(57)【要約】【課題】改良されたアミノ脂質および核酸の送達方法の提供。【解決手段】本発明は、細胞に治療剤を送達するための優れた組成物および方法を提供する。特に、これらは、核酸の効率的なカプセル化およびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのカプセル化された核酸の効率的な送達をもたらす新規の脂質および核酸−脂質粒子を含む。本発明の組成物は、非常に強力であり、それによって、相対的に低い用量で特定の標的タンパク質の有効なノックダウンを可能にする。さらに、本発明の組成物および方法は、毒性がより小さく、当技術分野で以前より公知の組成物および方法と比較してより大きい治療指数をもたらす。【選択図】図３
2018119016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造：
【化１Ａ】
2018119016.tif 000063
のうちの１つを有する、アミノ脂質。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ脂質を含む脂質粒子。
【請求項３】
中性脂質、および、粒子凝集を抑制することができるコンジュゲート脂質をさらに含む、請求項２に記載の脂質粒子。
【請求項４】
治療剤をさらに含む、請求項２または３のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項５】
前記治療剤が核酸である、請求項４に記載の脂質粒子。
【請求項６】
前記核酸がプラスミドまたは免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の脂質粒子。
【請求項７】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される、請求項５に記載の脂質粒子。
【請求項８】
前記核酸がｓｉＲＮＡである、請求項７に記載の脂質粒子。
【請求項９】
請求項２から８のいずれか一項に記載の脂質粒子、および、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
細胞によるポリペプチドの発現を調節するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、請求項２から８のいずれか一項に記載の脂質粒子を細胞に供給する工程を含む、方法。
【請求項１１】
細胞によるポリペプチドの発現を調節するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、請求項４に記載の脂質粒子を細胞に供給する工程を含み、前記治療剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、前記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含み、その結果、前記ポリペプチドの発現が低減される、方法。
【請求項１２】
細胞によるポリペプチドの発現を調節するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、請求項４に記載の脂質粒子を細胞に供給する工程を含み、前記治療剤が、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドであり、その結果、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片の発現が増大する、方法。
【請求項１３】
被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法において使用するための、請求項４に記載の脂質粒子、および、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む、医薬組成物であって、前記方法は、前記医薬組成物を前記被験体に提供する工程を含み、前記治療剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、前記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
被験体におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法において使用するための、請求項４に記載の脂質粒子、および、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む、医薬組成物であって、前記治療剤が、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドである、医薬組成物。
【請求項１５】
被験体における免疫応答を誘導する方法において使用するための、請求項４に記載の脂質粒子、および、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む、医薬組成物であって、前記治療剤が免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、医薬組成物。
【請求項１６】
前記医薬組成物が、ワクチンまたは抗原と併用して前記患者に提供される、請求項１５に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１７】
請求項４から６のいずれか一項に記載の脂質粒子、および、疾患または病原体に関連する抗原を含む、ワクチン。
【請求項１８】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌性抗原、または寄生生物抗原である、請求項１７に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法の、２００８年１０月９日出願の米国仮特許出願第６１／１０４，２１９号；２００８年１０月９日出願の米国仮特許出願第６１／１０４，２１２号；および２００９年６月２６日出願の米国仮特許出願第６１／２２０，６６６号における利益を主張し、これら（３つ）の仮出願は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【０００２】
配列表に関する陳述
本願に関連する配列表は、紙での写しの代わりにテキスト形式で提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。この配列表を含んでいるテキストファイルの名称は、４８０２０８＿４６１ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは９ＫＢであり、２００９年１０月９日に作られたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
本発明は、脂質粒子を使用する治療剤送達の分野に関する。特に、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療用途に適した核酸、ならびに核酸−脂質粒子組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ送達に有利である、カチオン性脂質ならびにこれらの脂質を含む脂質粒子を提供する。さらに、本発明は、これらの組成物を製造する方法、ならびに例えば、様々な病状を治療するために、これらの組成物を使用して細胞内に核酸を導入する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
治療用核酸として、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、および免疫刺激核酸が挙げられる。これらの核酸は、様々な機構を介して作用する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの場合では、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて、特定のタンパク質の細胞内濃度を下方制御することができる。細胞の細胞質にｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを導入した後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物は、ＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体から置き換えられて、結合したｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの配列と相補性の配列を有するｍＲＮＡを認識し、結合することができるＲＩＳＣ内の鋳型を提供する。相補性ｍＲＮＡを結合させると、ＲＩＳＣ複合体は、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を解放する。ＲＮＡｉは、タンパク質合成をコードする対応するｍＲＮＡの特異的な破壊を標的にすることによって、特定のタンパク質を下方制御することができる。
【０００５】
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ構築物は、標的タンパク質に対して向けられた任意のヌクレオチド配列を用いて合成することができるので、ＲＮＡｉの治療用途は極度に広い。これまで、ｓｉＲＮＡ構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両モデルにおいて、標的タンパク質を特異的に下方制御する能力を示している。さらに、ｓｉＲＮＡ構築物は、現在、臨床試験において評価されている。
【０００６】
しかし、現在、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ構築物が直面している２つの問題は、第１に、血漿中のヌクレアーゼ消化に対するその感受性であり、第２に、これらが遊離ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして全身投与されたとき、ＲＩＳＣに結合することができる細胞内コンパートメントへのアクセスを得る能力が限られていることである。これらの二本鎖構築物は、分子内の化学修飾されたヌクレオチドリンカー、例えば、ホスホチオエート基の組込みによって安定化することができる。しかし、これらの化学修飾は、ヌクレアーゼ消化からの限られた保護のみをもたらし、構築物の活性を減少させる場合がある。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの細胞内送達は、担体システム、例えば、ポリマー、カチオン性リポソームなどの使用によって、または構築物の化学修飾、例えば、コレステロール分子の共有結合によって促進することができる［参考文献］。しかし、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子の効力を増大させ、化学修飾の必要性を低減または排除するために、送達システムの改善が必要とされる。
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムも、タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害することができる。アンチセンス構築物の場合では、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列と相補性の配列を有し、ワトソン−クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防止し、かつ／またはｍＲＮＡ転写物のＲＮａｓｅ  Ｈ分解を引き起こす。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用の特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方制御）について極めて大きい可能性を有する。これまで、これらの化合物は、炎症疾患、癌、およびＨＩＶのモデルを含めたいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて有望性を示している（Ａｇｒａｗａｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １４巻：３７６〜３８７頁（１９９６年）において概説されている）。アンチセンスは、染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズさせることによって、細胞活性に影響することもできる。いくつかのアンチセンス薬物の進展したヒト臨床評価は、現在、進行中である。これらの薬物についての標的は、ｂｃｌ２およびアポリポタンパクＢ遺伝子、ならびにｍＲＮＡ生成物が含まれる。
【０００８】
免疫刺激核酸には、デオキシリボ核酸およびリボ核酸が含まれる。デオキシリボ核酸の場合では、ある特定の配列またはモチーフは、哺乳動物において免疫刺激を誘発する（ｉｌｌｉｃｉｔ）ことが示されている。これらの配列またはモチーフには、ＣｐＧモチーフ、ピリミジンに富む配列およびパリンドローム（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）配列が含まれる。デオキシリボ核酸中のＣｐＧモチーフは、エンドソーム受容体、トール様受容体９（ＴＬＲ−９）によって特異的に認識され、次いでこれは、先天免疫刺激経路および後天免疫刺激経路の両方を引き起こすと考えられている。ある特定の免疫刺激リボ核酸配列も報告されている。これらのＲＮＡ配列は、トール様受容体６および７（ＴＬＲ−６およびＴＬＲ−７）に結合することによって、免疫活性化を引き起こすと考えられている。さらに、二本鎖ＲＮＡも免疫刺激性であることが報告されており、ＴＬＲ−３への結合を介して活性化すると考えられている。
【０００９】
治療用核酸の使用に伴う１つの周知の問題は、ホスホジエステルヌクレオチド間連結の安定性、およびこのリンカーのヌクレアーゼに対する感受性に関係する。血清中のエクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの存在は、ホスホジエステルリンカーを有する核酸を急速に消化し、したがって、治療用核酸は、血清の存在下または細胞内で非常に短い半減期を有する場合がある。（Ｚｅｌｐｈａｔｉ，  Ｏ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ３巻：３２３〜３３８頁（１９９３年）；およびＴｈｉｅｒｒｙ，  Ａ．Ｒ．ら、１４７〜１６１頁、Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  ＲＰおよびＩｚａｎｔ，  ＪＧ編；Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２年））。現在開発されている治療用核酸は、これらおよび他の公知の問題のために、天然核酸において見出される基本的なホスホジエステル化学反応を使用しない。
【００１０】
この問題は、血清または細胞内分解を低減する化学修飾によって部分的に克服されている。改変は、ヌクレオチド間ホスホジエステル架橋（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、またはホスホラミデート連結を使用して）、ヌクレオチド塩基（例えば、５−プロピニル−ピリミジン）、または糖（例えば、２’−改変糖）において試験されている（Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｘ巻、６４〜８１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９７年））。２’−５’糖連結を使用して安定性を改善するために他のことも試みられている（例えば、米国特許第５，５３２，１３０号参照）。他の変更も試みられている。しかし、これらの解決策のいずれも、完全に十分であると証明されておらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遊離治療用核酸は、依然として限られた効力のみを有する。
【００１１】
さらに、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関して上記したように、細胞膜を横断する、治療用核酸の限られた能力（Ｖｌａｓｓｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１９７巻：９５〜１０８２頁（１９９４年）参照）に、および全身性毒性、例えば、補体媒介性アナフィラキシー、凝固特性の変化、および血球減少などに関連する問題において、問題が残っている（Ｇａｌｂｒａｉｔｈら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  ４巻：２０１〜２０６頁（１９９４年））。
【００１２】
効力の改善を試みるために、研究者らは、化学修飾された、または無改変の治療用核酸を送達するための脂質をベースとした担体システムも使用した。Ｚｅｌｐｈａｔｉ，  ＯおよびＳｚｏｋａ，  Ｆ．  Ｃ、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒ．  Ｒｅｌ．  ４１巻：９９〜１１９頁（１９９６年）において、本著者らは、アニオン性（従来の）リポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポゾーム、融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソーム、およびカチオン性脂質／アンチセンス凝集体の使用に言及している。同様に、ｓｉＲＮＡが、カチオン性リポソームで全身投与され、これらの核酸−脂質粒子は、非ヒト霊長類を含めた哺乳動物において、標的タンパク質の下方制御の改善をもたらすことが報告されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４１巻：１１１〜１１４頁（２００６年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４１巻：１１１〜１１４頁（２００６年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
この進展にもかかわらず、一般的な治療用途に適した核酸−脂質粒子および組成物の改善の必要性が当技術分野において残っている。これらの組成物は、高効率で核酸をカプセル化し、高い薬物：脂質比を有し、血清中での分解およびクリアランスからカプセル化された核酸を保護し、全身送達に適しており、カプセル化された核酸の細胞内送達をもたらすことが好ましい。さらに、これらの核酸−脂質粒子は、耐容性がよく、適切な治療指数をもたらすべきであり、その結果、有効用量の核酸での患者の治療が、患者への著しい毒性および／またはリスクを伴うべきでない。本発明は、疾患の治療用を含めた、そのような組成物、この組成物を製造する方法、および核酸を細胞内に導入するためのこの組成物の使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、新規なアミノ脂質、ならびにそれを含む脂質粒子を提供する。この脂質粒子は、活性薬剤をさらに含んでよく、本発明の関連方法に従って使用して、活性薬剤を細胞に送達することができる。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、次の構造（Ｉ）：
【００１７】
【化１】
2018119016.tif 000003
を有するアミノ脂質またはその塩を包含する。式中、
Ｒ１およびＲ２は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルケニル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキニル、または任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アシルであり、
Ｒ３およびＲ４は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニル、または任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキニルであるか、あるいはＲ３およびＲ４は、一緒になって、４〜６個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される１または２個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
Ｒ５は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ６アルキルのいずれかであって第四級アミン（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｉｎｅ）をもたらし、
ｍ、ｎおよびｐは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０にならず、
ｑは、２、３または４であり、
ＹおよびＺは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００１８】
一実施形態では、アミノ脂質は、ｑが２である構造（Ｉ）を有するアミノ脂質である。
【００１９】
特定の実施形態では、アミノ脂質は、次の構造（ＩＩ）：
【００２０】
【化２】
2018119016.tif 000004
またはその塩を有する。式中、
Ｒ１およびＲ２は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルケニル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキニル、または任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アシルであり、
Ｒ３およびＲ４は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニル、または任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキニルであるか、あるいはＲ３およびＲ４は、一緒になって、４〜６個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される１または２個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
Ｒ５は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ６アルキルのいずれかであって第四級アミンをもたらし、ｍ、ｎおよびｐは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、
０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０にならず、
ＹおよびＺは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００２１】
特定の実施形態では、アミノ脂質は、次の構造（ＩＩＩ）を有する。
【００２２】
【化３】
2018119016.tif 000005
式中、
ｎは、２、３または４である。
【００２３】
特定の一実施形態では、アミノ脂質は、次の構造を有する。
【００２４】
【化４】
2018119016.tif 000006
特定の一実施形態では、アミノ脂質は、次の構造を有する。
【００２５】
【化５】
2018119016.tif 000007
特定の一実施形態では、アミノ脂質は、次の構造を有する。
【００２６】
【化６】
2018119016.tif 000008
別の実施形態では、本発明は、次の構造を有するアミノ脂質を提供する。
【００２７】
【化７】
2018119016.tif 000009
関連する別の実施形態では、本発明は、上記本発明のアミノ脂質の１種または複数種を含む脂質粒子を包含する。特定の実施形態では、上記粒子は、中性脂質、および粒子の凝集を低減することのできる脂質をさらに含む。特定の一実施形態では、上記脂質粒子は、本質的に、（ｉ）ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質、（ｉｉｉ）コレステロール、ならびに（ｉｖ）ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡからなり、モル比は、約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡである。特定の一実施形態では、上記脂質粒子は、本質的に、（ｉ）ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質、（ｉｉｉ）コレステロール、ならびに（ｉｖ）ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡからなり、モル比は、約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡである。
【００２８】
追加の関連実施形態では、本発明は、治療剤をさらに含む本発明の脂質粒子を含む。一実施形態では、上記治療剤は核酸である。様々な実施形態では、上記核酸はプラスミド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボザイムである。
【００２９】
さらに別の関連実施形態では、本発明は、本発明の脂質粒子、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物を含む。
【００３０】
本発明は、他の関連実施形態では、細胞によってポリペプチドの発現を調節する方法であって、本発明の脂質粒子または医薬組成物を細胞に提供する工程を含む方法をさらに含む。特定の実施形態では、上記脂質粒子（ｐａｔｉｃｌｅ）は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される治療剤を含み、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその相補体を含み、その結果、上記ポリペプチドの発現が低減される。別の実施形態では、上記核酸は、上記ポリペプチドまたはその機能性改変体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）もしくは断片をコードするプラスミドであり、その結果上記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片の発現が増大する。
【００３１】
なおさらなる関連実施形態では、本発明は、被験体において、ポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の脂質粒子または医薬組成物を上記被験体に提供する工程を含み、上記治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、上記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む方法を含む。
【００３２】
別の関連実施形態では、本発明は、被験体において、ポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の上記医薬組成物を上記被験体に提供する工程を含み、上記治療剤は、上記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドである方法を含む。
【００３３】
さらなる実施形態では、本発明は、被験体において免疫応答を誘導する方法であって、本発明の上記医薬組成物を上記被験体に提供する工程を含み、上記治療剤は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドである方法を含む。特定の実施形態では、上記医薬組成物は、ワクチンまたは抗原と併用して上記患者に提供される。
【００３４】
関連実施形態では、本発明は、本発明の上記脂質粒子、および疾患または病原体に関連する抗原を含むワクチンを含む。一実施形態では、上記脂質粒子は、免疫賦活性の核酸またはオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、上記抗原は腫瘍抗原である。別の実施形態では、上記抗原は、ウイルス抗原、細菌性抗原、または寄生生物抗原である。
【００３５】
本発明は、本発明の上記脂質粒子および医薬組成物を調製する方法、ならびにこれらの脂質粒子および医薬組成物の調製に有用なキットをさらに含む。
【００３６】
粒子の実施形態では、本発明の任意の組成物または方法は、本明細書に記載されるように、カチオン性脂質として、本発明の他のカチオン性脂質のいずれも含むことができる。特定の実施形態では、上記カチオン性脂質はＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
次の構造（ＩＩ）：
【化４１】
2018119016.tif 000010
［式中、
Ｒ１およびＲ２は、同じか異なるものかのいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルケニル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキニル、または任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アシルであり、
Ｒ３およびＲ４は、同じか異なるものかのいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニル、または任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキニルであるか、あるいはＲ３およびＲ４は、一緒になって、４〜６個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される１または２個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
Ｒ５は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ６アルキルであって第四級アミンをもたらすかのいずれかであり、
ｍ、ｎおよびｐは、同じか異なるものかのいずれかであり、それぞれ独立に０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０にならず、
ＹおよびＺは、同じか異なるものかのいずれかであり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである］を有するアミノ脂質、またはその塩。
（項目２）
構造：
【化４２】
2018119016.tif 000011
を有する、項目１に記載のアミノ脂質。
（項目３）
次の構造：
【化４３】
2018119016.tif 000012
のうちの１つを有する、アミノ脂質。
（項目４）
項目１から３のいずれか一項に記載のアミノ脂質を含む脂質粒子。
（項目５）
中性脂質および粒子凝集を低減することができる脂質をさらに含む、項目４に記載の脂質粒子。
（項目６）
（ｉ）ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ；
（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭから選択される中性脂質；
（ｉｉｉ）コレステロール；および
（ｉｖ）ＰＥＧ−脂質を、約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ脂質のモル比で含む、項目５に記載の脂質粒子。
（項目７）
治療剤をさらに含む、項目４から６のいずれか一項に記載の脂質粒子。
（項目８）
前記治療剤が核酸である、項目７に記載の脂質粒子。
（項目９）
前記核酸がプラスミドである、項目８に記載の脂質粒子。
（項目１０）
前記核酸が免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、項目８に記載の脂質粒子。
（項目１１）
前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される、項目８に記載の脂質粒子。
（項目１２）
前記核酸がｓｉＲＮＡである、項目１１に記載の脂質粒子。
（項目１３）
項目７から１２のいずれか一項に記載の脂質粒子、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物。
（項目１４）
細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法であって、項目７から１２のいずれか一項に記載の脂質粒子を細胞に供給する工程を含む方法。
（項目１５）
前記治療剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、前記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含み、その結果、前記ポリペプチドの発現が低減される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記治療剤が、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドであり、その結果、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片の発現が増大する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、項目１３に記載の医薬組成物を前記被験体に提供する工程を含み、前記治療剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、前記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む、方法。
（項目１８）
被験体におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、項目１３に記載の医薬組成物を前記被験体に提供する工程を含み、前記治療剤が、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドである、方法。
（項目１９）
被験体における免疫応答を誘導する方法であって、項目１３に記載の医薬組成物を前記被験体に提供する工程を含み、前記治療剤が免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、方法。
（項目２０）
前記医薬組成物が、ワクチンまたは抗原と併用して前記患者に提供される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
項目１０に記載の脂質粒子、および疾患または病原体に関連する抗原を含むワクチン。
（項目２２）
前記抗原が腫瘍抗原である、項目２１に記載のワクチン。
（項目２３）
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌性抗原、または寄生生物抗原である、項目２１に記載のワクチン。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、カチオン性脂質の膜破壊効果に関する作用の提唱される機序の略図および頭部基（ｈｅａｄｇｒｏｕｐ）、リンカーおよび炭化水素鎖ドメインに分けられたＤＬｉｎＤＭＡの構造的略図である。単離において、カチオン性脂質およびエンドソーム膜のアニオン性脂質、例えば、ホスファチジルセリンは、円筒状分子形状をとり、二重層立体配置（ｂｉｌａｙｅｒ  ｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎ）中でのパッキングに適合している。しかし、カチオン性脂質およびアニオン性脂質が一緒に混合された場合、それらは結合し、結合した頭部基の断面積が、単離された個別の頭部基面積の合計の断面積より小さいイオン対を形成する。したがって、このイオン対は、「コーン型」の分子形状をとり、非二重層の相、例えば、例示のような六方晶の（ｈｅｘａｇｏｎａｌ）ＨＩＩ相の転換された形状を促進する。転換相（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｐｈａｓｅ）は、二重層構造を支持せず、膜融合および膜破壊に関与する（Ｈａｆｅｚ，  Ｉ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８巻、１１８８〜１１９６頁（２００１年）およびＣｕｌｌｉｓ，  Ｐ．  Ｒ．ら、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ、４０巻、１２７〜１４４頁（１９８６年））。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、様々なカチオン性脂質を含む、核酸−脂質粒子のｉｎ  ｖｉｖｏのサイレンシング活性を表すグラフである。図１Ａは、マウスＦＶＩＩモデルにおける、ＤＬｉｎＤＡＰ（▼）、ＤＬｉｎＤＭＡ（▲）、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ（■）およびＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ（●）製剤のサイレンシング活性を表す。すべての核酸−脂質粒子は、プリフォームドベシクル（ＰＦＶ）法を使用して調製し、イオン化カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質（４０／１０／４０／１０ｍｏｌ／ｍｏｌ）で構成され、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ対総脂質の比は約０．０５（ｗｔ／ｗｔ）であった。データ点は、ＰＢＳ対照動物のパーセントとして表し、群平均（ｎ＝５）±ｓ．ｄ．で表し、全製剤を同じ研究内で比較した。図２Ｂは、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの上記活性についての頭部基の伸長の影響を実証する。ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ（■）は、ＤＭＡ頭部基とケタール環リンカーとの間に付加された、追加のメチレン基を有し、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ（●）、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ（▲）およびＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ（▼）を生み出した。各脂質のＰＦＶ製剤の活性を、上記マウスＦＶＩＩモデルにおいて評価した。データ点は、ＰＢＳ対照動物のパーセントとして表し、群平均（ｎ＝４）±ｓ．ｄ．で表す。
【図３】図３は、カプセル化ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを含む表示の核酸−脂質粒子製剤を様々な投与量でマウスに投与した後の残留ＦＶＩＩ量を表すグラフである。
【図４】図４は、カプセル化ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを含む表示の核酸−脂質粒子製剤を様々な投与量でラットに投与した後の残留ＦＶＩＩ量を表すグラフである。
【図５】図５は、カプセル化ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを含む２種の核酸−脂質粒子製剤（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）をマウスまたはラットに投与した後の残留ＦＶＩＩ量を比較するグラフである。
【図６】図６は、カプセル化ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを含む３種の異なる核酸−脂質粒子製剤（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）を様々な濃度でマウスに投与した後の残留ＦＶＩＩ量を比較するグラフである。
【図７】図７は、カプセル化ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを含む表示の核酸−脂質粒子製剤を様々な投与量で動物に投与した後の残留ＦＶＩＩ量を表すグラフである。Ｃ２は、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡを示し、Ｃ３はＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡを示し、Ｃ４はＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡを示す。
【図８】図８は、異なる表示のカチオン性脂質：ＤＬｉｎＤＡＰ（●）、ＤＬｉｎＤＭＡ（▲）、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ（■）またはＤＬＩＮ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ（◆）を含む核酸−脂質粒子製剤を様々な投与量で投与した後の残留ＦＶＩＩ量を示すグラフである。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、ＫＣ２−ＳＮＡＬＰ製剤の有効性を例示する図である。図９Ａは、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ  ＰＦＶ製剤に対するＫＣ２−ＳＮＡＬＰ製剤の、マウスにおける効力の改善を示すグラフである。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰ製剤（○）のｉｎ  ｖｉｖｏの効力を、非最適化ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ  ＰＦＶ製剤（●）のｉｎ  ｖｉｖｏの効力を、マウスＦＶＩＩモデルにおいて比較した。データ点は、ＰＢＳ対照動物に対するパーセントとして表し、群平均（ｎ＝５）±ｓ．ｄ．で表す。図９Ｂは、非ヒト霊長類におけるＫＣ２−ＳＮＡＬＰ製剤の効力を表す図である。０．０３、０．１、０．３または１ｍｇ／ｋｇいずれかのｓｉＴＴＲまたはＫＣ２−ＳＮＡＬＰ中で製剤化した１ｍｇ／ｋｇのｓｉＡｐｏＢまたはＰＢＳを、カニクイザル（ｎ＝３／群）に、橈側皮静脈を介して１５分の静脈内注入（５ｍＬ／ｋｇ）で与えた。動物を、投与後４８時間で犠牲にした。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルと比べたＴＴＲ  ｍＲＮＡレベルを、肝臓試料において決定した。データ点は、群平均±ｓ．ｄ．を表す。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、治療剤をｉｎ  ｖｉｖｏで送達するために脂質粒子中で使用される場合に、優れた結果をもたらす新規カチオン性脂質の同定に部分的に基づく。特に、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸の活性の増大および組成物の著しい耐容性をもたらす、本発明によるカチオン性脂質を含む核酸−脂質粒子組成物（製剤またはリポソーム製剤とも呼ばれる）を提供し、これは、以前に記載された核酸−脂質粒子組成物と比較した場合、治療指数の著しい増大と相関することが予期される。
【００３９】
添付の実施例において記載されるように、合理的な設計手法が、例えば、ＲＮＡｉ治療剤を含めた核酸を送達するための次世代脂質粒子システムにおいて使用するための新規脂質の発見に使用された。この手法を使用して、イオン化カチオン性脂質についての重要な構造−活性考慮事項が記述され、ＤＬｉｎＤＭＡ構造に基づく複数の脂質が設計され、特徴付けられた。ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡと呼ばれるカチオン性脂質を含む核酸−脂質粒子は、げっ歯類および非ヒト霊長類の両方において耐容性がよいことが示され、げっ歯類において、０．０１ｍｇ／ｋｇという低いｓｉＲＮＡ用量でのｉｎ  ｖｉｖｏ活性、ならびに非ヒト霊長類において治療上重要な遺伝子のサイレンシング（ＴＴＲ）を示した。特に、この研究において実現されたＴＴＲサイレンシング（ＥＤ５０  約０．３ｍｇ／ｋｇ）は、非ヒト霊長類におけるＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングの以前の報告と比べて、活性の著しい改善を示す。この研究において観察された効力は、これまで非ヒト霊長類においてＲＮＡｉ治療剤について観察された最高レベルの効力を代表すると考えられる。
