(57)【要約】【課題】本発明は、植物ミトコンドリアゲノムの構造変化を誘導する方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、植物細胞中のミトコンドリアゲノムDNA上に存在する標的配列領域であって、該ミトコンドリアゲノムDNA各分子種に存在する該標的配列領域に二重鎖切断を導入することにより、該ミトコンドリアゲノムの構造変化を誘導する方法である。また、植物細胞中のミトコンドリアゲノムDNAに存在する遺伝子または該遺伝子近傍領域であって、該ミトコンドリアゲノムDNA各分子種に存在する該遺伝子または該遺伝子近傍領域に二重鎖切断を導入することにより、該遺伝子を欠失させる方法である。さらに、前記方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノムを有する植物細胞、該植物細胞を有する種子および植物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞中のミトコンドリアゲノムDNA各分子種に存在する標的配列領域に二重鎖切断を導入することにより、該ミトコンドリアゲノムの構造変化を誘導する方法。
【請求項２】
前記ミトコンドリアゲノムの構造変化が、前記標的配列領域付近に存在する配列と他の領域に存在する相同配列との間で生じるDNA組換えによって誘導されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物細胞中のミトコンドリアゲノムDNA各分子種に存在する遺伝子または該遺伝子近傍領域に二重鎖切断を導入することにより、該遺伝子を欠失させる方法。
【請求項４】
前記遺伝子の欠失が、該遺伝子または該遺伝子近傍領域に存在する配列と他の領域に存在する相同配列との間で生じるDNA組換えによって誘導されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子が雄性不稔の原因遺伝子であることを特徴とする請求項３または４に記載の方法
【請求項６】
前記二重鎖切断が、 TALEN（transcription activator-like effector nucleases）によって導入されることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記TALENをミトコンドリアへ移行させるために、植物ミトコンドリアに局在するタンパク質由来のミトコンドリア局在シグナルペプチドを用いることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記TALENの発現コンストラクトが以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法によって調整されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
（ａ）２つ相同組換配列L1とL4の間にTALEN leftを挿入したエントリーベクター１、２つ相同組換配列R4とR3の間にターミネーター、プロモーターおよびミトコンドリア局在シグナルの順に挿入したエントリーベクター２、ならびに２つ相同組換配列L3とL2の間にTALEN rightを挿入したエントリーベクター３を提供する工程、
（ｂ）プロモーター、ミトコンドリア局在シグナル、相同組換え配列R1および相同組換え配列R2の順に挿入されたデスティネーションベクターを提供する工程、および
（ｃ）前記エントリーベクター１、エントリーベクター２、エントリーベクター３およびデスティネーションベクターを混合し、L1とR1間、L4とR4間、L3とR3間、およびL2とR2間において相同組換えを行わせる工程、
【請求項９】
請求項１、２、６、７または８に記載の方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノムを有する植物細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の植物細胞を含む種子または植物。
【請求項１１】
請求項１、２、６、７または８に記載の方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノムを有する植物の細胞質。
【請求項１２】
請求項１、２、６、７または８に記載の方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノムを有するミトコンドリア。
【請求項１３】
請求項１、２、６、７または８に記載の方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノム。
【請求項１４】
請求項３ないし８のいずれかに記載の方法により少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノムを有する植物細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の植物細胞を含む種子または植物。
【請求項１６】
請求項３ないし８のいずれかに記載の方法により少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノムを有する植物の細胞質。
【請求項１７】
請求項３ないし８のいずれかに記載の方法により少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノムを有するミトコンドリア。
【請求項１８】
請求項３ないし８のいずれかに記載の方法により少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物ミトコンドリアゲノムの編集または改変方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の核ゲノムと葉緑体ゲノムの形質転換技術は四半世紀以前から確立され、膨大な量の解析と基礎理解がなされてきた。その一方で、ミトコンドリアゲノム形質転換体作製は、酵母や緑藻クラミドモナス（非特許文献１）などの単細胞生物以外で成功したとの報告はこれまでに存在していない。
核ゲノムは通常、ゲノムセットを二コピーもった二倍体であるが、ミトコンドリアゲノムは細胞内に数十〜数百コピー以上が存在する。また、種子植物のミトコンドリアゲノム（50 kb〜>10 Mb）は哺乳類（15〜20 kb）のものと比べて非常に大きく、数多くの反復配列が存在している。そして、相同組換えによって多様なキメラORFが生じ（非特許文献２〜５）、様々な大きさのゲノムDNA分子種が混在した状態 (マルチパータイト構造)で存在していると考えられている。
【０００３】
