(57)【要約】【課題】新規な口腔用組成物、特に、歯周病菌の動物細胞への付着阻害や、歯周病菌の線毛発現の抑制に有効な口腔用組成物の提供。【解決手段】本発明によれば、カカオ豆抽出物を含んでなる、口腔用組成物が提供される。本発明の口腔用組成物は、歯周病菌の動物細胞への付着阻害剤や、歯周病菌の線毛発現抑制剤等として用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオ豆抽出物を含んでなる、口腔用組成物。
【請求項２】
歯周病菌の動物細胞への付着阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
歯周病菌の線毛発現抑制剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
カカオ豆抽出物が未発酵のカカオ豆抽出物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
歯周病菌および／または口臭原因菌に対する抗菌剤である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
歯周病およびその関連疾患の治療、予防または改善に用いるための、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
口臭抑制に用いるための、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項８】
歯周病菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ニグレセンス、トレポネーマ・デンティコーラ、タンネレラ・フォーサイセンシス、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、カンピロバクター・レクタスおよびフロバクテリウム・ヌクレイタムからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項２、３または５に記載の組成物。
【請求項９】
口臭原因菌が、フソバクテリウム・ヌクレアタムおよびベイロネラ・ディスパー並びに請求項８に記載された歯周病菌からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
食品組成物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は口腔用組成物に関し、詳細には歯周病菌の動物細胞への付着阻害や、歯周病菌の線毛発現の抑制に有効な口腔用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕および歯周病などの歯科疾患は、その進行度合いが歯の喪失に繋がるため、食生活や社会生活に支障をきたし、ひいては、全身の健康に影響を与えるとされている。このうち歯周病は、ポルフィロモナス・ジンジバリス等の歯周病菌により引き起こされる歯周組織の疾患である。歯周病菌が形成するプラークは歯周組織に炎症を引き起こし、やがては歯を支えている骨を溶かし、最終的には歯の喪失を引き起こす。軽度な歯周病の場合には歯周病菌を殺菌、除去し、プラークを除去することで炎症が改善され、歯周組織は健全な状態に戻ることが知られている。このため歯周病は予防と初期の処置が重要といえ、歯周病の予防や初期の処置に有効な様々な殺菌剤や抗菌剤が開発されている。
【０００３】
これまで開発されてきた歯周病菌に対する殺菌成分や抗菌成分のうち、天然由来の成分としては発酵カカオ豆から作られるココア抽出物およびカカオマス抽出物（特許文献１）や、カカオ豆の外殻粉砕物に由来するカカオハスク抽出物（非特許文献１〜３）が知られている。カカオ豆に含まれる各種成分は発酵によって変化することが知られているが（非特許文献４）、発酵カカオ豆から作られるカカオマスやココア抽出物については歯周病菌の殺菌効果の報告があるのに対して、未発酵カカオ豆からの抽出物についてはこれまで歯周病菌の殺菌効果の報告はなされていない。
【０００４】
また、近年になって歯周病菌が動物上皮細胞に侵入する際に、歯周病菌が持つ線毛の重要性が示されているが（非特許文献５）、カカオ抽出物による歯周病菌の線毛発現や動物上皮細胞への付着に対する抑制効果はこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００３／０９９３０４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】桑島治博等、医学と生物学、123巻1号33-38頁、1991年
【非特許文献２】Osawa K et al., J DENT RES 80: pp2000-2004(2001)
【非特許文献３】Osawa K et al., Bull Tokyo Dent Coll. 31: pp125-128(1990)
【非特許文献４】後藤泰信等、日本食品科学工学会誌、49巻11号731-735(2002)
