(57)【要約】【課題】従来よりも正常な細胞への影響を低減でき、がん細胞の増殖を抑制、更には、がん細胞を消失させることが可能な、がん治療薬及びがん治療法並びにがん細胞の処置方法を提供する。【解決手段】がん治療薬は、水素と、該水素から原子状水素を生成可能な白金ナノ粒子とを有し、生成した前記原子状水素をがん治療に用いる。がん治療法は、哺乳動物の組織に白金ナノ粒子を投与し、該白金ナノ粒子により前記哺乳動物に供給された水素から原子状水素を生成させ、該原子状水素をがん治療に用いる。がん細胞の処置方法は、白金ナノ粒子により水素から生成させた原子状水素を、がん細胞に当てる。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素と、該水素から原子状水素を生成可能な白金ナノ粒子とを有し、生成した前記原子状水素をがん治療に用いることを特徴とするがん治療薬。
【請求項２】
請求項１記載のがん治療薬において、前記白金ナノ粒子の粒径は２ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲にあることを特徴とするがん治療薬。
【請求項３】
哺乳動物の組織に白金ナノ粒子を投与し、該白金ナノ粒子により前記哺乳動物に供給された水素から原子状水素を生成させ、該原子状水素をがん治療に用いることを特徴とするがん治療法。
【請求項４】
請求項３記載のがん治療法において、前記白金ナノ粒子の粒径は２ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲にあることを特徴とするがん治療法。
【請求項５】
白金ナノ粒子により水素から生成させた原子状水素を、がん細胞に当てることを特徴とするがん細胞の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療薬及びがん治療法並びにがん細胞の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のがんの主な治療法としては、手術による外科的療法、放射線治療法、抗がん剤等を用いた化学療法（三大療法）がある（例えば、特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１６−５９３６９号公報
【特許文献２】特開２０１６−１９０７９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前記従来の治療法には、以下のような問題があった。
外科的療法では、完全に切除できなかったがん細胞が増殖し、再発や転移する可能性が残る。
放射線治療法では、身体に損傷を与えることなく体内のがん細胞を殺すことはできる。しかし、がん細胞を１００％死滅させることが可能であるとは言い切れず、また、正常な細胞にもダメージを与えてしまう危険性がある。
化学療法では、様々な抗がん剤が開発されてきており、腫瘍を形成するがんに関しては、がん細胞の増殖を遅らせることは可能である。しかし、がん細胞を完全に消失させることができる抗がん剤は、未だ開発されていない。
【０００５】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、従来よりも正常な細胞への影響を低減でき、がん細胞の増殖を抑制、更には、がん細胞を消失させることが可能な、がん治療薬及びがん治療法並びにがん細胞の処置方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的に沿う第１の発明に係るがん治療薬は、水素と、該水素から原子状水素を生成可能な白金ナノ粒子とを有し、生成した前記原子状水素をがん治療に用いる。
ここで、前記白金ナノ粒子の粒径は２ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲にあることが好ましい。
【０００７】
前記目的に沿う第２の発明に係るがん治療法は、哺乳動物の組織に白金ナノ粒子を投与し、該白金ナノ粒子により前記哺乳動物に供給された水素から原子状水素を生成させ、該原子状水素をがん治療に用いる。
ここで、前記白金ナノ粒子の粒径は２ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲にあることが好ましい。
【０００８】
前記目的に沿う第３の発明に係るがん細胞の処置方法は、白金ナノ粒子により水素から生成させた原子状水素を、がん細胞に当てる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るがん治療薬及びがん治療法並びにがん細胞の処置方法は、白金ナノ粒子により水素から生成させた原子状水素を用いるので、従来の化学療法に比べて、正常な細胞への影響を低減でき、がん細胞の増殖を抑制、更には、がん細胞を消失させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】白金ナノ粒子及び水素存在下におけるＥＳＲスピントラッピング解析を行って得られたＥＳＲスペクトルのグラフである。
【図２】（Ａ）、（Ｂ）は白金ナノ粒子及び溶存水素存在下で発生する原子状水素のＤＰＰＨラジカル消去活性を示すグラフである。
【図３】（Ａ）は細胞培養と同時に白金ナノ粒子と水素を処理した場合の細胞数を示したグラフ、（Ｂ）は白金ナノ粒子と水素を予め培地に処理し、その培地で細胞を培養した場合の細胞数を示したグラフ、である。
【図４】培地成分のＲＰＭＩ及び／又は血清を、予め水素と白金ナノ粒子で処理した後細胞培養を行った場合の細胞生存率を示したグラフである。
【図５】水素と白金ナノ粒子が細胞だけでなく培地成分にも影響を与えた結果の説明図である。
【図６】（Ａ）は０から１０ｐｐｍ濃度の白金ナノ粒子入り培地で２時間処理したときの細胞内白金ナノ粒子量を示したグラフ、（Ｂ）は１０ｐｐｍ白金ナノ粒子入り培地で０から２４０分の範囲で処理したときの細胞内白金ナノ粒子量を示したグラフ、である。