【００４０】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子を送達するための改善された組成物を特に提供する。これらの組成物は、標的タンパク質のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルを下方制御することにおいて有効であることが本明細書で示される。本発明の脂質粒子および組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、結合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、またはカプセル化された治療剤の細胞への送達を含めた様々な目的のために使用することができる。したがって、本発明は、適当な治療剤に結合した本発明の脂質粒子に被験体を接触させることによって、疾患または障害の治療を必要とする上記被験体における、疾患または障害を治療する方法を提供する。
【００４１】
本明細書に記載されるように、本発明の脂質粒子は、例えば、ｓｉＲＮＡ分子およびプラスミドを含めた核酸の送達に特に有用である。したがって、本発明の脂質粒子および組成物は、標的遺伝子発現を低減する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、または所望のタンパク質の発現を増大させるのに使用することができる核酸（例えば、所望のタンパク質をコードするプラスミド）に結合する本発明の脂質粒子と細胞を接触させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、標的遺伝子およびタンパク質の発現を調節するのに使用することができる。
【００４２】
本発明のカチオン性脂質、ならびに脂質粒子および脂質粒子を含む組成物、ならびに治療剤を送達し、遺伝子およびタンパク質発現を調節するためのその使用の様々な例示的な実施形態を、以下にさらに詳細に記載する。
【００４３】
Ａ．アミノ脂質
本発明は、治療薬を細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ送達するために本発明の脂質粒子において有利に使用される、以下の構造を有するアミノ脂質を含めた新規なアミノ脂質を提供する。
【００４４】
本発明の一実施形態では、上記アミノ脂質は、次の構造（Ｉ）を有する。
【００４５】
【化８】
2018119016.tif 000013
式中、
Ｒ１およびＲ２は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルケニル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキニル、または任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アシルであり、Ｒ３およびＲ４は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニル、または任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキニルであるか、あるいはＲ３およびＲ４は、一緒になって、４〜６個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される１または２個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
Ｒ５は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ６アルキルのいずれかであって第四級アミン（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｉｎｅ）をもたらし、
ｍ、ｎおよびｐは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０にならず、
ｑは、２、３または４であり、そして
ＹおよびＺは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００４６】
特定の一実施形態では、ｑは２である。
【００４７】
「アルキル」とは、１〜２４個の炭素原子を含んでいる、直鎖または分枝の、非環式または環式の飽和脂肪族炭化水素を意味する。典型的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられ、飽和分枝アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。典型的な飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
【００４８】
「アルケニル」とは、近接する炭素原子間の二重結合を少なくとも１個含んでいる、上で定義したようなアルキルを意味する。アルケニルは、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓの両方の異性体を包含する。典型的な直鎖および分枝アルケニルとして、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられる。
【００４９】
「アルキニル」とは、近接する炭素間の三重結合を少なくとも１個さらに含んでいる、上で定義したような任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。典型的な直鎖および分枝アルキニルとして、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどが挙げられる。
【００５０】
「アシル」とは、結合点（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）にある炭素が、以下で定義するようなオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルは、アシル基である。
【００５１】
「ヘテロ環」とは、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、また窒素、酸素、および硫黄から独立に選択される１または２個のヘテロ原子を含んでいる、５〜７員単環式のヘテロ環式の環または上記ヘテロ環のいずれかがベンゼン環に縮合している二環式の環を含めた７〜１０員二環式のヘテロ環式の環を意味し、ここで、上記窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意選択で酸化されていてもよく、上記窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されていてもよい。上記ヘテロ環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合していてよい。ヘテロ環は、以下で定義するようなヘテロアリールを包含する。ヘテロ環として、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
【００５２】
用語「任意選択で置換されているアルキル」、「任意選択で置換されているアルケニル」、「任意選択で置換されているアルキニル」、「任意選択で置換されているアシル」、および「任意選択で置換されているヘテロ環」とは、置換されたとき、少なくとも１個の水素原子が置換基で置き換えられていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合では、２個の水素原子が置き換えられている。この点について、置換基としては、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、ｎは、０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じか異なるものであり、独立に、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、前記アルキルおよびヘテロ環置換基は、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、ヘテロ環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つまたは複数でさらに置換されていてもよい。
【００５３】
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
【００５４】
特定の実施形態では、上記アミノ脂質は、次の構造（ＩＩ）：
【００５５】
【化９】
2018119016.tif 000014
またはその塩を有する。式中、
Ｒ１およびＲ２は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルケニル、任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アルキニル、または任意選択で置換されているＣ１２〜Ｃ２４アシルであり、
Ｒ３およびＲ４は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニル、または任意選択で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキニルであるか、あるいはＲ３およびＲ４は、一緒になって、４〜６個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される１または２個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
Ｒ５は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ６アルキルのいずれかであって第四級アミンをもたらし、
ｍ、ｎおよびｐは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０にならず、
ＹおよびＺは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００５６】
特定の実施形態では、上記アミノ脂質は、次の構造（ＩＩＩ）を有する。
【００５７】
【化１０】
2018119016.tif 000015
式中、
ｎは、２、３または４である。
【００５８】
特定の一実施形態では、ｎは２である。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明のアミノ脂質は、次の構造のうちの１つを有する。
【００６０】
【化１１】
2018119016.tif 000016
特定の実施形態では、本発明のアミノ脂質は、次の構造のうちの１つを有する。
【００６１】
【化１２】
2018119016.tif 000017
【００６２】
【化１３】
2018119016.tif 000018
【００６３】
【化１４】
2018119016.tif 000019
一部の実施形態では、本発明の方法に保護基の使用が必要となる場合がある。保護基の方法論は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｇｒｅｅｎ，  Ｔ．Ｗ．ら、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ、１９９９年を参照されたい）。簡潔に述べると、本発明の状況の範囲内の保護基は、官能基の望ましくない反応性を低減または除去する任意の基である。保護基を官能基に付加して、特定の反応の間にその反応性を遮断し、次いで除去して、もとの官能基を表わす（ｒｅｖｅａｌ）ことができる。一部の実施形態では、「アルコール保護基」を使用する。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低減または除去する任意の基である。保護基は、当技術分野で周知の技術を使用して付加および除去することができる。
【００６４】
本発明の化合物は、本実施例でより詳細に記載する方法を含む、公知の有機合成技術によって調製することができる。一般に、上記構造（Ｉ）の化合物は、以下の反応スキーム１または２によって作製することができ、反応スキームにおいて、すべての置換基は、別段表記しない限り上で規定した通りである。
【００６５】
ｍが１であり、ｐが０である構造（Ｉ）の化合物は、反応スキーム１に従って調製することができる。ケトン１およびグリニャール試薬２（Ｐは、トリチルなどのアルコール保護基である）は、購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製することができる。１と２の反応によって、アルコール３が得られる。例えば緩酸（ｍｉｌｄ  ａｃｉｄ）での処理によって３を脱保護した後、適切な臭素化試薬、例えば三臭化リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｔｒｉｂｒｏｍｉｄｅ）を用いて臭素化すると、それぞれ４および５が得られる。臭化物５を６で処理すると、ヘテロ環式化合物７が得られる。次いで、７をアミン８で処理すると、ｍが１であり、Ｒ５が存在しない構造（Ｉ）の化合物（９）が得られる。９を塩化物１０でさらに処理すると、ｍが１であり、Ｒ５が存在する構造（Ｉ）の化合物が得られる。
【００６６】
１．反応スキーム１
【００６７】
【化１５】
2018119016.tif 000020
ｍおよびｐが０である構造（Ｉ）の化合物は、反応スキーム２に従って調製することができる。ケトン１および臭化物６は、購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製することができる。１と６の反応によって、ヘテロ環１２が得られる。１２をアミン８で処理すると、ｍが０であり、Ｒ５が存在しない構造（Ｉ）の化合物（１３）が得られる。１３を１０でさらに処理すると、ｗが０であり、Ｒ５が存在する構造（Ｉ）の化合物が生成される。
【００６８】
２．反応スキーム２
【００６９】
【化１６】
2018119016.tif 000021
ｍおよびｐが１であり、ｎが０である場合の特定の実施形態では、本発明の化合物は、反応スキーム３に従って調製することができる。化合物１２および１３は、購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製することができる。１２と１３の反応によって、Ｒ５が存在しない構造（Ｉ）の化合物（１４）が得られる。Ｒ５が存在する他の実施形態では、１３を１０で処理して、構造１５の化合物を得ることができる。
【００７０】
３．反応スキーム３
【００７１】
【化１７】
2018119016.tif 000022
ｍまたはｐのどちらかが１であり、ｎが０である他の特定の実施形態では、本発明の化合物は、反応スキーム４に従って調製することができる。化合物１６は、購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製することができ、１３と反応させて、Ｒ５が存在しない構造（Ｉ）の化合物（１７）を得ることができる。Ｒ５が存在する、構造（Ｉ）の他の実施形態は、１７を１０で処理して、構造１８の化合物を得ることにより調製できる。
【００７２】
４．反応スキーム４
【００７３】
【化１８】
2018119016.tif 000023
ｎが１であり、ｍおよびｐが０である構造（Ｉ）の特定の詳細な実施形態では、本発明の化合物は、反応スキーム５に従って調製することができる。化合物１９は、購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製することができる。１９をホルムアルデヒドと反応させた後、任意選択のアルコール保護基（Ｐ）を除去すると、アルコール２０が得られる。２０を臭素化した後、アミン８で処理すると２２が得られる。次いで、化合物２２をｎ−ブチルリチウムおよびＲ１Ｉで処理した後、ｎ−ブチルリチウムおよびＲ２Ｉでさらに処理すると、Ｒ５が存在しない構造（Ｉ）の化合物（２３）を得ることができる。２３を１０でさらに処理すると、Ｒ５が存在する構造（Ｉ）の化合物（２４）が得られる。
【００７４】
５．反応スキーム５
【００７５】
【化１９】
2018119016.tif 000024
特定の実施形態では、本発明のアミノ脂質は、カチオン性脂質である。本明細書で使用する場合、「アミノ脂質」という用語は、生理的ｐＨでプロトン化されて、カチオン性脂質を形成することのできる、１つまたは２つの脂肪酸または脂肪アルキル鎖とアミノ頭部基（アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基を含める）とを有する脂質を包含することを意味する。
【００７６】
他のアミノ脂質として、別の脂肪酸基と、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−など）を含めた他のジアルキルアミノ基とを有するアミノ脂質が挙げられることになる。Ｒ１１およびＲ１２が両方とも長鎖アルキル基または長鎖アシル基である実施形態については、これらは同じでも異なってもよい。一般に、飽和度の低いアシル鎖を有するアミノ脂質の方が、特にその複合体を濾過滅菌の目的のために約０．３ミクロン未満の大きさにしなければならない場合、特定の大きさにすることが容易である。炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ２２の範囲にある不飽和脂肪酸を含んでいるアミノ脂質が好ましい。他の骨組み（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を使用して、上記アミノ脂質のアミノ基と脂肪酸または脂肪アルキル部分とを隔てることもできる。適切な骨組みは、当業者に公知である。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明のアミノ脂質またはカチオン性脂質は、少なくとも１個のプロトン化可能な（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）基または脱プロトン化可能な（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）基を有する結果、生理的ｐＨ以下のｐＨ（例えばｐＨ７．４）で正に荷電し、第二のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨ以上で中性である。当然のことながら、ｐＨに応じたプロトンの付加または除去は平衡過程であること、ならびに荷電脂質、または中性脂質への言及は、主要な（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）種の性質を指し、上記脂質のすべてが荷電形態または中性の形態で存在する必要はないことは理解される。プロトン化可能な基または脱プロトン化可能な基を２個以上有する、または双性イオン性である脂質は、本発明における使用から除外されない。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明によるプロトン化可能な脂質は、プロトン化可能な基のｐＫａが約４〜約１１の範囲にある。ｐＫａが約４〜約７であることが最も好ましいが、それは、こうした脂質が、より低いｐＨの製剤化段階ではカチオン性となる一方、ｐＨ７．４付近の生理的ｐＨでは、粒子の表面が（完全ではないが）広く中和されるからである。このｐＫａの利点の１つは、上記粒子の外表面に結合している少なくとも一部の核酸が、生理的ｐＨでその静電相互作用を失い、単なる透析によって除去されること、従って上記粒子のクリアランスされやすさが大きく低減されることである。
【００７９】
Ｂ．脂質粒子
本発明は、上記のアミノ脂質の１種または複数種を含む脂質粒子も提供する。脂質粒子としては、限定はしないが、リポソームが挙げられる。本明細書で用いる場合、リポソームとは、水性の内部を囲む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、１重または複数の脂質膜を有するものでよい。本発明は、単層と呼ばれる単一の層からなるリポソーム、および多層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）と呼ばれる複数の層からなるリポソームの両方を企図する。核酸との複合体を形成するとき、脂質粒子は、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎに記載されているような、ＤＮＡ層の間に挟まれたカチオン性脂質二重層から構成されるリポプレックスにしてもよい。
【００８０】
本発明の脂質粒子は、１種または複数種の追加の脂質および／または他の成分、例えばコレステロールをさらに含んでよい。他の脂質は、脂質酸化を防いだり、リポソーム表面にリガンドを付着させるなどの様々な目的で、本発明のリポソーム組成物に含ませることができる。両親媒性脂質、中性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質を含めて、いくつかの脂質のいずれもが、本発明のリポソームに存在してよい。そのような脂質は、単独で使用することも、組み合わせて使用することもできる。存在してよい追加の脂質成分の詳細な例は、以下に記載する。
【００８１】
特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は、上記のアミノ脂質、非カチオン性脂質または中性脂質、および粒子凝集を抑制するコンジュゲート脂質を含む。特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は、上記のアミノ脂質、非カチオン性脂質または中性脂質、ステロール、および粒子凝集を抑制するコンジュゲート脂質を含む。特定の実施形態では、こうした脂質粒子は、本発明のアミノ脂質に加えてカチオン性脂質をさらに含む。
【００８２】
本発明の脂質粒子に存在してよい追加の成分として、二重層安定化成分、例えば、ポリアミドオリゴマー（例えば米国特許第６，３２０，０１７号を参照されたい）、ペプチド、タンパク質、洗浄剤、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧやセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ（米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）などの脂質誘導体が挙げられる。
【００８３】
形成中の粒子の凝集を低減する脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）改変脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、および（米国特許第６，３２０，０１７号に記載のもの）などのポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）が挙げられる。製剤化の間の凝集を防止する、ＰＥＧ、Ｇｍ１、またはＡＴＴＡのような、非荷電の親水性立体障壁部分を有する他の化合物を、本発明の方法および組成物における使用のために脂質に結合させることもできる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号、および同第５，８８５，６１３号に記載されている。典型的には、凝集を低減するために選択される脂質成分の濃度は、約１から１５％（脂質に対するモルパーセント）である。
【００８４】
本発明において有用であるＰＥＧ改変脂質（または脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）の詳細な例は、様々な「固定（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）」脂質部分を有して、ＰＥＧ部分を脂質ベシクルの表面に固定する（ｓｅｃｕｒｅ）ことができる。適切なＰＥＧ改変脂質の例として、ＰＥＧ改変ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、参照により本明細書に組み込まれる同時係属のＵＳＳＮ０８／４８６，２１４に記載されているＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ改変ジアルキルアミン、ならびにＰＥＧ改変１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。特に好ましいのは、ＰＥＧ改変ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールである。
【００８５】
特定の実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、以下のものから選択される。
【００８６】
【化２０】
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ＰＥＧやＡＴＴＡなどの立体的に大きい部分が脂質アンカーにコンジュゲートしている実施形態では、上記脂質アンカーの選択は、上記コンジュゲートが有することになる上記脂質粒子との結合のタイプに応じて決まる。ｍｅＰＥＧ（ｍｗ２０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、上記粒子が循環から取り除かれるまで、恐らく約数日、リポソームと結合したままとなることは周知である。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０などの他のコンジュゲートも、同様の滞留能力を有する。しかし、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、いくつかのアッセイにおいて、血清に曝されると、製剤の外へと急速に交換され、Ｔ１／２は６０分未満である。米国特許出願第０８／４８６，２１４号で例示されているように、交換速度に影響を及ぼすのは、次の少なくとも３つの特徴、すなわち、アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和状態、および立体障壁頭部基の大きさである。これらの特性の適切な変形形態（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を備えた化合物は、本発明にとって有用となり得る。一部の治療適用例では、上記ＰＥＧ改変脂質が上記核酸−脂質粒子からｉｎ  ｖｉｖｏで急速に失われることが好ましい場合もあり、したがって、上記ＰＥＧ改変脂質は、比較的短い脂質アンカーを有することになる。他の治療適用例では、上記核酸−脂質粒子がより長い血漿循環寿命を示すことが好ましい場合もあり、したがって、上記ＰＥＧ改変脂質は、比較的より長い脂質アンカーを有することになる。
【００８７】
凝集を防止する化合物は、正しく機能するのに脂質コンジュゲーションを必ずしも必要としないことに留意すべきである。溶液中の遊離ＰＥＧまたは遊離ＡＴＴＡは、凝集を十分に防止することができる。上記粒子が製剤化後に安定している場合、上記ＰＥＧまたはＡＴＴＡは、被験体に投与される前に透析によって除くことができる。
【００８８】
用語「非カチオン性脂質」とは、任意の両親媒性脂質ならびに任意の他の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。上記脂質粒子、例えば本発明のＳＮＡＬＰにおいて使用される非カチオン性脂質は、安定な複合体を生成することのできる様々な中性非荷電脂質、双性イオン脂質、またはアニオン性脂質のいずれかでよい。
【００８９】
用語「中性脂質」とは、選択されたｐＨで、非荷電または中性双性イオンのいずれかの形態で存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す。生理的ｐＨでは、そのような脂質として、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが挙げられる。
【００９０】
用語「アニオン性脂質」とは、生理的ｐＨで負に荷電した任意の脂質を指す。こうした脂質として、限定はしないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＰＯＰＧ）、およびアニオン修飾基が中性脂質に結合した他の脂質が挙げられる。そのような脂質として、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが挙げられる。本明細書に記載の粒子において使用する中性脂質の選択は、例えば、リポソームの大きさおよびリポソームの血流中での安定性を考慮して一般に決められる。中性脂質成分は、２個のアシル基を有する脂質（すなわち、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）であることが好ましい。鎖長および飽和度の様々な種々のアシル鎖基を有する脂質が入手可能であり、または周知の技術によって単離もしくは合成することができる。一群の実施形態では、炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ２２の範囲にある飽和脂肪酸を含んでいる脂質が好ましい。別の群の実施形態では、炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ２２の範囲にある一価または二価不飽和脂肪酸を有する脂質を使用する。加えて、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。本発明で使用する中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の同類のホスファチジルコリンであることが好ましい。本発明において有用な中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロフィンゴミエリン、またはセリンやイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質から構成されたものでもよい。
【００９１】
非カチオン性脂質の非限定的な例として、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌ）−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリンなどのリン脂質、およびそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリンリン脂質およびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、Ｃ１０〜Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルであることが好ましい。
【００９２】
非カチオン性脂質の追加の例として、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノールなどのコレステロールおよびその誘導体といったステロールが挙げられる。
【００９３】
一部の実施形態では、上記脂質粒子、例えばＳＮＡＬＰに存在する非カチオン性脂質は、コレステロールを含むか、またはコレステロールからなり、例えば、リン脂質を含まないＳＮＡＬＰである。他の実施形態では、上記脂質粒子、例えばＳＮＡＬＰに存在する非カチオン性脂質は、１種または複数種のリン脂質を含むか、または１種または複数種のリン脂質からなり、例えば、コレステロールを含まないＳＮＡＬＰである。さらなる実施形態では、ＳＮＡＬＰに存在する非カチオン性脂質は、１種または複数種のリン脂質とコレステロールの混合物を含むか、または１種または複数種のリン脂質とコレステロールの混合物からなる。
【００９４】
本発明での使用に適する非カチオン性脂質の他の例として、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート（ｇｌｙｃｅｒｏｌｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）、ヘキサデシルステレエート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｓｔｅｒｅａｔｅ）、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル−アリールスルフェートポリエチルオキシレート化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｏｘｙｌａｔｅｄ）脂肪酸アミド、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリンなどの、リンを含まない脂質が挙げられる。
【００９５】
非カチオン性脂質は典型的には、上記粒子中に存在する全脂質の約１３ｍｏｌ％〜約４９．５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を占める。
【００９６】
上記脂質混合物中のステロール成分は、存在する場合、リポソーム、脂質ベシクル、または脂質粒子調製の分野で慣例的に使用されているステロールのいずれかでよい。好ましいステロールは、コレステロールである。
【００９７】
上で詳述したものに加えて、生理的ｐＨ周辺で正味の正電荷を有する他のカチオン性脂質も、本発明の脂質粒子に含めることができる。そのようなカチオン性脂質として、限定はしないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（“ＤＯＤＡＣ”）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（“ＤＯＴＭＡ”）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（“ＤＤＡＢ”）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（“ＤＯＴＡＰ”）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（“ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ”）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（“ＤＣ−Ｃｈｏｌ”）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオルアセテート（“ＤＯＳＰＡ”）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（“ＤＯＧＳ”）、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（“ＤＯＰＥ”）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（“ＤＯＤＡＰ”）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（“ＤＯＤＭＡ”）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（“ＤＭＲＩＥ”）が挙げられる。加えて、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）やＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）などの、カチオン性脂質のいくつかの市販調製物を使用することができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、アミノ脂質である。
【００９８】
数多くの実施形態では、両親媒性脂質が本発明の脂質粒子に含まれる。「両親媒性脂質」とは、脂質材料の疎水性部分が疎水性の相に配向し、その親水性部分が水相に向かって配向する任意の適切な材料を指す。そのような化合物として、限定はしないが、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられる。代表的なリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質類、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール類、およびβ−アシルオキシ酸類などの、他のリンを含まない化合物も使用することができる。加えて、このような両親媒性脂質類は、トリグリセリド類やステロール類などの他の脂質と容易に混合することができる。
【００９９】
プログラム可能な融合脂質も、本発明の脂質粒子に含めるのに適する。そのような脂質粒子は、細胞膜と融合する傾向がほとんどなく、所与のシグナル事象が起こるまでその負荷量（ｐａｙｌｏａｄ）を送達する。このため、上記脂質粒子は、生物または疾患部位に注入された後、それが細胞と融合し始める前に、より均等に分配される。上記シグナル事象は、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境、または時間の変化でよい。最後のケースでは、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ−脂質コンジュゲートなどの融合遅延または「遮蔽（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」成分が、時間と共に上記脂質粒子膜の外へと単純に交換されることが可能である。上記脂質粒子は、体内に適切に分配される時までには、十分な遮蔽剤を失っていて、融合性となる。他のシグナル事象では、炎症部位での温度の上昇など、上記疾患部位または標的細胞に関連するシグナルを選択することが望ましい。
【０１００】
特定の実施形態では、細胞型または組織に特異的であるターゲッティング部分を使用した本発明の脂質粒子をターゲッティングすることが望ましい。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えばリボフラビン）、モノクローナル抗体などの様々なターゲッティング部分を使用した脂質粒子のターゲッティングについては、以前から記載されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および第４，６０３，０４４号を参照されたい）。上記ターゲッティング部分は、タンパク質全体またはその断片を含むものでよい。ターゲッティング機序では、一般に、ターゲッティング因子（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、標的（例えば細胞表面受容体）との相互作用に上記標的部分が利用可能になるようにして、上記脂質粒子の表面上に配置されることが必要となる。例えば、Ｓａｐｒａ，  Ｐ．およびＡｌｌｅｎ，  ＴＭ、Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４２巻（５号）：４３９〜６２頁（２００３年）、およびＡｂｒａ，  ＲＭら、Ｊ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １２巻：１〜３頁（２００２年）に記載のものを含めて、様々な異なるターゲッティング因子および方法が当技術分野で公知であり、入手可能である。
【０１０１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などの親水性ポリマー鎖の表面コーティングが施された、脂質粒子、すなわちリポソームをターゲッティングのために使用することが提案されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３７巻：９９〜１０８頁（１９９５年）；ＤｅＦｒｅｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１８巻：６１０１〜６１０４頁（１９９６年）；Ｂｌｕｍｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１４９巻：１８０〜１８４頁（１９９３年）；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２巻：３２１〜３３４頁（１９９２年）；米国特許第５，０１３５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４巻：２９６〜２９９頁（１９９３年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５３巻：７１〜７４頁（１９９４年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  第９章（ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ編）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌ（１９９５年）。１つの手法では、上記脂質粒子をターゲッティングするための、抗体などのリガンドを、上記脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に連結する。別の手法では、上記ターゲッティングリガンドを、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位末端に結合させる（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２巻：３２１〜３３４頁（１９９２年）；Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８８巻：１１５〜１１８頁（１９９６年））。
【０１０２】
上記標的因子（ｔａｒｇｅｔ  ａｇｅｎｔ）を結合する標準の方法を使用することができる。例えば、標的因子を結合するために活性化することのできるホスファチジルエタノールアミン、または脂質によって誘導体化された（ｌｉｐｉｄ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）ブレオマイシンなどの、誘導体化された親油性化合物を使用することができる。抗体によって標的指向化された（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）リポソームを、例えば、プロテインＡが組み込まれているリポソームを使用して構築することができる（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１６３３７〜１６３４２頁（１９９０年）およびＬｅｏｎｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）、８７巻：２４４８〜２４５１頁（１９９０年）を参照されたい）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号で開示されており、その教示を参照により本明細書に組み込む。ターゲッティング部分の例として、新生物または腫瘍に関連する抗原を含めて、細胞成分に特異的な他のタンパク質も挙げることができる。ターゲッティング部分として使用するタンパク質は、共有結合によって上記リポソームに結合させることができる（Ｈｅａｔｈ、Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、１４９巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１１〜１１９頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８７年）を参照されたい）。他のターゲッティング方法として、ビオチン−アビジン系が挙げられる。
【０１０３】
例となる一実施形態では、上記脂質粒子は、本発明のアミノ脂質、（アミノ脂質以外の）中性脂質、ステロール（例えばコレステロール）、およびＰＥＧ改変脂質（例えば、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡ）からなる混合物を含む。特定の実施形態では、上記脂質混合物は、本発明のアミノ脂質、中性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ改変脂質からなるか、または本質的にこれらからなる。さらに好ましい実施形態では、上記脂質粒子は、約２０〜７０％のアミノ脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ改変脂質というモル比の上記脂質混合物からなるか、または本質的にこの混合物からなる。
