(57)【要約】      （修正有）【課題】記憶障害を改善するための新規な化合物の提供。【解決手段】ＧＰＰＧＰＡＧのアミノ酸配列からなるペプチド、該ペプチドをコードする核酸及び該ペプチドを含む記憶障害改善用医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを含む、記憶障害改善用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、記憶障害を改善するための化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病及び認知症等を含む記憶障害を改善するための化合物としては、４’−デメチルノビレチン及び４’−デメチルタンゲレチン（特許文献１）並びに低用量ピオグリタゾン（特許文献２）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第８９４０７８９号明細書
【特許文献２】国際公開第１２／０９６８７３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、記憶障害を改善するための新規な化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者らは、ＧＰＰＧＰＡＧのアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチドが、記憶障害を改善することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［６］を提供する。
［１］配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
［２］上記［１］に記載のペプチドをコードする核酸。
［３］上記［１］に記載のペプチドを含む、記憶障害改善用医薬組成物。
［４］配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、記憶障害改善方法。
［５］記憶障害改善方法のための、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
［６］記憶障害改善用医薬組成物を製造するための、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの使用。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、記憶障害を改善するための新規な化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ａβ２５−３５処置細胞における、ＧＰＰＧＰＡＧ、ＧＰＰＧＰＰＧ、ＧＰＰＧＰＰ、ＧＰＰＧＰＡ、ＰＰＧＰＡＧ及びＧＰＰの１ｎＭ及び１０ｎＭの後処置による樹状突起の密度の変化を示した図である。「対照」はＡβ２５−３５未処置細胞、「溶媒」はペプチドを含まない溶媒のみを処置したＡβ２５−３５処置細胞を表す。アスタリスクは、有意差を表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図２】Ａβ２５−３５処置細胞における、ＧＰＰＧＰＡＧの１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭの後処置による樹状突起上の前シナプス密度の変化を示した図である。「対照」はＡβ２５−３５未処置細胞、「溶媒」はペプチドを含まない溶媒のみを処置したＡβ２５−３５処置細胞を表す。アスタリスクは、有意差を表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図３】５ＸＦＡＤマウスにおける、ＧＰＰＧＰＡＧ投与による探索指向指数の変化を示した図である。「ＧＰＰＧＰＡＧ」はＧＰＰＧＰＡＧを投与したＧＰＰＧＰＡＧ投与群、「溶媒」はペプチドを含まない溶媒のみを投与した溶媒投与群を表す。アスタリスクは、有意差を表す（＊Ｐ＜０．０５、＃Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００１０】
本発明のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなり、当業者に周知の方法、例えば、ペプチド固相合成法及びペプチド液相合成法等により合成することができる。また、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸は、当業者に周知の方法、例えば、固相合成法により合成することができる。上記の配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、上記核酸を用いて、当業者に周知の方法、例えば、大腸菌、酵母及び昆虫細胞・バキュロウイルス等を用いた発現系を使用する方法により発現させ、入手することができる。
【００１１】
本発明の一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、公知の製剤学的方法により製剤化し、医薬組成物とすることができる。医薬組成物に含まれる上記ペプチドの含有量は、医薬組成物の形態、医薬組成物を用いる対象の病状及び体重等により当業者が適宜決定することができる。医薬組成物は、上記ペプチドと、適宜の薬学的に許容される担体又は媒体及び添加剤等の製薬上に必要な成分を含むことができる。担体又は媒体としては、例えば、滅菌精製水及び生理食塩水が挙げられる。添加剤としては、例えば、賦形剤、ｐＨ調整剤、安定剤、増粘剤、防腐剤、界面活性剤、乳化剤及び希釈剤が挙げられる。薬学的に許容される担体又は媒体及び添加剤等の製薬上に必要な成分の種類及び含有量は、医薬組成物の形態により適宜調整することができる。
【００１２】
本発明の一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む医薬組成物は、それを必要とする対象に投与することができる。
【００１３】
