(57)【要約】      （修正有）【課題】組織片や細胞塊を対象とした、ゲノム変異や遺伝子発現の部位特異的な変化を網羅的に観察するためのデバイスおよび解析方法の提供。【解決手段】組織切片などの細胞塊を1細胞〜1000細胞程度に二次元に微細分画し、夫々の分画の細胞塊における位置情報が付加されたDNA又はRNAの核酸解析を実現するためのデバイス及び解析方法。また得られた核酸解析情報と分画する前の細胞塊の画像による形態情報との関連性を解析するシステム。【選択図】図１
2018102144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞塊を2次元に分画し切断する刃構造と該刃構造により区分化された空間とを備え、該区分化された空間は分画された細胞塊を保持することができるものであり、それぞれの分画に由来する核酸に細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする細胞塊微細分画デバイス。
【請求項２】
前記区分化される空間が複数の細胞を保持することができる、請求項1に記載の細胞塊微細分画デバイス。
【請求項３】
前記区分化される空間に保持される細胞が単一層もしくは複数層である、請求項1に記載の細胞塊微細分画デバイス。
【請求項４】
前記刃構造により分画され前記空間に保持された細胞塊から捕獲される核酸に対し、それぞれの分画ごとに異なる配列を有する分画タグを付与することにより、それぞれの分画に由来する核酸に細胞塊における該分画の位置情報を付加する、請求項1に記載の細胞塊微細分画デバイス。
【請求項５】
前記区分化される空間に、核酸捕獲配列および分画タグ配列を含む分画タグを固定した担体が供与される、請求項4に記載の細胞塊微細分画デバイス。
【請求項６】
前記分画タグ配列が、前記区分化される空間ごとに既知の異なる配列を有することにより、捕獲された核酸に分画の位置情報を付与するものである、請求項4に記載の細胞塊微細分画デバイス。
【請求項７】
前記分画タグ配列が、前記区分化される空間ごとに異なる配列を有し、位置情報識別タグ配列を含む位置情報識別タグが固定された基板と組み合わせて使用することにより、捕獲された核酸に分画の位置情報を付与するものである、請求項4に記載の細胞塊微細分画デバイス。
【請求項８】
前記分画タグ配列が、前記区分化される空間ごとに異なる配列を有し、前記区分化される空間の内部に固定された位置情報識別タグ配列と組み合わせて使用することにより、捕獲された核酸に分画の位置情報を付与するものである、請求項4に記載の細胞塊微細分画デバイス。
【請求項９】
請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞塊微細分画デバイスを用いて細胞塊を2次元に分画し、前記空間に保持された細胞塊を溶解して核酸を抽出および捕獲し、該核酸にそれぞれの分画ごとに異なる配列を有する分画タグ配列を付与することにより、細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする位置情報保持微細分画試料解析方法。
【請求項１０】
請求項6に記載の細胞塊微細分画デバイスを用いて細胞塊を2次元に分画し、前記空間に保持された細胞塊を溶解して核酸を抽出および捕獲し、該核酸にそれぞれの分画ごとに既知の異なる配列を有する分画タグ配列を付与することにより、細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする位置情報保持微細分画試料解析方法。
【請求項１１】
請求項7に記載の細胞塊微細分画デバイスを用いて細胞塊を2次元に分画し、前記空間に保持された細胞塊を溶解して核酸を抽出および捕獲し、該核酸にそれぞれの分画ごとに異なる配列を有する分画タグ配列を付与し、前記分画タグを遊離させて前記基板に固定された位置情報識別タグと相補鎖結合させることにより、細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする位置情報保持微細分画試料解析方法。
【請求項１２】
請求項8に記載の細胞塊微細分画デバイスを用いて細胞塊を2次元に分画し、前記空間に保持された細胞塊を溶解して核酸を抽出および捕獲し、該核酸にそれぞれの分画ごとに異なる配列を有する分画タグ配列を付与し、前記空間の内部に固定された位置情報識別タグを前記分画タグと相補鎖結合させることにより、細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする位置情報保持微細分画試料解析方法。
【請求項１３】
細胞塊の形態情報と、同じ細胞塊の分画後の位置情報が保持された核酸解析情報とが蓄積されたデータベースに基づいて、被検細胞塊の一方の情報から他方の情報を予測するためのシステム。
【請求項１４】
データベースがさらに細胞塊についての医療情報を蓄積するものであり、被検細胞塊の形態情報と被検細胞塊の分画後の位置情報が保持された核酸解析情報とから被検細胞塊についての医療情報を予測するための、請求項13に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織切片などの細胞塊を1細胞〜1000細胞程度に微細分画し、それぞれの分画の細胞塊における位置情報が付加されたDNAもしくはRNAの核酸解析を実現するためのデバイスおよび解析方法に関する。また得られた核酸解析情報と分画する前の細胞塊の画像による形態情報との関連性を解析するシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞それぞれから抽出されたRNAやDNAを用いた遺伝子発現解析やゲノム変異解析を細胞レベルで実施する様々な手法が近年次々と報告されている。また次世代シーケンサ技術の発展により、解析する細胞数も103〜105個と大規模化している。単一細胞解析や次世代シーケンサの技術進歩により、生命の基本単位である細胞レベルでRNAやDNAを解析できるようになれば、発生のメカニズムや病気の原因などの解明が飛躍的に進むと考えられていた。これは、一様に同じ細胞からなるように見える組織も、多様な細胞が混在する不均一な状態からなることがわかってきたからである。
【０００３】
一方で、これまでの単一細胞解析は細胞をばらばらに単離した後に試料の調製を実施していた。即ち、組織切片を材料にして単一細胞解析を実施するには、例えばコラゲナーゼなどを用いて細胞をばらばらにした上で一つ一つの細胞に別々の細胞識別タグを挿入しシーケンスライブラリを調製するといった工程をとっていた。このため、個々の細胞がそもそも組織切片のどの位置から単離されたのかといった位置情報が欠落していた。
【０００４】
位置情報を保持した核酸解析を実現する方法としては、レーザーマイクロダイセクション（LMD）がある。これは顕微鏡にレーザー照射装置が接続されている装置で、顕微鏡下で対象部位を観察しながら、標的部位をレーザーによって切り出し回収するものである。最近では、一細胞程度の極微小な領域を正確に切り出し回収できる機種が、ThermoFisher社や、Zeiss社から発売されている。狙った部位の回収が容易である一方で、網羅的に分画回収するといったコンセプトではないため、回収のスループットが非常に低く、1箇所（もしくは1細胞）回収するのに、2〜5分程度要する。また対象領域の周囲をレーザーで焼ききり回収する機構のため、細胞へのダメージが懸念される方法である。同様の顕微鏡で観察しながら採取する装置としてUnipick（NeurolnDx社）がある。こちらはレーザーではなく吸引吐出で細胞を回収する。LMDと異なり細胞へのダメージは少ないと考えられるが、LMDと同様に狙った対象を一箇所ずつ回収するというコンセプトの装置である。このため、回収効率はLMDと同様に1箇所（もしくは1細胞）回収するのに、2〜5分程度要する。
【０００５】
