(57)【要約】      （修正有）【課題】貯蔵及び投与のための改良された二重特異性Ｔ細胞結合抗体構築物を含むタンパク質ベースの医薬組成物の提供。【解決手段】以下を含む、医薬組成物：ｉ．第一の結合ドメインを介して標的細胞表面抗原に、第二の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性抗体構築物であって、前記鎖抗体構築物が、０．５μｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１０または５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、前記二重特異性抗体構築物；ｉｉ．微生物の増殖を阻害するのに有効な濃度の、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン及びチオメロサールから選択される、少なくとも１つの保存剤；ｉｉｉ．前記二重特異性抗体構築物が安定である、希釈剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、医薬組成物：
ｉ．第一の結合ドメインを介して標的細胞表面抗原に、第二の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性抗体構築物であって、前記鎖抗体構築物が、０．５μｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１０または５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、前記二重特異性抗体構築物；
ｉｉ．微生物の増殖を阻害するのに有効な濃度の、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン及びチオメロサールから選択される、少なくとも１つの保存剤；
ｉｉｉ．前記二重特異性抗体構築物が安定である、希釈剤。
【請求項２】
前記二重特異性抗体構築物が、以下：
（ａ）ｐＨ６．５〜７．５で０．５〜２００μｇ／ｍｌ、または
（ｂ）ｐＨ４．０〜６．０で０．５〜１０００μｇ／ｍｌ、または
（ｃ）ＣＤ３結合ドメイン安定化剤、好ましくはクエン酸の存在下、ｐＨ４．０〜７．５で０．５μｇ〜２ｍｇ、または
（ｄ）ｐＨ４．０〜７．５、好ましくは４．０〜６．０で、０．５μｇ〜２０ｍｇ、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ〜１０または５ｍｇ／ｍｌ、
からなる群から選択される範囲の濃度で存在し、
各々がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ペプチドリンカーを介して互いに融合された２つのポリペプチド単量体を含む第三の結合ドメインを前記二重特異性抗体が含み、前記第三の結合ドメインがアミノからカルボキシルに向けて順に：
ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３ − リンカー − ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３
を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記二重特異性抗体構築物が、二重特異性一本鎖抗体構築物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの保存剤が、０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記保存剤が、０．００９〜０．９％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１１〜０．９％、または０．５〜０．７５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記希釈剤が、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩及び酒石酸塩からなる群から選択される塩を含む緩衝液であり、及び／または前記緩衝液が、ヒスチジン、グリシン、ＴＲＩＳグリシン、トリス、またはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記希釈剤が、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、及びヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌまたはそれらの混合物からなる群から選択される緩衝液である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記希釈剤が、０．１〜１５０ｍＭの範囲の、好ましくは０．２５〜５０ｍＭの範囲の濃度で存在する緩衝液である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記希釈剤が、クエン酸塩を含む緩衝液である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記希釈剤が、０．２５〜５０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩を含む緩衝液である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物のｐＨが４．０〜８．０の範囲であり、好ましくはｐＨ４．０〜５．０、または６．０〜７．５の範囲であり、好ましくはｐＨ７．０である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック及びその組合せからなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０及び／またはリジンＨＣＬをさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
二重特異性抗体構築物の濃度が少なくとも１０、１５または２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１５μｇ／ｍｌである場合、前記組成物がポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０及び／またはリジンＨＣＬを含まない、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記二重特異性抗体構築物の前記第一の結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＦＬＴ３、ＤＬＬ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡからなる群から選択される少なくとも１つの標的細胞表面抗原に結合する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記第一の結合ドメインが：
（ａ）配列番号１に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５に記載するＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号６に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｂ）配列番号２９に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３１に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号３４に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３６に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｃ）配列番号４２に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４４に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４５に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４７に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号５３に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５４に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号５５に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号５６に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５７に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５８に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｅ）配列番号６５に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６６に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６７に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号６８に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６９に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号７０に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｆ）配列番号８３に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８４に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８５に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８７に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号８８に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｇ）配列番号９４に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９５に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９６に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号９７に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９８に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号９９に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｈ）配列番号１０５に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０６に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１０７に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１０９に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１０に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１１に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｉ）配列番号１１５に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１６に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１１７に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１１８に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１９に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１２０に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｊ）配列番号１２６に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２７に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１２８に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１２９に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３０に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１３１に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｋ）配列番号１３７に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３８に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３９に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１４０に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４１に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１４２に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｌ）配列番号１５２に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５３に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５４に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５５に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５６に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５７に記載するＣＤＲ−Ｌ３、ならびに
（ｍ）配列番号１６７に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６８に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６９に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１７０に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７１に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７２に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
液体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、＜５％、好ましくは＜１％の前記二重特異性抗体構築物の多量体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記多量体が二量体である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、室温で、少なくとも４日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１４日間の期間、＜５％、好ましくは＜１％の前記二重特異性抗体構築物の多量体を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
好ましくはＥＶＡ、ポリオレフィン、及び／またはＰＶＣ製のプラスチック投与容器に充填される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記二重特異性一本鎖抗体構築物が、請求項６〜１３に記載の緩衝液及び／または賦形剤の少なくとも１つを含む前記プラスチック投与容器由来の希釈物から、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、または更には少なくとも９９％まで回収される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記二重特異性一本鎖抗体構築物が、ポリソルベート８０を含む前記プラスチック投与容器由来の希釈物から、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、または更には少なくとも９９％まで回収される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ｐＨ６．５〜７．５で、少なくとも０．２５ｍＭのクエン酸、少なくとも０．０１２５ｍＭのリジン及び／または少なくとも０．００１％のポリソルベート８０を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、−５０℃で、好ましくは−４０℃、−３０℃、または−２０℃で保存された貯蔵溶液である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
各々がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ペプチドリンカーを介して互いに融合された２つのポリペプチド単量体を含む第三の結合ドメインを含む前記二重特異性抗体を前記組成物が含み、前記第三の結合ドメインがアミノからカルボキシルに向けて順に：
ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３ − リンカー − ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３
を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、貯蔵のために凍結乾燥物として提供される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、溶液として、凍結状態の溶液として、または凍結乾燥物として、使用まで保存され、その後、任意で希釈または再構成ののちに、投与され、保存剤、安定化剤、または界面活性剤から選択される更なる賦形剤の添加を要しない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記二重特異性抗体構築物を凍結乾燥物として提供し、前記凍結乾燥物が、好ましくは、凍結保護剤、緩衝液及び／または界面活性剤を含み、
保存剤を含み且つ好ましくは請求項６〜１３のいずれか一項に記載の緩衝液及び／または賦形剤を含む希釈剤によって、前記凍結乾燥物を再構成する、
請求項１に記載の医薬組成物の、調製方法。
【請求項３０】
悪性疾患の治療に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載の医薬組成物、または請求項２９に記載の方法に従って製造した医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、悪性疾患の治療または改善のための方法。
【請求項３２】
１〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、または２〜５時間、静脈内に連続的に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
２〜１４日間、好ましくは２〜１０日間、最も好ましくは４〜７日間、静脈内に連続的に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
好ましくは凍結保護剤、緩衝液及び／または界面活性剤を含む凍結乾燥物としての、前記二重特異性抗体構築物；ならびに
保存剤を含み且つ好ましくは請求項６〜１３のいずれか一項に記載の緩衝液及び／または賦形剤を含む、希釈剤
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
タンパク質ベースの医薬品をはじめとするタンパク質治療薬は、すでに医薬品のほとんどすべての分野で重要な役割を果たしており、（前）臨床開発及び市販製品で最も急速に成長している治療薬の１つである（非特許文献１）。小型化学医薬品に比べて、タンパク質医薬品は、比較的低い濃度で高い特異性及び活性を有し、一般的に、様々な癌、自己免疫疾患、及び代謝障害のような重篤な疾患の治療を提供する（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００２】
商業規模の精製プロセスの進歩により、現在、組換えタンパク質などのタンパク質ベースの医薬品は、初期製造段階において高純度で得ることができる。しかしながら、タンパク質の安定性は低く、化学的にも物理的にも非常に分解しやすい。化学的分解とは、脱アミド化、酸化、新規ジスルフィド架橋の開裂または形成、加水分解、異性化、または脱グリコシル化などの共有結合を含む修飾を指す。物理的分解には、タンパク質のアンフォールディング、表面への望ましくない吸着、及び凝集が含まれる。これらの物理的及び化学的不安定性への対処は、タンパク質型医薬品の開発における最も困難な課題の１つである（非特許文献４、非特許文献２）。
【０００３】
興味深いタンパク質ベースの医薬品として、２つの柔軟に結合した抗体由来結合ドメインから作製した組換えタンパク質構築物であるＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体構築物などの二重特異性抗体構築物が挙げられる。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物の１つの結合ドメインは、標的細胞上の選択した腫瘍関連表面抗原に特異的であり；第二の結合ドメインは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３に特異的である。それらの特定の設計により、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物は、Ｔ細胞と標的細胞とを一時的に連結させると同時に、標的細胞に対するＴ細胞の固有の細胞溶解能力を強力に活性化するというユニークな点において適している。ＡＭＧ１０３及びＡＭＧ１１０として臨床開発された第１世代のＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物（特許文献１及び特許文献２参照）の重要なさらなる発展は、ＣＤ３ε鎖のＮ末端において状況独立性エピトープに結合する二重特異性抗体構築物の提供であった（特許文献３）。この選択したエピトープに結合するＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物は、ヒト及びマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）またはリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３ε鎖に対して異種特異性を示すだけでなく、二重特異性Ｔ細胞結合分子におけるＣＤ３結合体に対する前述のエピトープの代わりにこの特異的エピトープを認識するため、以前の世代のＴ細胞結合抗体で観察された活性と同程度でＴ細胞を非特異的に活性化することがない。このＴ細胞活性化の低下は、副作用のリスクとして同定された患者におけるＴ細胞再分布の減少または低下と関連していた。
【０００４】
非特許文献３に記載されているような抗体構築物は、身体からの急速なクリアランスに直面する可能性があり；したがって、それらは身体の大部分に迅速に到達可能で、迅速に生成し、取り扱いが容易である一方で、それらのｉｎ  ｖｉｖｏでの応用は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける短い持続性によって制限され得る。この小さな一本鎖分子はｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が短いため、連続静脈内注入による長期投与を使用して、治療効果を達成する。しかしながら、このような連続静脈内注入は、例えば、微生物の混入、したがって敗血症のような副作用を回避するために、輸液バッグを少なくとも２日おきに頻繁に交換しなければならないことから、患者にとって不便なものとして分類される。
【０００５】
保存剤の添加は、この問題の１つの解決策として考えられている。それらの主な機能は、微生物の増殖を抑制し、薬物製品の貯蔵寿命または使用期間を通じて製品の無菌性を保証することである。一般的に使用される保存剤として、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが挙げられる。保存剤は小分子非経口で長く利用されてきた歴史があるが、保存剤を含有するタンパク質製剤の開発は困難である。保存剤は、ほとんどの場合においてタンパク質に対する不安定化効果（凝集）を有しており、このことがタンパク質製剤におけるそれらの使用を制限する主な要因となっている。したがって、現在の大部分のタンパク質医薬品は、一回限りの使用のために製剤化されている。保存製剤の開発により、より便利で多目的な注射ペン用プレゼンテーションの商業化をもたらしたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のような保存剤含有製剤はごくわずかしか存在し得なかった。ｈＧＨ保存製剤を含有する少なくとも４つのそのようなペンデバイスが、現在市販されている。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥―デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含有し、一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）はｍ−クレゾールとともに製剤化される。保存剤形の製剤化及び開発時には、いくつかの側面を考慮する必要がある。薬物製品中の有効な保存剤濃度を最適化しなければならない。これには、剤形中の所与の保存剤について、タンパク質の安定性を損なうことなく抗菌効力を与える濃度範囲を試験することが必要である。注意すべき重要な点は、防腐効果が、活性薬剤及びすべての賦形剤成分を含有する最終製剤において示されるべきであるということである。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、連続注入をより長い間隔で実施することができるように、すなわち患者の快適性を高め、同時に貯蔵中と投与中の両方で安定であるように好ましくは保存される、二重特異性抗体構築物を含む改良された医薬組成物を提供することである。しかしながら、二重特異性抗体構築物を含む適切な保存性の高い医薬組成物は、数日にわたる連続注入を必要としないが、数時間のみを必要とするそのような二重特異性抗体構築物においても利点を有すると考えられ、なぜならば、これらの半減期延長（ＨＬＥ）二重特異性抗体構築物の注入もまた、数時間を要する場合があり、その時間内における微生物混入のリスク、したがって感染症を低減する必要があるからである。同時に、それに含まれる医薬組成物及び二重特異性抗体構築物の回収もまた本発明の目的である。
【０００７】
半減期の増大は、免疫グロブリン、具体的には抗体、及び最も具体的には小サイズの抗体断片のｉｎ  ｖｉｖｏ応用において一般的に有用である。当該技術分野で記載されているそのような効果を達成するためのアプローチは、小さな二重特異性抗体構築物のより大きなタンパク質への融合を含み、好ましくはＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物の治療効果を妨げない。そのような二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのさらなる開発の例として、例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、及び特許文献８に記載されているような二重特異性Ｆｃ分子が挙げられる。
【０００８】
しかしながら、保存を目的とする場合、タンパク質の凝集を避けることは大きな障害となる。タンパク質凝集は、タンパク質の物理的不安定性の主要な事象を表しており、溶媒と疎水性タンパク質残基との間の熱力学的に好ましくない相互作用を最小限に抑える固有の傾向に起因して生じる。凝集は、リフォールディング、精製、滅菌、輸送、及び貯蔵プロセス中に日常的に起こるため、特に問題がある。凝集は、タンパク質の未変性状態が高度に熱力学的に好ましく（例えば、中性ｐＨ及び３７℃）、ストレスがない溶液条件下であっても起こり得る（非特許文献４、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献５）。
【０００９】
半減期延長様式を有するＦｃ分子などの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのような半減期延長抗体構築物もまた、タンパク質凝集及び／または他の分解事象から保護する必要がある。タンパク質凝集は、治療用タンパク質の生物学的活性を損なう可能性があるため、問題である。さらに、タンパク質凝集は、薬物製品の見栄えを悪くするうえに、最終生成物から凝集体を除去するために精巧な精製工程が必要となるため、生成物の収率を低下させる。最近では、凝集したタンパク質が存在する（ヒト化または完全ヒトタンパク質であっても）ことにより、患者が活性タンパク質単量体に対する免疫応答を発達させ、中和抗体の形成及び薬剤耐性、または他の有害な副作用をもたらすリスクを有意に増加させ得るという懸念及びエビデンスが増加している（非特許文献５）。
【００１０】
一般的に、様々なメカニズムによるタンパク質凝集を最小限に抑えるために、いくつかの試みが文献に報告されている。タンパク質を、その一次構造を改変することにより安定化し、凝集体形成及び他の化学変化から保護し、それにより内部疎水性を高め、外部疎水性を低下させることができる。しかしながら、タンパク質の遺伝子改変は、機能の障害及び／または免疫原性の増加をもたらし得る。別のアプローチは、温度、圧力、ｐＨ、及び塩などの様々なメカニズムを用いることによって、機能的な未変性単量体を回収するための凝集体の解離（「脱凝集」と呼ばれる）に焦点を当てている。現在、タンパク質凝集体は、主に下流のプロセスの研磨工程において不純物として除去される。しかしながら、高分子量（ＨＭＷ）の場合、相当量のＨＭＷを除去すると実質的な収率損失が生じるだけでなく、ロバストな下流プロセスの設計が困難になる（非特許文献４）。
【００１１】
その安定性を維持しながら投与容器から確実に定量的に回収する一方で、広い濃度範囲にわたる二重特異性抗体構築物製剤を保存することは、重大な課題を提起する。当該分野において、保存した治療用タンパク質製剤に対して高い安定性を提供する医薬組成物の最適化が必要である。本発明の目的は、非半減期延長二重特異性抗体構築物と、Ｆｃ分子を含む半減期延長モダリティを有する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの半減期延長二重特異性抗体構築物の両方に関して、この必要性に応じることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO 99/54440
【特許文献２】WO 2005/040220
【特許文献３】WO 2008/119567
【特許文献４】US 2014/0302037
【特許文献５】US 2014/0308285
【特許文献６】WO 2014/144722
【特許文献７】WO 2014/151910
【特許文献８】WO 2015/048272
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Leader, Nature Reviews Drug Discovery 2008 Jan 7, 21-39
【非特許文献２】Roberts, Trends Biotechnol. 2014 Jul;32(7):372-80
【非特許文献３】Wang, Int J Pharm. 1999 Aug 20;185(2):129-88
【非特許文献４】Chi et al., Pharm Res, Vol. 20, No. 9, Sept 2003, pp. 1325-1336
【非特許文献５】Mahler J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34
【発明の概要】
【００１４】
二重特異性Ｔ細胞結合抗体構築物を含むタンパク質ベースの医薬品、例えば二重特異性抗体構築物の、通常、静脈内経路を介した、安全、定量的、かつ任意で長期的な投与は、課題である。このために、本発明に関して、以下を含む、医薬組成物を提供する：
ｉ．第一の結合ドメインを介して標的細胞表面抗原に結合し、第二の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性抗体構築物であって、前記鎖抗体構築物が０．５μｌ／ｍｌ〜２０、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１０または５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、前記二重特異性抗体構築物；
ｉｉ．ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタクレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン及びチオメロサールから選択される、微生物の増殖を阻害するのに有効な濃度の少なくとも１つの保存剤；
ｉｉｉ．二重特異性抗体構築物が安定である、希釈剤。
【００１５】
本発明に関して、二重特異性抗体構築物が、以下からなるリストから選択される範囲の濃度で存在することが想定される：
（ａ）ｐＨ６．５〜７．５で、０．５〜２００μｇ／ｍｌ；または
（ｂ）ｐＨ４．０〜６．０で、０．５〜１０００μｇ／ｍｌ；または
（ｃ）ＣＤ３結合ドメイン安定化剤、好ましくはクエン酸塩の存在下、ｐＨ４．０〜７．５で、０．５μｇ〜２ｍｇ；または
（ｄ）ｐＨ４．０〜７．５で、０．５μｇ〜２０ｍｇ、好ましくは０．５μｇ〜１０または５ｍｇ／ｍｌ、ここで二重特異性抗体は、それぞれヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含む第三の結合ドメインを含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合され、かつ前記第三の結合ドメインは、アミノからカルボキシルに向けて順に以下を含む：
ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３− リンカー − ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３。
【００１６】
本発明に関して、医薬組成物が、二重特異性一本鎖抗体構築物である二重特異性抗体構築物を含むこともまた想定される。
【００１７】
本発明に関して、二重特異性抗体構築物が、１．０〜２０ｍｇ／ｍｌ、または１．０〜１０ｍｇ／ｍｌ、または１．０μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、または１．０μｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、または１．０μｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌ、または１．０μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、または１．０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、または１．５〜５ｍｇ／ｍｌ、または１．５μｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、または１．５μｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌ、または１．５μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、または１．５μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、または１．５〜２００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することがさらに想定される。
【００１８】
本発明に関して、少なくとも１種の保存剤が、０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在することも想定される。
【００１９】
本発明に関して、保存剤が、０．００９〜０．９％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１１〜０．９％、または０．５〜０．７５％（ｗ／ｖ）、または０．６〜０．７４％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在することがさらに想定される。
【００２０】
本発明に関して、希釈剤が、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩及び酒石酸塩からなる群から選択される塩を含む緩衝液であり、及び／または、そこにおいて緩衝液が、ヒスチジン、グリシン、ＴＲＩＳグリシン、トリス、またはそれらの混合物を含むことが想定される。
【００２１】
本発明に関して、希釈剤が、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、及びヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、またはそれらの混合物からなる群から選択される緩衝液であることがさらに想定される。
【００２２】
本発明に関して、希釈剤が、０．１〜１５０ｍＭの範囲の、好ましくは０．２５〜５０ｍＭの範囲の濃度で存在する緩衝液であることも想定される。
【００２３】
本発明に関して、希釈剤が、０．２５〜５０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩を含む緩衝液であることがさらに想定される。
【００２４】
本発明に関して、組成物のｐＨが、４．０〜８．０の範囲、好ましくはｐＨ４．０〜５．０またはｐＨ６．５〜７．５の範囲、または好ましくはｐＨ７．０であることが想定される。
【００２５】
本発明に関して、医薬組成物が、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック及びそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含むことがさらに想定される。
【００２６】
本発明に関して、医薬組成物が、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０、及び／またはリジンＨＣＬをさらに含むことも想定される。
【００２７】
本発明に関して、二重特異性抗体構築物の濃度が少なくとも１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１５μｇ／ｍｌ、または２０μｇ／ｍｌである場合、医薬組成物が、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０、及び／またはリジンＨＣＬを含まないことがさらに想定される。
【００２８】
本発明に関して、二重特異性抗体構築物の第一の結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＦＬＴ３、ＤＬＬ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡからなる群から選択される少なくとも１つの標的細胞表面抗原に結合することが、なおさらに想定される。
【００２９】
本発明に関して、第一の結合ドメインが：
（ａ）配列番号１に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｂ）配列番号２９に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３１に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号３４に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３６に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｃ）配列番号４２に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４４に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４５に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４７に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号５３に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５４に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号５５に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号５６に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５７に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５８に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｅ）配列番号６５に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６６に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６７に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号６８に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６９に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号７０に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｆ）配列番号８３に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８４に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８５に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８７に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号８８に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｇ）配列番号９４に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９５に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９６に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号９７に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９８に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号９９に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｈ）配列番号１０５に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０６に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１０７に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１０９に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１０に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１１に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｉ）配列番号１１５に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１６に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１１７に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１８５に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１９に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１２０記載のＣＤＲ−Ｌ３、
（ｊ）配列番号１２６に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２７に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１２８に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１２９に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３０に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１３１に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｋ）配列番号１３７に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３８に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３９に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１４０に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４１に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１４２に示すＣＤＲ−Ｌ３、
（ｌ）配列番号１５２に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５３に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５４に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５５に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５６に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５７に示すＣＤＲ−Ｌ３、ならびに
（ｍ）配列番号１６７に示すＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６８に示すＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６９に示すＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１０７に示すＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７１に示すＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７２に示すＣＤＲ−Ｌ３
からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが想定される。
【００３０】
本発明に関して、二重特異性抗体構築物が、半減期延長（ＨＬＥ）部分、好ましくはｓｃＦｃドメインを有することがさらに想定される。
【００３１】
本発明に関して、医薬組成物が、液体、凍結乾燥物、または凍結した液体であることも想定される。
【００３２】
本発明に関して、組成物が、＜５％、好ましくは＜１％の二重特異性抗体構築物の多量体を含むことがなおさらに想定される。
【００３３】
本発明に関して、多量体は二量体であると考えられる。
【００３４】
本発明に関して、組成物が、室温で、少なくとも４日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１４日間、＜５％、好ましくは＜１％の二重特異性抗体構築物の多量体を含むことがさらに想定される。
【００３５】
本発明に関して、医薬組成物を、好ましくはＥＶＡ、ポリオレフィン、及び／またはＰＶＣ製のプラスチック投与容器に充填することも想定される。
【００３６】
本発明に関して、請求項６〜１３に記載の緩衝液及び／または賦形剤の少なくとも１つを含むプラスチック投与容器からの希釈物から、二重特異性一本鎖抗体構築物を少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、または更に少なくとも９９％回収することがなおさらに想定される。
【００３７】
本発明に関して、医薬組成物は、ｐＨ６．５〜７．５で少なくとも０．２５ｍＭのクエン酸塩、少なくとも０．０１２５ｍＭのリジン及び／または少なくとも０．００１％のポリソルベート８０を含むことが想定される。
【００３８】
本発明に関する医薬組成物は、−５０℃、好ましくは−４０℃、−３０℃または−２０℃で保存される貯蔵溶液であることがさらに想定される。
【００３９】
本発明に関して、−５０℃、好ましくは−４０℃、−３０℃または−２０℃で保存された貯蔵溶液として提供される医薬組成物は、それぞれヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含む第三の結合ドメインを含む二重特異性抗体を含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合され、前記第三の結合ドメインは、アミノからカルボキシルに向けて順に以下のとおりであることも想定される：
ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３ − リンカー − ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３。
【００４０】
本発明に関して、二重特異性抗体構築物を凍結乾燥物として提供し、前記凍結乾燥物は、好ましくは、凍結保護剤、緩衝液及び／または界面活性剤を含み、前記凍結乾燥物を、保存剤を含み且つ好ましくは緩衝液及び／または賦形剤を含む希釈剤によって再構成することがさらに想定される。
【００４１】
本発明の文脈において、溶液として、凍結状態の溶液としてまたは凍結乾燥物として、医薬組成物は使用するまで保存され、その後、任意で希釈または再構成の後に、保存剤、安定化剤または界面活性剤から選択されるさらなる賦形剤を添加する必要なく、投与されることが特に想定される。
【００４２】
本発明に関して、医薬組成物を悪性疾患の治療に使用することも想定される。
【００４３】
本発明に関して、悪性疾患の治療または改善方法であって、それを必要とする対象に、本発明の、または本発明の方法により製造した医薬組成物を投与する工程を含む、前記治療または改善方法もなおさらに想定される。
【００４４】
本発明に関して、本発明による医薬組成物を、１〜２４時間、好ましくは１〜１０または２〜５時間、静脈内に、好ましくは連続的に投与することが想定される。
【００４５】
本発明に関して、本発明による医薬組成物を、２〜１４日間、好ましくは２〜１０日間、最も好ましくは４〜７日間、静脈内に連続的に投与することがさらに想定される。
【００４６】
また、本発明に関して、好ましくは凍結保護剤、緩衝液及び／または界面活性剤を含む凍結乾燥物としての、二重特異性抗体構築物と、保存剤を含み且つ好ましくは本発明による緩衝液及び／または賦形剤を含む、希釈剤と、を含むキットも想定される。
【００４７】
より具体的には、本発明は以下を提供する：
[１]
以下を含む、医薬組成物：
ｉ．第一の結合ドメインを介して標的細胞表面抗原に、第二の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性抗体構築物であって、前記鎖抗体構築物が、０．５μｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１０または５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、前記二重特異性抗体構築物；
ｉｉ．微生物の増殖を阻害するのに有効な濃度の、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン及びチオメロサールから選択される、少なくとも１つの保存剤；
ｉｉｉ．前記二重特異性抗体構築物が安定である、希釈剤；
[２]
前記二重特異性抗体構築物が、以下：
（ａ）ｐＨ６．５〜７．５で０．５〜２００μｇ／ｍｌ、または
（ｂ）ｐＨ４．０〜６．０で０．５〜１０００μｇ／ｍｌ、または
（ｃ）ＣＤ３結合ドメイン安定化剤、好ましくはクエン酸の存在下、ｐＨ４．０〜７．５で０．５μｇ〜２ｍｇ、または
（ｄ）ｐＨ４．０〜７．５、好ましくは４．０〜６．０で、０．５μｇ〜２０ｍｇ、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ〜１０または５ｍｇ／ｍｌ、
からなる群から選択される範囲の濃度で存在し、
各々がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ペプチドリンカーを介して互いに融合された２つのポリペプチド単量体を含む第三の結合ドメインを前記二重特異性抗体が含み、前記第三の結合ドメインがアミノからカルボキシルに向けて順に：
ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３ − リンカー − ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３
を含む、[１]に記載の医薬組成物；
[３]
前記二重特異性抗体構築物が、二重特異性一本鎖抗体構築物である、[１]に記載の医薬組成物；
[４]
前記少なくとも１つの保存剤が、０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、[１]に記載の医薬組成物；
[５]
前記保存剤が、０．００９〜０．９％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１１〜０．９％、または０．５〜０．７５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、[１]に記載の医薬組成物；
[６]
前記希釈剤が、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩及び酒石酸塩からなる群から選択される塩を含む緩衝液であり、及び／または前記緩衝液が、ヒスチジン、グリシン、ＴＲＩＳグリシン、トリス、またはそれらの混合物を含む、[１]に記載の医薬組成物；
[７]
前記希釈剤が、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、及びヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌまたはそれらの混合物からなる群から選択される緩衝液である、[１]に記載の医薬組成物；
[８]
前記希釈剤が、０．１〜１５０ｍＭの範囲の、好ましくは０．２５〜５０ｍＭの範囲の濃度で存在する緩衝液である、[１]に記載の医薬組成物；
[９]
前記希釈剤が、クエン酸塩を含む緩衝液である、[１]に記載の医薬組成物；
[１０]
前記希釈剤が、０．２５〜５０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩を含む緩衝液である、[１]に記載の医薬組成物；
[１１]
前記組成物のｐＨが４．０〜８．０の範囲であり、好ましくはｐＨ４．０〜５．０、または６．０〜７．５の範囲であり、好ましくはｐＨ７．０である、[１]に記載の医薬組成物；
[１２]
スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック及びその組合せからなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、[１]に記載の医薬組成物；
[１３]
ポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０及び／またはリジンＨＣＬをさらに含む、[１２]に記載の医薬組成物；
[１４]
二重特異性抗体構築物の濃度が少なくとも１０、１５または２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１５μｇ／ｍｌである場合、前記組成物がポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０及び／またはリジンＨＣＬを含まない、[１２]に記載の医薬組成物；
[１５]
前記二重特異性抗体構築物の前記第一の結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＦＬＴ３、ＤＬＬ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡからなる群から選択される少なくとも１つの標的細胞表面抗原に結合する、[１]に記載の医薬組成物；
[１６]
前記第一の結合ドメインが：
（ａ）配列番号１に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５に記載するＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号６に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｂ）配列番号２９に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３１に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号３４に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３６に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｃ）配列番号４２に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４４に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４５に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４７に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号５３に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５４に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号５５に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号５６に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５７に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５８に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｅ）配列番号６５に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６６に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６７に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号６８に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６９に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号７０に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｆ）配列番号８３に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８４に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８５に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８６に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８７に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号８８に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｇ）配列番号９４に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９５に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９６に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号９７に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９８に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号９９に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｈ）配列番号１０５に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０６に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１０７に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１０９に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１０に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１１に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｉ）配列番号１１５に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１６に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１１７に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１１８に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１９に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１２０に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｊ）配列番号１２６に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２７に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１２８に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１２９に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３０に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１３１に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｋ）配列番号１３７に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３８に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３９に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１４０に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４１に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１４２に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
（ｌ）配列番号１５２に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５３に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５４に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５５に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５６に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５７に記載するＣＤＲ−Ｌ３、ならびに
（ｍ）配列番号１６７に記載するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６８に記載するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６９に記載するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１７０に記載するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７１に記載するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７２に記載するＣＤＲ−Ｌ３、
からなる群から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、[１]に記載の医薬組成物；
[１７]
液体である、[１]に記載の医薬組成物；
[１８]
前記組成物が、＜５％、好ましくは＜１％の前記二重特異性抗体構築物の多量体を含む、[１]に記載の医薬組成物；
[１９]
前記多量体が二量体である、[１８]に記載の医薬組成物；
[２０]
前記組成物が、室温で、少なくとも４日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１４日間の期間、＜５％、好ましくは＜１％の前記二重特異性抗体構築物の多量体を含む、[１７]に記載の医薬組成物；
[２１]
好ましくはＥＶＡ、ポリオレフィン、及び／またはＰＶＣ製のプラスチック投与容器に充填される、[１]に記載の医薬組成物；
[２２]
前記二重特異性一本鎖抗体構築物が、[６]〜[１３]に記載の緩衝液及び／または賦形剤の少なくとも１つを含む前記プラスチック投与容器由来の希釈物から、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、または更には少なくとも９９％まで回収される、[２１]に記載の医薬組成物；
[２３]
前記二重特異性一本鎖抗体構築物が、ポリソルベート８０を含む前記プラスチック投与容器由来の希釈物から、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、または更には少なくとも９９％まで回収される、[２１]に記載の医薬組成物；
[２４]
ｐＨ６．５〜７．５で、少なくとも０．２５ｍＭのクエン酸、少なくとも０．０１２５ｍＭのリジン及び／または少なくとも０．００１％のポリソルベート８０を含む、[２１]に記載の医薬組成物；
[２５]
前記組成物が、−５０℃で、好ましくは−４０℃、−３０℃、または−２０℃で保存された貯蔵溶液である、[１]に記載の医薬組成物；
[２６]
各々がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ペプチドリンカーを介して互いに融合された２つのポリペプチド単量体を含む第三の結合ドメインを含む前記二重特異性抗体を前記組成物が含み、前記第三の結合ドメインがアミノからカルボキシルに向けて順に：
ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３ − リンカー − ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３
を含む、[２５]に記載の医薬組成物；
[２７]
前記組成物が、貯蔵のために凍結乾燥物として提供される、[１]に記載の医薬組成物；
[２８]
前記組成物が、溶液として、凍結状態の溶液として、または凍結乾燥物として、使用まで保存され、その後、任意で希釈または再構成ののちに、投与され、保存剤、安定化剤、または界面活性剤から選択される更なる賦形剤の添加を要しない、[１]に記載の医薬組成物；
[２９]
前記二重特異性抗体構築物を凍結乾燥物として提供し、前記凍結乾燥物が、好ましくは、凍結保護剤、緩衝液及び／または界面活性剤を含み、
保存剤を含み且つ好ましくは[６]〜[１３]のいずれかに記載の緩衝液及び／または賦形剤を含む希釈剤によって、前記凍結乾燥物を再構成する、
[１]に記載の医薬組成物の、調製方法；
[３０]
悪性疾患の治療に使用するための、[１]に記載の医薬組成物；
[３１]
[１]に記載の医薬組成物、または[２９]に記載の方法に従って製造した医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、悪性疾患の治療または改善のための方法；
[３２]
１〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、または２〜５時間、静脈内に連続的に投与される、[１]に記載の医薬組成物；
[３３]
２〜１４日間、好ましくは２〜１０日間、最も好ましくは４〜７日間、静脈内に連続的に投与される、[１]に記載の医薬組成物；
[３４]
好ましくは凍結保護剤、緩衝液及び／または界面活性剤を含む凍結乾燥物としての、前記二重特異性抗体構築物；ならびに
保存剤を含み且つ好ましくは[６]〜[１３]のいずれかに記載の緩衝液及び／または賦形剤を含む、希釈剤
を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】クロロブタノール、メチルパラベン、フェノール及びチオメロサールの保存剤について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定した、２５℃、ｐＨ４におけるＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のパーセンタイル高分子量（ＨＭＷ）種による安定性の図表。
【図２】保存剤ベンジルアルコールについて、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定した、２５℃、ｐＨ７におけるＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の濃度依存的な、ＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のパーセンタイル高分子量（ＨＭＷ）種の安定性の図表。
【図３Ａ】パーセンタイル主ピークによる安定性の図表。
【図３Ｂ】保存剤ベンジルアルコールの場合の、２５℃における保存剤濃度依存的な、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定したＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のパーセンタイル高分子量（ＨＭＷ）種による安定性の図表。
【図３Ｃ】保存剤ベンジルアルコールの場合の、投与容器材料に依存した、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定したＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のパーセンタイル高分子量（ＨＭＷ）種による安定性の図表。
【図３Ｄ】保存剤ベンジルアルコールの場合の、投与容器材料に依存した、２５℃における保存濃度依存的な、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定したＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のパーセンタイル主ピーク（単量体）による安定性の図表。
【図４】蛍光分光法によって測定した、保存剤ベンジルアルコールの存在下または非存在下における、ｐＨ４での、１ｍｇ／ｍｌのＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の変性の図表。
【図５】ＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物及び０、０．５、０．６または０．７％ベンジルアルコールを含む製剤中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ａ）、緑膿菌（Ｐ．ａｒｕｇｅｎｏｓａ）（Ｂ）、Ｅ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃｅ）（Ｃ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｄ）、Ｍ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）（Ｅ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（Ｆ）の微生物増殖の図表。
【図６−１】ベンジルアルコールの存在下で適用可能なＦＡＰαに対するクエン酸の安定化効果（Ａ）。抗ＣＤ３ドメインであって、抗ＣＤ３ドメイン中のペプチド１０８〜１１２（ＹＩＳＹＷ）がＦＡＰα中のペプチド３６７〜３７０に対応する（Ｂ）。ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物であって、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物中のペプチド３６４〜３６８（ＹＩＳＹＷ）がＦＡＰα中のペプチド３６６〜３７０に対応する（Ｃ）。ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物であって、ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物中のペプチド３６５〜３６９（ＹＩＳＹＷ）がＦＡＰαのペプチド３６６〜３７０に対応する（Ｄ）。
【図６−２】それぞれ二重特異性抗体構築物または単一ドメインの６００μｇ／ｍｌの濃度での、図６Ｅ及びＦはクエン酸及びベンジルアルコールの個々の効果を、図６Ｇ及びＨは組み合わせでの効果を示す。結果は、抗ＣＤ３ドメイン、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物、ＦＡＰα、およびＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物について同じである。
【図７】０．９％生理食塩水中、０〜１０％のＩＶＳＳ中でそれぞれ１μｇ／ｍＬに希釈したＣ８カラム上へのＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３非ＨＬＥ二重特異性抗体構築物の５０μＬ注入後の逆相クロマトグラム（Ａ）。各溶出ＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３非ＨＬＥ二重特異性抗体構築物試料のピーク面積を、希釈溶液に含まれるパーセンタイルＩＶＳＳ濃度［％ＩＶＳＳ］の関数としてプロットしている（Ｂ）。
【図８Ａ】パーセンタイル回収に関する賦形剤の影響及び必要性が評価される。２５℃で２４時間観察した場合、構築物濃度が少なくとも１５μｇ／ｍｌであれば、定量的なＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の回収を確実にするために、クエン酸、リジン、及びポリソルベート８０の組み合わせ（本明細書ではこの組み合わせをＩＶＳＳと略す）を添加する必要はない。
【図８Ｂ】定量的回収を促進する剤はポリソルベート８０であり、非界面活性剤賦形剤はこの効果のために必要ではない。
【図８Ｃ】０．００２％のポリソルベート８０は、１μｇ／ｍｌ及び０．０５μｇ／ｍｌの非常に低い濃度であっても、ＩＶバッグ中のＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の回収を確実にする。０．０２％のポリソルベート８０は、ＩＶＳＳ中の典型的な濃度に相当する。
【図９】保存剤ベンジルアルコールは、−２０℃で４週間にわたる保存後に示されるように、ｐＨ４で１ｍｇ／ｍｌの濃度で第三のドメイン（ＨＬＥドメイン）を含むＣＤ１９ｘＣＤ３、ＣＤ３３ｘＣＤ３、ＢＣＭＡｘＣＤ３及びＤＬＬ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物を含む医薬組成物の凍結安定性を改善する。
【図１０】凍結安定性に関する保存剤ベンジルアルコールによる安定化効果は、０．１％を超える濃度で最良であり、−２０℃で４週間にわたる保存後に、ｐＨ４でのＤＬＬ３ｘＣＤ３で例示されるように、二重特異性抗体構築物が５ｍｇ／ｍｌの高濃度であっても、ＨＭＷ種の減少を確実にする。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
本発明の根底にある一般的概念は、本発明による二重特異性抗体構築物を含む医薬組成物の安定性が、溶液及び凍結乾燥状態の両方において、液体医薬組成物への保存剤の添加によって、典型的には、二重特異性抗体構築物及び保存剤の濃度に依存して向上するという驚くべき知見である。驚くべきことに、本明細書で定義される第三のドメインを含む場合、すなわち半減期延長（ＨＬＥ）二重特異性抗体構築物であるか否かにかかわらず、約０．５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの特定の濃度で存在する場合、好ましくはＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物などの一本鎖抗体構築物である二重特異性抗体構築物を含む医薬組成物は、保存剤の存在下において安定であるだけでなく、この保存剤によっても安定化され得ることが見出されている。ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール及びフェノキシエタノールのような保存剤が、抗体などのタンパク質の凝集を促進することが当該技術分野において知られているので、これは特に驚くべきことである。しかし、例えば、二重特異性抗体濃度の種類、及び任意でｐＨ及び更なる補完安定化剤の存在に依存して、本発明の医薬組成物は安定である。ここで、保存剤及び任意でさらなる安定化補完賦形剤（例えば、クエン酸塩）の安定化作用は、主として第二の結合ドメイン（ＣＤ３結合ドメイン）との相互作用に関連するため、本明細書に記載の第一の結合ドメイン（標的化ドメイン）は、あまり重要でない。利点として、保存剤は、保存中、例えば凍結状態で、及び投与する際、任意でｐＨ調整後及び／または希釈後に、医薬組成物を物理的かつ微生物学的に安定化させるのに役立ち得る。したがって、好都合なことに、任意でｐＨ調整、例えばｐＨ４．０〜６．５のような低ｐＨから、ｐＨ６．５〜７．５の中性ｐＨ、及びｉ．ｖ．投与を目的とした希釈を行ったとしても、同じ医薬組成物を使用し得る。しかしながら、二重特異性抗体構築物の濃度は全体として、０．５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの範囲、または場合によっては０．３μｇ／ｍｌ〜１０、２０、またはさらには３０ｍｇ／ｍｌの範囲である。したがって、医薬組成物を含む静脈内輸液バッグなどの容器は、微生物混入が低減することにより、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３またはさらには１４日間などのより長い時間間隔で交換するだけでよく、これにより、患者の快適性は有意に向上する。
【００５０】
安定化及び微生物学的に有効な保存剤として、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン、フェノール及びチエロサールが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。医薬組成物を製剤化するのに有用な保存剤として、一般的に、抗菌剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤）、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられ；例として：塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素が挙げられる。抗菌保存剤は、微生物の増殖を低減することによって薬剤の貯蔵寿命を延ばすために使用する物質である。本発明の医薬組成物を製剤化するのに特に有用な保存剤として、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタクレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベンチオメロサールが挙げられる。構造及びこれらの保存剤の使用に対する典型的な濃度は、Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９６（１２），３１５５の表１に記載されている。
【００５１】
前述の保存剤は、異なる濃度で医薬組成物中に存在してもよい。例えば、ベンジルアルコールは、０．２〜１．１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜０．９％（ｖ／ｖ）の濃度で、クロロブタノールは０．３〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で、フェノールは０．０７〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で、メタクレゾールは０．１７〜０．３２％（ｗ／ｖ）の濃度で、またはチオメロサールは０．００３〜０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在してもよい。メチルパラベンの好ましい濃度は０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）、フェノキシエタノールについては０．１〜３％（ｗ／ｖ）、及びプロピルパラベンについては０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００５２】
理論に拘泥することを望むものではないが、ベンジルアルコールのような保存剤は、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物などの二重特異性抗体構築物の二量化部位に適切な濃度で結合し、二量体または他の多量体の形成の可能性を低下させる。それによって、例えばＣＤ１９ｘＣＤ３、ＢＣＭＡｘＣＤ３、ＰＳＡＭｘＣＤ３、ＣＤ３３ｘＣＤ３、またはＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物における凝集リスクを有意に低下させる。いくつかの領域のアンフォールディングは、ベンジルアルコールのような保存剤が、二重特異性抗体構築物の単量体を不安定化させ、そのことで二量体／凝集体の形成を増加させることを示唆しているため、これは特に驚くべきことである。しかしながら、これらの領域のいくつかは、二量体形成に関与する可能性が高い領域と重複する。領域性のアンフォールディングは、変換によって二量体形成を妨げて単量体へ戻し得、二重特異性抗体濃度が一定の限度内にある間は、全体の安定化に効果を与える。
【００５３】
特定の実施形態では、緩衝液及び／または賦形剤を用いて、本発明による静脈内投与のための医薬組成物中の保存剤の存在下での二重特異性抗体構築物の安定性を増加させてもよい。そのような賦形剤は本明細書において補完安定化剤と称され、これはＣＤ３結合ドメインと相互作用する。特定の実施形態、例えば、中性ｐＨにて、及び／または、本明細書に記載の第三の結合ドメインを有さず、且つ、より高濃度、例えば約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、もしくは１０００μｇ／ｍｌ、典型的には少なくとも５０μｇ／ｍｌもしくは２００μｇ／ｍｌで医薬組成物に存在する二重特異性抗体構築物では、そのような補完安定化剤が、保存剤の存在下での二重特異性抗体構築物の安定性を保証するために好ましい場合がある。これは、本明細書に記載の、第三の結合ドメインを有さない二重特異性抗体構築物、例えばＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性構築物の場合に当てはまり得る。二重特異性抗体構築物の濃度が、例えば２００、１５０、１００、または５０μｇ／ｍｌ以下である場合、そのような補完安定化剤、例えばクエン酸は必要とされないと考えられる。しかしながら、量的回収を可能にするために、すなわち損失（例えば投与容器への吸着）が低く、回収量のパーセンタイルが少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは更には９９．５％であるために、他の緩衝液及び／または賦形剤、例えばポリソルベート、例えばポリソルベート８０が、２０、１５、または１０μｇ／ｍｌの濃度にあることが好ましい場合もある。このことは、実用性（取扱い）の面と、医学的理由（アレルギー、副作用）の両方に関して、過剰な賦形剤が節約されることから、特に有効である。
【００５４】
中性ｐＨに比べると低いｐＨは、より高い濃度でもまた、保存剤による二重特異性抗体構築物の安定化を補完し、これはより高い濃度、例えば少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００μｇ／ｍｌで含む医薬組成物が安定であること、つまり、好ましくは５、４、３、２、１、またはさらには０．５％未満の低いパーセンタイルのＨＭＷ濃度を示すことが、理由である。
【００５５】
特定の実施形態において、保存剤の存在下で二重特異性抗体構築物を安定化するために使用する緩衝液及び／または賦形剤は、クエン酸、リジン及びポリソルベート８０を含む場合があるが、必ずしもこれらに限定するものではない。これらの任意の化合物を個別に、または任意の組合せで、またはその機能または構造における類似の化合物を用いて、本発明による保存剤の存在下での二重特異性抗体構築物の安定化効果を得てもよく、且つ／または、後者が安定性もしくは微生物学的安定性のために必要とされない、保存剤の不在下でもまた、これらを用いて回収率を増加させてもよい。
【００５６】
驚くべきことに、保存剤の存在下で二重特異性抗体構築物を安定化するための特定の実施形態で使用する緩衝液及び／または賦形剤もまた、及び／または同時に、患者に医薬組成物を投与するために使用する（プラスチック）容器からの二重特異性抗体構築物の回収を向上させるために使用してもよい。本発明による薬物は、通常、非常に低い濃度で投与するため、例えば、静脈内輸液バッグなどの投与容器への吸着は、有効量に重大な影響を及ぼす可能性がある。したがって、そのような緩衝液及び／または賦形剤の添加が容器からの薬物の回収を増加させ得ることは非常に有益である。例えば、クエン酸、リジン及び／またはポリソルベート８０の組合せを医薬組成物に加え、患者に投与することにより、これらの化合物の非存在下での薬物濃度に比べて、回収率を最大２５０％高め得る。この目的のためには、比較的低い量、例えば、少なくとも０．２５〜１ｍＭのクエン酸、０．０１２５Ｍのリジン及び／または０．００１％のポリソルベート８０で十分である場合がある。これは、十分な量であり得る１％のＩＶＳＳ溶液を患者に投与することに相当する。２、３、４、５、６、７、８、９または１０％のＩＶＳＳのようなより高い量でもより良い結果が得られる場合がある。４％ＩＶＳＳが好ましい場合がある。しかしながら、回収率向上の効果を得るために、ＩＶＳＳの全構成要素が必要とされるわけではない。例えば、ポリソルベートのみで、投与容器への薬物吸着を十分に低減し得る。本発明の前記態様は、非常に強力な薬物、例えば二重特異性抗体構築物の用量信頼性の向上に寄与する。したがって、本発明によって患者の安全性も向上する。
【００５７】
しかしながら、一定の閾値を超えると、そのような緩衝液及び／または賦形剤は、回収率を向上するためにもはや必要とされないことがある。そのような閾値は、例えば、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、または２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１５μｇ／ｍｌである。しかしながら、一般的に、医薬組成物は、回収率に関して、好ましくは少なくとも賦形剤としての界面活性剤、例えばポリソルベート、特にポリソルベート８０を含む。
【００５８】
本発明の別の局面において、ＨＤＸ所見に基づくと、本発明の第三の結合ドメインの存在の非存在に依存して、及び／または医薬組成物のｐＨに依存して、二重特異性抗体構築物が一定の閾値を超えて存在すると、ベンジルアルコールのような保存剤は、（疎水性）相互作用によって本発明に従う二重特異性抗体構築物の第二の結合ドメイン（抗ＣＤ３ドメイン）を特異的に不安定化させ得る。本明細書に記載の第三の結合ドメインが存在する場合、及び／またはｐＨが酸性、例えばｐＨ４．０〜６．５の場合、典型的には、この閾値は高くなる。理論に拘泥することを望むものではないが、そのような二重特異性抗体構築物の不安定化は、増加した立体配座の動力学と関連し得、ひいては、一般的には減少した分子安定性と関連し得る。しかしながら、驚くべきことに、本明細書では、緩衝液及び／または賦形剤、例えばクエン酸を含有する緩衝液または賦形剤は、不安定化効果を相殺し得る。そのような緩衝液及び／または賦形剤と保存剤との間の相殺効果は、配列番号１８〜２３に表すＣＤＲＳによって特徴付けられる抗ＣＤ３ドメインを有するすべての二重特異性抗体構築物に当てはまり得る（立体構造に関して）。このような二重特異性抗体構築物に関しては、より低濃度（例えば、５０μｇ／ｍｌ未満）で見られるように、二量体の抑制または減少が理由でベンジルアルコールのような保存剤が驚くべきことに単独で安定化特性を有する場合、ベンジルアルコールのような保存剤の存在下では安定化用の賦形剤は不要である。典型的には、医薬組成物が６．５を超えるｐＨを有し、かつ／または二重特異性抗体構築物が本明細書に記載の第三のドメインを含むならば、より高濃度、例えば２００μｇ／ｍｌより高い濃度では、これは当てはまらない。保存剤の不安定化効果が二重特異性抗体構築物濃度に基づくその安定化効果を上回る場合、クエン酸塩のような賦形剤を追加の補完安定化賦形剤として使用することができる。したがって、クエン酸塩のような追加の安定化剤の添加は、ベンジルアルコールのような保存剤の存在下での二重特異性抗体構築物のより多目的な使用（濃度範囲）を可能にする。
【００５９】
一方で、本発明に関して、医薬組成物は、例えば、静菌性０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ（０．９％ベンジルアルコールを含有する）を用いる７日間にわたる注入に適していると考えられる。特に、この選択肢は、安全上の理由から一定の閾値以上の体重の患者に利用可能であることが想定され、そのような閾値は、２０、２２または２５ｋｇであってもよい。
【００６０】
本発明に関する特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗体構築物を、静脈内投与のために、単回投与バイアル中に、滅菌した保存剤フリーの白色〜灰白色の凍結乾燥粉末として供給することが想定される。ＣＤ１９ｘＣＤ３抗体構築物の各単回用量バイアルは、本発明による３５ｍｃｇの二重特異性抗体構築物、クエン酸一水和物（３．３５ｍｇ）、塩酸リジン（２３．２３ｍｇ）、ポリソルベート８０（０．６４ｍｇ）、トレハロース二水和物（９５．５ｍｇ）、及びｐＨを７．０に調整するための水酸化ナトリウムを含有する。３ｍＬの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ（０．９％ベンジルアルコールを含む）で再構成した後、濃度は、本発明による二重特異性抗体構築物が１２．５ｍｃｇ／ｍＬとなる。単回投与バイアル中に、ＩＶＳＳ（Ｉ．ｖ．  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を、滅菌した保存剤フリー、無色〜淡黄色の透明な溶液として供給する。ＩＶ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒの各単回用量バイアルは、クエン酸一水和物（５２．５ｍｇ）、塩酸リジン（２２８３．８ｍｇ）、ポリソルベート８０（１０ｍｇ）、ｐＨを７．０に調整するための水酸化ナトリウム、及び注射用の水を含有する。
【００６１】
本発明において、用語「安定性」または「安定化」とは、医薬組成物の全体的な安定性、特に有効成分（すなわち、二重特異性一本鎖抗体構築物）自体の、特に、製剤化、充填、出荷、貯蔵及び投与時の安定性に関する。本発明の医薬組成物及び二重特異性一本鎖抗体構築物に関して、用語「安定性」または「安定」とは、特に、タンパク質凝集体（ＨＭＷＳ）の形成の減少または予防を指す。具体的には、用語「安定性」はまた、本明細書に記載の医薬組成物中に含まれる二重特異性（一本鎖）抗体構築物のコロイド安定性に関する。「コロイド安定性」とは、コロイド粒子（タンパク質など）が液体中に長時間（数日から数年）分散したままでいる能力のことである。保存に関する安定性に関して、微生物学的安定性という用語が用いられる。
【００６２】
本明細書中で使用する用語「（タンパク質）凝集体」とは、一般的に、所望の定義する種（例えば、単量体）の代わりに、「オリゴマー」または「多量体」などの、より高分子量のタンパク質種を包含する。この用語は、本明細書中において用語「高分子量種」及び「ＨＭＷＳ」と同じ意味で使用する。タンパク質凝集体は、一般的に、サイズ（小さいもの（二量体）から大きな集合体（準可視的または可視粒子）まで、及び直径がナノメートル〜マイクロメートルの範囲）、形態（ほぼ球状から線維状）、タンパク質構造（ネイティブに対して、非ネイティブ／変性）、分子間結合のタイプ（共有結合対非共有結合）、可逆性ならびに可溶性において異なっている。可溶性凝集体は、およそ１〜１００ｎｍのサイズ範囲をカバーし、タンパク質微粒子は、準可視的（約０．１〜１００．ｍ）及び可視（＞１００．ｍ）範囲をカバーする。前述のタイプのタンパク質凝集体はすべて一般的にこの用語に包含される。したがって、「（タンパク質）凝集体」という用語は、２種以上のタンパク質単量体の物理的に関連するまたは化学的に結合した非天然種のすべての種類を指す。
【００６３】
したがって、用語「タンパク質凝集」または「非天然凝集」とは、タンパク質分子が２つ以上のタンパク質からなる複合体に集合するプロセス（複数可）を意味し、そこでは個々のタンパク質は単量体として示される。タンパク質凝集をもたらす複数の経路が存在し、それらは、温度、振盪及び撹拌などの機械的ストレス、ポンピング、凍結及び／または融解ならびに製剤化を含む広範囲の条件によって誘導することができる。
【００６４】
温度が上昇すると、タンパク質の酸化や脱アミド化などの化学反応が促進され、それによって凝集が促進し得る。より高い温度はまた、四次、三次、及び二次構造レベルでのタンパク質の立体配座に直接影響を及ぼし、温度誘導性のアンフォールディングをもたらし、凝集を促進し得る。本願で言及する温度は、通常、不安定なタンパク質に基づく医薬品を長期貯蔵するための冷凍保存温度（−７０℃）、通常の凍結温度（−２０℃）、冷蔵温度（４℃）、室温（２５℃）及び生理学的温度（３７℃）である。
