(57)【要約】【課題】干渉物質の影響を抑制し、より高感度に過酸化水素を検出できる新たな手段を提供すること。【解決手段】酵素センサ２０の作用電極３０に用いられる過酸化水素電極１００において、基板２１上に、粒子と前記粒子を保持するための保持物質を含む中間層１０１を設け、中間層１０１上に電極層１０７とを設ける。これにより、過酸化水素電極１００によれば、生体内に存在する干渉物質による干渉を受けにくい印加電圧を用いた場合でも、過酸化水素を高感度に検出できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に配置され、粒子および前記粒子を保持するための保持物質を含む中間層と、
前記中間層上に配置され、過酸化水素を検出するための電極層と
を備える電極。
【請求項２】
前記電極層が白金を含む請求項１記載の電極。
【請求項３】
前記中間層において、前記粒子を含む層と前記保持物質を含む層とが積層されている請求項１または２記載の電極。
【請求項４】
前記粒子がナノ粒子またはマイクロ粒子である請求項１〜３のいずれか１項に記載の電極。
【請求項５】
前記粒子が多孔質粒子である請求項１〜３のいずれか１項に記載の電極。
【請求項６】
前記粒子が非導電性粒子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の電極。
【請求項７】
前記保持物質が親水性高分子物質である請求項１〜６のいずれか１項に記載の電極。
【請求項８】
前記親水性高分子物質がポリビニルアルコールである請求項７に記載の電極。
【請求項９】
基板と、
前記基板上に配置された請求項１〜８のいずれか１項に記載の電極と、
前記電極の表面上に固定化されたオキシダーゼと
を備える酵素センサ。
【請求項１０】
基板と、
前記基板上に配置された請求項１〜８のいずれか１項に記載の電極と、
前記電極の表面上に固定化されたグルコースオキシダーゼと
を備えるグルコースセンサ。
【請求項１１】
生体から抽出された体液に含まれる測定対象の生体内成分の量に関する成分情報を取得するための検出部と、
前記成分情報に基づいて、前記測定対象の生体内成分の量に関する解析値を取得するための解析部と
を備え、
前記検出部が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の電極および前記電極の表面上に固定化されたオキシダーゼを含む作用電極と、対電極とを含む生体内成分測定装置。
【請求項１２】
（Ａ）基板の一方の表面上に、粒子と前記粒子を保持するための保持物質とを含む中間層を形成する工程、および
（Ｂ）前記中間層の表面上に、過酸化水素を検出するための電極層を形成する工程
を含む電極の製造方法。
【請求項１３】
前記工程（Ａ）において、前記基板の一方の表面上に、前記保持物質を含む層を形成した後、粒子を含む層を形成する請求項１２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酸化水素を検出するための電極およびその製造方法、酵素センサ、グルコースセンサならびに生体内成分測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿などの体液に含まれる生体内成分、例えば、グルコースおよび尿酸は、それぞれ、糖尿病および痛風の指標となる。このような疾患を早期に発見するために生体内成分を精度良く検出できることが求められている。
【０００３】
特許文献１には、過酸化水素を検出するための過酸化水素電極を備える酵素センサを用いて体液中のグルコースを検出する技術が開示されている。図１５に示すように、特許文献１に記載の酵素センサ５００では、基板５０１上に導電性薄膜電極層５０２が形成され、導電性薄膜電極層５０２の表面に過酸化水素選択透過膜５０３が設けられる。この過酸化水素選択透過膜５０３の表面には、グルコースオキシダーゼが固定化された酵素固定化層５０４が設けられる。体液中のグルコースは、酵素固定化層５０４に固定化されたグルコースオキシダーゼの存在下で酸素と反応して、過酸化水素を発生する。発生した過酸化水素は過酸化水素選択透過膜５０３を透過して導電性薄膜電極層５０２で電気分解され、電流を生じさせる。この電流値を測定することによりグルコース量が定量される。
【０００４】
このような酵素センサを用いてグルコース量を定量する場合、過酸化水素の電気分解に必要な電圧を印加すると、体液に含まれるアスコルビン酸等の還元性物質も電極層で電気分解されてしまうことが知られている。アスコルビン酸等が電極層で電気分解されると電流が生じるため、過酸化水素のみに起因する電流値を正確に測定することが困難となり、グルコースの検出精度が低下するおそれがある。そこで、特許文献１の酵素センサ５００では、アスコルビン酸等の干渉物質が導電性薄膜電極層５０２で電気分解されることを抑制するため、酵素反応により生じた過酸化水素のみを選択的に導電性薄膜電極層５０２側に透過させるよう、過酸化水素選択透過膜５０３が導電性薄膜電極層５０２の表面に設けられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−２４１３４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の酵素センサ５００を用いた場合、グルコースから生じた過酸化水素の全てを過酸化水素選択透過膜５０３が透過させることは困難であり、一部の過酸化水素しか過酸化水素選択透過膜５０３を透過しないため、電流値によってグルコース量を精度良く定量することが困難であった。
【０００７】
干渉物質の影響を抑制し、より高感度に過酸化水素を検出できることが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の側面に係る電極は、基板上に配置され、粒子および当該粒子を保持するための保持物質を含む中間層と、中間層上に配置され、過酸化水素を検出するための電極層とを備える。本発明者らは、電極層上に過酸化水素選択透過膜を設けなくても、基板と電極層との間に、粒子と保持物質とを含む中間層を設けることによって、干渉物質の影響を抑制して、電極層で過酸化水素を高感度に検出できることを見出した。具体的には、本発明者らは、生体内に存在する干渉物質が電極層で電気分解されないような低い印加電圧を用いた場合でも、過酸化水素を電極層で電気分解し、生じた電流を高感度に検出できることを見出した。そのため、本発明の第１の側面に係る電極においては、干渉物質が電極層で電気分解されないような低い印加電圧を用いることによって過酸化水素のみに起因する電流を検出することができるため、電極層上に過酸化水素選択透過膜を設けなくてもよく、電極層に到達する過酸化水素の量が減少することを抑制できる。したがって、本発明の第１の側面に係る電極によれば、干渉物質の影響を抑制して、より高感度に過酸化水素を検出できる。なお、本明細書において、「粒子」とは、微小球体、ナノ粒子、マイクロ粒子またはビーズなど、硬化状態にある粒子を指す。「粒子」は、半硬化状態にある粒子であってもよい。「保持物質」とは、基板と電極層との間に粒子を分散させて保持させることが可能な物質を指す。「保持物質」は、親水性高分子物質、疎水性高分子物質などであってもよい。「中間層」とは、基板上に配置され、基板と電極層との間に設けられた層をいう。中間層の表面には、電極層を接着させるための接着層が設けられてもよい。「電極層」は、金、白金などの金属薄膜により形成される層である。電極層は、過酸化水素を電気分解し、生じた電子を受け取る機能を有する。
【０００９】
中間層において、粒子を含む層と保持物質を含む層とが積層されていることが好ましい。この場合、過酸化水素電極の強度が向上することを本発明者らは見出した。
【００１０】
粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子であってもよい。また、粒子は、多孔質粒子であってもよい。粒子の形状は、球形状であってもよく、非球形状であってもよい。非球形状には、円柱状、角柱状、板状などが包含される。
【００１１】
保持物質は、親水性高分子物質であってもよい。本明細書において、「親水性高分子物質」とは、水溶性の高分子化合物であるか、または非水溶性であっても静電相互作用または水素結合により水分子と相互作用する高分子化合物をいう。親水性高分子物質は、ポリビニルアルコールであることが好ましい。ポリビニルアルコールは、粒子に対して高い接着性を示す。したがって、このような構成を有する過酸化水素電極によれば、過酸化水素電極の強度を向上させることができる。
【００１２】
本発明の第２の側面に係る酵素センサは、基板と、基板上に配置された前述の電極と、電極の表面上に固定化されたオキシダーゼとを備える。酵素センサは、酵素であるオキシダーゼの作用によって産物として過酸化水素を生じる物質の測定などに用いられる。本発明の第２の側面に係る酵素センサによれば、前述の電極を備えるので、生体内に存在する干渉物質による干渉を受けにくい印加電圧を用いた場合でも、過酸化水素に起因する電流を高感度に検出できる。したがって、本発明の第２の側面に係る酵素センサによれば、オキシダーゼの作用によって産物として過酸化水素を生じる生体内成分を高感度に検出できる。
【００１３】
本発明の第３の側面に係るグルコースセンサは、基板と、基板上に配置された前述の電極と、電極の表面上に固定化されたグルコースオキシダーゼとを備える。グルコースセンサは、グルコースに起因する過酸化水素に基づくグルコースの測定に用いられる。本発明の第３の側面に係るグルコースセンサによれば、前述の電極を備えるので、生体内に存在する干渉物質による干渉を受けにくい印加電圧を用いた場合でも、過酸化水素に起因する電流を高感度に検出できる。したがって、本発明の第３の側面に係るグルコースセンサによれば、干渉物質による影響を抑制し、グルコースを高感度に検出できる。
【００１４】
本発明の第４の側面に係る生体内成分測定装置は、生体から抽出された体液に含まれる測定対象の生体内成分の量に関する成分情報を取得するための検出部と、成分情報に基づいて、測定対象の生体内成分の量に関する解析値を取得するための解析部とを備え、検出部が、前述電極および電極の表面上に固定化されたオキシダーゼを含む作用電極と、対電極とを含む。生体内成分測定装置は、オキシダーゼの作用によって産物として過酸化水素を生じる生体内成分の測定などに用いられる。本発明の第４の側面に係る生体内成分測定装置は、前述の電極を含む作用電極を含むので、生体内成分から生じた過酸化水素に起因する電流を高感度に検出できる。したがって、本発明の第４の側面に係る生体内成分測定装置によれば、干渉物質による影響を抑制し、生体内成分を高感度に検出できる。
【００１５】
本発明の第５の側面に係る電極の製造方法は、
（Ａ）基板の一方の表面上に、粒子と当該粒子を保持するための保持物質を含む中間層を形成する工程、および
（Ｂ）中間層の表面上に電極層を形成する工程
を含む。本発明の第５の側面に係る電極の製造方法は、基板上に中間層を形成し、形成された中間層の表面上に電極層を形成するという操作が採用されているので、前述の作用効果を奏する電極を得ることができる。
【００１６】
