(57)【要約】【課題】  トルラ酵母に外来タンパク質を導入させるにあたり、細胞毒性の低減と導入効率の向上を目的とした方法を提供する。また、その方法を用いて得られる改変トルラ酵母の取得を課題とする。【解決手段】  細胞膜透過性塩基性ペプチドを用いることで、外来タンパク質を、より高効率で、かつ細胞毒性低く、トルラ酵母に導入させることができる。また該方法を用いることで、産業上有用な改変トルラ酵母の作出が可能となる。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過性塩基性ペプチドを用いた、トルラ酵母又はキシロース資化性酵母への外来タンパク質導入方法。
【請求項２】
請求項１の外来タンパク質の導入方法であって、酵母、膜透過性塩基性ペプチド及び外来タンパク質を緩衝液に懸濁させる工程を有し、緩衝液の水素イオン濃度がｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０である、外来タンパク質導入方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、緩衝液が、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）緩衝液又は酢酸ナトリウム緩衝液である、外来タンパク質導入方法。
【請求項４】
請求項２又は３の方法であって、酵母、膜透過性塩基性ペプチド及び外来タンパク質を緩衝液に懸濁させる工程の前に、トルラ酵母又はキシロース資化性酵母をＹＰＤ培地、ＹＥＳ培地、又はＳＭＭ培地から選択される一つの培地で培養する工程を有する、外来タンパク質導入方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法で、外来タンパク質として、ＤＮＡ二本鎖切断酵素を導入する、トルラ酵母又はキシロース資化性酵母のゲノム再編方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法で得られた改変トルラ酵母又は改変キシロース資化性酵母の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性塩基性ペプチドを用い、高効率で、トルラ酵母、又はキシロース資化性酵母に外来タンパク質を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のタンパク質トランスフェクション法は、活性型タンパク質を生細胞に直接導入する方法を提供するもので、好適なタイミングで一過的にタンパク質の機能を細胞内で発現させ、細胞機能の人工的な制御を実現する。そのため、動物細胞を中心に多くの技術が開発され、近年では再生医学やゲノム編集の分野への応用が期待されている。
【０００３】
また、タンパク質トランスフェクション法は、標的細胞への組換えDNAや遺伝子導入の必要がないため、遺伝子組換えが規制上の問題となる食品関連生物への適用が期待されている。この技術を用いることで、外来DNAの細胞内導入に基づく各種問題、すなわちゲノムDNAへの予想外の位置への挿入やそれに伴う周辺遺伝子の転写活性化やサイレンシングなどを回避することが可能になる（非特許文献１）。
【０００４】
細胞内へ送致するタンパク質としては、例えばCRISPR-Cas9:guide RNA複合体などが挙げられる。CRISPR-Cas9:guide RNA複合体は分子量が大きく、遺伝子導入効率が低いことが知られているが、ヒト細胞ではタンパク質を直接導入することで、この課題が解決されたという報告がなされている（非特許文献２）。
【０００５】
細胞内へのタンパク質の送致法としては、高圧電流による一過的な生体膜穿孔法などが開発されており、主として植物や動物細胞の事例が集積しつつある。しかしこれらの方法では、細胞膜や細胞壁への損傷に伴う細胞毒性があらわれること、また機能発現に必要な十分量のタンパク質を細胞内に導入することが困難であること、などの問題があった。そのため、より効率的なタンパク質導入方法や、細胞毒性の低いトランスフェクション方法の開発が求められてきた。
【０００６】
低侵襲性のタンパク質トランスフェクション技術の例としては、PEI（ポリエチレンイミン）のような担体とタンパク質をEDC（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）共存下で共有結合させ、カチオン性複合体を形成させる方法が挙げられる（特許文献１）。
【０００７】
またGST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）融合させた外来タンパク質と、PEIとグルタチオンのジスルフィド結合体とを混合することで、上記にあるような共有結合化しないで簡便かつ高効率で細胞内にタンパク質を輸送する方法が開発されている（特許文献２）。しかし一般にカチオン性の媒体は強い細胞毒性を示すため、やはり侵襲性の問題が認識されていた（特許文献１）。
