(57)【要約】【課題】特定の長さの尾を基質のポリヌクレオチドに付加するための方法および組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、尾を有する基質を固体支持体に固定するための方法および組成物も企図する。本開示は、アテニュエーター分子が基質ポリヌクレオチドに付加される尾配列と会合し、基質ポリヌクレオチドの３’端への尾配列の付加を制御する任意の生分子であることを企図する。基質ポリヌクレオチドに付加される配列は、本明細書において、尾配列、または単純に尾と称され、ヌクレオチドの基質ポリヌクレオチドへの付加の過程は、本明細書において、テーリングと称される。【選択図】図１
2018130124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書の記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、米国仮出願第６１／６１０，２９６号（２０１２年３月１３日出願）および米国仮出願第６１／６１３，７８４号（２０１２年３月２１日出願）の優先利益を主張し、そのそれぞれはその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、特定の長さの尾を基質のポリヌクレオチドに付加するための方法および組成物に関する。本発明は、尾を有する基質を固体支持体に固定化するための方法および組成物も企図する。
【背景技術】
【０００３】
多くの現在の次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットホームは、配列決定前に特別なＤＮＡおよびＲＮＡ調製を必要とする。最も一般的に使用される調製は、連結反応を通した２本鎖ＤＮＡ断片の端部へのアダプター配列の付加を伴う。反応は、典型的には、平滑断端ＤＮＡまたは３’端に単一のデオキシアデノシン（ｄＡ）ヌクレオチドを有するＤＮＡ、および高濃度のＤＮＡリガーゼを伴い、反応は、かなりの数のキメラテンプレートの形成をもたらす。ＤＮＡ特異的末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ならびにＲＮＡ特異的ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼ等のテンプレート非依存ポリメラーゼは、ＮＧＳ分析用のＤＮＡおよびＲＮＡの調製の魅力的な代替アプローチの可能性を示すが、これらの酵素によって生成されたポリマー尾の長さが多くの要因により広い範囲にわたって変動し（２０〜５００個のヌクレオチド）、制御するのが容易ではなく、よってＮＧＳのためのそれらの利用性を減少させるという困難な警告を伴う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本開示は、核酸ポリメラーゼおよびアテニュエーター分子を含む組成物を提供する。本開示は、アテニュエーター分子は、基質ポリヌクレオチドに付加された尾配列と会合し、基質ポリヌクレオチドの３’端への尾配列の付加を制御する任意の生分子であることを企図する。基質ポリヌクレオチドに付加される配列は、本明細書において、尾配列、または単純に尾と称され、ヌクレオチドの基質ポリヌクレオチドへの付加の過程は、本明細書において、テーリングと称される。本明細書で使用される、アテニュエーター分子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、およびそれらの組み合わせである。アテニュエーター分子がポリヌクレオチドである態様では、ポリヌクレオチドが環状分子であるか、またはポリヌクレオチドがペプチド核酸、シゾフィラン多糖、ロックド核酸、およびそれらの組み合わせを含むことがさらに企図される。
【０００５】
上述のように、アテニュエーター分子は、基質ポリヌクレオチドへ付加された尾配列と会合し、それへのヌクレオチドの付加を制御する。いくつかの実施形態では、アテニュエーター分子は、基質ポリヌクレオチドに付加された配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、本質的に、尾配列と会合するアテニュエーター分子の部分のヌクレオチドの数と等しい。いくつかの態様では、基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、本質的に、尾配列と会合するアテニュエーター分子のヌクレオチドの数の倍数に等しい。本明細書で使用される、「本質的に」および「本質的に等しい」という用語は、ほぼ、またはほぼ等しいことを意味すると理解される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、テンプレート非依存ポリメラーゼである。一態様では、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであり、さらなる態様では、ＤＮＡポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である。関連する実施形態では、核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼであり、それは、様々な態様では、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＲＮＡ特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼからなる群から選択される
【０００７】
いくつかの実施形態では、アテニュエーター分子が、２’−デオキシチミジン５’−１リン酸（ｄＴＭＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−１リン酸（ｄＧＭＰ）、２’−デオキシアデノシン５’−１リン酸（ｄＡＭＰ）、２’−デオキシシチジン５’−１リン酸（ｄＣＭＰ）、２’−デオキシウリジン５’−１リン酸（ｄＵＭＰ）、チミジン１リン酸（ＴＭＰ）、グアノシン１リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン１リン酸（ＵＭＰ）、塩基類似体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチドを含むことが、本開示により企図される。よって、ある特定の実施形態では、アテニュエーター分子は、ヘテロポリマー配列またはホモポリマー配列であるアテニュエーター配列を含み、本配列は、ジヌクレオチド配列またはホモポリマー配列のいずれかである。
【０００８】
様々な態様では、アテニュエーター分子は、１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、またはそれ以上を含む。
【０００９】
アテニュエーター分子は、いくつかの実施形態では、保護基を含み、一態様では、保護基は、分子の３’端上にある。保護基は、核酸ポリメラーゼによるアテニュエーター分子の伸長を阻止する。よって、様々な態様では、保護基は、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー、リン酸塩、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、および逆位デオキシチミジンからなる群から選択される。
【００１０】
本開示のいくつかの実施形態では、アテニュエーター分子は、アテニュエーター配列、ホモポリマー配列、またはジヌクレオチド配列の５’に位置するアダプター配列、識別タグ配列、またはそれらの両方をさらに含む。一実施形態では、アテニュエーター分子は固定化される。さらなる実施形態では、リガーゼは、組成物中に存在する。別の実施形態では、組成物は、リガーゼ酵素をさらに含む。
【００１１】
別の実施形態では、アテニュエーター分子は、アテニュエーター配列を含み、かつアテニュエーター配列に隣接して位置付けられ、別のポリヌクレオチド上の配列Ｘに相補的である配列Ｗをさらに含むアテニュエーター−アダプター分子であり、組成物は、配列Ｖに相補的である配列Ｙを含むアダプター分子をさらに含み、配列Ｖは、Ｙと同じ長さであるか、または配列Ｙと同じ長さ未満であり、アダプター分子は、アテニュエーター−アダプター分子とは別の分子である。
【００１２】
本開示のいくつかの実施形態では、アテニュエーター分子は、次世代配列決定（ＮＧＳ）アダプター配列をさらに含む。ＮＧＳアダプター配列は、ＮＧＳアダプター配列が配列決定プラットホームにおいて有用であるという点でアダプター配列とは異なる。本開示のいくつかの実施形態では、アテニュエーター分子は、ホモポリマー配列またはジヌクレオチド配列の５’に位置する、配列Ｘおよび配列Ｙ（本明細書で論じられる様々な配列決定（例えば配列Ｘ、配列Ｙ等）のさらなる説明に関しては、以下の図および考察を参照）、識別タグ配列、またはそれらの組み合わせを含む次世代配列決定（ＮＧＳ）アダプター配列をさらに含む。アテニュエーター分子がアダプター配列をさらに含む実施形態では、それは、本明細書において、アテニュエーター−アダプター分子と称される。一実施形態では、アテニュエーター分子および／またはアテニュエーター−アダプター分子は固定化される。関連する実施形態では、配列Ｘおよび配列Ｙは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ４５４、またはＳＯＬｉＤ配列決定プラットホームと適合性があるＮＧＳアダプター配列である。
【００１３】
さらなる実施形態では、配列Ｘおよび配列Ｙは、別のアテニュエーター−アダプター分子上にあり、一方、他の実施形態では、配列Ｘおよび配列Ｙは、同じアテニュエーター−アダプター分子上で相互に隣接する。
【００１４】
本開示は、いくつかの実施形態では、アダプター配列が配列Ｘと配列Ｙとの間に位置する切断可能な配列（Ｚ）をさらに含む組成物も提供する。いくつかの態様では、配列Ｚの切断可能な部位は、少なくとも１つのｄＵ塩基もしくはＲＮＡ塩基または制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【００１５】
アテニュエーター分子が１本鎖または少なくとも部分的に２本鎖である組成物も本開示により提供される。「部分的に２本鎖」とは、アテニュエーター分子が１本鎖部分と２本鎖部分とを含むことを意味する。アテニュエーター分子が少なくとも部分的に２本鎖であるいくつかの態様では、部分的に２本鎖のアテニュエーター分子は、アテニュエーター分子の一部分を、それが相補的であるアダプター分子（いくつかの実施形態では、ＮＧＳアダプター配列であるアダプター配列を含む）にアニールすることにより生成される。いくつかの態様では、アニーリングは、（ａ）アテニュエーター分子と別のアダプター分子との間であるか、または（ｂ）アニーリングは、ヘアピン構造を形成する単一のアテニュエーター分子において生じ、よって、アテニュエーター分子はホモポリマー配列またはジヌクレオチド配列およびアダプター配列の両方を含む。
【００１６】
またさらなる実施形態では、アテニュエーター分子は、アダプター配列Ｘに完全に相補的である配列Ｗを含む。いくつかの態様では、配列Ｗはまた、アダプター配列Ｙに全てまたは部分的に相補的でもある。
【００１７】
様々な態様では、アテニュエーター分子は、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＵ）、ポリ（ｒＡ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（ｒＣ）、ポリ（ｒＧ）、およびヘテロポリマーからなる群から選択されるホモポリマー配列、または（ｉ）ｄＡおよびｒＡ塩基、（ｉｉ）ｄＴ、ｄＵ、およびＵ塩基、（ｉｉｉ）ｄＣおよびｒＣ塩基、もしくは（ｉｖ）ｄＧおよびｒＧ塩基の組み合わせを含むジヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
さらなる態様では、アテニュエーター分子は、デオキシリボヌクレオチドを含み、ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼにより分解性である。これらの態様のいくつかでは、ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅ  Ｉである。さらなる実施形態では、本開示により提供される組成物は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅおよび／またはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩを含むがこれらに限定されない１本鎖環状化リガーゼを含む。
【００１９】
本開示は、いくつかの態様では、プルーフリーディング活性を欠損するＤＮＡポリメラーゼ、およびプルーフリーディング活性を保有するカッパＨｉＦｉポリメラーゼを含む組成物も提供する。さらなる実施形態では、本開示の組成物は、リガーゼ酵素をさらに含む。
【００２０】
本開示のさらなる実施形態は、相補的Ｘ’Ｚ’Ｙ’ポリヌクレオチドとハイブリダイズされるとき、配列Ｘと配列Ｙとの間に位置し、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、配列Ｚを切断することができる制限エンドヌクレアーゼを含む組成物を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、部分的に２本鎖のアダプターが２本鎖基質分子に平滑連結され得るように、ＶがＹの切り詰められた補体であり、かつ保護された３’端を含む、部分的に２本鎖のアダプター配列が配列Ｖおよび配列Ｙから構成される組成物が提供される。別の実施形態では、配列Ｖは、配列Ｙに完全に相補的である。
【００２２】
本開示は、アテニュエーター分子が分解性である組成物をさらに企図する。いくつかの態様では、アテニュエーター分子は、ｄＵ塩基を含み、ｄＵ−グリコシラーゼ（脱塩基部位を作製する）とのインキュベーション、続く８０℃を上回る温度でのインキュベーション（脱塩基部位内に破壊を生じる）により分解性であるか、またはｄＵ−グリコシラーゼと脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼの混合物とのインキュベーションにより分解性である。よって、本開示は、様々な態様では、アテニュエーター分子がｄＵ塩基を含み、ｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーションがアテニュエーター分子を不安定化するか、またはｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーション、および後続の８０℃を上回る温度でのインキュベーションがアテニュエーター分子を分解するか、あるいはアテニュエーター分子がｄＵ−グリコシラーゼと脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼの混合物とインキュベートされる組成物を提供する。さらなる態様では、アテニュエーター分子は、リボヌクレオチドを含み、リボヌクレアーゼ活性に十分な条件下でリボヌクレアーゼにより分解性である。関連する態様では、リボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ１からなる群から選択される。
【００２３】
さらなる態様では、アテニュエーター分子は、デオキシリボヌクレオチドを含み、ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼにより分解性である。これらの態様のいくつかでは、ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅ  Ｉである。
【００２４】
本開示は、基質ポリヌクレオチドを、基質ポリヌクレオチドの３’端への、尾配列の付加を可能にするのに十分な条件下で、本明細書に記載の組成物とインキュベートすることを含み、尾配列の付加が尾配列とアテニュエーター分子との間の会合を可能にし、複合体を形成する、基質ポリヌクレオチドを伸長する方法も提供する。別の態様では、本方法は、基質ポリヌクレオチドの伸長後、アテニュエーター分子を分解することをさらに含む。さらなる態様では、本方法は、伸長した基質ポリヌクレオチドを単離することをさらに含む。本方法の他の態様は、本明細書に記載される組成物を、基質ポリヌクレオチドおよびアテニュエーター分子のホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することをさらに含む。
【００２５】
本開示の様々な態様によると、基質ポリヌクレオチドは、１本鎖ポリヌクレオチドであるか、または２本鎖ポリヌクレオチドである。２本鎖ポリヌクレオチドは、いくつかの態様では、平滑断端、３’突出端、３’陥凹末端、または遊離３’ヒドロキシル基を有する。本開示は、基質ポリヌクレオチドが２本鎖であり、ある態様では、２本鎖基質ポリヌクレオチドは、第１の基質ポリヌクレオチドを第２の基質ポリヌクレオチドと会合させるのに十分な条件下で、第１の基質ポリヌクレオチドを第２の基質ポリヌクレオチドにアニールすることにより生成される方法を提供する。本開示のさらなる態様によると、基質ポリヌクレオチドは、遊離３’ヒドロキシル基を含む。１本鎖ポリヌクレオチドは、様々な実施形態では、断片化された２本鎖ＤＮＡの変性により、またはＲＮＡの逆転写から調製される。２本鎖ポリヌクレオチドは、いくつかの態様では、平滑断端、または遊離３’ヒドロキシル基を伴う３’突出端を有する。
【００２６】
本開示の方法の様々な態様では、多数のヌクレオチドが基質ポリヌクレオチドに付加される。基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、様々な態様では、少なくとも約１個のヌクレオチド〜最大約１０個、２０個、５０個、または１００個のヌクレオチド、少なくとも約３個のヌクレオチド〜最大約１０個、２０個、５０個、または１００個のヌクレオチド、少なくとも約１０個のヌクレオチド〜最大約２０個、３０個、５０個、または１００個のヌクレオチド、少なくとも約５個のヌクレオチド〜最大約１０個、２０個、５０個、または１００個のヌクレオチド、少なくとも約１０個のヌクレオチド〜最大約２０個、３０個、５０個、または１００個のヌクレオチド、少なくとも約１個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、または２０個のヌクレオチド、少なくとも約３個ヌクレオチド〜最大約５個、１０個、または２０個のヌクレオチド、少なくとも約５個のヌクレオチド〜最大約２０個、４０個、または５０個のヌクレオチド、少なくとも１個のヌクレオチド、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個、少なくとも５１個、少なくとも５２個、少なくとも５３個、少なくとも５４個、少なくとも５５個、少なくとも５６個、少なくとも５７個、少なくとも５８個、少なくとも５９個、少なくとも６０個、少なくとも６１個、少なくとも６２個、少なくとも６３個、少なくとも６４個、少なくとも６５個、少なくとも６６個、少なくとも６７個、少なくとも６８個、少なくとも６９個、少なくとも７０個、少なくとも７１個、少なくとも７２個、少なくとも７３個、少なくとも７４個、少なくとも７５個、少なくとも７６個、少なくとも７７個、少なくとも７８個、少なくとも７９個、少なくとも８０個、少なくとも８１個、少なくとも８２個、少なくとも８３個、少なくとも８４個、少なくとも８５個、少なくとも８６個、少なくとも８７個、少なくとも８８個、少なくとも８９個、少なくとも９０個、少なくとも９１個、少なくとも９２個、少なくとも９３個、少なくとも９４個、少なくとも９５個、少なくとも９６個、少なくとも９７個、少なくとも９８個、少なくとも９９個、少なくとも１００個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。
【００２７】
本開示により提供されるさらなる実施形態は、アテニュエーター分子がアテニュエーター分子の長さ全てまたはその一部にわたって尾配列と会合するものを含む。いくつかの実施形態では、アテニュエーター分子は、尾配列を付加する過程中に尾配列と会合する。アテニュエーター分子の尾配列への会合は、さらなる態様では、ヌクレオチドの基質ポリヌクレオチドへの付加を調節する。アテニュエーター分子は、アダプター配列をさらに含み、いくつかの態様では、アダプター配列は、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加中に、リガーゼ酵素によって基質ポリヌクレオチドに連結され、様々な実施形態では、リガーゼは、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである。
【００２８】
いくつかの態様では、本発明の条件が尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加を調節することも本開示により企図される。尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加を調節するために企図される条件に関して、いくつかの態様では、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加は温度感受性であることが企図される。温度が約４℃〜約５０℃である条件が企図される。熱安定性ポリメラーゼが使用される態様では、温度は、５０℃を上回ってよい。したがって、さらなる態様では、温度は、約５０℃〜約９０℃である。
【００２９】
別の実施形態では、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加は、時間感受性であり、様々な態様では、インキュベーションステップは、約０．５分〜約１２０分の範囲の時間の長さにわたって進行する。さらなる実施形態では、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加は、ｐＨ感受性である。これらの実施形態のいくつかでは、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加は、ｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０である条件下で実施される。
【００３０】
様々な実施形態では、基質ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００３１】
本明細書に提供される方法は、アテニュエーター−アダプター分子が固定化されるものも含む。いくつかの態様では、固定化されたアテニュエーター−アダプター分子は、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加中に、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼによって基質ポリヌクレオチドに連結され、基質ポリヌクレオチドの固定化をもたらす。さらなる態様では、反応物に添加されるリガーゼ酵素の量は、約０．１〜約１０００単位（Ｕ）である。
【００３２】
ある態様では、本明細書に記載される方法は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの量のマグネシウムをさらに含む。さらなる態様では、本方法は、約１ｍＭ〜約１Ｍの量のカリウムまたはナトリウムをさらに含む。
【００３３】
本開示の具体的な態様では、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ＴｄＴ酵素、３’リン酸塩を含む分解性アテニュエーターポリヌクレオチド、およびアテニュエーターポリヌクレオチドのホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することと、混合物を３７℃で約３０分間インキュベートし、続いて７０℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、ＤＮＡグリコシラーゼを添加し、混合物を３７℃で約５分間インキュベートすることにより、アテニュエーター分子を分解することと、任意に、伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することとを含む、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法が提供される。
【００３４】
別の態様では、本開示は、基質ポリヌクレオチドを、ＴｄＴ酵素、３’端に２個のリボヌクレオチドを含むアテニュエーターポリヌクレオチド、およびアテニュエーターポリヌクレオチドのホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することと、混合物を３０℃で約３０分間インキュベートし、続いてＴｄＴ酵素を不活性化するために７０℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、任意に、伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することとを含む、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法を提供する。
【００３５】
本開示は、一態様では、基質ＲＮＡポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、分解性アテニュエーターポリヌクレオチド、およびアテニュエーターポリヌクレオチドのホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドと混合することと、混合物を３０℃で約３０分間インキュベートし、続いて９５℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、ＤＮＡグリコシラーゼを添加し、混合物を３７℃で約１０分間インキュベートすることにより、アテニュエーター分子を分解することと、任意に、伸長した基質ポリヌクレオチドを単離することとを含む、基質ＲＮＡポリヌクレオチドを伸長する方法をさらに提供する。
【００３６】
別の態様では、本開示は、アテニュエーター分子とアダプター分子の混合物を、適切な緩衝液中で約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、アテニュエーター分子および相互に部分的に相補的であるアダプター分子をアニールすることであって、アニーリングが、部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドをＴｄＴ酵素、リガーゼ酵素、部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子、およびアテニュエーター−アダプター分子のホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することと、約３７℃で約１５〜約３０分間インキュベートすることと、任意に、アテニュエーター−アダプター分子に連結される伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することとを含む、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法を提供する。
【００３７】
本開示は、一態様では、相互に少なくとも部分的に相補的である第２のビオチン化アダプター分子に１つのアテニュエーター−アダプター分子をアニールすることを、２つの分子の混合物を適切な緩衝液中で約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって行うことであって、アニーリングが、２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、２５℃で約３０〜約６０分間、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを含む溶液と混合することにより、２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を固定化し、２本鎖ビオチン化アテニュエーター−アダプター分子のストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズへの固定化をもたらすことと、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズに結合された固定化された２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約３７℃で１５〜約３０分間、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチド、ＴｄＴ酵素、リガーゼ酵素、および２本鎖のアテニュエーター分子のホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドとインキュベートすることと、溶液をＮａＯＨで洗浄し、ビーズから非ビオチン化１本鎖ＤＮＡを除去することと、任意に、２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子に連結された伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することとを含む、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法をさらに提供する。
【００３８】
別の態様では、相互に少なくとも部分的に相補的であるアテニュエーター分子およびアダプター分子を、当該２つの分子の混合物を適切な緩衝液中で、約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによってアニールすることであって、部分的に２本鎖アテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）酵素、リガーゼ酵素、部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子、および部分的に２本鎖のアテニュエーター分子の１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドと混合することと、約３０℃〜約３７℃で約１５〜３０分間インキュベートすることと、任意に、アテニュエーター−アダプター分子に連結された伸長したＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することとを含む、ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法が提供される。
【００３９】
さらなる態様では、本開示は、アテニュエーター−アダプター分子を、相互に少なくとも部分的に相補的であるビオチン化アダプター分子にアニールすることを、当該２つの分子の混合物を適切な緩衝液中で、約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって行うことであって、部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約２５℃で約２時間、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを含む溶液と混合することにより、部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を固定化し、部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子のストレプトアビジン−コーティングされた磁気ビーズへの固定化をもたらすことと、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズに結合された固定化された部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約３０℃〜約３７℃で約１５〜３０分間、ＲＮＡ基質ポリヌクレオチド、ポリ（Ａ）もしくはポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、リガーゼ酵素、および部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子の１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドとインキュベートすることと、溶液をＮａＯＨで洗浄し、ビーズから非ビオチン化１本鎖ポリヌクレオチドを除去することと、任意に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子に連結された伸長し、固定化したＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することとを含む、ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長し、固定化する方法を提供する。
【００４０】
本開示は、様々な実施形態では、基質ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を実施するために、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを混合する方法も提供し、前記ポリメラーゼ伸長は制御されたホモポリマーテーリングの後に生じ、ＮＧＳアダプター配列（複数可）の配列Ｘ、配列Ｙ、または配列Ｘ、ならびに追加の配列Ｘ’に相補的である基質ホモポリマーのＹ３’、およびアテニュエーター分子のホモポリマーの５’である配列Ｙ’の組み込みをもたらす。
【００４１】
さらなる実施形態では、ＮＧＳアダプター配列Ｘ、配列Ｙ、または配列ＸおよびＹは、任意に、ヌクレオチドの基質ポリヌクレオチドへの付加中に、リガーゼ酵素によって基質ポリヌクレオチドに連結される。他の実施形態では、ＮＧＳアダプター配列Ｘ、配列Ｙ、または配列ＸおよびＹは、任意に、ヌクレオチドの基質ポリヌクレオチドへの付加後に、リガーゼ酵素によって基質ポリヌクレオチドに連結される。関連する実施形態では、リガーゼは、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである。
【００４２】
またさらなる実施形態では、アテニュエーター分子配列Ｗは、完全長Ｘ’Ｙ’ポリヌクレオチドプライマーに切り詰められたアテニュエーターを置換させ、ポリメラーゼ伸長が２本鎖の適合された基質分子を作製することを可能にするように、配列Ｘ’およびＹ’に関して、任意に切り詰められる。本明細書で使用される、「適合された分子」は、テーリングおよび連結反応を受けた基質分子である。
【００４３】
本開示は、基質分子が、ホモポリマー付加およびポリメラーゼ伸長後、適合された１本鎖ＤＮＡ分子の環状化をもたらす１本鎖ＤＮＡ環状化リガーゼと任意にインキュベートされる実施形態をさらに提供する。一実施形態では、配列Ｘおよび配列Ｙを含むアテニュエーター分子の環状化は、分解により阻止される。
【００４４】
別の実施形態では、基質分子は、ホモポリマー付加および伸長後、適合された１本鎖ＤＮＡ分子の環状化をもたらす１本鎖ＤＮＡ環状化リガーゼと任意にインキュベートされる。
【００４５】
本開示のさらなる実施形態では、ＸＺＹアダプター分子の環状化は、２本鎖または部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子の形成により阻止される。
【００４６】
本開示の実施形態は、配列Ｚの環状ＤＮＡ分子の切断を企図し、前記切断は、例えば、制限されないが、ＺがｄＵ塩基を含む実施形態において、ｄＵグリコシラーゼおよび脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼとのインキュベーションにより生じる。
【００４７】
本開示のさらなる実施形態は、配列Ｚの環状ＤＮＡ分子の切断を含み、前記切断は、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  Ｈ  ＩＩ（ＺがＲＮＡ塩基を含む実施形態において）との、または制限酵素とのインキュベーション、続くＸＺＹ接合部に相補的であるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより生じる。
