(57)【要約】【課題】親和性増強型Ｔ細胞受容体およびその作製方法を提供すること。【解決手段】本開示は、デルタ様１またはデルタ様４を発現する間質細胞とともに培養された抗原特異的ＴＣＲαを発現する造血前駆細胞のアゴニスト選択により、親和性増強型Ｔ細胞受容体を生成する方法、このような方法から調製された組成物、およびその使用を提供する。さらなる態様において、本明細書に開示の方法により生成され、細胞結合状態または可溶形態であり得、さらにコドン最適化を行い、Ｔ細胞の発現を増強させることができる親和性増強型ＴＣＲを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年５月３日に出願された米国特許仮出願第６１／６４２，３５８号における米国特許法§１１９（ｅ）の下で利益を請求し、本出願は、その全体が本開示に参照によって組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する声明
本出願に関する配列表は、紙の写しに代えてテキスト形式で提供され、これにより参照によって本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、３６００５６＿４１２ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴ．である。テキストファイルは１２９ＫＢであり、２０１３年５月２日に作製され、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出されている。
【０００３】
政府の利益についての声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｐ０１  ＣＡ  １８０２９による国庫補助によってなされた。政府は、この発明における特定の権利を有する。
【０００４】
技術分野
本開示は、親和性増強型Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）、より詳細には抗原特異的ＴＣＲαを発現する造血前駆細胞のアゴニスト選択を使用し、親和性増強型ＴＣＲを生成すること、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
関連技術の説明
ＴＣＲ遺伝子治療は、従来のＴ細胞養子免疫療法に関連する障害、例えば、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞クローンの単離、特徴づけおよび増殖に必要な莫大な時間および労力の多くを克服することができる新たな処置手法である（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ，＆Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，２００９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０：１２４０−１２４８）。遺伝子治療のさらなる利点には、インビボでの長時間持続可能な定義されたＴ細胞集団を利用する特性がある（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８：２９４−３０５；Ｈｉｎｒｉｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０６：１７４６９−１７４７４）。このようなＴ細胞を、腫瘍抗原に高い親和性を有する十分に特徴づけられたＴＣＲをコードする遺伝子を用いて形質導入し、それにより抗腫瘍効果を取り成す可能性を増大させることができる。実際に、自己／腫瘍抗原を標的とする高親和性キメラ受容体を発現する遺伝的に改変されたＴ細胞を用いた進行期Ｂ細胞白血病を標的とする治療の最近の報告では、白血病の処置用に操作された高親和性Ｔ細胞を使用する可能性が強調されている（Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５ｒａ７３）。しかし、Ｔ細胞免疫療法で標的となるほとんどの腫瘍抗原は、過剰発現した自己タンパク質であるため、これらの抗原に特異的な高親和性Ｔ細胞は一般に、胸腺で負の選択が行われる。それゆえ、一般のＴ細胞系免疫療法の大きな制限の１つには、突然変異していない腫瘍抗原に十分に高い親和性を有する内因性ＴＣＲを発現するＴ細胞の可用性の制限がある。
【０００６】
ＴＣＲ遺伝子治療に使用する目的のＴＣＲの親和性を増強させるいくつかの方法が開発されている（Ｒｉｃｈｍａｎ＆Ｋｒａｎｚ，２００７，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２４：３６１−３７３；Ｕｄｙａｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：４４３９−４４４７；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：５８４５−５８５４）。これらの手法は一般に、数ラウンドの突然変異誘発を行ったＴＣＲ突然変異体のライブラリを生成後に、標的ペプチド／ＭＨＣリガンドにさらに高い親和性を与える突然変異をスクリーニングすることを必要とする。突然変異は一般に、ペプチド／ＭＨＣと相互作用することが知られているＣＤＲ領域でなされる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域は大部分がＭＨＣ分子と接触するが、超可変ＣＤＲ３領域はおもにペプチドと接触する（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２：ａ００５１４０−ａ００５１４０）。部位特異的突然変異誘発法は一般に、これらの３領域全ての選択された部分を標的とするが、それでも必ずしも高い親和性の変異体を生成することに成功しておらず、改良は具体的に標的とした領域のみにおいての変更に限定される。さらに、ＭＨＣ接触残基に導入された突然変異は、ＭＨＣにおけるＴＣＲの親和性を潜在的に増大させるが、その同族ペプチドに対する受容体の特異性全体を減少させる危険がある。このため、理想的には、ＴＣＲの親和性を増強させるために導入されるほとんどの突然変異をＣＤＲ３領域に制限する。しかし、現在の方法論は、部位特異的突然変異誘発がＣＤＲ３領域のもともとの長さにより制約されるため、ＣＤＲ３多様性を生成する量を限定している。
【０００７】
関連腫瘍に関連する抗原を認識する高親和性Ｔ細胞を単離する困難さを考えると、親和性増強型ＴＣＲを生成する代替えの方法が継続して求められる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
親和性増強型Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生成する方法であって、
ａ．造血前駆細胞と間質細胞およびペプチド抗原を諸条件下および造血前駆細胞のＤＮ
ＴＣＲαβ＋胸腺細胞への分化を誘導するのに十分な時間接触させること、
ｂ．該ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞由来の種々のＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を単離し、細胞表面上にＴＣＲを発現することができ、ステップ（ａ）からのＴＣＲα鎖をコードする核酸配列を含む細胞に該ＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を導入すること、および
ｃ．親和性増強型ＴＣＲを同定すること
を含む方法であって、該造血前駆細胞が該ペプチド抗原に特異的な親ＴＣＲ由来のＴＣＲα鎖をコードする非内因性核酸配列を含み、
該間質細胞がデルタ様１またはデルタ様４をコードする非内因性核酸配列およびＭＨＣ分子をコードする核酸配列を含む、方法。
（項目２）
前記ＴＣＲβ鎖が親ＴＣＲから単離される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記造血前駆細胞が胸腺前駆細胞または胚性幹細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記造血前駆細胞が骨髄または臍帯血由来の造血幹細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
ウイルスベクターを使用し、前記ペプチド抗原に特異的な前記ＴＣＲα鎖をコードする前記非内因性核酸配列を前記造血前駆細胞に導入する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ウイルスベクターが形質導入のための遺伝子マーカーをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目９）
該形質導入のための前記遺伝子マーカーが緑色蛍光タンパク質またはヒトＣＤ２の細胞外ドメインを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記間質細胞がデルタ様１を発現する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記間質細胞がＯＰ９由来である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記方法がステップ（ｂ）に起因して前記細胞表面上にＴＣＲを発現することができる細胞を、ＭＨＣペプチド四量体染色を用いて選択することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｂ）に起因して前記細胞表面上にＴＣＲを発現することができる前記細胞が複数回のＭＨＣペプチド四量体染色を用いて選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ウイルスベクターを使用し、ステップ（ｂ）由来の前記種々のＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を前記細胞表面上にＴＣＲを発現することができる前記細胞に導入する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記ウイルスベクターが形質導入のための遺伝子マーカーをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
形質導入のための前記遺伝子マーカーが緑色蛍光タンパク質を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞表面上にＴＣＲを発現することができる前記細胞がＴＣＲα−／β−５８Ｔ細胞ハイブリドーマ由来である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記親和性増強型ＴＣＲがヒトＴＣＲである、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ＭＨＣ分子がクラスＩ  ＭＨＣ分子またはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２およびヒトベータ２マイクログロブリン（β２Ｍ）を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ペプチド抗原がウイルス抗原、細菌抗原、癌抗原、および自己免疫抗原からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記ペプチド抗原がＷＴ１ペプチド抗原またはメソテリンペプチド抗原である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ＷＴ１ペプチド抗原がアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２）を含む、請求項２４に記載の方法。
（項目２６）
前記メソテリンペプチド抗原がアミノ酸配列ＧＱＫＭＮＡＱＡＩ（配列番号３１）を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記ペプチド抗原を培養物中の前記造血前駆細胞および間質細胞に添加する、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記間質細胞が前記ペプチド抗原をコードする核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞由来の前記種々のＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列の単離が、前記選択されたＴＣＲβ鎖を前記細胞表面上にＴＣＲを発現することのできる細胞に導入する前に前記親ＴＣＲβ鎖と同じＶβ遺伝子を含むＴＣＲβ鎖を選択することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
項目１に記載の方法により生成される親和性増強型ＴＣＲ。
（項目３１）
前記項目１に記載の方法により生成される親和性増強型ＴＣＲおよび細胞毒性構成要素または検出可能な構成要素を含む融合タンパク質。
（項目３２）
前記項目２３または２４に記載の方法により生成される親和性増強型ＴＣＲ。
（項目３３）
項目１に記載の方法により生成される親和性増強型ＴＣＲ、および薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目３４）
項目１に記載の方法により作製される親和性増強型ＴＣＲを投与することを含む、被験体の疾患を処置する方法。
（項目３５）
前記疾患がウイルス感染、細菌感染、癌、および自己免疫疾患からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記被験体がヒトである、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記増強型ＴＣＲを可溶性ＴＣＲとして前記被験体に投与する、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記被験体に前記親和性増強型ＴＣＲを含むＴ細胞を投与する、項目３４に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記Ｔ細胞が自己Ｔ細胞である、項目３８に記載の方法。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ，＆Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，２００９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０：１２４０−１２４８
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８：２９４−３０５
【非特許文献３】Ｈｉｎｒｉｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０６：１７４６９−１７４７４
【非特許文献４】Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５ｒａ７３
【非特許文献５】Ｒｉｃｈｍａｎ＆Ｋｒａｎｚ，２００７，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２４：３６１−３７３
【非特許文献６】Ｕｄｙａｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：４４３９−４４４７
【非特許文献７】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：５８４５−５８５４
【非特許文献８】Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２：ａ００５１４０−ａ００５１４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本開示は、ａ）造血前駆細胞と間質細胞およびペプチド抗原を諸条件下において、造血前駆細胞のＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞への分化を誘導するのに十分な時間接触させることであって、造血前駆細胞がペプチド抗原に特異的な親ＴＣＲ由来のＴＣＲα鎖をコードする非内因性核酸配列を含み、間質細胞がデルタ様１またはデルタ様４をコードする非内因性の核酸配列およびＭＨＣ分子をコードする核酸配列を含み、ｂ）ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞由来の種々のＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を単離すること、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を、細胞表面にＴＣＲ発現することができ、かつステップａ）由来のＴＣＲα鎖をコードする核酸配列を含む細胞に導入すること、および（例えば、ＭＨＣ四量体アッセイにより高親和性ＴＣＲαβ候補を検出または選択後、結合親和性を親ＴＣＲαβと比較して測定することにより）親和性増強型ＴＣＲを同定することを含む親和性増強型ＴＣＲを生成する方法を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本明細書に開示の方法により生成され、細胞結合状態または可溶形態であり得、さらにコドン最適化を行い、Ｔ細胞の発現を増強させることができる親和性増強型ＴＣＲを提供する。