それを必要とする対象とは、記憶障害を発症している対象を意味する。記憶障害は、脳内の神経細胞の機能障害又は神経細胞死による記憶障害を含む。したがって、それを必要とする対象は、脳内の神経細胞の機能障害又は神経細胞死による記憶障害を発症している対象であってよい。また、記憶障害は、アルツハイマー病及び認知症を含む。したがって、それを必要とする対象は、アルツハイマー病又は認知症を発症している対象であってよい。対象は、ヒト及び非ヒト動物を含む哺乳類であり、ヒトを対象とすることが好ましい。
【００１４】
医薬組成物の投与形態としては、例えば、経口投与、経鼻投与、経粘投与、皮内投与、皮下投与、経皮投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、動脈内投与、脳室内投与、くも膜下投与及び硬膜外投与が挙げられる。
【００１５】
医薬組成物の形態は、投与形態により適宜選択できるが、例えば、水溶液、シロップ剤、ゼリー剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び散剤が挙げられる。
【００１６】
医薬組成物の効果的な投与量及び投与スケジュールは、投与形態、対象の病状、体重及び年齢等により当業者が適宜決定することができる。
【００１７】
本発明の一実施形態における医薬組成物は、アルツハイマー病及び認知症等を含む記憶障害の治療薬として用いることができ、アルツハイマー病及び認知症の治療薬として用いることもできる。治療は、記憶障害を発症している対象を完全に回復させることのみを意味するものではなく、記憶障害を改善させること及び記憶障害の進行を抑制することも含む。
【実施例】
【００１８】
＜アルツハイマー病モデルマウス＞
アルツハイマー病モデルマウス：アルツハイマー病の動物モデルであるトランスジェニックマウス（５ＸＦＡＤ）は、ジャクソン研究所（バーハーバー（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）、メイン州、米国）から入手した。５ＸＦＡＤマウスは、ニューロン特異的マウスＴｈｙ−１プロモータの転写制御下、スウェーデン（Ｓｗｅｄｉｓｈ）（Ｋ６７０ＮとＭ６７１Ｌ）、フロリダ（Ｆｌｏｒｉｄａ）（Ｉ７１６Ｖ）及びロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）（Ｖ７１７Ｉ）に変異を持つヒトＡＰＰ６９５  ｃＤＮＡ、及びヒトＰＳ１  ｃＤＮＡ（Ｍ１４６ＬとＬ２８６Ｖの変異）を過剰発現している（Oakley,H.ら,J Neurosci,26,10129-10140,2006．）。それらはＢ６／ＳＪＬ  Ｆ１ブリーダーとヘミ接合トランスジェニックマウスを交配することによって維持された。
【００１９】
本実施例においては、５ＸＦＡＤマウスは、５〜７か月齢である雌性を用い、餌と水を自由に摂取できる状態で、２２±２℃、５０±５％の湿度、午前７時から始まる１２時間の明暗サイクルで制御された環境で飼育した。
【００２０】
＜ペプチド＞
本実施例で用いたペプチドを表１に示す。ペプチドは、培養神経細胞実験の場合は滅菌精製水に、マウス脳室内投与実験の場合は人工脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ（ＡＣＳＦ）：１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，３．５ｍＭ  ＫＣｌ，１．３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ａｎｄ  １０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｔ  ｐＨ７．４）に溶解した。
【表１】
2018130044.tif 000002
【００２１】
＜統計処理＞
本実施例において、得られた結果は以下の統計処理を行った：
一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、事後ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）検定、非対応ｔ−検定及び対応ｔ−検定は、グラフパッド５（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６）  （グラフパッドソフトウエア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社、ラホヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜  ０．０５は統計学的に有意とし、平均値は標準誤差とともに示す。
【００２２】
＜樹状突起伸長の定量実験＞
マウス大脳皮質神経細胞は胎生１４日齢のｄｄＹマウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，  静岡）から取り出した胎児をＰＢＳで洗浄後、断頭し、初代培養用に作成した培地［Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中に１２％馬血清（ライフテクノロジーズ），２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸，０．６％グルコースを溶解］に入れた。培地中で、実体顕微鏡（ＳＺ−６１，Ｏｌｙｍｐｕｓ，東京）下で大脳皮質のみを単離した。
【００２３】
大脳皮質を安全キャビネット内で約１ｍｍ角に切断した。７００ｒｐｍで３分間遠心した後、上清を除去し、沈殿物に０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ライフテクノロジーズ）を２ｍＬ加え、懸濁した。３７℃で１５分間、５分置きに攪拌しながらインキュベーションし、培地を４ｍＬ加え、７００ｒｐｍで３分間遠心して上清を除去し、沈殿に６００Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（和光純薬）−０．０３％  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ライフテクノロジーズ）−ＰＢＳ溶液を２ｍＬ加え、懸濁した。