位置情報を保持した核酸解析を実現する方法として、上記のように装顕微鏡で観察しながら対象を絞り込んで採取する、というのと全く異なるコンセプトの方法が報告されている（非特許文献１）。これは、あらかじめスライドガラス上に固定化されたオリゴdTの上に組織片を重ね、細胞溶解と同時に、固定化されたオリゴdTで細胞から溶出されるRNAを捕獲するというものである。オリゴdTには位置情報識別のためのタグ配列が挿入されている。このため、捕獲されたRNAを逆転写反応でcDNAを合成する際に、位置情報識別配列が挿入される。これにより、スライドガラスに重ねられた組織のどの部分のRNAであるかを、後の工程で実施するシーケンス配列決定において同定することが可能である。また小さい孔が多数開いたメンブレン上に組織をのせ、あらかじめメンブレンに開いた孔に固定化された位置情報識別タグで組織から溶出されたRNAを捕獲し、解析を行うという方法も報告されている（特許文献１）。これらの方法の優れた点は、組織片の遺伝子の発現解析を一度に網羅的に実施できることにある。組織片の一部を狙うのではなく、全体を網羅的かつ一括して、というコンセプトはこれまでになかったものである。
【０００６】
顕微鏡で観察して得られる、2次元の画像データと、位置情報を保持した核酸情報を付き合わせることができれば、例えば、がんとその周辺組織でどのように遺伝子の発現状態が変化していっているのか、ゲノム変異がどの部分から顕著に観察できるのか、というような複合情報を得ることが可能になる。複合情報を蓄積していくことで、どういった画像の時にどういう発現情報を示す傾向にあるのか、どういったゲノム変異を持つときにどういった画像結果となる傾向になるのか、という結果の予測が可能になる。複合情報には、実験的に得られるものだけではなく、患者の診断結果や既往症などの多角的な情報を加え蓄積していくことで、予測結果の精度はあがっていく。IBM社の人工知能Watsonは膨大な論文データを蓄積し、患者の所見から病名を予測する、ということを既に実現している。論文データだけではなく、実験による核酸データや、顕微鏡観察による形態解析のデータさらにはタンパク解析など複数の情報をコンテンツとして加えることで、病因解明などの医療の分野だけではなく、生命の発生のメカニズム解明の一助となりうる優れた技術である。このような考えは、従来にもあったが（特許文献２）、これは組織単位で核酸情報を蓄積し、画像データとの関連性を解析していくものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2014/020657号
【特許文献２】特表2001-511546号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Science Vol.353, Issue 6294, pp.78-82 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
組織片や細胞塊を対象とした、ゲノム変異や遺伝子発現の部位特異的な変化を網羅的に観察するためには、以下の技術が必要となる。即ち(1) 1細胞〜1000細胞程度を含む極微小領域に2次元分画する技術、および(2) それぞれの分画に位置情報を識別できるタグを付与する技術である。
【００１０】
組織片や細胞塊を網羅的に微小分画するのに必要な効率とは、例えば組織片が1cm×2cmだった場合、分画のサイズを100μm×100μmとすると100×200＝20,000の領域に分画する必要がある。前述のLMDやUnipickでは概ね100箇所＝10時間となっており、20,000箇所の採取には、200時間を要することになり現実的ではない。また、前述の位置情報を保持した核酸解析を実現する従来技術（非特許文献１および特許文献１）では、一細胞毎の解析を目的としており細胞層が一層であることが前提である。
【００１１】
病因の解明や、生命の発生のメカニズムを解明しようと考えた時、生体を構成する最小単位である一細胞レベルで解析を実施することが有効であると考えられてきた。一方で、一細胞という極微量の試料からスタートすることによる、実験結果のゆらぎなどを考慮すると、単一細胞解析の結果の精度への不安が常につきまとう。このような背景から、一細胞ではないが、限りなく一細胞に近い極微量の試料を解析するということに価値がでてくる。細胞の数が、2個以上になることにより、実験精度は格段にあがる。組織全体を一つの塊（試料）としてみているわけではないので、部位特異的な情報も得ることが可能になる。また、試料を構成する細胞が、一層であるか多層であるかにより、解析結果の精度に差がでるような技術では試料を選ぶという観点で応用範囲が狭くなってしまう。望まれるのは、細胞塊全体の核酸情報の傾向をつかむことができる技術である。厚みのきわめて薄い（例えば10μm程度、一細胞の径と同じ程度）試料でも、iPS細胞などを培養した時に得られる、コロニー様に中心部が盛り上がっており部位により厚みの異なる試料に対しても、適宜微小領域に分画し解析できる技術が求められる。
【００１２】
試料を微小領域に分画解析した後に、分画ごとの結果を元の試料の部位に応じて再構築する必要がある。即ち、細胞塊などの試料を微量分画するわけだが、もとのアドレスを包含した情報解析の実施が必須である。このためには、分画ごとにアドレスとなる識別タグを付与する技術が必須となる。位置情報を付与するための従来技術では、あらかじめ識別タグがデバイス上に固定化されており、そこへ核酸を後から反応させるものが主流であった。一方でこの方法だと、識別タグの種類が増えると作業がより煩雑になる。分画数や分画サイズに自由度を持たせた上で、識別タグを確実に付与できる技術が求められる。
【００１３】
極微量の試料単位で細胞塊を解析した場合、組織単位で解析するのと異なり、核酸情報の容量もきわめて大きいものになる。細胞塊を分画するのと同じ分解能で画像データの処理を行い、この二つの関連性についての解析を実施することに対応するためのシステム構築が必要となる。
【００１４】
これらの課題から、本発明の目的は、組織切片などの細胞塊を1細胞〜1000細胞程度に微細分画し、それぞれの分画の分画前の位置情報が付加されたDNAもしくはRNAの核酸解析を実現するためのデバイスおよび解析方法を提供することである。また得られた核酸解析情報と分画する前の細胞塊の画像による形態情報との関連性を解析するシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、組織切片などの細胞塊を1細胞〜1000細胞程度に刃構造をもつ細胞塊微細分画デバイスで2次元に区分化し、それぞれの分画に分画タグを付与し、場合により位置情報識別タグと組み合わせることで、分画前の細胞塊における位置情報が付加された核酸解析を実現する新たな技術を開発した。
【００１６】
即ち、本発明は以下を包含する。
(1) 細胞塊を2次元に分画し切断する刃構造と該刃構造により区分化された空間とを備え、該区分化された空間は分画された細胞塊を保持することができるものであり、それぞれの分画に由来する核酸に細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする細胞塊微細分画デバイス。
(1-1) 前記刃構造が細胞塊を10μm〜数百μmに分画切断することができる、(1)の細胞塊微細分画デバイス。
(2) 前記区分化される空間が、1〜1000細胞、好ましくは複数の細胞、例えば2〜1000細胞を保持することができる、(1)の細胞塊微細分画デバイス。
(3) 前記区分化される空間に保持される細胞が単一層もしくは複数層である、(1)の細胞塊微細分画デバイス。
(4) 前記刃構造により分画され前記空間に保持された細胞塊から捕獲される核酸に対し、それぞれの分画ごとに異なる配列を有する分画タグを付与することにより、それぞれの分画に由来する核酸に細胞塊における該分画の位置情報を付加する、(1)の細胞塊微細分画デバイス。
(5) 前記区分化される空間に、核酸捕獲配列および分画タグ配列を含む分画タグを固定した担体が供与される、(4)の細胞塊微細分画デバイス。
(5-1) 前記担体がゲルビーズであり、好ましくは該ゲルビーズが前記区分化される空間内に1個供与される、(5)の細胞塊微細分画デバイス。
(6) 前記分画タグ配列が、前記区分化される空間ごとに既知の異なる配列を有することにより、捕獲された核酸に分画の位置情報を付与するものである、(4)の細胞塊微細分画デバイス。