【非特許文献５】Chinmay K. Mantri et al., Microbiology Open 4(1), 53-65(2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は新規な口腔用組成物、特に、歯周病菌の動物細胞への付着阻害や、歯周病菌の線毛発現の抑制に有効な口腔用組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、歯周病菌および口臭原因菌に対して有効な口腔用組成物を提供することを目的とする。本発明はさらに、歯周病菌等の口腔細菌の生体内侵入が一因となる血管障害、早産、糖尿病等の様々な疾患等の予防や軽減ができる口腔用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは今般、未発酵のカカオ豆抽出物が歯周病菌の線毛発現を抑制するとともに、未発酵のカカオ豆抽出物と発酵カカオ豆抽出物が歯周病菌の動物細胞への付着を阻害することを見出した。本発明者らはまた、未発酵のカカオ豆抽出物が歯周病菌に対して優れた抗菌活性を有すること、歯周病菌が形成したバイオフィルムに対して優れた抗菌活性を有することを見出した。本発明者らはさらに、未発酵のカカオ豆抽出物を歯周炎モデルラットに投与したところ、歯周炎が改善されることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００９】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］カカオ豆抽出物を含んでなる、口腔用組成物。
［２］歯周病菌の動物細胞への付着阻害剤である、上記［１］に記載の組成物。
［３］歯周病菌の線毛発現抑制剤である、上記［１］に記載の組成物。
［４］カカオ豆抽出物が未発酵のカカオ豆抽出物である、上記［１］に記載の組成物。
［５］歯周病菌および／または口臭原因菌に対する抗菌剤である、上記［４］に記載の組成物。
［６］歯周病およびその関連疾患の治療、予防または改善に用いるための、上記［４］または［５］に記載の組成物。
［７］口臭抑制に用いるための、上記［４］または［５］に記載の組成物。
［８］歯周病菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ニグレセンス、トレポネーマ・デンティコーラ、タンネレラ・フォーサイセンシス、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、カンピロバクター・レクタスおよびフロバクテリウム・ヌクレイタムからなる群から選択される１種または２種以上である、上記［２］、［３］または［５］に記載の組成物。
［９］口臭原因菌が、フソバクテリウム・ヌクレアタムおよびベイロネラ・ディスパー並びに上記［８］に記載された歯周病菌からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［５］に記載の組成物。
［１０］食品組成物である、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の組成物。
【００１０】
本発明の口腔用組成物はカカオ豆抽出物を有効成分とするものである。カカオ豆抽出物は人類が長年食品の原料として使用してきた天然素材であることから、本発明によれば副作用の懸念がなく、安全な口腔用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株）の線毛（Ｍｆａ１、ＦｉｍＡ）の発現に対する未発酵カカオ豆抽出物（ＣＢＰ、ＨＰ−ＰＷ）の阻害効果を示した図（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の写真）である。図中の「Ｐｇ」は、未発酵カカオ豆抽出物非添加培地でポルフィロモナス・ジンジバリスを培養した対照群の結果を示す。
【図２】ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株）の動物細胞への付着性に対するカカオ豆抽出物の阻害効果を示した図である。
【図３】未発酵のカカオ豆抽出物の歯周病菌に対する効果を、ＣＢＰ濃度およびＨＰ−ＰＷ濃度と、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株）の生残細菌数との関係から示した図である。
【図４】未発酵のカカオ豆抽出物の歯周病菌に対する効果を、ＣＢＰ濃度およびＨＰ−ＰＷ濃度と、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株）の生残率との関係から示した図である。
【図５】ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株）が形成したバイオフィルムに対する未発酵カカオ豆抽出物（ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷ）の殺菌効果を示した図（顕微鏡写真）である。写真中の数字（％）は、生菌の割合を示す。なお、図３中の「ＰＷ−ＶＥ−Ｒ」は「ＨＰ−ＰＷ」と同義である。
【図６】ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株）の歯槽骨吸収に対する未発酵カカオ豆抽出物の抑制効果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５）。
【図７】ラット口腔内のポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株）をＰＣＲにより検出した結果を示した図（写真）である。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明の口腔用組成物はカカオ豆抽出物を含んでなるものである。本発明において「カカオ豆抽出物」は、発酵カカオ豆抽出物のみならず、未発酵のカカオ豆抽出物をも含む意味で用いられるものとする。