【００１１】
よりさらなる態様において、本開示の親和性増強型ＴＣＲを使用し、親和性増強型ＴＣＲを含む組成物を投与することにより被験体の疾患（例えば、癌、感染症、または自己免疫疾患）を処置することができる。さらなる実施形態において、本開示の親和性増強型ＴＣＲを診断方法または画像方法、例えば、本明細書において同定される徴候または病態に関して使用されるこれらの方法に使用することができる。
【００１２】
本発明のこれらの、および他の態様は、以下の発明を実施するための形態および添付の図面を参照すると明らかとなるだろう。本明細書に開示された全ての参照は、それぞれが個々に組み込まれたかのようにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、ＯＴ−１遺伝子導入マウス由来の胸腺細胞を、ＴＣＲβ−ＴＣＲγδ−ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ１１７＋ＣＤ４４＋ＤＮ１およびＤＮ２前駆細胞用に選別し、示された種々の濃度のオバルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号１）の存在下において、ＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｋｂ分子を発現するＯＰ９−ＤＬ１細胞上で２０日間培養した。（Ａ、Ｂ、Ｃ）培養物をフローサイトメトリーにより示された時間点にて分析した。（Ｄ）各培養物の総細胞充実度を培養２０日目に決定した。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、ＯＴ−１遺伝子導入マウス由来の胸腺細胞を、ＴＣＲβ−ＴＣＲγδ−ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ１１７＋ＣＤ４４＋ＤＮ１およびＤＮ２前駆細胞用に選別し、示された種々の濃度のオバルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号１）の存在下において、ＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｋｂ分子を発現するＯＰ９−ＤＬ１細胞上で２０日間培養した。（Ａ、Ｂ、Ｃ）培養物をフローサイトメトリーにより示された時間点にて分析した。（Ｄ）各培養物の総細胞充実度を培養２０日目に決定した。
【００１４】
【図２】図２は、Ｂ６またはＯＴ−１遺伝子導入マウスから選別された正の選択によりなお除去されなかったＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞を、オバルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号１）の存在下において、ＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｋｂ分子を発現するＯＰ９−ＤＬ１細胞上で培養した。
【００１５】
【図３】図３Ａ〜Ｃは、Ｂ６胸腺細胞をＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ１１７＋ＣＤ４４＋ＤＮ１およびＤＮ２前駆細胞用に選別し、親和性増強型ＷＴ１特異的ＴＣＲ３ＤクローンのＴＣＲα鎖を用いて形質導入し、１μＭのＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２）の存在下または非存在下においてＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｄｂ分子を発現するＯＰ９−ＤＬ１細胞上で培養した。（Ａ）培養１６日目に、形質導入（ｈＣＤ２＋）および形質導入していない（ｈＣＤ２−）細胞をフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）１μＭ  ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２）の存在下におけるＯＰ９−ＤＬ１培養の２１日目に、ＤＮ  ＴＣＲαβ＋細胞を、示されたスキームに従い選別した。（Ｃ）選別された細胞を溶解し、ＤＮＡを単離し、ＰＣＲをＶｂ１０特異的フォワードプライマーおよびＣｂ２特異的リバースプライマーを使用して行った。次いでＶｂ  １０ＰＣＲ産物をベクターｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯに定方向ＴＯＰＯクローン化し、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を使用してレトロウイルスベクターＭｉｇＲ１−ａｔｔＲに移入し、レトロウイルスの上清を生成し、それを使用して記載のライブラリスクリーニングのためにマウス５８−／−細胞を形質導入した。
【００１６】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｃは、レトロウイルスＴＣＲβライブラリを使用し、ＣＤ８＋３Ｄα＋５８−／−細胞を形質導入した。（Ａ）形質導入された細胞をはじめにＧＦＰ発現のみ（図示せず）において選別し、続いてさらに２回ＧＦＰおよび示された高ＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体発現において選別した。選別された５８−／−細胞も非特異的四量体結合の対照として非特異的であるが、ＧＰ３３に特異的なＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂ−ペプチド四量体で染色して分析した。（Ｂ）単離されたＴＣＲβ鎖の配列分析。（Ｃ）４つの候補ＴＣＲβ鎖を配列分析により同定し、ＭｉｇＲ１−ａｔｔＲレトロウイルスベクターに戻した。レトロウイルス上清を生成し、それを使用しＣＤ８＋３Ｄα＋５８−／−細胞を形質導入した。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｃは、レトロウイルスＴＣＲβライブラリを使用し、ＣＤ８＋３Ｄα＋５８−／−細胞を形質導入した。（Ａ）形質導入された細胞をはじめにＧＦＰ発現のみ（図示せず）において選別し、続いてさらに２回ＧＦＰおよび示された高ＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体発現において選別した。選別された５８−／−細胞も非特異的四量体結合の対照として非特異的であるが、ＧＰ３３に特異的なＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂ−ペプチド四量体で染色して分析した。（Ｂ）単離されたＴＣＲβ鎖の配列分析。（Ｃ）４つの候補ＴＣＲβ鎖を配列分析により同定し、ＭｉｇＲ１−ａｔｔＲレトロウイルスベクターに戻した。レトロウイルス上清を生成し、それを使用しＣＤ８＋３Ｄα＋５８−／−細胞を形質導入した。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｃは、レトロウイルスＴＣＲβライブラリを使用し、ＣＤ８＋３Ｄα＋５８−／−細胞を形質導入した。（Ａ）形質導入された細胞をはじめにＧＦＰ発現のみ（図示せず）において選別し、続いてさらに２回ＧＦＰおよび示された高ＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体発現において選別した。選別された５８−／−細胞も非特異的四量体結合の対照として非特異的であるが、ＧＰ３３に特異的なＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂ−ペプチド四量体で染色して分析した。（Ｂ）単離されたＴＣＲβ鎖の配列分析。（Ｃ）４つの候補ＴＣＲβ鎖を配列分析により同定し、ＭｉｇＲ１−ａｔｔＲレトロウイルスベクターに戻した。レトロウイルス上清を生成し、それを使用しＣＤ８＋３Ｄα＋５８−／−細胞を形質導入した。
【００１７】
【図５Ａ】（Ａ）３つの最も高い親和性ＴＣＲの相対的な親和性をＭＨＣ−ペプチド四量体を用いて、形質導入された細胞株それぞれを染色後、フローサイトメトリーにより決定した。ＫＤ測定は、ＰＥ結合四量体の２倍希釈液を６つ使用して行われ、見かけのＫＤ値を非線形回帰による結合曲線から最大半量結合を生じるリガンド濃度として決定した。
【図５Ｂ】（Ｂ）最も高い親和性ＴＣＲβ鎖（クローン番号１）をコドン最適化し、四量体結合を元の親和性増強型３Ｄαβ構築物と比較した。
【図５Ｃ】（Ｃ）３Ｄαと対合する候補ＴＣＲβ鎖のそれぞれを用いて形質導入された５８−／−細胞をＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド特異的四量体ならびにいくつかの非特異的ＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂ−ペプチド四量体で染色し、ＭＨＣに対する潜在的なペプチド非依存性反応度を評価した。
【００１８】
【図６】図６Ａ〜Ｂは、３Ｄ−ＰＹＹα−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ２および７４３１α−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ２レトロジェニックマウス由来のＴＣＲβ＋胸腺細胞（Ａ）および脾細胞（Ｂ）のＣＤ４およびＣＤ８発現の分析。３Ｄ−ＰＹＹα−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ２および７４３１α−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ２レトロジェニックマウス由来のＴＣＲβ＋胸腺細胞（Ａ）のＶβ１０およびＶβ９発現。
【００１９】
【図７】図７は、インビトロでのＷＴ１のメソテリンペプチド刺激＋ＩＬ２の６日後のレトロジェニックマウス由来の脾細胞の分析。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、親和性増強型または高親和性ＴＣＲを生成する方法および組成物であって、抗原特異的ＴＣＲ由来のＴＣＲα鎖を使用し、インビトロでＴ細胞が成長する間に抗原特異的ＴＣＲα鎖と対合する新たに生成されたＴＣＲβ鎖を選択し、目的の抗原を標的とする新規の選択プロセスを介して負の選択に依存しないＴ細胞成熟を有利に促進することができる新たな親和性増強型受容体を形成する方法および組成物を提供する。
【００２１】
一態様において、本開示は、造血前駆細胞（抗原特異的ＴＣＲα鎖をコードする非内因性核酸配列を含有）と間質細胞（デルタ様１またはデルタ様４をコードする非内因性核酸配列およびＭＨＣ分子をコードする核酸配列を含有）をペプチド抗原の存在下において培養し、これにより造血前駆細胞のＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞への分化を誘導することにより親和性増強型Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生成する方法を提供する。次いで、ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞由来の種々のＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を単離し、細胞表面上にＴＣＲを発現することができ、また上記のＴＣＲα鎖を発現する細胞に導入する。最後に、候補ＴＣＲαβの結合親和性を親ＴＣＲαβと比較することにより、親和性増強型ＴＣＲを同定する。
【００２２】
さらに、本開示は上記の方法を使用して生成された親和性増強型ＴＣＲならびに種々の治療用途、例えば、被験体の疾患（例えば、癌、感染症、自己免疫疾患）の処置に本開示の親和性増強型ＴＣＲを使用する組成物および方法を提供する。
【００２３】
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用される特定の用語の定義を記載することは、その理解に役立ち得る。さらなる定義を本開示を通して記載する。
【００２４】
本明細書において、用語「約」および「本質的に〜からなる」は、他に明記されない限り、示された範囲、値、または構造の平均±２０％を意味する。本明細書において使用される場合、用語、不定冠詞の「ａ」および「ａｎ」は、列挙する構成要素の「１つ以上」を指すと理解するものとする。選択肢（例えば「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方、またはその任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解するものとする。本明細書において使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同意語として使用され、これらの用語およびその異綴語は非限定的であるとして解釈されるものとする。
【００２５】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）はＣＤ３に関連して、一般に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することに関与する、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見つかる分子を指す。ＴＣＲは、ほとんどのＴ細胞の高度可変αおよびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）のジスルフィド結合ヘテロ二量体を有する。Ｔ細胞の小集団では、ＴＣＲは可変γおよびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても知られる）のヘテロ二量体からなる。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｎ末端免疫グロブリン可変ドメインを１つ、免疫グロブリン定常ドメインを１つ、膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質側末端を保持する（Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．４：３３，１９９７を参照のこと）。本開示に使用されるＴＣＲは、種々の動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳類動物由来であってよい。ＴＣＲは細胞結合状態または可溶形態であり得る。
【００２６】
本開示のＴＣＲおよびその結合ドメインは、例えば、約１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上の親和性すなわちＫａ（すなわち１／Ｍの単位の特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子と結合する場合、標的物質と「特異的または選択的に結合」するが、試験サンプルに存在する他の構成要素とあまり結合しないなどの所望の程度で「免疫特異的」あってよくまたは結合することができる。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１以上のＫａのこのような結合ドメインを指す。代替えとして、親和性はＭ（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）の単位の特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。本開示におけるＴＣＲおよび結合ドメインポリペプチドの親和性は、従来の技法（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；および米国特許第５，２８３，１７３号；同第５，４６８，６１４号、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析、または等価物を参照のこと）を用いて容易に決定することができる。それゆえ、「親和性増強型Ｔ細胞受容体」（親和性増強型ＴＣＲ）は、野生型（または親）ＴＣＲより標的抗原により強く結合する、選択されまたは操作されたＴＣＲを指す。親和性増強型は、野生型（親または元のとも呼ばれる）ＴＣＲの標的抗原に対するＫａ（平衡会合定数）より大きい、標的抗原に対するＫａを有するＴＣＲ、野生型（親または元のとも呼ばれる）ＴＣＲの標的抗原に対するＫｄ（解離定数）より小さい、標的抗原に対するＫｄを有するＴＣＲ、または野生型（または親）ＴＣＲの標的抗原に対する解離率（Ｋｏｆｆ）より小さい、標的抗原に対するＫｏｆｆを有するＴＣＲにより示されることができる。