【０００８】
このようなタンパク質トランスフェクション方法の細胞毒性については、膜透過性を有する塩基性ペプチドを採用することで改善される場合が、動物細胞を中心に報告されている（非特許文献１）。細胞膜透過性塩基性ペプチドの報告としては、ウイルス由来のTATタンパク質共存下でβ−ガラクトシダーゼをマウス細胞組織に導入した報告が最初である（非特許文献３）。その後検証が重ねられ、外来タンパク質の導入効率が改善された塩基性ペプチド試薬キットの開発、例えばXfectシステム（タカラバイオ・クローンテック社）が開発された（非特許文献1）。
【０００９】
また、従来の技術は、主として細胞壁をもたない動物細胞が対象であるが、細胞壁をもつ植物をプロトプラスト化してタンパク質を送致した報告もある（非特許文献４）。しかしながら、強固なキチン細胞壁を有する産業用酵母であるトルラ酵母等に外来タンパク質を導入するには困難と考えられており、これまでの報告例はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−４９２１４号公報
【特許文献２】特開２００８−１１５１５０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】円居隆宏、高蔵昇, 細胞透過性ペプチドによるタンパク質トランスフェクション, Medical Bio, 2011年03月号、オーム社刊
【非特許文献２】John A Zuris , David B Thompson , Yilai Shu , John P Guilinger , Jeffrey L Bessen , Johnny H Hu , Morgan L Maeder ,J Keith Joung , Zheng-Yi Chen & David R Liu ,Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo, Nature Biotechnology 33, 73?80 (1 January 2015)
【非特許文献３】Schwarze SR, Ho A, Vocero-Akbani A and Dowdy SF, In vivo protein transduction : delivery of a biologically active protein into the mouse. Science, 285(5433), p1569-72, 1999
【非特許文献４】Je Wook Woo, Jungeun Kim , Soon Il Kwon , Claudia Corval?n , Seung Woo Cho , Hyeran Kim , Sang-Gyu Kim , Sang-Tae Kim , Sunghwa Choe &?Jin-Soo Kim, DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology, 33: 1162-1164 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、かかる背景に鑑みて発明されたものであり、細胞璧を有するトルラ酵母、又はキシロース資化性酵母に外来タンパク質の活性を保持したまま導入させるにあたり、細胞毒性の低減と導入効率の向上を目的とした方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために鋭意研究したところ、本発明者らは、特定の条件で細胞膜透過性塩基性ペプチドを用いることにより、外来タンパク質を細胞壁の構造を変化させず非侵襲的に、トルラ酵母又はキシロース資化性酵母に対して、高効率で導入させる方法を確立し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、第一に、細胞膜透過性塩基性ペプチドを用いた、トルラ酵母又はキシロース資化性酵母への外来タンパク質導入方法である。
第二に、トルラ酵母を懸濁させる緩衝液の水素イオン濃度がｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０である、上記第一に記載の方法である。
第三に、トルラ酵母を懸濁させる緩衝液がＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）および／または酢酸Ｎａからなる、上記第一または第二に記載の方法である。
第四に、トルラ酵母を培養する培地が、ＹＰＤ培地またはＹＥＳ培地、ＳＭＭ培地からなる群より選択される一種である上記第一に記載の方法である。