【図７】５ｐｐｍ及び１０ｐｐｍの白金ナノ粒子を０から４８時間の範囲で処理したときの細胞内白金ナノ粒子量を示したグラフである。
【図８】１０ｐｐｍの白金ナノ粒子を８時間処理した後、０から４８時間通常培地に変えた場合の細胞内白金ナノ粒子量を示したグラフである。
【図９】白金ナノ粒子及び溶存水素の存在処理下におけるヒト前骨髄性白血病株ＨＬ６０細胞の生存率を示すグラフである。
【図１０】白金ナノ粒子及び溶存水素の存在処理下におけるヒト前骨髄性白血病株ＨＬ６０細胞と正常ヒト末梢血単核細胞ＰＢＭＣ細胞の生存率を示すグラフである。
【図１１】白金ナノ粒子及び溶存水素の存在処理下における肉腫細胞株Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞の生存率を示すグラフである。
【図１２】白金ナノ粒子の粒径によるがん細胞の細胞死への影響を示すグラフである。
【図１３】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれＳｕｂ−Ｇ１期の細胞数の変化を示すグラフである。
【図１４】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれカスパーゼカスケードの活性化状態を示す説明図である。
【図１５】試験区毎の担がんマウスの腹腔内の写真である。
【図１６】図１５の腹腔内の腫瘍塊の数を示すグラフである。
【図１７】白金ナノ粒子による各種細胞株の生存率への影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の第１の実施の形態に係るがん治療薬は、水素と、この水素から原子状水素を生成可能な白金ナノ粒子（Ｐｔナノ粒子）とを有し、生成した原子状水素をがん治療に用いるものである。
本発明の第２の実施の形態に係るがん治療法は、哺乳動物の組織に白金ナノ粒子を投与し、この白金ナノ粒子により哺乳動物に供給された水素から原子状水素を生成させ、この原子状水素をがん治療に用いる方法である。
本発明の第３の実施の形態に係るがん細胞の処置方法は、白金ナノ粒子により水素から生成させた原子状水素を、がん細胞に当てる方法である。
【００１２】
上記した白金ナノ粒子は、ナノ粒子自体が有するがん選択制、及び、正常な細胞に対して損傷を与えない、という観点から、既存の抗がん剤におけるがん選択性やがん特異性の問題点が解決される。
また、本発明者が行った予備試験により、白金ナノ粒子は正常な細胞への毒性が低いことも明らかとなった。
現在、金属ナノ粒子によるドラッグデリバリー（薬物輸送）に関する報告が数多くされており、これはがん治療に十分応用できると考えられる。
【００１３】
一方、抗酸化物質を含む還元剤とがん細胞死誘導に関する報告も少なくないが、いずれも生体内におけるプロオキシダント効果や還元物質の還元基以外の反応が生じてしまい、還元反応が細胞内に起こす影響を検討することができていない。
しかし、本発明は、白金ナノ粒子を細胞内に取り込ませ、白金ナノ粒子の表面を反応場として水素から原子状水素のみを発生させる構成であるため、従来の物質反応で考慮せざるを得ない還元反応以外の副次的な反応を考慮する必要性がない。
即ち、本発明によって還元反応のみによる細胞死誘導に関する新規な証拠が得られた。
【００１４】
上記した原子状水素の生成に用いる水素には、水素ガスや、液体（例えば、水）に水素を溶解させた溶存水素を利用できる。
また、白金ナノ粒子は、合成により得たものを使用できるが、購入したものを使用してもよい。なお、白金ナノ粒子の合成方法としては、例えば、クエン酸還元法（Ｆｕｒｌｏｎｇ  Ｄ, １９８４）によってＨ２ＰｔＣｌ６を還元する方法があるが、白金ナノ粒子を得ることができれば、これに限定されるものではない。
【００１５】
この白金ナノ粒子は、その表面上で原子状水素を発生させるものであるため、触媒効果が生じる表面場が必要となる。このため、白金ナノ粒子は、この表面場を確保可能な粒径を備えればよく、２ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲にあることが好ましい。
ここで、白金ナノ粒子の粒径が２ｎｍ未満の場合、粒径が小さくなり過ぎ、粒子表面の触媒効果が減少する傾向にある。一方、粒径の上限値については、金属粒子の触媒活性はサイズが大きくてもほとんど変化がないことが知られていることから、１０００ｎｍ（数百ｎｍ）であればよいが、例えば、哺乳動物への投与のし易さ等を考慮すれば１００ｎｍ（数十ｎｍ）程度である。
【００１６】
この白金ナノ粒子を投与する哺乳動物は、主として人間であるが、これに限定されるものではなく、例えば、犬や猫でもよい。
なお、白金ナノ粒子の哺乳動物の細胞への投与方法としては、例えば、注射による腹腔投与や口からの服用（経口）があるが、がん細胞への効果が得られるのであれば、特に限定されるものではない。この白金ナノ粒子への水素の供給は、例えば、水素ガスや液体に水素を溶解させた溶存水素を白金ナノ粒子に直接供給してもよく、また、水素と酸素の混合ガス中に哺乳動物を配置してもよい。
ここで、白金ナノ粒子の投与量は、原子状水素の発生量（水素の供給量）を考慮して決定するのがよい。
以下、添付した図面を参照しながら、更に具体的な実施例をあげて説明する。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）
溶存水素及び白金ナノ粒子が存在する溶液中において、原子状水素が発生するか否かについて調査した結果を、以下に示す。
１）試薬
ＤＭＰＯ（スピントラップ剤）にはラボテック（株）製を、白金ナノ粒子には田中貴金属工業（株）製を、それぞれ使用した。表記のない試薬は全て和光純薬工業（株）製試薬を使用した。