(7) 前記分画タグ配列が、前記区分化される空間ごとに異なる配列を有し、位置情報識別タグ配列を含む位置情報識別タグが固定された基板と組み合わせて使用することにより、捕獲された核酸に分画の位置情報を付与するものである、(4)の細胞塊微細分画デバイス。
(8) 前記分画タグ配列が、前記区分化される空間ごとに異なる配列を有し、前記区分化される空間の内部に固定された位置情報識別タグ配列と組み合わせて使用することにより、捕獲された核酸に分画の位置情報を付与するものである、(4)の細胞塊微細分画デバイス。
(9) (1)〜(8)のいずれかの細胞塊微細分画デバイスを用いて細胞塊を2次元に分画し、前記空間に保持された細胞塊を溶解して核酸を抽出および捕獲し、該核酸にそれぞれの分画ごとに異なる配列を有する分画タグ配列を付与することにより、細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする位置情報保持微細分画試料解析方法。
(10) (6)の細胞塊微細分画デバイスを用いて細胞塊を2次元に分画し、前記空間に保持された細胞塊を溶解して核酸を抽出および捕獲し、該核酸にそれぞれの分画ごとに既知の異なる配列を有する分画タグ配列を付与することにより、細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする位置情報保持微細分画試料解析方法。
(11) (7)の細胞塊微細分画デバイスを用いて細胞塊を2次元に分画し、前記空間に保持された細胞塊を溶解して核酸を抽出および捕獲し、該核酸にそれぞれの分画ごとに異なる配列を有する分画タグ配列を付与し、前記分画タグを遊離させて前記基板に固定された位置情報識別タグと相補鎖結合させることにより、細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする位置情報保持微細分画試料解析方法。
(12) (8)の細胞塊微細分画デバイスを用いて細胞塊を2次元に分画し、前記空間に保持された細胞塊を溶解して核酸を抽出および捕獲し、該核酸にそれぞれの分画ごとに異なる配列を有する分画タグ配列を付与し、前記空間の内部に固定された位置情報識別タグを前記分画タグと相補鎖結合させることにより、細胞塊における該分画の位置情報を付加することを特徴とする位置情報保持微細分画試料解析方法。
(13) 細胞塊の形態情報と、同じ細胞塊の分画後の位置情報が保持された核酸解析情報とが蓄積されたデータベースに基づいて、被検細胞塊の一方の情報から他方の情報を予測するためのシステム。
(13-1) 細胞塊における類似の核酸解析情報から予測する形態情報を類似グループとして抽出することが可能であり、および／または類似の形態情報から予測する核酸解析情報を類似グループとして抽出することが可能である、(13)のシステム。
(14) データベースがさらに細胞塊についての医療情報を蓄積するものであり、被検細胞塊の形態情報と被検細胞塊の分画後の位置情報が保持された核酸解析情報とから被検細胞塊についての医療情報を予測するための、(13)のシステム。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、2次元または3次元に積層する細胞塊の位置情報を保持した網羅的核酸解析を迅速かつ効率的に行うことが可能になる。また、細胞塊の形態情報と網羅的核酸解析情報を関連付けたデータベース構築とそれに基づく情報の予測が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の細胞塊微細分画デバイスの一例と該デバイスを用いた反応工程を示す図である。
【図２】本発明において使用する分画タグの一実施形態を示す図である。
【図３】本発明において使用するオリゴおよびアダプターの構成例を示す図である。
【図４】本発明の細胞塊微細分画デバイスを用いる別の実施形態を示す図である。
【図５】本発明の細胞塊微細分画デバイスを用いた細胞塊の区分化の具体例を示す図である。
【図６】本発明において使用する位置情報識別タグの一実施形態を示す図である。
【図７】本発明の細胞塊微細分画デバイスを用いる一実施形態を示す図である。
【図８】本発明の細胞塊微細分画デバイスの別の例と該デバイスを用いた反応工程を示す図である。
【図９】本発明の細胞塊微細分画デバイスの別の例を示す図である。
【図１０】本発明のシステムの一実施形態を示す図である。
【図１１】本発明のシステムの一実施形態を示す図である。
【図１２】本発明のシステムの構成例を示す図である。
【図１３】本発明のシステムの一実施形態を示す図である。
【図１４】本発明のシステムの一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．細胞塊
細胞塊は、2次元的もしくは3次元的に細胞が複数並び重なり合うことで形成された細胞群をいう。2次元的に細胞が並んだものとしては、組織をホルマリンやアルコールにより固定化もしくは凍結したものを、ミクロトームやクライオトームなどの薄切装置により、細胞が複数層並び合わない厚みである概ね10μm程度に薄切した試料が包含される。さらには、培養された細胞が2次元的に増加した状態のものも包含する。3次元的に展開する細胞群は、上記薄切切片の薄切の厚みが、複数重なり合った細胞を想定しており、10μm以上500μm以下を、望ましくは、10μm以上100μm以下を包含する。さらに、全ての領域において同じ厚みである必要はなく、iPS細胞培養時に形成されるコロニーのように、辺縁部と中心部とで厚みが異なる試料も細胞塊として包含している。細胞塊の大きさとして、スライドガラス上で観察できる程度のおよそ2cm四方までの大きさを想定している。
【００２０】
２．細胞塊微細分画デバイス
細胞塊分画デバイスは、細胞塊を2次元的に分画し切断することのできる刃構造と、刃構造により区分化された空間を備える。刃構造の刃先端部分の厚みは、細胞を切断することが可能であれば限定されるものではない。しかしながら、細胞を刃の先端でつぶすことなく切断することが望ましく、細胞の分画を目的とする観点から、切断はできるだけ細い刃先端で実施されることが望ましく、0.05〜1μmであることが好ましい。例えば、特開2015-31549号公報で報告されているような刃を使用することができる。
【００２１】
区分化される空間の大きさは、細胞を保持することができる大きさ、例えば1〜1000細胞、好ましくは複数の細胞、例えば2〜1000細胞を保持することができる大きさである。細胞1個の大きさが数μm〜数十μmであることを鑑み、区分化される空間の大きさは10μm〜数百μm四方であることが好ましいが、解析の目的により変更することが可能であり、限定されるものではない。また、区分化される空間の深さも細胞の大きさおよび試料の厚みを考慮して決定されるものであり限定されるものではないが、数十μm〜五百μm程度が好ましい形態である。これは細胞一層から五層程度までに相当する。
【００２２】
区分化される空間の形状は、正方形や長方形などの四角の形状が並んだ格子状に限定されるものではなく、三角形や六角形からなるハニカム構造も包含される。隙間無く網羅的に細胞塊を分画することが目的であり、目的を達成できる形状であれば限定はされない。
【００２３】
刃構造により形成される区分化空間には、板状の基部が片側に張り付いている。これは分画の形状を維持するためのものである。一方で、分画後は反応容器底の役割を担うこともできる。後述する分画タグをこの空間の内部、例えば基部にあらかじめ固定化しておくことも可能である。その場合、刃構造で区分化された空間ごとに異なる配列を有する分画タグが固定化される必要がある。空間内部（特に基部）および刃構造は、分画された細胞から溶出される核酸が非特異吸着しないもしくは非特異吸着しにくい材料で作製されるか、あるいは吸着を防止する処理が施されていることが望ましい。上記目的を達成していれば、これらの素材は限定されるものではなく、金属であっても樹脂であっても限定されるものではない。
【００２４】
