．３２
（１Ｈ，ｓ），７．７８−７．８１（２Ｈ，ｍ），７．９５−７．９７（３Ｈ，ｍ），８
．３３−８．３５（２Ｈ，ｍ），８．４８−８．５１（２Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：８３９（Ｍ＋Ｈ）＋
【０２３１】
工程３：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９
Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ
−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ
［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４
−オキソブチル）グリシンアミド
上記工程２で得た化合物（３３７ｍｇ，０．３５３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド（１．２ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（４４．３ｍＬ，０．３１８ｍｍｏＬ
）、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル（１１９．７ｍｇ，０．３８８ｍｍ
ｏＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ
）］にて精製し、標記化合物（２７８．０ｍｇ，７６％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈ
ｚ），１．１２−１．２２（２Ｈ，ｍ），１．４０−１．５１（４Ｈ，ｍ），１．６６−
１．７６（２Ｈ，ｍ），１．８０−１．９１（２Ｈ，ｍ），２．０５−２．２１（６Ｈ，
ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．０，９．８Ｈｚ），２
．９８−３．２１（５Ｈ，ｍ），３．５５−３．７７（８Ｈ，ｍ），４．４１−４．４８
（１Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
８．９Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ），５．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
７．１Ｈｚ），５．５４−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），６．９９（２
Ｈ，ｓ），７．２０−７．２７（５Ｈ，ｍ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．７０（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．０３（１Ｈ，ｔ
，Ｊ＝５．８Ｈｚ），８．０８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝７．９Ｈｚ），８．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８
．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１０３２（Ｍ＋Ｈ）＋
【０２３２】
工程４：抗体−薬物コンジュゲート（１）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｃ−１及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用
）を用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製
した。本溶液（１．２５ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに１
０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０２５ｍＬ；抗体一分子に対し
て３．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，
Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを
確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフィ
ド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０．１０９ｍＬ）と上記工程３で得た化合物を１
０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０３９ｍＬ；抗体一分子に対して４．６当量
）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用い
て室温下４０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００８ｍＬ）を加え、さら
に室温下２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１３．０２ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９．１ｍｇ（７３％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．４
【０２３３】
実施例３  抗体−薬物コンジュゲート（２）
【０２３４】
【化７２】
2018188455.tif 000073
【０２３５】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−
１を用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（４．０ｍ
Ｌ）を１５ｍＬチューブに採取し、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液
（０．１１８ｍＬ；抗体一分子に対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶
液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．２００ｍＬ）を加えた。本溶液のｐ
Ｈが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートするこ
とによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例２の工程３で得た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．
２３６ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュベー
トし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌ
ｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００４７１ｍＬ）を加え、さらに２２℃にて２
０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を１７．５ｍＬ得た
。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１．８０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２６．１ｍｇ（６５％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：５．９
【０２３６】
実施例４  抗体−薬物コンジュゲート（３）
【０２３７】
【化７３】
2018188455.tif 000074
【０２３８】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（３）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｃ−１及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用
）を用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製
した。本溶液（１．２５ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに１
０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液０．０５１ｍＬ（抗体一分子に対して
６．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉ
ｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確
認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフィド
結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０．０６７ｍＬ）と実施例２の工程３で得た化合
物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０８５ｍＬ；抗体一分子に対して１０
．０当量）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社
）を用いて室温下６０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ
ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１３ｍＬ）を加
え、さらに室温下２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１．６７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１０．０２ｍｇ（８０％），抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：６．３
【０２３９】
実施例５  抗体−薬物コンジュゲート（４）
【０２４０】
【化７４】
2018188455.tif 000075
【０２４１】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（４）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｃ−１及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用
）を用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製
した。本溶液（１．２５ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに１
０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０５１ｍＬ；抗体一分子に対し
て６．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，
Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを
確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフィ
ド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０．０２５ｍＬ）と実施例２の工程３で得た化合
物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．１２７ｍＬ；抗体一分子に対して１５
．０当量）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社
）を用いて室温下６０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ
ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１９ｍＬ）を加
え、さらに室温下２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１．１９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：７．１４ｍｇ（５７％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：７．５
【０２４２】
実施例６  抗体−薬物コンジュゲート（５）
【０２４３】
【化７５】
2018188455.tif 000076
【０２４４】
実施例４と実施例５の抗体−薬物コンジュゲートのほぼ全量を混合し、共通操作Ａを使
用して溶液を濃縮し、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１５．３７ｍｇ，抗体一分子あたりの薬物平
均結合数（ｎ）：６．７
【０２４５】
実施例７  抗体−薬物コンジュゲート（６）
【０２４６】
【化７６】
2018188455.tif 000077
【０２４７】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（６）
抗体の還元：参考例３にて作製した抗ＣＤ３０抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．７５を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤ
ＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を２ｍＬチューブに採取し、
１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液０．０２９７ｍＬ（抗体一分子に対
して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ
，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを
確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジス
ルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例２の工程３で得た化合物１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．０５９
３ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュベートし
、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒ
ｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１１９ｍＬ；抗体一分子に対して１８．４当量）
を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた
。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２７
０４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：０．９９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５．９４ｍｇ（５９％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．３
【０２４８】
実施例８  抗体−薬物コンジュゲート（７）
【０２４９】
【化７７】
2018188455.tif 000078
【０２５０】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（７）
抗体の還元：参考例３にて作製した抗ＣＤ３０抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．７５を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤ
ＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を２ｍＬチューブに採取し、
３０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０１４８ｍＬ；抗体一分子に
対して６．９当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕ
ｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であること
を確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジ
スルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例２の工程３で得た化合物３０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．０２９
７ｍＬ；抗体一分子に対して１３．８当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュベート
し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄ
ｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１７８ｍＬ；抗体一分子に対して２７．６当量
）を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させ
た。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２７
０４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：０．９９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５．９４ｍｇ（５９％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．８
【０２５１】
実施例９  抗体−薬物コンジュゲート（８）
【０２５２】
【化７８】
2018188455.tif 000079
【０２５３】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（８）
抗体の還元：参考例４にて作製した抗ＣＤ３３抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．６６を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤ
ＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を２ｍＬチューブに採取し、
１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０２９７ｍＬ；抗体一分子に
対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕ
ｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であること
を確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジ
スルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例２の工程３で得た化合物１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．０５９
３ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュベートし
、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒ
ｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１１９ｍＬ；抗体一分子に対して１８．４当量）
を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた
。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２５
６４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１．０６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６．３６ｍｇ（６４％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．４
【０２５４】
実施例１０  抗体−薬物コンジュゲート（９）
【０２５５】
【化７９】
2018188455.tif 000080
【０２５６】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（９）
抗体の還元：参考例４にて作製した抗ＣＤ３３抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．６６を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤ
ＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を２ｍＬチューブに採取し、
３０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０１４８ｍＬ；抗体一分子に
対して６．９当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕ
ｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であること
を確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジ
スルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例２の工程３で得た化合物３０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．０２９
７ｍＬ；抗体一分子に対して１３．８当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュベート
し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄ
ｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１７８ｍＬ；抗体一分子に対して２７．６当量
）を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させ
た。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２５
６４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：０．９５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５．７０ｍｇ（５７％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．７
【０２５７】
実施例１１  抗体−薬物コンジュゲート（１０）
【０２５８】
【化８０】
2018188455.tif 000081
【０２５９】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１０）
抗体の還元：参考例５にて作製した抗ＣＤ７０抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．６９を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤ
ＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を２ｍＬチューブに採取し、
１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０２９７ｍＬ；抗体一分子に
対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕ
ｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であること
を確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジ
スルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例２の工程３で得た化合物１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．０５９
３ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュベートし
、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒ
ｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１１９ｍＬ；抗体一分子に対して１８．４当量）
を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた
。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２６
２４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１．００ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６．００ｍｇ（６０％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．２
【０２６０】
実施例１２  抗体−薬物コンジュゲート（１１）
【０２６１】
【化８１】
2018188455.tif 000082
【０２６２】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１１）
抗体の還元：参考例５にて作製した抗ＣＤ７０抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．６９を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤ
ＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を２ｍＬチューブに採取し、
３０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０１４８ｍＬ；抗体一分子に
対して６．９当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕ
ｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であること
を確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジ
スルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例２の工程３で得た化合物３０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．０２９
７ｍＬ；抗体一分子に対して１３．８当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュベート
し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄ
ｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１７８ｍＬ；抗体一分子に対して２７．６当量
）を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させ
た。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２６
２４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：０．９６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５．７６ｍｇ（５８％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．６
【０２６３】
実施例１３  抗体−薬物コンジュゲート（１２）
【０２６４】
【化８２】
2018188455.tif 000083
【０２６５】