白金ナノ粒子は、クエン酸還元法（Ｆｕｒｌｏｎｇ  Ｄ, １９８４）により、Ｈ２ＰｔＣｌ６を還元することで合成した。具体的には、以下の通りである。
２５０ｍｇ／ｍＬのＨ２ＰｔＣｌ６（終濃度：２００ｐｐｍ）を６３６μＬ、ＭＱ水を２９０ｍＬ、３％  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅを１０ｍＬ（終濃度：０．１％）添加し、Ｎ２ガスで通気を行いながら十分に沸騰させ、２時間還流状態にした。反応液が黄橙色から黒色になるのを確認した後、水中に移すことによって反応を終了させた。反応終了後、アンバーライトＥＧ−４（イオン交換樹脂−ＯＲＧＡＮＯ, Ｔｏｋｙｏ）を２０％ｗ／ｖ添加し、暗所で２０分激しく撹拌して脱塩した後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。
なお、白金濃度は、九州大学中央分析センターの誘導結合型プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）（ＰＭＳ−２０００, Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ, ＣＡ）で測定した。
２）ＤＭＰＯと水素反応溶液の調整
反応溶液（２００μＬ）中にはそれぞれ、終濃度が４０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）、１００ｐｐｍ白金ナノ粒子、３７５μＭ水素、０．４５Ｍ  ＤＭＰＯを加えて調整した。
３）測定機器
ＥＳＲスペクトルは、水溶液測定用石英扁平セル（Ｉｎｎｅｒ  ｓｉｚｅ：６０ｍｍ×１０ｍｍ×０．３１ｍｍ）を使用し、ＪＥＯＬ  ＪＥＳＲＥＩＸ分光計（日本電子（株）製）に記録した。
【００１８】
４）測定結果
記録時のＥＳＲスペクトルを図１に示す。
図１において、活性水素（原子状水素）とＤＭＰＯとの反応により生成するＤＭＰＯ−Ｈアダクトが、白金ナノ粒子及び水素の存在下で検出された。
水素の存在下では、白金表面上において水素分子の分子間共有結合が減弱し、水素分子の共有結合が弱くなるため、又は、乖離するため、原子状水素になる。水溶液中で同様な反応が生じる検証はこれまでなかったが、水溶液中に分散できる白金ナノ粒子を使用することで同様な反応が生じることを期待し、水素を溶存させた水溶液中に白金ナノ粒子を添加し、ＥＳＲを用いてＤＭＰＯスピントラッピング法で確認したところ、図１に示すように、ＤＭＰＯ−Ｈの生成を確認することができた。
このため、溶存水素及び白金ナノ粒子が存在する溶液中において、反応性の高い水素である原子状水素が発生していることが明らかとなった。
【００１９】
（実施例２）
白金ナノ粒子及び溶存水素の存在下で発生する原子状水素のラジカル消去活性について調査した結果を、以下に示す。
１）試薬
高純度水素ガス（福岡酸素（株）製）、１, １−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）、及び、酢酸バッファ（ｐＨ６．５）、を使用した。
２）ＤＰＰＨと水素反応溶液の調整
測定条件：２００μＭ  ＤＰＰＨ溶液をアセトニトリル溶媒において用時調製し、セル中にＤＰＰＨ溶液を加え、各濃度の白金ナノコロイド及び水素飽和水を添加した。
スペクトルは、ＤＰＰＨ溶液への抗酸化剤添加に伴う反応速度定数及び化学量論定数を決定するため、１秒毎に測定した。
３）測定機器
ＵＶ−２４５０（ＵＶ−Ｖｉｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：（株）島津製作所製）を使用した。
【００２０】
４）測定結果
白金ナノ粒子及び溶存水素の存在下で発生する原子状水素のラジカル消去活性についてＤＰＰＨラジカルを用いて評価した。評価法は、ＤＰＰＨラジカルと原子状水素との反応速度定数を算出することで示した。
図２（Ａ）は白金ナノ粒子１ｐｐｍ存在下で溶存水素量を変化させた場合の結果、図２（Ｂ）は溶存水素１．２ｐｐｍ存在下で白金ナノ粒子量を変化させた場合の結果、である。
それぞれ濃度依存的な反応速度定数の増加が認められた。
【００２１】
（実施例３）
近年、水素による酸化ストレス関連疾患の軽減効果が示されてから、水素を用いた酸化ストレス関連疾患の治療応用が期待されている。
これまで、還元剤ががん細胞を抑制することを示す証拠は存在していないが、本発明者は、原子状水素を発生させる本発明を用いることで、還元力を持つ原子状水素ががん細胞に与える影響を示すことができると考えた。
水素と白金ナノ粒子を同時処理した細胞死の報告はすでにいくつかあるが、いずれの方法においても原子状水素を暴露した結果ではないため、この原子状水素の影響を調査した結果を、以下に示す。
【００２２】
１）試薬
培地はＲＰＭＩ培地２（日本製薬（株）製：以下、単にＲＰＭＩ培地と記載）を用い、白金ナノ粒子は前記した実施例１と同様の手順により生成させたものを用いた。水素ガスは高純度水素ガス（福岡酸素（株）製）を使用した。
２）培養液の調整
ＲＰＭＩ培地に１０％血清（シグマアルドリッチ）を加え細胞培養に使用した。
３）各処理条件
１０％血清ＲＰＭＩ培地に、水素のみ、白金ナノ粒子のみ、及び、水素と白金ナノ粒子の双方を、それぞれ加えて２４時間静置した後、各培地を細胞に処理した。
４）測定機器
細胞数は、セルカウンター（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｆ−３００＆ＣＭ−５：シスメックス（株）製）を用いて測定した。
【００２３】
５）測定結果
ヒト前骨髄性白血病株ＨＬ６０細胞（以下、単にＨＬ６０細胞とも記載）を培養しているシャーレに、２ｐｐｍ白金ナノ粒子及び／又は１．２ｐｐｍ溶存水素を含む１０％血清ＲＰＭＩ培地を加えて２４時間培養し、細胞生存率を算出した。