【００４８】
さらなる態様では、本開示は、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素およびリガーゼ酵素、ＮＧＳアダプター配列ＸおよびＹならびに切断可能な配列Ｚを含むアダプターポリヌクレオチド（アダプターは、任意に３’リボヌクレオチドおよび５’リン酸塩を含み、切り詰められたＮＧＳアダプター配列Ｗおよび３’ブロックによりアテニュエーターにアニールされる）、ならびにアテニュエーターポリヌクレオチドのホモポリマー部分に相補的であるデオキシヌクレオチドと混合することと、テーリングと連結の同時反応を実施し、ポリメラーゼおよびリガーゼ酵素を熱不活性化し、続いて１本鎖特異的環状化リガーゼ酵素とインキュベートすることと、任意に、Ｚ配列で切断反応を含むか、または逆ＸおよびＹプライマー（そのいずれも環状分子を完全な直鎖状ＮＧＳライブラリ分子に分解するために実施される）と増幅反応させることとを含む、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法を提供する。
【００４９】
別の態様では、本開示は、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素、ＮＧＳアダプター配列Ｘ’およびＹ’を有し、３’伸長ブロックおよび本明細書に記載される切断部位を含むアテニュエーター、ならびにアテニュエーターポリヌクレオチドのホモポリマー部分に相補的であるデオキシヌクレオチドと混合することと、テーリング反応を実施し、ポリメラーゼ酵素を熱不活性化し、続いてポリメラーゼ伸長を実施するためにＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰの混合物を、基質上にホモポリマー付加のＮＧＳアダプター配列ＸおよびＹ３’を組み込むために尾を有する基質ポリヌクレオチドに添加することと、次に、アテニュエーター−テンプレートポリヌクレオチドがＲＮａｓｅまたはｄＵ−グリコシラーゼにより分解され、続いて１本鎖特異的環状化リガーゼ酵素とインキュベートされることと、任意に、Ｚ配列で切断反応を含むか、または逆ＸおよびＹプライマー（そのいずれも環状分子を完全直鎖状ＮＧＳライブラリ分子に分解するために実施される）と増幅反応させることとを含む、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法を提供する。
【００５０】
別の態様では、本開示は、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素、およびリガーゼ酵素、ＮＧＳアダプター配列Ｘを含むアダプターポリヌクレオチド（アダプターは任意に３’伸長ブロックおよび５’リン酸塩を含み、切り詰められたＮＧＳアダプター配列Ｗおよび３’ブロックによりアテニュエーターにアニールされる）、ならびにアテニュエーターポリヌクレオチドのホモポリマー部分に相補的であるデオキシヌクレオチドと混合することと、テーリングと連結の同時反応を実施し、ポリメラーゼおよびリガーゼ酵素を熱不活性化し、続いてアテニュエーター分子、ＤＮＡポリメラーゼ、および任意にｄＵＴＰを含むｄＮＴＰを置換することができる完全長ＮＧＳアダプター配列Ｘ’に相補的であるプライマーとインキュベートし、平滑断端を有する第２の鎖および２本鎖の基質分子を生成するために伸長反応を実施することと、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと、ＮＧＳアダプター配列Ｙおよび切り詰められた補体（配列Ｖ）を含む２つのポリヌクレオチドをアニールすることにより形成される平滑断端アダプターと、３’リン酸塩との連結を実施することと（Ｙポリヌクレオチドは基質分子の５’リン酸塩に連結され、直鎖状ＮＧＳライブラリ分子を完成する）、任意に、合成鎖がｄＵグリコシラーゼを使用し、９５℃に加熱されることにより分解されることとを含む、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法を提供する。
【００５１】
本開示のさらなる態様は、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素、ＮＧＳアダプター配列Ｘ’を有し、３’伸長ブロックおよび切断部位を有するアテニュエーター、ならびにアテニュエーターポリヌクレオチドのホモポリマー部分に相補的であるデオキシヌクレオチドと混合することと、テーリング反応を実施し、ポリメラーゼ酵素を熱不活性化し、続いてポリメラーゼ伸長を実施するためにプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰの混合物を添加し、基質上にホモポリマー付加のＮＧＳアダプター配列Ｘ３’を組み込み、ポリメラーゼ伸長が平滑断端２本鎖基質を生成することができるようにアテニュエーター３’端から非相補性塩基を除去することと、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと、ＮＧＳアダプター配列Ｙおよび切り詰められた補体（配列Ｖ）を含む２つのポリヌクレオチドをアニールすることにより形成される平滑断端アダプター分子と、３’リン酸塩との連結を実施することと（Ｙポリヌクレオチドは基質分子の５’リン酸塩に連結され、直鎖状ＮＧＳライブラリ分子を完成する）、任意に、合成鎖がｄＵグリコシラーゼを使用し、約９０℃〜１００℃に加熱されることにより分解されることとを含む、ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法を提供する。様々な実施形態では、混合物は、約９０℃〜９５℃、もしくは約９５℃〜１００℃に加熱されるか、または約９０℃、もしくは約９１℃、もしくは約９２℃、もしくは約９３℃、もしくは約９４℃、もしくは約９５℃、もしくは約９６℃、もしくは約９７℃、もしくは約９８℃、もしくは約９９℃、もしくは約１００℃である。
【００５２】
また別の態様では、ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）酵素、およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ、ＮＧＳアダプター配列Ｘを含むＤＮＡアダプターポリヌクレオチド（アダプターは任意に３’伸長ブロックおよび５’リン酸塩を含み、切り詰められたＮＧＳアダプター配列Ｗおよび３’ブロックによりＲＮＡアテニュエーターにアニールされる）、およびアテニュエーターポリヌクレオチドのホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドと混合することと、テーリングと連結の同時反応を実施し、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）酵素を熱不活性化し、続いて配列Ｘ’のために切り詰められたアテニュエーター分子、逆転写酵素、およびｄＮＴＰを置換することができる完全長ＮＧＳアダプター配列Ｘ’に相補的なプライマーとインキュベートし、第２の鎖および２本鎖の基質分子を生成するために伸長反応を実施することと、磁気ビーズＤＮＡ精製ステップ、続いて９５℃で鎖変性を実施することと、次に、ポリメラーゼ酵素、およびリガーゼ酵素、ならびにホモポリマーおよびＹ  ＮＧＳアダプター配列を基質分子の遊離３’端に付加するアテニュエーター−アダプター分子を使用して第２の同時テーリングおよび連結を実施し、よって任意のＤＮＡ精製ステップが要求される直線状ＮＧＳライブラリ分子を完成することとを含む、ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法が提供される。
【００５３】
本開示は、断片化１本鎖ＤＮＡが断片化２本鎖ＤＮＡの変性により、またはＲＮＡの逆転写により調製される、制御されたホモポリマーテーリングおよび連結、続く基質ポリヌクレオチドの環状化を使用してＮＧＳライブラリを合成する方法も提供し（図２５）、制御されたテーリングおよび連結は、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素、ヌクレオチドＤ（Ｄ＝ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＧＴＰ）、およびアテニュエーター−アダプター分子の存在下で実施され、アテニュエーター−アダプター分子は、２つのポリヌクレオチド、すなわちポリヌクレオチドＸＺＹおよびポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎをアニールすることにより形成される。
【００５４】
ポリヌクレオチドＸＺＹは、５’リン酸塩、および３’端に、ホモポリマー尾の付加を阻止するリボヌクレオチド塩基、または他の保護基を含む。配列ＸおよびＹは、ＮＧＳライブラリのアダプター配列および任意のＩＤタグを表す。任意の配列Ｚは切断に使用され、ｄＵ塩基、ＲＮＡ塩基、または制限エンドヌクレアーゼ部位から構成される。ポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎは、２つの配列、すなわちポリヌクレオチドＸＺＹの５’部分に相補的である配列Ｗおよびホモポリマーアテニュエーター配列（Ｈ）ｎ（ＨはＡ、Ｔ、またはＣ塩基であり、ｎ＝１０〜３０である）を含む。ポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎは、ポリメラーゼ酵素により塩基の付加を特異的に阻害する３’リン酸塩、ジデオキシヌクレオチドＣ３−スペーサー、逆位チミジン、または１つ以上のリボヌクレオチドを含むが、これらに限定されない３’保護基を含む。反応において、ポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ基質の３’端に限られた数の塩基を付加し、続いてリガーゼ酵素によりＸＺＹアダプター分子が連結される。ある特定の実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、約１〜５０個のｄＡもしくはｄＴ塩基、または約１〜５０個のｄＧ塩基である。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、約１個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約５個〜最大約１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約１０個〜最大約１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約９個〜約１２個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチド、または約６個〜約８個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、また少なくとも約５０個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、またはそれ以上のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチドである。
【００５５】
ポリメラーゼ酵素およびリガーゼ酵素の任意の熱不活性化後、１本鎖環状化リガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とのインキュベーションは、適合された１本鎖ＤＮＡ分子の環状化をもたらす。ＸＺＹポリヌクレオチドの環状化は、ＸＺＹとＷ（Ｈ）ｎポリヌクレオチドとの間の２本鎖アテニュエーター−アダプター複合体の形成により阻止される。環状化されたＮＧＳライブラリを、クラスター形成（Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４、および固体プラットホームの場合、エマルジョンＰＣＲ、そしてＩｌｌｕｍｉｎａプラットホームの場合、架橋増幅）に直接使用するか、または配列決定（ＰａｃＢｉｏ）に直接使用することができる。任意に、環状ＤＮＡ分子の切断は、ｄＵグリコシラーゼおよび脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼにより（Ｚ配列がｄＵ塩基を含むとき）、ＲＮａｓｅ  ＨもしくはＲＮａｓｅ  Ｈ  ＩＩにより（Ｚ配列がＲＮＡ塩基を含むとき）、または制限エンドヌクレアーゼにより達成される。後者２つの場合、ＸＺＹ接合部に相補的なポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが、ＲＮａｓｅ  Ｈまたは制限エンドヌクレアーゼのテンプレートを提供するのに必要である。あるいは、増幅反応が環状形態を直線状形態に分解するために実施される。
【００５６】
本開示は、制御されたホモポリマーテーリング、続いてポリメラーゼ伸長、および環状化を使用したＮＧＳライブラリ合成のための代替方法も提供し（図２６）、１本鎖の基質ポリヌクレオチドのテーリングは、ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチドＤ（Ｄ＝ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＧＴＰ）およびアテニュエーター−テンプレートポリヌクレオチドの存在下で実施され、アテニュエーター−テンプレートポリヌクレオチドは、３つの配列、すなわちアダプター配列Ｙに相補的である５’配列Ｙ’、アダプター配列Ｘに相補的である配列Ｘ’、およびホモポリマーアテニュエーター配列（Ｈ）ｎ（Ｈは、Ａ、Ｔ、またはＣ塩基であり、ｎ＝１０〜３０である）を含む。アテニュエーター−テンプレートポリヌクレオチドは、３’端にリン酸基、リボヌクレオチド、または他の保護基を追加でさらに含む。配列ＸおよびＹは、ＮＧＳライブラリのアダプター配列および任意のＩＤタグを表す。アテニュエーター配列およびＸ’、Ｙ’配列の両方は、リボヌクレオチドまたはｄＵ等の分解性塩基を有する。アテニュエーター分子の存在下で、ポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡの３’端に限られた数の塩基を付加する。ある特定の実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、約１〜５０個のｄＡもしくはｄＴ塩基、または約１〜５０個のｄＧ塩基である。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、約１個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約５個〜最大約１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは、約１０個〜最大約１２個、１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約１０個〜約１３個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、また少なくとも約５０個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、またはそれ以上のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチドである。
【００５７】
ポリメラーゼ酵素およびリガーゼ酵素の任意の熱不活性化後、ホモポリマー配列（Ｄ）ｎの３’端へのＸおよびＹ配列の付加をもたらすポリメラーゼ伸長を実施するために、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰのミックスを添加する。ｄＵグルコシラーゼまたはＲＮａｓｅの添加によるアテニュエーター−テンプレート分解後、１本鎖環状化リガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とのインキュベーションは、適合された１本鎖ＤＮＡ分子の環状化もたらす。必要であれば、任意の増幅は環状形態を直線状形態に分解するために実施される。あるいは、ＸとＹとの間の任意の配列Ｚが、ＸＺＹドメインへの相補的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび切断反応の後に直鎖状形態を作製するために使用される（上記の本明細書に記載される）。ある特定の実施形態では、環状形態から直線状形態に分解するために実施される任意の増幅は、逆ＰＣＲを含むが、これに限定されない技法である。
【００５８】
制御されたホモポリマーテーリングおよび連結、続く逆鎖合成および平滑アダプター連結を含むＮＧＳライブラリ合成の方法も企図され（図２７）、テーリングおよび連結は、ＴｄＴ酵素、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、ヌクレオチドＤ（Ｄ＝ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＧＴＰ）、および２つのポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドＸおよびポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎをアニールすることにより形成されるアテニュエーター−アダプター分子の存在下で実施される。ポリヌクレオチドＸは５’リン酸塩および３’保護基を含み、配列Ｘは、ＮＧＳライブラリアダプター配列および任意のＩＤタグを含む。ポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎは、２つの配列：ポリヌクレオチドＸの５’部分に相補的である５’配列Ｗおよびホモポリマーアテニュエーター配列（Ｈ）ｎ（Ｈは、Ａ、Ｔ、またはＣ塩基であり、ｎ＝１０〜３０である）からなり、３’保護基をさらに含む。反応において、ポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ基質の３’端に限られた数の塩基を付加し、続いてリガーゼ酵素によりアテニュエーター−アダプター分子が連結される。ある特定の実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、約１〜５０個のｄＡもしくはｄＴ塩基、または約１〜５０個のｄＧ塩基である。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、約１個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約５個〜最大約１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約１０個〜最大約１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約９個〜約１２個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチド、または約６個〜約８個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、また少なくとも約５０個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、またはそれ以上のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチドである。
【００５９】
ポリメラーゼ酵素およびリガーゼ酵素の任意の熱不活性化後のＤＮＡポリメラーゼ、ならびに５’配列Ｘ’、３’端に１〜１０Ｈ塩基（またはさらなる実施形態では、約１〜約５、７、もしくは１０Ｈ塩基、または約５〜約６、８、もしくは１０Ｈ塩基、または約６〜約８Ｈ塩基）、および任意のｄＵ塩基を含有するプライマーの付加は、逆鎖複製をもたらし、よって２本鎖の平滑断端（プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼの存在下で）または３’ｄＡ塩基を有する２本鎖端（ＤＮＡポリメラーゼがプルーフリーディング活性を欠損するとき）のいずれかを形成し、重合ミックスは、ｄＵＴＰを任意に含む。平滑断端またはｄＴ−アダプターの連結はリガーゼ酵素により達成され、連結されるアダプターは、２つのポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドＹ（Ｙは第２のＮＧＳアダプターである）およびポリヌクレオチドＹの３’部分に相補的であるポリヌクレオチドＶにより形成される。ポリヌクレオチドＶの３’端はリン酸保護基を有する。連結は、ポリヌクレオチドＹの３’端の、元のＤＮＡ断片の５’リン酸塩への共有結合をもたらし、一方で、ポリヌクレオチドＶの５’端とプライマー伸長生成物の３’端との間に連結は形成されない。任意に、複製されたＤＮＡ鎖およびプライマーＸ’は、ｄＵグリコシラーゼとのインキュベーションおよび９５℃でのインキュベーションにより分解される。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約９０℃〜１００℃の間で行われる。さらなる実施形態では、混合物は、約９０℃〜９５℃、または約９５℃〜１００℃に加熱されるか、または約９０℃、もしくは約９１℃、もしくは約９２℃、もしくは約９３℃、もしくは約９４℃、もしくは約９５℃、もしくは約９６℃、もしくは約９７℃、もしくは約９８℃、もしくは約９９℃、もしくは約１００℃である。
【００６０】
本開示は、制御されたテーリングおよび重合、続いて逆鎖合成および平滑連結を含むＮＧＳライブラリ構築のための代替方法も提供し（図２８）、テーリングは、ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチドＤ（Ｄ＝ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＧＴＰ）、および２つの配列：ＮＧＳアダプターＸに相補的である５’配列Ｘ’、およびホモポリマーアテニュエーター配列（Ｈ）ｎ（Ｈは、Ａ、Ｔ、またはＣ塩基であり、ｎ＝１０〜３０であり、３’リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドまたはｄＵ等の内部分解性塩基をさらに含む）を含むアテニュエーター−テンプレートポリヌクレオチドの存在下で実施される。アテニュエーター分子の存在下で、ポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ基質の３’端に限られた数の塩基を付加し、任意の熱不活性後、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰミックスを含むことにより、配列Ｘを含むようにＤＮＡ基質を伸長し、またアテニュエーターポリヌクレオチド３’終端から過剰な非相補性塩基も除去し、その後、２本鎖平滑断端をもたらす逆鎖複製をもたらす。重合ミックスは、ｄＵＴＰを任意に含むことができる。平滑断端アダプターの連結は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより達成され、そこでは平滑断端アダプターが２つのポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドＹ（Ｙは、第２のＮＧＳアダプターの配列である）、およびポリヌクレオチドＹの３’部分に相補的であるポリヌクレオチドＶ（ポリヌクレオチドＶの３’端は、リン酸塩または他の保護基を含む）により形成される。平滑連結は、ポリヌクレオチドＹの３’端の、本来のＤＮＡ断片の５’リン酸塩への共有結合をもたらし、一方で、ポリヌクレオチドＶの５’端とプライマー伸長生成物の３’端との間に連結は生じない。任意に、複製されたＤＮＡ鎖およびプライマーＸ’は、ｄＵグリコシラーゼとのインキュベーションおよび９５℃でのインキュベーションにより分解される。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約９０℃〜１００℃の間で行われる。さらなる実施形態では、混合物は、約９０℃〜９５℃、または約９５℃〜１００℃に加熱されるか、または約９０℃、もしくは約９１℃、もしくは約９２℃、もしくは約９３℃、もしくは約９４℃、もしくは約９５℃、もしくは約９６℃、もしくは約９７℃、もしくは約９８℃、もしくは約９９℃、もしくは約１００℃である。
【００６１】
ＮＧＳライブラリ調製のための本開示の別の方法は、２つの連続したテーリングおよび連結反応を含み（図２９）、第１のテーリングおよび連結反応は、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素、ヌクレオチドＤ（Ｄ＝ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＧＴＰ）、ならびに２つのポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドＸおよびポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎ（ポリヌクレオチドＸは、５’リン酸塩、３’保護基、およびＮＧＳアダプター配列、ならびに任意のＩＤタグを含み、ポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎは、２つの配列：ポリヌクレオチドＸの５’部分に相補的である５’配列Ｗ、およびホモポリマーアテニュエーター配列（Ｈ）ｎ（Ｈは、Ａ、Ｔ、またはＣ塩基であり、ｎ＝１０〜３０である）を含み、３’保護基を任意に含む）をアニールすることにより形成されるアテニュエーター−アダプター分子の存在下で実施される。
【００６２】
その反応において、ポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ基質の３’端に限られた数の塩基を付加し（１〜５０個のｄＡまたはｄＴ塩基、および１〜５０個のｄＧ塩基）、続いてリガーゼ酵素により第１のアテニュエーター−アダプター分子が連結される。ポリメラーゼおよびリガーゼの任意の熱不活性化後、配列Ｘに相補的な５’配列Ｘ’および３’端に１〜１０のＨ塩基を含有するプライマーの添加は、アダプター配列Ｘへのプライマーアニーリングおよびアテニュエーターポリヌクレオチドの置換をもたらす。加えて、プライマーＸ’は、第２のテーリングおよび連結反応によるポリメラーゼ媒介プライマーテーリングを阻止するために、３’端にｒＨ保護塩基を含み得る。ＤＮＡポリメラーゼの付加はプライマーを伸長し、基質の逆鎖を複製し、この場合、反応は、ＥＤＴＡにより任意に停止され、第２のポリメラーゼ酵素の添加が、ＤＮＡ伸長生成物の３’端に限られた数の塩基（１〜５０個のｄＡまたはｄＴ塩基、および１〜５０個のｄＧ塩基）を付加する前に、第２のＮＧＳアダプターＹにアニールされ、続いて第２のＮＧＳアダプターＹを含む第２のアテニュエーター−アダプター分子がリガーゼ酵素により連結される第２のアテニュエーターの存在下で、磁気ビーズ系ＤＮＡ精製により精製される。任意に、ポリメラーゼおよびリガーゼは、熱不活性化され、続いて磁気ビーズ系ＤＮＡ精製される。上記およびさらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、約１個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約５個〜最大約１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約１０個〜最大約１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチド、あるいは約９個〜約１２個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチド、または約６個〜約８個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、また少なくとも約５０個のｄＡ、ｄＴ、もしくはｄＧヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼによりＤＮＡ基質の３’端に付加される塩基の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、またはそれ以上のｄＡ、ｄＴ、またはｄＧヌクレオチドである。
【００６３】
本開示は、基質ポリヌクレオチド上の５’尾状ランダムプライマー伸長、続く制御されたテーリングおよび連結の組み合わせを使用して、ＮＧＳライブラリ合成のための方法も提供し（図３０）、この場合、無傷または断片化１本鎖核酸を、２つのドメイン：５’ドメインＸ（配列Ｘは、様々な実施形態では、ＮＧＳアダプター配列、および任意に識別タグを含む）、および３’ドメイン（ランダム配列ｎを含む）を含むランダムプライマーへのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ、それによって、核酸サンプル内の任意の領域とのプライマーハイブリダイゼーションを可能にし、適切な反応条件下のポリメラーゼおよびヌクレオチドの存在下で、プライマー伸長および伸長生成物の５’終端のアダプターＸの組み込みが達成される。プライマーは、様々な態様では、ビオチンを含むがこれに限定されない５’標識を含む。任意の精製またはヌクレオチド分解ステップ後、テーリングおよび連結反応は、ポリメラーゼ、リガーゼ酵素、ヌクレオチドＤ（Ｄ＝Ａ、Ｔ、またはＧ）、および２つのポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドＹおよびポリヌクレオチドＶ（Ｈ）ｎをアニールすることにより形成されるアテニュエーター−アダプター分子の存在下で、伸長生成物に対して実施される。ポリヌクレオチドＹは、５’リン酸塩および３’保護基を含み、配列Ｙは、第２のＮＧＳライブラリアダプター配列および任意の識別タグを含む。ポリヌクレオチドＶ（Ｈ）ｎは、２つの配列：ポリヌクレオチドＹの５’部分に相補的である５’配列Ｖ、およびホモポリマーアテニュエーター配列（Ｈ）ｎ（Ｈは、Ａ、Ｔ、またはＣ塩基であり、ｎ＝１０〜３０である）からなり、３’保護基を追加で含む。反応において、ポリメラーゼ酵素は、プライマー伸長生成物の３’端に限られた数の塩基（すなわち、約１〜約５０個のヌクレオチド）を付加し、続いてリガーゼ酵素によるＹ／Ｖ（Ｈ）ｎアテニュエーター−アダプター分子が連結され、よって第１および第２のＮＧＳアダプターの両方の付加が完了する。
【００６４】
本開示は、基質ポリヌクレオチド上の５’尾状標的特異的プライマー伸長、続く制御されたテーリングおよび連結の組み合わせを使用して、標的ＮＧＳライブラリ合成の方法も企図し（図３１）、この場合、無傷または断片化１本鎖核酸は、２つのドメイン：配列ＸがＮＧＳアダプター配列および任意の識別タグを含む複数の全てのプライマーに一般的な５’ドメインＸと多数の各プライマーに独特の３’ドメイン（それぞれ標的特異的配列を含む）とを含む複数の標的特異的プライマーによりハイブリダイゼーションを受け、それによって、核酸サンプル内の任意の所望の複数の標的とのプライマーハイブリダイゼーションを可能にし、適切な反応条件下のポリメラーゼおよびヌクレオチドの存在下で、プライマー伸長および伸長生成物の５’終端のアダプターＸの組み込みが達成される。プライマー多数性は、ビオチンを含むがこれに限定されない５’標識をさらに含む。任意の精製またはヌクレオチド分解ステップ後、テーリングおよび連結反応は、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素、ヌクレオチドＤ（Ｄ＝Ａ、Ｔ、またはＧ）、および２つのポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドＹおよびポリヌクレオチドＶ（Ｈ）ｎをアニールすることにより形成されるアテニュエーター−アダプター分子の存在下で実施される。ポリヌクレオチドＹは、５’リン酸塩および３’保護基を含み、配列Ｙは、第２のＮＧＳライブラリアダプター配列および任意の識別タグを含む。ポリヌクレオチドＶ（Ｈ）ｎは、２つの配列：ポリヌクレオチドＹの５’部分に相補的である５’配列Ｖ、およびホモポリマーアテニュエーター配列（Ｈ）ｎ（Ｈは、Ａ、Ｔ、またはＣ塩基であり、ｎ＝１０〜３０である）からなり、３’保護基をさらに含む。反応において、ポリメラーゼ酵素は、プライマー伸長生成物の３’端に限られた数の塩基（すなわち、約１〜約５０個のヌクレオチド）を付加し、続いてリガーゼ酵素によるＹ／Ｖ（Ｈ）ｎアテニュエーター−アダプター分子が連結され、よって複数の各標的上の両方のＮＧＳアダプターの付加が完了する。
【００６５】
制御されたホモポリマーテーリングおよび連結、続いて標的特異的プライマー伸長および標的特異的平滑アダプター連結を含む標的ＮＧＳライブラリ合成の方法も企図し（図３２）、テーリングおよび連結は、ポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレオチドＤ（Ｄ＝Ａ、Ｔ、またはＧ）、および２つのポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドＸおよびポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎをアニールすることにより形成されるアテニュエーター−アダプター分子の存在下で実施される。ポリヌクレオチドＸは、５’リン酸塩および３’保護基を含み、配列Ｘは、ＮＧＳライブラリアダプター配列、および任意の識別タグを含む。ポリヌクレオチドＷ（Ｈ）ｎは、２つの配列：ポリヌクレオチドＸの５’部分に相補的である５’配列Ｗ、およびホモポリマーアテニュエーター配列（Ｈ）ｎ（Ｈは、Ａ、Ｔ、またはＣ塩基であり、ｎ＝１０〜３０である）を含み、３’保護基をさらに含む。反応において、ポリメラーゼは、核酸基質の３’端に限られた数の塩基（すなわち、約１〜約５０個のヌクレオチド）を付加し、続いてリガーゼによるアテニュエーター−アダプター分子が連結される。ポリメラーゼおよびリガーゼの任意の熱不活性化後、適切な条件下でのポリメラーゼ、ヌクレオチド、および複数の標的特異的プライマーの添加は、複数の標的特異的プライマーに対して相補性配列を含む断片に関して、２本鎖平滑断端（プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼの存在下で）、または３’ｄＡ塩基を有する２本鎖端（ＤＮＡポリメラーゼがプルーフリーディング活性を欠損するとき）のいずれかの形成をもたらす。プライマー多数性は、ビオチンを含むがこれに限定されない５’標識をさらに含む。平滑断端またはｄＴ−アダプターの複数の標的特異的生成物への連結は、リガーゼ酵素により達成され、連結されるアダプターは、２つのポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドＹ（Ｙは第２のＮＧＳアダプターである）およびポリヌクレオチドＹの３’部分に相補的であるポリヌクレオチドＶにより形成される。ポリヌクレオチドＶの３’端はリン酸保護基を有する。連結は、ポリヌクレオチドＹの３’端の、複数の標的特異的断片の５’リン酸塩への共有結合をもたらし、一方で、ポリヌクレオチドＶの５’端と標的特異的プライマー生成物の３’端との間に連結は形成されない。任意に、完全な複数の標的特異的ライブラリ生成物は、ＮＧＳアダプター特異的プライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅される。
【００６６】
図３３において、制御されたテーリングおよび連結ステップを伴う標的特異的ＮＧＳライブラリ調製方法の要約が示される。方法１は、図３２に記載される方法を要約し、方法２の任意の標的ライブラリビーズ捕捉を伴う。方法３は、全ゲノムＮＧＳライブラリが構築され、その後、標的特異的プライマー伸長、および標的ライブラリビーズ捕捉、ならびに増幅が続く、方法が要約される。方法４および５は、図３１に提示される方法の代替のワークフローを示す。方法４において、複数のビオチン化標的特異的プライマーは、断片化核酸サンプルから選択領域に伸長し、続いて第１のＮＧＳアダプターの平滑またはＴＡ連結、ビーズ捕捉、次に制御されたテーリングおよび連結が行われ、第２のＮＧＳアダプターを付加する。方法５は、第１のステップの標的特異的鵜ライマーがＮＧＳアダプター配列を有する５’尾を含むことを除き、４に類似する。方法６において、第１のＮＧＳアダプターおよびアダプター特異的プライマー伸長を導入するための制御されたテーリングおよび連結後、変性、続く第２の５’にＮＧＳアダプターの尾を有する標的特異的プライマー伸長により、さらに増幅され得るＮＧＳライブラリが完成する。標的特異的ＮＧＳライブラリ調製のための方法のいずれにおいても、本明細書に記載されるアテニュエーター分子を使用することにより、それが多重化できることを企図する。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるアテニュエーター分子を使用することにより、それがライブラリ生成物を表面に固定化できるようにする。