植物のミトコンドリアゲノムDNAには、繰り返し配列が散在している。この繰り返し配列のうち、特に、長いサイズの繰り返し配列（数kb〜）同士の相同組換えにより、複数の相互変換可能なゲノム構造が形成される。また、中間サイズの繰り返し配列（intermediate size repeats；ISRs）（通常50〜600bp）間の相同組換えも生じており、複雑なゲノム再構成を誘導すると考えられているが、通常、このISRsの相同組換えの頻度は非常に低い。ISRsが関与する組換えの多くは、DNA鎖切断により誘発される複製（break-induced replication；BIR）経路（非特許文献６）、あるいは、一本鎖アニーリング（single-strand annealing；SSA）を介する経路などが関与していると考えられている（非特許文献７）。これらの低頻度の組換え活性は、非対立遺伝子性で、その過程は不均整であり、予想される相互組換え産物の一方のみを生じさせる。さらに、非常に短い数個のヌクレオチド配列の相同性が関与する非正統的組換が生じていることも報告されている（非特許文献８）。
【０００４】
また、ミトコンドリアゲノムDNAが損傷を受けた場合、核ゲノムDNAと同様に修復機構が機能する。通常、ミトコンドリアゲノムDNAに、薬剤などで二重鎖切断（double-strand breaks；DSBs）が誘導されると、相同組換えによる修復が行われ、その初期過程において生じるD-loopの形成にRecAが関与している。RecAの変異などによって、RecA依存的なミトコンドリアDNAの修復に障害が生じた場合、ミトコンドリアDNAに導入されたDSBsは、microhomology-mediated recombination（MHMR）による産物が蓄積されることが報告されている（非特許文献２）。ミトコンドリアゲノムDNAの修復経路はいくつか存在しており、各々が状況に応じて機能していると考えられる。しかしながら、これまでの報告は、いずれもDSBはランダムに起こり、かつその位置は不明のまま、修復配列が見つかった箇所のごく近傍でDSBが起こったと推測している。また、細胞内のDNA分子種の一部でのみDSBと修復産物の蓄積がおこっており、したがって、細胞内では正常配列と修復後の配列が混在（ヘテロプラスミー）しており、ゲノムの修復後配列への純化（ホモプラスミー）は達成されていない（非特許文献２、６、７および８）。
【０００５】
ところで、植物ミトコンドリアゲノムには、電子伝達系に関わるタンパク質、リボソームタンパク質のサブユニットをコードする遺伝子など、動物ミトコンドリアゲノムにも存在するものの他、植物に特有な遺伝子、例えば、細胞質雄性不稔（CMS; cytoplasmic male sterility）に関連する遺伝子が存在している。CMSは、雑種強勢現象を利用したF1育種において、F1種子を採るために使用される一般的な表現型である。CMS個体との交配によって種子を採れば、除雄操作などをせずとも確実なF1種子を得ることができる。しかしながら、現在CMSは種類の少なさによる遺伝的脆弱性や開発の困難さが問題となっており、新たなCMS創出法の確立が待望されている。作物のミトコンドリアゲノムを直接改変し、CMSを付与することができれば、多様な作物・品種に多様なCMSを付与し、核や葉緑体ゲノム配列を乱さず、迅速に導入することに道を開き、作物増産と安定生産等に大きく貢献することになる。
ところが、上述の通り、植物のミトコンドリアゲノムは、動物のものよりも複雑な構造を有しており、この複雑さが、植物ミトコンドリアゲノムの解析および編集方法の開発を遅らせている要因の１つとなっている。
【０００６】
動物のミトコンドリアゲノムの人為的改変については、いくつか報告されている（非特許文献９および非特許文献１０）。Bacmanらは、ミトコンドリア用にデザインされたTALENs（transcription activator-like effector nucleases、以下「mito-TALENs」とする）を用いて、ミトコンドリア病の原因となるミトコンドリアDNA上の突然変異部位に、二重鎖切断を導入したところ、突然変異を持つミトコンドリアDNA分子種が消失することを示した（非特許文献９）。また、Reddyらは、mito-TALENsを用いて、レーベル遺伝子視神経症（Leber’s hereditary optic neuropathy；LHOND）およびNARP（Neurogenic muscle weakness, Ataxia, and Retinitis Pigmentosa）の原因であるヒトのミトコンドリア変異部位を切断することで、変異ミトコンドリアDNA分子種を減少させることに成功した（非特許文献１０）。
これらの報告は、動物ミトコンドリアDNAの特定部位をmitoTALENsで切断すると、切断標的部位を有するミトコンドリアDNA分子種が、修復されることなく消失することを示すものではあるが、その一部である標的遺伝子のみを欠失させるなど、遺伝子特異的な編集および標的遺伝子のみの消失による表現型の変化の誘導が可能であるかどうかについては言及していない。
【０００７】
また、植物の核ゲノムDNAに関しては、TALENsを用いて二重鎖切断を導入すると、非相同末端結合（non-homologous end joining；NHEJ）により修復されることが報告されている（特許文献１）。特許文献１においては、葉緑体やミトコンドリア中のDNAについても、同様な方法で二重鎖切断を導入できることが記載されているが、その結果、葉緑体およびミトコンドリアゲノムDNAにいかなる影響があるかについては、全く言及されていない。すなわち、植物核ゲノムDNAに１または複数の二重鎖切断を導入するとNHEJが誘導されることが示されているが、植物ミトコンドリアゲノムDNAに関しては不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表2016-521561
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Larosaら, Int J Dev Biol 57, 659-665 2013
【非特許文献２】Gualbertoら, Biochimie 100, 107-120 2014
【非特許文献３】Kuboら, Mitochondrion 8, 5-14 2008
【非特許文献４】Skippingtonら, Proc Natl Acad Sci U S A 112, E3515-3524 2015
【非特許文献５】Sloanら, New Phytol 196, 1228-1239 2012
【非特許文献６】Davilaら, BMC Biol. 9, 64 2011
【非特許文献７】Miller-Messmerら, Plant Physiol. 159, 211-226 2012
【非特許文献８】Cappadociaら, Plant Cell 22, 1849-1867 2010
【非特許文献９】Bacmanら, Nat Med 19, 1111-1113 2013
【非特許文献１０】Reddyら, Cell 161, 459-469 2015
【非特許文献１１】Iwabuchiら、EMBO J 12, 1437-1446 1993