刃構造により形成される区分化空間により、対象となる細胞塊が、一様な厚みを有するものであってもまたは縦方向に一層から複数層の細胞が不均一に重なっていても、分画を実施し、抽出された核酸に対して分画ごとに異なる分画タグを付与することが可能である。これは、分画された微量細胞分画を、刃構造により区分化された空間の中に封入することが可能なためである。厚みが不均一であったり、多層構造であったりする場合、細胞を溶解した際に、細胞の数が多いため溶出する内容物（例えばRNA量）も多く、横へ拡散しやすい。しかしながら、刃構造により区分化され、刃が仕切りとして機能するため横方向への拡散がない。そのため、それぞれの区分化された細胞塊（分画）からの核酸の捕獲をそのままその区分化空間内で行うことが可能となり、迅速かつ高精度な解析が可能となる。また、分画あたりの細胞数が一定である必要もなく、1細胞しかない分画も複数細胞が混在する分画も同様の処理を施すことが可能である。あくまでも分画で区分化された中にある微量細胞が一つの試料として扱われる点が本発明の特徴である。
【００２５】
３．分画タグ
分画タグは、分画ごとの位置情報を、分画で区分化された細胞塊（およびそれから得られる核酸）に付加するものである。このため、分画の数だけ異なる分画タグ配列を有する分画タグの準備が必要である。また、分画ごとに異なった分画タグ配列を有するタグを付与する必要がある。分画タグの配列は、核酸として末端にポリA配列部を持つmRNAを捕獲する場合は、その3’末端部に核酸捕獲配列としてポリT配列を有するものを使用することができる。ポリT配列を構成するT塩基の数は8〜40塩基、更に好ましくは12〜30塩基がよい。またポリA配列ではなく、mRNAの既知の配列を捕獲の標的とすることが可能な場合は、この配列と相補的な配列を核酸捕獲配列として3’末端側に配置する構成を持つことも可能である。T配列に続いて、3’末端にVN配列（VはT以外のA、C、Gのいずれかの塩基、NはA、C、G、Tのいずれかのランダム塩基を意味する）を挿入することにより、mRNAの遺伝子固有配列に続くポリA配列の始まり部分を精度よく捕獲できる。ポリT＋VN配列を使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。一方、核酸としてDNA（ゲノムDNAなど）やmRNA以外のRNA（snRNAなど）を捕獲する場合は、3’末端部にランダム配列または標的とする部位に特異的な配列を有するものが望ましい。ランダム配列または部位特異的配列は核酸と安定して相補鎖を形成できる塩基長が好ましく、具体的には2〜20塩基、好ましくは4〜10塩基がよいが、限定はされない。RNAもしくはDNAを捕獲するのに使用される分画タグを構成する合成オリゴは、LNAなどの人工核酸を一部もしくは全てに使用し、相補鎖結合能を上げることも可能である。
【００２６】
分画タグの5’末端には、全ての分画タグに共通のアンカー配列を付加する。捕獲された核酸を後の工程において一括増幅したり、シーケンスしたりする際に使用する部位となる。アンカー配列は限定されるものではなく、増幅に都合がよいもの、シーケンスの仕様に併せたものなど、実験の条件によって決定されるものである。そのような配列は、当業者であれば適宜設計可能である。
【００２７】
分画タグの5’末端アンカー配列と3’末端のDNAもしくはRNAを捕獲するために挿入された核酸捕獲配列の間に、分画識別用の分画タグ配列が位置する。分画タグ配列は3〜10塩基程度で構成されることが好ましい。配列を構成する塩基のバリエーションはA、C、GもしくはTの4種類であり、分画タグ配列の塩基数が3塩基で構成されれば、43＝64種類の識別が可能になり、N塩基で構成されれば、4N種類の異なる母集団の識別が可能となる。従って、分画タグ配列の塩基数は、デバイスにおける区分化された空間の数、組織の大きさなどに応じて適宜決定すればよい。分画タグ配列と3’末端のDNAもしくはRNAを捕獲するために挿入された核酸捕獲配列の間に全分画タグに共通で、5’末端に挿入されたのとは異なる配列を有するアンカー配列２を挿入することも可能である。このアンカー配列２も、一括増幅やシーケンスの際に使用する。
【００２８】
４．分画タグの付与
分画タグの分画への付与は、次の方法が想定される。分画タグは、微小切断された分画細胞が、切断前の細胞塊のどの位置に存在していたかの位置情報を付与するためのものである。そのため、分画ごとに分画タグの配列が明らかである必要がある。
【００２９】
一つ目として、異なる分画タグがあらかじめ固定化された担体、例えばゲルビーズを用いる方法が挙げられる。ビーズの径は分画にちょうど一つ収まるサイズがよい。ビーズの素材はサイズが容易に可変であれば特に限定されるものではなく、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金、チタン、ニッケル等の金属、ステンレスやジュラルミンなどの合金、シリコン、ガラス、石英ガラス、セラミクス等のガラス材料、ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン樹脂、ナイロン、エポキシ樹脂、および塩化ビニル樹脂等のプラスチック、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、キトサン等が挙げられる。
【００３０】
異なる分画タグをビーズごとに付与する方法としては、分画タグごとに別々の反応容器でビーズへの固定を実施することがある。
【００３１】
別の方法としてPCR反応で増幅しながらビーズ上に分画タグを固定化する方法が挙げられる。即ち、あらかじめ2種類の分画タグ生成用オリゴおよび鋳型オリゴを用意する。オリゴ１は、5’末端にビーズに結合固定化するための修飾基が挿入されている。ビーズとオリゴの結合の方法は、生物学的結合、共有結合、イオン結合、または物理吸着が挙げられる。生物学的結合の例としては、ビオチンとアビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラルアビジンとの結合、抗原と抗体との結合などのような接合分子を介した結合が挙げられる。さらに5’側に光切断スペーサー（UV照射により切断できるスペーサー）を挿入することも可能である。これは後段の工程において、ビーズから切断し溶液中に産物を解放するのに適している。これにより反応効率上昇などが期待できる。
【００３２】
オリゴ１は、既知配列で構成されるアダプター配列１で構成される。鋳型オリゴは、アダプター配列１、分画タグ配列および既知配列からなるアダプター配列２からなる。オリゴ２の構成は、5’末端から、第３の既知配列で構成されるアダプター配列３、ClassII制限酵素認識配列、続いて、核酸捕獲配列（mRNA捕獲用の場合にはポリA配列、DNA捕獲にはランダム配列もしくはターゲットとする部位特異的な配列からなる配列）、鋳型オリゴの3’末端部に位置するアダプター配列２と相補的な配列からなるアダプター配列４で構成される（一例を図３に示す）。
【００３３】
ビーズ1個に対しオリゴ１を1分子固定する。この際、オリゴ１は、分画タグ配列の配列が全て異なっていれば混合された状態で供給することが可能である。ビーズ1個に対しオリゴ１を1分子固定する方法は、例えばマイクロ流路を用いて、オイルエマルジョンを形成しながら固定化する方法が挙げられる。詳細な方法はCell vol.161, pp.1187-1201 (2015)にある。同様の効果が得られるのであれば、1対1で固定する方法は限定されるものではない。ビーズ1個にオリゴ１が1分子固定化された後、アダプター配列１からなりオリゴ１と同様の修飾基が5’末端に施された増幅用のオリゴ３、および上記オリゴ２でPCR反応を実施する。この際、ビーズは1個ずつ別々の反応空間で反応される必要がある。即ち、別々のチューブ、マイクロウエルプレート、もしくはマイクロエマルジョンなどが挙げられる。この別々の反応空間に、オリゴ１が1分子固定されたビーズ1個、オリゴ２およびオリゴ３とPCR反応試薬（バッファー、酵素、およびdNTP）を封入する。オリゴ１とオリゴ２は、3’末端部が相補的であるため結合し、オリゴ１とオリゴ２がつながった構成をもつ生成物が生成される。この生成物が反応の過程でビーズ上に固定されていく。あるいは、あらかじめ、ビーズにオリゴ１を1分子とオリゴ３が多数固定されているものを用意しても、同様の効果が得られる。このようにして得られたビーズには、多数のオリゴ１とオリゴ２がつながった構成をもつ生成物が結合している。このあと、オリゴ２がもつClassII制限酵素を用いて切断処理を行い、オリゴ２の5’末端部位に相当するアダプター配列２およびClassII制限酵素認識配列部位を切断除去する。最終的に、5’末端から、アダプター配列１、分画タグ配列、アダプター配列２そして核酸捕獲配列で構成されるプローブ（分画タグ）が多数結合したビーズが得られる。