その結果、図３（Ａ）に示すように、水素のみ（水素処理）又は白金のみ（白金処理）の場合、細胞生存率に影響は見られなかったが、水素と白金ナノ粒子の双方を同時に処理（水素＋白金処理）した場合では、極めて強い増殖抑制が確認された。
また、ＨＬ６０細胞を含まない、１０％血清ＲＰＭＩ培地（通常培地）、２ｐｐｍ白金ナノ粒子を含む１０％血清ＲＰＭＩ培地（白金処理培地）、１．２ｐｐｍ溶存水素を含む１０％血清ＲＰＭＩ培地（水素処理培地）、及び、２ｐｐｍ白金ナノ粒子と１．２ｐｐｍ溶存水素とを含む１０％血清ＲＰＭＩ培地（水素＋白金処理培地）を用意し２４時間静置させ、その後脱気処理により水素を除いた後、各培地をＨＬ６０細胞に加えて２４時間培養した。
その結果、図３（Ｂ）に示すように、図３（Ａ）と全く同様の結果を示し、白金ナノ粒子と水素を同時に存在させた場合、培地成分が影響を受け細胞死を誘導することが確認された。
【００２４】
（実施例４）
次に、白金ナノ粒子及び水素の存在下によって影響を受けている培地成分を調べるために調査した結果を、以下に示す。
１）試薬
前記した実施例３で使用した試薬と同様の試薬を用いた。
２）培養液の調整
前記した実施例３と同様の手順で調整した。
３）各処理条件
白金ナノ粒子及び水素の存在下で２４時間静置した１０％血清及び／又はＲＰＭＩと、未処理（処理無し）の１０％血清及び／又はＲＰＭＩを、細胞に処理した。
４）測定機器
細胞数は、セルカウンター（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｆ−３００＆ＣＭ−５：シスメックス（株）製）を用いて測定した。
【００２５】
５）測定結果
白金ナノ粒子及び水素の存在下によって影響を受けている培地成分を調べるため、細胞処理前に白金ナノ粒子及び水素を存在させた各培地組成（血清とＲＰＭＩ）を用いて、細胞を２４時間培養した。
図４には左から、血清及びＲＰＭＩを未処理、血清及びＲＰＭＩを白金ナノ粒子と水素で処理、ＲＰＭＩのみ白金ナノ粒子と水素で処理、血清のみを白金ナノ粒子と水素で処理した培地で、２４時間ＨＬ６０細胞を培養した結果を示している。
いずれも血清を白金ナノ粒子と水素の存在下で２４時間処理した場合に、細胞死が生じていることが分かる。
【００２６】
これらの結果から、白金ナノ粒子を含む培地に水素を溶存させると、培地が細胞培養に影響を受けるということが確認された（図５参照）。そして、それは、培地中の血清が、白金ナノ粒子によって分子状水素から変化した原子状水素と反応して、細胞の成長に影響を与える、又は、細胞死を誘導する物質が生成し細胞死が生じている、ことに起因すると考えられる。
なお、白金ナノ粒子単独や水素単独の処理では培地に影響がないことを確認しているため、白金ナノ粒子と水素によって生じる原子状水素を直接細胞に影響させるには、処理溶液が影響を受けないような条件が必要であるといえる。
【００２７】
（実施例５）
原子状水素の直接的な細胞に対する影響を見るためには、処理溶液中に白金ナノ粒子と水素を同時に存在させないことが重要であることが確認されたので、その方法を確立するため、一連の実験を行った。
【００２８】
１）試薬
培地はＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル最小培地（ＤＭＥＭ、日水製薬（株）：以下、単にＤＭＥＭ培地と記載）を用い、白金ナノ粒子は前記した実施例１と同様の手順により生成させたものを用いた。
２）培養液の調整
ＤＭＥＭ培地に１０％血清（シグマアルドリッチ）を加え細胞培養に使用した。
３）各処理条件
細胞密度１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬでＬ６筋芽細胞を５ｍＬ  ｄｉｓｈに播種した。２４時間ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）に入れた後、白金ナノ粒子をＤＭＥＭ培地中に１、２、４、６、８、１０ｐｐｍ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養した。取り込ませた後Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅｓ（以下、ＰＢＳと記載）５ｍＬで細胞を２回洗浄し、洗浄液を吸引除去し、Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＥＤＴＡ溶液１ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に１分間入れ、細胞を剥離させた。
所持時間の変化を見る試験では、白金ナノ粒子をＤＭＥＭ培地中に１０ｐｐｍで添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に、１０、３０、６０、１２０、２４０分培養させた後、上記と同様に細胞を剥離させた。その後遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）にかけ、細胞を回収して、サンプル作成後各添加濃度における経時的な取り込み量の変化をＩＣＰ／ＯＥＳで測定した。
４）測定機器
白金ナノ粒子の分析にはＩＣＰ−ＯＥＳ（誘導結合プラズマ発光分光分析法、ＯｐｔｉｍａＴＭ  ＩＣＰ−ＯＥＳ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【００２９】
５）測定結果
各濃度の白金ナノ粒子をＲＰＭＩで処理した後、細胞に残存する白金ナノ粒子量を測定したところ、図６（Ａ）に示すように、１０ｐｐｍの範囲では処理した白金ナノ粒子量に依存的に増加した。
また、１０ｐｐｍ（１０ｍｇ／Ｌ）の白金ナノ粒子を培地に加え細胞に各時間処理した後、細胞を回収して細胞に吸着又は取り込まれている白金ナノ粒子量を測定したところ、図６（Ｂ）に示すように、細胞に存在する白金ナノ粒子は２４０分の範囲での処理時間に依存的に増加した。