工程１：Ｎ−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）プロパノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９
Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ
−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ
［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４
−オキソブチル）グリシンアミド
実施例２の工程２で得た化合物（８０ｍｇ，０．０８４ｍｍｏＬ）を、６−マレイミド
ヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりに３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイ
ミジル（２４．６ｍｇ，０．０９２４ｍｍｏＬ）を用いて、実施例２の工程３と同様に反
応させ、標記化合物（６０．０ｍｇ，７３％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈ
ｚ），１．７０−１．７８（２Ｈ，ｍ），１．８１−１．９４（２Ｈ，ｍ），２．１２−
２．２３（４Ｈ，ｍ），２．４２（３Ｈ，ｓ），２．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，
９．８Ｈｚ），３．０１−３．１５（３Ｈ，ｍ），３．１６−３．２３（２Ｈ，ｍ），３
．３０−３．３５（１Ｈ，ｍ），３．５８−３．７１（６Ｈ，ｍ），３．７１−３．７９
（１Ｈ，ｍ），４．４４−４．５１（１Ｈ，ｍ），５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．０Ｈ
ｚ），５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．０Ｈｚ），５．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈ
ｚ），５．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ），５．５７−５．６３（１Ｈ，ｍ），６
．５６（１Ｈ，ｓ），７．０２（２Ｈ，ｓ），７．１７−７．２２（１Ｈ，ｍ），７．２
２−７．３０（５Ｈ，ｍ），７．３４（１Ｈ，ｓ），７．７３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈ
ｚ），７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），８．０８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ
），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．３０（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１８．７，５
．７Ｈｚ），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：９９０（Ｍ＋Ｈ）＋
【０２６６】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（１２）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び上記工程１で得た化合物を用いて
、実施例２の工程４と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１２．１６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．５ｍｇ（６８％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．４
【０２６７】
実施例１４  抗体−薬物コンジュゲート（１３）
【０２６８】
【化８３】
2018188455.tif 000084
【０２６９】
工程１：Ｎ−｛３−［２−（２−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ
−ピロール−１−イル）プロパノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシ］プロパノイル｝グ
リシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−
５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０
，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，
７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）グ
リシンアミド
実施例２の工程２で得た化合物（１００ｍｇ，０．１１９ｍｍｏＬ）を、トリエチルア
ミンの代わりにジイソプロピルエチルアミン（２０．８μＬ，０．１１９ｍｍｏＬ）を、
６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりに３−（２−（２−（３−マレ
インイミドプロパンアミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸Ｎ−スクシンイミジル（５
０．７ｍｇ，０．１１９ｍｍｏＬ）を用いて、実施例２の工程３と同様に反応させ、標記
化合物（６６．５ｍｇ，４８％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．６５−１．７４（２Ｈ，ｍ），１．７７−１．９０（２Ｈ，ｍ），２．０７−
２．１９（４Ｈ，ｍ），２．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．３３−２．３６（
２Ｈ，ｍ），２．３８（３Ｈ，ｓ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，９．８Ｈｚ
），２．９６−３．１８（９Ｈ，ｍ），３．４２−３．４４（４Ｈ，ｍ），３．５３−３
．７６（１０Ｈ，ｍ），４．４３（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８．６，４．７Ｈｚ），５．１４（
１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．３８（
１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．５２−
５．５８（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），６．９８（２Ｈ，ｓ），７．１２−７．
１７（１Ｈ，ｍ），７．１８−７．２５（４Ｈ，ｍ），７．２９（１Ｈ，ｓ），７．６９
（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），７．９８−
８．０３（２Ｈ，ｍ），８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｔ，
Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
９．０Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１１４９（Ｍ＋Ｈ）＋
【０２７０】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（１３）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び上記工程１で得た化合物を用いて
、実施例２の工程４と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１２．７６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．９ｍｇ（７１％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．４
【０２７１】
実施例１５  抗体−薬物コンジュゲート（１４）
【０２７２】
【化８４】
2018188455.tif 000085
【０２７３】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１４）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び実施例１４の工程１で得た化合物
を用いて、実施例４の工程１と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得
た。
抗体濃度：１．６０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９．６０ｍｇ（７７％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：６．１
【０２７４】
実施例１６  抗体−薬物コンジュゲート（１５）
【０２７５】
【化８５】
2018188455.tif 000086
【０２７６】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１５）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び実施例１４の工程１で得た化合物
を用いて、実施例５の工程１と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得
た。
抗体濃度：１．６４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９．８４ｍｇ（７９％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：７．１
【０２７７】
実施例１７  抗体−薬物コンジュゲート（１６）
【０２７８】
【化８６】
2018188455.tif 000087
【０２７９】
実施例１５と実施例１６の抗体−薬物コンジュゲートのほぼ全量を混合し、共通操作Ａ
を使用して溶液を濃縮し、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１７．３０ｍｇ，抗体一分子あたりの薬物平
均結合数（ｎ）：６．５
【０２８０】
実施例１８  抗体−薬物コンジュゲート（１７）
【０２８１】
【化８７】
2018188455.tif 000088
【０２８２】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１７）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−
１を用いて、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１００ｍ
Ｌ、抗体１ｇ）を２５０ｍＬフラスコに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会
社）水溶液（２．４３ｍＬ；抗体一分子に対して３．６当量）を加え、さらに１Ｍ  リン
酸水素二カリウム水溶液（５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４付近であることをｐ
Ｈメーターで確認した後、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒン
ジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（３．５１ｍＬ；抗体一分子に対して
５．２当量）及びジメチルスルホキシド（２．１４ｍＬ）を室温下加え、１５℃水浴中で
攪拌子で１３０分攪拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ
水溶液（０．５４７ｍＬ）を加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし、薬物リン
カーの反応を停止させた。
精製：上記溶液に対して、限外ろ過膜（メルク株式会社、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｃａ
ｓｓｅｔｔｅ、Ｂｉｏｍａｘ  ５０ＫＤａ）、チューブポンプ（米国コールパーマー社マ
スターフレックスポンプ  ｍｏｄｅｌ  ７７５２１−４０、ポンプヘッド  ｍｏｄｅｌ  
７５１８−００）及びチューブ（米国コールパーマー社マスターフレックスチューブ  Ｌ
／Ｓ１６）で構成された限外ろ過装置を用い、限外ろ過精製を行った。すなわち、反応液
に精製緩衝液としてＡＢＳを滴下しながら（計８００ｍＬ）、限外ろ過精製を行うことで
、未結合の薬物リンカー及び他の低分子量試薬を除去するとともに緩衝液をＡＢＳへ置換
し、さらに濃縮まで行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を約７０ｍＬ得
た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１４．５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１.０ｇ（約１００％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．５
【０２８３】
実施例１９  抗体−薬物コンジュゲート（１８）
【０２８４】
【化８８】
2018188455.tif 000089
【０２８５】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１８）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−
１を用いて、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５ｍＬ、
抗体５０ｍｇ）を１５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社
）水溶液（０．１３５ｍＬ；抗体一分子に対して４当量）を加えた。本溶液のｐＨが７．
４付近であることをｐＨメーターで確認した後、３７℃で１時間インキュベートすること
によって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．２１９ｍＬ；抗体一分子に対し
て６．５当量）及びジメチルスルホキシド（０．０６４ｍＬ）を加え、１５℃水浴中で９
０分インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ水
溶液（０．０３３ｍＬ；抗体一分子に対して９．８当量）を加え、さらに室温にて２０分
間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を１９ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：２．１７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４１ｍｇ（８２％），抗体一分子あたりの薬
物平均結合数（ｎ）：５．０
【０２８６】
実施例２０  抗体−薬物コンジュゲート（１９）
【０２８７】
【化８９】
2018188455.tif 000090
【０２８８】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（１９）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−
１を用いて、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（４ｍＬ、
抗体４０ｍｇ）を１５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社
）水溶液（０．１４０ｍＬ；抗体一分子に対して５．２当量）を加えた。本溶液のｐＨが
７．４付近であることをｐＨメーターで確認した後、３７℃で１時間インキュベートする
ことによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．２３２ｍＬ；抗体一分子に対し
て８．６当量）を加え、１５℃水浴中で９０分インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ
結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ水溶液（０．０３５ｍＬ；抗体一分子に対して１
２．９当量）を加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を
停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を１３ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：２．３６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：３１ｍｇ（７７％），抗体一分子あたりの薬
物平均結合数（ｎ）：５．９
【０２８９】
実施例２１  抗体−薬物コンジュゲート（２０）
【０２９０】
【化９０】
2018188455.tif 000091
【０２９１】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２０）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体を、製造方法１に記載した共
通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１
を用いて、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．２５ｍ
Ｌ、抗体１２．５ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工
業株式会社）水溶液（０．０２８７ｍＬ；抗体一分子に対して３．４当量）及び１Ｍリン
酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ
）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時
間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０４３９ｍＬ；抗体一分子に対
して５．２当量）及びジメチルスルホキシド（０．０２６７ｍＬ）を室温下加え、１５℃
の水浴中で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍ
Ｍ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００６６ｍＬ）
を加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．７ｍｇ（７０％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：３．５
【０２９２】
実施例２２  抗体−薬物コンジュゲート（２１）
【０２９３】
【化９１】
2018188455.tif 000092
【０２９４】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２１）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体を、製造方法１に記載した共
通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１
を用いて、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．２５ｍ
Ｌ、抗体１２．５ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工
業株式会社）水溶液（０．０４３９ｍＬ；抗体一分子に対して５．２当量）（０．０２８
７ｍＬ；抗体一分子に対して３．４当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃ
ａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．
４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによっ
て、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０７２６ｍＬ；抗体一分子に対
して８．６当量）を室温下加え、１５℃の水浴中で１時間インキュベートし、薬物リンカ
ーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ
．ＬＬＣ）水溶液（０．０１１ｍＬ）を加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし
、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．３ｍｇ（６６％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：５．５
【０２９５】
実施例２３  抗体−薬物コンジュゲート（２２）
【０２９６】
【化９２】
2018188455.tif 000093
【０２９７】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２２）
抗体の還元：参考例３にて作製した抗ＣＤ３０抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．７５ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１を用いて
、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（０．４ｍＬ、抗体４
ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶
液（０．００６５ｍＬ；抗体一分子に対して２．５当量）を加え、３７℃で１時間インキ
ュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０１１６ｍＬ；抗体一分子に対
して４．５当量）及びジメチルスルホキシド（０．００９８ｍＬ）を室温下加え、チュー
ブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて室温下１時間攪拌し、
薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ
ｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００１７ｍＬ）を加え、さらに室温にて２０分間イン
キュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２７
０４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：０．８６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２．２ｍｇ（５４％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：２．５
【０２９８】
実施例２４  抗体−薬物コンジュゲート（２３）
【０２９９】
【化９３】
2018188455.tif 000094
【０３００】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２３）
抗体の還元：参考例３にて作製した抗ＣＤ３０抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．７５ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１を用いて
、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（０．３５ｍＬ、抗体
３．５ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社
）水溶液（０．０１１３ｍＬ；抗体一分子に対して５当量）を加え、３７℃で１時間イン
キュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０２０４ｍＬ；抗体一分子に対
して９当量）及びプロピレングリコール（関東化学株式会社、０．１８ｍＬ）を室温下加
え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて室温下１時
間攪拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００３１ｍＬ）を加え、さらに室温にて２
０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２７
０４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：０．４１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１．０ｍｇ（２９％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：７．１
【０３０１】
実施例２５  抗体−薬物コンジュゲート（２４）
【０３０２】
【化９４】
2018188455.tif 000095
【０３０３】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２４）
抗体の還元：参考例４にて作製した抗ＣＤ３３抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．６６ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１を用いて
、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（０．４ｍＬ、抗体４
ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶
液（０．００６５ｍＬ；抗体一分子に対して２．５当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム
水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．００５８ｍＬ）を加えた。本溶
液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベート
することで、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０１１６ｍＬ；抗体一分子に対
して４．５当量）及びジメチルスルホキシド（０．０１０１ｍＬ）を室温下加え、チュー
ブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて室温下１時間攪拌し、
薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ
ｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００１７ｍＬ）を加え、さらに室温にて２０分間イン
キュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２５
６４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１．２５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：３．１ｍｇ（７８％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：３．７
【０３０４】
実施例２６  抗体−薬物コンジュゲート（２５）
【０３０５】
【化９５】
2018188455.tif 000096
【０３０６】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２５）
抗体の還元：参考例４にて作製した抗ＣＤ３３抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．６６ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１を用いて
、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（０．４ｍＬ、抗体４
ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶
液（０．０１２９ｍＬ；抗体一分子に対して５当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶
液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．００６ｍＬ）を加えた。本溶液のｐ
Ｈが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートするこ
とで、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０２３３ｍＬ；抗体一分子に対
して９当量）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会
社）を用いて室温下１時間攪拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ
ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００３５ｍＬ）を
加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２５
６４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１．１７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２．９ｍｇ（７３％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：７．３
【０３０７】
実施例２７  抗体−薬物コンジュゲート（２６）
【０３０８】
【化９６】
2018188455.tif 000097
【０３０９】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２６）
抗体の還元：参考例５にて作製した抗ＣＤ７０抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．６９ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１を用いて
、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（０．４ｍＬ、抗体４
ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶
液（０．００６５ｍＬ；抗体一分子に対して２．５当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム
水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．００５８ｍＬ）を加えた。本溶
液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベート
することで、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０１１６ｍＬ；抗体一分子に対
して４．５当量）及びジメチルスルホキシド（０．０１０１ｍＬ）を室温下加え、チュー
ブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて室温下１時間攪拌し、
薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ
ｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００１７ｍＬ）を加え、さらに室温にて２０分間イン
キュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２６
２４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１．１４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２．９ｍｇ（７１％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：３．８
【０３１０】
実施例２８  抗体−薬物コンジュゲート（２７）
【０３１１】
【化９７】
2018188455.tif 000098
【０３１２】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（２７）
抗体の還元：参考例５にて作製した抗ＣＤ７０抗体を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ
（２８０ｎｍ吸光係数として１．６９ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１を用いて
、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（０．４ｍＬ、抗体４
ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶
液（０．０１２９ｍＬ；抗体一分子に対して５当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶
液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．００６ｍＬ）を加えた。本溶液のｐ
Ｈが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートするこ
とで、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例１４の工程１で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０２３３ｍＬ；抗体一分子に対
して９当量）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会
社）を用いて室温下１時間攪拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ
ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００３５ｍＬ）を
加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２６
２４００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝４９６４（
実測値）、εＤ，３７０＝１８９８２（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１．１３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２．８ｍｇ（７１％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：７．４
【０３１３】
実施例２９  抗体−薬物コンジュゲート（２８）
【０３１４】
【化９８】
2018188455.tif 000099
【０３１５】
工程１：Ｎ−［１９−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イ
ル）−１７−オキソ−４，７，１０，１３−テトラオキソ−１６−アザノナデカン−１−
オイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９
−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３
，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，
４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソ
ブチル）グリシンアミド
実施例２の工程２で得た化合物（９０ｍｇ，０．１０７ｍｍｏＬ）を、トリエチルアミ
ンの代わりにジイソプロピルエチルアミン（１８．７μＬ，０．１０７ｍｍｏＬ）を、６
−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりに１−マレインイミド−３−オキ
ソ−７，１０，１３，１６−テトラオキサ−４−アザノナデカン−１９−酸Ｎ−スクシン
イミジル（５５．１ｍｇ，０．１０７ｍｍｏＬ）を用いて、実施例２の工程３と同様に反
応させ、標記化合物（５０ｍｇ，３７％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈ
ｚ），１．６４−１．７４（２Ｈ，ｍ），１．７７−１．９０（２Ｈ，ｍ），２．０６−
２．１９（４Ｈ，ｍ），２．２７−２．３２（２Ｈ，ｍ），２．３３−２．３７（２Ｈ，
ｍ），２．３８（３Ｈ，ｓ），２．７２−２．８０（３Ｈ，ｍ），２．９６−３．１９（
６Ｈ，ｍ），３．３９−３．４８（１０Ｈ，ｍ），３．５２−３．７５（１０Ｈ，ｍ），
４．３９−４．４８（１Ｈ，ｍ），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２３
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ），５．４２
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ），５．５２−５．５８（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，
ｓ），６．９８（１Ｈ，ｓ），７．１３−７．２４（５Ｈ，ｍ），７．２９（１Ｈ，ｓ）
，７．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），
７．９８−８．０３（２Ｈ，ｍ），８．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．１６（
１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．４４（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１２３７（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３１６】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（２８）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｃ−１及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用
）を用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製
した。本溶液（１．２５ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに１
０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０２５ｍＬ；抗体一分子に対し
て３．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，
Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを
確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフィ
ド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０．１０２ｍＬ）と上記工程１で得た化合物を１
０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０４７ｍＬ；抗体一分子に対して５．５当量
）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用い
て室温下４０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００９）ｍＬを加え、さら
に室温下２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１３．６０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９．５ｍｇ（７６％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．３
【０３１７】
実施例３０  抗体−薬物コンジュゲート（２９）
【０３１８】
【化９９】
2018188455.tif 000100
【０３１９】
工程１：Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−β−アラニルグリシルグリシル−Ｌ−
フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒ
ドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサ
ヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１
，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）グリシンアミド
実施例２の工程２で得た化合物（０．８３９ｇ，１．００ｍｍｏＬ）を、４−（ｔｅｒ
ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸の代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニ
ル）−β−アラニンを用いて実施例１の工程１と同様に反応させ、得られた粗生成物を精
製せずに次の工程に用いた。
【０３２０】
工程２：β−アラニルグリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ
，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオ
キソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピ
ラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝
−４−オキソブチル）グリシンアミド
上記工程１で得た粗生成物を、実施例２の工程２と同様に反応させ、標記化合物（０．
６１０ｇ，６７％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．６７−１．７７（２Ｈ，ｍ），１．７９−１．９２（２Ｈ，ｍ），２．０９−
２．２２（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．４６−２．５５（２Ｈ，ｍ），２．
８２−２．７３（１Ｈ，ｍ），２．９５−３．１３（５Ｈ，ｍ），３．１４−３．２１（
２Ｈ，ｍ），３．５５−３．８０（６Ｈ，ｍ），４．４４−４．５２（１Ｈ，ｍ），５．
２０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３５．０，１９．０Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５３−
５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５４（１Ｈ，ｓ），７．１４−７．２８（５Ｈ，ｍ），７．
３１（１Ｈ，ｓ），７．６７（２Ｈ，ｂｒｓ），７．７２−７．７８（１Ｈ，ｍ），７．
８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．１０−８．１７（２Ｈ，ｍ），８．２９（１
Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．４２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
【０３２１】
工程３：Ｎ−（ブロモアセチル）−β−アラニルグリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニ
ル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−
メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，
１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノ
リン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）グリシンアミド
２−ブロモ酢酸（９６．３ｍｇ，０．６９３ｍｍｏＬ）のジクロロメタン（４．５ｍＬ
）溶液へ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（７９．７ｍｇ，０．６９３ｍｍｏＬ）、１，
３−ジイソプロピルカルボジイミド（０．１０７ｍＬ，０．６９３ｍｍｏＬ）を加え室温
で撹拌した。反応溶液を、上記工程２で得た化合物（４７３ｍｇ，０．４６２ｍｍｏＬ）
、トリエチルアミン（０．１５４ｍＬ，１．１１ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（４．５ｍＬ）溶液へ０℃で加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー［溶出溶媒：クロロホルム〜クロロホルム：メタノール＝８５：
１５（ｖ／ｖ）］にて精製し、得られた固体をクロロホルム：メタノール：ジエチルエー
テル混合溶媒にて洗浄することで、標記化合物（１９１ｍｇ，４０％）を淡黄色固体とし
て得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．６７−１．７７（２Ｈ，ｍ），１．７９−１．９２（２Ｈ，ｍ），２．０８−
２．２２（４Ｈ，ｍ），２．３３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．４０（３Ｈ，ｓ）
，２．７４−２．８３（１Ｈ，ｍ），２．９９−３．１２（３Ｈ，ｍ），３．１４−３．
２１（２Ｈ，ｍ），３．２４−３．３０（２Ｈ，ｍ），３．５６−３．７７（６Ｈ，ｍ）
，３．８２（２Ｈ，ｓ），４．４１−４．５１（１Ｈ，ｍ），５．２０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝
１８．９Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｓ），５．５４−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５４（
１Ｈ，ｓ），７．１５−７．２７（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．６９−７．
７４（１Ｈ，ｍ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｔ，Ｊ
＝５．７Ｈｚ），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．２１−８．３４（３Ｈ，
ｍ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０３０，１０３２（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３２２】
工程４：抗体−薬物コンジュゲート（２９）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｃ−１及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用
）を用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製
した。本溶液（１．２５ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに１
０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０２５ｍＬ；抗体一分子に対し
て３．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，
Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを
確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフィ
ド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０．０９ｍＬ）と上記工程３で得た化合物を１０
ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０５９ｍＬ；抗体一分子に対して７．０当量）
を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて
室温下４０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００９ｍＬ）を加え、さらに
室温下２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１３．９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９．７ｍｇ（７８％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：３．２
【０３２３】
実施例３１  抗体−薬物コンジュゲート（３０）
【０３２４】
【化１００】
2018188455.tif 000101
【０３２５】
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び実施例３０の工程３で得た化合物
を用いて、実施例４の工程１と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得
た。
抗体濃度：１．９４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１１．６４ｍｇ（９３％），抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：５．６
【０３２６】
実施例３２  抗体−薬物コンジュゲート（３１）
【０３２７】
【化１０１】
2018188455.tif 000102
【０３２８】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（３１）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び実施例３０の工程３で得た化合物
を用いて、実施例５の工程１と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得
た。
抗体濃度：１．９０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１１．４０ｍｇ（９１％），抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：６．７
【０３２９】
実施例３３  抗体−薬物コンジュゲート（３２）
【０３３０】
【化１０２】
2018188455.tif 000103
【０３３１】
実施例３１と実施例３２の抗体−薬物コンジュゲートのほぼ全量を混合し、共通操作Ａ
を使用して溶液を濃縮し、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２１．０６ｍｇ，抗体一分子あたりの薬物平
均結合数（ｎ）：６．０
【０３３２】
実施例３４  抗体−薬物コンジュゲート（３３）
【０３３３】
【化１０３】
2018188455.tif 000104
【０３３４】
工程１：ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（｛Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−
［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リジル｝アミノ）ブタノ
エート
Ｎε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎα−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメ
トキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン（１．００ｇ，２．１４ｍｍｏＬ）、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド（０．３７０ｇ，３．２０ｍｍｏＬ）、及びｔｅｒｔ−ブチル４−アミノ
ブタン酸エステル塩酸塩（０．８３０ｇ，４．２７ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（１０．０ｍＬ）溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩（０．６１０ｇ，３．２０ｍｍｏＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミン（０．４１０ｍｌ，２．３５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３日間撹拌した。反応液
を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽
和食塩水で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、標
記化合物（１．３５ｇ，定量的）を無色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．１４−１．４２（４Ｈ，ｍ），
１．３６（９Ｈ，ｓ），１．３７（９Ｈ，ｓ），１．４８−１．６７（４Ｈ，ｍ），２．
１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．８４−２．９３（２Ｈ，ｍ），２．９９−３．
１１（２Ｈ，ｍ），３．８４−３．９４（１Ｈ，ｍ），４．１８−４．３０（３Ｈ，ｍ）
，６．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．３３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７
．３９−７．４５（３Ｈ，ｍ），７．７３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．３，２．７Ｈｚ），７
．８５−７．９２（３Ｈ，ｍ）．
【０３３５】
工程２：ｔｅｒｔ−ブチル  ４−｛［Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リ
ジル］アミノ｝ブタノエート
上記工程１で得た化合物（１．３５ｇ，２．２２ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（８．００ｍＬ）溶液に、ピペリジン（２．００ｍＬ）を加え、室温で１．５時間
撹拌した。溶媒を減圧留去し、標記化合物を含む混合物を得た。本混合物は、これ以上の
精製は行わずに次の反応に用いた。
【０３３６】
工程３：Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−バリル−Ｎ
６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−４−オキソブ
チル）−Ｌ−リシンアミド
上記工程２で得た混合物（２．２２ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０
．０ｍＬ）溶液に、Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−
バリン（１．１３ｇ，３．３２ｍｍｏＬ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３１０
ｇ，２．６６ｍｍｏＬ）、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩（０．５５０ｇ，２．８８ｍｍｏＬ）を加え、室温にて１８時間撹拌した
。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄後
、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残留物をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール＝９：１
（ｖ／ｖ）］にて精製し、（０．３６３ｇ，２３％）を無色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８４（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈ
ｚ），１．１２−１．６４（８Ｈ，ｍ），１．３４（９Ｈ，ｓ），１．３８（９Ｈ，ｓ）
，１．９０−２．０４（１Ｈ，ｍ），２．１７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．７９
−２．９０（２Ｈ，ｍ），２．９９−３．０９（２Ｈ，ｍ），３．８３−３．９１（１Ｈ
，ｍ），４．０８−４．４４（４Ｈ，ｍ），６．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７
．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．７