【００３４】
以上のような方法を取れば、異なる配列を有する分画タグをビーズごとに付与することが可能であるが、分画タグを有するビーズの調製は上記方法には限定されない。
【００３５】
異なる分画タグがそれぞれ固定されたビーズを細胞塊微細分画デバイスの区分化された空間（分画）に充填する方法としては、分画デバイス上に液滴として添加し、遠心や圧力、吸引により分画内にビーズを充填する方法がある。ビーズに一定重量があれば、特に上記操作を実施しないでも重力で分画内に沈殿する。これらの方法で分画に分画タグ固定化ビーズが充填された場合、分画のどの位置にどのタグをもつビーズが付与されたかの情報がない。このため、分画タグの位置情報を得るための工程が必要になる。
【００３６】
分画タグに位置情報を識別するタグ（オリゴDNA）を付与することで、方法の効率化を図ることができる。即ち、各分画に1種以上の位置情報識別タグが付与されるように基板上に位置情報識別タグを固定しておく（例えば図８の（１−１））。基板は、ガラススライドやPDMS（ジメチルポリシロキサン）など平面を保て、かつ位置情報識別タグを一定の間隔で固定できるものであれば限定はされない。基板への位置情報識別タグの結合の方法は、生物学的結合、共有結合、イオン結合、または物理吸着が上げられる。生物学的結合の例としては、ビオチンとアビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラルアビジンとの結合、抗原と抗体との結合などのような接合分子を介した結合が上げられるが限定はされない。位置情報識別タグの構成は、固定化された5’末端側から、既知配列からなるアダプター配列５、位置情報識別タグ配列、および分画タグにあらかじめ挿入されている既知配列からなるアダプター配列２と相補的な配列からなる（一例を図６に示す）。位置情報識別タグ配列は3〜10塩基程度で構成されることが好ましい。配列を構成する塩基のバリエーションはA、C、GもしくはTの4種類であり、位置情報識別タグ配列の塩基数が3塩基で構成されれば、43＝64種類の識別が可能になり、N塩基で構成されれば、4N種類の異なる位置の識別が可能となる。従って、位置情報識別タグ配列の塩基数は、適宜決定すればよい。
【００３７】
あらかじめ位置情報識別タグが配置された基板上に解析対象となる細胞塊を配置し、分画デバイスで切断分画を実施し、その後分画タグが固定されたビーズを分画ごとに添加する。切断分画された微量細胞から溶出された核酸がビーズ上の分画タグに捕獲される。
【００３８】
解析対象がmRNAの場合、分画に添加されたビーズに固定された分画タグの3’末端に配置された核酸捕獲配列であるポリT配列でmRNAを捕獲し、逆転写反応によりcDNAを合成する。合成されたcDNAは5’末端部位がビーズに結合しており、また分画タグ配列が5’末端に挿入されている。この産物にUVを照射することであらかじめ分画タグの5’末端部に挿入された光切断スペーサーの部分で切断され分画内溶液中に産物が解放される。このとき、合成されたcDNAだけでなく、反応に寄与しなかった余剰分画タグも解放される。これらの末端に分画タグ配列を有する配列部分のアダプター２および位置情報識別タグのアダプター２と相補的な配列部が相補鎖結合する。
【００３９】
分画タグと位置情報識別タグの相補鎖結合部位を含むアダプター１とアダプター５の配列部位をプライマーとしてPCRを実施することで、アダプター１、分画タグ配列、アダプター３、位置情報識別タグ配列、アダプター５の順番に並ぶ産物を得ることができる。この産物のPCRは、上記位置情報識別タグと分画タグが相補鎖結合してしまえば、基板全体の複数のタグ同士の反応を一括混合して実施することも可能である。こうして得られた、短鎖DNA産物の配列決定を実施することで、分画タグと位置情報の関連付けが可能になる。
【００４０】
また、分画タグの付与の方法としては、分画デバイスの区画化された空間ごとに、その内部（例えば基部）に直接分画タグを固定することも可能である。空間の内部（基部）と分画タグの結合の方法はこれまでに述べたいかなる結合方法でも実施可能である。この場合は、どの分画にどういった配列を有する分画タグが配置されるかあらかじめ知ることが可能であり、位置情報識別タグを用いた工程は必要ない。
【００４１】
本発明のデバイスおよび解析方法により、細胞塊の区分化された分画について、遺伝子発現解析を行うことができ、一細胞ごと分離させた解析と比べて非常に迅速にかつ異なる観点での解析を行うことが可能である。
【００４２】
５．解析システム
細胞塊の形態情報（例えば顕微鏡による形態観察情報）や、分画区分ごとに決定される細胞塊における位置情報を伴った核酸解析情報などの測定データは、データベースに蓄積される。データベースに、ネットワークインターフェースカード（NIC）、CPU、I/Oコントローラ、メモリ、ディスプレイアダプタ、モニタ、記憶装置、および電源からなる解析システムを用いてアクセスする。解析システムの構成は限定されるものではなく、これらの構成要素の一部を省略したり、さらに別の構成要素を追加してもよい。解析システムには、分画されたあとの核酸解析情報を、分画タグ配列の情報を利用して、もとの細胞塊の状態に再構成するためのプログラムを包含する。細胞塊を数十μm程度の厚みで複数枚に薄切し、各々の薄切切片に対して分画および核酸解析を実施することも可能である。解析システムには、連続する薄切切片の分画核酸解析結果を、分画タグ配列の情報をもとに、3次元的に再構成するプログラムも包含する。
【００４３】
また、形態観察により得られた形態情報に核酸解析情報を関連付けるためのプログラムを包含する。さらには、コンピュータモニタ上で形態情報を見ながら、核酸解析情報を確認できる描画機能を有する。描画の方法は、解析の目的に応じて異なり、限定されるものではない。
【００４４】
さらに、解析システムは、データベースに蓄積された、形態情報と核酸解析情報の関連性を蓄積することで、形態情報を入力することで、核酸解析情報の予測を出力したり、核酸解析情報を入力することで、形態情報の予測を出力したりすることができる学習機能を有する。予測の確度を挙げるために、以下の方法も包含する。即ち、形態情報には、顕微鏡下で観察される「見た目」以外の情報として、免疫染色などによる「色」による特徴も包含する。また、核酸解析情報には、DNAやRNAを解析することによって得られるあらゆる情報を包含し、ゲノム変異情報、遺伝子発現情報や、遺伝子融合、挿入欠失情報などが挙げられる。さらには、分画した細胞を分画ごとに分割し、核酸とタンパク質、代謝産物などの解析を同時に実施するということも可能である。一つの細胞塊試料に付随する情報の量を増やすことで、上記予測の精度を上げることが可能になる。この予測機能により、形態情報は類似していないが、核酸解析情報に類似性のある場合、類似グループとしての抽出が可能になる。位置情報を伴った核酸解析情報からは、形態観察で興味の対象を絞り、それ以外の部分を近傍データとして集積することも可能になる。核酸解析情報以外に、位置情報など付加情報をデータベースに蓄積し蓄積量を増加させることで類似推定の精度を上げることが可能になる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の実施形態の具体例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００４６】
［実施例１］
本実施例では、図１に示すように組織切片を極微小領域に2次元分画し、分画された試料の遺伝子発現解析を実施する工程について説明する。
【００４７】