第五に、上記第一から第四のいずれか一つに記載の方法で得られた改変トルラ酵母である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、細胞膜透過性塩基性ペプチドを用いることによって、高効率で、かつ細胞毒性低く、外来タンパク質をトルラ酵母に導入させることができる。本発明は、従来の動物細胞等への導入条件に比べ、従来適用例が知られていなかったトルラ酵母又はキシロース資化性酵母に最適化された条件であり、動物細胞用の標準手順に準ずる方法で出芽酵母において実現される導入効率に比して、最大で12-16倍以上のタンパク質導入効率を示す。また、本発明の方法を用いることで、任意の遺伝子切断酵素などをトルラ酵母に導入させることができるため、改変トルラ酵母等の取得が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】出芽酵母(Sc)及びトルラ酵母(Cu)、各々を各種培地で培養したときの、細胞内に導入されたβ−ガラクトシダーゼ活性の比較。両酵母ともにＯＤ６００＝１の状態の細胞を回収してトランスフェクション処理した。
【図２】出芽酵母(Sc)及びトルラ酵母(Cu)、各々を各種培地で培養したときの、細胞内に導入されたβ−ガラクトシダーゼ活性の比較。両酵母ともに定常期の状態の細胞を回収してトランスフェクション処理した。
【図３】出芽酵母(Sc)及びトルラ酵母(Cu)をYPD培地で培養した場合の培養時期の違いによる、細胞内に導入されるβ−ガラクトシダーゼ量についての比較
【図４】出芽酵母(Sc)及びトルラ酵母(Cu)の細胞懸濁液を構成する緩衝液における塩濃度と、細胞内に導入されたβ−ガラクトシダーゼ量の関係性。
【図５】出芽酵母(Sc)及びトルラ酵母(Cu)の細胞懸濁液を構成する緩衝液のpHと緩衝液組成と、細胞内導入β−ガラクトシダーゼ量の関係性。
【図６】出芽酵母(Sc)及びトルラ酵母(Cu)の細胞懸濁液と、Xfect/β−ガラクトシダーゼ混合液について、インキュベーション温度の違いによる細胞内導入量を比較。
【図７】動物細胞用の手順書と、本発明の方法での、出芽酵母(Sc)とトルラ酵母(Cu)のβ−ガラクトシダーゼ導入量の比較。
【図８】顕微鏡画像（GFP-Cas9）
【図９】顕微鏡画像（ゲノム再編による形質転換）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における細胞膜透過性塩基性ペプチドは、特に制限されないが、公知の膜透過性の塩基性ペプチドを使用することができる。具体的には、アルギニンを多く含むペプチドである、オリゴアルギニン、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-１）の Ｔａｔ タンパク質由来の塩基性ペプチド、ポリヒスチジン（特開2013-100273号公報）などを用いることができる。市販品であれば、例えば、タカラバイオ・クローンテック社の「Xfect Protein Transfection Reagent」や、ヒュギエイアバイオサイエンス社の”Prote-in” Transfection Reagentなどが挙げられる。特に、「Xfect Protein Transfection Reagent」（以下「Xfect」）は、トルラ酵母においては、高効率にタンパク質を導入することができる。
【００１８】
本発明のタンパク質導入に用いるトルラ酵母の培養は、特に制限されることなく、公知の酵母用培地を選択して使用することができる。特にＹＰＤ培地、分裂酵母で汎用されるＹＥＳ培地、或いは最少合成培地ＳＭＭが好ましい。導入を行う細胞の培養時期は、特に制限されないが、対数期の初期（ＯＤ６００＝０．５まで）、中期から後期（ＯＤ６００＝１〜１５）が好ましいが、定常期（ＯＤ６００＝２１）でも可能であり、特に好ましくは対数期の初期である。
【００１９】
本発明では、培養したトルラ酵母等を緩衝液に懸濁させる。
なお本発明は、Xfect添付の動物細胞の標準手順書に記載の方法（標準手順書では、細胞培地中でXfectとタンパク質を混合する）と異なり、トルラ酵母細胞又はキシロース資化性酵母をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳ）で懸濁し、これにXfectとβ−ガラクトシダーゼを添加する方法で顕著に細胞への導入が認められた。
トルラ酵母等を懸濁させる緩衝液は、ＮａＣｌ濃度が０％〜０．８５％であることが好ましく、より好ましくは０％である。また、水素イオン濃度はｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０であることが好ましく、より好ましくはｐＨ５．０〜ｐＨ６．０であり、特に好ましくは、ｐＨ６．０である。緩衝液の組成は、ＰＢＳ以外に特に制限されないが、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）や酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリシンナトリウム、炭酸・重炭酸ナトリウム等で特に、ＭＥＳ又は酢酸ナトリウムからなるものが好ましい。