【００１３】
本発明の口腔用組成物は発酵カカオ豆抽出物を含んでなるものである。発酵カカオ豆抽出物は、発酵処理されたカカオ豆を加工処理して得られた素材をそのまま用いるか、あるいは、後述の抽出処理の原料として用いることができる。加工処理後の素材としては、カカオ豆からセパレーターにより皮を取り除いたもの、例えば、カカオニブ、カカオマス、脱脂カカオマスおよびココアパウダーが挙げられる。すなわち、本発明においては、カカオニブ、カカオマス、脱脂カカオマスおよびココアパウダー並びにこれらの抽出物を発酵カカオ豆抽出物として用いることができる。また、カカオ豆の発酵処理は、常法に従って自然発酵により実施することができる。
【００１４】
発酵カカオ豆抽出物は、発酵処理されたカカオ豆（上記加工処理されたものを含む）を溶媒抽出することにより調製することができる。使用できる溶媒としては水、炭素数１〜６のアルコール（例えば、エタノール）、アルデヒドおよびケトンが挙げられ、それぞれを組み合わせてカカオ豆の品種に合った溶媒を抽出溶媒として用いてもよい。溶媒抽出工程に先立って搾油（エクスペラー）工程を実施してもよい。搾油工程を実施することにより脱脂された抽出物を得ることができる。溶媒抽出工程により得られた抽出液は、例えば、ろ過および濃縮した後、スプレードライ法やフリーズドライ法などの乾燥手段により乾燥させて、乾燥粉末の形態としてもよい。発酵カカオ豆抽出物の調製方法は公知であり、例えば、特開２００１−６９９４６号公報の記載に従って調製することができる。
【００１５】
本発明の口腔用組成物は未発酵のカカオ豆抽出物を含んでなるものである。未発酵のカカオ豆抽出物はカカオ豆（生豆）を溶媒抽出することにより調製することができる。使用できる溶媒としては水、炭素数１〜６のアルコール（例えば、エタノール）、アルデヒドおよびケトンが挙げられ、それぞれを組み合わせてカカオ豆の品種に合った溶媒を抽出溶媒として用いてもよい。溶媒抽出工程に先立ってカカオ豆を破砕する工程や搾油（エクスペラー）工程を実施してもよい。搾油工程を実施することにより脱脂された抽出物を得ることができる。溶媒抽出工程により得られた抽出液は、例えば、ろ過および濃縮した後、スプレードライ法やフリーズドライ法などの乾燥手段により乾燥させて、乾燥粉末の形態としてもよい。
【００１６】
未発酵のカカオ豆抽出物の調製方法は公知であり、例えば、特開２０１４−１１８３６９号公報の記載に従って調製することができる。また、未発酵のカカオ豆抽出物は市販されており、例えば、株式会社明治製の「カカオ豆抽出物ＣＢＰ」や「HPカカオエキスPW」を本発明に用いることができる。
【００１７】
本発明の組成物におけるカカオ豆抽出物の含有量（固形分換算基準）は、後述する歯周病菌の動物細胞への付着阻害活性、歯周病菌の線毛発現抑制活性、歯周病菌および口臭原因菌に対する抗菌活性などの効果が発揮される限り特に限定されないが、上限を１００質量％、３０質量％あるいは１０質量％とすることができ、下限を０．０１質量%、０．１質量％、１質量％あるいは５質量％とすることができる。
【００１８】
本発明の組成物は口腔用組成物として用いることができ、具体的には、歯周病菌の動物細胞（特に、上皮細胞）への付着阻害剤および歯周病菌の線毛（特に、Ｍｆａ１線毛およびＦｉｍＡ線毛）の発現抑制剤として用いることができる。本発明による組成物はまた、歯周病菌および／または口臭原因菌に対する抗菌剤として用いることができる。
【００１９】
ここで、歯周病菌としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス (Porphyromonas gingivalis)などのポルフィロモナス属細菌、プレボテラ・インターメディア (Prevotella intermedia)、プレボテラ・ニグレセンス（Prevotella nigrescens）などのプレボテラ属細菌、トレポネーマ・デンティコーラ（Treponema denticola）、タンネラ・フォーサイセンシス（Tannella forsythensis）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）などが挙げられる。
【００２０】
また、口臭原因菌としては、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）などのフソバクテリウム属細菌、ベイロネラ・ディスパー（Veillonella dispar）などのベイロネラ属細菌、さらには前述の各種歯周病菌などが挙げられる。
【００２１】
本発明の組成物によれば歯周病菌の動物細胞（特に、上皮細胞）への付着を阻害することができ、また、歯周病菌の線毛（特に、Ｍｆａ１線毛およびＦｉｍＡ線毛）の発現を抑制することができる。歯周病菌の口腔内への定着は細胞への付着が足がかりとなっており、また、歯周病菌の口腔内への定着とバイオフィルムの形成には菌体上に発現する線毛が重要な役割を果たしている。従って、本発明の組成物によれば、歯周病菌の動物細胞への付着阻害や歯周病菌の線毛の発現抑制を通じて、歯周病やその関連疾患を治療、予防および改善することができる。
【００２２】