工程（Ａ）において、基板の一方の表面上に、保持物質を含む層を形成した後、粒子を含む層を形成することが好ましい。この場合、より強度に優れた電極を得ることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、干渉物質の影響を抑制し、より高感度に過酸化水素を検出できる新たな手段およびその用途を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】過酸化水素電極を示す模式的な断面図である。
【図２】過酸化水素電極を示す模式的な断面図である。
【図３】過酸化水素電極を含む酵素センサを示す模式的な平面図である。
【図４】生体内成分測定装置の一例を示す斜視図である。
【図５】生体内成分測定装置を示す模式的な平面図である。
【図６】生体内成分測定装置を示す模式的な側面図である。
【図７】過酸化水素電極の製造手順を示す工程図である。
【図８】（Ａ）は実施例１のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｂ）は実施例１のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンの検出感度と印加電圧との関係を示すグラフである。
【図９】（Ａ）比較例１のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｂ）比較例１のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンの検出感度と印加電圧との関係を示すグラフである。
【図１０】（Ａ）は比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｂ）は比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｃ）は比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を示すグラフである。
【図１１】（Ａ）は実施例２および比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｂ）は実施例２および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を示すグラフである。
【図１２】（Ａ）は実施例３および比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｂ）は実施例３および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｃ）は実施例３および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を示すグラフである。
【図１３】（Ａ）は実施例４および比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｂ）は実施例４および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を示すグラフ、（Ｃ）は実施例４および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を示すグラフである。
【図１４】（Ａ）は実験番号１の電極基板の作用電極の表面の図面代用写真、（Ｂ）は実験番号２の電極基板の作用電極の表面の図面代用写真、（Ｃ）は実験例２（３）で得られた対照の電極基板の作用電極の表面の図面代用写真である。
【図１５】従来の酵素センサを示す模式的な断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［用語の説明］
本明細書において、「Ｘ〜Ｙ」のように、端点による数値範囲の記載は、各範囲内に含まれるすべての数および有理数ならびに記載されている端点を含む。
【００２０】
「微侵襲組織液抽出技術」とは、僅かな侵襲で被験者から組織液を抽出する技術をいう。微侵襲組織液抽出技術では、穿刺具などによって生体の皮膚に微細孔を形成して組織液の抽出を促進する。微細孔から抽出された組織液をゲルなどの抽出媒体を用いて回収する。
【００２１】
「生体内成分」とは、生体、例えば、被験者から抽出した体液に含まれる成分をいう。生体内成分としては、例えば、グルコース、尿酸、乳酸、ガラクトースなどが挙げられるが、特に限定されない。体液としては、例えば、組織液、血液などが挙げられるが、特に限定されない。
【００２２】
［過酸化水素電極］
過酸化水素電極について、図面を参照して説明する。図１に示されるように、過酸化水素電極１００は、基板２１上に設けられている。過酸化水素電極１００は、中間層１０１と、接着層１０５と、電極層１０７とを含む。過酸化水素電極１００は、例えば、電極層１０７の表面にオキシダーゼを固定化すること、電極層１０７の表面にオキシダーゼを含有するゲルなどを接触させることなどにより、オキシダーゼの存在下で生体内成分から生じた過酸化水素を検出するための電極として用いることができる。電極層１０７の表面にゲルを接触させる場合、ゲル中に抽出された生体内成分から生じた過酸化水素を過酸化水素電極１００で検出することができる。
【００２３】
中間層１０１は、基板２１上に設けられている。中間層１０１の表面には、接着層１０５を介して電極層１０７が設けられている。中間層１０１は、保持物質としての親水性高分子物質と、粒子とを含む。
【００２４】
本発明者らは、基板２１と電極層１０７との間に中間層１０１を含む過酸化水素電極１００を作製することにより、生体内に存在する干渉物質が電極層１０７で電気分解されにくい低い印加電圧を用いた場合でも、過酸化水素を高感度に検出できることを見出した。この効果については実施例とともに後述する。
【００２５】
親水性高分子物質としては、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、セルロースエーテル、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、デンプン、ポリアクリルアミド、それらの誘導体などが挙げられるが、特に限定されない。これらの親水性高分子物質のなかでは、粒子との接着性が高いことから、ポリビニルアルコールが好ましい。この場合、過酸化水素電極の強度を向上させることができる。
【００２６】
粒子の形状は、球形状であってもよく、非球形状であってもよい。非球形状には、円柱状、角柱状、板状などが包含される。粒子としては、例えば、ナノ粒子、マイクロ粒子、多孔質材料からなる粒子などが挙げられるが、特に限定されない。「ナノ粒子」とは、通常、１〜５００ｎｍの平均粒子径を有する粒子をいう。「マイクロ粒子」とは、０．５〜１００μｍの平均粒子径を有する粒子をいう。本明細書において、平均粒子径は、電子顕微鏡を用いて直接粒子を観察し、電子顕微鏡に内臓されている基準スケールを用いて計測された値をいう。粒子の具体例としては、ポリスチレンビーズ、アクリルビーズ、二酸化ケイ素粒子、アルミナ粒子、酸化亜鉛粒子、酸化イリジウム粒子、酸化インジウム（Ｉｎ２Ｏ３）粒子、二酸化チタン粒子、メソポーラスシリカ、メソポーラスアルミノシリケート、それらの混合物などが挙げられるが、特に限定されない。粒子は、非導電性粒子であることが好ましい。粒子の平均粒子径は、干渉物質の影響を受けずにグルコースを高感度に検出する観点から、好ましくは０．００１μｍ以上、より好ましくは０．００５μｍ以上、さらに好ましくは０．０１μｍ以上であり、同様の観点から、好ましくは１０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以下である。
【００２７】
中間層１０１は、図２（Ａ）に示される単層構造を有していてもよく、図２（Ｂ）に示される２層構造を有していてもよい。図２（Ａ）に示される単層１０２は、親水性高分子物質１１１中に粒子１１２が分散した構造である。図２（Ｂ）に示される２層構造は、親水性高分子物質１１１を含む第１中間層１０３と、第１中間層１０３上に設けられ、粒子１１２を含む第２中間層１０４とからなる構造である。中間層１０１は、過酸化水素電極１００の強度を向上させる観点から、図２（Ｂ）に示される２層構造であることが好ましい。
【００２８】
中間層１０１の厚さは、電極層１０７の導電性に影響しない範囲であればよく、特に限定されない。中間層１０１の厚さは、通常、基板上に粒子を確実に接着固定させる観点から、好ましくは０．００１μｍ以上、より好ましくは０．０１μｍ以上であり、基板からの電極層の剥離を抑制する観点から、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは５０μｍ以下、さらに好ましくは３０μｍ以下である。
【００２９】
中間層１０１が２層構造である場合、第１中間層１０３の厚さと第２中間層１０４の厚さが前述の中間層１０１の厚さの範囲であればよい。この場合、第１中間層１０３の厚さは、通常、粒子の接着性の観点から、好ましくは０．００１μｍ以上、より好ましくは０．０１μｍ以上であり、基板との剥離の観点から、好ましくは１０００μｍ以下、より好ましくは１００μｍ以下である。第２中間層１０４において、粒子は、第２中間層１０４の厚さ方向に積み重なっていてもよく、積み重なっていなくてもよい。第２中間層１０４の厚さ方向に粒子が積み重なっていない場合、第２中間層１０４の厚さは、通常、粒子の粒子径と同程度の厚さである。また、第２中間層１０４の厚さ方向に粒子が積み重なっている場合、第２中間層１０４の厚さは、通常、厚さ方向に積み重なった粒子の数を粒子径に乗じた値の厚さと同程度の厚さである。
【００３０】
中間層１０１における粒子１１２の密度は、通常、過酸化水素を高感度に検出する観点から、好ましくは９×１０４個／ｍｍ２以上、より好ましくは２×１０５個／ｍｍ２以上であり、製造コストを低減する観点から、好ましくは９×１０９個／ｍｍ２以下、より好ましくは１×１０９個／ｍｍ２以下である。
【００３１】
接着層１０５は、中間層１０１と電極層１０７とを接着するための層である。接着層１０５を構成する材料としては、例えば、チタンなどが挙げられるが、特に限定されない。接着層１０５の厚さは、中間層１０１と電極層１０７とを接着するのに十分な厚さであればよい。接着層１０５の厚さは、電極層を基板上に強固に密着させる観点から、好ましく０．００１μｍ以上、より好ましくは０．００５μｍ以上であり、接着性を確保するとともに製造コストを低減する観点から、好ましくは０．０３μｍ以下、より好ましくは０．０２μｍ以下である。
【００３２】
電極層１０７は、グルコースに起因する過酸化水素との間で電子のやり取りを行なう。電極層１０７の厚さは、導電性が維持される厚さであればよく、特に限定されない。電極層１０７の厚さは、通常、導電性の観点から、好ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは０．０５μｍ以上であり、作製コストの観点から、好ましくは０．５μｍ以下、さらに好ましくは０．３μｍ以下である。
【００３３】
本実施形態において、過酸化水素電極１００の形状は、円形状である。過酸化水素電極１００の形状は、円形状以外の形状であってもよい。過酸化水素電極１００の形状としては、例えば、矩形状、多角形形状などが挙げられるが、特に限定されない。
【００３４】
［酵素センサの構成］