前段の条件で培養したトルラ酵母等を通常用いられる方法で、培地から前述の緩衝液に置換し、トルラ酵母等の懸濁液を調整する。
【００２０】
本発明の方法では、外来タンパク質と細胞膜透過性塩基性ペプチドを混合する。混合条件は、使用する細胞膜透過性塩基性ペプチドで異なるが、タカラバイオ・クローンテック社の「Xfect Protein Transfection Reagent」を使用する場合は、トランスフェクション試薬の調整は、以下の通りである。製品に添付のXfect溶液と脱イオン水を製品付属のプロトコールに従い調整する。調整した溶液に外来タンパク質を添加し、混合する。混合後、室温で、３０分保持し、外来タンパク質を含む溶液を調整する。
【００２１】
その後、トルラ酵母等の懸濁液に、前段で調整した外来タンパク質を含む溶液を混合する。当該混合時の温度（トランスフェクション処理温度）は、２０℃以上であることが好ましく、より好ましくは２０℃〜３７℃で、１時間〜２時間保持し、外来タンパク質をトルラ酵母細胞内又はキシロール資化性酵母細胞内に導入する。
【００２２】
本発明で導入可能な外来タンパク質としては、特に制限はないが、β−ガラクトシダーゼのような活性を保持した酵素、オワンクラゲ由来ＧＦＰのような蛍光タンパク質、マウスやヤギ由来の免疫グロブリン抗体、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体のようなゲノム編集酵素複合体、転写活性化や抑制に関わる転写調整因子、酵母プリオン、オーキシンデグロンのようなプロテアーゼ、ヒストンアセチル基転移酵素のようなエピジェネティクス制御タンパク質、ゲノム再編に用いるＤＮＡ二本鎖切断酵素等を例示することができる。
【００２３】
以上のように、本発明の方法では、既知の動物細胞用の標準的な条件、手順と異なる方法を見出すことにより、トルラ酵母又はキシロース資化性酵母においては、標準的な条件、手順よりも、最大で１２〜１６倍以上の導入効率となる発明である。
なお、標準的な条件、手順とは、市販品を用いる場合は、製品に付属している手順書に記載されている方法であり、それ以外の細胞膜透過性塩基性ペプチドを使用する場合は、使用するペプチドにおいて一般的に用いられている条件、手順を意味する。
【００２４】
本発明におけるＯＤは、分光光度計を用いて測定した値であり、具体的には分光光度計（レシオビーム分光光度計U-5100：日立ハイテクサイエンス社製）を用いて測定する。またｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定する。具体的には、ｐＨメーターＨＭ−３０Ｇ（東亜ディーケーケー社製）を用いて測定する。
【００２５】
以下に本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例において、トルラ酵母「ＮＢＲＣ０９８８」（Ｃｕ）をＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構）から入手し使用した。また比較例として出芽酵母「Ｓ２８８ｃ」（Ｓｃ）を、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から入手し使用した。
【実施例１】
【００２７】
［酵母培養］
トルラ酵母又は出芽酵母は試験管内で、３０℃でＯＤ６００＝１、または定常期まで好気培養した。培地はＹＰＤ培地、ＹＥＳ培地、ＳＤ培地又はＳＭＭ培地をそれぞれ用いた。ＯＤ６００×サンプリングボリューム＝１．０［ｃｍ・ｍｌ］となるようにトルラ酵母等を回収し、緩衝液で洗浄後、２００μｌの緩衝液で細胞懸濁液を調製した。なお、緩衝液には１０ｍＭ  ＰＢＳ（１３７ｍＭ 塩化Ｎａ，２．７ｍＭ 塩化Ｋ，ｐＨ７．４）を用いた。
【００２８】
［タンパク質トランスフェクション処理］
タンパク質導入試薬キットXfect（タカラバイオ・クローンテック社製）について、添付指示書に則りXfect溶液２００  μｌを調製した。即ちXfect reaent  １００μｌに９９μｌのキット添付バッファーを添加し、引続きキットに附属するβ−ガラクトシダーゼ溶液（５００Ｕｎｉｔｓ／μｌ）を１μｌ添加し、室温で３０分間インキュベーションした。２００μｌの細胞懸濁液にβ−ガラクトシダーゼを添加したXfect溶液１００μｌを混合し３０℃で１時間インキュベーションした。
【００２９】
［導入タンパク質の定量］