本発明の組成物によれば歯周病菌や口臭原因菌などの口腔内病原菌の総菌数を減少させるか、あるいは、増殖を抑制することができ、ひいては、歯周病や口臭などの口腔内疾患を治療、予防または改善することができる。すなわち、本発明の組成物は口臭抑制に用いることができ、口臭抑制剤として用いることができる。ここで、「口臭」とは、呼気に含まれている口臭成分を人が感じるものをいい、呼気と共に口腔から発せられる悪臭の総称である。該悪臭の代表成分として硫化水素やメチルメルカプタンのような揮発性含硫化合物が挙げられる。
【００２３】
本発明の組成物は歯周病およびその関連疾患の治療、予防または改善のために用いることができる。すなわち、本発明によれば未発酵のカカオ豆抽出物を有効成分として含んでなる歯周病およびその関連疾患の治療、予防または改善剤が提供される。
【００２４】
本発明において「歯周病」とは歯肉炎および歯周炎を含む意味で用いられる。また、歯周病の関連疾患は、歯周病に起因して生じうる２次的な疾患を意味し、例えば、誤嚥性肺炎、口腔細菌の生体内侵入が一因となる血管障害（例えば、狭心症、心筋梗塞）、早産、糖尿病などが挙げられる。
【００２５】
本発明の組成物は歯周病菌や口臭原因菌に対する抗菌活性等が奏される限り、その形態や形状に特に制限はなく、固形状の形態であっても、液体、半液体、ゲル状、ペースト状、粉末状などの形態であってもよい。本発明の組成物としては、例えば、タブレット（例えば、トローチ、チュアブル錠）、ガム、グミ、キャンディ、錠菓、飲料、ゼリーなどの食品組成物や、可食性フィルム、歯磨剤、洗口剤、うがい剤、義歯洗浄剤、口腔内崩壊錠、ジェルなどの口腔ケア組成物が挙げられ、携帯性や口腔内滞留性の観点から、タブレット、ガム、グミ、キャンディが好ましい。本発明の組成物は、その剤型に応じ、カカオ豆抽出物以外に任意成分としてその他の公知の添加剤を配合することができる。
【００２６】
本発明の組成物をタブレットとして提供する場合には、カカオ豆抽出物以外に、糖質、賦形剤、甘味料、酸味料、香料、着色料、保存剤、安定化剤、乳化剤、植物抽出物、果汁パウダーなどから選択される１種または２種以上の成分を配合し、常法により製造することができる。
【００２７】
カカオ豆抽出物はそれ自体喫食可能な材料であり、後記実施例に示す通り歯周病菌や口臭原因菌に対する抗菌活性等を有するため、日常摂取する食品やサプリメントとして摂取する食品に含有させて提供することもできる。すなわち、本発明の組成物は食品組成物として提供することができる。本発明の組成物を食品組成物として提供する場合には、本発明の組成物は有効成分であるカカオ豆抽出物を配合する以外は、当該食品の通常の製造手順に従って製造することができる。
【００２８】
本発明の有効成分であるカカオ豆抽出物を食品組成物として提供する場合には、カカオ豆抽出物をそのまま食品に含有させることで調製することができ、該食品組成物はカカオ豆抽出物を有効量含有した食品である。ここで、カカオ豆抽出物を「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に所定の範囲でカカオ豆抽出物が摂取されるような含有量をいう。なお、本発明の有効成分であるカカオ豆抽出物そのものあるいはそれを含む組成物を、摂取者において食品（例えば、飲料）に添加し食品組成物とするような態様も本発明の範囲に含まれるものとする。
【００２９】
本発明の組成物は、歯周病菌の動物細胞への付着阻害活性、歯周病菌の線毛発現抑制活性および歯周病菌に対する抗菌活性等に有効な１回分の摂取量のカカオ豆抽出物を含んでなる組成物として提供することができる。これらの活性に有効な１回分のカカオ豆抽出物の摂取量や、１日当たりの摂取回数は、摂取者の年齢、症状、体感に依存して決定することができる。例示をすれば、歯周病菌の動物細胞への付着阻害活性、歯周病菌の線毛発現抑制活性および歯周病菌に対する抗菌活性等に有効な１回分のカカオ豆抽出物の摂取量は固形分換算質量で０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／回であり、好ましくは１．０ｍｇ〜１０ｍｇ／回である。また、これらの活性に効果的な１日当たりのカカオ豆抽出物の摂取回数は、１〜１０回／日であり、好ましくは３〜５回／日である。
【００３０】
本発明の別の面によれば、有効量のカカオ豆抽出物をヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、或いは投与することを含んでなる、歯周病菌の動物細胞への付着阻害方法および歯周病菌の線毛発現の抑制方法が提供される。本発明によればまた、有効量の未発酵のカカオ豆抽出物をヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、或いは投与することを含んでなる、歯周病菌および／または口臭原因菌の殺菌方法が提供される。本発明の殺菌方法、阻害方法および抑制方法は、本発明の組成物に関する記載に従って実施することができる。
【００３１】
本発明のさらに別の面によれば、有効量の未発酵のカカオ豆抽出物をヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、或いは投与することを含んでなる、歯周病およびその関連疾患の治療、予防または改善方法が提供される。本発明の治療、予防または改善方法は本発明の組成物に関する記載に従って実施することができる。
【００３２】
ここで、本発明におけるカカオ豆抽出物のヒトおよび非ヒト動物に対する使用については治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。ここで、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