【００３０】
（実施例６）
更に、長時間の処理によって細胞内の白金取り込み量がどのように変化するかを検討した。
１）試薬
前記した実施例５で使用した試薬と同様の試薬を用いた。
２）培養液の調整
前記した実施例５と同様の手順で調整した。
３）各処理条件
細胞密度１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬでＬ６筋芽細胞を５ｍＬ  ｄｉｓｈに播種した。２４時間ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）で培養した後、白金ナノ粒子をＤＭＥＭ培地中に１０ｐｐｍで添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で１、２、４、８、１２、２４、４８時間培養した。ＰＢＳ５ｍＬで細胞を２回洗浄し、洗浄液を吸引除去して、Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＥＤＴＡ溶液１ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に１分間入れ、細胞を剥離させた。
その後遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）にかけ、細胞を回収して、サンプル作成後各添加濃度における経時的な取り込み量の変化をＩＣＰ／ＯＥＳで測定した。
４）測定機器
白金ナノ粒子の分析にはＩＣＰ−ＯＥＳ（誘導結合プラズマ発光分光分析法、ＯｐｔｉｍａＴＭ  ＩＣＰ−ＯＥＳ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【００３１】
５）測定結果
図７に示すように、５ｐｐｍ（５ｍｇ／Ｌ：図７中○印）及び１０ｐｐｍ（１０ｍｇ／Ｌ：図７中●印）の白金ナノ粒子を処理した場合、細胞内の白金ナノ粒子が５ｐｐｍでは、２時間から４時間まで取り込み量が増加し、その後は処理時間を増やしても増加することはなかった。細胞内の白金ナノ粒子が１０ｐｐｍでも、約８時間までは増加しその後取り込み量が増加しないことが確認された。
【００３２】
（実施例７）
上記した実施例６により、細胞に白金ナノ粒子が取り込まれる量を確認できたので、次に、取り込まれた後に白金ナノ粒子が排出されるかどうかを検討した。
１）試薬
前記した実施例５で使用した試薬と同様の試薬を用いた。
２）培養液の調整
前記した実施例５と同様の手順で調整した。
３）各処理条件
細胞密度１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬでＬ６筋芽細胞を５ｍＬ  ｄｉｓｈに播種した。２４時間ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）に入れた後、白金ナノ粒子をＤＭＥＭ培地中に添加し、白金ナノ粒子をＤＭＥＭ培地中に添加して、白金ナノ粒子１０ｐｐｍ／ＤＭＥＭ培地で８時間、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に入れて取り込ませた。ＰＢＳ  ５ｍＬで細胞を２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地に交換し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に入れて培養して排出させた後、ＰＢＳ  ５ｍＬで細胞を２回洗浄し、洗浄液を吸引除去して、Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＥＤＴＡ溶液１ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に１分間入れ、細胞を剥離させた。
その後遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）にかけ、細胞を回収して、サンプル作成後ＩＣＰ／ＯＥＳで測定した。
４）測定機器
白金ナノ粒子の分析にはＩＣＰ−ＯＥＳ（誘導結合プラズマ発光分光分析法、ＯｐｔｉｍａＴＭ  ＩＣＰ−ＯＥＳ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【００３３】
５）測定結果
８時間１０ｐｐｍ（１０ｍｇ／Ｌ）の白金ナノ粒子を処理した後、通常培地に交換して、一定の時間経過後の細胞内の白金ナノ粒子量を測地した。
その結果、図８に示すように、細胞内の白金ナノ粒子量は０時間で約１２ｐｇ／ｃｅｌｌの白金ナノ粒子が確認されたが、回収時間を変化させてもその量に変化はほとんど見られず、４８時間後において８ｐｇ／ｃｅｌｌの量白金ナノ粒子が確認された。０時間での白金ナノ粒子が約１２ｐｇ／ｃｅｌｌであることから、４８時間で排出された量は約４ｐｇ／ｃｅｌｌであると考えられる。
この４ｐｇ／ｃｅｌｌという濃度は、培地中に存在して約０．４ｐｐｍの濃度となる。
【００３４】
これらの結果から本発明者は、細胞に白金ナノ粒子をいったん取り込ませ、血清成分に影響を与える可能性のある余分な白金ナノ粒子を除くことで、培地成分を変性させることによって生じる細胞死ではなく、原子状水素によって細胞死を生じさせることができることを明らかにした。
水素と白金ナノ粒子を同時処理した細胞死の報告はいくつかあるが、いずれの方法においてもこれらの点を考慮している報告はなく、原子状水素を細胞に与えているとはいえない。本発明の方法は、原子状水素によってがん細胞に細胞死を誘導する方法を確立していることが一つの大きなポイントである。
【００３５】
（実施例８）
次に、各種細胞に対する原子状水素の効果（生理的効果）を検証するため、各種細胞に対して白金ナノ粒子と水素の併用処理を行った。各種細胞の生存率を調査した結果を、以下に示す。