【非特許文献１２】Kazamaら, Plant J 55, 619-628 2008
【非特許文献１３】Wangら, Plant Cell 18, 676-687 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記事情に鑑み、本発明は、植物のミトコンドリアゲノムの編集または改変方法の提供を目的とする。より具体的には、植物ミトコンドリアゲノム（植物ミトコンドリアゲノムDNAの各分子種）の構造変化を誘導する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、CMS関連遺伝子であるイネのorf79（非特許文献１０〜１３）を標的として、この領域にゲノムDNAの二重鎖切断を導入し、orf79の編集（または改変）を試みた。ゲノムDNAへの二重鎖切断は、ミトコンドリア用にデザインしたTALENs（transcription activator-like effector nucleases）（mito-TALENs）を用いた。
【００１２】
今回、発明者らは、orf79を標的としてmitoTALENsを18系統のイネに発現させたところ、植物の核ゲノムの例（NHEJによる修復が生じる）とは異なり、16系統においてorf79が破壊（欠失）されることを確認した。植物用のmito-TALENsをデザインする上で、注意すべき点としては、ミトコンドリア内へTALENsを移行させるためのミトコンドリア局在シグナルペプチドを、植物以外の生物由来のものをそのまま使用すると葉緑体へも同時に移行してしまう点が挙げられる。そこで、発明者らは、TALENsをミトコンドリア内に移行させるためのシグナルペプチドとして、植物由来のミトコンドリア局在ペプチドを使用することとした。その結果、mitoTALENsを効率的に植物ミトコンドリア内に移行させることができた。
具体的には、orf79を標的とした二重鎖切断の導入（植物ミトコンドリアゲノムDNAの全分子種に存在するorf79を標的とした二重鎖切断の導入であって、細胞内に存在するほぼ全てのミトコンドリアゲノムDNAに二重鎖切断が導入される）により、orf79領域では、数100 bp〜数kbの大きな欠失／消失が生じていたが、他の遺伝子またはorfのほとんどが維持されていた。この結果は、植物の核ゲノムに二重鎖切断を導入した場合（NHEJ修復により数bp程度の欠失／挿入が生じる；特許文献１）とは大きく異なっていた。また、動物ミトコンドリアDNAのように、二重鎖切断を導入したミトコンドリアゲノムDNA分子種が消失するという現象は生じなかった。
すなわち、発明者らは、植物ミトコンドリアゲノムDNA分子種全体に対して、同じ配列領域（実施例においてorf79領域）へ二重鎖切断を導入すると、切断領域近傍に存在する配列と他の領域に存在する配列との間で、比較的短い相同配列を介したillegitimateな相同組換（homologous recombination；HR）が誘導され、その結果、二重鎖切断箇所近傍のミトコンドリアゲノム領域に大きな欠失／消失が生じることを見いだした。
発明者らによって明らかにされた上記結果は、動物ミトコンドリアゲノムDNAや植物核ゲノムDNAにTALENsによる二重鎖切断を導入した結果からは予測できないものであった。
【００１３】
また、植物ミトコンドリアゲノムは1細胞内に数100コピー存在するため、一部のコピーに遺伝子破壊が生じても、正常遺伝子との混在（ヘテロプラスミー）が問題になる可能性があった。しかしながら、遺伝子破壊後の配列解析の結果、orf79が欠失したDNA配列のみが確認され、野生型DNA配列が見いだされなかったことから（実施例および図２、３、４および図６の結果を参照のこと）、orf79を破壊した系統のほとんどが遺伝子破壊型に純化（ホモプラスミー化）していると考えられる。
本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１８）である。
（１）植物細胞中のミトコンドリアゲノムDNA各分子種に存在する標的配列領域に二重鎖切断を導入することにより、該ミトコンドリアゲノムの構造変化を誘導する方法。
（２）前記ミトコンドリアゲノムの構造変化が、前記標的配列領域付近に存在する配列と他の領域に存在する相同配列との間で生じるDNA組換えによって誘導されることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）植物細胞中のミトコンドリアゲノムDNA各分子種に存在する遺伝子または該遺伝子近傍領域に二重鎖切断を導入することにより、該遺伝子を欠失させる方法。
（４）前記遺伝子の欠失が、該遺伝子または該遺伝子近傍領域に存在する配列と他の領域に存在する相同配列との間で生じるDNA組換えによって誘導されることを特徴とする上記（３）に記載の方法。
（５）前記遺伝子が雄性不稔の原因遺伝子であることを特徴とする上記（３）または（４）に記載の方法
（６）前記二重鎖切断が、 TALEN（transcription activator-like effector nucleases）によって導入されることを特徴とする上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記TALENをミトコンドリアへ移行させるために、植物ミトコンドリアに局在するタンパク質由来のミトコンドリア局在シグナルペプチドを用いることを特徴とする上記（６）に記載の方法。
（８）前記TALENの発現コンストラクトが以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法によって調整されることを特徴とする上記（７）に記載の方法。
（ａ）２つ相同組換配列L1とL4の間にTALEN leftを挿入したエントリーベクター１、２つ相同組換配列R4とR3の間にターミネーター、プロモーターおよびミトコンドリア局在シグナルの順に挿入したエントリーベクター２、ならびに２つ相同組換配列L3とL2の間にTALEN rightを挿入したエントリーベクター３を提供する工程、
（ｂ）プロモーター、ミトコンドリア局在シグナル、相同組換え配列R1および相同組換え配列R2の順に挿入されたデスティネーションベクターを提供する工程、および
（ｃ）前記エントリーベクター１、エントリーベクター２、エントリーベクター３およびデスティネーションベクターを混合し、L1とR1間、L4とR4間、L3とR3間、およびL2とR2間において相同組換えを行わせる工程、
（９）上記（１）、（２）、（６）、（７）または（８）に記載の方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノムを有する植物細胞。
（１０）上記（９）に記載の植物細胞を含む種子または植物。
（１１）上記（１）、（２）、（６）、（７）または（８）に記載の方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノムを有する植物の細胞質。