細胞を１ｍｌの１０  ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。この際、５００ｘｇで遠心分離操作を１回行い、チューブを逆向きにして引き続き５００ｘｇ（逆スピン）で遠心沈降させた。最後にチューブを元の向きに戻して５００ｘｇで細胞を沈降させた．上清の洗浄液を除き、１ｍｌのＰＢＳを加えてもう一度同様の操作を実施した．１ｍｌのＺバッファー（６０ｍＭ リン酸水素２Ｎａ、４０ｍＭ リン酸二水素Ｎａ、１０ｍＭ 塩化Ｋ、１ｍＭ 硫酸Ｍｇ、５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で細胞を懸濁し、Ｚバッファーで適宜希釈し１ｍｌにフィルアップした。サンプルを氷上に置き１６μｌの０．１％  ＳＤＳと１６μｌのクロロフォルムを添加し転倒混和させた。３０℃で１５分間インキュベーションし３２μｌの４ｍｇ／ｍｌ  ＯＮＰＧ（２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を加え１０秒間ミキサーで振盪撹拌した。１５分後に氷から取り出し、８０μｌの１ｍｏｌ／ｌの炭酸Ｎａ水溶液を加えて消光させた。１０，０００ｘｇで細胞残渣を遠心沈降させて上清を回収し、ＯＤ４２０とＯＤ５５０を測定した。活性の大きさはＵ＝ＯＤ４２０−（１．７５×ＯＤ５５０）で計算した。β−ガラクトシダーゼを段階希釈させ検量線を描画し定量的に活性を評価した。本願では、β−ガラクトシダーゼの導入量を、その活性値から推定し、導入効率を評価した。
【００３０】
（比較例１）
実施例１において、トルラ酵母を出芽酵母としたこと以外は実施例１と同様に行った。
【００３１】
上記、実施例１および比較例１で得られた結果を図１と図２に示す。
【００３２】
結果より、ＹＰＤ培地またはＹＥＳ培地、ＳＭＭ培地のいずれの培地を用いた場合でも、トルラ酵母は出芽酵母に比べ、β−ガラクトシダーゼの導入効率が高いことが確認された。
【実施例２】
【００３３】
実施例１における［酵母培養］において、培地にＹＰＤ培地を用い、ＯＤ６００が０〜２１のいずれかとなる培養時期で好気培養したこと以外は実施例１と同様に行った。
【００３４】
（比較例２）
実施例２において、トルラ酵母を出芽酵母としたこと以外は実施例２と同様に行った。
【００３５】
上記、実施例２および比較例２で得られた結果を図３に示す。
【００３６】
結果より、ＯＤ６００の値が０〜２１のいずれの場合でも、トルラ酵母は出芽酵母に比べ、β−ガラクトシダーゼの導入効率が高いことが確認された。
【実施例３】
【００３７】
実施例１における［酵母培養］において、培地にＹＰＤ培地を用い、ＯＤ６００＝１まで好気培養し、緩衝液に、ＮａＣｌを０％または０．８５％または３．５％含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を用いた以外は実施例１と同様に行った。
【００３８】
（比較例３）
実施例３において、トルラ酵母を出芽酵母としたこと以外は実施例３と同様に行った。
【００３９】
上記、実施例３および比較例３で得られた結果を図４に示す。
【００４０】
結果より、ＮａＣｌ濃度が０％及び０．８５％の場合も、トルラ酵母は出芽酵母に比べ、β−ガラクトシダーゼの導入効率が高いことが確認された。ＮａＣｌ濃度が０％は、より導入効率が高い。ＮａＣｌ濃度が３．５％では、出芽酵母よりもトルラ酵母への導入効率が低い結果となった。
【実施例４】
【００４１】
実施例１における［酵母培養］において、培地にＹＰＤ培地を用い、ＯＤ６００＝１まで好気培養し、緩衝液に、図５に記載の緩衝液を同じく図５に記載のｐＨに調整したものを用いたこと以外は実施例１と同様に行った。
【００４２】
（比較例４）
実施例４において、トルラ酵母を出芽酵母としたこと以外は実施例４と同様に行った。
【００４３】
上記、実施例４および比較例４で得られた結果を図５に示す。
【００４４】
結果より、緩衝液の水素イオン濃度が、ｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０のいずれの場合でも、トルラ酵母は出芽酵母に比べ、β−ガラクトシダーゼの導入効率が高いことが確認された。また、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを除く各種組成物を含むいずれの緩衝液を用いた場合でも、トルラ酵母は出芽酵母に比べ、β−ガラクトシダーゼの導入効率が高いことが確認された。なお、動物細胞用の標準手順では、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）が記載されており、本実施例では、当概方法よりもβ−ガラクトシダーゼの導入効率が著しく高くなる。
【実施例５】
【００４５】