前述の過酸化水素電極１００は、酵素であるオキシダーゼの作用によって酵素産物として過酸化水素を生じる物質を検出するための酵素センサの電極に用いることができる。酵素センサについて、図面を参照して説明する。以下において、被験者から抽出した組織液に含まれるグルコースの検出に用いるためのグルコースセンサを例として挙げて説明する。
【００３５】
図３に示されるように、酵素センサ２０は、基板２１と、作用電極３０と、対電極４０と、参照電極５０と、電極リード７１，７２，７３とを含む。作用電極３０、対電極４０、参照電極５０および電極リード７１，７２，７３は、基板２１の一方の表面に設けられている。
【００３６】
基板２１は、矩形状を呈している。なお、基板２１の形状は、多角形形状、円形状などであってもよく、特に限定されない。
【００３７】
基板２１を構成する材料は、少なくとも作用電極３０、対電極４０および参照電極５０の導電性に影響を与えない絶縁性材料である。基板２１を構成する材料としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレートなどのポリエステル系樹脂；ポリイミド；ガラスエポキシ樹脂；ガラス；セラミックなどが挙げられるが、特に限定されない。基板２１の厚さは、酵素センサの用途などに応じて適宜決定することができる。
【００３８】
作用電極３０は、図３に示されるように、基板２１の表面における一側部に配置されている。作用電極３０は、電極リード７１と接続されている。電極リード７１は、作用電極３０から基板２１の他側部、具体的には、図３において、基板２１の下側に向けて延びている。
【００３９】
図１に戻り、作用電極３０は、基板２１の一方の表面上に形成された過酸化水素電極１００と、グルコースオキシダーゼを含む酵素層１１０とを含む。酵素層１１０は、過酸化水素電極１００の表面上に設けられている。
【００４０】
酵素層１１０は、過酸化水素電極１００における電極層１０７の表面に設けられている。本実施形態において、酵素層１１０は、グルコースオキシダーゼを含む。グルコースオキシダーゼは、グルコースを基質として用いて過酸化水素を生成する酵素である。グルコースオキシダーゼの供給源の生物は、特に限定されない。酵素層１１０におけるグルコースオキシダーゼの量は、電極層上に塗布される溶液中のグルコースオキシダーゼＧＯＤ活性量に換算した場合、通常、グルコースの検出感度の観点から、好ましくは０．０１Ｕ／μＬ以上、より好ましくは０．１Ｕ／μＬ以上である。またコストの観点から、好ましくは１００Ｕ／μＬ以下、より好ましくは５０Ｕ／μＬ以下である。
【００４１】
作用電極３０は、体液と接触される。体液にグルコースが含まれる場合には、図１に示されるように、作用電極３０における酵素層１１０に存在するグルコースオキシダーゼがグルコースを酸化する。グルコースの酸化により、過酸化水素とグルコン酸とが生成する。生成した過酸化水素は、作用電極３０の過酸化水素電極１００における電極層１０７上で電気分解される。電極層１０７は導電性材料を含む。電極層１０７に用いられる導電性材料としては、白金、金などの金属材料などが挙げられるが、特に限定されない。酵素センサ２０によれば、過酸化水素の電気分解に伴って生じる電流に基づき、体液に含まれるグルコースを検出することができる。
【００４２】
対電極４０は、作用電極３０よりも外側、具体的には、図３において、基板２１の表面における作用電極３０の上側に配置されている。対電極４０は、電極リード７２と接続されている。電極リード７２は、対電極４０から基板２１の他側部、具体的には、図３において、基板２１の下側に向けて延びている。対電極４０は、導電性材料を含む電極層を含む。対電極４０における電極層に用いられる導電性材料としては、白金、金などの金属材料などが挙げられるが、特に限定されない。対電極４０における電極層の厚さは、酵素センサの用途などに応じて適宜決定することができる。なお、対電極４０は、過酸化水素電極１００と同様の構成を有していてもよい。
【００４３】
参照電極５０は、図３において、作用電極３０を挟んで、対電極４０と対向する位置に配置されている。参照電極５０は、電極リード７３と接続されている。電極リード７３は、参照電極５０から基板２１の他側部、具体的には、図３において、基板２１の下側に向けて延びている。参照電極５０は、導電性材料を含む電極層を含む。導電性材料としては、例えば、白金、金、銀、銅、カーボン、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケルなどの金属、これらの金属の少なくとも１つを含む合金、これらの金属の塩化物などの金属ハロゲン化物などが挙げられるが、特に限定されない。参照電極の具体例としては、銀−塩化銀電極などが挙げられるが、特に限定されない。参照電極５０における電極層の厚さは、測定装置１０の用途などに応じて適宜決定することができる。酵素センサ２０は、参照電極５０を含んでいなくてもよい。この場合、対電極４０に用いられる導電性材料の種類、対電極４０の厚さなどにもよるが、対電極４０が参照電極５０を兼ねていてもよい。また、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極３０への印加電圧を安定化させる観点から、酵素センサ２０は、参照電極５０を含むことが好ましい。
【００４４】
電極リード７１と、電極リード７２と電極リード７３とは、基板２１の他側部、具体的には、図３において、基板２１の下側の部分において互いに並列するように配置されている。
【００４５】
［酵素センサの変形例］
酵素センサ２０において、作用電極３０の酵素層１１０に含まれるグルコースオキシダーゼの代わりに、基質となる物質に対する作用によって過酸化水素を生成する他の酵素を用いることもできる。他の酵素を含む酵素センサ２０によれば、グルコース以外の物質の検出を行なうことができる。酵素としては、例えば、乳酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。
【００４６】
［生体内成分測定装置］
前述の過酸化水素電極１００を含む酵素センサ２０は、酵素の作用によって酵素産物として過酸化水素を生じる生体内成分の量を測定するための生体内成分測定装置の酵素センサとして用いることができる。生体内成分測定装置（以下、単に、「測定装置」ともいう）について図面を参照して説明する。図４〜図６に示されるように、測定装置１０は、表示部１１と、記録部１２と、解析部１３と、検出部１４と、電源１５と、ユーザである被験者が測定装置１０を操作するための操作ボタン１６とを備えている。図４に示されるように、測定装置１０は、設置部１４ａに、酵素センサ２０と、被験者から抽出した組織液を蓄積した収集部材３００とを設置することによって用いられる。
【００４７】
収集部材３００は、微侵襲組織液抽出技術によって被験者から抽出した組織液を蓄積するための部材である。収集部材３００は、組織液を蓄積可能な抽出媒体と、抽出媒体を支持し、粘着層を有する支持部材とを含む。収集部材３００は、粘着層によって被験者の皮膚に取り付けることができる。抽出媒体としては、例えば、ポリビニルアルコールゲルなどのゲルなどが挙げられるが、特に限定されない。ゲルを含む収集部材３００によれば、ゲルが有する吸湿性によって生体の皮膚から組織液を抽出することができる。
【００４８】
図５および図６において、表示部１１は、解析部１３による測定結果および記録部１２に記録されたデータなどを表示する機能を有する。記録部１２は、過去のデータを保存する機能および測定結果を一時的に保存する機能を有する。解析部１３は、検出部１４から出力された情報に基づいて、組織液における測定対象の生体内成分濃度、具体的には、グルコース濃度を算出する機能を有する。検出部１４は、設置部１４ａと、電気回路１４ｂと、電流計１４ｃとを含む。設置部１４ａは、酵素センサ２０を収容可能な凹形状の凹部である。電気回路１４ｂは、設置部１４ａ内に露出した図示しない３つの端子を含む。電気回路１４ｂは、３つの端子を介して酵素センサ２０と接続される。また、電気回路１４ｂは、電流計１４ｃと接続されている。電流計１４ｃは、酵素センサ２０で生じて電気回路１４ｂを流れた電流を測定する機能を有する。操作ボタン１６は、表示部１１の表示の切換などの操作をするために設けられている。
【００４９】
なお、測定装置１０は、組織液の代わりに、血液その他の体液に含まれる生体内成分の量に関する成分情報の取得にも用いることができる。また、測定装置１０においては、酵素センサ２０における作用電極３０の表面に体液を直接供給してもよい。この場合、作用電極３０の表面を体液の受領部として用いることができる。また、被験者の皮下に、酵素センサ２０を直接組み込み、体液の抽出を行なうことなく、連続的に生体内成分の量に関する成分情報を取得するようにしてもよい。
【００５０】
測定装置１０を用いる場合、体液に含まれる生体内成分の量の測定は、例えば、以下のステップを含む方法などによって行なうことができる。
（Ｉ）測定装置１０の設置部１４ａに酵素センサ２０をセットするステップ、
（ＩＩ）設置部１４ａ内の酵素センサ２０の作用電極３０上に、体液を供給するステップ、
（ＩＩＩ）酵素センサ２０の参照電極５０を基準として所定電圧を作用電極３０に印加するステップ、
（ＩＶ）作用電極３０と対電極４０との間に流れる電流を測定するステップ、
（Ｖ）測定された電流に基づき、体液に含まれる生体内成分量を算出するステップ
【００５１】
ステップ（ＩＩＩ）において、作用電極３０への印加電圧は、生体内成分の種類、生体内成分の量の測定目的などに応じて適宜決定することができる。生体内成分がグルコースである場合、作用電極３０への印加電圧は、干渉物質による干渉を抑制し、高感度にグルコースの量を測定する観点から、好ましくは０．２５〜０．３５Ｖである。
【００５２】
ステップ（ＩＶ）において、電流の測定方法としては、例えば、クロノアンペロメトリー法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００５３】
ステップ（Ｖ）において、体液に含まれる生体内成分量の算出は、既知量の生体内成分量の標準液を用いたときの電流値に基づいて予め作成された電流値の検量線を用いることなどによって行なうことができる。また、生体内成分がグルコースである場合、ナトリウムイオンやカリウムイオンなど生体内に含まれる他の成分も同時に測定し、グルコースに対して得られた信号とグルコース以外の生体内成分に対して得られた信号の比を算出することによって体液に含まれるグルコースの量の算出を行なうことができる。
【００５４】
［過酸化水素電極の製造方法］
過酸化水素電極１００は、（Ａ）基板２１の一方の表面上に、親水性高分子物質１１１と粒子１１２とを含む中間層１０１を形成する工程、および
（Ｂ）中間層１０１の表面上に電極層１０７を形成する工程
を含む製造方法によって製造することができる。以下、図面を参照して製造方法の手順を説明する。図７における工程Ｓ１は、前述の工程（Ａ）に対応する。図７における工程Ｓ２および工程Ｓ３は、前述の工程（Ｂ）に対応する。
【００５５】
工程Ｓ１において、基板２１の一方の表面上に中間層１０１を形成する。中間層１０１は、中間層１０１の構造に応じた方法によって形成できる。
【００５６】