（１２）上記（１）、（２）、（６）、（７）または（８）に記載の方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノムを有するミトコンドリア。
（１３）上記（１）、（２）、（６）、（７）または（８）に記載の方法により構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノム。
（１４）上記（３）ないし（８）のいずれかに記載の方法により少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノムを有する植物細胞。
（１５）上記（１４）に記載の植物細胞を含む種子または植物。
（１６）上記（３）ないし（８）のいずれかに記載の方法により少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノムを有する植物の細胞質。
（１７）上記（３）ないし（８）のいずれかに記載の方法により少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノムを有するミトコンドリア。
（１８）上記（３）ないし（８）のいずれかに記載の方法により少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノム。
【発明の効果】
【００１５】
本発明にかかる方法によれば、植物ミトコンドリアゲノムの構造変化を誘導することができる。
【００１６】
本発明にかかる方法によれば、植物ミトコンドリアゲノム上に存在する遺伝子を標的とした、遺伝子破壊ならびに新たなキメラ遺伝子の創出を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】mito TALENsによるミトコンドリアorf79のノックアウト方法。（ａ）ミトコンドリア局在シグナル（MLS）融合TALENs（TAL）であるmitoTALENs（TALEN-Left, TALEN-Right）は、核ゲノムに挿入された T-DNAから発現され、ミトコンドリアへ輸送される。（ｂ）mito TALENの発現カセットを有する腫瘍誘発プラスミド（Ti-DNA）を模式的に示す。（ｃ）mito TALEN2とmito TALEN3の標的サイトが存在するorf79近傍のゲノム構造と塩基配列を示す。
【図２】orf79のノックアウトの確認。（ａ）orf79のPCR解析結果を示す。PCRプライマーの設定位置は、図１のｃに示した（ヌクレオチド配列の下に示す矢印）。T65；non-CMS rice Taichung 65、DDW；double distilled water、cox 2；ポジティブコントロール。（ｂ）atp6とorf79のサザンブロット解析結果を示す。総DNAはEcoRIで切断した。
【図３】orf79近傍における欠失および相同的組換（１）。（ａ）orf79近傍のゲノム構造を示す（上図）。（ｂ）で増幅されたPCR領域（i〜x）、繰り返し構造（LR02-1とIRs）および各形質転換体の残存／欠損領域（下図）を示す。実線は残存領域を、<hrN>は相同組換部位を、破線はLR02-1領域を示す。（ｂ）形質転換体のorf79近傍のPCR解析結果を示す。
【図４】orf79近傍における欠失および相同的組換（２）。（ａ）左図はサザンブロット解析結果、右図はhr1配列で相同的に組換えられる様子を模式的に示す。また、EcoRIサイト（E1〜E5）とプローブ（波線）を示す。（ｂ）hr10のドナー、レシピエントおよび組換えられた配列のアライメントを示す。
【図５】相同的に組換えられた領域のゲノム上における位置を示す。例えば、hr1は#2-1系統、#3-2系統および#3-5系統で認められ、エッジ１（Edge 1）は167bpの相同配列を介してエッジ２（Edge 2）と結合している。＋（または−）は結合の方向を示す。
【図６】BTAおよび形質転換体におけるミトコンドリアDNA欠失の影響。orf79近傍領域（ａ）および全ミトコンドリアゲノム領域（ｂ）。上図の模式図は、ゲノム構造を示す。下部は、各植物の総DNAを次世代シークエンサーで解読しマッピングした時の相対的なリード深度（各位置におけるBTAのリード数に対する各植物のリード数の割合）を示す。アステリスクは、orf79以外に欠失した部分を示す。
【図７】orf79欠失BTA-CMSイネにおける稔性回復の検討。（ａ）自家受粉した#3-7（左；orf79存在）と#3-11（右；orf79不存在）の写真。（ｂ）雄性不稔のテスト結果を自己交雑種子が結実した割合（％）として示す。#2-6および#3-7は0 %であった。N=3. バーは平均値±s.d.を示す。
【図８】形質転換体のT1世代のPCR解析。#3-10のT1世代におけるミトコンドリアゲノムおよび核導入遺伝子のジェノタイピングを行った結果を示す。上図は、orf79近傍の遺伝子構造を模式的に示す。欠失を確認するための増幅断片をi〜xで示す。下図は、#3-10の自家受粉によって得られたT1世代のミトコンドリアジェノタイピングの結果を示す。PCR反応のポジティブコントロールとして、cox2断片を増幅した。ii〜xはBTAに特異的に存在しているため、T65では増幅されなかった。mitoTALEN発現カセットに存在するHPTおよびFok Iが存在することは確認された。T1世代の系統５はmitoTALEN発現カセットを喪失していた。
【図９】Multisite Gate wayの概要図である。
【図１０】TALEN発現コンストラクトの作製概要を示す。（Ａ）Multisite Gateway（登録商標） pro 3.0を利用してミトコンドリア局在シグナル付きタンデムコンストラクト構築システムを作製した。（Ｂ）ミトコンドリア局在シグナル付きタンデムコンストラクト構築システムを利用して、２種類のプロモーター（恒常的発現プロモーター（p35S）と誘導型発現プロモーター（pLesA））を用いた場合のタンデムコンストラクトの模式図を示す。P；プロモーター、T；ターミネーター、MLS；ミトコンドリア局在シグナル、TALEN left/right； TALEN left/rightの遺伝子配列（Invitorogen；核移行シグナル、V5エピトープタグ、TAL DNA結合ドメイン、FokIで構成されている）、p35S；CaMV35Sプロモーター、pLexA；上流にLexAオペレーターを繋いだ 35Sミニマルプロモーター、HSP；Heat shock protein 18.2のターミネーター、T35S；35Sターミネーター、NOS；NOSターミネーター、T3A；T3Aターミネーター
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の第１の実施形態は、植物細胞中のミトコンドリアゲノムDNA各分子種に存在する標的配列領域に二重鎖切断を導入することにより、該ミトコンドリアゲノムの構造変化を誘導する方法である。