【００６７】
ＮＧＳアダプター配列を導入するために制御されたテーリングおよび連結の開示される方法を使用する全ゲノムまたは標的ライブラリ構築の様々な実施形態のいずれに関しても、第２のアダプター配列は、第２の制御されたテーリングおよび連結により導入されるか、またはプライマー伸長反応後に平滑もしくはＴＡ連結により２本鎖基質に導入されるかのいずれかである。図３７に示されるように、１本鎖を選択的に連結するか、または両方の鎖を連結するかのいずれかである平滑およびＴＡアダプター連結に関して、様々な方法が企図される。よって、アダプター配列は、様々な実施形態では、平滑断端またはＴ−突出端（よってＴＡ連結を生じさせる）を含む。さらなる実施形態では、アダプター配列は、平滑断端であってよく、Ｔ−塩基３’突出、５’−リン酸塩、もしくは３’−基保護連結（これに限定されないが、例えばジデオキシヌクレオチド）、またはそれらの組み合わせを有する。
【００６８】
本開示は、（１）基質ポリヌクレオチドを含む混合物を、基質ポリヌクレオチドの伸長が基質に尾を付けるのを可能にする条件下で、（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）アテニュエーター配列を含み、かつアテニュエーター配列に隣接して位置付けられ、別のポリヌクレオチド上のアダプター配列Ｘに相補的である配列Ｗをさらに含むアテニュエーター分子であり、組成物が配列Ｖに相補的な配列Ｙを含むアダプター分子をさらに含み、配列ＶがＹと同じ長さであるか、または配列Ｙと同じ長さ未満であり、アダプター分子がアテニュエーター−アダプター分子とは別の分子である組成物、および（ｉｉｉ）アテニュエーター分子のアテニュエーター配列に相補的であるデオキシヌクレオチドとインキュベートすることと、（２）アダプター配列Ｘを基質ポリヌクレオチドに連結し、別のポリヌクレオチドからアテニュエーター分子を解離することと、（３）プライマーが基質ポリヌクレオチドとハイブリダイズする条件下で、基質ポリヌクレオチドの配列に相補的なプライマーを付加することと、（４）ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドを付加して、基質ポリヌクレオチドに相補的な第２鎖ポリヌクレオチドを生成し、２本鎖基質分子を作製するためにプライマーからポリメラーゼ伸長を実施することと、（５）アダプター分子を２本鎖基質分子に連結することと、（６）任意に、第２鎖ポリヌクレオチドを分解することとを含む、基質ポリヌクレオチドを伸長する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、プライマーは、適切な条件下で、配列Ｘとハイブリダイズするのに基質ポリヌクレオチドの配列に十分に相補的である。さらなる実施形態では、プライマーは、適切な条件下で、配列Ｘ以外の基質分子の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的である標的特異的プライマーである。さらなるの実施形態では、基質ポリヌクレオチドは、１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドであり、またさらなる実施形態では、基質ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００６９】
本明細書に開示される組成物のいずれかを含むキットも提供される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
核酸ポリメラーゼと、アテニュエーター分子と、を含む、組成物。
（項目２）
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記核酸ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼである、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記ＲＮＡ特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびポリ（Ｕ）ポリメラーゼからなる群から選択される、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記アテニュエーター分子が、２’−デオキシチミジン５’−１リン酸（ｄＴＭＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−１リン酸（ｄＧＭＰ）、２’−デオキシアデノシン５’−１リン酸（ｄＡＭＰ）、２’−デオキシシチジン５’−１リン酸（ｄＣＭＰ）、２’−デオキシウリジン５’−１リン酸（ｄＵＭＰ）、チミジン１リン酸（ＴＭＰ）、グアノシン１リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン１リン酸（ＵＭＰ）、塩基類似体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチドを含む、項目１〜６のいずれかに記載の組成物。
（項目８）
前記アテニュエーター分子が、１０個のヌクレオチドを含む、項目１〜７のいずれかに記載の組成物。
（項目９）
前記アテニュエーター分子が、２０個のヌクレオチドを含む、項目１〜８のいずれかに記載の組成物。
（項目１０）
前記アテニュエーター分子が、３０個のヌクレオチドを含む、項目１〜９のいずれかに記載の組成物。
（項目１１）
前記アテニュエーター分子が、５０個のヌクレオチドを含む、項目１〜１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）
前記アテニュエーター分子が、１００個のヌクレオチドを含む、項目１〜１１のいずれかに記載の組成物。
（項目１３）
前記アテニュエーター分子が、３’保護基を含む、項目１〜１２のいずれかに記載の組成物。
（項目１４）
前記保護基が、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー、リン酸塩、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、および逆位デオキシチミジンからなる群から選択される、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記アテニュエーター分子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、環状分子、ペプチド核酸、シゾフィラン多糖、ロックド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１６）
前記アテニュエーター分子が、分解性である、項目１〜１５のいずれかに記載の組成物。
（項目１７）
前記アテニュエーター分子が、ホモポリマー配列の５’に位置するアダプター配列、識別タグ配列、またはそれらの両方をさらに含む、項目１〜１６のいずれかに記載の組成物。
（項目１８）
リガーゼが、存在する、項目１〜１７のいずれかに記載の組成物。
（項目１９）
前記アテニュエーター分子が、アテニュエーター配列を含み、かつ前記アテニュエーター配列に隣接して位置付けられ、別のポリヌクレオチド上の配列Ｘに相補的である配列Ｗをさらに含むアテニュエーター−アダプター分子であり、
前記組成物が、配列Ｖに相補的である配列Ｙを含むアダプター分子をさらに含み、配列Ｖが、Ｙと同じ長さであるか、または配列Ｙと同じ長さ未満であり、前記アダプター分子が、前記アテニュエーター−アダプター分子とは別の分子である、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記アテニュエーター分子が、固定化される、項目１７に記載の組成物。
（項目２１）
前記アテニュエーター分子が、１本鎖である、項目１〜２０のいずれかに記載の組成物。
（項目２２）
前記アテニュエーター分子が、少なくとも部分的に２本鎖である、項目１７〜２１のいずれかに記載の組成物。
（項目２３）
前記少なくとも部分的に２本鎖のアテニュエーター分子が、前記アダプター配列を含むアダプター分子に前記アテニュエーター分子をアニールすることにより生成される、項目２１または２２のいずれかに記載の組成物。
（項目２４）
前記アテニュエーター分子が、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＵ）、ポリ（ｒＡ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（ｒＣ）、ポリ（ｒＧ）、ならびに
（ｉ）ｄＡおよびｒＡ塩基、
（ｉｉ）ｄＴ、ｄＵ、およびＵ塩基、
（ｉｉｉ）ｄＣおよびｒＣ塩基、または
（ｉｖ）ｄＧおよびｒＧ塩基の組み合わせを含むヘテロポリマー配列からなる群から選択されるホモポリマー配列を含む、項目１〜２３のいずれかに記載の組成物。
（項目２５）
前記アテニュエーター分子が、ｄＵ塩基を含み、ｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーションが前記アテニュエーター分子を不安定化するか、またはｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーション、および後続の８０℃を上回る温度でのインキュベーションが前記アテニュエーター分子を分解するか、あるいは前記アテニュエーター分子がｄＵ−グリコシラーゼと脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼの混合物とインキュベートされる、項目１６に記載の組成物。
（項目２６）
前記アテニュエーター分子が、リボヌクレオチドを含み、リボヌクレアーゼ活性に十分な条件下でリボヌクレアーゼにより分解性である、項目１６に記載の組成物。
（項目２７）
前記リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ１からなる群から選択される、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記アテニュエーター分子が、デオキシリボヌクレオチドを含み、ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼにより分解性である、項目１６に記載の組成物。
（項目２９）
前記ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼが、ＤＮａｓｅ  Ｉである、項目２８に記載の組成物。（項目３０）
基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
前記基質ポリヌクレオチドの３’端への、尾配列の付加を可能にするのに十分な条件下で、前記基質ポリヌクレオチドを項目１〜２９のいずれかに記載の組成物とインキュベー
トすることを含み、前記尾配列の付加が前記尾配列と前記アテニュエーター分子との間の会合を可能にし、複合体を形成する、方法。
（項目３１）
前記基質ポリヌクレオチドの伸長後、前記アテニュエーター分子を分解することをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記基質ポリヌクレオチドの伸長後、前記アテニュエーター分子を不安定化することをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記伸長した基質ポリヌクレオチドを単離することをさらに含む、項目３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
項目１〜２７のいずれか１項に記載の組成物を、前記基質ポリヌクレオチド、および前記アテニュエーター分子の前記ホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することをさらに含む、項目３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
基質ポリヌクレオチドが、１本鎖基質ポリヌクレオチドである、項目３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記基質ポリヌクレオチドが、２本鎖基質ポリヌクレオチドである、項目３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記基質ポリヌクレオチドが、部分的に２本鎖であり、部分的に１本鎖の基質ポリヌクレオチドである、項目３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記２本鎖基質ポリヌクレオチドが、３’突出端を有する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記基質ポリヌクレオチドが、遊離３’ヒドロキシル基を含む、項目３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
多数のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記アテニュエーター分子が、前記アテニュエーター分子の長さ全てまたは一部にわたって前記尾配列と会合する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記アテニュエーター分子が、前記尾配列を付加する過程中に前記尾配列と会合する、項目４０または項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記アテニュエーター分子の前記尾配列への会合が、ヌクレオチドの前記基質ポリヌクレオチドへの付加を調節する、項目４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記条件が、前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加を調節する、項目３０〜４３のいずれかに記載の方法。
（項目４５）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、温度感受性である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
約４℃〜約５０℃の温度範囲で実施される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記温度が、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、時間感受性である、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記インキュベーションステップが、約０．５分〜約１２０分の範囲の時間の長さにわたって進行する、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記インキュベーションステップが進行する前記時間の長さが、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、約３０分、約３１分、約３２分、約３３分、約３４分、約３５分、約３６分、約３７分、約３８分、約３９分、約４０分、約４１分、約４２分、約４３分、約４４分、約４５分、約４６分、約４７分、約４８分、約４９分、約５０分、約５１分、約５２分、約５３分、約５４分、約５５分、約５６分、約５７分、約５８分、約５９分、約６０分、約６１分、約６２分、約６３分、約６４分、約６５分、約６６分、約６７分、約６８分、約６９分、約７０分、約７１分、約７２分、約７３分、約７４分、約７５分、約７６分、約７７分、約７８分、約７９分、約８０分、約８１分、約８２分、約８３分、約８４分、約８５分、約８６分、約８７分、約８８分、約８９分、約９０分、約９１分、約９２分、約９３分、約９４分、約９５分、約９６分、約９７分、約９８分、約９９分、約１００分、約１０１分、約１０２分、約１０３分、約１０４分、約１０５分、約１０６分、約１０７分、約１０８分、約１０９分、約１１０分、約１１１分、約１１２分、約１１３分、約１１４分、約１１５分、約１１６分、約１１７分、約１１８分、約１１９分、または約１２０分である、項目４８または項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、ｐＨ感受性である、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、ｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０の範囲である条件下で実施される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、ｐＨが約ｐＨ５．１、約ｐＨ５．２、約ｐＨ５．３、約ｐＨ５．４、約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．６、約ｐＨ５．７、約ｐＨ５．８、約ｐＨ５．９、約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．１、約ｐＨ６．２、約ｐＨ６．３、約ｐＨ６．４、約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．６、約ｐＨ６．７、約ｐＨ６．８、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．５、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．９、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．１、約ｐＨ８．２、約ｐＨ８．３、約ｐＨ８．４、約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．６、約ｐＨ８．７、約ｐＨ８．８、約ｐＨ８．９、または約ｐＨ９．０である条件下で実施される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記基質ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、項目３０に記載の方法。
（項目５５）
前記基質ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、項目３０に記載の方法。
（項目５６）
少なくとも３個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
少なくとも１０個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
少なくとも２０個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
少なくとも３０個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
少なくとも５０個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
少なくとも１００個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記アダプター分子が、ヌクレオチドの前記基質ポリヌクレオチドへの付加中に、リガーゼ酵素によって前記基質ポリヌクレオチドに連結され、前記基質ポリヌクレオチドの固定化をもたらす、項目３０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
前記リガーゼが、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記アダプター分子が、ヌクレオチドの前記基質ポリヌクレオチドへの付加後に、リガーゼ酵素によって前記基質ポリヌクレオチドに連結される、項目３０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記固定化されたアテニュエーター−アダプター分子が、尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加中に、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼによって基質ポリヌクレオチドに連結される、項目３０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記固定化されたアテニュエーター−アダプター分子が、尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加後に、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼによって基質ポリヌクレオチドに連結される、項目３０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
反応物に添加される前記リガーゼ酵素の量が、約０．１〜約１０００単位（Ｕ）である、項目６２〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ＴｄＴ酵素、３’リン酸塩を含む分解性アテニュエーターポリヌクレオチド、および前記アテニュエーターポリヌクレオチドの前記ホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することと、
前記混合物を、約３０℃〜約３７℃で約３０分間インキュベートし、続いて７０℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、
ＤＮＡグリコシラーゼを添加することにより、前記アテニュエーター分子を不安定化す
ることと、
前記混合物を、３７℃で約５分間インキュベートするか、または前記混合物を、８０℃を上回る温度でインキュベートすることにより、前記アテニュエーター分子を分解することと、
任意に、前記伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目６９）
ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ＴｄＴ酵素、少なくとも２つのリボヌクレオチドを任意に含む保護基を含むアテニュエーターポリヌクレオチド、および前記アテニュエーターポリヌクレオチドの前記ホモポリマー部分に相補的であるデオキシヌクレオチドと混合することと、
前記混合物を、約３０℃〜約３７℃で約３０分間インキュベートし、続いてＴｄＴ酵素を不活性化するために、７０℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、
任意に、前記伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。（項目７０）
基質ＲＮＡポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
基質ＲＮＡポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、分解性アテニュエーターポリヌクレオチド、および前記アテニュエーターポリヌクレオチドの前記ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドと混合することと、
前記混合物を、約３０℃〜約３７℃で約３０分間インキュベートし、続いて９５℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、
ＤＮＡグリコシラーゼを添加することによって前記アテニュエーター分子を不安定化し、前記混合物を３７℃で約１０分間インキュベートするか、またはＤＮＡグリコシラーゼを添加し、前記化合物を３７℃で約１０分間インキュベートし、続いて８０℃を上回る温度でインキュベートすることにより、前記アテニュエーター分子を分解することと、
任意に、前記伸長した基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７１）
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼである、項目７０に記載の方法。（項目７２）
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、項目７０に記載の方法。（項目７３）
ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
アテニュエーター分子とアダプター分子の混合物を、適切な緩衝液中で約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、前記アテニュエーター分子および相互に少なくとも部分的に相補的である前記アダプター分子をアニールすることであって、前記アニーリングが、部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、
前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ＴｄＴ酵素、リガーゼ酵素、前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子、および前記アテニュエーター−アダプター分子の前記ホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することと、
約３０℃〜約３７℃で約１５分〜約３０分間インキュベートすることと、
任意に、前記アテニュエーター−アダプター分子に連結された前記伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７４）
ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
アテニュエーター分子とビオチン化アダプター分子の混合物を、適切な緩衝液中で約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、相互に少なくとも部分的に相補的である前記前記ビオチン化アダプター分子にアテニュエーター分子をアニールすることであって、前記アニーリングが、部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、
前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約２５℃で約２時間、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを含む溶液と混合することにより、前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を固定化し、前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子の前記ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズへの固定化をもたらすことと、
前記ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズに結合された前記固定化された部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約３０℃〜約３７℃で約１５分〜３０分間、前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチド、ＴｄＴ酵素、リガーゼ酵素、および前記部分的に２本鎖のアテニュエーター分子の１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドとインキュベートすることと、
前記溶液をＮａＯＨで洗浄し、前記ビーズから前記非ビオチン化１本鎖ＤＮＡを除去することと、
任意に、前記２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子に連結された伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７５）
ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
アテニュエーター分子とアダプター分子の混合物を、適切な緩衝液中で、約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、前記アテニュエーター分子および相互に少なくとも部分的に相補的である前記アダプター分子をアニールすることであって、前記アニーリングが、部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、
ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）酵素、リガーゼ酵素、前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子、および前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子の前記１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドと混合することと、
前記ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを、約３０℃〜約３７℃で約１５〜約３０分間、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）酵素、リガーゼ酵素、前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子、および前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子の前記１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドとインキュベートすることと、
任意に、前記アテニュエーター−アダプター分子に連結された前記伸長したＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７６）
ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長し、固定する方法であって、
２つの分子の混合物を、適切な緩衝液中で、約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、相互に少なくとも部分的に相補的である前記ビオチン化アダプター分子に前記アテニュエーター分子をアニールすることであって、前記アニーリングが、部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、
前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約２５℃で約２時間、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを含む溶液と混合することにより、前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を固定化し、前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子の前記ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズへの固定化をもたらすことと、
前記ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズに結合された前記固定化された部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプターｖを、約３０℃〜約３７℃で約１５〜３０分、前記ＲＮＡ基質ポリヌクレオチド、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、リガーゼ酵素、および前記部分的に２本鎖のアテニュエーター分子の１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドとインキュベートすることと、
前記溶液をＮａＯＨで洗浄し、前記ビーズから前記非ビオチン化１本鎖ポリヌクレオチドを除去することと、
任意に、前記２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子に連結された伸長
し、かつ固定化されたＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７７）
項目１〜２６のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
（項目７８）
基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
（１）前記基質ポリヌクレオチドを含む混合物を、前記基質ポリヌクレオチドの伸長が前記基質に尾を付けることを可能にする条件下で、（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）アテニュエーター配列を含み、かつ前記アテニュエーター配列に隣接して位置付けられ、別のポリヌクレオチド上のアダプター配列Ｘに相補的である配列Ｗをさらに含むアテニュエーター分子を含み、前記組成物が、配列Ｖに相補的である配列Ｙを含むアダプター分子をさらに含み、配列Ｖが、Ｙと同じ長さであるか、または配列Ｙと同じ長さ未満であり、前記アダプター分子が、前記アテニュエーター−アダプター分子とは別の分子である組成物、および（ｉｉｉ）前記アテニュエーター分子のアテニュエーター配列に相補的であるデオキシヌクレオチドとインキュベートすることと、
（２）前記アダプター配列Ｘを前記基質ポリヌクレオチドに連結し、前記アテニュエーター分子を前記別のポリヌクレオチドから解離することと、
（３）前記基質ポリヌクレオチドの配列に相補的なプライマーを、前記プライマーを前記基質ポリヌクレオチドとハイブリダイズする条件下で添加することと、
（４）前記プライマーからポリメラーゼ伸長を実施するために、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドを添加して、前記基質ポリヌクレオチドに相補的な２本鎖ポリヌクレオチドを生成し、２本鎖基質分子を作製することと、
（５）前記アダプター分子を前記２本鎖基質分子に連結することと、
（６）任意に、前記２本鎖ポリヌクレオチドを分解することと、を含む、方法。
（項目７９）
前記プライマーが、適切な条件下で配列Ｘとハイブリダイズするのに前記基質ポリヌクレオチドの配列に十分に相補的である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記プライマーが、適切な条件下で配列Ｘ以外の前記基質分子の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的である標的特異的プライマーである、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記基質ポリヌクレオチドが、１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記基質ポリヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）である、項目７８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】長い（＞２０ｂ）相補性ポリ（ｄＴ）ポリヌクレオチドの存在下の減弱されたポリメラーゼ媒介ポリ（ｄＡ）ＤＮＡテーリングを示す。図は、これに限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図２】短い（１２〜１４ｂ）相補性ポリ（ｄＴ）ポリヌクレオチドを伴う減弱されたポリメラーゼ−媒介ポリ（ｄＡ）テーリングを示す。図は、これに限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図３】短いポリ（ｄＴ）アテニュエーター分子の存在下のポリ（ｄＡ）テーリングの予期される動態を示す。