実施例１における［酵母培養］において、培地にＹＰＤ培地を用い、ＯＤ６００＝１まで好気培養したこと以外は実施例１［酵母培養］と同様に行った。
【００４６】
実施例１における［タンパク質トランスフェクション処理］において、細胞懸濁液と、β―ガラクトシダーゼを添加したXfect溶液とのインキュベーション温度を４℃または２０℃または３０℃または３７℃としたこと以外は実施例１［タンパク質トランスフェクション処理］と同様に行った。
【００４７】
（比較例５）
実施例５において、トルラ酵母を出芽酵母としたこと以外は実施例５と同様に行った。
【００４８】
上記、実施例５および比較例５で得られた結果を図６に示す。
【００４９】
結果より、タンパク質トランスフェクション処理温度が２０℃以上で、トルラ酵母は出芽酵母に比べ、β−ガラクトシダーゼの導入効率が高いことが確認された。
【００５０】
Xfectに添付されている動物細胞用の標準手順に従いβ−ガラクトシダーゼを導入した場合（一部変更あり）と、本発明で見出した方法によりβ−ガラクトシダーゼを導入した場合の比較を行った。動物細胞用の標準手順方法（従来法）を一部変更した手順は、標準手順では、細胞を培地に懸濁することが記載されているが、本実施例では、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）緩衝液に酵母細胞を懸濁し、さらに、トラスフェクション処理温度を３７℃とすることが記載されているが、本実施例では、トランスフェクション処理温度を３０℃とした。本発明の方法の一方法として、対数期初期（ＯＤ６００＝０．４）の酵母を回収し、酵母細胞をＭＥＳ（ｐH ６．０）に懸濁した他は、実施例１の方法と同様に行った。この結果を図７に示す。
【００５１】
YPD培地30℃で培養を行い対数増殖期にあるトルラ酵母  １５ｘ１０６個の細胞をPBSにより洗浄後PBSに懸濁した。Xfectに添付されている動物細胞用の標準手順に従いAlexafluor488標識ヤギIgG抗体（抗ウサギIgG）０．２５ugを導入した。トランスフェクション処理は30℃において2時間行った。PBSにより洗浄後再度細胞をPBSに懸濁してAlexafluor488に由来する緑色蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した。
【実施例６】
【００５２】
ＤＮＡ二本鎖切断酵素であるＴａｑＩをトルラ酵母に導入した。
[酵母培養]
トルラ酵母をＯＤ６００＝１までＹＰＤ培地を用いて３０℃で培養し、ＯＤ６００×サンプリングボリューム＝５．０［ｃｍ・ｍｌ］となるように細胞をＭＥＳ（ｐＨ ６．０）で懸濁した。
[タンパク質トランスフェクション処理]
タンパク質導入試薬キットXfect（タカラバイオ・クローンテック社製）について、Xfect溶液２００  μｌを調製した。即ちXfect reagent  １００μｌに８５μｌのキット添付バッファーを添加し、引続きＴａｑＩ酵素溶液（３．２ ｍｇ／ｍｌ）を１５μｌ添加し、室温で３０分間インキュベーションした。５００μｌの細胞懸濁液にXfect溶液２００μｌを混合し３０℃で２時間インキュベーションした。
[ＴａｑＩの活性化]
酵母細胞を、実施例１の[導入タンパク質定量]に記載の方法で、ＰＢＳのかわりにＭＥＳ（ｐＨ ６．０）を用いたこと以外は同様の手順で洗浄した。細胞に５００μｌのＹＰＤ培地を添加し、３０℃で３０分間復帰培養させた。引き続きＴａｑＩの活性化は、３８℃で９０分間処理し、活性化した。滅菌水で適宜希釈し、ＹＰＤ寒天培地に播いて３０℃で３日間保持した。大きさが小さい３８個のコロニーをピックアップして光学顕微鏡で観察した。その結果、図９のように、凝集性を有する形質転換体が出現した。この形質転換体は３８株中６株で観察されたことから１５％以上の高い変異効率を示す結果となった。さらに６株をＹＰＤ培地で５回継代培養を繰り返したところ２株で凝集性が保持された。以上のことから、本発明の方法であるタンパク質を直接トルラ酵母に導入させる方法においても、ＤＮＡ二本鎖切断酵素を導入することで、高効率で変異導入させ、かつ安定的に形質を次世代に受け継がせることが可能な方法であることが確認された。図9中１の画像は、ＴａｑＩを導入していないネガティブコントロール。図9中２及び３は、ＴａｑＩを導入した形質転換体で、それぞれの下図は、拡大写真を示す。
【００５３】
以上より、本発明に係る方法により、他種酵母よりも高効率で、かつ細胞毒性低く、外来タンパク質をトルラ酵母に導入させることが可能となった。また、本発明により、産業上有用な改変トルラ酵母の作出が可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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