(57)【要約】【課題】形態が均一な収縮型の血管壁細胞を短期間で大量に取得することができる細胞増殖分化誘導方法を提供する。【解決手段】iPS細胞由来のVEGFR2陽性且つVEカドヘリン陰性細胞を、(1)bFGF、インシュリン、及び、IGF-Iを有効成分として含む第１の平滑筋細胞培地で、増殖型の表現型で培養し、次に、(2)EGF、及び、BFGFを有効成分として含む第２の平滑筋細胞培地で、収縮型の表現型で培養する。形態が均一な収縮型の血管壁細胞を例えば12日間で約10倍取得することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
iPS細胞由来のVEGFR2陽性且つVEカドヘリン陰性細胞を、
(1)bFGF、インシュリン、及び、IGF-Iを有効成分として含む第１の平滑筋細胞培地で、増殖型の表現型で培養し、次に、
(2)EGF、及び、bFGFを有効成分として含む第２の平滑筋細胞培地で、収縮型の表現型で培養することを特徴とする、
未熟血管壁細胞の成熟血管壁細胞への細胞増殖分化誘導方法。
【請求項２】
前記第１の平滑筋細胞培地は、更に、FBS、BSA、apo-transferrin及びヒドロコロチゾンを含有することを特徴とする請求項１に記載の細胞増殖分化誘導方法。
【請求項３】
前記第２の平滑筋細胞培地は、更に、FCS及びインシュリンを含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞増殖分化誘導方法。
【請求項４】
前記第１の平滑筋細胞培地及び第２の平滑筋細胞培地での培養では、ラミニンでコーティングした培養ディッシュにて培養することを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の細胞増殖分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞増殖分化誘導方法に関し、具体的には、未熟血管壁細胞の成熟血管壁細胞への細胞増殖分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管の構造は内腔を一層におおう内皮細胞と、それを外側から取り巻く血管構造の支持や収縮・弛緩を行う血管壁細胞（血管平滑筋細胞）の２種類の細胞からなる。血管平滑筋細胞は血管の中膜に存在し、血管の収縮を担う血管の主要細胞である。
【０００３】
血管壁細胞は、血管壁細胞が関わる疾患の病態解析や、血管の動脈硬化の研究等に利用される。そのため血管壁細胞の効率的な増殖分化誘導方法が求められる。
【０００４】
例えば非特許文献１には、未分化ES細胞をフィーダー細胞OP9と共培養することによりVEGFR2陽性細胞が誘導され、その後所定条件下に血管壁細胞が誘導されることが記載されている。しかしながらこの方法はES細胞から誘導する方法であるため大量の血管壁細胞を得ることが難しい。
【０００５】
また例えば特許文献１及び非特許文献２には、iPS細胞をGSK-3β阻害剤及びVEGFで処理することで、発生初期血管内皮細胞をVE-カドヘリン陽性、VEGFR2陽性細胞として取得し、この際、未熟壁細胞がVE-カドヘリン陰性、VEGFR2陽性細胞として採取できることが報告されている。
【０００６】
この方法では、フローサイトメトリーにより得られた未熟壁細胞をコラーゲンIコートディッシュ上でPDGF-BBを含む培地で培養後、成熟壁細胞として使用しており、壁細胞のマーカーであるαSMAとCalponinの発現が確認されている。
【０００７】
しかしながら、ヒト成人の血管壁に存在する平滑筋細胞は収縮型の形態であるが、この方法で得られた細胞は形態が均一でなく、培養中にたびたび神経細胞様の突起を伸ばす細胞が混入する。更には細胞の増殖能が低く、十分な細胞数を得るためには大量のiPS細胞を分化させる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ/２００５/１２３９０４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Yamahara, PLoS One, 2008
【非特許文献２】Taura D et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009;29(7):1100-3; Tatsumi R et al. Cell Transplantation. 2011;20(9):1423-30