【図４】減弱されたポリメラーゼ媒介ポリ（ｄＡ）テーリングが、ｄＵ塩基を含有する分解性アテニュエーターポリヌクレオチドを用いて実施される方法を示す。図は、これに限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図５】長い（＞２０ｂ）相補性アテニュエーターポリヌクレオチドを伴う減弱されたポリメラーゼ媒介ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＧ）、およびポリ（ｄＣ）テーリングを示す。図は、これに限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図６】分解性アテニュエーターリボ−ポリヌクレオチドを伴う減弱されたポリメラーゼ媒介ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＧ）、およびポリ（ｄＣ）テーリングを示す。図は、これに限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図７】相補性ＤＮＡポリ（ｄＴ）３０ポリヌクレオチドを使用したＲＮＡ基質の減弱されたポリ（Ａ）−ポリメラーゼ媒介ポリ（ｒＡ）テーリングを示す。
【図８】相補性ＤＮＡポリ（ｄＡ）３０ポリヌクレオチドを使用したＲＮＡ基質の減弱されたポリ（Ｕ）−ポリメラーゼ媒介ポリ（ｒＵ）テーリングを示す。
【図９】制限されたテーリング反応を使用した１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への３’端アダプター結合を示す。
【図１０】共役した制限されたテーリング−連結反応または制限されたテーリング−ポリメラーゼ伸長反応のいずれかを使用した１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの固体支持体への共有結合固定化を示す。
【図１１】平滑断端またはｄＡ／ｄＴ連結による第２のアダプター結合を示す。
【図１２】共役した制限されたテーリング−連結反応による第２のアダプター結合を示す。ｇＤＮＡは、ゲノムＤＮＡを表す。
【図１３】制限されたテーリング−ポリメラーゼ伸長反応による第２のアダプター結合を示す。
【図１４】長いポリ（ｄＴ）アテニュエーター分子の存在下、ポリメラーゼ酵素により導入されたポリ（ｄＡ）配列の、反応温度の関数としての予測される長さを示す。図は、限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図１５】長い分解性ＤＮＡアテニュエーター分子（ＴＴＴＴＴＵ）６ＴＴＴ（配列番号４３）の不在下、および存在下のＴｄＴ酵素による１本鎖ＤＮＡテンプレートのポリ（ｄＡ）テーリングの実験的に決定された時間経過を示す。
【図１６Ａ】短いアテニュエーター分子の存在下のＴｄＴによる１本鎖ＤＮＡテンプレートの制御されたポリ（ｄＡ）テーリングを示す：ａ．アテニュエーターの長さの作用と反応時間；ｂ．短いアテニュエーターによる長いインキュベーション時間の作用。
【図１６Ｂ】短いアテニュエーター分子の存在下のＴｄＴによる１本鎖ＤＮＡテンプレートの制御されたポリ（ｄＡ）テーリングを示す：ａ．アテニュエーターの長さの作用と反応時間；ｂ．短いアテニュエーターによる長いインキュベーション時間の作用。
【図１７】２本鎖ＤＮＡテンプレートの制御されたおよび未制御のポリ（ｄＡ）ＴｄＴテーリングを示す。
【図１８】ランダム化端部を伴う１本鎖ＤＮＡテンプレートの制御されたポリ（ｄＡ）ＴｄＴテーリングを示す。
【図１９】ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＣ）、およびポリ（ｄＧ）尾を伴う１本鎖ＤＮＡテンプレートの制御されたＴｄＴテーリングを示す。
【図２０】大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼによる１本鎖ＲＮＡテンプレートの制御されたポリ（ｒＡ）テーリングを示す。
【図２１ａ】酵母（分裂酵母）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる１本鎖ＲＮＡテンプレートの制御されたポリ（ｒＵ）テーリングを示す；ａ．短いＤＮＡアテニュエーターの存在下の時間経過；ｂ．長いＤＮＡおよびＲＮＡアテニュエーターの作用；ｃ．長いＲＮＡオリゴヌクレオチドアテニュエーターの作用。
【図２１ｂ】酵母（分裂酵母）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる１本鎖ＲＮＡテンプレートの制御されたポリ（ｒＵ）テーリングを示す；ａ．短いＤＮＡアテニュエーターの存在下の時間経過；ｂ．長いＤＮＡおよびＲＮＡアテニュエーターの作用；ｃ．長いＲＮＡオリゴヌクレオチドアテニュエーターの作用。
【図２１ｃ】酵母（分裂酵母）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる１本鎖ＲＮＡテンプレートの制御されたポリ（ｒＵ）テーリングを示す；ａ．短いＤＮＡアテニュエーターの存在下の時間経過；ｂ．長いＤＮＡおよびＲＮＡアテニュエーターの作用；ｃ．長いＲＮＡオリゴヌクレオチドアテニュエーターの作用。
【図２２】溶液および固体相中の同時に起こる制御されたＤＮＡ  ＴｄＴテーリングおよびアテニュエーター−アダプター複合体への連結を示す。
【図２３】溶液中の同時に起こる制御されたポリ（Ａ）ポリメラーゼテーリングおよび１本鎖ＲＮＡテンプレートのアテニュエーター−アダプター複合体への連結を図示する実験データを示す。
【図２４ａ】１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの制御されたテーリング、連結、および固定化の同時過程を図示するダイアグラムを示す：ａ．溶液中のアテニュエーター−アダプター複合体（ＤＮＡ）を用いる；ｂ．磁気ビーズに固定化されたアテニュエーター−アダプター複合体（ＤＮＡ）を用いる；ｃ．溶液中のアテニュエーター−アダプター複合体（ＲＮＡ）を用いる。図は、限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図２４ｂ】１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの制御されたテーリング、連結、および固定化の同時過程を図示するダイアグラムを示す：ａ．溶液中のアテニュエーター−アダプター複合体（ＤＮＡ）を用いる；ｂ．磁気ビーズに固定化されたアテニュエーター−アダプター複合体（ＤＮＡ）を用いる；ｃ．溶液中のアテニュエーター−アダプター複合体（ＲＮＡ）を用いる。図は、限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図２４ｃ】１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの制御されたテーリング、連結、および固定化の同時過程を図示するダイアグラムを示す：ａ．溶液中のアテニュエーター−アダプター複合体（ＤＮＡ）を用いる；ｂ．磁気ビーズに固定化されたアテニュエーター−アダプター複合体（ＤＮＡ）を用いる；ｃ．溶液中のアテニュエーター−アダプター複合体（ＲＮＡ）を用いる。図は、限定されないが、テーリング反応用のＴｄＴ酵素の使用を例示する。
【図２５】制御されたホモポリマーテーリングおよび連結、続いて基質ポリヌクレオチドの環状化を使用したＮＧＳライブラリ合成の方法を示す。
【図２６】制御されたホモポリマーテーリング、続いてポリメラーゼ伸長および環状化を使用したＮＧＳライブラリ合成の代替方法を示す。
【図２７】制御されたホモポリマーテーリングおよび連結、続いて逆鎖合成および平滑アダプター連結を使用したＮＧＳライブラリ合成の方法を示す。
【図２８】制御されたテーリングおよび重合、続いて逆鎖合成および平滑連結を使用したＮＧＳライブラリ構築のための代替方法を示す。
【図２９】２つの連続したテーリングおよび連結反応を含むＮＧＳライブラリ調製の別の方法を示す。
【図３０】ランダムプライマー伸長ならびに伸長生成物の制御されたテーリングおよび連結による断片ＮＧＳライブラリの調製の図式的説明である。
【図３１】標的特異的プライマー伸長ならびに伸長生成物の制御されたテーリングおよび連結による標的ＮＧＳライブラリの調製の図式的説明である。
【図３２】制御されたテーリングおよび連結反応、続いて複製およびアダプター連結を使用した標的ＮＧＳライブラリの調製の図式的説明である。
【図３３】本開示により企図される、制御されたテーリング−アダプター連結反応を使用した標的ＮＧＳライブラリを調製するための様々なアプローチの図式的説明である。
【図３４】ランダム塩基組成物の追加の３’ドメインを含むアテニュエーター−アダプター分子を用いた制御されたテーリングおよび連結反応である、実施例１２のゲル１に関する実験データを示す。
【図３５】ランダム塩基組成物の追加の３’ドメインを含むアテニュエーター−アダプター分子を用いた制御されたテーリングおよび連結反応である、実施例１２のゲル２に関する実験データを示す。
【図３６】ジヌクレオチドアテニュエーター−アダプターを用いた制御されたテーリングおよび連結反応に関する実験データを示す。
【図３７】全ゲノムまたは標的ライブラリ調製物の一部としての平滑またはＴＡアダプター連結の様々な方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本明細書において、核酸ポリメラーゼおよびアテニュエーター分子を含む組成物が提供される。本組成物は、制御された様式で１つ以上のヌクレオチドを基質ポリヌクレオチドに付加し、それによって、所望の数のヌクレオチドを基質ポリヌクレオチドに付加するための方法に使用される。例として、および制限されることなく、核酸ポリメラーゼを使用したポリヌクレオチドの鎖の伸長は、ポリメラーゼにより作製された新しく付加された尾配列に結合するアテニュエーター分子の伸長反応混合物への付加によって調節され、それによって、２本鎖構造を形成し、よって重合過程の速度を減少させる。結果として、反応速度は制御され、所望の制限された大きさの尾配列が反応混合物中の基質ポリヌクレオチドに付加され、反応混合物中の基質ポリヌクレオチドに付加された尾は、非常に狭い大きさ分布を有する。
【００７２】
本開示は、核酸ポリメラーゼによる尾配列の基質ポリヌクレオチドの端部への付加の減弱および制御を可能にする方法および試薬を提供する。本開示は、核酸ポリメラーゼを使用した本明細書に記載される尾配列の付加により基質ポリヌクレオチドの大きさが制御されたテーリングのための方法の基礎として使用される反応用の組成物、および本方法を実施するために設計されたキットも提供する。組成物、および方法、ならびに本方法を実行するためのキットは、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの効率的かつ制御された結合を提供する。
【００７３】
本明細書で使用される、「テーリング」という用語は、「制御されたテーリング」および「制限されたテーリング」という用語と交換可能である。
【００７４】
本明細書および付属の特許請求の範囲に使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に明確に記載のない限り、複数形の参照を含むことを、ここに記載しておく。
【００７５】
本明細書で使用される、「約」という用語は、おおよそを意味すると理解されることにもまた留意されたい。本開示の分子に関する場合（例えば、および限定されることなく、アテニュエーター分子）、「不安定化」とは、破壊されやすいことを意味する。破壊は、例えば、および限定されることなく、高温（約８０℃以上）で分子をインキュベートすること、分子を脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼとインキュベートすること、またはそれらの組み合わせを介して生じる。
【００７６】
核酸ポリメラーゼ
本開示は、アテニュエーター分子および核酸ポリメラーゼを含む組成物を企図する。本開示の方法は、さらなる核酸ポリメラーゼを利用するものも含む。特定のホモポリマー配列を核酸の３’端に付加することができる任意のポリメラーゼが、本明細書に記載される方法の使用に企図される。
【００７７】
いくつかの態様では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼであり、具体的な態様の１つでは、ＤＮＡポリメラーゼは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である。核酸ポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼであり、これらの態様では、ＲＮＡポリメラーゼは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびポリ（Ｕ）ポリメラーゼからなる群から選択されることも企図される。具体的な態様の１つでは、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ特異的リボヌクレオチドトランスフェラーゼである。これらのポリメラーゼは全て、テンプレート依存ポリメラーゼのファミリーを表す。
【００７８】
酵素が特定のホモポリマー配列を核酸の３’端に付加することができる範囲内において、本発明を実践するのに使用され得る酵素の非限定的な例としては、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、分裂酵母ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、および酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。反復配列の基質の３’端への付加は、ＤＮＡテロメラーゼによって実施され得る。
【００７９】
本開示の方法を実践するために使用され得る他のポリメラーゼは、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高信頼性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート高信頼性ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉｒｅ（商標）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、標準Ｔａｑ（Ｍｇを含まない）緩衝液付属Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、標準Ｔａｑ緩衝液付属Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  ＩＩ（Ｍｇを含まない）緩衝液付属Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液付属Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、（Ｍｇを含まない）緩衝液付属Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＡＭＶ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｍ−ＭｕＬＶ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、完全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液付属のＬａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、（Ｍｇを含まない）緩衝液付属Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高信頼性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート高信頼性ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブスＤＮＡポリメラーゼ  ＩＶ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ  （Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３´→５´  ｅｘｏ−）、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（未修飾）、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ  逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ６  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００８０】
本開示の方法を実践するために使用され得るリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および大腸菌ＲＮＡリガーゼを含むが、これらに限定されない。
【００８１】
アテニュエーター分子
本開示は、アテニュエーター分子（本明細書において「アテニュエーターポリヌクレオチド」と交換可能に使用される）を含む組成物および方法を提供する。アテニュエーターは、様々な態様では、ポリヌクレオチド、固定化された分子、ポリペプチド、多糖、直鎖状分子、環状分子、１本鎖分子、部分的に２本鎖の分子、ペプチド核酸、シゾフィラン多糖、ロックド核酸、および／またはそれらの組み合わせである。
【００８２】
基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、反応が実施される条件に依存する。いくつかの態様では、アテニュエーター分子は、組成物において、ポリメラーゼ活性を伴う基質ポリヌクレオチドに付加される配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、本質的に、尾配列が会合できるアテニュエーター分子のヌクレオチドの数に等しい。いくつかの態様では、基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、本質的に、尾配列が会合できるアテニュエーター分子のヌクレオチドの数の倍数に等しい。例として、および制限することなく、アテニュエーター分子の長さが１３個のヌクレオチドである場合、基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、本質的に１３個のヌクレオチドである。しかしながら、反応が実施される条件により、基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、１３の倍数であるか、または本質的に２６個（アテニュエーター分子の長さの２倍）、または本質的に３９個（アテニュエーター分子の長さの３倍）、または本質的に５２個（アテニュエーター分子のさの４倍）、またはそれ以上のアテニュエーター分子の長さの倍数である。いくつかの態様では、したがって、基質ポリヌクレオチドの尾配列は、２個以上のアテニュエーター分子と作用する。いくつかの態様では、基質ポリヌクレオチドの尾に付加されるヌクレオチドの数は、アテニュエーター分子の長さ未満である。
【００８３】
いくつかの態様では、基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数は、アテニュエーターの長さではなく、反応が実施される温度および／または塩濃度によって決定される。いくつかの態様では、高温および低塩濃度は、基質ポリヌクレオチドの尾へのより多くのヌクレオチドの付加をもたらす。基質ポリヌクレオチドの尾に付加されるヌクレオチドの数はある数に達するまで増加し、その数は、安定した２本鎖が基質ポリヌクレオチドとアテニュエーター分子との間に形成される条件（すなわち、温度および／または塩濃度）により決定されることが企図される。アテニュエーター分子との安定した２本鎖の形成は、基質ポリヌクレオチドの尾へのヌクレオチドのさらなる付加を阻害し、よって、基質ポリヌクレオチドの尾に付加されるヌクレオチドの数を決定するのは安定した２本鎖のＴｍである。
【００８４】
さらなる実施形態では、アテニュエーター分子は、以下に本明細書に記載されるアダプター配列をさらに含む。アテニュエーター分子がポリヌクレオチドである態様では、ポリヌクレオチドのホモポリマー部分が「アテニュエーター」部分であることが企図される。ポリヌクレオチドがホモポリマー配列に加えてヌクレオチドを含む態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書において「アテニュエーター−アダプター」分子と称される。さらなるヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドの一部であるか、または相互とハイブリダイズする２つの別のポリヌクレオチドに存在し得る。よって、またさらなる実施形態では、アテニュエーター分子およびアダプター分子（アダプター配列を含む）は、少なくとも部分的に一緒にハイブリダイズされる２つの別のポリヌクレオチドである。様々な実施形態では、単一のポリヌクレオチドは、アテニュエーター部分およびアダプター配列を含む。様々な態様では、ポリヌクレオチドは、部分的に２本鎖のポリヌクレオチドを作製するためにヘアピン構造を形成する。このヘアピン構成において、アテニュエーター部分は１本鎖であり、アダプター配列は２本鎖である。
【００８５】
さらなる実施形態では、アテニュエーターまたはアテニュエーター−アダプター分子は、ホモポリマー配列の代わりにジヌクレオチドポリマー配列を含む。よって、様々な実施形態では、本開示はアテニュエーターのジヌクレオチド部分が次のジヌクレオチドの組み合わせ：（ｉ）ｄＧもしくはｄＣ、（ｉｉ）ｄＡもしくはｄＴ、（ｉｉｉ）ｄＧもしくはｄＴ、（ｉｖ）ｄＧもしくはｄＡ、（ｖ）ｄＡもしくはｄＣ、または（ｖｉ）ｄＣもしくはｄＴからなる複数のランダム配列を含むことを企図する。ジヌクレオチド配列は、様々な実施形態では、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む。これらの実施形態では、テーリング反応に使用されるヌクレオチドミックスがアテニュエーターのホモポリマー部分に使用されるものに相補的なヌクレオチドを含むことがさらに企図される。テーリング過程中、ジヌクレオチドアテニュエーターに相補的なジヌクレオチドから構成される複数のランダム尾配列が生成される。本開示において、様々な実施形態が、ホモポリマー配列、もしくはホモポリマー、またはジヌクレオチド配列に関して記載される。しかしながら、作業者または当業者は、ホモポリマーのみが記載される場合、方法は、本明細書に記載される修飾を伴うジヌクレオチド配列を使用して容易に実施され得ることを理解する。
【００８６】
またさらなる実施形態では、アテニュエーターまたはアテニュエーター−アダプター分子は、その３’端上にさらなる配列をさらに含み、さらなる配列は、ホモポリマーまたはジヌクレオチド配列ではなく、様々な態様では、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含むランダムヌクレオチド配列を含む。さらなるランダム配列は、長さが約１個〜約５０個以上のヌクレオチド、または約１個〜約５個のヌクレオチド、または約１個〜約１０個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のヌクレオチド、または約５個〜約１０個のヌクレオチド、または約４個〜約７個のヌクレオチド、または約５個〜約１５個のヌクレオチド、または約１０個〜約１５個のヌクレオチド、または長さが約１０個〜約２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のヌクレオチド、または約５個〜約１０個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のヌクレオチド、または長さが約１０個〜約２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のヌクレオチド、または長さが約２０個〜約３０個、４０個、もしくは５０個のヌクレオチドである。さらなる実施形態では、さらなる配列は、長さが約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、またはそれ以上のヌクレオチドである。またさらなる実施形態では、さらなる配列は、長さが少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、少なくとも約３０個、少なくとも約３１個、少なくとも約３２個、少なくとも約３３個、少なくとも約３４個、少なくとも約３５個、少なくとも約３６個、少なくとも約３７個、少なくとも約３８個、少なくとも約３９個、少なくとも約４０個、少なくとも約４１個、少なくとも約４２個、少なくとも約４３個、少なくとも約４４個、少なくとも約４５個、少なくとも約４６個、少なくとも約４７個、少なくとも約４８個、少なくとも約４９個、少なくとも約５０個以上のヌクレオチドである。さらなる実施形態では、さらなる配列は、長さが１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、またはそれ以上のヌクレオチドである。
【００８７】
所与の反応で使用されるアテニュエーターまたはアテニュエーター−アダプター分子の全てが均一な大きさではないことを理解する。よって、様々な実施形態では、アテニュエーター分子のホモポリマー部分およびさらなる配列部分は、それぞれ、長さが約１個〜約５００個のヌクレオチドである。さらなる実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチドであるアテニュエーター分子はホモポリマー部分と、さらなる配列部分とを含み、そのそれぞれは、少なくとも１個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、２０個、３０個、５０個、１００個、２００個、３００個、もしくは５００個のヌクレオチド、少なくとも２個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、２０個、３０個、５０個、１００個、２００個、３００個、もしくは５００個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド〜最大約１０個、２０個、３０個、５０個、１００個、２００個、３００個、もしくは５００個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド〜最大約１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、もしくは５０個のヌクレオチド、少なくとも１０個〜最大約１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、もしくは５０個のヌクレオチド、少なくとも１０個〜最大約２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、２００個、３００個、もしくは５００個のヌクレオチド、少なくとも２０個〜最大約３０個、４０個、５０個、１００個、２００個、３００個、もしくは５００個のヌクレオチド、少なくとも５０個〜最大約７０個、１００個、２００個、３００個、もしくは５００個のヌクレオチド、または少なくとも５０個〜最大約１００個、３００個、４００個、もしくは５００個のヌクレオチドであることを企図する。
【００８８】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」は、アテニュエーター分子と基質ポリヌクレオチドの尾配列との間の任意の会合を包含することが企図される。例えば、および制限されるとこなく、会合は、ワトソン−クリック塩基対、またはアテニュエーター分子と、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）等の基質ポリヌクレオチドとの間の他の種類の塩基対の結果であり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、アテニュエーター分子はポリヌクレオチドであり、それは厳密な条件下で基質ポリヌクレオチドの尾部分とハイブリダイズする。本明細書で使用される「厳密な条件」は、当業者によって経験的に決定され得、例えば、および限定されることなく、アテニュエーター分子および基質ポリヌクレオチドの尾配列の長さ、アテニュエーター分子および基質ポリヌクレオチドの濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーションが実行される温度、ハイブリダイゼーションが実行される時間の長さ、ならびにアテニュエーター分子および基質ポリヌクレオチドの尾配列の表面電荷に影響を及ぼす因子の存在に基づき変動する。一般に、厳密な条件とは、基質ポリヌクレオチドの尾配列がその相補的配列に優先的かつアテニュエーター分子上の任意の他の領域に対して高い親和性で結合することができるものである。２０個の塩基を有する基質ポリヌクレオチド配列の尾配列のその補体とハイブリダイズするための例示的な厳密な条件は、約５０ｍＭ塩（Ｎａ＋）、および約６０℃のアニーリング温度を含むが、これらに限定されない。より長い配列に関しては、特定のハイブリダイゼーションが高温で達成される。一般に、厳密な条件は、アニーリングが基質ポリヌクレオチドの融解温度を約５℃下回って実行されるような条件である。「融解温度」は、一定のイオン強度、ｐＨ、および濃度で平衡状態にある基質ポリヌクレオチドに相補的であるアテニュエーター分子の５０％が基質ポリヌクレオチドから解離する温度である。本明細書において以下にさらに記載されるように、ハイブリダイゼーションおよび伸長が実施される温度は、様々な態様では、ヌクレオチドの基質ポリヌクレオチドへの付加に関連する。
【００９０】
アテニュエーター分子がポリヌクレオチドである、ある特定の実施形態では、２本鎖ポリヌクレオチドは基質ポリヌクレオチドに付加された尾配列と会合することができるため、アテニュエーターポリヌクレオチドは、１本鎖もしくは少なくとも部分的に２本鎖である。さらなる実施形態では、アテニュエーター分子は、基質ポリヌクレオチドに付加された尾配列と会合することができるホモポリマーヌクレオチド配列を含む環状分子である。
【００９１】
さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドであるアテニュエーター分子は、２’−デオキシチミジン５’−１リン酸（ｄＴＭＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−１リン酸（ｄＧＭＰ）、２’−デオキシアデノシン５’−１リン酸（ｄＡＭＰ）、２’−デオキシシチジン５’−１リン酸（ｄＣＭＰ）、２’−デオキシウリジン５’−１リン酸（ｄＵＭＰ）、チミジン１リン酸（ＴＭＰ）、グアノシン１リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン１リン酸（ＵＭＰ）、塩基類似体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチドを含む。アテニュエーター分子ポリヌクレオチドが本明細書に定義される修飾されたヌクレオチドを含むことも企図される。
【００９２】
関連する態様では、アテニュエーター分子は、ポリ２’−デオキシアデノシン５’−１リン酸（ｄＡＭＰ）（ポリｄＡ）、ポリ２’−デオキシチミジン５’−１リン酸（ｄＴＭＰ）（ポリｄＴ）、ポリ２’−デオキシシチジン５’−１リン酸（ポリｄＣ）、ポリ２’−デオキシグアノシン５’−１リン酸（ポリｄＧ）、ポリ２’−デオキシウリジン５’−１リン酸（ポリｄＵ）、ポリアデノシン１リン酸（ポリｒＡ）、ポリウリジン１リン酸（ポリＵ）、ポリシチジン１リン酸（ポリｒＣ）、ポリグアノシン１リン酸（ポリｒＧ）等のホモポリマー分子、またはｄＡおよびｒＡ塩基、もしくはｄＴ、ｄＵ、およびＵ塩基、もしくはｄＣおよびｒＣ塩基、もしくはｄＧおよびｒＧ塩基の組み合わせを含むヘテロポリマー分子を含む。
【００９３】
様々な態様では、アテニュエーター分子は、１個、５個、１０個、２０個、３０個、５０個、１００個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。実際、本開示は、ポリヌクレオチドであるアテニュエーター分子が、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個、５００個、５１０個、５２０個、５３０個、５４０個、５５０個、５６０個、５７０個、５８０個、５９０個、６００個、６１０個、６２０個、６３０個、６４０個、６５０個、６６０個、６７０個、６８０個、６９０個、７００個、７１０個、７２０個、７３０個、７４０個、７５０個、７６０個、７７０個、７８０個、７９０個、８００個、８１０個、８２０個、８３０個、８４０個、８５０個、８６０個、８７０個、８８０個、８９０個、９００個、９１０個、９２０個、９３０個、９４０個、９５０個、９６０個、９７０個、９８０個、９９０個、１０００個、または以上のヌクレオチドを含むことを企図する。さらなる実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチドであるアテニュエーター分子が、少なくとも１個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、２０個、５０個、１００個、２００個、５００個、もしくは１０００個のヌクレオチド、少なくとも２個のヌクレオチド〜最大約５個、１０個、２０個、５０個、１００個、２００個、５００個、もしくは１０００個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド〜最大約１０個、２０個、５０個、１００個、２００個、５００個、もしくは１０００個のヌクレオチド、少なくとも５個ヌクレオチド〜最大約１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、もしくは５０個のヌクレオチド、少なくとも１０個〜最大約１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、もしくは５０個のヌクレオチド、少なくとも１０個〜最大約２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、２００個、５００個、もしくは１０００個のヌクレオチド、少なくとも２０個〜最大約３０個、４０個、５０個、１００個、２００個、５００個、もしくは１０００個のヌクレオチド、少なくとも５０個〜最大約約７０個、１００個、２００個、５００個、７００個、もしくは１０００個のヌクレオチド、または少なくとも５０個〜最大約１００個、５００個、７５０個、８００個、もしくは１０００個のヌクレオチドを含むことを企図する。
【００９４】
様々な態様では、アテニュエーター分子は保護基を含む。本明細書で使用される保護基は、ヌクレオチドの付加によりポリヌクレオチドを合成することができる酵素によって伸長を阻止する部分である。保護基は、リン酸基、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド（ＴｄＴ酵素が使用される態様において）、デオキシヌクレオチド（ポリ（Ａ）および／またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼが使用される態様において）、アミノ基、３〜６個の炭素グリコールスペーサー（一態様では、６個の炭素グリコールスペーサーがヘキサンジオールである）、および逆位デオキシチミジン（ｄＴ）を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