【００３３】
本発明のさらにまた別の面によれば、歯周病菌の動物細胞への付着阻害剤および歯周病菌の線毛発現抑制剤の製造のための、カカオ豆抽出物の使用と、歯周病菌の動物細胞への付着阻害剤および歯周病菌の線毛発現抑制剤としての、カカオ豆抽出物の使用が提供される。本発明によればまた、歯周病菌および／または口臭原因菌に対する抗菌剤の製造のための、未発酵のカカオ豆抽出物の使用と、歯周病菌および／または口臭原因菌に対する抗菌剤としての、未発酵のカカオ豆抽出物の使用が提供される。本発明の使用は本発明の組成物に関する記載に従って実施することができる。
【実施例】
【００３４】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３５】
例１：歯周病菌の線毛の発現に対する未発酵カカオ豆抽出物の影響
（１）未発酵カカオ豆抽出物含有培地の調製
被検試料として、カカオ豆抽出物（ポリフェノール濃度８２質量％、以下「ＣＢＰ」という）（株式会社明治製）およびＨＰカカオエキスＰＷ（ポリフェノール濃度１７質量％、以下「ＨＰ−ＰＷ」という）（株式会社明治製）を用いた。ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷは、それぞれ抽出方法の異なる未発酵カカオ豆抽出物である。ＣＢＰ粉末およびＨＰ−ＰＷ粉末はそれぞれ５０％エタノール溶解液に溶解し、ＣＢＰ含有５０％エタノール溶解液およびＨＰ−ＰＷ含有５０％エタノール溶解液とした。ＢＨＩ−ＹＨＫ培地は、ブレインハートインフュージョン培地（ベクトンディキンソン社製、以下「ＢＨＩ培地」という）に５ｍｇ／ｍＬの酵母エキス（ベクトンディキンソン社製）、５μｇ／ｍＬのヘミン（和光純薬社製）および０．５μｇ／ｍＬのビタミンＫ１（和光純薬社製）を添加して調製した（以下、同様）。次いで、表１に示すＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷ濃度となるように、ＢＨＩ−ＹＨＫ培地にＣＢＰ含有５０％エタノール溶解液およびＨＰ−ＰＷ含有５０％エタノール溶解液をそれぞれ添加することにより、ＣＢＰを含有するＢＨＩ−ＹＨＫ培地およびＨＰ−ＰＷを含有するＢＨＩ−ＹＨＫ培地を調製した。また、対照群として、ＢＨＩ−ＹＨＫ培地にＣＢＰ含有５０％エタノール溶解液およびＨＰ−ＰＷ含有５０％エタノール溶解液のいずれも添加しない試験区を設けた。
【００３６】
（２）歯周病菌の調製
歯周病菌として、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株、以下同様)を用いた。ポルフィロモナス・ジンジバリスをＢＨＩ−ＹＨＫ培地に接種し、嫌気ガス（７０％Ｎ２、１５％Ｈ２、１５％ＣＯ２）を満たしたＡｎａｅｒｏｂｏｘ（テーハー式・アナエロ・ボックスANX-3型、株式会社ヒラサワ社製）内で、３７℃で１８時間培養した。培養後、遠心分離処理により集菌し、５５０ｎｍの波長で吸光度１．０であるポルフィロモナス・ジンジバリス菌液を調製した。
【００３７】
（３）線毛の発現阻害の測定
上記（１）で調製したＣＢＰ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地およびＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地に、上記（２）で調製したポルフィロモナス・ジンジバリス菌液１０μＬを接種し、嫌気条件下、室温で１時間または２４時間作用させた後、培養後の各ＢＨＩ−ＹＨＫ培地を線毛発現阻害測定試験に供した。具体的には、培養後の各ＢＨＩ−ＹＨＫ培地に１ｍＬのＳＤＳサンプルバッファーを添加して１００℃、５分間保持し各溶菌液サンプルを調製した。各溶菌液サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ＦｉｍＡ（４１ｋＤａ）およびＭｆａ１（６７ｋＤａ）の各線毛タンパク質の発現を調べた。
【００３８】
（４）結果
結果は図１に示される通りであった。図１の結果より、０．０１ｍｇ／ｍＬおよびこれよりも高い濃度のＣＢＰ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地はＦｉｍＡおよびＭｆａ１線毛の発現に対して阻害作用を有することが確認された。また、０．０１ｍｇ／ｍＬおよびこれよりも高い濃度のＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地はＭｆａ１線毛の発現に対して阻害作用を有すること、０．１ｍｇ／ｍＬおよびこれよりも高い濃度のＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地はＦｉｍＡ線毛の発現に対して阻害作用を有することが確認された。
【００３９】
例２：歯周病菌の動物細胞への付着性に対するカカオ豆抽出物の影響
（１）カカオ豆抽出物含有培地の調製