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、形態が均一な収縮型の血管壁細胞を短期間で大量に取得する細胞増殖分化誘導方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明にかかる細胞増殖分化誘導方法は、iPS細胞由来のVEGFR2陽性且つVEカドヘリン陰性細胞を、(1)bFGF、インシュリン、及び、IGF-Iを有効成分として含む第１の平滑筋細胞培地で、増殖型の表現型で培養し、次に、(2)EGF、及び、bFGFを有効成分として含む第２の平滑筋細胞培地で、収縮型の表現型で培養することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、形態が均一な収縮型の血管壁細胞を短期間で大量に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】培養ディッシュのコーティング及び培地の検討結果を示す図である。
【図２】平滑筋細胞培地の検討結果を示す図であり、そのうち(A)はSMCM培地での培養したヒト動脈由来平滑筋初代培養細胞であり、(B)はSMCGM2培地での培養したヒト動脈由来平滑筋初代培養細胞である。
【図３】SMCM培地での培養後、SMCGM2培地での培養したヒトiPS細胞である。
【図４】収縮型細胞であることを示すWestern blotting図である。
【図５】フローサイトメトリー直後からSMCGM2培地を使用した培養結果を示す図であり、そのうち(A)は形態異常の発生を示す図であり、(B)は未分化iPS細胞の混入を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本発明にかかる細胞増殖分化誘導方法は、iPS細胞由来のVEGFR2陽性且つVEカドヘリン(Vascular Endothelial-cadherin)陰性細胞を、(1)第１の平滑筋細胞培地で増殖型の表現型で培養(第１の培養)し、次に、(2)第２の平滑筋細胞培地で収縮型の表現型で培養(第２の培養)する。
【００１６】
iPS細胞としては、例えば哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられ、好ましくはヒトに由来のものが使用可能である。
【００１７】
iPS細胞としては、例えば体細胞に複数の遺伝子を導入して得られるES細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、C-Myc遺伝子及びSox2遺伝子を導入することによって得られるiPS細胞や、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子及びSox2遺伝子を導入することによって得られるiPS細胞等が使用可能である。
【００１８】
血管内皮増殖因子VEGFの受容体であるVEGFR2陽性細胞は、血管内皮細胞及び壁細胞の双方に分化する能力を有する。VEGFR2陽性且つVEカドヘリン陰性細胞は、血管前駆細胞(vascular progenitor cell:VPC)として機能する。
【００１９】
VEGFR2陽性且つVEカドヘリン陰性の細胞分離は、特に限定されるものではないが例えばフローサイトメトリーによるソーティングにて行われる。かかる場合、例えば細胞群をPBSに懸濁して、所定の細胞濃度の細胞懸濁液を取得後に得られた細胞懸濁液をフローサイトメーターに供してソーティングすることにより目的細胞を分取可能である。
【００２０】
第１の平滑筋細胞培地は、主たる栄養因子として、BFGF(FGF-2)、インシュリン、及び、IGF-Iを含む。それぞれの含有量は、例えば、BFGF(FGF-2) 1〜3ng/ml、インシュリン 4〜6μg/ml、及び、IGF-I 1〜3ng/mlとすることが可能である。また第１の平滑筋細胞培地には、fetal bovine serum (FBS)、bovine serum albumin(BSA)、apo-transferrin及びヒドロコロチゾン(hydrocortisone)を含有させることも可能である。
【００２１】
第２の平滑筋細胞培地は、主たる栄養因子として、EGF、及び、bFGF(FGF-2)を含む。それぞれの含有量は、例えば、EGF 0.3〜0.7ng/ml、及び、bFGF(FGF-2) 1〜3ng/mlとすることが可能である。また第２の平滑筋細胞培地には、fetal calf serum albumin(FCS)及びインシュリンを含有させることも可能である。