中間層１０１が、図２（Ａ）に示される単層構造を有する場合、まず、親水性高分子物質１１１と粒子１１２とを含む混合溶液を基板２１の一方の表面上に滴下する。滴下する混合溶液の量、混合溶液における親水性高分子物質１１１の濃度および混合溶液における粒子１１２の濃度は、中間層１０１の厚さなどに応じて適宜決定できる。混合溶液における親水性高分子物質１１１の濃度は、通常、好ましくは１〜５０質量％、より好ましくは３〜３０質量％、さらに好ましくは３〜２０質量％である。また、混合溶液における粒子１１２の濃度は、通常、好ましくは０．１〜１００質量％、より好ましくは０．５〜５０質量％、さらに好ましくは０．５〜３０質量％である。つぎに、スピンコーターを用いて基板２１を回転させて、余分な液体を除去する。これにより、基板２１上に親水性高分子物質１１１と粒子１１２とを含む塗膜が形成される。スピンコーターによる基板２１の回転数および時間は、中間層１０１の厚さなどに応じて適宜決定できる。つぎに、基板２１を加熱して塗膜を乾燥させる。これにより、親水性高分子物質１１１と粒子１１２とを含む単層１０２である中間層１０１が形成される。
【００５７】
中間層１０１が、図２（Ｂ）に示される２層構造を有する場合、基板の一方の表面上に、親水性高分子物質１１１を含む溶液を基板２１の一方の表面上に滴下する。滴下する溶液の量および溶液における親水性高分子物質１１１の濃度は、第１中間層１０３の厚さなどに応じて適宜決定できる。溶液における親水性高分子物質１１１の濃度は、通常、好ましくは１〜５０質量％、より好ましくは３〜３０質量％、さらに好ましくは３〜２０質量％である。つぎに、スピンコーターを用いて基板２１を回転させて、余分な液体を除去する。これにより、基板２１上に親水性高分子物質１１１を含む塗膜が形成される。つぎに、基板２１を加熱して塗膜を乾燥させる。これにより、親水性高分子物質１１１を含む第１中間層１０３が形成される。つぎに、粒子１１２を含む溶液を基板２１の一方の表面上に滴下する。滴下する溶液の量、溶液における粒子１１２の濃度は、第２中間層１０４の厚さなどに応じて適宜決定できる。溶液における粒子１１２の濃度は、通常、好ましくは０．１〜１００質量％、より好ましくは０．５〜５０質量％、さらに好ましくは０．５〜３０質量％である。つぎに、スピンコーターを用いて基板２１を回転させて、余分な液体を除去する。これにより、基板２１上に粒子１１２を含む塗膜が形成される。つぎに、基板２１を加熱して塗膜を乾燥させる。これにより、粒子１１２を含む第２中間層１０４が形成される。２層構造を有する中間層１０１の形成方法としては、前述の手法の他、第１中間層１０３の形成後の基板２１の第１中間層１０３を、粒子１１２を含む溶液に浸漬させる手法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００５８】
図７に戻り、工程Ｓ２において、中間層１０１の表面に接着層１０５を形成する。接着層１０５がチタン層である場合、接着層１０５の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、真空蒸着法、無電解めっき法、電解めっき法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００５９】
つぎに、工程Ｓ３において、接着層１０５の表面に電極層１０７を形成させる。電極層１０７の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、真空蒸着法、無電解めっき法、電解めっき法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００６０】
［酵素センサの製造方法］
酵素センサ２０は、過酸化水素電極１００の電極層１０７の表面に酵素を固定化して酵素層１１０を形成することによって製造できる。電極層１０７の表面への酵素の固定は、例えば、以下の方法などによって行なうことができる。
方法（ａ−１）：過酸化水素電極１００の電極層１０７の表面に酵素を含む溶液を塗布する方法
方法（ａ−２）：過酸化水素電極１００の電極層１０７の表面を、酵素を含む溶液に浸漬させる方法
方法（ａ−３）：過酸化水素電極１００の電極層１０７の表面に官能基を導入し、この官能基を介して酵素を固定する方法
【実施例】
【００６１】
略語の説明
ＰＥＴ：ポリエチレンテレフタレート
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＶＡ：ポリビニルアルコール
ＰＳ：ポリスチレン
【００６２】
実施例および比較例のグルコースセンサの構成および影響が調べられた干渉物質を表１に示す。
【００６３】
【表１】
2018017593.tif 000003
【００６４】
（実施例１）
以下において、実施例１と、比較例１および２とにより、干渉物質存在下でのグルコースの検出に対するアルミナ水和物粒子と親水性高分子物質との混合層である中間層の有無の影響を調べた。実施例１では、中間層として、アルミナ水和物粒子と親水性高分子物質との混合層が用いられた。
【００６５】
（１）中間層の形成
アルミナ水和物粒子（平均粒子径：１００ｎｍ）１００ｇと、部分けん化ＰＶＡ１５ｇと、シラン化変性ＰＶＡ２ｇとを、９５℃に加熱されたイオン交換水６１４ｇに添加し、撹拌することにより、粒子含有液を得た。
【００６６】
得られた粒子含有液０．３ｇを基板であるＰＥＴ製フィルム（長さ：３ｃｍ、幅：３ｃｍおよび厚さ：７５μｍ）の一方の表面に塗布した。粒子含有液が塗布されたＰＥＴ製フィルムを、スピンコーターによって７５０ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、余分な液体を除去して塗膜を形成した。その後、塗膜を有するＰＥＴ製フィルムを１１０℃で３分間加熱することにより、親水性高分子物質であるＰＶＡとアルミナ水和物粒子とを含む中間層（表１の「混合層」）をフィルム上に固定した。
【００６７】
（２）電極層の形成
実施例１（１）で得られた中間層上に、スパッタリング法によってチタン層（厚さ：約５ｎｍ）を形成した。つぎに、図３に示されるパターンとなるように、チタン層上に、スパッタリング法によって白金を含む作用電極用の電極層（直径８ｍｍ、厚さ：約１００ｎｍ）および白金を含む対電極用の電極層（厚さ：約１００ｎｍ）を形成した。また、図３に示されるパターンとなるように、チタン層上に銀／塩化銀インクを塗布し、乾燥させることによって銀／塩化銀からなる参照電極を形成した。これにより、電極基板を得た。
【００６８】
（３）酵素層の形成
実施例１（２）で得られた電極基板の作用電極上に、酵素溶液〔０．２５質量％グルタルアルデヒドと４２．９８４ｍｇ／ｄＬウシ血清アルブミンと１．５２２５Ｕ／ｍＬグルコースオキシダーゼと０．５Ｕ／ｍＬムタロターゼとを含むＰＢＳ溶液〕１０μＬを滴下した。つぎに、相対湿度３０％で２５℃に保たれた環境下に電極基板を静置することにより、酵素溶液を乾燥させた。これにより、作用電極上に酵素層を形成し、グルコースセンサを得た。
【００６９】
（４）グルコース溶液およびアセトアミノフェン溶液の調製
グルコース標準液〔シスメックス（株）製、商品名：グルコース標準液〕をＰＢＳで希釈することにより、グルコース濃度が０．０５ｍｇ／ｄＬ、０．２ｍｇ／ｄＬまたは０．８ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を得た。また、アセトアミノフェンをＰＢＳで希釈することにより、アセトアミノフェン濃度が０．００２５ｍｇ／ｄＬ、０．０１ｍｇ／ｄＬまたは０．０４ｍｇ／ｄＬのアセトアミノフェン溶液を得た。
【００７０】
（５）ハイドロゲルの調製
ＰＶＡ水溶液Ａ〔組成：１２％（ｗ／ｗ）ＰＶＡ、２％（ｗ／ｗ）塩化カリウムおよび８６％（ｗ／ｗ）水〕に対し、線量：２５ｋＧｒの電子線を照射することにより、ＰＶＡのハイドロゲルを得た。
【００７１】
（６）電気化学測定
実施例１（５）で得られたハイドロゲルをフローセル内に貼り付けた。実施例１（３）で得られたグルコースセンサをフローセル内のハイドロゲルに接触するように設置した。フローセルの治具でハイドロゲルとグルコースセンサとを固定した。シリンジポンプを用いて、フローセル内にＰＢＳを流すことにより、ハイドロゲルを介してグルコースセンサとＰＢＳとを接触させた。
【００７２】
グルコースセンサをポテンショスタット〔ビー・エー・エス（ＢＡＳ）（株）製、商品名：ＡＬＳ８３２ｂ〕と接続した。参照電極を基準として、グルコースセンサの作用電極に電圧を印加した。作用電極と対電極との間に流れる電流をクロノアンペロメトリー法で測定した。
【００７３】
（７）グルコース検出感度の印加電圧依存性の評価
実施例１（６）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後、ＰＢＳ、０．０５ｍｇ／ｄＬグルコース溶液、０．２ｍｇ／ｄＬグルコース溶液、０．８ｍｇ／ｄＬグルコース溶液およびＰＢＳをこの順でフローセル内に流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流し、電流値を測定した。各濃度のグルコース溶液を流し始めて４００秒間経過時から２００秒間で測定される電流値の平均値を、各濃度のグルコース溶液に対する電流値とした。
【００７４】
作用電極への印加電圧を０．２５Ｖ、０．３Ｖ、０．４Ｖまたは０．５Ｖに変え、グルコースの検出感度の印加電圧依存性を評価した。グルコースの検出感度を式（Ｉ）：
【００７５】
［グルコースの検出感度］
＝グルコース濃度を変化させた時の電流値の変化量／グルコース濃度の変化量    （Ｉ）
【００７６】
にしたがって求めた。
【００７７】
実施例１のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を図８（Ａ）に示す。
【００７８】
（８）アセトアミノフェン検出感度の印加電圧依存性の評価
実施例１（６）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後、ＰＢＳ、０．００２５ｍｇ／ｄＬアセトアミノフェン溶液、０．０１ｍｇ／ｄＬアセトアミノフェン溶液、０．０４ｍｇ／ｄＬアセトアミノフェン溶液およびＰＢＳをこの順でフローセル内に流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流し、電流値を測定した。各濃度のアセトアミノフェン溶液を流し始めて４００秒間経過時から２００秒間で測定される電流値の平均値を、各濃度のアセトアミノフェン溶液に対する電流値とした。
【００７９】
作用電極への印加電圧を０．２５Ｖ、０．３Ｖ、０．４Ｖまたは０．５Ｖに変え、アセトアミノフェンの検出感度の印加電圧依存性を評価した。アセトアミノフェンの検出感度を式（ＩＩ）：
【００８０】
［アセトアミノフェンの検出感度］
＝アセトアミノフェン濃度を変化させた時の電流値の変化量／アセトアミノフェン濃度の変化量                                                                  （ＩＩ）
【００８１】
にしたがって求めた。
【００８２】
実施例１のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンの検出感度と印加電圧との関係を図８（Ｂ）に示す。
【００８３】
（９）結果