ＣＢＰ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地およびＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地は、例１（１）に記載の手順に従って、ＣＢＰとＨＰ−ＰＷの最終培地濃度がそれぞれ０．００１、０．０１、０．１ｍｇ／ｍＬであるＢＨＩ−ＹＨＫ培地と、対照群としてＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷのいずれも添加しないＢＨＩ−ＹＨＫ培地を調製した。また、被験試料として、Natsume et al., Biosci Biotechnol Biochem., 64, 2581-2587(2000)に記載された手順で調製した発酵カカオ豆抽出物であるＣＬＰｒ（ポリフェノール濃度７１質量％）を用いて、例１（１）に記載の手順に従ってＣＬＰｒ含有５０％エタノール溶解液を調製し、次いでＣＬＰｒの最終培地濃度がそれぞれ０．００１、０．０１、０．１ｍｇ／ｍＬであるＣＬＰｒ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地を調製した。
【００４０】
（２）歯周病菌の調製
歯周病菌は、５５０ｎｍの波長で吸光度０．３であるポルフィロモナス・ジンジバリス菌液（１０９ＣＦＵ／ｍＬ）とした以外は、例１（２）に記載の手順に従って調製した。
【００４１】
（３）歯周病菌の細胞付着性に対する阻害効果の測定
動物細胞として、ヒト歯肉上皮細胞（ＨＧＥＣ細胞）を用いた。ヒト歯肉上皮細胞を２４ウェルプレートに１ウェルあたり１ｍＬのＫＧＭ培地（ＬＯＮＺＡ社製）を用いて５％ＣＯ２・３７℃の条件下で４８時間培養した。培養後のヒト歯肉上皮細胞に、上記（１）で調製したＣＢＰ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地、ＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地およびＣＬＰｒ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地を０．０００１ｍｇ／ｍＬ、０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬのカカオ豆抽出物濃度となるように添加し、次いで上記（２）で調製したポルフィロモナス・ジンジバリス菌液１０μＬを接種し、５％ＣＯ２・３７℃の条件下で１時間処理した。処理後のヒト歯肉上皮細胞をＰＢＳで３回洗浄後、水１ｍＬで室温下２０分放置することで上皮細胞を破壊して調製したポルフィロモナス・ジンジバリス菌液を適当に希釈し、希釈液０．１ｍＬをＢＨＩ血液寒天培地に塗抹し、３７℃で５日間培養後、生菌数を測定した。ＢＨＩ血液寒天培地はＢＨＩ−ＹＨＫ培地に１．５％バクトアガー（ベクトンディキンソン社製）を添加して滅菌後、５％羊脱繊血（日本バイオテスト研究所）を加えて作製した。
【００４２】
（４）結果
結果は図２に示される通りであった。図２の結果より、ＣＢＰ、ＨＰ−ＰＷおよびＣＬＰｒは歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリスの動物細胞への付着に対して阻害効果を有することが確認された。
【００４３】
例３：未発酵のカカオ豆抽出物の歯周病菌に対する効果
（１）未発酵カカオ豆抽出物含有培地の調製
ＣＢＰ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地およびＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地は、例１（１）に記載の手順に従って、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷの最終培地濃度がそれぞれ０．０１、０．１、１．０、１０ｍｇ／ｍＬであるＢＨＩ−ＹＨＫ培地と、対照群としてＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷのいずれも添加しないＢＨＩ−ＹＨＫ培地を調製した。
【００４４】
（２）歯周病菌の調製
歯周病菌は、例１（２）に記載の手順に従って調製した。
【００４５】
（３）殺菌効果の測定
上記（１）で調製したＣＢＰ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地およびＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地に、上記（２）で調製したポルフィロモナス・ジンジバリス菌液１０μＬを入れ、嫌気条件下、室温で１時間処理した後、処理後の各ＢＨＩ−ＹＨＫ培地を生菌数測定試験に供した。具体的には、処理後の各ＢＨＩ−ＹＨＫ培地を適当に希釈した希釈液０．１ｍＬを、実施例２で用いたＢＨＩ血液寒天培地に塗抹し、３７℃で５日間培養後、生菌数を測定し、下記式（１）に従って生残率を求めた。
【００４６】
【数１】
2018150282.tif 000002
【００４７】
（４）結果
結果は図３および図４に示される通りであった。図３および図４の結果より、ＣＰＢおよびＨＰ−ＰＷは歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリスに対して殺菌効果を有することが確認された。
【００４８】
例４：未発酵のカカオ豆抽出物がバイオフィルムに与える影響
（１）未発酵カカオ豆抽出物含有培地の調製