４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．８５−７．９１（４Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７０９（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３３７】
工程４：Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−バリル−Ｎ
−（３−カルボキシプロピル）−Ｌ−リシンアミドギ酸塩
上記工程３で得た化合物（０．３６３ｍｇ，０．５１２ｍｍｏＬ）にギ酸（１０．０ｍ
ｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、標記化合物を得た。本化合物
は、これ以上の精製は行わずに次の反応に用いた。
【０３３８】
工程５：Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−バリル−Ｎ
６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−Ｌ−リシン
アミド
上記工程４で得た化合物（０．５１２ｍｍｏＬ）の１，４−ジオキサン（５．００ｍＬ
）懸濁液に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０．０ｍｌ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチル
ジカルボネート（０．１７８ｍｌ，０．７６９ｍｍｏＬ）を加え、室温にて３時間撹拌し
た。反応液を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液及び飽和食塩水で洗浄後、有機
層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、標記化合物（０．２９５ｇ
，８８％）を無色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８４（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈ
ｚ），１．１３−１．３９（４Ｈ，ｍ），１．３５（９Ｈ，ｓ），１．４８−１．６２（
４Ｈ，ｍ），１．９１−２．０４（１Ｈ，ｍ），２．２０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
，２．８０−２．８９（２Ｈ，ｍ），２．９９−３．１１（２Ｈ，ｍ），３．８７（１Ｈ
，ｄｄ，Ｊ＝８．５，６．７Ｈｚ），４．０６−４．３５（４Ｈ，ｍ），６．７１（１Ｈ
，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３９−７．４６
（３Ｈ，ｍ），７．７４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．８３−７．９４（４Ｈ，ｍ
）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６５３（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３３９】
工程６：Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−バリル−Ｎ
６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−
５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０
，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，
７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）−
Ｌ−リシンアミド
化合物（４）のメシル酸塩（０．２４０ｇ、０．４５２ｍｍｏＬ）を、４−（ｔｅｒｔ
−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸の代わりに上記工程５で得た化合物（０．２９５
ｇ，０．４５２ｍｍｏＬ）を用いて、実施例１の工程１と同様に反応させ、標記化合物（
０．２０８ｇ，４３％）を淡橙色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０７１（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３４０】
工程７：Ｌ−バリル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ
，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオ
キソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピ
ラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝
−４−オキソブチル）−Ｌ−リシンアミド
上記工程６で得た化合物（０．２０８ｇ，０．１９４ｍｍｏＬ）を、上記工程２と同様
に反応させ、標記化合物を含む混合物を得た。本混合物は、これ以上の精製は行わずに次
の反応に用いた。
【０３４１】
工程８：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（４−
｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，
１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ
［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル
］アミノ｝−４−オキソブチル）−Ｌ−リシンアミド
上記工程７で得た混合物（０．１９４ｍｍｏＬ）を、実施例２の工程３と同様に反応さ
せ、標記化合物（０．１３３ｇ，５６％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７７（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈ
ｚ），０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．１４−１．７１（１０Ｈ，ｍ），１
．３５（９Ｈ，ｓ），１．７７−１．９５（３Ｈ，ｍ），２．０２−２．２３（７Ｈ，ｍ
），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．８４（３Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．０５（２Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．１７（２Ｈ，ｓ），３．２６−３．３９（３Ｈ，ｍ），４．
０１−４．１６（２Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２４（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．３６−５．４８（２Ｈ，ｍ），５．５１−５．６０（
１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），６．９９
（２Ｈ，ｓ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７１−７．８５（５Ｈ，ｍ），８．４１（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０４１（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３４２】
工程９：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フル
オロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，
１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］イン
ドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）−Ｌ−リシ
ンアミドトリフルオロ酢酸塩
上記工程８で得た化合物（０．１１０ｍｇ，０．１０６ｍｍｏＬ）のジクロロメタン（
１０．０ｍｌ）溶液に、トリフルオロ酢酸（４．００ｍｌ）を加え、室温で５時間撹拌し
た。減圧下溶媒を留去し、標記化合物（７０．０ｍｇ，６４％）を淡黄色固体として得た
。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７６−０．８１（６Ｈ，ｍ），
０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．１２−１．３１（４Ｈ，ｍ），１．３９−
１．５６（８Ｈ，ｍ），１．５７−１．７４（３Ｈ，ｍ），１．７９−１．９６（３Ｈ，
ｍ），２．０６−２．１８（７Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７０−２．８０（
２Ｈ，ｍ），３．０１−３．１０（２Ｈ，ｍ），３．１３−３．２２（２Ｈ，ｍ），４．
０４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．１０−４．２０（１Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．３６−５．
４７（２Ｈ，ｍ），５．５２−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），７．００
（２Ｈ，ｓ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．６１（３Ｈ，ｂｒｓ），７．７５−７．８８
（４Ｈ，ｍ），８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９４１（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３４３】
工程１０：抗体−薬物コンジュゲート（３３）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び上記工程９で得た化合物を用いて
、実施例２９の工程２と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１２．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．４ｍｇ（６７％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：３．２
【０３４４】
実施例３５  抗体−薬物コンジュゲート（３４）
【０３４５】
【化１０４】
2018188455.tif 000105
【０３４６】
工程１：Ｎ−（３−スルファニルプロパノイル）グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニ
ル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−
メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，
１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノ
リン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）グリシンアミド
実施例２の工程２で得た化合物（８４．０ｍｇ，０．１００ｍｍｏＬ）を、６−マレイ
ミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりに３−メルカプトプロピオン酸Ｎ−スクシ
ンイミジルを用いて実施例２の工程３と同様に反応させ、標記化合物（６１．２ｍｇ，６
６％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．７７
−１．６６（２Ｈ，ｍ），１．７９−１．９２（２Ｈ，ｍ），２．０７−２．２４（４Ｈ
，ｍ），２．３１−２．４７（３Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．５９−２．６９
（２Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，９．８Ｈｚ），２．９８−３．１
３（３Ｈ，ｍ），３．１４−３．２３（２Ｈ，ｍ），３．５４−３．７９（６Ｈ，ｍ），
４．４０−４．５０（１Ｈ，ｍ），５．２０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３６．８，１９．２Ｈｚ
），５．３６−５．４７（２Ｈ，ｍ），５．５２−５．６３（１Ｈ，ｍ），６．５４（１
Ｈ，ｓ），７．１４−７．２８（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．６８−７．７
４（１Ｈ，ｍ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），８．０３−８．０９（１Ｈ
，ｍ），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．１９−８．２９（２Ｈ，ｍ），８
．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９２７（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３４７】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（３４）
抗体のＳＭＣＣ誘導体化：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、共通操作
Ｃ−２及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）を用い
て、媒体をＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡに置換し、２０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製した。本
溶液（０．２５ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、ここにｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−
４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏ
ｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎ
ｃ．）を２７．６ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（０．００６３ｍＬ；抗体一分子に対して約２．
５５当量相当）を室温下加え、室温で２時間反応させた。この反応液を共通操作Ｄ−２を
用いた精製を行い、ＳＭＣＣ誘導体化された抗体を約５ｍｇ含む溶液を０．７ｍＬ得た。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ＤＭＳＯ（０．０４５ｍＬ）と
上記工程１で得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（０．０１５ｍＬ；抗体一分子に対
して約２．４当量相当）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，  ア
ズワン株式会社）を用いて室温下１６時間攪拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。
精製：上記溶液を、共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）を用いた精製を行い、
標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を３．５ｍＬ得たのち、共通操作Ａを使用
して、溶液を濃縮した。
特性評価：共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３５３００（計算推定値
）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（実測平均値）、εＤ，
３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：３．８５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：０．８ｍｇ（１６％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：２．９
【０３４８】
実施例３６  抗体−薬物コンジュゲート（３５）
【０３４９】
【化１０５】
2018188455.tif 000106
【０３５０】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（３５）
抗体のＳＭＣＣ誘導体化：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、共通操作
Ｃ−２及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）を用い
て、媒体をＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡに置換し、２０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製した。本
溶液（０．２５ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、ここにｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−
４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏ
ｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ
．）を２７．６ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（０．０１２５ｍＬ；抗体一分子に対して約５．１
当量相当）を室温下加え、室温で２時間反応させた。この反応液を共通操作Ｄ−２を用い
た精製を行い、ＳＭＣＣ誘導体化された抗体を約５ｍｇ含む溶液を０．７ｍＬ得た。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ＤＭＳＯ（０．０３ｍＬ）と実
施例３５の工程１で得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（０．０３ｍＬ；抗体一分子
に対して約４．８当量相当）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，
アズワン株式会社）を用いて室温下１６時間攪拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。
精製：上記溶液を、共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）を用いた精製を行い、
標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を３．５ｍＬ得たのち、共通操作Ａを使用
して、溶液を濃縮した。
特性評価：共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３５３００（計算推定値
）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（実測平均値）、εＤ，
３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．４３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：０．５ｍｇ（１０％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：４．２
【０３５１】
実施例３７  抗体−薬物コンジュゲート（３６）
【０３５２】
【化１０６】
2018188455.tif 000107
【０３５３】
工程１：Ｎ−｛８−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−８−オキソ
オクタノイル｝グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ
）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−
２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［
３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−
オキソブチル）グリシンアミド
実施例２の工程２で得た化合物（８４．０ｍｇ，０．１００ｍｍｏＬ）を、６−マレイ
ミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりにスベリン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）
を用いて実施例２の工程３と同様に反応させ、標記化合物（７７．１ｍｇ，７１％）を淡
黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．２１
−１．３８（４Ｈ，ｍ），１．４３−１．５０（２Ｈ，ｍ），１．５５−１．６３（２Ｈ
，ｍ），１．６８−１．７６（２Ｈ，ｍ），１．８０−１．９１（２Ｈ，ｍ），２．０７
−２．２２（６Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．６０−２．６７（２Ｈ，ｍ），２
．７６−２．８４（５Ｈ，ｍ），２．９７−３．２２（５Ｈ，ｍ），３．５６−３．７６
（６Ｈ，ｍ），４．４０−４．５０（１Ｈ，ｍ），５．２０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝１８．８Ｈ
ｚ），５．３７−５．４８（２Ｈ，ｍ），５．５３−５．６２（１Ｈ，ｍ），６．５４（
１Ｈ，ｓ），７．１５−７．２８（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７１（１Ｈ
，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），８．０４（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．０９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．１４（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０９２（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３５４】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（３６）
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ
抗体を、共通操作Ｃ−２及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−
１を使用）を用いて、媒体をＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡに置換し、２０ｍｇ／ｍＬの抗体濃
度に調製した。本溶液（０．２５ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、ここに、上記工程
１にて得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液０．０２５ｍＬ（抗体一分子に対して約３
．７当量相当）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式
会社）を用いて室温下１６時間攪拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。
精製：上記溶液を、共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）を用いた精製を行い、
標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を３．５ｍＬ得たのち、共通操作Ａを使用
して、溶液を濃縮した。
特性評価：共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３５３００（計算推定値
）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（実測平均値）、εＤ，
３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：６．２５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１．３ｍｇ（２６％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：３．２
【０３５５】
実施例３８  抗体−薬物コンジュゲート（３７）
【０３５６】
【化１０７】
2018188455.tif 000108
【０３５７】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（３７）
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ
抗体を、共通操作Ｃ−２及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−
１を使用）を用いて、媒体をＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡに置換し、２０ｍｇ／ｍＬの抗体濃
度に調製した。本溶液（０．５ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れたのち、ここに、ＤＭ
ＳＯ（０．０２５ｍＬ）と実施例３７の工程１にて得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶
液（０．０２５ｍＬ；抗体一分子に対して約７．４当量相当）を室温下加え、チューブ・
ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて室温下１６時間攪拌し、薬
物リンカーを抗体へ結合させた。
精製：上記溶液を、共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）を用いた精製を行い、
標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を３．５ｍＬ得たのち、共通操作Ａを使用
して、溶液を濃縮した。
特性評価：共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３５３００（計算推定値
）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（実測平均値）、εＤ，
３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：４．３６ｍｇ／ｍＬ，  抗体収量：０．９ｍｇ（１８％），  抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：４．１
【０３５８】
実施例３９  抗体−薬物コンジュゲート（３８）
【０３５９】
【化１０８】
2018188455.tif 000109
【０３６０】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（３８）
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：参考例３にて作製した抗ＣＤ３０抗体を、共
通操作Ｃ−２及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．７５ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）
を用いて、媒体をＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製し
た。本溶液（０．４ｍＬ、抗体４ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れたのち、ここに、Ｄ
ＭＳＯ（０．０１７ｍＬ）と実施例３７の工程１にて得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ
溶液（０．０２３ｍＬ；抗体一分子に対して９当量相当）を室温下加え、チューブ・ロー
テーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて室温下４時間攪拌し、薬物リン