図８（Ａ）に示された結果から、グルコースの検出感度は、作用電極への印加電圧に依存せず、一定であることがわかった。一方、図８（Ｂ）に示された結果から、アセトアミノフェンの検出感度は、作用電極への印加電圧に依存することがわかった。これらの結果から、作用電極への印加電圧を低くすれば、アセトアミノフェンによる干渉または妨害を受けずに、グルコースを高感度で検出できることが示唆された。
【００８４】
（比較例１）
（１）電極層の形成
基板であるＰＥＴ製フィルム（長さ：３ｃｍ、幅：３ｃｍおよび厚さ：７５μｍ）上に、スパッタリング法によってチタン層（厚さ：約５ｎｍ）を形成した。つぎに、図３に示されるパターンとなるように、チタン層上に、スパッタリング法によって白金を含む作用電極用の電極層（直径８ｍｍ、厚さ：約１００ｎｍ）および白金を含む対電極用の電極層（厚さ：約１００ｎｍ）を形成した。また、図３に示されるパターンとなるように、チタン層上に銀／塩化銀インクを塗布し、乾燥させることによって銀／塩化銀からなる参照電極を形成した。これにより、電極基板を得た。
【００８５】
（２）酵素層の形成
比較例１（１）で得られた電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、グルコースセンサを得た。
【００８６】
（３）電気化学測定
比較例１（２）で得られたグルコースセンサを用いたことを除き、実施例１（６）と同様の操作を行ない、電気化学測定を行なった。
【００８７】
（４）グルコースの検出感度の印加電圧依存性の評価
比較例１（３）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことを除き、実施例１（７）と同様の操作を行ない、グルコースの検出感度の印加電圧依存性を評価した。
【００８８】
比較例１のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を図９（Ａ）に示す。
【００８９】
（５）アセトアミノフェンの検出感度の印加電圧依存性の評価
比較例１（３）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことを除き、実施例１（８）と同様の操作を行ない、アセトアミノフェンの検出感度の印加電圧依存性を評価した。
【００９０】
比較例１のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンの検出感度と印加電圧との関係を図９（Ｂ）に示す。
【００９１】
（６）結果
図９（Ａ）に示された結果から、グルコースの検出感度は、電極に印加する電圧を大きくすると増大し、電極に印加する電圧を小さくすると低下することがわかった。したがって、グルコースを高感度で検出するためには、印加電圧を大きくする必要があることがわかった。また、図９（Ｂ）に示された結果から、アセトアミノフェンの検出感度も、グルコースの検出感度と同様に、電極に印加する電圧に依存することがわかった。これらの結果から、グルコースを高感度で検出するために印加電圧を大きくした場合、アセトアミノフェンによる干渉を受けることがわかった。したがって、比較例１のグルコースセンサによれば、アセトアミノフェンなどの干渉物質による影響を受けずに、高感度でグルコースを検出することができないことがわかった。実施例１のグルコースセンサと比較例１のグルコースセンサとは、中間層の有無の点で異なっていた。これらの結果から、実施例１のグルコースセンサによれば、中間層を有しているので、アセトアミノフェンなどの干渉物質による影響を受けずに、高感度でグルコースを検出することができることが示唆された。
【００９２】
（比較例２）
（１）電極層の形成
チタン層の厚さを約１０ｎｍにしたことおよび白金を含む電極層の厚さを約２００ｎｍにしたことを除き、比較例１（１）と同様の操作を行ない、電極基板を得た。
【００９３】
（２）酵素層の形成
比較例２（１）で得られた電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、グルコースセンサを得た。
【００９４】
（３）グルコース溶液および試験溶液の調製
グルコース標準液をＰＢＳで希釈することにより、グルコース濃度が０．０５ｍｇ／ｄＬ、０．１ｍｇ／ｄＬ、０．２ｍｇ／ｄＬまたは０．８ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を得た。アセトアミノフェンをその濃度が０．１ｍｇ／ｄＬとなるように０．１ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に溶解させることにより、アセトアミノフェン含有試験溶液を得た。アスコルビン酸をその濃度が０．１ｍｇ／ｄＬとなるように０．１ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に溶解させることにより、アスコルビン酸含有試験溶液を得た。
【００９５】
（４）電気化学測定
比較例２（２）で得られたグルコースセンサをポテンショスタット〔ビー・エー・エス（ＢＡＳ）（株）製、商品名：ＡＬＳ８３２ｂ〕と接続した。つぎに、グルコースセンサ上にＰＢＳ４００μＬを滴下した。その後、参照電極を基準として、グルコースセンサの作用電極に電圧を印加した。作用電極と対電極との間に流れる電流をクロノアンペロメトリー法で測定した。
【００９６】
（５）グルコース検出感度の印加電圧依存性の評価
比較例２（４）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後、ＰＢＳ４００μＬ、０．０５ｍｇ／ｄＬグルコース溶液４００μＬ、０．２ｍｇ／ｄＬグルコース溶液４００μＬ、０．８ｍｇ／ｄＬグルコース溶液４００μＬおよびＰＢＳ４００μＬをこの順でグルコースセンサに滴下し、１８０秒間電流値を測定した。各濃度のグルコース溶液の滴下後１５０秒間経過時から３０秒間で測定された電流値の平均値を、各濃度のグルコース溶液の電流値とした。
【００９７】
作用電極への印加電圧を０．２５Ｖ、０．３Ｖ、０．４Ｖまたは０．５Ｖに変え、グルコースの検出感度の印加電圧依存性を評価した。グルコースの検出感度を式（Ｉ）にしたがって求めた。
【００９８】
比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を図１０（Ａ）に示す。
【００９９】
（６）干渉物質による影響の評価
比較例２（４）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後、ＰＢＳ４００μＬ、０．１ｍｇ／ｄＬグルコース溶液４００μＬ、ＰＢＳ４００μＬ、アセトアミノフェン含有試験溶液４００μＬ、ＰＢＳ４００μＬ、アスコルビン酸含有試験溶液４００μＬおよびＰＢＳ４００μＬをこの順でグルコースセンサ上に滴下し、１８０秒間電流値を測定した。各溶液の滴下後１５０秒間経過時から３０秒間で測定された電流値の平均値を、各溶液の電流値とした。
【０１００】
作用電極への印加電圧を０．１２Ｖ、０．２Ｖ、０．３Ｖ、０．４Ｖ、０．５Ｖまたは０．６Ｖに変え、干渉物質による影響を評価した。
【０１０１】
アセトアミノフェンによる干渉率を式（ＩＩＩ）：
【０１０２】
［アセトアミノフェンによる干渉率］
＝１００×（［アセトアミノフェン含有試験溶液の電流値］−［０．１ｍｇ／ｄＬグルコース溶液の電流値］）／［０．１ｍｇ／ｄＬグルコース溶液の電流値］      （ＩＩＩ）
【０１０３】
にしたがって求めた。また、アスコルビン酸による干渉率を式（ＩＶ）：
［アスコルビン酸による干渉率］
＝１００×（［アスコルビン酸含有試験溶液の電流値］−［０．１ｍｇ／ｄＬグルコース溶液の電流値］）／［０．１ｍｇ／ｄＬグルコース溶液の電流値］            （ＩＶ）
【０１０４】
にしたがって求めた。
【０１０５】
比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を図１０（Ｂ）、比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を図１０（Ｃ）に示す。
【０１０６】
（７）結果
図１０（Ａ）に示された結果から、グルコースの検出感度は、電極に印加する電圧を大きくすると増大し、電極に印加する電圧を小さくすると低下することがわかった。また、図１０（Ｂ）および（Ｃ）に示された結果から、グルコースを高感度で検出するために印加電圧を大きくした場合、アセトアミノフェンおよびアスコルビン酸それぞれによる干渉を受けることがわかった。したがって、比較例２のグルコースセンサによれば、干渉物質の影響を受けずに、高感度でグルコースを検出することができないことがわかった。実施例１のグルコースセンサと比較例２のグルコースセンサとは、中間層の有無の点で異なっていた。これらの結果から、実施例１のグルコースセンサによれば、中間層を有しているので、アセトアミノフェンなどの干渉物質による影響を受けずに、高感度でグルコースを検出することができることが示唆された。
【０１０７】
（実施例２）
以下において、実施例２と、比較例２とにより、干渉物質存在下でのグルコースの検出に対する中間層の有無の影響を調べた。実施例２では、中間層として、ＰＳ製ビーズを含む層と親水性高分子物質を含む層との２層の中間層が用いられた。
【０１０８】
（１）第１中間層の形成
９５℃に加熱したイオン交換水５０ｇに、ＰＶＡ２．５ｇを攪拌しながら溶解させ、ＰＶＡ水溶液Ｂを得た。得られたＰＶＡ水溶液Ｂ５００μＬを、基板であるＰＥＴ製フィルム（長さ：３ｃｍ、幅：３ｃｍおよび厚さ：７５μｍ）の一方の表面に塗布した。ＰＶＡ水溶液が塗布されたＰＥＴ製フィルムを、スピンコーターによって７５０ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、余分な液体を除去して塗膜を形成した。その後、塗膜を有するＰＥＴ製フィルムを１１０℃で３分間加熱することにより、親水性高分子物質であるＰＶＡを含む第１中間層をフィルム上に固定した。これにより、第１中間層を有する中間基板Ａを得た。
【０１０９】
（２）第２中間層の形成
実施例２（１）で得られた中間基板Ａの第１中間層上に、ＰＳ製ビーズ含有溶液〔ＰＳ製ビーズの平均粒子径：５００ｎｍ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、商品名：５０５０Ａ〕５００μＬを滴下した。ＰＳ製ビーズ含有溶液が滴下された中間基板Ａを、スピンコーターによって３００ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、余分な液体を除去した。その後、中間基板Ａを１１０℃で３分間加熱することにより、ＰＳ製ビーズを含む第２中間層を第１中間層上に固定した。これにより、第２中間層を含む作用電極を備える中間基板Ｂを得た。
【０１１０】
（３）電極層の形成
実施例２（２）で得られた中間基板Ｂを用いたこと、チタン層の厚さを約１０ｎｍとしたこと、作用電極用の電極層の厚さを約２００ｎｍとしたことならびに対電極用の電極層の厚さを約２００ｎｍとしたことを除き、実施例１（２）と同様の操作を行ない、電極基板を得た。
【０１１１】
（４）酵素層の形成
実施例２（３）で得られた電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、グルコースセンサを得た。
【０１１２】
（５）電気化学測定