【０１０４】
特定の実施形態では、上記脂質粒子は、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡのいずれかからなるか、または本質的にこれらからなり、モル比は、例えば約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡである。特定の実施形態では、上記脂質モル比は、およそ４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＡ）、または３５／１５／４０／１０ｍｏｌ％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＡである。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質を、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置き換える。
【０１０５】
特定の実施形態では、上記脂質粒子は、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡのいずれかからなるか、または本質的にこれらからなり、モル比は、例えば約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡである。特定の実施形態では、上記脂質モル比は、およそ４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％のＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＡ）、または３５／１５／４０／１０ｍｏｌ％のＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＡである。別の群の実施形態では、これら組成物の中性脂質を、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置き換える。
【０１０６】
特定の実施形態では、上記脂質粒子は、ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡのいずれかからなるか、または本質的にこれらからなり、モル比は、例えば約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡである。特定の実施形態では、上記脂質モル比は、およそ４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％のＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＡ）、または３５／１５／４０／１０ｍｏｌ％のＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＡである。別の群の実施形態では、これら組成物の中性脂質を、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置き換える。
【０１０７】
Ｃ．治療剤−脂質粒子組成物および製剤
本発明は、本発明の脂質粒子および活性剤を含む組成物であって、上記活性剤が上記脂質粒子に結合している組成物を含む。特定の実施形態では、上記活性剤は治療剤である。特定の実施形態では、上記活性剤は、上記脂質粒子の水性内部内にカプセル化される。他の実施形態では、上記活性剤は、上記脂質粒子の１つまたは複数の脂質層内に存在する。他の実施形態では、上記活性剤は、脂質粒子の外側または内側脂質表面に結合している。
【０１０８】
「完全にカプセル化された（ｆｕｌｌｙ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）」は、本明細書で使用する場合、上記粒子中の核酸が、血清、または遊離核酸を著しく分解するヌクレアーゼアッセイに曝露した後に著しくは分解されないことを示す。完全にカプセル化されたシステムでは、好ましくは上記粒子核酸の２５％未満が、遊離核酸の１００％を通常分解する処理において分解され、より好ましくは粒子核酸の１０％未満、最も好ましくは５％未満が分解される。あるいは、完全なカプセル化は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイによって判定することができる。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを定量化するための超高感度蛍光性核酸染色剤である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能）。完全にカプセル化されたは、上記粒子が血清安定であり、すなわち、これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された際に、急速に分解してその成分部分にならないことも示す。
【０１０９】
活性剤は、本明細書で使用する場合、細胞、組織、器官、または被験体に所望の効果を発揮することができる任意の分子または化合物を含む。そのような効果は、例えば、生物学的、生理的、または美容的とすることができる。活性剤は、例えば、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、および霊長類化（Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（商標）抗体など、サイトカイン類、増殖因子類、アポトーシス因子類、分化−誘導因子類、細胞表面受容体類およびそのリガンド類；ホルモン類；ならびに小有機分子もしくは化合物を含めた小分子類を含む、例えば、核酸類、ペプチド類、およびポリペプチド類を含めた、任意の型の分子または化合物とすることができる。
【０１１０】
一実施形態では、上記活性剤は治療剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤誘導体は、それ自体で治療的に活性であってもよく、またはこれらは、さらに改変されると活性になるプロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態では、治療剤誘導体は、改変しない薬剤と比較した場合、上記治療活性の一部またはすべてを保持し、一方、別の実施形態では、治療剤誘導体は、治療活性を欠いている。
【０１１１】
様々な実施形態では、治療剤には、任意の治療上有効な薬剤または薬物、例えば、抗炎症化合物、抗うつ剤、刺激剤、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張剤、抗脈管形成剤、サイトバスキュラー剤、シグナル伝達阻害剤、心血管薬、例えば、抗不整脈剤、血管収縮剤、ホルモン、およびステロイドなどが含まれる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、上記治療剤は、抗腫瘍薬（ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｄｒｕｇ）であり、これは、抗腫瘍薬（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｄｒｕｇ）、抗癌剤、腫瘍薬（ｔｕｍｏｒ  ｄｒｕｇ）、抗新生物薬（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）などと呼ぶこともできる。本発明によって使用することができる抗腫瘍薬の例として、限定はしないが、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、静脈内用ブスルファン、経口用ブスルファン、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドデタキセル（ｄｏｄｅｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミソール、リトレチノイン（ｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、メガストロール（ｍｅｇａｓｔｒｏｌ）、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキセート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテル、テモゾルアミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、およびビノレルビンが挙げられる。本発明によって使用することができる抗腫瘍薬の他の例は、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎ）およびエリプチシン類似体または誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、ならびにカンプトテシンである。
【０１１３】
１．核酸−脂質粒子
ある特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸と結合しており、核酸−脂質粒子をもたらす。特定の実施形態では、上記核酸は、上記脂質粒子中に部分的または完全にカプセル化されている。本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことを意味する。最大５０ヌクレオチドを含有する断片は、オリゴヌクレオチドと一般に呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅ）は、長さが２０〜５０ヌクレオチドである。
【０１１４】
本発明の脈絡において、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ））連結からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同様に機能する、天然に存在しないモノマー、またはその一部を含むポリマーまたはオリゴマーも含む。そのような改変または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取込みの増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの特性のために、天然型を超えて好適であることが多い。
【０１１５】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドと分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、交互の非分枝ポリマーを形成するために、この糖の５’  炭素および３’炭素でホスフェートと共有結合したデオキシリボースと呼ばれる５炭素糖からなる。リボオリゴヌクレオチドは、５炭素糖がリボースである、同様の繰り返し構造からなる。
【０１１６】
本発明による脂質−核酸粒子中に存在する核酸は、公知である任意の形態の核酸を含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。二本鎖ＤＮＡの例には、構造遺伝子、制御領域および終止領域を含む遺伝子、ならびにウイルス性ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡなどの自己複製系が含まれる。二本鎖ＲＮＡの例には、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が含まれる。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１１７】
本発明の核酸は、核酸の特定の形態に一般に依存して、様々な長さのものとすることができる。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、長さが約１，０００〜１００，０００ヌクレオチド残基とすることができる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが約１０〜１００ヌクレオチドの範囲とすることができる。様々な関連実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、および三本鎖ともに、長さが約１０〜約５０ヌクレオチド、約２０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、約２０〜約３０ヌクレオチドの長さの範囲とすることができる。
【０１１８】
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするか、または標的ポリヌクレオチドと相補性である。「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補性の」は、上記ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的と上記オリゴヌクレオチドの間で、安定で特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性を示すのに使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列と１００％相補性である必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドは、上記オリゴヌクレオチドの上記標的への結合が、上記標的分子の正常な機能を妨害することによって、上記標的分子に由来する有用性または発現の低下を生じさせ、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイもしくは治療的処置の場合における生理的条件下、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合では、上記アッセイが行われる条件下で、上記オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、これが標的としているか、またはこれが特異的にハイブリダイズする遺伝子配列またはｍＲＮＡ配列の領域と比較した場合、１つ、２つ、または３つの塩基置換を含む。
【０１１９】
ＲＮＡ干渉核酸
特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子と結合している。ＲＮＡｉ分子を使用するＲＮＡ干渉法は、対象とする遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を乱すために使用することができる。最近の５年間のうちに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、開発中の次世代の標的化オリゴヌクレオチド薬物として、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムに実質的に取って代わった。ＳｉＲＮＡは、通常２１〜３０ヌクレオチドの長さのＲＮＡ二本鎖であり、これは、ＲＮＡｉ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知の細胞質多タンパク質複合体と結合することができる。ｓｉＲＮＡを負荷されたＲＩＳＣは、相同の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ｍＲＮＡ転写物の分解を媒介し、したがってｓｉＲＮＡは、高い特異性でタンパク質発現をノックダウンするように設計することができる。他のアンチセンス技術と異なり、ｓｉＲＮＡは、非コードＲＮＡを通じて遺伝子発現を制御するように進化した天然の機構を通じて機能する。これが、ｓｉＲＮＡの活性が、アンチセンスＯＤＮまたはリボザイムのいずれかより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで強力である理由であると一般に考えられている。例えば、ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，  Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６巻：４４３〜４５３頁（２００７年）において記載されたように、臨床的に関連した標的を標的化するｓｉＲＮＡを含めた様々なＲＮＡｉ試薬が、現在医薬として開発中である。
【０１２０】
最初に記載されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンス鎖およびＲＮＡアンチセンス鎖の両方を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスハイブリッド、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、ＲＮＡｉを媒介することができることが現在では実証されている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ，  Ｊ．Ｓ．およびＣｈｒｉｓｔｉａｎ，  ＡＴ．、（２００３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４巻：１１１〜１１９頁）。したがって、本発明は、任意のこれらの様々な型の二本鎖分子を含むＲＮＡｉ分子の使用を含む。さらに、ＲＮＡｉ分子は、様々な形態で使用し、細胞に導入することができることが理解される。したがって、本明細書で使用する場合、ＲＮＡｉ分子は、限定はしないが、２本の別個の鎖、すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；二本鎖領域を形成する相補性配列のヘアピンループを含むポリヌクレオチド、例えば、ｓｈＲＮＡｉ分子、ならびに単独で、または別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターを含めた、細胞内でＲＮＡｉ応答を誘導することができる任意の分子、ならびにすべての分子を包含する。
【０１２１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害するために使用することができる。遺伝子および核酸発現の二本鎖ＲＮＡ媒介性抑制は、細胞または生物中にｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを導入することによって、本発明によって実現することができる。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方、例えば、１本のＲＮＡ鎖および１本のＤＮＡ鎖を含むハイブリッド分子とすることができる。ｓｉＲＮＡを細胞に直接導入することにより、哺乳動物細胞内でＲＮＡｉを作動させる（ｔｒｉｇｇｅｒ）ことができることが実証された（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，  Ｓ．  Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４９４〜４９８頁（２００１年））。さらに、哺乳動物細胞内の抑制は、ＲＮＡレベルで起こり、上記標的遺伝子に特異的であり、ＲＮＡとタンパク質抑制の間で強い相関を伴った（Ｃａｐｌｅｎ，  Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８巻：９７４６〜９７４７頁（２００１年））。さらに、ＨｅＬａ  Ｓ３、ＣＯＳ７、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＣＨＯ−ＫＩ、およびＭＣＦ−７細胞を含めた多種多様な細胞株は、いくつかのレベルのｓｉＲＮＡサイレンシングに感受性であることが示された（Ｂｒｏｗｎ，  Ｄ．ら、ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ  ９巻（１号）：１〜７頁、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｔ．ａｍｂｉｏｎ．ｄｏｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ（９／１／０２）で入手可能）。
【０１２２】
特定のポリヌクレオチドを標的にするＲＮＡｉ分子は、当技術分野で公知の手順に従って容易に調製することができる。有効なｓｉＲＮＡ分子の構造上の特性は同定されている。Ｅｌｓｈａｂｉｒ，  Ｓ．  Ｍ．ら（２００１年）、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４９４〜４９８頁、およびＥｌｓｈａｂｉｒ，  Ｓ．  Ｍ．ら（２００１年）、ＥＭＢＯ  ２０巻：６８７７〜６８８８頁。したがって、当業者は、多種多様な異なるｓｉＲＮＡ分子を、特定の遺伝子または転写物を標的にするために使用することができることを理解する。ある特定の実施形態では、本発明によるｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖であり、長さが、間の各整数を含めた１６〜３０または１８〜３５ヌクレオチドである。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが２１ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、０〜７のヌクレオチド３’オーバーハング、または０〜４のヌクレオチド５’オーバーハングを有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、２つのヌクレオチド３’オーバーハングを有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが２１ヌクレオチドであり、２つのヌクレオチド３’オーバーハングを有する（すなわち、これらは、そのセンス鎖とアンチセンス鎖の間に１９ヌクレオチドの相補性領域を含有する）。ある特定の実施形態では、上記オーバーハングは、ＵＵまたはｄＴｄＴ  ３’オーバーハングである。
【０１２３】
一般に、１個の塩基対ミスマッチでさえ、サイレンシングを低減することが示されているので、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ分子の１本の鎖と完全に相補性である。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、改変主鎖組成、例えば、２’−デオキシ−または２’−Ｏ−メチル改変を有することができる。しかし、好適な実施形態では、上記ｓｉＲＮＡの鎖全体は、２’デオキシまたは２’−Ｏ−改変塩基を用いて作製されない。
【０１２４】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ標的部位は、ＡＡジヌクレオチド配列の出現について、上記標的ｍＲＮＡ転写物配列をスキャンすることによって選択される。３’側の隣接する約１９ヌクレオチドと組み合わせた各ＡＡジヌクレオチド配列は、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ標的部位は、その５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはその開始コドン付近の領域（約７５塩基内）に優先的に配置されないが、その理由は、調節領域に結合するタンパク質がｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害することができるためである（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，  Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４９４〜４９８頁（２００１年）；Ｅｌｓｈａｂｉｒ，  Ｓ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２０巻：６８７７〜６８８８頁（２００１年））。さらに、潜在的な標的部位は、適切なゲノムデータベース、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍにおけるＮＣＢＩサーバーで入手可能なＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５など、および排除される他のコード配列と著しい相同性を有する潜在的な標的配列と比較することができる。
【０１２５】
特定の実施形態では、短いヘアピンＲＮＡが本発明の核酸−脂質粒子の核酸成分を構成する。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現を配列特異的に低減することができるヘアピンＲＮＡの一形態である。短いヘアピンＲＮＡは、上記細胞環境において一般により安定であり、分解に対する感受性がより低いので、これらは、遺伝子発現の抑制において、ｓｉＲＮＡを超えて利点を提供することができる。そのような短いヘアピンＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングは、様々な正常細胞株および癌細胞株、ならびにマウス細胞およびヒト細胞を含めた哺乳動物細胞において機能することが確立されている。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，  Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６巻（８号）：９４８〜５８頁（２００２年）。さらに、操作されたｓｈＲＮＡをコードする染色体性遺伝子を有するトランスジェニック細胞株が生成された。これらの細胞は、ｓｈＲＮＡを構成的に合成し、それによって、子孫細胞に伝える（ｐａｓｓ）ことができる、持続的または構成的な遺伝子サイレンシングを促進することができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９巻（３号）：１４４３〜１４４８頁（２００２年）。
【０１２６】
ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を含有する。ある特定の実施形態では、これらは、長さが１９〜２９ヌクレオチド、またはその間の任意の数の可変の（ｖａｒｉａｂｌｅ）ステム長を含有することができる。ある特定の実施形態では、ヘアピンは、１９〜２１ヌクレオチドのステムを含有し、一方、他の実施形態では、ヘアピンは、２７〜２９ヌクレオチドのステムを含有する。ある特定の実施形態では、上記ループサイズは、長さが４〜２３ヌクレオチドの間であるが、ループサイズは、サイレンシング活性に著しく影響することなく、２３ヌクレオチドより大きくすることができる。ｓｈＲＮＡ分子は、効力を減少させることなく、ミスマッチ、例えば、上記ｓｈＲＮＡステムの２本の鎖の間のＧ−Ｕミスマッチを含有することができる。実際に、ある特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、例えば、細菌内で増殖する間に、ヘアピンを安定化させるために、そのヘアピンステム中に１つまたはいくつかのＧ−Ｕ対形成を含むように設計される。しかし、上記標的ｍＲＮＡ（アンチセンス鎖）に結合する上記ステムの一部と上記ｍＲＮＡとの間に相補性が一般に要求され、この領域内の１個の塩基対ミスマッチでさえ、サイレンシングを無効にする場合がある。５’および３’オーバーハングは、ｓｈＲＮＡ機能にとって重要ではないようにみえるので、必要とされないが、これらは存在してもよい（Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２年）、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １６巻（８号）：９４８〜５８頁）。
【０１２７】
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない、高度に保存されたクラスの低分子ＲＮＡ分子である。プロセシングされるｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれた状態になる一本鎖の約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡ分子であり、発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、細胞増殖、アポトーシス、および分化の重要な制御因子として同定された。これらは、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に結合することによって、遺伝子発現の制御において役割を果たすと考えられている。ＲＩＳＣは、翻訳の阻害、転写物の切断、またはその両方を通じて遺伝子発現の下方制御を媒介する。ＲＩＳＣは、広範囲の真核生物の核内での転写サイレンシングにもかかわる。
【０１２８】
これまでに同定されたｍｉＲＮＡ配列の数は多く、増えており、その例示的な例は、例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓら、ＮＡＲ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０−Ｄ１４４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．  ＮＡＲ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９−Ｄ１１１；およびまたｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／において見出すことができる。
【０１２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、または単に「アンチセンス」は、標的化ポリヌクレオチド配列と相補性であるオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列と相補性である一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡの場合では、相補性ＲＮＡ鎖の翻訳を、これに結合することによって防止する。アンチセンスＤＮＡは、特定の、相補性（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的にするのに使用することができる。結合が起こる場合、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素ＲＮａｓｅ  Ｈによって分解され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の上記標的遺伝子と正確に相補性でない場合のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、本発明は、標的でない特定の活性が、アンチセンスに見出される場合、または上記標的配列と１つまたは複数のミスマッチを含有するアンチセンス配列が、特定の使用について最も好適である場合に利用することができる。
【０１３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効な標的化阻害剤（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であることが実証されており、したがって、標的とされる遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するのに使用することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）およびムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許５，７３９，１１９号および米国特許５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、複数の薬剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、およびヒトＥＧＦに関して実証されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９８８年６月１０日；２４０巻（４８５８号）：１５４４〜６頁；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９８９年；１巻（４号）：２２５〜３２頁；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  １９９８年６月１５日；５７巻（２号）：３１０〜２０頁；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号、および米国特許第５，６１０，２８８号）。さらに、アンチセンス構築物は、様々な異常な細胞増殖、例えば、癌を阻害し、これを治療するのに使用することができることも記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７号、および米国特許第５，７８３，６８３号）。
【０１３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する方法は、当技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成することに容易に適応させることができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択される標的配列の分析および二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的な安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二量体、ヘアピン、または宿主細胞内で標的ｍＲＮＡへの特異的結合を低減または禁止する他の二次構造を形成することが比較的できないことに基づいて選択することができる。上記ｍＲＮＡの非常に好適な標的領域は、そのＡＵＧ翻訳開始コドンにおける領域またはこのコドン付近の領域、および上記ｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補性である配列を含む。これらの二次構造分析、および標的部位選択の考察は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）および／またはＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７年、２５巻（１７号）：３３８９〜４０２頁）を使用して実施することができる。
【０１３２】
リボザイム
本発明の別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子は、リボザイムと結合する。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ−タンパク質複合体である（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ
Ａ．  １９８７年１２月；８４巻（２４号）：８７８８〜９２頁；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ．  １９８７年４月２４日；４９巻（２号）：２１１〜２０頁）。例えば、多数のリボザイムは、高度の特異性を伴ってリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断することが多い（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．  １９８１年１２月；２７巻（３  Ｐｔ  ２）：４８７〜９６頁；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９０年１２月５日；２１６巻（３号）：５８５〜６１０頁；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ．  １９９２年５月１４日；３５７巻（６３７４号）：１７３〜６頁）。この特異性は、上記基質が、化学反応の前に、特定の塩基対合相互作用を介して、上記リボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合するという必要条件に起因している。
【０１３３】
少なくとも６つの基本的な種類の天然に存在する酵素ＲＮＡが、現在公知である。それぞれは、生理的条件下で、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解をトランスで触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素核酸（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、最初に標的ＲＮＡに結合することによって作用する。そのような結合は、上記標的ＲＮＡを切断するように作用する酵素核酸分子の酵素部分にごく接近して保持されている酵素核酸の標的結合部分を通じて起こる。したがって、上記酵素核酸は、相補性の塩基対形成を通じて標的ＲＮＡを最初に認識し、次いでこれに結合し、そして一旦その正しい部位に結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力を破壊することになる。酵素核酸が、そのＲＮＡ標的に結合し、これを切断した後、酵素核酸は、そのＲＮＡから離れることによって別の標的を探し、繰り返して新しい標的に結合し、これを切断することができる。
【０１３４】
酵素核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、δ肝炎ウイルス、Ｉ群イントロン、またはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列を伴って）、またはニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳ  ＲＮＡモチーフにおいて形成することができる。ハンマーヘッドモチーフの具体例は、Ｒｏｓｓｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９２年９月１１日；２０巻（１７号）：４５５９〜６５頁によって記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開第ＥＰ０３６０２５７号）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９年６月１３日；２８巻（１２号）：４９２９〜３３頁；Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９０年１月２５日；１８巻（２号）：２９９〜３０４頁、および米国特許第５，６３１，３５９号によって記載されている。δ肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９９２年１２月１日；３１巻（４７号）：１１８４３〜５２頁によって記載されており；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｃｅｌｌ．  １９８３年１２月；３５巻（３  Ｐｔ  ２）：８４９〜５７頁によって記載されており；ニューロスポラＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｃｅｌｌ．  １９９０年５月１８日；６１巻（４号）：６８５〜９６頁；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９１年１０月１日；８８巻（１９号）：８８２６〜３０頁；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９９３年３月２３日；３２巻（１１号）：２７９５〜９頁）によって記載されており；Ｉ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明によって使用される酵素核酸分子の重要な特性は、これらが、上記標的遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡ領域の１つまたは複数と相補性である特異的基質結合部位を有すること、およびこれらが、その基質結合部位内または周囲にヌクレオチド配列を有し、この配列が分子にＲＮＡ切断活性を付与することである。したがって、上記リボザイム構築物は、本明細書に述べられる特定のモチーフに限定される必要はない。
【０１３５】
任意のポリヌクレオチド配列を標的にしたリボザイムを生成する方法は、当技術分野で公知である。リボザイムは、それぞれが具体的に参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願公開第ＷＯ９３／２３５６９号および国際特許出願公開第ＷＯ９４／０２５９５号に記載されているように設計し、これらに記載されているように、合成することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで試験することができる。
【０１３６】
リボザイムの活性は、そのリボザイム結合アームの長さを変更し、または血清リボヌクレアーゼによるその分解を防止する改変（例えば、酵素ＲＮＡ分子の糖部分に行うことができる様々な化学修飾を記載している、国際特許出願公開第ＷＯ９２／０７０６５号；国際特許出願公開第ＷＯ９３／１５１８７号；国際特許出願公開第ＷＯ９１／０３１６２号；欧州特許出願公開第９２１１０２９８．４号；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際特許出願公開第ＷＯ９４／１３６８８号を参照）、細胞内のその効力を増強する改変、およびＲＮＡ合成時間を短くし、化学的必要条件を低減するためのステムＩＩ塩基の除去を用いてリボザイムを化学的に合成することによって最適化することができる。
【０１３７】
免疫賦活性オリゴヌクレオチド
哺乳動物または他の患者であってよい被験体に投与されたとき、免疫応答を誘導することができる免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ：一本鎖または二本鎖）を含めて、本発明の脂質粒子（ｐａｔｉｃｌｅｓ）と結合する核酸は、免疫賦活性とすることができる。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン二次構造に導くある特定のパリドローム（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓ．ら（１９９２年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８巻：４０７２〜４０７６頁を参照）、またはＣｐＧモチーフ、ならびに他の公知のＩＳＳ機能（マルチＧドメインなど、ＷＯ９６／１１２６６を参照）が含まれる。
【０１３８】
上記免疫応答は、先天免疫応答であっても、適応免疫応答であってもよい。上記免疫系は、より先天免疫系、および脊椎動物の後天性の適応免疫系に分けられ、これらのうちの後者は、体液性細胞成分にさらに分けられる。特定の実施形態では、上記免疫応答は、粘膜性であってもよい。
【０１３９】
特定の実施形態では、免疫賦活性核酸は、脂質粒子と組合せて投与されるときのみ免疫賦活性であり、その「遊離形態」で投与されるとき免疫賦活性ではない。本発明によれば、そのようなオリゴヌクレオチドは、免疫賦活性であるとみなされる。
【０１４０】
免疫賦活性核酸は、これらが、免疫応答を引き起こすために標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、標的ポリヌクレオチドの発現を低減する必要がないとき、非配列特異的であるとみなされる。したがって、ある特定の免疫賦活性核酸は、天然に存在する遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含むことができるが、これらは、依然として非配列特異的な免疫賦活性核酸とみなすことができる。
【０１４１】