カーを抗体へ結合させた。
精製：上記溶液を、共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）を用いた精製を行い、
標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２７０４００（計算推定値
）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝２６７０（実測値）、εＤ，３７
０＝１５８２０（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：０．５５ｍｇ／ｍＬ，  抗体収量：１．４ｍｇ（３４％），  抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：２．７
【０３６１】
実施例４０  抗体−薬物コンジュゲート（３９）
【０３６２】
【化１０９】
2018188455.tif 000110
【０３６３】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（３９）
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：参考例４にて作製した抗ＣＤ３３抗体を、共
通操作Ｃ−２及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６６ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）
を用いて、媒体をＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製し
た。本溶液（０．４ｍＬ、抗体４ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れたのち、ここに、Ｄ
ＭＳＯ（０．０１７ｍＬ）と実施例３７の工程１にて得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ
溶液（０．０２３ｍＬ；抗体一分子に対して９当量相当）を室温下加え、チューブ・ロー
テーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて室温下４時間攪拌し、薬物リン
カーを抗体へ結合させた。
精製：上記溶液を、共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）を用いた精製を行い、
標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２５６４００（計算推定値
）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝２６７０（実測値）、εＤ，３７
０＝１５８２０（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：０．９３ｍｇ／ｍＬ，  抗体収量：２．３ｍｇ（５８％），  抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：４．０
【０３６４】
実施例４１  抗体−薬物コンジュゲート（４０）
【０３６５】
【化１１０】
2018188455.tif 000111
【０３６６】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（４０）
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：参考例５にて作製した抗ＣＤ７０抗体を、共
通操作Ｃ−２及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６９ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）
を用いて、媒体をＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製し
た。本溶液（０．４ｍＬ、抗体４ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れたのち、ここに、Ｄ
ＭＳＯ（０．０１７ｍＬ）と実施例３７の工程１にて得た化合物を１０ｍＭ含むＤＭＳＯ
溶液（０．０２３ｍＬ；抗体一分子に対して９当量相当）を室温下加え、チューブ・ロー
テーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて室温下４時間攪拌し、薬物リン
カーを抗体へ結合させた。
精製：上記溶液を、共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）を用いた精製を行い、
標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を２．５ｍＬ得た。
特性評価：共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２６２４００（計算推定値
）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝２６７０（実測値）、εＤ，３７
０＝１５８２０（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：１．０４ｍｇ／ｍＬ，  抗体収量：２．６ｍｇ（６５％），  抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：４．１
【０３６７】
実施例４２  ２−（２−アミノエトキシ）−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フ
ルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３
，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］イ
ンドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アセトアミド
【０３６８】
【化１１１】
2018188455.tif 000112
【０３６９】
工程１：ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ
−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５
−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリ
ジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）エチル］カー
バメート
化合物（４）のメシル酸塩（３．１０ｇ、５．４７ｍｏＬ）を、４−（ｔｅｒｔ−ブト
キシカルボニルアミノ）ブタン酸の代わりに｛２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）
アミノ］エトキシ｝酢酸（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９２年，３５巻，２９２８項）
（１．５５ｇ，６．０１ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程１と同様に反応させ、標記
化合物（２．５６ｇ，７３％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈ
ｚ），１．２６（９Ｈ，ｓ），１．８１−１．９１（２Ｈ，ｍ），２．１３−２．２２（
２Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），３．０８−３．２６（４Ｈ，ｍ），３．４３−３．
５３（２Ｈ，ｍ），４．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），４．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝１５．１Ｈｚ），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝１８．７Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ），５．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝１６．６Ｈｚ），５．５９−５．６６（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），６．８６
（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０
．９Ｈｚ），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：６３７（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３７０】
工程２：２−（２−アミノエトキシ）−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオ
ロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１
５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インド
リジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アセトアミド
上記工程１で得た化合物（１．５０ｇ，２．３６ｍｏｌ）を、実施例１の工程２と同様
に反応させ、標記化合物のトリフルオロ塩酸塩（１．５０ｇ，定量的）を淡黄色固体とし
て得た。抗体−薬物コンジュゲート（４１）を担癌マウスに投与した際に、この化合物が
腫瘍中で確認された。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈ
ｚ），１．８１−１．９２（２Ｈ，ｍ），２．１５−２．２３（２Ｈ，ｍ），２．４１（
３Ｈ，ｓ），３．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），３．１５−３．２３（２Ｈ，ｍ）
，３．７１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．１０（２Ｈ，ｓ），５．１９（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．４３（２Ｈ，ｓ
），５．５８−５．６６（１Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．３３（１Ｈ，ｓ），
７．７３−７．８４（４Ｈ，ｍ），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：５３７（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３７１】
実施例４３  抗体−薬物コンジュゲート（４１）
【０３７２】
【化１１２】
2018188455.tif 000113
【０３７３】
工程１：Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニ
ル−Ｎ−［２−（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ
−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−
１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ
］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）エチル］グリシンアミド
実施例４２の化合物（５５４ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）を、実施例２の工程１と同様に
反応させ、標記化合物（７７５ｍｇ，９５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈ
ｚ），１．３６（９Ｈ，ｓ），１．７８−１．８９（２Ｈ，ｍ），２．１３−２．２２（
２Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．４，９．８Ｈｚ
），２．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．４，４．３Ｈｚ），３．０９−３．２３（１Ｈ，
ｍ），３．２３−３．３２（２Ｈ，ｍ），３．４０−３．６２（８Ｈ，ｍ），３．７３（
１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．５，５．５Ｈｚ），４．０３（２Ｈ，ｓ），４．３９−４．４７
（１Ｈ，ｍ），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
８．９Ｈｚ），５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ），５．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
６．８Ｈｚ），５．５７−５．６４（１Ｈ，ｍ），６．５４（１Ｈ，ｓ），６．９９（１
Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），７．１３−７．２６（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），
７．７６−７．８２（２Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．１３（
１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），８．４９（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：９５５（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３７４】
工程２：グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［２−（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ
）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−
２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［
３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−
オキソエトキシ）エチル］グリシンアミドトリフルオロ酢酸塩
上記工程１で得た化合物（６３０ｍｇ，０．６５９ｍｍｏｌ）を、実施例２の工程２と
同様に反応させ、標記化合物（５８８ｍｇ，９２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈ
ｚ），１．７９−１．９０（２Ｈ，ｍ），２．１３−２．２２（２Ｈ，ｍ），２．３９（
３Ｈ，ｓ），２．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．４，１０．１Ｈｚ），２．９９（１Ｈ，
ｄｄ，Ｊ＝１３．４，４．３Ｈｚ），３．０９−３．２３（１Ｈ，ｍ），３．２４−３．
３２（３Ｈ，ｍ），３．４１−３．７１（７Ｈ，ｍ），３．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６
．８，５．８Ｈｚ），４．０４（２Ｈ，ｓ），４．５２（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝９．０，４．
１Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．
９Ｈｚ），５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ），５．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．
５Ｈｚ），５．５６−５．６５（１Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．１３−７．２
６（５Ｈ，ｍ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７
．８７−８．０１（４Ｈ，ｍ），８．２９−８．３６（２Ｈ，ｍ），８．４６−８．５５
（２Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：８５５（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３７５】
工程３：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［２−（２−｛［（１
Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジ
オキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］
ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ
｝−２−オキソエトキシ）エチル］グリシンアミド
上記工程２で得た化合物（２４０ｍｇ，０．２４７ｍｍｏｌ）を、実施例２の工程３と
同様に反応させ、標記化合物（１６２ｍｇ，６２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈ
ｚ），１．１３−１．２２（２Ｈ，ｍ），１．４０−１．５１（４Ｈ，ｍ），１．７８−
１．９０（２Ｈ，ｍ），２．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．１４−２．２１（
２Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．６，９．７Ｈｚ
），２．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．６，４．５Ｈｚ），３．０８−３．２４（１Ｈ，
ｍ），３．２４−３．３０（１Ｈ，ｍ），３．３３−３．４０（４Ｈ，ｍ），３．４７−
３．６８（７Ｈ，ｍ），３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．６，５．７Ｈｚ），４．０３
（２Ｈ，ｓ），４．４２（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８．６，４．２Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．５７−５．６４
（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ，ｓ），７．１３−７．２５（５
Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７４−７．８１（２Ｈ，ｍ），７．９９（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．０３−８．１１（２Ｈ，ｍ），８．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５
．７Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１０４８（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３７６】
工程４：抗体−薬物コンジュゲート（４１）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び上記工程３で得た化合物を用いて
、実施例２９の工程２と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１２．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．４ｍｇ（６７％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：３．５
【０３７７】
実施例４４  抗体−薬物コンジュゲート（４２）
【０３７８】
【化１１３】
2018188455.tif 000114
【０３７９】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（４２）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び実施例４３の工程３で得た化合物
を用いて、実施例５の工程１と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得
た。
抗体濃度：０．８３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４．９８ｍｇ（４０％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：７．２
【０３８０】
実施例４５  抗体−薬物コンジュゲート（４３）
【０３８１】
【化１１４】
2018188455.tif 000115
【０３８２】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（４３）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び実施例４３の工程３で得た化合物
を用いて、実施例４の工程１と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得
た。
抗体濃度：１．０６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６．３６ｍｇ（５１％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：６．３
【０３８３】
実施例４６  抗体−薬物コンジュゲート（４４）
【０３８４】
【化１１５】
2018188455.tif 000116
【０３８５】
実施例４４と実施例４５の抗体−薬物コンジュゲートのほぼ全量を混合し、共通操作Ａ
を使用して溶液を濃縮し、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１０．２１ｍｇ，抗体一分子あたりの薬物平
均結合数（ｎ）：６．６
【０３８６】
実施例４７  抗体−薬物コンジュゲート（４５）
【０３８７】
【化１１６】
2018188455.tif 000117
【０３８８】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（４５）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体を、製造方法１に記載した共
通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１
を用いて、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．２５ｍ
Ｌ、抗体１２．５ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工
業株式会社）水溶液（０．０２８７ｍＬ；抗体一分子に対して３．４当量）及び１Ｍリン
酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ
）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時
間インキュベートすることによって、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例４３の工程３で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０４３９ｍＬ；抗体一分子に対
して５．２当量）及びジメチルスルホキシド（０．０２６７ｍＬ）を室温下加え、１５℃
の水浴中で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍ
Ｍ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００６６ｍＬ）
を加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５１９３（
実測値）、εＤ，３７０＝２０３４７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９．３ｍｇ（７４％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：３．７
【０３８９】
実施例４８  抗体−薬物コンジュゲート（４６）
【０３９０】
【化１１７】
2018188455.tif 000118
【０３９１】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（４６）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体を、製造方法１に記載した共
通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−１
を用いて、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．２５ｍ
Ｌ、抗体１２．５ｍｇ）を１．５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工
業株式会社）水溶液（０．０４３９ｍＬ；抗体一分子に対して５．２当量）（０．０２８
７ｍＬ；抗体一分子に対して３．４当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃ
ａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．
４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによっ
て、抗体内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例４３の工程３で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０７２６ｍＬ；抗体一分子に対
して８．６当量）を室温下加え、１５℃の水浴中で１時間インキュベートし、薬物リンカ
ーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ
．ＬＬＣ）水溶液（０．０１１ｍＬ）を加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし
、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５１９３（
実測値）、εＤ，３７０＝２０３４７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：７．８ｍｇ（６２％），抗体一分子あたりの
薬物平均結合数（ｎ）：５．２
【０３９２】
実施例４９  Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−
メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，
１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノ
リン−１−イル］−β−アラニンアミド
【０３９３】
【化１１８】
2018188455.tif 000119
【０３９４】
工程１：ｔｅｒｔ−ブチル  （３−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９
−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘ
キサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ
［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−３−オキソプロピル）カーバメート
化合物（４）のメシル酸塩（５００ｍｇ、０．９４１ｍｍｏＬ）を、４−（ｔｅｒｔ−
ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸の代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）
−β−アラニンを用いて、実施例１の工程１と同様に反応させ、標記化合物（６１６ｍｇ
、定量的）を黄茶色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈ
ｚ），１．２９（９Ｈ，ｓ），１．８６（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１５．１，７．３Ｈｚ），２
．０４−２．２２（２Ｈ，ｍ），２．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．４０（３