【００６５】
したがって、本発明の医薬組成物に保存剤を添加することにより、本発明の二重特異性抗体構築物に関して凍結状態での凝集が抑制され得ることが見出されたことは驚くべきことであった。したがって、そのような二重特異性抗体構築物は、−７０℃の代わりに、−５０℃、−４０℃、または好ましくはたとえ−３０℃または−２０℃であっても凍結状態での凝集を示さずに保存され、すなわち凝集物、例えば高分子量（ＨＭＷ）種が、少なくとも１ヶ月、例えば１、２、３、４、５、６、１２、または２４ヶ月の貯蔵時間にわたって、１％未満、またはさらには０．８％、０．６％、０．４％未満またはさらには０．３％未満にとどまる。利点として、−７０℃での貯蔵がより高い貯蔵温度に置き換えられ得る場合、または−７０℃での貯蔵能力が他のより不安定な貯蔵要素に割り当てられ得る場合、エネルギーの無駄を無くし得る。同時に、本発明による医薬組成物を保存するために、冷凍範囲の代わりに通常の凍結の保存温度が必要な場合にのみ、輸送上の課題が軽減される。理論に拘泥することを望むものではないが、凍結状態の凝集物は、二重特異性抗体構築物の第一の結合ドメインの特異的領域と第二の結合ドメインとの間の疎水性相互作用が理由で形成される可能性が高い。ベンジルアルコールのような保存剤の添加は、凍結状態での凝集を低く保つことができる。例えば、本発明による二重特異性抗体構築物の第二の結合ドメイン中の疎水性パッチに結合することにより、（凍結）溶液中の二重特異性抗体構築物の総量に対して１％未満のＨＭＷ種を有する。これは、ｓｃＦｃ  ＨＬＥドメインのような、本発明による第三のドメインを含む二重特異性抗体構築物に特に当てはまる。
【００６６】
好ましくは、凍結状態で貯蔵する薬学的組成物は、ｐＨ４．０〜６．５、好ましくは４．２〜４．８の範囲のｐＨを有する。患者に投与する前に、より良いｉ．ｖ．適合性のために、ｐＨを上げ得る。しかしながら、典型的には、医薬組成物は、投与前に賦形剤などの特定の成分を除去する必要なく使用することができる。従って、例えば凍結状態での貯蔵の間、物理的安定化剤として機能した保存剤は、任意で希釈及び／またはｐＨ調整後に、液体投与医薬組成物中で安定化剤としてその後作用することができ、また本発明による医薬組成物の微生物学的安定性を保証するための保存剤として働くことができる。
【００６７】
新しい氷／溶液界面の生成、容器表面への吸着、タンパク質及び溶質の凍結濃縮、ならびに緩衝液成分の結晶化によるｐＨ変化などの複雑な物理的及び化学的変化によって、凍結／解凍中にタンパク質の変性及び凝集が起こり得る。
【００６８】
タンパク質濃度の増加もまた、タンパク質凝集体の形成を促進し得る。高タンパク質濃度では、高分子溶質による高い全体積占有がその溶液中の各高分子種の挙動に与える影響を表す用語である、高分子クラウディングが生じる。この排除体積理論によれば、自己組織化、したがって潜在的に凝集が促進される可能性がある。
【００６９】
ベンジルアルコール及びフェノールなどの抗菌性保存剤は、保存期間中の無菌性を確実にするために、多くの場合、液体製剤中に必要であることが既知であり、また、それに加えて、多回投与製剤及びある種の薬物送達システム、例えば注射ペン、ミニポンプ及び局所塗布において必要である。多くの保存剤が、タンパク質の凝集を誘導すると報告されているが、根本的なメカニズムは十分に理解されていない。保存剤が、凝集しやすい折り畳まれていないタンパク質状態に結合し、そこを占有するとの説が提唱されている。
【００７０】
利点として、本発明の医薬組成物は、安定であること、すなわちストレス、特に熱ストレス、貯蔵、表面誘発ストレス（例えば凍結／融解サイクル、発泡）、濃縮（限外濾過及びダイアフィルトレーションによる）、または抗菌保存剤などの有機化合物との混合にさらされても、タンパク質凝集体を含まないかまたは実質的に含まないと考えられる。好ましくは、医薬組成物は、添付の実施例において評価した低ｐＨを有する組成物に比べて、同様の特性または向上した特性を有していてもよい。本発明の医薬組成物は、好ましくは、半減期が延長された、分散した単量体型二重特異性一本鎖抗体構築物などのタンパク質ベースの医薬品の均質な溶液である。
【００７１】
当業者であれば、医薬組成物が有効成分の安定化を効果的に提供する（すなわち、二重特異性一本鎖抗体構築物のタンパク質凝集体の形成を低減または阻害する）場合でさえ、いくつかの凝集体または配座異性体が場合によっては形成され得るものの、医薬組成物の全体的な有用性を実質的に損なうことはないことを認識するであろう。この場合、凝集体を「実質的に含まない」とは、特に、例えば添付の実施例で評価するような環境ストレスにさらされている場合においても、凝集体の量が、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％（ｗ／ｖ）未満にとどまることを意味する。
【００７２】
可溶性及び不溶性タンパク質凝集体の存在を判定するための方法は、とりわけ、Ｍａｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００９  Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９−３４に概説されている。可溶性タンパク質凝集体の形成は、添付の実施例に記載のように、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）によって評価することができる。ＳＥＣは、タンパク質凝集体の検出及び定量のために最もよく使用される分析方法の１つである。ＳＥＣ分析により、凝集体のサイズ決定、及びその定量化の両方が可能になる。ＳＥＱ−ＵＰＬＣは、約５〜１０００ｋＤａの分子量範囲におけるそれらの形状及びサイズ（流体力学的半径）に基づいて高分子の選択的かつ迅速な分離を可能にする。
【００７３】
タンパク質溶液は、不透過率または濁度と呼ばれる光学特性を示す。溶液の光学特性は、光を散乱し且つ光を吸収する、存在する粒子の関数である。タンパク質は天然のコロイドであり、水性製剤の濁度は、タンパク質濃度、非溶解粒子の存在、粒径及び体積単位当たりの粒子数に依存する。濁度は、３４０〜３６０ｎｍの範囲の光学密度としてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって測定することができ、可溶性及び不溶性凝集体の両方を検出するために使用することができる。
【００７４】
さらに、視覚的手段による試料の検査は、なおタンパク質凝集体を評価する重要な側面である。目に見える凝集体の有無の目視評価は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  Ｃｏｄｅｘ（ＤＡＣ）試験５に従って行うことが好ましい。
【００７５】
本明細書の他の箇所に記載されているように、本発明の医薬組成物は、おそらくは低ｐＨの作用及び場合によりそれに含まれるさらなる安定化剤の作用により、二重特異性一本鎖抗体構築物のコロイド安定性の増加を選好し、したがって液−液相分離（ＬＬＰＳ）の低下を示すか、またはまったく示さない。ＬＬＰＳは、熱力学的に駆動される現象であり、均質なタンパク質溶液が、温度の低下に伴って、タンパク質欠乏相（通常は最上層）及びタンパク質が豊富な相（通常は最下層）に分離する。ＬＬＰＳは、通常、単に２つの相を混合し、溶液の温度を上げることによって、完全に可逆的となる。ＬＬＰＳの発生は、短距離での誘引性のタンパク質−タンパク質相互作用に起因しており、タンパク質−タンパク質間の誘引力の強さの尺度となっている。本発明によるβ−シクロデキストリンを含有する医薬組成物は、β−シクロデキストリンを含有しない医薬組成物に比べて、ＬＬＰＳタンパク質欠乏相において二重特異性一本鎖抗体構築物を高濃度で含むことが見出されている。したがって、本発明の医薬組成物は、対照に比べて少ないＬＬＰＳを示すか、またはＬＬＰＳをまったく示さないことが想定され、したがって本発明の二重特異性一本鎖抗体構築物のコロイド安定性の増加を促進する。ＬＬＰＳは誘導可能であり、添付の実施例に記載のように、異なる相のタンパク質含量を調べることができる。
【００７６】
環境ストレスは、特に、熱変性及び／または化学変性に起因して、立体構造変化をもたらし得、このことが、今度は凝集に有利に働き得る。驚くべきことに、本発明者らは、二重特異性一本鎖抗体構築物も、芳香族アミノ酸の自家蛍光の発光強度を測定することによって評価される立体構造変化に関して安定であることを見出した。したがって、本発明の医薬組成物は、好ましくは、配座異性体（すなわち、非天然の、異常に折りたたまれたタンパク質種）の形成を低減または阻害する。
【００７７】
先に説明したように、本発明の安定な医薬組成物は、第一の結合ドメインを介して標的細胞表面抗原に結合し、第二の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性一本鎖抗体構築物を含む。
【００７８】
用語「抗体構築物」とは、抗体の構造及び／または機能、例えば全長すなわち免疫グロブリン分子全体の構造及び／または機能に基づく分子及び／または抗体またはその断片の可変重鎖（ＶＨ）及び／または可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから導出される分子を指す。したがって、抗体構築物は、その特定の標的または抗原に結合することができる。さらに、本発明による抗体構築物の結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つすべてＣＤＲの存在によって定義してもよい。抗体の最小構造要件を定義する別のアプローチは、それぞれ、特異的標的の構造内の抗体のエピトープの定義、エピトープ領域を構成する標的タンパク質のタンパク質ドメイン（エピトープクラスター）、または定義する抗体のエピトープと競合する特異的抗体への参照によるものである。本発明による構築物の由来元の抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含む。
【００７９】
本発明による抗体構築物の結合ドメインは、例えば、上記ＣＤＲの群を含み得る。好ましくは、これらのＣＤＲは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワークに含まれるが；ただし、両方を含む必要はない。例えば、Ｆｄフラグメントは２つのＶＨ領域を有し、しばしば完全な抗原結合ドメインのいくつかの抗原結合機能を保持する。抗体断片、抗体変異体または結合ドメインのフォーマットのさらなる例として、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価断片であるＦａｂフラグメント；（２）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結する２つのＦａｂフラグメントを有する二価断片であるＦ（ａｂ′）２フラグメント；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（４）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦＶライブラリー由来）。本発明による抗体構築物の実施形態の例として、例えば、ＷＯ００／００６６０５、ＷＯ２００５／０４０２２０、ＷＯ２００８／１１９５６７、ＷＯ２０１０／０３７８３８、ＷＯ２０１３／０２６８３７、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＵＳ２０１４／０３０８２８５、ＵＳ２０１４／０３０２０３７、ＷＯ２０１４／１４４７２２、ＷＯ２０１４／１５１９１０、及びＷＯ２０１５／０４８２７２に記載されている。
【００８０】
また、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２または「ｒ  ＩｇＧ」（「半抗体」）などの全長抗体の断片である「結合ドメイン」または「結合するドメイン」もまた、定義の範囲内にある。ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）、タンデム−ジｓｃＦｖ、タンデム−トリｓｃＦｖ、トリアボディまたはテトラボディなどの「多重特異性抗体」、及びナノボディのような単一ドメイン抗体、または他のＶ領域もしくはドメインとは独立して抗原もしくはエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨもしくはＶＬであり得るただ一つの可変ドメインを有する単一可変ドメイン抗体などの、抗体改変体とも呼ばれる抗体の改変断片をも含み得る。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、用語「一本鎖Ｆｖ」、「一本鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠失している一本鎖ポリペプチド抗体断片を指す。通常、一本鎖抗体は、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、抗原結合を可能にする所望の構造を形成可能にする。一本鎖抗体は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎにより、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）に記載されている。一本鎖抗体を産生する様々な方法が公知であり、米国特許第４，６９４，７７８号及び第５，２６０，２０３号；国際特許出願公開ＷＯ８８／０１６４９；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１に記載されているものが挙げられる。特定の実施形態では、一本鎖抗体は、二重特異性、多重特異性、ヒト、及び／またはヒト化及び／または合成抗体であり得る。
【００８２】
さらに、用語「抗体構築物」の定義には、別個の結合ドメインを介して、一価、二価及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）構築物、したがって２つのみの抗原性構造に特異的に結合する二重特異性構築物、ならびに２つより多くの、例えば３つ、４つまたはそれ以上の抗原性構造に特異的に結合する多特異性／多重特異性構築物が含まれる。さらに、用語「抗体構築物」の定義には、１つのポリペプチド鎖のみからなる分子、ならびに同一鎖（ホモ二量体、ホモ三量体またはホモオリゴマー）または異なる鎖（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロオリゴマー）であり得る、１つより多くのポリペプチド鎖からなる分子が含まれる。上記の同定した抗体及びその変異体または誘導体の例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ  ｅｄ．２０１０ならびにＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９に記載されている。
【００８３】
本明細書中で使用する用語「二重特異性」とは、「少なくとも二重特異性」である、すなわち、少なくとも第一の結合ドメイン及び第二の結合ドメインを有し、第一の結合ドメインが一つの抗原または標的（本明細書では：標的細胞表面抗原）に結合し、第二の結合ドメインが別の抗原または標的（本明細書では：ＣＤ３）に結合する抗体構築物を指す。したがって、本発明による抗体構築物は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を有する。例えば、第一のドメインは、好ましくは、本明細書に記載の１つ以上の種のＣＤ３εの細胞外エピトープに結合しない。用語「標的細胞表面抗原」とは、細胞が発現し、本明細書に記載の抗体構築物が接近可能であるように細胞表面に存在する抗原性構造を指す。それは、タンパク質、好ましくはタンパク質の細胞外部分、または糖鎖構造、好ましくは糖タンパク質などのタンパク質の炭水化物構造であってもよい。それは、好ましくは腫瘍抗原である。本発明の用語「二重特異性抗体構築物」は、例えば、３つの結合ドメインを有する三重特異性抗体構築物、または３つより多く（例えば、４つ、５つ…）の特異性を有する構築物などの多重特異性抗体構築物も包含する。
【００８４】
本発明による抗体構築物が（少なくとも）二重特異性であるとすれば、それらは天然に存在せず、それらは天然産物と顕著に異なる。したがって、「二重特異性」抗体構築物または免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合サイドを有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体構築物は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ′フラグメントの連結を含む様々な方法によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）参照。
【００８５】
本発明の抗体構築物の少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）は、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも含まなくてもよい。本発明によれば、用語「ペプチドリンカー」には、本発明の抗体構築物の１つの（可変及び／または結合）ドメイン及び別の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列を互いに連結するアミノ酸配列が含まれる。ペプチドリンカーはまた、本発明の抗体構築物の他のドメインに第三のドメインを融合させるために使用してもよい。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、いかなる重合活性も有さないことである。適切なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号及び第４，９３５，２３３号またはＷＯ８８／０９３４４に記載されているものがある。ペプチドリンカーはまた、他のドメインまたはモジュールまたは領域（半減期延長ドメインなど）を本発明の抗体構築物に結合させるために使用することもできる。
【００８６】
本発明の抗体構築物は、好ましくは、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製した抗体構築物」である。この用語は、抗原結合能力について候補配列を試験することができる非免疫細胞選択法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏファージディスプレイ、プロテインチップまたは任意の他の方法において可変領域（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）の全部または一部を生成する、上記定義による抗体構築物を指す。したがって、この用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によってのみ生成される配列を排除する。「組換え抗体」とは、組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学を用いて作製した抗体である。
【００８７】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築物とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団からなる個々の抗体が、可能な天然起源の突然変異及び／または少量で存在し得る翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）以外は同一であることを意味する。通常、異なる決定基（またはエピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原サイドまたは決定基に対して高度に特異的である。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、したがって他の免疫グロブリンの混入がないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈されない。
【００８８】
モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技術を使用することができる。例えば、使用するモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製してもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。ヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる技術の例として、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４（１９８３），７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。
【００８９】
次いで、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を用いてハイブリドーマをスクリーニングし、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。関連抗原の任意の形態、例えば、組換え抗原、天然起源の形態、その任意の変異体または断片、ならびにその抗原ペプチドを免疫原として使用してもよい。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられる表面プラズモン共鳴を使用して、標的細胞表面抗原のエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。
【００９０】
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法は、タンパク質発現ライブラリー、例えばファージディスプレイまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２２３，４０９；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７，Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）。
【００９１】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、関連する抗原を用いて、非ヒト動物、例えばげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ウサギまたはラット）を免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座のラージフラグメントを用いて、マウス抗体産生が欠損したマウス株を操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を産生し、選択してもよい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６、及びＷＯ９６／３３７３５参照。
【００９２】
モノクローナル抗体はまた、非ヒト動物から取得し、次いで当該技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、ヒト化抗体、脱免疫化抗体、キメラ抗体などに改変可能である。改変された抗体構築物の例として、非ヒト抗体のヒト化変異体、「親和性成熟」抗体（例えばＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，１０８３２−１０８３７（１９９１）参照）、ならびにエフェクター機能（複数可）を改変した抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２０１０）、前掲、及びＬｉｔｔｌｅ（２００９）、前掲、参照）が挙げられる。
【００９３】
免疫学において、親和性成熟とは、Ｂ細胞が、免疫応答の過程で抗原に対する親和性を増大させた抗体を産生するプロセスである。同じ抗原への反復的な曝露により、宿主は連続的により大きな親和性の抗体を産生する。天然プロトタイプと同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの親和性成熟は、突然変異及び選択の原理に基づいている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの親和性成熟は、抗体、抗体構築物、及び抗体断片の最適化に首尾よく用いられている。ＣＤＲ内部におけるランダム突然変異は、放射線、化学変異原またはエラープローンＰＣＲを用いて導入する。さらに、鎖シャッフリングによって遺伝子多様性を増加させることができる。ファージディスプレイなどのディスプレイ法を用いた２〜３ラウンドの突然変異及び選択は、通常、低いナノモル範囲の親和性を有する抗体断片を生じる。
【００９４】
抗体構築物のアミノ酸置換変異の好ましいタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般的に、さらなる開発のために選択して得られた変異体（複数可）は、それらを生成した親抗体に比べて向上した生物学的特性を有するであろう。そのような置換変異体を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟を含む。簡潔に述べると、いくつかの超可変領域サイド（例えば、６〜７サイド）に突然変異を導入し、各サイドですべての可能なアミノ酸置換を生成する。このようにして生成した抗体変異体を、各粒子内にパッケージングしたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合物として繊維状ファージ粒子から一価の様式で提示する。次いで、ファージディスプレイした変異体を、本明細書に開示するように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域サイドを同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、またはそれに加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、結合ドメインと、例えばヒト標的細胞表面抗原との間の接触点を同定することが有益であり得る。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述する技術による置換の候補である。そのような変異体が生成したならば、変異体のパネルを本明細書に記載するようなスクリーニングに供し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択してもよい。
【００９５】
本発明のモノクローナル抗体及び抗体構築物は、具体的には、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、そこにおいては、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である一方で、残りの鎖（複数可）は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同であり、ならびに所望の生物学的活性を示す限りにおいてそのような抗体の断片についても同様である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書で対象とするキメラ抗体として、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を有する「霊長類化（ｐｒｉｍｉｔｉｚｅｄ）」抗体が挙げられる。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２，１９８５，Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，３９７；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ０１７１４９６；ＥＰ０１７３４９４；及びＧＢ２１７７０９６。
【００９６】
抗体、抗体構築物、抗体断片または抗体変異体はまた、例えば、ＷＯ９８／５２９７６またはＷＯ００／３４３１７に開示されている方法による、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫」と呼ばれる方法）によって改変することができる。簡潔に述べると、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができ；これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープを表す（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に定義されているように）。潜在的なＴ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング」と呼ばれるコンピューターモデリングアプローチを適用することができ、さらに、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に記載されているように、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフに関して検索することができる。これらのモチーフは、１８種の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、したがって潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出した潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは単一のアミノ酸置換によって除去することができる。一般的には、保存的置換を行う。限定するものではないが、多くの場合、ヒト生殖系列抗体配列の位置に共通のアミノ酸を使用してもよい。ヒト生殖系列の配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１４：４６２８−４６３８に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ  ａｌ．  ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによってコンパイルされている）。これらの配列は、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲのためのヒト配列の供給源として使用することができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載されているように、コンセンサスのヒトフレームワーク領域を使用することもできる。
【００９７】
「ヒト化」抗体、抗体構築物、変異体またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２または抗体の他の抗原結合部分配列のような）は、大部分がヒト配列の抗体または免疫グロブリンであり、（ａ）非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列（複数可）を有する。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲも）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト（例えば、げっ歯類）種、例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどの種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換された、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基によって置換する。さらに、本明細書中で使用する場合、「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出されない残基も含む場合がある。これらの改変は、抗体性能をさらに改良し、最適化するために行われる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む場合がある。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）参照。
【００９８】
ヒト化抗体またはその断片は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価な配列で置換することによって作製することができる。ヒト化抗体またはその断片を生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７によって；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４によって；ならびにＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；ＵＳ５，８５９，２０５；及びＵＳ６，４０７，２１３によって提供されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全部または一部をコードする核酸配列を単離、操作、及び発現することを含む。そのような核酸は、上記のような所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、ならびに他の供給源から取得してもよい。次いで、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００９９】
ヒト化抗体はまた、トランスジェニック動物、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどを用いて産生してもよい。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載するヒト化抗体を調製するために使用してもよい例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のすべてのＣＤＲを、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置換してもよく、またはＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲと置換してもよい。所定の抗原へのヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置き換えるだけでよい。
【０１００】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換及び／または逆突然変異の導入によって最適化することができる。そのような改変型免疫グロブリン分子は、当該分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２，及びＥＰ２３９４００）。
【０１０１】
用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築物」及び「ヒト結合ドメイン」には、抗体、抗体構築物、ならびに、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（前掲）に記載されているような当該分野で公知の実質的にヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変及び定常領域またはドメインなどの抗体領域を有する結合ドメインが含まれる。本発明のヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムまたはサイド特異的突然変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入した変異）を有する場合がある。ヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基で置換された少なくとも１、２、３、４、５、またはそれ以上の位置を有することができる。しかしながら、本明細書中で使用する場合、ヒト抗体、抗体構築物及び結合ドメインの定義はまた、ゼノマウスなどの技術または系を用いて誘導可能な、非人工的及び／または遺伝的に改変した抗体のヒト配列のみを有する「完全ヒト抗体」を意図している。好ましくは、「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含まない。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物は、「単離された」または「実質的に純粋な」抗体構築物である。本明細書中に開示する抗体構築物を記載するために使用する場合、「単離された」または「実質的に純粋な」とは、その産生環境の成分から同定、分離、及び／または回収した抗体構築物を意味する。好ましくは、抗体構築物は、その産生環境からの他のすべての成分と遊離または実質的に会合しない。その産生環境の混入成分、例えば、組換え形質移入した細胞に由来する成分は、通常、ポリペプチドの診断的または治療的使用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。抗体構築物は、例えば、所与の試料中の総タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、状況に応じて、総タンパク質含量の５重量％〜９９．９重量％を構成し得ると考えられる。誘導可能なプロモーターまたは高発現プロモーターを使用することによって、ポリペプチドを有意により高い濃度で作製してもよく、それにより、ポリペプチドは高い濃度レベルで作製される。この定義には、当該技術分野で公知の多種多様な生物及び／または宿主細胞における抗体構築物の産生が含まれる。好ましい実施形態では、抗体構築物を、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によって少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（２）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して、非還元もしくは還元条件下で行うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製する。しかしながら、通常は、少なくとも１つの精製工程によって、単離された抗体構築物を調製する。
【０１０３】
用語「結合ドメイン」は、本発明に関連して、所与の標的エピトープまたは標的分子（抗原）の所与の標的サイド、例えば、それぞれ、ＣＤ３３及びＣＤ３上に（特異的に）結合／相互作用／認識するドメインを特徴とする。第一の結合ドメインの構造及び／または機能（例えばＣＤ３３を認識する）、及び好ましくは第二の結合ドメインの構造及び／または機能（ＣＤ３を認識する）もまた、抗体、例えば、全長すなわち免疫グロブリン分子全体の構造及び／または機能に基づいており、及び／または、抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び／または可変軽鎖（ＶＬ）ドメインまたはその断片から導出される。好ましくは、第一の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。第二の結合ドメインは、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件も含む。より好ましくは、第二の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第一及び／または第二の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列を骨格に移植するのではなく、ファージディスプレイまたはライブラリースクリーニング法によって産生されるかまたは入手可能であると考えられる。
【０１０４】
本発明によれば、結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドの形態である。そのようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカーまたはグルタルアルデヒドのような化学的架橋剤）を含む場合がある。タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性な断片、及び通常３０アミノ酸未満のペプチドを含む）は、共有ペプチド結合（アミノ酸の鎖を生じる）を介して互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む。
【０１０５】
本明細書中で使用する用語「ポリペプチド」は、通常３０個を超えるアミノ酸からなる分子群を記述する。ポリペプチドは、二量体、三量体及びより高次のオリゴマー、すなわち１残基を超えるポリペプチド分子からなる多量体をさらに形成する場合がある。そのような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一でも異なっていてもよい。したがって、そのような多量体の対応する高次構造は、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと呼ばれる。ヘテロ多量体の一例は抗体分子であり、その天然に存在する形態では２つの同一の軽ポリペプチド鎖及び２つの同一の重鎖ポリペプチド鎖からなる。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾によってもたらされた天然起源の修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指す。本明細書中で言及する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はまた、ペグ化などの化学修飾であってもよい。そのような改変は、当該技術分野において周知であり、本明細書において以下に記載される。
【０１０６】
好ましくは、標的細胞表面抗原に結合する結合ドメイン及び／またはＣＤ３εに結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを有する抗体及び抗体構築物は、げっ歯類（例えばネズミ、ラット、ハムスターまたはウサギ）可変及び／または定常領域のような非ヒト型を保有する抗体または抗体構築物に関連する問題のいくつかを回避する。そのようなげっ歯類由来タンパク質が存在することにより、抗体もしくは抗体構築物の迅速なクリアランスが生じ得るか、または患者による抗体もしくは抗体構築物に対する免疫応答が生じ得る。げっ歯類由来の抗体または抗体構築物の使用を避けるために、げっ歯類に完全なヒト抗体を産生させるようにヒト抗体機能をげっ歯類に導入することにより、ヒトすなわち完全ヒト抗体／抗体構築物を作製することができる。
【０１０７】
メガベースサイズのヒト遺伝子座をＹＡＣにおいてクローニング及び再構成し、それらをマウス生殖系列に導入する能力は、非常に広大にまたは粗くマッピングした遺伝子座の機能的構成要素を解明し、ならびにヒト疾患の有用なモデルを生成する強力なアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換するためのそのような技術の使用は、発生中のヒト遺伝子産物の発現及び調節、他のシステムとのそれらの情報伝達、ならびに疾患の誘導及び進行へのそれらの関与に関するユニークな洞察を提供し得る。
【０１０８】
そのような戦略の重要な実際的な応用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内在性Ｉｇ遺伝子を不活性化したマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入によって、プログラム化された発現及び抗体の組立ての背景にあるメカニズムならびにＢ細胞発生におけるそれらの役割を研究する機会が得られる。さらに、そのような戦略は、ヒト疾患における抗体治療の展望を開くための重要なマイルストーンである、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生産の理想的な供給源を提供することができる。完全なヒト抗体または抗体構築物は、マウスまたはマウス誘導化ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー性反応を最小限に抑え、したがって投与した抗体／抗体構築物の有効性及び安全性を高めることが期待される。完全なヒト抗体または抗体構築物を使用することにより、化合物の反復投与を必要とする炎症、自己免疫、及び癌などの慢性及び再発性のヒト疾患の治療において実質的な利点を提供することが期待できる。
【０１０９】
この目標のための１つのアプローチは、そのようなマウスがマウス抗体の非存在下で多くのレパートリーのヒト抗体を産生することを想定して、ヒトＩｇ遺伝子座のラージフラグメントを用いてマウス抗体の産生を欠損したマウス株を操作することであった。ヒトＩｇラージフラグメントは、大きな可変遺伝子多様性ならびに抗体産生及び発現の適切な調節を保持しているであろう。抗体の多様化及び選択のためのマウス機構、ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の欠如を利用することにより、これらのマウス株において複製されるヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む任意の目的の抗原に対する高親和性抗体を産生するはずである。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製し選択することができた。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス株の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）参照）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株は、それぞれ、コア可変及び定常領域配列を含むヒト重鎖遺伝子座及びκ軽鎖遺伝子座の２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖系列構成断片を含む、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いて操作された。ヒトＩｇ含有ＹＡＣは、抗体の再構成及び発現の両方に対してマウス系と適合性があることが証明され、不活化マウスＩｇ遺伝子を置換することができた。これは、Ｂ細胞発生を誘導し、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを作製し、抗原特異的ヒトｍＡｂを生成する能力によって示された。これらの結果はまた、より多くのＶ遺伝子、追加の調節要素、及びヒトＩｇ定常領域を含むヒトＩｇ遺伝子座のより大きな部分を導入することによって、感染及び免疫化に対するヒトの体液性応答の特徴である完全なレパートリーが実質的に再現される可能性を示唆した。Ｇｒｅｅｎらの研究は、それぞれ、ヒト重鎖遺伝子座及びκ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系列構成ＹＡＣフラグメントを導入することにより、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％超を導入するまでに最近拡張された。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及び米国特許出願第０８／７５９，６２０号参照。
【０１１０】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの作製については、米国特許第０７／４６６，００８号、第０７／６１０，５１５号、第０７／９１９，２９７号、第０７／９２２，６４９号、第０８／０３１，８０１号、第０８／１１２，８４８号、第０８／２３４，１４５号、第０８／３７６，２７９号、第０８／４３０，９３８号、第０８／４６４，５８４号、第０８／４６４，５８２号、第０８／４６３，１９１号、第０８／４６２，８３７号、第０８／４８６，８５３号、第０８／４８６，８５７号、第０８／４８６，８５９号、第０８／４６２，５１３号、第０８／７２４，７５２号、及び第０８／７５９，６２０号；ならびに、米国特許第６，１６２，９６３号；第６，１５０，５８４号；第６，１１４，５９８号；第６，０７５，１８１号、及び第５，９３９，５９８号、ならびに日本国特許第３０６８１８０Ｂ２号、第３０６８５０６Ｂ２号、及び第３０６８５０７Ｂ２号において論じられ、記述されている。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）、ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０、及びＷＯ０３／４７３３６も参照されたい。
【０１１１】
別のアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他の企業は、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用している。ミニ遺伝子座アプローチでは、外来性Ｉｇ遺伝子座を、そのＩｇ遺伝子座由来の断片（個々の遺伝子）を包含させることによって模倣する。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ｍｕ定常領域、及び第二の定常領域（好ましくはγ定常領域）を、動物への挿入のための構築物に形成する。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、及び各々Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号；第５，６２５，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号；第５，７７０，４２９号；第５，７８９，６５０号；第５，８１４，３１８号；第５，８７７，３９７号；第５，８７４，２９９号；及び第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓの米国特許第５，５９１，６６９号及び第６，０２３，０１０号、Ｂｅｒｎｓらの米国特許第５，６１２，２０５号；５，７２１，３６７；及び第５，７８９，２１５号、Ｃｈｏｉ及びＤｕｎｎの米国特許第５，６４３，７６３号、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号、第０７／５７５，９６２号、第０７／８１０，２７９号、第０７／８５３，４０８号、第０７／９０４，０６８号、第０７／９９０，８６０号、第０８／０５３，１３１号、第０８／０９６，７６２号、第０８／１５５，３０１号、第０８／１６１，７３９号、第０８／１６５，６９９号、第０８／２０９，７４１号に記載されている。ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、及びＷＯ９８／２４８８４、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたい。さらにＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）参照。
【０１１２】
Ｋｉｒｉｎはまた、マイクロセル融合によって染色体の大部分または染色体全体を導入した、マウスからのヒト抗体の生成も示した。欧州特許出願第７７３２８８号及び第８４３９６１号参照。Ｘｅｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ヒト抗体の潜在的な生成技術を開発している。この技術においては、ＳＣＩＤマウスを、ヒトリンパ細胞、例えば、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞で再構成する。次いで、マウスを抗原で免疫化し、その抗原に対する免疫応答を生じさせることができる。米国特許第５，４７６，９９６号；第５，６９８，７６７号；及び第５，９５８，７６５号参照。
【０１１３】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が存在することから、業界はキメラ抗体またはヒト化抗体を調製する必要に迫られた。しかしながら、特に抗体の慢性的使用、または多回にわたる使用により、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が観察されることが予想される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の懸念及び／または影響を低下させるために、標的細胞表面抗原に対するヒト結合ドメイン及びＣＤ３εに対するヒト結合ドメインを含む抗体構築物を提供することが望ましいと考えられる。
【０１１４】
用語「（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）指向する」及び「（特異的に）反応する」とは、本発明によれば、結合ドメインが、標的分子（抗原）上の所与のエピトープまたは所与の標的サイド、本明細書では：それぞれ、標的細胞表面抗原とＣＤ３εとが相互作用するか、または特異的に相互作用することを意味する。
【０１１５】
用語「エピトープ」とは、抗体もしくは免疫グロブリン、または抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体、断片もしくは変異体などの結合ドメインが、特異的に結合する抗原上のサイドを指す。「エピトープ」は抗原性であり、したがって、用語「エピトープ」は、本明細書において「抗原性構造」または「抗原決定基」と呼ばれることもある。したがって、結合ドメインは「抗原相互作用サイド」である。前記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義すると理解される。
【０１１６】
「エピトープ」は、タンパク質の三次折り畳みによって並置された連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「連続性エピトープ」とは、アミノ酸一次配列が認識エピトープを含むエピトープである。連続性エピトープは、通常、ユニークな配列中に、少なくとも３残基または少なくとも４残基、より一般的には、少なくとも５残基または少なくとも６残基または少なくとも７残基、例えば約８〜約１０残基のアミノ酸を含む。
【０１１７】
「構造的エピトープ」とは、連続性エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が認識エピトープの唯一の規定成分ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が結合ドメインによって必ずしも認識されないエピトープ）である。通常、構造的エピトープは、連続性エピトープよりも多くの数のアミノ酸を含む。構造的エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはその断片の３次元構造を認識する（本発明に関しては、結合ドメインの１つに対する抗原性構造は、標的細胞表面抗原タンパク質に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成する場合、構造的エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／またはポリペプチド主鎖が並置され、抗体がエピトープを認識することが可能になる。エピトープの立体構造を決定する方法として、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光法及び部位特異的スピン標識及び電子常磁体共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０１１８】
エピトープマッピング法を、以下に記載する：ヒト標的細胞表面抗原タンパク質の領域（隣接するアミノ酸ストレッチ）を、非ヒト及び非霊長類標的細胞表面抗原（例えば、マウス標的細胞表面抗原、しかし、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなどの他種のものも考え得る）の対応する領域と交換／置換する場合、使用する非ヒト、非霊長類標的細胞表面抗原に対して結合ドメインが交差反応性を有していない限り、結合ドメインの結合は減少すると考えられる。ヒト標的細胞表面抗原タンパク質内のそれぞれの領域への結合を１００％とする場合、前記減少は、ヒト標的細胞表面抗原タンパク質内のそれぞれの領域への結合に比べて、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％であり；より好ましくは、少なくとも６０％、７０％、または８０％、最も好ましくは９０％、９５％、またはさらには１００％である。上記のヒト標的細胞表面抗原／非ヒト標的細胞表面抗原のキメラは、ＣＨＯ細胞中で発現することが想定される。ヒト標的細胞表面抗原／非ヒト標的細胞表面抗原のキメラは、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインと融合することも想定される。
【０１１９】
エピトープマッピングのための代替的または追加の方法では、結合ドメインによって認識される特定の領域を決定するために、ヒト標的細胞表面抗原細胞外ドメインのいくつかの短縮型を生成することができる。これらの短縮型では、異なる細胞外標的細胞表面抗原ドメイン／サブドメインまたは領域を、Ｎ末端から開始して段階的に欠失させる。標的細胞表面抗原の短縮型を、ＣＨＯ細胞で発現させ得ることが想定される。標的細胞表面抗原の短縮型を、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインと融合させ得ることも想定される。標的細胞表面抗原の短縮型は、そのＮ末端にシグナルペプチドドメイン、例えばマウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチド由来のシグナルペプチドを包含し得ることも想定される。標的細胞表面抗原の短縮型は、細胞表面上のそれらの正しい発現を確認することを可能にするｖ５ドメインをＮ末端に（シグナルペプチドの後に）包含し得ることがさらに想定される。結合ドメインによって認識される標的細胞表面抗原領域をそれ以上包含しない標的細胞表面抗原の短縮型では、結合の減少または消失が起こると予想される。ヒト標的細胞表面抗原タンパク質全体（またはその細胞外領域もしくはドメイン）への結合を１００とする場合、結合の減少は、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％であり；より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、最も好ましくは９０％、９５％またはさらには１００％である。
【０１２０】
抗体構築物または結合ドメインによる認識に対する標的細胞表面抗原の特定の残基の寄与を決定するさらなる方法は、アラニンスキャニングであり（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＫＬ＆Ｗｅｉｓｓ  ＧＡ．  Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｎ；５（３）：３０２−７参照）、そこでは、例えば、部位特異的突然変異誘発により、分析すべき各残基をアラニンに置換する。アラニンは、その嵩張っていない、化学的に不活性なメチル官能基を有しながらも、他のアミノ酸の多くが有する二次構造基準を模倣することから、用いられる。突然変異させる残基のサイズを保存することが望ましい場合には、バリンまたはロイシンなどの嵩高いアミノ酸を用いることができる。アラニンスキャニングは、長い間使用されてきた成熟した技術である。
【０１２１】
結合ドメインとエピトープまたはエピトープを含む領域との間の相互作用は、結合ドメインが、特定のタンパク質または抗原（本明細書では：それぞれ、標的細胞表面抗原及びＣＤ３）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対して明白な親和性を示し、標的細胞表面抗原またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原では有意な反応性を示さない。「明白な親和性」とは、約１０−６Ｍ（ＫＤ）以上の親和性での結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０−１２〜１０−８Ｍ、１０−１２〜１０−９Ｍ、１０−１２〜１０−１０Ｍ、１０−１１〜１０−８Ｍの場合に特異的であると考えられ、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍである。結合ドメインが標的と特異的に反応するか、または標的に結合するかどうかは、とりわけ、前記結合ドメインと標的タンパク質または抗原との反応と、前記結合ドメインと標的細胞表面抗原またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応とを比較することによって容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、標的細胞表面抗原またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に本質的にまたは実質的に結合しない（すなわち、第一の結合ドメインは標的細胞表面抗原以外のタンパク質に結合することができず、第二の結合ドメインはＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。本発明による抗体構築物の予想される特徴は、他のＨＬＥフォーマットに比べて優れた親和性特性を有することである。そのような優れた親和性は、結果として、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の延長を示唆する。本発明による抗体構築物がより長い半減期を有することは、投与期間及び頻度を低減する可能性があり、これは通常は患者コンプライアンスの向上に寄与する。このことは、本発明の抗体構築物が、非常に弱体化しているか、または多疾病罹患癌患者にとっても特に有効であることから、特に重要な点である。
【０１２２】
用語「本質的に／実質的に結合しない」または「結合することができない」とは、本発明の結合ドメインが、標的細胞表面抗原またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に結合しないこと、すなわち、それぞれ、標的細胞表面抗原またはＣＤ３への結合を１００％とした場合、標的細胞表面抗原またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に対し、好ましくは３０％を超える、より好ましくは２０％を超える、より好ましくは１０％を超える、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％を超える反応性を示さないことを意味する。
【０１２３】
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列の特定のモチーフによって影響されると考えられる。したがって、それらの一次、二次及び／または三次構造ならびに前記構造の二次修飾の結果として結合が達成される。抗原相互作用サイドとその特異的抗原との特異的相互作用は、前記サイドの抗原への単純な結合をもたらし得る。さらに、抗原相互作用サイドとその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば、抗原の立体構造変化の誘導、抗原のオリゴマー化などにより、代替的または追加的にシグナルの開始をもたらす場合がある。
【０１２４】
用語「可変」とは、その配列の可変性を示し、特定の抗体（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）の特異性及び結合親和性を決定することに関与する抗体または免疫グロブリンドメインの部分を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）の対形成は、共に単一の抗原結合サイドを形成する。
【０１２５】
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく；重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭまたはＦＲ）と呼ばれ、三次元空間において６つのＣＤＲの骨格を提供し、抗原結合表面を形成する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分においてβシート構成をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）であって、ループ接続部を形成するとともに場合によってはβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって連結した前記ＦＲＭ領域を有する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲＭにより近接して一緒に保持され、そして他の鎖由来の超可変領域と共に、抗原結合サイドの形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、前掲参照）。
【０１２６】
用語「ＣＤＲ」及びその複数形の「ＣＤＲｓ」とは、３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）の結合特性を構成し、３つが重鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）の結合特性を構成する相補性決定領域を指す。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与し：それらは抗原特異性の主な決定因子である。
【０１２７】
正確な定義上のＣＤＲ境界及び長さは、異なる分類及びナンバリングシステムの対象となる。したがって、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触定義によって、または本明細書に記載のナンバリングシステムを含む任意の他の境界定義によって参照してもよい。境界が異なるにもかかわらず、これらの系の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」の構成においてある程度の重複を有する。したがって、これらの系によるＣＤＲの定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界領域が異なる可能性がある。例えば、Ｋａｂａｔ（種間配列多様性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）、及び／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）参照。抗原結合サイドを特徴付けるさらに別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）参照。２残基同定技術が、重複する領域だが同一ではない領域を定義する限りにおいて、これらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ系によるナンバリングが好ましい。
【０１２８】
一般的には、ＣＤＲは、正準構造として分類可能なループ構造を形成する。用語「正準構造」とは、抗原結合（ＣＤＲ）ループによって採用される主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つは、利用可能な立体構造のうちの限られたレパートリーしか有さないことが判明した。各正準構造は、ポリペプチド主鎖のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループのほとんどの部分においてアミノ酸配列変動率が高いにもかかわらず、非常に類似した３次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用されたループ構造とそれを取り巻くアミノ酸配列との間には関連性がある。特定の正準クラスの立体構造は、ループの長さ、及びループ内のキーポジション、ならびに保存されたフレームワーク（すなわち、ループの外側）内に存在するアミノ酸残基によって決定される。したがって、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて特定の正準クラスへの割り当てを行うことができる。
【０１２９】
用語「正準構造」とは、例えば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）にカタログ記載されているように、抗体の直鎖配列に関する考察も含む場合がある。Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（システム）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した方法で番号付けするために広く採用されている基準であり、本明細書中の他の箇所でも言及されているように、本発明に適用する好ましいスキームである。さらなる構造的考察を用いて、抗体の正準構造を決定することもできる。例えば、Ｋａｂａｔナンバリング法によって完全には反映されていないそれらの差異は、Ｃｈｏｔｈｉａらのナンバリングシステムによって記述し、及び／または他の技術、例えば、結晶学及び２次元または３次元計算モデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列を正準クラスに入れてもよく、それにより、とりわけ、適切なシャーシ配列（例えば、ライブラリー中の様々な正準構造を含むという要望に基づく）を同定することができる。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔナンバリング及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、前掲、に記載される構造に関する考察、ならびに抗体構造の正準態様を解釈するためのそれらの意義は、文献に記載されている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元立体配置は、当該技術分野で公知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８参照。
【０１３０】
軽鎖及び重鎖可変領域内の抗原結合において、軽鎖のＣＤＲ３、及び特に重鎖のＣＤＲ３は、最も重要な決定因子を構成し得る。いくつかの抗体構築物において、重鎖ＣＤＲ３は、抗原と抗体との間の主要な接触領域を構成すると考えられる。ＣＤＲ３のみを変化させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択スキームを用いて、抗体の結合特性を変化させたり、どの残基が抗原の結合に寄与するかを判定したりすることができる。したがって、ＣＤＲ３は、通常、抗体結合サイドの分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、最小で２アミノ酸残基まで短くてもよく、または２６アミノ酸を超えてもよい。
【０１３１】
古典的な全長抗体または免疫グロブリンでは、各軽鎖（Ｌ）は１つの共有ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結する一方で、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結する。ＶＨに最も近いＣＨドメインは通常ＣＨ１と呼ばれる。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性、細胞を介した細胞傷害性及び補体活性化などの様々なエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えばＦｃ受容体に位置する細胞表面と相互作用することができる。
【０１３２】
組換え及び体細胞突然変異後の抗体遺伝子の配列は非常に多様であり、これらの変化した遺伝子は、１０１０種類の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」とは、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に、全体的または部分的に由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。その配列（複数可）は、重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメント、ならびに軽鎖のＶ及びＪセグメントのｉｎ  ｖｉｖｏでの再構成によって生成し得る。あるいは、その配列（複数可）は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激に応答して再構成が生じた細胞から生成することができる。あるいは、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異誘発及び他の方法によって、配列（複数可）の一部または全部を得てもよく、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。レパートリーは、１つの配列のみを含んでもよく、または遺伝子的に多様なコレクションの配列を含む複数の配列を含んでもよい。
【０１３３】
本発明に関して、用語「Ｆｃ部分」または「Ｆｃ単量体」は、免疫グロブリン分子のＣＨ２ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメイン及びＣＨ３ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドを意味する。用語「Ｆｃ単量体」から明らかなように、これらのＣＨドメインを含むポリペプチドは「ポリペプチド単量体」である。Ｆｃ単量体は、重鎖（ＣＨ１）の第一の定常領域の免疫グロブリンドメインを除く少なくとも１つの免疫グロブリン定常領域の断片を含むが、１つのＣＨ２ドメインの機能的部分及び１つのＣＨ３ドメインの機能的部分を維持しており、そこにおいてＣＨ２ドメインはＣＨ３ドメインのアミノ末端にある。この定義の好ましい態様において、Ｆｃ単量体は、Ｉｇ−Ｆｃヒンジ領域の一部、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含むポリペプチド定常領域であり得、そこにおいてヒンジ領域はＣＨ２ドメインのアミノ末端にある。本発明のヒンジ領域は二量化を促進することが想定される。そのようなＦｃポリペプチド分子は、限定するものではないが、例えば、免疫グロブリン領域のパパイン消化によって得ることができる（当然、結果的に２つのＦｃポリペプチドの二量体が得られる）。この定義の別の態様では、Ｆｃ単量体は、ＣＨ２領域の一部とＣＨ３領域とを含むポリペプチド領域であり得る。そのようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、限定するものではないが、免疫グロブリン分子のペプシン消化によって得ることができる。一実施形態では、Ｆｃ単量体のポリペプチド配列は：ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域、ＩｇＧ３  Ｆｃ領域、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ＩｇＭ  Ｆｃ領域、ＩｇＡ  Ｆｃ領域、ＩｇＤ  Ｆｃ領域及びＩｇＥ  Ｆｃ領域のＦｃポリペプチド配列と実質的に同様である。（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９−２１７（１９９３）参照）。免疫グロブリン間にはある程度のバリエーションがあるため、また、単に明確にするために、Ｆｃ単量体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後部の２つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後部の３つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメインを指す。言及したように、Ｆｃ単量体はまた、これらのドメインのＮ末端に可撓性ヒンジを有することができる。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、Ｆｃ単量体はＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃ部分は免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３ならびに最初の２つのドメインとＣＨ２との間にヒンジを含む。Ｆｃ部分の境界は、様々に異なり得るが、機能的ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、それぞれ、Ｄ２３１（ヒンジドメインの―以下の表１中のＤ２３４に対応する）〜Ｐ４７６、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端のＬ４７６（ＩｇＧ４の場合）の残基を含むように規定することができる（ただし、ナンバリングはＫａｂａｔ法による）。ペプチドリンカーを介して互いに融合した２つのＦｃ部分またはＦｃ単量体は、本発明の抗体構築物の第三のドメインを定義し、ｓｃＦｃドメインと定義してもよい。
【０１３４】
本発明の一実施形態では、本明細書において開示するｓｃＦｃドメイン、すなわち、お互いに融合したＦｃ単量体は、抗体構築物の第三のドメインにのみ含まれることが想定される。
【０１３５】
本発明によれば、ＩｇＧヒンジ領域は、表１に示すＫａｂａｔナンバリングを用いて類推することによって同定することができる。上記に則して、本発明のヒンジドメイン／領域は、ＫａｂａｔナンバリングによるＤ２３４〜Ｐ２４３のＩｇＧ１配列ストレッチに対応するアミノ酸残基を含むと考えられる。同様に、本発明のヒンジドメイン／領域は、ＩｇＧ１ヒンジ配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１４４９）（以下の表１に示すストレッチＤ２３４〜Ｐ２４３に対応する−ヒンジ領域が依然として二量体化を促進する限り、前記配列の変異も想定される）を含むか、またはそれらからなると考えられる。本発明の好ましい実施形態では、抗体構築物の第三のドメイン内のＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位を、Ｎ３１４Ｘ置換によって除去し、そこにおいてＸはＱ以外の任意のアミノ酸である。前記置換は好ましくはＮ３１４Ｇ置換である。より好ましい態様では、前記ＣＨ２ドメインは、以下の置換（Ｋａｂａｔによる位置）Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃをさらに含む（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインのジスルフィド架橋を導入する）。
【０１３６】
本発明の抗体構築物の第三のドメインは、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて：ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１４４９）（すなわちヒンジ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１４４９）（すなわちヒンジ）−ＣＨ２−ＣＨ３を含むか、またはそれからなると考えられる。好ましい実施形態では、上記抗体構築物のペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）、またはそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、式中、ｘは５以上の整数（例えば、５、６、７、８以上など）であり、６が好ましい（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６）。上記構築物は、上記構築物は、上記置換Ｎ３１４Ｘ、好ましくはＮ３１４Ｇ、及び／またはさらなる置換Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃをさらに含む場合がある。本明細書中において前述で定義した本発明の抗体構築物の好ましい実施形態では、第二のドメインがヒト及び／またはＭａｃａｃａのＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合することが想定される。
【０１３７】
（表１）ヒンジ領域のアミノ酸残基のＫａｂａｔナンバリング
2018188437.tif 000002
【０１３８】
本発明のさらなる実施形態では、ヒンジドメイン／領域は、ＩｇＧ２サブタイプヒンジ配列ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１４５０）、ＩｇＧ３サブタイプヒンジ配列ＥＬＫＴＰＬＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号１４５１）またはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号１４５８）、及び／またはＩｇＧ４サブタイプヒンジ配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号１４５２）を含むか、またはそれらからなる。ＩｇＧ１サブタイプヒンジ配列は、以下の配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（表１及び配列番号１４５９に示す）であってもよい。したがって、これらのコアヒンジ領域もまた、本発明において想定される。
【０１３９】
ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＤ３ドメインの位置及び配列は、表２に示すＫａｂａｔナンバリングを用いて類推することによって同定することができる。
【０１４０】
（表２）ＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３領域のアミノ酸残基のＫａｂａｔナンバリング
2018188437.tif 000003
【０１４１】
本発明の一実施形態では、第一のまたは両方のＦｃ単量体のＣＨ３ドメイン内の強調した太字のアミノ酸残基を欠失させる。
【０１４２】
第三のドメインのポリペプチド単量体（「Ｆｃ部分」または「Ｆｃ単量体」）を互いに融合させるペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも２５個（２５、２６、２７、２８、２９、３０個など）のアミノ酸残基を有する。より好ましくは、このペプチドリンカーは、少なくとも３０個（３０、３１、３２、３３、３４、３５個など）のアミノ酸残基を有する。また、リンカーが、最大４０個のアミノ酸残基、より好ましくは最大３５個のアミノ酸残基、最も好ましくはちょうど３０個のアミノ酸残基を有することが好ましい。そのようなペプチドリンカーの好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）、またはそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、式中、ｘは５以上（例えば、６、７または８）の整数である。好ましくは、整数は６または７であり、より好ましくは、整数は６である。
【０１４３】
リンカーを使用して第一のドメインを第二のドメインへ、または第一もしくは第二のドメインを第三のドメインへ融合させる場合、このリンカーは、好ましくは、第一及び第二のドメインのそれぞれが互いに独立してそれらの異なる結合特異性を保持することを保証するのに十分な長さ及び配列を有する。本発明の抗体構築物中の少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を連結するペプチドリンカーについては、これらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基、例えば１２アミノ酸残基以下しか含まないペプチドリンカーが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６または５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５残基未満のアミノ酸を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２または１残基のアミノ酸（複数可）を有し、Ｇｌｙを豊富に含むリンカーが好ましい。第一及び第二のドメインの融合用のペプチドリンカーの好ましい実施形態を、配列番号１に示す。第二及び第三のドメインの融合用のペプチドリンカーの好ましいリンカーの実施形態は、（Ｇｌｙ）４リンカー、すなわち、それぞれＧ４リンカーである。
【０１４４】
上記の「ペプチドリンカー」の１つに関して、特に好ましい「単一」のアミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、前記ペプチドリンカーは単一のアミノ酸Ｇｌｙからなってもよい。本発明の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）、またはそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、式中、ｘは１以上の整数（例えば、２または３）である。好ましいリンカーを、配列番号１〜１２に示す。二次構造の促進がないことを含む前記ペプチドリンカーの特徴は、当該分野で公知であり、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３），Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１−３０）及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。任意の二次構造をさらに促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの相互の連結は、実施例に記載のように、例えば遺伝子工学によって提供することができる。融合し、機能的に連結した二重特異性一本鎖構築物を調製し、哺乳類細胞または細菌においてそれらを発現させる方法は、当該技術分野において公知である（例えば、ＷＯ９９／５４４４０またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。
【０１４５】
抗体構築物の好ましい実施形態または本発明では、第一及び第二のドメインは、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ、それらの形態のいずれかのダイアボディ及びオリゴマーからなる群から選択される形態の抗体構築物を形成する。
【０１４６】
特に好ましい実施形態によれば、及び添付の実施例に記載されるように、本発明の抗体構築物の第一及び第二ドメインは、「二重特異性一本鎖抗体構築物」、より好ましくは二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を用いて、上述のような合成リンカーにより、それらを単一のタンパク質鎖として作製することができ、そこにおいてＶＬ及びＶＨ領域は対になって一価分子を形成する；例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）参照。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、その断片を、全体すなわち全長抗体に対する方法と同じ方法で機能について評価する。したがって、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、通常、約１０〜約２５アミノ酸、好ましくは約１５〜２０アミノ酸の短いリンカーペプチドでこれらを連結する。リンカーは、通常、可撓性のためのグリシン、ならびに可溶性のためのセリンまたはトレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはその逆のいずれかで連結することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【０１４７】
二重特異性一本鎖抗体構築物は、当該分野で公知であり、ＷＯ９９／５４４４０，Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０，Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５，Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７，Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３，Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。一本鎖抗体の生成について記載する技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２０１０）、前掲、及びＬｉｔｔｌｅ（２００９）、前掲、を参照されたい）を適合させ、（１つの）選出した標的（複数可）を特異的に認識する一本鎖抗体構築物を生成することができる。
【０１４８】
２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、上記のようなリンカーを用いて）連結することにより、二価（２価とも呼ばれる）または二重特異性一本鎖可変断片（（ｓｃＦｖ）２の形態を有するｂｉ−ｓｃＦｖまたはｄｉ−ｓｃＦｖ）を操作することができる。２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、好ましくは二価であると呼ばれる（すなわち、同じ標的エピトープに対して２つの価数を有する）。２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、好ましくは二重特異性であると呼ばれる。２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を生成することによって連結を行い、タンデムｓｃＦｖを得ることができる（例えば、Ｋｕｆｅｒ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（５）：２３８−２４４参照）。別の可能性は、２つの可変領域が一緒に折り畳まれるには短すぎるリンカーペプチド（例えば、約５残基のアミノ酸）を有するｓｃＦｖ分子を作製し、ｓｃＦｖを二量体化させることである。このタイプは、ダイアボディとして知られる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊｕｌｙ  １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９０（１４）：６４４４−８参照）。
【０１４９】
本発明によれば、第一、第二ドメインのいずれか、または第一及び第二ドメインは、それぞれ、単一ドメイン抗体、可変ドメイン、または少なくとも単一ドメイン抗体のＣＤＲを含む場合がある。単一ドメイン抗体は、他のＶ領域またはドメインとは無関係に、特異的抗原に選択的に結合可能な一つ（単量体）の抗体可変ドメインのみを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物において見出された重鎖抗体から操作され、これらはＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類もまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、この抗体からＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。別のアプローチは、一般的な、例えば、ヒトまたはげっ歯類由来の免疫グロブリンから、二量体可変ドメインを分割して単量体に変換し、したがってＶＨまたはＶＬを単一ドメイン抗体として得ることである。単一ドメイン抗体に関するほとんどの研究は現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディまたは単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
【０１５０】
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体からなるモノクローナル抗体構築物である。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ」は、上記の少なくとも１つの単一ドメイン抗体及び上記の１つのｓｃＦｖ分子からなるモノクローナル抗体構築物である。この場合もまた、リンカーは好ましくはペプチドリンカーの形態である。
【０１５１】
抗体構築物が別の所与の抗体構築物との結合について競合するか否かは、競合アッセイ、例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは細胞ベースの競合アッセイなどで測定することができる。アビジン結合微粒子（ビーズ）も使用することができる。アビジンコーティングＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応させた場合、これらのビーズの各々を基質として用いて、ビーズ上でアッセイを行うことができる。抗原をビーズ上にコーティングし、次いで第一の抗体でプレコーティングする。第二の抗体を添加し、任意のさらなる結合を測定する。読取り用の可能な手段として、フローサイトメトリーが挙げられる。
【０１５２】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球（それ自体が白血球の一種）の一種である。Ｔ細胞のいくつかのサブセットが存在し、それぞれ異なる機能を有する。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識する役割を担い、２つの異なるタンパク質鎖からなる。Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲはアルファ（α）及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と結合すると、Ｔリンパ球は、関連する酵素、共受容体、特殊アダプター分子、及び活性化または遊離転写因子によって媒介される一連の生化学的事象によって活性化される。
【０１５３】
ＣＤ３受容体複合体はタンパク質複合体であり、４つの鎖からなる。哺乳類では、複合体はＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連性が高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部には、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフまたは短縮してＩＴＡＭとして知られる単一の保存モチーフが含まれており、これはＴＣＲのシグナル伝達能力にとって不可欠である。ＣＤ３ε分子は、ヒトにおいては、第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。ＣＤ３εの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３ε細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７内に含まれる。本発明による抗体構築物は、一般的に、及び効果的なことに、特異的免疫療法において望ましくない非特異的Ｔ細胞活性化をあまり示さないと考えられる。これは、副作用のリスクの低減につながる。
【０１５４】
多重特異的、少なくとも二重特異的な抗体構築物によるＴ細胞の動員による標的細胞のリダイレクト溶解は、細胞溶解シナプス形成及びパーフォリン及びグランザイムの送達を含む。関与するＴ細胞は、連続標的細胞溶解が可能であり、ペプチド抗原のプロセシング及び提示、またはクローン性Ｔ細胞分化を妨害する免疫逃避機構によって影響されない；例えば、ＷＯ２００７／０４２２６１参照。
【０１５５】
本発明の抗体構築物によって媒介される細胞傷害性は、様々な方法で測定することができる。エフェクター細胞は、例えば、刺激した濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞または非刺激（ヒト）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク起源であるか、または発現しているか、または第一のドメインが結合しているマカク標的細胞表面抗原で標的細胞を形質移入する場合、エフェクター細胞はまた、マカクＴ細胞株、例えば４１１９ＬｎＰｘなどのマカク起源でなければならない。標的細胞は、標的細胞表面抗原、例えば、ヒトまたはマカク標的細胞表面抗原（の少なくともその細胞外ドメイン）を発現するはずである。標的細胞は、標的細胞表面抗原、例えばヒトまたはマカク標的細胞表面抗原で安定にまたは一過性に形質移入される細胞株（例えば、ＣＨＯ）であり得る。あるいは、標的細胞は、標的細胞表面抗原陽性の天然発現細胞株であることもできる。通常、細胞表面上により高いレベルの標的細胞表面抗原を発現する標的細胞株では、ＥＣ５０値はより低いと予想される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、通常、約１０：１であるが、変化させることもできる。標的細胞表面抗原ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性は、５１Ｃｒ遊離アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）またはＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ（約４８時間のインキュベーション時間）で測定することができる。アッセイのインキュベーション時間の改変（細胞傷害性反応）も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は当業者に周知であり、これには、ＭＴＴまたはＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰベースのアッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ及びＥＣＩＳ技術が含まれる。