ＣＢＰ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地およびＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地は、例１（１）に記載の手順に従って、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷの最終培地濃度がそれぞれ０．１、１．０、１０ｍｇ／ｍＬであるＢＨＩ−ＹＨＫ培地と、対照群としてＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷのいずれも添加しないＢＨＩ−ＹＨＫ培地を調製した。
【００４９】
（２）バイオフィルム形成
ＢＨＩ−ＹＨＫ培地１ｍＬを添加した２４ウェルマイクロプレートに円形カバーガラスを入れ、これに例１（２）で調製したポルフィロモナス・ジンジバリス菌液１０μＬを接種し、嫌気条件下、３７℃で１６．５時間培養した。培養後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でウェル内の浮遊菌を除去し、新鮮なＢＨＩ−ＹＨＫ培地に交換し、３７℃で２４時間培養して、カバーガラス上にポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムを形成させた。
【００５０】
形成されたバイオフィルムに、上記（１）で得られたＣＢＰ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地およびＨＰ−ＰＷ含有ＢＨＩ−ＹＨＫ培地を添加し、嫌気条件下、室温で１時間作用させた後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標名）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標名） Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｉｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてバイオフィルムを染色し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、キーエンス社製）で観察した。生菌は緑色で標識され、死菌は赤色で標識されるため、顕微鏡観察下では両者を識別することができる。また、蛍光顕微鏡写真を画像解析し、写真全体面積に対する緑色面積の割合（生菌の割合）を算出した。なお、緑色は図５では白ないし灰色で示された部分に対応し、赤色は図５では濃い灰色ないし黒で示された部分に対応する。
【００５１】
（３）結果
結果は図５に示される通りであった。図５の結果より、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷ（図５中では「ＰＷ−ＶＥ−Ｒ」と表記）をそれぞれ作用させたポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムでは、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷの濃度に依存してバイオフィルム形成細菌の死滅が観察された。すなわち、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷを添加しない「Control」では観察面全体が緑色に染色され、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷをそれぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ添加すると赤色にやや染色された部分が観察面に出現し、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷをそれぞれ１．０ｍｇ／ｍＬ添加すると赤色に染色された部分が観察面に複数箇所出現し、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷをそれぞれ１．０ｍｇ／ｍＬ添加すると観察面全体が赤色に染色された。また、写真全体面積に対する緑色面積（図５では白ないし灰色で示された部分）の割合（生菌の割合）も、未発酵カカオ豆抽出物の添加濃度が増加するにつれて減少傾向を示した。以上から、ＣＢＰおよびＨＰ−ＰＷは歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムに対して殺菌効果を有することが確認された。
【００５２】
例５：未発酵のカカオ豆抽出物の歯周病に対する効果
（１）実験的歯周炎モデルの作製
３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（日本クレア社より入手）を群分けした。具体的には、コントロール群（以下、「Ｉ群」という）、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染群（以下、「ＩＩ群」という）、未発酵カカオ豆抽出物摂取群（以下、「ＩＩＩ群」という）および未発酵カカオ豆抽出物摂取かつポルフィロモナス・ジンジバリス感染群（以下、「ＩＶ群」という）の４群（各群ｎ＝６）に分けた。未発酵カカオ豆抽出物はＣＢＰを用いた。口腔常在菌を減少させる目的で、各群に最終濃度１ｍｇ／ｍＬのサルファメトキサゾールと２００μｇ／ｍＬのトリメトプリムをイオン交換水中に混合したものを飲料水として４日間与え、その後３日間は抗生物質を含まないイオン交換水を与えた後、１日目、３日目、５日目に以下の処理を行った。