Ｈ，ｓ），３．１０−３．２６（４Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ）
，５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１８．８，１
６．４Ｈｚ），５．５７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．５，４．２Ｈｚ），６．５３（１Ｈ，ｓ
），６．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．８０（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６０７（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３９５】
工程２：Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチ
ル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２
Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン
−１−イル］−β−アラニンアミド
上記工程１で得た化合物を、実施例１の工程２と同様に反応させ、標記化合物（４９９
ｍｇ、８６％）のトリフルオロ酢酸塩を黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈ
ｚ），１．８６（２Ｈ，ｄｑｕｉｎ，Ｊ＝１４．６，７．２，７．２，７．２，７．２Ｈ
ｚ），２．０６−２．２７（１Ｈ，ｍ），２．４１（３Ｈ，ｓ），２．４６−２．５７（
２Ｈ，ｍ），３．０８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．１４−３．２４（２Ｈ，ｍ）
，５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ）
，５．４３（２Ｈ，ｓ），５．５８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．５，４．５Ｈｚ），６．５５
（１Ｈ，ｓ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．７４（３Ｈ，ｂｒｓ），７．８２（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０７（Ｍ＋Ｈ）＋
【０３９６】
実施例５０  抗体−薬物コンジュゲート（４７）
【０３９７】
【化１１９】
2018188455.tif 000120
【０３９８】
工程１：Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニ
ルグリシル−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−
メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，
１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノ
リン−１−イル］−β−アラニンアミド
実施例４９の化合物（４８４ｍｇ、０．７８０ｍｍｏＬ）を、実施例２の工程１と同様
に反応させ、標記化合物（６２６ｍｇ、８７％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．２７−１．４２（９Ｈ，ｍ），１．７７−１．９３（２Ｈ，ｍ），２．０６−
２．２２（２Ｈ，ｍ），２．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．４０（３Ｈ，ｄ，
Ｊ＝１．６Ｈｚ），２．４４−２．５４（２Ｈ，ｍ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４
．５，１０．２Ｈｚ），３．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．９，４．５Ｈｚ），３．１２
−３．２２（２Ｈ，ｍ），３．５２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．４２−４．５４
（１Ｈ，ｍ），５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
８．４Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１８．４，１６．４Ｈｚ），５．５７（１Ｈ
，ｄｔ，Ｊ＝８．７，４．４Ｈｚ），６．５３（１Ｈ，ｓ），６．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝
５．９Ｈｚ），７．１４−７．２８（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７７−７
．８４（１Ｈ，ｍ），７．９１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝７．８Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９
．０Ｈｚ）．
【０３９９】
工程２：グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニルグリシル−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９
−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３
，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，
４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］−β−アラニンアミド
トリフルオロ酢酸塩
上記工程１で得た化合物（６２４ｍｇ、０．６７５ｍｍｏＬ）を、実施例２の工程２と
同様に反応させ、標記化合物（６２６ｍｇ、９２％）を黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．８６（２Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１４．５，７．２Ｈｚ），２．０７−２．２２（２Ｈ
，ｍ），２．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．４４−２
．５４（２Ｈ，ｍ），２．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，９．８Ｈｚ），３．０４（
１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，４．３Ｈｚ），３．１２−３．２２（２Ｈ，ｍ），３．５８
（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），３．６９（３Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１１．２，５．７Ｈｚ），
３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．０，５．７Ｈｚ），４．５４（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝１７．
８，４．５Ｈｚ），５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝１８．８Ｈｚ），５．４３（２Ｈ，ｓ），５．５１−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５５
（１Ｈ，ｓ），７．１４−７．２９（５Ｈ，ｍ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．８１（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），７．８８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），７．９７（３Ｈ
，ｂｒｓ），８．２９−８．３８（２Ｈ，ｍ），８．５０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）
，８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８２５（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４００】
工程３：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニルグリシル−Ｎ−［（１Ｓ，９
Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ
−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ
［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］−β−アラニ
ンアミド
上記工程２で得た化合物（６０．０ｍｇ、０．０６４６ｍｍｏＬ）を、実施例２の工程
３と同様に反応させ、標記化合物（１４．０ｍｇ、２１％）を固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈ
ｚ），１．１２−１．２２（２Ｈ，ｍ），１．３９−１．５１（４Ｈ，ｍ），１．７９−
１．９１（２Ｈ，ｍ），２．０２−２．２０（２Ｈ，ｍ），２．０７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７
．４Ｈｚ），２．３０−２．４２（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７８（１Ｈ
，ｄｄ，Ｊ＝１４．１，９．４Ｈｚ），３．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．７，４．９Ｈ
ｚ），３．１２−３．２１（２Ｈ，ｍ），３．２６−３．４２（２Ｈ，ｍ），３．５０−
３．８０（６Ｈ，ｍ），４．４０−４．５１（１Ｈ，ｍ），５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
９．６Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｂｒｓ），
５．５１−５．６２（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ，ｓ），７．
１３−７．２８（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．７４−７．８４（２Ｈ，ｍ）
，８．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８
．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．５
３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０１８（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４０１】
工程４：抗体−薬物コンジュゲート（４７）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び上記工程３で得た化合物を用いて
、実施例２の工程４と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１２．２７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．６ｍｇ（６９％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．４
【０４０２】
実施例５１  抗体−薬物コンジュゲート（４８）
【０４０３】
【化１２０】
2018188455.tif 000121
【０４０４】
工程１：Ｎ−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）プロパノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニルグリシル−Ｎ−［（１Ｓ，９
Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ
−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ
［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］−β−アラニ
ンアミド
実施例５０の工程２で得た化合物（６０．０ｍｇ、０．０６４６ｍｍｏＬ）を、６−マ
レイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりに３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ス
クシンイミジルを用いて、実施例２の工程３と同様に反応させ、標記化合物（３６．０ｍ
ｇ、５７％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．８５（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１４．４，７．５Ｈｚ），２．０５−２．２２（２Ｈ
，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．３０−２．４４（５Ｈ，ｍ），２．７３−２．８４
（１Ｈ，ｍ），３．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．９，４．５Ｈｚ），３．１７（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），３．２６−３．４０（２Ｈ，ｍ），３．４１−３．８１（６Ｈ，
ｍ），４．４０−４．５１（１Ｈ，ｍ），５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５
．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｂｒｓ），５．５２−５．６
１（１Ｈ，ｍ），６．５３（１Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ，ｓ），７．１３−７．２８（
５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），８．０
３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．２０−
８．３１（２Ｈ，ｍ），８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９７６（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４０５】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（４８）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び上記工程１で得た化合物を用いて
、実施例２の工程４と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１１．５９ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．１ｍｇ（６５％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．７
【０４０６】
実施例５２  抗体−薬物コンジュゲート（４９）
【０４０７】
【化１２１】
2018188455.tif 000122
【０４０８】
工程１：Ｎ−｛３−［２−（２−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ
−ピロール−１−イル）プロパノイル］アミノ｝）エトキシ］プロパノイル｝グリシルグ
リシル−Ｌ−フェニルアラニルグリシル−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フル
オロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，
１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］イン
ドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］−β−アラニンアミド
実施例５０の工程２で得た化合物（６０．０ｍｇ、０．０６４６ｍｍｏＬ）を、６−マ
レイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりに３−（２−（２−（３−マレインイ
ミドプロパンアミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸Ｎ−スクシンイミジルを用いて、
実施例２の工程３と同様に反応させ、標記化合物（２３．０ｍｇ、３１％）を固体として
得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．７７−１．９２（２Ｈ，ｍ），２．０７−２．２１（２Ｈ，ｍ），２．２７−
２．４２（６Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．７４−２．８４（１Ｈ，ｍ），２．
９７−３．０６（１Ｈ，ｍ），３．０９−３．２１（４Ｈ，ｍ），３．２５−３．３９（
６Ｈ，ｍ），３．４５（４Ｈ，ｓ），３．５０−３．８０（８Ｈ，ｍ），４．４１−４．
５１（１Ｈ，ｍ），５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．４Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｍ，Ｊ
＝１８．４Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｂｒｓ），５．５１−５．６１（１Ｈ，ｍ），６．
５４（１Ｈ，ｓ），７．００（２Ｈ，ｓ），７．１３−７．２８（５Ｈ，ｍ），７．３１
（１Ｈ，ｓ），７．７４−７．８７（２Ｈ，ｍ），７．９３−８．０７（２Ｈ，ｍ），８
．０９−８．２１（２Ｈ，ｍ），８．２６（１Ｈ，ｂｒｓ），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１１３５（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４０９】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（４９）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び上記工程１で得た化合物を用いて
、実施例２９の工程２と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１４．５０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１０．２ｍｇ（８２％），抗体一分子あた
りの薬物平均結合数（ｎ）：３．８
【０４１０】
実施例５３  抗体−薬物コンジュゲート（５０）
【０４１１】
【化１２２】
2018188455.tif 000123
【０４１２】
工程１：Ｎ−［１９−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イ
ル）−１７−オキソ−４，７，１０，１３−テトラオキサ−１６−アザノナンデカン−１
−オイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニルグリシル−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−
９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，
３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’
，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］−β−アラニンアミ
ド
実施例５０の工程２で得た化合物（６０．０ｍｇ、０．０６４６ｍｍｏＬ）を、６−マ
レイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルの代わりに１−マレインイミド−３−オキソ−
７，１０，１３，１６−テトラオキサ−４−アザノナデカン酸Ｎ−スクシンイミジルを用
いて、実施例２の工程３と同様に反応させ、標記化合物（２３．０ｍｇ、２９％）を固体
として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈ
ｚ），１．８５（２Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１４．６，７．１Ｈｚ），２．０６−２．２２（２Ｈ
，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．２８−２．４３（６Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝１３．７，９．４Ｈｚ），３．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．１，３．９Ｈｚ）
，３．０９−３．２２（４Ｈ，ｍ），３．２７−３．４１（４Ｈ，ｍ），３．４７（１２
Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．５３−３．８１（１０Ｈ，ｍ），４．４１−４．５１（
１Ｈ，ｍ），５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８
．８Ｈｚ），５．４２（２Ｈ，ｂｒｓ），５．５３−５．６１（１Ｈ，ｍ），６．５４（
１Ｈ，ｓ），７．００（２Ｈ，ｓ），７．１２−７．２９（５Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ
，ｓ），７．７４−７．８５（２Ｈ，ｍ），８．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），８
．１１−８．２１（２Ｈ，ｍ），８．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．５４（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１２２４（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４１３】
工程２：抗体−薬物コンジュゲート（５０）
参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体及び上記工程１で得た化合物を用いて
、実施例２の工程４と同様の方法によって、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１３．４７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：９．４ｍｇ（７５％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．１
【０４１４】
実施例５４  抗体−薬物コンジュゲート（５１）
【０４１５】
【化１２３】
2018188455.tif 000124
【０４１６】
工程１：ｔｅｒｔ−ブチル  （６−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９
−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘ
キサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ
［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）カーバメート
化合物（４）のメシル酸塩（０．５００ｇ，０．８８２ｍｍｏＬ）を、４−（ｔｅｒｔ
−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸の代わりに６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
アミノ）ヘキサン酸を用いて、実施例１の工程１と同様に反応させ、標記化合物（０．６
２０ｇ，定量的）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），１．１４
−１．２８（２Ｈ，ｍ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．４７−１．６１（２Ｈ，ｍ），１
．７５−１．８９（２Ｈ，ｍ），２．０４−２．１７（４Ｈ，ｍ），２．３５（３Ｈ，ｓ
），２．８１−２．８８（２Ｈ，ｍ），３．０９−３．１６（２Ｈ，ｍ），５．１０（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．４Ｈｚ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．４Ｈｚ），５．３９（２
Ｈ，ｓ），５．４８−５．５５（１Ｈ，ｍ），６．５０（１Ｈ，ｓ），６．７３−６．７
８（１Ｈ，ｍ），７．２６（１Ｈ，ｓ），７．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），８
．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）．
【０４１７】
工程２：６−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキ
シ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ
−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−
ｂ］キノリン−１−イル］ヘキサンアミドトリフルオロ酢酸塩
上記工程１で得た化合物（０．３９７ｇ，０．６１１ｍｍｏＬ）を、実施例１の工程２
と同様に反応させ、標記化合物（０．３４２ｇ，８４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３１
−１．４１（２Ｈ，ｍ），１．５２−１．７０（４Ｈ，ｍ），１．８０−１．９４（２Ｈ
，ｍ），２．０５−２．１８（２Ｈ，ｍ），２．２１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２
．４０（３Ｈ，ｓ），２．８１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），３．１０−３．２５（２
Ｈ，ｍ），３．３３（２Ｈ，ｂｒｓ），５．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．８Ｈｚ），５．
２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．８Ｈｚ），５．４１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ），５．
４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ），５．５３−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５５（１
Ｈ，ｓ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），８．４９
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）．
【０４１８】
工程３：Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニ
ル−Ｎ−（６−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−
メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，
１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノ
リン−１−イル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）グリシンアミド
上記工程２で得た化合物（０．１７０ｇ，０．５１６ｍｍｏＬ）を、実施例２の工程１
と同様に反応させ、標記化合物（０．２２５ｇ，９１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．４３
−１．７０（６Ｈ，ｍ），１．８７（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１５．０，７．４Ｈｚ），２．１
０−２．２２（３Ｈ，ｍ），２．２８−２．３７（１Ｈ，ｍ），２．４２（３Ｈ，ｓ），