本開示の別の態様では、アテニュエーター分子は分解性である。分解性アテニュエーター分子は、様々な態様では、ｄＵ塩基を含み、分解は、ｄＵ−グリコシラーゼと接触させ、続いて８０℃を上回る温度でインキュベートするか、またはｄＵ−グリコシラーゼと脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼの混合物と接触させることにより生じる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、アテニュエーター分子がリボヌクレオチドを含み、リボヌクレアーゼにより分解性である配列を有することも企図される。様々な態様では、リボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性に十分な条件下のＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ１からなる群から選択される。関連する態様では、アテニュエーター分子は、デオキシリボヌクレオチドを含み、ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼにより分解性である配列を有する。ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼは、いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ  Ｉである。
【００９７】
アテニュエーター分子は、さらなる実施形態では、アダプター配列、識別タグ配列、またはそれらの両方をさらに含む。「アダプター配列」は、核酸断片の増幅および配列決定の両方のプライミング配列を提供し、いくつかの態様では、次世代配列決定用途に使用される。さらなる態様では、「アダプター配列」は、ＲＮＡ分子を生成するためのプロモーター配列として使用され、プロモーター配列は、例えば、および限定されることなく、Ｔ７プロモーター配列またはＳＰ６プロモーター配列である。当該技術分野に既知の任意のＲＮＡプロモーターがアダプター配列として企図される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、「識別タグ配列」は、特定の基質またはアテニュエーター分子を一意的に識別する配列である。一態様では、識別タグ配列は、バーコードである。
【００９９】
いくつかの態様では、アテニュエーター分子は、ポリペプチドである。本明細書で使用される、用語「ポリペプチド」とは、天然に由来する、合成により生成される、または組換えにより生成されるペプチド、タンパク質、アミノ酸のポリマー、および抗体を指す。ポリペプチドは、例えばグリコシル化タンパク質等のリポタンパク質および翻訳後修飾タンパク質、ならびにＤアミノ酸、ＤまたはＬ構成中の修飾された、誘導された、もしくは天然に生じないアミノ酸、および／またはそれらの構造の一部としてのペプト摸倣単位（ｐｅｐｔｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｕｎｉｔ）を有するタンパク質もしくはタンパク質物質も含む。
【０１００】
タンパク質に関して、企図されるアテニュエーター分子は、完全長タンパク質、および完全長タンパク質の所望の性質を維持するその断片を含む。１つの成分が断片または摸倣物である融合タンパク質を含む融合タンパク質も企図される。
【０１０１】
抗体アテニュエーター分子は、完全長抗体の断片および誘導体を含む。具体的に企図される断片および誘導体は、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｃ断片、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、個々の重鎖、個々の軽鎖、二量体重鎖および軽鎖（無傷抗体において見られるヘテロ四量体重鎖および軽鎖に対立するものとして）、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ヒト化抗体（ならびにヒト化抗体の様式で修飾されたが、生じる抗体が非ヒト種における抗体によりよく似ている抗体）、キレート化組換え抗体（ＣＲＡＢｓ）、二重特異性抗体および多特異性抗体、ならびに当技術分野で知られている他の抗体誘導体または断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
ＤＮＡおよびＲＮＡ結合タンパク質は、本開示の方法および組成物の使用に企図される。ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインから構成されるタンパク質であり、よって、１本鎖ＤＮＡに特定のまたは一般的な親和性を有する［Ｔｒａｖｅｒｓ，ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９３；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．．５３：２９３−３２１（１９８４）］。ホモポリマー配列に結合するポリペプチドは、当該技術分野において公知であり［Ｌｏｂａｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５９（１）：１８１−８（１９８６）、Ｔｒａｖｅｒｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５８：４２７−４５２（１９８９）、Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９８（１６）：９０４４−９０４９（２００１）］、本明細書における使用に企図される。
【０１０３】
ＲＮＡ結合タンパク質は、典型的には、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を通して２本鎖または１本鎖ＲＮＡと会合する細胞質および核タンパク質である。ＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡの翻訳、これらに限定されないがＲＮＡスプライシングおよび編集等の翻訳後事象を調節することができる。ＲＮＡ結合タンパク質のいくつかの例としては、ＲＮＡを結合する翻訳開始因子、ポリＡ結合タンパク質、ｓｎＲＮＰ、および２本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本開示により企図されるアテニュエーター分子の別の種類は、ポリ（Ｃ）、ポリ（Ａ）、ポリ（ｄＡ）、およびポリ（ｄＴ）ホモポリマーと非ワトソンクリック型マクロ分子複合体を形成することができる多糖シゾフィランである。シゾフィラン（ＳＰＧ）は、それぞれ、水中で３重らせん体として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）において単鎖として存在する天然のβ−（１，３）−Ｄ−グルカンである［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１６７０（２）：９１−１０４（２００４）］。シゾフィランは、β−１，６−グリコシル結合を通してグルコース側鎖を有する。シゾフィランは１本鎖ポリヌクレオチドと複合体を形成することが示されている。ポリヌクレオチドの存在下、水性溶液中の１本鎖ＳＰＧは、２つのＳＰＧ鎖とポリヌクレオチド鎖からなる３本鎖複合体を形成する。シゾフィランは、水素結合および疎水性相互作用を通して１本鎖ポリヌクレオチドと３本鎖複合体を形成することができる。ポリヌクレオチドがシゾフィランとの複合体の形成においてヌクレアーゼの攻撃から効果的に保護され、シゾフィランがアンチセンス効率を強化したことが示された［Ｓａｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｎｏ．１：２２３−２２４（２００１）］。
【０１０５】
アテニュエーター分子の種類に関わらず、いくつかの態様では、アテニュエーター分子が以下の本明細書に記載されるように、支持体上に固定化されることが企図される。
【０１０６】
基質ポリヌクレオチド
基質ポリヌクレオチドは、以下の本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチド、修飾されたポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせである。基質ポリヌクレオチドは、様々な実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。尾が付加される基質ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖のいずれかである。さらなる態様では、基質ポリヌクレオチドは、３重らせん体、Ｇ−４重鎖、または他の多重鎖構造であり得る。別の実施形態では、基質ポリヌクレオチドは、化学的に処理された核酸であり、基質ポリヌクレオチドがＮＧＳによるメチル化を検出するために亜硫酸水素延処理されたＤＮＡで他の実施形態を含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
基質ポリヌクレオチドが天然に生じる供給源から得られるか、またはそれらが合成され得ることが企図される。天然に生じる供給源は、原核生物もしくは真核生物からのＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡである。例えば、および限定されることなく、供給源は、ヒト、マウス、ウイルス、植物、または細菌であり得る。様々な態様では、基質ポリヌクレオチドは、マイクロアレイを伴い、次世代核酸配列決定のためのライブラリを作製するアッセイに使用するために尾を付けられる。尾を有する基質ポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡの効率的なクローン化にも使用され得る。
【０１０８】
基質ポリヌクレオチドの供給源がゲノムＤＮＡである場合、いくつかの態様では、ゲノムＤＮＡはそれが尾を付けられる前に断片化されることが企図される。ゲノムＤＮＡの断片化は、当業者に公知の一般的な手順であり、例えば、および限定されることなく、ＤＮＡを剪断する（噴霧する）こ、ＤＮＡをエンドヌクレアーゼで切断する、ＤＮＡを超音波処理することにより、ＤＮＡを加熱することにより、アルファ、ベータ、ガンマ、または他の放射線源を使用してＤＮＡを照射することにより、光により、金属イオンの存在下でＤＮＡを化学切断することにより、ラジカル切断により、およびそれらの組み合わせで、インビトロで実施される。ゲノムＤＮＡの断片化は、例えば、および限定されることなく、アポトーシス、放射線、および／またはアスベストへの曝露により、インビボでも生じ得る。本明細書に提供される方法によると、基質ポリヌクレオチドの集団は、均一の大きさのものである必要はない。よって、本開示の方法は、異なる大きさの基質ポリヌクレオチド断片の集団に使用するのに有効である。
【０１０９】
基質ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるように、１本鎖または２本鎖のいずれかであり、３’突出を含む。いくつかの態様では、基質ポリヌクレオチドは２本鎖であり、平滑断端を含む。他の態様では、２本鎖基質ポリヌクレオチドは３’陥凹末端を含む。全ての態様において、基質ポリヌクレオチドは遊離３’ヒドロキシル基を含む。基質ポリヌクレオチドの突出または陥凹末端の長さは変動し得る。様々な態様では、基質ポリヌクレオチドの突出または陥凹末端の長さは、長さが１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドである。特定の態様では、長さが３個のヌクレオチドの３’突出は、長さが２個のヌクレオチドまたは長さが１個のヌクレオチドのいずれかである３’突出より効率的な基質ポリヌクレオチドである。基質ポリヌクレオチドの集団は、様々な態様では、上述の種類の基質ポリヌクレオチドのうちの２つ以上が単一反応で存在するものを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、基質ポリヌクレオチドが、以下の本明細書に記載されるように、固体表面上に固定化されることが企図される。基質ポリヌクレオチドの固定化は、一態様では、以下の本明細書に記載されるように、アテニュエーター−アダプター分子へのその連結によって生じる。
【０１１１】
基質ポリヌクレオチドの長さは、約３個〜約１×１０６個のヌクレオチドであることが企図される。いくつかの態様では、基質ポリヌクレオチドの長さは、約１０個〜約３０００個のヌクレオチド、または約４０個〜約２０００個のヌクレオチド、または約５０個〜約１０００個のヌクレオチド、または約１００個〜約５００個のヌクレオチド、または約１０００個〜約５０００個のヌクレオチド、または約１０，０００個〜約５０，０００個のヌクレオチド、または約１００，０００〜１×１０６個のヌクレオチドである。さらなる態様では、基質ポリヌクレオチドの長さは、少なくとも３個〜最大約５０個、１００個、もしくは１０００個のヌクレオチド、または少なくとも１０個〜最大約５０個、１００個、もしくは１０００個のヌクレオチド、または少なくとも１００個〜最大約１０００個、５０００個、もしくは１００００個のヌクレオチド、または少なくとも１０００個〜最大約１００００個、２００００個、および５００００個、または少なくとも１００００〜最大約２００００、５００００、および１００，０００個のヌクレオチド、または少なくとも２００００個〜最大約１００，０００個、２００，０００個、もしくは５００，０００個のヌクレオチド、または少なくとも２００，０００個〜最大約５００，０００個、７００，０００個、もしくは１，０００，０００個のヌクレオチドである。様々な態様では、基質ポリヌクレオチドの長さは、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約５１個、約５２個、約５３個、約５４個、約５５個、約５６個、約５７個、約５８個、約５９個、約６０個、約６１個、約６２個、約６３個、約６４個、約６５個、約６６個、約６７個、約６８個、約６９個、約７０個、約７１個、約７２個、約７３個、約７４個、約７５個、約７６個、約７７個、約７８個、約７９個、約８０個、約８１個、約８２個、約８３個、約８４個、約８５個、約８６個、約８７個、約８８個、約８９個、約９０個、約９１個、約９２個、約９３個、約９４個、約９５個、約９６個、約９７個、約９８個、約９９個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３１０個、約３２０個、約３３０個、約３４０個、約３５０個、約３６０個、約３７０個、約３８０個、約３９０個、約４００個、約４１０個、約４２０個、約４３０個、約４４０個、約４５０個、約４６０個、約４７０個、約４８０個、約４９０個、約５００個、約５１０個、約５２０個、約５３０個、約５４０個、約５５０個、約５６０個、約５��０個、約５８０個、約５９０個、約６００個、約６１０個、約６２０個、約６３０個、約６４０個、約６５０個、約６６０個、約６７０個、約６８０個、約６９０個、約７００個、約７１０個、約７２０個、約７３０個、約７４０個、約７５０個、約７６０個、約７７０個、約７８０個、約７９０個、約８００個、約８１０個、約８２０個、約８３０個、約８４０個、約８５０個、約８６０個、約８７０個、約８８０個、約８９０個、約９００個、約９１０個、約９２０個、約９３０個、約９４０個、約９５０個、約９６０個、約９７０個、約９８０個、約９９０個、約１０００個、約１１００個、約１２００個、約１３００個、約１４００個、約１５００個、約１６００個、約１７００個、約１８００個、約１９００個、約２０００個、約２１００個、約２２００個、約２３００個、約２４００個、約２５００個、約２６００個、約２７００個、約２８００個、約２９００個、約３０００個、約３１００個、約３２００個、約３３００個、約３４００個、約３５００個、約３６００個、約３７００個、約３８００個、約３９００個、約４０００個、約４１００個、約４２００個、約４３００個、約４４００個、約４５００個、約４６００個、約４７００個、約４８００個、約４９００個、約５０００個、１０，０００個、１５，０００個、２０，０００個、５０，０００個、１００，０００個、１５０，０００個、２００，０００個、２５０，０００個、３００，０００個、３５０，０００個、４００，０００個、４５０，０００個、５００，０００個、５５０，０００個、６００，０００個、６５０，０００個、７００，０００個、７５０，０００個、８００，０００個、８５０，０００個、９００，０００個、９５０，０００個、１，０００，０００個、または以上のヌクレオチドである。
【０１１２】
ポリヌクレオチド
本明細書で使用される、用語「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド」または複数形態は、本明細書で論じられるように、さもなければ当該技術分野において公知であるように修飾形態と交換可能である。本明細書に記載される、ポリヌクレオチドは、アテニュエーターポリヌクレオチドまたは基質ポリヌクレオチドのいずれかを指し、様々な実施形態では、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含むアテニュエーターポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかである基質ポリヌクレオチドと組み合わせて使用される。
【０１１３】
ある特定の場合では、当該技術分野は、重合され得る、天然に生じるヌクレオチドならびにヌクレオチドの修飾を包含する「核酸塩基」という用語を使用する。よって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、天然に生じる核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イソシン、およびＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：ｐｐ４４２９〜４４４３に記載される「天然に生じない」核酸塩基等の天然に生じない核酸塩基を意味する。「核酸塩基」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、その複素環式類似体および互変異性体も含む。さらなる天然に生じる、および天然に生じない核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３におけるＳａｎｇｈｖｉによる第１５章、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に６２２および６２３頁、およびｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ  ８５８〜８５９、Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１，６，５８５−６０７、それらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものを含む。様々な態様では、ポリヌクレオチドはまた、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として役立つ、ある特定の「万能塩基」を含む、核酸塩基のように役立ち得る複素環式化合物等の化合物を含む１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」も含む。万能塩基は、３−ニトロピロール、任意に置換されるインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意に置換されるヒポキサンチンを含む。他の望ましい  万能塩基は、当技術分野で知られているこれらの万能塩基を含む、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体を含む。
【０１１４】
ポリヌクレオチドは、修飾された核酸塩基も含み得る。「修飾された塩基」は、当該技術分野において、天然の塩基（例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、および／またはチミン）と対になることができる、ならびに／または天然に生じない塩基と対になることができるものであると理解される。例となる修飾された塩基は、欧州特許第ＥＰ１  ０７２  ６７９号および国際特許第ＷＯ  ９７／１２８９６号に記載され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換されたウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含むが、これらに限定されない。さらなる修飾された塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）等の３環式ピリミジン、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）等のＧ−クランプを含む。修飾された塩基はまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられるもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンも含み得る。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒ���ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３開示されるものを含む。ある特定のこれらの塩基は、結合親和性を増加するために有用であり、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換されたピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換されたプリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸２本鎖安定性を増加することがしめされており、ある特定の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合せられる。それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、第５，７５０，６９２号、および第５，６８１，９４１号を参照し、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．  １９８９）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ  Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成方法が、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドの両方に対して好ましい（ＤＮＡを合成する周知の方法もまたＲＮＡの合成に有用である）。ポリリボヌクレオチドはまた、酵素学的に調製され得る。天然に生じない核酸塩基が、同様にポリヌクレオチドに組み込まれ得る。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４−７５（２００５）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４−１３６８５（２００２）を参照されたい。
【０１１６】
修飾されたポリヌクレオチド
修飾されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド単位の１つ以上の糖および／または１つ以上のヌクレオチド間連結の両方が、「天然に生じない」基で置換されるアテニュエーター分子または基質ポリヌクレオチドにたいして用いることが企図される。一態様では、本実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格が、骨格を含有するアミドで置換される。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００を参照し、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
開示されるポリヌクレオチドに企図されるヌクレオチドと非天然ヌクレオチドとの間の他の結合は、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、および同第５，７００，９２０号、米国特許公開第２００４０２１９５６５号、国際特許公開第ＷＯ９８／３９３５２号および第ＷＯ９９／１４２２６号、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：３４３−３５５（１９９５）  ａｎｄ  Ｓｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４４２９−４４４３（１９９７）に記載されるものを含み、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
ポリヌクレオチドの具体的な例は、修飾された骨格または天然ではないヌクレオシド間連結を含有するものを含む。修飾骨格を有するポリヌクレオチドは、骨格内にリン原子を保持するもの、および骨格内にリン原子を有さないものを含む。それらのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾されたポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の意義の範囲内であると見なされる。
【０１１９】
リン原子を含有する修飾されたポリヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホン酸塩を含むメチルおよび他のアルキルホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩およびキラルホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、３’−アミノホスホロアミド酸塩およびアミノアルキルホスホロアミド酸塩を含むホスホロアミド酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルホスホトリエステル、これらの正常な３’−５’結合、２’−５’連結類似体を有するセレノリン酸塩およびボラノリン酸塩、ならびに１つ以上のヌクレオチド間連結が、３’−３’、５’−５’、または２’−２’連結である逆位極性を有するものを含む。最も３’−側のヌクレオチド間連結に単一の３’−３’連結、すなわち、脱塩基であってもよい単一の逆位ヌクレオシド残基（ヌクレオチドが欠損しているか、またはその位置にヒドロキシル基を有する）を含む、逆位極性を有するポリヌクレオチドも企図される。塩類、混合塩、および遊離酸形態も企図される。
【０１２０】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号、および第５，６２５，０５０号が挙げられ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
リン原子を含まない修飾されたポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸塩骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格、アミド骨格、および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものを有するものを含む。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドにはホスホロチオエート骨格が提供され、オリゴヌクレオシドにはヘテロ原子骨格が提供され、米国特許第５，４８９，６７７号および第５，６０２，２４０号に記載される−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号、および第５，６７７，４３９号を参照し、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
様々な形態では、ポリヌクレオ｀チド内の２つの連続した単量体間の連結は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ，−Ｓｉ（Ｒ”）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される２〜４個、望ましくは３個の基／原子からなり、式中、ＲＨは水素およびＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。そのような連結の例示的な例は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続の単量体への連結として使用されるとき、Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（後続の単量体への連結として使用されるとき、Ｒ５を含む）、ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続の単量体への連結として使用されるとき、Ｒ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ  Ｈ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）２−Ｏ−であり、とりわけ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ  Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−が企図され、式中、ＲＨは水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる例示的な例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５、およびＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ  ２５：ｐｐ４４２９〜４４４３に記載される。
【０１２３】
ポリヌクレオチドのさらに他の修飾された形態は、米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
修飾されたポリヌクレオチドは、１つ以上の置換された糖部分も含有することができる。ある態様では、ポリヌクレオチドは、２’位に次のＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換された、もしくは非置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。他の実施形態は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含み、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他のポリヌクレオチドは、２’位に次の：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ポリヌクレオチドの薬物動態性質を改善するための基、またはポリヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、ならびに類似する性質を有する他の置換基のうちの１つを含む。一態様では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。他の修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１２５】
さらに他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってよい。一態様では、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。類似する修飾は、ポリヌクレオチド上の他の位置で、例えば、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結ポリヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行われてよい。ポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖摸倣物も有してもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、および第５，７００，９２０号を参照し、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
さらなる修飾は、限定されないが、イソ−ｄＣおよびイソ−ｄＧ等の遺伝子コードを伸長するものを含む。イソ−ｄＣおよびイソ−ｄＧは、それぞれ、シトシンおよびグアニンの化学変異体である。イソ−ｄＣは、イソ−ｄＧと水素結合するが、ｄＧと水素結合しない。同様に、イソ−ｄＧは、イソ−ｄＣと塩基対をなすが、ｄＣと塩基対をなさない［Ｓｗｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０４８９−９６（１９９３）］。これらの態様では、イソ−ｄＣ塩基の付加による制御されたテーリングは、ポリ（イソ−ｄＧ）アテニュエーター分子を使用することにより達成され、逆もまた同様である。
【０１２７】
一態様では、糖の修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に連結され、それによって２環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。この連結は、ある特定の態様では、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、式中、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製物は、国際公開第ＷＯ９８／３９３５２号および第ＷＯ９９／１４２２６号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
標識