ここで、ミトコンドリアゲノムDNA上の「標的配列領域」とは、ミトコンドリアゲノムDNA各分子種（すなわち、ミトコンドリアゲノムDNAは複数の分子種（コピー）が存在するが、それら各分子種のことである）において、大規模な欠失／消失および新たなゲノムDNA配列の再構成を誘導したい領域もしくはその近傍領域のことである。「標的配列領域」としては、ミトコンドリアゲノムDNA上に存在する配列領域であれば、いかなる領域であってよいが、例えば、欠失／消失および新たなゲノムDNA配列の再構成の有無を確認する場合には、必須遺伝子以外の領域が好ましい。
ミトコンドリアゲノムDNAに二重鎖切断を導入する方法については、例えば、ZFN（Zinc Finger Nucleases）（Urnovら, Nature 435, 646-651 2005）を使用した方法、CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins）（Jinekら, Science 337, 816-821 2012）を使用した方法、TALEN（transcription activator-like effector nucleases；転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）（Mahfouzら, Proc Natl Acad Sci USA 108, 2623-2628 2011）を使用した方法および、各種の制限酵素を使用した方法を挙げることができるが、TALENを使用した方法が最も好ましい。
ミトコンドリアゲノムDNA各分子種中に二重鎖切断を導入する「標的配列領域」の数は、特に限定はしないが、例えば、１箇所以上が好ましく、より好ましくは１〜５箇所程度である。そして、二重鎖切断の導入の程度（すなわち、植物細胞内に存在する全てのミトコンドリアゲノムDNA分子種中、二重鎖切断が導入された分子種の割合）は、該植物細胞中に存在する「標的配列領域」が欠失して、ほとんど検出されない状態になればよく、切断条件を予備的な実験によって検討することで、容易に確認することができる。この二重鎖切断導入の程度は、特に限定はしないが、例えば、植物細胞中に存在する「標的配列領域」を有するミトコンドリアゲノムDNA分子種のうち、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、最も好ましくは、95%以上に対して行われるように実施するのがよい。なお、「標的配列領域」の欠失は、当該領域を増幅するPCR、あるいは、当該領域をプローブとするサザンブロッティングなどによって確認することができる。
【００１９】
TALENを用いてミトコンドリアゲノムDNAを切断する場合、例えば、TALENをコードする遺伝子を核ゲノムに導入し、細胞質で発現したTALENをミトコンドリア内に輸送する必要がある。TALENをミトコンドリアに導入する方法として、TALENにミトコンドリア局在シグナルペプチド（塩基性アミノ酸と複数の疎水性アミノ酸が交互に現れる特徴を示すペプチド）を融合させて発現させる方法を挙げることができる。本発明の実施形態において使用可能なミトコンドリア局在シグナルペプチドは、葉緑体へTALENが輸送されることを回避するために、植物ミトコンドリアに局在するタンパク質が持つシグナルペプチドが好ましい。好ましいシグナルペプチドとしては、限定はしないが、例えば、シロイヌナズナのATPase δ′サブユニット由来のシグナルペプチド（配列番号７５）、イネのALDH2a遺伝子産物由来のシグナルペプチド（配列番号７６）およびエンドウのチトクロームｃオキシダーゼＶｂ−３由来のシグナルペプチド（配列番号７７）を挙げることができる。
あるいは、TALENタンパク質をコードするmRNAやTALENタンパク質を直接細胞内へ導入する方法（導入方法としては、例えば、ウィルス法、パーティクルガン法、PEG法、細胞膜透過性ペプチド法やミトコンドリア移行ペプチドを用いたミトコンドリアへの直接導入法など）も使用可能である。
【００２０】
ミトコンドリアゲノムDNAに確実に二重鎖切断を導入するためには、２つのTALEN（TALEN leftとTALEN right；図１ａを参照）を、１つのTiプラスミドで同時に発現させ、かつ、ミトコンドリアに局在させるために、ミトコンドリア局在シグナルを付加したタンデム発現Tiプラスミドを用いることができる（例えば、Kusanoら, Scientific Reports |6:30234|DOI:10.10.8/srep30234などを参照のこと）。
ここで、発明者らは、TALENはその特性上、非常に類似したリピート配列が多く存在するためクローニングが容易ではないこと考慮し、さらに複数の標的の切断領域に合わせて同様のプラスミドを多数作製する工程を効率化するため、まず、ミトコンドリア局在シグナル付きタンデムコンストラクト構築システムを作製した。ミトコンドリア局在シグナル付きタンデムコンストラクト構築システムの作製には、例えば、MultiSite Gateway （登録商標）Pro 3.0 (invitrogen) を利用することができる。MultiSite Gateway を用いると、複数のDNA断片を目的の順序・方向で正確にクローニングすることができる（図９）。これを用いて、以下のようにしてタンデムコンストラクト構築システムを作製することができる（図１０）。
【００２１】
すなわち、（ａ）２つ相同組換配列L1とL4の間にTALEN leftを挿入したエントリーベクター１、２つ相同組換配列R4とR3の間にターミネーター、プロモーターおよびミトコンドリア局在シグナルの順に挿入したエントリーベクター２、ならびに２つ相同組換配列L3とL2の間にTALEN rightを挿入したエントリーベクター３を提供する工程、
（ｂ）プロモーター、ミトコンドリア局在シグナル、相同組換え配列R1および相同組換え配列R2の順に挿入されたデスティネーションベクターを提供する工程、および
（ｃ）前記エントリーベクター１、エントリーベクター２、エントリーベクター３およびデスティネーションベクターを混合し、L1とR1間、L4とR4間、L3とR3間、およびL2とR2間において相同組換えを行わせる工程、
により、ミトコンドリア局在シグナル付きのTALENがタンデム連結されたコンストラクトを作製することができる（図１０Ａ）。
各工程において、遺伝子を挿入する場合、最終産物であるコンストラクトからミトコンドリア局在シグナル付きのTALEN leftとTALEN rightが発現可能となるように、翻訳フレームを合わせて行うことは言うまでもない。なお、各工程において、ベクターを調製するために必要な各種反応に必要な試薬類は、MultiSite Gateway （登録商標）Pro 3.0 (Invitrogen)に添付の試薬等を使用することができる。ここで使用するプロモーターは、恒常的発現用のプロモーターまたは誘導型発現プロモーターのいずれであっても使用することができる（図１０Ｂ）。また、２つのTALENの発現方向は同一方向でも逆方向であってもよい。