２．７８−２．８５（１Ｈ，ｍ），３．０１−３．１０（３Ｈ，ｍ），３．１５−３．２
２（２Ｈ，ｍ），３．５４−３．６１（５Ｈ，ｍ），３．６２−３．６９（１Ｈ，ｍ），
４．４４−４．５３（１Ｈ，ｍ），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．２５
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ），５．４５（２Ｈ，ｓ），５．５４−５．６１（１Ｈ，
ｍ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），７．１１−７．
２８（５Ｈ，ｍ），７．３３（１Ｈ，ｓ），７．６３−７．６９（１Ｈ，ｍ），７．８２
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．９０−７．９６（１Ｈ，ｍ），８．１７（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．４６（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝９．０Ｈｚ）．
【０４１９】
工程４：グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（６−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９
−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，
１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７
］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）グ
リシンアミド
上記工程３で得た化合物（０．１０５ｇ，０．１０８ｍｍｏＬ）を、実施例２の工程２
と同様に反応させ、標記化合物（０．０６８ｍｇ，６５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１５
−１．６７（６Ｈ，ｍ），１．７９−１．９７（２Ｈ，ｍ），２．０８−２．２４（４Ｈ
，ｍ），２．４２（３Ｈ，ｓ），２．７６−２．８２（１Ｈ，ｍ），３．００−３．１０
（５Ｈ，ｍ），３．１９（１Ｈ，ｓ），３．５０−３．６３（２Ｈ，ｍ），３．６４−３
．７６（３Ｈ，ｍ），３．８４−３．９２（１Ｈ，ｍ），４．５１−４．５９（１Ｈ，ｍ
），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．４Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．４Ｈｚ
），５．４４（２Ｈ，ｓ），５．５３−５．６１（１Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｂｒｓ
），７．１５−７．２９（５Ｈ，ｍ），７．３３（１Ｈ，ｓ），７．７２−７．７８（１
Ｈ，ｍ），７．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．９６−８．０８（２Ｈ，ｍ）
，８．３０−８．３８（２Ｈ，ｍ），８．４６−８．５６（２Ｈ，ｍ）．
【０４２０】
工程５：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−（６−｛［（１Ｓ，９
Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−１０，１３−ジオキソ−２，３，９
，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’
：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−６−オキソヘキ
シル）グリシンアミド
上記工程４で得た化合物（５８ｍｇ，０．０６０ｍｍｏＬ）を、実施例２の工程３と同
様に反応させ、標記化合物（３９ｍｇ，６２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．９９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．２７（２
Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１１．６，６．１Ｈｚ），１．３８−１．４４（２Ｈ，ｍ），１．５０−
１．６３（６Ｈ，ｍ），１．６５−１．８０（２Ｈ，ｍ），１．８９−１．９８（２Ｈ，
ｍ），２．１７−２．２５（３Ｈ，ｍ），２．２６−２．３６（３Ｈ，ｍ），２．４０（
３Ｈ，ｓ），２．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．３，９．２Ｈｚ），３．１２（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝１３．７，５．７Ｈｚ），３．１５−３．２５（４Ｈ，ｍ），３．４４（２Ｈ，
ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），３．７６（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），３．７９−３．８６（４Ｈ，ｍ），４．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
８．９，６．０Ｈｚ），５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ），５．５６（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝１６．０Ｈｚ），５．６０−５．６４（１Ｈ，ｍ），６．７６（２Ｈ，ｓ），７．
１２−７．２４（６Ｈ，ｍ），７．５８（１Ｈ，ｓ），７．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．
９Ｈｚ），７．６８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０６０（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４２１】
工程６：抗体−薬物コンジュゲート（５１）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６
．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチュ
ーブに採取し、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０１４７ｍＬ
；抗体一分子に対して２．３当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａ
ｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．
１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体
内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に上記工程５で得た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０２９
５ｍＬ；抗体一分子に対して４．６当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュベートし
、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒ
ｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００５９０ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）
を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停止させた
。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＰＢＳ７．４を
使用）を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た
。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：０．９７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５．８２ｍｇ（５８％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：１．７
【０４２２】
実施例５５  抗体−薬物コンジュゲート（５２）
【０４２３】
【化１２４】
2018188455.tif 000125
【０４２４】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（５２）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６
．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチュ
ーブに採取し、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０２９５ｍＬ
；抗体一分子に対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａ
ｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．
１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体
内ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例５４の工程５で得た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０
．０５９０ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュ
ベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１１８ｍＬ；抗体一分子に対して１８．
４当量）を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停
止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＰＢＳ７．４を
使用）を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た
。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：０．９４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５．６４ｍｇ（５６％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．１
【０４２５】
実施例５６  抗体−薬物コンジュゲート（５３）
【０４２６】
【化１２５】
2018188455.tif 000126
【０４２７】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（５３）
抗体の還元：参考例１にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体を、製造方法１に記載した共
通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６．
０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチュー
ブに採取し、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０１４７ｍＬ；
抗体一分子に対して２．３当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ
Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１
内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内
ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例５４の工程５で得た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０
．０２９５ｍＬ；抗体一分子に対して４．６当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュ
ベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００５９０ｍＬ；抗体一分子に対して９．
２当量）を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停
止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＰＢＳ７．４を
使用）を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た
。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１．２２ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：７．３２ｍｇ（７３％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：１．５
【０４２８】
実施例５７  抗体−薬物コンジュゲート（５４）
【０４２９】
【化１２６】
2018188455.tif 000127
【０４３０】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（５４）
抗体の還元：参考例１にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４抗体を、製造方法１に記載した共
通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１を使用）及びＣ−１を用いて、ＰＢＳ６．
０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチュー
ブに採取し、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０２９５ｍＬ；
抗体一分子に対して４．６当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ
Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１
内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内
ヒンジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を２２℃で１０分間インキュベート
した後に実施例５４の工程５で得た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０
．０５９０ｍＬ；抗体一分子に対して９．２当量）を加え、２２℃にて４０分間インキュ
ベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１１８ｍＬ；抗体一分子に対して１８．
４当量）を加え、さらに２２℃にて２０分間インキュベートし、薬物リンカーの反応を停
止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＰＢＳ７．４を
使用）を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た
。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１．０６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６．３６ｍｇ（６４％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．０
【０４３１】
実施例５８  抗体−薬物コンジュゲート（５５）
【０４３２】
【化１２７】
2018188455.tif 000128
【０４３３】
工程１：（｛Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシル｝ア
ミノ）メチルアセテート
Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルグリシルグリシン（４．３３ｇ，１２．２ｍ
ｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１２０ｍｌ）、及びトルエン（４０．０ｍｌ）からなる
混合物に、ピリジン（１．１６ｍｌ，１４．７ｍｍｏｌ及び四酢酸鉛（６．８４ｇ，１４
．７ｍｍｏｌ）を加え、５時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、不溶物をセ
ライト濾過によって除き、減圧下濃縮した。得られた残留物を酢酸エチルに溶解し、水及
び飽和食塩水で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で留去
した後、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル
＝９：１（ｖ／ｖ）〜酢酸エチル］にて精製し、標記化合物（３．００ｇ，６７％）を無
色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．０７（３Ｈ，ｓ），３．９０（２Ｈ
，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．４６（２Ｈ，ｄ
，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｂｒｓ
），６．９６（１Ｈ，ｂｒｓ），７．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４１（２
Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．７７（２Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
【０４３４】
工程２：ベンジル  ［（｛Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］
グリシル｝アミノ）メトキシ］アセテート
上記工程１で得た化合物（３．６８ｇ，１０．０ｍｍｏＬ）及びベンジルグリコレート
（４．９９ｇ，３０．０ｍｍｏＬ）のテトラヒドロフラン（４０．０ｍＬ）溶液に、カリ
ウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２．２４ｇ，２０．０ｍｍｏＬ）を０℃で加え、室温にて１
５分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチル、水を０℃で加え、酢酸エチル、クロロホルムで
抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去し、得ら
れた残留物をジオキサン（４０．０ｍＬ）、水（１０．０ｍＬ）に溶解し、炭酸水素ナト
リウム（１．０１ｇ，１２．０ｍｍｏＬ）、クロロぎ酸９−フルオレニルメチル（２．５
９ｇ，１０．０ｍｍｏＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液に水を加え、酢酸エ
チルで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去し
、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝１０
０：０（ｖ／ｖ）〜０：１００］にて精製し、無色油状の標記化合物（１．８８ｇ、４０
％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：３．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）
，４．２４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．４９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），４
．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．１５−５．２７（１Ｈ，ｍ），５．１９（２
Ｈ，ｓ），６．７４（１Ｈ，ｂｒｓ），７．３１−７．３９（７Ｈ，ｍ），７．４３（２
Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７９（２Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）．
【０４３５】
工程３：［（｛Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシル｝
アミノ）メトキシ］酢酸
上記工程２で得た化合物（１．８８ｇ、３．９６ｍｍｏＬ）をエタノール（４０．０ｍ
Ｌ）、酢酸エチル（２０．０ｍｌ）に溶解した。パラジウム炭素触媒（３７６ｍｇ）を加
え、水素雰囲気下、室温にて２時間撹拌した。不溶物をセライト濾過によって除き、溶媒
を減圧留去し、標記化合物（１．５２ｇ、定量的）を無色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈ
ｚ），３．９７（２Ｈ，ｓ），４．１８−４．３２（３Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，
Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．２９−７．４６（４Ｈ，ｍ），７．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９
Ｈｚ），７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ
），８．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）．
【０４３６】
工程４：９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（２−｛［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−
エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，
９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４
’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエ
トキシ）メチル］アミノ｝−２−オキソエチル）カーバメート
氷冷下、化合物（４）のメシル酸塩（０．２８３ｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド（６１．４ｍｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）、及び上記工程３で得た化
合物（０．２０５ｇ，０．５３３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．０
ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９２．９μＬ，０．５３３ｍｍｏ
Ｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１４３ｇ，０．６９３ｍｍｏ
Ｌ）を加え、室温にて３日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１
（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製し、標記化合物（０．３５２ｇ，８２％）を淡茶
色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈ
ｚ），１．７３−１．８７（２Ｈ，ｍ），２．０６−２．２０（２Ｈ，ｍ），２．３４（
３Ｈ，ｓ），３．０１−３．２３（２Ｈ，ｍ），３．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）
，３．９８（２Ｈ，ｓ），４．１３−４．２５（３Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．７Ｈｚ），５．０９−５．２２（２Ｈ，ｍ），５．３２−５．４２（２Ｈ，ｍ），５
．５０−５．５９（１Ｈ，ｍ），６．４９（１Ｈ，ｓ），７．２４−７．３０（３Ｈ，ｍ
），７．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），
７．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７
．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），８．７
７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８０２（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４３７】
工程５：Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ
−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−
１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ
］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド
上記工程４で得た化合物（０．８８１ｇ，１．１０ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド（１１．０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（１．１ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌
した。溶媒を減圧留去し、標記化合物を含む混合物を得た。本混合物は、これ以上の精製
は行わずに次の反応に用いた。
【０４３８】
工程６：Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシルグリシル
−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ
−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５
−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリ
ジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）メチル］グリ
シンアミド
氷冷下、上記工程５で得た混合物（０．４３９ｍｍｏＬ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（０．１０１ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）、及びＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イル
メトキシ）カルボニル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニン（特開２００２−６０
３５１号公報に記載された化合物）（０．４４０ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド（５０．０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（０．１８１ｇ，０．８７８ｍｍｏＬ）を加え、室温にて４日間撹拌した。溶媒を減圧
留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロ
ホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．２６９ｇ，５８
％）を淡橙色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０６３（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４３９】
工程７：グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−
９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，