本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法または組成物に使用される任意のポリヌクレオチドは、標識を含む。これらの態様のうちのいくつかでは、標識は、蛍光である。ポリヌクレオチドを蛍光分子で標識し、蛍光を測定する方法は、当該技術分野において周知である。本発明の実践に有用な蛍光標識は、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５−（および−６）−カルボキシ−２’、７’−ジクロロフルオレセイン  ｐＨ  ９．０、５−ＦＡＭ  ｐＨ９．０、５−ＲＯＸ  （５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸ  ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡ  ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６  ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ  ｐＨ７．０、６−カルボキシローダミン  ６Ｇ、塩酸塩、６−ＨＥＸ、ＳＥ  ｐＨ９．０、６−ＴＥＴ、ＳＥ  ｐＨ９．０、７−アミノ−４−メチルクマリン  ｐＨ７．０、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ  ９．０、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４０５、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６６０、Ａｌｅｘａ６８０、Ａｌｅｘａ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗体複合体ｐＨ８．０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヒドラジド−水、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６１０  Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ストレプトアビジン  ｐＨ  ７．２，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｐＨ  ７．２，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００抗体複合体ｐＨ７．２、アロフィコシアニン  ｐＨ７．５、ＡＭＣＡ複合体、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｔｔｏ６４７、ＢＣＥＣＦ  ｐＨ５．５、ＢＣＥＣＦ  ｐＨ９．０、ＢＦＰ（青蛍光タンパク質）、ＢＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５−Ｘ、ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ複合体、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＭｅＯＨ、ボディパイＲ６Ｇ  ＳＥ、ボディパイＲ６Ｇ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＭＲ−Ｘ抗体複合体ｐＨ７．２、ボディパイＴＭＲ−Ｘ複合体、ボディパイＴＭＲ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ボディパイＴＲ−ＸファラシジンｐＨ７．０、ボディパイＴＲ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＲ−Ｘ、ＳＥ、ＢＯＰＲＯ−１、ＢＯＰＲＯ−３、カルセイン、カルセインｐＨ９．０、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１  Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カルボキシナフトフルオレセインｐＨ１０．０、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡ  ｐＨ７．０、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体複合体  ｐＨ８．０、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦ  ｐＨ２．５、ＣＩ−ＮＥＲＦ  ｐＨ６．０、シトリン、クマリン、Ｃｙ  ２、Ｃｙ  ３、Ｃｙ  ３．５、Ｃｙ  ５、Ｃｙ  ５．５、ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン、ＭｅＯＨ、ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、ダポキシル（Ｄａｐｏｘｙｌ）（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯ  ｐＨ９．０、Ｄｉ−８  ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ−脂質、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦ  ｐＨ４．０、ＤＭ−ＮＥＲＦ  ｐＨ７．０、Ｄｓレッド、ＤＴＡＦ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅＣＦＰ（高感度シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（高感度緑蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体複合体  ｐＨ８．０、エリスロシン−５−イソチオシアン酸塩  ｐＨ９．０、エチジウム臭化物、エチジウムホモ二量体、エチジウムホモ二量体−１−ＤＮＡ、ｅＹＦＰ（高感度黄色蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体複合体  ｐＨ８．０、ＦｌＡｓＨ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３  Ｃａ２＋、Ｆｌｕｏ−４、フルオロ（Ｆｌｕｏｒ）−ルビー、フルオレセイン、フルオレセイン０．１Ｍ  ＮａＯＨ、フルオレセイン抗体複合体ｐＨ８．０、フルオレセインデキストランｐＨ８．０、フルオレセインｐＨ９．０、フルオロ−エメラルド、ＦＭ  １−４３、ＦＭ  １−４３脂質、ＦＭ  ４−６４、ＦＭ  ４−６４、２％ＣＨＡＰＳ、ＦｕｒａレッドＣａ２＋、Ｆｕｒａレッド、高Ｃａ、Ｆｕｒａレッド、低Ｃａ、Ｆｕｒａ−２  Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ−２、高Ｃａ、Ｆｕｒａ−２、Ｃａなし、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、Ｈｃレッド、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３２５８−ＤＮＡ、ヘキスト３３３４２、Ｉｎｄｏ−１  Ｃａ２＋、Ｉｎｄｏ−１、Ｃａを含まない、Ｉｎｄｏ−１、Ｃａ飽和ＪＣ−１、ＪＣ−１  ｐＨ８．２、リサミンローダミン、ＬＯＬＯ−１−ＤＮＡ、ルシファーイエロー、ＣＨ、ライソセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）ブルー、ライソセンサーブルーｐＨ５．０、ライソセンサーグリーン、ライソセンサーグリーンｐＨ５．０、ライソセンサーイエローｐＨ３．０、ライソセンサーイエローｐＨ９．０、ライソトラッカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）ブルー、ライソトラッカーグリーン、ライソトラッカーレッド、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーン  Ｍｇ２＋、マグネシウムオレンジ、マリーナブルー、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ミトトラッカー（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）グリーン、ミトトラッカーグリーンＦＭ、ＭｅＯＨ、ミトトラッカーオレンジ、ミトトラッカーオレンジ、ＭｅＯＨ、ミトトラッカーレッド、ミトトラッカーレッド、ＭｅＯＨ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ  ５００／５２５、緑蛍光ニッスル染色−ＲＮＡ、ナイルブルー、ＥｔＯＨ、ナイルレ��ド、ナイルレッド−脂質、ニッスル、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン４８８抗体複合体ｐＨ８．０、オレゴングリーン５１４、オレゴングリーン５１４抗体複合体ｐＨ８．０、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体複合体ｐＨ８．０、フィコエリトリン、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−３、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム−ＤＮＡ、Ｒ−フィコエリトリンｐＨ７．５、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィンｐＨ９．０、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２  Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン  １１０、ローダミン  １１０  ｐＨ７．０、ローダミン  １２３、ＭｅＯＨ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジンｐＨ７．０、ローダミンレッド−Ｘ抗体複合体  ｐＨ８．０、ローダミネン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅｎ）グリーン  ｐＨ７．０、Ｒｈｏｄｏｌグリーン抗体複合体ｐＨ８．０、サファイア、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーン  Ｎａ＋、スルホローダミン  １０１、ＳＹＢＲグリーン  Ｉ、ＳＹＰＲＯルビー、ＳＹＴＯ  １３−ＤＮＡ、ＳＹＴＯ  ４５−ＤＮＡ、ＳＹＴＯＸブルー−ＤＮＡ、テトラメチルローダミン抗体複合体ｐＨ８．０、テトラメチルローダミンデキストランｐＨ７．０、テキサスレッド−Ｘ抗体複合体ｐＨ７．２、ＴＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−３−ＤＮＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１  Ｃａ２＋、ＹＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−１−ＤＮＡ、およびＹＯＹＯ−３−ＤＮＡを含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
ハイブリダイゼーション時に検出可能なシグナルまたは検出可能なシグナルの変化をもたらす化学発光、および放射性分子等の蛍光分子以外の他の標識を使用することができる。加えて、ビオチン、２重ビオチン、およびジゴキシゲニンを含むがこれらに限定されない親和性標識を使用することができる。
【０１３０】
方法
本開示は、核酸ポリメラーゼおよびアテニュエーター分子を含む組成物を使用するための方法を提供する。一実施形態では、基質ポリヌクレオチドの３’端への尾配列の付加を可能にするのに十分な条件下で、基質ポリヌクレオチドを本明細書に記載される組成物とインキュベートすることを含み、尾配列の付加が尾配列とアテニュエーター分子との間の会合を可能にし、複合体を形成する基質ポリヌクレオチドを伸長する方法が提供される。いくつかの態様では、本方法は、基質ポリヌクレオチドの伸長後、アテニュエーター分子を分解することをさらに含む。別の態様では、本開示の方法の実践は、伸長した基質ポリヌクレオチドを単離することをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される組成物を、基質ポリヌクレオチドおよびアテニュエーター分子のホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することをさらに含む。本開示の様々な態様は、基質ポリヌクレオチドおよび／または部分的に２本鎖であるアテニュエーター分子を企図する。加えて、本方法のいくつかの態様は、アニーリングステップをさらに含み、２本鎖ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドと会合させるのに十分な条件下で、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドにアニールすることにより生成される。本開示のいくつかの態様では、基質ポリヌクレオチドは、１本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである。様々な態様では、基質ポリヌクレオチドは、２本鎖であり、その２つの遊離３’端のそれぞれが伸長される。他の態様では、２本鎖基質ポリヌクレオチドの遊離３’端のうちの１つのみが伸長される。２本鎖基質ポリヌクレオチドの遊離３’端のうちの１つのみが伸長される態様では、他の遊離３’端は、伸長が阻止されることが企図される。本開示のまた別の態様は、固定化ステップを含む方法を企図し、アテニュエーター／アテニュエーター−アダプター分子もしくは基質ポリヌクレオチドまたはそれらの両方が表面に固定化される。本開示のさらなる態様は、連結ステップを企図し、またさらなる態様は、酵素の不活性化を含むステップを企図する。本明細書に開示される方法のいずれかでは、２つ以上の反応が同じ反応槽で行われることが企図される。例として、本開示は、テーリング反応および連結反応が同じ反応槽で生じる方法を企図する。
【０１３１】
したがって、本開示により提供される方法は、様々な態様では、インキュベーションステップ、分解ステップ、混合ステップ、単離ステップ、アニーリングステップ、不活性化ステップ、連結ステップ、および固定化ステップを含む。いくつかの態様では、本方法は、インキュベーションステップおよび混合ステップを含む。別の態様では、本方法は、インキュベーションステップおよび単離ステップを含む。いくつかの態様では、本方法は、インキュベーションステップおよび不活性化ステップを含む。本開示のさらなる態様は、インキュベーションステップ、混合ステップ、および連結ステップを含む方法を提供する。本開示の別の態様は、インキュベーションステップ、不活性化ステップ、および分解ステップを含む方法を提供する。さらなる態様では、本方法は、インキュベーションステップ、混合ステップ、およびアニーリングステップを含む。本開示の別の態様は、インキュベーションステップ、混合ステップ、アニーリングステップ、連結ステップ、および固定化ステップを含む方法を提供する。また別の態様では、本方法は、インキュベーションステップ、混合ステップ、アニーリングステップ、および単離ステップを含む。本開示のさらなる態様は、インキュベーションステップ、混合ステップ、アニーリングステップ、分解ステップ、および単離ステップを含む方法を企図する。本開示のまた別の態様は、インキュベーションステップ、混合ステップ、アニーリングステップ、分解ステップ、固定化ステップ、および単離ステップを含む方法を提供する。本開示のさらなる態様は、インキュベーションステップ、混合ステップ、アニーリングステップ、不活性化ステップ、分解ステップ、固定化ステップ、および単離ステップを含む方法を提供する。様々なステップが任意の組み合わせおよび順序で使用され得、混合ステップおよびインキュベーションステップのみが全ての方法に共通の特徴であることを当業者は理解する。
【０１３２】
制御されたテーリングおよび連結を使用する、本明細書に記載されるＮＧＳライブラリ調製が標的ＮＧＳ配列決定の濃縮ステップを伴う方法も企図される。一実施形態では、制御されたテーリングおよび連結媒介ＮＧＳライブラリ調製のための入力基質ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション捕捉および標的特異的ＰＣＲを含むがこれらに限定されない任意の方法によって得られたゲノムの濃縮された画分である。別の実施形態では、本開示に記載される制御されたテーリングおよび連結媒介ＮＧＳライブラリの生成物は、後に、ハイブリダイゼーション捕捉を含むがこれに限定されない任意の方法により標的濃縮を受ける。代替の実施形態では、入力基質ポリヌクレオチドは、最初に、第１のＮＧＳアダプターを導入するために制御されたテーリングおよび連結反応を受け、ハイブリダイゼーション捕捉による標的濃縮を含む第２のステップが実施され、第３のステップでは、第２のＮＧＳアダプターが、第２の制御されたテーリングおよび連結反応、または平滑連結もしくはＴＡ連結のいずれかにより、濃縮されたＤＮＡ画分に導入される。
【０１３３】
制御されたテーリングおよび連結を伴う本開示の方法は、様々な実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、およびＲＮＡ転写に由来するこれらの増幅生成物を含むが、これらに限定されないプライマー伸長生成物または増幅生成物に適用される。本開示の方法は、合成核酸にも適用することができる。具体的には、本方法は、合成オリゴヌクレオチド、合成遺伝子、ゲノムセグメント、およびゲノムの配列分析に適用可能である。
【０１３４】
同時に起こる端部修復を制御されたテーリングおよび連結反応と組み合わせる方法も本開示において企図される。端部修復は、次の酵素：ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰＥ１エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｆｐｇ、ｈＡＡＧ、ｈＯＧＧ１、およびｈｓＭＵＧ１を含むが、これらに限定されない。端部修復は、本開示内のＤＮＡ断片化の手段としてＤＮＡの物理的剪断により誘発された損傷を修復するために、既存のＮＧＳライブラリ調製方法に組み込まれる別の反応である。本態様では、制御されたテーリングおよび連結反応条件は、端部修復反応条件に対応し、単一ステップとして同時に実施することができる。
【０１３５】
理論に拘束されることなく、いくつかの態様では、溶液中で行われる反応は固定化ステップを伴うものより効率的であることが、本開示により企図される。「より効率的」とは、溶液中の反応が固定化ステップ後の同じ反応より短い時間で完了することを意味する。
【０１３６】
上述の方法のステップのそれぞれは、以下により詳細に論じられる。
【０１３７】
インキュベーションステップ
本開示の方法は、基質ポリヌクレオチドを、基質ポリヌクレオチドの３’端への尾配列の付加を可能にするのに十分な条件下で、本明細書に記載される組成物とインキュベートすることを伴う。いくつかの態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミン、ヘキサミンコバルト、およびＣｏＣｌ２からなる群から選択される薬剤は、アテニュエーター／アテニュエーター−アダプター分子と基質ポリヌクレオチドの会合を容易にする、またはヌクレオチドの基質ポリヌクレオチドへの付加を制御するために使用される。
【０１３８】
本開示により提供される方法は、複数のヌクレオチドが基質ポリヌクレオチドに付加されて、尾配列を形成するものも含む。いくつかの態様では、アテニュエーター分子は、アテニュエーター分子の長さの全てまたはその一部にわたって尾配列と会合するさらなる実施形態では、アテニュエーター分子は、尾配列を付加する過程中に尾配列と会合する。
【０１３９】
一般に、本明細書に記載される方法は、アテニュエーター分子の尾配列との会合がヌクレオチドのポリヌクレオチドへの付加を調節するものも含む。
【０１４０】
ヌクレオチドの基質ポリヌクレオチドへの付加に関して、本開示は、条件が尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加を調節する方法を提供する。例えば、および限定されることなく、一態様では、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加は温度感受性である。一実施形態では、尾配列が基質ポリヌクレオチドに付加される温度は、少なくとも約４℃である。さらなる実施形態では、尾配列が付加される温度条件は、少なくとも約４℃〜約５０℃、約４℃〜約４０℃、約４℃〜約３７℃、約４℃〜約３０℃、約４℃〜約２５℃、約４℃〜約２０℃、約１０℃〜約５０℃、約１０℃〜約４０℃、約１０℃〜約３７℃、約１０℃〜約３０℃、約１０℃〜約２５℃、約１０℃〜約２０℃、約２０℃〜約５０℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３７℃、約２５℃〜約３７℃、約２５℃〜約４０℃、約３０℃〜約４０℃、少なくとも約５℃、少なくとも約６℃、少なくとも約７℃、少なくとも約８℃、少なくとも約９℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１１℃、少なくとも約１２℃、少なくとも約１３℃、少なくとも約１４℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約１６℃、少なくとも約１７℃、少なくとも約１８℃、少なくとも約１９℃、少なくとも約２０℃、少なくとも約２１℃、少なくとも約２２℃、少なくとも約２３℃、少なくとも約２４℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約２６℃、少なくとも約２７℃、少なくとも約２８℃、少なくとも約２９℃、少なくとも約３０℃、少なくとも約３１℃、少なくとも約３２℃、少なくとも約３３℃、少なくとも約３４℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約３６℃、少なくとも約３７℃、少なくとも約３８℃、少なくとも約３９℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４１℃、少なくとも約４２℃、少なくとも約４３℃、少なくとも約４４℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約４６℃、少なくとも約４７℃、少なくとも約４８℃、少なくとも約４９℃、少なくとも約５０℃、およびそれ以上である。
【０１４１】
したがって、ある態様では、インキュベーションステップが実施される温度は、基質ポリヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数の決定要因である。例として、基質ポリヌクレオチドに付加される尾の長さは、２５℃で約１０個のヌクレオチド、３０℃で１１個のヌクレオチド、３７℃で１３個のヌクレオチド、および４５℃で１６個のヌクレオチドである方法が提供される。
【０１４２】
インキュベーションステップが実施される温度に加えて、尾配列の基質ポリヌクレオチドへの付加を調節する別の条件は、インキュベーションステップが進行する時間の長さである。一般に、インキュベーションステップが進行する時間の長さは、約０．５分〜約１２０分である。いくつかの態様では、インキュベーションステップが進行する時間の長さは、少なくとも約０．５分〜最大約１分、２分、もしくは３分、または少なくとも約１分〜最大約２分、５分、もしくは１０分、または少なくとも約２分〜最大約５分、８分、もしくは１０分、または少なくとも約５分〜最大約１０分、１５分、もしくは２０分、または少なくとも約１０分〜最大約１５分、２０分、もしくは３０分、または少なくとも約２０分〜最大約３０分、４０分、もしくは６０分、または少なくとも約３０分〜最大約４０分、６０分、もしくは８０分、または少なくとも約６０分〜最大約８０分、９０分、もしくは１００分、または少なくとも約９０分〜最大約１００分、１１０分、もしくは１２０分である。様々な実施形態では、インキュベーションステップが進行する時間の長さは、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、約３０分、約３１分、約３２分、約３３分、約３４分、約３５分、約３６分、約３７分、約３８分、約３９分、約４０分、約４１分約４２分、約４３分、約４４分、約４５分、約４６分、約４７分、約４８分、約４９分、約５０分、約５１分、約５２分、約５３分、約５４分、約５５分、約５６分、約５７分、約５８分、約５９分、約６０分、約６１分、約６２分、約６３分、約６４分、約６５分、約６６分、約６７分、約６８分、約６９分、約７０分、約７１分、約７２分、約７３分、約７４分、約７５分、約７６分、約７７分、約７８分、約７９分、約８０分、約８１分、約８２分、約８３分、約８４分、約８５分、約８６分、約８７分、約８８分、約８９分、約９０分、約９１分、約９２分、約９３分、約９４分、約９５分、約９６分、約９７分、約９８分、約９９分、約１００分、約１０１分、約１０２分、約１０３分、約１０４分、約１０５分、約１０６分、約１０７分、約１０８分、約１０９分、約１１０分、約１１１分、約１１２分、約１１３分、約１１４分、約１１５分、約１１６分、約１１７分、約１１８分、約１１９分、約１２０分、またはそれ以上である。
【０１４３】
インキュベーションが実施されるｐＨは、約５．０〜約９．０である。一態様では、ｐＨは、約７．９である。いくつかの態様では、インキュベーションが実施されるｐＨは、少なくとも約ｐＨ５．０〜最大約ｐＨ５．１、５．５、もしくは５．８、または少なくとも約ｐＨ５．５〜最大約ｐＨ５．８、６．０、もしくは６．２、または少なくとも約ｐＨ６．０〜最大約ｐＨ６．２、６．５、もしくは６．８、または少なくとも約ｐＨ６．５〜最大約ｐＨ７．０、７．２、もしくは７．５、または少なくとも約ｐＨ７．５〜最大約ｐＨ７．８、８．０、もしくは８．２、または少なくとも約ｐＨ８．０〜最大約ｐＨ８．２、８．５、もしくは９．０である。様々な態様では、インキュベーションが実施されるｐＨは、約ｐＨ５．１、約Ｈ５．２、約ｐＨ５．３、約ｐＨ５．４、約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．６、約ｐＨ５．７、約ｐＨ５．８、約ｐＨ５．９、約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．１、約ｐＨ６．２、約ｐＨ６．３、約ｐＨ６．４、約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．６、約ｐＨ６．７、約ｐＨ６．８、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．５、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．９、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．１、約ｐＨ８．２、約ｐＨ８．３、約ｐＨ８．４、約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．６、約ｐＨ８．７、約ｐＨ８．８、約ｐＨ８．９、または約ｐＨ９．０、またはそれ以上である。
【０１４４】
分解ステップ
アテニュエーター分子が分解性である方法の態様では、分解ステップが、任意に、インキュベーションステップに続く。一態様では、核酸分解活性を保有する酵素の量が反応槽中に添加され、混合物が酵素の最適温度でさらなる時間期間の間インキュベートされる。様々な態様では、アテニュエーター分子はポリヌクレオチドであり、核酸分解活性を保有する酵素は、ＤＮＡグリコシラーゼ、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ、およびリボヌクレアーゼからなる群から選択される。さらなる態様では、リボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ１からなる群から選択される。したがって、および例として、分解性であるアテニュエーター分子  は、様々な態様では、ウラシルヌクレオチドを含み、分解は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性の結果として生じる。別の態様では、分解性であるアテニュエーター分子はリボヌクレオチドを含み、分解は、リボヌクレアーゼの活性の結果として生じる。核酸分解酵素は、基質ポリヌクレオチドがアテニュエーター分子により分解されないように選択されることを理解する。よって、一態様では、リボヌクレオチドを含むアテニュエーター分子は、基質分子がデオキシリボヌクレオチドを含み、かつ使用される核酸分解酵素が基質ポリヌクレオチドを分解しないリボヌクレアーゼである方法に使用される。
【０１４５】
アテニュエーター分子を分解するために反応槽が所望の温度でインキュベートされるさらなる時間期間は、少なくとも約５分であるが、約０．５分〜約６０分、またはそれ以上であることが企図される。
【０１４６】
混合ステップ
本明細書に提供される方法は、一般的に、核酸ポリメラーゼ、基質ポリヌクレオチド、およびアテニュエーター分子を適切な反応槽中で混合することを含む。混合物のさらなる成分は、核酸ポリメラーゼが基質ポリヌクレオチドおよびリガーゼ酵素の添加に最適に活性なヌクレオチドである適切な緩衝液を含む。任意に、および以下に記載される様々な方法によると、さらなる成分は、カリウム、ＣｏＣｌ２、ナトリウム、リチウム、カルシウムマンガン、トリス、およびその誘導体、ならびにマグネシウムを含む。
【０１４７】
適切な反応槽は、当業者に既知であり、マイクロ遠心管またはマイクロタイタープレートを含むが、これらに限定されない。
【０１４８】
いくつかの態様では、２つ以上の種類の基質ポリヌクレオチドが単一の反応槽に添加される。したがって、様々な態様では、２つ以上の種類の基質ポリヌクレオチドと会合することができる２つ以上の種類のアテニュエーター分子が、単一の反応槽に添加され得る。さらなる態様では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上の種類の基質ポリヌクレオチド、および２つ以上の種類の基質ポリヌクレオチドと会合することができるアテニュエーター分子は、単一の反応槽に添加される。反応物が２つ以上のアテニュエーターポリヌクレオチドおよび／もしくは２つ以上のアテニュエーター−アダプター分子ならびに／またはアテニュエーターポリヌクレオチドとアテニュエーター−アダプター分子の混合物を含むことがさらに企図される。２つ以上のアテニュエーターポリヌクレオチドおよび／または２つ以上のアテニュエーター−アダプター分子の使用は、多重化、ならびにデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼ等のテンプレート依存ポリメラーゼによる制御されたＤＮＡおよびＲＮＡテーリング−連結反応を可能にする。
【０１４９】
核酸ポリメラーゼに関して、添加される量は、１反応につき約１単位（「Ｕ」）〜約１０００Ｕである。いくつかの態様では、添加される核酸ポリメラーゼの量は、少なくとも約１Ｕ〜最大約２、３、もしくは４Ｕ、または少なくとも約２Ｕ〜最大約３、４、もしくは５Ｕ、または少なくとも約５Ｕ〜最大約２０、５０、もしくは１００Ｕ、または少なくとも約５Ｕ〜最大約６、７、もしくは８Ｕ、または少なくとも約６Ｕ〜最大約７、８、もしくは９Ｕ、または少なくとも約７Ｕ〜最大約８、９、もしくは１０Ｕ、または少なくとも約１０Ｕ〜最大約５０、１００、もしくは５００Ｕ、または少なくとも約１０Ｕ〜最大約１２、１５、もしくは１８Ｕ、または少なくとも約１５Ｕ〜最大約１８、２０、もしくは２５Ｕ、または少なくとも約２０Ｕ〜最大約５０、１００、もしくは１０００Ｕ、または少なくとも約２０Ｕ〜最大約２５、３０、もしくは３５Ｕ、または少なくとも約３０Ｕ〜最大約３５、４０、もしくは５０Ｕ、または少なくとも約４０Ｕ〜約５０、６０、もしくは７０Ｕ、または少なくとも約５０Ｕ〜最大約１００、５００、もしくは１０００Ｕ、または少なくとも約６０Ｕ〜最大約８０、９０、もしくは１００Ｕ、または少なくとも約１００Ｕ〜最大約１２０、１５０、もしくは２００Ｕ、または  少なくとも約２００Ｕ〜最大約２５０、２７５、もしくは３００Ｕ、または少なくとも約３００Ｕ〜最大約３２５、３５０、もしくは４００Ｕ、または少なくとも約４００Ｕ〜最大約４５０、５００、もしくは５５０Ｕ、または少なくとも約６００Ｕ〜最大約７００、８００、もしくは９００Ｕ、または少なくとも約７００Ｕ〜最大約８００、９００、もしくは１０００Ｕである。様々な態様では、添加される核酸ポリメラーゼの量は、１反応につき約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４３０、約４４０、約４５０、約４６０、約４７０、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５８０、約５９０、約６００、約６１０、約６２０、約６３０、約６４０、約６５０、約６６０、約６７０、約６８０、約６９０、約７００、約７１０、約７２０、約７３０、約７４０、約７５０、約７６０、約７７０、約７８０、約７９０、約８００、約８１０、約８２０、約８３０、約８４０、約８５０、約８６０、約８７０、約８８０、約８９０、約９００、約９１０、約９２０、約９３０、約９４０、約９５０、約９６０、約９７０、約９８０、約９９０、または約１０００単位、またはそれ以上である。
【０１５０】
反応槽に添加されるヌクレオチドは、所与の用途に依存する。例として、アテニュエーター分子がホモポリマーポリヌクレオチドである場合、反応槽に添加されるヌクレオチドは、アテニュエーター分子のホモポリマー部分を構成するヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドである。様々な実施形態では、ヌクレオチドの混合物が反応槽に添加されることも企図される。よっていくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの混合物が反応槽に添加される（例えばｄＡ／ｒＡ、ｄＴ／ｄＵ／ｒＵ、ｄＣ／ｒＣ、またはｄＧ／ｒＧ）。いくつかの実施形態では、反応槽にリボヌクレオチドを含むことにより、ＴｄＴ等のポリメラーゼの存在下でのさらなるテーリングが減少し、一方で、反応槽にデオキシヌクレオチドを含むことにより、ポリ（Ａ）ポリメラーゼまたはポリ（Ｕ）ポリメラーゼ等のポリメラーゼの存在下でのさらなるテーリングが減少する。反応槽内のヌクレオチドの濃度は、一般的に、約０．１ｍＭであるが、様々な態様では、約０．０１〜約５ｍＭである。
【０１５１】
上述のように、本方法のいくつかの実施形態は、リガーゼ酵素を含む。リガーゼ酵素に関して、添加される量は、１反応につき約０．１〜約１０００Ｕである。
【０１５２】
マグネシウムに関して、添加される量は、１反応につき約１ｍＭ〜約１００ｍＭであることが企図される。様々な態様では、添加されるカリウムの量は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約１００ｍＭである。
【０１５３】
単離ステップ
いくつかの実施形態では、基質ポリヌクレオチドは単離される。基質ポリヌクレオチドの単離は、当業者に既知であり、理解される任意の方法により実施される。一態様では、基質ポリヌクレオチドの単離は、本明細書に記載される基質ポリヌクレオチドの固定化により実施される。別の態様では、リガンド結合ビーズまたは小球体は、具体的に基質ポリヌクレオチドと会合し、その単離を容易にするために使用される。例として、ホモポリマーアデニン配列により尾を付けられた基質ポリヌクレオチドは、ポリ−ｄＴ結合ビーズを使用して単離され得る。他の態様では、基質ポリヌクレオチドの単離は、基質ポリヌクレオチドの沈殿、ゲル濾過、またはスピンカラムマイクロ遠心分離により実施される。
【０１５４】
固定化ステップ
いくつかの態様では、アテニュエーター分子および／または基質ポリヌクレオチドは、共有結合的にまたは非共有結合的に支持体に結合する。当該技術分野に周知の結合化学法および支持体材料の選択が企図される。例えば、支持体は、ガラス、シリカ、金属、プラスチック、繊維、樹脂、およびポリマー全て、またはそれらの一部から作製されたものを含む。例となるポリマーとしては、例えば、および限定されることなく、セルロース、ニトロセルロース、ポリアセテート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエステル、ポリビニルジフルオロベンゼン、ナイロン、炭素繊維、または他の適切なポリマー材料が挙げられる。ある特定の関連する実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のアテニュエーター分子および／または基質ポリヌクレオチドは、識別可能な（例えば、および限定されることなく、指定可能な）様式で空間的に配置されるそのような分子の多くの周知の構成のいずれかを含む固体支持体上に固定化されたアレイとして提供され得る。固定化は、様々な態様では、ビオチン化アテニュエーター−アダプター分子およびストレプトアビジン（アビジン）コーティングされた表面（例えば、および限定されることなく、管、ビーズ、または磁気ビーズ）を伴う。当業者は、複数のそのような固相固定化されたアテニュエーター分子および／または基質ポリヌクレオチドアレイを作製する、および使用するための様々な組成物および方法に精通している。
【０１５５】
不活性化ステップ