以上のタンデムコンストラクト構築システムは、ミトコンドリアゲノムを標的とした場合に限らず、植物用のTALEN発現コンストラクトの作製を簡略化することができるという点で非常に有用である。
【００２２】
植物ミトコンドリアゲノムDNA各分子種に二重鎖切断を導入すると、核とは異なり、NHEJ修復が起こらず、切断部位近傍の配列と、当該切断部位とは離れたミトコンドリアゲノムDNA上に存在する相同配列が組換えを起こしていることを、発明者らが初めて見いだした。このようなゲノムDNA上離れた位置に存在する配列間で引き起こされたillegitimateな相同組換えにより、ミトコンドリアゲノムの数カ所でキメラ配列が生じ、ゲノム構造が大規模な再編成をおこし、その構造が変化したことが確認された。ここで確認されたミトコンドリアゲノム構造の再編成は、ミトコンドリアゲノムDNA上の離れた部位間において相同配列を介し引き起こされる現象であるため、このゲノム構造の変化により、ミトコンドリアゲノム上存在していた遺伝子またはorfが消失するのみならず、新たな機能を有するDNA配列（すなわち、新たな機能を担うタンパク質をコードする配列）が創出される可能性も非常に高い。
【００２３】
本発明の第２の実施形態は、植物細胞中のミトコンドリアゲノムDNA各分子種に存在する遺伝子または該遺伝子近傍領域に二重鎖切断を導入することにより、該遺伝子を欠失させる方法である。
上述の通り、植物ミトコンドリアゲノムDNAに二重鎖切断を導入するとその箇所が修復されることなく、切断領域周辺の配列が、ゲノム上の全く別の部分の相同配列を介した部分と組換えにより接続されることが確認された。この結果、切断領域周辺には大規模な欠失／消失（例えば、数100bp〜数kb程度の欠失が生じる）が生じ、当該切断領域または切断領域近傍に存在する遺伝子またはorfが欠失する。
すなわち、植物ミトコンドリアゲノム上に存在する所望の遺伝子もしくはorf中、または、該遺伝子もしくはorf近傍（好ましくは、標的とする遺伝子もしくはorfから0〜10 kb程度の範囲内の領域）に二重鎖切断を導入することで、該遺伝子もしくはorfを欠失させることができる。導入する二重鎖切断の数は１以上であれば特に限定はされない。
【００２４】
欠失させる遺伝子は、ミトコンドリアゲノム上に存在する遺伝子であればいかなるものであってもよい。例えば、植物の稔性回復を目的とする場合には、例えば、イネCMS関連遺伝子であるorf79（配列番号１）上またはその近傍に二重鎖切断を導入してもよい。その他の植物のCMS関連遺伝子（orf）を表１に例示する（なお、表１は、Letian Chen and Yao-Guang Liu, Annu. Rev. Plant Biol. 65, 579-606 2014から一部抜粋して引用する）。
【表１】
2018130043.tif 000002
所望の遺伝子またはその近傍のDNA領域への二重鎖切断の導入は、上述のTALEN、そしてZFNやCRISPR-Cas9を使用した方法および、各種の制限酵素を使用した方法により実施することができる。
例えば、イネのCMS関連遺伝子であるorf79を、TALENsを使用して欠失させる場合、orf79塩基配列中のTACCCGAGGGACTAACGGT（配列番号２）に結合するTALENとTCCTACAACGACACCGAAG（配列番号３）に結合するTALENをペアにしてミトコンドリア内に導入し、および／または、orf79塩基配列中のTTGCTAAAGTATCAGGC（配列番号４）に結合するTALENとTTTTCCATTAAAGCCGG（配列番号５）に結合するTALENをペアにしてミトコンドリア内に導入することで、orf79内に１以上の二重鎖切断を導入することで、orf79近傍のミトコンドリアゲノム構造を大きく変化させ、orf79を欠失させることができる。
【００２５】
本発明の第３の実施形態は、植物ミトコンドリアゲノムDNAの任意の領域に二重鎖切断を導入することにより構造変化が誘導されたミトコンドリアゲノム、該ミトコンドリアゲノムを有するミトコンドリア、該ミトコンドリアゲノムを有する植物細胞、当該植物細胞の細胞質、ならびに、当該植物細胞を含む種子および植物（植物成体）である。
【００２６】
本発明の第４の実施形態は、植物ミトコンドリアゲノムに存在する遺伝子上または該遺伝子近傍のDNAに二重鎖切断を導入することにより、少なくとも１つの遺伝子が欠失したミトコンドリアゲノム、該ミトコンドリアゲノムを有するミトコンドリア、該ミトコンドリアゲノムを有する植物細胞、当該植物細胞の細胞質、ならびに、当該植物細胞を含む種子および植物（植物成体）である。
【００２７】
本発明の第３および第４の実施形態における植物（植物成体）には、ミトコンドリアゲノムDNAに二重鎖DNAを導入した形質転換細胞から分化して植物成体となった世代（T0世代）のみならず、T0から得られた子孫世代も含まれる。また、本発明の第３および第４の実施形態における種子には、前記T0世代から得られた種子のみならず、子孫世代から得られる種子も含まれる。
【００２８】
本発明の第１〜第４の実施形態にかかる植物は、特に限定されず、種子植物であれば、いかなるものであってもよい。あえて例示するならば、例えば、イネ科植物、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、ソルガムなど、あるいは、アブラナ科の植物、例えば、ミヤマナズナ属、シロイヌナズナ属（シロイヌナズナなど）、セイヨウワサビ属（セイヨウワサビなど）、イワナズナ属、アブラナ属（タアサイ、カラシナ、タカナ、セイヨウアブラナ、ミズナ、ハゴロモカンラン（ケール）、ハボタン、カリフラワー、キャベツ、メキャベツ（コモチカンラン）、ブロッコリー、チンゲンサイ、ノザワナ、アブラナ、ハクサイ、コマツナ、カブなど）、アマナズナ属、ナズナ属、タネツケバナ属、カラクサナズナ属、エダウチナズナ属、イヌナズナ属、キバナスズシロ属（ルッコラなど）、ハナダイコン属、ダイコンモドキ属、マガリバナ属、イオノプシディウム属、マメグンバイナズナ属、ニワナズナ属、ゴウダソウ属、マルコルミア属、アラセイトウ属、オランダガラシ属、オオアラセイトウ属、ダイコン属（ダイコン、ハツカダイコンなど）、ミヤガラシ属、イヌガラシ属、キハナハタザオ属、グンバイナズナ属、ワサビ属（ワサビなど）などに属する植物を使用することができる。さらに、トマト、ジャガイモ、ピーマン、シシトウ、ペチュニアなどのナス科植物、ヒマワリ、タンポポなどのキク科植物、ヒルガオ、サツマイモなどのヒルガオ科植物、コンニャク、タロイモ、サトイモ、ヤツガシラなどのサトイモ科植物、ダイズ、アズキ、インゲンなどマメ科植物、カボチャ、キュウリ、メロンなどのウリ科植物、タマネギ、ネギ、ニンニクなどのヒガンバナ科植物などを例示することができる。
【００２９】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