【００２７】
「主要組織適合遺伝子複合体分子」（ＭＨＣ分子）は、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜貫通α鎖（３つのαドメインを含む）および非共有結合β２マイクログロブリンからなるヘテロ二量体である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、膜を貫通する２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβからなる。各鎖は２つのドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞質ゾルに由来するペプチドを細胞表面に送達し、ペプチド：ＭＨＣ複合体をＣＤ８＋Ｔ細胞により認識する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系に由来するペプチドを細胞表面に送達し、これらをＣＤ４＋Ｔ細胞より認識する。ＭＨＣ分子は、種々の動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳類動物由来であってよい。
【００２８】
「造血前駆細胞」は、造血幹細胞または成熟細胞型にさらに分化することができる胎児組織（例えば、Ｔ細胞系統の細胞）由来の細胞である。具体的な実施形態において、ＣＤ２４ｌｏ Ｌｉｎ−ＣＤ１１７＋造血前駆細胞を使用する。本明細書において定義されるように、造血前駆細胞は、Ｔ細胞系統の細胞にさらに分化することができる胚性幹細胞を含み得る。造血前駆細胞は、種々の動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳類動物由来であってよい。
【００２９】
「胸腺細胞前駆細胞」または「胸腺細胞」は胸腺に存在する造血前駆細胞である。
【００３０】
「造血幹細胞」は、インビボまたはエクスビボのいずれかで本質的に制限なく増殖することができ、Ｔ細胞系統の細胞を含む他の細胞型に分化することができる未分化の造血細胞を指す。造血幹細胞を例えば、胎児肝臓、骨髄および臍帯血から単離することができる。
【００３１】
「Ｔ細胞系統の細胞」は、当該細胞を他のリンパ細胞、および赤血球もしくは骨髄系統の細胞から区別する、Ｔ細胞またはその前駆体もしくは前駆細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞を指す。このような表現型特徴は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋）に特異的な１つ以上のタンパク質の発現またはＴ細胞に特異的な生理学的、形態学的、機能的、または免疫学的特徴を含むことができる。例えば、Ｔ細胞系統の細胞は、Ｔ細胞系統に決定する前駆細胞または前駆体細胞、ＣＤ２５＋未熟および不活性化Ｔ細胞、ＣＤ４またはＣＤ８系統決定を行った細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋のダブルポジティブである胸腺前駆細胞、シングルポジティブのＣＤ４＋またはＣＤ８＋、ＴＣＲαβまたはＴＣＲγδ、あるいは成熟および機能的または活性化Ｔ細胞であってよい。
【００３２】
「間質細胞」は任意の器官の結合組織細胞である。具体的な実施形態において、間質細胞は骨髄間質細胞である。ＤＬＬ１またはＤＬＬ４を発現するよう操作することができる間質細胞株の例として、マウス間質細胞株ＭＳ５（Ｉｔｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９８９，１７：１４５−１５３）およびＳ１７ならびにヒト間質細胞株ＨＧＳ２．１１、ＨＧＳ２．５２、ＨＧＳ．１８、ＨＧＳ３．３０、ＨＧＳ３．６５、ＨＧＳ．３．６６、ＨＧＳ３．１０３、およびＨＧＳ３．１１４（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤより入手可能、米国公開公報第２００２０００１８２６号を参照のこと）がある。具体的な実施形態において、ＯＰ９細胞（Ｋｏｄａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２２：９７９−９８４；ＲＩＫＥＮ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙより入手可能）を使用する。ＤＬＬ１およびＤＬＬ４を発現するＯＰ９細胞は既に報告されている（例えば、Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ：１７：７４９−７５６；米国特許第７，５７５，９２５号を参照のこと）。
【００３３】
「ダブルネガティブのＴＣＲαβ胸腺細胞」（ＤＮ  ＴＣＲαβ胸腺細胞）は、ＣＤ４およびＣＤ８共受容体を発現しないが、ＴＣＲαおよびβ鎖を発現する胸腺細胞の集団を指す。
【００３４】
「ペプチド抗原」は、抗原としてＴＣＲまたはその結合ドメインにより特異的に認識される約７アミノ酸長から約２５アミノ酸長の範囲にあり、より長い標的生物学的分子（例えば、ポリペプチド、タンパク質）またはその誘導体の断片由来つまりこれに基づき得るアミノ酸配列を指す。抗原は細胞表面上、細胞内または内在性膜タンパク質として発現し得る。抗原は宿主由来（例えば、腫瘍抗原、自己免疫抗原）であってよく、または外因性起源（例えば、細菌性、ウイルス性）を有し得る。
【００３５】
「核酸配列」すなわちポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であってよく、これにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。核酸配列は二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス鎖）であってよい。コード配列は、当技術分野で公知のコード配列と同一であってよく、または遺伝コードの冗長または縮重の結果として、またはスプライシングにより同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であってよい。
【００３６】
「非内因性」は、分子が例えば組み換えにより導入されるなどで導入される（各）宿主細胞／サンプルに存在しない分子（例えば、核酸配列）を指す。非内因性分子は、同じ種または異なる種由来であってよい。
【００３７】
Ｎｏｔｃｈリガンドである「デルタ様１」（ＤＬ１またはＤＬＬ１）および「デルタ様４」（ＤＬ４またはＤＬＬ４）はＮｏｔｃｈデルタリガンドの同族体であり、ｄｅｌｔａ／ｓｅｒｒａｔｅ／ｊａｇｇｅｄタンパク質ファミリーのメンバーである。これらは造血中の細胞運命決定を介在する役割を果たし、細胞間伝達の役割を果たし得る。例示的なデルタ様１配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６１８．３（配列番号３）およびＮＰ＿００５６０９．３（配列番号４）（それぞれ、ホモ・サピエンス転写産物およびタンパク質配列）ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７８６５．３（配列番号５）およびＮＰ＿０３１８９１．２（配列番号６）（それぞれ、ハツカネズミ転写産物およびタンパク質配列）がある。例示的なデルタ様４配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１９０７４．３（配列番号７）およびＮＰ＿０６１９４７．１（配列番号８）（それぞれ、ホモ・サピエンス転写産物およびタンパク質配列）ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１９４５４．３（配列番号９）およびＮＰ＿０６２３２７．２（配列番号１０）（ぞれぞれ、ハツカネズミ転写産物およびタンパク質配列）がある。Ｎｏｔｃｈリガンドは市販されており、または標準的な組み換えＤＮＡ法により生成され、種々の程度に精製することができる。
【００３８】
「胚性幹細胞」すなわち「ＥＳ細胞」すなわち「ＥＳＣ」は、成長中の胚の生殖細胞系に組み込まれおよびその一部になる能力を有する未分化の胚性幹細胞を指す。胚性幹細胞は造血前駆細胞に分化することができる。本明細書における使用に適した胚性幹細胞は、Ｊ１  ＥＳ細胞株、１２９Ｊ  ＥＳ細胞株、マウス幹細胞株Ｄ３（米国培養細胞系統保存機関品番ＣＲＬ１９３４）、１２９／Ｓｖマウス由来のＲ１もしくはＥ１４Ｋ細胞株、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の細胞株、ならびにヒト胚性幹細胞（例えば、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＷＩ；またはＥＳ  ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａより入手）由来の細胞がある。
【００３９】
「ＷＴ１」は、Ｃ末端に４つの亜鉛フィンガーモチーフおよびＮ末端にプロリン／グルタミン富化ＤＮＡ結合ドメインを含有する転写因子である、ウィルムス腫瘍１を指す。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の正常な成長に欠かせない役割を有し、ウィルムス腫瘍の患者の小集団において突然変異する。ＷＴ１の高い発現は、種々の癌、例えば、乳癌、卵巣癌、急性白血病、血管新生物、悪性黒色腫、結腸癌、肺癌、甲状腺癌、骨および軟組織の肉腫、および食道癌において認められている。ＷＴ１に対する選択的スプライシングが報告されている。例示的なＷＴ１配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３７８．４（配列番号１１）（ヒト転写産物）、ＮＰ＿０００３６９．３（配列番号１２）（ヒトタンパク質）、ＮＭ＿０２４４２４．３（配列番号１３）（ヒト転写産物）、ＮＰ＿０７７７４２．２（配列番号１４）（ヒトタンパク質）、ＮＭ＿０２４４２６．４（配列番号１５）（ヒト転写産物）、ＮＰ＿０７７７４４．３（配列番号１６）、ＮＭ＿００１１９８５５２．１（配列番号１７）、ＮＰ＿００１１８５４８１．１（配列番号１８）（ヒトタンパク質）、ＮＭ＿００１１９８５５１．１（配列番号１９）（ヒト転写産物）、ＮＰ＿００１１８５４８０．１（配列番号２０）（ヒトタンパク質）、ＮＭ＿１４４７８３．２（配列番号２１）（マウス転写産物）、およびＮＰ＿６５９０３２．３（配列番号２２）（マウスタンパク質）がある。
【００４０】
「メソテリン」（ＭＳＬＮ）は、２つの産物である巨核球増殖因子およびメソテリンに切断される前駆細胞タンパク質をコードする遺伝子を指す。巨核球増殖因子は、骨髄巨核球のコロニー形成を刺激することができるサイトカインとして機能する。メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）は、細胞付着タンパク質として機能し得るグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー細胞表面タンパク質である。このタンパク質は、上皮型中皮腫、卵巣癌において、および特定の扁平上皮癌腫において過剰発現する。選択的スプライシングにより多数の転写産物変異体が生じる。例示的なメソテリン配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１７７３５５．１（配列番号２３）、ＮＰ＿００１１７０８２６．１（配列番号２４）（それぞれ、ヒト転写産物およびプレタンパク質配列）、ＮＭ＿００５８２３．５（配列番号２５）、ＮＰ＿００５８１４．２（配列番号２６）（それぞれ、ヒト転写産物およびプレタンパク質配列）、ＮＭ＿０１３４０４．４（配列番号２７）、ＮＰ＿０３７５３６．２（配列番号２８）（それぞれ、ヒト転写産物およびプレタンパク質配列）、ＮＭ＿０１８８５７．１（配列番号２９）、ＮＰ＿０６１３４５．１（配列番号３０）（それぞれ、マウス転写産物および前駆体タンパク質配列）がある。
【００４１】
「ＭＨＣ−ペプチド四量体染色」は、ＭＨＣ分子の四量体を特徴とし、それぞれが同族の（例えば同一または関連する）少なくとも１種の抗原であるアミノ酸配列を有する同一のペプチドを含む、抗原特異的Ｔ細胞を検出するために使用されるアッセイであって、複合体がその同族抗原に特異的なＴ細胞と結合することができるアッセイを指す。ＭＨＣ分子のそれぞれをビオチン分子で標識することができる。ビオチン化ＭＨＣ／ペプチドを典型的に蛍光標識するストレプトアビジンの添加により四量体化する。四量体を、蛍光標識を介してフローサイトメトリーにより検出することができる。特定の実施形態において、ＭＨＣペプチド四量体アッセイを使用し、本開示の高親和性ＴＣＲを検出または選択する。
【００４２】
親和性増強型ＴＣＲを生成する方法
バックグランドとして、胸腺でＴ細胞が成長する間、前駆胸腺細胞は、多くのＴＣＲ介在性チェックポイント下に置かれる。これらの１つ目はβ選択と呼ばれ、マウスＴ細胞成長のダブルネガティブ３（ＤＮ３）の段階で生じる。Ｔｃｒｂ遺伝子座で再構成を成功させるＤＮ３細胞は、インバリアントプレＴαタンパク質と対合する細胞表面でＴＣＲβタンパク質を発現することができる。この受容体はプレＴＣＲと呼ばれ、リガンドに依存しない形式でシグナル伝達し、増殖、αβ系統細胞のＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ（ＤＰ）段階への分化、およびＴｃｒａ遺伝子座での再構成を促進する（Ｂｏｅｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１３５−１４２）。ＴＣＲα遺伝子座はβ選択の前では不活性であり、ＴＣＲ遺伝子再構成が行われないが、ＴＣＲγおよびδ遺伝子座はともに、成長中のＤＮ３段階で再構成を行い、これら両方の遺伝子座の再構成の成功により成熟γδＴＣＲの発現が得られ、これにより成長中のＤＰ段階を通して分化しないγδＴ細胞系統−γδＴ細胞への分化を促進するシグナルがもたらされ、一般にＤＮまたはＣＤ８αα＋のままとなり得る。成長中のＴ細胞が、成熟γδＴＣＲと関連するより強いシグナルによりプレＴＣＲシグナルとγδＴＣＲシグナルを識別するとき、αβ／γδ細胞の運命決定が成長中のこの段階のＴＣＲシグナルの強度により決定される（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓｉｌｖａ−Ｓａｎｔｏｓ，＆Ｈａｙｄａｙ，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０８−１１５）。興味深いことに、多くのαβＴＣＲ遺伝子導入マウスは、胸腺に大きな成熟ＣＤ２４−ＴＣＲαβポジティブＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞集団を有し、β選択チェックポイントで成熟αβ遺伝子導入ＴＣＲからのより強いシグナルの結果として成長する「γδ志願（ｗａｎｎａ−ｂｅ）」細胞を表すことが示されている（Ｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ３：１５１２）。
【００４３】
本明細書において、親和性増強型ＴＣＲを生成する方法であって、インビトロでのＴ細胞分化中に同族抗原の存在下において分化するときに、β選択前の抗原特異的ＴＣＲα鎖の異所性発現が、同じ抗原に対する高親和性ＴＣＲを発現するＴ細胞を成長させる方法を開示する。この方法を使用して高親和性受容体を発現するＴ細胞が、Ｔ細胞成長中のＤＮ３段階でのアゴニストシグナルに応答してＤＮ  ＴＣＲαβ＋系統の運命を取り入れることにより負の選択を回避する。
【００４４】
特定の実施形態において、本開示は、親和性増強型ＴＣＲを生成する方法であって、ａ）造血前駆細胞と間質細胞およびペプチド抗原を諸条件下において、造血前駆細胞のＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞への分化を誘導するのに十分な時間接触させることであって、造血前駆細胞がペプチド抗原に特異的な親ＴＣＲ由来のＴＣＲα鎖をコードする非内因性の核酸配列を含み、間質細胞がデルタ様１またはデルタ様４をコードする非内因性の核酸配列およびＭＨＣ分子をコードする核酸配列を含み、ｂ）ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞由来の種々のＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を単離し、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を、細胞表面上にＴＣＲを発現することができ、かつステップａ）由来のＴＣＲα鎖をコードする核酸配列を含む細胞に導入すること、および（例えば、ＭＨＣ四量体アッセイによる高親和性ＴＣＲαβ候補を検出または選択後、結合親和性を親ＴＣＲαβと比較して測定することにより）親和性増強型ＴＣＲを同定することを含む方法を提供する。
【００４５】