すなわち、Ｉ群は５％カルボキシメチルセルロース溶液（以下、「ＣＭＣ」）という）を、ＩＩ群は５％ＣＭＣで調製したポルフィロモナス・ジンジバリス菌液（１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を、それぞれラット口腔内へ投与した。Ｉ群とＩＩ群の投与を行った２時間後に、ＩＩＩ群は最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように５％ＣＭＣで調製したＣＢＰ溶液をＩ群の処理を行ったラット口腔内へ投与し、ＩＶ群は最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように５％ＣＭＣで調製したＣＢＰ溶液をＩＩ群の処理を行ったラット口腔内に投与した。すべてのラットは、食事および飲料水を自由に摂取できるようにし、温度２３℃、湿度６０％および明暗１２時間のサイクルの環境下で飼育した。また、体重をポルフィロモナス・ジンジバリス感染直後（４週齢）、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染１週間後（５週齢）および屠殺時（１１週齢）に測定し、各群の体重の平均値を求めた。最終投与日より４０日目にすべてのラットをエーテル麻酔下で断頭潟血により屠殺した。本動物感染実験は神奈川歯科大学実験動物倫理委員会の承認を得て実施した。
【００５３】
（２）歯槽骨吸収量の測定
歯槽骨の吸収量は、上記（１）で屠殺したラットの上顎臼歯部のセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を７か所測定して行った。具体的には、頭蓋骨を２気圧下で１０分間加熱後、３％次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬して軟組織を除去後、１％メチレンブルー溶液で歯槽骨を染色乾燥させたものを試料として、実体顕微鏡下、倍率４０倍で測定した。７か所の測定値の平均値を個体あたりの骨吸収量とし、各群６匹の平均値を各実験群の骨吸収量としてミリメートルで表し標準偏差（ＳＤ）を求めた。統計学的分析は、Ｔｕｋｅｙ法を用いて行った。
【００５４】
（３）ＰＣＲによるラット口腔内の歯周病菌の検出
ラット口腔内のプラーク細菌の採取は、水で湿らせた綿棒でラット口腔内を拭って行い、水０．５ｍｌ中で綿棒についた菌を懸濁させ、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２１，５００×ｇで３分間、）して得られる沈殿画分をプラーク細菌とした。ポルフィロモナス・ジンジバリス標準菌株および採取したプラーク細菌からのＤＮＡ抽出は、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポン・ジーン社製）を用い、添付の手順書に従って実施した。抽出したＤＮＡを３０μＬのＴ１０Ｅ１溶液に溶解して保存した。ＰＣＲ反応には、ポルフィロモナス・ジンジバリス １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から作製されたＡｓｈｉｍｏｔｏ等（Ashimoto A. et al., Oral Microbiol Immunol. 1996;11(4):266-73）が報告したプライマー（５’−ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＣＧ−３’（配列番号１）および５’−ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＣＧＡ  ＴＧＴ−３’（配列番号２）、増幅断片長は４０４ｂｐ）を用いた。ＤＮＡの増幅は、９５℃５分間加熱した後、９５℃３０秒、６０℃１分、７２℃１分を３６サイクル行った。ＰＣＲ試薬はＧｏＴａｑ（商標名） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、遺伝子の増幅はｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。ＰＣＲ反応終了後のＤＮＡサンプルおよび分子量マーカーとしてＳｍａｒｔ Ｌａｄｄｅｒ（和光純薬工業社製）を１．５％アガロースゲル電気泳動後、写真撮影を行い、増幅ＤＮＡ断片を検出した。
【００５５】
（４）結果
結果は図６および７に示される通りであった。図６の結果より、歯周病菌感染群（II群）は歯周病菌未投与群（I群）に比較して有意な歯槽骨吸収が確認されたが、歯周病菌感染後に未発酵カカオ豆抽出物を投与した群（IV群）では、歯槽骨吸収量が抑制され、未発酵カカオ豆抽出物投与群（III群）とほぼ同様の骨吸収量となることが確認された。また、図７の結果より、歯周病菌感染後に未発酵カカオ豆抽出物を投与した群（IV群）では、歯周病菌感染群（II群）と比較して口腔内の歯周病菌が低減されることが確認された。なお、実験期間中の各群の体重には違いは認められなかった（データ示さず）。
【００５６】
【図１】
2018150282.tif 000003
【図２】
2018150282.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018150282.tif 000008
【図７】
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【配列表】
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