一実施形態では、上記免疫賦活性核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。上記オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていなくても、メチル化されていてもよい。別の実施形態では、上記免疫賦活性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態では、上記核酸は、１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンは、メチル化されている。特定の実施形態では、上記核酸は、配列５’ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ３’（配列番号：２）を含む。代替の実施形態では、上記核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、上記ＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１つのシトシンは、メチル化されている。さらなる実施形態では、上記配列中に存在する上記ＣｐＧジヌクレオチド中の各シトシンがメチル化されている。別の実施形態では、上記核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つは、メチル化シトシンを含む。例示的な免疫賦活性（ｉｍｍｙｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）オリゴヌクレオチドを表１に示す。
【０１４２】
特定の一実施形態では、上記核酸は、配列５’ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ３’（配列番号：１）を含む。別の特定の実施形態では、上記核酸配列は、配列５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ３’（配列番号：３１）を含み、太字で示された上記２つのシトシンは、メチル化されている。特定の実施形態では、上記ＯＤＮは、以下に示すように、ＯＤＮ＃１、ＯＤＮ＃２、ＯＤＮ＃３、ＯＤＮ＃４、ＯＤＮ＃５、ＯＤＮ＃６、ＯＤＮ＃７、ＯＤＮ＃８、およびＯＤＮ＃９からなるＯＤＮの群から選択される。
【０１４３】
【表１−１】
2018119016.tif 000026
【０１４４】
【表１−２】
2018119016.tif 000027
【０１４５】
【表１−３】
2018119016.tif 000028
・「Ｚ」は、メチル化シトシン残基を表す。
・注：ＯＤＮ１４は、１５−塩基長（ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドであり、ＯＤＮ１は、５’末端上に追加されたチミジンを有し、ＯＤＮ１を１６−塩基長にしている同じオリゴヌクレオチドである。ＯＤＮ１４とＯＤＮ１の間に生物活性の差はまったく検出されず、両者ともに同様の免疫賦活作用を示す（Ｍｕｉら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２９８巻：１１８５〜１１９２頁（２００１年））。
【０１４６】
本発明の組成物および方法において使用するのに適したオリゴヌクレオチドの追加の特定の核酸配列（ＯＤＮ）は、米国特許出願第６０／３７９，３４３号、米国特許出願第０９／６４９，５２７号、国際公開第ＷＯ０２／０６９３６９号、国際公開第ＷＯ０１／１５７２６号、米国特許第６，４０６，７０５号、およびＲａｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２９８巻：１１８５〜１１９２頁（２００１年）に記載されている。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用されるＯＤＮは、ホスホジエステル（「ＰＯ」）主鎖、またはホスホロチオエート（「ＰＳ」）主鎖、および／またはＣｐＧモチーフ中の少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
【０１４７】
核酸改変
１９９０年代において、ＤＮＡに基づくアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）およびリボザイム（ＲＮＡ）は、薬物の設計および開発にとって興奮させる、新しいパラダイムを示したが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその用途は、エンドヌクレアーゼ活性およびエクソヌクレアーゼ活性、ならびに細胞内送達の成功の欠如によって妨げられた。分解問題は、化学修飾の広範な研究の後に有効に克服され、この化学修飾は、上記オリゴヌクレオチド（オリゴ）薬物が、ヌクレアーゼ酵素によって認識されるのを防止したが、その作用機序を阻害しなかった。この研究は、今日の開発におけるアンチセンスＯＤＮ薬物が、無改変分子についての数分と比較して、数日間ｉｎ  ｖｉｖｏで無傷なままであるほど成功した（Ｋｕｒｒｅｃｋ，  Ｊ．  ２００３年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０巻：１６２８〜４４頁）。しかし、細胞内送達および作用機序の問題が、これまでのところ、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムが臨床製品となることを制限している。
【０１４８】
ＲＮＡ二本鎖は、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡより、ヌクレアーゼに対して本質的に安定であり、アンチセンスＯＤＮと異なり、改変していないｓｉＲＮＡは、これらが細胞質にアクセスすると良好な活性を示す。それでも、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムを安定化させるために開発された化学修飾も、ｓｉＲＮＡに系統的に適用されることによって、化学修飾がどの程度耐容性を示すことができるか、ならびに薬物動態学的および薬力学的活性が増強され得るかどうかが決定されている。ｓｉＲＮＡ二本鎖によるＲＮＡ干渉は、異なる機能を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を必要とする。上記ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣに入ることを可能にするのに両方が必要であるが、一旦負荷されると、上記２本の鎖は、分離し、上記センス鎖は分解される一方で、上記アンチセンス鎖は残ることによって、ＲＩＳＣを上記標的ｍＲＮＡにガイドする。ＲＩＳＣ中への流入は、上記標的ｍＲＮＡの認識および切断より、構造的により低いストリンジェントなプロセスである。したがって、上記センス鎖の多くの異なる化学修飾が可能であるが、限られた変更のみが、上記アンチセンス鎖によって耐容性となる。
【０１４９】
当技術分野で公知のように、ヌクレオシドは、塩基−糖の組合せである。ヌクレオチドは、上記ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、上記リン酸基は、上記糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基が隣接するヌクレオシドに互いに共有結合することによって、線状ポリマー化合物を形成する。さらには、この線状ポリマー構造のそれぞれの末端がさらに結合することによって、環状構造を形成することができる。上記オリゴヌクレオチド構造内で、上記リン酸基は一般に、上記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものとしてみなされる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な連結または主鎖は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。
【０１５０】
本発明による脂質−核酸粒子中に使用される核酸は、公知である任意の形態の核酸を含む。したがって、上記核酸は、ヌクレアーゼ耐性および血清安定性を増強するために以前に使用された型の改変核酸とすることができる。目ざましいことに、しかし、許容される治療製品は、天然核酸ポリマーのホスホジエステル結合に対してまったく改変がない核酸から、脂質−核酸粒子を製剤化するための本発明の方法を使用して調製することもでき、改変していないホスホジエステル核酸（すなわち、その連結のすべてがホスホジエステル結合である核酸）の使用は、本発明の好適な実施形態である。
【０１５１】
ａ．主鎖の改変
本発明において有用なアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、および他のオリゴヌクレオチドには、限定はしないが、改変主鎖または非天然ヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。改変主鎖を有するオリゴヌクレオチドには、上記主鎖中にリン原子を保持するもの、および上記主鎖中にリン原子を有さないものが含まれる。そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有さない改変オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。改変オリゴヌクレオチド主鎖として、例えば、ホスホロチオエート類、キラルなホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類（ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉ−ｅｓｔｅｒｓ）、３’−アルキレンホスホネート類およびキラルなホスホネート類を含めたメチルホスホネート類および他のアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、３’−アミノホスホラミデート、およびアミノアルキルホスホラミデート類を含めたホスホラミデート類、チオノホスホラミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、ホスホロセレネート、メチルホスホネート、またはＯ−アルキルホスホトリエステル連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ならびに通常の３’−５’連結を有するボラノホスフェート類、これらの２’−５’連結類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に連結している、逆極性（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｐｏｌａｒｉｔｙ）を有するものが挙げられる。本発明による核酸中に存在することができる特定の改変の特定の非限定例を、表２に示す。
【０１５２】
様々な塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。上記連結の調製を教示する代表的な米国特許として、限定はしないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号が挙げられる。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、その中にリン原子を含まない改変オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子、およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子のヌクレオシド間連結もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される主鎖を有する。これらとして、例えば、モルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびメチレンチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分部分の混合を有する他のものが挙げられる。上記オリゴヌクレオシドを記載している代表的な米国特許として、限定はしないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号が挙げられる。
【０１５４】
上記ホスホジエステル結合中の非架橋酸素が硫黄によって置換されたホスホロチオエート主鎖の改変（表２、＃１）は、ヌクレアーゼ分解に対して核酸薬物を安定化させるのに展開された最も初期の、最も一般的な手段の１つである。一般に、ＰＳ改変は、活性にそれほど強い影響を与えることなく、両方のｓｉＲＮＡ鎖に対して広範に行うことができる（Ｋｕｒｒｅｃｋ，  Ｊ．、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０巻：１６２８〜４４頁、２００３年）。しかし、ＰＳオリゴ（ｏｌｉｇｏｓ）は、タンパク質と非特異的に非常によく結合し、特にｉ．ｖ．投与すると毒性をもたらすことが公知である。したがって、ＰＳ改変は、３’および５’末端における１つまたは２つの塩基に対して通常制限される。ボラノホスフェートリンカー（表２、＃２）は、ＰＳより明らかに安定であり、ｓｉＲＮＡ活性を増強し、毒性が低い最近の改変である（Ｈａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２巻：５９９１〜６０００頁、２００４年）。
【０１５５】
【表２−１】
2018119016.tif 000029
【０１５６】
【表２−２】
2018119016.tif 000030
【０１５７】
【表２−３】
2018119016.tif 000031
他の有用な核酸誘導体には、上記架橋酸素原子（上記リン酸エステル結合を形成するもの）が、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＨ２−などで置換された核酸分子が含まれる。ある特定の実施形態では、上記アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、または使用される他の核酸に対する変化は、上記核酸に結合する負電荷に完全には影響しない。したがって、本発明は、上記連結の一部が、例えば、その中性のメチルホスホネートまたはホスホラミデート連結で置換されているアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび他の核酸の使用を企図する。中性連結が使用される場合、ある特定の実施形態では、上記核酸連結の８０％未満がそのように置換されているか、または上記連結の５０％未満がそのように置換されている。
【０１５８】
ｂ．塩基改変
塩基改変は、上記主鎖および糖への改変より、あまり一般的ではない。０．３〜６において示される改変はすべて、ヌクレアーゼ対してｓｉＲＮＡを安定化させ、活性に対してほとんど作用がないように思われる（Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．Ｙ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６巻：８９３〜９００頁（２００６年））。
【０１５９】
したがって、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）（「塩基」と単に当技術分野で呼ばれることが多い）改変または置換も含むことができる。本明細書で使用する場合、「改変していない（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）」または「天然」核酸塩基として、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。改変核酸塩基として、他の合成ならびに天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃまたはｍ５ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、ならびに２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロアデニンおよび８−ハログアニン、８−アミノアデニンおよび８−アミノグアニン、８−チオールアデニンおよび８−チオールグアニン、８−チオアルキルアデニンおよび８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、特に５−ブロモウラシルおよび５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロメチルシトシンおよび他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニン、ならびに７−メチルアデニン、８−アザグアニン、ならびに８−アザアデニン、７−デアザグアニン、ならびに７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン、ならびに３−デアザアデニンなどが挙げられる。
【０１６０】
５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含めた）を含めたある特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示された（Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．  Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，  Ｂ．編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９３年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、２７６〜２７８頁）。これらは、特定の実施形態では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と合わせることができる。ある特定のこれらの改変核酸塩基ならびに他の改変核酸塩基の調製を教示する米国特許として、限定はしないが、上記した米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号、および同第５，６８１，９４１号が挙げられる。
【０１６１】
ｃ．糖改変
糖基上のほとんどの改変は、好都合な化学反応性部位をもたらす、ＲＮＡ糖環（ｓｕｇａｒ  ｒｉｎｇ）の２’−ＯＨで行われる（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，  Ｍ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８巻：５７０〜９頁（２００４年）；Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．Ｙ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６巻：８９３〜９００頁（２００６年））。その２’−Ｆおよび２’−ＯＭＥは一般的であり、両者ともに安定性を増大させ、上記２’−ＯＭＥ改変は、これが、１本の鎖当たり４ヌクレオチド未満に制限されている限り、活性を低減しない（Ｈｏｌｅｎ，  Ｔ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１巻：２４０１〜７頁（２００３年））。上記２’−Ｏ−ＭＯＥは、改変塩基が、その分子の中央領域に制限されている場合、ｓｉＲＮＡにおいて最も有効である（Ｐｒａｋａｓｈ，  Ｔ．Ｐ．ら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８巻：４２４７〜５３頁（２００５年））。活性の喪失を伴うことなく、ｓｉＲＮＡを安定化させることが見出された他の改変は、表２、１０〜１４に示されている。
【０１６２】
改変オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換糖部分も含有することができる。例えば、本発明は、その２’位に以下のもののうちの１つを含むオリゴヌクレオチドを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、またはＯ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル（ここで、上記アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１Ｏアルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルとすることができる）。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である）は、特に好適である。他の好適なオリゴヌクレオチドは、その２’位に以下のもののうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。１つの改変は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １９９５年、７８巻、４８６〜５０４頁）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。他の改変には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）が含まれる。
【０１６３】
追加の改変には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の改変を、上記オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、その３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位でも行うことができる。オリゴヌクレオチドは、そのペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体も有することができる。そのような改変糖構造の調製を教示する代表的な米国特許として、限定はしないが、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号が挙げられる。
【０１６４】
他のオリゴヌクレオチド模倣体では、そのヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、その主鎖は、新規の基と置換されているが、上記塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。１つのそのようなオリゴマー化合物、すなわち、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特に、アミノエチルグリシン主鎖で置換されている。上記核酸塩基は、保持されており、その主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、限定はしないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が含まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４巻、１４９７〜１５００頁（１９９１年）に見出すことができる。
【０１６５】
本発明の特定の実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド、ならびにヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオチド、特に、上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖と呼ばれる）−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−（その天然のホスホジエステル主鎖は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−と表される）、ならびに上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖である。上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好適である。
【０１６６】
ｄ．キメラオリゴヌクレオチド
所与の化合物中のすべての位置が、均一に改変される必要はなく、実際には、上記の改変のうちの１つを超えるものを、１つの化合物中、またはオリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドにおいてさえ組み込むことができる。本発明のある特定の好適なオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。本発明の状況において、「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は、それぞれが、少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、１つまたは複数の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞内への取込みの増大、上記ＲＮＡ標的に対する結合親和性の増大など）を付与する改変ヌクレオチドの少なくとも１つの領域、およびＲＮａｓｅ  Ｈ切断のための基質である領域を含有する。
【０１６７】
一実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増大させるように改変された少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのその標的に対する親和性は、上記オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度である、オリゴヌクレオチド／標的対のＴｍを測定することによって日常的に決定され、解離は、分光光度法で検出される。上記Ｔｍがより高いほど、上記オリゴヌクレオチドの上記標的に対する親和性がより大きい。一実施形態では、標的ｍＲＮＡ結合親和性を増大させるように改変されたオリゴヌクレオチドの領域は、その糖の２’位で改変された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ−改変ヌクレオチドを含む。そのような改変は、オリゴヌクレオチド中に日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する、２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示された。そのような親和性増大の効果は、標的遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害を大いに増強することである。
【０１６８】
別の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅ）は、ＲＮＡｓｅ  Ｈのための基質として作用する領域を含む。もちろん、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される様々な改変の任意の組合せを含むことができることが理解される。
【０１６９】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変は、上記オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する上記オリゴヌクレオチドの１つまたは複数の部分またはコンジュゲートへの化学的連結を伴う。そのようなコンジュゲート、およびそのようなコンジュゲートを調製する方法は、当技術分野で公知である。
【０１７０】
当業者は、治療効力などのｉｎ  ｖｉｖｏでの有用性について、妥当な経験則により、その配列のチオエート化型が、遊離形態で機能する場合、任意の化学的性質の、同じ配列のそのカプセル化された粒子も有効なことを認識することになる。カプセル化された粒子は、より広範囲のｉｎ  ｖｉｖｏでの有用性も有することができ、アンチセンス療法に対して他の方法では応答性であることが公知でない状態およびモデルにおいて効力を示す。当業者は、本発明を適用して、当業者が、アンチセンス療法に今度は応答する古いモデルを見つけることができることが分かる。さらに、当業者は、廃棄したアンチセンス配列または化学反応（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を再び採り上げ（ｒｅｖｉｓｉｔ）、本発明を使用することによって効力を見出すことができる。
【０１７１】
本発明によって使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知技法によって、好都合なことに、かつ日常的に作製することができる。そのような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの供給業者によって販売されている。そのような合成のための任意の他の手段も使用することができ、上記オリゴヌクレオチドの実際の合成は、通常の技術者（ｒｏｕｔｉｎｅｅｒ）の才能の十分範囲内である。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技法を使用することも周知である。
【０１７２】
核酸−脂質粒子の特性
ある特定の実施形態では、本発明は、核酸が、脂質層内にカプセル化された脂質−カプセル化核酸粒子を製造するための方法および組成物に関する。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み込んでいるそのような核酸−脂質粒子は、（１）脂質に対する薬物の比；（２）カプセル化効率；および（３）粒径を含めた、様々な生物物理学的パラメーターを使用して特徴付けられる。脂質に対する高い薬物の比（ｒａｔｉｏｎｓ）、高いカプセル化効率、良好なヌクレアーゼ耐性および血清安定性、ならびに制御可能な粒径（一般に２００ｎｍ未満）の直径が所望される。さらに、上記核酸ポリマーの性質は重要であり、その理由は、ヌクレアーゼ耐性を付与する取り組みにおける核酸の改変が、治療剤の費用を増す一方で、多くの場合において、限られた耐性しかもたらさないためである。別段の言明のない限り、これらの判定基準は、本明細書において以下のように計算される：
脂質に対する核酸の比は、規定体積の製剤中の核酸の量を、同じ体積中の脂質の量で除したものである。これは、モル当たりのモルに基づき、または重量当たりの重量に基づき、またはモル当たりの重量に基づくことができる。最終的な、投与がすぐできる製剤について、上記核酸：脂質の比は、透析、クロマトグラフィーおよび／または酵素（例えば、ヌクレアーゼ）消化が使用されることによって、可能な限り多くの外部の核酸が除去された後に計算される；
カプセル化効率は、出発混合物が有する脂質に対する薬物の比を、最終的な、投与できる製剤が有する脂質に対する薬物の比で除したものを指す。これは、相対的な効率の尺度である。絶対的な効率の尺度について、上記投与できる製剤に最終的になる、上記出発混合物に加えられた核酸の総量も計算することができる。製剤化プロセスの間に失われる脂質の量も計算することができる。効率は、上記製剤の損失および費用の尺度である；
サイズは、上記形成される粒子のサイズ（直径）を示す。サイズ分布は、Ｎｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ３７０サブミクロン粒子サイザーで、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して求めることができる。２００ｎｍ未満の粒子が、新血管新生した（漏出性の）組織、例えば、新生物および炎症部位などへの分配に好適である。
【０１７３】
医薬組成物
本発明の脂質粒子は、特に治療剤と結合する場合、例えば、投与経路および標準的な薬学的実施法（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って選択される、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体、例えば、生理食塩水、またはホスフェートバッファーなどをさらに含む、医薬組成物として製剤化することができる。
【０１７４】
特定の実施形態では、本発明の脂質−核酸粒子を含む医薬組成物は、標準的な技法に従って調製され、薬学的に許容される担体をさらに含む。一般に、ノーマルセーラインが、薬学的に許容される担体として使用されることになる。他の適当な担体として、安定性を増強するための糖タンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含む、例えば、水、緩衝用水、０．９％の食塩水、０．３％のグリシンなどが挙げられる。食塩水または他の塩を含有する担体を含む組成物では、上記担体は、脂質粒子形成の後に添加されることが好ましい。したがって、上記脂質−核酸組成物が形成された後、上記組成物を、ノーマルセーラインなどの薬学的に許容される担体中に希釈することができる。
【０１７５】
得られた医薬製剤は、従来の、周知の滅菌技法によって滅菌することができる。次いでこの水溶液は、使用するために包装し、または無菌条件下で濾過し、凍結乾燥することができ、上記凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水溶液と合わされる。上記組成物は、生理的条件に近づけるのに必要とされるような、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを含有することができる。さらに、その脂質懸濁液は、貯蔵中にフリーラジカル損傷および脂質過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含むことができる。α−トコフェロールなどの親油性フリーラジカルクエンチャー、およびフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレーターが適当である。
【０１７６】
医薬製剤中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は、広く、すなわち、約０．０１重量％未満から１０〜３０重量％ほどまで、通常、約０．０５〜５重量％において、または少なくとも約０．０５〜５重量％から、１０〜３０重量％ほどまで変更することができ、選択される特定の投与方法に従って、流体体積、粘度などによって主に選択される。例えば、上記濃度は、治療に伴う流体負荷を下げるために増加させることができる。これは、アテローム性動脈硬化症に関連したうっ血性心不全、または重度の高血圧症を有する患者において特に望ましい場合がある。あるいは、刺激性脂質からなる複合体を、希釈して低濃度にすることによって、投与部位での炎症を和らげることができる。実施形態の１つの群では、上記核酸は、付加した標識を有し、診断に使用される（相補性核酸の存在を示すことによって）。この場合では、投与される複合体の量は、使用される特定の標識、診断されている疾患状態、および臨床医の判断に依存することになるが、一般に、体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇと約５０ｍｇの間、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇと約５ｍｇの間となる。
【０１７７】
上記したように、本発明の核酸−脂質粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）改変リン脂質、ＰＥＧ−セラミド、またはガングリオシドＧＭ１−改変脂質、または凝集を防止もしくは制限するのに有効な他の脂質を含むことができる。そのような成分の添加は、複合体の凝集を単に防止するだけではない。むしろこれは、循環寿命を増加させ、上記脂質−核酸組成物のその標的組織への送達を増大させるための手段も提供することができる。
【０１７８】
本発明は、キット形態での脂質−治療剤組成物も提供する。上記キットは典型的には、上記キットの様々な要素を収容するために区画に分けられた容器からなる。上記キットは、本発明の粒子または医薬組成物を、好ましくは脱水形態または濃縮形態で、これらを再水和または希釈および投与するための指示書と共に含有する。ある特定の実施形態では、上記粒子は活性剤を含み、一方、他の実施形態では、粒子は活性剤を含まない。
【０１７９】
Ｄ．製造方法
本発明の方法および組成物は、特定のカチオン性脂質を使用し、その合成、調製および特徴付けを、以下および添付の実施例に記載する。加えて、本発明は、治療薬（例えば核酸）に関連する脂質粒子を含む、脂質粒子の調製法を提供する。一般に、核酸−脂質粒子の任意の調製方法は、得られた核酸−脂質粒子中に本発明の１種または複数種の脂質を使用することによって、本発明に従って使用できる。適切な方法の例は、当分野において公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１３４１８９号に記載されている。
【０１８０】
一実施形態では、脂質混合物を、核酸の緩衝水溶液と組み合わせ、脂質粒子内にカプセル化された核酸を含有する、中間混合物を作製し、上記カプセル化核酸は、核酸／脂質の比が約３ｗｔ％対約２５ｗｔ％、好ましくは５ｗｔ％対１５ｗｔ％で存在する。上記中間混合物は、場合により、脂質−カプセル化核酸粒子が得られるようにサイズ化でき、上記脂質部分は、好ましくは直径３０ｎｍから１５０ｎｍ、より好ましくは約４０ｎｍから９０ｎｍを有す単層ベシクルである。その後、そのｐＨを上げ、上記脂質−核酸粒子の少なくとも表面荷電部分を中和し、したがって、少なくとも部分的に表面が中和された（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ）脂質−カプセル化核酸組成物を提供する。
【０１８１】
上記のように、これらのカチオン性脂質のいくつかはそのアミノ基のｐＫａより低いｐＨで荷電しており、そのｐＫａより高いｐＨで実質的に中性であるアミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と呼ばれ、２工程の方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）を使用して本発明の製剤に使用できる。第１に、脂質ベシクルは、滴定可能なカチオン性脂質および他のベシクル成分を用いて、核酸の存在下で、より低いｐＨにおいて形成できる。この手法において上記ベシクルはカプセル化し、上記核酸を封入するものである。第２に、新しく形成されたベシクルの表面電荷は、その媒体のｐＨを、存在する滴定可能なカチオン性脂質のｐＫａを超えるレベル、すなわち、生理的ｐＨまたはそれより高いレベルに上げることによって中和できる。任意の特定の理論に縛られるつもりはないが、非常に高い効率の核酸カプセル化は、低ｐＨにおける静電相互作用の結果であると考えられる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）において、上記ベシクル表面は荷電しており、静電相互作用を介して上記核酸の一部と結合する。外部酸性バッファーを、より中性のバッファー（例えば、ｐＨ７．５）に交換した場合、上記脂質粒子またはリポソームの表面は中和され、任意の外部核酸を除去することができる。上記製剤化方法についてのより詳細な情報は、様々な刊行物（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号）において提供される。本方法の特に有利な態様は、表面に吸着された任意の核酸の容易な除去および中性表面を有する得られた核酸送達ビヒクルの両方を含む。中性表面を有するリポソームまたは脂質粒子は、循環からの急速なクリアランスを避け、カチオン性リポソーム調製物に伴う特定の毒性を避けることが期待される。この手法で形成されたベシクルは、高含有量の核酸を有する均一なベシクルサイズの製剤を提供することもさらに留意されたい。加えて、上記ベシクルは、約３０ｎｍから約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０ｎｍから約９０ｎｍの範囲のサイズを有する。核酸−脂質粒子の製剤中のこのような滴定可能なカチオン性脂質のこれらの使用に関するさらなる詳細は、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号に提供されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
ある実施形態では、上記脂質混合物は、少なくとも２種の脂質成分：そのｐＫａより低いｐＨにおいてカチオン性であり、そのｐＫａを超えるｐＨにおいて中性であるようなｐＫａを有する脂質の中から選択される、本発明の第１のアミノ脂質成分および脂質−核酸粒子形成の間に粒子の凝集を防ぐ脂質の中から選択される第２の脂質成分を含む。特定の実施形態では、上記アミノ脂質は、本発明の新規なカチオン性脂質である。
【０１８３】
本発明の核酸−脂質粒子の調製に関するある実施形態では、上記脂質混合物は、典型的には有機溶媒中の脂質溶液である。その後、この脂質混合物を、水性バッファーを用いて水和してリポソームを形成する前に、乾燥して薄膜を形成する、または凍結乾燥して粉末を形成できる。または、好ましい方法において、上記脂質混合物を、水混和アルコール、例えばエタノールにおいて可溶化し、このエタノール溶液を水性バッファーに加え、自発的なリポソームの形成を得ることができる。大部分の実施形態では、上記アルコールは市販の形態で使用される。例えば、エタノールを無水エタノール（１００％）として、または９５％エタノール（その残りは水である）として使用できる。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号にさらに詳細に記載されている。
【０１８４】
一例示的実施形態では、上記脂質混合物は、カチオン性アミノ脂質、中性脂質（アミノ脂質以外）、ステロール（例えば、コレステロール）およびアルコール溶媒中のＰＥＧ改変脂質（例えば、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）である。ある実施形態では、上記脂質混合物は、本質的にカチオン性アミノ脂質、中性脂質、コレステロールおよびアルコール（より好ましくはエタノール）中のＰＥＧ改変脂質からなる。ある実施形態では、その第１の溶液は、モル比が約２０〜７０％のアミノ脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ−改変脂質の上記の脂質混合物からなる。他の実施形態では、上記第１の溶液は、本質的に、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ、より好ましくは、モル比約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなる。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭに置き換えられる。
【０１８５】
本発明に従ったある実施形態では、上記脂質混合物を、核酸を含有できる緩衝水溶液と組み合わせる。この緩衝水溶液は、典型的には、そのバッファーが、上記脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のｐＫａより低いｐＨを有する溶液である。適切なバッファーの例は、シトレート、ホスフェート、アセテートおよびＭＥＳを含む。特に好ましいバッファーは、シトレートバッファーである。好ましいバッファーは、１〜１０００ｍＭの範囲のアニオンであり、カプセル化される核酸の化学的性質に依存し、バッファー濃度の最適化は高い負荷レベルを達成するために重要であり得る（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号を参照されたい）。または、塩化物、硫酸塩などを用いてｐＨ５〜６に酸性化した純水も有用であり得る。この場合、５％のグルコースまたは別の非イオン性溶質（上記粒子を透析し、エタノールを除去し、そのｐＨを上昇させ、または薬学的に許容される担体、例えばノーマルセーラインと混合するときに、上記粒子膜を通過する浸透ポテンシャル（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）のバランスを取る）を加えることが適切であり得る。バッファー中の核酸の量は変動可能であるが、通常約０．０１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬである。
【０１８６】