特定の実施形態において、造血前駆細胞は、胸腺細胞前駆細胞または胚性幹細胞を含む。他の実施形態において、造血前駆細胞は胎児肝組織由来である。他の実施形態において、造血前駆細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢血由来つまり起源とする造血幹細胞を含む。さらに他の実施形態において、造血前駆細胞は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳類動物由来である。具体的な実施形態において、ＣＤ２４ｌｏ Ｌｉｎ−ＣＤ１１７＋胸腺細胞前駆細胞を使用する。
【００４６】
造血前駆細胞は、ペプチド抗原に特異的な親ＴＣＲ由来のＴＣＲα鎖をコードする非内因性の核酸配列を含むよう改変されている。特定の実施形態において、ＴＣＲβ鎖も親ＴＣＲから単離される。ＴＣＲαおよびβ鎖のクローニングを、当技術分野で公知である標準的な分子生物学的技法を用いて行うことができる。ＴＣＲ鎖をクローニングする方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｗａｌｃｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ６：ｅ２７９３０；Ｂｉｒｋｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３４６：４５−５４；Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：３４０−３４５を参照のこと）。
【００４７】
「間質細胞」は、任意の器官の結合組織細胞である。本発明において使用することができる間質細胞には、ヒトおよびマウス間質細胞がある。ＤＬ１またはＤＬ４を発現するよう操作することができる間質細胞株の例として、マウス間質細胞株ＭＳ５（Ｉｔｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９８９，１７：１４５−１５３）およびＳ１７、ならびにヒト間質細胞株ＨＧＳ２．１１、ＨＧＳ２．５２、ＨＧＳ．１８、ＨＧＳ３．３０、ＨＧＳ３．６５、ＨＧＳ．３．６６、ＨＧＳ３．１０３、およびＨＧＳ３．１１４（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤより入手可能、米国公開公報第２００２０００１８２６号を参照のこと）がある。特定の実施形態において、間質細胞は骨髄間質細胞である。さらなる実施形態において、ＯＰ９細胞を使用する。
【００４８】
特定の実施形態において、間質細胞は、ＤＬ１、例えば、ヒトＤＬ１をコードする非内因性の核酸配列を含む。例示的なデルタ様１配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６１８．３（配列番号３）およびＮＰ＿００５６０９．３（配列番号４）（それぞれ、ホモ・サピエンス転写産物およびタンパク質配列）ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７８６５．３（配列番号５）およびＮＰ＿０３１８９１．２（配列番号６）（それぞれ、ハツカネズミ転写産物およびタンパク質配列）がある。特定の実施形態において、間質細胞は、ＤＬ４、例えば、ヒトＤＬ４をコードする非内因性の核酸配列を含む。例示的なデルタ様４配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１９０７４．３（配列番号７）およびＮＰ＿０６１９４７．１（配列番号８）（それぞれ、ホモ・サピエンス転写産物およびタンパク質配列）ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１９４５４．３（配列番号９）およびＮＰ＿０６２３２７．２（配列番号１０）（それぞれ、ハツカネズミ転写産物およびタンパク質配列）がある。Ｎｏｔｃｈリガンドは市販されており、または標準的な組み換えＤＮＡ法により生成し、種々の程度に精製することができる。
【００４９】
なおさらなる実施形態において、間質細胞はＤＬ１、例えば、ヒトＤＬ１を発現するＯＰ９細胞またはその誘導体である。ＤＬ１およびＤＬ４を発現するＯＰ９細胞はこれまでに報告されている（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１７：７４９−７５６；米国特許第７，５７５，９２５号）。
【００５０】
特定の実施形態において、間質細胞はＭＨＣ分子をコードする核酸配列も含む。具体的な実施形態において、間質細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子をコードする核酸配列を含み、場合によりβ２マイクログロブリンをコードする核酸配列も含み得る。ＭＨＣクラスＩおよびβ２マイクログロブリン分子は、当技術分野において遺伝子およびタンパク質配列が公知である、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳類種のＭＨＣクラスＩ分子由来であり得る。他の実施形態において、間質細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする核酸配列を含む。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、当技術分野において遺伝子およびタンパク質配列が公知である、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳類動物種のＭＨＣ分子由来であり得る。
【００５１】
所与のＴ細胞は宿主細胞のＭＨＣ分子に結合するときにのみ、ペプチド抗原を認識する（ＭＨＣ制限抗原認識）。本開示の方法を用いてＴＣＲ親和性を増強するために公知のペプチド抗原に特異性を有する親ＴＣＲを選択する。それゆえ、具体的なペプチド抗原と結合するＭＨＣ分子も選択され、間質細胞で発現し、本開示のインビトロ系におけるＭＨＣ制限抗原認識を可能する。ペプチド抗原と結合するＭＨＣ分子を同定する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ａｋａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ５９：５０２−５１１を参照のこと）。特定の実施形態において、ＭＨＣ分子は、例えば、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２）に結合することができる、好ましくはヒト由来のＨＬＡ−Ａ２およびベータ２マイクログロブリンを含む。他の実施形態において、ＭＨＣ分子は、例えば、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬに結合することができるマウスＨ−２ＤｂまたはＨｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１４：９２１−９２９の図３Ａに開示される種々のメソテリンペプチドまたは例えば、Ｈｕｎｇらの図３Ａに開示される種々のメソテリンペプチドに結合することができるＨ−２Ｋｂを含む。Ｈｕｎｇらにおいて開示された潜在的Ｈ−２Ｄｂ制限メソテリンエピトープには、ＩＳＫＡＮＶＤＶＬ（配列番号４２）、ＧＱＫＭＮＡＱＡＩ（配列番号４３）、ＳＡＦＱＮＶＳＧＬ（配列番号４４）、およびＬＬＧＰＮＩＶＤＬ（配列番号４５）がある。Ｈｕｎｇらにおいて開示された潜在的Ｈ−２Ｋｂ制限メソテリンエピトープには、ＥＩＰＦＴＹＥＱＬ（配列番号４６）およびＧＩＰＮＧＹＬＶＬ（配列番号４７）がある。
【００５２】
本開示の方法において使用されるペプチド抗原は、抗原のペプチド配列または親ＴＣＲが特異的に結合する標的生物学的分子（例えば、ポリペプチド、タンパク質）を指す。ペプチド配列は、細胞表面上、細胞内に発現し、または内因性膜タンパク質である抗原由来であり得る。抗原は、宿主由来抗原（例えば、腫瘍／癌抗原、および自己免疫抗原）、または外因性抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原）であり得る。腫瘍または癌抗原は、種々の癌、例えば、本明細書に記載のもの由来であり得る。いくつかの実施形態において、癌抗原は白血病抗原を含む。特定の実施形態において、ペプチド抗原はウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、例えば、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２）を含むＷＴ１ペプチド由来である。他の実施形態において、ペプチド抗原は、メソテリン、例えば、Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１４：９２１−９２９の図３Ａに開示されたメソテリンペプチド由来である。いくつかの実施形態において、メソテリンペプチドはアミノ酸配列ＧＱＫＭＮＡＱＡＩ（配列番号３１）を含む。他の実施形態において、メソテリンペプチドはＩＳＫＡＮＶＤＶＬ（配列番号４２）、ＧＱＫＭＮＡＱＡＩ（配列番号４３）、ＳＡＦＱＮＶＳＧＬ（配列番号４４）、およびＬＬＧＰＮＩＶＤＬ（配列番号４５）、ＥＩＰＦＴＹＥＱＬ（配列番号４６）、またはＧＩＰＮＧＹＬＶＬ（配列番号４７）を含むアミノ酸配列を含む。自己免疫抗原は、自己抗原に特異的な自己反応性ＴＣＲにより認識される抗原であり、結合後の免疫エフェクター機能が自己免疫疾患を生じ、自己免疫疾患を悪化させ、自己免疫疾患の進行に寄与し、自己免疫疾患に関連する症状を生じ、または重くする。例えば、コラーゲンペプチドに特異的な自己反応性ＴＣＲは、関節リウマチにおけるＴｒｅｇの抑制遺伝子治療に有用であり得る。自己免疫抗原はまた、自己免疫疾患を生じ、または自己免疫疾患の症状を介在する他の免疫細胞（例えば、自己抗体を産生するＢ細胞）上に位置する抗原であり得る。例えば、ＣＤ２０ペプチド抗原は、標的Ｂ細胞が関節リウマチに関与し、または関連する親和性増強型ＴＣＲを生成するのに有用であり得る。ペプチド抗原を培養系、本明細書に記載の造血前駆細胞および間質細胞に添加することができる。代替えとして、目的のペプチド抗原をコードする核酸配列を含む間質細胞を使用し、細胞培養液中にこのような抗原を発現させることができる。理論に束縛されることを望まないが、培養系に外因性ペプチド抗原として添加され、または間質細胞により発現したかのペプチド抗原は、間質細胞により発現したＭＨＣ分子を含む複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅ）を形成し、ＭＨＣペプチド抗原複合体を形成する。ＭＨＣペプチド抗原複合体は、培養系のＴＣＲによりＭＨＣ制限ペプチド抗原認識を可能にする。特定の実施形態において、ＯＰ９細胞を核酸配列を用いて形質導入し、ＷＴ１抗原ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２）を発現させる。他の実施形態において、ＯＰ９細胞を核酸配列を用いて形質導入し、メソテリン抗原ペプチドＧＱＫＭＮＡＱＡＩ（配列番号３１）を発現させる。
【００５３】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは一般に約７〜約１０アミノ酸長である。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、長さが多様であり、通常約１０〜２５アミノ酸長である。特定の実施形態において、親ＴＣＲのペプチド抗原特異性が公知である。他の実施形態において、親ＴＣＲのペプチド抗原特異性は、当技術分野において公知の方法を用いて決定するのに必要である（Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２６７：７９−９７；Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：８０−４）。例えば、親ＴＣＲの標的抗原が公知である場合、特異的ペプチド配列ではないが、標的抗原ポリペプチド配列由来のペプチドライブラリを、親ＴＣＲに特異的なペプチド抗原をスクリーニングし、同定するために使用することができる。
【００５４】
「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはファージであってよい。「発現ベクター」は、適切な環境に存在するときにベクターにより担持される１つ以上の遺伝子がコードするタンパク質の発現に関与することができるベクターである。
【００５５】
「レトロウイルス」はＲＮＡゲノムを有するウイルスである。「ガンマレトロウイルス」は、レトロウイルスファミリーの一属を指す。例示的なガンマレトウイルスには、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルスがあるが、それらに限定されない。
【００５６】
「レンチウイルス」は、分裂細胞および非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの一属を指す。レンチウイルスのいくつかの例として、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：例えばＨＩＶ  １型、およびＨＩＶ  ２型）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）がある。
【００５７】
コアウイルスをコードするベクターも「ウイルスベクター」として知られている。本発明との使用に適した多くの入手可能なウイルスベクターがあり、例えば、ヒト遺伝子治療の用途において同定されているもの、例えば、ＰｆｅｉｆｅｒおよびＶｅｒｍａにより報告されたもの（Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｉ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ．２００１．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２：１７７−２１１）がある。適切なウイルスベクターには、ＲＮＡウイルス系ベクター、例えば、レトロウイルス由来ベクター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターなどがあり、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えば、レンチウイルス由来ベクターがある。ＨＩＶ−１由来ベクターはこの分類に属する。他の例として、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびマエディ／ビスナウイルス由来のレンチウイルスベクターがある。レトロウイルスおよびレンチウイルスのウイルスベクターならびにＴＣＲ導入遺伝子を含有するウイルス粒子を用いて哺乳類動物の標的細胞を形質導入するためのパッケージング細胞を使用する方法が当技術分野において周知であり、これまでに、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；Ｗａｌｃｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ６：３２７９３０；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７４：４４１５−４４２３；Ｅｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４：１１５５−６８；Ｆｒｅｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：１７４８−５７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０６：９７−１１４に記載されている。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系も市販されている。
【００５８】
特定の実施形態において、ウイルスベクターを使用してペプチド抗原に特異的なＴＣＲα鎖をコードする非内因性核酸配列を造血前駆細胞に導入する。別の実施形態において、ウイルスベクターを使用し、ＤＬ１またはＤＬ４をコードする非内因性核酸配列およびＭＨＣ分子をコードする核酸配列を間質細胞に導入する。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってよい。ウイルスベクターはまた、形質導入のためのマーカーをコードする核酸配列を含んでもよい。ウイルスベクターのための形質導入マーカーは当技術分野において公知であり、薬剤耐性を付与し得る選択マーカーまたは検出可能なマーカー、例えば、フローサイトメトリーなどの方法によって検出されることができる蛍光マーカーまたは細胞表面タンパク質を含む。具体的な実施形態において、ウイルスベクターはさらに、緑色蛍光タンパク質またはヒトＣＤ２の細胞外ドメインを含む形質導入のための遺伝子マーカーを含む。ウイルスベクターゲノムが個別の転写産物として宿主細胞に発現する、２つ以上の核酸配列を含む場合、ウイルスベクターはまた、バイシストロニックまたはマルチシストロニック発現を可能にする２つ（以上）の転写産物の間にさらなる配列を含むことができる。ウイルスベクターに使用されるこのような配列の例として、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、フーリン切断部位、ウイルス２Ａペプチドがある。