３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’
，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−２−オキ
ソエトキシ）メチル］グリシンアミド
上記工程６で得た化合物（０．２６９ｇ，０．２５３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（４．００ｍＬ）溶液に、ピペリジン（０．２５１ｍＬ，２．５３ｍｍｏＬ）
を加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、標記化合物を含む混合物を得た。本
混合物は、これ以上の精製は行わずに次の反応に用いた。
【０４４０】
工程８：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）ヘキサノイル］グリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［（２−｛［（１Ｓ，
９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキ
ソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラ
ノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−
２−オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド
上記工程７で得た化合物（０．２５３ｍｍｏＬ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１
０．０ｍＬ）溶液に、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル（０．１５６ｇ，
０．５０６ｍｍｏＬ）を加え、室温で３日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール＝
９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（０．１００ｇ，３８％）を淡黄色固体とし
て得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈ
ｚ），１．０９−１．２１（２Ｈ，ｍ），１．３３−１．４７（４Ｈ，ｍ），１．７５−
１．９０（２Ｈ，ｍ），２．００−２．２３（４Ｈ，ｍ），２．３６（３Ｈ，ｓ），２．
６９−２．８１（１Ｈ，ｍ），２．９４−３．０３（１Ｈ，ｍ），３．０６−３．２２（
２Ｈ，ｍ），３．２３−３．７４（８Ｈ，ｍ），３．９８（２Ｈ，ｓ），４．３９−４．
５０（１Ｈ，ｍ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．１７（２Ｈ，ｓ），５
．３９（２Ｈ，ｓ），５．５３−５．６１（１Ｈ，ｍ），６．５０（１Ｈ，ｓ），６．９
６（２Ｈ，ｓ），７．１１−７．２４（５Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｓ），７．７５（
１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．９７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．０３（１
Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．６０（１Ｈ，ｔ，
Ｊ＝６．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０３４（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４４１】
工程９：抗体−薬物コンジュゲート（５５）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｃ−１及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用
）を用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製
した。本溶液（１．２５ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに１
０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０２５ｍＬ；抗体一分子に対し
て３．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，
Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを
確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフィ
ド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）０．１０９ｍＬと上記工程８で得た化合物を１０
ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０３９ｍＬ；抗体一分子に対して４．６当量）
を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社）を用いて
室温下４０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ（
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００８ｍＬ）を加え、さらに
室温下２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
製造方法１に記載した共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１２．５７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：８．８ｍｇ（７０％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．２
【０４４２】
実施例５９  抗体−薬物コンジュゲート（５６）
【０４４３】
【化１２８】
2018188455.tif 000129
【０４４４】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（５６）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｃ−１及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用
）を用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製
した。本溶液（１．２５ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに１
０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０５１ｍＬ；抗体一分子に対し
て６．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，
Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを
確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフィ
ド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０．０６７ｍＬ）と実施例５８の工程８で得た化
合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．０８５ｍＬ；抗体一分子に対して１
０．０当量）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会
社）を用いて室温下６０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍ
Ｍ  ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１３ｍＬ）を
加え、さらに室温下２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：１．３３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：７．９８ｍｇ（６４％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：４．９
【０４４５】
実施例６０  抗体−薬物コンジュゲート（５７）
【０４４６】
【化１２９】
2018188455.tif 000130
【０４４７】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（５７）
抗体の還元：参考例２にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｃ−１及びＢ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用
）を用いて、媒体をＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡに置換し、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調製
した。本溶液（１．２５ｍＬ）を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに入れ、ここに１
０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０５１ｍＬ；抗体一分子に対し
て６．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，
Ｉｎｃ．；０．０６２５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを
確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることで、抗体内ヒンジ部のジスルフィ
ド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液へ、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ；０．０２５ｍＬ）と実施例５８工程８で得た化合
物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（０．１２７ｍＬ；抗体一分子に対して１５
．０当量）を室温下加え、チューブ・ローテーター（ＭＴＲ−１０３，アズワン株式会社
）を用いて室温下６０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ
ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０１９ｍＬ）を加
え、さらに室温下２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄ−１（緩衝液としてＡＢＳを使用）
を用いた精製を行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を６ｍＬ得たのち、
製造方法１に記載した共通操作Ａを使用して、溶液を濃縮した。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５０００（
実測平均値）、εＤ，３７０＝１９０００（実測平均値）を使用）を使用して、下記の特
性値を得た。
抗体濃度：０．９１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５．４６ｍｇ（４４％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：６．３
【０４４８】
実施例６１  抗体−薬物コンジュゲート（５８）
【０４４９】
【化１３０】
2018188455.tif 000131
【０４５０】
実施例５９と実施例６０の抗体−薬物コンジュゲートのほぼ全量を混合し、製造方法１
に記載した共通操作Ａを使用して溶液を濃縮し、標記抗体−薬物コンジュゲートを得た。
抗体濃度：１０．０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１２．３０ｍｇ，抗体一分子あたりの薬物平
均結合数（ｎ）：５．４
【０４５１】
実施例６２  抗体−薬物コンジュゲート（５９）
【０４５２】
【化１３１】
2018188455.tif 000132
【０４５３】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（５９）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を使用）及びＣ−
１を用いて、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１００ｍ
Ｌ、抗体１ｇ）を２５０ｍＬフラスコに入れ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会
社）水溶液（２．４３ｍＬ；抗体一分子に対して３．６当量）を加え、さらに１Ｍ  リン
酸水素二カリウム水溶液（５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４付近であることをｐ
Ｈメーターで確認した後、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内ヒン
ジ部のジスルフィド結合を還元させた。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液に対して、実施例５８の工程８で得
た化合物を１０ｍＭ含むジメチルスルホキシド溶液（３．５１ｍＬ；抗体一分子に対して
５．２当量）及びジメチルスルホキシド（２．１４ｍＬ）を室温下加え、１５℃水浴中で
攪拌子で１３０分攪拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮＡＣ
水溶液（０．５４７ｍＬ）を加え、さらに室温にて２０分間インキュベートし、薬物リン
カーの反応を停止させた。
精製：上記溶液に対して、限外ろ過膜（メルク株式会社、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｃａ
ｓｓｅｔｔｅ、Ｂｉｏｍａｘ  ５０ＫＤａ）、チューブポンプ（米国コールパーマー社マ
スターフレックスポンプ  ｍｏｄｅｌ  ７７５２１−４０、ポンプヘッド  ｍｏｄｅｌ  
７５１８−００）及びチューブ（米国コールパーマー社マスターフレックスチューブ  Ｌ
／Ｓ１６）で構成された限外ろ過装置を用い、限外ろ過精製を行った。すなわち、反応液
に精製緩衝液としてＡＢＳを滴下しながら（計８００ｍＬ）、限外ろ過精製を行うことで
、未結合の薬物リンカー及び他の低分子量試薬を除去するとともに緩衝液をＡＢＳへ置換
し、さらに濃縮まで行い、標記抗体−薬物コンジュゲートを含有する溶液を約７０ｍＬ得
た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（モル吸光係数として、εＡ，２８０＝２３
５３００（計算推定値）、εＡ，３７０＝０（計算推定値）、εＤ，２８０＝５１７８（
実測値）、εＤ，３７０＝２０２１７（実測値）を使用）を使用して、下記の特性値を得
た。
抗体濃度：１４．２ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１.０ｇ（約１００％），抗体一分子あたり
の薬物平均結合数（ｎ）：３．２
【０４５４】
実施例６３  抗体−薬物コンジュゲート（６０）
【０４５５】
【化１３２】
2018188455.tif 000133
【０４５６】
工程１：抗体−薬物コンジュゲート（６０）
抗体の還元：参考例1にて作製したＭ３０−Ｈ１−Ｌ４Ｐ抗体を、製造方法１に記載した
共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．６１ｍＬｍｇ−１畳㹰뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵銂뷤ꢔ볯誏臣ꎼ裢㲒牢ਾ볯銂铧蒁臣膀볯ꊼ볯隼볯閼볯ꖼ볯뒼볯ꮁ臣醼볯趽뷯込뷯겼臣뾪ꏨ鞁臣芀鳦뚺뛦袼볯趽볯膀戼㹲鞊뷤閼볯趽뷯覼苣醼볯趽볯膃菣벃菣ꮁ藥貂胣醼볯趽볯₭뒼볯ꖼ볯袼鷦겺賥邈럥궥ꃦ込볤뺤戼㹲覼냦뚺뛦袼볯躼볯鞼볯趽볯鮼諦鎽룤蚈귥ꮁ꿥鞁臣钼뷥辇볯銂諥袁臣芀鳦뚺뛦꺁뷯ꢼ臣鞼볯㲎牢ਾ볯颻뿨ꞁ臣讂臣ꢁ苣邽볯ꆃ菣뾂菣ꞁꋧ趪臣龁뻥膀볯鞼蓢ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂臣ꢁ戼㹲ꮁ苣ꎁ臣膀諦鎽蛥銃菣뢂菩꺁苣릂菣閃苣覃뗧袐苣蒂藥閁臣龁胣㲂牢ਾ諦鎽臣겖觧ꪃ菣ꮂ菣꺁苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣骼룤風뫦늶臣뺯臣ꚁ胣龮雦设볯颼臣ꖷ꣧颼臣鞾戼㹲龁賥袐觧銂볯邼뷯궼郥肂苣ꆃ菣ꮃ苣ꮃ菣궂苣覃뫦늶볯邼볯銼볯馼뷯겼볯鞊뷤肸裥邭臣뺯臣㲗牢ਾ臣隼볯閼뷥辇볯誏臣뢂菣膃菣릂菣鮃苣랂菣袼볯躼볯隼볯趽볯覼苣ꂊ臣膀볯閼蓢뒰뗦궸臣馼戼㹲邼裥ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀雨ꦉ菣뎃苣벃苣鞊뷤뢁뗧袐臣鮁臣芀곦ꮁ胣醼볯邼뷯궼†볯ꆼ볯뒰戼㹲뚺뛦袼볯躼볯鎼볯趽볯鮼諦鎽룤蚈귥ꮁ꿥鞁臣馼볯颼뷥辇볯銂諥袁胣閁苣ꮁ껥ꦸ臣ꚁ볯邼裥㲆牢ਾ雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀雨ꦉ菣뎃苣벃臣趏뿥銂臥ꊭ臣鮁臣芀戼㹲뺲ꏨ骼룤風뫦늶苣膀ꏨꂀ雦閳볯ꮁ꣨覼臣龁藥骀鏦鲽볯銈볯袼럧鶡뛦ꢁ臣ꚁ볯ꊼ볯銂뷤ꢔ볯㲉牢ਾ苣ꢔ臣龁닧붣苣財臣膀꣦風諦鎽裢겖觧뎂菣뢂菣늂菣袃苣ꮐ鳦馁苣뚺뛦銂볯馼뷯겼뻥龁胣㲂牢ਾ觧Ꞁꧨꆾ볯붣胩릖돦醼臣風볨鞁臣놅胩趓뷤ꖼ볯ꊃ菣뢐藥芿闦ꢁ臣ꚁ胣캁㲵畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯貼볯颼볯㲐猯扵鶼볯鎼戼㹲閼볯邼볯袼꣨鞮軦骮胥覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膀⼼畳㹢뗎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ꆼ볯鎼볯邼⼼畳㹢볯邼볯袨껧ꢎ껥ꒀ볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢胣㲁猯扵츾㲵畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯貼볯颼볯㲐猯扵鶼볯醼볯颼볯㲈牢ਾ껥겸胥覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膀⼼畳㹢뗎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鎼볯邼⼼畳㹢볯銼볯銼볯鞼볯龮룦ꒀ볯銂뷤ꢔ볯銂뷤ꢔ臣ꚁ胣许꣨꺁觧Ꞁ胥銂뻥㲗牢ਾ臣芀戼㹲鞊뷤莿뫥骼볯躼볯馼뷯螽볯趽볯貼諦鎽迥辇볯钼볯趽뷯袼볯鎼볯覼볯鞊뷤肸裥邭臣龁苣꺁雨㲬牢ਾ觧뎹鷥邵郥낕볯躽볯骼볯躼볯ગ䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤隼볯ₔ鞊뷤銈雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣袼볯醼볯ઉ䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀賥醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㠱㠱㐸㔵琮晩㸢〲㠱㠱㐸㔵琮晩ꃂ〰㄰㐳⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯馼胣㲑䐯噉ਾ럥讨볯骼諦鎽裢겖觧뎂菣뢂菣늂菣袃볯隼볯覼戼㹲鞊뷤꺁苩莅볯芏胨设ꮁ臣鲽ꏨ鞁臣궼볯邼裢ꢼ볯銈볯钼볯鞊뷤銂胣붣胩릖돦醼臣風볨鞁臣㲟牢ਾ藥骀鏦鲽볯袼볯颼볯躽뷯뢐藥芿闦ꢁ臣ꚁ볯躼볯醼뷯겼뷯螽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵莽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢醼⼼畳㹰苣뾽铧覼迥뎁볯銈戼㹲醼苣ꢔ臣ꚁ胣낼볯뎼볯躼볯込볯꒼볯ꆼ臣ꚁ볯邼뷯螽볯趽볯ꮁꫨ붣臣龁胣겜뫦늶볯钼뷯겼胣㲁牢ਾ諦鎽볯邼뷯螽볯銂볯閼뷯겼菣ꖃ菣隃臣ꖅ苣膀볯邼뷯궼†볯ꎼ볯낼볯놝뫤隌裦ꖷꗦꪠ볥骼ꓧ㲾牢ਾ볯뒰뫦늶볯邼볯醼볯趽볯鮼諦鎽룤蚈귥ꮁ꿥鞁臣閼볯銼뷥辇볯銂諥袁臣芀鳦뚺뛦꺁뷯ꢼ臣鞼戼㹲躼볯颻뿨ꞁ臣讂臣ꢁ苣邽볯ꆃ菣뾂菣ꞁꋧ趪臣龁뻥膀볯鞼蓢ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂臣㲓牢ਾ臣ꮁ苣ꎁ臣膀諦鎽蛥銃菣뢂菩꺁苣릂菣閃苣覃뗧袐苣蒂藥閁臣龁胣㲂牢ਾ諦鎽臣겖觧ꪃ菣ꮂ菣꺁苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣骼룤風뫦늶臣뺯臣ꚁ胣龮雦设볯颼臣ꖷ꣧颼臣鞾戼㹲龁賥袐觧銂볯邼뷯궼郥肂苣ꆃ菣ꮃ苣ꮃ菣궂苣覃뫦늶볯邼볯銼볯銼뷯겼볯鞊뷤肸裥邭臣뺯臣㲗牢ਾ臣颼볯隼뷥辇볯銂諥袁胣醼볯莄냦뒵룤ꞁ볯邼裥ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀雨ꦉ菣뎃苣벃苣鞊뷤뢁戼㹲邵郥閁臣龁胣ꆬ臣膀볯邼볯趽볯₭꺼볯ꎼ냦뚺뛦袼볯躼볯鎼볯趽볯鮼諦鎽룤蚈귥ꮁ꿥鞁臣醼戼㹲銼볯馼뷥辇볯銂諥袁胣閁苣ꮁ껥ꦸ臣ꚁ볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣겖觧ꪃ菣ꮂ菣꺁迥鲿苣㲒牢ਾ臥ꊭ臣鮁臣芀戼㹲뺲ꏨ骼룤風뫦늶苣膀ꏨꂀ雦閳볯ꮁ꣨覼臣龁藥骀鏦鲽볯銈볯袼럧鶡뛦ꢁ臣ꚁ볯ꊼ볯銂뷤ꢔ볯㲉牢ਾ苣ꢔ臣龁닧붣苣財臣膀꣦風諦鎽裢겖觧뎂菣뢂菣늂菣袃苣ꮐ鳦馁苣뚺뛦銂볯鎼뷯겼뻥龁胣㲂牢ਾ觧Ꞁꧨꆾ볯붣胩릖돦醼臣風볨鞁臣놅胩趓뷤ꖼ볯ꊃ菣뢐藥芿闦ꢁ臣ꚁ胣캁㲵畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯貼볯颼볯㲐猯扵鶼볯鎼戼㹲閼볯邼볯袼꣨鞮軦骮胥覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膀⼼畳㹢뗎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ꆼ볯鎼볯邼⼼畳㹢볯邼볯袨껧ꢎ껥ꒀ볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢胣㲁猯扵츾㲵畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯貼볯颼볯㲐猯扵鶼볯醼볯颼볯㲈牢ਾ껥겸胥覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膀⼼畳㹢뗎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鎼볯邼⼼畳㹢볯銼볯銼볯鞼볯龮룦ꒀ볯銂뷤ꢔ볯銂뷤ꢔ臣ꚁ胣许꣨꺁觧Ꞁ胥銂뻥㲗牢ਾ臣芀戼㹲鞊뷤莿뫥骼볯躼볯鎼뷯螽볯趽볯貼諦鎽迥辇볯銼볯趽뷯袼볯隼볯覼볯鞊뷤肸裥邭臣龁苣꺁雨㲬牢ਾ觧뎹鷥邵郥낕볯躽볯骼볯躼볯ગ䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤隼볯ₕ鞊뷤銈雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣袼볯銼볯ઉ䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀賥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㠱㠱㐸㔵琮晩㸢〲㠱㠱㐸㔵琮晩ꃂ〰㄰㔳⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ럥讨볯骼諦鎽裢겖觧뎂菣뢂菣늂菣袃볯隼볯覼戼㹲鞊뷤꺁苩莅볯芏胨设ꮁ臣鲽ꏨ鞁臣궼볯邼裢ꢼ볯銈볯钼諦鎽苣膀ꏨꂀ雦閳볯ꮁ꣨覼臣龁藥㲱牢ਾ胩趓뷤ꊼ볯銼볯邼뷯趽郥覅뿤낕臣鞁臣醼볯隼볯趽볯趽뷯㲇畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢醼⼼畳㹰뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵銂뷤ꢔ볯誏臣ꎼ裢醼戼㹲銂铧蒁臣膀볯ꊼ볯隼볯閼볯ꖼ볯뒼볯ꮁ臣醼볯趽뷯込뷯겼臣뾪ꏨ鞁臣芀鳦뚺뛦袼볯躼볯閼뷯㲍牢ਾ볯膀諦鎽볯銼볯閼뷯螽볯銂볯躼볯趽볯膃菣벃菣ꮁ藥貂胣醼볯趽볯₭뒼볯ꖼ볯袼鷦겺賥邈럥㲥牢ਾꗦꪠ볥骼ꓧ覼냦뚺뛦袼볯躼볯銼볯鞼뷯겼볯鞊뷤肸裥邭臣뺯臣ꚁ볯躼볯鎽蟩覼迥뎁볯궼菣뎃戼㹲뢅냦ꂴ뫤ꮂ菣Ꚃ菣뒰뫦늶볯꺼뷯莽뷯貽뷯覽†볯薽뷯醽뷯薽볯ꦼ뷯莽볯鮼볯躼볯隼볯閼뷯겼戼㹲覼苣ꂊ臣龁胣겜뫦늶臣邽볯貁볯躼볯슔邼볯醼蛥ꞁ臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ鞁臣貾臣膀볯鞼蓢ꞁ볯芙戼㹲鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀諦鎽蛥銃菣뢂菩꺁苣릂菣閃苣覃뗧袐苣蒂藥閁臣龁胣㲂牢ਾ諦鎽臣겖觧ꪃ菣ꮂ菣꺁苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣骼룤風뫦늶臣뺯臣ꚁ胣龮雦设볯颼臣ꖷ꣧颼臣鞾戼㹲龁賥袐觧銂볯邼뷯궼郥肂苣ꆃ菣ꮃ苣ꮃ菣궂苣覃뫦늶볯邼볯邼볯鎼볯趽볯鮼諦鎽룤蚈귥ꮁ꿥㲾牢ਾ臣ꚁ볯躼볯鎽蟩覼迥뎁苣ꆃ菣ꮃ苣ꮃ菣궂苣覃볯邼볯邼볯隼볯趽볯覼苣꒮룦许諥袁胣醼볯莄戼㹲꺁냦뒵룤ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀雨ꦉ菣뎃苣벃苣鞊뷤뢁뗧袐臣鮁臣芀곦ꮁ胣醼볯邼뷯㲍牢ਾ볯₭꺼볯ꎼ볯뎼뷯螽뷯膽裢ꆼ뷯蒽뷯覽뷯袽†볯辽볯겼볯ꎼ볯뒰뫦늶볯邼볯邼볯隼볯趽볯覼戼㹲銂諥袁胣閁苣ꮁ껥ꦸ臣ꚁ볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣겖觧ꪃ菣ꮂ菣꺁迥鲿苣鲁귦閁臣龁胣㲂牢ਾ닧붣볯誸꣨뚺뛦銂胣붣胩릖돦醼臣風볨鞁臣놅胩趓뷤꒼裢醼볯ꦷꇨ늶臣鞁臣ꆼ볯뎼苣뾽铧覼戼㹲銂铧蒁臣뺲ꏨ銂ꇨ蒁胣馨꣨鞊뷤銈雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂郥覜臣讂뫦늶苣隼뷯겼뻥龁臣ꆁ胣㲁牢ਾ藥骀鏦鲽볯銂뷤ꢔ臣ꚁ胣뚺뛦銂뿦꺸臣龁胣㲂牢ਾ觧Ꞁꧨꆾ볯붣胩릖돦醼臣風볨鞁臣놅胩趓뷤ꖼ볯ꊃ菣뢐藥芿闦ꢁ臣ꚁ胣캁㲵畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯貼볯颼볯㲐猯扵鶼볯鎼戼㹲閼볯邼볯袼꣨鞮軦骮胥覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膀⼼畳㹢뗎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ꆼ볯鎼볯邼⼼畳㹢볯邼볯袨껧ꢎ껥ꒀ볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢胣㲁猯扵츾㲵畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯貼볯颼볯㲐猯扵鶼볯醼볯颼볯㲈牢ਾ껥겸胥覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膀⼼畳㹢뗎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鎼볯邼⼼畳㹢볯銼볯銼볯鞼볯龮룦ꒀ볯銂뷤ꢔ볯銂뷤ꢔ臣ꚁ胣许꣨꺁觧Ꞁ胥銂뻥㲗牢ਾ臣芀戼㹲鞊뷤莿뫥骼볯邼볯邼뷯螽볯趽볯貼諦鎽迥辇볯鞼볯颼뷯螽볯隼볯薼볯貼諦鎽룤蚈귥芁臣誂臣㲮牢ਾ雨ꦉ맥螝뗧袐闦袼뷯覼볯鎼볯钼㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖龮雦设볯隼†諦鎽裢겖觧뎂菣뢂菣늂菣袃볯隼볯覼㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣隌볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰ㄸ㠸㔴⸵楴≦㈾㄰ㄸ㠸㔴⸵楴쉦゠〰㌱㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖ꖷ꣧醼볯鞊뷤銈雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣袼볯鎼볯㲉牢ਾ諦鎽臣蒂藥骼迥莀뻤ㆋ臣ꚁ뷤붣臣龁볯鎼볯銈볯醼裢겼볯鞊뷤銂胣붣胩릖돦醼臣風볨鞁臣놅戼㹲骀鏦鲽볯袼볯颼볯躽뷯뢐藥芿闦ꢁ臣ꚁ볯躼볯醼뷯겼뷯螽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵莽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢醼⼼畳㹰苣뾽铧覼迥뎁볯銈볯㲑牢ਾ苣ꢔ臣ꚁ胣낼볯뎼볯躼볯込볯꒼볯ꆼ臣ꚁ볯邼뷯螽볯趽볯ꮁꫨ붣臣龁胣겜뫦늶볯醼볯銼볯趽戼㹲겼胣鞊뷤醼볯躼볯趽뷯覼苣醼볯閼뷯겼菣ꖃ菣隃臣ꖅ苣膀볯邼뷯궼†볯ꎼ볯낼볯놝뫤隌裦ꖷ戼㹲궥ꃦ込볤뺤볯뒰뫦늶볯邼볯邼볯鎼볯趽볯鮼諦鎽룤蚈귥ꮁ꿥鞁臣閼볯銼뷥辇볯袼볯躼볯銼볯㲘牢ਾ볯趽볯鮼諦鎽룤蚈귥ꮁ꿥鞁臣鎼볯钼뷥辇볯誏臣醼볯ꪃ菣뢅냦ꂴ뫤ꮂ菣Ꚃ菣뒰뫦늶볯꺼뷯莽戼㹲膽뷯膽뷯₉뒼뷯鎽뷯閽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