上記脂質混合物と上記治療用核酸の緩衝水溶液とを組み合わせ、上記中間混合物を提供する。中間混合物は、典型的にはカプセル化された核酸を有する脂質粒子の混合物である。加えて、上記中間混合物は、上記脂質粒子表面上の負に荷電した核酸および正に荷電した脂質のイオンの引力（プロトン化可能な第１の脂質成分を構成しているアミノ脂質または他の脂質は、上記脂質のプロトン化可能な基のｐＫａより低いｐＨを有するバッファー中で正に荷電している）により、上記脂質粒子（リポソームまたは脂質ベシクル）表面に結合した核酸のいくつかの部分をさらに含有することができる。好ましい実施形態の１群では、上記脂質混合物は脂質のアルコール溶液であり、上記溶液の個々の体積は、組合せる際にの得られたアルコール含有量が、体積で約２０％から体積で約４５％であるように調整される。上記混合物の組合せ方法は、任意の様々な方法を含むことができ、多くの場合製造する製剤の規模に依存する。例えば、その全体積が約１０〜２０ｍＬまたはそれ未満である場合、上記溶液は試験管中で組み合わせ、ボルテックスミキサーを使用して一緒に攪拌できる。大規模な方法は、適切な製造規模のガラス器具において実施できる。
【０１８７】
場合により、上記脂質混合物と上記治療薬（核酸）の緩衝水溶液とを組み合わせることによって作製される上記脂質−カプセル化治療薬（例えば、核酸）複合体は、所望のサイズ範囲および比較的狭い脂質粒径分布を得るようにサイズ化できる。好ましくは、本明細書において提供する組成物は平均直径約７０ｎｍから約２００ｎｍ、より好ましくは約９０ｎｍから約１３０ｎｍにサイズ化される。いくつかの技術が、リポソームを所望のサイズにサイズ化するために適用可能である。１つのサイズ化の方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載され、これは本明細書に参照により組み込まれる。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のどちらかによるリポソーム懸濁液の超音波処理は、約０．０５ミクロン未満のサイズの小型単層ベシクル（ＳＵＶ）に漸進的サイズ減少を起こす。均質化は、大型リポソームをより小さなリポソームに断片化するせん断エネルギーに頼る別の方法である。典型的な均質化手順において、多層ベシクルは、標準的エマルジョンホモジナイザーを介して、選択されたリポソームサイズ、典型的には約０．１および０．５ミクロンの間が観察されるまで再循環させる。両方の方法において、上記粒径分布は、従来のレーザー光粒径決定によりモニターできる。本明細書における特定の方法に関して、押し出しを使用して、均一なベシクルサイズを得る。
【０１８８】
細孔ポリカーボネート膜または非対照セラミック膜を介するリポソーム組成物の押し出しは、比較的正確に規定された（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）サイズ分布をもたらす。典型的には、その懸濁液を、所望のリポソーム複合体のサイズ分布が得られるまで１回または複数回膜を通して循環させる。上記リポソームは、連続的に細孔膜を介して押し出され、徐々にリポソームサイズの減少を達成できる。ある場合には、形成される脂質−核酸組成物は、サイズ化すること無しに使用できる。
【０１８９】
特定の実施形態では、本発明の方法は、上記脂質−核酸組成物の脂質部分上の表面電荷の少なくとも一部を中和する工程をさらに含む。表面電荷の少なくとも部分的中和により、非カプセル化核酸は上記脂質粒子表面から離れ、従来技術を使用する上記組成物から除去できる。好ましくは、非カプセル化核酸および表面吸着核酸は、バッファー溶液の交換を介して得られた組成物から除去される。例えば、シトレートバッファーの（ｐＨ約４．０、上記組成物の形成に使用）ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ  ｐＨ約７．５）溶液による置き換えは、リポソーム表面の中和および上記表面からの核酸遊離がもたらされる。上記離れた核酸は、次いで、標準的方法を使用するクロマトグラフィーを介して除去でき、その後使用した脂質のｐＫａを上回るｐＨのバッファーに切り替える。
【０１９０】
場合により、上記脂質ベシクル（すなわち、脂質粒子）は、水性バッファーにおける水和によって形成でき、上記核酸の添加前に上記の方法のうちのいずれかを使用して、プリフォームドベシクル（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＰＦＶ）法に従ってサイズ化できる。上記のように、上記水性バッファーは、上記アミノ脂質のｐＫａより低いｐＨのバッファーでなくてはならない。その後、上記核酸溶液を、これらのサイズ化した、プリフォームドベシクルに加えることができる。核酸を、このような「プリフォームド」ベシクル内にカプセル化するために、上記混合物は、アルコール、例えばエタノールを含有しなくてはならない。エタノールの場合、エタノールは、約２０％（ｗ／ｗ）から約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在しなくてはならない。さらに、プリフォームドベシクルと、水性バッファー−エタノール混合物中の核酸との混合物を、上記脂質ベシクルの組成および上記核酸の性質に依存して、約２５℃から約５０℃の温度に暖める必要があり得る。当業者には、上記脂質ベシクル中で所望の核酸レベルを得るためのカプセル化方法の最適化は、変数、例えばエタノール濃度および温度の操作を必要とすることが明らかである。核酸のカプセル化のための適切な条件の例は、本実施例に提供する。上記核酸を、上記プリフォームドベシクル内に一旦カプセル化すると、その外部ｐＨを上昇させ、上記表面電荷を少なくとも部分的に中和させることができる。その後、非カプセル化核酸および表面吸着核酸を、上記のように除去できる。
【０１９１】
他の実施形態では、核酸−脂質粒子を、連続混合法、例えば、ｓｉＲＮＡなどの核酸を含む水溶液を第１の容器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）に提供する工程および第２の容器に有機脂質溶液を提供する工程および上記核酸をカプセル化するリポソームを実質的に瞬時に生成させるために上記有機溶液を上記水溶液と混合するように、上記水溶液と上記有機脂質溶液とを混合する工程を含む方法を介して調製する。この方法およびこの方法を実施するための装置は、米国特許出願公開第２００４／０１４２０２５号に詳細に記載されている。
【０１９２】
別の実施形態では、核酸脂質粒子は、リポソーム溶液を形成する工程、および上記リポソーム溶液を、調節された量の希釈バッファーを含有する回収器（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｅｓｓｅｌ）に迅速かつ直接導入する工程を含む、直接希釈法を介して作製される。ある実施形態では、上記回収器は、上記回収器の内容物を攪拌し、希釈を容易にするために構成された１つまたは複数の要素を含む。他の実施形態では、希釈バッファーを含有する第３の容器が、第２の混合領域に流動的に連結されている。この実施形態では、第１の混合領域において形成されたリポソーム溶液は、第２の混合領域において希釈バッファーと迅速かつ直接混合される。これらの直接希釈法を実施するための方法および装置は、米国特許出願公開第２００７／００４２０３１号にさらに詳細に記載されている。
【０１９３】
Ｅ．使用の方法
本発明の脂質粒子を使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて治療薬を細胞に送達できる。特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子を使用して細胞に送達される治療薬は核酸である。上記脂質粒子を使用する様々な方法の以下の記載および関連する本発明の医薬組成物を、核酸−脂質粒子に関連する記載により例示するが、これらの方法および組成物は、このような治療から利益を得る任意の疾患および障害の治療のための任意の治療薬の送達のために容易に適用できることを理解されたい。
【０１９４】
ある実施形態では、本発明は、核酸を細胞内に導入する方法を提供する。細胞内への導入のために好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムである。これらの方法は、本発明の粒子または組成物と上記細胞とを、細胞内送達が起こるために十分な期間接触させることによって実施され得る。
【０１９５】
本発明の組成物は、大部分が任意の細胞型に吸着され得る。一旦吸着されたら、上記核酸−脂質粒子は、上記細胞の一部によりエンドサイトーシスされ、脂質と細胞膜が交換され得るか、または上記細胞と融合できるかのどちらかである。その複合体の核酸部分の輸送または取りこみは、これらの経路の任意の１つを介して起こり得る。本発明の範囲に関して限定する意図のものではないが、粒子がエンドサイトーシスにより上記細胞内に取り込まれる場合、次いで上記粒子はエンドソーム膜と相互作用し、おそらく非二重層の相の形成によってエンドソーム膜の不安定化をもたらし、上記細胞の細胞質内へのカプセル化核酸の導入をもたらすと考えられる。同様に、上記粒子と上記細胞の細胞膜の直接融合の場合、融合が起こったとき、そのリポソーム膜は上記細胞膜に組み込まれ（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）、上記リポソームの内容物は細胞内液と組み合わせられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する場合，上記細胞および上記脂質−核酸組成物間の接触は、生物学的に適合した媒体において起こる。上記組成物の濃度は、特定の適用に依存して大きく変動可能であるが、一般に約１μｍｏｌおよび約１０ｍｍｏｌの間である。ある実施形態では、上記脂質−核酸組成物を用いた上記細胞の処理は、一般に生理学的温度（約３７℃）において約１から２４時間、好ましくは約２から８時間の期間実施される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの適用のために、培養において成長した任意の細胞（植物または動物起源のどちらの細胞、脊椎動物または無脊椎動物のどちらの細胞および任意の組織または型のどちらの細胞）に上記核酸を送達できる。好ましい実施形態では、上記細胞は動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【０１９６】
実施形態の１群では、脂質−核酸粒子懸濁液を、約１０３から約１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍＬの細胞密度を有する６０〜８０％に集密的に播種された（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｐｌａｔｅｄ）細胞に加える。上記細胞に加えた懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１から２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬである。
【０１９７】
典型的な適用は、ｓｉＲＮＡの細胞内送達を提供し、特異的細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングする周知の手順を使用する工程を含む。または、適用は、治療的に有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。この手法において、療法は、欠損しているかまたは存在しない遺伝子産物を供給することによって遺伝子疾患に対して提供される（すなわち、デュシェーヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｂｒｉｔ．  Ｍｅｄ．  Ｂｕｌｌ．４５巻（３号）：６３０〜６４３頁（１９８９年）を参照されたい、および嚢胞性線維症に関しては、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：１０２〜１０３頁（１９８９年）を参照されたい）。本発明の組成物の他の使用は、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入を含む（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．４１巻：１０２３〜１０３３頁（１９９２年）を参照されたい）。
【０１９８】
または、本発明の組成物は、当業者に公知の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏの核酸の細胞内への送達にも使用できる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達に関する本発明の適用に関して、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻：２０９〜２１１頁（１９９３年）は、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を使用する、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達を記載している。参照により本明細書に組み込まれるＨｙｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２巻：２５０〜２５６頁（１９９３年）は、リポソームを使用する、マウスの肺中の気道上皮および肺胞への嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達を記載している。参照により本明細書に組み込まれるＢｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ２９８巻：２７８〜２８１頁（１９８９年）は、細胞内酵素のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能的原核細胞遺伝子を用いた、マウスの肺のｉｎ  ｖｉｖｏのトランスフェクションを記載している。したがって、本発明の組成物は、感染性疾患の治療に使用できる。
【０１９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために、上記医薬組成物は、非経口、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内の投与が好ましい。特定の実施形態では、上記医薬組成物は、ボーラス注入により静脈内または腹腔内投与される。一例として、参照により本明細書に組み込まれるＳｔａｄｌｅｒら、米国特許第５，２８６，６３４号を参照されたい。細胞内の核酸送達は、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１０１巻：５１２〜５２７頁（１９８３年）；Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６巻：６８２〜６９０頁（１９８８年）；Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．６巻：２３９〜２７１頁（１９８９年）およびＢｅｈｒ、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２６巻：２７４〜２７８頁（１９９３年）においても議論されている。脂質に基づく治療薬を投与するさらに他の方法は、例えば、Ｒａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ、米国特許第４，１４５，４１０号；  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号およびＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号にも記載されている。
【０２００】
他の方法において、上記医薬調製物は、上記調製物の上記標的組織への直接適用によって、上記標的組織と接触させることができる。この適用は、局所的、「オープン」または「クローズド」手順により実施できる。「局所的」は、上記医薬調製物を環境にさらされている組織、例えば皮膚、口腔咽頭部、外耳道などに直接適用することを意味する。「オープン」手順は、患者の皮膚の切開および上記医薬調製物を適用する下層にある（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）組織の直接可視化を含む手順である。これは、一般に外科的手順、例えば、肺に接近するための開胸、腹部内臓に接近するための腹式開腹、または上記標的組織への他の直接外科的取り組みによって達成される。「クローズド」手順は、その内部標的組織は直接可視化されないが、皮膚の小さな傷を通して挿入した道具を介して接近する、侵襲的手順である。例えば、上記調製物は、針洗浄によって腹膜に投与できる。同様に、医薬調製物は、脊髄麻酔または脊髄のメトリザミド（ｍｅｔｒａｚａｍｉｄｅ）画像化のために一般的に実施される、腰椎穿刺、その後の患者の適切な位置決めの際の注入によって、髄膜または脊髄に投与できる。または、上記調製物は内視鏡装置を介して投与できる。
【０２０１】
上記脂質−核酸組成物は、さらに、エアゾール吸入により肺に投与でき（Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｓｃｉ．  ２９８巻（４号）：２７８〜２８１頁（１９８９年）を参照されたい）、または疾患部位への直接注入により投与できる（Ｃｕｌｖｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＭａｒｙＡｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７０〜７１頁（１９９４年））。
【０２０２】
本発明の方法は、様々な宿主において実施できる。好ましい宿主は、哺乳動物種、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどである。
【０２０３】
本発明の脂質−治療薬粒子の投与量は、脂質に対する治療薬の比率および患者の年齢、体重、病態に基づく、投与する医師の見解に依存する。
【０２０４】
一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、細胞と、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節できる核酸を伴う、本発明の脂質粒子とを接触させる工程を一般に含む。本明細書において使用する場合、「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」という用語は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の改変を指す。異なる実施形態では、調節は、増加もしくは増強を意味することができ、または低下もしくは減少を意味することができる。標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの測定方法は公知であり、当分野において利用可能であり、例えば、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および免疫組織化学的技術を使用する方法を含む。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルは、適切な対照値と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％を超えて増加または減少する。
【０２０５】
例えば、ポリペプチドの発現の増加を望む場合、上記核酸は、上記所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであってよい。他方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の減少を望む場合、その場合は、上記核酸は、上記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含み、その結果、上記標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を破壊する、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡであってよい。または、上記核酸は、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドであってよい。
【０２０６】
特定の一実施形態では、本発明は、細胞に、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなり、または本質的にそれらからなり、例えば、モル比が、約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡの脂質粒子を提供し、上記脂質粒子が、上記ポリペプチドの発現を調節できる核酸を伴う工程を含む、細胞によるポリペプチドの発現を調製する方法を提供する。特定の実施形態では、上記脂質のモル比は、およそ４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換えられる。他の実施形態では、上記カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡと置き換えられる。
【０２０７】
特定の実施形態では、上記治療薬は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現できるプラスミドから選択され、ここで、上記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体に特異的に結合し、それにより上記ポリペプチドの発現が減少する、ポリヌクレオチドを含む。
【０２０８】
他の実施形態では、上記核酸は、上記ポリペプチドまたはそれらの機能性改変体もしくは断片の発現を増加させるような、上記ポリペプチドまたはそれらの機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドである。
【０２０９】
関連する実施形態では、本発明は、被験体に本発明の医薬組成物を提供する工程を含む、上記被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害の治療方法を提供し、上記治療薬はｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現できるプラスミドから選択され、上記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体と特異的に結合するポリヌクレオチドを含む。
【０２１０】
一実施形態では、上記医薬組成物は、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなり、または本質的にそれらからなり、モル比が、例えば、約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡの脂質粒子を含み、上記脂質粒子は上記治療用核酸を伴う。特定の実施形態では、上記脂質のモル比は、およそ４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換えられる。他の実施形態では、上記カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡで置き換えられる。
【０２１１】
別の関連する実施形態では、本発明は、被験体に本発明の医薬組成物を提供する工程を含み、上記治療薬が、ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドである、上記被験体における上記ポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害の治療方法を含む。
【０２１２】
一実施形態では、上記医薬組成物は、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなり、または本質的にそれらからなり、モル比が、例えば、約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡの脂質粒子を含み、上記脂質粒子は上記治療用核酸を伴う。特定の実施形態では、上記脂質のモル比は、およそ４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭで置き換えられる。他の実施形態では、上記カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡで置き換えられる。
【０２１３】
本発明は、被験体に本発明の医薬組成物を提供する工程を含み、上記治療薬が免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、上記被験体において免疫応答を誘導する方法をさらに提供する。ある実施形態では、上記免疫応答は液性または粘膜性の免疫応答である。一実施形態では、上記医薬組成物は、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなり、または本質的にそれらからなり、モル比が、例えば、約２０〜６０％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡの脂質粒子を含み、上記脂質粒子は上記治療用核酸を伴う。特定の実施形態では、上記脂質のモル比は、およそ４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭで置き換えられる。他の実施形態では、上記カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡで置き換えられる。
【０２１４】
さらなる実施形態では、上記医薬組成物は、ワクチンまたは抗原と組み合わせて上記被験体に提供される。したがって、本発明それ自体が、本発明の脂質粒子を含むワクチンを提供し、本発明の脂質粒子は免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含み、免疫応答が望まれる抗原を伴う。特定の実施形態では、上記抗原は腫瘍抗原であり、または感染性病原体（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、例えば、ウイルス、細菌または寄生生物などに関連する抗原である。
【０２１５】
様々な腫瘍抗原、感染性病原体抗原および他の疾患に関連する抗原は、当分野において周知であり、これらの例は本明細書に引用した参考文献に記載されている。本発明における使用に適切な抗原の例は、限定はしないが、ポリペプチド抗原およびＤＮＡ抗原を含む。抗原の具体的な例は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、天然痘、ポリオ、炭疽、インフルエンザ、チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核および風疹の抗原である。好ましい実施形態では、上記抗原はＢ型肝炎組換え抗原である。他の態様では、上記抗原はＡ型肝炎組換え抗原である。別の態様では、上記抗原は腫瘍抗原である。このような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原およびバーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫に関連する抗原である。さらなる態様では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原組換え抗原である。当業者は、本発明における使用に適切な他の抗原を知っている。
【０２１６】
本発明における使用に適切な腫瘍関連抗原は、単一型腫瘍の指標となり得る、いくつかの腫瘍型の間で共有される、および／または正常細胞と比較して腫瘍細胞においてもっぱら発現するもしくは過剰発現する、変異分子および非変異分子の両方を含む。タンパク質および糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質およびムチンの発現の腫瘍特異的パターンもまた、確認されている。上記被験体での癌ワクチンの使用のための例示的腫瘍関連抗原は、癌遺伝子のタンパク質産物、腫瘍抑制遺伝子および腫瘍細胞に特有の変異または再構成を有する他の遺伝子、再活性化胚性遺伝子産物、癌胎児性抗原、（腫瘍特異的ではないが）組織特異的分化抗原、成長因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来ウイルスタンパク質およびいくつかの他の自己タンパク質を含む。
【０２１７】
腫瘍関連抗原の具体的実施形態は、例えばＲａｓ  ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３およびＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子のタンパク質産物などの変異抗原、ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８およびベータカテニン；過剰発現抗原、例えば、ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２およびＫＳＡ、癌胎児性抗原、例えばアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；自己抗原、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびメラニン細胞分化抗原、例えば、Ｍａｒｔ  １／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１およびＴＲＰ２；前立腺関連抗原、例えば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１およびＰＳＭ−Ｐ２；再活性化胚性遺伝子産物、例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥおよび他の精巣癌抗原（ｃａｎｃｅｒ  ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２およびＳＣＰ１；ムチン、例えば、Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２；ガングリオシド、例えば、ＧＭ２、ＧＤ２およびＧＤ３、中性糖脂質ならびに糖タンパク質、例えばＬｅｗｉｓ（ｙ）およびｇｌｏｂｏ−Ｈ；ならびに糖タンパク質、例えば、Ｔｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）およびｓＴｎを含む。本明細書において、腫瘍関連抗原は、全細胞および腫瘍細胞溶解物ならびにそれらの免疫原性部分ならびにＢ細胞リンパ腫に対する使用のために、モノクローナル増殖のＢリンパ球に発現した免疫グロブリンイディオタイプをさらに含む。
【０２１８】
病原体は、限定はしないが、感染性病原体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）、例えば、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染するウイルスを含む。感染性ウイルスの例は、限定はしないが、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ−ＩＩＩとも称される）；および他の単離株、例えばＨＩＶ−ＬＰ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｈｄａｅ（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血性熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分がアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海面状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損型サテライトであると考えられている）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原因子（クラス１＝内因的に（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ）伝染するもの；クラス２＝非経口的に伝染するもの（すなわちＣ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）を含む。
【０２１９】
さらに、グラム陰性菌およびグラム陽性菌は脊椎動物において抗原として機能する。このようなグラム陽性菌は、限定はしないが、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種を含む。グラム陰性菌は、限定はしないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種を含む。感染性細菌の具体的な例は、限定はしないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉを含む。
【０２２０】
病原体のさらなる例は、限定はしないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染する感染性真菌を含む。感染性真菌の例は、限定はしないが、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含む。感染性寄生生物の例は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘを含む。他の感染性生物（すなわち、原生生物）は、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉを含む。
【実施例】
【０２２１】
（実施例１）
２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡは、以下の概略図に示し、以下で述べる通りに合成した。
【０２２２】
【化２１】
2018119016.tif 000032
臭化リノレイル（ＩＩ）の合成
無水エーテル（３００ｍＬ）中のメタンスルホン酸リノレイル（６．２ｇ、１８ｍｍｏｌ）と臭化マグネシウムエーテラート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ｅｔｈｅｒａｔｅ）（１７ｇ、５５ｍｍｏｌ）の混合物を、アルゴン下で終夜（２１時間）攪拌した。得られる懸濁液を３００ｍＬの冷水中に注いだ。振盪した後、その有機相を分離した。その水相をエーテル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。エーテル相を合わせて水（２×１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、無水のＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、６．５ｇの無色の油状物を得た。粗生成物をシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、３００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサンで溶出した。これにより、６．２ｇ（約１００％）の臭化リノレイル（ＩＩ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４５  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ３．４２  （２Ｈ，  ｔ，  ＣＨ２Ｂｒ），  ２．７９  （２Ｈ，  ｔ，  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．０６  （４Ｈ，  ｑ，  ２  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．８７  （２Ｈ，  五重線，  ＣＨ２），  １．２−１．５  （１６Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （３Ｈ，  ｔ，  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２２３】
ジリノレイルメタノール（ＩＩＩ）の合成
無水エーテル２００ｍＬ中のＭｇ旋削くず（ｔｕｒｎｉｎｇ）（０．４５ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）とヨウ素結晶１個の懸濁液に、窒素下、無水エーテル５０ｍＬ中の臭化リノレイル（ＩＩ）溶液を室温で加えた。得られる混合物を窒素下で終夜還流させた。その混合物を室温に冷却した。窒素下でその濁った混合物に、無水エーテル３０ｍＬ中のギ酸エチル（０．６５ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）溶液を室温で滴下添加した。添加後、その混合物を室温で終夜（２０時間）攪拌した。そのエーテル層を１０％のＨ２ＳＯ４水溶液（１００ｍＬ）、水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、５．０ｇの淡色の油状物を得た。ヘキサン中０〜７％の勾配のエーテル溶液を溶離液として用いてシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、３００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーにかけ、ジリノレイルメタノール（２．０ｇ、ＩＩＩ）とジリノレイルメチルホルメート（１．４ｇ、ＩＶ）の２種の生成物を得た。ジリノレイルメチルホルメート  （ＩＶ）についての１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ８．１０  （１Ｈ，  ｓ，  ＣＨＯ），  ５．２７−５．４５  （８Ｈ，  ｍ，  ４  ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ４．９９  （１Ｈ，  五重線，  ＯＣＨ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．０６  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．５−１．６  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  １．２−１．５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２２４】
ジリノレイルメチルホルメート（ＩＶ、１．４ｇ）およびＫＯＨ（０．２ｇ）を、８５％のＥｔＯＨ中、窒素下、室温で終夜攪拌した。反応が完了した後、その溶媒の半分を蒸発させた。得られる混合物を１５０ｍＬの５％ＨＣＬ溶液中に注いだ。その水相をエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した。エーテル抽出物を合わせて水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させ、１．０ｇのジリノレイルメタノール（ＩＩＩ）を無色の油状物として得た。全体で３．０ｇ（６０％）のジリノレイルメタノール（ＩＩＩ）を得た。ジリノレイルメタノール  （ＩＩＩ）についての１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ｐｐｍ。
【０２２５】
ジリノレイルケトン（Ｖ）の合成
ＣＨ２Ｃｌ２  １００ｍＬ中のジリノレイルメタノール（２．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）および無水炭酸ナトリウム（０．２ｇ）の混合物に、クロロクロム酸ピリジニウム（ｐｙｄｉｍｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏｍａｔｅ）（ＰＣＣ、２．０ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を加えた。得られる懸濁液を室温で６０分間攪拌した。次いでその混合物にエーテル（３００ｍＬ）を加え、得られる褐色の懸濁液をシリカゲルパッドを通して濾過した（３００ｍＬ）。そのシリカゲルパッドをエーテル（３×２００ｍＬ）でさらに洗浄した。エーテル濾液および洗液を合わせた。その溶媒を蒸発させ、３．０ｇの油性残留物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ヘキサン中０〜３％のエーテルを用いて溶出することによるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、２５０ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、１．８ｇ（９０％）のジリノレイルケトン（Ｖ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２５−５．４５  （８Ｈ，  ｍ，  ４  ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．３９  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＯＣＨ２），  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．４５−１．７  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２２６】
２，２−ジリノレイル−４−ブロモメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＶＩ）の合成
トルエン  ２００ｍＬ中のジリノレイルメタノール（Ｖ、１．３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、３−ブロモ−１，２−プロパンジオール（１．５ｇ、９．７ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸水和物（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅ  ｓｕｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒａｔｅ）（０．１６ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ管を用いて３日間還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水（２×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させ、黄色がかった油性残留物を得た。ヘキサン中０〜６％の勾配のエーテルを溶離液として用いてシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）のカラムクロマトグラフィーを行い、０．１ｇの純粋なＶＩ、およびＶＩと出発材料の混合物１．３ｇを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４５  （８Ｈ，  ｍ，  ４  ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ４．２８−４．３８  （１Ｈ，  ｍ，  ＯＣＨ），  ４．１５  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＯＣＨ），  ３．８０  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＯＣＨ），  ３．４７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＣＨＢｒ），  ３．３０  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＣＨＢｒ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．０６  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．５２−１．６８  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  １．２２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．８６−０．９４  （６Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２２７】