【００５９】
ＤＮＡウイルスベクター、例えば、アデノウイルス系ベクターおよびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）系ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のベクター、例えば、アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶなどの他のベクターもポリヌクレオチド運搬に使用することができる（Ｋｒｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１５１７−３０）。
【００６０】
遺伝子治療のために最近開発された他のベクターも本開示の方法を用いて使用することができる。このようなベクターは、バキュロウイルスおよびアルファウイルス由来のものを含む（Ｊｏｌｌｙ  Ｄ  Ｊ．１９９９．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．ｐｐ２０９−４０  ｉｎ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ．ｅｄ．１９９９．Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ）。
【００６１】
造血前駆細胞を、非内因性のＤＬ１またはＤＬ４をコードする核酸配列およびＭＨＣ分子をコードする核酸配列を含む間質細胞とともに諸条件下において、造血前駆細胞のＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞への分化を誘導するのに十分な時間培養する。特定の実施形態において、造血前駆細胞を６ｃｍまたは１０ｃｍの組織培養処理皿で培養する。培養物中の造血前駆細胞の濃度は、１〜１０９、もしくは１×１０２〜１×１０６、または１×１０３〜１×１０４であってよい。いくつかの実施形態において、造血前駆細胞（約１〜５×１０４細胞）を、ＤＬ１を発現するＯＰ９細胞の単層上で培養する。
【００６２】
造血前駆細胞の決定および分化を促進する１つ以上のサイトカインも培養物に添加することができる。サイトカインは、ヒトまたは他の種由来であってよい。培養物中のサイトカインの濃度は、約１ｎｇ／ｍｇ〜約５０ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。使用することができるサイトカインの代表的な例として、ＦＧＦファミリーの全てのメンバー、例えば、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−２、Ｆｌｔ−３−リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびＩＬ−７がある。サイトカインをグルコサミノグリカン、例えばヘパリン硫酸と併用することができる。サイトカインは市販され、または組み換えＤＮＡ法により生成され、種々の程度に精製することができる。一部のサイトカインを標準的な生化学技法により細胞株の培養培地から精製することができる。
【００６３】
造血前駆細胞を、馴化培地、非馴化培地、または胚性幹細胞培地を含む培養培地で培養することができる。適切な馴化培地の例として、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、またはαＭＥＭ、胚性線維芽細胞（例えば、ヒト胚性線維芽細胞）で馴化または等価の培地がある。適切な非馴化培地の例として、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＤＭＤ）、ＤＭＥＭ、またはαＭＥＭあるいは等価の培地がある。培養培地が、血清（例えば、ウシ血清、胎児ウシ血清、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、または人工血清代替物）を含むことができ、または血清非含有であってよい。
【００６４】
培養条件は、造血前駆細胞のＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞への分化を誘導するのに十分な時間で造血前駆細胞を培養することを必要とする。細胞を一般に約４〜５日、好ましくは約５〜２０日間培養物中に維持する。細胞を、所望の結果、すなわち、所望の細胞組成物を得るために必要な適切な時間量で維持し得ることが理解されるだろう。例えば、おもに未成熟および不活性Ｔ細胞を含む細胞組成物を生成するために、細胞を約５〜２０日間培養物中で維持することができる。細胞を２０〜３０日間培養物中に維持し、おもに成熟Ｔ細胞を含む細胞組成物を生成することができる。非付着細胞も種々の時間点、例えば約数日〜約２５日にて培養物から回収することができる。間質細胞株上での造血幹細胞の培養方法はこれまでに報告されている（米国特許第７，５７５，９２５号；Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：４１０−４１７；Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１７：７４９−７５６）。
【００６５】
造血前駆細胞のＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞への分化を検出することができ、これらの細胞を標準的なフローサイトメトリー法を使用して単離した。１回以上の細胞選別を行い、ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞を単離することができる。例えば、１回目の細胞選別により、形質導入マーカー（すなわち、ＴＣＲα発現用マーカー）を発現する造血前駆細胞を同定することができる。特定の実施形態において、形質導入マーカーはヒトＣＤ２の細胞外ドメインである。さらなる実施形態において、形質導入マーカーポジティブ細胞に２回目の細胞選別を行い、ＣＤ４−およびＣＤ８−である細胞をスクリーニングすることができる。ＤＮ細胞上の３回目の細胞選別によりＴＣＲβを発現する細胞をスクリーニングすることができる。当業者であれば、これらの選別の一部、または単回もしくは複数回の細胞選別を細胞表面または形質導入マーカーの様々な組み合わせを用いて設計し、ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞の所望の部分集合を同定することができる。ＤＮ  ＴＣＲαβ＋細胞を選別する方法は当技術分野において公知である（米国特許第７，５７５，９２５号およびＳｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ：１７：７４９−７５６）。
【００６６】
ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞由来の種々のＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を単離し、親ＴＣＲ由来のＴＣＲα鎖をコードする核酸配列を含むＴ細胞に導入する。本明細書において詳述されるように、細胞からＴＣＲβ鎖をクローニングする方法は当技術分野において周知であり、これまでに報告されている。特定の実施形態において、候補ＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列がＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞から単離されると、核酸配列にさらなる選択プロセスを行い、それによりＴ細胞に導入するために、親ＴＣＲβ鎖により使用される同じＶβ遺伝子を含むＴＣＲβを選択する。ＴＣＲβ鎖を含有する親Ｖβ遺伝子を、Ｖβ遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲにおいて選別された細胞集団内で同定することができる。インビトロでの抗原特異的ＴＣＲの親和性を増強させることに関連した懸念の１つとして、一部の改変がペプチド／ＭＨＣよりむしろ、ＭＨＣのみの受容体の親和性を増大させ、それによりＴＣＲが自己反応性となる可能性を増大させ得ることがある。候補ＴＣＲβ鎖を親Ｖβ遺伝子を含有するものに制限することにより、ＭＨＣと接触するＴＣＲ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ドメインを保持し、ＣＤＲ３に対する多様性を制限する可能性を増大させる。これまでに詳述されているように、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、種々のＴＣＲβ鎖および／または親ＴＣＲαをコードする核酸配列をＴ細胞に導入するのに適している。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはさらに形質導入のための遺伝子マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）を含む。
【００６７】
細胞表面上にＴＣＲを発現することができる細胞を、ＤＮ  ＴＣＲαβ＋胸腺細胞由来の種々のＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を用いた形質転換または形質導入に使用する。細胞表面上にＴＣＲを発現することができる細胞はＣＤ３分子を発現する。「ＣＤ３」は、細胞表面上のＴＣＲと安定して会合する６つの鎖の多タンパク質複合体である。哺乳類動物において、複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤδ鎖、２つのＣＤ３ε、およびＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含む。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３εは、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの、関連性の高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３εの膜貫通領域は負に電荷しており、これらの鎖が正に電荷したＴＣＲ鎖と会合することを可能にする特徴がある。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖の細胞質ドメインは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有し、これはＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖を細胞質ゾルタンパク質のチロシンキナーゼと会合させた後受容体を刺激し、それにより細胞内部にシグナル伝達する。ＣＤ３タンパク質はＴＣＲの細胞表面発現に必要である（Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．４：３９，１９９７を参照のこと）。
【００６８】
いくつかの実施形態において、細胞表面上にＴＣＲを発現することができる細胞はＴ細胞、例えば、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳類動物由来の初代細胞または細胞株である。哺乳類動物から得られた場合、Ｔ細胞を多くの供給源、例えば、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液から得ることができる。Ｔ細胞を富化し、または精製することができる。Ｔ細胞株は当技術分野において周知であり、そのいくつかはＳａｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｌｅｕｋｅｍｉａ２１：２３０−２３７に記載されている。特定の実施形態において、ＴＣＲαおよびβ鎖の内因性発現を欠損しているＴ細胞を使用する。このようなＴ細胞はＴＣＲαおよびβ鎖の内因性発現が自然に欠損している可能性があり、または発現を遮断するよう改変されている可能性がある（例えば、ＴＣＲαおよびβ鎖を発現しない遺伝子導入マウス由来のＴ細胞またはＴＣＲαおよびβ鎖の発現を阻害するように操作されている細胞株）。特定の実施形態において、５８α−β−細胞、つまり内因性ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を欠損しているマウスＴ細胞株を使用する（Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｓｓｅｎ，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２２６９−７４）。他の実施形態において、Ｈ９  Ｔ細胞株を使用する（品番ＨＴＢ−１７６，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。特定の実施形態において、細胞表面上にＴＣＲを発現することができる細胞はＴ細胞またはＴ細胞系統の細胞ではないが、ＴＣＲの細胞表面発現を可能にする、ＣＤ３を発現するよう改変されている細胞（例えば、２９３細胞または３Ｔ３細胞）である。Ｔ細胞系統でない細胞上のＴＣＲの細胞表面発現はこれまでに報告されている（Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９−５９４）。
【００６９】
潜在的親和性増強型ＴＣＲを同定するため、細胞表面上にＴＣＲを発現することができ、親ＴＣＲα鎖も発現する細胞を候補ＴＣＲβ鎖のライブラリを用いて形質転換または遺伝子導入すると、抗原特異的細胞をＭＨＣペプチド四量体染色を用いて選別または同定する。ＭＨＣペプチド四量体染色はＭＨＣ分子の四量体を特徴とし、それぞれが同族（例えば、同一または関連する）少なくとも１種の抗原であるアミノ酸配列を有する同一のペプチドを含み、複合体が同族抗原に特異的なＴ細胞に結合することができる。ＭＨＣ分子のそれぞれをビオチン分子で標識することができる。ビオチン化ＭＨＣ／ペプチドを、典型的に蛍光標識するストレプトアビジンの添加により四量体化する。四量体を蛍光標識を介してフローサイトメトリーにより検出することができる。抗原特異的Ｔ細胞を検出するためのＭＨＣペプチド四量体染色法は、当技術分野において周知である（例えば、Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：９４−９６；Ｋａｌｅｒｇｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２３４：６１−７０；Ｘｕ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅａｔｏｎ，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２６８：２１−８；Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２５：１１６７）。特定の実施形態において、ＭＨＣペプチド四量体はＭＨＣクラスＩ分子を含む。他の実施形態において、ＭＨＣペプチド四量体はＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。さらなる実施形態において、本開示の方法の培養ステップで使用される同じペプチド抗原（ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｓｅｄ  ｔｈｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔｅｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）は、ＭＨＣペプチド四量体に組み込まれるペプチドと同じである。他の実施形態において、本開示の方法の培養ステップにおいて間質細胞により発現したＭＨＣ分子は、ＭＨＣペプチド四量体のＭＨＣ分子と同じである。ＭＨＣペプチド四量体染色した細胞をフローサイトメトリーにより１回または複数回選別することができる。１回目の選別は、検出可能な形質導入マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）を発現する形質導入された細胞を選択することができる。形質導入ポジティブ細胞も親ＴＣＲと同じＶβ鎖を発現する細胞に対して１回または複数回選別することができる。当業者であれば、これらの選別の一部、または単回もしくは複数回の細胞選別を細胞表面または形質導入マーカーの様々な組み合わせを用いて設計し、所望の細胞小集団を同定することができることは明らかである。
【００７０】