実施例２（４）で得られたグルコースセンサを用いたことを除き、比較例２（４）と同様の操作を行ない、作用電極と対電極との間に流れる電流を測定した。
【０１１３】
（６）グルコースの検出感度の印加電圧依存性の評価
実施例２（５）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことおよび作用電極への印加電圧を０．０５Ｖまたは０．１Ｖに変えたことを除き、比較例２（５）と同様の操作を行ない、低電圧印加時のグルコースの検出感度の印加電圧依存性を評価した。
【０１１４】
実施例２および比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を図１１（Ａ）に示す。図中、クロス（「×」）は実施例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を調べた結果、白丸は比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を調べた結果を示す。
【０１１５】
（７）干渉物質による影響の評価
実施例２（５）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後、ＰＢＳ４００μＬ、０．１ｍｇ／ｄＬグルコース溶液４００μＬ、ＰＢＳ４００μＬ、アセトアミノフェン含有試験溶液４００μＬおよびＰＢＳ４００μＬをこの順でグルコースセンサ上に滴下し、１８０秒間電流値を測定した。各溶液の滴下後滴下後１５０秒間経過時から３０秒間で測定された電流値の平均値を、各溶液の電流値とした。
【０１１６】
作用電極への印加電圧を０．０５Ｖまたは０．１Ｖに変え、低電圧印加時のアセトアミノフェンによる影響による影響を評価した。アセトアミノフェンによる干渉率を式（ＩＩＩ）にしたがって求めた。アスコルビン酸による干渉率を式（ＩＶ）にしたがって求めた。
【０１１７】
実施例２および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を図１１（Ｂ）に示す。図中、クロスは実施例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を調べた結果、白丸は比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を調べた結果を示す。
【０１１８】
（８）結果
図１１（Ａ）に示された結果から、作用電極への印加電圧が０．２５Ｖ以下である場合、実施例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度は、比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と比べて高いことがわかった。また、図１１（Ｂ）に示された結果から、作用電極への印加電圧が０．２５Ｖ以下である場合、実施例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率は、比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と同程度以下であることがわかった。
【０１１９】
実施例２のグルコースセンサは、基板と電極層との間にＰＳ製ビーズを含む中間層を含む作用電極を備えていた。これに対し、比較例２のグルコースセンサは、中間層を有していなかった。したがって、基板と電極層との間に粒子を含む中間層を含む作用電極を備えるグルコースセンサによれば、アセトアミノフェンなどの干渉物質による干渉を受けにくい印加電圧を用い、干渉物質による干渉を受けずに、高感度でグルコースを検出できることが示唆された。
【０１２０】
（実施例３）
以下において、実施例３と、比較例２とにより、干渉物質存在下でのグルコースの検出に対する中間層の有無の影響を調べた。実施例３では、中間層として、メソポーラスシリカを含む層と親水性高分子物質を含む層との２層の中間層が用いられた。
【０１２１】
（１）第１中間層の形成
実施例２（１）と同様の操作を行ない、第１中間層を有する中間基板Ａを得た。
【０１２２】
（２）第２中間層の形成
実施例３（１）で得られた中間基板Ａの第１中間層上に、１％（ｗ／ｗ）メソポーラスシリカ含有水溶液〔シグマアルドリッチ社製、商品名：ＭＣＭ−４１〕５００μＬを滴下した。メソポーラスシリカ含有溶液が滴下された中間基板Ａを、スピンコーターによって３００ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、余分な液体を除去した。その後、中間基板Ａを１１０℃で３分間加熱することにより、メソポーラスシリカを含む第２中間層を第１中間層上に固定した。これにより、第２中間層を有する中間基板Ｂを得た。
【０１２３】
（３）電極層の形成
実施例３（２）で得られた中間基板Ｂを用いたことを除き、実施例１（２）と同様の操作を行い、電極基板を得た。
【０１２４】
（４）酵素層の形成
実施例３（３）で得られた電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、グルコースセンサを得た。
【０１２５】
（５）電気化学測定
実施例３（４）で得られたグルコースセンサを用いたことを除き、比較例２（４）と同様の操作を行ない、作用電極と対電極との間に流れる電流を測定した。
【０１２６】
（６）グルコースの検出感度の印加電圧依存性の評価
実施例３（５）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことおよび作用電極への印加電圧を０．１８Ｖ、０．２５Ｖ、０．３５Ｖまたは０．４５Ｖに変えたことを除き、比較例２（５）と同様の操作を行ない、グルコースの検出感度の印加電圧依存性を評価した。
【０１２７】
実施例３および比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を図１２（Ａ）に示す。図中、クロスは実施例３のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を調べた結果、白丸は比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を調べた結果を示す。
【０１２８】
（７）干渉物質による影響の評価
実施例３（５）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことおよび作用電極への印加電圧を０．１８Ｖ、０．２５Ｖ、０．３５Ｖまたは０．４５Ｖに変えたことを除き、比較例２（６）と同様の操作を行ない、アセトアミノフェンによる影響およびアスコルビン酸による影響を評価した。
【０１２９】
実施例３および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を図１２（Ｂ）に示す。図中、クロスは実施例３のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を調べた結果、白丸は比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を調べた結果を示す。実施例３および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を図１２（Ｃ）に示す。図中、クロスは実施例３のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を調べた結果、白丸は比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を調べた結果を示す。
【０１３０】
（８）結果
図１２（Ａ）に示された結果から、印加電圧を０．４Ｖ以下にした場合、実施例３のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度は、比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と比べ、高いことがわかった。また、図１２（Ｂ）に示された結果から、実施例３のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率は、印加電圧を０．４以下にした場合、比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と同程度以下であることがわかった。さらに、図１２（Ｃ）に示された結果から、印加電圧を０．４Ｖ以下にした場合、実施例３のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率は、比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と同程度以下であることがわかった。
【０１３１】
実施例３のグルコースセンサは、基板と電極層との間に、実施例１および２のグルコースセンサに用いられた粒子の代わりに多孔質材料からなる粒子であるメソポーラスシリカを含む中間層を含む作用電極を備えていた。これに対し、比較例２のグルコースセンサは、中間層を有していなかった。したがって、これらの結果から、基板と電極層との間に多孔体を含む中間層を含む作用電極を備えるグルコースセンサによれば、アセトアミノフェン、アスコルビン酸などの干渉物質による干渉を受けにくい印加電圧を用い、干渉物質による干渉を受けずに、高感度でグルコースを検出できることが示唆された。
【０１３２】
（実施例４）
以下において、実施例４と、比較例２とにより、干渉物質存在下でのグルコースの検出に対する中間層の有無の影響を調べた。実施例４では、中間層として、実施例２で用いられたＰＳ製ビーズよりも平均粒子径が大きいＰＳ製ビーズを含む層と親水性高分子物質を含む層との２層の中間層が用いられた。
【０１３３】
（１）第１中間層の形成
実施例２（１）と同様の操作を行ない、第１中間層を有する中間基板Ａを得た。
【０１３４】
（２）第２中間層の形成
実施例４（１）で得られた中間基板Ａを用いたことおよびＰＳ製ビーズ含有溶液〔ＰＳ製ビーズの平均粒子径：１．５μｍ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、商品名：５１５３Ａ〕を用いたことを除き、実施例２（２）と同様の操作を行ない、第２中間層を有する中間基板Ｂを得た。
【０１３５】
（３）電極層の形成
実施例４（２）で得られた中間基板Ｂを用いたことを除き、実施例２（３）と同様の操作を行ない、電極基板を得た。
【０１３６】
（４）酵素層の形成
実施例４（３）で得られた電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、グルコースセンサを得た。
【０１３７】
（５）電気化学測定
実施例４（４）で得られたグルコースセンサを用いたことを除き、比較例２（４）と同様の操作を行ない、作用電極と対電極との間に流れる電流を測定した。
【０１３８】
（６）グルコースの検出感度の印加電圧依存性の評価
実施例４（５）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことおよび作用電極への印加電圧を０．２Ｖまたは０．２５Ｖに変えたことを除き、比較例２（５）と同様の操作を行ない、グルコースの検出感度の印加電圧依存性を評価した。
【０１３９】