２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
２，２−ジリノレイル−４−ブロモメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＶＩ）とジリノレイルケトン（Ｖ）の混合物１．３ｇを含有する無水ＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）中に、無水ジメチルアミンを０℃で１０分間バブリングした（ｂｕｂｂｌｅｄ）。次いで反応フラスコを密閉し、その混合物を室温で６日間攪拌した。その溶媒を蒸発させて、１．５ｇの残留物を得た。粗生成物を、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中０〜５％の勾配のメタノールで溶出した。これにより、０．８ｇの所望の生成物ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２５−５．４５  （８，  ｍ，  ４ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ４．２８−４．４  （１Ｈ，  ｍ，  ＯＣＨ），  ４．１  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＯＣＨ），  ３．５３  （１Ｈ，  ｔ  ＯＣＨ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．５−２．６５  （２Ｈ，  ｍ，  ＮＣＨ２），  ２．４１  （６Ｈ，  ｓ，  ２  ｘ  ＮＣＨ３），  ２．０６  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．５６−１．６８  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  １．２２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２２８】
（実施例２）
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎＤＭＡは、以下で述べる通りに合成した。
【０２２９】
【化２２】
2018119016.tif 000033
無水ベンゼン  １２０ｍＬ中のＮａＨ（９５％、５．２ｇ、０．２０６ｍｏｌ）懸濁液に、無水ベンゼン  ４０ｍＬ中のＮ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン−１，２−ジオール（２．８ｇ、０．０２３５ｍｏｌ）をアルゴン下で滴下添加した。添加後、得られる混合物を室温で１５分間攪拌した。前記混合物に、無水ベンゼン  ７５ｍＬ中のメタンスルホン酸リノレイル（９９％、２０ｇ、０．０５８ｍｏｌ）を、アルゴン下にて室温で滴下添加した。室温で３０分間攪拌した後、その混合物をアルゴン下で終夜還流させた。冷却した後、得られる懸濁液を、２５０ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼン溶液の滴下によって処理した。その有機相を水（１５０ｍＬ）、ブライン（２×２００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空下でその溶媒を蒸発させて、１７．９ｇのさらりとした（ｌｉｇｈｔ）油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、塩化メチレン中０〜５％の勾配のメタノールを使用するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって２回精製して、１０．４ｇの純粋なＤＬｉｎＤＭＡを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．３５  （８Ｈ，  ｍ，  ＣＨ＝ＣＨ），  ３．５  （７Ｈ，  ｍ，  ＯＣＨ），  ２．７５  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  ２．４２  （２Ｈ，  ｍ，  ＮＣＨ２），  ２．２８  （６Ｈ，  ｓ，  ２  ｘ  ＮＣＨ３），  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  ビニル  ＣＨ２），  １．５６  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  １．２８  （３２Ｈ，  ｍ，  １６  ｘ  ＣＨ２），  ０．８８
（６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２３０】
（実施例３）
２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡは、以下の概略図および記述において示す通りに合成した。
【０２３１】
２，２−ジリノレイル−４−（２−ヒドロキシエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩ）の合成
トルエン  ５０ｍＬ中のジリノレイルケトン（Ｉ、実施例１に記載の通りに予め調製したもの、５２７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、１，３，４−ブタントリオール（工業グレード（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ）、約９０％、２３６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下にて、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水（２×３０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物（０．６ｇ）を得た。その粗生成物を、ジクロロメタンを溶離液に用いたシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、０．５ｇの純粋なＩＩを無色の油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２５−５．４８  （８Ｈ，  ｍ，  ４  ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ４．１８−４．２２  （１Ｈ，  ｍ，  ＯＣＨ），  ４．０８  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＯＣＨ），  ３．８２  （２Ｈ，  ｔ，  ＯＣＨ２），  ３．５３  （１Ｈ，  ｔ，  ＯＣＨ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．０６  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．７７−１．９３  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＨ２），  １．５２−１．６８  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  １．２２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．８６−０．９４  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２３２】
【化２３】
2018119016.tif 000034
２，２−ジリノレイル−４−（２−メタンスルホニルエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩＩ）の合成
無水ＣＨ２Ｃｌ２  ５０ｍＬ中の２，２−ジリノレイル−４−（２−ヒドロキシエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩ、５００ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）および無水（ｄｒｙ）トリエチルアミン（２１８ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下でメタンスルホニル無水物（２９０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた。得られる混合物を室温で終夜攪拌した。その混合物を２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。その有機相を水（２×３０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、５１０ｍｇの黄色がかった油状物を得た。その粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０２３３】
２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）の合成
窒素下にある上記粗製材料（ＩＩＩ）に、ＴＨＦ中の２０ｍＬのジメチルアミン（２．０Ｍ）を加えた。得られる混合物を室温で６日間攪拌した。その溶媒を蒸発させて油性残留物を得た。ジクロロメタン中０〜５％の勾配のメタノールを溶離液に用いたシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーを行い、３８０ｍｇの生成物ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡを淡色の油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４９  （８，  ｍ，  ４ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ４．０１−４．１５  （２Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＯＣＨ），  ３．４９  （１Ｈ，  ｔ  ＯＣＨ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．３４−２．５４  （２Ｈ，  ｍ，  ＮＣＨ２），  ２．３０  （６Ｈ，  ｓ，  ２  ｘ  ＮＣＨ３），  ２．０６  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．６７−１．９５  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＨ２），  １．５４−１．６５  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  １．２２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２３４】
（実施例４）
２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
【０２３５】
【化２４】
2018119016.tif 000035
１，２，５−ペンタントリオールの合成
無水ＴＨＦ  ８０ｍＬ中のＬｉＡｌＨ４（１．７５ｇ）懸濁液に、無水ＴＨＦ  ２０ｍＬ中の（Ｒ）−γ−ヒドロキシメチル−γ−ブタロラクトン（ｂｕｔａｒｏｌａｃｔｏｎｅ）（０．５０ｇ、４ｍｍｏｌ）溶液を、窒素下で滴下添加した。得られる懸濁液を窒素下にて室温で終夜攪拌した。氷水浴を使用して、この混合物に、５．５ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液を極めてゆっくりと加えた。その混合物を窒素下にて終夜さらに攪拌した。その白色固体を濾過し、ＴＨＦ（２×２０ｍＬ）で洗浄した。その濾液および洗液を合わせた。その溶媒を蒸発させて、０．２５ｇの無色の油状物を粗生成物として得た。その粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０２３６】
２，２−ジリノレイル−４−（３−ヒドロキシプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩ）の合成
トルエン  １５０ｍＬ中のジリノレイルケトン（Ｉ、実施例１に記載の通りに予め調製したもの、１．０ｇ、２ｍｍｏｌ）、１，２，５−ペンタントリオール（粗製の、０．２５ｇ、２ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）混合物を、窒素下にて、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水（３×４０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させ、黄色がかった油性残留物（１．１ｇ）を得た。その粗生成物を、ジクロロメタン中０〜１％のメタノールを溶離液に用いたシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、０．９０ｇの純粋なＩＩを無色の油状物として得た。
【０２３７】
２，２−ジリノレイル−４−（３−メタンスルホニルプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩＩ）の合成
無水ＣＨ２Ｃｌ２  １００ｍＬ中の２，２−ジリノレイル−４−（３−ヒドロキシプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩ、０．９０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（０．５１ｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液に、メタンスルホニル無水物（０．７０ｇ、４ｍｍｏｌ）を窒素下で加えた。得られる混合物を室温で終夜攪拌した。有機相を水（２×４０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、１．０ｇの褐色がかった油状物を粗生成物として得た。粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０２３８】
２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ）の合成
上記粗製材料（ＩＩＩ、１．０ｇ）に、窒素下で、ＴＨＦ中ジメチルアミン４０ｍＬ（２．０Ｍ）を加えた。得られる混合物を室温で８日間攪拌した。その固体を濾過した。その溶媒を蒸発させて、橙色の残留物を得た。ヘキサン中０〜４０％の勾配の酢酸エチルを溶離液に用いた、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーを行い、５１０ｇの生成物ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡを淡色の油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２２−５．５０  （８，  ｍ，  ４ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ３．９５−４．１５  （２Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＯＣＨ），  ３．３５−３．５５  （１Ｈ，  ｍ  ＯＣＨ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．４５−２．５５  （２Ｈ，  ｍ，  ＮＣＨ２），  ２．３５  （６Ｈ，  ｓ，  ２  ｘ  ＮＣＨ３），  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．４５−１．７５  （６Ｈ，  ｍ，  ＣＨ２），  １．２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２３９】
（実施例５）
２，２−ジリノレイル−４−（４−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡは、以下で記載し、以下の概略図に示す通りに合成した。
【０２４０】
２，２−ジリノレイル−４−（４−ヒドロキシブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩ）の合成
トルエン  １５０ｍＬ中のジリノレイルケトン（Ｉ、実施例１に記載の通りに予め調製したもの、１．０５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、１，２，６−ヘキサントリオール（０．５４ｇ、４ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下にて、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水（２×６０ｍＬ）、ブライン（６０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物（１．５ｇ）を得た。粗生成物を、ジクロロメタン中０〜０．５％のメタノールを溶離液に用いたシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、１．４ｇの純粋なＩＩを無色の油状物として得た。
【０２４１】
【化２５】
2018119016.tif 000036
２，２−ジリノレイル−４−（４−メタンスルホニルブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩＩ）の合成
無水ＣＨ２Ｃｌ２  １５０ｍＬ中の２，２−ジリノレイル−４−（４−ヒドロキシブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＩＩ、１．４ｇ、２ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（０．７３ｇ、７．２ｍｍｏｌ）溶液に、メタンスルホニル無水物（１．０ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を窒素下で加えた。得られる混合物を室温で終夜攪拌した。その有機相を水（２×７５ｍＬ）、ブライン（７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、１．４５ｇの淡色の油状物を粗生成物として得た。その粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０２４２】
２，２−ジリノレイル−４−（４−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ）の合成
上記粗製材料（ＩＩＩ、１．４５ｇ）に、窒素下で、ＴＨＦ中のジメチルアミン６０ｍＬ（２．０Ｍ）を加えた。得られる混合物を室温で６日間攪拌した。その固体を濾過した。その溶媒を蒸発させて、油性残留物（１．２ｇ）を得た。ジクロロメタン中０〜５％の勾配のメタノールを溶離液に用いた、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーにかけて、０．９５ｇの生成物ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡを淡色の油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２６−５．４９  （８，  ｍ，  ４ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ３．９７−４．１５  （２Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＯＣＨ），  ３．４５  （１Ｈ，  ｔ  ＯＣＨ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．４５−２．５５  （２Ｈ，  ｍ，  ＮＣＨ２），  ２．４０  （６Ｈ，  ｓ，  ２  ｘ  ＮＣＨ３），  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．４５−１．７５  （８Ｈ，  ｍ，  ＣＨ２），  １．２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２４３】
（実施例６）
２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキサン（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
【０２４４】
２，２−ジリノレイル−５−ヒドロキシメチル）−［１，３］−ジオキサン（ＩＩ）の合成
トルエン  １５０ｍＬ中のジリノレイルケトン（Ｉ、実施例１に記載の通りに予め調製したもの、１．０５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（４７５ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下にて、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水（２×６０ｍＬ）、ブライン（６０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、淡色の油状物（１．２ｇ）を得た。その粗生成物を、ジクロロメタン中０〜１％の勾配のメタノールを溶離液に用いたシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、１．０ｇの純粋なＩＩを無色の油状物として得た。
【０２４５】
【化２６】
2018119016.tif 000037
２，２−ジリノレイル−５−メタンスルホニルメチル−［１，３］−ジオキサン（ＩＩＩ）の合成
無水ＣＨ２Ｃｌ２  １２０ｍＬ中の２，２−ジリノレイル−５−ヒドロキシメチル−［１，３］−ジオキサン（ＩＩ、１．０ｇ、１．６ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（４３０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）の溶液に、メタンスルホニル無水物（６００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）を窒素下で加えた。得られる混合物を室温で終夜攪拌した。その有機相を水（２×６０ｍＬ）、ブライン（６０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、１．１ｇの淡色の油状物を得た。その粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０２４６】
２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル）−［１，３］−ジオキサン（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）の合成
上記粗製材料（ＩＩＩ、１．１ｇ）に、窒素下で、ＴＨＦ中のジメチルアミン２０ｍＬ（２．０Ｍ）を加えた。得られる混合物を室温で７日間攪拌した。その溶媒を蒸発させて、油性残留物を得た。ヘキサン中０〜３０％の勾配の酢酸エチルを溶離液に用いた、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーにかけて、２６０ｍｇの生成物ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡを淡色の油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２４−５．５１  （８，  ｍ，  ４ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ４．０４  （２Ｈ，  ｄｄ，  ２  ｘ  ＯＣＨ）），  ３．７５  （２Ｈ，  ｄｄ  ＯＣＨ），  ２．７−２．９  （２Ｈ，  ｂｒ，  ＮＣＨ２），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．５７  （６Ｈ，  ｓ，  ２  ｘ  ＮＣＨ３），  １．９５−２．１７  （９Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２およびＣＨ），  １．６７−１．９５  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＨ２），  １．５４−１．６５  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  １．２２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２４７】
（実施例７）
ジリノレイルメチル３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
【０２４８】
【化２７】
2018119016.tif 000038
ジリノレイルメタノール（ＩＩ）の合成
メタノール中のジリノレイルケトン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ  ｋｅｔｏｎｅ）（Ｉ、１．３ｇ）の溶液（１３０ｍＬ）に、ＮａＢＨ４（０．７ｇ）を加えた。得られる溶液を室温で６０分間攪拌した。その混合物を３００ｍＬの氷水中に注いだ。その水相をエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した。そのエーテル相を合わせて水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物（１．４ｇ）を得た。その粗生成物を、ヘキサン中０〜５％の勾配の酢酸エチルを溶離液に用いたシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、１．１ｇの純粋なＩＩを淡色の油状物として得た。
【０２４９】
ジリノレイルメチル３−ブロモプロピオネート（ＩＩＩ）の合成
無水ＣＨ２Ｃｌ２  ５０ｍＬ中のジリノレイルメタノール（ＩＩ、５６０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（０．４４ｇ、４．２ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で塩化３−ブロモプロピオニル（工業グレード、０．３４ｍＬ）を滴下添加した。得られる混合物を室温で３日間攪拌した。その有機相を５０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、水（３×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、６１０ｍｇの褐色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ヘキサン中０〜３％の勾配の酢酸エチルを溶離液に用いたシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、主生成物としてのＩＩＩと副生成物の混合物５４０ｇを得た。その混合物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０２５０】
ジリノレイルメチル３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
上記混合物（ＩＩＩ、５４０ｍｇ）に、窒素下で、ＴＨＦ中のジメチルアミン１５ｍＬ（２．０Ｍ）を加えた。得られる混合物を室温で８日間攪拌した。その固体を濾過した。その溶媒を蒸発させて、褐色がかった残留物を得た。ジクロロメタン中０〜３％のメタノールを溶離液として、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーを行い、４３０ｍｇの生成物ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡを淡色の油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２５−５．５０  （８，  ｍ，  ４ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ４．７０−５．００  （１Ｈ，  ｑ，  ＯＣＨ），  ２．８−３．０  （２Ｈ，  ｍ，  ＮＣＨ２），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．６−２．７  （２Ｈ，  ｍ，  ＣＯＣＨ２），  ２．４５  （６Ｈ，  ｓ，  ２  ｘ  ＮＣＨ３），  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．４５−１．７５  （４Ｈ，  ｍ，  ＣＨ２），  １．２−１．４５  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９０  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２５１】
（実施例８）
２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−メチルピペラジノ（ｍｅｔｈｙｌｐｅｐｉａｚｉｎｏ）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
【０２５２】
【化２８】
2018119016.tif 000039
工程１
トルエン  ２５ｍＬ中のジリノレイルケトン（Ｉ、１．３ｇｍ、２．５ｍｍｏｌ）、３−ブロモ１，２−プロパンジオール（１．５ｇｍ、９．７ｍｍｏｌ）、およびＰＰＴＳ（ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホネート）（１００ｍｇ）の混合物を、窒素下にて、Ｄｅａｎ−ｓｔａｒｋ管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水（２×５０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物を得た。ヘキサン中０〜５％のエーテルを溶離液に用いた、シリカ（２３０〜４００メッシュ）でのカラムクロマトグラフィーを行い、７５０ｍｇのケタールを得、これを以下のようにメチルピペラジン（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｐｅｒｚｉｎｅ）とさらに反応させた。
【０２５３】
工程２
アセトニトリル  ５ｍＬ中のＤ−Ｌｉｎ−ケタール（ＩＩ、２５０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１３８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の混合物に、モルホリン（５０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られる溶液をアルゴン下にて終夜還流させた。得られる混合物を室温に冷却し、溶媒を蒸発させ、その有機相を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物を得た。シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、５００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって、２５〜５０％のヘキサンおよび酢酸エチルで溶出し、次いでジクロロメタン中０〜５％の勾配のメタノールで溶出した。これにより、２２５ｍｇの所望の生成物Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペラジン（Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）を得た。
【０２５４】
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４６  （８Ｈ，  ｍ），  ４．２１−４．３１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０６−４．０９  （１Ｈ，  ｔ），  ３．４９−３．５７  （１Ｈ，  ｔ）  ３．４９−３．５５  （１Ｈ，  ｔ），  ２．７５−２．８１  （４Ｈ，  ｔ）  ２．４２−２．６２  （８Ｈ，  ｍ），  ２．３０  （３Ｈ，  ｓ），  ２．０２−２．０９  （８Ｈ，  ｍ）  １．５５−１．６５  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （３２  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２５５】
（実施例９）
２，２−ジオレオイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
以下に示す構造を有するＤＯ−Ｋ−ＤＭＡは、最初の出発材料を、メタンスルホン酸リノレイルに代えてメタンスルホン酸オレオイルとしたことを除き、Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを生成する実施例１に記載の方法と同様の方法を使用して調製した。
【０２５６】
【化２９】
2018119016.tif 000040
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．３２−５．４０  （４Ｈ，  ｍ），    ４．２１−４．３１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０６−４．１０  （１Ｈ，  ｔ），  ３．４９−３．５５  （１Ｈ，  ｔ），  ２．５−２．６  （２Ｈ，  ｍ），  ２．３５  （６Ｈ，  ｓ），  １．９０−２．００  （８Ｈ，  ｍ），  １．７０−１．８０  （２Ｈ，  ｍ），  １．５５−１．６５  （８Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （４０  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２５７】
（実施例１０）
２，２−ジステアロイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
以下に示す構造を有するＤＳ−Ｋ−ＤＭＡは、以下で述べる通りに合成した。
【０２５８】
【化３０】
2018119016.tif 000041
実施例８に記載の通りに調製したＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ（２５０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の溶液に、エタノール中のパラジウム炭（ｐｓｌｌｓｄｉｕｍ  ｃｈａｒｃｏａｌ）を加え、得られる混合物を水素雰囲気下で終夜攪拌した。その反応混合物をセライトを通して濾過し、その溶媒を蒸発させ、次いでその粗生成物を、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、５００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中２５〜５０％の勾配の酢酸エチルで溶出した。これにより、白色の固体２２５ｍｇの所望の生成物ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡを得た。
【０２５９】
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ４．２１−４．３１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０６−４．０９  （１Ｈ，  ｔ），  ３．４９−３．５５  （１Ｈ，  ｔ），  ２．５−２．６  （２Ｈ，  ｍ），  ２．３５  （６Ｈ，  ｓ），  １．５５−１．６５  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （４０  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２６０】
（実施例１１）
２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−モルホリノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ）の合成
以下に示す構造を有するＤｌｉｎ−Ｋ−ＭＡは、以下で述べる通りに合成した。
【０２６１】
アセトニトリル  ５ｍＬ中のＤ−Ｌｉｎ−ケタール（Ｉ、２５０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１３８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の混合物に、モルホリン（５０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られる溶液をアルゴン下で終夜還流させた。得られる混合物を室温に冷却し、溶媒を蒸発させ、その有機相を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物を得た。
【０２６２】
【化３１】
2018119016.tif 000042
シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、５００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって、２５〜５０％のヘキサンおよび酢酸エチルで溶出し、次いでジクロロメタン中０〜５％の勾配のメタノールで溶出した。これにより、２２５ｍｇの所望の生成物ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡを得た。
【０２６３】
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４６  （８Ｈ，  ｍ），  ４．２１−４．３１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０６−４．０９  （１Ｈ，  ｔ），  ３．７１−３．７３  （４Ｈ，  ｔ）  ３．４９−３．５５  （１Ｈ，  ｔ），  ２．７８  （４Ｈ，  ｔ）  ２．４２−２．６２  （６Ｈ，  ｍ），２．０２−２．０９  （８Ｈ，  ｍ）  １．５５−１．６５  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （３２  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２６４】
（実施例１２）
２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−ジオキソラン塩化物（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
【０２６５】
【化３２】
2018119016.tif 000043
２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡは、実施例１に記載の通りに調製した。
【０２６６】
２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−ジオキソラン塩化物（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｉ）の合成
無水ＣＨ２Ｃｌ２  １０ｍＬ中の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、１．５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）およびＣＨ３Ｉ（４．０ｍＬ、６４ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下にて室温で９日間攪拌した。その溶媒および過剰のヨードメタンを蒸発させて、２０ｇの黄色のシロップを粗製ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｉとして得、これをそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０２６７】
２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−ジオキソラン塩化物（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ）の調製
上記の粗製ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｉ（２．０ｇ）を、分液漏斗中の１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。３０ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌメタノール溶液を加え、得られる溶液を十分に振盪した。その溶液に５０ｍＬのブラインを加え、その混合物を十分に振盪した。その有機相を分離した。その水相を１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。次いで有機相と抽出物を合わせた。これにより、イオン交換の最初の工程が完了した。そのイオン交換工程をもう４回繰り返した。その最終の有機相をブライン（２×７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、２．０ｇの黄色がかった粘稠な油状物を得た。その生成物を、クロロホルム中０〜１５％の勾配のメタノールで溶出するシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、１．２ｇの２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−ジオキソラン塩化物（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ）を、淡色の蝋様物質として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２５−５．４５  （８Ｈ，  ｍ，  ４  ｘ  ＣＨ＝ＣＨ），  ４．５５−４．７５  （２Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＯＣＨ），  ４．２６−４．３８  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＯＣＨ），  ３．４８−３．５７  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＮＣＨ），  ３．５１  （９Ｈ，  ｓ，  ３  ｘ  ＮＣＨ３），  ３．１１−３．２２  （１Ｈ，  ｄｄ，  ＮＣＨ），  ２．７７  （４Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  ４  ｘ  アリル型  ＣＨ２），  １．４９−１．７  （４Ｈ，  ｍ，  ２  ｘ  ＣＨ２），  １．２−１．４５  （３０Ｈ，  ｍ），  ０．８９  （６Ｈ，  ｔ，  ２  ｘ  ＣＨ３）  ｐｐｍ。
【０２６８】
（実施例１３）
２，２−ジリノレイル−４，５−ビス（ジメチルアミノメチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
【０２６９】
Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−ジエチルタルタレート（ＩＩ）の合成
【０２７０】
【化３３】
2018119016.tif 000044