【００２２】
第１の平滑筋細胞培地及び第２の平滑筋細胞培地での培養における培養容器は、細胞培養に適したものであれば特に限定されるものではなく、例えば6cm径培養ディッシュや、10cm径培養ディッシュ等が使用される。
【００２３】
培養ディッシュに播種される細胞の量は、特に限定されるものではないが、例えば、10cm径培養ディッシュに対し、3×104細胞〜7×105細胞であり、好ましくは5×104細胞〜5×105細胞である。
【００２４】
第１の平滑筋細胞培地での培養条件は、例えば5%CO2で36〜38℃好ましくは37℃の気相条件で12日〜30日維持することが可能である。
【００２５】
第２の平滑筋細胞培地での培養条件は、例えば5%CO2で36〜38℃好ましくは37℃の気相条件で細胞を実験に使用する前の3日〜7日維持することが可能である。
【００２６】
なお、本発明においては、細胞誘導期に血管内皮細胞増殖因子を投与することにより、iPS細胞から血管壁細胞及び血管内皮細胞の２種類の細胞を同時に取得することも可能である。例えば上述の第１の培養において培養開始から3日目〜6日目に、血管内皮細胞増殖因子としてVEGFを投与することが可能である。
【００２７】
また、本発明によれば形態が均一な血管壁細胞を短期間で大量に取得することができるため、血管壁細胞の機能異常に起因する病態解析に有効に応用可能である。例えばCADASIL(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy)はNotch3遺伝子変異により血管壁細胞の変性や血管反応性の異常等が起こり、白質障害や脳梗塞に至る疾患である。本発明によれば、NOTCH3変異を持つCADASIL患者からiPS細胞を樹立して血管壁細胞へと分化誘導し、マウス脳の血管平滑筋初代培養細胞（CVSMC）から得られたNotch3変異が血管平滑筋機能に及ぼす解析結果との比較検討も可能である。
【実施例】
【００２８】
(1)コーティング及び培地の検討
ヒトiPS-TIG107-4f1(細胞番号(JCRB) JCRB1628)を分化誘導させ、フローサイトメトリーで得られたVE-カドヘリン陰性且つVEGFR2陽性細胞を各培養条件（培地：2% FCS, 10 ng/ml PDGF-BB in αMEM又はSmooth Muscle Cell Medium (SMCM, ScienCell), コーティング：コラーゲンI又はラミニン）で９日間培養した。
【００２９】
SMCM培地の組成は、2% FBS、BSA 10 μg/ml, apo-transferrin 10 μg/ml, insulin 5 μg/ml, FGF-2 2 ng/ml, IGF-I 2 ng/ml,hydrocortisone 1 μg/mlであった。結果を図１に示す。図１に記載されているように、PDGFを加えた培地に比べ、SMCMで培養した細胞は増殖能が高く、また形態も壁細胞らしいものとなった。
【００３０】
コーティングの差は培地の差よりも小さいものの、ラミニンコートの方が均一な細胞集団となっていた。この結果から、平滑筋細胞培地及びラミニンコートを使用することとした。
(2)平滑筋細胞培地の検討
下記の平滑筋細胞培地２種を比較した。
・Smooth Muscle Cell Medium (SMCM): ScienCell
・Smooth Muscle Cell Growth Medium 2 (SMCGM2): PromoCell
なお、SMCGM2培地の組成は、FCS 0.05 ml/ml, EGF 0.5 ng/ml, FGF-2 2 ng/ml, insulin 5 μg/mlであった。
【００３１】
まず、動脈平滑筋初代培養細胞において、それぞれの培地による形態への影響を検討した。初代培養細胞はScienCell社から購入したHuman Aortic Smooth Muscle Cell (HASMC)を使用し、ラミニンコートディッシュ上で各培地で３日間培養した。
【００３２】
結果を図２に示す。増殖に関しては、SMCMが非常に早く増殖するのに対し、SMCGM2はゆっくりと増殖したが、図２に記載されているように、SMCMでは増殖型と思われる形態の細胞が均一に増殖し、SMCGM2ではネットワーク状に増殖して、形態も収縮型に近いものとなった。ここで、図２(A)はSMCM培地での培養したヒト動脈由来平滑筋初代培養細胞であり、図２(B)はSMCGM2培地での培養したヒト動脈由来平滑筋初代培養細胞である。