【０１５６】
本発明の標的細胞表面抗原ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害性活性は、好ましくは、細胞ベースの細胞傷害性アッセイにおいて測定する。また、５１Ｃｒ遊離アッセイで測定してもよい。それはＥＣ５０値によって表され、それは、最大有効濃度の半分（ベースラインと最大の間の中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体構築物の濃度）に相当する。好ましくは、標的細胞表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭ、より好ましくは≦３０００ｐＭまたは≦２０００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦４００ｐＭまたは≦３００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦２０ｐＭまたは≦１０ｐＭ、最も好ましくは≦５ｐＭである。
【０１５７】
上記のＥＣ５０値は、異なるアッセイで測定することができる。当業者は、刺激／濃縮ＣＤ８＋  Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する場合、非刺激ＰＢＭＣに比べて、ＥＣ５０値がより低いと予想され得ることを認識している。標的細胞が多数の標的細胞表面抗原を発現している場合、標的の発現が少ないラットに比べてＥＣ５０値がより低いことがさらに予測され得る。例えば、刺激／濃縮ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し（そして標的細胞表面抗原を形質移入したＣＨＯ細胞などの細胞または標的細胞表面抗原陽性ヒト細胞株のいずれかを標的細胞として使用する）、標的細胞表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦１０００ｐＭ、より好ましくは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０ｐＭ、最も好ましくは≦５ｐＭである。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する場合、標的細胞表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭ（特に、標的細胞が標的細胞表面抗原陽性ヒト細胞株である場合）であり、より好ましくは≦２０００ｐＭ（特に、標的細胞が標的細胞表面抗原を形質移入したＣＨＯ細胞などの細胞である場合）、より好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、最も好ましくは≦５０ｐＭ、またはそれ以下である。エフェクター細胞としてＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株を用い、マカク標的細胞表面抗原を形質移入したＣＨＯ細胞などの細胞株を標的細胞株とした場合、標的細胞表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦２０００ｐＭまたは≦１５００ｐＭ、より好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦３００ｐＭまたは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、最も好ましくは≦５０ｐＭである。
【０１５８】
好ましくは、本発明の標的細胞表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＨＯ細胞などの標的細胞表面抗原陰性細胞の溶解を誘導／媒介せず、または本質的に誘導／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「本質的に溶解を誘導しない」、「溶解を媒介しない」または「本質的に溶解を媒介しない」とは、標的細胞表面抗原陽性ヒト細胞株の溶解を１００％とした場合、本発明の抗体構築物が、標的細胞表面抗原陰性細胞の３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％超の溶解を誘導または媒介しないことを意味する。これは、通常、５００ｎＭまでの抗体構築物濃度に対して適用される。さらなる労力を必要とせずに細胞溶解を測定する方法は、当業者には周知である。さらに、本明細書は、細胞溶解を測定する具体的な指示について示す。
【０１５９】
個々の標的細胞表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの間の細胞傷害活性の差は、「力価ギャップ」と呼ばれる。この力価の差は、例えば、分子の単量体型と二量体型のＥＣ５０値の間の比として計算することができる。本発明の標的細胞表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の力価ギャップは、好ましくは≦５、より好ましくは≦４、さらにより好ましくは≦３、さらにより好ましくは≦２、最も好ましくは≦１である。
【０１６０】
本発明の抗体構築物の第一及び／または第二の（またはいずれかの）結合ドメイン（複数可）は、好ましくは、霊長類目の哺乳類のメンバーに対して種間特異的である。種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えばＷＯ２００８／１１９５６７に記載されている。一実施形態によれば、ヒト標的細胞表面抗原及びヒトＣＤ３へのそれぞれの結合に加えて、第一及び／または第二の結合ドメインは、新世界霊長類（マーモセット、ワタボウシタマリン、またはリスザルなど）、旧世界霊長類（ヒヒやマカクなど）、テナガザル、及び非ヒトｈｏｍｉｎｉｎａｅを含む（が必ずしもこれらに限定されない）霊長類の標的細胞表面抗原／ＣＤ３にも結合する。
【０１６１】
本発明の抗体構築物の一実施形態では、第一のドメインは、ヒト標的細胞表面抗原に結合し、さらにマカク標的細胞表面抗原、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の標的細胞表面抗原、より好ましくはマカク細胞表面上に発現するマカク標的細胞表面抗原に結合する。マカク標的細胞表面抗原に対する第一の結合ドメインの親和性は、好ましくは≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭ、最も好ましくは≦０．０５ｎＭまたはさらに≦０．０１ｎＭである。
【０１６２】
好ましくは、マカク標的細胞表面抗原対ヒト標的細胞表面抗原［ｍａ標的細胞表面抗原：ｈｕ標的細胞表面抗原］の結合のための本発明の抗体構築物の親和性ギャップ（例えば、ＢｉａＣｏｒｅまたはＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって測定するような）は、＜１００、好ましくは＜２０、より好ましくは＜１５、さらに好ましくは＜１０、さらにより好ましくは＜８、さらに好ましくは＜６であり、最も好ましくは＜２である。マカク標的細胞表面抗原対ヒト標的細胞表面抗原の結合に対する本発明による抗体構築物の親和性ギャップの好ましい範囲は、０．１〜２０、より好ましくは０．２〜１０、さらにより好ましくは０．３〜６、さらにより好ましくは０．５〜３または０．５〜２．５、最も好ましくは０．５〜２または０．６〜２である。
【０１６３】
本発明の抗体構築物の第二の（結合）ドメインは、ヒトＣＤ３ε及び／またはＭａｃａｃａ  ＣＤ３εに結合する。好ましい実施形態では、第二のドメインは、さらに、マーモセット、ワタボウシタマリンまたはリスザル  ＣＤ３εに結合する。マーモセット及びワタボウシタマリンは、マーモセット亜科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）に属する新世界霊長類であり、一方、リスザルは、マーモセット科（Ｃｅｂｉｄａｅ）に属する新世界霊長類である。
【０１６４】
本発明の抗体構築物は、ヒト及び／またはＭａｃａｃａ  ＣＤ３の細胞外エピトープに結合する第二のドメインが、以下から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を有することが好ましい：
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２７に記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２８に記載のＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２９に記載のＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１７に記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１８に記載のＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１９に記載のＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５３に記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５４に記載のＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５５に記載のＣＤＲ−Ｌ３。
【０１６５】
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態では、ヒト及び／またはＭａｃａｃａ  ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第二のドメインは、以下から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を有する：
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３０に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３１に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３２に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４８に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４９に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５０に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６６に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６７に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６８に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８４に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８５に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８６に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０２に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０３に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０４に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２０に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２１に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２２に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３８に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３９に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４０に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５６に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５７に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５８に記載のＣＤＲ−Ｈ３；ならびに
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７４に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７５に記載のＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７６に記載のＣＤＲ−Ｈ３。
【０１６６】
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態では、上記の３つのＶＬ  ＣＤＲ群は、第二の結合ドメイン内の上記１０種のＶＨ  ＣＤＲ群と結合して、各々がＣＤＲ−Ｌ  １〜３及びＣＤＲ−Ｈ  １〜３を含む（３０）群を形成する。
【０１６７】
ＣＤ３に結合する第二のドメインが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７、２１、３５、３９、５３、５７、７１、７５、８９、９３、１０７、１１１、１２５、１２９、１４３、１４７、１６１、１６５、１７９もしくは１８３に記載されているか、または添付の配列表に配列番号１６もしくは２５として記載されているＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を有することは、本発明の抗体構築物にとって好適である。
【０１６８】
また、ＣＤ３に結合する第二のドメインが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７または１８１に記載されているか、または添付の配列表に配列番号１５もしくは２４として記載されているＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を有することも、本発明の抗体構築物にとって好適である。
【０１６９】
より好ましくは、本発明の抗体構築物は、以下からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含むＣＤ３に結合する第二のドメインを特徴とする：
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７または２１に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５または１９に記載のＶＨ領域；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５または３９に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３３または３７に記載のＶＨ領域；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５３または５７に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５１または５５に記載のＶＨ領域；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号７１または７５に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６９または７３に記載のＶＨ領域；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８９または９３に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８７または９１に記載のＶＨ領域；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０７または１１１に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０５または１０９に記載のＶＨ領域；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２５または１２９に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２３または１２７に記載のＶＨ領域；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４３または１４７に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４１または１４５に記載のＶＨ領域；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１６１または１６５に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５９または１６３に記載のＶＨ領域；ならびに
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７９または１８３に記載のＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７７または１８１に記載のＶＨ領域。
【０１７０】
本発明の抗体構築物に関して、配列番号１６または２５に記載のＶＬ領域及び添付の配列表に配列番号１５または２４として記載されるＶＨ領域を有するＣＤ３に結合する第二のドメインは、好適である。
【０１７１】
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態によれば、第一及び／または第二のドメインは、以下のフォーマットを有する：ＶＨ領域及びＶＬ領域の対は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットである。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順に配置される。ＶＨ領域はリンカー配列のＮ末端に位置し、ＶＬ領域はリンカー配列のＣ末端に位置することが好ましい。
【０１７２】
上記の本発明の抗体構築物の好ましい実施形態は、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５または１８７からなる群から選択されるか、または添付の配列表に配列番号２６として記載されているアミノ酸配列を有するＣＤ３に結合する第二のドメインを特徴とする。
【０１７３】
抗体構築物の共有結合修飾もまた、本発明の範囲内に含まれ、通常、修飾は翻訳後に行うが、必ずしも常にそうであるというわけではない。例えば、選択した側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤を、抗体構築物の特定のアミノ酸残基と反応させることによって、抗体構築物のいくつかのタイプの共有結合修飾を分子に導入する。
【０１７４】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０１７５】
ジエチルピロカルボネートがヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるため、ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０において、ジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化される。ｐ−臭化ブロモフェナシルも有用であり；好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で反応を行う。リジニル及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬として、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロホウ水素化物；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【０１７６】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンのうちの１つまたはいくつかの従来の試薬との反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、反応をアルカリ性条件下で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応し得る。
【０１７７】
チロシル残基に特定の修飾を行ってもよく、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心が持たれている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを用いて、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化し、ラジオイムノアッセイで使用するための標識タンパク質を調製するが、標識には上記のクロラミンＴ法が適切である。
【０１７８】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）をカルボジイミド（Ｒ′−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）との反応により選択的に修飾し、式中、Ｒ及びＲ′は、場合により異なるアルキル基、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【０１７９】
二官能性薬剤による誘導体化は、様々な方法で使用するための水不溶性支持マトリックスまたは表面に、本発明の抗体構築物を架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば３，３′−ジチオビス−（スクシンイミジルプロピオン酸）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及び、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋形成可能な光活性化性中間体を生成する。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックス及び米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；及び第４，３３０，４４０号に記載されているような反応性基質を、タンパク質固定化のために使用する。
【０１８０】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパラギン酸残基に脱アミドされることが多い。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミノ化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に入る。
【０１８１】
他の修飾として、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１８２】
本発明の範囲内に含まれる抗体構築物の共有結合修飾の別のタイプは、タンパク質のグリコシル化パターンを変更することを含む。当該技術分野で公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下に記載する特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）、またはタンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系を以下に記載する。
【０１８３】
ポリペプチドのグリコシル化は、一般的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかを存在させることによって、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに、糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つを結合させることを意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用してよい。
【０１８４】
抗体構築物へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記のトリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に達成される。改変はまた、（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）開始配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加または置換によって行ってもよい。容易にするために、抗体構築物のアミノ酸配列は、好ましくは、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが生成されるように、予め選択した塩基で突然変異させることによる、ＤＮＡレベルでの変化によって改変する。
【０１８５】
抗体構築物上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの手順は、Ｎ及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中でのタンパク質の産生を必要としない点で効果的である。使用するカップリングの様式に応じて、糖（複数可）を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させてもよい。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【０１８６】
出発抗体構築物上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成してもよい。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または同等の化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理により、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖が切断され、ポリペプチドはそのまま残る。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載されているように様々なエンド及びエキソグルコシダーゼを使用することによって達成できる。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５に記載されているように、化合物ツニカマイシンを使用することによって阻止してもよい。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。
【０１８７】
抗体構築物の他の改変もまた、本明細書において企図される。例えば、抗体構築物の共有結合修飾の別のタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載されているような方法で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレンの共重合体などの様々なポリオールを含むが、必ずしもこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーに抗体構築物を結合することを含む。さらに、当該技術分野で公知のように、例えば、ＰＥＧのようなポリマーの添加を容易にするために、抗体構築物内の様々な位置でアミノ酸置換を行ってもよい。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物の共有結合修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。様々な長さのスペーサーアームを介して抗体構築物に標識基を結合させ、潜在的な立体障害を低減してもよい。タンパク質を標識するための様々な方法が当該分野で公知であり、本発明を実施する際に使用することができる。用語「標識」または「標識基」とは、任意の検出可能な標識を指す。一般的に、標識は、検出するアッセイに応じて、様々なクラスに分類され、―これには以下の例が含まれるが、必ずしもこれらに限定するものではない：
ａ）放射性同位体または放射性核種などの放射性または重同位元素であってもよい同位体標識（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、
ｂ）磁気標識（例えば磁性粒子）
ｃ）レドックス活性部分
ｄ）蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基、及び「小分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれかであり得る蛍光体などの光学色素（発色団、蛍光体及びフルオロフォアを含むが、必ずしもこれらに限定されない）
ｅ）酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合サイド、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。
【０１８９】
「蛍光標識」とは、その固有の蛍光特性によって検出され得る任意の分子を意味する。適切な蛍光標識として、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファー・イエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｊ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ｄｙｅ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン）、ＦＩＴＣ、ローダミン、及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、ペンシルベニア）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。フルオロフォアを含む適切な光学色素は、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。
【０１９０】
適切なタンパク質性蛍光標識として、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、オレンジシーペン（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）、またはオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）種のＧＦＰを含む緑色蛍光タンパク質（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号；第５，４１８，１５５号；第５，６８３，８８８号；第５，７４１，６６８号；第５，７７７，０７９号；第５，８０４，３８７号；第５，８７４，３０４号；第５，８７６，９９５号；第５，９２５，５５８号）も挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０１９１】
本発明の抗体構築物はまた、さらなるドメインを含み場合があり、それは、例えば、分子の単離において有用であるか、または分子の適合した薬物動態特性に関連する。抗体構築物の単離に有用なドメインは、ペプチドモチーフまたは二次導入した部分から選択してもよく、これは単離法、例えば、分離カラムにおいて捕捉可能である。そのようなさらなるドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びその変異体（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）ならびにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを有する。同定したＣＤＲによって特徴づける本明細書に開示するすべての抗体構築物は、Ｈｉｓタグドメインを含む場合があり、それは、通常、分子のアミノ酸配列中の連続したＨｉｓ残基、すなわち、好ましくは５個、より好ましくは６個のＨｉｓ残基（ヘキサ−ヒスチジン）の反復として知られる。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体構築物のＮ末端またはＣ末端に配置してもよく、好ましくは、それはＣ末端に位置する。最も好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１６）を、ペプチド結合を介して本発明の抗体構築物のＣ末端に連結させる。さらに、徐放適用及び薬物動態特性の向上のために、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡの複合体システムをポリヒスチジンタグと組み合わせてもよい。
【０１９２】
本明細書に記載の抗体構築物のアミノ酸配列改変もまた意図される。例えば、抗体構築物の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体構築物のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体構築物核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製する。以下に記載するすべてのアミノ酸配列修飾は、非修飾の親分子の所望の生物学的活性（標的細胞表面抗原及びＣＤ３への結合）を依然として保持する抗体構築物をもたらすはずである。
【０１９３】
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」とは、一般的に、当該分野で認識されている定義を有するアミノ酸、例えば：アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＨｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；及びバリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群から選択されるアミノ酸を指すが、望みに応じて、改変した、合成の、または希なアミノ酸を使用してもよい。一般的に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負に荷電した側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正に帯電した側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）を有するアミノ酸として分類することができる。
【０１９４】
アミノ酸修飾には、例えば、抗体構築物のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／または挿入、及び／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特性を有するという条件の下に、欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを最終構築物に到達するように行う。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、抗体構築物の翻訳後プロセスを変化させる可能性がある。
【０１９５】
例えば、各ＣＤＲにおいて、１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸を挿入、置換または欠失させてもよく（もちろんそれらの長さに応じて）、一方、各ＦＲにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸を挿入、置換または欠失させてもよい。好ましくは、抗体構築物へのアミノ酸配列の挿入には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基〜１００残基以上を有するポリペプチドまでの範囲の長さのアミノ及び／またはカルボキシル末端への融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の内部配列挿入が含まれる。対応する改変を、本発明の抗体構築物の第三のドメイン内においても、行ってよい。本発明の抗体構築物の挿入変異体は、酵素の抗体構築物のＮ末端またはＣ末端への融合またはポリペプチドへの融合を含む。
【０１９６】
置換突然変異誘発にとって最も関心のある部位には、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が含まれる（しかし、必ずしもこれらに限定されない）が、重鎖及び／または軽鎖のＦＲ改変もまた意図される。置換は、好ましくは、本明細書に記載するような保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、ＣＤＲ内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を置換してもよく、一方、フレームワーク領域（ＦＲ）において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸を置換してもよい。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２または３個を置換することが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含する場合、１、２、３、４、５または６個のこれらのアミノ酸を置換することが想定される。
【０１９７】
突然変異誘発の好ましい位置である抗体構築物の特定の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。本明細書では、抗体構築物内の標的残基の残基または基（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置換し、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を与える。
【０１９８】
置換に対する機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、置換部位に、または置換部位のためにさらなるまたは他の変異体を導入することによって精製する。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位または領域は予め決定するが、突然変異そのものの性質は予め決定する必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析または最適化するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で行い、発現した抗体構築物変異体を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてもよい。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換変異を作製する技術、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発法及びＰＣＲ突然変異誘発法は公知である。突然変異体のスクリーニングは、標的細胞表面抗原またはＣＤ３結合などの抗原結合活性のアッセイを用いて行う。
【０１９９】
一般的に、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲの１つ以上またはすべてにおいてアミノ酸を置換する場合、その後得られる「置換」配列は、「元の」ＣＤＲ配列に対して、少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、さらにより好ましくは８０％または８５％、特に好ましくは９０％または９５％同一であるＣＤＲ配列を有する。このことは、その同一性の程度が、「置換」配列と同一であるＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個のアミノ酸が置換されるように、その置換後の配列と８０％同一であることが好ましい。したがって、抗体構築物のＣＤＲは、それらの置換後の配列と異なる程度の同一性を有する場合があり、例えば、ＣＤＲＬ１が８０％を有する一方で、ＣＤＲＬ３が９０％を有する場合がある。
【０２００】
好ましい置換（または置換え）は保存的置換である。しかしながら、抗体構築物が、それぞれ、第一のドメインを介して標的細胞表面抗原に、及び第二のドメインを介してＣＤ３、ＣＤ３εに結合する能力を保持し、及び／またはそのＣＤＲが、置換後の配列に対して同一性を有する（「元の」ＣＤＲ配列に対して、少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、さらにより好ましくは８０％または８５％、そして特に好ましくは９０％または９５％同一である）限り、（非保存的置換または以下の表３に列挙する１つ以上の「例示的置換」を含む）任意の置換が想定される。
【０２０１】
保存的置換を、「好適な置換」の見出しの下で表３に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表３の「例示的置換」と呼ばれる、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載するようなより実質的な変化を導入し、産物を所望の特性についてスクリーニングしてもよい。
【０２０２】
（表３）アミノ酸置換
2018188437.tif 000004
【０２０３】
本発明の抗体構築物の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、例えば、シートもしくはヘリカル構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さ、を維持することに対する効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ、に基づいてグループに分類される。
【０２０４】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。抗体構築物の適切なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基を、通常、セリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止してもよい。逆に、システイン結合（複数可）を抗体に添加して、その安定性を向上させてもよい（特に、抗体がＦｖフラグメントのような抗体断片である場合）。
【０２０５】
アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／または類似性は、限定するものではないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装版（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５によって記載されたＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムを含む当該分野で公知の標準的な技術を用いて、好ましくはデフォルト設定を使用して決定するか、または検査によって決定する。好ましくは、同一性の割合を、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算する：ミスマッチペナルティ１；ギャップペナルティ１；ギャップサイズペナルティ０．３３；及び結合ペナルティ３０、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．
【０２０６】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的なペアワイズアライメントを用いて関連配列のグループから複数の配列アライメントを作成する。また、アライメントを作成するために使用するクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレッシブアライメント法を単純化したものを使用し；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３に記載されたものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトのギャップウェイト３．００、デフォルトのギャップ長ウェイト０．１０、及び加重エンドギャップを含む。
【０２０７】
有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり：Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７に記載されている。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、その大部分はデフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは、以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の組成及び目的の配列を検索する特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体によって確立される；しかしながら、値を調整して感度を高めてもよい。
【０２０８】
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されたｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴである。ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを用い；閾値Ｔパラメータを９に設定する；ギャップのない延長を生じるツー・ヒット法は、ｋのギャップ長を１０＋ｋのコストでチャージし；Ｘｕを１６に設定し、Ｘｇをデータベース検索ステージでは４０、アルゴリズムの出力ステージでは６７に設定する。約２２ビットに対応するスコアによってギャップアライメントを生じさせる。
【０２０９】
一般的に、個々の変異型ＣＤＲまたはＶＨ／ＶＬ配列間のアミノ酸相同性、類似性または同一性は、本明細書に記載する配列に対して少なくとも６０％であり、より一般的には、少なくとも６５％または７０％、より好ましくは少なくとも７５％または８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及びほぼ１００％の高い相同性または同一性が好ましい。同様に、本明細書中で同定する結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、抗体構築物のコード配列中のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基の百分率として定義される。特定の方法は、デフォルトパラメーターに設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用し、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションはそれぞれ１及び０．１２５に設定する。
【０２１０】