本実施例では、実験マウスより摘出された肝臓組織を液体窒素下で凍結したのち、20μm程度の厚みに薄切した切片を解析対象として想定している。図１に細胞塊微細分画デバイスの一例と該デバイスを用いた反応工程フローを示す。
【００４８】
図１に示すように、スライドガラス（１）上に、PDMSシート（50μm厚）（２）を敷き、その上に本実施例では20μm厚の薄切組織切片（３）をのせる。細胞塊微細分画デバイスは、基部（４）に約0.1μm厚の刃（５）が固定され格子を形成している。本実施例で用いたデバイスの格子の深さは300μmであり、70μm×70μmの大きさであるが、格子の深さおよび大きさは限定されるものではなく、薄切組織切片の大きさや解析の精度などに応じて適宜設定することができる。
【００４９】
あらかじめ分画タグが結合したゲルビーズ（６）を用意する。分画タグの構成を図２に示す。分画タグの5’末端には、アクリダイト修飾が施されている。配列部は5’末端から、既知配列であるアダプター配列１（３１）（5’- CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT -3’：配列番号１）、続いて分画タグ配列（３２）、2番目の既知配列であるアダプター配列２（３３）（5’-GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC -3’：配列番号２）、そして分画試料中のRNAを捕獲するためのポリT配列（３４）からなる。分画タグ配列は任意の7塩基（NNN NNN N）（ここでN＝A、C、GまたはTの混合塩基）からなる配列である。ポリT配列は、Tが20塩基連続したのち、3’末端にVN（ここでV＝A、CまたはGの混合塩基、N＝A、C、GまたはTの混合塩基）となるものを用いた。
【００５０】
ゲルビーズは、文献（Cell Vol.161, pp.1187-1201 (2015)）を参考に合成し、上記分画タグをアクリダイト修飾部でゲルビーズ合成中に結合させた。ゲルビーズの合成方法およびオリゴDNAの結合方法は、上記文献以外にも同様の効果を得られる方法が複数知られており、いずれの方法でも使用することができる。本実施例では、格子の大きさが70μm×70μmであるため、ゲルビーズの径は60μmのものを用意した。ゲルビーズは、合成時の流路の幅により径の大きさを自由に変えられるため、格子サイズに合わせたビーズを用意するという目的に適している。分画タグの結合数は、概ねビーズの径によるが、60μmではビーズ1個当たり109〜1010分子とすることができる。
【００５１】
分画タグの種類毎に合成を実施すれば、それぞれの生成物に含まれる分画タグ配列の配列は既知であり、既知配列に基づいて簡便に位置情報を知ることができる。一方でこの方法では、分画タグ配列の種類だけゲルビーズ生成が必要となり煩雑となることがある。一つのビーズに109〜1010分子の同じ配列を有する分画タグビーズを結合させる工程を、複数配列で一括処理できる方法として、PCRを利用する方法がある。ゲルビーズを合成する際に、図３（１）に示す、5’末端にアクリダイト修飾が施されており、アダプター配列１（３１）（5’- CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT -3’：配列番号１）のみからなるオリゴ１を結合させる。こうしてできたゲルビーズには、一つのビーズに109〜1010分子のオリゴ１が結合している。続いて、マイクロドロップレットを用いたPCR反応を実施する（Cell Vol.161, pp.1187-1201 (2015)）。マイクロドロップレット1個あたりゲルビーズが1個になるように封入する。ドロップレット内の溶液は、ドロップレット1個当たり1分子以下に濃度調整されたPCRの鋳型（図３（２）に示す鋳型オリゴ）、および、マイクロドロップレットPCRで使用するプライマー濃度調整されたオリゴ２（図３（３））そして、PCR反応溶液で構成される。図３（２）に示される鋳型オリゴは、既知配列であるアダプター配列１（３１）（5’- CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT -3’：配列番号１）、続いて分画タグ配列（３２）、2番目の既知配列であるアダプター配列２（３３）(5’-GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC -3’：配列番号２)で構成される。また、図３（３）に示されるオリゴ２は、5’末端から、既知配列であるアダプター配列３（３５）（5’- GAC TGC CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG -3’：配列番号３）、ClassII制限酵素認識配列（5’- GCA GTG -3’）（３６）、ポリT配列と相補的であるポリA配列（３７）、およびアダプター配列２と相補的な配列であるアダプター配列４（３８）(5’-GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC -3’：配列番号４)からなる。ClassII制限酵素は、本実施例ではBtsαIを用いた。BtsαIはGCAGTGの配列から2塩基3’側先の塩基で切断する酵素である。即ち、ゲルビーズに結合したオリゴ１、鋳型オリゴ、およびオリゴ２で生成されるPCR産物の、ゲルビーズと結合している鎖のポリT塩基の3’末端から2塩基内側で切断されることになる。ドロップレットPCR実施後、ドロップレットを破壊し、全てのゲルビーズに対して一括での制限酵素切断およびゲルビーズから切り離された断片の除去、およびゲルビーズに結合している2本鎖PCR生成物切断断片のゲルビーズと結合していない鎖を除去することで、上記、個別にゲルビーズに異なる配列を有する分画タグを結合した時と同様の生成物を得ることが可能である。ClassII制限酵素は認識塩基から離れた部位を切断することのできる制限酵素であるが、本発明ではゲルビーズに結合した鎖のポリT塩基が3’末端に配置する部位で切断できる制限酵素であればBtsαIには限定されない。
【００５２】
作製したゲルビーズ（６）は、図１（４）に示すように細胞塊微細分画デバイスにあらかじめ充填しておく。ゲルビーズ（６）の充填方法は、ゲルビーズ（６）を懸濁した表１に示す細胞溶解液（７）を細胞塊微細分画デバイス上に滴下し、遠心で分画内に溶液とゲルビーズを充填する。
【００５３】
【表１】
2018102144.tif 000003
【００５４】
この溶液およびゲルビーズが入ったデバイスに対して、図１（２）に示すように、スライドガラス（１）上のPDMSシート（２）および薄切組織切片（３）で構成される試料（図１（１））をさかさまにして細胞塊微細分画デバイスの刃（５）部分を押し当てる。刃（５）はPDMSシート（２）に食い込むところまで押しこむ。こうすることで、格子で仕切られた空間の蓋の役割を果たすことができる。続いて、図１（３）に示すように、細胞塊微細分画デバイスおよび試料一式ごとをチャンバー（８）に入れる。チャンバー内で70度5分維持した後、4度までゆっくりと温度を下げる。この工程で、分画された組織内からRNA（９）が溶出し、RNAの3’末端部分のポリA配列とゲルビーズ（６）に結合している分画タグの3’末端ポリT配列部が相補鎖結合することで、RNA（９）がゲルビーズ上に捕獲される。このあと、PDMSシート（２）を剥がし、ゲルビーズ（６）を回収、チューブ（１０）などにまとめて以降のcDNAライブラリの調製およびシーケンスライブラリの調製を一括して実施することが可能である。あるいは、PDMSシート（２）を剥がし、表２に示す逆転写試薬を添加し、新たにPDMSシート（２）で蓋をし、チャンバー（８）内で50度一時間維持することで、分画内でcDNAが合成される。これらの工程で、ゲルビーズ（６）に結合している分画タグが、分画ごとに異なる配列を有しているため、合成されたcDNAをシーケンスすることで配列決定される遺伝子がどの分画由来かを分画タグの配列を手がかりに知ることができるようになる。
【００５５】
【表２】
2018102144.tif 000004