【００３３】
この検討からSMCMで培養することでフローサイトメトリーで得られた細胞を比較的短期間で大量に増やすことができ、次にSMCGM2で培養することで増殖型から収縮型にフェノタイプ転換させて細胞の形態を均一化させることができることが示唆された。
(3)SMCM及びSMCGM2を使用した培養の検討
iPS細胞のコロニーを剥離・破砕後、WiCell conditioned medium (20% KSR, 1mM L-Glutamine, 0.07% 2-merceptoethanol, 非必須アミノ酸入りDMEM/F12)に懸濁してコラーゲンＩコートディッシュに播種し、5% CO2の気相、37℃で培養した。
【００３４】
播種後１日目に培地をGSK-3α/β阻害剤である5μM BIOとB27/N2サプリメントを添加したWiCell conditioned mediumに交換し、3日間培養した。その後、さらにVEGF入りStemPro-34 (Thermo-Fisher社)中で4日間培養して、血管内皮細胞と壁細胞へ分化誘導した。
【００３５】
分化誘導を終えた細胞を剥離して回収し、抗TRA-1-60抗体、抗VEカドヘリン抗体(CD144)、及び抗VEGFR2(flk-1)抗体で染色し、フローサイトメトリーでTRA-1-60陰性、VEGFR2陽性、VEカドヘリン陰性細胞を未熟血管壁細胞として回収した。得られた細胞は、ScienCell社製Smooth Muscle Cell Mediumに懸濁し、ラミニンでコーティングされた培養容器に播種した（10cmディッシュあたり約5x105細胞）。
【００３６】
5%CO2の気相、37℃で12日培養した。培養中は、3日に1回培地の交換を行い、増殖に応じて継代を行った。12日目に細胞を回収し、ナカライテスク社のCell Reservoir One (DMSO不含)を用いて凍結保存した。
【００３７】
実験に使用するにあたって、凍結から起こした細胞は7〜10日間ラミニンコーティングディッシュ上でScienCell社製Smooth Muscle Cell Medium中で培養し、実験に必要な細胞数まで増殖させた。この間、3日に1回培地の交換を行い、増殖に応じて継代を行った。
【００３８】
実験開始の3〜7日前にPromoCell社製Smooth Muscle Cell Growth Medium 2に培地交換し、壁細胞を収縮型にフェノタイプ転換させて培養した。結果を図３に示す。図３に示されるように収縮型の細胞が見られた。
【００３９】
なお、Western blottingで平滑筋細胞及び非筋細胞の収縮を調節している収縮制御タンパクCaldesmonの発現を確認したところ、本実施例にかかる手法で得られた細胞では、図４に示されるように、収縮型平滑筋細胞で発現するH-CaldesmonがL-Caldesmonよりも多く検出され、細胞が収縮型になっていることが確認された。このように本発明によれば、形態が均一な収縮型の血管壁細胞を短期間で大量に取得することができる。
(4)フローサイトメトリー直後からのSMCGM2を使用した培養の検討
本実施例にかかる手法では、フローサイトメトリー後、SMCMで維持した壁細胞をSMCGM2で培養したが、フローサイトメトリー直後からSMCGM2で培養することで、より収縮型に近い壁細胞が得られるか検討した。
【００４０】
即ち、上記したようにフローサイトメトリーでTRA-1-60陰性、VEGFR2陽性、VEカドヘリン陰性細胞を未熟血管壁細胞として回収した後、ラミニンコートディッシュでのSMCGM2で継代数5まで培養した。
【００４１】
図５(A)に示されるように、SMCGM2での培養が１週間を超えると、次第に細胞内に内包物が溜まった細胞がでてくることが明らかとなった。また、図５(B)に示されるように、フローサイトメトリーでごく少量混入する未分化細胞がSMCGM2では未分化のままコロニーを形成すること見られた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
研究用の平滑筋細胞の大量培養に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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