【００３６】
１）試薬
培地は、ＲＰＭＩ培地（日本製薬（株）製）を用い、白金ナノ粒子は前記した実施例１と同様の手順により生成させたものを用いた。水素ガスは高純度水素ガス（福岡酸素（株）製）を使用した。
２）処理条件
白金ナノ粒子を滅菌水で５ｐｐｍに希釈し、ＲＰＭＩ培地と混和して白金ナノ粒子添加培地（無血清）とした。また、ＨＬ６０細胞及び正常ヒト末梢血単核細胞ＰＢＭＣ細胞（以下、単にＰＢＭＣ細胞とも記載）は５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で白金ナノ粒子添加培地に懸濁し、５ｍＬ  ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養した。
２時間後、ＰＢＳで２回洗浄し、２％  ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地に懸濁し、７５％Ｈ２、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２雰囲気下の水素ガスインキュベーターで２４時間インキュベートした後、１．５ｍＬ  ｔｕｂｅに回収し、２５００×ｇで３分間遠心分離した後、ＰＢＳで１回洗浄し細胞回収後細胞数を測定した。
３）測定機器
細胞数は、セルカウンター（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｆ−３００＆ＣＭ−５：シスメックス（株）製）を用いて測定した。
【００３７】
４）測定結果
図９、図１０に示すように、水素及び白金ナノ粒子を同時処理したＨＬ６０細胞では、極めて強い増殖抑制が確認された。特に、図１０に示すように、白金ナノ粒子５ｐｐｍを含む１．２ｐｐｍ溶存水素含有培地下では、ＨＬ６０細胞を２４時間培養すると極めて高い生存率の低下が確認された。
一方、同時処理条件で処理したＰＢＭＣ細胞では、図１０に示すように、細胞死（生存率の変化）が全く確認されなかった。
以上の結果から、発生した原子状水素は正常細胞では毒性を示さずがん細胞に対して強い毒性を示すことが確認された。
更に、図１１に示すように、肉腫細胞株Ｓａｒｃｏｍａ１８０（以下、単にＳａｒｃｏｍａとも記載）においても、極めて強い細胞増殖の抑制（２４時間処理後に白金ナノ粒子濃度に依存した細胞数の減少）が確認された。また、同様に、生存率の低下が確認された。
【００３８】
（実施例９）
続いて、白金ナノ粒子の粒径によるがん細胞死の変化について調査した結果を、以下に示す。
１）試薬
培地は、ＲＰＭＩ培地（日本製薬（株）製）を用い、白金ナノ粒子は前記した実施例１と同様の手順により生成させたものを用いた。なお、白金ナノ粒子は、粒径（粒子径）が１．２ｎｍ、３ｎｍ、５〜８ｎｍのものを、電子顕微鏡により選出して用いた。
そして、１．２ｐｐｍ溶存水素含有培地において各濃度の白金ナノ粒子を添加し、２４時間培養した後の細胞数を測定した。なお、数値は、白金ナノ粒子の未処理の細胞数を１００％としている。
２）培養液の調整
前記した実施例８と同様の手順で調整した。
３）測定機器
前記した実施例８で使用した測定機器と同様の測定機器を用いた。
【００３９】
４）測定結果
図１２に示すように、粒径が１．２ｎｍの白金ナノ粒子では、細胞死に与える影響が僅かであった。一方、３ｎｍ、５〜８ｎｍの白金ナノ粒子では、同程度の細胞数の減少が確認された。
原子状水素は白金ナノ粒子の表面上で発生するため、白金ナノ粒子には触媒が生じる表面場が必要となる。ここで、白金ナノ粒子の粒径が２ｎｍ未満では、白金ナノ粒子の表面触媒効果が減少する。一方、１０ｎｍ以上では、触媒活性に大きな変化はない。
このため、白金ナノ粒子の粒径は、触媒能力が得られる２ｎｍから数百ｎｍ（１０００ｎｍ以下）の範囲で、細胞死誘導効果が得られると考えられる。
【００４０】
（実施例１０）
次に、白金ナノ粒子と水素によるがん細胞の細胞死誘導のメカニズムについて検証した結果を、以下に示す。
１）試薬
培地は、前記した実施例８と同様の培地を用い、白金ナノ粒子は前記した実施例１と同様の手順により生成させたものを用いた。
２）Ｓｕｂ−Ｇ１解析
白金ナノ粒子を滅菌水で５ｐｐｍに希釈し、ＲＰＭＩ培地と混和して白金ナノ粒子添加培地（無血清）とした。また、ＨＬ６０細胞は５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で白金ナノ粒子添加培地に懸濁し、５ｍＬ  ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養した。
２時間後、ＰＢＳで２回洗浄し、２％  ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地に懸濁して２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｍＬずつ播種した。７５％Ｈ２、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２雰囲気下の水素ガスインキュベーターで２４時間インキュベートした後、１．５ｍＬ  ｔｕｂｅに回収し、２５００×ｇで３分間遠心分離した後、ＰＢＳで１回洗浄を行った。洗浄後、７０％エタノールを５００μＬ加え、３０分間氷上固定を行った。３０分後、遠心して上清を除去しＰＢＳ  ４７０μＬ及び１ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅＡ／ＰＢＳ  ２０μＬを添加し室温で３０分静置した。３０分後、１ｍｇ／ｍＬ  ＰＩを１０ｍＬ添加し１０分間静置した。１０分後、フローサイトメーターを用いてＳｕｂ−Ｇ１解析を行った。
３）測定機器