【００２４】
その懸濁液をさらに、３７℃で１５分間、５分置きに攪拌しながらインキュベーションし、培地を４ｍＬ加え、７００ｒｐｍで３分間遠心した。沈渣にカルシウム・マグネシウム不含Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）を４ｍＬ加え７００ｒｐｍで３分間遠心した。沈渣に培地を４ｍＬ加えた。
【００２５】
培地を加えた沈渣を、先端を炙りなめしたパスツールピペットで細胞塊が見えなくなるまで穏やかに懸濁した後、７０μｍ  ｎｙｌｏｎ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）で濾過した。細胞の培養は８−ｗｅｌｌチャンバースライド（ｆａｌｃｏｎ）で行った。前日にコーティング［Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ（ＰＤＬ，和光純薬）をＰＢＳで０．００５ｍｇ／ｍＬに希釈したものをまき、３７℃でインキュベーションしたもの。培養当日に滅菌精製水で２回洗浄。］したものに細胞を播種した。３７℃、１０％ＣＯ２、飽和水蒸気下で培養を開始した。
【００２６】
樹状突起の伸長の定量実験の際は、培養開始５時間後及び３日後に培地を全量、馬血清の代わりにＢ−２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む新しい培地で交換した。３日後の培地交換の際に、事前に凝集させておいたアミロイドベータ部分配列（Ａβ２５−３５）を１０μＭになるように加え、その３日後に培地を全量新しいものに換える際にペプチドあるいは溶媒を加え、さらに４日後に免疫染色を実施した。
【００２７】
樹状突起の伸長を定量する免疫染色は、薬物処置期間終了後、培地を除いてＰＢＳで洗浄し、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ，和光純薬）−ＰＢＳ溶液を加え、１時間室温で静置し、細胞を固定した。０．３％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬）−ＰＢＳ溶液で５分間の洗浄を２回行った。その後、１次抗体溶液［０．３％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００−ＰＢＳ溶液、１％ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ（和光純薬）、１次抗体］を加え、４℃で一晩反応させた。
【００２８】
１次抗体には、ウサギ抗ＭＡＰ２ポリクローナル抗体（１：２０００）（ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）を用いた。翌日、１次抗体溶液を除き、０．３％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００−ＰＢＳ溶液で５分間の洗浄を２回行った後、２次抗体溶液［０．３％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００−ＰＢＳ溶液、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ，ＵＳＡ）］を加え、遮光下の室温で２時間反応させた。反応後、２次抗体溶液を除き、ＰＢＳで５分間、２回洗浄し、ＤＡＰＩ染色で核を染めた後、Ａｑｕａ  Ｐｏｌｙ  Ｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，米国）で封入した。
【００２９】
蛍光顕微鏡（Ｃｅｌｌ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて、各薬物処置を施したｗｅｌｌから倍率１０倍の対物レンズを使用して画像を取得した。それらの画像について、画像解析ソフトＭｅｔａＭｏｒｐｈ（モレキュラーデバイス，東京）を用いて、画面全体のＭＡＰ２陽性の樹状突起の長さと、各画像内のＭＡＰ２陽性神経細胞数を計測し、１神経細胞あたりの樹状突起の長さを算出した。
【００３０】
Ａβ２５−３５未処置細胞（対照）と比較してＡβ２５−３５処置細胞（溶媒）では、樹状突起の密度が有意に減少していた（図１）。これに対し、ＧＰＰＧＰＡＧ（１０ｎＭ）の後処置によって有意な樹状突起の密度の増加が認められた。１ｎＭ及び１０ｎＭのいずれの処置によっても、ＧＰＰＧＰＰＧ、ＧＰＰＧＰＰ、ＧＰＰＧＰＡ、ＰＰＧＰＡＧ、ＧＰＰでは、効果が認められなかった（図１）。
【００３１】
＜前シナプス密度定量実験＞
前シナプス密度定量実験の際は、細胞の培養開始５時間後及び３日後に培地を全量、馬血清の代わりにＢ−２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む新しい培地で交換した。その後１週間に１度程度の頻度で培地交換を繰り返した。培養開始から２１日後の培地交換の際、事前に凝集させておいたアミロイドベータ部分配列（Ａβ２５−３５）を１０μＭになるように加えた。その３日後に培地を全量新しいものに換える際にペプチドあるいは溶媒を加え、さらに４日後に免疫染色を実施した。
【００３２】
前シナプス密度を定量する免疫染色は、薬物処置期間終了後、培地を除いてＰＢＳで洗浄し、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ，和光純薬）−ＰＢＳ溶液を加え、１時間室温で静置し、細胞を固定した。０．３％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬）−ＰＢＳ溶液で５分間の洗浄を２回行った。その後、１次抗体溶液［０．３％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００−ＰＢＳ溶液、１％ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ（和光純薬）、１次抗体］を加え、４℃で一晩反応させた。