いくつかの態様では、反応の成分を含む反応槽のインキュベーション後、反応槽は、核酸ポリメラーゼを不活性化するために、高温でさらにインキュベートされる。いくつかの態様では、さらなるインキュベーションは、少なくとも約１分間〜最大約２、５、もしくは１０分間、または少なくとも約５分間〜最大約１０、２０、もしくは３０分間、または少なくとも約１０分間〜最大約１５、２０、もしくは３０分間、または少なくとも約１５分間〜最大約２０、２５、もしくは３０分間実施される。いくつかの実施形態では、さらなるインキュベーションは、約１分間〜約３０分間実施される。様々な態様では、さらなるインキュベーションは、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１１分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、約１９分間、約２０分間、約２１分間、約２２分間、約２３分間、約２４分間、約２５分間、約２６分間、約２７分間、約２８分間、約２９分間、約３０分間、またはそれ以上実施される。
【０１５６】
さらなるインキュベーションが実施される高温は、約６０Ｃ〜約１００℃である。いくつかの態様では、さらなるインキュベーションが実施される温度は、少なくとも約６０℃〜最大約６２℃、６５℃、もしくは６８℃、または少なくとも約６０℃〜最大約６５℃、７０℃、もしくは７５℃、または少なくとも約６０℃〜最大約７０℃、７５℃、もしくは８０℃、または少なくとも約７０℃〜最大約７５℃、８０℃、もしくは８５℃、または少なくとも約７０℃〜最大約８０℃、９０℃、もしくは１００℃である。様々な態様では、さらなるインキュベーションが実施される温度は、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃、約８０℃、約８１℃、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃、約１００℃、またはそれ以上である。
【０１５７】
連結ステップ
提供される方法のいくつかの態様では、反応は、基質ポリヌクレオチドのテーリングがアダプター分子への基質ポリヌクレオチド連結と同時に生じるような反応である。これらの態様では、核酸ポリメラーゼ、基質ポリヌクレオチド、アテニュエーター−アダプター分子、緩衝剤、およびリガーゼ酵素を含む混合物は、全て単一の反応槽に存在する（例えば、および限定されることなく、実施例９を参照）。基質ポリヌクレオチドのテーリングおよびアテニュエーター−アダプター分子へのその連結を生成するための混合物のインキュベーションは、テーリングのみに関する上述の方法と同一である。様々な態様では、リガーゼ酵素は、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである。固定化されたアテニュエーター分子は、本明細書に記載されている。本方法のいくつかの態様では、固定化されたアテニュエーター分子は、尾配列のポリヌクレオチド分子への付加中に、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼによってポリヌクレオチドに連結される。
【０１５８】
リガーゼ酵素に関して添加される量は、１反応につき約０．１単位（「Ｕ」）〜約１０００Ｕである。いくつかの態様では、付加されるリガーゼ酵素の量は、少なくとも約０．１Ｕ〜最大約０．５、１、２、３、もしくは４Ｕ、または少なくとも約１Ｕ〜最大約３、４もしくは５Ｕ、または少なくとも約５Ｕ〜最大約２０、５０、もしくは１００Ｕ、または少なくとも約５Ｕ〜最大約６、７、もしくは８Ｕ、または少なくとも約６Ｕ〜最大約７、８、もしくは９Ｕ、または少なくとも約７Ｕ〜最大約８、９、もしくは１０Ｕ、または少なくとも約１０Ｕ〜最大約５０、１００、もしくは５００Ｕ、または少なくとも約１０Ｕ〜最大約１２、１５、もしくは１８Ｕ、または少なくとも約１５Ｕ〜最大約１８、２０、もしくは２５Ｕ、または少なくとも約２０Ｕ〜最大約５０、１００、もしくは１０００Ｕ、または少なくとも約２０Ｕ〜最大約２５、３０、もしくは３５Ｕ、または少なくとも約３０Ｕ〜最大約３５、４０、もしくは５０Ｕ、または少なくとも約４０Ｕ〜約５０、６０、もしくは７０Ｕ、または少なくとも約５０Ｕ〜最大約１００、５００、もしくは１０００Ｕ、または少なくとも約６０Ｕ〜最大約８０、９０、もしくは１００Ｕ、または少なくとも約１００Ｕ〜最大約１２０、１５０、もしくは２００Ｕ、または  少なくとも約２００Ｕ〜最大約２５０、２７５、もしくは３００Ｕ、または少なくとも約３００Ｕ〜最大約３２５、３５０、もしくは４００Ｕ、または少なくとも約４００Ｕ〜最大約４５０、５００、もしくは５５０Ｕ、または少なくとも約６００Ｕ〜最大約７００、８００、もしくは９００Ｕ、または少なくとも約７００Ｕ〜最大約８００、９００、もしくは１０００Ｕである。様々な態様では、付加されるリガーゼ酵素の量は、１反応につき約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４３０、約４４０、約４５０、約４６０、約４７０、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５８０、約５９０、約６００、約６１０、約６２０、約６３０、約６４０、約６５０、約６６０、約６７０、約６８０、約６９０、約７００、約７１０、約７２０、約７３０、約７４０、約７５０、約７６０、約７７０、約７８０、約７９０、約８００、約８１０、約８２０、約８３０、約８４０、約８５０、約８６０、約８７０、約８８０、約８９０、約９００、約９１０、約９２０、約９３０、約９４０、約９５０、約９６０、約９７���、約９８０、約９９０、または約１０００単位、またはそれ以上である。
【０１５９】
治療用途
加えて、本開示は、細胞およびウイルス増殖を制御するための減弱された基質ポリヌクレオチドの治療用途も企図する。治療用途は、遺伝子発現のアンチセンス調節を含むが、これに限定されない。真核生物のポリ（Ａ）ポリメラーゼは、メッセンジャーＲＮＡ加工中にポリ（Ａ）尾の付加を伴う。得られたｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾は、複数の機能に役立つ。それらは核から細胞質への輸送に必要であり、それらはタンパク質合成の効率を刺激し、かつそれらはｍＲＮＡを安定化する。細菌におけるＲＮＡのポリアデニル化は、ＲＮＡ分解に顕著な役割を果たす。真核生物におけるポリ（Ｕ）尾の付加は、あまり理解されていないが、あるＲＮＡの分解を制御する可能性がある。合成アテニュエーター分子は、細胞内のポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）テーリングを阻害する、または限定し、よって、細胞およびウイルスの増殖の制御を確立するために、アンチセンス分子として使用することができる可能性がある。
【０１６０】
キット
本開示は、核酸ポリメラーゼによって制御され、かつ制限された核酸テーリングのためのキットを提供する。
【０１６１】
本開示により提供されるキットは、実践される特定のアッセイ構成により、本明細書に記載されるアテニュエーター／任意のアテニュエーター−アダプター分子（任意の固相固定化されたアテニュエーター−アダプター分子を含む）、核酸ポリメラーゼ、任意に、リガーゼ、グリコシラーゼ、ならびに適切な緩衝剤、洗浄溶液、指示薬、および検出培地等の補助試薬を含む。いくつかの態様では、アテニュエーター分子は、核酸ポリメラーゼと予め混合されるか、または別の管で提供される。
【０１６２】
そのようなキットの例としては、以下が挙げられるか、これらに限定されない。
【０１６３】
ＴｄＴ媒介ＤＮＡテーリング
このキットは、次の成分を含む。ポリ（ｄＡ）テーリングキットに関しては、３’保護直鎖状または環状ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＵ）またはポリ（Ｕ）アテニュエーター分子で補足されたＴｄＴ酵素。ポリ（ｄＴ）テーリングキットに関しては、３’保護直鎖状または環状ポリ（ｄＡ）またはポリ（Ａ）アテニュエーター分子で補足されたＴｄＴ酵素。ポリ（ｄＧ）テーリングキットに関しては、３’保護直鎖状または環状ポリ（ｄＣ）またはポリ（Ｃ）アテニュエーター分子で補足されたＴｄＴ酵素。ポリ（ｄＣ）テーリングキットに関しては、３’保護直鎖状または環状ポリ（ｄＧ）またはポリ（Ｇ）アテニュエーター分子で補足されたＴｄＴ酵素。
【０１６４】
ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）−ポリメラーゼ媒介ＲＮＡテーリング
ポリ（Ａ）テーリングキットは、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＵ）、またはポリ（Ｕ）アテニュエーター分子で補足されたポリ（Ａ）ポリメラーゼを含む。ポリ（Ｕ）テーリングキットは、ポリ（ｄＡ）またはポリ（Ａ）アテニュエーター分子で補足されたポリ（Ｕ）ポリメラーゼを含む。
【０１６５】
さらなるキットは、ＤＮＡおよびＲＮＡ基質用の単一反応テーリングおよびアダプター連結両方の試薬と、ＤＮＡおよびＲＮＡ基質用の単一反応テーリングおよびアダプター連結両方の試薬とを含む。他のキットは、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子にバーコードを導入することができる。また他のキットは、ＤＮＡおよびＲＮＡ基質を、次世代配列決定のためのライブラリに変換することができる。一実施形態では、（ｉ）制御されたテーリング反応、（ｉｉ）端部修復、（ｉｉｉ）プライマー伸長、および（ｉｖ）平滑断端もしくはＴＡ連結または第２の制御されたテーリングおよび連結を実施するための材料を含むＮＧＳライブラリ調製キットが提供される。
【０１６６】
以下の実施例の項には、本開示により記載される組成物および方法を使用した特定の用途が提供される。これらの用途は単に例として提供され、決して制限されないことが理解される。
【実施例】
【０１６７】
（実施例１）
長い（＞２０ｂ）相補性ポリ（ｄＴ）ポリヌクレオチドの存在下の減弱されたＴｄＴ媒介ポリ（ｄＡ）ＤＮＡテーリング
第１段階：ＤＮＡプライマーの非減弱で高速なＴｄＴ媒介ポリ（ｄＡ）テーリングは、尾の大きさが長い（ｄＴ）３０配列を含有する相補性アテニュエーター分子と安定した複合体を形成することができる臨界の大きさに達する大きさまで３７℃で生じる。アテニュエーター分子のテーリングが、アテニュエーター分子の３’端に保護基（例えば、および限定されることなくリン酸塩、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、逆位ｄＴ）もしくはいくつかのリボヌクレオチドを配置することにより、または環状アテニュエーター分子を使用することにより阻止される。
【０１６８】
第２段階：アテニュエーターポリヌクレオチド（ｄＴ）３０とポリ（ｄＡ）尾との間の複合体の形成は、ポリ（ｄＡ）合成の大幅な減少をもたらす。ＴｄＴ酵素により付加される各後続のｄＡ塩基は、２本鎖の長さおよび安定性を増加させ、よって、ＴｄＴ酵素によるほぼ完全なポリ（ｄＡ）合成の阻害をもたらす（図１）。
【０１６９】
長いポリ（ｄＴ）アテニュエーター分子の存在下のポリ（ｄＡ）テーリングの動態
本方法のいくつかの実施形態では、長いアテニュエーター分子の存在下での３７℃でのＴｄＴ媒介ｄＡテーリングは、非常に狭い大きさ分布の比較的短い尾（約１３ｂ）を生成する（実施例１および以下のスキーム１を参照）。
【化１】
2018130124.tif 000003
【０１７０】
短い（１２〜１４ｂ）相補性ポリ（ｄＴ）ポリヌクレオチドを伴う減弱されたＴｄＴ媒介ポリ（ｄＡ）テーリング
さらなる実施形態では、基質ＤＮＡプライマーの非減弱で高速なＴｄＴ媒介ポリ（ｄＡ）テーリングが第１相で生じる方法を提供する（図２）。第２ａ段階におけるアテニュエーターポリヌクレオチドとポリ（Ａ）尾との間の複合体の形態およびポリ（ｄＡ）合成速度の減少。この段階で、全てのさらに付加されたｄＡ塩基は、尾の長さがアテニュエーター分子の完全な長さに達し、２本鎖平滑断端を形成するまで複合体をより安定化する。反応は、制限されたアテニュエーター分子の大きさのため、本方法の代替の実施形態のように（上記を参照）第２ｂ段階には決して進まない。
【０１７１】
第３段階（図３）では、３〜４個のｄＡ塩基を含有する３’１本鎖ポリ（ｄＡ）突出が作製されるまで、平滑断端基質のゆっくりなポリ（ｄＡ）テーリングが生じる。その後第１段階〜第３段階が繰り返される。
【０１７２】
短いポリ（ｄＴ）アテニュエーター分子の存在下のポリ（ｄＡ）テーリングの動態
いくつかの態様では、短いアテニュエーター分子の存在下におけるＴｄＴ媒介ＤＮＡテーリングは、ポリ（ｄＡ）尾が例えば、および限定されることなく１３個の塩基の倍数（１３、２６、３９等）を有する尾の長さの離散型ラダー様大きさ分布を有するＤＮＡ分子の合成をもたらす（図３）。別の実施形態では、減弱されたＴｄＴ媒介ポリ（ｄＡ）テーリングがｄＵ塩基を含有する分解性アテニュエーターポリヌクレオチドと実施される方法が企図される（図４）。
【０１７３】
本開示により提供される方法は、長い（約２０〜３０個の塩基）相補性アテニュエーターポリヌクレオチドを伴う減弱されたＴｄＴ媒介ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＧ）、およびポリ（ｄＣ）テーリングも含む（図５を参照）。分解性アテニュエーターリボ−ポリヌクレオチドを伴う減弱されたＴｄＴ媒介ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＧ）、およびポリ（ｄＣ）テーリングの方法も提供される（図６）。
【０１７４】
ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる制御されたＲＮＡテーリング
ＴｄＴ媒介ホモポリマーＤＮＡテーリングの減弱および制御に関連する本明細書に記載される方法も、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）配列をＲＮＡテンプレートに付加するポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼによって触媒される酵素反応に適用されるように企図される。ＤＮＡ、３’保護直鎖状ポリ（Ｕ）およびポリ（Ａ）に関連する方法と同様に、非保護ポリ（ｄＵ）およびポリ（ｄＡ）分子、ならびにポリ（Ｕ）、ポリ（Ａ）、ポリ（ｄＵ）、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＵ）、およびポリ（ｄＡ）分子、ならびにポリ（Ｕ）、ポリ（Ａ）、ポリ（ｄＵ）、ポリ（ｄＡ）環が、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼのアテニュエーターとして使用され得る。
【０１７５】
ＣおよびＧリボヌクレオチドを伴うポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼによるＲＮＡの制御されたテーリングは、様々な態様では、対応するＤＮＡまたはＲＮＡアテニュエーター分子を必要とする。
【０１７６】
図７は、相補性ＤＮＡポリ（ｄＴ）３０ポリヌクレオチドを使用したＲＮＡ基質の減弱されたポリ（Ａ）−ポリメラーゼ媒介ポリ（ｒＡ）テーリングを示す。第１段階では（図７の頂部）、ＲＮＡプライマーの非減弱で高速なポリ（Ａ）−ポリメラーゼ媒介ポリ（Ａ）テーリングが示される。第２段階では（ポリ（ｒＡ）尾の付加後）、アテニュエーターポリヌクレオチドポリ（ｄＴ）３０とポリ（Ａ）尾との間の安定した複合体の形成は、ポリ（Ａ）合成の大幅な減少、または完全な阻害さえももたらす。
【０１７７】
本方法の別の態様は、相補性ＤＮＡポリ（ｄＡ）３０ポリヌクレオチドを使用したＲＮＡ基質の減弱されたポリ（Ｕ）−ポリメラーゼ媒介ポリ（ｒＵ）テーリングを提供する（図８）。図８の頂部は、ＲＮＡプライマーの非減弱ポリ（Ｕ）−ポリメラーゼ媒介ポリ（Ｕ）テーリングが起こる、そのような方法の第１段階を示す。第２段階では（ポリ（ｒＵ）尾の付加後）、アテニュエーターポリヌクレオチドポリ（ｄＡ）３０とポリ（Ｕ）尾との間で生じる安定した複合体の形成は、ポリ（Ｕ）合成の大幅な減少、または完全な阻害さえももたらす。
【０１７８】
ＤＮＡまたはＲＮＡ断片の１端へのアダプター（バーコード）結合および固体支持体への固定化のための制御された大きさ制限されたテーリングの使用
前述のアテニュエーター分子は、例えば、および限定されることなく、ＴｄＴ、ポリ（Ａ）、またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼによって生成された尾に相補的な分解性または非分解性ホモポリマー分子である。それらのホモポリマー３’ドメインに加えて、５’部分に１本鎖または２本鎖ドメインを有するアテニュエーター分子のクラスが以下に示される。これらのドメインは、重合または連結反応により尾領域の下流にアダプター配列を導入するために使用される。連結反応の利点は、それが単一管の単一ステップ反応で非テンプレートホモポリマーテーリング反応により結合されることである。そのようなテーリング−連結反応の使用は、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ次世代配列決定（ＮＧＳ）アプリケーションからサンプル調製するためのアプリケーションを用いて、１つまたは２つのアダプターを伴うＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡライブラリを作製するための単純かつ効率的な方式を提供する。制限されたテーリング反応を使用した１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への３’端アダプター結合の概略図が図９に提供される。図９のパートＡは、制限されたテーリング−連結反応を示す。そのような反応では、１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡまたはＲＮＡが、アテニュエーター−アダプターの３’保護１本鎖ポリ（Ｔ）またはポリ（ｄＴ）部分がアテニュエーターとして機能し、アテニュエーター−アダプターの５’リン酸化２本鎖部分がアダプターとして機能する部分的に２本鎖であるアテニュエーター−アダプター分子の存在下で、テンプレート依存ポリメラーゼおよびリガーゼとインキュベートされる。制限されたポリ（ｄＡ）またはポリ（Ａ）伸長が、次に、テンプレート非依存ポリメラーゼを介してポリヌクレオチドに付加され、アテニュエーター−アダプターの１本鎖部分と２本鎖を形成する。アテニュエーター−アダプターのアダプター部分は、次に、アダプター分子上に存在する５’リン酸塩を介して減弱されたポリヌクレオチドに連結される。制御されたテーリングおよび連結反応は、閉管形式で生じる。アダプター分子は、タグ（例えば、および限定されることなく、ビオチン）を任意にさらに含む。連結された分子は、次に、単離を容易にするためにストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズに任意に固定化される。
【０１７９】
図９のパートＢは、制限されたテーリング−ポリメラーゼ伸長反応を示す。そのような反応では、ＤＮＡまたはＲＮＡは、１本鎖であるアテニュエーター−アダプター分子の存在下でテンプレート非依存ポリメラーゼとインキュベートされる。次に、ポリ（ｄＡ）またはポリ（Ａ）伸長が、テンプレート依存ポリメラーゼを介してポリヌクレオチドに付加され、ＤＮＡポリメラーゼの存在によりＤＮＡまたはＲＮＡ分子にわたる伸長が可能になり、それによって２本鎖の生成物がもたらされる。制御されたテーリングおよび伸長反応は、閉管形式で生じ得る。この場合、デオキシヌクレオチド３リン酸塩（ｄＮＴＰ）ミックスは、熱活性化できるｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（ＣｌｅａｎＡｍｐ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ならびに標準的なｄＡＴＰを含まなければならず、また１本鎖アテニュエーター−アダプターの３’端も熱活性化された塩基を含有しなければならない。結果として、制御された減弱されたテーリングは、ｄＡＴＰのみが利用可能であり、他のヌクレオチドおよびアテニュエーター−アダプターの３’端が保護されたままであるとき、３７℃で生じるだろう。９５℃で混合物を加熱した後、残りのヌクレオチドは活性化され、アテニュエーター−アダプターの３’端が伸長可能となる。アダプター分子は、タグ（例えば、および限定されることなく、ビオチン）を任意にさらに含む。次に、生成物分子は、単離を容易にするために、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズに任意に固定化される。
【０１８０】
本開示のさらなる態様では、制限されたテーリング反応を使用して、固体支持体に１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを共有結合的に固定化するための方法が提供される（図１０）。図１０のパートＡは、制限されたテーリング−連結反応を使用した３’端による固定化を示す。そのような反応では、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、３’端保護された１本鎖ポリ（Ｔ）またはポリ（ｄＴ）部分がアテニュエーターとして機能し、５’リン酸化２本鎖部分がアダプターとして機能する、部分的に２本鎖である３’端の共有結合的に固定化されたアテニュエーター−アダプター分子の存在下で、テンプレート非依存ポリメラーゼおよびリガーゼとインキュベートされる。制限されたポリ（ｄＡ）またはポリ（Ａ）伸長が、次に、テンプレート依存ポリメラーゼによって基質に付加され、基質は、アテニュエーター−アダプターの１本鎖部分と２本鎖を形成する。固定化されたアテニュエーター−アダプターのアダプター部分は、次に、アダプター分子上に存在する５’リン酸塩を介して、減弱された基質ポリヌクレオチドに連結され、固定化されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子をもたらす。制御されたテーリング、連結、固体化反応は、閉管形式で生じる。
【０１８１】
図１０のパートＢは、本開示のさらなる態様である制限されたテーリング−ポリメラーゼ伸長反応を使用した、５’端による固定化を示す。そのような反応では、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、５’端の共有結合的に固定化されたアテニュエーター−アダプター分子の存在下で、テンプレート非依存ポリメラーゼとインキュベートされる。次に、ポリ（ｄＡ）またはポリ（Ａ）伸長が、テンプレート依存ポリメラーゼによって付加され、ＤＮＡポリメラーゼの存在によりＤＮＡまたはＲＮＡ分子にわたる伸長が可能になり、それによって固定化された２本鎖の生成物がもたらされる。制御されたテーリング、連結、固体化反応は、閉管形式で行うことができる。この場合、ｄＮＴＰミックスは、熱活性化できるｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（ＣｌｅａｎＡｍｐ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ならびに標準的なｄＡＴＰを含まなければならず、また固定化された１本鎖のアテニュエーター−アダプターの３’端も熱活性化された塩基を含有しなければならない。結果として、制御された減弱されたテーリングは、ｄＡＴＰのみが利用可能であり、他のヌクレオチドおよび固定化されたアテニュエーター−アダプターの３’端が保護されたままであるとき、３７℃で生じるだろう。９５℃で混合物を加熱した後、残りのヌクレオチドは活性化され、固定化されたアテニュエーター−アダプターの３’端が伸長可能となる。
【０１８２】
いくつかの態様では、ＤＮＡ基質の場合、テーリング−連結同時反応（図９のパートＡ、および図１０のパートＡ）は、ＴｄＴ酵素および大腸菌ＤＮＡリガーゼ（理論に拘束されることなく、いくつかの実施形態では、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに必要とされるＡＴＰはＴｄＴテーリング過程を阻止することが企図される）を伴う。ＲＮＡ基質の場合、テーリング−連結同時反応（図９のパートＡ、および図１０のパートＡ）は、ポリ（Ａ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼまたはポリ（Ｕ）ポリメラーゼを伴う。しかしながら、いくつかの態様では、ＡＴＰの存在は、混合されたポリ（Ｕ／Ａ）テーリングをもたらす。
【０１８３】
ＤＮＡ基質の場合、テーリング−伸長反応（図９のパートＢ、および図１０のパートＢ）は、ＴｄＴ酵素、および中温性また好熱性ＤＮＡポリメラーゼによって行われる。ＲＮＡ基質の場合、テーリング−伸長反応（図９のパートＢ、および図１０のパートＢ）は、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼによって行われ、逆転写酵素活性を伴う。本開示の方法および組成物に使用するために企図されるポリメラーゼは、本明細書上記に記載されている。
【０１８４】
固体支持体への固定化を伴う、または伴わないＤＮＡライブラリの両端へのアダプター結合のための制御された大きさ制限されたテーリングの使用
２本鎖基質へのアダプター連結の場合（図１１）、方法は、高濃度のＤＮＡリガーゼ（例えば、および限定されることなくＴ４  ＤＮＡリガーゼ）および平滑断端アダプターを伴う。代替的に、アダプターは、基質核酸の第２のＤＮＡ鎖が３’プルーフリーディング活性なしでポリメラーゼによって合成される場合、単一のｄＴ塩基３’突出を有する。いくつかの態様では、そのようなポリメラーゼは、ＤＮＡの３’端にさらなるｄＡ塩基を付加する。
【０１８５】
１本鎖ＤＮＡ基質の場合（そのような基質は、図１２および１３に示されるそれらの５’端によって、またはビオチン−ストレプトアビジン相互作用を通して共有結合的に固定化され得るか、または溶液中で遊離であってよい）、第２のアダプターの結合は、連結過程（図１２）または重合過程（図１３）のいずれかで結合される制限されたテーリングを利用する、図９に示される過程を伴うことができる。
（実施例２）
【０１８６】
長いポリ（ｄＴ）アテニュエーター分子の存在下でＴｄＴ酵素によって導入されるポリ（ｄＡ）配列の長さ
図１４は、ポリ（ｄＡ）／ポリ（ｄＴ）２本鎖の長さおよびその融解温度の間の計算された依存度（白丸）を示し、減弱されたポリ（ｄＡ）尾の予測された大きさが反応温度の関数として変動するが、１０〜１６個の塩基の範囲によって限定されると結論付けられた。
【０１８７】
長い（分解性）アテニュエーター分子の存在下のＴｄＴ酵素による１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドテンプレートの制御されたポリ（ｄＡ）テーリング
【化２】
2018130124.tif 000004
【０１８８】
方法：ポリ（ｄＡ）テーリング反応を、１×ＴｄＴ緩衝液、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、４ｐｍｏｌの基質ポリヌクレオチド１０−００１、１０Ｕ  ＴｄＴ酵素、および０または２０ｐｍｏｌのアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１０３を含有する５μｌの反応体積中で、３７℃で１、５、１５、３０、および６０分間実施し、続いて、ＴｄＴ酵素を不活性化するために、７０℃で１０分間インキュベートした。０．２５ＵのＵＳＥＲ酵素を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。試料を、ホルムアミド充填緩衝液中で沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２Ｂｏｘ）にかけ、ＳＹＢＲ金染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１８９】
結果：ＴｄＴ酵素による標準的および減弱されたポリ（ｄＡ）テーリング反応の生成物の電気泳動による分析が、図１５に示される。列１、２、３、４、および５は、アテニュエーター１０−１０３の存在下で、ＴｄＴ酵素と１、５、１０、１５、および３０分間インキュベートした後のテーリング反応の生成物を示し、列７、８、９、１０、および１１は、アテニュエーターの不在下で、ＴｄＴ酵素と１、５、１０、１５、および３０分間インキュベートした後のテーリング反応の生成物を示し、列６は、ＤＮＡポリヌクレオチド大きさマーカーである。両場合とも、テーリング反応は、３０分以内に完了した。アテニュエーター分子の不在下では、基質ポリヌクレオチドに付加されるＴｄＴ酵素は、非常に長く、大きさが不均一のポリ（ｄＡ）尾である。アテニュエーター分子の存在下では、付加されたポリ（ｄＡ）尾の大きさは、非常に離散的であり、その分布は、非常に狭く、約１２〜１３個の塩基が最大である（ＵＳＥＲによって分解された長いアテニュエーター分子は、分解生成物が５個の塩基を超えなかったため、ゲル上では見えなかった）。興味深いことには、アテニュエーター分子１０−１０３および１３ｄＡ塩基を含有するポリ（ｄＡ）尾によって形成された複合体の融解温度（または安定性）は約３７．６℃であり、これは３７℃の反応温度に非常に近い。１３個の塩基を超える尾を伴ういずれの生成物の不在は、ｄＡ塩基の付加がこの制限を上回るアテニュエーター分子によって強く阻害されたことを示す。
【０１９０】
結論：ポリ（ｄＡ）テーリングの完全な減弱が、長い（４０ｂポリ（ｄＴ）分子を使用して達成された。長いアテニュエーター分子の存在下でＴｄＴ酵素によって付加されたポリ（ｄＡ）尾の長は、約１２〜１３個のｄＡ塩基から構成され、極度に狭い大きさ分布を有し、アテニュエーター分子の不在下で付加された数百個のｄＡ塩基と対照である。ｄＵ塩基を含有するアテニュエーター分子は、ｄＡ尾状ＤＮＡ基質の下流利用を簡潔化するためにＵＳＥＲ酵素を使用したテーリング反応の完了後に分解した。
（実施例３）
【０１９１】
短いアテニュエーター分子の存在下のＴｄＴ酵素による１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドテンプレートの制御されたポリ（ｄＡ）テーリング
【化３】
2018130124.tif 000005
【０１９２】
方法：ポリ（ｄＡ）テーリング反応を、１×ＴｄＴ緩衝液、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、４ｐｍｏｌの基質ポリヌクレオチド１０−００１、１０Ｕ  ＴｄＴ酵素、および６０ｐｍｏｌの短いアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１３０−１０１３５もしくは２０ｐｍｏｌの長いアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１０３を含有する５μｌの反応体積中で、３０℃で３０分間実施し、続いて、ＴｄＴ酵素を不活性化するために、７０℃で１０分間インキュベートした。基質１０−００１を用いた制御された反応を、０、３０、６０、９０、および１２０分間、アテニュエーター分子１０−１３３の存在下でも実施した。０．２５ＵのＵＳＥＲ酵素を、長いアテニュエーター分子１０−１０３を含有する管に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。試料を、ホルムアミド充填緩衝液中で沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２Ｂｏｘ）にかけ、ＳＹＢＲ金染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１９３】
結果：異なる長さおよび安定性のアテニュエーター分子を使用したＴｄＴ酵素による減弱されたポリ（ｄＡ）テーリング反応の生成物の電気泳動による分析が、図１６ａに示される。列２は尾がないテンプレートポリヌクレオチド−基質１０−００１を示し、列３〜１０は、ＴｄＴテーリング後のポリヌクレオチド−基質１０−００１を示す。列３は未制御のテーリング生成物を示し、列４は長いアテニュエーター分子１０−１０３の存在下の制御されたテーリング生成物を示し、列５、６、７、８、９、および１０は、それぞれ、アテニュエーター分子１０−１３０、１０−１３１、１０−１３２、１０−１３３、１０−１３４、および１０−１３５の存在下の制御されたテーリングを示す。列１および１１は、それぞれ、ＤＮＡポリヌクレオチドおよび２５ｂｐラダー大きさマーカーを示す。図１６ｂは、アテニュエーター分子１０−１３３の存在下のテーリング反応の動態を示し、列１は基質１０−００１、列２、３、４、および５は、それぞれ、３０、６０、９０、および１２０分間ＴｄＴ酵素とインキュベートした後のテーリング生成物を示す。実施例２と同様、長いアテニュエーター分子１０−１０３の存在下、付加されたポリ（ｄＡ）尾の大きさは、非常に離散的であり、その分布は非常に狭く、平均値は１２〜１３個の塩基であった。短いアテニュエーター分子の作用は、より複雑であり、それらの大きさに依存した。Ｔ７  ｒＵｒＵおよびＴ８  ｒＵｒＵ伸長を伴うアテニュエーター分子１０−１３０および１０−１３１（ポリ（ｄＡ）尾と複合体を形成することができ、融解温度は、それぞれ、Ｔｍ＝１４．５℃および１０℃である）は、ポリ（ｄＡ）尾の平均の大きさをわずかに減少させたのみであり、一方、それらの大きさ分布は尚、非常に広範なままであった（図１６ａの列５および６）。Ｔｍ＝２４．７℃の融解温度を有するポリ（ｄＡ）尾と複合体を形成することができるＴ９  ｒＵｒＵ伸長を伴うアテニュエーター分子１０−１３２は、予測されたラダーのバンドを生成し、約１５個の塩基が増加した（図１６ａ、列７）。ラダーは、図１６ｂの列４および５に見られるように、インキュベーション時間が最大９０〜１２０分増加したとき、より顕著となった。短いアテニュエーター分子を伴う減弱されたテーリングのそのような動態は、本明細書において、理論的に予測され、論じられた。アテニュエーター分子１０−１３３、１０−１３４、および１０−１３５（ポリ（ｄＡ）尾と複合体を形成することができ、融解温度は、それぞれ、Ｔｍ＝２８．６℃、３２℃、および３５℃である）は、単一の離散型バンドを生成し、大きさは、アテニュエーターの大きさが増加するとき、１５個から１２個の塩基に徐々に減少する（図１６ａの列８〜１０）。合計数１４個の塩基を伴うアテニュエーター分子１０−１３５は、Ｔｍ＝３５℃でポリ（ｄＡ）尾と複合体を形成することができ、長い４０塩基アテニュエーター分子１０−１０３と同じ作用を有した。反応温度３０℃で観察されたポリ（ｄＡ）尾の１２塩基の長さは、反応温度３７℃で観察された１３塩基の大きさより１塩基低く、より低い反応温度で長さが短い複合体の予測された安定性の増加と一致する。アテニュエーター分子１０−１３０〜１０−１３５は、図１６ａの列５〜１０に示されるように、ゲルの底部に見られた。
【０１９４】
結論：ポリ（ｄＡ）テーリングの完全な減弱は、１〜２個のリボヌクレオチド、リン酸基、またはアテニュエーター分子のＴｄＴテーリングを阻止する他の修飾によって３’端で保護される短い（１２〜１４個の塩基）ポリ（ｄＴ）分子を使用して達成された。アテニュエーター分子の存在下でＴｄＴ酵素によって付加されたポリ（ｄＡ）尾の長さは、反応温度およびアテニュエーター分子の大きさによって制御された。減弱されたポリ（ｄＡ）尾は、非常に狭い大きさ分布（＋／−１塩基）を有し、平均値は１１〜１５個の塩基まで変動する。約１２個のｄＴ塩基を含有するアテニュエーターの存在下でＴｄＴと長期間インキュベートすることにより、反復がもたらされ、１２〜１５個のｄＡ塩基が増加した。
（実施例４）
【０１９５】
ＴｄＴ酵素による２本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドテンプレートの制御された、および未制御の両方のポリ（ｄＡ）テーリングは、非効率的であり、強い配列の偏りを示す。
【化４】
2018130124.tif 000006
【０１９６】