フローサイトメーターは、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ＡＤＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマン・コールター（株）製）を用いた。
【００４１】
４）測定結果
図１３（Ａ）に、無処理（Ｎ２７５％、Ｏ２２０％、ＣＯ２５％）の場合のＳｕｂ−Ｇ１解析結果を、図１３（Ｂ）に、ＨＬ６０細胞に白金ナノ粒子 ５ｐｐｍを添加し、水素ガス下で２４時間培養した場合（培養後）のＳｕｂ−Ｇ１解析結果を、それぞれ示す。
図１３（Ａ）、（Ｂ）に示すように、水素ガス存在下で白金ナノ粒子をがん細胞に併用処理したＨＬ６０細胞では、Ｓｕｂ−Ｇ１細胞数の明らかな増加が確認された。
従って、白金ナノ粒子と水素を併用処理すること（原子状水素）により、がん細胞にアポトーシス誘導が生じていることが示された。
【００４２】
（実施例１１）
細胞死誘導に深く関与するカスパーゼカスケードについて、上記したＳｕｂ−Ｇ１解析と同条件下で検証（アポトーシス関連タンパク発現量の確認）した結果を、以下に示す。
１）試薬
培地は、前記した実施例８と同様の培地を用い、白金ナノ粒子は前記した実施例１と同様の手順により生成させたものを用いた。また、カスパーゼファミリー活性化剤として、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ：Ｂｉｏ  Ａｕｓｔｒａｌｉｓ製）を用いた。
２）タンパク質サンプルの調整
白金ナノ粒子を滅菌水で希釈し、ＲＰＭＩ培地と混和して白金ナノ粒子添加培地（無血清）とした。また、ＨＬ６０細胞は３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で白金ナノ粒子添加培地に懸濁し、１０ｍＬ  ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養した。
２時間後、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％  ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地に懸濁して再度１０ｍＬ  ｄｉｓｈに播種し、７５％Ｈ２、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２雰囲気下の水素ガスインキュベーターで５時間インキュベートした。処理後、冷却したＰＢＳで２回洗浄を行い、冷却した１０％ＴＣＡで１．５ｍＬ  ｔｕｂｅに回収し懸濁した後、３０分間氷上に静置した。３０分後、７２０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去して冷却したＰＢＳ  １ｍＬ／ｓａｍｐｌｅを添加した後、再度７２０×ｇで１０分間遠心分離を行った。タンパク質可溶液（２Ｍチオウレア１．５２２ｇ、ウレア４．２０４ｇ、３％ＣＨＡＰＳ  ３００ｍｇ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００をＭＱ水で１０ｍＬにメスアップして作製）を１００μＬ／ｓａｍｐｌｅ添加し、３０分間氷上で静置した。３０分後、３６００×ｇで３０分間遠心分離を行い、上清を回収して以降のサンプルとして用いた。また、ＳＴＳ（２μＭ）で２４時間処理を行ったものをＰｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた。
３）測定機器
電気泳動は、ミニプロティアンＴｅｔｒａセルシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）を用い、転写装置は、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ  ＳＤ  ＳＥＭＩ−ＤＲＹ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）を用いた。検出には、ＬＡＳ−１０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を用いた。
【００４３】
４）結果
水素と白金ナノ粒子の併用処理では、図１４（Ａ）に示すように、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ３の発現が確認された。また、水素存在下の白金ナノ粒子処理により、図１４（Ｂ）に示すように、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ８の発現も確認されたことから、ミトコンドリア経路のアポトーシスを誘導していることが明らかとなった。即ち、白金ナノ粒子と水素ガスの併用下においては、カスパーゼ３、８共に、活性化状態（Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ３、８）になっていることを確認できた。
なお、図示していないが、白金ナノ粒子又は水素の単独処理では、これらの活性がみられないことから、併用処理によって生じる原子状水素が、カスパーゼファミリーの活性化に伴うがん細胞のアポトーシス誘導を誘発していることが示唆された。
【００４４】
（実施例１２）
生体内での検証を行うため、担がんモデルマウスを用いて試験を行った。
１）対象動物及び試薬
対象動物には、九動（株）から購入したＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。また、水素混合ガス供給用飼育ボックスは、アネロパック（登録商標）角型ジャー（三菱ガス化学（株）製）を加工して作製した。
２）マウスに対する水素と白金の処理
飼育ボックスに水素混合ガス（８０％Ｈ２、２０％Ｏ２）を通気し、水素濃度を高濃度ガス検知器（ＸＰ−３１４０：ＮＥＷ  ＣＯＳＭＯＳ  ＥＬＥＣＴＲＩＣ製）で２５分後まで１分毎に測定した。そして、ボックスの空気組成が「８０％Ｈ２、２０％Ｏ２」になったことを確認した後、マウスを１２時間ボックス内においた。