一般的に、個々の変異型ＣＤＲまたはＶＨ／ＶＬ配列をコードするヌクレオチド配列と本明細書に記載するヌクレオチド配列との間の核酸配列相同性、類似性または同一性は、少なくとも６０％であり、より一般的には、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％  ９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、及びほぼ１００％の高い相同性または同一性が好ましい。したがって、「変異型ＣＤＲ」または「変異型ＶＨ／ＶＬ領域」は、本発明の親ＣＤＲ／ＶＨ／ＶＬに対して特定の相同性、類似性、または同一性を有するものであり、必ずしも限定するものではないが、親ＣＤＲまたはＶＨ／ＶＬの特異性及び／または活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む、生物学的機能を共有する。
【０２１１】
一実施形態では、本発明による抗体構築物のヒト生殖系列に対する同一性の割合は、≧７０％または≧７５％、より好ましくは≧８０％または≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％または≧９６％である。ヒト抗体の生殖系列遺伝子産物に対する同一性は、治療中の患者の薬物に対する免疫応答を誘発する治療タンパク質のリスクを低減する重要な特徴であると考えられている。Ｈｗａｎｇ＆Ｆｏｏｔｅ（“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（２００５）３−１０）は、薬物抗体構築物の非ヒト部分の低減が、治療中の患者において抗薬物抗体を誘発するリスクを低下させることを示す。網羅的な数の臨床的に評価された抗体薬物とそれぞれの免疫原性データとを比較することにより、抗体のＶ領域のヒト化は、未改変非ヒトＶ領域を保有する抗体（患者の平均２３．５９％）よりもタンパク質の免疫原性を低くする（患者の平均５．１％）ことを示す。したがって、ヒト配列に対するより高い程度の同一性は、抗体構築物の形態のＶ領域に基づくタンパク質治療剤にとって望ましい。生殖系列の同一性を決定する目的のために、ベクターＮＴＩソフトウェアを使用して、ＶＬのＶ領域を、ヒト生殖系列Ｖセグメント及びＪセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）のアミノ酸配列に対してアライメントすることができ、かつアミノ酸配列は、同一アミノ酸残基をＶＬのアミノ酸残基の総数で割った百分率で計算することができる。ＶＨ  ＣＤＲ３が、その高い多様性及び既存のヒト生殖系列ＶＨ  ＣＤＲ３アライメントパートナーの欠如のため、除外され得ることを除いて、ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についても同様であり得る。次いで、組換え技術を用いて、ヒト抗体生殖系列遺伝子に対する配列同一性を高めることができる。
【０２１２】
さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物は、標準的な研究規模条件下で、例えば標準的な二段階精製プロセスにおいて高い単量体収率を示す。好ましくは、本発明による抗体構築物の単量体収率は≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ上清である。
【０２１３】
同様に、二量体抗体構築物アイソフォームの収量、したがって、抗体構築物の単量体比率（すなわち、単量体：（単量体＋二量体））を決定することができる。単量体及び二量体抗体構築物の生産性及び計算した単量体比率は、例えば、ローラーボトルにおける標準化された研究規模の生産に由来する培養上清のＳＥＣ精製工程において得ることができる。一実施形態では、抗体構築物の単量体比率は≧８０％、より好ましくは≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９５％である。
【０２１４】
一実施形態では、抗体構築物の好ましい血漿安定性（血漿存在下でのＥＣ５０と血漿非存在下でのＥＣ５０の比率）は、≦５または≦４、より好ましくは≦３．５または≦３、さらにより好ましくは≦２．５または≦２、最も好ましくは≦１．５または≦１である。抗体構築物の血漿安定性は、３７℃での２４時間のヒト血漿中での構築物のインキュベーションと、その後の５１クロム遊離細胞傷害アッセイにおけるＥＣ５０測定によって試験することができる。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、濃縮したヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激することができる。標的細胞は、例えば、ヒト標的細胞表面抗原を形質移入したＣＨＯ細胞であり得る。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１を選択することができる。この目的のために使用するヒト血漿プールは、ＥＤＴＡでコーティングしたシリンジによって収集した健常ドナーの血液に由来する。遠心分離によって細胞成分を除去し、上部血漿相を集め、続いてプールする。対照として、抗体構築物を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中の細胞傷害性アッセイの直前に希釈する。血漿安定性はＥＣ５０（血漿インキュベーション後）とＥＣ５０（対照）との比として計算される。
【０２１５】
本発明の抗体構築物の単量体から二量体への変換が少ないことがさらに好ましい。この変換は、異なる条件下で測定し、高速サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。例えば、抗体構築物の単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーター中で、３７℃、７日間、例えば、１００μｇ／ｍｌまたは２５０μｇ／ｍｌの濃度で行うことができる。これらの条件下で、本発明の抗体構築物は、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、最も好ましくは≦１％または≦０．５％またはさらには０％の二量体比率を示す。
【０２１６】
本発明の二重特異性抗体構築物は、多数の凍結／融解サイクル後に非常に低い二量体変換を示すことも好ましい。例えば、抗体構築物単量体は、例えば、一般的な製剤の緩衝液中で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、３回の凍結／解凍サイクル（−８０℃で３０分間凍結し、続いて室温で３０分間解凍）に供した後、高速ＳＥＣにより、二量体抗体構築物に変換した、初期の単量体抗体構築物の割合を決定する。好ましくは、例えば３回の凍結／融解サイクルの後の二重特異性抗体構築物の二量体比率は、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、最も好ましくは≦１％、またはさらには≦０．５％である。
【０２１７】
本発明の二重特異性抗体構築物は、≧４５℃または≧５０℃、より好ましくは≧５２℃または≧５４℃、さらにより好ましくは≧５６℃または≧５７℃、最も好ましくは≧５８℃または≧５９℃の凝集温度で好適な温度安定性を示す。熱安定性パラメータは、抗体凝集温度に関して以下のように決定することができる：濃度２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を使い捨て型キュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置に入れる。測定した半径を一定に取得しながら、０．５℃／ｍｉｎの加熱速度で試料を４０℃から７０℃に加熱する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加を利用して、抗体の凝集温度を計算する。
【０２１８】
あるいは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって温度融解曲線を測定して、抗体構築物の固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定することができる。これらの実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＬＬＣ（ノーサンプトン、マサチューセッツ、米国）ＶＰ−ＤＳＣ装置を用いて実施する。抗体構築物を含有する試料のエネルギー吸収を、製剤緩衝液のみを含有する試料と比較して、２０℃〜９０℃で記録する。例えば、ＳＥＣランニング緩衝液中における抗体構築物の最終濃度を２５０μｇ／ｍｌに調整する。それぞれの融解曲線を記録するために、全体の試料温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔにおいて、試料及び製剤緩衝液標準のエネルギー吸収量を記録する。それぞれの温度に対して、試料のエネルギー吸収量Ｃｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃）から標準の吸収量を引いた差分をプロットする。融解温度は、エネルギー吸収の最初の極大での温度として定義される。
【０２１９】
本発明の標的細胞表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体構築物はまた、≦０．２、好ましくは≦０．１５、より好ましくは≦０．１２、さらにより好ましくは≦０．１、最も好ましくは≦０．０８の濁度（精製単量体抗体構築物を２．５ｍｇ／ｍｌへ濃縮し、一晩インキュベーション後のＯＤ３４０によって測定する）を有することも想定される。
【０２２０】
さらなる実施形態では、本発明による抗体構築物は酸性ｐＨで安定である。ｐＨ５．５（例えば陽イオン交換クロマトグラフィーを行うのに必要なｐＨ）またはそれ未満、例えばｐＨ４．０〜５．５のような非生理的ｐＨで、抗体構築物がより高い耐性を示すほど、イオン交換カラムを用いての、ロードしたタンパク質の総量に対する抗体構築物の回収率は高くなる。ｐＨ５．５でのイオン（例えば陽イオン）交換カラムからの抗体構築物の回収率は、好ましくは≧３０％、より好ましくは≧４０％、より好ましくは≧５０％、さらにより好ましくは≧６０％、さらにより好ましくは≧７０％、さらにより好ましくは≧８０％、さらにより好ましくは≧９０％、さらにより好ましくは≧９５％、及び最も好ましくは≧９９％である。
【０２２１】
さらに、本発明の二重特異性抗体構築物は、治療効果または抗腫瘍活性を示すことが想定される。これは、例えば、進行した段階のヒト腫瘍異種移植片モデルの以下の実施例に開示するような試験において評価することができる。
【０２２２】
この試験の特定のパラメータ、例えば、注入する腫瘍細胞の数、注射部位、移植するヒトＴ細胞の数、投与する二重特異性抗体構築物の量、及びタイムラインなどを修正または適合させる一方で、依然として有意義かつ再現性のある結果を達成する方法は、当業者には周知である。好ましくは、腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０または≦６０、より好ましくは≦５０または≦４０、さらにより好ましくは≦３０または≦２０、最も好ましくは≦１０または≦５またはさらに≦２．５である。
【０２２３】
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態では、抗体構築物は一本鎖抗体構築物である。
【０２２４】
また、好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、ＨＬＥドメイン中にアミノからカルボキシルに向けて順に：
ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３ − リンカー − ヒンジ − ＣＨ２ − ＣＨ３
を有する。
【０２２５】
本発明の一実施形態ではまた、第三のドメインの１つまたは好ましくはそれぞれ（両方）のポリペプチド単量体のＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を有する。当該技術分野で公知のように、用語「システインジスルフィド架橋」とは、一般構造Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒを有する官能基を指す。この結合は、ＳＳ結合またはジスルフィド架橋とも呼ばれ、システイン残基の２つのチオール基のカップリングによって誘導される。成熟抗体構築物中のシステインジスルフィド架橋を形成するシステインを、３０９及び３２１に対応するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（Ｋａｂａｔナンバリング）に導入することは、本発明の抗体構築物にとって特に好ましい。
【０２２６】
本発明の一実施形態では、ＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位を除去する。このグリコシル化部位の除去は、ＸがＱ以外の任意のアミノ酸であるＮ３１４Ｘ置換によって達成することが好ましい。前記置換は好ましくはＮ３１４Ｇ置換である。より好ましい形態では、前記ＣＨ２ドメインは、以下の置換（Ｋａｂａｔによる位置）Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換はＫａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）をさらに有する。
【０２２７】
例えば当該技術分野で公知の二重特異性ヘテロＦｃ抗体構築物（図１ｂ）と比較しての、本発明の抗体構築物の好ましい特徴は、とりわけ、ＣＨ２ドメインにおける上記修飾の導入に関連し得ると考えられる。したがって、本発明の抗体構築物の第三のドメイン中のＣＨ２ドメインが、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でのドメイン内システインジスルフィド架橋を有すること、及び／またはＫａｂａｔ位置３１４でのグリコシル化部位を上記のようなＮ３１４Ｘ置換、好ましくはＮ３１４Ｇ置換により除去することは、本発明の構築物にとって好ましい。
【０２２８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物の第三のドメイン内のＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を有しており、Ｋａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位は、Ｎ３１４Ｇ置換によって除去されている。
【０２２９】
一実施形態では、本発明は、抗体構築物を提供し、そこにおいて：
（ｉ）第一のドメインは２つの抗体可変ドメインを含み、第二のドメインは２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉ）第一のドメインは１つの抗体可変ドメインを含み、第二のドメインは２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉｉ）第一のドメインは２つの抗体可変ドメインを含み、第二のドメインは１つの抗体可変ドメインを含むか；または
（ｉｖ）第一のドメインは１つの抗体可変ドメインを含み、第二のドメインは１つの抗体可変ドメインを含む。
【０２３０】
したがって、第一及び第二のドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインのような２つの抗体可変ドメインをそれぞれ含む結合ドメインであってもよい。２つの抗体可変ドメインを含むそのような結合ドメインの例は、本明細書において上記に記載されており、例えば、本明細書において上記に記載した、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、これらの結合ドメインの一方または両方は、単一の可変ドメインのみを含む場合がある。そのような単一ドメインの結合ドメインの例は、上記に記載されており、例えば、他のＶ領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬであってもよい１つの可変ドメインのみを含む単一の可変ドメイン抗体またはナノボディが挙げられる。
【０２３１】
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態では、第一及び第二のドメインを、ペプチドリンカーを介して第三のドメインに融合させる。好ましいペプチドリンカーは、上に記載されており、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ、またはそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、式中、ｘは１以上の整数（例えば２または３）である。
【０２３２】
本発明の一態様では、第一のドメインによって結合する標的細胞表面抗原は、腫瘍抗原、免疫学的障害に特異的な抗原またはウイルス抗原である。本明細書中で使用する場合、用語「腫瘍抗原」とは、腫瘍細胞上に提示される抗原として理解してもよい。これらの抗原は、細胞表面上に、分子の膜貫通及び細胞質部分としばしば組み合わされる細胞外部分を用いて提示することができる。これらの抗原は、腫瘍細胞のみが提示可能であり、正常細胞は提示不可能なことがある。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上でのみ発現可能であるか、または正常細胞に比べて腫瘍特異的突然変異を提示し得る。この場合、それらは腫瘍特異的抗原と呼ばれる。腫瘍細胞及び正常細胞によって提示される抗原は、より一般的であり、腫瘍関連抗原と呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原は、正常細胞に比べて過剰に発現し得るか、または正常組織に比べてコンパクト性に欠ける腫瘍組織の構造に起因して、腫瘍細胞における抗体結合のためのアクセス性が高い。本明細書で使用する腫瘍抗原の非限定的な例は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＦＬＴ３、ＤＬＬ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡである。
【０２３３】
本発明の抗体構築物の腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＦＬＴ３、ＤＬＬ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡからなる群から選択されることが想定される。
【０２３４】
本発明に関して、ＣＤ１９に対する二重特異性抗体構築物の例は、配列番号１〜６に記載するＣＤＲを有する抗体構築物である。ＣＤ３結合ドメインは、配列番号９〜１４に示されるＣＤＲによって特徴付けられる。本発明に関する特定の例は、ＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物である。本発明に関して、ＣＤ１９に対する二重特異性ＨＬＥ抗体構築物の例は、配列番号１０２〜１０４及び１０６〜１０８に記載するＣＤＲを有する抗体構築物である。本発明に関する特定の例は、ＢＣＭＡｘＣＤ３二重特異性抗体構築物である。本発明に関して、ＣＤ３３に対する二重特異性抗体構築物の例は、配列番号２９〜３１及び３４〜３６に記載するＣＤＲを有する抗体構築物である。本発明に関する特定の例は、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物である。本発明に関して、ＣＤ３３に対する二重特異性ＨＬＥ抗体構築物の例は、配列番号２９〜３１及び３４〜３６に記載するＣＤＲを有する抗体構築物である。本発明に関する特定の例は、ＨＬＥに対する第三のドメインを含む、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物である。本発明に関して、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する二重特異性抗体構築物の例は、配列番号４２〜４７に記載するＣＤＲを有する抗体構築物である。本発明に関する特定の例は、ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物である。
【０２３５】
一態様では、本発明の抗体構築物は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする：
（ａ）配列番号３７〜４１；ＣＤ３３
（ｂ）配列番号５１及び５２；ＥＧＦＲｖＩＩＩ
（ｃ）配列番号６２、６３及び６４；ＭＳＬＮ
（ｄ）配列番号７４〜８２  ＣＤＨ１９
（ｅ）配列番号１０３及び１０３  ＤＬＬ３
（ｆ）配列番号１７、１１３及び１１４  ＣＤ１９
（ｇ）配列番号９２及び９３  ＦＬＴ３
（ｈ）配列番号１２４及び１２５  ＣＤＨ３
（ｉ）配列番号１３５及び１３６  ＢＣＭＡ
（ｊ）配列番号１４６〜１５１、１６１〜１６８及び１７６〜１８１  ＰＳＭＡ。
上記の二重特異性抗体構築物のいずれかは、半減期延長ドメイン、好ましくはｓｃＦｃドメインまたはヘテロＦｃドメインまたはアルブミン結合ドメインである、第三のドメインを備えていてもいなくてもよい。
【０２３６】
本発明はさらに、本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド／核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドは、鎖中において共有結合した１３個以上のヌクレオチド単量体からなる生体高分子である。ＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、明確な生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、単量体またはＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸分子の単量体またはサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子またはポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、直鎖状ならびに環状であり得る。これは、好ましくはベクターに含まれ、そのベクターは、好ましくは宿主細胞に含まれる。前記宿主細胞は、例えば、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドで形質転換または形質移入した後、抗体構築物を発現することができる。その目的のために、ポリヌクレオチドまたは核酸分子を、調節配列に作動可能に連結させる。
【０２３７】
遺伝コードとは、遺伝物質（核酸）内にコードされた情報がタンパク質に翻訳される一連の規則である。生存細胞における生物学的デコーディングは、ｔＲＮＡ分子を使用してアミノ酸を運び、ｍＲＮＡの３個のヌクレオチドを一度に読み取り、ｍＲＮＡによって特定される順序でアミノ酸を連結するリボソームによって達成される。このコードは、コドンと呼ばれるこれらの３連ヌクレオチドの配列が、タンパク質合成中に次にどのアミノ酸を付加するかを特定する方法を定義する。いくつかの例外を除いて、核酸配列中の３ヌクレオチドのコドンは、単一のアミノ酸を特定する。大多数の遺伝子はまったく同じコードでコードされているため、この特定のコードは、しばしば正準または標準遺伝コードと呼ばれる。遺伝コードは、所定のコード領域のタンパク質配列を決定するが、他のゲノム領域は、これらのタンパク質を産生する時期及び場所に影響を及ぼし得る。
【０２３８】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、（外来の）遺伝物質を細胞に移入するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を包含するが、これらに限定されない。一般的に、改変ベクターは、複製起点、マルチクローニングサイト及び選択マーカーを備える。ベクター自体は、通常、ヌクレオチド配列、一般的には、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」として働くより大きな配列を含むＤＮＡ配列である。現代のベクターは、導入遺伝子のインサート及び骨格に加えて、以下のようなさらなる形質を包含する場合がある：プロモーター、遺伝マーカー、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子、標的配列、タンパク質精製タグ。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞内での導入遺伝子の発現に特化しており、通常、調節配列を有する。
【０２３９】
用語「調節配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結するコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した調節配列として、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合サイドが挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０２４０】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に「作動可能に連結する」。例えば、プレ配列または分泌リーダー配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結し；リボソーム結合サイドは、翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結する。一般的に、「作動可能に連結する」とは、連結しているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接しているとともにリーディング・フェーズ内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の方法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【０２４１】
「形質移入」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に標的細胞に導入するプロセスである。この用語は、真核細胞における非ウイルス性の方法において主に使用される。形質導入は、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルスを介した伝達を記載するためにしばしば用いられる。動物細胞の形質移入は、一般的には、細胞膜に一時的な孔または「穴」を開き、物質の取込みを可能にすることを含む。形質移入は、リン酸カルシウムを用いて、電気穿孔法によって、細胞圧搾によって、またはカチオン性脂質を物質と混合してリポソームを生成し、これを細胞膜と融合させ、内部に積荷を蓄積させることによって行うことができる。
【０２４２】
用語「形質転換」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の細菌への、及び植物細胞を含む非動物真核細胞への非ウイルス性移入を記載するために使用される。したがって、形質転換とは、細胞周囲からの細胞膜（複数可）を介した直接取込み、及びその後の外来性遺伝物質（核酸分子）の組込みに起因する、細菌性または非動物性真核細胞の遺伝子改変である。形質転換は人為的手段によって行うことができる。形質転換が起こるためには、細胞または細菌がコンピテント状態にある必要があり、この状態は、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時間制限のある応答として生じ得る。
【０２４３】
さらに、本発明は、ポリヌクレオチド／核酸分子または本発明のベクターで形質転換または形質移入した宿主細胞を提供する。本明細書中で使用する場合、用語「宿主細胞」または「レシピエント細胞」は、本発明の抗体構築物をコードするベクター、外来性核酸分子、及びポリヌクレオチドのレシピエント；及び／または抗体構築物それ自体のレシピエントであるかまたはあり得る任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことを意図する。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、形質移入などによって行う。用語「宿主細胞」はまた、単一細胞の子孫または潜在的子孫を含むことを意図する。自然発生的、偶発的、もしくは意図的な突然変異または環境的な影響のために、特定の改変が後続の世代で起こる可能性があるため、そのような子孫は、実際には親細胞と完全に同一ではない（形態学的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性において）が、本明細書中で使用する用語の範囲内に依然として含まれる。適切な宿主細胞として、原核細胞または真核細胞が挙げられ、さらに、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、ならびに動物細胞、例えば昆虫細胞及び哺乳類細胞、例えばマウス、ラット、マカクまたはヒトなどが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０２４４】
本発明の抗体構築物は、細菌中で産生することができる。発現後、本発明の抗体構築物を可溶性画分中の大腸菌細胞ペーストから単離し、例えばアフィニティークロマトグラフィー及び／またはサイズ排除法を介して精製することができる。最終精製は、例えばＣＨＯ細胞内で発現させた抗体を精製するプロセスと同様に行うことができる。
【０２４５】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、本発明の抗体構築物の適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えばＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッカーラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィララム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイｓセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの、本明細書中の多数の他の属、種、及び株が一般に利用可能で有用である。
【０２４６】
本発明のグリコシル化抗体構築物の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物及び昆虫細胞が挙げられる。例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（幼虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（カ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（カ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの、多数のバキュロウイルス株及び変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入用の様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公に入手可能であり、そのようなウイルスは、本明細書において、本発明によるウイルスとして、特にヨトウガ細胞の形質移入用に使用してもよい。
【０２４７】
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ及びタバコの植物細胞培養物も宿主として使用することができる。植物細胞培養におけるタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に公知である。例えば、Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６−７８，Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９０−７９４，Ａｒｔｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ８：７４５−７５０、及びＦｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：９７９−９８６参照。
【０２４８】
しかしながら、脊椎動物細胞での関心が最も高く、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は日常的な手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（２９３  ｏｒ  ２９３  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、１４１３  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２４９】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物の産生プロセスであって、本発明の抗体構築物の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養し、産生した抗体を培養物から回収することを含む、前記プロセスを提供する。
【０２５０】
本明細書中で使用する場合、用語「培養する」とは、培地中の適切な条件下での細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ維持、分化、生育、増殖及び／または繁殖を指す。用語「発現」とは、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むが、必ずしもこれらに限定されない、本発明の抗体構築物の産生に関与する任意の段階を含む。
【０２５１】
組換え技術を用いる場合、抗体構築物は、細胞内、ペリプラズム空間内で産生可能であるか、または培地中に直接分泌できる。抗体構築物を細胞内で産生する場合、第一の工程として、宿主細胞または溶解した断片のいずれかである微粒子破片を、例えば遠心分離または限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡潔に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞破片を、遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、一般的に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて最初に濃縮する。上記の工程のいずれかにおいて、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含ませてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含ませて外来の汚染菌の増殖を防止してもよい。
【０２５２】
宿主細胞から調製した本発明の抗体構築物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて回収または精製することができる。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収すべき抗体に応じて利用可能である。本発明の抗体構築物がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、ニュージャージー）は精製に有用である。
【０２５３】
アフィニティークロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドが付着するマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成可能なマトリックスよりも、速い流速及びより短い処理時間を可能にする。
【０２５４】
さらに、本発明は、本発明の抗体構築物、または本発明のプロセスに従って産生した抗体構築物を含む医薬組成物を提供する。抗体構築物の均質性は、≧８０％、より好ましくは≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、または≧８５％、さらに好ましくは≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、または≧９０％、さらにより好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、または≧９５％、及び最も好ましくは≧９６％、≧９７％、≧９８％、または≧９９％であることが本発明の医薬組成物にとって好ましい。
【０２５５】
本明細書中で使用する場合、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者への投与に適した組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、本発明の抗体構築物（複数可）の１つ以上を、好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物は、１つ以上の（薬学的に有効な）担体、安定化剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤及び／またはアジュバントの適切な製剤をさらに含む。組成物の許容可能な成分は、好ましくは、使用する用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。本発明の医薬組成物として、液体型、凍結型及び凍結乾燥型の組成物が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０２５６】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体を含み得る。本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」とは、任意の及びすべての水性及び非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液などの緩衝液、水、懸濁液、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、リポソーム、分散媒体ならびにコーティングを意味し、これらは、薬学的投与、特に非経口投与に適合する。そのような媒体及び薬剤の医薬組成物における使用は、当該技術分野において周知であり、そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。
【０２５７】
特定の実施形態は、本発明の抗体構築物と、さらなる１つ以上の賦形剤、例えば本節及び本明細書の他の箇所に例示的に記載する賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明において、賦形剤は、例えば、製剤の物理的、化学的または生物学的特性の調整、例えば、粘性の調節などの多種多様な目的のために、及び／または、有効性を向上させるための、及び／または、例えば、製造、出荷、貯蔵、使用前の調製、投与の最中及びその後に生じるストレスに起因する分解及び腐敗に対して、そのような製剤及びプロセスを安定化するための、本発明のプロセスに使用することができる。
【０２５８】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出、吸収または浸透の速度などを改変、維持または保存する目的で製剤物質を含む場合がある（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ参照）。そのような実施形態では、適切な製剤物質として以下のものが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない：
・アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、プロリン、２−フェニルアラニンなど、荷電アミノ酸、好ましくはリジン、リジンアセテート、アルギニン、グルタミン酸及び／またはヒスチジンを含む
・抗菌剤、例えば、抗細菌剤及び抗真菌剤
・抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム；
・組成物を約５．５〜７．５、好ましくは６．５〜７に維持するために使用する、緩衝液、緩衝液系及び緩衝剤；緩衝液の例は、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン及び酢酸塩である；
・非水性溶媒、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル；
・水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む水性担体、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体；
・生分解性ポリマー、例えばポリエステル；
・増量剤、例えば、マンニトールまたはグリシン；
・キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；
・等張化剤及び吸収遅延剤；
・錯化剤、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン
・充填剤；
・単糖類；二糖類；他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタ硫酸、ソルビトールまたはキシリトールであってもよい；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質性担体、例えば、ヒトもしくはウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン、好ましくはヒト起源のもの；
・着色剤及び着香剤；
・硫黄含有還元剤、例えば、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［α］−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム
・希釈用の剤；
・乳化剤；
・親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン）
・塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；
・保存剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス；例としては：塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）である；
・金属複合体、例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体；
・溶媒及び共溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；
・糖及び糖アルコール、例えば、トレハロース、スクロース、オクタ硫酸、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールスタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えばイノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコール；
・懸濁剤；
・界面活性剤または湿潤剤、例えば、プルロニックス、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール；界面活性剤は、好ましくは＞１．２ＫＤの分子量を有する洗剤及び／または好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであってもよく；好ましい洗剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ８５であり；好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びＰＥＧ５０００である；
・安定性増強剤、例えば、スクロースまたはソルビトール；
・等張化剤、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール；
・塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油を含む非経口送達ビヒクル；
・静脈内送達ビヒクル、例えば、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンガーデキストロースに基づくものなど）。
【０２５９】
医薬組成物の異なる構成成分（例えば、上に列挙したもの）が、例えば異なる効果を有することができ、アミノ酸が、緩衝剤、安定化剤及び／または抗酸化剤として作用することができ；マンニトールが、増量剤及び／または等張化剤として作用することができ；塩化ナトリウムが、送達ビヒクル及び／または等張化剤として作用することができる；などは当業者には明らかである。
【０２６０】
本発明の組成物は、組成物の意図される用途に応じて、本明細書で定義する本発明のポリペプチドに加えて、さらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。そのような薬剤は、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖阻害剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬物、循環系に作用する薬物及び／または当該分野で公知のサイトカインなどの薬剤であってもよい。本発明の抗体構築物を、併用療法において、すなわち別の抗癌剤と組み合わせて適用することも想定される。
【０２６１】
特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図する投与経路、送達形態及び所望の用量に応じて、当業者が決定する。例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ参照。特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗体構築物の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与え得る。特定の実施形態では、医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、性質上、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であってもよく、場合により、非経口投与のための組成物に一般的な他の物質を補充してもよい。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。特定の実施形態では、本発明の組成物の抗体構築物は、所望の純度を有する選択した組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤物質（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、上記）と混合することによって貯蔵用に調製してもよい。さらに、特定の実施形態では、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、本発明の抗体構築物を凍結乾燥物として製剤化してもよい。
【０２６２】
非経口投与を企図する場合、本発明で使用するための治療組成物は、薬学的に許容可能なビヒクル中に本発明の所望の抗体構築物を含むパイロジェンフリーの非経口的に許容可能な水溶液の形態で提供してもよい。非経口注射のための特に適切なビヒクルは滅菌蒸留水であり、この滅菌蒸留水中で本発明の抗体構築物を、適切に保存された滅菌等張液として製剤化する。特定の実施形態では、調製は、注射可能なミクロスフェア、生体分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの薬剤とともに、所望の分子を製剤化することを含むことができ、それは、デポー注射によって送達可能な生成物の徐放または持続性放出を提供し得る。特定の実施形態では、循環器中での持続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸もまた使用してよい。特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の抗体構築物を導入してもよい。
【０２６３】