親和性増強型ＴＣＲを候補ＴＣＲαβと親ＴＣＲαβの結合親和性を比較することにより同定する。次いで、抗原特異的Ｔ細胞をクローン化し、標準的な分子生物学的技法を用いて配列決定することができる。次いで、候補ＴＣＲβクローンを使用し、親ＴＣＲα鎖を含むＴ細胞を形質導入することができ、ＭＨＣペプチド四量体染色を使用し、これまでに報告されたように親ＴＣＲαβと染色レベルを比較することができる。候補ＴＣＲβを用いて観察された染色の増大量が親ＴＣＲαβと比較して親和性増強型の指標となり得る。しかし、親ＴＣＲαβがＴ細胞の発現増大に対してコドン最適化された場合、候補ＴＣＲβと四量体染色レベルの直接的な比較は可能ではないかもしれない。また、親ＴＣＲβと直接比較するために、候補ＴＣＲβ鎖をコドン最適化することができる。
【００７１】
候補ＴＣＲαβは、親ＴＣＲαβよりペプチド抗原に強く結合している場合、親ＴＣＲαβと比較し親和性が増強する。親和性の増強は、親ＴＣＲの標的抗原に対するＫａ（平衡会合定数）より大きい、標的抗原に対するＫａを有するＴＣＲ、親ＴＣＲの標的抗原に対するＫＤ（解離定数）より小さい、標的抗原に対するＫＤを有するＴＣＲ、または野生型（または親）ＴＣＲの標的抗原に対する解離率（Ｋｏｆｆ）より小さい、標的抗原に対する解離率（Ｋｏｆｆ）を有するＴＣＲにより示されることができる。ＴＣＲ結合親和性を測定する方法はこれまでに報告されている（例えば、Ｌａｕｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２３７９９−２３８１０；Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：６８１８−６８２３）。
【００７２】
親和性増強型ＴＣＲおよび組成物
別の態様において、本明細書に開示の方法により生成された親和性増強型ＴＣＲを提供する。親和性増強型ＴＣＲは、細胞結合状態（例えば、成熟Ｔ細胞の表面に発現）、または可溶形態であってよい。特定の実施形態において、親和性増強型ＴＣＲをコドン最適化し、Ｔ細胞の発現を増強することができる（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９：１３５−１４５）。
【００７３】
他の実施形態において、親和性増強型ＴＣＲはまた、融合タンパク質の構成要素であってよく、これはさらに細胞毒性構成要素（例えば、ビンデシン、抗葉酸剤などの化学療法剤、細菌毒素、リシン、抗ウイルス剤）を含み、癌細胞または感染細胞あるいは検出可能な構成要素（例えば、ビオチン、蛍光部分、放射性核種）を特異的に死滅または無能力にするのに有用であり、癌細胞、感染細胞、または自己免疫攻撃下にある組織を画像化するのに有用である。
【００７４】
本開示はまた、本明細書において開示の方法により生成される親和性増強型ＴＣＲを含む薬学的組成物および薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を提供する。適切な賦形剤には水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせがある。
用途
【００７５】
本開示の方法により生成された親和性増強型ＴＣＲを使用し、親和性増強型ＴＣＲを含む組成物を投与することにより被験体の疾患（例えば、癌、感染症、または自己免疫疾患）を処置することができる。
【００７６】
親和性増強型ＴＣＲ治療で処置され得る疾患には、癌、感染症（ウイルス感染、細菌感染、原生動物感染）、および自己免疫疾患がある。ＴＣＲ遺伝子治療は種々の種類の癌（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１４：１２６−１２９；ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｊｕｎｅ，２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：１４６６−１４７６）および感染症（Ｋｉｔｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ４：３８２０８；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１４４４−５４；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．６：ｅ１００１０１８；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８９：９０３−９１３）において期待される処置である。自己反応性ＴＣＲを含む制御性Ｔ細胞を使用する、自己免疫疾患のための免疫抑制遺伝子治療も新たな処置である（Ｆｕｊｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：８１４０−８１４７；Ｂｒｕｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２３：３７１−３９０）。
【００７７】
多種多様な癌、例えば、充実性腫瘍および白血病は、本明細書に開示の組成物および方法に適している。処置され得る癌の種類には、乳房、前立腺および結腸の腺癌腫、肺の気管支原性癌腫の全ての形態、骨髄性、悪性黒色腫、肝細胞癌、神経芽腫、乳頭腫、アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、および癌腫（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン・ピアース癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス２癌、メルケル細胞癌、膠様癌、非小細胞性肺癌、燕麦細胞癌、乳頭癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮癌、および移行上皮癌）がある。処置され得る癌のさらなる種類には、組織球性障害、白血病、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖性小腸疾患（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮症、悪性黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍がある。さらに、以下の種類の癌も処置に適しているとして考慮される：腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、肝細胞癌、汗腺腫、膵島細胞腫瘍、ライジッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉種、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クローム親和性傍神経節腫。処置され得る癌の種類には、被角血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、血管球腫瘍、血管内皮腫、血管腫、血管外皮腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌腫、横紋筋肉腫、肉腫、新生物、神経線維腫症、および子宮頚部異形成もある。
【００７８】
増強型ＴＣＲ治療に適した種々の過剰増殖障害の例は、Ｂ細胞癌、例えば、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、種々の形態のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または中枢神経系リンパ腫）、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病および慢性骨髄芽球性白血病）および骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）である。さらなるＢ細胞癌には、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性度不定のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、および移植後リンパ増殖性疾患である。
【００７９】
自己免疫疾患には、関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、多発性軟骨炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、炎症性ミオパシー、中毒性表皮壊死症、全身性硬化症および硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群、炎症性腸疾患に関連した反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤に関与する状態および慢性炎症反応、アテローム性動脈硬化、自己免疫性心筋炎、白血球粘着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性皮膚エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、ループス脊髄炎、ループス脳炎、若年発症性糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、リウマチ熱、シデナム舞踏病、サイトカインおよびＴリンパ球により介在される急性および遅延型過敏症に関連する免疫反応、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例えば、ウェゲナー肉芽腫症およびチャーグ・ストラウス病、無果粒球症、脈管炎（例えば、過敏性脈管炎／血管炎、ＡＮＣＡおよびリウマチ性脈管炎）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、免疫性溶血性貧血、例えば、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第８因子欠乏症、血友病Ａ、自己免液性好中球減少、汎血球減少、白血球減少症、白血球漏出に関与する疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器損傷症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多内分泌腺症、血清反応陰性脊椎関節症、ライター病、スティッフマン症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合体性腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経炎またはＩｇＭ介在性神経炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、自己免疫性血小板減少症、精巣および卵巣の自己免疫疾患、例えば、自己免疫性精巣炎および卵巣炎、原発性甲状腺機能低下症、自己免疫性内分泌疾患、例えば、自己免疫性甲状線炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アディソン病、グレーヴス病、多腺性自己免疫症候群（または自己免疫性多腺性内分泌症候群）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれるＩ型糖尿病およびシーハン症候群、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）と非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、ギラン・バレー症候群、大血管炎（例えば、リウマチ性多発筋痛症および巨細胞性（高安）動脈炎）、中血管炎（例えば、川崎病および結節性多発動脈炎）、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）強直性脊椎炎、バージャー病（ＩｇＡ腎障害）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病（グルテン性腸症）、クリオグロブリン血症、肝炎に関連したクリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠動脈疾患、家族性地中海熱、顕微鏡的多発血管炎、コーガン症候群、ヴィスコット・アルドリッチ症候群および閉塞性血栓性血管炎がある。
【００８０】
具体的な実施形態において、本明細書に開示の方法により生成された親和性増強型ＴＣＲを用いて被験体を処置する方法には、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、または慢性骨髄性白血病の被験体を含む。
【００８１】
感染症には、感染因子に関連するものを含み、種々の細菌（例えば、病原性大腸菌、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、リステリア属、リケッチア属、クラミジア属など）、マイコバクテリア、および寄生生物（例えば、原生動物の任意の公知の寄生メンバー）のいずれかを含む。感染性ウイルスには、真核生物ウイルス（例えば、アデノウイルス、ブニヤウイルス、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病）、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザ）、ポックスウイルス（例えば、ワクチニア）、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、ＨＣＶ）など）がある。特定の実施形態において、抗原をプロセシングし、ＭＨＣクラスＩ分子を用いて提示される細胞質ゾル病原体を含む感染を本発明の親和性増強型ＴＣＲで処置する。
【００８２】
親和性増強型ＴＣＲを、細胞結合形態（すなわち、標的細胞集団（成熟Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）またはＴ細胞系統の他の細胞の遺伝子治療））において被験体に投与することができる。具体的な実施形態において、被験体に投与される親和性増強型ＴＣＲを含むＴ細胞系統の細胞は自己細胞である。別の実施形態において、親和性増強型ＴＣＲを可溶性形態で被験体に投与することができる。可溶性ＴＣＲは当技術分野において公知である（例えば、Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：４３８−４４３；米国特許第６，７５９，２４３号を参照のこと）。
【００８３】
「処置する」および「処置」は、被験体（すなわち、ヒトまたは非ヒト哺乳類動物（例えば、霊長類、マウス、ラット）であり得る個体）の疾患、障害、または病態の医学的管理を指す。一般に、適切な用量および処置方法により、治療的または予防的恩恵をもたらすのに十分な量の本明細書に記載の親和性増強型ＴＣＲおよび場合により補助剤を提供する。治療的および予防的恩恵には、臨床的転帰の改善、疾患に関連する症状の軽減または緩和、症状発症の減少、生活品質の改善、長い無病状態、疾患の程度の縮小、疾患状態の安定化、疾患の進行の遅延、寛解、生存、または長命がある。
【００８４】
親和性増強型受容体を含む薬学的組成物を、医学分野の当業者により決定された処置（または予防）される疾患または病態に適切に投与することができる。適正な用量、適切な期間、および組成物の投与頻度は、患者の病態、疾患の規模、種類および重症度、有効成分の具体的な形態、および投与方法などの因子により決定されるだろう。
【００８５】
さらなる実施形態において、本開示の親和性増強型ＴＣＲを診断方法または画像方法、例えば、本明細書に同定される徴候または病態に関連して使用されるこれらの方法に使用することができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例は、本開示により提供されるように、例えば、ＴＣＲ遺伝子導入胸腺細胞をＯＰ９−ＤＬ１培養物中の同族抗原に暴露させたときに「γδ様」ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ２４−ＴＣＲβ＋系統に効率よく分化することを例証する。さらに、腫瘍抗原ＷＴ１に特異的なＴ細胞クローン由来のＴＣＲα鎖のみを発現する前駆体胸腺細胞もＯＰ９−ＤＬ１培養物中の成熟ＴＣＲαβ＋系統に分化することができる。ＴＣＲβ鎖のライブラリをこれらの培養物から選別したＤＮ  ＴＣＲαβ＋細胞集団から生成し、抗原特異的ＴＣＲα鎖と対合したときのＷＴ１  ＭＨＣ四量体反応度をスクリーニングした。これらの手法を使用して、抗原特異的ＴＣＲα鎖と対合することができるいくつかのＴＣＲβ鎖を同定し、元のＴＣＲに比較して最大１０倍のＷＴ１ペプチドの親和性を有するＴＣＲを生成することができた。
【００８７】
実施例１：ＯＰ９−ＤＬ１細胞上で分化中のペプチドアゴニストの増殖によりＴＣＲ遺伝子導入マウスから精製されたＴ細胞前駆細胞由来の成熟ＴＣＲαβ＋ＤＮ細胞の分化を促進することができる。
【００８８】