【００５６】
以上の工程を実施することで、細胞塊を微小領域に分画し、分画ごとの遺伝子発現情報（核酸解析情報）を得ることが可能になった。
【００５７】
上記実施例では薄切組織切片を試料として用い、工程を示す図１においては模式化して図示しているが、薄切組織切片は一様な厚みである必要は無い。即ち、細胞が複数層に重なり合う一様な厚みの組織切片であっても同様の処理が実施可能であるし、図４に示すように、細胞（１１）が縦方向に一層から複数層の細胞が不均一に重なっていても同様の処理を施すことが可能である。これは、分画された微量細胞分画が、刃（５）で仕切りを作る構造となっていて、基部（４）および細胞（１１）の下にしかれたPDMSシート（２）やスライドガラス（１）により閉鎖された空間となっているためである。厚みが不均一であったり、多層構造であったりする場合、細胞を溶解した際に、細胞の数が多いため溶出する内容物（ここではRNA量）も多く、横へ拡散しやすい。しかしながら、本発明では刃構造により仕切りがあり横方向への拡散がない。また、分画あたりの細胞数が一定である必要もなく、1細胞しかない分画も複数細胞が混在する分画も同様の処理を施すことが可能である。
【００５８】
また、図５に示すように、同じ組織であっても、刃構造で仕切られた分画（１２）のサイズが異なるデバイスを使用することで、一区画に入る細胞（１１）の数をコントロールすることが可能である。より詳細に解析したい場合は、図５（２）に示す刃構造で仕切られた分画（１２）の細かいものを用いることで、感度の高いデータの取得が可能になる。一方で、まずは目的遺伝子の発現についておおよその目安を得たい場合や、そもそも組織の不均一性が低いことが分かっているような対象には、図５（１）に示すように刃構造で仕切られた分画（１）が大きいものを用いることが有効である。目的に合わせて分画のサイズを選択し、あくまでも分画で仕切られた中にある微量細胞が一つの試料として扱われる点が本発明の特徴である。
【００５９】
［実施例２］
本実施例では、分画タグの配列情報と付加された分画タグの位置情報を連携させる工程について説明する。
【００６０】
実施例１で示す方法で、分画ごとに識別するための分画タグを、捕獲される核酸または合成されるcDNAに挿入することができる。分画タグの配列が明らかなゲルビーズを、位置を定めて分画に充填した場合には、分画タグの配列決定をすることで、分画切断しばらばらになる前の初期位置の情報が得られる。一方で、分画タグをゲルビーズにPCRを介して結合させた場合などには、ゲルビーズごとに異なる分画タグの配列が付加されるが、その配列情報を知ることができない。このため、どの位置のゲルビーズにどの分画タグ配列が付与されたかの情報が別途必要になる。
【００６１】
本実施例では、スライドガラスに複数の位置情報識別タグを格子状にあらかじめ固定化し、分画タグと位置情報識別タグを合致させることで、分画に由来する核酸への位置情報の付与を実施した。位置情報識別タグは、5’末端に固定化のためにアミノ基が修飾されている。一方で、固定化されるほうのスライドガラスにはアミノ修飾オリゴDNA固定コートタイプのスライドガラス（松浪ガラス）を用いた。位置情報識別タグの配列構造は、図６に示すように5’末端側から、既知配列からなるアダプター配列5（３９）（5’- TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT CT -3’：配列番号５）、位置情報識別タグ配列（４０）（任意の7塩基で構成  5’- NNN NNN N -3’）、および分画タグにあらかじめ挿入されている既知配列からなるアダプター配列2と相補的な配列であるアダプター配列４（３８）(5’-GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC -3’：配列番号４)からなる。配列に関しては、適宜変更が可能でありこの限りではない。固定の方法は、松浪ガラスより提示される方法に従ったが、アミノ基修飾オリゴをガラス表面に固定化する方法は広く知られた方法であり、限定はされない。
【００６２】
固定する位置情報識別タグは、図７（１）に示すように横方向と縦方向とそれぞれ別の位置情報識別タグ配列を有するものを固定する。即ち、横方向には6種類（#1〜#6）、縦方向には19種類（#A〜#S）の異なる配列を有する位置情報識別タグを固定する。横方向と縦方向に固定する位置情報識別タグは、ほぼ同一の位置に固定化され、固定化されたスポットは2種類の位置情報識別タグが混在する状態となる。即ち、図７に示されるように、横列には#1〜#6の6種類のタグが一列同じものが固定される。縦列には#A〜#Sまで列ごとに同じものが固定される。こうすることで、横列の6種類×縦列の19種類＝114種類のバリエーションが生まれる。それぞれの位置情報識別タグ配列部分の配列は、下記に示すとおりである。
【００６３】
［横方向位置情報識別タグ配列］
#1  5’-TAATAGC-3’
#2  5’-TGGTCCA-3’
#3  5’-GTTGTTG-3’
#4  5’-CGAAGAG-3’
#5  5’-TTACCAA-3’
#6  5’-CTGTTGT-3’
［縦方向位置情報識別タグ配列］
#A  5’-AACTTCG-3’
#B  5’-GGCGAGG-3’
#C  5'-TACTGAC -3'
#D  5'-AGTCAAG -3'
#E  5'-CGGACGT -3'
#F  5'-TTTTGCC -3'
#G  5'-GATCCCA -3'
#H  5'-CCTCATT -3'
#I  5'-CAGCGGC -3'
#J  5'-ATATTCA -3'
#K  5'-GTTTTTG -3'
#L  5'-TCGATAG -3'
#M  5'-AAGTCAC -3'
#N  5'-TCCGAGC -3'
#O  5'-TCGAGTA -3'
#P  5'-GAACCTT -3'
#Q  5'-TACTTGG -3'
#R  5'-CGCGTCA -3'
#S  5'-GACGTGG -3'
【００６４】
実施例１に示す方法で、細胞塊を切断分画し、分画タグの3’末端に配置されたポリT配列でRNAの3’末端のポリA配列部部分を捕獲する（図８）。ゲルビーズに結合している分画タグは5’末端のアクリダイト修飾に続いて、光切断スペーサーが挿入されているものを使用する。実施例１に記載の方法で、逆転写反応によりcDNAを合成する。この際、ゲルビーズには、合成されたcDNAと余剰の分画タグが5’末端部位でゲルビーズに結合している。一方、位置情報識別タグが固定されたスライドガラス（４１）は固定された位置情報識別部タグの部位を囲むように、スペーサー（４３）が取り付けられている。これは、シリコンやPDMSなどの素材で、溶液の流出を防ぎ、かつ密封する効果を持つ。スライドガラス（４１）に取り付けられたスペーサー（４３）に囲まれる空間には表３に示す相補鎖結合反応溶液（４４）を添加しておく。スペーサーの高さは、細胞塊微細分画デバイスの刃の高さと同一以上であれば限定はされない。実施例１で示した刃構造で形成される格子の深さ（刃の高さ）は300μmであるため、本実施例ではスペーサーは500μm厚のシリコンシートを用いて囲いを形成した。
【００６５】
【表３】
2018102144.tif 000005
【００６６】
続いて、図８に示すように、上記、cDNAが合成されたゲルビーズ（６）を含む細胞塊微細分画デバイスのPDMSシートを剥がしさかさまにして、固定された位置情報識別タグ（４２）が相補鎖結合反応溶液（４４）で満たされた、スライドガラスのスペーサー（４３）の上にのせる。図８（２）に示す構成となる。このデバイスを、4度に設定されたチャンバー（８）に設置し、温度反応を始める前に、UVを照射する。すると、ゲルビーズ上に結合しているcDNAおよび余剰分画タグが溶液中に解放される。続いて、チャンバーの温度を４４度5分維持した後、72度で6分維持しその後4度までゆっくりと温度を下げる。この過程でゲルビーズから解放された余剰分画タグのアダプター配列２（３３）が、位置情報識別タグの3’末端に配置するアダプター配列４（３８）と相補鎖を形成し、さらに、位置情報識別タグの伸長反応が進み、3’末端のアダプター配列４（３８）に続いて、分画タグ配列と相補的な配列部分、およびアダプター１配列と相補的な配列部分が、得られる生成物に挿入される。上記工程で生成される産物は、既知配列からなるアダプター配列５とアダプター配列１に挟まれた部分に位置情報識別タグ配列と分画タグ配列の両方の配列を有する。このため、アダプター配列５とアダプター配列１を有するプライマーを新たに用意することで、PCRによる上記位置情報識別タグ配列と分画タグ配列を含む部分の増幅を容易に行うことができる。