方法：２本鎖ＤＮＡテンプレートを、ポリヌクレオチド対１０−１０５／１０−１０６、１０−１０７／１０−１０８、１０−１０５／１０−１０９、および１０−１０５／１０−１１０をアニールすることにより調製した。具体的には、沸騰後、混合したポリヌクレオチドを、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ中で、室温にゆっくり冷却させた。ポリ（ｄＡ）テーリング反応を、１×ＴｄＴ緩衝液、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、１ｐｍｏｌの基質ポリヌクレオチド対１０−１０５／１０６、１０５／１０９、１０５／１１０、または１０７／１０８、１０Ｕ  ＴｄＴ酵素、０．５μＬの２．５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、および０または２０ｐｍｏｌのアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１０３を含有する５μｌの反応体積中で、３７℃で６０分間実施し、続いて、ＴｄＴ酵素を不活性化するために、７０℃で１０分間インキュベートした。０．２５ＵのＵＳＥＲ酵素を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。試料を、ホルムアミド充填緩衝液中で沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）にかけ、ＳＹＢＲ金（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１９７】
結果：ＴｄＴ酵素による標準的および減弱されたポリ（ｄＡ）テーリング反応の生成物の電気泳動による分析が、図１７に示される。列１〜４はアテニュエーター分子の存在下のテーリング生成物を示し、列６〜１０はアテニュエーター分子の不在下のテーリング生成物を示し、列５は、２５の塩基対ラダー大きさマーカーを示し、列６は１本鎖ポリヌクレオチド−基質１０−００１の未制御のテーリングを示す。全ての２本鎖テンプレートは、１本鎖テンプレートよりも効率が低いＴｄＴテーリングを呈した。３’突出を有する２本鎖構築物（図１７の列２および８）は、テーリング反応に関して、陥凹末端（図１７の列３および９）または平滑断端（図１７の列１、４、７、および１０）を有する２本鎖構築物より良好なテンプレートであった。ＡＴ豊富平滑断端構築物（図１７の列４よび１０）は、対応するＧＣ豊富構築物（図１７の列１および７）より効率的に尾が付けられた。制御されたテーリングは、３’突出を有する構築物（図１７の列２）に関してより明白であったが、それは完了しなかった。
【０１９８】
結論：平滑断端２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のテーリングは、３’突出を有するｄｓＤＮＡのテーリングよりも非常にゆっくり生じた。ＡＴ豊富平滑断端は、ＧＣ豊富端部より効率的に尾が付けられた。理論に拘束されるものではないが、これは、ＡＴ豊富配列の３’端の「呼吸」の増加のためであり、それが１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のように幾分挙動することを可能にする。陥凹末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、もしある場合、ほとんどテーリングをもたらさない。制御されたテーリングが観察され得、それは３’１本鎖突出を有する２本鎖ＤＮＡ分子に関してより効率的である。
（実施例５）
【０１９９】
アテニュエーター分子の存在下のＴｄＴ酵素による１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドテンプレートの制御されたポリ（ｄＡ）テーリングは配列の偏りを示さない。
【化５】
2018130124.tif 000007
【０２００】
方法：ポリ（ｄＡ）テーリング反応を、１×ＴｄＴ緩衝液、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、４ｐｍｏｌの基質ポリヌクレオチド１０−０１、もしくは１０−１２７、もしくは１０−１２８、もしくは１０−１２９、もしくは１０−１３９（または４つのポリヌクレオチド１０−１２７、１０−１２８、１０−１２９、および１０−１３９のミックス）、ならびに０または２０ｐｍｏｌのアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１０３を含有する５μｌの反応体積中で実施し、次に、全ての基質が１本鎖であることを確実にするために、９５℃で３分間沸騰させた。１０単位のＴｄＴ酵素を添加し、反応ミックスを３７℃で３０分間インキュベートし、続いてＴｄＴ酵素を不活性化するために、７０℃で１０分間インキュベートした。０．２５ＵのＵＳＥＲ酵素を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。試料を、ホルムアミド充填緩衝液中で沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）にかけ、ＳＹＢＲ金（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２０１】
結果：ＴｄＴ酵素による標準的および減弱されたポリ（ｄＡ）テーリング反応の生成物の電気泳動による分析が、図１８に示される。列１、３、５、７、９、および１１は、それぞれ、尾がないテンプレート１０−１００１、混合テンプレート（方法を参照）、ならびにテンプレート１０−１３９、１０−１２７、１０−１２８、および１０−１２９を示し、列２、４、６、８、１０、および１２は、それぞれ、制御された尾状テンプレート１０−１００１、制御された尾状混合テンプレート、ならびに制御された尾状テンプレート１０−１３９、１０−１２７、１０−１２８、および１０−１２９を示す。ランダム化ポリヌクレオチド−基質の全ては、非ランダム化基質１０−００１と同様に尾が付けられた。
【０２０２】
結論：ＴｄＴ酵素は、アテニュエーター分子の存在下で、１本鎖ＤＮＡ基質の制御されたポリ（ｄＡ）テーリング中に配列の偏りを呈さない。
（実施例６）
【０２０３】
アテニュエーター分子の存在下のＴｄＴ酵素による１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドテンプレートの制御されたポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）テーリング
【化６】
2018130124.tif 000008
【０２０４】
方法：ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＧ）、およびポリ（ｄＣ）テーリング反応を、１×ＴｄＴ緩衝液、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＣＴＰのいずれか、４ｐｍｏｌの基質ポリヌクレオチド１０−１８５、およびそれぞれ、０または２０ｐｍｏｌのアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１０３、１０−１３６、１０−１３７、または１０−１３８を含有する５μＬの反応体積中で実施した。１０ＵのＴｄＴ酵素を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、続いてＴｄＴ酵素を不活性化するために、７０℃で１０分間インキュベートした。０．２５ＵのＵＳＥＲ酵素は、１０−１０３を含有する反応物に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。試料を、ホルムアミド充填緩衝液中で沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）にかけ、ＳＹＢＲ金（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２０５】
結果：ＴｄＴ酵素による標準的および減弱されたポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＧ）、およびポリ（ｄＣ）テーリング反応の生成物の電気泳動による分析が、図１９に示される。列１は、尾がない基質ポリヌクレオチド１０−０８５を示し、列２、４、６、および８は、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、およびｄＣヌクレオチドによる基質１０−１０８５の制御されたテーリングの生成物を示し、列３、５、７、および９は、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、およびｄＣヌクレオチドによる基質１０−０８５の未制御のテーリングの生成物を示し、列１１は、２５ｂｐラダーＤＮＡの大きさマーカーである。アテニュエーター分子１０−１３６の存在下のｄＴヌクレオチドを有する制御された減弱されたテーリングは、アテニュエーター分子１０−１０３の存在下のｄＡヌクレオチドとの制御された減弱されたテーリングと識別不可能であった。両反応は、鋭いバンドを生成し、ポリ（ｄＡ）およびポリ（ｄＴ）尾の大きさは、約１２〜１３個の塩基であった（図１９の列２および４）。ｄＧヌクレオチドとの制御された減弱されたテーリングも、鋭いバンドを生成し、ポリ（ｄＧ）尾の平均の大きさは、約１０〜１２個の塩基であり、これはポリ（ｄＧ／ポリ（ｄＣ）２本鎖の高い安定性と一致する。ポリ（ｄＣ）テーリングを制御する試みは、あまり良好ではなく、解釈が困難な結果をもたらした。
【０２０６】
結論：アテニュエーター制御されたポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、およびポリ（ｄＧ）ＴｄＴテーリング反応は、非常に類似して挙動し、１００％のテンプレートの効率的なテーリングをもたらし、非常に短くかつ正確なホモポリマー尾を基質ＤＮＡ分子に付加した。ｄＡおよびｄＴヌクレオチドとのテーリングは、約１２〜１３個の塩基の尾を生成し、一方、ｄＧヌクレオチドとのテーリングは、約１０〜１２個の塩基の尾を生成した。ｄＣヌクレオチドとの制御されたテーリングは、ｄＧ塩基の長い伸長（６より大きい）を含有するアテニュエーターポリヌクレオチドの調製および取り扱いが困難なため、問題であった（この理由のため、ｄＴ塩基はアテニュエーター１０−１３８に含まれた）。
（実施例７）
【０２０７】
アテニュエーター分子の存在下の大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼによる１本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドテンプレートの制御されたポリ（ｒＡ）テーリング
【化７】
2018130124.tif 000009
【０２０８】
方法：反応を、４ｐｍｏｌの基質ポリヌクレオチド１０−１９１および０または２０ｐｍｏｌのアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１０３、ならびに２．５Ｕのポリ（Ａ）ポリメラーゼを含有する５μＬの１×ポリ（Ａ）ポリメラーゼ緩衝液中で実行した。反応は、３０℃（図２０）で５、１０、１５、または３０分間実施し、次に、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを不活性化するために、９５℃に加熱した。次に、０．５ＵのＵＳＥＲ酵素を、アテニュエーター分子を含有する管に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。試料を、ホルムアミド充填緩衝液中で沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）にかけ、ＳＹＢＲ金（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２０９】
結果：ポリ（Ａ）ポリメラーゼ酵素によるＲＮＡ基質ポリヌクレオチド１０−１９１の標準的および減弱されたポリ（ｒＡ）テーリングの生成物の電気泳動による分析は、図２０に示される。列４、５、６、および７、ならびに列９、１０、１１、および１２は、それぞれ、アテニュエーター分子１０−１０３の存在下および不在下で、５、１０、１５、および３０分間ポリ（Ａ）ポリメラーゼとインキュベーションしたテーリング動態を示す。列１、２、および３は、それぞれＵＳＥＲ酵素とインキュベートした後の、ＲＮＡ基質１０−１９１、アテニュエーターポリヌクレオチド１０−１０３、およびアテニュエーターポリヌクレオチドを示す。列８は、低範囲ｓｓＲＮＡマーカーとマイクロＲＮＡマーカーの組み合わせを示す。両場合とも、テーリング反応は、１５分以内に完了した。アテニュエーター分子の不在下で、基質ポリヌクレオチドに付加されたポリ（Ａ）ポリメラーゼは、非常に長く、大きさが不均一なポリ（ｒＡ）尾であった。アテニュエーター分子の存在下では、付加されたポリ（ｒＡ）尾の大きさは、実質的に短く、バンドは非常に狭く、約２０個の塩基の尾を有する基質に対応する（図２０の列９）。長いアテニュエーター分子は、ＵＳＥＲ酵素により分解され、分解生成物が５個の塩基を超えないため、ゲル上では見えなかった（図２０の列２および３）。４０個の塩基の大きさに対応する２量体バンドは、より長いインキュベーション時間で見られた（図２０の列１０、１１、および１２）。ＴｄＴ酵素によって付加された尾（１２〜１３個の塩基）と比較して、大腸菌ポリメラーゼ（Ａ）により導入された制御された減弱された尾（２０ｂ）のより大きい大きさ、および同じアテニュエーター分子１０−１０３の存在下の２量体バンドの出現は、ポリ（ｄＡ）／ポリ（ｄＴ）２本鎖に対するポリ（ｒＡ）／ポリ（ｄＴ）２本鎖の低熱安定性により説明された。
【０２１０】
結論：ＲＮＡテンプレートのポリ（ｒＡ）テーリングの完全な減弱が、長いＤＮＡポリ（ｄＴ）分子を使用することにより達成された。長いアテニュエーター分子の存在下で、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによって付加されたポリ（ｒＡ）尾の長さは、約２０個のｒＡ塩基を構成し、狭い大きさ分布を有し、アテニュエーター分子の不在下で付加された数百個のｒＡ塩基と対照である。ｄＵ塩基を含有するアテニュエーター分子は、ｒＡ尾状ＲＮＡ基質の下流利用を簡潔化するために、ＵＳＥＲ酵素を使用したテーリング反応の完了後分解された。ポリ（Ａ）ポリメラーゼによる減弱されたテーリングは、約２０個の塩基の尾を生成し、これは、ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ分析に効率的に使用することができる。（実施例８）
【０２１１】
ＤＮＡおよびＲＮＡアテニュエーター分子の存在下の酵母（分裂酵母）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる１本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドテンプレートの制御されたポリ（ｒＵ）テーリング
【化８】
2018130124.tif 000010
【０２１２】
方法：反応を、４ピコモル（ｐｍｏｌ）の基質ポリヌクレオチド１０−１９１、ならびに０または２０ｐｍｏｌのＤＮＡアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１３６、および１０−１９２、もしくは高分子量（ＨＭＷ）ＲＮＡアテニュエーターポリ（ｒＡ）（平均の大きさは約２００ｂ）を含有する５uＬの１×ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ緩衝液中で実行した。反応は、３７℃（図２１Ａ）または３０℃（図２２１Ｂ）のいずれかで１０、１５、または３０分間実施した。ＲＮＡアテニュエーターとの反応は、８ｐｍｏｌの基質リボ−ポリヌクレオチド１０−１９１、および４０ｐｍｏｌのリボ−ポリヌクレオチド１１−０４もしくは２μｌの超純水のいずれかを、１×ＮＥＢ２緩衝液と１ｍＭのｒＵＴＰを含有する反応管に添加することにより調製した。各管に、２ＵのＮＥＢポリ（Ｕ）ポリメラーゼを添加し、反応を３０℃（図７）で１５分間インキュベートした。反応を停止させるために、１０ｍｌの２×ホルムアミド充填緩衝液を各管に添加し、沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）にかけ、ＳＹＢＲ金（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２１３】
結果：ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ酵素による標準的および減弱されたポリ（ｒＵ）テーリング反応の生成物の電気泳動による分析が、図２１ａおよび図２１ｂに示される。図２１ａは、比較的短いＤＮＡアテニュエーターポリヌクレオチド１０−１３６（２０ｂ）の存在下で、それぞれ、１０、１５、および３０分のインキュベーション時間のＲＮＡ基質１０−１９１の制御された（列６、７、および８）、および未制御の（列３、４、および５）ポリ（Ｕ）テーリングの時間経過を示し、列２は、元来のＲＮＡ基質１０−１９１であり、列１は、２５ｂｐラダーＤＮＡ大きさマーカーである。図２１ｂは、長い４０塩基ＤＮＡアテニュエーター（図２１ｂの列３）の存在下のＲＮＡ基質１０−１９１（図２１ｂの列２）の制御されたテーリング、および高分子ポリ（ｒＡ）ＲＮＡアテニュエーター（図２１ｂの列４）を示す。列１は、低範囲ｓｓＲＮＡマーカーとマイクロＲＮＡマーカーの組み合わせを示し、列５は、ＲＮＡ基質１０−１９１と高分子量ポリ（ｒＡ）ＲＮＡアテニュエーターの混合物を示す。図２０Ｃは、長い３０ｂＲＮＡアテニュエーターポリヌクレオチド１１−０４９の存在下のＲＮＡ基質１０−１９１（列３）の制御されたテーリングを示す。図２１ａから見られるように、短いＤＮＡポリ（ｄＡ）２０（配列番号２１）アテニュエーターの存在下の減弱されたテーリングは、減弱工程が作動していることを示す反復テーリングパターンをもたらすが、２０塩基ＤＮＡアテニュエーターによる完全な阻害および狭い尾の大きさ分布は達成することができない。ＤＮＡアテニュエーターの長さを４０個の塩基に増加することにより、減弱工程を改善し、広範な単一バンドが得られた（図２１ｂの列３）。ポリ（ｒＵ）およびポリ（ｄＡ）ポリマーが非常に不安定な２本鎖を形成し、一方で、ポリ（ｒＵ）およびポリ（ｒＡ）がはるかに安定した複合体を形成することが知られている。これは、ポリ（Ｕ）ＲＮＡテーリングのアテニュエーターとして高分子量ポリ（ｒＡ）および短いリボ−ポリヌクレオチド（ｒＡ）３０（１１−０４９）の両方を使用することによって確認された。図２１ｂの列４に見ることができるように、長いＲＮＡアテニュエーターの存在下のテーリングは、非常に狭い大きさ分布および尾の大きさが約２０個の塩基のテーリング生成物をもたらした（１９個の塩基の基質＋約２０個の塩基のポリ（Ｕ）尾は、大きさが約４０個の塩基の分子を生成し、４０塩基アテニュエーター１０−１９２の大きさに類似する）。同様の結果が、ポリ（Ｕ）の尾を有する基質リボ−ポリヌクレオチド１０−１９１が約４０個の塩基の生成物として見ることができるアテニュエーターリボ−ポリヌクレオチド１１−０４９（図２１ｃの列３）を使用して得られ、ポリ（Ｕ）尾の大きさが約２０個の塩基であることを示唆する。
【０２１４】
結論：制御された減弱されたポリ（Ｕ）テーリングが、ＤＮＡポリ（ｄＡ）アテニュエーターの存在下で達成されたが、ＲＮＡポリ（ｒＡ）アテニュエーターの存在下でははるかに効率的である。ポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる減弱されたテーリングは、ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ分析に効率的に使用される約２０個の塩基の尾を生成した。
（実施例９）
【０２１５】
ＴｄＴと大腸菌ＤＮＡリガーゼ酵素の組み合わせ作用による同時に起こる制御されたポリ（ｄＡ）テーリングおよび１本鎖ＤＮＡへのアテニュエーター−アダプター分子連結
【化９】
2018130124.tif 000011
【０２１６】
方法：ポリヌクレオチド１０−２１１および１０−２１２を、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ中で、沸騰させ、次に室温にゆっくり冷却させることにより一緒にアニールした。同時に起こるポリ（ｄＡ）テーリングおよびアテニュエーター−アダプター連結反応を、１×ＴｄＴ緩衝液、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、２６ｕＭのＮＡＤ＋、４ｐｍｏｌの基質ポリヌクレオチド、および２０ｐｍｏｌのアテニュエーター−アダプター分子を含有する１０μＬの反応体積中で実施した。１０ＵのＴｄＴ酵素、および０または１０ＵのいずれかのＤＮＡリガーゼ酵素を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。試料を、ホルムアミド充填緩衝液中で沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）にかけ、ＳＹＢＲ金（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２１７】
結果：同時に減弱されたＴｄＴ媒介ポリ（ｄＡ）テーリングおよびアダプター連結反応の生成物の電気泳動による分析が、図２２に示される。列１は、２５ｂｐラダーＤＮＡマーカーを表し、列２は、反応に使用された基質およびアテニュエーター−アダプター分子を表す。列３は、同時に起こるテーリング−連結反応の生成物を示し、列４は、アテニュエーター−アダプター構築物（リガーゼなし）を使用したテーリング反応の生成物を示す。ＴｄＴ酵素および大腸菌リガーゼの存在下で、反応は、２５塩基ＤＮＡラダーの７５と１００塩基バンドの間に位置する鋭いバンドをもたらした。テーリングおよび連結生成物の予測された大きさは、９５個の塩基であり、これは観察された生成物の大きさに非常に近い（図２２の列３、最大バンド）。非反応基質に対応する５０塩基バンドは、列４においてほとんど見ることができず、減弱されたテーリング−連結反応の効率が１００％に近いことを示す。列４（ＴｄＴのみ）および５（ＴｄＴリガーゼ）に表されるデータは、使用された反応時間（１５分）が１２塩基尾を付加し、アダプターを結合させるのに十分であるが、基質を１２〜１３個付加されたｄＡ塩基を有する生成物に変換するのに十分ではないことを示唆する。概略的に、単一管の単一ステップのＤＮＡテーリング−連結過程が図２４ａに示される。
【０２１８】
結論：ポリ（ｄＡ）テーリングおよび後続のアテニュエーター−アダプター分子への連結は、単一のサンプル管で平行して実施されたとき、非常に迅速かつ効率的に起こった。反応は、単一管の単一反応形式で、ランダム１本鎖ＤＮＡ分子の効率的な適合およびタグ付けに使用される。
（実施例１０）
【０２１９】
ＴｄＴとＤＮＡリガーゼ酵素の組み合わせ作用および磁気ビーズに固定化されたアテニュエーター−アダプターの使用により同時に起こる１本鎖ＤＮＡの制御されたポリ（ｄＡ）テーリングおよび固定化
【化１０】
2018130124.tif 000012
【０２２０】
方法：アテニュエーター−アダプター複合体を、実施例９に記載されるように調製した。１００ｕＬのＤｙｎａｂｅａｄｓをビーズ洗浄緩衝液で２回洗浄し、次に２０μＬのビーズ洗浄緩衝液に再懸濁した。ビーズ溶液に、８０ｐｍｏｌの１０−２１１／２１２のアニールした対を添加した。ビーズを、旋回振盪器（Ｎａｔａｔｏｒ）上で室温で約２時間インキュベートし、その後、必要になるまで４℃で保管した。反応を実行する直前に、５μＬのビーズ溶液を新しい管に移動し、ＴｄＴ緩衝液で２回洗浄した。同時に起こるポリ（ｄＡ）テーリングおよびアテニュエーター連結反応を、１×ＴｄＴ緩衝液、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、２６ｕＭのＮＡＤ＋、４ｐｍｏｌの基質ポリヌクレオチド、および２０ｐｍｏｌのビーズ上に固定化されたアテニュエーター−アダプター複合体を含有する１０ｕＬの反応体積中で実施した。１０ＵのＴｄＴ酵素、および０または１０ＵのいずれかのＤＮＡリガーゼ酵素を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ビーズを脱イオン水、次に１０μＬの１２５ｍＭ  ＮａＯＨで２回洗浄し、ビーズから非ビオチン化ｓｓＤＮＡを剥離した。ＮａＯＨにより解放されたＤＮＡを中和し、次に残りの試料を、ホルムアミド充填緩衝液中で沸騰させ、予め成型された１５％のＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）にかけ、ＳＹＢＲ金（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２２１】
結果：同時に起こる減弱されたＴｄＴ媒介ポリ（ｄＡ）テーリングおよび固定化されたアテニュエーター−アダプターの連結の生成物の電気泳動による分析が、図２２の列５に示される。テーリングおよび連結生成物の予測された大きさは、９５個の塩基であり、これは観察された生成物の大きさに非常に近く（図２２の列５、最大バンド）、テーリング−連結反応の生成物は実施例９に記載される（列３）。列３および５の９５塩基対バンドの強度は、減弱されたテーリング−連結−固定化反応の効率が１００％に近かったことを示した。列５のポリヌクレオチド１０−２１２に対応する強いバンドは、過剰に存在する非反応アダプターによるものであった。固定化過程は図２４ｂに示される。
【０２２２】
結論：ポリ（ｄＡ）テーリングおよび後続の固定化されたアテニュエーター−アダプター分子への連結は、単一のサンプル管で平行して実施されたとき、非常に迅速かつ効率的に起こった。反応は、単一管の単一反応形式で、ランダム１本鎖ＤＮＡ分子の効率的な適合、タグ付け、および固定化に使用される。
（実施例１１）
【０２２３】
酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼとＴ４  ＤＮＡリガーゼ酵素の組み合わせ作用による同時に起こる制御されたポリ（ｒＡ）テーリングおよび１本鎖ＲＮＡへのアテニュエーター−アダプター分子連結
【化１１】
2018130124.tif 000013
【０２２４】
方法：反応を、８ｐｍｏｌの基質リボ−オリゴヌクレオチド（１０−１９１）および４０ｐｍｏｌのアテニュエーター／アダプターオリゴ対（１１−０１０／１１−０１１）を、１×ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応緩衝液と１ｍＭのｒＡＴＰを含有する反応管に添加することにより調製した。各管に、３００単位の酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよび２，０００付着端単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。反応を停止させるために、１０μＬの２×ホルムアミド充填緩衝液を各管に添加し、反応物を９５℃で２分間沸騰させた。１５％のＴＢＥ−尿素ゲルを２５ｂｐラダーおよび１０ｕＬの各反応物で充填した。２００ボルトの電流をゲルに３０分間適用して分子を分離し、次にゲルをＳＹＢＲ金で１０分間染色し、その後、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライトボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２２５】
結果：ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素により同時に尾を付けられ、連結された基質の生成物の電気泳動による分析が、図２３に示される。概略的に、単一管の単一ステップのＲＮＡテーリング−連結過程が図２４ｃに示される。
【０２２６】
結論：合成ＲＮＡ基質は、混合された減弱されたポリ（ｒＡ）テーリングならびにポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼにより触媒された連結によりＲＮＡ基質の３’端に連結されたＤＮＡアダプター配列を有することができる。反応は、単一管の単一反応形式で、ランダム１本鎖ＲＮＡ分子の効率的な適合およびタグ付けに使用され得る。
【表１】
2018130124.tif 000014
【表２】
2018130124.tif 000015
【表３】
2018130124.tif 000016
【表４】
2018130124.tif 000017
【表５】
2018130124.tif 000018
【表６】
2018130124.tif 000019
【０２２７】
次の表７は、ＮＧＳ配列Ｘおよび配列Ｙに対応するＮＧＳアダプター配列を提供する（図２５〜２９を参照）。
【表７】
2018130124.tif 000020
（実施例１２）
【０２２８】
ランダム塩基組成物のさらなる３’ドメインを含むアテニュエーター−アダプター分子との制御されたテーリングおよび連結反応
【化１２】
2018130124.tif 000021
【０２２９】
方法：
【０２３０】
制御されたテーリングおよび連結反応を、この順序で、０．２５μＭの基質オリゴヌクレオチド１２−４９２、０．７５μＭのアダプターオリゴヌクレオチド１３−１２８、１．５μＭのアテニュエーター−アダプターオリゴヌクレオチド１３−２８１、または１．５μＭのアテニュエーター−アダプターオリゴヌクレオチド１３−２８０、または１．５μＭのアテニュエーター−アダプターオリゴヌクレオチド１３−２７９、または  １．５μＭのアテニュエーター−アダプターオリゴヌクレオチド１３−２７８、もしくは各０．３７５μＭのこれらの４つの組み合わせ、または各０．７５０μＭまたは各１．１２５μＭ、１Ｘ緑緩衝液、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのｄＡＴＰ、１５Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ  、および０．５Ｕ／μｌの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの最終濃度で、総体積４０μｌに組み合わせた。
【０２３１】
反応物を、２５℃で１０分間、９５℃で２分間インキュベートした。次に、１０μｌの試料を、２×ホルムアミド充填緩衝液と沸騰させ、その後予め成型された１５％のポリアクリルアミドゲルＴＢＥ−尿素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１４９４）にかけ、ＳＹＢＲ（登録商標）金核酸ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２３２】
結果：
【０２３３】
制御されたテーリングおよび連結反応を実施し、変性条件下で、電気泳動により１５％のポリアクリルアミドゲル上で可視化した。ゲル１の列１は、オリゴヌクレオチドのみを含有する。ゲル１の列２、３、および４は、ホモポリマーが付加され（約２〜６塩基対）、アダプター（２３塩基対）が基質（４３塩基対）に連結した生成物を表すバンドを示す（図３４）。ゲル２の列１、２、３、および４は、ホモポリマーが付加され（約２〜６塩基対）、アダプター（２３塩基対）が基質（４３塩基対）に連結された生成物を表すバンドを示す（図３５）。ホモポリマー尾が付加され、標的基質に連結された生成物に対応するバンドが、ランダム塩基アテニュエーター−アダプター１３−２７８、１３−２７９、１３−２８０、１３−２８１、および４つ全ての等モルのランダム塩基アテニュエーター−アダプターの組み合わせの存在下で観察される。
【０２３４】
結論：
【０２３５】
ホモポリマー尾の付加および標的基質への連結は、様々な効率で、ランダム塩基アテニュエーター−アダプター１３−２７８、１３−２７９、１３−２８０、および１３−２８１を用いて達成された。
（実施例１３）
【０２３６】
ジヌクレオチドアテニュエーター−アダプターとの制御されたテーリングおよび連結反応
【化１３】
2018130124.tif 000022
【０２３７】
方法：
【０２３８】
制御されたテーリングおよび連結反応が、この順序で、０．２５μＭの基質オリゴヌクレオチド１３−３２５、０．７５μＭのアダプターオリゴヌクレオチド１３−１２８、１２Ｔもしくは６Ｃのホモポリマー、または複数の６Ｒ（Ｇ／Ａ）もしくは６Ｋ（Ｇ／Ｔ）のランダムに合成されたジヌクレオチドに相当するアテニュエーター部分を有する１．５μＭのアテニュエーター−アダプターオリゴヌクレオチド、１×緑緩衝液０．５ｍＭ、使用されたモノヌクレオチドもしくはジヌクレオチドアテニュエーター−アダプターに相補的である（ゲル標識を参照）１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭの適切なｄＮＴＰモノヌクレオチドもしくはジヌクレオチド混合物、１５Ｕ／μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、および０．５Ｕ／μｌの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの最終濃度で、４０μｌの総体積で組み合わされた。
【０２３９】
反応物を、２５℃で３０分間、続いて９５℃で２分間インキュベートした。次に、１０μｌの試料を、２×ホルムアミド充填緩衝液と沸騰させ、その後予め成型された１５％のポリアクリルアミドゲルＴＢＥ−尿素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１４９４）にかけ、ＳＹＢＲ（登録商標）金核酸ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色し、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒライドボックス（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０２４０】
結果：
【０２４１】
制御されたテーリングおよび連結反応を実施し、変性条件下で、電気泳動により１５％のポリアクリルアミドゲル上で可視化した。列２、３、４、および５は、約７２個の塩基の生成物の大きさに関して、ＴｄＴ酵素（約６個の塩基）によって尾が付けられた４３個の塩基の基質（１２−４９２）への２３個の塩基のアダプター（１３−１２８）の連結に対応する、７５塩基マーカーのちょうど下にある、尾が付けられ、連結された生成物を示す。アダプター（１３−１２８）およびアテニュエーター−アダプターの過剰も観察される。一部の残余生成物も、列２、４、および５の４３塩基で観察される。列１は、基質オリゴヌクレオチド（１２−４９２）、アダプターオリゴヌクレオチド（１３−１２８）、およびアテニュエーター−アダプターオリゴヌクレオチド６Ｋ（１３−２７４）を添加した（ＤＮＡポリヌクレオチドマーカーに対応する（図３６）。
【０２４２】
結論：
【０２４３】
制御されたテーリングおよび連結反応は、対応する相補性の複数のランダムベースのジヌクレオチドアテニュエーター−アダプターを有するジヌクレオチドを使用することにより効率的である。
【表８】
2018130124.tif 000023
【表９】
2018130124.tif 000024
【表１０】
2018130124.tif 000025
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2018130124.tif 000029
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018130124.tif 000040
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2018130124.tif 000046
【図２１ａ】
2018130124.tif 000047
【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
2018130124.tif 000049
【図２２】
2018130124.tif 000050
【図２３】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月30日(2018.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2018130124.tif 000068
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2018130124.tif 000069
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2018130124.tif 000070
【外国語明細書】
2018130124000001.pdf