β選択前のαβＴＣＲを介したアゴニストシグナルにより、インビボでのＴ細胞成長中の「γδ様」ダブルネガティブ（ＤＮ）ＴＣＲαβ＋細胞の分化が生じ、ＤＮ３段階でのＴＣＲ交差が、インビトロでのＯＰ９−ＤＬ１細胞上のＴ細胞分化中の同様の系統の分化を生じる。ＴＣＲ遺伝子導入マウス由来の前駆Ｔ細胞もＤＮ３段階で同族のペプチド抗原に応答してＤＮ  ＴＣＲαβ＋系統に分化することができたかどうかを決定するため、ＴＣＲαβ−ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ１１７＋ＣＤ４４＋ＤＮ１およびＤＮ２前駆胸腺細胞を遺伝子導入ＯＴ−１マウス（ＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｋｂ上に提示されるオバルブミンペプチド配列ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）に特異的なＴＣＲを発現、ストック液番号００３８３１、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＥ、またＨｏｇｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ７６：１７−２７を参照のこと）から選別し、ペプチドの非存在下、またはオバルブミン特異的ペプチド（配列番号１）の高濃度下のいずれかにおいて、マウスＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２Ｋｂを発現するように形質導入されたＯＰ９−ＤＬ１細胞（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１７：７４９−７５６；米国特許第７，５７５，９２５号）とともに２０日間培養し、フローサイトメトリーにより種々の時間点にて分析した。ペプチドの非存在下において、ダブルポジティブ（ＤＰ）Ｔ細胞は１６日目に検出することができ、２０日目に培養物の主要な画分を構成した（図１Ａ）。しかし、ＤＰ  Ｔ細胞の成長つまり生存は、非常に低濃度のペプチド（０．０００１μＭ）で消失し、ＤＰは０．０１μＭ以上のペプチドを含有する培養液から完全に存在しなくなり（図１Ａ）、ＤＰ細胞がＯＰ９−ＤＬ１培養物中の強いアゴニストシグナル伝達により負に選択されることを示した。
【００８９】
かなり強いアゴニストシグナルがＴＣＲαβ＋ＤＮ細胞の成長を促進するかどうかを決定するために、ＤＮ集団のＣＤ２４発現、全ての未成熟前駆Ｔ細胞集団上に高レベルに発現する成熟マーカーおよびＴＣＲβを分析した。細胞の大部分に、５日目に高レベルのＣＤ２４を発現し、ＴＣＲβを発現しないことが認められたが（図１Ｂ）、１６日目に全ての培養条件からの大部分のＤＮ細胞がＴＣＲβを発現したが、０．０１μＭ以上のペプチドを含有する培養物から、かなりの相当量のＣＤ２４−細胞が観察された（ペプチド非含有培養物中の６．９％ＴＣＲ＋ＣＤ２４−に比較し、それぞれ０．０１および１．０μＭのペプチドを含有する培養液中において３８．２％および３１．４％のＴＣＲ＋ＣＤ２４−細胞）（図１Ｂ）。２０日目に０．０１μＭまたは１．０μＭのペプチドを含有する培養物の全てのＤＮ細胞の約６０％がＴＣＲ＋ＣＤ２４−であったが、ペプチドを含有しない、または低濃度（０．０００１μＭ）のペプチドを含有する培養物において約２０％のＤＮのみがＴＣＲβ＋ＣＤ２４−であり、５０％近くがＴＣＲβ−であった（図１Ｂ、１Ｃ）。さらに、ＴＣＲ表面発現のレベルを様々な培養条件間で比較すると、高レベルのペプチドに応答して成長したＴＣＲβ＋細胞は、細胞表面上で高レベルのＴＣＲβを発現した（図１Ｃ）。理論に束縛されることを望まないが、ペプチドを添加しなかった培養物中の一部のＴＣＲαβ＋ＤＮ細胞の成長は、ＯＰ９−ＤＬ１培養系の他のペプチド−ＭＨＣリガンドとの交差反応によるものであることが考えられる。これらの培養物中に観察されたＴＣＲαβ＋ＤＮ細胞がＤＰ段階を通して成長しなかったことを確認するために、まだ正に選択されていなかったＣＤ６９−ＤＰ細胞をＢ６またはＯＴ−１胸腺から選別し、オバルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号１）の存在下または非存在下において培養した。Ｂ６  ＤＰ細胞はＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号１）の存在により影響されなかったが、ＯＴ−１  ＤＰ胸腺細胞をＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）の存在下においてＯＰ９−ＤＬ１細胞上で培養したときに、負の選択の特徴全て、例えば、かなりの細胞充実度の減少および共受容体の発現低下を観察した（図２）。重要なことは、これらの培養物に観察されたＤＮ細胞は、均一にＴＣＲネガティブであった（図２）。
【００９０】
これらのデータは、ＯＰ９−ＤＬ１細胞上の分化中のペプチドアゴニストの増殖がＴＣＲ遺伝子導入マウスから精製されたＴ細胞前駆細胞由来の成熟ＴＣＲαβ＋ＤＮ細胞の分化を促進することができることを示す。
【００９１】
実施例２：遺伝子導入ＴＣＲα鎖は内因性ＴＣＲβ鎖と対合し、ＯＰ９−ＤＬ１培養系中でＤＮ  ＣＤ２４−ＴＣＲαβ＋「γδ志願」細胞の成長を促進する。
【００９２】
β選択前のＴＣＲα鎖のみの発現も、特定の親和性閾値より上でＯＰ９−ＤＬ１培養系のペプチド−ＭＨＣリガンドとの係合が可能な導入されたＴＣＲα鎖と対合する内因性ＴＣＲβ鎖を発現する、ＤＮ３  Ｔ細胞前駆細胞の系統分岐を生じるかどうかを決定するために、ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ１１７＋ＣＤ４４＋ＤＮ１およびＤＮ２前駆胸腺細胞は、Ｂ６マウスから選別され、３ＤαのＣＤＲ３領域の飽和突然変異誘発ライブラリから単離された親和性増強型変異体としてこれまでに同定されているウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）特異的Ｔ細胞クローン３Ｄ由来のＴＣＲα鎖を用いて形質導入された。３Ｄα発現構築物は、リボソーム内エントリー配列モチーフを含有し、これを受けて形質導入マーカー（ｍａｒｋｅｒ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）としてヒトＣＤ２の細胞外ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７６７．３（配列番号４８）およびＮＰ＿００１７５８．２（配列番号４９）（それぞれ、完全長ＣＤ２の転写産物およびタンパク質配列））（ＩＲＥＳ−ｈＣＤ２）を含有する。形質導入された前駆胸腺細胞を１．０μＭのＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｄｂ制限ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２）の存在下または非存在下において１４日間培養後、フローサイトメトリーにより分析した。培養条件にペプチドが存在したにも関わらず、ｈＣＤ２ネガティブ画分内のＤＮ細胞はほとんどＴＣＲαβ＋細胞を含有しなかった。対照的に、ペプチドを含有しなかった培養物由来のｈＣＤ２ポジティブ画分（３Ｄα遺伝子を発現）は、６．８％のＴＣＲβ＋細胞を含有し、１．０μＭのＷＴ１ペプチドを添加すると、ＴＣＲαβ＋細胞の数は１６．６％に増加した（図３Ａ）。これらのデータは、大きなＴＣＲαβ＋ＤＮ細胞集団がβ選択前にＴＣＲα鎖を異所的に発現する初期前駆胸腺細胞から成長することができることを示す。さらに、このＴＣＲαβ＋ＤＮ細胞集団が（導入されたＴＣＲα鎖の）同族ペプチドが存在するときに増大することは、これらの細胞のかなりの画分がＷＴ１抗原特異的シグナルに応答して成長したことを示唆する。
【００９３】
それとともに、これらのデータはＴＣＲαβ＋ＤＮ集団が、導入された３Ｄαと対合し、元の親和性増強型受容体よりＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体の親和性が高く、通常のＴ細胞レパートリーから単離できるものよりかなり高いＴＣＲを形成することができるＴＣＲβ鎖を発現する細胞を潜在的に含有することができたことを示す。
【００９４】
それゆえ、３Ｄα形質導入されたＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ１１７＋ＣＤ４４＋ＤＮ１およびＤＮ２前駆胸腺細胞は、マウスＭＨＣクラス１  Ｈ−２Ｄｂを発現するＯＰ９−ＤＬ１細胞上で分化し、また形質導入されＷＴ１を発現した。非付着細胞を数日から最大２１日目に回収し、ｈＣＤ２＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＴＣＲβ＋細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に選別する（図３Ｂ）。各回収日の細胞選別物をプールし、ＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを生成した。親３Ｄ  ＴＣＲはＶｂ１０可変領域を使用する。ＭＨＣと接触するＴＣＲ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ドメインを保持するために、候補ＴＣＲβ鎖をこの可変領域を含有するものに制限した。それゆえ、選別された細胞集団内のＶβ１０含有ＴＣＲβ鎖をＶβ１０特異的フォワードプライマーおよびＣβ２特異的リバースプライマーを用いてＰＣＲにより単離した（図３Ｃ）。Ｖｂ１０特異的フォワードプライマーをｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に定方向ＴＯＰＯクローニングし、次いで、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組み換え技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング用のａｔｔＲ部位およびｃｃｄＢ遺伝子を含有するように改変されているレトロウイルスベクターＭｉｇＲ１−ａｔｔＲ（ＭｉｇＲ１ベクターの一型（Ｐｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ９２：３７８０−３７９２））に移入することを可能にするＣＡＣＣ配列を含有するよう設計した。ＭｉｇＲ１−ＴＣＲβライブラリを使用し、ＰｌａｔＥレトロウイルスパッケージング細胞（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ７：１０６３−１０６６；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ）を形質導入し、レトロウイルス上清を生成し、次いでこれを使用し、レトロウイルスによって形質導入した５８α−β−細胞、つまり内因性ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を欠失しているマウスＴ細胞株、（５８−／−）を作製した（Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｓｓｅｎ，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２２６９−７４）。
【００９５】
レトロウイルスＴＣＲβライブラリ上清を漸増し、形質導入後に２０％未満の形質導入された細胞を生じる希釈を使用し、ほとんどの細胞が１種のレトロウイルスのみのインテグレーションを含有することを確実にした。形質導入された細胞をまずＧＦＰポジティブ細胞に選別し、次いでＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体染色が高レベルのＶβ１０＋細胞上で２回以上再選別した（図４Ａ）。２回目の選別後、細胞を関連しないがＧＰ３３に特異的なＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂペプチド四量体の染色について分析し、ＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体ポジティブ細胞がＭＨＣ残基にペプチド非依存的に結合しているかどうかを評価した（図４Ａ）。
【００９６】
高レベルのＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体の３回目の選別後、ライブラリ形質導入された５８−／−細胞、つまり選別された細胞を増殖し、溶解し、ＤＮＡを単離した。レトロウイルス挿入物をＭｉｇＲ１−ａｔｔＲベクター特異的プライマーを用いるＰＣＲにより回収し、ベクター由来のＡｔｔＢ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング部位を含むよう設計した。２段階手法を使用し、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組み換えクローニング法を用いて挿入物をまずｐＤＯＮＲ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した後、ＭｉｇＲ１−ａｔｔＲに戻した。個々の細菌コロニーを組み換えクローニング反応から取り出し配列決定した。３０より多いクローンの配列分析後、４つの最も多いＴＣＲβ鎖をさらなる分析用に同定した。興味深いことに、クローンのいくつかは、複数の保存残基を元の３Ｄβ鎖と共有したＣＤＲ３β配列を有した（図４Ｂ）。クローンの１つ（クローン番号１）はＰ１０８Ｑ置換およびＧ１１２Ｓ置換を除き、元の３Ｄβにほぼ同一であることがわかった（図４Ｂ）。４つの候補ＴＣＲβ鎖を３Ｄα＋５８−／−細胞にレトロウイルスにより形質導入し、フローサイトメトリーにより分析した（図４Ｃ）。３Ｄα＋５８−／−細胞に形質導入したときに、４つ全ての候補クローンはＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体と結合したが、クローン番号４は他のものよりかなり低レベルでＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体と結合し、さらに分析は行わなかった。親３Ｄβ鎖を予めコドン最適化していたため、細胞表面に高レベルのＴＣＲを発現し、３Ｄβおよび単離したクローンとの間の四量体染色レベルの直接の比較から除外した。
【００９７】
ＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体のＴＣＲβ鎖のそれぞれの相対的な親和性をより直接評価するために、３Ｄαを用いて形質導入された３Ｄα＋５８−／−細胞および候補ＴＣＲβ鎖のそれぞれをＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体の２倍希釈液６つを用いて染色し、ＭＦＩ値を最大半量結合となるリガンドの濃度として非線形回帰による飽和結合曲線に嵌合させた（図５Ａ）。３Ｄαと対合したときに、３つ全ての候補ＴＣＲβ鎖の見かけの親和性が親３Ｄβより高いことがわかり、クローン番号１は、約１０倍高い親和性を有した（図５Ａ）。それゆえ、クローン番号１と対合した３Ｄαと親３Ｄβの四量体染色を直接比較するために、クローン番号１を元の３Ｄβとクローン番号１との配列差のみがＣＤＲ３領域にあるようにコドン最適化した。両方の構築物を５８−／−細胞に形質導入し、ＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体染色をフローサイトメトリーにより評価した。クローン番号１をコドン最適化したときに、予測されたように元の３Ｄβより高レベルで四量体と結合することがわかった（図５Ｂ）。
【００９８】
インビトロでの抗原特異的ＴＣＲの親和性の増強に関連する懸念の１つに、一部の改変がペプチド／ＭＨＣよりむしろＭＨＣのみに対する受容体の親和性を増大させ、それによりＴＣＲが自己反応性になる可能性が高まる可能性がある。この危険は、ＴＣＲβライブラリを同じ可変ドメイン（Ｖｂ１０）を共有するＴＣＲβ鎖に制限し、ＣＤＲ３に対する多様性を制限することにより最小限となった。候補ＴＣＲβ鎖のいずれかがＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂ分子とペプチド非依存的に結合する傾向を増大させるかどうかを決定するため、形質導入された５８−／−細胞をＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂ四量体（ペプチド：ＷＴ１、ＧＰ３３、Ｅ４、ＭＥＳＮ、ＳＱＶ）のパネルを用いて染色した。３つ全ての候補ＴＣＲβ鎖を、元の３Ｄβと同様に３Ｄαと対合したときに高レベルにてＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体により染色した（図５Ｃ）。４つの他のＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂペプチド四量体で染色したときに、３つ全てのＴＣＲβ鎖は、四量体染色に均一にネガティブであり、これらの受容体で観察された親和性の増大がＭＨＣのみの親和性の増大の結果ではないことを示唆した（図５Ｃ）。
【００９９】