１．実験方法
１−１．プラスミドの構築
mitoTALENバイナリーベクターは、Multisite Gateway Pro 3.0 Kitマニュアル（Invitrogen）に従って、Gateway（登録商標）テクノロジーを用いて構築した。ミトコンドリア内へ移行するTALENsを発現させるために、left TALENモノマーとright TALENモノマーを各々、pDONR221 P1-P4またはpDONR221 P3-P2にクローニングし、シロイヌナズナのATPase δ′サブユニット（Sakamoto およびWintz,  Plant Physiol. 112, 1736 1996）由来のミトコンドリア局在シグナルを、発現可能にフレームを合わせて、改変pH7WG2（Karimiら, Trends Plant Sci 7, 193-195 2002）および改変pDONR P4r-P3rベクターに挿入した。また、シロイヌナズナHSP（At5g59720）（Nagayaら, Plant Cell Physiol 51, 328-332 2010）由来のターミネーターを、left TALENのターミネーションのためにpDONR P4r-P3rに挿入した。mitoTALEN2ベクターについては、pDONR221に構築されたカスタムTALENコンストラクトをInvitrogenから入手した。mitoTALEN3ベクターについては、カスタムTALENコンストラクトをCellectis Bioreserach（フランス）から入手し、left TALENのEcoRV-XbaIフラグメントとright TALENのBsaI-XbaIフラグメントを改変したpDONR221ベクターにクローニングした。
【００３１】
１−２．植物材料
細胞質雄性不稔イネのBTA系統は、Shinjoら（Shinjoら, Journal of Genetics 44, 149-156 1969）の方法に従って、連続的な戻し交配を行って作製した。細胞質ドナーのOryza sativa L. subsp. Indica Chinsurah Boro IIは花粉親のjaponica cultivar Taichung 65（Kazamaら, Plant J 85, 707-716 2016）と連続的な戻し交配を行った。
【００３２】
１−３．遺伝子組換イネ
植物の生育および形質転換は、Kazamaら, Plant J 85, 707-716 2016に記載の方法に則して行った。T0形質転換体は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt; hygromycin phosphotransferase）部分を増幅するためのプライマーセットを用いてPCRによりスクリーニングを行った。Hptを有するT0植物は、鉢に植えた後、温室に植え替えた。全てのT0植物に対し、他家受粉を防ぐために出穂に袋をかけ、T1種子の数をカウントした。結実度は各系統から少なくとも３つの円錐花序（１円錐花序あたり74-152の花を付ける）についてカウントした。
【００３３】
１−４．総DNAの調製
総DNAはDNeasy Plant Mini kit（Qiagen）を用いて葉身から抽出した。Mito TALEN標的配列近傍のミトコンドリアゲノム構造は、extended data table 4に示すプライマーを用いたPCR、ならびに次世代シークエンスを行い決定した。また、サザンブロット解析はKarimiら, Trends Plant Sci 7, 193-195 2002に記載された方法に基づいて行った。
【００３４】
１−５．TAIL-PCR
欠失の外側領域は、(TAIL)-PCR（Singerら, Methods Mol Biol 236, 241-272 2003）で増幅した。偽陽性を減少させるため、表２に示すFPNI-PCR-like （Wangら, BMC Biotechnol 11, 109 2011）arbitrary degenerate primerを使用した。TAIL-PCR産物の配列決定を行った後、見いだされた接続部位をその近傍に設定した新たなプライマーを使用してPCRを行い、確認した。TAIL-PCR解析で使用した全てのプライマー対を表２および表３に示した。
【００３５】
【表２】
2018130043.tif 000003
【００３６】
【表３】
2018130043.tif 000004
【００３７】
１−６．ゲノムシークエンスとアセンブリー
総DNAは、形質転換していないBTA植物、8系統（#2-1、#2-4、#3-1、#3-2、#3-3、#3-9、#3-10、#3-11）のT1植物、結実しなかった2系統のT0植物の葉身から抽出した。T1植物からDNAを抽出する前に、導入遺伝子の有無を、HPTプライマーセット（表２）を用いてPCRで確認した。ライブラリーの調製とシークエンス（Illumina HiSeq 4,000）は、Macrogen Inc.（日本）で行った。異なるタグを持つ350bpのペアエンドのライブラリーは、１つのレーンでシークエンスを行った。全てのリードは、4.1〜6.7 Gbの範囲であった。各ライブラリーの総計40-66 Mbは、BWA-MEMを用いてBTAのミトコンドリアゲノム（536 kb）（アクセッション番号；AP017385（Subgenome 1）、AP017386（subgenome 2））の参照配列上にマッピングした。
【００３８】
２．結果
２−１．mito TALENsを用いたミトコンドリアorf79のノックアウト
TALENsをミトコンドリア内へ移動させるために、ミトコンドリア局在配列（MLS; mitochondorial-localizing sequence）をN末端に連結させた（図１ａ）。このようなミトコンドリアをターゲットとしたTALENs（mitoTALENsと記す）は、哺乳類細胞においても使用されている（BacmanらNat Medicine 19, 1111-1113 2013, ReddyらCell 161,459-469 2015）、mitoTALENsはこれまでにより複雑な植物ミトコンドリアには使用されていなかった。植物でmitoTALENsを発現させるために、我々は、Gateway（登録商標）クローニングのためのエントリーベクターとデスティネーションベクターを構築し、N末端にMLS（ミトコンドリア局在シグナルペプチド）が付加された２つの異なるタンパク質を同時に発現する、アグロバクテリウム媒介形質転換用ベクター（orf79の異なるサイトを標的とする２つのタイプのmitoTALEN発現ベクター；図１ｂ）を作製した（図１ａ）。２つのベクターは、mitoTALEN2(#2)とmitoTALEN(#3)（図１ｃ）を、別々に、CMS(orf79＋) rice 株BTAのカルスに導入し、各々、７（#2-1〜#2-7）および１１（#3-1〜#3-11）の形質転換体を得た。
【００３９】