トルエン  ２５ｍＬ中のＤ−Ｌｉｎ−ケトン（Ｉ、１ｇｒａｍ、１．９ｍｍｏｌ）、ジエチル−Ｄ−タルタレート（４１２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｐ−ｔｏｌｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（２５０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下にて、Ｄｅａｎ−ｓｔａｒｋ管を用いて２日間還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水、ＮａＨＣＯ３、およびブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物を得た。ヘキサン中０〜１０％の勾配のエーテルを溶離液に用いた、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、５００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーにかけて、４００ｍｇの純粋なＤ−Ｌｉｎ−ジエチルタルタレート（ＩＩ）を得た。
【０２７１】
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４６  （８Ｈ，  ｍ），  ４．６７  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２０−４．３０  （１Ｈ，  ｔ），  ２．７５  （４Ｈ，  ｔ），    ２．０２−２．０９  （８Ｈ，  ｍ）  １．６２−１．７２  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （３２  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２７２】
Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−ジエチルジオール（ＩＩＩ）の合成
無水ＴＨＦ中の水素化リチウムアルミニウム（ｌｉｔｈｉｕｍａｌｕｍｉｎｉｕｍｈｙｄｒｉｄｅ）（３２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ＴＨＦ中のＤ−Ｌｉｎ−Ｋ−ジエチルタルタレート（ＩＩ、６００ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン雰囲気下にて０℃で加え、次いでその反応物液を室温で４時間攪拌した。その反応混合物を氷冷水でクエンチし、次いでセライトを通して濾過し、溶媒を蒸発させて、粗製の還元アルコールを得た。シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、５００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって、ヘキサン中１０〜４０％の勾配の酢酸エチルを用いて溶出して、３５０ｍｇの純粋なＤ−Ｌｉｎ−ジエチルタルタレート（ＩＩＩ）を得た。
【０２７３】
【化３４】
2018119016.tif 000045
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４６  （８Ｈ，  ｍ），  ３．９５  （２Ｈ，  ｔ），  ３．６５−３．８５  （４Ｈ，  ｄｄ），  ２．７５  （４Ｈ，  ｔ），    ２．０２−２．０９  （８Ｈ，  ｍ）  １．６２−１．７２  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （３２  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２７４】
Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−ジエチルジメシレート（ＩＶ）の合成
無水ジクロロメタン中のＤ−Ｌｉｎ−Ｋ−ジエチルタルタレート（ＩＩＩ）アルコール（５７０ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）の混合物に、ピリジン（２７５ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１２２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で加え、この溶液に、塩化メタンスルホニル（５００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加え、終夜攪拌した。
【０２７５】
【化３５】
2018119016.tif 000046
その有機相を水およびブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いでその溶媒を蒸発させて、黄色がかった油状物残留物を得た。シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、５００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーで精製し、ヘキサン中１０〜４０％の勾配の酢酸エチルを溶離液として用いて溶出し、３００ｍｇの純粋なＤ−Ｌｉｎ−ジエチルタルタレート（ＩＶ）を得た。
【０２７６】
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４６  （８Ｈ，  ｍ），  ４．３５  （４Ｈ，  ｄ），  ４．１２−４．１７  （２Ｈ，  ｔ），  ３．０８（６Ｈ，  ｓ），  ２．７５  （４Ｈ，  ｔ），  ２．０２−２．０９  （８Ｈ，  ｍ）  １．６２−１．７２  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （３２  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２７７】
Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡの合成
（３００ｍｇ）のＤ−Ｌｉｎ−ジエチルタルタレート（ＩＶ）を含有する反応容器に、ＴＨＦ中の無水ジメチルアミンの溶液を室温で５分間かけて加えた。次いでその反応フラスコを密閉し、その混合物を室温で６日間攪拌した。その溶媒を蒸発させて、３００ｍｇの残留物を得た。その粗生成物を、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、５００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、クロロホルム中０〜１０％の勾配のメタノールを溶離液として用いて溶出し、５０ｍｇの純粋なＤ−Ｌｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡを得た。
【０２７８】
【化３６】
2018119016.tif 000047
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４６  （８Ｈ，  ｍ），  ３．７２−３．８０  （２Ｈ，  ｔ），  ２．７５  （４Ｈ，  ｔ），  ２．４９  （４Ｈ，  ｄ），  ２．３０  （１２Ｈ，  ｓ），  ２．０２−２．０９  （８Ｈ，  ｍ）  １．６２−１．７２  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （３２  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２７９】
（実施例１４）
Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペルジン（ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｚｉｎｅ）の合成
以下の構造を有するＤ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペルジンは、以下に記載の通りに合成した。
【０２８０】
アセトニトリル  ５ｍＬ中のＤ−Ｌｉｎ−ケタール（Ｉ、２５０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１３８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の混合物に、モルホリン（５０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られる溶液をアルゴン下で終夜還流させた。得られる混合物を室温に冷却し、溶媒を蒸発させ、その有機相を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物を得た。シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、５００ｍＬ）でのカラムクロマトグラフィーによって、２５〜５０％のヘキサンおよび酢酸エチルで溶出し、次いでジクロロメタン中０〜５％の勾配のメタノールで溶出した。これにより、２２５ｍｇの所望の生成物Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペルジンを得た。
【０２８１】
【化３７】
2018119016.tif 000048
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２７−５．４６  （８Ｈ，  ｍ），  ４．２１−４．３１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０６−４．０９  （１Ｈ，  ｔ），  ３．４９−３．５７  （１Ｈ，  ｔ）  ３．４９−３．５５  （１Ｈ，  ｔ），  ２．７５−２．８１  （４Ｈ，  ｔ）  ２．４２−２．６２  （８Ｈ，  ｍ），  ２．３０  （３Ｈ，  ｓ），  ２．０２−２．０９  （８Ｈ，  ｍ）  １．５５−１．６５  （４Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４７  （３２  Ｈ，  ｍ），  ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｔ）  ｐｐｍ。
【０２８２】
（実施例１５）
ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ｃａｒｂｏｍｏｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）の合成
ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）などのＰＥＧ−脂質は、以下の概略図に示し、以下で記載する通りに合成した。
【０２８３】
【化３８】
2018119016.tif 000049
ＩＶａの合成
１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリドＩａ（３０ｇ、６１．８０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−スクシンイミジルカルボネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏａｎｔｅ）（ＤＳＣ、２３．７６ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（ＤＣＭ、５００ｍＬ）に入れ、氷水混合物上で攪拌した。その攪拌している溶液にトリエチルアミン（ＴＥＡ、２５．３０ｍＬ、３当量）を加え、引き続いてその反応混合物を周囲温度で終夜攪拌した。その反応の進行をＴＬＣによってモニターした。その反応混合物をＤＣＭ（４００ｍＬ）で希釈し、その有機層を水（２×５００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）で洗浄した後、標準の仕上げ（ｗｏｒｋ−ｕｐ）を行った。得られた残留物を、高真空下にて周囲温度で終夜乾燥させた。乾燥させた後、そうして得られた粗製カーボネートＩＩａをジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解させ、氷浴上で攪拌した。その攪拌している溶液に、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（ＩＩＩ、１０３．００ｇ、４７．２０ｍｍｏｌ、日油株式会社（日本）から購入）および無水ピリジン（Ｐｙ、８０ｍＬ、過剰）をアルゴン下で加えた。一部の実施形態では、化合物ＩＩＩのｘは、４５〜４９、好ましくは４７〜４９、より好ましくは４９の値を有する。次いでその反応混合物を周囲温度で終夜攪拌した。真空下で溶媒および揮発性物質を除去し、その残留物をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解させ、酢酸エチル中に充填されたシリカゲルのカラムにかけた。そのカラムを、最初は酢酸エチルで、引き続いてジクロロメタン中５〜１０％の勾配のメタノールで溶出して、所望のＰＥＧ−脂質ＩＶａを白色の固体（１０５．３０ｇ、８３％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ＝  ５．２０−５．１２（ｍ，  １Ｈ），  ４．１８−４．０１（ｍ，  ２Ｈ），  ３．８０−３．７０（ｍ，  ２Ｈ），  ３．７０−３．２０（ｍ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，  ＰＥＧ−ＣＨ２），  ２．１０−２．０１（ｍ，  ２Ｈ），  １．７０−１．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５６−１．４５（ｍ，  ４Ｈ），  １．３１−１．１５（ｍ，  ４８Ｈ），  ０．８４（ｔ，  Ｊ＝  ６．５Ｈｚ，  ６Ｈ）。
ＭＳ範囲実測値：２６６０−２８３６。
【０２８４】
ＩＶｂの合成
１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリドＩｂ（１．００ｇ、１．８４８ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（０．７１０ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に一緒に入れ、氷水混合物中にて０℃に冷却した。トリエチルアミン（１．００ｍＬ、３当量）を加え、その反応物を終夜攪拌した。その反応物をＴＬＣによって追跡し、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。その溶媒を減圧下で除去し、得られるＩＩｂの残留物を終夜高真空下に置いておいた。この化合物をそれ以上精製せずに次の反応にそのまま使用した。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２  ＩＩＩ（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、日油株式会社（日本）から購入）およびＩＩｂ（０．７０２ｇ、１．５当量）を、アルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解させた。一部の実施形態では、化合物ＩＩＩのｘは、４５〜４９、好ましくは４７〜４９、より好ましくは４９の値を有する。その反応物を０℃に冷却した。ピリジン（１ｍＬ、過剰）を加え、その反応物を終夜攪拌した。その反応物をＴＬＣによってモニターした。真空下で溶媒および揮発性物質を除去し、その残留物を、クロマトグラフィー（最初に酢酸エチル、続いて勾配溶出として５〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所望の化合物ＩＶｂを白色の固体（１．４６ｇ、７６％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ＝  ５．１７（ｔ，  Ｊ＝  ５．５Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１３（ｄｄ，  Ｊ＝  ４．００Ｈｚ，  １１．００  Ｈｚ，    １Ｈ），  ４．０５（ｄｄ，  Ｊ＝  ５．００Ｈｚ，  １１．００  Ｈｚ，    １Ｈ），    ３．８２−３．７５（ｍ，  ２Ｈ），  ３．７０−３．２０（ｍ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，  ＰＥＧ−ＣＨ２），  ２．０５−１．９０（ｍ，  ２Ｈ），  １．８０−１．７０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６１−１．４５（ｍ，  ６Ｈ），  １．３５−１．１７（ｍ，  ５６Ｈ），  ０．８５（ｔ，  Ｊ＝  ６．５Ｈｚ，  ６Ｈ）。
ＭＳ範囲実測値：２７１６−２８９２。
【０２８５】
ＩＶｃの合成
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリドＩｃ（４．００ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（２．５８ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（６０ｍＬ）中に一緒に入れ、氷水混合物中にて０℃に冷却した。トリエチルアミン（２．７５ｍＬ、３当量）を加え、その反応物を終夜攪拌した。その反応物をＴＬＣによって追跡し、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下でその溶媒を除去し、その残留物を終夜高真空下に置いておいた。この化合物をそれ以上精製せずに次の反応にそのまま使用した。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２  ＩＩＩ（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、日油株式会社（日本）から購入）およびＩＩｃ（０．７６０ｇ、１．５当量）を、アルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。一部の実施形態では、化合物ＩＩＩのｘは、４５〜４９、好ましくは４７〜４９、より好ましくは４９の値を有する。その反応物を０℃に冷却した。ピリジン（１ｍＬ、過剰）を加え、その反応物を終夜攪拌した。その反応物をＴＬＣによってモニターした。真空下で溶媒および揮発性物質を除去し、その残留物を、クロマトグラフィー（酢酸エチル、続いて勾配溶出として５〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所望の化合物ＩＶｃを白色の固体（０．９２ｇ、４８％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ＝  ５．２２−５．１５（ｍ，  １Ｈ），  ４．１６（ｄｄ，  Ｊ＝  ４．００Ｈｚ，  １１．００  Ｈｚ，    １Ｈ），  ４．０６（ｄｄ，  Ｊ＝  ５．００Ｈｚ，  １１．００  Ｈｚ，    １Ｈ），  ３．８１−３．７５（ｍ，  ２Ｈ），  ３．７０−３．２０（ｍ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，  ＰＥＧ−ＣＨ２），  １．８０−１．７０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６０−１．４８（ｍ，  ４Ｈ），  １．３１−１．１５（ｍ，  ６４Ｈ），  ０．８５（ｔ，  Ｊ＝  ６．５Ｈｚ，  ６Ｈ）。
ＭＳ範囲実測値：２７７４−２９４８。
【０２８６】
（実施例１６）
ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子サイレンシングに関するカチオン性脂質の影響
特定の肝細胞タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏのＲＮＡｉサイレンシングが、細胞内送達のために設計された選定ナノ粒子内にカプセル化された、または細胞内送達のために設計された選定ナノ粒子に伴われるｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与に続いて達成できることは十分確立されている。これらのうち最も活性であり、十分特徴付けられている１つが、カチオン性脂質、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含有する、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）である。この実施例では、ｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングと組み合わせた合理的設計を適用してＤＬｉｎＤＭＡの構造を組織的に改良し、カチオン性脂質の効力を増強または減少させる分子の特徴を特定した。３０種を超える脂質を合成し、核酸−脂質粒子、すなわち、血清中で容易に測定される、肝細胞により合成および分泌される血液凝固成分の第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）を標的とするｓｉＲＮＡ（ＬＮ−ｓｉＲＮＡ）をカプセル化する脂質ナノ粒子（ＬＮ）内に組み込んだ。ＬＮ−ｓｉＲＮＡ系を、同じ方法、脂質のモル比および粒径を使用して調製し、カチオン性脂質以外の製剤特徴に起因する、活性に対する作用を最小化した。個々の製剤を、２４時間後にＦＶＩＩの血清タンパク質濃度が５０％減少するために必要なｓｉＲＮＡ用量（ＥＤ５０）の予測を可能にする用量範囲にわたって、単回ボーラス注入として投与した。
【０２８７】
本明細書に記載した研究を、以下の材料および方法を使用して実施した。
【０２８８】
材料および方法
脂質
カチオン性脂質を、先の実施例に記載のように合成した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）からまたはＳｏｌｖａｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｗｅｅｓｐ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。
【０２８９】
Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）およびＮ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）スクシンイミジル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＡ）を、Ｈａｙｅｓら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ１１２巻：２８０〜２９０頁（２００６年）に記載のように合成した。Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を、本明細書およびＡｋｉｎｃら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６巻：５６１〜５６頁（２００８年）に記載のように合成した。これら３種のＰＥＧ−脂質は、製剤中で活性に影響することなく相互に交換可能であった（データ非掲載）。したがって、本文全体を通して、これら３種のＰＥＧ−脂質は、明確にするために全般にＰＥＧ−脂質と称される。
【０２９０】
ｓｉＲＮＡの合成
全ｓｉＲＮＡおよび２’−ＯＭｅオリゴリボヌクレオチドは、Ｊｏｈｎら、（Ｎａｔｕｒｅ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、２００７年９月２６日（ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６１７９））に記載のようにＡｌｎｙｌａｍによって合成された。オリゴヌクレオチドを、エレクトロスプレー質量分析法およびアニオン交換ＨＰＬＣにより特徴付けた。
【０２９１】
これらの研究に使用されたｓｉＲＮＡの配列は以下の通りであった：
【０２９２】
【化３９】
2018119016.tif 000050
小文字は２’−Ｏ−Ｍｅ−改変ヌクレオチドを表し、アンダーラインを引いた文字は、２’−Ｆ−改変ヌクレオチドを表す。全ｓｉＲＮＡは、個々の鎖の３’末端の２つのチミジン（Ｔ）間のホスホロチオエート結合を含有した。
【０２９３】
核酸−脂質粒子を処方するためのプリフォームドベシクル法
核酸−脂質粒子を、Ｍａｕｒｅｒら（Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．、２００１年）に基本的に記載のように、プリフォームドベシクル（ＰＦＶ）法を使用して作製した。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質を、それぞれ、４０／１０／４０／１０のモル比でエタノール中において可溶化した。その脂質混合物を、最終的濃度がそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）および６．１ｍｇ／ｍＬのエタノールおよび脂質と混合して水性バッファー（５０ｍＭのシトレート、ｐＨ４）に加え、押し出し前に、室温で２分間平衡化させた。水和した脂質を、２２℃において、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｈｏｐｅ，  Ｍ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｙｓ．  Ａｃｔａ  ８１２巻：５５〜６５頁（１９８５年））を使用し、Ｎｉｃｏｍｐ分析による測定で直径７０〜９０ｎｍのベシクルが得られるまで、２つ重ねた８０ｎｍの孔径のフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を介して押し出した。これは、通常１〜３回の通過を必要とした。ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する５０ｍＭのシトレート、ｐＨ４の水溶液中で可溶化）を、予め平衡化した（３５℃）ベシクルに、約５ｍＬ／分の速度で混合しながら加えた。標的ｓｉＲＮＡ／脂質の最終割合０．０６（ｗｔ／ｗｔ）を達成後、その混合物を３５℃においてさらに３０分間インキュベートし、ベシクルの再構成およびＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのカプセル化を可能にした。その後、エタノールを除去し、外部バッファーをＰＢＳ（１５５ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）に、透析またはタンジェンシャルフローダイアフィルトレーション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）のどちらかにより置き換えた。
【０２９４】
粒径分析
リポソームｓｉＲＮＡ製剤のサイズ分布を、ＮＩＣＯＭＰ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０サブミクロン粒径分析計（ＰＳＳ  ＮＩＣＯＭＰ、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して決定した。平均粒子直径は、使用する脂質組成物に依存して、一般的に５０〜１２０ｎｍの範囲内であった。リポソームｓｉＲＮＡ製剤は一般に均質であり、使用する脂質組成物および製剤化条件に依存して、２０〜５０ｎｍの（平均粒径からの）標準偏差を有した。
【０２９５】
イオン交換クロマトグラフィーによる遊離ｓｉＲＮＡの測定
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムまたは市販の遠心分離器（Ｖｉｖａｐｕｒｅ  Ｄ  Ｍｉｎｉカラム）のどちらかを使用するアニオン交換クロマトグラフィーを使用して、試料中の遊離ｓｉＲＮＡの量を測定した。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに関しては、ｓｉＲＮＡ含有製剤を、ＨＢＳ（１４５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化されたカラム（充填の高さ約２．５ｃｍ、直径１．５ｃｍ）を介して溶出した。初期試料および溶出試料のアリコートを、脂質およびｓｉＲＮＡの含有量に関して、それぞれＨＰＬＣおよびＡ２６０によりアッセイした。カプセル化のパーセントは、カラムを通す前後の試料の間のｓｉＲＮＡ対脂質の比の変化に基づいて計算した。Ｖｉｖａｐｕｒｅ遠心分離器のために、ｓｉＲＮＡ含有製剤のアリコート（０．４ｍＬ、＜１．５ｍｇ／ｍＬ  ｓｉＲＮＡ）が、遠心分離（２０００×ｇ、５分間）により正に荷電した膜を通って溶出された。カラムを通す前後の試料のアリコートを上記のように分析し、試料中の遊離ｓｉＲＮＡの量を決定した。
【０２９６】
ｓｉＲＮＡ濃度の決定
ｓｉＲＮＡ濃度を、上記脂質の可溶化後に２６０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって決定した。上記脂質を、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（Ｂｌｉｇｈら、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７巻：９１１〜９１７頁（１９５９年）により要約された手順に従って可溶化した。簡潔に言うと、リポソームｓｉＲＮＡ製剤の試料を、クロロホルム／メタノールと、１：２．１：１の体積比（水性試料：メタノール：クロロホルム）で混合した。混合後にその溶液が完全に透明（すなわち、単一の透明相）でない場合、さらに５０〜１００ｍｌ（体積を記録）のメタノールを加え、その試料を再混合した。透明な単相が得られたら、その試料を、分光光度計を使用して２６０ｎｍにおいてアッセイした。ｓｉＲＮＡ濃度を、およそ４５μｇ／ｍＬ＝１．０ＯＤの換算係数を使用して、光路長１．０ｃｍで、Ａ２６０の測定値から決定した。クロロホルム／メタノール／水の単相中の換算係数は個々の脂質組成物に関して変動し（３５〜５０μｇ／ｍＬ＝１．０ＯＤ）、既知の量のｓｉＲＮＡを使用する個々の新規な脂質製剤に関して実験的に決定する。
【０２９７】
脂質の濃度および比率の決定
コレステロール、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ−脂質および様々なカチオン性脂質を、Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（オートサンプラー、ＨＰＬＣポンプおよびカラムヒーター）、Ｗａｔｅｒｓ  ２４２４  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＥＬＳＤ）およびＷａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ  ＨＰＬＣソフトウェア（バージョン５．００．００．００、ビルド番号１１５４；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）からなるＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムを使用して、参照基準に対して測定した。９０％エタノール中０．８ｍｇ／ｍＬの総脂質を含有する試料（１５μＬ）を、２．５μｍパッキング、２．１ｍｍ×５０ｍｍの逆相ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に注入し、５５℃に加熱し、０．５ｍＬ／分の一定の流速における勾配溶出でクロマトグラフィーを行なった。移動相の組成を、１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３：メタノール（２０：８０）からＴＨＦ：１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３：メタノール（１６：４：８０）に１６分にわたって変更した。ＥＬＳＤにおけるガス圧は２５ｐｓｉに設定し、一方、噴霧器ヒーター−クーラーの設定点およびドリフトチューブの温度の設定点は、それぞれ１００％および８５℃であった。測定した脂質濃度（ｍｇ／ｍＬ）をモル濃度に変換し、相対的な脂質比をその製剤中の総脂質のｍｏｌ％で表した。
【０２９８】
カプセル化の効率の決定
捕捉効率を、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションまたはアニオン交換クロマトグラフィーにより、外部ｓｉＲＮＡの除去後に決定した。ｓｉＲＮＡおよび脂質の濃度を、初期製剤インキュベーション混合物において、およびタンジェンシャルフローダイアフィルトレーション後に（上記のように）決定した。上記ｓｉＲＮＡ対脂質比（ｗｔ／ｗｔ）は、本法の両方の点で決定し、そのカプセル化の効率は、最終および初期のｓｉＲＮＡ対脂質比の比を求め、パーセントを得るためにその結果に１００をかけて決定した。
【０２９９】
ＦＶＩＩ活性のためのカチオン性脂質のＩｎ  ｖｉｖｏのスクリーニング
ＦＶＩＩ活性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて静脈内（ボーラス）注入２４時間後、またはＳＤラットにおいて静脈内（ボーラス）注入４８時間に、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ処置動物において評価した。６から８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、研究に使用する前に１週間順化させた。動物を、病原体のない環境に保ち、動物に関するすべての手順を、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅにより確立されたガイドラインに従って実施した。
【０３００】
第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮ−ｓｉＲＮＡ系を、使用直前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水で適切な濃度に希釈し、その製剤を、外側尾静脈を介して、全体積１０ｍｌ／ｋｇで静脈内に投与した。２４時間後、ケタミン／キシラジンを用いて動物に麻酔をかけ、心臓穿刺により血液を採取し、血清に処理した（Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｔｕｂｅｓ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）。血清を、迅速に試験するかまたは血清中第ＶＩＩ因子レベルに関する後の分析のために−７０℃において保存した。
【０３０１】
ＦＶＩＩを、市販のキット（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩ  Ｋｉｔ（商標）；Ａｎｉａｒａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｓｏｎ、ＯＨ）を使用して、製造業者の指示書に従って、マイクロプレート規模で測定した。ＦＶＩＩの減少を、未処置の対照動物に対して決定し、その結果を残留ＦＶＩＩの％として表した。５種類の用量レベル（０．１、０．３、０．５、１．０および３．０ｍｇ／ｋｇ）を、代表として使用した。
【０３０２】
薬物動態学的および肝臓の分析
蛍光標識したｓｉＲＮＡ（Ｃｙ−３標識ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ、Ａｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して、ＬＮ−ｓｉＲＮＡ系のｉｖ投与後の血漿および肝臓におけるｓｉＲＮＡ含有量を測定した。その測定は、タンパク質含有生物学的マトリックスからＣｙ３−ｓｉＲＮＡをまず抽出し、次いで、蛍光により、その抽出液中のＣｙ−３標識の量を分析した。２種の抽出法、血漿試料に関してクロロホルム／メタノール混合物および組織試料には市販のフェノール／クロロホルム混合物（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬）を使用した。
【０３０３】
血漿のために、血液をＥＤＴＡ含有Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブに回収し、１０００×ｇで１０分間、４〜８℃において遠心分離し、その血漿を単離した。血漿をエッペンドルフチューブに移し、迅速にアッセイするか、または−３０℃のフリーザーにおいて保存するかのいずれかであった。その血漿のアリコート（最大１００μｌ）を、ＰＢＳ（１４５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．５）を用いて５００μＬに希釈し、メタノール（１．０５ｍＬ）およびクロロホルム（０．５ｍＬ）を加え、その試料をボルテックスにかけ、透明な単相の溶液を得た。その後、水（０．５ｍＬ）およびクロロホルム（０．５ｍＬ）を加え、得られたエマルジョンを、最低でも３分間、定期的に混合することによって維持した。その混合物を、３０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離にかけ、そのＣｙ−３−標識を含有する最上部の水相を新しい試験チューブに移した。その溶液の蛍光を、ＳＬＭ蛍光光度計を、励起波長５５０ｎｍ（バンド幅２ｎｍ）および発光波長６００ｎｍ（バンド幅１６ｎｍ）で使用して測定した。標準曲線を、Ｃｙ−３−ｓｉＲＮＡ含有製剤（０から１５μｇ／ｍＬ）を用いて処置していない動物由来の血漿のアリコートをスパイクすることによって作成し、試料を上記のように処理した。
【０３０４】
肝臓に関しては、生理食塩水灌流動物由来の組織の切片（４００〜５００ｍｇ）を、正確に重量を量り、Ｆａｓｔｐｒｅｐチューブを使用して、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中で均質化した。ホモジネート（典型的には、５０ｍｇの組織と同等物）のアリコートをエッペンドルフチューブに移し、さらなるＴｒｉｚｏｌを加え、最終的に１ｍＬにした。クロロホルム（０．２ｍＬ）を加え、その溶液を混合し、２〜３分間インキュベートし、その後、１２，０００×ｇにおいて１５分間遠心分離した。最上部のＣｙ−３含有水性相のアリコート（０．５ｍＬ）を、０．５ｍＬのＰＢＳで希釈し、その試料の蛍光を上記のように測定した。
【０３０５】
血清中のＦＶＩＩタンパク質の測定
血清第ＶＩＩ因子レベルを、比色分析用Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＶＩＩアッセイキット（Ａｎａｉｒａ、ＵＳＡ）を使用して決定した。簡潔に言うと、段階希釈し、プールした対照血清（２００％〜３．１２５％）および処置動物由来の適切に希釈した血漿試料を、Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＶＩＩキットを使用して、その製造業者の指示書に従って、９６ウェルの平底非結合ポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）において分析し、吸光度を４０５ｎｍにおいて測定した。較正曲線を、段階希釈対照血清を使用して作成し、処置動物由来の血清中第ＶＩＩ因子レベルを決定するために使用した。
【０３０６】
認容性の決定
空のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ脂質粒子（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（４０／１０／４０／１０））認容性を、重量変化のモニタリング、ケージの傍での観察（ｃａｇｅｓｉｄｅ  ｏｂｓｅｖａｔｉｏｎ）、臨床化学および場合によっては、雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットおよび雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血液学によって評価した。動物の体重を、処置前および様々な投与量による静脈内処置２４時間後に記録した。データは、体重の変化％で記録した。体重測定に加えて、肝機能マーカーを含む臨床化学パネルを、ＦＶＩＩ分析のために回収した血清のアリコートを使用して、注入２４時間後に各用量レベルにおいて得た。試料を、分析のためにＣｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ（Ｌａｎｇｌｅｙ、ＢＣ）に送った。場合によっては、追加の動物を処置群に含め、血液学的分析のために全血を回収させた。
【０３０７】
ＴＮＳを使用するｐＫａのｉｎ  ｓｉｔｕの決定
ｉｎ  ｓｉｔｕのｐＫａの測定を、ｐＨ感受性蛍光プローブＴＮＳを使用して、Ｂａｉｌｅｙ，  Ａ．Ｌ．  およびＣｕｌｌｉｓ，  Ｐ．  Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３巻：１２５７３〜１２５８０頁（１９９４年）においてすでに公開された取り組みの改良を使用して実施した。
【０３０８】
結果
初期研究を、８から１０週齢の、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、２段階で実施した。第１の段階において、その基準（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）脂質ＤＬｉｎＤＭＡに関連する活性を、ＤＬｉｎＤＭＡの改良型に関連する活性と比較した。この段階は、ＤＬｉｎＤＭＡと比較して増加した活性を有するＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの同定をもたらした。したがって、第２の段階において、ＤＬｉｎＤＭＡの改良型の活性を、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの活性と比較した。用量反応曲線を使用して、各製剤に関するＥＤ５０を推定し、ＥＤ５０は、血清ＦＶＩＩタンパク質の濃度を５０％減少させるために必要なｓｉＲＮＡの用量として定義され、ＤＬｉｎＤＭＡ基準製剤に関して約１．０ｍｇ／ｋｇである。活性の乏しい製剤に関するＥＤ５０は、例えば、１２〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲で表し、血清ＦＶＩＩタンパク質レベルの５０％の減少が、これらのｓｉＲＮＡ用量の間で起こることを示す。製剤が優れた活性（ＥＤ５０＜２ｍｇ／ｋｇ）を示した場合、そのときその用量反応をより狭い用量範囲にわたって繰り返し、より大きな比較精度でＤＬｉｎＤＭＡと付き合わせた。
【０３０９】
スクリーニング１ａ：ＤＬｉｎＤＭＡに対する頭部基の改変およびｉｎ  ｖｉｖｏのＦＶＩＩ活性
この研究の目的のために、ＤＬｉｎＤＭＡを、頭部基、リンカーおよび炭化水素鎖を含む個別に改変された、３つの主要な構造ドメインに分けた。ジメチルアミノプロパン頭部基は親水性であり、見かけのｐＫａ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）がｐＨ６．４である第３級アミン機能を含有する。その結果、ＤＬｉｎＤＭＡは、ｐＨ４において大部分が完全に荷電しており、このｐＨにおいてＬＮ−ｓｉＲＮＡ系はｓｉＲＮＡとの静電相互作用を介して形成される。ｐＨ７．４において、約５から１０％のＤＬｉｎＤＭＡ分子が荷電するが、したがって、循環においてこれらのナノ粒子の表面におけるカチオン電荷密度は、比較的低い。対照的に、エンドソームのｐＨ（約ｐＨ５）において、その表面電荷密度は顕著に増加し、アニオン性リン脂質とのイオン対の形成を促進し、エンドソーム膜を破壊することが期待される（Ｈａｆｅｚ，  Ｉ．  Ｍ．およびＣｕｌｌｉｓ，  Ｐ．  Ｒ．、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ４巻：１３９〜１４８頁（２００１年）ならびにＸｕ，  Ｙ．およびＳｚｏｋａ，  Ｆ．Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５巻：５６１６〜５６２３頁（１９９６年））。
【０３１０】