持続性または徐放性送達／放出製剤中に本発明の抗体構築物を含有する製剤を含む、さらなる医薬組成物は、当業者には明らかであろう。リポソーム担体、生体分解性微小粒子または多孔性ビーズ及びデポー注射などの様々な他の持続性または徐放性送達手段を製剤化するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の徐放を記載している国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号参照。持続放出性製剤は、成型品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に開示されている）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）。持続放出性組成物はまた、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製可能なリポソームを含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号；第ＥＰ０８８，０４６号及び第ＥＰ１４３，９４９号参照。
【０２６４】
抗体構築物はまた、例えばコアセルベーション技術によって、もしくは界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって調製したマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０２６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用する医薬組成物は、通常、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥させる場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれで行ってもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で保存することができる。非経口組成物は、通常、滅菌アクセスポート、例えば皮下注射針で穿孔可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたは容器に入れる。
【０２６６】
本発明の別の態様は、国際特許出願ＷＯ０６１３８１８１Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載されているように、医薬組成物として使用することができる本発明の自己緩衝性抗体構築物製剤を含む。Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ”ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２），ａｎｄ  Ｒａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）などの、タンパク質安定化ならびにそれに関して有用な製剤物質及び方法に関する様々な解説が利用可能であり、本発明による自己緩衝性タンパク質製剤に関する賦形剤及びそのプロセスに関連する部分、特に獣医学及び／またはヒトの医療用途のためのタンパク質医薬品及びプロセスに関する部分を参照されたい。
【０２６７】
本発明の特定の実施形態に従って、塩を使用して、例えば、製剤のイオン強度及び／または等張性を調節し、及び／またはタンパク質または本発明による組成物の他の成分の溶解性及び／または物理的安定性を改善してもよい。周知のように、イオンは、タンパク質の表面の荷電残基に結合し、タンパク質中の帯電した極性基を遮蔽し、それらの静電相互作用の強さ、誘引性、反発性の相互作用を減少させることによってタンパク質の天然状態を安定化することができる。イオンはまた、特にタンパク質の変性ペプチド結合（−ＣＯＮＨ）に結合することにより、タンパク質の変性状態を安定化することができる。さらに、タンパク質中の荷電した及び極性の基とのイオン相互作用はまた、分子間の静電相互作用を減少させ、それによってタンパク質の凝集及び不溶性を防止または低減することができる。
【０２６８】
イオン種は、タンパク質に対するその効果が大きく異なる。本発明に従って医薬組成物を製剤化する際に使用することができる、タンパク質に対するイオンの多数の分類別の順位付け及びその効能が開発されている。一例は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズであり、これは、溶液中のタンパク質の立体構造安定性への影響によって、イオン性及び極性の非イオン性溶質をランク付けする。安定化溶質は「コスモトロピック」と呼ばれる。不安定化溶質は、「カオトロピック」と呼ばれる。コスモトロープは、通常、溶液からタンパク質を沈殿させるために高濃度（例えば、＞１Ｍの硫酸アンモニウム）で用いられる（「塩析」）。カオトロープは、通常、タンパク質の変性及び／または可溶化に用いられる（「塩溶」）。「塩溶」と「塩析」に対するイオンの相対的な有効性は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズにおけるイオンの順位を規定する。
【０２６９】
本発明の様々な実施形態に従って、増量剤、安定化剤、及び抗酸化剤、ならびに他の標準的な用途として、遊離アミノ酸を本発明の製剤の抗体構築物において使用することができる。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥に有用であり、正しいケーキ構造及び特性を保証する。アルギニンは、液体及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは抗酸化剤として有用である。
【０２７０】
ポリオールは、糖、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトール、ならびに多価アルコール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコール、ならびに本明細書において考察を目的として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールはコスモトロピックである。それらは、液体及び凍結乾燥製剤の両方において有用な安定化剤であり、物理的及び化学的分解プロセスからタンパク質を保護する。ポリオールはまた、製剤の等張性を調整するのに有用である。本発明の選択した実施形態において有用なポリオールの中にはマンニトールがあり、凍結乾燥製剤中のケーキの構造安定性を保証するために一般的に使用される。それはケーキの構造的安定性を保証する。これは、通常、凍結防止剤、例えば、スクロースと共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調節するための、及び輸送中または製造工程時のバルク調製中の凍結−融解ストレスから保護するための安定化剤として好ましい薬剤の１つである。グルコース及びラクトースのような還元糖（遊離アルデヒドまたはケトン基を含む）は、表面リジン及びアルギニン残基を糖化することができる。したがって、それらは一般的に、本発明による使用のための好ましいポリオールではない。さらに、そのような反応種を形成する糖、例えばショ糖のような、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、結果的に糖化を生じる糖類もまた、本発明の好ましいポリオールではない。ＰＥＧはタンパク質を安定化させるのに有用であり、凍結保護剤として有用であり、この点で本発明で使用することができる。
【０２７１】
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態は、さらに界面活性剤を含む。タンパク質分子は、表面の吸着、ならびに気−液、固−液、及び液−液界面での変性、その結果としての凝集の影響を受けやすい場合がある。これらの影響は、通常、タンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、通常、タンパク質濃度に反比例し、一般的には、製品の輸送及び取扱い中に生成されるような物理的振動によって悪化する。界面活性剤は、表面吸着を防止、最小化、または低減するために日常的に使用されている。これに関して本発明における有用な界面活性剤として、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤はまた、タンパク質立体構造安定性を調節するために一般的に使用される。所与の界面活性剤は、通常、いくつかのタンパク質を安定化させ、他のタンパク質を不安定化するため、この点に関する界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。
【０２７２】
ポリソルベートは、酸化分解を受けやすく、しばしば、供給されると、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量の過酸化物を含む。したがって、ポリソルベートは慎重に使用する必要があり、使用する場合、最低有効濃度で使用する必要がある。これに関して、ポリソルベートは、賦形剤は最も低い有効濃度で使用するべきであるという一般的なルールを例示している。
【０２７３】
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態は、１つ以上の抗酸化剤をさらに含む。適切なレベルの周囲酸素及び温度を維持し、光への曝露を避けることによって、医薬製剤において、タンパク質の有害な酸化は、ある程度防止することができる。抗酸化性の賦形剤は、タンパク質の酸化的分解を防ぐためにも使用することができる。これに関する有用な抗酸化剤の中には、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、及びキレート剤がある。本発明による治療用タンパク質製剤に使用する抗酸化剤は、水溶性であり、製品の貯蔵寿命を通じてその活性を維持することが好ましい。ＥＤＴＡは、この点に関して本発明による好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤はタンパク質に損傷を与える可能性がある。例えば、特にグルタチオンのような還元剤は、分子内ジスルフィド結合を破壊する可能性がある。したがって、本発明で使用する抗酸化剤は、とりわけ、製剤中のタンパク質を損傷する可能性を排除するか、または十分に低減するように選択される。
【０２７４】
本発明による製剤は、タンパク質補因子であり且つ特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要な亜鉛などのタンパク質配位複合体を形成するのに必要な金属イオンを含み得る。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害することができる。しかしながら、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的及び化学的プロセスを触媒する。アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために、マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）を使用することができる。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を高めることができる。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させる可能性がある。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は第ＶＩＩＩ因子を安定化する可能性があり、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化する可能性があり、その凝集はＡｌ＋３イオンによって増大する可能性がある。
【０２７５】
本明細書中に開示する抗体構築物はまた、免疫リポソームとして製剤化してもよい。「リポソーム」は、哺乳類への薬物送達に有用な様々なタイプの脂質、リン脂質及び／または界面活性剤からなる小胞である。リポソームの成分は、一般的に、生物学的膜の脂質配置と同様に、二重層形成で配置される。抗体構築物を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号；及びＷ０９７／３８７３１に記載されているような当該分野で公知の方法によって調製する。循環時間を高めたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所定の細孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体構築物のＦａｂ′フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに複合体化することができる。化学療法剤は場合によりリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）参照。
【０２７６】
医薬組成物を製剤化したら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに保存してもよい。そのような製剤は、即時使用可能な形態または投与前に再構成する形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存し得る。
【０２７７】
本明細書中で定義する医薬組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例、ＷＯ９９／５４４４０、またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）に記載されているような細胞傷害性アッセイによって測定することができる。本明細書中で使用する「有効性」または「ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性」は、本発明の医薬組成物による、例えば、標準化されたＮＣＩ応答基準を用いた治療への応答を指す。本発明の医薬組成物を用いる治療の成果またはｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、その意図する目的、すなわち組成物がその所望の効果、すなわち病的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇を引き起こす能力に対する組成物の有効性を指す。ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、白血球数、差異、蛍光標識細胞分取、骨髄穿刺法を含むが必ずしもこれらに限定されないそれぞれの疾患実体について確立された標準的方法によってモニタリングしてもよい。さらに、様々な疾患特異的臨床化学パラメータ及び他の確立された標準的方法を使用してもよい。さらに、コンピュータ支援断層撮影法、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立癌研究所の基準に基づく応答評価［Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ  ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ，Ｓｈｉｐｐ  ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ  ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ  ＴＡ，Ｖｏｓｅ  Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ  Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ  Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ  Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｗ，Ｈｏｐｐｅ  Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ  ＧＰ．  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．  ＮＣＩ  Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９  Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、陽電子放射断層撮影スキャン、白血球数、差異、蛍光標識細胞分取、骨髄穿刺法、リンパ節生検／組織病理、及び様々なリンパ腫特異的臨床化学パラメータ（例えば、乳酸脱水素酵素）ならびに他の確立された標準的方法を使用してもよい。
【０２７８】
本発明の医薬組成物のような薬物の開発における別の主要な課題は、薬物動態学的特性の予測可能な調節である。この目的のために、薬物候補の薬物動態特性、すなわち所与の状態を治療する特定薬物の能力に影響を及ぼす薬物動態パラメータの特性を確立することができる。特定の疾患実体を治療するための薬剤の能力に影響を及ぼす薬剤の薬物動態パラメータとして：半減期、分布容積、肝初回通過代謝及び血清結合度が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。所与の薬剤の有効性は、上記のパラメータの各々によって影響され得る。
【０２７９】
「半減期」とは、投与した薬物の５０％が生物学的プロセス、例えば代謝、排泄などによって排除される時間を意味する。「肝初回通過代謝」とは、肝臓との最初の接触、すなわち、肝臓を最初に通過する間における、薬物が代謝される傾向を意味する。「分布容積」とは、身体の様々な区画、例えば、細胞内及び細胞外の空間、組織及び器官などにわたる薬物の保持の程度、ならびにこれらの区画内の薬剤の分布を意味する。「血清結合度」とは、薬物がアルブミンなどの血清タンパク質と相互作用して結合する傾向を意味し、薬物の生物学的活性の低下または損失をもたらす。
【０２８０】
薬物動態パラメータとして、投与した所定量の薬物についてのバイオアベイラビリティ、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの発症、及び／またはＣｍａｘが挙げられる。「バイオアベイラビリティ」とは、血液区画中の薬物の量を意味する。「遅延時間」とは、薬物の投与と血液または血漿中でのその検出及び可測性との間の時間遅延を意味し、「Ｔｍａｘ」は薬物の最大血中濃度に到達した後の時間であり、「Ｃｍａｘ」は所与の薬物の最大血中濃度である。その生物学的効果に必要とされる薬物の血中または組織濃度に到達する時間は、すべてのパラメータに影響を受ける。上記で概説したように、非チンパンジー霊長類において試験する、前臨床動物において決定され得る異種特異性を示す二重特異性抗体構築物の薬物動態パラメータは、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）による刊行物にも記載されている。
【０２８１】
本発明の好ましい態様では、医薬組成物は、約−２０℃で少なくとも４週間安定である。添付の実施例から明らかなように、本発明の抗体構築物の品質と、対応する最先端の抗体構築物の品質とを、異なるシステムを用いて試験してもよい。これらの試験は、“ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｑ５Ｃ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｑ６Ｂ”に準拠していると理解されており、したがって、これらの試験は、安定性を示す特性を提供するように選択され、それによって、製剤の同一性、純度、及び力価における変化の検出に確実性を提供する。純度という用語は、相対的用語であることはよく受け入れられている。グリコシル化、脱アミド化または他の異種性の効果のために、生物工学／生物学的製剤の絶対純度は、通常、複数の方法によって評価すべきであり、得られる純度値は方法依存的である。安定性試験を行う目的のために、純度試験は分解生成物の測定方法に焦点を当てるべきである。
【０２８２】
本発明の抗体構築物を含む医薬組成物の品質の評価のために、例えば、溶液中の可溶性凝集体の含量を分析することにより分析してもよい（サイズ排除あたりのＨＭＷＳ）。約−２０℃で少なくとも４週間の安定性は、１．５％未満のＨＭＷＳ含量、好ましくは１％未満のＨＭＷＳ含量を特徴とすることが好ましい。
【０２８３】
医薬組成物の形態の本発明の抗体構築物の安定性の評価に関する他の例は、添付の実施例４〜１２に提供する。これらの実施例において、本発明の抗体構築物の実施形態を、異なる医薬製剤中の異なるストレス条件に関して試験し、結果を、当該分野で公知の二重特異性Ｔ細胞結合抗体構築物の他の半減期延長（ＨＬＥ）フォーマットと比較する。本発明による特異的ＦＣモダリティを備えた抗体構築物は、通常、異なるＨＬＥフォーマットで、またはＨＬＥフォーマットなしで提供された抗体構築物（例えば、「正準的な」抗体構築物）に比べて、温度及び光ストレスなどの広範なストレス条件にわたってより安定であることが想定される。前記温度安定性は、低下した（凍結を含む室温未満の）及び増加した（体温以上の温度を含む室温より上の）温度の両方に関連し得る。当業者には理解されるように、診療においてほとんど不可避な、ストレスに関するそのような安定性の向上は、診療において生じる分解産物がより少なくなるため、抗体構築物をより安全にする。結果として、前記安定性の向上は、安全性の向上を意味する。
【０２８４】
水素−重水素交換（ＨＤＸ）は、共有結合した水素原子を重水素原子で置き換えるか、またはその逆の化学反応である。これは交換可能なプロトン及び重水素に最も容易に適用することができ、そのような変換は触媒なしで適切な重水素源の存在下で起こる。この方法は、分子の様々な部分、したがってタンパク質の三次構造の溶媒アクセス性に関する情報を与える。
【０２８５】
一実施形態は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患または免疫学的障害の予防、治療または寛解における使用のための、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスに従って作製した抗体構築物を提供する。
【０２８６】
本明細書に記載の製剤は、それを必要とする患者における本明細書に記載の病理学的病状の治療、寛解及び／または予防における医薬組成物として有用である。用語「治療」とは、治療的処置と、予防的または防止的措置の両方を指す。治療は、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害の素因を有する患者由来の身体、単離された組織、または細胞への、製剤の塗布または投与を含み、疾患、疾患の症状、または疾患の素因を、治癒、回復、緩和、軽減、改変、治療、寛解、改善、または作用する。
【０２８７】
本明細書中で使用する用語「寛解」とは、本発明の抗体構築物を、それを必要とする対象へ投与することによる、腫瘍または癌または本明細書において以下に記載する転移性癌を有する患者の疾患状態の任意の改善を指す。そのような改善は、患者の腫瘍または癌または転移性癌の進行の遅延または停止としても認められ得る。本明細書中で使用する用語「予防」とは、本発明の抗体構築物を、それを必要とする対象へ投与することによって、本明細書において以下に記載する腫瘍または癌または転移性癌を有する患者の発生または再発を回避することを意味する。
【０２８８】
用語「疾患」とは、本明細書に記載の抗体構築物または医薬組成物での治療により利益を得るであろう任意の状態を指す。これには、哺乳類を問題の疾患にかかりやすくする病的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患が含まれる。
【０２８９】
「新生物」は組織の異常な成長であり、通常は塊を形成するが、常にそうであるとは限らない。また、塊を形成する場合、それは一般に「腫瘍」と呼ばれる。新生物または腫瘍は、良性、潜在的に悪性（前癌性）、または悪性であり得る。悪性新生物は一般に癌と呼ばれる。それらは、通常、周囲の組織に侵入して破壊し、転移を形成し得る、すなわち、それらは身体の他の部分、組織または器官に広がる。したがって、用語「転移性癌」は、元の腫瘍とは別の、他の組織または器官への転移を包含する。リンパ腫及び白血病はリンパ系新生物である。本発明の目的のために、それらもまた、「腫瘍」または「癌」という用語に包含される。
【０２９０】
用語「ウイルス性疾患」は、対象のウイルス感染の結果である疾患を記載する。
【０２９１】
本明細書中で使用する用語「免疫学的障害」は、この用語、すなわち免疫学的障害の共通定義に沿って記載し、例えば、自己免疫疾患、過敏症、免疫不全などである。
【０２９２】
一実施形態では、本発明は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患または免疫学的障害の治療もしくは寛解方法であって、それを必要とする対象に本発明の、または本発明のプロセスに従って製造した抗体構築物を投与する工程を含む方法を提供する。
【０２９３】
用語「必要とする対象」またはそれらの「治療を必要とする」とは、障害を既に有する者、ならびに障害を予防するべき者を含む。必要とする対象または「患者」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトまたは哺乳類の対象を含む。
【０２９４】
本発明の抗体構築物に対し、特定の投与経路及び投与方法、特定の用量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療に関して、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲に関して、一般的に設計を行う。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容可能な濃度で製剤化する。
【０２９５】
したがって、製剤及び組成物は、任意の適切な投与経路による送達のために、本発明に従って設計してもよい。本発明に関して、投与経路は、好ましくは非経口経路（静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊水外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、関節滑液嚢内、管腔内など）である。
【０２９６】
本発明の医薬組成物及び抗体構築物は、非経口投与、例えばボーラス注射などの注射、または連続注入などの注入による、例えば皮下または静脈内送達に対して特に有用である。医薬組成物は、医療機器を用いて投与してもよい。医薬組成物を投与するための医療機器の例は、米国特許第４，４７５，１９６号；第４，４３９，１９６号；第４，４４７，２２４号；第４，４４７，２３３号；第４，４８６，１９４号；第４，４８７，６０３号；第４，５９６，５５６号；第４，７９０，８２４号；第４，９４１，８８０号；第５，０６４，４１３号；第５，３１２，３３５号；第５，３１２，３３５号；第５，３８３，８５１号；及び第５，３９９，１６３号に記載されている。
【０２９７】
特に、本発明は、適切な組成物の中断のない投与を提供する。非限定的な例として、患者の体内への治療剤の流入を計量するために患者が着用する小型ポンプシステムによって、中断のない、または実質的に中断のない、すなわち連続投与を実現してもよい。本発明の抗体構築物を含む医薬組成物は、前記ポンプシステムを用いて投与することができる。そのようなポンプシステムは、一般的に当該技術分野において公知であり、通常、注入する治療剤を含むカートリッジの定期的な交換に依存する。そのようなポンプシステムにおいてカートリッジを交換する場合、患者の体内への治療薬の中断のないフローの一時的中断が起こり得る。そのような場合、今なお、本発明の薬理学的手段の目的の範囲内において、カートリッジ交換前の投与段階とカートリッジ交換後の投与段階とを考慮するものと考えられるが、本発明の方法は、そのような治療薬の１つの「中断のない投与」を構成する。
【０２９８】
本発明の抗体構築物の連続的または中断のない投与は、リザーバから流体を駆動するための流体駆動機構と、駆動機構を作動させるための作動機構とを備える流体送達装置または小型ポンプシステムによる、静脈内または皮下への投与であってもよい。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚を貫通させ、適切な組成物を患者の体内に送達するための針またはカニューレを有し得る。前記ポンプシステムは、静脈、動脈または血管とは無関係に患者の皮膚に直接固定または取り付けてもよく、それによってポンプシステムと患者の皮膚との間の直接接触が可能になる。ポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間、最大で数日間、取り付けることができる。ポンプシステムは、小さな容積のリザーバを有する小型のものであってもよい。非限定的な例として、投与する適切な医薬組成物のリザーバの容積は０．１〜５０ｍｌであり得る。
【０２９９】
連続投与はまた、皮膚に着用し、間隔を置いて交換するパッチによる、経皮投与であってもよい。当業者は、この目的に適した薬物送達のためのパッチシステムを認識している。消耗した第一のパッチの交換は、例えば消耗した第一のパッチの直近の皮膚表面上に、消耗した第一のパッチを取り除く直前に、新しい第二のパッチを配置することと同時に効果的に達成することができるため、経皮的投与は特に中断のない投与に適していることは特筆すべき点である。フローの中断、または電池障害の問題は発生しない。
【０３００】
医薬組成物を凍結乾燥している場合、凍結乾燥した物質を、投与前にまず適切な液体中で再構成する。凍結乾燥した物質は、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥の前にタンパク質を入れていたものと同じ製剤で再構成してもよい。
【０３０１】
本発明の組成物は、本明細書に記載する種間特異性を示す本発明の抗体構築物を、チンパンジー以外の霊長類、例えば、マカクへ、用量を増加させて投与することによる用量漸増試験によって測定可能な、適切な用量で対象に投与することができる。上述のように、本明細書に記載する種間特異性を示す本発明の抗体構築物は、チンパンジー以外の霊長類における前臨床試験において、及びヒトにおける薬物として、同一の形態で効果的に使用することができる。投薬レジメンは主治医及び臨床的要因によって決定される。医学分野において周知であるように、任意の患者に対する用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与するその他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
【０３０２】
用語「有効量」または「有効用量」とは、所望の効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。用語「治療有効量」とは、すでに疾患に罹患している患者における疾患及びその合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量として定義される。この使用に有効な量または用量は、治療しようとする状態（適応症）、送達する抗体構築物、治療の背景及び目的、疾患の重篤度、前治療、患者の病歴及び治療剤に対する応答、投与経路、患者のサイズ（体重、体表面積または器官の大きさ）及び／または状態（年齢及び全身健康状態）、ならびに患者自身の免疫系の全般的な状態に依存する。一回または一連の投与にわたって患者に投与可能なように、及び最適な治療効果が得られるように、担当医師の判断に応じて適切な用量を調整することができる。
【０３０３】
一般的な用量は、上記要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上までの範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、１．０μｇ／ｋｇ〜最大約２０ｍｇ／ｋｇ、場合により１０μｇ／ｋｇ〜最大約１０ｍｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ〜最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０３０４】
本発明の抗体構築物の治療有効量は、好ましくは、疾患症状の重篤度の低減、疾患症状のない期間の頻度もしくは期間の増加、または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の予防をもたらす。標的細胞抗原を発現する腫瘍を治療するために、本発明の抗体構築物、例えば、抗標的細胞抗原／抗ＣＤ３抗体構築物の治療有効量は、未治療の患者に比べて、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖を少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、有効性を予測する動物モデルにおいて評価してもよい。
【０３０５】
医薬組成物は、唯一の治療剤として、または必要に応じて抗癌剤、例えば、他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物などの追加の治療薬と組み合わせて投与することができる。これらの薬物は、本明細書中で定義する本発明の抗体構築物を含む組成物と同時に、または適時に規定された間隔及び用量で前記抗体構築物の投与の前または後に別々に投与してもよい。
【０３０６】
本明細書中で使用する用語「有効及び非毒性用量」とは、主要な毒性作用を及ぼさないか、または実質的に及ぼさずに、病的細胞の除去、腫瘍の除去、腫瘍の収縮または疾患の安定化を引き起こすのに十分な高さの本発明の抗体構築物の耐量を指す。そのような有効及び非毒性用量は、例えば、当技術分野で述べられている用量漸増試験により求めてもよいが、重篤な有害な副作用を誘発する用量（用量制限毒性、ＤＬＴ）を下回る用量でなければならない。
【０３０７】
本明細書中で使用する用語「毒性」とは、有害事象または重篤な有害事象に現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副作用は、一般的に、投与後の薬物の忍容性の欠如及び／または局所寛容の欠如を意味し得る。毒性はまた、薬物によって引き起こされる催奇形性または発癌性の作用を含み得る。
【０３０８】
本明細書中で使用する用語「安全性」、「ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性」または「忍容性」は、投与直後（局所寛容）及び薬物のより長い投与期間中に重篤な有害事象を誘発することのない薬物の投与を規定する。「安全性」、「ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性」または「忍容性」は、例えば、治療及びフォローアップ期間中に定期的な間隔で評価することができる。測定には臨床評価、例えば、器官の所見、及び検査値の異常のスクリーニングが含まれる。ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／またはＭｅｄＤＲＡ基準に従って、臨床評価を実施し、正常所見からのずれを記録／コード化してもよい。器官の所見は、例えば、有害事象共通用語規準ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に記載されるように、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心臓不整脈、凝固などの基準を含み得る。臨床検査用パラメータとして、例えば、血液学、臨床化学、凝固特性及び尿分析、ならびに血清、血漿、リンパ液または髄液、脊髄液などの他の体液の検査が挙げられる。したがって、例えば、物理的試験、画像化技術（すなわち、超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、技術装置による他の測定（すなわち、心電図）、検査用パラメータの測定及び有害事象の記録によるバイタルサインによって、安全性を評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法におけるチンパンジー以外の霊長類における有害事象は、組織病理学的及び／または組織化学的方法によって試験してもよい。
【０３０９】
上記の用語については、例えば、バイオテクノロジー由来医薬品Ｓ６の前臨床安全性評価；ＩＣＨ統一三極ガイドライン；１９９７年７月１６日のＩＣＨ運営委員会も参照されたい。
【０３１０】
最後に、本発明は、本発明の抗体構築物または本発明の方法に従って製造した抗体構築物、本発明の医薬組成物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター及び／または本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。
【０３１１】
本発明に関して、用語「キット」は、容器、レシピエントまたはその他のものに、ともにパッケージングされた２つ以上の構成要素を意味し、それらのうちの１つは、本発明の抗体構築物、医薬組成物、ベクターまたは宿主細胞に対応する。したがって、キットは、特定の目標を達成するのに十分な製品及び／または器具のセットとして説明することができ、キットは単一のユニットとして市販可能である。
【０３１２】
キットは、投与のための適切な用量（上記参照）で本発明の抗体構築物または医薬組成物を含有する任意の適切な形状、サイズ及び材料（好ましくは防水性、例えばプラスチックまたはガラス）の１つ以上のレシピエント（バイアル、アンプル、容器、シリンジ、ボトル、バッグなど）を含み得る。キットは、さらに、使用のための指示書（例えば、リーフレットまたは取扱説明書の形態の）、シリンジ、ポンプ、注入器などのような本発明の抗体構築物を投与するための手段、本発明の抗体構築物を再構成するための手段及び／または本発明の抗体構築物を希釈するための手段を含む。
【０３１３】
本発明はまた、単回投与のためのキットも提供する。本発明のキットはまた、乾燥／凍結乾燥抗体構築物を含む第一のレシピエント及び水性製剤を含む第二のレシピエントを含み得る。本発明の特定の実施形態では、単一チャンバー及び複数チャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ）を含むキットを提供する。
【０３１４】
本発明の医薬組成物は、さらに緩衝液を含み、緩衝液は、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、グリシン、トリス、グルタミン酸塩、酢酸塩及びそれらの混合物、特にリン酸カリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、グルタミン酸塩、酢酸塩及びそれらの組合せからなる群から選択し得る。
【０３１５】
適切な緩衝液濃度は、約２００ｍＭ以下、例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５ｍＭの濃度を包含する。当業者であれば、本明細書に記載の医薬組成物の安定性を提供するために、緩衝液濃度を容易に調整することができるであろう。本発明の医薬組成物中の想定される緩衝液濃度は、具体的には、約５〜約２００ｍＭ、好ましくは約５〜約１００ｍＭ、より好ましくは約１０〜約５０ｍＭの範囲である。
【０３１６】
本明細書中で使用する場合、用語「医薬組成物」は、それを必要とする対象への投与に適した組成物に関する。用語「対象」または「個体」または「動物」または「患者」は、本明細書では同じ意味で用いられ、本発明の医薬組成物の投与が望まれる任意の対象、特に哺乳類対象を指す。哺乳類対象として、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなどが挙げられ、好ましくはヒトである。本発明の医薬組成物は、安定で薬学的に許容可能、すなわち、医薬組成物を投与する対象において望ましくない局所的または全身的作用を引き起こすことなく所望の治療効果を引き出すことができる。本発明の薬学的に許容可能な組成物は、特に、無菌及び／または薬学的に不活性であり得る。具体的には、用語「薬学的に許容可能な」とは、動物、特にヒトにおける使用のために、規制当局または他の一般的に認められている薬局方に承認されていることを意味し得る。
【０３１７】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載する１つ以上の二重特異性一本鎖抗体構築物（複数可）を、好ましくは治療有効量で、β−シクロデキストリン及び緩衝液を含む。「治療有効量」とは、所望の治療効果を誘発する前記構築物の量を意味する。治療有効性及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）によって決定することができる。治療効果と毒性作用との間の用量比は治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が一般に好ましい。
【０３１８】
組成物は、β−シクロデキストリン及び前記の緩衝液を含み得る。医薬組成物は、場合により、本明細書に記載するようなその有利な特性、特にその安定性を低下または消失させない限り、１つ以上のさらなる賦形剤を含む場合がある。
【０３１９】
賦形剤は、粘度の調整などの製剤の物理的、化学的または生物学的特性の調整、及びまたは、有効性をさらに改善するための、及びまたは、例えば、製造、出荷、貯蔵、使用前調製、投与中に、及びその後に生じるストレスに起因する分解及び腐敗に対して、そのような製剤及びプロセスをさらに安定化するための本発明のプロセスの調整などの、多種多様な目的のために本発明において使用することができる。用語「賦形剤」は、一般的に、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、抗付着剤、流動促進剤、保存剤、抗酸化剤、香味料、着色料、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、粘度付与剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、担体、希釈剤、保存剤、乳化剤、安定化剤及び等張性調整剤を含む。
【０３２０】
医薬組成物の異なる賦形剤（例えば、上記に列挙したもの）が異なる効果を有することが可能であり、例えば、アミノ酸が、緩衝剤、安定化剤及び／または抗酸化剤として作用することができ；マンニトールが、増量剤及び／または張性増強剤として作用することができ；塩化ナトリウムが、送達ビヒクル及び／または張性増強剤として作用することができる；などは、当業者には明らかである。
【０３２１】
ポリオールは、液体及び凍結乾燥製剤の両方において物理的及び化学的分解プロセスからタンパク質を保護する有用な安定化剤であり、製剤の等張性を調整するためにも有用である。ポリオールには、糖、例えばマンニトール、スクロース、及びソルビトール、ならびに多価アルコール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコール、ならびに本明細書における考察を目的として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質が含まれる。マンニトールは、凍結乾燥製剤中のケーキの構造安定性を保証するために一般的に使用される。マンニトールはケーキの構造的安定性を保証する。これは、一般的に、リオプロテクタント、例えば、スクロースと共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調節するための、及び輸送中または製造工程時のバルク調製中の凍結−融解ストレスに対して保護するための安定化剤として一般的に使用される薬剤である。ＰＥＧは、タンパク質を安定化させるため、及び凍結防止剤として有用である。
【０３２２】
界面活性剤は、表面吸着を防止、最小化、または低減するために日常的に使用される。タンパク質分子は、表面の吸着、ならびに気−液、固−液、及び液−液界面での変性、その結果としての凝集の影響を受けやすい場合がある。これらの影響は、通常、タンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、通常、タンパク質濃度に反比例し、一般的には、製品の輸送及び取扱い中に生成されるような物理的振動によって悪化する。一般的に使用される界面活性剤として、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤はまた、タンパク質立体構造安定性を調節するために一般的に使用される。所与の界面活性剤は、通常、いくつかのタンパク質を安定化させ、他のタンパク質を不安定化するため、この点に関する界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。
【０３２３】
ポリソルベートは、酸化分解を受けやすく、しばしば、供給されると、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量の過酸化物を含む。したがって、ポリソルベートは慎重に使用する必要があり、使用する場合、最低有効濃度で使用する必要がある。
【０３２４】
抗酸化剤は、適切なレベルの周辺酸素及び温度を維持し、光への曝露を避けることによって、医薬製剤中のタンパク質の有害な酸化をある程度防止することができる。抗酸化性の賦形剤は、タンパク質の酸化的分解を防ぐためにも使用することができる。これに関する有用な抗酸化剤の中には、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、及びキレート剤がある。治療用タンパク質製剤に使用するための抗酸化剤は、好ましくは水溶性であり、製品の貯蔵寿命を通じてその活性を維持する。ＥＤＴＡは有用な例である。
【０３２５】
金属イオンは、タンパク質補助因子として作用可能であり、タンパク質配位複合体の形成を可能にする。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害することができる。しかしながら、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的及び化学的プロセスを触媒する。マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）を使用して、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害することができる。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を高めることができる。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させる可能性がある。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は第ＶＩＩＩ因子を安定化する可能性があり、これはＭｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２ならびにＦｅ＋２によって不安定化する可能性があり、その凝集はＡｌ＋３イオンによって増大する可能性がある。
【０３２６】
本発明に従って塩を使用して、例えば、医薬製剤のイオン強度及び／または等張性を調節し、及び／または抗体構築物または他の成分の溶解性及び／または物理的安定性をさらに向上させてもよい。周知のように、イオンは、タンパク質の表面の荷電残基に結合し、タンパク質中の荷電した極性基を遮蔽し、それらの静電相互作用、誘引性、及び反発性相互作用の強度を低減することによってタンパク質の天然状態を安定化することができる。イオンはまた、特にタンパク質の変性ペプチド結合（−ＣＯＮＨ）に結合することにより、タンパク質の変性状態を安定化することができる。さらに、タンパク質中の荷電した及び極性の基とのイオン相互作用はまた、分子間の静電相互作用を低減し、それによってタンパク質の凝集及び不溶性を防止または低減することができる。イオン種は、タンパク質に対するその効果が異なる。本発明に従って医薬組成物を製剤化する際に使用可能な、タンパク質に対するイオンの多数の分類別の順位付け及びそれらの効能が開発されている。一例はＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズであり、これは、溶液中のタンパク質の立体構造安定性への影響によって、イオン性及び極性の非イオン性溶質をランク付けする。安定化溶質は「コスモトロピック」と呼ばれる。不安定化溶質は、「カオトロピック」と呼ばれる。コスモトロープは、通常、溶液からタンパク質を沈殿させるために高濃度（例えば、＞１Ｍの硫酸アンモニウム）で用いられる（「塩析」）。カオトロープは、通常、タンパク質の変性及び／または可溶化に用いられる（「塩溶」）。「塩溶」と「塩析」に対するイオンの相対的な有効性は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズにおけるイオンの順位を規定する。
【０３２７】
増量剤、安定化剤、及び抗酸化剤、ならびに他の標準的な用途として、遊離アミノ酸を医薬製剤において使用することができる。リジン、プロリン、セリン、及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥に有用であり、正しいケーキ構造及び特性を保証する。アルギニンは、液体及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは抗酸化剤として有用である。
【０３２８】