実施例３：インビトロでの初期ヒトＴ細胞成長中の抗原特異的ＴＣＲα鎖の異所性発現による高親和性ＷＴ１−特異的Ｔ細胞の生成
【０１００】
ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）抗原は、白血病細胞の表面に異常に高い量で発現する。ＨＬＡ  Ａ２／ＷＴ１特異的Ｔ細胞クローンの特異的活性の高いクローンをスクリーニングした。ＷＴ１に最も高親和性を有するように決定されたＣ４クローン由来のＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を単離した。Ｃ４  ＴＣＲを含み、高レベルに発現するレンチウイルスベクターは、２０１２年に予定されたＴＣＲ遺伝子治療臨床試験の題材である。ＷＴ１抗原に対するＣ４  ＴＣＲの親和性をさらに増強させるために、これまでの実施例に記載のインビトロでの分化系を、Ｃ４  ＴＣＲα鎖を発現するヒト臍帯血前駆細胞に使用した。
【０１０１】
ＷＴ１特異的Ｔ細胞の生成
ヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１８９３０．１（配列番号５０）およびＡＡＡ８７０７６．１（配列番号５１）、それぞれ転写産物およびタンパク質配列）およびヒトクラスＩ  ＭＨＣβ２マイクログロブリン（β２Ｍ）分子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４０４８．２（配列番号５２）およびＮＰ＿００４０３９．１（配列番号５３）、それぞれ転写産物およびタンパク質配列）を発現する実施例１に記載のＯＰ９−ＤＬ１細胞株の変異体を生成した。Ｃ４  ＴＣＲクローンのＴＣＲα鎖を形質導入マーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もコードするレトロウイルスベクターを用いたレトロウイルス形質導入により臍帯血由来造血前駆細胞に安定して形質導入した。ＧＦＰを発現する前駆細胞をフローサイトメトリーにより選別し、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２）の存在下または非存在下においてＯＰ９−ＤＬ１−Ａ２／β２Ｍ間質細胞上で培養した。ヒト造血細胞前駆細胞は容易に増殖し、ＯＰ９−ＤＬ１培養において、表現型ＣＤ３４＋ＣＤ１ａ＋ＣＤ４＋を特徴とするヒトＴ細胞成長段階に（Ｌａ  Ｍｏｔｔｅ−Ｍｏｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｌｏｏｄ  １０５：１４３１−１４３９）、β、γ、およびδ遺伝子座でＴＣＲ遺伝子再構成を行う点にて分化する（Ｓｐｉｔｓ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７６０−７７２）。マウス対応物のように、ＴＣＲβ遺伝子座でインフレーム再構成を生じるＴＣＲα発現ヒトＴ細胞前駆細胞は、２つの細胞運命の１つである、遺伝子導入ＴＣＲαと十分に対合しないＴＣＲβまたは遺伝子導入ＴＣＲαと対合するが、そのαβＴＣＲを介して強いシグナルを受け取らないＴＣＲβ鎖を発現するものがプレＴＣＲを介したシグナル伝達に応答してＤＰ段階に分化する運命、もう一方は、遺伝子導入ＴＣＲαと対合し、この成熟αβＴＣＲを介して十分に強いシグナルを受け取ることができるＴＣＲβを生成するものにシグナル伝達され、ＤＮ  ＴＣＲαβ＋γδ様系統に分化する運命に適合すると仮定する。ＤＰ細胞のみがポジティブ選択シグナルなしで約３〜４日間生存するため、かつ有効なポジティブ選択がＯＰ９−ＤＬ１培養において生じないため、αβＴＣＲを介したアゴニストシグナルを受け取らない膨大な細胞が培養物から排除され、初期αβＴＣＲシグナル伝達により成長するγδ様細胞を蓄積させることを可能にする。
候補ＴＣＲβ鎖の単離
【０１０２】
培養の種々の点で、ＤＮ  ＴＣＲαβ＋γδ様表現型を有し、ＷＴ１ペプチド／Ａ２  ＭＨＣ−四量体ポジティブである非付着細胞を細胞選別により回収する。培養物中の抗原が継続して存在することが検出未満に四量体染色を減少させ得るＴＣＲ発現低下を生じ得るとして、ＷＴ１四量体ポジティブ細胞を検出することができない可能性がある。さらに、これらの細胞は恐らくＣＤ８αβを発現しないため、ＣＤ８非依存性でない高親和性受容体を四量体染色により検出することができない。それゆえ、培養物中に出現する全てのＤＮ  ＴＣＲαβ＋細胞由来のＴＣＲβ鎖をスクリーニングする必要があり得る（以下を参照のこと）。候補Ｔ細胞を元のＣ４  ＴＣＲβ鎖（Ｖβ１７）により利用される同じＶβセグメントを使用するものに制限し、親Ｃ４  ＴＣＲのＣＤＲ１およびＣＤＲ２  ＭＨＣ接触を保持することも望ましい。
【０１０３】
細胞選別後、内因性ＴＣＲβ鎖は、総ＲＮＡを精製しＣ−β１またはＣ−β２プライマーを用いる全長ＲＡＣＥ  ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、つまりに定方向ＴＯＰＯクローニングを可能にし、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）技術組み換え系を用いたレトロウイルスベクターのＭｉｇ−ａｔｔＲ（目的の遺伝子を挿入するためのａｔｔＲ部位を含有するＭｉｇＲ１の変異体（Ｐｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ９２：３７８０−３７９２））への迅速および効率的な移入を可能にするａｔｔＬ部位を組み込むベクターにクローニングすることによりクローン化される。組み換え反応の産物を効率性の高い細菌に電気穿孔し、コロニーを合わせて引っ掻き、マキシプレップを行い、潜在的なＷＴ１−反応性ＴＣＲβ鎖のレトロウイルスライブラリを生成する。
高親和性ＷＴ１特異的ＴＣＲのスクリーニング
【０１０４】
Ｃ４  ＴＣＲαと対合し、高親和性ＷＴ１特異的ＴＣＲを形成することができるＴＣＲβ鎖を、ＴＣＲβライブラリをＣ４  ＴＣＲα鎖（Ｈ９−Ｃ４α）を発現するよう形質導入されているヒトＴ細胞株Ｈ９（品番ＨＴＢ−１７６，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に形質導入することにより同定する。形質導入された細胞を高レベルのＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体染色のフローサイトメトリーにより選別し、レトロウイルス挿入物を選別した集団からＰＣＲにより増幅させた。候補ＴＣＲβ鎖をＰＣＲ産物のＴＯＰＯクローニングにより同定した後配列分析を行う。選択されたＴＣＲβ鎖および親Ｃ４αをＨ９−Ｃ４α細胞に形質導入し、ＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド四量体の相対的な親和性をＰＥ結合四量体の連続２倍希釈を用いて形質導入した細胞を染色することにより算出する（実施例２に記載）。親和性の値を、各希釈液に対するＭＦＩを非線形回帰および最大半量結合を生じる四量体濃度として定義されるＫＤによる結合曲線に嵌合することにより決定する。Ｃ４  ＴＣＲαと対合し、野生型Ｃ４受容体に比べＭＨＣペプチド四量体染色により親和性が高いＴＣＲを生成することができるＴＣＲβ鎖をさらに、安全性および有効性において特徴づける。
【０１０５】
実施例４：インビボでのＷＴ１標的化ＴＣＲ遺伝子治療のマウスモデルを使用した、候補高親和性ＴＣＲの有効性および安全性の特徴づけ
【０１０６】
実施例３で同定されている親和性増強型ヒトＷＴ１特異的ＴＣＲの、ＷＴ１標的化遺伝子治療のＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスモデルの安全性および有効性を試験する。
増強型ＴＣＲのオフターゲット活性の評価
【０１０７】
高親和性ＴＣＲの広宿主域活性をＷＴ１ペプチドの存在下または非存在下において標的細胞を発現するＡ２のパネルに応答したＴＣＲ形質導入されたＴ細胞によるサイトカイン産生を測定することにより評価する。親Ｃ４  ＴＣＲと比較してＷＴ１ネガティブ標的細胞のオフターゲット認識を示すＴＣＲはさらなる試験を行なわなかった。
インビボでの正常組織の親和性増強型ＴＣＲ活性
【０１０８】
正常組織のＷＴ１発現はマウスおよびヒトの両方で類似しており、Ｃ４  ＴＣＲにより認識されたＷＴ１ペプチドはマウスと同一であり、マウス細胞によりプロセシングされ、提示されることが知られている（Ｇａｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ９６：１４８０−９）。ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスを使用し、Ｔ細胞を発現するヒト高親和性ＷＴ１特異的ＴＣＲによる正常組織の認識を試験している（Ｋｕｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６：４６３−４７５）。
【０１０９】
これまでの実施例に開示のようにインビトロで生成された親和性増強型ＴＣＲの安全性を評価するために、（マウスＣＤ８に結合する）Ｄｂのα３に融合したＡ２のα１およびα２ドメインをコードする導入遺伝子を発現するＢ６．Ａ２／Ｄｂマウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｎｅｗｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２４７３−２４８０）を、発現した候補親和性増強型ＴＣＲに形質導入する。ＴＣＲを形質導入の前にマウスＴ細胞の発現を増加させる、ヒトよりむしろマウスＣαおよびＣβドメインを含有するよう改変する（Ｐｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．９：５６１−５７０）。マウスへのＴＣＲ形質導入したＴ細胞の移入後約４〜６週間で、自然にＷＴ１を発現することが知られている組織（例えば、肺および腎臓）のＴ細胞の浸潤および組織損傷の証拠を組織学により分析し、骨髄のＷＴ１発現造血前駆細胞の枯渇をフローサイトメトリーにより評価する。
親和性増強型と標的認識および機能の改善との相関
【０１１０】
親和性閾値がＴＣＲに対して存在する可能性があり、それを上回るさらなる増強はＴ細胞機能を増大させず、実際に抗原感受性を低下させ得ることが明らかである（Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：４９３６−４６）。それゆえ、高親和性ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の、特定のペプチド濃度でパルスを与えた標的細胞への応答を、親Ｃ４  ＴＣＲを発現するＴ細胞と比較する。サイトカイン産生（ＩＦＮγ／ＩＬ−２）および増殖ならびに溶解活性を分析する。親和性の増大および機能の増強を示すＴＣＲにさらなる試験を行い、ＴＣＲ遺伝子治療試験における使用の可能性について追及する。
【０１１１】
実施例５：インビボでの高親和性ＷＴ１特異的Ｔ細胞の生成
【０１１２】
インビボのマウスモデル（ＴＣＲαレトロジェニックマウス）を使用し、ＴＣＲβ＋ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞が胸腺において成長することができるかどうかを決定した。レトロジェニック（レトロウイルスにより形質導入された）マウスは、形質導入方法と比較して特異的ＴＣＲ導入遺伝子を発現するマウスの迅速な生成を可能にする。レトロジェニックマウスを作製する方法は当技術分野において公知である（例えば、Ｈｏｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：４０６−４１７；Ｈｏｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３：１９１−１９７；Ｂｅｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３６：２６５−２７２）。つまり、造血前駆／幹細胞をＢ６マウスの骨髄から精製し、高親和性ＷＴ１特異的３Ｄ−ＰＹＹ  ＴＣＲまたは低親和性メソテリン特異的ＴＣＲ  ７４３１のいずれかからＴＣＲα鎖を発現するよう形質導入した。３Ｄ−ＰＹＹ  ＴＣＲは、Ｔ細胞提示系およびＷＴ１／Ｄｂ  Ｉｇ  ＤｉｍｅｒＸ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた選択を使用して同定された、３Ｄ  ＴＣＲから操作されたより高親和性ＴＣＲである（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６：５１９３−５２００；Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３３９：１７５−１８４）。３Ｄ−ＰＹＹ  ＴＣＲαまたは７４３１α導入遺伝子を含むレトロウイルス構築物も、２つの導入遺伝子間にＩＲＥＳを有する、形質導入マーカーとしてのヒトＣＤ２の細胞外ドメインを含む。形質導入された骨髄由来前駆細胞を、致死照射したＢ６宿主マウスに移入し、導入されたＴＣＲα鎖を発現する骨髄キメラを生成した。インビボのＴＣＲα形質導入された骨髄細胞の移入６週間後にマウスを屠殺した。胸腺および脾臓由来の細胞のＣＤ４およびＣＤ８発現をフローサイトメトリーにより分析した（図６Ａ、６Ｂ）。胸腺のＴＣＲβ＋細胞によるＣＤ４およびＣＤ８発現の分析（図６Ａ）は、大きなダブルネガティブＴＣＲβ＋細胞集団を、成長中の初期にＴＣＲα鎖を異所的に発現する形質導入された胸腺細胞においてインビボで検出することができることを示し、かつこの集団が高親和性ＴＣＲ（例えば、３Ｄ−ＰＹＹα）由来のＴＣＲαを発現するマウスにおいてより顕著であることを示す。３Ｄ−ＰＹＹαおよび７４３１αレトロジェニックマウス由来のＤＮ  ＴＣＲβ＋胸腺細胞のＶβ１０およびＶβ９の発現それぞれも分析した（図６Ａ）。これらのデータは、ＤＮ  ＴＣＲβ＋集団の、元の抗原特異的ＴＣＲと同じＶβ遺伝子セグメントを利用する細胞を富化することを示す。それと合わせて、これらのデータは、ＤＮ  ＴＣＲβ＋細胞が胸腺に発現した標的抗原（すなわち、ＷＴ１またはメソテリン）と同族の相互作用から得られる相対的に強いＴＣＲシグナル伝達に応答し成長するという仮設を裏付ける。ＴＣＲβ＋レトロジェニック脾細胞のＣＤ４およびＣＤ８発現の分析は、これらのＤＮ  ＴＣＲβ＋細胞もレトロジェニックマウスの周辺に存在することを示す（図６Ｂ）。
【０１１３】
３Ｄ−ＰＹＹαおよび７４３１αレトロジェニックマウス由来の脾細胞をＷＴ１ペプチドおよびメソテリンペプチドそれぞれで刺激し、ＩＬ−２の存在下において６日間インビトロで培養した。ＩＬ−２を培養物に添加し、抗原特異的細胞を四量体染色により検出できるように潜在的に増殖させた。培養物のＣＤ４およびＣＤ８発現をＴＣＲβ＋ゲート内でフローサイトメトリーにより分析し、親のＴＣＲ  Ｖβ遺伝子の発現を分析した（図７）。繰り返し、親のＶβ遺伝子ファミリーの富化が特に高親和性３Ｄ−ＰＹＹにおいて観察される。培養したＴ細胞の抗原特異的Ｔ細胞の存在をＷＴ１またはメソテリンペプチド／ＭＨＣ四量体で染色することにより分析した（図７）。これらのデータは、特に高親和性３Ｄ−ＰＹＹαレトロジェニックマウスにおいて、かなりの数の抗原特異的Ｔ細胞がこれらの培養物に存在することを示す。四量体ポジティブ細胞がＴＣＲαを形質導入した（ｈＣＤ２＋）集団に見つかるということは、これらの細胞がＴＣＲα鎖の初期発現の結果として成長したことを示す。これは、実際にこれらのマウスで成長するＤＮ  ＴＣＲβ＋細胞が高親和性抗原特異的Ｔ細胞を含有しないことを例証する。これらの細胞はＤＮ細胞であるためＣＤ８が四量体結合を助けるという寄与はなく、この時これらのＴＣＲは「ＣＤ８−非依存性」であり、ＣＤ８非依存性四量体の結合は高親和性ＴＣＲを必要とする。
【０１１４】
上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を提供することができる。本明細書に参照し、かつ／または出願データシートに記載した米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、海外特許、海外特許出願および非特許刊行物の全てを参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む。種々の特許、出願および刊行物の概念を使用する必要がある場合、各実施形態の態様を改変し、なおさらなる実施形態を提供することができる。
【０１１５】
これらおよびその他の変更は、上記に詳述した記載に照らして各実施形態になされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈されないものとするが、このような特許請求の範囲が付与される等価物の全範囲とともに全ての考えられ得る実施形態を含むと解釈されるものとする。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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