ＤＬｉｎＤＭＡに実施された頭部基の改変を表３に示し、最初の３つは、正電荷の特性を改変するために設計された。ＤＬｉｎＴＭＡは、第４級アミノ基を含有し、永久的に荷電しており（ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）、活性の減少を示し、ＥＤ５０は２〜５ｍｇ／ｋｇの間であると推定される。活性の同様の低下が、ジメチルアミン機能をピペラジン部分と置き換えた場合（ＤＬｉｎＭＰＺ、ＥＤ５０が２〜５ｍｇ／ｋｇ）に観察され、モルホリノ基と置換した場合（ＤＬｉｎＭＡ、ＥＤ５０が１２〜２５ｍｇ／ｋｇ）に、より顕著に減少した。
【０３１１】
表３に示した残り２つの改良を実施するための１つの理論的根拠は、類似の頭部基構造を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏの代謝比率が異なる２種の脂質の活性を比較することであった。脂質分解は、本明細書でスクリーニングした脂質のいずれに関してもｉｎ  ｖｉｖｏでは測定されなかったが、エトキシ基（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）が、エステル基（ＤＬｉｎＤＡＣ）よりも酵素切断に対してより抵抗性であることが期待され（Ｍａｒｔｉｎ，
Ｂ．ら、Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ  １１巻：３７５〜３９４頁（２００５年））、それにもかかわらず、両方の脂質は類似の活性を示した。
【０３１２】
【表３】
2018119016.tif 000051
スクリーニング１ｂ：ＤＬｉｎＤＭＡに対するリンカーの改変およびｉｎ  ｖｉｖｏのＦＶＩＩ活性
ＤＬｉｎＤＭＡは、２つのエトキシ結合を介してジメチルアミノプロパン頭部基に結合する２つの不飽和炭化水素鎖を有する。二重層構造において、そのリンカー領域は、その膜界面、その疎水性膜のコアおよび親水性頭部基表面の間の転移領域に存在する。ＤＬｉｎＤＭＡのリンカーの改変に対する取り組みは、様々な比率の化学的または酵素的安定性を示すことが期待されるリンカー基の導入および親水性範囲のスパニングであった。エトキシ部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏの他の型の化学結合の大部分より、分解に対してより抵抗性であると考えられ、このことが、これらの脂質が、例えば、エステル結合を有するカチオン性脂質ほど抵抗性でないことが発見されている理由と思われる（Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ  １１巻：３７５〜３９４頁（２００５年））。表４に示したものを含む、様々なこれらの合理的に設計された脂質を作製し、特徴付け、試験した。
【０３１３】
【表４】
2018119016.tif 000052
表４に載せた第１の改変はＤＬｉｎＤＡＰであり、ＤＬｉｎＤＭＡのエステルをエトキシリンカーに置き換えてある。注目すべきことには、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含み、ＤＬｉｎＤＡＰを含有する核酸脂質粒子は、ＤＬｉｎＤＭＡと非常によく似たその構造にもかかわらず、ＤＬｉｎＤＭＡを含有する核酸−脂質粒子と比較してｉｎ  ｖｉｖｏ活性において顕著な減少を示した（ＥＤ５０１２〜２５ｍｇ／ｋｇ）。さらにＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰに基づく核酸−脂質粒子、１つのエトキシ結合と１つのエステル結合を有する脂質は、ＤＬｉｎＤＡＰ−に基づく核酸−脂質粒子およびＤＬｉｎＤＭＡ−に基づく核酸−脂質粒子の中間に位置する活性をもたらした。カルバメート（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）またはチオエーテル（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）結合を含有する脂質に基づく核酸−脂質粒子もまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性の劇的な減少をもたらした。
【０３１４】
最後の改変は、上記脂質分子に興味深い構造変化を導入する、ケタール環リンカーの挿入であった。第１に、そのケタールはエトキシリンカーより酸に不安定であることが公知であり（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｂ．ら、Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ  １１巻：３７５〜３９４頁（２００５年））、エンドサイトーシス経路においてその半減期を減少させることがある。第２に、炭化水素鎖は、次に１個の炭素を介してそのリンカー基に結合する。興味深いことに、ケタール環リンカーのＤＬｉｎＤＭＡへの導入により、血清ＦＶＩＩタンパク質レベルの減少において、ＤＬｉｎＤＭＡ基準と比較して約２．５倍より強力な核酸−脂質粒子がもたらされ、ＥＤ５０（すなわち、５０％遺伝子サイレンシングを達成する用量）は、それぞれ約０．４ｍｇ／ｋｇ対１ｍｇ／ｋｇである（図２）。
【０３１５】
スクリーニング１ｃ：ＤＬｉｎＤＭＡ炭化水素鎖の不飽和の減少、種々の改変およびｉｎ  ｖｉｖｏのＦＶＩＩ活性
ＤＬｉｎＤＭＡと比較した改変を含有する様々な他のカチオン性脂質を、第ＶＩＩ因子ノックダウン系において試験した。例えば、炭化水素鎖の不飽和が増えることにより、脂質分子が、非二重層の反転相をとる傾向があることは公知である（Ｃｕｌｌｉｓ，  Ｐ．  Ｒ．ら、Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ  ４０巻：１２７〜１４４頁（１９８６年））。これらの非二重層の相の形成は、エンドソームの崩壊およびｓｉＲＮＡの細胞質への放出およびｉｎ  ｖｉｔｒｏのＳＮＡＬＰ活性もまた、不飽和が増えることにより増加するという観察と関係が有るという仮説を考慮すると（Ｈｅｙｅｓ，  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜２８７頁（２００５年））、２つのＣ１８：２鎖を含有するＤＬｉｎＤＭＡを２つのＣ１８：１鎖を有するＤＯＤＭＡによって置き換えた場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＮ−ｓｉＲＮＡ効力に起こることを見ることは興味深かった。これらのカチオン性脂質およびこれらの実験の結果を表５に示す。
【０３１６】
【表５】
2018119016.tif 000053
表５に示すように、ＤＯＤＭＡは、さらに不飽和が多いＤＬｉｎＤＭＡより活性が１／２から１／５と低くなり、エステル（ＤＯＤＡＰ）の代わりにエーテル結合で置換することで、活性が１／２５よりも低くなった。
【０３１７】
カルバメートとＣ１８：１鎖との結合（ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ）は、試験した最大用量の１０ｍｇ／ｋｇにおいて、不活性な組み合わせであった。ＤＭＤＡＰを合成し、より短いＣ１４：１炭化水素鎖は、増強した脂質を介してエステルと結合した脂質をその標的エンドソーム膜と混合可能にできるかどうかを決定したが（Ｍｕｉ，  Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １４６７巻：２８１〜２９２頁（２０００年））、しかし、最大用量１０ｍｇ／ｋｇまでにＦＶＩＩモデルにおいてＤＭＤＡＰ−ＬＮ−ｓｉＲＮＡに関して活性はまったく観察されなかった。その後者の脂質は、トランスフェクションに最も一般的に使用されるカチオン性脂質の１つであるので、永久的に荷電した、エステル結合脂質のＤＬｉｎＴＡＰおよびＤＯＴＡＰが対象であった。しかし、ＬＮ−ｓｉＲＮＡモデルにおいて、これらのエステル結合脂質はどちらも、活性の兆候はまったく示さなかった（ＥＤ５０＞２５ｍｇ／ｋｇ）。その最後の脂質は、ＤＬｉｎＤＭＡに対して基の（ｒａｄｉｃａｌ）構造変化を表し、そのジメチルプロパン頭部基は反転し、その炭化水素鎖はアミノ窒素に直接結合し、ジヒドロキシ頭部基が残っていたが、ＤＬｉｎＡＰは、ＥＤ５０が５〜１２ｍｇ／ｋｇの範囲内である低い活性を示した。
【０３１８】
要約すれば、ＤＬｉｎＤＭＡに対する改変の増加は、同じｉｎ  ｖｉｖｏモデルおよびＬＮ−ｓｉＲＮＡの処方においてつきあわせて（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）試験した場合、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを、ＤＬｉｎＤＭＡより顕著に効力のあるカチオン性脂質として特定することに成功した。
【０３１９】
スクリーニング２ａ：ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡに対する頭部基の改変およびｉｎ  ｖｉｖｏのＦＶＩＩ活性
上記脂質設計を導く作業仮説の機序における正電荷の重要性を考慮すると、アミンに基づく頭部基における構造変化の効果を、新規な基準脂質としてのＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡに関連して調査した。一連の頭部基の改変を実施し、特徴付け、試験し、サイズ選定の効果（ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｉｚｅ）、酸の解離定数およびイオン化できる基の数を調査した（表６）。
【０３２０】
【表６】
2018119016.tif 000054
ａ  ５ｍｇ／ｋｇにおいて活性が観察されず、次の１５ｍｇ／ｋｇの用量で致死
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡは、そのケタール環構造の４位にキラル炭素を含有する。したがって、２種の、場合によって純粋な（＋）および（−）のエナンチオマーを合成し、それらの活性をラセミ混合物のそれと比較した。全３種の製剤は、識別できない用量反応を示し、それぞれのＥＤ５０は約０．３ｍｇ／ｋｇであった。
【０３２１】
表６に載せた最初の３種の改変は、スクリーニング１においてＤＬｉｎＤＭＡに適用され、イオン化可能な正電荷の特性を改良するためのピペラジノ（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）およびモルホリノ（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ）アミノ部分の導入ならびに第３級ジメチルアミンの、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡの永久的に荷電した第４級アミンへのさらなる転換であった。これらの改変はすべて活性を顕著に減少させたが、ＥＤ５０が約１．５であるＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺはＤＬｉｎＤＭＡとほぼ同じくらいの活性であったが、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡのおよそ１／５の活性であり、ＤＬｉｎＤＭＡに対する同じ改変は、同様の因子によりその活性を減少させたことに注目することは重要である。さらに、そのモルホリノアミン官能基は、ＤＬｉｎＭＡと同様に、試験した最大用量（１５ｍｇ／ｋｇ）においてＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡを不活性にさせ、１２〜２５ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を有する。別の観察で注目すべきは、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ（永久正電荷）は毒性であるということである。５ｍｇ／ｋｇにおいて活性はまったく観察されなかったが、動物は顕著に体重が減少し（データ非掲載）、次の１５ｍｇ／ｋｇの用量において生存しなかった。
【０３２２】
ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡと省略された改変は、２種のジメチルアミン部分の存在を表す。誤差の範囲内で、この脂質はより大きい頭部基にもかかわらず、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡと同じ活性を有した。
【０３２３】
追加のパラメーターとして、そのジメチルアミノ基およびそのジオキソランリンカーの間の距離は、追加のメチレン基を導入することによって変動した。残りの３種の脂質は、構造において密接に関連しており、何が正電荷をそのジオキソラン環から遠ざけ、活性に影響をもたらしているのかを決定するために合成した。このパラメーターは、アミン頭部基のｐＫａならびに脂質二重層の界面に対する電荷の提示の距離および柔軟性の両方に影響を与え得る。頭部基への追加の１個のメチレン基の挿入（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）は、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡと比較して効力の劇的な増加を生み出した。この脂質に関するＥＤ５０は約０．１ｍｇ／ｋｇであり、ＦＶＩＩモデルにおいてじかに比較した場合、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡより４倍強力にし、ＤＬｉｎＤＭＡ基準より１０倍強力にした（図２Ａ）。追加のメチレン基は活性を低下させ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ（ＥＤ５０約０．６ｍｇ／ｋｇ）およびＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ（ＥＤ５０＞３ｍｇ／ｋｇ）の間に顕著な減少が起こった（図２Ｂ）。
【０３２４】
スクリーニング２ｂ：ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの頭部基、リンカーおよび炭化水素鎖に対する改変ならびにｉｎ  ｖｉｖｏのＦＶＩＩ活性
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡに対して実施されたいくつかの追加の構造的改変を、表７に表す。そのシリーズの最初の３種により、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性のための炭化水素鎖の不飽和の重要性が確認された。約０．３から約１．０および約８．０ｍｇ／ｋｇまでのＥＤ５０の漸進的減少が、それぞれ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ（Ｃ１８：２）からＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ（Ｃ１８：１）およびＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ（Ｃ１８：０）までにおいて観察された。次の改変（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）は、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの５員のケタール環が、活性を損なうことなく６員のジオキソラン環構造によって置換できることを実証した。表７に示した最終的な脂質は、より根本的な（ｒａｄｉｃａｌ）改良を表した。ＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡはケタール環リンカーを有さないが、その炭化水素鎖は未だ１個の炭素に直接結合している。興味深いことに、この脂質は、比較的活性のままであり、ＥＤ５０は約０．７ｍｇ／ｋｇであった。
【０３２５】
【表７】
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マウスおよびラットにおける核酸−脂質製剤のｉｎ  ｖｉｖｏ活性の比較
様々なカチオン性脂質を含有する様々な核酸−脂質製剤の能力を、マウスおよびラットにおいてさらに探求した。個々の被検核酸−脂質製剤は、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧをＰＥＧ−脂質として使用して上記のように調製した。最初に試験した製剤（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡのどれかを含んだ）は、マウス（図３）およびラット（図４）の両方において残留ＦＶＩＩレベルを減少させた。しかし、そのＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ製剤は、マウスおよびラットの両方において、ＦＶＩＩレベルを減少させる能力の著しい増強を示した。ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ製剤の活性は、マウスにおいてＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ製剤よりおよそ２〜３倍大きく、ラットにおいてＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ製剤よりおよそ１０〜２０倍大きかった。ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ製剤またはＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ製剤を使用する、マウスおよびラットにおけるＦＶＩＩの減少の比較を、図５に示す。ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ（ＭＰＺ）をカチオン性脂質として有する製剤は、互いに、およびＤＬｉｎＤＭＡ製剤と同様の活性を示した。
【０３２６】
ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡをカチオン性脂質として有するリポソーム製剤を、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡに対する比較においてさらに試験した。図６に示すように、ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ製剤は、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡと同様にマウスにおいてＦＶＩＩレベルを減少させた。
【０３２７】
カチオン性ＬＮ−ｓｉＲＮＡ製剤の薬物動態および肝臓蓄積
肝臓に送達されたｓｉＲＮＡのレベルとＦＶＩＩの減少との間の相関を、表８に示したｉｎ  ｖｉｖｏ活性のスペクトルにわたって、ＬＮ−ｓｉＲＮＡ系の選択において、Ｃｙ−３標識ｓｉＲＮＡをカプセル化することによって決定した。Ｃｙ−３の蛍光を、血漿および肝組織において注入０．５および３．０時間後に測定した。血漿データは、初期の時点で広範囲のクリアランス率を示したが、製剤の大部分に関しては、それらが高度に活性であろうがまたは低い活性を示そうが、注入したｓｉＲＮＡ用量の２０〜５０％が、０．５時間以内に肝臓に回収された。最も活性な製剤のＤＬｉｎＤＭＡおよびＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡは、０．５時間において肝臓中でそれぞれ５０％および３２％の比較的高いレベルのｓｉＲＮＡを示した。すべての製剤は、肝臓において３時間後Ｃｙ−３レベルの低下を示し、これはおそらく代謝を反映したものである。この研究は、肝臓への全体的送達だけでは活性の差が説明されないことを示唆している。
【０３２８】
【表８】
2018119016.tif 000056
ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ含有ＬＮ−ｓｉＲＮＡ系の認容性
ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡを含有するリポソーム製剤を投与したラットは、用量依存性の体重減少を示した。９１ｍｇ／ｋｇを投与したラットは、正常のように見え、正常な肝臓を有した。１８２ｍｇ／ｋｇを投与したラットは、緩慢な動きおよび毛並みの悪さ（ｓｃｒｕｆｆｙ  ｃｏａｔ）を示した。それらの肝臓はわずかに青白く、３つの肝臓の１つはわずかな斑点形成を示した。３６４ｍｇ／ｋｇを投与したラットのうち１匹は死亡し、それらは背中の湾曲（ｈｕｎｃｈｅｄ）、緩慢な動き、斜視眼（ｑｕｉｎｔｉｎｇ  ｅｙｅ）、毛並みの悪さ、立毛、赤色／橙色の尿（ｕｒｉｎｇ）を示し、青白く、いくつか斑点形成された肝臓を有した。１８２ｍｇ／ｋｇ脂質という低濃度でも、ラットは、ＡＬＴ／ＡＳＴの有意な増加を示した。
【０３２９】
９１ｍｇ／ｋｇ（「５」ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置したラットから得た肝臓の組織病理学的結果は正常であった。１８２ｍｇ／ｋｇ（「１０」ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置したラットの肝臓は、軽度から中程度の肝細胞壊死、小葉中心性壊死および肝細胞の空胞化を示した。３６４ｍｇ／ｋｇ（「２０」ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置した生存ラットの肝臓の１つは、中程度の肝細胞壊死、小葉中心性壊死を示し、他は、びまん性の、軽度から中程度の肝細胞壊死（小葉中心部領域に集中していなかった）で軽度の炎症を伴った。
【０３３０】
ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡのリポソーム製剤を用いて処置したマウスもまた、用量依存性体重減少を示したが、死亡したマウスはいなかった。マウスはさらに、およそ１１００ｍｇ／ｋｇの脂質において、ＡＬＴ−ＡＳＴが１０倍を超える増加を示した。しかし、１３００ｍｇ／ｋｇを超えた場合の背中の湾曲、緩慢な動きおよび毛並みの悪さを除いて、マウスは明らかな臨床的兆候は示さなかった。
【０３３１】
ケタールリンカーの導入は、マウスにおいていかなる重大な毒性問題ももたらしたようではなく、実際、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを含有するＬＮ系およびＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのカプセル化は、マウスにおいて並外れて十分認容された。表９に提示したデータは、適切な用量範囲を決定するために設計された研究によるものであり、脂質およびｓｉＲＮＡの極限の（ｅｘｔｒｅｍｅ）単回用量を得た。測定した毒性基準は体重変化の％および肝臓酵素マーカーのＡＬＴおよびＡＳＴの血清中レベルであった。
【０３３２】
【表９】
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セーライン対照と比較して、ｓｉＲＮＡ用量が１０ｍｇ／ｋｇまで、血液化学または体重において変化はまったく観察されず、１０ｍｇ／ｋｇは、この製剤に関してＥＤ５０用量より３０倍を超えて多かった。
【０３３３】
大量のｓｉＲＮＡ用量である４６ｍｇ／ｋｇ（ＥＤ５０より１５０倍多い）を投与し、その後、顕著な毒性の兆候を測定した。このｓｉＲＮＡ用量は、ｓｉＲＮＡ対脂質比が０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の場合、総脂質用量７５０ｍｇ／ｋｇに換算された。これらのレベルにおいてさえ、血清ＡＬＴおよびＡＳＴにおける増加は比較的少なく（正常値の１０倍より少ない）、ｓｉＲＮＡ用量が６１ｍｇ／ｋｇを超えるまで、激しい（＞１０倍）増加が観察されることはない。試験した最大用量は９２ｍｇのｓｉＲＮＡ／ｋｇであり、１５００ｍｇ総脂質／ｋｇと同等であった。動物は６％体重が減少したが、試験したいずれの用量においても死亡は起こらなかった。
【０３３４】
核酸−脂質粒子の特徴付け
選択した核酸−脂質製剤の特徴を、表１０に要約し、ここで、Ｃ２は、カチオン性脂質がＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡであることを示し、Ｃ４は、カチオン性脂質がＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡであることを示し、ＭＰＺは、カチオン性脂質がＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺであることを示す。以下に記載の個々の製剤は、ＰＥＧ−脂質としてＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを含有した。
【０３３５】
【表１０】
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ＬＮ−ｓｉＲＮＡ製剤における、ｉｎ  ｓｉｔｕで測定した主要なカチオン性脂質の見かけのｐＫａ
脂質設計の根底にある２つの重要なパラメーターは、プロトン化した場合のイオン化可能なカチオン性脂質のｐＫａおよびアニオン性脂質と混合した場合、非二重層（六方晶ＨＩＩ）相構造を誘導するこれらの脂質の能力である。イオン化可能なカチオン性脂質のｐＫａは、様々なｐＨ条件下でＬＮＰ上の表面電荷を決定する。生理的ｐＨにおける荷電状態（例えば、循環中）は、血漿タンパク質の吸着、血液クリアランスおよび組織分配挙動に影響を与えることができ（Ｓｅｍｐｌｅ，  Ｓ．  Ｃら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ３２巻：３〜１７頁（１９９８年））、一方酸性ｐＨにおける荷電状態（例えば、エンドソーム内）は、内因性アニオン性脂質と結合して、エンドソーム溶解性非二重層構造を形成するＬＮＰの能力に影響を与え得る（Ｈａｆｅｚ，  Ｉ．  Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８巻：１１８８〜１１９６頁（２００１年））。その結果として、アニオン性脂質との混合物中にＨＩＩ  相構造を誘導するこれらの脂質の能力は、それらの二重層不安定化能力および相対的エンドソーム溶解性潜在力の尺度である。
【０３３６】
疎水性環境において蛍光の増加を示す、蛍光性プローブの２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）を使用し、脂質二重層の表面電荷を評価できる。その後、ｐＨに応じて表面電荷の滴定を使用して、構成脂質の見かけのｐＫａ（これ以降ｐＫａと称される）を決定できる（Ｃｕｌｌｉｓ，  Ｐ．  Ｒ．ら、  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ  ４０巻：１２７〜１４４頁（１９８６年））。この取り組みを使用して、様々なカチオン性脂質を含有する核酸−脂質粒子についてのｐＫａ値を決定し、表１１に要約する。特定のイオン化可能なカチオン性脂質のプロトン化型の、アニオン性脂質中にＨＩＩ相構造を誘導する相対的能力を、等モル混合物中で、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）をｐＨ４．８において用いて、３１Ｐ  ＮＭＲ（Ｃｕｌｌｉｓ，  Ｐ．Ｒ．およびｄｅ  Ｋｒｕｉｊｆｆ，  Ｂ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５１３巻：３１〜４２頁（１９７８年））および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析（Ｅｘｐａｎｄ，  Ｒ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８巻：９３９８〜９４０２頁（１９８９年））を使用して、二重層と六方晶ＨＩＩの転移温度（ＴＢＨ）を測定することによって確定した。両方の技術により同様の結果が得られた。
【０３３７】
表１１に提示したデータは、高度に活性な脂質ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡが、ｓｉＲＮＡ送達系における使用に理論的に好ましいｐＫａ値およびＴＢＨ値を有することを示す。６．４のｐＫａは、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡに基づくＬＮＰが、循環中で限られた表面電荷を有するが、エンドソーム中で正に荷電するようになることを示す。さらに、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡに関するＴＢＨは、ＤＬｉｎＤＭＡに関するＴＢＨより７℃低く、この脂質が、二重層不安定化能力を改善したことを示唆する。しかし、そのデータは、ｐＫａおよびＴＢＨが、ＬＮＰ中に使用した脂質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を完全に説明するわけではないことを、さらに実証している。例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡは、同一のｐＫａ値およびＴＢＨ値を有するが、それにもかかわらず、ＤＬｉｎ−ＫＣ４−ＤＭＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで１／５よりも低い活性である。さらに、非常によく似たｐＫａ値およびＴＢＨ値を有する、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性において３０倍を超える差を示す。したがって、ｐＫａおよびＴＢＨの生物物理学的パラメーターは、脂質設計の指針として有用であるが、表１１に提示した結果は、非常によく似たｐＫａ値およびＴＢＨ値を有するものであっても、リード脂質の変異体を試験する戦略を支持する。
【０３３８】
【表１１】
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上記のように、４０モル％のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡを含有するＬＮ−ｓｉＲＮＡ系の効力は、単回ｉ．ｖ．ボーラスとしてマウスに投与された約１００ピコモルのカプセル化ｓｉＲＮＡが、ＦＶＩＩタンパク質の血清中濃度を、注入２４時間以内に５０％ノックダウンするために十分であったほどにわずかであった。
【０３３９】
この研究において、表面電荷におけるどのような差もカチオン性脂質のｐＫａに帰され得るように、脂質成分およびｓｉＲＮＡ対脂質の比を、すべての製剤において一定に保った。活性のスクリーニングに使用したｓｉＲＮＡ対脂質比は０．０６ｗｔ／ｗｔであり、このことは、正電荷が負電荷より過剰であったことを意味する。４０モル％の一塩基性カチオン性脂質を含有する製剤の電荷中和は、およそ０．１７ｗｔ／ｗｔの比において起こる。その結果、１種のカチオン性脂質が、ｓｉＲＮＡ主鎖上の個々の負電荷とイオン対を形成すると仮定すれば、その後、およそ３５％の合計カチオン性脂質が、ナノ粒子の内側でｓｉＲＮＡと結合し、したがって、表面電荷に寄与することはできない。興味深いことに、４０／１０／４０／１０製剤において、約０．０８（ｗｔ／ｗｔ）を超えてｓｉＲＮＡ対脂質比が増加すると、ＬＮ−ｓｉＲＮＡ系の効力が低下した（データ非掲載）。同様の反応が、脂質様（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ナノ粒子を使用する、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達されたｓｉＲＮＡに関して報告されており（Ａ．  Ａｋｉｎｃ，  Ｍ．ら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．（２００９年））、遊離のカチオン性脂質（脂質がｓｉＲＮＡと結合していない）および／または注入された合計カチオン性脂質用量の重要性を反映すると思われる。
【０３４０】
最も特筆すべき観察の１つは、炭化水素鎖の不飽和の程度に活性が依存することであった。ＤＬｉｎＤＭＡおよびＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの両方に関して、二重結合の数が下がる毎に効力に顕著な低下があった。理論に縛られることを望むものではないが、エンドソーム膜に挿入された（活性な）合成カチオン性脂質および内因性アニオン性リン脂質（ホスファチジルセリンなど）はイオン対を形成することが提唱されている（Ｈａｆｅｚ，  Ｉ．  Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ８巻：１１８８〜１１９６頁（２００１年）ならびにＸｕ，  Ｙ．および  Ｓｚｏｋａ，  Ｆ．  Ｃ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５巻：５６１６〜５６２３頁（１９９６年））。得られた電荷の中和は、結合した頭部基の断面積を有効に減少させ、このことは、それらの固有の曲率半径における実質的低下と一致する。脂質多形を記載するために用いられた分子形状議論（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｈａｐｅ  ａｒｇｕｍｅｎｔ）を適用すると、このことは、カチオン性脂質およびアニオン性脂質が、それらが単離においてとる円筒状形状から、中性イオン対により形成されるコーン型形状へ進むことを意味する。円筒状の形状の脂質は二重層構造に適合性であり、一方コーン形状の脂質は二重層構造に適合性ではなく、（Ｃｕｌｌｉｓ，  Ｐ．  Ｒ．ら、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ  ４０巻：１２７〜１４４頁（１９８６年）ならびにＨａｆｅｚ，  Ｉ．  Ｍ．  およびＣｕｌｌｉｓ，  Ｐ．Ｒ．，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ４７巻１３９〜１４８頁（２００１年））、コーン形状の脂質は脂質相の反転、例えば、二重層構造を破壊する六方晶ＨＩＩ相を採用することが好ましい。結論として、エンドソーム膜が溶解し、ｓｉＲＮＡの細胞質への接近が可能になり、細胞質においてＲＩＳＣに結合してＦＶＩＩ  ｍＲＮＡを切断することができる。
【０３４１】
本明細書に記載された結果は、上に導入された形状のコンセプトに一致し、ｃｉｓの二重結合を所与の鎖長に付加することは、末端メチル基によって掃きだされた断面積を増加させるので、したがってコーン様幾何図形的配置を促進する。アニオン性リン脂質と対合した場合、非二重層構造をとる傾向もまた、ケタール含有脂質ファミリーが非常に活性である理由の妥当な論理的根拠である。両方の炭化水素鎖は、１個の炭素を介してケタール環リンカーに結合し、その四面体結合角は、都合のよいコーン形状から離れて鎖を広げる傾向があると思われる。
【０３４２】
（実施例１７）
ＤＬＩＮ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡのＳＮＡＬＰ製剤の効力および認容性
ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡを含む核酸脂質粒子の効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）および認容性を、ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために製剤化された、ＫＣ２−ＳＮＡＬＰと呼ばれる核酸−脂質粒子に関連してさらに検証した。これらの粒子は、実施例１６に記載されたＰＦＶ−調製核酸−脂質粒子とは異なる比率の脂質を含む。
【０３４３】
ｓｉＲＮＡを、Ｊｅｆｆｓらにより記載された、調節された段階希釈方法のプロセスを使用して、ＳＮＡＬＰ中にカプセル化した（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２２巻：３６２〜３７２頁（２００５年））。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質構成成分は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであり、それぞれ５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で使用した。負荷された粒子の形成後、ＳＮＡＬＰをＰＢＳに対して透析し、使用前に０．２μｍのフィルターを通して濾過滅菌した。平均粒径は、７５〜８５ｎｍであり、９０〜９５％のｓｉＲＮＡを脂質粒子内にカプセル化した。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために使用した製剤中の最終的な脂質対ｓｉＲＮＡ比は、およそ６．５：１（ｗｔ：ｗｔ）であった。
【０３４４】
ＫＣ２−ＳＮＡＬＰ製剤は、マウスＦＶＩＩモデルにおいて、実施例１６に記載のＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ製剤と比較して著しい効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）の改善を示した。測定したＥＤ５０は、実施例１６に記載されたＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ核酸−脂質製剤に関する約０．１ｍｇ／ｋｇから、ＫＣ２−ＳＮＡＬＰ製剤に関する約０．０２ｍｇ／ｋｇまで低下した（図８Ａ）。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰが、ラットにおいても同様の効力を示すことがさらに見出された（データ非掲載）。
【０３４５】
効力に加えて、認容性は、ヒトの使用のための適切な核酸−脂質粒子送達系の別の重要な属性であり、それ故、ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの単回投与の認容性をラットにおいて研究した。有効な用量レベルに近い用量が、非常に認容性良好である（データ非掲載）ことを見出し、したがって、単回用量漸増（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｓｅ  ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）研究を、その製剤の観察されたＥＤ５０より約５０倍高い用量（１ｍｇ／ｋｇ）から開始して実施した。標的のサイレンシングから得られる任意の毒性または薬理学的効果が存在しない下で製剤の毒性を理解するために、これらの実験を、実施例１６に記載されたルシフェラーゼに対して向けられた非標的化対照ｓｉＲＮＡ配列を使用して実施した。臨床的兆候を毎日観察し、体重、血清化学および血液学的パラメーターを投与後７２時間に測定した。表１２に示すように、ＫＣ２−ＳＮＡＬＰは、試験した（観察されたＥＤ５０用量と比較して）高用量レベルにおいて非常に認容性良好であり、主要な血清化学または血液学的パラメーターにおいて用量依存性の臨床的に有意な変化はなかった。
【０３４６】
【表１２】
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（実施例１８）
霊長類におけるＫＣ２−ＳＮＡＬＰのＩＮ  ＶＩＶＯの効力および認容性
実施例１７に記載された研究において、げっ歯類において観察された有望な活性および安全性プロファイルを考慮して、非ヒト霊長類において研究を実施し、高等種においてＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ活性の換算を調査した。これらの研究のために、高度治療被験体の肝臓遺伝子であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）を標的とした。
【０３４７】
カニクイザルを、ｓｉＲＮＡ用量が０．０３、０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇで、ＫＣ２−ＳＮＡＬＰ−製剤化ｓｉＴＴＲの単回の１５分静脈内注入により処置した。対照動物には、ＰＢＳまたはＫＣ２−ＳＮＡＬＰ製剤化ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ１ｍｇ／ｋｇの用量の単回の１５分静脈内注入で与えた。すべてのｓｉＲＮＡは、Ａｌｎｙｌａｍにより合成され、エレクトロスプレー質量分析およびアニオン交換ＨＰＬＣにより特徴付けた。ＦＶＩＩ、ＡｐｏＢおよび対照のｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖に関する配列が報告されている（Ａｋｉｎｃ，  Ａ．ら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６巻：５６１〜５６９頁（２００８年））。ＴＴＲ  ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖に関する配列は以下の通りであった：
【０３４８】
【化４０】
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２’−Ｏ−Ｍｅ改変ヌクレオチドは小文字で示す。ｓｉＲＮＡは、等モル量の相補性センスおよびアンチセンス鎖をアニーリングすることによって作製した。
【０３４９】
組織を投与後４８時間で回収し、ＴＴＲの肝臓ｍＲＮＡレベルを決定した。見かけのＥＤ５０の約０．３ｍｇ／ｋｇにより明らかな用量反応が得られた（図８Ｂ）。毒物学的分析は、試験した用量レベルにおいてこの処置が認容性良好であることを示し、処置に関連する変化は動物の外観または挙動に現れなかった。用量依存性の、主要な臨床化学または血液学的パラメーターにおいて臨床的に有意な変化は観察されなかった（表１３）。
【０３５０】
【表１３】
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要約すれば、合理的設計の取り組みは、ＲＮＡｉ治療薬を送達する次世代のＬＮＰ系に使用するための新規な脂質の発見のために採用された。この取り組みを使用して、イオン化可能なカチオン性脂質の重要な構造−活性の考察を記載し、ＤＬｉｎＤＭＡ構造に基づく複数の脂質を設計し特徴付けた。最も実績のよかった（ｂｅｓｔ  ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ）脂質（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）のＳＮＡＬＰ製剤はげっ歯類および非ヒト霊長類の両方において認容性良好であり、げっ歯類において０．０１ｍｇ／ｋｇ程度の低いｓｉＲＮＡ用量におけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性および非ヒト霊長類における治療的に重要な遺伝子（ＴＴＲ）のサイレンシングを示した。注目すべきことに、そのＴＴＲのサイレンシングは、この作業（ＥＤ５０約０．３ｍｇ／ｋｇ）において達成され、非ヒト霊長類におけるＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ仲介サイレンシングの先の報告と比較して、活性の顕著な改善を表している。本発明者らの知る限りでは、この研究において観察された効力は、今日までに非ヒト霊長類において、ＲＮＡｉ治療薬に関して観察された効力の中で最も高いレベルを表しており、ＲＮＡｉおよび送達技術の両方においてなされた、かなりの進歩を強調している。
【０３５１】
上記の様々な実施形態を組み合わせ、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書において参照した、および／または出願データシートに載せた、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物はすべて、それらの全体を参照により本発明に組み込む。様々な特許、出願および刊行物のコンセプトを採用し、さらなる実施形態を提供することが必要な場合、本実施形態の態様は改良してもよい。
【０３５２】
これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明を考慮して本実施形態に対して実施可能である。一般に、下記の特許請求の範囲において、使用した用語は、本特許請求の範囲を、本明細書および本特許請求の範囲で開示した特定の実施形態に限定するものと解釈するべきではなく、権利を与えられるこのような特許請求の範囲の同等物の全範囲に加えて、実施形態のすべての可能性を含むと解釈するべきである。したがって、本特許請求の範囲は、本開示により限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2018119016000001.pdf