医薬組成物を製剤化するための特に有用な賦形剤として、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック及びそれらの組合せが挙げられる。組成物が本明細書に例示する望ましい特性を示し、特に含有する二重特異性一本鎖抗体構築物の安定化を促進する限り、前記賦形剤は、異なる濃度で医薬組成物中に存在してもよい。例えば、スクロースは、２％（ｗ／ｖ）〜１２％（ｗ／ｖ）の濃度で、すなわち１２％（ｗ／ｖ）、１１％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）または２％（ｗ／ｖ）の濃度で医薬組成物中に存在してもよい。好ましいスクロース濃度は、４％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは６％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。ポリソルベート８０は、０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で、すなわち０．５％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．００８％（ｗ／ｖ）、０．００５％（ｗ／ｖ）、０．００２％（ｗ／ｖ）または０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度で医薬組成物中に存在してもよい。好ましいポリソルベート８０濃度は、０．００２％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【０３２９】
しかしながら、医薬組成物がいかなる保存剤も含まないことも想定される。特に、本発明は、とりわけ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度の好ましくは一本鎖である二重特異性抗体構築物、ならびに緩衝液であって、そこにおいて抗体構築物は安定に存在し、ｐＨ約６．０で、約１０ｍＭの濃度のリン酸カリウム、さらに約８％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含む、１つ以上の保存剤を含む医薬組成物を提供する。
【０３３０】
本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、固体、液体、凍結、気体または凍結乾燥の形態で、とりわけ、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、散剤、錠剤、溶液、エアロゾル、顆粒、丸剤、懸濁液、エマルジョン、カプセル、シロップ、液剤、エリキシル剤、抽出物、チンキまたは液体抽出物の形態で製剤化することができる。
【０３３１】
一般的に、本発明の医薬組成物には、とりわけ、意図する投与経路、送達形態及び所望の用量に応じて、様々な貯蔵形態及び／または剤形が考えられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（２０１２））。当業者は、特定の剤形のそのような選択が、例えば、本発明の抗体構築物の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響し得ることを認識するであろう。
【０３３２】
例えば、医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、性質が水性または非水性のいずれかであり得る。適切なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であってもよく、場合により、非経口投与用の組成物に一般的な他の物質を補充してもよい。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。
【０３３３】
非経口投与を企図する場合、本発明の治療用組成物を、薬学的に許容可能なビヒクル中に所望の抗体構築物を含むパイロジェンフリーの非経口的に許容可能な水溶液の形態で提供してもよい。非経口注射用の特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、そこにおいて抗体構築物を、適切に保存される滅菌等張液として製剤化する。製剤は、注射可能なミクロスフェア、生体分解可能な粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの薬剤とともに、所望の分子を製剤化することを含むことができ、それは、デポー注射によって送達可能な生成物の徐放または持続性放出を提供し得る。循環器中での持続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸もまた使用してよい。移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の抗体構築物を導入してもよい。
【０３３４】
持続または制御−送達／放出製剤もまた本明細書において想定される。リポソーム担体、生体分解可能な微小粒子または多孔性ビーズ及びデポー注射などの様々な他の持続または制御送達手段を製剤化するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の徐放を記載している国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。持続放出性製剤は、成型品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に開示されている）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）を含み得る。持続放出性組成物はまた、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製可能なリポソームを含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号；第ＥＰ０８８，０４６号及び第ＥＰ１４３，９４９号参照。抗体構築物はまた、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中で、コアセルベーション技術または界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって調製したマイクロカプセルに封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（２０１２）に開示されている。
【０３３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する医薬組成物は、通常、滅菌調製物として提供する。滅菌は、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥させる場合、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれかにおいて、この方法を用いた滅菌を行ってもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中で貯蔵することができる。非経口組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針で穿孔可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れる。
【０３３６】
本明細書中に開示する抗体構築物はまた、免疫リポソームとして製剤化してもよい。「リポソーム」は、哺乳類への薬物の送達に有用な様々なタイプの脂質、リン脂質及び／または界面活性剤からなる小胞である。リポソームの成分は、一般的に、生体膜の脂質配置と同様に、二重層形成で配置される。抗体構築物を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号；及びＷ０９７／３８７３１に記載されているような、当業者に公知の方法で調製する。循環時間を高めたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを所定の細孔サイズのフィルターに通して押し出し、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体構築物のＦａｂ′フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに複合体化することができる。化学療法剤は場合によりリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）参照。
【０３３７】
本発明の組成物は、組成物の意図する用途に応じて、本明細書中で定義する二重特異性一本鎖抗体構築物に加えて、さらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。そのような薬剤は、特に、腫瘍及び／または悪性細胞に作用する薬剤であり得るが、医薬組成物の意図する用途に応じて、胃腸系に作用する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬剤、循環系に作用する薬剤、及び／または当該分野で公知のサイトカインなどの薬剤を含む、他の活性薬剤もまた、想定される。また、本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち別の抗癌剤と組み合わせて投与することも想定される。
【０３３８】
医薬組成物を製剤化すると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに貯蔵してもよい。そのような製剤は、即時使用可能な形態または投与前に再構成する形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで貯蔵してもよい。例えば、凍結乾燥組成物は、例えば、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥前にタンパク質を入れていたものと同じ製剤で再構成してもよい。
【０３３９】
本発明の医薬組成物は、一般的に、任意の適切な投与経路による送達のために製剤化してもよい。本発明に関して、投与経路として、局所経路（経皮、吸入、経鼻腔、経眼、経耳介／経耳、経膣、経粘膜など）；経腸経路（経口、胃腸管、舌下、口唇下、口腔、直腸など）；及び非経口経路（静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊水外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、関節滑液嚢内、管腔内など）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０３４０】
本明細書に記載の医薬組成物は、非経口投与、例えばボーラス注射などの注射、または連続注入などの注入による、例えば皮下または静脈内送達に対して特に有用である。医薬組成物は、医療機器を用いて投与してもよい。医薬組成物を投与するための医療機器の例は、米国特許第４，４７５，１９６号；第４，４３９，１９６号；第４，４４７，２２４号；第４，４４７，２３３号；第４，４８６，１９４号；第４，４８７，６０３号；第４，５９６，５５６号；第４，７９０，８２４号；第４，９４１，８８０号；第５，０６４，４１３号；第５，３１２，３３５号；第５，３１２，３３５号；第５，３８３，８５１号；及び第５，３９９，１６３号に記載されている。
【０３４１】
本発明の医薬組成物は、中断なく投与することもできる。非限定的な例として、患者の体内への治療剤の流入を計量するために患者が着用する小型ポンプシステムによって、中断のない、または実質的に中断のない、すなわち連続投与を実現してもよい。医薬組成物は、前記ポンプシステムを用いて投与することができる。そのようなポンプシステムは、一般的に当該技術分野において公知であり、通常、注入する治療剤を含むカートリッジの定期的な交換に依存する。そのようなポンプシステムにおいてカートリッジを交換する場合、患者の体内への治療薬の中断のないフローの一時的中断が起こり得る。そのような場合、今なお、本発明の薬理学的手段の目的の範囲内において、カートリッジ交換前の投与段階とカートリッジ交換後の投与段階とを考慮するものと考えられるが、本発明の方法は、そのような治療薬の１つの「中断のない投与」を構成する。
【０３４２】
本発明の医薬組成物の連続的または中断のない投与は、リザーバから流体を駆動するための流体駆動機構と、駆動機構を作動させるための作動機構とを備える流体送達装置または小型ポンプシステムによる、静脈内または皮下への投与であってもよい。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚を貫通させ、適切な組成物を患者の体内に送達するための針またはカニューレを有し得る。前記ポンプシステムは、静脈、動脈または血管とは無関係に患者の皮膚に直接固定または取り付けてもよく、それによってポンプシステムと患者の皮膚との間の直接接触が可能になる。ポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間、最大で数日間、取り付けることができる。ポンプシステムは、小さな容積のリザーバを有する小型のものであってもよい。非限定的な例として、投与する適切な医薬組成物のリザーバの容積は０．１〜５０ｍｌであり得る。
【０３４３】
本発明の医薬組成物が、通常、上記の賦形剤、もしくは追加の活性薬剤のいずれかを含んでもよく、または、本発明の医薬組成物が安定であり、好ましくは、添付の実施例において評価するβ−シクロデキストリンを含む医薬組成物と同じ特性を示す限り、それを任意の適切な形態で提供してもよいことは、当業者であれば容易に理解するであろう。当業者であれば、様々な成分を調整し、それによって、安定な、すなわち、好ましくは、その中に含まれる二重特異性一本鎖抗体断片の凝集体及び／または配座異性体を実質的に含まない医薬組成物を提供することができる。
【０３４４】
本明細書中で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明白に示さない限り、複数への言及を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば、「試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」への言及は、そのような異なる試薬の１つ以上を含み、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書に記載する方法に対して変更または置き換え可能な、当業者に公知の同等の工程及び方法への言及を含む。
【０３４５】
他に特段の指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の要素のすべてを指すものと理解される。当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明に包含されるものとする。
【０３４６】
本明細書中で使用する用語「及び／または」は、「及び」、「または」及び「前記用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組合せ」の意味を含む。
【０３４７】
本明細書中で使用する用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。しかしながら、具体的な数字も含み、例えば、約２０には２０が含まれる。
【０３４８】
用語「未満」または「より高い」は、具体的な数字を含む。たとえば、２０未満とは、それ未満またはそれに等しいことを意味する。同様に、上回るまたはより高いとは、それぞれ、その数字を上回るかもしくはその数字に等しい、またはその数字より高いかもしくはその数字に等しいことを意味する。
【０３４９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味を必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載する整数もしくは工程または整数もしくは工程のグループを包含するが、他の整数もしくは工程または整数もしくは工程のグループを除外するものではないことを意味するものと理解される。本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」で、または場合により、本明細書中で使用する場合、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」で置き換え可能である。
【０３５０】
本明細書中で使用する場合、「からなる」は、請求項の要素において特定されていない任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書中で使用する場合、「本質的に〜からなる」は、請求項の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない物質または工程を排除しない。
【０３５１】
本明細書中の各例において、用語「含む」、「本質的に〜からなる」及び「からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。
【０３５２】
本発明は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、及び物質などに限定されるものではなく、したがって様々に異なり得ることを理解すべきである。本明細書中で使用する用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３５３】
上記または下記のいずれかにかかわらず、本明細書の本文において引用するすべての刊行物及び特許（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造元の仕様書、指示書などを含む）は、参照としてその全体を本明細書に援用する。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような開示よりも先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるものではない。参照として援用する資料が本明細書と矛盾するかまたは不整合である場合、本明細書はそのような資料よりも優先する。
【０３５４】
本発明及びその利点のより良い理解は、単に例示のために提供する以下の実施例から得られるであろう。いずれにせよ、これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０３５５】
実施例１：公知の保存剤と、本発明による代表的な二重特異性抗体構築物との適合性を調べるために、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異的抗体構築物を、表４に示すパラメータを有するそれぞれの公知の保存剤の存在下で製剤化した。
【０３５６】
（表４）ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異的抗体構築物との保存剤適合性を試験するための製剤パラメータ
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【０３５７】
使用した製剤パラメータは、二重特異的抗体構築物を効率的に安定化するために以前に見出された。したがって、保存剤を含まない陰性対照（Ｇ４ＳｕＴ）と比較した差異は、より明白になるはずである。選択した保存剤濃度は、当該分野で用いられる標準濃度を反映したものであった。それぞれの製剤を２５℃で１４日間保存し、０、１、３、７及び１４日目に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって試験した。図１から分かるように、０％の保存剤を含む対照を含め、試験したいくつかの製剤は、２５℃で経時的に高分子量（ＨＭＷ）種の割合の減少を示した。これは、クロロブタノール及びメチルパラベンの場合にあてはまり、これらの保存剤がタンパク質薬物を不安定化せず、凝集を誘導せず、さらには凝集を減少させることを示す。フェノールを添加すると、ＨＭＷ値は全体的に一定のままであり、所定の実験条件下での、試験した二重特異性抗体構築物とフェノールとの適合性も示している。チメロサールは、経時的にＨＷＭのわずかな増加が認められたため、適さないようであった。ＨＭＷから主ピークへの再平衡化は、部分的には、薬物製品濃度からＩＶバッグ濃度への希釈によるものであり得る。４．０〜６．５の範囲の低いｐＨ、例えば４．０において、本発明の二重特異性抗体構築物は安定なままであるか、または例えばクロロブタノールもしくはメチルパラベンのような保存剤によって、あるいはベンジルアルコールによってもまた、安定化される、と概して結論づけできる。低いｐＨは、二重特異性抗体構築物の安定化を補完し、これは、より高い濃度、例えば少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μｇ／ｍｌを含む医薬組成物が安定であること、すなわち、パーセンタイルＨＭＷ濃度が低いことを示すことの理由である。
【０３５８】
実施例２：さらなる公知の保存剤として、ベンジルアルコールを、本発明による代表的な二重特異性抗体構築物であるＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物との適合性について試験した。本明細書に記載の典型的な二重特異的抗体構築物は、ｐＨ４の環境に比べてｐＨ７の環境において凝集に対する保護が少ないため、臨床適用状況をよりよく模倣するために、シビアな環境として生理学的ｐＨ７を選択した。全体的に凝集しやすい傾向にあると予想すべきと考えられる。詳細には、一般的な臨床適用濃度及びそれを超え得る濃度を反映した４．５〜８００μｇ／ｍｌのＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の希釈系列を調製した。０．９％のベンジルアルコール濃度は、商業的及び規制上認可された０．９％の塩化ナトリウム、ＵＳＰ（０．９％ベンジルアルコールを含有）に則して選択した。臨床環境においても一般的な周囲温度である２５℃での０、１及び２日後に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって、望ましくないＨＭＷ種の割合を測定することによって適合性を調べた。図１に見られるように、望ましくないＨＭＷ種の割合で表した凝集速度は、二重特異性抗体構築物、本事例では、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の濃度に依存する。驚くべきことに、５０μｇ／ｍｌ未満の濃度ではＨＭＷ種の増加は認められない。４．５μｇ／ｍｌの濃度でのＨＭＷの割合の値から、ＨＭＷ種は単量体への可逆性も示すことが認められる。したがって、約５０μｇ／ｍｌの閾値以下では、代表的なＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ベンジルアルコールのような保存剤との接触時にＨＭＷ種はほとんど見られず、２日間保存してもＨＭＷの割合は２％未満に留まることが観察された。また、２００μｇ／ｍｌ未満の濃度では、初期ＨＭＷ濃度は非常に低く（１％未満）、保存２日後でさえも５％を有意に下回ったままである。本発明によるＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物が、安定性の点でより感受性の高い二重特異性抗体構築物であるのと同様に、他の構築物は、それぞれの二重特異性抗体構築物濃度でさらに低いＨＭＷの割合を示し、さらなる任意の補完安定化剤が存在しなくても、臨床応用に適切な生理的ｐＨ７及び温度２５℃において、代表的な保存剤ベンジルアルコールの存在下で安定であることが観察された。
【０３５９】
実施例３：代表的な保存剤ベンジルアルコールの存在下、ならびに生理的ｐＨ７、冷凍及び臨床現場での投与をカバーする４及び２５℃の両方における代表的なＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、単量体に戻るＨＭＷ種の可逆性を１４日間にわたってさらに調べた。当該構築物の濃度は、それぞれ４μｇ／ｍｌであった。ベンジルアルコールの濃度はそれぞれ０．２５、０．５及び０．９％であった。図３Ａから分かるように、４℃ではＨＭＷの割合は０日目から７日目にかけて低下するが、７日目から１４日目にかけては有意に変化しない。ベンジルアルコールを含む製剤のＨＭＷ値は、安定化効果を示さないものよりもわずかに低い。この効果は２５℃でさらに顕著である（図３Ｂ参照）。ベンジルアルコール濃度が高く、観察時間が長いほど、ＨＭＷの割合は低い。この結果からは、ＨＭＷ種が、代表的な保存剤ベンジルアルコールの存在下で、好ましくはより高いが調節許容可能な濃度（０．９％）において、単量体へ戻る可逆性をも示すことが確認される。
【０３６０】
同じ実験条件下で、輸液バッグ材料の潜在的な影響を同様に調べた。７日間のＩＶバッグの予想される投与濃度である１９００ｎｇ／ｍＬのＢｌｉｎｃｙｔｏを含む微生物増殖試験用のＩＶバッグを調製した。安定性試験のために調製したＩＶバッグは、投与濃度を階層化し、４５００ｎｇ／ｍＬまたは１９００ｎｇ／ｍＬのいずれかでＢｌｉｎｃｙｔｏを含有させた。安定性指示アッセイＳＥ−ＨＰＬＣ及びＣＥ−ＨＰＬＣに対しては、ＬＯＱを上回る、より高い濃度が必要であった。
【０３６１】
両方の研究で２５０ｍＬのＩＶバッグを利用した。微生物増殖試験は、空のＥＶＡ  ＩＶバッグのみを用いて評価した。これらのバッグは、滅菌環境で調製し、室温で１４日間インキュベーションする間、微生物播種及び増殖試験のために調製した。安定性試験ではＥＶＡとポリオレフィンＩＶバッグの両方を評価した。生理食塩水で満たしたポリオレフィンＩＶバッグを、使用前に排出させた。Ｂｌｉｎｃｙｔｏを含有する注入溶液を調製した後、両方のＩＶバッグタイプを４℃で１０日間置いて、診療所での最大貯蔵時間をシミュレートし、その後、２５℃及び３７℃で１４日間、インキュベーションした。したがって、輸液バッグ材料エチルビニルアセテート（ＥＶＡ）及びポリオレフィンを、パーセンタイルＨＭＷ種に関してＢｉＴＥ（登録商標）安定性の差について比較した。
【０３６２】
それぞれの製剤は、４μｇ／ｍｌのＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性構築物を含み、０％、０．５％、０．６％または０．７４％のベンジルアルコール濃度を、２５℃で０、４、７、９、１１または１４日間維持し、１つの試料を静的対照として４℃で１０日間インキュベートした。図３Ｃから分かるように、ベンジルアルコールを含む製剤は、全体的に安定性の向上を示し、ＨＭＷ値をさらに低下させたが、このことは、特に保存剤濃度に依存した単量体への可逆性を示している。この傾向は、ポリオレフィンの場合よりもＥＶＡの方がやや一貫して観察された。したがって、単量体の指標としてのパーセンタイル主ピーク、すなわち非凝集及び活性二重特異性抗体構築物は、より高い濃度の保存剤及び検査時間にわたって増加する（図３Ｄ参照）。一般的に、ベンジルアルコールが存在することにより、特に２５℃でのインキュベーション中の再平衡化の速度が高まるようであった。全体として、試験した２種類のＩＶバッグ材料の間に有意差はなかった。
【０３６３】
実施例４：ベンジルアルコールのような保存剤によって付与される本発明の代表的な二重特異性抗体構築物の安定性の向上を、検出手段として蛍光を用いる変性アッセイによってさらに試験した。実験条件は、変性剤として塩化グアニジニウムを含み、その濃度をｘ軸上にプロットした（図４参照）。インキュベーション時間は、生理条件に近いｐＨ７、２５℃、２．５時間であった。蛍光励起を２８０ｎｍに設定し、発光スキャンを３００〜４００ｎｍで行った。パーセンタイル変性画分を、当該分野で標準的な蛍光アッセイから計算した。その結果を図４に見ることができる。灰色の曲線はベンジルアルコールを含む製剤を表し、黒色の曲線は保存剤を含まない製剤を表す。灰色の曲線は、曲線の底部の右側へのシフトを示す。これは、この領域、すなわちＣＤ３ドメインをアンフォールディングするためにより多くの変性剤が必要になることを意味しており、これは保存剤によって付与される安定性の向上と解釈される。
【０３６４】
実施例５：この実施例は、静脈内（ＩＶ）バッグを介して投与するＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物薬物製品（ＤＰ）のサポートによる微生物チャレンジ試験であった。この試験は、異なる濃度（０．５％〜０．７４％）のベンジルアルコール（ＢｅＯＨ）の能力を評価し、ベンジルアルコール、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物ＤＰ、及び静脈内溶液安定化剤（ＩＶＳＳ）を含有するブリナツモマブ輸液を保持し、２０〜２５℃で最大１４日間維持したＩＶバッグ中の微生物増殖を低減または排除する。
【０３６５】
この試験から得られた結果は、評価した濃度でのベンジルアルコールが、評価した６種の微生物の増殖を阻害できることを示している。試験で評価したグラム陰性細菌（大腸菌、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びＥ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ））に対する抗菌効力は明らかである。これらの微生物は、ＢｅＯＨを含まないブリナツモマブ輸液において約１０６ＣＦＵ／ｍＬまで増殖することができたが、評価した３つすべての濃度で増殖が完全に阻害された。この研究で評価したグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌、及びＭ．ルテウス）ならびに酵母（Ｃ．アルビカンス）に対する効果は、グラム陰性細菌に対する効果と同様には明らかでなく、これは主に、ブリナツモマブ輸液がグラム陽性細菌及び酵母の増殖をサポートしないことに起因する。これらの微生物の０．０％ＢｅＯＨ陽性対照については、力価の漸減と、評価期間の終了時に向けて回復可能な力価が低いものから回復しないものが観察された。それにもかかわらず、これらの微生物に対するベンジルアルコールの抗菌効力は、ＢｅＯＨ処理した試料中でチャレンジした播種菌を完全に不活性化または阻害するのに必要な持続時間の差によって示すことができる。
【０３６６】
この試験は、ベンジルアルコール（ＢｅＯＨ、最終濃度０．０％、０．５％、０．６％または０．７４％）、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物ＤＰ、及びＩＶＳＳを含むＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物輸液１０９ｍＬを充填したＩＶバッグ中の６つの異なる微生物の増殖を評価するために実施した。調製したＩＶバッグを２０〜２５℃で最大１４日間保持した。
【０３６７】
この試験のために選択した細菌及び酵母は、一般的に院内感染から単離された公知のヒト病原体の代表である。これらの微生物には、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＡＴＣＣ１０２３１）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（ＡＴＣＣ１３０４７）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ８７３９）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）（ＡＴＣＣ４６９８）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ９０２７）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ６５３８）が含まれる。
【０３６８】
ブリナツモマブＤＰ製剤は、２５ｍＭクエン酸一水和物、２００ｍＭ  Ｌ−リジン一塩酸塩、１５％（ｗ／ｖ）トレハロース二水和物、０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０（ｐＨ７．０）中に１．９１μｇ／ｍＬブリナツモマブを含有する。ＩＶＳＳ用の製剤は、２５ｍＭクエン酸一水和物、１．２５Ｍ  Ｌ−リジン一塩酸塩、０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ７．０である。
【０３６９】
被験物質：試験で評価した被験物質は、総容積１０９ｍＬ／バッグ中に１．９１μｇ／ｍＬの濃度のブリナツモマブを含有するＩＶバッグに充填したブリナツモマブ輸液であった。２．２ｍＬのＩＶＳＳ、１６．８ｍＬのプールし、再構成したブリナツモマブＤＰ（２１０μｇ）、ならびに合計９０ｍＬの総容量の生理食塩水及び０．９％ベンジルアルコールを含む生理食塩水（ｂｓａｌｉｎｅ）の組合せを加えることによってこの溶液を作製した。この試験で評価した４つの異なるレベルのＢｅＯＨ（０．０％、０．５％、０．６％及び０．７４％）は、異なる量の生理食塩水及びｂｓａｌｉｎｅを加えることによって達成された。例えば、生理食塩水９０ｍＬを添加することにより０．０％ＢｅＯＨ（陽性対照）を有するバッグを調製し、一方、１８ｍＬの生理食塩水及び７２ｍＬの０．９％ｂｓａｌｉｎｅを２．２ｍＬのＩＶＳＳ及び１６．８ｍＬのブリナツモマブＤＰに加えることによって０．６％ＢｅＯＨを有するバッグを調製した。詳細は、付録Ａを参照されたい。この報告の付録Ａの図１（ＩＶバッグ調製の概略図）における０．０％ＢｅＯＨ陽性対照の図、及び付録Ｄの図４の同じ図は、最終ＢｅＯＨ濃度を０．０％ではなく０．５％であると不注意にも記載した。これは誤植であり、試験結果に影響を及ぼすものではない。
【０３７０】
合計２４個のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物輸液を充填したＩＶバッグを評価し、上記６種の異なる微生物に対するベンジルアルコールの４種のレベルの効果（６×４＝２４）を評価した。＜１×１０４ＣＦＵの微生物を含有するおよそ１ｍＬの播種菌を、注入ポートを通して各バッグ内に播種し、約１ｘ１０２ＣＦＵ／ｍＬの初期微生物負荷を生じさせた。播種後、袋上のサンプリングポートを滅菌ＩＰＡで洗浄し、袋を短時間混合し、次いで２０〜２５℃でインキュベートした。
【０３７１】
陰性対照：チャレンジした微生物を含まない３種のレベルのＢｅＯＨ（０．５％、０．６％及び０．７４％）のブリナツモマブ輸液を含む３つのＩＶバッグを、試験化合物と共にインキュベートし、陰性対照として機能させた。０．１％ペプトン水（ＰＥＰＷ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＨＳＳ）を含む、追加のアッセイ陰性対照を、この試験で評価した。これらの陰性対照は、常に増殖するために陰性でなければならない。さらなる詳細は、付録Ａを参照されたい。
【０３７２】
サンプリング及び滴定手順：０時間、４日、８日、１０日、１２日及び１４日目の各時点で、評価した各バッグから３ｍＬのアリコートを採取し、滴定した。
【０３７３】
滴定した各試料について、１ｍＬのアリコートを２連で、膜濾過法によって試料の滴定を行った。さらなる希釈を行い、計数可能な結果（＜３００ＣＦＵ／プレート）を得た。
【０３７４】
チャレンジした微生物に対するＢｅＯＨの効果を、図１〜図６にグラフで示す。通常、この試験で評価したグラム陰性（Ｇ−）細菌（大腸菌、緑膿菌、及びＥ．クロアカ）は、グラム陽性（Ｇ＋）細菌（黄色ブドウ球菌、及びＭ．ルテウス）ならびに酵母（Ｃ．アルビカンス）よりもはるかに良好に増殖し、ブリナツモマブ輸液（ＢｅＯＨを含まない）中で生存率を維持した。３種すべての評価したＧ−バクテリアの０．０％ＢｅＯＨ陽性対照は、８日目に約１０６ＣＦＵ／ｍＬまで増殖し、試験終了（１４日間）までそのレベルを維持した（図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ）。対照的に、播種したＧ−バクテリア（約１００ＣＦＵ／ｍＬ）の増殖は、ＢｅＯＨの存在下で阻害された（すなわち不活性化された）。３種のＢｅＯＨ濃度の全てで、４日目以降に回復可能な緑膿菌はなく（図５Ｂ）、１０日目以降に回復可能な大腸菌またはＥ．クロアカはなかった（それぞれ図５Ａ及び図５Ｃ）。
【０３７５】
Ｇ−バクテリアとは異なり、Ｇ＋バクテリア（黄色ブドウ球菌、及びＭ．ルテウス）またはＣ．アルビカンスの増殖（それぞれ、図５Ｄ、５Ｅ及び５Ｆ）は、ブリナツモマブ輸液（ＢｅＯＨありまたはなし）によってサポートされなかった。０．０％ＢｅＯＨ陽性対照の経時試料中のＧ＋バクテリア及びＣ．アルビカンスの力価の漸減が観察され、試験終了時まで回復可能な力価が低いかまたは回復しなかった。同様に、これらの微生物に対するＢｅＯＨの抗菌効力は、それでもなお顕著ではあるが、Ｇ−バクテリアで観察されたほど明白なものではない。この作用は、チャレンジした微生物が、ＢｅＯＨ処理した試料において、０．０％ＢｅＯＨ対照に比べてより早く完全に不活性化または阻害されることを実証することができる。黄色ブドウ球菌について、チャレンジした播種菌は、陽性対照が１０日目であったのに対して、０．７４％ＢｅＯＨでは４日目以降に、０．５％または０．６％ＢｅＯＨでは８日目に回復不能になった（図５Ｄ）。同様に、チャレンジしたＭ．ルテウスは、０．７４％ＢｅＯＨでは８日目に、０．５％または０．６％ＢｅＯＨでは１４日目に回復不能になり、陽性対照は１４日目においても低い微生物の回復率を有し（図５Ｅ）；チャレンジしたＣ．アルビカンスは、３つすべてのレベルのＢｅＯＨで８日目に、陽性対照については１０日目に回復不能であった（図５Ｆ）。したがって、試験した製剤におけるロバストな抗菌活性を示すことができた。
【０３７６】
実施例６：本発明の二重特異性抗体構築物及び保存剤を含む製剤中で使用する緩衝液及び／または賦形剤による追加の安定化効果を証明することが本実験の目的であった。モデル抗ＦＡＰαドメイン、単離された抗ＣＤ３ドメイン（Ｉ２Ｃ、すべての例示される二重特異性抗体構築物にわたって典型的に使用される）、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物及びＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物を試験した。ＦＡＰａ、抗ＣＤ３ドメイン、及びＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物については、実験手順は同じであった。第一に、タンパク質試料をトリス−リン酸緩衝液（３５ｍＭトリス、１７．５ｍＭリン酸、ｐＨ６．０）及び（３５ｍＭトリス、１７．５ｍＭリン酸、５０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０）にそれぞれ透析した。透析後、タンパク質濃度を０．３ｍｇ／ｍＬに調整した。第二に、正確に同じ組成を有する対応するＤ２Ｏ緩衝液中へのタンパク質試料の１〜５倍希釈によって水素−重水素交換（ＨＤＸ）反応を開始した。第三に、ＨＤＸ反応を、１０秒、１分、１０分、１時間、４時間、及び１２時間後にクエンチし、次いで、クエンチしたタンパク質試料を質量分析によって分析した。ＦＡＰａについては、ＨＤＸ反応を４℃、２５℃、及び３７℃で行った。ＨＤＸ反応は、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物ＡＭＧ３３０及び抗ＣＤ３に関して３７℃で行った。ベンジルアルコールの存在下での抗体構築物の安定性の評価のために、ベンジルアルコールを０．９％の濃度でタンパク質試料に直接添加した。ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物については、タンパク質試料を（ａ）１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２％スクロース、４％マニトール、ｐＨ６、及び（ｂ）１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２％スクロース、４％マニトール、５０ｍｍクエン酸、ｐＨ６に、それぞれ透析した。透析後、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。第二に、正確に同じ組成を有する対応するＤ２Ｏ緩衝液中へのタンパク質試料の１〜５希釈によって、ＨＤＸ反応を開始した。第三に、１０秒、１０分、２時間、８時間、１６時間、２４時間後にＨＤＸ反応をクエンチし、次いで、クエンチしたタンパク質試料を質量分析によって分析した。実験は２５℃で行った。
【０３７７】
これらの図は、ＦＡＰα（図６Ａ）、抗ＣＤ３ドメイン（ＹＩＳＹＷ）中のペプチド１０８〜１１２がＦＡＰα中のペプチド３６７〜３７０に対応する抗ＣＤ３ドメイン（図６Ｂ）、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物（ＹＩＳＹＷ）中のペプチド３６４〜３６８がＦＡＰα中のペプチド３６６〜３７０に対応するＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物（図６Ｃ）、及びＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物（ＹＩＳＹＷ）中のペプチド３６５〜３６９がＦＡＰα中のペプチド３６６〜３７０に対応するＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物（図６Ｄ）に対する、ベンジルアルコールの存在下での適用可能なクエン酸の安定化効果を示す。したがって、異なるＢｉＴＥ分子に対する抗ＣＤ３ドメインのＣＤＲ−Ｈ３領域（ＹＩＳＹＷ）に対するクエン酸塩安定化効果を観察することができる。ＦＡＰａ、抗ＣＤ３、及びＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物については、実験条件は同一であり、安定化効果は同等である。ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物については、上記のようにわずかに異なる条件で実験を行ったが、同様の安定化効果が得られた。したがって、クエン酸は、必要に応じて保存剤の存在下で二重特異性抗体構築物を安定化することができることが示されている。
【０３７８】
さらに、ＦＡＰａ、ＡＭＧ３３０、ＡＭＧ５９６、及び単離されたＣＤ３結合体それ自身に対するクエン酸及びベンジルアルコールの効果を試験した。それぞれ試験された構築物に関して、結果は、同様の効果を示す。ここで、クエン酸及びベンジルアルコールは残基３６６〜３７０（ＹＩＳＹＷ）の領域に対して相殺効果を有し得ることが示される。図６Ｅ及び６Ｆは、クエン酸及びベンジルアルコールの個々の効果を示す。例えば、トリス−リン酸（スライド中、丸）の製剤にクエン酸塩（スライド中、四角）を添加することにより、この領域の立体配座の動態が低下する。比較として、ベンジルアルコール（スライド中、三角）をトリス−リン酸の製剤に添加すると、この領域の立体配座の動態が増加する。図６Ｇ及び６Ｈは、クエン酸及びベンジルアルコールの相殺作用を示す。クエン酸塩とベンジルアルコール（白菱形）の両方の添加では、立体配座の動態は、トリス−リン酸（黒丸）の製剤に戻っており、クエン酸塩とベンジルアルコールが互いに相殺することを示している。したがって、二重特異性抗体構築物が、ベンジルアルコールのような保存剤の安定化効果（抗二量体化効果）よりも高い場合に、クエン酸塩は、保存剤の不安定化作用を相殺するための補完安定化剤として役立ち得る。
【０３７９】
実施例７：この実施例は、ＩＶ注入バッグからのＢｉＴＥ（登録商標）回収のような低濃度二重特異性抗体構築物の改良に関する。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物の高い力価の結果として、通常、ＢｉＴＥ（登録商標）濃度は低くて済む。ＩＶバッグ適合性試験の間、静脈内連続注入による投与のためにＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物を０．９％（ｖ／ｖ）生理食塩水中に非常に低い濃度へと希釈する。ＦＩＨ臨床試験のための最小のコホート投与では、タンパク質濃度は約８０ｎｇ／ｍＬで済む。この極低濃度でのＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物回収の分析には、タンパク質由来のシグナルを最大化するために、かなり標準的な逆相クロマトグラフィー法に対するいくつかの工夫と適応が必要であった。
【０３８０】
ｐＨ７で２５ｍＭのクエン酸、１．２５Ｍのリジン及び０．１％のポリソルベートを含む静脈内安定化溶液ＩＶＳＳを添加した場合と添加しなかった場合のＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の回収を調べた初期の研究は、同じ調製プロトコールの下で、ＩＶＳＳの存在下で生理食塩水に希釈したタンパク質由来のシグナルは、ＩＶＳＳの非存在下で生理食塩水に希釈したタンパク質由来のシグナルよりも実質的に高かった。４％（ｖ／ｖ）の単一ＩＶＳＳ濃度をこの試験に利用した。
【０３８１】
シグナルの相違を理解するために、小規模の試験を設計し、記録したシグナルとして、２１５ｎｍの吸光度を用いてＣ８カラムからの溶出時に記録したタンパク質ピーク面積を比較した。以下のプロトコールでは、実行した実験について簡単に記載する。０％、１％、２％、４％、６％、８％、または１０％（ｖ／ｖ）ＩＶＳＳとともに０．９％生理食塩水を希釈剤として用いて、２ｍｇ／ｍＬの濃度を有するＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のストックをエッペンドルフチューブ中で連続的に２０００倍まで希釈して１μｇ／ｍＬまでとした。希釈は、以下の希釈スキームを用いて同じストックＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物アリコートで行った：１：１０→１：１０→１：１０→１：２。１μｇ／ｍＬの設定濃度を有する各５０μＬのＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物試料をＣ８カラムに負荷し、逆相クロマトグラフィーを用いて溶出した。２１５ｎｍの吸光度を用いてクロマトグラムを記録した。比較のために各試料についてピーク高さ及び面積を記録した。生成した生データを以下の図７Ａに示す。各ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物試料のピーク面積を、以下の図２の希釈溶液に含まれる％ＩＶＳＳの関数としてプロットする。
【０３８２】
図７Ｂから、生理食塩水希釈剤への１％（ｖ／ｖ）ＩＶＳＳの添加は、ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の回収率に有意な影響を与え、ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物回収率をおよそ２５０％増加させることが明らかである。４％〜１０％（ｖ／ｖ）のＩＶＳＳを生理食塩水希釈剤に添加すると、溶出ピークの高さ及び面積により評価するＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の回収率は一定であり、このことは、４％（ｖ／ｖ）ＩＶＳＳで分子の完全回収が得られたことを示している。
【０３８３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の試料はすべて、同一条件下で調製及び分析を行い、生理食塩水希釈剤中の％ＩＶＳＳは、唯一、試料間で異なっていたが、カラムに充填したタンパク質の量は、おそらく、分子が処理中に接触した表面への吸着を介してのタンパク質の損失の結果として、０％ＩＶＳＳ、１〜２％ＩＶＳＳ、及び４〜１０％ＩＶＳＳ試料の間で様々に異なっていたと結論づけるのが合理的である。逆に、ＩＶＳＳ溶液の存在下でのＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の回収率の増加は、おそらく、処理中のＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３二重特異性抗体構築物表面吸着の阻止の結果である。この理解を様々な薬物製品の投与工程で用いて、活性薬物製品の正確な送達を保証することができる。
【０３８４】
（表５）配列の表
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
2018188437.tif 000040
【図６−２】
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【図７】
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【図８Ａ】
2018188437.tif 000043
【図８Ｂ】
2018188437.tif 000044
【図８Ｃ】
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【図９】
2018188437.tif 000046
【図１０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2018188437000001.pdf