【００３３】
１次抗体には、マウス抗ｓｙｎａｔｏｐｈｙｓｉｎモノクローナル抗体（１：５００）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ、東京）、ウサギ抗ＭＡＰ２ポリクローナル抗体（１：２０００）（ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）を用いた。翌日、１次抗体溶液を除き、０．３％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００−ＰＢＳ溶液で５分間の洗浄を２回行った後、２次抗体溶液［０．３％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００−ＰＢＳ溶液，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：２００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）］を加え、遮光下の室温で２時間反応させた。反応後、２次抗体溶液を除き、ＰＢＳで５分間、２回洗浄し、ＤＡＰＩ染色で核を染めた後、Ａｑｕａ  Ｐｏｌｙ  Ｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，米国）で封入した。
【００３４】
蛍光顕微鏡（Ｃｅｌｌ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて、各薬物処置を施したｗｅｌｌから倍率２０倍の対物レンズを使用して画像を取得した。それらの画像について、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、米国）を用いて、ＭＡＰ２陽性の樹状突起の長さと、樹状突起上に重なるｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ陽性斑点の面積とを計測し、樹状突起の一定長さあたりのｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ陽性前シナプス面積を算出した。
【００３５】
２１日間の長期培養後にＡβ２５−３５処置細胞（溶媒）では、Ａβ２５−３５未処置細胞（対照）と比較して樹状突起上の前シナプス密度が有意に減少していた（図２）。これに対し、ＧＰＰＧＰＡＧの後処置によって濃度依存的な前シナプス密度の増加が認められた。特に１０ｎＭ及び１００ｎＭでは有意な増加が認められた（図２）。
【００３６】
＜物体認知記憶試験＞
ＧＰＰＧＰＡＧを人工脳脊髄液に溶解して、浸透圧ミニポンプ１００４タイプ（ＡＬＺＥＴ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐｓ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、米国）を用いて、５ＸＦＡＤマウスの右側脳室に刺入固定し、側脳室内に２８日間持続的に注入した。投与量はＧＰＰＧＰＡＧが脳脊髄液中で常に１０ｎＭになるように設定した。具体的には、ポンプからのペプチドの流量０．１１μｌ／ｈと、マウスにおける脳脊髄液生成量１８μｌ／ｈから計算し、マウス脳脊髄液中のペプチド濃度が、（細胞実験での有効濃度であった）１０ｎＭになっているようにペプチド液濃度を調製してポンプに入れた。比較群として、５ＸＦＡＤマウスの右側脳室に同様に浸透圧ミニポンプを刺入固定し、人工脳脊髄液のみを持続的に投与した５ＸＦＡＤマウス群（溶媒投与群）も設けた。これらのマウス群に対し、物体認知記憶試験を実施した。
【００３７】
物体認知記憶試験とは、動物が新しいものに興味を示す習性を利用した試験である。すなわち、テスト段階において、トレーニング段階で見た物体を覚えているか否かを確認する試験である。試験は、文献（Int J Neurosci, 121, pp.181-190, 2011.、及びIntJ Neurosci, 121, pp.641-648, 2011.）の記載にしたがって行った。具体的には、以下のように行った。
【００３８】
試験は比較的照明をおとした部屋（約１００ルクス）にて行った。トレーニング段階とテスト段階の間の適切な時間間隔（インターバル）は、別のマウスのグループで予めテストして決めた。試験を行うオープンフィールドボックスの内側の壁には、一切の目印はない。トレーニング段階ではフィールド内に２つの同じ物体を置き１０分間の探索行動をさせる。テストの段階では、物体の一つを新しい物体に置き換え、しかし置き場所は変えずに、１０分間の探索行動をさせる。マウスが、置き換えた新しい物体に興味を示して探索行動する回数の増加を、物体記憶能力の指標とするものである。
【００３９】
本実施例では、総探索時間に対する新たな物体への探索回数の割合（％）を探索指向指数（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ）として算出した。
【００４０】
本実施例では、トレーニング段階とテスト段階のインターバルは２４時間とした。５ＸＦＡＤマウスの溶媒投与群では、トレーニング段階の探索指向指数と比較して、２４時間後のテスト段階での探索指向指数に変化はなかった（図３）。この結果から、５ＸＦＡＤマウスの溶媒投与群では、物体の記憶が保持されておらず、記憶障害が生じていることが示された。一方、テスト段階でのＧＰＰＧＰＡＧ投与群では、探索指向指数がトレーニング段階よりも有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、記憶障害の改善が示された（図３）。
【００４１】
以上により、本発明の配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによる記憶障害改善効果が示された。
【図１】
2018130044.tif 000003
【図２】
2018130044.tif 000004
【図３】
2018130044.tif 000005
【配列表】
2018130044000001.app