【００６７】
UV照射により溶液中に解放された余剰分画タグがどの位置情報識別タグと相補鎖を結合するかがポイントとなるが、図７（２）および（３）に示すように、分画のポジションに対応する位置情報識別タグの配置で概ねの結合ペアが決定する。図８（２）に示すように、分画タグは最寄りの位置情報識別タグと直ちに相補鎖を形成するため、多少の隣の空間への漏れこみ（クロストーク）は考えられる。しかし、大多数が分画仕切り内に存在する位置情報識別タグと相補鎖を結合する。このため、配列決定後の配列情報から分画タグの位置情報を推測することが可能になる。即ち、図７（３）に示すように、aの分画にあるゲルビーズから解放された分画タグは、#6と#Gの位置情報識別タグと関連付けられる。ｂの分画にあるゲルビーズから解放された分画タグは、#6と#Gおよび#Hの位置情報識別タグと関連付けられる。
【００６８】
以上の工程を実施することで、位置情報識別タグの配置があらかじめ分かっていることで、ゲルビーズから解放される分画タグに位置情報を付与することが可能になった。
【００６９】
同様の効果が得られる方法を図９に示す。即ち、細胞塊微細分画デバイスの基部（４）にあらかじめ位置情報識別タグ（４２）を固定しておく。5’末端に光切断スペーサーが挿入された分画タグが固定されたゲルビーズを用いて、実施例１に示す方法で、ゲルビーズ上でcDNAを合成する。その後UV照射で分画タグを溶液中に解放する。これにより、上記記載の分画タグのアダプター配列２と位置情報識別タグのアダプター配列４との相補鎖結合を分画内で実施することが可能になる。
【００７０】
［実施例３］
本実施例では、細胞塊微細分画デバイスを用いて得られる位置情報が付与された核酸情報を解析する工程について説明する。
【００７１】
本実施例では、実験マウスより摘出された肝臓組織を液体窒素下で凍結したのち、20μm程度の厚みに薄切した切片を解析対象として想定している。図１０に示すように、スライドガラス（１）、およびPDMSシート（50μm厚）（２）を敷き、その上に20μm厚の薄切組織切片（３）をのせる。細胞塊微細分画デバイス（４５）は、本実施例では縦にA〜Cの3列、横に#1〜#10の10列、合計30区画に分画することが可能なものを用いている。実施例１および２に記載の方法で実施した結果得られる遺伝子発現解析により図１０（３）に示す分画ごとの遺伝子発現情報（４６）が得られる。各グラフは、横軸に遺伝子の種類を縦軸に発現量を示している。
【００７２】
図１１に示すように、細胞塊微細分画デバイス（４５）で分画された区画ごとの情報としては、上記遺伝子発現情報以外にゲノム変異や遺伝子融合などの位置情報付き核酸解析情報（４７）を取得可能である。また、分画切断する前の顕微鏡観察により、細胞塊の形態観察を実施し、形態情報（４８）を取得する。即ち、細胞の形や色の観察、さらに免疫染色による色の観察などである。これら位置情報付き核酸解析情報（４７）と形態情報（４８）の結果をデータベース（４９）に入力（５０）する。本実施例では、マウスの組織を用いているが、ヒト病理サンプルの場合であれば、上記位置情報付き核酸解析情報（４７）と形態情報（４８）の結果と併せて、医師による問診の情報や検査の結果などの医療情報（５１）の入力も可能である。データベースに蓄積された情報には、図１２に示すようなネットワークインターフェースカード（NIC）（５２）、CPU（５３）、I/Oコントローラ（５４）、メモリ（５５）、ディスプレイアダプタ（５６）、モニタ（５７）、記憶装置（５８）、および電源（５９）からなる解析システムを用いてアクセスする。あるいは、解析システムは、これらの要素を全て備える必要はなく、例えば遠隔操作により操作されるようなものであってもよい。即ち、図１３に示すように、位置情報付き核酸解析情報（４７）や形態情報（４８）をデータベース（４９）に入力（５０）し、解析システム（６０）で、上記測定結果を解析し、位置情報により紐付けされた形態観察結果（６１）と核酸解析結果（６２）の表示（６３）が可能になる。
【００７３】
位置情報付き核酸解析情報（４７）と形態情報（４８）を併せてデータベース（４９）に入力（５０）し、この紐付けされた情報を多数の細胞塊について蓄積する。蓄積された情報を基に、位置情報付き核酸解析情報（４７）と形態情報（４８）との関連性を人工知能により学習していくことで、図１４（１）に示すように、位置情報付き核酸解析情報（４７）の結果を入力（５０）することで、類似した位置情報付き核酸解析情報（４７）の結果を抽出し、抽出された位置情報付き核酸解析情報（４７）と紐付けされている形態情報（４８）の結果を予測（６４）し出力することが可能である。逆のパターンも可能であり、即ち、形態情報（４８）の結果を入力（５０）することで、類似した形態情報（４８）の結果を抽出し、抽出された形態情報（４８）と紐付けされている位置情報付き核酸解析情報（４７）の結果を予測（６４）し出力することが可能である。
【００７４】
同様に、図１１に示したように、医療情報（５１）の入力も併せて実施しておくことで、図１４（２）に示すように、位置情報付き核酸解析情報（４７）および形態情報（４８）の結果をデータベース（４９）に入力（５０）し、類似グループを抽出し、類似グループの医療情報（５１）から、診断サポート情報（６５）の予測（６４）も可能である。医療情報としては、問診、各種検査の結果、疾患情報、薬情報などが含まれる。データベースに蓄積される情報量が多いほど、予測の精度および感度があがることが期待できる。本実施例では、位置情報付き核酸解析情報および形態情報の具体例および医療情報の例も提示した。しかしながら、細胞塊もしくは分画に関する情報は他にも考えられ、タンパク質や、代謝産物の測定情報など、そもそも細胞塊がどういった状況で採取されたものなのかといった背景に関する情報、など、情報量が増えれば増えるほど、入力した情報に対して出力される予測の結果の精度の上昇が期待できる。
【００７５】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【符号の説明】
【００７６】
1:スライドガラス
2:PDMSシート
3:薄切組織切片
4:基部
5:刃
6:ゲルビーズ
7:細胞溶解液
8:チャンバー
9:RNA
10:チューブ
11:細胞
12:刃構造で仕切られた分画
31:アダプター配列１
32:分画タグ配列
33:アダプター配列２
34:ポリT配列
35:アダプター配列３
36:ClassII制限酵素認識配列
37:ポリA配列
38:アダプター配列４
39:アダプター配列５
40:位置情報識別タグ配列
41:位置情報識別タグが固定されたスライドガラス
42:固定された位置情報識別タグ
43:スペーサー
44:相補鎖結合反応溶液
45:細胞塊微細分画デバイス
46:遺伝子発現情報
47:位置情報付き核酸解析情報
48:形態情報
49:データベース
50:入力
51:医療情報
52:ネットワークインターフェースカード（NIC）
53:CPU
54:I/Oコントローラ
55:メモリ
56:ディスプレイアダプタ
57:モニタ
58:記憶装置
59:電源
60:解析システム
61:形態観察結果
62:核酸解析結果
63:表示
64:予測
65:診断サポート情報
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号１〜５：DNA（Artificial）  合成オリゴヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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