また、マウスへの白金処理は、マウスを水素混合ガスが供給された飼育ボックスに入れる前に、腹腔に白金ナノ粒子を１００μｇ投与した。
【００４５】
３）試験方法
Ｓａｒｃｏｍａ１８０（肉腫由来）細胞を腹腔内に移植させたマウスを、水素混合ガス（８０％Ｈ２かつ２０％Ｏ２）環境下、又は、空気（８０％Ｎ２かつ２０％Ｏ２）環境下で１２時間飼育する方法を２週間続け、安楽死後開腹してがんの有無を観察した。
実施した試験区を表１に示す。なお、表１に示す各試験区は、図１５、図１６の各試験区に対応している。
【００４６】
【表１】
2018150275.tif 000003
【００４７】
表１に示すように、試験区はａ〜ｄの４群用意した。具体的には、以下の通りである。
・試験区ａは、白金ナノ粒子を注射しなかったマウスを水素混合ガス環境下で飼育。
・試験区ｂは、担がん後に白金ナノ粒子を注射したマウスを水素混合ガス環境下で飼育。
・試験区ｃは、担がん前（前処理時）に白金ナノ粒子を注射したマウスを空気環境下で飼育。
・試験区ｄは、担がん前（前処理時）に白金ナノ粒子を注射したマウスを水素混合ガス環境下で飼育。
【００４８】
４）結果
開腹した担がんマウスの腹腔内の写真を図１５に示す。なお、図１５中の白矢印は、腫瘍塊を指している。
図１５に示すように、水素混合ガス環境下でかつ白金ナノ粒子を注射していない試験区ａと、空気環境下でかつ白金ナノ粒子を注射した試験区ｃにおいては、腹腔内のがん増殖に伴う腹水の増加による腹囲の増加が認められた。これに対し、水素混合ガス環境下でかつ白金ナノ粒子を注射した試験区ｂと、水素混合ガス環境下でかつ白金ナノ粒子を前処理した試験区ｄでは、試験したすべてのマウスにおいて腹囲の増加が認められなかった（腸の周囲や腹膜にできた腫瘍が消失していた）。
なお、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞の代わりにＣｏｌｏｎ２６（大腸がん由来）細胞を移植した場合も、同様の結果が得られた。
また、腹腔内に形成された腫瘍塊の数の測定結果を図１６に示す。
図１６から明らかなように、試験区ｂと試験区ｄは腫瘍塊を全く確認することができなかった。
【００４９】
以上の結果から、原子状水素を発生させる本発明は、効果的な抗がん治療法として機能するといえる。
これまでの抗がん作用をもたらす抗酸化剤には、プロオキシダント効果による正常細胞に対して損傷を与えることが報告されており、本発明のように抗酸化作用のみを有し、正常細胞に対して効果をもたらさないものは報告されていない。
また、本発明で用いる白金ナノ粒子のようなナノ粒子にはがん特異性があり、副作用の軽減も見込まれる。
【００５０】
（実施例１３）
溶存水素の存在下における白金ナノ粒子表面上で生じる原子状水素によるがん細胞死について更に調査した結果を、以下に示す。
１）試験方法
正常細胞であるヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ−３８、及び、ヒト胎児肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５と、がん細胞であるヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト子宮頸癌上皮細胞株ＨｅＬａ、及び、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２の各細胞株に対して、水素水及び白金ナノ粒子を含む培地で２４時間培養した後、細胞数を測定した。
２）結果
図１７に示すように、溶存水素の存在下における白金ナノ粒子表面上で生じる原子状水素による影響は、正常細胞であるＷＩ−３８やＭＲＣ−５に対しては少ないが、がん細胞であるＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、及び、Ｋ５６２については、白金濃度に依存して細胞数が減少することが確認された。
【００５１】
従って、本発明のがん治療薬及びがん治療法並びにがん細胞の処置方法により、従来よりも正常な細胞への影響を低減でき、がん細胞の増殖を抑制、更には、がん細胞を消失させることができることを確認できた。
【００５２】
以上、本発明を、実施の形態を参照して説明してきたが、本発明は何ら上記した実施の形態に記載の構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載されている事項の範囲内で考えられるその他の実施の形態や変形例も含むものである。例えば、前記したそれぞれの実施の形態や変形例の一部又は全部を組合せて本発明のがん治療薬及びがん治療法並びにがん細胞の処置方法を構成する場合も本発明の権利範囲に含まれる。
【図１】
2018150275.tif 000004
【図２】
2018150275.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018150275.tif 000009
【図７】
2018150275.tif 000010
【図８】
2018150275.tif 000011
【図９】
2018150275.tif 000012
【図１０】
2018150275.tif 000013
【図１１】
2018150275.tif 000014
【図１２】
2018150275.tif 000015
【図１３】
2018150275.tif 000016
【図１４】
2018150275.tif 000017
【図１５】
2018150275.tif 000018
【図１６】
2018150275.tif 000019
【図１７】
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