実施例４および比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を図１３（Ａ）に示す。図中、クロスは実施例４のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を調べた結果、白丸は比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と印加電圧との関係を調べた結果を示す。
【０１４０】
（７）干渉物質による影響の評価
実施例４（５）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことおよび作用電極への印加電圧を０．２Ｖまたは０．２５Ｖに変えたことを除き、比較例２（６）と同様の操作を行ない、アセトアミノフェンによる影響およびアスコルビン酸による影響を評価した。
【０１４１】
実施例４および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を図１３（Ｂ）に示す。図中、クロスは実施例４のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を調べた結果、白丸は比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と印加電圧との関係を調べた結果を示す。実施例４および比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を図１２（Ｃ）に示す。図中、クロスは実施例４のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を調べた結果、白丸は比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と印加電圧との関係を調べた結果を示す。
【０１４２】
（８）結果
図１３（Ａ）に示された結果から、印加電圧を０．４Ｖ以下にした場合、実施例４のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度は、実施例２のグルコースセンサを用いたときと同様に、比較例２のグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と比べて高いことがわかった。また、図１３（Ｂ）に示された結果から、印加電圧を０．４以下にした場合、実施例４のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率は、比較例２のグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と同程度以下であることがわかった。さらに、図１３（Ｃ）に示された結果から、印加電圧を０．４Ｖ以下にした場合、実施例４のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率は、比較例２のグルコースセンサを用いたときのアスコルビン酸による干渉率と同程度以下であることがわかった。
【０１４３】
実施例４のグルコースセンサは、実施例２のグルコースセンサと同様に、基板と電極層との間にＰＳ製ビーズを含む中間層を含む作用電極を備えている。これに対し、比較例２のグルコースセンサは、中間層を有していなかった。したがって、基板と電極層との間に粒子を含む中間層を含む作用電極を備えるグルコースセンサによれば、アセトアミノフェン、アスコルビン酸などの干渉物質による干渉を受けにくい印加電圧を用い、干渉物質による干渉を受けずに、高感度でグルコースを検出できることが示唆された。
【０１４４】
（比較例３）
比較例３では、干渉物質存在下でのグルコースの検出に対するＰＳ製ビーズのみの層を用いた場合の影響を調べた。
【０１４５】
（１）粒子層の形成
基板であるＰＥＴ製フィルム（長さ：３ｃｍ、幅：３ｃｍおよび厚さ：７５μｍ）の一方の表面に、ＰＳ製ビーズ含有溶液〔ＰＳ製ビーズの平均粒子径：５００ｎｍ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、商品名：５０５０Ａ〕５００μＬを滴下した。ＰＳ製ビーズ含有溶液が滴下されたフィルムを、スピンコーターによって３００ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、余分な液体を除去した。その後、フィルムを１１０℃で３分間加熱することにより、ＰＳ製ビーズを含む粒子層をフィルム上に固定した。
【０１４６】
（２）電極層の形成
比較例３（１）で形成された粒子層上に、スパッタリング法によってチタン層（厚さ：約１０ｎｍ）を形成した。つぎに、図３に示されるパターンとなるように、チタン層上に、スパッタリング法によって白金を含む作用電極用の電極層（直径８ｍｍ、厚さ：約２００ｎｍ）および白金を含む対電極用の電極層（厚さ：約２００ｎｍ）を形成した。また、図３に示されるパターンとなるように、チタン層上に銀／塩化銀インクを塗布し、乾燥させることによって銀／塩化銀からなる参照電極を形成した。これにより、電極基板を得た。
【０１４７】
（３）電気化学測定
比較例３（２）で得られた電極基板を用いたことを除き、比較例２（４）と同様の操作を行ない、作用電極と対電極との間に流れる電流を測定した。
【０１４８】
（４）結果
比較例３で得られた電極では、ＰＢＳを滴下した後、電極に電圧を印加すると、電極層および粒子層が剥離し、電気化学測定を行なうことができなかった。したがって、基板と電極層との間に粒子を含む層を設けるだけでは、電気化学測定を行なうことができないことが示唆された。実施例４のグルコースセンサと比較例３のグルコースセンサとは、基板と電極との間における親水性高分子物質の有無の点で異なっていた。これらの結果から、実施例４のグルコースセンサによれば、親水性高分子物質と粒子とを含む中間層を有しているので、アセトアミノフェンなどの干渉物質による影響を受けずに、高感度でグルコースを検出することができることが示唆された。
【０１４９】
（比較例４）
以下において、比較例４では、干渉物質存在下でのグルコースの検出に対する親水性高分子物質のみの層を用いた場合の影響を調べた。
【０１５０】
（１）親水性高分子物質層の形成
ＰＶＡ水溶液Ｂ５００μＬを、基板であるＰＥＴ製フィルム（長さ：３ｃｍ、幅：３ｃｍおよび厚さ：７５μｍ）の一方の表面に塗布した。ＰＶＡ水溶液が塗布されたＰＥＴ製フィルムを、スピンコーターによって７５０ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、余分な液体を除去して塗膜を形成した。その後、塗膜を有するＰＥＴ製フィルムを１１０℃で３分間加熱することにより、親水性高分子物質であるＰＶＡを含む親水性高分子物質層をフィルム上に固定した。
【０１５１】
（２）電極層の形成
比較例４（１）で形成された親水性高分子物質層上に、スパッタリング法によってチタン層（厚さ：約５ｎｍ）を形成した。つぎに、図３に示されるパターンとなるように、チタン層上に、スパッタリング法によって白金を含む作用電極用の電極層（直径８ｍｍ、厚さ：約１００ｎｍ）および白金を含む対電極用の電極層（厚さ：約２００ｎｍ）を形成した。また、図３に示されるパターンとなるように、チタン層上に銀／塩化銀インクを塗布し、乾燥させることによって銀／塩化銀からなる参照電極を形成した。これにより、電極基板を得た。
【０１５２】
（３）酵素層の形成
比較例４（２）で得られた電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、グルコースセンサを得た。
【０１５３】
（４）電気化学測定
比較例４（３）で得られたグルコースセンサを用いたことを除き、比較例２（４）と同様の操作を行ない、作用電極と対電極との間に流れる電流を測定した。
【０１５４】
（５）グルコースの検出感度の印加電圧依存性の評価
比較例４（４）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことを除き、比較例２（５）と同様の操作を行ない、グルコースの検出感度の印加電圧依存性を評価した。
【０１５５】
（６）結果
比較例４で得られたグルコースセンサでは、銀／塩化銀参照電極を基準として、作用電極への印加電圧が０．３Ｖである場合のグルコースの検出感度は、３２ｎＡ／ｍｇ／ｄＬであった。したがって、比較例４で得られたグルコースセンサによるグルコースの検出感度は、実施例２〜４または比較例２で得られたグルコースセンサによるグルコースの検出感度に比べ、非常に低いことがわかった。また、比較例４で得られたグルコースセンサでは、グルコースセンサの使用時に、電極層が徐々に剥がれていた。したがって、比較例４で得られたグルコースセンサの電極は、脆いことがわかった。実施例４のグルコースセンサと比較例４のグルコースセンサとは、基板と電極との間における粒子の有無の点で異なっていた。これらの結果から、実施例４のグルコースセンサによれば、親水性高分子物質と粒子とを含む中間層を有しているので、アセトアミノフェンなどの干渉物質による影響を受けずに、高感度でグルコースを検出することができることが示唆された。
【０１５６】
（実験例１）
（１）第１中間層の形成
ＰＶＡ水溶液Ｂ５００μＬを、基板であるＰＥＴ製フィルム（長さ：３ｃｍ、幅：３ｃｍおよび厚さ：７５μｍ）の一方の表面に塗布した。ＰＶＡ水溶液が塗布されたＰＥＴ製フィルムを、スピンコーターによって０ｒｐｍから３００ｒｐｍまで回転数を変化させながら１０秒間および７５０ｒｐｍから０ｒｐｍまで回転数を変化させながら１５秒間回転させることにより、余分な液体を除去して塗膜を形成した。その後、塗膜を有するＰＥＴ製フィルムを１２０℃で１０分間加熱することにより、親水性高分子物質であるＰＶＡを含む第１中間層をフィルム上に固定した。これにより、第１中間層を有する中間基板Ａを得た。
【０１５７】
（２）第２中間層の形成
実験例１（１）で得られた中間基板Ａの第１中間層上に、平均粒子径が０．１μｍ、０．５μｍ、１．５μｍまたは１９μｍであるアクリル製ビーズを含有するアクリル製ビーズ含有溶液４００μＬを滴下した。アクリル製ビーズ含有溶液が滴下された中間基板Ａを、スピンコーターによって３００ｒｐｍで１０秒間および７５０ｒｐｍで１５秒間回転させることにより、余分な液体を除去した。その後、中間基板Ａを１２０℃で１０分間加熱することにより、アクリル製ビーズを含む第２中間層を第１中間層上に固定した。これにより、第２中間層を有する中間基板Ｂを得た。
【０１５８】
（３）電極層の形成
実験例１（２）で得られた中間基板Ｂを用いたことを除き、実施例２（３）と同様の操作を行ない、電極基板を得た。
【０１５９】
（４）酵素層の形成
実験例１（３）で得られた電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、グルコースセンサを得た。
【０１６０】
（５）電気化学測定
実験例１（４）で得られたグルコースセンサを用いたことを除き、比較例２（４）と同様の操作を行ない、作用電極と対電極との間に流れる電流を測定した。
【０１６１】
（６）グルコースの検出感度と粒子の平均粒子径との関係の評価
実験例１（５）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことを除き、比較例２（５）と同様の操作を行ない、グルコースの検出感度を求めた。中間層に用いられる粒子の平均粒子径とグルコースの検出感度との関係を調べた結果を表２に示す。