形質転換後、２つの形質転換体を除き、orf79がノックアウトされたことをPCRで確認した（図２ａ）。さらに、形質転換体においてorf79がノックアウトされたことをサザンブロッティングで確認した（図２ｂ下のブロット）。植物のミトコンドリアゲノムについて検討する場合、全ての遺伝情報が含まれている「マスターサークル」と呼ばれる環状DNAと想定するが、イネの不稔系統であるBTAは他の栽培品種とは異なり、サブゲノム１およびサブゲノム２と称される２つの環状DNAが想定される。orf79はサブゲノム２のB-atp6遺伝子の下流に存在しており、長い繰り返し構造（LR）であるLR02-1（64 kb）端に位置している（図１ｃ左図を参照のこと）。図２ｂ上のブロットは、B-atp6に対応するバンドがほとんどの形質転換体において消失していることを示しており、このことから、TALENsによるミトコンドリアゲノムDNAの二重鎖切断によって、標的遺伝子のみならずそれ以外のゲノム領域の欠失も誘導されることが明らかとなった。
【００４０】
２−１．orf79近傍における欠失および相同配列を介した組換え
orf79周辺の欠失領域を決定するために、orf79とorf108との間の10領域（図３ａ上図参照）が、形質転換体において存在するかどうかを、PCRにより検討を行った。全ての形質転換体はorf108を有していたが、中間に存在する領域を欠失している形質転換体もあった。この欠失領域には、orf76および／またはorf82が含まれていた。#2-1、#3-2および#3-5にはこの領域に最も長い欠失が認められた（図３ａおよびｂ）。#3-11は最も短い欠失を有していて、orf79の周辺領域が欠失するのみであった（図３ａおよびｂ）。DNAの二重鎖切断によりDNA末端が直接再結合しているかどうかを調べるために、再結合すると考えられる領域をPCRで増幅しようと試みたが、増幅産物は得られたかった。これらの結果は、植物ミトコンドリアゲノムDNAに二重鎖切断を導入しても、非相同的末端結合（NHEJ）による修復は生じないことを示す。
【００４１】
二重鎖切断後に、非相同的末端結合以外に生じ得る現象として、開放末端は、相同なDNA配列と組換えられて、ミトコンドリアゲノム上の異なる位置に接続することが予想された。植物ミトコンドリアゲノムは、高い頻度で相互に再結合する長い繰り返し配列（LRs; >501 bp）、散発的で非相互的に再結合する中間サイズの繰り返し配列（IRs; 51〜500bp）を含む多くの相同配列を含んでいる。orf79近傍の繰り返し配列を検索した結果、B-atp6を含む64 kb長の繰り返し配列（LR02-1）、IR07-1およびIR35-2が存在していた（図３ａ）。また、他のIR07のコピー（IR07-2）はIR07-1から82kb下流に存在していた（図４ａ）。サザンブロットの結果から（図４ａ）、#2-1において、２つのIR07-1の間で生じた非相互的相同組換えが、新たなDNAの接続を形成したことが示された。同様なことが、#3-2および#3-5においても生じた。他の２つのIR35s間の非相互的相同組換えが、#3-4の欠失部の端で見いだされた（図３ａおよびｂ）。
【００４２】
orf79近傍におけるDNA二重鎖切断後、再結合したIRsは、他のいずれの株においても認められなかった（図３ａ）。そこで、TAIL-PCRを用いて、欠失した領域の近傍の配列決定を試みた。興味深いことに、#3-11においては、近傍の配列から、サブゲノム１の同一の配列に接続し、これらの配列間の接続部位は、11bp共通配列を有していた（図４ｂ）。このことは、開放端の一方の端は、相同的な組換えによって短い相同配列の対合を介して、異なる位置と接続することを示している。他の形質転換体由来の全ての開放端も、短い共通配列（11〜47bp）を有する離れたサイトと連結していることが確認された。これらの結果は、新たなプライマーで増幅したPCRアンプリコンのシークエンスによっても確認された（図５）。
【００４３】
２−３．BTAおよび10の形質転換体のTALENsによるミトコンドリアDNA欠失の影響
mitoTALENによるDNA二重鎖切断が、ミトコンドリアゲノムにどのような影響を与えるかを調べるために、10の形質転換体と形質転換していないBTAの全ゲノム配列をシークエンスした。塩基配列のリードは、参照配列であるBTAミトコンドリアゲノム上にマッピングした（図６）。配列の読みの深度から、orf79近傍の欠失（図６においてRelative depthが０となっている領域）と、図３ａに示される各相同的再結合配列（hr1〜hr11）が確認できた。また、リード深度のデータから、欠失した領域以外のほぼ全てのミトコンドリアゲノム領域において、コピー数はmitoTALENによる編集によって、影響を受けていないことが確認できた。また、機能未知ORFsのいくつかは存在していなかったが、全ての形質転換体のミトコンドリアゲノムにおいて、機能が推定された遺伝子の全てが存在していることが確認された。以上の結果は、各形質転換体のミトコンドリアゲノムにおいて、種々の欠失が生じているが、１）いずれの形質転換体においても必須の遺伝子は欠失しておらず、２）orf79欠損株において、orf79のみが共通の欠失orfであり、３）他の領域のコピー数は、ほとんどの領域において維持されていた。
【００４４】
２−４．稔性の回復
形質転換体において稔性が回復したかどうかを確認するために、出穂に袋をかけて異種交雑を防ぎ、T1種子の数をカウントした。orf79を欠失した形質転換体（#2-1および#3-1）はT1種子が結実したが、orf79を有している形質転換体（#2-6および#3-7）はオリジナルのBTAと同様に不稔のままだった（図７ｂ）。全ての形質転換体において、他の異常な表現型は見られなかった（図７ａ）。自家受粉したT1子孫のいつくかをPCR解析したところ、各形質転換体の欠失は少なくとも次世代までは維持されていた（図８）。このことから、mitoTALEN発現カセット（これは核に存在する）が受け継がれたかどうかにかかわらず、変化したミトコンドリアゲノムの配置は、次の世代に安定に受け継がれたことが示唆された。
【００４５】
以上の実験結果から、植物ミトコンドリアゲノムDNAへ二重鎖切断を導入すると切断付近に大きな欠失が生じ、切断部位近傍において相同配列を介した組換えによる修復が生じ、その結果、ミトコンドリアゲノムに構造変化が誘導されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明にかかる方法を使用することにより、植物ミトコンドリアゲノムの構造変化を誘導することができる。従って、本発明にかかる方法は、所望のミトコンドリア遺伝子の欠失のみならず、ミトコンドリアゲノムの構造変化を介した、新規orfの創出をも可能ならしめるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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