【０１６２】
【表２】
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【０１６３】
（７）結果
表２に示された結果から、平均粒子径が０．１μｍ、０．５μｍまたは１．５μｍであるアクリル製ビーズを用いた場合、グルコースの検出感度は、２７１〜４２２ｎＡ／ｍｇ／ｄＬであることがわかった。これに対し、平均粒子径が１９μｍであるアクリル製ビーズを用いた場合、グルコースの検出感度は、０．８ｎＡ／ｍｇ／ｄＬであることがわかった。したがって、これらの結果から、中間層に用いられる粒子の平均粒子径は、好ましくは０．００１〜１０μｍ、より好ましくは０．００５〜５μｍ、さらに好ましくは０．０１〜２μｍであることが示唆された。
【０１６４】
（実験例２）
（１）第１中間層の形成
実施例２（１）と同様の操作を行ない、中間基板Ａを得た。
【０１６５】
（２）第２中間層の形成
実験例２（１）で得られた中間基板Ａの第１中間層上に、ＰＳ製ビーズ濃度が１．４６×１０１２／ｍＬまたは３．６５×１０１２／ｍＬのＰＳ製ビーズ含有溶液〔ＰＳ製ビーズの平均粒子径：５００ｎｍ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、商品名：５０５０Ａ〕５００μＬを滴下した。ＰＳ製ビーズ含有溶液が滴下された中間基板Ａを、スピンコーターによって３００ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、余分な液体を除去した。液体除去後の中間基板Ａを１１０℃で３分間加熱することより、粒子としてＰＳ製ビーズを含み、粒子密度が８．７３×１０４個／ｍｍ２または２．０９×１０５個／ｍｍ２である第２中間層を第１中間層上に固定した。これにより、第２中間層における粒子密度が８．７３×１０４個／ｍｍ２または２．０９×１０５個／ｍｍ２である中間基板Ｂを得た。
【０１６６】
また、実験例２（１）で得られた中間基板Ａの第１中間層上に、ＰＳ製ビーズ濃度が１．４６×１０１３／ｍＬのＰＳ製ビーズ含有溶液〔ＰＳ製ビーズの平均粒子径：５００ｎｍ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、商品名：５０５０Ａ〕５００μＬを滴下した。ＰＳ製ビーズ含有溶液が滴下された中間基板Ａを１１０℃で３分間加熱することにより、粒子としてＰＳ製ビーズを含み、粒子密度が８．７３×１０９個／ｍｍ２である第２中間層を第１中間層上に固定した。これにより、第２中間層における粒子密度が８．７３×１０９個／ｍｍ２である中間基板Ｂを得た。
【０１６７】
また、第１中間層と第２中間層を形成していないＰＥＴ製フィルムを用意し、粒子密度が０である対照の基板とした。
【０１６８】
（３）電極層の形成
実験例２（２）で得られた中間基板Ｂを用いたことを除き、実施例２（３）と同様の操作を行ない、電極基板を得た。また、実験例２（２）で得られた対照の中間基板の表面に、前記と同様に、白金を含む作用電極用の電極層、白金を含む対電極用の電極層および銀／塩化銀からなる参照電極を形成した。これにより、対照の電極基板を得た。
【０１６９】
（４）粒子密度の評価
実験例２（３）で得られた電極基板および対照の電極基板それぞれの白金を含む作用電極用の電極層の表面を、電界放出形走査電子顕微鏡〔日本電子（株）製、商品名：ＪＳＭ−７５００ＦＴ〕を用いて観察し、基板上に固定されているＰＳ製ビーズの密度を評価した。その結果、第２中間層におけるＰＳ製ビーズの密度が８．７３×１０４個／ｍｍ２、２．０９×１０５個／ｍｍ２、７．９６×１０５個／ｍｍ２または８．７３×１０９個／ｍｍ２である電極基板および第２中間層におけるＰＳ製ビーズの密度が０である対照の電極基板が得られたことがわかった。
【０１７０】
（５）酵素層の形成
実験例２（３）で得られた電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、対照のグルコースセンサを得た。実験例２（３）で得られた対照の電極基板を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、対照のグルコースセンサを得た。
【０１７１】
（６）電気化学測定
実験例２（５）で得られたグルコースセンサまたは対照のグルコースセンサを用いたことを除き、比較例２（４）と同様の操作を行ない、作用電極と対電極との間に流れる電流を測定した。
【０１７２】
（７）グルコースの検出感度と粒子密度との関係の評価
実験例２（６）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことおよび作用電極への印加電圧を０．２Ｖとしたことを除き、比較例２（５）と同様の操作を行ない、グルコースの検出感度を求めた。グルコースの検出感度と粒子密度との関係を調べた結果を表３に示す。
【０１７３】
【表３】
2018017593.tif 000005
【０１７４】
（８）干渉物質による影響の評価
実験例２（４）の電気化学測定の際に電流値が定常化した後のグルコースセンサを用いたことおよび作用電極への印加電圧を０．２Ｖとしたことを除き、比較例２（６）と同様の操作を行ない、低電圧印加時のアセトアミノフェンによる影響および低電圧印加時のアスコルビン酸による影響を評価した。アセトアミノフェンによる干渉率と粒子密度との関係を調べた結果を表４、アスコルビン酸による干渉率と粒子密度との関係を調べた結果を表５に示す。
【０１７５】
【表４】
2018017593.tif 000006
【０１７６】
【表５】
2018017593.tif 000007
【０１７７】
（９）結果
表３に示された結果から、粒子密度が０を超えるグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度は、粒子密度が０であるグルコースセンサを用いたときのグルコースの検出感度と比べて高いことがわかった。表４に示された結果から、粒子密度が０を超えるグルコースセンサを用いた場合、アセトアミノフェンによる干渉率を低くすることができることがわかった。これに対し、粒子密度が０であるグルコースセンサを用いた場合、ノイズによって測定ができなかった。表５に示された結果から、粒子密度が８．７３×１０４を超えるグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率は、粒子密度が８．７３×１０４未満であるグルコースセンサを用いたときのアセトアミノフェンによる干渉率と比べて低いことがわかった。したがって、これらの結果から、中間層における粒子密度は、９×１０４〜９×１０９個／ｍｍ２程度が好ましいことが示唆された。
【０１７８】
（実験例３）
（１）第１中間層の形成
実験例２（１）と同様の操作を行ない、第１中間層を有する中間基板Ａを得た。
【０１７９】
（２）第２中間層の形成
実験例３（１）で得られた中間基板Ａの第１中間層上に、ＰＳ製ビーズ濃度が１．４６×１０１３／ｍＬのＰＳ製ビーズ含有溶液〔ＰＳ製ビーズの平均粒子径：５００ｎｍ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、商品名：５０５０Ａ〕５００μＬを滴下した。ＰＳ製ビーズ含有溶液が滴下された中間基板Ａを、スピンコーターによって３００ｒｐｍで１０秒間回転させることにより、余分な液体を除去した。液体除去後の中間基板Ａを１１０℃で３分間加熱した。これにより、粒子としてＰＳ製ビーズを含む第２中間層を第１中間層上に固定した。これにより、第２中間層における粒子密度が７．９５×１０５個／ｍｍ２である実験番号１の中間基板Ｂを得た。
【０１８０】
また、実験例３（１）で得られた中間基板Ａの第１中間層上に、ＰＳ製ビーズ濃度が１．４６×１０１３／ｍＬのＰＳ製ビーズ含有溶液〔ＰＳ製ビーズの平均粒子径：５００ｎｍ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、商品名：５０５０Ａ〕５００μＬを滴下した。ＰＳ製ビーズ含有溶液が滴下された中間基板Ａを１１０℃で３分間加熱した。これにより、粒子としてＰＳ製ビーズを含む第２中間層を第１中間層上に固定した。これにより、第２中間層における粒子密度が８．７９×１０９個／ｍｍ２である実験番号２の中間基板Ｂを得た。
【０１８１】
（３）電極層の形成
実験例３（２）で得られた中間基板Ｂを用いたことを除き、実験例２（３）と同様の操作を行ない、第２中間層における粒子密度が７．９５×１０５個／ｍｍ２である実験番号１の電極基板および第２中間層における粒子密度が８．７９×１０９個／ｍｍ２である実験番号２の電極基板を得た。
【０１８２】
（４）作用電極の表面の観察
実験番号１の電極基板、実験番号２の電極基板および実験例２（３）で得られた対照の電極基板それぞれの作用電極の表面を電子顕微鏡によって観察した。
【０１８３】
実験例３において、実験番号１の電極基板の作用電極の表面を観察した結果を図１４（Ａ）、実験番号２の電極基板の作用電極の表面を観察した結果を図１４（Ｂ）、実験例２（３）で得られた対照の電極基板の作用電極の表面を観察した結果を図１４（Ｃ）に示す。図中、スケールバーＭは１μｍである。
【０１８４】
（５）結果
図１４に示された結果から、粒子を含む中間層を含む作用電極の表面〔図１４（Ａ）および（Ｂ）参照〕は、粒子を含まない作用電極の表面〔図１４（Ｃ）参照〕と比べて、白金電極層の凹凸が増大している。つまり、基板と電極層との間に粒子を含む中間層を設けることにより、作用電極の表面に凹凸が形成され、この凹凸の効果により、干渉物質による干渉を受けずに、グルコースを高感度に検出することができると示唆された。
【符号の説明】
【０１８５】
１０  測定装置
１１  表示部
１２  記録部
１３  解析部
１４  検出部
１４ａ  設置部
１４ｂ  電気回路
１４ｃ  電流計
１５  電源
１６  操作ボタン
２０  酵素センサ
２１  基板
３０  作用電極
４０  対電極
５０  参照電極
７１，７２，７３  電極リード
１００  過酸化水素電極
１０１  中間層
１０２  単層
１０３  第１中間層
１０４  第２中間層
１０５  接着層
１０７  電極層
１１０  酵素層
１１１  親水性高分子物質
１１２  粒子
３００  収集部材
【図１】
2018017593.tif 000008
【図２】
2018017593.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
2018017593.tif 000012
【図６】
2018017593.tif 000013
【図７】
2018017593.tif 000014
【図８】
2018017593.tif 000015
【図９】
2018017593.tif 000016
【図１０】
2018017593.tif 000017
【図１１】
2018017593.tif 000018
【図１２】
2018017593.tif 000019
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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